CN116829722A - 用于递送kh902(康柏西普)的腺相关病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开的多个方面涉及用于在细胞或受试者中表达抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)剂的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开提供了包含衣壳蛋白(例如，AAV2变体、AAV2/3杂合变体、AAV8变体等)和编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因以及一个或多个调控序列的rAAV。在一些实施方案中，本文所述的组合物可用于治疗患有与血管生成或异常VEGF活性/信号传导相关的疾病的受试者。

Description

用于递送KH902(康柏西普)的腺相关病毒及其用途

相关应用

本申请根据35USC 119(e)要求于2021年4月26日提交的题为“ADENO-ASSOCIATEDVIRUS FOR DELIVERY OF KH902(CONBERCEPT)AND USES THEREOF”(用于递送KH902(康柏西普)的腺相关病毒及其用途)的美国临时申请序列号63/179,700和于2020年9月3日提交的题为“ADENO-ASSOCIATED VIRUS FOR DELIVERY OF KH902(CONBERCEPT)AND USESTHEREOF”(用于递送KH902(康柏西普)的腺相关病毒及其用途)的美国临时申请序列号63/074,361的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

KH902是一种目前正在进行用于抗VEGF治疗的临床试验的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受体融合蛋白。目前抗VEGF治疗的挑战包括需要重复注射以维持抗VEGF药物的功效和长效制剂。因此，需要开发用于将抗VEGF剂长期递送至所靶向的细胞和/或组织中的新方法。

发明内容

本公开的一些方面涉及用于将抗VEGF剂(例如，KH902)递送至细胞和/或组织(例如受试者的细胞)的组合物和方法。本公开部分基于经工程化以表达编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因的rAAV。

在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：(i)AAV衣壳蛋白，其中衣壳蛋白是AAV2衣壳蛋白、AAV2/3杂合衣壳蛋白和/或AAV8衣壳蛋白的变体；和(ii)分离的核酸，其包含编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因，所述转基因侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。

在一些实施方案中，抗VEGF剂是人VEGF诱饵受体(decoy receptor)。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。在一些实施方案中，VEGF诱饵受体能够结合抗血管内皮生长因子(VEGF)和/或胎盘生长因子(PlGF)。

在一些实施方案中，抗VEGF剂是人VEGF受体融合蛋白。在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白Fc部分融合的人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合，并进一步与免疫球蛋白Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，抗VEGF剂是KH902。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其部分至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、90％、99％或100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，转基因包含与SEQ ID NO:1的核酸序列或其密码子优化变体至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、90％、99％或100％同一的核酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂能够结合抗血管内皮生长因子(VEGF)和/或胎盘生长因子(PlGF)。

在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含有效连接至转基因的启动子。在一些实施方案中，启动子包含巨细胞病毒(CMV)早期增强子。在一些实施方案中，启动子是嵌合巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。在一些实施方案中，转基因包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，至少一个内含子位于启动子和编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的核酸序列之间。

在一些实施方案中，转基因包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列位于内含子和编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因之间。

在一些实施方案中，转基因包含3’非翻译区(3’UTR)。在一些实施方案中，转基因进一步包含一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于转基因的3’UTR中。在一些实施方案中，至少一个miRNA结合位点是免疫细胞相关miRNA结合位点。在一些实施方案中，免疫细胞相关miRNA选自：miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-21、miR-29a/b/c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a/b、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223和miR-424、miR-221、miR-222、let-7i、miR-148和miR-152。

在一些实施方案中，ITR是选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5ITR和AAV6 ITR的血清型的腺相关病毒ITR。

在一些实施方案中，分离的核酸包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少80％、90％、99％或100％同一的核酸序列。

在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与v224衣壳蛋白、v326衣壳蛋白、v358衣壳蛋白、v46衣壳蛋白、v56衣壳蛋白、v66衣壳蛋白、v67衣壳蛋白、v81衣壳蛋白、v439衣壳蛋白、v453衣壳蛋白、v513衣壳蛋白、v551衣壳蛋白、v556衣壳蛋白、v562衣壳蛋白或v598衣壳蛋白的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与v224衣壳蛋白、v326衣壳蛋白或v56衣壳蛋白的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白对眼组织具有嗜性。在一些实施方案中，眼组织包括眼神经元、视网膜、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹(fovea)、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜、结膜睫状体或视神经。

在一些实施方案中，rAAV是单链AAV(ssAAV)或自互补AAV(scAAV)。

在一些实施方案中，衣壳蛋白变体与其衍生自的野生型衣壳蛋白相比能够增加rAAV包装效率。在一些实施方案中，AAV2衣壳蛋白变体与野生型AAV2衣壳蛋白相比能够将rAAV包装效率提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在一些实施方案中，AAV2/3杂合衣壳蛋白变体与野生型AAV3b衣壳蛋白相比能够将rAAV包装效率提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。

在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒，其包含：(i)rAAV衣壳蛋白，其中衣壳蛋白是AAV8衣壳蛋白、AAV2衣壳蛋白和/或AAV2/3杂合衣壳蛋白的变体；和(ii)重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含核酸，所述核酸以5'至3'的顺序包含：(a)5'AAV ITR；(b)CMV增强子；(c)CBA启动子；(d)鸡β-肌动蛋白内含子；(e)Kozak序列；(f)编码抗VEGF剂的转基因，其中抗VEGF剂由SEQ ID NO:1中的核酸序列编码；(g)兔β-珠蛋白polyA信号尾；和(h)3'AAV ITR。

在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的rAAV的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。

在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的rAAV的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于玻璃体内注射、静脉内注射、瘤内注射或肌内注射。

在一些方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中抑制VEGF或PlGF活性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的rAAV或药物组合物。

在一些方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中递送抗VEGF剂的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的rAAV或药物组合物。

在一些方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中治疗血管新生相关疾病、血管生成相关疾病或VEGF相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的rAAV或药物组合物。

在一些方面，本公开提供了一种rAAV或包含所述rAAV的组合物，用于在有此需要的受试者中抑制VEGF活性，其中所述rAAV包含腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白(例如，AAV 2变体或AAV2/3杂合变体)和分离的核酸，其包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因。

在一些方面，本公开提供了一种rAAV或包含所述rAAV的组合物，用于在有此需要的受试者中递送抗VEGF剂，其中所述rAAV包含腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白(例如，AAV 2变体或AAV2/3杂合变体)和分离的核酸，其包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因。

在一些方面，本公开提供了一种rAAV或包含所述rAAV的组合物，用于在有此需要的受试者中治疗血管新生相关疾病、血管生成相关疾病或VEGF相关疾病，其中所述rAAV包含腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白(例如，AAV 2变体或AAV2/3杂合变体)和分离的核酸，其包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因。

在一些实施方案中，抗VEGF剂的递送导致至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的VEGF活性抑制。

在一些实施方案中，受试者是非人类哺乳动物。在一些实施方案中，非人类哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。

在一些实施方案中，受试者患有或被怀疑患有血管生成相关疾病或VEGF相关疾病。在一些实施方案中，VEGF相关疾病是肿瘤、癌症、视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)、黄斑水肿、脉络膜血管新生或角膜血管新生。

在一些实施方案中，施用是全身施用，任选地，其中施用是静脉内注射。在一些实施方案中，施用是直接施用至眼组织，任选地，其中直接施用是玻璃体内注射、眼内注射或外部施用。

在一些实施方案中，施用导致转基因被递送至眼组织。在一些实施方案中，眼组织包括眼神经元、视网膜、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜、结膜睫状体或视神经。

在一些实施方案中，施用导致受试者中的VEGF在施用后被抑制至少5天、10天、15天、20天、1个月、两个月或更长时间。

在一些方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中治疗角膜血管新生(CNV)的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的rAAV或药物组合物。在一些实施方案中，rAAV包含AAV8衣壳蛋白。在一些方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中减少角膜血管新生(CNV)(例如，相对于未经治疗的受试者或相对于施用前的受试者减少CNV)的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的rAAV或药物组合物。在一些实施方案中，rAAV包含AAV8衣壳蛋白。

在一些实施方案中，施用导致抗VEGF剂在角膜细胞中的递送。在一些实施方案中，施用导致抗VEGF剂在角膜的角膜基质细胞(keratocyte)中的递送。

在一些实施方案中，rAAV被施用一次。在一些实施方案中，施用导致抗VEGF剂在角膜细胞中表达长于三个月、六个月、一年或更长时间。在一些实施方案中，施用导致受试者中的VEGF(例如，VEGF表达或活性)在施用后被抑制至少1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长时间。在一些实施方案中，施用是基质内注射。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，角膜血管新生是急性角膜血管新生或慢性角膜血管新生。

附图简要说明

图1A-1C显示了rAAV-CBA-KH902载体和序列。所表达的rAAV载体表达分泌的KH902(康柏西普(Conbercept))，并由CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)盒驱动。还在起始密码子的5'处设计了Kozak序列以增强翻译起始。显示了质粒的图谱(图1A)和读取链序列(图1B，SEQ ID NO:3)。包含5'-ITR和3'-ITR并由5'-ITR和3'-ITR包围的序列被包装到AAV病毒体中(图1C)。

图2显示了经AAV-KH902感染的RPE-条件培养基的蛋白质印迹分析。对每条泳道上方标示的指定条件下的15μl ARPE-19-(左)或hTERT-RPE1-(右)条件培养基进行PAGE。半干转移后，用抗VEGFR1抗体(R&D Systems BAF321)对膜进行印迹。每个印迹包括20ng KH902药物(最后一条泳道)作为参考。

图3A-3C显示了AAV-KH902载体的体外功能验证。在KH902存在下，经VEGF刺激(25ng/mL)的HUVEC的血管生成或增殖能力；或用AAV2-KH902或对照GFP载体感染的RPE细胞的条件培养基(1:10稀释)。分别通过管形成测定(图3A和3B)或通过CCK-8活性(图3C)来定量抗VEGF活性。*，p<0.01；**，p<0.001；***，p<0.0001。

图4显示了玻璃体内rAAV2-KH902注射阻止正常的视网膜血管发育。通过玻璃体内施用向新生小鼠幼崽(P0-P3)注射rAAV2-KH902。小鼠在含氧量正常的条件下(～21％ O2)饲养，并在>P18时处死。将视网膜封片并用PECAM抗体(内皮细胞)或DAPI(DNA)和PNA(光感受器)染色，并从神经节细胞侧(上小图)或光感受器侧(下小图)进行成像。

图5A-5C显示了玻璃体内rAAV2-KH902注射预防早产儿视网膜病变中的视网膜水肿。向新生小鼠(P0-P3)注射rAAV2-KH902并在含氧量正常的条件下(～21％ O2)饲养大约4天，然后在高氧条件(75％ O2)下饲养大约1周。在P12-P18，将小鼠恢复到含氧量正常的条件下饲养6天并处死。(图5A)将视网膜封片并用抗同工凝集素B4(血管染色)和抗PECAM抗体(内皮细胞)染色。针对水肿的发生(图5B)和囊肿的数量(图5C)对每个处理组(n＝6)进行分析和制表。

图6A-6B显示了在氧诱导的视网膜病变小鼠模型中对rAAV2-KH902的评估。图6A显示了用rAAV2-EGFP(左栏)和5:1比例的rAAV2-KH902:rAAV2-EGFP混合物(右栏)注射并在解剖后立即成像的眼的明场图像。同一行中的眼来自同一只动物，因此，注射了rAAV2-Egfp的眼可作为个体动物内病理诱导程度的对照。图6B显示了来自代表性小鼠的眼的荧光成像，然后将其平封(flat-mounted)并进行同工凝集素-B4染色。阳性转导区域由EGFP表达标记。rAAV2-KH902减少正常血管发育和动脉瘤结节；即，强烈的EGFP表达减少了视网膜脉管系统。动脉瘤结节的示例显示在下小图(箭头)中。

图7A-7B显示了在氧诱导的视网膜病变小鼠模型中对rAAV8-KH902的评估。图7A显示了用rAAV8-EGFP(左栏)和5:1比例的rAAV8-KH902:rAAV8-EGFP混合物(右栏)注射并在解剖后立即成像的眼的明场图像。同一行中的眼来自同一只动物，因此，注射了rAAV8-Egfp的眼可作为个体动物内病理诱导程度的对照。图7B显示了来自代表性小鼠的眼的荧光成像，然后将其平封(flat-mounted)并进行同工凝集素-B4染色。阳性转导区域由EGFP表达标记。rAAV8-KH902未减少正常血管发育，并且仅轻微影响动脉瘤结节的形成。

图8显示了经rAAV处理的眼出现病变的百分比。对图6A-6B和7A-7B中小鼠眼的水肿或挽救进行评分。实验组：rAAV2，n＝10；rAAV8，n＝10。

图9A-9B显示了被注射包含AAV2和AAV2/3杂合衣壳变体和编码EGFP的核酸的rAAV的小鼠眼的眼底检查。通过玻璃体内施用注射了包装CB6-EGFP的八种AAV2变体(v224、v326、v358、v46、v56、v66、v67和v81)和七种AAV2/3杂合变体(v439、v453、v513、v551、v556、v562和v598)。在注射后两周(图9A)和四周(图9B)对代表性眼进行成像。选择三种衣壳v56、v224、v326(用星号表示)来包装KH902。评估的眼数量(EGFP阳性眼的数量/所有眼的数量)显示在每张显微照片的右下角。

图10显示了用rAAV.v224包装的载体化KH902治疗激光损伤诱导的CNV。小鼠眼受到激光损伤以诱导脉络膜血管新生(CNV)事件。损伤后五天，进行玻璃体内rAAV注射。对编码GFP和v224-KH902的对照衣壳进行剩余CNV的纵向分析。rAAV v224-KH902能够在损伤后20天，将激光损伤后CNV的数量减少到少于80％。数据代表平均值±ME，置信度90％。

图11显示了rAAV v224-KH902不会引起与免疫细胞浸润到眼中脉管系统相关的眼部病变。

图12显示了通过粗裂解物PCR进行的体外包装产量评估。瀑布图显示了AAV2变体(上小图)、AAV2/3变体(中小图)和AAV8变体(下小图)的相对包装产量。每种衣壳的包装产量值表示为其原型形式(分别为AAV2、AAV3b和AAV8)所赋予的产量百分比。衣壳变体v56显示比AAV2增加9.42倍；v224显示比AAV2增加8.96倍，v326显示比AAV2增加9.79倍。涉及的衣壳总数显示在x轴上。AAV2/3杂合变体也显示比AAV3b增加2到8倍。

图13A-13F显示了用rAAV8-eGFP进行的基质内和结膜下注射之间的角膜转导的比较。图13A-13C显示了小鼠角膜的基质内注射。图13D-13F显示了结膜下注射。图13B和13E显示了在基质内注射rAAV8(每个角膜注射4μl，含1.6×10¹⁰GC)两周后通过活体动物成像检测到eGFP信号。虚线圆圈代表小鼠角膜的边缘。图13C、13F分别显示了来自图13B和13E的代表性横截面中的eGFP表达的荧光显微术。箭头划定了注射部位。GC：基因组拷贝。

图14A-14C显示了rAAV2和rAAV8介导的KH902表达动力学和细胞嗜性。图14A显示了rAAV2和rAAV8介导的eGFP表达在不同时间点通过活体成像显微镜术检测到相同强度，直到基质内注射后三个月(12周)。虚线圆圈代表小鼠角膜的边缘。图14B显示了经rAAV8和rAAV2载体处理的小鼠角膜中的相对KH902 mRNA表达(***p<0.001，***p<0.0001)。数据显示为平均值±SEM，n＝3。图14C显示了具有rAAV2和rAAV8的角膜切片中的细胞特异性的组织学分析。(i，ii)基质内注射rAAV2和rAAV8介导的eGFP表达两周后的小鼠角膜的抗波形蛋白染色。角膜基质中的eGFP信号与波形蛋白标记的角膜基质细胞共定位。(iii，v)分别用rAAV8或PBS基质内处理的角膜切片中的抗人IgG(H+L)标记的KH902蛋白。(iv)小图iii中与抗波形蛋白共染色(红色)共染色的虚线框区域的更高放大倍率。放大倍率a、b和d：400X。比例尺，25μm。放大倍率c：200X。比例尺，500μm。Epi：上皮层；Endo：内皮层。对于所有上述实验，每种rAAV载体的剂量为每个角膜4μl PBS，含1.6×10¹⁰GC。

图15A-15D显示了中央角膜厚度(CCT)和针对rAAV2和rAAV8载体的免疫应答的测量。图15A显示了剂量为每个角膜4μl，1.6×10¹⁰GC剂量的PBS、rAAV2-KH902和rAAV8-eGFP/KH902的角膜注射前、注射后即刻和注射后第1、2和12周时角膜的OCT图像。图15B显示了从图15A图像测量的中央角膜厚度的定量分析。图15C显示了对高剂量(1.6×10¹⁰GC/角膜)和低剂量(8×10⁸GC/角膜)rAAV2-或rAAV8-eGFP/KH902的角膜免疫应答的分析，其中对单核细胞/巨噬细胞进行免疫荧光染色(CD11b，F4/80，红色)。放大倍数：200X。比例尺，50μm。图15D显示了图15C数据所示组中CD11b+细胞和F4/80+细胞的计算百分比。***，p<0.001；****，p<0.0001。数据显示为平均值±SEM，n＝5。

图16A-16E显示了rAAV8-KH902在碱烧伤诱导的CoNV模型中通过单剂量的基质内递送对CoNV的长期抑制。图16A显示了注射PBS、rAAV8-eGFP、康柏西普(10mg/ml，4μl)、rAAV2-KH902、rAAV8-KH902和rAAV8-KH902与康柏西普(10mg/ml，4μl)组合的碱处理角膜在第5和10天，以及第2、3、4、8和12周的代表性CoNV图像。图16B-16C显示了小图16A数据中每个条件下CoNV面积定量的直方图。与PBS组有显著差异；*：与rAAV8-eGFP或KH902组有显著差异；#：与rAAV2-KH902组有显著差异；/>*和#，p<0.05；/>**和##，p<0.01；/>***和###，p<0.001；/>****和####，p<0.0001。数据显示为平均值±SEM，n＝5～7。图16D显示了小鼠角膜平封片的免疫荧光分析。对在碱烧伤12周后收获的图16A每个条件下的角膜进行双染，被CD31⁺⁺⁺/LYVE-1覆盖的区域指血管，被CD31⁺/LYVE-1⁺⁺⁺覆盖的区域指淋巴管(+++表示强阳性；++，中等阳性；+，轻度阳性)。放大倍数，100X。比例尺，50μm。图16E显示了角膜血管生成和淋巴管生成分析，通过测量在图16D数据的每个条件下分别被CD31⁺⁺⁺和LYVE-1⁺⁺⁺染色覆盖的区域。*：与PBS组有显著差异；·：与rAAV8-eGFP组有显著差异；#：与KH902组有显著差异；/>与rAAV2-KH902组有显著差异。###，p<0.001；/>****、····、####和/>p<0.0001。数据显示为平均值±SEM，n＝4。用于上述实验的每种rAAV载体的剂量是每个角膜4μl PBS或康柏西普溶液，8×10⁸GC。

图17A-17F显示了rAAV8递送的KH902在碱烧伤诱导的CoNV模型中下调Dll4/Notch信号传导和ERK激活。图17A显示了在碱烧伤后两周，在PBS、rAAV8-eGFP和rAAV8-KH902(8×10⁸GC/角膜)处理的角膜中，与CD31共染色的小鼠角膜平封片中Dll4表达的免疫荧光分析。放大倍数：200X。比例尺，100μm。图17B、17C、17D显示了在每个所示处理组中，碱烧伤后两周的小鼠角膜中Dll4和NICD表达的蛋白质印迹半定量分析。图17E、17F显示了ERK激活的蛋白质印迹半定量分析。结果表示为碱烧伤后八天的所示处理组中磷酸化ERK(pERK)与总ERK的比率(pERK/ERK)。***，p<0.001；****，p<0.0001。

图18A-18C显示了rAAV8-KH902在碱烧伤损伤模型中防止预先存在的CoNV的进展。图18A显示了在碱烧伤后第10天(基线)对小鼠角膜进行基质内注射PBS、rAAV8-eGFP和rAAV8-KH902(每个角膜4μl，8×10⁸GC)。显示了四个星期内每周观察到的CoNV的代表性图像。图18B显示了图18A中所示的每组中每周CoNV面积的定量分析。星号表示观察结束时间点(第4周)与相应基线之间存在显著差异(**p<0.01)。数据显示为平均值±SEM，n＝5。图18C显示了在图18A的实验组之间对定量的CoNV面积进行4周的每周平行比较。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。数据显示为平均值±SEM，n＝5。

图19A-19C显示了rAAV8-KH902在缝合诱导的CoNV模型中防止预先存在的血管新生的进展。图19A显示了经受五天缝合放置(基线)的小鼠角膜用PBS、rAAV8-eGFP和rAAV8-KH902(每个角膜4μl，8×10⁸GC)的基质内注射进行处理。显示CoNV的每周代表性图像，并进行为期4周的跟进。图19B显示了四周内CoNV区域的定量分析，其中比较了来自图19A的实验组。(****p<0.0001)。数据显示为平均值±SEM，n＝4～7。图19C显示了来自图19A数据的每组中每周CoNV面积的定量分析。星号表示结束时间点(第4周)和基线之间存在显著差异(****p<0.0001)。

图20A-20C显示了用rAAV2载体递送的eGFP进行基质内注射和结膜下注射的角膜转导。图20A显示了在基质内注射rAAV2载体(1.6×10¹⁰GC/角膜)后2周，通过荧光显微镜检测小鼠角膜切片中eGFP表达的代表性图像。图20B、20C分别显示了在基质内或结膜下注射rAAV2后两周，通过活体动物成像检测到的eGFP信号的代表性图像。虚线圆圈代表成像显微镜下小鼠角膜的边缘。

图21A-21B显示角膜中通过基质内注射的由rAAV2载体介导的KH902表达的组织学分析。图21A显示了由抗人IgG(H+L)抗体标记的KH902表达的代表性眼球图像。放大倍数：200X。比例尺，500μm。图21B显示了图21A中加框区域的更高放大倍数，其具有抗波形蛋白共染，说明KH902的表达主要分布在角膜基质层。放大倍数：400X。比例尺，100μm。rAAV2载体的剂量为每个角膜4μl PBS，1.6×10¹⁰GC。

图22A-22C显示了与注射了编码KH902的rAAV的非人灵长类动物(NHP)的眼底摄影和荧光血管造影术(FP和FFA)相关的代表性数据。图22A显示了表明编码KH902的rAAV的注射相对于对照注射减少了IV级CNV病变的代表性数据；康柏西普用作阳性治疗对照。图22B显示了表明编码KH902的rAAV的注射相对于对照注射减少了荧光素渗漏面积的代表性数据；康柏西普用作阳性治疗对照。图22C显示了表明在施用后第29天通过FFA观察到光斑消退的代表性数据。

发明详述

本公开的多个方面涉及用于在细胞或受试者中表达抗VEGF剂(例如，KH902)的组合物和方法。本公开部分基于包含衣壳蛋白(例如，AAV2/3衣壳蛋白、AAV8衣壳蛋白等)的rAAV和包含侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)的编码抗VEGF剂的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，核酸包含启动子，例如CMV启动子或鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。

在一些方面，本文公开的rAAV包括AAV衣壳(例如，AAV2变体或AAV2/3杂合变体衣壳蛋白)，其含有编码包含核酸序列抗血管内皮生长因子(例如，抗VEGF)剂的转基因表达盒的分离的核酸，所述转基因表达盒侧翼是AAV反向末端重复(ITR)。本公开部分基于经工程化以表达编码抗VEGF剂(例如，VEGF受体融合蛋白，如KH902)的转基因或其变体的rAAV。在一些实施方案中，本公开描述的组合物(例如，rAAV)可用于治疗眼相关疾病，例如角膜血管形成。

重组腺相关病毒(rAAV)

在一些方面，本公开提供了分离的腺相关病毒(AAV)。如本文关于AAV使用的，术语“分离的”是指经人工产生或获得的AAV。可以使用重组方法产生分离的AAV。此类AAV在本文中被称为“重组AAV”。重组AAV(rAAV)优选具有组织特异性靶向能力，从而将rAAV的转基因特异性递送至一种或多种预定组织(例如眼组织)。AAV衣壳是确定这些组织特异性靶向能力(例如，组织嗜性)的重要因素。因此，可以选择具有适合于被靶向组织的衣壳的rAAV。

本公开至少部分涉及重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：(i)AAV衣壳蛋白，其中衣壳蛋白是AAV2变体或AAV2/3杂合体的衣壳蛋白，和(ii)分离的核酸，其包含编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因，所述转基因侧翼是反向末端重复(ITR)。本公开至少部分还涉及重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：(i)AAV衣壳蛋白，其中衣壳蛋白是AAV8血清型的衣壳蛋白，和(ii)分离的核酸，其包含编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因，所述转基因侧翼是反向末端重复(ITR)。

获得具有所需衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域公知的。(参见，例如，US 2003/0138772，其内容通过引用以其整体并入本文)。通常，这些方法包括培养含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；包含AAV反向末端重复(ITR)和转基因的重组AAV载体；和允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中的足够辅助功能的宿主细胞。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。AAV包含三种衣壳蛋白，即病毒体蛋白1至3(命名为VP1、VP2和VP3)，所有这些蛋白均通过可变剪接从单个cap基因转录。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译后，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形的60-mer蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组、递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有对眼组织或肌肉组织的嗜性。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白靶向眼细胞类型(例如，感光细胞、视网膜细胞等)。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.hr、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV.PHP的AAV血清型，以及上述任何一者的变体。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有源自非人类灵长类动物的血清型，例如AAVrh8血清型。在一些实施方案中，衣壳蛋白具有AAV血清型6(例如，AAV6衣壳蛋白)、AAV血清型8(例如，AAV8衣壳蛋白)、AAV血清型2(例如，AAV2衣壳蛋白)、AAV血清型5(例如，AAV5衣壳蛋白)或AAV血清型9(例如，AAV9衣壳蛋白)。在一些实施方案中，AAV衣壳是AAV1。在一些实施方案中，AAV衣壳是AAV2。在一些实施方案中，具有所需组织嗜性的AAV衣壳蛋白可以选自分离自哺乳动物(例如，来自受试者的组织)的AAV衣壳蛋白。(参见，例如，WO2010138263A2和WO2018071831，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，AAV衣壳是AAV8。

在一些实施方案中，AAV衣壳是已知AAV衣壳蛋白的变体或同源物。在一些实施方案中，衣壳蛋白变体和KH902的组合在基于rAAV的治疗中比先前描述的用于递送KH902的衣壳赋予了优势(更好的包装效率、对VEGF的有效抑制或更低的与KH902过表达相关的毒性)。衣壳变体相对于其衍生自的野生型衣壳(或多个衣壳)通常包含至少一个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，AAV变体与已知AAV衣壳(例如AAV血清型2，或AAV2/3(例如，AAV2/3杂合)等)相比包含约1至约100个氨基酸(例如，1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、1-30个氨基酸、20-50个氨基酸、20-60个氨基酸、50-80个氨基酸、50-100个氨基酸、60-100个氨基酸等)的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，AAV变体与已知AAV衣壳(例如AAV血清型2，或AAV2/3(例如，AAV2/3杂合)等)相比包含超过100个氨基酸(例如，100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、100-500个氨基酸、500-1000个氨基酸或更多)的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，AAV变体与已知AAV衣壳(例如AAV血清型2，或AAV2/3(例如，AAV2/3杂合)等)相比可包含约5至约50个氨基酸(例如，5-10个氨基酸、5-20个氨基酸、5-30个氨基酸、5-40个氨基酸、10-20个氨基酸、10-30个氨基酸、10-40个氨基酸、10-50个氨基酸或30-50个氨基酸)的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，AAV变体与已知AAV衣壳(例如AAV血清型2，或AAV2/3(例如，AAV2/3杂合))相比可包含约10至约30个氨基酸(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸)的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，AAV变体与已知AAV衣壳(例如AAV血清型2，或AAV2/3(例如，AAV2/3杂合))相比可包含1、或2、或3、或4、5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或16、或17、或18、或19、或20个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，AAV变体与已知AAV衣壳(例如AAV血清型2，或AAV2/3(例如，AAV2/3杂合)等)相比包含与其具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，衣壳变体可以是嵌合衣壳变体。嵌合衣壳变体序列可包含两种或更多种AAV衣壳血清型或其变体的部分。在一些实施方案中，嵌合衣壳包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同衣壳蛋白血清型的部分。在一些实施方案中，嵌合衣壳蛋白具有不同于其衍生自的AAV衣壳蛋白的特性，例如组织嗜性等。片段可以通过任何合适的方法并入，例如重组DNA克隆。

在一些实施方案中，本文所述的AAV变体是AAV2、AAV2/3(例如，AAV2/3杂合)或AAV8的变体。已观察到AAV2可有效转导眼组织(例如，感光细胞和视网膜色素上皮细胞(RPE))、人中枢神经系统(CNS)组织、肾组织和其他组织。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳是AAV2变体。因此，在一些实施方案中，本文所述的AAV2变体可用于将基因治疗递送至眼组织(例如，视网膜)。已观察到AAV3可有效转导癌性人肝细胞。在一些实施方案中，本文所述的AAV变体是AAV2/3(例如，AAV2/3杂合体)。

在一些实施方案中，衣壳变体(例如，AAV2变体、AAV 2/3变体或AAV8变体)是如WO2018071831中所述的任何衣壳变体，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，AAV2变体是v224、v326、v358、v46、v56、v66、v67或v81。在一些实施方案中，AAV2变体是v224。在一些实施方案中，AAV2变体是v326。在一些实施方案中，AAV2变体是v56。在一些实施方案中，AAV2/3杂合体是v439、v453、v513、v551、v556、v562或v598。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与野生型AAV2/3氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与野生型AAV8氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:11所示的野生型AAV2氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。野生型AAV2的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示：

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSF YCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:12所示的AAV2变体v224氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v224的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:13所示的AAV2变体v326氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v326的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:14所示的AAV2变体v56氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v56的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:15所示的AAV2变体v358氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v358的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:16所示的AAV2变体v46氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v46的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:17所示的AAV2变体v66氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v66的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:18所示的AAV2变体v67氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v67的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:19所示的AAV2变体v81氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v81的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示：

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPLKPAERHQDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMAAGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTNAPSGTTTMSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATTDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:20所示的AAV2/3杂合变体v439氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v439的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:21所示的AAV2/3杂合变体v453氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v453的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:22所示的AAV2/3杂合变体v513氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v513的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:23所示的AAV2/3杂合变体v551氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v551的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:24所示的AAV2/3杂合变体v556氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v556的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:25所示的AAV2/3杂合变体v562氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v562的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示：

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在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与如SEQ ID NO:26所示的AAV2/3杂合变体v598氨基酸序列的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。v598的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示：

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在一些实施方案中，本文所述的rAAV是单链AAV(ssAAV)。如本文所用，ssAAV是指在单独的链上具有转基因表达盒的编码序列和互补序列并且包装到不同的病毒衣壳中的rAAV。

待在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可以使用本领域技术人员已知的方法由经工程化以包含一种或多种所需组分的稳定宿主细胞提供。最合适地，这样的稳定宿主细胞含有在诱导型启动子控制下的所需组分。然而，一种或多种所需组分可以在组成型启动子的控制之下。在讨论适用于转基因的调控元件时，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个可选方案中，选定的稳定宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的一种或多种选定组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的一种或多种其他选定组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其衍生自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但其包含在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他的稳定宿主细胞。

在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳蛋白赋予比参考AAV衣壳蛋白更好的包装效率。如本文所用，AAV包装效率是指在一批生产的AAV病毒体中具有封装的完整基因组的AAV病毒体的百分比。包装效率可以通过适合于确定包装效率的任何已知方法来确定(例如，通过粗裂解物PCR或通过感染细胞，并评估转基因表达，如Zhou等人，In VitroPackaging of Adeno-Associated Virus DNA，J Virol.1998年4月；72(4):3241–3247)。在一些实施方案中，更好的包装效率是指与参考衣壳蛋白相比有至少大于10％、至少大于20％、至少大于30％、至少大于40％、至少大于50％、至少大于60％、至少大于70％、至少大于80％、至少大于90％、至少大于100％、至少大于150％、至少大于200％、至少大于250％、至少大于300％、至少大于350％、至少大于400％、至少大于450％、至少大于500％或更多的具有封装的完整基因组的AAV病毒体。在一些实施方案中，更好的包装效率是指与参考衣壳蛋白相比有至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少10至50倍(例如，10倍、20倍、30倍、40倍或50倍)、至少50至100倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)或更多的具有封装的完整基因组的AAV病毒体。在一些实施方案中，参考衣壳蛋白是衍生出衣壳变体的原型衣壳蛋白(例如，AAV2或AAV3b衣壳蛋白)。在一些实施方案中，与它们衍生自的原型衣壳相比，本文所述的衣壳变体赋予更好的包装效率。在一些实施方案中，本文所述的AAV2变体(例如，v224、v56或v326)与AAV2相比具有至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍或更高的包装效率。在一些实施方案中，本文所述的AAV2/3杂合衣壳蛋白(例如，v439、v453、v513、v551、v556、v562或v598)与AAV3b相比具有至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍或更高的包装效率。

在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码转基因(例如，KH902)的编码序列。“宿主细胞”是指含有或能够含有感兴趣的物质的任何细胞。宿主细胞通常是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、角质形成细胞、角膜细胞和/或肿瘤细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、AAV载体、附属功能载体或与重组AAV产生相关的其他转移DNA的接受者。所述术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于自然的、偶然的或有意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学或在基因组或总DNA互补物上不一定与原始亲本完全相同。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是神经元、感光细胞、色素性视网膜上皮细胞或神经胶质细胞。

可以使用任何合适的遗传元件(载体)将产生本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。选定的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y。类似地，产生rAAV病毒体的方法是公知的，并且对合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，K.Fisher等人,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利号5,478,745。

在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(详细描述在美国专利号6,001,650中)产生重组AAV。通常，重组AAV是通过用待包装进AAV颗粒的AAV载体(包含侧翼为ITR元件的转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞而产生的。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(例如，rep和cap)，其对于生产性AAV复制和封装而言以反式起作用。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产，而不产生任何可检测的野生型AAV病毒体(例如，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。适用于本公开的载体的非限制性实例包括pHLP19，其描述在美国专利号6,001,650中，以及pRep6cap6载体，其描述在美国专利号6,156,303中，两者的全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码用于非AAV衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖于这些功能进行复制(例如，“附属功能”)。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒除外)和牛痘病毒。

在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA，当外源DNA已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，Graham等人(1973)Virology,52:456、Sambrook等人(1989)MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis等人(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier和Chu等人(1981)Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞。

如本文所用，术语“重组细胞”是指外源DNA片段，例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸如RNA产生的DNA片段被引入其中的细胞。

如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，当其与合适的控制元件结合时能够复制，并且其能够在细胞之间转移基因序列。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如rAAV载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、指环病毒载体(anellovirus vector)(例如，如US20200188456A1中所述的指环病毒载体)等。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体预期是其中待转录的核酸片段位于启动子的转录控制下的那些载体。

编码转基因的分离的核酸

在一些方面，本公开涉及编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)蛋白的分离的核酸。血管内皮生长因子(VEGF)，最初称为血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，是一种由细胞产生的信号蛋白，可刺激血管的形成。VEGF是生长因子的一个子家族，即胱氨酸结生长因子的血小板衍生生长因子家族。它们是重要的信号传导蛋白，参与血管发生(胚胎循环系统的从头形成)和血管生成(血管从预先存在的脉管系统生长)。VEGF的正常功能是在胚胎发育期间产生新血管，在损伤后产生新血管，在运动后产生肌肉，和产生绕过阻塞的血管的新血管(侧支循环)。然而，异常的VEGF活性/信号传导会导致各种疾病，例如血管疾病。

抗血管内皮生长因子治疗，也称为抗VEGF治疗或抗VEGF药物治疗，是使用阻断血管内皮生长因子活性的药物。抗VEGF剂的非限制性实例包括VEGF受体融合蛋白(例如，KH902)、单克隆抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、抗体衍生物(例如雷珠单抗(ranibizumab，Lucentis))或抑制被VEGF刺激的酪氨酸激酶的口服可利用的小分子(例如，拉帕替尼(lapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、阿西替尼(axitinib)和帕唑帕尼(pazopanib))

在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸包含编码抗VEGF剂的转基因。在一些实施方案中，抗VEGF剂靶向(例如特异性结合)人VEGF受体。VEGF受体是血管内皮生长因子(VEGF)的受体。VEGF受体有三种主要亚型，编号为1、2和3。VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3属于受体酪氨酸激酶家族(图1A)。VEGFR-1和-2主要参与血管生成，而VEGFR-3参与造血和淋巴管生成。VEGFR含有大约750个氨基酸残基的细胞外结构域，其被组织成七个免疫球蛋白样折叠。与细胞外结构域相邻的是单个跨膜区域，然后是一个近膜结构域、一个被70个氨基酸的激酶插入片段打断的分裂酪氨酸激酶结构域和一个C末端尾。VEGF受体激活需要二聚化。在配体结合特性的指导下，VEGFR形成同二聚体和异二聚体。VEGFR的二聚化伴随着受体激酶活性的激活，导致自身磷酸化。当激活的VEGF受体将含SH2结构域的蛋白底物磷酸化时，信号转导被传播。血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的信号传导蛋白，其参与许多生物学途径(例如，血管发生和血管生成)。VEGF受体具有由7个免疫球蛋白样结构域(例如，细胞外结构域1-7)组成的细胞外部分、单个跨膜区域和含有分裂酪氨酸激酶结构域的细胞内部分。在一些实施方案中，人VEGF受体1包含如NCBI登录号NP_001153392.1、NCBI登录号NP_001153502.1、NCBI登录号NP_001153503.1或NCBI登录号NP_002010.2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，人VEGF受体2包含如NCBI登录号NP_002244.1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，人VEGF受体3包含如NCBI登录号NP_002011.2、NCBI登录号NP_001341918.1或NCBI登录号NP_891555.2中所示的氨基酸序列。血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的信号传导蛋白，其参与许多生物学途径(例如，血管发生和血管生成)。VEGF受体具有由7个免疫球蛋白样结构域(例如，细胞外结构域1-7)组成的细胞外部分、单个跨膜区域和含有分裂酪氨酸激酶结构域的细胞内部分。在一些实施方案中，抗VEGF剂靶向(例如特异性结合)胎盘衍生生长因子(PlGF)。

在一些实施方案中，抗VEGF剂是人VEGF诱饵受体或其部分。“诱饵受体”是指能够识别和结合配体(例如，VEGF)，但在结构上不能发出信号或激活配体的关联受体复合物的受体。VEGF诱饵受体充当抑制剂，结合配体并阻止其与其常规受体结合。在一些实施方案中，VEGF诱饵受体包含VEGF受体1和/或VEGF受体2的一个或多个细胞外结构域。在一些实施方案中，抗VEGF剂是人VEGF诱饵受体融合蛋白。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体融合蛋白包含多于一个选自融合在一起的VEGF受体1和/或VEGF受体2的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体融合蛋白包含第一部分，所述第一部分包括与VEGF受体2融合的VEGF受体1，其进一步与包含不同蛋白的第二部分(例如，免疫球蛋白的Fc部分)融合。VEGF诱饵受体和VEGF诱饵受体融合蛋白先前已经描述，参见例如WO2007112675和EP1767546B1，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含结合VEGF的蛋白的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。

在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体是人VEGF受体融合蛋白。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含选自VEGF受体1或VEGF受体2的细胞外结构域，和一个或多个选自VEGF受体1或VEGF受体2的第二细胞外结构域。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含VEGF受体1的细胞外结构域2和VEGF受体2的细胞外结构域3。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含VEGF受体1的细胞外结构域2和VEGF受体2的细胞外结构域3和4。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体2的细胞外结构域3融合，并进一步与VEGF受体1的细胞外结构域4融合的VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体1的细胞外结构域2融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域3融合的VEGF受体2的细胞外结构域1。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体2的细胞外结构域3融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域4融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域5融合的VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体2的细胞外结构域3融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域4融合，并进一步与VEGF受体1的细胞外结构域5融合的VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，VEGF诱饵受体的融合的细胞外结构域通过接头彼此连接。在一些实施方案中，VEGF诱饵受体的融合的细胞外结构域彼此直接连接。

此外，本文所述的任何VEGF受体融合蛋白可以与另一蛋白融合。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与另一蛋白融合以提供二聚化或多聚化特性的VEGF受体(例如，本文所述的任何VEGF诱饵受体或VEGF诱饵受体融合蛋白)的部分。为融合蛋白提供二聚化或多聚化特性的蛋白的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体(例如，本文所述的任何VEGF诱饵受体或VEGF诱饵受体融合蛋白)的部分。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白(例如，本文所述的VEGF诱饵受体或VEGF诱饵受体融合蛋白)与其他部分(例如，Fc结构域)直接融合。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白(例如，VEGF受体诱饵)通过接头与其他部分融合。

合适的接头是本领域已知的。(参见，例如，Chen等人,Fusion protein linkers:property,design and functionality,Adv Drug Deliv Rev.2013Oct；65(10):1357-69)。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白进一步与免疫球蛋白的Fc部分融合。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白是KH902。KH902又名康柏西普(例如，US20100272719A1，全部内容通过引用并入本文)，是一种诱饵受体蛋白，其通过血管内皮生长因子(VEGF)受体1和VEGF受体2细胞外结构域与人免疫球蛋白的Fc区融合而构建得到。KH902的大小为约142kD。康柏西普介导的VEGF和胎盘生长因子(PIGF)(其可以诱导血管新生)阻断已在临床试验(包括3期试验)中被证明可有效治疗湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)，参见例如Liu等人,AJO,2019年8月17日，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。KH902的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTEL NVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPGPGDKTHTCPLCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO:5)

在一些实施方案中，抗VEGF剂包含SEQ ID NO:5的部分。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:6所示的VEGF受体1的细胞外结构域2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:7所示的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:8所示的与VEGF受体1的细胞外结构域2融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:9所示的与免疫球蛋白Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:10所示的与免疫球蛋白Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

VEGF受体1的细胞外结构域2的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDV(SEQ ID NO:6)

VEGF受体2的细胞外结构域3和4的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：

VLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPP(SEQ ID NO:7)

与VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPP(SEQ ID NO:8)

与Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVGPGDKTHTCPLCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:9)

与Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的示例性氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示：

VLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPGPGDKTHTCPLCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)

在一些实施方案中，分离的核酸包含与如SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。KH902的示例性编码序列如SEQ ID NO:1所示。

ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTAGTTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAACCTTTTGTTGCTTTTGGAAGTGGCATGGAATCTCTGGTGGAAGCCACGGTGGGGGAGCGTGTCAGAATCCCTGCGAAGTACCTTGGTTACCCACCCCCAGAAATAAAATGGTATAAAAATGGAATACCCCTTGAGTCCAATCACACAATTAAAGCGGGGCATGTACTGACGATTATGGAAGTGAGTGAAAGAGACACAGGAAATTACACTGTCATCCTTACCAATCCCATTTCAAAGGAGAAGCAGAGCCATGTGGTCTCTCTGGTTGTGTATGTCCCACCGGGCCCGGGCGACAAAACTCACACATGCCCACTGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGGCCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQID NO:1)

本文所述的任何抗VEGF剂和/或它们的组合可以由本文的分离的核酸表达。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域和编码VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域，以及编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域。在一些实施方案中，第一区域可以位于任何合适的位置。第一区域可以位于第二区域的上游。例如，第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的2000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的1000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的500个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的250个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的150个核苷酸之间。在其他实施方案中，第一区域可以位于第二区域的下游。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的2000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的1000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的500个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的250个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的150个核苷酸之间。

在一些实施方案中，核酸还可以包含第三区域。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域，编码VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域，以及编码与VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第三区域。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域，编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域，以及编码与VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合、并进一步与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第三区域。在一些实施方案中，第三区域位于第一区域的第一个密码子的上游。在一些实施方案中，第三区域位于第一区域的最后一个密码子和第二区域的第一个密码子之间。在一些实施方案中，第三区域位于第二区域的最后一个密码子的下游。

在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸的各个区域是用于表达本文所述的抗-VEGF剂或抗-VEGF剂的组合的表达盒。在一些实施方案中，多顺反子表达构建体包含两个或更多个表达盒，其编码一种或多种本文所述的抗VEGF剂或抗VEGF剂的组合。

在一些实施方案中，多顺反子表达构建体包含以不同方式定位的表达盒。例如，在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中第一表达盒(例如，编码第一抗VEGF剂或其部分的表达盒)定位于邻近第二表达盒(例如，编码第二抗VEGF剂或其部分的表达盒)。在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中第一表达盒包含内含子，并且第二表达盒位于第一表达盒的内含子内。在一些实施方案中，位于第一表达盒的内含子内的第二表达盒包含启动子和编码与所述启动子有效连接的基因产物的核酸序列。

在不同的实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中表达盒以不同方式定向。例如，在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中第一表达盒与第二表达盒处于相同的方向。在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其包含处于相反方向的第一表达盒和第二表达盒。

如本文所用的与表达盒有关的术语“方向”是指给定盒或结构的方向特征。在一些实施方案中，表达盒含有编码核酸序列5'的启动子，并且编码核酸序列的转录从有义链的5'末端运行至3'末端，使其成为定向盒(例如5'-启动子/(内含子)/编码序列-3')。由于实际上所有表达盒在这个意义上都是定向的，本领域技术人员可以容易地确定给定表达盒相对于第二核酸结构(例如，第二表达盒、病毒基因组)的方向，或者，如果盒包含在AAV构建体中，则相对于AAV ITR。

例如，如果给定的核酸构建体在构型5'-启动子1/编码序列1---启动子2/编码序列2-3'中包含两个表达盒，

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表达盒处于相同方向，箭头表示每个盒的转录方向。对于另一个示例，如果给定的核酸构建体包含的有义链在构型5'-启动子1/编码序列1---编码序列2/启动子2-3'中包含两个表达盒，

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则表达盒彼此处于相反方向，并且如箭头所示，表达盒的转录方向相反。在这个示例中，显示的链包含启动子2和编码序列2的反义链。

对于另一个示例，如果表达盒包含在AAV构建体中，则所述盒可以与AAV ITR处于相同方向，或相反方向。AAV ITR是定向的。例如，如果ITR和表达盒均位于相同的核酸链上，则3'ITR将与上述示例的启动子1/编码序列1表达盒处于相同方向，但与5'ITR处于相反方向。

大量证据表明，与仅含一个顺反子的表达系统相比，多顺反子表达构建体通常不能达到最佳表达水平。使用包含两个或更多个启动子元件的多顺反子表达构建体实现的低于标准表达水平的推测原因之一是启动子干扰现象(参见，例如，Curtin JA,Dane AP,Swanson A,Alexander IE,Ginn SL.Bidirectional promoter interference betweentwo widely used internal heterologous promoters in a late-generationlentiviral construct.Gene Ther.2008Mar；15(5):384-90；和Martin-Duque P,JezzardS,Kaftansis L,Vassaux G.Direct comparison of the insulating properties of twogenetic elements in an adenoviral vector containing two different expressioncassettes.Hum Gene Ther.2004Oct；15(10):995-1002；两篇参考文献均通过引用并入本文以公开启动子干扰现象)。已经提出了多种策略来克服启动子干扰的问题，例如，通过产生多顺反子表达构建体，所述构建体仅含一个启动子以驱动由内部核糖体进入位点分隔的多个编码核酸序列的转录，或通过将包含其自身启动子的顺反子与转录绝缘子元件(transcriptional insulator element)分隔开。然而，所有克服启动子干扰的建议策略都面临着其自身的一系列问题。例如，单个启动子驱动的多顺反子表达通常会导致顺反子的表达水平不均匀。此外，一些启动子不能有效地被分离，并且分离元件与一些基因转移载体如一些逆转录病毒载体不兼容。

在本发明的一些实施方案中，提供了一种多顺反子表达构建体，其允许有效表达由第一启动子驱动的第一编码核酸序列和由第二启动子驱动的第二编码核酸序列，而不使用转录绝缘子元件。本文提供了此类多顺反子表达构建体的多种构型，例如，含有包含内含子的第一表达盒和位于内含子内并且与第一盒处于相同或相反方向的第二表达盒的表达构建体。其他构型在本文别处更详细地描述。

在一些实施方案中，提供了允许两个或更多个编码核酸序列有效表达的多顺反子表达构建体。在一些实施方案中，多顺反子表达构建体包含两个表达盒。在一些实施方案中，如本文提供的多顺反子表达构建体的第一表达盒包含第一RNA聚合酶II启动子，并且第二表达盒包含第二RNA聚合酶II启动子。在一些实施方案中，如本文提供的多顺反子表达构建体的第一表达盒包含RNA聚合酶II启动子，并且第二表达盒包含RNA聚合酶III启动子。

在一些实施方案中，所提供的多顺反子表达构建体是重组AAV(rAAV)构建体。

在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸包含抗VEGF剂(例如，KH902)的经密码子优化的核酸序列。可通过本领域已知的方法实现对核酸编码序列的密码子优化以优化在靶细胞(例如哺乳动物细胞)中的表达。

“核酸”序列是指DNA或RNA序列。在一些实施方案中，本公开的蛋白和核酸是分离的。如本文所用，术语“分离的”意指人工产生的。如本文所用，关于核酸，术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)在体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)纯化的，如通过裂解和凝胶分离；(iv)通过例如化学合成来合成。分离的核酸是易于通过本领域公知的重组DNA技术操作的核酸。因此，包含在其中5'和3'限制性位点已知或聚合酶链式反应(PCR)引物序列已公开的载体中的核苷酸序列被认为是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不是。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必须的。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸不是纯的，因为它可能仅占其所在细胞中物质的很小百分比。然而，这样的核酸是分离的，正如本文所用的术语，因为它很容易通过本领域普通技术人员已知的标准技术进行操作。如本文关于蛋白或肽所使用的，术语“分离的”是指已从其自然环境中分离或人工产生(例如，通过化学合成、通过重组DNA技术等)的蛋白或肽。

在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸和rAAV包含一种或多种以下结构特征(例如，控制或调控序列)：长的鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、延伸的CBA内含子、Kozak序列、抗-VEGF剂(例如KH902)或密码子优化的编码抗VEGF剂(例如KH902)变体的核酸序列、一个或多个microRNA结合位点和兔β-珠蛋白(RBG)poly A序列。在一些实施方案中，一个或多个前述控制序列与编码抗VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列有效连接。

如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调控序列以将核酸序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下的方式共价连接时，称它们为“有效连接”。如果希望将核酸序列翻译成功能性蛋白，如果在5'调控序列中启动子的诱导导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白的能力，则称两个DNA序列为有效连接。因此，如果启动子区域能够影响该DNA序列的转录，从而得到的转录物可被翻译成所需的蛋白或多肽，则启动子区域将与核酸序列有效连接。类似地，当两个或更多个编码区以它们从共同启动子的转录导致两个或更多个已在阅读框内翻译的蛋白的表达的方式连接时，它们是有效连接的。

在一些实施方案中，转基因包含编码与启动子有效连接的抗-VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列。“启动子”是指由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列，为启动基因的特异性转录所需。短语“有效连接”、“有效定位”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向以控制RNA聚合酶的起始和基因的表达。

通常，启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)[参见，例如，Boshart等人,Cell,41:521-530(1985)]、嵌合巨细胞病毒嵌合巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子(CBA启动子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是RNApol II启动子。在一些实施方案中，启动子是嵌合巨细胞病毒嵌合巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子(CBA启动子)。在一些实施方案中，启动子是RNA pol III启动子，例如U6或H1。

由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995)，另见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导系统(Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari等人,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在本上下文中可能有用的其他类型的诱导型启动子是受特定生理状态调节的那些，这些生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中。

在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调控序列(例如，启动子、增强子等)是本领域公知的。示例性组织特异性调控序列包括但不限于以下组织特异性启动子：视网膜劈裂蛋白近端启动子(retinoschisin proximalpromoter)、光感受器间类视黄醇结合蛋白增强子(interphotoreceptor retinoid-binding protein enhancer，RS/IRBPa)、视紫红质激酶(RK)、肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(desmin，DES)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))、骨骨钙素启动子(Stein等人,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen等人,J.BoneMiner.Res.,11:654-64(1996))、CD2启动子(Hansal等人,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α-链启动子、神经元如神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)启动子(Andersen等人,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))以及神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人,Neuron,15:373-84(1995))，以及其他对技术人员来说显而易见的启动子。

在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子。眼特异性启动子的实例包括视网膜劈裂蛋白近端启动子、光感受器间类视黄醇结合蛋白增强子(RS/IRBPa)、视紫红质激酶(RK)、RPE65和人视锥细胞视蛋白启动子(human cone opsin promoter)。

在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。鸡β-肌动蛋白启动子可以是短的鸡β-肌动蛋白启动子或长的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子(例如，鸡β-肌动蛋白启动子)包含增强子序列，例如巨细胞病毒(CMV)增强子序列。CMV增强子序列可以是短的CMV增强子序列或长的CMV增强子序列。在一些实施方案中，启动子包含长的CMV增强子序列和长的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子包含短的CMV增强子序列和短的鸡β-肌动蛋白启动子。然而，本领域技术人员知晓，短的CMV增强子可以与长的CB启动子一起使用，并且长的CMV增强子可以与短的CB启动子一起使用(反之亦然)。

本文所述的分离的核酸还可包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，至少一个内含子位于启动子/增强子序列和转基因之间。在一些实施方案中，内含子是合成的或人工的(例如异源的)内含子。合成内含子的实例包括衍生自SV-40的内含子序列(称为SV-40T内含子序列)和衍生自鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列。在一些实施方案中，本公开所述的转基因包含一个或多个(1、2、3、4、5个或更多个)人工内含子。在一些实施方案中，一个或多个人工内含子位于启动子和编码抗VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列之间。

在一些实施方案中，本文所述的转基因包含Kozak序列。Kozak序列是包含共有序列GCC(A/G)CC(SEQ ID NO:4)的核酸基序，其存在于真核mRNA中并且在蛋白翻译的起始中起作用。在一些实施方案中，Kozak序列位于内含子和编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因之间。

本公开所述的分离的核酸可以编码进一步包含聚腺苷酸化(poly A)序列的转基因。在一些实施方案中，包含poly A序列的转基因是兔β-珠蛋白(RBG)poly A序列。

在一些实施方案中，转基因包含3'-非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，本公开涉及分离的核酸，其包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因和一个或多个miRNA结合位点。不希望受到任何特定理论的束缚，将miRNA结合位点并入基因表达构建体允许在表达相应miRNA的细胞和组织中调节转基因表达(例如，抑制转基因表达)。在一些实施方案中，将一个或多个miRNA结合位点并入转基因允许转基因表达以细胞类型特异性方式脱靶。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于转基因的3'非翻译区(3'-UTR)中，例如在编码抗VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列的最后一个密码子和poly A序列之间。

在一些实施方案中，转基因包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)miRNA结合位点，其使抗VEGF剂(例如，KH902)的表达从免疫细胞(例如，抗原呈递细胞(APC)，例如巨噬细胞、树突细胞等)脱靶。并入免疫相关miRNA的miRNA结合位点可以使转基因(例如，KH902)表达从抗原呈递细胞脱靶，从而减少或消除受试者针对转基因产物产生的(细胞和/或体液)免疫应答，例如在US 2018/0066279中所述，其全部内容通过引用并入本文。

在一些方面，本公开涉及分离的核酸，其包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因和一个或多个miRNA结合位点。不希望受到任何特定理论的束缚，将miRNA结合位点并入基因表达构建体允许在表达相应miRNA的细胞和组织中调节转基因表达(例如，抑制转基因表达)。在一些实施方案中，将一个或多个miRNA结合位点并入转基因允许转基因表达以细胞类型特异性方式脱靶。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于转基因的3'非翻译区(3'UTR)中，例如在编码一种或多种GM3S蛋白的核酸序列的最后一个密码子与polyA序列之间。

在一些实施方案中，转基因包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)miRNA结合位点，其使抗VEGF剂(例如，KH902)表达从肝细胞脱靶。例如，在一些实施方案中，转基因包含一个或多个miR-122结合位点。

在一些实施方案中，转基因包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)miRNA结合位点，其使一种或多种GM3S蛋白的表达从免疫细胞(例如，抗原呈递细胞(APC)，例如巨噬细胞、树突细胞等)脱靶。免疫相关miRNA的miRNA结合位点的并入可以使转基因表达从抗原呈递细胞脱靶，从而减少或消除受试者中针对转基因产物产生的(细胞和/或体液)免疫应答，例如US 2018/0066279中所述，其全部内容通过引用并入本文。

如本文所用，“免疫细胞相关miRNA”是优先在免疫系统的细胞如抗原呈递细胞(APC)中表达的miRNA。在一些实施方案中，免疫细胞相关miRNA是在免疫细胞中表达的miRNA，与非免疫细胞(例如，对照细胞，如HeLa细胞、HEK293细胞、间充质细胞等)相比，其在免疫细胞中的表达水平表现高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。在一些实施方案中，免疫细胞相关miRNA在其中表达的免疫系统的细胞(免疫细胞)是B细胞、T细胞、杀伤T细胞、辅助T细胞、γδT细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞或其他免疫细胞。在一些实施方案中，免疫系统的细胞是表达一种或多种以下标志物的B细胞：B220、BLAST-2(EBVCS)、Bu-1、CD19、CD20(L26)、CD22、CD24、CD27、CD57、CD72、CD79a、CD79b、CD86、chB6、D8/17、FMC7、L26、M17、MUM-1、Pax-5(BSAP)和PC47H。在一些实施方案中，免疫系统的细胞是表达一种或多种以下标志物的T细胞：ART2、CD1a、CD1d、CD11b(Mac-1)、CD134(OX40)、CD150、CD2、CD25(白细胞介素2受体α)、CD3、CD38、CD4、CD45RO、CD5、CD7、CD72、CD8、CRTAM、FOXP3、FT2、GPCA、HLA-DR、HML-1、HT23A、Leu-22、Ly-2、Ly-m22、MICG、MRC OX 8、MRCOX-22、OX40、PD-1(程序性死亡-1)、RT6、TCR(T细胞受体)、Thy-1(CD90)和TSA-2(胸腺共享Ag-2(Thymic shared Ag-2))。在一些实施方案中，免疫细胞相关miRNA选自：miR-31、miR-106a、miR-125a/b、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223、miR-221、miR-222、let-7i、miR-148、miR-152、miR-126a、miR-142、miR-15、miR-150、miR-155、miR-16、miR-17、miR-18、miR-181a、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21a、miR-223、miR-24-3p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-302a-3p、miR-30b、miR-33-5p、miR-34a、miR-424、miR-652-3p、miR-652-5p、miR-9-3p、miR-9-5p、miR-92a和miR-99b-5。在一些实施方案中，本文所述的转基因包含一个或多个针对miR-142的结合位点。

在一些实施方案中，分离的核酸包含反向末端重复。本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV载体)。在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)的区域(例如，第一区域)，或其变体。分离的核酸(例如，重组AAV载体)可以被包装到衣壳蛋白中并施用于受试者和/或递送至选定的靶细胞。“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因及其调控序列以及5'和3'AAV反向末端重复(ITR)组成。转基因可包含编码例如蛋白(例如，抗VEGF剂，例如KH902)的区域和/或表达控制序列(例如poly-A尾)，如本公开中别处所述。

通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，在分子中使用编码ITR的基本上完整的序列，尽管允许对这些序列进行某种程度的微小修饰。修饰这些ITR序列的能力在本领域的技术范围内。(参见，例如，教科书如Sambrook等人,"Molecular Cloning.A LaboratoryManual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等人,JVirol.,70:520 532(1996))。本公开中使用的这样的分子的一个实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中选定的转基因序列和相关的调控元件的侧翼是5'和3'AAV ITR序列。AAVITR序列可以从任何已知的AAV中获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含含有第二AAV ITR的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，编码转基因的分离的核酸的侧翼是AAV ITR(例如，在方向5'-ITR-转基因-ITR-3'上)。在一些实施方案中，AAV ITR选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4ITR、AAV5 ITR和AAV6 ITR。在一些实施方案中，第二ITR是缺失功能性末端解析位点(TRS)的突变体ITR。术语“缺失末端解析位点”可以指包含废除ITR的末端解析位点(TRS)的功能的突变(例如，有义突变，如非同义突变或错义突变)的AAV ITR，或缺失编码功能性TRS的核酸序列(例如，ΔTRS ITR或ΔITR)的截短的AAV ITR。不希望受到任何特定理论的束缚，包含缺失功能性TRS的ITR的rAAV载体产生自互补的rAAV载体，例如McCarthy(2008)Molecular Therapy 16(10):1648-1656所述。在一些实施方案中，本文所述的载体包含一个或多个AAV ITR，并且至少一个ITR是已知AAV血清型ITR的ITR变体。在一些实施方案中，AAV ITR变体是合成的AAV ITR(例如，非天然存在的AAV ITR)。在一些实施方案中，AAV ITR变体是杂合ITR(例如，杂合ITR包含源自两种或更多种不同AAV血清型的ITR的序列)。

在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸(例如，rAAV载体)从5'至3'顺序包含：5'AAV ITR、CMV增强子、CBA启动子、内含子(例如，鸡β肌动蛋白内含子)、Kozak序列、编码抗VEGF剂(例如KH902)的转基因、兔β-珠蛋白poly A和3'AAV ITR。分离的核酸序列的示例性序列如SEQ ID NO:2所示。在一些实施方案中，rAAV包含分离的核酸，所述分离的核酸包含与如SEQ ID NO:2(Kozak序列以下划线表示；KH902编码序列以粗体表示)所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列：

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAACTATAGCTAGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCG

GGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTG

GGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCC

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GGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGA

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GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGG

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GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGAC

GCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG(SEQ ID NO:2)

此外，在本公开的范围内的是包含本文所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒。在一些实施方案中，包含rAAV载体的质粒进一步包含一种或多种选择标记。选择标记是本领域已知的并且包括抗生素抗性标记。在一些实施方案中，选择标记包含卡那霉素抗性标记(例如，新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因)。在一些实施方案中，选择标记包含氨苄青霉素抗性标记(例如，β-内酰胺酶基因)。

pAAV-CBA0KH902的示例性完整载体序列如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中，rAAV载体包含与如SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列：

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAACTATAGCTAGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGC

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GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

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GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

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GGTCAGCCTGACCTGCCTAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGGCCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT

CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCT

CCCTGTCTCCGGGTAAATGAACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGG

GCGGCCTCGAGGACGGGGTGAACTACGCCTGAGGATCCGATCTTTTTC

CCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGA

CTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAA

TTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACC

ACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAAT

CATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCT

GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGAC

GCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGC

CTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGG

AAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTT

CGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCA

ACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCG

CATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACAC

TTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTC

GCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTT

TAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTG

ATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTT

TTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTT

CCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTA

TAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATT

TAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATT

TAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATT

TTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTG

ATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACA

TTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTT

TTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAG

TTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAG

ATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACT

TTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGC

AAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTG

AGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTA

AGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCC

AACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTT

TTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCG

GAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCC

TGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACT

TACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAA

AGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATT

GCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCA

GCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACG

ACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGA

GATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTA

CTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGG

ATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAAC

GTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAG

GATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC

AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCT

ACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACC

AAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA

CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTG

GCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGA

CGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTC

GTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGAT

ACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGA

AAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCG

CACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGT

CGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA

GGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACG

GTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTAT

CCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATAC

CGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGG

AAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGG

CCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCG

GGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCA

CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG

TGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG(SEQ ID NO:3)

在一些实施方案中，rAAV包含分离的核酸，所述分离的核酸包含与如SEQ ID NO:30所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列：

GGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCTCGAGGACGGGGTGAACTACGCCTGAGGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCG

GCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAAT

TTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAA

ATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATAT

GTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTG

AAAAAGGAAGAGTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTC

CGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAG

ACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGG

CGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAA

CTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGT

TCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTG

GCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCT

TGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCT

GCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACA

TCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCA

GGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGT

TCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTG

ACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGC

TTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTAT

CAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGC

GAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT

CGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACTGTC

AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTT

TAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACC

AAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTA

GAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCT

GCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGC

CGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCA

GAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCC

ACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAA

TCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCG

GGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGC

TGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTA

CACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGC

TTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTC

GGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTA

TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTT

TTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAA

CGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

TTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCT

TTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGC

GAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCC

TCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTT

TCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTT

AGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCG

TATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG

CTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGC

GCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGG

GCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGA

GGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAA

CCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAACTA

TAGCTAGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC

GGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACT

TACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT

GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT

CCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGC

AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAA

TGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATG

GGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACC

ATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCC

CCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCA

GCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGG

GGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGC

AGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCG

GCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAG

TCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGC

GCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCG

GGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAAT

GACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCG

GGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGT

GTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCT

GTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGC

GCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGC

TGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTG

AGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCC

CCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCG

TACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGC

AGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGC

TCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGG

CGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGC

GCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAG

GCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCG

CCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGC

CGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGAC

GGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCG

TGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTC

TTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATC

ATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGG

TCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTAGTTC

CGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTAT

ACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTC

ACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATC

CCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCAT

ATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAA

CAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAA

CCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAAC

TATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAAC

TAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATC

AGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGT

GAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGG

AGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACC

AAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAACCTTTTGTTGCT

TTTGGAAGTGGCATGGAATCTCTGGTGGAAGCCACGGTGGGGGAGCG

TGTCAGAATCCCTGCGAAGTACCTTGGTTACCCACCCCCAGAAATAAA

ATGGTATAAAAATGGAATACCCCTTGAGTCCAATCACACAATTAAAGC

GGGGCATGTACTGACGATTATGGAAGTGAGTGAAAGAGACACAGGAA

ATTACACTGTCATCCTTACCAATCCCATTTCAAAGGAGAAGCAGAGCC

ATGTGGTCTCTCTGGTTGTGTATGTCCCACCGGGCCCGGGCGACAAAA

CTCACACATGCCCACTGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT

CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC

GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC

CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT

GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGT

GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA

GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA

AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACA

CCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA

CCTGCCTAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG

AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGGCCACGCCTCCCGTG

CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC

AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT

GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG

GGTAAATGAACGCGT

在一些实施方案中，rAAV包含分离的核酸，所述分离的核酸包含与如SEQ ID NO:31所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列：

CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTACTCGAGGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCT

CATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGA

AGAGTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTT

GGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGC

TGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTT

CTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGAC

GAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCA

GCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTG

GGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCC

GAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTT

GATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAG

CGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTG

GACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCT

CAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCG

ATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGAT

TCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAG

CGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTG

ACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCAT

CGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACTGTCAGACCAAGTT

TACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAA

GGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTT

AACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCA

AAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCA

AACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA

GCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT

ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAA

GAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA

GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCA

AGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGG

TTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAG

ATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA

GAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGA

GCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCC

TGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCG

TCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTT

ACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGT

TATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGA

TACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCG

AGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGT

TGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAA

GCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAG

GCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAA

TTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATT

ACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTC

ACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCG

CCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACT

CCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTT

ATCTACCAGGGTAATGGGGATCCGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACG

GTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACG

TCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCAT

TGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTA

CATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGAC

GGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGAC

TTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG

TGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACT

CACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGT

TTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCG

CCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATA

TAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATC

CACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCT

ATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGGTGAGCTACTGGGACACCGGCGTG

CTGCTGTGCGCCCTGCTGAGCTGCCTGCTGCTGACCGGCAGCAGCAGC

GGCGGCAGACCTTTCGTGGAGATGTACTCCGAGATCCCCGAGATCATC

CACATGACCGAGGGCAGGGAGCTCGTGATCCCCTGCAGAGTGACCAG

CCCCAACATCACCGTGACCCTGAAGAAGTTCCCCCTGGACACCCTGAT

CCCCGACGGCAAGAGAATCATCTGGGACAGCAGAAAGGGCTTCATCA

TCTCCAACGCCACCTACAAGGAGATCGGCCTGCTGACCTGCGAGGCCA

CCGTGAACGGCCACCTGTACAAGACCAATTACCTGACCCACAGGCAG

ACCAATACCATCATCGACGTGGTGCTGTCCCCCAGCCACGGCATCGAG

CTGAGCGTGGGCGAGAAGCTGGTGCTGAACTGCACCGCCAGGACCGA

GCTGAACGTGGGGATCGATTTTAACTGGGAGTACCCCAGCAGCAAGC

ACCAGCACAAGAAGCTGGTGAATAGGGACCTGAAAACCCAGAGCGGA

AGCGAGATGAAGAAGTTTCTGAGCACCCTGACCATCGACGGCGTGAC

CCGGAGCGACCAGGGCCTGTACACCTGCGCCGCCTCCAGCGGCCTGAT

GACTAAGAAGAACAGCACCTTTGTGCGGGTGCACGAGAAGCCCTTCGT

GGCCTTCGGCAGCGGGATGGAGTCTCTGGTGGAGGCTACCGTGGGCG

AGAGAGTGAGAATCCCCGCCAAGTACCTGGGCTACCCCCCTCCTGAGA

TCAAGTGGTATAAGAACGGCATCCCTCTGGAGTCCAACCACACCATCA

AGGCAGGCCACGTGCTGACCATCATGGAAGTGAGCGAGAGGGACACC

GGCAACTACACCGTGATCCTGACCAACCCCATCTCCAAGGAGAAGCA

GAGCCACGTGGTGAGCCTGGTGGTGTACGTGCCTCCAGGGCCTGGCGA

TAAGACCCACACATGCCCCCTGTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGG

ACCAAGCGTGTTCCTGTTCCCACCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGAT

CAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACG

AGGATCCAGAGGTGAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTG

CACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTA

CAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACG

GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCT

ATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCA

GGTGTACACACTGCCCCCTAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGG

TGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG

TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGGCCACC

CCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTG

ACCGTGGACAAGTCCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTAGC

GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGC

CTGAGCCCCGGCAAGTGAACGCGT

在一些实施方案中，rAAV包含分离的核酸，所述分离的核酸包含与如SEQ ID NO:32所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列：

AATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACCCGGGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTACTCGAGGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCAC

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GCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAA

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TGTTCAGCTGTAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCC

AGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTGAACGCGT

在一些实施方案中，本文所述的抗VEGF剂(例如，KH902)可以通过非病毒平台递送至受试者。在一些实施方案中，本文所述的抗VEGF剂(例如，KH902)可以通过封闭端线性双链体DNA(ceDNA)递送至受试者。先前已经描述了转基因(例如，抗VEGF剂，如KH902)的递送，参见例如WO2017152149，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，具有不对称末端序列(例如，不对称间断自互补序列)的核酸形成封闭端线性双链体DNA结构(例如，ceDNA)，在一些实施方案中，其与目前可用的基因递送载体相比表现出降低的免疫原性。在一些实施方案中，ceDNA在天然条件下的表现与线性双链体DNA相同，并且在变性条件下转化为单链环状DNA。不希望受到任何特定理论的束缚，在一些实施方案中，ceDNA可用于将转基因(例如，抗VEGF剂，如KH902)递送至受试者。

AAV介导的转基因向眼组织的递送

本公开的多个方面涉及包含含有衣壳蛋白和编码转基因的核酸的重组AAV的组合物，其中所述转基因包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列。在一些实施方案中，核酸进一步包含AAV ITR。

本公开的分离的核酸、包含本文所述的分离的核酸的载体、rAAV和组合物、本文所述的载体或本文所述的rAAV可以根据本领域已知的任何合适方法以组合物形式递送至受试者。例如，rAAV，优选悬浮于生理学上相容的载体中(例如，在组合物中)，可以施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(例如，猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。在一些实施方案中，受试者是人。

在一些实施方案中，如本文所述的分离的核酸和/或rAAV的施用导致转基因(例如，KH902)向眼组织的递送。可以通过例如眼内注射、视网膜下注射、外用施用(例如滴眼剂)或通过注射至哺乳动物受试者的眼中(例如，玻璃体内注射，或基质内注射)来将rAAV递送至哺乳动物受试者的眼组织。如本文所用，“眼组织”是指源自眼或包含在眼中的任何组织。眼组织的非限制性实例包括神经元、视网膜(例如，感光细胞)、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜(例如，角质细胞、角膜内皮细胞、角膜基底细胞、角膜翼细胞和角膜鳞状细胞)、结膜睫状体和视神经。视网膜位于眼的后部，并且包含感光细胞。这些感光细胞(例如，视杆细胞、视锥细胞)通过辨别颜色来赋予视觉灵敏度(visual acuity)，以及视野中的对比度。在一些实施方案中，施用如本文所述的分离的核酸和/或rAAV导致转基因(例如，KH902)被递送至角膜。在一些实施方案中，施用如本文所述的分离的核酸和/或rAAV导致转基因(例如，KH902)被递送至角膜的角膜基质细胞。

或者，可以通过肌内注射或通过施用至哺乳动物受试者的血流中来将rAAV递送至哺乳动物受试者。可以通过注射至静脉、动脉或任何其他血管导管中来施用至血流中。rAAV的肌内施用的非限制性示例性方法包括肌内(IM)注射和血管内肢体输注。在一些实施方案中，通过分离的肢体灌注将rAAV施用至血流中，这是外科领域中公知的技术，所述方法基本上使技术人员能够在施用rAAV病毒体之前将肢体从体循环中分离出来。分离的肢体灌注技术的一种变化形式描述在美国专利号6,177,403中，其可以被技术人员用于将病毒体施用至分离的肢体的脉管系统中，以潜在地增强向肌细胞或组织的转导。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV或组合物(例如，含有分离的核酸或rAAV的组合物)通过玻璃体内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV或组合物(例如，含有分离的核酸或rAAV的组合物)通过眼内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV或组合物(例如，含有分离的核酸或rAAV的组合物)通过视网膜下注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV或组合物(例如，含有分离的核酸或rAAV的组合物)通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV或组合物(例如，含有分离的核酸或rAAV的组合物)通过肌内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV或组合物(例如，含有分离的核酸或rAAV的组合物)通过瘤内注射施用。

在一些实施方案中，施用如本文所述的分离的核酸和/或rAAV导致VEGF(例如，VEGF活性)的抑制。在一些实施方案中，如本文所述的分离的核酸和/或rAAV的施用导致眼组织中VEGF(例如，VEGF活性)的抑制。可以通过任何合适的已知方法(例如，HUVEC血管生成测定、视网膜血管发育测定、视网膜水肿测定、激光损伤诱导的脉络膜新生血管(CNV)、碱烧伤损伤模型或缝合诱导的CoNV模型等)来测量VEGF抑制的程度。在一些实施方案中，接受了抗VEGF剂(例如，注射了本文所述的分离的核酸和/或rAAV)的受试者中的VEGF(例如，VEGF活性)活性与未经注射的受试者或接受所述抗VEGF剂之前的同一受试者相比，被抑制至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少100％。在一些实施方案中，未经注射的受试者或接受抗VEGF剂之前的受试者中的VEGF(例如，VEGF活性)比接受了抗VEGF剂施用(例如，注射了本文所述的分离的核酸和/或rAAV)的受试者高至少2％、至少5％、至少10％、至少15％，至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少10至50倍(例如，10倍、20倍、30倍、40倍或50倍)、至少50至100倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)。在一些实施方案中，抗VEGF剂(例如，本文所述的分离的核酸和/或rAAV)的施用导致VEGF(例如，VEGF活性)被抑制长于1天、长于2天、长于3天、长于4天、长于5天、长于6天、长于7天、长于1周(例如，8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)、长于2周(例如，15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天)、长于3周(例如，22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天)、长于4周(例如，29天、30天、40天、50天、60天、100天或更多)、长于1个月(例如，5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周)、长于2个月(例如，2个月至2.5个月之间、2个月至3个月之间、2个月至4个月之间、2个月至5个月之间、2个月至6个月之间、2个月至7个月之间、2个月至8个月之间、2个月至9个月之间、2个月至10个月之间、2个月至11个月之间、2个月至12个月之间)、长于3个月(例如，3个月至4个月之间、3个月至5个月之间、3个月至6个月之间、3个月至7个月之间、3个月至8个月之间、3个月至9个月之间、3个月至10个月之间、3个月至11个月之间、3个月至12个月之间)、长于4个月(例如，4个月至5个月之间、4个月至6个月之间、4个月至7个月之间、4个月至8个月之间、4个月至9个月之间、4个月至10个月之间、4个月至11个月之间、4个月至12个月之间)、长于5个月(例如，5个月至6个月之间、5个月至7个月之间、5个月至8个月之间、5个月至8个月之间、5个月至9个月之间、5个月至10个月之间、5个月至11个月之间、5个月至12个月之间)、长于6个月(例如6个月至7个月之间、6个月至8个月之间、6个月至9个月之间、6个月至10个月之间、6个月至11个月之间、6个月至12个月之间)、长于7个月(例如，7个月至8个月之间、7个月至9个月之间、7个月至10个月之间、7个月至11个月之间、7个月至12个月之间)、长于8个月(例如，8个月至9个月之间、8个月至10个月之间、8个月至11个月之间、8个月至12个月之间)、长于9个月(例如，9个月至10个月之间、9个月至11个月之间、9个月至12个月之间)、长于10个月(例如，10个月至11个月之间、11个月至12个月之间)、长于11个月(例如，11个月至12个月之间)、长于12个月(例如，12至15个月之间、12至18个月之间、12至21个月之间、12-2个月之间)、长于1年(例如，1至1.5年之间)、长于2年、长于3年、长于4年、长于5年、长于10年、长于15年、长于20年或更长。

本公开的组合物可以包含单独的rAAV，或与一种或多种其他病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因的第二rAAV)组合的rAAV。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的rAAV，每种均具有一种或多种不同的转基因。

在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体。鉴于rAAV所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起配制。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载体的选择不是对本发明的限制。

任选地，除了rAAV和载体之外，本公开的组合物还可以包含其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯苯酚和泊洛沙姆(非离子表面活性剂)如F-68。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。/>

以足以转染所需组织的细胞并提供足够水平的基因转移和表达而没有过度的副作用的量施用rAAV或组合物(例如，含有本文所述的分离的核酸或rAAV的组合物)。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所选器官(例如，玻璃体内递送至眼)、眼内注射、视网膜下注射、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内和其他胃肠外施用途径。如果需要，可以将施用途径组合。

实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量，例如，以基因组拷贝数/每千克体重(GC/kg)表示的剂量单位，将基于多个因素而有所不同，包括但不限于：rAAV病毒体的施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、正在治疗的特定疾病或病症以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及本领域公知的其他因素，本领域技术人员可以容易地确定rAAV病毒体剂量范围以治疗患有特定疾病或病症的患者。

rAAV或组合物(例如，含有本文所述的分离的核酸或rAAV的组合物)的有效量是足以靶向感染动物、靶向目标组织(例如，肌组织、眼组织等)的量。在一些实施方案中，在退行性疾病的症状前阶段向受试者施用有效量的rAAV。在一些实施方案中，在表现出退行性疾病的一种或多种体征或症状后，向受试者施用rAAV或组合物。在一些实施方案中，有效量将主要取决于诸如物种、年龄、体重、受试者的健康和待靶向的组织等因素，因此可以在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量通常在约1ml至约100ml溶液的范围内，所述溶液含有约10⁶至10¹⁶个基因组拷贝(例如，1x 10⁶至1x 10¹⁶，包括端点)。在一些实施方案中，rAAV的有效量范围在1x10⁹至1x10¹⁴个rAAV基因组拷贝之间。在一些情况下，约10¹¹至10¹²个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹¹至10¹³个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹¹至10¹⁴个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹¹至10¹⁵个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹²至10¹⁴个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹³至10¹⁴个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1x 10¹²、约1.1x 10¹²、约1.2x10¹²、约1.3x 10¹²、约1.4x 10¹²、约1.5x 10¹²、约1.6x 10¹²、约1.7x 10¹²、约1.8x 10¹²、约1.9x 10¹²、约1x 10¹³、约1.1x 10¹³、约1.2x 10¹³、约1.3x 10¹³、约1.4x 10¹³、约1.5x 10¹³、约1.6x 10¹³、约1.7x 10¹³、约1.8x 10¹³、约1.9x 10¹³或约2.0x 10¹⁴个载体基因组(vg)拷贝/千克(kg)体重是合适的。在一些实施方案中，约4x 10¹²至2x 10¹³个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，通过静脉内施用的约1.5x 10¹³vg/kg的剂量是合适的。在某些实施方案中，10¹²-10¹³个rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，眼)是有效的。在某些实施方案中，10¹³-10¹⁴个rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，眼)是有效的。

在一些实施方案中，将rAAV注射至受试者。在其他的实施方案中，通过外用施用(例如，滴眼剂)将rAAV施用至受试者。在一些实施方案中，rAAV的有效量是足以在受试者的靶组织(例如眼)中表达有效量的抗VEGF剂(例如KH902)的量。

在一些实施方案中，通过注射递送的rAAV(例如，递送编码抗VEGF剂的rAAV(例如，KH902)的有效量是足以在靶组织中表达有效量的抗VEGF剂(例如，KH902)的量。在一些实施方案中，递送有效量的编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV足以通过合适的施用途径(例如，眼内注射、i.v.注射、腹膜内注射和肌内注射)向受试者每眼递送10μg至10mg或介于之间的任何中间值的抗VEGF剂(例如，KH902)。在一些实施方案中，编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV足以向受试者每眼递送20μg至5mg或介于之间的任何中间值的抗VEGF剂(例如，KH902)。在一些实施方案中，编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV足以向受试者每眼递送10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、10mg或更多的抗VEGF剂(例如，KH902)。

在一些实施方案中，将编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV每天一次、每周一次、每两周一次、每个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每6个月一次、一年一次或受试者的一生一次地施用给受试者。

在一些实施方案中，通过外用施用如滴眼剂递送的rAAV(例如，递送编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV的有效量是足以在靶组织中表达有效量的抗VEGF剂(例如，KH902)的量。在一些实施方案中，将含有编码的rAAV的滴眼剂每周一次、每个月一次、每3个月一次、每6个月一次或每年一次地施用给受试者。

在一些实施方案中，滴眼剂包含的编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV足以递送浓度为1mg/ml至20mg/ml的抗VEGF剂。在一些实施方案中，滴眼剂包含的编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV足以递送浓度为2.5mg/ml至10mg/ml的抗VEGF剂。在一些实施方案中，滴眼剂包含的编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV足以递送浓度为1mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml或20mg/ml的抗VEGF剂。在一些实施方案中，滴眼剂以0.01ml、0.02ml、0.03ml、0.04ml、0.05ml、0.06ml、0.07ml、0.08ml、0.09ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml或0.5ml来施用。

rAAV或组合物(例如，包含本文所述的分离的核酸或rAAV的组合物)的有效量也可以取决于施用方式。例如，在一些情况下，通过基质内施用或皮下注射靶向眼部(例如，角膜)组织可能需要与通过另一种方法(例如，全身施用，外用施用)不同(例如，更高或更低)的剂量。在一些实施方案中，具有某些血清型(例如，AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43)的rAAV的基质内注射(IS)介导眼部(例如，角膜、视网膜等)细胞的有效转导。因此，在一些实施方案中，注射是基质内注射(IS)。在一些实施方案中，注射是外用施用(例如，外用施用至眼)。在一些情况下，施用多个剂量的rAAV。

在一些实施方案中，配制rAAV组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，尤其是在存在高rAAV浓度(例如，～10¹³GC/mL或更高)的情况下。减少rAAV聚集的方法是本领域公知的，并且包括例如添加表面活性剂、调节pH、调节盐浓度等(参见，例如，Wright FR,等人,Molecular Therapy(2005)12,171–178，其内容通过引用并入本文。)

药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制，以及开发用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的给药和治疗方案，是本领域技术人员公知的。

通常，这些制剂可以含有至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地在总制剂重量或体积的约1或2％至约70％或80％或更多之间。自然地，每种在治疗上有用的组合物中的活性化合物的量都可以以使得在任何给定的化合物单位剂量中都将获得合适的剂量的方式制备。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑等因素将由制备此类药物制剂的本领域技术人员考虑，因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。

在某些情况下，希望通过玻璃体内、眼内、视网膜下、基质内、皮下、胰内、鼻内、胃肠外、静脉内、肌内、鞘内、经口、腹膜内或吸入之一来递送本文公开的合适配制的药物组合物中的基于rAAV的治疗构建体。在一些实施方案中，可以使用如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(每一个均通过引用以其整体并入本文)中描述的施用方式来递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过门静脉注射。

适合注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。在许多情况下，所述形式是无菌的，并且流动性达到容易注射的程度。它必须在制造和储存条件下保持稳定，并且其保存必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和/或植物油。合适的流动性可以例如通过使用包衣剂如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需粒径和通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，引起可注射组合物的延长吸收。

例如，对于可注射水性溶液的施用，如果需要，可以将溶液适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这个方面，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解在1mL的等渗NaCl溶液中，然后添加到1000mL的皮下灌注液中或在建议的输注部位注射，(参见，例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版,第1035-1038和1570-1580页)。根据宿主的情况，一定会出现一些剂量上的变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定针对个体宿主的合适剂量。

通过将所需量的活性rAAV与本文列举的各种其他成分(根据需要)并入合适溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散液是通过将各种经灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自上述列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。

本文公开的rAAV组合物也可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。通过配制，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。所述制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。

如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。补充活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用给宿主时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。

诸如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等递送媒介物可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以被配制用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中递送。

此类制剂可优选用于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。目前，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制备物作为潜在药物载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。

脂质体已成功用于许多通常对通过其他步骤进行的转染具有抗性的细胞类型。此外，脂质体不受DNA长度的限制，该限制对基于病毒的递送系统来说是典型的。脂质体已被有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入各种培养的细胞系和动物。此外，已经完成了数项成功的检查脂质体介导的药物递送有效性的临床试验。

脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV)的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致形成直径在200至范围内的小的单层囊泡(SUV)，其核心中含有水性溶液。

或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式捕获物质。为避免因细胞内聚合物超载而产生的副作用，此类超细颗粒(尺寸为约0.1μm)应使用能够在体内降解的聚合物进行设计。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。

除了上述递送方法之外，还考虑将以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。超声导入法(即超声)已在美国专利号5,656,016中使用并描述为提高药物渗透进入和通过循环系统的速率和功效的装置。考虑的其他药物递送替代方案是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、眼科制剂(Bourlais等人,1998)、透皮基质(美国专利号5,770,219和5,783,208)和反馈控制的递送(美国专利号5,697,899)。

在一些实施方案中，本文所述的抗VEGF剂(例如，KH902)通过ceDNA递送至受试者。包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA的任何组合物也在本公开的范围内。在一些实施方案中，编码抗VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA及其组合物可以使用本文所述的任何合适方法施用给受试者。在一些实施方案中，通过注射递送的编码抗VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA的有效量是足以在靶组织中表达有效量的抗VEGF剂(例如，KH902)的量。在一些实施方案中，有效量的编码抗VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA的递送足以通过合适的施用途径(例如，眼内注射、i.v.注射、腹膜内注射和肌内注射)向受试者每眼递送10μg至10mg或介于之间的任何中间值的抗VEGF剂(例如，KH902)。在一些方面，本公开涉及知晓向受试者施用AAV的一种潜在副作用是受试者中对AAV的免疫应答，包括炎症。在一些实施方案中，受试者在施用如本文所述的一种或多种rAAV之前被免疫抑制。

如本文所用，“免疫抑制的”或“免疫抑制”是指受试者中免疫应答激活或功效的降低。可以使用一种或多种(例如，多种，例如2、3、4、5或更多种)药剂在受试者中诱导免疫抑制，所述药剂包括但不限于利妥昔单抗(rituximab)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙、西罗莫司(sirolimus)、免疫球蛋白注射液、泼尼松(prednisone)、甲强龙(Solu-Medrol)、兰索拉唑(Lansoprazole)、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、甲氨蝶呤及其任意组合。在一些实施方案中，免疫抑制方案包括施用西罗莫司、泼尼松龙、兰索拉唑、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑或其任意组合。

在一些实施方案中，本公开描述的方法进一步包括在受试者被施用rAAV(例如，本公开所述的rAAV或药物组合物)之前在受试者中诱导免疫抑制(例如，施用一种或多种免疫抑制剂)的步骤。在一些实施方案中，在向受试者施用rAAV之前的约30天至约0天之间(例如，施用rAAV前的30天之内的任何时间，包括端点)，对受试者进行免疫抑制(例如，在受试者中诱导免疫抑制)。在一些实施方案中，将受试者用免疫抑制剂(例如，利妥昔单抗、西罗莫司和/或泼尼松)预处理至少7天。

在一些实施方案中，本公开中描述的方法进一步包括向被施用本公开的rAAV或包含rAAV的药物组合物的受试者共同施用或预先施用药剂。在一些实施方案中，所述药剂选自米格鲁他(Miglustat)、开浦兰(Keppra)、兰索拉唑(Prevacid)、氯硝西泮(Clonazepam)及其任何组合。在一些实施方案中，可以以任何顺序将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂递送至受试者。在一些实施方案中，将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)同时递送至受试者。在一些实施方案中，将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)共同施用给受试者(例如，在一种组合物中或在不同组合物中)。在一些实施方案中，rAAV(例如，用于KH902的rAAV)在额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)之前递送。在一些实施方案中，rAAV(例如，用于KH902的rAAV)在额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)之后递送。在一些实施方案中，以不同频率将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)递送至受试者，例如，受试者每个月、每两个月、每六个月、每年、每两年、每三年、每5年或更长时间地接受rAAV(例如，用于KH902)，但每天、每周、每两周、每个月、每天两次、每天三次或每周两次地接受额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)。

在一些实施方案中，在施用rAAV或药物组合物期间和/或之后维持受试者的免疫抑制。在一些实施方案中，在施用rAAV或药物组合物之后将受试者免疫抑制(例如，施用一种或多种免疫抑制剂)1天至1年之间的时间。

治疗与VEGF和/或血管生成相关的疾病的方法

本公开的多个方面涉及将编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因递送至受试者(例如，受试者中的细胞)的方法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。非人哺乳动物的非限制性实例是小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物。

在一些实施方案中，本公开涉及一种抑制有此需要的受试者中的VEGF活性的方法。在一些实施方案中，本公开描述的方法可用于治疗患有或怀疑患有与VEGF相关的疾病的受试者。如本文所用，“与VEGF相关的疾病”是指与异常VEGF活性/信号传导相关的一组疾病。VEGF是一种由细胞产生的信号蛋白，其可刺激血管的形成。VEGF是一种已知的诱导血管生成的因子。在一些实施方案中，本公开描述的方法可用于治疗患有或怀疑患有血管生成相关疾病的受试者。如本文所用，血管生成相关疾病是指与异常的血管生成相关的疾病。非限制性示例性血管生成相关疾病包括血管生成依赖性癌症，包括例如血管生成相关眼病、实体瘤(例如，肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌、结肠癌、黑色素瘤)、血源性肿瘤如白血病、转移性肿瘤、良性肿瘤(例如，血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、颗粒性结膜炎和化脓性肉芽肿)、类风湿性关节炎、银屑病、虹膜红变(rubeosis)、斯特奇-韦伯综合征(Osier-Webber Syndrome)、心肌血管生成、斑块血管新生、毛细血管扩张、血友病性关节或血管纤维瘤。

在一些实施方案中，血管生成相关眼病包括但不限于角膜新生血管形成(CoNV)、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶状体后纤维增生、流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、接触镜超戴症、特应性角膜炎、上部角膜缘角膜炎(superior limbic keratitis)、翼状胬肉干燥性角膜炎(pterygiumkeratitis sicca)、干燥综合征、红斑痤疮、小水泡病(phylectenulosis)、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角膜溃疡(Mooren ulcer)、Terrien角膜边缘性变性、边缘性角质层分离、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多动脉炎、创伤、韦格纳结节病、巩膜炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Steven's Johnson disease)、类天疱疮放射状角膜切开术、和角膜移植排斥、镰状细胞贫血、肉样瘤、弹性假黄色瘤、Paget病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉闭锁性病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、Eales病、白塞氏病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假定眼组织胞浆菌病(presumedocular histoplasmosis)、Bests病、近视、视盘先天性小凹(optic pits)、Stargardt病、睫状体扁平部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综合征、弓形体病、创伤或激光术后并发症。

如本文所用，术语“治疗”是指将包含抗VEGF剂(例如，KH902)的组合物应用或施用于患有与异常VEGF活性或血管生成相关的症状或疾病或具有对与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病的易感性的受试者，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对与异常的VEGF活性或血管生成相关的疾病的易感性。在一些实施方案中，施用抗VEGF剂导致VEGF活性与参考值相比降低2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。测量VEGF活性的方法是本领域已知的。非限制性示例性参考值可以是相同受试者在接受抗VEGF剂治疗之前的VEGF活性。在一些实施方案中，施用抗VEGF剂导致血管生成与参考值相比减少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。测量血管生成的方法是本领域已知的。非限制性示例性参考值可以是相同受试者在接受抗VEGF剂治疗之前的血管生成水平。

在一些实施方案中，本公开涉及一种用于在有此需要的受试者中减少角膜新生血管形成(CoNV)(例如，相对于未经治疗的受试者或相对于施用前的受试者减少CoNV)的方法。在一些实施方案中，所述方法相对于未经治疗的受试者或相对于施用前的受试者将CoNV减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。测量CoNV的方法是本领域已知的(例如，光学相干断层扫描血管造影术(OCTA)、吲哚菁绿血管造影术(ICGA)等)。本文中可使用任何合适的方法来测量CoNV。

缓解与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。缓解疾病并不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延迟”疾病(例如与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病)的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，取决于疾病的病史和/或正在接受治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是当与不使用该方法相比时，降低在给定时间范围内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或降低在给定时间范围内的症状程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用的受试者数量足以给出统计学上显著的结果。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域公知的标准临床技术来检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。

实施例

实施例1：用于递送康柏西普(KH902)的rAAV载体平台

此处描述了一种rAAV载体平台，用于将康柏西普(KH902)作为一种抗VEGF治疗剂通过玻璃体内施用(或其他途径)递送至视网膜。独特的设计是包含由CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子调节盒驱动的KH902转基因的单链AAV载体基因组(图1A-1C)。在KH902起始密码子的上游设计了Kozak序列以增强翻译(图1C)。当顺式质粒(图1A)通过反式质粒(trans-plasmid)共转染或通过稳定整合被递送至表达AAV Rep和Cap基因以及强制性辅助基因的包装细胞系中时，包括反向末端重复序列(ITR)并且被其侧接的序列被包装到AAV衣壳病毒体中。

将细胞用所得的表达分泌的KH902的ssAAV-KH902病毒体感染或转导，其通过标准蛋白质印迹分析检测(图2)。用包装在AAV2衣壳中的ssAAV-KH902转导视网膜色素上皮(RPE)细胞系，导致KH902的蛋白表达与在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中生产的康柏西普药物具有相似的分子量。该数据表明，rAAV-KH902载体可以被包装到不同的AAV衣壳中，并且当感染至细胞中时，可以有效地分泌KH902。

来自用rAAV-KH902感染的RPE细胞的条件培养基以与康柏西普药物相同的方式强烈抑制血管生成，如通过血管内皮生长因子(VEGF)诱导的肾小管生成(图3A和3B)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖(CCK-8，图3C)的减少所示。该数据表明，用rAAV-KH902感染的细胞可以在体外表达和分泌功能性抗血管生成的KH902。

将rAAV2-CBA-KH902注射到新生小鼠幼崽的玻璃体中可防止正常的视网膜血管发育(图4)。该数据表明，AAV-KH902病毒体在体内抑制血管形成。为了确定这种载体设计是否可以抑制脉络膜新生血管形成，在早产儿视网膜病变(ROP)的小鼠模型中测试了rAAV2-CBA-KH902载体(图5)。与未经注射的眼对照相比，rAAV2-CBA-KH902的玻璃体内注射和随后的小鼠高氧处理导致可检测到水肿的眼百分比和经治疗小鼠的眼中水肿的数量减少。该数据表明，AAV-KH902是一种潜在可行的基因治疗平台，用于预防脉络膜新生血管形成，并有可能逆转脉络膜新生血管形成。

实施例2：玻璃体内注射AAV2载体可有效递送KH902以预防小鼠中氧诱导的视网膜病变和血管形成

在出生后(PN)1-3天通过玻璃体内注射载体来处理新生小鼠。分别将每只小鼠的一只眼用包装EGFP转基因的载体(rAAV-EGFP)处理，另一只眼用包装KH902转基因的载体(rAAV-KH902)和rAAV-EGFP的5:1比例混合物处理。在所有情况下，总剂量为每只眼1.5E⁹vg，体积为1μL。然后将小鼠保持在70％氧气下直至PN 7，并置于常氧条件下(20-21％氧气)直至PN 11。在PN 18处死小鼠，并收获和观察眼(图6A-6B和图7A-7B)。然后通过目视检查对所处理的眼的病理学进行评分并评分(图8)。仅用rAAV-EGFP处理的眼可以指示高氧诱导的程度，并作为病理学变化性的内部对照。应该注意的是，没有水肿并不意味着高氧不能诱导视网膜病变，经rAAV-KH902处理的眼中存在水肿也不意味着载体是无效的。血管病理学的挽救取决于动脉瘤结节是否存在。

在用作阴性对照的rAAV2-Egfp处理的眼中，由于过度增殖和血管动脉瘤结节的形成而观察到血管病变(图6B，下小图)。经rAAV2-KH902处理的眼有效地预防了病变(图6A-6B)，并且还在一定程度上减少了血管发育(图6B，右小图)。相反地，rAAV8-KH902在预防血管病变方面非常低效(图7A-7B)。该观察结果与视网膜组织中rAAV8-EGFP的低转导相关(图7B，左小图)。尽管如此，在存在一些转导的区域中，rAAV8-KH902能够部分预防病变(图7B右小图和图8)。

总的来说，即使眼睛没有出现水肿，由高氧诱导的视网膜病变在所有小鼠中都出现了(图8)。重要的是，KH902转基因能够通过rAAV2逆转病理性血管形成，但rAAV8则效果不佳。然而，目前的结果并不能预测在成年动物中的治疗结果，因为届时常规血管发育已经完成。

实施例3：人类起源的AAV衣壳变体，用于将基因高效安全地递送至视网膜

为了评估AAV2变体衣壳和AAV2/3杂合衣壳是否能够将转基因递送至视网膜细胞，将AAV2变体和AAV2/3杂合衣壳包装到携带条形码化的EGFP转基因的rAAV中，并通过玻璃体内或视网膜下注射到小鼠体内。GFP在视网膜中的表达反映了某种衣壳蛋白转导视网膜中细胞的能力。

在初步研究中，测试了八种AAV2变体(v224、v326、v358、v46、v56、v66、v67和v81)和七种AAV2/3杂合变体(v439、v453、v513、v551、v556、v562和v598)。将包含每种衣壳变体和条形码化的EGFP转基因的rAAV通过玻璃体内施用注射到小鼠体内(3只小鼠/组；总共45只小鼠)。在注射后两周(图9A)和四周(图9B)通过眼底镜检查观察转导效率。经眼底镜检查评估，在所有变体中，v56、v224和v326的转导最高。使用这三种衣壳包装KH902，用于后续在激光诱导的脉络膜血管新生小鼠模型中的研究。在该研究中，观察到AAV2变体在小鼠中的表现优于AAV2/3杂合变体。

在激光损伤治疗模型中研究了rAAV-KH902的功效。激光损伤会诱发脉络膜血管新生(CNV)事件，KH902能够减少激光损伤后眼中的CNV。CNV的数量或CNV的大小均可以作为将KH902有效递送至眼的指标进行测量。在目前的研究中，小鼠眼睛在注射rAAV前5天受到激光损伤。给小鼠注射对照-GFP或AAVv224-KH902。如图10所示，与对照-GFP组相比，用AAVv224-KH902处理的小鼠能够在激光损伤后20天将CNV数量减少至低于80％。AAVv56-KH902和AAVv326-KH902在同一小鼠模型中表现出与AAVv224-KH902相似的治疗效果。此外，还测量了CNV的表面积，预计通过AAV2变体或AAV2/3杂合变体递送KH902能够减小CNV的大小。

先前观察到，由于免疫细胞在脉管系统中的积累，KH902的过表达以剂量依赖性方式导致眼部病变。通过明视野眼底镜检查，此类病变可以在眼中观察到白色条纹。为了测试v224-KH902是否会在眼中引起此类病变，向小鼠玻璃体内注射了v224-KH902(一种先前观察到会引起眼部病变的对照衣壳-KH902)、对照衣壳-KH902的1:10稀释、对照衣壳-KH902的1:20稀释、对照衣壳-KH902的1:50稀释或对照衣壳-KH902的1:20稀释。如图11所示，未稀释的对照衣壳-KH902引起眼部病变，对照衣壳-KH902的稀释使病变减轻。在注射了v224-KH902的小鼠眼中没有观察到病变。

此外，衣壳变体(例如，AAV2变体、AAV2/3杂合变体和AAV8变体)与其各自的原型衣壳蛋白相比显示出更好的包装效率。如图12所示，通过粗裂解物PCR进行的体外包装产量评估绘制为瀑布图，其显示了AAV2变体(上小图)、AAV2/3变体(中小图)和AAV8变体(下小图)的相对包装产量。每个衣壳的包装产量值表示为其原型形式赋予的产量的百分比：分别为AAV2、AAV3b和AAV8。衣壳变体v56显示比AAV2增加9.42倍；v224显示比AAV2增加8.96倍，v326显示比AAV2增加9.79倍。展示的衣壳总数显示在x轴上。

实施例4：

正常的哺乳动物角膜是透明的且没有血管和淋巴管。在促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡被病理条件如炎症、缺氧和角膜缘屏障功能障碍破坏的情况下，可能会发生角膜新生血管形成(CoNV)。CoNV会降低角膜透明度并导致视力障碍。在美国，它每年影响超过140万人。目前针对CoNV的治疗包括外部类固醇和非类固醇抗炎施用、激光烧灼、细针透热疗法和羊膜移植。然而，上述所有方法都具有有限的功效并带来了相关的副作用。血管内皮生长因子(VEGF)在角膜血管生成中起关键作用，但上述治疗均未特异性针对该关键分子。抗VEGF剂在脉络膜新生血管形成中的成功应用引起了人们对这些药物在动物模型和临床试验中控制角膜血管生成能力的兴趣和测试的激增。例如，一些早期研究表明，贝伐单抗在许多动物模型和临床试验中具有通过外用、结膜下、角膜缘和基质内施用来抑制CoNV的潜力。此后，更多的抗VEGF药物如雷珠单抗和阿柏西普被开发并应用于角膜血管新生的临床治疗。然而，由于它们的半衰期短，这些VEGF中和蛋白的持久性有限是实现对CoNV的可持续且有效的治疗的明显障碍。基因治疗技术的显著进步激发了通过将编码VEGF中和蛋白的表达盒包装到重组腺相关病毒(rAAV)载体中来提高抗VEGF药物持久性的努力，rAAV是极具吸引力的用于在眼部疾病中体内递送治疗性转基因的载体。rAAV因其低免疫原性、低遗传毒性和高转导特性而受到青睐。单剂量的rAAV载体能够介导稳健且持续的基因表达，这对于实现治疗目标和减轻慢性角膜疾病患者的治疗负担具有重要意义。

在这项研究中，目的是开发一种新的治疗方法，其使用rAAV介导的外源性KH902表达，进行单次给药以稳定地预防和抑制受损角膜中的血管生成。

基质内注射rAAV2和rAAV8载体可产生有效的角膜细胞转导

为确保rAAV介导的基因治疗成功，应用途径必须允许治疗基因在靶组织内有效递送和表达。目前，靶向角膜的治疗剂主要通过外部滴注、结膜下注射或基质内注射施用。已证明在不去除表层上皮的情况下外部滴注rAAV载体的转导效率相对较低；因此，rAAV载体的生物分布主要按照结膜下和基质内注射途径进行比较。在普遍存在的鸡β-肌动蛋白启动子(rAAV2-eGFP或rAAV8-eGFP)下，通过基质内或结膜下途径，以相同剂量(1.6×10¹⁰个基因组拷贝(GC)/角膜)向小鼠角膜注射包装有eGFP报告转基因的rAAV2或rAAV8(图13A、13D)。通过活体动物成像系统(Micron IV相机)直接检测eGFP信号，在施用后两周评估角膜中eGFP的表达水平。有趣的是，在通过基质内途径而非结膜下途径治疗的小鼠的角膜中成功检测到了eGFP信号(图13B、13D、20B、20C)。为了进一步确认角膜中的eGFP生物分布模式，在施用后两周在去核眼球切片中分析eGFP荧光。与活体成像数据一致，在基质内注射载体后，eGFP在整个角膜中表达。相反，结膜下注射导致角膜缘、结膜和巩膜组织中的表达，但角膜中的表达很差或不存在(图13C、13F、20A)。总之，这些数据证明，基质内注射是施用rAAV2和rAAV8载体以在角膜中广泛转导的更有效的途径。

rAAV2和rAAV8介导的eGFP和KH902表达的角膜细胞嗜性和动力学

为了检查由通过角膜基质内注射的rAAV2和rAAV8介导的转基因表达的动力学，将rAAV2-eGFP或rAAV8-eGFP以每个角膜1.6×10¹⁰GC的等剂量基质内施用。rAAV8介导的eGFP信号早在注射后28小时就很容易通过活体动物成像检测到(图14A)。然而，rAAV2-eGFP处理的角膜中的eGFP信号直到施用后一周才被观察到，并且其信号强度比rAAV8-eGFP处理赋予的信号强度弱得多(图14A)。接下来，将rAAV2-KH902或rAAV8-KH902以每个角膜1.6×10¹⁰GC基质内注射到野生型小鼠角膜中，并通过液滴数字PCR(ddPCR)评估第1周和第2周以及第1、2和3个月的相对KH902 mRNA表达。在rAAV8-KH902组中检测到KH902 mRNA的强表达，在注射后一周达到峰值。同时，rAAV2也导致可检测的KH902表达，但水平显著更低，并且在注射后两周出现滞后的峰。在达到峰值水平后，由rAAV2和rAAV8介导的KH902 mRNA表达逐渐下降，但直到注射后三个月(实验的最后时间点)仍可检测到(图14B)。值得注意的是，在每个时间点，rAAV8介导的相对KH902 mRNA表达均高于rAAV2所达到的水平。该观察结果与rAAV-eGFP载体赋予的eGFP信号一致(图14A)。

为了研究rAAV2和rAAV8转导在小鼠角膜中的嗜性，在注射后两周分析了来自基质内注射rAAV2-eGFP或rAAV8-eGFP的角膜组织切片(图14C)。结果表明，eGFP信号主要与波形蛋白(一种角膜基质细胞标志物)共定位，表明rAAV2和rAAV8主要转导角膜基质细胞。还观察到在上皮细胞中的零星表达。另一方面，rAAV2-eGFP和rAAV8-eGFP均未转导角膜内皮细胞(图14C-i、ii)。随后，在用rAAV2-KH902或rAAV8-KH902(1.6×10¹⁰GC/角膜)转导的角膜中使用抗人IgG(H+L)抗体探测KH902蛋白的分布。rAAV2和rAAV8转导后的KH902蛋白主要存在于角膜基质细胞中，很少见于角膜上皮细胞中(图14C-iii、iv和图21A-21B)，这与rAAV2-eGFP和rAAV8-eGFP转导后的eGFP表达模式相一致。然而，结果清楚地表明，KH902蛋白不仅分布在角膜基质细胞的细胞体中，并且还扩散到整个角膜基质层。这归因于KH902在N末端含有分泌性信号肽，从而促进KH902蛋白从角膜基质细胞分泌到角膜基质中的事实。

总体而言，数据表明，相比于rAAV2，rAAV8在基质内递送后在角膜中介导了更强且更早开始的KH902表达，表明rAAV8-KH902在治疗角膜新生血管形成方面优于rAAV2-KH902。此外，由rAAV8介导的KH902的表达可持续长达三个月，并分散在整个角膜基质层中。这一发现表明rAAV8-KH902具有中和VEGF并因此减弱CoNV的稳健的潜在能力。

小鼠角膜中对rAAV2-KH902或rAAV8-KH902的免疫应答的表征

考虑到中央角膜厚度(CCT)是角膜健康和生理功能的指标，在基质内注射PBS、rAAV8-eGFP、rAAV2-KH902和rAAV8-KH902(1.6×10¹⁰GC/角膜)后，通过光学相干断层扫描(OCT)成像在不同时间点分析CCT。其中，PBS和rAAV8-eGFP分别作为注射对照和载体媒介物对照。注射后即刻发现，PBS组的CCT增加了22.73±2.93μm，rAAV8-eGFP组的CCT增加了23.50±5.37μm，rAAV2-KH902组的CCT增加了22.12±3.43μm，且rAAV8-KH902组的CCT增加了22.75±3.12μm，然后在第12周结束时(数据收集的最后时间点)逐渐降低回注射前水平，并在OCT扫描下具有正常的形态学结构和解剖结构(图15A、15B)。在所有组中未观察到CCT的显著差异。总之，这些数据表明，在三个月后，基质内注射rAAV载体和KH902转基因产物不会改变中央角膜厚度和破坏角膜生理结构以产生局部瘢痕或后弹力层脱离(Descemet’smembrane detachment)。同时，还在注射rAAV-KH902后两周通过估计角膜中单核细胞/巨噬细胞标志物(CD11b、F4/80)的水平来评估免疫应答。在高剂量(1.6×10¹⁰GC/角膜)rAAV2-eGFP/KH902和rAAV8-eGFP/KH902施用后，CD11b+或F4/80+细胞的水平显著更高，而CD11b+或F4/80+细胞的百分比在它们的低剂量(8×10⁸GC/角膜)对应物中，相比之下显著更低，其水平与PBS对照相似(图15C、15D)。因此，rAAV2-KH902和rAAV8-KH902递送的低剂量(8×10⁸GC/角膜)注射方案用于随后的体内CoNV治疗研究。

通过基质内施用的rAAV8-KH902治疗可有效抑制碱烧伤损伤模型中的CoNV

为了测试通过基质内递送的rAAV2-KH902和rAAV8-KH902是否会治疗性抑制角膜新生血管形成，对小鼠角膜进行碱烧伤以创建CoNV模型，随后在碱烧伤后第一天向小鼠注射PBS、8×10⁸GC/角膜剂量的rAAV8-eGFP、rAAV2-KH902或rAAV8-KH902。在角膜损伤后第5天、第10天以及角膜损伤后2、3、4、8和12周，跟踪CoNV进展(图16A)。在碱损伤后第5天，所有组都开始可见来自角膜缘血管丛的CoNV出芽和分裂，各组的CoNV区域之间没有统计学差异。令人兴奋的是，在rAAV8-KH902处理组中，CoNV的长度和面积没有明显增加，并且从第5天到第12周(实验终点)保持相对静止。与之相反，rAAV2-KH902在烧伤后约4周时未能抑制CoNV从角膜缘到中央角膜的进一步生长，如rAAV8-eGFP和PBS对照组一样(图16A、16B)。为了比较rAAV8-KH902和康柏西普药物的疗效，对单剂量康柏西普(10mg/ml)和rAAV8-KH902处理组的CoNV面积进行了定量分析。结果表明，在第5天和第10天时，CoNV生长的早期阶段没有显著差异。但是，在单剂量康柏西普药物处理组中，CoNV从治疗后两周开始迅速增长，并进一步进展至在四周时侵入中央角膜，最终在12周时形成大小与PBS对照组相似的密集的CoNV。注射后2周至12周，rAAV8-KH902转导组的CoNV面积显著小于康柏西普药物处理组中的CoNV面积，表明rAAV8-KH902表现出延长的抗VEGF功效。此外，在整个观察期间，与单独的rAAV8-KH902相比，rAAV8-KH902与康柏西普的组合没有进一步抑制CoNV面积(图16A、16C)，表明在该剂量下，由rAAV8递送的KH902的表达足够来及时中和VEGF，以达到抗血管生成的作用。额外的康柏西普药物补充对进一步加强rAAV8-KH902的治疗效果没有帮助。为了验证，使用抗CD31(也称为血小板-内皮细胞粘附分子1，PECAM-1)勾勒出角膜包埋片上的血管的免疫染色数据显示，CoNV大小与12周时的总体血管病理学结果相关(图16D，左小图)。

淋巴管生成也与CoNV的病理过程有关。新淋巴管从角膜缘形成被认为类似于血管生成过程中的血管生长，并且主要由VEGF-C和VEGF-D与VEGFR-2和VEGFR-3的结合诱导。鉴于VEGF-A也已被显示有助于淋巴管生成，并且康柏西普阻断所有VEGF-A同种型，还评估了rAAV8-KH902对淋巴管生成的影响。由于侵入角膜的病理性淋巴管不直接可见，因此在第12周在每组中收集小鼠角膜。将角膜包埋片用作为泛内皮标志物的CD31和作为特异性淋巴管标志物的LYVE-1(淋巴管内皮受体1)进行双重染色。CD31⁺⁺⁺/LYVE-1^–血管和CD31⁺/LYVE-1⁺⁺⁺淋巴管覆盖的区域在角膜包埋片中测量。在12周随访的所有实验组中，rAAV8-KH902单独治疗和与康柏西普药物组合治疗均未减少淋巴管生成的大小，并且在PBS对照与各处理组之间未观察到显著差异(图16D、16E)。

rAAV8-KH902下调Dll4/Notch信号传导和ERK激活

出芽的血管生成由内皮“尖端”细胞引导，指导出芽过程，而内皮“茎”细胞使新血管芽伸长。在此过程中，VEGF和Notch信号通路与血管内皮中尖端和茎细胞的选择有关。特化的内皮尖端细胞导致血管芽向VEGF-A梯度生长。Dll4和Notch信号传导的报告子以马赛克模式分布在活跃出芽血管的内皮细胞中。在VEGF的刺激下，静止的内皮细胞被诱导形成尖端细胞丝状伪足并上调尖端细胞中Dll4的表达水平。反过来，Dll4配体激活茎细胞中的Notch信号，导致细胞膜释放活性Notch细胞间结构域(NICD)，从而实现足够间隔的分支和出芽。然而，先前的研究并未解决Dll4/Notch信号在CoNV中的作用。因此，在碱烧伤后两周，通过免疫染色和蛋白质印迹分析，在血管生长旺盛的小鼠角膜中评估Dll4/Notch信号传导表达。在PBS和rAAV8-eGFP对照组中，Dll4在角膜新生血管出芽中广泛表达，表明Dll4参与角膜血管生成过程。与之相反，在rAAV8-KH902处理组中，很少检测到Dll4并且尖端细胞丝状伪足完全缩回(图17A)。这些结果证明，VEGF-A刺激被rAAV8-KH902阻断，从而阻止尖端细胞迁移和CoNV进展。蛋白质印迹结果证实了这些发现，其显示与对照组相比，rAAV8-KH902处理组中Dll4和NICD表达的显著下调(图17B、17C、17D)。

VEGF与VEGFR结合导致磷酸化VEGFR2，启动与血管生成相关的下游信号传导通路，并在上皮细胞(EC)中产生多种细胞应答。在这些途径中，VEGF诱导的ERK1/2信号传导已得到广泛研究，并显示可调节微血管内皮分化和增殖。因此，在碱烧伤后八天收集小鼠角膜，以评估每种情况下的ERK激活水平。通过蛋白质印迹分析，与PBS组和rAAV8-eGFP处理组相比，rAAV8-KH902处理组中磷酸化ERK(pERK)与总ERK的比率(pERK/ERK)显著降低(图17E、17F)，表明通过rAAV8-KH902阻断VEGF导致碱烧伤诱导的CoNV小鼠中ERK激活的抑制。

rAAV8-KH902防止了碱烧伤和缝合诱导的CoNV模型中预先存在的血管新生的进展

化学烧伤是一种急性眼损伤，是一种复杂的病况，具有不同的严重程度和棘手的病变。对于初期未能得到即刻或强化管理的病例，CoNV容易在活跃期迅速进展。因此，探索rAAV8-KH902是否能够抑制或甚至消退由碱灼伤引发的活跃扩张的CoNV引起了人们很大的兴趣。在碱烧伤后10天，向小鼠角膜基质内注射PBS、rAAV8-eGFP或rAAV8-KH902(8×10⁸GC/角膜)，此时CoNV已不同程度侵入角膜，处于活跃阶段并持续增长(图18A)。一旦碱烧伤诱导了CoNV，通过自身对照研究方法，在任何实验组中均未发现显著的消退(图18A、18B)。然而，在rAAV8-KH902处理组中，现有的CoNV在4周的随访期间被显著抑制并维持在治疗前的状态(图18A、18C)。

为了确认KH902在不同损伤模型中抑制CoNV的作用，通过在小鼠角膜上放置带结的基质内缝合线，使用缝合诱导的CoNV小鼠模型进行了进一步探索。缝合刺激5天后，CoNV活跃生长并已侵入角膜。此时，以每个角膜8×10⁸GC的剂量向小鼠基质内注射PBS、rAAV8-eGFP或rAAV8-KH902。在注射前和注射后跟踪和定量CoNV进展水平。与PBS和rAAV8-eGFP对照相比，rAAV8-KH902处理显著抑制了CoNV的进展，并且抑制作用持续到最终时间点(图19A、19B)。然而，在rAAV8-KH902处理后没有观察到已建立的角膜血管的退化(图19A、19C)。因此，数据证实了rAAV8-KH902对现有的处于活跃阶段的CoNV具有持续的治疗作用。

角膜血管新生严重影响视觉功能，并且可以是多种病因的病理性后遗症，如隐形眼镜佩戴、干眼症、外伤、化学烧伤、角膜缘干细胞缺陷、眼表炎症和角膜细菌、真菌和病毒感染。目前的治疗受到疗效和安全问题的限制。基质内注射康柏西普可以抑制角膜血管新生，但它需要重复给药并且会产生与注射相关的副作用。为了减少药物施用频率，研究了使用rAAV载体介导角膜中的KH902表达。结果表明，rAAV8-KH902在角膜中产生了稳健且持续的KH902表达，并通过单次的低剂量基质内注射成功抑制了CoNV，而没有明显的副作用，单独使用rAAV8-KH902进行治疗足以即时抑制CoNV发作时的血管生成。

CoNV的抗血管生成治疗窗口难以确定，因为不同的病例具有不同的病理性病因。血管生成的模式和适当的治疗过程在很大程度上取决于先前刺激类型的特征和潜在的病理学。例如，在单纯疱疹病毒(HSV)诱发的角膜炎中，CoNV可能早在第一天就很明显，并且可能在角膜HSV-1感染后持续长达三周。随着疾病的进展，感染、炎症和CoNV将在正反馈循环中相互触发，从而导致病程延长。在其他情况下，患有严重化学损伤的患者可能会进入可能持续六周以上的慢性期，出现严重的角膜缘干细胞缺陷和血管新生并发症。此外，数据显示单剂量的rAAV8-KH902递送提供至少三个月的治疗窗口，而直接应用康柏西普只能持续10-14天。因此，rAAV8-KH902持续赋予抗VEGF作用，显著延长了治疗窗口。这在减少慢性角膜疾病患者重复服用抗VEGF药物的需求方面起到了显著作用。

血管生成是从预先存在的血管形成新血管。它不仅依赖于内皮细胞(EC)的增殖和侵入，还需要随后的周细胞覆盖以实现血管稳定和成熟。在没有周细胞的情况下，新形成的EC不稳定并且在没有VEGF刺激的情况下容易退化，这表明未成熟的血管依赖于VEGF进行生存和生长。一项关于抗VEGF单药治疗的研究表明，成熟血管退化无法被有效诱导，这归因于这些血管对VEGF的依赖性较低(49)。同样，该研究中CoNV的成功抑制和退化失败也证明了VEGF对于维持和促进新形成的血管很重要，但不是维持成熟血管所必需的。因此，较早用rAAV8-KH902治疗CoNV会得到更好的结果。

施用途径是开发眼部疾病基因治疗时需要考虑的关键因素。正在探索用于角膜组织中rAAV基因转导的各种施用途径。外部应用是最简单的施用途径，但对于rAAV载体来说并不理想，因为它们的转导效率相对较低，并且当载体通过眼泪扩散时，非靶组织的转导可能会造成潜在的不利影响。比较结膜下和基质内注射rAAV2-eGFP和rAAV8-eGFP的角膜生物分布。证据表明，与结膜下注射相比，rAAV2或rAAV8载体的基质内递送在角膜中产生更有效和更广泛的转导。此外，基质内注射rAAV2和rAAV8具有相似的角膜细胞嗜性，主要是对角膜基质细胞，并且散布在上皮细胞中，但不是内皮细胞。与rAAV2相比，rAAV8介导的基因表达发生得更早，并且效率更高。这解释了为什么rAAV8-KH902成功抑制了CoNV，但rAAV2-KH902失败了。

角膜伤口愈合级联包括血管生成、上皮形成和各种类型的胶原蛋白的异常沉积，其导致角膜瘢痕和混浊。将rAAV-KH902或rAAV-eGFP基质内注射到健康角膜中不会引起瘢痕形成或混浊。这表明碱烧伤引起的角膜损伤是伤口愈合过程中瘢痕形成和透明度降低的原因。

总之，单次低剂量rAAV8-KH902注射到角膜基质中可在较长时间段内有效抑制CoNV。这项研究证明了针对CoNV的基于rAAV的抗VEGF基因治疗的潜在长效和相对安全性。

方法

载体生产

在鸡β-肌动蛋白/巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下，将载体与编码eGFP或KH902的转基因盒包装在一起。编码KH902的载体是用兔珠蛋白poly A设计的。载体是使用所描述的三重转染产生的。载体通过CsCl梯度超速离心纯化，并通过ddPCR和十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶的银染进行滴定。

动物

C57BL/6J小鼠获自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)，在马萨诸塞大学医学院(University of Massachusetts Medical School)的动物设施中以12小时光照/12小时黑暗循环在标准化条件下繁育和饲养。所有实验均由机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees)批准，并符合ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。

碱烧伤诱导的CoNV

碱烧伤诱导CoNV的小鼠模型如前所述(25)进行，并进行了一些修改。通过腹膜内注射氯胺酮(5mg/mL)和甲苯噻嗪(2mg/mL)组合(10mL/kg体重)麻醉小鼠，并将局部麻醉剂丙美卡因(0.5％)应用于角膜表面。将圆形滤纸盘(直径2mm)预先浸泡在1M NaOH中20秒，然后放在中央角膜上约40秒，然后用15mL无菌生理盐水充分洗涤1分钟。

缝合诱导的CoNV

对先前描述的缝合技术进行了修改以诱导CoNV(55)。简言之，小鼠右眼在全身麻醉下接受角膜缝合置换[腹腔内注射氯胺酮(5mg/mL)和甲苯噻嗪(2mg/mL)组合(10mL/kg体重)]，辅以局部麻醉(0.5％丙美卡因)。单根10-0尼龙缝合线置于基质内，在距离角膜缘1mm处的眼颞部角膜处打结。为了确保程序的一致性和可重复性，整个过程由同一位研究人员在解剖显微镜下对每只动物进行。

通过基质内或结膜下注射的rAAV载体递送

使用先前公布的方法(7)进行基质内注射。简言之，首先30号针尖在颞部缘和角膜中心之间的角膜上皮等距处切开约1.0mm大小的切口。然后，使用带有34号针头(Hamilton,Reno,NV,USA；30°斜角)的5-μL Hamilton注射器，将4μL PBS中的1.6×10¹⁰或8×10⁸GC的rAAV载体通过切口注射到角膜基质中。还通过使用5-μL Hamilton注射器进行结膜下注射。将总共1.6×10¹⁰GC的rAAV载体分别注射到上部、下部、鼻部和颞部结膜下，每个部位注射1μL(0.4×10¹⁰GC)。在注射后应用抗生素软膏。

体内荧光成像

在rAAV施用后，每周对每组动物进行观察，总共十二周。小鼠眼中的eGFP表达由Micron IV相机(Phoenix Research Labs，Pleasanton，CA)捕获。

角膜光学相干断层扫描

小鼠角膜光学相干断层扫描(OCT)使用Micron IV OCT成像系统(PhoenixResearch Labs，Pleasanton，CA)进行。如前所述，通过腹膜内注射来麻醉小鼠。将小鼠角膜朝向相机镜头放置，并对整个前房进行成像。然后通过ImageJ软件(可在imagej.nih.gov/ij/在线获取)在捕获的图像中测量角膜中央厚度(CCT)。在注射前、注射后即刻以及注射后1、2和12周测量CCT。

角膜NV的前部彩色成像和定量分析

如前所述，程序是在全身麻醉和局部滴眼液下进行的。将小鼠眼置于眼科手术显微镜(WILD HEERBRUGG)下，并通过连接在显微镜上的数码相机从不同角度对角膜进行成像。使用ImageJ软件在设定的时间点分析CoNV。使用以下公式计算CoNV的面积：面积(mm2)＝CN/12×3.1416×[R²-(R-VL)²]，其中CN是NV的时钟小时数；R为角膜半径；VL是最长的血管长度，从角膜缘脉管系统延伸(56)。以八个不同的角度对活体小鼠的每个角膜进行彩色成像，并相应地在每个角度计算四次角膜NV的面积。

角膜包埋平封片的免疫组织化学

用针在角膜缘处打一个小孔后，将眼球摘出并用4％ PFA在室温下固定1小时。然后准备切除的眼球用于包埋染色，并对之前的报告进行了修改(31)。简言之，通过沿角膜缘的切口分离角膜和巩膜，然后去除晶状体和虹膜。在角膜中进行四个径向切口以允许包埋压平。然后将组织用含0.3％ Triton X-100的PBS溶液洗涤并用封闭缓冲液(0.3％ TritonX-100/5％正常牛血清白蛋白(BSA，Cell Signaling Technology)/1X PBS封闭1小时。角膜用大鼠抗CD31(PECAM-1，1:400，sc-18916，Santa Cruz，Santa Cruz)、兔抗小鼠LYVE-1(1:200，11-034，AngioBio Co)或山羊抗小鼠Dll4(1:40，AF1389，R&D Systems)在4℃下染色过夜。然后用与Alexa fluor 488或594(Thermo Fisher Scientific，Singapore)缀合的山羊抗兔、抗大鼠或驴抗山羊二抗检测一抗。最后一次用含0.3％ Triton X-100的PBS溶液洗涤后，将角膜组织内皮面朝下固封片，并通过具有16位单色相机的Leica DM6显微镜成像。图像处理使用Adobe Photoshop CC 2019进行以改善清晰度。使用ImageJ软件检测和测量被血管和淋巴管标志物覆盖的区域。由两名独立的观察员对整个角膜进行分析，他们对治疗状态是盲的，以尽量减少抽样偏差。

角膜冷冻切片的组织学和免疫组织化学

新鲜切除的眼球直接嵌入O.C.T.(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)以准备切片。14μm厚的冷冻切片由冷冻块制成(Leica CM3050 S，Leica Biosystems Inc.，BuffaloGrove，IL)。在室温下用4％ PFA固定切片15分钟后，组织切片用含0.3％ Triton X-100的PBS冲洗并用封闭缓冲液(1X PBS/1％ BSA/0.3％ Triton^TMX-100)封闭1小时。载玻片在4℃下用一抗染色过夜。使用的一抗是：大鼠抗F4/80(1:400，NB600-404，Novus)，大鼠抗小鼠CD11b(1:50，#550282，BD Pharmingen)，兔抗波形蛋白(1:100，#5741，Cell SignalingTechnology)和与Alexa Fluor 488缀合的驴抗人IgG(H+L)(1:400，#144222，JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)，均在含有0.3％ Triton X-100和5％BSA的PBS中稀释。用于复染的含DAPI的二抗(#9542，Sigma-Aldrich)是山羊抗大鼠IgG-Alexa Fluor 594和山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 594。荧光图像由Leica DM6显微镜获取。使用AdobePhotoshop软件进行图像分析。使用ImageJ软件检测和计数CD11b+或F4/80+细胞。

KH902 mRNA表达分析

使用RNeasy Plus Micro Kit在治疗后第1周和第2周以及第1、2和3个月分离来自用rAAV2-KH902或rAAV8-KH902处理或未处理的正常小鼠角膜(4个角膜/组)的RNA，并使用QuantiTect逆转录试剂盒(均来自Qiagen,Hilden，德国)逆转录成cDNA。多重ddPCR使用QX200 ddPCR系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)进行，其带有靶向KH902的探针和参考转录物葡萄糖醛酸酶beta(GUSB)(#4448489；ThermoFisher)。用于KH902的引物和探针组由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA，USA)设计和合成(正向：5’-GGACATACACAACCAGAGAGAC-3’(SEQ ID NO:27)和反向：5’-GTGAGTGAAAGAGACACAGGAA-3(SEQID NO:28)，探针：5’-/56-FAM/CCCATTTCA/ZEN/AAGGAGAAGCAGAGCCA/3IABkfq/-3’(SEQ IDNO:29))。将KH902 mRNA拷贝数标准化为GUSB拷贝。ddPCR结果表示为KH902值与GUSB值的比率。

蛋白质印迹

在使用QIAGEN TissueLysis II匀浆后，在含有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)的RIPA裂解缓冲液中冰上提取每组混合角膜的总蛋白。将总共20μg/泳道的蛋白提取物加载到4％–12％ Bis-Tris预制凝胶(QP3510，SMOBIO)上并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。用含5％ BSA的Tris缓冲盐水和Tween-20(TBST)封闭非特异性结合。将膜与兔抗切割的Notch1(#4147，Cell signalingTechnology)、山羊抗小鼠Dll4(AF1389，R&D Systems)、兔抗pERK1/2(#4370，Cellsignaling Technology)和抗ERK1/2(#9102，Cell signaling Technology)抗体在4℃下一起孵育过夜。在膜苛刻剥离(membrane harsh strpping)后，将膜与兔抗ERK一起孵育。用TBST洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG(1:10,000，G-21234；Invitrogen)或兔抗山羊IgG(1:1000；HAF017，R&D Systems)一起孵育1.5小时。使用增强化学发光(ECL)蛋白质印迹底物(目录号W1001；Promega，Madison，WI，USA)结合Odyssey系统进行蛋白检测。使用ImageJ软件定量特定条带的强度。

统计学

结果表示为平均值±SEM。每个数据点代表3个重复值的平均值。使用单向或双向ANOVA对多个变量进行分析，并使用GraphPad Prism7.0(GraphPad Software，La Jolla，CA，USA)将Tukey的多重比较检验用于组间差异。认为p<0.05是显著的。

实施例5：质粒分析

产生了两种含有KH902转基因的质粒。质粒1包含rAAV载体，所述rAAV载体包含5'AAV ITR、CBA启动子、内含子、Kozak序列、编码KH902的转基因、兔珠蛋白polyA和3'AAVITR。rAAV载体序列从质粒1的5'-ITR运行至3'-ITR，并且如SEQ ID NO:3所示。质粒1的完整质粒序列如SEQ ID NO:30所示。

质粒2包含rAAV载体，所述rAAV载体包含5'AAV ITR、CMV启动子、内含子、Kozak序列、编码KH902的转基因、SV40 polyA和3'AAV ITR。KH902转基因的序列是密码子优化的。质粒2的完整质粒序列如SEQ ID NO:31所示。

每个质粒中有两个ITR序列，分别命名为ITR1和ITR2(例如，分别为rAAV载体的5'和3'ITR)。两种质粒中有多个SmaI位点；ITR1中有两个，ITR2中有两个。计算用SmaI消化质粒后理论DNA条带的数量和大小。当质粒完整时，可根据DNA序列确定SmaI消化的位置，经SmaI完全消化后可计算出DNA条带的数量和大小。这是完整质粒的条带概况。当消化质粒的ITR1(相当于ITR1中的SmaI位点缺失)时，计算用SmaI完全消化后缺失质粒的DNA条带的数量和大小。这是ITR1缺失质粒的条带概况。使用相同方法计算用SmaI完全酶切后的ITR2缺失质粒和ITR1+ITR2缺失质粒的条带谱。质粒1和质粒2的样品使用SmaI完全消化，并进行琼脂糖凝胶电泳。在ITR缺失的情况下，样本预计是完整质粒和缺失质粒的混合物。根据电泳DNA条带，可以估计ITR缺失的可能类型和程度。

如果质粒1是完整的，凝胶电泳图谱将显示407bp、307bp、343bp、2868bp和2817bp附近的条带。当质粒1的ITR1缺失时，一条带将出现在3171bp附近。如果ITR2缺失，一条带将出现在5696bp附近，如果ITR1和ITR2两者都缺失，一条带将出现在6050bp附近。实验结果表明，质粒1消化的凝胶电泳图谱与理论完整质粒图谱相一致，在3171、5696和6050bp附近均无条带，表明质粒1不具有ITR缺失。

如果质粒2完整，凝胶电泳全谱将显示2817bp和2834bp附近的条带。当ITR1和/或ITR2缺失时，条带将出现在5673bp处。质粒2酶切凝胶电泳结果显示有少量>5000bp的条带，而正常质粒酶切图谱未见5000bp以上的条带，说明质粒2包含ITR1和/或ITR2缺失。

实施例6：单次玻璃体内注射后紫绀蓝兔(cyanotic blue rabbit)中的蛋白表达

本实施例描述了单次玻璃体内注射后紫绀蓝兔眼组织中由不同rAAV载体表达的KH902蛋白的分布。使用rAAV 7m8-CBA-KH902，其含有由CMV增强子驱动的KH902转基因和由AAV7m8衣壳蛋白包封的鸡β-肌动蛋白启动子调节盒(例如实施例5中描述的质粒1)。rAAV7m8-CMV-KH902，其包含分离的核酸，所述分离的核酸包含CMV启动子、内含子、Kozak序列、编码KH902的密码子优化的转基因、WPRE、SV40 polyA、3'AAV ITR，并由AAV7m8衣壳蛋白包封，用于比较。用于产生rAAV7m8-CMV-902的质粒如SEQ ID NO:32所示。

向紫绀蓝兔左右眼玻璃体腔注射rAAV 7m8-CBA-KH902或rAAV 7m8-CMV-KH902(2E¹¹ vg/50μl)后，在规定时间(第2周和第4周)处死动物。然后取出眼球和视神经，解剖眼球，分离视网膜-脉络膜和玻璃体，并且在匀浆后测定康柏西普蛋白(例如，KH902蛋白)的表达。

数据表明，与rAAV 7m8-CMV-KH902相比，rAAV 7m8-CBA-KH902在视网膜脉络丛和玻璃体中具有更高且更稳定的表达(表1)。

表1

实施例7：食蟹猴(cynomolgus monkey)中经视网膜下递送的房水的表达

rAAV8-CBA-KH902包含由CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子调节盒驱动的KH902转基因(例如，实施例5中描述的质粒1)，用于该研究。

以1E¹² vg/100μL/眼的剂量，将rAAV8-CBA-KH902视网膜下注射到食蟹猴眼的颞侧中，正好在上血管弓下方。施用后第3、7、21、28天，取前房房水，约50μL/眼。通过ELISA检测房水中目标蛋白的浓度，结果如表2所示。观察到注射后28天内房水中康柏西普蛋白(例如，KH902蛋白)浓度逐渐增加。

表2

实施例8：在恒河猴(Rhesus monkey)中通过视网膜下递送的载体功效

非人灵长类动物(NHP)具有与人类相似的黄斑结构。激光光凝术诱导的NHP脉络膜血管新生模型是nAMD的一种模型(Wang Q等人British Journal of Ophthalmology,2015,99(1):119-24.)。本研究使用实施例7中描述的rAAV8-CBA-KH902。选取具有健康眼的恒河猴，在扩瞳、麻醉后使其仰卧于手术台上。眼周皮肤用聚维酮碘消毒，结膜囊用聚维酮碘粘膜消毒液洗涤。使用WPI微注射针(36G)通过造口穿入玻璃体腔，并将视网膜镜置于角膜上。以100μL/眼的体积在后极的上血管弓附近进行注射。施用日记录为第1天。剂量和分组显示在下表3中。

表3

在第15天，将恒河猴扩瞳并麻醉，在眼表面应用卡波姆滴眼液，并使用眼底激光镜片。待眼底清晰可见后，选择距离黄斑中心小凹约1.5～2PD的位置进行光凝术，避开血管。激光参数设置如下：波长532nm，功率450-550MW，光斑直径50μm，曝光时间100ms。在阳性对照组中，激光光凝术后立即玻璃体内注射50μL康柏西普眼用注射液(0.5mg/眼)。

对于检测和检查指标，使用增强深度成像光学相干断层扫描(EDI-OCT)在施用前、施用后即刻、第15天(建模前和后)、第29天、第43天和第57天对第1-4组中动物的眼进行检查。使用OCT在施用前、第15天(建模后)、第29天、第43天和第57天对第5组中动物的眼进行检查。激光前检查区域应覆盖后极、施用区域和所有激光光凝点。

使用仪器提供的软件测量OCT图像中对应于荧光渗漏引起的4级病变的超反射材料(SHRM)厚度，并计算每只眼的平均SHRM厚度。

使用眼底照相和荧光血管造影(FP和FFA)在施用前、施用后即刻(仅FP)、第15天(仅FP，建模前和后)、第29天、第43天和第57天对第1-4组中动物的眼进行检查。使用FA和FFA在第15天(仅FP，建模后)、第29天、第43天和第57天对第5组中动物的眼进行检查。在眼底荧光素血管造影前，向动物静脉内注射荧光素钠注射液(10mg/kg，100mg/mL)。

比较眼底荧光血管造影的早期和晚期图像，并根据动物眼底有无荧光渗漏来确定脉络膜血管新生和渗漏情况。对荧光渗漏程度进行评级，并计算4级病变的数目和概率。评级标准如下所示：

1级：病变中未出现高荧光；

2级：病变有高荧光但无荧光渗漏；

3级：高荧光病变，有轻微荧光渗漏，渗漏不超过病变边缘；

4级：高荧光病变，有轻微荧光渗漏，渗漏超过斑点边缘。

应测量4级病变的渗漏面积(注意：如果光凝点在药物施用后的一个检查时间点被评为4级病变，则应在所有检查时间点测量该病变的荧光渗漏面积。如果没有荧光泄漏，则不需要测量)。

施用后第29天(即建模后第14天)的4级病变比例和4级病变渗漏面积分别示于图22A和图22B。可以看出，与阴性组相比，高、中、低剂量组的4级病变比例和4级病变渗漏面积均显著下降。

另外，从图22C中FFA也可以观察到施用后第29天光斑的消退。该图是每个实验组的代表性FFA图。从图22C可以看出，高、中、低剂量药物组的4级病变与阴性组相比显著减退。

等同方案

尽管本文已经描述和说明了本发明的若干实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或本文描述的一个或多个优点的各种其他装置和/或结构，并且，这些变化和/或修改中的每一个均被认为是在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教导使用的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。因此，应当理解，前述实施方案仅作为示例呈现，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围内。

除非明确相反指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个(种)”应理解为表示“至少一个(种)”。

如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示由如此结合的要素中的“一个或两个”，即在一些情况下要素共同存在，以及在其他情况下分开存在。除了“和/或”从句所具体标识的要素之外，可以任选存在其他要素，而不论与具体标识的那些要素相关还是不相关，除非明确相反指出。因此，作为一个非限制性实例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可以是指A且无B(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，是指B且无A(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，是指A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。

如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选的其他未列出的项。只有明确相反地指出的术语，例如“仅一个”或“唯一一个”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”将指的是包含许多要素或要素列表中的唯一一个要素。一般而言，在排他性术语之前，如“任一”、“之一”、“仅一个”或“唯一一个”，本文所用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，而不是两个”)。“基本上由……组成”在用于权利要求时，应具有其在专利法领域中使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个要素的列表，短语“至少一个”应理解为表示从要素列表中任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许任选地存在短语“至少一个”所指要素列表内所具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地“A或B中的至少一个”；或等同地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以是指至少一个，任选地包括多于一个A但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个B但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个A，以及至少一个，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。

在权利要求书中以及在上述说明书中，所有过渡短语，如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等应理解为开放式的，即表示包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所述。

在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一权利要求要素的任何优先权、优先级或顺序或方法的动作执行的时间顺序，而是仅用作标签以将具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称(但用于顺序术语)的另一个要素区分开来以区分权利要求要素。

序列表

<110> 马萨诸塞大学（University of Massachusetts）

<120> 用于递送KH902（康柏西普）的腺相关病毒及其用途

<130> U0120.70148WO00

<140> 尚未指定

<141> 同上

<150> US 63/179,700

<151> 2021-04-26

<150> US 63/074,361

<151> 2020-09-03

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 1

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatcta gttccggagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt 120

atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc 180

actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc 240

tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 300

acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa actatctcac acatcgacaa 360

accaatacaa tcatagatgt ggttctgagt ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga 420

gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga actgaactaa atgtggggat tgacttcaac 480

tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaacc 540

cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg 600

agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc 660

acatttgtca gggtccatga aaaacctttt gttgcttttg gaagtggcat ggaatctctg 720

gtggaagcca cggtggggga gcgtgtcaga atccctgcga agtaccttgg ttacccaccc 780

ccagaaataa aatggtataa aaatggaata ccccttgagt ccaatcacac aattaaagcg 840

gggcatgtac tgacgattat ggaagtgagt gaaagagaca caggaaatta cactgtcatc 900

cttaccaatc ccatttcaaa ggagaagcag agccatgtgg tctctctggt tgtgtatgtc 960

ccaccgggcc cgggcgacaa aactcacaca tgcccactgt gcccagcacc tgaactcctg 1020

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1080

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1140

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1200

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1260

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1320

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1380

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctag tcaaaggctt ctatcccagc 1440

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa ggccacgcct 1500

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1560

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1620

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1659

<210> 2

<211> 4011

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 2

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180

atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600

gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660

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ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780

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gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg 1080

gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc 1140

gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt 1200

gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg 1260

aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg 1320

gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg 1380

ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg 1440

caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg 1500

cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt 1560

ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg 1620

aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc 1680

ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc 1740

cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg 1800

gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat 1860

gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat 1920

tttggcaaag aattcgccac catggtcagc tactgggaca ccggggtcct gctgtgcgcg 1980

ctgctcagct gtctgcttct cacaggatct agttccggag gtagaccttt cgtagagatg 2040

tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc 2100

cgggttacgt cacctaacat cactgttact ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc 2160

cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg 2220

tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa gcaacagtca atgggcattt gtataagaca 2280

aactatctca cacatcgaca aaccaataca atcatagatg tggttctgag tccgtctcat 2340

ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta 2400

aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac ccttcttcga agcatcagca taagaaactt 2460

gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg agtgagatga agaaattttt gagcacctta 2520

actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg 2580

ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc agggtccatg aaaaaccttt tgttgctttt 2640

ggaagtggca tggaatctct ggtggaagcc acggtggggg agcgtgtcag aatccctgcg 2700

aagtaccttg gttacccacc cccagaaata aaatggtata aaaatggaat accccttgag 2760

tccaatcaca caattaaagc ggggcatgta ctgacgatta tggaagtgag tgaaagagac 2820

acaggaaatt acactgtcat ccttaccaat cccatttcaa aggagaagca gagccatgtg 2880

gtctctctgg ttgtgtatgt cccaccgggc ccgggcgaca aaactcacac atgcccactg 2940

tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 3000

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 3060

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 3120

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 3180

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 3240

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 3300

tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgccta 3360

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 3420

aacaactaca aggccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 3480

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 3540

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 3600

acgcgtggta cctctagagt cgacccgggc ggcctcgagg acggggtgaa ctacgcctga 3660

ggatccgatc tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat 3720

ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg 3780

tgtctctcac tcggaagcaa ttcgttgatc tgaatttcga ccacccataa tacccattac 3840

cctggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga 3900

gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 3960

ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca g 4011

<210> 3

<211> 6052

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 3

gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 60

aaagcgaagc gcgcggcggg cggggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc 120

tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg 180

agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt 240

gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg 300

gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc 360

gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt 420

gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg 480

aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg 540

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ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg 660

caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg 720

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ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg 840

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gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat 1140

tttggcaaag aattcgccac catggtcagc tactgggaca ccggggtcct gctgtgcgcg 1200

ctgctcagct gtctgcttct cacaggatct agttccggag gtagaccttt cgtagagatg 1260

tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc 1320

cgggttacgt cacctaacat cactgttact ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc 1380

cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg 1440

tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa gcaacagtca atgggcattt gtataagaca 1500

aactatctca cacatcgaca aaccaataca atcatagatg tggttctgag tccgtctcat 1560

ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta 1620

aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac ccttcttcga agcatcagca taagaaactt 1680

gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg agtgagatga agaaattttt gagcacctta 1740

actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg 1800

ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc agggtccatg aaaaaccttt tgttgctttt 1860

ggaagtggca tggaatctct ggtggaagcc acggtggggg agcgtgtcag aatccctgcg 1920

aagtaccttg gttacccacc cccagaaata aaatggtata aaaatggaat accccttgag 1980

tccaatcaca caattaaagc ggggcatgta ctgacgatta tggaagtgag tgaaagagac 2040

acaggaaatt acactgtcat ccttaccaat cccatttcaa aggagaagca gagccatgtg 2100

gtctctctgg ttgtgtatgt cccaccgggc ccgggcgaca aaactcacac atgcccactg 2160

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ggatccgatc tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat 2940

ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg 3000

tgtctctcac tcggaagcaa ttcgttgatc tgaatttcga ccacccataa tacccattac 3060

cctggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga 3120

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ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gccttaatta 3240

acctaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 3300

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cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 3480

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tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 3600

cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 3660

gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 3720

aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 3780

gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 3840

caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 3900

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 3960

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 4020

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 4080

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 4140

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tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 4260

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catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 4380

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 4440

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gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 4680

gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 4740

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 4800

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 4860

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 4920

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tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 5520

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 5580

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5640

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gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 5820

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 5880

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 5940

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 6000

ggaaacagct atgaccatga ttacgccaga tttaattaag gccttaatta gg 6052

<210> 4

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 4

gccrcc 6

<210> 5

<211> 552

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu

20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu

85 90 95

Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys

100 105 110

Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val

115 120 125

Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val

130 135 140

Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn

145 150 155 160

Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg

165 170 175

Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr

180 185 190

Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys

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Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg

210 215 220

Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu

225 230 235 240

Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu

245 250 255

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260 265 270

Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu

275 280 285

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Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val

305 310 315 320

Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala

325 330 335

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

340 345 350

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

355 360 365

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

370 375 380

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

385 390 395 400

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

405 410 415

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

420 425 430

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

435 440 445

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450 455 460

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

465 470 475 480

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

485 490 495

Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

500 505 510

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

515 520 525

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

530 535 540

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550

<210> 6

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu

20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu

85 90 95

Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys

100 105 110

Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val

115 120 125

<210> 7

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu

1 5 10 15

Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe

20 25 30

Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn

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Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser

50 55 60

Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val

85 90 95

Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser

100 105 110

Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr

115 120 125

Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro

130 135 140

Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met

145 150 155 160

Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn

165 170 175

Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr

180 185 190

Val Pro Pro

195

<210> 8

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu

20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu

85 90 95

Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys

100 105 110

Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val

115 120 125

Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val

130 135 140

Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn

145 150 155 160

Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg

165 170 175

Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr

180 185 190

Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys

195 200 205

Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg

210 215 220

Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu

225 230 235 240

Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu

245 250 255

Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu

260 265 270

Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu

275 280 285

Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro

290 295 300

Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val

305 310 315 320

Pro Pro

<210> 9

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu

20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

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Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu

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Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

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Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu

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Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys

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Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gly

115 120 125

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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

165 170 175

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

180 185 190

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

195 200 205

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

210 215 220

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

225 230 235 240

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

245 250 255

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

260 265 270

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

275 280 285

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr

290 295 300

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

305 310 315 320

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

325 330 335

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

340 345 350

Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 10

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu

1 5 10 15

Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe

20 25 30

Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn

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Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser

50 55 60

Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val

85 90 95

Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser

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Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr

115 120 125

Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro

130 135 140

Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met

145 150 155 160

Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn

165 170 175

Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr

180 185 190

Val Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro

195 200 205

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

210 215 220

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

225 230 235 240

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

245 250 255

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

260 265 270

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

275 280 285

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

290 295 300

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

305 310 315 320

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

325 330 335

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

355 360 365

Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

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465 470 475 480

Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Gln Ala Asn Asp Asn Asn

485 490 495

Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly

500 505 510

Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp

515 520 525

Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Thr Leu Ile Phe Gly Lys

530 535 540

Gln Gly Thr Asn Ala Asn Asp Ala Asp Leu Glu His Val Met Ile Thr

545 550 555 560

Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr

565 570 575

Gly Asn Val Ser Asn Asn Leu Gln Asn Ser Asn Thr Gly Pro Thr Thr

580 585 590

Glu Asn Val Asn His Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp

595 600 605

Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr

610 615 620

Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys

625 630 635 640

His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn

645 650 655

Pro Pro Thr Asn Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln

660 665 670

Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr

690 695 700

Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Ala Asn Gly Val Tyr

705 710 715 720

Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 27

ggacatacac aaccagagag ac 22

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 28

gtgagtgaaa gagacacagg aa 22

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 可以由ZEN修饰

<400> 29

cccatttcaa aggagaagca gagcca 26

<210> 30

<211> 6764

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 30

ggtacctcta gagtcgaccc gggcggcctc gaggacgggg tgaactacgc ctgaggatcc 60

gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 120

tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 180

tcactcggaa gcaattcgtt gatctgaatt tcgaccaccc ataataccca ttaccctggt 240

agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc 300

cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg 360

cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagcctta attaacctaa 420

ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 480

tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 540

tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 600

attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 660

agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 720

tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 780

ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 840

ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 900

aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 960

ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 1020

attaacgctt acaatttagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 1080

ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 1140

cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 1200

ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 1260

tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 1320

gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 1380

acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 1440

ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 1500

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 1560

ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 1620

cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 1680

gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 1740

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 1800

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 1860

cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 1920

cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gactgtcaga ccaagtttac 1980

tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 2040

atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 2100

tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 2160

tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 2220

ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt 2280

cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 2340

ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 2400

gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 2460

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 2520

gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 2580

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 2640

tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 2700

ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 2760

tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 2820

attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 2880

tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg 2940

ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc 3000

aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt 3060

ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat 3120

gaccatgatt acgccagatt taattaaggc cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac 3180

tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag 3240

cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct tgtagttaat 3300

gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg atcctctaga actatagcta 3360

gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 3420

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 3480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 3540

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 3600

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 3660

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 3720

tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 3780

tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 3840

cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 3900

ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 3960

ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 4020

cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 4080

cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 4140

ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 4200

aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 4260

gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 4320

gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 4380

ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 4440

tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 4500

acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 4560

gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 4620

cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 4680

gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 4740

cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 4800

ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 4860

agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 4920

cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 4980

tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 5040

tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttcgccacca 5100

tggtcagcta ctgggacacc ggggtcctgc tgtgcgcgct gctcagctgt ctgcttctca 5160

caggatctag ttccggaggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaatc cccgaaatta 5220

tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca cctaacatca 5280

ctgttacttt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa cgcataatct 5340

gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata gggcttctga 5400

cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca catcgacaaa 5460

ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta tctgttggag 5520

aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt gacttcaact 5580

gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac ctaaaaaccc 5640

agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt gtaacccgga 5700

gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag aagaacagca 5760

catttgtcag ggtccatgaa aaaccttttg ttgcttttgg aagtggcatg gaatctctgg 5820

tggaagccac ggtgggggag cgtgtcagaa tccctgcgaa gtaccttggt tacccacccc 5880

cagaaataaa atggtataaa aatggaatac cccttgagtc caatcacaca attaaagcgg 5940

ggcatgtact gacgattatg gaagtgagtg aaagagacac aggaaattac actgtcatcc 6000

ttaccaatcc catttcaaag gagaagcaga gccatgtggt ctctctggtt gtgtatgtcc 6060

caccgggccc gggcgacaaa actcacacat gcccactgtg cccagcacct gaactcctgg 6120

ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga 6180

cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca 6240

actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt 6300

acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg 6360

gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca 6420

tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg 6480

atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctagt caaaggcttc tatcccagcg 6540

acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag gccacgcctc 6600

ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca 6660

ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact 6720

acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgaac gcgt 6764

<210> 31

<211> 5673

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 31

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60

aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120

ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180

gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg tactcgagga agcaattcgt 240

tgatctgaat ttcgaccacc cataataccc attaccctgg tagataagta gcatggcggg 300

ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 360

cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 420

gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagcctt aattaaccta attcactggc cgtcgtttta 480

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 540

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 600

cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg 660

gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct 720

ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg 780

ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag 840

ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg 900

gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc 960

tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat 1020

gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag 1080

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 1140

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 1200

ggaagagtat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 1260

ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 1320

ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga 1380

atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg 1440

cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc 1500

cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 1560

atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 1620

aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 1680

tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca 1740

tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 1800

tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 1860

atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 1920

accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 1980

gccttcttga cgagttcttc tgactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 2040

atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 2100

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 2160

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 2220

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 2280

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 2340

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 2400

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 2460

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 2520

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 2580

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 2640

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 2700

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 2760

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 2820

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 2880

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 2940

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 3000

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 3060

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 3120

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccagat 3180

ttaattaagg ccttaattag gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag 3240

cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag 3300

ggagtggcca actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac 3360

ttatctacca gggtaatggg gatccggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 3420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 3480

tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 3540

cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 3600

acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 3660

ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 3720

ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 3780

tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 3840

ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 3900

ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata 3960

gaagacaccg actctactag aggatctatt tccggtgaat tcgccaccat ggtgagctac 4020

tgggacaccg gcgtgctgct gtgcgccctg ctgagctgcc tgctgctgac cggcagcagc 4080

agcggcggca gacctttcgt ggagatgtac tccgagatcc ccgagatcat ccacatgacc 4140

gagggcaggg agctcgtgat cccctgcaga gtgaccagcc ccaacatcac cgtgaccctg 4200

aagaagttcc ccctggacac cctgatcccc gacggcaaga gaatcatctg ggacagcaga 4260

aagggcttca tcatctccaa cgccacctac aaggagatcg gcctgctgac ctgcgaggcc 4320

accgtgaacg gccacctgta caagaccaat tacctgaccc acaggcagac caataccatc 4380

atcgacgtgg tgctgtcccc cagccacggc atcgagctga gcgtgggcga gaagctggtg 4440

ctgaactgca ccgccaggac cgagctgaac gtggggatcg attttaactg ggagtacccc 4500

agcagcaagc accagcacaa gaagctggtg aatagggacc tgaaaaccca gagcggaagc 4560

gagatgaaga agtttctgag caccctgacc atcgacggcg tgacccggag cgaccagggc 4620

ctgtacacct gcgccgcctc cagcggcctg atgactaaga agaacagcac ctttgtgcgg 4680

gtgcacgaga agcccttcgt ggccttcggc agcgggatgg agtctctggt ggaggctacc 4740

gtgggcgaga gagtgagaat ccccgccaag tacctgggct acccccctcc tgagatcaag 4800

tggtataaga acggcatccc tctggagtcc aaccacacca tcaaggcagg ccacgtgctg 4860

accatcatgg aagtgagcga gagggacacc ggcaactaca ccgtgatcct gaccaacccc 4920

atctccaagg agaagcagag ccacgtggtg agcctggtgg tgtacgtgcc tccagggcct 4980

ggcgataaga cccacacatg ccccctgtgc cccgcccccg agctgctggg cggaccaagc 5040

gtgttcctgt tcccacccaa gcctaaggac accctgatga tcagccggac ccccgaggtg 5100

acctgcgtgg tggtggatgt gagccacgag gatccagagg tgaagtttaa ctggtatgtg 5160

gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 5220

tacagagtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 5280

aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccc gcccctatcg agaaaaccat cagcaaggcc 5340

aagggccagc cccgcgagcc ccaggtgtac acactgcccc ctagccgcga cgagctgacc 5400

aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 5460

gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaagg ccaccccccc tgtgctggac 5520

tccgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagtcccg ctggcagcag 5580

ggcaacgtgt tcagctgtag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 5640

tccctgagcc tgagccccgg caagtgaacg cgt 5673

<210> 32

<211> 6318

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的

<400> 32

aattcgatat caagcttatc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 60

ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 120

tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 180

tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 240

tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 300

ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 360

gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat 420

catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 480

tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 540

ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 600

ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgacccg ggcggccgct tcgagcagac atgataagat 660

acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 720

aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca 780

acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga gatgtgggag gttttttaaa 840

gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtactc gaggaagcaa ttcgttgatc tgaatttcga 900

ccacccataa tacccattac cctggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 960

aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 1020

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 1080

cgagcgcgca gccttaatta acctaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 1140

gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 1200

cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 1260

gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 1320

gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 1380

ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 1440

cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 1500

agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 1560

aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 1620

gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 1680

aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg 1740

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 1800

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgattg 1860

aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 1920

actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 1980

ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg 2040

aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 2100

ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 2160

tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 2220

tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 2280

gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 2340

aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg 2400

atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 2460

tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 2520

tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 2580

tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 2640

tcttctgact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 2700

tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 2760

aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 2820

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 2880

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 2940

gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 3000

agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 3060

ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 3120

cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 3180

acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 3240

gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 3300

ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 3360

agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 3420

cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 3480

tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 3540

gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac 3600

gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc 3660

ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg 3720

caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat 3780

aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc cagatttaat taaggcctta 3840

attaggctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 3900

acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc 3960

atcactaggg gttccttgta gttaatgatt aacccgccat gctacttatc taccagggta 4020

atggggatcc ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 4080

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 4140

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 4200

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 4260

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 4320

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 4380

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 4440

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 4500

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 4560

gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgactct 4620

actagaggat ctatttccgg tgaattcgcc accatggtga gctactggga caccggcgtg 4680

ctgctgtgcg ccctgctgag ctgcctgctg ctgaccggca gcagcagcgg cggcagacct 4740

ttcgtggaga tgtactccga gatccccgag atcatccaca tgaccgaggg cagggagctc 4800

gtgatcccct gcagagtgac cagccccaac atcaccgtga ccctgaagaa gttccccctg 4860

gacaccctga tccccgacgg caagagaatc atctgggaca gcagaaaggg cttcatcatc 4920

tccaacgcca cctacaagga gatcggcctg ctgacctgcg aggccaccgt gaacggccac 4980

ctgtacaaga ccaattacct gacccacagg cagaccaata ccatcatcga cgtggtgctg 5040

tcccccagcc acggcatcga gctgagcgtg ggcgagaagc tggtgctgaa ctgcaccgcc 5100

aggaccgagc tgaacgtggg gatcgatttt aactgggagt accccagcag caagcaccag 5160

cacaagaagc tggtgaatag ggacctgaaa acccagagcg gaagcgagat gaagaagttt 5220

ctgagcaccc tgaccatcga cggcgtgacc cggagcgacc agggcctgta cacctgcgcc 5280

gcctccagcg gcctgatgac taagaagaac agcacctttg tgcgggtgca cgagaagccc 5340

ttcgtggcct tcggcagcgg gatggagtct ctggtggagg ctaccgtggg cgagagagtg 5400

agaatccccg ccaagtacct gggctacccc cctcctgaga tcaagtggta taagaacggc 5460

atccctctgg agtccaacca caccatcaag gcaggccacg tgctgaccat catggaagtg 5520

agcgagaggg acaccggcaa ctacaccgtg atcctgacca accccatctc caaggagaag 5580

cagagccacg tggtgagcct ggtggtgtac gtgcctccag ggcctggcga taagacccac 5640

acatgccccc tgtgccccgc ccccgagctg ctgggcggac caagcgtgtt cctgttccca 5700

cccaagccta aggacaccct gatgatcagc cggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 5760

gatgtgagcc acgaggatcc agaggtgaag tttaactggt atgtggacgg cgtggaggtg 5820

cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag cagtacaaca gcacctacag agtggtgagc 5880

gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 5940

aacaaggccc tgcccgcccc tatcgagaaa accatcagca aggccaaggg ccagccccgc 6000

gagccccagg tgtacacact gccccctagc cgcgacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc 6060

ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 6120

ggccagcccg agaacaacta caaggccacc ccccctgtgc tggactccga cggcagcttc 6180

ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag tcccgctggc agcagggcaa cgtgttcagc 6240

tgtagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gagcctgagc 6300

cccggcaagt gaacgcgt 6318

Claims (69)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：

(i)AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白是AAV2衣壳蛋白、AAV2/3杂合衣壳蛋白、AAV8衣壳蛋白，或其变体；和

(ii)分离的核酸，其包含编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因，所述转基因侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。

2.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂是人VEGF诱饵受体。

3.根据权利要求2所述的rAAV，其中所述人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域2。

4.根据权利要求2所述的rAAV，其中所述人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的rAAV，其中所述VEGF诱饵受体能够结合抗血管内皮生长因子(VEGF)和/或胎盘生长因子(PlGF)。

6.根据权利要求1或2所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂是人VEGF受体融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。

8.根据权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。

9.根据权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白Fc部分融合的人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。

10.根据权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合、并进一步与免疫球蛋白Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。

11.根据权利要求10所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂是KH902。

12.根据权利要求10或11所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其部分至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。

13.根据权利要求10至12所述的rAAV，其中所述转基因包含与SEQ ID NO:1或其密码子优化变体的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的核酸。

14.根据权利要求6至13中任一项所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂能够结合抗血管内皮生长因子(VEGF)和/或胎盘生长因子(PlGF)。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的rAAV，其中所述分离的核酸进一步包含有效连接至所述转基因的启动子。

16.根据权利要求15所述的rAAV，其中所述启动子包含巨细胞病毒(CMV)早期增强子。

17.根据权利要求16所述的rAAV，其中所述启动子包含嵌合的巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的rAAV，其中所述转基因包含一个或多个内含子。

19.根据权利要求18所述的rAAV，其中至少一个内含子位于所述启动子和编码所述抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的核酸序列之间。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的rAAV，其中所述转基因包含Kozak序列。

21.根据权利要求20所述的rAAV，其中所述Kozak序列位于所述内含子和编码所述抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因之间。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的rAAV，其中所述转基因进一步包含3’非翻译区(3’UTR)。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的rAAV，其中所述转基因进一步包含一个或多个miRNA结合位点。

24.根据权利要求23所述的rAAV，其中所述一个或多个miRNA结合位点位于所述转基因的3’UTR中。

25.根据权利要求23或24所述的rAAV，其中至少一个miRNA结合位点是免疫细胞相关miRNA结合位点。

26.根据权利要求25所述的rAAV，其中所述免疫细胞相关miRNA选自：miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-21、miR-29a/b/c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a/b、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223和miR-424、miR-221、miR-222、let-7i、miR-148和miR-152。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的rAAV，其中所述ITR是选自AAV1 ITR、AAV2ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR和AAV6 ITR的血清型的腺相关病毒ITR。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的rAAV，其中所述分离的核酸包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少80％、90％、99％或100％同一的核酸序列。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白包含与v224衣壳蛋白、v326衣壳蛋白、v358衣壳蛋白、v46衣壳蛋白、v56衣壳蛋白、v66衣壳蛋白、v67衣壳蛋白、v81衣壳蛋白、v439衣壳蛋白、v453衣壳蛋白、v513衣壳蛋白、v551衣壳蛋白、v556衣壳蛋白、v562衣壳蛋白或v598衣壳蛋白的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。

30.根据权利要求29所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白包含与v224衣壳蛋白、v326衣壳蛋白或v56衣壳蛋白的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白对眼组织具有嗜性。

32.根据权利要求35所述的rAAV，其中所述眼组织包括眼神经元、视网膜、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜、结膜睫状体或视神经。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV是单链AAV(ssAAV)或自互补AAV(scAAV)。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的rAAV，其中衣壳蛋白变体与其衍生自的野生型衣壳蛋白相比能够提高rAAV包装效率。

35.根据权利要求34所述的rAAV，其中AAV2衣壳蛋白变体与野生型衣壳蛋白相比能够将rAAV包装效率提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。

36.根据权利要求34所述的rAAV，其中AAV2/3杂合衣壳蛋白变体与野生型AAV3b衣壳蛋白相比能够将rAAV包装效率提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。

37.一种重组腺相关病毒，其包含：

(i)rAAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白是AAV8衣壳蛋白、AAV2衣壳蛋白和/或AAV2/3杂合衣壳蛋白或其变体的变体；和

(ii)重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含核酸，所述核酸以5’至3’的顺序包含：

(a)5’AAV ITR；

(b)CMV增强子；

(c)CBA启动子；

(d)鸡β-肌动蛋白内含子；

(d)Kozak序列；

(e)编码抗VEGF剂的转基因，其中所述抗VEGF剂由SEQ ID NO:1中的核酸序列编码；

(f)兔β-珠蛋白polyA信号尾；和

(g)3’AAV ITR。

38.一种宿主细胞，其包含权利要求1至37中任一项所述的rAAV。

39.根据权利要求38所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。

40.一种药物组合物，其包含权利要求1至37中任一项所述的rAAV。

41.根据权利要求40所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。

42.根据权利要求40或41所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为用于玻璃体内注射、静脉内注射、瘤内注射、基质内注射或肌内注射。

43.一种在有此需要的受试者中抑制VEGF或PlGF活性的方法，所述方法包括

向所述受试者施用有效量的权利要求1至37中任一项所述的rAAV或权利要求40至42中任一项所述的药物组合物。

44.一种在有此需要的受试者中递送抗VEGF剂的方法，所述方法包括

向所述受试者施用有效量的权利要求1至37中任一项所述的rAAV或权利要求40至42中任一项所述的药物组合物。

45.一种在有此需要的受试者中治疗血管新生相关疾病、血管生成相关疾病或VEGF相关疾病的方法，所述方法包括

向所述受试者施用有效量的权利要求1至37中任一项所述的rAAV或权利要求40至42中任一项所述的药物组合物。

46.根据权利要求1至37中任一项所述的rAAV，或根据权利要求40至42中任一项所述的药物组合物，用于在有此需要的受试者中抑制VEGF活性。

47.根据权利要求1至37中任一项所述的rAAV，或根据权利要求40至42中任一项所述的药物组合物，用于在有此需要的受试者中递送抗VEGF剂。

48.根据权利要求1至37中任一项所述的rAAV，或根据权利要求40至42中任一项所述的药物组合物，用于在有此需要的受试者中治疗血管新生相关疾病、血管生成相关疾病或VEGF相关疾病。

49.根据权利要求43至48所述的方法或用途，其中所述抗VEGF剂的递送导致至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的VEGF活性抑制。

50.根据权利要求43至49中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者是非人类哺乳动物。

51.根据权利要求50所述的方法或用途，其中所述非人类哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物。

52.根据权利要求43至49中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者是人。

53.根据权利要求52所述的方法或用途，其中所述受试者被诊断为或被怀疑患有血管生成相关疾病或VEGF相关疾病。

54.根据权利要求53所述的方法或用途，其中所述VEGF相关疾病是肿瘤、癌症、视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)、黄斑水肿、脉络膜血管新生或角膜血管新生。

55.根据权利要求43至54中任一项所述的方法或用途，其中所述施用是全身施用，任选地，其中所述施用是静脉内注射。

56.根据权利要求43至55中任一项所述的方法或用途，其中所述施用是直接施用至眼组织，任选地，其中所述直接施用是玻璃体内注射、眼内注射、基质内注射或局部施用。

57.根据权利要求43至56中任一项所述的方法或用途，其中所述施用导致所述转基因被递送至眼组织。

58.根据权利要求57所述的方法或用途，所述眼组织包括眼神经元、视网膜、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜、结膜睫状体或视神经。

59.根据权利要求43至58中任一项所述的方法或用途，其中所述施用导致所述受试者中的VEGF在施用后被抑制至少5天、10天、15天、20天、1个月、两个月或更长时间。

60.一种在有此需要的受试者中治疗角膜血管新生(CoNV)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至37中任一项所述的rAAV或权利要求40至42中任一项所述的药物组合物。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述rAAV包含AAV8衣壳蛋白。

62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述施用导致抗VEGF剂在角膜细胞中的递送。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述施用导致抗VEGF剂在角膜的角膜基质细胞中的递送。

64.根据权利要求60至63中任一项所述的方法，其中所述rAAV被施用一次。

65.根据权利要求60至64中任一项所述的方法，其中所述施用导致抗VEGF剂在角膜细胞中的表达长于三个月、六个月、一年或更长时间。

66.根据权利要求35所述的方法，其中所述施用导致所述受试者中的VEGF在施用后被抑制1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长时间。

67.根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述施用是基质内注射。

68.根据权利要求60至67中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

69.根据权利要求60至68中任一项所述的方法，其中所述角膜血管新生是急性角膜血管新生或慢性角膜血管新生。