ES2903000T3

ES2903000T3 - Materiales y métodos para administrar ácidos nucleicos a las células cocleares y vestibulares

Info

Publication number: ES2903000T3
Application number: ES16874069T
Authority: ES
Inventors: Konstantina Stankovic; Luk H Vandenberghe; Jeffrey Holt; Gwenaelle Galeoc
Original assignee: Childrens Medical Center Corp; Massachusetts Eye and Ear Infirmary; Schepens Eye Research Institute Inc
Current assignee: Childrens Medical Center Corp; Schepens Eye Research Institute Inc; Massachusetts Eye and Ear
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2016-12-12
Publication date: 2022-03-30
Anticipated expiration: 2036-12-12
Also published as: SG11201804814YA; JP2018536420A; EP3386537B1; JP6990182B2; EP3984550A1; KR20180097631A; JP2022046484A; US20220016262A1; WO2017100791A1; US11167042B2; EP3386537A4; JP2023145460A; AU2016366846B2; EP3386537A1; CN109310745A; CA3007476A1; CN109310745B; AU2016366846A1; US20180369414A1; CN116236591A

Abstract

Un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una proteína de cápside Anc80 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y uno o más transgenes seleccionados del grupo que consiste en TMC1, TMC2, MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7, para el uso en un método para tratar un trastorno de la audición, donde uno o más transgenes se administran al menos al 80% de las células ciliadas del oído interno (CCI) y al menos al 80% de las células ciliadas del oído externo (CCE) en el oído interno de un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Materiales y métodos para administrar ácidos nucleicos a las células cocleares y vestibulares

Campo técnico

Esta divulgación se refiere en general a los materiales y métodos para administrar ácidos nucleicos a las células cocleares y vestibulares.

Antecedentes

La pérdida de audición de origen genético es un problema importante con pocas opciones terapéuticas aparte de los implantes cocleares. Los problemas auditivos heredados se deben a menudo a defectos en un solo gen. La sordera prelingual se diagnostica en 1/500 bebés, de los cuales aproximadamente el 50% es de etiología genética. El síndrome de Usher, que se asocia a una serie de distintos subtipos clínicos, cada uno de los cuales puede estar causado por una mutación en cualquiera de un número de genes diferentes, es responsable de entre el 3 y el 6% de las sorderas infantiles tempranas, mientras que uno de los defectos genéticos más prevalentes, estimado en un 1-2% de todas las sorderas genéticas, se produce en el gen TMC1.

El oído interno, por ejemplo, la cóclea, en particular las células ciliadas internas y externas (CCI y CCE) de la cóclea, es un objetivo atractivo para el enfoque de terapias génicas para intervenir en la pérdida de audición y la sordera de diversas etiologías, más propiamente en las formas monogénicas de sordera hereditaria. Sin embargo, ha sido todo un reto focalizar y transducir eficientemente las CCI y CCE, así como otras células del oído interno que pueden ser relevantes para los enfoques de terapias génicas.

Resumen

La pérdida de audición es el trastorno sensorial más común en todo el mundo, y la mitad de las sorderas prelinguales se deben a causas genéticas. No obstante, la traslación de la terapia génica coclear a la clínica se ha visto frenada por la falta de modalidades de administración seguras, clínicamente relevantes y eficientes. Las nuevas modalidades de administración de genes descritas aquí, sin embargo, que incluyen nuevas composiciones y métodos basados en un virus adenoasociado (AAV) que contiene una proteína de cápside Anc80, proporcionan una transferencia de genes altamente eficiente a las células del oído interno, incluyendo tanto las CCI como las CCE. Como se muestra en el presente documento, un virus adenoasociado (AAV) que contiene una proteína de cápside de andamiaje ancestral referida como Anc80 o una proteína de cápside Anc80 específica (por ej., Anc80-0065) es sorprendentemente eficiente para focalizar varias células del oído interno in vivo, incluyendo las CCI y CCE.

La invención proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una proteína de cápside Anc80 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y uno o más transgenes seleccionados del grupo que consiste en TMC1, TMC2, MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7, para el uso en un método para tratar un trastorno de la audición, donde uno o más transgenes se administran al menos al 80% de las células ciliadas del oído interno (CCI) y al menos al 80% de las células ciliadas del oído externo (CCE) en el oído interno de un sujeto. En un aspecto, se proporciona un vector AAV que incluye una proteína de cápside Anc80 y un transgén TMC1 o TMC2. En otro aspecto, se proporciona un vector de AAV que incluye una proteína de cápside Anc80 y uno o más transgenes seleccionados del grupo que consta de MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7. En una realización, el vector de AAV comprende además un promotor heterólogo.

En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para suministrar un transgén a una o más células del oído interno en un sujeto. Dicho método incluye típicamente la administración de un virus adenoasociado (AAV) al oído interno de un sujeto, donde el AAV comprende una proteína de cápside Anc80 y un transgén.

En otro aspecto más, la invención proporciona un AAV para el uso en un método de tratamiento de un trastorno auditivo (por ej., restauración de la audición). El método incluye administrar un AAV al sujeto, donde el AAV comprende una proteína de cápside Anc80 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 y un transgén que, cuando se expresa en una o más células del oído interno, restaura la audición del sujeto, donde el transgén se administra al menos al 80% de las células ciliadas internas (CCI) y al menos al 80% de las células ciliadas del oído externo (CCE) del oído interno del sujeto. Una o más células del oído interno se seleccionan del grupo formado por las células ciliadas internas (CCI) y las células ciliadas externas (CCE). El transgén se libera al menos en el 80% de las células ciliadas internas y al menos en el 80% de las células ciliadas externas. En algunas realizaciones, una o más células del oído interno se seleccionan del grupo que consiste en neuronas ganglionares espirales, células ciliadas vestibulares, neuronas ganglionares vestibulares, células de soporte y células de la estría vascular.

En algunas realizaciones, el transgén se selecciona del grupo que consta de ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP.NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1,WFS1, WHRN, y XIAP.

En algunas realizaciones, el transgén codifica un factor neurotrófico (por ej., GDNF, BDNF, NT3 y HSP70). En algunas realizaciones, el transgén codifica un anticuerpo o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el transgén codifica un anticuerpo o una proteína inmunomoduladora. En algunas realizaciones, el transgén codifica una transcripción antioncogénica. En algunas realizaciones, el transgén codifica una especie de ARN antisentido, silenciador o no codificante largo. En algunas realizaciones, el transgén codifica un sistema de edición del genoma seleccionado del grupo que consiste en una nucleasa de dedo de zinc modificada genéticamente, TALEN y CRISPR.

En algunas realizaciones, la proteína de cápside Anc80 tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la proteína de cápside Anc80 tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, el transgén está bajo el control de una secuencia de promotor heterólogo. Las secuencias de promotor heterólogo representativas incluyen, sin limitación, un promotor de CMV, un promotor de CBA, un promotor de CASI, un promotor de PGK, un promotor de EF-1, un promotor del receptor nicotínico alfa9, un promotor de prestina, un promotor de KCNQ4, un promotor de Myo7a, un promotor de Myo6, un promotor de Gfi1, un promotor de Vglut3 y un promotor de Atoh1.

En algunas realizaciones del vector de AAV para el uso definido en las reivindicaciones, el paso de administración incluye inyectar el Anc AAV a través de la ventana redonda. En algunas realizaciones del vector de AAV para el uso definido en las reivindicaciones, el Anc AAV se administra mediante inyección a través de la ventana redonda. En algunas realizaciones del vector de AAV para el uso definido en las reivindicaciones, el Anc AAV se administra durante una cocleostomía o durante una canalostomía.. En algunas realizaciones del vector de AAV para el uso definido en las reivindicaciones, el Anc AAV se administra al oído medio y/o a la ventana redonda a través de uno o más vehículos de administración de fármacos.

En algunas realizaciones, la expresión del transgén resulta en la regeneración de las células ciliadas internas (CCI), las células ciliadas externas (CCE), las neuronas ganglionares espirales, la estría vascular, las células ciliadas vestibulares y/o las neuronas ganglionares vestibulares (por ej., Atoh1, NF2), restaurando así la función auditiva o vestibular.

En un aspecto, la invención proporciona un artículo de fabricación que incluye un vector de AAV y una composición farmacéutica para el uso en un método de tratamiento de un trastorno auditivo. En dicho artículo de fabricación, el vector de AAV comprende una proteína de cápside Anc80 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 y un transgén unido operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, el transgén se selecciona del grupo que consta de ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP,NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1 ,WFS1, WHRN, y XIAP. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para suministrar un transgén TMC1 o TMC2 a una o más células del oído interno en un sujeto. Dicho método incluye típicamente la administración de un virus adenoasociado (AAV) al oído interno de un sujeto, donde el AAV comprende una proteína de cápside Anc80 y un transgén. En otro aspecto más de la divulgación, se proporciona un método para tratar un trastorno auditivo en un sujeto. Dicho método incluye típicamente administrar un AAV al sujeto, donde el AAV comprende una proteína de cápside Anc80 y un transgén TMC1 o TMC2 que, cuando se expresa en una o más células del oído interno, restaura la audición del sujeto o previene la pérdida de audición en el sujeto (por ej., una mayor pérdida de audición).

En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para suministrar un transgén Usher a una o más células en el oído interno de un sujeto. Dicho método incluye típicamente la administración de un virus adenoasociado (AAV) al oído interno de un sujeto, donde el AAV comprende una proteína de cápside Anc80 y un transgén. En otro aspecto más de la divulgación, se proporciona un método para tratar un trastorno auditivo en un sujeto. Dicho método puede incluir la administración de un AAV al sujeto, donde el AAV comprende una proteína de cápside Anc80 y un transgén Usher que, cuando se expresa en una o más células del oído interno, restaura la audición del sujeto. Los transgenes Usher representativos incluyen, sin limitación, MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, estría vascular En una realización de la divulgación, una o más células del oído interno se seleccionan del grupo que consta de células ciliadas internas (CCI) y células ciliadas externas (CCE). En una realización de la divulgación, el transgén se libera en al menos el 80% de las células ciliadas internas y al menos el 80% de las células ciliadas externas. En una realización de la divulgación, una o más células del oído interno se seleccionan del grupo que consta de neuronas ganglionares espirales, células ciliadas vestibulares, neuronas ganglionares vestibulares, células de soporte y células de la estría vascular. En una realización de la divulgación, la proteína de la cápside Anc80 tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1. En una realización de la divulgación, la proteína de cápside Anc80 tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:2. En una realización de la divulgación, el transgén está bajo el control de una secuencia promotora heteróloga. Las secuencias del promotor heterólogo representativas incluyen, sin limitación, un promotor de CMV, un promotor de CBA, un promotor de CASI, un promotor de PGK, un promotor de EF-1, un promotor del receptor nicotínico alfa9, un promotor de prestina, un promotor de KCNQ4, un promotor de Myo7a, un promotor de Myo6, un promotor de Gfi1, un promotor de Vglut3 y un promotor de Atoh1.

En una realización de la divulgación, el paso de administración comprende la inyección del Anc AAV a través de la ventana redonda. En una realización de la divulgación, el Anc AAV se administra mediante inyección a través de la ventana redonda. En una realización de la divulgación, el Anc AAV se administra durante una cocleostomía o una canalostomía. En una realización de la divulgación, el Anc AAV se administra en el oído medio y/o en la ventana redonda a través de uno o más vehículos de administración de fármacos.

En una realización de la divulgación, la expresión del transgén resulta en la regeneración de las células ciliadas internas (CCI), las células ciliadas externas (CCE), las neuronas ganglionares espirales, la estría vascular, las células ciliadas vestibulares y/o las neuronas ganglionares vestibulares (por ej., Atoh1, NF2), restaurando así la función auditiva o vestibular y/o previniendo la pérdida de audición (por ej., una mayor pérdida de audición).

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenecen los métodos y las composiciones de la materia. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en las pruebas de los métodos y composiciones de la materia, a continuación se describen unos métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Descripción de las Figuras

Parte 1: Transferencia génica coclear altamente eficiente

Las Figuras 1A-1G son imágenes que muestran proyecciones confocales representativas de una comparación in vitro de varios serotipos de AAV para la expresión del transgén eGFP en explantes cocleares de ratones C57BL/6. Las Figuras 1A-1G muestran la expresión en la base coclear para todos los serotipos, y el ápex y la base para el AAV indicado. Barra de escala = 100 ^M. Arriba: Myo7A+TuJ1; abajo: eGFP solo; centro: superposición; Células S: células de soporte, CCE: célula ciliada externa, CCI: célula ciliada interna. Las Figuras 1H-1K son gráficos que muestran el porcentaje de células ciliadas eGFP-positivas por 100 ^M tras 48 h o 48 h+5 días de incubación. N=3 para 48 h, y N=2 para 48h+5d. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

Las Figuras 2A-2G son imágenes que muestran la transducción coclear in vivo del serotipo de AAV indicado en el título indicado encima de cada panel. La Figura 2A son imágenes confocales de los órganos de Corti de ratón, sometidos a contratinción con Alexa-546-faloidina (rojo) y representados para eGFP (verde). Barra de escala = 50 ^M. La Figura 2B es un gráfico que muestra la cuantificación de CCI eGFP-positivas en la base y el ápex de las cócleas inyectadas con AAV-eGFP. La Figura C es un gráfico que muestra la cuantificación de CCE eGFP-positivas en la base y el ápex de las cócleas inyectadas con AAV-eGFP. La Figura 2D son imágenes que muestran familias de corrientes de transducción sensorial registradas en P7 (izquierda) de las CCE eGFP-negativas (negro) y de las CCE eGFP-positivas (verde). La barra de escala vertical indica 200 pA; la barra de escala horizontal indica 20 mseg. A la derecha se muestran las corrientes de las CCI P35 eGFP-negativas (negro) y eGFP-positivas (verde). La barra de escala vertical indica 100 pA; la barra de escala horizontal indica 20 mseg. La Figura 2E es un gráfico que muestra las amplitudes de la corriente de transducción sensorial trazada para 103 CCI y CCE en las edades indicadas en la parte inferior. Se muestran los datos de eGFP-negativas (negro) y eGFP-positivas (verde). El número de células de cada grupo se muestra en el gráfico. La Figura 2F es un gráfico que muestra la ± desviación estándar de la media (SD). Los umbrales ABR se representan para cuatro oídos inyectados con Anc80 (verde) y cuatro oídos no inyectados (negro) junto con los datos de un oído inyectado sin fluorescencia eGFP debido al daño relacionado con la inyección (rojo). La Figura 2G es un gráfico que muestra la SD± de la media. Los umbrales DPOAE se representan para cuatro oídos inyectados con Anc80 (verde) y cuatro oídos no inyectados (negro) y un oído de control negativo con daño por inyección sin fluorescencia eGFP (rojo). Los títulos de inyección para los puntos de datos en las Figuras 2B-2G son como en la Figura 2A.

Las Figuras 3A-3D son imágenes que muestran la transducción de Anc80-eGFP en los epitelios sensoriales vestibulares. La Figura 3A son imágenes que muestran el utrículo de un ratón P1 inyectado con 1 mL de Anc80-eGFP (1,7 x 1012 GC/mL). El tejido se recogió, se fijó y se tiñó con Alexa546-faloidina (rojo) y se obtuvieron imágenes de eGFP (verde). Barra de escala = 100 mm. La Figura 3B son imágenes que muestran la crista del canal semicircular posterior del mismo ratón descrito en la Figura 3A. Barra de escala = 50 mm. La Figura 3C son imágenes que muestran el epitelio sensorial de un utrículo humano. El tejido se expuso al vector Anc80-eGFP, se cultivó, se fijó, se tiñó con Alexa546-faloidina (rojo) y se representó en imagen para la fluorescencia eGFP (verde). Barra de escala = 100 mm. La Figura 3D muestra una imagen de gran aumento de un epitelio humano en el utrículo teñido con Alexa546-faloidina (rojo) y Myo7A (azul) y representado en imagen para eGFP (verde) transducido en condiciones idénticas a las de la Figura 3C. Las flechas blancas en el panel superpuesto indican las células seleccionadas eGFP-positivas/Myo7A-positivas. Barra de escala = 20 ^M.

Las Figuras 4A-4J son imágenes representativas de una comparación in vitro de varios serotipos de AAV con respecto a la expresión de eGFP en explantes cocleares de ratón CBA/CaJ. Las Figuras 4A-4F son imágenes que muestran los resultados tras la incubación a dosis iguales del serotipo de AAV. Barra de escala = 200 ^m. Las barras de error mostradas en las Figuras 4G-4J representan la microscopía SEM. Las Figuras 5A-5H son imágenes que muestran un sistema de puntuación de la expresión cualitativa de eGFP que va de 0 (Figuras 5D, 5H) (la expresión más baja) a 3 (Figuras 5A, 5E) (el nivel más alto de expresión) para ilustrar el rango de expresión en términos de intensidad y número de células infectadas con "0" que representa sin expresión (Figuras 5D, 5H), "1" selecciona el número de células que se expresan débilmente (Figuras 5C, 5G), "2" niveles bajos a moderados de expresión en un número significativo de células por campo microscópico (Figuras 5B, 5F), y "3" alto porcentaje de células que expresan eGFP a niveles que van de moderado a alto (Figuras 5A, 5E). Barra de escala mostrada en la Figura 5A (para las Figuras 5A-5D) y en la Figura 5E (para las Figuras 5E-5H) = 20 |^m.

La Figura 6 son gráficos que muestran la expresión de eGFP en el limbo, las células de soporte y las neuronas del ganglio espiral de ratones C57BL/6 utilizando un sistema de puntuación de eGFP detallado anteriormente en la Figura 5. Las barras de error representan el SEM. La transducción de SGN se evaluó mediante el recuento de células eGFP-positivas por campo microscópico.

La Figura 7 son gráficos que muestran la expresión de eGFP en el limbo, las células de soporte y las neuronas del ganglio espiral de ratón CBA/CaJ utilizando un sistema de puntuación de eGFP detallado anteriormente en la Figura 5. Las barras de error representan el SEM. La transducción de SGN se evaluó mediante el recuento de células eGFP-positivas por campo microscópico.

Las Figuras 8A-8E son imágenes que muestran la transducción extensiva de células ciliadas internas y externas en cócleas murinas con Anc80. La Figura 8A es una imagen que muestra a bajo aumento la porción apical completa de una cóclea de ratón inyectada con Anc80-eGFP. La cóclea se recogió y se tiñó con Alexa546-faloidina (rojo) y se obtuvieron imágenes de eGFP (verde). Barra de escala = 100 ^m. La Figura 8B es una imagen que muestra una vista a gran aumento de una porción basal de otra cóclea de ratón diferente inyectada con Anc80-eGFP. La cóclea se recogió y se tiñó con Alexa546-faloidina (rojo) y se obtuvieron imágenes de eGFP (verde). Barra de escala = 20 ^m. Las Figuras 8C y 8D son gráficos que muestran la comparación cuantitativa de la eficiencia de la transducción de las células ciliadas internas y externas tras la inyección en la ventana redonda de ratones C57BL/6. La Figura 8E son imágenes que muestran la dependencia de la dosis de transducción de las células ciliadas con Anc80. Las cócleas se expusieron a dos títulos diferentes de Anc80-eGFP, se fijaron, se tiñeron con Alexa546-faloidina (rojo) y se obtuvieron imágenes de eGFP (verde). Barra de escala = 20 ^m

Las Figuras 9A-9H son imágenes que muestran la transducción coclear bilateral desde la base hasta el ápex en cócleas de ratón evaluadas para la expresión del transgén eGFP en secciones histológicas teñidas para TuJ1 (Rojo) y Myo7A (Mangenta) Se observó una transducción eficiente de Anc80 en la cóclea inyectada que se extendía hasta el ápex (Figuras 9A/9F) y también en el oído contralateral no inyectado (Figuras 9B-9E=desde el ápex hasta la base). Imagen cercana de neuronas ganglionares espirales de eGFP-positivo y TuJ1-positivo (Figura 9G). Imagen 3D reconstruida para la evaluación de SGN de la transducción de Anc80 (Figura 9H). Barras de escala 100 ^m (Figuras 9A-9E) y 20 ^m (Figuras 9F/9G). Las Figuras 10A-10B son representaciones de imágenes microscópicas que muestran una sección axial de un cerebro de ratón tras la inyección coclear unilateral con Anc80 (Figura 10A). La expresión predominante se observó en el cerebelo, en particular en las células de Purkinje (puntas de flecha blancas) (Figura 10B). Barras de escala 1 mm (Figura 10A) y 300 ^m (Figura 10B). La Figura 10C es una imagen que muestra los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-AAV (NAB) en suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) en animales no inyectados y en animales inyectados con Anc80 RWM (Nicho de ventana redonda). Los títulos reflejan la dilución de suero o LCR a la que se observó una inhibición del 50% de la transducción en el ensayo NAB. Debido a las limitaciones del volumen de la muestra, el límite de sensibilidad para el NAB en suero fue de 1/4 y para el LCR fue de 1/52,5.

Las Figuras 11A-11B son una imagen y un gráfico, respectivamente, que muestran la función vestibular tras la transducción coclear de Anc80. Se inyectaron ratones con Anc80-eGFP y se evaluó la expresión y la función de equilibrio en el dispositivo rotarod. La Figura 11A es una imagen que muestra la expresión de eGFP (verde) en el tejido vestibular mediante microscopía confocal con tinción inmunofluorescente para Myo7A (rojo). La Figura 11B es un gráfico que muestra el tiempo medio hasta que los ratones cayeron del dispositivo /- SEM. Barra de escala = 50 ^m

Parte 2—La terapia génica restaura la función en un modelo de ratón del Síndrome de Usher

Las Figuras 12A-12L son imágenes que muestran la microscopía electrónica de barrido del órgano de Corti en ratones mutantes c.216G>A Ushlc. Las Figuras 12A-12F son imágenes que muestran las regiones basal, media y apical del órgano de Corti representadas en ratones mutantes c.216GA y c.216AA. Las Figuras 12G-12L son imágenes a gran aumento de CCE (Figuras 12G-12H) y de CCI (Figuras 12I-12J). Las estrellas indican haces ciliares conservados; punta de flecha, haces ciliares desorganizados; y flechas, haces de CCI onduladas. Barras de escala bajo aumento: 5 mm (Figuras 12A-12F); gran aumento: 2 ^m (Figura 12G), 3 ^m (Figura 12H), 2 ^m (Figuras 12I-12J) y 1 ^m (Figuras 12K, 12L).

Las Figuras 13A-13H son imágenes que muestran la mecanotransducción en las células ciliadas de ratones mutantes neonatos c.216G>A Ush1c.

Las Figuras 13A-13D son imágenes que muestran la tinción de FM1-43 para evaluar la presencia de canales de transducción abiertos en las células ciliadas de ratones c.216GA y c.216AA. La fluorescencia de FM1-43 en las CCI aparece más tenue ya que las CCI están en un plano focal diferente. Izquierda: DIC, Derecha: FM1-43; Barra de escala 10 ^m; Figura 13C, barra de escala 50 ^m; Figura 13D, barra de escala 10 ^m. La línea blanca de la Figura 13D delinea las regiones de la estriola (sin captar) y extra-estriola (captada). Las Figuras 13E-13H son gráficos que muestran la mecanotransducción evaluada en las CCE, CCI y VHC en ratones neonatos c.216GA y c.216AA. Se representan las corrientes de transducción representativas (Figura 13E), sus gráficos asociados de corriente/desplazamiento ajustados con una función de Boltzmann de segundo orden (Figura 13F) y la media de la corriente de transducción máxima (Figuras 13G-13H). La transducción máxima media fue significativamente diferente entre los dos genotipos en las CCE, CCI y VHC (***P < 0,01, ANOVA de una vía).

Las Figuras 14A-14E son imágenes que muestran la expresión y localización de armonina marcada con fluorescencia en los tejidos expuestos en vectores virales adenoasociados in vitro e in vivo. Las Figuras 14A-14C muestran tejidos del oído interno sometidos a disección aguda y expuestos a vectores AAV2/1, cultivados, fijados, contrateñidos (Alexa Fluor faloidina, Invitrogen) y captados con un microscopio confocal. Figura 14A barra de escala: 10 ^m- paneles superiores; 5 ^m- paneles inferiores; Figura 14B barra de escala: 10 ^m; Figura 14C barra de escala: 3 ^m; Figura 14D barra de escala: 30 ^m; Figura 14E barra de escala: 5^m.

Las Figuras 15A-15C son imágenes que muestran la recuperación de la mecanotransducción en células ciliadas de ratones inyectados con vectores de armonina Anc80. Las Figuras 15A-15C muestran las corrientes de mecanotransducción registradas en las CCI de ratones c.216AA de control no inyectados y de ratones c.216AA inyectados con Anc80 armoninab1 o con una inyección combinada de Anc80 armonina-b1 y Anc80 armonina-al. Se prepararon cultivos organotípicos y se hicieron registros. Curva I/X correspondiente a cada serie de datos y función de ajuste de Boltzmann doble. Corriente de mecanotransducción máxima respectiva Imax= 102,1 pA (c.216AA); 424,3 pA (c.216AA armonina-bl) y 341,1 pA (c.216AA armonina-al&-bl) (Figura 15B). Las respuestas promedio (± SD (desviación estándar) de la media) muestran una recuperación significativa de la transducción (***P < 0,001) en los ratones inyectados con armonina-b1 y armonina-a1 -b1 en relación con los no inyectados. Las corrientes de transducción medias fueron significativamente diferentes en los ratones inyectados con armonina-b1 y los ratones de control c.216GA (NS P>0,5). La recuperación de la mecanotransducción tampoco mejoró significativamente cuando se combinaron armonina-a y armonina-b. La Figura 15C muestra el análisis ANOVA de una vía.

Las Figuras 16A-16E son imágenes que muestran la recuperación del umbral de ABR y DPOAE en ratones inyectados con Anc80 armonina-b 1. La Figura 16A es una imagen que muestra las respuestas ABR representativas para tonos de 16 kHz en ratones c.216AA de control y ratones c.216AA inyectados con vectores que codifican armonina-al, armonina-b 1 o una combinación de ambos. Se midieron los umbrales ABR recuperados cercanos a 30 dB SPL en ratones inyectados con armonina-b 1 solo o armonina-al y b1 combinadas. La Figura 16B es una imagen que muestra las respuestas ABR medias obtenidas para: c.216 AA; c.216GA; c.216AA armonina-al; c.216AA armonina-bl; c.216AA armonina-al&-bl. ± SE de la media, líneas continuas. Líneas de puntos: Umbrales ABR para toda la gama de frecuencias en los ratones cuyos registros de 16 kHz se muestran en la Figura 16A. La Figura 16C muestra las respuestas de DPOAE medias obtenidas para: c.216AA; c.216GA; c.216AA armonina-al; c.216AA armonina-bl; c.216AA armonina-al&-bl. ± SE de la media, líneas continuas. Líneas de puntos: Umbrales de DPOAE para los cuatro ratones cuyos registros se ilustran en la Figura 16A. Las flechas indican que los umbrales son superiores al nivel de estímulo máximo ensayado. Las Figuras 16D-16E muestran las respuestas de ABR y DPOAE obtenidas a las 6 semanas y a los 3 meses en los ratones que mostraron umbrales de ABR iniciales inferiores o iguales a 45 dB. Seis de los ocho ratones se mantuvieron durante 6 meses y se evaluaron las respuestas de ABR y DPOAE (línea de puntos). ± SE de la media. Mientras que los cambios en los umbrales de ABR y DPOAE fueron evidentes durante los tres primeros meses, el rescate auditivo seguía siendo destacado a los 6 meses de edad en el rango de frecuencia más bajo.

Las Figuras 17A-17E son imágenes que muestran la respuesta del reflejo de sobresalto, el rendimiento en el rotarod y la recuperación del comportamiento en campo abierto en ratones inyectados con Anc80 armonina-al y Anc80 armonina-b1. La Figura 17A muestra la respuesta del reflejo de sobresalto a los estímulos de ruido blanco registrados en los ratones de control c.216GA, c.216AA y c.216AA inyectados. El rescate parcial del reflejo de sobresalto fue evidente en los ratones inyectados con armonina-b1 pero no con armonina-al. Se muestra la ± SE de la media. La Figura 17B muestra el rendimiento en el rotarod en ratones de control c.216GA, c.216AA y c.216AA inyectados. Se observó una recuperación completa en los ratones inyectados con armonina-b1 y armonina-a1/b1; no se observó recuperación con armonina-a1 solo. Se muestra la ± SE de la media. Las Figuras 17C-17E muestran observaciones de campo abierto realizadas durante 5 minutos en ratones de control c.216GA, c.216AA y c.216AA y c.216GA inyectados. Se muestran rastros representativos durante 2,5 minutos (Figura 17B). Mientras que los ratones mutantes c.216AA exploran todo el campo y realizan rotaciones repetitivas de todo el cuerpo, los ratones c.216AA inyectados en P1 con armonina-a1, armonina-b1 o la combinación de los dos vectores demuestran un comportamiento normal similar al de sus homólogos heterocigotos c.216GA o a los ratones c.216GA inyectados con el vector truncado. La Figura 17C muestra gráficos que ilustran ± SD de la media para el número de rotaciones y la distancia cubierta por minuto. Se observó una recuperación significativa ***P < 0,001 entre los ratones no inyectados y los inyectados. Análisis estadístico por ANOVA de una vía.

La Figura 18 son imágenes de microscopía electrónica de barrido del órgano de Corti en ratones inyectados con Anc80 armonina-b1. Se tomaron imágenes de la región basal, media y apical del órgano de Corti en ratones c.216GA, c.216AA y c.216AA. Los haces ciliares de CCI y CCE se conservaron en los ratones c.216GA, pero aparecieron desorganizados a lo largo del órgano de Corti en los ratones c.216AA. En los ratones c.216AA se observó una notable pérdida de células ciliadas (asterisco) y una desorganización de los haces ciliares, con una degeneración más pronunciada en el extremo basal del órgano. Los haces ciliares de los ratones c.216AA carecían de filas de estereocilios normales. Las filas más cortas parecían estar retraídas mientras que las filas más altas se mantuvieron en los ratones c.216AA (flecha).

Mientras que la pérdida de células ciliadas y la desorganización de los haces seguían siendo evidentes en los ratones c.216AA rescatados, la supervivencia de las células ciliadas era notablemente mayor en las regiones basal y media del órgano. El recuento de células ciliadas se resume en el gráfico de barras. Se contaron un total de 1824 células en los ratones c.216AA y 792 en los ratones c.216AA rescatados. ± SE de la media. Las imágenes a gran aumento revelan el rescate de la matriz de escalera en los ratones c.216AA inyectados (flecha) en muchas células, pero no en todas (punta de flecha).

Barras de escala bajo aumento: 5 ^m; gran aumento: 1 ^m.

Las Figuras 19A-19L son imágenes que muestran el análisis de la morfología del haz ciliar en ratones c.216G>A Ushlc por SEM. Las Figuras 19A-19C muestran que los ratones heterocigotos c.216GA mostraron una morfología normal del haz ciliar. Las Figuras 19D-19I muestran haces ciliares desorganizados observados a lo largo del órgano de los ratones mutantes homocigóticos c.216AA. Las Figuras 19J-19L muestran el haz ciliar de las CCI ligeramente alterado en los ratones c.216AA. Distancia medida desde la punta del ápex: base 3,5-4 mm; centro 1,8-2,2 mm; ápex 0,6-0,8 mm. Barra de escala bajo aumento: 5 ^m; gran aumento: 1 ^m.

Las Figuras 20A-20J son imágenes que muestran las propiedades de mecanotransducción en los ratones mutantes c.216AA. Las Figuras 20A-20E muestran el análisis de la mecanotransducción en las CCE neonatales de los giros medio y medio-apical de la cóclea. Los trazos de corriente representativa de ~Po= 0,5 se ajustaron con una función de doble deterioro exponencial para evaluar la adaptación en los mutantes c.216GA y c.216AA (Figura 20A). Los ajustes se utilizaron para generar constantes de tiempo rápidas (Figura 20C) y lentas (Figura 20D), así como el grado de adaptación (Figura 20E). El rango operativo del 10-90% no se alteró significativamente (Figura 20B). La extensión de la adaptación en los ratones c.216AA fue significativamente menor que en las CCE heterocigotas, como se muestra en este gráfico de dispersión (Figura 20E). Las Figuras 20F-20J muestran el análisis de la mecanotransducción en las CCI neonatales. Los valores del rango operativo del 10-90% fueron menores en las CCI de c.216GA frente a c.216AA (Figura 20G). La adaptación siempre estuvo presente, aunque de forma ligeramente más lenta y con un grado significativamente menor en las CCI de c.216AA (Figuras 20H-20J). El análisis estadístico se indica en cada gráfico: *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001, ANOVA de una vía.

Las Figuras 21A-21C son datos que muestran la expresión de los vectores Anc80 armonina-a y armonina-b marcados con fluorescencia a las 6 semanas en el órgano de Corti de c.216AA tras la inyección del vector dual P1. Las Figuras 21A-21C muestran imágenes confocales del giro basal en ratones c.216AA de 6 semanas de edad tras la co-inyección P1 de AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::armonina-a1 (0,5 p.l; 4,11 EA12 gc/ml) y AAV2/Anc80.CMV.eGFP::armonina-b1 (0,5 ml; 2,99EA12 gc/ml). El 69% y el 74% del número total de células eGFP expresadas respectivamente (Figura 21A) y tdTomato (Figura 21C) y el 65% expresaron ambos marcadores, demostrando así el éxito de la cotransducción. Barra de escala: 20 ^m.

Las Figuras 22A-22F son datos que muestran el análisis de la respuesta ABR en los ratones c.216GA de control y los ratones c.216AA rescatados inyectados. Las Figuras 22A y 22D muestran ejemplos de respuestas ABR a 8 y 16 kHz para los ratones c.216GA de control y c.216AA rescatados. Las Figuras 22B-22C y 22E-22F muestran la amplitud 1 de pico media (Figuras 22B-22D) y la latencia (Figuras 22C-22D) a 8-11,3 y 16 kHz en ratones de 6 semanas con umbrales comparables (n=8 c.216GA, n=5 c.216a A armonina-b1 Rw M P1). ± SE de la media: ANOVA de una vía.

Las Figuras 23A-23D muestran que la forma mutante de la armonina expresada en los ratones c.216G>A Ushlc no altera las células ciliadas o la función auditiva. La Figura 23A es una alineación de la secuencia entre la proteína armonina-b 1 de tipo salvaje y la armonina truncada que se segrega como resultado del empalme críptico y el cambio de marco asociado a la mutación acadiana G>A en el exón 3 del gen Ushlc. La Figura 23B muestra la RT-PCR semicuantitativa de los órganos auditivos de los ratones de tipo salvaje, y de los ratones mutantes c.216GA y c.216AA, que confirma la expresión de la armonina de tipo salvaje (450 pb) y truncada (-35 pb) en ratones c.216GA y c.216AA. Las Figuras 23C-23D muestran las respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR, Figura 23C) y por productos de distorsión (DPOAE, Figura 23D) que se midieron en los ratones inyectados c.216GA y ratones de control c.216GA y c.216AA. Los gráficos se muestran como ± SE de la media.

Las Figuras 24A-24C son imágenes que muestran la recuperación del empalme Ushlc correcto en el oído interno de ratones de 6 semanas inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1. La Figura 24A muestra la cuantificación de RT-PCR semicuantitativa del ARNm correctamente empalmado (450 pb) y aberrante (415 pb) del alelo Ush1c.216A y muestra la recuperación del empalme Ush1c correcto en los oídos inyectados (I) y contralaterales (Figura 24C) de los ratones rescatados c.216AA n°1 y n° 2 (respuesta de 35 dB SPL a 11,3 kHz de los oídos inyectados). El ratón n° 3 con una respuesta ABR pobre (90 dB SPL a 11,3 kHz) muestra una modesta recuperación de la expresión correcta del ARNm y el ratón n° 4 (100 dB SPL a 11,3 kHz) no muestra ninguna. Mientras que la forma de empalme correcta no se detecta en los ratones c.216AA no inyectados (ratones n° 5,6), tanto la forma de empalme correcta como la truncada se detectan en los ratones c.216GA (ratones n° 7,8,9). La GAPDH de ratón correspondiente que se muestra en el panel inferior se amplificó para confirmar la cantidad relativa de material. La Figura 24B es una imagen que muestra que el análisis de la PCR radiomarcada semicuantitativa confirmó la presencia de AAV-mUshlc en los oídos inyectados y contralaterales de los ratones Ush1c.216AA. Los niveles relativos de ADN AAV-mUshlc estaban presentes pero se redujeron en los ratones n° 3 y n° 4. La Figura 24C muestra la cantidad relativa de AAV-mUshlc correlacionada con los umbrales ABR. Se ilustran los análisis para 11,3 y 16 kHz. Las regresiones lineales mostraron altas correlaciones entre ambos.

La Figura 25 es un gráfico que muestra la recuperación del umbral ABR a largo plazo correlacionado con la supervivencia de las CCE en la región media a apical del órgano auditivo. El recuento de células ciliadas en todo el órgano de Corti se realizó post-mortem en los oídos izquierdos de tres ratones c.216AA no inyectados y cinco c.216AA inyectados. El número total de células ciliadas CCI y CCE aumentó en los ratones inyectados. La comparación de los ratones inyectados rescatados con los inyectados que tuvieron un rescate deficiente muestra que el número de CCI no cambió, pero se observó un número significativo de CCE en los ratones rescatados. El análisis a lo largo de todo el órgano mostró que la diferencia puede explicarse como un aumento en la supervivencia de las células ciliadas desde la región media a la apical del órgano. Inserción: mientras que dos de los ratones (ratones n° 1,2) mostraron umbrales de respuesta ABR pobres en todo el rango ensayado (>95 dB SPL), tres (ratones n° 3,4,5) respondieron con umbrales que oscilaban entre 35 y 55 dB SPL para estímulos sonoros entre 5,6 y 16 kHz.

Parte 3—Terapia génica de mutaciones adicionales implicadas en la pérdida de audición

Las Figuras 26A-26D son imágenes confocales representativas de una cóclea de un ratón mutante Ushlc inyectada a través de RWM con Anc80-armonina::GFP (es decir, la GFP está fusionada al polipéptido armonina), recogida, y teñida con actina (rojo; Figura 26A), Myo7a (azul; Figura 26B), y representada para GFP (verde; Figura 26C). En la Figura 26D se muestra una imagen combinada de las Figuras 26A, 26B y 26C.

La Figura 27 es un gráfico que muestra el umbral ABR trazado en función de la frecuencia del sonido para un ratón mutante Ushlc (cuadrados) y un ratón mutante Ushlc inyectado con un vector Anc80-armonina::GFP (círculos).

Las Figuras 28A-28C muestran imágenes confocales representativas de una cóclea KCNQ4 -/- inyectada a través de RWM con Anc80-KCNQ4, recogida y teñida con Alexa 546-faloidina (rojo) y un anticuerpo contra KCNQ4 (verde) a bajo aumento (Figura 28A) o a gran aumento (Figura 28B) en relación con la cóclea no inyectada a alto aumento (Figura 28C).

Las Figuras 29A-29C son una serie de gráficos que muestran la corriente KCNQ4 en un ratón de tipo salvaje (Figura 29A), un ratón P10 KCNQ4 -/-(Figura 29B), y un ratón P10 KCNQ4 -/ inyectado con Anc80- KCNQ4 (Figura 29C). Las cócleas se recogieron 8 días después de la inyección.

La Figura 30 es una serie de tres imágenes que muestran la captación de FM1-43 (el FM1-43 solo permea los canales Tmcl funcionales) en el tejido Tmcl -/- inyectado con el vector Anc80 Tmcl.

La Figura 31A es una imagen que muestra familias representativas de corrientes de transducción sensorial registradas de las CCI de un ratón de tipo salvaje (izquierda), un ratón Tmcl -/-(centro), y un ratón Tmcl -/- inyectado con Anc80 Tmcl (derecha). Las cócleas se recogieron 8 días después de la inyección.

La Figura 31B es una representación gráfica de la tasa de recuperación de los ratones mostrados en la Figura 31A. El gráfico de la Figura 31B indica el porcentaje de células funcionales en un ratón de tipo salvaje (izquierda), un ratón Tmcl -/-(centro) y un ratón Tmcl -/- inyectado con Anc80 Tmcl (derecha).

La Figura 32 es un gráfico que muestra los umbrales de las otoemisiones acústicas por productos de distorsión (DPOAE) en función de la frecuencia del estímulo para los ratones de tipo salvaje, los ratones Tmcl -/ y los ratones Tmcl -/ inyectados con Anc80 Tmcl.

Descripción detallada

Dado que las células sensoriales de la cóclea de los mamíferos adultos carecen de capacidad de autorreparación, las estrategias terapéuticas actuales (dependiendo del nivel y la posición exacta de la deficiencia) se basan en la amplificación (audífonos), la mejora de la transmisión del sonido (prótesis del oído medio/implantes activos) o la estimulación neuronal directa (implantes cocleares) para compensar el daño permanente de las células ciliadas sensoriales primarias o las neuronas ganglionares espirales que forman el nervio auditivo y transmiten la información acústica al cerebro. Aunque estos enfoques han sido transformadores, están lejos de ser óptimos para restaurar la compleja función auditiva humana, importante para la vida moderna. Específicamente, los principales problemas siguen siendo la sensibilidad limitada a las frecuencias, la percepción de sonidos no naturales y la discriminación limitada del habla en entornos ruidosos.

Se ha considerado la transferencia de genes terapéuticos a la cóclea para mejorar aún más el estándar de tratamiento actual que va desde la pérdida de audición relacionada con la edad y la inducida por el medio ambiente hasta las formas genéticas de sordera. Se han relacionado más de 300 loci genéticos en la pérdida de audición hereditaria y se han descrito más de 70 genes causantes (Parker & Bitner-Glindzicz, 201 5, Arch. Dis. Childhood, 100:271-8). El éxito terapéutico de estos enfoques depende en gran medida de la administración segura y eficiente de construcciones de genes exógenas a las dianas celulares terapéuticas pertinentes en el órgano de Corti (OC) de la cóclea.

El OC incluye dos clases de células ciliadas sensoriales: Las CCI, que convierten la información mecánica transportada por el sonido en señales eléctricas que se transmiten a las estructuras neuronales, y las CCE, que sirven para amplificar y afinar la respuesta coclear, un proceso necesario para la función auditiva compleja. Otras dianas potenciales en el oído interno incluyen las neuronas ganglionares espirales, las células columnares del limbo espiral, que son importantes para el mantenimiento de la membrana tectorial adyacente o las células de soporte, que tienen funciones protectoras y pueden ser desencadenadas para transdiferenciar en células ciliadas en una etapa neonatal temprana.

La inyección en el conducto coclear, que está lleno de líquido endolinfático con alto contenido de potasio, podría proporcionar un acceso directo a las células ciliadas. Sin embargo, las alteraciones de este delicado entorno de líquido pueden alterar el potencial endococlear, aumentando el riesgo de toxicidad relacionada con la inyección. Se puede acceder a los espacios llenos de perilinfa que rodean el conducto coclear, la scala tympani y la scala vestibuli, desde el oído medio, ya sea a través de la membrana de la ventana oval o redonda (RWM). La RWM, que es la única abertura no ósea del oído interno, es relativamente accesible en muchos modelos animales y la administración del vector viral por esta vía es bien tolerada. En los humanos, la colocación de implantes cocleares se basa habitualmente en la inserción quirúrgica de electrodos a través de la RWM.

Los estudios previos que evaluaban los serotipos de AAV en explantes cocleares organotípicos y en la inyección in vivo en el oído interno han dado como resultado solo un rescate parcial de la audición en modelos de ratón con sordera hereditaria. Inesperadamente, un virus adenoasociado (AAV) que contiene una proteína de cápside de AAV ancestral transduce las CCE con alta eficiencia. Este hallazgo supera las bajas tasas de transducción que han limitado el desarrollo satisfactorio de la terapia génica coclear utilizando serotipos convencionales de AAV. Un AAV que contiene una proteína de cápside de AAV ancestral, tal como se describe en el presente documento, proporciona una valiosa plataforma para la administración de genes del oído interno a las CCI y CCE, así como a una serie de otros tipos de células del oído interno que están comprometidas por trastornos genéticos de la audición y el equilibrio. Además de proporcionar altas tasas de transducción, un AAV que contiene una proteína de cápside de AAV ancestral como la descrita en el presente documento demostró tener un perfil de seguridad análogo en ratones y primates no humanos tras la inyección sistémica, y es antigénicamente distinto de los AAV circulantes, proporcionando un beneficio potencial en términos de inmunidad preexistente que limita la eficacia de los vectores de AAV convencionales.

Sin embargo, en este documento se describen composiciones y métodos de la divulgación que permiten la administración altamente eficiente de ácidos nucleicos a las células, particularmente a las células del oído interno, por ejemplo, en la cóclea (o células de la cóclea o células cocleares). Tal como se utiliza aquí, las células del oído interno se refieren, sin limitación, a células ciliadas internas (CCI), células ciliadas externas (CCE), neuronas ganglionares espirales, células ciliadas vestibulares, neuronas ganglionares vestibulares, células de soporte y células en la estría vascular. Las células de soporte se refieren a las células del oído que no son excitables, por ejemplo, células que no son células ciliadas o neuronas. Un ejemplo de célula de soporte es una célula de Schwann.

La administración de uno o más de los ácidos nucleicos descritos aquí a las células del oído interno puede utilizarse para tratar cualquier número de trastornos auditivos heredados o adquiridos, que se definen típicamente por la pérdida parcial de la audición o la sordera completa. Los métodos descritos aquí, pueden utilizarse para tratar un trastorno auditivo como, por ejemplo, las sorderas recesivas, las sorderas dominantes, el síndrome de Usher y otras sorderas sindrómicas, así como la pérdida de audición debida a un traumatismo o al envejecimiento.

Métodos de fabricación de virus portadores de transgenes específicos

Como se describe en este documento, un virus adenoasociado (AAV) que contiene una proteína de cápside ancestral de AAV es particularmente eficiente para la transmisión de ácidos nucleicos (por ej., transgenes) a las células del oído interno, y una clase particularmente eficaz de proteínas de cápside de AAV ancestral se designa por una proteína de cápside de andamio ancestral designada Anc80, que se muestra en la SEQ ID NO:1. Una proteína de cápside ancestral particular que se incluye dentro de la clase de proteínas de cápside ancestrales Anc80 es Anc80-0065 (SEQ ID NO:2), sin embargo, el documento WO 2015/054653 describe un número de proteínas de cápside ancestrales adicionales que se incluyen dentro de la clase de proteínas de cápside ancestrales Anc80.

Los virus descritos aquí que contienen una proteína de cápside Anc80 pueden utilizarse para suministrar una variedad de ácidos nucleicos a las células del oído interno. Una secuencia de ácido nucleico introducida en una célula para su expresión suele denominarse transgén. Entre los transgenes representativos que pueden administrarse y expresarse en las células del oído interno se incluyen, sin limitación, un transgén que codifica un factor neurotrófico (por ej., factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT3) o proteína de choque térmico (HSP)-70), una proteína inmunomoduladora o un transcrito antioncogénico. Además, los transgenes representativos que pueden administrarse y expresarse en las células del oído interno también incluyen, sin limitación, un transgén que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo, una especie de ARN antisentido, silenciador o no codificante largo, o un sistema de edición del genoma (por ej., una nucleasa de dedo de zinc modificada genéticamente, nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALENs), o repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente agrupadas (CRISPR)). Además, los transgenes representativos que pueden administrarse y expresarse en las células del oído interno incluyen los ácidos nucleicos designados ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP.NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1,WFS1, WHRN, y XIAP. Las descripciones y definiciones de la nomenclatura utilizada en el presente documento pueden encontrarse en hered-itaryhearingloss.org/ en Internet.

La expresión de un transgén puede ser dirigida por el promotor natural del transgén (es decir, el promotor que se encuentra naturalmente con la secuencia codificante transgénica) o la expresión de un transgén puede ser dirigida por un promotor heterólogo. Por ejemplo, cualquiera de los transgenes descritos aquí puede utilizarse con su promotor natural. Alternativamente, cualquiera de los transgenes descritos aquí puede utilizarse con un promotor heterólogo. Tal como se usa en este documento, un promotor heterólogo se refiere a un promotor que no dirige naturalmente la expresión de esa secuencia (es decir, no se encuentra con esa secuencia en la naturaleza). Los promotores heterólogos representativos que pueden utilizarse para dirigir la expresión de cualquiera de los transgenes indicados en este documento incluyen, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de beta actina de pollo (CBA), un promotor sintético CASI, un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK), y un promotor del factor de elongación (EF)-1, un promotor del receptor nicotínico alfa9, un promotor de prestina, un promotor independiente del factor de crecimiento (GFI1), y un promotor del transportador de glutamato vesicular 3 (VGLUT3). Además, un promotor que dirige naturalmente la expresión de uno de los transgenes mencionados antes (por ej., un promotor KCNQ4, un promotor Myo7a, un promotor Myo6 o un promotor ATOH1) puede utilizarse como promotor heterólogo para dirigir la expresión de un transgén.

Los métodos de fabricación de un transgén para empaquetar en un virus que contiene una proteína de cápside Anc80 son conocidos en la técnica, y utilizan técnicas convencionales de biología molecular y de ácido nucleico recombinante. En una realización, se proporciona una construcción que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de cápside Anc80 y una construcción que lleva el transgén flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR) adecuadas, lo que permite que el transgén se empaquete dentro de la proteína de cápside Anc80.

El transgén puede empaquetarse en un AAV que contenga una proteína de cápside Anc80 utilizando, por ejemplo, una célula huésped de empaquetamiento. Los componentes de una partícula de virus (por ej., secuencias rep, secuencias cap, secuencias de repetición terminal invertida (ITR)) pueden introducirse, de forma transitoria o estable, en una célula huésped de empaquetamiento utilizando una o más construcciones como las descritas en el presente documento. Los virus descritos aquí contienen al menos una proteína de cápside Anc80; los demás componentes de una partícula de virus (por ej., secuencias rep, secuencias ITR) pueden basarse en una secuencia ancestral o en una secuencia contemporánea. En algunos casos, por ejemplo, toda la partícula del virus puede basarse en secuencias ancestrales. Tales virus pueden purificarse utilizando métodos rutinarios.

Se apreciaría que uno o más de un transgén puede ser administrado al oído interno. También se apreciaría que más de un transgén puede ser administrado al oído interno usando un solo vector de AAV que incluye una proteína de cápside Anc80 o usando múltiples vectores de AAV que incluyen una proteína de cápside Anc80.

En general, tal y como se usa aquí, los "ácidos nucleicos" pueden incluir ADN y ARN, y también pueden incluir ácidos nucleicos que contienen uno o más análogos de nucleótidos o modificaciones troncales. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, lo que suele depender de su uso previsto. Los ácidos nucleicos que pueden utilizarse en los métodos descritos en este documento pueden ser idénticos a una secuencia de ácido nucleico conocida, o los ácidos nucleicos que pueden utilizarse en los métodos descritos aquí pueden diferir en secuencia de dichas secuencias conocidas. Simplemente a modo de ejemplo, los ácidos nucleicos (o los polipéptidos codificados) pueden tener al menos un 75% de identidad de secuencia (por ej., al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 3090%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia) con una secuencia conocida.

Para calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácidos entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas se divide por la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos alineados) y se multiplica por 100 para obtener un valor de identidad de secuencia porcentual. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una porción de una o ambas secuencias hasta el tamaño completo de la secuencia más corta. También se apreciará que una única secuencia puede alinearse con más de una secuencia y, por lo tanto, puede tener diferentes valores de identidad de secuencia en cada región alineada.

La alineación de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia se realiza utilizando el programa informático ClustalW y parámetros por defecto, lo que permite realizar alineaciones de secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos en toda su longitud (alineación global). Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500. ClustalW calcula la mejor coincidencia entre una consulta y una o más secuencias objeto de estudio, y las alinea para determinar las identidades, similitudes y diferencias. Se pueden insertar huecos de uno o más residuos en una secuencia de consulta, en una secuencia objeto, o en ambas, para maximizar los alineamientos de las secuencias. Para el alineamiento por pares de secuencias de ácidos nucleicos, se utilizan parámetros por defecto (es decir, tamaño de palabra: 2; tamaño de ventana: 4; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 4; y penalización por hueco: 5; para un alineamiento de múltiples secuencias de ácidos nucleicos, se utilizan los siguientes parámetros: penalización por apertura de hueco: 10,0; penalización por extensión de huecos: 5,0; y transiciones de peso: sí. Para el alineamiento por pares de secuencias de polipéptidos, se utilizan los siguientes parámetros por defecto: tamaño de palabra: 1; tamaño de ventana: 5; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 5; y penalización por hueco: 3. Para el alineamiento múltiple de secuencias de polipéptidos, se utilizan los siguientes parámetros: matriz de peso: BLOSUM (matriz de sustitución de bloques); penalización por apertura de huecos: 10,0; penalización por extensión de huecos: 0,05; huecos hidrofílicos: (on); residuos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg y Lys; y penalizaciones de huecos específicos de residuos: (on). ClustalW puede ejecutarse, por ejemplo, en el sitio web del Baylor College of Medicine Search Launcher o en el sitio web del European Bioinformatics Institute en Internet.

Pueden introducirse cambios en una secuencia de ácido nucleico, lo que puede conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado si la secuencia de ácido nucleico es una secuencia codificante. Por ejemplo, pueden introducirse cambios en las secuencias codificantes de ácido nucleico mediante mutagénesis (por ej., mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR) o sintetizando químicamente una molécula de ácido nucleico que tenga dichos cambios. Dichos cambios en el ácido nucleico pueden dar lugar a sustituciones de aminoácidos conservadoras y/o no conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que un residuo de aminoácidos se sustituye por otro residuo de aminoácidos que tenga una cadena lateral similar (ver, por ejemplo, Dayhoff et al. (1978, en Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352), que proporciona tablas de frecuencia para sustituciones de aminoácidos), y una sustitución no conservadora es aquella en la que un residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que no tiene una cadena lateral similar. Un ácido nucleico puede estar contenido en una construcción, que también puede denominarse vector o plásmido. Las construcciones están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante técnicas recombinantes rutinarias en la técnica. Una construcción que contenga un ácido nucleico puede tener elementos de expresión que dirijan y/o regulen la expresión de dicho ácido nucleico, y también puede incluir secuencias como las de mantenimiento de la construcción (por ej., origen de replicación, un marcador seleccionable). Los elementos de expresión son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, promotores, intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles.

Métodos de administración de ácidos nucleicos a las células del oído interno

Los métodos de administración de ácidos nucleicos a las células son generalmente conocidos en la técnica, y los métodos de administración de virus (que también se pueden denominar partículas virales) que contienen un transgén a las células del oído interno in vivo, que forman parte de la divulgación, se describen en el presente documento. Tal como se describe aquí, pueden administrarse entre 108 y 1012 de partículas virales a un sujeto, y el virus puede suspenderse dentro de un volumen adecuado (por ej., 10 ^L, 50 ^L, 100 ^L, 500 ^L, o 1000 ^L) de, por ejemplo, una solución de perilinfa artificial. Un virus que contiene un transgén como el descrito aquí como parte de la divulgación puede ser administrado a las células del oído interno (por ej., las células de la cóclea) utilizando cualesquiera mecanismos. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que incluye partículas de virus que contienen uno o más tipos diferentes de transgenes, tal como se describe aquí, puede inyectarse a través de la ventana redonda o ventana oval, normalmente en un procedimiento relativamente sencillo (por ej., ambulatorio). En algunas realizaciones de la divulgación, una composición que comprende un número terapéuticamente efectivo de partículas de virus que contienen un transgén, o que contiene uno o más conjuntos de partículas de virus diferentes, donde cada partícula de un conjunto puede contener el mismo tipo de transgén, pero donde cada conjunto de partículas contiene un tipo de transgén diferente que en los demás conjuntos, según se describe aquí puede administrarse en la posición adecuada dentro del oído durante la cirugía (por ej., una cocleostomía o una canalostomía).

Además, existen vehículos de administración (por ej., polímeros) que facilitan la transferencia de agentes a través de la membrana timpánica y/o a través de la ventana redonda, y cualquiera de estos vehículos de administración puede utilizarse para administrar los virus descritos en este documento. Ver, por ejemplo, Arnold et al., 2005, Audiol. Neurootol., 10:53-63. Las composiciones y métodos descritos aquí permiten la administración altamente eficiente de ácidos nucleicos a las células del oído interno, por ej., las células cocleares. Por ejemplo, las composiciones y métodos descritos aquí permiten la administración a, y la expresión de, un transgén en al menos el 80% (por ej., al menos 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99%) de las células ciliadas internas o la administración a, y la expresión en, al menos el 80% (por ej., al menos 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99) de las células ciliadas externas.

Como se ha demostrado en este documento, la expresión de un transgén administrado usando un AAV que contiene una proteína de cápside Anc80 puede dar lugar a la regeneración de las células ciliadas internas (CCI), las células ciliadas externas (CCE), las neuronas ganglionares espirales, la estría vascular, las células ciliadas vestibulares y/o las neuronas ganglionares vestibulares (por ej., Atoh1, NF2), de tal manera que la función auditiva o vestibular se restaura durante un período de tiempo prolongado (por ej., meses, años, décadas, toda una vida).

Como se comenta en el documento WO 2015/054653, un AAV que contiene una proteína de cápside Anc80 puede caracterizarse por su seroprevalencia y/o el grado de neutralización en relación con los AAV convencionales (es decir, un AAV que no contiene una proteína de cápside Anc80). La seroprevalencia se entiende en la técnica como la proporción de sujetos de una población que es seropositiva (es decir, que ha estado expuesta a un patógeno o inmunógeno en particular), y se calcula como el número de sujetos de una población que producen un anticuerpo contra un patógeno o inmunógeno particular dividido por el número total de individuos de la población examinada. La determinación de la seroprevalencia de un virus se realiza de forma rutinaria en la técnica y suele incluir el uso de un inmunoensayo para determinar la prevalencia de uno o más anticuerpos en muestras (por ej., muestras de sangre) de una población particular de individuos. Además, existen varios métodos para determinar el grado de anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero. Por ejemplo, un ensayo de anticuerpos neutralizantes mide el título en el que una muestra experimental contiene una concentración de anticuerpos que neutraliza la infección en un 50% o más en comparación con una muestra de control sin anticuerpos. Ver también Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12) and Manning et al. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85). Los AAV convencionales representativos incluyen, sin limitación, AAV8 (o un virus que comprende una proteína de cápside AAV8) y/o AAV2 (o un virus que comprende una proteína de cápside AAV2).

Síndrome de Usher

El síndrome de Usher humano (USH) es una rara condición genética responsable de la sordera y la ceguera combinadas. Se hereda como un rasgo autosómico recesivo, afecta a entre 16.000 y 20.000 personas en Estados Unidos y es responsable del 3 al 6% de las sorderas infantiles tempranas. El síndrome de Usher se clasifica en tres subtipos clínicos (USH-1, - 2 y -3) según la gravedad de los síntomas. El USH1 es la forma más grave. Los pacientes afectados por USH1 padecen una pérdida auditiva neurosensorial profunda bilateral congénita, arreflexia vestibular y retinitis pigmentaria prepuberal (una degeneración progresiva, bilateral y simétrica de la función de los bastones y conos de la retina). Salvo que se les coloque un implante coclear, los individuos no suelen desarrollar la capacidad de generar el habla. Aunque actualmente no existen tratamientos biológicos para los pacientes de Usher, la reintroducción temprana de la forma de tipo salvaje del gen defectuoso puede permitir la reversión de la enfermedad.

Seis genes Usher están asociados con el USH1: MYO7A (miosina 7a), USH1C (armonina), CDH23 (cadherina 23), PCDH15 (protocadherina 15), SANS (sans) y CIB2 (proteína de unión a calcio e integrina 2). Estos genes codifican proteínas que participan en la morfogénesis del haz ciliar en el oído interno y forman parte de un interactoma (ver, por ejemplo, Mathur & Yang, 2015, Biochim. Biophys. Acta, 1852:406-20). La armonina reside en el centro del interactoma del USH1 donde se une a otras proteínas de Usher 1. Debido a sus dominios de interacción PDZ (PSD-59 95/Dlg/ZO-1), se ha propuesto que la armonina funcione como una proteína de andamiaje. Los estudios de unión in vitro han demostrado que todas las demás proteínas de USH1 conocidas se unen a los dominios PDZ de la armonina, al igual que dos de las proteínas de USH2, la usherina y la VLGR1. El gen USH1C consta de 28 exones, que codifican 10 formas de empalme alternativas de la armonina, agrupadas en tres subclases diferentes (a, b y c) según la composición de los dominios de la proteína. Las tres isoformas difieren en el número de dominios de interacción proteína-proteína PDZ, dominios superenrollados (CC) y dominios ricos en prolina-serina-treonina (PST).

Las proteínas USH1 se localizan en el ápex de las células ciliadas en los haces ciliares mecanosensoriales, que están compuestos por cientos de estereocilios interconectados por numerosos enlaces extracelulares. La cadherina 23 y la protocadherina 15, productos de los genes Usher (USH1D y USH1E, respectivamente) forman enlaces de punta ubicados en el extremo distal de los estereocilios. La armonina-b se une a CDH23, PCDH15, F-actina y a sí misma. Se encuentra en las puntas de los estereocilios, cerca del punto de inserción del enlace de punta o tip-link en las células ciliadas, donde se cree que desempeña un papel funcional en la transducción y adaptación en las células ciliadas. La armonina-b se expresa durante las primeras etapas postnatales, pero su expresión disminuye alrededor del día 30 postnatal (P30) tanto en la cóclea como en el vestíbulo. La armonina-a también se une a la cadherina 23 y se encuentra en los estereocilios. Informes recientes revelan una función adicional de la armonina-a en la sinapsis, donde se asocia con los canales de Cav1.3 Ca2+ para limitar la disponibilidad del canal a través de una vía dependiente de la ubiquitina.

En la última década se han identificado o diseñado varios modelos de ratón del síndrome de Usher, siete de los cuales afectan a la armonina. De ellos, solo un modelo, el modelo Ushlc c.216G>A, reproduce los déficits auditivos y de retina que caracterizan al síndrome de Usher humano. Ushlc c.216G>A es un modelo de ratón knock-in que afecta a la expresión de todas las isoformas convencionales de la armonina debido a una mutación puntual similar a la encontrada en una cohorte de pacientes franceses-acadianos de USH1C. La mutación introduce un sitio de empalme críptico al final del exón tres del gen Ushlc. El uso de este sitio de empalme críptico produce un transcrito desplazado del marco con una deleción de 35 pb y resulta en la traslación de una proteína severamente truncada que carece de los dominios PDZ, PST y CC. Los ratones knock-in homocigotos c.216AA sufren una grave pérdida de audición al mes de edad, mientras que los ratones heterocigotos c.216GA no presentan ningún fenotipo anormal. La histología coclear en los ratones c.216AA muestra haces ciliares desorganizados, filas celulares anormales y pérdida de células ciliadas internas y externas en los giros medio y basal en P30.

En particular, se puede tratar a un paciente diagnosticado con sordera relacionada con el Síndrome de Usher, por ejemplo, sordera relacionada con USH1C, utilizando las proteínas de cápside AAV ancestrales descritas aquí combinadas con un transgén de armonina para transducir con éxito las células ciliadas e impulsar la expresión y la localización correcta de formas de empalme de armonina, reintroduciendo así la armonina de tipo salvaje. Además, se demuestra aquí que la inyección en la membrana de la ventana redonda postnatal de un AAV que contiene una proteína de cápside ancestral de AAV, tal como se describe aquí, restauró con éxito la función auditiva y vestibular en ratones homocigotos c.216AA. La recuperación de la función auditiva en los ratones inyectados está asociada a la recuperación de la expresión del ARNm que codifica la armonina de tipo salvaje, así como a la conservación de la morfología del haz ciliar y la mecanotransducción. TMC1 / TMC2

Se han identificado más de 40 mutaciones distintas en TMC1 que causan sordera. Éstas se subdividen en 35 mutaciones recesivas y 5 mutaciones dominantes. La mayoría de las mutaciones recesivas causan una pérdida de audición profunda y congénita (por ej., DFNB7/11), si bien unas pocas causan una pérdida de audición de moderada a grave de aparición tardía. Todas las mutaciones dominantes causan pérdida de audición progresiva (por ej., DFNA36), con aparición en la adolescencia. En particular, un vector de AAV que incluye una proteína de cápside Anc80 como se describe aquí puede utilizarse para aportar una secuencia TMC1 no mutante (por ej., de tipo salvaje) o una secuencia TMC2, evitando así la pérdida de audición (por ej., una mayor pérdida de audición) y/o restaurar la función auditiva.

Pueden usarse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bioquímica y de ADN recombinante consideradas dentro de los conocimientos de la técnica de acuerdo con la presente divulgación. Dichas técnicas se explican ampliamente en la literatura y se ejemplifican en algunos de los Ejemplos siguientes. La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los métodos y composiciones de la materia que se describe en las reivindicaciones. Los ejemplos que quedan fuera del alcance de las reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines comparativos.

EJEMPLOS

Parte 1: Transferencia génica coclear altamente eficiente

Ejemplo 1 — Un virus adenoasociado (AAV) que contiene una proteína de cápside ancestral de AAV da lugar a una transferencia génica coclear segura y eficiente

En el Ejemplo 1 se utilizaron los siguientes métodos y materiales.

Vectores virales

Se prepararon AAV2/1, 2/2, 2/6, 2/8, 2/9 y AAV2/Anc80L65 con un transgén eGFP impulsado por CMV y el casete de elemento regulador postranscripcional (WPRE) del virus de la hepatitis de Woodchuck en Gene Transfer Vector Core (vector.meei.harvard.edu) en Massachusetts Eye and Ear como se describió previamente (Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68). Los reactivos del plásmido AAV2/Anc80L65 están disponibles en addgene.com.

Cultivos de explantes in vitro

Se prepararon un total de 156 cultivos de explantes cocleares de crías de ratón de ambas cepas en el día postnatal 4 en orden para su evaluación como se describe en una publicación anterior (Dilwali et al., 2015, Scientific Reports, 5:18599). En resumen, se recogieron los huesos temporales murinos después de la decapitación y se diseccionó la cóclea para cultivarla como explantes organotípicos conectados a la región de las neuronas ganglionares espirales. Se obtuvieron dos muestras por cóclea, una ("apical") consistente en el giro apical inferior y otra ("basal") en el giro basal superior. Para cada serotipo, se inocularon un mínimo de 4 (CBA/CaJ, 48h), 2 (CBA/CaJ, 48h+5d), 3 (C57BL/6, 48h), 2 (C57BL/6, 48h+5d) muestras basales y apicales. Se excluyeron las muestras si no se conservaba la morfología coclear durante el cultivo. El número de muestras se eligió para informar sobre la variabilidad de la transducción y para proporcionar una base de selección para la evaluación posterior in vivo. Los explantes se incubaron con medio de cultivo (98% de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 1% de ampicilina y 1% de suplemento de N2 durante las primeras 12 horas, más 1 % de suero bovino fetal (FBS)) y 1010 GC de AAV durante 48 h en 50 p.l. Para la condición de 48h+5d, el medio con AAV se sustituyó por medio fresco sin AAV durante 5 días adicionales. Los epitelios vestibulares humanos procedentes de utrículos obtenidos de cuatro pacientes adultos sometidos a resección de tumor de schwannoma vestibular, con su consentimiento, se cultivaron como se ha descrito antes (Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-1131), se expusieron a 1010 GC de AAV durante 24 horas y se mantuvieron en cultivo durante 10 días, tras lo cual se fijó el tejido, se tiñó con faloidina y se obtuvieron las imágenes. Los estudios fueron aprobados por el Surrey Borders NRES Committee London (Autoridad de Investigación Sanitaria) con el número de referencia 11/LO/0475.

Modelos animales y métodos generales

Los ratones de tipo salvaje C57BL/6J y CBA/CaJ se obtuvieron del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se utilizaron animales de ambos sexos para la experimentación en una ratio estimada de 50/50. El tamaño de los grupos por experimento para los ensayos de transducción in vitro e in vivo y los criterios de valoración posteriores se determinó en función del acceso a las muestras y la viabilidad técnica. Las observaciones sobre la transducción de Anc80 se validaron cualitativamente en experimentos posteriores con varios lotes de vectores (excepto en el caso de la transducción de tejido vestibular humano, debido a la naturaleza única y limitada del acceso a la muestra). No se realizó ningún análisis estadístico entre las eficiencias de transducción de los serotipos debido al acceso limitado a la muestra y a la naturaleza cualitativa de los resultados comunicados.

Muestreo de LCR y sangre

El muestreo de líquido cefalorraquídeo (LCR) de la cisterna magna (Lui & Duff, 2008, J. Visualized Exp., 21:e960) y la recogida de sangre intracardíaca con toracotomía se realizaron en un procedimiento terminal. A través de un tubo microcapilar, se recogió la máxima cantidad (hasta 5 ^L) de LCR claro por animal en un volumen de 60 ^L de PBS, lo que dio lugar a diluciones iniciales ligeramente diferentes que posteriormente se estandarizaron con PBS de control adicional antes del inicio del experimento. Tras obtener la muestra de sangre en un microtubo Z-Gel de 1,1 mL (Sarstedt, Numbrecht, Alemania), se centrifugó a 8.000 rpm durante 8 minutos y el suero se almacenó junto con la muestra de LCR (en PBS) a -80°C hasta su uso posterior.

Ejemplo 1A - Análisis histológico

Después de un período de seguimiento de 5 a 29 días, los animales fueron sacrificados y se prepararon montajes cocleares completos como se indicó antes (Sergeyenko et al., 2013, J. Neurosci., 33:13686-94). Tanto los montajes cocleares completos como los explantes se tiñeron con anticuerpos contra miosina 7A (Myo7A, #25-6790 Proteus Biosciences, Ramona, CA, 1:400) y beta-tubulina (TuJ1, #MMS-435P Biolegend, San Diego, CA, 1: 200), junto con los correspondientes anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 555 anti-ratón y Alexa Fluor 647 anti-conejo, #A-21422 y #A-21245 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 1:1000) (Dilwali et al. , 2015, Scientific Reports, 5:18599). El montaje de las muestras fue seguido por microscopía confocal. Todas las imágenes de una serie experimental determinada se obtuvieron con los mismos ajustes, y la intensidad del láser se eligió en función de la muestra con la señal eGFP más intensa para evitar la saturación de fluorescencia. Se obtuvieron pilas Z para las imágenes generales e imágenes ampliadas para las áreas del órgano de Corti y de la neurona ganglionar espiral (SGN). Se utilizó la reconstrucción en 3D con AMIRA para determinar la transfección de SGN con mayor precisión.

Los resultados de la Figura 1 y la Figura 4 ilustran el tropismo de los 5 serotipos según la expresión del AAV que codifica la eGFP en C57BL/6 y CBA/CaJ respectivamente. En particular, la expresión de eGFP fue cualitativamente más brillante en los cultivos cocleares expuestos a Anc80, con expresión aparente en muchos tipos de células cocleares.

Ejemplo 1B - Cuantificación de la expresión de eGFP

Para los datos in vitro, el porcentaje de células ciliadas internas (CCI) y externas (CCE) eGFP-positivas se cuantificó manualmente a lo largo de la cóclea, dividiendo el número de células eGFP-positivas por el número total de células ciliadas externas o internas por una o dos secciones de 100 mm por muestra de la base y ápex para cada muestra. Se evaluaron todas las SGN visibles en un explante coclear en cuanto a su expresión de eGFP. Las áreas del limbo espiral y de las células de soporte se evaluaron con un enfoque cualitativo (como se ha explicado antes, ajustado para cada serie experimental) mediante una escala de 0 (sin expresión) a 3 (señal más intensa). Se utilizaron muestras de control sin AAV para excluir la autofluorescencia. Los datos demostraron que Anc80 se dirigía a las CCI y CCE con una eficacia de entre el 60 y el 100% en el ápex y la base en las dos cepas de ratón analizadas. Anc80 demostró una expresión de eGFP en las CCI y CCE consistente y cualitativamente más brillante en comparación con AAV2 (Figura 1 y Figura 4).

Para controlar las posibles diferencias en la aparición de la expresión entre los diferentes AAV que podrían llevar a una subestimación de la expresión en un plazo de tiempo de 2 días (temprano), se realizó un experimento más largo. Se transdujo un nuevo conjunto de cócleas en condiciones idénticas, pero tras 48 horas de incubación con el AAV se retiró el medio que contenía el vector del cultivo del explante y se sustituyó por medio fresco para mantener el cultivo viable durante 5 días más (referido a 48h+5d) En este estudio a largo plazo se observó un patrón de expresión similar para AAV2 y Anc80. Se observaron aumentos moderados de la expresión para los AAV6, 8 y 9 en los ratones CBA/CaJ, especialmente en el giro basal (Figura 1J, 1K y Figura 4I, 4J). Todos los serotipos se dirigieron a otros tipos de células, siendo el limbo más permisivo que las células de soporte, seguido por el SGN (Figura 5, 6 y 7). De manera consistente, la transducción de Anc80 produjo mayores eficiencias y una expresión más intensa, evidenciada por una fluorescencia de eGFP más brillante.

Ejemplo 1C - Inyecciones in vivo

Se inyectaron crías de ratón (P0 a P2) a través de la membrana de ventana redonda (RWM) utilizando pipetas de microinyección biseladas de vidrio. Las pipetas se extrajeron del tubo capilar (WPI) en un extractor de pipetas P-2000 (Sutter Instrument, Novato, CA) y se biselaron (-20 mm diámetro de punta en un ángulo de 28°) utilizando una biseladora de micropipetas (Sutter Instrument, Novato, CA). Se aplicó externamente crema EMLA (lidocaína al 2,5% y prilocaína al 2,5%) para la analgesia, utilizando hisopos estériles para cubrir el punto quirúrgico (prominencia mastoidea izquierda). La temperatura corporal se mantuvo con una almohadilla térmica a 38°C antes de la cirugía. Las crías se anestesiaron mediante la inducción rápida de hipotermia en hielo/agua durante 2-3 minutos hasta la pérdida de conciencia, y este estado se mantuvo en una plataforma de enfriamiento durante 5-10 minutos durante la cirugía. El punto quirúrgico se desinfectó frotando con Betadine y limpiando con etanol al 70% hasta tres veces. Se realizó una incisión postauricular para exponer la bulla ótica transparente, se avanzó manualmente una micropipeta a través de la bulla y la fascia suprayacente, y se penetró en la RWM con la punta de la micropipeta. Se inyectó aproximadamente 1 ^L de virus unilateralmente en 1 minuto en el oído izquierdo de forma manual en (AAV1), 4 (Aa V2), 2 (AAV8), 1 (AAv 6), 3 (Anc80) C57BL/6 animales. Para controlar los factores relacionados con la preparación específica del vector, como la calidad y la pureza, los resultados de Anc80 se confirmaron en estudios posteriores con diferentes lotes de vectores procedentes de una preparación independiente que confirmaron nuestros resultados cualitativos presentados aquí (datos no mostrados). Las inyecciones se realizaron por grupo de forma no ciega. Ocasionalmente, la aguja de inyección se insertó demasiado profunda, demasiado superficial o en un ángulo incorrecto. Si había daños visibles en las estructuras del oído medio o interno, las muestras se excluyeron de los análisis posteriores. Las tasas de éxito de la inyección oscilaron entre el -50% al -80%, dependiendo del nivel de experiencia del inyector. Tras la inyección, se cerró la incisión de la piel con una sutura de monofilamento negro 6-0 (Surgical Specialties, Wyomissing, PA). Las crías se volvieron a colocar en la almohadilla térmica a 38°C durante 5-10 minutos y luego se devolvieron a su madre para la cría.

En consonancia con informes anteriores, el AAV1 transducía las CCI con una eficiencia de moderada a alta (Figura 2A, 2B). Estos estudios indican que AAV2, arrojaron los números más bajos 6 y 8 de CCI, y solo AAV8 demostró una transducción aproximadamente equivalente en el ápex y la base (Figura 2B). También, en consonancia con informes anteriores, hubo una transducción mínima de CCE (<5%) para todos los serotipos de AAV convencionales probados. Sin embargo, Anc80 transducía casi el 100% de las CCI y el -90% de las CCE (Figura 2A-2C) a una dosis menor de 20- (para AAV1) a 3 veces (para AAV2). La transducción a una dosis igual de 1,36 x 1012 de GC para todos los serotipos dio lugar a una transducción sustancial de las CCI y CCE en el caso de Anc80, pero una focalización mínima de CCI en el caso de AAV1, 2 y 8, y no se observó ninguna en las CCE, tal como se observó en las imágenes de células vivas mediante microscopía epifluorescente (Figura 8C, 8D).

Las muestras transducidas de Anc80 fueron posteriormente fijadas, teñidas y representadas por microscopía confocal, revelando una dependencia de la dosis de transducción de las células ciliadas (Figura 8E). La focalización sin precedentes de las CCE (Figura 2C, Figura 8) ilustra una biología de transducción cualitativamente distinta de Anc80 en comparación con otros AAV. Se encontraron niveles similares de transducción de Anc80 en toda la cóclea desde la base hasta el ápex en un total de tres ratones inyectados con Anc80 (Figura 2A, B, C). Las vistas de bajo aumento del ápex coclear (Figura 8A) mostraron una intensa expresión de eGFP lejos del punto de la inyección. Las imágenes a gran aumento de la base revelan un 100% de transducción de CCI y un 95% de CCE (Figura 8B).

En algunos animales, se encontró una robusta expresión de eGFP en el oído contralateral no inyectado (Figura 9). En los ratones, el acueducto coclear es patente y proporciona una vía de fluido desde la perilinfa coclear al LCR, al acueducto contralateral y a la cóclea contralateral. Por ello, también se investigó si Anc80-eGFP inyectado a través de la RWM era capaz de transducir neuronas en el cerebro. De hecho, los cortes transversales del cerebelo revelaron una intensa expresión de eGFP en las neuronas de Purkinje cerebelosas (Figura 10A, 10B).

Dado que algunas formas de sordera genética también causan disfunción vestibular, Anc80 puede ser un vector útil para la administración de genes en órganos vestibulares humanos. Para investigar esta posibilidad, se recogieron epitelios vestibulares humanos de cuatro pacientes adultos sometidos a resección de tumores de schwannoma vestibular; el epitelio sensorial se depositó en cultivo como se describió antes (Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-31). En el caso de las muestras transducidas con AAV, las Figuras 3C revelan una intensa fluorescencia de eGFP en todo el epitelio vestibular humano, tanto en las células ciliadas como en las células de soporte. Una vista a gran aumento en un epitelio teñido con Myo7A en la Figura 3D reveló que el 83% (19/23) de las células ciliadas Myo7A-positivas también eran eGFP-positivas, lo que sugiere que Anc80 puede transducir eficientemente tanto células ciliadas de ratón como humanas.

Ejemplo 1D - Ensayos inmunológicos

Los títulos de anticuerpos contra Anc80 en LCR y suero se determinaron mediante ensayos de neutralización (Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68). Utilizando un formato de 96 pocillos, las muestras de LCR o suero inactivadas por calor (recogidas como se ha descrito antes) se diluyeron en serie en medio libre de suero (Life Technologies, Carlsbad, CA), y luego se trataron con luciferasa Anc80-30 (10⁶GC/pocillo) durante 1 hora a 37°C. A continuación, la mezcla de muestra /Anc80-luciferasa se transfirió a células HEK293, que fueron tratadas con adenovirus (MOI 20) el día antes. Después de 1 hora a 37°C, se añadió a cada pocillo un medio con suero diluido (1 parte sin suero, 2 partes con suero).

Dos días después, las células se trataron con tampón de lisis (Promega, Madison, WI) y se congelaron a -80°C durante 30 minutos. A continuación, las células se descongelaron a 37°C durante 15 minutos antes de ser tratadas con tampón sustrato (Tris-HCl, MgC12, 35 ATP (Life Technologies, Carlsbad, CA), D-Luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)). La salida de luminiscencia se leyó utilizando el lector de placas Synergy BioTek (BioTek, Winooski, VT).

Se detectó un bajo nivel de neutralización contra el vector en el suero de los ratones inyectados, pero no en el LCR, en el nivel de sensibilidad del ensayo y de muestreo (Figura 10C).

Ejemplo 1E - Electrofisiología de las células ciliadas

Se extirparon las cócleas, se colocaron en un cubreobjetos de vidrio y se observaron en un microscopio vertical Axio Examiner.A1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión en agua de 63x y óptica de contraste de interferencia diferencial. Los registros electrofisiológicos se realizaron a temperatura ambiente (22°C - 24°C) en soluciones estándar que contenían (en mM): 137 NaCl, 5,8 KCl, 10 HEPES, 0,7 NaH²PO⁴, 1,3 CaCl2, 0,9 MgCl2 y 5,6 D-glucosa, vitaminas (1:100) y aminoácidos (1:50) como en MEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) (pH 7.4; -310 mOsm/kg)

Los electrodos de registro (3-4 MQ) se extrajeron del tubo R-6 (King Precision Glass, Claremont, CA) y se llenaron con una solución intracelular que contenía (en mM): 140 CsC1, 5 eGtA-KOH, 5 HEPES, 2,5 Na2ATP, 3,5 MgCl2 y 0,1 CaCl2 (pH 7.4; -280 mOsm/kg). Se utilizó la técnica de cierre hermético de células enteras para registrar las corrientes de mecanotransducción utilizando un Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las células ciliadas se mantuvieron a -84 mV. Las corrientes se filtraron a 5 kHz con un filtro Bessel de paso bajo, se digitalizaron a > 20 kHz con una placa de adquisición de 12 bits (Digidata 1440A, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se registraron con el software pCLAMP 10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Los haces ciliares de las CCI y CCE se desviaron utilizando sondas de vidrio rígido montadas en un actuador piezoeléctrico de chip PICMA (Physik Instrumente, Karlsruhe, Alemania) accionado por un amplificador LVPZT (E-500.00, Physik Instrumente, Karlsruhe, Alemania) y filtrado con un filtro Bessel de 8 polos (filtro modelo 3384, Krohn-Hite Corporation, Brockton, MA) a 40 kHz para eliminar la resonancia de la pipeta residual. Las sondas de vidrio rígido se diseñaron para encajar en el aspecto cóncavo del conjunto de estereocilios de las células ciliadas para los registros del haz completo (3 4 ^m de diámetro para las CCE y 4-5 ^m diámetro para las CCI). Para el registro electrofisiológico de células completas a >P10, los tejidos de la cóclea se diseccionaron en P5-7 y se incubaron en medio MEM(1X) GlutaMAXTM-I con 1% de FBS a 37°C, 5% de CO2 hasta 30 días.

Las corrientes representativas evocadas por las desviaciones del haz ciliar de las CCE de P7 y las CCI de P35 no revelaron diferencias en amplitud, sensibilidad o cinética, entre las células de control eGFP-positivas y eGFP-negativas (Figura 2D). Se registraron 51 células ciliadas eGFP-positivas y 52 eGFP-negativas de todas las regiones de la cóclea y de edades comprendidas entre una y cinco semanas después de la exposición a Anc80. Las respuestas fueron indistinguibles de las de tipo salvaje en todos los casos (Figura 2E), lo que confirmó que la transducción de Anc80 no tenía efectos perjudiciales en la función de las células sensoriales.

Ejemplo 1F - Pruebas de audición

Los datos de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) y de las otoemisiones acústicas por productos de distorsión (DPOAE) se recogieron como se describió antes (Askew et al., 2015, Science Translational Med., 7:285ra108). El test de DPOAE es un ensayo de amplificación y sintonización coclear adecuado y es una medida sensible de la viabilidad de las células ciliadas externas (Guinan et al., 2012, Hearing Res., 293:12-20). Los estímulos probados en ratones anestesiados variaron entre 10 y 90 dB de nivel de presión sonora a frecuencias de 5,6, 8, 11,3, 16, 22,6 y 32 kHz. Se analizaron cuatro oídos inyectados con Anc80 y cuatro oídos no inyectados y un oído de control negativo con daño por inyección sin fluorescencia de eGFP en P28-P30.

Se trazaron los umbrales sonoros mínimos necesarios para evocar la respuesta ABR (Figura 2F) y no revelaron ninguna diferencia en el umbral entre los oídos inyectados y los no inyectados. El análisis histológico reveló una intensa fluorescencia de eGFP en los cuatro oídos inyectados (datos no mostrados). En uno de los casos, no había células eGFP-positivas y los umbrales de ABR eran elevados (Figura 2F), lo que sugiere que la inyección falló y que la aguja pudo haber atravesado el conducto coclear y haber causado un daño permanente. A pesar de la robusta transducción de células ciliadas externas por Anc80-eGFP, no se encontraron diferencias en los umbrales de DPOAE en relación con los oídos de control no inyectados (Figura 2G). Por tanto, los datos de las pruebas ABR y DPOAE indican que la inyección de RWM, la transducción de Anc80 y la expresión del transgén en las CCI y CCE son seguras para la función auditiva.

Ejemplo 1G - Pruebas en el dispositivo rotarod

Se probó el comportamiento de equilibrio de cinco ratones C57BL/6 en el dispositivo rotarod. Se sabe que los ratones con la función vestibular deteriorada tienen un mal rendimiento en el dispositivo rotarod (Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Archives Dis. Childhood, 100:271-8). Estudios previos destacaron la capacidad de esta prueba del rotarod para detectar la disfunción del equilibrio cuando solo está afectado un oído (Fukui & Raphael, 2013, Hearing Res., 297:99-105; Geleoc & Holt, 2014, Science, 344:1241062). Tres ratones inyectados en P1 y examinados en P36 y dos ratones de control no inyectados en P79. Todos los ratones fueron sometidos a las pruebas utilizando el siguiente protocolo de rotarod. El primer día, los ratones fueron entrenados para mantener el equilibrio sobre una varilla que giraba a cuatro RPM durante cinco minutos. El segundo día, los ratones fueron sometidos a cinco ensayos, cada uno de los cuales estaba separado por cinco minutos. En cada ensayo, la varilla se aceleró una RPM (Fukui & Rapheal, 2013, Hearing Res., 297:99-105) a partir de una velocidad inicial de dos RPM.. Se registró el tiempo (en segundos) hasta que los ratones se cayeron del dispositivo. Dado que las soluciones perilinfáticas de la cóclea son continuas con las del laberinto vestibular, se evaluó si la Anc80-eGFP inyectada a través de la RWM coclear transduciría los órganos sensoriales vestibulares. De hecho, los montajes completos de los epitelios vestibulares revelaron una expresión de eGFP robusta tanto en las células ciliadas de tipo I como de tipo II del utrículo, un órgano vestibular sensible a la gravedad y a los movimientos lineales de la cabeza, y en los canales semicirculares, que son sensibles a los movimientos rotativos de la cabeza (Figura 3A, 3B). Por eso, para abordar la preocupación de seguridad de que la transducción de Anc80 pueda afectar al equilibrio, los ratones inyectados con expresión vestibular confirmada realizaron la prueba del rotarod para la función vestibular de forma similar a los controles no inyectados (Figura 11).

Parte 2 — La terapia génica restaura la función en un modelo de ratón del síndrome de Usher

Ejemplo 2 — Modelo de ratón del síndrome de Usher

En el Ejemplo 2 se utilizaron los siguientes métodos y materiales.

Preparación del tejido

El utrículo y el órgano de Corti de los ratones Ushlc c.216G>A heterocigotos u homocigotos se recogieron del día postnatal 0 al 8 (P0 a P8) para realizar estudios electrofisiológicos. Las crías de ratón postnatal fueron sacrificadas por decapitación rápida. Se extirparon los huesos temporales y se bañaron en MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10 mM de HEPES (pH 7.4). El órgano de Corti se diseccionó sin el uso de enzimas como se ha descrito antes. Los utrículos se eliminaron después de 10 minutos de tratamiento con proteasa (Proteasa XXIV, Sigma) a 0,1 mg/ml. Los órganos extirpados se colocaron en cubreobjetos de cristal redondos. En el borde del tejido se colocaron un par de finas fibras de vidrio previamente pegadas al cubreobjetos para estabilizarlo en posición plana. Los tejidos se sometieron a disección aguda o se mantuvieron en cultivo en presencia de suero bovino fetal al 1%. Los cultivos se mantuvieron durante 7 a 8 días y el medio se sustituyó cada 2 o 3 días para los experimentos que implicaban la infección de vectores virales in vitro.

Animales

Los ratones knock-in Ushlc c.216G>A se obtuvieron del Health Science Center de la Universidad Estatal de Luisiana. La cepa importada, aunque en un origen C57BL6, fue criada previamente con la mutación Cdh23 (Ahl) que causa la pérdida de audición relacionada con la edad. Los ratones fueron genotipados utilizando una pinza en el dedo del pie (antes de P8) o un punzón en la oreja (después de P8) y la PCR se realizó como se ha descrito antes (Lentz et al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44). Para todos los estudios, se utilizaron ratones machos y hembras en proporciones aproximadamente iguales. No se aplicó ningún otro paradigma de aleatorización.

Generación de vectores virales

Se aisló el ARN total de las cócleas de los ratones mutantes c.216AA (kit RNAqueous micro, Ambion) y se transcribió de forma inversa con el kit de transcripción inversa QuantiT ect (Qiagen). El ADNc de la trunc-armonina se amplificó por PCR con la Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen) y los cebadores: Trunc-armonina.F(KpnI) GAG GTA CCA TGG ACC GGA AGG TGG CCC GAG (SEQ ID NO:9); Trunc-armonina.RV(BamHI) CAG GAT CCG GAC AAT TTC ATC CCC TAC (SEQ ID NO:10). El producto de la PCR de 387 pb se clonó con el kit de clonación TA (Invitrogen) y se confirmó mediante secuenciación. Para generar una construcción de fusión de GFP, el fragmento truncado de armonina se subclonó en pEGFP-C1 con KpnI y BamHI. El ADNc de la EGFP::trunc-armonina por NheI-XbaI se transfirió a un vector lanzadera AAV. Los vectores personalizados se empaquetaron con repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 en la cápside de AAV1, donde el casete transgénico fue impulsado por un promotor CMV (AAV2/1.CMV.EGFP::trunc-armonina.hGH, 1.92 E14gc/m, BCH).

Los plásmidos armonina-al y armonina-b1 se prepararon en nuestro laboratorio a partir de construcciones marcadas EGFP proporcionadas amablemente por Lily Zheng y James Bartles (Zheng et al., 2010, J. Neurosci., 30:7187-201) (Departamento de Biología Celular y Molecular, Northwestern University, Feinberg School of medicine, Chicago, IL). La armonina-a1 se obtuvo originalmente del riñón de ratón y la armonina-b1 del epitelio sensorial aislado de la cóclea de ratón. La construcción de armonina-al se modificó para sustituir la etiqueta EGFP por tdTomato en su extremo terminal N. Las construcciones marcadas con fluorescencia y las no marcadas se empaquetaron en vectores AAV. Los vectores virales fueron generados por el centro viral del Boston Children's Hospital y el Gene Transfer Vector Core del Massachusetts Eye and Ear Infirmary. Se generaron los siguientes vectores: AAV2/1.CMV.tdTomato::armonina-a1 4,33 10A13gc/ml (BCH); AAV2/1.CMV.EGFP::armonina-b1 2,73 564 10A14 gc/ml (BCH); AAV2/1.CMV.EGFP-armonina-al: 2,81 10A12 gc/ml (MEEI); AAV2/1.CMV.EGFP-trunc-armonina; 1,92 10A14 gc/ml (BCH); AAV2/Anc80.CMV.armonina-al: 1,93 W12 gc/ml (MEEI); AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1: 1,74 10A12 gc/ml (MEEI); AAV2/Anc80.CMV.trunc-armonina.WPRE: 9,02 567 W12 gc/ml (MEEI); Para los experimentos in vitro, se aplicaron 10 ^l del vector concentrado a V l del medio suplementado MEM sobre el tejido sometido a disección aguda en presencia de suero bovino fetal al 1% durante 24 h. Los cultivos se mantuvieron posteriormente hasta 10 días.

Inyección de Membrana de Ventana Redonda (RWM)

Las inyecciones en la RWM se realizaron según lo aprobado por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Boston Children's Hospital en el protocolo de animales n° 15-01-2878R. Se inyectaron 0,8 ^l-1 ^l de vectores de AAV en ratones neonatos P0-P1 y P10-P12. Los ratones P0-P1 fueron anestesiados primero mediante exposición a hipotermia, mientras que los ratones P10-P12 fueron anestesiados con isoflurano. Tras la anestesia, se realizó una incisión postauricular para exponer la bulla ótica y visualizar la cóclea. Las inyecciones se realizaron a través de la RWM con una micropipeta de cristal controlada por un micromanipulador (Askew et al., 2015, Sci.

Transl. Transl. Med., 7:295ra108). El volumen de los materiales inyectados se controló a un ritmo aproximado de 0,02 ^l/min durante 10 minutos. Se aplicaron los cuidados postoperatorios habituales. El tamaño de la muestra para los estudios in vivo se determinó de forma continua para optimizar el tamaño de la muestra y disminuir la varianza.

Registro electrofisiológico

Los registros se realizaron en una solución de perilinfa artificial estándar que contenía (en mM): 144 NaCl, 0,7 NaH²PO⁴, 50 5,8 KCl, 1,3 CaCl2, 0,9 MgCh, 5,6 D-glucosa y 10 HEPES-NaOH, ajustada a pH 7.4 y 320 mOsmol/kg. Se añadieron vitaminas (1:50) y aminoácidos (1:100) a partir de concentrados (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células ciliadas se observaron desde la superficie apical utilizando un microscopio vertical Axioskop FS (Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión en agua de 63X con óptica de contraste de interferencia diferencial. Las pipetas de registro (3-5 MQ) se extrajeron del tubo capilar de borosilicato (Garner Glass, Claremont, CA) y se llenaron con una solución intracelular que contenía (en mM): 135 KCl, 5 EGTA-Ko H, 10 HEPES, 2,5 K2ATP, 3,5 MgCh, 0,1 CaCl2, pH 7.4. Las corrientes se registraron bajo una pinza de voltaje en células enteras a un potencial de mantenimiento de -64 mV a temperatura ambiente. Los datos se adquirieron utilizando un Axopatch Multiclamp 700A o Axopatch 200A (Molecular devices, Palo Alto, CA) filtrado a 10 kHz con un filtro Bessel de paso bajo, digitalizado a >20 kHz con una placa de adquisición de 12 bits (Digidata 1322) y pClamp 8.2 y 10.5 (Molecular Devices, Palo Alto, CA). Los datos se analizaron fuera de línea con el software OriginLab y se presentan como ± desviaciones estándar de la media, salvo indicación contraria.

Análisis estadísticos

Los vectores de prueba y de control se evaluaron en al menos tres ratones por grupo en cada punto temporal para garantizar la reproducibilidad. El tamaño de las muestras se indica en las leyendas de las figuras. Todos los animales con inyección satisfactoria en la RWM se incluyeron en el análisis del estudio. Los animales con inyección fallida se excluyeron de la media pero se incluyeron en la leyenda para su completa divulgación. El éxito de la inyección se determinó según la recuperación de ABR con umbrales >90 dB SPL. Los análisis estadísticos se realizaron con Origin 2016 (OriginLab Corporation). Los datos se presentan como ± desviaciones estándar de la media (SD) o error estándar de la media (SEM) como se indica en el texto y la leyenda de la figura. Se utilizó el análisis de varianza de una vía (ANOVA) para determinar las diferencias significativas entre las medias.

Ejemplo 2A - Microscopía electrónica de barrido (SEM) en el modelo Usher de ratón

La SEM se realizó en P7, P18 y -P42 (6 semanas) a lo largo del órgano de Corti de los ratones de control y mutantes. La SEM P18 se realizó en colaboración con el Dr. Edwin Rubel en la Universidad de Washington. Los oídos internos se fijaron en glutaraldehído al 4% en 0,1 M de fosfato sódico a 4°C durante toda la noche. Al día siguiente, las muestras se enjuagaron tres veces en 0,1 M de tampón de fosfato sódico (PB) y se posfijaron en tetróxido de osmio al 1% en 0,1 M de PB durante 30 minutos en un baño de hielo. A continuación, las muestras se enjuagaron en 0,1 M de PB y se deshidrataron mediante una serie gradual de etanol: 35%, 70%, 95%, y 100% (x2). Las muestras se secaron en el punto crítico, se montaron en los portamuestras del dispositivo SEM y se recubrieron con una capa de Au/Pd. La SEM se realizó con un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-840A. Se realizó una preparación similar para las etapas P8 y 6 semanas. Los explantes del órgano de Corti se fijaron en glutaraldehído al 2,5% en 0,1 M de tampón de cacodilato (Electron Microscopy Sciences) complementado con 2 mM de CaCl2 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se deshidrataron en una serie graduada de acetona, se secaron en el punto crítico de CO2 líquido, se recubrieron con 4-5 nm de platino (Q150T, Quorum Technologies, Reino Unido) y se observaron con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (S-4800, Hitachi, Japón).

Los ratones mutantes homocigotos c.216AA son sordos y muestran el comportamiento de dar vueltas y mover la cabeza característicos de la disfunción vestibular. Trabajos previos (Lentz et al., 2010, Dev., Neurobiol., 70:253-67) describieron una pronunciada degeneración de las células ciliadas internas y externas en la base de la cóclea en P30. También se observó degeneración y muerte de células ciliadas en el giro medio, mientras que la porción apical del órgano estaba mejor conservada a 1 mes de edad. Se planteó la hipótesis de que la degeneración de las células ciliadas se produce progresivamente durante el desarrollo de los órganos del oído interno y, para evaluar la supervivencia de las células ciliadas en etapas anteriores, se realizó un análisis de SEM a lo largo del órgano de Corti en P8 y P18. Las células ciliadas externas (CCE) y las células ciliadas internas (CCI) de los ratones heterocigotos c.216GA se conservaron y sus haces estaban correctamente orientados a estas edades (Figura 12A-12C, 12G, 12I y Figura 19A-19C, 19K). Sin embargo, los haces ciliares desorganizados eran evidentes a lo largo de toda la longitud del órgano de Corti en los ratones homocigóticos c.216AA a ambas edades analizadas (Figura 12D-12F, 12H, 12J-12L y Figura 19D-19J, 19L). En P8, los haces de las CCI estaban ligeramente desorganizados en las regiones de la base, media y apical (Figura 12D-12F, 12J). Numerosos haces de CCI mostraban un patrón ondulado y una leve desorganización de las filas de estereocilios (Figura 12J). Mientras que muchas CCE de ratones mutantes c.216AA poseían haces ciliares bien conservados (Figura 12H, 12K), los haces ciliares fragmentados y desorganizados eran evidentes de forma esporádica a lo largo del órgano (Figura 12D-12F, 12L). La alteración era más pronunciada en P18, aunque la mayoría de las células ciliadas seguían presentes como se informó antes (Lentz et al., 2013, Nat. Med., 19:345-50) (Figura 19D-19F).

Para evaluar la morfología del haz ciliar en los ratones sometidos a terapia génica con armonina-b1, se prepararon los huesos temporales de ratones de 6 semanas de edad no tratados (o no inyectados) y tratados (o inyectados) para el análisis SEM. Los ratones c.216AA no tratados mostraron una grave pérdida de células ciliadas en las regiones basal y media del órgano (Figura 18). En la región basal, las CCE estaban mayoritariamente ausentes en la primera fila y presentes de forma esporádica en la segunda y tercera filas. En la región media del órgano, la primera fila de CCE también estaba ausente en gran medida. En el extremo apical se observaron fenotipos más leves. La SEM a gran aumento también reveló la existencia de haces ciliares severamente desorganizados a lo largo de toda la longitud del órgano de los ratones mutantes c.216AA. Sorprendentemente, en los ratones c.216AA de 6 semanas de edad, no se observaron haces ciliares que conservaran la típica estructura en escalera con las tres filas de estereocilios. En contraste, las células ciliadas de los ratones c.216AA mostraban haces ciliares desorganizados con estereocilios retraídos a lo largo de la primera fila, una segunda fila anormal y una fila más alta bastante conservada. En cambio, en los ratones c.216AA se observó una reducción de la pérdida de células ciliadas y haces ciliares normales tras el tratamiento con armonina-b1. El recuento de células ciliadas se estimó a partir de la presencia o ausencia de haces ciliares en campos de visión representativos.

Los datos revelaron una pronunciada preservación del número de células ciliadas en los ratones inyectados desde la base hasta el ápex del órgano, del 40 al 79% en la base, del 68 al 95% en el centro y del 93 al 99% en el ápex (n=1824 células de n=4 oídos de ratones C.216AA y n=792 de n=2 oídos C.216AA rescatados). Aunque los haces ciliares anormales seguían siendo evidentes en los ratones inyectados con armonina-b1, la mayoría de los haces ciliares tenían tres filas de estereocilios y presentaban una morfología casi indistinta de sus controles heterocigotos (Figura 18).

Ejemplo 2B - Imágenes de FM1-43 en el modelo de ratón Usher

Se diluyó FM1-43 de 5 micromolares (Invitrogen) en solución de registro extracelular y se aplicó a los tejidos durante 10 segundos y luego se lavó 3 veces en solución de registro extracelular para eliminar el exceso de colorante y evitar la captación por endocitosis. Después de 5 minutos, se obtuvieron imágenes de FM1-43 intracelular utilizando una fuente de luz de epifluorescencia, una óptica de contraste de interferencia diferencial y un conjunto de filtros FM1-43 (Chroma Technologies) en un Zeiss Axioscope FS plus con objetivos de inmersión en agua de 20x, 40x y 63x. Las imágenes se capturaron a 16 bits con una cámara CCD y un procesador de imágenes Argus-20 (Hamamatsu) utilizando la sustracción de fluorescencia de fondo. Se mantuvieron los mismos ajustes de ganancia y contraste para la adquisición de todas las imágenes y se analizaron fuera de línea con el software Adobe Photoshop o Image-J.

Para evaluar la función de las células ciliadas en etapas más tempranas, se analizó la captación de FM1-43 en órganos del oído interno sometidos a disección aguda en P4. Tras aplicaciones breves (< 10 s), el FM1-43 permea las células ciliadas que poseen canales mecanosensibles funcionales. Se observó una captación uniforme de FM1-43 en las células ciliadas de los ratones c.216GA (Figura 13A), pero el nivel de captación variaba entre las CCE de los ratones c.216AA, lo que sugiere que algunas células, no todas, conservaban los canales de transducción funcionales (Figura 13B). Se realizaron observaciones similares a lo largo de toda la cóclea. No se observaron diferencias tonotópicas. La captación de FM1-43 también disminuyó en las CCI de los ratones c.216AA durante la primera semana postnatal (datos no mostrados). La captación de FM1-43 también se evaluó en las células ciliadas del utrículo de los ratones mutantes. Curiosamente, en los ratones mutantes c.216AA, la captación estaba restringida a la región de la extra-estriola en P6, lo que sugiere que las células ciliadas de la región de la estriola carecen de canales mecanosensibles abiertos en reposo (Figura 13C, 13D). Ejemplo 2C - Estimulación mecánica en el modelo de ratón Usher

CCE y CCI: Los estímulos mecánicos se transmitieron a través de una sonda de vidrio rígido montada en un actuador piezoeléctrico de chip PICMA dimensional 524 (Physik Instruments, Waldbronn, Gernamy) impulsado por un amplificador ENV400 de 400 mA (Piezo-system Jena Alemania). La punta de la sonda se pulió con llama (Fire polisher, H602, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL) para ajustarse al haz estereociliar (Stauffer & Holt, 2007, J. Neurophysiol., 98:3360-9). Las deflexiones se evocaron aplicando pasos de voltaje filtrados con un filtro Bessel de 8 polos (Khron-Hite, 528 Brockton, MA) a 50 kHz para eliminar la resonancia residual de la pipeta. Las deflexiones del haz ciliar se monitorizaron utilizando una cámara CCD C2400 (Hamamatsu, Japón). Se utilizaron pasos de voltaje para calibrar el movimiento de la sonda de estímulo en torno ± 2 ^m de su posición de reposo. Se grabaron imágenes de vídeo de la sonda para confirmar la ausencia de movimiento fuera del eje y calibrar el movimiento de la sonda (resolución espacial de - 4 nm). El tiempo de subida del 10-90% de la sonda fue de -20 ^seg.

VCH: Los estímulos mecánicos se transmitieron a través de una sonda de vidrio rígido montada en un elemento bimorfo piezoeléctrico. El acoplamiento se realizó mediante la succión suave de kinocilio en la pipeta de estímulo. Las deflexiones se evocaron aplicando pasos de voltaje al dispositivo piezoeléctrico que consistía en dos bimorfos montados en serie y acoplados directamente a la sonda de estímulo. Los pasos de voltaje se controlaron con el software pClamp 8.0 y se filtraron con un filtro Bessel de 8 polos a 1 kHz (Khron-Hite, Brockton, MA). Las deflexiones del haz ciliar se monitorizaron utilizando una cámara CCD C2400 (Hamamatsu, Japón). El movimiento de la sonda de estímulo se calibró en torno a (± 2 ^m) su posición de reposo antes de los experimentos.

Durante la primera semana postnatal, los epitelios auditivo y vestibular conservan células ciliadas mecanosensibles, incluyendo algunas con morfología relativamente normal (Figura 12). En el órgano de Corti, se obtuvieron registros de los giros medio y apical de la cóclea de los ratones c.216AA de P3 a P6 de las células ciliadas con haces que parecían normales y de las que tenían haces ciliares más gravemente alterados. En los mutantes c.216AA, las CCE conservaron la mecanosensibilidad, aunque las amplitudes de las respuestas se redujeron significativamente en un -63% a 170 ± 80 pA (n=24; p<0,001, Figura 13E, 13F, 13G). Se observó un amplio rango de amplitudes de respuesta en las CCE, entre 31 y 292 pA en los ratones c.216AA. Se observaron diferencias significativas (p<0,01) cuando se agruparon los datos según la morfología del haz ciliar: las corrientes evocadas en las células ciliadas mutantes que tenían haces ciliares severamente desorganizados eran menores que las evocadas en las células mutantes que tenían haces ciliares más conservados, 120 ± 65 pA (n=9) y 201 ± 74 pA (n=15), respectivamente. A pesar de la reducción de la amplitud de la corriente, las respuestas de las células ciliadas a los desplazamientos mecánicos conservaron propiedades similares a las de los ratones heterocigotos c.216GA. Las curvas de respuesta al estímulo [I(X)] se ajustaron utilizando una ecuación de Boltzmann de segundo orden (Figura 13F) y el ajuste se utilizó para determinar el rango operativo del 10-90% (Figura 20B). No se observó ninguna diferencia significativa (p= 0,054) en el rango operativo entre las CCE registradas de c.216GA y c.216AA. Del mismo modo, mientras que los haces ciliares de las CCI de los ratones mutantes c.216AA parecían ligeramente alterados bajo el microscopio DIC, las corrientes de transducción se redujeron significativamente en P6 (Figura 13E, 13F, 13G). A un potencial de mantenimiento de -64 mV, las corrientes de transducción máximas en las CCI de los heterocigotos c.216GA (P6-P7) alcanzaron una media de 587 ± 96 pA (n=21), pero se redujeron en un 46% a 316 ± 127 pA (n=19; p<0,001) en las CCI de c.216AA. Se midió una reducción significativa (p<0,01) en el rango operativo en las CCI de los ratones mutantes c.216AA (Figura 20G).

La adaptación, definida como una disminución de la corriente de transducción en presencia de una desviación constante del haz, también estaba presente en los ratones mutantes c.216AA. La cinética de adaptación se analizó utilizando ajustes exponenciales dobles para determinar los componentes rápidos y lentos. Mientras que ambos componentes eran más lentos en las CCI y las CCE de los ratones mutantes c.216AA, la diferencia solo era significativa para el componente lento (p<0,05 en las CCE y p<0,001 en las CCI; Figura 20C, 20D, 20H, 20I). Por otra parte, el grado de adaptación medido en Popen= 0,5 fue significativamente menor en las CCE y las CCI de las células ciliadas de c.216AA que en las de c.216GA (Figura 20E, 20J; p<0,001). En conjunto, estos resultados demuestran que la mecanosensibilidad está ligeramente comprometida en las células ciliadas internas y externas de los ratones c.216AA y, lo que es más importante, que ambos tipos de células sobreviven a lo largo de la primera semana postnatal, un requisito previo para la terapia génica y la restauración de la función celular.

En las células ciliadas vestibulares, también se observó una reducción de las corrientes de mecanotransducción en los ratones c.216AA. En la región de la extra-estriola, las corrientes de c.216AA se redujeron significativamente (p<0,001) a 109 ± 30 pA (n=9, P5-P7) frente a 231 ± 53 pA (n=8, P6-P7) para las corrientes de c.216GA (Figura 13E, 13F, 13H). Se registraron corrientes muy pequeñas o nulas en las células ciliadas de la región la estriola (6 ±13 pA, n=6, P5-P7), de acuerdo con la ausencia de captación de FM1-43 en esa región (ver abajo; Figura 13C, 13D). Mientras que los haces ciliares del utrículo parecían estar bien conservados por microscopía DIC, las corrientes de transducción estaban significativamente reducidas o ausentes en las células ciliadas de la estriola y extra-estriola, respectivamente. Así pues, con la excepción de la región de la estriola, estos resultados sugieren que el aparato de transducción está correctamente ensamblado y dirigido en los ratones mutantes, pero que el número de complejos funcionales se reduce en los ratones neonatos.

A continuación, se evaluó la función en las células ciliadas de c.216AA expuestas a vectores de AAV que impulsan la expresión de armonina. Para aumentar la probabilidad de rescate funcional con armonina exógena, las secuencias codificantes de armonina-al o armonina-b1 sin marcar, dirigidas por un promotor CMV, se empaquetaron en una cápside de AAV conocida como Anc80 (Zinn et al., 2015, Cell Rep., 12:1056-68). Como se muestra aquí, la cápside Anc80 transduce el 100% de las CCI y el 80-90% de las CCE in vivo. La hipótesis es que la armonina-b se necesita para la mecanotransducción tanto en las CCI como en las CCE y es necesaria para la función auditiva en ambos tipos de células. Se realizaron inyecciones de AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 (0,8 p.l, 1,9x10A12 gc/ml) y, por separado, una mezcla de AAV2/Anc80.CMV.armonina-a1 (1,7x 10A12 gc/ml) AAV2/Anc80.CMV, armonina-b1 (0,5 ^l 0,5 ^l) y se evaluaron las respuestas de mecanotransducción dos semanas después del tratamiento.

El tejido se extrajo en P5-P6, antes de que la cóclea se osificara, y se mantuvo en cultivo durante 10 días. Aunque las CCE maduras (>P10) no sobreviven a los paradigmas de registro ex vivo, se obtuvieron registros electrofisiológicos robustos de las CCI en el equivalente de P14-P16. Los resultados se presentan en la Figura 15. Mientras que las CCI de los ratones no inyectados mostraron corrientes de transducción severamente reducidas en P16 (79 ± 43 pA, n=8), la recuperación de la transducción sensorial fue evidente en los ratones que recibieron el tratamiento de AAV. Se observó una recuperación significativa (***P<0,001) en los ratones inyectados en P1 con armonina-b1 o una combinación de b1 y a1, con corrientes de transducción máximas medias respectivas de 388 ± 66 pA (n=15) y 352 ± 28 pA (n=7; Figura 15C). Las amplitudes de las corrientes de transducción en las CCI tras el tratamiento con armonina-b1 no fueron significativamente diferentes de las de los ratones c.216GA de control. El nivel de recuperación no se vio significativamente alterado por la co-inyección de armonina-b1 y armonina-al. Estos resultados sugieren que la administración de armoninab1 exógena vía inyección en RWM en etapas tempranas puede restaurar la mecanotransducción en las CCI.

Ejemplo 2D - Imagen confocal en el modelo de ratón Usher

Para preparar el tejido para la obtención de imágenes confocales de ratones postnatales en P0-P8, se realizó una fijación durante 15 minutos con paraformaldehído al 4% (PFA). Se utilizó la permeabilización con tritón al 0,01% y la contratinción con faloidina Alexa Fluor (Invitrogen, 1/200) para marcar los filamentos de actina. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio confocal LSM700 Zeiss. En los ratones más viejos (de 4 a 8 semanas), se extrajeron los huesos temporales tras la eutanasia y se colocaron en PFA al 4% durante 1 hora, seguido por descalcificación durante 24 a 36 horas con EDTA 120 mM. A continuación se diseccionó el epitelio sensorial y se inyectó como se ha indicado antes para la inmunotinción. Se aplicó antiCTBP2 de ratón (BD bioscience #612044, 1/200) durante 48 horas y se contratiñó con antiratón de cabra Alexa Fluor (1/200) durante la noche a 4°C para marcar las sinapsis de cinta. Las imágenes se captaron en un microscopio confocal láser Zeiss LSM 710 (IDDRC Imaging Core grant P30 HD18655) y se procesaron con Zeiss LSM image viewer 4.2.

Trabajos previos revelaron la expresión de dos formas alternativas de empalme de la armonina en las células ciliadas sensoriales. Para evaluar la capacidad de los vectores de AAV de impulsar la expresión de formas exógenas de empalme de la armonina, se expusieron los utrículos y los órganos de Corti de ratones neonatos c.216AA y de tipo salvaje (C57BL/6J) a vectores AAV2/1 que codificaban la eGFP fusionada con el N-terminal de armonina-b1 (eGFP::armoninab1) o tdTomato fusionado al 181 N-terminal de la armonina-al (tdTomato::armonina-a1). Los vectores se aplicaron in vitro o in vivo mediante inyección en la RWM (1 ^l) en P1. Cuando se aplicaron in vitro, los tejidos P0-P1 se incubaron en presencia de los vectores durante 24 horas y se mantuvieron en cultivo durante una semana. Las imágenes confocales muestran que las células ciliadas de los ratones de tipo salvaje, c.216GA y c.216AA fueron transducidas con éxito (Figura 14A-14C, 14E). La señal de EGFP::armonina-b1 era evidente en las puntas de los estereocilios en las VHC (Figura 14A), las CCI y las CCE (Figura 14B, 14C). La señal de EGFP también se detectó en P60 en las CCE y CCI en la porción basal de la cóclea de los ratones inyectados en P1 (Figura 14D). Se detectó TdTomato::armonina-a1 en la base de las células ciliadas auditivas (Figura 14E). La cotinción con un marcador de sinapsis de cinta CTBP2 reveló frecuentemente colocalización en las CCI de P7 (Figura 14E) pero no en los utrículos de P7 (datos no mostrados).

La localización de las construcciones de fusión exógenas era coherente con trabajos previos que localizaban la armoninab en el extremo distal de los estereocilios, cerca de las inserciones de los enlaces de las puntas, y la armonina-a en la sinapsis.

Ejemplo 2E - Respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR) y por productos de distorsión (DPOAE)

Se registraron las respuestas de ABR y DPOAE en ratones anestesiados con xilacina (5-10 mg/kg i.p.) y ketamina (60 -100 mg/kg i.p.). Se insertaron electrodos de aguja subcutáneos en la piel a) dorsalmente entre los dos oídos (electrodo de referencia); b) detrás del pabellón auricular izquierdo (electrodo de registro); y c) dorsalmente en la grupa del animal (electrodo de tierra). El meato de la base del pabellón auditivo se recortó para dejar al descubierto el canal auditivo. Para los registros ABR, el canal auditivo y el aparato auditivo (sistema EPL Acoustic, MEEI, Boston) se presentaron con pips de tono de 5 milisegundos. Las respuestas se amplificaron (10.000 veces), se filtraron (0,1-3 kHz) y se promediaron con una placa analógica-digital en un sistema de adquisición de datos basado en PC (EPL, Cochlear function test suite, MEEI, Boston). El nivel de sonido se elevó en pasos de 5 a 10 dB, desde 0 a 110 dB de nivel de presión sonora (decibelios SPL). En cada nivel, se promediaron de 512 a 1024 respuestas (con la polaridad del estímulo alterada) tras el "rechazo de artefactos". El umbral se determinó mediante inspección visual. Los datos se analizaron y trazaron con Origin-2015 (OriginLab Corporation, MA). Se presentan los umbrales de las ± desviaciones estándar de la media salvo otra indicación. Para la respuesta de DPOAE, se presentaron tonos primarios f1 y f2 (f2/f1 = 1,2) con f2 variado entre 5,6 y 45,2 kHz en pasos de media octava y L1-L2 = 10 dB SPL. En cada f2, L2 se varió entre 10 y 80 dB SPL en incrementos de 10 dB SPL. El umbral de DPOAE se definió a partir de los espectros medios como el nivel L2 que provocaba un DPOAE de magnitud 5 dB SPL por encima del ruido de fondo. El nivel medio de ruido de fondo fue inferior a 0 dB SPL en todas las frecuencias. Los estímulos se generaron con tarjetas I-O digitales de 24 bits (National Instruments PXI-4461) en un chasis PXI-1042Q, amplificados por un controlador de altavoz SA-1 (Tucker-Davis Technologies, Inc.), y suministrados por dos controladores electrostáticos (CUI CDMG15008-03A) en nuestro sistema acústico personalizado. Se utilizó un micrófono electret (Knowles FG-23329-P07) en el extremo de un pequeño tubo de sonda para controlar la presión sonora del canal auditivo. La mayoría de estos experimentos no se realizaron bajo condiciones ciegas.

Para determinar si la armonina truncada interfería con la función auditiva normal, se generaron vectores Anc80.CMV.truncharm para sobreexpresar la proteína truncada. Los vectores se inyectaron vía RWM en los oídos internos de ratones c.216GA. Se midieron las respuestas ABR y DPOAE a las 4, 6 y 12 semanas y no se encontraron diferencias en los umbrales entre los ratones c.216GA inyectados y los no inyectados (los registros de los ratones de 6 semanas se muestran en la Figura 23C-23D). Los datos sirven de control para la técnica de inyección, el vector y, lo que es más importante, sostienen que la armonina truncada exógena no compite con la armonina de longitud completa endógena, lo que implica que es poco probable que la forma truncada endógena en las células ciliadas de c.216AA interfiera con la armonina de longitud completa exógena expresada mediante vectores de terapia génica.

Para determinar si el aumento del gen de la armonina puede rescatar la función auditiva y de equilibrio en ratones Ushlc, se realizaron inyecciones vía RWN a P0-P1 de AAV2/Anc80.CMV.armonina1 (0,8 p.l, 1,7X10A12 gc/ml) o AAV2/Anc80.CMV.armonina-a1 (0. 8 p.l, 1,9X10A12 gc/ml) y se evaluaron las respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR), las emisiones otoacústicas de productos de distorsión (DPOAE), los reflejos acústicos de sobresalto, el comportamiento en campo abierto y en el rotarod. Los ratones fueron evaluados a las seis semanas, una etapa en la que los ratones c.216AA sufren una profunda pérdida de audición y disfunción vestibular. Algunos de los ratones fueron evaluados además a los 3 y 6 meses.

Ninguno de los 12 ratones inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-a1 recuperó la función auditiva a las 6 semanas (Figura 16A-16C), lo que sugiere que la expresión exógena de armonina-al fue insuficiente para el rescate auditivo. Sin embargo, 19 de 25 ratones inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 recuperaron la función auditiva de forma significativa a las 6 semanas. A bajas frecuencias (de 5,6 a 16 kHz), los mejores umbrales de ABR en los oídos inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 estaban a 25-30 dB SPL, notablemente similares a los umbrales de los ratones de tipo salvaje (Figura 16A-16B). Se observó un rescate parcial a 22,6 kHz y poco o nada a 32 kHz. El rescate de los umbrales de DPOAE también fue evidente, en consonancia con el rescate de la función en las CCE (Figura 16C). Ocho de los ratones que poseían umbrales auditivos <45 dB SPL para estímulos de 8-11,3 kHz fueron examinados en etapas posteriores para evaluar la longevidad del rescate. Desde las 6 semanas hasta los 3 meses, se observaron desplazamientos del umbral de ABR de -10 dB SPL en el rango de frecuencia baja y de -30 dB SPL en el rango de frecuencia alta (Figura 16D). También se observó un cambio similar en los umbrales de DPOAE (Figura 16E). Después de este punto de tiempo, los umbrales de ABR y DPOAEs permanecieron estables hasta los 6 meses de edad (Figura 16D-16E), el último punto de tiempo probado.

Para evaluar si tanto la armonina-al como la armonina-b1 son necesarias para un rescate auditivo más completo, especialmente en el extremo de alta frecuencia, se coinyectaron AAV2/Anc80.CMV.tdTomato:: armonina-al (0,5 p.l; 238 4,1EA12 gc/ml) y AAV2/Anc80.CMV.eGFP::armonina-b1 (0,5 p.l; 3,0EA12 gc/ml). El 65% de las células ciliadas expresaron tanto la armonina-al como la armonina-b1, como se desprende de las células positivas para ambas etiquetas fluorescentes (Figura 21). Ocasionalmente se observó armonina-al marcada con fluorescencia en los estereocilios de los ratones expuestos a AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::armonins-a1, quizás debido a la sobreexpresión. Los umbrales de ABR y DPOAE de los ratones coinyectados con vectores de armonina-al y armonina-b1 no etiquetados (Figura 16) fueron similares a los inyectados con armonina-b1 sola y no proporcionaron una mejora adicional, lo que sugiere que la armoninaal puede ser prescindible para la función auditiva. Es importante destacar que los datos demuestran que la armonina-b1 por sí sola es suficiente para la restauración significativa de los umbrales auditivos a bajas frecuencias (Figura 16). Para evaluar con más detalle el alcance del rescate, se analizaron las formas de onda de ABR, de ratones con umbrales < 45 dB SPL, y se compararon entre ocho ratones c.216GA de control y cinco ratones c.216AA inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1. El análisis de las respuestas a 8-11,3 kHz y 16 kHz reveló amplitudes de onda 1 normales (diferencias no significativas, P>0,2, prueba t de Student) y latencias de pico 1 más largas (P>0,001) (Figura 22), lo que sugiere un posible retraso en la neurotransmisión en la sinapsis. En muchos animales, también se observó un rescate auditivo en el oído contralateral, con umbrales de ABR tan bajos como 20 dB SPL a 11,3 kHz (armonina-bl: media de 59,7 ± 5,3 dB SPL, n=15/25; armonina-a1 -b1: 255 media de 76,2 ± 10,3 dB SPL, n=4-6). La difusión de los vectores AAV en el oído contralateral se ha observado antes y probablemente se produce a través del conducto perilinfático que se mantiene continuo con el espacio subaracnoideo en los ratones recién nacidos.

También examinamos si las inyecciones en etapas posteriores del desarrollo podrían conducir a un rescate auditivo parcial. Se realizaron inyecciones RWM de AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 (0,8 ^l) en P10-P12 y se evaluaron los umbrales auditivos a las 6 semanas. Ninguno de los ratones inyectados en P10-P12 tenía DPOAEs detectables y sus umbrales ABR no diferían de los ratones de control c.216AA no inyectados (n=10; datos no mostrados), lo que sugiere que la ventana de oportunidad para la intervención puede estar limitada a las etapas postnatales tempranas, posiblemente debido a la baja eficiencia de la transducción viral en el tejido más antiguo o a la degeneración del órgano de Corti en etapas posteriores del desarrollo.

Ejemplo 2F-RT-PCR en el modelo de ratón Usher

Se preparó ADNc a partir de 6 órganos auditivos de ratones P2-P3 de tipo salvaje, heterocigotos y homocigotos Ushlc c.216G>A utilizando el kit de transcripción inversa QUANTITECT® (Qiagen). Se amplificó el ADNc que codifica la armonina de longitud completa (450 pb) o truncada (-35 pb) utilizando los siguientes cebadores: Cebador directo mUsh1c_Ex2F: 5' CTC ATT GAA AAT GAC GCA GAG AAG G 3' (SEQ ID NO:11), Reverso mUsh1c_Ex5R: 5' TCT CAC TTT GAT GGA CAC GGT CTT 3' (SEQ ID NO:12). Estos cebadores son específicos para las secuencias Ushlc de ratón y amplificarán tanto el Ushlc endógeno como el derivado de AAV2, ya que la secuencia objetivo está fuera de la región de la porción humana eliminada del alelo Ush1c c.216A. También se evaluaron los niveles de ADN y ARN de los tejidos de los ratones recogidos a las seis semanas después del tratamiento. El ADN y el ARN se aislaron de la cóclea utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) según el protocolo del fabricante. El ARN se transcribió de forma inversa utilizando el sistema de transcripción inversa GoScript (Promega, Madison, WI). La PCR radiomarcada se llevó a cabo utilizando GoTaq Green Master Mix (Promega, Madison, WI). Para la amplificación del ADN viral, se utilizaron cebadores específicos para ratón Ushlc: mUsh1c_Ex3F (5'-GAA CCC AAC CGC CTG CCG (SEQ ID NO:13)) y mUsh1c Ex4WTR (5'-TGC AGA CGG TCC AAG CGT-3' (SEQ ID NO:14)).

Estos cebadores solo amplificarán el ADN Ushlc viral porque los ratones homocigotos Ushlc.216AA tienen el gen USH1C c.216A humano eliminado en el exón 3 y 4, sustituyendo la secuencia de ratón (Lentz et al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44). Para la amplificación del ADNc de la armonina de longitud completa (450 pb) y armonina empalmada/truncada aberrantemente (415 pb), se utilizaron los mismos cebadores anteriores (mUsh1c_Ex2F y mUsh1c_Ex5R). Los cebadores de Gapdh fueron: mGapdh Ex3F (5'-611 GTG AGG CCG GTG CTG AGT ATG-3' (SEQ ID NO:15)) y mGapdh Ex4R (5'-GCC Aa A GTT GTC ATG GAT Ga C-3' (SEQ ID NO: 16)). Los productos se separaron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% y se cuantificaron utilizando un fosforímetro Typhoon 9400 (GE Healthcare).

Dado que estudios previos plantearon la posibilidad de que la armonina truncada pueda interrumpir la función al competir con la armonina de longitud completa por los socios de unión endógenos, se exploró si la expresión persistente de la proteína truncada puede limitar la recuperación en ratones c.216AA inyectados con vectores que expresan armonina exógena de longitud completa (Figura 23A). Para abordar esta cuestión, se examinó la expresión de los transcritos de Ushlc en los ratones c.216GA y c.216AA mediante un ensayo de RT-PCR. En consonancia con informes anteriores, se detectaron transcritos Ushlc que codificaban armonina de longitud completa y truncada en c.216GA cócleas y solo se detectaron transcritos que codificaban armonina truncada en c.216AA cócleas (Figura 23B).

Para confirmar la expresión de AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 y explorar la relación entre el nivel de expresión viral y los umbrales de ABR, se aisló ADN y ARN de cócleas inyectadas y contralaterales y se cuantificó por PCR y RT-PCR, respectivamente. Se evaluó la expresión en ratones de seis semanas c.216GA y AAV2/Anc80.CMV. armonina-b1 (0,8 p.l; 1,9310A12 gc/ml) ratones c.216AA inyectados y no inyectados. Las muestras incluían dos ratones inyectados con rescate de ABR buena (umbrales < 35 dB SpL a 11,3 kHz) y dos con un rescate de ABR pobre (umbrales > 90 dB SPL a 11,3 kHz). El ARN que codifica la forma de empalme correcta de la armonina (Figura 24A) y el ADN de la armonina-b1 de AAV2/Anc80.CMV (Figura 24B) se detectaron en todas las cócleas inyectadas y, en menor medida, en las cócleas contralaterales de todos los animales ensayados.

Hubo variabilidad entre los animales en los umbrales de ABR y la cantidad de ADN y ARN expresadas (Figura 24C). No obstante, se encontró una fuerte correlación entre los niveles de ADN de AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1, la cantidad de ARN que codifica para la forma de empalme correcta de armonina y los niveles de umbral de ABR, lo que sugiere que la variabilidad en los datos de ABR puede ser un resultado directo de la expresión del AAV. Para evaluar la supervivencia a largo plazo de las células ciliadas en los ratones que habían recuperado con éxito los umbrales de ABR, se preparó el tejido y se contó el número de CCI y CCE a los 6 meses de edad en 5 ratones (Figura 25). Mientras que el número de CCI no varió en las dos cohortes, el 50% o más de las CCE se mantuvieron en los tres ratones que mostraron un rescate de ABR a largo plazo. La supervivencia de las CCE se observó a lo largo de todo el órgano, con la excepción del giro basal (Figura 25).

Ejemplo 2G-Respuestas del reflejo de sobresalto acústico en el modelo de ratón Usher

Las respuestas del reflejo de sobresalto acústico (ASR) se midieron utilizando el Startle Monitor (Kinder Scientific). Los ratones se colocaron en una cámara de registro cúbica de plexiglás de pequeño tamaño, no restrictiva (27 cm x 10 cm x 12,5 cm), fijada en un conjunto de sensores piezoeléctricos/plexiglás, y se les dejó aclimatarse durante 5 minutos con un ruido blanco de fondo de 60 dB SPL. Cada sesión constaba de 35 ensayos, durante los cuales se emitía un único pulso de ruido que oscilaba en intensidades de 10 dB SPL de 60-120 db SPL con un intervalo inter-ensayo medio de 30 s (rango de 25-35 s) Los pulsos se dispusieron en un orden pseudoaleatorio, sobre un ruido de fondo constante de 60 dB SPL para limitar la interferencia del ruido externo. El sistema Startle Monitor redujo la respuesta a cada pulso en mediciones del primer N, el N máximo y el tiempo máximo de la respuesta (ms), para calcular la respuesta del reflejo de sobresalto máxima (amplitud de ASR) y el tiempo desde el estímulo hasta la respuesta del reflejo de sobresalto máxima (latencia de ASR). Todas las ASR se realizaron en condiciones ciegas.

Para evaluar si la recuperación de ABR / DPOAE produjo una recuperación conductualmente relevante de la función auditiva, se midieron las respuestas del reflejo de sobresalto acústico en ratones inyectados con AAV2/Anc80.CMV.aarmonina-a1, AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 y aquellos inyectados con ambos vectores. El análisis de la respuesta del reflejo de sobresalto al ruido blanco mostró un rescate parcial de la respuesta en los ratones de 6 semanas inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 y en los ratones coinyectados con ambos vectores (Figura 17A). Los ratones que recibieron solo armonina-al fueron similares a los ratones c.216AA no inyectados y no recuperaron las respuestas del reflejo de sobresalto.

Ejemplo 2H-Evaluación vestibular en el modelo de ratón Usher

La función vestibular se evaluó mediante una prueba de equilibrio de campo abierto y el rotarod. La prueba de campo abierto se llevó a cabo utilizando un marco circular de 42 cm de diámetro, colocado dentro de una cámara de sonido con iluminación LED encima, ajustada a 30 lux en el centro, dentro de una sala atenuada. Los ratones se colocaron de uno en uno dentro del campo abierto circular y se les permitió explorar durante 5 minutos. El comportamiento se grabó y se siguió con Ethovision XT, lo que permitió medir la distancia recorrida y la velocidad. Las evaluaciones en campo abierto se realizaron en condiciones ciegas. El trabajo del rotarod implicaba la colocación de los ratones en una varilla en una carcasa cerrada que empezaba a girar a 4 rpm y se aceleraba a una velocidad de 0,1 rpm s-1. Los ratones fueron colocados en las barras el primer día durante 5 minutos para que se familiarizaran con el equipo. Al día siguiente, se colocaron los animales en las barras durante un total de 5 ensayos. Se impuso un período de descanso de 5 minutos entre los ensayos. El tiempo que los animales eran capaces de mantenerse en el dispositivo antes de caer al suelo instrumentado de la carcasa se mostraba en un temporizador y se registraba después de cada prueba.

Dado que el espacio perilinfático es continuo entre la cóclea y el laberinto vestibular, los vectores de AAV inyectados a través de la RWM pueden transducir también los órganos sensoriales vestibulares. Para evaluar el comportamiento vestibular, se probó el rendimiento de los ratones en un rotarod. Mientras que se observó un rendimiento deficiente en el rotarod en los ratones c.216AA y c.216AA inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-a1 (latencia a la caída < 22 s de media), los ratones c.216AA inyectados con AAV2/Anc80.CMV.armonina-b1 y los coinyectados con vectores armonina-a1 y -b1 mantuvieron la función de equilibrio en el rotarod durante 60-120 segundos, en consonancia con los ratones c.216GA de control (Figura 17B).

La recuperación del comportamiento en campo abierto también se observó en los ratones c.216AA inyectados con armonina-b1 y con doble armonina1 y b1. En la Figura 17C se muestran trazos representativos de la exploración en campo abierto. Los ratones c.216GA exploraron el borde del campo y mostraron un mínimo de rotaciones de todo el cuerpo, mientras que los ratones c.216AA mostraron más actividad en toda la cámara con un aumento de las rotaciones de todo el cuerpo cuantificadas como rotaciones/min (Figura 17D-17E). Sorprendentemente, aunque no se observó rescate de ABR en los ratones inyectados con AAV2/Anc80.CMV. armonina-al, los datos de campo abierto demostraron la recuperación de la función vestibular al nivel de los ratones de control. El comportamiento de los ratones c.216GA inyectados con AAV2/Anc80.CMV.trunc-armonina no difirió del de los ratones c.216GA de control, indicando de nuevo una falta de interferencia entre la armonina truncada y la de tipo salvaje (Figura 17C-17E).

Los ensayos conductuales demostraron un rescate vestibular parcial con armonina-al, ya que se abolió el comportamiento en círculos pero los ratones inyectados con armonina-al fallaron en la prueba del rotarod. Los ratones inyectados con armonina-bl, por el contrario, tuvieron una recuperación funcional en ambas pruebas (Figura 17). La ausencia de transducción y de captación de FM1-43 en las regiones estriadas indica que las células ciliadas de la región de la estriola y, tal vez, la función de las células de tipo I dependen de la expresión adecuada de la armonina (Figura 13).

Mientras que el rescate auditivo fue prominente a bajas pero no a altas frecuencias (Figura 16), se observó la preservación de la morfología del haz ciliar a las 6 semanas a lo largo de todo el órgano (Figura 18). La ausencia de rescate a altas frecuencias es poco probable que se deba al daño causado por la inyección. No se observó pérdida de audición a altas frecuencias en ninguno de los c.216GA inyectados con vectores AAV (Figura 23C-23D). La orientación del AAV a lo largo de toda la extensión de la cóclea descarta como explicación la falta de eficiencia de la transducción en la base. Una posibilidad es que otras isoformas de armonina, como la armonina-c corta, sean necesarias para rescatar la función en el extremo basal de alta frecuencia de la cóclea. Alternativamente, dado que el desarrollo coclear empieza en el extremo basal, es posible que para P0, las células ciliadas del extremo basal de alta frecuencia hayan madurado más allá del punto de reparación. Si este es el caso, la intervención embrionaria puede permitir un mejor rescate en la región de alta frecuencia.

Ejemplo 3A - Experimentos in vivo

Los vectores Anc80 que portan la secuencia codificadora de TMC1 de ratón dirigida por un promotor CMV modificado se generaron utilizando un sistema libre de virus de soporte y un método de transfección doble como se ha descrito anteriormente (Grimm et al., 2003, Mol. Ther., 7:839:50). Se fusionó una secuencia triple flag-tag (FLAG) en el extremo C-terminal de la secuencia codificante de TMC para permitir la visualización de la proteína expresada. El vector Anc80-CMV-Tmc se purificó utilizando un gradiente de iodixanol seguido de cromatografía de intercambio iónico. Los títulos oscilaron entre 1x 1012 y 1x 1013 gc/ml, medidos mediante PCR cuantitativa utilizando una serie de cebadores específicos para el elemento intrónico de la beta-globina humana. Las alícuotas del virus se almacenaron a -80°C y se descongelaron justo antes del uso.

Se utilizaron ratones, de edades P0-P2, para la administración in vivo de vectores virales, como se describe a continuación, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolos n° 2659, n° 2146) en el Hospital Infantil de Boston. Se utilizaron líneas de ratones C57BL/6J (Jackson Laboratories) o Swiss Webster (Taconic) para los ratones de control de tipo salvaje, y ratones portadores de alelos mutantes TMC1 (TMC1A/A o Tmcl -/-) en un fondo C57BL/6J como se ha descrito antes (Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809).

Para preparar el tejido para la evaluación, se recogieron los huesos temporales de crías de ratón en P0-P10. Las crías fueron sometidas a eutanasia por decapitación rápida y los huesos temporales se diseccionaron en MEM (Invitrogen) suplementado con 10 mM de HEPES, 0,05 mg/ml de ampicilina y 0,01 mg/ml de ciprofloxacina a pH 7.40. Se aisló el laberinto membranoso bajo un microscopio de disección, se peló la membrana de Reissner y se retiraron mecánicamente la membrana tectorial y la estría vascular. Los cultivos del órgano de Corti se fijaron de forma plana debajo de un par de fibras de vidrio finas adheridas en un extremo con Sylgard a un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 mm. El tejido se sometió a disección aguda para los estudios electrofisiológicos. En el caso de los ratones mayores que P10, se recogieron los huesos temporales tras la eutanasia del animal con CO2 inhalado, y se generaron montajes completos de la cóclea. Todos los valores medios y barras de error presentados en las figuras representan la ± SD de la media. Las comparaciones de significación estadística entre los oídos inyectados y los oídos no inyectados se realizaron mediante una prueba t emparejada de dos colas. P < 0,05 se consideró significativo.

Ejemplo 3B Inyección in vivo de vectores virales

Se inyectaron a crías de ratón (P0-P2 a P2) a través de la membrana de ventana redonda (RWM) utilizando pipetas de microinyección biseladas de vidrio. Las pipetas se extrajeron del tubo capilar en un extractor de pipetas P-2000 (Sutter Instruments) y se biselaron (-20^m diámetro de punta en un ángulo de 28°) utilizando una biseladora de micropipetas (Sutter Instruments). Se aplicó externamente crema EMLA (lidocaína al 2,5% y prilocaína al 2,5%) para la analgesia, utilizando hisopos estériles para cubrir el punto quirúrgico (prominencia mastoidea izquierda). La temperatura corporal se mantuvo con una almohadilla de calentamiento a 37°C durante 30-60 minutos antes de la cirugía.

Las crías se anestesiaron mediante la inducción rápida de hipotermia durante 2-3 minutos hasta la pérdida de conciencia, y este estado se mantuvo en una plataforma de enfriamiento durante 10-15 minutos durante la cirugía. El punto quirúrgico se desinfectó frotando con Betadine y limpiando con etanol al 70% en repetidas ocasiones. Se realizó una incisión postauricular para exponer la bulla ótica transparente, se hizo avanzar una micropipeta con un micromanipulador (MP-30, Sutter Instrument Company) a través de la bulla y la fascia suprayacente, y se penetró en la RWM con la punta de la micropipeta.

Se inyectó aproximadamente V l de virus a títulos entre 10¹²y 10¹⁴gc/mL (10⁹y 10¹¹de partículas virales totales) unilateralmente a 0,1 ^l/min en el oído izquierdo utilizando un microinyector neumático (WPI Nanoliter 2010). La incisión de la piel se cerró con una sutura de monofilamento 6-0 (Ethicon). Las crías fueron devueltas a la almohadilla térmica para su recuperación.

Ejemplo 3C-Inmunofluorescencia

Se realizó la inmunotinción para determinar la distribución de la expresión de un transgén aportado por un vector viral. Para ello, se realizó la inmunotinción en órganos de Corti recién diseccionados, fijados por inmersión durante 1 h a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% diluido en PBS. A continuación, se enjuagó el tejido en PBS, se permeabilizó en Tritón X-100 al 0,01-0,1% durante 30 minutos y se hizo una contratinción durante 1 hora con AlexaFluor546-faloidina (Molecular Probes, dilución 1:200) para marcar la actina filamentosa.

Para la localización de las proteínas de fusión TMC::FLAG expresadas exógenamente, el tejido se bloqueó durante 1 hora con BSA al 2% y suero de cabra normal al 5%, y se incubó durante la noche a 4°C con un anticuerpo en el motivo FLAG (BD Biosciences, dilución 1:200). Para el recuento de las células ciliadas, el tejido se bloqueó en suero normal de cabra durante 1 hora, se tiñó con un anticuerpo primario anti-miosina VIIa de conejo (Proteus Biosciences, dilución 1:1000) a 4 °C durante la noche y se marcó con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con AlexaFluor488 (Life Technologies, dilución 1:200) durante 1 hora. Las muestras se montaron en cubreobjetos de vidrio con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories), y se obtuvieron imágenes con un aumento de 10X-63X utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM700.

La Figura 26 muestra la inmunofluorescencia que demuestra el suministro uniforme de Anc80 de armonina a los ratones mutantes Ushlc, y la Figura 28 muestra la inmunofluorescencia que demuestra el suministro de Anc80 de KCNQ4 a las células en ratones mutantes KCNQ4. Por lo tanto, Anc80 es un vector efectivo para tratar una serie de defectos genéticos diferentes (en una serie de loci genéticos diferentes) que dan lugar a la pérdida de audición.

Ejemplo 3D-Electrofisiología de las células ciliadas

Los cultivos cocleares organotípicos se bañaron en perilinfa artificial estándar que contenía 137 mM de NaCl, 0,7 mM de NaH²PO⁴, 5,8 mM de KCl, 1,3 mM de CaCl2, 0,9 mM MgCl²,10 mM de Hepes y 5,6 mM de D-glucosa. Se añadieron vitaminas (1:50) y aminoácidos (1:100) a la solución a partir de concentrados (Invitrogen), y se utilizó NaOH para ajustar el pH final a 7.40 (310 mosmol/kg). Se extrajeron las pipetas de registro (de 3 a 5 megaohmios) del tubo capilar R6 (King Precision Glass) y se llenaron con una solución intracelular que contenía 135 mM de CsCl, 5 mM de Hepes, 5 mM de EGTA, 2,5 mM de MgCl2, 2,5 mM de Na2-adenosina trifosfato y 0,1 mM de CaCh, y se utilizó CsOH para ajustar el pH final a 7.40 (285 mosmol/kg). Los registros de pinzamiento de voltaje de células enteras, con cierre hermético, se realizaron a -84 mV a temperatura ambiente (22° a 24°C) utilizando un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices). Las corrientes de transducción sensorial se filtraron a 10 kHz con un filtro Bessel de paso bajo y se digitalizaron a >20 kHz con una placa de adquisición de 16 bits (Digidata 1440A) y el software pCLAMP 10 (Molecular Devices). Los datos se almacenaron para el análisis fuera de línea utilizando OriginPro 8 (OriginLab).

La Figura 29 muestra la recuperación de las corrientes de potasio a niveles cercanos a los de tipo salvaje (Figura 29A) en las células KCNQ4 -/- transfectadas con Anc80-KCNQ4 (Figura 10C) en relación con los ratones mutantes (Figura 29B), demostrando así que la terapia génica utilizando Anc80 es capaz de restaurar la función.

Ejemplo 3E - Respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR)

Los registros de ABR se llevaron a cabo como se ha descrito antes (Maison et al., 2010, J. Neurosci., 30:6751-62). Brevemente, los ratones P25-P30 fueron anestesiados mediante inyección IP (0,1 ml/10 g-peso corporal) con 50 mg de ketamina y 5 mg de xilacina diluidos en 5 ml de solución salina al 0,9%. Los experimentos de ABR se realizaron a 32°C en una cámara insonorizada. Para comprobar la función auditiva, se presentaron a los ratones estímulos de tonos puros de 5,6 kHz, 8 kHz, 11,3k Hz, 16 kHz, 22,6 kHz o 32 kHz a niveles de presión sonora entre 10 y 115 dB en pasos de 5 dB hasta que se detectó una intensidad umbral que evocaba una forma de onda de ABR reproducible (picos I-IV). Utilizando un estímulo de polaridad alterna, se recogieron de 512 a 1024 respuestas y se promediaron para cada nivel de presión sonora.. Las formas de onda con una amplitud superior a 15 ^V (pico a valle) se descartaron mediante una función de "rechazo de artefactos".

Antes del inicio de la prueba ABR, el colgajo de piel y cartílago que típicamente oscurece la entrada del meato auditivo externo fue recortado con tijeras de disección, y la presión sonora en la entrada del canal auditivo fue calibrada para cada sujeto de prueba individual en todas las frecuencias de estímulo. Los estímulos acústicos se aplicaron directamente en el oído estudiado a través de un conjunto de altavoz/micrófono con tubo de sonda personalizado (EPL PXI Systems) que consistía en dos auriculares electrostáticos (CUI Miniature Dynamics) para generar tonos primarios y un micrófono miniatura Knowles (Electret Condenser) para registrar la presión sonora del canal auditivo. Los estímulos sonoros consistían en ráfagas de tonos de 5 ms (0,5 ms de subida y bajada con un inicio de cos2, emitido a 40/s).

Las señales de ABR se recogieron utilizando electrodos de aguja subcutáneos insertados en el pabellón de la oreja (electrodo activo), el vértice (electrodo de referencia) y la grupa (electrodo de tierra). Los potenciales de ABR se amplificaron (10.000 veces), se filtraron (0,3-10 kHz) y se digitalizaron utilizando un software de adquisición de datos personalizado (LabVIEW). Los estímulos sonoros y el voltaje de los electrodos se muestrearon a intervalos de 40 segundos utilizando una placa I-O digital (National Instruments) y se almacenaron para su análisis fuera de línea. El umbral se definió visualmente como el nivel de decibelios más bajo en el que cualquier onda (I-IV) podía ser detectada y reproducida con intensidades de sonido crecientes. Los umbrales de ABR se promediaron dentro de cada grupo experimental y se utilizaron para el análisis estadístico.

La Figura 27 demuestra gráficamente que la administración de un vector viral Anc80 que codifica y expresa armonina puede proporcionar una recuperación casi completa de la función auditiva, particularmente a frecuencias más bajas (por ej., de unos 5 a unos 22 kHz).

Ejemplo 3F - Análisis cuantitativo de RT-PCR

Se realizaron experimentos para evaluar la cantidad de virus presente en la cóclea tras la administración in vivo. Se inyectaron dos ratones TMC1 -/- en el oído izquierdo en P1. Se extirparon cócleas de los oídos izquierdo y derecho y se mantuvieron en cultivo durante 3 días, el equivalente de P10. Se extrajo el ARN y se confirmó su calidad utilizando un bioanalizador Agilent (Agilent Technologies), y se transcribió de forma inversa en ADNc para el análisis cuantitativo de RT-PCR con conjuntos de cebadores eficientes específicos para TMC1 con el reactivo SYBR GreenER qPCR (Invitrogen), como se describió antes (Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809).

Para amplificar un fragmento de TMC1, se utilizaron los siguientes cebadores: 5'-CAT CTG CAG CCA ACT TTG GTG TGT-3' (SEQ ID NO:17) y 5'-AGA GGT AGC CGG AAA TTC AGC CAT-3' (SEQ ID NO:18). Los niveles de expresión se normalizaron con los de Actb (que codifica p-actina) amplificados con 5'-TGA GCG CAA GTA CTC TGT GTG GAT-3' (SEQ ID NO:19) y 5'-ACT CAT CGT ACT CCT GCT TGC TGA-3' (SEQ ID NO:20). Todos los cebadores se diseñaron para abarcar los intrones y se validaron mediante un análisis de la curva de fusión y controles negativos. Los datos se analizaron con el método AACT, relativo a Actb y la diferencia entre los oídos inyectados y no inyectados.

Estos resultados demuestran que, en los oídos inyectados, la expresión de ARNm de TMC1 fue 12 veces mayor que en los oídos no inyectados.

Ejemplo 3G - Marcado de FM1-43

Los experimentos de carga de colorante FM1-43 se realizaron como se ha descrito antes (Gale et al., 2001, J. Neurosci., 10 21:7013-25; Meyers et al., 2003, J. Neurosci., 23:4054-65; y Geleoc & Holt, 2003, Nat. Neurosci., 10:1019-20). Los cubreobjetos con cultivos cocleares adheridos se colocaron bajo un microscopio vertical (Zeiss Axioscope FS Plus) sobre una cámara con fondo de cristal. Se aplicó Cinco-FM1-43FX (Invitrogen) diluido en perilinfa artificial durante 10 segundos y se lavó el tejido tres veces en perilinfa artificial para eliminar el colorante de la hoja exterior de la membrana celular. Después de 5 minutos, se obtuvieron imágenes del FM1-43 intracelular utilizando un conjunto de filtros de FM1-43 y una fuente de luz de epifluorescencia con un objetivo de inmersión en agua de 63X. El tejido se fijó y se procesó para inmunofluorescencia como se ha descrito antes.

La Figura 30 presenta las imágenes de inmunotinción que muestran la captación del colorante FM1-43 por las células expuestas a un vector viral Anc80 como se describe en el presente documento, y la Figura 31 demuestra gráficamente que el TMC1 administrado por un vector viral Anc80 como se describe aquí restaura la transducción sensorial en las células ciliadas Tmcl-deficientes in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una proteína de cápside Anc80 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y uno o más transgenes seleccionados del grupo que consiste en TMC1, TMC2, MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7, para el uso en un método para tratar un trastorno de la audición, donde uno o más transgenes se administran al menos al 80% de las células ciliadas del oído interno (CCI) y al menos al 80% de las células ciliadas del oído externo (CCE) en el oído interno de un sujeto.

2. Un virus adenoasociado (AAV) para el uso en un método de tratamiento de un trastorno auditivo, el método comprende: administrar el virus adenoasociado (AAV) al oído interno del sujeto, en el que el AAV comprende una proteína de cápside Anc80 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 y un transgén, en el que el transgén se administra al menos al 80% de las células ciliadas internas (CCI) y al menos al 80% de las células ciliadas del oído externo (CCE) del oído interno del sujeto.

3. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el transgén se administra también a una o más células del oído interno seleccionadas del grupo que consiste de neuronas del ganglio espiral, células ciliadas vestibulares, neuronas ganglionares vestibulares, células de soporte y células en la estría vascular del oído interno del sujeto.

4. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el transgén se selecciona del grupo que consiste en ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP,NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1,WFS1, WHRN, y XIAP.

5. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el transgén codifica un factor neurotrófico, opcionalmente en el que el factor neurotrófico se selecciona del grupo que consiste en GDNF, BDNF, NT3 y HSP70.

6. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el transgén codifica un anticuerpo o una especie de ARN antisentido, silenciador o no codificante largo, o un sistema de edición del genoma seleccionado del grupo que consiste en una nucleasa de dedo de zinc de ingeniería genética, TALEN y CRISPR.

7. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el transgén está bajo control de una secuencia promotora heteróloga, opcionalmente en el que la secuencia promotora heteróloga se selecciona del grupo que consiste en un promotor CMV, un promotor CBA, un promotor CASI, un promotor PGK, un promotor EF-1, un promotor del receptor nicotínico alfa9, un promotor de prestina, un promotor KCNQ4, un promotor Myo7a, un promotor Myo6, un promotor Gfi1, un promotor Vglut3 y un promotor Atoh1.

8. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el paso de administración comprende inyectar el AAV a través de la ventana redonda.

9. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el AAV se administra mediante inyección a través de la ventana redonda.

10. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el AAV se administra durante una cocleostomía o durante una canalostomía.

11. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que el AAV se administra al oído medio y/o a la ventana redonda a través de uno o más vehículos de administración de fármacos.

12. El virus adenoasociado (AAV) para el uso según la reivindicación 2, en el que la expresión del transgén resulta en la regeneración de las células ciliadas internas (CCI), las células ciliadas externas (CCE), las neuronas ganglionares espirales, la estría vascular, las células ciliadas vestibulares y/o las neuronas ganglionares vestibulares, restaurando así la audición o la función vestibular.

13. Un artículo de fabricación que comprende un vector de AAV y una composición farmacéutica para el uso en un método de tratamiento de un trastorno auditivo, en el que el vector de AAV comprende una proteína de cápside Anc80 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 y un transgén unido de forma operable a un promotor, opcionalmente en el que el transgén se selecciona del grupo que consiste en ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LR-TOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP,NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1,WFS1, WHRN, y XIAP, donde uno o más transgenes se administran al menos al 80% de las células ciliadas internas (CCI) y al menos al 80% de las células ciliadas del oído externo (CCE) en el oído interno de un sujeto.