KR20190096329A

KR20190096329A - 녹내장에서 신경보호 요법으로서 sfasl의 aav2-매개된 유전자 전달

Info

Publication number: KR20190096329A
Application number: KR1020197003089A
Authority: KR
Inventors: 안 마샥-로스스타인; 메레디스 그레고리-크샌더; 브루스 크샌더
Original assignee: 유니버시티 오브 매사추세츠; 매사추세츠 아이 앤드 이어 인퍼머리
Priority date: 2016-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2019-08-19
Also published as: CA3029864A1; US20190240353A1; JP2022084594A; MX2019000221A; JP2019520405A; CN110177577A; JP7493334B2; WO2018009553A1; EP3481433A1; EP3481433A4

Abstract

대상체에게 가용성 Fas 리간드 (sFasL) 또는 그의 단편을 rAAV-매개에 의해 전달할 수 있는, sFasL 또는 그의 단편을 이용하여 대상체에서 녹내장 및/또는 Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법.

Description

녹내장에서 신경보호 요법으로서 SFASL의 AAV2-매개된 유전자 전달

정부 지원

본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 GM058724, CA090691 및 EY021543 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정한 권리를 갖는다.

관련 출원

본 출원은 35 U.S.C. 119(e)하에 2017년 5월 26일에 출원되고 "녹내장에서 신경보호 요법으로서 SFASL의 AAV2-매개된 유전자 전달"을 발명의 명칭으로 하는 미국 가출원 일련 번호 62/511,629, 및 2016년 7월 5일에 출원되고 "녹내장에서 신경보호 요법으로서 SFASL의 AAV2-매개된 유전자 전달"을 발명의 명칭으로 하는 미국 가출원 일련 번호 62/358,541을 우선권으로 주장하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.

전세계적으로 실명의 주요 원인인 녹내장은 망막 신경절 세포 (RGC)의 진행성 손실을 특징으로 하는 복잡한 다원적 질환이다. 상승된 안내압 (IOP)은 녹내장의 발생에 대해 널리 인식되는 위험 요인이며, 유일한 변경가능한 질환-관련 변수로 남아있다. 그러나, IOP를 감소시키는 것만으로는 모든 환자에서 RGC의 손실을 예방하지 못하며, IOP가 성공적으로 저하된 후에도 RGC 파괴가 계속될 수 있다. 정상 IOP를 가진 환자에서도 RGC 손실과 함께 녹내장이 많이 발병한다.

본 개시내용의 측면은 시신경 변성을 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 녹내장의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 Fas 리간드 (FasL)가 조직 손상, 예를 들어 녹내장을 일으키는 아폽토시스 및 염증을 매개한다는 발견에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 가용성 Fas 리간드 (sFasL)의 rAAV-매개된 전달이 녹내장의 마우스 모델에서 망막 신경절 세포 (RGC) 및 축삭돌기의 사멸을 예방한다는 발견에 관한 것이다.

따라서, 본 개시내용의 한 측면은 대상체에서 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 녹내장의 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV는 (i) 캡시드 단백질 및 (ii) sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함한다. 일부 예에서, sFasL 또는 그의 단편의 양은 녹내장 질환 진행을 감소시키고, 대상체에서 안내압을 저하시키고, 망막 신경교 세포를 불활성화시키고, TNFα 활성을 억제하고, 망막 신경절 세포 (RGC) 사멸을 감소시키고/거나 축삭 변성을 감소시키는데 효과적인 것이다. 일부 실시양태에서, 시신경 변성의 예방 및/또는 녹내장의 치료를 위한 신규한 조성물 및 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 Fas 리간드-의존성 염증 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV는 (i) 캡시드 단백질 및 (ii) sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fas 리간드-의존성 염증 상태는 녹내장 또는 피부 루푸스이다.

대안적으로, 본 개시내용은 Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 조직에서 막-결합된 Fas 리간드 (mFasL) 및/또는 가용성 Fas 리간드 (sFasL)의 존재 또는 부재를 검출하고, mFasL 및/또는 sFasL의 존재 또는 부재에 기초하여 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여함으로써 대상체를 치료하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 rAAV는 (i) 캡시드 단백질 및 (ii) sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함한다.

여전히 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 가용성 FasL (sFasL) 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 연령-관련 상승된 안내압을 갖고 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 안내로 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 치료하고자 하는 대상체는 Fas 리간드-의존성 염증 상태를 갖고 있거나 또는 가진 것으로 의심되는 환자 (예를 들어, 인간 환자)이다. 일부 예에서, 대상체는 녹내장을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 의심되는 인간 환자이다. 이러한 인간 환자는 상승된 안내압 (IOP), 망막 신경절 세포 (RGC) 및/또는 축삭돌기의 손실, 프로아폽토시스 유전자 (예를 들어, Bax, FADD, Fas 및 FasL)의 증가된 발현, 항아폽토시스 유전자 (예를 들어, c-Flip, Bcl-2 및 CIAP-2)의 감소된 발현, 활성화된 망막 신경교 세포, 증가된 TNFα 활성, mFasL의 증가된 발현, 및 sFasL의 감소된 발현을 나타낼 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료하고자 하는 임의의 대상체를 또 다른 녹내장 요법 (예를 들어, 안약, 경구 의약, 또는 수술)으로 치료할 수 있었다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에게 또 다른 항녹내장 치료를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 개시내용은 또한 (a) 대상체에서 녹내장을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 제약 조성물은 본원에 기재된 sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함하는 1종 이상의 rAAV, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 녹내장 치료를 위한 의약의 제조에서 sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함하는 rAAV의 용도 또한 제공된다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세한 내용은 하기 설명에 기재된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 몇몇 실시양태에 대한 하기 도면 및 상세한 설명으로부터 및 첨부된 청구항으로부터 명백해질 것이다.

도 1a-1e는 FasL의 막 형태만을 발현하는 DBA/2J 마우스에서 RGC 및 축삭돌기의 가속된 손실을 도시한다. 도 1a는 3, 6 및 9 개월령의 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 마우스 (N=16 D2-Gp; N=22 D2, N=22 D2-ΔCS)에서 반동 안압계에 의해 얻어진 IOP 측정치를 도시한다. 데이터는 평균 IOP ± SEM으로 나타내었다. 도 1b는 β-III 튜불린 및 RGC-특이적 마커 및 DAPI 핵 염색으로 염색된, 3 및 6 개월령의 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 마우스로부터 단리된 망막 플랫 마운트(flat-mount)의 대표적인 공초점 영상을 도시한다 (스케일 75μm). 도 1c는 β-III 튜불린 양성 RGC의 정량화를 도시하며, RGC 밀도/㎟ 망막으로 나타내었다. N = 그룹당 10개의 눈. 도 1d는 3 및 6 개월령의 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS로부터 얻어진 PPD 시신경 횡단면의 대표적인 현미경 사진을 도시한다 (스케일 100x). 도 1e는 건강한 축삭돌기의 정량화를 도시하며, 축삭돌기 밀도 (10⁴)/㎟으로 나타내었다. N = 그룹당 10개의 시신경. ns - 유의하지 않음, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001.
도 2a-2d는 sFasL의 부재시에 가속된 아폽토시스가 RGC 손실과 동시에 일어남을 도시한다. 3 개월령 (도 2a) 및 6 개월령 (도 2c)의 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 마우스로부터 얻어진 파라핀 매립된 망막 절편에서 대표적인 TUNEL 염색 (스케일 100μm). GCL, 신경절 세포층; INL, 내핵층; ONL, 외핵층; 백색 화살촉 = GCL에서 TUNEL 양성 세포; 백색 화살표 = INL에서 TUNEL 양성 세포. GCL에서 TUNEL-양성 세포를 3 개월령 (도 2b) 및 6 개월령 (도 2d)에 정량화하였고, TUNEL 양성 세포/망막 절편 (9개 절편/망막)으로 나타내었다 (N = 그룹당 8). ns - 유의하지 않음, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 3a-3f는 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 동물에서 Fas, FasL 및 FADD의 발현을 도시한다. 정량적 RT-PCR을 3 및 6 개월령의 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 마우스로부터 단리된 신경 망막에 대해 수행하여, Fas (도 3a), FasL (도 3b) 및 FADD (도 3c)의 mRNA 수준을 정량화하였다. N = 그룹당 6. 3 및 6 개월째에 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 마우스로부터 단리된 후방 안배(posterior eye cup)로부터 제조된 단백질 용해물 (20μg/샘플)로부터의 대표적인 웨스턴 블롯 (도 3d). sFasL 또는 mFasL을 과발현하는 L5178Y-R 종양 형질감염체로부터 제조된 단백질 용해물을 양성 대조군으로 사용하였고, FasL-KO 마우스로부터 단리된 후방 안배로부터 제조된 단백질 용해물을 음성 대조군으로 사용하였다. mFasL 34 및 38 kD 밴드 (도 3e) 및 sFasL 26 kD 밴드 (도 3f)의 농도계측 분석은 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균이다 (3회의 독립적인 블롯은 실험마다 그룹당 1개의 후분절로 이루어짐). 오차 막대는 SEM+를 나타낸다. ns-유의하지 않음. N.D.- 검출되지 않음, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001.
도 4a-4f는 AAV2.sFasL로 처리된 D2-ΔCS 마우스 및 D2 마우스의 망막에서 GFAP 및 TNFα의 발현을 도시한다. 3 개월령 및 6 개월령의 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 마우스로부터 얻어졌으며 GFAP 및 DAPI에 대해 염색된, 파라핀 매립된 망막 절편의 대표적인 공초점 현미경 영상 (백색 화살표 = 뮬러 세포에서 GFAP, 스케일 100μm) (도 4a). 정량적 RT- PCR을 3 및 6 개월령의 D2-Gp, D2 및 D2-ΔCS 마우스로부터 단리된 신경 망막에 대해 수행하여, GFAP (도 4b) 및 TNFα (도 4c)의 mRNA 수준을 정량화하였다. 10 개월령의 D2-Gp, D2-uninj., D2-AAV2-eGFP, 및 D2-AAV2-sFasL 마우스로부터 얻어졌으며 GFAP 및 DAPI에 대해 염색된, 파라핀 매립된 망막 절편의 대표적인 공초점 현미경 영상 (스케일 100μm) (도 4d). 정량적 RT-PCR을 10 개월령의 D2-Gp, D2-uninj., D2-AAV2-eGFP, 및 D2-AAV2-sFasL 마우스로부터 단리된 신경 망막에 대해 수행하여, GFAP (도 4e) 및 TNFα (도 4f)의 mRNA 수준을 정량화하였다. N = 그룹당 6. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. ns-유의하지 않음, *P<0.05, **<0.01, ****<0.0001.
도 5a-5d는 DBA2/J 마우스에서 sFasL의 과발현을 도시한다. DBA/2J 마우스에게 2 개월령째에 대조군으로서 AAV2.sFasL 또는 AAV2.eGFP를 유리체내로 1회 주사하였다. 망막을 통한 AAV2.eGFP 발현을 도시하는 망막 플랫 마운트 (스케일 5x 및 100μm) (도 5a). 망막의 횡단면 3-D 재구성 (도 5b). GCL-신경절 세포층, INL-내핵층. AAV2 주사 이후 2 주일째 및 8 개월째 둘 다에서 26 kD에서 sFasL의 과발현을 도시하는 웨스턴 블롯 형태 신경 망막 용해물 (5μg/샘플) (N = 그룹당 3) (도 5c). IOP 측정치를 D2 (주사하지 않음), D2-AAV2.eGFP, 및 D2-AAV2.sFasL에서 반동 안압계에 의해 3, 5, 7 및 9 개월령에 수득하였다 (도 5d). 데이터는 평균 IOP ± SEM IOP로 나타내었다 (N = 그룹당 10). 9 개월령의 D2-Gp, D2 (주사하지 않음), D2-AAV.eGFP, 및 D2-AAV.sFasL에서 색소 분산 및 홍채 간질 위축. *P<0.05.
도 6a-6b는 유리체내 AAV2.sFasL이 DBA/2J 마우스에서 RGC 및 축삭돌기를 보호함을 도시한다. DBA/2J 마우스에게 2 개월령째에 대조군으로서 AAV2.sFasL 또는 AAV2.eGFP를 유리체내로 1회 주사하였다. 10 개월령째에, 동일 연령의 D2-uninj (주사하지 않음) 및 D2.Gp 마우스 외에도, AAV2.sFasL 및 AAV2.eGFP 처리된 마우스를 안락사시켰고, RGC 및 축삭돌기의 분석을 위해 망막 및 시신경을 가공하였다. β-III 튜불린, RGC-특이적 마커, 및 DAPI로 염색된, D2-Gp, D2 주사하지 않음, D2-AAV2.eGFP 및 D2-AAV2.sFasL 마우스로부터 단리된 망막 플랫 마운트의 대표적인 공초점 영상 (스케일 50μm). RGC 밀도/㎟ 망막으로 나타낸 β-III 튜불린 양성 RGC의 정량화. N = 그룹당 10개의 눈 (도 6a). D2-Gp, D2 주사하지 않음, D2-AAV2.eGFP 및 D2-AAV2.sFasL 마우스로부터 얻어진 PPD 시신경 횡단면의 대표적인 현미경 사진. 축삭돌기 밀도 (10⁴)/㎟으로 나타낸 건강한 축삭돌기의 정량화. N = 그룹당 10개의 눈 (도 6b). 스케일 100x, ns - 유의하지 않음, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 7a-7b는 AAV2.sFasL로 처리된 D2 마우스에서 프로아폽토시스 및 항아폽토시스 매개자의 발현을 도시한다. 정량적 RT-PCR을 신경 망막에 대해 수행하여, 프로아폽토시스 매개자 (도 7a) Fas, FADD 및 BAX, 및 항아폽토시스 매개자 cFLIP, Bcl2 및 cIAP2 (도 7b)의 mRNA 수준을 정량화하였다. N = 그룹당 5. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. ns-유의하지 않음, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001.
도 8a-8d는 AAV2.sFasL로의 처리가 질환이 시작되기 전에 또는 시작된 후에 제공되었을 때 D2 마우스에서 RGC 및 축삭돌기의 장기간 보호를 제공함을 도시한다. 2 개월령에 AAV2-eGFP 또는 AAV2-sFasL로 처리된 D2 마우스 (전처리) (도 8a) 및 7 개월령에 AAV2-eGFP 또는 AAV2-sFasL로 처리된 D2 마우스 (질환이 시작된 후) (도 8c)로부터 15 개월령에 βIII 튜불린 및 DAPI로 염색된 망막 전체 마운트로부터의 대표적인 공초점 현미경 영상 (스케일 100μm). 동일 연령의 D2-Gp 및 D2-주사하지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다 (스케일 100μm). RGC 밀도/㎟ 망막으로 나타낸 β-III 튜불린 양성 RGC의 정량화. 2 개월령에 AAV2-eGFP 또는 AAV2-sFasL로 처리된 D2 마우스 (도 8b) 및 7 개월령에 AAV2-eGFP 또는 AAV2-sFAsL로 처리된 D2 마우스 (도 8d)로부터 15 개월령에 PPD로 염색된 시신경 횡단면의 대표적인 현미경 사진. 스케일 100x. 동일 연령의 D2-Gp 및 D2-주사하지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 축삭돌기 밀도 (10⁴)/㎟으로 나타낸 건강한 축삭돌기의 정량화. N = 그룹당 10개의 눈. ns - 유의하지 않음, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001.
도 9a-9f는 AAV2.sFasL로의 전처리가 C57/BL6 마우스의 상승된 IOP의 마이크로비드-유도된 마우스 모델에서 RGC 세포 사멸을 보호함을 도시한다. 식염수 및 마이크로비드 주사된 B6.AAV2.eGFP 및 B6.AAV2.sFasL 마우스에서 마이크로비드 또는 식염수 주사 이후 4 주일째에 26 kD sFasL 및 액틴의 발현을 도시하는 웨스턴 블롯 형태 신경 망막 용해물 (5ug/샘플) (도 9a). IOP 측정치는 식염수 또는 마이크로비드로 처리된 B6.AAV2.eGFP 및 B6.AAV2.sFasL 마우스로부터 반동 안압계에 의해 수득하였다 (도 9b). 데이터는 평균 IOP ± SEM으로 나타내었다 (N = 그룹당 10). 마이크로비드 주사 이후 28 일째에 신경 망막 및 시신경을 RGC 및 축삭돌기의 정량화를 위해 가공하였다. 마이크로비드 또는 식염수 주사 이후 4 주일째에 βIII 튜불린, RGC-특이적 마커, 및 DAPI로 염색된 망막 플랫 마운트로부터의 대표적인 공초점 현미경 영상 (도 9c). RGC 밀도/㎟ 망막으로 나타낸 β-III 튜불린 양성 RGC의 정량화 (스케일 75μm) (도 9d). 마이크로비드 또는 식염수 주사 이후 4 주일째에 PPD로 염색된 시신경 횡단면의 대표적인 현미경 사진 (스케일 100x) (도 9e). 축삭돌기 밀도 (10⁴)/㎟으로 나타낸 건강한 축삭돌기의 정량화 (도 9f). N = 그룹당 5개의 눈. ns- 유의하지 않음, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

본 발명의 측면은 대상체에게 전달시 대상체에서 망막 신경절 세포 (RGC) 사멸을 치료 또는 예방하는데 효과적인 특정한 단백질-코딩 트랜스진 (예를 들어, 가용성 Fas 리간드 (sFasL) 또는 그의 단편)에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 방법 및 조성물은 녹내장의 치료에 유용하다.

녹내장의 치료 방법

본 개시내용은 트랜스진 (예를 들어, sFasL 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자)을 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 전형적으로 대상체에게 sFasL 단백질 단편을 코딩하는 단리된 핵산, 또는 sFasL 단백질 단편을 발현하기 위한 핵산을 포함하는 rAAV의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

Fas 리간드 (FasL)는 원래 Fas 수용체 양성 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력에 의해 식별되는, TNF 패밀리의 40 kDa 유형 II 막경유 단백질이다. FasL은 막-결합된 단백질 (mFasL)로서 발현될 수 있거나, 또는 가용성 단백질 (sFasL)로서 절단 및 방출될 수 있다.

인간 FasL 유전자는 281개 아미노산 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 인간 FasL 유전자는 서열식별번호(SEQ ID NO): 6에 제시되고 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NM_000639.2로 제시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 인간 FasL의 아미노산 잔기 127-281에 상응하는 인간 sFasL 단백질이 서열식별번호: 3에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간 sFasL 단백질은 서열식별번호: 2에 제시된 핵산에 의해 코딩된다.

본 개시내용의 측면은 부분적으로 sFasL이 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, rAAV)의 투여를 통해 그를 필요로 하는 대상체에서 발현될 때 RGC 및 축삭돌기의 손실을 예방한다는 놀라운 발견에 기초한다.

따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 sFasL 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 트랜스진을 제공한다. "sFasL 단백질 단편"은 sFasL 단백질의 기능성 2 내지 154 (예를 들어, 2와 154 사이의 임의의 정수) 아미노산 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, sFasL 단백질 단편은 sFasL (예를 들어, 서열식별번호: 3)의 연속성 아미노산 부분 (예를 들어, 아미노산 1 내지 154)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sFasL 단백질 단편은 sFasL (예를 들어, 서열식별번호: 3)의 1개 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의) 비연속성 아미노산 부분 (예를 들어, 아미노산 1 내지 10, 32 내지 120 및 64 내지 150)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 sFasL 또는 그의 단편을 코딩하는 트랜스진은 RGC 및 축삭돌기의 손실을 예방하고, 따라서 녹내장의 치료에 유용하다. 일반적으로, "녹내장"은 시신경이 손상된 안구 상태의 그룹을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 녹내장에서 시신경에 대한 손상은 눈에서 상승된 압력으로 인해 초래된다. 녹내장의 예에는 개방각 녹내장, 폐쇄각 녹내장, 정상 안압 녹내장 (NTG), 선천성 녹내장, 속발성 녹내장, 색소성 녹내장, 거짓 비늘 녹내장, 외상성 녹내장, 혈관신생성 녹내장, 홍채 각막 내피 증후군 (ICE), 및 포도막염 녹내장이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 녹내장을 가진 대상체에게 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산 또는 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 녹내장의 치료를 필요로 하는 대상체에서 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다.

물질의 "유효량"은 원하는 효과를 제공하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예를 들어, sFasL 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산)의 유효량은 대상체의 표적 조직의 충분한 개수의 표적 세포를 형질감염시키는데 (또는 rAAV 매개된 전달의 측면에서 감염시키는데) 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 안구 조직 (예를 들어, 광수용체 세포, 간상 세포, 원추 세포, 망막 신경절 세포, 망막 세포 등)이다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, rAAV를 통해 전달될 수 있는) 단리된 핵산의 유효량은 대상체에서 치료적 이익을 갖는데, 예를 들어 관심 유전자 또는 단백질 (예를 들어, sFasL)의 발현을 증가시키거나 보충하는데, 또는 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상 (예를 들어, 녹내장의 증상, 예컨대 RGC 손상)을 개선시키는데 등에 충분한 양일 수 있다. 상기 유효량은 다양한 인자, 예를 들어 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 및 표적으로 하는 조직에 따라 좌우될 것이고, 따라서 본 개시내용에 기재된 대상체 및 조직에 따라 달라질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 녹내장, 녹내장의 증상, 또는 녹내장에 대한 소인을 치료하거나, 치유하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경시키거나, 해결하거나, 향상시키거나, 개선시키거나 또는 그에 영향을 미치기 위한 목적으로, sFasL 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 녹내장, 녹내장의 증상, 또는 녹내장에 대한 소인을 가진 대상체에게 적용하거나 투여하는 것을 지칭한다.

녹내장의 완화에는 상기 질환의 발생 또는 진행의 지연, 또는 질환 중증도의 감소가 포함된다. 상기 질환의 완화가 반드시 치료 결과를 필요로 하는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환 (예컨대, 녹내장) 발생의 "지연"은 상기 질환의 진행을 연기, 방해, 늦춤, 지연, 안정화 및/또는 미룸을 의미한다. 이러한 지연은 치료할 질환 및/또는 개체의 이력에 따라 다양한 기간일 수 있다. 질환의 발생을 "지연" 또는 완화시키거나 또는 질환의 개시를 지연시키는 방법은, 상기 방법을 사용하지 않을 때와 비교시 주어진 기간 내에 질환의 1종 이상의 증상이 발생할 가능성을 감소시키고/거나 주어진 기간 내에 상기 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하는데 충분한 개수의 대상체를 이용하는 임상적 연구를 기초로 한다.

질환의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 질환의 발생은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 임상 기술을 이용하여 검출하고 평가할 수 있다. 그러나, 발생은 검출 불가능한 진행 또한 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"에는 발병, 재발 및 발생이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 녹내장의 "발생" 또는 "발병"에는 초기 발생 및/또는 재발이 포함된다.

일부 실시양태에서, sFasL 또는 그의 단편을 대상체에서 안내압을 적어도 5% (예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상) 저하시키는데 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여한다. 일부 실시양태에서, sFasL 또는 그의 단편을 대상체에서 망막 신경교 세포를 적어도 5% (예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상) 불활성화시키는데 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여한다. 일부 실시양태에서, sFasL 또는 그의 단편을 대상체에서 TNFα 활성을 적어도 5% (예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상) 억제하는데 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여한다. 일부 실시양태에서, sFasL 또는 그의 단편을 대상체에서 망막 신경절 세포 (RGC) 사멸 및/또는 축삭 변성을 적어도 5% (예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상) 감소시키는데 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여한다.

본원에는 Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법 및 조성물 또한 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Fas 리간드-의존성 염증 상태"는 Fas 리간드-의존성 염증에 의해 매개되는 상태 또는 질환이다. Fas 리간드-의존성 염증은 안구 염증 질환과 관련이 있을 수 있다. 안구 염증 질환의 비제한적인 예에는 알러지성 결막염, 포도막염, 공막염, 상공막염, 시신경염, 각막염, 안와 거짓종양, 망막 혈관염, 만성 결막염, 및 자가면역 유도된 만성 염증 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스)이 포함되나 이로 제한되지 않는다. Fas 리간드-의존성 염증 상태는 종종 mFasL에 의해 초래되는 눈의 염증과 관련이 있다. 임의의 특별한 이론에 구애되지 않고, sFasL의 rAAV-기반 전달은 Fas 리간드-의존성 염증 상태를 가진 대상체에서 눈의 염증을 감소시킨다.

일부 실시양태에서, Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법은 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV는 (i) 캡시드 단백질 및 (ii) sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함한다.

일부 실시양태에서, Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법은 대상체의 조직에서 막-결합된 Fas 리간드 (mFasL) 및/또는 가용성 Fas 리간드 (sFasL)의 존재 또는 부재를 검출하고, mFasL 및/또는 sFasL의 존재 또는 부재에 기초하여 대상체를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 대상체를 치료하는 것은 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, rAAV는 (i) 캡시드 단백질 및 (ii) sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함한다.

통상의 기술자는 FasL 단백질 (예를 들어, FasL, mFasL, 또는 sFasL)이 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검출될 수 있음을 인식한다. 일부 실시양태에서, 전기영동, 웨스턴 블롯, 및 질량 분석법을 이용하여 FasL 단백질을 검출한다. 일부 실시양태에서, FasL 단백질을 안구 유체 (예를 들어, 안내 유체, 수양액, 또는 눈물)에서 검출한다.

조합 요법

본원에는 본원에 기재된 sFasL 또는 그의 단편, 및 본원에 기재된 것과 같은 또 다른 항녹내장 치료제를 이용하는 조합 요법이 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 조합 요법은 이들 작용제 (예를 들어, sFasL 또는 그의 단편 및 항녹내장 치료제)를 순차적인 방식으로 투여하는 것 (즉, 각각의 치료제를 상이한 시간에 투여함) 뿐만 아니라, 이들 치료제 또는 적어도 2종의 작용제를 실질적으로 동시적인 방식으로 투여하는 것을 포함한다.

각각의 작용제의 순차적 투여 또는 실질적으로 동시 투여는 임의의 적절한 경로, 예컨대 비제한적으로 rAAV-매개된 전달, 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내, 피하 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수에 의해 이루어질 수 있다. 상기 작용제들은 동일한 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 작용제 (예를 들어, sFasL 또는 그의 단편)는 rAAV-매개된 전달을 통해 투여할 수 있고, 제2 작용제 (예를 들어, 항녹내장제)는 경구로 투여할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "순차적"은 달리 명시되지 않는다면 규칙적인 순서 또는 차례를 특징으로 하는 것을 의미하며, 예를 들어 투약 섭생법이 sFasL 또는 그의 단편 및 항녹내장제의 투여를 포함하는 경우, 순차적 투약 섭생법은 항녹내장제의 투여 이전에, 동시에, 실질적으로 동시에 또는 이후에 sFasL 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함할 수 있지만, 이들 두 작용제는 규칙적인 순서 또는 차례로 투여될 것이다. 용어 "별도의"는 달리 명시되지 않는다면 다른 것과 따로 유지하는 것을 의미한다. 용어 "동시에"는 달리 명시되지 않는다면 동일한 시간에 일어나거나 수행하는 것을 의미하며, 즉, 본 발명의 작용제들을 동일한 시간에 투여한다. 용어 "실질적으로 동시에"는 상기 작용제들을 서로 수분 내에 (예를 들어, 서로 10 분 내에) 투여하는 것을 의미하며, 공동 투여 뿐만 아니라 연속 투여를 포함하는 것으로 의도되지만, 연속으로 투여하는 경우에는 단기간 동안만 시간이 떨어져 있다 (예를 들어, 의사가 2개의 작용제를 별도로 투여하는데 걸리는 시간). 본원에서 사용된 바와 같이, 공동 투여 및 실질적으로 동시 투여는 상호교환적으로 사용된다. 순차적 투여는 본원에 기재된 작용제들을 시간적으로 별도로 투여하는 것을 지칭한다.

조합 요법은 본원에 기재된 작용제 (예를 들어, sFasL 또는 그의 단편 및 항녹내장제)를 생물학적으로 활성인 다른 성분들 (예를 들어, 상이한 항녹내장제) 및 비-약물 요법 (예를 들어, 수술)과 함께 투여하는 것을 또한 포함할 수 있다.

sFasL 또는 그의 단편 및 또 다른 항녹내장제의 임의의 조합물 (예를 들어, 안약을 통해 전달됨)이 녹내장의 치료를 위해 임의의 순서로 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 기재된 조합물은 수많은 인자에 기초하여 선택될 수 있으며,그에는 녹내장 질환 진행의 감소, 안내압 (IOP)의 저하, 망막 신경교 세포의 불활성화, TNFα 활성의 억제, 망막 신경절 세포 (RGC) 사멸의 감소, 축삭 변성의 감소, 및/또는 녹내장과 관련된 적어도 1종의 증상의 완화에 대한 유효성, 또는 조합물의 또 다른 작용제의 부작용 경감에 대한 유효성이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 조합 요법은 조합물의 각각의 개별 구성원과 관련된 임의의 부작용, 예를 들어 항녹내장제와 관련된 부작용을 감소시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 또 다른 항녹내장 치료제는 안약, 경구 의약, 및/또는 수술적 요법이다. 안약은 1종 이상의 치료제, 예를 들어 프로스타글란딘, 베타 차단제, 알파-아드레날린성 효능제, 탄산 탈수효소 억제제, 동공 축소제, 및 콜린성 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경구 의약은 탄산 탈수효소 억제제를 포함한다. 수술적 요법의 예에는 레이저 요법, 여과 수술, 배액관, 및 전기소작이 포함되나 이로 제한되는 것이 아니다.

단리된 핵산

일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 sFasL 또는 그의 단편을 발현하는데 유용한 단리된 핵산을 제공한다. "핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 및 핵산은 단리된 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 인공적으로 생성된 것을 의미한다. 핵산과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 (i) 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 시험관 내에서 증폭된; (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성된; (iii) 분할 및 겔 분리에 의해 정제된; 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성에 의해 합성된 것을 의미한다. 단리된 핵산은 관련 기술분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 다루어질 수 있는 것이다. 따라서, 5' 및 3' 제한 부위가 공지되어 있거나 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 프라이머 서열이 개시된 적이 있는 벡터에 함유된 뉴클레오티드 서열은 단리된 것으로 간주되지만, 그의 천연 숙주에서 그의 본래 상태로 존재하는 핵산 서열은 그렇지 않다. 단리된 핵산은 실질적으로 정제될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터 내에서 단리된 핵산은 그가 있었던 세포 내의 물질을 아주 적은 백분율로만 포함할 수 있다는 점에서 순수하지 않다. 그러나, 이러한 핵산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 용이하게 다루어질 수 있기 때문에, 이러한 핵산은 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이 단리된 것이다. 단백질 또는 펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 단리되었거나 또는 인공적으로 생성된 (예를 들어, 화학적 합성, 재조합 DNA 기술 등에 의해) 단백질 또는 펩티드를 지칭한다.

통상의 기술자는 캡시드 단백질의 기능적으로 등가인 변이체 또는 동족체를 제공하도록 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있음을 또한 인지할 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 보존적 아미노산 치환을 일으키는 서열 변경을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적인 전하 또는 크기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경시키는 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 방법에 대해서는 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]을 참고한다. 아미노산의 보존적 치환에는 하기 그룹 내의 아미노산 중에서 이루어지는 치환이 포함된다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 따라서, 본원에 개시된 단백질 및 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.

본 발명의 단리된 핵산은 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (rAAV 벡터)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산은 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 반전 말단 반복부 (ITR) 또는 그의 변이체를 포함하는 영역 (예를 들어, 제1 영역)을 포함한다. 단리된 핵산 (예를 들어, 재조합 AAV 벡터)을 캡시드 단백질로 패키징하여 대상체에게 투여하고/거나 선택된 표적 세포에 전달할 수 있다. "재조합 AAV (rAAV) 벡터"는 전형적으로 최소한 트랜스진 및 그의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 반전 말단 반복부 (ITR)로 구성된다. 트랜스진은 본원에 개시된 바와 같이 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 인간 sFasL 또는 그의 단편)을 코딩하는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 트랜스진은 또한 본 개시내용에 기재된 바와 같이 예를 들어 miRNA 결합 부위 및/또는 발현 제어 서열 (예를 들어, 폴리-A 꼬리)을 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.

일반적으로, ITR 서열은 약 145 bp의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 코딩하는 전체 서열이 분자에서 사용되지만, 이들 서열에서 어느 정도의 적은 변형이 허용된다. 이들 ITR 서열을 변형시키는 능력은 관련 기술분야 내에 있다. (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)]과 같은 문헌 참고). 본 발명에서 사용되는 이러한 분자의 예는 트랜스진을 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이고, 선택된 트랜스진 서열 및 관련된 조절 요소는 5' 및 3' AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된다. AAV ITR 서열은 임의의 공지된 AAV, 예컨대 현재 확인된 포유류 AAV 유형으로부터 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 그의 변이체로부터 선택된 혈청형을 갖는 적어도 하나의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 AAV2 ITR을 코딩하는 영역 (예를 들어, 제1 영역)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 제2 AAV ITR을 포함하는 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 그의 변이체로부터 선택된 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 ITR은 기능성 말단 분할 부위 (TRS)가 결여된 돌연변이 ITR이다. 용어 "말단 분할 부위가 결여된"은 ITR의 말단 분할 부위 (TRS)의 기능을 없애는 돌연변이 (예를 들어, 센스 돌연변이, 예컨대 비-동일(non-synonymous) 돌연변이, 또는 미스센스 돌연변이)를 포함하는 AAV ITR을 지칭하거나, 또는 기능성 TRS를 코딩하는 핵산 서열이 결여된 말단절단된 AAV ITR (예를 들어, ΔTRS ITR)을 지칭한다. 임의의 특별한 이론에 구애되지 않고, 기능성 TRS가 결여된 ITR을 포함하는 rAAV 벡터는 예를 들어 문헌 [McCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656]에 기재된 바와 같은 자가-상보성 rAAV 벡터를 생성한다.

재조합 AAV 벡터에 대해 상기 확인된 주요 요소 이외에도, 벡터는 본 발명에 의해 생성된 벡터로 형질감염되거나 바이러스로 감염된 세포에서 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 트랜스진의 요소와 작동가능하게 연결된 통상적인 제어 요소 또한 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로(in trans) 또는 소정 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다. 발현 제어 서열에는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 유효한 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 개선시키는 서열 (즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 개선시키는 서열; 및 원하는 경우, 코딩된 생성물의 분비를 개선시키는 서열이 포함된다. 본래의, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 비롯하여 수많은 발현 제어 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있고 이용할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열 (예를 들어, 코딩 서열) 및 조절 서열은 조절 서열의 영향 또는 제어하에 핵산 서열의 발현 또는 전사를 일어나게 하는 방식으로 공유 연결될 때 작동가능하게 연결된 것이라고 말한다. 핵산 서열이 기능성 단백질로 번역되는 것을 원하는 경우에는, 5' 조절 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 일으키는 경우 및 2개의 DNA 서열 사이의 연결의 성질이 (1) 프레임-쉬프트 돌연변이의 도입을 일으키지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역되는 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는 경우에 2개의 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 것이라고 말한다. 따라서, 생성된 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 프로모터 영역이 DNA 서열을 전사시킬 수 있는 경우에는, 프로모터 영역이 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 유사하게는, 2개 이상의 코딩 영역은 공통된 프로모터로부터 그들의 전사가 프레임 내에서 번역된 2개 이상의 단백질을 발현하도록 연결될 때, 상기 코딩 영역은 작동가능하게 연결된 것이다. 일부 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 융합 단백질을 생성한다. 일부 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 기능성 RNA (예를 들어, miRNA)를 생성한다.

"프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하기 위해 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 문구 "작동가능하게 위치한", "조절하에" 또는 "전사 조절하에"는 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자 발현을 제어하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 있음을 의미한다.

단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 이후 및 3' AAV ITR 서열 이전에 삽입된다. 본 개시내용에서 유용한 rAAV 구축물은 또한 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 트랜스진 사이에 위치하는 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래하며, SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다. 사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 1개 초과의 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용된다. IRES 서열은 1개 초과의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질을 생성하기 위해 사용될 것이다. 이들 및 다른 공통된 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 이러한 여러 서열이 이용가능하다 [예를 들어, Sambrook 등의 문헌 및 그에 인용된, 예를 들어 3.18 3.26 및 16.17 16.27 페이지에 인용된 참고 문헌, 및 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참고]. 일부 실시양태에서, 구제역 바이러스 2A 서열은 다단백질에 포함되고; 이는 다단백질의 절단을 매개하는 것으로 확인된 소형 펩티드 (대략 18개 아미노산 길이)이다 (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). 상기 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 요법 벡터 (AAV 및 레트로바이러스)를 비롯한 인공 시스템에서 이전에 입증되었다 (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; 및 Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).

구성적 프로모터의 예에는 비제한적으로 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의적으로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의적으로 CMV 인핸서를 가짐) [예를 들어, 문헌 [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참고], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터 [인비트로젠(Invitrogen)]가 포함된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 개선된 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 U6 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터이다.

유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인성으로 공급된 화합물, 환경적 인자, 예컨대 온도, 또는 구체적인 생리학적 상태의 존재, 예를 들어 급성기, 세포의 특정한 분화 상태, 또는 세포 복제에 의해서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 다양한 상업적 공급처, 예컨대 비제한적으로 인비트로젠, 클론테크(Clontech) 및 아리애드(Ariad)로부터 입수가능하다. 여러 다른 시스템이 기재되었으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인성으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예에는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템 (WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라시클린-억제성 시스템 (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라시클린-유도성 시스템 (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 또한 참고), RU486-유도성 시스템 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템 (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))이 포함된다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 여전히 다른 유형은 구체적인 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정한 분화 상태, 또는 세포 복제에 의해서만 조절되는 것들이다.

또 다른 실시양태에서, 트랜스진에 대해 본래의 프로모터가 사용될 것이다. 본래의 프로모터는 트랜스진의 발현이 본래의 발현을 모방하는 것을 원하는 경우에 바람직할 수 있다. 본래의 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발생적으로, 또는 조직 특이적인 방식으로, 또는 특이적인 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 다른 본래의 발현 조절 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 컨센서스 서열 또한 본래의 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 조절 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절 서열은 조직 특이적인 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적 전사 인자에 결합한다. 이러한 조직-특이적 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터는 눈-특이적 프로모터이다. 눈-특이적 프로모터의 예에는 레티노쉬신(retinoschisin) 프로모터, K12 프로모터, 로돕신 프로모터, 간상-특이적 프로모터, 원추-특이적 프로모터, 로돕신 키나제 프로모터, GRK1 프로모터, 광수용체간 레티노이드-결합 단백질 근접 (IRBP) 프로모터, 및 옵신 프로모터 (예를 들어, 적색 옵신 프로모터, 청색 옵신 프로모터 등)가 포함되나 이로 제한되지 않는다.

재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)

일부 측면에서, 본 개시내용은 단리된 AAV를 제공한다. AAV와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 인공적으로 생성되거나 수득된 AAV를 지칭한다. 단리된 AAV는 재조합 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 AAV는 본원에서 "재조합 AAV"로 지칭된다. 재조합 AAV (rAAV)는 바람직하게는 조직-특이적 표적화 능력을 가지며, 따라서 rAAV의 트랜스진이 하나 이상의 예정된 조직(들)에게 특이적으로 전달될 것이다. AAV 캡시드는 이러한 조직-특이적 표적화 능력을 결정하는데 중요한 요소이다. 따라서, 표적화될 조직에 적절한 캡시드를 갖는 rAAV를 선택할 수 있다.

원하는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV를 수득하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. (예를 들어, US 2003/0138772 참고, 상기 문헌의 내용은 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨). 전형적으로, 상기 방법은 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 기능성 rep 유전자; AAV 반전 말단 반복부 (ITR) 및 트랜스진으로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 재조합 AAV 벡터를 AAV 캡시드 단백질로 패키징하는 것을 허용하는데 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV의 cap 유전자에 의해 코딩되는 구조성 단백질이다. AAV는 3개의 캡시드 단백질인 비리온 단백질 1 내지 3 (VP1, VP2 및 VP3으로 명명됨)을 포함하며, 이들 모두는 대안적인 스플라이싱을 통해 단일 cap 유전자로부터 전사된다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2 및 VP3의 분자량은 각각 약 87 kDa, 약 72 kDa 및 약 62 kDa이다. 일부 실시양태에서, 번역시 캡시드 단백질은 바이러스 게놈 둘레에 구형 60합체 단백질 쉘을 형성한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질의 기능은 바이러스 게놈을 보호하고, 게놈을 전달하고, 숙주와 상호작용하는 것이다. 일부 측면에서, 캡시드 단백질은 조직 특이적인 방식으로 바이러스 게놈을 숙주에게 전달한다.

일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAVrh8, AAV9 및 AAV10으로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 비-인간 영장류로부터 유래된 혈청형, 예를 들어 AAVrh8 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 대상체의 눈에 대해 굴성을 갖는 혈청형, 예를 들어 다른 벡터에 비해 더욱 유효하게 대상체의 안구 세포를 형질도입하는 AAV (예를 들어, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh.39 및 AAVrh.43)를 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV8 혈청형 또는 AAV5 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 제시된 서열을 포함한다.

AAV 캡시드에서 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포에서 배양되는 성분들은 숙수 세포에 트랜스로 전달될 수 있다. 대안적으로, 임의의 하나 이상의 필요한 성분들 (예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및/또는 헬퍼 기능)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 하나 이상의 필요한 성분들을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 조절하에 필요한 성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 필요한 성분(들)은 구성적 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 구성적 프로모터의 예는 본원에서 트랜스진과의 사용에 적합한 조절 요소의 논의에서 제공된다. 여전히 또 다른 대안에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 조절하에 선택된 성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 조절하에 다른 선택된 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포 (구성적 프로모터의 조절하에 E1 헬퍼 기능을 함유함)로부터 유래되지만, 유도성 프로모터의 조절하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포를 생성할 수 있다. 여전히 다른 안정한 숙주 세포를 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 생성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 (예를 들어, sFasL 단백질 또는 그의 단편)을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 숙주 세포를 포함하는 조성물은 동결보존제를 추가로 포함한다.

본 개시내용의 rAAV를 생성하는데 필요한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및 헬퍼 기능을 임의의 적절한 유전자 요소 (벡터)를 이용하여 패키징 숙주 세포에 전달할 수 있다. 선택된 유전자 요소는 본원에 기재된 것들을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 실시양태를 구축하기 위해 이용되는 방법은 핵산 조작에 대한 기술자에게 공지되어 있고, 유전자 조작, 재조합 조작, 및 합성 기술이 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참고한다. 유사하게는, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 널리 공지되어 있으며, 적합한 방법의 선택은 본 개시내용을 제한하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 번호 5,478,745를 참고한다.

일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질감염 방법 (미국 특허 번호 6,001,650에 기재되어 있음)을 이용하여 생성할 수 있다. 전형적으로, 재조합 AAV는 숙주 세포를 AAV 입자로 패키징될 재조합 AAV 벡터 (트랜스진을 포함함), AAV 헬퍼 기능 벡터, 및 보조 기능 벡터로 형질감염시킴으로써 생성된다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 "AAV 헬퍼 기능" 서열 (즉, rep 및 cap)을 코딩하고, 이는 생산성 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 트랜스로 기능한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출가능한 야생형 AAV 비리온 (즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하지 않고 유효한 AAV 벡터 생성을 지원한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 벡터의 비제한적인 예에는 미국 특허 번호 6,001,650에 기재된 pHLP19 및 미국 특허 번호 6,156,303에 기재된 pRep6cap6 벡터가 포함되며, 상기 두 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 보조 기능 벡터는 복제를 위해 AAV가 의존하는 비-AAV 유래된 바이러스 및/또는 세포 기능 (즉, "보조 기능")에 대한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다. 보조 기능에는 AAV 복제를 위해 필요한 이들 기능, 예컨대 비제한적으로, AAV 유전자 전사의 활성화와 관련된 이들 모이어티, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성, 및 AAV 캡시드 조립이 포함된다. 바이러스-기반 보조 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (단순 헤르페스 바이러스 유형-1 이외의) 및 우두 바이러스로부터 유래될 수 있다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하기 위해 사용되며, 외인성 DNA가 세포 막 내부로 도입되었을 때 세포는 "형질감염된" 것이다. 수많은 형질감염 기술이 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, 및 Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참고한다. 이러한 기술을 이용하여 1종 이상의 외인성 핵산, 예컨대 뉴클레오티드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.

"숙주 세포"는 관심 물질을 잠복시키나 또는 잠복시킬 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종 숙주 세포는 포유류 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 구축물, AAV 미니유전자 플라스미드, 보조 기능 벡터, 또는 재조합 AAV의 생성과 관련된 다른 전이 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 상기 용어에는 형질감염된 원래 세포의 자손이 포함된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 자연적인, 우연한 또는 의도적인 돌연변이로 인해, 단일 모세포의 자손이 형태학적으로 또는 게놈 또는 전체 DNA 성분에 있어서 원래 모체와 완전히 동일할 필요가 없을 수 있는 것으로 이해된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포주"는 시험관 내에서 연속적으로 또는 장기간 성장 및 분열할 수 있는 세포의 집단을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 조상 세포로부터 유래된 클론성 집단이다. 이러한 클론성 집단의 보관 또는 이동 동안에 핵형에서 자발적 또는 유도된 변화가 일어날 수 있음이 관련 기술분야에 추가로 공지되어 있다. 따라서, 상기 언급된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일하지 않을 수 있고, 상기 언급된 세포주에는 이러한 변이체가 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 세포"는 외인성 DNA 분절, 예컨대 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 전사 또는 생물학적으로 활성인 핵산, 예컨대 RNA의 생성을 유도하는 DNA 분절이 도입된 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 회합될 때 복제할 수 있고 세포간에 유전자 서열을 이동시킬 수 있는 임의의 유전자 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 분절이 프로모터의 전사 제어하에 위치하는 이들 벡터인 것으로 고려된다. "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하게 위해 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 문구 "작동가능하게 위치한", "조절하에" 또는 "전사 제어하에"는 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자 발현을 제어하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 있음을 의미한다. 용어 "발현 벡터 또는 구축물"은 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전자 구축물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 발현은 예를 들어 전사된 유전자로부터 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 생성물 또는 기능성 RNA (예를 들어, 가이드 RNA)를 생성하기 위한 핵산의 전사를 포함한다. 재조합 벡터를 원하는 AAV 캡시드에 패키징하여 본 개시내용의 rAAV를 생성하는 상기 방법은 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 다른 적합한 방법이 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

눈으로 sFasL 트랜스진의 rAAV-매개된 전달

본원에는 트랜스진을 대상체의 안구 (예를 들어, 광수용체, 예컨대 간상 세포 또는 원추 세포, 망막 세포 등) 조직으로 전달하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 전형적으로 대상체에서 트랜스진 (예를 들어, sFasL 단백질 또는 그의 단편)을 발현하기 위해 핵산을 포함하는 rAAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. rAAV의 "유효량"은 대상체에서 표적 조직의 충분한 개수의 세포를 감염시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 안구 (예를 들어, 광수용체, 망막 등) 조직이다. rAAV의 유효량은 대상체에서 치료적 이익을 갖는데, 예를 들어 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상, 예를 들어 녹내장의 증상을 개선시키는데 충분한 양일 수 있다. 녹내장 증상의 예에는 주변 및/또는 중심 시야에서의 맹점, 좁은 시야, 중증의 두통, 안통, 구역질 및 구토, 흐린 시야, 빛 주변 달무리 현상, 및 눈 충혈이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 유효량은 다양한 인자, 예를 들어 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 및 표적으로 하는 안구 조직에 따라 좌우될 것이고, 따라서 대상체 및 조직에 따라 달라질 수 있다.

유효량은 또한 사용된 rAAV에 따라 좌우될 수 있다. 본 발명은 부분적으로 캡시드 단백질을 포함하는 특정한 rAAV가 안구 (예를 들어, 광수용체, 망막 등) 세포의 유효한 형질도입을 매개한다는 인식에 기초한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 rAAV는 AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh.39, 및 AAVrh.43으로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 AAV2 혈청형의 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 단백질이다.

특정한 실시양태에서, rAAV의 유효량은 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ 또는 10¹⁴ 게놈 카피/kg이다. 특정한 실시양태에서, rAAV의 유효량은 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴ 또는 10¹⁵ 게놈 카피/대상체이다.

유효량은 또한 투여 방식에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들어, 기질내 투여 또는 피하 주사에 의한 안구 (예를 들어, 광수용체, 망막 등) 조직의 표적화는, 일부 경우에 또 다른 방법 (예를 들어, 전신 투여, 국소 투여)에 의한 안구 (예를 들어, 광수용체, 망막 등) 조직의 표적화와는 상이한 (예를 들어, 보다 높거나 낮은) 용량을 필요로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정한 혈청형 (예를 들어, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh.39, 및 AAVrh.43)을 갖는 rAAV의 기질내 주사 (IS)는 안구 (예를 들어, 각막, 광수용체, 망막 등) 세포의 유효한 형질도입을 매개한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 주사는 기질내 주사 (IS)이다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 주사, 임의적으로 망막하 주사 또는 유리체내 주사를 통한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 주사는 국소 투여 (예를 들어, 눈으로의 국소 투여)이다. 일부 경우에, rAAV의 다중 용량을 투여한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV에 의한 안구 (예를 들어, 광수용체, 망막 등) 세포의 유효한 형질도입은 녹내장 (예를 들어, 개방각 녹내장)을 가진 대상체의 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 녹내장의 치료를 위한 방법 및 조성물 또한 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 녹내장을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 의심되는 대상체에게 rAAV의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 녹내장 (예를 들어, 개방각 녹내장)을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV는 (i) AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh.39, 및 AAVrh.43으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 캡시드 단백질, 및 (ii) 트랜스진 (예를 들어, 본 개시내용에 기재된 sFasL 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 트랜스진)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV (또는 단리된 핵산)의 투여는 망막 뉴런의 형질도입을 일으킨다. 망막 뉴런의 예에는 양극성 세포, 신경절 세포, 수평 세포, 망막 무축삭 세포, 간상 세포 및 원추 세포가 포함되나 이로 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV (또는 단리된 핵산)의 투여는 망막 신경절 세포 (RGC)의 형질도입을 일으킨다. RGC의 예에는 W-신경절 세포, X-신경절 세포, Y-신경절 세포, 초소형(midget) 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 감광성 신경절 세포, 및 눈 움직임을 위해 상구로 돌출하는 다른 신경절 세포가 포함되나 이로 제한되지 않는다.

망막 신경절 세포는 그들의 크기, 접속, 및 시각적 자극에 대한 반응의 측면에서 유의하게 달라지지만, 이들 모두는 뇌로 연장되는 긴 축삭돌기를 갖는다는 결정적인 특징을 공유한다. 이들 축삭돌기는 시신경, 시각 교차, 및 시각로를 형성한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV (또는 단리된 핵산)의 투여는 RGC, 축삭돌기, 또는 이들의 조합의 사멸을 예방한다.

rAAV는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 바람직하게는, 생리학적으로 상용성인 담체에 현탁된 (즉, 조성물 중의) rAAV를 대상체, 즉, 숙주 동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니 피그, 햄스터, 닭, 칠면조 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 마카크)에게 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 동물은 인간을 포함하지 않는다.

포유류 대상체에게 rAAV의 전달은 예를 들어 안내 주사 또는 국소 투여 (예를 들어, 안약)에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안내 주사는 기질내 주사, 결막하 주사, 또는 유리체내 주사이다. 일부 실시양태에서, 주사는 국소 투여가 아니다. 투여 방법의 조합 (예를 들어, 국소 투여 및 기질내 주사) 또한 이용할 수 있다.

본 개시내용의 조성물은 rAAV를 단독으로 또는 1종 이상의 다른 바이러스 (예를 들어, 1종 이상의 상이한 트랜스진을 코딩하는 제2 rAAV)와 조합하여 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 상이한 트랜스진을 각각 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 이상의 상이한 rAAV를 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 적합한 담체는 rAAV가 지정된다는 지시의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 한 적합한 담체에는 식염수가 포함되며, 이는 다양한 완충 용액 (예를 들어, 인산염 완충된 식염수)에 의해 제형화될 수 있다. 다른 예시적인 담체에는 멸균성 식염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 낙화생유, 참깨유, 및 물이 포함된다. 담체의 선택은 본 개시내용을 제한하지 않는다.

임의적으로, 본 개시내용의 조성물은 rAAV 및 담체(들) 외에도 다른 제약 성분, 예컨대 보존제, 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제에는 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀이 포함된다. 적합한 화학적 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다.

rAAV는 과도한 부작용이 없이 원하는 조직 (예를 들어, 안구 조직, 예컨대 광수용체, 망막 등의 조직)의 세포를 형질감염시키는데 및 유전자 전달 및 발현의 충분한 수준을 제공하는데 충분한 양으로 투여된다. 제약상 허용가능한 투여 경로의 예에는 선택된 장기로의 직접 전달 (예를 들어, 눈으로의 망막하 전달), 경구, 흡입 (예컨대, 비내 및 기관내 전달), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내, 및 다른 비경구 투여 경로가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 투여 경로는 원하는 경우에 조합될 수 있다.

특별한 "치료 효과"를 달성하기 위해 필요한 rAAV 비리온의 용량, 예를 들어 게놈 카피/체중 킬로그램 (GC/kg)의 용량 단위는 몇몇 인자, 예컨대 비제한적으로 rAAV 비리온 투여 경로, 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료할 특정한 질환 또는 장애, 및 유전자 또는 RNA 생성물의 안정성에 기초하여 달라질 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 언급된 인자 뿐만 아니라 다른 인자에 기초하여 특정한 질환 또는 장애를 가진 환자를 치료하기 위해 rAAV 비리온 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.

rAAV의 유효량은 동물을 표적 감염시키는데, 원하는 조직을 표적으로 하는데 충분한 양이다. 유효량은 기본적으로 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 및 표적으로 하는 조직과 같은 인자에 따라 좌우될 것이고, 따라서 동물 및 조직에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, rAAV의 유효량은 일반적으로 약 10⁹ 내지 10¹⁶ 게놈 카피를 함유하는 용액 약 1 ml 내지 약 100 ml의 범위이다. 일부 경우에, 약 10¹¹ 내지 10¹³ rAAV 게놈 카피의 용량이 적절하다. 특정한 실시양태에서, 10⁹ rAAV 게놈 카피는 안구 조직 (예를 들어, 각막 조직)을 표적으로 하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 10⁹ rAAV 게놈 카피 초과로 농축된 용량은 대상체의 눈에 투여할 때 독성이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 rAAV의 다중 용량에 의해 제공된다.

일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 역일당 (예를 들어, 24-시간 기간) 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 역일당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 역주당 (예를 들어, 7 역일) 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 2 주마다 1회 이하로 (예를 들어, 2 역주 기간 내에 1회) 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 역월당 1회 이하로 (예를 들어, 30 역일 내에 1회) 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 6 역월당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 역년당 (예를 들어, 365 일 또는 윤년에는 366 일) 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 2 역년당 (예를 들어, 730 일 또는 윤년에는 731 일) 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 대상체에게 3 역년당 (예를 들어, 1095 일 또는 윤년에는 1096 일) 1회 이하로 투여된다.

일부 실시양태에서, rAAV 조성물은 조성물 중에서 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제형화되며, 특히 높은 rAAV 농도가 존재한다 (예를 들어, ~10¹³ GC/ml 이상). 응집을 감소시키는데 적절한 방법, 예를 들어 계면활성제의 첨가, pH 조정, 염 농도 조정 등을 이용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178]을 참고하며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)

제약상 허용가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 본원에 기재된 구체적인 조성물을 사용하기에 적합한 투약 및 치료 섭생법을 다양한 치료 섭생법으로 개발하는 것과 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이들 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 달라질 수 있고, 편리하게는 전체 제형의 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 70% 또는 80% 이상일 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물 중에서 활성 화합물의 양은 적합한 용량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량으로 수득되도록 제조될 수 있다. 가용성, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같인 인자가 이러한 제약 제형 제조에 대한 분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 투약 및 치료 섭생법이 바람직할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 적합하게 제형화된 제약 조성물 중의 rAAV는 표적 조직으로 직접, 예를 들어 안구 조직 (예를 들어, 광수용체, 망막 등의 조직)으로 직접 전달된다. 그러나, 특정한 상황에서는, 또 다른 경로, 예를 들어 피하, 췌장내, 비내, 비경구, 정맥내, 근육내, 경막내, 또는 경구, 복강내, 또는 흡입을 통해 rAAV-기반 치료 구축물을 별도로 또는 추가로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미국 특허 번호 5,543,158; 5,641,515 및 5,399,363 (이들 각각은 전문이 본원에 구체적으로 참고로 포함됨)에 기재된 투여 방식을 이용하여 rAAV를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 투여 방식은 유리체내 주사 또는 망막하 주사에 의한 것이다.

주사 사용에 적합한 제약 형태는 멸균성 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균성 수성 용액 또는 분산액 및 멸균성 분말을 포함한다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 일상적인 보관 및 사용 조건하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 여러 경우에, 상기 형태는 멸균성이고, 시린지에서 용이하게 사용가능한 정도의 유체이다. 이는 제조 및 보관 조건하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항미생물제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 여러 경우에, 등장성제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴의 조성물에서 사용함으로써 이루어질 수 있다.

주사가능한 수성 용액의 투여를 위해, 예를 들어 상기 용액은 필요에 따라 적합하게 완충될 수 있고, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코스에 의해 등장성으로 만든다. 이들 특별한 수성 용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 대해 특히 적합하다. 이와 관련하여, 적합한 멸균성 수성 매질을 이용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 용량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있고, 1000 ml의 대량 피하 주입 유체에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참고). 숙주의 상태에 따라 용량에서의 일부 편차가 반드시 발생할 것이다. 투여 담당자는 임의의 경우에 개별 숙주에 대해 적절한 용량을 결정할 것이다.

멸균성 주사가능한 용액은 활성 rAAV를 필요한 양으로 적절한 용매 중에 필요에 따라 본원에 나열된 다양한 다른 성분과 함께 도입한 후, 멸균 여과함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 상기 나열된 것들로부터의 기본 분산 매질 및 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균성 비히클에 다양한 안정화된 활성 성분을 도입시킴으로써 제조된다. 멸균성 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균성 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

본원에 개시된 rAAV 조성물은 또한 중성 형태 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 제약상 허용가능한 염에는 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성됨)이 포함되고, 이는 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된다. 유리 카르복실산에 의해 형성된 염 또한 무기 염기, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제형화시, 용액은 투약 제형과 상용성인 방식으로 및 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투약 형태, 예컨대 주사가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등으로 용이하게 투여된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분 또한 조성물에 도입될 수 있다. 문구 "제약상 허용가능한"은 숙주에게 투여시 알러지 또는 유사한 부작용을 일으키지 않는 분자 개체 및 조성물을 지칭한다.

본 개시내용의 조성물을 적합한 숙주 세포에 도입하기 위해 전달 비히클, 예컨대 리포솜, 나노캡슐, 미세입자, 미세구, 지질 입자, 소포 등을 이용할 수 있다. 특히, rAAV 벡터 전달된 트랜스진은 전달을 위해 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구, 또는 나노입자 등으로 캡슐화되어 제형화될 수 있다.

이러한 제형은 본원에 개시된 핵산 또는 rAAV 구축물의 제약상 허용가능한 제형을 도입하는데 바람직할 수 있다. 리포솜의 제형화 및 사용은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 최근에, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖는 리포솜이 개발되었다 (미국 특허 번호 5,741,516). 추가로, 잠재적인 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 기재되었다 (미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587).

리포솜은 일반적으로 다른 절차에 의한 형질감염에 대해 내성인 수많은 세포 유형을 이용하여 성공적으로 사용되었다. 또한, 리포솜은 바이러스-기반 전달계에서 전형적인 DNA 길이에 대한 제약이 없다. 리포솜은 유전자, 약물, 방사선 치료제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테릭 이펙터를 다양한 배양된 세포주 및 동물에 도입하기 위해 효과적으로 사용되었다. 또한, 리포솜-매개된 약물 전달의 유효성을 실험하는 몇몇 성공적인 임상 시험이 완료되었다.

리포솜은 수성 매질에 분산되고 다층형 동심원성 이중층 소포 (다층형 소포 (MLV)로도 지칭됨)를 자발적으로 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV를 초음파로 처리하여, 200 내지 500 Å 범위의 직경을 가지며 코어에 수성 용액을 함유하는 작은 단층형 소포 (SUV)를 형성한다.

대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제형을 사용할 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 물질을 포착할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자 (대략 0.1 μm 크기)는 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 고안되어야 한다. 이들 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자의 사용이 고려된다.

키트 및 관련 조성물

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 치료, 진단 또는 연구 적용에서의 사용을 용이하게 하기 위해 제약 또는 진단 또는 연구 키트로 조립될 수 있다. 키트는 본 개시내용의 성분을 하우징하는 하나 이상의 용기 및 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 구체적으로, 이러한 키트는 본원에 기재된 1종 이상의 작용제를 이들 작용제의 의도된 적용 및 적절한 사용에 대해 기재하는 지침서와 함께 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 키트 중의 작용제는 작용제의 특별한 적용 및 투여 방법에 적합한 제약 제형 및 용량을 가질 수 있다. 연구 목적을 위한 키트는 다양한 실험을 수행하기에 적절한 농도 및 양으로 성분들을 함유할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV를 생성하는 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 sFasL 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 하우징하는 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 AAV2 캡시드 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 1)을 코딩하는 단리된 핵산을 하우징하는 용기를 추가로 포함한다.

키트는 연구자에 의한 본원에 기재된 방법의 이용을 용이하게 하도록 고안될 수 있으며, 여러 형태를 가질 수 있다. 키트의 각각의 조성물은 적용가능한 경우 액체 형태 (예를 들어, 용액) 또는 고체 형태 (예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정한 경우에, 일부 조성물은 예를 들어 키트와 함께 제공되거나 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종 (예를 들어, 물 또는 세포 배양 매질)의 첨가에 의해 (예를 들어, 활성 형태로) 구성가능하거나 또는 달리 가공가능할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "지침서"는 지침 및/또는 홍보의 구성요소를 정의할 수 있고, 전형적으로 본 개시내용의 패키징에 대한 또는 그와 관련된 서면 지침서를 포함할 수 있다. 지침서는 또한 상기 지침서가 키트와 관련된 것임을 사용자가 명확하게 인식하도록 임의의 방식으로, 예를 들어 시청각 자료 (예를 들어, 비디오테이프, DVD 등), 인터넷, 및/또는 웹-기반 정보통신 등으로 제공된 임의의 구두 또는 전자 지침서를 포함할 수 있다. 서면 지침서는 제약학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지정된 형태를 가질 수 있고, 지침서는 또한 동물 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인을 반영할 수 있다.

키트는 하나 이상의 용기 내에 본원에 기재된 임의의 1종 이상의 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 키트는 키트의 1종 이상의 성분을 혼합하고/거나 샘플을 분리 및 혼합하고, 대상체에게 적용하는 것에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 작용제를 하우징하는 용기를 포함할 수 있다. 상기 작용제는 액체, 겔 또는 고체 (분말)의 형태를 가질 수 있다. 상기 작용제는 멸균적으로 제조되고, 시린지에 포장되고, 냉장 운반될 수 있다. 대안적으로, 이는 보관을 위해 바이알 또는 다른 용기에 하우징될 수 있다. 제2 용기는 멸균적으로 제조된 다른 작용제를 가질 수 있다. 대안적으로, 키트는 미리 혼합되고 시린지, 바이알, 튜브 또는 다른 용기로 운반되는 활성 작용제를 포함할 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시양태가 하기 실시예에 더욱 상세하게 기재될 것이다. 이들 실시양태는 본 발명을 예시하는 것이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 예시적인 실시양태로 제한되지 않음을 인식할 것이다.

실시예

실시예 1 : 높은 수준의 mFasL은 Fas-매개된 아폽토시스성 및 비-아폽토시스성 염증 경로의 활성화와 동시에 일어난다

물질 및 방법

동물

모든 동물 실험은 쉐펜스 아이 리서치 인스티튜트(Schepens Eye Research Institute)에서 국제 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인받았고, 시력 및 안과 연구 위원회(Association of Research in Vision and Ophthalmology, 매릴랜드주 록빌)의 지침하에 수행되었다. DBA/2J-Gpnmb⁺/SjJ 마우스 (D2-Gp)를 구입하였다. ΔCS 파운더 마우스를 잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories)로부터 구입한 DBA/2J 마우스와 10 세대 동안 교배시킴으로써 ΔCS 돌연변이를 발현하는 DBA/2J 마우스를 생성하였다. 10 세대 이후, ΔCS 돌연변이에 대해 이형접합성인 D2.ΔCS 마우스를 이종교배시켜, ΔCS 돌연변이에 대해 동형접합성인 D2.ΔCS (D2.ΔCS) 마우스 및 WT 한배 새끼 (D2)를 생성하였다. 3종의 모든 유전자형 (D2, D2.ΔCS, 및 D2.Gp)을 하우징하여, 쉐펜스 아이 리서치 인스티튜트에서 AAALAC 승인된 동물 시설에서 주기적인 광 (12L-30 lux:12D) 조건하에 유지하였다.

IOP 측정

반동 토노랩(TonoLab) 안압계 (콜로니얼 메디컬 서플라이(Colonial Medical Supply), 핀란드 에스푸)를 이용하여 IOP를 측정하였다. 마우스를 정밀 증발기에 의해 전달되는 100% 산소 중 3% 이소플루란 (유도)에 이어서 100% 산소 중 1.5% 이소플루란 (유지)에 의해 마취시켰다. 동물이 발가락 꼬집음 반사 또는 꼬리 꼬집음 반응을 상실한 지 2 내지 3 분 후에, IOP 측정을 시작하였다. 마취된 마우스를 플랫폼에 놓고, 압력 감지기의 첨단을 중심 각막으로부터 대략 1/8 인치에 두었다. 평균 IOP는 6회 측정 이후 최고 및 최저 값을 제거한 후에 자동으로 표시되었다. 이러한 기계-발생 평균을 하나의 판독치로 간주하였고, 각각의 눈에 대해 6개의 판독치를 수득하였다. D2.Gp, D2, 및 D2.ΔCS 마우스의 경우, IOP를 개월당 한번 측정하였다. 마이크로비드 연구를 위해, 마이크로비드를 주사하기 하루 전에 기준선 IOP를 수득한 다음, 마이크로비드를 주사한 후 3 일마다 IOP를 측정하였다. 하루에 걸쳐 IOP에 편차가 있을 수 있기 때문에, 하루중 동일한 시간에 (10:00 시 내지 12:00 시) 모든 IOP를 수득하였다.

망막 신경절 세포의 정량화

신경 망막을 단리하고, 실온에서 2 시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 망막 플랫 마운트를 RGC-특이적 마커 및 β-III-튜불린에 대한 일차 항체 (밀리포어(Millipore), 메사추세츠주 빌레리카)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594-접합된 이차 항체 (인비트로젠)를 이차 항체로서 사용하였다. 핵을 DAPI로 대조염색하였다. 60X 유침을 사용하였고, 각각의 사분면 내에 4-5개의 영상을 갖는 16개의 중복되지 않는 영상을 수득하였다. β-III-튜불린 항체에 의해 양성으로 표지된, 신경절 세포층에 있는 모든 세포를 카운트하였다. 이미지 제이(Image J) 소프트웨어를 이용하여 망막 면적을 측정하고, RGC 밀도/㎟망막을 계산하였다.

시신경 축삭돌기의 정량화

축삭돌기의 정량화를 위해, 시신경을 절개하여 밤새 카르노브스키(Karnovsky) 시약 (인산염 완충제 중 50%)에 고정시켰다. 준초박 신경 횡단면을 눈알로부터 1.0 mm 후방에서 취하였고, 이를 절개하여 밤새 카르노브스키 용액 (인산염 완충제 중 50%)에 고정시켰다. 초박 (60-90 nm) 시신경 횡단면을 제조하였고, 광현미경에 의한 평가를 위해 1% p-페닐렌디아민 (PPD)으로 염색하였다. 10개의 중복되지 않는 현미경 사진을 시신경 횡단면의 전체 면적을 커버하는 100X 배율에서 수득하였다. 각각의 시신경 횡단면의 총 면적을 이미지 제이 소프트웨어를 이용하여 측정하였고, 이 값을 이용하여 시신경 횡단면당 전체 축삭돌기 밀도를 추정하였다.

TUNEL 염색

아폽토시스성 세포를 TUNEL 염색에 의해 평가하였다. 눈을 적출하고, 10% 포르말린에 고정하였다. 눈을 가공하였고, 슬라이드 상에 탑재된 20 μm 파라핀 절편을 염색을 위해 사용하였다. 상기 절편을 제조자의 프로토콜에 따라 TUNEL에 대해 염색하기 전에 탈파라핀화시켰다 (인 시츄 셀 데쓰 디텍션 키트(In Situ Cell Death Detection Kit); 로쉐 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 독일 만하임, 11684795910). 상기 절편을 DAPI를 갖는 벡터쉴드 마운팅 미디엄(VECTARSHIELD Mounting Medium) (벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories), H-1200)을 이용하여 탑재시켰다. 절편을 세척하고, 커버를 벗기고, 공초점 레이저 주사 현미경 (레이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems), SP6 소프트웨어를 이용하여 가공함)에 의해 실험하였다.

정량적 RT-PCR

안락사 시점에서, 마취된 마우스의 좌심실을 10 ml의 1xPBS로 관류시켰다. 관류한 후, 눈을 적출하고, 제조자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 알엔이지(Qiagen RNeasy) 미니 키트 (Cat # 74104)를 이용하여 RNA를 신경 망막으로부터 단리하였다. RNA를 DNAse (Cat # AM222, 인비트로젠)로 처리하여, 게놈 DNA가 오염되지 않도록 하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 바이오-라드(Bio-Rad)로부터의 아이스크립트(iScript) cDNA 합성 키트 (Cat # 170-8890)에 의해 500ng의 RNA를 이용하여 cDNA를 제조하였다. cDNA를 RNaseH (18021-014, 인비트로젠)로 처리하여, 단일 가닥 RNA가 부재하도록 하였다. 제조자의 프로토콜을 이용하여 인비트로젠으로부터의 마스터 믹스 (Cat # 4472903)를 10μl의 총 부피로 이벌식으로 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 하우스키핑 유전자 β-액틴에 대한 상대적인 발현을 하기 식을 이용하여 정량화하였다: 상대적인 발현 =10,000 x 1/2^(평균 유전자 cT - 평균 β-액틴 cT). 사용된 모든 프라이머를 표 1에 열거하였다.

표 1. 실시간 PCR을 위해 사용된 RNA 프라이머의 목록.

웨스턴 블롯 분석

D2, D2.Gp 및 D2.ΔCS 마우스의 후분절에서 총 FasL 발현을 평가하기 위해, 단백질 용해물 (20μg/샘플)을 후방 안배 (신경 망막, 맥락막 및 공막)로부터 제조하였다. AAV2 처리된 눈의 신경 망막에서 sFasL의 과발현을 평가하기 위해, 단백질 용해물 (5ug/샘플)을 신경 망막으로부터만 제조하였다. 단백질을 12% 트리스-글리신 겔 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 상에서 분리하고, 폴리비닐리덴 디플오라이드 막 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)으로 옮겼다. 폴리클로날 토끼 항-Fas 리간드 항체에 이어서 IRDye 이차 항체 (LI-COR 바이오테크놀로지(LI-COR Biotechnology), 네브래스카주 링컨)를 이용하여 Fas 리간드에 대해 상기 막을 프로빙하였다. 마우스 β 액틴을 이용하여 동등한 부하를 평가하였다. LI-COR 오디세이(Odyssey) 영상화 시스템 (LI-COR 바이오테크놀로지, 네브래스카주 링컨)을 이용하여 각각의 블롯을 전개시켰다. 이미지 스튜디오(Image Studio) 소프트웨어를 이용하여 농도계측을 수행하였다. sFasL 또는 mFasL을 과발현하는 L5178Y-R 종양 형질감염체를 양성 대조군으로 사용하고, FasL-KO 마우스로부터 제조된 후방 안배로부터 제조된 단백질 용해물을 음성 대조군으로 사용하였다.

통계

모든 데이터를 평균 ± SEM으로 나타내었다. 그래프 패드 프리즘 6 (미국 캘리포니아주 라호이야). 비교를 위해, D2-AAV2.eGFP 및 D2-AAV2.sFasL에 대해서는 이원 ANOVA, 일원 ANOVA 및 터키(Tukey) 다중-비교 검사를 이용하고, 상승된 IOP의 마이크로비드-유도된 모델에 대해서는 사이닥(Sidak) 다중-비교 검사를 이용하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다.

결과

D2.ΔCS 마우스에서 가속된 녹내장

각각 홍채 간질 위축 및 색소 분산을 촉발시키는 Gpnmb 및 Tyrp1 유전자에서의 돌연변이로 인해 DBA/2J (D2) 마우스에서 연령-관련 상승된 안내압 (IOP)이 자발적으로 발생하였다. 그 결과, D2 마우스에서 대략 6-8 개월령까지 상승된 IOP가 발생한 후, RGC 및 신경 섬유의 손실이 발생하였다. FasL의 막 형태만을 발현하는 DBA/2J 마우스 (D2.ΔCS)가 5 개월령째에 신경 섬유 층의 현저한 박막화를 나타내었고, WT FasL을 발현하는 D2 마우스에서는 박막화가 나타나지 않았음이 입증되었다. 신경 섬유 층의 조기 박막화는 녹내장의 발생이 가속되었음을 시사하였다.

D2.ΔCS 마우스에서 녹내장의 가속된 발생을 입증하기 위해, 어린 및 늙은 D2.ΔCS 마우스에서의 질환 진행을 WT FasL을 발현하는 D2 한배 새끼 (양성 대조군), 및 정상 Gpnmb 유전자 (D2-Gp)를 발현하고, Tyrp1 돌연변이로 인해 매우 경증의 홍채 질환이 발생하지만, 상승된 안내압 (IOP) 또는 녹내장은 나타내지 않는 DBA/2J 유사 유전자형 마우스 (음성 대조군)와 비교하였다. 3, 6 및 9 개월령째에 반동 안압계를 이용하여 IOP를 측정하였다 (도 1a). 음성 대조군 D2.Gp 마우스와 비교시, D2 및 D2.ΔCS 마우스는 6 개월령째에 시작하는 상승된 IOP를 나타내었다. 그러나, 임의의 연령의 D2 마우스와 D2.ΔCS 마우스 사이에는 IOP에 있어서 유의한 차이가 없었으며, 이는 ΔCS 돌연변이가 IOP에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.

D2.ΔCS 마우스에서 RGC 및/또는 축삭돌기의 손실이 가속되었는지 여부를 결정하기 위해, 마우스의 그룹들을 3 및 6 개월령째에 안락사시키고, 망막 플랫 마운트를 RGC-특이적 마커 βIII 튜불린으로 염색하여 RGC 밀도를 평가하였고, 시신경 절편을 파라페닐렌디아민 (PPD)으로 염색하여 축삭돌기 밀도를 평가하였다. D2 마우스에서 RGC 및 축삭돌기의 손실은 연령과 관련이 있으며, >8 개월령의 마우스에서만 발생하였다. 따라서, 3 및 6 개월령째에, D2.Gp 마우스와 비교시, D2는 RGC (도 1b-1c) 또는 축삭돌기 (도 1d-1e)의 유의한 손실을 나타내지 않았다. 대조적으로, D2.ΔCS 마우스는 6 개월째에 RGC (도 1b-1c) 및 축삭돌기 (도 1d-1e)의 조기 손실을 나타내었고, 이는 D2.ΔCS 마우스에서 절단 불가능한 FasL의 발현이 녹내장의 가속된 발생을 일으켰음을 나타낸다.

D2.ΔCS 마우스에서 RGC의 가속된 사멸이 아폽토시스로 인한 것임을 입증하기 위해, 3 및 6 개월령의 D2, D2.ΔCS 및 D2.Gp 마우스로부터의 망막 절편에 대해 TUNEL 염색을 수행하였다. D2 및 D2.Gp 마우스와 비교시, 3 개월령 (도 2a-2b) 및 6 개월령 (도 2c-2d) 둘 다에서 D2.ΔCS의 RGC 층에서 TUNEL+ 세포가 검출되었다. 더욱이, 6 개월령째에, D2.ΔCS 마우스에서 검출된 TUNEL 양성 세포는 더이상 RGC 층으로 제한되지 않았다 (도 2c). 종합하면, 이들 결과는 D2.ΔCS 마우스가 아폽토시스 및 축삭돌기 손실을 통해 RGC의 조기 사멸을 나타내어, 녹내장의 가속된 발생을 일으켰음을 나타낸다.

D2.ΔCS 마우스에서 Fas, FasL 및 FADD의 발현

D2 및 D2.ΔCS 마우스에서 Fas-유도된 아폽토시스 경로의 성분에 대한 상승된 IOP의 효과를 결정하기 위해, Fas, FasL 및 FADD의 mRNA 수준에 대한 정량적 RT-PCR에 의해 망막을 분석하였고, 웨스턴 블롯을 이용하여 mFasL 및 sFasL의 상대적인 발현을 측정하였다.

D2, D2.ΔCS 또는 D2.Gp 마우스에서 3 또는 6 개월령째에 Fas mRNA 발현에서의 유의한 차이가 없었다 (도 3a). 대조적으로, 6 개월령의 D2.ΔCS 마우스는 Fas-유도된 아폽토시스의 외인성 경로의 매개자인 FasL 및 FADD에 대한 mRNA의 유의한 증가를 나타내었다 (도 3b-3c). 6 개월령의 D2.ΔCS 마우스에서 mFasL 발현은 검출되는 반면에 sFasL 발현은 검출되지 않았기 때문에 (도 3d-3f), FasL의 증가는 mFasL의 증가된 발현으로 인한 것이었다. FasL의 검출 불가능한 발현은 망막 내에서 sFasL의 발현을 방지하는 D2.ΔCS 마우스에서 FasL 절단 부위의 녹-인 돌연변이와 일치한다. 또한, 이 실험은 FasL에 대한 WT 대립 유전자를 보유한 마우스 (D2.Gp 및 D2 마우스)에서 sFasL이 망막에서 발현되는 FasL의 우세한 형태임을 나타내었고, 이는 눈에서 항상성 조건하에 대부분의 FasL이 가용성 형태로 절단됨을 나타낸다.

종합하면, 이들 데이터는 6 개월의 D2-ΔCS 마우스에서 관찰되는 RGC의 가속된 손실이 mFasL의 증가된 발현, 및 Fas-유도된 아폽토시스의 외인성 경로의 매개자의 유도와 동시에 일어남을 입증한다.

D2-ΔCS 마우스에서 뮬러 세포 활성화

모든 망막 층에 걸쳐 있는 뮬러 세포는 망막의 주요 신경교 세포를 구성하고, 망막 뉴런에 대한 지지체를 제공한다. 정상 망막에서, 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP)은 신경 섬유 층에서 성상세포 및 뮬러 세포 엔드 피트에 의해 발현된다. 그러나, 녹내장에서는, GFAP 발현이 반응성 신경아교종의 결과로서 뮬러 세포에서 유의하게 증가하며, 이는 신경세포염증의 지표로서 간주된다.

D2.ΔCS 마우스에서 녹내장의 가속된 발생이 염증전 뮬러 세포의 조기 활성화와 동시에 일어나는지 여부를 결정하기 위해, RT-PCR에 의해 및 항-GFAP 항체를 이용하는 면역조직화학 염색에 의해 D2, D2.ΔCS 및 D2.Gp 마우스에서 3 및 6 개월령째에 망막에서의 GFAP 발현을 측정하였다. 3 개월령째에, GFAP 발현은 3종의 모든 마우스 그룹에서 신경 섬유 층의 성상세포 및 뮬러 세포 엔드 피트로 제한되었고, D2, D2.ΔCS 및 D2.Gp 마우스들 사이에는 GFAP의 발현에 있어서 유의한 차이가 없었다 (도 4a-4b). 그러나, D2 및 D2.Gp 마우스와 비교시, 6 개월령까지, D2.ΔCS 마우스에서는 GFAP의 발현이 더이상 신경 섬유 층의 성상세포 및 뮬러 엔드 피트로 제한되지 않았고, 망막 뮬러 세포의 전체 길이에 걸쳐 연장되었으며, 이는 GFAP mRNA 수준에서의 유의한 증가와 동시에 일어났다 (도 4a-4b). GFAP에서의 증가는 D2 및 D2.Gp 마우스와 비교시 D2.ΔCS 마우스에서의 TNFα mRNA 수준에서의 유의한 증가와 동시에 일어났다 (도 4c). TNFα는 녹내장에서 활성화된 신경교 세포에 의해 생성되고, 신경교 활성화, 염증, 및 RGC 사멸의 매개와 연결된다. 이들 데이터는 높은 수준의 mFasL을 발현하는 D2.ΔCS 마우스에서 RGC의 가속된 손실이 RGC의 아폽토시스의 유도 뿐만 아니라 신경교 활성화 및 TNFα 유도와 동시에 일어남을 나타낸다. 따라서, D2.ΔCS 마우스에서 높은 수준의 mFasL은 Fas-매개된 아폽토시스성 및 비-아폽토시스성 염증 경로의 활성화와 동시에 일어난다.

실시예 2 : sFasL의 전달은 녹내장의 마우스 모델에서 치료 효과를 제공한다

물질 및 방법

바이러스 벡터 구축

아데노-연관 벡터인 scAAV2-CB6-PI-eGFP 및 scAAV2-CB6-PI-sFasLecto를 제조하였다. scAAV2-CB6-PI-sFasLecto 벡터는 서열식별번호: 5에 제시된 핵산 서열을 갖는다. 시드 플라스미드 pAAVsc CB6 PI sFasLecto는 pcDNA3-sFasL-ecto + 5' mGCSF로부터 sFasL ecto 5'GCSF의 전체 cDNA 서열에 상응하는 582 bp 단편을 단리함으로써 제조하였다. 582 bp 단편을 BamHI, HindIII 이중 소화 및 안타르틱(Antartic) 포스파타제 처리된 pAAVsc-CB6-PI 플라스미드에 라이게이션하였다 (T4 리가제 NEB #M0202). 라이게이션 혼합물의 분취량을 이. 콜라이(E.coli) 적격 세포로 형질감염시키고, LB-한천 + 50 ug/ml 카르베니실린 상에 두었다. 콜로니를 채취하여, LB-카르베니실린 배지에서 성장시키고, 플라스미드 미니-프렙을 제한 효소 및 시퀀싱에 의해 검사하였다. 대규모의 플라스미드를 1 리터의 박테리아 배양물로부터 제조하고, ZR 플라스미드 기가프렙 키트 (#D4056, 자이모 리써치(Zymo Research), 캘리포니아주 어빈)를 이용하여 단리하였다.

유리체내 주사

각막 윤부-평행 결막 혈관 바로 뒤쪽에서 유리체내 주사를 수행하였다. 마우스의 양쪽 눈에 AAV2CB6.sFasL (3x10⁹ PFU/ml) 또는 AAV2CB6.eGFP (3x10⁹ PFU/ml)를 함유하는 1μl 유리체내 주사를 제공하였고, 멸균성 생리 식염수를 비히클 대조군으로 사용하였다.

결과

AAV2를 이용하는 sFasL의 유리체내 전달

본원에서 나타낸 바와 같이, FasL의 막-결합된 형태는 아폽토시스 유도 및 염증전 시토카인 생성 둘 다를 담당한다. 따라서, D2.ΔCS 마우스에서 녹내장의 악화된 발생은 절단되지 않은 mFasL의 증가된 발현에 의해 쉽게 설명된다. 그러나, sFasL은 mFasL 길항제로서 작용하고 실제로 FasL-유도된 염증을 차단하는 것으로 확인되었다.

sFasL이 녹내장에서 mFasL의 효과도 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2) 벡터를 사용하여 단일 유리체내 주사를 통해 sFasL을 D2 마우스의 RGC에 전달하였다. 마우스에서 AAV2 벡터의 유리체내 투여가 기본적으로 오래 생존한 RGC 및 내핵층 세포의 형질도입을 일으킴이 입증되었다. 그 결과, AAV2를 사용하는 유전자 전달은 장기간 지속되는 발현을 제공할 수 있다.

망막 세포가 AAV2에 의해 형질도입되었는지 여부를 평가하기 위해, eGFP만을 발현하는 AAV2 벡터 (AAV.eGFP)를 2 개월령의 D2 마우스의 유리체내로 주사하였다. 공초점 현미경을 사용하여 주사후 2 주째에 망막 전체 마운트에서 eGFP 발현을 평가하였고, 망막을 통해 균일한 eGFP 분포를 나타내었다 (도 5a). 망막의 횡단면 재구성은 신경절 세포층 및 내핵층을 통해 강력한 eGFP 발현을 나타내었다 (도 5b). D2 마우스에게 AAV2.sFasL의 유사한 주사를 제공하였고, AAV2.eGFP로 처리된 D2 마우스 또는 주사하지 않은 대조군 마우스와 비교시, 신경 망막에서 sFasL의 웨스턴 블롯 분석은 주사후 2 주째만큼 조기에 sFasL 발현에서의 유의한 증가를 나타내었다 (도 5c). 더욱이, 망막에서 sFasL의 증가가 단일 주사 이후 연구하는 내내 (8 개월) 일정한 수준으로 지속되었다. IOP의 매월 모니터링은 주사하지 않은 대조군 D2 마우스와 AAV2.eGFP 또는 AAV2.sFasL로 처리한 D2 마우스 사이에서 임의의 IOP 수준에 있어서 유의한 차이를 나타내지 않았다 (도 5d). 또한, 9 개월령째에 수득한 대표적인 세극등 영상은 주사하지 않은 대조군 D2 마우스와 AAV2.eGFP 또는 AAV2.sFasL로 처리한 D2 마우스 사이에서 홍채 색소 분산 또는 홍채 위축의 중증도에 있어서 차이를 나타내지 않았다 (도 5d).

종합하면, 이들 결과는 D2 마우스에게 AAV2.sFasL의 단일 유리체내 주사가 내부 망막 내에서 높은 수준의 sFasL의 장기간 안정한 발현을 제공하고, 이는 홍채 색소 분산, 홍채 위축, 및 상승된 IOP의 발생에 영향을 미치지 않음을 입증한다.

AAV2.sFasL의 유리체내 전달은 D2 마우스에서 RGC 및 축삭돌기의 손실을 예방한다

sFasL의 과발현이 D2 마우스에서 RGC 및 축삭돌기의 손실을 예방하는지 여부를 결정하기 위해, 2 개월령째에 마우스에게 AAV2.sFasL를 유리체내로 주사하고, 8 개월 이후 10 개월령째에 안락사시켰다. RGC 밀도를 βIII 튜불린으로 염색된 망막 전체 마운트에서 측정하였고, 축삭돌기 밀도를 시신경 절편에서 측정하였다. D2.Gp 음성 대조군 마우스와 비교시, 녹내장이 발생한 D2-주사하지 않은 마우스와 D2 AAV2.eGFP 마우스 사이에서 RGC 및 축삭돌기 밀도 둘 다에 있어서 유의한 감소가 있었다 (도 6a-6b). 대조적으로, 녹내장이 발생하지 않은 D2.Gp 대조군 마우스와 비교시 AAV2.sFasL로 처리된 D2 마우스는 RGC 또는 축삭돌기 밀도에서 유의한 손실을 나타내지 않았다 (도 6a). 이들 데이터는 심지어 상승된 IOP의 존재하에서도 망막에서 sFasL의 과발현이 D2 마우스에서 녹내장의 발생, 및 RGC 및 축삭돌기의 손실을 예방하였음을 입증한다.

sFasL은 D2 마우스에서 염증전 뮬러 세포의 활성화를 예방한다

본원에서 나타낸 바와 같이, 녹내장에서 RGC의 손실은 GFAP를 발현하는 염증전 뮬러 세포의 활성화 및 TNFα의 유도와 동시에 일어난다. AAV2.sFasL 처리된 D2 마우스에서 녹내장의 부재가 감소된 뮬러 세포 활성화와 동시에 일어났는지 여부를 결정하기 위해, 뮬러 세포에서 GFAP 발현을 면역조직화학 염색에 의해 측정하였고, RT-PCR을 이용하여 10 개월령의 D2-비처리, D2.AAV2.eGFP, D2.AAV2.sFasL 및 D2.Gp 마우스의 신경 망막에서 GFAP 및 TNFα mRNA 발현을 측정하였다.

본원에서 나타낸 바와 같이, 녹내장이 발생한 D2-비처리 및 D2.AAV2.eGFP 마우스는 공초점 영상에서 확인되는 바와 같이 높은 수준의 GFAP를 발현하는 활성화된 염증전 뮬러 세포를 나타내고 (도 4d), RT-PCR에 의해 GFAP 및 TNFα mRNA 발현에서의 유의한 증가를 나타내었다 (도 4e-4f). 대조적으로, 녹내장이 발생하지 않은 D2.AAV2.sFasL 마우스에서는 뮬러 세포가 유의하게 적은 GFAP를 발현하고, TNFα mRNA 수준은 D2.Gp 정상 대조군 마우스에서 확인된 것과 동등하였다 (도 4d-4f). 이들 데이터는 D2.AAV2.sFasL 마우스에서 RGC 및 축삭돌기의 sFasL-매개된 보호가 염증전 뮬러 세포의 활성화의 예방과 동시에 일어남을 나타낸다.

sFasL은 D2 마우스에서 아폽토시스성 유전자의 상향조절 및 생존-촉진 유전자의 하향조절을 예방한다

녹내장에서, 아폽토시스의 외인성 및 내인성 경로 둘 다 RGC 아폽토시스의 매개자인 것으로 확인되었다. sFasL로의 처리가 아폽토시스의 외인성 및 내인성 경로 둘 다의 활성화를 억제하였는지 여부를 결정하기 위해, qRT-PCR을 10 개월령의 D2, D2.Gp, D2-AAV2.eGFP 및 D2-AAV2.sFasL 마우스로부터의 망막 조직에 대해 수행하여, 외인성 및 내인성 경로 둘 다에서 아폽토시스성 유전자 및 생존-촉진 유전자의 발현을 평가하였다. 10 개월령째에, 프로아폽토시스 매개자 Fas, FADD 및 BAX가 D2 및 D2-AAV2.eGFP 마우스에서 상승하였다 (도 7a). 그러나, AAV2.sFasL로의 처리는 이들 유전자의 상향조절을 예방하였고, D2-AAV2.sFasL 마우스에서 Fas, FADD 및 BAX의 mRNA 수준은 D2.Gp 대조군 마우스에서 검출된 수준과 동등하였다 (도 7a). 유사하게는, 생존-촉진 유전자 cFLIP, BCL2 및 cIAP-2의 수준 (도 7b)은 D2 및 D2 AAV2.eGFP 마우스에서 하향조절되었고, AAV2.sFasL로의 처리는 이들 유전자의 하향조절을 예방하였고, D2-AAV2.sFasL 마우스에서 cFLIP, Bcl2 및 cIAP2의 mRNA 수준은 D2.Gp 대조군 마우스에서 검출된 수준과 동등하였다. 이들 결과는 심지어 상승된 IOP의 존재하에서도 sFasL의 존재가 생존-촉진 유전자의 FasL-매개된 하향조절 및 아폽토시스성 유전자의 FasL 매개된 상향조절을 차단하였음을 입증한다.

실시예 3 : sFasL 처리는 RGC 손상의 증거 이후에 투여시 치료 효과를 제공한다

본원에 제공된 데이터는, 비처리 및 AAV2.eGFP 대조군 그룹과 비교시, AAV2.sFasL로의 D2 마우스의 처리가 RGC 및 그들의 축삭돌기에 대한 유의한 보호를 제공하였음을 나타낸다 (도 6a-6b). 그러나, 이들 마우스를 10 개월령까지만 추적 관찰하였다.

AAV2.sFasL 처리가 장기간 보호를 제공하고, RGC 및 축삭돌기의 사멸을 지연시키만 한 것이 아님을 입증하기 위해, 마우스의 그룹을 15 개월령까지 추적 관찰하였다. RGC 및 축삭돌기의 정량화는, D2-주사하지 않은 마우스 및 AAV2.eGFP 마우스와 비교시, 심지어 15 개월령째에도 AAV2.sFasL 처리된 D2 마우스가 RGC 및 축삭돌기의 유의한 보호를 계속해서 나타내었음을 밝혀 내었다 (도 8a-8b). 이들 데이터는, 심지어 상승된 IOP의 존재하에서도, AAV2.sFasL로의 녹내장 이전의 D2 마우스의 처리가 RGC 및 축삭돌기의 완전하고 지속적인 보호를 나타내었음을 입증한다.

그러나, 더욱 임상적으로 관련있는 질문은, AAV2.sFasL 처리가 RGC 손상이 검출된 이후에 제공되었을 때 유의한 보호를 제공할 수 있는지 여부이다. D2 마우스에서는 6 개월령만큼 조기에 RGC 아폽토시스의 증거가 기록되었고, 이는 본원에서 보고된 TUNEL 염색과 일치한다 (도 2a-2d). 따라서, 7 개월령의 D2 마우스를 음성 대조군으로서 AAV2.sFasL 또는 AAV2.eGFP로 처리하였고, 마우스를 15 개월령까지 추적 관찰하였다. 15 개월령째에 RGC 및 축삭돌기의 정량화는, 비처리 및 AAV2.eGFP 대조군 그룹과 비교시, RGC 및 축삭돌기 둘 다의 유의한 보존을 나타내었다 (도 8c-8d).

이들 데이터는, 심지어 RGC 손상의 증거 이후에 투여하였을 때에도, 신경 망막에서 sFasL의 과발현이 D2 마우스의 RGC 및 축삭돌기 둘 다에 대해 유의한 장기간 보호를 제공함을 입증한다.

실시예 4 : sFasL 처리는 녹내장의 마이크로비드-유도된 모델에서 치료 효과를 제공한다

물질 및 방법

상승된 IOP의 유도

프로파라카인 (0.5%; 보쉬 앤 롬(Bausch & Lomb), 플로리다주 탬파)의 국소 적용에 의해 보충되는 케타민 (100 mg/kg; 케타세트(Ketaset); 포트 다지 애니멀 헬쓰(Fort Dodge Animal Health), 아이오와주 포트 다지) 및 크실라진 (9 mg/kg; 트란퀴베드(TranquiVed); 베드코, 인크.(Vedco, Inc.), 미주리주 세인트 조셉)의 혼합물의 복강내 주사에 의해 마우스를 마취하였다. 외과적 현미경 하에서 각각의 동물의 우측 눈의 전안방에 폴리스티렌 마이크로비드 (플루오스피어즈(FluoSpheres); 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드; 15-μm 직경)를 주사하여 IOP의 상승을 한쪽에만 유도하였다. 간략히, 마이크로비드를 멸균성 생리 식염수 중에서 5.0 x 10⁶개 비드/mL의 농도로 제조하였다. 예리한 유리 마이크로피펫 (월드 프리시젼 인스트루먼츠 인크.(World Precision Instruments Inc.), 플로리다주 사라소타)을 사용하여 우측 각막의 중심 근처를 부드럽게 천공시켰다. 이렇게 생성된 구멍을 통해 적은 부피 (2 μL)의 마이크로비드를 전안방으로 주사한 후, 해밀턴(Hamilton) 시린지에 연결된 마이크로피펫을 통해 기포를 주사하였다. 염증의 징후 (각막의 혼탁, 부종성 각막 등)가 발생한 임의의 마우스는 연구로부터 배제시켰다.

결과

sFasL의 신경보호 효과가 녹내장의 DBA/2J 모델에서 고유한 것인지 여부를 결정하기 위해, sFasL이 상승된 IOP의 마이크로비드-유도된 마우스 모델에서 RGC 손실을 예방하는 능력을 조사하였다. C57BL/6 마우스에게 AAV2.eGFP 또는 AAV2.sFasL을 유리체내로 주사한 후, 음성 대조군으로서 마이크로비드 또는 식염수를 전안방으로 주사하였다.

AAV2 주사 이후 3 주째에, 웨스턴 블롯 분석에 의해 AAV2.eGFP 마우스와 비교시 AAV2.sFasL 마우스의 신경 망막에서 sFasL의 과발현이 확인되었다 (도 9a). 15μm 폴리스티렌 마이크로비드의 단일 전안방 주사는 식염수 대조군과 비교시 AAV2.eGFP 및 AAV2.sFasL 마우스 둘 다에서 21 일까지 상승된 IOP를 나타내었다 (도 9b). IOP는 마이크로비드 주사 이후 11 일째에 최고 높았고, AAV2.sFasL 또는 AAV2.eGFP 처리된 마우스 사이에서 마이크로비드-유도된 상승된 IOP의 시간 경과 또는 크기에서 유의한 차이가 없었다. 마이크로비드 주사 이후 4 주째에 RGC 밀도의 정량화는 식염수-주사된 대조군과 비교시 마이크로비드-주사된 AAV2.eGFP 처리된 마우스에서 RGC 밀도에 있어서 유의한 감소를 나타내었다 (도 9c-9d). 그러나, AAV2.sFasL로의 처리는 RGC를 보호하였고, 마이크로비드-주사된 AAV2.sFasL 마우스에서의 RGC 밀도는 식염수-주사된 대조군에서의 RGC 밀도와 동등하였다 (도 9c-9d). 유사한 결과가 시신경에서 관찰되었으며, AAV2.eGFP 처리된 대조군 그룹과 비교시 AAV2.sFasL 처리에 의해 축삭돌기의 완전한 보호가 제공되었다 (도 9e-9f).

이들 결과는 AAV2.sFasL이 상승된 IOP의 만성 DBA/2J 및 급성 마이크로비드-유도된 모델 둘 다에서 완전한 신경세포 보호를 제공함을 입증한다.

서열

서열식별번호: 1 - AAV 유형 2 캡시드 단백질 서열

서열식별번호: 2 - 인간 가용성 Fas 리간드 (수탁 번호: NM_000639.2; 핵산 잔기 576-1040) DNA 서열

서열식별번호: 3 - 인간 가용성 Fas 리간드 (수탁 번호: P48023.1; 아미노산 128-281) 단백질 서열

서열식별번호: 4 - 유인원 바이러스 40 (SV40) 프로모터 DNA 서열

서열식별번호: 5 - pAAVsc-CB6-PI-sFasLecto 벡터 서열

서열식별번호: 6 - 인간 Fas 리간드 (수탁 번호: P48023.1; 아미노산 1-281) 단백질 서열

서열식별번호: 7 - 인간 Fas 리간드 (수탁 번호: NM_000639.2; 핵산 잔기 195-1040) DNA 서열

다른 실시양태

본 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일한, 등가의 또는 유사한 목적으로 작용하는 대안적인 특징으로 교체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 나타내지 않는다면, 개시된 각각의 특징은 등가의 또는 유사한 특징들의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다. 상기 기재내용으로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 필수적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그의 개념 및 범위를 벗어나지 않고, 다양한 용법 및 조건에 적합화시키기 위해 본 개시내용의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시양태 또한 청구범위 내에 있다.

등가물 및 범위

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 개시내용의 구체적인 실시양태에 대한 여러 등가물을 인식할 것이고, 일상적인 실험만을 이용하여 그를 확인할 수 있을 것이다. 본 개시내용의 범위는 상기 기재내용으로 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 첨부된 청구범위에 기재된 바와 같다.

청구항에서, 단수 형태는 달리 나타내지 않거나 문맥상 달리 명백하지 않는다면 하나 이상을 의미할 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 및 기재는, 달리 나타내지 않거나 문맥상 달리 명백하지 않는다면, 그룹 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련이 있는 경우를 충족시키는 것으로 고려된다. 본 개시내용은 그룹 중 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련이 있는 실시양태를 포함한다. 본 개시내용은 그룹 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련이 있는 실시양태를 포함한다.

추가로, 본 개시내용은, 하나 이상의 열거된 청구항으로부터 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 설명 용어가 또 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함한다. 예를 들어, 또 다른 청구항의 종속항인 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항의 종속항인 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하는 것으로 변형될 수 있다. 요소들이 예를 들어 마쿠쉬 그룹 형식으로 목록으로 제시되는 경우, 상기 요소들의 각각의 하위 그룹 또한 개시되고, 임의의 요소(들)가 상기 그룹으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용 또는 본 개시내용의 측면이 특별한 요소 및/또는 특징을 포함하는 것으로 언급된 경우에는, 본 개시내용 또는 본 개시내용의 측면의 특정한 실시양태가 이러한 요소 및/또는 특징으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어짐을 이해해야 한다. 간략화를 위해, 이들 실시양태는 본원에 구체적으로 기재되지 않았다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적인 것으로 의도되고, 추가의 요소 및 단계의 포함을 허용한다는 것을 주목한다. 범위가 주어지는 경우에는, 종점이 포함된다. 또한, 달리 나타내지 않거나 문맥상 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 달리 명백하지 않는다면, 범위로 표현된 값들은 본 개시내용의 상이한 실시양태에서 명시된 범위 내에서 임의의 구체적인 값 또는 하위 범위를 문맥상 달리 명확하게 해석되지 않는다면 상기 범위의 하한의 1/10 단위까지 추정할 수 있다.

본 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 기사 및 다른 공보를 언급하며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다. 도입된 임의의 참고문헌과 본 명세서 사이에 모순이 있는 경우에는, 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 선행 기술에 속하는 본 개시내용의 임의의 특별한 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 배재될 수 있다. 이러한 실시양태가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 본원에 배재한다고 명시적으로 기재하지 않더라도 배재될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 특별한 실시양태는 선행 기술의 존재와 관련이 있건 없건간에 임의의 이유로 임의의 청구항으로부터 배재될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 대한 여러 등가물을 인식할 것이고, 일상적인 실험만을 이용하여 그를 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 실시양태의 범위는 상기 기재내용으로 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 첨부된 청구범위에 기재된 바와 같다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 청구범위에서 정의된 바와 같이, 본 개시내용의 개념 또는 범위를 벗어나지 않고 본 기재에 대해 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Massachusetts Massachusetts Eye and Ear Infirmary <120> AAV2-MEDIATED GENE DELIVERY OF SFASL AS A NEUROPROTECTIVE THERAPY IN GLAUCOMA <130> U0120.70085WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/511,629 <151> 2017-05-26 <150> US 62/358,541 <151> 2016-07-05 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 735 <212> PRT <213> adeno-associated virus 2 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 2 <211> 465 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 2 gagaagcaaa taggccaccc cagtccaccc cctgaaaaaa aggagctgag gaaagtggcc 60 catttaacag gcaagtccaa ctcaaggtcc atgcctctgg aatgggaaga cacctatgga 120 attgtcctgc tttctggagt gaagtataag aagggtggcc ttgtgatcaa tgaaactggg 180 ctgtactttg tatattccaa agtatacttc cggggtcaat cttgcaacaa cctgcccctg 240 agccacaagg tctacatgag gaactctaag tatccccagg atctggtgat gatggagggg 300 aagatgatga gctactgcac tactgggcag atgtgggccc gcagcagcta cctgggggca 360 gtgttcaatc ttaccagtgc tgatcattta tatgtcaacg tatctgagct ctctctggtc 420 aattttgagg aatctcagac gtttttcggc ttatataagc tctaa 465 <210> 3 <211> 154 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Glu Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu 1 5 10 15 Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro 20 25 30 Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys 35 40 45 Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val 50 55 60 Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu 65 70 75 80 Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr 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gacgcgcgag cgagcgagtg 120 actccggcgg gcccgtttcg ggcccgcagc ccgctggaaa ccagcgggcc ggagtcactc 180 gctcgctcgc gcgtctctcc gagtgtagcc atgctctagg aagatcaatt cggtacaatt 240 cacgcgtcga cattgattat tgactctggt cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 300 ctcacatcgg tacgagatcc ttctagttaa gccatgttaa gtgcgcagct gtaactaata 360 actgagacca gcaatgtatt gaatgccatt taccgggcgg tggctgaccg cccaacgacc 420 ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 480 ttgacgtcaa tgggtggagt accgactggc gggttgctgg ggcgggtaac tgcagttatt 540 actgcataca agggtatcat tgcggttatc cctgaaaggt aactgcagtt acccacctat 600 ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 660 attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattata aatgccattt gacgggtgaa 720 ccgtcatgta gttcacatag tatacggttc atgcggggga taactgcagt tactgccatt 780 taccgggcgg accgtaattg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 840 catctactcg aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccac 900 gggtcatgta ctggaatacc ctgaaaggat gaaccgtcat gtagatgagc tccggtgcaa 960 gacgaagtga gaggggtaga ggggggggag gggtggggca attttgtatt tatttatttt 1020 ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg 1080 gggcggggcg gggcgagggt taaaacataa ataaataaaa aattaataaa acacgtcgct 1140 acccccgccc cccccccccc cccccccgcg cgcggtccgc cccgccccgc cccgctccgg 1200 cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag 1260 tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctacc gccccgcccc gctccgcctc 1320 tccacgccgc cgtcggttag tctcgccgcg cgaggctttc aaaggaaaat accgctccgc 1380 cgccgccgcc gccgggatta aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac 1440 cgcggtggcg gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaaat 1500 ttttcgcttc gcgcgccgcc cgccctcgcc ctagtcggtg gcgccaccgc cgggatctca 1560 gctagctcct tgactttttg gtctttcaat tgaccattgt ttagtctttt tgtcttttat 1620 ttcaggtccc cggatccatg gctcaacttt ctgcccagag gcgcatgaag ctaatggccc 1680 tgcagctgct gctgtggcca aatcagaaaa acagaaaata aagtccaggg gcctaggtac 1740 cgagttgaaa gacgggtctc cgcgtacttc gattaccggg acgtcgacga 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ttaccagtgc 2640 tgaccattta tatgtcaaca tatctcaact ctctctgatc aattttgagg aatctaaggg 2700 tgtcgtcgat ggacccccgt cataagttag aatggtcacg actggtaaat atacagttgt 2760 atagagttga gagagactag ttaaaactcc ttagattcac ctttttcggc ttatataagc 2820 ttatcgatac cgtcgactag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 2880 ccatctgttg tttgcccctg gaaaaagccg aatatattcg aatagctatg gcagctgatc 2940 tcgagcgact agtcggagct gacacggaag atcaacggtc ggtagacaac aaacggggtc 3000 ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 3060 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctaag ggggcacgga aggaactggg 3120 accttccacg gtgagggtga caggaaagga ttattttact cctttaacgt agcgtaacag 3180 actcatccac agtaagattt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 3240 gggaagacaa ttaggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaaccaa 3300 gaccccccac cccaccccgt cctgtcgttc cccctcctaa cccttctgtt aatccatcta 3360 ttcatcgtac cgcccaatta gtaattgatg ttccttggcc tagtgatgga gttggccact 3420 ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 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Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys 20 25 30 Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro 50 55 60 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly 65 70 75 80 Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly 85 90 95 Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala 100 105 110 Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu 115 120 125 Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg 130 135 140 Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu 145 150 155 160 Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr 165 170 175 Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 180 185 190 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser 195 200 205 His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met 210 215 220 Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 225 230 235 240 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His 245 250 255 Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser 260 265 270 Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 <210> 7 <211> 846 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 7 atgcagcagc ccttcaatta cccatatccc cagatctact gggtggacag cagtgccagc 60 tctccctggg cccctccagg cacagttctt ccctgtccaa cctctgtgcc cagaaggcct 120 ggtcaaagga ggccaccacc accaccgcca ccgccaccac taccacctcc gccgccgccg 180 ccaccactgc ctccactacc gctgccaccc ctgaagaaga gagggaacca cagcacaggc 240 ctgtgtctcc ttgtgatgtt tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg 300 atgtttcagc tcttccacct acagaaggag ctggcagaac tccgagagtc taccagccag 360 atgcacacag catcatcttt ggagaagcaa ataggccacc ccagtccacc ccctgaaaaa 420 aaggagctga ggaaagtggc ccatttaaca ggcaagtcca actcaaggtc catgcctctg 480 gaatgggaag acacctatgg aattgtcctg ctttctggag tgaagtataa gaagggtggc 540 cttgtgatca atgaaactgg gctgtacttt gtatattcca aagtatactt ccggggtcaa 600 tcttgcaaca acctgcccct gagccacaag gtctacatga ggaactctaa gtatccccag 660 gatctggtga tgatggaggg gaagatgatg agctactgca ctactgggca gatgtgggcc 720 cgcagcagct acctgggggc agtgttcaat cttaccagtg ctgatcattt atatgtcaac 780 gtatctgagc tctctctggt caattttgag gaatctcaga cgtttttcgg cttatataag 840 ctctaa 846 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 gggacagtga cctggactgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 9 ctccctttgc agaactcagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 10 tgttaccaac tgggacgaca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 11 cttttcacgg ttggccttag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 12 ttctgatata gggtcctgc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 13 tcaccagatc caagaaactc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 14 caagctgagt gtaactgaag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 15 ttaaaaggca tcagcaagag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 16 ggcgctcaat gctggcttca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 17 tctgcctcca gcctcaggtt 20 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 18 agggtttcat ccaggatcga gcag 24 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 19 atcttccaga tggtgagcga g 21 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 20 ttgtggcctt ctttgagttc ggtg 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 21 ggtgccggtt caggtactca gtca 24 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 22 gaagttcccg gtttcctctc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 23 gagggcagga tctctcagtg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 24 tgtcagccaa gttcaagctg 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 25 atcttccgaa ctttctccag gg 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 26 tgggtagaca gcagtgccac 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 27 gcccacaaga tggacaggg 19 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 28 gtcctgcctc tggtgcttgc tg 22 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 29 caggttggca tggttga 17

Claims

녹내장의 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV는 (i) 캡시드 단백질 및 (ii) 가용성 Fas 리간드 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함하는 것인, 대상체에서 녹내장을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 대상체가 상승된 안내압 (IOP)을 갖는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체에게 또 다른 항녹내장 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 또 다른 항녹내장 치료제를 투여중이거나 또는 투여한 적이 있는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체의 눈에 단리된 핵산 또는 rAAV를 전달하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 주사, 임의적으로 망막하 주사 또는 유리체내 주사를 통한 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체의 눈으로의 국소 투여를 통한 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체에게 rAAV를 15 개월 내에 1회 이하로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 녹내장 질환 진행을 감소시키는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체에서 안내압을 저하시키는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체에서 망막 신경교 세포를 불활성화시키는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체에서 TNFα 활성을 억제하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 망막 신경절 세포 (RGC) 사멸을 감소시키고/거나 축삭 변성을 감소시키는 것인 방법.
Fas 리간드-의존성 염증 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV는 (i) 캡시드 단백질, 및 (ii) 가용성 Fas 리간드 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함하는 것인, Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법.
제15항에 있어서, Fas 리간드-의존성 염증 상태가 녹내장 또는 피부 루푸스인 방법.
(a) 대상체의 조직에서 막-결합된 Fas 리간드 (mFasL) 및/또는 가용성 Fas 리간드 (sFasL)의 존재 또는 부재를 검출하고,
(b) mFasL 및/또는 sFasL의 존재 또는 부재에 기초하여 대상체를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 대상체를 치료하는 것은 대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 rAAV는 (i) 캡시드 단백질, 및 (ii) sFasL 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함하는 것인, Fas 리간드-의존성 염증 상태를 치료하는 방법.
가용성 FasL (sFasL) 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 안내로 투여하는 것을 포함하는, 연령-관련 상승된 안내압을 가진 대상체에게 sFasL 또는 그의 단편을 투여하는 방법.
서열식별번호: 1에 제시된 서열을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 및
가용성 Fas 리간드 (sFasL) 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된 핵산
을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
제19항에 있어서, sFasL이 인간 sFasL인 rAAV.
제20항에 있어서, 인간 sFasL이 서열식별번호: 2에 제시된 핵산 서열 또는 서열식별번호: 3에 제시된 단백질 서열을 포함하는 것인 rAAV.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 2개의 AAV 반전 말단 반복부 (ITR)를 추가로 포함하고, 여기서 ITR은 트랜스진에 플랭킹되는 것인 rAAV.
제22항에 있어서, AAV ITR이 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5 및 AAV8로부터 선택된 1종 이상의 혈청형을 갖는 ITR인 rAAV.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열식별번호: 4에 제시된 프로모터 서열을 포함하는 것인 rAAV.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 눈으로 전달하도록 제형화된 rAAV.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항의 rAAV 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
서열식별번호: 5에 제시된 서열을 갖는 단리된 핵산.
제27항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
제27항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.