CN113365603A - Aav1载体及其用于治疗耳部适应症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够用于转导多种内耳细胞类型的AAV1载体及其用于治疗听力损失、耳聋、耳鸣和前庭功能障碍的用途。

Description

AAV1载体及其用于治疗耳部适应症的用途
序列表
本申请含有已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此以引用的方式整体并入的序列表。2019年10月11日创建的所述ASCII拷贝名为51124-054WO3_Sequence_Listing_10.11.2019_ST25且大小为38,358字节。
技术领域
本发明提供了可用于转导多种内耳细胞类型的AAV1载体及其用于治疗听力损失、耳鸣和前庭功能障碍的用途。
发明背景
基因疗法最近作为治疗内耳病症(如听力损失和前庭功能障碍)的有前途的方法出现，因为它可用于治疗这些病症的遗传原因，诱导编码治疗性蛋白质的基因的表达，并且可使听力保留或恢复，与人工耳蜗相比具有更自然的声音感知。然而，已经在内耳的多种不同细胞类型中鉴定出导致听力丧失和/或前庭功能障碍的突变，并且在啮齿动物模型中的临床前研究有待鉴定可用于转导大部分或所有内耳细胞类型的单个病毒载体。此外，很少研究在较大的动物模型中进行，所述较大动物模型更能预测人类治疗。因此，需要在临床上相关的动物模型中表现出内耳细胞的泛嗜性转导的病毒载体。
发明内容
本公开是基于发明人的以下发现：具有AAV1血清型的腺相关病毒(AAV)载体(例如AAV1衣壳)在非人灵长类动物的内耳中出人意料地具有泛嗜性。与小鼠内耳中的AAV1嗜性相比以及还与非人灵长类动物中的其它AAV血清型(例如AAV2和AAV7m8)的嗜性相比，AAV1载体在非人灵长类动物内耳的多种细胞类型中均表现出强表达和出人意料的优异嗜性。因此，本发明提供了使用AAV1载体转导灵长类动物(例如人)内耳的细胞类型的组合物和方法。本文所述的AAV1载体可施用于灵长类动物(例如人)受试者以促进多核苷酸，例如对应于促进或改善一种或多种灵长类动物(例如人)内耳细胞的内耳细胞功能、再生、维持、发育、增殖或存活的基因的多核苷酸的表达。本文所述的组合物和方法可施用于灵长类动物(例如人)患者以治疗或预防听力损失(例如感觉神经性听力损失)和/或前庭功能障碍(例如眩晕、头晕或失衡)。
本发明的示例性实施方案在以下列举的段落中进行了描述。
E1.一种在灵长类动物受试者中转导发育的内耳细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的转导一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)选自由以下组成的组的内耳细胞类型的量的血清型1腺相关病毒(AAV1)载体：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜(Reissner’s membrane)的细胞和胶质细胞。
E2.如E1所述的方法，其中所述AAV1载体转导三种或更多种选自由以下组成的组的内耳细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
E3.如E2所述的方法，其中所述AAV1载体转导五种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
E4.如E3所述的方法，其中所述AAV1载体转导十种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
E5.如E4所述的方法，其中所述AAV1载体转导十五种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
E6.如E5所述的方法，其中所述AAV1载体转导二十种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
E7.如E1-E6中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体转导至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞。
E8.如E1-E7中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体转导给定细胞类型或所有内耳细胞类型的所有细胞。
E9.如E1-E8中任一项所述的方法，其中转导贯穿整个耳蜗长度(例如，耳蜗的基底至顶端轴)发生。
E10.如E1-E9中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体跨耳蜗的基底至顶端轴长度转导至少20％(例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞。
E11.如E1-E10中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体在耳蜗的基底中转导至少20％(例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞。
E12.如E1-E11中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体在耳蜗的中部中转导至少20％(例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞。
E13.如E1-E12中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体在耳蜗的顶端中转导至少20％(例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞。
E14.如E1-E13中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含选自表5中的启动子列表的启动子。
E15.如E14所述的方法，其中所述启动子是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子。
E16.如E14所述的方法，其中所述启动子是突触蛋白(SYN)启动子。
E17.如E14所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：Jagged 1(JAG1)启动子、Notch 1(NOTCH1启动子)、肌球蛋白7A(MYO7A)启动子、溶质运载蛋白家族1成员3(GLAST)启动子以及POU 4类同源盒3(POU4F3)启动子。
E18.如E14所述的方法，其中所述AAV1载体包含选自由以下组成的组的启动子：动力蛋白(Prestin)(SLC26A5)启动子、癌调蛋白(OCM)启动子、硬纤毛蛋白(Stereocilin)(STRC)启动子、肌球蛋白15(MYO15)启动子、生长因子独立的1转录阻遏因子(GFI1)启动子、钾电压门控通道亚家族Q成员1(KCNQ1)启动子、钾电压门控通道亚家族J成员10(KCNJ10)启动子、酪氨酸酶(TYR)启动子、SRY-盒2(SOX2)启动子、钙结合蛋白2(CALB2)启动子、碱性螺旋-环-螺旋家族成员E22(BHLHE22)启动子、含富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)启动子、Hes家族BHLH转录因子1(HES1)启动子、Hes家族BHLH转录因子5(HES5)启动子、SRY-盒9(SOX9)启动子、ATP酶质膜Ca2+转运2(ATP2B2)启动子、CD44分子(CD44)启动子、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)启动子、卷曲相关蛋白(FRZB)启动子、溶质运载蛋白家族26成员4(SLC26A4)启动子、癌胚抗原相关细胞粘附分子16(CEACAM16)启动子、密封蛋白11(CLDN11)启动子、外周髓鞘蛋白22(PMP22)启动子、钾电压门控通道亚家族E调控亚基1(KCNE1)启动子、POU 3类同源盒4(POU3F4)启动子、缝隙连接蛋白β2(GJB2)启动子和微管蛋白β3III类(TUBB3)启动子。
E19.如E18所述的方法，其中所述启动子是SLC26A5启动子。
E20.如E18所述的方法，其中所述启动子是OCM启动子。
E21.如E18所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E22.如E18所述的方法，其中所述启动子是ATP2B2启动子。
E23.如E18所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E24.如E18所述的方法，其中所述启动子是TYR启动子。
E25.如E1-E13中任一项所述的方法，其中所述启动子是遍在启动子。
E26.如E25所述的方法，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
E27.如E25所述的方法，其中所述启动子是源自CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体的杂合启动子(CAG启动子)。
E28.如E25所述的方法，其中所述启动子是截短的CMV-鸡β-肌动蛋白(smCBA)启动子。
E29.如E1-E28中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含选自表2中的列表的多核苷酸。
E30.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码Strc。
E31.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码跨膜通道样1(Tmc1)。
E32.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码Harmonin(Ush1c)。
E33.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码Atonal BHLH转录因子1(Atoh1)。
E34.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码Clarin 1(Clrn1)。
E35.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码SRY-盒4(Sox4)。
E36.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码脑源性神经营养因子(Bdnf)。
E37.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码神经营养蛋白3(Ntf3)。
E38.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码SRY-盒11(Sox11)。
E39.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码肌球蛋白7A(Myo7a)。
E40.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E41.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码胆碱能受体烟碱α9亚基(Chrna9)。
E42.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码胆碱能受体烟碱α10亚基(Chrna10)。
E43.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ocm。
E44.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tyr。
E45.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码含跨膜和三十四肽(Tetratricopeptide)重复序列的4(Tmtc4)。
E46.如E29所述的方法，其中所述多核苷酸编码TEA结构域转录因子2(Tead2)。
E47.如E29的方法，其中所述多核苷酸编码Yes相关蛋白1(Yap1)。
E48.一种在灵长类动物受试者的支持细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的AAV1载体，所述载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：GFAP启动子、GLAST启动子、HES1启动子、JAG1启动子、NOTCH1启动子、LGR5启动子、SOX2启动子、HES5启动子和SOX9启动子。
E49.如E48所述的方法，其中所述启动子是GFAP启动子。
E50.如E48所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：HES1启动子、LGR5启动子、SOX2启动子、HES5启动子和SOX9启动子。
E51.如E48-E50中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Sox9、Spalt样转录因子2(Sall2)、钙调蛋白结合转录激活因子1(Camta1)、具有YRPW基序2的Hes相关家族BHLH转录因子(Hey2)、Gata结合蛋白质2(Gata2)、具有YRPW基序1的Hes相关家族BHLH转录因子(Hey1)、神经酰胺合酶2(Lass2)、SRY-盒10(Sox10)、GATA结合蛋白3(Gata3)、切割样同源盒1(Cux1)、核受体亚家族2F组成员(Nr2f1)、Hes家族BHLH转录因子1(Hes1)、RAR相关孤儿受体B(Rorb)、Jun原癌基因AP-1转录因子亚基(Jun)、锌指蛋白667(Zfp667)、LIM同源盒3(Lhx3)、Nescient螺旋-环-螺旋1(Nhlh1)、MAX二聚化蛋白4(Mxd4)、含锌指MIZ类型1(Zmiz1)、髓磷脂转录因子1(Myt1)、信号转导子和转录激活因子3(Stat3)、BarH样同源盒1(Barhl1)、胸腺细胞选择相关的高迁移率组盒(Tox)、Prospero同源盒1(Prox1)、核因子I A(Nfia)、甲状腺激素受体β(Thrb)、MYCL原癌基因BHLH转录因子(Mycl1)、赖氨酸脱甲基酶5A(Kdm5a)、CAMP响应元件结合蛋白3样4(Creb3I4)、ETS变体1(Etv1)、亲本表达3(Peg3)、BTB结构域和CNC同源物2(Bach2)、ISL LIM同源盒(Isl1)、含锌指和BTB结构域的38(Zbtb38)、肢芽和心脏发育(Lbh)、Tubby二分转录因子(Tub)、泛素C(Hmg20)、RE1沉默转录因子(Rest)、锌指蛋白827(Zfp827)、AF4/FMR2家族成员3(Aff3)、PBX/有节的1同源盒2(Pknox2)、富含AT的相互作用结构域3B(Arid3b)、MLX相互作用蛋白(Mlxip)、锌指蛋白(Zfp532)、IKAROS家族锌指2(Ikzf2)、Spalt样转录因子1(Sall1)、SIX同源盒2(Six2)、Spalt样转录因子3(Sall3)、Lin-28同源物B(Lin28b)、Pou4f3、调控因子X7(Rfx7)、Atoh1、在氨基酸328、331和/或334处包含突变的Atoh1变体(例如，S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A和S328A/S331A/S334，例如具有SEQ ID NO:4-10中任一者的序列的变体)、Gfi1、Sox4、Bdnf、Ntf3、Sox11、Tead2、Yap1或核酸酶(例如，CRISPR相关蛋白9(Cas9)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或向导RNA(gRNA))，或者为微小RNA(miRNA，例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E52.如E48-E51中任一项所述的方法，其中所述支持细胞是前庭支持细胞。
E53.如E52所述的方法，其中所述前庭支持细胞位于椭圆囊中。
E54.如E48-E51中任一项所述的方法，其中所述支持细胞是耳蜗支持细胞，并且所述启动子是SOX2。
E55.一种在灵长类动物受试者的内耳的毛细胞(例如前庭毛细胞和/或耳蜗毛细胞)中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7A启动子。
E56.如E55所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E57.如E55或E56所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA(miRNA，例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E58.如E55-E57中任一项所述的方法，其中所述毛细胞是耳蜗毛细胞。
E59.如E58所述的方法，其中所述耳蜗毛细胞是内毛细胞。
E60.如E58所述的方法，其中所述耳蜗毛细胞是外毛细胞。
E61.如E55-E57中任一项所述的方法，其中所述毛细胞是前庭毛细胞。
E62.一种在灵长类动物受试者的外毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：SLC26A5启动子、OCM启动子、STRC启动子和ATP2B2启动子。
E63.如E62所述的方法，其中所述启动子是SLC26A5启动子。
E64.如E62所述的方法，其中所述启动子是OCM启动子。
E65.如E62所述的方法，其中所述启动子是ATP2B2启动子。
E66.如E62-E65中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Strc、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、ISL LIM同源盒1(Isl1)、Clrn1、原钙粘蛋白相关15(Pcdh15)、原钙粘蛋白相关23(Cdh23)、Chrna9、Chrna10、Ocm、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E67.一种在灵长类动物受试者的耳蜗毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7A启动子。
E68.如E67所述的方法，其中所述启动子是GFI1启动子。
E69.如E67所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E70.如E67-E69中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、耳畸蛋白(Otof)、溶质运载蛋白家族17成员8(Vglut3)、Strc、Chrna9、Chrna10、Ocm、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Whirlin(Whrn)、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E71.一种在灵长类动物受试者的内毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：OTOF启动子、成纤维细胞生长因子8(FGF8)启动子和溶质运载蛋白家族17成员8(SLC17A8)启动子。
E72.如E71所述的方法，其中所述启动子是OTOF启动子。
E73.如E72或E72所述的方法，其中所述多核苷酸编码Otof、Vglut3、Whirlin、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、Myo7a、Tmc1、Ush1c、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E74.一种在灵长类动物受试者的前庭毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子、MYO7A启动子、ATP2B2启动子和CALB2启动子。
E75.如E74所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E76.如E74所述的方法，其中所述启动子是ATP2B2启动子。
E77.如E74所述的方法，其中所述前庭毛细胞是I型前庭毛细胞，并且所述启动子是ATP2B2启动子。
E78.如E74所述的方法，其中所述前庭毛细胞是II型前庭毛细胞，并且所述启动子是CALB2启动子。
E79.如E74-E78中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Whirlin、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E80.一种在灵长类动物受试者的柱细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至CD44启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
E81.如E80所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E82.如E80或E81所述的方法，其中所述多核苷酸编码神经生长因子受体(Ngfr)、Bdnf、Ntf3、Tectorinβ(Tectb)、Tectorinα(Tecta)、Gjb2或缝隙连接蛋白β6(Gjb6)。
E83.一种在灵长类动物受试者的螺旋神经节神经元中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：BHLHE22启动子、SYN启动子和CALB2启动子。
E84.如E83所述的方法，其中所述启动子是SYN启动子。
E85.如E83所述的方法，其中所述螺旋神经节神经元具有高自发触发速率，并且所述启动子是CALB2启动子。
E86.如E83所述的方法，其中所述螺旋神经节神经元是传入螺旋神经节神经元，并且所述启动子是BHLHE22启动子。
E87.如E83-E86中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA (miRNA，例如miR-183、miR-96或miR-182)或针对RGMA的shRNA。
E88.一种在灵长类动物受试者的血管纹边缘细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：KCNQ1启动子、KCNE1启动子和GJB2启动子。
E89.如E88所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E90.一种在灵长类动物受试者的血管纹基底细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至CLDN11启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
E91.如E90所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E92.一种在灵长类动物受试者的血管纹中间细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：KCNJ10启动子、GJB2启动子和TYR启动子。
E93.如E92所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E94.如E92所述的方法，其中所述启动子是TYR启动子。
E95.如E90-E94中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1、Tyr、Gjb2、Gjb6或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E96.一种在灵长类动物受试者的边缘细胞和/或内指状细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至GLAST启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
E97.如E96所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E98.如E96或E97所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、跨膜蛋白16A(Tmem16a)、Gjb2或Gjb6。
E99.一种在灵长类动物受试者的Dieter氏细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至FGFR3启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
E100.如E99所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E101.如E99或E100所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、IKAROS家族锌指2(Ikzf2)、Gjb2或Gjb6。
E102.一种在灵长类动物受试者的Hensen氏细胞和/或Claudius细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至FRZB启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
E103.如E102所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子
E104.如E102或E103所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2或Gjb6。
E105.一种在灵长类动物受试者的螺旋凸细胞细胞和/或根细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至SLC26A4启动子的多核苷酸。
E106.如E105所述的方法，其中所述多核苷酸是Slc26a4。
E107.一种在灵长类动物受试者的齿间细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至CEACAM16启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
E108.如E107所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子
E109.如E107或E108所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ceacam16、耳锚蛋白(Otoa)、Gjb2或Gjb6。
E110.一种在灵长类动物受试者的胶质细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至PMP22启动子的多核苷酸。
E111.如E110所述的方法，其中所述多核苷酸编码Pmp22、Bdnf、Ntf3或髓鞘蛋白零(Mpz)。
E112.一种在灵长类动物受试者的前庭暗细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至KCNE1启动子的多核苷酸。
E113.如E112所述的方法，其中所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1或Slc26a4。
E114.一种在灵长类动物受试者的纤维细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至POU3F4启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
E115.如E114所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子
E116.如E114或E115所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2、Gjb6或胶原蛋白。
E117.一种在灵长类动物受试者的Scarpa神经节神经元(前庭神经节神经元)中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：TUBB3启动子和SYN启动子。
E118.如E117所述的方法，其中所述启动子是SYN启动子。
E119.如E117或E118所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf或Ntf3，或者为针对排斥性导向分子BMP共受体A(RGMA)的shRNA。
E120.一种在灵长类动物受试者的支持细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Sox9、Sall2、Camta1、Hey2、Gata2、Hey1,Lass2、Sox10、Gata3、Cux1、Nr2f1、Hes1、Rorb、Jun、Zfp667、Lhx3、Nhlh1、Mxd4、Zmiz1、Myt1、Stat3、Barhl1、Tox、Prox1、Nfia、Thrb、Mycl1、Kdm5a、Creb3I4、Etv1、Peg3、Bach2、Isl1、Zbtb38、Lbh、Tub、Hmg20、Rest、Zfp827、Aff3、Pknox2、Arid3b、Mlxip、Zfp532、Ikzf2、Sall1、Six2、Sall3、Lin28b、Pou4f3、Rfx7、Atoh1、在氨基酸328、331和/或334处包含突变的Atoh1变体(例如，S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A和S328A/S331A/S334，例如具有SEQ ID NO:4-10中任一者的序列的变体)、Gfi1、Sox4、Bdnf、Ntf3、Sox11、Tead2、Yap1或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)，或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E121.如E120所述的方法，其中所述多核苷酸编码Atoh1。
E122.如E120所述的方法，其中所述多核苷酸编码Sox4。
E123.如E120的所述方法，其中所述多核苷酸编码Sox11。
E124.如E120所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E125.如E120所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E126.如E120所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tead2。
E127.如E120所述的方法，其中所述多核苷酸编码Yap1。
E128.如E120-E127中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：GFAP启动子、GLAST启动子、HES1启动子、JAG1启动子、NOTCH1启动子、LGR5启动子、SOX2启动子、HES5启动子和SOX9启动子。
E129.如E128所述的方法，其中所述启动子是GFAP启动子。
E130.如E128所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：HES1启动子、LGR5启动子、SOX2启动子、HES5启动子和SOX9启动子。
E131.如E120-E130中任一项所述的方法，其中所述支持细胞是前庭支持细胞。
E132.如E131所述的方法，其中所述前庭支持细胞位于椭圆囊中。
E133.如E120-E130中任一项所述的方法，其中所述支持细胞是耳蜗支持细胞，并且所述启动子是SOX2。
E134.一种在灵长类动物受试者的内耳的毛细胞(例如，前庭毛细胞和/或耳蜗毛细胞)中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者时微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E135.如E134所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E136.如E134所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E137.如E134所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tmtc4。
E138.如E134-E137中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7A启动子。
E139.如E134-E138中任一项所述的方法，其中所述毛细胞是耳蜗毛细胞。
E140.如E139所述的方法，其中所述耳蜗毛细胞是内毛细胞。
E141.如E139所述的方法，其中所述耳蜗毛细胞是外毛细胞。
E142.如E134-E138中任一项所述的方法，其中所述毛细胞是前庭毛细胞。
E143.一种在灵长类动物受试者的外毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Strc、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、Chrna9、Chrna10、Ocm、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E144.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Strc。
E145.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Chrna9。
E146.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Chrna10。
E147.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ocm。
E148.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tmc1。
E149.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Myo7a。
E150.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ush1c。
E151.如E143所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tmtc4。
E152.如E143-E151中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：SLC26A5启动子、OCM启动子、STRC启动子和ATP2B2启动子。
E153.一种在灵长类动物受试者的耳蜗毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、Otof、Vglut3、Strc、Chrna9、Chrna10、Ocm、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Whirlin、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E154.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Atoh1。
E155.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Clrn1。
E156.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Otof。
E157.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tmc1。
E158.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ush1c。
E159.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Myo7a。
E160.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Vglut3。
E161.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Strc。
E162.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Chrna9。
E163.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Chrna10。
E164.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tmtc4。
E165.如E153所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ocm。
E166.如E153-E165中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7a启动子。
E167.如E166所述的方法，其中所述启动子是GFI1启动子。
E168.如E166所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E169.一种在灵长类动物受试者的内毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Otof、Vglut3、Whirlin、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh14、Cdh23、Myo7a、Ush1c、Tmc1、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E170.如E169所述的方法，其中所述多核苷酸编码Otof。
E171.如E169所述的方法，其中所述多核苷酸编码Atoh1。
E172.如E169所述的方法，其中所述多核苷酸编码Vglut3。
E173.如E169所述的方法，其中所述多核苷酸编码Clrn1。
E174.如E169-E173中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：OTOF启动子、FGF8启动子和SLC17A8启动子。
E175.一种在灵长类动物受试者的前庭毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Whirlin、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E176.如E175所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E177.如E175所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E178.如E175所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tmtc4。
E179.如E175-E178中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子、MYO7A启动子、ATP2B2启动子和CALB2启动子。
E180.如E175-E179中任一项所述的方法，其中所述前庭毛细胞是I型前庭毛细胞，并且所述启动子是ATP2B2。
E181.如E175-E179中任一项所述的方法，其中所述前庭毛细胞是II型前庭毛细胞，并且所述启动子是CALB2启动子。
E182.一种在灵长类动物受试者的柱细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Ngfr、Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、Gjb2或Gjb6。
E183.如E182所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E184.如E182或E183所述的方法，其中所述启动子是CD44启动子或GJB2启动子。
E185.一种在灵长类动物受试者的螺旋神经节神经元中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)或针对RGMA的shRNA。
E186.如E185所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E187.如E185所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E188.如E185-E187中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：BHLHE22启动子、SYN启动子和CALB2启动子。
E189.如E185-E188中任一项所述的方法，其中所述螺旋神经节神经元具有高自发触发速率，并且所述启动子是CALB2启动子。
E190.如E185-E188中任一项所述的方法，其中所述前庭毛细胞是传入螺旋神经节神经元，并且所述启动子是BLHLE22启动子。
E191.一种在灵长类动物受试者的血管纹中的细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1、Gjb2、Gjb6、Tyr或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E192.如E191所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E193.如E191所述的方法，其中所述多核苷酸编码Tyr。
E194.如E191-E193中任一项所述的方法，其中所述细胞是血管纹边缘细胞，并且所述启动子选自由以下组成的组：KCNQ1启动子、GJB2启动子和KCNE1启动子。
E195.如E191-E193中任一项所述的方法，其中所述细胞是血管纹基底细胞，并且所述启动子是CLDN11启动子或GJB2启动子。
E196.如E191-E193中任一项所述的方法，其中所述细胞是血管纹中间细胞，并且所述启动子选自由以下组成的组：KCNJ10启动子、GJB2启动子和TYR启动子。
E197.一种在灵长类动物受试者的边缘细胞和/或内指状细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、Tmem16a、Gjb2或Gjb6。
E198.如E197所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E199.如E197或E196所述的方法，其中所述启动子是GLAST启动子或GJB2启动子。
E200.一种在灵长类动物受试者的Dieter氏细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、Ikzf2、Gjb2或Gjb6。
E201.如E200所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E202.如E200或E201所述的方法，其中所述启动子是FGFR3启动子或GJB2启动子。
E203.一种在灵长类动物受试者的Hensen氏细胞和/或Claudius细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Gjb2或Gjb6的多核苷酸的启动子。
E204.如E203所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E205.如E203或E204所述的方法，其中所述启动子是FRZB启动子或GJB2启动子。
E206.一种在灵长类动物受试者的螺旋凸细胞和/或根细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Slc26a4的多核苷酸的启动子。
E207.如E206所述的方法，其中所述启动子是SLC26A4启动子。
E208.一种在灵长类动物受试者的齿间细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Ceacam16、Otoa、Gjb2或Gjb6。
E209.如E208所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E210.如E208或E209所述的方法，其中所述启动子是CEACAM16启动子或GJB2启动子。
E211.一种在灵长类动物受试者的胶质细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Pmp22、Bdnf、Ntf3或Mpz。
E212.如E211所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E213.如E211所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E214.如E211-E213中任一项所述的方法，其中所述启动子是PMP22启动子。
E215.一种在灵长类动物受试者的前庭暗细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1或Slc26a4。
E216.如E215所述的方法，其中所述启动子是KCNE1启动子。
E217.一种在灵长类动物受试者的纤维细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Gjb2、Gjb6或胶原蛋白。
E218.如E217所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E219.如E217或E218所述的方法，其中所述启动子是POU3F4启动子或GJB2启动子。
E220.一种在灵长类动物受试者的Scarpa神经节神经元(前庭神经节神经元)中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf或Ntf3的多核苷酸或针对RGMA的shRNA的启动子。
E221.如E220所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E222.如E220所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E223.如E220-E222中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由TUBB3启动子和SYN启动子组成的组。
E224.一种治疗患有与OTOF中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Otof的多核苷酸的启动子。
E225.如E224所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子、smCBA启动子、MYO15启动子和OTOF启动子。
E226.如E225所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子或OTOF启动子
E227.一种治疗患有与STRC中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Strc的多核苷酸的启动子。
E228.如E227所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子、smCBA启动子、MYO15启动子、SLC26A5启动子、OCM启动子和ATP2B2启动子。
E229.如E228所述的方法，其中所述启动子选自包括以下的组：MYO15启动子、SLC26A5启动子、OCM启动子和ATP2B2启动子。
E230.一种治疗患有氨基糖苷诱导的双侧前庭功能低下或有发展氨基糖苷诱导的双侧前庭功能低下的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Atoh1的多核苷酸的启动子。
E231.一种治疗患有双侧前庭功能低下或有发展双侧前庭功能低下的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Atoh1的多核苷酸的启动子。
E232.一种治疗患有年龄相关性前庭障碍或有发展年龄相关性前庭障碍的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Atoh1的多核苷酸的启动子。
E233.一种治疗患有前庭障碍或有发展前庭障碍的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Atoh1的多核苷酸的启动子。
E234.一种治疗患有听力损失或有发展听力损失的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Atoh1的多核苷酸的启动子。
E235.如E230-E234中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子、smCBA启动子和GFAP启动子。
E236.如E235所述的方法，其中所述启动子是GFAP启动子。
E237.一种治疗患有与GJB2中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Gjb2的多核苷酸的启动子。
E238.一种治疗患有与GJB2中的突变相关的年龄相关性听力损失或有发展年龄相关性听力损失的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Gjb2的多核苷酸的启动子。
E239.如E237或E238所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子、smCBA启动子和GJB2启动子。
E240.如E239所述的方法，其中所述启动子是GJB2启动子。
E241.一种治疗患有与SLC17A8中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Slc17a8的多核苷酸的启动子。
E242.如E241所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子、smCBA启动子、MYO15启动子和OTOF启动子。
E243.如E242所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子或OTOF启动子。
E244.一种治疗患有与TMC1中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Tmc1的多核苷酸的启动子。
E245.如E244所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E246.如E244所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E247.一种治疗患有听力损失或有发展听力损失的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Ntf3的多核苷酸的启动子。
E248.一种治疗患有耳鸣或有发展耳鸣的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Ntf3的多核苷酸的启动子。
E249.一种治疗患有噪声下言语理解困难或有发展噪声下言语理解困难的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Ntf3的多核苷酸的启动子。
E250.一种治疗患有腓骨肌萎缩症或有发展腓骨肌萎缩症的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Ntf3的多核苷酸的启动子。
E251.一种治疗患有弗里德赖希氏共济失调或有发展弗里德赖希氏共济失调的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Ntf3的多核苷酸的启动子。
E252.如E247-E251中任一项所述的方法，其中所述启动子是SYN启动子。
E253.如E247-E251中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E254.一种治疗患有听力损失或有发展听力损失的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf的多核苷酸的启动子。
E255.一种治疗患有耳鸣或有发展耳鸣的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf的多核苷酸的启动子。
E256.一种治疗患有噪声下言语理解困难或有发展噪声下言语理解困难的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf的多核苷酸的启动子。
E257.一种治疗患有腓骨肌萎缩症或有发展腓骨肌萎缩症的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf的多核苷酸的启动子。
E258.一种治疗患有弗里德赖希氏共济失调或有发展弗里德赖希氏共济失调的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf的多核苷酸的启动子。
E259.如E254-E258中任一项所述的方法，其中所述启动子是SYN启动子。
E260.如E254-E258中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E261.一种治疗患有双侧前庭功能低下或有发展双侧前庭功能低下的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox4的多核苷酸的启动子。
E262.一种治疗患有年龄相关性前庭障碍或有发展年龄相关性前庭障碍的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox4的多核苷酸的启动子。
E263.一种治疗患有前庭障碍或有发展前庭障碍的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox4的多核苷酸的启动子。
E264.一种治疗患有听力损失或有发展听力损失的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox4的多核苷酸的启动子。
E265.如E261-E264中任一项所述的方法，其中所述启动子是GFAP启动子。
E266.如E261-E264中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E267.一种治疗患有双侧前庭功能低下或有发展双侧前庭功能低下的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox11的多核苷酸的启动子。
E268.一种治疗患有年龄相关性前庭障碍或有发展年龄相关性前庭障碍的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox11的多核苷酸的启动子。
E269.一种治疗患有前庭障碍或有发展前庭障碍的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox11的多核苷酸的启动子。
E270.一种治疗患有听力损失或有发展听力损失的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Sox11的多核苷酸的启动子。
E271.如E267-E270中任一项所述的方法，其中所述启动子是GFAP启动子。
E272.如E267-E270中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E273.一种治疗患有与USH1C中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，向所述受试者有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Ush1c的多核苷酸的启动子。
E274.如E273所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E275.如E273所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E276.一种治疗患有与MYO7A中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Myo7a的多核苷酸的启动子。
E277.如E276所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E278.如E276所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E279.一种治疗患有与CLRN1中的突变相关的单基因遗传性耳聋或有发展单基因遗传性耳聋的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Clrn1的多核苷酸的启动子。
E280.如E279所述的方法，其中所述启动子是MYO15启动子。
E281.如E279所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、CAG启动子和smCBA启动子。
E282.一种治疗患有前庭功能障碍或有发展前庭功能障碍的风险的灵长类动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
E283.如E282所述的方法，其中所述启动子是表5中列出的支持细胞启动子、Scarpa神经节启动子、前庭毛细胞启动子或前庭支持细胞启动子。
E284.如E283所述的方法，其中所述启动子是MYO15。
E285.如E282-E284中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含用于在选自表2中的列表的前庭毛细胞和耳蜗毛细胞、耳蜗支持细胞和前庭支持细胞或Scarpa神经节中表达的多核苷酸。
E286.如E282-E285中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Whirlin、Sox9、Sall2、Camta1、Hey2、Gata2、Hey1、Lass2、Sox10、Gata3、Cux1、Nr2f1、Hes1、Rorb、Jun、Zfp667、Lhx3、Nhlh1、Mxd4、Zmiz1、Myt1、Stat3、Barhl1、Tox、Prox1、Nfia、Thrb、Mycl1、Kdm5a、Creb3I4、Etv1、Peg3、Bach2、Isl1、Zbtb38、Lbh、Tub、Hmg20、Rest、Zfp827、Aff3、Pknox2、Arid3b、Mlxip、Zfp532、Ikzf2、Sall1、Six2、Sall3、Lin28b、Pou4f3、Rfx7、Atoh1、在氨基酸328、331和/或334处包含突变的Atoh1变体(例如，S328A、S331A、S334A、S328A/S331A、S328A/S334A、S331A/S334A和S328A/S331A/S334，例如具有SEQ ID NO:4-10中任一者的序列的变体)、Gfi1、Sox4、Bdnf、Ntf3、Tead2、Yap1、Tmtc4、Sox11或核酸酶(例如，Cas9、TALEN、ZFN或gRNA)或者为微小RNA(例如miR-183、miR-96或miR-182)。
E287.如E282-E286中任一项所述的方法，其中所述前庭功能障碍是眩晕、头晕或失衡。
E288.一种通过向患有听力损失(例如，感觉神经性听力损失、耳聋或听神经病)或有发展听力损失的风险的灵长类动物受试者施用有效量的AAV1载体来治疗所述受试者的方法，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
E289.如E288所述的方法，其中所述启动子是表5中列出的IHC启动子、OHC启动子、支持细胞启动子、耳蜗支持细胞亚型启动子、耳蜗毛细胞启动子或SGN启动子。
E290.如E288或E289所述的方法，其中所述AAV1载体包含用于在选自表2中的列表的IHC、OHC、耳蜗毛细胞、前庭毛细胞和耳蜗毛细胞、耳蜗支持细胞和前庭支持细胞、耳蜗支持细胞亚型或螺旋神经节神经元中表达的多核苷酸。
E291.如E224-E290中任一项所述的方法，其中所述听力损失、耳聋、前庭障碍、前庭功能障碍或前庭功能低下与毛细胞(例如，耳蜗毛细胞和/或前庭毛细胞)的损失相关。
E292.一种通过向有需要的灵长类动物受试者施用有效量的AAV1载体来促进所述受试者中的毛细胞再生的方法，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
E293.如E292所述的方法，其中所述启动子是表5中列出的支持细胞启动子、前庭支持细胞启动子或耳蜗支持细胞亚型启动子。
E294.如E292或E293所述的方法，其中所述AAV1载体含有用于在选自表2中的列表的IHC、OHC、耳蜗毛细胞、前庭毛细胞和耳蜗毛细胞、耳蜗支持细胞亚型或耳蜗支持细胞和前庭支持细胞中表达的多核苷酸。
E295.一种通过向有需要的灵长类动物受试者施用有效量的AAV1载体来增加所述受试者中支持细胞(例如，耳蜗和/或前庭支持细胞，例如，增加支持细胞增殖)的数量的方法，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
E296.如E295所述的方法，其中所述启动子是表5中列出的支持细胞启动子、耳蜗支持细胞亚型启动子或前庭支持细胞启动子。
E297.如E295或E296所述的方法，其中所述AAV1载体含有用于在选自表2中的列表的耳蜗支持细胞和前庭支持细胞或耳蜗支持细胞亚型中表达的多核苷酸。
E298.一种通过向有需要的灵长类动物受试者施用有效量的本发明的AAV1载体或本发明的组合物来预防或减少所述受试者的内耳细胞损伤或死亡的方法。
E299.如E298所述的方法，其中所述内耳细胞损伤或死亡是耳毒性药物引起的损伤或死亡。
E300.如E299所述的方法，其中所述耳毒性药物选自包括以下的组：氨基糖苷类(例如，庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、万古霉素和阿米卡星)、抗肿瘤药(例如，含铂化疗剂，诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂)、依他尼酸、速尿灵(furosemide)、水杨酸盐类(例如，阿司匹林，特别是在高剂量下)和奎宁。
E301.如E298所述的方法，其中所述内耳细胞损伤或死亡是由于声创伤、疾病或感染、头部创伤或衰老所致。
E302.一种通过向患有耳鸣或有发展耳鸣的风险的受试者施用有效量的本发明的AAV1载体或本发明的组合物来治疗所述受试者的方法。
E303.一种通过向有需要的灵长类动物受试者施用有效量的本发明的AAV1载体或本发明的组合物来增加所述受试者的内耳细胞存活的方法。
E304.如E1-E303中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体局部施用于所述受试者的中耳或内耳。
E305.如E304所述的方法，其中所述AAV1载体经鼓膜或鼓膜内施用。
E306.如E304所述的方法，其中将所述AAV1载体施用到外淋巴中。
E307.如E304所述的方法，其中将所述AAV1载体施用到内淋巴中。
E308.如E304所述的方法，其中将所述AAV1载体施用至卵圆窗或通过卵圆窗施用。
E309.如E304所述的方法，其中将所述AAV1载体施用至圆窗或通过圆窗施用。
E310.如E304所述的方法，其中将所述AAV1载体施用至内淋巴囊。
E311.如E304所述的方法，其中将所述AAV1载体施用至半规管或通过半规管施用。
E312.如E1-E311中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含来自血清型2腺相关病毒(AAV2)载体的反向末端重复序列(ITR)。
E313.如E1-E312中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含野生型AAV1衣壳(例如，其中所述AAV1载体含有具有SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的衣壳蛋白)。
E314.如E1-E313中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体具有约1x109个载体基因组(VG)/mL至1x1015个VG/mL(例如，1x109个VG/mL、2x109个VG/mL、3x109个VG/mL、4x109个VG/mL、5x109个VG/mL、6x109个VG/mL、7x109个VG/mL、8x109个VG/mL、9x109个VG/mL、1x1010个VG/mL、2x1010个VG/mL、3x1010个VG/mL、4x1010个VG/mL、5x1010个VG/mL、6x1010个VG/mL、7x1010个VG/mL、8x1010个VG/mL、9x1010个VG/mL、1x1011个VG/mL、2x1011个VG/mL、3x1011个VG/mL、4x1011个VG/mL、5x1011个VG/mL、6x1011个VG/mL、7x1011个VG/mL、8x1011个VG/mL、9x1011个VG/mL、1x1012个VG/mL、2x1012个VG/mL、3x1012个VG/mL、4x1012个VG/mL、5x1012个VG/mL、6x1012个VG/mL、7x1012个VG/mL、8x1012个VG/mL、9x1012个VG/mL、1x1013个VG/mL、2x1013个VG/mL、3x1013个VG/mL、4x1013个VG/mL、5x1013个VG/mL、6x1013个VG/mL、7x1013个VG/mL、8x1013个VG/mL、9x1013个VG/mL、1x1014个VG/mL、2x1014个VG/mL、3x1014个VG/mL、4x1014个VG/mL、5x1014个VG/mL、6x1014个VG/mL、7x1014个VG/mL、8x1014个VG/mL、9x1014个VG/mL或1x1015个VG/mL)的滴度并且以1μL至200μL(例如，1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μL)的体积施用。
E315.如E1-E314所述的方法，其中所述AAV1载体以1x107个VG/耳朵至2x1014个VG/耳朵(例如，1x107个VG/耳朵、2x107个VG/耳朵、3x107个VG/耳朵、4x107个VG/耳朵、5x107个VG/耳朵、6x107个VG/耳朵、7x107个VG/耳朵、8x107个VG/耳朵、9x107个VG/耳朵、1x108个VG/耳朵、2x108个VG/耳朵、3x108个VG/耳朵、4x108个VG/耳朵、5x108个VG/耳朵、6x108个VG/耳朵、7x108个VG/耳朵、8x108个VG/耳朵、9x108个VG/耳朵、1x109个VG/耳朵、2x109个VG/耳朵、3x109个VG/耳朵、4x109个VG/耳朵、5x109个VG/耳朵、6x109个VG/耳朵、7x109个VG/耳朵、8x109个VG/耳朵、9x109个VG/耳朵、1x1010个VG/耳朵、2x1010个VG/耳朵、3x1010个VG/耳朵、4x1010个VG/耳朵、5x1010个VG/耳朵、6x1010个VG/耳朵、7x1010个VG/耳朵、8x1010个VG/耳朵、9x1010个VG/耳朵、1x1011个VG/耳朵、2x1011个VG/耳朵、3x1011个VG/耳朵、4x1011个VG/耳朵、5x1011个VG/耳朵、6x1011个VG/耳朵、7x1011个VG/耳朵、8x1011个VG/耳朵、9x1011个VG/耳朵、1x1012个VG/耳朵、2x1012个VG/耳朵、3x1012个VG/耳朵、4x1012个VG/耳朵、5x1012个VG/耳朵、6x1012个VG/耳朵、7x1012个VG/耳朵、8x1012个VG/耳朵、9x1012个VG/耳朵、1x1013个VG/耳朵、2x1013个VG/耳朵、3x1013个VG/耳朵、4x1013个VG/耳朵、5x1013个VG/耳朵、6x1013个VG/耳朵、7x1013个VG/耳朵、8x1013个VG/耳朵、9x1013个VG/耳朵、1x1014个VG/耳朵或2x1014个VG/耳朵)的剂量施用。
E316.如E1-E315中任一项所述的方法，其中所述灵长类动物是人。
E317.如E1-E316中任一项所述的方法，其中所述受试者是成人。
E318.如E1-E316中任一项所述的方法，其中所述受试者是青少年。
E319.如E1-E316中任一项所述的方法，其中所述受试者是儿童。
E320.如E1-E316中任一项所述的方法，其中所述受试者是婴儿或足月新生儿。
E321.如E55-E57和E134-E138中任一项所述的方法，其中所述毛细胞是耳蜗毛细胞。
E322.如E321所述的方法，其中所述耳蜗毛细胞是IHC。
E323.如E321所述的方法，其中所述耳蜗毛细胞是OHC。
E324.如E55-E57和E134-E138中任一项所述的方法，其中所述毛细胞是前庭毛细胞。
E325.如E48-E51和E120-E130中任一项所述的方法，其中所述支持细胞是前庭支持细胞。
E326.如E48-E51和E120-E130中任一项所述的方法，其中所述支持细胞是耳蜗支持细胞(例如，Hensen氏细胞、Deiter氏细胞、柱细胞、内指状细胞和/或边缘细胞)。
E327.如E1-E326中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在施用所述AAV1载体或组合物之前评估所述受试者的听力(例如，使用标准测试评估听力，所述标准测试诸如听力测验法(audiometry)、听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)、耳蜗电图描记法(electrochocleography，ECOG)或耳声发射)。
E328.如E1-E327中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在施用所述AAV1载体或组合物之后评估所述受试者的听力(例如，使用标准测试评估听力，所述标准测试诸如听力测验法、ABR、ECOG或耳声发射)。
E329.如E1-E328中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在施用所述AAV1载体或组合物之前评估所述受试者的前庭功能(例如，使用标准测试评估前庭功能，所述标准测试诸如眼震电图(electronystagmogram，ENG)或视频眼震图(videonystagmogram，VNG)、姿势描记术(posturography)、转椅测试(rotary-chair testing)、ECOG、前庭诱发的肌源性电位(vestibular evoked myogenic potential，VEMP)或专科临床平衡测试(specializedclinical balance test))。
E330.如E1-E329中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在施用AAV1载体或组合物之后评估所述受试者的前庭功能(例如，使用标准测试评估前庭功能，所述标准测试诸如ENG或VNG、姿势描记术、转椅测试、ECOG、VEMP或专科临床平衡测试)。
E331.如E1-E330中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体或组合物以足以预防或减轻听力损失、预防或减轻前庭功能障碍、预防或减轻耳鸣、延迟听力损失的发展、延迟前庭功能障碍的发展、减缓听力损失的进展、减缓前庭功能障碍的进展、改善听力、改善前庭功能(例如，改善平衡或减轻头晕或眩晕)、促进或诱导内耳细胞再生(例如，耳蜗毛细胞、前庭毛细胞或螺旋神经节神经元的再生)、增加毛细胞数(例如IHC、OHC和/或前庭毛细胞数量)、增加SGN数量、增加支持细胞数量(例如，耳蜗和/或前庭支持细胞，例如增加支持细胞的增殖)、增加支持细胞分化为毛细胞(例如引起耳蜗支持细胞分化为IHC和/或OHC，和/或引起前庭支持细胞分化为前庭毛细胞)、预防或减少内耳细胞损伤或死亡(例如，IHC、OHC、SGN、耳蜗支持细胞、前庭支持细胞和/或前庭毛细胞损伤或死亡)、促进或增加内耳细胞发育、促进或增加内耳细胞存活(例如，增加受损内耳细胞的存活，促进受损内耳细胞的修复，或保留有内耳细胞的损伤或退化或损失的风险的受试者中的内耳细胞)、改善内耳细胞功能、保留带状突触、促进或增加带状突触形成、维持毛细胞与神经元(例如SGN和/或前庭神经节神经元)之间的连接(例如突触连接)或增加或恢复毛细胞与神经元(例如SGN和/或前庭神经节神经元)之间的连接(例如，突触连接)。
E332.如E1-E331中任一项所述的方法，其中所述受试者患有听力损失(例如，感觉神经性听力损失、耳聋或听神经病)或有发展听力损失的风险。
E333.如E1-E332中任一项所述的方法，其中所述受试者患有前庭功能障碍(例如头晕、眩晕或失衡)或有发展前庭功能障碍的风险。
E334.如E1-E333中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已被诊断为患有前庭功能障碍(例如，头晕、眩晕或失衡)。
E335.如E1-E334中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已被诊断为患有听力损失(例如，感觉神经性听力损失、耳聋或听神经病)。
E336.如E234-E236、E238、E247、E254、E264、E270、E288-E291和E331-E335中任一项所述的方法，其中所述听力损失是遗传性听力损失。
E337.如E336所述的方法，其中所述遗传性听力损失是常染色体显性听力损失、常染色体隐性听力损失或X连锁性听力损失。
E338.如E234-E236、E238、E247、E254、E264、E270、E288-E291和E331-E335中任一项所述的方法，其中所述听力损失是获得性听力损失。
E339.如E338所述的方法，其中所述获得性听力损失是噪声引起的听力损失、年龄相关的听力损失、疾病或感染相关的听力损失、头部创伤相关的听力损失或耳毒性药物引起的听力损失。
E340.如E339所述的方法，其中所述获得性听力损失是年龄相关性听力损失。
E341.如E339所述的方法，其中所述听力损失是噪声引起的听力损失。
E342.如E339所述的方法，其中所述听力损失是耳毒性药物引起的听力损失。
E343.一种AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自表5中的启动子列表的启动子的多核苷酸。
E344.如E343所述的AAV1载体，其中所述启动子是GFAP启动子。
E345.如E343所述的AAV1载体，其中所述启动子是SYN启动子。
E346.如E343所述的AAV1载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：SLC26A5启动子，OCM启动子、STRC启动子、MYO15启动子、OTOF启动子、SLC17A8启动子、FGF8启动子、JAG1启动子、NOTCH1启动子、MYO7A启动子、GLAST启动子、POU4F3启动子、GFI1启动子、KCNQ1启动子、KCNJ10启动子、TYR启动子、SOX2启动子、CALB2启动子、BHLHE22启动子、LGR5启动子、HES1启动子、HES5启动子、SOX9启动子、ATP2B2启动子、CD44启动子、FGFR3启动子、FRZB启动子、SLC26A4启动子、CEACAM16启动子、CLDN11启动子、PMP22启动子、KCNE1启动子、POU3F4启动子、GJB2启动子和TUBB3启动子。
E347.如E346所述的AAV1载体，其中所述启动子是SLC26A5启动子。
E348.如E346所述的AAV1载体，其中所述启动子是OCM启动子。
E349.如E346所述的AAV1载体，其中所述启动子是OTOF启动子。
E350.如E346所述的AAV1载体，其中所述启动子是MYO15启动子。
E351.如E346所述的AAV1载体，其中所述启动子是ATP2B2启动子。
E352.如E346所述的AAV1载体，其中所述启动子是GJB2启动子。
E353.如E346所述的AAV1载体，其中所述启动子是TYR启动子。
E354.如E343-E353中任一项所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸选自表2中列出的多核苷酸。
E355.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Otof。
E356.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Strc。
E357.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Atoh1。
E358.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E359.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Slc17a8。
E360.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tmc1。
E361.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E362.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E363.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Sox4。
E364.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Sox11。
E365.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Ush1c。
E366.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Myo7a。
E367.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Clrn1。
E368.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Chrna9。
E369.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Chrna10。
E370.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tmtc4。
E371.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Ocm。
E372.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tyr。
E373.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tead2。
E374.如E354所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Yap1。
E375.一种AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自表2中列出的多核苷酸的多核苷酸的启动子。
E376.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Otof。
E377.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Strc。
E378.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Atoh1。
E379.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Gjb2。
E380.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Slc17a8。
E381.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tmc1。
E382.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Ntf3。
E383.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Bdnf。
E384.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Sox4。
E385.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Sox11。
E386.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Ush1c。
E387.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Myo7a。
E388.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Clrn1。
E389.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Chrna9。
E390.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Chrna10。
E391.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tmtc4。
E392.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Ocm。
E393.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tyr。
E394.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Tead2。
E395.如E375所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸编码Yap1。
E396.如E375-E395中任一项所述的AAV1载体，其中所述启动子选自表5中的启动子列表。
E397.如E396所述的AAV1载体，其中所述启动子是GFAP启动子。
E398.如E396所述的AAV1载体，其中所述启动子是SYN启动子。
E399.如E396所述的AAV1载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：SLC26A5启动子，OCM启动子、STRC启动子、MYO15启动子、OTOF启动子、SLC17A8启动子、FGF8启动子、JAG1启动子、NOTCH1启动子、MYO7A启动子、GLAST启动子、POU4F3启动子、GFI1启动子、KCNQ1启动子、KCNJ10启动子、TYR启动子、SOX2启动子、CALB2启动子、BHLHE22启动子、LGR5启动子、HES1启动子、HES5启动子、SOX9启动子、ATP2B2启动子、CD44启动子、FGFR3启动子、FRZB启动子、SLC26A4启动子、CEACAM16启动子、CLDN11启动子、PMP22启动子、KCNE1启动子、POU3F4启动子、GJB2启动子和TUBB3启动子。
E400.如E399所述的AAV1载体，其中所述启动子是SLC26A5启动子。
E401.如E399所述的AAV1载体，其中所述启动子是OCM启动子。
E402.如E399所述的AAV1载体，其中所述启动子是OTOF启动子。
E403.如E399所述的AAV1载体，其中所述启动子是MYO15启动子。
E404.如E399所述的AAV1载体，其中所述启动子是ATP2B2启动子。
E405.如E399所述的AAV1载体，其中所述启动子是GJB2启动子。
E406.如E399所述的AAV1载体，其中所述启动子是TYR启动子。
E407.如E343-E406中任一项所述的AAV1载体，其中所述AAV1载体包含AAV2 ITR。
E408.如E343-E407中任一项所述的AAV1载体，其中所述AAV1载体包含野生型AAV1衣壳(例如，其中所述AAV1载体含有具有SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的衣壳蛋白)。
E409.一种药物组合物，所述药物组合物包含如E343-E408中任一项所述的AAV1载体。
E410.如E409所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
E411.如E409或E410所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于局部施用至内耳或中耳。
E412.一种药盒，所述药盒含有如E343-E408中任一项所述的AAV1载体或如E409-E411中任一项所述的药物组合物。
在以下描述、权利要求书和附图中，本发明的这些和其它方面对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。
定义
如本文所用，术语“约”是指在所述值的上下10％以内的值。
如本文所用，“施用”是指通过任何有效途径向受试者提供或给予治疗剂(例如本文所述的AAV1载体)。示例性的施用途径在下文描述。
如本文所用，术语“腺相关病毒血清型1载体”和“AAV1载体”是指具有AAV1衣壳的腺相关病毒载体。术语“腺相关病毒血清型1载体”和“AAV1载体”在本文中可互换使用，并且不仅指具有野生型AAV1衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的AAV载体，而且指具有AAV1衣壳蛋白的AAV载体，所述AAV1衣壳蛋白具有灵长类动物内耳中的野生型AAV1的广泛嗜性的序列修饰。可用于本文所述的组合物和方法中的AAV1载体包括具有AAV1衣壳蛋白的那些载体，所述AAV1衣壳蛋白具有与野生型AAV1衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的氨基酸序列至少90％同一(例如与野生型AAV1衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一)的氨基酸序列；以及具有AAV1衣壳蛋白的那些载体，所述AAV1衣壳蛋白相对于野生型AAV1衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的氨基酸序列具有一个或多个保守氨基酸取代(例如，至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45或至多50个保守氨基酸取代)和/或一个或多个非保守氨基酸取代(例如，至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45或至多50个非保守氨基酸取代)。可用于本文所述的组合物和方法中的AAV1载体不含所有六个以下氨基酸取代：L129F、E418D、E531K、F584L、A598V和N642H。可用于本文所述的组合物和方法中的AAV1载体可在衣壳蛋白的一个或多个表面暴露的酪氨酸残基处具有突变，如Tyr252至Phe272(Y252F)、Tyr272至Phe272(Y272F)、Tyr444至Phe444(Y444F)、Tyr500至Phe500(Y500F)、Tyr700至Phe700(Y700F)、Tyr704至Phe704(Y704F)、Tyr730至Phe730(Y730F)以及Tyr 733至Phe733(Y733F)，其减少蛋白质体降解。本文所述的组合物和方法中使用的AAV1载体的衣壳蛋白可具有美国专利第6,759,237号中描述氨基酸序列，并且由其中描述的多核苷酸序列编码，所述专利以引用的方式并入本文。还可如美国专利第7,749,492号中所述对AAV1衣壳蛋白进行修饰，所述专利以引用的方式并入本文。可使用本文所述的方法来评估内耳中的嗜性。
如本文所用，术语“细胞类型”是指共享基于基因表达数据在统计学上可分离的表型的一组细胞。例如，常见细胞类型的细胞可共享相似的结构和/或功能特征，诸如相似的基因激活模式和抗原呈递特征谱。常见细胞类型的细胞可包括从常见组织(例如，上皮组织、神经组织、结缔组织或肌肉组织)分离的那些细胞和/或从常见器官、组织系统、血管或生物体的其它结构和/或区域分离的那些细胞。
如本文所用，术语“保守突变”、“保守取代”和“保守氨基酸取代”是指一个或多个氨基酸取代成表现出相似物理化学特性(诸如极性、静电荷和空间体积)的一个或多个不同的氨基酸。下表1中汇总了20种天然存在的氨基酸中的每一种的这些特性。
表1.天然存在的氨基酸的代表性物理化学特性
Figure BDA0003110881970000491
由此表应认识到，保守氨基酸家族包括(i)G、A、V、L和I；(ii)D和E；(iii)C、S和T；(iv)H、K和R；(v)N和Q；以及(vi)F、Y和W。因此，保守突变或取代是一个氨基酸取代成同一氨基酸家族的成员的一种突变或取代(例如，Ser取代成Thr或Lys取代成Arg)。
如本文所用，术语“发育的内耳细胞”是指已完成足月妊娠期间发生的发育过程的内耳细胞，足月妊娠被定义为灵长类动物(例如人)在37周或更晚(例如，37周、38周、39周、40周、41周、42周或更晚)分娩发动。成人、青少年、儿童、婴儿和足月新生儿的耳朵都含有发育的内耳细胞。发育的内耳细胞表达细胞特异性标记，并且可使用本文所述的AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)转导。
如本文所用，术语本文所述的组合物、载体构建体或病毒载体的“有效量”、“治疗有效量”和“足够量”是指当施用至受试者时足以实现有益或所需结果(包括临床结果)的量，并且因此，“有效量”或其同义词取决于其所应用的背景。例如，在治疗感觉神经性听力损失、耳鸣或前庭功能障碍的背景中，它是与不施用组合物、载体构建体或病毒载体的情况下获得的响应相比，足以实现治疗响应的组合物、载体构建体或病毒载体的量。在转导内耳细胞的情况下，它是足以转导一种或多种内耳细胞类型(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种内耳细胞类型)的组合物、载体构建体或病毒载体的量。将与这样的量相对应的本文所述的给定组合物的量将根据各种因素而变化，诸如给定的剂、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、所治疗的受试者(例如年龄、性别、体重)或宿主的身份等，但是仍然可由本领域普通技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。可调整剂量方案以提供最佳的治疗应答。
如本文所用，术语“增强子”是指能够提高转录效率而与增强子相对于转录起始位点的距离或定向无关的一种类型的调控元件。因此，可将增强子置于转录起始位点的上游或下游或与启动子相距相当远的距离。增强子也可在物理上和功能上与启动子重叠。包含启动子序列(例如，CMV启动子)的许多多核苷酸也含有增强子序列。
如本文所用，术语“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3′端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
如本文所用，术语“异源的”是指非天然存在的元件的组合。例如，异源转基因是指由与其可操作连接的启动子不天然表达的转基因。
如本文所用，术语“增加”和“减少”是指相对于参考分别产生更大或更少量的功能、表达或活性的调节。例如，在以本文所述的方法施用组合物之后，如本文所述的度量(例如，转基因表达)的标志物的量可相对于施用之前的标志物的量在受试者中增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。通常，在施用后，在施用已达到所述效果的时间，例如，在治疗方案开始之后至少一周、一个月、3个月或6个月测量所述度量。
如本文所用，术语“内耳细胞类型”是指在灵长类动物(例如人)受试者的内耳(例如耳蜗和/或前庭系统)中发现的细胞类型。内耳细胞类型包括内毛细胞、外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元(前庭神经节神经元)、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
如本文所用，“局部”或“局部施用”是指在身体的特定部位上旨在局部作用而不是全身作用的施用。局部施用的实例是表皮、吸入、关节内、鞘内、阴道内、玻璃体内、子宫内、病灶内施用、淋巴结施用、肿瘤内施用、施用至内耳(例如，如通过卵圆窗、圆窗或水平半规管施用到外淋巴或内淋巴中，例如鼓膜内或经鼓膜施用)和施用至受试者的粘膜，其中施用旨在产生局部而非全身作用。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指第一分子连结至第二分子，其中所述分子的排列使得第一分子影响第二分子的功能。两个分子可为或可不为单个邻接分子的一部分且可为或可不为相邻的。例如，如果启动子调节细胞中的目标可转录多核苷酸分子的转录，则所述启动子可操作地连接至可转录多核苷酸分子。另外，如果转录调控元件的两个部分连接在一起以使得一个部分的转录活化功能性不受另一部分的存在不利地影响，则所述两个部分彼此可操作地连接。两个转录调控元件可通过接头核酸(例如，插入非编码核酸)彼此可操作地连接，或者可在不存在插入核苷酸的情况下彼此可操作地连接。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物。通常，多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的天然存在于DNA或RNA中的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)构成。所述术语涵盖包含含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的骨架等的核苷或核苷类似物的分子，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且此类分子对于某些应用可以是优选的。当本申请涉及多核苷酸时，应理解，提供了DNA、RNA，并且在每种情况下都提供了单链和双链形式(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用，“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或生物化学表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的一连串字母)。除非另外指明，否则本文给出的多核苷酸序列以5'至3'方向给出。
如本文所用，术语“启动子”是指DNA上由RNA聚合酶结合的识别位点。聚合酶驱动与启动子可操作连接的转基因的转录。
相对于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列且引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。用于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术人员能力范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可使用序列比较计算机程序BLAST生成序列同一性百分比值。作为说明，给定核酸或氨基酸序列A对于、与或针对给定核酸或氨基酸序列B的序列同一性百分比(其可以替代地措词为给定核酸或氨基酸序列A具有对于、与或针对给定核酸或氨基酸序列B的某一序列同一性百分比)计算如下：
100×(分数X/Y)
其中X是通过序列比对程序(例如，BLAST)在所述程序的A和B的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y是B中核酸的总数。应当理解，在核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸序列B的长度的情况下，A对于B的序列同一性百分比将不等于B对于A的序列同一性百分比。
如本文所用，术语“药物组合物”是指含有任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体组合的治疗剂，待施用至受试者以便预防、治疗或控制影响或可能影响受试者的特定疾病或疾患的混合物。
如本文所用的术语“药学上可接受的”是指适于与受试者的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应和其它问题并发症并与合理效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“样品”是指从受试者中分离的样本(例如，血液、血液组分(例如，血清或血浆)、尿液、唾液、羊水、脑脊液、组织(例如，神经组织、胎盘组织或真皮组织)、胰液、绒毛膜和细胞(例如，内耳细胞或干细胞)。
如本文所用，术语“转录调控元件”是指至少部分地控制多核苷酸的转录的核酸。转录调控元件可包括启动子、增强子以及控制或帮助控制基因转录的其它核酸(例如，聚腺苷酸化信号)。转录调控元件的实例描述于，例如，Lorence,Recombinant GeneExpression:Reviews and Protocols(Humana Press,New York,NY,2012)。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指灵长类动物(例如，人)。根据本文描述的方法待治疗的受试者可以是已被诊断患有听力损失(例如，感觉神经性听力损失、听神经病或耳聋)、耳鸣或前庭功能障碍(例如，头晕、眩晕或失衡)的受试者，或有发展这些疾患的风险的受试者(例如，由于年龄、头部创伤、声创伤(例如，暴露于嘈杂的噪音)、疾病或感染、用耳毒性药物治疗、基因突变或听力损失、耳鸣或前庭功能障碍的家族史而有发展听力损失、耳鸣或前庭功能障碍的风险的受试者)。可通过本领域已知的任何方法或技术进行诊断。本领域技术人员将理解，待根据本公开治疗的受试者可能已经接受了标准测试，或可能由于存在一种或多种与疾病或疾患相关的风险因素而未经检查就被鉴定为有风险的受试者。
如本文所用，术语“转导(transduction和transduce)”是指将载体构建体或其部分引入细胞中的方法。其中载体构建体包含在病毒载体如AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)中，转导是指细胞的病毒感染以及随后载体构建体或其部分转移和整合到细胞基因组中。如本文所用，“转导内耳细胞类型”所需的AAV1载体的量被定义为转导至少20％的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞(例如，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的给定细胞类型的细胞，如20％-25％、20％-30％、20％-35％、20％-40％、20％-45％、20％-50％、20％-55％、20％-60％、20％-65％、20％-70％、20％-75％、20％-80％、20％-85％、20％-90％、20％-95％、20％-100％、25％-30％、25％-35％、25％-40％、25％-45％、25％-50％、25％-55％、25％-60％、25％-65％、25％-70％、25％-75％、25％-80％、25％-85％、25％-90％、25％-95％、25％-100％、30％-35％、30％-40％、30％-45％、30％-50％、30％-55％、30％-60％、30％-65％、30％-70％、30％-75％、30％-80％、30％-85％、30％-90％、30％-95％、30％-100％、35％-40％、35％-45％、35％-50％、35％-55％、35％-60％、35％-65％、35％-70％、35％-75％、35％-80％、35％-85％、35％-90％、35％-95％、35％-100％、40％-45％、40％-50％、40％-55％、40％-60％、40％-65％、40％-70％、40％-75％、40％-80％、40％-85％、40％-90％、40％-95％、40％-100％、45％-50％、45％-55％、45％-60％、45％-65％、45％-70％、45％-75％、45％-80％、45％-85％、45％-90％、45％-95％、45％-100％、50％-55％、50％-60％、50％-65％、50％-70％、50％-75％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、50％-100％、55％-60％、55％-65％、55％-70％、55％-75％、55％-80％、55％-85％、55％-90％、55％-95％、55％-100％、60％-65％、60％-70％、60％-75％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-70％、65％-75％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-75％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞)所需的量。
如本文所用，关于疾病或疾患的“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指用于获得有益或所需结果(例如临床结果)的方法。有益的或所需的结果可包括但不限于一种或多种症状或疾患的缓解或改善；疾病或疾患的程度减小；疾病、病症或疾患的状态稳定(即不恶化)；预防疾病或疾患的扩散；延迟或减缓疾病或疾患的进展；疾病或疾患的改善或缓和；以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。“改善”或“缓和”疾病或疾患意指与缺乏治疗下的程度或时间进程相比，所述疾病、病症或疾患的程度和/或不良临床表现减少和/或进展的时间进程被减缓或加长。“治疗”还可意指相比于如果不接受治疗的预期存活，延长存活。需要治疗的那些包括已患有疾患或病症的那些以及易于患上疾患或病症的那些或打算预防疾患或病症的那些。
附图说明
图1A-1B是在CMV启动子控制下用表达EGFP的AAV1载体处理的9-10周龄小鼠的内耳的一系列荧光图像。在CBA/CaJ小鼠(n＝6)中，单侧注射用于以0.1μL/min的流速向内耳后半规管施用1μL的AAV1-CMV-GFP(病毒滴度为2.94×1013个基因组拷贝/mL)。注射后两周，取出内耳，并进行基底膜的表面制备。示出一只代表性耳朵。在耳蜗的顶周、中周和底周中观察到EGFP表达(图1A；左上图：耳蜗的顶端；下图：耳蜗的中周；右上图：耳蜗的底周)。高倍图像显示EGFP在内毛细胞(IHC)、顶端区域中的外毛细胞(OHC)和螺旋缘细胞中表达(图1B)。
图2A-2B是用在CAG启动子控制下表达EGFP的AAV7m8载体处理的9-10周小鼠的内耳的一系列荧光图像。在9-10周龄CBA/CaJ小鼠(n＝8)中，进行单侧注射以按0.1μL/min的流速向内耳后半规管施用1μL的AAV7m8-CAG-EGFP(病毒滴度为9.4×1012个基因组拷贝/mL)。注射后两周，取出内耳，并进行基底膜的表面制备。示出一只代表性耳朵。在耳蜗的顶周、中周和底周中观察到EGFP表达(图2A)。高倍图像显示多种细胞类型(包括IHC、OHC以及贯穿整个耳蜗基底至顶端程度的螺旋神经节和螺旋缘的细胞)中的EGFP表达(图2B；左图：耳蜗的顶端；中间图：耳蜗的中周；右图：耳蜗的底周)。
图3A-3B是用在CMV启动子控制下表达GFP的AAV2载体处理的恒河猴的内耳的一系列荧光图像。单侧注射(n＝1只动物)和双侧注射(n＝2只动物)用于以15μL/min的流速将30μL的AAV2-CMV-GFP(病毒滴度为3.39×1012个基因组拷贝/mL)施用至内耳的圆窗。注射后四周，取出内耳并进行基底膜的表面制备。示出一只代表性耳朵。Myo7A的免疫组织化学用于鉴定毛细胞(图3A，右列中的图)，并且GFP表达用于监测AAV1感染性(图3A，左列中的图)。恒河猴内耳的AAV2-CMV-GFP转导导致跨整个耳蜗的基底-顶端轴的GFP表达(图3A；左上图：耳蜗顶端，左中图：耳蜗的中周；左下图：耳蜗的底周)。在IHC和螺旋缘内的一些细胞中观察到耳蜗GFP表达(图3A；左列的图)。沿着耳蜗的频率图在IHC中定量GFP表达，证明GFP在40％-80％的IHC中表达(图3B)。
图4A-4F是用在CAG启动子控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)的腺相关病毒血清型7m8(AAV7m8)载体处理的食蟹猴的内耳石蜡切片的一系列图像。双侧注射用于以15μL/min的流速将30μL的AAV7m8-CAG-EGFP(病毒滴度为9.4×1012个基因组拷贝/mL)施用至内耳的圆窗。注射后两周(n＝1只动物)或四周(n＝1只动物)，将内耳取出并包埋在石蜡中，以进行切片、固定、用抗GFP抗体免疫染色以及组织学分析。在一只动物中，在用AAV7m8-CAG-EGFP转导内耳后两周，在耳蜗的底周处观察到EGFP表达(图4A，上图：虚线方框表示耳蜗的底周)，如使用EGFP的免疫染色可视化。EGFP在螺旋韧带的IHC、OHC和纤维细胞中表达(图4B，图4A中虚线方框的放大图；左上方的插图：柯蒂氏器官的放大图)。在另一只动物中，注射后四周，跨耳蜗的基底-顶端轴观察到EGFP的表达(图4C，虚线方框表示耳蜗的底周并且在图4D中放大)。EGFP在螺旋韧带的IHC、OHC和纤维细胞中表达(图4D，柯蒂氏器官在图的左上角的插图中放大)。如图4E所示，在不存在第一抗GFP抗体的情况下，二抗没有对耳蜗染色(虚线方框表示耳蜗的底周)。在基底没有观察到染色(图4F，图4E中方框的放大；柯蒂氏器官在左上插图中放大)。
图5A-5E是用在CAG启动子控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)的AAV1载体处理的食蟹猴的内耳石蜡切片的一系列图像。双侧注射用于以15μL/min的流速将30μL的AAV1-CAG-GFP(病毒滴度为9.9×1012个基因组拷贝/mL)施用至内耳的圆窗。注射后四周，将内耳取出并包埋在石蜡中，以进行切片、固定、用抗GFP抗体免疫染色以及组织学分析。如图5A所示，在不存在抗GFP抗体的情况下仅用二抗染色不会对耳蜗染色，从而证实抗体的特异性。内耳的AAV1-CAG-GFP转导导致遍及内耳的整个耳蜗和球囊中的稳健GFP表达(图5B，左上方的大圆圈表示耳蜗的顶周，左侧的小椭圆形表示血管纹，并且右下角的小圆圈表示球囊)，如使用GFP的免疫染色可视化的。在耳蜗的顶周(图5C，来自图5B的左上方圆圈的放大)和球囊的所有层(图5E，来自图5B的右下方圆圈的放大)中检测到GFP的免疫染色。在螺旋状韧带以及血管纹边缘细胞和中间细胞中检测到稳健的GFP表达。在此部分中，血管纹的基底细胞未表现出GFP表达，但是在耳蜗的其它周中在基底细胞中可见GFP表达(图5D)。
图6A-6C是用在CMV启动子控制下表达GFP的AAV1载体处理的恒河猴的内耳的一系列荧光图像。单侧注射(n＝1只动物)和双侧注射(n＝2只动物)用于以15μL/min的流速将30μL的AAV1-CMV-GFP(病毒滴度为2.01×1013个基因组拷贝/mL)施用至内耳的圆窗。注射后四周，取出内耳并进行基底膜、椭圆囊和嵴的表面制备。示出代表性内耳之一。Myo7A的免疫组织化学用于可视化毛细胞，并且GFP表达用于监测AAV1感染性(图6A-6C)。恒河猴的内耳的AAV1-CMV-GFP转导导致跨耳蜗整个基底-顶端轴的GFP的强烈泛嗜表达(图6A)。在内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)和支持细胞以及非感觉螺旋韧带和螺旋缘中观察到耳蜗GFP表达(图6B，图6A的中周中的框状区域的放大)。前庭结构如椭圆囊和嵴在感觉和非感觉区域中也显示出明显的GFP表达(图6C)。
图7A-7F是用在CAG启动子控制下表达GFP的AAV1载体处理的食蟹猴的内耳石蜡切片的一系列图像。双侧注射用于以15μL/min的流速将30μL的AAV1-CAG-GFP(3.15×1010或3.15×1011个基因组拷贝/耳朵施用至内耳的圆窗。注射后四周，将内耳取出并包埋在石蜡中，以进行切片、固定、用抗GFP抗体免疫染色以及组织学分析。如图7A所示，抗GFP抗体对未注射AAV的耳朵的耳蜗未染色，从而证实了抗体的特异性。图7B示出内耳的AAV1-CAG-GFP(3.15×1010个基因组拷贝/耳朵)的转导产生在整个耳蜗中的稳健GFP表达，如使用GFP的免疫染色可视化的。在毛细胞、支持细胞、内沟细胞、外沟细胞和螺旋韧带的细胞中检测到GFP的免疫染色。如图7C所示，在这些细胞类型中，较高剂量的AAV-CAG-GFP(3.15×1011个基因组拷贝/耳朵)显示更强的GFP表达。图7D-7F示出分别与图7A-7C相同的图像，其中移除了核染色(即，这些图像仅显示GFP标记)。所有比例尺是100μm。
具体实施方式
本文描述了用于转导发育的灵长类动物(例如人)内耳细胞(例如耳蜗和/或前庭系统的细胞，如内毛细胞、外毛细胞、前庭毛细胞、耳蜗支持细胞和前庭支持细胞)的组合物和方法。本发明的特征在于使用血清型1腺相关病毒(AAV1)载体转导灵长类动物(例如人)受试者中发育的内耳细胞(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种不同类型的发育的内耳细胞)的方法。本发明的特征还在于使用AAV1载体在灵长类动物(例如人)受试者中的特定内耳细胞类型(例如外毛细胞、前庭毛细胞或前庭支持细胞)中表达多核苷酸的方法，以及含有启动子(例如，在一种或多种内耳细胞类型中诱导基因表达的启动子)和/或多核苷酸(例如，对应于编码治疗性蛋白质的基因，如在正常内耳细胞中表达的基因，或编码调控内耳细胞存活、再生、细胞命运和/或细胞增殖的蛋白质的基因的多核苷酸)的AAV1载体。本文所述的组合物和方法可用于在灵长类动物(例如人)内耳细胞的全部或子集中表达一种或多种多核苷酸，并且因此本文所述的组合物可施用于灵长类动物(例如人)受试者以治疗因内耳细胞的损伤、退化、损失和/或功能障碍引起的病症，如听力损失(例如，感觉神经性听力损失)、耳鸣或前庭功能障碍。
内耳细胞
内耳由许多专门的细胞组成。耳蜗和前庭系统均含有毛细胞，毛细胞是内耳的主要感觉细胞。耳蜗毛细胞由两种主要细胞类型组成：负责感测声音的内毛细胞(IHC)和被认为放大低音量声音的外毛细胞(OHC)。前庭毛细胞位于前庭细胞的半规管和耳石器官(例如，椭圆囊和球囊)中，并参与移动的感觉，这有助于平衡和空间定向的感测。螺旋神经节神经元使神经分布于耳蜗毛细胞并将轴突送入中枢神经系统中，而前庭神经节的神经元使神经分布于前庭毛细胞。称为支持细胞的非感觉细胞位于耳蜗和前庭系统的毛细胞之间，并且执行许多重要功能，如提供结构性支架以允许对毛细胞的机械刺激，从而维持内淋巴和外淋巴的离子组成并调控带状突触的突触形成。在耳蜗内，支持细胞可分为五种不同的类型：1)Hensen氏细胞，2)Deiter氏细胞，3)柱细胞；4)内指状细胞；以及5)边缘细胞，所有这些都具有不同的形态和基因表达模式。耳蜗毛细胞、耳蜗支持细胞和/或螺旋神经节神经元中表达的基因中的突变一直与听力损失(例如，感觉神经性听力损失)、听神经病、耳聋和耳鸣相关，因为具有这些细胞的损害、损伤、退化或损失(例如死亡)。类似地，前庭系统细胞(例如，前庭毛细胞、前庭支持细胞和/或前庭神经节神经元)中表达的基因中的突变以及前庭系统细胞的损害、损伤、退化或损失(例如，死亡)一直与前庭功能障碍(例如，眩晕、头晕和/或失衡)相关。基因疗法近来已成为治疗听力损失和前庭功能障碍的有吸引力的治疗方法；然而，鉴于可能需要针对大量细胞类型以解决听力损失和前庭功能障碍的各种原因，因此需要具有广泛嗜性的病毒载体来转导灵长类动物(例如，人)内耳的许多细胞类型。
本发明部分地基于以下发现：向成人非人灵长类动物的内耳施用含有可操作地连接至绿色荧光蛋白(GFP)的遍在启动子的AAV1载体产生内耳细胞的大多数或所有细胞类型中的泛嗜性转导和GFP强表达，与使用其它AAV血清型观察到的嗜性形成对比。不希望受理论束缚，人与非人灵长类动物之间的高度相似性表明，AAV1载体可用于转导大多数或所有发育的人内耳细胞(例如，人类成人、青少年、儿童或足月新生儿中的大多数或所有内耳细胞)。因此，本文所述的组合物和方法可用于在发育的灵长类动物(例如人)内耳的所有细胞中诱导多核苷酸的表达，或者它们可基于AAV1载体中所含的启动子用于在内耳的特定区域(例如，耳蜗或前庭系统)或细胞类型(例如，一种或多种内耳细胞类型，如内毛细胞、外毛细胞、前庭毛细胞、耳蜗支持细胞和/或前庭支持细胞)中诱导多核苷酸的表达。因此，本文所述的方法和组合物可施用于灵长类动物(例如人)受试者，以治疗由内耳的所有细胞类型中的遗传突变或损伤、退化、损失和/或功能障碍引起的病症，或治疗由一种或部分内耳细胞类型的遗传突变或损伤、退化、损失和/或功能障碍引起的病症。
在一些实施方案中，将AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)以足以转导3种或更多种(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20种或更多种)内耳细胞类型的量施用于灵长类动物(例如人)受试者的发育的内耳，所述内耳细胞类型选自包括以下的组：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元(前庭神经节神经元)、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。AAV1载体对内耳细胞的泛嗜性转导可用于在整个内耳中诱导多核苷酸的表达(例如，在其中多核苷酸可操作地连接至遍在启动子的AAV1载体中)。转导3种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)不同内耳细胞类型的能力对于其中期望在内耳的许多或大多数细胞类型中表达多核苷酸，例如以递送在所有内耳细胞类型中突变的基因的野生型型式或以产生大量在高浓度下产生治疗效果的分泌蛋白质的治疗方法是有益的。
在一些实施方案中，将AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)施用至灵长类动物(例如，人)受试者以在特定细胞类型(例如，支持细胞，如耳蜗和/或前庭支持细胞；OHC；前庭毛细胞；或螺旋神经节神经元)或区域(例如，耳蜗或前庭系统)中表达多核苷酸。可在AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)中包含细胞类型特异性启动子，以诱导一种或多种细胞类型中的基因表达。细胞类型特异性表达可用于模拟仅在一种或几种细胞类型中自然表达的多核苷酸的内源表达模式。这种方法是有益的，因为它可用于避免多核苷酸在它不正常表达的细胞中的异位表达。
外源多核苷酸在人细胞中的表达
多种基因，如肌球蛋白7A(MYO7A)、POU 4类同源盒3(POU4F3)、溶质运载蛋白家族17成员8(SLC17A8)、缝隙连接蛋白β2(GJB2)、密封蛋白14(CLDN14)、凝血因子C同源蛋白(Cochlin)(COCH)、原钙粘蛋白相关15(PCDH15)和跨膜1(TMC1)中的突变一直与感觉神经性听力损失和/或耳聋有关，并且这些突变中的一些(如MYO7A、POU4F3和COCH中的突变)也与前庭功能障碍相关。本文所述的组合物和方法可用于诱导或增加发育的人内耳细胞中由多核苷酸编码的蛋白质的表达(例如，对应于在健康内耳细胞中表达的基因的核酸，所述基因如听力损失和/或前庭功能障碍中涉及的基因的野生型形式，或参与内耳细胞发育、功能、细胞命运决定、再生、存活、增殖和/或维持的基因)。可将含有多核苷酸的AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)施用至人受试者(例如，施用至受试者的内耳)以诱导或增加一种或多种内耳细胞类型中由所述多核苷酸编码的蛋白质的表达。已经建立了广泛的方法将蛋白质递送至人细胞并用于在人细胞中稳定表达编码蛋白质的多核苷酸。
本文所述的AAV1载体可用于在一种或多种内耳细胞类型中表达多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的AAV1载体可用于在一种或多种细胞类型中表达两种或更多种(例如2、3、4种或更多种)多核苷酸。以下表2中提供内耳细胞类型和可在每种细胞类型中表达的多核苷酸的列表。表3中提供表2的多核苷酸的登录号。
表2：可在一种或多种内耳细胞类型中表达的多核苷酸
Figure BDA0003110881970000621
Figure BDA0003110881970000631
Figure BDA0003110881970000641
表3：表2中列出的多核苷酸的登录号
Figure BDA0003110881970000651
Figure BDA0003110881970000661
Figure BDA0003110881970000671
Figure BDA0003110881970000681
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Figure BDA0003110881970000721
Figure BDA0003110881970000731
表4：Atoh1变体的氨基酸序列
Figure BDA0003110881970000732
Figure BDA0003110881970000741
在一些实施方案中，多核苷酸是或编码基因编辑系统的组分。包含可操作地连接至细胞类型特异性启动子(例如，表5中列出的细胞类型特异性启动子)的基因编辑系统的组分的AAV1载体可用于细胞类型特异性基因编辑。例如，基因编辑系统的组分可用于在已知调控内耳细胞功能的基因，如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因中引入改变(例如，插入、缺失(例如，敲除)、易位、倒位、单点突变或其它突变)。示例性基因编辑系统包括锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子的样效应物的核酸酶(TALEN)以及成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统。基于ZFN、TALEN和CRISPR的方法描述于例如Gaj等人,Trends Biotechnol.31:397-405,2013中。
CRISPR是指一组(或包括一组)成簇规则间隔的短回文重复序列(的系统)。CRISPR系统是指源自CRISPR和Cas(一种CRISPR相关蛋白)或另一种核酸酶的系统，其可用于使本文所述的基因沉默或突变。CRISPR系统是在细菌和古细菌基因组中发现的天然系统。CRISPR基因座由交替的重复序列和间隔区序列组成。在天然存在的CRISPR系统中，间隔区通常是细菌外来的序列(例如，质粒或噬菌体序列)。CRISPR系统已进行修饰以用于真核生物中的基因编辑(例如改变、沉默和/或增强某些基因)。参见例如，Wiedenheft等人,Nature482:331,2012。例如，对系统的这种修饰包括将含有专门设计的CRISPR和一种或多种适当的Cas蛋白的质粒引入真核细胞中。CRISPR基因座被转录为RNA，并被Cas蛋白加工成小的RNA，所述RNA包含侧接间隔区的重复序列。取决于间隔区序列，RNA充当指导来引导Cas蛋白以使特定DNA/RNA序列沉默。参见例如，Horvath等人,Science 327:167,2010；Makarova等人,Biology Direct 1:7,2006；Pennisi,Science 341:833,2013。在一些实例中，CRISPR系统包括Cas9蛋白，一种在DNA的两条链上切割的核酸酶。参见，例如，上文。
在一些实施方案中，在本文描述使用的CRISPR系统中，例如，根据本文描述的一种或多种方法，CRISPR的间隔区源自靶基因序列，例如，源自已知调控内耳细胞功能的基因，如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因。
在一些实施方案中，多核苷酸包括用于基因编辑的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统中的向导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，多核苷酸包含或编码锌指核酸酶(ZFN)或编码ZFN的mRNA，所述锌指核酸酶靶向(例如裂解)已知调控内耳细胞功能的基因，如与感觉神经性听力损失或前庭功能障碍有关的基因的核酸序列(例如DNA序列)。在一些实施方案中，多核苷酸包含或编码TALEN或编码TALEN的mRNA，所述TALEN靶向(例如裂解)已知调控内耳细胞功能的基因，如与感觉神经性听力损失或前庭功能障碍有关的基因的核酸序列(例如DNA序列)。
例如，可在CRISPR系统中使用gRNA来工程化基因(例如，已知调控内耳细胞功能的基因，例如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因)的改变。在其它实例中，ZFN和/或TALEN可用于工程化基因(例如，已知调控内耳细胞功能的基因，例如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因)的改变。示例性改变包括插入、缺失(例如敲除)、易位、倒位、单点突变或其它突变。可例如在体外、离体或体内将改变引入细胞中的基因中。在一些实施方案中，所述改变降低(例如敲低或敲除)已知调控内耳细胞功能的基因的水平和/或活性，所述基因如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因，例如，所述改变是功能的负调控因子。在另一个实例中，所述改变纠正已知调控内耳细胞功能的基因中的缺陷(例如，引起缺陷的突变)，所述基因如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因。
在某些实施方案中，CRISPR系统用于编辑(例如，添加或删除碱基对)靶基因，例如，已知调控内耳细胞功能的基因，如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因。在其它实施方案中，CRISPR系统用于引入过早终止密码子，例如，从而降低靶基因的表达。在其它实施方案中，CRISPR系统用于以可逆方式关闭靶基因，例如类似于RNA干扰。在一些实施方案中，CRISPR系统用于将Cas引导至靶基因的启动子，所述靶基因例如是已知调控内耳细胞功能的基因，如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因，从而在空间上阻断RNA聚合酶。
在一些实施方案中，可使用例如在美国公布第20140068797号；Cong,Science339:819,2013；Tsai,Nature Biotechnol.,32:569,2014；和美国专利第8,871,445号；第8,865,406号；第8,795,965号；第8,771,945号；和第8,697,359号中描述的技术来产生CRISPR系统以编辑已知调控内耳细胞功能的基因，如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因。
在一些实施方案中，CRISPR干扰(CRISPRi)技术可用于特定基因的转录抑制，所述基因例如编码已知调控内耳细胞功能的基因的基因，如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因。在CRISPRi中，工程化的Cas9蛋白(例如，无核酸酶的dCas9或dCas9融合蛋白，例如，dCas9–KRAB或dCas9–SID4X融合蛋白)可与序列特异性向导RNA(sgRNA)配对。Cas9-gRNA复合物可阻断RNA聚合酶，从而干扰转录延伸。所述复合物还可通过干扰转录因子结合来阻断转录起始。CRISPRi方法是特异性的，具有最小的脱靶效应，并且是可复用的，例如可同时阻遏多于一种基因(例如，使用多种gRNA)。同样，CRISPRi方法允许可逆性基因阻遏。
在一些实施方案中，CRISPR介导的基因激活(CRISPRa)可用于例如本文所述的一种或多种基因的转录激活，所述基因例如已知调控内耳细胞功能的基因，如牵涉于感觉神经性听力损失或前庭功能障碍中的基因。在CRISPRa技术中，dCas9融合蛋白募集转录激活因子。例如，dCas9可用于募集多肽(例如，激活结构域)，如VP64或p65激活结构域(p65D)，并且与sgRNA(例如，单个sgRNA或多个sgRNA)一起使用，以激活一种或多种基因，例如一种或多种内源性基因。可通过使用多个sgRNA来募集多种激活因子-这样可提高激活效率。可使用多个激活结构域和单个或多个激活结构域。除了将dCas9工程化以募集激活因子外，还可对sgRNA进行工程化以募集激活因子。例如，可将RNA适体掺入sgRNA中以募集蛋白质(例如，激活结构域)，如VP64。在一些实例中，协同激活介体(SAM)系统可用于转录激活。在SAM中，将MS2适体添加到sgRNA。MS2募集融合至p65AD和热休克因子1(HSF1)的MS2外壳蛋白(MCP)。CRISPRi和CRISPRa技术在例如Dominguez等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.17:5,2016中进行了详细描述，所述文献以引用的方式并入本文。
编码目标蛋白质的多核苷酸
可用于在灵长类动物(例如人)细胞中实现治疗有效的细胞内目标蛋白质浓度的一种平台是通过编码目标蛋白质的核酸的稳定表达(例如，通过整合到灵长类动物(例如人)细胞的核或线粒体基因组中，或通过在灵长类动物(例如人)细胞的核中形成附加型串联体(concatemer))。所述核酸是编码相应蛋白质的一级氨基酸序列的多核苷酸。为了将外源基因引入灵长类(例如人)细胞中，可将基因掺入载体，如AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)中。为了引入内耳细胞，可将AAV1载体局部施用至灵长类动物(例如人)受试者的内耳。
灵长类动物(例如人)RNA聚合酶对编码目标蛋白质的多核苷酸的识别和结合对于基因表达很重要。因此，可在多核苷酸内包括对募集RNA聚合酶并促进转录复合物在转录起始位点的组装的转录因子表现出高亲和力的序列元件。此类序列元件包括，例如，启动子，其序列可被特异性转录起始因子和最终的RNA聚合酶识别并结合。启动子的实例已经描述于在线公布的Smith等人,Mol.Sys.Biol.,3:73中，其公开内容以引用的方式并入本文。在本文所述的方法和组合物中使用的启动子可以是遍在启动子(例如，以诱导或增加内耳所有细胞中多核苷酸的表达)或细胞类型特异性启动子(例如，以诱导或增加一种或多种内耳细胞类型中多核苷酸的表达)。遍在启动子包括CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、smCBA启动子(描述于Haire等人,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.47:3745-3753,2006中)、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。或者，源自病毒基因组的启动子也可用于在灵长类动物(例如人)细胞中稳定表达多核苷酸。可用于在灵长类动物(例如人)细胞中表达多核苷酸的功能性病毒启动子的实例包括腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
以下表5中提供可包含在本文所述的AAV1载体中以在一种或多种内耳细胞类型中表达编码目标蛋白质(例如表2中所列的多核苷酸)的核酸的细胞类型特异性启动子。
表5：内耳细胞类型特异性启动子
Figure BDA0003110881970000791
一旦将编码目标蛋白质的多核苷酸掺入灵长类动物(例如人)细胞中，就可通过本领域已知的方法诱导这种多核苷酸的转录。例如，可通过将灵长类动物(例如人)细胞暴露于外部化学试剂，诸如调节转录因子和/或RNA聚合酶与启动子的结合并因此调控基因表达的剂来诱导表达。化学试剂可用于促进RNA聚合酶和/或转录因子与启动子的结合，例如通过除去已结合启动子的阻遏蛋白。可替代地，化学试剂可以用于增强启动子对RNA聚合酶和/或转录因子的亲和力，使得在化学试剂的存在下，位于启动子下游的基因的转录速率增加。通过以上机制增强多核苷酸转录的化学试剂的实例包括四环素和强力霉素。这些试剂是可商购获得的(Life Technologies,Carlsbad,CA)，并且可根据建立的方案施用于灵长类动物(例如人)细胞以便促进基因表达。
可包括在本文所述的组合物和方法中使用的多核苷酸中的其它DNA序列元件包括增强子序列。增强子代表另一类调控元件，所述调控元件在含有多核苷酸的多核苷酸中诱导构象变化，以使得DNA采用三维定向，所述三维定向有利于转录起始位点处的转录因子和RNA聚合酶的结合。因此，用于在本文所述的组合物和方法中使用的多核苷酸包括编码目标蛋白质的那些，并且另外包括增强子序列。现在已知许多增强子序列，并且实例包括来自编码珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素的基因的增强子。本文所述的组合物和方法中使用的增强子还包括衍生自能够感染真核细胞的病毒的遗传物质的那些增强子。实例包括复制起点后侧(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。诱导真核基因转录的激活的另外增强子序列包括CMV增强子和RSV增强子。可将增强子剪接到包含编码目标蛋白质的多核苷酸的载体中，例如在该基因的5’或3’位置。在优选定向上，增强子位于启动子的5’侧，所述启动子又位于编码目标蛋白质的多核苷酸的5’。
本文所述的AAV1载体可包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。WPRE通过促进转录物的核输出和/或通过增加新生转录物的聚腺苷酸化效率而在转录水平上发挥作用，从而增加细胞中的总mRNA量。将WPRE添加至载体可导致体外和体内来自若干不同启动子的转基因表达的水平的显著改善。
在一些实施方案中，本文所述的AAV1载体包含报告基于序列，其可用于验证AAV1载体中所含的核酸例如在细胞和组织中(例如在耳蜗和/或前庭系统中，或在特定内耳细胞类型，如IHC、OHC、耳蜗支持细胞、前庭毛细胞和/或前庭支持细胞中)的表达。可在转基因中提供的报告基因序列包括编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(Cat)、荧光素酶以及本领域众所周知的其它物质的DNA序列。当与驱动其表达的调控元件(诸如本文所述的遍在或细胞类型特异性启动子)相关联时，报告基因序列提供通过常规手段可检测的信号，所述手段包括酶促、射线照相、比色、荧光或其它光谱测定、荧光激活细胞分选测定和免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。例如，在标志物序列是LacZ基因的情况下，通过针对β-半乳糖苷酶活性的测定检测携带信号的载体的存在。在转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶的情况下，可在光度计中通过颜色或光产生来目测携带信号的载体。
在一些实施方案中，本文所述的AAV1载体用于表达两种或更多种多核苷酸(例如，表2中列出的两种或更多种多核苷酸，例如，AAV1载体含义编码两种不同目标蛋白质的多核苷酸)。在一些实施方案中，使用双顺反子或多顺反子表达盒来表达两种或更多种多核苷酸。在一些实施方案中，多顺反子表达盒包含位于两种或更多种多核苷酸之间的内部核糖体进入位点(IRES)(例如，位于编码两种不同目标蛋白质的多核苷酸之间的IRES)。在一些实施方案中，多顺反子表达盒包含位于两种或更多种多核苷酸之间的口蹄疫病毒2A(FMDV2A)多核苷酸(例如，位于编码目标蛋白质的每种核酸之间的FMDV 2A多核苷酸)。
在一些实施方案中，本文所述的两种或更多种AAV1载体(例如2、3、4种或更多种AAV1载体)可用于表达单一多核苷酸(例如表2中列出的单一多核苷酸)，如具有3kb或更长(例如3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb或更长)的编码序列的多核苷酸。例如，两种或更多种AAV1载体可用于表达编码耳畸蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有大约6kb的编码序列。在其中两种或更多种AAV1载体用于表达单一多核苷酸的实施方案中，所述多核苷酸的编码序列分派在载体之间，以使得可在体内重构全长编码序列。在一些实施方案中，包括两种AAV1载体的双载体系统可用于表达单一多核苷酸(例如，表2中列出的单一多核苷酸)。多核苷酸(例如，具有3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb或更长的编码序列的多核苷酸)的编码序列的一部分可包含在每种AAV1载体中(例如，一种AAV1载体可包含编码序列的N末端部分，并且另一种AAV1载体可包含编码序列的C末端部分)。示例性双载体系统包括片段化双载体、重叠双载体、反式剪接双载体和双杂交载体。这些系统在McClements和MacLaren,Yale J Biol Med.90:611-623,2017中进行了描述，其公开内容以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的AAV1载体含义增强多核苷酸的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列元件包括，例如，5’和3’非翻译区、IRES和聚腺苷酸化信号位点，以便指导载体中携带的核酸的有效转录。适用于本文所述的组合物和方法的载体还可含有编码用于选择含有这种载体的细胞的标记物的多核苷酸。合适的标志物的实例包括编码对抗生素，诸如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔斯菌素的抗性的基因。
用于核酸递送的AAV1载体
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，对应于在健康内耳细胞中表达的基因的多核苷酸，如牵涉于听力损失和/或前庭功能障碍中的基因的野生型形式，或参与内耳细胞发育、功能、细胞命运决定、再生、存活、增殖和/或维持的基因)掺入AAV1载体和/或病毒体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)中以便有助于将它们引入细胞中。在一些实施方案中，可用于本文所述的组合物和方法中的AAV1载体含义具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-3的野生型AAV1衣壳蛋白，如下所示。
在一些实施方案中，野生型AAV1衣壳蛋白VP1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:1)
在一些实施方案中，野生型AAV1衣壳蛋白VP2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
TAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:2)
在一些实施方案中，野生型AAV1衣壳蛋白VP3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
MASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:3)
可用于本文所述的组合物和方法中的AAV1载体是重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含以下中的一者或多者：(1)本文所述的启动子(例如，遍在启动子或细胞类型特异性启动子)，(2)待表达的异源序列(例如，表2中列出的多核苷酸)，和(3)促进异源基因的整合和表达的病毒序列。病毒序列可包括AAV的将DNA复制和包装(例如，功能性ITR)到病毒体中所需(顺式)的那些序列。在典型应用中，异源转基因编码在健康内耳细胞中表达的蛋白质，所述蛋白质可促进内耳细胞发育、功能、细胞命运决定、再生、存活、增殖和/或维持，或在患有遗传性或遗传性听力损失、耳聋和/或前庭功能障碍(例如头晕、眩晕或失衡)的受试者中发生突变的毛细胞蛋白的野生型形式。此类AAV1载体还可含有标志物或报告基因。可用的AAV1载体具有一个或多个整体或部分缺失但仍保留功能性侧接ITR序列的AAV WT基因。本文所述的AAV1载体中包含的AAV ITR可具有适合特定应用的任何血清型(例如，ITR可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11 ITR)。为了用于本文所述的方法和组合物，ITR可以是AAV2 ITR。使用AAV载体的方法描述于，例如，Tal等人,J.Biomed.Sci.7:279(2000)以及Monahan和Samulski,Gene Delivery 7:24(2000)中，其中每一个涉及用于基因递送的AAV载体的公开内容以引用方式并入本文。
可将本文所述的启动子和多核苷酸掺入AAV1病毒体中，以有助于将启动子和/或多核苷酸引入到灵长类动物(例如人)内耳细胞中。AAV1的衣壳蛋白构成病毒体的外部非核酸部分并且由AAV1 cap基因编码。cap基因编码病毒体组装所需的三种病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3。AAV病毒体的构建已描述于，例如，US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US 5,869,305；US 6,057,152；和US 6,376,237；以及Rabinowitz等人,J.Virol.76:791(2002)和Bowles等人,J.Virol.77:423(2003)中，其中每一个涉及用于基因递送的AAV载体的公开内容以引用方式并入本文。用于本文所述的组合物和方法中的AAV1载体的衣壳蛋白可具有美国专利第6,759,237号中描述的氨基酸序列(并且由其中描述的多核苷酸序列编码，所述专利以引用的方式并入本文。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的AAV病毒体包括源自AAV血清型1的那些AAV病毒体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)。不同血清型的AAV载体和AAV蛋白的构建和使用描述于，例如，Chao等人,Mol.Ther.2:619(2000)；Davidson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3428(2000)；Xiao等人,J.Virol.72:2224(1998)；Halbert等人,J.Virol.74:1524(2000)；Halbert等人,J.Virol.75:6615(2001)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075(2001)中，其中每一个涉及用于基因递送的AAV载体的公开内容以引用方式并入本文。
还可与本文所述的组合物和方法结合使用的是假型化rAAV载体。假型化载体包括用源自AAV1的衣壳基因(例如野生型AAV1衣壳)假型化的给定血清型的AAV载体(例如AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV8)。涉及假型化rAAV病毒体的构建和使用的技术是本领域已知的并且描述于，例如，Duan等人,J.Virol.75:7662(2001)；Halbert等人,J.Virol.74:1524(2000)；Zolotukhin等人,Methods,28:158(2002)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075(2001)中。
药物组合物
可将本文所述的AAV1载体(例如，包含野生型AAV1衣壳的AAV1载体)掺入媒介物中，以施用于患者，如患有感觉神经性听力损失、耳聋、听神经病、耳鸣和/或前庭功能障碍的灵长类动物(例如人)患者。含有载体(如AAV1载体)的药物组合物可使用本领域已知的方法制备。例如，此类组合物可使用，例如，生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacology第22版,Allen,L.编(2013)；以引用方式并入本文)并且以所需形式，例如以冻干制剂或水溶液的形式来制备。
AAV1载体的混合物可在适当地与一种或多种赋形剂、载体或稀释剂混合的水中制备。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物以及在油中制备。在正常储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(描述于US 5,466,468中，其公开内容以引用方式并入本文)。在任一情况下，制剂可为无菌的且可为流体，达到存在容易可注射性的程度。制剂在制造和储存条件下可以是稳定的并且可在防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用的条件下保存。载体可以是含有以下各项的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油。可例如通过使用包衣诸如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需要的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等)来预防微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
例如，如果需要，可将包含本文所述的药物组合物的溶液适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就这一点而言，可使用的无菌水性介质将为本领域技术人员根据本公开内容所已知的。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中并且添加到1000ml皮下输液流体中或在建议的输注部位注射。根据所治疗受试者的疾患，将必要地出现一定的剂量变化。为了向内耳局部施用，可将组合物配制成包含合成外淋巴液。示例性合成外淋巴液包括20-200mM NaCl、1-5mM KCl、0.1-10mM CaCl2、1-10mM葡萄糖和2-50mM HEPE，具有介于约6与9之间的pH以及约300mOsm/kg的渗透度。负责施用的人在任何情况下将决定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于灵长类动物(例如人)施用，制剂可满足FDA生物制剂标准办公室(FDA Office of Biologics standard)要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
治疗方法
本文所述的AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)可通过多种途径施用于患有感觉神经性听力损失、听神经病、耳聋、耳鸣和/或前庭功能障碍的受试者，诸如局部施用至内耳或中耳(例如，例如，如通过卵圆窗、内淋巴囊、圆窗或半规管施用到外淋巴或内淋巴中，例如经鼓膜或鼓膜内施用)、静脉内、肠胃外、皮内、透皮、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、血管内、吸入、灌注、灌洗和口服施用。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于所施用的特定组合物、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的年龄、体重、性别、所治疗的疾病的严重程度、患者的饮食和患者的排泄率。组合物可施用一次或多于一次(例如，一年一次、一年两次、一年三次、两月一次或一月一次)。
可如本文所述进行治疗的受试者是患有感觉神经性听力损失、耳聋、听神经病、耳鸣和/或前庭功能障碍或有发展感觉神经性听力损失、耳聋、听神经病、耳鸣和/或前庭功能障碍的风险的受试者(例如，患有听力损失、前庭功能障碍或两者或有发展听力损失、前庭功能障碍或两者的风险的受试者)。本文所述的组合物和方法可用于治疗患有内耳细胞损伤(例如，耳蜗毛细胞、前庭毛细胞、耳蜗支持细胞、前庭支持细胞和/或螺旋神经节神经元，例如与声创伤、疾病或感染、头部创伤、耳毒性药物或衰老相关的损伤)或有发展内耳细胞损伤的风险的受试者，患有感觉神经性听力损失、耳聋、耳鸣或听神经病或有发展感觉神经性听力损失、耳聋、耳鸣或听神经病的风险的受试者，患有前庭功能障碍(例如，头晕、眩晕或失衡)或有发展前庭功能障碍的风险的受试者，患有耳鸣(例如，仅耳鸣，或与感觉神经性听力损失或前庭功能障碍相关的耳鸣)的受试者，具有与听力损失和/或前庭功能障碍相关的基因突变的受试者，或具有遗传性听力损失、耳聋、听神经病、耳鸣或前庭功能障碍家族史的受试者。在一些实施方案中，所述受试者患有与损伤，变性，功能障碍或内耳细胞(例如，耳蜗毛细胞、前庭毛细胞、耳蜗支持细胞、前庭支持细胞和/或螺旋神经节神经元)的损伤、退化、功能障碍或损失相关或由其引起的听力损失和/或前庭功能障碍。本文所述的方法可包括在用本文所述的组合物治疗或施用之前，针对已知与听力损失或前庭功能障碍相关的基因中的一种或多种突变筛选受试者的步骤。可使用本领域技术人员已知的标准方法(例如，基因测试)针对基因突变筛选受试者。本文所述的方法还可包括在用本文所述的组合物治疗或施用之前评估受试者的听力和/或前庭功能的步骤。可以使用标准测试评估听力，诸如听力测验法、听性脑干反应(ABR)、耳蜗电图描记法(ECOG)和耳声发射。可使用标准测试评估前庭功能，诸如眼动测试(例如，眼震电图(ENG)或视频眼震图(VNG))、姿势描记术、转椅测试、ECOG、前庭诱发的肌源性电位(VEMP)和专科临床平衡测试，诸如Mancini和Horak,Eur J Phys Rehabil Med,46:239(2010)中描述的那些。这些测试还可用于在用本文所述的组合物治疗或施用之后评估受试者的听力和/或前庭功能。本文所述的组合物和方法还可作为预防性治疗施用给有发展听力损失和/或前庭功能障碍风险的患者，例如，具有听力损失或前庭功能障碍家族史(例如，遗传性听力损失或前庭功能障碍)的患者、携带与听力损失或前庭功能障碍相关的基因突变但尚未表现出听力障碍或前庭功能障碍的患者，或暴露于获得性听力损失(例如，声创伤、疾病或感染、头部创伤、耳毒性药物或衰老)或前庭功能障碍(例如，疾病或感染、头部创伤、耳毒性药物或衰老)的风险因素的患者。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于治疗由自身免疫性内耳疾病、炎症(例如，内耳炎或前庭神经炎)或美尼尔氏病引起的听力损失或前庭功能障碍。
本文所述的组合物和方法可用于促进或诱导灵长类动物(例如人)受试者的内耳细胞再生(例如耳蜗毛细胞、前庭毛细胞或螺旋神经节神经元的再生)和/或增加灵长类动物(例如人)受试者中的毛细胞(例如IHC、OHC和/或前庭毛细胞)和/或SGN的数量。本文所述的组合物和方法还可用于增加支持细胞的数量(例如，耳蜗和/或前庭支持细胞，例如通过诱导或增加支持细胞增殖)，或诱导支持细胞分化为毛细胞(例如，以诱导耳蜗支持细胞分化为IHC和/或OHC，和/或诱导前庭支持细胞分化为前庭毛细胞)。可受益于促进或诱导内耳细胞再生、增加毛细胞、SGN和/或支持细胞(例如耳蜗和/或前庭支持细胞)的数量和/或诱导支持细胞(例如，耳蜗和/或前庭支持细胞)分化为毛细胞的组合物的受试者包括由于内耳细胞的损伤、退化、功能障碍或损失(例如，IHC、OHC、SGN、前庭毛细胞，或支持细胞(例如耳蜗和/或前庭支持细胞)，例如与创伤(例如，声创伤或头部创伤)、疾病或感染、耳毒性药物或衰老有关的内耳细胞的损伤、退化或损失)引起的听力损失或前庭功能障碍的受试者，以及内耳细胞异常(例如，与正常健康内耳细胞相比不能正常发挥作用的内耳细胞)或由于遗传突变或先天性异常导致内耳细胞数量减少的受试者。本文所述的组合物和方法还可用于促进或增加毛细胞存活(例如，增加损伤毛细胞的存活，促进损伤内耳细胞的修复，或在有内耳细胞的损伤、退化或损失(例如，由于年龄、暴露于嘈杂的噪音、疾病或感染、头部创伤或耳毒性药物引起的内耳细胞损失)风险的受试者中保存内耳细胞)。
本文所述的组合物和方法还可用于在用耳毒性药物治疗过或正在用或即将开始用耳毒性药物治疗的受试者中预防或减少耳毒性药物引起的内耳细胞损伤或死亡(例如，IHC、OHC、SGN、耳蜗支持细胞、前庭支持细胞和/或前庭毛细胞损伤或死亡)。耳毒性药物对内耳的细胞有毒，并且可以引起感觉神经性听力损失、前庭功能障碍(例如，眩晕、头晕或失衡)、耳鸣或这些症状的组合。已发现具有耳毒性的药物包括氨基糖苷抗生素(例如，庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、万古霉素和阿米卡星)、紫霉素、抗肿瘤药(例如，含铂化疗剂，诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂)、髓袢利尿剂(例如，依他尼酸和速尿灵)、水杨酸盐类(例如，阿司匹林，特别是在高剂量下)和奎宁。在一些实施方案中，本文所述的方法预防或减少与声创伤、疾病或感染、头部创伤或衰老有关的内耳细胞损伤或死亡(例如，IHC、OHC、SGN、耳蜗支持细胞、前庭支持细胞和/或前庭毛细胞损伤或死亡)。
本文所述的组合物和方法还可用于维持或改善内耳中的毛细胞与神经元之间的连接(例如，耳蜗毛细胞(IHC和/或OHC)与SGN或前庭毛细胞与前庭神经节神经元之间的突触连接)。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法保留带状突触或促进或增加带状突触形成。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法维持或增加内耳中的神经元(例如，SGN或前庭神经节神经元)对毛细胞(例如，耳蜗毛细胞(IHC和/或OHC)或前庭毛细胞)的神经支配。
治疗可包括以各种单位剂量施用包含本文所述的AAV1载体(例如，包含野生型AAV1衣壳的AAV1载体)的组合物。每个单位剂量通常将包含预定量的治疗性组合物。待施用的量以及具体施用途径和制剂在临床领域技术人员的技能范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，而是可包括在设定的时间段内连续输注。可使用注射泵进行给药以控制输注速率，以便使对内耳(例如，耳蜗)的损伤最小化。AAV1载体可具有例如约1x109个载体基因组(VG)/mL至约1x1015个VG/mL(例如，1x109个VG/mL、2x109个VG/mL、3x109个VG/mL、4x109个VG/mL、5x109个VG/mL、6x109个VG/mL、7x109个VG/mL、8x109个VG/mL、9x109个VG/mL、1x1010个VG/mL、2x1010个VG/mL、3x1010个VG/mL、4x1010个VG/mL、5x1010个VG/mL、6x1010个VG/mL、7x1010个VG/mL、8x1010个VG/mL、9x1010个VG/mL、1x1011个VG/mL、2x1011个VG/mL、3x1011个VG/mL、4x1011个VG/mL、5x1011个VG/mL、6x1011个VG/mL、7x1011个VG/mL、8x1011个VG/mL、9x1011个VG/mL、1x1012个VG/mL、2x1012个VG/mL、3x1012个VG/mL、4x1012个VG/mL、5x1012个VG/mL、6x1012个VG/mL、7x1012个VG/mL、8x1012个VG/mL、9x1012个VG/mL、1x1013个VG/mL、2x1013个VG/mL、3x1013个VG/mL、4x1013个VG/mL、5x1013个VG/mL、6x1013个VG/mL、7x1013个VG/mL、8x1013个VG/mL、9x1013个VG/mL、1x1014个VG/mL、2x1014个VG/mL、3x1014个VG/mL、4x1014个VG/mL、5x1014个VG/mL、6x1014个VG/mL、7x1014个VG/mL、8x1014个VG/mL、9x1014个VG/mL或1x1015个VG/mL)的滴度并且可以1μL至200μL(例如，1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μL)的体积施用。所述AAV1载体可以1x107个VG/耳朵至2x1014个VG/耳朵(例如，1x107个VG/耳朵、2x107个VG/耳朵、3x107个VG/耳朵、4x107个VG/耳朵、5x107个VG/耳朵、6x107个VG/耳朵、7x107个VG/耳朵、8x107个VG/耳朵、9x107个VG/耳朵、1x108个VG/耳朵、2x108个VG/耳朵、3x108个VG/耳朵、4x108个VG/耳朵、5x108个VG/耳朵、6x108个VG/耳朵、7x108个VG/耳朵、8x108个VG/耳朵、9x108个VG/耳朵、1x109个VG/耳朵、2x109个VG/耳朵、3x109个VG/耳朵、4x109个VG/耳朵、5x109个VG/耳朵、6x109个VG/耳朵、7x109个VG/耳朵、8x109个VG/耳朵、9x109个VG/耳朵、1x1010个VG/耳朵、2x1010个VG/耳朵、3x1010个VG/耳朵、4x1010个VG/耳朵、5x1010个VG/耳朵、6x1010个VG/耳朵、7x1010个VG/耳朵、8x1010个VG/耳朵、9x1010个VG/耳朵、1x1011个VG/耳朵、2x1011个VG/耳朵、3x1011个VG/耳朵、4x1011个VG/耳朵、5x1011个VG/耳朵、6x1011个VG/耳朵、7x1011个VG/耳朵、8x1011个VG/耳朵、9x1011个VG/耳朵、1x1012个VG/耳朵、2x1012个VG/耳朵、3x1012个VG/耳朵、4x1012个VG/耳朵、5x1012个VG/耳朵、6x1012个VG/耳朵、7x1012个VG/耳朵、8x1012个VG/耳朵、9x1012个VG/耳朵、1x1013个VG/耳朵、2x1013个VG/耳朵、3x1013个VG/耳朵、4x1013个VG/耳朵、5x1013个VG/耳朵、6x1013个VG/耳朵、7x1013个VG/耳朵、8x1013个VG/耳朵、9x1013个VG/耳朵、1x1014个VG/耳朵或2x1014个VG/耳朵)的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文所述的组合物以足以转导3种或更多种(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)发育的内耳细胞类型的量施用，所述内耳细胞类型选自包括以下的组：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元(前庭神经节神经元)、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。在一些实施方案中，以足以转导所有或发育程度最高的内耳细胞类型的量施用本文所述的组合物。
本文所述的组合物以足以实现以下的量施用：改善听力、改善前庭功能(例如，改善平衡或减轻头晕或眩晕)、减轻耳鸣、增加AAV1载体中所包含的多核苷酸的表达、增加由AAV1载体中所包含的多核苷酸编码的蛋白质的功能、促进或诱导内耳细胞再生(例如，耳蜗毛细胞、前庭毛细胞或螺旋神经节神经元的再生)、增加毛细胞数量(例如IHC、OHC和/或前庭毛细胞数量)、增加SGN数量、增加支持细胞数量(例如，耳蜗和/或前庭支持细胞，例如增加支持细胞的增殖)、增加支持细胞分化为毛细胞(例如引起耳蜗支持细胞分化为IHC和/或OHC，和/或引起前庭支持细胞分化为前庭毛细胞)、预防或减少内耳细胞损伤或死亡(例如，与声创伤、头部创伤、耳毒性药物、疾病或感染或衰老有关的IHC、OHC、SGN、耳蜗支持细胞、前庭支持细胞和/或前庭毛细胞损伤或死亡)、促进或增加内耳细胞发育、促进或增加内耳细胞存活(例如，增加受损内耳细胞的存活，促进受损内耳细胞的修复，或保留有内耳细胞的损伤或退化或损失(例如，由于年龄、暴露于嘈杂的噪声、疾病或感染、头部创伤或耳毒性药物引起的内耳细胞损失)的风险的受试者中的内耳细胞)、改善内耳细胞功能、保留带状突触、促进或增加带状突触形成、维持毛细胞与神经元(例如SGN和/或前庭神经节神经元)之间的连接(例如突触连接)或增加或恢复毛细胞与神经元(例如SGN和/或前庭神经节神经元)之间的连接(例如，突触连接)。听力可使用标准听力测试(例如，听力测验法、ABR、耳蜗电图描记法(ECOG)和耳声发射)进行评估，并且与治疗前获得的听力测量结果相比可改善5％或更多(例如，5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或更多)。前庭功能可使用平衡和眩晕的标准测试(例如，眼动测试(例如，ENG或VNG)、姿势描记术、转椅测试、ECOG、VEMP和专科临床平衡测试)进行评估，并且与治疗前获得的测量结果相比可改善5％或更多(例如，5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或更多)。在一些实施方案中，以足以改善受试者理解对话的能力的量施用组合物。本文所述的组合物也可以足以减慢或防止感觉神经性听力损失和/或前庭功能障碍的发展或进展的量施用(例如，在携带与听力损失或前庭功能障碍相关的基因突变，具有听力损失或前庭功能障碍的家族史(例如，遗传性听力损失或前庭功能障碍)，或已暴露于与听力损失或前庭功能障碍相关的风险因素(例如，耳毒性药物、头部创伤、疾病或感染或声创伤)，但不表现出听力障碍或前庭功能障碍(例如，眩晕、头晕或失衡)的受试者中，或在表现出轻度至中度听力损失或前庭功能障碍的受试者中)。由多核苷酸编码的蛋白质的表达可使用免疫组织化学、蛋白质印迹分析、定量实时PCR或本领域已知的用于检测蛋白质或mRNA的其它方法进行评估，并且与施用本文所述的组合物之前的表达相比，可增加5％或更多(例如，5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或更多)。内耳细胞数量、内耳细胞功能、毛细胞或SGN再生或由AAV1载体中包含的多核苷酸编码的蛋白质的功能可基于听力测试或前庭功能测试间接评估，并且与施用本文所述的组合物之前的内耳细胞数量、内耳细胞功能或、毛细胞或SGN再生，或由多核苷酸编码的蛋白质的功能相比，可增加5％或更多(例如5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或更多)。与在未治疗的受试者中通常观察到的内耳细胞损伤和死亡相比，内耳细胞损伤或死亡可减少5％或更多(例如，5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或更多)。这些效果可发生在，例如，施用本文所述的组合物之后的1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周或更长时间内。取决于用于治疗的施用剂量和途径，可在施用组合物之后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间对患者进行评估。根据评估结果，患者可能接受另外的治疗。
药盒
本文所述的组合物可以提供于用于治疗感觉神经性听力损失或前庭功能障碍的药盒中。组合物可包含AAV1载体，所述AAV1载体含有启动子和/或多核苷酸的核酸序列，并且可以单位剂型、任选地在药学上可接受的赋形剂(例如，盐水或人工淋巴)中以足以转导3种或更多种(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)发育的内耳细胞类型的量提供，所述内耳细胞类型选自包括以下的组：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元(前庭神经节神经元)、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。药盒还可以包括包装说明书，其指示药盒的用户(诸如医师)执行本文所述的方法。药盒可任选地包括注射器或用于施用组合物的其它装置。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供本文所述的组合物和方法可如何使用、制备和评价的描述，并且仅仅意图对本发明进行举例说明且不意图限制发明人所认定的发明范围。
下文的实施例说明与AAV2和AAV7m8血清型载体的嗜性相比，非人灵长类动物内耳中AAV1病毒载体的出乎意料的优异嗜性。与小鼠中的AAV1嗜性(其表现出内耳的几种细胞类型的有限转导)不同，AAV1介导的向非人灵长类动物内耳的转基因递送表现出多种细胞类型的广泛转导。这与血清型如AAV7m8形成对照，AAV7m8在小鼠中表现出多种内耳细胞类型的广泛转导，但在非人类灵长类动物的内耳中显示出更受限制的嗜性。
在下文描述的所有实施例中，AAV1载体含有具有SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的衣壳蛋白。
实施例1.将含有携带转基因的AAV1病毒载体的组合物体内施用至小鼠耳蜗
为了确定AAV1病毒载体在小鼠内耳内的转导功效，将含有在CMV启动子控制下携带EGFP转基因的AAV1载体的组合物(AAV1-CMV-EGFP)通过向内耳后半规管注射的方式单侧递送至9-10周龄CBA/CaJ小鼠(n＝6只小鼠)的内耳中。以0.1μL/min的注射速率进行病毒滴度为2.94×1013个基因组拷贝/mL的注射(1μL)。注射后两周，手术切除内耳并进行基底膜的表面制备。为了评估AAV-1介导的内耳转导，使用荧光显微术直接观察EGFP表达。在耳蜗的整个基底-顶端轴中观察到EGFP表达，但是沿着频率图的长度在细胞类型之间不同。(图1A；左上图：耳蜗的顶端；下图：耳蜗的中周；右上图：耳蜗的底周)。内毛细胞(IHC)跨耳蜗的基底-顶端轴表达EGFP，但外毛细胞(OHC)主要表现出在耳蜗的顶端区域表达GFP。在螺旋缘的一些细胞内也观察到EGFP表达(图1B)。
实施例2.将含有携带转基因的AAV7m8病毒载体的组合物体内施用至小鼠耳蜗
为了确定AAV7m8病毒载体在小鼠内耳内的转导功效，将含有在CAG启动子控制下携带EGFP转基因的AAV7m8载体的组合物(AAV7m8-CAG-EGFP)通过向内耳后半规管注射的方式单侧递送至9-10周龄CBA/CaJ小鼠(n＝8只小鼠)的内耳中。以0.1μL/min的注射速率进行病毒滴度为9.4×1012个基因组拷贝/mL的注射(1μL)。注射后两周，手术切除内耳并进行基底膜的表面制备。在整个耳蜗中观察到EGFP表达(图2A)。高倍图像显示多种细胞类型(包括IHC、OHC以及贯穿整个耳蜗基底至顶端程度的螺旋神经节和螺旋缘的细胞)中的EGFP表达(图2B；左图：耳蜗的顶端；中间图：耳蜗的中周；右图：耳蜗的底周)。
实施例3.将含有携带转基因的AAV2载体的组合物体内施用至成年非人灵长类动物的内耳
为了确定AAV2病毒载体在成年非人灵长类动物内耳中的转导功效，将含有在CMV启动子控制下携带GFP转基因的AAV2载体的组合物通过圆窗膜注射的方式单侧(n＝1只动物)和双侧(n＝2只动物)递送至恒河猴的内耳中。以15μL/min的注射速率进行病毒滴度为3.39×1012个基因组拷贝/mL的注射(30μL)。注射后四周，手术切除内耳并进行基底膜的表面制备。Myo7A的免疫标记用于鉴定内耳的毛细胞(图3A，右列中的图)，并且通过直接GFP荧光测量AAV2介导的内耳细胞转导(图3A，左列中的图)。跨耳蜗的基底-顶端轴观察到GFP表达，特别是在IHC和螺旋缘的一些细胞内(图3A，左列中的图)。为了确定AAV2-CMV-GFP载体在恒河猴内耳的IHC中的转导功效，沿耳蜗的频率图定量IHC中的GFP表达，从而证明40％-80％的细胞中的GFP表达(图3B)
实施例4.将含有携带转基因的AAV7m8载体的组合物体内施用至成年非人灵长类动物的内耳
为了确定AAV7m8病毒载体在成年非人灵长类动物内耳中的转导功效，将含有在CAG启动子控制下携带EGFP转基因的AAV7m8载体的组合物通过圆窗膜注射的方式双侧递送至食蟹猴的内耳中。以15μL/min的注射速率进行病毒滴度为9.4×1012个基因组拷贝/mL的注射(30μL)。注射后两周(n＝1只动物)或四周(n＝1只动物)，将内耳手术取出并包埋在石蜡中，以进行切片、固定并用抗GFP抗体免疫染色以用于组织学分析。在一只动物中，在用AAV7m8-CAG-EGFP转导内耳后两周，在耳蜗的底周处观察到EGFP表达(图4A，上图：虚线方框表示耳蜗的底周)。在螺旋韧带的IHC、OHC和纤维细胞中观察到EGFP(图4B，图4A中虚线方框的放大图；左上方的插图：柯蒂氏器官的放大图)。在另一只动物中，注射后四周，跨耳蜗的基底-顶端轴观察到EGFP的表达(图4C，虚线方框表示耳蜗的底周并且在图4D中放大)。EGFP在螺旋韧带的IHC、OHC和纤维细胞中表达(图4D，柯蒂氏器官在图的左上角的插图中放大)。作为阴性对照，在不存在抗GFP一抗的情况下用二抗免疫染色显示耳蜗内没有染色(图4E-F)。
实施例5.将含有携带转基因的AAV1病毒载体的组合物体内施用至成年非人灵长类动物的内耳
为了确定AAV1病毒载体在成年非人灵长类动物内耳中的转导功效，将含有在CAG启动子控制下携带GFP转基因的AAV1载体的组合物(AAV1-CAG-GFP)通过圆窗膜注射的方式双侧递送至食蟹猴的内耳中。以15μL/min的注射速率进行病毒滴度为9.9×1012个GC/mL的注射(30μL)。注射后四周，将内耳手术切除并包埋在石蜡中用于切片和组织学分析。为了评估AAV1介导的内耳转导，将石蜡切片用兔单克隆抗GFP抗体(Abcam EPR14104)进行免疫标记。在包括耳蜗(图5B和5C)和球囊(图5B和5E)的多个内耳结构中观察到GFP表达。在螺旋状韧带以及血管纹边缘细胞和中间细胞中检测到稳健的GFP表达。在图像中所示的切片中，血管纹的基底细胞未表现出GFP表达，但是在耳蜗的其它周中在基底细胞中可见GFP表达(图5D)。在不存在抗GFP抗体的情况下，仅用二抗染色用作阴性对照，以确认抗体的特异性(图5A)。
为了确定是否能够在其它灵长类动物物种中观察到在食蟹猴内耳中观察到的AAV1载体的广泛转导，使用在CMV启动子控制下携带GFP转基因的AAV1载体(AAV1-CMV-GFP)的注射在恒河猴中进行了另一组实验。通过内耳的圆窗单侧(n＝1只动物)和双侧(n＝2只动物)注射2.01×1013GC/mL的病毒滴度，以15μL/min的注射速率输送30μL的组合物。在注射后4周通过手术切除内耳以及进行基底膜、椭圆囊和嵴的表面制备来测定AAV1载体的嗜性。通过GFP荧光直接监测AAV1介导的GFP表达，并通过用针对Myo7a的抗体免疫标记来鉴定内耳的毛细胞。荧光成像揭示了在耳蜗的整个基底-顶端轴中的稳健GFP表达(图6A)，所述GFP表达在内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)层(图6B)中强烈地明显。在支持细胞和非感觉螺旋韧带和螺旋缘中也观察到GFP表达(图6B)。此外，内耳的前庭结构在椭圆囊和嵴的感觉细胞和非感觉细胞中显示强GFP表达(图6C)。
因此，如图5和图6所示，AAV1在非人类灵长类动物的内耳内表现出稳健的泛嗜性转导。可利用耳蜗和前庭的感觉和非感觉细胞中生物这种广泛嗜性来获得治疗益处。以下表6提供使用不同的AAV衣壳在非人灵长类动物内耳中观察到的嗜性的总结。
表6：非人灵长类动物内耳中不同衣壳的嗜性
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强＝强表达；中等＝中等表达；弱＝弱表达；少/无＝少或无表达
实施例6.使用低和高病毒滴度将含有携带转基因的AAV1病毒载体的组合物体内施用至成年非人灵长类动物的内耳
为了确定病毒滴度对AAV1病毒载体在成年非人灵长类动物内耳中的转导功效的影响，将含有在CAG启动子控制下携带GFP转基因的AAV1载体的组合物(AAV1-CAG-GFP)通过圆窗膜注射的方式双侧递送至食蟹猴的内耳中。以15μL/min的注射速率进行病毒滴度分别为1.05×1012个GC/mL(3.15×1010个GC/耳朵；“AAV1低”)或1.05×1013个GC/mL(3.15×1011个GC/耳朵；“AAV1高”)的注射(30μL)。注射后四周，将内耳手术切除并包埋在石蜡中用于切片和组织学分析。为了评估AAV1介导的内耳转导，将石蜡切片用兔单克隆抗GFP抗体(AbcamEPR14104)进行免疫标记。图7A-7C展示在未注射AAV的耳朵(图7A)、在AAV低注射的耳朵(图7B)和在AAV高注射的耳朵(图7C)中的GFP标记。图7D至图7F示出在无核染色(即仅GFP染色)情况下分别与图7A-7C相同的图像。抗GFP抗体未标记未注射AAV的耳朵的耳蜗，从而证实抗体的特异性(图7A和7D)。AAV1低注射的耳朵在多种细胞类型(包括毛细胞、支持细胞、内沟细胞、外沟细胞和螺旋韧带中的细胞)中显示了从耳蜗的基底至顶部的稳健GFP表达(图7B和7E)。增加病毒滴度在前述细胞类型中产生更强的GFP表达，以及在另外细胞和细胞类型中的GFP表达(图7C和7F)。因此，AAV1在非人类灵长类动物的内耳内表现出稳健的泛嗜性转导，所述转导可通过增加病毒滴度来增强。
实施例7.多核苷酸在人受试者的内耳的外毛细胞中的表达
根据本文公开的方法和组合物，本领域技术人员可向人受试者施用含有AAV1载体的组合物(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)以在OHC中诱导多核苷酸表达。为此，本领域技术人员可将含有AAV1载体的组合物局部施用至人受试者的内耳(例如，施用至内淋巴或外淋巴，如施用至圆窗、卵圆窗或水平半规管或通过圆窗、卵圆窗或水平半规管施用，或通过经鼓膜或鼓膜内注射)，所述AAV1载体含有与OHC特异性启动子(例如，SLC26A5启动子、OCM启动子、STRC启动子或ATP2B2启动子)可操作连接的多核苷酸(例如，编码Strc、Chrna9、Chrna10、Ocm、Tmc1、Myo7a或Ush1c的多核苷酸)。为了在OHC中诱导多核苷酸的表达，可以例如1x107个VG/耳朵至2x1014个VG/耳朵(例如，1x107个VG/耳朵、2x107个VG/耳朵、3x107个VG/耳朵、4x107个VG/耳朵、5x107个VG/耳朵、6x107个VG/耳朵、7x107个VG/耳朵、8x107个VG/耳朵、9x107个VG/耳朵、1x108个VG/耳朵、2x108个VG/耳朵、3x108个VG/耳朵、4x108个VG/耳朵、5x108个VG/耳朵、6x108个VG/耳朵、7x108个VG/耳朵、8x108个VG/耳朵、9x108个VG/耳朵、1x109个VG/耳朵、2x109个VG/耳朵、3x109个VG/耳朵、4x109个VG/耳朵、5x109个VG/耳朵、6x109个VG/耳朵、7x109个VG/耳朵、8x109个VG/耳朵、9x109个VG/耳朵、1x1010个VG/耳朵、2x1010个VG/耳朵、3x1010个VG/耳朵、4x1010个VG/耳朵、5x1010个VG/耳朵、6x1010个VG/耳朵、7x1010个VG/耳朵、8x1010个VG/耳朵、9x1010个VG/耳朵、1x1011个VG/耳朵、2x1011个VG/耳朵、3x1011个VG/耳朵、4x1011个VG/耳朵、5x1011个VG/耳朵、6x1011个VG/耳朵、7x1011个VG/耳朵、8x1011个VG/耳朵、9x1011个VG/耳朵、1x1012个VG/耳朵、2x1012个VG/耳朵、3x1012个VG/耳朵、4x1012个VG/耳朵、5x1012个VG/耳朵、6x1012个VG/耳朵、7x1012个VG/耳朵、8x1012个VG/耳朵、9x1012个VG/耳朵、1x1013个VG/耳朵、2x1013个VG/耳朵、3x1013个VG/耳朵、4x1013个VG/耳朵、5x1013个VG/耳朵、6x1013个VG/耳朵、7x1013个VG/耳朵、8x1013个VG/耳朵、9x1013个VG/耳朵、1x1014个VG/耳朵或2x1014个VG/耳朵)的剂量施用AAV1载体。
在将组合物施用至人受试者后，本领域的熟练从业人员可通过多种方法监测基因表达和/或由多核苷酸编码的蛋白质的表达，以及响应于疗法的患者的改善。例如，在施用组合物之后，医师可通过执行标准测试(诸如听力测验法、ABR、耳蜗电图描记法(ECOG)和耳声发射的畸变产物(DPOAE))来间接评估基因表达和/或蛋白质产生并监测患者的听力。可将治疗后收集的听力测量值与治疗前获得的测量值进行比较。与施用组合物之前的听力测试结果相比，发现在施用组合物之后患者在一种或多种测试中表现出听力的改善(例如，如通过DPOAE测量值指示的改善的OHC功能)，这表明患者对治疗有良好的响应。后续剂量可根据需要确定和施用。
实施例8.通过施用AAV1载体治疗人受试者的前庭功能障碍
根据本文公开的方法，本领域技术人员可治疗患有前庭功能障碍(例如，眩晕、头晕或失衡)的受试者，例如人患者，以改善或恢复前庭功能(例如，平衡、空间定向、翻正(righting)、步态和/或前庭眼动反射)。为此，本领域的医师可向人患者施用含有AAV1载体(例如，含有野生型AAV1衣壳的AAV1载体)的组合物，所述AAV1载体含有可操作地连接至前庭细胞类型特异性启动子(例如，椭圆囊支持细胞特异性启动子，如GFAP启动子、GLAST启动子、HES1启动子、JAG1启动子、NOTCH1启动子、LGR5启动子、SOX2启动子、HES5启动子或SOX9启动子；或前庭毛细胞特异性启动子，如MYOSIN 15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子或MYOSIN 7A启动子)的编码转基因的多核苷酸(例如，编码Atoh1、Gfi1、Sox11、Ntf3、Bdnf、Whirlin、Sox11、Tmtc4或Pou4f3的多核苷酸)。含有AAV载体的组合物可例如通过局部施用于内耳(例如内淋巴或外淋巴)而施用于患者，如通过施用至圆窗、卵圆窗或水平半规管或通过圆窗、卵圆窗或水平半规管施用，或通过施用至半规管，以治疗前庭功能障碍。为了治疗前庭功能障碍，可以例如1x107个VG/耳朵至2x1014个VG/耳朵(例如，1x107个VG/耳朵、2x107个VG/耳朵、3x107个VG/耳朵、4x107个VG/耳朵、5x107个VG/耳朵、6x107个VG/耳朵、7x107个VG/耳朵、8x107个VG/耳朵、9x107个VG/耳朵、1x108个VG/耳朵、2x108个VG/耳朵、3x108个VG/耳朵、4x108个VG/耳朵、5x108个VG/耳朵、6x108个VG/耳朵、7x108个VG/耳朵、8x108个VG/耳朵、9x108个VG/耳朵、1x109个VG/耳朵、2x109个VG/耳朵、3x109个VG/耳朵、4x109个VG/耳朵、5x109个VG/耳朵、6x109个VG/耳朵、7x109个VG/耳朵、8x109个VG/耳朵、9x109个VG/耳朵、1x1010个VG/耳朵、2x1010个VG/耳朵、3x1010个VG/耳朵、4x1010个VG/耳朵、5x1010个VG/耳朵、6x1010个VG/耳朵、7x1010个VG/耳朵、8x1010个VG/耳朵、9x1010个VG/耳朵、1x1011个VG/耳朵、2x1011个VG/耳朵、3x1011个VG/耳朵、4x1011个VG/耳朵、5x1011个VG/耳朵、6x1011个VG/耳朵、7x1011个VG/耳朵、8x1011个VG/耳朵、9x1011个VG/耳朵、1x1012个VG/耳朵、2x1012个VG/耳朵、3x1012个VG/耳朵、4x1012个VG/耳朵、5x1012个VG/耳朵、6x1012个VG/耳朵、7x1012个VG/耳朵、8x1012个VG/耳朵、9x1012个VG/耳朵、1x1013个VG/耳朵、2x1013个VG/耳朵、3x1013个VG/耳朵、4x1013个VG/耳朵、5x1013个VG/耳朵、6x1013个VG/耳朵、7x1013个VG/耳朵、8x1013个VG/耳朵、9x1013个VG/耳朵、1x1014个VG/耳朵或2x1014个VG/耳朵)的剂量施用AAV1载体。
在将组合物施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者响应于治疗的改善。例如，医师可通过执行标准测试(如眼震电图、视频眼震图、旋转测试、前庭诱发的肌源性电位或计算机动态姿势图)来监测患者的前庭功能。与施用组合物之前的测试结果相比，发现在施用组合物之后患者在一种或多种测试中表现出改善的平衡、步态、姿势和/或前庭眼动反射，这表明患者对治疗有良好的响应。后续剂量可根据需要确定和施用。
其它实施方案
在不偏离本发明的范围和精神的情况下，所述发明的各种修改和更改对于本领域技术人员而言将是明显的。尽管已结合具体实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解所要求保护的本发明不应当不适当地限定于此类具体实施方案。实际上，对于本领域技术人员来说清楚的用于实施本发明所描述的方式的各种修改旨在本发明的范围内。其它实施方案在权利要求中。
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Claims (97)

1.一种在人受试者中转导发育的内耳细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的转导三种或更多种选自由以下组成的组的内耳细胞类型的量的血清型1腺相关病毒(AAV1)载体：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述AAV1载体转导五种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述AAV1载体转导十种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述AAV1载体转导十五种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述AAV1载体转导二十种或更多种选自由以下组成的组的细胞类型：外毛细胞、前庭毛细胞、前庭暗细胞、前庭纤维细胞、Scarpa神经节神经元、前庭毛细血管的内皮细胞、前庭支持细胞、边缘细胞、内指状细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排Deiter细胞、第二排Deiter细胞、第三排Deiter氏细胞、Hensen氏细胞、Claudius细胞、螺旋凸细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹基底细胞、血管纹中间细胞、血管纹边缘细胞、螺旋神经节神经元、耳蜗毛细血管的内皮细胞、纤维细胞、赖斯纳氏膜的细胞和胶质细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体转导至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的给定细胞类型或所有内耳细胞类型的细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体局部施用于所述受试者的中耳或内耳。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述AAV1载体经鼓膜或鼓膜内施用。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含选自表5中的启动子列表的启动子。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含遍在启动子。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含选自表2中的列表的多核苷酸。
12.一种在人受试者的支持细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：GFAP启动子、GLAST启动子、HES1启动子、JAG1启动子、NOTCH1启动子、LGR5启动子、SOX2启动子、HES5启动子和SOX9启动子。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述多核苷酸编码Sox9、Spalt样转录因子2(Sall2)、钙调蛋白结合转录激活因子1(Camta1)、具有YRPW基序2的Hes相关家族BHLH转录因子(Hey2)、Gata结合蛋白质2(Gata2)、具有YRPW基序1的Hes相关家族BHLH转录因子(Hey1)、神经酰胺合酶2(Lass2)、SRY-盒10(Sox10)、GATA结合蛋白3(Gata3)、切割样同源盒1(Cux1)、核受体亚家族2F组成员(Nr2f1)、Hes家族BHLH转录因子1(Hes1)、RAR相关孤儿受体B(Rorb)、Jun原癌基因AP-1转录因子亚基(Jun)、锌指蛋白667(Zfp667)、LIM同源盒3(Lhx3)、Nescient螺旋-环-螺旋1(Nhlh1)、MAX二聚化蛋白4(Mxd4)、含锌指MIZ类型1(Zmiz1)、髓磷脂转录因子1(Myt1)、信号转导子和转录激活因子3(Stat3)、BarH样同源盒1(Barhl1)、胸腺细胞选择相关的高迁移率组盒(Tox)、Prospero同源盒1(Prox1)、核因子IA(Nfia)、甲状腺激素受体β(Thrb)、MYCL原癌基因BHLH转录因子(Mycl1)、赖氨酸脱甲基酶5A(Kdm5a)、CAMP响应元件结合蛋白3样4(Creb3I4)、ETS变体1(Etv1)、亲本表达3(Peg3)、BTB结构域和CNC同源物2(Bach2)、ISL LIM同源盒(Isl1)、含锌指和BTB结构域的38(Zbtb38)、肢芽和心脏发育(Lbh)、Tubby二分转录因子(Tub)、泛素C(Hmg20)、RE1沉默转录因子(Rest)、锌指蛋白827(Zfp827)、AF4/FMR2家族成员3(Aff3)、PBX/有节的1同源盒2(Pknox2)、富含AT的相互作用结构域3B(Arid3b)、MLX相互作用蛋白(Mlxip)、锌指蛋白(Zfp532)、IKAROS家族锌指2(Ikzf2)、Spalt样转录因子1(Sall1)、SIX同源盒2(Six2)、Spalt样转录因子3(Sall3)、Lin-28同源物B(Lin28b)、Pou4f3、调控因子X7(Rfx7)、Atoh1、在氨基酸328、331和/或334处包含突变的Atoh1变体、Gfi1、Sox4、Bdnf、Ntf3、Sox11、Tead2、Yap1或核酸酶，或者为微小RNA。
14.一种在人受试者的内耳的毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7A启动子。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、含跨膜和三十四肽重复序列的4(Tmtc4)或核酸酶，或者为微小RNA。
16.一种在人受试者的外毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：SLC26A5启动子、OCM启动子、STRC启动子和ATP2B2启动子。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述多核苷酸编码Strc、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、ISL LIM同源盒1(Isl1)、Clrn1、原钙粘蛋白相关15(Pcdh15)、原钙粘蛋白相关23(Cdh23)、Chrna9、Chrna10、Ocm、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
18.一种在人受试者的耳蜗毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7A启动子。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述多核苷酸编码Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、耳畸蛋白(Otof)、溶质运载蛋白家族17成员8(Vglut3)、Strc、Chrna9、Chrna10、Ocm、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Whirlin、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
20.一种在人受试者的内毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：OTOF启动子、成纤维细胞生长因子8(FGF8)启动子和溶质运载蛋白家族17成员8(SLC17A8)启动子。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸编码Otof、Vglut3、Whirlin、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、Myo7a、Tmc1、Ush1c、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
22.一种在人受试者的前庭毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子、MYO7A启动子、ATP2B2启动子和CALB2启动子。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸编码Whirlin、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
24.一种在人受试者的柱细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至CD44启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述多核苷酸编码神经生长因子受体(Ngfr)、Bdnf、Ntf3、Tectorinβ(Tectb)、Tectorinα(Tecta)、Gjb2或缝隙连接蛋白β6(Gjb6)。
26.一种在人受试者的螺旋神经节神经元中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：BHLHE22启动子、SYN启动子和CALB2启动子。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3或核酸酶，或者为微小RNA或针对RGMA的shRNA。
28.一种在人受试者的血管纹边缘细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：KCNQ1启动子、KCNE1启动子和GJB2启动子。
29.一种在人受试者的血管纹基底细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至CLDN11启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
30.一种在人受试者的血管纹中间细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：KCNJ10启动子、GJB2启动子和TYR启动子。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1、Tyr、Gjb2、Gjb6或核酸酶，或者为微小RNA。
32.一种在人受试者的边缘细胞和/或内指状细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至GLAST启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、跨膜蛋白16A(Tmem16a)、Gjb2或Gjb6。
34.一种在人受试者的Dieter氏细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至FGFR3启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、IKAROS家族锌指2(Ikzf2)、Gjb2或Gjb6。
36.一种在人受试者的Hensen氏细胞和/或Claudius细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至FRZB启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2或Gjb6。
38.一种在人受试者的螺旋凸细胞细胞和/或根细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至SLC26A4启动子的多核苷酸。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述多核苷酸是Slc26a4。
40.一种在人受试者的齿间细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至CEACAM16启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述多核苷酸编码Ceacam16、耳锚蛋白(Otoa)、Gjb2或Gjb6。
42.一种在人受试者的胶质细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至PMP22启动子的多核苷酸。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述多核苷酸编码Pmp22、Bdnf、Ntf3或髓鞘蛋白零(Mpz)。
44.一种在人受试者的前庭暗细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至KCNE1启动子的多核苷酸。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1或Slc26a4。
46.一种在人受试者的纤维细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至POU3F4启动子或GJB2启动子的多核苷酸。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述多核苷酸编码Gjb2、Gjb6或胶原蛋白。
48.一种在人受试者的Scarpa神经节神经元中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自由以下组成的组的启动子的多核苷酸：TUBB3启动子和SYN启动子。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述多核苷酸编码Bdnf或Ntf3，或者为针对排斥性导向分子BMP共受体A(RGMA)的shRNA。
50.一种在人受试者的支持细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Sox9、Sall2、Camta1、Hey2、Gata2、Hey1,Lass2、Sox10、Gata3、Cux1、Nr2f1、Hes1、Rorb、Jun、Zfp667、Lhx3、Nhlh1、Mxd4、Zmiz1、Myt1、Stat3、Barhl1、Tox、Prox1、Nfia、Thrb、Mycl1、Kdm5a、Creb3I4、Etv1、Peg3、Bach2、Isl1、Zbtb38、Lbh、Tub、Hmg20、Rest、Zfp827、Aff3、Pknox2、Arid3b、Mlxip、Zfp532、Ikzf2、Sall1、Six2、Sall3、Lin28b、Pou4f3、Rfx7、Atoh1、在氨基酸328、331和/或334处包含突变的Atoh1变体、Gfi1、Sox4、Bdnf、Ntf3、Sox11、Tead2、Yap1或核酸酶，或者为微小RNA。
51.如权利要求50中任一项所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：GFAP启动子、GLAST启动子、HES1启动子、JAG1启动子、NOTCH1启动子、LGR5启动子、SOX2启动子、HES5启动子和SOX9启动子。
52.一种在人受试者的内耳的毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7A启动子。
54.一种在人受试者的外毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Strc、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、Chrna9、Chrna10、Ocm、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：SLC26A5启动子、OCM启动子、STRC启动子和ATP2B2启动子。
56.一种在人受试者的耳蜗毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh15、Cdh23、Otof、Vglut3、Strc、Chrna9、Chrna10、Ocm、Tmc1、Myo7a、Ush1c、Whirlin、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子和MYO7a启动子。
58.一种在人受试者的内毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Otof、Vglut3、Whirlin、Atoh1、Pou4f3、Gfi1、Isl1、Clrn1、Pcdh14、Cdh23、Myo7a、Ush1c、Tmc1、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：OTOF启动子、FGF8启动子和SLC17A8启动子。
60.一种在人受试者的前庭毛细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Whirlin、Bdnf、Ntf3、Tmtc4或核酸酶，或者为微小RNA。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：MYO15启动子、GFI1启动子、POU4F3启动子、MYO7A启动子、ATP2B2启动子和CALB2启动子。
62.一种在人受试者的柱细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Ngfr、Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、Gjb2或Gjb6。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述启动子是CD44启动子或GJB2启动子。
64.一种在人受试者的螺旋神经节神经元中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf、Ntf3或核酸酶的多核苷酸或连接至微小RNA或针对RGMA的shRNA的启动子。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：BHLHE22启动子、SYN启动子和CALB2启动子。
66.一种在人受试者的血管纹中的细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1、Gjb2、Gjb6、Tyr或核酸酶，或者为微小RNA。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述细胞是血管纹边缘细胞，并且所述启动子选自由以下组成的组：KCNQ1启动子、GJB2启动子或KCNE1启动子。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述细胞是血管纹基底细胞，并且所述启动子是CLDN11启动子或GJB2启动子。
69.如权利要求66所述的方法，其中所述细胞是血管纹中间细胞，并且所述启动子选自由以下组成的组：KCNJ10启动子、GJB2启动子和TYR启动子。
70.一种在人受试者的边缘细胞和/或内指状细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、Tmem16a、Gjb2或Gjb6。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述启动子是GLAST启动子或GJB2启动子。
72.一种在人受试者的Dieter氏细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Bdnf、Ntf3、Tectb、Tecta、Ikzf2、Gjb2或Gjb6。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述启动子是FGFR3启动子或GJB2启动子。
74.一种在人受试者的Hensen氏细胞和/或Claudius细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Gjb2或Gjb6的多核苷酸的启动子。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述启动子是FRZB启动子或GJB2启动子。
76.一种在人受试者的螺旋凸细胞和/或根细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Slc26a4的多核苷酸的启动子。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述启动子是SLC26A4启动子。
78.一种在人受试者的齿间细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Ceacam16、Otoa、Gjb2或Gjb6。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述启动子是CEACAM16启动子或GJB2启动子。
80.一种在人受试者的胶质细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Pmp22、Bdnf、Ntf3或Mpz。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述启动子是PMP22启动子。
82.一种在人受试者的前庭暗细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Kcnq1、Kcne1或Slc26a4。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述启动子是KCNE1启动子。
84.一种在人受试者的纤维细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码Gjb2、Gjb6或胶原蛋白。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述启动子是POU3F4启动子或GJB2启动子。
86.一种在人受试者的Scarpa神经节神经元中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至编码Bdnf或Ntf3的多核苷酸或连接至针对RGMA的shRNA的启动子。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述启动子选自由TUBB3启动子和SYN启动子组成的组。
88.如权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含野生型AAV1衣壳。
89.如权利要求1-88中任一项所述的方法，其中所述AAV1载体包含AAV2反向末端重复序列(ITR)。
90.一种AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自表5中的启动子列表的启动子的多核苷酸。
91.如权利要求90所述的AAV1载体，其中所述多核苷酸选自表2中列出的多核苷酸。
92.一种AAV1载体，所述AAV1载体包含可操作地连接至选自表2中列出的多核苷酸的多核苷酸的启动子。
93.如权利要求92所述的AAV1载体，其中所述启动子选自表5中的启动子列表。
94.如权利要求90-93中任一项所述的AAV1载体，其中所述AAV1载体包含AAV2 ITR。
95.如权利要求90-94中任一项所述的AAV1载体，其中所述AAV1载体包含野生型AAV1衣壳。
96.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求88-93中任一项所述的AAV1载体和药学上可接受的赋形剂。
97.如任一权利要求96所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于局部施用至内耳或中耳。
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