TW202124719A - 前庭支持細胞啟動子及其用途 - Google Patents

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約瑟夫 伯恩斯
泰勒 吉勃遜
蓋博雅拉 普列格寧
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美商迪賽博治療公司
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Abstract

本揭示案提供含有SLC6A14啟動子之多核苷酸以及含有該等核苷酸之載體，其可用於促進轉殖基因在前庭支持細胞中之表現。本文所述之多核苷酸可操作連接至轉殖基因，例如編碼治療蛋白之轉殖基因，以促進該轉殖基因之前庭支持細胞表現。本文所述之多核苷酸可操作連接至治療性轉殖基因且用於治療患有前庭功能障礙或具有患上該疾病之風險之個體。

Description

前庭支持細胞啟動子及其用途
前庭功能障礙係重大公共健康問題，對生活品質有深遠影響。約35%之40歲及以上的美國成年人展現平衡病症，且此比例隨年齡顯著增加，導致老年人之日常活動中斷、情緒及認知下降以及跌倒之盛行率增加。前庭功能障礙通常為獲得性障礙，且具有多種病因，包括疾病或感染、頭部創傷、耳毒性藥物及衰老。前庭功能障礙病因中之常見因素是內耳前庭毛細胞損傷。因此，旨在恢復毛細胞功能之療法將有益於患有前庭功能障礙之患者。已知前庭支持細胞在損傷後會自發分化為毛細胞，因此用作適於恢復毛細胞功能之治療靶。
本發明提供促進相關基因(例如促進或改良毛細胞或支持細胞功能、再生、成熟、增殖或存活之基因)在特定細胞類型中之表現之組合物及方法。本文所述之組合物及方法與刺激轉殖基因在內耳前庭支持細胞(VSC)中之轉錄之溶質載劑家族6成員14 (SLC6A14)啟動子序列相關。本文所述之SLC6A14啟動子序列可操作連接至轉殖基因，且可投與患者來治療前庭功能障礙(例如暈眩、眩暈、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下、振動幻視或平衡病症)。
在第一態樣中，本發明提供核酸載體，其包含與SEQ ID NO: 1-6中之任一者具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 1具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 2具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 4具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 5具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 6具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 3之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 5之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 6之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 2之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 1之序列。
在一些實施例中，多核苷酸可操作連接至轉殖基因。在一些實施例中，轉殖基因係異源轉殖基因。在一些實施例中，轉殖基因含有編碼蛋白質(例如治療蛋白或報導基因蛋白)、短干擾RNA (siRNA)、反義寡核苷酸(ASO)、核酸酶(例如CRISPR相關蛋白9 (Cas9)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)或嚮導RNA (gRNA))之多核苷酸序列，或為微小RNA。在一些實施例中，蛋白質係治療蛋白。
在一些實施例中，多核苷酸能夠引導蛋白質(例如治療蛋白或報導基因蛋白)、siRNA、ASO、核酸酶或微小RNA在哺乳動物VSC中之前庭支持細胞(VSC)特異性表現。在一些實施例中，VSC係人類VSC。
在一些實施例中，治療蛋白係婆羅雙樹樣轉錄因子2 (Sall2)、攜鈣蛋白結合轉錄活化劑1 (Camta1)、具有YRPW基序2之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey2)、Gata結合蛋白2 (Gata2)、具有YRPW基序1之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey1)、神經醯胺合酶2 (Lass2)、SRY框10 (Sox10)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、Cut樣同源異形框1 (Cux1)、核受體亞家族2 F族成員(Nr2f1)、Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hes1)、RAR相關孤兒受體B (Rorb)、Jun原癌基因AP-1轉錄因子次單元(Jun)、鋅指蛋白667 (Zfp667)、LIM同源異形框3 (Lhx3)、無義螺旋-環-螺旋1 (Nhlh1)、MAX二聚化蛋白4 (Mxd4)、MIZ1型鋅指(Zmiz1)、髓磷脂轉錄因子1 (Myt1)、信號轉導子及轉錄活化劑3 (Stat3)、BarH樣同源異形框1 (Barhl1)、胸腺細胞選擇相關之高遷移率族蛋白框(Tox)、Prospero同源異形框1 (Prox1)、核因子I A (Nfia)、甲狀腺激素受體β (Thrb)、MYCL原癌基因BHLH轉錄因子(Mycl1)、離胺酸去甲基酶5A (Kdm5a)、CAMP反應元件結合蛋白3反應元件樣4 (Creb3I4)、ETS變異體1 (Etv1)、父系表現之3 (Peg3)、BTB結構域及CNC同系物2 (Bach2)、ISL LIM同源異形框1 (Isl1)、鋅指及含BTB結構域之38 (Zbtb38)、肢芽及心臟發育(Lbh)、桶狀家族二分轉錄因子(Tub)、泛素C (Hmg20)、RE1沈默轉錄因子(Rest)、鋅指蛋白827 (Zfp827)、AF4/FMR2家族成員3 (Aff3)、PBX/有節的1同源異形框2 (Pknox2)、富含AT之相互作用結構域3B (Arid3b)、MLX相互作用蛋白(Mlxip)、鋅指蛋白(Zfp532)、IKAROS家族鋅指2 (Ikzf2)、婆羅雙樹樣轉錄因子1 (Sall1)、SIX同源異形框2 (Six2)、婆羅雙樹樣轉錄因子3 (Sall3)、Lin-28同系物B (Lin28b)、調節因子X7 (Rfx7)、腦源性神經營養因子(Bdnf)、非生長因子依賴性1轉錄抑制子(Gfi1)、POU 4類同源異形框3 (Pou4f3)、MYC原癌基因BHLH轉錄因子(Myc)、β-連環蛋白(Ctnnb1)、SRY框2 (Sox2)、SRY框4 (Sox4)、SRY框11 (Sox11)、TEA結構域轉錄因子2 (Tead2)、無調BHLH轉錄因子1 (Atoh1)或Atoh1變異體。在一些實施例中，Atoh1變異體具有一或多個選自由以下組成之群之胺基酸取代：S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A及S328A/S331A/S334。在一些實施例中，治療蛋白係Atoh1 (例如人類Atoh1)。在一些實施例中，Atoh1蛋白包含SEQ ID NO: 10之序列或其具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個)保守胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，Atoh1蛋白變異體中不超過10% (10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少)之胺基酸係保守胺基酸取代。在一些實施例中，Atoh1蛋白係由SEQ ID NO: 10之序列組成。在一些實施例中，Atoh1蛋白係由SEQ ID NO: 11之序列編碼。
在一些實施例中，核酸載體進一步包括反向末端重複序列(ITR)。在核酸載體包括可操作連接至轉殖基因之本發明多核苷酸之實施例中，核酸載體包括多核苷酸5’之第一ITR序列及轉殖基因3’之第二ITR序列。在一些實施例中，ITR係AAV2 ITR。在一些實施例中，ITR與AAV2 ITR具有至少80%序列一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)。
在一些實施例中，核酸載體進一步包括多聚腺苷酸化(聚(A))序列。在一些實施例中，聚(A)序列係牛生長激素(bGH)聚(A)信號序列。在核酸載體包括可操作連接至轉殖基因之本發明多核苷酸之實施例中，聚(A)序列定位於轉殖基因之3’。在核酸載體包括第一及第二ITR序列以及可操作連接至轉殖基因之本發明多核苷酸之實施例中，聚(A)序列定位於轉殖基因之3’及第二ITR序列之5’。
在一些實施例中，核酸載體進一步包括土撥鼠(Woodchuck)轉錄後調節元件(WPRE)。在一些實施例中，WPRE具有SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15之序列。在核酸載體包括可操作連接至轉殖基因之本發明多核苷酸之實施例中，WPRE定位於轉殖基因之3’。在核酸載體包括可操作連接至轉殖基因之本發明多核苷酸及聚(A)序列之實施例中，WPRE定位於轉殖基因之3’及聚(A)序列之5’。
在一些實施例中，核酸載體含有包含SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922之序列之多核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明之核酸載體包括SLC6A14啟動子(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)，其可操作連接至編碼人類Atoh1 (人類ATOH1蛋白= RefSeq登錄號NP_005163 (SEQ ID NO: 10)；mRNA序列= RefSeq登錄號NM_005172)之多核苷酸序列。在一些更特定實施例中，本發明之核酸載體包括SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子，其可操作連接至編碼人類Atoh1之多核苷酸序列(例如編碼SEQ ID NO: 10之多核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 11之多核苷酸序列)。在一些甚至更特定實施例中，核酸載體以5’至3’順序包括第一反向末端重複；SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子；可操作連接至SLC6A14啟動子之編碼人類Atoh1之多核苷酸序列；多聚腺苷酸化序列；及第二反向末端重複。在其他更特定實施例中，核酸載體以5’至3’順序包括第一反向末端重複；SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子；可操作連接至SLC6A14啟動子之編碼人類Atoh1之多核苷酸序列；土撥鼠轉錄後調節元件(WPRE)；多聚腺苷酸化序列；及第二反向末端重複。在甚至更特定實施例中，核酸載體包括側接有反向末端重複之SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922。在甚至更特定實施例中，核酸載體包括側接有反向末端重複之SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922，其中5’反向末端重複與SEQ ID NO: 7之核苷酸1-130具有至少80%序列一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)；且其中3’反向末端重複與SEQ ID NO: 7之核苷酸3010-3139具有至少80%序列一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)。
在一些實施例中，核酸載體係病毒載體、質體、黏粒或人工染色體。在一些實施例中，核酸載體係選自包括腺相關病毒(AAV)、腺病毒及慢病毒之群之病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係AAV載體。在一些實施例中，AAV載體具有AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、rh10、rh39、rh43、rh74、Anc80、Anc80L65、DJ/8、DJ/9、7m8、PHP.B、PHP.eB或PHP.S衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV1衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV9衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV6衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV8衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有Anc80衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有Anc80L65衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有DJ/9衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有7m8衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV2衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有PHP.B衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV2quad(Y-F)衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有PHP.S衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有PHP.eB衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV3衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV4衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV5衣殼。在一些實施例中，AAV載體具有AAV7衣殼。
熟習此項技術者應理解，產生本發明之病毒載體通常需要使用本發明之質體以及提供正確的病毒包裝及活力所需之元件之額外質體(例如對於AAV，提供適宜AAV rep基因、cap基因及其他基因(例如E2A及E4)之質體)。產生細胞株中彼等質體之組合產生病毒載體。然而，熟習此項技術者應理解，對於用於產生病毒載體之本發明轉移質體中之任何給定對之反向末端重複序列(例如SEQ ID NO: 7、8或9)，病毒載體中之相應序列可因ITR在重組期間採取「翻轉」或「倒轉」取向而改變。因此，轉移質體中ITR之序列不必為在自其製備之病毒載體中發現之相同序列。然而，在一些極特定實施例中，本發明之病毒載體包含SEQ ID NO: 7之核苷酸1-3139。
在另一態樣中，本發明提供含有本發明核酸載體之組合物。在一些實施例中，組合物進一步包括醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在另一態樣中，本發明提供與可操作連接至轉殖基因之SEQ ID NO: 1-6中之任一者具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 1具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 2具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 4具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 5具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 6具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 3之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 5之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 6之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 2之序列。在一些實施例中，多核苷酸具有SEQ ID NO: 1之序列。
在一些實施例中，轉殖基因係異源轉殖基因。在前述態樣之一些實施例中，轉殖基因編碼蛋白質(例如治療蛋白或報導基因蛋白)、siRNA、ASO、核酸酶(例如Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或為微小RNA。在一些實施例中，蛋白質係治療蛋白。
在一些實施例中，治療蛋白係Sox9、Sall2、Camta1、Hey2、Gata2、Hey1、Lass2、Sox10、Gata3、Cux1、Nr2f1、Hes1、Rorb、Jun、Zfp667、Lhx3、Nhlh1、Mxd4、Zmiz1、Myt1、Stat3、Barhl1、Tox、Prox1、Nfia、Thrb、Mycl1、Kdm5a、Creb314、Etv1、Peg3、Bach2、Isl1、Zbtb38、Lbh、Tub、Hmg20、Rest、Zfp827、Aff3、Pknox2、Arid3b、Mlxip、Zfp532、Ikzf2、Sall1、Six2、Sall3、Lin28b、Rfx7、Bdnf、Gfi1、Pou4f3、Myc、Ctnnb1、Sox2、Sox4、Sox11、Tead2、Atoh1或Atoh1變異體(例如具有一或多個選自由以下組成之群之胺基酸取代之Atoh1變異體：S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A及S328A/S331A/S334)。在一些實施例中，治療蛋白係Atoh1 (例如人類Atoh1)。在一些實施例中，Atoh1蛋白包含SEQ ID NO: 10之序列或其具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個)保守胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，Atoh1蛋白變異體中不超過10% (10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少)之胺基酸係保守胺基酸取代。在一些實施例中，Atoh1蛋白係由SEQ ID NO: 10之序列組成。在一些實施例中，Atoh1蛋白係由SEQ ID NO: 11之序列編碼。
在另一態樣中，本發明提供包括前述態樣及實施例中任一者之多核苷酸或核酸載體之細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞，例如VSC)。在一些實施例中，細胞係哺乳動物VSC。在一些實施例中，哺乳動物VSC係人類VSC。在一些實施例中，多核苷酸與SEQ ID NO: 1-6中之任一者具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
在另一態樣中，本發明提供藉由使哺乳動物VSC與前述態樣及實施例中任一者之核酸載體或組合物接觸在哺乳動物VSC中表現轉殖基因之方法。在一些實施例中，轉殖基因在VSC中特異性表現。在一些實施例中，哺乳動物VSC係人類VSC。
在另一態樣中，本發明提供藉由向患有前庭功能障礙或具有患上該疾病之風險之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來治療個體的方法。在一些實施例中，前庭功能障礙係暈眩、眩暈、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下、振動幻視或平衡病症。在一些實施例中，前庭功能障礙係年齡相關之前庭功能障礙、頭部創傷相關之前庭功能障礙、疾病或感染相關之前庭功能障礙或耳毒性藥物誘導之前庭功能障礙。在一些實施例中，前庭功能障礙與遺傳突變相關。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來誘導或增加個體之前庭毛細胞再生之方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來誘導或增加個體之VSC增殖之方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來誘導或增加個體之前庭毛細胞增殖之方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來誘導或增加個體之前庭毛細胞成熟之方法。在一些實施例中，前庭毛細胞係再生前庭毛細胞。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來增加個體之VSC存活之方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來增加個體之前庭毛細胞存活之方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來誘導或增加個體之前庭毛細胞神經分佈之方法。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，個體患有前庭功能障礙(例如眩暈、暈眩、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下、振動幻視或平衡病症)或具有患上該疾病之風險。
在另一態樣中，本發明提供藉由向患有雙側前庭功能低下或具有患上該疾病之風險之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來治療個體的方法。在一些實施例中，雙側前庭功能低下係耳毒性藥物誘導之雙側前庭功能低下。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，耳毒性藥物係選自由以下組成之群：胺基糖苷、抗腫瘤藥物、依他尼酸(ethacrynic acid)、呋塞米(furosemide)、水楊酸鹽及奎寧。
在另一態樣中，本發明提供藉由向患有振動幻視或具有患上該疾病之風險之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來治療個體的方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向患有雙側前庭病或具有患上該疾病之風險之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來治療個體的方法。
在另一態樣中，本發明提供藉由向患有平衡病症(例如不平衡)或具有患上該疾病之風險之個體投與有效量之本發明核酸載體或組合物來治療個體的方法。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括在投與核酸載體或組合物之前評估個體之前庭功能。在一些實施例中，該方法進一步包括在投與核酸載體或組合物之後評估個體之前庭功能。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，核酸載體或組合物係局部投與。在一些實施例中，核酸載體或組合物係投與半規管。在一些實施例中，核酸載體或組合物係經鼓室或鼓室內(例如經由經鼓室或鼓室內注射)投與。在一些實施例中，核酸載體或組合物係投與外淋巴或內淋巴，例如經由卵圓窗、圓窗或半規管(例如外半規管)，例如投與前庭支持細胞。在一些實施例中，本發明之核酸載體或組合物係投與外淋巴中。在一些實施例中，本發明之核酸載體或組合物係投與內淋巴中。在一些實施例中，本發明之核酸載體或組合物係投與卵圓窗或經由卵圓窗投與。在一些實施例中，本發明之核酸載體或組合物係投與圓窗或經由圓窗投與。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，核酸載體或組合物係以足以預防或減輕前庭功能障礙、延遲前庭功能障礙之發生、減緩前庭功能障礙之進展、改良前庭功能、增加前庭毛細胞數、增加前庭毛細胞成熟、增加前庭毛細胞增殖、增加前庭毛細胞再生、增加前庭毛細胞神經分佈、增加VSC增殖或增加VSC數之量投與。
在一些實施例中，個體係人類。
在另一態樣中，本發明提供含有本發明核酸載體或本發明組合物之套組。定義
如本文所用，「投與」係指藉由任一有效途徑提供或給予個體治療劑(例如含有可操作連接至轉殖基因之溶質載劑家族6成員14 (SLC6A14)啟動子之核酸載體)。下文闡述例示性投與途徑。
如本文所用之術語「細胞類型」係指共用基於基因表現資料在統計學上可分離之表型之細胞群。例如，常見細胞類型之細胞可共用相似之結構及/或功能特徵，例如相似之基因活化模式及抗原呈遞譜。常見細胞類型之細胞可包括自常見組織(例如上皮組織、神經組織、結締組織或肌肉組織)分離之彼等細胞及/或自常見器官、組織系統、血管或生物體中之其他結構及/或區域分離之彼等細胞。
如本文所用之術語「保守突變」、「保守取代」及「保守胺基酸取代」係指用一或多個胺基酸取代一或多個展現相似物理化學性質(例如極性、靜電荷及立體體積)之不同胺基酸。20種天然胺基酸中每一者之該等性質匯總於下表1中。表 1. 天然胺基酸之代表性物理化學性質
胺基酸 3 字母代碼 1 字母代碼 側鏈極性 生理 pH (7.4) 下之靜電特徵 立體體積 †
丙胺酸 Ala A 非極性 中性 小
精胺酸 Arg R 極性 陽離子 大
天冬醯胺 Asn N 極性 中性 中等
天冬胺酸 Asp D 極性 陰離子 中等
半胱胺酸 Cys C 非極性 中性 中等
麩胺酸 Glu E 極性 陰離子 中等
麩醯胺酸 Gln Q 極性 中性 中等
甘胺酸 Gly G 非極性 中性 小
組胺酸 His H 極性 在pH 7.4下平衡之中性及陽離子形式二者 大
異白胺酸 Ile I 非極性 中性 大
白胺酸 Leu L 非極性 中性 大
離胺酸 Lys K 極性 陽離子 大
甲硫胺酸 Met M 非極性 中性 大
苯丙胺酸 Phe F 非極性 中性 大
脯胺酸 Pro P 非極性 中性 中等
絲胺酸 Ser S 極性 中性 小
蘇胺酸 Thr T 極性 中性 中等
色胺酸 Trp W 非極性 中性 巨大
酪胺酸 Tyr Y 極性 中性 大
纈胺酸 Val V 非極性 中性 中等
† 基於A3 之體積：50-100為小，100-150為中等， 150-200為大，且＞200為巨大
根據此表應瞭解，保守胺基酸家族包括(i) G、A、V、L及I；(ii) D及E；(iii) C、S及T；(iv) H、K及R；(v) N及Q；及(vi) F、Y及W。因此，保守突變或取代係用一種胺基酸取代同一胺基酸家族之成員者(例如用Ser取代Thr或用Lys取代Arg)。
如本文所用之術語本文所述組合物、載體構築體或病毒載體之「有效量」、「治療有效量」及「足量」係指在投與個體(包括哺乳動物，例如人類)時足以實現有益或期望結果(包括臨床結果)之量，且因此「有效量」或其同義詞取決於應用其之上下文。舉例而言，在治療前庭功能障礙之上下文中，其係與未投與組合物、載體構築體或病毒載體時獲得之反應相比，足以達成治療反應之組合物、載體構築體或病毒載體之量。將對應於該量之本文所述給定組合物之量將端視多種因素而變化，例如給定劑、醫藥調配物、投與途徑、疾病或病症之類型、個體之個性(例如年齡、性別、體重)或所治療之宿主及諸如此類，但仍可以常規方式由熟習此項技術者確定。此外，如本文所用之本揭示案之組合物、載體構築體或病毒載體之「治療有效量」係與對照相比在個體中產生有益或期望結果之量。如本文所定義，本揭示案之組合物、載體構築體或病毒載體之治療有效量可容易地由熟習此項技術者藉由此項技術中已知之常規方法來確定。可調整劑量方案以提供最佳治療反應。
如本文所用之術語「內源」闡述天然存在於特定生物體(例如人類)或生物體內之特定位置(例如器官、組織或細胞，例如人類細胞，例如人類前庭支持細胞)中之分子(例如多肽、核酸或輔因子)。
如本文所用之術語「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如藉由轉錄)；(2)處理RNA轉錄物(例如藉由剪接、編輯、5′帽形成及/或3′端處理)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
如本文所用之術語「外源」闡述並非天然存在於特定生物體(例如人類)或生物體內之特定位置(例如器官、組織或細胞，例如人類細胞，例如人類前庭支持細胞)中之分子(例如多肽、核酸或輔因子)。外源材料包括自生物體之外部來源或自其提取之培養物提供之彼等材料。
如本文所用之術語「外顯子」係指基因編碼區內之區域，其核苷酸序列決定相應蛋白質之胺基酸序列。術語外顯子亦指RNA之自基因轉錄之相應區域。外顯子轉錄成前mRNA，且可包括在成熟mRNA中，此端視基因之選擇式剪接而定。在處理後包括在成熟mRNA中之外顯子轉譯成蛋白質，其中外顯子之序列決定蛋白質之胺基酸組成。
如本文所用之術語「異源」係指非天然元件之組合。舉例而言，異源轉殖基因係指並非由與其可操作連接之啟動子天然表現之轉殖基因。
如本文所用之術語「增加」及「減少」係指調節分別產生度量之功能、表現或活性相對於參照更大或更小之量。舉例而言，在本文所述之方法中投與組合物後，個體中如本文所述度量(例如轉殖基因表現)之標記物之量相對於投與前標記物之量可增加或減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%或更大。通常，度量係在投與後投與已具有所列舉效應時(例如在治療方案開始後至少一週、一個月、3個月或6個月)進行量測。
如本文所用之「經局部」或「局部投與」意指欲用於局部效應而非全身效應之身體特定位點處之投與。局部投與之實例係皮上、吸入、關節內、鞘內、陰道內、玻璃體內、子宮內、病灶內投與、淋巴結投與、腫瘤內投與、投與中耳或內耳及投與個體之黏膜，其中投與意欲具有局部效應而非全身效應。
如本文所用之術語「可操作連接」係指連結至第二分子之第一分子，其中該等分子如此排列以使得第一分子影響第二分子之功能。兩種分子可或可不為單個鄰接分子之一部分且可或可不為相鄰的。舉例而言，若啟動子調節相關可轉錄多核苷酸分子在細胞中之轉錄，則啟動子可操作連接至可轉錄多核苷酸分子。另外，若連結轉錄調節元件之兩部分使得一部分之轉錄活化功能不因另一部分之存在而受到不利影響，則該兩部分彼此可操作連接。兩個轉錄調節元件可藉助連接體核酸(例如間插的非編碼核酸)彼此可操作連接或可在不存在間插的核苷酸時彼此可操作連接。
如本文所用之術語「質體」係指額外DNA區段可連接至其中之染色體外環狀雙股DNA分子。質體係一種載體，其係能夠運輸與其連接之另一核酸之核酸分子。某些質體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌質體及游離型哺乳動物質體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中後整合至宿主細胞之基因體中，且由此與宿主基因體一起複製。某些質體能夠引導與其可操作連接之基因之表現。
如本文所用之術語「多核苷酸」係指核苷之聚合物。通常，多核苷酸係由天然存在於藉由磷酸二酯鍵連結之DNA或RNA中之核苷(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)組成。該術語涵蓋包含含有經化學或生物修飾之鹼基、經修飾主鏈等之核苷或核苷類似物之分子，無論是否發現於天然核酸中，且該等分子對於某些應用可為較佳的。當此應用係關於多核苷酸時應理解，提供DNA、RNA及在每一情形下單股及雙股形式(及每一單股分子之補體)。如本文所用之「多核苷酸序列」可指多核苷酸材料自身及/或生物化學表征特定核酸之序列資訊(即用作鹼基之縮寫之字母串)。除非另有指示，否則本文所呈現之多核苷酸序列係以5'至3’方向呈現。
如本文所用之術語「啟動子」係指DNA上由RNA聚合酶結合之識別位點。聚合酶驅動轉殖基因之轉錄。
相對於參照多核苷酸或多肽序列之「序列一致性百分比」定義為在比對序列及引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，候選序列中與參照多核苷酸或多肽序列中之核酸或胺基酸一致之核酸或胺基酸之百分比。出於確定核酸或胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2或Megalign軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何演算法。舉例而言，序列一致性百分比值可使用序列比較電腦程式BLAST來產生。作為說明，給定核酸或胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或針對(against)給定核酸或胺基酸序列B之序列一致性% (替代地可表達為相對於、與或針對給定核酸或胺基酸序列B具有一定序列一致性%之給定核酸或胺基酸序列A)計算如下： 100 × (分數X/Y) 其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式(例如BLAST)評定為一致性匹配之核苷酸或胺基酸之數量，且其中Y係B中核酸之總數。應瞭解，當核酸或胺基酸序列A之長度不等於核酸或胺基酸序列B之長度時，A相對於B之序列一致性%將不等於B相對於A之序列一致性%。
如本文所用之術語「醫藥組合物」係指含有治療劑、視情況地與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑組合之混合物，欲投與個體(例如哺乳動物，例如人類)來預防、治療或控制侵襲或可能侵襲個體之特定疾病或病狀。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受」係指適於與個體(例如哺乳動物，例如人類)之組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應及其他問題併發症且與合理益處/風險比相稱之彼等化合物、材料、組合物及/或劑量形式。
如本文所用之術語「轉錄調節元件」係指至少部分地控制相關基因之轉錄之核酸。轉錄調節元件可包括啟動子、增強子及控制或幫助控制基因轉錄之其他核酸(例如多聚腺苷酸化信號)。轉錄調節元件之實例闡述於例如Lorence，Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Humana Press，New York，NY，2012)中。
如本文所用之術語「轉染」係指常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之眾多種技術中之任一者，例如電穿孔、脂轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE聚葡萄糖轉染、Nucleofection、擠壓穿孔、聲致穿孔、光學轉染、磁性轉染、刺穿轉染及諸如此類。
如本文所用之術語「個體」及「患者」係指動物(例如哺乳動物，例如人類)。欲根據本文所述之方法治療之個體可為已經診斷患有前庭功能障礙(例如眩暈、暈眩或不平衡)之個體或具有患上該等病狀之風險之個體。診斷可藉由此項技術中已知之任一方法或技術來實施。熟習此項技術者應理解，欲根據本揭示案治療之個體可能已經受標準測試或可能在無檢查之情況下已經鑒別為因存在一或多種與疾病或病狀相關之風險因子而具有風險之個體。
如本文所用之術語「轉導(transduction)」及「轉導(transduce)」係指將載體構築體或其一部分引入細胞中之方法。其中載體構築體含於病毒載體(例如AAV載體)中，轉導係指用病毒感染細胞並隨後將載體構築體或其一部分轉移及整合至細胞基因體中。
如本文提及疾病或病狀所用之「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指用於獲得有益或期望結果(例如臨床結果)之方法。有益或期望結果可包括(但不限於)緩和或改善一或多種症狀或病狀；降低疾病或病狀之程度；穩定(即不惡化)疾病、病症或病狀之狀態；防止疾病或病狀之擴散；延遲或減緩疾病或病狀之進展；改善或減輕疾病或病狀；及緩解(無論部分或完全)，無論可偵測或不可偵測。「改善」或「減輕」疾病或病狀意指無治療時之程度或時程相比，減小疾病、病症或病狀之程度及/或不期望臨床表現及/或減緩或延長進展之時程與。「治療」亦可意指與未接受治療時之預期存活相比提供存活。需要治療之彼等包括已患有病狀或病症之彼等以及易患病狀或病症之彼等或欲預防病狀或病症之彼等。
如本文所用之術語「載體」包括核酸載體，例如DNA載體，例如質體、黏粒或人工染色體、RNA載體、病毒或任何其他適宜複製子(例如病毒載體)。已開發出多種載體用於將編碼外源蛋白質之多核苷酸遞送至原核或真核細胞中。該等表現載體之實例闡述於例如Gellissen，Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems (John Wiley & Sons，Marblehead，MA，2006)。適用於本文所述組合物及方法之表現載體含有多核苷酸序列以及例如用於表現蛋白質及/或將該等多核苷酸序列整合至哺乳動物細胞之基因體中之額外序列元件。可用於表現如本文所述轉殖基因之某些載體包括含有引導基因轉錄之調節序列(例如啟動子及增強子區域)之載體。可用於表現轉殖基因之其他載體含有增強轉殖基因之轉譯速率或改良源自基因轉錄之mRNA之穩定性或核輸出之多核苷酸序列。該等序列元件包括例如5’及3’非轉譯區及引導表現載體上所攜帶基因之有效轉錄之多聚腺苷酸化信號位點。適用於本文所述組合物及方法之表現載體亦可含有編碼用於選擇含有該載體之細胞之標記物之多核苷酸。適宜標記物之實例包括編碼抗生素(例如胺苄青黴素(ampicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、康黴素(kanamycin)或諾爾斯菌素(nourseothricin))抗性之基因。
如本文所用之術語「前庭支持細胞」及「VSC」係指內耳之前庭系統中參與前庭毛細胞發育、存活、功能、死亡及吞噬作用之特化上皮細胞之集合。VSC藉由將前庭毛細胞錨定在感覺上皮中並釋放對於毛細胞神經分佈至關重要之神經營養因子為該等前庭毛細胞提供結構支持。
如本文所用之術語「前庭支持細胞特異性表現」及「VSC特異性表現」係指與內耳之其他細胞類型(例如前庭毛細胞、耳蝸毛細胞、耳蝸支持細胞、神經膠質或其他內耳細胞類型)相比，主要在前庭支持細胞內產生RNA轉錄物或多肽。轉殖基因之VSC表現可藉由使用任一標準技術(例如定量RT PCR、免疫組織化學、西方墨點法分析(western blot analysis)或量測可操作連接至啟動子之報導基因(例如GFP)之螢光)比較內耳之各種細胞類型之間(例如VSC對非VSC細胞)之轉殖基因表現(例如RNA或蛋白質表現)來確認。與以下內耳細胞類型中之至少3者(例如3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者或更多者)相比，在VSC中VSC特異性啟動子誘導之與其可操作連接之轉殖基因之表現(例如RNA或蛋白質表現)大至少50% (例如大50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%或更大)：前庭神經節細胞、前庭器官之非感覺上皮細胞、前庭器官之暗細胞、前庭器官之間葉細胞、螺旋神經節細胞、邊緣細胞、內指細胞、內柱細胞、外柱細胞、第一列戴特氏細胞(first row Deiter cell)、第二列戴特氏細胞、第三列戴特氏細胞、亨森氏細胞(Hensen’s cell)、克勞氏細胞(Claudius cell)、內溝細胞、外溝細胞、螺旋突細胞、足細胞、齒間細胞、血管紋基底細胞、血管紋中間細胞、血管紋緣細胞、內毛細胞、外毛細胞、前庭毛細胞及施旺氏細胞(Schwann cell)。
如本文所用之術語「野生型」係指在給定生物體中具有特定基因之最高頻率之基因型。
本文闡述用於特異性誘導轉殖基因在內耳之前庭支持細胞(VSC)中之表現之組合物及方法。本發明之特征在於多核苷酸，其含有溶質載劑家族6成員14 (SLC6A14)啟動子之能夠在VSC中特異性表現轉殖基因之區域。本發明之特征亦在於核酸載體，其含有可操作連接至編碼多肽之多核苷酸之該等啟動子。本文所述之組合物及方法可用於在VSC中表現編碼蛋白質(例如治療蛋白、報導基因蛋白或其他相關蛋白質)之多核苷酸，該等蛋白質向前庭毛細胞提供結構及營養支持，且因此可將本文所述之組合物投與個體(例如哺乳動物個體，例如人類)來治療由前庭毛細胞之功能障礙引起之病症，例如源自前庭功能障礙之平衡病症。支持細胞
前庭系統之支持細胞係駐留於內耳中之特化上皮細胞。VSC構成介導正常前庭功能所需之關鍵結構、發育及營養活性之一類解剖學及形態學均一之細胞。VSC位於內耳之橢圓囊、小囊及半規管中且用作前庭毛細胞之結構錨，該等前庭毛細胞係外周前庭系統之主要感覺細胞，參與有助於平衡及空間定向感之運動感覺。突觸形成至前庭耳蝸神經之毛細胞上係由VSC分泌之神經營養因子來介導，由此有助於建立及維持適當的前庭功能。此外，VSC藉助其控制細胞外及細胞內鈣信號傳導並形成吞噬細胞多細胞結構(稱為吞噬體)用作前庭毛細胞存活、死亡及吞噬細胞清除之重要介導劑，該等吞噬細胞多細胞結構藉由去除已死亡之毛細胞或正在死亡之毛細胞來維持感覺上皮之完整性。前庭毛細胞損傷及破壞前庭毛細胞功能之遺傳突變與前庭功能障礙(例如平衡缺失及暈眩(例如眩暈))相關。基因療法最近已成為用於治療前庭功能障礙之有吸引力之方法；然而，該領域缺少使用於基因療法中之核酸載體靶向前庭系統之支持細胞之方法。
本發明部分地基於SLC6A14在內耳VSC中特異性表現之發現。SLC6A14係編碼鈉及氯依賴性神經傳遞質運輸蛋白之基因，該鈉及氯依賴性神經傳遞質運輸蛋白能夠以先前尚未鑒別為在內耳中表現之鈉及氯依賴性方式運輸中性及帶正電之胺基酸。本文所揭示之SLC6A14啟動子序列以VSC特異性方式誘導內耳中之基因表現。因此，本文所述之組合物及方法可用於在VSC中表現相關基因(例如在患有前庭功能障礙之個體中，參與前庭毛細胞發育、前庭毛細胞命運特化、前庭毛細胞再生、前庭毛細胞及/或VSC增殖、前庭毛細胞神經分佈或前庭毛細胞成熟之基因或已知被破壞、例如突變之基因)以治療患有前庭功能障礙(例如暈眩、眩暈或平衡缺失)或具有患上該疾病之風險之個體。
本文所述之組合物及方法包括表2中所示之SLC6A14啟動子(例如SEQ ID NO: 1-6中之任一者)，其能夠在VSC或其變異體(例如與表2中所列出之多核苷酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中之任一者)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之核酸序列)中特異性表現轉殖基因。本文所述之多核苷酸可包括位於SLC6A14基因之轉譯起始位點(TSS)上游及下游之區域或僅可包括SLC6A14基因之上游區域。
前述核酸序列匯總於下表2中。表 2 ： SLC6A14 啟動子序列
SEQ ID NO ： 啟動子序列之描述 啟動子序列
1 含有位於人類SLC6A14基因之轉譯起始位點(TSS)之-2 kb至+0.5 kb之多核苷酸之人類SLC6A14啟動子序列#1 (人類啟動子#1) GATACTAAAAAGGCAGGCAGGAGCCAGGTCATGAAAAGCAAAGCATGGTAATGGGAATAATCCTACCCCCCCCCACCCCGAAACAGAAGTATATTATCTAAAATCGATCTCACATTTTATGTGTTAAATGCTCCAACTCTCAAAGGTGATAGAAACTTTACTGCATAACAGGCAGGGAAAATTGGCCCCCCTGTATAACAGATACCCTTGCCTTGTGATATGTTTGGGCTTTGTGCCCCCACCCAAATTTTATCTTAAATTGTAGTTCCCATGATCCCCACGTGTGATGGAAGGGACCCAGTGGTATGTCATTGAAACATGGGGTGGTTACCCCCATGCTGTTCTCGTGATAGTGAGTAAATTCTCACAAGATCTGATGGTTATATAAGGGACTTTTCTCCCTTTGCTTGGCACTTCTTTCTCCTGCTGCCATGTGAATAAGGACGTGTTTGCTTTCCCTTCCACCATGATTGTAAGTTTCCCAAGGCCTCCCCAGCCACGTGGAACTGTTAATCAATTAAACCTCTTTCCTTTATAAATTACCTAGTCTCGAGCAATTCTTCATAGCAGCATGAGAACGAACTAATACACCTTGTGATTCCCATAATCTCTCTATCCTTAGGATTCCTGTCTTCTTTCTATTTCCTTGGTTACCAATTGTTTGACGTGCCCCAAGGTTGGCTTCTTTCATTTATATGGGACTTTGATCGTTTAGTAAATGCTATTGGATTTGCTTTTTAGCTCATCCTTTTATAAGGAGGTTTATAAGCCCTTCTTGCTCCTCTCCCTTCTATGTTTAATCTTAGCCTTTAGGTCATACCAGTAGTGTACAGTACTAATAGGCACACACTCATGCATTAGCACTCTCCATCCCCCAATTCCCCATTGATACATGCACATGTGCACACACACACACATGCACATCAGCCTTTGTTATGTTCAAGACAAAGTTAAATAAAACTTATTGATACTTTCCTTACTACCATCCTACATCTTTCATGGACTTTTCTCTACCTTACCTGCCAAGATTCCCCAGGGCATATTTCTATTGCAAATGGAAAATTCTTGCAGTCAGTGGAGAACAAAGGAGCTATACATAGGGTACAGAATTTGCCTATTTGCTCATTCCTCTGTGTGCATGAATTTGTGCTTTGCTTCATAGAACCACCATCACTATCTGTTACCTGGGCAGACTGAGTTTAAATCCTTTGAGTTTCCTGATGAAAAGGCATTCCATTGGTAAACAGCATTATAATAATTATTTCCTCCCTGGTCAAGCTGGGATGTTTCCTCATAGTTTACTTTCTAGGCCTCATCTTTCTTACAGACTGTGCTCCTTTGTTAAGGTTAGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCCTGTAAAAGGCAAAGCTGTCCTGAAGGCTGAGAAAGGAGCCTGAGACATAGGCTCCAAGTTGCTCTTTTCAGGCAGAGCCAGCTGGGTAATCTTATCTCAGATGGCTGCTTTTCAAGGTGCCCAATTCAGGGGCTTTTCCTCTGGGAGCAGCATTTGCCCCAGGGAATCAAGTGCTTTCTAGTCAGGGGCAAAACTTTGGGAAATCTGAGGACCCAGGGTGGTATGGTCTGTTCAGGAGAATTTTGGGGAACAGAATGGCCCCCTTCTCCCTCCAGCACTTGTACAGATCAGCACTTGGCCCCAGAACAGAGACCAGACTGAGAGACGAGGTTAGGAGGAAACAGGGGACCCAGGAAAGGCGGCTAGATTGCAAACGTACCTACACAGCTCTGAGTCAAAGGCTGTCAGTCATCTCGGCTCAGACTGCTCTGCTCTCCAGCAGCCCAGCCCTTTCCCAGGGCTGGGGCAGGAGATTGCTACATGTAGGCTTATCTGGGGAAAAACCAGAGCCTCACTTTAGTCCCTTCCGGTAATTGACACTACTGGACACCCAGGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCTCTTCATAAATGTTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCGGAGCCAGCCGAGGGAGTGAACCATGGACAAGTTGAAATGCCCGAGTTTCTTCAAGTGCAGGGAGAAGGAGGTAGGGGTCTGGGAGCTGCGGGAGGTGTGGAGGACCTGAGAGTGGAAAACTTAAGGGGGGTTGCTAGTCTCAGTTTTTGCTTTCTGTGGCTGTTCCTTGTGCTCCACATTTCTGTTCAACTATTAGGTGTGACTGAGATATACCTATAGAGTAGAGAAGAAAGAAAAGCTCTTACTCTCATAGCTAGAAGACTTAGGGCCACCTCATCCTCTGCCTTGGGAGTACCCACAAAATCCTGTTCTCTATCCCTCTCCTAACTGTGTCCACATGCTAGAGGAAAGTACAAAAGTACACTGTTCTTAATTGACCCAAAGAACCCTC
2 含有人類啟動子#1 (SEQ ID NO: 1)之在哺乳動物物種中保守之區域之人類SLC6A14啟動子序列#2 ACTTTTCTCTACCTTACCTGCCAAGATTCCCCAGGGCATATTTCTATTGCAAATGGAAAATTCTTGCAGTCAGTGGAGAACAAAGGAGCTATACATAGGGTACAGAATTTGCCTATTTGCTCATTCCTCTGTGTGCATGAATTTGTGCTTTGCTTCATAGAAGTTTCCTGATGAAAAGGCATTCCATTGGTAAACAGCATTATAATAATTATTTCCTCCCTGGTCAAGCTGGGATGTTTCCTCATAGTTTACTTTCTAGGCCTCATCTTTCTTACAGACTGTGCTCCTTTGTTAAGGTTAGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCCTGTAAAAGGCAAAGCTGTCCTGAAGGCTGAGAAAGGAGCCTGAGACATAGGCTCCAAGTTGCTCTTTTCAGGCAGAGCCAGCTGGGTAATCTTATCTCAGATGGCTGCTTTTCAAGGTGCCCAATTCAGGGGCTTTTCCTCTGGGAGCAGCATTTGCCCCAGGGAATCAAGTGCTTTCTAGTCAGGGGCAAAACTTTGGGAAATCTGAGGACCCAGGGTGGTATGGTCTGTTCAGGAGAATTTTGGGGAACAGAATGGCCCCCTTCTCCCTCCAGCACTTGTACAGATCAGCACTTGGCCCCAGAACAGAGACCAGACTGAGAGACGAGGTTAGGAGGAAACAGGGGACCCAGGAAAGGCGGCTAGATTGCAAACGTACCTACACAGCTCTGAGTCAAAGGCTGTCAGTCATCTCGGCTCAGACTGCTCTGCTCTCCAGCAGCCCAGCCCTTTCCCAGGGCTGGGGCAGGAGATTGCTACATGTAGGCTTATCTGGGGAAAAACCAGAGCCTCACTTTAGTCCCTTCCGGTAATTGACACTACTGGACACCCAGGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCTCTTCATAAATGTTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCGGAGCCAGCCGAGGGAGTGAACCATGGACAAGTTGAAATGCCCGAGTTTCTTCAAGTGCAGGGAGAAGGAGGTAGGGGTCTGGGAGCTGCGGGAGGTGTGGAGGACCTGAGAGTGGAAAACTTAAGGGGGGTTGCTAGTCTCAGTTTTTGCTTTCTGTGGCTGTTCCTTGTGCTCCACATTTCTGTTCAACTATTAGGTGTGACTGAGATATACCTATAGAGTAGAGAAGAAAGAAAAGCTCTTACTCTCATTCCCTCTCCTAACTGTGTCCACATGCTAGAGGAAAGTACAAAAGTACACTGTTCTTAATTGACCCAAAGAACCCTCCATACCCCAGAGAAGTGAGCAGGTTGGGA
3 人類SLC6A14啟動子序列#3 ACCTGGGCAGACTGAGTTTAAATCCTTTGAGTTTCCTGATGAAAAGGCATTCCATTGGTAAACAGCATTATAATAATTATTTCCTCCCTGGTCAAGCTGGGATGTTTCCTCATAGTTTACTTTCTAGGCCTCATCTTTCTTACAGAGTGTGCTCCTTTGTTAAGGTTAGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCCTGTAAAAGGCAAAGCTGTCCTGAAGGCTGAGAAAGGAGCCTGAGACATAGGCTCCAAGTTGCTCTTTTCAGGCAGAGCCAGCTGGGTAATCTTATCTCAGATGGCTGCTTTTCAAGGTGCCCAATTCAGGGGCTTTTCCTCTGGGAGCAGCATTTGCCCCAGGGAATCAAGTGCTTTCTAGTCAGGGGCAAAACTTTGGGAAATCTGAGGACCCAGGGTGGTATGGTCTGTTCAGGAGAATTTTGGGGAACAGAATGGCCCCCTTCTCCCTCCAGCACTTGTACAGATCAGCACTTGGCCCCAGAACAGAGACCAGACTGAGAGGCGAGGTTAGGAGGAAACAGGGGACCCAGGAAAGGCGGCTAGATTGCAAACGTACCTACACAGCTCTGAGTCAAAGGCTGTCAGTCATCTCGGCTCAGACTGCTCTGCTCTCCAGCAGCCCAGCCCTTTCCCAGGGCTGGGGCAGGAGATTGCTACATGTAGGCTTATCTGGGGAAAAACCAGAGCCTCACTTTAGTCCCTTCCGGTAATTGACACTACTGGACACCCAGGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCTCTTCATAAATGTTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCGGAGCCAGCCGAGGGAGTGAACC
4 人類SLC6A14啟動子序列#4 AAGCTGGGATGTTTCCTCATAGTTTACTTTCTAGGCCTCATCTTTCTTACAGAGTGTGCTCCTTTGTTAAGGTTAGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCCTGTAAAAGGCAAAGCTGTCCTGAAGGCTGAGAAAGGAGCCTGAGACATAGGCTCCAAGTTGCTCTTTTCAGGCAGAGCCAGCTGGGTAATCTTATCTCAGATGGCTGCTTTTCAAGGTGCCCAATTCAGGGGCTTTTCCTCTGGGAGCAGCATTTGCCCCAGGGAATCAAGTGCTTTCTAGTCAGGGGCAAAACTTTGGGAAATCTGAGGACCCAGGGTGGTATGGTCTGTTCAGGAGAATTTTGGGGAACAGAATGGCCCCCTTCTCCCTCCAGCACTTGTACAGATCAGCACTTGGCCCCAGAACAGAGACCAGACTGAGAGGCGAGGTTAGGAGGAAACAGGGGACCCAGGAAAGGCGGCTAGATTGCAAACGTACCTACACAGCTCTGAGTCAAAGGCTGTCAGTCATCTCGGCTCAGACTGCTCTGCTCTCCAGCAGCCCAGCCCTTTCCCAGGGCTGGGGCAGGAGATTGCTACATGTAGGCTTATCTGGGGAAAAACCAGAGCCTCACTTTAGTCCCTTCCGGTAATTGACACTACTGGACACCCAGGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCTCTTCATAAATGTTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCG
5 鼠類SLC6A14啟動子序列#1 AACCTGGCTTGTTTCCTTACAGTTTACTTTCTAGGCCTCGCCTTTCTCACAGAGTGAAGTCCTTTGTTAAGGTTCGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCTTGTAAAAGGCAAAACTATTCCGAAGGCTGAGAAAGGAGCTCCAGGACATAGATTCAAAGTCGCTCTTTTCAGGTAGAGACAGCTGGGTAATCTTATCTTAACTGGCTACATTTCAAGGTTCCCAATTCAGGGGCTTTCCCCTCTGGGAGCAGCATTCTCTCCGGGTGATGAAGAGCTTTCTAGTGAGGAGCAAAACTTTCAGAAAACCGGAGGGCCCAGAGCAGTCTGGTCTGTTCACAAAAATTATAGCAAACAAAATAAGCCCGGCGGATTGGGTCTCTCCTACCTCCAGCACCAGGGGAGATCAGCACTTGGCCCCAGGACAGAGACCTGAGAAGTGAGGTTTGGAAGAAGCCAGGAATCCAGGAAAGGAGGCAAGATTGCTAAGGCACCGGCACAGCTCTGAGTCAAAAGTTGTCAGTCTTCTTTGGCTCTGGCTGCGGAGCTCAATTGCTCACAGCCCTGCCCTTTCCTAGGGCTGGGGCAAGGAATTGCTACATTCAGGATTACCTGGGGGAAAAACCAGAGGCTTGCTTTGGTCCCTTCCGGTAATTGAAAGGACTGGCCGTCAGCGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCCCTCCATAAATGGTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTTTGGCAGGTAGCAACCGGGGAGTGTGCACCTGCCACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGTGAGAAGAGGAGAGGCG
6 鼠類SLC6A14啟動子序列#2 GTAGAATATAAATAACATACAGTAGAATTTAATGCAAGATTGTTTTATTGTTGCAAAAATAATGCTTTTTATACTTTGTGAATTGTTAAGGTAGGCCCAATAAGAACATGAAACTAACCAAGGCGACCCACAGAGCGAAAGAAAATGAATTGCACAATACTCTAGTAATGTGGAAACAGCTTTTCAGTTACACCACTTTAACTTACTTGAGCTTACAGGTTCTGTTAGAAGTATTGAGGTGACATGTGCCTGTATTACATAATTGAATACCATTGAAATTTTGCCAGTATAATTATTTTTCTCTTGGCACAATAGGATTTTGTGTGGTGATGTTTCAACCACATATCTTGTTAATTGAGTGATCAGCACTTGGCCCCAGGACAGAGACCTGAGAAGTGAGGTTTGGAAGAAGCCAGGAATCCAGGAAAGGAGGCAAGATTGCTAAGGCACCGGCACAGCTCTGAGTCAAAAGTTGTCAGTCTTCTTTGGCTCTGGCTGCGGAGCTCAATTGCTCACAGCCCTGCCCTTTCCTAGGGCTGGGGCAAGGAATTGCTACATTCAGGATTACCTGGGGGAAAAACCAGAGGCTTGCTTTGGTCCCTTCCGGTAATTGAAAGGACTGGCCGTCAGCGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCCCTCCATAAATGGTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTTTGGCAGGTAGCAACCGGGGAGTGTGCACCTGCCACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGTGAGAAGAGGAGAGGCG
外源核酸在哺乳動物細胞中之表現
本文所述之組合物及方法可用於藉由投與含有可操作連接至編碼相關蛋白質之核酸序列之SLC6A14啟動子(例如與SLC6A14啟動子之序列(例如SEQ ID NO: 1-6中之任一者)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)之核酸載體，誘導或增加由相關基因(例如參與前庭功能障礙之基因之野生型形式，或參與前庭毛細胞發育、前庭毛細胞命運特化、前庭毛細胞再生、前庭毛細胞及/或VSC增殖、前庭毛細胞神經分佈或前庭毛細胞成熟之基因)編碼之蛋白質在VSC中之表現。已建立將蛋白質遞送至哺乳動物細胞及在哺乳動物細胞中穩定表現編碼蛋白質之基因之眾多種方法。可與本文所述之組合物結合表現(例如當編碼蛋白質之轉殖基因可操作連接至SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)之蛋白質係在健康VSC中表現之蛋白質(例如在前庭毛細胞發育、前庭毛細胞命運特化、前庭毛細胞再生、前庭毛細胞及/或VSC增殖、前庭毛細胞神經分佈或前庭毛細胞成熟中起作用之蛋白質，或在患有前庭功能障礙之個體中缺失之蛋白質)或其他相關蛋白質。可使用本文所述之組合物及方法在VSC中表現之蛋白質包括婆羅雙樹樣轉錄因子2 (Sall2)、攜鈣蛋白結合轉錄活化劑1 (Camta1)、具有YRPW基序2之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey2)、Gata結合蛋白2 (Gata2)、具有YRPW基序1之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey1)、神經醯胺合酶2 (Lass2)、SRY框10 (Sox10)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、Cut樣同源異形框1 (Cux1)、核受體亞家族2族F成員(Nr2f1)、Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hes1)、RAR相關孤兒受體B (Rorb)、Jun原癌基因AP-1轉錄因子次單元(Jun)、鋅指蛋白667 (Zfp667)、LIM同源異形框3 (Lhx3)、無義螺旋-環-螺旋1 (Nhlh1)、MAX二聚化蛋白4 (Mxd4)、MIZ1型鋅指(Zmiz1)、髓磷脂轉錄因子1 (Myt1)、信號轉導子及轉錄活化劑3 (Stat3)、BarH樣同源異形框1 (Barhl1)、胸腺細胞選擇相關之高遷移率族蛋白框(Tox)、Prospero同源異形框1 (Prox1)、核因子I A (Nfia)、甲狀腺激素受體β (Thrb)、MYCL原癌基因BHLH轉錄因子(Mycl1)、離胺酸去甲基酶5A (Kdm5a)、CAMP反應元件結合蛋白3反應元件樣4 (Creb3I4)、ETS變異體1 (Etv1)、父系表現之3 (Peg3)、BTB結構域及CNC同系物2 (Bach2)、ISL LIM同源異形框1 (Isl1)、鋅指及含BTB結構域之38 (Zbtb38)、肢芽及心臟發育(Lbh)、桶狀家族二分轉錄因子(Tub)、泛素C (Hmg20)、RE1沈默轉錄因子(Rest)、鋅指蛋白827 (Zfp827)、AF4/FMR2家族成員3 (Aff3)、PBX/有節的1同源異形框2 (Pknox2)、富含AT之相互作用結構域3B (Arid3b)、MLX相互作用蛋白(Mlxip)、鋅指蛋白(Zfp532)、IKAROS家族鋅指2 (Ikzf2)、婆羅雙樹樣轉錄因子1 (Sall1)、SIX同源異形框2 (Six2)、婆羅雙樹樣轉錄因子3 (Sall3)、Lin-28同系物B (Lin28b)、調節因子X7 (Rfx7)、腦源性神經營養因子(Bdnf)、非生長因子依賴性1轉錄抑制子(Gfi1)、POU 4類同源異形框3 (Pou4f3)、MYC原癌基因BHLH轉錄因子(Myc)、β-連環蛋白(Ctnnb1)、SRY框2 (Sox2)、SRY框4 (Sox4)、SRY框11 (Sox11)、TEA結構域轉錄因子2 (Tead2)、無調BHLH轉錄因子1 (Atoh1)及在胺基酸328、331及/或334處含有取代(例如S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A及S328A/S331A/S334)之Atoh1變異體。本文所述之多核苷酸(例如SLC6A14啟動子)亦可用於在VSC中表現短干擾RNA (siRNA)、反義寡核苷酸(ASO)、核酸酶(例如CRISPR相關蛋白9 (Cas9)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)或嚮導RNA(gRNA))或微小RNA。
在一些實施例中，使用本文所述之組合物及方法在VSC中表現之蛋白質係Atoh1。SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)可操作連接至編碼野生型Atoh1或其變異體之多核苷酸序列，例如編碼與野生型哺乳動物(例如人類或小鼠) Atoh1之胺基酸序列(例如SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12)具有至少85%序列一致性(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之蛋白質之多核苷酸序列。例示性Atoh1胺基酸及多核苷酸序列列於下表3中。
在一些實施例中，編碼Atoh1蛋白之多核苷酸序列編碼相對於SEQ ID NO: 10含有一或多個保守胺基酸取代(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個保守胺基酸取代)之胺基酸序列，條件係編碼之Atoh1類似物保留野生型Atoh1之治療功能(例如促進毛細胞發育之能力)。Atoh1蛋白中不超過10%之胺基酸可用保守胺基酸取代來替代。在一些實施例中，編碼Atoh1之多核苷酸序列係因遺傳密碼之冗餘性而編碼SEQ ID NO: 10之任一多核苷酸序列。編碼Atoh1之多核苷酸序列可經部分或完全密碼子最佳化用於表現(例如在人類VSC中)。Atoh1可由具有SEQ ID NO: 11之序列之多核苷酸編碼。Atoh1蛋白可為人類Atoh1蛋白或可為來自另一哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、牛、馬、山羊、綿羊、驢、貓、犬、兔、天竺鼠或其他哺乳動物)之人類Atoh1蛋白之同系物。表 3 ： Atoh1 序列
SEQ ID NO ： 啟動子序列之描述 序列
10 人類Atoh1胺基酸序列，RefSeq登錄號NP_005163.1 MSRLLHAEEWAEVKELGDHHRQPQPHHLPQPPPPPQPPATLQAREHPVYPPELSLLDSTDPRAWLAPTLQGICTARAAQYLLHSPELGASEAAAPRDEVDGRGELVRRSSGGASSSKSPGPVKVREQLCKLKGGVVVDELGCSRQRAPSSKQVNGVQKQRRLAANARERRRMHGLNHAFDQLRNVIPSFNNDKKLSKYETLQMAQIYINALSELLQTPSGGEQPPPPPASCKSDHHHLRTAASYEGGAGNATAAGAQQASGGSQRPTPPGSCRTRFSAPASAGGYSVQLDALHFSTFEDSALTAMMAQKNLSPSLPGSILQPVQEENSKTSPRSHRSDGEFSPHSHYSDSDEAS
11 人類ATOH1蛋白編碼序列，亦記載於 RefSeq登錄號NM_005172.2下 ATGTCCCGCCTGCTGCATGCAGAAGAGTGGGCTGAAGTGAAGGAGTTGGGAGACCACCATCGCCAGCCCCAGCCGCATCATCTCCCGCAACCGCCGCCGCCGCCGCAGCCACCTGCAACTTTGCAGGCGAGAGAGCATCCCGTCTACCCGCCTGAGCTGTCCCTCCTGGACAGCACCGACCCACGCGCCTGGCTGGCTCCCACTTTGCAGGGCATCTGCACGGCACGCGCCGCCCAGTATTTGCTACATTCCCCGGAGCTGGGTGCCTCAGAGGCCGCTGCGCCCCGGGACGAGGTGGACGGCCGGGGGGAGCTGGTAAGGAGGAGCAGCGGCGGTGCCAGCAGCAGCAAGAGCCCCGGGCCGGTGAAAGTGCGGGAACAGCTGTGCAAGCTGAAAGGCGGGGTGGTGGTAGACGAGCTGGGCTGCAGCCGCCAACGGGCCCCTTCCAGCAAACAGGTGAATGGGGTGCAGAAGCAGAGACGGCTAGCAGCCAACGCCAGGGAGCGGCGCAGGATGCATGGGCTGAACCACGCCTTCGACCAGCTGCGCAATGTTATCCCGTCGTTCAACAACGACAAGAAGCTGTCCAAATATGAGACCCTGCAGATGGCCCAAATCTACATCAACGCCTTGTCCGAGCTGCTACAAACGCCCAGCGGAGGGGAACAGCCACCGCCGCCTCCAGCCTCCTGCAAAAGCGACCACCACCACCTTCGCACCGCGGCCTCCTATGAAGGGGGCGCGGGCAACGCGACCGCAGCTGGGGCTCAGCAGGCTTCCGGAGGGAGCCAGCGGCCGACCCCGCCCGGGAGTTGCCGGACTCGCTTCTCAGCCCCAGCTTCTGCGGGAGGGTACTCGGTGCAGCTGGACGCTCTGCACTTCTCGACTTTCGAGGACAGCGCCCTGACAGCGATGATGGCGCAAAAGAATTTGTCTCCTTCTCTCCCCGGGAGCATCTTGCAGCCAGTGCAGGAGGAAAACAGCAAAACTTCGCCTCGGTCCCACAGAAGCGACGGGGAATTTTCCCCCCATTCCCATTACAGTGACTCGGATGAGGCAAGT
12 鼠類Atoh1胺基酸序列，UniProt P48985    MSRLLHAEEWAEVKELGDHHRHPQPHHVPPLTPQPPATLQARDLPVYPAELSLLDSTDPRAWLTPTLQGLCTARAAQYLLHSPELGASEAAAPRDEADSQGELVRRSGCGGLSKSPGPVKVREQLCKLKGGVVVDELGCSRQRAPSSKQVNGVQKQRRLAANARERRRMHGLNHAFDQLRNVIPSFNNDKKLSKYETLQMAQIYINALSELLQTPNVGEQPPPPTASCKNDHHHLRTASSYEGGAGASAVAGAQPAPGGGPRPTPPGPCRTRFSGPASSGGYSVQLDALHFPAFEDRALTAMMAQKDLSPSLPGGILQPVQEDNSKTSPRSHRSDGEFSPHSHYSDSDEAS
13 鼠類ATOH1蛋白編碼序列，亦記載於RefSeq登錄號NM_007500.5下 ATGTCCCGCCTGCTGCATGCAGAAGAGTGGGCTGAGGTAAAAGAGTTGGGGGACCACCATCGCCATCCCCAGCCGCACCACGTCCCGCCGCTGACGCCACAGCCACCTGCTACCCTGCAGGCGAGAGACCTTCCCGTCTACCCGGCAGAACTGTCCCTCCTGGATAGCACCGACCCACGCGCCTGGCTGACTCCCACTTTGCAGGGCCTCTGCACGGCACGCGCCGCCCAGTATCTGCTGCATTCTCCCGAGCTGGGTGCCTCCGAGGCCGCGGCGCCCCGGGACGAGGCTGACAGCCAGGGTGAGCTGGTAAGGAGAAGCGGCTGTGGCGGCCTCAGCAAGAGCCCCGGGCCCGTCAAAGTACGGGAACAGCTGTGCAAGCTGAAGGGTGGGGTTGTAGTGGACGAGCTTGGCTGCAGCCGCCAGCGAGCCCCTTCCAGCAAACAGGTGAATGGGGTACAGAAGCAAAGGAGGCTGGCAGCAAACGCAAGGGAACGGCGCAGGATGCACGGGCTGAACCACGCCTTCGACCAGCTGCGCAACGTTATCCCGTCCTTCAACAACGACAAGAAGCTGTCCAAATATGAGACCCTACAGATGGCCCAGATCTACATCAACGCTCTGTCGGAGTTGCTGCAGACTCCCAATGTCGGAGAGCAACCGCCGCCGCCCACAGCTTCCTGCAAAAATGACCACCATCACCTTCGCACCGCCTCCTCCTATGAAGGAGGTGCGGGCGCCTCTGCGGTAGCTGGGGCTCAGCCAGCCCCGGGAGGGGGCCCGAGACCTACCCCGCCCGGGCCTTGCCGGACTCGCTTCTCAGGCCCAGCTTCCTCTGGGGGTTACTCGGTGCAGCTGGACGCTTTGCACTTCCCAGCCTTCGAGGACAGGGCCCTAACAGCGATGATGGCACAGAAGGACCTGTCGCCTTCGCTGCCCGGGGGCATCCTGCAGCCTGTACAGGAGGACAACAGCAAAACATCTCCCAGATCCCACAGAAGTGACGGAGAGTTTTCCCCCCACTCTCATTACAGTGACTCTGATGAGGCCAGT
編碼相關蛋白質之多核苷酸
可用於在哺乳動物細胞中達成相關蛋白質之治療有效之細胞內濃度之一個平台係經由穩定表現編碼相關蛋白質之基因(例如，藉由整合至哺乳動物細胞之核或粒線體基因體中，或藉由在哺乳動物細胞核中形成游離型多聯體)。該基因係編碼相應蛋白質之一級胺基酸序列之多核苷酸。為將外源基因引入哺乳動物細胞中，可將基因納入載體中。可藉由多種方法將載體引入細胞中，包括轉型、轉染、轉導、直接攝取、射彈轟擊及藉由將載體囊封於脂質體中。轉染或轉型細胞之適宜方法之實例包括磷酸鈣沈澱、電穿孔、顯微注射、感染、脂轉染及直接攝取。該等方法更詳細闡述於例如Green等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第4版(Cold Spring Harbor University Press，New York 2014)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons，New York 2015)，該等文獻各自之揭示內容以引用方式併入本文中。
亦可藉由使含有編碼相關蛋白質之基因之載體靶向細胞膜磷脂將相關蛋白質引入哺乳動物細胞中。舉例而言，可藉由將載體分子連接至VSV-G蛋白使載體靶向細胞膜之細胞外表面上之磷脂，該VSV-G蛋白係對所有細胞膜磷脂具有親和力之病毒蛋白。該構築體可使用熟習此項技術者所熟知之方法產生。
哺乳動物RNA聚合酶對編碼相關蛋白質之多核苷酸之識別及結合對於基因表現至關重要。因此，可在多核苷酸內包括對招募RNA聚合酶且促進轉錄複合物在轉錄起始位點組裝之轉錄因子展現高親和力之序列元件。該等序列元件包括例如哺乳動物啟動子，其序列可由特異性轉錄起始因子及最終RNA聚合酶識別及結合。哺乳動物啟動子之實例已闡述於Smith等人，Mol. Sys.Biol.，3:73在線公開案中，其揭示內容係以引用方式併入本文中。用於本文所述方法及組合物中之啟動子係SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出之多核苷酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)。
一旦將編碼相關蛋白質之多核苷酸納入哺乳動物細胞之核DNA中，便可立即藉由此項技術中已知之方法來誘導此多核苷酸之轉錄。舉例而言，可藉由使哺乳動物細胞暴露於外部化學試劑(例如調節轉錄因子及/或RNA聚合酶與哺乳動物啟動子之結合且因此調節基因表現之劑)來誘導表現。化學試劑可用於促進RNA聚合酶及/或轉錄因子與哺乳動物啟動子之結合，例如藉由移除已結合啟動子之抑制蛋白。替代地，化學試劑可用於增強哺乳動物啟動子對RNA聚合酶及/或轉錄因子之親和力，使得位於啟動子下游之基因之轉錄速率在化學試劑存在下增加。加強藉由上述機制之多核苷酸轉錄之化學試劑之實例包括四環素及去氧羥四環素。該等試劑在市面上有售(Life Technologies，Carlsbad，CA)且可根據所建立之方案投與哺乳動物細胞來促進基因表現。
可包括在用於本文所述組合物及方法中之多核苷酸中之其他DNA序列元件包括增強子序列。增強子代表另一類調節元件，其誘導含有相關基因之多核苷酸之構形變化，使得DNA採取有利於轉錄因子及RNA聚合酶在轉錄起始位點結合之三維取向。因此，用於本文所述組合物及方法中之多核苷酸包括編碼相關蛋白質且另外包括哺乳動物增強子序列之彼等多核苷酸。現自哺乳動物基因已知許多增強子序列，且實例包括來自編碼哺乳動物球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素之基因之增強子。用於本文所述組合物及方法中之增強子亦包括衍生自能夠感染真核細胞之病毒之遺傳材料之彼等增強子。實例包括在複製起點後側(bp 100-270)之SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、在複製起點後側之多瘤增強子及腺病毒增強子。誘導真核基因轉錄活化之其他增強子序列包括CMV增強子及RSV增強子。增強子可剪接至含有編碼相關蛋白質之多核苷酸之載體中，例如在此基因之位置5’或3’處。在較佳取向中，增強子定位於啟動子之5’側，該啟動子進而位於相對於編碼相關蛋白質之多核苷酸之5’。
本文所述含有SLC6A14啟動子之核酸載體可包括土撥鼠轉錄後調節元件(WPRE)。WPRE在mRNA層級上藉由促進轉錄物之核輸出及/或藉由增加新生轉錄物之多聚腺苷酸化效率、由此增加細胞中mRNA之總量起作用。將WPRE添加至載體可在活體外及活體內實質上改良來自若干不同啟動子之轉殖基因表現之水準。在本文所述之組合物及方法之一些實施例中，WPRE具有以下序列： GATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGA (SEQ ID NO: 14)。
在其他實施例中，WPRE具有以下序列： AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAA (SEQ ID NO: 15)
在一些實施例中，本文所述含有SLC6A14啟動子之核酸載體包括報導基因序列，其可用於驗證可操作連接至VSC中之SLC6A14啟動子之基因的表現。可提供於轉殖基因中之報導基因序列包括編碼β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、螢光素酶及此項技術中所熟知之其他蛋白質之DNA序列。當與驅動其表現之調節元件(例如SLC6A14啟動子)締合時，報導基因序列提供可藉由習用方法偵測到之信號，該等習用方法包括酶、放射照相、比色、螢光或其他光譜分析、螢光活化細胞分選分析及免疫分析，包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)及免疫組織化學。舉例而言，當標記物序列係LacZ基因時，藉由分析β-半乳糖苷酶活性偵測到攜帶信號之載體之存在。當轉殖基因係綠色螢光蛋白或螢光素酶時，攜帶信號之載體可以視覺方式藉由光度計中之色彩或光產生來量測。
可用於產生用於本文所述組合物及方法中之核酸載體(例如AAV載體)之轉移質體提供於表4中。轉移質體(例如含有欲藉由核酸載體遞送、例如欲藉由AAV遞送之DNA序列之質體)可與輔助質體(例如提供AAV製造所需之蛋白質之質體)及rep/cap質體(例如提供AAV衣殼蛋白及將轉移質體DNA序列插入衣殼外殼中之蛋白質之質體)共遞送至產生細胞中以產生用於投與之核酸載體(例如AAV載體)。可使用表4中所提供之轉移質體來產生含有可操作連接至轉殖基因(例如編碼Atoh1之多核苷酸或編碼GFP之多核苷酸)之SLC6A14啟動子之核酸載體(例如AAV載體)。表 4 ：轉移質體
SEQ ID NO. 描述 質體序列
7 SLC6A14-ATOH1       位置1-130處之ITR    位置233-1066處之SLC6A14啟動子    位置1083-2144處之Atoh1編碼序列    位置2155-2702處之WPRE序列    位置2715-2922處之牛生長激素多聚腺苷酸化(bGH聚(A))序列    位置3010-3139處之ITR    位置1-3139處之欲轉移至載體中之轉殖基因 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCACCGGTGCGATCGCAAGCTGGGATGTTTCCTCATAGTTTACTTTCTAGGCCTCATCTTTCTTACAGAGTGTGCTCCTTTGTTAAGGTTAGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCCTGTAAAAGGCAAAGCTGTCCTGAAGGCTGAGAAAGGAGCCTGAGACATAGGCTCCAAGTTGCTCTTTTCAGGCAGAGCCAGCTGGGTAATCTTATCTCAGATGGCTGCTTTTCAAGGTGCCCAATTCAGGGGCTTTTCCTCTGGGAGCAGCATTTGCCCCAGGGAATCAAGTGCTTTCTAGTCAGGGGCAAAACTTTGGGAAATCTGAGGACCCAGGGTGGTATGGTCTGTTCAGGAGAATTTTGGGGAACAGAATGGCCCCCTTCTCCCTCCAGCACTTGTACAGATCAGCACTTGGCCCCAGAACAGAGACCAGACTGAGAGGCGAGGTTAGGAGGAAACAGGGGACCCAGGAAAGGCGGCTAGATTGCAAACGTACCTACACAGCTCTGAGTCAAAGGCTGTCAGTCATCTCGGCTCAGACTGCTCTGCTCTCCAGCAGCCCAGCCCTTTCCCAGGGCTGGGGCAGGAGATTGCTACATGTAGGCTTATCTGGGGAAAAACCAGAGCCTCACTTTAGTCCCTTCCGGTAATTGACACTACTGGACACCCAGGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCTCTTCATAAATGTTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCGCCGCGGCCGCGCCACCATGTCCCGCCTGCTGCATGCAGAAGAGTGGGCTGAAGTGAAGGAGTTGGGAGACCACCATCGCCAGCCCCAGCCGCATCATCTCCCGCAACCGCCGCCGCCGCCGCAGCCACCTGCAACTTTGCAGGCGAGAGAGCATCCCGTCTACCCGCCTGAGCTGTCCCTCCTGGACAGCACCGACCCACGCGCCTGGCTGGCTCCCACTTTGCAGGGCATCTGCACGGCACGCGCCGCCCAGTATTTGCTACATTCCCCGGAGCTGGGTGCCTCAGAGGCCGCTGCGCCCCGGGACGAGGTGGACGGCCGGGGGGAGCTGGTAAGGAGGAGCAGCGGCGGTGCCAGCAGCAGCAAGAGCCCCGGGCCGGTGAAAGTGCGGGAACAGCTGTGCAAGCTGAAAGGCGGGGTGGTGGTAGACGAGCTGGGCTGCAGCCGCCAACGGGCCCCTTCCAGCAAACAGGTGAATGGGGTGCAGAAGCAGAGACGGCTAGCAGCCAACGCCAGGGAGCGGCGCAGGATGCATGGGCTGAACCACGCCTTCGACCAGCTGCGCAATGTTATCCCGTCGTTCAACAACGACAAGAAGCTGTCCAAATATGAGACCCTGCAGATGGCCCAAATCTACATCAACGCCTTGTCCGAGCTGCTACAAACGCCCAGCGGAGGGGAACAGCCACCGCCGCCTCCAGCCTCCTGCAAAAGCGACCACCACCACCTTCGCACCGCGGCCTCCTATGAAGGGGGCGCGGGCAACGCGACCGCAGCTGGGGCTCAGCAGGCTTCCGGAGGGAGCCAGCGGCCGACCCCGCCCGGGAGTTGCCGGACTCGCTTCTCAGCCCCAGCTTCTGCGGGAGGGTACTCGGTGCAGCTGGACGCTCTGCACTTCTCGACTTTCGAGGACAGCGCCCTGACAGCGATGATGGCGCAAAAGAATTTGTCTCCTTCTCTCCCCGGGAGCATCTTGCAGCCAGTGCAGGAGGAAAACAGCAAAACTTCGCCTCGGTCCCACAGAAGCGACGGGGAATTTTCCCCCCATTCCCATTACAGTGACTCGGATGAGGCAAGTTAGAAGCTTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTTGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG
8 SLC6A14-H2B-EGFP    位置1-130處之ITR    位置233-1066處之SLC6A14啟動子    位置1083-2198處之融合至組織蛋白2b基因之H2B片段之GFP (H2B-GFP融合物)    位置2207-2754處之WPRE序列    位置2767-2974處之bGH聚(A)序列位置    位置3062-3191處之ITR    位置1-3191處之欲轉移至載體中之轉殖基因    CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCACCGGTGCGATCGCAAGCTGGGATGTTTCCTCATAGTTTACTTTCTAGGCCTCATCTTTCTTACAGAGTGTGCTCCTTTGTTAAGGTTAGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCCTGTAAAAGGCAAAGCTGTCCTGAAGGCTGAGAAAGGAGCCTGAGACATAGGCTCCAAGTTGCTCTTTTCAGGCAGAGCCAGCTGGGTAATCTTATCTCAGATGGCTGCTTTTCAAGGTGCCCAATTCAGGGGCTTTTCCTCTGGGAGCAGCATTTGCCCCAGGGAATCAAGTGCTTTCTAGTCAGGGGCAAAACTTTGGGAAATCTGAGGACCCAGGGTGGTATGGTCTGTTCAGGAGAATTTTGGGGAACAGAATGGCCCCCTTCTCCCTCCAGCACTTGTACAGATCAGCACTTGGCCCCAGAACAGAGACCAGACTGAGAGGCGAGGTTAGGAGGAAACAGGGGACCCAGGAAAGGCGGCTAGATTGCAAACGTACCTACACAGCTCTGAGTCAAAGGCTGTCAGTCATCTCGGCTCAGACTGCTCTGCTCTCCAGCAGCCCAGCCCTTTCCCAGGGCTGGGGCAGGAGATTGCTACATGTAGGCTTATCTGGGGAAAAACCAGAGCCTCACTTTAGTCCCTTCCGGTAATTGACACTACTGGACACCCAGGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCTCTTCATAAATGTTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCGCCGCGGCCGCGCCACCATGCCAGAGCCAGCGAAGTCTGCTCCCGCCCCGAAAAAGGGCTCCAAGAAGGCGGTGACTAAGGCGCAGAAGAAAGGCGGCAAGAAGCGCAAGCGCAGCCGCAAGGAGAGCTATTCCATCTATGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTCCACCCTGACACCGGCATTTCGTCCAAGGCCATGGGCATCATGAATTCGTTTGTGAACGACATTTTCGAGCGCATCGCAGGTGAGGCTTCCCGCCTGGCGCATTACAACAAGCGCTCGACCATCACCTCCAGGGAGATCCAGACGGCCGTGCGCCTGCTGCTGCCTGGGGAGTTGGCCAAGCACGCCGTGTCCGAGGGTACTAAGGCCATCACCAAGTACACCAGCGCTAAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAAGCTTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG
9 與H2B-EGFP共表現之SLC6A14-ATOH1    位置1-130處之ITR    位置233-1066處之SLC6A14啟動子    位置1083-2144處之Atoh1編碼序列       位置2217-3332處之融合至組織蛋白2b基因之H2B片段之GFP (H2B-GFP融合物)    位置3341-3888處之WPRE序列    位置3901-4108處之bGH聚(A)序列    位置4196-4325處之ITR    位置1-4325處之欲轉移至載體中之轉殖基因    CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGGCGCGCCACCGGTGCGATCGCAAGCTGGGATGTTTCCTCATAGTTTACTTTCTAGGCCTCATCTTTCTTACAGAGTGTGCTCCTTTGTTAAGGTTAGAATTTCCCATAAACCTGCTCAATAATTTGTTTGTGTTTGGCTTCTTTGAAATACTACACAAAGCAATCCCTGTAAAAGGCAAAGCTGTCCTGAAGGCTGAGAAAGGAGCCTGAGACATAGGCTCCAAGTTGCTCTTTTCAGGCAGAGCCAGCTGGGTAATCTTATCTCAGATGGCTGCTTTTCAAGGTGCCCAATTCAGGGGCTTTTCCTCTGGGAGCAGCATTTGCCCCAGGGAATCAAGTGCTTTCTAGTCAGGGGCAAAACTTTGGGAAATCTGAGGACCCAGGGTGGTATGGTCTGTTCAGGAGAATTTTGGGGAACAGAATGGCCCCCTTCTCCCTCCAGCACTTGTACAGATCAGCACTTGGCCCCAGAACAGAGACCAGACTGAGAGGCGAGGTTAGGAGGAAACAGGGGACCCAGGAAAGGCGGCTAGATTGCAAACGTACCTACACAGCTCTGAGTCAAAGGCTGTCAGTCATCTCGGCTCAGACTGCTCTGCTCTCCAGCAGCCCAGCCCTTTCCCAGGGCTGGGGCAGGAGATTGCTACATGTAGGCTTATCTGGGGAAAAACCAGAGCCTCACTTTAGTCCCTTCCGGTAATTGACACTACTGGACACCCAGGAGGGGGAGGAGAGAGCTTCTCTTCATAAATGTTCCCACCCCTGGGCAAGGTGGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCGCCGCGGCCGCGCCACCATGTCCCGCCTGCTGCATGCAGAAGAGTGGGCTGAAGTGAAGGAGTTGGGAGACCACCATCGCCAGCCCCAGCCGCATCATCTCCCGCAACCGCCGCCGCCGCCGCAGCCACCTGCAACTTTGCAGGCGAGAGAGCATCCCGTCTACCCGCCTGAGCTGTCCCTCCTGGACAGCACCGACCCACGCGCCTGGCTGGCTCCCACTTTGCAGGGCATCTGCACGGCACGCGCCGCCCAGTATTTGCTACATTCCCCGGAGCTGGGTGCCTCAGAGGCCGCTGCGCCCCGGGACGAGGTGGACGGCCGGGGGGAGCTGGTAAGGAGGAGCAGCGGCGGTGCCAGCAGCAGCAAGAGCCCCGGGCCGGTGAAAGTGCGGGAACAGCTGTGCAAGCTGAAAGGCGGGGTGGTGGTAGACGAGCTGGGCTGCAGCCGCCAACGGGCCCCTTCCAGCAAACAGGTGAATGGGGTGCAGAAGCAGAGACGGCTAGCAGCCAACGCCAGGGAGCGGCGCAGGATGCATGGGCTGAACCACGCCTTCGACCAGCTGCGCAATGTTATCCCGTCGTTCAACAACGACAAGAAGCTGTCCAAATATGAGACCCTGCAGATGGCCCAAATCTACATCAACGCCTTGTCCGAGCTGCTACAAACGCCCAGCGGAGGGGAACAGCCACCGCCGCCTCCAGCCTCCTGCAAAAGCGACCACCACCACCTTCGCACCGCGGCCTCCTATGAAGGGGGCGCGGGCAACGCGACCGCAGCTGGGGCTCAGCAGGCTTCCGGAGGGAGCCAGCGGCCGACCCCGCCCGGGAGTTGCCGGACTCGCTTCTCAGCCCCAGCTTCTGCGGGAGGGTACTCGGTGCAGCTGGACGCTCTGCACTTCTCGACTTTCGAGGACAGCGCCCTGACAGCGATGATGGCGCAAAAGAATTTGTCTCCTTCTCTCCCCGGGAGCATCTTGCAGCCAGTGCAGGAGGAAAACAGCAAAACTTCGCCTCGGTCCCACAGAAGCGACGGGGAATTTTCCCCCCATTCCCATTACAGTGACTCGGATGAGGCAAGTACGCGTGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGCCAGAGCCAGCGAAGTCTGCTCCCGCCCCGAAAAAGGGCTCCAAGAAGGCGGTGACTAAGGCGCAGAAGAAAGGCGGCAAGAAGCGCAAGCGCAGCCGCAAGGAGAGCTATTCCATCTATGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTCCACCCTGACACCGGCATTTCGTCCAAGGCCATGGGCATCATGAATTCGTTTGTGAACGACATTTTCGAGCGCATCGCAGGTGAGGCTTCCCGCCTGGCGCATTACAACAAGCGCTCGACCATCACCTCCAGGGAGATCCAGACGGCCGTGCGCCTGCTGCTGCCTGGGGAGTTGGCCAAGCACGCCGTGTCCGAGGGTACTAAGGCCATCACCAAGTACACCAGCGCTAAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAAGCTTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGT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將外源核酸遞送至靶細胞之方法
可用於將轉殖基因(例如可操作連接至本文所述之SLC6A14啟動子之轉殖基因)引入靶細胞(例如哺乳動物細胞)中之技術為此項技術中所熟知。例如，可使用電穿孔藉由將靜電勢施加至相關細胞(例如人類靶細胞)使哺乳動物細胞透化。以此方式經受外部電場之哺乳動物細胞(例如人類細胞)隨後易於攝取外源核酸。哺乳動物細胞之電穿孔詳細闡述於例如Chu等人，Nucleic Acids Research 15:1311 (1987)中，該文獻之揭示內容係以引用方式併入本文中。類似技術NucleofectionTM 利用施加之電場來刺激外源多核苷酸攝取至真核細胞之核中。NucleofectionTM 及可用於實施此技術之方案詳細闡述於例如Distler等人，Experimental Dermatology 14:315 (2005)以及US 2010/0317114中，該等文獻各自之揭示內容係以引用方式併入本文中。
可用於轉染靶細胞之其他技術包括擠壓-穿孔方法。此技術誘導細胞之快速機械變形以刺激經由因應所施加應力形成之膜孔攝取外源DNA。此技術之優點在於，載體並非將核酸遞送至細胞(例如人類靶細胞)中所必需。擠壓-穿孔詳細闡述於例如Sharei等人，Journal of Visualized Experiments 81:e50980 (2013)中，該文獻之揭示內容係以引用方式併入本文中。
脂轉染代表可用於轉染靶細胞之另一種技術。此方法涉及將核酸加載至脂質體中，該脂質體通常呈現朝向脂質體外部之陽離子官能基，例如四級或質子化胺。此因細胞膜之陰離子性質而促進脂質體與細胞之間之靜電相互作用，最終例如藉由引導脂質體與細胞膜融合或藉由複合物之胞吞作用攝取外源核酸。脂轉染詳細闡述於例如美國專利第7,442,386號中，該專利之揭示內容係以引用方式併入本文中。利用與細胞膜之離子相互作用來引起外源核酸攝取之類似技術包括使細胞與陽離子聚合物-核酸複合物接觸。與多核苷酸締合以賦予有利於與細胞膜相互作用之正電荷之例示性陽離子分子包括活化樹枝狀聚合物(闡述於例如Dennig，Topics in Current Chemistry 228:227 (2003)中，該文獻之揭示內容係以引用方式併入本文中)、聚乙亞胺及二乙基胺基乙基(DEAE)-聚葡萄糖，其作為轉染劑之用途詳細闡述於例如Gulick等人，Current Protocols in Molecular Biology 40:I:9.2:9.2.1 (1997)中，該文獻之揭示內容係以引用方式併入本文中。磁珠係可用於以溫和且有效之方式轉染靶細胞之另一工具，此乃因此方法利用所施加之磁場來引導核酸之攝取。此技術詳細闡述於例如US 2010/0227406中，該專利之揭示內容係以引用方式併入本文中。
另一可用於誘導靶細胞對外源核酸之攝取之工具係雷射轉染，亦稱為光學轉染，其係涉及使細胞曝露於特定波長之電磁輻射以溫和地透化細胞並允許多核苷酸透過細胞膜之技術。此技術之生物活性類似於電穿孔，且在一些情形下發現優於電穿孔。
刺穿轉染係可用於將遺傳材料遞送至靶細胞之另一技術。其依賴於奈米材料(例如碳奈米纖維、碳奈米管及奈米線)之使用。垂直於基板之表面來合成針樣奈米結構。將含有意欲細胞內遞送之基因之DNA附接至奈米結構表面。然後將具有該等針之陣列之晶片按壓在細胞或組織上。由奈米結構刺穿之細胞可表現所遞送之基因。此技術之實例闡述於Shalek等人，PNAS 107: 1870 (2010)中，該文獻之揭示內容係以引用方式併入本文中。
亦可使用磁性轉染將核酸遞送至靶細胞。磁性轉染原理係使核酸與陽離子磁性奈米粒子締合。磁性奈米粒子係由完全生物可降解之氧化鐵製成，且塗覆有根據應用變化之特定陽離子專有分子。其與基因載體(DNA、siRNA、病毒載體等)之締合係藉由鹽誘導之膠質聚集及靜電相互作用來達成。然後藉由影響磁鐵所產生之外部磁場使磁性粒子集中於靶細胞上。此技術詳細闡述於Scherer等人，Gene Therapy 9:102 (2002)，該文獻之揭示內容係以引用方式併入本文中。
另一可用於誘導靶細胞對外源核酸之攝取之工具係聲致穿孔，其係涉及使用聲音(通常超音波頻率)來改變細胞質膜之透性以透化細胞並允許多核苷酸透過細胞膜之技術。此技術詳細闡述於例如Rhodes等人，Methods in Cell Biology 82:309 (2007)，該文獻之揭示內容係以引用方式併入本文中。
微泡代表可用於根據本文所述之方法修飾靶細胞之基因體之另一潛在媒劑。例如，已藉由糖蛋白VSV-G與例如基因體修飾蛋白(例如核酸酶)之共同過表現誘導之微泡可用於將蛋白質有效地遞送至細胞中，隨後催化內源多核苷酸序列之位點特異性裂解以使細胞之基因體準備用於共價納入相關多核苷酸(例如基因或調節序列)。該等囊泡(亦稱為奈米囊泡(Gesicle))於真核細胞之遺傳修飾之用途詳細闡述於例如Quinn等人，Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [摘要].Methylation changes in early embryonic genes in cancer [摘要]，Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 2015年5月13日，摘要編號122。將外源核酸遞送至靶細胞之載體
除達成高轉錄及轉譯速率以外，外源基因在哺乳動物細胞中之穩定表現可藉由將含有基因之多核苷酸整合至哺乳動物細胞之核基因體中來達成。已開發出將編碼外源蛋白質之多核苷酸遞送並整合至哺乳動物細胞之核DNA中之多種載體。表現載體之實例闡述於例如Gellissen，Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems (John Wiley & Sons，Marblehead，MA，2006)中。用於本文所述組合物及方法中之表現載體含有可操作連接至編碼相關蛋白質之多核苷酸序列之SLC6A14啟動子(例如與表2所示多核苷酸序列中之任一者具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)，以及例如用於表現該等劑及/或將該等多核苷酸序列整合至哺乳動物細胞之基因體中之其他序列元件。可含有可操作連接至編碼相關蛋白質之轉殖基因之SLC6A14啟動子之載體包括質體(例如可在細胞內自主複製之環狀DNA分子)、黏粒(例如pWE或sCos載體)、人工染色體(例如人類人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1源性人工染色體(PAC))及病毒載體。可用於表現相關蛋白質之某些載體包括含有引導基因轉錄之調節序列(例如增強子區域)之質體。其他可用於表現相關蛋白質之載體含有增強該等基因之轉譯速率或改良源自基因轉錄之mRNA之穩定性或核輸出之多核苷酸序列。該等序列元件包括例如5’及3’非轉譯區、內部核糖體進入位點(IRES)及引導表現載體上所攜帶基因之有效轉錄之多聚腺苷酸化信號位點。適用於本文所述組合物及方法之表現載體亦可含有編碼用於選擇含有該載體之細胞之標記物之多核苷酸。適宜標記物之實例包括編碼抗生素(例如胺苄青黴素、氯黴素、康黴素或諾爾斯菌素)抗性之基因。用於核酸遞送之病毒載體
病毒基因體提供可用於將相關基因有效遞送至靶細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)之基因體中之載體之豐富來源。病毒基因體係尤其可用於基因遞送之載體，此乃因含於該等基因體內之多核苷酸通常藉由一般或專門轉導納入哺乳動物細胞之核基因體中。該等過程作為天然病毒複製週期之一部分出現，且無需添加蛋白質或試劑來誘導基因整合。病毒載體之實例包括反轉錄病毒(例如反轉錄病毒科家族病毒載體)、腺病毒(例如Ad5、Ad26、Ad34、Ad35及Ad48)、小病毒(例如腺相關病毒)、冠狀病毒、負股RNA病毒(例如正黏液病毒，例如流行性感冒病毒)、棒狀病毒(例如狂犬病及水皰性口炎病毒)、副黏液病毒(例如麻疹及仙台病毒(Sendai))、正股RNA病毒、例如微小RNA病毒及α病毒以及雙股DNA病毒，包括腺病毒、皰疹病毒(例如1型及2型單純皰疹病毒、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、巨細胞病毒)及痘病毒(例如牛痘、經修飾安卡拉牛痘(modified vaccinia Ankara，MVA)、雞痘及金絲雀痘)。其他病毒包括例如諾沃克病毒(Norwalk virus)、披衣病毒、黃病毒、里奧病毒(reovirus)、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒、人類乳頭瘤病毒、人類泡沫病毒及肝炎病毒。反轉錄病毒之實例包括：鳥白血病-肉瘤、鳥C型病毒、哺乳動物C型、B型病毒、D型病毒、致癌反轉錄病毒、HTLV-BLV族、慢病毒、α反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、泡沫病毒(Coffin，J. M.，Retroviridae: The viruses and their replication，Virology，第3版(Lippincott-Raven，Philadelphia，1996))。其他實例包括鼠類白血病病毒、鼠類肉瘤病毒、小鼠乳房腫瘤病毒、牛白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒、鳥白血病病毒、人類T細胞白血病病毒、狒狒內源病毒、長臂猿白血病病毒、梅森菲舍猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)、猿猴免疫缺失病毒、猿猴肉瘤病毒、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)及慢病毒。載體之其他實例闡述於例如美國專利第5,801,030號中，該專利關於用於基因療法中之病毒載體之揭示內容係以引用方式併入本文中。用於核酸遞送之 AAV 載體
在一些實施例中，將本文所述組合物及方法之多核苷酸納入rAAV載體及/或病毒粒子中以促進其引入細胞(例如VSC)中。可用於本文所述組合物及方法中之rAAV載體係重組核酸構築體，其包括(1)本文所述之SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出之多核苷酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)，(2)欲表現之異源序列，及(3)促進異源基因之穩定性及表現之病毒序列。病毒序列可包括DNA順式複製及包裝(例如功能性ITR)至病毒粒子中所需之彼等AAV序列。在典型應用中，轉殖基因編碼可促進或增加前庭毛細胞發育、前庭毛細胞命運特化、前庭毛細胞再生、前庭毛細胞及/或VSC增殖、前庭毛細胞神經分佈或前庭毛細胞成熟之蛋白質，或在患有多種形式之遺傳性前庭功能障礙之個體中突變之前庭毛細胞蛋白之野生型形式，其可用於改良攜帶與前庭功能障礙(例如眩暈、暈眩、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下、振動幻視或平衡病症)相關之突變之個體之前庭功能。該等rAAV載體亦可含有標記物或報導基因。有用的rAAV載體具有一或多個整體或部分缺失之AAV WT基因，但保留功能性側接ITR序列。AAV ITR可具有適於特定應用之任何血清型。為用於本文所述方法及組合物中，ITR可為AAV2 ITR。使用rAAV載體之方法闡述於例如Tal等人，J. Biomed.Sci. 7:279 (2000)以及Monahan及Samulski，Gene Delivery 7:24 (2000)中，該等文獻中之每一者關於用於基因遞送之AAV載體之揭示內容皆以引用方式併入本文中。
本文所述之多核苷酸及載體(例如可操作連接至編碼相關蛋白質之轉殖基因之SLC6A14啟動子)可納入rAAV病毒粒子中以促進多核苷酸或載體引入細胞(例如VSC)中。AAV之衣殼蛋白構成外部，病毒粒子之非核酸部分係由AAV cap基因編碼。cap基因編碼三種病毒外殼蛋白VP1、VP2及VP3，其為病毒粒子組裝所必需。rAAV病毒粒子之構築已闡述於例如US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US 5,869,305；US 6,057,152；及US 6,376,237；以及Rabinowitz等人，J. Virol. 76:791 (2002)及Bowles等人，J. Virol. 77:423 (2003)中，該等文獻中之每一者關於用於基因遞送之AAV載體之揭示內容皆以引用方式併入本文中。
可與本文所述之組合物及方法結合使用之rAAV病毒粒子包括衍生自多種AAV血清型之彼等rAAV病毒粒子，該等AAV血清型包括AAV 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、rh10、rh39、rh43、rh74、Anc80、Anc80L65、DJ/8、DJ/9、7m8、PHP.B、PHP.eB及PHP.S。為靶向VSC，AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80、Anc80L65、7m8、PHP.B、PHP.eB或PHP.S血清型可能係尤其有用的。經進化用於轉導視網膜之血清型亦可用於本文所述方法及組合物中。不同血清型之AAV載體及AAV蛋白之構築及用途闡述於例如Chao等人，Mol. Ther. 2:619 (2000)；Davidson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428 (2000)；Xiao等人，J. Virol. 72:2224 (1998)；Halbert等人，J. Virol. 74:1524 (2000)；Halbert等人，J. Virol. 75:6615 (2001)；及Auricchio等人，Hum. Molec.Genet. 10:3075 (2001)中，該等文獻中之每一者關於用於基因遞送之AAV載體之揭示內容皆以引用方式併入本文中。
假型rAAV載體亦可與本文所述之組合物及方法結合使用。假型載體包括經衍生自除給定血清型(例如AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8等)外之血清型之衣殼基因假型化之給定血清型(例如AAV9)之AAV載體。涉及假型rAAV病毒粒子之構築及用途之技術為此項技術中已知且闡述於例如Duan等人，J. Virol. 75:7662 (2001)；Halbert等人，J. Virol. 74:1524 (2000)；Zolotukhin等人，Methods，28:158 (2002)；及Auricchio等人，Hum. Molec.Genet. 10:3075 (2001)中。
在病毒粒子衣殼內具有突變之AAV病毒粒子可用於比非突變衣殼病毒粒子更有效地感染特定細胞類型。舉例而言，適宜AAV突變體可具有幫助AAV靶向特定細胞類型之配位體插入突變。AAV衣殼突變體之構築及表徵(插入突變體、丙胺酸篩選突變體及抗原決定基標籤突變體)闡述於Wu等人，J. Virol. 74:8635 (2000)中。可用於本文所述方法中之其他rAAV病毒粒子包括藉由病毒之分子育種以及藉由外顯子改組產生之彼等衣殼雜合體。例如，參見Soong等人，Nat. Genet.，25:436 (2000)以及Kolman及Stemmer，Nat. Biotechnol. 19:423 (2001)。
在一些實施例中，核酸載體(例如AAV載體)包括本文所述之SLC6A14啟動子(例如具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之多核苷酸)，其可操作連接至編碼人類Atoh1之多核苷酸序列(人類ATOH1蛋白= RefSeq登錄號NP_005163 (SEQ ID NO: 10)；mRNA序列= RefSeq登錄號NM_005172)。在一些實施例中，SLC6A14啟動子係SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子(亦由SEQ ID NO: 7之核苷酸233-1066表示)且其可操作連接至編碼人類Atoh1之多核苷酸序列。在一些實施例中，編碼人類Atoh1之多核苷酸序列係SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，編碼人類Atoh1之多核苷酸序列係SEQ ID NO: 7之核苷酸1083-2144。在一些實施例中，編碼人類Atoh1之多核苷酸序列係因遺傳密碼之冗餘性而編碼SEQ ID NO: 10之任一多核苷酸序列。編碼Atoh1之多核苷酸序列可經部分或完全密碼子最佳化用於表現。在一些實施例中，載體以5’至3’順序包括第一反向末端重複；SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子；可操作連接至SLC6A14啟動子之編碼人類Atoh1之多核苷酸序列；多聚腺苷酸化序列；及第二反向末端重複。在一些實施例中，核酸載體以5’至3’順序包括第一反向末端重複；SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子；可操作連接至SLC6A14啟動子之編碼人類Atoh1之多核苷酸序列；土撥鼠轉錄後調節元件(WPRE)；多聚腺苷酸化序列；及第二反向末端重複。在一些實施例中，WPRE具有SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15之序列。在一些實施例中，WPRE具有SEQ ID NO: 14之序列。在一些實施例中，WPRE具有SEQ ID NO: 7之核苷酸2155-2702之序列。在一些實施例中，多聚腺苷酸化序列具有SEQ ID NO: 7之核苷酸2715-2922之序列。在某些實施例中，核酸載體包括側接有反向末端重複之SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922。在一些實施例中，側接反向末端重複係AAV2反向末端重複。在一些實施例中，側接反向末端重複係AAV2反向末端重複之可經攜帶AAV2 Rep基因之質體殼體化之任一變異體。在特定實施例中，核酸載體包括側接有反向末端重複之SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922，其中5’反向末端重複與SEQ ID NO: 7之核苷酸1-130具有至少80%序列一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)；且其中3’反向末端重複與SEQ ID NO: 7之核苷酸3010-3139具有至少80%序列一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)。在一些實施例中，核酸載體係病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係AAV載體。在一些實施例中，AAV載體具有AAV8衣殼。
熟習此項技術者應理解，產生本發明之病毒載體通常需要使用本發明之質體以及提供正確的病毒包裝及活力所需之元件之額外質體(例如對於AAV，提供適宜AAV rep基因、cap基因及其他基因(例如E2A及E4)之質體)。產生細胞株中彼等質體之組合產生病毒載體。然而，熟習此項技術者應理解，對於用於產生病毒載體之本發明轉移質體中之任何給定對之反向末端重複序列(例如SEQ ID NO: 7、8或9)，病毒載體中之相應序列可因ITR在重組期間採取「翻轉」或「倒轉」取向而改變。因此，轉移質體中ITR之序列不必為在自其製備之病毒載體中發現之相同序列。然而，在一些極特定實施例中，本發明之病毒載體包括SEQ ID NO: 7之核苷酸1-3139。醫藥組合物
本文所述之多核苷酸(例如與表2中所列出之多核苷酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之SLC6A14啟動子)可操作連接至轉殖基因(例如編碼相關蛋白質、siRNA、ASO或核酸酶(例如Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)之轉殖基因，或為微小RNA之轉殖基因)且納入媒劑中以投與患者，例如患有前庭功能障礙之人類患者。含有含本文所述可操作連接至轉殖基因之多核苷酸之載體(例如病毒載體)之醫藥組合物可使用此項技術中已知之方法來製備。舉例而言，該等組合物可使用例如生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington: The Science and Practice of Pharmacology，第22版，Allen，L.(編輯). (2013)；以引用方式併入本文中)且以期望形式(例如以凍乾調配物或水溶液之形式)來製備。
含有可操作連接至轉殖基因之本文所述SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出之核酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)之核酸載體(例如病毒載體)之混合物可於與一或多種賦形劑、載劑或稀釋劑適當混合之水中製備。分散液亦可於甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及油中製備。在普通儲存及使用條件下，該等製劑可含有防止微生物生長之防腐劑。適於可注射用途之醫藥形式包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末(闡述於US 5,466,468中，其揭示內容係以引用方式併入本文中)。在任一情形下，調配物可為無菌的且可為容易注射之流體。調配物在製造及儲存條件下可為穩定的且可防止微生物(例如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)。其適宜混合物及/或植物油之溶劑或分散介質。可例如藉由使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液之情形下藉由維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由多種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及諸如此類)來防止微生物之作用。在許多情形下，較佳應包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
舉例而言，若需要，含有本文所述醫藥組合物之溶液可經適當緩衝，且首先用足量鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。該等特定水溶液尤其適用於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與。就此而言，根據本揭示案，可採用之無菌水性介質將為彼等熟習此項技術者所知。舉例而言，可將一劑量溶解於1 ml NaCl等滲溶液中且添加至1000 ml皮下灌注液中或在所提出之輸注位點處注射。端視所治療個體之病狀，劑量必然將發生一些變化。為局部投與中耳或內耳，組合物可經調配以含有合成外淋巴溶液。例示性合成外淋巴溶液包括20-200 mM NaCl、1-5 mM KCl、0.1-10 mM CaCl2 、1-10 mM葡萄糖及2-50 mM HEPE，其中pH介於約6與9之間且滲透重量莫耳濃度為約300 mOsm/kg。負責投與之人在任何情形下將決定個別個體之適宜劑量。此外，對於人類投與，製劑應符合FDA生物製品標準辦公室(FDA Office of Biologics standards)所要求之無菌性、熱原性、一般安全性及純度標準。治療方法
本文所述之組合物可藉由多種途徑投與患有前庭功能障礙或具有患上該疾病之風險之個體，例如局部投與中耳或內耳(例如投與外淋巴或內淋巴中，例如經由卵圓窗、圓窗或半規管(例如外半規管)，或藉由經鼓室或鼓室內注射，例如投與前庭支持細胞或毛細胞)、靜脈內、非經腸、真皮內、經皮、肌內、鼻內、皮下、經皮、氣管內、腹膜內、動脈內、血管內、吸入、灌注、灌洗及經口投與。在任一給定情形下最適於投與之途徑將端視所投與之具體組合物、患者、醫藥調配方法、投與方法(例如投與時間及投與途徑)、患者之年齡、體重、性別、所治療疾病之嚴重程度、患者之飲食及患者之排泄速率而定。組合物可投與一次或一次以上(例如每年一次、每年兩次、每年三次、每兩月、每月或每兩週)。
可如本文所述治療之個體係患有前庭功能障礙或具有患上該疾病之風險之個體。本文所述之組合物及方法可用於治療患有前庭毛細胞損傷(例如與疾病或感染、頭部創傷、耳毒性藥物(例如胺基糖苷)或老化相關之損傷)或具有患上該疾病之風險之個體、患有前庭功能障礙(例如眩暈、暈眩、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下、振動幻視或平衡病症)或具有患上該疾病之風險之個體、攜帶與前庭功能障礙相關之遺傳突變之個體或具有遺傳性前庭功能障礙家族史之個體。在一些實施例中，與毛細胞(例如前庭毛細胞)損傷或損失相關之疾病係其中自體免疫反應導致毛細胞損傷或死亡之自體免疫疾病或病狀。與前庭功能障礙相關之自體免疫疾病包括自體免疫內耳疾病(AIED)、結節性多動脈炎(PAN)、科根症候群(Cogan's syndrome)、復發性多發性軟骨炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、華格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、薛格連氏症候群(Sjögren's syndrome)及貝賽特氏病(Behçet's disease)。一些傳染病(例如萊姆病(Lyme disease)及梅毒)亦可引起前庭功能障礙(例如藉由觸發自體抗體產生)。病毒感染(例如風疹、巨細胞病毒(CMV)、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、1型及2型HSV、西尼祿病毒(West Nile virus，WNV)、人類免疫缺失病毒(HIV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、麻疹及腮腺炎)亦可引起前庭功能障礙。在一些實施例中，個體患有與毛細胞(例如前庭毛細胞)損失相關或源自其之前庭功能障礙。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於治療患有振動幻視或具有患上該疾病之風險之個體。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於治療患有雙側前庭病或具有患上該疾病之風險之個體。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於治療患有平衡病症(例如不平衡)或具有患上該疾病之風險之個體。本文所述之方法可包括在用本文所述之組合物治療或投與本文所述之組合物之前篩選個體之已知與前庭功能障礙相關之基因之一或多個突變的步驟。個體遺傳突變可使用熟習此項技術者已知之標準方法(例如遺傳性測試)來篩選。本文所述之方法亦可包括在用本文所述之組合物治療之前或投與本文所述之組合物之前評價個體之前庭功能之步驟。前庭功能可使用諸如以下之標準測試來評價：眼移動測試(例如眼震圖(ENG)或視頻眼震圖(VNG))、前庭眼反射(VOR)測試(例如可在床邊實施之頭部衝擊測試(哈-克測試(Halmagyi-Curthoys test))或使用視頻頭部衝擊測試(VHIT)或熱量反射測試)、體位圖、旋轉椅測試、ECOG、前庭引發之肌源性電勢(VEMP)及專門臨床平衡測試，例如Mancini及Horak，Eur J Phys Rehabil Med，46:239 (2010)中所述之彼等測試。該等測試亦可用於在用本文所述之組合物治療或投與本文所述之組合物後評價個體之前庭功能。本文所述之組合物及方法亦可作為預防性治療投與具有患上前庭功能障礙之風險之患者，例如具有前庭功能障礙家族史(例如遺傳性前庭功能障礙)之患者、尚未展現前庭功能障礙症狀之攜帶與前庭功能障礙相關之遺傳突變之患者或暴露於獲得性前庭功能障礙之風險因子(例如疾病或感染、頭部創傷、耳毒性藥物或老化)之患者。
本文所述之組合物及方法可用於誘導或增加個體中之毛細胞再生(例如前庭毛細胞再生)及/或誘導或增加前庭毛細胞及/或VSC之增殖。可自促進或誘導前庭毛細胞再生、前庭毛細胞神經分佈及/或前庭毛細胞及/或VSC增殖之組合物獲益之個體包括因毛細胞損失(例如與創傷(例如頭部創傷)、疾病或感染、耳毒性藥物或老化相關之前庭毛細胞損失)而患有前庭功能障礙或具有患上該疾病之風險之個體，及具有異常前庭毛細胞(例如與正常前庭毛細胞相比不能正確地發揮功能之前庭毛細胞)、受損前庭毛細胞(例如與創傷(例如頭部創傷)、疾病或感染、耳毒性藥物或老化相關之前庭毛細胞損傷)或因遺傳突變或先天異常導致之前庭毛細胞數減少之個體。本文所述之組合物及方法亦可用於促進或增加前庭毛細胞成熟，此可改良前庭功能。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法促進或增加再生前庭毛細胞之成熟(例如促進或增加因應本文所述之組合物(例如含有可操作連接至轉殖基因之SLC6A14啟動子之組合物)在VSC中之表現形成之前庭毛細胞之成熟)。本文所述之組合物及方法亦可促進或增加VSC及/或前庭毛細胞存活及/或改良VSC功能。
本文所述之組合物及方法亦可用於預防或減輕已用耳毒性藥物治療或當前正在用耳毒性藥物治療或很快開始用耳毒性藥物治療之個體中由耳毒性藥物誘導之毛細胞損傷或死亡(例如前庭毛細胞損傷或死亡)引起之前庭功能障礙。耳毒性藥物對內耳細胞有毒性，且可引起前庭功能障礙(例如暈眩、眩暈、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下或振動幻視)。已發現具有耳毒性之藥物包括胺基糖苷抗生素(例如慶大黴素、新黴素(neomycin)、鏈黴素(streptomycin)、妥布黴素(tobramycin)、康黴素(kanamycin)、萬古黴素(vancomycin)及阿米卡星(amikacin))、紫黴素(viomycin)、抗腫瘤藥物(例如含鉑化學治療劑，例如順鉑、卡鉑及奧沙利鉑(oxaliplatin))、袢利尿劑(例如依他尼酸及呋塞米)、水楊酸鹽(例如阿斯匹林(aspirin)，尤其在高劑量下)及奎寧。在一些實施例中，本文所述之方法及組合物可用於治療雙側前庭功能低下。雙側前庭功能低下可由胺基糖苷誘導(例如在患有胺基糖苷誘導之雙側前庭功能低下之個體中，可使用本文所述之方法及組合物來減少胺基糖苷誘導之前庭毛細胞損傷或死亡，或促進或增加毛細胞再生及/或毛細胞或VSC增殖)。
如本文所述可操作連接至SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出之多核苷酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)來治療個體之轉殖基因可為編碼在健康VSC中表現之蛋白質(例如在前庭毛細胞發育、前庭毛細胞命運特化、前庭毛細胞再生、前庭毛細胞及/或VSC增殖、前庭毛細胞成熟或前庭毛細胞神經分佈中起作用之蛋白質或患有前庭功能障礙之個體中缺失之蛋白質)、另一相關蛋白質(例如治療蛋白或報導基因蛋白，例如螢光蛋白、lacZ或螢光素酶)、siRNA、ASO、核酸酶或微小RNA之轉殖基因。轉殖基因可基於個體前庭功能障礙之病因(例如若個體之前庭功能障礙與特定遺傳突變相關，則轉殖基因可為在個體中突變之基因之野生型形式，或若個體患有與毛細胞損失相關之前庭功能障礙，則轉殖基因可編碼促進前庭毛細胞再生、前庭毛細胞神經分佈或前庭毛細胞及/或VSC增殖之蛋白質)、個體前庭功能障礙之嚴重程度、個體毛細胞之健康狀況、個體之年齡、個體之前庭功能障礙家族史或其他因素來選擇。如本文所述可由可操作連接SLC6A14啟動子之轉殖基因表現來治療個體之蛋白質包括Sox9、Sall2、Camta1、Hey2、Gata2、Hey1、Lass2、Sox10、Gata3、Cux1、Nr2f1、Hes1、Rorb、Jun、Zfp667、Lhx3、Nhlh1、Mxd4、Zmiz1、Myt1、Stat3、Barhl1、Tox、Prox1、Nfia、Thrb、Mycl1、Kdm5a、Creb314、Etv1、Peg3、Bach2、Isl1、Zbtb38、Lbh、Tub、Hmg20、Rest、Zfp827、Aff3、Pknox2、Arid3b、Mlxip、Zfp532、Ikzf2、Sall1、Six2、Sall3、Lin28b、Rfx7、Bdnf、Gfi1、Pou4f3、Myc、Ctnnb1、Sox2、Sox4、Sox11、Tead2、Atoh1及在胺基酸328、331及/或334處含有取代之Atoh1變異體(例如S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A及328A/S331A/S334)。
治療可包括以不同單位劑量投與含有含本文所述之SLC6A14啟動子(例如SEQ ID NO: 1-6中之任一者)之核酸載體(例如AAV病毒載體)之組合物。每個單位劑量通常將含有預定量之治療性組合物。欲投與之量及具體投與途徑及調配物為熟習臨床技術者所熟知。單位劑量無需作為單次注射來投與，但可包括在設定的時間段內連續輸注。可使用注射幫浦實施投藥來控制輸注速率以最小化內耳(例如前庭迷路)之損傷。在核酸載體係AAV載體(例如AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、rh10、rh39、rh43、rh74、Anc80、Anc80L65、DJ/8、DJ/9、7m8、PHP.B、PHP.eB或PHP.S載體)之情形下，病毒載體可以例如下列劑量投與患者：約1 × 109 個載體基因體(VG)/mL至約1 × 1016 VG/mL (例如1 x 109 VG/mL、2 x 109 VG/mL、3 x 109 VG/mL、4 x 109 VG/mL、5 x 109 VG/mL、6 x 109 VG/mL、7 x 109 VG/mL、8 x 109 VG/mL、9 x 109 VG/mL、1 x 1010 VG/mL、2 x 1010 VG/mL、3 x 1010 VG/mL、4 x 1010 VG/mL、5 x 1010 VG/mL、6 x 1010 VG/mL、7 x 1010 VG/mL、8 x 1010 VG/mL、9 x 1010 VG/mL、1 x 1011 VG/mL、2 x 1011 VG/mL、3 x 1011 VG/mL、4 x 1011 VG/mL、5 x 1011 VG/mL、6 x 1011 VG/mL、7 x 1011 VG/mL、8 x 1011 VG/mL、9 x 1011 VG/mL、1 x 1012 VG/mL、2 x 1012 VG/mL、3 x 1012 VG/mL、4 x 1012 VG/mL、5 x 1012 VG/mL、6 x 1012 VG/mL、7 x 1012 VG/mL、8 x 1012 VG/mL、9 x 1012 VG/mL、1 x 1013 VG/mL、2 x 1013 VG/mL、3 x 1013 VG/mL、4 x 1013 VG/mL、5 x 1013 VG/mL、6 x 1013 VG/mL、7 x 1013 VG/mL、8 x 1013 VG/mL、9 x 1013 VG/mL、1 x 1014 VG/mL、2 x 1014 VG/mL、3 x 1014 VG/mL、4 x 1014 VG/mL、5 x 1014 VG/mL、6 x 1014 VG/mL、7 x 1014 VG/mL、8 x 1014 VG/mL、9 x 1014 VG/mL、1 x 1015 VG/mL、2 x 1015 VG/mL、3 x 1015 VG/mL、4 x 1015 VG/mL、5 x 1015 VG/mL、6 x 1015 VG/mL、7 x 1015 VG/mL、8 x 1015 VG/mL、9 x 1015 VG/mL或1 x 1016 VG/mL)於1 µL至200 µL (例如1 µL、2 µL、3 µL、5 µL、6 µL、7 µL、8 µL、9 µL、10 µL、15 µL、20 µL、25 µL、30 µL、35 µL、40 µL、45 µL、50 µL、55 µL、60 µL、65 µL、70 µL、75 µL、80 µL、85 µL、90 µL、95 µL、100 µL、110 µL、120 µL、130 µL、140 µL、150 µL、160 µL、170 µL、180 µL、190 µL或200 µL)之體積中。AAV載體可以下列劑量投與個體：約1 x 107 VG/耳至約2 x 1015 VG/耳(例如，1 x 107 VG/耳、2 x 107 VG/耳、3 x 107 VG/耳、4 x 107 VG/耳、5 x 107 VG/耳、6 x 107 VG/耳、7 x 107 VG/耳、8 x 107 VG/耳、9 x 107 VG/耳、1 x 108 VG/耳、2 x 108 VG/耳、3 x 108 VG/耳、4 x 108 VG/耳、5 x 108 VG/耳、6 x 108 VG/耳、7 x 108 VG/耳、8 x 108 VG/耳、9 x 108 VG/耳、1 x 109 VG/耳、2 x 109 VG/耳、3 x 109 VG/耳、4 x 109 VG/耳、5 x 109 VG/耳、6 x 109 VG/耳、7 x 109 VG/耳、8 x 109 VG/耳、9 x 109 VG/耳、1 x 1010 VG/耳、2 x 1010 VG/耳、3 x 1010 VG/耳、4 x 1010 VG/耳、5 x 1010 VG/耳、6 x 1010 VG/耳、7 x 1010 VG/耳、8 x 1010 VG/耳、9 x 1010 VG/耳、1 x 1011 VG/耳、2 x 1011 VG/耳、3 x 1011 VG/耳、4 x 1011 VG/耳、5 x 1011 VG/耳、6 x 1011 VG/耳、7 x 1011 VG/耳、8 x 1011 VG/耳、9 x 1011 VG/耳、1 x 1012 VG/耳、2 x 1012 VG/耳、3 x 1012 VG/耳、4 x 1012 VG/耳、5 x 1012 VG/耳、6 x 1012 VG/耳、7 x 1012 VG/耳、8 x 1012 VG/耳、9 x 1012 VG/耳、1 x 1013 VG/耳、2 x 1013 VG/耳、3 x 1013 VG/耳、4 x 1013 VG/耳、5 x 1013 VG/耳、6 x 1013 VG/耳、7 x 1013 VG/耳、8 x 1013 VG/耳、9 x 1013 VG/耳、1 x 1014 VG/耳、2 x 1014 VG/耳、3 x 1014 VG/耳、4 x 1014 VG/耳、5 x 1014 VG/耳、6 x 1014 VG/耳、7 x 1014 VG/耳、8 x 1014 VG/耳、9 x 1014 VG/耳、1 x 1015 VG/耳或2 x 1015 VG/耳)。
本文所述之組合物係以足以改良前庭功能(例如改良平衡或減少眩暈或暈眩)、治療雙側前庭病、治療雙側前庭功能低下、治療振動幻視、治療平衡病症、增加由可操作連接至SLC6A14啟動子之轉殖基因編碼之蛋白質之表現、增加由可操作連接至SLC6A14啟動子之轉殖基因編碼之蛋白質之功能、促進或增加毛細胞發育、增加毛細胞數(例如促進或誘導毛細胞再生或增殖)、增加或誘導毛細胞成熟(例如再生毛細胞之成熟)、改良毛細胞功能、改良VSC功能、促進或增加VSC及/或前庭毛細胞存活及/或促進或增加VSC增殖之量投與。前庭功能可使用標準平衡及暈眩測試(例如眼移動測試(例如ENG或VNG)、VOR測試(例如頭部衝擊測試(哈-克測試，例如VHIT)或熱量反射測試)、體位圖、旋轉椅測試、ECOG、VEMP及專門臨床平衡測試)來評估，且與在治療之前獲得之量測相比可改良5%或更大(例如5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、200%或更大)。本文所述之組合物亦可以足以減緩或防止前庭功能障礙之發生或進展之量來投與(例如在攜帶與前庭功能障礙相關之遺傳突變、具有前庭功能障礙家族史(例如遺傳性前庭功能障礙)或已暴露於與前庭功能障礙相關之風險因子(例如耳毒性藥物、頭部創傷或疾病或感染)但未展現前庭功能障礙(例如暈眩、眩暈或不平衡)之個體中，或在展現輕度至中度前庭功能障礙之個體中)。在投與個體之核酸載體中由可操作連接至SLC6A14啟動子之轉殖基因編碼之蛋白質之表現可使用免疫組織化學、西方墨點法分析、定量即時PCR或此項技術中已知用於偵測或mRNA之其他方法來評估，且與投與本文所述之組合物之前之表現相比可增加5%或更大(例如5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、200%或更大)。毛細胞數、毛細胞功能、毛細胞成熟、毛細胞再生或由投與個體之核酸載體編碼之蛋白質之功能可間接基於前庭功能之測試來評估，且與投與本文所述之組合物之前之毛細胞數、毛細胞功能、毛細胞成熟、毛細胞再生或蛋白質功能相比或與未經治療之個體相比，可增加5%或更大(例如5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、200%或更大)。該等效應可在例如投與本文所述之組合物之後1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、15週、20週、25週或更長時間內出現。可在投與組合物之後1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長時間來評估患者，此端視用於治療之劑量及投與途徑而定。端視評估之結果，患者可接受額外治療。套組
本文所述之組合物可於用於治療前庭功能障礙之套組中提供。組合物可包括本文所述之SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出之多核苷酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)、含有該等多核苷酸之核酸載體及含有可操作連接至編碼相關蛋白質(例如可在VSC中表現以治療前庭功能障礙之蛋白質)之轉殖基因之本文所述多核苷酸之核酸載體。核酸載體可包裝於AAV病毒衣殼(例如AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80、7m8、PHP.B、PHP.eB或PHP.S)中。該套組可進一步包括指導套組之使用者(例如醫師)實施本文所述方法之包裝插頁。該套組可視情況地包括注射器或用於投與組合物之其他器件。實例
提出以下實施例以向熟習此項技術者提供如何使用、製造及評估本文所述之組合物及方法之描述，且意欲純粹例示本發明，而不欲限制發明人認為其發明之範圍。實例 1. 使用單細胞 RNA-Seq 將溶質載劑家族 6 成員 14 (SLC6A14) 鑒別為前庭支持細胞特異性基因
對成年小鼠之前庭及耳蝸組織實施單細胞RNA測序且分析轉錄體以鑒別在內耳之不同細胞類型中表現之基因。此分析集中在鑒別在前庭支持細胞中表現但不在耳蝸支持細胞中表現之基因。SLC6A14鑒別為在前庭支持細胞(VSC)中穩健偵測到、但在其他前庭細胞類型或耳蝸細胞類型中無法偵測到之轉錄物(圖1A-1B)。實例 2. 鑒別內源表現 SLC6A14 之細胞株
為鑒別內源表現SLC6A14基因之細胞株，吾人詢問ARCHS資料庫，其含有可公開獲得之鼠類及人類細胞之RNA測序資料(amp.pharm.mssm.edu/archs4)。根據此詢問將多種細胞株鑒別為內源表現SLC6A14 (圖2)。HepG2 (人類肝癌細胞)係具有SLC6A14最高中點表現之三種細胞株中之一者。實例 3. 測定 HepG2 細胞中多種腺相關病毒 (AAV) 血清型之轉導效率
為以實驗方式驗證HepG2細胞可由多種重組AAV血清型轉導，藉由質體構築體使用多種AAV血清型轉導HepG2細胞。具體而言，首先將HepG2細胞接種至板中。藉由Lipofectamine 3000轉染質體。使用習用三重轉染方法將AAV包裝於HEK293T細胞中。自產生細胞收穫AAV病毒，藉由碘克沙醇(iodixanol)梯度離心純化，且然後通過緩衝液交換以產生最終純AAV原液。將在巨細胞病毒(CMV)啟動子控制下編碼融合至綠色螢光蛋白基因(GFP)之人類組織蛋白H2B基因(CMV-H2B-GFP)之質體構築體包裝至AAV1、AAV8及AAV9衣殼中且以1×106 vg/細胞之感染複數(MOI)轉導至HepG2細胞中。藉由螢光顯微鏡術使GFP可視化且藉由流式細胞術量化。發現所有血清型轉導HepG2細胞，但AAV9轉導細胞之效率低得多(圖3)。實例 4. 測定 HepG2 細胞中之 SLC6A14 啟動子活性
鼠類(SEQ ID NO: 5)及人類(SEQ ID NO: 3-4) SLC6A14啟動子經設計以促進外源轉殖基因表現。為驗證該等SLC6A14啟動子在作為外源DNA遞送時有活性且與病毒包裝之效能無關，使用Lipofectamine將編碼SLC6A14啟動子之三種變異體之質體P530、P335及P372 (分別為圖19、圖21及圖22)轉染至HepG2細胞中。亦比較SLC6A14啟動子活性與CMV啟動子之活性。使用未經轉導之細胞作為對照。所測試構築體之脂轉染效率顯示於圖4A中。經SLC6A14啟動子變異體轉染之細胞之GFP表現水準相當於或大於遍在強CMV啟動子，此指示細胞株可用作SLC6A14啟動子活性之模型(圖4B)。用螢光顯微鏡術驗證該等結果(圖5A-5E)。實例 5. 測定 HepG2 細胞中編碼 SLC6A14 啟動子之 AAV8 病毒載體之轉導效率
在CMV啟動子或四種SLC6A14啟動子變異體中之一者控制下將含有核H2B-GFP之轉殖基因包裝至AAV8病毒載體中。使用轉殖基因質體P530 (人類SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子)、P335 (SEQ ID NO:3之人類SLC6A14啟動子)、P372 (SEQ ID NO:5之小鼠SLC6A14啟動子)或P373 (SEQ ID NO:6之小鼠SLC6A14啟動子；圖23)合成驅動H2B-GFP表現之SLC6A14啟動子。將每一病毒載體以1×106 vg/細胞之MOI遞送至HepG2細胞。所有病毒皆出現GFP陽性HepG2細胞，此確認包裝至AAV8中之SLC6A14啟動子能夠驅動基因表現(圖6)。實例 6. 測定活體外鼠類前庭器官中之 SLC6A14 啟動子活性
為測定活體外鼠類前庭器官中之SLC6A14啟動子活性，自尸檢後成年C57Bl/6小鼠之內耳解剖成年雄性小鼠橢圓囊及脊且將其維持於細胞培養物中。添加慶大黴素以殺死毛細胞。在上述SLC6A14啟動子之鼠類形式中之任一者(SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6)控制下將攜帶GFP之AAV8載體以1×1011 個病毒基因體(vg)/培養物之劑量遞送至細胞培養基中來轉導組織。培養7天後，用4%多聚甲醛將組織在室溫下固定1小時。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)將器官洗滌三次，每次五分鐘，然後在室溫下用M.O.M.封閉試劑(Vector Laboratories，Burlingame CA)根據製造商之方案封閉1小時。然後將器官在室溫下用PBS + 0.5% Triton X-100 (PBST)中之10%血清封閉3小時，隨後在4℃下在PBST加2%血清中之一級兔抗Sall2 (支持細胞之標記物)抗體(1:200稀釋；目錄號HPA004162，Millipore Sigma，St. Louis，MO)或一級小鼠單株抗Brn-3c (Pou4f3 -毛細胞之標記物)抗體(1:200稀釋；目錄號sc-81980，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX)中培育過夜。使組織升溫至室溫且然後用PBS洗滌三次，每次五分鐘。然後將組織與PBST加2%血清中之Alexa Fluor 568驢抗兔或Alexa Fluor 647抗小鼠二級抗體(1:500稀釋；ThermoFisher Scientific，Waltham MA)在室溫下一起培育3小時。用PBS將器官洗滌三次，每次五分鐘，安裝至載玻片上，且使用具有airyscan之Zeiss LSM 880 (Zeiss，Germany)獲得共焦影像。將耳用福馬林固定且用石蠟包埋(FFPE)並製成切片，用發色IHC針對GFP染色，且成像。鼠類啟動子#1 (SEQ ID NO: 5)以高水準在橢圓囊及脊中之支持細胞中表現(圖7A-7D)。具體而言，在含有毛細胞(Pou4f3)及支持細胞(Sall2)之感覺上皮上可見GFP表現(圖7A)。橢圓囊之橫向視圖顯示與Sall2陽性支持細胞核一致、但不與Pou4f3陽性毛細胞核一致之GFP標記(圖7B)。在外植脊中亦可見GFP表現(圖7C)。脊之橫向視圖顯示主要與支持細胞共定位之GFP表現(圖7D)。表現替代同型之鼠類啟動子#2 (SEQ ID NO: 6)僅在橢圓囊中產生弱表現(圖8A-8D)，且在毛細胞及支持細胞中皆偵測到。僅在橢圓囊感覺上皮之小部分中可見GFP表現，該等小部分含有毛細胞(Pou4f3)及支持細胞(Sall2)(圖8A)。橢圓囊之橫向視圖顯示與Sall2陽性支持細胞核亦及Pou4f3陽性毛細胞核之一部分一致之GFP標記(圖8B)。在外植脊中亦可見低水準之GFP表現(圖8C)。脊之橫向視圖顯示主要與支持細胞共定位、但亦出現在非特異性區域中之GFP表現(圖8D)。實例 7. 測定活體內鼠類前庭器官中之 SLC6A14 啟動子活性
為測定活體內SLC6A14啟動子之活性，將驅動包裝至AAV8中之核GFP (來自質體P372)之鼠類SLC6A14啟動子#1 (SEQ ID NO: 5)以9.78×109 vg/耳之劑量藉由注射遞送至成年小鼠之後半規管中。兩週後，隨後藉由CO2 對動物實施安樂死且灌注PBS，然後灌注中性緩衝福馬林(NBF)。移除顳骨且在室溫(RT)下在NBF中固定過夜。自顳骨解剖前庭器官且在室溫下在14% EDTA (BM-150A，Boston BioProducts)中脫鈣過夜。在整個安裝的橢圓囊(圖9A)、小囊(圖9B)及脊(圖9C)中可見GFP表現。
為測定表現之特異性，將整個耳固定，脫鈣，石蠟包埋，且用蘇木素及伊紅(H&E)染色製成切片以使整個組織之橫截面可視化。在小囊、橢圓囊及脊之細胞核中可見穩健的GFP表現，而在耳蝸中未見GFP信號(圖10)。在毛細胞核或間葉細胞核中存在低脫靶GFP信號，此指示此啟動子之特異性。藉由H&E染色及針對GFP蛋白復染來確認啟動子活性之細胞類型特異性以鑒別表現GFP之細胞之核(圖11A)及其中AAV載體基因體之WPRE元件經RNAScope探針標記之相鄰切片(圖11B)。染色顯示前庭器官之支持細胞核中之特異性表現，其中在毛細胞中偵測到極少至無的GFP。在感覺上皮下方之毛細胞、支持細胞及間葉細胞中偵測到大量載體基因體，此指示表現GFP之載體轉導多種細胞類型(圖11B)。然而，僅在支持細胞中偵測到GFP表現(圖11A)。實例 8. 沈默新毛細胞中之 Atoh1 轉殖基因表現經由支持細胞特異性啟動子驅動進一步成熟
為評估啟動子特異性對毛細胞成熟之效應，自雄性C57Bl/6J小鼠(6-8週齡)解剖橢圓囊且培養於37℃及5% CO2 下100 µL含有DMEM/F12以及5% FBS及2.5 µg/ml環丙沙星(ciprofloxacin)之基礎培養基中。將慶大黴素(0.5 mg/mL)添加至培養基中保持24小時以殺死毛細胞，然後洗掉慶大黴素並更換含有劑量為1E12 gc之以下AAV中之一者之250 µL新鮮培養基：AAV8-CMV-Atoh1-2A-H2BGFP (CMV啟動子組)、AAV8-GFAP-Atoh1-2A-H2BGFP (SC特異性啟動子組)、AAV8-RLBP1-Atoh1-2A-H2BGFP (SC特異性啟動子組)。培育一天後，洗掉病毒且將橢圓囊於2 mL新鮮培養基中再培養3天、8天或16天。在培養時段結束時，使橢圓囊解離且捕獲並用10X Genomics Chromium系統製備單細胞用於單細胞RNA-Seq。在Illumina NovaSeq上實施測序，用CellRanger比對對數，且用Seurat實施下游分析。在Seurat中藉由與自胚胎第18天(E18)、出生後第12天(P12)及成年小鼠產生之橢圓囊毛細胞單細胞RNA-Seq特征之資料庫比較產生預測評分。圖12A-12D係顯示經在遍在CMV啟動子或支持細胞(SC)特異性啟動子(GFAP或RLBP1)控制下表現Atoh1之AAV治療之成年橢圓囊外植體中之再生毛細胞之Atoh1轉殖基因表現及成熟預測評分的小提琴圖。Atoh1轉殖基因在SC特異性啟動子組中在再生毛細胞中係以低水準或不可偵測之水準表現(圖12A)，而其在來自CMV組之幾乎所有毛細胞中係以高水準表現。該等結果證實，Atoh1轉殖基因在其由SC特異性啟動子驅動時在再生毛細胞中通常下調。來自SC特異性啟動子組之與P12 (圖12C)及成年毛細胞(圖12D)強相關之單細胞RNA-Seq特征多於來自CMV組之單細胞RNA-Seq特征。相反，來自CMV組之與E18毛細胞(圖12B)強相關之單細胞RNA-Seq特征多於來自SC特異性啟動子組之單細胞RNA-Seq特征。因此，具有SC特異性啟動子之Atoh1轉殖基因之天然沈默驅動再生毛細胞之成熟。實例 9. 構築含有可操作連接至編碼 Atoh1 之多核苷酸之 SLC6A14 啟動子之 AAV 載體
如下產生AAV8載體：將HEK293T細胞(自ATCC，Manassas，VA獲得)接種至細胞培養物處理之皿(15 cm)中且使其生長直至其在容器中達到70-80%鋪滿。使用習用三重轉染方法將質體轉染至293T細胞中：SEQ ID NO: 7之轉移質體，其編碼驅動人類ATOH1 (由SEQ ID NO: 7之核苷酸1083-2144編碼)表現之SLC6A14啟動子(SEQ ID NO: 7之核苷酸233-1066)，且亦含有土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE，SEQ ID NO: 7之核苷酸2155-2702)，並將3’ UTR中之牛生長激素(bGH)多聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO: 7之核苷酸2715-2922)與含有AAV2 rep/AAV8 cap之質體pXR8 (Addgene #112864)及腺病毒輔助質體pXX6-80 (X Xiao等人，J Virol 72(3)，第2224-32頁(1998))以1:1:1莫耳比組合，且將52.3 µg該混合物與PEIMax (Polysciences)組合。將總共52.3 µg該質體混合物遞送至含有細胞之每一15 cm板上。隨後收集細胞培養基及細胞以提取並純化AAV。經由三個冷凍解凍週期自細胞釋放細胞之AAV且收集細胞培養基以獲評分泌之AAV。藉由將PEG8000添加至溶液、在4℃下培育並離心來濃縮細胞培養基之AAV以收集AAV粒子。使所有AAV通過碘克沙醇密度梯度離心以純化AAV粒子，且藉由使經純化AAV及緩衝液通過具有100 kDa分子量截止值之離心管柱將緩衝液更換為含有0.01% pluronic F68之PBS。以類似方式使用適宜轉殖基因質體(其提供啟動子、轉殖基因及轉殖基因表現所需之其他元件)合成本文所述之其他AAV病毒載體。實例 10. 測定活體內鼠類前庭器官中之人類 SLC6A14 啟動子活性
為確定人類SLC6A14啟動子是否亦在活體內前庭支持細胞中有活性，將含有驅動核定向H2B-GFP融合蛋白(SEQ ID NO: 8之核苷酸1083-2198)之表現之人類SLC6A14啟動子(核苷酸233-1066)的SEQ ID NO: 8之轉移質體包裝至AAV8中。將所得AAV8載體以3×1010 vg/耳之劑量藉由注射遞送至雄性8週齡C57BL/6小鼠之後半規管中。兩週後，隨後藉由CO2 對動物實施安樂死且灌注PBS，然後灌注中性緩衝福馬林(NBF)。移除顳骨，顯微解剖出橢圓囊及脊，且針對毛細胞標記物Pou4f3 (1:200, sc-1980, Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Texas，USA)及支持細胞標記物Sall2 (1:200, HPA004162, Atlas Antibodies，Bromma，Sweden)實施螢光免疫標記。將器官安裝於載玻片上且使其在Zeiss LSM 800共焦顯微鏡上成像。在大多數支持細胞中偵測到天然GFP表現(圖13A-13B)。GFP似乎高度局限於支持細胞且未在毛細胞或任何其他非感覺細胞類型中偵測到。實例 11. 測定活體內非人類靈長類動物前庭器官中之人類 SLC6A14 啟動子活性
為測定活體內非人類靈長類動物前庭器官中之SLC6A14啟動子活性，將用於實例10中之相同AAV8載體以1.5×1012 個病毒基因體(vg)/耳之劑量藉由注射遞送至圓窗膜中，該圓窗膜具有為成年食蟹獼猴之側半規管中之流體流出產生之開窗位點。四週後，隨後用氯胺酮(10-15 mg/kg，IM)或泰拉唑(Telazol，5-8 mg/kg，IM)使動物鎮靜且灌注含有肝素(100 U/mL)之PBS，然後灌注中性緩衝福馬林(10% NBF)。移除顳骨並在室溫(RT)下在NBF固定過夜且然後在室溫下在Immunocal (StatLab)溶液中脫鈣。
以兩種方式檢查GFP表現：顯微解剖出前庭器官且使其成像，將整片或整耳用石蠟包埋並製成切片以使耳所有區域中之表現可視化。對於整片器官，用DAPI對核進行復染，安裝於載玻片上，且在Zeiss LSM 880共焦顯微鏡上成像。對於各切片，實施免疫標記以偵測GFP，此乃因石蠟包埋過程使天然GFP信號淬滅。脫蠟並抗原修復後，用針對GFP之兔一級抗體(Abcam，ab183734)及結合至鹼性磷酸酶之抗兔二級抗體標記切片以使用快紅染料使發紅色之染色顯影。使用蘇木素將切片復染成藍色。實例資料顯示橢圓囊中之GFP表現。與在小鼠中所觀察到之結果類似，GFP表現局限於感覺上皮，且在非感覺細胞中未偵測到表現(圖14A)。在支持細胞中偵測到穩健的GFP表現(圖14B)。實例 12. 在小鼠 IDPN 損傷模型中在活體內經由 SLC6A14 啟動子驅動之 ATOH1 過表現使前庭毛細胞再生
吾人隨後評價在成年小鼠活體內在殺死預先存在之毛細胞後，由人類SLC6A14啟動子驅動之轉錄因子ATOH1之表現是否能夠將前庭支持細胞轉化成新毛細胞。為損傷毛細胞，對雄性8週齡C57BL/6小鼠稱重且腹膜內注射PBS中之4 mg/kg無菌3,3'-亞胺基二丙腈(TCI America，I0010)。將含有編碼驅動人類ATOH1 (SEQ ID NO: 9之核苷酸1083-2144)之表現且共表現核靶向綠色螢光蛋白(GFP融合至組織蛋白2b基因之H2B片段-SEQ ID NO: 9之核苷酸2217-3332)之人類SEQ ID NO:4之SLC6A14啟動子(SEQ ID NO: 9之核苷酸233-1066)、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE，SEQ ID NO: 9之核苷酸3341-3888)及3’ UTR中之牛生長激素(bGH)多聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO: 9之核苷酸3901-4108)之表現盒的SEQ ID NO: 9之質體以7.3×1012 vg/mL之效價包裝至AAV8中。將此AAV8載體以7.3×109 vg/耳之劑量投與雄性8週齡C57BL/6小鼠(n=6)之後半規管中。6週後，隨後藉由CO2 對動物實施安樂死且灌注PBS，然後灌注中性緩衝福馬林(NBF)。移除顳骨，顯微解剖出橢圓囊，且針對毛細胞標記物Pou4f3 (1:200, sc-81980, Santa Cruz Biotechnology)及支持細胞標記物Sall2 (1:200, HPA004162, Atlas Antibodies)實施螢光免疫標記。將器官安裝於載玻片上且使其在Zeiss LSM 800共焦顯微鏡上成像。共焦影像之定性觀察揭露與對側耳之未經治療之橢圓囊相比，經載體治療之橢圓囊中之毛細胞數明顯增加(如用Pou4f3標記所評價) (圖15A)。使用Imaris軟體中之3D計數自動化演算法定量量測毛細胞數確認存在顯著增加(圖15B)。實例 13. 在小鼠 IDPN 損傷模型中在活體內編碼 SLC6A14 啟動子驅動之 ATOH1 表現盒之 AAV 載體之劑量反應
利用實例12中所述之相同方法及載體，吾人亦藉由以1×109 、5×109 、1×1010 及2×1010 vg/耳之劑量遞送載體來評價毛細胞再生效應之劑量依賴性(n=8隻小鼠/劑量)。在所有測試劑量下，經治療之(左)耳與未經治療之(右)耳之間之動物內毛細胞數差異之量化揭露顯著再生，且明顯劑量依賴性停留在2×1010 vg/耳處(圖16)。實例 14. 在小鼠慶大黴素損傷模型中在活體內經由 SLC6A14 啟動子驅動之 ATOH1 過表現使前庭毛細胞再生
為確定在替代損傷模型中是否可觀察到類似再生反應，將實例12及13中所述之相同SLC6A14-ATOH-H2BGFP AAV8載體遞送至成年小鼠，其中藉由局部遞送胺基糖苷抗生素慶大黴素損傷前庭毛細胞。具體而言，經由間隔三天之三次經鼓室注射將400 mg/mL慶大黴素遞送至8週齡雄性C57BL/6小鼠之中耳。兩週後，將AAV8載體以2×1010 vg/耳之劑量遞送至後半規管中(n=12隻小鼠)。對於對照小鼠，將等體積之PBS (1 µL)注射至後半規管中(n=14隻小鼠)。在病毒遞送後4週將小鼠殺死，且如實例12中所述處理耳並量化。為確認慶大黴素成功地損傷毛細胞，亦殺死幼稚小鼠(n=12)用於比較。Pou4f3+毛細胞之量化揭露慶大黴素顯著減少橢圓囊中之毛細胞計數，且表現ATOH1之AAV8載體顯著增加毛細胞數(圖17A-17B)。實例 15. 向患有前庭功能障礙之個體投與含有含 SLC6A14 啟動子之核酸載體之組合物
根據本文所揭示之方法，熟習此項技術者可治療患有前庭功能障礙之患者(例如人類患者)以改良或恢復前庭功能。為此，熟習此項技術之醫師可向人類患者投與含有AAV載體(例如AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80、7m8、PHP.B、PHP.eB或PHP.S)之組合物，該AAV載體含有可操作連接至編碼治療蛋白(例如無調BHLH轉錄因子1 (Atoh1)之轉殖基因)之SLC6A14啟動子(例如與表2中所列出之多核苷酸序列中之任一者(例如SEQ ID NO: 1-6中任一者之多核苷酸)具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸)。在一個實例中，載體具有AAV8衣殼且含有SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922。含有AAV載體之組合物可例如藉由局部投與內耳(例如注射至半規管中)來投與患者，以治療前庭功能障礙。
在將組合物投與患者後，熟習此項技術者可藉由多種方法監測由轉殖基因編碼之治療蛋白之表現及患者因應療法之改良。舉例而言，醫師可藉由實施標準測試(例如眼震電圖、視頻眼震圖、VOR測試(例如頭部衝擊測試(哈-克測試，例如VHIT)或熱量反射測試)、旋轉測試、前庭引發之肌源性電勢或電腦化動態姿勢儀)來監測患者之前庭功能。與投與組合物之前獲得之測試結果相比，患者在投與組合物後在一或多個測試中展現改良之前庭功能指示患者對治療之反應良好。可視需要確定及投與後續劑量。
本發明之例示性實施例闡述於以下所列舉段落中。
E1. 一種核酸載體，其包含與SEQ ID NO: 1-6中之任一者具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)之多核苷酸。
E2. 如E1之核酸載體，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 4具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E3. 如E1之核酸載體，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E4. 如E1之核酸載體，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 5具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E5. 如E1之核酸載體，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 6具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E6. 如E1之核酸載體，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 2具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E7. 如E1之核酸載體，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 1具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E8. 如E1-E7中任一者之核酸載體，其中多核苷酸可操作連接至轉殖基因。
E9. 如E8之核酸載體，其中轉殖基因係異源轉殖基因。
E10.      如E8或E9之核酸載體，其中轉殖基因編碼蛋白質、短干擾RNA (siRNA)、反義寡核苷酸(ASO)、核酸酶，或為微小RNA。
E11.      如E10之核酸載體，其中多核苷酸能夠引導蛋白質、siRNA、ASO、核酸酶或微小RNA在哺乳動物VSC中之前庭支持細胞(VSC)特異性表現。
E12.      如E11之核酸載體，其中VSC係人類VSC。
E13.      如E10-E12中任一者之核酸載體，其中蛋白質係治療蛋白，且其中治療蛋白係婆羅雙樹樣轉錄因子2 (Sall2)、攜鈣蛋白結合轉錄活化劑1 (Camta1)、具有YRPW基序2之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey2)、Gata結合蛋白2 (Gata2)、具有YRPW基序1之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey1)、神經醯胺合酶2 (Lass2)、SRY框10 (Sox10)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、Cut樣同源異形框1 (Cux1)、核受體亞家族2 F族成員(Nr2f1)、Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hes1)、RAR相關孤兒受體B (Rorb)、Jun原癌基因AP-1轉錄因子次單元(Jun)、鋅指蛋白667 (Zfp667)、LIM同源異形框3 (Lhx3)、無義螺旋-環-螺旋1 (Nhlh1)、MAX二聚化蛋白4 (Mxd4)、MIZ1型鋅指(Zmiz1)、髓磷脂轉錄因子1 (Myt1)、信號轉導子及轉錄活化劑3 (Stat3)、BarH樣同源異形框1 (Barhl1)、胸腺細胞選擇相關之高遷移率族蛋白框(Tox)、Prospero同源異形框1 (Prox1)、核因子I A (Nfia)、甲狀腺激素受體β (Thrb)、MYCL原癌基因BHLH轉錄因子(Mycl1)、離胺酸去甲基酶5A (Kdm5a)、CAMP反應元件結合蛋白3反應元件樣4 (Creb3I4)、ETS變異體1 (Etv1)、父系表現之3 (Peg3)、BTB結構域及CNC同系物2 (Bach2)、ISL LIM同源異形框1 (Isl1)、鋅指及含BTB結構域之38 (Zbtb38)、肢芽及心臟發育(Lbh)、桶狀家族二分轉錄因子(Tub)、泛素C (Hmg20)、RE1沈默轉錄因子(Rest)、鋅指蛋白827 (Zfp827)、AF4/FMR2家族成員3 (Aff3)、PBX/有節的1同源異形框2 (Pknox2)、富含AT之相互作用結構域3B (Arid3b)、MLX相互作用蛋白(Mlxip)、鋅指蛋白(Zfp532)、IKAROS家族鋅指2 (Ikzf2)、婆羅雙樹樣轉錄因子1 (Sall1)、SIX同源異形框2 (Six2)、婆羅雙樹樣轉錄因子3 (Sall3)、Lin-28同系物B (Lin28b)、調節因子X7 (Rfx7)、腦源性神經營養因子(Bdnf)、非生長因子依賴性1轉錄抑制子(Gfi1)、POU 4類同源異形框3 (Pou4f3)、MYC原癌基因BHLH轉錄因子(Myc)、β-連環蛋白(Ctnnb1)、SRY框2 (Sox2)、SRY框4 (Sox4)、SRY框11 (Sox11)、TEA結構域轉錄因子2 (Tead2)、無調BHLH轉錄因子1 (Atoh1)或Atoh1變異體。
E14.      如E13之核酸載體，其中治療蛋白係Atoh1。
E15.      如E13之核酸載體，其中Atoh1變異體具有一或多個選自由以下組成之群之胺基酸取代：S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A及S328A/S331A/S334。
E16.      如E1-E15中任一者之核酸載體，其中核酸載體係病毒載體、質體、黏粒或人工染色體。
E17.      如E16之核酸載體，其中核酸載體係選自由以下組成之群之病毒載體：腺相關病毒(AAV)、腺病毒及慢病毒。
E18.      如E17之核酸載體，其中病毒載體係AAV載體。
E19.      如E18之核酸載體，其中AAV載體具有AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、rh10、rh39、rh43、rh74、Anc80、Anc80L65、DJ/8、DJ/9、7m8、PHP.B、PHP.eB或PHP.S衣殼。
E20.      一種組合物，其包含如E1-E19中任一者之核酸載體。
E21.      如E20之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
E22.      一種多核苷酸，其與可操作連接至轉殖基因之SEQ ID NO: 1-6中之任一者具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E23.      如E22之多核苷酸，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 4具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E24.      如E22之多核苷酸，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E25.      如E22之多核苷酸，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 5具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E26.      如E22之多核苷酸，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 6具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E27.      如E22之多核苷酸，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 2具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E28.      如E22之多核苷酸，其中多核苷酸與SEQ ID NO: 1具有至少85%序列一致性(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)。
E29.      如E22-E28中任一者之多核苷酸，其中轉殖基因係異源轉殖基因。
E30.      如E29之多核苷酸，其中轉殖基因編碼蛋白質、siRNA、ASO、核酸酶，或為微小RNA。
E31.      如E30之多核苷酸，其中蛋白質係治療蛋白，且其中治療蛋白係Sox9、Sall2、Camta1、Hey2、Gata2、Hey1、Lass2、Sox10、Gata3、Cux1、Nr2f1、Hes1、Rorb、Jun、Zfp667、Lhx3、Nhlh1、Mxd4、Zmiz1、Myt1、Stat3、Barhl1、Tox、Prox1、Nfia、Thrb、Mycl1、Kdm5a、Creb314、Etv1、Peg3、Bach2、Isl1、Zbtb38、Lbh、Tub、Hmg20、Rest、Zfp827、Aff3、Pknox2、Arid3b、Mlxip、Zfp532、Ikzf2、Sall1、Six2、Sall3、Lin28b、Rfx7、Bdnf、Gfi1、Pou4f3、Myc、Ctnnb1、Sox2、Sox4、Sox11、Tead2、Atoh1或Atoh1變異體。
E32.      如E31之多核苷酸，其中治療蛋白係Atoh1。
E33.      一種細胞，其包含如E22-E32中任一者之多核苷酸或如E1-E19中任一者之核酸載體。
E34.      如E33之細胞，其中細胞係哺乳動物VSC。
E35.      如E34之細胞，其中哺乳動物VSC係人類VSC。
E36.      一種在哺乳動物VSC中表現轉殖基因之方法，其包括使哺乳動物VSC與如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物接觸。
E37.      如E36之方法，其中轉殖基因在VSC中特異性表現。
E38.      如E36或E37之方法，其中哺乳動物VSC係人類VSC。
E39.      一種治療患有前庭功能障礙或具有患上該疾病之風險之個體的方法，其包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E40.      如E39之方法，其中前庭功能障礙包括暈眩、眩暈、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下、振動幻視或平衡病症。
E41.      如E39或E40之方法，其中前庭功能障礙係年齡相關之前庭功能障礙、頭部創傷相關之前庭功能障礙、疾病或感染相關之前庭功能障礙或耳毒性藥物誘導之前庭功能障礙。
E42.      如E39-E41中任一者之方法，其中前庭功能障礙與遺傳突變相關。
E43.      一種誘導或增加有需要之個體之前庭毛細胞再生之方法，其包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E44.      一種誘導或增加有需要之個體之VSC增殖之方法，其包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E45.      一種誘導或增加有需要之個體之前庭毛細胞增殖之方法，其包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E46.      一種誘導或增加有需要之個體之前庭毛細胞成熟(例如再生毛細胞之成熟)之方法，該方法包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E47.      一種誘導或增加有需要之個體之前庭毛細胞神經分佈之方法，該方法包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E48.      一種增加有需要之個體之VSC及/或前庭毛細胞存活之方法，該方法包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E49.      如E43-E48中任一者之方法，其中個體患有前庭功能障礙(例如暈眩、眩暈、不平衡、雙側前庭病、雙側前庭功能低下、振動幻視或平衡病症)或具有患上該疾病之風險。
E50.      一種治療患有雙側前庭病或具有患上該疾病之風險之個體的方法，該方法包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E51.      一種治療患有雙側前庭功能低下或具有患上該疾病之風險之個體的方法，該方法包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E52.      如E51之方法，其中雙側前庭功能低下係耳毒性藥物誘導之雙側前庭功能低下。
E53.      如E41或E52之方法，其中耳毒性藥物係選自由以下組成之群：胺基糖苷、抗腫瘤藥物、依他尼酸、呋塞米、水楊酸鹽及奎寧。
E54.      一種治療患有振動幻視或具有患上該疾病之風險之個體的方法，該方法包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E55.      一種個體患有平衡病症或具有患上該疾病之風險之治療的方法，該方法包括向個體投與有效量之如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。
E56.      如E39-E55中任一者之方法，其中該方法進一步包括在投與核酸載體或組合物之前評估個體之前庭功能。
E57.      如E39-E56中任一者之方法，其中該方法進一步包括在投與核酸載體或組合物之後評估個體之前庭功能。
E58.      如E39-E57中任一者之方法，其中核酸載體或組合物係經局部投與。
E59.      如E58之方法，其中核酸載體或組合物係投與半規管。
E60.      如E58之方法，其中核酸載體或組合物係經鼓室或鼓室內投與。
E61.      如E58之方法，其中核酸載體或組合物係投與外淋巴中。
E62.      如E58之方法，其中核酸載體或組合物係投與內淋巴中。
E63.      如E58之方法，其中核酸載體或組合物係投與卵圓窗或經由卵圓窗投與。
E64.      如E58之方法，其中核酸載體或組合物係投與圓窗或經由圓窗投與。
E65.      如E39-E64中任一者之方法，其中核酸載體或組合物係以足以預防或減輕前庭功能障礙、延遲前庭功能障礙之發生、減緩前庭功能障礙之進展、改良前庭功能、增加前庭毛細胞數、增加前庭毛細胞成熟(例如再生毛細胞之成熟)、增加前庭毛細胞增殖、增加前庭毛細胞再生、增加前庭毛細胞神經分佈、增加VSC增殖、增加VSC數、增加VSC存活、增加前庭毛細胞存活或改良VSC功能之量投與。
E66.      如E39-E65中任一者之方法，其中個體係人類。
E67.      一種套組，其包含如E1-E19中任一者之核酸載體或如E20或E21之組合物。其他實施例
在不脫離本發明之範圍及精神之情況下，熟習此項技術者將明了所述發明之各種修改及變化。儘管已結合特定實施例闡述了本發明，但應理解，所主張之本發明不應不適當地限於該等特定實施例。實際上，對熟習此項技術者顯而易見之用於實施本發明之所述模式之各種修改意欲在本發明之範圍內。其他實施例在申請專利範圍中。
圖 1A-1B 係顯示如藉由單細胞RNA測序所量測之小鼠內耳組織中之溶質載劑家族6成員14 (SLC6A14)表現的一系列小提琴圖。僅在耳蝸細胞類型中觀察到SLC6A14之背景表現(圖1A)。在支持細胞橢圓囊及脊中可見穩健的SLC6A14表現(圖1B)。圖 2 顯示使用ARCHS4資料庫分析多種組織之大量細胞株中之SLC6A14表現。HepG2細胞株(人類肝癌)係具有內源SLC6A14之最高中點表現之三種細胞株中之一者。圖 3 係顯示不同腺相關病毒(AAV)血清型在HepG2細胞中之轉導效率之條形圖。將巨細胞病毒(CMV)-人類組織蛋白H2B-綠色螢光蛋白(GFP)報導基因包裝至腺相關病毒(AAV) 1、AAV8及AAV9衣殼中且以1×106 個載體基因體(vg)/細胞之感染複數(MOI)轉導至HepG2細胞中。若藉由流式細胞術分析之細胞產生之GFP信號大於在未經轉導(NT)之細胞中量測之背景，則將該等藉由流式細胞術分析之細胞計數為GFP陽性。圖 4A-4B 係顯示經SLC6A14啟動子質體轉染之HepG2細胞中之GFP表現之一系列條形圖。用編碼CMV或SLC6A14啟動子之三種變異體中之一者之質體轉導HepG2細胞。自所有測試之質體觀察到可偵測GFP信號，該等質體包括含有SLC6A14啟動子之質體(即含有SEQ ID NO: 3之啟動子序列之P335 SLC6A14 hum v1；含有SEQ ID NO: 5之啟動子序列之P372 Slc6a14 mus；及含有SEQ ID NO: 4之啟動子序列之P530 SLC6A14 hum v2)，如藉由流式細胞術所偵測(圖4A)。經過濾為GFP陽性之細胞產生強於CMV對照之GFP信號(圖4B)。圖 5A-5E 係顯示在多個啟動子控制下經核GFP轉染之HepG2細胞之一系列螢光影像。在未經轉染之對照細胞中未見GFP信號(圖5A)。對四種不同質體觀察到GFP陽性核，包括P329 CMV (圖5B)、P335 SLC6A14 v1 (含有SEQ ID NO: 3之啟動子序列；圖5C)、P372 SLC6A14 v1 (含有SEQ ID NO: 5之啟動子序列；圖5D)及P530 SLC6A14 v2 (含有SEQ ID NO: 4之啟動子序列；圖5E)。圖 6 顯示在多個啟動子控制下用編碼GFP之AAV8載體轉導HepG2細胞，該多個啟動子包括CMV、SLC6A14 (鼠類啟動子#1；SEQ ID NO: 5)、SLC6A14 (鼠類啟動子#2；SEQ ID NO: 6)、SLC6A14 (人類啟動子#3；SEQ ID NO: 3)及SLC6A14 (人類啟動子#4；SEQ ID NO: 4)。細胞係以1×106 vg/細胞之MOI轉導。所有啟動子產生GFP陽性細胞，此指示啟動子在經病毒遞送時係功能性啟動子。圖 7A-7D 係顯示在SLC6A14鼠類啟動子#1 (SEQ ID NO: 5)控制下GFP之病毒轉導之一系列螢光影像。在感覺上皮中可見GFP表現，該感覺上皮含有毛細胞(POU 4類同源異形框3 (Pou4f3))及支持細胞(婆羅雙樹樣轉錄因子2 (Sall2)；圖7A)。橢圓囊之橫向視圖顯示與Sall2陽性支持細胞核一致、但不與Pou4f3陽性毛細胞核一致之GFP標記(圖7B)。在外植脊中亦可見GFP表現(圖7C)。脊之橫向視圖顯示主要與支持細胞共定位之GFP表現(圖7D)。圖 8A-8D 係顯示在SLC6A14鼠類啟動子#2 (SEQ ID NO: 6)控制下GFP之病毒轉導之一系列螢光影像。僅在橢圓囊感覺上皮之小部分中可見GFP表現，該等小部分含有毛細胞(Pou4f3)及支持細胞(Sall2；圖8A)。橢圓囊之橫向視圖顯示與Sall2陽性支持細胞核亦及Pou4f3陽性毛細胞核之一部分一致之GFP標記(圖8B)。在外植脊中亦可見低水準之GFP表現(圖8C)。脊之橫向視圖顯示主要與支持細胞共定位、但亦出現在非特異性區域中之GFP表現(圖8D)。圖 9A-9C 係顯示在經由局部注射將AAV8-SLC6A14鼠類啟動子#1 (SEQ ID NO: 5)-H2B-GFP之病毒載體遞送至成年小鼠之後半規管中後，小鼠前庭器官中之GFP表現之一系列螢光影像。在局部遞送SLC6A14啟動子AAV後在鼠類內耳之橢圓囊(圖9A)、小囊(圖9B)及脊(圖9C)中可見GFP表現。圖 10 係顯示GFP表現在內耳組織中之特異性之一系列影像。針對GFP蛋白進行小鼠內耳之內耳蘇木素及伊紅(H&E)染色之復染以鑒別耳蝸之小囊、橢圓囊、脊及窩管中表現GFP之細胞之核。影像之上圖顯示蘇木素及GFP染色。然後對影像濾色以自原始RGB影像僅提取紅色通道(GFP)來突出顯示GFP染色，如影像之下圖中所顯示。染色顯示前庭器官之支持細胞核中之特異性表現，其中在毛細胞中偵測到極少至無的GFP。在耳蝸組織(包括Corti器官或血管紋)中未偵測到GFP。圖 11A-11B 係顯示SLC6A14啟動子將GFP表現局限於支持細胞之一系列影像。針對GFP對小鼠內耳之內耳H&E切片進行復染蛋白以鑒別表現GFP之細胞之核(圖11A)。在相鄰切片中，用RNAScope探針標記AAV載體基因體之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE) (圖11B)。對於所顯示之每一切片，然後對影像濾色以自原始RGB影像提取紅色通道來突出顯示GFP染色(圖11A)或RNAScope染色(圖11B)，如圖11A-11B中每一者之右圖所顯示。可在感覺上皮下方之毛細胞、支持細胞及間葉細胞中偵測到大量載體基因體，此指示表現GFP之載體轉導多種細胞類型。然而，僅在支持細胞中偵測到GFP表現。圖 12A-12D 係顯示沈默新毛細胞中之Atoh1轉殖基因表現經由支持細胞特異性啟動子驅動進一步成熟之一系列圖。自雄性C57Bl/6J小鼠(6-8週齡)解剖橢圓囊且培養於100 µl之基礎培養基中。將慶大黴素(Gentamicin，0.5 mg/mL)添加至培養基中保持24小時以殺死毛細胞，然後洗掉慶大黴素並更換含有劑量為1E12 gc之以下AAV中之一者之250 µL新鮮培養基：AAV8-CMV-Atoh1-2A-H2BGFP (CMV啟動子組)、AAV8-GFAP-Atoh1-2A-H2BGFP (支持細胞(SC)特異性啟動子組)或AAV8-RLBP1-Atoh1-2A-H2BGFP (SC特異性啟動子組)。培育一天後，洗掉病毒且將橢圓囊於2 mL新鮮培養基中再培養3天、8天或16天。在培養時段結束時，使橢圓囊解離且捕獲並製備單細胞用於單細胞RNA-Seq。在Seurat中藉由與自胚胎第18天(E18)、出生後第12天(P12)及成年小鼠產生之橢圓囊毛細胞單細胞RNA-Seq特征之資料庫比較產生預測評分。產生小提琴圖以顯示成年橢圓囊外植體中再生毛細胞之Atoh1轉殖基因表現及成熟預測評分。Atoh1轉殖基因在SC特異性啟動子組中在再生毛細胞中係以低水準或不可偵測之水準表現，而其在來自CMV組之幾乎所有毛細胞中係以高水準表現(圖12A)。該等結果證實，Atoh1轉殖基因在其由SC特異性啟動子驅動時在再生毛細胞中通常下調。另外，來自SC特異性啟動子組之與P12 (圖12C)及成年毛細胞(圖12D)強相關之單細胞RNA-Seq特征多於來自CMV組之單細胞RNA-Seq特征。相反，來自CMV組之與E18毛細胞(圖12B)強相關之單細胞RNA-Seq特征多於來自SC特異性啟動子組之單細胞RNA-Seq特征。因此，具有SC特異性啟動子之Atoh1轉殖基因之天然沈默誘導再生毛細胞之成熟。圖 13A-13B 係顯示人類SLC6A14啟動子亦將GFP表現局限於小鼠前庭支持細胞之一系列影像。圖13A顯示已注射有AAV8載體之成年小鼠之平面安裝之橢圓囊(頂部3圖)及後脊(底部3圖)之最大強度共焦z-堆疊投影，該AAV8載體含有驅動H2B-GFP表現(產生GFP之核表現)之人類SLC6A14啟動子(SEQ ID NO:4)。用DAPI標記所有核(每圖中之第一影像)，且用針對Sall2之抗體對支持細胞核進行免疫標記(每圖中之第二影像)。非感覺細胞之DAPI標記延伸超出由Sall2分界之感覺上皮之區域。核GFP表現(每圖中之第三影像)限於感覺上皮且未延伸至由Sall2標記之區域。圖13B顯示經由圖13A中所示之橢圓囊之共焦z-堆疊之正交橫截面。自圖之頂部至底部，DAPI標記顯示毛細胞核之假複層、毛細胞核下方之支持細胞核單層及支持細胞下方之間葉細胞核。Sall2標記局限於支持細胞核及毛細胞核之小亞組。Pou4f3標記所有毛細胞核。GFP表現嚴密地僅局限於支持細胞核，此證實啟動子序列之特異性。圖 14A-14B 係展示人類SLC6A14啟動子在非人類靈長類動物中之活性之一系列影像。圖14A顯示注射有AAV8載體之成年非人類靈長類動物之平面安裝之橢圓囊之最大強度共焦z-堆疊投影，該AAV8載體含有驅動H2B-GFP表現(產生GFP之核表現)之人類SLC6A14啟動子(SEQ ID NO:4)。用DAPI標記所有核。核GFP表現局限於感覺上皮且未延伸至非感覺上皮中(在右圖中，感覺上皮與非感覺上皮之間之邊緣係由虛線分界)。圖14B顯示經H&E染色(上方影像)且然後經濾色以自原始RGB影像去除紅色通道來突出顯示GFP染色之橢圓囊之FFPE切片。在大多數支持細胞中偵測到核GFP表現(深色核)。圖 15A-15B 展示含有人類SLC6A14啟動子之AAV8載體在活體內IDPN損傷小鼠模型中驅動ATOH1再生毛細胞之表現。圖15A顯示成年小鼠之右耳及左耳之平面安裝之橢圓囊之最大強度共焦z-堆疊投影，向該成年小鼠全身投與3,3'-亞胺基二丙腈(IDPN)以殺死前庭毛細胞且然後局部注射含有人類SLC6A14啟動子之AAV8載體，該人類SLC6A14啟動子驅動ATOH1及H2B-GFP融合蛋白(核GFP)在左耳中之共表現。用針對Pou4f3之抗體對毛細胞進行免疫標記。未經治療之右耳(左圖)顯示與經治療之左耳(右圖)相比毛細胞密度之明顯減小。圖15B係顯示經治療對未經治療之耳中Pou4f3+ 細胞之量化之橫條圖。治療之耳顯示與未經治療之耳相比毛細胞之統計學上顯著之增加(n=6，司徒頓氏t測試(Student’s t-test)，p＜0.01)。圖 16 係展示活體內IDPN損傷小鼠模型中因應AAV8載體之毛細胞再生之圖，該AAV8載體含有驅動ATOH1及H2B-GFP融合蛋白(核GFP)在四種不同載體劑量下之共表現之人類SLC6A14啟動子。用針對Pou4f3之抗體對毛細胞進行免疫標記且藉由自每隻小鼠之經治療左耳中之計數減去未經治療之右耳中之計數來確定再生毛細胞數。誤差條顯示S.E.M。圖 17A-17B 展示在成年小鼠慶大黴素損傷模型中含有驅動ATOH1表現之人類SLC6A14啟動子之AAV8載體使活體內毛細胞再生之能力。圖17A顯示成年小鼠之平面安裝之橢圓囊之一系列最大強度共焦z-堆疊投影，向該等成年小鼠之左耳局部投與慶大黴素以殺死前庭毛細胞且然後注射AAV8載體，該AAV8載體含有驅動ATOH1及H2B-GFP融合蛋白(核GFP) (「AAV.ATOH1」)在同一耳中之共表現之人類SLC6A14啟動子。用針對Pou4f3之抗體對毛細胞進行免疫標記。媒劑治療之慶大黴素損傷(「Gent (鹽水)」)之橢圓囊顯示與AAV8載體治療之慶大黴素損傷之橢圓囊(「AAV.ATOH1」)相比毛細胞密度明顯減小。與媒劑對照橢圓囊相比，ATOH1治療之橢圓囊中之毛細胞密度似乎增加。圖17B係顯示用於多種治療之Pou4f3+核之量化之散佈圖。與慶大黴素損傷之媒劑治療之耳相比，AAV8慶大黴素損傷之載體治療之耳顯示毛細胞數顯著增加(n=12-14，ANOVA及圖基氏測試(Tukey’s test)，p＜0.05)。圖 18 係SEQ ID NO: 7之轉殖基因質體(質體P760)之圖。圖 19 係SEQ ID NO: 9之轉殖基因質體(質體P530)之圖。圖 20 係SEQ ID NO: 8之轉殖基因質體(質體P625)之圖。圖 21 係含有SEQ ID NO: 3之人類SLC6A14啟動子之轉殖基因質體P335之圖。圖 22 係含有SEQ ID NO: 5之小鼠SLC6A14啟動子之轉殖基因質體P372之圖。圖 23 係含有SEQ ID NO: 6之小鼠SLC6A14啟動子之轉殖基因質體P373之圖。序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式以電子方式提交且全文皆以引用方式併入本文中。ASCII拷貝創建於2020年10月27日，命名為51471-006WO3_Sequence_Listing_10.27.20_ST25且大小為46,466個位元組。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (14)

  1. 一種核酸載體，其包含： a. 溶質載劑家族6成員14 (SLC6A14)啟動子，其包含與SEQ ID NO: 1-6中之任一者具有至少85%序列一致性之核苷酸序列，該啟動子可操作連接至： b.      異源轉殖基因，其中該轉殖基因編碼治療蛋白、短干擾RNA (siRNA)、反義寡核苷酸(ASO)、核酸酶，或為微小RNA。
  2. 如請求項1之核酸載體，其中該SLC6A14啟動子包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。
  3. 如請求項2之核酸載體，其中該SLC6A14啟動子包含該SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之核酸載體，其中該轉殖基因編碼治療蛋白。
  5. 如請求項4之核酸載體，其中該治療蛋白係選自由以下組成之群：無調BHLH轉錄因子1 (Atoh1)、婆羅雙樹樣轉錄因子2 (Sall2)、攜鈣蛋白結合轉錄活化劑1 (Camta1)、具有YRPW基序2之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey2)、Gata結合蛋白2 (Gata2)、具有YRPW基序1之Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hey1)、神經醯胺合酶2 (Lass2)、SRY框10 (Sox10)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、Cut樣同源異形框1 (Cux1)、核受體亞家族2 F族成員(Nr2f1)、Hes相關家族BHLH轉錄因子(Hes1)、RAR相關孤兒受體B (Rorb)、Jun原癌基因AP-1轉錄因子次單元(Jun)、鋅指蛋白667 (Zfp667)、LIM同源異形框3 (Lhx3)、無義螺旋-環-螺旋1 (Nhlh1)、MAX二聚化蛋白4 (Mxd4)、MIZ1型鋅指(Zmiz1)、髓磷脂轉錄因子1 (Myt1)、信號轉導子及轉錄活化劑3 (Stat3)、BarH樣同源異形框1 (Barhl1)、胸腺細胞選擇相關之高遷移率族蛋白框(Tox)、Prospero同源異形框1 (Prox1)、核因子I A (Nfia)、甲狀腺激素受體β (Thrb)、MYCL原癌基因BHLH轉錄因子(Mycl1)、離胺酸去甲基酶5A (Kdm5a)、CAMP反應元件結合蛋白3反應元件樣4 (Creb3I4)、ETS變異體1 (Etv1)、父系表現之3 (Peg3)、BTB結構域及CNC同系物2 (Bach2)、ISL LIM同源異形框1 (Isl1)、鋅指及含BTB結構域之38 (Zbtb38)、肢芽及心臟發育(Lbh)、桶狀家族二分轉錄因子(Tub)、泛素C (Hmg20)、RE1沈默轉錄因子(Rest)、鋅指蛋白827 (Zfp827)、AF4/FMR2家族成員3 (Aff3)、PBX/有節的1同源異形框2 (Pknox2)、富含AT之相互作用結構域3B (Arid3b)、MLX相互作用蛋白(Mlxip)、鋅指蛋白(Zfp532)、IKAROS家族鋅指2 (Ikzf2)、婆羅雙樹樣轉錄因子1 (Sall1)、SIX同源異形框2 (Six2)、婆羅雙樹樣轉錄因子3 (Sall3)、Lin-28同系物B (Lin28b)、調節因子X7 (Rfx7)、腦源性神經營養因子(Bdnf)、非生長因子依賴性1轉錄抑制子(Gfi1)、POU 4類同源異形框3 (Pou4f3)、MYC原癌基因BHLH轉錄因子(Myc)、β-連環蛋白(Ctnnb1)、SRY框2 (Sox2)、SRY框4 (Sox4)、SRY框11 (Sox11)、TEA結構域轉錄因子2 (Tead2)及Atoh1變異體。
  6. 如請求項5之核酸載體，其中該治療蛋白係Atoh1。
  7. 如請求項1至6中任一項之核酸載體，其中該核酸載體另外包含該SLC6A14啟動子5’之第一反向末端重複；及該異源轉殖基因3’且以5’至3’順序，視情況存在之轉錄後調節元件、多聚腺苷酸化信號及第二反向末端重複。
  8. 如請求項7之核酸載體，其包含SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922、SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922 5’之第一反向末端重複，其中該5’反向末端重複與SEQ ID NO: 7之核苷酸1-130具有至少80%序列一致性；及SEQ ID NO: 7之核苷酸233-2922 3’之第二反向末端重複，其中該3’反向末端重複與SEQ ID NO: 7之核苷酸3010-3139具有至少80%序列一致性。
  9. 如請求項1至8中任一項之核酸載體，其中該核酸載體係質體。
  10. 如請求項1至8中任一項之核酸載體，其中該核酸載體係AAV病毒載體。
  11. 如請求項10之核酸載體，其中該AAV病毒載體具有AAV8衣殼。
  12. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之核酸載體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  13. 一種在哺乳動物前庭支持細胞(VSC)中表現轉殖基因之方法，其包括使該哺乳動物VSC與如請求項1至11中任一項之核酸載體或如請求項12之組合物接觸。
  14. 如請求項13之方法，其中該哺乳動物VSC係人類VSC。
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