CN113106124B

CN113106124B - 表达cyp4v2的aav载体及其用途

Info

Publication number: CN113106124B
Application number: CN202010520246.7A
Authority: CN
Inventors: 杨丽萍; 陈邵宏; 贾睿璇; 张天赋; 张凡; 和赛超; 史天永; 郝丹丹; 裴红杰; 曾露颖
Original assignee: Beijing Chinagene Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Chinagene Tech Co ltd
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-06-09
Also published as: CN113106124A

Abstract

本申请涉及一种载体，所述载体包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。本申请所述的载体具有好的表达效果，表达速度快，且表达强度更为稳定。本申请还提供了包含所述载体的细胞核药物组合物，以及它们在制备药物中的用途。

Description

表达CYP4V2的AAV载体及其用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种重组AAV载体，所述AAV载体可以表达CYP4V2蛋白。

背景技术

结晶样视网膜变性(Bietti’s crystalline dystrophy，BCD)是一种视网膜变性罕见病，其症状主要包括角膜中的晶体(透明覆盖物)，沉积在视网膜的光敏组织中的细小、黄色或白色晶体状的沉积物，以及视网膜、脉络膜毛细血管和脉络膜的进行性萎缩。沉积物会损伤视网膜，导致视力逐渐丧失。患有结晶样视网膜变性的人通常会在十几岁或二十几岁时开始察觉到视力问题，每只眼睛的视力问题可能以不同的速度恶化，即使在同一个家庭中症状的严重程度和进展在不同的个体中差异很大，然而大多数患者在四十或五十岁时就会失明。据估计，世界范围内每67,000人中有1人患有结晶样视网膜变性，在东亚人中更为常见，尤其是中国人和日本人。

现有研究表明BCD为常染色体隐性遗传疾病，并且是由CYP4V2基因突变引起的，目前国内外关于BCD患者的基因研究中已发现CYP4V2多个基因突变位点。CYP4V2基因是细胞色素P450超家族中的蛋白质之一，CYP4V2基因编码蛋白参与脂肪酸代谢的过程，一般认为结晶样视网膜变性中CYP4V2基因突变破坏了其参与脂肪酸代谢的酶功能，从而影响了脂质分解。然而CYP4V2如何导致了BCD的特定体征和症状尚不清楚。目前BCD的治疗主要参考视网膜色素变性(RP)的治疗方法，虽然CYP4V2基因突变的研究为未来的基因治疗提供了可能，但是目前还没有效的治疗方法。

发明内容

本申请提供了一种载体，所述载体包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。本申请所述的载体具有好的表达效果，表达速度快，且表达强度更为稳定，不仅能在视网膜的RPE细胞中表达，还可以有效地在感光细胞层表达，表达范围广，可以发挥更好的治疗效果。本申请的载体核/或包含所述载体的组合物，能够有效减少CYP4V2基因突变的RPE细胞的脂质沉积情况，恢复BCD患者的受损的脂肪酸代谢、脂质分解的正常功能，恢复BCD病人RPE细胞的吞噬能力，并增强正常人RPE细胞的吞噬能力，且能够显著提高BCD小鼠视网膜电图的波幅，改善BCD小鼠的视网膜功能，以及改善BCD小鼠的RPE细胞形态，维持RPE细胞数目。总的来说，本申请提供了一种包含特定的CYP4V2基因序列和启动子序列的载体，且能够显著提高CYP4V2蛋白表达效果、有效改善视网膜功能、预防或治疗BCD。本申请所述的载体在细胞、类器官以及动物水平等不同层面都具有有效性和实用性，这对于日后在人体的应用具有非常高的指导意义。

一方面，本申请提供了一种载体，所述载体包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述启动子包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。在某些实施方式中，所述多聚腺苷酸信号位点包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

在某些实施方式中，所述载体包括病毒载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包括AAV载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包括重组病毒载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包括重组AAV2/8载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述载体具备筛选标记，所述筛选标记包括抗生素筛选标记。在某些实施方式中，所述抗生素筛选标记包括卡那霉素筛选标记。

在某些实施方式中，所述载体包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

另一方面，本申请提供了细胞，所述细胞包含本申请所述的载体。

另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述的载体和/或所述的细胞。

另一方面，本申请提供了所述的载体，或所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮(RPE)萎缩相关的疾病或病症。

在某些实施方式中，所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示的是本申请所述载体片段结构示意图。

图2显示的是不同启动子的载体的GFP荧光强度。

图3显示的是不同启动子的载体的CYP4Y2蛋白表达。

图4显示的是不同血清型的AAV在注射1周后在小鼠视网膜的表达，其中，A：AAV2，B：AAV5，C和D：AAV8，E：AAV9，F：4种AAV血清型的局部检测。

图5显示的是不同启动子的AAV8病毒感染iPSC诱导分化的RPE细胞效果。

图6显示的是不同启动子的AAV8病毒感染iPSC诱导分化的3D-视网膜类器官效果。

图7显示的是不同启动子的AAV8病毒注射小鼠视网膜下腔后的蛋白表达情况，A：2周后，B：6周后。

图8A显示的是空白组CYP4V2 KO-ARPE19细胞系的脂类沉积情况，图8B显示的是AAV8-CAG-CYP4V2病毒感染CYP4V2 KO-ARPE19细胞系的脂类沉积情况，图8C显示的是AAV8-CAG-CYP4V2病毒感染CYP4V2 KO-ARPE19细胞系与野生型ARPE19中的CYP4V2表达情况。

图9A显示的是AAV8-CAG-CYP4V2感染正常人及BCD病人iPSC诱导的RPE细胞后的脂类沉积情况。

图9B显示的是AAV8-CAG-CYP4V2感染正常人及BCD病人iPSC诱导的RPE细胞后CYP4V2的表达情况。

图10显示的是AAV8-CAG-CYP4V2感染正常人及BCD病人iPSC诱导的RPE细胞后细胞的吞噬能力。

图11A显示的是显微镜下小鼠视网膜下腔注射示意图。

图11B显示的是AAV8-CAG-CYP4V2注射BCD小鼠3个月或6个月后，眼底照相的结晶沉积情况。

图12显示的是AAV8-CAG-CYP4V2注射BCD小鼠后CYP4V2的表达情况。

图13显示的是AAV8-CAG-CYP4V2注射BCD小鼠3个月后的REG水平。

图14显示的是AAV8-CAG-CYP4V2注射BCD小鼠6个月后的REG水平。

图15显示的是AAV8-CAG-CYP4V2注射BCD小鼠6个月后的ERG暗反应b波。

图16显示的是AAV8-CAG-CYP4V2注射BCD小鼠3个月和6个月后的REG水平。

图17显示的是BCD小鼠治疗6个月后RPE细胞形态改善和数目维持情况。

图18显示的是pAAV-CAG-CYP4V2载体的示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本申请中，术语“3’端”通常指多核苷酸上的核苷酸位置，其处于3’-端(即3’-端碱基)，或距离核酸或其子序列末端的一个或两个核苷酸碱基位置(即，处于距3’-端(-1)或(-2)的位置)。“3’端”与“5’端”是用来描述与遗传元件的位置和/或事件的方向(5′至3’)相关的核酸序列特征的约定，例如通过RNA聚合酶的转录或通过核糖体的翻译，其按5’至3’方向前进。同义词是上游(5’)和下游(3’)。通常，按5’至3’从左至右绘制DNA序列、基因图谱、载体图和RNA序列或用箭头表示5’至3’方向，其中箭头指向3’方向。因此，在遵循此约定时，5’(上游)表示定位在左手侧的遗传元件，而3’(下游)表示定位在右手侧的遗传元件。

在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及病毒载体等。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

在本申请中，术语“病毒载体”通常使指充当基因递送载体且包含包装于病毒衣壳内的重组病毒基因组的非野生型重组病毒颗粒。用作载体的动物病毒种类可以包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(例如SV40)。

在本申请中，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是只在细胞中生长的一种单链DNA细小病毒，其中某些功能由共感染辅助病毒提供。当前存在已经被表征的十三种AAV血清型，如下表1中所示。有关AAV的一般信息和综述可以见于例如Carter,1989，《细小病毒手册》(Handbook of Parvoviruses)，第1卷，第169-228页以及Berns,1990,《病毒学》(Virology)，第1743-1764页，Raven Press,(New York)中。然而，完全预期的是，这些相同的原理将适用于另外的AAV血清型，这是因为已知各种血清型在结构和功能这两方面，甚至是在基因水平上是非常密切相关的。举例来说，所有AAV血清型显然表现出由同源rep基因所介导的非常相似的复制特性；并且全部均带有三种相关的衣壳蛋白，如AAV6中表达的那些。相关度进一步通过异源双链体分析来表明，所述异源双链体分析揭示了血清型之间沿基因组长度的广泛的交叉杂交；以及对应于“反向末端重复序列(ITR)”的末端处类似的自退火段的存在。相似的感染模式还表明每一种血清型中的复制功能处在相似的调节控制之下。

表1 AAV衣壳蛋白血清型

在本申请中，术语“AAV载体”通常是指包含由AAV末端重复序列(ITR)侧接的一个或多个感兴趣的多核苷酸(或转基因)的载体。当存在于已经被转染了编码和表达rep和cap基因产物的载体的宿主细胞中时，这样的AAV载体可以被复制和包装到感染性病毒颗粒中。术语“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”指的是由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如欲被递送到哺乳动物细胞中的转基因)，那么它通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，以使得载体被包含在AAV载体颗粒内。

AAV“rep”基因和“cap”基因分别是指编码复制蛋白和衣壳蛋白的基因。已经在迄今为止所研究的所有AAV血清型中发现了AAV rep基因和cap基因，并且所述基因描述于本文和所引用的参考文献中。在野生型AAV中，rep基因和cap基因一般在病毒基因组中是彼此相邻的(即它们在一起“偶联”成邻接或重叠的转录单位)，并且它们在AAV血清型间一般是保守的。AAV rep基因和cap基因还可被单独或统称为“AAV包装基因”。所述的AAV cap基因编码Cap蛋白，所述Cap蛋白能够在rep和腺病毒辅助功能的存在下包装AAV载体并且能够结合靶细胞受体。在某些情形中，AAV cap基因编码具有源自于特定的AAV血清型，例如表1中所示的血清型的衣壳蛋白。

AAV不同的血清型具有在氨基酸水平和核酸水平上显著同源的基因组序列，提供一组相似的遗传功能，产生在物理上和功能上基本上等同的病毒体，并且通过几乎相同的机制复制和组装。

在本申请中，术语“多聚腺苷酸序列”，也称作多聚腺苷酸尾，PolyA尾，通常是指转录后的mRNA在3’端加上的一段几十至几百个单一的腺苷酸链。多聚腺苷酸化通常发生在脱氧核糖核酸(DNA)在细胞核内转录成核糖核酸(RNA)的过程中及完成后，该反应通常是由多聚腺苷酸聚合酶完成的。在真核生物中，多聚腺苷酸化是一种机制，可以使mRNA分子于其3’端中断，多聚腺苷酸序列可以保护mRNA免受核酸外切酶攻击，并且对mRNA的细胞核输出、翻译和稳定性都十分重要。

在本申请中，术语“多聚腺苷酸信号位点”通常是指一段位于信使RNA(mRNA)的3’端能够被多聚腺苷酸化相关裂解因子识别的碱基序列。通常也是mRNA上的一段顺式调节信号。一般情况下加尾的过程(即多聚腺苷酸化)开始于转录终止后，多聚腺苷酸化相关裂解因子在多聚腺苷酸信号位点的调控下，在mRNA的3’UTR的后面加上几十到几百个单一的腺苷酸。常见的加尾信号包括SV40，BGH，HSV，TK信号等。所述多聚腺苷酸化相关裂解因子可以包括裂解/聚腺苷酸特异性因子(CPSF)、裂解刺激因子(CstF)、裂解因子I(CFI)、裂解因子II(CFII)。多聚腺苷酸信号位点通常可以包含AAUAAA序列，但是在真核生物组之间有所不同。例如，大多数人的多聚腺苷酸信号位点含有AAUAAA序列，但该序列在植物和真菌中较少见。

在本申请中，术语“可操作连接”通常是指将编码序列表达所必需的调控序列置于相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。例如，当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。在某些实施方式中，可以表示表达载体中编码序列和转录控制元件的排列。所述控制元件可以包括启动子、增强子和终止元件。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。在某些实施方式中，“可操作连接”还可以是指目的基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节目的基因的转录和翻译的预期功能。

在本申请中，术语“启动子”通常指一段能使特定基因进行转录的脱氧核糖核酸(DNA)序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录合成RNA。在核糖核酸(RNA)合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子包含核心启动子区域和调控区域，位于控制基因表达的调控序列中、基因转录起始位点的上游(DNA反义链的5’方向)，本身并无编译功能。根据其作用方式及功能分为三类：组成型启动子(在多数或全部组织中保持持续的活性)、特异型启动子(组织特异性或者发育时期的特异性)和诱导型启动子(受外界化学或物理信号调控)。

在本申请中，术语“CYP4V2”通常是指一种蛋白质，其为细胞色素P450家族4亚家族V成员2。术语“细胞色素P450”，也称作cytochromeP450或CYP450，通常是指一类亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，参与内源性物质或包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级。细胞色素P450酶系统可以缩写为CYP，其中家族以阿拉伯数字表示，亚家族以大写英文字母表示，酶个体以阿拉伯数字表示，例如本申请中的CYP4V2。人CYP4V2基因(HGNC：23198)全长19.28kb，位于4q35，具有11个外显子，在脂肪酸代谢中发挥重要作用(Kumar S.,Bioinformation,2011,7:360-365)。CYP4V2几乎在所有组织中表达，但是在视网膜和视网膜色素上皮中以高水平表达，而角膜，组织中以稍低的水平表达。CYP4V2基因的突变可能与结晶样视网膜变性和/后视网膜色素变性有关。

在本申请中，术语“视网膜色素上皮(RPE)”通常是指一层紧贴于视网膜感觉神经之外的色素细胞。视网膜色素上皮由单层六边形细胞组成，其内含有密集的色素颗粒。网膜色素上皮(RPE)与其下的脉络膜和其上视网膜神经细胞紧密相连，其主要功能可以包括：控制视网膜下间隙的液体和营养，起到血-视网膜屏障的功能；合成生长因子调整局部的结构；吸收光，调节电平衡；视色素的再生和合成；吞噬和消化光感受器外节；维持视网膜的附着；损伤后的再生和修复。通常认为RPE是维持光感受器功能的重要组织，同时也受脉络膜和视网膜的很多病变影响。

在本申请中，术语“视网膜色素上皮(RPE)萎缩”通常是指视网膜色素上皮(RPE)表现为细胞死亡或功能障碍的退行性变化。年龄相关黄斑变性或视网膜色素变性(RP)通常伴有视网膜色素上皮萎缩。视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa，简称RP)也称视网膜色素病变，通常是指一类遗传性眼科疾病。其遗传方式有常染色体隐性、显性与X性连锁隐性三种，也存在双基因和线粒体遗传。初期普遍的病征可以是夜盲、视野变窄，能够看到正前方景物而无法看见略偏左右的视野，之后视力将会逐渐消失。RP可以包括单眼性原发性视网膜色素变性、象限性原发性视网膜色素变性、中心性或旁中心性原发性视网膜色素变性、无色素性视网膜色素变性白点状视网膜变性、结晶样视网膜变性、静脉胖色素性视网膜色素变性、小动脉旁色素上皮保留型视网膜色素变性、Leber先天黑蒙和其他综合征中的视网膜色素变性。

在本申请中，术语“结晶样视网膜变性”通常是指一类由意大利眼科医生GBBietti博士于1937年首次描述的常染色体隐性遗传眼病。其主要症状包括角膜中的晶体(透明覆盖物)，沉积在视网膜的光敏组织中的细小、黄色或白色晶体状的沉积物，以及视网膜、脉络膜毛细血管和脉络膜的进行性萎缩。结晶样视网膜变性可以包括由CYP4V2基因突变引起的疾病。

在本申请中，术语“预防”通常是指对健康受试者预防性地施用组合，以预防某种疾病或病症的发生。其也可以包含对处于待治疗变应性疾病前期的患者预防性地施用组合。“预防”不需要100％消除疾病或病症发生的可能性，换句话说，“预防”通常指在所述施用组合的存在下疾病或病症发生的可能性降低了。

在本申请中，术语“缓解”指减少、缩减或迟滞某种病状、疾病、病症或表型。所述病状、疾病、病症或表型可以包括包括受试者主观感知例如疼痛、晕眩或其他生理性障碍，或者医学上可以检测的指征，例如通过医学检验手段检测到的病灶情况。

在本申请中，术语“治疗”通常指用于改变所处理的个体或细胞在临床病理过程中的自然过程的临床干预。可以包括改善病状态、消除病灶或改善的预后。

在本申请中，术语“细胞”通常可以是或已经是核酸分子或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物。细胞可以包括本申请所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。在某些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞为HEK293T细胞。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指涉及适合施用于患者、人患者的组合物。例如，本申请所述的药物组合物，其可以包含本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下可以对接受者无毒。本申请的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。

在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。

在本申请中，术语“包含”或“包括”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

发明详述

CYP4V2

一方面，本申请提供了一种载体，所述载体可包含编码CYP4V2的多核苷酸。在本申请中，CYP4V2可以包含一类其功能障碍或其编码基因突变可能导致结晶样视网膜变性的蛋白，包括但不限于人类、黑猩猩、大猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、果蝇、线虫或青蛙的CYP4V2或其功能性变体。例如，所述CYP4V2可以包含人CYP4V2。本申请中，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。例如，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。

在某些情形中，本申请所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含天然编码CTP4V2多核苷酸的同义突变后的序列。在某些情形中，本申请所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQID NO:4所示的核苷酸序列。例如，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列至少90％同源的核苷酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种多核苷酸序列。

本申请的编码CYP4V2的多核苷酸的5’端可以包含kozak序列，例如，kozak序列可以包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

启动子

本申请所述的载体可包含启动子。在本申请中，所述启动子可以包含RPE细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、角膜细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子或组成型启动子。所述启动子还可以包含哺乳动物β肌动蛋白启动子或病毒启动子。所述启动子还可以包含CAG启动子(杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，也称为CAGGS启动子，CB启动子或CBA启动子)、人β肌动蛋白启动子、小CBA(smCBA)启动子、CBS启动子或CBh启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、延伸因子1α(EF-1α)启动子、CMV启动子、PGK启动子、UBC启动子、GUSB启动子、UCOE启动子、VMD2(也称为BEST1)启动子、OPEFS启动子、CYP4V2自身启动子、RPE65启动子或其杂合体或衍生物。例如，所述启动子可以为CAG启动子。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。例如，所述启动子可以包含与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少90％同源的核苷酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种多核苷酸序列。

在本申请中，所述启动子可以与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。在某些情形中，所述启动子可以位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

本申请所述的启动子能够使编码蛋白的基因高效地表达。

多聚腺苷酸信号位点

在本申请中，所述载体还可包含多聚腺苷酸信号位点。所述多聚腺苷酸信号位点可以包含SV40信号位点、BGH信号位点、WPRE信号位点、WPRE-SV40信号位点、WPRE-BGH信号位点或其衍生物。

在某些情形中，所述多聚腺苷酸信号位点可被多聚腺苷酸化相关裂解因子识别从而产生SV40多聚腺苷酸序列、BGH信号多聚腺苷酸序列、HSV信号多聚腺苷酸序列、TK信号多聚腺苷酸序列、WPRE信号多聚腺苷酸序列等。例如，所述多聚腺苷酸信号位点可以为BGH信号位点，可包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。例如，所述多聚腺苷酸信号位点可以包含与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列至少90％同源的核苷酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种多核苷酸序列。

在某些情形中，所述多聚腺苷酸信号位点可以位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

载体

在本申请中，所述载体从5’端到3’端可以依次包含所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述多聚腺苷酸信号位点包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。其中，在所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端可以包含kozak序列(SEQ ID NO:10)。

例如，本申请所述编码CYP4V2的多核苷酸可包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。例如，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列至少90％同源的核苷酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种多核苷酸序列。

在本申请中，所述载体可以包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及病毒载体。

本申请所述载体可以为病毒载体。在某些情形中，所述病毒载体可以包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(AAV载体)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(例如SV40)。

所述腺相关病毒载体(AAV载体)基因可以包含反向末端重复序列(ITR)、开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框可以包括编码Rep蛋白的多核苷酸，还可以包括编码衣壳的多核苷酸。所述腺相关病毒载体(AAV载体)还可以包括重组腺相关病毒载体(rAAV载体)。

在一些情形中，所述载体还可包含启动子下游的限制性酶切位点以允许插入编码所述CYP4V2的多核苷酸，其中启动子和限制性酶切位点可位于5’AAV ITR的下游和3’AAVITR的上游。在一些情形中，所述载体还可包含处于限制性酶切位点下游和3’AAV ITR上游的转录后调节元件。在一些情形中，所述载体还可包含插入于限制性酶切位点处并且与启动子可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸可包含所述CYP4V2的编码区。如本领域技术人员所将了解的那样，本申请中所公开的AAV载体中的任一种可以作为病毒构建体用于所述方法中以产生重组AAV。

在某些情形中，包含腺病毒或杆状病毒辅助基因的一种或多种辅助质粒或辅助病毒可以提供辅助功能。腺病毒或杆状病毒辅助基因的非限制性实例包括但不限于E1A、E1B、E2A、E4以及VA，它们可以为AAV包装提供辅助功能。

AAV的辅助病毒是本领域已知的，可以包括例如来自腺病毒科(Adenoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。本领域技术人员将了解的是，可以为AAV提供足够的辅助功能的AAV的任何辅助病毒或辅助质粒均可以用于本文。

在一些情形中，AAV cap基因可存在于质粒中。所述质粒还可以包含AAV rep基因。来自任何AAV血清型(包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13和其任何变体)的rep基因和/或cap基因可以用于本文中以产生重组AAV。在一些情形中，AAV cap基因可以编码来自血清1型、血清2型、血清3型、血清3B型、血清4型、血清5型、血清6型、血清7型、血清8型、血清9型、血清10型、血清11型、血清12型、血清13型或其变体的衣壳。

例如，所述重组腺相关病毒载体中衣壳、ITR和其它所选AAV组件可以独立地选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、DJ、DJ/8、Rh10任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

在某些情形中，所述载体的衣壳序列可以由另外的质粒提供。例如，可以由AAV-RC8提供，且其载体序列可以如SEQ ID NO:9所示。在某些情形中，所述衣壳序列还可以包含氨基酸突变。

在某些情形中，所述AAV载体可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8、AAVAnc80、DJ、DJ/8、Rh10中的任意一种。例如，所述AAV载体为眼组织亲和性AAV载体，例如，AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、DJ/8或任意rAAV载体。

在一些情形中，可以将昆虫细胞或哺乳动物细胞用辅助质粒或辅助病毒、编码AAVcap基因的病毒构建体和质粒转染；并且可以在共转染之后的各个时间点收集重组AAV病毒。例如，可以在共转染之后的约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时、或这些时间点中的任何两个之间的时间收集重组AAV病毒。

在某些情形中，所述AAV载体可以是AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8或AAV2/9。

例如，所述病毒载体可以包含AAV2/8。

例如，所述病毒载体可以包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。例如，所述载体可以包含与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列至少90％同源的核苷酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种多核苷酸序列。

还可以使用本领域已知的适用于产生感染性重组AAV的任何常规方法来产生重组AAV。在一些情况下，可以通过使用稳定表达对于AAV颗粒产生来说一些必要的组分的昆虫细胞或哺乳动物细胞来产生重组AAV。举例来说，包含AAV rep基因和cap基因以及筛选标记，如卡那霉素抗性基因的质粒(或多种质粒)可以被整合到细胞的基因组中。然后可以将昆虫细胞或哺乳动物细胞用辅助病毒(例如提供辅助功能的腺病毒或杆状病毒)以及包含5’AAV ITR和3’AAV ITR(以及,如果需要的话，编码异源蛋白质的核苷酸序列)的病毒载体共感染。这种方法的优势在于所述细胞是可选择的并且适用于大规模产生重组AAV。作为另一个非限制性实例，可以使用腺病毒或杆状病毒，而不是使用质粒来将rep基因和cap基因引入到包装细胞中。作为又另一个非限制性实例，含有5’AAV ITR和3’AAV ITR的病毒载体以及含有rep-cap基因的病毒载体这两者可以被稳定整合到生产细胞的DNA中，并且辅助功能可以由野生型腺病毒提供以产生重组AAV。

在某些情形中，本申请所述的载体可包含5’非编码区和/或3’非编码区。5’非编码区和/或3’非编码区的序列可以有多种，示例性的5’非编码区的核苷酸你序列如SEQ IDNO:6所示，示例性的3’非编码区的核苷酸你序列如SEQ ID NO:7所示。在另一些情形中，本申请所述的载体可不包含5’非编码区和/或3’非编码区。

本申请所述载体可以具备筛选标记，所述筛选标记可以包括抗生素筛选标记。例如，所述抗生素筛选标记可以包括卡那霉素筛选标记。

例如，本申请所述的载体可以包含如图18所示的图谱。例如，本申请所述载体可包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。例如，所述载体可以包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％同源的核苷酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种多核苷酸序列。

细胞

本申请还提供了细胞，其可以包含本申请所述的载体。在某些情形中，所述细胞可以是使得所述载体在其中表达的细胞。在某些情形中，所述细胞可以包含单个细胞的后代。所述后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。所述细胞还可以包含用本申请所述的载体在体外转染的细胞。在某些情形中，所述细胞可以包含细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞、293T细胞。在某些情形中，所述细胞为来自结晶样视网膜变性患者的细胞。例如，所述细胞可以包含体细胞或干细胞。

本申请所述细胞可以包含视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、晶状体细胞、神经细胞、RPE细胞、干细胞，所述干细胞可以包含诱导性多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)、成体干细胞或源自干细胞的任何细胞。例如，所述视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、晶状体细胞、神经细胞、RPE细胞可以是由所述干细胞诱导分化的。又例如，所述细胞可以包含ARPE-19细胞、人iPSC诱导的RPE细胞。

药物组合物

另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述的载体和/或所述的细胞。所述药物组合物还可以包含任选地药学上可接受的佐剂。在某些情形中，本申请所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。

在某些情形中，所述组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下对接受者无毒。在某些情形中，所述药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。在某些情形中，所述药学上可接受的佐剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒，且既不是生物学上也非其它方面不合需要的。

例如，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或眼内施用或直接注射到组织中。

例如，所述药物组合物可以通过滴注、输注或注射施用于患者或者受试者。例如，所述药物组合物可以不间断(或连续)施用。例如，所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。

在本申请中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

用途

另一方面，本申请提供了所述的载体，或所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮(RPE)萎缩相关的疾病或病症。在某些情形中，所述疾病或病症包括视网膜变性。

在某些情形中，所述视网膜色素变性可以包括单眼性原发性视网膜色素变性、象限性原发性视网膜色素变性、中心性或旁中心性原发性视网膜色素变性、无色素性视网膜色素变性白点状视网膜变性、结晶样视网膜变性、静脉胖色素性视网膜色素变性、小动脉旁色素上皮保留型视网膜色素变性、Leber先天黑蒙和其他综合征中的视网膜色素变性。例如，所述视网膜色素变性可以包括结晶样视网膜变性。

例如，所述结晶样视网膜变性可以包括由CYP4V2基因突变引起的疾病。

在某些情形中，所述CYP4V2基因突变可以包括但不限于错义突变、复制错误、剪接位点错误、移码、碱基缺失或插入、无义突变、多态性(例如，单核苷酸多态性)、过早终止、CYP4V2部分或全基因缺失及尚未鉴定的与结晶样视网膜变性相关的CYP4V2基因变异。

例如，所述CYP4V2基因突变可以包括表2所示突变：

表2 CYP4V2基因突变部分类型

表2中所示的CYP4V2基因突变型可自数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/？term＝CYP4V2[gene]获得。

本申请还可包括以下实施方案：

1.载体，其包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述启动子包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.根据实施方案1所述的载体，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

3.根据实施方案1-2中任一项所述的载体，其还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

4.根据实施方案3所述的载体，其中所述多聚腺苷酸信号位点包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

5.根据实施方案1-4中任一项所述的载体，其中所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

6.根据实施方案1-5中任一项所述的载体，其中所述载体包括病毒载体。

7.根据实施方案6所述的载体，其中所述病毒载体包括AAV载体。

8.根据实施方案6-7中任一项所述的载体，其中所述病毒载体包括重组病毒载体。

9.根据实施方案6-8中任一项所述的载体，其中所述病毒载体包括重组AAV2/8载体。

10.根据实施方案6-9中任一项所述的载体，其中所述病毒载体包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

11.根据实施方案1-10中任一项所述的载体，其具备筛选标记，所述筛选标记包括抗生素筛选标记。

12.根据实施方案11所述的载体，其中所述抗生素筛选标记包括卡那霉素筛选标记。

13.根据实施方案1-12中任一项所述的载体，其包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

14.细胞，其包含根据实施方案1-13中任一项所述的载体。

15.药物组合物，其包含实施方案1-13中任一项所述的载体和/或实施方案14所述的细胞。

16.实施方案1-13中任一项所述的载体，或实施方案14所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮(RPE)萎缩相关的疾病或病症。

17.根据实施方案16所述的用途，其中所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring HarborLaboratory Press。未注明的化学试剂均可通过常规商业渠道购买获得。

实施例

实施例1构建载体

构建载体pAAV-CAG-CYP4V2：载体骨架是pAAV质粒，ITR序列来自于AAV2，两个ITR之间的载体结构如图1所示，包括启动子promoter，编码区以及终止子polyA信号。编码区包含人源野生型的CYP4V2 CDS的核苷酸序列。CDS的5’端加入kozak序列以促进翻译。其中，载体启动子为CAG，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；kozak序列如SEQ ID NO:10所示，人源CYP4V2 CDS核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，终止子polyA BGH核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，骨架载体核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

构建不同启动子的AAV载体：使用不同的启动子CMV、EFS和EF1a构建包含CYP4V2CDS序列的AAV载体，以表达CYP4V2。

另外构建不同启动子的报告载体：在不同启动子的AAV载体的CYP4V2 CDS序列的3’端连接GFP CDS作为报告基因，构建包含不同启动子的报告载体。

克隆各片段并合成载体，将得到的病毒载体转化至大肠杆菌感受态细胞，摇菌测序，使用中提试剂盒(Omega，D6915-04)提质粒。

实施例2包装和纯化

(1)病毒包装

第0天：细胞接种(接种数为1x10⁷)，将293T细胞接种于15cm培养皿中。第1天：293T细胞量在80％-90％时，换含10％血清(上海吉泰依科赛，FSP500)的完全培养基(Gibco，C11965500BT)20ml，进行质粒转染。第2天：转染12-18小时后换新鲜完全培养基30ml。第3天：转染48小时换新鲜完全培养基30ml。第4天：转染72h后按照常规方法胰酶消化293T细胞，并收集至50ml离心管中，用PBS洗两次，1200rpm离心5min，吸干PBS，冻存于-80℃冰箱。

(2)病毒纯化

将包装所得的AAV293T细胞解冻。用细胞裂解液(150mM NaCl，50mM Tris，pH8.5)重悬细胞。离心管内加入细胞裂解液半数体积(3ml)的氯仿，拧紧管口，水平放置于37℃摇床250rpm摇动30min。加入5M的氯化钠，混匀。转移至高速离心管，11000rpm离心25min。取上层水相，将交界处不易吸取的部分转移至1.5ml离心管，12000rpm离心30s，合并上清，往上层水相中加入核酸酶(Benzonase)至终浓度50U/ml，加入脱氧胆酸纳至终浓度0.4％，添加终浓度为10mM的MgCl₂，0.5mM的CaCl₂，5IU/ml的Turbo DNase I，25ug/ml的RNaseA(储存液浓度10mg/ml)。37℃水浴30min。加入50％PEG8000，震荡混匀，冰上放置1hr，11000rpm离心25min。吸取并弃上清，再次离心1min，去除残余上清。按最终溶解体积需求加入PBS，吹打悬浮，转移至1.5ml离心管。加入500μl氯仿，震荡，12000rpm离心20min。无菌条件下吸取上清，分装-80℃保存。

实施例3以EGFP为报告基因验证启动子强度

将不同启动子的报告载体质粒分别转染293T细胞(ATCC，CRL-3216)，具体如下：第一天分293T细胞(ATCC，CRL-3216)到35mm细胞培养皿，第二天至70％左右，配制转染体系：100μl无血清DMEM分别加入2μg实施例2所得质粒，加入3μl PEI，混匀，静止20min；将所得转染体系加入细胞培养基中，晃匀，置于CO₂培养箱中，6h后或过夜换液。24小时后荧光显微镜(Life AMF4305)观察荧光信号。

结果如图2所示，不同启动子的载体均能表达GFP，CAG、EF1a启动子表达效果好，CMV启动子次之，EFS启动子弱。

实施例4通过CYP4V2的表达验证启动子强度

将不同启动子的报告载体质粒分别转染293T细胞(ATCC，CRL-3216)。48小时后RIPA裂解液(北京普利莱C1053-100)裂解细胞，跑蛋白胶。Western blot检测CYP4V2的表达。所使用抗体：anti-CYP4V2(Atlas，HPA029122)，anti-actin(Abclonal，AC026)，goat-anti-rabbit(Abclonal，AS014)24小时后荧光显微镜(Life AMF4305)观察荧光信号。

结果如图3所示，不同启动子的载体均能表达CYP4V2，CAG、EF1a启动子的表达效果好，CMV启动子次之，EFS启动子弱。

实施例5 AAV衣壳血清型的选择

使用包装GFP报告基因的AAV2/2，AAV2/5，AAV2/8和AAV2/9血清型病毒(购自山东维真生物科技有限公司)，启动子均为CMV，对野生型小鼠进行视网膜下腔注射。注射后1周或一个月处死小鼠，包埋切片进行视网膜组织形态学观察。GFP蛋白荧光指示载体的表达部位，DAPI标记细胞核。

如图4可知，注射后1周时，衣壳蛋白血清型AAV8的表达最强，AAV2、AAV5和AAV9也可检测到表达。注射后一个月时，AAV2、AAV5荧光强度中等，主要是RPE细胞及感光细胞；AAV8、AAV9效果好，特异感染感光细胞内节和RPE细胞，外核层和双极细胞也有表达。GFP荧光表达强度为AAV8>AAV9>AAV5>AAV2。

因此，AAV8表达速度最快，且表达强度更为稳定。

实施例6构建并包装不同启动子的AAV8病毒载体

6.1AAV2/8载体的构建

在pAAV-RC5-Amp(购自北京西美杰科技有限公司)基础上改造得到pAAV-RC8-Kana(即AAV2/8)，载体序列如SEQ ID NO:9所示。

6.2包装和纯化

(1)病毒包装

按照实施例2的方法进行包装和纯化，具体转染体系见表3。

表3转染体系

得到不同启动子的AAV8病毒载体。

实施例7不同启动子的AAV8病毒感染iPSC诱导分化的RPE细胞效果

人诱导多潜能干细胞(iPSC)购自北京赛贝。按照文献da Cruz,L.,et al.(2018)，Phase 1clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigmentepithelium patch in age-related macμlar degeneration，Nat Biotechnol 36(4):328-337中记载的方法制备RPE细胞。将3x10⁴/cm²人iPSC培养于T25瓶的TESR-E8培养基4ml(STEMCELL,CAT#05990,#05991)中，5天后更换为含有20％的血清替代物(Gibco，CAT#A3181502)6ml的培养基(Gibco，CAT#10829018)，培养2天后换为6ml无血清培养基(Gibco，CAT#10829018)继续培养约20周。得到椭圆形深色的可分裂细胞，即RPE细胞。

采用MOI＝1x10⁶的实施例6的包装GFP报告基因的不同启动子的AAV2/8血清型病毒感染等量的RPE细胞，感染10天后，使用荧光显微镜(Life AMF4305)观察荧光信号。结果如图5所示，使用CAG启动子的病毒载体的荧光蛋白表达效果好，CMV启动子次之，EF1a启动子更次之，EFS启动子最弱。

实施例8不同启动子的AAV8病毒感染iPSC诱导分化的3D-视网膜类器官效果

从人诱导多潜能干细胞(iPSC)诱导制备3D-视网膜类器官的方法请参见Zhong,X.,Gutierrez,C.,Xue,T.et al.Generation of three-dimensional retinal tissuewith functional photoreceptors from human iPSCs.Nat Commun 5,4047(2014)。

采用病毒滴度为5x10¹⁰/cup的实施例6的包装GFP报告基因的不同启动子的AAV2/8血清型病毒感染96孔板中的3D-视网膜类器官。14天后，使用荧光显微镜(Life AMF4305)观察荧光信号。结果如图6所示，使用CAG启动子的病毒载体的荧光蛋白表达效果好。

实施例9不同启动子的AAV8病毒注射小鼠视网膜下腔的表达情况

使用实施例6的包装GFP报告基因的不同启动子的AAV2/8血清型病毒，对野生型小鼠进行视网膜下腔注射。注射后2周或6周处死小鼠，包埋切片进行视网膜组织形态学观察。GFP荧光指示载体的表达部位，DAPI标记细胞核。染色图结果如图7。

如图7A可知，注射后2周时，CMV启动子，CAG启动子，EF1a启动子表达强，EFS启动子表达的EGFP强度弱；其中CMV启动子和CAG启动子表达部位主要在RPE层及内节、外节，EF1a启动子和EFS启动子在RPE层、内节、外节及外核层均有表达。

如图7B所示，注射6周后，CAG启动子和EF1a启动子表达强，CMV启动子和EFS启动子表达的EGFP强度较弱。各个启动子在RPE层、内节、外节及外核层均有表达。

因此，AAV8-CAG启动子在小鼠视网膜表达强度更为稳定，并且表达范围广。

实施例10 AAV8-CAG-CYP4V2感染细胞后的脂类沉积情况

将实施例1的pAAV-CAG-CYP4V2质粒按照实施例6的方法进行包装后得到AAV8-CAG-CYP4V2病毒载体。

敲除ARPE19细胞系(CRL-2302)的CYP4V2基因，构建CYP4V2 KO-ARPE19细胞系，用AAV8-CAG-CYP4V2感染，显微镜下观察脂质沉积情况。由下图8A-8C可见，AAV8-CAG-CYP4V2病毒感染CYP4V2 KO-ARPE19细胞系，可检测到CYP4V2的蛋白表达，并且可以减少该细胞系的脂类沉积情况。且脂类的沉积量与CYP4V2的蛋白表达量存在负相关的关系。

实施例11 AAV8-CAG-CYP4V2病毒感染BCD病人iPSC诱导的RPE细胞后的脂类沉积情况

BCD病人(基因型为CYP4V2：c.802-8_810del17bpinsGC纯合突变)为于2018年11月至2018年12月在北京大学第三医院眼科收治的患者。北京大学第三医院伦理委员会批准了本研究的所有方面，并从受试者(或其法定监护人)处获得了样品采集的知情同意书。

人诱导多潜能干细胞(iPSC)的制备。使用Urineasy尿液细胞分离试剂盒(北京赛贝，CA3102500)从尿液中提取肾上皮细胞，使用Urineasy尿液细胞扩增试剂盒(北京赛贝，CA3103200)培养扩增，选取3-4代汇合度达到70-80％细胞进行重编程实验。重编程实验使用hiPSC重编程试剂盒(北京赛贝，CA5002002)，按照试剂盒说明书中的操作方法进行操作，获得人iPSC用于细胞分化实验。

RPE制备参考实施例7。

采用MOI＝1x10⁶的病毒AAV8-CAG-CYP4V2感染等量的正常人或患者RPE细胞，感染10天后，采用BODIPY(D3922,Thermo Fisher)染中性脂类，并使用荧光显微镜(LifeAMF4305)观察荧光信号。结果如图9A所示，有效减少CYP4V2基因突变的RPE细胞的脂质沉积情况。感染组及非感染组的正常人及患者RPE细胞使用RIPA裂解液裂解，western可以检测到CYP4V2的表达(图9B)。

实施例12 AAV8-CAG-CYP4V2病毒感染BCD病人iPSC诱导的RPE细胞并检测细胞吞噬能力

RPE细胞的制备和感染以及western检测同实施例11。细胞培养基中加入latex小球(L4655,Sigma)，24小时后使用荧光显微镜(Life AMF4305)观察荧光信号。

由图10可见，RPE-BCD组中(左三上下图)少量的荧光点为游离的latex小球，而非进入细胞的latex小球，其他各幅图中的荧光点均为被RPE吞噬而进入细胞的latex小球。与正常人的RPE相比，BCD病人的RPE细胞的吞噬latex小球的能力受到大幅度削弱，而感染AAV8-CAG-CYP4V2病毒，可以一定程度的恢复BCD病人RPE细胞的吞噬能力，并增强正常人RPE细胞的吞噬能力。

实施例13AAV8-CAG-CYP4V2病毒治疗BCD模型小鼠

13.1BCD模型小鼠的制备和检测

BCD小鼠符合BCD疾病的某些特征，是一个很好的研究BCD疾病的动物模型。BCD小鼠(购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，Cyp4v3-/-)1月龄进行视网膜下腔注射，眼球注射AAV8-CAG-CYP4V2，注射后3-6个月观察。

视网膜下腔注射方法：准备实验物品，将小鼠用1％阿托品散瞳，后按80mg/kg氯胺酮+8mg/kg甲苯噻嗪安腹腔内注射麻醉。麻醉后再次用1％阿托品散瞳，然后将小鼠置于眼外科手术显微镜(Topcon，OMS800)的动物实验平台前方，在小鼠眼球上滴加0.5％丙美卡因局麻。以荧光素钠：病毒＝100：1的浓度在病毒里加入荧光素钠原液，用移液枪吸混。用胰岛素针在小鼠眼球睫状体平坦部预扎一个小孔，用微量注射器的针头穿过该小孔后进入小鼠眼球玻璃体腔，这时在小鼠眼球上滴加适量2％羟甲基纤维素使在镜下能见到小鼠眼底，再继续将针头避开晶状体插入对侧周边的视网膜下，缓慢推入带有荧光素钠的病毒，每只眼睛注射量为1μl，病毒浓度为1x10⁹，以荧光素钠为指示剂判断是否注射入视网膜下腔，如图11所示。术后用生理盐水清洗眼球表面，置于笼子里等小鼠苏醒。图11A显示的是显微镜下小鼠视网膜下腔注射示意图。

13.2在体眼底照相观察结晶样沉积情况

注射AAV8-CAG-CYP4V2后3或6个月的小鼠，眼球用1％阿托品散瞳，后按80mg/kg氯胺酮+8mg/kg甲苯噻嗪安腹腔内注射麻醉。使麻醉后的小鼠平躺于Micro III小动物视网膜影像系统(Phoenix Research Laboratory，Micro III)的实验台，在小鼠眼球上滴加适量2％羟甲基纤维素以改善镜头及角膜的接触效果。)升降、旋转实验台调整小鼠眼睛的位置，调整焦距与光强得到小鼠眼底图像，用Micro III软件拍摄。摄片完成后，利用GraphPadPrism软件进行结晶沉积定量分析。

结果如图11B所示，结果表明注射AAV8-CAG-CYP4V2后，眼底结晶沉积情况有所改善。

13.3视网膜组织形态学观察

固定脱水：颈椎脱臼处死注射AAV8-CAG-CYP4V2的小鼠，摘取眼球，将小鼠眼球放入1.5ml EP管内，加入1ml 4％多聚甲醛4℃过夜。然后将眼球转入盛有1ml 30％蔗糖溶液的1.5ml EP管内脱水，眼球沉底即可。将小鼠眼球放入装有冷冻包埋剂(OCT)的1.5ml EP管中，用镊子将小鼠眼睛摆成直视前方的方位，盖好EP管后放入液氮内，待完全冻上后可进行冰冻切片，切片厚度为7μm。4℃丙酮固定10min后，放入-80℃保存。)取出切片，待切片恢复至室温后，用PBS洗3次，每次5min。将玻片无组织处擦干，每张切片滴加40μl封闭液(5％驴血清)，室温封闭1h。用5％驴血清稀释一抗，滴加40μl左右抗体工作液，使完全覆盖小鼠眼球组织，4℃过夜。本实验所用一抗有：CYP4V2(1：50，购自Sigma)，取出玻片，PBS洗3次，每次5min。用PBS以1:800的比例稀释二抗(购自Thermo Fisher Scientific)，滴加40μl左右二抗工作液，使完全覆盖小鼠眼睛组织，室温孵育1h。PBS洗3遍后，滴加DAPI稀释液(1：5000)，室温孵育15min。在载玻片中滴加防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，-20℃避光保存。用配备有NIS-Elements C软件的尼康A1激光共聚焦显微镜观察，拍照。

结果如图12所示，表明AAV8-CAG-CYP4V2注射小鼠视网膜下腔后，hCYP4V2的表达情况(途中双箭头所示范围)。

13.4小鼠ERG水平改善情况

单侧眼球注射AAV8-CAG-CYP4V2后的小鼠暗适应：将小鼠暗适应至少16小时，之后所有操作在暗红光下进行。小鼠麻醉：按80mg/kg氯胺酮+8mg/kg甲苯噻嗪安腹腔内注射麻醉。麻醉完成后，在暗红光照明下小鼠眼睛用1％阿托品散瞳，将小鼠用胶带固定放置在视觉电生理仪Espion E2的动物实验平台前方，双眼一致，充分暴露。将地电极针插入小鼠尾巴根部，参考电极针插入小鼠下颌，两个金环记录电极夹在动物实验平台的电极支架上，调整其角度，使其分别轻微的接触左右眼角膜的中心顶端，滴加适量2％羟甲基纤维素，改善金环电极及角膜的接触效果。在计算机Espion E2系统内输入小鼠编号与月龄信息后运行程序。分别行暗适应闪光强度为0.003，0.01，0.1，1，3，10，100cd·s/m²(背景光强度为0cd·s/m²，刺激间隔为15s，记录3个ERG信号的平均值)；明适应闪光强度为3，10，30，100cd·s/m²(明适应时间5min，背景光强度为30cd·s/m²，刺激间隔为15s，记录5个ERG信号的平均值)。程序运行结束后自动保存运行结果，使用GraphPad Prism统计结果。注射病毒的一侧为病毒组，未注射病毒的一侧为对照组。统计分析方法：双尾配对t检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。误差线：标准误。

结果如图13-16所示。Cyp4v3 KO小鼠单侧眼注射病毒，治疗后3个月ERG(n＝8)治疗眼(病毒组)与对照眼(对照组)相比各波振幅均没有明显变化(图13)。治疗后6个月ERG(n＝8)治疗眼(病毒组)整体波幅高于对照眼(对照组)，个别光强刺激下的波幅变化差异具有统计学意义(图14)。治疗6个月ERG暗反应b波，治疗眼(病毒组，图15)比对照眼(对照组，图15)振幅明显增高。比较治疗后3个月和6个月的ERG情况，治疗后6个月小鼠治疗眼波幅明显高于治疗后3个月(图16)。

13.5小鼠眼球RPE铺片染色检查细胞数量及形态

在1.5mlEP管中加入预冷的PBS，处死小鼠后将小鼠眼球取下，浸入PBS中15min。将小鼠眼球转移到1ml 4％多聚甲醛的1.5mlEP管中固定1h。在体视显微镜(Olympus，SZ61-SET)下去除小鼠眼球前节，将神经视网膜层与RPE层分离，并将RPE层剪成4瓣。将RPE铺片放入预冷的PBS中清洗3次，每次5min。将RPE铺片放入0.1％Triton中通透20min，后用PBS清洗3次，每次5min。将RPE铺片放入96孔板的一个孔内，加入按1：200比例PBS稀释后的Phalloidin工作液，室温孵育1h。PBS清洗3次，每次5min，将RPE铺片至于载玻片上展平，滴加少量封片剂后用盖玻片封片，在Nikon荧光显微镜下观察。

结果如图17所示，注射病毒的BCD小鼠(右侧)与未注射病毒的对照组BCD小鼠(左侧)相比，RPE细胞的六边形形态更完整，排列紧密。且同等面积内病毒组的RPE细胞数量多于对照组。

序列表

<110> 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) ；北京中因科技有限公司

<120> 表达CYP4V2的AAV载体及其用途

<130> 0138-PA-004

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6202

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 载体完整序列

<400> 1

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccggtc gcgtctagta ctagtctagt cgcgtaccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 420

ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 480

gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 540

cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 600

ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 660

gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc 720

ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac 780

tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt 840

aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc 900

ctttgtgcgg ggggagcggc tcggggctgt ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga 960

cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac 1020

catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg 1080

tctcatcatt ttggcaaaga attggatcgg taccgaggag atctgccacc atggcggggc 1140

tctggctggg gctcgtgtgg cagaagctgc tgctgtgggg cgcggcgagt gccctttccc 1200

tggccggcgc cagtctggtc ctgagtctgc tgcagagggt ggcgagctac gcgcggaaat 1260

ggcagcagat gcggcccatc cccacggtgg cccgcgccta cccactggtg ggccacgcgc 1320

tgctgatgaa gccggacggg cgagaatttt ttcagcagat cattgagtac acagaggaat 1380

accgccacat gccgctgctg aagctctggg tcgggccagt gcccatggtg gccctttata 1440

atgcagaaaa tgtggaggta attttaacta gttcaaagca aattgacaaa tcctctatgt 1500

acaagttttt agaaccatgg cttggcctag gacttcttac aagtactgga aacaaatggc 1560

gctccaggag aaagatgtta acacccactt tccattttac cattctggaa gatttcttag 1620

atatcatgaa tgaacaagca aatatattgg ttaagaaact tgaaaaacac attaaccaag 1680

aagcatttaa ctgctttttt tacatcactc tttgtgcctt agatatcatc tgtgaaacag 1740

ctatggggaa gaatattggt gctcaaagta atgatgattc cgagtatgtc cgtgcagttt 1800

atagaatgag tgagatgata tttcgaagaa taaagatgcc ctggctttgg cttgatctct 1860

ggtaccttat gtttaaagaa ggatgggaac acaaaaagag ccttcagatc ctacatactt 1920

ttaccaacag tgtcatcgcg gaacgggcca atgaaatgaa cgccaatgaa gactgtagag 1980

gtgatggcag gggctctgcc ccctccaaaa ataaacgcag ggcctttctt gacttgcttt 2040

taagtgtgac tgatgacgaa gggaacaggc taagtcatga agatattcga gaagaagttg 2100

acaccttcat gtttgagggg cacgatacaa ctgcagctgc aataaactgg tccttatacc 2160

tgttgggttc taacccagaa gtccagaaaa aagtggatca tgaattggat gacgtgtttg 2220

ggaagtctga ccgtcccgct acagtagaag acctgaagaa acttcggtat ctggaatgtg 2280

ttattaagga gacccttcgc ctttttcctt ctgttccttt atttgcccgt agtgttagtg 2340

aagattgtga agtggcaggt tacagagttc taaaaggcac tgaagccgtc atcattccct 2400

atgcattgca cagagatccg agatacttcc ccaaccccga ggagttccag cctgagcggt 2460

tcttccccga gaatgcacaa gggcgccatc catatgccta cgtgcccttc tctgctggcc 2520

ccaggaactg tataggtcaa aagtttgctg tgatggaaga aaagaccatt ctttcgtgca 2580

tcctgaggca cttttggata gaatccaacc agaaaagaga agagcttggt ctagaaggac 2640

agttgattct tcgtccaagt aatggcatct ggatcaagtt gaagaggaga aatgcagatg 2700

aacgctaaac gcgtggttta tccgatccac cggatctaga taagatatcc gatccaccgg 2760

atctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa 2820

aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg gcggccgcct 2880

cgagctgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 2940

accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 3000

tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 3060

gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggg gtaaccacgt 3120

gcggacccaa cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 3180

tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 3240

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct 3300

ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 3360

tgtagcggca cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 3420

gccagcgcct tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 3480

ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 3540

cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 3600

tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 3660

ttccaaactg gaacaacact caactctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt 3720

ttgccgattt cggtctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 3780

tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 3840

gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 3900

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 3960

cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 4020

tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 4080

ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 4140

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtcctgag 4200

gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 4260

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 4320

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 4380

tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 4440

cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 4500

agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaagatcgat 4560

caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 4620

ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 4680

tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 4740

gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 4800

acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 4860

ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 4920

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 4980

ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 5040

cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 5100

gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 5160

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 5220

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 5280

cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 5340

cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gactgtcaga ccaagtttac 5400

tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 5460

atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 5520

tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 5580

tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 5640

ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt 5700

cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 5760

ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 5820

gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 5880

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 5940

gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 6000

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 6060

tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 6120

ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 6180

tgctggcctt ttgctcacat gt 6202

<210> 2

<211> 937

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 启动子CAG

<400> 2

ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60

cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120

atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180

cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 240

attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 300

ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 360

gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 420

cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 480

aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 540

acgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg 600

actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa 660

ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg 720

gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 780

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 840

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 900

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaatt 937

<210> 3

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> polyA BGH

<400> 3

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 4

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码区CYP4V2 CDS

<400> 4

atggcggggc tctggctggg gctcgtgtgg cagaagctgc tgctgtgggg cgcggcgagt 60

gccctttccc tggccggcgc cagtctggtc ctgagtctgc tgcagagggt ggcgagctac 120

gcgcggaaat ggcagcagat gcggcccatc cccacggtgg cccgcgccta cccactggtg 180

ggccacgcgc tgctgatgaa gccggacggg cgagaatttt ttcagcagat cattgagtac 240

acagaggaat accgccacat gccgctgctg aagctctggg tcgggccagt gcccatggtg 300

gccctttata atgcagaaaa tgtggaggta attttaacta gttcaaagca aattgacaaa 360

tcctctatgt acaagttttt agaaccatgg cttggcctag gacttcttac aagtactgga 420

aacaaatggc gctccaggag aaagatgtta acacccactt tccattttac cattctggaa 480

gatttcttag atatcatgaa tgaacaagca aatatattgg ttaagaaact tgaaaaacac 540

attaaccaag aagcatttaa ctgctttttt tacatcactc tttgtgcctt agatatcatc 600

tgtgaaacag ctatggggaa gaatattggt gctcaaagta atgatgattc cgagtatgtc 660

cgtgcagttt atagaatgag tgagatgata tttcgaagaa taaagatgcc ctggctttgg 720

cttgatctct ggtaccttat gtttaaagaa ggatgggaac acaaaaagag ccttcagatc 780

ctacatactt ttaccaacag tgtcatcgcg gaacgggcca atgaaatgaa cgccaatgaa 840

gactgtagag gtgatggcag gggctctgcc ccctccaaaa ataaacgcag ggcctttctt 900

gacttgcttt taagtgtgac tgatgacgaa gggaacaggc taagtcatga agatattcga 960

gaagaagttg acaccttcat gtttgagggg cacgatacaa ctgcagctgc aataaactgg 1020

tccttatacc tgttgggttc taacccagaa gtccagaaaa aagtggatca tgaattggat 1080

gacgtgtttg ggaagtctga ccgtcccgct acagtagaag acctgaagaa acttcggtat 1140

ctggaatgtg ttattaagga gacccttcgc ctttttcctt ctgttccttt atttgcccgt 1200

agtgttagtg aagattgtga agtggcaggt tacagagttc taaaaggcac tgaagccgtc 1260

atcattccct atgcattgca cagagatccg agatacttcc ccaaccccga ggagttccag 1320

cctgagcggt tcttccccga gaatgcacaa gggcgccatc catatgccta cgtgcccttc 1380

tctgctggcc ccaggaactg tataggtcaa aagtttgctg tgatggaaga aaagaccatt 1440

ctttcgtgca tcctgaggca cttttggata gaatccaacc agaaaagaga agagcttggt 1500

ctagaaggac agttgattct tcgtccaagt aatggcatct ggatcaagtt gaagaggaga 1560

aatgcagatg aacgctaa 1578

<210> 5

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2氨基酸序列

<400> 5

Met Ala Gly Leu Trp Leu Gly Leu Val Trp Gln Lys Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Ala Leu Ser Leu Ala Gly Ala Ser Leu Val Leu Ser

20 25 30

Leu Leu Gln Arg Val Ala Ser Tyr Ala Arg Lys Trp Gln Gln Met Arg

35 40 45

Pro Ile Pro Thr Val Ala Arg Ala Tyr Pro Leu Val Gly His Ala Leu

50 55 60

Leu Met Lys Pro Asp Gly Arg Glu Phe Phe Gln Gln Ile Ile Glu Tyr

65 70 75 80

Thr Glu Glu Tyr Arg His Met Pro Leu Leu Lys Leu Trp Val Gly Pro

85 90 95

Val Pro Met Val Ala Leu Tyr Asn Ala Glu Asn Val Glu Val Ile Leu

100 105 110

Thr Ser Ser Lys Gln Ile Asp Lys Ser Ser Met Tyr Lys Phe Leu Glu

115 120 125

Pro Trp Leu Gly Leu Gly Leu Leu Thr Ser Thr Gly Asn Lys Trp Arg

130 135 140

Ser Arg Arg Lys Met Leu Thr Pro Thr Phe His Phe Thr Ile Leu Glu

145 150 155 160

Asp Phe Leu Asp Ile Met Asn Glu Gln Ala Asn Ile Leu Val Lys Lys

165 170 175

Leu Glu Lys His Ile Asn Gln Glu Ala Phe Asn Cys Phe Phe Tyr Ile

180 185 190

Thr Leu Cys Ala Leu Asp Ile Ile Cys Glu Thr Ala Met Gly Lys Asn

195 200 205

Ile Gly Ala Gln Ser Asn Asp Asp Ser Glu Tyr Val Arg Ala Val Tyr

210 215 220

Arg Met Ser Glu Met Ile Phe Arg Arg Ile Lys Met Pro Trp Leu Trp

225 230 235 240

Leu Asp Leu Trp Tyr Leu Met Phe Lys Glu Gly Trp Glu His Lys Lys

245 250 255

Ser Leu Gln Ile Leu His Thr Phe Thr Asn Ser Val Ile Ala Glu Arg

260 265 270

Ala Asn Glu Met Asn Ala Asn Glu Asp Cys Arg Gly Asp Gly Arg Gly

275 280 285

Ser Ala Pro Ser Lys Asn Lys Arg Arg Ala Phe Leu Asp Leu Leu Leu

290 295 300

Ser Val Thr Asp Asp Glu Gly Asn Arg Leu Ser His Glu Asp Ile Arg

305 310 315 320

Glu Glu Val Asp Thr Phe Met Phe Glu Gly His Asp Thr Thr Ala Ala

325 330 335

Ala Ile Asn Trp Ser Leu Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Pro Glu Val Gln

340 345 350

Lys Lys Val Asp His Glu Leu Asp Asp Val Phe Gly Lys Ser Asp Arg

355 360 365

Pro Ala Thr Val Glu Asp Leu Lys Lys Leu Arg Tyr Leu Glu Cys Val

370 375 380

Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ser Val Pro Leu Phe Ala Arg

385 390 395 400

Ser Val Ser Glu Asp Cys Glu Val Ala Gly Tyr Arg Val Leu Lys Gly

405 410 415

Thr Glu Ala Val Ile Ile Pro Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Arg Tyr

420 425 430

Phe Pro Asn Pro Glu Glu Phe Gln Pro Glu Arg Phe Phe Pro Glu Asn

435 440 445

Ala Gln Gly Arg His Pro Tyr Ala Tyr Val Pro Phe Ser Ala Gly Pro

450 455 460

Arg Asn Cys Ile Gly Gln Lys Phe Ala Val Met Glu Glu Lys Thr Ile

465 470 475 480

Leu Ser Cys Ile Leu Arg His Phe Trp Ile Glu Ser Asn Gln Lys Arg

485 490 495

Glu Glu Leu Gly Leu Glu Gly Gln Leu Ile Leu Arg Pro Ser Asn Gly

500 505 510

Ile Trp Ile Lys Leu Lys Arg Arg Asn Ala Asp Glu Arg

515 520 525

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 5‘非编码区

<400> 6

ggatcggtac cgaggagatc tgccacc 27

<210> 7

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3‘非编码区

<400> 7

acgcgtggtt tatccgatcc accggatcta gataagatat ccgatccacc ggatctagat 60

aactgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 120

cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tggcggccgc ctcgag 176

<210> 8

<211> 3259

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 载体骨架

<400> 8

ggtaaccacg tgcggaccca acggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 60

tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc 120

tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg gcgcctgatg 180

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat 240

agtacgcgcc ctgtagcggc acattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 300

ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 360

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 420

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg 480

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 540

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt 600

tataagggat tttgccgatt tcggtctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 660

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa 720

tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 780

cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 840

gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg 900

tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg 960

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 1020

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 1080

agagtcctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 1140

cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 1200

gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 1260

gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 1320

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 1380

ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 1440

caaagatcga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 1500

acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga 1560

caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 1620

ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat 1680

cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 1740

gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg 1800

ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc 1860

cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 1920

tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 1980

ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc 2040

atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 2100

actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata 2160

ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 2220

ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgactgtcag 2280

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 2340

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 2400

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2460

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 2520

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 2580

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2640

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2700

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2760

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2820

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2880

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2940

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 3000

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 3060

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgtcctgcag gcagctgcgc gctcgctcgc 3120

tcactgaggc cgcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga 3180

gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt cctgcggccg gtcgcgtcta 3240

gtactagtct agtcgcgta 3259

<210> 9

<211> 7663

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AAV2/8

<400> 9

atcgttaacg ccccgcgccg gccgctctag aactagtgga tcccccggaa gatcagaagt 60

tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgatctg cgcagccgcc 120

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 180

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 240

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 300

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 360

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 420

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 480

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 540

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 600

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 660

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 720

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 780

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 840

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 900

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 960

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 1020

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 1080

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1140

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1200

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1260

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1320

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1380

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1440

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1500

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1560

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1620

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1680

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1740

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1800

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1860

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1920

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1980

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 2040

caacctctct gagggcattc gcgagtggtg ggcgctgaaa cctggagccc cgaagcccaa 2100

agccaaccag caaaagcagg acgacggccg gggtctggtg cttcctggct acaagtacct 2160

cggacccttc aacggactcg acaaggggga gcccgtcaac gcggcggacg cagcggccct 2220

cgagcacgac aaggcctacg accagcagct gcaggcgggt gacaatccgt acctgcggta 2280

taaccacgcc gacgccgagt ttcaggagcg tctgcaagaa gatacgtctt ttgggggcaa 2340

cctcgggcga gcagtcttcc aggccaagaa gcgggttctc gaacctctcg gtctggttga 2400

ggaaggcgct aagacggctc ctggaaagaa gagaccggta gagccatcac cccagcgttc 2460

tccagactcc tctacgggca tcggcaagaa aggccaacag cccgccagaa aaagactcaa 2520

ttttggtcag actggcgact cagagtcagt tccagaccct caacctctcg gagaacctcc 2580

agcagcgccc tctggtgtgg gacctaatac aatggctgca ggcggtggcg caccaatggc 2640

agacaataac gaaggcgccg acggagtggg tagttcctcg ggaaattggc attgcgattc 2700

cacatggctg ggcgacagag tcatcaccac cagcacccga acctgggccc tgcccaccta 2760

caacaaccac ctctacaagc aaatctccaa cgggacatcg ggaggagcca ccaacgacaa 2820

cacctacttc ggctacagca ccccctgggg gtattttgac tttaacagat tccactgcca 2880

cttttcacca cgtgactggc agcgactcat caacaacaac tggggattcc ggcccaagag 2940

actcagcttc aagctcttca acatccaggt caaggaggtc acgcagaatg aaggcaccaa 3000

gaccatcgcc aataacctca ccagcaccat ccaggtgttt acggactcgg agtaccagct 3060

gccgtacgtt ctcggctctg cccaccaggg ctgcctgcct ccgttcccgg cggacgtgtt 3120

catgattccc cagtacggct acctaacact caacaacggt agtcaggccg tgggacgctc 3180

ctccttctac tgcctggaat actttccttc gcagatgctg agaaccggca acaacttcca 3240

gtttacttac accttcgagg acgtgccttt ccacagcagc tacgcccaca gccagagctt 3300

ggaccggctg atgaatcctc tgattgacca gtacctgtac tacttgtctc ggactcaaac 3360

aacaggaggc acggcaaata cgcagactct gggcttcagc caaggtgggc ctaatacaat 3420

ggccaatcag gcaaagaact ggctgccagg accctgttac cgccaacaac gcgtctcaac 3480

gacaaccggg caaaacaaca atagcaactt tgcctggact gctgggacca aataccatct 3540

gaatggaaga aattcattgg ctaatcctgg catcgctatg gcaacacaca aagacgacga 3600

ggagcgtttt tttcccagta acgggatcct gatttttggc aaacaaaatg ctgccagaga 3660

caatgcggat tacagcgatg tcatgctcac cagcgaggaa gaaatcaaaa ccactaaccc 3720

tgtggctaca gaggaatacg gtatcgtggc agataacttg cagcagcaaa acacggctcc 3780

tcaaattgga actgtcaaca gccagggggc cttacccggt atggtctggc agaaccggga 3840

cgtgtacctg cagggtccca tctgggccaa gattcctcac acggacggca acttccaccc 3900

gtctccgctg atgggcggct ttggcctgaa acatcctccg cctcagatcc tgatcaagaa 3960

cacgcctgta cctgcggatc ctccgaccac cttcaaccag tcaaagctga actctttcat 4020

cacgcaatac agcaccggac aggtcagcgt ggaaattgaa tgggagctgc agaaggaaaa 4080

cagcaagcgc tggaaccccg agatccagta cacctccaac tactacaaat ctacaagtgt 4140

ggactttgct gttaatacag aaggcgtgta ctctgaaccc cgccccattg gcacccgtta 4200

cctcacccgt aatctgtaat tgcttgttaa tcaataaacc gtttaattcg tttcagttga 4260

actttggtct ctgcgtattt ctttcttatc tagtttccat ggctacgtag ataagtagca 4320

tggcgggtta atcattaact acagcccggg cgtttaaaca gcgggcggag gggtggagtc 4380

gtgacgtgaa ttacgtcata gggttaggga ggtcctgtat tagaggtcac gtgagtgttt 4440

tgcgacattt tgcgacacca tgtggtctcg ctgggggggg gggcccgagt gagcacgcag 4500

ggtctccatt ttgaagcggg aggtttgaac gagcgctggc gcgctcactg gccgtcgttt 4560

tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc 4620

cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt 4680

tgcgcagcct gaatggcgaa tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt 4740

aaatttttgt taaatcagct cattttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt 4800

ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 4860

cactattaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 4920

cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 4980

aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 5040

ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 5100

ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc 5160

aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 5220

ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 5280

aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 5340

aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 5400

accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 5460

aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 5520

agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 5580

gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 5640

ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg 5700

attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 5760

acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 5820

tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg 5880

gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 5940

agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 6000

ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 6060

tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 6120

tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 6180

gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 6240

gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt 6300

catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 6360

tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 6420

cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgact 6480

gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 6540

aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 6600

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 6660

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 6720

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 6780

gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 6840

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 6900

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 6960

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 7020

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 7080

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 7140

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 7200

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 7260

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 7320

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 7380

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 7440

tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 7500

agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 7560

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 7620

cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcgcgcc gat 7663

<210> 10

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> kozak

<400> 10

gccacc 6

Claims

1.载体，其包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述启动子包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；其中所述载体为重组AAV2/8载体。

2.根据权利要求1所述的载体，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的载体，其还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

4.根据权利要求3所述的载体，其中所述多聚腺苷酸信号位点包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的载体，其中所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

6.细胞，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的载体。

7.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的载体和/或权利要求6所述的细胞。

8.权利要求1-5中任一项所述的载体，或权利要求6所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮(RPE)萎缩相关的疾病或病症。