TW202130654A - 使用耳畸蛋白雙載體系統治療感覺神經性聽力損失之組合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示案之特徵在於藉助OTOF基因療法治療感覺神經性聽力損失及聽神經病變、尤其與耳畸蛋白(OTOF)突變相關之疾病形式之組合物及方法。本揭示案提供多種組合物，其包括含有編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之多核苷酸之第一核酸載體及含有編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之多核苷酸之第二核酸載體。該等載體可用於增加個體、例如患有感覺神經性聽力損失之人類個體中OTOF之表現。
Description
本文闡述藉助OTOF基因療法治療感覺神經性聽力損失及聽神經病變、尤其與耳畸蛋白(otoferlin，OTOF)突變相關之疾病形式之組合物及方法。本揭示案提供雙載體系統，其包括第一核酸載體，該第一核酸載體含有編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之多核苷酸；及第二核酸載體，該第二核酸載體含有編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之多核苷酸。該等載體可用於增加野生型OTOF之表現或向個體(例如患有感覺神經性聽力損失之人類個體)提供野生型OTOF。
感覺神經性聽力損失係一種由內耳細胞或自內耳投射至腦之神經通路之缺陷引起之聽力損失。儘管感覺神經性聽力損失通常係獲得性的且可由雜訊、感染、頭部創傷、耳毒性藥物或老化引起，但亦存在與體染色體隱性突變相關之先天性形式之感覺神經性聽力損失。體染色體隱性感覺神經性聽力損失之一種該形式與耳畸蛋白(OTOF)基因之突變相關，該耳畸蛋白基因參與習語前非綜合症狀性聽力損失。近年來，治療聽力損失之努力越來越多地集中在基因治療作為可能的解決方案上；然而，OTOF因太大而不允許使用標準基因治療方法來治療。需要新的治療劑來治療OTOF相關之感覺神經性聽力損失。
本發明係基於本發明人之發現：OTOF同功型5優先在非人類靈長類動物之內耳中表現，且人類OTOF同功型5而非人類OTOF同功型1能夠拯救經遺傳改造之具有耳畸蛋白缺陷之先天性耳聾小鼠之聽力。因此，本發明提供用於治療個體(例如人類個體)之感覺神經性聽力損失或聽神經病變之組合物及方法。本揭示案之組合物及方法係關於將編碼耳畸蛋白(OTOF)同功型5蛋白之多核苷酸遞送至患有感覺神經性聽力損失或聽神經病變或具有患上該疾病之風險之個體(例如具有OTOF突變之個體)的雙載體系統。舉例而言，使用本文所述之組合物及方法，各自編碼功能性OTOF同功型5蛋白之一部分之第一核酸載體(例如第一腺相關病毒(AAV)載體)及第二核酸載體(例如第二AAV載體)可藉助病毒基因療法遞送至個體。本文所述之組合物及方法亦可用於增加耳蝸毛細胞(例如內毛細胞)中WT OTOF蛋白(例如全長OTOF同功型5蛋白)之表現及/或治療患有感覺神經性聽力損失或具有患上該疾病之風險之個體，例如具有OTOF突變之個體。
在第一態樣中，本發明提供雙載體系統，其包括第一AAV載體，該第一AAV載體包含可操作連接至編碼耳畸蛋白(OTOF)同功型5蛋白之N端部分之第一編碼多核苷酸之Myo15啟動子、定位於第一編碼多核苷酸3’之剪接供體序列及定位於剪接供體序列3’之第一重組基因區；及第二AAV載體，該第二AAV載體包含第二重組基因區、定位於第二重組基因區3’之剪接受體序列、定位於剪接受體序列3’之編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之第二編碼多核苷酸及定位於第二編碼多核苷酸3’之聚(A)序列；其中編碼OTOF同功型5蛋白之第一編碼多核苷酸及第二編碼多核苷酸並不重疊，且其中第一及第二AAV載體皆不編碼全長OTOF同功型5蛋白。
在一些實施例中，第一AAV載體及第二AAV載體包括AAV1衣殼。
在一些實施例中，第一AAV載體及第二AAV載體包括AAV9衣殼。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：7或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之第一區，該功能性部分或衍生物包括連結(例如可操作連接)至第二區之SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之序列，該第二區與SEQ ID NO：8或其包括SEQ ID NO：14及/或SEQ ID NO：15之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)，視情況地含有連接體，該連接體包含第一區與第二區之間之1至100個核苷酸(例如1-5個、1-10個、1-15個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-60個、1-70個、1-80個、1-90個、10-20個、10-30個、10-40個、10-50個、10-60個、10-70個、10-80個、10-90個、10-100個、20-30個、20-40個、20-50個、20-60個、20-70個、20-80個、20-90個或20-100個核苷酸)。在一些實施例中，第一區包含SEQ ID NO：7之序列或由其組成。在一些實施例中，第二區包含SEQ ID NO：8之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：19之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：21之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：22之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：36之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：37之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：42之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：43之序列或由其組成。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：8或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之第一區，該功能性部分或衍生物包括連結(例如可操作連接)至第二區之SEQ ID NO：14及/或SEQ ID NO：15之序列，該第二區與SEQ ID NO：7或其包括SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)，視情況地含有連接體，該連接體包括第一區與第二區之間之1至100個核苷酸(例如1-5個、1-10個、1-15個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-60個、1-70個、1-80個、1-90個、10-20個、10-30個、10-40個、10-50個、10-60個、10-70個、10-80個、10-90個、10-100個、20-30個、20-40個、20-50個、20-60個、20-70個、20-80個、20-90個或20-100個核苷酸)。在一些實施例中，第一區包含SEQ ID NO：8之序列或由其組成。在一些實施例中，第二區包含SEQ ID NO：7之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：20之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：41之序列或由其組成。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：7或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域，該功能性部分或衍生物包括SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之序列。在一些實施例中，該區域包含SEQ ID NO：7之序列或由其組成。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：8或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域，該功能性部分或衍生物包括SEQ ID NO：14及/或SEQ ID NO：15之序列。在一些實施例中，該區域包含SEQ ID NO：8之序列或由其組成。
在一些實施例中，SEQ ID NO：7之功能性部分含有SEQ ID NO：9之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：7之功能性部分含有SEQ ID NO：10之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：7之功能性部分含有SEQ ID NO：9之序列及SEQ ID NO：10之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：7之功能性部分含有SEQ ID NO：11之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：7之功能性部分含有SEQ ID NO：12之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：7之功能性部分含有SEQ ID NO：13之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：7之功能性部分含有SEQ ID NO：33之序列。
在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：14之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：15之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：34之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：35之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：14之序列及SEQ ID NO：15之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：16之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：17之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：18之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分含有SEQ ID NO：38之序列。
在一些實施例中，Myo15啟動子與SEQ ID NO：33-41中任一者之核酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：33之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：34之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：35之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：36之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：37之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：38之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：39之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：40之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：41之序列或由其組成。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：23或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之第一區，該功能性部分或衍生物包括連結(例如可操作連接)至第二區之SEQ ID NO：25之序列，該第二區與SEQ ID NO：24或其包括SEQ ID NO：26及/或SEQ ID NO：27之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)，視情況地含有連接體，該連接體包含第一區與第二區之間之1至400個核苷酸(例如1-5個、1-10個、1-15個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-60個、1-70個、1-80個、1-90個、1-100個、1-125個、1-150個、1-175個、1-200個、1-225個、1-250個、1-275個、1-300個、1-325個、1-350個、1-375個、1-400個、10-20個、10-30個、10-40個、10-50個、10-60個、10-70個、10-80個、10-90個、10-100個、20-30個、20-40個、20-50個、20-60個、20-70個、20-80個、20-90個、20-100個、30-100個、40-100個、50-100個、50-150個、50-200個、50-250個、50-300個、50-350個、50-400個、100-150個、100-200個、100-250個、100-300個、100-350個、100-400個、150-200個、150-250個、150-300個、150-350個、150-400個、200-250個、200-300個、200-350個、200-400個、250-300個、250-350個、250-400個、300-400個或350-400個核苷酸)。在一些實施例中，第一區包含SEQ ID NO：23之序列或由其組成。在一些實施例中，第二區包含SEQ ID NO：24之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：31之序列或由其組成。在一些實施例中，Myo15啟動子包含SEQ ID NO：32之序列或由其組成。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：24或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之第一區，該功能性部分或衍生物包括連結(例如可操作連接)至第二區之SEQ ID NO：26及/或SEQ ID NO：27之序列，該第二區與SEQ ID NO：23或其包括SEQ ID NO：25之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)，視情況地含有連接體，該連接體包括第一區與第二區之間之1至400個核苷酸(例如1-5個、1-10個、1-15個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-60個、1-70個、1-80個、1-90個、1-100個、1-125個、1-150個、1-175個、1-200個、1-225個、1-250個、1-275個、1-300個、1-325個、1-350個、1-375個、1-400個、10-20個、10-30個、10-40個、10-50個、10-60個、10-70個、10-80個、10-90個、10-100個、20-30個、20-40個、20-50個、20-60個、20-70個、20-80個、20-90個、20-100個、30-100個、40-100個、50-100個、50-150個、50-200個、50-250個、50-300個、50-350個、50-400個、100-150個、100-200個、100-250個、100-300個、100-350個、100-400個、150-200個、150-250個、150-300個、150-350個、150-400個、200-250個、200-300個、200-350個、200-400個、250-300個、250-350個、250-400個、300-400個或350-400個核苷酸)。在一些實施例中，第一區包含SEQ ID NO：24之序列或由其組成。在一些實施例中，第二區包含SEQ ID NO：23之序列或由其組成。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：23或其包括SEQ ID NO：25之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域。在一些實施例中，該區域包含SEQ ID NO：23之序列或由其組成。
在一些實施例中，Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：24或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域，該功能性部分或衍生物包括SEQ ID NO：26及/或SEQ ID NO：27之序列。在一些實施例中，該區域包含SEQ ID NO：24之序列或由其組成。
在一些實施例中，SEQ ID NO：23之功能性部分含有SEQ ID NO：25之序列。
在一些實施例中，SEQ ID NO：24之功能性部分含有SEQ ID NO：26之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：24之功能性部分含有SEQ ID NO：27之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：24之功能性部分含有SEQ ID NO：26之序列及SEQ ID NO：27之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：24之功能性部分含有SEQ ID NO：28之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：24之功能性部分含有SEQ ID NO：29之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：24之功能性部分含有SEQ ID NO：30之序列。
在另一態樣中，本發明提供雙載體系統，其包括第一AAV1載體，該第一AAV1載體含有可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之第一編碼多核苷酸之遍在啟動子、定位於第一編碼多核苷酸3’之剪接供體序列及定位於剪接供體序列3’之第一重組基因區；及第二AAV1載體，該第二AAV1載體含有第二重組基因區、定位於第二重組基因區3’之剪接受體序列、定位於剪接受體序列3’之編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分的第二編碼多核苷酸及定位於第二編碼多核苷酸3’之聚(A)序列；其中編碼OTOF同功型5蛋白之第一編碼多核苷酸及第二編碼多核苷酸並不重疊，且其中第一及第二AAV1載體皆不編碼全長OTOF同功型5蛋白。
在一些實施例中，遍在啟動子係選自由以下組成之群：CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子及截短CMV-雞β-肌動蛋白啟動子(smCBA)。在一些實施例中，遍在啟動子係smCBA啟動子。在一些實施例中，smCBA啟動子包含SEQ ID NO：44之序列或由其組成。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一及第二重組基因區係相同的。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一重組基因區及/或第二重組基因區係AK重組基因區。在一些實施例中，AK重組基因區包含SEQ ID NO：47之序列或由其組成。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一重組基因區及/或第二重組基因區係AP基因片段。在一些實施例中，AP基因片段包含SEQ ID NO：48-53中任一者之序列或由其組成。在一些實施例中，AP基因片段包含SEQ ID NO：51之序列或由其組成。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一及第二編碼多核苷酸中之每一者編碼約一半的OTOF同功型5蛋白序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一編碼多核苷酸編碼SEQ ID NO：1之胺基酸1-802。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二編碼多核苷酸編碼SEQ ID NO：1之胺基酸803-1997。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一及第二編碼多核苷酸在OTOF外顯子邊界處分開。在一些實施例中，第一及第二編碼多核苷酸在OTOF之外顯子20與21之間之邊界處分開。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一編碼多核苷酸係由編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸之外顯子1-20組成且第二編碼多核苷酸係由編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸(例如編碼人類OTOF同功型5蛋白之多核苷酸)之外顯子21-45及47組成。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，編碼OTOF同功型5蛋白之第一及第二編碼多核苷酸不包含內含子。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，OTOF同功型5蛋白係人類OTOF同功型5蛋白(例如具有SEQ ID NO：1之序列之蛋白質)。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，OTOF同功型5蛋白包含SEQ ID NO：1之序列或其具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個)保守胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白變異體中不超過10% (10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小)之胺基酸係保守胺基酸取代。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：1之序列組成。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：2之序列編碼。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：3之序列編碼。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，OTOF同功型5蛋白之N端部分係由SEQ ID NO：58之序列或其具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個)保守胺基酸取代之變異體組成。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白變異體之N端部分中不超過10% (10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小)之胺基酸係保守胺基酸取代。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白之N端部分係由SEQ ID NO：58之序列組成。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白之N端部分係由SEQ ID NO：56之序列編碼。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，OTOF同功型5蛋白之C端部分係由SEQ ID NO：59之序列或其具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個)保守胺基酸取代之變異體組成。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白變異體之C端部分中不超過10% (10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小)之胺基酸係保守胺基酸取代。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白之C端部分係由SEQ ID NO：59之序列組成。在一些實施例中，OTOF同功型5蛋白之C端部分係由SEQ ID NO：57之序列編碼。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一載體包括啟動子5’之第一反向末端重複(ITR)序列及重組基因區3’之第二ITR序列，且第二載體包括重組基因區5’之第一ITR序列及聚(A)序列3’之第二ITR序列。在一些實施例中，第一載體及第二載體中之ITR係AAV2 ITR。在一些實施例中，第一載體及第二載體中之ITR與AAV2 ITR具有至少80%序列一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，聚(A)序列係牛生長激素(bGH)聚(A)信號序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一載體中之剪接供體序列包含SEQ ID NO：54之序列或由其組成。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二載體中之剪接受體序列包含SEQ ID NO：55之序列或由其組成。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體包含啟動子3’及編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之第一編碼多核苷酸5’之Kozak序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：60之核苷酸2272至6041之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：60之核苷酸2049至6264之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：62之核苷酸182至3949之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：62之核苷酸19至4115之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：64之位置2267至6014之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：64之位置2049至6237之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：65之位置177至3924之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：65之位置19至4090之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二AAV載體含有包含SEQ ID NO：61之核苷酸2267至6476之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二AAV載體含有包含SEQ ID NO：61之核苷酸2049至6693之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二AAV載體含有包含SEQ ID NO：63之核苷酸187至4396之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二AAV載體含有包含SEQ ID NO：63之核苷酸19至4589之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：66之核苷酸235至4004之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：66之核苷酸12至4227之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：68之核苷酸230至3977之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一AAV載體含有包含SEQ ID NO：68之核苷酸12至4200之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二AAV載體含有包含SEQ ID NO：67之核苷酸229至4438之序列之多核苷酸序列。在前述態樣中任一者之一些實施例中，第二AAV載體含有包含SEQ ID NO：67之核苷酸12至4655之序列或由其組成之多核苷酸序列。
在另一態樣中，本發明提供含有本發明之雙載體系統及醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物經調配以投與內耳。
在另一態樣中，本發明提供含有本發明之雙載體系統或醫藥組合物之套組。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與治療有效量之本發明雙載體系統增加個體中之OTOF表現(例如野生型OTOF表現，例如全長OTOF同功型5表現)之方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向患有感覺神經性聽力損失或具有患上該疾病之風險之個體投與治療有效量之本發明雙載體系統來治療個體之方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向患有聽神經病變或具有患上該疾病之風險之個體投與治療有效量之本發明雙載體系統來治療個體之方法。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，個體具有OTOF突變。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，個體已經鑒別為具有OTOF突變。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括在投與組合物之前將個體鑒別為具有OTOF突變。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，個體患有或已經鑒別為患有9型體染色體隱性耳聾(DFNB9)。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括在投與雙載體系統之前評估個體聽力之步驟。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，雙載體系統係經局部投與耳。在一些實施例中，雙載體系統係藉由注射通過圓窗膜、注射至半規管中、小管造口術、通過圓窗膜插入導管、經鼓室注射或鼓室內注射來投與。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法增加耳蝸毛細胞中之OTOF表現。在一些實施例中，耳蝸毛細胞係內毛細胞。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，個體係哺乳動物。在一些實施例中，個體係人類。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括在投與雙載體系統後評估個體之聽力。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，雙載體系統增加細胞(例如耳蝸毛細胞)中之OTOF表現，改良聽力(例如如藉由標準測試(例如測聽術、聽性腦幹反應(ABR)、耳蝸電描記術(ECOG)及耳聲傳射)所評價)，預防或減輕聽力損失，延遲聽力損失之發生，減緩聽力損失之進展，改良言語識別或改良毛細胞功能。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，雙載體系統係以足以增加耳蝸毛細胞中之OTOF表現、預防或減輕聽力損失、延遲聽力損失之發生、減緩聽力損失之進展、改良聽力(例如如藉由標準測試(例如測聽術、ABR、ECOG及耳聲傳射)所評價)、改良言語識別或改良毛細胞功能之量投與。
在另一態樣中，本發明提供藉由將本發明之雙載體系統引入細胞中來增加細胞中之OTOF表現之方法。
在一些實施例中，細胞係耳蝸毛細胞。在一些實施例中，細胞係內毛細胞。在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞係人類細胞。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一載體與第二載體係同時投與。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一載體與第二載體係相繼投與。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，第一載體與第二載體係以下列濃度投與：1 × 107
個載體基因體(VG)/耳至約2 × 1015
VG/耳(例如1 × 107
VG/耳、2 × 107
VG/耳、3 × 107
VG/耳、4 × 107
VG/耳、5 × 107
VG/耳、6 × 107
VG/耳、7 × 107
VG/耳、8 × 107
VG/耳、9 × 107
VG/耳、1 × 108
VG/耳、2 × 108
VG/耳、3 × 108
VG/耳、4 × 108
VG/耳、5 × 108
VG/耳、6 × 108
VG/耳、7 × 108
VG/耳、8 × 108
VG/耳、9 × 108
VG/耳、1 × 109
VG/耳、2 × 109
VG/耳、3 × 109
VG/耳、4 × 109
VG/耳、5 × 109
VG/耳、6 × 109
VG/耳、7 × 109
VG/耳、8 × 109
VG/耳、9 × 109
VG/耳、1 × 1010
VG/耳、2 × 1010
VG/耳、3 × 1010
VG/耳、4 × 1010
VG/耳、5 × 1010
VG/耳、6 × 1010
VG/耳、7 × 1010
VG/耳、8 × 1010
VG/耳、9 × 1010
VG/耳、1 × 1011
VG/耳、2 × 1011
VG/耳、3 × 1011
VG/耳、4 × 1011
VG/耳、5 × 1011
VG/耳、6 × 1011
VG/耳、7 × 1011
VG/耳、8 × 1011
VG/耳、9 × 1011
VG/耳、1 × 1012
VG/耳、2 × 1012
VG/耳、3 × 1012
VG/耳、4 × 1012
VG/耳、5 × 1012
VG/耳、6 × 1012
VG/耳、7 × 1012
VG/耳、8 × 1012
VG/耳、9 × 1012
VG/耳、1 × 1013
VG/耳、2 × 1013
VG/耳、3 × 1013
VG/耳、4 × 1013
VG/耳、5 × 1013
VG/耳、6 × 1013
VG/耳、7 × 1013
VG/耳、8 × 1013
VG/耳、9 × 1013
VG/耳、1 × 1014
VG/耳、2 × 1014
VG/耳、3 × 1014
VG/耳、4 × 1014
VG/耳、5 × 1014
VG/耳、6 × 1014
VG/耳、7 × 1014
VG/耳、8 × 1014
VG/耳、9 × 1014
VG/耳、1 × 1015
VG/耳或2 × 1015
VG/耳)。定義
如本文所用之術語「約」係指在所述值以上或以下10%內之值。
如本文所用之「投與」係指藉由任一有效途徑提供或給予個體治療劑(例如組合物，其含有第一核酸載體，該第一核酸載體含有編碼耳畸蛋白之N端部分之多核苷酸；及第二核酸載體，該第二核酸載體含有編碼耳畸蛋白之C端部分之多核苷酸)。下文闡述例示性投與途徑。
如本文所用之術語「細胞類型」係指共用基於基因表現數據在統計學上可分離之表型之細胞群。例如，常見細胞類型之細胞可共用相似之結構及/或功能特徵，例如相似之基因活化模式及抗原呈遞譜。常見細胞類型之細胞可包括自常見組織(例如上皮組織、神經組織、結締組織或肌肉組織)分離之彼等細胞及/或自常見器官、組織系統、血管或生物體中之其他結構及/或區域分離之彼等細胞。
如本文所用之術語「耳蝸毛細胞」係指內耳中參與感知聲音之特化細胞之群。存在兩種類型之耳蝸毛細胞：內毛細胞及外毛細胞。耳蝸毛細胞損傷及破壞耳蝸毛細胞功能之遺傳突變與聽力損失及耳聾相關。
如本文所用之術語「保守突變」、「保守取代」及「保守胺基酸取代」係指用一或多個胺基酸取代一或多個展現相似物理化學性質(例如極性、靜電荷及立體體積)之不同胺基酸。20種天然胺基酸中每一者之該等性質匯總於下表1中。表 1. 天然胺基酸之代表性物理化學性質
| 胺基酸 | 3 字母代碼 | 1 字母代碼 | 側鏈極性 | 生理 pH (7.4) 下之靜電特徵 | 立體體積 † |
| 丙胺酸 | Ala | A | 非極性 | 中性 | 小 |
| 精胺酸 | Arg | R | 極性 | 陽離子 | 大 |
| 天冬醯胺 | Asn | N | 極性 | 中性 | 中等 |
| 天冬胺酸 | Asp | D | 極性 | 陰離子 | 中等 |
| 半胱胺酸 | Cys | C | 非極性 | 中性 | 中等 |
| 麩胺酸 | Glu | E | 極性 | 陰離子 | 中等 |
| 麩醯胺酸 | Gln | Q | 極性 | 中性 | 中等 |
| 甘胺酸 | Gly | G | 非極性 | 中性 | 小 |
| 組胺酸 | His | H | 極性 | 在pH 7.4下平衡之中性及陽離子形式二者 | 大 |
| 異白胺酸 | Ile | I | 非極性 | 中性 | 大 |
| 白胺酸 | Leu | L | 非極性 | 中性 | 大 |
| 離胺酸 | Lys | K | 極性 | 陽離子 | 大 |
| 甲硫胺酸 | Met | M | 非極性 | 中性 | 大 |
| 苯丙胺酸 | Phe | F | 非極性 | 中性 | 大 |
| 脯胺酸 | Pro | P | 非極性 | 中性 | 中等 |
| 絲胺酸 | Ser | S | 極性 | 中性 | 小 |
| 蘇胺酸 | Thr | T | 極性 | 中性 | 中等 |
| 色胺酸 | Trp | W | 非極性 | 中性 | 巨大 |
| 酪胺酸 | Tyr | Y | 極性 | 中性 | 大 |
| 纈胺酸 | Val | V | 非極性 | 中性 | 中等 |
| † 基於A3 之體積：50-100為小，100-150為中等， 150-200為大，且＞200為巨大 |
根據此表應瞭解，保守胺基酸家族包括(i) G、A、V、L及I；(ii) D及E；(iii) C、S及T；(iv) H、K及R；(v) N及Q；及(vi) F、Y及W。因此，保守突變或取代係用一種胺基酸取代同一胺基酸家族之成員者(例如用Ser取代Thr或用Lys取代Arg)。
如本文所用之術語本文所述組合物、載體構築體或病毒載體之「有效量」、「治療有效量」及「足量」係指在投與有需要之個體(包括哺乳動物，例如人類)時足以實現有益或期望之結果(包括臨床結果)，且因此「有效量」或其同義詞取決於應用其之上下文。舉例而言，在治療感覺神經性聽力損失之上下文中，其係與未投與組合物、載體構築體或病毒載體時獲得之反應相比，足以達成治療反應之組合物、載體構築體或病毒載體之量。將對應於該量之本文所述給定組合物之量將端視多種因素而變化，例如給定劑、醫藥調配物、投與途徑、疾病或病症之類型、個體之個性(例如年齡、性別、體重)或所治療之宿主及諸如此類，但仍可以常規方式由熟習此項技術者確定。此外，如本文所用之本揭示案之組合物、載體構築體或病毒載體之「治療有效量」係與對照相比在個體中產生有益或期望結果之量。應注意，當投與活性成分之組合時，組合之有效量可或可不包括在個別投與時有效之每一成分之量。如本文所定義，本揭示案之組合物、載體構築體、病毒載體或細胞之治療有效量可容易地由熟習此項技術者藉由此項技術中已知之常規方法確定。可調整劑量方案以提供最佳治療反應。
如本文所用之術語「內源」闡述天然存在於特定生物體(例如人類)或生物體內之特定位置(例如器官、組織或細胞，例如人類細胞，例如人類耳蝸毛細胞)之分子(例如多肽、核酸或輔因子)。
如本文所用之術語「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如藉由轉錄)；(2)處理RNA轉錄物(例如藉由剪接、編輯、5′帽形成及/或3′端處理)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
如本文所用之術語「外源」闡述並非天然存在於特定生物體(例如人類)或生物體內之特定位置(例如器官、組織或細胞，例如人類細胞，例如人類耳蝸毛細胞)之分子(例如多肽、核酸或輔因子)。外源材料包括自生物體之外部來源或自其提取之培養物提供之彼等材料。
如本文所用之術語「毛細胞特異性表現」係指與內耳之其他細胞類型(例如螺旋神經節神經元、神經膠質或其他內耳細胞類型)相比，主要在毛細胞(例如耳蝸毛細胞)內產生RNA轉錄物或多肽。轉殖基因之毛細胞特異性表現可藉由使用任一標準技術(例如定量RT PCR、免疫組織化學、西方墨點法分析(Western Blot analysis)或量測可操作連接至啟動子之報導基因(例如GFP)之螢光)比較內耳之各種細胞類型之間(例如毛細胞對非毛細胞)之轉殖基因表現(例如RNA或蛋白質表現)來確認。與以下內耳細胞類型中之至少3者(例如3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者或更多者)相比，毛細胞特異性啟動子在毛細胞(例如耳蝸毛細胞)中誘導之可操作連接至其之轉殖基因之表現(例如RNA或蛋白質表現)大至少50% (例如大50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%或更大)：邊緣細胞、內指細胞、內柱細胞、外柱細胞、第一列戴特氏細胞(first row Deiter cell)、第二列戴特氏細胞、第三列戴特氏細胞、亨森氏細胞(Hensen’s cell)、克勞氏細胞(Claudius cell)、內溝細胞、外溝細胞、螺旋隆凸細胞、根細胞、齒間細胞、血管紋基底細胞、血管紋中間細胞、血管紋邊緣細胞、螺旋神經節神經元、許旺氏細胞(Schwann cell)。
如本文所用之術語「增加」及「減少」係指調節分別產生度量之功能、表現或活性相對於參照更大或更小之量。舉例而言，在本文所述之方法中投與組合物後，相對於投與前標記物之量，如本文所述度量(例如OTOF表現)之標記物之量在個體中可增加或減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%或更大。通常，度量係在投與後投與已具有所列舉效應時(例如在治療方案開始後至少一週、一個月、3個月或6個月)進行量測。
如本文所用之術語「內含子」係指基因之編碼區內之區域，其核苷酸序列不會轉譯成相應蛋白質之胺基酸序列。術語內含子亦指RNA之自基因轉錄之相應區域。內含子轉錄成前mRNA，但在處理期間移除，且不包括在成熟mRNA中。
如本文所用之「經局部」或「局部投與」意指欲用於局部效應而非全身效應之身體特定位點處之投與。局部投與之實例係皮上、吸入、關節內、鞘內、陰道內、玻璃體內、子宮內、病灶內投與、淋巴結投與、腫瘤內投與、投與內耳及投與個體之黏膜，其中投與意欲具有局部效應而非全身效應。
如本文所用之術語「可操作連接」係指可連結至第二分子之第一分子，其中該等分子如此排列以使得第一分子影響第二分子之功能。術語「可操作連接」包括兩種或更多種組分(例如啟動子及另一序列元件)之並置，使得兩種組分正常發揮功能並允許至少一種組分可調介對其他組分中之至少一者發揮之功能的可能性。兩種分子可或可不為單個鄰接分子之一部分且可或可不為相鄰的。舉例而言，若啟動子調節相關可轉錄多核苷酸分子在細胞中之轉錄，則啟動子可操作連接至可轉錄多核苷酸分子。在其他實施例中，若連結轉錄調節元件之兩部分使得一部分之轉錄活化功能不因另一部分之存在而受到不利影響，則該兩部分彼此可操作連接。兩個轉錄調節元件可藉助連接體核酸(例如間插的非編碼核酸)彼此可操作連接或可在不存在間插的核苷酸時彼此可操作連接。
如本文所用之術語「耳畸蛋白同功型5」及「OTOF同功型5」係指與非綜合症狀性隱性耳聾DFNB9相關之基因之同功型。基因之人類同功型與參照序列NM_001287489相關，且轉錄物包括人類耳畸蛋白之外顯子1-45及47，但缺少OTOF基因之外顯子46。人類OTOF同功型5蛋白亦稱為耳畸蛋白同功型e。術語「耳畸蛋白同功型5」及「OTOF同功型5」亦指野生型OTOF同功型5蛋白及編碼其之多核苷酸之變異體，例如與野生型OTOF同功型5蛋白之胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%或更大一致性)之變異體蛋白或與野生型OTOF同功型5基因之多核苷酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%或更大一致性)之多核苷酸，條件係所編碼之OTOF同功型5類似物保留野生型OTOF同功型5之治療功能。OTOF同功型5蛋白變異體相對於野生型OTOF同功型5 (例如SEQ ID NO：1)可具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個)保守胺基酸取代，條件係OTOF同功型5變異體保留野生型OTOF同功型5之治療功能且在胺基酸序列之N端部分中具有不超過10%之胺基酸取代並在胺基酸序列之C端部分中具有不超過10%之胺基酸取代。如本文所用之OTOF同功型5可指定位於內毛細胞之蛋白質或編碼此蛋白質之基因，此端視上下文而定，如熟習此項技術者將瞭解。OTOF同功型5可指人類OTOF同功型5或來自另一哺乳動物物種之同系物。鼠類耳畸蛋白相對於人類耳畸蛋白含有一個額外外顯子(在鼠類耳畸蛋白中有48個外顯子)，且對應於編碼人類OTOF同功型5之外顯子之鼠類耳畸蛋白外顯子係1-5、7-46及48。本文所用之外顯子編號慣例係基於外顯子目前理解為存在於人類OTOF之一致轉錄物中。
如本文所用之術語「質體」係指額外DNA區段可連接至其中之染色體外環狀雙股DNA分子。質體係一種載體，其係能夠運輸與其連接之另一核酸之核酸分子。某些質體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌質體及游離型哺乳動物質體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中後整合至宿主細胞之基因體中，且由此與宿主基因體一起複製。某些質體能夠引導與其可操作連接之基因之表現。
如本文所用之術語「核酸」及「多核苷酸」在本文中可互換使用且係指任一長度之核苷之聚合形式。通常，多核苷酸係由天然存在於藉由磷酸二酯鍵連結之DNA或RNA中之核苷(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)組成。然而，該術語涵蓋含有核苷或含有經化學或生物修飾之鹼基、經修飾主鏈等之核苷類似物之分子，無論是否發現於天然核酸中，且該等分子對於某些應用可為較佳的。當此應用係關於多核苷酸時應理解，提供DNA、RNA及在每一情形下單股及雙股形式(及每一單股分子之補體)。如本文所用之「多核苷酸序列」可指多核苷酸材料自身及/或生物化學表徵特定核酸之序列資訊(即用作鹼基之縮寫之字母串)。除非另有指示，否則本文所呈現之多核苷酸序列係以5'至3’方向呈現。
如本文所用之術語核酸之「互補性」或「互補」意指核酸之一個股中之核苷酸序列因其核鹼基群之取向而與相對核酸股上之另一序列形成氫鍵。DNA中之互補鹼基通常係A與T及C與G。在RNA中，其通常係C與G及U與A。互補可為完全的或實質的/充分的。兩個核酸之間之完全互補意指兩個核酸可形成雙鏈體，其中雙鏈體中之每個鹼基藉由沃森-克里克配對(Watson-Crick pairing)鍵結至互補鹼基。「實質」或「充分」互補意指一個股中之序列與相對股中之序列不完全(completely及/或perfectly)互補，但在一組雜交條件下(例如鹽濃度及溫度)在兩股之間之鹼基之間發生充分鍵結以形成穩定的雜合複合物。該等條件可藉由使用預測雜交股之Tm (熔融溫度)之序列及標準數學計算或藉由使用常規方法經驗確定Tm來預測。Tm包括在兩個核酸股之間形成之雜交複合物群體為50%變性(即雙股核酸分子群體變得半解離成單股)時之溫度。在低於Tm之溫度下，形成雜交複合物係有利的，而在高於Tm之溫度下，雜交複合物中股之熔融或分離係有利的。可藉由使用例如Tm=81.5+0.41(G+C%)估計在1 M NaCl水溶液具有已知G+C含量之核酸之Tm，儘管其他已知Tm計算將核酸結構特徵考慮在內。
如本文所用之術語「啟動子」係指DNA上由RNA聚合酶結合之識別位點。聚合酶驅動轉殖基因之轉錄。適用於本文所述之組合物及方法之例示性啟動子包括遍在啟動子(例如CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子及smCBA啟動子)及耳蝸毛細胞特異性啟動子(例如肌凝蛋白15 (Myo15)啟動子)。
相對於參照多核苷酸或多肽序列之「序列一致性百分比」定義為在比對序列及引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，候選序列中與參照多核苷酸或多肽序列中之核酸或胺基酸一致之核酸或胺基酸之百分比。出於確定核酸或胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2或Megalign軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何演算法。舉例而言，序列一致性百分比值可使用序列比較電腦程式BLAST來產生。作為說明，給定核酸或胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或針對(against)給定核酸或胺基酸序列B之序列一致性% (替代地可表達為相對於、與或針對給定核酸或胺基酸序列B具有一定序列一致性%之給定核酸或胺基酸序列A)計算如下：
100 × (分數X/Y)
其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式(例如BLAST)評定為一致性匹配之核苷酸或胺基酸之數量，且其中Y係B中核酸之總數。應瞭解，當核酸或胺基酸序列A之長度不等於核酸或胺基酸序列B之長度時，A相對於B之序列一致性%將不等於B相對於A之序列一致性%。
如本文所用之術語「衍生物」係指與相應全長野生型核酸、肽或蛋白質相比包含一或多個突變及/或化學修飾之核酸、肽或蛋白質或其變異體或類似物。涉及核酸之化學修飾之非限制性實例包括例如對鹼基部分、糖部分、磷酸部分、磷酸-糖主鏈或其組合之修飾。
如本文所用之術語「醫藥組合物」係指含有治療劑、視情況地與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑組合之混合物，欲投與個體(例如哺乳動物，例如人類)來預防、治療或控制侵襲或可能侵襲 個體之特定疾病或疾患。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受」係指適於與個體(例如哺乳動物，例如人類)之組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應及其他問題併發症且與合理益處/風險比相稱之彼等化合物、材料、組合物及/或劑量形式。較佳地，術語「醫藥學上可接受」意指經聯邦或州政府管理機構批准或列於美國藥典(U.S. Pharmacopoeia)或其他公認藥典中用於哺乳動物、且更具體而言用於人類中。
如本文所用之術語「重組基因區」係指調介兩個不同序列之間之重組之同源區域。
如本文所用之術語「調節序列」包括啟動子、增強子及控制編碼OTOF之多核苷酸之轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如多聚腺苷酸化信號) 。該等調節序列闡述於例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185 (Academic Press，San Diego，CA，1990)中；該文獻以引用方式併入本文中。
如本文所用之術語「樣品」係指自個體分離之樣本(例如血液、血液組分(例如血清或血漿)、尿液、唾液、羊水、腦脊髓液、組織(例如胎盤或皮膚)、胰液、絨毛膜絨毛樣品及細胞)。
如本文所用之術語「轉染」係指常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之眾多種技術中之任一者，例如電穿孔、脂轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染、核轉染(Nucleofection)、擠壓穿孔、聲致穿孔、光學轉染、磁性轉染、刺穿轉染及諸如此類。
如本文所用之術語「個體」及「患者」係指動物(例如哺乳動物，例如人類)、獸醫動物(例如貓、狗、牛、馬、綿羊、豬等)及實驗動物疾病模型(例如小鼠、大鼠)。欲根據本文所述之方法治療之個體可為已經診斷患有聽力損失(例如與OTOF突變相關之聽力損失)之個體或具有患上該等疾患之風險之個體。診斷可藉由此項技術中已知之任一方法或技術來實施。熟習此項技術者應理解，欲根據本揭示案治療之個體可能已經受標準測試或可能在無檢查之情況下已經鑒別為因存在一或多種與疾病或疾患相關之風險因子而具有風險之個體。
如本文所用之術語「轉導(transduction)」及「轉導(transduce)」係指將載體構築體或其一部分引入細胞中之方法。其中載體構築體含於病毒載體(例如AAV載體)中，轉導係指用病毒感染細胞並隨後將載體構築體或其一部分轉移及整合至細胞基因體中。
如本文所用之狀態、病症或疾患之「治療(treatment)」及「治療(treating)」可包括：(1)預防、延遲或減少在個體中發展之狀態、病症或疾患之至少一種臨床或亞臨床症狀之出現之發生及/或可能性，該個體可能患有或易患該狀態、病症或疾患，但尚未經歷或展示該狀態、病症或疾患之臨床或亞臨床症狀；或(2)抑制狀態、病症或疾患，即停止、減少或延遲疾病或其復發或其至少一種臨床或亞臨床症狀之發展；或(3)減輕疾病，即使狀態、病症或疾患或其臨床或亞臨床症狀中之至少一者消退。對欲治療個體之益處係統計學上顯著的或至少為患者或醫師可察覺的。
如本文所用之術語「載體」包括核酸載體，例如DNA載體，例如質體、RNA載體、病毒或其他適宜複製子(例如病毒載體)。已開發出多種載體用於將編碼外源蛋白質之多核苷酸遞送至原核或真核細胞中。該等表現載體之實例揭示於例如WO94/11026中；該文獻關於適於表現相關基因之載體以引用方式併入本文中。適用於本文所述組合物及方法之表現載體含有多核苷酸序列以及例如用於表現蛋白質及/或將該等多核苷酸序列整合至哺乳動物細胞之基因體中之額外序列元件。可用於表現如本文所述OTOF之某些載體包括含有引導基因轉錄之調節序列(例如啟動子及增強子區域)之載體。可用於表現OTOF之其他載體含有增強該等基因之轉譯速率或改良源自基因轉錄之mRNA之穩定性或核輸出之多核苷酸序列。該等序列元件包括例如5’及3’非轉譯區及引導表現載體上所攜帶基因之有效轉錄之多聚腺苷酸化信號位點。適用於本文所述組合物及方法之表現載體亦可含有編碼用於選擇含有該載體之細胞之標記物之多核苷酸。適宜標記物之實例包括編碼抗生素(例如胺苄青黴素(ampicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、康黴素(kanamycin)或諾爾斯菌素(nourseothricin))抗性之基因。
如本文所用之術語「野生型」係指在給定生物體中具有特定基因之最高頻率之基因型。
序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式以電子方式提交且全文皆以引用方式併入本文中。ASCII拷貝創建於2020年10月23日，命名為51471-004WO5_Sequence_Listing_10_23_2020_ST25且大小為222,004個位元組。
本文闡述藉由投與含有啟動子及編碼耳畸蛋白(OTOF)同功型5蛋白之N端部分(例如野生型(WT)人類OTOF同功型5蛋白)之多核苷酸之第一核酸載體(例如AAV載體)及含有編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之多核苷酸及多聚腺苷酸化(聚(A))序列之第二核酸載體(例如AAV載體)來治療個體(例如哺乳動物個體，例如人類)之感覺神經性聽力損失或聽神經病變之組合物及方法。當引入哺乳動物細胞(例如耳蝸毛細胞)中時，由兩種核酸載體編碼之多核苷酸可組合形成編碼全長OTOF同功型5蛋白之核酸分子。因此，本文所述之組合物及方法可用於誘導或增加具有OTOF缺陷(例如低OTOF表現或損害OTOF表現或功能之OTOF突變)之個體之耳蝸毛細胞中WT OTOF同功型5之表現。耳畸蛋白
OTOF係含有至少6個參與鈣、磷脂及蛋白質結合之C2結構域之230 kDa膜蛋白。人類OTOF係由含有47個外顯子之基因編碼，且全長蛋白質由1,997個胺基酸構成。OTOF位於內毛細胞中之帶狀突觸處，其中認為其用作突觸囊泡融合物中之鈣感測器，從而觸發含有神經傳遞質之囊泡與質膜之融合。其亦已參與囊泡補充及格形蛋白介導之胞吞作用，且已顯示與肌凝蛋白VI、Rab8b、SNARE蛋白、鈣通道Cav1.3、Ergic2及AP-2相互作用。OTOF調介胞吐作用之機制及其與其結合伴侶相互作用之生理意義仍待確定。
存在耳畸蛋白基因之多種長及短同功型。人類遺傳性耳聾之研究已表明長同功型對於內耳功能至關重要。然而，未理解該等個別長同功型及其他蛋白質變異體在內耳功能中之作用。為開發出對經歷繼發於遺傳驅動之耳畸蛋白缺陷之耳聾之患者有效之基因轉移療法，必須鑒別出編碼耳中之功能性OTOF同功型之cDNA序列。
本發明部分地基於以下發現：OTOF同功型5優先在非人類靈長類動物之內耳中表現，且人類OTOF同功型5而非人類OTOF同功型1能夠拯救經遺傳改造之具有耳畸蛋白缺陷之先天性耳聾小鼠之聽力。因此，可使用本文所述之雙載體系統(例如用於表現OTOF同功型5之雙載體系統)來治療具有OTOF基因缺陷(例如突變)之人類個體之感覺神經性聽力損失或聽神經病變。耳畸蛋白相關之聽力損失
OTOF首次係由研究耳聾之非綜合症狀形式體染色體隱性耳聾-9 (DFNB9)之遺傳學之研究鑒別出。此後，在世界各地的患者中發現OTOF突變引起感覺神經性聽力損失，其中許多攜帶OTOF突變之患者患有聽神經病變，其係內耳偵測到聲音、但無法正確地將聲音自耳傳遞至腦之病症。該等患者具有異常聽性腦幹反應(ABR)及受損之言語識別及最初正常之耳聲傳射。攜帶同型接合或化合物異型接合突變之患者通常在兒童早期罹患聽力損失，且已發現聽力損害之嚴重程度隨著OTOF突變之位置及類型而變化。
本文所述之組合物及方法可用於藉由投與含有編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之多核苷酸之第一核酸載體及含有編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之多核苷酸之第二核酸載體來治療感覺神經性聽力損失或聽神經病變。全長OTOF同功型5編碼序列因太大而無法包括在常用於基因療法之載體類型(例如腺相關病毒(AAV)載體，認為其具有5 kb之包裝限值)中。本文所述之組合物及方法藉由將OTOF同功型5編碼序列分在可組合於細胞中以復原全長OTOF同功型5序列之兩個不同核酸載體(例如AAV載體)之間克服了此問題。該等組合物及方法可用於治療具有一或多個OTOF基因突變(例如減少OTOF表現、降低OTOF功能或與聽力損失相關之OTOF突變，例如框移突變、無義突變、缺失或錯義取代)之個體。當第一及第二核酸載體係以組合物形式投與時，編碼OTOF同功型5之N端及C端部分之多核苷酸可組合於細胞(例如人類細胞，例如耳蝸毛細胞)內以形成含有全長OTOF同功型5編碼序列之單個核酸分子(例如經由同源重組及/或剪接)。
用於本文所述組合物及方法中之核酸載體(例如AAV載體)包括編碼野生型OTOF同功型5或其變異體之多核苷酸序列，例如在組合時編碼與野生型哺乳動物(例如人類或小鼠) OTOF同功型5之胺基酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之蛋白質之多核苷酸序列。用於本文所述核酸載體中之多核苷酸可編碼下表2中OTOF同功型5胺基酸序列之N端部分及C端部分(例如在組合時編碼表2中所列出之全長OTOF同功型5胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1)之兩個部分)。
根據本文所述之方法，可向個體投與組合物，該組合物含有第一核酸載體及第二核酸載體，該第一核酸載體及第二核酸載體分別含有編碼SEQ ID NO：1之胺基酸序列之多核苷酸序列或編碼與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之胺基酸序列之多核苷酸序列或編碼相對於SEQ ID NO：1含有一或多個保守胺基酸取代(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個保守胺基酸取代)之胺基酸序列之多核苷酸序列的N端及C端部分，條件係所編碼OTOF類似物保留野生型OTOF同功型5之治療功能(例如調節帶狀突觸處之胞吐作用或拯救或改良與耳畸蛋白基因缺陷(例如OTOF突變)相關之聽力損失動物模型中之ABR反應的能力)。人類OTOF同功型5蛋白之N端部分中不超過10%之胺基酸及人類OTOF同功型5蛋白之C端部分中不超過10%之胺基酸可經保守胺基酸取代替代。OTOF同功型5蛋白可由具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之序列之多核苷酸編碼。OTOF同功型5蛋白亦可由具有已發現在人類個體中為非致病性之單核苷酸變異體(SNV)之多核苷酸編碼。OTOF同功型5蛋白可為人類OTOF同功型5蛋白或可為來自另一哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、牛、馬、山羊、綿羊、驢、貓、狗、兔、天竺鼠或其他哺乳動物)之人類同功型5蛋白之同系物。表 2 ： OTOF 序列
OTOF 在哺乳動物細胞中之表現
| SEQ ID NO. | 序列名稱 | 序列 |
| 1 | 人類OTOF同功型5蛋白(NP_001274418.1)，亦稱為人類耳畸蛋白同功型e，1997 aa | MALLIHLKTVSELRGRGDRIAKVTFRGQSFYSRVLENCEDVADFDETFRWPVASSIDRNEMLEIQVFNYSKVFSNKLIGTFRMVLQKVVEESHVEVTDTLIDDNNAIIKTSLCVEVRYQATDGTVGSWDDGDFLGDESLQEEEKDSQETDGLLPGSRPSSRPPGEKSFRRAGRSVFSAMKLGKNRSHKEEPQRPDEPAVLEMEDLDHLAIRLGDGLDPDSVSLASVTALTTNVSNKRSKPDIKMEPSAGRPMDYQVSITVIEARQLVGLNMDPVVCVEVGDDKKYTSMKESTNCPYYNEYFVFDFHVSPDVMFDKIIKISVIHSKNLLRSGTLVGSFKMDVGTVYSQPEHQFHHKWAILSDPDDISSGLKGYVKCDVAVVGKGDNIKTPHKANETDEDDIEGNLLLPEGVPPERQWARFYVKIYRAEGLPRMNTSLMANVKKAFIGENKDLVDPYVQVFFAGQKGKTSVQKSSYEPLWNEQVVFTDLFPPLCKRMKVQIRDSDKVNDVAIGTHFIDLRKISNDGDKGFLPTLGPAWVNMYGSTRNYTLLDEHQDLNEGLGEGVSFRARLLLGLAVEIVDTSNPELTSSTEVQVEQATPISESCAGKMEEFFLFGAFLEASMIDRRNGDKPITFEVTIGNYGNEVDGLSRPQRPRPRKEPGDEEEVDLIQNASDDEAGDAGDLASVSSTPPMRPQVTDRNYFHLPYLERKPCIYIKSWWPDQRRRLYNANIMDHIADKLEEGLNDIQEMIKTEKSYPERRLRGVLEELSCGCCRFLSLADKDQGHSSRTRLDRERLKSCMRELENMGQQARMLRAQVKRHTVRDKLRLCQNFLQKLRFLADEPQHSIPDIFIWMMSNNKRVAYARVPSKDLLFSIVEEETGKDCAKVKTLFLKLPGKRGFGSAGWTVQAKVELYLWLGLSKQRKEFLCGLPCGFQEVKAAQGLGLHAFPPVSLVYTKKQAFQLRAHMYQARSLFAADSSGLSDPFARVFFINQSQCTEVLNETLCPTWDQMLVFDNLELYGEAHELRDDPPIIVIEIYDQDSMGKADFMGRTFAKPLVKMADEAYCPPRFPPQLEYYQIYRGNATAGDLLAAFELLQIGPAGKADLPPINGPVDVDRGPIMPVPMGIRPVLSKYRVEVLFWGLRDLKRVNLAQVDRPRVDIECAGKGVQSSLIHNYKKNPNFNTLVKWFEVDLPENELLHPPLNIRVVDCRAFGRYTLVGSHAVSSLRRFIYRPPDRSAPSWNTTVRLLRRCRVLCNGGSSSHSTGEVVVTMEPEVPIKKLETMVKLDATSEAVVKVDVAEEEKEKKKKKKGTAEEPEEEEPDESMLDWWSKYFASIDTMKEQLRQQEPSGIDLEEKEEVDNTEGLKGSMKGKEKARAAKEEKKKKTQSSGSGQGSEAPEKKKPKIDELKVYPKELESEFDNFEDWLHTFNLLRGKTGDDEDGSTEEERIVGRFKGSLCVYKVPLPEDVSREAGYDSTYGMFQGIPSNDPINVLVRVYVVRATDLHPADINGKADPYIAIRLGKTDIRDKENYISKQLNPVFGKSFDIEASFPMESMLTVAVYDWDLVGTDDLIGETKIDLENRFYSKHRATCGIAQTYSTHGYNIWRDPMKPSQILTRLCKDGKVDGPHFGPPGRVKVANRVFTGPSEIEDENGQRKPTDEHVALLALRHWEDIPRAGCRLVPEHVETRPLLNPDKPGIEQGRLELWVDMFPMDMPAPGTPLDISPRKPKKYELRVIIWNTDEVVLEDDDFFTGEKSSDIFVRGWLKGQQEDKQDTDVHYHSLTGEGNFNWRYLFPFDYLAAEEKIVISKKESMFSWDETEYKIPARLTLQIWDADHFSADDFLGAIELDLNRFPRGAKTAKQCTMEMATGEVDVPLVSIFKQKRVKGWWPLLARNENDEFELTGKVEAELHLLTAEEAEKNPVGLARNEPDPLEKPNRPDTAFVWFLNPLKSIKYLICTRYKWLIIKIVLALLGLLMLGLFLYSLPGYMVKKLLGA |
| 2 | 編碼人類耳畸蛋白同功型5蛋白(SEQ ID NO：1)之DNA序列，5994 bp，對應於以NM_001287489記載之編碼序列 | ATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGA |
| 3 | 編碼人類耳畸蛋白同功型5蛋白(SEQ ID NO：1)之密碼子最佳化(CO) DNA序列，5994 bp | ATGGCACTGCTGATCCACCTGAAAACCGTCTCCGAACTGAGAGGCAGAGGGGACAGAATCGCTAAAGTCACCTTCCGGGGACAGAGCTTTTACAGCAGGGTGCTGGAGAACTGCGAGGACGTGGCCGACTTTGACGAGACATTCAGGTGGCCCGTGGCCAGCTCCATCGATCGCAATGAGATGCTGGAGATCCAGGTGTTTAACTATAGCAAGGTGTTCTCCAATAAGCTGATCGGCACCTTCCGGATGGTGCTGCAGAAGGTGGTGGAGGAGTCCCACGTGGAGGTGACCGACACACTGATCGACGATAACAATGCCATCATCAAGACATCCCTGTGCGTGGAGGTGCGCTACCAGGCCACCGATGGCACAGTGGGCTCTTGGGACGATGGCGACTTCCTGGGCGATGAGTCCCTGCAGGAGGAGGAGAAGGACTCTCAGGAGACAGATGGCCTGCTGCCTGGCTCCCGGCCATCTAGCCGCCCCCCTGGCGAGAAGTCTTTTAGGAGAGCCGGCAGGTCCGTGTTCTCTGCCATGAAGCTGGGCAAGAACAGGAGCCACAAGGAGGAGCCTCAGAGGCCCGACGAGCCAGCCGTGCTGGAGATGGAGGACCTGGATCACCTGGCCATCAGACTGGGCGATGGCCTGGACCCTGATAGCGTGTCCCTGGCCTCCGTGACCGCCCTGACCACAAACGTGTCTAATAAGCGGAGCAAGCCAGACATCAAGATGGAGCCATCTGCCGGCAGGCCCATGGATTACCAGGTGAGCATCACAGTGATCGAGGCCAGACAGCTGGTGGGCCTGAACATGGACCCCGTGGTGTGCGTGGAAGTGGGCGACGATAAGAAGTACACCTCCATGAAGGAGTCTACAAACTGTCCATACTACAACGAGTACTTCGTGTTTGATTTCCACGTGAGCCCCGACGTGATGTTCGATAAGATCATCAAGATCAGCGTGATCCACTCCAAGAATCTGCTGCGGTCTGGCACCCTGGTGGGAAGCTTTAAGATGGACGTGGGCACAGTGTACTCTCAGCCTGAGCACCAGTTCCACCACAAGTGGGCCATCCTGAGCGATCCAGACGATATCTCCTCTGGCCTGAAGGGCTATGTGAAGTGCGACGTGGCAGTGGTGGGCAAGGGCGATAACATCAAGACCCCACACAAGGCCAATGAGACAGACGAGGACGATATCGAGGGAAACCTGCTGCTGCCAGAGGGAGTGCCACCCGAGAGGCAGTGGGCCAGGTTCTACGTGAAGATCTATAGGGCAGAGGGCCTGCCTAGGATGAACACCAGCCTGATGGCCAATGTGAAGAAGGCCTTCATCGGCGAGAACAAGGACCTGGTGGATCCCTACGTGCAGGTGTTCTTTGCCGGCCAGAAGGGCAAGACCTCCGTGCAGAAGAGCTCCTATGAGCCTCTGTGGAATGAGCAGGTGGTGTTTACAGACCTGTTCCCTCCACTGTGCAAGAGGATGAAGGTGCAGATCAGAGACTCTGATAAGGTGAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTTATCGATCTGAGGAAGATCAGCAATGACGGCGATAAGGGCTTCCTGCCCACCCTGGGCCCCGCCTGGGTGAACATGTACGGCAGCACCAGAAATTATACACTGCTGGACGAGCACCAGGATCTGAACGAGGGCCTGGGCGAGGGCGTGAGCTTTAGAGCCAGGCTGCTGCTGGGCCTGGCCGTGGAGATCGTGGACACCTCCAATCCCGAGCTGACCTCTAGCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACACCTATCTCTGAGAGCTGTGCCGGCAAGATGGAGGAGTTCTTTCTGTTTGGCGCCTTCCTGGAGGCCTCCATGATCGACCGGCGCAACGGCGATAAGCCTATCACCTTCGAGGTGACAATCGGCAACTACGGCAATGAGGTGGACGGCCTGTCTCGGCCCCAGCGCCCAAGGCCCAGAAAGGAGCCTGGCGACGAGGAGGAGGTGGATCTGATCCAGAACGCCAGCGACGATGAGGCAGGCGACGCAGGCGATCTGGCCTCCGTGTCCTCTACCCCCCCTATGCGGCCACAGGTGACAGACCGCAATTACTTTCACCTGCCTTATCTGGAGCGCAAGCCATGCATCTACATCAAGTCTTGGTGGCCCGATCAGAGGAGACGGCTGTATAACGCCAATATCATGGACCACATCGCCGATAAGCTGGAGGAGGGCCTGAATGACATCCAGGAGATGATCAAGACCGAGAAGTCCTATCCAGAGCGCAGGCTGAGGGGCGTGCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGTAGATTCCTGTCCCTGGCCGACAAGGATCAGGGGCACTCATCACGGACACGGCTGGACCGGGAGCGGCTGAAATCATGTATGCGGGAGCTGGAAAATATGGGACAGCAGGCAAGGATGCTGCGCGCCCAGGTGAAGAGGCACACCGTGAGAGACAAGCTGCGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTTCTGGCCGATGAGCCACAGCACAGCATCCCCGACATCTTCATCTGGATGATGTCCAACAATAAGAGAGTGGCCTACGCCCGGGTGCCCTCTAAGGATCTGCTGTTTAGCATCGTGGAGGAGGAGACAGGCAAGGACTGTGCCAAGGTGAAGACCCTGTTCCTGAAGCTGCCTGGCAAGAGAGGCTTTGGCAGCGCCGGATGGACCGTGCAGGCAAAGGTGGAGCTGTATCTGTGGCTGGGCCTGTCTAAGCAGCGGAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTTCAGGAGGTGAAGGCAGCACAGGGACTGGGACTGCACGCCTTCCCCCCCGTGAGCCTGGTGTACACCAAGAAGCAGGCCTTTCAGCTGAGGGCCCATATGTACCAGGCCAGGTCTCTGTTCGCCGCCGATAGCTCCGGACTGAGCGACCCTTTTGCCAGGGTGTTCTTTATCAATCAGAGCCAGTGCACAGAGGTGCTGAACGAGACCCTGTGCCCAACATGGGATCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTGTACGGAGAGGCACACGAGCTGAGGGACGATCCACCCATCATCGTGATCGAGATCTATGATCAGGACTCCATGGGCAAGGCCGATTTCATGGGCAGGACCTTTGCCAAGCCCCTGGTGAAGATGGCCGACGAGGCCTACTGCCCTCCAAGATTCCCCCCTCAGCTCGAGTACTATCAGATCTATAGGGGAAATGCAACCGCCGGAGACCTGCTGGCCGCCTTTGAGCTGCTGCAGATCGGCCCCGCCGGAAAGGCAGACCTGCCACCCATCAACGGCCCAGTGGATGTGGACAGAGGCCCCATCATGCCTGTGCCAATGGGCATCAGACCAGTGCTGTCCAAGTACAGGGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGACTGCGCGACCTGAAGAGGGTGAATCTGGCCCAGGTGGATAGGCCCAGAGTGGACATCGAGTGCGCCGGAAAGGGCGTGCAGTCTAGCCTGATCCACAACTATAAGAAGAACCCAAATTTCAACACCCTGGTGAAGTGGTTTGAGGTGGATCTGCCCGAGAATGAGCTGCTGCACCCTCCACTGAACATCCGGGTGGTGGACTGTAGAGCCTTCGGCAGGTACACCCTGGTGGGCAGCCACGCCGTGAGCAGCCTGAGGAGGTTCATCTACAGGCCCCCTGACAGGTCCGCCCCTTCTTGGAATACCACAGTGAGACTGCTGCGGCGCTGCAGGGTGCTGTGCAACGGAGGCAGCTCCTCTCACTCTACCGGCGAGGTGGTGGTGACAATGGAGCCTGAGGTACCCATCAAGAAGCTGGAGACCATGGTGAAGCTGGATGCCACAAGCGAGGCAGTGGTGAAGGTGGACGTGGCAGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGAACCGCCGAGGAGCCTGAGGAAGAGGAGCCAGATGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTCGCCTCTATCGACACAATGAAGGAGCAGCTGAGACAGCAGGAGCCTAGCGGCATCGATCTGGAGGAGAAGGAGGAGGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGCTCCATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCAGCAAAGGAAGAGAAGAAGAAGAAGACCCAGAGCAGCGGCTCTGGACAGGGCAGCGAGGCACCAGAGAAGAAGAAGCCTAAGATCGATGAGCTGAAGGTGTACCCAAAGGAGCTGGAGTCCGAGTTCGATAATTTTGAGGACTGGCTGCACACCTTCAACCTGCTGCGCGGCAAGACAGGCGACGATGAGGACGGCAGCACCGAGGAGGAGAGAATCGTGGGCCGGTTTAAGGGCTCCCTGTGCGTGTACAAGGTGCCACTGCCTGAGGACGTGAGCAGGGAGGCCGGATACGACTCTACCTATGGCATGTTCCAGGGCATCCCCTCTAATGATCCTATCAACGTGCTGGTGCGCGTGTATGTGGTGAGGGCCACAGATCTGCACCCCGCCGACATCAACGGCAAGGCCGACCCTTACATCGCCATCCGCCTGGGCAAGACCGATATCAGGGACAAGGAGAATTATATCTCCAAGCAGCTGAACCCCGTGTTCGGCAAGTCTTTTGACATCGAGGCCAGCTTCCCTATGGAGTCCATGCTGACCGTGGCCGTGTACGATTGGGACCTGGTGGGCACCGACGATCTGATCGGCGAGACAAAGATCGATCTGGAGAATCGCTTTTATTCTAAGCACAGGGCAACCTGCGGAATCGCACAGACCTACAGCACACACGGCTATAACATCTGGCGCGACCCCATGAAGCCTAGCCAGATCCTGACAAGGCTGTGCAAGGATGGCAAGGTGGACGGACCACACTTCGGACCACCCGGCAGAGTGAAGGTGGCCAATCGGGTGTTTACAGGCCCTTCCGAGATCGAGGATGAGAACGGCCAGCGCAAGCCAACCGACGAGCACGTGGCCCTGCTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGATATCCCAAGGGCCGGATGTAGGCTGGTGCCTGAGCACGTGGAGACCAGACCACTGCTGAATCCAGACAAGCCAGGAATCGAGCAGGGCAGGCTGGAGCTGTGGGTGGATATGTTCCCAATGGACATGCCAGCCCCAGGAACACCCCTGGATATCTCCCCTAGAAAGCCAAAGAAGTACGAGCTGAGAGTGATCATCTGGAACACAGACGAGGTGGTGCTGGAGGACGATGACTTCTTTACCGGCGAGAAGTCTAGCGATATCTTTGTGCGCGGATGGCTGAAGGGACAGCAGGAGGACAAGCAGGATACAGACGTGCACTACCACTCCCTGACCGGCGAGGGCAATTTCAACTGGAGATACCTGTTCCCTTTTGATTATCTGGCCGCCGAGGAGAAGATCGTGATCTCTAAGAAGGAGAGCATGTTTTCCTGGGACGAGACAGAGTATAAGATCCCAGCCAGACTGACCCTGCAGATCTGGGATGCCGACCACTTCAGCGCCGATGACTTTCTGGGCGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCAAGAGGCGCCAAGACCGCCAAGCAGTGCACAATGGAGATGGCAACCGGAGAGGTGGACGTGCCTCTGGTGTCTATCTTCAAGCAGAAGCGGGTGAAGGGATGGTGGCCACTGCTGGCCAGGAACGAGAATGATGAGTTTGAGCTGACAGGCAAGGTGGAGGCAGAGCTGCACCTGCTGACCGCCGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCAGGAATGAGCCCGACCCTCTGGAGAAGCCAAACAGGCCCGATACAGCCTTCGTGTGGTTTCTGAATCCTCTGAAGAGCATCAAGTACCTGATCTGTACCAGGTATAAGTGGCTGATCATCAAGATCGTGCTGGCCCTGCTGGGACTGCTGATGCTGGGCCTGTTTCTGTACTCCCTGCCCGGCTATATGGTGAAGAAGCTGCTGGGCGCCTGA 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| 4 | 人類OTOF同功型1蛋白(NP_919224.1)，亦稱為人類耳畸蛋白同功型a，1997 aa | MALLIHLKTVSELRGRGDRIAKVTFRGQSFYSRVLENCEDVADFDETFRWPVASSIDRNEMLEIQVFNYSKVFSNKLIGTFRMVLQKVVEESHVEVTDTLIDDNNAIIKTSLCVEVRYQATDGTVGSWDDGDFLGDESLQEEEKDSQETDGLLPGSRPSSRPPGEKSFRRAGRSVFSAMKLGKNRSHKEEPQRPDEPAVLEMEDLDHLAIRLGDGLDPDSVSLASVTALTTNVSNKRSKPDIKMEPSAGRPMDYQVSITVIEARQLVGLNMDPVVCVEVGDDKKYTSMKESTNCPYYNEYFVFDFHVSPDVMFDKIIKISVIHSKNLLRSGTLVGSFKMDVGTVYSQPEHQFHHKWAILSDPDDISSGLKGYVKCDVAVVGKGDNIKTPHKANETDEDDIEGNLLLPEGVPPERQWARFYVKIYRAEGLPRMNTSLMANVKKAFIGENKDLVDPYVQVFFAGQKGKTSVQKSSYEPLWNEQVVFTDLFPPLCKRMKVQIRDSDKVNDVAIGTHFIDLRKISNDGDKGFLPTLGPAWVNMYGSTRNYTLLDEHQDLNEGLGEGVSFRARLLLGLAVEIVDTSNPELTSSTEVQVEQATPISESCAGKMEEFFLFGAFLEASMIDRRNGDKPITFEVTIGNYGNEVDGLSRPQRPRPRKEPGDEEEVDLIQNASDDEAGDAGDLASVSSTPPMRPQVTDRNYFHLPYLERKPCIYIKSWWPDQRRRLYNANIMDHIADKLEEGLNDIQEMIKTEKSYPERRLRGVLEELSCGCCRFLSLADKDQGHSSRTRLDRERLKSCMRELENMGQQARMLRAQVKRHTVRDKLRLCQNFLQKLRFLADEPQHSIPDIFIWMMSNNKRVAYARVPSKDLLFSIVEEETGKDCAKVKTLFLKLPGKRGFGSAGWTVQAKVELYLWLGLSKQRKEFLCGLPCGFQEVKAAQGLGLHAFPPVSLVYTKKQAFQLRAHMYQARSLFAADSSGLSDPFARVFFINQSQCTEVLNETLCPTWDQMLVFDNLELYGEAHELRDDPPIIVIEIYDQDSMGKADFMGRTFAKPLVKMADEAYCPPRFPPQLEYYQIYRGNATAGDLLAAFELLQIGPAGKADLPPINGPVDVDRGPIMPVPMGIRPVLSKYRVEVLFWGLRDLKRVNLAQVDRPRVDIECAGKGVQSSLIHNYKKNPNFNTLVKWFEVDLPENELLHPPLNIRVVDCRAFGRYTLVGSHAVSSLRRFIYRPPDRSAPSWNTTVRLLRRCRVLCNGGSSSHSTGEVVVTMEPEVPIKKLETMVKLDATSEAVVKVDVAEEEKEKKKKKKGTAEEPEEEEPDESMLDWWSKYFASIDTMKEQLRQQEPSGIDLEEKEEVDNTEGLKGSMKGKEKARAAKEEKKKKTQSSGSGQGSEAPEKKKPKIDELKVYPKELESEFDNFEDWLHTFNLLRGKTGDDEDGSTEEERIVGRFKGSLCVYKVPLPEDVSREAGYDSTYGMFQGIPSNDPINVLVRVYVVRATDLHPADINGKADPYIAIRLGKTDIRDKENYISKQLNPVFGKSFDIEASFPMESMLTVAVYDWDLVGTDDLIGETKIDLENRFYSKHRATCGIAQTYSTHGYNIWRDPMKPSQILTRLCKDGKVDGPHFGPPGRVKVANRVFTGPSEIEDENGQRKPTDEHVALLALRHWEDIPRAGCRLVPEHVETRPLLNPDKPGIEQGRLELWVDMFPMDMPAPGTPLDISPRKPKKYELRVIIWNTDEVVLEDDDFFTGEKSSDIFVRGWLKGQQEDKQDTDVHYHSLTGEGNFNWRYLFPFDYLAAEEKIVISKKESMFSWDETEYKIPARLTLQIWDADHFSADDFLGAIELDLNRFPRGAKTAKQCTMEMATGEVDVPLVSIFKQKRVKGWWPLLARNENDEFELTGKVEAELHLLTAEEAEKNPVGLARNEPDPLEKPNRPDTSFIWFLNPLKSARYFLWHTYRWLLLKLLLLLLLLLLLALFLYSVPGYLVKKILGA |
| 5 | 編碼人類耳畸蛋白同功型1蛋白(SEQ ID NO：4)之DNA序列，5979 bp，對應於以NM_001100395記載之編碼序列 | ATGGCCCTGATTGTTCACCTCAAGACTGTCTCAGAGCTCCGAGGCAAAGGTGACCGGATTGCCAAAGTCACTTTCCGAGGGCAGTCTTTCTACTCCCGGGTCCTGGAGAACTGCGAGGGTGTGGCTGACTTTGATGAGACGTTCCGGTGGCCAGTGGCCAGCAGCATCGACCGGAATGAAGTGTTGGAGATTCAGATTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTGATAGGGACCTTCTGCATGGTGCTGCAGAAAGTGGTGGAGGAGAATCGGGTAGAGGTGACCGACACGCTGATGGATGACAGCAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGAGCATGGAGGTCCGGTATCAGGCCACAGATGGCACTGTGGGCCCCTGGGATGATGGAGACTTCCTGGGAGATGAATCCCTCCAGGAGGAGAAGGACAGCCAGGAGACAGATGGGCTGCTACCTGGTTCCCGACCCAGCACCCGGATATCTGGCGAGAAGAGCTTTCGCAGCAAAGGCAGAGAGAAGACCAAGGGAGGCAGAGATGGCGAGCACAAAGCGGGAAGGAGTGTGTTCTCGGCCATGAAACTCGGCAAAACTCGGTCCCACAAAGAGGAGCCCCAAAGACAAGATGAGCCAGCAGTGCTGGAGATGGAGGACCTGGACCACCTAGCCATTCAGCTGGGGGATGGGCTGGATCCTGACTCCGTGTCTCTAGCCTCGGTCACCGCTCTCACCAGCAATGTCTCCAACAAACGGTCTAAGCCAGATATTAAGATGGAGCCCAGTGCTGGAAGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACAGTGATTGAGGCTCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGTGTGGAGGTGGGTGATGACAAGAAATACACGTCAATGAAGGAGTCCACAAACTGCCCTTACTACAACGAGTACTTTGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCTGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATCTCGGTTATCCATTCTAAGAACCTGCTTCGGAGCGGCACCCTGGTGGGTTCCTTCAAAATGGATGTGGGGACTGTGTATTCCCAGCCTGAACACCAGTTCCATCACAAATGGGCCATCCTGTCAGACCCCGATGACATCTCTGCTGGGTTGAAGGGTTATGTAAAGTGTGATGTCGCTGTGGTGGGCAAGGGAGACAACATCAAGACACCCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGACGACATTGAAGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGCGTGCCCCCCGAACGGCAGTGGGCACGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGACTGCCCCGGATGAACACAAGCCTCATGGCCAACGTGAAGAAGGCGTTCATCGGTGAGAACAAGGACCTCGTCGACCCCTATGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGACAAAAGGGCAAAACATCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCGCTATGGAATGAGCAGGTCGTCTTCACAGACTTGTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGGGACTCTGACAAGGTCAATGATGTGGCCATCGGCACCCACTTCATCGACCTGCGCAAGATTTCCAACGATGGAGACAAAGGCTTCCTGCCTACCCTCGGTCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACGCGCAACTACACACTGCTGGACGAGCACCAGGACTTGAATGAAGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGCCTCATGTTGGGACTAGCTGTGGAGATCCTGGACACCTCCAACCCAGAGCTCACCAGCTCCACGGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCTGTCTCGGAGAGCTGCACAGGGAGAATGGAAGAATTTTTTCTATTTGGAGCCTTCTTGGAAGCCTCAATGATTGACCGGAAAAATGGGGACAAGCCAATTACCTTTGAGGTGACCATAGGAAACTACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGCCCCTGAGGCCTCGGCCCCGGAAAGAGCCTGGGGATGAAGAAGAGGTAGACCTGATTCAGAACTCCAGTGACGATGAAGGTGACGAAGCCGGGGACCTGGCCTCGGTGTCCTCCACCCCACCTATGCGGCCCCAGATCACGGACAGGAACTATTTCCACCTGCCCTACCTGGAGCGCAAGCCCTGCATCTATATCAAGAGCTGGTGGCCTGACCAGAGGCGGCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGATCACATTGCTGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAATGATGTACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCGGAGCGCCGCCTGCGGGGTGTGCTAGAGGAACTCAGCTGTGGCTGCCACCGCTTCCTCTCCCTCTCGGACAAGGACCAGGGCCGCTCGTCCCGCACCAGGCTGGATCGAGAGCGTCTTAAGTCCTGTATGAGGGAGTTGGAGAGCATGGGACAGCAGGCCAAGAGCCTGAGGGCTCAGGTGAAGCGGCACACTGTTCGGGACAAGCTGAGGTCATGCCAGAACTTTCTGCAGAAGCTACGCTTCCTGGCGGATGAGCCCCAGCACAGCATTCCTGATGTGTTCATTTGGATGATGAGCAACAACAAACGTATCGCCTATGCCCGCGTGCCTTCCAAAGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAACTGGGCAAGGACTGCGCCAAAGTCAAGACCCTCTTCCTGAAGCTGCCAGGGAAGAGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTACAGGCCAAGCTGGAGCTCTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAGCAGCGAAAGGACTTCCTGTGTGGTCTGCCCTGTGGCTTCGAGGAGGTCAAGGCAGCCCAAGGCCTGGGCCTGCATTCCTTTCCGCCCATCAGCCTAGTCTACACCAAGAAGCAAGCCTTCCAGCTCCGAGCACACATGTATCAGGCCCGAAGCCTCTTTGCTGCTGACAGCAGTGGGCTCTCTGATCCCTTTGCCCGTGTCTTCTTCATCAACCAGAGCCAATGCACTGAGGTTCTAAACGAGACACTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTATTTGACAACCTGGAGCTGTACGGTGAAGCTCACGAGTTACGAGATGATCCCCCCATCATTGTCATTGAAATCTACGACCAGGACAGCATGGGCAAAGCCGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAGCCCCTGGTGAAGATGGCAGATGAAGCATACTGCCCACCTCGCTTCCCGCCGCAGCTTGAGTACTACCAGATCTACCGAGGCAGTGCCACTGCCGGAGACCTACTGGCTGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGGCCATCAGGGAAGGCTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGGACATGGACAGAGGGCCCATCATGCCTGTGCCCGTGGGAATCCGGCCAGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTGAGGGACCTAAAGAGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGACCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGAAAGGGGGTACAATCCTCCCTGATTCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACGCTGGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCGGAGAATGAGCTCCTGCACCCACCCTTGAACATCCGAGTGGTAGATTGCCGGGCCTTTGGACGATACACCCTGGTGGGTTCCCACGCAGTCAGCTCACTGAGGCGCTTCATCTACCGACCTCCAGACCGCTCAGCCCCCAACTGGAACACCACAGGGGAGGTTGTAGTAAGCATGGAGCCTGAGGAGCCAGTTAAGAAGCTGGAGACCATGGTGAAACTGGATGCGACTTCTGATGCTGTGGTCAAGGTGGATGTGGCTGAAGATGAGAAGGAAAGGAAGAAGAAGAAAAAGAAAGGCCCGTCAGAGGAGCCAGAGGAGGAAGAGCCCGATGAGAGCATGCTGGATTGGTGGTCCAAGTACTTCGCCTCCATCGACACAATGAAGGAGCAACTTCGACAACATGAGACCTCTGGAACTGACTTGGAAGAGAAGGAAGAGATGGAAAGCGCTGAGGGCCTGAAGGGACCAATGAAGAGCAAGGAGAAGTCCAGAGCTGCAAAGGAGGAGAAAAAGAAGAAAAACCAGAGCCCTGGCCCTGGCCAGGGATCGGAGGCTCCTGAGAAGAAGAAAGCCAAGATCGATGAGCTTAAGGTGTACCCCAAGGAGCTGGAATCGGAGTTTGACAGCTTTGAGGACTGGCTGCACACCTTCAACCTGTTGAGGGGCAAGACGGGAGATGATGAGGATGGCTCCACAGAGGAGGAGCGCATAGTAGGCCGATTCAAGGGCTCCCTCTGTGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAAGATGTATCTCGAGAAGCTGGCTATGATCCCACCTATGGAATGTTCCAGGGCATCCCAAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAATCTATGTGGTCCGGGCCACAGACCTGCACCCGGCCGACATCAATGGCAAAGCTGACCCCTATATTGCCATCAAGTTAGGCAAGACCGACATCCGAGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTGTTTGGGAAGTCCTTTGACATTGAGGCCTCCTTCCCCATGGAGTCCATGTTGACAGTGGCCGTGTACGACTGGGATCTGGTGGGCACTGATGACCTCATCGGAGAAACCAAGATTGACCTGGAAAACCGCTTCTACAGCAAGCATCGCGCCACCTGCGGCATCGCACAGACCTATTCCATACATGGCTACAATATCTGGAGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACACGCCTCTGTAAAGAGGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGTCCCCATGGGAGAGTGAGGGTTGCCAACCGTGTCTTCACGGGGCCTTCAGAAATAGAGGATGAGAATGGTCAGAGGAAGCCCACAGATGAGCACGTGGCACTGTCTGCTCTGAGACACTGGGAGGACATCCCCCGGGTGGGCTGCCGCCTTGTGCCGGAACACGTGGAGACCAGGCCGCTGCTCAACCCTGACAAGCCAGGCATTGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACACCTCTGGATATATCCCCCAGGAAACCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCGTGTGGAACACAGACGAGGTGGTCCTGGAAGACGATGATTTCTTCACGGGAGAGAAGTCCAGTGACATTTTTGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAACAGGACACAGATGTCCACTATCACTCCCTCACGGGGGAGGGCAACTTCAACTGGAGATACCTCTTCCCCTTCGACTACCTAGCGGCCGAAGAGAAGATCGTTATGTCCAAAAAGGAGTCTATGTTCTCCTGGGATGAGACGGAGTACAAGATCCCTGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGACGCTGACCACTTCTCGGCTGACGACTTCCTGGGGGCTATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGAGGGGCGCTAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTACCCCTGGTTTCCATCTTTAAACAGAAACGTGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAATGATGAGTTTGAGCTCACAGGCAAAGTGGAGGCGGAGCTACACCTACTCACGGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCTGTGGGCCTGGCTCGCAATGAACCTGATCCCCTAGAAAAACCCAACCGGCCTGACACGGCATTCGTCTGGTTCCTGAACCCACTCAAATCTATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTGATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGCTGGGGCTGCTCATGCTGGCCCTCTTCCTTTACAGCCTCCCAGGCTACATGGTCAAGAAGCTCCTAGGGGCCTGA 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| 6 | 編碼人類耳畸蛋白同功型1蛋白(SEQ ID NO：4)之密碼子最佳化(CO) DNA序列，5994 bp | ATGGCACTGCTGATCCACCTGAAAACCGTCTCCGAACTGAGAGGCAGAGGGGACAGAATCGCTAAAGTCACCTTCCGGGGACAGAGCTTTTACAGCAGGGTGCTGGAGAACTGCGAGGACGTGGCCGACTTTGACGAGACATTCAGGTGGCCCGTGGCCAGCTCCATCGATCGCAATGAGATGCTGGAGATCCAGGTGTTTAACTATAGCAAGGTGTTCTCCAATAAGCTGATCGGCACCTTCCGGATGGTGCTGCAGAAGGTGGTGGAGGAGTCCCACGTGGAGGTGACCGACACACTGATCGACGATAACAATGCCATCATCAAGACATCCCTGTGCGTGGAGGTGCGCTACCAGGCCACCGATGGCACAGTGGGCTCTTGGGACGATGGCGACTTCCTGGGCGATGAGTCCCTGCAGGAGGAGGAGAAGGACTCTCAGGAGACAGATGGCCTGCTGCCTGGCTCCCGGCCATCTAGCCGCCCCCCTGGCGAGAAGTCTTTTAGGAGAGCCGGCAGGTCCGTGTTCTCTGCCATGAAGCTGGGCAAGAACAGGAGCCACAAGGAGGAGCCTCAGAGGCCCGACGAGCCAGCCGTGCTGGAGATGGAGGACCTGGATCACCTGGCCATCAGACTGGGCGATGGCCTGGACCCTGATAGCGTGTCCCTGGCCTCCGTGACCGCCCTGACCACAAACGTGTCTAATAAGCGGAGCAAGCCAGACATCAAGATGGAGCCATCTGCCGGCAGGCCCATGGATTACCAGGTGAGCATCACAGTGATCGAGGCCAGACAGCTGGTGGGCCTGAACATGGACCCCGTGGTGTGCGTGGAAGTGGGCGACGATAAGAAGTACACCTCCATGAAGGAGTCTACAAACTGTCCATACTACAACGAGTACTTCGTGTTTGATTTCCACGTGAGCCCCGACGTGATGTTCGATAAGATCATCAAGATCAGCGTGATCCACTCCAAGAATCTGCTGCGGTCTGGCACCCTGGTGGGAAGCTTTAAGATGGACGTGGGCACAGTGTACTCTCAGCCTGAGCACCAGTTCCACCACAAGTGGGCCATCCTGAGCGATCCAGACGATATCTCCTCTGGCCTGAAGGGCTATGTGAAGTGCGACGTGGCAGTGGTGGGCAAGGGCGATAACATCAAGACCCCACACAAGGCCAATGAGACAGACGAGGACGATATCGAGGGAAACCTGCTGCTGCCAGAGGGAGTGCCACCCGAGAGGCAGTGGGCCAGGTTCTACGTGAAGATCTATAGGGCAGAGGGCCTGCCTAGGATGAACACCAGCCTGATGGCCAATGTGAAGAAGGCCTTCATCGGCGAGAACAAGGACCTGGTGGATCCCTACGTGCAGGTGTTCTTTGCCGGCCAGAAGGGCAAGACCTCCGTGCAGAAGAGCTCCTATGAGCCTCTGTGGAATGAGCAGGTGGTGTTTACAGACCTGTTCCCTCCACTGTGCAAGAGGATGAAGGTGCAGATCAGAGACTCTGATAAGGTGAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTTATCGATCTGAGGAAGATCAGCAATGACGGCGATAAGGGCTTCCTGCCCACCCTGGGCCCCGCCTGGGTGAACATGTACGGCAGCACCAGAAATTATACACTGCTGGACGAGCACCAGGATCTGAACGAGGGCCTGGGCGAGGGCGTGAGCTTTAGAGCCAGGCTGCTGCTGGGCCTGGCCGTGGAGATCGTGGACACCTCCAATCCCGAGCTGACCTCTAGCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACACCTATCTCTGAGAGCTGTGCCGGCAAGATGGAGGAGTTCTTTCTGTTTGGCGCCTTCCTGGAGGCCTCCATGATCGACCGGCGCAACGGCGATAAGCCTATCACCTTCGAGGTGACAATCGGCAACTACGGCAATGAGGTGGACGGCCTGTCTCGGCCCCAGCGCCCAAGGCCCAGAAAGGAGCCTGGCGACGAGGAGGAGGTGGATCTGATCCAGAACGCCAGCGACGATGAGGCAGGCGACGCAGGCGATCTGGCCTCCGTGTCCTCTACCCCCCCTATGCGGCCACAGGTGACAGACCGCAATTACTTTCACCTGCCTTATCTGGAGCGCAAGCCATGCATCTACATCAAGTCTTGGTGGCCCGATCAGAGGAGACGGCTGTATAACGCCAATATCATGGACCACATCGCCGATAAGCTGGAGGAGGGCCTGAATGACATCCAGGAGATGATCAAGACCGAGAAGTCCTATCCAGAGCGCAGGCTGAGGGGCGTGCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGTAGATTCCTGTCCCTGGCCGACAAGGATCAGGGGCACTCATCACGGACACGGCTGGACCGGGAGCGGCTGAAATCATGTATGCGGGAGCTGGAAAATATGGGACAGCAGGCAAGGATGCTGCGCGCCCAGGTGAAGAGGCACACCGTGAGAGACAAGCTGCGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTTCTGGCCGATGAGCCACAGCACAGCATCCCCGACATCTTCATCTGGATGATGTCCAACAATAAGAGAGTGGCCTACGCCCGGGTGCCCTCTAAGGATCTGCTGTTTAGCATCGTGGAGGAGGAGACAGGCAAGGACTGTGCCAAGGTGAAGACCCTGTTCCTGAAGCTGCCTGGCAAGAGAGGCTTTGGCAGCGCCGGATGGACCGTGCAGGCAAAGGTGGAGCTGTATCTGTGGCTGGGCCTGTCTAAGCAGCGGAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTTCAGGAGGTGAAGGCAGCACAGGGACTGGGACTGCACGCCTTCCCCCCCGTGAGCCTGGTGTACACCAAGAAGCAGGCCTTTCAGCTGAGGGCCCATATGTACCAGGCCAGGTCTCTGTTCGCCGCCGATAGCTCCGGACTGAGCGACCCTTTTGCCAGGGTGTTCTTTATCAATCAGAGCCAGTGCACAGAGGTGCTGAACGAGACCCTGTGCCCAACATGGGATCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTGTACGGAGAGGCACACGAGCTGAGGGACGATCCACCCATCATCGTGATCGAGATCTATGATCAGGACTCCATGGGCAAGGCCGATTTCATGGGCAGGACCTTTGCCAAGCCCCTGGTGAAGATGGCCGACGAGGCCTACTGCCCTCCAAGATTCCCCCCTCAGCTCGAGTACTATCAGATCTATAGGGGAAATGCAACCGCCGGAGACCTGCTGGCCGCCTTTGAGCTGCTGCAGATCGGCCCCGCCGGAAAGGCAGACCTGCCACCCATCAACGGCCCAGTGGATGTGGACAGAGGCCCCATCATGCCTGTGCCAATGGGCATCAGACCAGTGCTGTCCAAGTACAGGGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGACTGCGCGACCTGAAGAGGGTGAATCTGGCCCAGGTGGATAGGCCCAGAGTGGACATCGAGTGCGCCGGAAAGGGCGTGCAGTCTAGCCTGATCCACAACTATAAGAAGAACCCAAATTTCAACACCCTGGTGAAGTGGTTTGAGGTGGATCTGCCCGAGAATGAGCTGCTGCACCCTCCACTGAACATCCGGGTGGTGGACTGTAGAGCCTTCGGCAGGTACACCCTGGTGGGCAGCCACGCCGTGAGCAGCCTGAGGAGGTTCATCTACAGGCCCCCTGACAGGTCCGCCCCTTCTTGGAATACCACAGTGAGACTGCTGCGGCGCTGCAGGGTGCTGTGCAACGGAGGCAGCTCCTCTCACTCTACCGGCGAGGTGGTGGTGACAATGGAGCCTGAGGTACCCATCAAGAAGCTGGAGACCATGGTGAAGCTGGATGCCACAAGCGAGGCAGTGGTGAAGGTGGACGTGGCAGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGAACCGCCGAGGAGCCTGAGGAAGAGGAGCCAGATGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTCGCCTCTATCGACACAATGAAGGAGCAGCTGAGACAGCAGGAGCCTAGCGGCATCGATCTGGAGGAGAAGGAGGAGGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGCTCCATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCAGCAAAGGAAGAGAAGAAGAAGAAGACCCAGAGCAGCGGCTCTGGACAGGGCAGCGAGGCACCAGAGAAGAAGAAGCCTAAGATCGATGAGCTGAAGGTGTACCCAAAGGAGCTGGAGTCCGAGTTCGATAATTTTGAGGACTGGCTGCACACCTTCAACCTGCTGCGCGGCAAGACAGGCGACGATGAGGACGGCAGCACCGAGGAGGAGAGAATCGTGGGCCGGTTTAAGGGCTCCCTGTGCGTGTACAAGGTGCCACTGCCTGAGGACGTGAGCAGGGAGGCCGGATACGACTCTACCTATGGCATGTTCCAGGGCATCCCCTCTAATGATCCTATCAACGTGCTGGTGCGCGTGTATGTGGTGAGGGCCACAGATCTGCACCCCGCCGACATCAACGGCAAGGCCGACCCTTACATCGCCATCCGCCTGGGCAAGACCGATATCAGGGACAAGGAGAATTATATCTCCAAGCAGCTGAACCCCGTGTTCGGCAAGTCTTTTGACATCGAGGCCAGCTTCCCTATGGAGTCCATGCTGACCGTGGCCGTGTACGATTGGGACCTGGTGGGCACCGACGATCTGATCGGCGAGACAAAGATCGATCTGGAGAATCGCTTTTATTCTAAGCACAGGGCAACCTGCGGAATCGCACAGACCTACAGCACACACGGCTATAACATCTGGCGCGACCCCATGAAGCCTAGCCAGATCCTGACAAGGCTGTGCAAGGATGGCAAGGTGGACGGACCACACTTCGGACCACCCGGCAGAGTGAAGGTGGCCAATCGGGTGTTTACAGGCCCTTCCGAGATCGAGGATGAGAACGGCCAGCGCAAGCCAACCGACGAGCACGTGGCCCTGCTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGATATCCCAAGGGCCGGATGTAGGCTGGTGCCTGAGCACGTGGAGACCAGACCACTGCTGAATCCAGACAAGCCAGGAATCGAGCAGGGCAGGCTGGAGCTGTGGGTGGATATGTTCCCAATGGACATGCCAGCCCCAGGAACACCCCTGGATATCTCCCCTAGAAAGCCAAAGAAGTACGAGCTGAGAGTGATCATCTGGAACACAGACGAGGTGGTGCTGGAGGACGATGACTTCTTTACCGGCGAGAAGTCTAGCGATATCTTTGTGCGCGGATGGCTGAAGGGACAGCAGGAGGACAAGCAGGATACAGACGTGCACTACCACTCCCTGACCGGCGAGGGCAATTTCAACTGGAGATACCTGTTCCCTTTTGATTATCTGGCCGCCGAGGAGAAGATCGTGATCTCTAAGAAGGAGAGCATGTTTTCCTGGGACGAGACAGAGTATAAGATCCCAGCCAGACTGACCCTGCAGATCTGGGATGCCGACCACTTCAGCGCCGATGACTTTCTGGGCGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCAAGAGGCGCCAAGACCGCCAAGCAGTGCACAATGGAGATGGCAACCGGAGAGGTGGACGTGCCTCTGGTGTCTATCTTCAAGCAGAAGAGGGTGAAGGGCTGGTGGCCACTGCTGGCCAGAAACGAGAATGATGAGTTTGAGCTGACAGGCAAGGTGGAGGCAGAGCTGCACCTGCTGACCGCCGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCAGGAATGAGCCCGACCCTCTGGAGAAGCCAAACAGGCCCGACACCAGCTTCATCTGGTTTCTGAATCCTCTGAAGTCCGCCCGGTACTTCCTGTGGCACACCTATCGCTGGCTGCTGCTGAAGCTGTTATTACTGTTATTACTGCTGCTGCTGCTGGCCCTGTTTCTGTACAGCGTGCCCGGCTATCTGGTGAAGAAGATCCTGGGCGCCTGA 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OTOF突變與感覺神經性聽力損失及聽神經病變相關。本文所述之組合物及方法藉由投與含有編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之多核苷酸之第一核酸載體及含有編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之多核苷酸之第二核酸載體來增加WT OTOF同功型5蛋白之表現。為將核酸載體用於治療感覺神經性聽力損失及聽神經病變之治療應用，可將其引導至耳內部，且具體而言引導至特定細胞類型。已建立將蛋白質遞送至哺乳動物細胞及在哺乳動物細胞中穩定表現編碼蛋白質之基因之眾多種方法。編碼 OTOF 之多核苷酸
可用於在哺乳動物細胞中達成OTOF同功型5之治療有效之細胞內濃度之一個平台係經由穩定表現編碼OTOF同功型5之基因(例如，藉由整合至哺乳動物細胞之核或粒線體基因體中，或藉由在哺乳動物細胞核中形成游離型多聯體)。該基因係編碼相應蛋白質之一級胺基酸序列之多核苷酸。為將外源基因引入哺乳動物細胞中，可將基因納入載體中。可藉由多種方法將載體 引入細胞中，包括轉型、轉染、轉導、直接攝取、射彈轟擊及藉由將載體囊封於脂質體中。轉染或轉型細胞之適宜方法之實例包括磷酸鈣沈澱、電穿孔、顯微注射、感染、脂轉染及直接攝取。該等方法更詳細闡述於例如Green等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第4版(Cold Spring Harbor University Press，New York 2014)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons，New York 2015)，該等文獻各自之揭示內容以引用方式併入本文中。
亦可藉由使含有編碼OTOF同功型5蛋白之基因之部分之載體靶向細胞膜磷脂將OTOF同功型5引入哺乳動物細胞中。舉例而言，可藉由將載體分子連接至VSV-G蛋白使載體靶向細胞膜之細胞外表面上之磷脂，該VSV-G蛋白係對所有細胞膜磷脂具有親和力之病毒蛋白。該構築體可使用熟習此項技術者所熟知之方法產生。
哺乳動物RNA聚合酶對編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸之識別及結合對於基因表現至關重要。因此，可在多核苷酸內包括對招募RNA聚合酶且促進轉錄複合物在轉錄起始位點組裝之轉錄因子展現高親和力之序列元件。該等序列元件包括例如哺乳動物啟動子，其序列可由特異性轉錄起始因子及最終RNA聚合酶識別及結合。
適用於本文所述組合物及方法中之多核苷酸亦包括編碼哺乳動物啟動子下游之OTOF蛋白之多核苷酸(例如編碼哺乳動物啟動子下游之OTOF同功型5蛋白之N端部分之多核苷酸)。可用於在哺乳動物細胞中表現OTOF蛋白之啟動子包括遍在啟動子及耳蝸毛細胞特異性啟動子。遍在啟動子包括CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子及嵌合CMV-雞β-肌動蛋白啟動子(CBA)之截短形式，其中 雜合雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白內含子極大地縮短以產生啟動子之較小形式，稱為smCBA。耳蝸毛細胞特異性啟動子包括肌凝蛋白15 (Myo15)啟動子。用於本文所述方法及組合物中之Myo15啟動子序列闡述於下文及表3中。替代地，衍生自病毒基因體之啟動子亦可用於在哺乳動物細胞中穩定表現該等劑。可用於促進該等劑之哺乳動物表現之功能性病毒l啟動子之實例包括腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子、SV40啟動子、HSV之tk
啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、HIV之LTR啟動子、莫洛尼病毒(Moloney virus)之啟動子、愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein barr virus，EBV)啟動子及勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子。鼠類肌凝蛋白 15 啟動子
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之Myo15啟動子包括來自能夠在毛細胞中特異性表現轉殖基因之鼠類Myo15基因座區域之多核苷酸序列，或其變異體，例如與能夠在毛細胞中特異性表現轉殖基因之鼠類Myo15基因座區域具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸序列。該等區域包括緊接在鼠類Myo15轉譯起始位點之前之多核苷酸序列及位於距鼠類Myo15轉譯起始位點超過5 kb之上游調節元件。用於本文所述組合物及方法中之鼠類Myo15啟動子可視情況地包括可操作連接能夠在毛細胞中特異性表現轉殖基因之鼠類Myo15基因座區域之連接體，或鼠類Myo15基因座之區域可無需間插的連接體直接連結。
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之鼠類Myo15啟動子含有與含有鼠類Myo15基因之第一非編碼外顯子之區域(相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-6755至-7209之核酸，其序列示於SEQ ID NO：7中)或其連結(例如可操作連接)至第二區之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之第一區(上游調節元件)，該第二區與緊接在鼠類Myo15轉譯起始位點之前之多核苷酸序列(相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-1至-1157之核酸，其序列示於SEQ ID NO：8中)或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。SEQ ID NO：7之功能性部分可具有相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-7166至-7091之核酸之序列(示於SEQ ID NO：9中)及/或相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-7077至-6983之核酸之序列(示於SEQ ID NO：10中)。第一區可含有融合至SEQ ID NO：10之多核苷酸序列之SEQ ID NO：9之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：11中所示，或第一區可含有融合至SEQ ID NO：9之多核苷酸序列之SEQ ID NO：10之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：12中所示。替代地，第一區可含有藉由內源間插的多核苷酸序列(例如，第一區可具有或包括相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-7166至-6983之核酸之序列，如SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：33中所示)或核酸連接體連結之SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之序列。在第一區含有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之鼠類Myo15啟動子中，兩個序列可以任一順序納入(例如，SEQ ID NO：9可連結至(例如先於) SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：10可連結至(例如先於) SEQ ID NO：9)。SEQ ID NO：8之功能性部分可具有相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-590至-509之核酸之序列(示於SEQ ID NO：14中)及/或相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-266至-161之核酸之序列(示於SEQ ID NO：15中)。在一些實施例中，含有SEQ ID NO：14之序列具有SEQ ID NO：34之序列。在一些實施例中，含有SEQ ID NO：15之序列具有SEQ ID NO：35之序列。第二區可含有融合至SEQ ID NO：15之多核苷酸序列之SEQ ID NO：14之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：16中所示，或第二區可含有融合至SEQ ID NO：14之多核苷酸序列之SEQ ID NO：15之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：17中所示。第二區可含有融合至SEQ ID NO：35之核酸序列之SEQ ID NO：34之核酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：38中所示，或第二區可含有融合至SEQ ID NO：34之核酸序列之SEQ ID NO：35之核酸序列而無間插的核酸。替代地，第二區可含有藉由內源間插的多核苷酸序列(例如，第二區可具有相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-590至-161之核酸之序列，如SEQ ID NO：18中所示)或核酸連接體連結之SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之序列。在第二區含有SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之鼠類Myo15啟動子中，兩個序列可以任一順序納入(例如，SEQ ID NO：14可連結至(例如先於) SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：15可連結至(例如先於) SEQ ID NO：14)。
鼠類Myo15啟動子之第一區及第二區可直接連結或可藉由核酸連接體連結。舉例而言，鼠類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：8之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：14-18、34、35及38中之任一或多者，例如SEQ ID NO 14及15)之SEQ ID NO：7之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：9-13及33中之任一或多者，例如SEQ ID NO 9及10)而無間插的核酸。舉例而言，鼠類Myo15啟動子之源自SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8之直接融合之多核苷酸序列示於SEQ ID NO：19中。替代地，連接體可用於將SEQ ID NO：7之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：9-13及33中之任一或多者，例如SEQ ID NO 9及10)連結至SEQ ID NO：8之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：14-18、34、35及38中之任一或多者，例如SEQ ID NO 14及15)。含有SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之功能性部分之例示性Myo15啟動子提供於SEQ ID NO：21、22、36、37、42及43中。
用於本文所述鼠類Myo15啟動子中之核酸連接體之長度可為約5 kb或更短(例如約5 kb、4.5 kb、4 kb、3.5 kb、3 kb、2.5 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、450 bp、400 bp、350 bp、300 bp、250 bp、200 bp、150 bp、100 bp、90 bp、80 bp、70 bp、60 bp、50 bp、40 bp、30 bp、25 bp、20 bp、15 bp、10 bp、5 bp、4 bp、3 bp、2 bp或更短)。可用於本文所述鼠類Myo15啟動子中之核酸連接體不會破壞本發明之鼠類Myo15啟動子誘導毛細胞中之轉殖基因表現之能力。
在一些實施例中，SEQ ID NO：7之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：9-13及33中之任一或多者，例如SEQ ID NO 9及10)連結(例如可操作連接)至SEQ ID NO：8之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：14-18、34、35及38中之任一或多者，例如SEQ ID NO 14及15)，且在一些實施例中，區域之順序係相反的(例如SEQ ID NO：8之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：14-18、34、35及38中之任一或多者，例如SEQ ID NO 14及15)連結(例如可操作連接)至SEQ ID NO：7之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：9-13及33中之任一或多者，例如SEQ ID NO 9及10))。舉例而言，鼠類Myo15啟動子之源自SEQ ID NO：8與SEQ ID NO：7之直接融合之多核苷酸序列示於SEQ ID NO：20中。SEQ ID NO：8之功能性部分或衍生物先於SEQ ID NO：7之功能性部分或衍生物之鼠類Myo15啟動子之實例提供於SEQ ID NO：41中。無論順序如何，SEQ ID NO：7之序列或其功能性部分或衍生物及SEQ ID NO：8之序列或其功能性部分或衍生物可藉由直接融合或核酸連接體連結，如上文所述。
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之鼠類Myo15啟動子含有與含有鼠類Myo15基因之第一非編碼外顯子之區域(相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-6755至-7209之核酸，其序列示於SEQ ID NO：7中)或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域。SEQ ID NO：7之功能性部分可具有相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-7166至-7091之核酸之序列(示於SEQ ID NO：9中)及/或相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-7077至-6983之核酸之序列(示於SEQ ID NO：10中)。鼠類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：10之多核苷酸序列之SEQ ID NO：9之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：11中所示，或鼠類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：9之多核苷酸序列之SEQ ID NO：10之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：12中所示。替代地，鼠類Myo15啟動子可含有藉由內源間插的多核苷酸序列(例如，第一區可具有或包括相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-7166至-6983之核酸之序列，如SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：33中所示)或多核苷酸連接體連結之SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之序列。在含有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之鼠類Myo15啟動子中，兩個序列可以任一順序納入(例如，SEQ ID NO：9可連結至(例如先於) SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：10可連結至(例如先於) SEQ ID NO：9)。
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之鼠類Myo15啟動子含有與緊接在鼠類Myo15轉譯起始位點上游之多核苷酸序列(相對於鼠類Myo15轉譯起始位點之-1至-1157之核酸，其序列示於SEQ ID NO：8中)或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域。SEQ ID NO：8之功能性部分可具有相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-590至-509之核酸之序列(示於SEQ ID NO：14中)及/或相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-266至-161之核酸之序列(示於SEQ ID NO：15中)。在一些實施例中，含有SEQ ID NO：14之序列具有SEQ ID NO：34之序列。在一些實施例中，含有SEQ ID NO：15之序列具有SEQ ID NO：35之序列。鼠類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：15之多核苷酸序列之SEQ ID NO：14之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：16中所示，或鼠類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：14之多核苷酸序列之SEQ ID NO：15之多核苷酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：17中所示。鼠類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：35之核酸序列之SEQ ID NO：34之核酸序列而無間插的核酸，如SEQ ID NO：38中所示，或鼠類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：41之核酸序列之SEQ ID NO：35之核酸序列而無間插的核酸。替代地，鼠類Myo15啟動子可含有藉由內源間插的多核苷酸序列(例如，第二區可具有相對於鼠類Myo15轉譯起始位點-590至-161之核酸之序列，如SEQ ID NO：18中所示)或核酸連接體連結之SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之序列。在含有SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之鼠類Myo15啟動子中，兩個序列可以任一順序納入(例如，SEQ ID NO：14可連結至(例如先於) SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：15可連結至(例如先於) SEQ ID NO：14)。
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之鼠類Myo15啟動子含有與含有Myo15基因之第一非編碼外顯子之區域(相對於鼠類Myo15轉譯起始位點之-6755至-7209之核酸，其序列示於SEQ ID NO：7中)具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域之功能性部分或衍生物，該含有Myo15基因之第一非編碼外顯子之區域在任一側側接有與緊接在鼠類Myo15轉譯起始位點上游之核酸序列(相對於鼠類Myo15轉譯起始位點之-1至-1157之核酸，其序列示於SEQ ID NO：8中)具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域之功能性部分或衍生物。舉例而言，SEQ ID NO：8之功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：14或34)可直接融合或藉由核酸連接體連結至SEQ ID NO：7之部分，例如SEQ ID NO：9-13及33中之任一者，其直接融合或藉由核酸連接體連結至SEQ ID NO：8之不同功能性部分，例如SEQ ID NO：15或35。在其他實施例中，SEQ ID NO：8之功能性部分或衍生物，例如SEQ ID NO：15或35可直接融合或藉由核酸連接體連結至SEQ ID NO：7之部分，例如SEQ ID NO：9-13及33中之任一者，其直接融合或藉由核酸連接體連結至SEQ ID NO：8之不同功能性部分，例如SEQ ID NO：14或34。 舉例而言，與SEQ ID NO：34、33及35之核酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸可融合產生與SEQ ID NO：39之核酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸。在一些實施例中，與SEQ ID NO：35、33及34之核酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸可融合產生與SEQ ID NO：40之核酸序列具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸。人類肌凝蛋白 15 啟動子
本文所述組合物及方法之多核苷酸亦可包括來自能夠在毛細胞中特異性表現轉殖基因之人類Myo15基因座區域或其變異體之核酸序列，例如與能夠在毛細胞中特異性表現轉殖基因之人類Myo15基因座區域具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之核酸序列。本文所述組合物及方法之多核苷酸可視情況地包括可操作連接能夠在毛細胞中特異性表現轉殖基因之人類Myo15基因座區域之連接體，或人類Myo15基因座之區域可無需間插的連接體直接連結 。
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之人類Myo15啟動子含有與SEQ ID NO：23中所示之序列或其連結(例如可操作連接)至第二區之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之第一區，該第二區與SEQ ID NO：24中所示之序列或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。SEQ ID NO：23之功能性部分可具有SEQ ID NO：25中所示之序列。SEQ ID NO：24之功能性部分可具有SEQ ID NO：26中所示之序列及/或SEQ ID NO：27中所示之序列。第二區可含有融合至SEQ ID NO：27之核酸序列而無間插的核酸之SEQ ID NO：26之核酸序列，如SEQ ID NO：28中所示，或第二區可含有融合至SEQ ID NO：26之核酸序列而無間插的核酸之SEQ ID NO：27之核酸序列，如SEQ ID NO：29中所示。替代地，第二區可含有藉由內源間插的核酸序列(如SEQ ID NO：30中所示)或核酸連接體連結之SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27之序列。在第二區含有SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27之人類Myo15啟動子中，兩個序列可以任一順序納入(例如，SEQ ID NO：26可連結至(例如先於) SEQ ID NO：27，或SEQ ID NO：27可連結至(例如先於) SEQ ID NO：26)。
人類Myo15啟動子之第一區及第二區可直接連結或可藉由核酸連接體連結。舉例而言，人類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：24之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：26-30中之任一或多者，例如SEQ ID NO：26及/或27)而無間插的核酸之SEQ ID NO：23之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：25)。替代地，可使用連接體將SEQ ID NO：23之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：25)連結至SEQ ID NO：24之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：26-30中之任一或多者，例如SEQ ID NO：26及/或27)。含有SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24之功能性部分之例示性人類Myo15啟動子提供於SEQ ID NO：31及32中。
在一些實施例中，SEQ ID NO：23之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：25)連結(例如可操作連接)至SEQ ID NO：24之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：26-30中之任一或多者，例如SEQ ID NO：26及27)，且在一些實施例中，區域之順序係相反的(例如，SEQ ID NO：24之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：26-30中之任一或多者，例如SEQ ID NO：26及/或27)連結(例如可操作連接)至SEQ ID NO：23之序列或其功能性部分或衍生物(例如SEQ ID NO：25))。無論順序如何，SEQ ID NO：23之序列或其功能性部分或衍生物及SEQ ID NO：24之序列或其功能性部分或衍生物可藉由直接融合或核酸連接體連結，如上文所述。
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之人類Myo15啟動子含有與含有SEQ ID NO：23中所示之序列或其功能性部分或衍生物之區域具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域。SEQ ID NO：23之功能性部分可具有SEQ ID NO：25中所示之核酸之序列。
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之人類Myo15啟動子含有與SEQ ID NO：18中所示之序列或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之區域。SEQ ID NO：24之功能性部分可具有SEQ ID NO：26中所示之序列及/或SEQ ID NO：27中所示之序列。人類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：27之核酸序列而無間插的核酸之SEQ ID NO：26之核酸序列，如SEQ ID NO：28中所示，或人類Myo15啟動子可含有融合至SEQ ID NO：26之核酸序列而無間插的核酸之SEQ ID NO：27之核酸序列，如SEQ ID NO：29中所示。替代地，人類Myo15啟動子可含有藉由內源間插的核酸序列(例如如SEQ ID NO：30中所示)或核酸連接體連結之SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27之序列。在含有SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27之人類Myo15啟動子中，兩個序列可以任一順序納入(例如SEQ ID NO：26可連結至(例如先於) SEQ ID NO：27，或SEQ ID NO：27可連結至(例如先於) SEQ ID NO：26)。
用於本文所述人類Myo15啟動子中之核酸連接體之長度可為約5 kb或更短(例如約5 kb、4.5 kb、4 kb、3.5 kb、3 kb、2.5 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、450 bp、400 bp、350 bp、300 bp、250 bp、200 bp、150 bp、100 bp、90 bp、80 bp、70 bp、60 bp、50 bp、40 bp、30 bp、25 bp、20 bp、15 bp、10 bp、5 bp、4 bp、3 bp、2 bp或更短)。可用於本文所述人類Myo15啟動子中之核酸連接體不會破壞本發明之Myo15啟動子誘導毛細胞中之轉殖基因表現之能力。
前述Myo15啟動子序列匯總於下表3中。表 3 ：用於本文所述 Myo15 啟動子中之例示性核苷酸序列
| SEQ ID NO. | 多核苷酸序列之描述 | 多核苷酸序列 |
| 7 | 含有鼠類Myo15之非編碼外顯子1之區域(-6755至-7209) | CTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGAGCTGAACCTTAGCCTTGCCTTCCTGGGTACCCTTCTGAGCCTCACTGTCTTCTGTGAGATGGGCAAAGTGCGGGTGTGACTCCTTGGCAACGGTGTTACACCAGGGCAGGTAAAGTTGTAGTTATTTGTGGGGTACACCAGGACTGTTAAAGGTGTAACTAT |
| 8 | 緊接在鼠類Myo15之轉譯起始位點之前之區域(-1至-1157) | GGTCTCACCCAGCATTTTCACTTCTAATAAGTTCAAATGTGATACGGCACCTTTCTAAAAATTAGTTTTCAGGGAAATAGGGTTCAAAACTGGTAGTGGTAGGGTCCATTCTCACGACCCCCAGGCCTGCTAACCCTGACCAAGCTACCTATTACTTACCCTCCTCTTTCTCCTCCTCCTCTTTCTCCTTCTCCTGCTTCCCCTCTTCCTTCTCCCTCCCTTCCTCTCCCTCCTCCCCCTCCTTGGCTGTGATCAGATCCAGAGCCTGAATGAGCCTCCTGACCCCACACCCCCACTAGCATGGGCCTGCAAGTGCCCAGAAGTCCCTCCTGCCTCCTAAACTGCCCAGCCGATCCATTAGCTCTTCCTTCTTCCCAGTGAAAGAAGCAGGCACAGCCTGTCCCTCCCGTTCTACAGAAAGGAAGCTACAGCACAGGGAGGGCCAAAGGCCTTCCTGGGACTAGACAGTTGATCAACAGCAGGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACC |
| 9 | SEQ ID NO：7之部分(-7166至-7091) | CCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGG |
| 10 | SEQ ID NO：7之部分(-7077至-6983) | AGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGG |
| 11 | SEQ ID NO：7之部分(SEQ ID NO：9融合至SEQ ID NO：10) | CCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGG |
| 12 | SEQ ID NO：7之部分(SEQ ID NO：10融合至SEQ ID NO：9) | AGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGG |
| 13 | SEQ ID NO：7之部分(-7166至-6983) | CCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGG |
| 14 | SEQ ID NO：8之部分(-590至-509) | TGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTG |
| 15 | SEQ ID NO：8之部分(-266至-161) | CACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCT |
| 16 | SEQ ID NO：8之部分(SEQ ID NO：14融合至SEQ ID NO：15) | TGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTG CACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCT |
| 17 | SEQ ID NO：8之部分(SEQ ID NO：15融合至SEQ ID NO：14) | CACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTTGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTG |
| 18 | SEQ ID NO：8之部分(-590至-161) | TGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCT |
| 19 | SEQ ID NO：7融合至SEQ ID NO：8 | CTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGAGCTGAACCTTAGCCTTGCCTTCCTGGGTACCCTTCTGAGCCTCACTGTCTTCTGTGAGATGGGCAAAGTGCGGGTGTGACTCCTTGGCAACGGTGTTACACCAGGGCAGGTAAAGTTGTAGTTATTTGTGGGGTACACCAGGACTGTTAAAGGTGTAACTATGGTCTCACCCAGCATTTTCACTTCTAATAAGTTCAAATGTGATACGGCACCTTTCTAAAAATTAGTTTTCAGGGAAATAGGGTTCAAAACTGGTAGTGGTAGGGTCCATTCTCACGACCCCCAGGCCTGCTAACCCTGACCAAGCTACCTATTACTTACCCTCCTCTTTCTCCTCCTCCTCTTTCTCCTTCTCCTGCTTCCCCTCTTCCTTCTCCCTCCCTTCCTCTCCCTCCTCCCCCTCCTTGGCTGTGATCAGATCCAGAGCCTGAATGAGCCTCCTGACCCCACACCCCCACTAGCATGGGCCTGCAAGTGCCCAGAAGTCCCTCCTGCCTCCTAAACTGCCCAGCCGATCCATTAGCTCTTCCTTCTTCCCAGTGAAAGAAGCAGGCACAGCCTGTCCCTCCCGTTCTACAGAAAGGAAGCTACAGCACAGGGAGGGCCAAAGGCCTTCCTGGGACTAGACAGTTGATCAACAGCAGGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACC |
| 20 | SEQ ID NO：8融合至SEQ ID NO：7 | GGTCTCACCCAGCATTTTCACTTCTAATAAGTTCAAATGTGATACGGCACCTTTCTAAAAATTAGTTTTCAGGGAAATAGGGTTCAAAACTGGTAGTGGTAGGGTCCATTCTCACGACCCCCAGGCCTGCTAACCCTGACCAAGCTACCTATTACTTACCCTCCTCTTTCTCCTCCTCCTCTTTCTCCTTCTCCTGCTTCCCCTCTTCCTTCTCCCTCCCTTCCTCTCCCTCCTCCCCCTCCTTGGCTGTGATCAGATCCAGAGCCTGAATGAGCCTCCTGACCCCACACCCCCACTAGCATGGGCCTGCAAGTGCCCAGAAGTCCCTCCTGCCTCCTAAACTGCCCAGCCGATCCATTAGCTCTTCCTTCTTCCCAGTGAAAGAAGCAGGCACAGCCTGTCCCTCCCGTTCTACAGAAAGGAAGCTACAGCACAGGGAGGGCCAAAGGCCTTCCTGGGACTAGACAGTTGATCAACAGCAGGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACCCTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGAGCTGAACCTTAGCCTTGCCTTCCTGGGTACCCTTCTGAGCCTCACTGTCTTCTGTGAGATGGGCAAAGTGCGGGTGTGACTCCTTGGCAACGGTGTTACACCAGGGCAGGTAAAGTTGTAGTTATTTGTGGGGTACACCAGGACTGTTAAAGGTGTAACTAT |
| 21 | 含有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之SEQ ID NO：7之部分融合至含有SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之SEQ ID NO：8之部分 | CTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACC |
| 22 | 含有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之SEQ ID NO：7之部分融合至含有SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之SEQ ID NO：8之部分 | CTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTG |
| 23 | 人類Myo15啟動子之區域1 | GTATGCCTTTTGAGATGGATGCAGCAGGTTCTGTGAGGCTGCCAGGAGGGGTAGAGTTCCCGGGGGCCTCGGGCCCCGCTGGAGTGTGGAGCAGGCCCATGCTCAGCTCTCCAGGCTGTTCGTGGCTCCCCTGTCAGCTGCTCACTCCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGACATCATTAAATATACATAGGGCCCCAGGCGGTCGGCGTGGTGGGCTGGGCCTCCCTTCC |
| 24 | 人類Myo15啟動子之區域2 | TGCCCTGCCTTCTGAGCCGGCAGCCTGGCTCCCCACCCCATGTATTATTCAGCTCCTGAGAGCCAGCCAGCTCCTGTTACACTGACCGCAGCCCAGCACCTGCTCTGCCCATTCCCCTCCTCCCTTGCCTAGGACCTAGAGGGTTCAAAGTTCTCCTCCAAGATGACTTGGTGGGCTTTGGCCATCCCACCCTAGGCCCCACTTCTGGCCCAGTGCAGGTGTGCTGGTGATTTAGGGCAGGTGGCATTCCATCTCTGTGGCTCAATGTCTTCCTCTGTGAAGCCGAAGTGACCCAAGGGCTCCCTTCATGGGGTTGAGCCAGCTGTGGCCCAGGGAGGGCCTAACCAGGATGAGCACTGATGTTGCCATGACGACTCCGAGGCCAGAATGTCTCCCCCAGCACAGGCCTCATAGGCAGGCTTCCCCATCCTGGTAAACAACACCCACACACTTTCTACTACTGCTCTAGGGTGAAACCCAAGGCGCTCTAGAGGAGATGAATTATGGATCCGCCCTCCCGGAATCCTGGCTCGGCCCTCCCCACGCCACCCAGGGCCAGTCGGGTCTGCTCACAGCCCGAGGAGGCCGCGTGTCCAGCCGCGGGCAAGAGACAGAGCAGGTCCCTGTGTCTCCAAGTCCCTGAGCCCGTGACACCGGCCCCAGGCCCTGTAGAGAGCAGGCAGCCACC |
| 25 | SEQ ID NO：23之部分 | CCCCTGTCAGCTGCTCACTCCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGACATCATTAAATATACATAGGGCCCCAGG |
| 26 | SEQ ID NO：24之部分 | TGAGCCGGCAGCCTGGCTCCCCACCCCATGTATTATTCAGCTCCTGAGAGCCAGCCAGCTCCTGTTACACTGACCGCAGCCC |
| 27 | SEQ ID NO：24之部分 | CACAGGCCTCATAGGCAGGCTTCCCCATCCTGGTAAACAACACCCACACACTTTCTACTACTGCTCTAGGGTGAAACCCAAGGCGCTCTAGAGGAGATGAATTATGGATCC |
| 28 | SEQ ID NO：24之部分(SEQ ID NO：26融合至SEQ ID NO：27) | TGAGCCGGCAGCCTGGCTCCCCACCCCATGTATTATTCAGCTCCTGAGAGCCAGCCAGCTCCTGTTACACTGACCGCAGCCCCACAGGCCTCATAGGCAGGCTTCCCCATCCTGGTAAACAACACCCACACACTTTCTACTACTGCTCTAGGGTGAAACCCAAGGCGCTCTAGAGGAGATGAATTATGGATCC |
| 29 | SEQ ID NO：24之部分(SEQ ID NO：27融合至SEQ ID NO：26) | CACAGGCCTCATAGGCAGGCTTCCCCATCCTGGTAAACAACACCCACACACTTTCTACTACTGCTCTAGGGTGAAACCCAAGGCGCTCTAGAGGAGATGAATTATGGATCCTGAGCCGGCAGCCTGGCTCCCCACCCCATGTATTATTCAGCTCCTGAGAGCCAGCCAGCTCCTGTTACACTGACCGCAGCCC |
| 30 | SEQ ID NO：24之部分(鄰接序列包括SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27) | TGAGCCGGCAGCCTGGCTCCCCACCCCATGTATTATTCAGCTCCTGAGAGCCAGCCAGCTCCTGTTACACTGACCGCAGCCCAGCACCTGCTCTGCCCATTCCCCTCCTCCCTTGCCTAGGACCTAGAGGGTTCAAAGTTCTCCTCCAAGATGACTTGGTGGGCTTTGGCCATCCCACCCTAGGCCCCACTTCTGGCCCAGTGCAGGTGTGCTGGTGATTTAGGGCAGGTGGCATTCCATCTCTGTGGCTCAATGTCTTCCTCTGTGAAGCCGAAGTGACCCAAGGGCTCCCTTCATGGGGTTGAGCCAGCTGTGGCCCAGGGAGGGCCTAACCAGGATGAGCACTGATGTTGCCATGACGACTCCGAGGCCAGAATGTCTCCCCCAGCACAGGCCTCATAGGCAGGCTTCCCCATCCTGGTAAACAACACCCACACACTTTCTACTACTGCTCTAGGGTGAAACCCAAGGCGCTCTAGAGGAGATGAATTATGGATCC |
| 31 | 含有SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24之多核苷酸 | GTATGCCTTTTGAGATGGATGCAGCAGGTTCTGTGAGGCTGCCAGGAGGGGTAGAGTTCCCGGGGGCCTCGGGCCCCGCTGGAGTGTGGAGCAGGCCCATGCTCAGCTCTCCAGGCTGTTCGTGGCTCCCCTGTCAGCTGCTCACTCCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGACATCATTAAATATACATAGGGCCCCAGGCGGTCGGCGTGGTGGGCTGGGCCTCCCTTCCCCATAACACTGAGCTGCTCTGCTGGGCCAACCGTGCTCCTGGGCCAGCCAGAGGACCCCCATGAGGCGGCATGCAGGCGGGGAGCAGGCCACAGAACGCAGGTAAGGAGACCTTAGCCTAGAGTCCTTGGGGTCTGTCACTGGCCACCCTCGCATCCCAGGCTGCAGGAAACTGAGGCCCAGAGAGGACAAGGACTTTCCTGGACCCACACAGCCAGTCAGTGACAGAGCCTAGGGTCTGAGCCAGGCCTGACCCAACCTCCATTTCTGCCTCTCTACCCCTGCCCCCGCCCCAACACACACACACACACAAGTGGAGTTCCACTGAAACGCCCCTCCTTGCCCTGCCTTCTGAGCCGGCAGCCTGGCTCCCCACCCCATGTATTATTCAGCTCCTGAGAGCCAGCCAGCTCCTGTTACACTGACCGCAGCCCAGCACCTGCTCTGCCCATTCCCCTCCTCCCTTGCCTAGGACCTAGAGGGTTCAAAGTTCTCCTCCAAGATGACTTGGTGGGCTTTGGCCATCCCACCCTAGGCCCCACTTCTGGCCCAGTGCAGGTGTGCTGGTGATTTAGGGCAGGTGGCATTCCATCTCTGTGGCTCAATGTCTTCCTCTGTGAAGCCGAAGTGACCCAAGGGCTCCCTTCATGGGGTTGAGCCAGCTGTGGCCCAGGGAGGGCCTAACCAGGATGAGCACTGATGTTGCCATGACGACTCCGAGGCCAGAATGTCTCCCCCAGCACAGGCCTCATAGGCAGGCTTCCCCATCCTGGTAAACAACACCCACACACTTTCTACTACTGCTCTAGGGTGAAACCCAAGGCGCTCTAGAGGAGATGAATTATGGATCCGCCCTCCCGGAATCCTGGCTCGGCCCTCCCCACGCCACCCAGGGCCAGTCGGGTCTGCTCACAGCCCGAGGAGGCCGCGTGTCCAGCCGCGGGCAAGAGACAGAGCAGGTCCCTGTGTCTCCAAGTCCCTGAGCCCGTGACACCGGCCCCAGGCCCTGTAGAGAGCAGGCAGCCACC |
| 32 | 含有SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27之多核苷酸 | GCAGGCCCATGCTCAGCTCTCCAGGCTGTTCGTGGCTCCCCTGTCAGCTGCTCACTCCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGACATCATTAAATATACATAGGGCCCCAGGCGGTCGGCGTGGTGGGCTGGGCCTCCCTTCCCCATAACACTGAGCTGCTCTGCTGGGCCAACCGTGCTCCTGGGCCAGCCAGAGGACCCCCATGAGGCGGCATGCAGGCGGGGAGCAGGCCACAGAACGCAGGTAAGGAGACCTTGCCTTCTGAGCCGGCAGCCTGGCTCCCCACCCCATGTATTATTCAGCTCCTGAGAGCCAGCCAGCTCCTGTTACACTGACCGCAGCCCAGCACCTGCTCTGCCCATTCCCCTCCTCCCTTGCCTAGGACCTAGAGGGTTCAAAGTTCTCCTCCAAGATGACTTGGTGGGCTTTGGCCATCGGGCCTAACCAGGATGAGCACTGATGTTGCCATGACGACTCCGAGGCCAGAATGTCTCCCCCAGCACAGGCCTCATAGGCAGGCTTCCCCATCCTGGTAAACAACACCCACACACTTTCTACTACTGCTCTAGGGTGAAACCCAAGGCGCTCTAGAGGAGATGAATTATGGATCCGCCCTCCCGGAATCCTGGCTCGGCCCTCCCCACGC |
| 33 | 含有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之SEQ ID NO：7之部分 | CTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTT |
| 34 | 含有SEQ ID NO：14之SEQ ID NO：8之部分 | TTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGC |
| 35 | 含有SEQ ID NO：15之SEQ ID NO：8之部分 | TGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTG |
| 36 | SEQ ID NO：33融合至SEQ ID NO：34 | CTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGC |
| 37 | SEQ ID NO：33融合至SEQ ID NO：35 | CTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTG |
| 38 | SEQ ID NO：34融合至SEQ ID NO：35 | TTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTG |
| 39 | SEQ ID NO：34融合至SEQ ID NO：33，該SEQ ID NO：33融合至SEQ ID NO：35 | TTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCCTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTG |
| 40 | SEQ ID NO：35融合至SEQ ID NO：33，該SEQ ID NO：33融合至SEQ ID NO：34 | TGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGCTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGC |
| 41 | SEQ ID NO：34融合至SEQ ID NO：35，該SEQ ID NO：35融合至SEQ ID NO：33 | TTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGCTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTT |
| 42 | 含有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之SEQ ID NO：7之部分融合至含有SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之SEQ ID NO：8之部分 | TGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACC |
| 43 | 含有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之SEQ ID NO：7之部分融合至含有SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之SEQ ID NO：8之部分 | TGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTG |
可與本文所述之組合物及方法結合使用之額外Myo15啟動子包括與表3中所示之多核苷酸序列以及表3中所示多核苷酸序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之核酸分子。表3中所列出之Myo15啟動子表徵於國際申請公開案 第WO2019210181A1號及第WO2020163761A1號中，該等國際申請公開案係以引用方式併入本文中。
在smCBA啟動子包括在本文所述之雙載體系統中(例如在雙載體系統中之第一載體中)之實施例中，smCBA啟動子可具有美國專利第8,298,818號中所述之smCBA啟動子之序列，該專利係以引用方式併入本文中。在一些實施例中，smCBA啟動子具有以下序列： GGTACCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCA (SEQ ID NO：44)。
一旦將編碼OTOF之多核苷酸納入哺乳動物細胞之核DNA中或穩定在游離型單體或多聯體中，便可立即藉由此項技術中已知之方法來誘導此多核苷酸之轉錄。舉例而言，可藉由使哺乳動物細胞暴露於外部化學試劑(例如調節轉錄因子及/或RNA聚合酶與哺乳動物啟動子之結合且因此調節基因表現之劑)來誘導表現。化學試劑可用於促進RNA聚合酶及/或轉錄因子與哺乳動物啟動子之結合，例如藉由移除已結合啟動子之抑制蛋白。替代地，化學試劑可用於增強哺乳動物啟動子對RNA聚合酶及/或轉錄因子之親和力，使得位於啟動子下游之基因之轉錄速率在化學試劑存在下增加。加強藉由上述機制之多核苷酸轉錄之化學試劑之實例包括四環素及去氧羥四環素。該等試劑在市面上有售(Life Technologies，Carlsbad，CA)且可根據所建立之方案投與哺乳動物細胞來促進基因表現。
可包括在用於本文所述組合物及方法中之核酸載體中之其他DNA序列元件包括增強子序列。增強子代表另一類調節元件，其誘導含有相關基因之多核苷酸之構形變化，使得DNA採取有利於轉錄因子及RNA聚合酶在轉錄起始位點結合之三維取向。因此，用於本文所述組合物及方法中之多核苷酸包括編碼OTOF蛋白且另外包括哺乳動物增強子序列之彼等多核苷酸。現自哺乳動物基因已知許多增強子序列，且實例包括來自編碼哺乳動物球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素之基因之增強子。用於本文所述組合物及方法中之增強子亦包括衍生自能夠感染真核細胞之病毒之遺傳材料之彼等增強子。實例包括在複製起點後側(bp 100-270)之SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、在複製起點後側之多瘤增強子及腺病毒增強子。誘導真核基因轉錄活化之額外增強子序列揭示於Yaniv等人，Nature 297:17 (1982)中。增強子可剪接至含有編碼OTOF蛋白之多核苷酸之載體中，例如在此基因之位置5’或3’處。在較佳取向中，增強子定位於啟動子之5’側，該啟動子進而位於相對於編碼OTOF蛋白之多核苷酸之5’。
本文所述之核酸載體可包括土撥鼠轉錄後調節元件(WPRE)。WPRE在mRNA層級上藉由促進轉錄物之核輸出及/或藉由增加新生轉錄物之多聚腺苷酸化效率、由此增加細胞中mRNA之總量起作用。將WPRE添加至載體可在活體外及活體內實質上改良來自若干不同啟動子之轉殖基因表現之水準。WPRE可位於編碼OTOF蛋白之C端部分之多核苷酸與聚(A)序列之間之第二核酸載體中。在本文所述之組合物及方法之一些實施例中，WPRE具有以下序列：
GATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGA (SEQ ID NO：45)。
在其他實施例中，WPRE具有以下序列：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAA (SEQ ID NO：46)
在一些實施例中，用於本文所述組合物及方法中之核酸載體包括 報導基因序列，其可用於驗證例如特定細胞及組織中(例如耳蝸毛細胞中)之OTOF基因表現。可提供於轉殖基因中之報導基因序列包括編碼β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、螢光素酶及此項技術中所熟知之其他蛋白質之DNA序列。當與驅動其表現之調節元件締合時，報導基因序列提供可藉由習用方法偵測到之信號，該等習用方法包括酶、放射照相、比色、螢光或其他光譜分析、螢光活化細胞分選分析及免疫分析，包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)及免疫組織化學。舉例而言，當標記物序列係LacZ基因時，藉由分析β-半乳糖苷酶活性偵測到攜帶信號之載體之存在。當轉殖基因係綠色螢光蛋白或螢光素酶時，攜帶信號之載體可以視覺方式藉由光度計中之色彩或光產生來量測。用於表現 OTOF 之雙雜合載體
OTOF同功型5蛋白(例如具有SEQ ID NO：1之序列之OTOF同功型5蛋白)可使用雙雜合載體系統在哺乳動物細胞中表現。此方法使用兩種核酸載體(例如兩種腺相關病毒載體)來表現單一大蛋白。兩種核酸載體(例如兩種腺相關病毒載體)中之每一者含有編碼蛋白質之多核苷酸之一部分(例如一種載體含有編碼蛋白質之N端部分之多核苷酸，且另一種載體含有編碼蛋白質之C端部分之多核苷酸，且編碼蛋白質之N端部分之多核苷酸與編碼蛋白質之C端部分之多核苷酸並不重疊)。雙雜合載體之特徵亦在於可進行同源重組之重疊區域(例如含於每一載體內之重組基因區)以及剪接供體及剪接受體序列(例如，第一載體含有剪接供體序列且第二載體含有剪接受體序列)。重組基因區係第一核酸載體中之剪接供體序列之3’及第二核酸載體中之剪接受體序列之5’。第一及第二多核苷酸序列則可基於兩種機制中之一者連結形成單一序列：1)在重疊區域重組，或2) ITR之多聯體化。可藉由剪接移除剩餘重組基因區及/或多聯體化ITR，從而形成編碼相關全長蛋白之鄰接多核苷酸序列。
可用於本文所述組合物及方法中之重組基因區包括具有以下序列之F1噬菌體AK基因：GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAA
AAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO：47)，及如美國專利第8,236,557號中所述之鹼性磷酸酶(AP)基因片段，該美國專利係以引用方式併入本文中。在一些實施例中，AP基因片段具有以下序列：
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCGTATAGGAGGACCGTGTAGGCCTTCCTGTCCCGGGCCTTGCCAGCGGCCAGCCCGATGAAGGAGCTCCCTCGCAGGGGGTAGCCTCCGAAGGAGAAGACGTGGGAGTGGTCGGCAGTGACGAGGCTCAGCGTGTCCTCCTCGCTGGTGAGCTGGCCCGCCCTCTCAATGGCGTCGTCGAACATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGGTAAGCCCTGCTTTCATGATGACCATGGTCGATGCGACCACCCTCCACGAAGAGGAAGAAGCCGCGGGGGTGTCTGCTCAGCAGGCGCAGGGCAGCCTCTGTCATCTCCATCAGGGAGGGGTCCAGTGTGGAGTCTCGGTGGATCTCGTATTTCATGTCTCCAGGCTC
AAAGAGACCCATGAGATGGGTCACAGACGGGTCCAGGGAAGCCTGCATGAGCTCAGTGCGGTTCCACACGTACCGGGCACCCTGGCGTTCGCCGAGCCATTCCTGCACCAGATTCTTCCCGTCCAGCCTGGTCCCACCTTGGCTGTAGTCATCTGGGTACTCAGGGTCTGGGGTTCCCATGCGAAACATGTACTTTCGGCCTCCA (SEQ ID NO：48)。
在一些實施例中，AP基因片段具有以下序列：
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCGTATAGGAGGACCGTGTAGGCCTTCCTGTCCCGGGCCTTGCCAGCGGCCAGCCCGATGAAGGAGCTCCCTCGCAGGGGGTAGCCTCCGAAGGAGAAGACGTGGGAGTGGTCGGCAGTGACGAGGCTCAGCGTGTCCTCCTCG CTGGTGA (SEQ ID NO：49)。
在一些實施例中，AP基因片段具有以下序列：
GCTGGCCCGCCCTCTCAATGGCGTCGTCGAACATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGGTAAGCCCTGCTTTCATGATGACCATGGTCGATGCGACCACCCTCCACGAAGAGGAAGAAGCCGCGGGGGTGTCTGCTCAGCAGGCGCAGGGCAGCCTCTGTCATCTCCATCAGGGAGGGGTCCAGTGTGGAGTCTCGGTGGATCTCGTATTTCATGTCTCCAGGCTCAAAGAGACCCATGAGATGGGTCACAGACGGGTCCAGGGAAGCCTGCATGAGCTCAGTGCGGTTCCACACGTACCGGGCACCCTGGCGTTCGCCGAGCCATTCCTGCACCAGATTCTTCCCGTCCAGCCTGGTCCCACCTTGGCTGTAGTCATCTGGGTACTCAGGGTCTGGGGTTCCCATGCGAAACATGTACTTTCGGCCTCCA (SEQ ID NO：50)。
在一些實施例中，AP基因片段具有以下序列：
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTC (SEQ ID NO：51)
在一些實施例中，AP基因片段具有以下序列：
CGTATAGGAGGACCGTGTAGGCCTTCCTGTCCCGGGCCTTGCCAGCGGCCAGCCCGATGAAGGAGCTCCCTCGCAGGGGGTAGCCTCCGAAGGAGAAGACGTGGGAGTGGTCGGCAGTGACGAGGCTCAGCGTGTCCTCCTCGCTGGTGAGCTGGCCCGCCCTCTCAATGGCGTCGTCGAACATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGGTAAGCCCTGCTTTCATGATGACCATGGTCGATGCGACCACCCTCCACGAAGAGGAAGAAGCCGCGGGGGTGTCTGCTCAGCAGG (SEQ ID NO：52)。
在一些實施例中，AP基因片段具有以下序列：
CGCAGGGCAGCCTCTGTCATCTCCATCAGGGAGGGGTCCAGTGTGGAGTCTCGGTGGATCTCGTATTTCATGTCTCCAGGCTCAAAGAGACCCATGAGATGGGTCACAGACGGGTCCAGGGAAGCCTGCATGAGCTCAGTGCGGTTCCACACGTACCGGGCACCCTGGCGTTCGCCGAGCCATTCCTGCACCAGATTCTTCCCGTCCAGCCTGGTCCCACCTTGGCTGTAGTCATCTGGGTACTCAGGGTCTGGGGTTCCCATGCGAAACATGTACTTTCGGCCTCCA (SEQ ID NO：53)。
用於本文所述方法及組合物中之例示性剪接供體序列可包括以下序列：
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGA (SEQ ID NO：54)。
用於本文所述方法及組合物中之例示性剪接受體序列可包括以下序列：
TAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO：55)。
剪接供體及剪接受體序列之其他實例為此項技術中已知。
用於本文所述方法及組合物中之雙雜合載體經設計，使得約一半之OTOF基因含於每一載體內(例如，每一載體含有編碼約一半之OTOF同功型5蛋白之多核苷酸)。可基於啟動子之大小及編碼OTOF C2結構域之多核苷酸部分之位置來確定如何將多核苷酸序列分流於兩種核酸載體之間。當將短啟動子用於雙雜合載體系統中時(例如1 kb或更短、例如約1 kb、950 bp、900 bp、850 bp、800 bp、750 bp、700 bp、650 bp、600 bp、550 bp、500 bp、450 bp、400 bp、350 bp、300 bp或更短之啟動子)，例如CAG、CMV、smCBA或具有1 kb或更短之序列之Myo15啟動子(例如上文所述之Myo15啟動子，例如具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：42之序列之Myo15啟動子)，可在外顯子邊界處將OTOF多核苷酸序列分在兩種核酸載體之間，該外顯子邊界出現在編碼C2D結構域之多核苷酸部分之後及編碼C2E結構域之多核苷酸部分之前，例如外顯子26/27邊界。含有此大小之啟動子之核酸載體可視情況地含有OTOF UTR (例如全長5’及3’ UTR)。當將長啟動子用於雙雜合載體系統中時(例如長於1 kb、例如1.1 kb、1.25 kb、1.5 kb、1.75 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb或更長之啟動子)，例如長於1 kb之Myo15啟動子(例如SEQ ID NO：19)，可在外顯子邊界處將OTOF多核苷酸序列分在兩種核酸載體之間，該外顯子邊界出現在編碼C2C結構域之多核苷酸部分之後及編碼C2D結構域之多核苷酸部分之前(例如外顯子19/20邊界或外顯子20/21邊界)，或編碼C2D結構域之多核苷酸部分內(例如外顯子25/26邊界)。短啟動子(例如CMV啟動子、CAG啟動子、smCBA啟動子或具有1 kb或更短之序列之Myo15啟動子，例如具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：42之序列之Myo15啟動子)亦可用於經設計用於大啟動子之雙載體系統中，在該情形下可使額外元件(例如OTOF UTR序列)包括在第一載體(例如含有編碼C2C結構域之多核苷酸部分之載體)中。
使用短啟動子之一種例示性雙雜合載體系統包括第一核酸載體，該第一核酸載體含有可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子1-26之CAG啟動子、多核苷酸序列3’之剪接供體序列及剪接供體序列3’之重組基因區；及第二核酸載體，該第二核酸載體含有重組基因區、重組基因區3’之剪接受體序列、剪接受體序列3’之含有編碼OTOF同功型5蛋白(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子27-45及47之多核苷酸及聚(A)序列(例如bGH聚(A)信號序列)。第一及第二核酸載體亦可分別含有全長5’及3’ OTOF UTR (例如，127 bp人類OTOF 5’ UTR可包括在第一核酸載體中，且1035 bp人類OTOF 3’ UTR可包括在第二核酸載體中)。使用短啟動子之另一例示性雙雜合載體系統包括第一核酸載體，該第一核酸載體含有可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子1-20之smCBA啟動子或1 kb或更短之Myo15啟動子(例如具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：42之序列之Myo15啟動子)、多核苷酸序列3’之剪接供體序列及剪接供體序列3’之重組基因區；及第二核酸載體，該第二核酸載體含有重組基因區、重組基因區3’之剪接受體序列、剪接受體序列3’之含有編碼OTOF同功型5蛋白(例如人類OTOF，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子21-45及47之多核苷酸及聚(A)序列(例如bGH聚(A)信號序列)。第一核酸載體亦可含有全長5’ OTOF UTR (例如，127 bp人類OTOF 5’ UTR可包括在第一核酸載體中)。可在前述雙載體系統中之任一者中使用CMV啟動子來替代CAG、smCBA或Myo15啟動子。
使用長啟動子之例示性雙雜合載體系統包括第一核酸載體，該第一核酸載體含有可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子1-19或外顯子1-20之長於1 kb之Myo15啟動子(例如SEQ ID NO：19)、多核苷酸序列3’之剪接供體序列及剪接供體序列3’之重組基因區；及第二核酸載體，該第二核酸載體含有重組基因區、重組基因區3’之剪接受體序列、剪接受體序列3’之含有編碼OTOF同功型5蛋白(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子20-45及47 (當第一核酸載體含有多核苷酸之外顯子1-19時)或外顯子21-45及47 (當第一核酸載體含有多核苷酸之外顯子1-20時)之多核苷酸及聚(A)序列(例如bGH聚(A)信號序列)。前述Myo15啟動子雙雜合載體系統中之第一及第二核酸載體皆不含OTOF UTR。短啟動子(例如CMV啟動子、CAG啟動子、smCBA啟動子或具有1 kb或更短之序列之Myo15啟動子，例如具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：42之序列之Myo15啟動子)亦可用於經設計用於大啟動子之前述雙載體系統中。若該等雙載體系統含有短啟動子，則其亦可在第一載體中包括5’ OTOF UTR。
為適應OTOF UTR，OTOF編碼序列可在不同位置中分開。舉例而言，在雙雜合載體系統中，其中第一核酸載體含有可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子1-25之長於1 kb之Myo15啟動子(例如SEQ ID NO：19)、多核苷酸序列3’之剪接供體序列及剪接供體序列3’之重組基因區；且其中第二核酸載體含有重組基因區、重組基因區3’之剪接受體序列、剪接受體序列3’之含有編碼OTOF蛋白(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1)之多核苷酸之外顯子26-45及47之多核苷酸及聚(A)序列(例如bGH聚(A)信號序列)，第二核酸亦可含有全長OTOF 3’ UTR (例如1035 bp人類OTOF UTR)。短啟動子(例如CMV啟動子、CAG啟動子、smCBA啟動子或具有1 kb或更短之序列之Myo15啟動子，例如具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：42之序列之Myo15啟動子)亦可用於經設計用於大啟動子之前述雙載體系統中。若該等雙載體系統含有短啟動子，則其亦可在第一載體中包括5’ OTOF UTR。
編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸序列可為cDNA序列(例如不包括內含子之序列)。在一些實施例中，雙載體系統中之第一及/或第二核酸載體可包括內含子序列。內含子序列可包括在OTOF編碼序列中之一或多個外顯子之間，或內含子序列可包括在編碼序列之外顯子與核酸載體之另一組分之間(例如，第一核酸載體中之OTOF編碼序列之外顯子與剪接供體序列之間或第二核酸載體中之OTOF編碼序列之外顯子與剪接受體序列之間)。
在一些實施例中，編碼OTOF同功型5之多核苷酸在外顯子20/21邊界處分在雙載體系統中之第一與第二核酸載體(例如AAV載體)之間。當編碼OTOF同功型5之多核苷酸在外顯子20/21邊界處分在第一與第二核酸載體(例如AAV載體)之間時，編碼OTOF之N端部分之多核苷酸序列具有以下序列：
ATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTG (SEQ ID NO：56)。
當編碼OTOF同功型5之多核苷酸在外顯子20/21邊界處分在第一與第二核酸載體(例如AAV載體)之間時，編碼OTOF之C端部分之多核苷酸序列具有以下序列：
GAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGA (SEQ ID NO：57)。
在編碼OTOF同功型5之多核苷酸在外顯子20/21邊界處分在第一與第二核酸載體(例如AAV載體)之間之實施例中，OTOF多肽之N端部分具有以下序列：
MALLIHLKTVSELRGRGDRIAKVTFRGQSFYSRVLENCEDVADFDETFRWPVASSIDRNEMLEIQVFNYSKVFSNKLIGTFRMVLQKVVEESHVEVTDTLIDDNNAIIKTSLCVEVRYQATDGTVGSWDDGDFLGDESLQEEEKDSQETDGLLPGSRPSSRPPGEKSFRRAGRSVFSAMKLGKNRSHKEEPQRPDEPAVLEMEDLDHLAIRLGDGLDPDSVSLASVTALTTNVSNKRSKPDIKMEPSAGRPMDYQVSITVIEARQLVGLNMDPVVCVEVGDDKKYTSMKESTNCPYYNEYFVFDFHVSPDVMFDKIIKISVIHSKNLLRSGTLVGSFKMDVGTVYSQPEHQFHHKWAILSDPDDISSGLKGYVKCDVAVVGKGDNIKTPHKANETDEDDIEGNLLLPEGVPPERQWARFYVKIYRAEGLPRMNTSLMANVKKAFIGENKDLVDPYVQVFFAGQKGKTSVQKSSYEPLWNEQVVFTDLFPPLCKRMKVQIRDSDKVNDVAIGTHFIDLRKISNDGDKGFLPTLGPAWVNMYGSTRNYTLLDEHQDLNEGLGEGVSFRARLLLGLAVEIVDTSNPELTSSTEVQVEQATPISESCAGKMEEFFLFGAFLEASMIDRRNGDKPITFEVTIGNYGNEVDGLSRPQRPRPRKEPGDEEEVDLIQNASDDEAGDAGDLASVSSTPPMRPQVTDRNYFHLPYLERKPCIYIKSWWPDQRRRLYNANIMDHIADKLEEGLNDIQEMIKTEKSYPERRLRGVLEELSCGCCRFLSLADKDQGHSSRTRLDRERLKSCMREL (SEQ ID NO：58)。
在編碼OTOF同功型5之多核苷酸在外顯子20/21邊界處分在第一與第二核酸載體(例如AAV載體)之間之實施例中，OTOF多肽之C端部分具有以下序列：
ENMGQQARMLRAQVKRHTVRDKLRLCQNFLQKLRFLADEPQHSIPDIFIWMMSNNKRVAYARVPSKDLLFSIVEEETGKDCAKVKTLFLKLPGKRGFGSAGWTVQAKVELYLWLGLSKQRKEFLCGLPCGFQEVKAAQGLGLHAFPPVSLVYTKKQAFQLRAHMYQARSLFAADSSGLSDPFARVFFINQSQCTEVLNETLCPTWDQMLVFDNLELYGEAHELRDDPPIIVIEIYDQDSMGKADFMGRTFAKPLVKMADEAYCPPRFPPQLEYYQIYRGNATAGDLLAAFELLQIGPAGKADLPPINGPVDVDRGPIMPVPMGIRPVLSKYRVEVLFWGLRDLKRVNLAQVDRPRVDIECAGKGVQSSLIHNYKKNPNFNTLVKWFEVDLPENELLHPPLNIRVVDCRAFGRYTLVGSHAVSSLRRFIYRPPDRSAPSWNTTVRLLRRCRVLCNGGSSSHSTGEVVVTMEPEVPIKKLETMVKLDATSEAVVKVDVAEEEKEKKKKKKGTAEEPEEEEPDESMLDWWSKYFASIDTMKEQLRQQEPSGIDLEEKEEVDNTEGLKGSMKGKEKARAAKEEKKKKTQSSGSGQGSEAPEKKKPKIDELKVYPKELESEFDNFEDWLHTFNLLRGKTGDDEDGSTEEERIVGRFKGSLCVYKVPLPEDVSREAGYDSTYGMFQGIPSNDPINVLVRVYVVRATDLHPADINGKADPYIAIRLGKTDIRDKENYISKQLNPVFGKSFDIEASFPMESMLTVAVYDWDLVGTDDLIGETKIDLENRFYSKHRATCGIAQTYSTHGYNIWRDPMKPSQILTRLCKDGKVDGPHFGPPGRVKVANRVFTGPSEIEDENGQRKPTDEHVALLALRHWEDIPRAGCRLVPEHVETRPLLNPDKPGIEQGRLELWVDMFPMDMPAPGTPLDISPRKPKKYELRVIIWNTDEVVLEDDDFFTGEKSSDIFVRGWLKGQQEDKQDTDVHYHSLTGEGNFNWRYLFPFDYLAAEEKIVISKKESMFSWDETEYKIPARLTLQIWDADHFSADDFLGAIELDLNRFPRGAKTAKQCTMEMATGEVDVPLVSIFKQKRVKGWWPLLARNENDEFELTGKVEAELHLLTAEEAEKNPVGLARNEPDPLEKPNRPDTAFVWFLNPLKSIKYLICTRYKWLIIKIVLALLGLLMLGLFLYSLPGYMVKKLLGA (SEQ ID NO：59)。
可用於產生用於本文所述組合物及方法中之核酸載體之轉移質體提供於表4中。轉移質體(例如含有欲藉由核酸載體遞送、例如欲藉由AAV遞送之DNA序列之質體)可與輔助質體(例如提供AAV製造所需之蛋白質之質體)及rep/cap質體(例如提供AAV衣殼蛋白及將轉移質體DNA序列插入衣殼外殼中之蛋白質之質體)共遞送至產生細胞中以產生用於投與之核酸載體(例如AAV載體)。核酸載體(例如含有編碼OTOF同功型5之N端部分之多核苷酸之核酸載體(例如AAV載體)及含有編碼OTOF同功型5之C端部分之多核苷酸之核酸載體(例如AAV載體))可在投與之前組合(例如於單一調配物中)。以下轉移質體經設計以產生在雙雜合載體系統中共調配或共投與(例如同時或依序投與)之核酸載體(例如AAV載體)：SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61；SEQ ID NO：62及SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：61；SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：67；及SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：67。表 4 ：用於產生雙雜合載體系統之轉移質體
用於表現 OTOF 之載體
| SEQ ID NO. | 描述 | 質體序列 |
| 60 | 含有以下特徵之5’轉殖基因質體： 位置53-2027處之λ (衍生自噬菌體λ之生物插入物及不活化的DNA以減少脫靶DNA殼體化) 位置2049-2178處之ITR 位置2272-3236處之Myo15啟動子 位置3253-3262處之Kozak序列(起始蛋白質轉譯之位點) 位置3259-5664處之人類OTOF同功型5之N端部分 位置5665-5748處之剪接供體(APSD)序列 位置5755-6041處之AP頭部序列(重組基因區) 位置6135-6264處之ITR 位置6275-8287處之λ 位置8344-8932處之ori (複製起點) 位置9110-9919處之KanR (抗生素抗性基因) 位置2049-6264處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGATAGAGGTCATCCTTCCTGACCATTTCCATCATTCCAGTCGAACTCACACACAACACCAAATGCATTTAAGTCGCTTGAAATTGCTATAAGCAGAGCATGTTGCGCCAGCATGATTAATACAGCATTTAATACAGAGCCGTGTTTATTGAGTCGGTATTCAGAGTCTGACCAGAAATTATTAATCTGGTGAAGTTATTCCTCTGTCATTACGTCATGGTCGATTTCAATTTCTATTGATGCTTTCCAGTCGTAATCAATGATGTATTTTTTGATGTTTGACCTCTGTTCATATCCTCACAGATAAAAAATCGCCCTCACACTGGAGGGCAAAGAAGATTTCCAATAATCAGAACAAGTCGGCTCCTGTTTAGTTACGAGCGACATTGCTCCGTGTATTCACTCGTTGGAATGAATACACAGTGCAGTGTTTATTCTGTTATTTATGCCAAAAATTAAGGCCACTATCAGGCAGCTTTGTTGTTCTGTTTACCAAGTTCTCTGGCAATCATTGCCGTCGTTCGTATTGCCCATTTATCGACATATTTCCCATCTTCCTATACAGGAAACATTTCTTCAGGCTTAACCATGCATTCCGATTGCAGCTTGCATCCATTGCATCGCTTGAATTGTCCACACCATTGATTTTTATCAATAGTCGTAGTTTAACGGATAGTCCTGGTATTGTTCCATCACATCCTGAGGATGCCCTTCGAACTCTTCAAATTCTTCTTCCTAATATCACCTTAAATAGTGGATTGCGGTAGTAAAGATTGTGCCTGTCTTTTAACCACATCAGGCTCGGTGGTTCTCGTGTACCCCTACAGCGAGAAATCGGATAAACTATTACAACCCCTACAGTTTGTAGAGTATAGAAAATGATCCACTCGTTATTCTCGGACGAGTGTTCAGTAATGAACCTCTGGAGAGAACCATCTATATGATCGTTATCTGGGTTTGACTTCTGCTTTTAAGCCCAGATAACTTGCCTGAATATGTTAATGAGAGAATCGGTATTCCTCATGTGTGGCATGTTTTCGTCTTTGCTCTTGCATTTTCACTAGCAATTAATGTGCATCGATTATCAGCTATTGCCAGCGCCAGATATAAGCGATTTAAGCTAAGAAAACGCATTAAGGTGCAAAACGATAAAGTGCGATCAGTAATTCAAAACCTTACAGGAGAGCAATCTATGGTTTTGTGCTCAGCCCTTAATGAAGGCAGGTAGTATGTGGTTACATCAAAACAATTCCCATACATTAGTGAGTTGATTGAGCTTGGTGTGTTGAACAAAACTTTTTCCCGATGGAATGGAAAGCATATATTATTCCCTATTGAGGATATTTACTGGACTGAATTAGTTGCCAGCTATGATCCATATAATATTGAGATAAAGCCAAGGCCAATATCTAAGTAACTAGATAAGAGGAATCGATTTTCCCTTAATTTTCTGGCGTCCACTGCATGTTATGCCGCGTTCGCCAGGCTTGCTGTACCATGTGCGCTGATTCTTGCGCTCAATACGTTGCAGGTTGCTTTCAATCTGTTTGTGGTATTCAGCCAGCACTGTAAGGTCTATCGGATTTAGTGCGCTTTCTACTCGTGATTTCGGTTTGCGATTCAGCGAGAGAATAGGGCGGTTAACTGGTTTTGCGCTTACCCCAACCAACAGGGGATTTGCTGCTTTCCATTGAGCCTGTTACTCTGCGCGACGTTCGCGGCGGCGTGTTTGTGCATCCATCTGGATTCTCCTGTCAGTTAGCTTTGGTGGTGTGTGGCAGTTGTAGTCCTGAACGAAAACCCCCCGCGATTGGCACGTTGGCAGCTAATCCGGAATCGCACTTACGGCCAATGCTTCGTTTCGTATCACACACCCCAAAGCCTTCTGCTTTGAATGCTGCCCTTCTTCAGGGCTTAATTTTTAAGAGCGTCACCTTCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGGCACGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCCAATTCTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACCAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACCTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAAATCCACATCTGTATGTTTTTTATATTAATTTATTTTTTGCAGGGGGGCATTGTTTGGTAGGTGAGAGTTCTGAATTGCTATGTTTAGTGAGTTGTATCTATTTATTTTTCAATAAATACAATTAGTTATGTGTTTTGGGGGCGATCGTGAGGCAAAGAAAACCCGGCGCTGAGGCCGGGTTATTCTTGTTCTCTGGTCAAATTATATAGTTGGAAAACAAGGATGCATATATGAATGAACGATGCAGAGGCAATGCCGATGGCGATAGTGGGTATCAGGTAGCCGCTTATGCTGGAAAGAAGCAATAACCCGCAGAAAAACAAAGCTCCAAGCTCAACAAAACTAAGGGCATAGACAATAACTACCTATGTCATATACCCATACTCTCTAATCTTGGCCAGTCGGCGCGTTCTGCTTCCGATTAGAAACGTCAAGGCAGCAATCAGGATTGCAATCTTGGTTCCTGCATAGGATGACAATGTCGCCCCAAGACCATCTCTATGAGCTGAAAAAGAAACACAAGGAATGTAGTGGCGGAAAAGGAGATAGCAAATGCTTACGATAACGTAAGGAATTATTACTATGTAAACACCAGGCAAGATTCTGTTCCGTATAATTACTCCTGATAATTAATCCTTAACTTTGCCCACCTGCCTTTTAAAACATTCCAGTATATCACTTTTCATTCTTGCGTAGCAATATGCCCTCTCTTCAGCTATCTCAGCATTGGTGACCTTGTTCAGAGGCGCTGAGAGATGGCCTTTTTCTGATAGATAATGTTCTGTTAAAATATCTCCGGCCTCATCTTTTGCCCGCAGGCTAATGTCTGAAAATTGAGGTGACGGGTTAAAAATAATATCCTTGGCAACCTTTTTTATATCCCTTTTAAATTTTGGCTTAATGACTATATCCAATGAGTCAAAAAGCTCCCCTTCAATATCTGTTGCCCCTAAGACCTTTAATATATCGCCAAATACAGGTAGCTTGGCTTCTACCTTCACCGTTGTTCTGCCGATGAAATGCTAATGCATAACATCGTCTTTGGTGGTTCCCCTCATCAGTGGCTCTATCTGAACGCGCTCTCCACTGCTTAATGACATTCCTTTCCCGATTAAAAAATCTGTCAGATCGGATGTGGTCGGCCCGAAAACAGTTCTGGCAAAACCAATGGTGTCGCCTTCAACAAACAAAAAAGATGGGAATCCCAATGATTCGTCATCTGCGAGGCTGTTCTTAATATCTTCAACTGTAGCTTTAGAGCGATTTATCTTCTGAACCAGACTCTTGTCATTTGTTTTGGTAAAGAGAAAAGTTTTTCCATCGATTTTATGAATATACAAATAATTGGAGCCAACCTTCAGGTGATGATTATCAGCCAGCAGAGAATTAAGGAAAACAGACAGGTTTATTGAGCACTTATCTTTCCCTTTATTTTTGCTGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTCTTCACAATTCAATCCATTTACTATGTTATGTTCTGAGGGGAGTGAAAATTCCCCTAATTCGATGAAGATTCTTGCTAAATTGTTATCAGCTATGCGCCGACCAGAACACCTTGCCGATCAGCCAAACGTCTAATCAGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCACAACGGAACAACTCTCATTGCATGGGATAATTGGGTACTGTGGGTTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACCGCTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCACCCCCAAGTCTGGCTATACAGAAATCACCTGGCTCAACAGCCTGCTCAGGGTCAACGAGAATTTACATTCCGTCAGGATAGCTTGGCTTGGAGCCTGTTGGTGCGGTCACGGAATTACCTTCAACCTCAAGCCAGAATGCAGAATCACTGGCTTTTTTGGTTGTGCTTACCCATCTCTCCGCATCACCTTTGGTAAAGGTTCTAAGCTAAGGTGAGAACATCCCTGCCTGAACATGAGAAAAAACAGGGTACTCATACTCACTTATTAGTGACGGCTATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCAAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA |
| 61 | 含有以下特徵之3’轉殖基因質體： 位置53-2027處之λ 位置2049-2178處之ITR 位置2267-2553處之AP頭部序列 位置2576-2624處之剪接受體序列 人類OTOF同功型5之位置2625-6212處之C端部分 位置6255-6476處之bGH聚(A)序列 位置6564-6693處之ITR 位置6704-8716處之λ 位置8773-9361處之Ori 位置9539-10,348處之KanR 位置2049-6693處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGATAGAGGTCATCCTTCCTGACCATTTCCATCATTCCAGTCGAACTCACACACAACACCAAATGCATTTAAGTCGCTTGAAATTGCTATAAGCAGAGCATGTTGCGCCAGCATGATTAATACAGCATTTAATACAGAGCCGTGTTTATTGAGTCGGTATTCAGAGTCTGACCAGAAATTATTAATCTGGTGAAGTTATTCCTCTGTCATTACGTCATGGTCGATTTCAATTTCTATTGATGCTTTCCAGTCGTAATCAATGATGTATTTTTTGATGTTTGACCTCTGTTCATATCCTCACAGATAAAAAATCGCCCTCACACTGGAGGGCAAAGAAGATTTCCAATAATCAGAACAAGTCGGCTCCTGTTTAGTTACGAGCGACATTGCTCCGTGTATTCACTCGTTGGAATGAATACACAGTGCAGTGTTTATTCTGTTATTTATGCCAAAAATTAAGGCCACTATCAGGCAGCTTTGTTGTTCTGTTTACCAAGTTCTCTGGCAATCATTGCCGTCGTTCGTATTGCCCATTTATCGACATATTTCCCATCTTCCTATACAGGAAACATTTCTTCAGGCTTAACCATGCATTCCGATTGCAGCTTGCATCCATTGCATCGCTTGAATTGTCCACACCATTGATTTTTATCAATAGTCGTAGTTTAACGGATAGTCCTGGTATTGTTCCATCACATCCTGAGGATGCCCTTCGAACTCTTCAAATTCTTCTTCCTAATATCACCTTAAATAGTGGATTGCGGTAGTAAAGATTGTGCCTGTCTTTTAACCACATCAGGCTCGGTGGTTCTCGTGTACCCCTACAGCGAGAAATCGGATAAACTATTACAACCCCTACAGTTTGTAGAGTATAGAAAATGATCCACTCGTTATTCTCGGACGAGTGTTCAGTAATGAACCTCTGGAGAGAACCATCTATATGATCGTTATCTGGGTTTGACTTCTGCTTTTAAGCCCAGATAACTTGCCTGAATATGTTAATGAGAGAATCGGTATTCCTCATGTGTGGCATGTTTTCGTCTTTGCTCTTGCATTTTCACTAGCAATTAATGTGCATCGATTATCAGCTATTGCCAGCGCCAGATATAAGCGATTTAAGCTAAGAAAACGCATTAAGGTGCAAAACGATAAAGTGCGATCAGTAATTCAAAACCTTACAGGAGAGCAATCTATGGTTTTGTGCTCAGCCCTTAATGAAGGCAGGTAGTATGTGGTTACATCAAAACAATTCCCATACATTAGTGAGTTGATTGAGCTTGGTGTGTTGAACAAAACTTTTTCCCGATGGAATGGAAAGCATATATTATTCCCTATTGAGGATATTTACTGGACTGAATTAGTTGCCAGCTATGATCCATATAATATTGAGATAAAGCCAAGGCCAATATCTAAGTAACTAGATAAGAGGAATCGATTTTCCCTTAATTTTCTGGCGTCCACTGCATGTTATGCCGCGTTCGCCAGGCTTGCTGTACCATGTGCGCTGATTCTTGCGCTCAATACGTTGCAGGTTGCTTTCAATCTGTTTGTGGTATTCAGCCAGCACTGTAAGGTCTATCGGATTTAGTGCGCTTTCTACTCGTGATTTCGGTTTGCGATTCAGCGAGAGAATAGGGCGGTTAACTGGTTTTGCGCTTACCCCAACCAACAGGGGATTTGCTGCTTTCCATTGAGCCTGTTACTCTGCGCGACGTTCGCGGCGGCGTGTTTGTGCATCCATCTGGATTCTCCTGTCAGTTAGCTTTGGTGGTGTGTGGCAGTTGTAGTCCTGAACGAAAACCCCCCGCGATTGGCACGTTGGCAGCTAATCCGGAATCGCACTTACGGCCAATGCTTCGTTTCGTATCACACACCCCAAAGCCTTCTGCTTTGAATGCTGCCCTTCTTCAGGGCTTAATTTTTAAGAGCGTCACCTTCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGGCACGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGAACGGCCGCTATGCTAGCTTGGTACCAAGGGCGGATCCTGCATAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATCTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAAATCCACATCTGTATGTTTTTTATATTAATTTATTTTTTGCAGGGGGGCATTGTTTGGTAGGTGAGAGTTCTGAATTGCTATGTTTAGTGAGTTGTATCTATTTATTTTTCAATAAATACAATTAGTTATGTGTTTTGGGGGCGATCGTGAGGCAAAGAAAACCCGGCGCTGAGGCCGGGTTATTCTTGTTCTCTGGTCAAATTATATAGTTGGAAAACAAGGATGCATATATGAATGAACGATGCAGAGGCAATGCCGATGGCGATAGTGGGTATCAGGTAGCCGCTTATGCTGGAAAGAAGCAATAACCCGCAGAAAAACAAAGCTCCAAGCTCAACAAAACTAAGGGCATAGACAATAACTACCTATGTCATATACCCATACTCTCTAATCTTGGCCAGTCGGCGCGTTCTGCTTCCGATTAGAAACGTCAAGGCAGCAATCAGGATTGCAATCTTGGTTCCTGCATAGGATGACAATGTCGCCCCAAGACCATCTCTATGAGCTGAAAAAGAAACACAAGGAATGTAGTGGCGGAAAAGGAGATAGCAAATGCTTACGATAACGTAAGGAATTATTACTATGTAAACACCAGGCAAGATTCTGTTCCGTATAATTACTCCTGATAATTAATCCTTAACTTTGCCCACCTGCCTTTTAAAACATTCCAGTATATCACTTTTCATTCTTGCGTAGCAATATGCCCTCTCTTCAGCTATCTCAGCATTGGTGACCTTGTTCAGAGGCGCTGAGAGATGGCCTTTTTCTGATAGATAATGTTCTGTTAAAATATCTCCGGCCTCATCTTTTGCCCGCAGGCTAATGTCTGAAAATTGAGGTGACGGGTTAAAAATAATATCCTTGGCAACCTTTTTTATATCCCTTTTAAATTTTGGCTTAATGACTATATCCAATGAGTCAAAAAGCTCCCCTTCAATATCTGTTGCCCCTAAGACCTTTAATATATCGCCAAATACAGGTAGCTTGGCTTCTACCTTCACCGTTGTTCTGCCGATGAAATGCTAATGCATAACATCGTCTTTGGTGGTTCCCCTCATCAGTGGCTCTATCTGAACGCGCTCTCCACTGCTTAATGACATTCCTTTCCCGATTAAAAAATCTGTCAGATCGGATGTGGTCGGCCCGAAAACAGTTCTGGCAAAACCAATGGTGTCGCCTTCAACAAACAAAAAAGATGGGAATCCCAATGATTCGTCATCTGCGAGGCTGTTCTTAATATCTTCAACTGTAGCTTTAGAGCGATTTATCTTCTGAACCAGACTCTTGTCATTTGTTTTGGTAAAGAGAAAAGTTTTTCCATCGATTTTATGAATATACAAATAATTGGAGCCAACCTTCAGGTGATGATTATCAGCCAGCAGAGAATTAAGGAAAACAGACAGGTTTATTGAGCACTTATCTTTCCCTTTATTTTTGCTGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTCTTCACAATTCAATCCATTTACTATGTTATGTTCTGAGGGGAGTGAAAATTCCCCTAATTCGATGAAGATTCTTGCTAAATTGTTATCAGCTATGCGCCGACCAGAACACCTTGCCGATCAGCCAAACGTCTAATCAGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCACAACGGAACAACTCTCATTGCATGGGATAATTGGGTACTGTGGGTTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACCGCTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCACCCCCAAGTCTGGCTATACAGAAATCACCTGGCTCAACAGCCTGCTCAGGGTCAACGAGAATTTACATTCCGTCAGGATAGCTTGGCTTGGAGCCTGTTGGTGCGGTCACGGAATTACCTTCAACCTCAAGCCAGAATGCAGAATCACTGGCTTTTTTGGTTGTGCTTACCCATCTCTCCGCATCACCTTTGGTAAAGGTTCTAAGCTAAGGTGAGAACATCCCTGCCTGAACATGAGAAAAAACAGGGTACTCATACTCACTTATTAGTGACGGCTATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCAAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA |
| 62 | 含有以下特徵之5’轉殖基因質體： 位置19-161處之ITR 位置182-1146處之Myo15啟動子 位置1167-3572處之人類OTOF同功型5之N端部分 位置3573-3656處之剪接供體序列 位置3663-3949處之AP頭部序列 位置3973-4115處之ITR 位置4641-5435處之KanR 位置5821-6491處之pUC ori 位置19-4115處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | GGGGGGGGGGGGGGGGGGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACCGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACCCCCCCCCCCCCCCCCCTGCAGCCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCGCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATGTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTTAACAAAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGT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|
| 63 | 含有以下特徵之3’轉殖基因質體： 位置19-161處之ITR 位置187-473處之AP頭部序列 位置496-544處之剪接受體序列 人類OTOF同功型5之位置545-4132處之C端部分 位置4175-4396處之bGH聚(A)序列 位置4447-4589處之ITR 位置5115-5909處之KanR 位置6295-6965處之pUC ori 位置19-4589處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | GGGGGGGGGGGGGGGGGGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCTAGCGGCCGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGAACGGCCGCTATGCTAGCTTGGTACCAAGGGCGGATCCTGCATAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGACTAGTCCGTCGACTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACCCCCCCCCCCCCCCCCCTGCAGCCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCGCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATGTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTTAACAAAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCGAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGTCCATAAAACCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGGCTGCA |
| 64 | 含有以下特徵之5’轉殖基因質體： 位置53-2027處之λ 位置2049-2178處之ITR 位置2267-2636處之CMV，即增強子(smCBA啟動子之一部分) 位置2633-2915處之雞β-肌動蛋白啟動子(smCBA啟動子之一部分) 位置2916-3008處之外顯子1 (smCBA啟動子之一部分) 位置3008-3209處之嵌合內含子 (smCBA啟動子之一部分) 位置3226-3235處之Kozak序列 位置3232-5637處之人類OTOF同功型5之N端部分 位置5638-5721處之剪接供體序列 位置5728-6014處之AP頭部序列 位置6108-6237處之ITR 位置6248-8260處之λ 位置8317-8905處之Ori 位置9083-9892處之KanR 位置2049-6237處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGATAGAGGTCATCCTTCCTGACCATTTCCATCATTCCAGTCGAACTCACACACAACACCAAATGCATTTAAGTCGCTTGAAATTGCTATAAGCAGAGCATGTTGCGCCAGCATGATTAATACAGCATTTAATACAGAGCCGTGTTTATTGAGTCGGTATTCAGAGTCTGACCAGAAATTATTAATCTGGTGAAGTTATTCCTCTGTCATTACGTCATGGTCGATTTCAATTTCTATTGATGCTTTCCAGTCGTAATCAATGATGTATTTTTTGATGTTTGACCTCTGTTCATATCCTCACAGATAAAAAATCGCCCTCACACTGGAGGGCAAAGAAGATTTCCAATAATCAGAACAAGTCGGCTCCTGTTTAGTTACGAGCGACATTGCTCCGTGTATTCACTCGTTGGAATGAATACACAGTGCAGTGTTTATTCTGTTATTTATGCCAAAAATTAAGGCCACTATCAGGCAGCTTTGTTGTTCTGTTTACCAAGTTCTCTGGCAATCATTGCCGTCGTTCGTATTGCCCATTTATCGACATATTTCCCATCTTCCTATACAGGAAACATTTCTTCAGGCTTAACCATGCATTCCGATTGCAGCTTGCATCCATTGCATCGCTTGAATTGTCCACACCATTGATTTTTATCAATAGTCGTAGTTTAACGGATAGTCCTGGTATTGTTCCATCACATCCTGAGGATGCCCTTCGAACTCTTCAAATTCTTCTTCCTAATATCACCTTAAATAGTGGATTGCGGTAGTAAAGATTGTGCCTGTCTTTTAACCACATCAGGCTCGGTGGTTCTCGTGTACCCCTACAGCGAGAAATCGGATAAACTATTACAACCCCTACAGTTTGTAGAGTATAGAAAATGATCCACTCGTTATTCTCGGACGAGTGTTCAGTAATGAACCTCTGGAGAGAACCATCTATATGATCGTTATCTGGGTTTGACTTCTGCTTTTAAGCCCAGATAACTTGCCTGAATATGTTAATGAGAGAATCGGTATTCCTCATGTGTGGCATGTTTTCGTCTTTGCTCTTGCATTTTCACTAGCAATTAATGTGCATCGATTATCAGCTATTGCCAGCGCCAGATATAAGCGATTTAAGCTAAGAAAACGCATTAAGGTGCAAAACGATAAAGTGCGATCAGTAATTCAAAACCTTACAGGAGAGCAATCTATGGTTTTGTGCTCAGCCCTTAATGAAGGCAGGTAGTATGTGGTTACATCAAAACAATTCCCATACATTAGTGAGTTGATTGAGCTTGGTGTGTTGAACAAAACTTTTTCCCGATGGAATGGAAAGCATATATTATTCCCTATTGAGGATATTTACTGGACTGAATTAGTTGCCAGCTATGATCCATATAATATTGAGATAAAGCCAAGGCCAATATCTAAGTAACTAGATAAGAGGAATCGATTTTCCCTTAATTTTCTGGCGTCCACTGCATGTTATGCCGCGTTCGCCAGGCTTGCTGTACCATGTGCGCTGATTCTTGCGCTCAATACGTTGCAGGTTGCTTTCAATCTGTTTGTGGTATTCAGCCAGCACTGTAAGGTCTATCGGATTTAGTGCGCTTTCTACTCGTGATTTCGGTTTGCGATTCAGCGAGAGAATAGGGCGGTTAACTGGTTTTGCGCTTACCCCAACCAACAGGGGATTTGCTGCTTTCCATTGAGCCTGTTACTCTGCGCGACGTTCGCGGCGGCGTGTTTGTGCATCCATCTGGATTCTCCTGTCAGTTAGCTTTGGTGGTGTGTGGCAGTTGTAGTCCTGAACGAAAACCCCCCGCGATTGGCACGTTGGCAGCTAATCCGGAATCGCACTTACGGCCAATGCTTCGTTTCGTATCACACACCCCAAAGCCTTCTGCTTTGAATGCTGCCCTTCTTCAGGGCTTAATTTTTAAGAGCGTCACCTTCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGGCACGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCGGTACCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACCTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAAATCCACATCTGTATGTTTTTTATATTAATTTATTTTTTGCAGGGGGGCATTGTTTGGTAGGTGAGAGTTCTGAATTGCTATGTTTAGTGAGTTGTATCTATTTATTTTTCAATAAATACAATTAGTTATGTGTTTTGGGGGCGATCGTGAGGCAAAGAAAACCCGGCGCTGAGGCCGGGTTATTCTTGTTCTCTGGTCAAATTATATAGTTGGAAAACAAGGATGCATATATGAATGAACGATGCAGAGGCAATGCCGATGGCGATAGTGGGTATCAGGTAGCCGCTTATGCTGGAAAGAAGCAATAACCCGCAGAAAAACAAAGCTCCAAGCTCAACAAAACTAAGGGCATAGACAATAACTACCTATGTCATATACCCATACTCTCTAATCTTGGCCAGTCGGCGCGTTCTGCTTCCGATTAGAAACGTCAAGGCAGCAATCAGGATTGCAATCTTGGTTCCTGCATAGGATGACAATGTCGCCCCAAGACCATCTCTATGAGCTGAAAAAGAAACACAAGGAATGTAGTGGCGGAAAAGGAGATAGCAAATGCTTACGATAACGTAAGGAATTATTACTATGTAAACACCAGGCAAGATTCTGTTCCGTATAATTACTCCTGATAATTAATCCTTAACTTTGCCCACCTGCCTTTTAAAACATTCCAGTATATCACTTTTCATTCTTGCGTAGCAATATGCCCTCTCTTCAGCTATCTCAGCATTGGTGACCTTGTTCAGAGGCGCTGAGAGATGGCCTTTTTCTGATAGATAATGTTCTGTTAAAATATCTCCGGCCTCATCTTTTGCCCGCAGGCTAATGTCTGAAAATTGAGGTGACGGGTTAAAAATAATATCCTTGGCAACCTTTTTTATATCCCTTTTAAATTTTGGCTTAATGACTATATCCAATGAGTCAAAAAGCTCCCCTTCAATATCTGTTGCCCCTAAGACCTTTAATATATCGCCAAATACAGGTAGCTTGGCTTCTACCTTCACCGTTGTTCTGCCGATGAAATGCTAATGCATAACATCGTCTTTGGTGGTTCCCCTCATCAGTGGCTCTATCTGAACGCGCTCTCCACTGCTTAATGACATTCCTTTCCCGATTAAAAAATCTGTCAGATCGGATGTGGTCGGCCCGAAAACAGTTCTGGCAAAACCAATGGTGTCGCCTTCAACAAACAAAAAAGATGGGAATCCCAATGATTCGTCATCTGCGAGGCTGTTCTTAATATCTTCAACTGTAGCTTTAGAGCGATTTATCTTCTGAACCAGACTCTTGTCATTTGTTTTGGTAAAGAGAAAAGTTTTTCCATCGATTTTATGAATATACAAATAATTGGAGCCAACCTTCAGGTGATGATTATCAGCCAGCAGAGAATTAAGGAAAACAGACAGGTTTATTGAGCACTTATCTTTCCCTTTATTTTTGCTGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTCTTCACAATTCAATCCATTTACTATGTTATGTTCTGAGGGGAGTGAAAATTCCCCTAATTCGATGAAGATTCTTGCTAAATTGTTATCAGCTATGCGCCGACCAGAACACCTTGCCGATCAGCCAAACGTCTAATCAGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCACAACGGAACAACTCTCATTGCATGGGATAATTGGGTACTGTGGGTTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACCGCTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCACCCCCAAGTCTGGCTATACAGAAATCACCTGGCTCAACAGCCTGCTCAGGGTCAACGAGAATTTACATTCCGTCAGGATAGCTTGGCTTGGAGCCTGTTGGTGCGGTCACGGAATTACCTTCAACCTCAAGCCAGAATGCAGAATCACTGGCTTTTTTGGTTGTGCTTACCCATCTCTCCGCATCACCTTTGGTAAAGGTTCTAAGCTAAGGTGAGAACATCCCTGCCTGAACATGAGAAAAAACAGGGTACTCATACTCACTTATTAGTGACGGCTATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCAAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA |
| 65 | 含有以下特徵之5’轉殖基因質體： 位置19-161處之ITR 位置177-546處之CMV增強子(smCBA啟動子之一部分) 位置548-825處之雞β-肌動蛋白啟動子(smCBA啟動子之一部分) 位置826-918處之外顯子1 (smCBA啟動子之一部分) 位置918-1119處之嵌合內含子 (smCBA啟動子之一部分) 位置1142-3547處之人類OTOF同功型5之N端部分 位置3548-3631處之剪接供體序列 位置3638-3924處之AP頭部序列 位置3948-4090處之ITR 位置4616-5410處之KanR 位置5796-6466處之pUC ori 位置19-4090處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | GGGGGGGGGGGGGGGGGGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACCCCCCCCCCCCCCCCCCTGCAGCCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCGCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATGTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTTAACAAAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCGAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGTCCATAAAACCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGGCTGCA 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| 66 | 含有以下特徵之5’轉殖基因質體： 位置12-141處之ITR 位置235-1199處之Myo15啟動子 位置1216-1225處之Kozak序列 位置1222-3627處之人類OTOF同功型5之N端部分 位置3628-3711處之剪接供體序列 位置3718-4004處之AP頭部序列 位置4098-4227處之ITR 位置4246-4262處之M13 fwd 位置4404-4859處之f1 ori 位置4885-4989處之AmpR啟動子 位置4990-5799處之KanR 位置5430-5430處之mutBsmBI 位置5970-6558處之ori 位置6846-6867處之CAP結合位點 位置6882-6912處之lac啟動子 位置6920-6936處之lac操縱子 位置6944-6960處之M13 rev 位置12-4227處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | CCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCCAATTCTGCAGCTCAGCCTACTACTTGCTTTCCAGGCTGTTCCTAGTTCCCATGTCAGCTGCTTGTGCTTTCCAGAGACAAAACAGGAATAATAGATGTCATTAAATATACATTGGGCCCCAGGCGGTCAATGTGGCAGCCTGAGCCTCCTTTCCATCTCTGTGGAGGCAGACATAGGACCCCCAACAAACAGCATGCAGGTTGGGAGCCAGCCACAGGACCCAGGTAAGGGGCCCTGGGTCCTTAAGCTTCTGCCACTGGCTCCGGCATTGCAGAGAGAAGAGAAGGGGCGGCAGACTGGAGAGCTGGGCTCCATTTTTGTTCCTTGGTGCCCTGCCCCTCCCCATGACCTGCAGAGACATTCAGCCTGCCAGGCTTTATGAGGTGGGAGCTGGGCTCTCCCTGATGTATTATTCAGCTCCCTGGAGTTGGCCAGCTCCTGTTACACTGGCCACAGCCCTGGGCATCCGCTTCTCACTTCTAGTTTCCCCTCCAAGGTAATGTGGTGGGTCATGATCATTCTATCCTGGCTTCAGGGACCTGACTCCACTTTGGGGCCATTCGAGGGGTCTAGGGTAGATGATGTCCCCCTGTGGGGATTAATGTCCTGCTCTGTAAAACTGAGCTAGCTGAGATCCAGGAGGGCTTGGCCAGAGACAGCAAGTTGTTGCCATGGTGACTTTAAAGCCAGGTTGCTGCCCCAGCACAGGCCTCCCAGTCTACCCTCACTAGAAAACAACACCCAGGCACTTTCCACCACCTCTCAAAGGTGAAACCCAAGGCTGGTCTAGAGAATGAATTATGGATCCTCGCTGTCCGTGCCACCCAGCTAGTCCCAGCGGCTCAGACACTGAGGAGAGACTGTAGGTTCAGCTACAAGCAAAAAGACCTAGCTGGTCTCCAAGCAGTGTCTCCAAGTCCCTGAACCTGTGACACCTGCCCCAGGCATCATCAGGCACAGAGGGCCACCAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACCTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATAT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|
| 67 | 含有以下特徵之3’轉殖基因質體： 位置12-141處之ITR 位置229-515處之AP頭部序列 位置538-586處之剪接受體序列 人類OTOF同功型5之位置587-4174處之C端部分 位置4217-4438處之bGH聚(A)序列 位置4526-4655處之ITR 位置4674-4690處之M13 fwd 位置4832-5287處之f1 ori 位置5313-5417處之AmpR啟動子 位置5418-6227處之KanR 位置5858-5858處之mutBsmBI 位置6398-6986處之ori 位置7274-7295處之CAP結合位點 位置7310-7340處之lac啟動子 位置7348-7364處之lac操縱子 位置7372-7388處之M13 rev 位置12-4655處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | CCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGAACGGCCGCTATGCTAGCTTGGTACCAAGGGCGGATCCTGCATAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATCTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTTGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGG 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| 68 | 含有以下特徵之5’轉殖基因質體： 位置12-141處之ITR 位置230-594處之CMV，即增強子 位置296-599處之CMV增強子 位置596-878處之雞β-肌動蛋白啟動子 位置879-971處之外顯子1 位置971-1172處之嵌合內含子 位置1189-1198處之Kozak序列 位置1195-3600處之人類OTOF同功型5之N端部分 位置3601-3684處之剪接供體序列 位置3691-3977處之AP頭部序列 位置4071-4200處之ITR 位置4219-4235處之M13 fwd 位置4377-4832處之f1 ori 位置4858-4962處之AmpR啟動子 位置4963-5772處之KanR 位置4963-5772處之mutBsmBI 位置5943-6531處之ori 位置6819-6840處之CAP結合位點 位置6855-6885處之lac啟動子 位置6835-6909處之lac操縱子 位置6917-6933處之M13 rev 位置12-4200處之欲轉移至雙載體系統中之載體中之轉殖基因 | A. CCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCGGTACCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACCTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATT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除達成高轉錄及轉譯速率以外，外源基因在哺乳動物細胞中之穩定表現可藉由將含有基因之多核苷酸整合至哺乳動物細胞之核基因體中來達成。已開發出將編碼外源蛋白質之多核苷酸遞送並整合至哺乳動物細胞之核DNA中之多種載體。表現載體之實例揭示於例如WO 1994/011026中且以引用方式併入本文中。用於本文所述組合物及方法中之表現載體含有編碼OTOF之一部分之多核苷酸序列以及例如用於表現該等劑及/或將該等多核苷酸序列整合至哺乳動物細胞之基因體中之額外序列元件。可用於表現OTOF之某些載體包括含有引導基因轉錄之調節序列(如啟動子及 增強子區域)之質體。可用於表現OTOF之其他載體含有增強該等基因之轉譯速率或改良源自基因轉錄之mRNA之穩定性或核輸出之多核苷酸序列。該等序列元件包括例如5’及3’非轉譯區及引導表現載體上所攜帶基因之有效轉錄之多聚腺苷酸化信號位點。適用於本文所述組合物及方法 之表現載體亦可含有編碼用於選擇含有該載體之細胞之標記物之多核苷酸。適宜標記物之實例包括編碼抗生素(例如胺苄青黴素、氯黴素、康黴素或諾爾斯菌素)抗性之基因。用於核酸遞送之 AAV 載體
在一些實施例中，將本文所述組合物及方法之核酸納入重組AAV (rAAV)載體及/或病毒粒子中以促進其引入細胞中。可用於本文所述組合物及方法中之rAAV載體係重組核酸構築體，其包括(1)欲表現之異源序列(例如編碼OTOF蛋白之N端或C端部分之多核苷酸)及(2)促進異源基因之穩定性及表現之病毒序列。病毒序列可包括DNA順式複製及包裝(例如功能性ITR)至病毒粒子中所需之彼等AAV序列。該等rAAV載體亦可含有標記物或報導基因。有用的rAAV載體具有一或多個整體或部分缺失之AAV WT基因，但保留功能性側接ITR序列。AAV ITR可具有適於特定應用之任何血清型。為用於本文所述方法及組合物中，ITR可為 AAV2 ITR。使用rAAV載體之方法闡述於例如Tal等人，J. Biomed. Sci. 7:279 (2000)以及Monahan及Samulski，Gene Delivery 7:24 (2000)，該等文獻中之每一者關於用於基因遞送之AAV載體之揭示內容皆以引用方式併入本文中。
本文所述之核酸及載體可納入rAAV病毒粒子中以促進核酸或載體引入細胞中。AAV之衣殼蛋白構成外部，病毒粒子之非核酸部分係由AAV cap基因編碼。cap基因編碼三種病毒外殼蛋白VP1、VP2及VP3，其為病毒粒子組裝所必需。rAAV病毒粒子之構築已闡述於例如US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US 5,869,305；US 6,057,152；及US 6,376,237；以及Rabinowitz等人，J. Virol. 76:791 (2002)及Bowles等人，J. Virol. 77:423 (2003)中，該等文獻中之每一者關於用於基因遞送之AAV載體之揭示內容皆以引用方式併入本文中。
可與本文所述之組合物及方法結合使用之rAAV病毒粒子包括衍生自多種AAV血清型之彼等rAAV病毒粒子，該等AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、rh10、rh39、rh43、rh74、Anc80、Anc80L65、DJ/8、DJ/9、7m8、PHP.B、PHP.eb及PHP.S。為靶向耳蝸毛細胞，AAV1、AAV2、AAV6、AAV9、Anc80、Anc80L65、DJ/9、7m8及PHP.B可能係尤其有用的。經進化用於轉導視網膜之血清型亦可用於本文所述方法及組合物中。本文所述組合物及方法中之第一及第二核酸載體(例如AAV載體)可具有相同血清型或不同血清型。不同血清型之AAV載體及AAV蛋白之構築及用途闡述於例如Chao等人，Mol. Ther. 2:619 (2000)；Davidson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428 (2000)；Xiao等人，J. Virol. 72:2224 (1998)；Halbert等人，J. Virol. 74:1524 (2000)；Halbert等人，J. Virol. 75:6615 (2001)；及Auricchio等人，Hum. Molec. Genet. 10:3075 (2001)中，該等文獻中之每一者關於用於基因遞送之AAV載體之揭示內容皆以引用方式併入本文中。
假型rAAV載體亦可與本文所述之組合物及方法結合使用。假型載體包括經衍生自除給定血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8等)外之血清型之衣殼基因假型化之給定血清型(例如AAV9)之AAV載體。涉及假型rAAV病毒粒子之構築及用途之技術為此項技術中已知且闡述於例如Duan等人，J. Virol. 75:7662 (2001)；Halbert等人，J. Virol. 74:1524 (2000)；Zolotukhin等人，Methods，28:158 (2002)；及Auricchio等人，Hum. Molec. Genet. 10:3075 (2001)中。
在病毒粒子衣殼內具有突變之AAV病毒粒子可用於比非突變衣殼病毒粒子更有效地感染特定細胞類型。舉例而言，適宜AAV突變體可具有幫助AAV靶向特定細胞類型之配位體插入突變。AAV衣殼突變體之構築及表徵(插入突變體、丙胺酸篩選突變體及抗原決定基標籤突變體)闡述於Wu等人，J. Virol. 74:8635 (2000)中。可用於本文所述方法中之其他rAAV病毒粒子包括藉由病毒之分子育種以及藉由外顯子改組產生之彼等衣殼雜合體。例如，參見Soong等人，Nat. Genet.，25:436 (2000)以及Kolman及Stemmer，Nat. Biotechnol. 19:423 (2001)。
在一些實施例中，使用AAV載體來遞送功能性OTOF同功型5蛋白需要使用雙載體系統，其中雙載體系統之第一成員編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分且第二成員編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分，使得在將雙載體系統投與細胞後，含於兩種載體內之多核苷酸序列可連結形成產生全長OTOF同功型5蛋白之單一序列。
在一些實施例中，雙載體系統之第一成員以5’至3’順序亦將包括第一反向末端重複(「ITR」)；啟動子(例如Myo15啟動子)；Kozak序列；OTOF同功型5編碼序列之N端部分；剪接供體序列；AP基因片段(例如AP頭部序列)；及第二ITR；且雙載體系統之第二成員以5’至3’順序將包括第一ITR；AP基因片段(例如AP頭部序列)；剪接受體序列；OTOF同功型5編碼序列之C端部分；聚A序列；及第二ITR。在一些實施例中，OTOF同功型5編碼序列之N端部分及OTOF同功型5編碼序列之C端部分並不重疊且在細胞中連結(例如藉由在重疊區域(AP基因片段)重組或藉由ITR之多聯體化)以產生如SEQ ID NO:1中所示之全長OTOF同功型5胺基序列。在特定實施例中，OTOF同功型5編碼序列之N端部分編碼SEQ ID NO:1之胺基酸1-802 (SEQ ID NO：58)且OTOF同功型5編碼序列之C端部分編碼SEQ ID NO:1之胺基酸803-1997 (SEQ ID NO：59)。
在一些實施例中，雙載體系統之第一成員包括SEQ ID NO:21之Myo15啟動子(亦由SEQ ID NO:66之核苷酸235-1199表示)，其可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白之N端802個胺基酸(SEQ ID NO:1之胺基酸1-802)之核苷酸，該等核苷酸由編碼該蛋白質之天然多核苷酸序列之外顯子1-20編碼。在某些實施例中，編碼OTOF同功型5蛋白之N端胺基酸之核苷酸序列係SEQ ID NO:66之核苷酸1222-3627。在一些實施例中，碼OTOF同功型5蛋白之N端胺基酸之核苷酸序列係因遺傳密碼之冗餘性編碼SEQ ID NO:1之胺基酸1-802之任一核苷酸序列。編碼OTOF同功型5蛋白之核苷酸序列可經部分或完全密碼子最佳化用於表現。在一些實施例中，雙載體系統之第一成員包括對應於SEQ ID NO:66之核苷酸1216-1225之Kozak序列。在一些實施例中，雙載體系統之第一成員包括對應於SEQ ID NO:66之核苷酸3628-3711之剪接供體序列。在一些實施例中，雙載體系統之第一成員包括對應於SEQ ID NO:66之核苷酸3718-4004之AP頭部序列。在特定實施例中，雙載體系統之第一成員包括在5’及3’側中之每一者上側接有反向末端重複之SEQ ID NO:66之核苷酸235-4004。在一些實施例中，側接反向末端重複係AAV2反向末端重複之可經攜帶AAV2 Rep基因之質體殼體化之任一變異體。在某些實施例中，5’側接反向末端重複具有對應於SEQ ID NO:66之核苷酸12-141之序列或與其具有至少80%序列一致性(至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之序列；且3’側接反向末端重複具有對應於SEQ ID NO:66之核苷酸4098-4227之序列或與其具有至少80%序列一致性(至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之序列。熟習此項技術者應理解，對於用於產生病毒載體之轉移質體(通常藉由用該質體以及攜帶病毒載體形成所需之AAV基因之其他質體轉染細胞)中任何給定對之反向末端重複序列(例如SEQ ID NO：60、62、64、65、66或68中之任一者)，病毒載體中之相應序列可因ITR在重組期間採取「翻轉」或「倒轉」取向而改變。因此，轉移質體中ITR之序列不必為在自其製備之病毒載體中發現之相同序列。然而，在一些極特定實施例中，雙載體系統之第一成員包括SEQ ID NO:66之核苷酸12-4227。
在一些實施例中，雙載體系統之第二成員包括其後緊接終止密碼子之編碼OTOF同功型5蛋白之C端1195個胺基酸(SEQ ID NO:1之胺基酸803-1997)之核苷酸。在某些實施例中，編碼OTOF同功型5蛋白之C端胺基酸之核苷酸序列係SEQ ID NO:67之核苷酸587-4174。在一些實施例中，碼OTOF同功型5蛋白之C端胺基酸之核苷酸序列係因遺傳密碼之冗餘性編碼SEQ ID NO:1之胺基酸803-1997之任一核苷酸序列。編碼OTOF同功型5蛋白之核苷酸序列可經部分或完全密碼子最佳化用於表現。在一些實施例中，雙載體系統之第二成員包括對應於SEQ ID NO:67之核苷酸538-586之剪接受體序列。在一些實施例中，雙載體系統之第二成員包括對應於SEQ ID NO:67之核苷酸229-515之AP頭部序列。在一些實施例中，雙載體系統之第二成員包括對應於SEQ ID NO:67之核苷酸4217-4438之聚(A)序列。在特定實施例中，雙載體系統之第二成員包括在5’及3’側中之每一者上側接有反向末端重複之SEQ ID NO:67之核苷酸229-4438。在一些實施例中，側接反向末端重複係AAV2反向末端重複之可經攜帶AAV2 Rep基因之質體殼體化之任一變異體。在某些實施例中，5’側接反向末端重複具有對應於SEQ ID NO:67之核苷酸12-141之序列或與其具有至少80%序列一致性(至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之序列；且3’側接反向末端重複具有對應於SEQ ID NO:67之核苷酸4526-4655之序列或與其具有至少80%序列一致性(至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之序列。熟習此項技術者應理解，對於用於產生病毒載體之轉移質體(通常藉由用該質體以及攜帶病毒載體形成所需之AAV基因之其他質體轉染細胞)中之任一給定對之反向末端重複序列(例如SEQ ID NO：61、63或67中之任一者)，病毒載體中之相應序列可因ITR在重組期間採取「翻轉」或「倒轉」取向而改變。因此，轉移質體中ITR之序列不必為在自其製備之病毒載體中發現之相同序列。然而，在一些極特定實施例中，雙載體系統之第一成員包括SEQ ID NO:67之核苷酸12-4655。
在一些實施例中，雙載體系統係AAV1雙載體系統。
在一些實施例中，雙載體系統係AAV9雙載體系統。醫藥組合物
本文所述之核酸載體(例如AAV載體)可納入媒劑中來投與患者，例如患有感覺神經性聽力損失或聽神經病變之人類患者，如本文所述。含有含編碼OTOF同功型5蛋白之一部分之多核苷酸之載體(如病毒載體)之醫藥組合物可使用此項技術中已知之方法來製備。舉例而言，該等組合物可使用例如生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.(編輯). (1980)；以引用方式併入本文中)且以期望形式(以凍乾調配物或水溶液之形式)來製備。
本文所述核酸載體(例如AAV載體)之混合物可於水與一或多種賦形劑、載劑或稀釋劑之適宜混合物中製備。分散液亦可於甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及油中製備。在普通儲存及使用條件下，該等製劑可含有防止微生物生長之防腐劑。適於可注射用途之醫藥形式包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末(闡述於US 5,466,468中，其揭示內容係以引用方式併入本文中)。在任一情形下，調配物可為無菌的且可為容易注射之流體。調配物在製造及儲存條件下可為穩定的且可防止微生物(例如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)。其適宜混合物及/或植物油之溶劑或分散介質。可例如藉由使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液之情形下藉由維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由多種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及諸如此類)來防止微生物之作用。在許多情形下，較佳應包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
舉例而言，若需要，含有本文所述醫藥組合物之溶液可經適當緩衝，且首先用足量鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。該等特定水溶液尤其適用於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與。就此而言，根據本揭示案，可採用之無菌水性介質將為彼等熟習此項技術者所知。舉例而言，可將一劑量溶解於1 ml NaCl等滲溶液中且添加至1000 ml皮下灌注液中或在所提出之輸注位點處注射。端視所治療個體之疾患，劑量必然將發生一些變化。為局部投與內耳，組合物可經調配以含有合成外淋巴溶液。例示性合成外淋巴溶液包括20-200 mM NaCl、1-5 mM KCl、0.1-10 mM CaCl2
、1-10 mM葡萄糖及2-50 mM HEPE，其中pH介於約6與9之間且滲透重量莫耳濃度為約300 mOsm/kg。負責投與之人在任何情形下將決定個別個體之適宜劑量。此外，對於人類投與，製劑應符合FDA生物製品標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)所要求之無菌性、熱原性、一般安全性及純度標準。治療方法
本文所述之組合物可藉由多種途徑投與患有感覺神經性聽力損失或聽神經病變之個體，例如局部投與內耳(例如投與外淋巴或內淋巴中，例如藉由通過圓窗膜注射或導管插入、注射至半規管中、藉由小管造口術或藉由鼓室內或經鼓室注射，例如投與耳蝸毛細胞)、靜脈內、非經腸、真皮內、經皮、肌內、鼻內、皮下、經皮、氣管內、腹膜內、動脈內、血管內、吸入、灌注、灌洗及經口投與。若組合物係藉由直接遞送至內耳來投與，則可在內耳中別處添加第二開窗或通氣孔。在任一給定情形下最適於投與之途徑將端視所投與之具體組合物、患者、醫藥調配方法、投與方法(例如投與時間及投與途徑)、患者之年齡、體重、性別、所治療疾病之嚴重程度、患者之飲食及患者之排泄速率而定。組合物可投與一次或一次以上(例如每年一次、每年兩次、每年三次、每兩月、每月或每兩週)。在一些實施例中，第一及第二核酸載體(例如AAV載體)係同時投與(例如在一種組合物中)。在一些實施例中，第一及第二核酸載體(例如AAV載體)係相繼投與(例如，第二核酸載體係緊跟第一核酸載體或在第一核酸載體後5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、8小時、12小時、1天、2天、7天、2週、1個月或更長時間投與)。第一及第二核酸載體可具有相同血清型或不同血清型(例如AAV血清型)。
可如本文所述治療之個體係患有感覺神經性聽力損失或聽神經病變或具有患上該疾病之風險之個體。本文所述之組合物及方法可用於治療具有OTOF突變(例如降低OTOF功能或表現之突變或與感覺神經性聽力損失相關之OTOF突變)之個體、具有體染色體隱性感覺神經性聽力損失或耳聾家族史(例如OTOF相關聽力損失家族史)之個體或OTOF突變狀態及/或OTOF活性水準未知之個體。本文所述之方法可包括在用本文所述之組合物治療之前或投與本文所述之組合物之前篩選個體之OTOF突變之步驟。個體之OTOF突變可使用熟習此項技術者已知之標準方法(例如遺傳性測試)來篩選。本文所述之方法亦可包括在用本文所述之組合物治療之前或投與本文所述之組合物之前評價個體聽力之步驟。聽力可使用標準測試(例如測聽術、ABR、耳蝸電描記術(ECOG)及耳聲傳射)來評價。本文所述之組合物及方法亦可作為預防性治療投與具有患上聽力損失或聽神經病變之風險之患者，例如具有遺傳性聽力損失家族史之患者或尚未展現聽力損失或損害之攜帶OTOF突變之患者。
治療可包括以多個單位劑量投與含有本文所述之核酸載體(例如AAV載體)之組合物。每個單位劑量通常將含有預定量之治療性組合物。欲投與之量及具體投與途徑及調配物為熟習臨床技術者所熟知。單位劑量無需作為單次注射來投與，但可包括在設定的時間段內連續輸注。可使用注射幫浦實施投藥來控制輸注速率以最小化耳蝸之損傷。在核酸載體係AAV載體(例如AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、rh10、rh39、rh43、rh74、Anc80、Anc80L65、DJ/8、DJ/9、7m8、PHP.B、PHP.eb或PHP.S載體)之情形下，AAV載體可具有例如以下效價：約1 × 109
個載體基因體(VG)/mL至約1 × 1016
VG/mL (例如1 × 109
VG/mL、2 × 109
VG/mL、3 × 109
VG/mL、4 × 109
VG/mL、5 × 109
VG/mL、6 × 109
VG/mL、7 × 109
VG/mL、8 × 109
VG/mL、9 × 109
VG/mL、1 × 1010
VG/mL、2 × 1010
VG/mL、3 × 1010
VG/mL、4 × 1010
VG/mL、5 × 1010
VG/mL、6 × 1010
VG/mL、7 × 1010
VG/mL、8 × 1010
VG/mL、9 × 1010
VG/mL、1 × 1011
VG/mL、2 × 1011
VG/mL、3 × 1011
VG/mL、4 × 1011
VG/mL、5 × 1011
VG/mL、6 × 1011
VG/mL、7 × 1011
VG/mL、8 × 1011
VG/mL、9 × 1011
VG/mL、1 × 1012
VG/mL、2 × 1012
VG/mL、3 × 1012
VG/mL、4 × 1012
VG/mL、5 × 1012
VG/mL、6 × 1012
VG/mL、7 × 1012
VG/mL、8 × 1012
VG/mL、9 × 1012
VG/mL、1 × 1013
VG/mL、2 × 1013
VG/mL、3 × 1013
VG/mL、4 × 1013
VG/mL、5 × 1013
VG/mL、6 × 1013
VG/mL、7 × 1013
VG/mL、8 × 1013
VG/mL、9 × 1013
VG/mL、1 × 1014
VG/mL、2 × 1014
VG/mL、3 × 1014
VG/mL、4 × 1014
VG/mL、5 × 1014
VG/mL、6 × 1014
VG/mL、7 × 1014
VG/mL、8 × 1014
VG/mL、9 × 1014
VG/mL、1 × 1015
VG/mL、2 × 1015
VG/mL、3 × 1015
VG/mL、4 × 1015
VG/mL、5 × 1015
VG/mL、6 × 1015
VG/mL、7 × 1015
VG/mL、8 × 1015
VG/mL、9 × 1015
VG/mL或1 × 1016
VG/mL)於 1 µL至200 µL (例如1 µL、2 µL、3 µL、5 µL、6 µL、7 µL、8 µL、9 µL、10 µL、15 µL、20 µL、25 µL、30 µL、35 µL、40 µL、45 µL、50 µL、55 µL、60 µL、65 µL、70 µL、75 µL、80 µL、85 µL、90 µL、95 µL、100 µL、110 µL、120 µL、130 µL、140 µL、150 µL、160 µL、170 µL、180 µL、190 µL或200 µL)之體積中。AAV載體可以下列劑量投與個體：約1 × 107
VG/耳至約2 × 1015
VG/耳(例如1 × 107
VG/耳、2 × 107
VG/耳、3 × 107
VG/耳、4 × 107
VG/耳、5 × 107
VG/耳、6 × 107
VG/耳、7 × 107
VG/耳、8 × 107
VG/耳、9 × 107
VG/耳、1 × 108
VG/耳、2 × 108
VG/耳、3 × 108
VG/耳、4 × 108
VG/耳、5 × 108
VG/耳、6 × 108
VG/耳、7 × 108
VG/耳、8 × 108
VG/耳、9 × 108
VG/耳、1 × 109
VG/耳、2 × 109
VG/耳、3 × 109
VG/耳、4 × 109
VG/耳、5 × 109
VG/耳、6 × 109
VG/耳、7 × 109
VG/耳、8 × 109
VG/耳、9 × 109
VG/耳、1 × 1010
VG/耳、2 × 1010
VG/耳、3 × 1010
VG/耳、4 × 1010
VG/耳、5 × 1010
VG/耳、6 × 1010
VG/耳、7 × 1010
VG/耳、8 × 1010
VG/耳、9 × 1010
VG/耳、1 × 1011
VG/耳、2 × 1011
VG/耳、3 × 1011
VG/耳、4 × 1011
VG/耳、5 × 1011
VG/耳、6 × 1011
VG/耳、7 × 1011
VG/耳、8 × 1011
VG/耳、9 × 1011
VG/耳、1 × 1012
VG/耳、2 × 1012
VG/耳、3 × 1012
VG/耳、4 × 1012
VG/耳、5 × 1012
VG/耳、6 × 1012
VG/耳、7 × 1012
VG/耳、8 × 1012
VG/耳、9 × 1012
VG/耳、1 × 1013
VG/耳、2 × 1013
VG/耳、3 × 1013
VG/耳、4 × 1013
VG/耳、5 × 1013
VG/耳、6 × 1013
VG/耳、7 × 1013
VG/耳、8 × 1013
VG/耳、9 × 1013
VG/耳、1 × 1014
VG/耳、2 × 1014
VG/耳、3 × 1014
VG/耳、4 × 1014
VG/耳、5 × 1014
VG/耳、6 × 1014
VG/耳、7 × 1014
VG/耳、8 × 1014
VG/耳、9 × 1014
VG/耳、1 × 1015
VG/耳或2 × 1015
VG/耳)。
本文所述之組合物係以足以改良聽力、增加WT OTOF表現(例如耳蝸毛細胞、例如內毛細胞中OTOF同功型5之表現)或增加OTOF功能之量來投與。聽力可使用標準聽力測試(例如測聽術、ABR、耳蝸電描記術(ECOG)及耳聲傳射)來評估且與治療之前獲得之聽力量測值相比可改良5%或更大(例如5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更大)。在一些實施例中，組合物係以足以改良個體理解言語之能力之量投與。本文所述之組合物亦可以足以緩解或防止感覺神經性聽力損失或聽神經病變之發生或進展之量投與(例如在攜帶OTOF突變或具有體染色體隱性聽力損失家族史但未展現聽力損害之個體中，或在展現輕度至中度聽力損失之個體中)。OTOF表現可使用免疫組織化學、西方墨點法分析、定量即時PCR或此項技術中已知用於偵測蛋白質或mRNA之其他方法來評估，且與投與本文所述之組合物之前之OTOF表現相比可增加5%或更大(例如5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更大)。OTOF功能可直接(例如使用電生理方法或成像方法來評價胞吐作用)或間接基於聽力測試來評估，且與投與本文所述之組合物之前之OTOF功能相比可增加5%或更大(例如5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更大)。該等效應可在例如投與本文所述之組合物之後1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、15週、20週、25週或更長時間內出現。可在投與組合物之後1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長時間來評估患者，此端視用於治療之劑量及投與途徑而定。端視評估之結果，患者可接受額外治療。套組
本文所述之組合物可以套組提供用於治療感覺神經性聽力損失或聽神經病變(例如與OTOF突變相關之聽力損失)。組合物可包括本文所述之核酸載體(例如AAV載體) (例如含有編碼及OTOF同功型5蛋白之N端部分之多核苷酸之第一核酸載體及含有編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之多核苷酸之第二核酸載體)，視情況地包裝於AAV病毒衣殼(例如AAV1衣殼)中。該套組可進一步包括指導套組之使用者(例如醫師)實施本文所述方法之包裝插頁。該套組可視情況地包括注射器或用於投與組合物之其他器件。實例
提出以下實施例以向熟習此項技術者提供如何使用、製造及評估本文所述之組合物及方法之描述，且意欲純粹例示本發明，而不欲限制發明人認為其發明之範圍。實例 1. 人類 OTOF 同功型 5 而非人類 OTOF 同功型 1 拯救 OTOFQ828X/Q828X 小鼠中之功能
存在耳畸蛋白(OTOF)基因之多個長及短同功型。人類遺傳性耳聾之研究已表明長同功型對於內耳功能至關重要。然而，未理解該等個別長同功型及其他蛋白質變異體在內耳功能中之作用。為開發出對經歷繼發於遺傳驅動之OTOF缺陷之耳聾之患者有效的基因轉移療法，必須鑒別出編碼耳中之功能性OTOF同功型之cDNA序列。
在人類中，已在聽覺外組織中鑒別出7種OTOF同功型。該等同功型中之兩者(同功型1 (V1)及同功型5 (V5))係長的(長度皆為1997個胺基酸)。
吾人使用雙雜合AAV技術將人類V1及V5同功型局部遞送至經遺傳改造之具有耳畸蛋白缺陷之先天性耳聾小鼠之內耳。在先天性耳聾小鼠中遞送人類V5同功型後一個月，吾人觀察到聽力之拯救(圖1A)。相反，吾人未見注射V1人類長同功型之小鼠中之聽力恢復。該等研究將OTOF V5序列確立為能夠在基因轉移治療之背景下恢復聽力。
下文詳細闡述經實施以比較使用編碼OTOF同功型1或OTOF同功型5之雙雜合載體系統之功能恢復及OTOF表現之實驗。將 AAV 遞送至內耳
將載體(AAV2quad(Y-F)-smCBA-OTOF同功型1 (天然或密碼子最佳化)或AAV2quad(Y-F)-smCBA-OTOF同功型5 (天然或密碼子最佳化))藉由注射通過圓窗膜遞送至P30-50 OTOFQ828X/Q828X
突變體小鼠(人類OTOF突變之小鼠模型p.Gln828Ter)。編碼OTOF蛋白之N端部分之多核苷酸及編碼OTOF蛋白之C端部分之多核苷酸分在使用外顯子20/21邊界之雙雜合載體系統中之兩種載體之間，且使用AP基因片段(SEQ ID NO：51)作為雙雜合載體系統之兩種載體中之重組基因區。如下遞送載體。用異氟醚將動物麻醉。將眼用軟膏劑(Puralube Vet)施加至雙眼且以0.3-2.0 mg/kg，SC投與美洛西卡(Meloxicam，Putney)/卡布洛芬(Rimadyl)作為止痛藥。在耳後切口前藉由用倍他定(Betadine，Avrio Health L.P.)及70%酒精擦洗手術位點對其進行剃毛及消毒，以暴露出大皰。使用無菌26-30 G針或直徑0.004-0.008 mm的鑽頭(Performance Micro Tool)在大皰中鑽一小洞，並使用無菌鋒利鑷子將其擴大，以使圓窗龕可視化。然後用拉出的玻璃微量移液管或35 G聚醯亞胺管(WPI Instrument)之尖端刺穿圓窗，並使用無菌紗布吸收任何滲漏的流體。然後使用微量移液管(約0.5 mm深度)或聚醯亞胺管注射兩微升載體。注射持續約30秒。當完成遞送時，切開一小塊乳突肌且將其推入大皰，以覆蓋圓窗。將脂肪組織移動回至其原始區域。然後使用3至4滴GLUture (Zoetis Inc .)封閉皮膚切口，使其乾燥1-2分鐘。然後將動物移動至乾淨且溫暖之恢復籠中。對動物進行為期五天之疼痛體徵、感染體徵或其他窘迫體徵之術後檢查。術後前三天給予止痛藥，每日一次。適當時，亦給予動物鹽水、營養支援及額外止痛。聽性腦幹反應
在注射後4週，藉由聽覺腦幹反應(ABR)評估小鼠之外周聽覺功能。在投與麻醉劑(氯胺酮100 mg/kg，i.p.、甲苯噻嗪10 mg/kg，i.p.；視需要補充氯胺酮)且驗證適當麻醉深度後，將皮下針電極放置在頂點及腹側耳廓(差異記錄)以及尾部底部(地面)。將含有兩個揚聲器及探針管麥克風之定制聲學系統(Eaton-Peabody Laboratories，MEE)放置在耳道中，並在每個測試會話之前實施耳內校準。使用參考1/4英吋麥克風及前置放大器(PCB Piezotronics型號2530，426B31；Larson-Davis型號2221)實施探針管麥克風校正；用探針管麥克風及定制麥克風放大器(Eaton-Peabody Laboratories，MEE)來實施耳內校正。所有ABR刺激及反應係由RZ6多I/O信號處理器及BioSigRZ軟體(Tucker-Davis Technologies)產生及獲取。用連接至RA4LI低阻抗頭級之RA4PA Medusa前置放大器(Tucker-Davis Technologies)放大及數位化針電極之反應。ABR刺激為22.6 kHz 5 ms短音(0.5 ms cos2
斜坡)，以40/s之速率呈現且極性交替，以5 dB步進自5至105 dB SPL。對於每個聲級，總共對1024次試驗進行了平均化(消除偽影后)、數字濾波(0.1-5 kHz)，然後離線進行額外高通濾波(0.3 kHz)。藉由視覺檢查堆疊波形(「瀑布圖」)確定ABR臨限值作為偵測到可再現峰或谷之最低聲級。若直至設備限值(105 dB SPL)仍未偵測到反應，則指定110 dB SPL之最高值。22.6 kHz下ABR臨限值之結果顯示於圖1A中。免疫組織化學
在完成生理學測試後，經由吸入過量二氧化碳對小鼠實施安樂死。在安樂死後立即經由血管系統用10%中性緩衝福馬林(NBF)灌注小鼠。收集內耳顳骨並將其於10% NBF中浸沒2-16小時且然後在8% EDTA中脫鈣3天。自脫鈣顳骨解剖耳蝸且於PBS中洗滌3次。在室溫下與5%馬血清於PBST (0.5% triton X-100於1XPBS中)中之封閉溶液一起培育1小時後，將解剖之耳蝸塊與小鼠抗耳畸蛋白抗體(abcam ab53233，1:200稀釋於PBST中)在4℃下一起培育12-16小時，然後在PBS中洗滌3次且在室溫下於Alexa 568驢抗小鼠二級抗體(ThermoFisher Scientific A10037)中培育1-2小時。用DAPI對比染色且最終用PBS洗滌後，使用Vectashield封固劑(Vector Laboratories H-1000)將耳蝸塊安裝於載玻片上且用玻璃蓋玻片覆蓋。使用Zeiss Axio成像儀M2顯微鏡使組織成像。影像顯示於圖1B中。實例 2. 投與較高劑量之 OTOF 同功型 5 改良 OTOF Q828X/Q828X 小鼠中之功能恢復
為評估投與較高劑量之OTOF同功型5對OTOFQ828X/Q828X
突變體小鼠中之功能恢復之效應，將載體(AAV1-smCBA-OTOF同功型5 (天然或密碼子最佳化))注射通過4-7週齡之OTOFQ828X/Q828X
小鼠之圓窗膜，如上文實例1中所述。與實例1中所用之載體相似，將編碼OTOF蛋白之N端部分之多核苷酸及編碼OTOF蛋白之C端部分之多核苷酸分在使用外顯子20/21邊界之雙雜合載體系統中之兩種載體之間，且使用AP基因片段(SEQ ID NO：51)作為雙雜合載體系統之兩種載體中之重組基因區。在注射病毒後約4週量測ABR反應，如上文實例1中所述。相對於投用7E9或6E9載體基因體/耳之動物(圖1A)，該等動物顯示甚至更強之ABR反應，而與密碼子最佳化無關(圖2)。實例 3. 向小鼠投與含有表現 OTOF 之雙雜合載體之組合物使聽力功能之電生理特徵恢復
對同型接合(HOM) OTOF-Q828X小鼠(7週齡)不治療或用4E10 (4×1010
)載體基因體(vg)/耳之AAV1-Myo15 (SEQ ID NO：21)-hOTOF (同功型5，SEQ ID NO：1)雙雜合載體系統治療(藉由注射通過圓窗膜)，其中編碼OTOF蛋白之N端部分之多核苷酸(SEQ ID NO：56)之外顯子1-20及編碼OTOF蛋白之C端部分之多核苷酸(SEQ ID NO：57)之外顯子21-45及47係在單獨載體中遞送(圖3A)。AP重組基因區(SEQ ID NO：51)包括在雙雜合載體系統之兩種載體中。使用聽性腦幹反應(ABR)臨限值來評價聽力功能。未經治療之動物(未經治療之Otof HOM)未顯示可偵測到之聽力功能恢復，而經治療之動物展現穩健的恢復，此與治療後4週(治療後4週時之Otof HOM)至治療後8週(治療後8-11週時之Otof HOM)一致。亦測試異型接合動物(Otof HET)中之ABR臨限值。
在一組單獨實驗中，對同型接合OTOF-Q828X小鼠不治療或用4E10 (4×1010
) vg/耳之如上文所述之AAV1截短之嵌合CMV-雞β-肌動蛋白(smCBA，SEQ ID NO：44)-hOTOF (同功型5，SEQ ID NO：1)雙雜合載體系統治療(藉由注射通過圓窗膜) (圖3B)。第一載體含有編碼OTOF蛋白之N端部分之多核苷酸(SEQ ID NO：56)之外顯子1-20及編碼OTOF蛋白之C端部分之多核苷酸(SEQ ID NO：57)之外顯子21-45及47且兩種載體含有AP重組基因區(SEQ ID NO：51)。未經治療之動物不具可偵測到之聽力功能恢復，而經治療之動物在治療後4週展現穩健的恢復(治療後4週時之Otof HOM)。當在治療後8週評估該等相同的動物(治療後8週時之Otof HOM)時，ABR臨限值增加，此表明使用smCBA啟動子具有較不耐久之恢復。亦測試異型接合動物中之ABR臨限值。
在另一組實驗中，對同型接合OTOF-Q828X小鼠不治療或如上文所述用AAV1-smCBA (SEQ ID NO：44)-hOTOF (同功型5，SEQ ID NO：1)雙雜合載體以8E9 (8×109
) vg/耳(低劑量)、1.6E10 (1.6×1010
) vg vg/耳(中等劑量)或6.4E10 (6.4×1010
) vg/耳(高劑量)治療(藉由注射通過圓窗膜)。第一載體含有編碼OTOF蛋白之N端部分之多核苷酸(SEQ ID NO：56)之外顯子1-20及編碼OTOF蛋白之C端部分之多核苷酸(SEQ ID NO：57)之外顯子21-45及47且兩種載體含有AP重組基因區(SEQ ID NO：51)。使用ABR臨限值來評價治療後4週及8週時之聽力功能(圖3C)。在兩個時間點觀察到ABR之劑量依賴性恢復。當比較8週對4週時間點時，低劑量及中等劑量下之聽力功能之恢復係穩定的，但高劑量動物聽力功能之恢復有所降低。亦測試異型接合動物中之ABR臨限值。實例 4. 向小鼠投與含有表現鼠類 OTOF 之雙雜合載體之組合物使聽力功能之電生理特徵恢復
用AAV2quad(Y-F)-Myo15 (SEQ ID NO：21)-鼠類OTOF (mOTOF，轉錄物變異體1，RefSeq NM_001100395)及AAV2quad(Y-F)-Myo15 (SEQ ID NO：31)-mOTOF (轉錄物變異體1，RefSeq NM_001100395)雙雜合載體系統藉由如上文所述注射通過圓窗膜(注射2µL總體積，每種載體1 µL)治療同型接合OTOF-Q828X小鼠(6-7週齡)且使用ABR臨限值來評價聽力功能。編碼mOTOF蛋白之N端部分之多核苷酸之外顯子1-20包括在5’載體中且mOTOF多核苷酸之剩餘C端部分包括在3’載體中。AP重組基因區(SEQ ID NO：51)包括在雙雜合載體系統之兩種載體中。5’ AAV2quad(Y-F)-Myo15 (SEQ ID NO：21)-mOTOF載體之效價為1.49E12 vg/mL，5’ AAV2quad(Y-F)-Myo15 (SEQ ID NO：31)-mOTOF載體之效價為2.68E12 vg/mL，且相應3’載體之效價為1.05E12 vg/mL及1.58E12 vg/mL。未經治療之動物不顯示可偵測到之聽力功能恢復，而經治療之動物展現穩健的恢復，此與治療後4週至治療後17週一致(圖4)。圖4繪示22.6 kHz下之平均聽力臨限值+/-標準偏差。實例 5. 雙雜合載體可用於在非人類靈長類動物之毛細胞中表現全長功能性 GFP
用AAV1- Myo15 (SEQ ID NO：21)-GFP (對於5’載體病毒效價為3.18E13 vg/mL且對於3’載體病毒效價為3.42E13 vg/mL)雙雜合載體系統(注射60 µL總體積，每種載體30 µL)以6 µL/min之流量使2.6歲之非人類靈長類動物接受局部注射至內耳之圓窗。在注射後4週，移除內耳，且製造基底膜之表面製劑。雙雜合載體使得GFP跨過耳蝸之整個基底-頂軸在毛細胞中表現。4kHz下之高倍放大影像顯示在內毛細胞(IHC)內觀察到GFP表現(圖5B)。使用Myo7A之免疫組織化學使毛細胞可視化(圖5A)且用DAPI對核染色(圖5C)。實例 6. 編碼人類 OTOF 之雙雜合載體系統之構築
將HEK293T細胞(自ATCC，Manassas，VA獲得)接種至細胞培養物處理之皿中直至其在容器中達到70-80%鋪滿。使用來自Cell Biolabs，Inc. (San Diego，CA)之AAV-1包裝系統實施轉染。根據175 cm2
之培養物表面積，將16 µg pHelper、8 µg pAAV-RC1及8 µg轉移質體SEQ ID NO:66與PEI (PEIpro，polyplus)以1:1重量比混合。隨後將DNA/PEI混合物添加至細胞培養基中。在轉染後三天，收集細胞培養基及細胞以提取並純化AAV。經由切向流過濾濃縮細胞培養基之AAV。經由三個冷凍解凍週期自細胞釋放細胞之AAV。最終經由經由碘克沙醇密度梯度純化來純化任一流份之AAV且藉由使經純化AAV及含有0.01% pluronic F68之無菌DPBS (Mg+、Ca+)通過100 kDa MWCO離心過濾器交換緩衝液以產生經純化AAV，其係雙載體系統之第一成員。使用轉移質體SEQ ID NO:67實施類似程序以產生雙載體系統之第二成員。
使用相同程序產生在AAV9中編碼OTOF之雙載體系統，只是在轉染步驟期間用含有AAV9 cap基因而非AAV1 cap基因之相當質體替代pAAV-RC1。實例 7. 在非人類靈長類動物中表現編碼人類 OTOF 之雙雜合載體系統
在非人類靈長類動物(NHP)中，天然耳畸蛋白係在內耳之感覺細胞中表現。吾人使用BaseScope™系統來偵測病毒轉導之人類耳畸蛋白在NHP中之表現。
經由圓窗膜向六隻幼稚NHP之第一同類群(1.5-4歲)組注射包裝至AAV1血清型中之Myo15-耳畸蛋白雙雜合載體，如實例6中所述。使每隻耳一起接受兩種載體各1.1× 1012
拷貝之劑量，總體積為60 µl。使耳在外側半規管通氣，以在病毒遞送期間允許外淋巴流出。以與第一同類群組相同之方式及劑量向幼稚NHP之第二同類群組(1.5-4歲)注射包裝至AAV9血清型中之Myo15-耳畸蛋白雙雜合系統，亦如實例6中所述。
在病毒載體注射後4週，藉由心臟灌注10%中性緩衝福馬林 (NBF)殺死所有動物且收穫其顳骨。在Immunocal中脫鈣5天後，將顳骨包埋於石蠟中，以5 µm間隔製成切片且使用特異性針對人類耳畸蛋白之外顯子20與21之間之兩種載體接合處之剪接mRNA之探針針對BaseScope™ (Advanced Cell Diagnostics，Newark，CA)染色。因此，偵測需要雙載體正確地在活體內
雜交並表現全長人類OTOF同功型5。
在Leica Bond RX自動染色平台上實施BaseScope™分析。簡言之，將石蠟切片在60℃下焙燒30 min且脫蠟。在95℃下實施5 min之目標提取步驟，其後在40℃下實施10 min之蛋白酶步驟，且最後在E20/21探針上運行包括8個擴增步驟之標準BaseScope™方案。使用快紅染料(Fast Red dye)偵測探針信號，其在明視野顯微鏡術中可觀察為紅色染色。最初，在40×放大倍數下掃描及數位化影像並篩選陽性。然後，使用快紅染料之螢光信號使用共焦成像(63×，1.4 NA，激發：在1%雷射功率下為568 nm；發射：在642V偵測器下為BP 578-730 nm)確認正信號。圖6顯示經Myo15-耳畸蛋白AAV1雙載體系統治療之代表性NHP之切片。在AAV1注射之動物中，在所有經注射動物之感覺細胞中可觀察到明顯陽性，且偏向耳蝸及橢圓囊之頂端。在AAV9注射之動物中，六隻動物中之三隻顯示明顯陽性以及偏向耳蝸頂端及橢圓囊表現之類似傾向(數據未顯示)。在每一情形下，OTOF轉錄物定位於前庭器中之內毛細胞、外毛細胞及毛細胞。實例 8. NHP 中編碼 eGFP 之代用 Myo15 啟動子雙雜合載體系統之量化及局部化
為確定毛細胞特異性Myo15啟動子之特異性及在NHP中之轉導效率，使用具有與實施例6中所述相同之重組區及啟動子之雙載體系統，只是用編碼5’載體中eGFP 5’部分之前393個核苷酸及編碼3’載體中eGFP 3’部分之後908個核苷酸分別替代兩種各別載體中人類耳畸蛋白之5’及3’部分。即使在耳畸蛋白野生型背景中亦可容易地偵測到eGFP。
所有動物經由圓窗膜接受60 µl雙病毒載體注射且使其耳在外側半規管通氣。本研究中所用之動物為1.5-4歲。向六隻NHP耳中注射在Myo15啟動子下在上文所述之AAV1血清型中以1.6×1012
個載體基因體/耳之效價表現eGFP之代用載體。向另六隻NHP耳中注射在Myo15啟動子下在AAV9血清型中以1.9×1012
個載體基因體/耳之效價表現eGFP之相似之代用雙病毒載體系統。藉由關聯之前中等劑量及高劑量實驗之小鼠表現資料並將其與較小規模NHP中等劑量實驗比較，對NHP研究之劑量進行縮放(下表5)。吾人將NHP之可能結果估計為來自高劑量雙載體方法之表現eGFP之內毛細胞(IHC)之百分比(表5)。表 5 ：在雙載體 eGFP 遞送中自小鼠至 NHP 之劑量放大
vg =病毒基因體
*總劑量計算為5’+3’
**小鼠中hOTOF之IHC表現%在8 kHz、11.3 kHz、16 kHz、22.6 kHz及32 kHz下平均化
**食蟹猴中雙GFP之IHC表現%在1 kHz、2 kHz、4 kHz及8 kHz下平均化
| 所預測最小有效劑量(MED) 範圍 | 效能飽和之所預測劑量範圍 | |||||
| 物種 | 劑量濃度 | 總劑量* | IHC表現%** | 劑量濃度 | 總劑量* | IHC表現%** |
| 小鼠 | 3.9e10 vg/µL | 7.4e10 vg/耳 | 57% | 6.2e10 vg/µL | 1.2e11 vg/耳 | 82% |
| 食蟹猴 | 3.1e10 vg/µL | 1.2e12 vg/耳 | 40-60% | 5.2e10 vg/µL | 2e12 vg/耳 | 75-100% |
吾人使用全安裝共焦成像(40×，0.95 NA，激發：在14%雷射功率下為488 nm；發射：在600V偵測器增益下為BP 495-543 nm)使用天然eGFP信號作為讀出確認NHP在整個Corti器官中之表現(圖7A)。顯示表現之內毛細胞數之量化與根據劑量縮放(圖7B)對AAV1血清型之預測充分關聯，而AAV9血清型顯示較低之表現百分比。實例 9. 向具有感覺神經性聽力損失之個體投與含有表現 OTOF 同功型 5 之雙雜合載體之組合物
根據本文所揭示之方法，熟習此項技術之醫師可治療具有感覺神經性聽力損失(例如與OTOF突變相關之感覺神經性聽力損失)之患者，例如人類患者，以改良或恢復聽力。為此，熟習此項技術之醫師可向人類患者投與組合物，該組合物含有第一AAV載體(例如AAV1)，該第一AAV載體含有可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1，例如具有SEQ ID NO：56之序列之多核苷酸)之外顯子1-20之Myo15啟動子(例如SEQ ID NO：19、21、22、31或32)、多核苷酸序列3’之剪接供體序列及剪接供體序列3’之AP重組基因區(例如AP基因片段，SEQ ID NO：48-53中之任一者，例如SEQ ID NO：51)；及第二AAV載體(例如AAV1)，該第二AAV載體含有AP重組基因區(AP基因片段，SEQ ID NO：48-53中之任一者，例如SEQ ID NO：51)、重組基因區3’之剪接受體序列、剪接受體序列3’之含有編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸(例如人類OTOF同功型5，例如SEQ ID NO：1，例如具有SEQ ID NO：57之序列之多核苷酸)之外顯子21-45及47之多核苷酸及bGH聚(A)序列。含有雙雜合AAV載體之組合物可例如藉由局部投與內耳(例如注射通過圓窗膜、注射至半規管中或藉由小管造口術)投與患者來治療感覺神經性聽力損失。
向患者投與組合物後，熟習此項技術者可藉由多種方法監測OTOF之表現及患者對療法之反應之改良。舉例而言，醫師可在投與組合物後藉由實施標準測試(例如測聽術、ABR、耳蝸電描記術(ECOG))及量測耳聲傳射來監測患者之聽力。與投與組合物之前之聽力測試結果相比，患者在投與組合物後在一或多種測試中展現改良之聽力(例如改良之ABR)之發現指示，患者對治療具有有利反應。可視需要確定及投與後續劑量。
本發明之例示性實施例闡述於以下所列舉段落中。
E1. 一種雙載體系統，其包含： 第一腺相關病毒(AAV)載體，其包含可操作連接至編碼耳畸蛋白(OTOF)同功型5蛋白之N端部分之第一編碼多核苷酸之Myo15啟動子、定位於第一編碼多核苷酸3’之剪接供體信號序列及定位於剪接供體信號序列3’之第一重組基因區；及
第二AAV載體，其包含第二重組基因區、定位於第二重組基因區3’之剪接受體信號序列、定位於剪接受體信號序列3’之編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之第二編碼多核苷酸及定位於第二編碼多核苷酸3’之聚(A)序列；
其中編碼OTOF同功型5蛋白之第一編碼多核苷酸及第二編碼多核苷酸並不重疊，且其中第一及第二AAV載體皆不編碼全長OTOF同功型5蛋白。
E2. 如E1之雙載體系統，其中第一AAV載體及第二AAV載體包含AAV1衣殼。
E3. 如E1或E2之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：7或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性之第一區，該功能性部分或衍生物包含可操作連接至第二區之SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之序列，該第二區與SEQ ID NO：8或其包含SEQ ID NO：14及/或SEQ ID NO：15之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性，視情況地包含連接體，該連接體包含第一區與第二區之間之1至100個核苷酸。
E4. 如E3之雙載體系統，其中第一區包含SEQ ID NO：7之序列或由其組成。
E5. 如E3之雙載體系統，其中SEQ ID NO：7之功能性部分包含SEQ ID NO：9之序列。
E6. 如E3之雙載體系統，其中SEQ ID NO：7之功能性部分包含SEQ ID NO：10之序列。
E7. 如E3之雙載體系統，其中SEQ ID NO：7之功能性部分包含SEQ ID NO：9之序列及SEQ ID NO：10之序列。
E8. 如E7之雙載體系統，其中SEQ ID NO：7之功能性部分包含SEQ ID NO：11之序列。
E9. 如E7之雙載體系統，其中SEQ ID NO：7之功能性部分包含SEQ ID NO：12之序列。
E10. 如E7之雙載體系統，其中SEQ ID NO：7之功能性部分包含SEQ ID NO：13之序列。
E11. 如E7之雙載體系統，其中SEQ ID NO：7之功能性部分包含SEQ ID NO：33之序列。
E12. 如E3-E11中任一者之雙載體系統，其中第二區包含SEQ ID NO：8之序列或由其組成。
E13. 如E3-E11中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：14之序列。
E14. 如E3-E11中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：15之序列。
E15. 如E3-E11中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：14之序列及SEQ ID NO：15之序列。
E16. 如E15之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：16之序列。
E17. 如E15之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：17之序列。
E18. 如E15之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：18之序列。
E19. 如E3-E11中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：34之序列。
E20. 如E3-E11中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：35之序列。
E21. 如E3-E11中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：34之序列及SEQ ID NO：35之序列。
E22. 如E21之雙載體系統，其中SEQ ID NO：8之功能性部分包含SEQ ID NO：38之序列。
E23. 如E3之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含SEQ ID NO：19之序列或由其組成。
E24. 如E3之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含SEQ ID NO：21之序列或由其組成。
E25. 如E3之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含SEQ ID NO：22之序列或由其組成。
E26. 如E3之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含SEQ ID NO：42之序列或由其組成。
E27. 如E3之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含SEQ ID NO：43之序列或由其組成。
E28. 如E1或E2之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：23或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性之第一區，該功能性部分或衍生物包含可操作連接至第二區之SEQ ID NO：25之序列，該第二區與SEQ ID NO：24或其包含SEQ ID NO：26及/或SEQ ID NO：27之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性，視情況地包含連接體，該連接體包含第一區與第二區之間之1至400個核苷酸。
E29. 如E28之雙載體系統，其中第一區包含SEQ ID NO：23之序列或由其組成。
E30. 如E28之雙載體系統，其中SEQ ID NO：23之功能性部分包含SEQ ID NO：25之序列。
E31. 如E28-E30中任一者之雙載體系統，其中第二區包含SEQ ID NO：24之序列或由其組成。
E32. 如E28-E30中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：24之功能性部分包含SEQ ID NO：26之序列。
E33. 如E28-E30中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：24之功能性部分包含SEQ ID NO：27之序列。
E34. 如E28-E30中任一者之雙載體系統，其中SEQ ID NO：24之功能性部分包含SEQ ID NO：26之序列及SEQ ID NO：27之序列。
E35. 如E34之雙載體系統，其中SEQ ID NO：24之功能性部分包含SEQ ID NO：28之序列。
E36. 如E34之雙載體系統，其中SEQ ID NO：24之功能性部分包含SEQ ID NO：29之序列。
E37. 如E34之雙載體系統，其中SEQ ID NO：24之功能性部分包含SEQ ID NO：30之序列。
E38. 如E28之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含SEQ ID NO：31之序列或由其組成。
E39. 如E28之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含SEQ ID NO：32之序列或由其組成。
E40. 如E1或E2之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：34具有至少85%序列一致性之序列。
E41. 如E1或E2之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：38具有至少85%序列一致性之序列。
E42. 如E1或E2之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：39具有至少85%序列一致性之序列。
E43. 如E1或E2之雙載體系統，其中Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：40具有至少85%序列一致性之序列。
E44. 一種雙載體系統，其包含：
第一AAV1載體，其包含可操作連接至編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之第一編碼多核苷酸之遍在啟動子、定位於第一編碼多核苷酸3’之剪接供體信號序列及定位於剪接供體信號序列3’之第一重組基因區；及
第二AAV1載體，其包含第二重組基因區、定位於第二重組基因區3’之剪接受體信號序列、定位於剪接受體信號序列3’之編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之第二編碼多核苷酸及定位於第二編碼多核苷酸3’之聚(A)序列；
其中第一編碼多核苷酸與第二編碼多核苷酸並不重疊，且其中第一及第二AAV1載體皆不編碼全長OTOF同功型5蛋白。
E45. 如E44之雙載體系統，其中遍在啟動子係選自由以下組成之群：CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子及截短CMV-雞β-肌動蛋白啟動子(smCBA啟動子)。
E46. 如E45之雙載體系統，其中遍在啟動子係smCBA啟動子。
E47. 如E46之雙載體系統，其中smCBA啟動子包含SEQ ID NO：44之序列或由其組成。
E48. 如E1-E47中任一者之雙載體系統，其中第一及第二重組基因區係相同的。
E49. 如E1-E48中任一者之雙載體系統，其中第一重組基因區及/或第二重組基因區係AK重組基因區。
E50. 如E49之雙載體系統，其中AK重組基因區包含SEQ ID NO：47之序列或由其組成。
E51. 如E1-E48中任一者之雙載體系統，其中第一重組基因區及/或第二重組基因區係AP基因片段。
E52. 如E51之雙載體系統，其中AP基因片段包含SEQ ID NO：48-53中任一者之序列或由其組成。
E53. 如E52之雙載體系統，其中AP基因片段包含SEQ ID NO：51之序列或由其組成。
E54. 如E1-E53中任一者之雙載體系統，其中第一及第二編碼多核苷酸中之每一者編碼約一半的OTOF同功型5蛋白序列。
E55. 如E1-E54中任一者之雙載體系統，其中第一及第二編碼多核苷酸在OTOF外顯子邊界處分開。
E56. 如E55之雙載體系統，其中第一及第二編碼多核苷酸在OTOF外顯子20/外顯子21邊界處分開。
E57. 如E1-E55中任一者之雙載體系統，其中第一編碼多核苷酸係由編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸之外顯子1-20組成，且第二編碼多核苷酸係由編碼OTOF同功型5蛋白之多核苷酸之外顯子21-45及47組成。
E58. 如E1-E57中任一者之雙載體系統，其中編碼OTOF同功型5蛋白之第一及第二編碼多核苷酸不包含內含子。
E59. 如E1-E58中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白係人類OTOF同功型5蛋白。
E60. 如E1-E59中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白包含SEQ ID NO：1之序列或其具有一或多個保守胺基酸取代之變異體。
E61. 如E60之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白變異體中不超過10%之胺基酸係保守胺基酸取代。
E62. 如E60之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：1之序列組成。
E63. 如E1-E60及E62中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：2之序列編碼。
E64. 如E1-E60及E62中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：3之序列編碼。
E65. 如E1-E64中任一者之雙載體系統，其中第一編碼多核苷酸編碼SEQ ID NO：1之胺基酸1-802且第二編碼多核苷酸編碼SEQ ID NO：1之胺基酸803-1997。
E66. 如E1-E65中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白之N端部分係由SEQ ID NO：58之序列或其具有一或多個保守胺基酸取代之變異體組成。
E67. 如E66之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白變異體之N端部分中不超過10% (例如10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小)之胺基酸係保守胺基酸取代。
E68. 如E66之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白之N端部分係由SEQ ID NO：58之序列組成。
E69. 如E1-E66及E68中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白之N端部分係由SEQ ID NO：56之序列編碼。
E70. 如E1-E69中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白之C端部分係由SEQ ID NO：59之序列或其具有一或多個保守胺基酸取代之變異體組成。
E71. 如E70之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白變異體之C端部分中不超過10% (例如10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小)之胺基酸係保守胺基酸取代。
E72. 如E70之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白之C端部分係由SEQ ID NO：59之序列組成。
E73. 如E1-E70及E72中任一者之雙載體系統，其中OTOF同功型5蛋白之C端部分係由SEQ ID NO：57之序列編碼。
E74. 如E1-E73中任一者之雙載體系統，其中第一載體包含啟動子5’之第一反向末端重複(ITR)序列及重組基因區3’之第二ITR序列，且第二載體包含重組基因區5’之第一ITR序列及聚(A)序列3’之第二ITR序列。
E75. 如E74之雙載體系統，其中第一載體及第二載體中之ITR係AAV2 ITR或與AAV2 ITR具有至少80%序列一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)。
E
76. 如E1-E75中任一者之雙載體系統，其中聚(A)序列係牛生長激素(bGH)聚(A)信號序列。
E77. 如E1-E76中任一者之雙載體系統，其中第一載體中之剪接供體序列包含SEQ ID NO：54之序列或由其組成。
E78. 如E1-E77中任一者之雙載體系統，其中第二載體中之剪接受體序列包含SEQ ID NO：55之序列或由其組成。
E79. 如E1-E78中任一者之雙載體系統，其中第一AAV載體包含啟動子3’及編碼OTOF同功型5蛋白之N端部分之第一編碼多核苷酸5’之Kozak序列。
E80. 如E1之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：60之核苷酸2272至6041之序列之多核苷酸序列。
E81. 如E1或E80之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：60之核苷酸2049至6264之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E82. 如E1之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：62之核苷酸182至3949之序列之多核苷酸序列。
E83. 如E1或E82之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：62之核苷酸19至4115之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E84. 如E44之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：64之位置2267至6014之序列之多核苷酸序列。
E85. 如E44或E84之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：64之位置2049至6237之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E86. 如E44之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：65之位置177至3924之序列之多核苷酸序列。
E87. 如E44或E86之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：65之位置19至4090之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E88. 如E1、E44、E80、E81、E84及E85中任一者之雙載體系統，其中第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：61之核苷酸2267至6476之序列之多核苷酸序列。
E89. 如E1、E44、E80、E81、E84、E85及E88中任一者之雙載體系統，其中第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：61之核苷酸2049至6693之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E90. 如E1、E44、E82、E83、E86及E87中任一者之雙載體系統，其中第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：63之核苷酸187至4396之序列之多核苷酸序列。
E91. 如E1、E44、E82、E83、E86、E87及E90中任一者之雙載體系統，其中第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：63之核苷酸19至4589之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E92. 如E1之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：66之核苷酸235至4004之序列之多核苷酸序列。
E93. 如E1或E92之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：66之核苷酸12至4227之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E94. 如E44之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：68之核苷酸230至3977之序列之多核苷酸序列。
E95. 如E44或E94之雙載體系統，其中第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：68之核苷酸12至4200之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E96. 如E1、E44及E92-E95中任一者之雙載體系統，其中第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：67之核苷酸229至4438之序列之多核苷酸序列。
E97. 如E1、E44及E92-E96中任一者之雙載體系統，其中第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：67之核苷酸12至4655之序列或由其組成之多核苷酸序列。
E98. 一種增加有需要之個體中之OTOF表現之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如E1-E97中任一者之雙載體系統。
E99. 一種治療患有感覺神經性聽力損失或具有患上該疾病之風險之個體之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如E1-E97中任一者之雙載體系統。
E100. 一種治療患有聽神經病變或具有患上該疾病之風險之個體之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如E1-E97中任一者之雙載體系統。
E101. 如E98-E100中任一者之方法，其中個體具有OTOF突變。
E102. 如E98-E100中任一者之方法，其中個體已經鑒別為具有OTOF突變。
E103. 如E98-E100中任一者之方法，其中該方法進一步包括在投與雙載體系統之前將個體鑒別為具有OTOF突變。
E104. 如E98-E103中任一者之方法，其中個體患有或經鑒別為患有9型體染色體隱性耳聾(DFNB9)。
E105. 如E98-E104中任一者之方法，其中該方法進一步包括在投與雙載體系統之前評估個體之聽力。
E106. 如E98-E105中任一者之方法，其中雙載體系統係經局部投與中耳或內耳。
E107. 如E106之方法，其中雙載體系統係藉由注射通過圓窗膜、注射至半規管中、小管造口術、通過圓窗膜插入導管、經鼓室注射或鼓室內注射來投與。
E108. 如E98-107中任一者之方法，其中該方法增加耳蝸毛細胞中之OTOF表現。
E109. 如E108之方法，其中耳蝸毛細胞係內毛細胞。
E110. 如E98-E109中任一者之方法，其中個體係哺乳動物。
E111. 如E110之方法，其中個體係人類。
E112. 如E98-E111中任一者之方法，其中該方法進一步包括在投與雙載體系統後評估個體之聽力。
E113. 如E98-E112中任一者之方法，其中雙載體系統預防或減輕聽力損失，延遲聽力損失之發生，減緩聽力損失之進展，改良聽力，改良言語識別或改良毛細胞功能。
E114. 如E98-E113中任一者之方法，其中雙載體系統係以足以增加耳蝸毛細胞中之OTOF表現、預防或減輕聽力損失、延遲聽力損失之發生、減緩聽力損失之進展、改良聽力、改良言語識別或改良毛細胞功能之量來投與。
E115. 一種增加細胞中之OTOF表現之方法，該方法包括將如E1-E97中任一者之雙載體系統引入細胞中。
E116. 如E115之方法，其中細胞係耳蝸毛細胞。
E117. 如E116之方法，其中細胞係內毛細胞。
E118. 如E115-117中任一者之方法，其中細胞係哺乳動物細胞。
E119. 如E118之方法，其中細胞係人類細胞。
E120. 如E98-E119中任一者之方法，其中第一載體與第二載體係同時投與。
E121. 如E98-E120中任一者之方法，其中第一載體與第二載體係相繼投與。
E122. 如E98-E121中任一者之方法，其中第一載體及第二載體係以約1 × 107
個載體基因體(VG)/耳至約2 × 1015
VG/耳之濃度投與。其他實施例
在不脫離本發明之範圍及精神之情況下，熟習此項技術者將明了所述發明之各種修改及變化。儘管已結合特定實施例闡述了本發明，但應理解，所主張之本發明不應不適當地限於該等特定實施例。實際上，對熟習此項技術者顯而易見之用於實施本發明之所述模式之各種修改意欲在本發明之範圍內。其他實施例在申請專利範圍中。
圖 1A
係顯示投與OTOF雙載體系統之OTOF同型接合突變體(OTOFQ828X/Q828X
)小鼠中之聽性腦幹反應(ABR)之分析之圖，其展示人類OTOF同功型5而非人類OTOF同功型1之AAV介導之基因轉移改良聽覺功能。自接受攜帶編碼人類OTOF同功型1 (V1) (SEQ ID NO：4)或同功型5 (V5) (SEQ ID NO：1)之密碼子最佳化(CO)或天然(天然)序列之OTOF雙載體系統之小鼠記錄對22.6 kHz純音刺激之ABR臨限值。遞送至耳之病毒劑量(以載體基因體(vg)表示)指示於下文投與每一治療組之序列之描述。將OTOF病毒注射通過4至7週齡之OTOFQ828X/Q828X
小鼠(人類OTOF突變之小鼠模型p.Gln828Ter)之圓窗膜。在注射病毒後約4週量測ABR反應。ABR反應在經人類OTOF同功型5治療之小鼠中得到顯著改良，而與密碼子最佳化無關。在經人類OTOF同功型1治療之小鼠中未偵測到ABR反應。方框指示在野生型及異型接合OTOF突變體小鼠(OTOFQ828X/+
)中觀察到之ABR臨限值之範圍。圖 1B
係經攜帶編碼人類OTOF同功型1 (V1)或同功型5 (V5)之密碼子最佳化(CO)序列之OTOF雙載體系統轉導之小鼠耳蝸之系列螢光影像。向小鼠注射攜帶人類OTOF同功型1 (V1) (SEQ ID NO：6)或同功型5 (V5) (SEQ ID NO：3)之密碼子最佳化(CO)序列之OTOF雙載體系統。在完成生理學測試後(參見圖1A中之資料)，對小鼠實施安樂死且灌注10%中性緩衝福馬林。收穫內耳顳骨且在8% EDTA中脫鈣3天。自脫鈣顳骨解剖耳蝸，用OTOF抗體免疫染色以偵測OTOF轉殖基因之表現，並安裝於載玻片上用於螢光成像。注射有編碼人類OTOF同功型1 (V1)或同功型5 (V5)之雙載體系統之耳蝸顯示相當之OTOF表現水準(圖1B)。由於僅對人類OTOF同功型5 (V5)而非同功型1 (V1)觀察到功能恢復(參見圖1A)，該等資料指示，人類OTOF同功型5 (V5)係耳蝸內毛細胞中功能相關之OTOF同功型。圖 2
係顯示OTOF同型接合突變體(OTOFQ828X/Q828X
)小鼠中之ABR之分析之圖，其展示在以較高劑量遞送時，人類OTOF同功型5之AAV介導之基因轉移將聽覺功能改良至野生型水準。自接受攜帶人類OTOF同功型5 (V5)之密碼子最佳化(CO)或天然(天然)序列(分別為SEQ ID NO：3及2)之OTOF雙載體之小鼠記錄對22.6 kHz之純音刺激之ABR臨限值。對於每一治療組，遞送至耳之病毒劑量(以載體基因體(vg)表示)指示於下文投與每一治療組之序列之描述。將OTOF病毒注射通過4至7週齡OTOFQ828X/Q828X
小鼠之圓窗膜。在注射病毒後約4週量測ABR反應。相對於投用7E9或6E9載體基因體/耳之動物(圖1A)，該等動物顯示甚至更強之ABR反應，而與密碼子最佳化無關(圖2)。方框指示在野生型及異型接合OTOF突變體小鼠(OTOFQ828X/+)
中觀察到之ABR臨限值之範圍。圖 3A-3C
係顯示用經由雙雜合載體系統表現OTOF之病毒載體治療之小鼠中聽力功能之電生理特徵之系列圖。用AAV1-Myo15 (SEQ ID NO：21)-hOTOF (同功型5，SEQ ID NO：1)雙雜合載體系統藉由注射通過圓窗膜來治療同型接合OTOF-Q828X小鼠，且使用聽性腦幹反應(ABR)臨限值來評價聽力功能(圖3A)。未經治療之動物(未經治療之Otof HOM)不顯示可偵測到之聽力功能恢復，而經治療之動物展現穩健的恢復，此與治療後4週(治療後4週時之Otof HOM)至治療後8週(治療後8-11週時之Otof HOM)一致。亦測試異型接合小鼠(Otof HET)之ABR臨限值。
在另一組實驗中，用AAV1截短之嵌合CMV-雞β-肌動蛋白(smCBA; SEQ ID NO：44)-hOTOF (同功型5，SEQ ID NO：1)雙雜合載體系統藉由注射通過圓窗膜來治療同型接合OTOF-Q828X小鼠，且使用ABR臨限值來評價如上文所述之聽力功能(圖3B)。未經治療之動物不顯示可偵測到之聽力功能恢復，而經治療之動物在治療後4週時展現穩健的恢復(治療後4週時之Otof HOM)。當在治療後8週評估小鼠(治療後8週時之Otof HOM)時，ABR臨限值增加，此表明使用smCBA啟動子具有較不耐久之恢復。亦測試異型接合小鼠之ABR臨限值。
在另一組實驗中，用AAV1-smCBA (SEQ ID NO：44)-hOTOF (同功型5，SEQ ID NO：1)雙雜合載體系統藉由以低、中等(mid)及高劑量注射通過圓窗膜來治療同型接合OTOF-Q828X小鼠，且使用ABR臨限值來評價治療後4週及8週時之聽力功能(圖3C)。在兩個時間點觀察到ABR臨限值之劑量依賴性恢復。當比較8週對4週時間點時，低劑量及中等劑量下之恢復係穩定的，但高劑量動物之恢復減少。亦測試HET動物之ABR臨限值。圖 4
係顯示用經由雙雜合載體系統表現OTOF之病毒載體治療之小鼠中聽力恢復之耐久性之圖。用AAV2quad (Y-F)-Myo15 (SEQ ID NO：21)-鼠類OTOF (mOTOF，轉錄物變異體1，RefSeq NM_001100395)及AAV2quad (Y-F)-Myo15 (SEQ ID NO：31)-mOTOF (轉錄物變異體1，RefSeq NM_001100395)雙雜合載體系統藉由注射通過圓窗膜來治療同型接合OTOF-Q828X小鼠，且使用ABR臨限值來評價聽力功能。未經治療之動物不顯示可偵測到之聽力功能恢復，而經治療之動物展現穩健的恢復，此與治療後4週至治療後17週一致(圖4)。該圖繪示22.6 kHz下之平均聽力臨限值 +/- 標準偏差。圖 5A-5C
係非人類靈長類動物耳蝸之系列螢光影像，其顯示可使用雙雜合載體在毛細胞中表現全長功能性GFP。使非人類靈長類動物(NHP)接受流量為6 µL/min之AAV1- Myo15 (SEQ ID NO：21)-GFP (對於5’載體病毒效價為3.18E13 vg/mL，且對於3’載體病毒效價為3.42E13 vg/mL)雙雜合載體系統之局部注射至內耳之圓窗。在注射後4週，移除內耳，且製造基底膜之表面製劑。雙雜合載體使得GFP跨過耳蝸之整個基底-頂軸在毛細胞中表現。4kHz下之高倍放大影像顯示在內毛細胞(IHC)內觀察到GFP表現(圖5B)。使用Myo7A之免疫組織化學使毛細胞可視化(圖5A)且用DAPI對核染色(圖5C)。圖 6
係在用本文實例6中所述表現全長OTOF之雙雜合病毒載體系統治療後4週，來自NHP耳之不同區域之具有微分干涉對比影像(頂部三圖)及特異性針對人類OTOF之外顯子20/外顯子21接合處之相應BaseScope™螢光染色(底部三圖)之切片之系列影像。螢光染色特異性針對自雙載體產生之全長人類OTOF轉錄物。「IHC」係指內毛細胞。「OHC」係指外毛細胞。「HC」係指毛細胞。下圖中可見之刻度條代表10 µm之刻度。圖 7A-7B
代表經在如實例6中所述之AAV1或AAV9載體中在Myo15啟動子之控制下表現eGFP之雙載體系統治療之NHP中在Corti器官之不同位置內毛細胞中之GFP表現。圖7A顯示在AAV1雙雜合GFP轉導後跨過Corti器官及相應eGFP信號在不同頻率位置之內毛細胞之系列共焦影像 。圖7B係顯示在Corti器官之不同區域中表現eGFP之內毛細胞數量之量化。圖 8
係繪示本發明之例示性雙載體系統之示意圖。5’載體自5’至3’含有Myo15啟動子、人類耳畸蛋白同功型5編碼序列5’半部分之前20個外顯子、剪接供體位點(SD)及鹼性磷酸酶(AP)源性同源區域。3’載體自5’至3’含有AP同源區域之拷貝、互補剪接受體位點(SA)、人類耳畸蛋白同功型5編碼序列之剩餘3’部分(外顯子21-45及47)及多聚腺苷酸化(聚A)信號。5’及3’載體含有側接反向末端重複(ITR)。該等載體經設計以在共轉導至相同靶細胞中時復原功能人類OTOF同功型5基因盒且載體重組可經由兩種活體內重組基因機制來進行。ITR通常在第二股DNA合成及延伸期間締合且每一載體中之相同AP序列可經歷同源重組，從而在任一情形下形成功能性人類OTOF同功型5盒。所得雙股DNA可自Myo15啟動子表現RNA，且SD/SA位點促進藉由剪接移除AP區域及ITR序列以產生編碼全長人類OTOF同功型5編碼序列之成熟mRNA。
Claims (36)
- 一種雙載體系統，其包含： 第一腺相關病毒(AAV)載體，其包含可操作連接至編碼耳畸蛋白(OTOF)同功型5蛋白之N端部分之第一編碼多核苷酸之Myo15啟動子、定位於第一編碼多核苷酸3’之剪接供體信號序列及定位於剪接供體信號序列3’之第一重組基因區；及 第二AAV載體，其包含第二重組基因區、定位於第二重組基因區3’之剪接受體信號序列、定位於剪接受體信號序列3’之編碼OTOF同功型5蛋白之C端部分之第二編碼多核苷酸及定位於第二編碼多核苷酸3’之聚(A)序列； 其中編碼OTOF同功型5蛋白之第一編碼多核苷酸及第二編碼多核苷酸並不重疊，且其中第一及第二AAV載體皆不編碼全長OTOF同功型5蛋白。
- 如請求項1之雙載體系統，其中該第一AAV載體及該第二AAV載體包含AAV1衣殼。
- 如請求項1或2之雙載體系統，其中該Myo15啟動子包含與SEQ ID NO：7或其功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性之第一區，該功能性部分或衍生物包含可操作連接至第二區之SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之序列，該第二區與SEQ ID NO：8或其包含SEQ ID NO：14及/或SEQ ID NO：15之序列之功能性部分或衍生物具有至少85%序列一致性，視情況地包含連接體，該連接體包含該第一區與該第二區之間之1至100個核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之雙載體系統，其中該Myo15啟動子包含SEQ ID NO：21之序列或由其組成。
- 如請求項1至4中任一項之雙載體系統，其中該第一重組基因區及/或該第二重組基因區係AP基因片段。
- 如請求項5之雙載體系統，其中該AP基因片段包含SEQ ID NO：48-53中任一者之序列或由其組成。
- 如請求項6之雙載體系統，其中該AP基因片段包含SEQ ID NO：51之序列或由其組成。
- 如請求項1至7中任一項之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白包含SEQ ID NO：1之序列或其具有一或多個保守胺基酸取代之變異體。
- 如請求項8之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白變異體中不超過10%之胺基酸係保守胺基酸取代。
- 如請求項8之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白係由該SEQ ID NO：1之序列組成。
- 如請求項1至8及10中任一項之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：2之序列編碼。
- 如請求項1至8及10中任一項之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白係由SEQ ID NO：3之序列編碼。
- 如請求項1至12中任一項之雙載體系統，其中該第一編碼多核苷酸編碼SEQ ID NO：1之胺基酸1-802且該第二編碼多核苷酸編碼SEQ ID NO：1之胺基酸803-1997。
- 如請求項1至13中任一項之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白之N端部分係由SEQ ID NO：58之序列或其具有一或多個保守胺基酸取代之變異體組成。
- 如請求項14之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白變異體之該N端部分中不超過10%之胺基酸係保守胺基酸取代。
- 如請求項14之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白之該N端部分係由該SEQ ID NO：58之序列組成。
- 如請求項1至14及16中任一項之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白之該N端部分係由SEQ ID NO：56之序列編碼。
- 如請求項1至17中任一項之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白之該C端部分係由SEQ ID NO：59之序列或其具有一或多個保守胺基酸取代之變異體組成。
- 如請求項18之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白變異體之該C端部分中不超過10%之胺基酸係保守胺基酸取代。
- 如請求項18之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白之該C端部分係由該SEQ ID NO：59之序列組成。
- 如請求項1至18及20中任一項之雙載體系統，其中該OTOF同功型5蛋白之該C端部分係由SEQ ID NO：57之序列編碼。
- 如請求項1至21中任一項之雙載體系統，其中該第一載體包含該啟動子5’之第一反向末端重複(ITR)序列及該重組基因區3’之第二ITR序列，且該第二載體包含該重組基因區5’之第一ITR序列及該聚(A)序列3’之第二ITR序列。
- 如請求項22之雙載體系統，其中該第一載體及該第二載體中之該等ITR與AAV2 ITR具有至少80%序列一致性。
- 如請求項1至23中任一項之雙載體系統，其中該聚(A)序列係牛生長激素(bGH)聚(A)信號序列。
- 如請求項1至24中任一項之雙載體系統，其中該第一載體中之剪接供體序列包含SEQ ID NO：54之序列或由其組成。
- 如請求項1至25中任一項之雙載體系統，其中該第二載體中之剪接受體序列包含SEQ ID NO：55之序列或由其組成。
- 如請求項1至26中任一項之雙載體系統，其中該第一AAV載體包含該Myo15啟動子3’及編碼該OTOF同功型5蛋白之該N端部分之該第一編碼多核苷酸5’之Kozak序列。
- 如請求項1之雙載體系統，其中該第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：66之核苷酸235至4004之序列之多核苷酸序列。
- 如請求項1或28之雙載體系統，其中該第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：67之核苷酸229至4438之序列之多核苷酸序列。
- 如請求項1之雙載體系統，其中該第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：60之核苷酸2272至6041之序列之多核苷酸序列。
- 如請求項1之雙載體系統，其中該第一AAV載體包含含有SEQ ID NO：62之核苷酸182至3949之序列之多核苷酸序列。
- 如請求項1或30之雙載體系統，其中該第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：61之核苷酸2267至6476之序列之多核苷酸序列。
- 如請求項1或31之雙載體系統，其中該第二AAV載體包含含有SEQ ID NO：63之核苷酸187至4396之序列之多核苷酸序列。
- 一種增加有需要之個體中之OTOF表現之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如請求項1至33中任一項之雙載體系統。
- 一種治療患有感覺神經性聽力損失或具有患上該疾病之風險之個體之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如請求項1至33中任一項之雙載體系統。
- 一種治療患有聽神經病變或具有患上該疾病之風險之個體之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如請求項1至33中任一項之雙載體系統。
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