KR20210113160A - Aav1 벡터 및 귀 적응증의 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

Aav1 벡터 및 귀 적응증의 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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KR20210113160A
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조셉 번스
캐스린 엘리스
매튜 응우옌
아담 팔레르모
가브리엘라 프레거닉
푸신 시
조나단 휘트턴
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데시벨 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 여러 내이 세포 유형을 형질도입하는데 사용될 수 있는 AAV1 벡터 및 청력 상실, 난청, 이명 및 전정 기능장애의 치료에 대한 이의 용도를 제공한다.

Description

AAV1 벡터 및 귀 적응증의 치료를 위한 이의 용도
서열 목록
본 발명은 ASCII 포맷으로 전자 형식으로 제출되고, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된 서열 목록을 포함한다. 2019년 10월 11일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 51124-054WO3_서열_Listing_10.11.2019_ST25이고, 크기는 38,358 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 다수의 내이 세포(inner ear cell) 유형을 형질도입하는데 사용될 수 있는 AAV1 벡터 및 청력 상실(hearing loss), 이명(tinnitus) 및 전정 기능장애(vestibular dysfunction)의 치료를 위한 이의 용도를 제공한다.
유전자 요법은 이러한 장애의 유전적 요인을 치료하고 치료적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있고, 달팽이관 이식(vestibular implant)보다 더 자연스러운 소리 인식으로 청력을 보존하거나 복원할 수 있으므로, 최근 청력 상실 및 전정 기능장애와 같은 내이의 장애를 치료하기 위한 유망한 접근법으로 등장하였다. 그러나, 청력 상실 및/또는 전정 기능장애를 유발하는 돌연변이가 내이의 여러 세포 유형에서 확인되었으며, 설치류 모델에서의 전임상 연구에서는 내이의 대부분 또는 모든 세포 유형을 형질도입하는데 사용될 수 있는 단일 바이러스 벡터를 아직 확인하지 못하였다. 또한, 인간 치료를 더 예측할 수 있는 더 큰 동물 모델에서의 최소한의 연구가 수행되었다. 따라서, 임상적으로 관련된 동물에서 내이 세포의 범친화성(pantropic) 형질도입을 나타내는 바이러스 벡터가 필요하다.
본 개시내용은 AAV1 혈청형(예를 들어, AAV1 캡시드)을 갖는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터가 놀랍게도 비인간 영장류의 내이에서 범친화성이라는 본 발명자들의 발견에 기초한다. AAV1 벡터는 마우스의 내이에서의 AAV1 향성과 비교하여 그리고 또한 비인간 영장류에서의 다른 AAV 혈청형(예를 들어, AAV2 및 AAV7m8)의 향성과 비교하여, 비인간 영장류의 여러 세포 유형에서 강력한 발현 및 예기치 않게 우수한 향성(tropism)을 나타내었다. 따라서, 본 발명은 AAV1 벡터를 사용하여 영장류(예를 들어, 인간) 내이의 세포 유형을 형질도입하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터는 하나 이상의 영장류(예를 들어, 인간)의 내이 세포에서 내이 세포 기능, 재생, 유지, 발달, 증식 또는 생존을 촉진 또는 개선하는 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드의 발현을 촉진시키기 위해 영장류(예를 들어, 인간) 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 청력 상실(예를 들어, 감각신경성(sensorineural) 청력 상실) 및/또는 전정 기능장애(예를 들어, 어지러움(vertigo), 현기증(dizziness) 또는 불균형(imbalance))를 치료 또는 예방하기 위해 영장류(예를 들어, 인간) 환자에 투여될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시형태가 아래에 열거된 단락에 기재된다.
E1. 영장류 대상체에서 발달된 내이 세포를 형질도입하는 방법으로서, 방법은 외유모 세포(outer hair cell), 전정 유모 세포(vestibular hair cell), 전정 흑색 세포(vestibular dark cell), 전정 섬유세포(vestibular fibrocyte), 스카르파 신경절 뉴런(Scarpa's ganglion neuron), 전정 모세혈관(vestibular capillary)의 내피세포(endothelial cell), 전정 지지 세포(vestibular supporting cell), 경계 세포(Border cell), 내지상 세포(inner phalangeal cell), 내주 세포(inner pillar cell), 외주 세포(outer pillar cell), 제1 열 다이테르스 세포(Deiters' cell), 제2열 다이테르스 세포(second row Deiters' cell), 제3열 다이테르스 세포(third row Deiters' cell), 헨센 세포(Hensen's cell), 클라우디우스 세포(Claudius cell), 나선융기 세포(spiral prominence cell), 근부 세포(root cell), 치간 세포(interdental cell), 혈관조(stria vascularis)의 기저세포(basal cell), 혈관조의 중간세포(intermediate cell), 혈관조의 변연세포(marginal cell), 나선 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron), 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막(Reissner's membrane)의 세포 및 아교세포(glial cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상)의 내이 세포 유형을 형질도입하는 양으로 유효량의 혈청형 1 아데노-관련 바이러스(AAV1) 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E2. E1에 있어서, AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 내이 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
E3. E2에 있어서, AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
E4. E3에 있어서, AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 10개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
E5. E4에 있어서, AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 15개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
E6. E5에 있어서, AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 20개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
E7. E1 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 형질도입하는, 방법.
E8. E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 모든 세포를 형질도입하는, 방법.
E9. E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, 형질도입은 달팽이관(예를 들어, 달팽이관의 기저부-정상 축(basal-to-apical axis))의 길이 전체에 걸쳐 발생하는, 방법.
E10. E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 달팽이관의 기저부-정상 축의 길이에 걸쳐 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%)를 형질도입하는, 방법.
E11. E1 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 달팽이관의 기저부(base)에서 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%)를 형질도입하는, 방법.
E12. E1 내지 E11 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 달팽이관의 중간부(middle)에서 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%)를 형질도입하는, 방법.
E13. E1 내지 E12 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 달팽이관의 첨단부(apex)에서 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%)를 형질도입하는, 방법.
E14. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 표 5의 프로모터 리스트로부터 선택되는 프로모터 를 포함하는, 방법.
E15. E14에 있어서, 프로모터는 아교섬유성 산성 단백질(Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP) 프로모터인, 방법.
E16. E14에 있어서, 프로모터는 시냅신(Synapsin: SYN) 프로모터인, 방법.
E17. E14에 있어서, 프로모터는 재그드 1(JAG1) 프로모터, 노치 1(NOTCH1 프로모터), 미오신 7A(MYO7A) 프로모터, 용질 운반체 패밀리 1 멤버 3(GLAST) 프로모터 및 POU 클래스 4 호메오박스 3(POU4F3) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E18. E14에 있어서, AAV1 벡터는 프레스틴(SLC26A5) 프로모터, 온코모듈린(OCM) 프로모터, 스테레오실린(STRC) 프로모터, 미오신 15(MYO15) 프로모터, 성장인자 독립적 1 전사 억제자(GFI1) 프로모터, 포타슘 전압-개폐성 채널 서브패밀리 Q 멤버 1(KCNQ1) 프로모터, 포타슘 전압-개폐성 채널 서브패밀리 J 멤버 10(KCNJ10) 프로모터, 타이로시네이스(TYR) 프로모터, SRY-박스 2(SOX2) 프로모터, 칼빈딘 2(CALB2) 프로모터, 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 패밀리 멤버 E22(BHLHE22) 프로모터, 류신 풍부 반복체 함유 G 단백질-텍토린 수용체 5(LGR5) 프로모터, Hes 패밀리 BHLH 전사 인자 1(HES1) 프로모터, Hes 패밀리 BHLH 전사 인자 5(HES5) 프로모터, SRY-박스 9(SOX9) 프로모터, ATPase 원형질막 Ca2+ 수송 2(ATP2B2) 프로모터, CD44 분자(CD44) 프로모터, 섬유아세포 성장인자 수용체 3(FGFR3) 프로모터, 프리즐드 관련 단백질(FRZB) 프로모터, 용질 운반체 패밀리 26 멤버 4(SLC26A4) 프로모터, 암배아 항원 관련 세포 부착 분자 16(CEACAM16) 프로모터, 클라우딘 11(CLDN11) 프로모터, 말초 마이엘린 단백질 22(PMP22) 프로모터, 포타슘 전압-개폐성 채널 서브패밀리 E 조절 서브유닛 1(KCNE1) 프로모터, POU 클래스 3 호메오박스 4(POU3F4) 프로모터, 간극결합 단백질 베타 2(GJB2) 프로모터 및 튜불린 베타 3 클래스 III(TUBB3) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 방법.
E19. E18에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터인, 방법.
E20. E18에 있어서, 프로모터는 OCM 프로모터인, 방법.
E21. E18에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E22. E18에 있어서, 프로모터는 ATP2B2 프로모터인, 방법.
E23. E18에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E24. E18에 있어서, 프로모터는 TYR 프로모터인, 방법.
E25. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터인, 방법.
E26. E25에 있어서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터인, 방법.
E27. E25에 있어서, 프로모터는 닭 베타-액틴 유전자의 CMV 초기 인핸서 요소, 프로모터, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용자(CAG 프로모터)로부터 유래되는 하이브리드 프로모터인, 방법.
E28. E25에 있어서, 프로모터는 절단된 CMV-닭 베타-액틴(smCBA) 프로모터인, 방법.
E29. E1 내지 E28 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 표 2의 리스트로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
E30. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Strc를 암호화하는, 방법.
E31. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 막관통 채널 유사 1(Tmc1)을 암호화하는, 방법.
E32. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 하모닌(Ush1c)을 암호화하는, 방법.
E33. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 무조성 BHLH 전사 인자 1(Atoh1)을 암호화하는, 방법.
E34. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 클라린 1(Clrn1)을 암호화하는, 방법.
E35. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SRY-박스 4(Sox4)를 암호화하는, 방법.
E36. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 뇌 유래 신경영양인자(Bdnf)를 암호화하는, 방법.
E37. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 뉴로트로핀 3(Ntf3)을 암호화하는, 방법.
E38. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SRY-박스 11(Sox11)을 암호화하는, 방법.
E39. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 미오신 7A(Myo7a)를 암호화하는, 방법.
E40. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, 방법.
E41. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 콜린성 수용체 니코틴 알파 9 서브유닛(Chrna9)을 암호화하는, 방법.
E42. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 콜린성 수용체 니코틴 알파 10 서브유닛(Chrna10)을 암호화하는, 방법.
E43. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ocm을 암호화하는, 방법.
E44. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tyr을 암호화하는, 방법.
E45. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 막관통 및 테트라트라이코펩타이드 반복부 함유 4(Tmtc4)를 암호화하는, 방법.
E46. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 TEA 도메인 전사 인자 2(Tead2)를 암호화하는, 방법.
E47. E29에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Yes 관련 단백질 1(Yap1)을 암호화하는, 방법.
E48. 영장류 대상체의 지지 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 GFAP 프로모터, GLAST 프로모터, Hes1 프로모터, JAG1 프로모터, Notch1 프로모터, LGR5 프로모터, SOX2 프로모터, Hes5 프로모터 및 SOX9 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E49. E48에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터인, 방법.
E50. E48에 있어서, 프로모터는 HES1 프로모터, LGR5 프로모터, SOX2 프로모터, HES5 프로모터 및 SOX9 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E51. E48 내지 E50 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Sox9, Spalt 유사 전사 인자 2(Sall2), 칼모듈린 결합 전사 활성자 1(Camta1), YRPW 모티프 2를 갖는 Hes 관련 패밀리 BHLH 전사 인자(Hey2), Gata 결합 단백질 2(Gata2), YRPW 모티프 1을 갖는 Hes 관련 패밀리 BHLH 전사 인자(Hey1), 세라마이드 신테이스 2(Lass2), SRY-박스 10(Sox10), GATA 결합 단백질 3(Gata3), Cut 유사 호메오박스 1(Cux1), 핵수용체 서브패밀리 2 그룹 F 멤버(Nr2f1), Hes 패밀리 BHLH 전사 인자 1(Hes1), RAR 관련 희귀 수용체 B(Rorb), Jun 원종양 유전자 AP-1 전사 인자 서브유닛(Jun), 아연 핑거 단백질 667(Zfp667), LIM 호메오박스 3(Lhx3), 발생기 헬릭스-루프-헬릭스 1(Nhlh1), MAX 이량체화 단백질 4(Mxd4), 아연 핑거 MIZ-유형 함유 1(Zmiz1), 마이엘린 전사 인자 1(Myt1), 신호 변환자 및 전사 활성자 3(Stat3), BarH 유사 호메오박스 1(Barhl1), 흉선세포 선택 관련 고 이동성 그룹 박스(Tox), 프로스페로 호메오박스 1(Prox1), I A(Nfia), 갑상선 호르몬 수용체 베타(Thrb), MYCL 원종양 유전자 BHLH 전사 인자(Mycl1), 라이신 데메틸레이스 5A(Kdm5a), CAMP 반응성 요소 결합 단백질 3 유사 4(Creb3I4), ETS 변이체 1(Etv1), 부계 발현 3(Peg3), BTB 도메인 및 CNC 상동체 2(Bach2), ISL LIM 호메오박스(Isl1), 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 38(Zbtb38), 지아(Limb Bud) 및 심장 발달(Lbh), 터비 이분형 전사 인자(Tub), 유비퀴틴 C(Hmg20), RE1 침묵 전사 인자(Rest), 아연 핑거 단백질 827(Zfp827), AF4/FMR2 패밀리 멤버 3(Aff3), PBX/노티드 1 호메오박스 2(Pknox2), AT-풍부 상호작용 도메인 3B(Arid3b), MLX 상호작용 단백질(Mlxip), 아연 핑거 단백질(Zfp532), IKAROS 패밀리 아연 핑거 2(Ikzf2), Spalt 유사 전사 인자 1(Sall1), SIX 호메오박스 2(Six2), Spalt 유사 전사 인자 3(Sall3), Lin-28 상동체 B(Lin28b), Pou4f3, 조절 인자 X7(Rfx7), Atoh1, 328, 331 및/또는 334번 아미노산에 돌연변이를 포함하는 Atoh1 변이체(예를 들어, S328A, S331A, S334A, S328A/S331A, S328A/S334A, S331A/S334A 및 S328A/S331A/S334, 예를 들어, 서열번호 4 내지 10 중 어느 하나의 서열을 갖는 변이체), Gfi1, Sox4, Bdnf, Ntf3, Sox11, Tead2, Yap1 또는 뉴클레이스(예를 들어, CRISPR 관련 단백질 9(Cas9), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레이스(TALEN), 아연 핑거 뉴클레이스(ZFN) 또는 가이드 RNA(gRNA))를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(miRNA, 예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E52. E48 내지 E51 중 어느 하나에 있어서, 지지 세포는 전정 지지 세포인, 방법.
E53. E52에 있어서, 전정 지지 세포는 난형낭(utricle)인, 방법.
E54. E48 내지 E51 중 어느 하나에 있어서, 지지 세포는 달팽이관 지지 세포이고, 프로모터는 SOX2인, 방법.
E55. 영장류 대상체의 내이의 유모 세포(예를 들어, 전정 유모 세포 및/또는 달팽이관 유모 세포)에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E56. E55에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E57. E55 또는 E56에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(miRNA, 예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E58. E55 내지 E57 중 어느 하나에 있어서, 유모 세포는 달팽이관 유모 세포인, 방법.
E59. E58에 있어서, 달팽이관 유모 세포는 내유모 세포인, 방법.
E60. E58에 있어서, 달팽이관 유모 세포는 외유모 세포인, 방법.
E61. E55 내지 E57 중 어느 하나에 있어서, 유모 세포는 전정 유모 세포인, 방법.
E62. 영장류 대상체의 외유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터, STRC 프로모터 및 ATP2B2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E63. E62에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터인, 방법.
E64. E62에 있어서, 프로모터는 OCM 프로모터인, 방법.
E65. E62에 있어서, 프로모터는 ATP2B2 프로모터인, 방법.
E66. E62 내지 E65 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Strc, Tmc1, Myo7a, Ush1c, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, ISL LIM 호메오박스 1(Isl1), Clrn1, 프로토카데린 관련 15(Pcdh15), 카데린 관련 23(Cdh23), Chrna9, Chrna10, Ocm, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E67. 영장류 대상체의 달팽이관 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E68. E67에 있어서, 프로모터는 GFI1 프로모터인, 방법.
E69. E67에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E70. E67 내지 E69 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, 오토펠린(Otof), 용질 운반체 패밀리 17 멤버 8(Vglut3), Strc, Chrna9, Chrna10, Ocm, Tmc1, Myo7a, Ush1c, 윌린(Whrn), Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E71. 영장류 대상체의 내유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 OTOF 프로모터, 섬유아세포 성장인자 8(FGF8) 프로모터 및 용질 운반체 패밀리 17 멤버 8(SLC17A8) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E72. E71에 있어서, 프로모터는 OTOF 프로모터인, 방법.
E73. E72 또는 E72에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Otof, Vglut3, 윌린, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, Myo7a, Tmc1, Ush1c, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E74. 영장류 대상체의 전정 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터, MYO7프로모터, ATP2B2 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E75. E74에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E76. E74에 있어서, 프로모터는 ATP2B2 프로모터인, 방법.
E77. E74에 있어서, 전정 유모 세포는 유형 I 전정 유모 세포이고, 프로모터는 ATP2B2 프로모터인, 방법.
E78. E74에 있어서, 전정 유모 세포는 유형 II 전정 유모 세포이고, 프로모터는 CALB2 프로모터인, 방법.
E79. E74 내지 E78 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 윌린, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E80. 영장류 대상체의 주상 세포(pillar cell)에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 CD44 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E81. E80에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E82. E80 또는 E81에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 신경 성장인자 수용체(Ngfr), Bdnf, Ntf3, 텍토린 베타(Tectb), 텍토린 알파(Tecta), Gjb2 또는 간극결합 단백질 베타 6(Gjb6)을 암호화하는, 방법.
E83. 영장류 대상체의 나선 신경절 뉴런에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 BHLHE22 프로모터, SYN 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E84. E83에 있어서, 프로모터는 SYN 프로모터인, 방법.
E85. E83에 있어서, 나선 신경절 뉴런은 높은 자발적 발화율(high spontaneous rate of firing)을 가지며, 프로모터는 CALB2 프로모터인, 방법.
E86. E83에 있어서, 나선 신경절 뉴런은 구심성(afferent) 나선 신경절 뉴런이며, 프로모터는 BHLHE22 프로모터인, 방법.
E87. E83 내지 E86 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(miRNA, 예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182) 또는 RGMA에 대해 지시된 shRNA인, 방법.
E88. 영장류 대상체의 혈관조의 변연세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 KCNQ1 프로모터, KCNE1 프로모터 및 GJB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E89. E88에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E90. 영장류 대상체의 혈관조의 기저세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 CLDN11 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E91. E90에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E92. 영장류 대상체의 혈관조의 중간세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 KCNJ10 프로모터, GJB2 프로모터 및 TYR 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E93. E92에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E94. E92에 있어서, 프로모터는 TYR 프로모터인, 방법.
E95. E90 내지 E94 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Kcnq1, Kcne1, Tyr, Gjb2, Gjb6 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E96. 영장류 대상체의 경계 세포 및/또는 내지상 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 GLAST 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E97. E96에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E98. E96 또는 E97에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, 막관통 단백질 16A(Tmem16a), Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
E99. 영장류 대상체의 다이테르스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 FGFR3 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E100. E99에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E101. E99 또는 E100에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, IKAROS 패밀리 아연 핑거 2(Ikzf2), Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
E102. 영장류 대상체의 헨센 세포 및/또는 클라우디우스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 FRZB 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E103. E102에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E104. E102 또는 E103에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
E105. 영장류 대상체의 나선융기 세포 및/또는 근부 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 SLC26A4 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E106. E105에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Slc26a4인, 방법.
E107. 영장류 대상체의 치간 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 CEACAM16 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E108. E107에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E109. E107 또는 E108에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ceacam16, 오토안코린(Otoa), Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
E110. 영장류 대상체의 아교세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 PMP22 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E111. E110에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Pmp22, Bdnf, Ntf3 또는 마이엘린 단백질 제로(Mpz)를 암호화하는, 방법.
E112. 영장류 대상체의 전정 흑색 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 KCNE1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E113. E112에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Kcnq1, Kcne1 또는 Slc26a4를 암호화하는, 방법.
E114. 영장류 대상체의 섬유세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 POU3F4 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E115. E114에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E116. E114 또는 E115에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2, Gjb6 또는 콜라겐을 암호화하는, 방법.
E117. 영장류 대상체의 스카르파 신경절 뉴런(전정 신경절 뉴런)에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 TUBB3 프로모터 및 SYN 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E118. E117에 있어서, 프로모터는 SYN 프로모터인, 방법.
E119. E117 또는 E118에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf 또는 Ntf3을 암호화하거나, 반발성 유도 분자 BMP 공동-수용체 A(RGMA)에 대해 지시된 shRNA인, 방법.
E120. 영장류 대상체의 지지 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Sox9, Sall2, Camta1, Hey2, Gata2, Hey1, Lass2, Sox10, Gata3, Cux1, Nr2f1, Hes1, Rorb, Jun, Zfp667, Lhx3, Nhlh1, Mxd4, Zmiz1, Myt1, Stat3, Barhl1, Tox, Prox1, Nfia, Thrb, Mycl1, Kdm5a, Creb3I4, Etv1, Peg3, Bach2, Isl1, Zbtb38, Lbh, Tub, Hmg20, Rest, Zfp827, Aff3, Pknox2, Arid3b, Mlxip, Zfp532, Ikzf2, Sall1, Six2, Sall3, Lin28b, Pou4f3, Rfx7, Atoh1, 아미노산 328, 331 및/또는 334번 아미노산에 돌연변이를 포함하는 Atoh1 변이체(예를 들어, S328A, S331A, S334A, S328A/S331A, S328A/S334A, S331A/S334A 및 S328A/S331A/S334, 예를 들어, 서열번호 4 내지 10 중 어느 하나의 서열을 갖는 변이체), Gfi1, Sox4, Bdnf, Ntf3, Sox11, Tead2, Yap1 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E121. E120에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Atoh1을 암호화하는, 방법.
E122. E120에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Sox4를 암호화하는, 방법.
E123. E120에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Sox11을 암호화하는, 방법.
E124. E120에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, 방법.
E125. E120에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ntf3을 암호화하는, 방법.
E126. E120에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tead2를 암호화하는, 방법.
E127. E120에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Yap1을 암호화하는, 방법.
E128. E120 내지 E127 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터, GLAST 프로모터, Hes1 프로모터, JAG1 프로모터, Notch1 프로모터, LGR5 프로모터, SOX2 프로모터, Hes5 프로모터 및 SOX9 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E129. E128에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터인, 방법.
E130. E128에 있어서, 프로모터는 HES1 프로모터, LGR5 프로모터, SOX2 프로모터, HES5 프로모터 및 SOX9 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E131. E120 내지 E130 중 어느 하나에 있어서, 지지 세포는 전정 지지 세포인, 방법.
E132. E131에 있어서, 전정 지지 세포는 난형낭에 있는, 방법.
E133. E120 내지 E130 중 어느 하나에 있어서, 지지 세포는 달팽이관 지지 세포이고, 프로모터는 SOX2인, 방법.
E134. 영장류 대상체의 내이의 유모 세포(예를 들어, 전정 유모 세포 및/또는 달팽이관 유모 세포)에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E135. E134에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, 방법.
E136. E134에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ntf3을 암호화하는, 방법.
E137. E134에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는Tmtc4를 암호화하는, 방법.
E138. E134 내지 E137 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E139. E134 내지 E138 중 어느 하나에 있어서, 유모 세포는 달팽이관 유모 세포인, 방법.
E140. E139에 있어서, 달팽이관 유모 세포는 내유모 세포인, 방법.
E141. E139에 있어서, 달팽이관 유모 세포는 외유모 세포인, 방법.
E142. E134 내지 E138 중 어느 하나에 있어서, 유모 세포는 전정 유모 세포인, 방법.
E143. 영장류 대상체의 외유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Strc, Tmc1, Myo7a, Ush1c, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, Chrna9, Chrna10, Ocm, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E144. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Strc를 암호화하는, 방법.
E145. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Chrna9를 암호화하는, 방법.
E146. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Chrna10을 암호화하는, 방법.
E147. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ocm을 암호화하는, 방법.
E148. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tmc1을 암호화하는, 방법.
E149. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Myo7a를 암호화하는, 방법.
E150. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ush1c를 암호화하는, 방법.
E151. E143에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tmtc4를 암호화하는, 방법.
E152. E143 내지 E151 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터, STRC 프로모터 및 ATP2B2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E153. 영장류 대상체의 달팽이관 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, Otof, Vglut3, Strc, Chrna9, Chrna10, Ocm, Tmc1, Myo7a, Ush1c, 윌린, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E154. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Atoh1을 암호화하는, 방법.
E155. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Clrn1을 암호화하는, 방법.
E156. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Otof를 암호화하는, 방법.
E157. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tmc1을 암호화하는, 방법.
E158. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ush1c를 암호화하는, 방법.
E159. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Myo7a를 암호화하는, 방법.
E160. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Vglut3을 암호화하는, 방법.
E161. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Strc를 암호화하는, 방법.
E162. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Chrna9를 암호화하는, 방법.
E163. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Chrna10을 암호화하는, 방법.
E164. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tmtc4를 암호화하는, 방법.
E165. E153에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ocm을 암호화하는, 방법.
E166. E153 내지 E165 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E167. E166에 있어서, 프로모터는 GFI1 프로모터인, 방법.
E168. E166에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E169. 영장류 대상체의 내유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Otof, Vglut3, 윌린, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh14, Cdh23, Myo7a, Ush1c, Tmc1, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E170. E169에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Otof를 암호화하는, 방법.
E171. E169에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Atoh1을 암호화하는, 방법.
E172. E169에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Vglut3을 암호화하는, 방법.
E173. E169에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Clrn1을 암호화하는, 방법.
E174. E169 내지 E173 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 OTOF 프로모터, FGF8 프로모터 및 SLC17A8 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E175. 영장류 대상체의 전정 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 윌린, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E176. E175에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, 방법.
E177. E175에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ntf3을 암호화하는, 방법.
E178. E175에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tmtc4를 암호화하는, 방법.
E179. E175 내지 E178 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터, MYO7프로모터, ATP2B2 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E180. E175 내지 E179 중 어느 하나에 있어서, 전정 유모 세포는 유형 I 전정 유모 세포이고, 프로모터는 ATP2B2인, 방법.
E181. E175 내지 E179 중 어느 하나에 있어서, 전정 유모 세포는 유형 II 전정 유모 세포이고, 프로모터는 CALB2 프로모터인, 방법.
E182. 영장류 대상체의 주상 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Ngfr, Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E183. E182에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, 방법.
E184. E182 또는 E183에 있어서, 프로모터는 CD44 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
E185. 영장류 대상체의 나선 신경절 뉴런에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Bdnf, Ntf3 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182) 또는 RGMA에 대해 지시된 shRNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E186. E185에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, 방법.
E187. E185에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ntf3을 암호화하는, 방법.
E188. E185 내지 E187 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 BHLHE22 프로모터, SYN 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E189. E185 내지 E188 중 어느 하나에 있어서, 나선 신경절 뉴런은 높은 자발적 발화율을 갖고, 프로모터는 CALB2 프로모터인, 방법.
E190. E185 내지 E188 중 어느 하나에 있어서, 전정 유모 세포는 구심성 나선 신경절 뉴런이고, 프로모터는 BLHLE22 프로모터인, 방법.
E191. 영장류 대상체의 혈관조의 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Kcnq1, Kcne1, Gjb2, Gjb6, Tyr 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E192. E191에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, 방법.
E193. E191에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tyr을 암호화하는, 방법.
E194. E191 내지 E193 중 어느 하나에 있어서, 세포는 혈관조의 변연세포이고, 프로모터는 KCNQ1 프로모터, GJB2 프로모터 및 KCNE1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E195. E191 내지 E193 중 어느 하나에 있어서, 세포는 혈관조의 기저세포이고, 프로모터는 CLDN11 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
E196. E191 내지 E193 중 어느 하나에 있어서, 세포는 혈관조의 중간세포이고, 프로모터는 KCNJ10 프로모터, GJB2 프로모터 및 TYR 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E197. 영장류 대상체의 경계 세포 및/또는 내지상 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, Tmem16a, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E198. E197에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, 방법.
E199. E197 또는 E196에 있어서, 프로모터는 GLAST 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
E200. 영장류 대상체의 다이테르스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, Ikzf2, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E201. E200에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, 방법.
E202. E200 또는 E201에 있어서, 프로모터는 FGFR3 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
E203. 영장류 대상체의 헨센 세포 및/또는 클라우디우스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E204. E203에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는Gjb2를 암호화하는, 방법.
E205. E203 또는 E204에 있어서, 프로모터는 FRZB 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
E206. 영장류 대상체의 나선융기 세포 및/또는 근부 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Slc26a4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E207. E206에 있어서, 프로모터는 SLC26A4 프로모터인, 방법.
E208. 영장류 대상체의 치간 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Ceacam16, Otoa, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E209. E208에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, 방법.
E210. E208 또는 E209에 있어서, 프로모터는 CEACAM16 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
E211. 영장류 대상체의 아교세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Pmp22, Bdnf, Ntf3 또는 Mpz를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E212. E211에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, 방법.
E213. E211에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ntf3을 암호화하는, 방법.
E214. E211 내지 E213 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 PMP22 프로모터.
E215. 영장류 대상체의 전정 흑색 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Kcnq1, Kcne1 또는 Slc26a4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E216. E215에 있어서, 프로모터는 KCNE1 프로모터인, 방법.
E217. 영장류 대상체의 섬유세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Gjb2, Gjb6 또는 콜라겐을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E218. E217에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, 방법.
E219. E217 또는 E218에 있어서, 프로모터는 POU3F4 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
E220. 영장류 대상체의 스카르파 신경절 뉴런(전정 신경절 뉴런)에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 방법은 Bdnf 또는 Ntf3을 암호화하거나 또는 RGMA에 대해 지시된 shRNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E221. E220에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, 방법.
E222. E220에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ntf3를 암호화하는, 방법.
E223. E220 내지 E222 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 TUBB3 프로모터 및 SYN 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E224. OTOF의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청(monogenetic deafness)을 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Otof를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E225. E224에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCB프로모터, MYO15 프로모터 및 OTOF 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E226. E225에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터 또는 OTOF 프로모터인, 방법.
E227. STRC의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Strc를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E228. E227에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCB프로모터, MYO15 프로모터, SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터 및 ATP2B2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E229. E228에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터, SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터 및 ATP2B2 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
E230. 아미노글리코시드-유도성 양측성 전정기능 저하(아미노글리코시드-induced bilateral vestibular hypofunction)를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Atoh1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E231. 양측성 전정기능 저하를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Atoh1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E232. 나이-관련 전정 장애(age-related vestibular disorder)를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Atoh1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E233. 전정 장애를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Atoh1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E234. 청력 상실을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Atoh1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E235. E230 내지 E234 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCB프로모터 및 GFAP 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E236. E235에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터인, 방법.
E237. GJB2의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Gjb2를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E238. GJB2의 돌연변이와 관련된 나이-관련 청력 상실을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Gjb2를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E239. E237 또는 E238에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCB프로모터 및 GJB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E240. E239에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, 방법.
E241. SLC17A8의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Slc17a8을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E242. E241에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCB프로모터, MYO15 프로모터 및 OTOF 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E243. E242에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터 또는 OTOF 프로모터인, 방법.
E244. TMC1의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Tmc1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E245. E244에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E246. E244에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E247. 청력 상실을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Ntf3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E248. 이명을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Ntf3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E249. 소음 속 어음인지도 저하(difficulty understanding speech-in-noise)를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Ntf3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E250. 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease)을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Ntf3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E251. 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia)을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Ntf3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E252. E247 내지 E251 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 SYN 프로모터인, 방법.
E253. E247 내지 E251 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E254. 청력 상실을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Bdnf를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E255. 이명을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Bdnf를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E256. 소음 속 어음인지도 저하를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Bdnf를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E257. 샤르코-마리-투스병을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Bdnf를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E258. 프리드리히 운동실조증을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Bdnf를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E259. E254 내지 E258 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 SYN 프로모터인, 방법.
E260. E254 내지 E258 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E261. 양측성 전정기능 저하를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E262. 나이-관련 전정 장애를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E263. 전정 장애를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E264. 청력 상실을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E265. E261 내지 E264 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터인, 방법.
E266. E261 내지 E264 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E267. 양측성 전정기능 저하를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E268. 나이-관련 전정 장애를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E269. 전정 장애를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E270. 청력 상실을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 Sox11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E271. E267 내지 E270 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터인, 방법.
E272. E267 내지 E270 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E273. Ush1c를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터로, USH1C의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법.
E274. E273에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E275. E273에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E276. Myo7a를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터로, MYO7A의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법.
E277. E276에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E278. E276에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E279. Clrn1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터로, CLRN1의 돌연변이와 관련된 단일유전자성 난청을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법.
E280. E279에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, 방법.
E281. E279에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 smCB프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E282. 전정 기능장애를 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E283. E282에 있어서, 프로모터는 표 5에 열거된 지지 세포 프로모터, 스카르파 신경절 프로모터, 전정 유모 세포 프로모터 또는 전정 지지 세포 프로모터인, 방법.
E284. E283에 있어서, 프로모터는 MYO15인, 방법.
E285. E282 내지 E284 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 표 2의 리스트로부터 선택된 전정 및 달팽이관 유모 세포, 달팽이관 및 전정 지지 세포 또는 스카르파 신경절에서의 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
E286. E282 내지 E285 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 윌린, Sox9, Sall2, Camta1, Hey2, Gata2, Hey1, Lass2, Sox10, Gata3, Cux1, Nr2f1, Hes1, Rorb, Jun, Zfp667, Lhx3, Nhlh1, Mxd4, Zmiz1, Myt1, Stat3, Barhl1, Tox, Prox1, Nfia, Thrb, Mycl1, Kdm5a, Creb3I4, Etv1, Peg3, Bach2, Isl1, Zbtb38, Lbh, Tub, Hmg20, Rest, Zfp827, Aff3, Pknox2, Arid3b, Mlxip, Zfp532, Ikzf2, Sall1, Six2, Sall3, Lin28b, Pou4f3, Rfx7, Atoh1, 아미노산 328, 331 및/또는 334번 아미노산에 돌연변이를 포함하는 Atoh1 변이체(예를 들어, S328A, S331A, S334A, S328A/S331A, S328A/S334A, S331A/S334A 및 S328A/S331A/S334, 예를 들어, 서열번호 4 내지 10 중 어느 하나의 서열을 갖는 변이체), Gfi1, Sox4, Bdnf, Ntf3, Tead2, Yap1, Tmtc4, Sox11 또는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9, TALEN, ZFN 또는 gRNA)를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA(예를 들어, miR-183, miR-96 또는 miR-182)인, 방법.
E287. E282 내지 E286 중 어느 하나에 있어서, 전정 기능장애는 어지러움, 현기증 또는 불균형인, 방법.
E288. 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여함으로써, 청력 상실(예를 들어, 감각신경성 청력 상실, 난청 또는 청각 신경병증(auditory neuropathy))을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법.
E289. E288에 있어서, 프로모터는 표 5에 열거된 IHC 프로모터, OHC 프로모터, 지지 세포 프로모터, 달팽이관 지지 세포 하위유형 프로모터, 달팽이관 유모 세포 프로모터 또는 SGN 프로모터인, 방법.
E290. E288 또는 E289에 있어서, AAV1 벡터는 표 2의 리스트로부터 선택된 IHC, OHC, 달팽이관 유모 세포, 전정 및 달팽이관 유모 세포, 달팽이관 및 전정 지지 세포, 달팽이관 지지 세포 하위유형 또는 나선 신경절 뉴런에서의 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
E291. E224 내지 E290 중 어느 하나에 있어서, 청력 상실, 난청, 전정 장애, 전정 기능장애 또는 전정기능 저하는 유모 세포(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 유모 세포)의 손실과 관련되는, 방법.
E292. 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여함으로써, 유모 세포 재생의 촉진을 필요로 하는 영장류 대상체에서 유모 세포 재생을 촉진하는 방법.
E293. E292에 있어서, 프로모터는 표 5에 열거된 지지 세포 프로모터, 전정 지지 세포 프로모터 또는 달팽이관 지지 세포 하위유형 프로모터인, 방법.
E294. E292 또는 E293에 있어서, AAV1 벡터는 표 2의 리스트로부터 선택된 IHC, OHC, 달팽이관 유모 세포, 전정 및 달팽이관 유모 세포, 달팽이관 지지 세포 하위유형 또는 달팽이관 및 전정 지지 세포에서의 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드를 함유하는, 방법.
E295. 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 대상체에 투여함으로써, 지지 세포의 수의 증가를 필요로 하는 영장류 대상체에서 지지 세포의 수를 증가(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포, 예를 들어, 지지 세포 증식의 증가)시키는 방법.
E296. E295에 있어서, 프로모터는 표 5에 열거된 지지 세포 프로모터, 달팽이관 지지 세포 하위유형 프로모터 또는 전정 지지 세포 프로모터인, 방법.
E297. E295 또는 E296에 있어서, AAV1 벡터는 표 2의 리스트로부터 선택되는 달팽이관 및 전정 지지 세포 또는 달팽이관 지지 세포 하위유형에서의 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드를 함유하는, 방법.
E298. 유효량의 본 발명의 AAV1 벡터 또는 본 발명의 조성물을 대상체에 투여함으로써, 내이 세포 손상 또는 사멸의 예방 또는 감소를 필요로 하는 영장류 대상체에서 내이 세포 손상 또는 사멸을 예방 또는 감소시키는 방법.
E299. E298에 있어서, 내이 세포 손상 또는 사멸은 내이 신경독성(ototoxic) 약물-유도성 손상 또는 사멸인, 방법.
E300. E299에 있어서, 내이 신경독성 약물은 아미노글리코시드(예를 들어, 젠타마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 카나마이신, 반코마이신 및 아미카신), 항종양성 약물(예를 들어, 백금-함유 화학치료제, 예컨대 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴), 에타크린산, 퓨로세마이드, 살리실레이트(예를 들어, 아스피린, 특히 고용량으로) 및 퀴닌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
E301. E298에 있어서, 내이 세포 손상 또는 사멸은 청각 외상(acoustic trauma), 질환 또는 감염, 두부 외상(head trauma) 또는 노화로 인한, 방법.
E302. 유효량의 본 발명의 AAV1 벡터 또는 본 발명의 조성물을 대상체에 투여함으로써, 이명을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 영장류 대상체를 치료하는 방법.
E303. 유효량의 본 발명의 AAV1 벡터 또는 본 발명의 조성물을 대상체에 투여함으로써, 내이 세포 생존의 증가를 필요로 하는 영장류 대상체에서 내이 세포 생존을 증가시키는 방법.
E304. E1 내지 E303 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 대상체의 중이 또는 내이에 국소적으로 투여되는, 방법.
E305. E304에 있어서, AAV1 벡터는 고실경유(transtympanically) 또는 고실내(intratympanically)로 투여되는, 방법.
E306. E304에 있어서, AAV1 벡터는 외림프(perilymph)로 투여되는, 방법.
E307. E304에 있어서, AAV1 벡터는 내림프(endolymph)로 투여되는, 방법.
E308. E304에 있어서, AAV1 벡터는 난원창(oval window)에 또는 이를 통해 투여되는, 방법.
E309. E304에 있어서, AAV1 벡터는 정원창(round window)에 또는 이를 통해 투여되는, 방법.
E310. E304에 있어서, AAV1 벡터는 내림프낭(endolymphatic sac)에 투여되는, 방법.
E311. E304에 있어서, AAV1 벡터는 반고리관(semicircular canal)에 또는 이를 통해 투여되는, 방법.
E312. E1 내지 E311 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 혈청형 2 아데노-관련 바이러스(AAV2) 벡터로부터의 역 말단 반복 서열(inverted terminal repeat 서열: ITR)을 포함하는, 방법.
E313. E1 내지 E312 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 야생형 AAV1 캡시드(예를 들어, AAV1 벡터는 서열번호 1 내지 3의 아미노산을 갖는 캡시드 단백질을 함유함)를 포함하는, 방법.
E314. E1 내지 E313 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 약 1×109 벡터 게놈(vector genome: VG)/mℓ 내지 1×1015 VG/㎖(예를 들어, 1×109 VG/㎖, 2×109 VG/㎖, 3×109 VG/㎖, 4×109 VG/㎖, 5×109 VG/㎖, 6×109 VG/㎖, 7×109 VG/㎖, 8×109 VG/㎖, 9×109 VG/㎖, 1×1010 VG/㎖, 2×1010 VG/㎖, 3×1010 VG/㎖, 4×1010 VG/㎖, 5×1010 VG/㎖, 6×1010 VG/㎖, 7×1010 VG/㎖, 8×1010 VG/㎖, 9×1010 VG/㎖, 1×1011 VG/㎖, 2×1011 VG/㎖, 3×1011 VG/㎖, 4×1011 VG/㎖, 5×1011 VG/㎖, 6×1011 VG/㎖, 7×1011 VG/㎖, 8×1011 VG/㎖, 9×1011 VG/㎖, 1×1012 VG/㎖, 2×1012 VG/㎖, 3×1012 VG/㎖, 4×1012 VG/㎖, 5×1012 VG/㎖, 6×1012 VG/㎖, 7×1012 VG/㎖, 8×1012 VG/㎖, 9×1012 VG/㎖, 1×1013 VG/㎖, 2×1013 VG/㎖, 3×1013 VG/㎖, 4×1013 VG/㎖, 5×1013 VG/㎖, 6×1013 VG/㎖, 7×1013 VG/㎖, 8×1013 VG/㎖, 9×1013 VG/㎖, 1×1014 VG/㎖, 2×1014 VG/㎖, 3×1014 VG/㎖, 4×1014 VG/㎖, 5×1014 VG/㎖, 6×1014 VG/㎖, 7×1014 VG/㎖, 8×1014 VG/㎖, 9×1014 VG/㎖ 또는 1×1015 VG/㎖)의 역가를 가지며, 1㎕ 내지 200㎕(예를 들어, 1㎕, 2㎕, 3㎕, 5㎕, 6㎕, 7㎕, 8㎕, 9㎕, 10㎕, 15㎕, 20㎕, 25㎕, 30㎕, 35㎕, 40㎕, 45㎕, 50㎕, 55㎕, 60㎕, 65㎕, 70㎕, 75㎕, 80㎕, 85㎕, 90㎕, 95㎕, 100㎕, 110㎕, 120㎕, 130㎕, 140㎕, 150㎕, 160㎕, 170㎕, 180㎕, 190㎕ 또는 200㎕)의 부피로 투여되는, 방법
E315. E1 내지 E314 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 1×107 VG/귀 내지 2×1014 VG/귀(예를 들어, 1×107 VG/귀, 2×107 VG/귀, 3×107 VG/귀, 4×107 VG/귀, 5×107 VG/귀, 6×107 VG/귀, 7×107 VG/귀, 8×107 VG/귀, 9×107 VG/귀, 1×108 VG/귀, 2×108 VG/귀, 3×108 VG/귀, 4×108 VG/귀, 5×108 VG/귀, 6×108 VG/귀, 7×108 VG/귀, 8×108 VG/귀, 9×108 VG/귀, 1×109 VG/귀, 2×109 VG/귀, 3×109 VG/귀, 4×109 VG/귀, 5×109 VG/귀, 6×109 VG/귀, 7×109 VG/귀, 8×109 VG/귀, 9×109 VG/귀, 1×1010 VG/귀, 2×1010 VG/귀, 3×1010 VG/귀, 4×1010 VG/귀, 5×1010 VG/귀, 6×1010 VG/귀, 7×1010 VG/귀, 8×1010 VG/귀, 9×1010 VG/귀, 1×1011 VG/귀, 2×1011 VG/귀, 3×1011 VG/귀, 4×1011 VG/귀, 5×1011 VG/귀, 6×1011 VG/귀, 7×1011 VG/귀, 8×1011 VG/귀, 9×1011 VG/귀, 1×1012 VG/귀, 2×1012 VG/귀, 3×1012 VG/귀, 4×1012 VG/귀, 5×1012 VG/귀, 6×1012 VG/귀, 7×1012 VG/귀, 8×1012 VG/귀, 9×1012 VG/귀, 1×1013 VG/귀, 2×1013 VG/귀, 3×1013 VG/귀, 4×1013 VG/귀, 5×1013 VG/귀, 6×1013 VG/귀, 7×1013 VG/귀, 8×1013 VG/귀, 9×1013 VG/귀, 1×1014 VG/귀 또는 2×1014 VG/귀)의 용량으로 투여되는, 방법.
E316. E1 내지 E315 중 어느 하나에 있어서, 영장류는 인간인, 방법.
E317. E1 내지 E316 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 성인인, 방법.
E318. E1 내지 E316 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 청소년인, 방법.
E319. E1 내지 E316 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 소아인, 방법.
E320. E1 내지 E316 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 유아 또는 신생아인, 방법.
E321. E55 내지 E57 및 E134 내지 E138 중 어느 하나에 있어서, 유모 세포는 달팽이관 유모 세포인, 방법.
E322. E321에 있어서, 달팽이관 유모 세포는 IHC인, 방법.
E323. E321에 있어서, 달팽이관 유모 세포는 OHC인, 방법.
E324. E55 내지 E57 및 E134 내지 E138 중 어느 하나에 있어서, 유모 세포는 전정 유모 세포인, 방법.
E325. E48 내지 E51 및 E120 내지 E130 중 어느 하나에 있어서, 지지 세포는 전정 지지 세포인, 방법.
E326. E48 내지 E51 및 E120 내지 E130 중 어느 하나에 있어서, 지지 세포는 달팽이관 지지 세포(예를 들어, 헨센 세포, 다이테르스 세포, 주상 세포; 내지상 세포; 및/또는 경계 세포)인, 방법.
E327. E1 내지 E326 중 어느 하나에 있어서, 방법은 AAV1 벡터 또는 조성물을 투여하기 전 대상체의 청력을 평가(예를 들어, 청력검사(audiometry), 청성 뇌간 반응(auditory brainstem response: ABR), 전기 와우도(electrochocleography: ECOG) 또는 이음향 방사(otoacoustic emissions)와 같은 표준 테스트를 사용하여 청력을 평가)하는 단계를 더 포함하는, 방법.
E328. E1 내지 E327 중 어느 하나에 있어서, 방법은 AAV1 벡터 또는 조성물을 투여한 후 대상체의 청력을 평가(예를 들어, 청력검사, ABR, ECOG 또는 이음향 방사와 같은 표준 테스트를 사용하여 청력을 평가)하는 단계를 더 포함하는, 방법.
E329. E1 내지 E328 중 어느 하나에 있어서, 방법은 AAV1 벡터 또는 조성물을 투여하기 전 대상체의 전정 기능을 평가(예를 들어, 전기 안진검사(electronystagmogram: ENG) 또는 비디오 안진검사(videonystagmogram: VNG), 동적자세 검사(posturography), 회전-의자 검사(rotary-chair testing), ECOG, 전정 유발 근전위(vestibular evoked myogenic potential: VEMP) 또는 전문화된 임상적 균형평가(specialized clinical balance test)와 같은 표준 테스트를 사용하여 전정 기능을 평가)하는 단계를 더 포함하는, 방법.
E330. E1 내지 E329 중 어느 하나에 있어서, 방법은 AAV1 벡터 또는 조성물을 투여한 후 대상체의 전정 기능을 평가(예를 들어, ENG 또는 VNG, 동적자세 검사, 회전-의자 검사, ECOG, VEMP 또는 전문화된 임상적 균형평가와 같은 표준 테스트를 사용하여 전정 기능을 평가)하는 단계를 더 포함하는, 방법.
E331. E1 내지 E330 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터 또는 조성물은 청력 상실의 예방 또는 감소, 전정 기능장애의 예방 또는 감소, 이명의 예방 또는 감소, 청력 상실 발생의 지연, 전정 기능장애 발생의 지연, 청력 상실 진행의 둔화, 전정 기능장애 진행의 둔화, 청력의 개선, 전정 기능의 개선(예를 들어, 균형의 개선, 또는 현기증 또는 어지러움의 감소), 내이 세포 재생의 촉진 또는 유도(예를 들어, 달팽이관 유모 세포, 전정 유모 세포 또는 나선 신경절 뉴런의 재생), 유모 세포 수(예를 들어, IHC, OHC 및/또는 전정 유모 세포 수)의 증가, SGN 수의 증가, 지지 세포 수의 증가(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포, 예를 들어, 지지 세포 증식의 증가), 지지 세포의 유모 세포로의 분화 증가(예를 들어, 달팽이관 지지 세포의 IHC 및/또는 OHC로의 분화 유도 및/또는 전정 지지 세포의 전정 유모 세포로의 분화 유도), 예방 또는 감소 내이 세포 손상 또는 사멸(예를 들어, IHC, OHC, SGN, 달팽이관 지지 세포, 전정 지지 세포 및/또는 전정 유모 세포 손상 또는 사멸), 내이 세포 발달 촉진 또는 증가, 내이 세포 생존 촉진 또는 증가(예를 들어, 내이 세포에 대한 손상 또는 이의 퇴행 또는 손실 위험이 있는 대상체에서 손상된 내이 세포 생존의 증가, 손상된 내이 세포 회복의 촉진 또는 내이 세포의 보존), 내이 세포 기능의 개선, 리본형 시냅스(ribbon synapse)의 보존, 리본형 시냅스 형성의 촉진 또는 증가, 유모 세포와 뉴런(예를 들어, SGN 및/또는 전정 신경절 뉴런) 사이의 연결(예를 들어, 시냅스 연결)의 유지 또는 유모 세포와 뉴런(예를 들어, SGN 및/또는 전정 신경절 뉴런) 사이의 연결(예를 들어, 시냅스 연결)의 증가 또는 회복에 충분한 양으로 투여되는, 방법.
E332. E1 내지 E331 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 청력 상실(예를 들어, 감각신경성 청력 상실, 난청 또는 청각 신경병증)을 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는, 방법.
E333. E1 내지 E332 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 전정 기능장애(예를 들어, 현기증, 어지러움 또는 불균형)를 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는, 방법.
E334. E1 내지 E333 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 전정 기능장애(예를 들어, 현기증, 어지러움 또는 불균형)를 갖는 것으로 이전에 진단된, 방법.
E335. E1 내지 E334 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 청력 상실(예를 들어, 감각신경성 청력 상실, 난청 또는 청각 신경병증)을 갖는 것으로 이전에 진단된, 방법.
E336. E234 내지 E236, E238, E247, E254, E264, E270, E288 내지 E291 및 E331 내지 E335 중 어느 하나에 있어서, 청력 상실은 유전적 청력 상실인, 방법.
E337. E336에 있어서, 유전적 청력 상실은 상염색체 우성(autosomal dominant) 청력 상실, 상염색체 열성(autosomal recessive) 청력 상실 또는 X-연관성(X-linked) 청력 상실인, 방법.
E338. E234 내지 E236, E238, E247, E254, E264, E270, E288 내지 E291 및 E331 내지 E335 중 어느 하나에 있어서, 청력 상실은 후천적 청력 상실인, 방법.
E339. E338에 있어서, 후천적 청력 상실은 소음-유도성(noise-induced) 청력 상실, 나이-관련 청력 상실, 질환 또는 감염-관련 청력 상실, 두부 외상-관련 청력 상실 또는 내이 신경독성 약물-유도성 청력 상실인, 방법.
E340. E339에 있어서, 후천적 청력 상실은 나이-관련 청력 상실인, 방법.
E341. E339에 있어서, 청력 상실은 소음-유도성 청력 상실인, 방법.
E342. E339에 있어서, 청력 상실은 내이 신경독성 약물-유도성 청력 상실인, 방법.
E343. 표 5의 프로모터의 리스트로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV1 벡터.
E344. E343에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터인, AAV1 벡터.
E345. E343에 있어서, 프로모터는 SYN 프로모터인, AAV1 벡터.
E346. E343에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터, STRC 프로모터, MYO15 프로모터, OTOF 프로모터, SLC17A8 프로모터, FGF8 프로모터, JAG1 프로모터, Notch1 프로모터, MYO7프로모터, GLAST 프로모터, POU4F3 프로모터, GFI1 프로모터, KCNQ1 프로모터, KCNJ10 프로모터, TYR 프로모터, SOX2 프로모터, CALB2 프로모터, BHLHE22 프로모터, LGR5 프로모터, Hes1 프로모터, Hes5 프로모터, SOX 프로모터, ATP2B2 프로모터, CD44 프로모터, FGFR3 프로모터, FRZB 프로모터, SLC26A4 프로모터, CEACAM16 프로모터, CLDN11 프로모터, PMP22 프로모터, KCNE1 프로모터, POU3F4 프로모터, GJB2 프로모터 및 TUBB3 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV1 벡터.
E347. E346에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터인, AAV1 벡터.
E348. E346에 있어서, 프로모터는 OCM 프로모터인, AAV1 벡터.
E349. E346에 있어서, 프로모터는 OTOF 프로모터인, AAV1 벡터.
E350. E346에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, AAV1 벡터.
E351. E346에 있어서, 프로모터는 ATP2B2 프로모터인, AAV1 벡터.
E352. E346에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, AAV1 벡터.
E353. E346에 있어서, 프로모터는 TYR 프로모터인, AAV1 벡터.
E354. E343 내지 E353 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 표 2에 열거된 폴리뉴클레오타이드로부터 선택되는, AAV1 벡터
E355. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Otof를 암호화하는, AAV1 벡터.
E356. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Strc를 암호화하는, AAV1 벡터.
E357. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Atoh1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E358. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, AAV1 벡터.
E359. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Slc17a8을 암호화하는, AAV1 벡터.
E360. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tmc1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E361. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ntf3을 암호화하는, AAV1 벡터.
E362. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, AAV1 벡터.
E363. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Sox4를 암호화하는, AAV1 벡터.
E364. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Sox11을 암호화하는, AAV1 벡터.
E365. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ush1c를 암호화하는, AAV1 벡터.
E366. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Myo7a를 암호화하는, AAV1 벡터.
E367. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Clrn1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E368. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Chrna9를 암호화하는, AAV1 벡터.
E369. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Chrna10을 암호화하는, AAV1 벡터.
E370. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tmtc4를 암호화하는, AAV1 벡터.
E371. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Ocm을 암호화하는, AAV1 벡터.
E372. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tyr을 암호화하는, AAV1 벡터.
E373. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Tead2를 암호화하는, AAV1 벡터.
E374. E354에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 Yap1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E375. 표 2에 열거된 폴리뉴클레오타이드로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 AAV1 벡터.
E376. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Otof를 암호화하는, AAV1 벡터.
E377. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Strc를 암호화하는, AAV1 벡터.
E378. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Atoh1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E379. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Gjb2를 암호화하는, AAV1 벡터.
E380. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Slc17a8을 암호화하는, AAV1 벡터.
E381. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Tmc1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E382. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Ntf3을 암호화하는, AAV1 벡터.
E383. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Bdnf를 암호화하는, AAV1 벡터.
E384. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Sox4를 암호화하는, AAV1 벡터.
E385. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Sox11을 암호화하는, AAV1 벡터.
E386. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Ush1c를 암호화하는, AAV1 벡터.
E387. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Myo7a를 암호화하는, AAV1 벡터.
E388. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Clrn1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E389. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Chrna9를 암호화하는, AAV1 벡터.
E390. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Chrna10을 암호화하는, AAV1 벡터.
E391. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Tmtc4를 암호화하는, AAV1 벡터.
E392. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Ocm을 암호화하는, AAV1 벡터.
E393. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Tyr을 암호화하는, AAV1 벡터.
E394. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Tead2를 암호화하는, AAV1 벡터.
E395. E375에 있어서,폴리뉴클레오타이드는 Yap1을 암호화하는, AAV1 벡터.
E396. E375 내지 E395 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 표 5의 프로모터의 리스트로부터 선택되는, AAV1 벡터.
E397. E396에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터인, AAV1 벡터.
E398. E396에 있어서, 프로모터는 SYN 프로모터인, AAV1 벡터.
E399. E396에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터, STRC 프로모터, MYO15 프로모터, OTOF 프로모터, SLC17A8 프로모터, FGF8 프로모터, JAG1 프로모터, Notch1 프로모터, MYO7프로모터, GLAST 프로모터, POU4F3 프로모터, GFI1 프로모터, KCNQ1 프로모터, KCNJ10 프로모터, TYR 프로모터, SOX2 프로모터, CALB2 프로모터, BHLHE22 프로모터, LGR5 프로모터, Hes1 프로모터, Hes5 프로모터, SOX 프로모터, ATP2B2 프로모터, CD44 프로모터, FGFR3 프로모터, FRZB 프로모터, SLC26A4 프로모터, CEACAM16 프로모터, CLDN11 프로모터, PMP22 프로모터, KCNE1 프로모터, POU3F4 프로모터, GJB2 프로모터 및 TUBB3 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV1 벡터.
E400. E399에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터인, AAV1 벡터.
E401. E399에 있어서, 프로모터는 OCM 프로모터인, AAV1 벡터.
E402. E399에 있어서, 프로모터는 OTOF 프로모터인, AAV1 벡터.
E403. E399에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터인, AAV1 벡터.
E404. E399에 있어서, 프로모터는 ATP2B2 프로모터인, AAV1 벡터.
E405. E399에 있어서, 프로모터는 GJB2 프로모터인, AAV1 벡터.
E406. E399에 있어서, 프로모터는 TYR 프로모터인, AAV1 벡터.
E407. E343 내지 E406 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 AAV2 ITR을 포함하는, AAV1 벡터.
E408. E343 내지 E407 중 어느 하나에 있어서, AAV1 벡터는 야생형 AAV1 캡시드를 포함(예를 들어, AAV1 벡터는 서열번호 1 내지 3의 아미노산을 갖는 캡시드 단백질을 함유함)하는, AAV1 벡터.
E409. E343 내지 E408 중 어느 하나에 따른 AAV1 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
E410. E409에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
E411. E409 또는 E410에 있어서, 약제학적 조성물은 내이 또는 중이에 국소 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
E412. E343 내지 E408 중 어느 하나에 따른 AAV1 벡터 또는 E409 내지 E411 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 다음의 설명, 청구범이 및 도면에서 당업자에게 명백할 것이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 기재되는 값보다 10% 이상 또는 이하인 값을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "투여"는 임의의 효과적인 경로에 의해 대상체에게 치료제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터)를 제공하거나 주는 것을 지칭한다. 예시적인 투여 경로는 본 명세서에서 아래에 기재된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아데노-관련 바이러스 혈청형 1 벡터" 및 "AAV1 벡터"는 AAV1 캡시드를 갖는 아데노-관련 바이러스 벡터를 지칭한다. 용어 "아데노-관련 바이러스 혈청형 1 벡터" 및 "AAV1 벡터"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 야생형 AAV1 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3)을 갖는 AAV 벡터뿐만 아니라 영장류 내이에서 야생형 AAV1의 광범위한 향성을 갖는 서열 변형을 갖는 AAV1 캡시드 단백질을 갖는 AAV 벡터를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 AAV1 벡터는 야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP1,VP2 및 VP3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP1,VP2 및 VP3의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99. 4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일)한 아미노산 서열을 갖는 AAV1 캡시드 단백질을 갖는 것뿐만 아니라, 야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(예를 들어, 최대 5, 최대 10, 최대 15, 최대 20, 최대 25, 최대 30, 최대 35, 최대 40, 최대 45 또는 최대 50개의 보존적 아미노산 치환) 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환(예를 들어, 최대 5, 최대 10, 최대 15, 최대 20, 최대 25, 최대 30, 최대 35, 최대 40, 최대 45 또는 최대 50개의 비보존적 아미노산 치환)을 갖는 AAV1 캡시드 단백질을 갖는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 AAV1 벡터는 다음 6개의 아미노산 치환을 모두 포함하지 않는다: L129F, E418D, E531K, F584L, A598V 및 N642H. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 AAV1 벡터는 Tyr252에서 Phe272(Y252F), Tyr272에서 Phe272(Y272F), Tyr444에서 Phe444(Y444F), Tyr500에서 Phe500(Y500F), Tyr700에서 Phe700(Y700F), Tyr704에서 Phe704(Y704F), Tyr730에서 Phe730(Y730F) 및 Tyr 733에서 Phe733(Y733F)과 같은, 캡시드 단백질 상의 하나 이상의 표면-노출된 타이로신 잔기에 돌연변이를 가질 수 있으며, 이는 단백질 분해성 분해를 감소시킨다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 AAV1 벡터의 캡시드 단백질은 아미노산 서열을 가지며, 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제6,759,237호에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. AAV1 캡시드 단백질은 또한 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제7,749,492호에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 내이에서 향성은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 유형"은 유전자 발현 데이터에 기초하여 통계적으로 분리 가능한 표현형을 공유하는 세포 그룹을 지칭한다. 예를 들어, 공통 세포 유형의 세포는 유사한 유전자 활성화 패턴 및 항원 제시 프로파일과 같은 유사한 구조적 및/또는 기능적 특성을 공유할 수 있다. 공통 세포 유형의 세포는 공통 조직(예를 들어, 상피 조직, 신경 조직, 결합 조직 또는 근육 조직)으로부터 단리된 것들 및/또는 공통 기관, 조직계, 혈관 또는 유기체에서의 다른 구조 및/또는 영역으로부터 단리되는 것들을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보존적 돌연변이", "보존적 치환" 및 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 물리화학적 특성, 예컨대 극성, 정전하 및 입체 부피를 나타내는 하나 이상의 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 지칭한다. 이러한 특성은 아래 표 1에서 20개의 자연-발생적 아미노산 각각에 대해 요약되어 있다.
Figure pct00001
이 표로부터, 보존적 아미노산 패밀리는 (i) G, A, V, L 및 I; (ii) D 및 E; (iii) C, S 및 T; (iv) H, K 및 R; (v) N 및 Q; 및 (vi) F, Y 및 W를 포함함을 이해하여야 한다. 따라서, 보존적 돌연변이 또는 치환은 동일한 아미노산 패밀리의 구성원을 하나의 아미노산으로 치환(예를 들어, Ser을 Thr로 또는 Lys를 Arg로 치환)하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발달된 내이 세포"는 영장류(예를 들어, 인간)에서 37주 이상(예를 들어, 37주, 38주, 39주, 40주, 41주, 42주 이상)에 분만이 시작되는 것으로 정의되는 임신 기간 동안 발생하는 발달 과정이 완료된 내이 세포를 지칭한다. 인간 성인, 청소년, 소아, 유아 및 신생아의 귀는 발달된 내이 세포를 포함한다. 발달된 내이 세포는 세포-특이적 마커를 발현하며, 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)를 사용하여 형질도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 본 명세서에 기재된 조성물, 벡터 작제물 또는 바이러스 벡터의 "유효량", "치료적 유효량" 및 "충분한 양"은 임상 결과를 포함하여 대상체에 투여될 때 유익하거나 목적하는 결과를 나타내기에 충분한 양을 지칭하므로, "유효량" 또는 이에 대한 동의어는 적용되는 상황에 따라 다르다. 예를 들어, 감각신경성 청력 상실, 이명 또는 전정 기능장애를 치료하는 맥락에서, 이는 조성물, 벡터 작제물 또는 바이러스 벡터의 투여 없이 얻어진 반응과 비교하여 치료 반응을 달성하기에 충분한 조성물, 벡터 작제물 또는 바이러스 벡터의 양이다. 내이 세포를 형질도입하는 맥락에서, 하나 이상의 내이 세포 유형(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 내이 세포 유형)을 형질도입하기에 충분한 조성물, 벡터 작제물 또는 바이러스 벡터의 양이다. 이러한 양에 상응할 수 있는 본 명세서에 기재된 주어진 조성물의 양은 주어진 작용제, 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 대상체의 정체(예를 들어, 연령, 성별, 체중) 또는 치료될 숙주 등과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이지만, 그럼에도 불구하고 당업계에 공지된 일상적인 방법에 의해 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 투여 양생법은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인핸서"는 전사 시작 부위에 대해 인핸서의 거리 또는 배향과 상관없이 전사 효율을 증가시킬 수 있는 조절 구성요소의 유형을 지칭한다. 따라서, 인핸서는 전사 시작 부위의 상류 또는 하류에 또는 프로모터로부터 상당한 거리에 위치될 수 있다. 인핸서는 또한 물리적으로 및 기능적으로 프로모터와 겹칠 수 있다. 프로모터 서열(예를 들어, CMV 프로모터)을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오타이드는 또한 인핸서 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현하다"는 다음 이벤트 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산(예를 들어, 전사에 의해); (2) RNA 전사체의 처리(예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 처리에 의해); (3) RNA의 폴리펩타이드 또는 단백질로의 번역; 및 (4) 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역 후 변형.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종"은 자연적으로 발생하지 않는 구성요소의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 이종 이식유전자는 작동 가능하게 연결된 프로모터에 의해 자연적으로 발현되지 않는 이식유전자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증가하는" 및 "감소하는"은 각각 참조에 대한 메트릭의 기능, 발현 또는 활성의 더 많거나 더 적은 양을 초래하는 조절을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에소 조성물의 투여 후, 본 명세서에 기재된 메트릭(예를 들어, 이식유전자 발현)의 마커의 양은 대상체에서 투여 전 마커의 양에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 증가되거나 감소될 수 있다. 일반적으로, 메트릭은 투여가 인용된 효과를 가졌던 시점, 예를 들어, 치료 양생법이 시작된 후 적어도 1주, 1개월, 3개월 또는 6개월에 투여 후 측정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "내이 세포 유형"은 영장류(예를 들어, 인간) 대상체의 내이(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정계)에서 발견되는 세포 유형을 지칭한다. 내이 세포 유형은 내유모 세포, 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런(전정 신경절 뉴런), 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "국소적으로" 또는 "국소 투여"는 전신 효과가 아닌 국소 효과를 위해 의도된 신체의 특정 부위에서의 투여를 의미한다. 국소 투여의 예는 피내, 흡입, 관절내, 척수강내, 질내, 유리체내, 자궁내, 병변내 투여, 림프절 투여, 종양내 투여, 내이에 투여(예를 들어, 외림프 또는 내림프로의 투여, 예컨대 난원창, 정원창 또는 수평 도관을 통해, 예를 들어, 고실내 또는 고실경유 투여) 및 대상체 점막에의 투여이되, 투여는 전신 효과가 아닌 국소 효과를 갖도록 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 분자에 연결된 제1 분자를 지칭하되, 분자는 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 두 분자는 단일 인접 분자의 일부일 수도 있고 아닐 수도 있으며, 인접할 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 관심 있는 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자의 전사를 조절하는 경우, 프로모터는 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동 가능하게 연결된다. 추가적으로, 전사 조절 요소의 두 부분은 한 부분의 전사-활성화 기능적이 다른 부분의 존재에 의해 악영향을 받지 않도록 결합되는 경우 서로 작동 가능하게 연결된다. 두 전사 조절 요소는 링커 핵산(예를 들어, 개재 논-코딩 핵산)에 의해 서로 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 또는 개재 뉴클레오타이드가 존재하지 않고 서로 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 결합에 의해 결합된 DNA 또는 RNA(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시사이티딘)에서 자연적으로 발견되는 뉴클레오사이드로 구성된다. 용어는 자연 발생적 핵산에서 발견되는지 여부에 관계없이 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된 염기, 변형된 골격 등을 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 함유하는 분자를 포함하며, 이러한 분자는 소정의 적용에 바람직할 수 있다. 본 출원이 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 때, DNA, RNA 및 각각의 경우 단일-가닥 및 이중-가닥 형태(및 각 단일-가닥 분자의 보체)가 모두 제공되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같dl "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 물질 자체 및/또는 특정 핵산을 생화학적으로 특성화하는 서열 정보(즉, 염기의 약어로 사용되는 문자의 연속)를 지칭할 수 있다. 본 명세서에서 제시되는 폴리뉴클레오타이드 서열은 달리 지시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머레이스에 의해 결합된 DNA 상의 인식 부위를 지칭한다. 폴리머레이스는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 전사를 유도한다.
참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 대한 "퍼센트(%) 서열 동일성"은 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 핵산 또는 아미노산과 동일한 후보 서열의 핵산 또는 아미노산의 백분율로 정의되며, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한다. 퍼센트 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업자의 능력 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2 또는 Megalign 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 예를 들어, 퍼센트 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용하여 생성될 수 있다. 예로서, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B와 또는 이에 대한 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A의 퍼센트 서열 동일성(이는 대안적으로 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B와 또는 이에 대해 소정의 퍼센트 서열 동일성을 갖는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 (분수 X/Y)
여기서, X는 해당 프로그램의 A 및 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램(예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 매치로 점수가 매겨진 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수이고, Y는 B의 총 핵산의 수이다. 핵산 또는 아미노산 서열 A의 길이가 핵산 또는 아미노산 서열 B의 길이가 동일하지 않은 경우, A 대 B의 퍼센트 서열 동일성은 B 대 A의 퍼센트 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인식할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 대상체에 영향을 미치거나 영향을 미칠 수 있는 특정 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 제어하기 위해 대상체에 투여되는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 선택적으로 조합된 치료제를 함유하는 혼합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 합리적인 이익/위험비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 다른 문제 합병증 없이 대상체의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된 표본(예를 들어, 혈액, 혈액 성분(예를 들어, 혈청 또는 혈장), 소변, 침, 양수, 뇌척수액, 조직(예를 들어, 신경 조직, 태반 조직 또는 피부 조직), 췌장액, 융모막 융모 샘플 및 세포(예를 들어, 내이 세포 또는 줄기 세포))을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전사 조절 요소"는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 적어도 부분적으로 제어하는 핵산을 지칭한다. 전사 조절 요소는 프로모터, 인핸서 및 유전자 전사를 제어하거나 제어하는데 도움이 되는 기타 핵산(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)을 포함할 수 있다. 전사 조절 요소의 예는 예를 들어, 문헌[Lorence, Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Humana Press, New York, NY, 2012)]에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 영장류(예를 들어, 인간)를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료될 대상체는 청력 상실(예를 들어, 감각신경성 청력 상실, 청각 신경병증 또는 난청), 이명 또는 전정 기능장애(예를 들어, 현기증, 어지러움 또는 균형 손실)가 있는 것으로 진단된 대상체 또는 이러한 병태가 발생할 위험이 있는 대상체(예를 들어, 나이, 두부 외상, 청각 외상(예를 들어, 시끄러운 소음에의 노출), 질환 또는 감염, 내이 신경독성 약물을 사용한 치료, 유전적 돌연변이, 또는 청력 상실, 이명 또는 전정 기능장애의 가족력으로 인한 청력 상실, 이명 또는 전정 기능장애가 발생할 위험이 있는 대상체)일 수 있다. 진단은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 기법에 의해 수행될 수 있다. 당업자는, 본 개시내용에 따라 치료될 대상체가 표준 테스트를 받을 수 있거나 또는 시험 없이 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 위험 인자의 존재로 인해 위험이 있는 것으로 확인될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질도입" 및 "형질도입하다"는 벡터 작제물 또는 이의 일부를 세포로 도입하는 방법을 지칭한다. 벡터 작제물이 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)와 같은 바이러스 벡터에 포함된다는 점에서, 형질도입은 벡터 작제물 또는 이의 일부의 세포로의 후속 전달 및/또는 통합을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "내이 세포 유형을 형질도입"하는데 필요한 AAV1 벡터의 양은 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포의 적어도 20%(예를 들어, 주어진 세포 유형의 세포의 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%, 예컨대, 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포의 20% 내지 25%, 20% 내지 30%, 20% 내지 35%, 20% 내지 40%, 20% 내지 45%, 20% 내지 50%, 20% 내지 55%, 20% 내지 60%, 20% 내지 65%, 20% 내지 70%, 20% 내지 75%, 20% 내지 80%, 20% 내지 85%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 25% 내지 30%, 25% 내지 35%, 25% 내지 40%, 25% 내지 45%, 25% 내지 50%, 25% 내지 55%, 25% 내지 60%, 25% 내지 65%, 25% 내지 70%, 25% 내지 75%, 25% 내지 80%, 25% 내지 85%, 25% 내지 90%, 25% 내지 95%, 25% 내지 100%, 30% 내지 35%, 30% 내지 40%, 30% 내지 45%, 30% 내지 50%, 30% 내지 55%, 30% 내지 60%, 30% 내지 65%, 30% 내지 70%, 30% 내지 75%, 30% 내지 80%, 30% 내지 85%, 30% 내지 90%, 30% 내지 95%, 30% 내지 100%, 35% 내지 40%, 35% 내지 45%, 35% 내지 50%, 35% 내지 55%, 35% 내지 60%, 35% 내지 65%, 35% 내지 70%, 35% 내지 75%, 35% 내지 80%, 35% 내지 85%, 35% 내지 90%, 35% 내지 95%, 35% 내지 100%, 40% 내지 45%, 40% 내지 50%, 40% 내지 55%, 40% 내지 60%, 40% 내지 65%, 40% 내지 70%, 40% 내지 75%, 40% 내지 80%, 40% 내지 85%, 40% 내지 90%, 40% 내지 95%, 40% 내지 100%, 45% 내지 50%, 45% 내지 55%, 45% 내지 60%, 45% 내지 65%, 45% 내지 70%, 45% 내지 75%, 45% 내지 80%, 45% 내지 85%, 45% 내지 90%, 45% 내지 95%, 45% 내지 100%, 50% 내지 55%, 50% 내지 60%, 50% 내지 65%, 50% 내지 70%, 50% 내지 75%, 50% 내지 80%, 50% 내지 85%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 55% 내지 60%, 55% 내지 65%, 55% 내지 70%, 55% 내지 75%, 55% 내지 80%, 55% 내지 85%, 55% 내지 90%, 55% 내지 95%, 55% 내지 100%, 60% 내지 65%, 60% 내지 70%, 60% 내지 75%, 60% 내지 80%, 60% 내지 85%, 60% 내지 90%, 60% 내지 95%, 60% 내지 100%, 65% 내지 70%, 65% 내지 75%, 65% 내지 80%, 65% 내지 85%, 65% 내지 90%, 65% 내지 95%, 65% 내지 100%, 70% 내지 75%, 70% 내지 80%, 70% 내지 85%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 75% 내지 80%, 75% 내지 85%, 75% 내지 90%, 75% 내지 95%, 75% 내지 100%, 80% 내지 85%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 또는 95%% 내지 100%)를 형질도입하는데 필요한 양으로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 질환 또는 병태와 관련하여 "치료" 및 "치료하다"는 유익하거나 목적하는 결과, 예를 들어, 임상적 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 유익하거나 목적하는 결과는 검출 가능 또는 검출 불가능 여부에 관계없이 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선; 질환 또는 병태 정도의 감소; 질환, 장애 또는 병태의 안정화된(즉, 악화되지 않음) 상태; 질환 또는 병태 확산의 예방; 질환 또는 병태 진행의 지연 또는 둔화; 질환 또는 병태의 개선 또는 일시적 완화; 및 관해(부분적 또는 전체적)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 질환 또는 병태를 "개선하는" 또는 "일시적으로 완화시키는" 것은 치료 부재시의 정도 또는 시간 경과와 비교하여 질환, 장애 또는 병태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되고/되거나 시간 경과에 따른 진행이 느려지거나 또는 길어지는 것을 의미한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상 생존율과 비교하여 길어진 생존율을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 병태 또는 장애가 있는 이들뿐만 아니라 병태 또는 장애를 가질 경향이 있는 이들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 이들을 포함한다.
도 1a 내지 도 1b는 CMV 프로모터의 제어하에 EGFP를 발현하는 AAV1 벡터로 처리된 9 내지 10주령 마우스의 내이의 일련의 형광 이미지이다. CBA/CaJ 마우스(n=6)에서 0.1㎕/분의 유속으로 내이의 후반 고리관(posterior canal)에 1㎕의 AAV1-CMV-GFP(2.94×1013 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가)를 투여하기 위해 편측 주사가 사용되었다. 주사 2주 후, 내이가 제거되고, 기저막(basilar membrane)의 표면 처리가 수행되었다. 대표적인 귀 중 하나가 나타나 있다. EGFP 발현은 달팽이관의 첨단 회전부(apical turn), 중간 회전부(middle turn) 및 기저 회전부(basal turn)에서 관찰되었다(도 1a; 왼쪽 상단 패널: 달팽이관의 첨단부; 하단 패널: 달팽이관의 중간 회전부; 오른쪽 상단 패널: 달팽이관의 기저 회전부). 고배율 이미지는 EGFP가 내유모 세포(IHC), 첨단 영역의 외유모 세포(OHC) 및 나선연의 세포에서 발현됨을 보여준다(도 1b).
도 2a 내지 도 2b는 CAG 프로모터의 제저하에 EGFP를 발현하는 AAV7m8 벡터로 처리된 9 내지 10주령 마우스의 내이의 일련의 형광 이미지이다. 편측 주사가 9 내지 10주령 CBA/CaJ 마우스(n=8)에서 0.1㎕/분의 유속으로 내이의 후반 고리관에 1㎕의 AAV7m8-CAG-EGFP(9.4×1012 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가)를 투여하기 위해 수행되었다. 주사 2주 후, 내이가 제거되고, 기저막의 표면 처리가 수행되었다. 대표적인 귀 중 하나가 나타나 있다. EGFP 발현이 달팽이관의 첨단 회전부, 중간 회전부 및 기저 회전부에서 관찰되었다(도 2a). 고배율 이미지는 달팽이관의 기저-첨단 범위 전체에 걸쳐 IHC, OHC 및 나선 신경절과 나선연의 세포를 포함하는 여러 세포 유형에서의 EGFP 발현을 보여준다(도 2b; 왼쪽 패널: 달팽이관의 첨단; 중간 패널: 달팽이관의 중간 회전부; 오른쪽 패널: 달팽이관의 기저 회전부).
도 3a 내지 도 3b는 CMV 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하는 AAV2 벡터로 처리된 레서스 원숭이의 내이의 일련의 형광 이미지이다. 편측(n=1마리의 동물) 및 양측(n=2마리의 동물) 주사가 15㎕/분의 유속으로 내이의 정원창에 30㎕의 AAV2-CMV-GFP(3.39×1012 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가)를 투여하기 위해 사용되었다. 주사 4주 후, 내이가 제거되고, 기저막의 표면 처리가 수행되었다. 대표적인 귀 중 하나가 나타나 있다. Myo7A에 대한 면역조직화학은 유모 세포를 확인하기 위해 사용되었고(도 3a, 오른쪽 열의 패널), GFP 발현은 AAV1 감염력을 관찰하기 위해 사용되었다(도 3a, 왼쪽 열의 패널). 레서스 원숭이 내이의 AAV2-CMV-GFP 형질도입은 달팽이관의 기저-첨단 축을 가로지르는 GFP 발현을 초래하였다(도 3a; 왼쪽 상단 패널: 달팽이관 첨단, 왼쪽 중간 패널: 달팽이관의 중간 회전부; 왼쪽 하단 패널: 달팽이관의 기저 회전부). 달팽이관 GFP 발현은 IHC 및 나선연 내의 일부 세포 내에서 관찰되었다(도 3a; 왼쪽 열의 패널). GFP 발현은 달팽이관의 주파수 맵(주파수 맵)을 따라 IHC에서 정량화되었으며, IHC의 40% 내지 80%에서 GFP 발현을 보였다(도 3b).
도 4a 내지 도 4f는 CAG 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 아데노-관련 바이러스 혈청형 7m8(AAV7m8) 벡터로 처리된 사이노몰구스 원숭이의 내이의 파라핀 절편의 일련의 이미지이다. 양측 주사가 15㎕/분의 유속으로 내이의 정원창에 30㎕의 AAV7m8-CAG-EGFP(9.4×1012 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가)를 투여하기 위해 사용되었다. 주사 2주(n=1마리의 동물) 또는 4주(n=1마리의 동물) 후, 내이가 제거되고, 절단, 접착, 항-GFP 항체를 이용한 면역염색 및 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매되었다. 한 동물에서, AAV7m8-CAG-EGFP를 이용한 내이의 형질도입 2주 후, EGFP에 대한 면역염색을 사용하여 시각화된 바와 같이, EGFP 발현은 달팽이관의 기저 회전부에서 관찰되었다(도 4a, 상단 패널: 점선 사각형은팽이관의 기저 회전부). EGFP는 나선 인대(spiral ligament)의 IHC, OHC 및 섬유세포에서 발현되었다(도 4b, 도 4a에서 점선 사각형의 확대; 왼쪽 상단의 삽도: 코르티 기관(organ of Corti)의 확대도). 다른 동물에서, 주사 4주 후, EGFP 발현은 달팽이관의 기저-첨단 축을 가로질러 관찰되었다(도 4c, 점선 사각형은 달팽이관의 기저 회전부를 나타내며, 도 4d에서 확대됨). EGFP는 나선 인대의 IHC, OHC 및 섬유세포에서 발현되었다(도 4d, 패널의 왼쪽 상단 가장자리의 삽도에서 코르티 기관이 확대됨). 도 4e에 나타낸 바와 같이, 1차 항-GFP 항체의 부재하에 2차 항체는 달팽이관을 염색하지 않았다(점선 사각형은 달팽이관의 기저 회전부를 나타냄). 기저에서 어떠한 염색도 관찰되지 않았다(도 4f, 도 4e의 사각형의 확대; 왼쪽 상단 삽도에서 확대된 코르티 기관).
도 5a 내지 도 5e는 CAG 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 AAV1 벡터로 처리된 사이노몰구스 원숭이의 내이의 파라핀 절편의 일련의 이미지이다. 양측 주사가 15㎕/분의 유속으로 내이의 정원창에 30㎕의 AAV1-CAG-GFP(9.9×1012 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가)를 투여하기 위해 사용되었다. 주사 4주 후, 내이가 제거되고, 절단, 접착, 항-GFP 항체를 이용한 면역염색 및 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매되었다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 항-GFP 항체의 부재하에 2차 항체 단독으로의 염색은 달팽이관을 염색하지 않아, 항체의 특이성을 확인하였다. 내이의 AAV1-CAG-GFP 형질도입은 GFP에 대한 면역염색을 사용하여 시각화된 바와 같이, 내이의 달팽이관과 구형낭(saccule) 전체에 걸쳐 강력한 GFP 발현을 초래하였다(도 5b, 왼쪽 상단의 큰 원은 달팽이관의 첨단 회전부를 나타내고, 왼쪽의 작은 타원형은 혈관조를 나타내고, 오른쪽 하단의 작은 원은 구형낭을 나타냄). GFP에 대한 면역염색은 달팽이관의 첨단 회전부(도 5c, 도 5b의 왼쪽 상단의 원의 확대) 및 구형낭의 모든 층(도 5e, 도 5b의 오른쪽 하단 원의 확대)에서 검출되었다. 강력한 GFP 발현이 나선 인대와 변연 세포 및 혈관조의 중간세포에서 검출되었다. 혈관조의 기저세포는 이 절편에서 GFP 발현을 나타내지 않았지만, 달팽이관의 다른 회전부의 기저 세포에서 GFP 발현을 볼 수 있었다(도 5d).
도 6a 내지 도 6c는 CMV 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하는 AAV1 벡터로 처리된 레서스 원숭이의 내이의 일련의 형광 이미지이다. 편측(n=1마리의 동물) 및 양측(n=2마리의 동물) 주사가 15㎕/분의 유속으로 내이의 정원창에 30㎕의 AAV1-CMV-GFP(2.01×1013 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가)를 투여하기 위해 사용되었다. 주사 4주 후, 내이가 제거되었고, 기저막, 난형낭 및 팽대부릉(cristae)의 표면 처리가 수행되었다. 대표적인 내이 중 하나가 나타나 있다. Myo7A에 대한 면역조직화학이 유모 세포를 시각화하기 위해 사용되었고, GFP 발현이 AAV1 감염력을 관찰하기 위해 사용되었다(도 6a 내지 도 6c). 레서스 원숭이 내이의 AAV1-CMV-GFP 형질도입은 달팽이관의 전체 기저-첨단 측을 가로지르는 GFP의 강력한 범친화성 발현을 초래하였다(도 6a). 달팽이관 GFP 발현은 내유모 세포(IHC), 외유모 세포(OHC) 및 지지 세포뿐만 아니라 비-감각 나선 인대 및 나선연에서도 관찰되었다(도 6b, 도 6a의 중간 회전부의 박스 영역의 확대). 난형낭 및 팽대부릉과 같은 전정 구조는 또한 감각 및 비-감각 영역 모두에서 뚜렷한 GFP 발현을 나타내었다(도 6c).
도 7a 내지 도 7f는 CAG 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하는 AAV1 벡터로 처리된 사이노몰구스 원숭이의 내이의 파라핀 절편의 일련의 이미지이다. 양측 주사가 15㎕/분의 유속으로 내이의 정원창에 30㎕의 AAV1-CAG-GFP(3.15×1010 또는 3.15×1011 게놈 카피/귀)를 투여하기 위해 사용되었다. 주사　4주 후, 내이가 제거되고, 절단, 접착, 항-GFP 항체를 사용한 면역염색 및 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매되었다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 항-GFP 항체는 AAV가 주사되지 않은 귀의 달팽이관을 염색하지 않아, 항체의 특이성을 확인하였다.　　도 7b는 내이의 AAV1-CAG-GFP(3.15×1010 게놈 카피/귀) 형질도입이 GFP에 대한 면역염색을 사용하여 시각화된 바와 같이 달팽이관 전체에 걸쳐 강력한 GFP 발현을 초래함을 보여준다.　GFP에 대한 면역염색은 유모 세포, 지지 세포, 내측 구세포(inner sulcus cell), 외측 구세포(outer sulcus cell) 및 나선 인대의 세포에서 검출되었다. 고용량의 AAV-CAG-GFP(3.15×1011 게놈 카피/귀)는 도 7c에 나타낸 바와 같이 이러한 세포 유형에서 더 강력한 GFP 발현을 보여주었다. 도 7d 내지 도 7f는 각각 핵 염색이 제거된, 도 7a 내지 도 7c와 동일한 이미지를 보여준다(즉, 이들 이미지는 GFP 표지만을 나타냄). 모든 스케일 바는 100㎛이다.
발달된 영장류(예를 들어, 인간)의 내이 세포(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정계의 세포, 예컨대 내유모 세포, 외유모 세포, 전정 유모 세포, 달팽이관 지지 세포 및 전정 지지 세포)를 형질도입하기 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 발명은 혈청형 1 아데노-관련 바이러스(AAV1) 벡터를 사용하여 영장류(예를 들어, 인간) 대상체에서 발달된 내이 세포(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 상이한 유형의 발달된 내이 세포)를 형질도입하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 AAV1 벡터를 사용하여 영장류(예를 들어, 인간) 대상체의 특정 내이 세포 유형(예를 들어, 외유모 세포, 전정 유모 세포 또는 전정 지지 세포)에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법을 특징으로 하며, AAV1 벡터는 프로모터(예를 들어, 하나 이상의 내이 세포 유형에서 유전자 발현을 유도하는 프로모터) 및/또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 치료적 단백질을 암호화하는 유전자, 예컨대 정상 내이 세포에서 발현되는 유전자 또는 내이 세포 생존, 재생, 세포 운명 및/또는 세포 증식을 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 영장류(예를 들어, 인간) 내이 세포의 전부 또는 서브세트에서 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는데 사용될 수 있으므로, 본 명세서에 기재된 조성물은 청력 상실(예를 들어, 감각신경성 청력 상실), 이명 또는 전정 기능장애와 같은 내이 세포의 손상, 퇴행, 손실 및/또는 기능장애에 의해 유발된 장애를 치료하기 위해 영장류(예를 들어, 인간) 대상체에 투여될 수 있다.
내이 세포
내이는 여러 특수한 세포들로 이루어져 있다. 달팽이관 및 전정계 모두 내이의 1차 감각 세포인 유모 세포를 포함한다. 달팽이관 유모 세포는 다음의 2개의 주요 세포 유형으로 구성된다: 소리를 감지하는 내유모 세포(IHC) 및 낮은 수준의 소리를 증폭시키는 것으로 생각되는 외유모 세포(OHC). 전정 유모 세포는 전정계의 반고리관 및 이석 기관(otolith organ)(예를 들어, 난형낭 및 구형낭)에 위치하며, 균형 감각 및 공간 방향에 기여하는 움직임의 감각에 관여한다. 나선 신경절 뉴런은 달팽이관 유모 세포를 자극하며 엑손을 중추 신경계로 보내는 반면, 전정 신경절의 뉴런은 전정 유모 세포를 자극한다. 지지 세포라 불리는 비-감각 세포는 달팽이관과 전정계의 유모 세포 사이에 있으며, 유모 세포의 기계적 자극을 가능하게 하는 구조적 스캐폴드를 제공하고, 내림프 및 외림프의 이온 구성을 유지하며, 리본형 시냅스의 시냅스 생성을 조절하는 것과 같은 여러 중요한 기능을 수행한다. 달팽이관 내에서, 지지 세포는 다음의 5개의 상이한 유형으로 세분화될 수 있다: 1) 헨센 세포, 2) 다이테르스 세포, 3) 주상 세포; 4) 내지상 세포; 및 5) 경계 세포, 이들 모두는 구별되는 형태 및 유전자 발현의 패턴을 갖는다. 달팽이관 유모 세포, 달팽이관 지지 세포 및/또는 나선 신경절 뉴런에서 발현되는 유전자의 돌연변이는 이러한 세포의 손상(damage), 상해(injury), 퇴행 또는 손실(예를 들어, 사멸)과 같이 청력 상실(예를 들어, 감각신경성 청력 상실), 청각 신경병증, 난청 및 이명과 관련이 있다. 유사하게는, 전정계 세포에서(예를 들어, 전정 유모 세포, 전정 지지 세포 및/또는 전정 신경절 뉴런에서) 발현되는 유전자의 돌연변이 및 전정계 세포의 손상, 상해, 퇴행 또는 손실(예를 들어, 사멸)은 전정 기능장애(예를 들어, 어지러움, 현기증 및/또는 균형 손실)와 관련이 있다. 유전자 요법은 최근 청력 상실 및 전정 기능장애를 치료하기 위한 매력적인 치료적 접근법으로 등장하였지만; 청력 상실 및 전정 기능장애의 다양한 원인을 해결하기 위해 표적화될 필요가 있는 많은 수의 세포 유형을 고려할 때, 영장류(예를 들어, 인간) 내이의 많은 세포 유형을 형질도입하기 위한 광범위한 향성을 갖는 바이러스 벡터가 필요하다.
본 발명은 부분적으로 녹색 형광 단백질(GFP)에 작동 가능하게 연결된 유비쿼터스 프로모터를 포함하는 AAV1 벡터를 성체 비인간 영장류의 내이에 투여하는 것이 다른 AAV 혈청형을 사용하여 관찰된 향성과는 대조적으로 내이의 대부분 또는 모든 세포 유형에서 GFP의 범친화성 형질도입 및 강력한 발현을 유도한다는 발견에 기초한다. 이론에 얽매이지 않고, 인간과 비인간 영장류 사이의 높은 유사성은 AAV1 벡터가 대부분 또는 모든 발달된 인간 내이 세포(예를 들어, 인간 성인, 청소년, 소아 또는 신생아의 대부분 또는 모든 내이 세포)를 형질도입하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 발달된 영장류(예를 들어, 인간) 내이의 모든 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는데 사용될 수 있거나, 또는 AAV1 벡터에 포함된 프로모터에 기초한 내이의 특정 영역(예를 들어, 달팽이관 또는 전정계) 또는 세포 유형(예를 들어, 하나 이상의 내이 세포 유형, 예컨대 내유모 세포, 외유모 세포, 전정 유모 세포, 달팽이관 지지 세포 및/또는 전정 지지 세포)에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 내이의 모든 세포 유형의 유전적 돌연변이 또는 손상, 퇴행, 손실 및/또는 기능장애에 의해 야기되는 장애를 치료하거나 또는 내이 세포 유형의 하나 또는 서브세트의 유전적 돌연변이 또는 손상, 퇴행, 손실 및/또는 기능장애에 의해 야기되는 장애를 치료하기 위해 영장류(예를 들어, 인간) 대상체에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런(전정 신경절 뉴런), 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 3개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개 이상)의 내이 세포 유형을 형질도입하기에 충분한 양으로 영장류(예를 들어, 인간) 대상체의 발달된 내이에 투여된다. 내이 전체에 걸쳐 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하기 위해(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 유비쿼터스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 AAV1 벡터에서) AAV1 벡터에 의한 내이 세포의 범친화성 형질도입이 사용될 수 있다. 3개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 상이한 내이 세포 유형을 형질도입하는 능력은 많은 또는 대부분의 내이 세포 유형에서 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것, 예를 들어, 모든 내이 세포 유형에서 돌연변이된 유전자의 야생형 버전을 전달하거나 또는 고농도에서 치료적 효과를 나타내는 다량의 분비된 단백질을 생산하는 것이 바람직한 치료적 접근법에 유익하다.
일부 실시형태에서, AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)는 특정 세포 유형(예를 들어, 지지 세포, 예컨대 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포; OHC; 전정 유모 세포; 또는 나선 신경절 뉴런) 또는 영역(예를 들어, 달팽이관 또는 전정계)에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해 영장류(예를 들어, 인간) 대상체에 투여된다. 세포 유형-특이적 프로모터는 하나 이상의 세포 유형에서 유전자 발현을 유도하기 위해 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)에 포함될 수 있다. 세포 유형-특이적 발현은 하나 또는 소수의 세포 유형에서만 자연적으로 발현되는 폴리뉴클레오타이드의 내인성 발현 패턴을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 폴리뉴클레오타이드가 정상적으로 발현되지 않는 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 이소성 발현(ectopic expression)을 방지하는데 사용될 수 있다는 점에서 유익하다.
인간 세포에서 외인성 폴리뉴클레오타이드의 발현
다양한 유전자의 돌연변이, 예컨대 미오신 7A(MYO7A), POU 클래스 4 호메오박스 3(POU4F3), 용질 운반체 패밀리 17 멤버 8(SLC17A8), 간극결합 단백질 베타 2(GJB2), 클라우딘 14(CLDN14), Cochlin(COCH), 프로토카데린 관련 15(PCDH15) 및 막관통 1(TMC1)이 감각신경성 청력 상실 및/또는 난청과 관련이 있으며, 이러한 돌연변이의 일부, 예컨대 MYO7A, POU4F3 및 COCH의 돌연변이도 또한 전정 기능장애와 관련이 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 발달된 인간 내이 세포에서 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 청력 상실 및/또는 전정 기능장애와 관련된 유전자 또는 내이 세포 발달, 기능, 세포 운명 결정(cell fate specification), 재생, 생존, 증식 및/또는 유지에 관련된 유전자의 야생형 형태와 같은 건강한 내이 세포에서 발현된 유전자에 상응하는 핵산)에 의해 암호화된 단백질의 발현을 유도 또는 증가시키는데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)가 하나 이상의 내이 세포 유형에서 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 유도 또는 증가시키기 위해 인간 대상체(예를 들어, 대상체의 내이에)에 투여될 수 있다. 단백질을 인간 세포에 전달하며, 인간 세포에서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 안정한 발현을 위한 다양한 방법이 확립되었다.
본 명세서에 기재된 AAV1 벡터는 하나 이상의 내이 세포 유형에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터는 하나 이상의 세포 유형 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상)의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 내이 세포 유형 및 각 세포 유형에서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 리스트가 아래 표 2에 제공된다. 표 2의 폴리뉴클레오타이드에 대한 등록번호는 표 3에 제공된다.
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일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 편집 시스템의 구성요소이거나 이를 암호화한다. 세포 유형-특이적 프로모터(예를 들어, 표 5에 열거된 세포 유형-특이적 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 유전자 편집 시스템의 구성요소를 포함하는 AAV1 벡터는 세포 유형-특이적 유전자 편집에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집 시스템의 구성요소는 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루되어 있는 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자에 변경(예를 들어, 삽입, 결실(예를 들어, 넉아웃), 전위, 역위, 단일 점 돌연변이 또는 기타 돌연변이)을 도입하는데 사용될 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 아연 핑거 뉴클레이스(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성자-유사 효과기-기반 뉴클레이스(Transcription Activator-Like Effector-based Nuclease: TALEN) 및 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(the clustered regulatory interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 시스템을 포함한다. ZFN, TALEN 및 CRISPR-기반 방법은 예를 들어, 문헌[Gaj et al., Trends Biotechnol. 31:397-405, 2013]에 기술되어 있다.
CRISPR은 일련의 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(또는 일련의 이를 포함하는 시스템)를 지칭한다. CRISPR 시스템은 CRISPR 및 Cas(CRISPR-관련 단백질) 또는 본 명세서에 기재된 유전자를 침묵 또는 돌연변이시키는데 사용될 수 있는 다른 뉴클레이스로부터 유래되는 시스템을 지칭한다. CRISPR 시스템은 세균 및 고세균 게놈에서 발견되는 자연 발생적 시스템이다. CRISPR 유전자좌는 교차하는 반복부 및 스페이서 서열로 구성된다. 자연 발생적 CRISPR 시스템에서, 스페이서는 전형적으로 세균에 대해 이물질인 서열(예를 들어, 플라스미드 또는 파지 서열)이다. CRISPR 시스템은 진핵생물의 유전자 편집(예를 들어, 소정의 유전자를 변경, 침묵 및/또는 강화)에 사용하기 위해 변형되었다. 예를 들어, 문헌[Wiedenheft et al., Nature 482: 331, 2012] 참조. 예를 들어, 시스템의 이러한 변형은 특이적으로-설계된 CRISPR 및 하나 이상의 적절한 Cas 단백질을 함유하는 플라스미드를 진핵 세포로 도입하는 것을 포함한다. CRISPR 유전자좌는 RNA로 전사되고, Cas 단백질에 의해 스페이서 옆에 있는 반복 서열을 포함하는 작은 RNA로 처리된다. RNA는 스페이서 서열에 따라 특정 DNA/RNA 서열을 침묵시키도록 지시하는 가이드 역할을 한다. 예를 들어, 문헌[Horvath et al., Science 327: 167, 2010; Makarova et al., Biology Direct 1:7, 2006; Pennisi, Science 341:833, 2013] 참조. 일부 예에서, CRISPR 시스템은 DNA의 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레이스인 Cas9 단백질을 포함한다. 예를 들어, Id를 참조.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재 용도를 위한 CRISPR 시스템에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법에 따라, CRISPR의 스페이서는 표적 유전자 서열, 예를 들어, 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 편집을 위한 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) 시스템에서 사용하기 위한 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)을 표적으로 하는(예를 들어, 절단) 아연 핑거 뉴클레이스(ZFN) 또는 ZFN을 암호화하는 mRNA를 포함하거나 이를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)을 표적으로 하는(예를 들어, 절단) TALEN 또는 TALEN을 암호화하는 mRNA를 포함하거나 이를 암호화한다.
예를 들어, gRNA는 유전자(예를 들어, 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자)에서 변경을 조작하기 위해 CRISPR 시스템에서 사용될 수 있다. 다른 예에서, ZFN 및/또는 TALEN은 유전자(예를 들어, 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자)에서 변경을 조작하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 변경은 삽입, 결실(예를 들어, 넉아웃), 전위, 역위, 단일 점 돌연변이 또는 기타 돌연변이를 포함한다. 변경은 예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포의 유전자에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변경은 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자의 수준 및/또는 활성을 감소(예를 들어, 넉다운 또는 넉아웃)시키며, 예를 들어, 변경은 기능의 음성 조절자이다. 또 다른 예에서, 변경은 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자에서 결함(예를 들어, 결함을 유발하는 돌연변이)을 교정한다
소정의 실시형태에서, CRISPR 시스템은 표적 유전자, 예를 들어, 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자를 편집(예를 들어, 염기쌍의 추가 또는 제거)하는데 사용된다. 다른 실시형태에서, CRISPR 시스템은 조기 정지 코돈을 도입하여, 예를 들어, 표적 유전자의 발현을 감소시키는데 사용된다. 또 다른 실시형태에서, CRISPR 시스템은 가역적인 방식, 예를 들어, RNA 간섭과 유사하게 표적 유전자를 턴오프시키는데 사용된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 Cas를 표적 유전자, 예를 들어, 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자로 유도하여 RNA 폴리머레이스를 입체적으로 차단하는데 사용된다.
일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 예를 들어, 미국 특허 제 20140068797호; 문헌[Cong, Science 339: 819, 2013; Tsai, Nature Biotechnol., 32:569, 2014]; 및 미국 특허 제8,871,445호; 제8,865,406호; 제8,795,965호; 제8,771,945호; 및 제8,697,359호에 기술된 기술을 사용하여 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자를 편집하기 위해 생성될 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR 간섭(CRISPRi) 기법은 특정 유전자, 예를 들어, 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자를 암호화하는 유전자의 전사 억제에 사용될 수 있다. CRISPRi에서, 조작된 Cas9 단백질(예를 들어, 뉴클레이스-널(null) dCas9 또는 dCas9 융합 단백질, 예를 들어, dCas9-KRAB 또는 dCas9-SID4X 융합)은 서열 특이적 가이드 RNA(sgRNA)와 쌍을 이룰 수 있다. Cas9-gRNA 복합체는 RNA 폴리머레이스를 차단하여, 전사 신장을 방해할 수 있다. 복합체는 또한 전사 인자 결합을 방해하여 전사 개시를 차단할 수 있다. CRISPRi 방법은 최소한의 표적외(off-target) 효과로 특이적이며, 다중화가 가능하며, 예를 들어, 하나 이상의 유전자(예를 들어, 여러 gRNA 사용)를 동시에 억제할 수 있다. 또한, CRISPRi 방법은 가역적 유전자 억제를 허용한다.
일부 실시형태에서, CRISPR-매개성 유전자 활성화(CRISPR-mediated gene activation: CRISPRa)는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애에 연루된 유전자와 같은 내이 세포 기능을 조절하는 것으로 알려진 유전자의 전사 활성화에 사용될 수 있다. CRISPRa 기법에서, dCas9 융합 단백질은 전사 활성자를 동원한다. 예를 들어, dCas9는 VP64 또는 p65 활성화 도메인(p65D)과 같은 폴리펩타이드(예를 들어, 활성화 도메인)를 동원하는데 사용될 수 있고, 유전자 또는 유전자들, 예를 들어, 내인성 유전자(들)을 활성화하기 위해 sgRNA(예를 들어, 단일 sgRNA 또는 다중 sgRNA)와 함께 사용될 수 있다. 여러 활성자는 활성화 효율을 증가시킬 수 있는 다중 sgRNA를 사용하여 동원될 수 있다. 다양한 활성화 도메인 및 단일 또는 다중 활성화 도메인이 사용될 수 있다. 활성자를 동원하도록 dCas9를 조작하는 것 외에도, sgRNA가 또한 활성자를 동원하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, RNA 압타머가 VP64와 같은 단백질(예를 들어, 활성화 도메인)을 동원하도록 sgRNA에 혼입될 수 있다. 일부 예에서, 상승적 활성화 매개자(synergistic activation mediator: SAM) 시스템이 전사 활성화에 사용될 수 있다. SAM에서, MS2 압타머는 sgRNA에 추가된다. MS2는 p65AD 및 열 충격 인자 1(HSF1)에 융합된 MS2 코팅 단백질(MS2 coat protein: MCP)을 동원한다. CRISPRi 및 CRISPRa 기법은 예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Dominguez et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17:5, 2016]에 더 상세히 기술되어 있다.
관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
영장류(예를 들어, 인간) 세포에서 관심 있는 단백질의 치료적으로 효과적인 세포내 농도을 달성하기 위해 사용될 수 있는 하나의 플랫폼은 관심 있는 단백질을 암호화하는 핵산의 안정한 발현을 통한(예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간) 세포의 핵 또는 미토콘드리아 게놈으로의 통합에 의해 또는 영장류(예를 들어, 인간) 세포의 핵에서 에피솜 연쇄체(episomal concatemer) 형성에 의해) 것이다. 핵산은 상응하는 단백질의 1차 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 외인성 유전자를 영장류(예를 들어, 인간) 세포에 도입하기 위해서, 유전자는 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)와 같은 벡터로 혼입될 수 있다. 내이 세포로의 도입을 위해, AAV1 벡터는 영장류(예를 들어, 인간) 대상체의 내이에 국소적으로 투여될 수 있다.
영장류(예를 들어, 인간) RNA 폴리머레이스에 의한 관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 인식 및 결합은 유전자 발현에 중요하다. 이와 같이, RNA 폴리머레이스를 동원하고 전사 개시 부위에서 전사 복합체의 조립을 촉진하는 전사 인자에 대해 높은 친화력을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 내에 서열 요소를 포함할 수 있다. 이러한 서열 요소는 예를 들어, 특정 전사 개시 인자 및 궁극적으로 RNA 폴리머레이스에 의해 서열이 인식되고 결합될 수 있는 프로모터를 포함한다. 프로모터의 예는 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Smith, et al., Mol. Sys. Biol., 3:73, online publication]에 기술되어 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 프로모터는 유비쿼터스 프로모터(예를 들어, 모든 내이 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도 또는 증가시키는 프로모터) 또는 세포 유형-특이적 프로모터(예를 들어, 하나 이상의 내이 세포 유형에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도 또는 증가시키는 프로모터)일 수 있다. 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, smCBA 프로모터(문헌[Haire et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 47:3745-3753, 2006]에 기술되어 있음), 다이하이드로폴레이트 리덕테이스(DHFR) 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 카이네이스(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 바이러스 게놈으로부터 유래된 프로모터가 또한 영장류(예를 들어, 인간) 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 안정적인 발현을 위해 사용될 수 있다. 영장류(예를 들어, 인간) 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현에 사용될 수 있는 기능적 바이러스 프로모터의 예는 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터를 포함한다.
하나 이상의 내이 세포 유형에서 관심 있는 단백질(예를 들어, 표 2에 열거된 폴리뉴클레오타이드)을 암호화하는 핵산을 발현시키기 위해 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터에 포함될 수 있는 세포 유형-특이적 프로모터가 아래 표 5에 제공된다.
Figure pct00019
Figure pct00020
관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 영장류(예를 들어, 인간) 세포에 혼입되면, 이러한 폴리뉴클레오타이드의 전사는 당업계에 공지된 방법에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 발현은 영장류(예를 들어, 인간) 세포를 프로모터에 대한 전사 인자 및/또는 RNA 폴리머레이스의 결합을 조절하여 유전자 발현을 조절하는 작용제와 같은 외부 화학 시약에 노출시킴으로써 유도될 수 있다. 화학 시약은 예를 들어, 프로모터에 결합된 억제 단백질을 제거함으로써 프로모터에 대한 RNA 폴리머레이스 및/또는 전사 인자의 결합을 촉진하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 화학 시약은 프로모터의 하류에 위치한 유전자의 전사율이 화학 시약의 존재하에 증가하도록 RNA 폴리머레이스 및/또는 전사 인자에 대한 프로모터의 친화력을 향상시키는 역할을 할 수 있다. 위의 메커니즘에 의해 폴리뉴클레오타이드 전사를 강화시키는 화학 시약의 예는 테트라사이클린 및 독시사이클린을 포함한다. 이러한 시약은 상업적으로 입수 가능하며(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캐나다 칼즈배드 소재), 확립된 프로토콜에 따라 유전자 발현을 촉진하기 위해 영장류(예를 들어, 인간) 세포에 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 다른 DNA 서열 요소는 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 DNA가 전사 개시 부위에서 전사 인자 및 RNA 폴리머레이스의 결합에 유리한 3차원 배향을 채택하도록, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 형태적 변화를 유도하는 다른 부류의 조절 요소를 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 관심 있는 단백질을 암호화하는 것을 포함하며, 추가적으로 인핸서 서열을 포함한다. 많은 인핸서 서열이 현재 알려져 있으며, 예는 글로빈, 엘라스테이스, 알부민, α-케토단백질 및 인슐린을 암호화하는 유전자로부터의 인핸서를 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 인핸서는 또한 진핵 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스의 유전 물질로부터 유래된 것을 포함한다. 예는 복제 기점(bp 100-270)의 후측(late side) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후측 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵생물 유전자 전사의 활성화를 유도하는 추가적인 인핸서 서열은 CMV 인핸서 및 RSV 인핸서를 포함한다. 인핸서는 예를 들어, 이러한 유전자의 5' 위치 또는 3' 위치에서 관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터에 스플라이싱될 수 있다. 바람직한 배향에서, 인핸서는 프로모터의 5' 측에 위치하며, 차례로 관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치된다.
본 명세서에 기재된 AAV1 벡터는 우드척 전사후 조절 요소(Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element: WPRE)를 포함할 수 있다. WPRE는 전사체의 핵외수송(nuclearexport)을 촉진하고/하거나 발생기(nascent) 전사체의 폴리아데닐화의 효율을 증가시켜 세포에서 mRNA의 총 양을 증가시킴으로써 전사 수준에서 작용한다. 벡터에 WPRE를 추가하면 시험관내 및 생체내 모두에서 여러 상이한 프로모터로부터의 이식유전자 발현의 수준이 크게 향상될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터는 예를 들어, 세포 및 조직에서(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정계에서 또는 특정 내이 세포 유형, 예컨대 IHC, OHC, 달팽이관 지지 세포, 전정 유모 세포 및/또는 전정 지지 세포에서) AAV1 벡터에 포함된 핵산의 발현을 확인하기에 유용할 수 있는 리포터 서열을 포함한다. 이식유전자에 제공될 수 있는 리포터 서열은 β-락타메이스, β-갈락토시데이스(LacZ), 알칼리 포스파테이스, 티미딘 카이네이스, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이스(Cat), 루시퍼레이스를 암호화하는 DNA 서열 및 다른 당업계에 잘 알려진 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 유비쿼터스 또는 세포 유형-특이적 프로모터와 같은 발현을 유도하는 조절 요소와 관련될 때, 리포터 서열은 효소 검정, 방사선 검정, 비색 검정, 형광 검정 또는 기타 분광 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정, 및 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사면역검정(radioimmunoassay: RIA) 및 면역조직화학을 포함하는 면역학적 검정을 포함하는 종래의 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 전달하는 벡터의 존재는 β-갈락토시데이스 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 이식유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼레이스인 경우, 신호를 전달하는 벡터는 광도계에서 색상 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 표 2에 열거된 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, AAV1 벡터는 2개의 상이한 관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유함)를 발현시키는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드는 이중시스트론성 또는 다중시스트론성(polycistronic) 발현 카세트를 사용하여 발현된다. 일부 실시형태에서, 다중시스트론성 발현 카세트는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)(예를 들어, 2개의 상이한 관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한 IRES)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중시스트론성 발현 카세트는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한 구제역 질환 바이러스 2A(foot-and-mouth disease virus 2A: FMDV 2A) 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 관심 있는 단백질을 암호화하는 각 핵산 사이에 위치한 FMDV 2A 폴리뉴클레오타이드)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 2개 이상의 AAV1 벡터(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상의 AAV1 벡터)가 3kb 이상(예를 들어, 3kb, 3.5kb, 4kb, 4.5kb, 5kb, 5.5kb, 6kb, 6.5kb 이상)의 코딩 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 같은 단일 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 표 2에 열거된 단일 폴리뉴클레오타이드)를 발현시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 AAV1 벡터가 대략 6kb의 코딩 서열을 갖는, 오토펠린을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 2개 이상의 AAV1 벡터가 단일 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는데 사용되는 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열은 전장 코딩 서열이 생체내에서 재구성될 수 있도록 벡터 사이에서 분할된다. 일부 실시형태에서, 2개의 AAV1 벡터를 포함하는 이중 벡터 시스템이 단일 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 표 2에 열거된 단일 폴리뉴클레오타이드)를 발현시키는데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 3kb, 3.5kb, 4kb, 4.5kb, 5kb, 5.5kb, 6kb, 6.5kb 이상의 코딩 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드)의 코딩 서열의 일부는 각 AAV1 벡터 내에 포함될 수 있다(예를 들어, 한 AAV1 벡터는 코딩 서열의 N-말단 부분을 포함할 수 있고, 다른 AAV1 벡터는 코딩 서열의 C-말단 부분을 포함할 수 있음). 예시적인 이중 벡터 시스템은 단편화된 이중 벡터, 중첩 이중 벡터, 트랜스-스플라이싱 이중 벡터 및 이중 하이브리드 벡터를 포함한다. 이러한 시스템은 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[McClements and MacLaren, Yale J Biol Med. 90:611-623, 2017]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터는 폴리뉴클레오타이드의 번역율을 향상시키거나 또는 유전자 전사로 인한 mRNA의 안정성 또는 핵외수송을 개선하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이러한 서열 요소는 벡터에 운반된 핵산의 효율적인 전사를 지시하기 위해, 예를 들어, 5' 및 3' 비번역 영역, IRES 및 폴리아데닐화 신호 부위를 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 사용하기에 적합한 벡터는 또한 이러한 벡터를 함유하는 세포의 선별을 위한 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 적합한 마커의 예는 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신 또는 노르세오트리신과 같은 항생제에 대한 저항성을 암호화하는 유전자를 포함한다.
핵산 전달을 위한 AAV1 벡터
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 청력 상실 및/또는 전정 기능장애에 연루된 유전자 또는 내이 세포 발달, 기능, 세포 운명 결정, 재생, 생존, 증식 및/또는 유지에 관여하는 유전자의 야생형 형태와 같은 건강한 내이 세포에서 발현된 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오타이드)는 세포로의 도입을 용이하게 하기 위해 AAV1 벡터 및/또는 비리온(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)에 혼입된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 AAV1 벡터는 아래에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 서열번호 1 내지 3을 갖는 야생형 AAV1 캡시드 단백질을 함유한다.
일부 실시형태에서, 야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00021
일부 실시형태에서, 야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00022
일부 실시형태에서, 야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00023
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 AAV1 벡터는 (1) 본 명세서에 기재된 프로모터(예를 들어, 유비쿼터스 프로모터 또는 세포 유형-특이적 프로모터), (2) 발현될 이종 서열(예를 들어, 표 2에 열거된 폴리뉴클레오타이드) 및 (3) 이종 유전자의 통합 및 발현을 용이하게 하는 바이러스 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 핵산 작제물이다. 바이러스 서열은 DNA의 복제 및 비리온으로의 패키징(예를 들어, 기능적 ITR)을 위해 시스로(in cis) 요구되는 AAV의 서열을 포함할 수 있다. 전형적인 적용에서, 이종 이식유전자는 내이 세포 발달, 기능, 세포 운명 결정, 재생, 생존, 증식 및/또는 유지를 촉진할 수 있는 건강한 내이 세포 또는 유전성 또는 유전적 청력 상실, 난청 및/또는 전정 기능장애(예를 들어, 현기증, 어지러움 또는 불균형)를 갖는 대상체에서 돌연변이된 유모 세포 단백질의 야생형 형태에서 발현되는 단백질을 암호화한다. 이러한 AAV1 벡터는 또한 마커 또는 리포터 유전자를 함유할 수 있다. 유용한 AAV1 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 AAV WT 유전자 중 하나 이상을 갖지만, 기능적 측면 ITR 서열을 유지한다. 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터에 포함되는 AAV ITR은 특정 적용에 적합한 임의의 혈청형일 수 있다(예를 들어, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 ITR일 수 있음). 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위해, ITR은 AAV2 ITR일 수 있다. AAV 벡터를 사용하는 방법은 예를 들어, 문헌[Tal et al., J. Biomed. Sci. 7:279 (2000), 및 Monahan and Samulski, Gene Delivery 7:24 (2000)]에 기술되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이므로 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 기재된 프로모터 및 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 영장류(예를 들어, 인간) 내이 세포로의 도입을 용이하게 하기 위해 AAV1 비리온에 혼입될 수 있다. AAV1의 캡시드 단백질은 비리온의 외부 비-핵산 부분을 구성하며, AAV1 캡 유전자에 의해 암호화된다. 캡 유전자는 비리온 조립에 필요한 3개의 바이러스 코팅 단백질인 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. AAV 비리온의 구성은 예를 들어, US 5,173,414; US 5,139,941; US 5,863,541; US 5,869,305; US 6,057,152; 및 US 6,376,237; 뿐만 아니라 문헌[Rabinowitz et al., J. Virol. 76:791 (2002) 및 Bowles et al., J. Virol. 77:423 (2003)]에도 기술되어 있으며, 이들 가각의 개시내용은 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이므로 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 AAV1 벡터의 캡시드 단백질은 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제6,759,237에 기재된 아미노산 서열(및 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화됨)을 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 관련하여 유용한 AAV 비리온은 AAV 혈청형 1로부터 유래되는 것(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)을 포함한다. 다양한 혈청형의 AAV 벡터의 및 AAV 단백질의 구성 및 용도는 예를 들어, 문헌[Chao et al., Mol. Ther. 2:619 (2000); Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428 (2000); Xiao et al., J. Virol. 72:2224 (1998); Halbert et al., J. Virol. 74:1524 (2000); Halbert et al., J. Virol. 75:6615 (2001); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075 (2001)]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이므로 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 관련하여 또한 유용한 것은 슈도형(pseudotyped) rAAV 벡터이다. 슈도형 벡터는 AAV1로부터 유래된 캡시드 유전자(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드)를 갖는 주어진 혈청형(예를 들어, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV8)의 슈도형 AAV 벡터를 포함한다. 슈도형 rAAV 비리온의 구성 및 사용과 관련된 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol. 75:7662 (2001); Halbert et al., J. Virol. 74:1524 (2000); Zolotukhin et al., Methods, 28:158 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075 (2001)]에 기술되어 있다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)는 감각신경성 청력 상실, 난청, 청각 신경병증, 이명 및/또는 전정 기능장애를 앓고 있는 영장류(예를 들어, 인간) 환자와 같은 환자에게 투여하기 위한 비히클로 혼입될 수 있다. AAV1 벡터와 같은 벡터를 함유하는 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacology 22nd edition, Allen, L. Ed. (2013)]; 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)를 사용하여 목적하는 형태, 예를 들어, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다.
AAV1 벡터의 혼합물은 하나 이상의 부형제, 담체 또는 희석제와 적절하게 혼합된 물로 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일로 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 포함할 수 있다. 주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 또는 분산액 및 멸균 주사액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 US 5,466,468에 기술되어 있음). 어떠한 경우에도 제형은 멸균될 수 있으며, 주사가 용이할 정도로 유동적일 수 있다. 제형은 제조 및 보관 조건하에서 안정할 수 있으며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염에 대해 보존될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제의 조성물, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 함유하는 용액은 필요한 경우 적절하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 되도록 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해되어 1000㎖의 피하 주사액에 첨가되거나 또는 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다. 투여량의 약간의 변화는 치료될 대상체의 병태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 내이에 대한 국소 투여를 위해, 조성물은 합성 외림프 용액을 포함하도록 제형화될 수 있다. 예시적인 합성 외림프 용액은 20mM 내지 200mM의 NaCl, 1mM 내지 5mM의 KCl, 0.1mM 내지 10mM의 CaCl2, 1mM 내지 10mM의 글루코스 및 2mM 내지 50mM의 HEPE를 포함하며, pH는 약 6 내지 9이고, 삼투압은 약 300 mOsm/㎏이다. 투여 책임자는 여하튼 개별 대상체에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다. 또한, 영장류(예를 들어, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 사무국의 생물제제 표준(Biologics Standard)에 의해 요구되는 바와 같은 멸균, 발열원성, 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족할 수 있다.
치료 방법
본 명세서에 기재된 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)는 내이 또는 중이(예를 들어, 난원창, 내림프낭, 정원창 또는 반고리관을 통해, 예를 들어, 고실경유 또는 고실내 주사와 같은 외림프 또는 내림프로의 투여)에 대한 국소 투여, 정맥내, 비경구, 피내, 경피, 근육내, 비강내, 피하, 피부경유, 기관내, 복강내, 동맥내, 혈관내, 흡입, 관류, 세척 및 경구 투여와 같은 다양한 경로에 의해 감각신경성 청력 상실, 청각 신경병증, 난청, 이명 및/또는 전정 기능장애가 있는 대상체에 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 투여 경로는 투여되는 특정 조성물, 환자, 약제학적 제형 방법, 투여 방법(예를 들어, 투여 시간 및 투여 경로), 환자의 연령, 체중, 성별, 치료중인 질환의 중증도, 환자의 식이 및 환자의 배설률에 따라 달라질 것이다. 조성물은 1회 또는 1회 이상(예를 들어, 1년에 1회, 1년에 2회, 1년에 3회, 2개월에 1회 또는 월간) 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 치료될 수 있는 대상체는 감각신경성 청력 상실, 난청, 청각 신경병증, 이명 및/또는 전정 기능장애(예를 들어, 청력 상실, 전정 기능장애 또는 둘 다를 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는 대상체)를 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는 대상체이다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 내이 세포의 손상(예를 들어, 달팽이관 유모 세포, 전정 유모 세포, 달팽이관 지지 세포, 전정 지지 세포 및/또는 나선 신경절 뉴런, 예를 들어, 청각 외상, 질환 또는 감염, 두부 외상, 내이 신경독성 약물 또는 노화와 관련된 손상)을 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는 대상체, 감각신경성 청력 상실, 난청, 이명 또는 청각 신경병증을 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는 대상체, 전정 기능장애(예를 들어, 현기증, 어지러움 또는 불균형)를 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는 대상체, 이명(예를 들어, 이명 단독 또는 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애와 관련된 이명)을 갖거나 또는 이의 발생 위험이 있는 대상체, 청력 상실 및/또는 전정 기능장애와 관련된 유전적 돌연변이를 갖는 대상체 또는 유전성 청력 상실, 난청, 청각 신경병증, 이명 또는 전정 기능장애의 가족력이 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 내이 세포(예를 들어, 달팽이관 유모 세포, 전정 유모 세포, 달팽이관 지지 세포, 전정 지지 세포 및/또는 나선 신경절 뉴런)의 손상, 퇴행, 기능장애 또는 손실과 관련되거나 이로부터 유발된 청력 상실 및/또는 전정 기능장애를 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 기재된 조성물의 처리 또는 투여 전 청력 상실 또는 전정 기능장애와 관련된 것으로 알려진 유전자에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 대상체를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체는 당업자에게 공지된 표준 방법(예를 들어, 유전자 테스트)을 사용하여 유전적 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 또한 본 명세서에 기재된 조성물의 처리 또는 투여 전 대상체에서 청력 및/또는 전정 기능을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 청력은 청력검사, 청성 뇌간 반응(ABR), 전기 와우도 검사(ECOG) 및 이음향 방사와 같은 표준 테스트를 사용하여 평가될 수 있다. 전정 기능은 안구 운동 검사(예를 들어, 전기안진도(ENG) 또는 비디오 안진검사(VNG)), 동적자세 검사, 회전-의자 검사, ECOG, 전정 유발 근전위(VEMP) 및 전문화된 임상적 균형평가, 예컨대 문헌[Mancini and Horak, Eur J Phys Rehabil Med, 46:239 (2010)]에 기재된 것들과 같은 표준 테스트를 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 테스트는 또한 본 명세서에 기재된 조성물의 처리 또는 투여 후 대상체에서 청력 및/또는 전정 기능을 평가하는데 사용된다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 또한 청력 상실 및/또는 전정 기능장애의 발생 위험이 있는 환자, 예를 들어, 청력 상실 또는 전정 기능장애의 가족력(예를 들어, 유전성 청력 상실 또는 전정 기능장애)이 있는 환자, 청력 손상 또는 전정 기능장애를 아직 나타내지 않지만 청력 상실 또는 전정 기능장애와 관련된 유전적 돌연변이를 보유하는 환자 또는 후천적 청력 상실(예를 들어, 청각 외상, 질환 또는 감염, 두부 외상, 내이 신경독성 약물 또는 노화) 또는 전정 기능장애(예를 들어, 질환 또는 감염, 두부 외상, 내이 신경독성 약물 또는 노화)에 대한 위험 인자에 노출된 환자에 대한 예방적 치료로서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 자가면역 내이 질환, 염증(예를 들어, 미로염(labrynthitis) 또는 전정 신경염(vestibular neuritis) 또는 메니에르병(Meniere's disease)으로 인한 청력 상실 또는 전정 기능장애를 치료하는데 사용된다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 영장류(예를 들어, 인간) 대상체에서 내이 세포 재생(예를 들어, 달팽이관 유모 세포, 전정 유모 세포 또는 나선 신경절 뉴런의 재생)을 촉진 또는 유도하고/하거나 영장류(예를 들어, 인간) 대상체에서 유모 세포(예를 들어, IHC, OHC 및/또는 전정 유모 세포) 및/또는 SGN의 수를 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 또한 지지 세포의 수를 증가(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포, 예를 들어, 지지 세포 증식을 유도 또는 증가시킴으로써)시키거나 또는 지지 세포의 유모 세포로의 분화를 유도(예를 들어, 달팽이관 지지 세포를 IHC 및/또는 OHC로 분화 유도 및/또는 전정 지지 세포를 전정 유모 세포로 분화 유도)하기 위해 사용될 수 있다. 내이 세포 재생을 촉진 또는 유도하고, 유모 세포, SGN 및/또는 지지 세포(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포)의 수를 증가시키고/시키거나 지지 세포(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포)의 유모 세포로의 분화를 유도하는 조성물로부터 혜택을 받을 수 있는 대상체는 내이 세포의 손상, 퇴행, 기능장애 또는 손실(예를 들어, IHC, OHC, SGN, 전정 유모 세포 또는 지지 세포(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포), 예를 들어, 외상(예를 들어, 청각 외상 또는 두부 외상), 질환 또는 감염, 내이 신경독성 약물 또는 노화와 관련된 내이 세포의 손상, 퇴행 또는 손실)로 인한 청력 상실 또는 전정 기능장애를 앓고 있는 대상체 및 비정상 내이 세포(예를 들어, 정상의, 건강한 내이 세포와 비교할 때 적절하게 기능하지 않는 내이 세포) 또는 유전적 돌연변이 또는 선천적 이상으로 인해 감소된 내이 세포의 수를 갖는 대상체를 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 또한 내이 세포의 생존을 촉진 또는 증가시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 손상된 내이 세포 생존의 증가, 손상된 내이 세포의 회복 촉진, 또는 내이 세포의 손상, 퇴행 또는 손실(예를 들어, 나이, 시끄러운 소음에의 노출, 질환 또는 감염, 두부 외상 또는 내이 신경독성 약물로 인한 내이 세포의 손실)의 위험이 있는 대상체에서 내부 세포를 보존함).
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 또한 내이 신경독성 약물 치료를 받았거나 또는 현재 내이 신경독성 약물로 치료를 받고 있거나 곧 치료를 시작할 예정인 대상체에서 내이 신경독성 약물-유도성 내이 세포 손상 또는 사멸(예를 들어, IHC, OHC, SGN, 달팽이관 지지 세포, 전정 지지 세포 및/또는 전정 유모 세포 손상 또는 사멸)을 예방 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 내이 신경독성 약물은 내이의 세포에 독성이 있으며, 감각신경성 청력 상실, 전정 기능장애(예를 들어, 어지러움, 현기증 또는 불균형), 이명 또는 이러한 증상의 조합을 유발할 수 있다. 내이 신경독성이 있는 것으로 밝혀진 약물은 아미노글리코시드 항생제(예를 들어, 젠타마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 카나마이신, 반코마이신 및 아미카신), 비오마이신, 항종양성 약물(예를 들어, 백금-함유 화학치료제, 예컨대 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴), 루프 이뇨제(예를 들어, 에타크린산 및 퓨로세마이드), 살리실레이트(예를 들어, 아스피린, 특히 고용량) 및 퀴닌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 청각 외상, 질환 또는 감염, 두부 외상 또는 노화와 관련된 내이 세포 손상 또는 사멸(예를 들어, IHC, OHC, SGN, 달팽이관 지지 세포, 전정 지지 세포 및/또는 전정 유모 세포 손상 또는 사멸)을 예방 또는 감소시킨다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 또한 내이의 유모 세포와 뉴런사이의 연결(예를 들어, 달팽이관 유모 세포(IHC 및/또는 OHC)와 SGN 또는 전정 유모 세포와 전정 신경절 뉴런간의 시냅스 연결)을 유지 또는 개선하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 리본형 시냅스를 보존하거나, 또는 리본형 시냅스 형성을 촉진 또는 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 내이에서 뉴런(예를 들어, SGN 또는 전정 신경절 뉴런)에 의한 유모 세포(예를 들어, 달팽이관 유모 세포(IHC 및/또는 OHC) 또는 전정 유모 세포)의 신경 분포를 유지 또는 증가시킨다.
치료는 본 명세서에 기재된 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)를 함유하는 조성물을 다양한 단위 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 각각의 단위 용량은 일반적으로 미리 결정된 양의 치료적 조성물을 함유할 것이다. 투여되는 양, 및 특정 투여 경로 및 제형은 임상 분야의 기술 범위 내에 있다. 단위 용량은 단일 주사로 투여될 필요는 없지만, 설정된 시간에 걸친 연속 주입을 포함할 수 있다. 투여는 내이(예를 들어, 달팽이관)의 손상을 최소화하기 위해 주입 속도를 제어하기 위한 주사기 펌프를 사용하여 수행될 수 있다. AAV1 벡터는 예를 들어, 약 1×109 벡터 게놈(VG)/㎖ 내지 약 1×1015 VG/㎖(예를 들어, 1×109 VG/㎖, 2×109 VG/㎖, 3×109 VG/㎖, 4×109 VG/㎖, 5×109 VG/㎖, 6×109 VG/㎖, 7×109 VG/㎖, 8×109 VG/㎖, 9×109 VG/㎖, 1×1010 VG/㎖, 2×1010 VG/㎖, 3×1010 VG/㎖, 4×1010 VG/㎖, 5×1010 VG/㎖, 6×1010 VG/㎖, 7×1010 VG/㎖, 8×1010 VG/㎖, 9×1010 VG/㎖, 1×1011 VG/㎖, 2×1011 VG/㎖, 3×1011 VG/㎖, 4×1011 VG/㎖, 5×1011 VG/㎖, 6×1011 VG/㎖, 7×1011 VG/㎖, 8×1011 VG/㎖, 9×1011 VG/㎖, 1×1012 VG/㎖, 2×1012 VG/㎖, 3×1012 VG/㎖, 4×1012 VG/㎖, 5×1012 VG/㎖, 6×1012 VG/㎖, 7×1012 VG/㎖, 8×1012 VG/㎖, 9×1012 VG/㎖, 1×1013 VG/㎖, 2×1013 VG/㎖, 3×1013 VG/㎖, 4×1013 VG/㎖, 5×1013 VG/㎖, 6×1013 VG/㎖, 7×1013 VG/㎖, 8×1013 VG/㎖, 9×1013 VG/㎖, 1×1014 VG/㎖, 2×1014 VG/㎖, 3×1014 VG/㎖, 4×1014 VG/㎖, 5×1014 VG/㎖, 6×1014 VG/㎖, 7×1014 VG/㎖, 8×1014 VG/㎖, 9×1014 VG/㎖ 또는 1×1015 VG/㎖)의 역가를 가질 수 있으며, 1㎕ 내지 200㎕(예를 들어, 1㎕, 2㎕, 3㎕, 5㎕, 6㎕, 7㎕, 8㎕, 9㎕, 10㎕, 15㎕, 20㎕, 25㎕, 30㎕, 35㎕, 40㎕, 45㎕, 50㎕, 55㎕, 60㎕, 65㎕, 70㎕, 75㎕, 80㎕, 85㎕, 90㎕, 95㎕, 100㎕, 110㎕, 120㎕, 130㎕, 140㎕, 150㎕, 160㎕, 170㎕, 180㎕, 190㎕ 또는 200㎕)의 부피로 투여될 수 있다. AAV1 벡터는 1×107 VG/귀 내지 2×1014 VG/귀(예를 들어, 1×107 VG/귀, 2×107 VG/귀, 3×107 VG/귀, 4×107 VG/귀, 5×107 VG/귀, 6×107 VG/귀, 7×107 VG/귀, 8×107 VG/귀, 9×107 VG/귀, 1×108 VG/귀, 2×108 VG/귀, 3×108 VG/귀, 4×108 VG/귀, 5×108 VG/귀, 6×108 VG/귀, 7×108 VG/귀, 8×108 VG/귀, 9×108 VG/귀, 1×109 VG/귀, 2×109 VG/귀, 3×109 VG/귀, 4×109 VG/귀, 5×109 VG/귀, 6×109 VG/귀, 7×109 VG/귀, 8×109 VG/귀, 9×109 VG/귀, 1×1010 VG/귀, 2×1010 VG/귀, 3×1010 VG/귀, 4×1010 VG/귀, 5×1010 VG/귀, 6×1010 VG/귀, 7×1010 VG/귀, 8×1010 VG/귀, 9×1010 VG/귀, 1×1011 VG/귀, 2×1011 VG/귀, 3×1011 VG/귀, 4×1011 VG/귀, 5×1011 VG/귀, 6×1011 VG/귀, 7×1011 VG/귀, 8×1011 VG/귀, 9×1011 VG/귀, 1×1012 VG/귀, 2×1012 VG/귀, 3×1012 VG/귀, 4×1012 VG/귀, 5×1012 VG/귀, 6×1012 VG/귀, 7×1012 VG/귀, 8×1012 VG/귀, 9×1012 VG/귀, 1×1013 VG/귀, 2×1013 VG/귀, 3×1013 VG/귀, 4×1013 VG/귀, 5×1013 VG/귀, 6×1013 VG/귀, 7×1013 VG/귀, 8×1013 VG/귀, 9×1013 VG/귀, 1×1014 VG/귀 또는 2×1014 VG/귀)의 용량으로 대상체에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런(전정 신경절 뉴런), 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 3개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 발달된 내이 세포 유형을 형질도입하기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 모든 또는 대부분의 발달된 내이 세포 유형을 형질도입하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 명세서에 기재된 조성물은 청력을 개선, 전정 기능을 개선(예를 들어, 균형을 개선하거나 또는 현기증 또는 어지러움을 감소), 이명을 감소, AAV1 벡터에 함유된 폴리뉴클레오타이드 발현을 증가, AAV1 벡터에 함유된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 기능을 증가, 내이 세포 재생(예를 들어, 달팽이관 유모 세포, 전정 유모 세포 또는 나선 신경절 뉴런의 재생)을 촉진 또는 유도, 유모 세포 수(예를 들어, IHC, OHC 및/또는 전정 유모 세포 수)를 증가, SGN 수를 증가, 지지 세포 수를 증가(예를 들어, 달팽이관 및/또는 전정 지지 세포, 예를 들어, 지지 세포 증식의 증가), 지지 세포의 유모 세포로의 분화(예를 들어, 달팽이관 지지 세포의 IHC 및/또는 OHC로의 분화 유도 및/또는 전정 지지 세포의 전정 유모 세포로의 분화 유도)를 증가, 내이 세포 손상 또는 사멸(예를 들어, 청각 외상, 두부 외상, 내이 신경독성 약물, 질환 또는 감염 또는 노화와 관련된 IHC, OHC, SGN, 달팽이관 지지 세포, 전정 지지 세포 및/또는 전정 유모 세포 손상 또는 사멸)을 예방 또는 감소, 내이 세포 발달을 촉진 또는 증가, 내이 세포 생존(예를 들어, 손상된 내이 세포 생존의 증가, 손상된 내이 세포의 회복의 촉진, 또는 내이 세포 손상, 퇴행 또는 손실(예를 들어, 나이, 시끄러운 소리에 대한 노출, 질환 또는 감염, 두부 외상 또는 내이 신경독성 약물로 인한 내이 세포의 손실))의 위험이 있는 대상체에서 내부 세포를 보존, 내이 세포 기능을 개선, 리본형 시냅스를 보존, 리본형 시냅스 형성을 촉진 또는 증가, 유모 세포와 뉴런(예를 들어, SGN 및/또는 전정 신경절 뉴런) 사이의 연결(예를 들어, 시냅스 연결)을 유지 또는 유모 세포와 뉴런(예를 들어, SGN 및/또는 전정 신경절 뉴런) 사이의 연결(예를 들어, 시냅스 연결)을 증가 또는 회복시키는데 충분한 양으로 투여된다. 청력은 표준 청력 테스트(예를 들어, 청력검사, ABR, 전기 와우도 검사(ECOG) 및 이음향 방사)를 사용하여 평가될 수 있으며, 치료 전 얻어진 청력 측정과 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 200% 이상) 개선될 수 있다. 전정 기능은 균형 및 어지러움에 대한 표준 테스트(예를 들어, 안구 운동 검사(예를 들어, ENG 또는 VNG), 동적자세 검사, 회전-의자 검사, ECOG, VEMP 및 전문화된 임상적 균형평가)를 사용하여 평가될 수 있으며, 치료 전 얻어진 청력 측정과 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 200% 이상) 개선될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 대상체의 언행 이해 능력을 개선시키기에 충분한 양으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 조성물은 또한 (예를 들어, 청력 상실 또는 전정 기능장애와 관련된 유전적 돌연변이를 보유하는 대상체, 청력 상실 또는 전정 기능장애(예를 들어, 유전성 청력 상실 또는 전정 기능장애)의 가족력을 가진 대상체 또는 청력 상실 또는 전정 기능장애과 관련된 위험 인자(예를 들어, 내이 신경독성 약물, 두부 외상, 질환 또는 감염 또는 청각 외상)에 노출되었지만 청력 손상 또는 전정 기능장애(예를 들어, 어지러움, 현기증 또는 불균형)를 나타내지 않는 대상체에서 또는 경증 내지 중등도의 청력 상실 또는 전정 기능장애를 나타내는 대상체에서) 감각신경성 청력 상실 및/또는 전정 기능장애의 발생 또는 진행을 둔화 또는 예방하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현은 면역조직화학, 웨스턴 블롯 분석, 정량적 실시간 PCR 또는 단백질 또는 mRNA를 검출하기 위한 기타 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 전 발현과 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 200% 이상) 증가될 수 있다. 내이 세포 수, 내이 세포 기능, 유모 세포 또는 SGN 재생 또는 AAV1 벡터에 함유된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 기능은 청력 테스트 또는 전정 기능의 테스트에 기초하여 간접적으로 평가될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 전 내이 세포 수, 내이 세포 기능, 유모 세포 또는 SGN 재생 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 기능과 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 200% 이상) 증가될 수 있다. 내이 세포 손상 또는 사멸은 비처리 대상체에서 전형적으로 관찰된 내이 세포 손상 및 사멸과 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 200% 이상) 감소될 수 있으며, 청력 및/또는 전정 기능의 표준 테스트에 기초하여 간접적으로 평가될 수 있다. 이러한 효과는 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 후, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 15주, 20주, 25주 이상 이내에 발생할 수 있다. 환자는 치료를 위해 사용된 용량 및 투여 경로에 따라 조성물의 투여 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상 평가될 수 있다. 평가 결과에 따라, 환자는 추가적인 치료를 받을 수 있다.
키트
본 명세서에 기재된 조성물은 감각신경성 청력 상실 또는 전정 기능장애를 테스트하는데 사용하기 위한 키트로 제공될 수 있다. 조성물은 프로모터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열을 함유하는 AAV1 벡터를 포함할 수 있으며, 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런(전정 신경절 뉴런), 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 3개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 발달된 내이 세포 유형을 형질도입하기에 충분한 양으로, 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 부형제(예를 들어, 식염수 또는 인공 외림프)에 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 키트는 의사와 같은 키트의 사용자에게 본 명세서에 기재된 방법을 수행하도록 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 조성물을 투여하기 위한 주사기 또는 기타 장치를 포함할 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법이 어떻게 사용되고, 제조되고, 평가될 수 있는지에 대한 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명의 순전히 예시인 것으로 발명자가 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
아래의 실시예는 AAV2 및 AAV7m8 혈청형 벡터의 향성과 비교하여 비인간 영장류의 내이에서 AAV1 바이러스 벡터의 예상치 못한 우수한 향성을 보여준다. 내이의 몇 개의 세포 유형에서 제한된 형질도입을 나타내는 마우스에서의 AAV1의 향성과 달리, 비인간 영장류의 내이로의 AAV1 매개성 이식유전자 전달은 여러 세포 유형의 광범위한 형질도입을 나타내었다. 이는 마우스에서 여러 내이 세포 유형의 광범위한 형질도입을 나타내었지만, 비인간 영장류의 내이에서 훨씬 더 제한된 향성을 나타내는 AAV7m8과 같은 혈청형과 대조적이다.
아래 기재된 모든 실시예에서, AAV1 벡터는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 함유한다.
실시예 1. 이식유전자를 운반하는 AAV1 바이러스 벡터를 함유하는 조성물의 마우스 달팽이관으로의 생체내 투여
마우스의 내이 내에서 AAV1 바이러스 벡터의 형질도입 효능을 결정하기 위해, CMV 프로모터(AAV1-CMV-EGFP)의 제어하에 EGFP 이식유전자를 운반하는 AAV1 벡터를 함유하는 조성물을 내이의 후반 고리관에 주입하여 9 내지 10주령의 CBA/CaJ 마우스(n=6마리의 마우스)의 내이로 편측 전달하였다. 2.94×1013 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가의 주사(1㎕)를 0.1㎕/분의 주입 속도로 수행하였다. 주사 2주 후, 내이를 외과적으로 제거하고, 기저막의 표면 처리를 수행하였다. 내이의 AAV-1 매개성 형질도입을 평가하기 위해, EGFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 직접 관찰하였다. EGFP 발현은 달팽이관의 기저-첨단 축 전체에 걸쳐 관찰되었지만, 주파수 맵의 길이를 따라 세포 유형에 따라 다양하였다(도 1a; 왼쪽 상단 패널: 달팽이관의 첨단; 하단 패널: 달팽이관의 중간 회전부; 오른쪽 상단 패널: 달팽이관의 기저 회전부). 내유모 세포(IHC)는 달팽이관의 기저-첨단 축을 가로질러 EGFP를 발현하였지만, 외유모 세포(OHC)는 주로 달팽이관의 첨단 영역에서 GFP 발현을 나타내었다. 나선연의 일부 세포 내에서도 EGFP 발현이 관찰되었다(도 1b).
실시예 2. 이식유전자를 운반하는 AAV7m8 벡터를 함유하는 조성물의 마우스 달팽이관으로의 생체내 투여
마우스의 내이 내에서 AAV7m8 바이러스 벡터의 형질도입 효능을 결정하기 위해, CAG 프로모터(AAV7m8-CAG-EGFP)의 제어하에 EGFP 이식유전자를 운반하는 AAV7m8 벡터를 함유하는 조성물을 내이의 후반 고리관에 주입하여 9 내지 10주령의 CBA/CaJ 마우스(n=8 마우스)의 내이로 편측 전달하였다. 9.4×1012 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가의 주사(1㎕)를 0.1㎕/분의 주입 속도로 수행하였다. 주사 2주 후, 내이를 외과적으로 제거하고, 기저막의 표면 처리를 수행하였다. EGFP 발현은 전체 달팽이관의 전체에서 관찰되었다(도 2a). 고배율 이미지는 달팽이관의 기저-첨단 범위 전체에 걸쳐 나선 신경절 및 나선연의 IHC, OHC 및 세포를 포함하는 여러 세포 유형에서 EGFP 발현을 보여준다(도 2b; 왼쪽 패널: 달팽이관의 첨단; 중간 패널: 달팽이관의 중간 회전부; 오른쪽 패널: 달팽이관의 기저 회전부).
실시예 3. 이식유전자를 운반하는 AAV2 벡터를 함유하는 조성물의 성체 비인간 영장류의 내이로의 생체내 투여
성체 비인간 영장류의 내이 내에서 AAV2 바이러스 벡터의 형질도입 효능을 결정하기 위해, CMV 프로모터의 제어하에 GFP 이식유전자를 운반하는 AAV2 벡터를 함유하는 조성물을 정원창 막을 통해 주입하여 레서스 원숭이의 내이로 편측(n=1마리의 동물) 및 양측(n=2마리의 동물)으로 전달하였다. 3.39×1012 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가의 주사(30㎕)를 15㎕/분의 주입 속도로 수행하였다. 주사 4주 후, 내이를 외과적으로 제거하고, 기저막의 표면 처리를 수행하였다. Myo7A에 대한 면역표지를 사용하여 내이의 유모 세포를 확인하고(도 3a, 오른쪽 열의 패널), 내이 세포의 AAV2-매개성 형질도입을 직접 GFP 형광에 의해 측정하였다(도 3a, 왼쪽 열의 패널). GFP 발현은 달팽이관의 기저-첨단 축을 가로질러, 특히 IHC 및 나선연의 일부 세포 내에서 관찰되었다(도 3a, 왼쪽 열의 패널). 레서스 원숭이의 내이의 IHC에서 AAV2-CMV-GFP 벡터의 형질도입 효능을 결정하기 위해, GFP 발현을 달팽이관의 주파수 맵을 따라 IHC에서 정량화하였으며, 세포의 40% 내지 80%에서 GFP 발현을 보였다(도 3b).
실시예 4. 이식유전자를 운반하는 AAV7m8 벡터를 함유하는 조성물의 성체 비인간 영장류의 내이로의 생체내 투여
성체 비인간 영장류의 내이 내에서 AAV7m8 바이러스 벡터의 형질도입 효능을 결정하기 위해, CAG 프로모터의 제어하에 EGFP 이식유전자를 운반하는 AAV7m8 벡터를 함유하는 조성물을 정원창 막을 통해 주입하여 사이노몰구스 원숭이의 내이로 양측 전달하였다. 9.4×1012 게놈 카피/㎖의 바이러스 역가의 주사(30㎕)를 15㎕/분의 주입 속도로 수행하였다. 주사 2주(n=1마리의 동물) 또는 4주(n=1마리의 동물) 후, 내이를 외과적으로 제거하고, 조직학적 분석을 위한 절단, 접착 및 항-GFP 항체를 사용한 면역염색을 위해 파라핀에 포매하였다. 한 동물에서, AAV7m8-CAG-EGFP를 이용한 내이의 형질도입 2주 후, EGFP 발현은 대부분 달팽이관의 기저 회전부에서 관찰되었다(도 4a, 상단 패널: 점선 사각형은 달팽이관의 기저 회전부를 나타냄). EGFP는 나선 인대의 IHC, OHC 및 섬유세포에서 관찰되었다(도 4b, 도 4a에서 점선 사각형의 확대; 왼쪽 상단의 삽도: 코르티 기관의 확대도). 다른 동물에서, 주사 4주 후, EGFP 발현은 달팽이관의 기저-첨단 축을 가로질러 관찰되었다(도 4c, 점선 사각형은 달팽이관의 기저 회전부를 나타내며, 도 4d에서 확대됨). EGFP는 나선 인대의 IHC, OHC 및 섬유세포에서 발현되었다(도 4d, 패널의 왼쪽 상단 가장자리의 삽도에서 코르티 기관이 확대됨). 음성 대조군으로서, 항-GFP 1차 항체의 부재하에 2차 항체를 이용한 면역염색은 달팽이관 내에서 염색을 나타내지 않았다(도 4e 내지 도 4f).
실시예 5. 이식유전자를 운반하는 AAV1 바이러스 벡터를 함유하는 조성물의 성체 비인간 영장류의 내이로의 생체내 투여
성체 비인간 영장류의 내이에서 AAV1 바이러스 벡터의 형질도입 효능을 결정하기 위해, CAG 프로모터(AAV1-CAG-GFP)의 제어하에 GFP 이식유전자를 운반하는 AAV1 벡터를 함유하는 조성물을 정원창 막을 통해 주입하여 사이노몰구스 원숭이의 내이로 양측 전달하였다. 9.9×1012 GC/㎖의 바이러스 역가의 주사(30㎕)를 15㎕/분의 주입 속도로 수행하였다. 주사 4주 후, 내이를 외과적으로 제거하고, 절단 및 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매하였다. 내이의 AAV1-매개성 형질도입을 평가하기 위해, 파라핀 절편을 토끼 단일클론 항-GFP 항체(Abcam EPR14104)로 면역표지하였다. GFP 발현은 달팽이관(도 5b 및 도 5c) 및 구형낭(도 5b 및 도 5e)을 포함하는 여러 내이 구조에서 관찰되었다. 강력한 GFP 발현이 나선 인대 및 혈관조의 변연 세포와 중간세포에서 검출되었다. 혈관조의 기저세포는 이미지에 나타낸 절편에서 GFP 발현을 나타내지 않았지만, GFP 발현은 달팽이관의 다른 회전부의 기저 세포에서 볼 수 있었다(도 5d). 항-GFP 항체의 부재하에 2차 항체 단독으로의 염색을 음성 대조군으로 사용하여 항체의 특이성을 확인하였다(도 5a).
사이노몰구스 원숭이 내이에서 관찰된 AAV1 벡터의 광범위한 형질도입이 다른 영장류 종에서도 관찰되는지 여부를 결정하기 위해, CMV 프로모터의 제어하에(AAV1-CMV-GFP) GFP 이식유전자를 운반하는 AAV1 벡터의 주사를 사용하는 다른 세트의 실험을 레서스 원숭이에서 수행하였다. 2.01×1013 GC/㎖의 바이러스 역가를 내이의 정원창을 통해 편측(n=1마리의 동물) 및 양측(n=2마리의 동물) 주사하여, 15㎕/분의 주입 속도로 30㎕의 조성물을 전달하였다. 내이의 외과적 제거 및 기저막, 난형낭 및 팽대부릉의 표면 처리에 의해 주사 4주 후 AAV1 벡터의 향성을 검정하였다. AAV1-매개성 GFP 발현을 GFP 형광에 의해 직접 모니터링하였고, 내이의 유모 세포를 Myo7a에 대한 항체로 면역표지하여 확인하였다. 형광 이미징은 달팽이관의 전체 기저-첨단 축 전체에 걸쳐 강력한 GFP 발현을 나타내었으며(도 6a), 이는 내유모 세포(IHC) 및 외유모 세포(OHC) 층에서 강하게 두드러졌다(도 6b). GFP 발현은 또한 지지 세포 및 비-감각 나선 인대 및 나선연에서도 관찰되었다(도 6b). 더욱이, 내이의 전정 구조는 난형낭 및 팽대부릉의 감각 및 비-감각 세포에서 강력한 GFP 발현을 보였다(도 6c).
따라서, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, AAV1은 비인간 영장류의 내이 내에서 강력한 범친화성 형질도입을 나타낸다. 달팽이관 및 전정기관의 감각 및 비-감각 세포에서 이러한 광범위한 향성은 치료적 이익을 위해 활용될 수 있다. 상이한 AAV 캡시드를 사용하여 비인간 영장류 내이에서 관찰된 향성의 요약은 아래 표 6에 제공된다.
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실시예 6. 낮은 및 높은 바이러스 역가를 사용하여 이식유전자를 운반하는 AAV1 바이러스 벡터를 함유하는 조성물의 성체 비인간 영장류의 내이로의 생체내 투여
성체 비인간 영장류의 내이 내에서 AAV1 바이러스 벡터의 형질도입 효능에 대한 바이러스 역가의 효과를 결정하기 위해, CAG 프로모터(AAV1-CAG-GFP)의 제어하에 GFP 이식유전자를 운반하는 AAV1 벡터를 함유하는 조성물을 정원창 막을 통해 주입하여 사이노몰구스 원숭이의 내이로 양측 전달하였다. 1.05×1012 GC/㎖(3.15×1010 GC/귀; "AAV1 낮음") 또는 1.05×1013 GC/㎖(3.15×1011 GC/귀; "AAV1 높음")의 바이러스 역가의 주사(30㎕)를 15㎕/분의 주입 속도로 수행하였다. 주사 4주 후, 내이를 외과적으로 제거하고, 절단 및 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매하였다. 내이의 AAV1-매개성 형질도입을 평가하기 위해, 파라핀 절편을 토끼 단일클론 항-GFP 항체(Abcam EPR14104)로 면역표지하였다. 도 7a 내지 도 7c는 AAV가 주사되지 않은 귀(도 7a), 낮은 AAV가 주사된 귀(도 7b) 및 높은 AAV가 주사된 귀(도 7c)에서의 GFP 표지를 보여준다. 도 7d 내지 도 7f는 각각 핵 염색 없이(즉, GFP 염색만) 도 7a 내지 도 7c와 동일한 이미지를 보여준다. 항-GFP 항체는 AAV가 주사되지 않은 귀의 달팽이관을 표지하지 않았으며, 항체의 특이성을 확인하였다(도 7a 및 도 7d). 낮은 AAV1이 주사된 귀는 유모 세포, 지지 세포, 내측 구세포, 외측 구세포 및 나선 인대의 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 달팽이관의 기저에서 첨단까지 강력한 GFP 발현을 나타내었다(도 7b 및 도 7e). 바이러스 역가의 증가는 전술한 세포 유형에서 더 강력한 GFP 발현을 초래할 뿐만 아니라, 추가적인 세포 및 세포 유형에서도 GFP 발현을 초래하였다(도 7c 및 도 7f). 따라서, AAV1은 바이러스 역가를 증가시킴으로써 강화될 수 있는 비인간 영장류의 내이 내에서 강력한 범친화성 형질도입을 나타낸다.
실시예 7. 인간 대상체의 내이의 외유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 따르면, 당업자는 OHC에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하기 위해 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)를 함유하는 조성물을 인간 대상체에 투여할 수 있다. 이를 위해, 당업자는 OHC-특이적 프로모터(예를 들어, SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터, STRC 프로모터 또는 ATP2B2 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, Strc, Chrna9, Chrna10, Ocm, Tmc1, Myo7a 또는 Ush1c를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유하는 AAV1 벡터를 포함하는 조성물을 인간 대상체의 내이(예를 들어, 내림프 또는 외림프에, 예컨대 정원창, 난원창 또는 수평 도관에의 투여 또는 이를 통해 또는 고실경유 또는 고실내 주사에 의해)에 국소적으로 투여할 수 있다. OHC에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하기 위해, AAV1 벡터는 예를 들어, 1×107 VG/귀 내지 2×1014 VG/귀(예를 들어, 1×107 VG/귀, 2×107 VG/귀, 3×107 VG/귀, 4×107 VG/귀, 5×107 VG/귀, 6×107 VG/귀, 7×107 VG/귀, 8×107 VG/귀, 9×107 VG/귀, 1×108 VG/귀, 2×108 VG/귀, 3×108 VG/귀, 4×108 VG/귀, 5×108 VG/귀, 6×108 VG/귀, 7×108 VG/귀, 8×108 VG/귀, 9×108 VG/귀, 1×109 VG/귀, 2×109 VG/귀, 3×109 VG/귀, 4×109 VG/귀, 5×109 VG/귀, 6×109 VG/귀, 7×109 VG/귀, 8×109 VG/귀, 9×109 VG/귀, 1×1010 VG/귀, 2×1010 VG/귀, 3×1010 VG/귀, 4×1010 VG/귀, 5×1010 VG/귀, 6×1010 VG/귀, 7×1010 VG/귀, 8×1010 VG/귀, 9×1010 VG/귀, 1×1011 VG/귀, 2×1011 VG/귀, 3×1011 VG/귀, 4×1011 VG/귀, 5×1011 VG/귀, 6×1011 VG/귀, 7×1011 VG/귀, 8×1011 VG/귀, 9×1011 VG/귀, 1×1012 VG/귀, 2×1012 VG/귀, 3×1012 VG/귀, 4×1012 VG/귀, 5×1012 VG/귀, 6×1012 VG/귀, 7×1012 VG/귀, 8×1012 VG/귀, 9×1012 VG/귀, 1×1013 VG/귀, 2×1013 VG/귀, 3×1013 VG/귀, 4×1013 VG/귀, 5×1013 VG/귀, 6×1013 VG/귀, 7×1013 VG/귀, 8×1013 VG/귀, 9×1013 VG/귀, 1×1014 VG/귀 또는 2×1014 VG/귀)의 용량으로 투여될 수 있다.
조성물을 인간 대상체에 투여한 후, 당업자는 다양한 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 유전자 발현 및/또는 발현, 및 요법에 대한 반응으로 환자의 개선을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 의사는 조성물의 투여 후 유전자 발현 및/또는 단백질 생산을 간접적으로 평가하고, 청력검사, ABR, 전기 달팽이관 조영술(electrocochleography: ECOG) 및 이음향 방사의 왜곡 산물(distortion product of otoacoustic emission: DPOAE)와 같은 표준 테스트를 수행하여 환자의 청력을 모니터링할 수 있다. 치료 후 수집된 청력 측정은 치료 전 얻어진 측정과 비교될 수 있다. 환자가 조성물의 투여 전 청력 테스트 결과와 비교하여 조성물의 투여 후 하나 이상의 테스트에서 개선된 청력(예를 들어, DPOAE 측정에 의해 인덱싱된 바와 같이 개선된 OHC 기능)을 나타낸다는 발견은 환자가 치료에 알맞게 반응하고 있음을 나타낸다. 후속 용량은 필요에 따라 결정하고 투여할 수 있다.
실시예 8. AAV1 벡터의 투여에 의한 인간 대상체에서 전정 기능장애의 치료
본 명세서에 개시된 방법에 따르면, 당업자는 전정 기능(예를 들어, 균형, 공간 방향, 정향(righting), 보행(gait) 및/또는 전정-안구 반사(vestibulo-ocular reflex))을 개선 또는 회복시키기 위해 전정 기능장애(예를 들어, 어지러움, 현기증 또는 균형 손실)를 갖는 인간 환자와 같은 대상체를 치료할 수 있다. 이를 위해, 당업자는 전정 세포 유형-특이적 프로모터(예를 들어, 난형낭 지지 세포-특이적 프로모터, 예컨대 GFAP 프로모터, GLAST 프로모터, Hes1 프로모터, JAG1 프로모터, Notch1 프로모터, LGR5 프로모터, SOX2 프로모터, Hes5 프로모터 또는 SOX9 프로모터; 또는 전정 유모 세포-특이적 프로모터, 예컨대 미오신 15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 또는 미오신 7프로모터)에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, Atoh1, Gfi1, Sox11, Ntf3, Bdnf, 윌린, Sox11, Tmtc4 또는 Pou4f3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유하는 AAV1 벡터(예를 들어, 야생형 AAV1 캡시드를 함유하는 AAV1 벡터)를 포함하는 조성물을 인간 환자에 투여할 수 있다. AAV 벡터를 함유하는 조성물은 전정 기능장애를 치료하기 위해, 예를 들어, 내이에 국소 투여에 의해(예를 들어, 내림프 또는 외림프에, 예컨대 정원창, 난원창 또는 수평 도관에의 투여 또는 이를 통해 또는 반고리관에의 투여에 의해) 환자에게 투여될 수 있다. 전정 기능장애를 치료하기 위해, AAV1 벡터는 예를 들어, 1×107 VG/귀 내지 2×1014 VG/귀(예를 들어, 1×107 VG/귀, 2×107 VG/귀, 3×107 VG/귀, 4×107 VG/귀, 5×107 VG/귀, 6×107 VG/귀, 7×107 VG/귀, 8×107 VG/귀, 9×107 VG/귀, 1×108 VG/귀, 2×108 VG/귀, 3×108 VG/귀, 4×108 VG/귀, 5×108 VG/귀, 6×108 VG/귀, 7×108 VG/귀, 8×108 VG/귀, 9×108 VG/귀, 1×109 VG/귀, 2×109 VG/귀, 3×109 VG/귀, 4×109 VG/귀, 5×109 VG/귀, 6×109 VG/귀, 7×109 VG/귀, 8×109 VG/귀, 9×109 VG/귀, 1×1010 VG/귀, 2×1010 VG/귀, 3×1010 VG/귀, 4×1010 VG/귀, 5×1010 VG/귀, 6×1010 VG/귀, 7×1010 VG/귀, 8×1010 VG/귀, 9×1010 VG/귀, 1×1011 VG/귀, 2×1011 VG/귀, 3×1011 VG/귀, 4×1011 VG/귀, 5×1011 VG/귀, 6×1011 VG/귀, 7×1011 VG/귀, 8×1011 VG/귀, 9×1011 VG/귀, 1×1012 VG/귀, 2×1012 VG/귀, 3×1012 VG/귀, 4×1012 VG/귀, 5×1012 VG/귀, 6×1012 VG/귀, 7×1012 VG/귀, 8×1012 VG/귀, 9×1012 VG/귀, 1×1013 VG/귀, 2×1013 VG/귀, 3×1013 VG/귀, 4×1013 VG/귀, 5×1013 VG/귀, 6×1013 VG/귀, 7×1013 VG/귀, 8×1013 VG/귀, 9×1013 VG/귀, 1×1014 VG/귀 또는 2×1014 VG/귀)의 용량으로 투여될 수 있다.
조성물을 환자에게 투여한 후, 당업자는 다양한 방법에 의해 요법에 대한 반응으로 환자의 개선을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 의사는 전기 안진 검사, 비디오 안진 검사, 회전 테스트, 전정 유발 근전위 또는 전산화된 동적자세 검사와 같은 표준 테스트를 수행하여 환자의 전정 기능을 모니터링할 수 있다. 환자가 조성물의 투여 전 테스트 결과와 비교하여 조성물의 투여 후 하나 이상의 테스트에서 개선된 균형, 보행, 자세 및/또는 전정-안구 반사를 나타낸다는 발견은 환자가 치료에 알맞게 반응하고 있음을 나타낸다. 후속 용량은 필요에 따라 결정하고 투여할 수 있다.
기타 실시형태
본 발명에 기재된 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 실시형태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 특정 실시형태에 과도하게 제한되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 모드의 다양한 수정은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 다른 실시형태는 청구범위에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Decibel Therapeutics, Inc. <120> AAV1 VECTORS AND USES THEREOF FOR TREATMENT OF OTIC INDICATIONS <130> WO 2020/077295 <150> US 62/911,885 <151> 2019-10-07 <150> US 62/744,604 <151> 2018-10-11 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus 1 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu 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Ala Pro Ser Ser Lys Gln Val Asn Gly Val Gln Lys Gln Arg 145 150 155 160 Arg Leu Ala Ala Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His Gly Leu Asn 165 170 175 His Ala Phe Asp Gln Leu Arg Asn Val Ile Pro Ser Phe Asn Asn Asp 180 185 190 Lys Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Thr Leu Gln Met Ala Gln Ile Tyr Ile 195 200 205 Asn Ala Leu Ser Glu Leu Leu Gln Thr Pro Ser Gly Gly Glu Gln Pro 210 215 220 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Cys Lys Ser Asp His His His Leu Arg Thr 225 230 235 240 Ala Ala Ser Tyr Glu Gly Gly Ala Gly Asn Ala Thr Ala Ala Gly Ala 245 250 255 Gln Gln Ala Ser Gly Gly Ser Gln Arg Pro Thr Pro Pro Gly Ser Cys 260 265 270 Arg Thr Arg Phe Ser Ala Pro Ala Ser Ala Gly Gly Tyr Ser Val Gln 275 280 285 Leu Asp Ala Leu His Phe Ser Thr Phe Glu Asp Ser Ala Leu Thr Ala 290 295 300 Met Met Ala Gln Lys Asn Leu Ser Pro Ser Leu Pro Gly Ser Ile Leu 305 310 315 320 Gln Pro Val Gln Glu Glu Asn Ser Lys Thr Ala Pro Arg Ala His Arg 325 330 335 Ser Asp Gly Glu Phe Ser Pro His Ser His Tyr Ser Asp Ser Asp Glu 340 345 350 Ala Ser <210> 10 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Ser Arg Leu Leu His Ala Glu Glu Trp Ala Glu Val Lys Glu Leu 1 5 10 15 Gly Asp His His Arg Gln Pro Gln Pro His His Leu Pro Gln Pro Pro 20 25 30 Pro Pro Pro Gln Pro Pro Ala Thr Leu Gln Ala Arg Glu His Pro Val 35 40 45 Tyr Pro Pro Glu Leu Ser Leu Leu Asp Ser Thr Asp Pro Arg Ala Trp 50 55 60 Leu Ala Pro Thr Leu Gln Gly Ile Cys Thr Ala Arg Ala Ala Gln Tyr 65 70 75 80 Leu Leu His Ser Pro Glu Leu Gly Ala Ser Glu Ala Ala Ala Pro Arg 85 90 95 Asp Glu Val Asp Gly Arg Gly Glu Leu Val Arg Arg Ser Ser Gly Gly 100 105 110 Ala Ser Ser Ser Lys Ser Pro Gly Pro Val Lys Val Arg Glu Gln Leu 115 120 125 Cys Lys Leu Lys Gly Gly Val Val Val Asp Glu Leu Gly Cys Ser Arg 130 135 140 Gln Arg Ala Pro Ser Ser Lys Gln Val Asn Gly Val Gln Lys Gln Arg 145 150 155 160 Arg Leu Ala Ala Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His Gly Leu Asn 165 170 175 His Ala Phe Asp Gln Leu Arg Asn Val Ile Pro Ser Phe Asn Asn Asp 180 185 190 Lys Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Thr Leu Gln Met Ala Gln Ile Tyr Ile 195 200 205 Asn Ala Leu Ser Glu Leu Leu Gln Thr Pro Ser Gly Gly Glu Gln Pro 210 215 220 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Cys Lys Ser Asp His His His Leu Arg Thr 225 230 235 240 Ala Ala Ser Tyr Glu Gly Gly Ala Gly Asn Ala Thr Ala Ala Gly Ala 245 250 255 Gln Gln Ala Ser Gly Gly Ser Gln Arg Pro Thr Pro Pro Gly Ser Cys 260 265 270 Arg Thr Arg Phe Ser Ala Pro Ala Ser Ala Gly Gly Tyr Ser Val Gln 275 280 285 Leu Asp Ala Leu His Phe Ser Thr Phe Glu Asp Ser Ala Leu Thr Ala 290 295 300 Met Met Ala Gln Lys Asn Leu Ser Pro Ser Leu Pro Gly Ser Ile Leu 305 310 315 320 Gln Pro Val Gln Glu Glu Asn Ala Lys Thr Ala Pro Arg Ala His Arg 325 330 335 Ser Asp Gly Glu Phe Ser Pro His Ser His Tyr Ser Asp Ser Asp Glu 340 345 350 Ala Ser

Claims (97)

  1. 인간 대상체에서 발달된 내이 세포를 형질도입하는 방법으로서, 외유모 세포(outer hair cell), 전정 유모 세포(vestibular hair cell), 전정 흑색 세포(vestibular dark cell), 전정 섬유세포(vestibular fibrocyte), 스카르파 신경절 뉴런(Scarpa's ganglion neuron), 전정 모세혈관(vestibular capillary)의 내피세포(endothelial cell), 전정 지지 세포(vestibular supporting cell), 경계 세포(Border cell), 내지상 세포(inner phalangeal cell), 내주 세포(inner pillar cell), 외주 세포(outer pillar cell), 제1 열 다이테르스 세포(Deiters' cell), 제2열 다이테르스 세포(second row Deiters' cell), 제3열 다이테르스 세포(third row Deiters' cell), 헨센 세포(Hensen's cell), 클라우디우스 세포(Claudius cell), 나선융기 세포(spiral prominence cell), 근부 세포(root cell), 치간 세포(interdental cell), 혈관조(stria vascularis)의 기저세포(basal cell), 혈관조의 중간세포(intermediate cell), 혈관조의 변연세포(marginal cell), 나선 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron), 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막(Reissner's membrane)의 세포 및 아교세포(glial cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 내이 세포 유형을 형질도입하는 양으로 유효량의 혈청형 1 아데노-관련 바이러스(AAV1) 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 10개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 15개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 외유모 세포, 전정 유모 세포, 전정 흑색 세포, 전정 섬유세포, 스카르파 신경절 뉴런, 전정 모세혈관의 내피세포, 전정 지지 세포, 경계 세포, 내지상 세포, 내주 세포, 외주 세포, 제1 열 다이테르스 세포, 제2열 다이테르스 세포, 제3열 다이테르스 세포, 헨센 세포, 클라우디우스 세포, 나선융기 세포, 근부 세포, 치간 세포, 혈관조의 기저세포, 혈관조의 중간세포, 혈관조의 변연세포, 나선 신경절 뉴런, 달팽이관 모세혈관의 내피세포, 섬유세포, 라이너스막의 세포 및 아교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 20개 이상의 세포 유형을 형질도입하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 주어진 세포 유형 또는 모든 내이 세포 유형의 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 형질도입하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 상기 대상체의 중이 또는 내이에 국소적으로 투여되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 고실경유(transtympanically) 또는 고실내(intratympanically)로 투여되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 표 5의 프로모터의 리스트로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 유비쿼터스 프로모터를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 표 2의 리스트로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  12. 인간 대상체의 지지 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, GFAP 프로모터, GLAST 프로모터, Hes1 프로모터, JAG1 프로모터, Notch1 프로모터, LGR5 프로모터, SOX2 프로모터, Hes5 프로모터 및 SOX9 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Sox9, Spalt 유사 전사 인자 2(Sall2), 칼모듈린 결합 전사 활성자 1(Camta1), YRPW 모티프 2를 갖는 Hes 관련 패밀리 BHLH 전사 인자(Hey2), Gata 결합 단백질 2(Gata2), YRPW 모티프 1을 갖는 Hes 관련 패밀리 BHLH 전사 인자(Hey1), 세라마이드 신테이스 2(Lass2), SRY-박스 10(Sox10), GATA 결합 단백질 3(Gata3), Cut 유사 호메오박스 1(Cux1), 핵수용체 서브패밀리 2 그룹 F 멤버(Nr2f1), Hes 패밀리 BHLH 전사 인자 1(Hes1), RAR 관련 희귀 수용체 B(Rorb), Jun 원종양 유전자 AP-1 전사 인자 서브유닛(Jun), 아연 핑거 단백질 667(Zfp667), LIM 호메오박스 3(Lhx3), 네션트 헬릭스-루프-헬릭스 1(Nhlh1), MAX 이량체화 단백질 4(Mxd4), 아연 핑거 MIZ-유형 함유 1(Zmiz1), 마이엘린 전사 인자 1(Myt1), 신호 변환자 및 전사 활성자 3(Stat3), BarH 유사 호메오박스 1(Barhl1), 흉선세포 선택 관련 고 이동성 그룹 박스(Tox), 프로스페로 호메오박스 1(Prox1), 핵 인자 I A(Nfia), 갑상선 호르몬 수용체 베타(Thrb), MYCL 원종양 유전자 BHLH 전사 인자(Mycl1), 라이신 데메틸레이스 5A(Kdm5a), CAMP 반응성 요소 결합 단백질 3 유사 4(Creb3I4), ETS 변이체 1(Etv1), 부계 발현 3(Peg3), BTB 도메인 및 CNC 상동체 2(Bach2), ISL LIM 호메오박스(Isl1), 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 38(Zbtb38), 지아 및 H귀t 발달(Lbh), 터비 이분형 전사 인자(Tub), 유비퀴틴 C(Hmg20), RE1 침묵 전사 인자(Rest), 아연 핑거 단백질 827(Zfp827), AF4/FMR2 패밀리 멤버 3(Aff3), PBX/노티드 1 호메오박스 2(Pknox2), AT-풍부 상호작용 도메인 3B(Arid3b), MLX 상호작용 단백질(Mlxip), 아연 핑거 단백질(Zfp532), IKAROS 패밀리 아연 핑거 2(Ikzf2), Spalt 유사 전사 인자 1(Sall1), SIX 호메오박스 2(Six2), Spalt 유사 전사 인자 3(Sall3), Lin-28 상동체 B(Lin28b), Pou4f3, 조절 인자 X7(Rfx7), Atoh1, 328, 331 및/또는 334번 아미노산에 돌연변이를 포함하는 Atoh1 변이체, Gfi1, Sox4, Bdnf, Ntf3, Sox11, Tead2, Yap1 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인, 방법.
  14. 인간 대상체의 내이의 유모세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3, 막관통 및 테트라트라이코펩타이드 반복부 함유 4(Tmtc4) 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인, 방법.
  16. 인간 대상체의 외유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터, STRC 프로모터 및 ATP2B2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Strc, Tmc1, Myo7a, Ush1c, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, ISL LIM 호메오박스 1(Isl1), Clrn1, 프로토카데린 관련 15(Pcdh15), 카데린 관련 23(Cdh23), Chrna9, Chrna10, Ocm, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인, 방법.
  18. 인간 대상체의 달팽이관 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, 오토펠린(Otof), 용질 운반체 패밀리 17 멤버 8(Vglut3), Strc, Chrna9, Chrna10, Ocm, Tmc1, Myo7a, Ush1c, 윌린, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인, 방법.
  20. 인간 대상체의 내유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, OTOF 프로모터, 섬유아세포 성장인자 8(FGF8) 프로모터 및 용질 운반체 패밀리 17 멤버 8(SLC17A8) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Otof, Vglut3, 윌린, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, Myo7a, Tmc1, Ush1c, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인, 방법.
  22. 인간 대상체의 전정 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터, MYO7프로모터, ATP2B2 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 윌린, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인, 방법.
  24. 인간 대상체의 주상 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, CD44 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 신경 성장인자 수용체(Ngfr), Bdnf, Ntf3, 텍토린 베타(Tectb), 텍토린 알파(Tecta), Gjb2 또는 간극결합 단백질 베타 6(Gjb6)을 암호화하는, 방법.
  26. 인간 대상체의 나선 신경절 뉴런에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, BHLHE22 프로모터, SYN 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3 또는 뉴클레이스를 암호화하거나, 또는 마이크로RNA이거나 RGMA에 대해 지시된 shRNA인, 방법.
  28. 인간 대상체의 혈관조의 변연세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, KCNQ1 프로모터, KCNE1 프로모터 및 GJB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 인간 대상체의 혈관조의 기저세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, CLDN11 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 인간 대상체의 혈관조의 중간세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, KCNJ10 프로모터, GJB2 프로모터 및 TYR 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Kcnq1, Kcne1, Tyr, Gjb2, Gjb6 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인, 방법.
  32. 인간 대상체의 경계 세포 및/또는 내지상 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, GLAST 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, 막관통 단백질 16A(Tmem16a), Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
  34. 인간 대상체의 다이테르스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, FGFR3 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, IKAROS 패밀리 아연 핑거 2(Ikzf2), Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
  36. 인간 대상체의 헨센 세포 및/또는 클라우디우스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, FRZB 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
  38. 인간 대상체의 나선융기 세포 및/또는 근부 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, SLC26A4 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Slc26a4인, 방법.
  40. 인간 대상체의 치간 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, CEACAM16 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Ceacam16, 오토안코린(Otoa), Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는, 방법.
  42. 인간 대상체의 아교세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, PMP22 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Pmp22, Bdnf, Ntf3 또는 마이엘린 단백질 제로(Mpz)를 암호화하는, 방법.
  44. 인간 대상체의 전정 흑색 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, KCNE1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Kcnq1, Kcne1 또는 Slc26a4를 암호화하는, 방법.
  46. 인간 대상체의 섬유세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, POU3F4 프로모터 또는 GJB2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Gjb2, Gjb6 또는 콜라겐을 암호화하는, 방법.
  48. 인간 대상체의 스카르파 신경절 뉴런에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, TUBB3 프로모터 및 SYN 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 Bdnf 또는 Ntf3을 암호화하거나 또는 반발성 유도 분자 BMP 공동-수용체 A(RGMA)에 대해 지시된 shRNA인, 방법.
  50. 인간 대상체의 지지 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Sox9, Sall2, Camta1, Hey2, Gata2, Hey1, Lass2, Sox10, Gata3, Cux1, Nr2f1, Hes1, Rorb, Jun, Zfp667, Lhx3, Nhlh1, Mxd4, Zmiz1, Myt1, Stat3, Barhl1, Tox, Prox1, Nfia, Thrb, Mycl1, Kdm5a, Creb3I4, Etv1, Peg3, Bach2, Isl1, Zbtb38, Lbh, Tub, Hmg20, Rest, Zfp827, Aff3, Pknox2, Arid3b, Mlxip, Zfp532, Ikzf2, Sall1, Six2, Sall3, Lin28b, Pou4f3, Rfx7, Atoh1, 328, 331 및/또는 334번 아미노산에 돌연변이를 포함하는 Atoh1 변이체, Gfi1, Sox4, Bdnf, Ntf3, Sox11, Tead2, Yap1 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 프로모터는 GFAP 프로모터, GLAST 프로모터, Hes1 프로모터, JAG1 프로모터, Notch1 프로모터, LGR5 프로모터, SOX2 프로모터, Hes5 프로모터 및 SOX9 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  52. 인간 대상체의 내이의 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 인간 대상체의 외유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Strc, Tmc1, Myo7a, Ush1c, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, Chrna9, Chrna10, Ocm, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 프로모터는 SLC26A5 프로모터, OCM 프로모터, STRC 프로모터 및 ATP2B2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  56. 인간 대상체의 달팽이관 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh15, Cdh23, Otof, Vglut3, Strc, Chrna9, Chrna10, Ocm, Tmc1, Myo7a, Ush1c, 윌린, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터 및 MYO7프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  58. 인간 대상체의 내유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Otof, Vglut3, 윌린, Atoh1, Pou4f3, Gfi1, Isl1, Clrn1, Pcdh14, Cdh23, Myo7a, Ush1c, Tmc1, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 프로모터는 OTOF 프로모터, FGF8 프로모터 및 SLC17A8 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  60. 인간 대상체의 전정 유모 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, 윌린, Bdnf, Ntf3, Tmtc4 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 프로모터는 MYO15 프로모터, GFI1 프로모터, POU4F3 프로모터, MYO7프로모터, ATP2B2 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  62. 인간 대상체의 주상 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Ngfr, Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 프로모터는 CD44 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
  64. 인간 대상체의 나선 신경절 뉴런에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Bdnf, Ntf3 또는 뉴클레이스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 마이크로RNA 또는 RGMA에 대해 지시된 shRNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 프로모터는 BHLHE22 프로모터, SYN 프로모터 및 CALB2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  66. 인간 대상체의 혈관조의 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Kcnq1, Kcne1, Gjb2, Gjb6, Tyr 또는 뉴클레이스를 암호화하거나 또는 마이크로RNA인 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 세포는 혈관조의 변연세포이고, 프로모터는 KCNQ1 프로모터, GJB2 프로모터 또는 KCNE1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 세포는 혈관조의 기저세포이고, 상기 프로모터는 CLDN11 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 세포는 혈관조의 중간세포이고, 상기 프로모터는 KCNJ10 프로모터, GJB2 프로모터 및 TYR 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  70. 인간 대상체의 경계 세포 및/또는 내지상 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, Tmem16a, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 프로모터는 GLAST 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
  72. 인간 대상체의 다이테르스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Bdnf, Ntf3, Tectb, Tecta, Ikzf2, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 프로모터는 FGFR3 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
  74. 인간 대상체의 헨센 세포 및/또는 클라우디우스 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 프로모터는 FRZB 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
  76. 인간 대상체의 나선융기 세포 및/또는 근부 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Slc26a4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 프로모터는 SLC26A4 프로모터인, 방법.
  78. 인간 대상체의 치간 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Ceacam16, Otoa, Gjb2 또는 Gjb6을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 프로모터는 CEACAM16 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
  80. 인간 대상체의 아교세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Pmp22, Bdnf, Ntf3 또는 Mpz를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 프로모터는 PMP22 프로모터인, 방법.
  82. 인간 대상체의 전정 흑색 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Kcnq1, Kcne1 또는 Slc26a4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 프로모터는 KCNE1 프로모터인, 방법.
  84. 인간 대상체의 섬유세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Gjb2, Gjb6 또는 콜라겐을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 프로모터는 POU3F4 프로모터 또는 GJB2 프로모터인, 방법.
  86. 인간 대상체의 스카르파 신경절 뉴런에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법으로서, Bdnf 또는 Ntf3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 RGMA에 대해 지시된 shRNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유효량의 AAV1 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 프로모터는 TUBB3 프로모터 및 SYN 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  88. 제1항 내지 87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 야생형 AAV1 캡시드를 포함하는, 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 AAV2 역 말단 반복 서열(ITR)을 포함하는, 방법.
  90. 표 5의 프로모터의 리스트로부터 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV1 벡터.
  91. 제90항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표 2에 열거된 폴리뉴클레오타이드로부터 선택되는, AAV1 벡터.
  92. 표 2에 열거된 폴리뉴클레오타이드로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 AAV1 벡터.
  93. 제92항에 있어서, 프로모터는 표 5의 프로모터의 리스트로부터 선택되는, AAV1 벡터.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 AAV2 ITR을 포함하는, AAV1 벡터.
  95. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV1 벡터는 야생형 AAV1 캡시드를 포함하는, AAV1 벡터.
  96. 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 AAV1 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  97. 제96항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 내이 또는 중이에 국소 투여하기 위해 제형화된, 약제학적 조성물.
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