KR20180117628A - 내이 지지 세포의 확장 및 분화 및 그의 사용 방법 - Google Patents

내이 지지 세포의 확장 및 분화 및 그의 사용 방법 Download PDF

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KR20180117628A
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앨버트 에지
마이클 베누티
아그니에시카 체코비치
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매사추세츠 아이 앤드 이어 인퍼머리
데시벨 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)를 확장시키고 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)를 내이 유모 세포 (예를 들어, 어토널 호몰로그 1 (Atoh1)+ 내이 유모 세포)로 분화시키는 방법 및 예를 들어, 청각 상실 및 균형 상실의 치료를 위한 후보 치료 화합물을 확인하기 위한 내이 지지 세포 및 유모 세포의 용도에 관한 것이다. 추가적으로, 본원에 기재된 방법은 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증가된 증식 및 분화로부터 이익을 얻을 청각 상실 및 균형 상실을 갖는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.

Description

내이 지지 세포의 확장 및 분화 및 그의 사용 방법
우선권 주장
본 출원은 2016년 1월 29일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/288,958을 우선권 주장한다. 상기 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
포유동물의 내이의 감각 상피로부터의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)를 확장시키고 분화시키는 방법, 및 예를 들어, 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 치료 화합물을 확인하기 위한 확장된 세포의 용도가 본원에 기재된다. 추가적으로, 본원에 기재된 방법은 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증가된 증식, 및 내이 유모 세포 (예를 들어, 어토널 호몰로그 1 (Atoh1)+ 내이 유모 세포)로의 그의 분화로부터 이익을 얻을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료에 사용될 수 있다.
청각 장애는 WHO에 의해 세계 인구 중 5% (32백만명의 소아를 포함하는 3억 6천만명의 사람)를 초과하여 영향을 미치는 것으로 추정되는 주요 건강 챌린지이다. 소리를 감지하고 그의 신호를 청신경을 통해 뇌로 전송하는 감각 유모 세포는 손상되기 쉽다. 상실 후, 유모 세포는 절대 대체되지 않고1 , 2, 따라서 출생후 생애의 시작 시 낮은 (귀당 15,000개) 세포의 수는 단지 연령에 따라 감소하고, 세포 대체의 부재는 후천성 형태의 난청의 높은 유병률로 이어진다. 실제로, 전형적으로 소음 노출, 이독성 약물, 바이러스/박테리아 감염, 및 노화에 의해 유발되는 유모 세포 및 청신경 손상은 청각 상실의 모든 경우의 80% 초과를 차지한다3. 청각 장애에 더하여, 감각 유모 세포의 손상 또는 상실은 균형 장애 및 균형 장애와 관련된 질환, 예를 들어, 양성 발작성 위치성 현기증 (BPPV)을 유발할 수 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 포유동물의 내이의 감각 상피로부터의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포, 예를 들어, Lgr5+ 와우 또는 전정 지지 세포)를 확장시키는 방법, 및 예를 들어, 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 치료 화합물을 확인하기 위한 확장된 세포의 용도의 발견에 기초한다. 추가적으로, 스크리닝된 화합물을 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증가된 증식 및/또는 내이 유모 세포 (예를 들어, 어토널 호몰로그 1 (Atoh1)+ 내이 유모 세포)의 증가된 수로부터 이익을 얻을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료에 사용하는 방법이 본원에 기재된다.
제1 측면에서, 본 발명은 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 내이 지지 세포의 집단을 (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (c) 표 B에 제시된 골 형태형성 단백질 (BMP) 신호전달 억제제; (d) 표 C에 제시된 시클린-의존성 키나제 (CDK) 활성화제; (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (f) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; (g) 표 F에 제시된 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제; (h) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (i) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및 (j) 표 I에 제시된 cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB) 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 작용제는 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 양으로 존재한다.
본 발명의 제1 측면의 일부 실시양태에서, Notch 신호전달 활성화제는 델타-유사 단백질 활성화제, 재기드 단백질 활성화제, Notch 활성화제, 및/또는 γ-세크레타제 활성화제이다.
본 발명의 제1 측면의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 작용제는 (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및 (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단은 Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단이다. 일부 실시양태에서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단은 Lgr5+ 와우 지지 세포의 확장된 집단이다. 일부 실시양태에서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단은 Lgr5+ 전정 지지 세포의 확장된 집단이다.
제2 측면에서, 본 발명은 내이 유모 세포의 집단으로의 내이 지지 세포의 집단의 분화를 촉진하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 내이 지지 세포의 집단을 (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (f) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (g) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (h) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; (i) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 (j) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 작용제는 내이 유모 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 양으로 존재한다.
본 발명의 제2 측면의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 작용제는 (a) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (b) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (c) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (d) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및 (e) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제2 측면의 일부 실시양태에서, Notch 신호전달 억제제는 델타-유사 단백질 억제제, 재기드 단백질 억제제, Notch 억제제, 및/또는 γ-세크레타제 억제제이다.
본 발명의 제2 측면의 일부 실시양태에서, 내이 유모 세포의 집단은 Atoh1+ 내이 유모 세포의 집단이다. 일부 실시양태에서, Atoh1+ 내이 유모 세포의 집단은 Atoh1+ 와우 유모 세포의 집단이다. 일부 실시양태에서, Atoh1+ 내이 유모 세포의 집단은 Atoh1+ 전정 유모 세포의 집단이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제는 표 K에 제시된 레티노산 수용체 (RAR) 효능제 및/또는 표 K에 제시된 레티노산 X 수용체 (RXR) 효능제이다. 일부 실시양태에서, RAR 효능제는 RARα 효능제, RARβ 효능제, 및/또는 RARγ 효능제이다. 일부 실시양태에서, RXR 효능제는 RXRα 효능제, RXRβ 효능제, 및/또는 RXRγ 효능제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, Wnt 신호전달 활성화제는 글리코겐 신타제 키나제-3β (GSK-3β) 억제제, Wnt 활성화제, 프리즐드 수용체 활성화제, 지단백질 수용체-관련 단백질 5/6 (LRP5/6) 활성화제, 디쉐블드 (Dvl) 활성화제, 액신 억제제, 딕코프 (Dkk) 억제제, 분비된 프리즐드-관련 단백질 (sFRP) 억제제, 그루초 억제제, 및/또는 Wnt 억제 단백질 (WIF) 억제제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, BMP 신호전달 억제제는 노긴 활성화제, 코르딘 활성화제, BMP 수용체 억제제, SMAD1/5/8 억제제, SMAD2/3 억제제, 및/또는 SMAD4 억제제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, CDK 활성화제는 p27Kip1 억제제 및/또는 망막모세포종 단백질 (Rb) 억제제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, E 박스-의존성 전사 활성화제는 Atoh1 활성화제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 HDAC 부류 I 억제제, HDAC 부류 II 억제제, HDAC 부류 III 억제제, 및/또는 범-HDAC 억제제이다. 일부 실시양태에서, HDAC 부류 III 억제제는 SIRT1 억제제 및/또는 SIRT2 억제제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, 단백질 분해 억제제는 프로테아솜 억제제 또는 유비퀴틴 리가제 억제제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, PI3K-Akt 신호전달 억제제는 Akt 억제제, PI3K 억제제, PKC 억제제, 및/또는 PDK1 억제제이다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 집단은 Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단이다. 일부 실시양태에서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단은 Lgr5+ 와우 지지 세포의 집단이다. 일부 실시양태에서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단은 Lgr5+ 전정 지지 세포의 집단이다.
제3 측면에서, 본 발명은 마우스의 게놈 내로 안정하게 통합된 2종 이상의 재조합 핵산 분자를 갖는 트랜스제닉 마우스를 특색으로 한다. 2종 이상의 재조합 핵산 분자는 적어도 Lgr5, Sox2, p27, Prox1, FGFR3, Glast, 및 Lfng로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 지지 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 제1 리포터 유전자를 포함하는 제1 재조합 핵산 분자, 및 Atoh1, Myo7a, Cdh23, Pcdh15, Myo6, Myo1c, Tmc1, 및 Cav1.3으로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 유모 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 재조합 핵산 분자를 포함하며, 여기서 제1 리포터 유전자는 제2 리포터 유전자와 상이하다.
본 발명의 제3 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 마커는 Lgr5이다.
본 발명의 제3 측면의 일부 실시양태에서, 내이 유모 세포 마커는 Atoh1이다.
본 발명의 제3 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 마커는 Lgr5이고 내이 유모 세포 마커는 Atoh1이다.
본 발명의 제3 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 마커의 조절 요소는 Lgr5 프로모터이다.
본 발명의 제3 측면의 일부 실시양태에서, 내이 유모 세포 마커의 조절 요소는 Atoh1 인핸서이다. 일부 실시양태에서, Atoh1 인핸서는 프로모터 요소, 예를 들어, SV40 프로모터 또는 글로빈 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 제3 측면의 일부 실시양태에서, 제1 리포터 유전자는 제1 형광 단백질을 코딩하고 제2 리포터 유전자는 제2 형광 단백질을 코딩하며, 여기서 제1 형광 단백질은 제2 형광 단백질과 상이하다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제3 측면의 트랜스제닉 마우스로부터 단리된 세포를 특색으로 한다. 세포는 제1 재조합 핵산 분자 및 제2 재조합 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 제4 측면의 일부 실시양태에서, 세포는 트랜스제닉 마우스의 내이로부터 단리된다.
본 발명의 제5 측면에서, 본 발명은 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 (a) 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 마우스로부터 내이 지지 세포의 집단을 단리시키고; (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하고; (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고; (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 지지 세포의 확장된 집단에서 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고; (e) 시험 화합물의 부재 하의 제1 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 제1 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키고/거나, 시험 화합물의 부재 하의 제2 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 제2 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것을 포함한다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건은 1종 이상의 성장 인자, 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 (IGF1)의 존재 하의 배지, 예를 들어, DMEM 및 F12 배지의 혼합물, 예를 들어, 1:1 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 집단은 2일 이상, 예를 들어, 2일 내지 10일, 예를 들어, 2일 내지 5일 동안 배양된다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건은 (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (f) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제 또는 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제; (g) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (h) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (i) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및 (j) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 추가로 포함한다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제는 표 K에 제시된 RAR 효능제 또는 표 K에 제시된 RXR 효능제이다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건은 표 1에 제시된 1종 이상의 작용제를 포함한다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건은 N2, B27, EGF, bFGF, IGF1, CHIR99021, 및 VPA로 보충된 배지, 예를 들어, DMEM 및 F12의 1:1 혼합물을 포함한다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 후보 작용제는 소분자, 화합물, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 성장 인자, 및 후성적 조절제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 집단은 먼저 코르티 기관을 절제하고, 감각 상피를 단리시키고, 단세포 현탁액을 생성하는 것을 포함하는 방법에 의해 마우스의 와우로부터 단리된다. 본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 집단은 마우스의 내이의 전정으로부터 단리된다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 집단은 Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단이다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 제1 리포터 유전자는 제1 형광 단백질을 코딩하고 제2 리포터 유전자는 제2 형광 단백질을 코딩하며, 여기서 제1 형광 단백질은 제2 형광 단백질과 상이하다.
본 발명의 제5 측면의 일부 실시양태에서, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자의 발현 수준은 단백질 발현 수준이다.
제6 측면에서, 본 발명은 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 (a) Lgr5, Sox2, p27, Prox1, FGFR3, Glast, 및 Lfng로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 지지 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 리포터 유전자를 포함하는 안정하게 통합된 재조합 핵산 분자를 갖는 내이 지지 세포의 집단을 제공하고; (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하며, 여기서 조건은 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제, (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제, (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제, (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제, (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제, (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제, (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제, (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제, (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제, 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하고; (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고; (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 지지 세포의 확장된 집단에서 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고; (e) 시험 화합물의 부재 하의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것을 포함한다.
제7 측면에서, 본 발명은 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 (a) Atoh1, Myo7a, Cdh23, Pcdh15, Myo6, Myo1c, Tmc1, 및 Cav1.3으로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 유모 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 리포터 유전자를 포함하는 안정하게 통합된 재조합 핵산 분자를 갖는 내이 지지 세포의 집단을 제공하고; (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하며, 여기서 조건은 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제, (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제, (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제, (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제, (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제, (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제, (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제, (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제, (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제, 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하고; (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고; (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 세포의 확장된 집단에서 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고; (e) 시험 화합물의 부재 하의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것을 포함한다.
본 발명의 제6 및 제7 측면의 일부 실시양태에서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제는 표 K에 제시된 RAR 효능제 또는 표 K에 제시된 RXR 효능제이다.
본 발명의 제6 및 제7 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건은 (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및 (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함한다.
본 발명의 제6 및 제7 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단은 Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단이다. 일부 실시양태에서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단은 Lgr5+ 와우 지지 세포의 확장된 집단이다. 일부 실시양태에서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단은 Lgr5+ 전정 지지 세포의 확장된 집단이다.
본 발명의 제6 및 제7 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 집단은 인간으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 집단은 마우스로부터 단리된다.
본 발명의 제6 및 제7 측면의 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩한다.
제8 측면에서, 본 발명은 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 하기 중 하나 또는 둘 다를 투여하는 것을 포함한다: (a) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및 (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제; 및/또는 (b) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제.
본 발명의 제8 측면의 일부 실시양태에서, 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 하기 중 하나 또는 둘 다를 투여하는 것을 포함한다: (a) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및 (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제; 및/또는 (b) (i) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (ii) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (iii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (iv) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및 (v) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제.
본 발명의 제8 측면의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 작용제는 전신으로 투여된다. 본 발명의 제8 측면의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 작용제는 국부로, 예를 들어, 대상체의 귀에, 예를 들어, 대상체의 중이에 경고실로 투여된다.
본 발명의 제8 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제는 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제 전에 투여된다.
제9 측면에서, 본 발명은 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 (a) 1개 이상의 내이 지지 세포를, 예를 들어, 시험관내에서, (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제와 접촉시키고; (b) 내이 지지 세포의 확장된 집단을 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제와 임의로 접촉시키고; (c) 대상체의 귀 (예를 들어, 내이)에 내이 유모 세포를 투여하는 것을 포함한다.
제10 측면에서, 본 발명은 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 (a) 1개 이상의 내이 지지 세포를, 예를 들어, 시험관내에서, (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제와 접촉시키고; (b) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제의 투여와 조합하여, 예를 들어, 그와 동시에 또는 그 전에 대상체의 귀 (예를 들어, 내이)에 내이 지지 세포의 확장된 집단을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제8, 제9, 및 제10 측면의 일부 실시양태에서, (a) 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제는 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및 (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제는 (i) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (ii) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (iii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (iv) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및 (v) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제8, 제9, 및 제10 측면의 일부 실시양태에서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제는 표 K에 제시된 RAR 효능제 또는 표 K에 제시된 RXR 효능제이다.
본 발명의 제8, 제9, 및 제10 측면의 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포는 Lgr5+ 내이 지지 세포이다.
본 발명의 제8, 제9, 및 제10 측면의 일부 실시양태에서, 내이 유모 세포는 Atoh1+ 내이 유모 세포이다.
본 발명의 제8, 제9, 및 제10 측면의 일부 실시양태에서, 대상체는 균형 상실을 갖는다. 본 발명의 제8, 제9, 및 제10 측면의 일부 실시양태에서, 대상체는 청각 상실 (예를 들어, 감각신경성 청각 상실)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 청각 상실은 유전적 또는 선천성 결함, 외상 (예를 들어, 신체적 외상 또는 소음-관련 손상 외상), 노화, 또는 화학물질-유발 이독성의 결과이다. 일부 실시양태에서, 청각 상실은 감염 (예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 감염)의 결과이다.
본 발명의 제8, 제9, 및 제10 측면의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 사용하기 위한 방법 및 물질이 본원에 기재되고; 관련 기술분야에 공지된 다른, 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
정의
본원에 사용된 용어 내이 지지 세포의 "확장된 집단"은 집단에서의 내이 지지 세포의 양이 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 작용제 (예를 들어, 하나 이상의 활성, 예컨대 레티노이드 수용체 신호전달의 활성화, Wnt 신호전달의 활성화, 골 형태형성 단백질 (BMP) 신호전달의 억제, 시클린-의존성 키나제 (CDK)의 활성화, E 박스-의존성 전사의 활성화, Notch 신호전달의 활성화, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)의 억제, 단백질 분해의 억제, PI3K-Akt 신호전달의 억제, 및 cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB)의 활성화를 나타내는 1종 이상의 작용제)의 투여 전의 내이 지지 세포의 수를 초과 (예를 들어, 적어도 10% 초과, 적어도 20% 초과, 적어도 30% 초과)하도록 하는 적어도 1개 이상의 내이 지지 세포를 포함하는 세포의 집단을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "내이 지지 세포"는 유모 세포 사이에 존재하고 (예를 들어, 와우 지지 세포 및 전정 지지 세포), 예컨대 유모 세포가 기능하도록 하는 상피에서의 환경을 유지하고 소리 자극 및 머리 운동 동안 감각 기관의 구조적 완전성을 지지하는 다양한 세트의 기능을 하는 비-감각 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "내이 유모 세포"는 내이의 골성 미로의 전정 또는 와우 내의 코르티 기관 내에 존재하는 감각 세포를 지칭한다. 내이 유모 세포는 음파를 전기 신호로서 뇌로 전송하는 것을 담당한다. 와우 내이 유모 세포에 대한 손상은 감소된 청각 감수성 또는 청각 상실을 일으킬 수 있다. 전정 내이 유모 세포에 대한 손상은 균형 장애 또는 균형 상실을 일으킬 수 있다.
본원에 사용된 "레티노이드 수용체 신호전달 활성화제"는 1종 이상의 레티노이드 수용체 (예를 들어, RARα, RARβ, RARγ, RXRα, RXRβ, 및 RXRγ)에 결합하고 이를 활성화시켜, 활성화된 레티노이드 수용체가 결합하는 표적 유전자의 전사 활성에 영향을 미치는 화합물을 지칭한다. 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제는 범-레티노이드 수용체 활성화제이거나 또는 1종 이상의 레티노이드 수용체에 대해 선택성을 나타낼 수 있다. 레티노이드 수용체 신호전달의 활성화제의 예는 표 K에 열거된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "Wnt 신호전달 활성화제"는 정규 Wnt 신호전달 경로의 효능제를 지칭한다. 이 경로의 효능제는 포유동물 세포의 핵에서의 β-카테닌의 농도의 증가를 촉진하는 방식으로 Wnt 단백질 또는 프리즐드 및 지단백질 수용체-관련 단백질 5/6 (LRP5/6) 보조-수용체 단백질에 직접적으로 결합하는 다른 화합물 (예를 들어, 프리즐드 수용체 활성화제, LRP5/6 활성화제)을 추가로 포함한다. 대안적으로, β-카테닌/Wnt 경로 효능제는 Wnt 단백질에 결합하고 이를 내인성 Wnt 보조-수용체와 상호작용하는 것으로부터 격리시키는 1종 이상의 분비된 프리즐드-관련 단백질 (sFRP)을 억제하거나 (예를 들어, sFRP 억제제) 또는 Wnt 억제 단백질 (WIF)을 억제함으로써 (예를 들어, WIF 억제제) 기능할 수 있다. Wnt 신호전달 활성화제의 예는 또한 글리코겐 신타제 키나제-3β (GSK-3β) 억제제, Wnt 활성화제, 디쉐블드 (Dvl) 활성화제, 액신 억제제, 딕코프 (Dkk) 억제제, 및 그루초 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. GSK-3β는 액신, APC (선종성 결장 폴립증), 및 β-카테닌과 복합체를 형성하여 프로테아솜에 의한 하류 분해를 위한 β-카테닌을 제조하는 키나제이다. 디쉐블드 (Dvl)는 활성화된 Notch 수용체로부터의 신호를 하류 이펙터로 전달하는 세포내 단백질이다. 디쉐블드 (Dvl)는 수용체 프리즐드에 의해 동원되고 β-카테닌의 구성적 파괴를 방지한다. 딕코프 (Dkk)는 LRP5/6 보조-수용체 단백질을 단리시키는 작용을 하여, Wnt 신호전달을 억제하는 분비 단백질이다. 그루초는 핵에서 TLE와 복합체를 형성하여 유전자 발현을 억제하는 단백질이다. β-카테닌이 핵에 진입하면, 이는 그루초/TLE 복합체를 파괴하여 유전자 발현을 활성화시킨다. Wnt 활성화제는 Wnt 신호전달을 활성화시키는 소분자 화합물을 지칭한다.
β-카테닌/Wnt 경로 효능제의 활성을 결정하는 데 사용될 수 있는 예시적인 방법은, 비제한적으로, TCF/LEF 패밀리 전사 인자의 제어 하에 리포터 유전자의 발현을 모니터링하는 것뿐만 아니라 US 2014/0044763에 기재된 바와 같은 탑플래쉬(TOPFlash) 루시페라제 리포터 검정을 포함한다. Wnt 신호전달의 활성화제의 예는 표 A에 열거된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "골 형태형성 단백질 (BMP) 신호전달 억제제"는 BMP 신호전달 경로의 길항제를 지칭한다. BMP는 리간드의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원이고, BMP 신호전달의 조정제는 본 발명의 방법과 함께, 예를 들어, 내이 지지 세포를 확장시키거나 또는 내이 지지 세포를 내이 유모 세포로 분화시키는 데 사용될 수 있다. BMP 신호전달 경로의 억제제는 BMP 신호전달 경로에 수반되는 단백질을 억제하는 임의의 단백질 또는 소분자 화합물을 포함한다. BMP 신호전달 억제제의 예는 노긴 활성화제, 코르딘 활성화제, BMP 수용체 억제제, SMAD1/5/8 억제제, SMAD2/3 억제제, 및 SMAD4 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 노긴 및 코르딘은 BMP 수용체에 대한 BMP의 결합을 억제하는 길항제이다. BMP 수용체는 BMP로부터의 신호를 전달한다. 활성화된 BMP 수용체는 전사 인자 SMAD1/5/8을 동원하고 인산화시킨다. 인산화된 SMAD1/5/8은 SMAD4와 상호작용하여 복합체를 형성하고, 이는 핵으로 들어가서 유전자 발현을 조절한다. BMP 수용체는 액티빈 또는 액티빈-유사 리간드로부터의 신호를 전달한다. 활성화된 BMP 수용체는 전사 인자 SMAD2/3을 동원하고 인산화시킨다. 인산화된 SMAD2/3은 SMAD4와 상호작용하여 복합체를 형성하고, 이는 핵으로 들어가서 유전자 발현을 조절한다. BMP 신호전달 억제제의 예는 표 B에 열거된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "시클린-의존성 키나제 (CDK) 활성화제"는 CDK의 효능제를 지칭한다. CDK는 세포 주기를 조절하는 데 수반되는 세린/트레오닌 키나제의 패밀리이다. CDK는 조절 단백질 시클린에 결합하여 활성화된 키나제를 형성한다. CDK 활성화제는 CDK와 상호작용하여 그의 활성을 증가시키는 단백질 또는 소분자 화합물, 또는 CDK와 상호작용하는 단백질과 상호작용하여 CDK 활성을 간접적으로 증가시키는 단백질 또는 소분자 화합물일 수 있다. CDK 활성화제는 CDK 억제제의 억제제 (예를 들어, p27Kip1 억제제) 또는 망막모세포종 단백질 (Rb) 억제제일 수 있다. 단백질 p27Kip1은 시클린-CDK2 복합체 및 시클린-CDK4 복합체와 상호작용하고 G1에서 세포 주기 진행을 억제하는 세포-주기 조절 단백질이다. Rb는 또한 G1에서 세포 주기 진행을 억제하는 종양 억제 단백질이다.
본원에 사용된 "E 박스-의존성 전사 활성화제"는 E 박스에 결합하여 E 박스의 하류의 유전자 발현을 활성화시키는 단백질 (예를 들어, 전사 인자) 화합물을 지칭한다. E 박스는 단백질-결합 부위로서 작용하여 유전자 발현을 조절하는 DNA 반응 요소인 인핸서 박스를 지칭한다. 전사 인자는 E 박스에 결합하여 유전자 전사를 개시한다. E 박스-의존성 전사 활성화제의 예는 Atoh1의 발현을 상향조절하는 Atoh1 활성화제이다. Atoh1은 귀에서 감각신경 발생을 조절하는 데 수반되는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 (bHLH) 전사 인자이다.
본원에 사용된 "Notch 신호전달 활성화제"는 Notch 경로 기능의 활성화를 촉진하는 단백질 또는 소분자 화합물을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "Notch 경로 기능"은 Notch의 세포내 도메인의 핵 전위, RBP-Jκ 또는 그의 드로소필라 상동체 헤어리스의 억제자의 핵 전위; 분할 복합체, 예를 들어, 마스터마인드의 인핸서의 bHLH 유전자의 활성화; HES-1 유전자 또는 KBF2 (또한 CBF1로 지칭됨) 유전자의 활성화; 드로소필라 신경모세포 분리의 억제; 및 델타 단백질, 재기드/세레이트 단백질, 프린지, 델텍스 또는 RBP-Jκ/헤어리스의 억제자, 또는 그의 상동체 또는 유사체에 대한 Notch의 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는, Notch 신호 전달 경로에 의해 매개되는 기능을 지칭한다. Notch 신호 전달 캐스케이드 및 Notch 신호전달에 의해 영향을 받는 표현형은, 예를 들어, 문헌 [Kopan et al., Cell 137:216-233 (2009) 및 Jarriault, et al., Mol. Cell. Biol. 18:7423-7431 (1998)]에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
Notch 효능제의 예는, 예를 들어, US 2014/0369973 및 US 7,399,633에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 Notch 효능제는, 비제한적으로, Notch 단백질뿐만 아니라, 그의 유사체, 유도체, 및 단편; Notch 신호전달 경로를 전파하는 다른 단백질뿐만 아니라 그의 유사체, 유도체, 및 단편; Notch 수용체 활성을 자극시키는 활성화 항체 및 효능작용 활성을 보유하는 그의 항원-결합 단편; Notch 신호전달을 강화하는 단백질을 코딩하는 핵산; 뿐만 아니라 Notch 단백질 또는 Notch 경로 활성이 촉진되도록 하는 Notch 경로에서의 다른 단백질에 결합하거나 또는 이와 달리 상호작용하는 단백질, 그의 유도체, 및 유사체를 포함한다. 이러한 효능제는 Notch 세포내 도메인을 함유하는 Notch 단백질 및 그의 유도체, 상기를 코딩하는 Notch 핵산, 및 Notch 리간드의 Notch-상호작용 도메인 (예를 들어, 델타 또는 세레이트의 세포외 도메인)과 접촉하는 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 Notch 효능제는 델타-유사 단백질 활성화제, 재기드 단백질 활성화제, Notch 활성화제, 및 γ-세크레타제 활성화제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 델타-유사 단백질 및 재기드 단백질은 인접 세포 상의 Notch 수용체와 상호작용하여 Notch 신호전달을 활성화시키는 막횡단 단백질이다. 감마-세크레타제는 Notch 수용체-발현 세포의 세포 막의 내엽 내부에서 Notch 수용체의 일부를 절단하는 효소이다. γ-세크레타제에 의한 절단은 Notch 수용체의 세포내 도메인을 방출하고, 이는 이어서 핵으로 이동하여 유전자 발현을 조절한다. Notch 활성화제는 Notch 신호전달을 활성화시키는 소분자 화합물을 지칭한다. 다른 Notch 효능제는 RBPJκ/헤어리스의 억제자 또는 델텍스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 프린지는 추가적으로, 예를 들어 델타 단백질과 함께 Notch 활성을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 이들 단백질, 그의 단편, 및 유도체는 재조합적으로 발현되고 단리될 수 있거나 또는 화학적으로 그러할 수 있다.
본원에 사용된 "Notch 신호전달 억제제"는 Notch 경로 기능을 억제하는 단백질 또는 소분자 화합물을 지칭한다. 용어 "Notch 경로 기능"은 상기 기재된다. 일부 실시양태에서, Notch 신호전달 억제제는 Notch 신호전달의 활성화에 수반되는 1종 이상의 단백질의 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, Notch 신호전달 억제제는 Notch 신호전달의 억제에 수반되는 1종 이상의 단백질의 활성을 활성화시킬 수 있다. Notch 신호전달 억제제는 델타-유사 단백질 억제제, 재기드 단백질 억제제, Notch 억제제, 및/또는 γ-세크레타제 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. Notch 신호전달 억제제의 예는 표 J에 열거된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제"는 1종 이상의 HDAC에 결합하고 이를 억제하여, HDAC의 효소 활성에 영향을 미치는 화합물을 지칭한다. HDAC는 히스톤의 N-말단에서 리신 잔기의 ε-아미노기로부터 아세틸 기를 제거하는 것은 촉매하는 효소의 패밀리 중 어느 하나를 지칭한다. 문맥에 의해 달리 나타내지 않는 한, 용어 "히스톤"은 임의의 종으로부터의 HI, H2A, H2B, H3, H4, 및 H5를 포함하는 임의의 히스톤 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 인간 HDAC 단백질은 4개의 부류로 분리된다: 부류 I는 HDAC1, HDAC2, HDAC3, 및 HDAC8을 포함하고; 부류 II는 HDAC4, HDAC5, HDAC7, 및 HDAC9를 포함하고; 부류 III는 SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, 및 SIRT7을 포함하고; 부류 IV는 HDAC11을 포함한다. HDAC 억제제는 범-HDAC 억제제이거나 또는 1종 이상의 HDAC에 대해 선택성을 나타낼 수 있다. HDAC 억제제의 예는 표 F에 열거된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "단백질 분해 억제제"는 단백질 분해 경로, 예를 들어, 유비퀴틴-프로테아솜 분해 경로를 억제하는 화합물을 지칭한다. 단백질 분해 억제제는 단백질 분해 경로, 예를 들어, 유비퀴틴-프로테아솜 분해 경로에 수반되는 단백질 중 1종 이상의 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분해 억제제는 프로테아솜을 억제하는 (예를 들어, 프로테아솜 억제제), 즉, 프로테아솜의 19S 또는 20S를 억제하는 소분자 화합물, 또는 유비퀴틴 활성화 효소 (E1), 유비퀴틴 접합 효소 (E2), 및/또는 유비퀴틴 리가제 (E3)를 억제하는 (예를 들어, 유비퀴틴 리가제 억제제) 소분자 화합물일 수 있다. 유비퀴틴-프로테아솜 분해 경로에서, 단백질은 보조-인자 유비퀴틴에 연결됨으로써 프로테아솜에 의한 분해에 대해 마킹된다. E1은 먼저 유비퀴틴과 티오-에스테르 결합을 형성한다. 이 반응은 E1을 대체하는 E2에 대한 유비퀴틴의 후속 결합을 허용한다. 마지막으로, E3 리가제는 유비퀴틴의 카르복시-말단과 기질 단백질 상의 리신 잔기 사이에 이소펩티드 결합을 형성한다. 수많은 E3 리가제는 각각이 단지 기질 단백질의 하위세트만을 변형시킬 수 있다는 점에서 특이성을 제공한다. 추가로 특이성은 인산화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 기질 단백질의 번역후 변형에 의해 달성된다. 단백질 분해 억제제의 예는 표 G에 열거된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "PI3K-Akt 신호전달 억제제"는 PI3K-Akt 신호전달에 수반되는 1종 이상의 단백질을 억제하는 화합물을 지칭한다. Akt는 다양한 세포 기능, 예컨대 대사, 성장, 증식, 생존, 전사, 및 단백질 합성을 조절하는 세린/트레오닌 키나제 (또한 단백질 키나제 B 또는 PKB로 공지됨)이다. Akt 신호전달 캐스케이드는 수용체 티로신 키나제, 인테그린, B 및 T 세포 수용체, 시토카인 수용체, G-단백질-커플링된 수용체, 및 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K)에 의한 포스파티딜이노시톨 (3,4,5) 트리스포스페이트 (PIP3)의 생산을 유도하는 다른 자극에 의해 활성화된다. 이들 지질은 Akt 및 그의 상류 활성화제 PDK1을 포함하는, 플렉스트린-상동성 (PH) 도메인을 보유하는 단백질에 대한 형질 막 도킹 부위로서 작용한다. 막에서, PDK1은 Akt를 인산화시키고, 이는 Akt의 부분 활성화로 이어진다. mTORC2에 의한 Akt의 인산화는 전체 효소적 활성을 자극시킨다. DNA-PK를 포함하는 PI3K-관련 키나제 (PIKK) 패밀리의 구성원은 또한 Akt를 인산화시킬 수 있다. Akt는 단백질 포스파타제 2A (PP2A) 및 PH-도메인 류신-풍부-반복부-함유 단백질 포스파타제 (PHLPP1/2)에 의해 탈인산화된다. 또한, 종약 억제 포스파타제 및 텐신 상동체 (PTEN)는 PIP3을 탈인산화시킴으로써 Akt 활성을 억제한다. 컨센서스 인산화 모티프 RxRxxS/T를 함유하는 기질을 인산화시키는 Akt의 3종의 고도로 관련된 이소형 (Akt1, Akt2, 및 Akt3)이 존재한다. PI3K-Akt 신호전달의 억제제의 예는 Akt를 억제하는 화합물 (즉, Akt의 활성화를 억제하는 화합물), PI3K를 억제하는 화합물, PKC를 억제하는 화합물, 및 PDK1을 억제하는 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. PI3K-Akt 신호전달 억제제의 예는 표 H에 열거된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB) 활성화제"는 CREB에 결합하고 이를 활성화시키는 화합물 또는 CREB의 활성화에 수반되는 단백질에 결합하고 이를 활성화시키는 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, CREB 활성화제는 CREB의 농도를 증가시킬 수 있다. CREB는 DNA 결합 단백질의 류신 지퍼 패밀리의 전사 인자이다. CREB는 동종이량체로서 cAMP-반응성 요소 (CRE)에 결합하여, 하류 유전자의 전사를 증가시키거나 또는 감소시킨다. CREB의 활성화에 수반되는 단백질의 예는 PKA 및 Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CREB에 의해 조절되는 유전자는 c-fos, BDNF, 티로신 히드록실라제, 뉴로펩티드 (예를 들어, 소마토스타틴, 엔케팔린, VGF, 코르티코트로핀-방출 호르몬), 및 포유동물 일주기 시계에 수반되는 유전자 (예를 들어, PER1, PER2)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CREB의 예는 CREB1, CREB2, CREB3, CREB5, CREB3-유사 단백질 1 (CREB3L1), CREB3L2, CREB3L3, 및 CREB3L4를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CREB 활성화제의 예는 AC102이다 (표 I 참조).
본원에 사용된 용어 "균형 상실"은, 예를 들어, 서있거나 또는 걷는 동안에 대상체가 불안정하게 느끼게 하는, 대상체의 전정계 또는 전정 기능에서의 결함을 지칭한다. 귀와 관련된 균형 상실은 또한 현기증 (어지러움) 및 오심을 유발한다. 균형 상실과 관련된 (즉, 균형 상실에 의해 유발된, 또는 균형 상실을 유발하는) 질환 및 장애는 양성 발작성 위치성 현기증 (BPPV), 미로염 (예를 들어, 전정 신경세포염, 와우 신경세포염), 외상 (즉, 귀 또는 두개골에 대한 손상, 귀 또는 두개골에 대한 수술에 의해 유발된 손상), 메니에르병, 외림프루, 상부고리관 피열 증후군, 및 양측 전정장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 균형 상실은 또한 약물, 스트레스, 불안, 및 노화에 의해 유발될 수 있다.
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도 1은 증식에 영향을 미치는 약물에 대한 Lgr5+ 세포의 스크리닝에 대한 시각표이다.
도 2는 분화에 영향을 미치는 약물에 대한 Lgr5+ 세포의 스크리닝에 대한 시각표이다.
도 3은 Lgr5-GFP 세포의 증식에 영향을 미치는 약물에 대한 스크린으로부터의 Lgr5-GFP+ 세포의 퍼센트를 도시하는 그래프이다. 화합물에 대한 요점에 대해 표 1을 참조한다 (WJM = CHIR 99021 및 발프로산).
도 4는 Lgr5-GFP 세포의 증식에 영향을 미치는 약물에 대한 스크린으로부터의 Lgr5-GFP+ 세포의 수를 도시하는 그래프이다. 화합물에 대한 요점에 대해 표 1을 참조한다 (WJM = CHIR 99021 및 발프로산).
도 5는 Atoh1-GFP+ 세포의 분화에 영향을 미치는 약물에 대한 스크린으로부터의 Atoh1-GFP+ 세포의 퍼센트를 도시하는 그래프이다. 화합물에 대한 요점에 대해 표 1을 참조한다 (WJM = CHIR 99021 및 발프로산).
도 6은 트랜스제닉 마우스를 생성하는 데 사용하기 위한 플라스미드의 개략도이며, 여기서 mCherry 형광 단백질은 Atoh1 인핸서의 제어 하에 있다.
도 7은 구체적 스크리닝 화합물, 화합물 A (WO 2009/100438 참조), 화합물 B (WO 2009/100438 참조), 화합물 C (WO 2009/100438 참조), 및 BI8622 (문헌 [Peter et al., EMBO Mol Med. 2014 Dec; 6(12): 1525-1541]으로부터의 것)의 구조이다.
유모 세포는 진동-유도된 변위를 이온-채널 게이팅에 커플링시키는 정단 부동섬모 다발을 통해 소리를 전달한다. 집단의 높은 백분율에서 발생하는 와우 유모 세포의 손상 및 사멸은 유모 세포 대체에 대한 메카니즘의 결여로 인해 광범위한 청각 상실의 원인이다. 그리고 전정 유모 세포의 손상 및 사멸은 균형 상실 또는 장애를 일으킬 수 있다.
상피 줄기 세포 마커인 Lgr5는 최근에 유모 세포를 둘러싸는 내이의 지지 세포 (예를 들어, 와우 지지 세포)에서 발현되는 것으로 밝혀졌고, Lgr5-발현 세포는 정상 유사분열후 와우 감각 상피에서 Wnt에 의해 자극되는 경우에 증식하도록 유도될 수 있다. 실제로, 전구세포 역할과 일치하게, Lgr5를 발현한 지지 세포는 전파에 의한 새로운 Lgr5-양성 세포 및 Lgr5-음성인 유모 세포를 발생시키는 한편, 이 수용체를 발현하지 않은 지지 세포는 유모 세포를 발생시키지 않았다. 유모 세포 분화의 마스터 조절제인 전사 인자 Atoh1의 상류 조절에 있어서의 그의 역할과 일치하게, Wnt의 상향조절은 또한 유모 세포 분화를 증가시켰다. Wnt 신호전달에 반응하여 분열하는 능력 및 유모 세포로 분화하는 효력의 이러한 조합은 Lgr5 세포가 와우 상피의 전구 세포로서 작용하고 있다는 것을 시사하였다. Lgr5+ 세포는 손상 후 자발적으로 재생하는 제한된 능력을 나타냈지만, Wnt 자극에 반응하여 분열하고 분화하고 Notch 억제에 반응하여 전환분화하는 그의 능력은 제한되고 단지 신생아 동물에서만 관찰되었다.
이들 데이터가 내이 (예를 들어, 와우) 전구 세포로서의 Lgr5+ 세포의 역할, 및 세포의 일부 확장이 와우 구체로서의 전파에 의해 달성될 수 있다는 것을 지지하였지만, 이종 세포 집단은 다른 신호전달 경로가 줄기 세포 확장 및 유모 세포 분화에 수반될 수 있다는 것을 시사하였다. 또한, 자발적 재생 능력은 출생후 첫 번째 주 후 상실되고, 이들 전구세포의 유전자 발현의 변화는 성체 마우스 와우에서 구체-형성 능력의 상실을 일으켰다. 유모 세포를 대체하기 위한 노력은 유모 세포로의 지지 세포 전환분화에 집중하였지만, 기능적 와우 또는 전정을 재생시키는 것은 이들 세포가 분열하도록 자극시키는 것 및 이들을 유모 세포로 분화시키는 것 둘 다를 필요로 할 것이다. 여기서, 스크린을 사용함으로써, 본 발명자들은 내이 지지 세포 (예를 들어, 와우 또는 전정의 Lgr5-발현 내이 지지 세포)의 증식 및/또는 분화를 촉진하는 경로 및 소분자를 확인하였다. 이들 확장된 내이 세포가, 예를 들어, 포유동물에서 청각 상실을 치료하는 데 사용될 수 있는 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 내이 지지 세포 및 유모 세포 마커에 대한 리포터 유전자 (예를 들어, 각각 Lgr5 및 Atoh1 리포터 유전자)를 포함하는 트랜스제닉 동물로부터의 확장된 내이 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 세포)가 특히 유용하다.
내이 지지 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진하는 화합물
내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하는 화합물의 예는 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제 (예를 들어, 표 K 참조); 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; 표 B에 제시된 골 형태형성 단백질 (BMP) 신호전달 억제제; 표 C에 제시된 시클린-의존성 키나제 (CDK) 활성화제; 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; 표 F에 제시된 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제; 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 표 I에 제시된 및 cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB) 활성화제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
내이 유모 세포 (예를 들어, 어토널 호몰로그 1 (Atoh1)+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 화합물의 예는 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제 (예를 들어, 표 K 참조); 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; 표 F에 제시된 HDAC 억제제; 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식을 지지하거나 또는 촉진하고/거나 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 다수의 화합물이 표 1에 제시되어 있다.
내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식을 지지하거나 또는 촉진하는 다수의 화합물이 본원에 기재되고, TTNPB, 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 1-아자켄파울론, BIO, WAY-316606, LDN-193189, 및 알스터파울론 중 1종 이상을 포함한다.
내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 다수의 화합물이 본원에 기재되고, 보리노스타트, 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 1-아자켄파울론, BIO, WAY-262611, NP031112, MG-132, IM-12, 트리코스타틴 A, HLY78, 및 PF03084014 중 1종 이상을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 표 A-K에 열거된 화합물의 유도체는 또한 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및/또는 확장을 촉진하거나 또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 데 사용될 수 있다. 표 A-K에 열거된 화합물의 유도체는 구조가 모 화합물과 상이하지만, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하거나 또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 능력을 보유하는 소분자이다. 화합물의 유도체는 모 화합물에 비해 특정 다른 분자 또는 단백질과의 그의 상호작용을 변화시킬 수 있다. 화합물의 유도체는 또한 모 화합물의 염, 부가물, 또는 다른 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 (예를 들어, 표 A-K에 열거된 화합물 중 어느 하나의 화합물)의 임의의 유도체가 모 화합물 대신에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 A-I 및 K에 열거된 화합물의 임의의 유도체가 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 A-D 및 F-K에 열거된 화합물의 임의의 유도체가 내이 유모 세포의 집단으로의 내이 지지 세포의 집단의 분화를 촉진하는 방법에 사용될 수 있다.
표 A
Figure pct00001
Figure pct00002
표 B
Figure pct00003
표 C
Figure pct00004
표 D
Figure pct00005
표 E
Figure pct00006
표 F
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
표 G
Figure pct00010
Figure pct00011
표 H
Figure pct00012
Figure pct00013
표 I
Figure pct00014
표 J
Figure pct00015
Figure pct00016
표 K
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하거나 또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 데 사용되는 1종 이상의 작용제는 작용제의 조합을 포함하며, 여기서 작용제는 하기 경로, 단백질, 및 DNA 반응 요소: 레티노이드 수용체 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, BMP 신호전달 경로, CDK 신호전달 경로, Notch 신호전달 경로, 단백질 분해 경로, PI3K-Akt 신호전달 경로, cAMP-의존성 경로, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), 및/또는 E 박스 DNA 반응 요소 중 2종 이상 (예를 들어, 3, 4, 5종 또는 그 초과)을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하거나 또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 데 사용되는 1종 이상의 작용제는 작용제의 조합 (예를 들어, 각각 표 A-K에 제시된 화합물로부터 선택된 2종의 작용제의 조합, 여기서 2종의 작용제는 서로 상이함; 각각 표 A-K에 제시된 화합물로부터 선택된 3종의 작용제의 조합, 여기서 3종의 작용제는 서로 상이함; 각각 표 A-K에 제시된 화합물로부터 선택된 4종의 작용제의 조합, 여기서 4종의 작용제는 서로 상이함; 및 각각 표 A-K에 제시된 화합물로부터 선택된 5종의 작용제의 조합, 여기서 5종의 작용제는 서로 상이함)을 포함한다.
예를 들어, 각각 표 A-K에 제시된 화합물로부터 선택된 2종의 작용제의 조합이 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하거나 또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 데 사용되는 경우에, 조합에서의 2종의 작용제는 표 L에 열거된 조합에 기초하여 선택될 수 있다.
표 L
Figure pct00020
Figure pct00021
대안적으로, 본 발명은 또한 레티노이드 수용체 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, BMP 신호전달 경로, CDK 신호전달 경로, Notch 신호전달 경로, 단백질 분해 경로, PI3K-Akt 신호전달 경로, 및/또는 cAMP-의존성 경로에 수반되는 1종 이상의 단백질을 사용하여 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하거나 또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 경로를 하향조절하거나 또는 상향조절하는 방법을 고려한다.
방법의 일부 실시양태에서, RAR 및/또는 RXR은 레티노이드 수용체 신호전달을 상향조절하는 데 사용될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, RSPO, 노린, Wnt3a, 및/또는 Wnt5a는 Wnt 신호전달 경로를 상향조절하는 데 사용될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 노긴 및/또는 코르딘은 BMP 신호전달 경로를 하향조절하는 데 사용될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, CDK 및/또는 시클린은 CDK 신호전달 경로를 상향조절하는 데 사용될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 델타/세레이트/Lag-2 펩티드 및/또는 Notch 수용체는 Notch 신호전달 경로를 상향조절하는 데 사용될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 유비퀴틴의 수준은 단백질 분해 경로를 하향조절하기 위해 감소될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, Akt, PI 3-키나제, 및/또는 PDK1의 수준은 PI3K-Akt 신호전달 경로를 하향조절하기 위해 감소될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, CREB 단백질의 수준은 cAMP-의존성 경로를 상향조절하기 위해 증가될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, E 박스 DNA 반응 요소에 결합하는 1종 이상의 전사 인자의 수준은 E 박스-의존성 전사를 상향조절하기 위해 증가될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)의 수준은 HDAC 활성을 하향조절하기 위해 감소될 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 또한 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하거나 또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하기 위해, 1종 이상의 성장 인자를 사용하여 하기 경로: 레티노이드 수용체 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, BMP 신호전달 경로, CDK 신호전달 경로, Notch 신호전달 경로, 단백질 분해 경로, PI3K-Akt 신호전달 경로, 및/또는 cAMP-의존성 경로 중 1종 이상을 하향조절하거나 또는 상향조절하는 방법을 고려한다.
방법의 일부 실시양태에서, 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 (IGF1)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
트랜스제닉 동물 및 사용 방법
한 측면에서, 본 발명은 그의 게놈 내로 안정하게 통합된 2종 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4종 또는 그 초과)의 재조합 핵산 분자를 갖는 비-인간 트랜스제닉 동물을 제공한다. 2종 이상의 재조합 핵산 분자는 적어도 Lgr5, Sox2, p27, Prox1, FGFR3, Glast, 및 Lfng로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 지지 세포 마커 (예를 들어, Lgr5)의 조절 요소의 제어 하에 제1 리포터 유전자 (예를 들어, 형광 마커)를 포함하는 제1 재조합 핵산 분자, 및 Atoh1, Myo7a, Cdh23, Pcdh15, Myo6, Myo1c, Tmc1, 및 Cav1.3으로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 유모 세포 마커 (예를 들어, Atoh1)의 조절 요소의 제어 하에 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 재조합 핵산 분자를 포함하며, 여기서 제1 리포터 유전자는 제2 리포터 유전자와 상이하다.
본 발명은 또한 다양한 유전 공학 기술을 사용하여 세포 또는 트랜스제닉 동물에서 1종 이상의 리포터를 생성하는 것을 고려한다. 일부 실시양태에서, 다양한 유전 공학 기술이 세포 또는 트랜스제닉 동물에서 2종 이상의 리포터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 유전 공학 기술의 예는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 기술, Cre 레콤비나제-loxP 재조합 시스템을 사용하는 기술, Cre-Lox 재조합 시스템을 사용하는 기술, Flp-FRT 재조합 시스템을 사용하는 기술, 및 RMCE (레콤비나제-매개 카세트 교환) 시스템을 사용하는 기술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 마커는 Lgr5이고 내이 유모 세포 마커는 Atoh1이다. 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 마커의 조절 요소는 Lgr5 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 내이 유모 세포 마커의 조절 요소는 Atoh1 인핸서이다. 일부 실시양태에서, Atoh1 인핸서는 SV40 프로모터 또는 글로빈 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 제1 리포터 유전자는 제1 형광 단백질을 코딩하고 제2 리포터 유전자는 제2 형광 단백질을 코딩하며, 여기서 제1 형광 단백질은 제2 형광 단백질과 상이하다.
일부 실시양태에서, Lgr5의 발현은 제1 형광 마커 (Lgr5 리포터 트랜스진)의 발현을 일으킨다. 일부 실시양태에서, Atoh1의 발현은 제2 형광 마커 (Atoh1 리포터 트랜스진)의 발현을 일으킨다. 바람직한 실시양태에서 그의 체세포 및 배세포 모두에서 Lgr5 리포터 단백질 및 Atoh1 리포터 단백질 트랜스진을 함유하는 마우스가 수득된다. 제1 및 제2 마커는 서로 구별가능해야 한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 마커는 세포에서 녹색 및 적색 형광을 생산한다. 형광 마커가 본원에 예시되지만, 다른 마커 (리포터 유전자)가 또한 사용될 수 있고; 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함한다. 수많은 다른 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 마커 중 하나는 녹색 형광 단백질 또는 그의 유도체, 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 적색 형광 단백질 (RFP), mCherry, Tag-RFP 등), 발광 리포터인 루시페라제 (라넬라, 반딧불이 등), 발색원성 (베타-Gal 등) 등이다. 예를 들어, 문헌 [Pollock et al., Trends in Cell Biology 9:57 (1999)]을 참조한다. 유용한 형광 단백질은 또한 형광을 내는 능력을 보유하는 이들 단백질의 돌연변이체 및 스펙트럼 변이체를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Shaner et al., Nat. Biotech. 22:1567 (2004), Tag-RFP (Shaner, N. C. et al., 2008 Nature Methods, 5(6), 545-551)]을 참조한다. 기재된 방법에 사용될 수 있는 다른 형광 단백질은 AcGFP, AcGFP1, 암시안, copGFP, CyPet, dKeima-Tandem, DsRed, dsRed-익스프레스, DsRed-모노머, DsRed2, 암시안1, AQ143, AsRed2, 아자미 그린, 아주라이트, BFP, 세룰리안, CFP, CGFP, 시트린, dTomato, dTomato-Tandem, EBFP, EBFP2, ECFP, EGFP, 에메랄드, EosFP, EYFP, GFP, mBanana, mCerulean, mCFP, mCherry, mCitrine, mECFP, mEmerald, mGrape1, mGrape2, mHoneydew, 미도리-이쉬 시안, mKeima, mKO, mOrange, mOrange2, mPlum, mRaspberry, mRFP1, mRuby, mStrawberry, mTagBFP, mTangerine, mTeal, mTomato, mTurquoise, mWasabi, PhiYFP, ReAsH, 사파이어, 슈퍼폴더 GFP, T- HcRed-Tandem, HcRedl, JRed, Katuska, Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mApple, 사파이어, TagCFP, TagGFP, TagRFP, TagRFP-T, TagYFP, tdTomato, 토파즈, TurboGFP, 비너스, YFP, YPet, ZsGreen, 및 ZsYellowl을 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 이들 모두는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌에 기재되어 있거나 또는 달리 상업적으로 입수가능하다.
"트랜스제닉 동물"은 동물의 세포 중 1개 이상이 본원에 기재된 바와 같은 트랜스진을 포함하는 비-인간 동물, 예컨대 포유동물, 일반적으로 설치류 예컨대 래트 또는 마우스이다. 트랜스제닉 동물의 다른 예는 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등을 포함한다. "트랜스진"은 그로부터 트랜스제닉 동물이 발생하는 세포의 게놈 내로 통합되고 따라서 성숙한 동물의 게놈 내에 남아있어, 트랜스제닉 동물의 1종 이상의 세포 유형 또는 조직에서 코딩된 유전자 산물의 발현을 지시하는 외인성 DNA이다. 유전자 삽입을 포함하는 녹-인 동물은 트랜스제닉 동물의 정의에 포함된다.
본원에 사용된 "Lgr5 리포터 트랜스진" 또는 "Atoh1 리포터 트랜스진"은 Lgr5 또는 Atoh1을 발현하는 세포에서 리포터 단백질의 발현을 일으키기 위해 Lgr5 또는 Atoh1 프로모터의 하류에 삽입된 리포터 단백질에 대한 코딩 서열을 특색으로 하는 구축물을 지칭한다. 프로모터는 리포터 단백질의 발현을 유도하고, 전사는 폴리아데닐화 신호에 의해 정지된다. 트랜스진은 일반적으로 트랜스제닉 동물의 세포의 게놈에서 발생하거나 또는 그에 통합된다. 따라서 본원에 기재된 바와 같은 Lgr5/Atoh1 트랜스제닉 동물은 Lgr5 리포터 트랜스진의 적어도 1개의 카피 및 Atoh1 리포터 트랜스진의 적어도 1개의 카피가 동물의 발생 전에 동물의 세포, 예를 들어, 동물의 배아 세포 내로 도입된 것이다. 그의 세포 중 일부 또는 (바람직하게는) 모두에서 Lgr5 리포터 트랜스진 및 Atoh1 리포터 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 토끼, 또는 다른 포유동물)의 계통이 생산될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 이러한 트랜스제닉 동물을 생성하는 방법은, 예를 들어, 하기 기재된 방법과 같이 사용될 것이다.
관련 기술분야에 공지된 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법은 Lgr5 리포터 트랜스진 또는 Atoh1 리포터 트랜스진을 보유하는 동물, 예를 들어, 마우스를 생성하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Barker et al., Nature. 2007 Oct 25;449(7165):1003 및 Lumpkin et al., Gene Expr Patterns. 2003 Aug;3(4):389] 참조, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 포함됨). 이러한 동물은 Lgr5 리포터 트랜스진 및 Atoh1 리포터 트랜스진 둘 다에 대해 동형접합인, 즉, 게놈 내로 통합된 Lgr5 리포터 트랜스진 및 Atoh1 리포터 트랜스진을 갖는 자손을 생산하도록 교배될 수 있다.
예를 들어, 한 실시양태에서, Lgr5 리포터 트랜스진 또는 Atoh1 리포터 트랜스진을 코딩하는 서열을 포함하는 적합한 벡터가 세포, 예를 들어, 수정된 난모세포 또는 배아 줄기 세포 내로 도입된다. 이어서, 이러한 세포는 상기 서열이 그의 게놈 내로 도입된 비-인간 트랜스제닉 동물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 이들 동물은 차례로, 예를 들어, 특정한 세포 또는 조직에서, 또는 발생에서의 특정한 시간에 리포터 단백질의 발현을 시작시킬 Lgr5 또는 Atoh1 프로모터의 제어 하에 레콤비나제를 발현하는 다른 트랜스제닉 동물과 교배될 수 있다.
배아 조작 및 만능 줄기 세포 또는 난모세포의 전기천공 또는 미세주사를 통해 트랜스제닉 동물, 특히 동물 예컨대 마우스를 생성하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,736,866 및 4,870,009, 미국 특허 번호 4,873,191, U.S.S.N. 10/006,611, 문헌 ["Transgenic Mouse Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)," Hofker and van Deursen, Editors (Humana Press, Totowa, N.J., 2002)]; 및 문헌 ["Manipulating the Mouse Embryo," Nagy et al., Editors (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2002)]에 기재되어 있고, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 트랜스제닉 마우스를 생성하는 데 사용되는 것과 유사한 방법이 다른 트랜스제닉 동물의 생산에 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 방법에서, 본원에 기재된 바와 같은 트랜스제닉 마우스는 본원에 기재된 바와 같이 만들어진 벡터를 수정된 마우스 난모세포 (예를 들어, Lgr5 리포터 유전자 녹인을 갖는 마우스로부터의 난모세포, 문헌 [Barker et al., Nature. 2007 Oct 25;449(7165):1003] 참조)의 전핵 내로 주사함으로써 만들어지고, 예를 들어, 문헌 ["Transgenic Mouse Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)," Hofker and van Deursen, Editors (Humana Press, Totowa, N.J., 2002)]; 미국 특허 번호 4,736,866 및 4,870,009, 미국 특허 번호 4,873,191 및 6,791,006, 및 문헌 [Hogan, "Manipulating the Mouse Embryo," Nagy et al., Editors (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2002)]에 기재된 바와 같은 표준 트랜스제닉 기술을 사용하여 모든 세포에서 발현되는 Lgr5 리포터 유전자 및 Atoh1 리포터 트랜스진을 갖는 트랜스제닉 마우스의 생성에 사용된다. 표준 분자 기술을 사용하여, 예를 들어, 플라스미드 상의 또는 게놈 내로 안정하게 통합된 리포터 유전자는 모든 세포에서 유지되고 발현될 수 있다.
트랜스제닉 창시자 Lgr5/Atoh1 동물은, 예를 들어 동물의 조직 또는 세포에서 리포터 서열 또는 단백질의 존재 또는 발현을 검출함으로써 그의 게놈 내의 Lgr5 리포터 트랜스진 및 Atoh1 리포터 트랜스진의 존재에 기초하여 확인될 수 있다. 이어서, 트랜스제닉 창시자 동물은 트랜스진을 보유하는 추가의 동물을 교배시키는 데 사용될 수 있다. 더욱이, Lgr5 리포터 트랜스진 및 Atoh1 리포터 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 동물은 추가로 다른 트랜스진을 보유하는 다른 트랜스제닉 동물과 교배될 수 있다.
벡터
본원에 기재된 마우스는 본원에 기재된 바와 같은 Lgr5 리포터 트랜스진 또는 Atoh1 리포터 트랜스진을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 예를 들어, 발현 벡터를 사용하여 만들어질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하고 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 자율 복제될 수 있거나 또는 이는 숙주 DNA 내로 통합될 수 있다. 바이러스 벡터는, 예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스를 포함한다.
벡터는 Lgr5 리포터 단백질 또는 Atoh1 리포터 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포에서의 핵산의 발현에 적합한 형태로 포함할 수 있다. 바람직하게는 재조합 발현 벡터는 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 1개 이상의 조절 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 조절 서열은 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열의 구성적 발현을 지시하는 것을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는 Lgr5 리포터 및 Atoh1 리포터를 생산할 수 잇다.
본원에 기재된 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서의 Lgr5 리포터 및 Atoh1 리포터 단백질의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 이. 콜라이(E. coli), 곤충 세포 (예를 들어, 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용함), 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185," Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 추가로 논의되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 전사되고 또는 번역될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실시예 5에 기재된 Atoh1 인핸서는 리포터 유전자의 발현을 유도하는 데 사용된다.
세포
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내의 Lgr5 리포터 단백질 또는 Atoh1 리포터 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 또는 이를 숙주 세포의 게놈의 특이적 부위 내로 상동 재조합되도록 하는 서열을 함유하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 용어는 핵산 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 벡터)와 접촉된 특정한 대상체 세포뿐만 아니라, 또한 핵산 분자를 함유하는 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 사실상, 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이들이 또한 핵산 분자를 함유하는 한 본원에 사용된 용어의 범주 내에 여전히 포함된다.
숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 박테리아 세포 예컨대 이. 콜라이, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포 (예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), HEK, 또는 COS 세포)일 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 벡터가 재조합 세포로부터 생산될 수 있는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터인 경우에, 세포는 바이러스 벡터를 생산하는 것일 수 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션, 또는 전기천공을 포함하는, 외래 핵산 (예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 관련 기술분야에서 인식되는 다양한 기술을 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 네이키드 DNA가 단순히 세포에 적용된다. 벡터가 바이러스 벡터인 경우에, 공지된 감염 프로토콜이 사용될 수 있다.
예를 들어, 레트로바이러스 벡터가, 예를 들어, 문헌 [Robertson et al., Nature 323:445-448 (1986)]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 레트로바이러스는 일반적으로 플랭킹 서열의 재배열 없이 숙주 게놈 내로 통합되고, 이는 항상 DNA가 미세주사 또는 다른 방법에 의해 도입되는 경우인 것은 아니다.
본 발명의 세포는 또한 본원에 기재된 트랜스제닉 동물로부터 수득된 세포, 예를 들어, 핵산 분자를 함유하는 이들 동물의 조직으로부터의 세포를 포함한다.
서열의 동일성
2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 갭이 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 비-상동 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 80%이고, 일부 실시양태에서는 적어도 90%, 95% 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유된 경우에, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 본 방법의 경우, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 디폴트 파라미터, 즉, 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4, 및 프레임시프트 갭 페널티 5의 블로섬(Blossum) 62 점수화 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (월드 와이드 웹 상의 gcg.com에서 이용가능함)에 통합된 문헌 [Needleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)] 알고리즘을 사용하여 결정된다.
본 방법에 유용한 트랜스진을 구축하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고; 예를 들어, 문헌 [Sambrook and Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Labman edition (January 15, 2001); 및 Ausubel et al., Eds., "Short Protocols in Molecular Biology," Current Protocols; 5 edition (November 5, 2002)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 상업적으로 입수가능한 벡터, 예를 들어, pC4M-Fv2E (아리아드 파마슈티칼스(Ariad Pharmaceuticals), (매사추세츠주 캠브리지)로부터 입수가능함)가 본원에 기재된 핵산 분자를 구축하는 데 사용될 수 있다.
스크리닝 방법
와우 유모 세포 (예를 들어, 내이 내의 와우 유모 세포)의 상실과 연관된 청각 상실의 치료에 유용한 작용제를 확인하기 위해 시험 화합물, 예컨대 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 무기 또는 유기 대분자 또는 소분자 시험 화합물 (예를 들어, 표 A-K에 열거된 화합물)을 스크리닝하는 방법이 본원에 포함된다.
본 개시내용은 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 (a) 본원에 기재된 트랜스제닉 마우스로부터 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 집단을 단리시키고; (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하고; (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고; (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 지지 세포의 확장된 집단에서 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고; (e) 시험 화합물의 부재 하의 제1 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 제1 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키고/거나, 시험 화합물의 부재 하의 제2 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 제2 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건은 표 1에 제시된 1종 이상의 작용제를 포함한다.
본 개시내용은 또한 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 (a) Lgr5, Sox2, p27, Prox1, FGFR3, Glast, 및 Lfng로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 지지 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 리포터 유전자를 포함하는 안정하게 통합된 재조합 핵산 분자를 갖는 내이 지지 세포의 집단을 제공하고; (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하며, 여기서 조건은 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제, (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제, (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제, (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제, (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제, (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제, (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제, (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제, (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제, 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하고; (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고; (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 지지 세포의 확장된 집단에서 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고; (e) 시험 화합물의 부재 하의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 또한 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 (a) Atoh1, Myo7a, Cdh23, Pcdh15, Myo6, Myo1c, Tmc1, 및 Cav1.3으로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 유모 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 리포터 유전자를 포함하는 안정하게 통합된 재조합 핵산 분자를 갖는 내이 지지 세포의 집단을 제공하고; (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하며, 여기서 조건은 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제, (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제, (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제, (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제, (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제, (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제, (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제, (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제, (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제, 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하고; (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고; (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 세포의 확장된 집단에서 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고; (e) 시험 화합물의 부재 하의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 또한 유모 세포를 사용하여 이독소를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 이독소에 의해 유발된 유모 세포 손상에 대해 보호적 특성을 나타내는 1종 이상의 화합물 (예를 들어, 표 A-K에 열거된 화합물)을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이독소는 항신생물제, 살리실레이트, 퀴닌, 및 아미노글라이코사이드 항생제를 포함하는 치료 약물, 음식물 또는 의약의 오염물, 및 환경 또는 산업 오염물을 포함한다. 본 개시내용은 또한 유모 세포를 사용하여 시냅스 연결성을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이들 방법에 사용되는 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)는 포유동물 (예를 들어, 마우스 또는 인간)로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 방법에 사용되는 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)는 본원에 제공된 방법에 의해 기재된 바와 같이 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)로부터 분화될 수 있다.
본원에 사용된 "소분자"는 약 3,000 달톤 미만의 분자량의 소형의 유기 또는 무기 분자를 지칭한다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 소분자는 3,000 달톤 (Da) 미만의 분자량을 갖는다. 소분자는, 예를 들어, 적어도 약 100 Da 내지 약 3,000 Da (예를 들어, 약 100 내지 약 3,000 Da, 약 100 내지 약 2500 Da, 약 100 내지 약 2,000 Da, 약 100 내지 약 1,750 Da, 약 100 내지 약 1,500 Da, 약 100 내지 약 1,250 Da, 약 100 내지 약 1,000 Da, 약 100 내지 약 750 Da, 약 100 내지 약 500 Da, 약 200 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 300 내지 약 1000 Da, 또는 약 100 내지 약 250 Da)일 수있다.
시험 화합물 (예를 들어, 표 A-K 및 표 1에 열거된 화합물)은, 예를 들어, 천연 생성물 또는 조합 화학 라이브러리의 구성원일 수 있다. 다양한 분자의 세트는 다양한 기능 예컨대 전하, 방향족성, 수소 결합, 가요성, 크기, 측쇄의 길이, 소수성, 및 강성을 포함하도록 사용되어야 한다. 소분자를 합성하는 데 적합한 조합 기술이, 예를 들어, 문헌 [Obrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998)]에 의해 예시된 바와 같이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대 "분할 및 풀링" 또는 "병행" 합성 기술, 고체-상 및 용액-상 기술, 및 코딩 기술을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Czarnik, Curr. Opin. Chem. Bio. 1:60-6 (1997)] 참조). 또한, 다수의 소분자 라이브러리가 상업적으로 입수가능하다. 다수의 적합한 소분자 시험 화합물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,503,713에 열거되어 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 스크리닝된 라이브러리는 다양한 유형의 시험 화합물 (예를 들어, 표 A-K 및 표 1에 열거된 화합물)을 포함할 수 있다. 주어진 라이브러리는 구조적으로 관련된 또는 관련되지 않은 시험 화합물의 세트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 펩티드 또는 펩티드모방체 분자이다. 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 핵산이다.
일부 실시양태에서, 시험 화합물 및 그의 라이브러리는 제1 시험 화합물, 예를 들어, 표적 폴리펩티드의 공지된 천연 결합 파트너와 구조적으로 유사한 제1 시험 화합물, 또는 표적 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것으로 확인된 제1 소분자의 구조를, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 방법 또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 체계적으로 변경시키고, 그 구조를 생성된 생물학적 활성과 상호 연관시킴으로써 (예를 들어, 구조-활성 관계 연구) 수득될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 이러한 구조-활성 관계를 생성하는 다양한 표준 방법이 존재한다. 따라서, 일부 경우에, 연구는 주로 실험적일 수 있고, 다른 경우에, 내인성 폴리펩티드 또는 그의 부분의 3차원 구조가 소분자 화합물 또는 화합물들의 합리적 설계를 위한 출발점으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 소분자의 일반적 라이브러리는, 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 스크리닝된다.
일부 실시양태에서, 시험 화합물 (예를 들어, 표 A-K 및 표 1에 열거된 화합물)은 시험 샘플, 예를 들어, 세포 또는 살아있는 조직 또는 기관, 예를 들어, 눈에 적용되고, 시험 화합물의 1종 이상의 효과가 평가된다. 배양된 또는 1차 세포에서 예를 들어, 지지 세포 마커 (예를 들어, Lgr5) 및/또는 유모 세포 마커 (예를 들어, Atoh1)의 발현을 증가시키는 시험 화합물의 능력이 평가된다.
일부 실시양태에서, 시험 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 장애의 생체내 모델이거나, 또는 그로부터 유래된다 (예를 들어, 그로부터 취해진 샘플). 예를 들어, 동물 모델, 예를 들어, 설치류 예컨대 래트가 사용될 수 있다.
각각의 이들 효과를 평가하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질의 발현을 조정하는 능력은, 예를 들어, 정량적 PCR 또는 면역검정 방법을 사용하여 유전자 또는 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고처리량 방법, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 단백질 또는 유전자 칩 (예를 들어, 문헌 [Ch. 12, Genomics, in Griffiths et al., Eds. Modern genetic Analysis, 1999,W. H. Freeman and Company; Ekins and Chu, Trends in Biotechnology, 1999, 17:217-218; MacBeath and Schreiber, Science 2000, 289(5485):1760-1763; Simpson, Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman, Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts, DNA Press, 2003] 참조)이 지지 세포 마커 (예를 들어, Lgr5) 및/또는 유모 세포 마커 (예를 들어, Atoh1)의 발현에 대한 효과를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 스크리닝되고 Lgr5 및/또는 Atoh1의 발현을 증가시키는 것으로 결정된 시험 화합물 (예를 들어, 표 A-K 및 표 1에 열거된 화합물)이 후보 화합물로 간주될 수 있다. 예를 들어, 장애의 생체내 모델, 예를 들어, 청각 상실의 동물 모델에서 스크리닝되고, 장애, 예를 들어, 장애의 1종 이상의 증상 또는 유모 세포의 수에 대해 바람직한 효과를 갖는 것으로 결정된 후보 화합물은 후보 치료제로 간주될 수 있다. 임상 세팅에서 스크리닝되면, 후보 치료제는 치료제이다. 후보 화합물, 후보 치료제, 및 치료제는 임의로 최적화되고/거나 유도체화되고, 생리학상 허용되는 부형제와 함께 제제화되어 제약 조성물을 형성할 수 있다.
따라서, 제1 스크린에서 "히트"로 확인된 시험 화합물 (예를 들어, Lgr5 및/또는 Atoh1의 발현을 증가시키는 시험 화합물)이 선택되고, 예를 들어, 합리적 설계를 사용하여 체계적으로 변경되어 결합 친화도, 결합력, 특이성, 또는 다른 파라미터를 최적화할 수 있다. 이러한 최적화는 또한 본원에 기재된 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 관련 기술분야에 공지되고/거나 본원에 기재된 방법을 사용하여 화합물의 제1 라이브러리를 스크리닝하고, 그 라이브러리에서 하나 이상의 히트를 확인하고, 이들 히트를 체계적 구조적 변경에 적용하여 히트와 구조적으로 관련된 화합물의 제2 라이브러리를 생성하고, 제2 라이브러리를 본원에 기재된 방법을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다.
히트로 확인된 시험 화합물은 본원에 기재된 바와 같은 와우 유모 세포 (예를 들어, 내이 내의 와우 유모 세포)의 상실과 연관된 장애, 예를 들어, 청각 상실을 치료하는 데 유용한 후보 치료 화합물로 간주될 수 있다. "히트"의 구조를 결정하는 데 유용한 다양한 기술, 예를 들어, NMR, 질량 분광측정법, 전자 포획 검출기가 구비된 가스 크로마토그래피, 형광 및 흡수 분광분석법이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 의해 "히트"로 확인된 화합물, 및 본원에 기재된 장애의 치료, 예방, 또는 발생 또는 진행의 지연에서의 그의 투여 및 사용 방법을 포함한다.
후보 치료 화합물로 확인된 시험 화합물은 본원에 기재된 바와 같은 와우 유모 세포 (예를 들어, 내이 내의 와우 유모 세포)의 상실과 연관된 장애의 동물 모델에게 투여함으로써 추가로 스크리닝될 수 있다. 동물은 장애의 변화, 예를 들어, 장애의 파라미터, 예를 들어, 임상 결과와 관련된 파라미터의 개선에 대해 모니터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 파라미터는 청각 능력이고, 개선은 개선된 청각 반응일 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간, 예를 들어, 청각 상실을 갖는 인간이고, 파라미터는 개선된 청각이다.
치료 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 각각 와우 유모 세포 (예를 들어, 내이 내의 와우 유모 세포) 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실 (즉, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증가된 증식 및 분화로부터 이익을 얻을 상태)을 치료하는 신규 치료 전략을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 전략은 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식의 증가 및/또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화의 증가를 촉진하여, 표적 세포의 확장 및 내이의 성숙 세포, 예를 들어, 청각 유모 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 실질적인 세포 증식을 촉진하지 않으면서 내이의 성숙 세포, 예를 들어, 청각 유모 세포 (예를 들어, 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포))로의 또는 이를 향한 표적 세포 (예를 들어, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포))의 분화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 실질적인 세포 증식을 촉진하지 않으면서 표적 세포 (예를 들어, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포))의 증식을 촉진한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 귀의 감각 세포로서 기능할 수 있는 1개 이상의 세포, 예를 들어, 유모 세포 (예를 들어, 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포))로의 1개 이상의 세포 (예를 들어, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포))의 분화 (예를 들어, 완전 또는 부분 분화)를 촉진함으로써, 유모 세포 상실 및 귀에서 세포 상실의 결과로서 발생하는 임의의 장애, 예컨대 청각 장애, 난청, 및 전정 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 청각 상실은 와우의 손상 또는 기능부전, 예를 들어, 유모 세포의 상실을 일으키는 감각 상피의 상실 또는 이에 대한 손상으로부터 발생할 수 있는 감각신경성 청각 상실이다.
일부 실시양태에서, 청각 상실은 임의의 이유, 또는 임의의 유형의 사건의 결과일 수 있다. 예를 들어, 유전적 또는 선천성 결함으로 인해; 예를 들어, 인간 대상체는 출생 이후 청각 장애를 가질 수 있거나, 또는 유전적 또는 선천성 결함으로 인한 청각의 점진적 상실의 결과로서 청각 장애 또는 난청을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 청각 상실은 외상성 사건, 예컨대 귀의 구조에 대한 신체적 외상, 또는 갑작스런 큰 소음, 또는 큰 소음에 대한 장기간 노출의 결과일 수 있다. 예를 들어, 콘서트 장소, 공항 활주로, 및 공사 영역에 대한 장기간 노출은 내이 손상 및 후속 청각 상실을 유발할 수 있다.
일부 실시양태에서, 청각 상실은 화학물질-유발 이독성으로 인한 것일 수 있으며, 여기서 이독소는 항신생물제, 살리실레이트, 퀴닌, 및 아미노글라이코사이드 항생제를 포함하는 치료 약물, 음식물 또는 의약에서의 오염물, 및 환경 또는 산업 오염물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 청각 상실은 노화로부터 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서
(a) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제; 및/또는
(b) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제를 대상체에게, 예를 들어 대상체의 귀에 투여하여 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포) 증식 및/또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화 (직접 요법)를 촉진한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서
(a) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및 (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제; 및/또는
(b) (i) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (ii) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (iii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (iv) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및 (v) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제를 대상체에게, 예를 들어 대상체의 귀에 투여하여 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포) 증식 및/또는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진한다.
청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 작용제는 전신으로 또는 대상체의 귀에, 예를 들어, 대상체의 중이에 경고실로 투여된다. 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제는 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제 전에 투여된다.
본 개시내용은 또한
(a) 1개 이상의 내이 지지 세포를, 예를 들어, 시험관내에서, (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제와 접촉시키고;
(b) 내이 지지 세포의 확장된 집단을 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제와 임의로 접촉시키고;
(c) 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체의 귀에 (예를 들어, 내이) 내이 유모 세포를 투여함으로써
상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한
(a) 1개 이상의 내이 지지 세포를, 예를 들어, 시험관내에서, (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및 (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제와 접촉시키고; 및
(b) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제의 투여와 조합하여, 예를 들어, 그와 동시에 또는 그 전에 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체의 귀 (예를 들어, 내이)에 내이 지지 세포의 확장된 집단을 투여함으로써
상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, (a) 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제는 (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제; (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및 (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제는 (i) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; (ii) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; (iii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제; (iv) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및 (v) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제는 표 K에 제시된 RAR 효능제 또는 표 K에 제시된 RXR 효능제이다. 일부 실시양태에서, 내이 지지 세포는 Lgr5+ 내이 지지 세포이다. 일부 실시양태에서, 내이 유모 세포는 Atoh1+ 내이 유모 세포이다.
본원에 기재된 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 균형 상실을 갖는다. 본원에 기재된 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 청각 상실 (예를 들어, 감각신경성 청각 상실)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 청각 상실은 유전적 또는 선천성 결함, 외상, 노화, 또는 화학물질-유발 이독성의 결과이다.
본원에 기재된 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일반적으로, 본원에 기재된 화합물 및 방법은 귀에서 유모 세포 성장 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포 성장)을 생성하고/거나 귀에서 (예를 들어, 내이, 중이, 및/또는 외이에서) 유모 세포의 수를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 귀에서의 유모 세포의 수는 치료 전 유모 세포의 수와 비교하여 약 2-, 3-, 4-, 6-, 8-, 또는 10-배, 또는 그 초과로 증가될 수 있다. 이러한 새로운 유모 세포 성장은 들을 수 있는 대상체의 능력의 적어도 부분적 개선을 효과적으로 회복시키거나 또는 확립할 수 있다. 예를 들어, 작용제의 투여는 청각 상실을 약 5, 10, 15, 20, 40, 60, 80, 100% 또는 그 초과만큼 개선시킬 수 있다.
내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식을 지지하거나 또는 촉진하고/거나 내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 다수의 화합물이 표 1에 제시되어 있다.
내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식을 지지하거나 또는 촉진하는 다수의 화합물이 본원에 기재되고, TTNPB, 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 1-아자켄파울론, BIO, WAY-316606, LDN-193189, 및 알스터파울론 중 1종 이상을 포함한다.
내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 다수의 화합물이 본원에 기재되고, 보리노스타트, 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 1-아자켄파울론, BIO, WAY-262611, NP031112, MG-132, IM-12, 트리코스타틴 A, HLY78, 및 PF03084014 중 1종 이상을 포함한다.
내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및 확장을 촉진하는 화합물의 다른 예는 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제 (예를 들어, 표 K 참조); 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; 표 B에 제시된 골 형태형성 단백질 (BMP) 신호전달 억제제; 표 C에 제시된 시클린-의존성 키나제 (CDK) 활성화제; 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제; 표 F에 제시된 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제; 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 표 I에 제시된 및 cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB) 활성화제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
내이 유모 세포 (예를 들어, Atoh1+ 내이 유모 세포)로의 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 분화를 촉진하는 화합물의 다른 예는 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제 (예를 들어, 표 K 참조); 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제; 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제; 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제; 표 F에 제시된 HDAC 억제제; 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
적절한 경우에, 치료 후, 인간은 청각 또는 내이 장애와 관련된 다른 증상의 개선에 대해 시험될 수 있다. 청각을 측정하는 방법은 널리 공지되어 있고 순음 청력검사, 공기 전도, 및 골 전도 시험을 포함한다. 이들 검사는 인간이 들을 수 있는 소리의 크기 (강도) 및 음의 높이 (주파수)의 한계를 측정한다. 인간에서의 청력검사는 행동 관찰 청력검사 (7개월령까지의 영유아의 경우), 시각 강화 방향 청력검사 (7개월령 내지 3세까지의 소아의 경우) 및 3세 초과의 소아의 경우 놀이 청력검사를 포함한다. 음향 방사 시험이 와우 유모 세포의 기능을 시험하는 데 사용될 수 있고, 전기-와우도검사는 와우 및 뇌로의 신경 경로의 제1 부분의 기능에 대한 정보를 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 변형과 함께 또는 변형 없이 계속될 수 있거나 또는 정지될 수 있다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및/또는 분화의 촉진을 위한 1종 이상의 화합물은 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 화합물을 함유하는 제약 조성물은 의도된 투여 방법에 따라 제제화될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 내이 지지 세포 (예를 들어, Lgr5+ 내이 지지 세포)의 증식 및/또는 분화의 촉진을 위한 1종 이상의 화합물은 대상체에게 직접 투여하기 위한 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 1종 이상의 화합물을 함유하는 제약 조성물은 1종 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하는 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 국부 또는 전신 투여, 예를 들어, 점적제 (예를 들어, 귀 점적제)에 의한 투여 또는 귀로의 주사, 취입 (예컨대 귀 내), 정맥내, 국소, 또는 경구 투여를 위해 제제화될 수 있다.
투여를 위한 제약 조성물의 성질은 투여 방식에 의존하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 또는 멸균성이다. 본 발명에서 특색으로 하는 치료 조성물은 담체 또는 부형제를 함유할 수 있고, 그 중 다수는 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 사용될 수 있는 부형제는 완충제 (예를 들어, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제, 및 비카르보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 폴리펩티드 (예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨, 물, 및 글리세롤을 포함한다. 본 발명에서 특색으로 하는 핵산, 폴리펩티드, 소분자, 및 다른 조정 화합물은 임의의 표준 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 피하, 또는 경구일 수 있다.
제약 조성물은 상응하는 투여 경로에 따라 다양한 방식으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 액체 용액은 귀로의 점적제에 의한 투여, 주사, 또는 섭취를 위해 제조될 수 있고; 겔 또는 분말은 섭취 또는 국소 적용을 위해 제조될 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Allen, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2012]에서 찾아볼 수 있다.
1종 이상의 화합물이, 예를 들어, 제약 조성물로서, 직접 및/또는 주사에 의해 또는 외과적 배치를 통해 국부로, 예를 들어, 내이로 투여될 수 있다. 제약 조성물의 양은 유효량으로서 기재될 수 있거나 또는 세포-기반 조성물의 양은 치료 유효량으로서 기재될 수 있다. 일정 기간에 걸친 적용이 권장할 만하거나 또는 바람직한 경우에, 본 발명의 조성물은 지속 방출 제제 또는 이식형 장치 (예를 들어, 펌프)에 위치할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 제약 조성물은 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 전신 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 보존제가 첨가된, 단위 투여 형태로, 예를 들어, 앰플 또는 다중-용량 용기에 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제제화제 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원-무함유 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
이전에 기재된 제제에 더하여, 조성물은 또한 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 이러한 장기 작용 제제는 이식에 의해 (예를 들어, 피하로) 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어 허용되는 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체, 예를 들어, 난용성 염으로서 제제화될 수 있다.
전신 경구 투여를 위해 제제화된 제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제 예컨대 결합제 (예를 들어, 예비젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예를 들어, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들어, 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 소듐 스타치 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예를 들어, 소듐 라우릴 술페이트)를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조되는 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제는, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 구성하기 위한 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 제약상 허용되는 첨가제 예컨대 현탁화제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별화 식물성 오일); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 제제는 또한 적절한 경우에 완충제 염, 향미제, 착색제 및 감미제 작용제를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 제공할 수 있도록 적합하게 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 상기 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 제제화된 화합물 중 1종 이상, 및 본원에 기재된 방법으로 수득된 1개 이상의 세포를 포함할 수 있다.
실시예
본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는 하기 실시예에 추가로 기재된다.
실시예 1. 증식 및 분화를 촉진하는 작용제에 대한 약물 스크리닝
2종의 마우스 계통을 사용하여 Lgr5-발현 세포의 증식 또는 분화를 촉진하는 작용제에 대한 스크린을 개발하였다. 각각의 계통은 Lgr5 발현 세포 또는 Atoh1 발현 유모 세포의 검출을 위한 형광 마커를 함유하였다. Lgr5-EGFP-IRES-Cre-ER 마우스를 사용하여 Lgr5+ 세포의 증식을 모니터링하였다 (Barker, N. et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgf5. Nature 449, 1003-1007 (2007)). 이어서, 이 계통을 Rosa26-td-Tomato 리포터 마우스 (Madisen, L. et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci 13, 133-140 (2010))와 교배시켜 분화된 Lgr5-발현 세포로부터 생성된 세포의 계통 추적을 가능하게 하는 마우스 계통을 생성하였다. Atoh1-nGFP 마우스를 사용하여 분화된 유모 세포를 확인하였다 (Lumpkin, E.A. et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns 3, 389-395 (2003)).
Lgr5-GFP+ 및 Atoh1-GFP+ 리포터 마우스 둘 다로부터의 Lgr5+ 세포를 하기와 같이 수득하였다. 신생아 마우스 (출생후 1-3일)로부터의 와우를 HBSS 중에서 절제하고 혈관조 및 와우축으로부터 코르티 기관을 분리하였다. 이어서, 코르티 기관을 세포 회수 용액 (코닝(Corning))으로 1시간 동안 처리하여 기저 중간엽으로부터 와우 상피를 분리하였다. 이어서, 상피를 수집하고 TrypLE (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))로 37℃에서 15-20분 동안 처리하였다. 기계적 연화처리에 의해 수득된 단세포를 여과하고 (40 μm) 3D 배양을 위해 매트리겔 중에 현탁시켰다. 매트리겔은 세포외 매트릭스 단백질이 풍부한 종양인 엥겔브레트-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm) (EHS) 마우스 육종으로부터 추출된 재구성된 기저막 제제이고, 대략 60% 라미닌, 30% 콜라겐 IV, 및 8% 엔탁틴이다. 생성된 세포를 글루타맥스 (깁코(GIBCO)), N2, B27 (인비트로젠(Invitrogen)), EGF (50 ng/mL; 케미콘(Chemicon)), bFGF (50 ng/mL; 케미콘), IGF1 (50 ng/mL; 케미콘), 및 CHIR99021 (3 μM; LC 랩스(LC Labs)), VPA (1 mM; 시그마(Sigma)), pVc (100 μg/ml; 시그마) 및 616452 (2 μM; 칼바이오켐(Calbiochem))를 포함하는 소분자로 보충된 DMEM 및 F12의 1:1 혼합물을 사용하여 웰당 1개의 와우의 농도로 24 웰 플레이트에서 5일 동안 개별적으로 배양하였다. 배지를 격일로 교체하였다.
Lgr5+ 세포의 증식의 정도를 평가하기 위해, 이어서 200 μl의 세포 해리 용액을 Lgr5-GFP+ 세포의 각각의 웰에 첨가하고 45분 동안 인큐베이션한 다음, 20분 동안 TrypleE와 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 배양물을 원심분리를 위해 15 ml 팔콘 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액을 제거하고 세포 배양물을 매트리겔 중에 다시 한번 재현탁시켰다. 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 대략 5000개의 세포로 분배하였다. 이어서, Lgr5-GFP+ 배양물을 나노몰 내지 마이크로몰 농도, 예를 들어, 0.001, 0.005 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 50 μM, 또는 100 μM의 후보 약물을 함유하는 DMEM/F12 배지로 추가로 5일 동안 처리하였다 (도 1 참조). 그 시점에 Lgr5-GFP+ 세포를 FACS를 사용하여 분류하고 형광을 측정하였다 (도 3 및 4 참조).
유모 세포로의 Lgr5+ 세포의 분화의 정도를 평가하기 위해, Atoh1-nGFP 세포를 EGF, bFGF, IGF, pVc, VPA, 및 CHIR99021을 함유하는 DMEM/F12 배지 (상기와 같음, 글루타맥스 (깁코), N2, B27 (인비트로젠), EGF (50 ng/mL; 케미콘), bFGF (50 ng/mL; 케미콘), IGF1 (50 ng/mL; 케미콘), 및 CHIR99021 (3 μM), VPA (1 mM), pVc (100 μg/ml) 및 616452 (2 μM)를 포함하는 소분자로 보충된 DMEM 및 F12의 1:1 혼합물)에서 2일 더 (총 7일) 배양하였다. 배지를 격일로 교체하였다. 4-히드록시타목시펜 (20 ng/ml)을 계통 추적 연구 동안 제0일에 배양물에 첨가하였다 (도 2 참조). 7일 인큐베이션 후, 200 μl의 세포 해리 용액을 각각의 웰에 첨가하고 45분 동안 인큐베이션한 다음, 20분 동안 TrypleE와 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 배양물을 원심분리를 위해 15 ml 팔콘 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액을 제거하고 세포 배양물을 매트리겔 중에 다시 한번 재현탁시켰다. 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 대략 5000개의 세포로 분배하였다. 이어서, 세포를 후보 약물을 함유하는 DMEM/F12 배지로 처리하였다. 후보 약물과 함께 10일 인큐베이션 후, 세포를 FACS에 의해 분류하고 Atoh1-nGFP 세포의 형광 수준을 측정하였다 (도 5 참조). Wnt 경로의 GSK-3β 억제제인 CHIR99021, 및 Notch 경로의 γ-세크레타제 억제제인 LY411575를 이 스크린에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다 (WO2014159356 및 도 5 참조). 이러한 스크리닝 방법을 사용하여 약물, 화합물, 유전자, 및 성장 인자를 스크리닝하였다 (표 1 참조).
표 1: 스크리닝 작용제
Figure pct00022
Figure pct00023
도 3-5에 제시된 결과는 다수의 스크리닝된 화합물이 증식 또는 분화를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 나타냈다. 표 2 및 3은 각각 증식 및 분화를 위한 최상의 화합물을 열거한다.
Figure pct00024
Figure pct00025
실시예 2. 와우 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실의 치료를 위한 작용제에 대한 약물 스크리닝.
마우스의 게놈 내로 안정하게 통합된 2종의 형광 리포터를 함유하는 신규 트랜스제닉 마우스를 만든다 (Lgr5/Atoh1 리포터 마우스). Lgr5/Atoh1 리포터 마우스는 Lgr5 프로모터의 제어 하에 GFP를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터의 난모세포 (상기 문헌 [Barker et al.])로 시작하고 Atoh1 인핸서 및 프로모터 (예를 들어, SV40 또는 글로빈 최소 프로모터)의 제어 하에 mCherry를 포함하는 플라스미드 (도 6 참조)를 첨가함으로써 만들어진다.
이들 구축물에 사용된 Atoh1 인핸서의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00026
Atoh1-mCherry 플라스미드의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
이러한 마우스로부터의 줄기 세포를 내이로부터 단리시키고, 매트리겔 중에 현탁시키고 EFG, bFGF, IGF, pVc 및 VPACHIR을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 24 웰 플레이트에서 최대 5일 동안 배양한다. 5일 후, 200 μl의 세포 해리 용액을 각각의 웰에 첨가하고 45분 동안 인큐베이션한 다음, 20분 동안 TrypleE와 인큐베이션한다. 이어서, 세포 배양물을 원심분리를 위해 15 ml 팔콘 튜브로 옮긴다. 이어서, 상청액을 제거하고 세포 배양물을 매트리겔 중에 다시 한번 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 대략 5000개의 세포로 분배한다.
이어서, 세포 배양물을 후보 약물을 함유하는 DMEM/F12 배지로 추가로 5-7일 동안 처리한다. 그 시점에 세포를 FACS를 사용하여 분류하고 마커 둘 다의 형광을 측정한다. 비처리된 트랜스제닉 대조군 세포와 비교한 경우 트랜스제닉 마우스 세포에서 마커 둘 다의 형광을 증가시키는 이들 후보 약물을 와우 유모 세포 (예를 들어, 내이 내의 와우 유모 세포)의 상실과 연관된 청각 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택한다. 이러한 스크리닝 방법을 사용하여 약물, 화합물, 유전자, 또는 성장 인자를 스크리닝한다.
참고문헌
Figure pct00030
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하고 제한하지 않는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MASSACHUSETTS EYE AND EAR INFIRMARY <120> EXPANSION AND DIFFERENTIATION OF INNER EAR SUPPORTING CELLS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 00633-0199WO1 <140> PCT/US2017/015379 <141> 2017-01-27 <150> US 62/288,958 <151> 2016-01-29 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1397 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atoh1 enhancer <400> 1 tccaaggtcc ggcaatgaag tttgcataac aaacgtttgg cagctccctc tctcacaccc 60 cattaacaag ctgtaacata tagctgcagg ttgctataat ctcattaata ttttggaaac 120 ttgaatattg agtatttctg agcgctcatt ccccatatgc cagaccactc ctgccatgct 180 gactggttcc tttctctcca ttattagcaa ttagcttcta ccttccaaag tcagatccaa 240 gtatctaaga tactaccaaa ggcatcaact atgtatgcaa gttaggcatg cttaatatca 300 cccaaacaaa caaagagtca gcacttctta aagtaatgaa gatagataaa tcgggttagt 360 tctttgggac accgctgttg ttttccagag tttttctata ctttaagcag cttgttttat 420 attctgtctt tgccctcagc cagctaacat tttatttgtt gagggttttg gctcaccaca 480 cttttggaaa cttatttgat ttcacgggga gctgaaggaa gattgttttt ggcaacaggc 540 aagtttaaca cgttcttcat ggggcattgc gaatggcaca tctaccagaa agggaggggg 600 agtaacttcc tcgtgctgaa ccagcaggag accagagctt tcctgaggtc ttcctattga 660 ttttaaagat ttaaaactga gccccaaagt tgtaatgtta ttgaagtttg tcttggaata 720 tacatctcct ctgctaactt aaaagttcaa gaaaggaaag gaaagaaata gaaccccttg 780 ctaactacaa cctagactga gaggtgaaga tcgcgggcaa agacaggtgg tcactgaaac 840 gtttgcagtt cttttcttcc gaaggcttag gacacagggt aaggaggagc taaaataaag 900 ccgagtgtac gtttagtctt ctctgcaccc caggcctagt gtctccccag gcaaggagtc 960 accccctttg cttctggctc ctaactgaaa aaggcaaaag ggagtggaga atgggttaaa 1020 tcccaggaca caggggagag gcaggggagg agagaagtcg gaggaagata aaggaaagga 1080 caggaaccaa gaagcgtggg ggtagtttgc cgtaatgtga gtgtttctta attagagagc 1140 ggctgacaat agaggggctg gcagaggctc ctggccccgg tgcggagcgt ctggagcgga 1200 gcacgcgctg tcagctggtg agcgcactcg ctttcaggcc gctccccggg gagctgagcg 1260 gccacattta acaccgtcgt caccctcccc ggcctcctca acatcggcct cctcctcgta 1320 gacagccttg ctcggccccc caccggcaga gtttacagaa gccagagcct ctcgccgttc 1380 ccccgcattc gcccggg 1397 <210> 2 <211> 5236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atoh1-mCherry plasmid <400> 2 ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc ttccaaggtc cggcaatgaa 60 gtttgcataa caaacgtttg gcagctccct ctctcacacc ccattaacaa gctgtaacat 120 atagctgcag gttgctataa tctcattaat attttggaaa cttgaatatt gagtatttct 180 gagcgctcat tccccatatg ccagaccact cctgccatgc tgactggttc ctttctctcc 240 attattagca attagcttct accttccaaa gtcagatcca agtatctaag atactaccaa 300 aggcatcaac tatgtatgca agttaggcat gcttaatatc acccaaacaa acaaagagtc 360 agcacttctt aaagtaatga agatagataa atcgggttag ttctttggga caccgctgtt 420 gttttccaga gtttttctat actttaagca gcttgtttta tattctgtct ttgccctcag 480 ccagctaaca ttttatttgt tgagggtttt ggctcaccac acttttggaa acttatttga 540 tttcacgggg agctgaagga agattgtttt tggcaacagg caagtttaac acgttcttca 600 tggggcattg cgaatggcac atctaccaga aagggagggg gagtaacttc ctcgtgctga 660 accagcagga gaccagagct ttcctgaggt cttcctattg attttaaaga tttaaaactg 720 agccccaaag ttgtaatgtt attgaagttt gtcttggaat atacatctcc tctgctaact 780 taaaagttca agaaaggaaa ggaaagaaat agaacccctt gctaactaca acctagactg 840 agaggtgaag atcgcgggca aagacaggtg gtcactgaaa cgtttgcagt tcttttcttc 900 cgaaggctta ggacacaggg taaggaggag ctaaaataaa gccgagtgta cgtttagtct 960 tctctgcacc ccaggcctag tgtctcccca ggcaaggagt cacccccttt gcttctggct 1020 cctaactgaa aaaggcaaaa gggagtggag aatgggttaa atcccaggac acaggggaga 1080 ggcaggggag gagagaagtc ggaggaagat aaaggaaagg acaggaacca agaagcgtgg 1140 gggtagtttg ccgtaatgtg agtgtttctt aattagagag cggctgacaa tagaggggct 1200 ggcagaggct cctggccccg gtgcggagcg tctggagcgg agcacgcgct gtcagctggt 1260 gagcgcactc gctttcaggc cgctccccgg ggagctgagc ggccacattt aacaccgtcg 1320 tcaccctccc cggcctcctc aacatcggcc tcctcctcgt agacagcctt gctcggcccc 1380 ccaccggcag agtttacaga agccagagcc tctcgccgtt cccccgcatt cgcccgggtc 1440 tagaatggtg agcaagggcg aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt 1500 caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga 1560 gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct 1620 gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa 1680 gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga 1740 gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca 1800 ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc 1860 cgtaatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga 1920 cggcgccctg aagggcgaga tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga 1980 cgctgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa 2040 cgtcaacatc aagttggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta 2100 cgaacgcgcc gagggccgcc actccaccgg cggcatggac gagctgtaca agtaatctag 2160 agtcggggcg gccggccgct tcgagcagac atgataagat acattgatga gtttggacaa 2220 accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct 2280 ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt 2340 atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa 2400 tgtggtaaaa tcgataagga tccgtcgacc gatgcccttg agagccttca acccagtcag 2460 ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat 2520 catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 2580 tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 2640 tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 2700 ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 2760 agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 2820 accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 2880 ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 2940 gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 3000 ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 3060 gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 3120 taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 3180 tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 3240 gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 3300 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 3360 agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 3420 cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 3480 cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 3540 ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 3600 taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 3660 tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 3720 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 3780 atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 3840 gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 3900 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 3960 cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 4020 taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 4080 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 4140 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 4200 cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 4260 ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 4320 gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 4380 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 4440 aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgcg ccctgtagcg 4500 gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 4560 ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 4620 cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 4680 tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 4740 cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 4800 ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 4860 tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 4920 aaatattaac gcttacaatt tgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 4980 gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agcccaagct accatgataa gtaagtaata 5040 ttaaggtacg ggaggtactt ggagcggccg caataaaata tctttatttt cattacatct 5100 gtgtgttggt tttttgtgtg aatcgatagt actaacatac gctctccatc aaaacaaaac 5160 gaaacaaaac aaactagcaa aataggctgt ccccagtgca agtgcaggtg ccagaacatt 5220 tctctatcga tacata 5236

Claims (80)

  1. 내이 지지 세포의 집단을
    (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (c) 표 B에 제시된 골 형태형성 단백질 (BMP) 신호전달 억제제;
    (d) 표 C에 제시된 시클린-의존성 키나제 (CDK) 활성화제;
    (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (f) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제;
    (g) 표 F에 제시된 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제;
    (h) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (i) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및
    (j) 표 I에 제시된 cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB) 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하는 방법이며,
    여기서 1종 이상의 작용제는 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, Notch 신호전달 활성화제가 델타-유사 단백질 활성화제, 재기드 단백질 활성화제, Notch 활성화제, 및/또는 γ-세크레타제 활성화제인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 1종 이상의 작용제가
    (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및
    (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 확장된 집단이 Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단인 방법.
  5. 제4항에 있어서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단이 Lgr5+ 와우 지지 세포의 확장된 집단인 방법.
  6. 제4항에 있어서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단이 Lgr5+ 전정 지지 세포의 확장된 집단인 방법.
  7. 내이 지지 세포의 집단을
    (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (f) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (g) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (h) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제;
    (i) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및
    (j) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는, 내이 유모 세포의 집단으로의 내이 지지 세포의 집단의 분화를 촉진하는 방법이며,
    여기서 1종 이상의 작용제는 내이 유모 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 1종 이상의 작용제가
    (a) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (b) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (c) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (d) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및
    (e) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, Notch 신호전달 억제제가 델타-유사 단백질 억제제, 재기드 단백질 억제제, Notch 억제제, 및/또는 γ-세크레타제 억제제인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 유모 세포의 집단이 어토널 호몰로그 1 (Atoh1)+ 내이 유모 세포의 집단인 방법.
  11. 제10항에 있어서, Atoh1+ 내이 유모 세포의 집단이 Atoh1+ 와우 유모 세포의 집단인 방법.
  12. 제10항에 있어서, Atoh1+ 내이 유모 세포의 집단이 Atoh1+ 전정 유모 세포의 집단인 방법.
  13. 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제가 표 K에 제시된 레티노산 수용체 (RAR) 효능제 또는 표 K에 제시된 레티노산 X 수용체 (RXR) 효능제인 방법.
  14. 제13항에 있어서, RAR 효능제가 RARα 효능제, RARβ 효능제, 및/또는 RARγ 효능제인 방법.
  15. 제13항에 있어서, RXR 효능제가 RXRα 효능제, RXRβ 효능제, 및/또는 RXRγ 효능제인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 신호전달 활성화제가 글리코겐 신타제 키나제-3β (GSK-3β) 억제제, Wnt 활성화제, 프리즐드 수용체 활성화제, 지단백질 수용체-관련 단백질 5/6 (LRP5/6) 활성화제, 디쉐블드 (Dvl) 활성화제, 액신 억제제, 딕코프 (Dkk) 억제제, 분비된 프리즐드-관련 단백질 (sFRP) 억제제, 그루초 억제제, 및/또는 Wnt 억제 단백질 (WIF) 억제제인 방법.
  17. 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 신호전달 억제제가 노긴 활성화제, 코르딘 활성화제, BMP 수용체 억제제, SMAD1/5/8 억제제, SMAD2/3 억제제, 및/또는 SMAD4 억제제인 방법.
  18. 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CDK 활성화제가 p27Kip1 억제제 및/또는 망막모세포종 단백질 (Rb) 억제제인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, E 박스-의존성 전사 활성화제가 Atoh1 활성화제인 방법.
  20. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, HDAC 억제제가 HDAC 부류 I 억제제, HDAC 부류 II 억제제, HDAC 부류 III 억제제, 및/또는 범-HDAC 억제제인 방법.
  21. 제20항에 있어서, HDAC 부류 III 억제제가 SIRT1 억제제 및/또는 SIRT2 억제제인 방법.
  22. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해 억제제가 프로테아솜 억제제 또는 유비퀴틴 리가제 억제제인 방법.
  23. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K-Akt 신호전달 억제제가 Akt 억제제, PI3K 억제제, PKC 억제제, 및/또는 PDK1 억제제인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 집단이 Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단인 방법.
  25. 제24항에 있어서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단이 Lgr5+ 와우 지지 세포의 집단인 방법.
  26. 제24항에 있어서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단이 Lgr5+ 전정 지지 세포의 집단인 방법.
  27. Lgr5, Sox2, p27, Prox1, FGFR3, Glast, 및 Lfng로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 지지 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 제1 리포터 유전자를 포함하는 제1 재조합 핵산 분자, 및 Atoh1, Myo7a, Cdh23, Pcdh15, Myo6, Myo1c, Tmc1, 및 Cav1.3으로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 유모 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 재조합 핵산 분자를 포함하는 인간 세포이며, 여기서 제1 리포터 유전자는 제2 리포터 유전자와 상이한 것인 세포.
  28. 제27항에 있어서, 내이 지지 세포 마커가 Lgr5인 세포.
  29. 제27항에 있어서, 내이 유모 세포 마커가 Atoh1인 세포.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 내이 지지 세포 마커가 Lgr5이고 내이 유모 세포 마커가 Atoh1인 세포.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포 마커의 조절 요소가 Lgr5 프로모터인 세포.
  32. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 유모 세포 마커의 조절 요소가 Atoh1 인핸서인 세포.
  33. 제32항에 있어서, Atoh1 인핸서가 SV40 프로모터 또는 글로빈 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 세포.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리포터 유전자가 제1 형광 단백질을 코딩하고 제2 리포터 유전자가 제2 형광 단백질을 코딩하며, 여기서 제1 형광 단백질은 제2 형광 단백질과 상이한 것인 세포.
  35. 적어도 Lgr5, Sox2, p27, Prox1, FGFR3, Glast, 및 Lfng로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 지지 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 제1 리포터 유전자를 포함하는 제1 재조합 핵산 분자, 및 Atoh1, Myo7a, Cdh23, Pcdh15, Myo6, Myo1c, Tmc1, 및 Cav1.3으로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 유모 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 재조합 핵산 분자를 포함하는, 마우스의 게놈 내로 안정하게 통합된 2종 이상의 재조합 핵산 분자를 갖는 트랜스제닉 마우스이며, 여기서 제1 리포터 유전자는 제2 리포터 유전자와 상이한 것인 트랜스제닉 마우스.
  36. 제35항에 있어서, 내이 지지 세포 마커가 Lgr5인 트랜스제닉 마우스.
  37. 제35항에 있어서, 내이 유모 세포 마커가 Atoh1인 트랜스제닉 마우스.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 내이 지지 세포 마커가 Lgr5이고 내이 유모 세포 마커가 Atoh1인 트랜스제닉 마우스.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포 마커의 조절 요소가 Lgr5 프로모터인 트랜스제닉 마우스.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 유모 세포 마커의 조절 요소가 Atoh1 인핸서인 트랜스제닉 마우스.
  41. 제40항에 있어서, Atoh1 인핸서가 SV40 프로모터 또는 글로빈 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스제닉 마우스.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리포터 유전자가 제1 형광 단백질을 코딩하고 제2 리포터 유전자가 제2 형광 단백질을 코딩하며, 여기서 제1 형광 단백질은 제2 형광 단백질과 상이한 것인 트랜스제닉 마우스.
  43. 제1 재조합 핵산 분자 및 제2 재조합 핵산 분자를 포함하는, 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항의 트랜스제닉 마우스로부터 단리된 세포.
  44. 제43항에 있어서, 트랜스제닉 마우스의 내이로부터 단리된 세포.
  45. 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법이며,
    (a) 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항의 마우스로부터 내이 지지 세포의 집단을 단리시키고;
    (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하고;
    (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고;
    (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 지지 세포의 확장된 집단에서 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고;
    (e) 시험 화합물의 부재 하의 제1 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 제1 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키고/거나, 시험 화합물의 부재 하의 제2 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 제2 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것
    을 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건이 1종 이상의 성장 인자, 바람직하게는 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 (IGF1)의 존재 하의 배지, 바람직하게는 DMEM 및 F12 배지의 혼합물, 바람직하게는 1:1 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건이
    (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (f) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제 또는 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제;
    (g) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (h) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (i) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및
    (j) 표 I에 제시된 CREB 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제가 표 K에 제시된 RAR 효능제 또는 표 K에 제시된 RXR 효능제인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건이 표 1에 제시된 1종 이상의 작용제를 포함하는 것인 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건이 N2, B27, EGF, bFGF, IGF1, CHIR99021, 및 VPA로 보충된 배지, 바람직하게는 DMEM 및 F12의 1:1 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 작용제가 소분자, 화합물, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 성장 인자, 및 후성적 조절제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 집단이 먼저 코르티 기관을 절제하고, 감각 상피를 단리시키고, 단세포 현탁액을 생성하는 것을 포함하는 방법에 의해 마우스의 와우로부터 단리된 것인 방법.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 집단이 Lgr5+ 내이 지지 세포의 집단인 방법.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리포터 유전자가 제1 형광 단백질을 코딩하고 제2 리포터 유전자가 제2 형광 단백질을 코딩하며, 여기서 제1 형광 단백질은 제2 형광 단백질과 상이한 것인 방법.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자의 발현 수준이 단백질 발현 수준인 방법.
  56. 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법이며,
    (a) Lgr5, Sox2, p27, Prox1, FGFR3, Glast, 및 Lfng로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 지지 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 리포터 유전자를 포함하는 안정하게 통합된 재조합 핵산 분자를 갖는 내이 지지 세포의 집단을 제공하고;
    (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하며, 여기서 조건은
    (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제,
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제,
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제,
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제,
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제,
    (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제,
    (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제,
    (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제,
    (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제, 및
    (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하고;
    (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고;
    (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 지지 세포의 확장된 집단에서 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고;
    (e) 시험 화합물의 부재 하의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것
    을 포함하는 방법.
  57. 와우 또는 전정 유모 세포의 상실과 연관된 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제를 확인하는 방법이며,
    (a) Atoh1, Myo7a, Cdh23, Pcdh15, Myo6, Myo1c, Tmc1, 및 Cav1.3으로 이루어진 군으로부터 선택된 내이 유모 세포 마커의 조절 요소의 제어 하에 리포터 유전자를 포함하는 안정하게 통합된 재조합 핵산 분자를 갖는 내이 지지 세포의 집단을 제공하고;
    (b) 내이 지지 세포의 집단을 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지하며, 여기서 조건은
    (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제,
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제,
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제,
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제,
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제,
    (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제,
    (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제,
    (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제,
    (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제, 및
    (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하고;
    (c) 내이 지지 세포의 확장된 집단에게 시험 화합물을 투여하고;
    (d) 시험 화합물의 존재 하의 내이 세포의 확장된 집단에서 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하고;
    (e) 시험 화합물의 부재 하의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하여 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 청각 상실 또는 균형 상실의 치료를 위한 후보 작용제로서 선택하는 것
    을 포함하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제가 표 K에 제시된 RAR 효능제 또는 표 K에 제시된 RXR 효능제인 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건이
    (a) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (b) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (c) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (d) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및
    (e) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 포함하는 것인 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 확장된 집단이 Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단인 방법.
  61. 제60항에 있어서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단이 Lgr5+ 와우 지지 세포의 확장된 집단인 방법.
  62. 제60항에 있어서, Lgr5+ 내이 지지 세포의 확장된 집단이 Lgr5+ 전정 지지 세포의 확장된 집단인 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 집단이 인간으로부터 단리된 것인 방법.
  64. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 집단이 마우스로부터 단리된 것인 방법.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자가 형광 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  66. 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법이며, 그를 필요로 하는 대상체에게 하기 중 하나 또는 둘 다를 투여하는 것을 포함하는 방법:
    (a) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제;
    (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및
    (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제; 및/또는
    (b) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및
    (ix) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제.
  67. 제66항에 있어서, 그를 필요로 하는 대상체에게 하기 중 하나 또는 둘 다를 투여하는 것을 포함하는 방법:
    (a) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제; 및/또는
    (b) (i) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (iii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (iv) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및
    (v) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 치료 유효량의 1종 이상의 작용제.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 1종 이상의 작용제가 전신으로 또는 대상체의 귀에, 바람직하게는 대상체의 중이에 경고실로 투여되는 것인 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제가 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제 전에 투여되는 것인 방법.
  70. 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법이며,
    (a) 1개 이상의 내이 지지 세포를, 임의로 시험관내에서,
    (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제;
    (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및
    (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제와 접촉시키고;
    (b) 내이 지지 세포의 확장된 집단을
    (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제;
    (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및
    (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제와 임의로 접촉시키고;
    (c) 대상체의 귀에 (임의로 내이에) 내이 유모 세포를 투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  71. 청각 상실 또는 균형 상실을 갖는 대상체를 치료하는 방법이며,
    (a) 1개 이상의 내이 지지 세포를, 임의로 시험관내에서,
    (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (vi) 표 E에 제시된 Notch 신호전달 활성화제;
    (vii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (viii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (ix) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제; 및
    (x) 표 I에 제시된 CREB 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제와 접촉시키고;
    (b) (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제;
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (vi) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (vii) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제;
    (viii) 표 H에 제시된 PI3K-Akt 신호전달 억제제;
    (ix) 표 I에 제시된 CREB 활성화제; 및
    (x) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제의 투여와 조합하여, 바람직하게는 그와 동시에 또는 그 전에 대상체의 귀 (바람직하게는 내이)에 내이 지지 세포의 확장된 집단을 투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  72. 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 내이 지지 세포의 증식을 촉진하는 1종 이상의 작용제가
    (i) 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (iii) 표 B에 제시된 BMP 신호전달 억제제;
    (iv) 표 C에 제시된 CDK 활성화제; 및
    (v) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제
    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (b) 내이 유모 세포로의 내이 지지 세포의 분화를 촉진하는 1종 이상의 작용제가
    (i) 표 A에 제시된 Wnt 신호전달 활성화제;
    (ii) 표 D에 제시된 E 박스-의존성 전사 활성화제;
    (iii) 표 F에 제시된 HDAC 억제제;
    (iv) 표 G에 제시된 단백질 분해 억제제; 및
    (v) 표 J에 제시된 Notch 신호전달 억제제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 레티노이드 수용체 신호전달 활성화제가 표 K에 제시된 RAR 효능제 또는 표 K에 제시된 RXR 효능제인 방법.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 지지 세포가 Lgr5+ 내이 지지 세포인 방법.
  75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 내이 유모 세포가 Atoh1+ 내이 유모 세포인 방법.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 균형 상실을 갖는 것인 방법.
  77. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 청각 상실을 갖는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 청각 상실이 감각신경성 청각 상실인 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 청각 상실이 유전적 또는 선천성 결함, 외상, 노화, 또는 화학물질-유발 이독성의 결과인 방법.
  80. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
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