KR20180097631A - 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법 - Google Patents

핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법 Download PDF

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콘스탄티나 스탠코빅
루크 에이치. 반덴버게
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그웨나엘 갈레옥
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매사추세츠 아이 앤드 이어 인퍼머리
더 셰펜스 아이 리써치 인스티튜트
칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
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Abstract

본원에서는 핵산을 와우 및 전정 세포에 효율적으로 전달하기 위한 물질 및 방법을 제공한다.

Description

핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법
본 개시내용은 일반적으로 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.
유전학상 그에 기반을 둔 청력 손실은 와우 임플란트 이외의 다른 치료학적 옵션이 거의 없는 중대한 문제이다. 유전된 청력 장애는 대개 단일 유전자 결손에 기인한다. 영아 500명 중 1명이 언어 습득 전 청각 장애 진단을 받고 있으며, 그 중 약 50%는 유전적 병인을 갖고 있다. 각각이 다수의 상이한 유전자 중 임의의 것에서 돌연변이에 의해 유발될 수 있는 것인 다수의 상이한 임상적 서브타입과 연관이 있는 어셔(Usher) 증후군은 유아기 청각 장애 중 3 내지 6%의 원인이 되며, 모든 유전적 청각 장애 중 1-2%로 추정되는, 보다 빈번한 유전적 결손 중 하나는 TMC1 유전자에서 발생한다.
내이, 예컨대, 와우, 특히, 와우내 내유모 세포 및 외유모 세포 (IHC 및 OHC)는 각종 병인의 청력 손실 및 청각 장애에서 가장 직접적으로 일유전자성 형태의 유전된 청각 장애에 개입하는 유전자 요법 접근법을 위한 매력적인 표적이다. 그러나, IHC 및 OHC 뿐만 아니라, 유전자 요법 접근법에 적절할 수 있는 다른 내이 세포를 효율적으로 표적화하고 형질도입시키는 것은 어려운 것이었다.
전 세계적으로 청력 손실은 가장 흔한 감각 장애이며, 언어 습득 전 청각 장애 중 절반은 유전적 원인에 기인한다. 그럼에도 불구하고, 와우 유전자 요법을 임상으로 옮기는 것은 안전하고 임상적으로 적절하며 효율적인 전달 방식의 결여로 인해 지연되고 있다. 그러나, Anc80 캡시드 단백질을 함유하는 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 기반한 새로운 조성물 및 방법을 포함하는, 본원에 기술된 신규한 유전자 전달 방식이 IHC 및 OHC 둘 모두를 포함하는 내이 세포로의 고도로 효율적인 유전자 전달을 제공한다. 본원에 제시된 바와 같이, Anc80 또는 특이적 Anc80 캡시드 단백질 (예컨대, Anc80-0065)로 지칭되는 조상 스캐폴드 캡시드 단백질을 함유하는 아데노 연관 바이러스 (AAV)가 놀랍게도 생체내에서 IHC 및 OHC 둘 모두를 포함하는 내이 중의 각종 세포를 표적화하는 데 효율적이다.
한 측면에서, Anc80 캡시드 단백질 및 TMC1 또는 TMC2 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터를 제공한다. 또 다른 측면에서, Anc80 캡시드 단백질, 및 MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 이종 프로모터를 추가로 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 대상체에서 내이 중의 하나 이상의 세포에 트랜스진을 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 전형적으로 대상체에서 내이에 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질 및 트랜스진을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 대상체에서 청력 장애를 치료하거나 (예컨대, 청력 회복), 청력 손실 (또는 추가의 청력 손실)을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 전형적으로 대상체에게 AAV를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질, 및 내이 중의 하나 이상의 세포에서 발현되었을 때 대상체의 청력을 회복시키는 트랜스진을 포함한다.
한 실시양태에서, 내이 중의 하나 이상의 세포는 내유모 세포 (IHC) 및 외유모 세포 (OHC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 적어도 80%의 내유모 세포 및 적어도 80%의 외유모 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 내이 중의 하나 이상의 세포는 나선 신경절 뉴런, 전정 유모 세포, 전정 신경절 뉴런, 지지 세포, 및 혈관조 중의 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP, NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1, WFS1, WHRN, 및 XIAP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 신경 영양 인자 (예컨대, GDNF, BDNF, NT3, 및 HSP70)를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 항체 또는 그의 단편을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 면역조절 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 항-종양원성 전사체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 안티센스, 침묵화, 또는 장쇄 비-코딩 RNA 종을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 유전자 조작된 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 및 CRISPR로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 편집 시스템을 코딩한다.
일부 실시양태에서, Anc80 캡시드 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 제시된 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, Anc80 캡시드 단백질은 서열식별번호: 2에 제시된 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 이종 프로모터 서열의 제어하에 있다. 대표적인 이종 프로모터 서열은 비제한적으로 CMV 프로모터, CBA 프로모터, CASI 프로모터, PGK 프로모터, EF-1 프로모터, 알파9 니코틴성 수용체 프로모터, 프레스틴 프로모터, KCNQ4 프로모터, Myo7a 프로모터, Myo6 프로모터, Gfi1 프로모터, Vglut3 프로모터, 및 Atoh1 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 원창을 통해 Anc AAV를 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Anc AAV는 원창을 통한 주사를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, Anc AAV는 와우개창술 동안 또는 반고리관 절개술 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, Anc AAV는 하나 이상의 약물 전달 비히클을 통해 중이 및/또는 원창에 투여된다.
일부 실시양태에서, 트랜스진의 발현을 통해 내유모 세포 (IHC), 외유모 세포 (OHC), 나선 신경절 뉴런, 혈관조, 전정 유모 세포, 및/또는 전정 신경절 뉴런 (예컨대 Atoh1, NF2)이 재생되고, 이에 의해 청력 또는 전정 기능이 회복된다.
한 측면에서, AAV 벡터 및 제약 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품에서, AAV 벡터는 Anc80 캡시드 단백질 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP, NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1, WFS1, WHRN, 및 XIAP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 내이 중의 하나 이상의 세포에 TMC1 또는 TMC2 트랜스진을 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 전형적으로 대상체에서 내이에 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질 및 트랜스진을 포함한다. 추가의 또 다른 측면에서, 대상체에서 청력 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 전형적으로 대상체에게 AAV를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질, 및 내이 중의 하나 이상의 세포에서 발현되었을 때 대상체의 청력을 회복시키거나 또는 대상체에서 청력 손실 (예컨대, 추가의 청력 손실)을 예방하는 TMC1 또는 TMC2 트랜스진을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 대상체에서 내이 중의 하나 이상의 세포에 어셔 트랜스진을 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 전형적으로 대상체에서 내이에 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질 및 트랜스진을 포함한다. 추가의 또 다른 측면에서, 대상체에서 청력 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 AAV를 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질, 및 내이 중의 하나 이상의 세포에서 발현되었을 때 대상체의 청력을 회복시키는 어셔 트랜스진을 포함한다. 대표적인 어셔 트랜스진은 비제한적으로 MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7을 포함한다.
한 실시양태에서, 내이 중의 하나 이상의 세포는 내유모 세포 (IHC) 및 외유모 세포 (OHC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 적어도 80%의 내유모 세포 및 적어도 80%의 외유모 세포에 전달된다. 한 실시양태에서, 내이 중의 하나 이상의 세포는 나선 신경절 뉴런, 전정 유모 세포, 전정 신경절 뉴런, 지지 세포 및 혈관조 중의 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, Anc80 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 제시된 서열을 가진다. 한 실시양태에서, Anc80 캡시드 단백질은 서열식별번호: 2에 제시된 서열을 가진다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 이종 프로모터 서열의 제어하에 있다. 대표적인 이종 프로모터 서열은 비제한적으로 CMV 프로모터, CBA 프로모터, CASI 프로모터, PGK 프로모터, EF-1 프로모터, 알파9 니코틴성 수용체 프로모터, 프레스틴 프로모터, KCNQ4 프로모터, Myo7a 프로모터, Myo6 프로모터, Gfi1 프로모터, Vglut3 프로모터, 및 Atoh1 프로모터를 포함한다.
한 실시양태에서, 투여 단계는 원창을 통해 Anc AAV를 주사하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, Anc AAV는 원창을 통한 주사를 통해 투여된다. 한 실시양태에서, Anc AAV는 와우개창술 동안 또는 반고리관 절개술 동안 투여된다. 한 실시양태에서, Anc AAV는 하나 이상의 약물 전달 비히클을 통해 중이 및/또는 원창에 투여된다.
한 실시양태에서, 트랜스진의 발현을 통해 내유모 세포 (IHC), 외유모 세포 (OHC), 나선 신경절 뉴런, 혈관조, 전정 유모 세포, 및/또는 전정 신경절 뉴런 (예컨대 Atoh1, NF2)이 재생되고, 이에 의해 청력 또는 전정 기능이 회복되고/거나, 청력 손실 (예컨대, 추가의 청력 손실)이 예방된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 방법 및 물질의 조성물이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 방법 및 물질이 본 방법 및 물질의 조성물을 실시하거나, 또는 시험하는 데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기술된다. 추가로, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
파트 1: 고도로 효율적인 와우 유전자 전달
도 1A-1G는 C57BL/6 마우스의 와우 외식편에서의 eGFP 트랜스진 발현에 대한 여러 AAV 혈청형에 관한 시험관내 비교의 대표적인 공초점 투사를 보여주는 영상이다. 도 1A-1G는 모든 혈청형에 대한 와우 기저에서의, 및 명시된 AAV에 대한 첨단 및 기저에서의 발현을 보여준다. 스케일 바 = 100 ㎛. 상단: Myo7A+TuJ1; 하단: 오직 eGFP만; 중간: 오버레이; S. 세포: 지지 세포, OHC: 외유모 세포, IHC: 내유모 세포. 도 1H-1K는 48 h 또는 48h+5일 동안의 인큐베이션 후, 100 ㎛당 eGFP 양성 유모 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다. 48 h의 경우, N=3, 및 48h+5d의 경우, N=2. 에러 바는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 2A-2G는 각 패널 상에 명시된 역가에서의 명시된 AAV 혈청형의 생체내 와우 형질도입을 보여주는 영상이다. 도 2A는 알렉사-546-팔로이딘 (적색)으로 대조염색되고 eGFP (녹색)에 대해 영상화된 마우스 코르티 기관의 공초점 영상이다. 스케일 바 = 50 ㎛. 도 2B는 AAV-eGFP를 주사한 와우의 기저 및 첨단에서의 eGFP 양성 IHC의 정량화를 보여주는 그래프이다. 도 2C는 AAV-eGFP를 주사한 와우의 기저 및 첨단에서의 eGFP 양성 OHC의 정량화를 보여주는 그래프이다. 도 2D는 P7째에 (좌측) eGFP 음성 OHC (검은색) 및 eGFP 양성 OHC (녹색)로부터 기록된 감각 형질도입 전류 패밀리를 보여주는 영상이다. 수직 스케일 바는 200 pA를 나타내고; 수평 스케일 바는 20 msec를 나타낸다. eGFP 음성 (검은색) 및 eGFP 양성 (녹색) P35 IHC로부터의 전류는 우측에 제시되어 있다. 수직 스케일 바는 100 pA를 나타내고; 수평 스케일 바는 20 msec를 나타낸다. 도 2E는 하단에 명시된 연령 시점에서의 103 IHC 및 OHC에 대하여 플롯팅된 감각 형질도입 전류 진폭을 보여주는 그래프이다. eGFP 음성 (검은색) 및 eGFP 양성 (녹색)으로부터의 데이터가 제시되어 있다. 각 군의 세포 개수는 그래프 상에 제시되어 있다. 도 2F는 평균 ± 표준 편차 (SD)를 보여주는 그래프이다. ABR 임계값은 주사와 관련된 손상에 기인하여 eGFP 형광을 보이지 않는 1개의 주사된 귀 (적색)로부터의 데이터와 함께, 4개의 Anc80-주사한 귀 (녹색) 및 4개의 주사하지 않은 귀 (검은색)에 대하여 플롯팅된 것이다. 도 2G는 평균 ± SD를 보여주는 그래프이다. DPOAE 임계값은 4개의 Anc80-주사한 귀 (녹색) 및 4개의 주사하지 않은 귀 (검은색), 및 eGFP 형광을 보이지 않는 주사에 의해 손상된 1개의 음성 대조군 귀 (적색)에 대하여 플롯팅된 것이다. 도 2B-2G에서의 데이터 점에 대한 주사 역가는 도 2A에서의 것과 같다.
도 3A-3D는 전정 감각 상피에서의 Anc80-eGFP 형질도입을 보여주는 영상이다. 도 3A는 1 ㎕ Anc80-eGFP (1.7 x 1012 GC/mL)를 주사한 P1 마우스로부터의 마우스 난형낭을 보여주는 영상이다. 조직을 수확하고, 고정시키고, 알렉사546-팔로이딘 (적색)으로 염색하고, eGFP (녹색)에 대해 영상화하였다. 스케일 바 = 100 ㎛. 도 3B는 도 3A에 기술된 것과 동일한 마우스로부터의 후방 반고리관 능선을 보여주는 영상이다. 스케일 바 = 50 ㎛. 도 3C는 인간 난형낭의 감각 상피를 보여주는 영상이다. 조직을 Anc80-eGFP 벡터에 노출시키고, 배양하고, 고정시키고, 알렉사546-팔로이딘 (적색)으로 염색하고, eGFP 형광 (녹색)에 대하여 영상화하였다. 스케일 바 = 100 ㎛. 도 3D는 도 3C에서와 동일한 조건으로 형질도입된, 알렉사546-팔로이딘 (적색) 및 Myo7A (청색)로 염색되고 eGFP (녹색)에 대해 영상화된, 난형낭 중의 인간 상피의 고배율 확대도를 보여주는 영상이다. 오버레이 패널 중의 흰색 화살표 표시는 선택된 eGFP-양성/Myo7A-양성 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 20 ㎛.
도 4A-4J는 CBA/CaJ 마우스의 와우 외식편에서의 eGFP 발현에 관한 여러 AAV 혈청형의 시험관내 비교에 관한 대표적인 영상이다. 도 4A-4F는 동일한 용량으로 AAV 혈청형을 인큐베이션시킨 이후의 결과를 보여주는 영상이다. 스케일 바 = 200 ㎛. 도 4G-4J에 제시된 에러 바는 SEM을 나타낸다.
도 5A-5H는 감염된 세포의 강도 및 개수의 관점에서 발현 범위를 나타내는 0 (도 5D, 5H) (최저 발현)부터 3 (도 5A, 5E) (최고 발현 수준)까지의 범위의 eGFP 정성적 발현 스코어링 체계를 보여주는 영상이고, 여기서 "0"은 관찰된 발현이 없다는 것을 나타내고 (도 5D, 5H), "1"은 선택적 개수의 세포만이 희미하게 발현한다는 것을 나타내고 (도 5C, 5G), "2"는 현미경 시야당 유의한 개수의 세포가 낮은 정도 내지 중간 정도의 발현 수준을 갖는다는 것을 나타내고 (도 5B, 5F), "3"은 높은 비율의 세포가 중간 정도 내지 높은 범위의 수준으로 eGFP를 발현한다는 것을 나타낸다 (도 5A, 5E). 도 5A (도 5A-5D의 경우), 및 도 5E (도 5E-5H의 경우)에 제시된 스케일 바 = 20 ㎛.
도 6은 상기 도 5에서 상세하게 설명된 eGFP 스코어링 체계를 사용하여 C57BL/6 마우스의 변연부, 지지 세포, 및 나선 신경절 뉴런에서의 eGFP 발현을 보여주는 그래프이다. 에러 바는 SEM을 나타낸다. 현미경 시야당 eGFP 양성 세포 계수에 의해 SGN 형질도입을 평가하였다.
도 7은 상기 도 5에서 상세하게 설명된 eGFP 스코어링 체계를 사용하여 CBA/CaJ 마우스의 변연부, 지지 세포, 및 나선 신경절 뉴런에서의 eGFP 발현을 보여주는 그래프이다. 에러 바는 SEM을 나타낸다. 현미경 시야당 eGFP 양성 세포 계수에 의해 SGN 형질도입을 평가하였다.
도 8A-8E는 Anc80을 이용한 뮤린 와우에서의 광범위한 내유모 세포 및 외유모 세포 형질도입을 보여주는 영상이다. 도 8A는 Anc80-eGFP를 주사한 마우스 와우의 전체 첨단부의 저배율도를 보여주는 영상이다. 와우를 수확하고, 알렉사546-팔로이딘 (적색)으로 염색하고, eGFP (녹색)에 대해 영상화하였다. 스케일 바 = 100 ㎛. 도 8B는 Anc80-eGFP를 주사한 상이한 마우스로부터의 기저부의 고배율 확대도를 보여주는 영상이다. 와우를 수확하고, 알렉사546-팔로이딘 (적색)으로 염색하고, eGFP (녹색)에 대해 영상화하였다. 스케일 바 = 20 ㎛. 도 8C 및 8D는 C57BL/6 마우스의 원창 주사 이후의 내유모 세포 및 외유모 세포 형질도입 효율의 정량적 비교를 보여주는 그래프이다. 도 8E는 Anc80 유모 세포 형질도입의 용량 의존성을 보여주는 영상이다. 와우를 2개의 상이한 Anc80-eGFP 역가에 노출시키고, 고정시키고, 알렉사546-팔로이딘 (적색)으로 염색하고, eGFP (녹색)에 대해 영상화하였다. 스케일 바 = 20 ㎛.
도 9A-9H는 TuJ1 (적색) 및 Myo7A (마젠타)에 대해 염색된 조직 절편에서의 eGFP 트랜스진 발현에 대해 평가된, 마우스 와우의 기저부터 첨단까지의 양측 와우 형질도입을 보여주는 영상이다. 효율적인 Anc80 형질도입이 주사한 와우에서 첨단까지 확장되어 관찰되었고 (도 9A/9F), 또한 주사하지 않은 반대쪽 귀에서도 관찰되었다 (도 9B-9E = 첨단에서부터 기저까지). eGFP 양성 및 TuJ1-양성 나선 신경절 뉴런의 클로즈업 영상 (도 9G). Anc80 형질도입의 SGN 평가를 위해 재구축된 3D 영상 (도 9H). 스케일 바 100 ㎛ (도 9A-9E) 및 20 ㎛ (도 9F/9G).
도 10A-10B는 Anc80을 와우 한쪽에 주사한 이후의 마우스 뇌의 축방향 단면을 보여주는 대표 현미경 영상이다 (도 10A). 소뇌, 특히 푸르키니에 세포 (흰색 화살표 표시)에서 뚜렷한 발현이 관찰되었다 (도 10B). 스케일 바 1 mm (도 10a) 및 300 ㎛ (도 10b). 도 10C는 주사하지 않은 동물 및 Anc80 RWM-주사한 동물에서의 혈청 및 뇌척수액 (CSF) 중의 항-AAV 중화 항체 (NAB) 역가를 보여주는 영상이다. 역가는 NAB 검정법에서 형질도입의 50% 억제가 관찰된 혈청 또는 CSF의 희석률을 반영한다. 샘플 부피 제한으로 인해, 혈청 NAB에 대한 감도 한계는 1/4이고, CSF의 경우에는 1/52.5였다.
도 11A-11B는 각각 Anc80 와우 형질도입 이후의 전정 기능을 보여주는 영상 및 그래프이다. 마우스에 Anc80-eGFP를 주사하고, 발현 및 로타로드 장치 상에서의 균형 기능에 대해 평가하였다. 도 11A는 Myo7A (적색)에 대한 면역형광 염색과 함께 공초점 현미경법을 통한 전정 조직에서의 eGFP (녹색)의 발현을 보여주는 영상이다. 도 11B는 마우스가 장치에서 낙하까지의 평균 시간 +/- SEM을 보여주는 그래프이다. 스케일 바 = 50 ㎛
파트 2 - 유전자 요법이 어셔 증후군 마우스 모델에서 기능을 회복시킨다
도 12A-12L은 Ush1c c.216G>A 돌연변이체 마우스에서의 코르티 기관의 주사 전자 현미경법을 보여주는 영상이다. 도 12A-12F는 c.216GA 및 c.216AA 돌연변이체 마우스에서의 영상화된 코르티 기관의 기저, 중간 및 첨단 영역을 보여주는 영상이다. 도 12G-12L은 OHC (도 12G-12H) 및 IHC (도 12I-12J)의 고배율 영상이다. 별표 표시는 보존된 유모 다발을 나타내고; 화살촉 표시는 비조직화된 유모 다발을 나타내고; 화살표 표시는 파상 IHC 다발을 나타낸다. 스케일 바 저배율: 5 ㎛ (도 12A-12F); 고배율: 2 ㎛ (도 12G), 3 ㎛ (도 12H), 2 ㎛ (도 12I-12J) 및 1 ㎛ (도 12K, 12L).
도 13A-13H는 Ush1c c.216G>A 신생 돌연변이체 마우스의 유모 세포에서의 기계적 형질도입을 보여주는 영상이다. 도 13A-13D는 c.216GA 및 c.216AA 마우스의 유모 세포에서의 개방 형질도입 채널의 존재를 평가하는 FM1-43 염색을 보여주는 영상이다. IHC가 상이한 초점면에 있기 때문에, IHC FM1-43 형광은 보다 흐리게 보인다. 좌측: DIC, 우측: FM1-43; 스케일 바 10 ㎛; 도 13C, 스케일 바 50 ㎛; 도 13D, 스케일 바 10 ㎛. 도 13D 상의 흰색 선은 스트리올라(striola) (흡수 부재) 및 스트리올라외 영역 (흡수)을 나타낸 것이다. 도 13E-13H는 신생 c.216GA 및 c.216AA 마우스의 OHC, IHC 및 VHC에서 평가된 기계적 형질도입을 보여주는 그래프이다. 대표적인 형질도입 전류 (도 13E), 2차 볼츠만 함수로 피팅된, 그와 연관된 전류/변위 플롯 (도 13F) 및 평균 피크 형질도입 전류가 플롯팅되어 있다 (도 13G-13H). 평균 피크 형질도입은 두 유전자형 사이에 OHC, IHC 및 VHC에서 유의하게 상이하였다 (***P < 0.01, 일원 ANOVA).
도 14A-14E는 시험관내 및 생체내에서 아데노 연관 바이러스 벡터에 노출된 조직 중의 형광 표지된 하모닌의 발현 및 국재화를 보여주는 영상이다. 도 14A-14C는 AAV2/1 벡터에 노출되고, 배양되고, 고정되고, 대조염색되고 (알렉사 플루오르 팔로이딘, 인비트로겐(Invitrogen)), 공초점 현미경으로 영상화된 예리하게 절개 내이 조직을 보여준다. 도 14A 스케일 바: 10 ㎛ - 상부 패널; 5 ㎛- 하부 패널; 도 14B 스케일 바: 10 ㎛; 도 14C 스케일 바: 3 ㎛; 도 14D 스케일 바: 30 ㎛; 도 14E 스케일 바: 5㎛.
도 15A-15C는 Anc80 하모닌 벡터를 주사한 마우스의 유모 세포에서의 기계적 형질도입의 회복을 보여주는 영상이다. 도 15A-15C는 c.216AA 주사하지 않은 대조군 마우스, 및 Anc80 하모닌-b1을 주사한 c.216AA 마우스 또는 Anc80 하모닌-b1 및 Anc80 하모닌-a1의 조합을 주사한 c.216AA 마우스의 IHC에서 기록된 기계적 형질도입 전류를 보여준다. 기관형 배양물을 제조하고, 기록을 수행하였다. 각 데이터세트 및 이중 볼츠만 피팅 함수에 대한 상응하는 I/X 곡선. 각각의 최대 기계적 형질도입 전류 Imax= 102.1 pA (c.216AA); 424.3 pA (c.216AA + 하모닌-b1) 및 341.1 pA (c.216AA + 하모닌-a1&-b1) (도 15B). 평균 반응 (평균 ± SD)은 주사하지 않은 마우스 대비 하모닌-b1 및 하모닌-a1 + -b1을 주사한 마우스에서의 형질도입의 유의한 회복 (***P < 0.001)을 나타낸다. 평균 형질도입 전류는 하모닌-b1을 주사한 마우스 및 c.216GA 대조군 마우스에서 유의한 차이를 보이지 않았다 (NS P>0.5). 기계적 형질도입의 회복은 또한 하모닌-a 및 하모닌-b를 조합하였을 때 유의하게 개선되지 않았다. 도 15C는 일원 ANOVA를 나타낸다.
도 16A-16E는 Anc80 하모닌-b1을 주사한 마우스에서의 ABR 및 DPOAE 임계값 회복을 보여주는 영상이다. 도 16A는 c.216AA 대조군 마우스, 및 하모닌-a1, 하모닌-b1, 또는 둘의 조합을 코딩하는 벡터를 주사한 c.216AA 마우스에서의 16 kHz 톤에 대한 대표적인 ABR 반응을 보여주는 영상이다. 하모닌-b1 단독, 또는 하모닌-a1 및 b1을 함께 주사한 마우스에서 ABR 임계값이 거의 30 dB SPL까지 회복된 것이 관찰되었다. 도 16B는 c.216 AA; c.216GA; c.216AA + 하모닌-a1; c.216AA + 하모닌-b1; c.216AA + 하모닌-a1&-b1에 대하여 수득된 평균 ABR 반응을 보여주는 영상이다. 평균 ± SE, 실선. 점선: 도 16A에서 16 kHz 기록을 보인 마우스에서의 전체 주파수 범위에 대한 ABR 임계값. 도 16C는 c.216AA; c.216GA; c.216AA + 하모닌-a1; c.216AA + 하모닌-b1; c.216AA + 하모닌-a1&-b1에 대하여 수득된 평균 DPOAE 반응을 보여준다. 평균 ± SE, 실선. 점선: 도 16A에 도시된 기록을 보인 4마리의 마우스에 대한 DPOAE 임계값. 화살표 표시는 임계값이 시험된 최대 자극 수준보다 높다는 것을 나타낸다. 도 16D-16E는 45 dB 이하의 초기 ABR 임계값을 보인 마우스에서 6주째 및 3개월째에 수득된 ABR 및 DPOAE 반응을 보여준다. 8마리의 마우스 중 6마리를 6개월 동안 계속 보존하였고, ABR 및 DPOAE를 평가하였다 (점선). 평균 ± SE. 처음 3개월 동안에 걸쳐 ABR 및 DPOAE 임계값 이동이 분명하게 나타났지만, 청력 구제는 보다 낮은 주파수 범위에서 생후 6개월이 되는 연령 시점에도 여전히 두드러지게 나타났다.
도 17A-17E는 Anc80 하모닌-a1 및 Anc80 하모닌-b1을 주사한 마우스에서의 놀람 반응, 로타로드 수행능 및 개방 필드 행동 회복을 보여주는 영상이다. 도 17A는 대조군 c.216GA, c.216AA 및 c.216AA를 주사한 마우스에서 기록된 백색 잡음 자극에 대한 놀람 반응을 보여준다. 하모닌-b1을 주사한 마우스에서 부분적인 놀람 구제가 분명하게 나타났으나 하모닌-a1은 그렇지 않았다. 평균 ± SE로 제시되어 있다. 도 17B는 대조군 c.216GA, c.216AA 및 c.216AA를 주사한 마우스에서의 로타로드 수행능을 보여준다. 하모닌-b1 및 하모닌-a1/b1을 주사한 마우스에서 완전한 회복이 관찰되었고; 하모닌-a1을 단독으로 주사한 것에서는 회복이 전혀 관찰되지 않았다. 평균 ± SE로 제시되어 있다. 도 17C-17E는 대조군 c.216GA, c.216AA 및 c.216AA 및 c.216GA를 주사한 마우스에서 5 min 동안 수행된 개방 필드 관찰결과를 보여준다. 2.5 min 동안에 걸친 대표적인 트랙이 제시된다 (도 17B). c.216AA 돌연변이체 마우스는 전체 필드를 탐색하고, 반복적인 전신 회전을 실행한 반면, P1째에 하모닌-a1, 하모닌-b1 또는 두 벡터의 조합을 주사한 c.216AA 마우스는 그의 이형접합성 c.216GA 카운터파트, 또는 말단절단된 벡터를 주사한 c.216GA 마우스와 유사한 정상적인 행동을 보였다. 도 17C는 분당 회전수 및 이동 거리에 대한 평균 ± SD를 도시한 그래프를 보여준다. 주사하지 않은 마우스와 주사한 마우스 사이에 유의한 회복 (***P < 0.001)이 관찰되었다. 일원 ANOVA에 의한 통계학적 분석.
도 18은 Anc80 하모닌-b1을 주사한 마우스에서의 코르티 기관의 주사 전자 현미경 영상이다. 코르티 기관의 기저, 중간 및 첨단 영역을 c.216GA, c.216AA 및 c.216AA 마우스에서 영상화하였다. OHC 및 IHC 유모 다발이 c.216GA 마우스에서는 보존되었지만, c.216AA 마우스에서는 코르티 기관을 따라 비조직화된 것으로 보였다. c.216AA 마우스에서 뚜렷한 유모 세포 손실 (별표 표시) 및 유모 다발 비조직화가 관찰되었고, 기관의 기저 단부에서 보다 현저한 퇴행이 관찰되었다. c.216AA 마우스의 유모 다발에는 정상적인 부동섬모 열이 존재하지 않았다. 더 짧은 열은 수축된 것으로 보인 반면, c.216AA 마우스에서 가장 키가 큰 열은 유지되었다 (화살표 표시). 구제된 c.216AA 마우스에서 유모 세포 손실 및 다발 비조직화가 여전히 분명하게 나타난 반면, 유모 세포 생존은 기관의 기저 및 중간 영역에서 눈에 띄게 더 높았다. 유모 세포 계수는 막대 그래프에 요약되어 있다. c.216AA 마우스에서 총 1824개의 세포가 계수되었고, 구제된 c.216AA 마우스에서는 792개가 계수되었다. 평균 ± SE. 고배율 영상화를 통해 주사한 c.216AA 마우스 (화살표 표시)의 모든 세포는 아니지만 다수의 세포에서 (화살촉 표시) 계단식 어레이의 구제가 나타났다. 스케일 바 저배율: 5 ㎛; 고배율: 1 ㎛.
도 19A-19L은 SEM에 의한 Ush1c c.216G>A 마우스에서의 유모 다발 형태의 분석을 보여주는 영상이다. 도 19A-19C는 정상적인 유모 다발 형태를 나타내는 이형접합성 c.216GA 마우스를 보여준다. 도 19D-19I는 동형접합성 c.216AA 돌연변이체 마우스의 기관을 따라 관찰되는 비조직화된 유모 다발을 보여준다. 도 19J-19L은 c.216AA 마우스에서 경미하게 파괴된 IHC 유모 다발을 보여주는 영상이다. 첨단 팁으로부터 측정된 거리: 기저 3.5-4 mm; 중간 1.8-2.2 mm; 첨단 0.6-0.8 mm. 스케일 바 저배율: 5 ㎛; 고배율: 1 ㎛.
도 20A-20J는 c.216AA 돌연변이체 마우스에서의 기계적 형질도입 특성을 보여주는 영상이다. 도 20A-20E는 와우의 중간 및 중간-첨단 회전부로부터의 신생 OHC에서의 기계적 형질도입을 분석한 것을 보여준다. ~Po= 0.5로부터의 대표적인 전류 트레이스를 이중 지수 감쇠 함수로 피팅하여 c.216GA 및 c.216AA 돌연변이체에서의 순응을 평가하였다 (도 20A). 피트를 사용하여 고속 (도 20C) 및 저속 (도 20D) 시간 상수 뿐만 아니라, 순응 정도 (도 20E)를 생성하였다. 10-90% 동작 범위는 유의하게 변경되지 않았다 (도 20B). c.216AA 마우스에서의 순응 정도는 상기 산점도에 제시된 바와 같이 이형접합성 OHC보다 유의하게 더 낮았다 (도 20E). 도 20F-20J는 신생 IHC에서의 기계적 형질도입 분석을 보여준다. 10-90% 동작 범위 값은 c.216AA IHC 대비 c.216GA에서 더 작았다 (도 20G). c.216AA IHC에서 순응은 비록 약간 더 느리고, 유의하게 그 정도가 더 작았지만, 항상 존재하였다 (도 20H-20J). 통계학적 분석은 각 플롯에 제시되어 있다: *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001, 일원 ANOVA.
도 21A-21C는 P1째의 이중 벡터 주사 후 c.216AA 코르티 기관에서의 6주째의 형광 표지된 하모닌-a 및 하모닌-b Anc80 벡터의 발현을 보여주는 데이터이다. 도 21A-21C는 P1째 AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::하모닌-a1 (0.5 ㎕; 4.11E^12 gc/ml) 및 AAV2/Anc80.CMV.eGFP::하모닌-b1 (0.5 ㎕; 2.99E^12 gc/ml)의 공동 주사 후의, 6주령된 c.216AA 마우스에서의 기저 회전부의 공초점 영상을 보여준다. 세포 총 개수의 69% 및 74%가 각각 eGFP (도 21A) 및 tdTomato (도 21C)를 발현하였고, 65%가 두 마커 모두를 발현하였으며, 이는 공동 형질감염이 성공적으로 이루어졌다는 것을 입증하는 것이다. 스케일 바: 20 ㎛.
도 22A-22F는 대조군 c.216GA 및 주사한 구제된 c.216AA 마우스에서의 ABR 반응 분석을 보여주는 데이터이다. 도 22A 및 22D는 대조군 c.216GA 및 구제된 c.216AA 마우스에 대한 8 및 16 kHz에서의 ABR 반응의 예를 보여준다. 도 22B-22C 및 22E-22F는 유사한 임계값을 가진 6주령된 마우스에서의 8-11.3 및 16 kHz에서의 평균 피크 1 진폭 (도 22B-22D) 및 지연 시간 (도 22C-22D)을 보여준다 (n=8 c.216GA, n=5 c.216AA + 하모닌-b1 RWM P1). 평균 ± SE: 일원 ANOVA.
도 23A-23D는 Ush1c c.216G>A 마우스에서 발현된 하모닌의 돌연변이체 형태가 유모 세포 또는 청각 기능을 변경시키지 않는다는 것을 보여준다. 도 23A는 야생형 하모닌-b1 단백질과, Ush1c 유전자의 엑손 3에서의 아카디아인의 G>A 돌연변이와 연관된 프레임시프트 및 잠재 스플라이싱의 결과로서 분비되는 말단절단된 하모닌 사이의 서열 정렬이다. 도 23B는 야생형 마우스, c.216GA 및 c.216AA 돌연변이체 마우스의 청각 기관으로부터의 반정량적 RT-PCR을 통해 c.216GA 및 c.216AA 마우스에서 야생형 (450 bp) 및 말단절단된 (-35 bp) 하모닌이 발현되었음을 확인한 것을 보여준다. 도 23C-23D는 c.216GA를 주사한 마우스 및 대조군 c.216GA 및 c.216AA 마우스에서 측정된 청각 뇌간 반응 (ABR, 도 23C) 및 변조 (DPOAE, 도 23D)를 보여준다. 플롯은 평균 ± SE로 제시되어 있다.
도 24A-24C는 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1을 주사한 6주령된 마우스의 내이에서의 올바른 Ush1c 스플라이싱의 회복을 보여주는 영상이다. 도 24A는 Ush1c.216A 대립유전자로부터의 올바르게 스플라이싱된 (450 bp) mRNA 및 비정상적인 (415 bp) mRNA의 반정량적 RT-PCR 정량화를 통해 c.216AA 구제된 마우스 #1 및 #2의 주사한 귀 (I) 및 반대쪽 귀 (도 24C)에서의 올바른 Ush1c 스플라이싱의 회복을 나타낸다는 것을 보여준다 (주사한 귀로부터 11.3 kHz에서 35 dB SPL 반응). ABR 반응이 불량한 (11.3 kHz에서 90 dB SPL) 마우스 #3은 올바른 mRNA 발현에 대해서는 보통 정도의 회복을 보이고, 마우스 #4 (11.3 kHz에서 100 dB SPL)는 전혀 보이지 않았다. 올바른 스플라이스 형태가 주사하지 않은 c.216AA 마우스 (마우스 #5,6)에서는 검출되지 않은 반면, 올바른 스플라이스 형태 및 말단절단된 스플라이스 형태 둘 모두가 c.216GA 마우스 (마우스 #7,8,9)에서 검출되었다. 물질의 상대량을 확인하기 위해 하단 패널에 제시된 상응하는 마우스 GAPDH를 증폭시켰다. 도 24B는 반정량적 방사선표지된 PCR 분석을 통해 Ush1c.216AA 마우스의 주사한 귀 및 반대쪽 귀에서의 AAV-mUsh1c의 존재를 확인하였다는 것을 보여주는 영상이다. 마우스 #3 및 #4에는 AAV-mUsh1c DNA가 상대적인 수준으로 존재하기는 하였지만, 감소되어 있었다. 도 24C는 ABR 임계값과 상관관계가 있는 AAV-mUsh1c의 상대량을 보여준다. 11.3 및 16 kHz에 대한 분석이 도시되어 있다. 선형 회귀는 둘 사이에 높은 상관관계를 나타내었다.
도 25는 청각 기관의 중간 내지 첨단 영역에서의 OHC의 생존과 상관관계가 있는 장기간의 ABR 임계값 회복을 보여주는 그래프이다. 사후에 3마리의 주사하지 않은 c.216AA 및 5마리의 주사한 c.216AA의 왼쪽 귀에서 전체 코르티 기관 간의 유모 세포 계수를 수행하였다. IHC 및 OHC 유모 세포의 총 개수는 주사한 마우스에서 증가되어 있었다. 구제된 주사한 마우스와, 구제는 불량한, 주사한 마우스를 비교한 결과, IHC 개수는 상이하지 않지만, 유의한 개수의 OHC가 구제된 마우스에서 관찰된 것으로 나타났다. 전장의 기관 전역에 걸쳐 진행된 분석 결과, 차이는 기관의 중간 내지 첨단 영역의 유모 세포 생존의 증가가 원인일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 인서트: 마우스 중 2마리 (마우스 #1,2)는 시험된 전체 범위에 걸쳐 불량한 ABR 반응 임계값을 보였고 (≥95 dB SPL), 3마리 (마우스 #3,4,5)는 5.6 내지 16 kHz의 사운드 자극에 대해 35 내지 55 dB SPL 범위의 임계값으로 반응하였다.
파트 3 - 청력 손실에 관여하는 추가의 돌연변이의 유전자 요법
도 26A-26D는 RWM을 통해 Anc80-하모닌::GFP (즉, GFP가 하모닌 폴리펩티드에 융합된 것)를 주사하고, 수확되고, 액틴 (적색; 도 26A), Myo7a (청색; 도 26B)로 염색되고, GFP (녹색; 도 26C)에 대해 영상화된, Ush1c 돌연변이체 마우스로부터의 와우의 대표적인 공초점 영상이다. 도 26A, 26B, 및 26C의 병합된 영상이 도 26D에 제시되어 있다.
도 27은 Ush1c 돌연변이체 마우스 (사각형 표시) 및 Anc80-하모닌::GFP 벡터를 주사한 Ush1c 돌연변이체 마우스 (동그라미 표시)에 대한 사운드 주파수의 함수로서 플롯팅된 ABR 임계값을 보여주는 그래프이다.
도 28A-28C는 고배율에서의 주사하지 않은 와우 (도 28C) 대비의, RWM을 통해 Anc80-KCNQ4를 주사하고, 수확되고, 알렉사 546-팔로이딘 (적색) 및 KCNQ4에 대한 항체 (녹색)로 염색된 KCNQ4 -/- 와우에 대한 저배율 (도 28A) 또는 고배율 (도 28B)에서의 대표적인 공초점 영상을 보여준다.
도 29A-29C는 야생형 마우스 (도 29A), P10 KCNQ4 -/- 마우스 (도 29B), 및 Anc80- KCNQ4를 주사한 P10 KCNQ4 -/- 마우스 (도 29C)에서의 KCNQ4 전류를 보여주는 그래프 시리즈이다. 와우는 주사 후 8일째에 수확하였다.
도 30은 Anc80 Tmc1 벡터를 주사한 Tmc1 -/- 조직에서의 FM1-43 흡수 (FM1-43은 오직 기능성 Tmc1 채널에만 침투한다)를 보여주는 3개의 영상 시리즈이다.
도 31A는 야생형 마우스 (좌측), Tmc1 -/- 마우스 (중간), 및 Anc80 Tmc1을 주사한 Tmc1 -/- 마우스 (우측)의 IHC로부터 기록된 감각 형질도입 전류의 대표적인 패밀리를 보여주는 영상이다. 와우는 주사 후 8일째에 수확하였다.
도 31B는 도 31A에 제시된 마우스의 회복률을 그래프로 나타낸 대표도이다. 도 31B의 그래프는 야생형 마우스 (좌측), Tmc1 -/- 마우스 (중간), 및 Anc80 Tmc1을 주사한 Tmc1 -/- 마우스 (우측)에서의 기능성 세포의 비율(%)을 나타내는 것이다.
도 32는 야생형, Tmc1 -/- 마우스, 및 Anc80 Tmc1을 주사한 Tmc1 -/- 마우스에 대한 자극 주파수의 함수로서 변조 이음향 방사 (DPOAE) 임계값을 보여주는 그래프이다.
성체 포유동물 와우의 감각 세포는 자기 수복 능력이 없기 때문에, (장애 수준 및 정확한 위치에 의존하는) 현행 치료 전략법은, 청신경을 형성하고, 음향 정보를 뇌로 전달하는 일차 감각 유모 세포 또는 나선 신경절 뉴런에 대한 영구적인 손상을 보상하기 위해 증폭 (보청기), 보다 우수한 사운드 전송 (중이 인공삽입물/능동 임플란트), 또는 직접적인 뉴런 자극 (와우 임플란트)에 의존한다. 이들 접근법이 혁신적이기는 하지만, 현대 생활에 중요한 복잡한 인간 청력 기능을 회복시키는 데 있어 최적인 것과는 여전히 거리가 멀다. 구체적으로, 주된 문제로는 여전히 제한된 주파수 감도, 비자연음 지각, 및 잡음 환경에서의 제한된 말소리 명료도를 포함한다.
와우로의 치료학적 유전자 전달이 연령 관련 및 환경 유도성 청력 손실에서부터 유전적 형태의 청각 장애에 이르는 것까지 그 범위에 대한 현행 표준 치료를 추가로 개선시키는 것으로 간주되고 있다. 300개 초과의 유전자 유전자좌가 기술된 70개 초과의 유전자와 함께 유전성 청력 손실과 연관되어져 왔다 (Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Arch. Dis . Childhood, 100:271-8). 상기 접근법에서의 치료학적 성공은 유의하게 와우 중 코르티 기관 (OC) 내의 관련된 치료학적 세포 표적으로의 외인성 유전자 구축물의 안전하고 효율적인 전달에 의존한다.
OC는 두 부류의 감각 유모 세포: 사운드에 운반된 기계적 정보를, 뉴런 구조체로 전송되는 전기 신호로 전환시키는 IHC, 및 복잡한 청력 기능이 요구되는 프로세스인 와우 반응을 증폭시키고, 조정하는 역할을 하는 OHC를 포함한다. 내이 중의 다른 잠재적 표적으로는 나선 신경절 뉴런, 인접한 덮개막 유지에 중요한 나선연의 원주 세포, 또는 보호 기능을 하고 조기 신생아 단계까지 유모 세포로 전환분화하도록 촉발될 수 있는 지지 세포를 포함한다.
고칼륨 내임파액으로 충전되어 있는 와우로의 주사를 통해 유모 세포로 직접 접근할 수 있다. 그러나, 이러한 연약한 유체 환경에 대한 변경은 주사와 관련된 독성 위험을 고조시키면서, 와우내 전위를 파괴시킬 수 있다. 와우, 고실계 및 전정계 주위의 외림프액으로 충전된 공간은 난원창 또는 원창 막 (RWM)을 통해 중이로부터 접근이 가능하다. 내이 내로의 유일의 무골질 구멍인 RWM은 다수의 동물 모델에서 비교적 쉽게 접근이 가능하고, 상기 경로를 사용하는 바이러스 벡터의 투여는 우수한 용인성을 띤다. 인간에서, 와우 임플란트 식립은 통상 RWM을 통한 외과적 전극 삽입에 의존한다.
기관형 와우 외식편 및 생체내 내이 주사에서의 AAV 혈청형을 평가한 선행 연구을 통해 유전된 청각 장애를 앓는 마우스 모델에서 오직 부분적으로만 청력 구제가 이루어졌다. 예상 밖으로, 조상 아데노 연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 함유하는 AAV는 고효율로 OHC를 형질도입시킨다. 이러한 관찰결과는 종래 AAV 혈청형을 사용하여 이루어진 와우 유전자 요법의 성공적인 개발을 제한하여 왔던 낮은 형질도입율을 극복하게 만든다. 본원에 기술된 바와 같은 조상 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 AAV는 IHC 및 OHC로의 내이 유전자 전달을 위한 가치있는 플랫폼 뿐만 아니라, 유전적 청력 및 균형 장애에 의해 손상되는 다른 내이 세포 유형의 어레이를 제공한다. 높은 형질도입율을 제공하는 것 이외에도, 본원에 기술된 바와 같은 조상 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 AAV는 마우스 및 비인간 영장류에서 전신 주사시 유사한 안전성 프로파일을 갖고, 항원과 관련하여 순환 AAV와는 상이하여, 종래 AAV 벡터의 효능을 제한하는 기존 면역에 대하여 잠재적인 이익을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 세포, 특히, 내이 내의, 예컨대, 와우 중의 세포 (또는 와우의 세포 또는 와우 세포)에 핵산을 고도로 효율적으로 전달할 수 있게 하는 조성물 및 방법을 본원에서 기술한다. 본원에 사용된 내이 세포는 비제한적으로 내유모 세포 (IHC), 외유모 세포 (OHC), 나선 신경절 뉴런, 전정 유모 세포, 전정 신경절 뉴런, 지지 세포 및 혈관조 중의 세포를 지칭한다. 지지 세포는 귀 안의 비흥분성 세포, 예컨대, 유모 세포 또는 뉴런이 아닌 세포를 지칭한다. 지지 세포의 예로는 슈반 세포가 있다.
본원에 기술된 핵산 중 하나 이상의 것을 내이 세포로 전달하는 것은, 전형적으로 부분적 청력 손실 또는 완전한 청각 장애에 의해 정의되는 임의의 수의 유전된 또는 후천성 청력 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 청력 장애, 예컨대 비제한적으로 열성 청각 장애, 우성 청각 장애, 어셔 증후군, 및 다른 증후성 청각 장애 뿐만 아니라, 외상 또는 노화에 기인하는 청력 손실을 치료하는 데 사용될 수 있다.
특정 트랜스진을 보유하는 바이러스 제조 방법
본원에 기술된 바와 같이, 조상 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 아데노 연관 바이러스 (AAV)는 핵산 (예컨대, 트랜스진)을 내이 세포로 전달하는 데 특히 효율적이고, 특히 효과적인 부류의 조상 AAV 캡시드 단백질은 Anc80으로 지정된 조상 스캐폴드 캡시드 단백질로 지정되며, 이는 서열식별번호: 1로 제시된다. Anc80 조상 캡시드 단백질 부류에 포함되는 한 특정 조상 캡시드 단백질은 Anc80-0065 (서열식별번호: 2)이지만, WO 2015/054653에는 Anc80 조상 캡시드 단백질 부류에 포함되는 추가의 조상 캡시드 단백질이 다수 기술되어 있다.
Anc80 캡시드 단백질을 함유하는, 본원에 기술된 바이러스는 다양한 핵산을 내이 세포로 전달하는 데 사용될 수 있다. 발현 목적으로 세포에 전달되는 핵산 서열은 대개 트랜스진으로 지칭된다. 내이 세포에 전달되고, 여기서 발현될 수 있는 대표적인 트랜스진은 비제한적으로 신경 영양 인자 (예컨대, 신경아교 세포주 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3 (NT3), 또는 열 충격 단백질 (HSP)-70), 면역조절 단백질 또는 항-종양원성 전사체를 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 추가로, 내이 세포에 전달되고, 여기서 발현될 수 있는 대표적인 트랜스진은 또한 비제한적으로 항체 또는 그의 단편, 안티센스, 침묵화 또는 장쇄 비-코딩 RNA 종, 또는 게놈 편집 시스템 (예컨대, 유전적으로 변형된 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 일정한 간격으로 주기적으로 분포하는 짧은 회문 구조의 반복부 (CRISPR))을 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 추가로, 내이 세포에 전달되고, 여기서 발현될 수 있는 대표적인 트랜스진은 ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP, NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1, WFS1, WHRN, 및 XIAP로 지정된 핵산을 포함한다. 본원에서 사용되는 명명법에 관한 설명 및 정의는 월드 와이드 웹의 hereditaryhearingloss.org/에서 살펴볼 수 있다.
트랜스진의 발현은 트랜스진의 천연 프로모터 (즉, 자연적으로 트랜스제닉 코딩 서열과 함께 발견되는 프로모터)의 지시에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 트랜스진의 발현은 이종 프로모터의 지시에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 트랜스진 중 임의의 것은 그의 천연 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 트랜스진 중 임의의 것은 이종 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 이종 프로모터는 자연적으로 상기 서열의 발현을 지시하지 않는 (즉, 자연에서 상기 서열과 함께 발견되지 않는) 프로모터를 지칭한다. 본원에 기술된 트랜스진 중 임의의 것의 발현을 지시하는 데 사용될 수 있는 대표적인 이종 프로모터는 예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터, 합성 CASI 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 및 신장 인자 (EF)-1 프로모터, 알파9 니코틴성 수용체 프로모터, 프레스틴 프로모터, 성장인자 비의존성 (GFI1) 프로모터, 및 소포 글루타메이트 수송체 3 (VGLUT3) 프로모터를 포함한다. 추가로, 자연적으로 상기 언급된 트랜스진 중 하나의 발현을 지시하는 프로모터 (예컨대, KCNQ4 프로모터, Myo7a 프로모터, Myo6 프로모터 또는 ATOH1 프로모터)가 트랜스진의 발현을 지시하는 이종 프로모터로서 사용될 수 있다.
Anc80 캡시드 단백질을 함유하는 바이러스 내로 패키징하기 위한 트랜스진을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 종래 분자 생물학 및 재조합 핵산 기술을 사용한다. 한 실시양태에서, Anc80 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 구축물, 및 트랜스진이 Anc80 캡시드 단백질 내에 패키징되도록 허용하는, 적합한 역위 말단 반복부(ITR)에 플랭킹되어 있는 트랜스진을 운반하는 구축물을 제공한다.
트랜스진은 예를 들어, 패키징 숙주 세포를 사용하여 Anc80 캡시드 단백질을 함유하는 AAV 내로 패키징될 수 있다. 바이러스 입자의 성분 (예컨대, rep 서열, cap 서열, 역위 말단 반복 (ITR) 서열)은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 구축물을 사용하여 패키징 숙주 세포 내로 일시적으로 또는 안정적으로 도입될 수 있다. 본원에 기술된 바이러스는 적어도 Anc80 캡시드 단백질을 함유하고; 바이러스 입자의 다른 성분 (예컨대, rep 서열, ITR 서열)은 조상 서열 또는 동시대의 서열에 기초하는 것일 수 있다. 일부 경우에서, 예를 들어, 전체 바이러스 입자는 조상 서열에 기초하는 것일 수 있다. 상기 바이러스는 통상의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
하나 또는 1개 초과의 트랜스진이 내이에 전달될 수 있는 것으로 이해될 것이다. Anc80 캡시드 단백질을 포함하는 단일 AAV 벡터를 사용하여, 또는 Anc80 캡시드 단백질을 포함하는 다중 AAV 벡터를 사용하여 1개 초과의 트랜스진이 내이에 전달될 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다.
일반적으로, 본원에 사용된 "핵산"은 DNA 및 RNA를 포함할 수 있고, 또한 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 백본 변형을 함유하는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 이는 일반적으로는 그의 의도된 용도에 의존한다. 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 핵산은 공지된 핵산 서열과 동일할 수 있거나, 또는 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 핵산은 상기 공지된 서열과 서열이 상이할 수 있다. 간단하게, 예로서, 핵산 (또는 코딩된 폴리펩티드)은 공지된 서열과 적어도 75%의 서열 동일성 (예컨대, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열 동일성(%)을 계산할 때, 두 서열을 정렬하고, 두 서열 사이에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 동일한 매치 개수를 측정한다. 동일한 매치 개수를 정렬된 영역의 길이 (즉, 정렬된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 개수)로 나누고, 100을 곱하여 서열 동일성(%) 값을 얻는다. 정렬된 영역의 길이는 한 서열 또는 두 서열 모두의 일부분에서 최대 가장 짧은 서열의 전장의 크기일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 단일 서열은 1개 초과의 다른 서열과 정렬될 수 있고, 이에 의해 각각의 정렬된 영역에 걸쳐 상이한 서열 동일성(%) 값을 가질 수 있다는 것 또한 이해할 것이다.
2개 이상의 서열을 정렬하여 서열 동일성(%)을 측정하는 것은 컴퓨터 프로그램 클러스탈W(ClustalW) 및 디폴트 파라미터를 사용하여 수행되며, 이를 통해 핵산 또는 폴리펩티드 서열 정렬은 그의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다 (전체 정렬). 문헌 [Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500]. 클러스탈W는 질의 서열과 하나 이상의 대상 서열 사이의 최적의 매치를 계산하고, 동일성, 유사성 및 차이가 계산될 수 있도록 그를 정렬한다. 서열 정렬을 최대화시키기 위해 하나 이상의 잔기의 갭이 질의 서열, 대상 서열, 또는 그 둘 모두의 내로 삽입될 수 있다. 핵산 서열의 쌍별 정렬을 위해, 디폴트 파라미터가 사용되고 (즉, 워드 크기: 2; 윈도우 크기: 4; 스코어링 방법: 백분율; 탑 다이애그널 개수: 4; 및 갭 패널티: 5); 다중 핵산 서열의 정렬을 위해, 하기 파라미터가 사용된다: 갭 개방 패널티: 10.0; 갭 연장 패널티: 5.0; 및 가중 이행: 예. 폴리펩티드 서열의 쌍별 정렬을 위해, 하기 파라미터가 사용된다: 워드 크기: 1; 윈도우 크기: 5; 스코어링 방법: 백분율; 탑 다이애그널 개수: 5; 및 갭 패널티: 3. 폴리펩티드 서열의 다중 정렬을 위해, 하기 파라미터가 사용된다: 가중치 행렬: BLOSUM (블록 치환 행렬: blocks substitution matrix); 갭 개방 패널티: 10.0; 갭 연장 패널티: 0.05; 친수성 갭: 작동(on); 친수성 잔기: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, 및 Lys; 및 잔기 특이적 갭 패널티: 작동. 클러스탈W는 예를 들어, 월드 와이드 웹상의 베일러 의대 서치 런처(Baylor College of Medicine Search Launcher) 웹사이트에서, 또는 유럽 생물정보 연구소(European Bioinformatics Institute) 웹사이트에서 실행될 수 있다.
변이가 핵산 서열 내로 도입될 수 있고, 핵산 서열이 코딩 서열일 경우, 상기 변이는 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변이시킬 수 있다. 예를 들어, 변이는 돌연변이유발법 (예컨대, 부위 지정 돌연변이유발법, PCR 매개 돌연변이유발법)을 사용하여, 또는 상기 변이를 갖는 핵산 분자를 화학적으로 합성함으로써 핵산 코딩 서열 내로 도입될 수 있다. 상기 핵산 변이는 하나 이상의 아미노산 잔기에 보존적 및/또는 비보존적 아미노산 치환을 유도할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체되는 것이며 (예를 들어, 아미노산 치환을 위한 빈도 표를 제공하는 문헌 [Dayhoff et al. (1978, in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352)] 참조), 비보존적 치환은 아미노산 잔기가 유사하지 않은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다.
핵산은 벡터 또는 플라스미드로도 지칭될 수 있는 구축물 내에 함유될 수 있다. 구축물은 상업적으로 이용가능하거나, 또는 관련 기술분야에서 통상적인 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 핵산을 함유하는 구축물은 상기 핵산의 발현을 지시하고/거나, 조절하는 발현 요소를 가질 수 있고, 이는 또한 서열, 예컨대, 구축물 유지를 위해 사용되는 서열 (예컨대, 복제 기점, 선별가능한 마커)도 포함할 수 있다. 발현 요소는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 프로모터, 인트론, 인핸서 서열, 반응 요소, 또는 유도성 요소를 포함한다.
핵산을 내이 세포에 전달하는 방법
핵산을 세포에 전달하는 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 트랜스진을 함유하는 바이러스 (이는 바이러스 입자로도 지칭될 수 있다)를 생체내에서 내이 세포에 전달하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 약 108 내지 약 1012개의 바이러스 입자를 대상체에게 투여할 수 있고, 바이러스를 적합한 부피 (예컨대, 10 ㎕, 50 ㎕, 100 ㎕, 500 ㎕, 또는 1000 ㎕)의 예를 들어, 인공 외림프액 용액 내에 현탁시킬 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 트랜스진을 함유하는 바이러스는 임의의 다수의 기전을 사용하여 내이 세포 (예컨대, 와우 중의 세포)에 전달될 수 있다. 예를 들어, 치료학상 유효량의, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 상이한 유형의 트랜스진을 함유하는 바이러스 입자를 포함하는 조성물은 전형적으로, 비교적 간단한 방법 (예컨대, 외래 환자)으로 원창 또는 난원창을 통해 주사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, 트랜스진을 함유하는 바이러스 입자를 치료학상 유효한 개수로 포함하거나, 또는 상이한 바이러스 입자로 이루어진 하나 이상의 세트 (여기서, 한 세트 중의 각 입자는 동일한 유형의 트랜스진을 함유할 수 있지만, 각각의 입자 세트는 다른 세트 중의 것과는 상이한 유형의 트랜스진을 함유한다)를 포함하는 조성물은 수술 (예컨대, 와우개창술 또는 반고리관 절개술) 동안 귀 내의 적절한 위치로 전달될 수 있다.
추가로, 고막을 통과하여 및/또는 원창을 통해 작용제를 전달하는 것을 촉진시키는 전달 비히클 (예컨대, 중합체)이 이용가능하고, 상기와 같은 임의의 전달 비히클은 본원에 기술된 바이러스를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Arnold et al., 2005, Audiol. Neurootol., 10:53-63]을 참조한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법을 통해 핵산을 내이 세포, 예컨대, 와우 세포에 고도로 효율적으로 전달할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물 및 방법을 통해 내유모 세포 중 적어도 80% (예컨대, 적어도 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)에 트랜스진을 전달할 수 있고, 상기 세포에서 발현시킬 수 있거나, 또는 외유모 세포 중 적어도 80% (예컨대, 적어도 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99)에 전달할 수 있고, 상기 세포에서 발현시킬 수 있다.
본원에서 입증된 바와 같이, Anc80 캡시드 단백질을 함유하는 AAV를 사용하여 전달된 트랜스진의 발현 결과로 내유모 세포 (IHC), 외유모 세포 (OHC), 나선 신경절 뉴런, 혈관조, 전정 유모 세포, 및/또는 전정 신경절 뉴런 (예컨대, Atoh1, NF2)이 재생될 수 있고, 이에 의해 청력 또는 전정 기능은 장기간 동안 (예컨대, 수개월, 수년, 수십 년, 평생) 회복된다.
WO 2015/054653에서 논의된 바와 같이, Anc80 캡시드 단백질을 함유하는 AAV는 그의 혈청학적 유병률 및/또는 종래 AAV (즉, Anc80 캡시드 단백질을 함유하지 않는 AAV) 대비 그가 중화되는 정도를 특징으로 할 수 있다. 혈청학적 유병률이란, 관련 기술분야에서 집단 중 혈청 반응 양성인 (즉, 특정 병원체 또는 면역원에 노출된 바 있는) 대상체의 비율을 지칭하는 것으로 이해되고 있으며, 이는 집단 중 특정 병원체 또는 면역원에 대한 항체를 생산하는 대상체의 수를 검사받은 집단 중 총 개체수로 나눈 값으로 계산된다. 바이러스의 혈청학적 유병률을 측정하는 것은 관련 기술분야에서 통상적으로 수행되며, 이는 전형적으로 면역검정법을 사용하여 특정 개체 집단으로부터의 샘플 (예컨대, 혈액 샘플) 중 하나 이상의 항체의 출현율을 측정하는 것을 포함한다. 추가로, 혈청 샘플 중 중화 항체의 정도를 측정하는 여러 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 중화 항체 검정법은 실험 샘플이 항체를 포함하지 않는 대조군 샘플과 비교하여 감염을 50% 이상만큼 중화시키는 항체 농도를 함유하는 때의 역가를 측정한다. 또한, 문헌 [Fisher et al. (1997, Nature Med ., 3:306-12)] 및 [Manning et al. (1998, 인간 Gene Ther., 9:477-85)]를 참조한다. 대표적인 종래 AAV는 비제한적으로 AAV8 (또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스) 및/또는 AAV2 (또는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스)를 포함한다.
어셔 증후군
인간 어셔 증후군 (USH)은 복합된 청각 장애와 시각상실의 원인이 되는 희귀성 유전적 병태이다. 상염색체 열성 형질로서 유전되는 바, 미국에서 16,000 내지 20,000명의 사람이 상기 병태에 이환되어 있고, 이는 유아기 청각 장애의 3 내지 6%의 원인이 된다. 어셔 증후군은 증상의 중증도에 따라 3가지 임상적 서브타입 (USH-1, -2 및 -3) 하에 분류된다. USH1이 가장 중증인 형태이다. USH1에 이환된 환자는 선천성 양측 최중증 감각신경 청력 손실, 전정 무반사 및 사춘기전 색소성 망막염 (망막 간상체 및 추상체 기능의 진행성, 양측, 대칭성 퇴행)으로 고통받게 된다. 와우 임플란트를 장착하지 않는다면, 개체는 전형적으로 언어를 구사할 수 있는 능력을 발생시키지 못한다. 현재는 어셔 환자를 위한 생물학적 치료법이 존재하지 않지만, 결손 유전자의 야생형 형태의 조기 재도입을 통해 질환은 회복될 수 있다.
6개의 어셔 유전자가 USH1과 연관이 있다: MYO7A (미오신 7a), USH1C (하모닌), CDH23 (카드헤린 23), PCDH15 (프로토카드헤린 15), SANS (sans) 및 CIB2 (칼슘 및 인테그린 결합 단백질 2). 상기 유전자들은 내이에서 유모 다발 형태형성에 관여하고, 인터액톰의 일부인 단백질을 코딩한다 (예를 들어, 문헌 [Mathur & Yang, 2015, Biochim . Biophys . Acta, 1852:406-20] 참조). 하모닌은 USH1 인터액톰 중앙부에 존재하고, 여기서 하모닌은 다른 어셔 1 단백질에 결합한다. 그의 PDZ (PSD-59 95/Dlg/ZO-1) 상호작용 도메인 때문에, 하모닌은 스캐폴딩 단백질로서 작용하는 것으로 제안되었다. 시험관내 결합 연구 결과, 공지된 모든 다른 USH1 단백질은 두 USH2 단백질, 어셔린, 및 VLGR1이 결합하는 것과 같이, 하모닌의 PDZ 도메인에 결합하는 것으로 밝혀졌다. USH1C 유전자는 28개의 엑손으로 이루어져 있으며, 이는 단백질의 도메인 조성에 따라 3개의 상이한 서브부류 (a, b, 및 c)로 분류되는, 하모닌의 10개의 선택적 스플라이스 형태를 코딩한다. 3가지 이소형은 PDZ 단백질-단백질 상호작용 도메인, 코일드-코일드 (CC) 도메인, 및 프롤린-세린-트레오닌 (PST) 풍부 도메인 개수에서 차이를 보인다.
USH1 단백질은 다수의 세포외 링크에 의해 상호연결된 수백 개의 부동섬모로 구성된 기계 감각적 유모 다발 중의 유모 세포의 첨단부로 국재화된다. 어셔 유전자 (각각 USH1D 및 USH1E)의 생성물인 카드헤린 23 및 프로토카드헤린 15는 부동섬모의 말단부에 위치하는 팁-링크를 형성한다. 하모닌-b는 CDH23, PCDH15, F-액틴 및 그 자체에 결합한다. 이는 유모 세포에서 팁-링크 삽입점 근처의 부동섬모의 팁에서 발견되며, 여기서 이는 유모 세포에서 형질도입 및 순응에서 기능적 역할을 하는 것으로 간주된다. 하모닌-b는 출생 후 초기 단계 동안에 발현되지만, 그의 발현은 와우 및 전정 둘 모두에서 대략 출생 후 30일째 (P30)쯤에 감소된다. 하모닌-a는 또한 카드헤린 23에 결합하고, 부동섬모에서 발견된다. 최근 보고에 따라, 하모닌-a는 Cav1.3 Ca2+ 채널과 회합하여 유비퀴틴 의존성 경로를 통한 채널 이용가능성을 제안한다는 그의 시냅스에서의 추가 역할이 밝혀졌다.
지난 10년간 어셔 증후군에 대한 여러 마리의 마우스 모델을 확인하거나, 조작하였고, 그중 7마리가 하모닌에 영향을 미쳤다. 이들 중, 단 1마리의 모델, Ush1c c.216G>A 모델만이 인간 어셔 증후군의 특징이 되는 청각 및 망막 결손 둘 모두를 재현하였다. Ush1c c.216G>A는 프랑스계 아카디아인 USH1C 환자 코호트에서 발견되는 것과 유사한 점 돌연변이에 기인하는 모든 통상의 하모닌 이소형 발현에 영향을 주는 넉-인 마우스 모델이다. 돌연변이는 Ush1c 유전자의 엑손 3 단부에 잠재 스플라이스 부위를 도입한다. 상기 잠재 스플라이스 부위의 사용으로 35 bp가 결실된 프레임 시프트 전사체가 생성되고, PDZ, PST 및 CC 도메인이 결여된 심하게 말단절단된 단백질로 번역된다. 동형접합성 c.216AA 넉-인 마우스는 생후 1개월째에 중증의 청력 손실을 앓는 반면, 이형접합성 c.216GA 마우스는 비정상적인 표현형을 보이지 않는다. c.216AA 마우스에서의 와우 조직학적 구조는 P30째 중간 회전부 및 기저 회전부에서 비조직화된 유모 다발, 비정상적인 세포 열 및 내유모 세포 및 외유모 세포 둘 모두의 손실을 보인다.
특히, 하모닌 트랜스진과 함께 조합된 본원에 기술된 조상 AAV 캡시드 단백질을 사용하여 성공적으로 유모 세포를 형질도입시키고, 하모닌 스플라이스 형태의 발현 및 정확한 국재화를 구동시켜 야생형 하모닌을 재도입시킴으로써 어셔 증후군 관련된 청각 장애, 예컨대, USH1C 관련된 청각 장애 진단을 받은 환자를 치료할 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 바와 같은 조상 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 AAV의 출생 후 초기 원창 막 주사가 동형접합성 c.216AA 마우스에서 청각 및 전정 기능을 성공적으로 회복시켰다는 것이 본원에서 입증되었다. 주사한 마우스에서의 청각 기능의 회복은 야생형 하모닌을 코딩하는 mRNA 발현의 회복 뿐만 아니라, 유모 다발 형태 및 기계적 형질도입의 보존과도 연관이 있다.
TMC1 / TMC2
40개 초과의 뚜렷이 다른 돌연변이가 청각 장애를 유발하는 TMC1에서 확인되었다. 이는 35개의 열성 돌연변이 및 5개의 우성 돌연변이로 세분된다. 비록 몇몇은 후기 발병, 중간 정도 내지 중증의 청력 손실을 유발하지만, 열성 돌연변이 대부분은 최중증, 선천성 청력 손실 (예컨대, DFNB7/11)을 유발한다. 모든 우성 돌연변이는 진행성 청력 손실 (예컨대, DFNA36)을 유발하며, 발병은 10대 중반에 이루어진다. 특히, 본원에 기술된 Anc80 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터는 비-돌연변이체 (예컨대, 야생형) TMC1 서열 또는 TMC2 서열을 전달함으로써 청력 손실 (예컨대, 추가의 청력 손실)을 예방하고/거나, 청력 기능을 회복시키는 데 사용될 수 있다.
관련 기술분야 내의 종래의 분자 생물학, 미생물학, 생화학, 및 재조합 DNA 기술은 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 상기 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있으며, 하기 실시예 중 일부에서 예시되어 있다. 본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이며, 하기 실시예가 특허청구범위에 기술되는 방법 및 물질의 조성물의 범주를 제한하지는 않는다.
실시예
파트 1: 고도로 효율적인 와우 유전자 전달
실시예 1 - 조상 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 아데노 연관 바이러스 ( AAV )를 통해 안전하고, 효율적인 방식으로 와우에 유전자를 전달한다
하기 방법 및 물질을 실시예 1에서 사용하였다.
바이러스 벡터
앞서 기술된 바와 같이 (Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68), 매사추세츠 아이 앤드 이어(Massachusetts Eye and Ear)의 진 트랜스퍼 벡터 코어(Gene Transfer Vector Core) (vector.meei.harvard.edu)에서 CMV-구동 eGFP 트랜스진 및 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE) 카세트를 포함하는 AAV2/1, 2/2, 2/6, 2/8, 2/9 및 AAV2/Anc80L65를 제조하였다. AAV2/Anc80L65 플라스미드 시약은 addgene.com을 통해 입수가능하다.
시험관내 외식편 배양
이전 공개문헌 (Dilwali et al., 2015, Scientific Reports, 5:18599)에서 기술된 바와 같이 평가하기 위해, 출생 후 4일째에 두 계통 모두의 마우스 새끼로부터 총 156개의 와우 외식편 배양물을 제조하였다. 간략하면, 단두 후 뮤린 측두골을 수확하고, 나선 신경절 뉴런 영역에 연결된 기관형 외식편으로서 배양하기 위해 와우를 절개하였다. 와우당, 하나는 하부 첨단 회전부로 이루어진 것 ("첨단")이고, 하나는 상부 기저 회전부로 이루어진 것 ("기저")인, 2개의 표본을 수득하였다. 각 혈청형에 대해 최소 4개 (CBA/CaJ, 48h), 2개 (CBA/CaJ, 48h+5d), 3개 (C57BL/6, 48h), 2개 (C57BL/6, 48h+5d)의 기저 및 첨단 표본을 접종하였다. 배양하는 동안 와우 형태가 유지되지 않았다면, 표본을 배제시켰다. 형질도입의 변동성에 관한 정보를 제공하고, 추가의 생체내 평가를 위한 선별의 근거를 제공하기 위해 샘플 번호를 선택하였다. 외식편을 50 ㎕로 48 h 동안 배양 배지 (98% 둘베코스 변형 이글 배지 (DMEM), 1% 암피실린, 및 1% N2 보충제 (처음 12시간 동안), + 1% 우태아 혈청 (FBS)) 및 1010 GC의 AAV와 함께 인큐베이션시켰다. 48h+5d 조건을 위해, AAV를 포함하는 배지를 추가의 5일 동안 AAV를 포함하지 않는 신선한 배지로 교체하였다. 전정 슈반세포종 종양 절제를 받은 성인 환자 4명으로부터 그의 동의하에 수득된 난형낭으로부터의 인간 전정 상피를 앞서 기술된 바와 같이 배양하고 (Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-1131), 24시간 동안 1010 GC AAV에 노출시키고, 10일 동안 배양물 중에서 유지시킨 후, 조직을 고정시키고, 팔로이딘으로 염색하고, 영상화하였다. 연구는 참조 번호 11/LO/0475 하에 서리 보더스 NRES 커미티 런던(Surrey Borders NRES Committee London) (헬쓰 리서치 오써러티(Health Research Authority))의 승인을 받았다.
동물 모델 및 일반적인 방법
잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory: 미국 메인주 바 하버)로부터 야생형 C57BL/6J 및 CBA/CaJ 마우스를 입수하고, 추정비 50/50으로 암수 중 어느 하나의 동물을 실험에 사용하였다. 시험관내 및 생체내 형질도입 검정법 및 후속된 종점을 위한 실험당 군의 크기는 표본에의 접근 및 기술상 실행가능성에 의해 결정되었다. Anc80 형질도입에 대하여 기록된 관찰결과를 후속 실험에서 다양항 벡터 로트를 이용하여 정량적으로 입증하였다 (단, 예외적으로, 표본에의 접근이 독특하고, 제한된 성질에 기인하는 것인 인간 전정 조직 형질도입은 제외). 표본에의 제한된 접근, 및 기록된 관찰결과의 정성적 성질에 기인하여 혈청형 형질도입률 사이의 통계학적 분석은 수행하지 않았다.
CSF 및 혈액 샘플링
최종 절차에서 대수조로부터의 뇌척수액 (CSF) 샘플링 (Lui & Duff, 2008, J. Visualized Exp., 21:e960) 및 개흉술을 이용한 심장내 채혈을 수행하였다. 미세모세관을 통해, 동물 1마리당 최대량 (최대 5 ㎕)의 투명한 CSF를 60 ㎕ 부피의 PBS 중에 수집하여 약간 상이한 출발 희석액을 얻고, 이어서, 실험 개시 전에 추가의 대조군 PBS로 표준화시켰다. 1.1 mL Z-겔(Z-Gel) 미세관(자르슈테트(Sarstedt: 독일 눔브레히트))에 혈액 샘플을 수득한 후, 8분 동안 8,000 rpm으로 스핀 다운시키고, (PBS 중) CSF 샘플과 함께 혈청을 추가 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 1A - 조직학적 분석
5 내지 29일의 추가 조사 기간 후, 동물을 희생시키고, 앞서 보고된 바와 같이 (Sergeyenko et al., 2013, J. Neurosci., 33:13686-94), 와우 홀 마운트를 제작하였다. 와우 홀 마운트 및 외식편 둘 모두를, 상응하는 2차 항체 (알렉사 플루오르 555 항-마우스 및 알렉사 플루오르 647 항-토끼, #A-21422 및 #A-21245 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬), 1:1000)와 함께 미오신 7A (Myo7A, #25-6790 프로테우스 바이오사이언시스(Proteus Biosciences: 미국 캘리포니아주 라모나), 1:400) 및 베타-튜불린 (TuJ1, #MMS-435P 바이오레전드(Biolegend: 미국 캘리포니아주 샌디에고), 1:200)에 대한 항체로 염색시켰다 (Dilwali et al., 2015, Scientific Reports, 5:18599). 표본을 고정시킨 후, 공초점 현미경법을 수행하였다. 주어진 실험 시리즈의 모든 영상은 동일한 설정하에서 수득하였고, 레이저 강도는 형광 포화를 막기 위해 가장 강한 eGFP 신호를 갖는 표본에 기초하여 선택하였다. 개괄 영상에 대한 Z-스택 및 코르티 기관 및 나선 신경절 뉴런 (SGN) 영역에 대한 줌 인 사진을 수득하였다. AMIRA를 사용하는 3D 재구성을 이용함으로써 보다 정확하게 SGN 형질감염을 측정하였다.
도 1 및 도 4의 결과는 각각 C57BL/6 및 CBA/CaJ에서 eGFP를 코딩하는 AAV의 발현에 의해 모니터링된 바와 같은 5개의 혈청형의 향성을 도시한 것이다. eGFP 발현은 Anc80에 노출된 와우 배양물에서 정성적으로 더 밝았고, 발현은 다수의 와우 세포 유형에서 뚜렷이 나타난다.
실시예 1B - eGFP 발현의 정량화
시험관내 데이터에 대하여, eGFP 양성 세포의 개수를 각 표본에 대한 기저 및 첨단 샘플마다 1 또는 2개의 100 ㎛ 절편당 외유모 세포 또는 내유모 세포의 총 개수로 나누어 와우를 따라 eGFP 양성 내유모 세포 (IHC) 및 외유모 세포 (OHC)의 비율(%)을 수동으로 정량화하였다. 와우 외식편 중 육안상 보이는 SGN 모두를 그의 eGFP 발현에 관하여 평가하였다. 0 (발현되지 않음) 내지 3 (가장 강한 신호)인 척도에 의해 (상기 설명된 바와 같은, 각 실험 시리즈에 대하여 조정된) 정성적 접근법을 이용하여 나선연 및 지지 세포 영역을 평가하였다. AAV를 포함하지 않는 대조군 샘플을 사용하여 자발형광을 배제시켰다. 데이터 통해 Anc80이 시험된 두 마우스 계통 모두의 첨단 및 기저에서 60 내지 100%의 효율로 IHC 및 OHC를 표적화하였다는 것이 입증되었다. Anc80은 AAV2와 비교하였을 때, 일관되게 및 정성적으로 더 밝은 IHC 및 OHC eGFP 발현을 보였다 (도 1 및 4).
2일차 (조기) 시점에 발현의 과소평가를 유도할 수 있는 상이한 AAV 사이의 발현 개시 시점의 잠재적 차이를 조정하기 위해, 더 긴 장기간 동안 실험을 수행하였다. 새로운 와우 세트를 동일한 조건에서 형질도입시켰지만, AAV와의 48 h 인큐베이션 후, 외식편 배양물의 벡터 함유 배지를 제거하고, 신선한 배지로 교체하여 배양물이 추가로 5일 (48h+5d로 지칭됨) 동안 생존가능하게 유지되도록 하였다. 본 장기간 연구에서 AAV2 및 Anc80에 대해 유사한 발현 패턴이 관찰되었다. CBA/CaJ 마우스에서, 특히, 기저 회전부 (도 1J, 1K, 및 도 4I, 4J)에서 AAV6, 8, 및 9의 경우, 발현이 중간 정도로 증가된 것이 관찰되었다. 모든 혈청형에 의해 다른 세포 유형이 표적화되었고, 변연부가 지지 세포보다 더 허용적이었고, 그 다음으로 SGN이었다 (도 5, 6, 및 7). 일관되게, 더 밝은 eGFP 형광에 의해 입증된 바와 같이, Anc80 형질도입이 더 높은 효율 및 더 강력한 발현을 이끌었다.
실시예 1C - 생체내 주사
사면 유리 미세주사 피펫을 이용하여 원창 막 (RWM)을 통해 마우스 새끼 (P0 내지 P2)에 주사하였다. P-2000 피펫 풀러 (서터 인스투르먼트(Sutter Instrument: 미국 캘리포니아주 노바토)) 상에서 모세관 유리 (WPI)로부터 피펫을 풀링하고, 미세피펫 베벨러 (서터 인스투르먼트: 미국 캘리포니아주 노바토)를 이용하여, 비스듬히 잘랐다 (28° 각도로, 팁 직경 ~20 ㎛). (유양 돌기 돌출부는 그대로 남겨둔 채) 수술 부위를 커버하기 위해 무통증을 위하여 멸균 스왑을 이용하여 EMLA 크림 (리도카인 2.5% 및 프릴로케인 2.5%)을 외부에서 도포하였다. 수술 전 체온을 38℃ 가온 패드 상에서 유지시켰다. 의식을 상실할 때까지 2-3분 동안 빙수 내에서 저체온증을 빠르게 유도하여 새끼를 마취시키고, 이 상태를 수술 중 5-10분 동안 냉각 플랫폼 상에서 유지시켰다. 반복하여 3회에 걸쳐 베타딘(Betadine)으로 문질러 씻고, 70% 에탄올로 닦아냄으로써 수술 부위를 소독하였다. 귀 후방부를 절개하여 투명한 귀 융기부를 노출시키고, 미세피펫을 수동으로 융기부 및 피개 근막을 통해 전진시키고, 미세피펫의 팁으로 RWM을 관통시켰다. 5마리 (AAV1), 4마리 (AAV2), 2마리 (AAV8), 1마리 (AAV6), 3마리 (Anc80)의 C57BL/6 동물의 왼쪽 귀 한쪽에 대략 1 ㎕의 바이러스를 1 min 이내에 수동으로 주사하였다. 특이적인 벡터 제제와 관련된 인자, 예컨대, 품질 및 순도에 대해 조정하기 위해, 본원에 제시된 본 발명자들의 정성적 관찰결과 (데이터는 제시되지 않음)를 확증한 독립 제제로부터의 상이한 벡터 로트를 이용하는 후속 연구에서 Anc80 결과를 확인하였다. 비맹검 방식으로 군마다 주사를 수행하였다. 종종, 주사 바늘이 너무 깊게, 너무 얕게, 또는 잘못된 각도로 주사되었다. 중이 또는 내이 구조에 대한 손상이 육안으로 보이는 경우에는 그 샘플을 추가 분석으로부터 배제시켰다. 주사 성공률은 주사 놓은 사람의 경험 수준에 따라 ~50% 내지 ~80% 범위였다. 주사 후, 6-0 모노필라멘트 봉합사 (서지컬 스페셜티즈(Surgical Specialties: 미국 펜실베이니아주 와이오미싱))를 사용하여 피부 절개부를 봉합하였다. 이어서, 새끼를 5-10 min 동안 38℃ 가온 패드로 다시 복귀시킨 후, 사육을 위해 다시 그의 모체에게로 돌려 보냈다.
이전 보고와 일관되게, AAV1은 중간 정도 내지 높은 효율로 IHC를 형질도입시켰다 (도 2A, 2B). 상기 연구는 AAV2, 6, 및 8이 소수의 IHC를 표적화하였다는 것을 나타내며, 오직 AAV8만이 첨단 및 기저에서 대략 등가인 형질도입을 보였다 (도 2B). 또한, 이전 보고와 일관되게, 시험된 종래의 모든 AAV 혈청형에 대하여 최소의 OHC 형질도입 (<5%)이 이루어졌다. 그러나, Anc80은 20배 (AAV1에 대해) 내지 3배 (AAV2에 대해) 더 낮은 용량에서 거의 100%의 IHC 및 ~90%의 OHC를 형질도입시켰다 (도 2A-2C). 표면형광 현미경법에 의한 생 세포 영상화에 의해 관찰되는 바와 같이 (도 8C, 8D), 모든 혈청형에 대해 1.36 x 1012 GC인 동일한 용량의 형질도입은 Anc80에 대해서는 상당한 IHC 및 OHC 형질도입을 일으킨 반면, AAV1, 2, 및 8의 경우에서는 최소 IHC 표적화가 이루어졌고, OHC에서는 전혀 관찰되지 않았다.
이어서, Anc80 형질도입된 샘플을 고정시키고, 염색하고, 공초점 현미경법에 의해 영상화하였고, 이를 통해 유모 세포 형질도입의 용량 의존성이 밝혀졌다 (도 8E). 비할 데 없는 OHC 표적화 (도 2C, 도 8)는 다른 AAV와 비교하여 Anc80의 정성적으로 뚜렷하게 다른 형질도입 생물학적 성질을 나타낸다. 총 3마리의 Anc80 주사한 마우스의 기저에서부터 첨단까지 와우 전역에 걸쳐 유사한 수준의 Anc80 형질도입이 관찰되었다 (도 2A, B, C). 와우 첨단에 대한 저배율 확대도 (도 8A)는 주사 부위에서 멀리 떨어진 곳에서 강력한 eGFP 발현을 보였다. 기저에 대한 고배율 확대 영상은 100% IHC 및 95% OHC 형질도입을 나타낸다 (도 8B).
일부 동물에서, 주사하지 않은 반대쪽 귀에서 강건한 eGFP 발현이 관찰되었다 (도 9). 마우스에서, 와우 도수관은 와우 외림프액으로부터 CSF 내로, 반대쪽 도수관 및 반대쪽 와우 내로의 유체 경로를 제공하는 독특한 방식이 특징이다. 따라서, RWM을 통해 주사된 Anc80-eGFP가 뇌에서 뉴런을 형질도입시킬 수 있는지 여부도 또한 조사하였다. 실제로, 소뇌 횡단면은 소뇌 푸르키니에 뉴런 중에서 강력한 eGFP 발현을 보였다 (도 10A, 10B).
일부 형태의 유전적 청각 장애는 또한 전정 기능 장애를 유발하기 때문에, Anc80은 인간 전정 기관 내로의 유전자 전달에 유용한 벡터가 될 수 있다. 이러한 가능성을 조사하기 위해, 전정 슈반세포종 종양 절제를 받은 성인 환자 4명으로부터 인간 전정 상피를 수확하고; 앞서 기술된 바와 같이 (Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-31), 감각 상피를 배양물 중에 배치하였다. AAV 형질도입된 샘플의 경우, 도 3C에서는 유모 세포 및 지지 세포 둘 모두에서 인간 전정 상피 전역에 걸쳐 강력한 eGFP 형광이 나타났다. 도 3D의 Myo7A로 대비염색된 상피의 고배율 확대도에서는 83% (19/23)의 Myo7A-양성 유모 세포가 또한 eGFP 양성인 것으로 나타났고, 이는 Anc80이 마우스 및 인간 유모 세포 둘 모두를 효율적으로 형질도입시킬 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 1D - 면역학적 검정법
중화 검정법을 통해 CSF 및 혈청 중 Anc80에 대한 항체 역가를 측정하였다 (Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68). 96 웰 포맷을 사용하여, 열 불활성화된 (상기 기술된 바와 같이 수집된) CSF 또는 혈청 샘플을 무혈청 배지 (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)) 중에서 연속하여 희석시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 Anc80-루시페라제 (106 GC/웰)로 처리하였다. 이어서, 샘플/Anc80-루시페라제 믹스를 HEK293 세포 상으로 옮겨 놓고, 그 전날 아데노바이러스 (MOI 20)로 처리하였다. 37℃에서 1시간 후, 희석된 혈청 배지 (1부 무혈청, 2부 혈청 포함)를 각 웰에 첨가하였다.
2일 경과 후, 세포를 용해 완충제 (프로메가(Promega: 미국 위스콘신주 매디슨))로 처리하고, -80℃에서 30분 동안 냉동시켰다. 이어서, 세포를 37℃에서 15분 동안 해동시킨 후, 기질 완충제 (트리스-HCl, MgCl2, ATP (라이프 테크놀러지즈: 미국 캘리포니아주 칼즈배드), D-루시페린 (캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences: 미국 매사추세츠주 홉킨턴))로 처리하였다. 시너지 바이오테크 플레이트 리더(Synergy BioTek Plate Reader) (바이오테크(BioTek: 미국 버몬트주 위누스키))를 이용하여 발광 출력량을 판독하였다.
주사한 마우스의 CSF가 아닌 혈청 중에서 검정 및 샘플링 감도 수준으로 벡터에 대한 낮은 수준의 중화가 검출가능하였다 (도 10C).
실시예 1E - 유모 세포 전기생리학
와우를 절제하고, 유리 커버슬립 상에 고정시키고, 63x 수침지 대물 렌즈 및 차등 간섭 대비 광학계가 장착된 악시오 이그재미너.A1(Axio Examiner.A1) 정립 현미경 (칼 자이스(Carl Zeiss: 독일 오버코헨)) 상에서 관찰하였다. 실온에서 (22℃ - 24℃) MEM (라이프 테크놀러지즈: 미국 캘리포니아주 칼즈배드) (pH 7.4; ~310 mOsm/kg)에서와 같이 137 mM NaCl, 5.8 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.7 mM NaH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 0.9 mM MgCl2, 및 5.6 mM D-글루코스, 비타민 (1:100), 및 아미노산 (1:50)을 함유하는 표준 용액 중에서 전기생리학적 기록을 수행하였다.
기록 전극 (3-4 MΩ)을 R-6 유리 (킹 프리시전 글래스(King Precision Glass: 미국 캘리포니아주 클레어몬트))로부터 풀링하고, 140 mM CsCl, 5 mM EGTA-KOH, 5 mM HEPES, 2.5 mM Na2ATP, 3.5 mM MgCl2, 및 0.1 mM CaCl2를 함유하는 세포내 용액 (pH 7.4; ~280 mOsm/kg)으로 충전시켰다. 전체 세포 밀봉 기술을 사용하여 악소패치(Axopatch) 200B (몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices: 미국 캘리포니아주 서니베일))를 이용함으로써 기계적 형질도입 전류를 기록하였다. 유모 세포를 -84 mV으로 유지시켰다. 저주파 통과 베셀(Bessel) 필터를 이용하여 5 kHz에서 전류를 여과하고, 12-비트 획득 보드 (디지데이터 1440A(Digidata 1440A), 몰레큘러 디바이시스: 미국 캘리포니아주 서니베일)를 이용하여 ≥20 kHz에서 디지털화하고, pCLAMP 10 소프트웨어 (몰레큘러 디바이시스: 미국 캘리포니아주 서니베일)를 이용하여 기록하였다.
LVPZT 증폭기 (E-500.00, 피지크 인스트루멘테(Physik Instrumente: 독일 칼스루에))에 의해 구동되는 PICMA 칩 피에조 액추에이터 (피지크 인스트루멘테: 독일 칼스루에) 상에 고정된 강성 유리 프로브를 사용하여 IHC 및 OHC로부터의 유모 다발을 편향시키고, 8-극 베셀 필터 (모델 3384 필터, 크론-하이트 코포레이션 (미국 매사추세츠주 브록톤))를 이용하여 40 kHz에서 여과하여 잔류 피펫 공명을 제거하였다. 강성 유리 프로브는 전체 다발 기록을 위해 유모 세포 부동섬모의 어레이의 오목한 면에 들어맞게 디자인되었다 (OHC를 위해 직경 3-4 ㎛, 및 IHC를 위해 직경 4-5 ㎛). >P10에서의 전체 세포 전기생리학 기록을 위해, P5-7째에 와우 조직을 절개하고, 37℃, 5% CO2에서 MEM(1X) + 1% FBS를 포함하는 글루타MAXTM-I(GlutaMAXTM-I) 배지 중에서 최대 30일 동안 인큐베이션시켰다.
P7 OHC 및 P35 IHC로부터의 유모 다발 편향에 의해 유발된 대표적인 전류는 eGFP 양성 및 eGFP 음성 대조군 세포 사이의 진폭, 감도 또는 동역학적 성질에 있어서 어떤 차이도 보이지 않았다 (도 2D). 와우의 모든 영역으로부터, 및 Anc80에의 노출 후 1 내지 5주 사이의 시기의 것으로부터 51개의 eGFP 양성 및 52개의 eGFP 음성 유모 세포가 기록되었다. 모든 경우에서 반응은 야생형과 구별하기 어려웠고 (도 2E), 이를 통해 Anc80 형질도입이 감각 세포 기능에는 어떤 해로운 영향도 미치지 않았다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1F - 청력 검사
앞서 기술된 바와 같이 (Askew et al., 2015, Science Translational Med., 7:285ra108) 청각 뇌간 반응 (ABR) 및 변조 이음향 방사 (DPOAE) 데이터를 수집하였다. DPOAE는 적절한 와우 증폭 및 튜닝 검정법이고, 외유모 세포 생존능에 관한 민감한 척도이다 (Guinan et al., 2012, Hearing Res., 293:12-20). 마취된 마우스에서 시험되는 자극은 5.6, 8, 11.3, 16, 22.6, 및 32 kHz 주파수에서 10 내지 90 dB 음압 수준으로 달리 하였다. Anc80 주사한 귀 4개 주사하지 않은 귀 4개, 및 주사 손상은 있으나, eGFP 형광은 없는 음성 대조군 귀 1개를 P28-P30째에 분석하였다.
ABR을 유발하는 데 필요한 최소 사운드 임계값을 플롯팅하였고 (도 2F), 주사한 귀와 주사하지 않은 귀 사이의 임계값에서는 어떤 차이도 나타나지 않았다. 조직학적 분석을 통해 주사한 귀 4개 모두에서 강력한 eGFP 형광이 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 한 경우에서, eGFP 양성 세포는 없었고, ABR 임계값은 상승되어 있었는데 (도 2F), 이는 주사에 실패하였고, 바늘이 와우를 파괴시키고, 영구적인 손상을 유발하였을 수 있음을 시사한다. Anc80-eGFP에 의한 강건한 외유모 세포 형질도입에도 불구하고, 주사하지 않은 대조군 귀와 비교하였을 때, DPOAE 임계값에 있어서 어떤 차이도 관찰되지 않았다 (도 2G). 따라서, ABR 및 DPOAE로부터의 데이터는 IHC 및 OHC에서의 RWM 주사, Anc80 형질도입 및 트랜스진 발현이 청각 기능에 모두 안전하다는 것을 시사한다.
실시예 1G - 로타로드 검사
5마리의 C57BL/6 마우스를 로타로드 장치 상에서 균형 행동에 대하여 검사하였다. 전정 기능이 손상된 마우스는 로타로드 장치 상에서 수행능이 불량한 것으로 알려져 있다 (Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Archives Dis. Childhood, 100:271-8). 이전 연구에서는 오직 한쪽 귀만이 이환되었을 때 균형 기능 장애를 검출할 수 있는 상기 로타로드 검사의 능력을 강조하였다 ([Fukui & Raphael, 2013, Hearing Res., 297:99-105]; [Geleoc & Holt, 2014, Science, 344:1241062]). P1째에 3마리의 마우스에 주사하고, P36째에 검사하였고, 주사하지 않은 대조군 마우스 2마리를 P79째에 검사하였다. 모든 마우스는 하기 로타로드 프로토콜을 사용하여 검사하였다. 1일째, 마우스를 5분 동안 4 RPM으로 회전하는 로드 상에서 균형을 잡도록 훈련시켰다. 2일째, 각 시도는 5분 동안의 간격을 두고 진행되도록 5회 시도로 마우스를 검사하였다. 매회 시도마다 로드를 2 RPM인 출발 속도로부터 1 RPM씩 가속화시켰다 (Fukui & Rapheal, 2013, Hearing Res., 297:99-105). 마우스가 장치에서 낙하까지의 시간 (초)을 기록하였다.
와우의 외림프액이 전정 미로의 것과 연속되어 있기 때문에, 와우 RWM을 통해 주사된 Anc80-eGFP가 전정 감각 기관을 형질도입시키는지 여부를 평가하였다. 실제로, 전정 상피의 홀 마운트는, 중력 및 선형 측두 운동에 민감한 전정 기관인 난형낭의 I형 및 II형 유모 세포 둘 모두에, 및 회전 측두 운동에 민감한 반고리관에서 강건한 eGFP 발현을 나타내었다 (도 3A, 3B). 따라서, Anc80 형질도입이 균형에 영향을 줄 수 있다는 안전성에 관한 우려 사항을 해결하기 위해, 주사하지 않은 대조군과 유사하게 전정 발현이 확인된 주사한 마우스에 대하여 전정 기능에 관한 로타로드 검사를 수행하였다 (도 11).
파트 2-유전자 요법이 어셔 증후군 마우스 모델에서 기능을 회복시킨다
실시예 2 - 어셔 증후군 마우스 모델
하기 방법 및 물질을 실시예 2에서 사용하였다.
조직 제조
전기생리학적 연구를 위해 출생 후 0일 내지 8일째 (P0 내지 P8) Ush1c c.216G>A 이형접합성 또는 동형접합성 돌연변이체 마우스로부터 난형낭 및 코르티 기관을 수확하였다. 빠르게 단두시켜 출생 후 마우스 새끼를 사망시켰다. 측두골을 절제하고, 10 mM HEPES (pH 7.4)로 보충된 MEM (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 중에서 배씽시켰다. 앞서 기술된 바와 같이 효소를 사용하지 않고 코르티 기관을 절개하였다. 난형낭은 0.1 mg/ml로 10 min 동안 프로테아제 (프로테아제 XXIV, 시그마(Sigma))로 처리한 후 제거하였다. 절제된 기관을 동그란 유리 커버슬립 상에 고정시켰다. 앞서 커버슬립에 접착된 한 쌍의 얇은 유리 섬유를 조직 가장 자리에 놓고, 이를 평평한 위치에서 안정화시켰다. 조직을 바로 사용하거나, 또는 1% 우태아 혈청의 존재하에 배양물 중에서 유지시켰다. 배양물을 7 내지 8일 동안 유지시키고, 시험관내 바이러스 벡터 감염을 포함하는 실험을 위해 배지를 매 2 내지 3일마다 교체하였다.
동물
루이지애나 주립 대학교 헬쓰 사이언스 센터(Louisiana State University Health Science Center)로부터 Ush1c c.216G>A 넉-인 마우스를 입수하였다. C57BL6 배경상의 도입된 계통은 앞서 연령 관련 청력 손실을 유발하는 Cdh23 (Ahl) 돌연변이로부터 생성된 것이었다. 토 클립(toe clip)(P8 이전) 또는 귀 펀치 (P8 이후)를 사용하여 마우스의 유전자형을 분석하고, 앞서 기술된 바와 같이 (Lentz et al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44) PCR을 수행하였다. 모든 연구를 위해, 수컷 및 암컷 마우스 둘 모두 대략 동일한 비율로 사용하였다. 무작위화 패러다임은 달리 적용되지는 않았다.
바이러스 벡터 생성
전체 RNA를 c.216AA 돌연변이체 마우스의 와우로부터 단리시키고 (RNA쿠어스(RNAqueous) 마이크로 키트, 암비온(Ambion)), 콴티테크 리버스 트랜스크립션 키트(QuantiTect Reverse Transcription kit) (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 역전시켰다. 플래티넘(Platinum) Taq DNA 폴리머라제 하이 피델러티(Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity) (인비트로겐) 및 프라이머: Trunc-하모닌.F(KpnI) GAG GTA CCA TGG ACC GGA AGG TGG CCC GAG (서열식별번호: 9); Trunc-하모닌.RV(BamHI) CAG GAT CCG GAC AAT TTC ATC CCC TAC (서열식별번호: 10)를 이용하여 PCR에 의해 trunc-하모닌의 cDNA를 증폭시켰다. 387 bp PCR 생성물을 TA 클로닝 키트 (인비트로겐)로 클로닝하고, 서열분석에 의해 확인하였다. GFP 융합 구축물을 생성하기 위해, 말단절단된 하모닌 단편을 KpnI 및 BamHI를 이용하여 pEGFP-C1로 서브클로닝하였다. NheI-XbaI EGFP::trunc-하모닌 cDNA를 AAV 셔틀 벡터로 전달하였다. 맞춤식 벡터를 AAV2 역위 말단 반복부 (ITR)와 함께 AAV1 캡시드 내로 패키징하였고, 여기서 트랜스진 카세트는 CMV 프로모터에 의해 구동되었다 (AAV2/1.CMV.EGFP::trunc-harmomin.hGH, 1.92 E14gc/m, BCH).
릴리 정(Lily Zheng) 및 하메스 바틀스(James Bartles) (Zheng et al., 2010, J. Neurosci., 30:7187-201) (Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University, Feinberg School of medicine, Chicago, IL)에 의해 친절하게 제공받은 EGFP 태그부착된 표지된 구축물로부터 하모닌-a1 및 하모닌-b1 플라스미드를 본 발명자들의 실험실에서 제조하였다. 하모닌-a1은 원래 마우스 신장으로부터 수득되었고, 하모닌-b1은 단리된 마우스 와우 감각 상피로부터 수득되었다. 하모닌-a1 구축물을 그의 N 말단 단부에서 EGFP 태그를 tdTomato로 대체시켜 추가로 변형시켰다. 형광 표지된 구축물, 및 표지되지 않은 구축물을 AAV 벡터 내로 패키징하였다. 보스톤 아동 병원(Boston Children's Hospital)의 바이러스 핵심 연구 지원시설, 및 매사추세츠 안과 이과 병원(Massachusetts Eye and Ear Infirmary)의 진 트랜스퍼 벡터 코어에서 바이러스 벡터를 생성하였다. 하기 벡터를 생성하였다: AAV2/1.CMV.tdTomato::하모닌-a1 4.33 10^13gc/ml (BCH); AAV2/1.CMV.EGFP::하모닌-b1 2.73 564 10^14 gc/ml (BCH); AAV2/1.CMV.EGFP-하모닌-a1: 2.81 10^12 gc/ml (MEEI); AAV2/1.CMV.EGFP-trunc-하모닌; 1.92 10^14 gc/ml (BCH); AAV2/Anc80.CMV.하모닌-a1: 1.93 10^12 gc/ml (MEEI); AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1: 1.74 10^12 gc/ml (MEEI); AAV2/Anc80.CMV.trunc-harm.WPRE: 9.02 567 10^12 gc/ml (MEEI); 시험관내 실험을 위해, 24 h 동안 1% 우태아 혈청의 존재하에서 예리하게 절개된 조직 상에서 1 ml MEM 보충 배지에 10 ㎕의 농축된 벡터를 가하였다. 이어서, 배양물을 최대 10일 동안 유지시켰다.
원창 막 ( RWM ) 주사
보스톤 아동 병원의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committees)에 의해 승인받은 바와 같이 동물 프로토콜 #15-01-2878R에 따라 RWM 주사를 수행하였다. 0.8 ㎕-1 ㎕의 AAV 벡터를 신생 마우스 P0-P1 및 P10-P12에 주사하였다. P0-P1 마우스를 먼저 저체온 노출을 사용하여 마취시킨 반면, P10-P12 마우스는 이소플루란을 사용하여 마취시켰다. 마취시, 귀 후방부를 절개하여 귀 융기부를 노출시키고, 와우를 시각화하였다. 현미 조작 장치에 의해 조절되는 유리 미세피펫을 이용하여 RWM을 통해 주사하였다(Askew et al., 2015, Sci. Transl. Med., 7:295ra108). 주사되는 물질의 부피를 10 min 동안 대략 0.02 ㎕/min으로 조절하였다. 표준 수술 후 관리를 적용시켰다. 생체내 연구를 위한 샘플 크기는 샘플 크기를 최적화하고, 변동을 감소시킬 수 있도록 지속적으로 결정하였다.
전기생리학적 기록
pH 7.4 및 320 mOsmol/kg로 조정된, 144 mM NaCl, 0.7 mM NaH2PO4, 5.8 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 0.9 mM MgCl2, 5.6 mM D-글루코스, 및 10 mM HEPES-NaOH를 함유하는 표준 인공 외림프액에서 기록을 수행하였다. 농축물 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로부터 비타민 (1:50) 및 아미노산 (1:100)을 첨가하였다. 차등 간섭 대비 광학계와 함께 63x 수침지 대물 렌즈가 장착된 정립 악시오스코프 FS 현미경(upright Axioskop FS 현미경) (자이스(Zeiss: 독일 오버코헨))을 사용하여 첨단 표면으로부터 유모 세포를 관찰하였다. 기록 피펫 (3-5 MΩ)을 보로실리케이트 모세관 유리 (가르너 글래스(Garner Glass: 미국 캘리포니아주 클레어몬트))로부터 풀링하고, 135 mM KCl, 5 mM EGTA-KOH, 10 mM HEPES, 2.5 mM K2ATP, 3.5 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2를 함유하는 세포내 용액 (pH 7.4)으로 충전시켰다. 실온에서 -64 mV의 홀딩 전위에서 전체 세포 전압 클램프하에 전류를 기록하였다. 저주파 통과 베셀 필터를 이용하여 10 kHz에서 여과된 악소패치 멀티클램프(Axopatch Multiclamp) 700A 또는 악소패치 200A (몰레큘러 디바이시스: 미국 캘리포니아주 팔로 알토)를 사용하여 데이터를 획득하고, 12-비트 획득 보드 (디지데이터 1322) 및 p클램프(pClamp) 8.2 및 10.5 (몰레큘러 디바이시스: 미국 캘리포니아주 팔로 알토)를 이용하여 ≥20 kHz에서 디지털화하였다. 오리진랩(OriginLab) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 오프라인에서 분석하였고, 데이터는 달리 언급되지 않는 평균 ± 표준 편차로 제시되어 있다.
통계학적 분석
확실하게 재현가능하도록 하기 위해 각 시점에 각 군당 적어도 3마리의 마우스에서 시험 벡터 및 대조군 벡터를 평가하였다. 샘플 크기는 도면 설명에 제시되어 있다. RWM 주사가 성공적으로 진행된 모든 동물을 연구 분석에 포함시켰다. 주사가 성공적으로 이루어지지 못한 동물은 평균에서 배제시켰지만, 전체 개시내용을 위해서는 도면 설명에 포함시켰다. 주사 성공 여부는 임계값 >90 dB SPL로 ABR 회복에 따라 결정되었다. 통계학적 분석은 오리진 2016(Origin 2016) (오리진랩 코포레이션(OriginLab Corporation))에 따라 수행되었다. 데이터는 본 명세서 및 도면 설명에 제시되어 있는 바와 같이 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 평균의 표준 오차 (SEM)로 제시된다. 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 평균 사이의 유의한 차이를 측정하였다.
실시예 2A - 마우스 어셔 모델에서의 주사 전자 현미경법 ( SEM )
P7, P18 및 ~P42 (6주)째에 대조군 및 돌연변이체 마우스의 코르티 기관을 따라 SEM을 수행하였다. 워싱턴 대학(University of Washington) 에드윈 루벨(Edwin Rubel) 박사와 함께 협력하여 P18 SEM을 수행하였다. 내이를 4℃에서 밤새도록 0.1 M 인산나트륨 중 4% 글루타르알데히드에서 고정시켰다. 다음날, 표본을 0.1 M 인산나트륨 완충제 (PB) 중에서 3회에 걸쳐 세정하고, 얼음 배쓰 중에서 30분 동안 0.1 M PB 중 1% 사산화오스뮴에서 후기 고정을 수행하였다. 이어서, 표본을 0.1 M PB 중에서 세정하고, 35%, 70%, 95%, 및 100% (x2)로 등급이 나뉜 에탄올 시리즈를 통해 탈수시켰다. 샘플을 임계점 방식으로 건조시키고, SEM 스터브 상에 고정시키고, Au/Pd로 스퍼터 코팅하였다. JEOL JSM-840A 주사 전자 현미경을 사용하여 SEM을 수행하였다. P8 및 6주 단계에 대해서도 유사하게 제조하였다. 코르티 기관 외식편을 실온에서 1 h 동안 2 mM CaCl2로 보충된 0.1 M 카코딜레이트 완충제 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences)) 중 2.5% 글루타르알데히드에서 고정시켰다. 등급이 나뉜 아세톤 시리즈에서 표본을 탈수시키고, 액상 CO2로부터 임계점 방식으로 건조시키고, 4-5 nm 백금 (Q150T, 쿼럼 테크놀러지즈(Quorum Technologies: 영국))으로 스퍼터 코팅하고, 전계 방출 주사 전자 현미경 (S-4800, 히타치(Hitachi: 일본))으로 관찰하였다.
동형접합성 c.216AA 돌연변이체 마우스는 청각 장애가 있고, 전정 기능 장애의 특징인 머리를 치켜드는 행동을 보인다. 이전 연구 (Lentz et al., 2010, Dev., Neurobiol., 70:253-67)에서는 P30째에 와우의 기저에서의 뚜렷한 내유모 세포 및 외유모 세포 퇴행을 기술하였다. 중간 회전부에서는 퇴행 및 유모 세포 사멸 또한 관찰된 반면, 기관의 첨단부는 생후 1개월째 보다 잘 보존되었다. 유모 세포 퇴행은 내이 기관의 발생 동안 점진적으로 일어난다는 가설이 제기되었고, 보다 이른 조기 단계에서의 유모 세포 생존을 평가하기 위해, P8 및 P18째에 코르티 기관을 따라 SEM 분석을 수행하였다. 이형접합성 c.216GA 마우스의 외유모 세포 (OHC) 및 내유모 세포 (IHC)는 보존되었고, 상기 연령 시점에 그의 다발은 적절한 배향을 보였다 (도 12A-12C, 12G, 12I 및 도 19A-19C, 19K). 그러나, 비조직화된 유모 다발은 분석된 두 연령 시점 모두에서 동형접합성 c.216AA 마우스의 코르티 기관의 전체 길이를 따라 분명하게 나타났다 (도 12D-12F, 12H, 12J-12L 및 도 19D-19J, 19L). P8째에, IHC 다발은 기저, 중간 및 첨단 영역에서 경미하게 비조직화된 것으로 보였다 (도 12D-12F, 12J). 다수의 IHC 다발은 파상 패턴 및 경미한 비조직화된 부동섬모 열을 나타내었다 (도 12J). c.216AA 돌연변이체 마우스의 다수의 OHC는 잘 보존된 유모 다발을 갖고 있으면서 (도 12H, 12K), 단편화되고, 비조직화된 유모 다발이 상기 기관을 따라 산발적으로 분명하게 나타났다 (도 12D-12F, 12L). 앞서 보고된 바와 같이 (Lentz et al., 2013, Nat. Med., 19:345-50), 대다수의 유모 세포는 여전히 존재하기는 하였지만, 파괴는 P18째에 보다 뚜렷하였다 (도 19D-19F).
하모닌-b1로 유전자 요법을 받은 마우스에서 유모 다발 형태를 평가하기 위해, 6주령된 비처리된 (또는 주사하지 않은) 및 처리된 (또는 주사한) 마우스의 측두골을 SEM 분석을 위해 준비하였다. 비처리된 c.216AA 마우스는 기관의 기저 및 중간 영역에서 심각한 유모 세포 손실을 보였다 (도 18). 기저 영역에서, OHC는 제1 열에는 대체로 존재하지 않았고, 제2 및 제3 열에서는 산발적으로 존재하였다. 상기 기관의 중간 영역에서, OHC의 제1 열 또한 대개는 존재하지 않았다. 첨단 단부에서 보다 경미한 표현형이 관찰되었다. 고배율 SEM 결과, c.216AA 돌연변이체 마우스의 기관의 전체 길이를 따라 심각하게 비조직화된 유모 다발이 또한 나타났다. 놀랍게도, 6주령된 c.216AA 마우스에서는 부동섬모 3개 열 모두 전형적인 계단식 구조를 유지한 유모 다발은 전혀 관찰되지 않았다. 대신, c.216AA 마우스로부터의 유모 세포는 제1 열, 비정상적인 제2 열 및 상당히 보존된 가장 키가 큰 열과 함께 부동섬모가 수축된 것으로 보이는 비조직화된 유모 다발을 나타내었다. 그에 반해, 하모닌-b1 처리 이후의 c.216AA 마우스에서는 유모 세포 손실 감소 및 정상적인 유모 다발이 관찰되었다. 대표적 시야에서 유모 다발의 존재 또는 부재로부터 유모 세포 계수를 추정하였다.
데이터 결과, 주사한 마우스에서는 기관의 기저에서부터 첨단까지, 기저의 경우, 40 내지 79%, 중간의 경우, 68 내지 95%, 및 첨단의 경우, 93 내지 99%로 유모 세포 개수가 뚜렷하게 보존되는 것으로 나타났다 (n=4 c.216AA 마우스 귀로부터 n=1824 세포 및 n=2 구제된 c.216AA 귀로부터 n=792). 비록 하모닌-b1을 주사한 마우스에서 여전히 비정상적인 유모 다발이 분명하게 나타났지만, 대부분의 유모 다발은 3개 열의 부동섬모를 가졌고, 그의 형태는 그의 이형접합성 대조군과 구별이 불가능하였다 (도 18).
실시예 2B - 어셔 마우스 모델에서의 FM1-43 영상화
5 μM FM1-43 (인비트로겐)을 세포외 기록 용액 중에 희석시키고, 10초 동안 조직에 적용시킨 후, 세포외 기록 용액 중에서 3회 세척하여 잉여량의 염료를 제거하고, 세포내이입을 통해 흡수를 막았다. 5분 후, 수침지 20x, 40x, 및 63x 대물 렌즈와 함께, 자이스 악시오 FS 플러스(Zeiss Axioscope FS plus) 상의 표면형광 광원, 차등 간섭 대비 광학계, 및 FM1-43 필터 세트 (크로마 테크놀러지즈(Chroma Technologies))를 이용하여 세포내 FM1-43을 영상화하였다. 배경 형광 감산을 사용하면서 CCD 카메라 및 아르구스-20(Argus-20) 영상 프로세서 (하마마쓰(Hamamatsu))를 이용하여 16-비트로 영상을 포착하였다. 모든 영상을 획득하기 위해 영상 밝기 조절 및 명암 조절에 관하여 동일한 설정 환경을 유지하고, 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) 또는 이미지-J(Image-J) 소프트웨어를 이용하여 오프라인으로 분석하였다.
보다 이른 조기 단계에서의 유모 세포 기능을 평가하기 위해, P4째에 예리하게 절개된 내이 기관에서의 FM1-43 흡수를 분석하였다. 단시간 적용시켰을 때 (< 10 s), FM1-43은 기능성 기계수용 채널을 소지하는 유모 세포에 침투한다. c.216GA 마우스의 유모 세포에서 균일한 FM1-43 흡수가 관찰되었지만 (도 13A), c.216AA 마우스의 OHC 사이에서 흡수 수준은 달랐고, 이는 모든 세포가 아닌, 일부 세포가 기능성 형질도입 채널을 유지하였다는 것을 시사한다 (도 13B). 와우의 전체 길이를 따라서도 유사하게 관찰되었다. 주파수 대응의 차이는 관찰되지 않았다. 출생 후 첫주 동안 c.216AA 마우스의 IHC에서 FM1-43 흡수가 또한 감소되었다 (데이터는 나타내지 않음). FM1-43 흡수를 또한 돌연변이체 마우스의 난형낭 유모 세포에서도 평가하였다. 흥미롭게도, c.216AA 돌연변이체 마우스에서는 흡수가 P6째에 스트리올라외 영역으로 한정되어 있었고, 이는 스트리올라 영역의 유모 세포에는 열려 있는 상태로 그대로 정지해 있는 기계수용 채널이 없다는 것을 시사한다 (도 13C, 13D).
실시예 2C - 어셔 마우스 모델에서의 기계적 자극
OHC 및 IHC: 400 mA ENV400 증폭기 (피에조시스템(Piezosystem: 독일 예나))에 의해 구동되는 1-524 크기의 PICMA 칩 피에조 액추에이터 (피지크 인스트루먼츠(Physik Instruments: 독일 발트브론)) 상에 고정된 강성 유리 프로브를 통해 기계적 자극을 전달하였다. 부동섬모 다발에 맞도록 프로브의 팁을 파이어 폴리싱하였다 (파이어폴리서 H602(Fire polisher H602), 월드 프리시전 인스트루먼츠 인크.(World Precision Instruments Inc.: 미국 플로리다주 새러소타)) (Stauffer & Holt, 2007, J. Neurophysiol., 98:3360-9). 잔류 피펫 공명을 제거하기 위해 8-극 베셀 필터 (크론-하이트: 미국 매사추세츠주 브록톤 528)를 이용하여 50 kHz에서 여과된 전압 단계를 가하여 편향을 유발하였다. C2400 CCD 카메라 (하마마쓰: 일본)를 이용하여 유모 다발 편향을 모니터링하였다. 전압 단계를 사용하여 자극 프로브의 운동을 그의 정지 위치의 약 ± 2 ㎛로 보정하였다. 프로브의 비디오 영상을 기록하여 축에서 벗어난 운동의 부재를 확인하고, 프로브 운동을 보정하였다 (공간 해상도 ~ 4 nm). 프로브의 10-90% 상승 시간은 ~20 μsec였다.
VHC: 압전 바이모르프 소자에 고정된 강성 유리 프로브를 통해 기계적 자극을 전달하였다. 자극 피펫 내로 운동섬모를 온화하게 흡입하여 커플링을 수행하였다. 연속하여 고정되고, 자극 프로브에 직접 커플링된 2개의 바이모르프로 이루어진 압전 장치에 전압 단계를 가하여 편향을 유발하였다. p클램프 8.0 소프트웨어에 의해 전압 단계를 제어하고, 1 kHz에서 8-극 베셀 필터 (크로흔-하이트: 미국 매사추세츠주 브록톤)를 이용하여 여과하였다. C2400 CCD 카메라 (하마마쓰: 일본)를 이용하여 유모 다발 편향을 모니터링하였다. 실험 이전에 자극 프로브의 운동을 그의 정지 위치의 약 (± 2 ㎛)로 보정하였다.
출생 후 첫주 동안, 청각 및 전정 상피는, 비교적 정상적인 형태를 갖는 일부 세포를 비롯한, 기계수용 유모 세포를 유지한다 (도 12). 코르티 기관에서는, P3 내지 P6 c.216AA 마우스로부터의 와우의 중간 및 첨단 회전부로부터 정상적인 것으로 보이는 다발을 갖는 유모 세포 및 보다 심하게 파괴된 유모 다발을 갖는 것으로부터 기록 결과를 얻었다. c.216AA 돌연변이체에서, 비록 반응의 진폭은 170 ± 80 pA로 ~63%만큼 유의하게 감소하였지만, OHC는 기계적 민감도를 유지하였다 (n=24; p<0.001, 도 13E, 13F, 13G). c.216AA 마우스에서는 OHC에서 31 내지 292 pA로 매우 광범위한 반응 진폭이 관찰되었다. 데이터를 유모 다발 형태에 따라 분류하였을 때, 유의한 차이 (p<0.01)가 관찰되었고: 각각 120 ± 65 pA (n=9) 및 201 ± 74 pA (n=15)로, 심하게 비조직화된 다발을 갖는 돌연변이체 유모 세포에서 유발된 전류는 보다 잘 보존된 유모 다발을 갖는 돌연변이체 유모 세포에서 유발된 전류보다 더 작았다. 전류 진폭 감소에도 불구하고, 기계적 변위에 대한 유모 세포 반응은 이형접합성 c.216GA 마우스의 것과 유사한 특성을 유지하였다. 2차 볼츠만 방정식을 사용하여 자극 반응 [I(X)] 곡선을 피팅하고 (도 13F), 피트를 이용하여 10-90% 동작 범위를 측정하였다 (도 20B). c.216GA 및 c.216AA로부터 기록된 OHC 사이에는 동작 범위에 있어서 어떤 유의한 차이(p= 0.054)도 관찰되지 않았다. 유사하게, c.216AA 돌연변이체 마우스의 IHC로부터의 유모 다발은 DIC 현미경하에서 경미하게 파괴된 것으로 보였지만, P6째에 형질도입 전류는 유의하게 감소되었다 (도 13E, 13F, 13G). -64 mV의 홀딩 전위에서, 이형접합성 c.216GA IHC (P6-P7)에서의 최대 형질도입 전류의 평균은 587 ± 96 pA (n=21)였지만, c.216AA IHC에서 316 ± 127 pA로 46%만큼 감소되었다 (n=19; p<0.001). c.216AA 돌연변이체 마우스의 IHC에서 동작 범위의 유의한 (p<0.01) 감소가 측정되었다 (도 20G).
일정한 다발 편향의 존재하의 형질도입 전류 감소로서 정의되는 순응 또한 c.216AA 돌연변이체 마우스에 존재하였다. 고속 및 저속 성분을 측정하기 위해 이중 지수 피트를 이용하여 순응 동역학적 성질을 분석하였다. 두 성분 모두 c.216AA 돌연변이체 마우스로부터의 IHC 및 OHC에서는 더 느렸지만, 저속 성분의 경우, 그 차이는 단지 유의적일 뿐이었다 (OHC에서, p<0.05, 및 IHC에서 p<0.001; 도 20C, 20D, 20H, 20I). 다른 한편으로는, Popen=0.5에서 측정된 순응 정도는 c.216GA 유모 세포보다 c.216AA의 OHC 및 IHC에서 유의하게 더 작았다 (도 20E, 20J; p<0.001). 종합해 보면, 본 결과는 c.216AA 마우스의 내유모 세포 및 외유모 세포에서 기계적 민감도가 경미하게 손상되어 있고, 중요하게는, 유전자 요법 및 세포 기능의 회복을 위한 전제 조건인, 두 세포 유형 모두 출생 후 첫주 동안 내내 생존해 있다는 것을 입증한다.
c.216AA 마우스에서는 전정 유모 세포에서 기계적 형질도입 전류 감소가 또한 관찰되었다. 스트리올라외 영역에서, c.216GA 전류의 경우, 231 ± 53 pA (n=8, P6-P7)인 것 대비로 c.216AA 전류는 109 ± 30 pA (n=9, P5-P7)로 유의하게 (p<0.001) 감소되었다 (도 13E, 13F, 13H). 스트리올라 영역에서 FM1-43 흡수가 존재하지 않은 것과 일치하여 (하기 참조; 도 13C, 13D), 스트리올라 영역의 유모 세포로부터는 극소량의 전류가 기록되거나, 또는 어떤 전류도 기록되지 않았다 (6 ±13 pA, n=6, P5-P7). DIC 현미경법에 의하면, 난형낭 유모 다발은 매우 잘 보존된 것으로 보였지만, 형질도입 전류는 스트리올라외 및 스트리올라 중의 유모 세포에서 각각 유의하게 감소되었거나, 또는 존재하지 않았다. 따라서, 스트리올라 영역을 제외하면, 본 결과는 돌연변이체 마우스에서 형질도입 기구가 올바르게 어셈블리되어 있고, 표적화되지만, 신생 마우스에서는 기능적 복합체의 개수가 감소되어 있다는 것을 시사한다.
이어서, 하모닌 발현을 구동시키는 AAV 벡터에 노출된 c.216AA 유모 세포에서의 기능을 평가하였다. 외인성 하모닌을 이용한 기능적 구제의 가능성을 증강시키기 위해, CMV 프로모터에 의해 구동되는 태그부착되지 않은 하모닌-a1 또는 하모닌-b1 코딩 서열을 Anc80으로 공지된 AAV 캡시드 내로 패키징하였다 (Zinn et al., 2015, Cell Rep., 12:1056-68). 본원에서 제시된 바와 같이, Anc80 캡시드는 생체내에서 IHC 100% 및 OHC 중 80-90%를 형질도입시킨다. 하모닌-b는 IHC 및 OHC 둘 모두에서 기계적 형질도입을 위해 요구되며, 두 세포 유형 모두에서 청각 기능을 위해서 필요하다는 가설이 제기되었다. AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1 (0.8 ㎕, 1.9x10^12 gc/ml) 및 별개로 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-a1 (1.7x10^12 gc/ml) + AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1 (0.5 ㎕ + 0.5 ㎕) 혼합물의 RWM 주사를 수행하고, 처리 후 2주 경과하였을 때, 기계적 형질도입 반응을 평가하였다.
와우가 골화되기 전, P5-P6째에 조직을 추출하고, 10일 동안 배양물 중에서 유지시켰다. 성숙한 OHC (>P10)가 생체외 기록 패러다임에도 불구하고 생존하지는 못하지만, P14-P16과 등가인 IHC로부터 강건한 전기생리학적 기록을 수득하였다. 결과는 도 15에 제시되어 있다. 주사하지 않은 마우스로부터의 IHC는 P16째에 크게 감소된 형질도입 전류를 보인 반면 (79 ± 43 pA, n=8), AAV 처리를 받은 마우스에서는 감각 형질도입의 회복이 명백하게 나타났다. P1째에 하모닌-b1 또는 b1 및 a1 둘 모두의 조합을 주사한 마우스에서는 유의한 회복 (***P<0.001)이 관찰되었으며, 각각의 평균 최대 형질도입 전류는 388 ± 66 pA (n=15) 및 352 ± 28 pA였다 (n=7; 도 15C). 하모닌-b1로 처리를 받은 후의 IHC에서의 형질도입 전류 진폭은 대조군 c.216GA 마우스와 유의한 차이를 보이지 않았다. 회복 수준은 하모닌-b1 및 하모닌-a1의 공동 주사에 의해 유의하게 변경되지 않았다. 이러한 결과는 조기 단계에서의 RWM 주사를 통한 외인성 하모닌-b1의 전달이 IHC에서 기계적 형질도입을 회복시킬 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 2D - 어셔 마우스 모델에서의 공초점 영상화
공초점 영상화를 위하여 출생 후 마우스 P0-P8로부터 조직을 제조하기 위해, 15 min 동안 4% 파라포름알데히드 (PFA)를 이용하여 고정을 수행하였다. 0.01% 트리톤을 이용하는 투과화 및 알렉사 플루오르 팔로이딘 (인비트로겐, 1/200)을 이용하는 대조염색을 사용하여 액틴 필라멘트를 표지하였다. LSM700 자이스 공초점 현미경 상에서 영상을 획득하였다. 노화된 마우스 (4 내지 8주)에서, 안락사 후 측두골을 제거하고, 1시간 동안 4% PFA에 놓은 후, 120 mM EDTA를 사용하여 24 내지 36시간 동안 탈회시켰다. 이어서, 감각 상피를 절개하고, 면역염색을 위해 상기와 같이 주사하였다. 마우스 항-CTBP2 (BD 바이오사이언스(BD bioscience) #612044, 1/200)를 48시간 동안 적용시키고, 4℃에서 밤새도록 알렉사 플루오르 염소 항-마우스 (1/200)로 대조염색시켜 리본형 시냅스를 표지하였다. 자이스 LSM 710 레이저 공초점 현미경(IDDRC 이미징 코어 그랜트 P30 HD18655(IDDRC Imaging Core grant P30 HD18655))) 상에서 영상을 획득하고, 자이스 LSM 이미지 뷰어 4.2를 이용하여 프로세싱하였다.
선행 연구를 통해 감각 유모 세포에서 하모닌의 2개의 선택적 스플라이스 형태의 발현이 밝혀졌다. 외인성 하모닌 스플라이스 형태의 발현을 구동시킬 수 있는 AAV 벡터의 능력을 평가하기 위해, 신생 c.216AA 및 야생형 (C57BL/6J) 마우스로부터의 난형낭 및 코르티 기관을 하모닌-b1의 N-말단에 융합된 eGFP (eGFP::하모닌-b1), 또는 하모닌-a1의 181 N-말단에 융합된 tdTomato (tdTomato::하모닌-a1)를코딩하는 AAV2/1 벡터에 노출시켰다. 벡터를 시험관내 또는 생체내에서 P1째에 RWM 주사 (1 ㎕)를 통해 적용시켰다. 시험관내 적용시, P0-P1 조직을 벡터의 존재하에서 24시간 동안 인큐베이션시키고, 1주 동안 배양물 중에서 유지시켰다. 공초점 영상은 야생형, c.216GA 및 c.216AA 마우스의 유모 세포가 성공적으로 형질도입되었다는 것을 보여준다 (도 14A-14C, 14E). EGFP::하모닌-b1 신호는 VHC (도 14A), IHC 및 OHC (도 14B, 14C) 중의 부동섬모의 팁에서 분명하게 나타났다. EGFP 신호 또한 P1째에 주사한 마우스의 와우의 기저부 중의 OHC 및 IHC에서 P60째에 검출되었다 (도 14D). TdTomato::하모닌-a1은 청각 유모 세포의 기저에서 검출되었다 (도 14E). 리본형 시냅스 마커인 CTBP2와의 공동 염색으로 빈번하게는 P7째의 난형낭에서가 아닌 (데이터는 나타내지 않음), P7째의 IHC에서 (도 14E) 공동 국재화되어 있다는 것이 나타났다.
외인성 융합 구축물의 국재화는 하모닌-b를 팁-링크 삽입점 근처의 부동섬모의 말단부에 국재화시켰고, 하모닌-a는 시냅스에 국재화시켰다는 선행 연구와 일치하였다.
실시예 2E - 청각 뇌간 반응 ( ABR ) 및 변조 ( DPOAE )
크실라진 (5-10 mg/kg i.p.) 및 케타민 (60 - 100 mg/kg i.p.)으로 마취된 마우스로부터 ABR 및 DPOAE를 기록하였다. a) 양쪽 귀 사이의 등부분에 (참조 전극); b) 왼쪽 귓바퀴 (기록 전극); 및 c) 동물의 둔부 등부분에 (접지 전극) 피부 내로 피하 니들 전극을 삽입하였다. 귓바퀴 기저의 관을 트리밍하여 이도를 노출시켰다. ABR 기록을 위해, 이도 및 청각 장치 (EPL 어쿠스틱 시스템(EPL Acoustic system), MEEI: 미국 보스톤)에 5-millisec 톤 핍을 제공하였다. 반응을 증폭시키고 (10,000배), 여과하고 (0.1-3 kHz), PC 기반 데이터 획득 시스템 (EPL, 와우 기능 시험 스위트, MEEI: 미국 보스톤)에서 아날로그-디지털 변환 보드를 이용하여 평균을 구하였다. 사운드 수준을 5 내지 10 dB 단계로 0 부터 110 dB 음압 수준 (데시벨 SPL)까지 상승시켰다. 각 수준에서, "허상 거부" 후 (자극 극성을 교대로 번갈아 가면서) 512 내지 1024개의 반응의 평균을 구하였다. 육안 검사에 의해 임계값을 측정하였다. 데이터를 분석하고, 오리진-2015 (오리진랩 코포레이션: 미국 매사추세츠주)를 이용하여 플롯팅하였다. 달리 언급되지 않는 한, 임계값 평균 ± 표준 편차가 제시되어 있다. DPOAE의 경우, f1 및 f2 원음 (f2/f1 = 1.2)을 반수-옥타브 단계로 5.6 내지 45.2 kHz로 달라지는 f2 및 L1-L2 = 10 dB SPL과 함께 제공하였다. 각 f2에서, L2는 10 dB SPL 증분으로 10 내지 80 dB SPL로 달라졌다. DPOAE 임계값은 잡음 플로어 초과로 5 dB SPL 규모의 DPOAE를 유도하는 L2-수준으로서 평균 스펙트럼으로부터 정의되었다. 평균 잡음 플로어 수준은 모든 주파수에 걸쳐 0 dB SPL 미만이었다. PXI-1042Q 섀시에서 24-비트 디지털 I-O 카드 (내셔널 인스트루먼츠 PXI-4461(National Instruments PXI-4461))로 자극을 생성하고, SA-1 스피커 드라이버 (터커-데이비스 테크놀러지즈, 인크.((Tucker-Davis Technologies, Inc.))에 의해 증폭시키고, 본 발명자들의 맞춤식 음향 시스템에서 2개의 정전식 드라이버 (CUI CDMG15008-03A)로부터 전달하였다. 작은 프로브 튜브 말단의 일렉트릿 마이크로폰 (놀스(Knowles) FG-23329-P07)을 사용하여 이도 음압을 모니터링하였다. 본 실험 대다수는 맹검 조건하에서는 수행하지 않았다.
말단절단된 하모닌이 정상적인 청각 기능을 방해하였는지 여부를 측정하기 위해, Anc80.CMV.trunc-harm 벡터를 생성하여 말단절단된 단백질을 과발현시켰다. RWM을 통해 c.216GA 마우스의 내이 내로 벡터를 주사하였다. 4, 6 및 12주째에 ABR 및 DPOAE를 측정하였고, 주사한 c.216GA 마우스와 주사하지 않은 c.216GA 마우스 사이에 임계값에 있어서 어떤 차이도 발견되지 않았다 (도 23C-23D에 제시된 6주령된 마우스로부터의 기록). 데이터는 주사 기술, 벡터 및 중요하게는 외인성 말단절단된 하모닌이 내인성 전장의 하모닌과 경쟁하지 않는다는 논쟁에 대한 조정 장치로서의 역할을 하며, 이는 c.216AA 유모 세포에서의 내인성 말단절단된 형태가 유전자 요법 벡터를 통해 발현된 외인성 전장의 하모닌을 방해할 가능성은 없다는 것을 암시한다.
하모닌 유전자 증강이 Ush1c 마우스에서 청각 및 균형 기능을 구제할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, AAV2/Anc80.CMV.하모닌-a1 (0.8 ㎕, 1.7x10^12 gc/ml) 또는 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1 (0.8 ㎕, 1.9x10^12 gc/ml)의 P0-P1 RWM 주사를 수행하고, 청각 뇌간 반응 (ABR), 변조 이음향 방사 (DPOAE), 음향 놀람 반사, 개방 필드 및 로타로드 행동을 평가하였다. c.216AA 마우스가 최중증 청력 손실 및 전정 기능 장애를 앓는 단계인 6주째에 마우스를 평가하였다. 마우스 중 일부는 3 및 6개월째에 추가로 검사하였다.
AAV2/Anc80.CMV.하모닌-a1을 주사한 12마리의 마우스 중 어느 것도 6주째 청각 기능을 회복하지 못했고 (도 16A-16C), 이는 하모닌-a1의 외인성 발현이 청각 구제에는 불충분하였다는 것을 시사한다. 그러나, AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1을 주사한 25마리의 마우스 중 19마리가 6주째 청각 기능을 상당부 회복하였다. 저주파수에서 (5.6 내지 16 kHz), AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1을 주사한 귀에서의 최상의 ABR 임계값은 25-30 dB SPL이었고, 특히 이는 야생형 마우스의 임계값과 유사한 값이었다 (도 16A-16B). 22.6 kHz에서 부분적인 구제가 관찰되었고, 32 kHz에서는 거의 관찰되지 않았거나, 전혀 관찰되지 않았다. OHC에서의 기능 구제와 일관되게, DPOAE 임계값 구제 또한 분명하게 나타났다 (도 16C). 자극 8-11.3 kHz에 대하여 청각 임계값이 <45 dB SPL인 마우스 중 8마리를 후기 단계에서 검사하여 구제 지속성에 대하여 평가하였다. 6주 내지 3개월 사이에, 저주파수 범위에서는 ~10 dB SPL의 ABR 임계값 이동이 관찰되었고, 고주파수 범위에서는 ~30 dB SPL의 ABR 임계값 이동이 관찰되었다 (도 16D). DPOAE 임계값에서도 또한 유사한 이동이 관찰되었다 (도 16E). 상기 시점 이후에, ABR 임계값 및 DPOAE는 최대 생후 6개월이 되는 연령 시점까지 안정된 상태 그대로 유지되었고 (도 16D-16E), 최후 시점에 검사하였다.
특히, 고주파수 단부에서 보다 완벽한 청각 구제를 위해서 하모닌-a1 및 하모닌-b1 둘 모두가 요구되는지 여부를 평가하기 위해, AAV2/Anc80.CMV.tdTomato:: 하모닌-a1 (0.5 ㎕; 238 4.1E^12 gc/ml) 및 AAV2/Anc80.CMV.eGFP::하모닌-b1 (0.5 ㎕; 3.0E^12 gc/ml)을 공동 주사하였다. 두 형광 태그 모두에 대하여 양성을 나타내는 세포로부터 분명하게 나타나는 바와 같이, 유모 세포 중 65%가 하모닌-a1 및 하모닌-b1 둘 모두를 발현하였다 (도 21). 형광 표지된 하모닌-a1이 종종 AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::하모닌-a1에 노출된 마우스의 부동섬모에서 관찰되었는데, 이는 아마도 과다발현에 기인하는 것이었다. 표지되지 않은 하모닌-a1 및 하모닌-b1 벡터로 공동 주사한 마우스에서의 ABR 및 DPOAE 임계값 (도 16)은 하모닌-b1만을 단독으로 주사한 것과 유사하였고, 추가 개선은 제공하지 않았으며, 이는 하모닌-a1이 청각 기능에는 없어도 되는 것일 수 있다는 것을 시사한다. 중요하게, 본 데이터는 하모닌-b1은 단독으로도 저주파수에서 청각 임계값의 유의한 회복에 충분하다는 것을 입증한다 (도 16).
구제 정도를 추가로 평가하기 위해, 임계값 ≤ 45 dB SPL인 마우스로부터의 ABR 파형을 분석하고, 8마리의 대조군 c.216GA 마우스 및 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1을 주사한 5마리의 c.216AA 마우스와 비교하였다. 8-11.3 kHz 및 16 kHz에서의 반응 분석 결과, 보통의 파동 1 진폭 (비유의한 차이, P>0.2, 스튜던트 t 검정) 및 보다 긴 피크 1 지연 시간 (P>0.001)이 밝혀졌고 (도 22), 이는 시냅스에서의 신경 전달에서 지연이 가능하다는 것을 시사한다. 다수의 동물에서, 반대쪽 귀에서도 또한 청각 구제가 관찰되었으며, ABR 임계값은 11.3 kHz에서 20 dB SPL 정도로 낮았다 (하모닌-b1: 평균 59.7 ± 5.3 dB SPL, n=15/25; 하모닌-a1+ -b1: 255 평균 76.2 ± 10.3 dB SPL, n=4-6). AAV 벡터의 반대쪽 귀로의 확산이 이전에 관찰된 바 있으며, 이는 신생 마우스에서 지주막하 공간과 계속해서 연속되어 있는 외림프액 관을 통해 발생할 수 있는 가능성을 갖고 있다.
본 발명자들은 또한 보다 후속의 발생 단계에서의 주사가 부분적인 청각 구제를 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. P10-P12째에 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1 (0.8 ㎕)의 RWM 주사를 수행하고, 6주째에 청각 임계값을 평가하였다. P10-P12째에 주사한 마우스 중 어느 것도 검출가능한 DPOAE를 보이지 않았고, 그의 ABR 임계값은 주사하지 않은 c.216AA 대조군 마우스와 다르지 않았으며 (n=10; 데이터는 나타내지 않음), 이는 가능하게는 노화된 조직에서의 낮은 바이러스 형질도입 효율 또는 보다 후속의 발생 단계에서의 코르티 기관의 퇴행에 기인하여 개입을 위한 기회의 창은 출생 후 초기 단계로 제한될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 2F - 어셔 마우스 모델에서의 RT- PCR
QUANTITECT RegS 리버스 트랜스크립션 키트(QUANTITECT RegS Reverse Transcription Kit) (퀴아젠)를 사용하여 P2-P3 야생형, 이형접합성 및 동형접합성 Ush1c c.216G>A 마우스의 6개의 청각 기관으로부터의 cDNA를 제조하였다. 전장의 (450 bp) 또는 말단절단된 하모닌 (-35 bp)을 코딩하는 cDNA를 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: 정방향 프라이머 mUsh1c_Ex2F: 5' CTC ATT GAA AAT GAC GCA GAG AAG G 3' (서열식별번호: 11), 역방향 mUsh1c_Ex5R: 5' TCT CAC TTT GAT GGA CAC GGT CTT 3' (서열식별번호: 12). 상기 프라이머는 마우스 Ush1c 서열에 특이적인 것이고, 표적 서열이 Ush1c c.216A 대립유전자 중의 일부가 넉인된 인간의 영역 밖에 존재하는 바, 내인성 및 AAV2-유래 Ush1c 둘 모두를 증폭시킬 것이다. 처리 후 6주째 수집된 마우스 조직으로부터의 DNA 및 RNA 수준 또한 평가하였다. TRI졸 시약 (라이프 테크놀러지즈: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 와우로부터 DNA 및 RNA를 단리시켰다. 고스크립트(GoScript) 역전사 시스템 (프로메가: 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 RNA를 역전사시켰다. 고태크 그린 마스터 믹스(GoTaq 녹색 Master Mix) (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 방사선표지된 PCR을 수행하였다. 바이러스 DNA 증폭을 위해, 마우스 Ush1c에 특이적인 프라이머: mUsh1c_Ex3F (5'-GAA CCC AAC CGC CTG CCG (서열식별번호: 13)) 및 mUsh1c_Ex4WTR (5'-TGC AGA CGG TCC AAG CGT-3' (서열식별번호: 14))을 사용하였다.
동형접합성 Ush1c.216AA 마우스는 마우스 서열을 대체하면서, 엑손 3 및 4에 넉인된 인간 USH1C c.216A 유전자를 가지기 때문에 (Lentz et al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44), 상기 프라이머는 바이러스 Ush1c DNA를 단지 증폭만 시킬 것이다. 전장의 (450 bp) 하모닌 및 비정상적으로 스플라이싱/말단절단된 하모닌 (415 bp)의 cDNA 증폭을 위해, 상기와 동일한 프라이머를 사용하였다 (mUsh1c_Ex2F 및 mUsh1c_Ex5R). Gapdh 프라이머는 mGapdh_Ex3F (5'-611 GTG AGG CCG GTG CTG AGT ATG-3' (서열식별번호: 15)) 및 mGapdh_Ex4R (5'-GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC-3' (서열식별번호: 16))이었다. 생성물을 6% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 타이푼 9400 포스포르이미저(Typhoon 9400 phosphorimager) (GE 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여 정량화하였다.
선행 연구를 통해 말단절단된 하모닌이 내인성 결합 파트너에 대하여 전장의 하모닌과 경쟁함으로써 기능을 파괴시킬 수 있다는 가능성이 제기되었는 바, 말단절단된 단백질의 지속적인 발현이 외인성 전장의 하모닌을 발현하는 벡터로 주사한 c.216AA 마우스에서 회복을 제한할 수 있는지 여부를 조사하였다 (도 23A). 이러한 우려 사항을 해결하기 위해, RT-PCR 검정법을 이용하여 c.216GA 및 c.216AA 마우스에서의 Ush1c 전사체의 발현을 조사하였다. 선행 보고와 일관되게, 전장의 하모닌 및 말단절단된 하모닌을 코딩하는 Ush1c 전사체가 c.216GA 와우에서 검출되었고, 오직 말단절단된 하모닌을 코딩하는 전사체는 c.216AA 와우에서 검출되었다 (도 23B).
AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1의 발현을 확인하고, 바이러스 발현 수준과 ABR 임계값 사이의 관계를 조사하기 위해, 주사한 반대쪽 와우로부터 DNA 및 RNA를 단리시키고, 각각 PCR 및 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 6주령된 c.216GA 및 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1 (0.8 ㎕; 1.93 10^12 gc/ml)을 주사한 마우스 및 주사하지 않은 c.216AA 마우스에서 발현을 평가하였다. 샘플은 ABR 구제가 우수한 (11.3 kHz에서, 임계값 ≤ 35 dB SPL) 주사한 마우스 2마리, 및 ABR 구제가 불량한 (11.3 kHz에서, 임계값 ≥ 90 dB SPL) 2마리를 포함하였다. 하모닌의 올바른 스플라이스 형태를 코딩하는 RNA (도 24A) 및 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1 DNA (도 24B)가 주사한 와우 모두에서 검출되었고, 검사받은 동물 모두의 반대쪽 와우에서 그보다는 더 적은 정도로 검출되었다.
ABR 임계값, 및 DNA 및 RNA 발현량에 있어 동물 간에 변동성이 존재하였다 (도 24C). 그러나, AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1 DNA 수준, 하모닌의 올바른 스플라이스 형태를 코딩하는 RNA 및 ABR 임계값 수준 사이에 강력한 상관관계가 발견되었으며, 이는 ABR 데이터의 변동성이 AAV 발현의 직접적인 결과일 수 있다는 것을 시사한다. ABR 임계값이 성공적으로 회복된 마우스에서의 장기간의 유모 세포 생존을 평가하기 위해, 조직을 제조하고, 5마리의 마우스로부터 생후 6개월되는 연령 시점에 IHC 및 OHC의 개수를 계수하였다 (도 25). 2개 코호트에서는 IHC 개수가 달라지지 않았지만, 장기간의 ABR 구제를 보인 3마리의 마우스에서는 50% 초과의 OHC가 그대로 유지되었다. 기저 회전부를 제외한 전체 기관을 따라 OHC 생존이 관찰되었다 (도 25).
실시예 2G - 어셔 마우스 모델에서의 음향 놀람 반응
스타틀 모니터(Startle Monitor) (카인더 사이언티픽(Kinder Scientific))를 사용하여 음향 놀람 반응 (ASR)을 측정하였다. 마우스를 피에조/플렉시유리 감지 어셈블리 상에 고정된 소규모의 비제한적인 정육면체의 플렉시글라스(Plexiglas) 기록 챔버 (27 cm x 10 cm x 12.5 cm)에 배치시키고, 60 dB SPL 배경의 백색 잡음으로 5 min 동안 순응시켰다. 각 세션은 35회 시도로 이루어졌고, 그 동안 10 dB SPL 강도에서 60-120 db SPL 범위의 단일 잡음 펄스를 시도 사이에 평균 30 s (25-35 s 범위) 간격을 두고 전달하였다. 외부 잡음 간섭을 제한하기 위해 일정한 60 dB SPL 배경 잡음하에 펄스를 의사 랜덤순으로 배열하였다. 피크 놀람 반응 (ASR 진폭) 및 자극에서부터 피크 놀람 반응까지의 소요 시간 (ASR 지연 시간)을 계산하기 위해, 스타틀 모니터 시스템은 각 펄스에 대한 반응을 최초 N, 최대 N, 및 최대 반응 시간 (ms) 측정치로 환산하였다. ASR은 모두 맹검 방식으로 수행하였다.
ABR/DPOAE 회복이 행동으로 관련이 있는 청각 기능의 회복을 이끌었는지 여부를 평가하기 위해, AAV2/Anc80.CMV.하모닌-a1, AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1을 주사한 마우스, 및 상기 두 벡터 모두를 주사한 마우스에서 음향 놀람 반응을 측정하였다. 백색 잡음에 대한 놀람 반응 분석 결과, 6주령된 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1을 주사한 마우스, 및 두 벡터 모두를 공동으로 주사한 마우스에서 반응의 부분적인 구제가 나타났다 (도 17A). 하모닌-a1만을 단독으로 받은 마우스는 주사하지 않은 c.216AA 마우스와 유사하였고, 놀람 반응을 회복하지 못했다.
실시예 2H - 어셔 마우스 모델에서의 전정 평가
개방 필드 및 로타로드 균형 검사를 사용하여 전정 기능을 평가하였다. 침침한 방 안에 중앙부는 30 lux로 설정된 오버헤드 LED 조명이 장착되어 있는 사운드 챔버 내부에 배치된, 직경이 42 cm로 측정된 원형 프레임을 사용하여 개방 필드 검사를 수행하였다. 마우스를 원형 개방 필드 안에 한 번에 1마리씩 배치하고, 5 min 동안 조사하였다. 행동을 기록하고, 에토비전 XT(Ethovision XT)를 사용하여 추적함으로써 이동 거리 및 속도를 측정할 수 있었다. 개방 필드 평가 또한 이 모두 맹검 방식으로 수행하였다. 로타로드 수행능은 4 rpm으로 회전하기 시작하여, 0.1 rpm s-1인 속도로 가속화되는, 둘러싸인 하우징 안의 로드 상에 마우스를 배치하는 것을 포함하였다. 마우스를 1일째 5 min 동안 로드 상에 배치하여 상기 장치에 친숙해지도록 만들었다. 다음날, 상기 동물을 총 5회 시도를 위해 로드 상에 배치하였다. 시도 사이에는 5 min의 휴식 기간을 부과하였다. 동물이 하우징의 계장화된 플로어 상에 낙하하기 전에 장치 상에 그대로 남아있을 수 있는 기간이 타이머 상에 제시되었고, 매회 검사 진행 후 기록하였다.
외림프액 공간이 와우와 전정 미로 사이에 연속되어 있기 때문에, RWM을 통해 주사된 AAV 벡터는 또한 전정 감각 기관을 형질도입시킬 수 있다. 전정 행동을 평가하기 위해, 마우스를 로타로드 상에서 그의 수행능에 대해 검사하였다. c.216AA 및 AAV2/Anc80.CMV.하모닌-a1 마우스 주사한 c.216AA 마우스에서는 불량한 로타로드 수행능이 관찰된 반면 (낙하까지의 지연 시간 평균 < 22 sec), AAV2/Anc80.CMV.하모닌-b1을 주사한 c.216AA 마우스 및 하모닌-a1 및 -b1 벡터를 공동으로 주사한 마우스는 대조군 c.216GA 마우스와 일관되게, 60-120초 동안 로타로드 상에서 균형 기능을 유지하였다 (도 17B).
개방 필드 행동 회복은 또한 하모닌-b1 및 이중 하모닌a1 및 b1을 주사한 c.216AA 마우스에서 관찰되었다. 대표적인 개방 필드 조사 트레이스는 도 17C에 플롯팅되어 있다. c.216GA 마우스를 필드의 경계에서 조사하였고, 이는 최소의 전신 회전을 보인 반면, c.216AA 마우스는 회전/min으로 정량화된 전신 회전 증가가 함께, 전체 챔버 전역에 걸쳐 더 많은 활동을 보였다 (도 17D-17E). 놀랍게도, AAV2/Anc80.CMV.하모닌-a1을 주사한 마우스에서는 ABR 구제가 관찰되지 않은 반면, 개방 필드 데이터는 전정 기능의 대조군 마우스의 수준으로의 회복을 입증하였다. AAV2/Anc80.CMV.trunc-하모닌을 주사한 c.216GA 마우스의 행동은 대조군 c.216GA 마우스와 차이가 없었고, 이는 다시 말단절단된 하모닌과 야생형 하모닌 사이에 간섭이 없다는 것을 시사한다 (도 17C-17E).
빙빙 도는 행동은 없어졌으나, 하모닌-a1을 주사한 마우스는 로타로드 검사에서 실패한 바와 같이, 행동 검정법을 통해 하모닌-a1을 이용한 부분적인 전정 구제가 입증되었다. 다른 한편으로, 하모닌-b1을 주사한 마우스는 두 검사 모두에서 기능적 회복을 이루었다 (도 17). 스트리올라 영역에서의 형질도입 및 FM1-43 흡수가 없다는 것은 스트리올라 영역의 유모 세포 및 아마도 I형 세포 기능이 적절한 하모닌 발현에 의존한다는 것을 시사한다 (도 13).
청각 구제는 고주파수가 아닌, 저주파수에서 두드러지게 나타난 반면 (도 16), 6주째 유모 다발 형태의 보존이 전체 기관을 따라 관찰되었다 (도 18). 고주파수에서 구제가 이루어지지 않는 것은 주사에 의해 유발되는 손상에 기인할 가능성이 없다. 고주파수 청력 손실은 AAV 벡터로 주사한 c.216GA 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다 (도 23C-23D). 전장의 와우를 따라 표적화하는 AAV는 설명하는 바와 같이 기저에서의 형질도입 효율의 결여에 관한 반대 의견을 제시하는 것이다. 한가지 가능성은 다른 하모닌 이소형, 예컨대, 짧은 하모닌-c가 와우의 기저 고주파수 단부에서 기능의 구제를 위해 필요할 수 있다는 것이다. 대안적으로, 와우 발생은 기저 단부에서 시작되기 때문에, P0째까지 기저 고주파수 단부로부터의 유모 세포는 수복 지점 너머까지 성숙화되었을 수도 있다는 가능성을 갖고 있다. 이러한 경우라면, 배아 개입을 통해 고주파수 영역에서 보다 잘 구제시킬 수 있다.
파트 3 - 청력 손실에 관여하는 추가의 돌연변이의 유전자 요법
실시예 3A - 생체내 실험
앞서 기술된 바와 같이 (Grimm et al., 2003, Mol. Ther., 7:839:50), 헬퍼 바이러스 무함유 시스템 및 이중 형질감염 방법을 사용하여 변형된 CMV 프로모터에 의해 구동되는 마우스 TMC1에 대한 코딩 서열을 운반하는 Anc80 벡터를 생성하였다. 삼중 flag-태그 (FLAG) 서열을 TMC 코딩 서열의 C-말단 단부에 융합시켜 발현된 발현이 시각화될 수 있도록 하였다. 이오딕사놀 단계 구배, 이어서, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 Anc80-CMV-Tmc 벡터를 정제하였다. 인간 베타-글로빈 인트로 요소에 특이적인 프라이머를 사용하여 정량적 PCR에 의해 측정된 바, 역가는 1x1012 내지 1x1013 gc/ml 범위였다. 바이러스 분취물을 -80℃에서 보관하고, 사용 직전에 해동시켰다.
연령이 P0-P2인 마우스를 보스톤 아동 병원의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인받은 프로토콜 (프로토콜 #2659, #2146)에 따라 하기 기술되는 바와 같이 바이러스 벡터의 생체내 전달을 위해 사용하였다. C57BL/6J (잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories)) 또는 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스 계통 (타코닉(Taconic))을 야생형 대조군 마우스로 사용하였고, TMC1 돌연변이체 대립유전자 (TMC1Δ/Δ 또는 Tmc1 -/-)를 보유하는 마우스는 앞서 기술된 바와 같이 (Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809), C57BL/6J 배경 상에 있는 것이었다.
평가를 위한 조직을 제조하기 위해, P0-P10째에 마우스 새끼로부터 측두골을 수확하였다. 새끼를 빠르게 단두시켜 안락사시키고, 10 mM HEPES, 0.05 mg/ml 암피실린, 및 0.01 mg/ml 시프로플록사신으로 보충된 MEM (인비트로겐) (pH 7.40) 중에서 측두골을 절개하였다. 절개 스코프하에서 막 미로를 단리시키고, 라이스너 막을 벗겨내고, 덮개막 및 혈관조를 기계에 의해 제거하였다. 코르티 기관 배양물을 한쪽 단부에서 실가드(Sylgard)로 18-mm 둥근 유리 커버슬립에 부착된 한 쌍의 얇은 유리 섬유 아래 평평하게 핀으로 고정시켰다. 전기생리학적 연구를 위해 조직을 즉각 사용하였다. P10보다 노화된 마우스의 경우, 흡입 CO2를 이용하여 동물을 안락사시킨 후, 측두골을 수확하였고, 와우 홀 마운트를 생성하였다.
도면에 제시된 모든 평균 값 및 에러 바는 평균 ± SD를 나타낸다. 주사한 귀와 주사하지 않은 귀 사이의 통계학적 유의도 비교는 양측 쌍별 t 검정을 이용하여 수행하였다. P < 0.05가 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 3B - 바이러스 벡터의 생체내 주사
사면 유리 미세주사 피펫을 이용하여 원창 막 (RWM)을 통해 마우스 새끼 (P0-P2)에 주사하였다. P-2000 피펫 풀러 (서터 인스투르먼트) 상에서 모세관 유리로부터 피펫을 풀링하고, 미세피펫 베벨러 (서터 인스투르먼트)를 이용하여, 비스듬히 잘랐다 (28° 각도로, 팁 직경 ~20 ㎛). (유양 돌기 돌출부는 그대로 남겨둔 채) 수술 부위를 커버하기 위해 무통증을 위하여 멸균 스왑을 이용하여 EMLA 크림 (리도카인 2.5% 및 프릴로케인 2.5%)을 외부에서 도포하였다. 수술 전 30-60분 동안 체온을 37℃ 가온 패드 상에서 유지시켰다.
의식을 상실할 때까지 2-3분 동안 저체온증을 빠르게 유도하여 새끼를 마취시키고, 이 상태를 수술 중 10-15분 동안 냉각 플랫폼 상에서 유지시켰다. 반복하여 3회에 걸쳐 베타딘으로 문질러 씻고, 70% 에탄올로 닦아냄으로써 수술 부위를 소독하였다. 귀 후방부를 절개하여 투명한 귀 융기부를 노출시키고, 미세피펫을 현미 조작 장치 (MP-30, 서터 인스투르먼트 컴퍼니(Sutter Instrument Company))에 의해 융기부 및 피개 근막을 통해 전진시키고, 미세피펫의 팁으로 RWM을 관통시켰다.
공기 미량주사기 (WPI 나노리터 2010((WPI Nanoliter 2010))를 이용하여 왼쪽 귀 한쪽에 0.1 ㎕/min으로 1012 내지 1014 gc/mL (총 바이러스 입자 109 내지 1011개)인 역가로 대략 1 ㎕의 바이러스를 주사하였다. 6-0 모노필라멘트 봉합사 (에티콘(Ethicon))를 사용하여 피부 절개부를 봉합하였다. 새끼를 회복시키기 위해 가온 패드로 복귀시켰다.
실시예 3C - 면역형광
바이러스 벡터에 의해 전달된 트랜스진의 발현 분포를 측정하기 위해 면역염색을 수행하였다. 이를 위해, PBS 중에 희석된 4% 파라포름알데히드로 실온에서 1 h 동안 침지 고정된, 새로 절개된 코르티 기관에서 면역염색을 수행하였다. 이어서, 조직을 PBS 중에서 세정하고, 30분 동안 0.01-0.1% 트리톤 X-100 중에서 침투시키고, 1 h 동안 알렉사플루오르546-팔로이딘 (몰레큘러 프로브스, 1:200 희석)으로 대조염색시켜 섬유상 액틴을 표지하였다.
외인성 방식으로 발현된 TMC::FLAG 융합 단백질의 국재화를 위해, 2% BSA 및 5% 정상 염소 혈청을 사용하여 1시간 동안 조직을 차단시키고, FLAG 모티프에 대한 항체 (BD 바이오사이언시스, 1:200 희석)와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 유모 세포 계수를 위해, 조직을 1시간 동안 정상 염소 혈청 중에서 차단시키고, 4℃에서 밤새도록 토끼 항-미오신 VIIa 1차 항체 (프로테우스 바이오사이언시스, 1:1000 희석)로 염색하고, 1 h 동안 알렉사플루오르488 (라이프 테크놀러지즈, 1:200 희석)에 접합된 염소 항-토끼 항체로 표지하였다. 벡타쉴드(Vectashield) 봉입제 (벡터 라보라토리즈(Vector Laboratories))를 이용하여 샘플을 유리 커버슬립 상에 고정시키고, 자이스 LSM700 공초점 현미경을 사용하여 10X-63X 배율로 영상화하였다.
도 26은 Ush1c 돌연변이체 마우스로의 하모닌의 균일한 Anc80 전달을 입증하는 면역형광을 보여주는 것이고, 도 28은 KCNQ4 돌연변이체 마우스의 세포로의 KCNQ4의 Anc80 전달을 입증하는 면역형광을 보여준다. 따라서, Anc80은 청력 손실을 일으키는 다수의 상이한 (다수의 상이한 유전적 유전자좌에서의) 유전적 결손을 표적화하는 데 효과적인 벡터이다.
실시예 3D - 유모 세포 전기생리학
기관형 와우 배양물을, 137 mM NaCl, 0.7 mM NaH2PO4, 5.8 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 0.9 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 및 5.6 mM D-글루코스를 함유하는 표준 인공 외림프액 중에서 배씽시켰다. 농축물 (인비트로겐)로부터 용액에 비타민 (1:50) 및 아미노산 (1:100)을 첨가하고, NaOH를 사용하여 최종 pH를 7.40 (310 mosmol/kg)으로 조정하였다. 기록 피펫 (3 내지 5 메그옴)을 R6 모세관 유리 (킹 프리시전 글래스)로부터 풀링하고, 135 mM CsCl, 5 mM Hepes, 5 mM EGTA, 2.5 mM MgCl2, 2.5 mM Na2-아데노신 트리포스페이트, 및 0.1 mM CaCl2 (여기서, CsOH를 사용하여 최종 pH를 7.40 (285 mosmol/kg)으로 조정하였다)를 함유하는 세포내 용액으로 충전시켰다. 악소패치 200B 증폭기 (몰레큘러 디바이시스)를 사용하여 실온 (22℃ 내지 24℃)하에 -84 mV에서 전체 세포 밀봉 전압 클램프 기록을 수행하였다. 저주파 통과 베셀 필터를 이용하여 10 kHz에서 감각 형질도입 전류를 여과하고, 16-비트 획득 보드 (디지데이터 1440A) 및 pCLAMP 10 소프트웨어 (몰레큘러 디바이시스)를 이용하여 ≥20 kHz에서 디지털화하였다. 오리진프로 8(OriginPro 8) (오리진랩)을 사용하여 오프라인 분석하기 위해 데이터를 저장하였다.
도 29는 돌연변이체 마우스 (도 29B) 대비 Anc80-KCNQ4로 형질감염된 KCNQ4 -/- 세포 (도 10C)에서 칼륨 전류가 거의 야생형 수준으로까지 회복되었다는 것을 보여주는 것이며 (도 29A), 이에 의해 Anc80을 이용하는 유전자 요법이 기능을 회복시킬 수 있다는 것이 입증되었다.
실시예 3E - 청각 뇌간 반응 ( ABR )
앞서 기술된 바와 같이 (Maison et al., 2010, J. Neurosci., 30:6751-62), ABR 기록을 수행하였다. 간략하면, P25-P30 마우스를 5 ml의 0.9% 염수에 희석된 50 mg의 케타민 및 5 mg의 크실라진을 이용하여 IP 주사 (0.1 ml/10 g-체중)를 통해 마취시켰다. ABR 실험을 방음 챔버에서 32℃하에 수행하였다. 청력 기능을 검사하기 위해, 재현가능한 ABR 파형 (피크 I-IV)을 유발한 임계값 강도가 검출될 때까지, 5 dB 단계로 10 내지 115 dB의 음압 수준에서 5.6 kHz, 8 kHz, 11.3k Hz, 16 kHz, 22.6 kHz, 또는 32 kHz의 순음 자극을 마우스에 제공하였다. 교번 극성 자극을 사용하여, 각 음압 수준에서 512 내지 1024개의 반응을 수집하고, 그의 평균을 구하였다. 15 μV 초과의 진폭 (피크에서 트로프)을 가진 파형은 "허상 거부" 기능에 의해 폐기하였다.
ABR 검사를 시작하기 전, 전형적으로 외이도 진입을 어렵게 만드는 피부 및 연골의 피부판을 절개용 가위로 트리밍하고, 모든 자극 주파수에서 각각의 개별 검사 대상체에 대해 이도 진입시 음압을 보정하였다. 원음을 생성하는 2개의 정전식 이어폰 (CUI 미니어쳐 다이나믹스(CUI Miniature Dynamics)) 및 이도 음압을 기록하는 놀스 소형 마이크로폰 (일렉트릿 콘덴서(Electret Condenser))으로 이루어진 맞춤식 프로브 튜브 스피커/마이크로폰 어셈블리 (EPL PXI 시스템즈(EPL PXI Systems))를 통해 음향 자극을 연구되는 귀로 직접 전달하였다. 사운드 자극은 5-ms 단음으로 이루어졌다 (cos2 시작으로 0.5 ms 상승-하락, 40/s로 전달).
귓바퀴 (활동 전극), 두정 (참조 전극), 및 둔부 (접지 전극)에 삽입된 피하 니들 전극을 사용하여 ABR 신호를 수집하였다. ABR 전위를 증폭시키고 (10,000x), 통과 여과시키고 (0.3-10 kHz), 맞춤식 데이터 획득 소프트웨어 (랩VIEW(LabVIEW))를 사용하여 디지털화하였다. 사운드 자극 및 전극 전압을 디지털 I-O 보드 (내셔널 인스트루먼츠)를 사용하여 40-μs 간격으로 샘플링하고, 오프라인 분석을 위해 저장하였다. 임계값은 시각적으로, 임의 파동 (I-IV)이 검출될 수 있고, 사운드 강도 증가에 따라 재현가능한 최저 데시벨 수준으로 정의되었다. 각 실험군 내에서 ABR 임계값의 평균을 구하고, 통계학적 분석을 위해 사용하였다.
도 27은 하모닌을 코딩하고, 발현하는 Anc80 바이러스 벡터의 전달이 특히 더 낮은 저주파수에서 (예컨대, 약 5 내지 약 22 kHz) 청각 기능을 거의 완전하게 회복시킬 수 있다는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
실시예 3F - 정량적 RT- PCR 분석
생체내 투여 후 와우에 존재하는 바이러스의 양을 평가하는 실험을 수행하였다. P1째에 2마리의 TMC1 -/- 마우스 왼쪽 귀에 주사하였다. 왼쪽 귀 및 오른쪽 귀로부터 와우를 절제하고, 3일 동안 (P10과 등가) 배양물 중에서 유지시켰다. RNA를 추출하고, 애질런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer) (애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies))를 사용하여 품질을 확인하고, 앞서 기술된 바와 같이 (Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809), SYBR 그린ER qPCR 시약(SYBR GreenER qPCR reagent) (인비트로겐)을 이용하여 TMC1에 특이적인 효과적인 프라이머 세트로 정량적 RT-PCR 분석을 수행하기 위해 cDNA로 역전사시켰다.
TMC1 단편을 증폭시키기 위해, 하기 프라이머를 사용하였다: 5'-CAT CTG CAG CCA ACT TTG GTG TGT-3' (서열식별번호: 17) 및 5'-AGA GGT AGC CGG AAA TTC AGC CAT-3' (서열식별번호: 18). 발현 수준을, 5'-TGA GCG CAA GTA CTC TGT GTG GAT-3' (서열식별번호: 19) 및 5'-ACT CAT CGT ACT CCT GCT TGC TGA-3' (서열식별번호: 20)으로 증폭된 (β-액틴을 코딩하는) Actb의 것으로 정규화하였다. 모든 프라이머는 인트론을 스패닝하도록 디자인하였고, 용융 곡선 분석 및 음성 대조군을 사용하여 입증되었다. Actb 대비 ΔΔCT 방법, 및 주사한 귀와 주사하지 않은 귀 사이의 차이를 이용하여 데이터를 분석하였다.
본 결과는 주사한 귀에서의 TMC1 mRNA 발현이 주사하지 않은 귀에서보다 12배 더 높았다는 것을 입증한다.
실시예 3G - FM1-43 표지
앞서 기술된 바와 같이([Gale et al., 2001, J. Neurosci., 21:7013-25]; [Meyers et al., 2003, J. Neurosci., 23:4054-65]; 및 [Geeleeoc & Holt, 2003, Nat. Neurosci., 10:1019-20]), FM1-43 염료 적재 실험을 수행하였다. 부착된 와우 배양물이 있는 커버슬립을 유리 바닥 챔버 상의 정립 현미경 (자이스 악시오 FS 플러스)에 배치하였다. 인공 외림프액 중에서 희석된 5 μM FM1-43FX (인비트로겐)를 10 sec 동안 적용시키고, 인공 외림프액 중에서 3회에 걸쳐 조직을 세척하여 세포막의 외부 첨판으로부터 염료를 제거하였다. 5분 후, 63x 수침지 대물 렌즈와 함께 FM1-43 필터 세트 및 표면형광 광원을 이용하여 세포내 FM1-43을 영상화하였다. 상기 기술된 바와 같이, 면역형광을 위해 조직을 고정시키고, 프로세싱하였다.
도 30은 본원에 기술된 바와 같이 Anc80 바이러스 벡터에 노출된 세포에 의한 FM1-43 염료의 흡수를 보여주는 면역염색 영상이고, 도 31은 본원에 기술된 바와 같이 Anc80 바이러스 벡터에 의해 전달된 TMC1이 생체내에서 Tmc1-결핍 유모 세포에서 감각 형질도입을 회복시킨다는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
실시예 3H - 변조 이음향 방사 ( DPOAE )
ABR 데이터와 동일한 조건하에, 및 동일한 기록 세션 동안 DPOAE 데이터를 수집하였다. 2f1-f2에서의 DPOAE 생성을 위해 1.2의 주파수 비 (f2/f1)로 원음을 생성하였다 (여기서, 각 f2/f1 쌍에 대하여 f2 수준은 f1 수준보다 아래로 10 dB 음압 수준이었다). f2 수준을 5-dB 단계로 20 내지 80 dB를 소해하였다. 각 수준에서 파형 및 스펙트럼 평균화를 이용하여 기록된 이도 음압의 신호 대 잡음비를 증가시켰다. 스펙트럼 중의 인근점에서의 잡음 플로어와 함께, 평균화된 스펙트럼으로부터 2f1-f2에서 DPOAE의 진폭을 추출하였다. DPOAE 진폭 대 사운드 수준의 플롯으로부터 등가 반응 곡선을 보간하였다. 임계값은 0 dB에서 DPOAE를 생성하는 데 요구되는 f2 수준으로 정의되었다.
도 32는 본원에 기술된 바와 같이 Anc80 바이러스 벡터를 사용하여 전달된 TMC1이 특히, 더 낮은 저주파수에서 (예컨대, 약 5 내지 약 16 kHz)에서 TMC1 -/- 마우스에서의 외유모 세포 기능을 구제한다는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
다른 실시양태
방법 및 물질의 조성물이 다수의 상이한 측면과 함께 본원에 기술되었지만, 상기의 다양한 측면에 관한 기술은 방법 및 물질의 조성물을 예시하는 것이지, 그의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형도 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함된다.
개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 그와 함께 사용될 수 있거나, 그의 제조를 위해 사용될 수 있거나, 또는 그의 생성물인 것인 방법 및 조성물을 개시한다. 상기 물질 및 다른 것도 본원에 개시하며, 이들 방법 및 조성물의 조합, 서브세트, 상호작용, 군 등도 개시함을 이해한다. 즉, 상기 조성물 및 방법의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 관한 구체적인 언급은 명백하게 개시되지 않을 수도 있지만, 각각은 구체적으로 고려되고, 본원에 기술되는 것이다. 예를 들어, 특정 물질의 조성물 또는 특정 방법이 개시되고, 논의되고, 다수의 조성물 또는 방법이 논의되었다면, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 조성물 및 방법에 대한 각각의 및 모든 조합 및 순열이 구체적으로 고려된다. 유사하게, 상기의 임의의 서브세트 또는 조합 또한 구체적으로 고려되고, 개시된다.
SEQUENCE LISTING <110> MASSACHUSETTS EYE AND EAR INFIRMARY THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION <120> MATERIALS AND METHODS FOR DELIVERING NUCLEIC ACIDS TO COCHLEAR AND VESTIBULAR CELLS <130> 00633-0203WO1 <140> PCT/US2016/066225 <141> 2016-12-12 <150> US 62/266,462 <151> 2015-12-11 <150> US 62/266,477 <151> 2015-12-11 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic viral capsid protein <220> <221> misc_feature <222> (168)..(168) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (266)..(266) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (311)..(311) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (411)..(411) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (460)..(460) <223> Xaa can be 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tcatcatccc agaggtgctg atgggcatgc 2220 cctatggaag tatacccaga aagacggtgc ctcgggctga ggaagagcga gccatggact 2280 tctctgtcct ttgggatttt gagggctaca tcaaatattc tgctctcttc tatggctact 2340 acaacaacca gcggaccatt ggatggctga ggtacaggct gcccatggct tactttatgg 2400 tgggggtcag cgtgtttggc tacagcttga tgatcgtcat taggtcgatg gccagcaata 2460 cccagggtag caccagtgag ggggacagtg acagcttcac gttcagcttc aagatgttca 2520 ccagctggga ctacctcatc gggaattcag agacagcaga caacaaatat gtctccatca 2580 ctaccagctt caaggagtct atagtggacg aacaagagag taacaaagaa gggaatatcc 2640 acctgacaag attcctccgc gtcctggcca actttctcat tctctgctgt ctgtgtggaa 2700 gcgggtacct catttacttt gtggtgaaac ggtcccagga gttctccaaa atgcaaaatg 2760 tcagctggta tgaaaggaat gaggtggaga tcgtgatgtc tctgctaggg atgttttgtc 2820 cccctctgtt tgaaaccatc gctgccttgg agaattatca cccacgaact gggctgaagt 2880 ggcagctggg ccgcatcttt gcccttttcc tgggaaacct ctacacgttt ctcctggccc 2940 tcatggacga tgtccacctt aagctttcta atgaggaaaa aatcaagaac atcactcact 3000 ggaccctgtt taactattac aattcctcag gtgggaatga gagtgtgccc cggccaccac 3060 cacaccctgc agatgtgccc agaggttctt gctgggagac agctgtgggc attgagttta 3120 tgaggctcac cgtgtctgac atgctggtaa catacctcac catcttggtc ggagatttcc 3180 tccgagcttg ttttgtccgg ttcatgaatc actgctggtg ttgggacctc gaggctggtt 3240 ttccctcata tgccgagttt gatattagtg gaaatgtgtt gggtttgatc ttcaaccaag 3300 gaatgatctg gatgggctcc ttctatgctc caggactggt gggcatcaat gtcctgcgcc 3360 tgttgacctc catgtacttc cagtgctggg cagtgatgag cagcaacgtt ccccatgagc 3420 gtgtgtttaa agcctcccga tccaacaact tctacatggg cctgctgctg ttggtgctct 3480 tcctcagcct cctgcctgtg gcctacactg tcatgtctct cccaccctcg tttgactgtg 3540 gccccttcag tgggaaaaac agaatgtacg atgtcctcca tgagaccatc gagaacgatt 3600 tccctaagtt cctgggcaag atctttgcgt tccttgccaa cccaggcctg atcattccag 3660 ccatcctgct aatgtttctg gccatttact acctgaactc agtttcaaaa agtctttcca 3720 gagctaatgc ccagctgcga aagaagatcc aagcgctccg tgaagttgag aagaaccata 3780 aatccatcaa gggaaaagcc atagtcacat attcagagga cacaatcaag aacagctcca 3840 aaaatgccac ccagatacat cttactaaag aagagcccac atctcactct tccagccaaa 3900 tccagaccct ggacaagaaa gcgcagggcc cccacacctc cagtactgag ggtggggcct 3960 cgccgtctac ctcctggcac catgttgggt ctcaaccacc gagaggcaga cgagattctg 4020 gccaacccca gtctcagact tatacaggca ggtcaccttc tggaaagaga acccagaggc 4080 ctcacaactg agcggccgct cgagcctaag cttctagaag atctacgggt ggcatccctg 4140 tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct 4200 tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat 4260 ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg 4320 cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc 4380 cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc 4440 atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt 4500 ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt 4560 gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac 4620 cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4680 cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 4740 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat 4800 tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg 4860 cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 4920 cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 4980 tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 5040 ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat 5100 cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 5160 tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag 5220 ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 5280 cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct 5340 ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 5400 gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 5460 tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac 5520 gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 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ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 6420 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 6480 cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 6540 cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 6600 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 6660 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 6720 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 6780 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 6840 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 6900 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 6960 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 7020 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 7080 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 7140 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 7200 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 7260 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 7320 acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 7380 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 gaggtaccat ggaccggaag gtggcccgag 30 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 caggatccgg acaatttcat cccctac 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 ctcattgaaa atgacgcaga gaagg 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 tctcactttg atggacacgg tctt 24 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 gaacccaacc gcctgccg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 tgcagacggt ccaagcgt 18 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 gtgaggccgg tgctgagtat g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 gccaaagttg tcatggatga c 21 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 catctgcagc caactttggt gtgt 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 agaggtagcc ggaaattcag ccat 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 tgagcgcaag tactctgtgt ggat 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 actcatcgta ctcctgcttg ctga 24

Claims (39)

  1. Anc80 캡시드 단백질, 및 TMC1, TMC2, MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터.
  2. 대상체에서 내이에 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질 및 트랜스진을 포함하는 것인, 대상체에서 내이 중의 하나 이상의 세포에 트랜스진을 전달하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 내이 중의 하나 이상의 세포가 내유모 세포 (IHC) 및 외유모 세포 (OHC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 트랜스진이 적어도 80%의 내유모 세포 및 적어도 80%의 외유모 세포에 전달되는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 내이 중의 하나 이상의 세포가 나선 신경절 뉴런, 전정 유모 세포, 전정 신경절 뉴런, 지지 세포, 및 혈관조 중의 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 트랜스진이 ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP, NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1, WFS1, WHRN, 및 XIAP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 트랜스진이 신경 영양 인자를 코딩하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 신경 영양 인자가 GDNF, BDNF, NT3, 및 HSP70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제2항에 있어서, 트랜스진이 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 트랜스진이 면역조절 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  11. 제2항에 있어서, 트랜스진이 항-종양원성 전사체를 코딩하는 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 트랜스진이 안티센스, 침묵화, 또는 장쇄 비-코딩 RNA 종을 코딩하는 것인 방법.
  13. 제2항에 있어서, 트랜스진이 유전자 조작된 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 및 CRISPR로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 편집 시스템을 코딩하는 것인 방법.
  14. 제2항에 있어서, Anc80 캡시드 단백질이 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 제시된 서열을 갖는 것인 방법.
  15. 제2항에 있어서, Anc80 캡시드 단백질이 서열식별번호: 2에 제시된 서열을 갖는 것인 방법.
  16. 제3항에 있어서, 트랜스진이 이종 프로모터 서열의 제어하에 있는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 이종 프로모터 서열이 CMV 프로모터, CBA 프로모터, CASI 프로모터, PGK 프로모터, EF-1 프로모터, 알파9 니코틴성 수용체 프로모터, 프레스틴 프로모터, KCNQ4 프로모터, Myo7a 프로모터, Myo6 프로모터, Gfi1 프로모터, Vglut3 프로모터, 및 Atoh1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제2항에 있어서, 투여 단계가 원창을 통해 Anc AAV를 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
  19. 제2항에 있어서, Anc AAV가 원창을 통한 주사를 통해 투여되는 것인 방법.
  20. 제2항에 있어서, Anc AAV가 와우개창술 동안 또는 반고리관 절개술 동안 투여되는 것인 방법.
  21. 제2항에 있어서, Anc AAV가 하나 이상의 약물 전달 비히클을 통해 중이 및/또는 원창에 투여되는 것인 방법.
  22. 제2항에 있어서, 트랜스진의 발현을 통해 내유모 세포 (IHC), 외유모 세포 (OHC), 나선 신경절 뉴런, 혈관조, 전정 유모 세포, 및/또는 전정 신경절 뉴런이 재생되고, 이에 의해 청력 또는 전정 기능이 회복되는 것인 방법.
  23. AAV 벡터 및 제약 조성물을 포함하는 제조 물품이며, 여기서 AAV 벡터는 Anc80 캡시드 단백질 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함하는 것인 제조 물품.
  24. 제23항에 있어서, 트랜스진이 ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPH1, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDR1, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MYO15A, MYO1A, MYO3A, MYO6, MYO7A, NARS2, NDP, NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, STRC, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E, TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1, WFS1, WHRN, 및 XIAP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조 물품.
  25. 대상체에서 내이에 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질 및 트랜스진을 포함하는 것인, 대상체에서 내이 중의 하나 이상의 세포에 TMC1 또는 TMC2 트랜스진을 전달하는 방법.
  26. 대상체에서 내이에 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV는 Anc80 캡시드 단백질 및 트랜스진을 포함하는 것인, 대상체에서 내이 중의 하나 이상의 세포에 어셔(Usher) 트랜스진을 전달하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 어셔 트랜스진이 MYO7A, USCH1C, CDH23, PCDH15, SANS, CIB2, USH2A, VLGR1, WHRN, CLRN1, PDZD7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 내이 중의 하나 이상의 세포가 내유모 세포 (IHC) 및 외유모 세포 (OHC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 트랜스진이 적어도 80%의 내유모 세포 및 적어도 80%의 외유모 세포에 전달되는 것인 방법.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서, 내이 중의 하나 이상의 세포가 나선 신경절 뉴런, 전정 유모 세포, 전정 신경절 뉴런, 지지 세포, 및 혈관조 중의 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제25항 또는 제26항에 있어서, Anc80 캡시드 단백질이 서열식별번호: 1에 제시된 서열을 갖는 것인 방법.
  32. 제25항 또는 제26항에 있어서, Anc80 캡시드 단백질이 서열식별번호: 2에 제시된 서열을 갖는 것인 방법.
  33. 제25항 또는 제26항에 있어서, 트랜스진이 이종 프로모터 서열의 제어하에 있는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 이종 프로모터 서열이 CMV 프로모터, CBA 프로모터, CASI 프로모터, PGK 프로모터, EF-1 프로모터, 알파9 니코틴성 수용체 프로모터, 프레스틴 프로모터, KCNQ4 프로모터, Myo7a 프로모터, Myo6 프로모터, Gfi1 프로모터, Vglut3 프로모터, 및 Atoh1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 제25항 또는 제26항에 있어서, 투여 단계가 원창을 통해 Anc AAV를 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
  36. 제25항 또는 제26항에 있어서, Anc AAV가 원창을 통한 주사를 통해 투여되는 것인 방법.
  37. 제25항 또는 제26항에 있어서, Anc AAV가 와우개창술 동안 또는 반고리관 절개술 동안 투여되는 것인 방법.
  38. 제25항 또는 제26항에 있어서, Anc AAV가 하나 이상의 약물 전달 비히클을 통해 중이 및/또는 원창에 투여되는 것인 방법.
  39. 제25항 또는 제26항에 있어서, 트랜스진의 발현을 통해 내유모 세포 (IHC), 외유모 세포 (OHC), 나선 신경절 뉴런, 혈관조, 전정 유모 세포, 및/또는 전정 신경절 뉴런이 재생되고, 이에 의해 청력 또는 전정 기능이 회복되는 것인 방법.
KR1020187019786A 2015-12-11 2016-12-12 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법 KR20180097631A (ko)

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