KR20220097875A - 게놈 통합을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20220097875A
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mrna
cell
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utr
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KR1020227010704A
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대니얼 겟츠
위샤오 왕
나미타 비사리아
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마이얼로이드 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

표적 게놈을 조절하고 관심 있는 전이 유전자를 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시키는 방법 및 조성물을 개시한다.

Description

게놈 통합을 위한 방법 및 조성물
교차참조
본원은 2019년 9월 3일에 출원된 미국 가출원 제62/895,441호, 2019년 10월 1일에 출원된 미국 가출원 제62/908,800호, 및 2020년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 제63/039,261호를 우선권으로 주장하고, 이 출원들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자 제출되었고 전체적으로 본원에 참고로 포함된 서열목록을 함유한다. 2020년 10월 13일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 56371-706_601_SL.txt이고 크기가 363,857 바이트이다.
세포 요법은 암, 지속적 감염 및 다른 형태의 치료에 불응하는 특정 질환과 같은 치료하기 어려운 질환을 해결하기 위해 빠르게 발전하는 분야이다. 세포 요법은 종종 생체외에서 조작되고 체내의 결핍을 바로잡기 위해 유기체에게 투여되는 세포를 활용한다. 세포 게놈 조작을 위한 효과적인 신뢰할 수 있는 시스템은 조작된 세포가 유기체에게 투여될 때 최적으로 장기간 효능을 가지면서 작용한다는 점에서 매우 중요하다. 마찬가지로, 유전자 조작의 신뢰할 수 있는 기작은 유전자 요법의 성공에 있어서 초석을 형성한다. 그러나, 치료적으로 안전하고 효과적인 방식으로 핵산 카고(cargo)(예를 들면, 큰 카고)를 전달하는 방법에는 심각한 결함이 있다. 바이러스 전달 기작은 세포에서 큰 핵산 카고를 전달하는 데 자주 사용되나, 안전성 문제와 연관되어 있고 일부 세포 유형에서 카고를 발현하는 데 사용될 수 없다. 추가로, 세포를 반복적으로 유전자 조작하는 것은 세포 건강에 영향을 미칠 수 있고, 세포 주기의 변경을 유도할 수 있고, 세포를 치료 용도에 부적합하게 만들 수 있다. 치료 목적을 위해 외생적으로 도입된 유전 물질의 효과적인 전달 및 안정화 분야에서 진일보는 계속 추구된다.
본원은 세포 내로의 유전 물질의 안정한 비-바이러스 전달 및 통합을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 양태에서, 유전 물질은 자가 통합 폴리뉴클레오타이드이다. 유전 물질은 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있다. 세포는 인간 세포일 수 있다. 유전 물질을 세포의 게놈 내로 안전하고 신뢰할 수 있게 통합시키는 방법이 디자인된다.
한 양태에서, 본원은 유전 물질을 세포의 게놈 내로 통합시키는 조성물 및 방법을 제공하는 것으로서, 이때 통합될 수 있는 유전 물질은 크기에 의해 구체적으로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법은 세포의 게놈 내로의 유전 "카고"의 1-단계 단일 폴리뉴클레오타이드 매개 전달 및 통합을 제공한다. 유전 물질은 코딩 서열, 예를 들면, 전이 유전자(transgene), 펩타이드, 재조합 단백질 또는 항체, 또는 이들의 단편을 코딩하는 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 방법 및 조성물은 코딩 서열에 의해 코딩된 전사된 생성물의 안정한 발현을 보장한다. 유전 물질은 비코딩 서열, 예를 들면, 조절 RNA 서열, 예를 들면, 조절 작은 억제 RNA(siRNA), microRNA(miRNA), 긴 비코딩 RNA(lncRNA), 또는 하나 이상의 전사 조절제, 예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있고, 구조 생체분자, 예컨대, 리보좀 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 또는 이들의 단편 또는 이들의 조합도 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본원은 전달의 안전성 및 효능 둘 다를 보장하는 비-바이러스 전달을 통해 크기에 의해 구체적으로 제한되지 않을 수 있는 유전 물질을 세포의 게놈 내로 부위 특이적으로 통합시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 제공된 방법 및 조성물은 유전 물질을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 치료제와 같은 치료제, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 mRNA를 세포 내로 전달할 수 있게 하고 전달된 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있게 하는 기구를 개발하는 데 특히 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용함으로써 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포일 수 있다.
한 양태에서, 본 개시내용은 유전자를 세포 내로 안정적으로 전달하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 조성물 및 방법은 유전자를 면역 세포 내로 안정적으로 전달하기 위한 것이다. 일부 경우, 면역 세포는 골수 세포이다. 일부 경우, 본원에 기재된 방법은 면역요법을 위한 골수 세포의 개발에 관한 것이다.
식세포를 사용한 면역요법은 암 세포 또는 감염된 세포와 같은 병든 세포를 공격하고 사멸시키는 대식세포 또는 다른 식세포와 같은 조작된 골수 세포를 만들고 사용하는 단계를 포함한다. 조작된 골수 세포, 예컨대, 대식세포 및 다른 식세포는 암 세포와 같은 표적 세포와 같은 표적의 표면의 특정 항원에 결합하도록 디자인된 표적화된 항원 결합 세포외 도메인을 포함하는 조작된 단백질, 예컨대, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 합성 재조합 핵산을, 재조합 핵산 기술을 통해 이 세포 내로 혼입함으로써 제조된다. 조작된 키메라 수용체와 암 항원(또는 마찬가지로 질환 표적)과 같은 표적의 항원의 결합은 표적의 식세포작용을 시작한다. 이것은 2배 작용을 유발한다: 하나는 식세포 삼킴과 표적의 용해가 표적을 파괴하고 제1선 면역 방어로서 이를 제거하고; 둘째, 표적의 항원이 골수 세포의 포식라이소좀(phagolysosome)에서 분해되고 골수 세포의 표면에 제시된 후, T 세포의 활성화 및 면역 반응의 추가 활성화와 면역학적 기억의 발생을 유발한다. 키메라 수용체는 그 자신이 혼입되고 발현되는 골수 세포의 향상된 식세포작용 및 면역 활성화를 위해 조작된다. 본 개시내용의 키메라 항원 수용체는 본원에서 키메라 융합 단백질, CFP, 식세포 수용체(PR) 융합 단백질(PFP), 또는 식세포작용을 위한 키메라 항원 수용체(CAR-P)로서 다양하게 지칭되지만, 각각의 용어는 재조합 키메라 및/또는 융합 수용체 단백질의 개념에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 비-수용체 단백질을 코딩하는 유전자도 전형적으로 키메라 항원 수용체 기능의 증강을 위해 골수 세포에서 공발현된다. 요약하건대, 질환 표적에 대한 골수 세포의 식세포작용 및/또는 면역 반응을 증강시키도록 디자인된 다양한 조작된 수용체들 및 비-수용체 재조합 단백질들, 및 방법과 조성물이 면역요법을 위한 조작된 골수 세포의 생성에 적합하도록 조작된 수용체 또는 비-수용체 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 생성하고 혼입하는 방법 및 조성물이 본원에서 예상된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 유전자를 세포 내로 안정적으로 전달하는 조성물 및 방법을 제공하는 것으로서, 이때 상기 세포는 임의의 체세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 및 방법은 세포 특이적 또는 조직 특이적 전달용으로 디자인된다. 일부 경우, 본원에 기재된 방법은 예를 들면, 단백질 대체 요법을 위해 생체내에서 부재하거나 결함이 있는(돌연변이된) 단백질을 보상하도록 기능적 단백질 또는 이의 단편을 제공하는 것에 관한 것이다.
세포 내로의 재조합 핵산의 혼입은 최신기술에서 이용될 수 있는 하나 이상의 유전자 전달 기법에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 치료 목적을 위해 외생성(exogenous) 유전(예를 들면, 핵산) 요소를 게놈 내로 혼입하는 것은 여전히 여러 도전과제에 직면한다. 안전하고 신뢰할 수 있는 방식으로 안정한 통합을 달성하는 것과 효율적인 연장된 발현이 이 도전과제들 중 일부이다. 카고 핵산 서열의 게놈 통합을 목적으로 하는 성공적인 유전자 전달 시스템들 중 대다수는 일부 내재하는 안전성 및 효능 문제들을 가진 바이러스 전달 기작에 의존한다. 긴 핵산 서열의 전달 및 통합은 현재 유전자 편집 시스템에 의해 달성될 수 없다.
지금까지 안정한 장기간 유전자 전달 및 전이 유전자의 발현을 위해 조작된 골수 세포를 제조하고 사용하는 데 거의 관심을 기울이지 않았다. 예를 들면, 세포 요법을 위해 생체외에서 유전자를 분화된 포유동물 세포에게 전달하는 것은 바이러스 유전자 전달 기작을 통해 달성될 수 있다. 그러나, 시간에 따른 원치 않는 전이 유전자 침묵 가능성, 다른 유전자(예를 들면, 발암유전자)의 원치 않는 활성화와 관련된 게놈의 전사 활성 부위 내로의 우선적인 통합 및 유전독성을 비롯한, 바이러스 유전자 전달 벡터의 사용과 관련된 몇 가지 전략적 단점이 있다. 안전성 문제 이외에, 증가된 비용과 통합 바이러스의 제조, 저장 및 취급의 번거로운 노력은 종종 치료 적용에 있어서 바이러스 벡터 매개 유전자 변형 세포의 대규모 사용을 방해한다. 안전성에 관한 바이러스 벡터와 관련된 이 지속적인 우려뿐만 아니라, 벡터 제조의 비용 및 규모도 효과적인 요법을 위한 대안적 방법을 필요로 한다.
면역요법에 사용되는 세포의 게놈 내로의 전이 유전자의 통합은 이것이 안정하고 요법 동안 전달을 위해 더 적은 수의 세포가 요구된다는 점에서 유리할 수 있다. 다른 한편으로, 비-분열 세포 내로의 전이 유전자의 통합은 세포의 건강 및 기능뿐만 아니라 생체내에서의 세포의 궁극적인 수명에도 영향을 미침으로써, 치료제로서의 그의 전체 유용성에 영향을 미친다는 점에서 어려울 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역요법을 위해 골수 세포를 생성하는 본원에 기재된 방법은 예를 들면, 변형시킬 골수 세포의 선택; 재조합 핵산을 골수 세포 내로 혼입하는 방법 및 조성물; 재조합 핵산의 발현을 향상시키는 방법 및 조성물; 벡터를 선택하고 변형시키는 방법 및 조성물; 생체내에서 골수 세포에 의한 재조합 핵산의 흡수 및 혼입을 위한 생체내 투여에 적합한 재조합 핵산을 제조함으로써 요법을 위한 골수 세포를 생성하는 방법을 포함하나 이들로 제한되지 않는 다수의 단계들과 조성물들의 누적 결과일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 다양한 발명들의 하나 이상의 실시양태는 서로 간에 전달될 수 있으며, 당분야에서 숙련된 자는 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 이들을 대안으로, 조합으로 또는 교환 가능하게 사용할 것으로 예상된다. 개시된 요소의 모든 이러한 변경이 고려되고 본원에 완전히 포함된다.
한 양태에서, 트랜스포존, 또는 전위 요소(TE)는 본원에서 관심 있는 전이 유전자를 코딩하는 이종, 합성 또는 재조합 핵산을 골수 세포 내로 혼입하는 수단으로서 간주된다. 트랜스포존 또는 전위 요소는 전위효소(transposase)로서 공지되어 있는 효소를 사용하여 유전 물질의 단편을 게놈 내로 전위시키는 능력을 가진 유전 요소이다. 포유동물 게놈은 많은 수의 전위 요소(TE) 유래 서열들을 함유하고, 본 발명자들의 게놈의 최대 70%는 TE 유래 서열을 나타낸다(de Koning et al. 2011; Richardson et al. 2015). 이 요소는 유전 물질을 세포의 게놈 내로 도입하는 데 이용될 수 있다. TE 요소는 종종 게놈 내에서 유전 물질의 "점핑"으로서 지칭되는 이동을 할 수 있다. TE는 일반적으로 가역적 불활성 후성적 침묵된 형태로 진핵생물 게놈에 존재한다. 본 개시내용에서, 전이 유전자를 대식세포 및 다른 식세포 내로 효율적 및 안정적으로 통합시키는 방법 및 조성물. 상기 방법은 전위효소 및 전위 요소 mRNA-코딩된 전위효소의 사용에 기반한다. 일부 실시양태에서, 긴 산재된 요소(Long Interspersed Element)-1(L1) RNA는 전이 유전자를 세포(예를 들면, 대식세포 또는 식세포) 내로 안정적으로 통합시키고/시키거나 역전위시키는 데 사용된다.
본원은 세포 게놈 내로의 외생성 핵산 서열의 레트로트랜스포존(retrotransposon) 매개 안정한 통합 방법을 예상한다. 이 방법은 불리한 효과를 생성하지 않으면서 레트로트랜스포존을 세포 내로 무작위 게놈 통합시키는 기구를 이용할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 외생성 핵산이 게놈 내의 안전한 좌위에서 혼입되고 세포의 내재하는 방어 기작에 의해 침묵되지 않으면서 발현되도록 외생성 핵산 서열을 세포 내로 강력하고 다양하게 혼입하는 데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 크기가 약 1 kb, 약 2 kb, 약 3 kb, 약 4 kb, 약 5 kb, 약 6 kb, 약 7 kb, 약 8 kb, 약 9 kb, 약 10 kb 이상인 외생성 핵산을 혼입하는 데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외생성 핵산은 리보좀 좌위 내에 혼입되지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 핵산은 ROSA26 좌위 또는 또 다른 안전한 은신처 좌위 내에 혼입되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 외생성 핵산 서열을 세포의 게놈 내의 임의의 위치에서 혼입할 수 있다. 나아가, 본원은 불리한 효과를 생성하지 않으면서 외생성 핵산 서열을 세포 게놈 내의 특정 예정된 부위 내로 혼입하기 위해 개발된 역전위 시스템을 고려한다. 개시된 방법 및 조성물은 높은 신뢰도로 외생성 핵산을 세포 내로 매우 특이적으로 혼입하기 위해 레트로트랜스포존을 조작하는 여러 기작들을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 세포의 게놈을 조작하는 분자 시스템 및 기작에 있어서 핵심적인 돌파구를 대표한다. 본원은 외생성 핵산 서열의 큰 단편(적어도 100개 초과의 핵염기, 적어도 1 kb 초과, 적어도 2 kb 초과, 적어도 3 kb 초과 등)을, rDNA 또는 리보좀 좌위 또는 지정된 안전한 은신처 좌위, 예컨대, ROSA 26 좌위가 아닌 게놈의 비-보존된 영역 내로 비-바이러스적으로 전달하고 안정적으로 통합시키는 데 있어서 인간 레트로트랜스포존 시스템을 활용하는 방법을 처음으로 제시한다.
일부 실시양태에서, 역전위 시스템을 사용하여 비-내생성 핵산을 게놈 내로 안정적으로 혼입하고 발현시키고, 이때 비-내생성 핵산은 핵산 서열 내에 역전위 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 내생성 역전위 시스템(예를 들면, 단백질 및 효소)을 이용하여 세포에서 비-내생성 핵산을 안정적으로 발현시킨다. 일부 실시양태에서, 세포의 내생성 역전위 시스템(예를 들면, 단백질 및 효소, 예컨대, LINE-1 역전위 시스템)이 이용되나, 세포에서 비-내생성 핵산을 안정적으로 발현시키기 위해 역전위 시스템의 하나 이상의 성분을 추가로 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 전이 유전자를 코딩하고 게놈 통합 및/또는 역전위를 위해 하나 이상의 성분을 코딩하는 합성 핵산을 제공한다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 외생성 서열, 또는 외생성 서열의 역상보체(reverse complement)인 서열을 포함하는 삽입체 서열; 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고; 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF 단백질에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF2p에 대한 결합 부위를 포함한다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 면역 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 (i) 외생성 서열 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고, 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제(endonuclease) 결합 부위 및/또는 역전사효소 결합 부위를 포함하고, 전이 유전자 서열은 면역 세포의 게놈 내로 통합된다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, mRNA는 (i) 외생성 서열 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; 5' UTR 서열, 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 인간 레트로트랜스포존의 서열, 및 인간 레트로트랜스포존의 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고, 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제 결합 부위 및/또는 역전사효소 결합 부위를 포함하고, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역된 2개의 단백질을 코딩하고, 상기 삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 ORF2p 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF2p 결합 부위는 3' UTR 서열 내의 폴리 A 서열이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 인간 레트로트랜스포존의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 5' UTR 서열의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 3' UTR 서열의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내로 전달되고 혼입되기를 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 삽입체)은 재조합 핵산 구축물에서 ORF1을 코딩하는 서열의 3' 부위에서 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내로 전달되고 혼입되기를 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 재조합 핵산 구축물에서 ORF2를 코딩하는 서열의 3' 부위에서 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내로 전달되고 혼입되기를 원하는 서열은 ORF1 또는 ORF2, 또는 이들 둘 다의 3' UTR 내에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내로 전달되고 혼입되기를 원하는 서열인 폴리뉴클레오타이드 서열은 재조합 핵산 구축물에서 ORF2의 폴리 A 꼬리의 업스트림에서 삽입된다.
일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역되는 2개의 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 2개의 ORF는 비-중첩 ORF이다. 일부 실시양태에서, 2개의 ORF는 ORF1 및 ORF2이다. 일부 실시양태에서, ORF1은 ORF1p를 코딩하고, ORF2는 ORF2p를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 비-LTR 레트로트랜스포존의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 LINE-1 레트로트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, LINE-1 레트로트랜스포존은 인간 LINE-1 레트로트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소는 ORF2p이다. 일부 실시양태에서, 역전사효소는 II군 인트론 역전사효소 도메인이다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소는 밍크 고래 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 ORF2p를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 ORF2p의 엔도뉴클레아제 도메인의 특이성을 이용함으로써 폴리 T 부위에서 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 폴리 T 부위는 서열 TTTTTA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 인간 레트로트랜스포존을 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 구축물을 제공하는 것으로서, 이때 (i) 인간 레트로트랜스포존의 서열은 ORF1p를 코딩하는 서열을 포함하거나, (ii) 상기 mRNA는 ORF1p를 코딩하는 서열을 포함하지 않거나, (iii) 상기 mRNA는 상보체 유전자의 5' UTR 서열에 의한 ORF1p 코딩 서열의 대체를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 ORF1p를 코딩하는 제1 mRNA 분자, 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 mRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 ORF1p를 코딩하는 제1 서열, 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열을 포함하는 mRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열과 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 링커 서열에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 링커 서열은 내부 리보좀 진입 서열(IRES)을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRES는 CVB3 또는 EV71의 IRES이다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 자가 절단 펩타이드 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 T2A, E2A 또는 P2A 서열을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 추가 단백질 서열에 융합된 ORF1p를 코딩하는 서열 및/또는 추가 단백질 서열에 융합된 ORF2p를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF1p 및/또는 ORF2p는 핵 체류(nuclear retention) 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 핵 체류 서열은 Alu 서열이다. 일부 실시양태에서, ORF1p 및/또는 ORF2p는 MS2 코트 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 적어도 1개, 2개, 3개 이상의 MS2 헤어핀 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 mRNA의 폴리 A 꼬리와 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 상호작용을 촉진하거나 향상시키는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 폴리 A 결합 단백질(예를 들면, PABP)과 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 상호작용을 촉진하거나 향상시키는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 상기 mRNA에 대한 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 특이성을 세포에 의해 발현된 또 다른 mRNA에 비해 증가시키는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 Alu 요소 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 동일한 프로모터를 가진다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 ORF1p를 코딩하는 제1 서열의 프로모터와 상이한 프로모터를 가진다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열의 프로모터와 상이한 프로모터를 가진다. 일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및/또는 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 유도성 프로모터, CMV 프로모터 또는 전사 시작 부위, T7 프로모터 또는 전사 시작 부위, EF1a 프로모터 또는 전사 시작 부위, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터 또는 전사 시작 부위를 가진다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유도성 프로모터, CMV 프로모터 또는 전사 시작 부위, T7 프로모터 또는 전사 시작 부위, EF1a 프로모터 또는 전사 시작 부위, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터 또는 전사 시작 부위를 가진다.
일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 인간 세포에서 발현되도록 코돈 최적화된다.
일부 실시양태에서, mRNA는 WPRE 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 선택 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 친화성 태그를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태에서, 3' UTR은 폴리 A 서열을 포함하거나, 폴리 A 서열은 시험관내에서 mRNA에 추가된다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 폴리 A 서열의 업스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 3' UTR 서열은 삽입체 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체인 서열의 업스트림에서 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 리보좀 좌위가 아닌 좌위에서 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 rDNA 좌위가 아닌 좌위에서 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유전자 또는 유전자의 조절 영역 내로 통합됨으로써, 유전자를 파괴하거나 유전자의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유전자 또는 유전자의 조절 영역 내로 통합됨으로써, 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈 내로 통합되고 유전자를 대체한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈 내로 역전위된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 mRNA에 의해 코딩된 엔도뉴클레아제에 의한 표적 부위의 DNA 가닥의 절단에 의해 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 표적 프라이밍 역전사(TPRT)를 통해 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈의 DNA 표적 부위로의 mRNA의 역스플라이싱을 통해 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 수지상 전구체 세포 및 대식세포 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, mRNA는 자가 통합 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 방법은 mRNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체외에서 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 인간 대상체에게 투여하는 단계도 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 인간 대상체에서 유발되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 mRNA 또는 상기 벡터는 실질적으로 면역원성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비-LTR 레트로트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 인간 L1 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존 ORF1 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존 ORF2 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존을 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 적어도 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 킬로베이스이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 최대 약 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5 킬로베이스이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 엑소뉴클레아제(exonuclease) 또는 RNAse에 의한 mRNA의 분해를 억제하거나 방지한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 G 사중체, 슈도노트(pseudoknot) 또는 삼중체 서열이다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 플라비바이러스 RNA의 엑소리보뉴클레아제(exoribonuclease) 내성 RNA 구조 또는 KSV의 ENE 요소이다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 데아데닐라제(deadenylase)에 의한 mRNA의 분해를 억제하거나 방지한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 mRNA의 폴리 A 꼬리의 내부 또는 말단에서 비-아데노신 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 mRNA의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열과 인 프레임(in frame)으로 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열과 인 프레임으로 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 인트론을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 효소, 수용체, 수송 단백질, 구조 단백질, 호르몬, 항체, 수축성 단백질 및 저장 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 리간드, 항체, 수용체 및 효소로 구성된 군으로부터 선택된 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 시스(cis) 작용 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 프로모터 또는 반응 요소로 구성된 군으로부터 선택된 시스 작용 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 트랜스(trans) 작용 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 전사 인자를 코딩하는 트랜스 작용 조절 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 삽입체 서열의 통합은 세포 건강에 불리한 영향을 미치지 않는다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제, 역전사효소 또는 이들 둘 다는 삽입체 서열을 부위 특이적으로 통합시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, mRNA는 추가 뉴클레아제 도메인 또는 ORF2로부터 유래하지 않은 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 megaTAL 뉴클레아제 도메인, TALEN 도메인, Cas9 도메인, R2 역요소의 징크 핑거(zinc finger) 결합 도메인, 또는 AAV의 Rep78과 같은 반복 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 돌연변이를 갖지 않은 엔도뉴클레아제에 비해 엔도뉴클레아제의 활성을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 ORF2p 엔도뉴클레아제이고, 돌연변이는 S228P이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 역전사효소의 신뢰도 및/또는 진행성을 증가시키는 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역전사효소는 ORF2 이외의 역요소의 역전사효소, 또는 ORF2p의 역전사효소에 비해 더 높은 신뢰도 및/또는 진행성을 가진 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, 역전사효소는 II군 인트론 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, II군 인트론 역전사효소는 IIA군 인트론 역전사효소, IIB군 인트론 역전사효소, 또는 IIC군 인트론 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, II군 인트론 역전사효소는 TGIRT-II 또는 TGIRT-III이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 Alu 요소 및/또는 리보좀 결합 앱타머를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' UTR 서열은 바이러스 3' UTR 또는 베타-글로빈 3' UTR로부터 유래한다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 인간 LINE-1 트랜스포존 5' UTR 서열, 인간 LINE-1 트랜스포존 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는, ORF1p를 코딩하는 서열, ORF1p를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있는 ORF간 링커 서열, ORF간 링커 서열의 다운스트림에 있는, ORF2p를 코딩하는 서열, 및 ORF2p를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있는, 인간 LINE-1 트랜스포존으로부터 유래한 3' UTR 서열을 포함하는 인간 LINE-1 트랜스포존 서열을 포함하고; 이때 3' UTR 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체 또는 외생성 조절 요소를 코딩하는 서열의 역상보체인 삽입체 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 세포 내로 도입될 때 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 병태 또는 질환과 관련된 유전자 내로 통합됨으로써, 상기 유전자를 파괴하거나 상기 유전자의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유전자 내로 통합됨으로써, 상기 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터는 단리되거나 정제된다.
한 양태에서, 본원은 (a) 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p를 포함하는 긴 산재된 핵 요소(LINE) 폴리펩타이드; 및 (b) 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체 또는 외생성 조절 요소를 코딩하는 서열의 역상보체인 삽입체 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 실질적으로 면역원성을 갖지 않은 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 핵산과 복합체를 형성한 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다.
한 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 수지상 전구체 세포 및 대식세포 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체이고, 외생성 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
한 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 유전자 요법에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 한 양태에서, 본원은 본원에 기재된 약학 조성물을, 질환 또는 병태를 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에서 단백질 또는 기능적 RNA의 양 또는 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 단백질 또는 기능적 RNA의 결핍된 양 또는 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 기능적 RNA의 결핍된 양 또는 활성은 상기 질환 또는 병태와 관련되어 있거나 이러한 질환 또는 병태를 야기한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제, FAM208A를 억제하는 작용제, 또는 TRIM28을 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제는 페리필린(Periphilin), TASOR 및/또는 MPP8을 억제하는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제는 HUSH 복합체의 어셈블리를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 판코니 빈혈 복합체를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 FANCD2-FANC1 이종이량체 모노유비퀴틴화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 FANCD2-FANC1 이종이량체 형성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 판코니 빈혈(FA) 코어 복합체를 억제한다. FA 코어 복합체는 예를 들면, 화학요법에 의해 유도된 DNA 가닥간 가교결합에서 판코니 빈혈 DNA 손상 복구 경로의 성분이다. FA 코어 복합체는 RING 핑거 서브유닛인 FANCL의 두 카피에 의해 플랭킹된, FANCB의 2개 중심 이량체 및 100 kDa 서브유닛의 FA 관련 단백질(FAAP100)을 포함한다. 이 2개의 이종삼량체는 남은 5개의 서브유닛들을 어셈블링하기 위한 스캐폴드로서 작용하여, 연장된 비대칭 구조를 생성한다. 이 스캐폴드의 불안정화는 전체 복합체를 파괴하여, 비-기능적 FA 경로를 야기할 것이다. FA 코어 복합체를 억제할 수 있는 작용제의 예는 보르테조밉(Bortezomib) 및 쿠르쿠민(curcumin) 유사체 EF24 및 4H-TTD를 포함한다.
따라서, 본 발명의 목적은 유전자 요법을 동물에게 제공하는 데 유용한 신규 트랜스포존 기반 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 유전자 요법을 동물 또는 인간에게 제공하는 데 유용한 의약의 제조에 사용하기 위한 신규 트랜스포존 기반 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 세포에서 원하는 단백질 또는 펩타이드의 생성을 코딩하는 신규 트랜스포존 기반 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 세포에서 원하는 핵산의 생성을 코딩하는 신규 트랜스포존 기반 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 선택된 유전자를 동물의 특정 세포 또는 조직으로 표적화하는 단계를 포함하는, 트랜스포존 기반 DNA 또는 RNA 구축물을 세포 또는 조직 특이적으로 혼입하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 전위효소에 의한 선택된 유전자의 안정한 혼입을 향상시키는 세포 특이적 프로모터를 가진 DNA 또는 RNA 구축물을 디자인하는 단계 및 세포에서 상기 선택된 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는, 트랜스포존 기반 DNA 또는 RNA 구축물을 세포 및 조직 특이적으로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 트랜스포존 기반 벡터의 생식 세포주 투여를 통해 유전자 요법을 세대에게 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 트랜스포존 기반 벡터의 비-생식 세포주 투여를 통해 동물에서 유전자 요법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 트랜스포존 기반 벡터의 투여를 통해 동물에서 유전자 요법을 제공하는 것으로서, 이때 상기 동물은 원하는 단백질, 펩타이드 또는 핵산을 생성한다. 본 발명의 또 다른 목적은 트랜스포존 기반 벡터의 투여를 통해 동물에서 유전자 요법을 제공하는 것으로서, 이때 상기 동물은 표적 세포의 수용체에 의해 인식되는 원하는 단백질 또는 펩타이드를 생성한다. 본 발명의 또 다른 목적은 트랜스포존 기반 벡터의 투여를 통해 동물에서 유전자 요법을 제공하는 것으로서, 이때 상기 동물은 원하는 융합 단백질 또는 융합 펩타이드의 다른 단백질 또는 펩타이드 성분을 세포에게 전달하여 생물학적 반응을 유도하기 위해 표적 세포의 수용체에 의해 인식되는 부분을 가진 원하는 융합 단백질 또는 융합 펩타이드를 생성한다. 본 발명의 또 다른 목적은 관심 있는 유전자의 조직 특이적 혼입 및 발현을 용이하게 하여 원하는 단백질, 펩타이드 또는 핵산을 생성하기 위해 조직 특이적 프로모터 및 관심 있는 유전자를 포함하는 트랜스포존 기반 벡터의 투여를 통한 동물의 유전자 요법을 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 관심 있는 유전자의 세포 특이적 혼입 및 발현을 용이하게 하여 원하는 단백질, 펩타이드 또는 핵산을 생성하기 위해 세포 특이적 프로모터 및 관심 있는 유전자를 포함하는 트랜스포존 기반 벡터의 투여를 통한 동물의 유전자 요법을 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 관심 있는 유전자의 세포 특이적 혼입 및 발현을 용이하게 하여 원하는 단백질, 펩타이드 또는 핵산을 생성하기 위해 세포 특이적 프로모터 및 관심 있는 유전자를 포함하는 트랜스포존 기반 벡터의 투여를 통한 동물의 유전자 요법을 위한 방법을 제공하는 것으로서, 이때 상기 원하는 단백질, 펩타이드 또는 핵산은 동물에서 원하는 생물학적 효과를 가진다.
참고에 의한 인용
본 명세서에서 언급된 모든 간행물들, 특허들 및 특허출원들은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허출원이 본 명세서에 함유된 개시내용과 모순되는 경우, 본 명세서는 임의의 이러한 모순되는 자료를 대체하고/하거나 이러한 자료보다 우선한다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 이용된 예시적인 실시양태가 기재된 하기 상세한 설명과 첨부된 도면(본원에서 "도"로서도 지칭됨)을 참고함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1a는 레트로트랜스포존의 일반적인 작용 기작을 예시한다. (I)는 자율 레트로트랜스포존의 전체 수명주기를 나타내는 개략도이다. (II) LINE-1 레트로트랜스포존은 mRNA로서 발현되는, 2개의 단백질 ORF1p 및 ORF2p를 코딩하는 LINE-1 요소를 포함한다. 바이시스트론(bicistronic) mRNA는 2개의 단백질로 번역되고, ORF2p가 리보좀에 의한 리드-쓰로우(read-through) 이벤트에 의해 번역될 때, 폴리 A 꼬리를 통해 그 자신의 mRNA의 3' 말단에 결합한다(III). ORF2p는 컨센서스 서열 TAAAA에서 절단하고, 이때 mRNA의 3' 말단에서 폴리 A는 하이브리드화하고 ORF2 단백질의 역전사효소 활성을 프라이밍한다. 단백질은 mRNA를 DNA로 다시 역전사하여, LINE-1 서열을 게놈의 새로운 위치 내로 다시 삽입한다(IV).
도 1b는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 다양한 예시적인 디자인들을 보여준다. 여기서 박스로 표시된 GFP는 예시적인 전이 유전자이다.
도 1c는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 다양한 예시적인 디자인들을 보여준다. 여기서 박스로 표시된 GFP는 예시적인 전이 유전자이다.
도 2a는 구축물을 사용하여 GFP를 코딩하는 서열을 안정적으로 혼입함으로써 예시적인 전이 유전자 GFP를 발현시키기 위한 세 가지 예시적인 디자인을 보여준다. 72시간에서 예상된 GFP 발현 수준은 우측에 표시되어 있다.
도 2b는 구축물을 사용하여 RFP, RFP 및 GFP, 또는 ORF2p 및 GFP를 코딩하는 서열을 안정적으로 혼입함으로써 예시적인 전이 유전자 GFP를 발현시키기 위한 세 가지 예시적인 디자인을 보여준다. 72시간에서 예상된 GFP 및 RFP 발현 수준은 우측에 표시되어 있다.
도 3a는 통상의 circRNA 구조 및 형성의 예시적인 도표를 보여준다.
도 3b는 예시적인 RL-GAAA tectoRNA 모티프 디자인(출현 순서대로 각각 서열번호 80 및 81)의 두 도면을 보여준다.
도 3c는 잠재적 tectoRNA를 시험하기 위한 플랫폼으로서 칩-유동 조각(chip-flow piece) RNA의 예시적인 구조를 보여준다.
도 4a는 ORF2 폴리 A 영역에 결합하는 ORF2p를 보여주는 예시적인 개략도를 보여준다.
도 4b는 ORF2p와 MS2 RNA 결합 도메인의 융합이 어떻게 ORF2를 코딩하는 mRNA의 3' UTR 내의 MS2 결합 RNA 서열에 결합하여 특이성을 증가시키는지를 보여주는 예시적인 개략도를 보여준다.
도 4c는 핵산을 특정 부위에서 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시키는 레트로트랜스포존 시스템의 예시적인 디자인을 보여준다. 상부 패널은 ORFp2-MegaTAL DNA 결합 도메인 융합체를 사용하는 다자인을 보여주고, 이때 ORF2p의 DNA 결합 및 엔도뉴클레아제 활성은 돌연변이되어, 불활성 상태가 된다. 중간 패널은 엔도뉴클레아제 도메인이 또 다른 단백질의 높은 특이성 및 높은 신뢰도 뉴클레아제 도메인으로 대체되어 있는 키메라 ORF2p를 보여준다. 하부 패널은 융합 단백질이 ORF2 결합 부위뿐만 아니라 ORF2 부위 근처의 추가 DNA 서열에도 결합하도록 이종 단백질의 DNA 결합 도메인과 ORF2p의 융합을 보여준다.
도 5는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 6a는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한, ORF1p를 코딩하는 서열을 가진 예시적인 구축물을 보여준다.
도 6b는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한, ORF1p를 코딩하는 서열을 갖지 않은 예시적인 구축물을 보여준다.
도 7a는 G-사중체 또는 슈도노트(서열번호 82)에 상응하는 구조를 5' UTR에 도입하고/하거나, xrRNA, 삼중체 모티프(출현 순서대로 각각 서열번호 83 내지 85) 및/또는 비-A 뉴클레오타이드 잔기를 3' UTR에 도입하여, 5'-3' 엑소뉴클레아제, 예컨대, XRN1에 의한 분해 또는 3'-5' 엑소좀 분해를 억제함으로써 mRNA 반감기를 개선하는 예시적인 방법을 보여준다.
도 7b는 암 세포에 결합하여 항암 활성을 유도하는 키메라 수용체를 코딩하는 전이 유전자를 발현하는 골수 세포의 예시적인 개략도를 보여준다.
도 7c는 키메라 수용체의 증가 및 연장된 발현에 대한, 도 7b에 기재된 바와 같이 암 세포에 결합하는 키메라 수용체를 코딩하는 벌크 또는 정제된 RNA 도입의 예상된 결과를 보여준다.
도 8a는 예시적인 플라스미드 디자인, 및 카고 핵산 서열을 가진 예상된 LINE-1 mRNA 전사체를 보여준다. 플라스미드는 (ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는) LINE-1 서열, 및 GFP를 코딩하는 핵산 서열인 카고 서열을 갖고, 이때 GFP의 코딩 서열은 인트론에 의해 불연속된다. GFP는 서열이 게놈 내로 통합되고 인트론이 스플라이싱될 때까지 발현되지 않는다.
도 8b는 도 8a에 나타낸 플라스미드에 의해 코딩된 mRNA 전사체의 성공적인 통합 및 모의 형질감염된 세포에 비해 GFP의 발현을 보여주는 예시적인 결과를 보여준다(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있다). 모의 형질감염된 세포는 GFP 카고 서열을 결여하는 벡터에 의해 형질감염되었다.
도 8c는 도 8b에 나타낸 결과로부터의 예시적인 유세포분석 결과를 보여준다.
도 9a는 예시적인 플라스미드 디자인, 및 카고 핵산 서열을 가진 예상된 LINE-1 mRNA 전사체를 보여준다. 플라스미드는 (ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는) LINE-1 서열, 및 CD5에 결합할 수 있는 세포외 영역과 FCR 세포내 도메인 및 PI3 키나제 동원 도메인을 포함하는 세포내 영역을 가진 재조합 키메라 융합 수용체 단백질(ATAK 수용체)을 코딩하는 핵산 서열인 카고 서열을 가진다. ATAK 수용체의 코딩 서열은 인트론에 의해 불연속된다.
도 9b는 도 9a에 나타낸 플라스미드에 의해 코딩된 mRNA 전사체의 성공적인 통합 및 모의 형질감염된 세포에 비해 ATAK의 발현을 보여주는 예시적인 결과를 보여준다(ATAK 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있다). 모의 형질감염된 세포는 ATAK 카고 서열을 결여하는 벡터에 의해 형질감염되었다. ATAK 수용체 단백질의 발현은 표지부착된 CD5 항체와의 결합에 의해 검출되었다.
도 9c는 도 9b에 제시된 결과로부터의 예시적인 유세포분석 결과를 보여준다.
도 10a는 예시적인 플라스미드 디자인, 및 카고 핵산 서열을 가진 예상된 LINE-1 mRNA 전사체를 보여준다. 플라스미드는 (ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는) LINE-1 서열, 및 재조합 키메라 융합 수용체 단백질(ATAK 수용체)을 코딩하는 핵산 서열인 카고 서열을 갖고, 그 뒤에 T2A 자가 절단 서열에 이어 분할 GFP 서열을 가진다(모두 LINE-1 서열에 대해 역방향으로 존재함). GFP의 코딩 서열은 인트론에 의해 불연속된다. 카고의 역전사 및 통합 후 예상된 mRNA가 도시되어 있다.
도 10b는 도 10a에 나타낸 플라스미드에 의해 코딩된 mRNA 전구체의 성공적인 통합 및 모의 형질감염된 세포에 비해 ATAK-T2A-GFP의 발현을 보여주는 예시적인 결과를 보여준다(GFP 및 ATAK 이중 양성 세포의 배수 변화가 표시되어 있다). 모의 형질감염된 세포는 ATAK 카고 서열을 결여하는 벡터에 의해 형질감염되었다. ATAK 수용체 단백질의 발현은 표지부착된 CD5 항체와의 결합에 의해 검출되었다.
도 10c는 도 10a에 나타낸 실험 설정을 이용하여 GFP 및 CD5 결합제(ATAK) 둘 다를 발현시키기 위한 2회 별도의 실험 실행으로부터의 대표적인 유세포분석 데이터를 보여준다.
도 10d는 도 10a에 나타낸 실험 설정을 이용하여 GFP 및 CD5 결합제(ATAK) 둘 다를 발현시키기 위한 2회 별도의 실험 실행으로부터의 대표적인 유세포분석 데이터를 보여준다.
도 11a는 역전위 기반 유전자 전달을 위한 예시적인 mRNA 구축물을 보여준다. ORF1 및 ORF2 서열은 2개의 상이한 mRNA 분자에 존재한다. ORF2p(ORF2) 코딩 mRNA는 역위된 GFP 코딩 서열을 포함한다.
도 11b는 ORF2-FLAG-GFPai mRNA만의 전기천공으로 정규화된 ORF1-mRNA 및 ORF2-FLAG-GFPai mRNA 둘 다의 전기천공 시 GFP의 발현(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있음)을 보여주는 예시적인 데이터를 도시한다.
도 12a는 상이한 양으로 ORF1-mRNA 및 ORF2-FLAG-GFPai mRNA를 전기천공하였을 때 GFP의 발현(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있음)을 보여주는 예시적인 데이터를 도시한다. 배수 증가는 1x ORF2-GFPao 및 1x ORF1 mRNA에 상대적인 것이다.
도 12b는 도 11a에 도시된 mRNA의 전기천공 후 GFP+ 세포의 예시적인 형광 현미경관찰 영상을 보여준다.
도 13a는 유전자 전달을 위해 ORF1 및 ORF2 서열이 2개의 상이한 mRNA 분자에 있는 예시적인 mRNA 구축물(상부 패널) 및 단일 mRNA 분자 상에 ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는 LINE-1 mRNA 전사체(하부 패널)를 보여준다. mRNA는 3'에서 5'으로 3' UTR 내에 CMV-GFP 서열과 함께 바이시스트론 ORF1 및 ORF2 서열을 함유한다. 전달된 ORF2-cmv-GFP 안티센스(LINE-1 mRNA)의 역전위 시, 세포는 GFP를 발현할 것으로 예상된다.
도 13b는 도 13a에 도시된 구축물을 전기천공하였을 때 GFP의 발현(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있음)을 보여주는 예시적인 데이터를 도시한다.
도 14a는 다중 전기천공이 역전위 효율을 증가시키는지를 시험하기 위한 예시적인 실험 디자인을 보여준다. HEK293T 세포를 맥스사이트(Maxcyte) 시스템으로 48시간마다 전기천공하고 24시간 내지 72시간 동안 배양한 후 유동을 이용하여 GFP 양성 세포에 대해 평가하였다.
도 14b는 도 14a에 따라 1회 내지 5회 전기천공하였을 때 표시된 시간에서 GFP의 발현(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있음)을 보여주는 예시적인 데이터를 도시한다.
도 15a는 mRNA 전달을 통해 역전위를 향상시키는 예시적인 구축물을 도시한다. 한 구축물에서, 핵 국소화 신호(NLS) 서열은 ORF2 서열의 C 말단에 융합된다(ORF2-NLS 융합체). 한 구축물에서, 인간 ORF2 대신에 밍크 고래 ORF2 서열이 사용되었다. 한 구축물에서, Alu 요소의 최소 서열(AJL-H33델타)은 LINE-1 서열의 3' UTR에 삽입된다. 한 구축물에서, MS2 헤어핀은 LINE-1 서열의 3' UTR에 삽입되고, MS2 헤어핀 결합 단백질(MCP) 서열은 ORF2 서열에 융합된다.
도 15b는 도 15a에 도시된 구축물을 사용하여 GFP의 발현(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있음)을 보여주는 예시적인 데이터를 도시한다.
도 16a는 유전자 전달을 위해 ORF1 및 ORF2 서열이 2개의 상이한 플라스미드 분자에 있는 예시적인 플라스미드 구축물(상부 패널), 및 ORF1과 ORF2 사이의 ORF간 서열의 다양한 대체를 가진 단일 mRNA 분자 상에 ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는 LINE-1 mRNA 전사체를 코딩하는 플라스미드(하부 패널)를 보여준다.
도 16b는 도 16a에 도시된 구축물을 사용하여 GFP의 발현(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있음)을 보여주는 예시적인 데이터를 도시한다.
도 17a는 GFP 서열을 가진 단일 mRNA 분자 상에 ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는 LINE-1 mRNA 전사체를 코딩하는 예시적인 플라스미드 구축물(상부 패널), 및 GFP 서열을 가진 단일 mRNA 분자 상에 ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는 예시적인 LINE-1 mRNA 전사체를 도시한다.
도 17b는 도 17a에 도시된 구축물을 사용하여 Jurkat 세포에서 GFP의 발현(GFP 양성 세포의 평균 형광 강도의 배수 증가가 표시되어 있음)을 보여주는 예시적인 데이터를 도시한다. 플라스미드 구축물을 형질감염시켰고, mRNA 구축물을 전기천공하였다.
도 18a는 예시적인 플라스미드 디자인, 및 카고 핵산 서열을 가진 예상된 LINE-1 mRNA 전사체를 보여준다. 플라스미드는 (ORF1 및 ORF2 단백질 코딩 서열을 포함하는) LINE-1 서열, 및 재조합 키메라 융합 수용체 단백질(ATAK 수용체)을 코딩하는 핵산 서열인 카고 서열을 갖고, 그 뒤에 T2A 자가 절단 서열에 이어 분할 GFP 서열을 가진다(모두 LINE-1 서열에 대해 역방향으로 존재함). GFP의 코딩 서열은 인트론에 의해 불연속된다. 카고의 역전사 및 통합 후 예상된 mRNA가 도시되어 있다.
도 18b는 골수 세포주(THP-1)에서 도 10a에 나타낸 플라스미드에 의해 코딩된 mRNA 전사체의 성공적인 통합 및 모의 형질감염된 세포에 비해 ATAK-T2A-GFP의 발현을 보여주는 예시적인 결과를 보여준다(GFP 및 ATAK 이중 양성 세포의 배수 변화가 표시되어 있다). 데이터는 GFP 코딩 서열을 갖지 않은 모의 플라스미드에 의해 형질감염된 세포에 대해 정규화된, 형질감염 후 6일째 날 발현을 나타낸다.
도 19는 세포 동기화를 위한 예시적인 실험 설정을 보여준다. 외생성 핵산의 전달 전에 세포 주기 단계를 기반으로 이종 세포 집단을 분류한다. 세포 주기 동기화는 전달된 외생성 핵산의 더 높은 발현 및 안정화를 야기할 것으로 예상된다. 세포 분류 후 세포가 균질하지 않은 경우, 단계에서 세포 주기를 정지시키는 적합한 작용제와 함께 세포를 더 인큐베이션할 수 있다.
도 20은 DNA 복구 경로를 억제하거나 억제하지 않으면서 DNA 이중 가닥 절단을 유도함으로써, 예컨대, DNA 리가제(ligase) 억제제 SCR7을 유도하거나 숙주 감시 단백질을 억제함으로써, 예를 들면, HUSH 복합체 TASOR 단백질에 대한 miRNA를 사용함으로써 레트로트랜스포존 효율을 증가시키는 예시적인 방법을 보여준다.
도 21은 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 22는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 23은 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 24는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 25는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 26은 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 27은 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 28은 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
본 발명은 부분적으로, 세포 게놈 내로의 유전 카고(큰 유전 카고)의 전달 및 통합을 달성하도록 폴리뉴클레오타이드를 디자인하고 개발할 수 있다는 흥미로운 발견으로부터 비롯된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 (i) 안정한 발현을 위한 유전 물질, 및 (ii) 안전하고 효과적인 비-바이러스 수단으로 유전 물질을 세포 내로 안정적으로 통합시킬 수 있게 하는 자가 통합 게놈 통합 기구를 포함한다. 더욱이, 유전 물질은 리보좀 좌위 이외의 좌위에서 통합될 수 있고/있거나; 유전 물질은 부위 특이적으로 통합될 수 있고/있거나; 통합된 유전 물질은 세포의 천연 침묵 기구를 유발하지 않으면서 발현하는 것으로 보인다.
클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드롬 반복부(CRISPR)는 분자생물학 분야에 혁명을 일으켰고 강력한 유전자 편집으로도 개발되었다. 이것은 상동성 유도 복구(HDR)를 이용하고 게놈 부위로 향할 수 있다. CRISPR/Cas9는 천연 생성 RNA 가이딩 엔도뉴클레아제이다. CRISPR/Cas9 시스템은 부위 특이적 유전자 편집 및 기타 응용에 대한 큰 가능성을 입증하였지만, 이것이 특히 생체내 인간 유전자 요법에 사용되는 경우 그의 효능에 영향을 미치는 몇 가지 요인이 해결되어야 한다. 이 요인은 표적 DNA 부위 선택, sgRNA 디자인, 오프-표적 절단, HDR 대 NHEJ의 발생률/효율, Cas9 활성 및 전달 방법을 포함한다. 전달은 생체내 적용을 위한 CRISPR의 사용에 대한 주요 장애물로 남아 있다. 징크 핑거 뉴클레아제 ZFN은 Cys2-His2 징크 핑거 단백질(ZFP)과, FokI 엔도뉴클레아제로부터 유래한 비특이적 DNA 제한 효소의 융합 단백질이다. ZFP의 도전과제는 원하는 서열의 고친화성 결합을 위한 ZFP의 디자인 및 조작을 포함하고, 이것은 사소하지 않다. 또한, 모든 서열들이 ZFP 결합에 사용될 수 있는 것은 아니므로, 부위 선택이 제한된다. 또 다른 유의미한 도전과제는 오프-표적 절단이다. 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 TALE 및 FokI 뉴클레아제로 구성된 융합 단백질이다. 오프-표적 절단이 우려사항으로 남아 있지만, TALEN은 한 병렬 비교 연구에서 ZFN보다 더 특이적이고 더 적은 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, TALEN은 실질적으로 더 크고, TALEN만을 코딩하는 cDNA는 3 kb이다. 이것은 전달 비히클 카고 크기 제한으로 인해 한 쌍의 TALEN의 전달을 한 쌍의 ZFN보다 더 어렵게 만든다. 추가로, 일부 바이러스 벡터들에서 TALEN의 팩키징 및 전달은 TALEN 서열의 높은 반복 수준으로 인해 문제가 될 수 있다. 돌연변이체 Cas9 시스템인, 불활성 dCas9와 FokI 뉴클레아제 이량체의 융합 단백질은 특이성을 증가시키고 오프-표적 절단을 감소시키며, 잠재적 표적 부위의 수는 PAM 및 다른 sgRNA 디자인 제약으로 인해 더 낮다.
본 발명은 유전자 요법을 비롯한 요법을 동물 및 인간에게 제공하기 위해 트랜스포존 기반 벡터를 포함하는, 효과적이고 효율적인 신규 조성물을 제공함으로써 전술된 문제점들을 해결한다. 본 발명은 요법을 동물 및 인간에게 제공하기 위해 이 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 이 트랜스포존 기반 벡터는 투여 후 원하는 효과를 수용자에게 제공하는 데 유용한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 유전자 요법은 트랜스포존 기반 벡터를 이용하여 외생성 유전자와 같은 유전자를 동물 내로 도입하는 것을 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다. 이 유전자는 수용자에서 다양한 기능들, 예컨대, 핵산, 예를 들면, RNA의 제조를 위한 코딩, 또는 단백질 및 펩타이드의 제조를 위한 코딩에 기여할 수 있다. 본 발명은 관심 있는 유전자, 프로모터, 삽입 서열, 폴리 A 및 임의의 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 효율적인 혼입을 용이하게 할 수 있다. 본 발명은 인간 LINE-1 요소가 인간 세포뿐만 아니라 다른 동물 종의 세포에서도 역전위를 할 수 있고 세포의 게놈 내로의 유전 카고의 효율적인 전달 및 통합을 달성하기 위해 다양한 방식으로 조작될 수 있다는 발견에 기반한다. 이러한 LINE-1 요소는 유전 장애 및 암의 진단 및 치료에서의 용도를 포함하나 이것으로 제한되지 않는, 인간 및 동물 유전학에서 다양한 용도를 가진다. 본 발명의 LINE-1 요소는 다양한 질환들의 다양한 표현형 효과들의 치료에도 유용하다. 예를 들면, LINE-1 요소는 항-종양발생 유전자 생성물을 코딩하는 DNA를 암 세포 내로 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 LINE-1 요소의 다른 용도는 본 명세서를 읽을 때 숙련된 당업자에게 명확해질 것이다.
일반적으로, 인간 LINE-1 요소는 내부 프로모터를 가진 5' UTR, 2개의 비-중첩 리딩 프레임(ORF1 및 ORF2), 200 bp 3' UTR 및 3' 폴리 A 꼬리를 포함한다. LINE-1 레트로트랜스포존은 LINE-1 ORF2 N-말단에서 엔도뉴클레아제 도메인도 포함할 수 있다. LINE-1이 엔도뉴클레아제를 코딩한다는 발견은 상기 요소가 자율 역전위를 할 수 있음을 입증한다. LINE-1은 그의 역전사 및 통합을 매개하는 비-중첩 기능적 도메인을 함유하는 모듈식 단백질이다. 일부 실시양태에서, LINE-1 엔도뉴클레아제 그 자체의 서열 특이성은 변경될 수 있거나, LINE-1 엔도뉴클레아제는 또 다른 부위 특이적 엔도뉴클레아제로 대체될 수 있다.
LINE-1 레트로트랜스포존은 재조합 DNA 기술을 이용함으로써, 레트로트랜스포존이 상당한 길이(최대 1 kb, 또는 1 kb 초과)의 이종 또는 동종 DNA를 세포의 게놈 내로 삽입하는 데 적합해지게 만드는 다른 DNA 요소를 포함하고/하거나 이러한 DNA 요소와 인접하도록 조작될 수 있다. LINE-1 레트로트랜스포존은 동일한 유형의 기술을 이용함으로써, 세포의 게놈 내로의 DNA의 삽입이 부위 지정되도록(이러한 DNA가 삽입되는 부위는 알려져 있음) 조작될 수도 있다. 대안적으로, LINE-1 레트로트랜스포존은 DNA의 삽입 부위가 무작위이도록 조작될 수 있다. 레트로트랜스포존은 정상적으로 전사 침묵 상태인 DNA 영역 내로의 원하는 DNA 서열의 삽입을 달성하도록 조작될 수도 있고, 이때 DNA 서열은 세포에서 유전자의 정상적 발현을 파괴하지 않는 방식으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 통합 또는 역전위는 트랜스 배향으로 일어난다. 일부 실시양태에서, 통합 또는 역전위는 시스 배향으로 일어난다.
LINE-1이 인간 세포에 천연적으로 존재하기 때문에, 구축물이 인간 세포 내에 배치될 때, 이 구축물은 면역 시스템에 의해 외부 물질로서 거절되지 않아야 한다. 추가로, LINE-1 역통합의 기작은 유전자의 한 카피만이 임의의 특정 염색체 위치에서 통합되게 한다. 따라서, 시스템으로 구축된 카피 수 조절이 있다. 대조적으로, 통상의 플라스미드를 사용하는 유전자 전달 절차는 카피 수에 대한 조절을 거의 또는 전혀 제공하지 않고 종종 동일한 게놈 위치 내로 직렬로 통합된 DNA 분자의 복잡한 어레이를 초래한다.
모든 용어들은 당분야에서 숙련된 자에 의해 이해될 바와 같이 이해되어야 한다. 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 개시내용이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용된 단락 제목은 조직화 목적만을 위한 것이고 기재된 보호대상을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수형 용어도 포함하기 위한 것이다.
본원에서, 달리 언급되어 있지 않은 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "및/또는" 및 "이들의 임의의 조합" 및 이들의 문법적으로 동등한 용어는 교환 가능하게 사용될 수 있다. 이 용어들은 임의의 조합이 구체적으로 예상됨을 전달할 수 있다. 오로지 예시 목적으로, 하기 어구 "A, B 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이들의 임의의 조합"은 "개별적으로 A; 개별적으로 B; 개별적으로 C; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 및 A, B 및 C"를 의미할 수 있다. 문맥이 구체적으로 이접적 사용을 지칭하지 않은 한, 용어 "또는"은 결합적 또는 분리적으로 사용될 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 부분적으로 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 의해 좌우될, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내에 있음을 의미할 수 있다. 예를 들면, "약"은 당분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 한 자릿수 이내, 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내에 있음을 의미할 수 있다. 특정 값이 본원 및 청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 언급되어 있지 않은 한, 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내에 있음을 의미하는 용어 "약"이 가정되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"(및 임의의 형태의 포함하는, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하고"), "가진"(및 임의의 형태의 가진, 예컨대, "가진다" 및 "갖고"), "포괄하는"(및 임의의 형태의 포괄하는, 예컨대, "포괄한다" 및 "포괄하고") 또는 "함유하는"(및 임의의 형태의 함유하는, 예컨대, "함유한다" 및 "함유하고")은 포괄적이거나 개방형이고 언급되지 않은 추가 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태는 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대도 마찬가지일 것으로 예상된다. 더욱이, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 방법을 달성하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "일부 실시양태", "실시양태", "한 실시양태" 또는 "다른 실시양태"의 언급은 실시양태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 개시내용의 적어도 일부 실시양태에 포함되나, 반드시 모든 실시양태에 포함되는 것이 아님을 의미한다. 본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어들 및 어구들이 이하에 정의된다.
본 개시내용의 다양한 특징들이 단일 실시양태와 관련하여 기재될 수 있지만, 상기 특징들은 따로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수도 있다. 대조적으로, 본 개시내용이 명료성을 위해 별도의 실시양태와 관련하여 본원에 기재될 수 있지만, 본 개시내용은 단일 실시양태로 구현될 수도 있다.
본 개시내용의 적용은 세포에서의 외생성 핵산의 발현과 관련된 방법 및 조성물을 포괄하나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 핵산은 골수 세포와 같은 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 외생성 핵산의 안정한 통합은 게놈 내의 특정 표적에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 외생성 핵산은 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 핵산은 면역 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 코딩을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응 기능과 관련된 막횡단 수용체(예를 들면, 식세포 수용체 또는 합성 키메라 항원 수용체)를 코딩하는 핵산을 인간 대식세포 또는 수지상 세포 또는 적합한 골수 세포 또는 골수 전구체 세포 내로 안정적으로 혼입하는 방법 및 조성물을 제공한다. 외생성 핵산은 이 핵산이 내생적으로 세포에 이미 존재할 수 있는 서열을 포함하는지와 관계없이 원래 세포에 존재하지 않았고 세포의 외부로부터 첨가된 핵산을 지칭할 수 있다. 외생성 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 외생성 핵산은 전이 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 외생성 핵산은 재조합 단백질, 예컨대, 재조합 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩할 수 있다. 외생성 핵산은 세포 내부로 전달되는 외생성 핵산과 관련하여 "유전 카고"로서 지칭될 수 있다. 유전 카고는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 유전 물질은 일반적으로 화학적(CaCl2 매개 형질감염) 또는 물리적(전기천공) 또는 생물학적(예를 들면, 바이러스 감염 또는 형질도입) 수단을 이용함으로써 몇몇 상이한 공지된 기법들에 의해 생체외에서 세포 내부로 전달될 수 있다.
한 양태에서, 본원은 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 세포, 예를 들면, 골수 세포 내부로 전달하고 안정적으로 혼입하는 방법 및 조성물을 제공하는 것으로서, 이때 안정한 혼입은 비-바이러스 기작을 통해 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 내로의 핵산 조성물의 전달은 비-바이러스 기작을 통해 일어난다. 일부 실시양태에서, 핵산의 전달은 플라스미드 매개 전달을 우회할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "플라스미드"는 비-바이러스 발현 벡터, 예를 들면, 유전자 및/또는 유전자의 발현에 필요한 조절 요소를 코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "바이러스 벡터"는 또 다른 핵산을 세포 내로 수송할 수 있는 바이러스 유래 핵산을 지칭한다. 바이러스 벡터는 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 단백질들의 발현을 유도할 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원은 하나 이상의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 조성물을 골수 세포와 같은 세포의 내부로 전달하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 하나 이상의 핵산 서열은 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 mRNA가 전달된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 mRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드"는 염기-당-포스페이트 조합을 지칭한다. 뉴클레오타이드는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 합성 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 핵산 서열(예를 들면, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA))의 단량체 유닛일 수 있다. 용어 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 아데노신 트리포스페이트(ATP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 사이토신 트리포스페이트(CTP), 구아노신 트리포스페이트(GTP) 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 예컨대, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들면, [aS]dATP, 7-데아자-dGTP 및 7-데아자-dATP, 및 그 자신을 함유하는 핵산 분자에 뉴클레아제 내성을 부여하는 뉴클레오타이드 유도체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 뉴클레오타이드는 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(ddNTP) 및 이의 유도체를 지칭할 수 있다. 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 예시적인 예는 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP 및 ddTTP를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 뉴클레오타이드는 표지부착되지 않을 수 있거나 잘 공지되어 있는 기법에 의해 검출 가능하게 표지부착될 수 있다. 표지부착은 양자 점을 사용함으로써 수행될 수도 있다. 검출 가능한 표지는 예를 들면, 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 생체발광 표지 및 효소 표지를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 형광 표지는 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인(FAM), 2'7'-디메톡시-4'5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 로다민, 6-카르복시로다민(R6G), N,N,NcN'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 4-(4'디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 오레곤 그린(Oregon Green), 텍사스 레드(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 형광 표지부착된 뉴클레오타이드의 구체적인 예는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)(캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 입수될 수 있는 [R6G]dUTP, [TAMRA]dUTP, [R110]dCTP, [R6G]dCTP, [TAMRA]dCTP, [JOE]ddATP, [R6G]ddATP, [FAM]ddCTP, [R110]ddCTP, [TAN1RA]ddGTP, [ROX]ddTTP, [dR6G]ddATP, [dR110]ddCTP, [dTAMRA]ddGTP 및 [dROX]ddTTP; 아머샴(Amersham)(일리노이주 알링톤 하이츠 소재)으로부터 입수될 수 있는 플루오로링크(FluoroLink) 데옥시뉴클레오타이드, 플루오로링크 Cy3-dCTP, 플루오로링크 Cy5-dCTP, 플루오로링크 플루오르 X-dCTP, 플루오로링크 Cy3-dUTP 및 플루오로링크 Cy5-dUTP; 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)(인디애나주 인디애나폴리스 소재)으로부터 입수될 수 있는 플루오레세인-15-dATP, 플루오레세인-12-dUTP, 테트라메틸-로다민-6-dUTP, TR770-9-dATP, 플루오레세인-12-ddUTP, 플루오레세인-12-UTP 및 플루오레세인-15-2'-dATP; 및 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)(오레곤주 유진 소재)로부터 입수될 수 있는 염색체 표지부착된 뉴클레오타이드, BODIPY-FL-1 4-UTP, BODIPY-FL-4-UTP, BODIPY-TMR-14-UTP, BODIPY-TMR-14-dUTP, BODIPY-TR-14-UTP, BODIPY-TR-14-dUTP, 캐스케이드 블루-7-UTP, 캐스케이드 블루-7-dUTP, 플루오레세인-12-UTP, 플루오레세인-12-dUTP, 오레곤 그린 488-5-dUTP, 로다민 그린-5-UTP, 로다민 그린-5-dUTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, 텍사스 레드-5-UTP, 텍사스 레드-5-dUTP 및 텍사스 레드-12-dUTP를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 화학적 변형에 의해 표지부착될 수도 있거나 표식될 수도 있다. 화학적으로 변형된 단일 뉴클레오타이드는 바이오틴-dNTP일 수 있다. 바이오티닐화된 dNTP의 일부 비제한적 예는 바이오틴-dATP(예를 들면, 바이오-N6-ddATP, 바이오틴-14-dATP), 바이오틴-dCTP(예를 들면, 바이오틴-11-cICTP, 바이오틴-14-dCTP) 및 바이오틴-dUTP(예를 들면, 바이오틴-11-dUTP, 바이오틴-1.6-dUTP, 바이오틴-20-dUTP)를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 단일, 이중 또는 다중 가닥 형태로 존재하는, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드인 임의의 길이의 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 중합체 형태를 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오타이드는 세포에 대한 외생성 또는 내생성 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 무세포 환경에 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 이의 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되어 있거나 공지되어 있지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 유사체(예를 들면, 변경된 골격, 당 또는 핵염기)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드 또는 유사체의 일부 비제한적 예는 슈도우리딘, 5-브로모우라실, 5-메틸사이토신, 펩타이드 핵산, 제노(xeno) 핵산, 모르폴리노, 잠긴 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오타이드, 코르디셉핀(cordycepin), 7-데아자-GTP, 형광단(예를 들면, 당에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 티올 함유 뉴클레오타이드, 바이오틴 연결된 뉴클레오타이드, 형광 염기 유사체, CpG 섬, 메틸-7-구아노신, 메틸화된 뉴클레오타이드, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 퀴오신 및 와이오신을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 좌위들(좌위), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, eDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 무세포 DNA(cfDNA) 및 무세포 RNA(cfRNA)를 포함하는 무세포 폴리뉴클레오타이드, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 불연속될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 조성물은 인간 대식세포 또는 수지상 세포 또는 적합한 골수 세포 또는 골수 전구체 세포에서 면역 반응에 관여하는 막횡단 수용체(예를 들면, 식세포 수용체 또는 합성 키메라 항원 수용체)를 코딩하는 적어도 하나의 mRNA를 포함하는 하나 이상의 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 조성물은 하나 이상의 mRNA, 및 상기 핵산을 조혈 유래의 세포, 예컨대, 골수 세포 또는 골수 세포 전구체 세포 내로 전달하기 위한 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질은 리포좀 복합체를 형성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 조성물은 세포 내부로의 전달을 위해 사용될 수 있다. 세포는 하나 이상의 세포를 가진 임의의 유기체로부터 유래할 수 있다. 일부 비제한적 예는 원핵 세포, 진핵 세포, 세균 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물의 세포(예를 들면, 식물 작물, 과일, 채소, 곡물, 대두, 옥수수, 밀, 종자, 토마토, 쌀, 카사바, 사탕수수, 호박, 건초, 감자, 목화, 대마초, 담배, 개화 식물, 침엽수, 겉씨식물, 양치류, 석송, 붕어마름, 우산이끼, 이끼의 세포), 조류 세포(예를 들면, 보트리오코커스 브라우니이(Botryococcus braunii), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 사르가숨 파텐스 씨. 아가르드(Sargassum patens C. Agardh) 등), 해조류(예를 들면, 다시마), 진균 세포(예를 들면, 효모 세포, 버섯의 세포), 동물 세포, 무척추 동물(예를 들면, 초파리, 자포동물, 극피동물, 선충류 등)의 세포, 척추동물(예를 들면, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유동물)의 세포, 포유동물(예를 들면, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 래트, 마우스, 비인간 영장류, 인간 등)의 세포 등을 포함한다. 종종, 세포는 천연 유기체로부터 유래하지 않을 수 있다(예를 들면, 세포는 합성에 의해 제조될 수 있고, 이것은 종종 인공 세포로서 지칭된다). 일부 실시양태에서, 본원에서 언급된 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 유전 물질을 세포, 보다 구체적으로 인간 세포 내로 혼입하는 것에 관한 것으로서, 이때 인간 세포는 임의의 인간 세포일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 세포는 임의의 유래의 세포, 예를 들면, 체세포, 뉴런, 섬유모세포, 근육 세포, 상피 세포, 심장 세포 또는 조혈 세포일 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 외생성 핵산을 형질감염시키기 어려운 인간 세포 내로 혼입하는 데에도 적용될 수 있고 이러한 혼입에 유용하다. 상기 방법은 일단 적합한 외생성 핵산 구축물이 디자인되고 개발되면 단순하고 보편적으로 적용될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 생체외에서 외생성 핵산을 세포 내로 혼입하는 데 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 유기체에의 전신 투여에 적용될 수 있고, 이때 상기 조성물 중의 핵산 물질은 생체내에서 세포에 의해 흡수될 수 있고, 그 결과 생체내에서 세포 내로 혼입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 외생성 핵산을 인간 조혈 세포, 예를 들면, 조혈 유래의 인간 세포, 예컨대, 인간 골수 세포 또는 골수 세포 전구체 내로 혼입하는 것에 관한 것일 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 최소 변형을 가진 임의의 생물학적 세포에 사용될 수 있거나 이 세포에 사용되기에 적합하도록 만들어질 수 있다. 그러므로, 세포는 살아있는 유기체의 기본 구조적, 기능적 및/또는 생물학적 유닛인 임의의 세포를 지칭할 수 있다.
한 양태에서, 본원은 하나 이상의 핵산을 세포의 게놈 내로 안정적으로 혼입하기 위해 전위 요소를 사용하는 방법 및 조성물을 제공하는 것으로서, 이때 상기 세포는 조혈 세포의 구성원, 예를 들면, 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산은 면역 반응에서 역할을 하는 막횡단 수용체 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법 및 조성물은 하나 이상의 핵산 서열을 골수 세포 내로 혼입하기 위한 역전위 요소의 사용에 관한 것이다. 상기 핵산 조성물은 유전자와 같은 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 유전자는 전이 유전자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 RNA 전사체를 코딩하는 데 관여하는 핵산(예를 들면, DNA, 예컨대, 게놈 DNA 및 cDNA) 및 이의 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 게놈 DNA와 대하여 본원에서 사용된 용어는 조절 영역뿐만 아니라 개재 비코딩 영역도 포함하고 5' 및 3' 말단을 포함할 수 있다. 일부 용도에서, 상기 용어는 5' 및 3' 비번역 영역(5' UTR 및 3' UTR), 엑손 및 인트론을 포함하는 전사된 서열을 포괄한다. 일부 유전자에서, 전사된 영역은 폴리펩타이드를 코딩하는 "오픈 리딩 프레임"을 함유할 것이다. 상기 용어의 일부 용도에서, "유전자"는 폴리펩타이드를 코딩하는 데 필요한 코딩 서열(예를 들면, "오픈 리딩 프레임" 또는 "코딩 영역")만을 포함한다. 일부 경우, 유전자, 예를 들면, 리보좀 RNA 유전자(rRNA) 및 전달 RNA(tRNA) 유전자는 폴리펩타이드를 코딩하지 않는다. 일부 경우, 용어 "유전자"는 전사된 서열을 포함할 뿐만 아니라, 추가로 업스트림 및 다운스트림 조절 영역, 인핸서 및 프로모터를 포함하는 비-전사된 영역도 포함한다. 유전자는 유기체 게놈 내의 그의 천연 위치에 있는 "내생성 유전자" 또는 천연 유전자를 지칭할 수 있다. 유전자는 "외생성 유전자" 또는 비천연 유전자를 지칭할 수 있다. 비천연 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로 발견되지 않으나 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 지칭할 수 있다. 비천연 유전자는 유기체 게놈 내의 그의 천연 위치에 있지 않은 유전자도 지칭할 수 있다. 비천연 유전자는 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 천연 생성 핵산 또는 폴리펩타이드 서열(예를 들면, 비천연 서열)도 지칭할 수 있다.
용어 "전이 유전자"는 본원에서 종종 수용자 세포로서 불릴 수 있는 세포 내로 도입된 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 전이 유전자를 받은 후 생성된 세포는 형질전환 세포로서 지칭될 수 있다. 전이 유전자는 형질전환 유기체 또는 세포에 대한 부분적 또는 전체적 이종성을 가진(즉, 외래) 유전자를 포함할 수 있거나, 유기체 또는 세포의 내생성 유전자에 대한 동종 유전자를 나타낼 수 있다. 일부 경우, 전이 유전자는 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 유전자, 억제 폴리뉴클레오타이드로 전사되는 폴리뉴클레오타이드, 또는 전사되지 않는(예를 들면, 발현 조절 요소, 예컨대, 전사를 유도하는 프로모터를 결여하는) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩타이드는 일괄적으로 "유전자 생성물"로서 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 발현과 관련하여 "상향조절"은 야생형 상태에서 그의 발현 수준에 비해 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, mRNA와 같은 RNA) 및/또는 폴리펩타이드 서열의 증가된 발현 수준을 의미하는 반면, "하향조절"은 야생형 상태에서 그의 발현에 비해 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, mRNA와 같은 RNA) 및/또는 폴리펩타이드 서열의 감소된 발현 수준을 의미한다. 형질감염된 유전자의 발현은 세포에서 일시적 또는 안정적으로 일어날 수 있다. "일시적 발현" 동안, 형질감염된 유전자는 세포 분열 동안 딸세포에게 전달되지 않는다. 그의 발현이 형질감염된 세포로 제한되기 때문에, 유전자의 발현은 시간에 따라 상실된다. 대조적으로, 형질감염된 유전자의 안정한 발현은 유전자가 형질감염된 세포에 대한 선택 이점을 부여하는 또 다른 유전자와 공형질감염될 때 일어날 수 있다. 이러한 선택 이점은 세포에게 제공된 특정 독소에 대한 내성일 수 있다. 형질감염된 유전자가 발현될 것이 요구되는 경우, 본원은 코돈 최적화된 서열의 사용을 예상한다. 코돈 최적화된 서열의 일례는 진핵생물, 예를 들면, 인간(즉, 인간에서의 발현을 위해 최적화됨) 또는 또 다른 진핵생물, 동물 또는 포유동물에서의 발현을 위해 최적화된 서열일 수 있다. 인간 이외의 숙주 종을 위한 코돈 최적화 또는 특정 장기를 위한 코돈 최적화는 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 단백질을 코딩하는 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서 발현되도록 코돈 최적화될 수 있다. 진핵 세포는 인간, 또는 본원에서 논의된 비인간 진핵생물 또는 동물 또는 포유동물, 예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축 또는 비인간 포유동물 또는 영장류를 포함하나 이들로 제한되지 않는 특정 유기체, 예컨대, 식물 또는 포유동물의 세포일 수 있거나 이러한 유기체로부터 유래할 수 있다. 코돈 최적화는 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들면, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개 또는 50개 이상의 코돈)을 그 숙주 세포의 유전자에서 더 자주 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 있는 숙주 세포에서 발현을 향상시키도록 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종들은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체들 사이에 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계를 갖고, 이 번역 효율은 특히 번역되는 코돈의 성질과 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 의해 좌우되는 것으로 생각된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 자주 사용되는 코돈을 반영할 수 있다. 따라서, 코돈 최적화를 기반으로 주어진 유기체에서의 최적 유전자 발현을 위해 유전자를 다듬을 수 있다. 코돈 사용 표는 예를 들면, 웹사이트(www.kazusa.orjp/codon/)에서 이용될 수 있는 "코돈 사용 데이터베이스"에서 용이하게 이용될 수 있고, 이 표는 다수의 방식들에 의해 개조될 수 있다. 특정 숙주 세포에서 발현시키기 위해 특정 서열을 코돈 최적화하는 컴퓨터 알고리즘도 이용될 수 있고, 예컨대, Gene Forge(Aptagen; 펜실배니아주 자코부스 소재)도 이용될 수 있다.
본원에서 사용된 "멀티시스트론 전사체"는 하나 초과의 단백질 코딩 영역 또는 시스트론을 함유하는 mRNA 분자를 지칭한다. 2개의 코딩 영역을 포함하는 mRNA는 "바이시스트론 전사체"로서 표기된다. "5'-근위" 코딩 영역 또는 시스트론은 번역 시작 코돈(통상적으로 AUG)이 멀티시스트론 mRNA 분자의 5' 말단에 가장 가까운 코딩 영역이다. "5'-원위" 코딩 영역 또는 시스트론은 번역 시작 코돈(통상적으로 AUG)이 mRNA의 5' 말단에 가장 가까운 시작 코돈이 아닌 코딩 영역이다.
용어 "형질감염" 또는 "형질감염된"은 핵산이 비-바이러스 또는 바이러스 기반 방법에 의해 세포 내로 도입되는 것을 의미한다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 유전자 서열일 수 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88]을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "프로모터"는 세포에서 코딩 서열의 전사를 유도할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 구축물에 사용된 프로모터는 시스 작용 전사 조절 요소, 및 유전자의 전사 시간 및/또는 속도를 제어하거나 조절하는 데 관여하는 조절 서열을 포함한다. 예를 들면, 프로모터는 전사 조절에 관여하는 인핸서, 프로모터, 전사 터미네이터, 복제 기점, 염색체 통합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역, 또는 인트론 서열을 비롯한 시스 작용 전사 조절 요소일 수 있다. 이 시스 작용 서열은 전형적으로 단백질 또는 다른 생체분자와 상호작용하여 유전자 전사를 수행한다(켜기/끄기, 제어, 조절 등). "항시성 프로모터"는 거의 모든 조직 유형에서 전사를 시작할 수 있는 프로모터인 반면, "조직 특이적 프로모터"는 하나 또는 소수의 특정 조직 유형에서만 전사를 시작한다. "유도성 프로모터"는 특정 환경 조건, 발생 조건, 또는 약물 또는 화학적 조건 하에서만 전사를 시작하는 프로모터이다. 예시적인 유도성 프로모터는 독시사이클린 또는 테트라사이클린 유도성 프로모터일 수 있다. 테트라사이클린에 의해 조절되는 프로모터는 tet-on 및 tet-off 시스템으로서 지칭되는 테트라사이클린 유도성 또는 테트라사이클린 억제성 프로모터일 수 있다. tet에 의해 조절되는 시스템은 두 가지 구성요소, 즉 테트라사이클린에 의해 조절되는 조절제(트랜스활성화제로서도 지칭됨)(tTA 또는 rtTA) 및 테트라사이클린 의존적 방식으로 다운스트림 cDNA의 발현을 조절하는 tTA/rtTA 의존적 프로모터에 의존한다. tTA는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 Tn10 테트라사이클린 내성 오페론의 리프레서(repressor) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스의 단백질 16(VP16)의 카르복실 말단 부분을 함유하는 융합 단백질이다. tTA 의존적 프로모터는 tet 오퍼레이터(tetO) 서열(7개의 동족 오퍼레이터 서열의 어레이)에 융합된 최소 RNA 중합효소 II 프로모터로 구성된다. 이 융합은 진핵 세포에서 tet 리프레서를 강한 전사 활성화제로 전환시킨다. 테트라사이클린 또는 이의 유도체(예컨대, 독시사이클린)의 부재 하에서, tTA는 tetO 서열에 결합하여, tTA 의존적 프로모터의 전사 활성화를 허용한다. 그러나, 독시사이클린의 존재 하에서, tTA는 그의 표적과 상호작용할 수 없고 전사는 일어나지 않는다. tTA를 사용하는 tet 시스템은 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 전사 하향조절을 허용하기 때문에 tet-OFF로서 지칭된다. 대조적으로, tet-ON 시스템에서 rtTA로서 지칭되는 tTA의 돌연변이 형태는 무작위 돌연변이유발을 이용함으로써 단리되었다. tTA와 대조적으로, rtTA는 독시사이클린의 부재 하에서 작용하지 않으나, 트랜스활성화를 위해 리간드의 존재를 요구한다. 용어 "엑손"은 인접 서열을 성숙 mRNA 전사체에 기여하는 것으로 생물정보학적으로 예측되고/되거나 실험적으로 확인된, 게놈 DNA에서 발견된 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "인트론"은 발현된 단백질의 일부 또는 전부를 코딩하지 않는 것으로 생물정보학적으로 예측되고/되거나 실험적으로 확인되고 내생성 조건에서 RNA(예를 들면, 전구-mRNA) 분자로 전사되나, RNA가 단백질로 번역되기 전에 내생성 RNA(예를 들면, 전구-mRNA)로부터 스플라이싱되는, 게놈 DNA에 존재하는 서열을 의미한다.
용어 "스플라이스 수용자 부위"는 전구-mRNA의 스플라이싱 동안 수용자 부위인 것으로 생물정보학적으로 예측되고/되거나 실험적으로 확인된, 게놈 DNA에 존재하는 서열을 지칭하고, 확인된 천연 스플라이스 수용자 부위 및 인위적으로 유도된 또는 유도될 수 있는 스플라이스 수용자 부위, 및 미확인된 천연 스플라이스 수용자 부위 및 인위적으로 유도된 또는 유도될 수 있는 스플라이스 수용자 부위를 포함할 수 있다.
"내부 리보좀 진입 부위" 또는 "IRES"는 5' 말단/캡 독립적 번역 시작을 가능하게 함으로써, 단일 메신저 RNA(mRNA) 분자로부터 2개의 단백질을 발현시킬 가능성을 높이는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. IRES는 일반적으로 캡핑되지 않은 게놈을 가진 양성 가닥 RNA 바이러스의 5' UTR에 위치한다. 단일 mRNA 분자로부터 2개의 단백질을 발현시키는 또 다른 수단은 2A 펩타이드(유사) 서열을 그들의 코딩 서열 사이에 삽입하는 것이다. 2A 펩타이드(유사) 서열은 "리보좀 건너뛰기(skipping)", "정지-진행(stop-go)" 번역 및 "정지 계속(stop carry-on)" 번역으로서 다양하게 지칭되는 과정에 의한 1차 번역 생성물의 자가 처리를 매개한다. 2A 펩타이드(유사) 서열은 피코르나비리대(Picornaviridae), 플라비비리대(Flaviviridae), 테트라비리대(Tetraviridae), 디시스트로비리대(Dicistroviridae), 레오비리대(Reoviridae) 및 토티비리대(Totiviridae)를 포함하는 다양한 양성 및 이중 가닥 RNA 바이러스 군에 존재한다.
용어 "2A 펩타이드"는 진핵 세포에서 번역하는 동안 폴리펩타이드의 "절단"을 매개하는 18개 내지 22개 아미노산(AA) 길이의 바이러스 올리고펩타이드의 클래스를 지칭한다. "2A"라는 명칭은 바이러스 게놈의 특정 영역을 지칭하고 상이한 바이러스 2A들은 일반적으로 이들의 기원인 바이러스의 명칭을 따서 명명되었다. 최초로 발견된 2A는 F2A(구제역 바이러스)이고, 그 후 E2A(말 비염 A 바이러스), P2A(돼지 테스코바이러스(teschovirus)-1 2A), T2A(토세아 아시그나(thosea asigna) 바이러스 2A)도 확인되었다. 2A 매개 "자가 절단"의 기작은 2A 서열의 C-말단에서 글리실-프롤릴 펩타이드 결합의 형성을 건너뛰는 리보좀인 것으로 여겨진다. 2A 펩타이드(유사) 서열은 "리보좀 건너뛰기", "정지-진행" 번역 및 "정지 계속" 번역으로서 다양하게 지칭되는 과정에 의한 1차 번역 생성물의 자가 처리를 매개한다. 2A 펩타이드(유사) 서열은 피코르나비리대, 플라비비리대, 테트라비리대, 디시스트로비리대, 레오비리대 및 토티비리대를 포함하는 다양한 양성 및 이중 가닥 RNA 바이러스 군에 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 분절 또는 폴리펩타이드 분절과 같은 2개 이상의 분절 사이의 기능적 관계를 의미한다. 전형적으로, 이 용어는 전사 조절 서열과 전사된 서열의 기능적 관계를 의미한다.
용어 "종결 서열"은 숙주 세포의 중합효소에 의해 인식되고 전사를 종결시키는 핵산 서열을 의미한다. 종결 서열은 천연 또는 합성 유전자의 3' 말단에서 mRNA 전사의 종결 또는 업스트림 오픈 리딩 프레임의 mRNA 전사 및 리보좀 번역 둘 다를 제공하는 DNA 서열이다. 원핵생물 종결 서열은 통상적으로 AT 풍부 서열이 뒤따르는 2중 대칭을 가진 GC 풍부 영역을 포함한다. 통상적으로 사용되는 종결 서열은 T7 종결 서열이다. 박테리오파지 람다로부터 유래한 TINT3, TL13, TL2, TR1, TR2 및 T6S 종결 신호, 및 세균 유전자, 예컨대, 이. 콜라이의 trp 유전자로부터 유래한 종결 신호를 비롯한 다양한 종결 서열들이 당분야에 공지되어 있으며 본 발명의 핵산 구축물에 사용될 수 있다.
용어 "폴리아데닐화 서열"("폴리 A 부위" 또는 "폴리 A 서열"로서도 지칭됨)은 신생 RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화 둘 다를 유도하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리 A 꼬리를 결여한 전사체는 전형적으로 불안정하고 빠르게 분해되기 때문에, 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 발현 벡터에 사용되는 폴리 A 신호는 "이종" 또는 "내생성" 폴리 A 신호일 수 있다. 내생성 폴리 A 신호는 게놈에서 소정의 유전자의 코딩 영역의 3' 말단에서 천연적으로 발견되는 폴리 A 신호이다. 이종 폴리 A 신호는 한 유전자로부터 단리되고 또 다른 유전자, 예를 들면, 단백질에 대한 코딩 서열의 3'에 위치하는 폴리 A 신호이다. 통상적으로 사용되는 이종 폴리 A 신호는 SV40 폴리 A 신호이다. SV40 폴리 A 신호는 237 bp BamHI/BclI 제한 단편에 함유되고 종결 및 폴리아데닐화 둘 다를 유도하고; 다수의 벡터들이 SV40 폴리 A 신호를 함유한다. 또 다른 통상적으로 사용되는 이종 폴리 A 신호는 소 성장 호르몬(BGH) 유전자로부터 유래하고; BGH 폴리 A 신호는 다수의 상업적으로 입수 가능한 벡터들에서도 이용될 수 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 타이미딘 키나제(HSV tk) 유전자의 폴리 A 신호도 다수의 상업적 발현 벡터들에서 폴리 A 신호로서 사용된다. 폴리아데닐화 신호는 RNA를 세포 핵 내부로부터 세포질로 수송하는 것을 용이하게 할 뿐만 아니라 이러한 RNA의 세포 반감기를 증가시킨다. 폴리아데닐화 신호는 mRNA의 3' 말단에 존재한다.
본원에서 사용된 용어 "상보체", "상보체들", "상보적" 및 "상보성"은 소정의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 서열을 지칭한다. 일부 경우, 소정의 핵산과 하이브리드화된 서열은 예를 들면, A-T, A-U, G-C 및 G-U 염기쌍이 형성되도록 소정의 영역에 걸쳐 그의 염기 서열이 그의 결합 파트너의 염기 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 경우 소정의 분자의 "상보체" 또는 "역상보체"로서 지칭된다. 일반적으로, 제2 서열에 하이브리드화될 수 있는 제1 서열은 제2 서열에 특이적 또는 선택적으로 하이브리드화될 수 있으므로, 하이브리드화 반응 동안 제2 서열 또는 제2 서열 세트에의 하이브리드화는 비-표적 서열에의 하이브리드화보다 더 선호된다(예를 들면, 소정의 조건 세트, 예컨대, 당분야에서 통상적으로 사용되는 엄격한 조건 하에서 열역학적으로 더 안정하다). 전형적으로, 하이브리드화될 수 있는 서열들은 이들 각각의 길이의 전체 또는 일부에 걸쳐 어느 정도의 서열 상보성, 예컨대, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 서열 상보성을 포함하는 25% 내지 100% 상보성을 공유한다. 예컨대, 퍼센트 상보성을 평가하기 위한 서열 동일성은 니들만-분슈(Needleman-Wunsch) 알고리즘(예를 들면, 웹사이트(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/embossneedle/nucleotide.html)에서 이용될 수 있는 EMBOSS Needle 정렬기 참조), BLAST 알고리즘(예를 들면, 임의적으로 디폴트 설정을 가진, 웹사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 이용될 수 있는 BLAST 정렬 수단 참조), 또는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘(예를 들면, 임의적으로 디폴트 설정을 가진, 웹사이트( www.ebi.ac.ukaools/psa/emboss_water/nucleotide.html)에서 이용될 수 있는 EMBOSS Water 정렬기 참조)을 포함하나 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 포함하는, 선택된 알고리즘의 임의의 적합한 파라미터를 사용함으로써 평가될 수 있다.
상보성은 완벽하거나 실질적/충분할 수 있다. 두 핵산들 사이의 완벽한 상보성은 두 핵산들이 이중체의 모든 염기가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 페어링에 의해 상보적 염기에 결합되어 있는 이중체를 형성할 수 있음을 의미할 수 있다. 실질적 또는 충분한 상보성은 한 가닥의 서열이 반대 가닥의 서열에 완전히 및/또는 완벽하게 상보적이지 않으나, 두 가닥의 염기 사이에 충분한 결합이 일어나 하이브리드화 조건 세트(예를 들면, 염 농도 및 온도)에서 안정한 하이브리드 복합체를 형성함을 의미할 수 있다. 이러한 조건은 서열과 표준 수학적 계산을 이용하여 하이브리드화된 가닥의 용융 온도(Tm)를 예측함으로써 예측될 수 있거나, 관용적인 방법을 이용하여 Tm을 경험적으로 결정함으로써 예측될 수 있다.
본원에서 사용된 "트랜스포존"은 "점핑 유전자"로서도 공지되어 있는, 게놈 내에서 전위될 수 있는 염색체 내의 분절이다. 두 가지 상이한 클래스의 트랜스포존이 있다: RNA 중간체 및 "복사 및 붙여넣기" 기작을 통해 이동하는 클래스 1 또는 레트로트랜스포존, 및 절단 통합 또는 "절단 및 붙여넣기" 기작을 통해 이동하는 클래스 II 또는 DNA 트랜스포존(Ivics Nat Methods 2009). 세균, 하등 진핵생물(예를 들면, 효모) 및 무척추동물 트랜스포존은 대체로 종 특이적인 것으로 보이며, 척추동물 세포에서 DNA의 효율적인 전위를 위해 사용될 수 없다. "슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)"(Ivics Cell 1997)는 어류의 불활성 TE의 서열 셔플링에 의해 인위적으로 재구성된 첫 번째 활성 트랜스포존이었다. 이것은 인간 세포를 포함하는 척추동물 세포 내로의 전위에 의한 DNA 통합을 성공적으로 달성하는 것을 가능하게 만들었다. 슬리핑 뷰티는 트랜스포존의 Tcl/마리너(mariner) 패밀리에 속하는 클래스 II DNA 트랜스포존이다(Ni Genomics Proteomics 2008). 한편, 추가 기능적 트랜스포존은 드로소필라(Drosophila), 개구리 및 심지어 인간 게놈을 포함하는 상이한 종으로부터 확인되었거나 재구성되었고, 이들 모두가 척추동물 및 인간 숙주 세포 게놈 내로의 DNA 전위를 허용하는 것으로 밝혀졌다. 이들 트랜스포존 각각은 전위 효율, 발현의 안정성, 유전적 페이로드 용량 등과 관련된 장점 및 단점을 가진다. 생성된 예시적인 클래스 II 전위효소는 슬리핑 뷰티, PiggyBac, 프로그 프린스(Frog Prince), Himarl, 패스포트(Passport), 미노스(Minos), hAT, Toll, To12, AciDs, PIF, 하빙거(Harbinger), 하빙거3-DR 및 Hsmarl을 포함한다.
본원에서 사용된 "이종"은 분자가 삽입되는 세포에서 천연적으로 발견되지 않을 수 있는 DNA 및 RNA와 같은 분자를 포함한다. 예를 들면, 마우스 또는 세균 DNA가 인간 세포의 게놈 내로 삽입될 때, 이러한 DNA는 본원에서 이종 DNA로서 지칭된다. 대조적으로, 본원에서 사용된 용어 "동종"은 분자가 삽입되는 세포에서 천연적으로 발견되는 DNA 및 RNA와 같은 분자를 의미한다. 예를 들면, 마우스 DNA를 마우스 세포의 게놈 내로 삽입하는 것은 동종 DNA를 그 세포 내로 삽입하는 것을 구성한다. 후자의 경우, 동종 DNA는 그 자신이 천연적으로 발견되는 세포 게놈의 부위 내로 삽입될 필요가 없고; 오히려, 동종 DNA가 천연적으로 발견되는 부위 이외의 부위에서 삽입됨으로써, 삽입된 부위에서 유전적 변경(돌연변이)을 생성할 수 있다.
"전위효소"는 트랜스포존 말단 함유 조성물(예를 들면, 트랜스포존, 트랜스포존 말단)과 기능적 복합체를 형성할 수 있고 시험관내 트랜스포존 반응과 함께 인큐베이션되는 이중 가닥 DNA 내로의 트랜스포존 말단 함유 조성물의 삽입 또는 전위를 촉매작용하는 효소이다. 용어 "트랜스포존 말단"은 시험관내 전위 반응에서 작용하는 전위효소 또는 통합효소(integrase)와 복합체를 형성하는 데 필요한 뉴클레오타이드 서열("트랜스포존 말단 서열")을 함유하는 이중 가닥 DNA를 의미한다.
트랜스포존 말단은 트랜스포존 말단을 인식하고 이에 결합하는 전위효소 또는 통합효소와 복합체 또는 시냅스 복합체 또는 트랜스포존 복합체 또는 트랜스포존 조성물을 형성하고, 이 복합체는 트랜스포존 말단을 시험관내 전위 반응에서 그와 함께 인큐베이션되는 표적 DNA 내로 삽입할 수 있거나 전위할 수 있다. 트랜스포존 말단은 전달된 트랜스포존 말단 서열 또는 전달된 가닥 및 전달되지 않은 트랜스포존 말단 서열, 또는 전달되지 않은 가닥으로 구성된 2개의 상보적 서열을 나타낸다. 예를 들면, 시험관내 전위 반응에서 활성을 나타내는 과활성 Tn5 전위효소와 복합체를 형성하는 하나의 트랜스포존 말단은 전달된 트랜스포존 말단 서열 5' AGATGTGTATAAGAGACAG 3'(서열번호 51)을 나타내는 전달된 가닥, 및 "전달되지 않은 트랜스포존 말단 서열" 5' CTGTCTCTTATACACATCT 3'(서열번호 52)을 나타내는 전달되지 않은 가닥을 포함한다. 전달된 가닥의 3' 말단은 시험관내 전위 반응에서 표적 DNA에 연결되거나 전달된다. 전달된 트랜스포존 말단 서열에 상보적인 트랜스포존 말단 서열을 나타내는 전달되지 않은 가닥은 시험관내 전위 반응에서 표적 DNA에 연결되지 않거나 전달되지 않는다.
일부 실시양태에서, 전달된 가닥과 전달되지 않은 가닥은 공유결합된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 전달된 가닥 서열과 전달되지 않은 가닥 서열은 예를 들면, 헤어핀 구조로 단일 올리고뉴클레오타이드 상에 제공된다. 따라서, 전달되지 않은 가닥의 자유 말단은 전위 반응에 의해 직접적으로 표적 DNA에 연결되지 않지만, 전달되지 않은 가닥은 전달되지 않은 가닥이 헤어핀 구조의 루프에 의해 전달된 가닥에 연결되기 때문에 간접적으로 DNA 단편에 부착되게 된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "절단 도메인"은 민감한 핵산 서열을 의미한다.
"제한 부위 도메인"은 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 절단을 용이하게 하기 위한 서열을 나타내는 태그 도메인을 의미한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 제한 부위 도메인은 2개의 태그가 부착된 선형 ssDNA 단편을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 제한 부위 도메인은 이중 가닥 5' 말단이 주형 의존적 DNA 리가제(ligase)의 사용에 의해 또 다른 DNA 분자에 라이게이션될 수 있도록 태그 도메인에서 호환 가능한 이중 가닥 5' 말단을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 태그 내의 제한 부위 도메인은 존재한다 하더라도 표적 DNA에 거의 존재하지 않는 제한 부위(예를 들면, NotI 또는 AscI과 같은 희귀 절단 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위)의 서열을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 핵산 분자"는 재조합 DNA 분자 또는 재조합 RNA 분자를 지칭한다. 재조합 핵산 분자는 상이한 최초 공급원으로부터 유래하고 천연적으로 함께 부착되어 있지 않은 연결된 핵산 분자들을 함유하는 임의의 핵산 분자이다. 재조합 RNA 분자는 재조합 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자를 포함한다. 재조합 핵산은 실험실에서 합성될 수 있다. 재조합 핵산은 효소적 제한 분해, 라이게이션 및 DNA 클로닝과 같은 DNA의 효소적 변형을 이용함으로써 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA는 시험관내에서 전사되어 메신저 RNA(mRNA)를 생성할 수 있고, 재조합 mRNA는 단리 및 정제될 수 있고 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 핵산은 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 적합한 조건 하에서 재조합 핵산은 살아있는 세포 내로 혼입될 수 있고, 살아있는 세포 내부에서 발현될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산의 "발현"은 일반적으로 핵산의 전사 및/또는 번역을 의미한다. 핵산 발현의 생성물은 일반적으로 단백질이나, mRNA일 수도 있다. 재조합 핵산이 혼입된 세포에서 재조합 핵산에 의해 코딩된 mRNA의 검출은 상기 핵산이 상기 세포에서 "발현"된다는 긍정적인 증거로서 간주된다. 핵산을 세포 내로 삽입하거나 혼입하는 과정은 형질전환, 형질감염 또는 형질도입을 통해 이루어질 수 있다. 형질전환은 세균 세포에 의한 외래 핵산의 흡수 과정이다. 이 과정은 플라스미드 DNA의 증식, 단백질 생성 및 기타 적용을 위해 개조된다. 형질전환은 재조합 플라스미드 DNA를, 환경으로부터 세포외 DNA를 흡수하는 적격 세균 세포 내로 도입한다. 일부 세균 종은 특정 환경 조건 하에서 천연적으로 적격하나, 적격성은 실험실 환경에서 인위적으로 유도된다. 형질감염은 DNA, RNA 또는 항체와 같은 소분자를 진핵 세포 내로 강제 도입하는 것이다. 단지 삶을 혼란스럽게 만들기 위해, '형질감염'은 또한 세균 세포 내로의 박테리오파지의 도입을 의미한다. '형질도입'은 재조합 바이러스 벡터 입자를 표적 세포 내로 도입하는 것을 기술하는 데 주로 사용되는 반면, '감염'은 야생형 바이러스에 의한 인간 또는 동물의 천연 감염을 의미한다.
"줄기-루프(stem-loop)" 서열은 하이브리드화여, 루프로 돌출되는 비-상보성 영역과 줄기를 형성하기에 충분한 자가 상보성을 가진 핵산 서열(예를 들면, RNA 서열)을 지칭한다. 줄기는 불일치 또는 돌출부를 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 이종 핵산의 발현을 수송하거나 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 "벡터 서열"은 적어도 하나의 복제 기점 및 적어도 하나의 선택 마커 유전자를 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 그 자신에 작동 가능하게 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
플라스미드는 용어 "벡터"에 포함되는 속의 종이다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드"의 형태로 존재하고, 이 플라스미드는 그의 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않은 원형 이중 가닥 DNA 분자를 의미하고 전형적으로 코딩된 DNA의 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 독립체를 포함한다. 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 다른 발현 벡터는 플라스미드, 에피좀, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터를 포함하나 이들로 제한되지 않으며, 이러한 벡터는 숙주의 게놈 내로 통합될 수 있거나 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 동등한 기능을 제공하는, 당분야에서 숙련된 자에 의해 공지된 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 자가 복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있는 벡터도 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 벡터에 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현을 할 수 있는 벡터이다. 안전한 은신처 좌위는 추가 외생성 또는 이종 핵산 서열이 삽입될 수 있는 게놈 내의 영역이고, 숙주 게놈은 삽입된 유전 물질을 수용할 수 있다. 예시적인 안전한 은신처 부위는 AAVS1 부위, GGTA1 부위, CMAH 부위, B4GALNT2 부위, B2M 부위, ROSA26 부위, COLA1 부위 및 TIGRE 부위를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 개시내용에 기재된 이종 핵산은 세포의 게놈 내의 하나 이상의 부위에서 통합될 수 있고, 이때 하나 이상의 부위는 AAVS1 부위, GGTA1 부위, CMAH 부위, B4GALNT2 부위, B2M 부위, ROSA26 부위, COLA1 부위 및 TIGRE 부위로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자를 포함하는 핵산 카고는 R2D 좌위로 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전이 유전자를 포함하는 핵산 카고는 유전자간 또는 유전자내 영역의 게놈에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자를 포함하는 핵산 카고는 내생성 활성 유전자의 0.1 kb, 0.25 kb, 0.5 kb, 0.75 kb, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 7.5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 50 kb, 75 kb 또는 100 kb 내에서 게놈 5' 또는 3' 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자를 포함하는 핵산 카고는 내생성 프로모터 또는 인핸서의 0.1 kb, 0.25 kb, 0.5 kb, 0.75 kb, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 7.5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 50 kb, 75 kb 또는 100 kb 내에서 게놈 5' 또는 3' 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자를 포함하는 핵산 카고는 50 내지 50,000 염기쌍, 예를 들면, 50 내지 40,000 bp, 500 내지 30,000 bp, 500 내지 20,000 bp, 100 내지 15,000 bp, 500 내지 10,000 bp, 50 내지 10,000 bp, 50 내지 5,000 bp이다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자를 포함하는 핵산 카고는 길이가 1,000개, 1,300개, 1500개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개 또는 7,500개 뉴클레오타이드 미만이다.
L1 레트로트랜스포존 시스템 및 비-L1 레트로트랜스포존 시스템
레트로트랜스포존은 그가 존재하는 게놈을 재구성하는 데 있어서 능동적으로 참여하는 전위 요소를 함유할 수 있다. 광범위하게, 레트로트랜스포존은 RNA로 전사되고 단백질로 번역되고 그 자신을 DNA로 다시 역전사하는 능력을 가진 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 인간 게놈의 대략 45%는 전위 이벤트로부터 비롯된 서열로 구성된다. 역전위는 종종 표적 부위 결실을 생성하거나 5'- 및 3'-형질도입으로서 지칭되는 과정으로 비-레트로트랜스포존 DNA를 게놈에 추가한다. 비-동종 레트로트랜스포존 사이의 재조합은 유전자 서열의 결실, 중복 또는 재배열을 야기한다. 지속적인 역전위는 신규 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 신호 및 프로모터를 생성할 수 있으므로, 새로운 전사 모듈을 구축한다.
일반적으로, 레트로트랜스포존은 두 클래스, 즉 레트로바이러스 유사 LTR 레트로트랜스포존과, 비-LTR 요소, 예컨대, 인간 L1 요소, 뉴로스포라(Neurospora) TAD 요소(Kinsey, 1990, Genetics 126:317-326), 드로소필라의 I 인자(Bucheton et al., 1984, Cell 38:153-163) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 R2Bm(Luan et al., 1993, Cell 72: 595-605)으로 분류될 수 있다. 이 두 가지 유형의 레트로트랜스포존은 구조적으로 상이하고 근본적으로 상이한 기작을 이용하여 역전위한다. LINE-코딩된 폴리펩타이드의 예시적인 비제한적 예는 진뱅크(GenBank) 수납번호 AAC51261, AAC51261, AAC51263, AAC51264, AAC51265, AAC51266, AAC51267, AAC51268, AAC51269, AAC51270, AAC51271, AAC51272, AAC51273, AAC51274, AAC51275, AAC51276, AAC51277, AAC51278 및 AAC51279에서 발견된다.
여러 가지 이유로 본 개시내용에 기재된 시스템으로 개발하기 위해 LINE-1에 초점을 맞추기로 결정하였고, 이 이유 중 적어도 일부는 이하에 예시되어 있다: (a) LINE-1(또는 L1-) 요소는 이 역전사 및 통합 과정을 완료하기 위해 단독으로 기구의 전부를 코딩하기 때문에 자율적이고; (b) L1 요소는 이 요소가 게놈의 천연화된 요소로서 간주될 수 있을 정도로 인간 게놈에 풍부하고; (c) L1 레트로트랜스포존은 세포에서 주변을 떠다니는 다른 mRNA에 비해 고도의 특이성으로 그 자신의 mRNA를 역전위한다.
L1은 필수적이나 불확실한 기능의 40 kDa 오픈 리딩 프레임-1 RNA 결합 단백질(ORF1p), 및 엔도뉴클레아제 및 역전사효소(RT) 활성을 가진 150 kDa ORF2 단백질을 코딩하는 6 kb 바이시스트론 RNA를 발현한다. L1 역전위는 통합 부위에서 L1의 전사, 세포질로의 그의 RNA의 수송, 바이시스트론 RNA의 번역, 리보핵단백질(RNP) 입자의 형성, 핵으로의 그의 재이입 및 표적 프라이밍 역전사를 수반하는 복잡한 과정이다. L1과 상호작용하는 몇몇 전사 인자가 확인되었다. 전사된 L1 RNA는 전사체로부터 번역된 단백질과 시스로 RNP를 형성한다. L1은 5'-TTTT-3'에서 ORF2p 절단에 의한 표적 부위 프라이머 역전사(TPRT)에 의해 게놈 DNA 내로 통합되고, 이때 L1 RNA의 폴리 A 서열은 어닐링되고 역전사효소(RT) 활성을 프라이밍하여 L1 cDNA를 만든다.
게놈의 다른 이동 요소는 역전위를 위해 L1 ORF를 "하이재킹"할 수 있다. 예를 들면, Alu 요소는 비-자율적 레트로트랜스포존이고 통합을 위해 트랜스 인자를 획득하는 짧은 산재된 요소(SINE)의 클래스에 속하는 이동 DNA 요소이다. Alu 요소 및 SINE-1 요소는 ORF1p 및 ORF2p에 의해 역전위되기 위해 트랜스로 L1 리보핵단백질과 회합할 수 있다. L1 RNA와 다소 유사하게, Alu 요소는 종종 A-꼬리로서도 지칭되는 긴 A-런(run)으로 끝나고, 분기된 이량체 구조의 두 절반을 분리하는 더 작은 A 풍부 영역(AA로 표시)도 가진다. Alu 요소는 RNA 중합효소 III 프로모터(예컨대, 통상적으로 A 박스 및 B 박스 프로모터로서 명명됨)의 내부 구성요소를 가질 가능성이 높으나, RNA 중합효소 III에 대한 터미네이터를 코딩하지 않는다. 이들은 전사를 종결하기 위해 Alu 요소의 다운스크림에서 다양한 거리에 있는 T 뉴클레오타이드의 스트레치를 사용할 수 있다. 전형적인 Alu 전사체는 A-꼬리를 포함하는 전체 Alu를 포함하고, 각각의 좌위에 대해 고유한 3' 영역을 가진다. Alu RNA는 각각의 단량체 유닛에 대해 별도의 구조로 접힌다. RNA는 7SL RNA SRP9 및 14 이종이량체뿐만 아니라 폴리 A 결합 단백질(PABP)에도 결합하는 것으로 밝혀졌다. Alu의 폴리 A 꼬리는 게놈의 T 풍부(TTTT) 영역으로 프라이밍하고 ORF2p를 끌어당겨 프라이밍된 영역에 결합하고 그의 엔도뉴클레아제 활성을 통해 T 풍부 영역에서 절단한다. T 풍부 영역은 Alu 요소의 3' A-꼬리 영역에서 ORF2p로 역전사를 프라이밍한다. 이것은 Alu 요소 본체의 cDNA 카피를 생성한다. 닉(nick)은 제2 가닥에서 비공지된 기작에 의해 일어나고 제2 가닥 합성은 프라이밍된다. 그 다음, 새로운 Alu 요소는 제1 닉과 제2 닉 사이의 DNA 서열의 중복체인 짧은 직접 반복부에 의해 플랭킹된다. Alu 요소는 유전자 풍부 영역을 선호하기 때문에 RNA 분자 내에서 매우 널리 퍼져 있다. 전체 길이 Alu(약 300 bp)는 신호 인식 입자 RNA 7SL로부터 유래하고, A 풍부 링커가 중간에 위치된 2개의 유사한 단량체, 5' 단량체에 존재하는 A 박스 및 B 박스, 및 앞서는 폴리아데닐화 신호를 결여하여 연장된 꼬리(길이가 최대 100 bp)를 야기하는 폴리 A 꼬리로 구성된다. Alu는 A 박스 및 B 박스 내의 내부 프로모터를 사용함으로써 RNA 중합효소 III에 의해 전사될 수 있으나; Alu는 ORF를 함유하지 않으므로 단백질 생성물을 코딩하지 않는다.
다른 비-L1 트랜스포존은 SVA 및 HERV-K를 포함한다. 전체 길이 SVA(SINE-VNTR-Alu) 요소(약 2 내지 3 kb)는 CCCTCT 반복부, 2개의 Alu 유사 서열, VNTR, env(외피) 유전자를 가진 SINE-R 영역, HERV-K10의 3' LTR, 및 폴리 A 꼬리가 뒤따르는 폴리아데닐화 신호를 함유하는 복합 유닛이다. SVA 요소가 내부 프로모터를 운반하는지 여부는 공지되어 있지 않지만 SVA가 RNA 중합효소 II에 의해 전사될 가능성은 가장 높다.
전체 길이 HERV-K 요소(약 9 내지 10 kb)는 내생성 레트로바이러스 서열의 고대 잔해물로 구성되며 3개의 레트로바이러스 ORF를 둘러싸는 2개의 플랭킹 LTR 영역을 포함한다: (1) 레트로바이러스 캡시드의 구조 단백질을 코딩하는 gag; (2) 효소를 코딩하는 pol-pro: 프로테아제, RT 및 통합효소; 및 (3) 수평 전달을 허용하는 단백질을 코딩하는 env. HERV-K의 LTR은 RNA 중합효소 II의 전사 조절 하에 있는 것으로 보이는 내부 양방향 프로모터를 함유한다.
L1 역전위 및 RNA 결합은 폴리 A 꼬리에서 또는 이 근처에서 일어날 수 있다. 3' UTR은 ORF1 단백질(ORF1p)의 엄격한 유형의 LINE RNA를 인식하는 역할을 한다. 엄격한 유형의 LINE은 3' UTR의 말단에 위치한 줄기-루프 구조를 함유할 수 있다. 트랜스포존 3' 말단 cDNA와 표적 DNA 사이의 연접, 및 ORF2 단백질(ORF2p) 내에서의 L1 RNA의 특이적 위치선정으로 구성된 분지된 분자는 시험관내에서 L1 역전위의 초기 단계 동안 검출되었다. L1과 Alu가 공유하는 2차 또는 3차 RNA 구조는 아마도 폴리 A 꼬리와 함께 ORF2의 인식 및 결합을 담당할 가능성이 높다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열의 다운스트림에 위치한 줄기-루프 구조는 절단 강도와 상관관계를 가진다.
L1 통합을 제한하거나 해소하는 기작도 게놈의 유전적 무결성 및 안정성을 유지하기 위해 진화되었다. XRCC1, Ku70 및 DNA-PK와 같은 비-동종 말단 연결 복구 단백질은 삽입 시 L1 통합의 해소에 관여한다. 또한, 세포는 APOBEC3 패밀리의 사이토신 데아미나제, 아데노신 데아미나제 ADAR1, 염색질 재모델링 인자, 및 남성 생식세포주에서 작용하는 전사 후 유전자 침묵을 위한 piRNA 경로의 구성원을 포함하는, 제한되지 않은 역전위에 저항하는 다수의 단백질들을 진화시켰다.
I. 코딩된 단백질의 안정한 발현을 위해 핵산 구축물을 포함하는 조성물 및 관련된 방법
본원은 골수 세포와 같은 세포에서 발현될 하나 이상의 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 재조합 핵산은 재조합 핵산에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 안정한 발현은 세포의 게놈 내로의 재조합 핵산의 혼입에 의해 달성된다.
당분야에서 숙련된 자는 본원에 기재된 조성물 및 방법이 생성물을 디자인하는 데 이용될 수 있고, 이때 재조합 핵산이 단백질 또는 폴리펩타이드 성분으로서 번역되지 않는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있으나, 조절 핵산, 예컨대, 억제제 올리고뉴클레오타이드 생성물, 예컨대, 활성화제 올리고뉴클레오타이드일 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 코딩할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있다.
한 양태에서, 본원은 관심 있는 유전자를 코딩하는 핵산 서열, 및 비-내생성 핵산을 세포 내로 안정적으로 혼입하는 하나 이상의 역전위 요소를 포함하는 합성 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 미분화된다. 일부 실시양태에서, 세포는 추가 분화력을 가진다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포가 아니다.
A. LINE/Alu 레트로트랜스포존 구축물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 역전위 시스템을 이용하여 비-내생성 핵산을 게놈 내로 안정적으로 혼입하고 발현시킬 수 있고, 이때 상기 비-내생성 핵산은 핵산 서열 내에 역전위 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포의 내생성 역전위 시스템(예를 들면, 단백질 및 효소)을 이용하여, 세포에서 비-내생성 핵산을 안정적으로 발현시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포의 내생성 역전위 시스템(예를 들면, 단백질 및 효소, 예컨대, LINE1 역전위 시스템)을 이용할 수 있으나, 세포에서 비-내생성 핵산을 안정적으로 발현시키기 위해 역전위 시스템의 하나 이상의 성분을 추가로 발현시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 전이 유전자를 코딩하고 역전위를 위한 하나 이상의 성분을 코딩하는 합성 핵산을 제공한다. 본원에 기재된 합성 핵산은 핵산 구축물, 전이 유전자 또는 외생성 핵산으로서 교환 가능하게 지칭된다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 외생성 서열, 또는 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고, 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF 단백질에 대한 결합 부위를 포함하고, 삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF2p에 대한 결합 부위를 포함한다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 면역 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 (i) 외생성 서열 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고, 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제 결합 부위 및/또는 역전사효소 결합 부위를 포함하고, 전이 유전자 서열은 면역 세포의 게놈 내로 통합된다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 (i) 외생성 서열 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; 5' UTR 서열, 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 인간 레트로트랜스포존의 서열, 및 인간 레트로트랜스포존의 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고, 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제 결합 부위 및/또는 역전사효소 결합 부위를 포함하고, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역되는 2개의 단백질을 코딩하고, 삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 ORF2p 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF2p 결합 부위는 3' UTR 서열 내의 폴리 A 서열이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 인간 레트로트랜스포존의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 5' UTR 서열의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 3' UTR 서열의 업스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역되는 2개의 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 2개의 ORF는 비-중첩 ORF이다. 일부 실시양태에서, 2개의 ORF는 ORF1 및 ORF2이다. 일부 실시양태에서, ORF1은 ORF1p를 코딩하고, ORF2는 ORF2p를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 비-LTR 레트로트랜스포존의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 LINE-1 레트로트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, LINE-1 레트로트랜스포존은 인간 LINE-1 레트로트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소는 ORF2p이다. 일부 실시양태에서, 역전사효소는 II군 인트론 역전사효소 도메인이다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소는 밍크 고래 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 ORF2p를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 ORF2p의 엔도뉴클레아제 도메인의 특이성을 이용함으로써 폴리 T 부위에서 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 폴리 T 부위는 서열 TTTTTA를 포함한다.
일부 실시양태에서, (i) 인간 레트로트랜스포존의 서열은 ORF1p를 코딩하는 서열을 포함하거나, (ii) mRNA는 ORF1p를 코딩하는 서열을 포함하지 않거나, (iii) mRNA는 상보체 유전자의 5' UTR 서열에 의한 ORF1p를 코딩하는 서열의 대체를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 ORF1p를 코딩하는 제1 mRNA 분자, 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 mRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 ORF1p를 코딩하는 제1 서열, 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열을 포함하는 mRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열과 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 링커 서열에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 링커 서열은 내부 리보좀 진입 서열(IRES)을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRES는 CVB3 또는 EV71의 IRES이다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 자가 절단 펩타이드 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 T2A, E2A 또는 P2A 서열을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 추가 단백질 서열에 융합된 ORF1p를 코딩하는 서열 및/또는 추가 단백질 서열에 융합된 ORF2p를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF1p 및/또는 ORF2p는 핵 체류 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 핵 체류 서열은 Alu 서열이다. 일부 실시양태에서, ORF1p 및/또는 ORF2p는 MS2 코트 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 적어도 1개, 2개, 3개 이상의 MS2 헤어핀 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 mRNA의 폴리 A 꼬리와 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 상호작용을 촉진하거나 향상시키는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 폴리 A 결합 단백질(PABP)과 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 상호작용을 촉진하거나 향상시키는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 상기 mRNA에 대한 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 특이성을 세포에 의해 발현된 또 다른 mRNA에 비해 증가시키는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 Alu 요소 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 동일한 프로모터를 가진다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 ORF1p를 코딩하는 제1 서열의 프로모터와 상이한 프로모터를 가진다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열의 프로모터와 상이한 프로모터를 가진다. 일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및/또는 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 유도성 프로모터, CMV 프로모터 또는 전사 시작 부위, T7 프로모터 또는 전사 시작 부위, EF1a 프로모터 또는 전사 시작 부위 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터 또는 전사 시작 부위를 가진다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유도성 프로모터, CMV 프로모터 또는 전사 시작 부위, T7 프로모터 또는 전사 시작 부위, EF1a 프로모터 또는 전사 시작 부위 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터 또는 전사 시작 부위를 가진다.
일부 실시양태에서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 인간 세포에서 발현되도록 코돈 최적화된다.
일부 실시양태에서, mRNA는 WPRE 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 선택 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 친화성 태그를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태에서, 3' UTR은 폴리 A 서열을 포함하거나, 폴리 A 서열은 시험관내에서 mRNA에 추가된다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 폴리 A 서열의 업스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 3' UTR 서열은 삽입체 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체인 서열의 업스트림에 있는 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 리보좀 좌위가 아닌 좌위에서 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유전자 또는 유전자의 조절 영역 내로 통합됨으로써, 유전자를 파괴하거나 유전자의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유전자 또는 유전자의 조절 영역 내로 통합됨으로써, 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈 내로 통합되고 유전자를 대체한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈 내로 역전위된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 mRNA에 의해 코딩된 엔도뉴클레아제에 의한 표적 부위의 DNA 가닥의 절단에 의해 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 표적 프라이밍 역전사(TPRT)를 통해 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 게놈의 DNA 표적 부위 내로의 mRNA의 역스플라이싱을 통해 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 수지상 전구체 세포 및 대식세포 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, mRNA는 자가 통합 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 방법은 mRNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체외에서 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 인간 대상체에게 투여하는 단계도 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 인간 대상체에서 유발되지 않는다. 일부 실시양태에서, mRNA 또는 벡터는 실질적으로 면역원성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비-LTR 레트로트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 인간 L1 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존 ORF1 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존 ORF2 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존을 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 적어도 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 킬로베이스이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 최대 약 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5 킬로베이스이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 엑소뉴클레아제 또는 RNAse에 의한 mRNA의 분해를 억제하거나 방지한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 G 사중체, 슈도노트 또는 삼중체 서열이다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 플라비바이러스 RNA의 엑소리보뉴클레아제 내성 RNA 구조 또는 KSV의 ENE 요소이다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 데아데닐라제에 의한 mRNA의 분해를 억제하거나 방지한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 mRNA의 폴리 A 꼬리의 내부 또는 말단에서 비-아데노신 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 mRNA의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열과 인 프레임으로 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열과 인 프레임으로 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 인트론을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 효소, 수용체, 수송 단백질, 구조 단백질, 호르몬, 항체, 수축성 단백질 및 저장 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 리간드, 항체, 수용체 및 효소로 구성된 군으로부터 선택된 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 시스 작용 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 인핸서, 사일런서, 프로모터 또는 반응 요소로 구성된 군으로부터 선택된 시스 작용 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 트랜스 작용 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 전사 인자를 코딩하는 트랜스 작용 조절 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 삽입체 서열의 통합은 세포 건강에 불리한 영향을 미치지 않는다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제, 역전사효소 또는 이들 둘 다는 삽입체 서열을 부위 특이적으로 통합시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, mRNA는 추가 뉴클레아제 도메인 또는 ORF2로부터 유래하지 않은 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 megaTAL 뉴클레아제 도메인, TALEN 도메인, Cas9 도메인, R2 역요소의 징크 핑거 결합 도메인, 또는 AAV의 Rep78과 같은 반복 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 돌연변이를 갖지 않은 엔도뉴클레아제에 비해 엔도뉴클레아제의 활성을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 ORF2p 엔도뉴클레아제이고, 돌연변이는 S228P이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 역전사효소의 신뢰도 및/또는 진행성을 증가시키는 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역전사효소는 ORF2 이외의 역요소의 역전사효소, 또는 ORF2p의 역전사효소에 비해 더 높은 신뢰도 및/또는 진행성을 가진 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, 역전사효소는 II군 인트론 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, II군 인트론 역전사효소는 IIA군 인트론 역전사효소, IIB군 인트론 역전사효소 또는 IIC군 인트론 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, II군 인트론 역전사효소는 TGIRT-II 또는 TGIRT-III이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 Alu 요소 및/또는 리보좀 결합 앱타머를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' UTR 서열은 바이러스 3' UTR 또는 베타-글로빈 3' UTR로부터 유래한다.
한 양태에서, 본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 인간 LINE-1 트랜스포존 5' UTR 서열, 인간 LINE-1 트랜스포존 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는, ORF1p를 코딩하는 서열, ORF1p를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있는 ORF간 링커 서열, ORF간 링커 서열의 다운스트림에 있는, ORF2p를 코딩하는 서열, 및 ORF2p를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있는, 인간 LINE-1 트랜스포존으로부터 유래한 3' UTR 서열을 포함하는 인간 LINE-1 트랜스포존 서열을 포함하고; 이때 3' UTR 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체 또는 외생성 조절 요소를 코딩하는 서열의 역상보체인 삽입체 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 세포 내로 도입될 때 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 병태 또는 질환과 관련된 유전자 내로 통합됨으로써, 상기 유전자를 파괴하거나 상기 유전자의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 유전자 내로 통합됨으로써, 상기 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 재조합 mRNA 또는 이 mRNA를 코딩하는 벡터는 단리되거나 정제된다.
한 양태에서, 본원은 (a) 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p를 포함하는 긴 산재된 핵 요소(LINE) 폴리펩타이드; 및 (b) 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체 또는 외생성 조절 요소를 코딩하는 서열의 역상보체인 삽입체 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공하는 것으로서, 이때 상기 조성물은 실질적으로 면역원성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 핵산과 복합체를 형성한 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다.
한 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 수지상 전구체 세포 및 대식세포 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체이고, 외생성 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
한 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 유전자 요법에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 한 양태에서, 본원은 본원에 기재된 약학 조성물을, 질환 또는 병태를 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 단백질 또는 기능적 RNA의 양 또는 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 단백질 또는 기능적 RNA의 결핍된 양 또는 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 기능적 RNA의 결핍된 양 또는 활성은 상기 질환 또는 병태와 관련되어 있거나 이러한 질환 또는 병태를 야기한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제, FAM208A를 억제하는 작용제, 또는 TRIM28을 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제는 페리필린, TASOR 및/또는 MPP8을 억제하는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제는 HUSH 복합체의 어셈블리를 억제한다.
일부 실시양태에서, 상기 작용제는 판코니 빈혈 복합체를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 FANCD2-FANC1 이종이량체 모노유비퀴틴화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 FANCD2-FANC1 이종이량체 형성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 판코니 빈혈(FA) 코어 복합체를 억제한다. FA 코어 복합체는 예를 들면, 화학요법에 의해 유도된 DNA 가닥간 가교결합에서 판코니 빈혈 DNA 손상 복구 경로의 성분이다. FA 코어 복합체는 RING 핑거 서브유닛인 FANCL의 두 카피에 의해 플랭킹된, FANCB의 2개 중심 이량체 및 100 kDa 서브유닛의 FA 관련 단백질(FAAP100)을 포함한다. 이 2개의 이종삼량체는 남은 5개의 서브유닛들을 어셈블링하기 위한 스캐폴드로서 작용하여, 연장된 비대칭 구조를 생성한다. 이 스캐폴드의 불안정화는 전체 복합체를 파괴하여, 비-기능적 FA 경로를 야기할 것이다. FA 코어 복합체를 억제할 수 있는 작용제의 예는 보르테조밉 및 쿠르쿠민 유사체 EF24 및 4H-TTD를 포함한다.
일부 실시양태에서, 삽입되는 서열은 조직 특이적 요소가 활성을 나타내는 세포에서만 전체 삽입된 DNA가 작용하도록 조직 특이적 요소의 조절 하에 놓일 수 있다.
한 양태에서, 본원은 세포의 게놈 내로의 이종 핵산 서열의 역전위를 야기하는 서열에 의해 플랭킹된 관심 있는 이종 핵산 또는 유전자(예를 들면, 전이 유전자, 조절 서열, 예를 들면, 억제 핵산에 대한 서열, siRNA, miRNA)를 세포 내로 도입함으로써 유전자를 세포에게 안정적으로 전달하는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 본 명세서에서 설명하기 위해 삽입체로서 지칭되고, 이때 삽입체는 본원에 기재된 구축물의 의도된 디자인에 의해 역전사되고 세포의 게놈 내로 삽입될 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 본 명세서에서 설명하기 위해 카고 또는 카고 서열로서도 지칭된다. 카고는 게놈 내로 삽입되는 이종 핵산의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 상피, 중피 또는 내피 유래의 포유동물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 말기 분화된 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 근육 세포, 심장 세포, 상피 세포, 조혈 세포, 점액 세포, 표피 세포, 편평 세포, 연골 세포, 골 세포, 또는 포유동물 유래의 임의의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 계통의 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수 계통의 세포 또는 식세포, 예를 들면, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 골수 전구체 세포이다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자를 코딩하는 핵산은 mRNA이다.
일부 실시양태에서, 역전위 요소는 비-LTR 레트로트랜스포존으로부터 유래할 수 있다.
본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 삽입체 서열을 포함하고, 삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 삽입체 서열은 (i) 외생성 서열 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열; 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고; 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF 단백질에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF 단백질은 인간 LINE 1 ORF2 단백질이다. 일부 실시양태에서, ORF 단백질은 비인간 ORF 단백질이다. 일부 실시양태에서, ORF 단백질은 키메라 단백질, 재조합 단백질 또는 조작된 단백질이다.
본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 면역 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 (a) (i) 외생성 서열 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; (b) 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고, 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제 결합 부위 및 역전사효소 결합 부위를 포함하고, 전이 유전자 서열은 면역 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, RNA 통합 또는 전위를 매개하는 구조 요소는 합성 구축물에 코딩될 수 있고 세포에게 전달할 관심 있는 이종 유전자에 의해 좌우된다. 일부 실시양태에서, 합성 구축물은 관심 있는 이종 유전자를 코딩하는 핵산, 및 게놈 내로의 관심 있는 이종 유전자의 통합 또는 역전위를 야기하는 구조 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 통합 또는 역전위를 야기하는 구조 요소는 5' L1 RNA 영역 및 3' L1 영역을 포함할 수 있고, 이때 3' L1 영역은 프라이밍을 위해 폴리 A 3' 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' L1 RNA 영역은 하나 이상의 줄기 루프 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 3' L1 영역은 하나 이상의 줄기 루프 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' L1 영역 및 3' L1 영역은 관심 있는 이종 유전자(전이 유전자)를 코딩하는 핵산 서열을 플랭킹하는 것으로서 구축된다. 일부 실시양태에서, 구조 유전자는 리보좀 결합 부위인 A 박스 및 B 박스 요소를 포함하는 헤어핀 루프 구조를 포함하는 L1 또는 Alu RNA의 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 핵산은 L1-Ta 프로모터를 포함할 수 있다.
ORF2p에 의한 두 가지 유형의 LINE RNA 인식이 있을 수 있다 - 엄격 및 완화. 엄격 유형에서 RT는 그 자신의 3' UTR 꼬리를 인식하고, 완화 유형에서 RT는 폴리 A 꼬리를 제외하고 어떠한 특이적 인식도 요구하지 않는다. 엄격 유형과 완화 유형으로 나누는 것은 일부 LINE/SINE 쌍들이 동일한 3' 말단을 공유한다는 관찰로부터 유래하였다. 엄격 유형의 경우, 실험 연구는 3' UTR 줄기-루프가 역전위를 촉진함을 보여주었다. LINE 역전위 서열의 5' UTR은 3개의 보존된 줄기 루프 영역을 함유하는 것으로 확인되었다.
일부 실시양태에서, 관심 있는 전이 유전자 또는 전사체는 5' 및 3' 말단에서 L1 또는 Alu 서열의 전위 요소에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존의 5' 영역은 Alu 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존의 3' 영역은 Alu 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존의 5' 영역은 L1 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존의 3' 영역은 L1 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 있는 전이 유전자 또는 전사체는 SVA 트랜스포존 서열에 의해 플랭킹된다.
일부 실시양태에서, 관심 있는 전사체는 ORF2p에 대한 결합 영역 및 3' 폴리 A 프라이밍 영역을 코딩하는 L1 또는 Alu 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 있는 전이 유전자를 코딩하는 이종 핵산은 ORF1p에 대한 결합 영역 및 3' 폴리 A 프라이밍 영역을 코딩하는 L1 또는 Alu 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 3' 영역은 하나 이상의 줄기 루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 있는 전사체는 시스 통합 또는 역전위를 위해 구조화된다. 일부 실시양태에서, 관심 있는 전사체는 트랜스 통합 또는 역전위를 위해 구조화된다.
일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존은 인간 레트로트랜스포존이다. 인간 레트로트랜스포존의 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 비-중첩 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역되는 2개의 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 ORF는 ORF1 및 ORF2이다.
따라서, 본원은 전이 유전자를 코딩하는 이종 핵산을 골수 세포와 같은 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시키는 방법으로서, 전이 유전자; 레트로트랜스포존의 5' 영역을 포함하는, 전이 유전자를 코딩하는 영역을 플랭킹하는 하나 이상의 5' 핵산 서열; 및 레트로트랜스포존의 3' 영역을 포함하는, 전이 유전자를 코딩하는 영역을 플랭킹하는 하나 이상의 3' 핵산 서열을 코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 레트로트랜스포존의 3' 영역은 각각 엔도뉴클레아제 및 역전사효소(RT) 활성을 가진 게놈 DNA 프라이밍 서열 및 LINE 전위효소 결합 서열을 포함한다.
본원은 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이때 mRNA는 (i) 외생성 서열 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; (b) 5' UTR 서열, 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 인간 레트로트랜스포존의 서열, 및 인간 레트로트랜스포존의 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하고; 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제 결합 부위 및 역전사효소 결합 부위를 포함하고, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역되는 2개의 단백질을 코딩하고, 삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 방법은 삽입체 서열을 세포의 게놈 내로 전달하고 통합시키기 위해 단일 핵산 분자를 사용하는 단계를 포함한다. 단일 핵산 분자는 플라스미드 벡터일 수 있다. 단일 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 단일 핵산은 mRNA일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 레트로트랜스포존 및 이종 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 (i) ORF1p를 코딩하는 제1 핵산 분자; (ii) ORF2p를 코딩하는 제2 핵산 분자 및 카고를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 예를 들면, 별도의 플라스미드 벡터에 코딩된 DNA이다.
본원은 세포의 게놈 내로 삽입되는 서열을 포함하는 자가 통합 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 삽입체는 자가 통합 네이키드(naked) 폴리뉴클레오타이드에 의해 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형을 가진 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포내 환경에서 RNase에 대한 보호를 보장한다. 일부 실시양태에서, 변형은 치환된 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들면, 5-메틸사이티딘, 슈도우리딘 또는 2-티오우리딘을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 폴리뉴클레오타이드는 삽입체(또는 카고) 핵산의 전달 및 게놈 통합을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리뉴클레오타이드는 바이시스트론이다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리뉴클레오타이드는 트리시스트론이다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리뉴클레오타이드는 멀티시스트론이다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자는 삽입체(또는 카고) 핵산의 전달 및 게놈 통합을 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 역전위 유전 요소를 생성할 수 있고, 역전위 유전 요소는 (i) 세포의 게놈 내로 삽입될 전이 유전자 또는 비코딩 서열을 코딩하는 이종 핵산(삽입체); (ii) 하나 이상의 레트로트랜스포존 ORF 코딩 서열을 코딩하는 핵산 서열; (iii) 삽입될 전이 유전자 또는 비코딩 서열을 코딩하는 이종 핵산이 UTR 서열 내에 포함되도록 ORF 코딩 서열의 하나 이상의 UTR 영역을 포함하고; 이때 레트로트랜스포존 ORF 코딩 서열의 3' 영역은 게놈 DNA 프라이밍 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 역전위 유전 요소는 전이 유전자를 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합시키기 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전위 유전 요소는 (a) 레트로트랜스포존 단백질 코딩 서열 및 3' UTR; 및 (b) 세포의 게놈 내로 삽입될(예를 들면, 통합될) 이종 핵산을 포함하는 서열을 포함한다. 레트로트랜스포존 단백질 코딩 서열 및 3' UTR은 이종 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 전달하기에 완전하고 충분한 유닛일 수 있고, 역전사를 시작하고 이종 핵산을 혼입하기 위해 역전위 요소, 예컨대, 엔도뉴클레아제, 역전사효소, 엔도뉴클레아제에 의해 절단된 영역에서 게놈 DNA에 결합하고 이를 프라이밍하기 위한 3' UTR 내의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 삽입체의 코딩 서열은 하나 이상의 ORF의 코딩 서열에 대하여 정방향으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 삽입체의 코딩 서열은 하나 이상의 ORF의 코딩 서열에 대하여 역방향으로 존재한다. 삽입체의 코딩 서열 및 하나 이상의 ORF의 코딩 서열은 5' UTR, 3' UTR, 프로모터, 인핸서 등을 비롯한 상이한 조절 요소들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 삽입체의 3' UTR 또는 5' UTR은 하나 이상의 ORF의 코딩 서열을 포함할 수 있고, 마찬가지로, 삽입체의 코딩 서열은 하나 이상의 ORF의 코딩 서열의 3' UTR 내에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, (a) (i) 외생성 서열, 또는 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열; 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열을 포함하는 역전위 유전 요소를 생성할 수 있고; 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF 단백질에 대한 결합 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존은 SINE 또는 LINE 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존은 SINE 또는 LINE 줄기 루프 구조, 예컨대, Alu 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존은 LINE-1(L1) 레트로트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존은 인간 LINE-1이다. 인간 LINE-1 서열은 인간 게놈에 풍부하다. 대략 총 13,224개의 인간 L1이 존재하고, 이들 중 약 3.6%를 차지하는 480개는 활성을 나타낸다. 따라서, 인간 L1 단백질은 인간에서 잘 용인되고 면역원성을 갖지 않는다. 더욱이, 인간에서 무작위 전위의 엄격한 조절은 무작위 전위효소 활성이 본원에 기재된 L1 시스템의 도입에 의해 유발되지 않도록 보장한다. 추가로, 본원에서 디자인된 역전위 구축물은 삽입체 서열의 표적화된 특이적 혼입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전위 유전 요소는 게놈 불안정성을 초래하는 무작위 통합이 시작되지 않도록 주의하면서 인간 세포에서 활발히 우세한 침묵 기구를 극복하도록 의도된 디자인을 포함할 수 있다.
따라서, 역전위 구축물은 인간 LINE-1 ORF1 단백질을 코딩하는 서열; 및 인간 LINE-1 ORF2 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 구축물은 하기 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 ORF1p 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 하기 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 하기 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 ORF2p 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 하기 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 하기 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 ORF2p 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00006
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 하기 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 PAAKRVKLD(서열번호 59)에 대한 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 핵 국소화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵 국소화 서열은 ORF2p 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 구축물은 서열 DYKDDDDK(서열번호 60)를 가진 플래그 태그를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 플래그 태그는 ORF2p 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 플래그 태그는 핵 국소화 서열에 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 하기 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 MS2 코트 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00009
일부 실시양태에서, MS2 코트 단백질 서열은 ORF2p 서열에 융합된다.
일부 실시양태에서, 전이 유전자는 Alu ORF2p 인식 서열을 포함하는 플랭킹 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 추가 요소를 mRNA 내로 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 요소는 IRES 요소 또는 T2A 요소일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA 전사체는 3' 말단에서 1개, 2개, 3개 이상의 정지 코돈을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1개, 2개, 3개 이상의 정지 코돈은 일렬로 존재하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 1개, 2개, 3개 이상의 정지 코돈은 모든 3개의 리딩 프레임으로 존재하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 1개, 2개, 3개 이상의 정지 코돈은 다중 리딩 프레임 및 일렬로 존재하도록 디자인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 특이적 뉴클레오타이드를 L1 또는 Alu RNA 프라이밍 영역의 프라이밍 말단에 추가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 ORF 단백질에 결합할 수 있는 것 이외에 유전자 역전위 및/또는 안정한 통합을 조절하는 하나 이상의 내생성 단백질에 결합할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 서열은 PABP 단백질에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전사체를 플랭킹하는 5' 영역은 강한 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다.
일부 실시양태에서, L1 ORF2p를 코딩하는 추가 핵산을 세포 내로 도입한다. 일부 실시양태에서, L1 ORF1을 코딩하는 서열은 누락되고, L1-ORF2만이 포함된다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 요소를 가진 전이 유전자를 코딩하는 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 내생성 L1-ORF1p 기능은 억제될 수 있거나 저해될 수 있다.
일부 실시양태에서, 역전위 플랭킹 요소와 함께 전이 유전자를 코딩하는 핵산은 하나 이상의 핵산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역전위 플랭킹 요소와 함께 전이 유전자를 코딩하는 핵산은 전이 유전자에서 하나 이상의 핵산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 전이 유전자 서열의 코돈 최적화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코돈 최적화는 인간 세포에서의 더 효율적인 발현으로 이어지는, 인간 번역 기구에 의한 더 효율적인 인식을 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 변형은 하나 이상의 줄기-루프 영역을 포함하는 5' 플랭킹 서열 또는 3' 플랭킹 서열에서 수행된다. 역전위 플랭킹 요소와 함께 전이 유전자를 코딩하는 핵산은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 핵산 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자는 세포의 수명 동안 안정적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 단핵구 전구체 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 미성숙 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 단핵구는 미분화된 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD14+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD16 마커를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 적합한 조건 하에서 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과, 8일 초과, 9일 초과, 10일 초과, 11일 초과, 12일 초과, 13일 초과, 14일 초과 또는 그 이상의 원하는 기간 동안 기능적 활성을 유지할 수 있다. 적합한 조건은 시험관내 조건 또는 생체내 조건, 또는 이들의 조합을 의미할 수 있다.
일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자는 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일 또는 약 10일 동안 세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자는 10일 이상 동안 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자는 2주 이상 동안 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자는 약 1개월 동안 세포에서 안정적으로 발현된다.
일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자는 안정한 발현을 위해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자는 생체내 침묵에 대한 내성을 갖도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자의 발현은 강한 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자의 발현은 적절히 강한 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전위된 전이 유전자의 발현은 생체내 환경에서 조절될 수 있는 강한 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 L1-Ta 프로모터이다.
일부 실시양태에서, ORF1p는 과다발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, ORF2는 과다발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, ORF1p 또는 ORF2p, 또는 이들 둘 다는 과다발현된다. 일부 실시양태에서, ORF1의 과다발현 시, ORF1p는 ORF1을 과다발현하지 않는 세포보다 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 14배, 16배, 18배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 적어도 100배 더 높다.
일부 실시양태에서, ORF2 서열의 과다발현 시, ORF2p는 ORF2p를 과다발현하지 않는 세포보다 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 14배, 16배, 18배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 적어도 100배 더 높다.
역전위 신뢰도 및 표적 특이성
LINE-1 요소는 역전위를 시작하기 위해 그 자신의 mRNA 폴리 A 꼬리에 결합할 수 있다. LINE-1 요소는 바람직하게는 무작위 mRNA에 비해 그 자신의 mRNA를 역전위한다(Dewannieux et al., 2013, 3,000-fold higher LINE-1 retrotransposition as compared to random mRNAs). 추가로, LINE-1 요소는 비특이적 폴리 A 서열을 게놈 내로 통합시킬 수도 있다.
한 양태에서, 본원은 증가된 역전위 특이성을 가진 역전위 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 높은 특이성을 가진 역전위 조성물은 고도 특이적 및 효율적 역전사 및 그 후 표적 세포, 예를 들면, 골수 세포의 게놈 내로의 통합을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 역전위 조성물은 통합 또는 역전위 특이성을 증가시키는 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 역전위 카세트를 포함한다. 예를 들면, 레트로트랜스포존 카세트는 폴리 A 서열과 ORF2 사이의 비특이적 결합을 능가하기 위해 고친화성 RNA-단백질 상호작용을 가능하게 하는 하나 이상의 추가 요소를 코딩할 수 있다.
따라서, 본원은 통합 또는 역전위 효율을 향상시키기 위한 여러 조치를 개시한다.
통합 또는 역전위 효율을 향상시키기 위한 한 예시적인 조치는 세포의 외부 조작이다. 세포 내로 전달된 역전위 기구의 엔도뉴클레아제 작용은 세포의 전위 침묵 기구, 예컨대, DNA 복구 경로에 의해 억제될 가능성이 높다. 예를 들면, 핵산을 도입하기 전에 소분자를 사용하여 세포에서 DNA 복구 경로를 조절하거나 억제할 수 있다. 예를 들면, 세포 주기 동기화된 세포 집단이 세포로의 유전자 전달을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 예컨대, 전기천공으로 핵산을 도입하기 전에 세포 분류 및/또는 동기화를 이용할 수 있다. 세포 분류는 세포 유형을 동기화하거나 균질화하고 외생성 핵산의 균일한 전달 및 발현을 증가시키는 데 이용될 수 있다. 균일성은 비-줄기 세포로부터 줄기 세포를 분류함으로써 달성될 수 있다. 통합 또는 역전위 효율을 향상시키기 위한 또 다른 예시적인 조치는 생화학적 활성을 향상시키는 것이다. 예를 들면, 이것은 역전사효소 진행성 또는 DNA 절단(엔도뉴클레아제) 활성을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 통합 또는 역전위 효율을 향상시키기 위한 또 다른 예시적인 조치는 내생성 침묵 기작을 와해시키는 것이다. 예를 들면, 이것은 전체 LINE-1 서열을 상이한 유기체의 LINE-1로 대체함으로써 달성될 수 있다. 통합 또는 역전위 효율을 향상시키기 위한 또 다른 예시적인 조치는 번역 및 리보좀 결합을 향상시키는 것이다. 예를 들면, 이것은 LINE-1 단백질의 발현을 증가시키거나, LINE 단백질 결합 LINE-1 mRNA를 증가시키거나, 리보좀에 결합하는 LINE-1 복합체를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 통합 또는 역전위 효율을 향상시키기 위한 또 다른 예시적인 조치는 핵 이입 또는 체류를 증가시키는 것이다. 예를 들면, 이것은 LINE-1 서열을 핵 체류 신호 서열에 융합시킴으로써 달성될 수 있다. 통합 또는 역전위 효율을 향상시키기 위한 또 다른 예시적인 조치는 특이적-특이적 삽입을 향상시키는 것이다. 예를 들면, 이것은 표적화 도메인을 ORF2에 융합시켜 서열 특이적 역전위를 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 LINE-1 ORF의 UTR 서열을 변형시킴으로써 카고 발현의 특이성 및 강건성을 증가시키기 위해 레트로트랜스포존을 향상시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF1 또는 ORF2 코딩 서열의 5' UTR 업스트림은 ORF 뉴클레아제가 작용할 수 있고 역전위가 일어날 수 있는 특정 부위에서 상동 재조합을 돕는, 게놈 내의 표적 영역의 서열에 상보적인 서열을 포함하도록 더 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성에 의해 표적 서열에 결합할 수 있는 서열은 길이가 2개 내지 15개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, ORF1 mRNA의 5' UTR에 포함되는, 게놈 표적에 대한 상동성을 가진 서열은 길이가 약 3개 뉴클레오타이드, 약 4개 뉴클레오타이드, 약 5개 뉴클레오타이드, 약 6개 뉴클레오타이드, 약 7개 뉴클레오타이드, 약 8개 뉴클레오타이드, 약 9개 뉴클레오타이드 또는 약 10개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 표적에 대한 상동성을 가진 서열은 길이가 약 12개 또는 약 15개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 게놈 표적에 대한 상동성을 가진 서열은 게놈 내의 각각의 표적 영역과 상보성을 공유하는 약 2개 내지 5개, 약 2개 내지 6개, 약 2개 내지 8개, 약 2개 내지 10개, 또는 약 2개 내지 12개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, ORF2는 RNA 결합 활성을 포함하는 추가 단백질 도메인과 회합되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존 카세트는 ORF2와 회합되거나 융합된 추가 단백질 도메인에 대한 친화성을 포함하는 동족 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF2는 MS2-MCP 코트 단백질과 회합되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존 카세트는 MS2-MCP 코트 단백질과 상호작용하는, 3' 또는 5' UTR 서열 내의 MS2 헤어핀 RNA 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF2는 PP7 코트 단백질과 회합되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 레트로트랜스포존 카세트는 MS2-MCP 코트 단백질과 상호작용하는, 3' 또는 5' UTR 서열 내의 PP7 헤어핀 RNA 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 요소는 하나 이상의 추가 요소를 갖지 않은 레트로트랜스포존 카세트에 비해 역전위 특이성을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 500배, 적어도 1000배, 적어도 1500배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 5000배 이상 증가시킨다.
DNA 엔도뉴클레아제 도메인은 일련의 피리미딘이 뒤따르는 표적 부위의 일련의 퓨린 3', 즉 (Py)n↓(Pu)n에 대한 특이성을 갖는 듯하다. 예시적인 서열은 (아데노신)n↓(타이미딘)n일 수 있다.
한 양태에서, 본원은 높은 표적 특이성을 가진 역전위를 이용하는 방법을 제공한다. 결과적으로, 본원은 전이 유전자를 단핵구 또는 대식세포와 같은 골수 세포의 게놈 내로 안정적으로 혼입하는 방법 및 조성물을 제공하는 것으로서, 이때 상기 방법은 비-LTR 레트로트랜스포존 시스템을 이용하여 전이 유전자를 혼입하는 단계를 포함하고, 역전위는 표적 특이성, 높은 정확도 및 신뢰도로 특정 게놈 좌위에서 일어난다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 전위 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 전이 유전자, 및 전위 특이성을 증가시키는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 가진 시스템을 포함하는 조성물을 세포에게 투여하는 단계를 포함하고/하거나, 역전위와 관련된 하나 이상의 유전자를 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.
역전위 요소의 UTR 영역에 위치한, 전이 유전자를 포함하는 핵산은 종종 역전위 카세트로서 지칭된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 역전위 카세트는 전이 유전자 및 플랭킹 Alu 전위 요소를 코딩하는 핵산을 포함한다. 역전위 요소는 레트로트랜스포존, 예를 들면, L1-트랜스포존에 결합하기 위한 서열, 예컨대, L1-ORF 단백질, ORF1p 및 ORF2p를 포함한다. ORF 단백질은 역전위를 위해 그 자신의 mRNA 서열에 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 역전위 카세트는 전이 유전자 서열 외부에서 L1-ORF1p 코딩 서열 및 L1-ORF2p 코딩 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, 전이 유전자; 플랭킹 L1-ORF2p 결합 서열 및/또는 L1-ORF1p 결합 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, L1-ORF1 및 L1-ORF2는 ORF1-ORF2 영역간으로서도 지칭되는 스페이서 영역에 의해 산재된다. 일부 실시양태에서, L1-ORF1 및 L1-ORF2 코딩 서열은 전이 유전자의 코딩 서열에 대하여 반대 방향으로 존재한다. 역전위 카세트는 L1-ORF2 코딩 서열의 다운스트림에서 폴리 A 영역을 포함할 수 있고, 전이 유전자 서열은 폴리 A 서열의 다운스트림에 위치한다. L1-ORF2는 엔도뉴클레아제(EN) 및 역전사효소(RT)에 이어 폴리 A 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 역전위 카세트 내의 L1-ORF2 서열은 완전한(온전한) 서열이다, 즉 전체 길이 천연(WT) L1-ORF2 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 역전위 카세트 내의 L1-ORF2 서열은 부분적 또는 변형된 서열을 포함한다.
본원에 기재된 시스템은 L1-ORF1p 및 L1-ORF2p를 발현시키기 위해 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자 발현은 별도의 프로모터에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자 및 ORF는 직렬 방향으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자 및 ORF는 반대 방향으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 방법은 레트로트랜스포존 카세트 이외에 하나 이상의 요소를 혼입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 요소는 이종 단백질의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이종 단백질은 서열 특이적 핵산 결합 단백질, 예를 들면, 서열 특이적 DNA 결합 단백질 도메인(DBD)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 뉴클레아제 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 추가 요소는 이종 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 뉴클레아제 도메인은 감소된 뉴클레아제 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, 이종 뉴클레아제 도메인은 불활성 상태가 된다. 일부 실시양태에서, ORF2 뉴클레아제는 불활성 상태가 되는 반면; 이종 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 역전위에 대한 특이성을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인 또는 이의 단편은 게놈 내의 특정 원하는 폴리뉴클레오타이드를 표적화하고, 이때 관심 있는 폴리뉴클레오타이드가 역전위되고 혼입된다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 mega-TAL 뉴클레아제 도메인, TALEN 또는 징크 핑거 뉴클레아제 도메인, 예를 들면, 뉴클레아제 도메인, 예를 들면, FokI 뉴클레아제 도메인에 융합되거나 회합된 mega-TAL, TALE 또는 징크 핑거 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 특정 표적 좌위에 대한 특정 가이드 핵산, 예를 들면, 가이드 RNA(gRNA)가 로딩되어 있는 CRISPR-Cas 단백질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 단백질은 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13, CasX 또는 CasY 단백질 도메인이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 표적 특이성을 가진다.
일부 실시양태에서, 추가 뉴클레아제 도메인은 ORF2 도메인 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 뉴클레아제는 ORF2p 도메인과 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 뉴클레아제 도메인은 ORF2p에 융합될 수 있고, 이때 ORF2p는 ORF2p 엔도뉴클레아제 도메인 내에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제 도메인을 불활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 점 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 결실이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 삽입이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2 엔도뉴클레아제(닉카제(nickase)) 활성을 제거한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제의 DNA 표적 인식을 불활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 뉴클레아제-DNA 인식과 관련된 영역을 커버한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제의 DNA 표적 인식을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, ORF2p 엔도뉴클레아제 도메인 돌연변이는 단백질의 N-말단 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, ORF2p 엔도뉴클레아제 도메인 돌연변이는 단백질의 보존된 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, ORF2p 엔도뉴클레아제 도메인 돌연변이는 단백질의 보존된 N-말단 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인 내에 N14 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인 내에 N14 아미노산을 비롯한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 보존적 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 내에 E43 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인 내에 E43 아미노산을 비롯한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 보존적 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인 내에 N14 또는 E43, 또는 이들의 조합을 비롯한 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인의 D145를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 D145A일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인의 D205를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 D205G일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인의 H230을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1 엔도뉴클레아제 도메인의 S228을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 S228P일 수 있다.
일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제의 DNA 표적 인식을 적어도 50% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제의 DNA 표적 인식을 적어도 60% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제의 DNA 표적 인식을 적어도 70% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제의 DNA 표적 인식을 80% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p 엔도뉴클레아제의 DNA 표적 인식을 90% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p의 DNA 표적 인식을 95% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 ORF2p의 DNA 표적 인식을 100% 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 돌연변이는 결실이다. 일부 실시양태에서, 결실은 완전하다, 즉 L1 엔도뉴클레아제 도메인의 100%가 결실된다. 일부 실시양태에서, 결실은 부분적이다. 일부 실시양태에서, ORF2 엔도뉴클레아제 도메인의 약 98%, 약 95%, 약 94%, 약 93%, 약 92%, 약 91%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60% 또는 약 50%가 결실된다.
일부 실시양태에서, 추가 뉴클레아제 도메인은 ORF2 단백질 서열 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, ORF2 엔도뉴클레아제 도메인은 결실되고 이종 단백질의 엔도뉴클레아제 도메인으로 대체된다. 일부 실시양태에서, ORF2 엔도뉴클레아제는 부분적으로 결실되고 이종 단백질의 엔도뉴클레아제 도메인으로 대체된다. 이종 단백질의 엔도뉴클레아제 도메인은 mega-TAL 뉴클레아제 도메인일 수 있다. 이종 단백질의 엔도뉴클레아제 도메인은 TALEN일 수 있다. 이종 단백질의 엔도뉴클레아제 도메인은 좌위에 대한 특이적 gRNA가 로딩되어 있는 Cas9일 수 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 (i) 게놈 상의 특정 표적을 갖고 (ii) 절단 부위에서 5'-P 및 3'-OH 말단을 생성하는 엔도뉴클레아제이다.
일부 실시양태에서, 이종 단백질의 추가 엔도뉴클레아제 도메인은 관련된 레트로트랜스포존의 엔도뉴클레아제 도메인이다.
일부 실시양태에서, 이종 단백질의 엔도뉴클레아제 도메인은 특정 부위를 표적화하도록 조작된 세균 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질의 엔도뉴클레아제 도메인은 귀소(homing) 엔도뉴클레아제의 도메인 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 귀소 엔도뉴클레아제는 조작된 LAGLIDADG 귀소 엔도뉴클레아제(서열번호 62로서 개시된 "LAGLIDADG")(LHE) 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 추가 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제, Cre, Cas TAL 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 II군 인트론 코딩된 단백질(리보자임(ribozyme)) 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
추가/이종 엔도뉴클레아제로 인해 특이적 DNA 표적화 능력이 부여된, 이전 단락에서 논의된 바와 같은 조작 또는 변형된 L1-ORF2p는 게놈 내로의 전이 유전자의 표적화된 안정한 통합을 유도하는 데 매우 유리할 것으로 예상된다. 조작된 L1-ORF2p는 세포에서 발현될 때 조작되지 않은 천연 L1-ORF2p를 사용하는 것보다 훨씬 더 감소된 오프-표적 효과를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 L1-ORF2p는 오프-표적 효과를 생성하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작 또는 변형된 L1-ORF2p는 통상의 (Py)n↓(Pu)n 부위 이외의 인식 부위를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 L1-ORF2p는 (Py)n↓(Pu)n 부위, 예를 들면, TTTT/AA 부위, 예컨대, 하이브리드 표적 부위를 포함하는 인식 부위를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 L1-ORF2p는 통상의 L1-ORF2 (Py)n↓(Pu)n 부위, 예를 들면, TTTT/AAG, 또는 TTTT/AAC, 또는 TTTT/AAT, TTTT/AAA, GTTTT/AA, CTTTT/AA, ATTTT/AA, 또는 TTTTT/AA 이외에 적어도 하나의 뉴클레오타드를 가진 인식 부위를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 L1-ORF2p는 통상의 L1-ORF2p (Py)n↓(Pu)n 부위 이외의 인식 부위를 표적한다. 일부 실시양태에서, 조작된 L1-ORF2p는 통상의 L1-ORF2p (Py)n↓(Pu)n 부위 이외의 인식 부위를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 L1-ORF2p는 길이가 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 뉴클레오타이드인 인식 부위를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 조작 또는 변형된 L1-ORF2p 인식 부위는 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다.
조작된 L1-ORF2p는 번역 후 그 자신의 mRNA에 결합하고 고효율로 역전사하는 그의 능력을 보유하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 L1-ORF2p는 천연(WT) L1-ORF2p에 비해 향상된 역전사 효율을 가진다.
일부 실시양태에서, 역전위 요소를 포함하는 시스템은 비특이적 역전위를 감소시키는 유전자 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 L1-ORF2p를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 ORF2p가 표적 게놈 DNA에 결합하는 것을 돕는 단백질에 결합하는 데 필수적인 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 포함할 수 있다. ORF2p가 표적 게놈 DNA에 결합하는 것을 돕는 단백질은 염색질-ORF 상호작용체의 일부일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 ORF2p DNA 엔도뉴클레아제 활성을 돕는 단백질에 결합하는 데 필수적인 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 ORF2p RT 활성을 돕는 단백질에 결합하는 데 필수적인 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 단백질과 ORF2p의 회합이 변경되도록 ORF2p 상의 단백질 결합 부위를 포함할 수 있고, 이때 상기 단백질과 ORF2p의 결합은 염색질에의 결합을 위해 요구된다. 일부 실시양태에서, 변형은 단백질과 ORF2p의 회합이 변형의 부재 하에서의 회합보다 더 엄격하고/하거나 특이적이도록 ORF2p 상의 단백질 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 결합 부위에서 ORF2p 코딩 서열의 변형으로 인한 ORF2p와 단백질의 변경된 회합의 결과로서, ORF2p와 표적 DNA의 결합은 증가된 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 변형은 ORF2p 염색질 상호작용체의 일부인 하나 이상의 단백질과 ORF2의 결합을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p의 PIP 도메인에 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p에 결합하고 ORF2p의 인식, 결합, 엔도뉴클레아제 또는 RT 활성을 돕는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 각각의 단백질에 대한 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 PCNA, PARP1, PABP, MCM, TOP1, RPA, PURA, PURB, RUVBL2, NAP1, ZCCHC3, UPF1 또는 MOV10 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 PCNA의 ORF2p 결합 도메인에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 TOP1의 ORF2p 결합 도메인에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 RPA의 ORF2p 결합 도메인에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 PARP1의 ORF2p 결합 도메인에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 PABP(예를 들면, PABPC1)의 ORF2p 결합 도메인에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 MCM 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 MCM3 단백질을 코딩하는 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 MCM5 단백질을 코딩하는 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 MCM6 단백질을 코딩하는 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 MEPCE 단백질을 코딩하는 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 RUVBL1 또는 RUVBL2 단백질을 코딩하는 유전자에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 ORF2p 상호작용 부위, 또는 단백질과 ORF2p의 상호작용 또는 ORF2p와 표적 DNA의 상호작용에 영향을 미치는 부위에서 TROVE 단백질을 코딩하는 유전자에 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 역전위 시스템은 역전사의 신뢰도를 증가시키는 하나 이상의 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, L1-ORF2 RT 도메인은 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형은 신뢰도 증가, 진행성 증가, DNA-RNA 기질 친화성 증가; 또는 RNase H 활성의 불활성화 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형은 RT의 신뢰도가 증가하도록 하나 이상의 돌연변이를 L1-ORF2의 RT 도메인 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1-ORF2p RT 도메인에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 아미노산의 치환과 같은 변경을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1-ORF2p RT 도메인에서 하나 이상의 아미노산, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 삽입결실 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 프레임 시프트 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형은 제2 단백질의 추가 RT 도메인 또는 이의 단편의 포함을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 바이러스 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 비-바이러스 역전사효소이다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 역전위 요소이다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 비-LTR 역전위 요소이다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 II군 인트론 단백질이다. 일부 실시양태에서, II군 인트론은 TGIRTII이다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 Cas 닉카제이고, 이때 역전위 시스템은 가이드 RNA를 도입하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 Cas9 엔도뉴클레아제이고, 이때 역전위 시스템은 가이드 RNA를 도입하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질 또는 이의 단편은 L1-ORF2 RT 도메인 또는 변형된 L1-ORF2 RT 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질 또는 이의 단편은 L1-ORF2 RT 도메인 또는 변형된 L1-ORF2 RT 도메인의 C-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 전체 길이 WT L1-ORF2p RT 도메인 이외에 제2 단백질의 추가 RT 도메인 또는 이의 단편이 역전위 시스템에 혼입된다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질의 추가 RT 도메인 또는 이의 단편은 변형된(조작된) L1-ORF2p RT 도메인 또는 이의 단편의 존재 하에서 혼입되고, 이때 변형(또는 조작)은 천연 또는 WT ORF2p에 비해 변형된 L1-ORF2p RT의 L1-ORF2p RT 진행성, 안정성 및/또는 신뢰도를 향상시키기 위한 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 역전사효소 도메인은 다른 역요소 또는 II군 인트론, 예컨대, TGIRTII의 다른 더 높은 진행성 및 높은 신뢰도 RT 도메인으로 대체될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형은 제2 단백질의 추가 RT 도메인 또는 이의 단편과의 융합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 역요소를 포함할 수 있다. 제2 단백질의 추가 RT 도메인 또는 이의 단편은 융합된 L1-ORF2p RT 도메인의 역전사의 신뢰도를 증가시키도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 추가 RT 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산은 천연 또는 WT L1-ORF2 코딩 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질의 추가 RT 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산은 변형된 L1-ORF2 코딩 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 변형은 융합된 RT의 신뢰도가 증가되도록 하나 이상의 돌연변이를 L1-ORF2의 RT 도메인 또는 이의 단편 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, L1-ORF2의 RT 도메인 또는 이의 단편 내의 돌연변이는 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1-ORF2p RT 도메인에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 아미노산의 변경, 예컨대, 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 L1-ORF2p RT 도메인에서 하나 이상의 아미노산, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 삽입결실 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 프레임 시프트 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 L1-ORF2p RT 도메인은 WT L1-ORF2p RT 도메인보다 증가된 진행성을 가진다.
일부 실시양태에서, 변형된 L1-ORF2p RT 도메인은 WT L1-ORF2p RT 도메인에 비해 적어도 10% 더 높은 진행성 및/또는 신뢰도를 가진다. 일부 실시양태에서, 변형된 L1-ORF2p RT 도메인은 WT L1-ORF2p RT 도메인에 비해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상 더 높은 진행성 및/또는 신뢰도를 가진다. 일부 실시양태에서, 변형된 RT는 6 kb 초과의 핵산 스트레치를 처리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 RT는 7 kb 초과의 핵산 스트레치를 처리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 RT는 8 kb 초과의 핵산 스트레치를 처리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 RT는 9 kb 초과의 핵산 스트레치를 처리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 RT는 10 kb 초과의 핵산 스트레치를 처리할 수 있다.
B. II군 인트론 및 리보자임
II 군 효소는 전구체 RNA를 자가 스플라이싱하여, 절단된 인트론 올가미(lariat) RNA를 생성하는 이동성 리보자임이다. 인트론은 역전사효소를 코딩한다. 역전사효소는 정방향 및 역방향 스플라이싱 및 그 후 DNA로의 통합된 인트론 RNA의 전환을 위해 RNA를 안정화시킬 수 있다.
II 군 RNA는 400 내지 800 b 뉴클레오타이드에 걸쳐 있는 보존된 2차 구조를 특징으로 한다. 2차 구조는 6개의 도메인 DI 내지 VI에 의해 형성되고, 바퀴와 유사한 구조로 조직화되고, 이때 도메인은 중심점으로부터 방사된다. 도메인은 상호작용하여 보존된 3차 구조를 형성하고, 이 3차 구조는 멀리 떨어진 서열과 함께 활성 부위를 형성한다. 활성 부위는 스플라이스 부위 및 분기점 잔기 뉴클레오타이드에 결합하고 Mg2+ 양이온과 함께 스플라이싱의 촉매작용을 활성화시킨다. DV 도메인은 보존된 촉매 AGC 및 AY 돌출부를 가진 활성 부위 내에 있고, 이 영역들 둘 다가 촉매작용에 필요한 Mg2+ 이온에 결합한다. DI는 카파 및 제타 모티프에 의해 분리된 상부 및 하부 절반을 가진 가장 큰 도메인이다. 하부 절반은 활성 부위와 관련된 □' 모티브를 함유한다. 상부 절반은 활성 부위에서 5' 및 3' 엑손에 결합하는 서열 요소를 함유한다. DIV는 인트론-코딩된 단백질(IEP)에 대한 고친화성 결합 부위를 함유하는 5' 말단 근처에서 서브도메인 IVa를 가진 IEP를 코딩한다. II군 인트론은 보존된 5' 말단 서열 및 3' 말단 서열, 즉 각각 GUGYG 및 AY를 가진다.
II 군 RNA 인트론은 표적 프라이밍 역전사를 통해 관심 서열을 DNA 내로 역전위시키는 데 이용될 수 있다. II 군 RNA 인트론에 의한 이 전위 과정은 종종 역귀소(retrohoming)로서 지칭된다. II군 인트론은 인트론 RNA와 DNA 표적 서열의 염기 페어링으로 DNA 표적 부위를 인식하고, 인트론 내에 담지된 특정 서열을 원하는 DNA 부위로 재표적화하도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 역전위를 위한 방법 및 조성물은 II군 인트론 서열, 변형된 II군 인트론 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예시적인 II 군 IEP(성숙효소)는 인간 세포에서 작용하는 세균, 진균, 효모 IEP를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 특히, 뉴클레아제는 프라이밍 및 역전사를 위해 또 다른 RT에 의해 활용될 수 있는 DNA의 절단 부위에서 3'-OH를 남긴다. 예시적인 II 군 성숙효소는 TGIRT(열적으로 안정한 II군 인트론 성숙효소)일 수 있다.
본원에 기재된 여러 양태의 하나 이상의 실시양태에서, 핵산 구축물은 RNA를 포함한다. 본 개시내용의 여러 양태의 하나 이상의 실시양태에서, 핵산 구축물은 RNA이다. 본 개시내용의 여러 양태의 하나 이상의 실시양태에서, 핵산 구축물은 mRNA이다. 한 양태에서, mRNA는 이종 유전자 또는 이의 일부의 서열을 포함하고, 이때 이종 유전자 또는 이의 일부는 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 재조합 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 합성 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 이종 단백질, 하나 이상의 재조합 단백질 또는 하나 이상의 합성 단백질, 또는 이들의 조합을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 합성 단백질 또는 재조합 단백질을 포함하는 하나 이상의 이종 단백질을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 또는 재조합 단백질은 재조합 융합 단백질이다.
본 개시내용의 여러 양태의 하나 이상의 실시양태에서, 핵산 구축물은 진핵 세포에서 발현되도록 개발된다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 인간 세포에서 발현되도록 개발된다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 조혈 세포에서 발현되도록 개발된다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 골수 세포에서 발현되도록 개발된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 인간 세포이다.
II. 코딩된 단백질의 발현을 향상시키는 방법을 위한 핵산 구축물의 변형
본 개시내용의 일부 양태에서, 재조합 핵산은 핵산의 서열에 의해 코딩된 단백질의 향상된 발현을 위해 변형된다. 코딩된 단백질의 향상된 발현은 핵산 안정성, 번역 효율 및 번역된 단백질의 안정성의 함수일 수 있다. 합성 재조합 단백질 또는 이의 단편일 수 있는 외생성 또는 이종 단백질을 코딩하는 메신저 RNA의 안정성과 같은 핵산 안정성을 부여할 수 있는 핵산 구축물의 디자인에 혼입될 다수의 변형이 본원에서 예상된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 합성 또는 재조합 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 이종 단백질을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 mRNA이다.
일부 실시양태에서, mRNA 반감기를 증가시키기 위해 재조합 또는 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA에서 하나 이상의 변형을 만든다.
엑소뉴클레아제에 의한 5'-3' 분해를 차단하는 구조 요소: 5'-캡 및 3' UTR 변형
적절한 5'-캡 구조는 기능적 메신저 RNA의 합성에 중요하다. 일부 실시양태에서, 5'-캡은 핵산의 5' 말단에서 GpppG로서 배열된 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 5' 7-메틸구아노신 캡인 m7-GpppG를 포함한다. 5' 7-메틸구아노신 캡은 mRNA 번역 효율을 증가시키고 mRNA 5'-3' 엑소뉴클레아제의 분해를 방지한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 "항-역" 캡 유사체(ARCA, m7,3'-OGpppG)를 포함한다. 그러나, 번역 효율은 ARCA의 사용에 의해 현저히 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구아노신 캡은 Cap 0 구조이다. 일부 실시양태에서, 구아노신 캡은 Cap 1 구조이다. mRNA 캡은 단백질 합성의 캡 의존적 시작이라는 그의 필수적인 역할 이외에 5'에서 3'으로의 엑소뉴클레아제 절단의 보호기, 및 전구-mRNA 스플라이싱, 폴리아데닐화 및 핵 이출을 위해 단백질 인자를 동원하기 위한 고유 식별자로서도 작용한다. 이것은 단백질 합성을 시작하는 시작 인자의 동원 및 번역 동안 mRNA의 5'에서 3'으로의 루핑을 위한 앵커로서 작용한다. Cap 0 구조를 생성하기 위해 세 가지 효소 활성, 즉 RNA 트리포스파타제(TPase), RNA 구아닐릴트랜스퍼라제(GTase) 및 구아닌-N7 메틸트랜스퍼라제(구아닌-N7 MTase)가 요구된다. 이 효소 활성들 각각은 신생 RNA의 5' 트리포스페이트를 Cap 0 구조로 전환시키는 데 있어서 필수적인 단계를 수행한다. RNA TPase는 5' 트리포스페이트로부터 γ-포스페이트를 제거하여 5' 디포스페이트 RNA를 생성한다. GTase는 라이신-GMP 공유 중간체를 통해 GMP 기를 GTP로부터 5' 디포스페이트로 전달한다. 그 다음, 구아닌-N7 MTase는 메틸 기를 구아닌 캡의 N7 아민에 추가하여 캡 0 구조를 형성한다. Cap 1 구조의 경우, m7G 특이적 2'O 메틸트랜스퍼라제(2'O MTase)는 리보스의 2'O 위치에서 +1 리보뉴클레오타이드를 메틸화하여 캡 1 구조를 생성한다. 핵 RNA 캡핑 효소는 C-말단 헵타드 반복부의 인산화된 Ser5에서 RNA 중합효소 II 복합체의 중합효소 서브유닛과 상호작용한다. RNA 구아닌-N7 메틸트랜스퍼라제는 RNA 중합효소 II 인산화된 헵타드 반복부와도 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 캡은 G-사중체 캡이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 시험관내 전사(IVT)에 의해 합성된다. 일부 실시양태에서, mRNA 합성과 캡핑은 한 단계에서 수행될 수 있다. 캡핑은 IVT와 동일한 반응 혼합물에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA 합성과 캡핑은 별도의 단계에서 수행될 수 있다. 따라서, IVT에 의해 형성된 mRNA는 정제된 후 캡핑된다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물, 예를 들면, mRNA 구축물은 관심 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하고, 내생성 5'-3' 엑소리보뉴클레아제, 예를 들면, Xrn1에 의한 mRNA의 분해를 보호하거나, 방지하거나, 억제하거나 감소시키는 요소를 포함하도록 디자인될 수 있다. Xrn1은 5' 일인산화된 RNA를 분해하는 정상적인 RNA 붕괴 경로의 세포 효소이다. 그러나, 일부 바이러스 RNA 구조 요소는 특히 이러한 RNase에 대한 내성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 'xrRNA'로서 지칭되는, 플라비바이러스 sfRNA의 Xrn1 내성 구조). 예를 들면, 모기 매개 플라비바이러스(MBFV) 게놈은 그의 3'-비번역 영역(UTR) 내에 Xrn1의 진행을 차단하는 별도의 RNA 구조를 함유한다. 이 RNA 요소는 보조 단백질을 사용하지 않으면서 Xrn1을 차단하기에 충분하다. xrRNA는 xrRNA의 다운스트림에 위치한 바이러스 RNA가 분해로부터 보호되도록 정해진 위치에서 효소를 정지시킨다. 예를 들면, 지카바이러스(Zikavirus) 또는 머레이 발리(Murray Valley) 뇌염 바이러스의 xrRNA는 MBFV 구조 전체에 걸쳐 보존된 뉴클레오타이드 세트를 요구하는 독특하고 복잡한 접힘을 생성하는 3-방향 연접 및 다중 슈도노트 상호작용을 포함한다. xrRNA는 xrRNA의 다운스트림에 위치한 바이러스 RNA가 분해로부터 보호되도록 정해진 위치에서 효소를 정지시킨다. RNA의 5' 말단은 상기 접힘의 고리 유사 구조를 통과하고 Xrn1 유사 엑소뉴클레아제로부터 보호된 상태를 유지하는 것으로 여겨진다.
일부 실시양태에서, 관심 있는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산 구축물은 그의 내부로 혼입된 하나 이상의 xrRNA 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, xrRNA는 하나 이상의 바이러스 xrRNA 서열의 3' UTR의 보존된 영역을 가진 뉴클레오타이드 스트레치이다. 일부 실시양태에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 xrRNA 요소가 핵산 구축물 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 xrRNA 요소가 핵산 구축물 내로 일렬로 혼입된다. 일부 실시양태에서, xrRNA는 보존된 서열 또는 이의 단편 또는 이의 변형을 포함하는 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, xrRNA는 레트로트랜스포존 요소의 3' UTR에 배치된다. 일부 실시양태에서, xrRNA는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 업스트림에 배치된다. 일부 실시양태에서, xrRNA는 레트로트랜스포존 요소의 3' UTR, 예컨대, ORF2 서열 및 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 업스트림에 배치된다.
일부 실시양태에서, xrRNA 구조는 MBFV xrRNA 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, xrRNA 구조는 진드기 매개 플라비바이러스(TBFV) xrRNA 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, xrRNA 구조는 진드기 매개 플라비바이러스(TBFV) xrRNA 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, xrRNA 구조는 진드기 매개 플라비바이러스(TBFV) xrRNA 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, xrRNA 구조는 알려지지 않은 절지동물 벡터 플라비바이러스(NKVFV) 구성원으로부터의 xrRNA 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, xrRNA 구조는 곤충 특이적 플라비바이러스(ISFV) 구성원으로부터의 xrRNA 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, xrRNA 구조는 지카바이러스 xrRNA 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 임의의 공지된 xrRNA 구조 요소 또는 도출될 수 있는 이의 자명하지 않은 변경이 본원에 기재된 목적을 위해 사용될 수 있음이 예상된다.
상이한 유기체로부터의 몇몇 메신저 RNA는 5'-3' 엑소뉴클레아제에 대한 내성을 나타내는 하나 이상의 슈도노트 구조를 나타낸다. 슈도노트의 여러 상이한 접힘 위상구조가 존재하지만, 슈도노트는 최소한 단일 가닥 영역 또는 루프에 의해 연결된 2개의 나선형 분절로 구성된 RNA 구조이다.
폴리 A 꼬리 변형
mRNA의 3' UTR에서 폴리 A 구조는 mRNA 반감기의 중요한 조절제이다. 폴리 A 꼬리에서의 엑소좀 탈아데닐화는 mRNA 본체 분해를 시작한다. 일부 실시양태에서, mRNA 구축물의 폴리 A 꼬리의 길이는 mRNA 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질의 발현 및 mRNA 안정성을 최대화하기 위해 핵심적으로 고려되고 디자인된다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 하나 이상의 폴리 A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 3' UTR에 있는 폴리 A 서열은 20개 내지 200개의 아데노신 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 30개 내지 200개의 아데노신 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 50개 내지 200개의 아데노신 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 80개 내지 200개의 아데노신 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA 분절은 약 180개의 아데노신 핵염기, 또는 약 140개의 아데노신 핵염기, 또는 약 120개의 아데노신 핵염기를 포함하는 폴리 A 꼬리를 가진 3' UTR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 꼬리는 약 122개의 아데노신 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 50개의 아데노신 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 30개의 아데노신 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 꼬리의 아데노신 핵염기는 개재된 비-아데노신 염기와 함께 또는 이러한 비-아데노신 염기 없이 일렬로 배치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-아데노신 핵염기는 폴리 A 꼬리 내로 혼입되고, 이것은 특정 엑소뉴클레아제에 대한 추가 내성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 구축물의 폴리 A 꼬리에서 아데노신의 스트레치는 하나 이상의 비-아데노신(A) 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-A 핵염기는 폴리 A 3' 말단 영역에서 -3, -2, -1 및/또는 +1 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, 비-A 염기는 구아노신(G) 또는 사이토신(C) 또는 우라실 염기(U)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-A 염기는 G이다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 비-A 염기, 예를 들면, GG는 일렬로 존재한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-A 염기를 가진 폴리 A 꼬리의 3' 말단에서의 변형은 폴리 A 꼬리에서 A 염기 적층을 파괴하도록 유도된다. 폴리 A 염기 적층은 다양한 탈아데닐화 효소들에 의한 탈아데닐화에 효과적이므로, -AAAG, -AAAGA 또는 -AAAGGA로 끝나는 폴리의 3' 말단은 탈아데닐화에 대한 안정성 부여에 효과적이다. 일부 유기체에서, 폴리 A 서열에 개재된 GC 서열은 3'-5' 엑소뉴클레아제 매개 붕괴를 효과적으로 보여주는 것으로 확인된다. 본원에서 고려되는 변형은 개재 비-A 잔기, 또는 3' 말단에서 폴리 A 스트레치에 개재된 비-A 잔기 이중체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 3' 말단을 이용하여 엑소뉴클레아제 활성을 효과적으로 정지시키거나 늦추는 삼중체 구조가 3' UTR 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 전술된 변형을 가진 mRNA는 연장된 반감기를 갖고 변형되지 않은 mRNA보다 더 긴 기간에 걸쳐 안정한 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 이상 동안 안정적으로 발현하고, mRNA 또는 이의 단백질 생성물은 생체내에서 검출 가능하다. 일부 실시양태에서, mRNA는 생체내에서 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일까지 검출된다. 일부 실시양태에서, mRNA의 단백질 생성물은 생체내에서 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 20일, 25일 또는 30일까지 검출된다.
circRNA 및 tectoRNA
원형 RNA는 합성 단백질 쇄, 예컨대, 긴 다중 반복 단백질 쇄를 유도하기 위한 메신저 RNA로서 사용되는 안정한 형태의 RNA의 디자인 및 생성에 유용하다. 원형 RNA(circRNA)를 만드는 방법은 거의 없다. 이 방법은 인트론의 두 절반이 전사된 mRNA의 말단에 위치하는 경우 인트론 그 자체가 스플라이싱되고 라이게이션된 생성물을 남기도록 RNA 리가제를 사용하고 분할 자가 스플라이싱 인트론을 사용하는 RNA 말단의 단백질 매개 라이게이션을 포함한다(도 3a). 또 다른 기법은 라이게이션될 RNA 말단이 올리고뉴클레오타이드에 의해 함께 유지될 때 RNA 리가제로서 작용하는 T4 DNA 리가제의 능력에 의존한다. 이 기법들 둘 다가 비효율적이고 다량의 효소를 필요로 한다. 세 번째 기법은 반응을 수행하는 대부분의 인트론 서열들이 원의 일부로 남아 있어야 하는 경우 I군 인트론의 고리화 또는 원형화 활성을 이용한다. I군 인트론은 촉매 코어를 형성하는 일련의 보존된 RNA 줄기 루프를 함유하는 복잡한 2차 및 3차 구조 세트를 공유한다. 이 인트론의 대부분은 시험관내에서 자가 스플라이싱하고 보조 단백질 인자 없이 스플라이싱하여 RNA로서 2개의 라이게이션된 엑손을 형성할 수 있다. I 군 자가 촉매 반응에 의해 생성된 생성물은 (1) 5' 스플라이스 부위에서 다운스트림 엑손의 3' 스플라이스 부위에 라이게이션된 업스트림 엑손 및 (2) 추가 가역적 자가 촉매작용을 거쳐 원형 인트론을 형성할 수 있는 선형 인트론이다. 이러한 고도로 구조화된 큰 핵산 서열의 존재는 그 기법에 의해 원형으로 만들 수 있는 RNA 서열의 유형을 심각하게 제한한다. 또한, 인트론의 촉매 활성이 남아 원형 RNA의 구조와 기능을 방해할 수 있다.
RNA의 말단을 더 가깝게 유지함으로써 반응 속도 및 이에 따른 전반적인 효율을 증가시키는 것이 유용하다. 선행 연구는 상보적인 RNA 서열 3' 및 5'를 mRNA의 말단에 포함시켜, 이 서열들의 하이브리드화 시 mRNA의 말단이 상기 상보적 서열을 갖지 않는 경우에 비해 전반적으로 더 빠른 속도로 라이게이션 또는 자가 스플라이싱 반응을 겪을 수 있도록 더 가까이 인접하게 함으로써 이를 달성하였다. 이들은 원형화 반응의 자가 스플라이싱 버전의 상동성 아암(arm)(도 3a)으로서 지칭된다. 이러한 하이브리드화 전략의 주요 문제점은 상동성 아암 중 어느 하나에 상보적인 서열이 코딩 영역 내에 있는 경우, 하이브리드화가 실제로 스플라이싱 반응을 억제할 것이고 상기 아암이 각각의 새로운 코딩 영역에 대해 최적화될 필요가 있을 것이라는 점이다. 본원에 기재된 이 전략의 대안은 3차원 구조로 접혀 서열과 무관한 안정한 결합 상호작용을 형성하는 RNA 서열의 사용이다.
비-왓슨-크릭 RNA 3차 상호작용을 이용하여 자가 어셈블리를 할 수 있는 RNA 분자로서 정의된 'tectoRNA' 분자 유닛을 구축할 수 있다. 이러한 유형의 3차 상호작용의 이용은 양이온 농도(예를 들면, Mg2+) 및/또는 적합한 온도를 조작하고 모듈식으로 디자인된 '선택제' RNA 분자를 사용함으로써 어셈블리 과정을 제어하고 조절할 수 있게 한다. 1차원 어레이의 자가 어셈블리를 위해, 각각의 나선형 아암에서 상호작용 모듈과 함께 4-방향 연접을 포함하는 기본 모듈식 유닛을 디자인하였다. 일부 실시양태에서, 상호작용 모듈은 GAAA 루프 또는 특정 GAAA 루프 수용체이다. 각각의 tectoRNA는 4개의 루프-수용체 상호작용의 형성을 통해 2개의 다른 tectoRNA와 상호작용할 수 있으며, 2개는 각각의 파트너 분자와 상호작용한다.
일부 실시양태에서, tectoRNA 구조는 적절히 선택되고, 엑손 및 인트론을 포함하는 RNA 내로 통합되어 circRNA를 형성한다. 일부 실시양태에서, 통합은 라이게이션과 같은 잘 알려진 분자생물학 기법에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, tectoRNA는 고온에서 안정한 구조를 형성한다. tectoRNA 구조는 내부 RNA 서열과 경쟁하지 않음으로써, 고효율 원형화 및 스플라이싱을 생성한다.
circRNA는 이전 단락들 중 임의의 단락에 기재된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이것은 테더링(tethering) 또는 수용체 분자를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 수용체는 식세포 수용체 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인트론은 자가 스플라이싱 인트론이다.
일부 실시양태에서, circRNA에 대한 스캐폴딩 영역으로서도 지칭되는, 3차 구조를 가진 말단 영역은 길이가 약 30개 뉴클레오타이드 내지 약 100개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 3차 구조 모티프는 길이가 약 45개 뉴클레오타이드, 약 50개 뉴클레오타이드, 약 55개 뉴클레오타이드, 약 60개 뉴클레오타이드, 약 65개 뉴클레오타이드, 약 70개 뉴클레오타이드 또는 약 75개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 3차 모티프는 고온에서 형성된다. 일부 실시양태에서, 3차 모티프는 안정하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 변형을 갖고 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산 구축물은 생체내로 투여될 때 안정하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 mRNA는 2일 초과, 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과, 8일 초과, 9일 초과, 10일 초과, 11일 초과, 12일 초과, 13일 초과, 14일 초과, 15일 초과, 16일 초과, 17일 초과, 18일 초과, 19일 초과 또는 20일 초과의 시간 동안 생체내에서 안정하다. 일부 실시양태에서, mRNA의 서열에 의해 코딩된 단백질은 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일 초과의 시간 동안 생체내에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA의 서열에 의해 코딩된 단백질은 mRNA가 투여된 후 약 7일 동안 생체내에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA의 서열에 의해 코딩된 단백질은 mRNA가 투여된 후 약 14일 동안 생체내에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA의 서열에 의해 코딩된 단백질은 mRNA가 투여된 후 약 21일 동안 생체내에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA의 서열에 의해 코딩된 단백질은 mRNA가 투여된 후 약 30일 동안 생체내에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA의 서열에 의해 코딩된 단백질은 mRNA가 투여된 후 약 30일 초과의 시간 동안 생체내에서 검출될 수 있다.
일부 양태에서, 역전위의 발현을 향상시키기 위해 세포 내로의 핵산 흡수 또는 혼입을 향상시키는 것이 고려된다. 방법 중 하나는 예를 들면, 플라스미드 벡터 구축물의 경우 형질감염을 통한, 또는 전기천공 또는 핵산 분자를 세포 내로 전달하는 데 적절하게 이용될 수 있는 임의의 다른 수단을 통한 핵산의 혼입을 시작하기 위해 균질한 세포 집단을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 주기 동기화가 추구될 수 있다. 세포 주기 동기화는 특정 공통 표현형에 대해 세포를 분류함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 특정 단계에서 모든 세포들의 세포 주기 진행을 정지시킬 수 있는 시약으로 처리될 수 있다. 예시적인 시약은 www.tocris.com/cell-biology/cell-cycle-inhibitors 또는 www.scbt.com/browse/chemicals-Other-Chemicals-cell-cycle-arresting-compounds와 같은 상업용 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 예를 들면, 몇몇을 나열하자면, G1 기에서 세포 주기를 억제하는 이트라코나졸 또는 노코다졸, 또는 G0/G1 기에서 세포 주기를 정지시키는 시약, 예를 들면, 5-[(4-에틸페닐)메틸렌]-2-티옥소-4-티아졸리디논(화합물 10058-F4)(Tocris Bioscience); 또는 G2M 세포 주기 차단제, 예컨대, G2M, G1 또는 S 기에서 세포 주기를 차단하는 AZD 5438(화학명, 4-[2-메틸-1-(1-메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-N-[4-(메틸설포닐)페닐]-2-피리미딘아민). 사이클로스포린, 하이드록시우레아, 타이미딘은 세포 주기 정지를 야기할 수 있는 잘 알려진 시약이다. 일부 시약은 세포 상태를 비가역적으로 변경시킬 수 있거나 세포에 대한 독성을 나타낼 수 있다. 세포 유형에 따라 전기천공 또는 형질감염 전에 약 2시간 내지 16시간 동안 세포의 혈청 박탈도 세포 동기화를 위한 용이한 가역적 전략일 수 있다.
일부 실시양태에서, 역전위 효율은 본원에 기재된 바와 같은 역전위 구축물에 의해 형질감염되었거나 전기천공된 세포에서 DNA 이중 가닥 절단의 생성을 촉진하고/하거나 DNA 복구 기구를 조절함으로써 증가될 수 있다. 이 기법들의 적용은 이 방법에 의한 핵산 서열의 안정한 혼입을 위해 생체외에서 유전자 조작을 겪을 세포의 최종 용도에 따라 제한될 수 있다. 일부 경우, 혼입된 핵산에 의해 코딩된 단백질 또는 전사체의 강력한 발현이 소정의 시간 동안 결과로서 예상되는 경우 이러한 기법의 이용이 고려될 수 있다. 이중 가닥 절단을 세포에 도입하는 방법은 세포를 짧은 시간 동안 약 0.1 Gy 이하의 조절된 이온화 방사선에 노출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, LINE-1 매개 역전위의 효율은 역전사효소가 작용할 윈도우를 증가시키기 위해 DNA 복구 단백질의 소분자 억제제로 세포를 처리함으로써 증가될 수 있다. DNA 복구 단백질의 예시적인 소분자 억제제는 벤즈아미드(Benzamide)(CAS 55-21-0), 올라파립(Olaparib)(Lynparza)(CAS 763113-22-0), 루카파립(Rucaparib)(Clovis-AG014699, PF-01367338 Pfizer), 니라파립(Niraparib)(MK-827 Tesaro)(CAS 1038915-60-4); 벨리파립(Veliparib)(ABT-888 Abbvie)(CAS 912444-00-9); 캄프토테신(Camptothecin)(CPT)(CAS 7689-03-4); 이리노테칸(Irinotecan)(CAS 100286-90-6); 토포테칸(Topotecan)(Hycamtin® GlaxoSmithKline)(CAS 123948-87-8); NSC 19630(CAS 72835-26-8); NSC 617145(CAS 203115-63-3); ML216(CAS 1430213-30-1); 6-하이드록시DL-도파(CAS 21373-30-8); D-103; D-G23; DIDS(CAS 67483-13-0); B02(CAS 1290541-46-6); RI-1(CAS 415713-60-9); RI-2(CAS 1417162-36-7); 스트렙토니그린(Streptonigrin)(SN)(CAS 3930-19-6)일 수 있다.
III. 핵산 카고:
A. 전이 유전자
한 양태에서, 세포의 게놈 내로 삽입될 이종 핵산 서열인 전이 유전자 또는 비코딩 서열은 mRNA로서 전달된다. mRNA는 약 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9000개, 10,000개 초과의 염기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 길이가 10,000개 초과의 염기일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 길이가 약 11,000개 염기일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 길이가 약 12,000개 염기일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 융합 단백질을 코딩하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 플라스미드로서 전달된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 형질감염에 의해 세포 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 전기천공에 의해 세포 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, 형질감염 또는 전기천공은 세포 내로의 핵산의 혼입을 향상시키기 위해 1회 초과의 빈도로 반복된다.
식세포 또는 테더링 수용체(PR) 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산의 레트로트랜스포존 매개 안정한 통합이 본원에서 고려된다. 일부 실시양태에서, CFP는 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 PR 서브유닛; 및 표적 세포의 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고; 이때 막횡단 도메인과 세포외 도메인은 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 CD5 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 세포외 도메인에 작동 가능하게 연결된 막횡단 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD5 결합 도메인은 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, scFv 도메인 또는 sdAb 도메인과 같은 CD5 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, CD5 결합 도메인은 (i) EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTV(서열번호 63)에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 가변 중쇄(VH) 서열; 및 (ii) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(서열번호 64)에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 가변 경쇄(VL) 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 세포내 도메인을 추가로 포함하고, 이때 세포내 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 세포내 도메인을 포함하는 야생형 단백질은 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 식세포 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcαR 및 Bai1 이외의 수용체로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 FcγR, FcαR 또는 FcεR로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 LYCRRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPP(서열번호 65)에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 전구염증 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 PI3-키나제(PI3K) 동원 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 YEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENM(서열번호 66)에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 CD40의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 KVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ(서열번호 67)에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 68)에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CD8로부터 유래한 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 이때 힌지 도메인은 막횡단 도메인 및 CD5 결합 도메인에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD(서열번호 69)에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 CD5에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함하는 세포외 도메인, 및 CD8로부터 유래한 힌지 도메인; CD28로부터 유래한 힌지 도메인 또는 CD68로부터의 세포외 도메인의 적어도 일부; CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인 또는 CD68 막횡단 도메인; 및 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하고, 이때 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인은 FcγR 또는 FcεR로부터 유래한 제1 세포내 신호전달 도메인, 및 PI3K 동원 도메인을 포함하거나 CD40으로부터 유래한 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 mRNA 또는 circRNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 골수 세포 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 CD14+ 세포, CD14+CD16- 세포, M0 대식세포, M2 대식세포, M1 대식세포 또는 모자이크 골수 세포/대식세포 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다:
Figure pct00010
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다:
Figure pct00011
또는
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 막횡단 단백질, 세포내 단백질 또는 세포내 단백질이다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 이들의 전구체로부터 선택된 면역 세포, 예를 들면, 골수 세포의 기능을 향상시키도록 유도된다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 면역 세포의 세포 기능, 예컨대, 식세포작용을 증강시킨다. 본 개시내용은 기재된 방법 및 조성물을 사용함으로써 발현될 수 있는 전이 유전자에 의해 제한되지 않는다. 이 단락에 표시된 전이 유전자는 예시적이다.
본원은 식세포의 게놈 내로의 안정한 통합을 위한 예시적인 전이 유전자 후보물질을 제공한다. 한 실시양태에서, 전이 유전자는 식세포 수용체(PR) 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산이다. 재조합 핵산은 (i) 막횡단 도메인 및 (ii) 식세포 수용체 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 PR 서브유닛; 및 표적 세포의 항원에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인을 갖고; 이때 막횡단 도메인과 세포외 항원 결합 도메인은 융합된 수용체의 세포외 항원 결합 도메인에 의한 표적에의 항원 결합이 식세포 수용체의 세포내 신호전달 도메인에서 활성화되도록 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 키메라 항원 수용체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(식세포작용)(CAR-P)이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 항-식세포 신호를 잠그기 위한 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 식세포작용을 향상시키는 키메라 단백질이다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 활성 식세포작용 신호 전달도입 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 가진다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 이것이 발현되는 식세포의 염증 잠재력을 향상시킴으로써 식세포 잠재력을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 전이 유전자는 표적 세포에서 항원과의 접촉에 의해 활성화되는 키메라 단백질을 발현하도록 디자인되고, 그 결과 식세포는 표적 세포를 포식하고 표적 세포를 사멸시킨다.
융합 단백질과 관련하여 사용된 용어 "스페이서" 또는 "링커"는 융합 단백질의 단백질 도메인을 연결하는 펩타이드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 스페이서는 단백질 또는 RNA 서열 사이의 어느 정도의 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 연결하거나 보존하는 것 이외에 특정 생물학적 활성을 갖지 않는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 스페이서의 구성 아미노산은 분자의 접힘, 순 전하 또는 소수성과 같은 분자의 일부 성질에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 본 개시내용의 실시양태에서 사용하기에 적합한 링커는 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있고, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로환형 탄소 링커 또는 펩타이드 링커를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 링커는 일부 실시양태에서 각각의 항원성 펩타이드가 적절히 접히는 것을 보장하기에 충분한 거리로 2개의 항원성 펩타이드를 분리하는 데 사용된다. 예시적인 펩타이드 링커 서열은 유연한 확장된 입체구조를 채택하고 정돈된 2차 구조를 발생시키는 경향을 나타내지 않는다. 유연한 단백질 영역의 전형적인 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. Gly, Asn 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 사실상 모든 순열은 링커 서열에 대한 상기 기준을 충족시킬 것으로 예상된다. Thr 및 Ala과 같은 다른 거의 중성 아미노산도 링커 서열에 사용될 수 있다.
식세포의 면역 잠재력을 향상시키기 위해 발현될 수 있는 전이 유전자에 의해 코딩된 다양한 예시적인 단백질들이 이하에 기재되어 있다. 이것은 완전한 목록이 아니라, 본 개시내용의 범위 내에서 전이 유전자 디자인을 위한 예시적인 목록으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, PSP 서브유닛은 식세포 수용체의 막횡단(TM) 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, PSP 서브유닛은 식세포 수용체의 ICD 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산에 의해 코딩된 ICD는 렉틴(lectin), 덱틴(dectin) 1, 만노스 수용체(CD206), 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L) 및 CD169 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ICD는 렉틴, 덱틴 1, 만노스 수용체(CD206), 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO(콜라겐 구조를 가진 대식세포 수용체, 별칭: SRA6, SCARA2), CD36(트롬보스폰딘 수용체, 별칭: 스캐빈저 수용체 클래스 B, 구성원 3), CD163(스캐빈저 수용체, 시스테인 풍부 1형), MSR1, SCARA3, COLEC12(별칭: C형 렉틴을 가진 스캐빈저 수용체, SCARA4, 또는 콜렉틴 12), SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68(SCARD, 마이크로시알린), OLR1(산화된 저밀도 지단백질 수용체 1, LOX1 또는 C형 렉틴 도메인 패밀리 8 구성원 A), SCARF1, SCARF2, SRCRB4D, SSC5D 및 CD169(별칭: 시알로어드헤신 수용체, SIGLEC1) 중 어느 하나 이상으로부터 유래한 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 예를 들면, 인간 MARCO의 세포내 도메인을 코딩한다. PSR 서브유닛은 아미노산 서열 MRNKKILKEDELLSETQQAAFHQIAMEPFEINVPKPKRRNGVNF(서열번호 73)를 가진 인간 MARCO의 44개 아미노산 ICD를 가진 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PSR 서브유닛은 MARCO의 세포내 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들면, PSR(식세포 스캐빈저 수용체)은 인간 MARCO의 막횡단 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 인간 SRA1의 세포내 도메인을 코딩한다. PSR 서브유닛은 아미노산 서열 MEQWDHFHNQQEDTDSCSESVKFDARSMTA LLPPNPKNSPSLQEKLKSFK(서열번호 74)를 가진 인간 SRA1의 50개 아미노산 ICD를 가진 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PSR 서브유닛은 인간 SRA1의 세포내 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 변이체를 포함한다. SRA의 세포내 영역은 인산화 부위를 가진다.
일부 실시양태에서, PSR은 인간 SRA1의 막횡단 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들면, 재조합 핵산은 CD36의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 CD36의 TM 도메인을 포함한다. 천연 생성 전체 길이 CD36은 2개의 TM 도메인과 2개의 짧은 세포내 도메인을 갖고, CD36의 세포외 도메인은 산화된 LDL에 결합한다. 세포내 도메인 둘 다가 지방산 아실화된 시스테인 쌍을 함유한다. 이것은 공지되어 있는 신호전달 도메인(예를 들면, 키나제, 포스파타제, g-단백질 결합 또는 스캐폴딩 도메인)을 결여한다. N-말단 세포질 도메인은 매우 짧고(5개 내지 7개의 아미노산 잔기) 원형질막의 내부 소엽과 밀접하게 연관되어 있다. 카르복시 말단 도메인은 신호전달 분자와 상호작용하는 것으로 알려진, CD4 및 CD8의 세포내 도메인 내의 영역에 상동한 CXCX5K 모티프를 함유하는 13개의 아미노산을 함유한다. CD36의 세포내 도메인은 lyn 키나제, MAP 키나제 및 국소 부착 키나제(FAK)를 활성화시키는 신호전달 복합체를 어셈블리할 수 있고 src 상동성 2-함유 포스포티로신 포스파타제(SHP-2)를 불활성화시킬 수 있다. 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(GEF)의 구성원은 잠재적 핵심 신호전달 중간체로서 확인되었다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 예를 들면, 인간 SCARA3의 세포내 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, PSR 서브유닛은 인간 SCARA3의 세포내 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PSR은 SCRA3의 TM 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TM 도메인은 길이가 약 20개 내지 30개 아미노산이다.
스캐빈저 수용체는 동종이량체 또는 이종이량체로서 존재할 수 있다. 예를 들면, MARCO는 동종삼량체로서 존재한다.
일부 실시양태에서, PSP의 TM 도메인 또는 ICD 도메인은 FcR, Megf10, Bai1 또는 MerTK로부터 유래하지 않는다. 일부 실시양태에서, PSR의 ICD는 CD3 제타 세포내 도메인을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인 및 막횡단 도메인은 FcR 베타로부터 유래한다.
한 양태에서, 재조합 핵산은 (a) 표적 세포의 항원에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 재조합 PSR 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 식세포 스캐빈저 수용체(PSR) 융합 단백질(CFP)인, 향상된 식세포작용을 위한 키메라 항원성 수용체(CAR-P)를 코딩하고, 이때 재조합 PSR 세포내 신호전달 도메인은 식세포로부터 유래한 제1 부분 및 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 부분은 PI3K 동원 도메인이 아니다. 일부 실시양태에서, 제2 부분은 PI3K 동원 도메인이다.
비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분은 재조합 핵산을 발현하는 조작된 식세포의 식세포작용 및/또는 염증 잠재력을 향상시키는 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분은 하나 초과의 세포내 도메인(ICD)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분은 제2 ICD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분은 제2 및 제3 ICD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분은 제2, 제3 및 제4 ICD를 포함하고, 이때 제2 부분은 재조합 핵산에 의해 코딩된다. 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2, 제3 또는 제4 ICD를 포함하는 각각의 제2 부분은 다음과 같이 기재된다.
세포내 신호전달 및 염증 활성화를 향상시키는 키메라 항원 수용체
한 양태에서, 재조합 핵산은 식세포 ICD 이외에, 예컨대, 대식세포가 감염과 싸울 때, 강력한 전구염증 면역 활성화 능력을 부여하는 제2 세포내 도메인을 코딩한다. 제2 세포내 도메인(제2 ICD)은 제1 식세포 ICD의 세포질 말단에 융합된다. 제2 세포내 도메인은 인플라마좀(inflammasome) 및 전구염증 신호를 유발하는 데 필요한 제2 신호를 제공한다. Nod 유사 수용체(NLR)는 선천성 면역 반응에서 활성화되는 수용체의 서브세트이고, 올리고머화하여 다중단백질 복합체를 형성하고, 이 다중단백질 복합체는 전구염증 캐스파제를 동원하고 이의 절단 및 활성화를 유도하는 플랫폼으로서 사용된다. 이것은 ROS의 직접적인 활성화로 이어지고, 종종 파이롭토시스(pyroptosis)로서 공지되어 있는 격렬한 세포 사멸을 초래한다. 4개의 인플라마좀 복합체들인 NLRP1m, NLRP3, IPAF 및 AIM2가 존재한다.
종양 미세환경(TME)은 면역억제 환경을 구성한다. IL-10, 글루코코르티코이드 호르몬, 아폽토시스 세포 및 면역 복합체의 영향은 선천성 면역 세포 기능을 방해할 수 있다. 식세포를 포함하는 면역 세포는 면역관용 표현형으로 정착된다. 대식세포에서, 통상적으로 M2 표현형으로서도 공지되어 있는 이 표현형은 대식세포가 강력하고 병원체를 사멸시킬 수 있는 M1 표현형과 구별된다. 예를 들면, LPS 또는 IFN-감마에 노출된 대식세포는 M1 표현형을 향해 분극화될 수 있는 반면, IL-4 또는 IL-13에 노출된 대식세포는 M2 표현형을 향해 분극화될 것이다. LPS 또는 IFN-감마는 대식세포 표면의 Toll 유사 수용체 4(TLR4)와 상호작용하여 Trif 및 MyD88 경로를 유도함으로써, 전사 인자 IRF3, AP-1 및 NFKB의 활성화를 유도하여, 전구염증 M1 대식세포 반응에 필요한 TNF 유전자, 인터페론 유전자, CXCL10, NOS2, IL-12 등을 활성화시킬 수 있다. 유사하게, IL-4 및 IL-13은 IL-4R에 결합하여, 소염 반응(M2 반응)과 관련된 유전자인 CCL17, ARG1, IRF4, IL-10, SOCS3 등의 발현을 조절하는 Jak/Stat6 경로를 활성화시킨다. CD14, CD80, D206의 발현 및 CD163의 낮은 발현은 M1 표현형을 향한 대식세포 분극화의 지표이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 염증 반응을 위한 세포질 도메인을 포함하는 하나 이상의 추가 세포내 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 조작된 대식세포에서 염증 반응을 위한 세포질 도메인을 포함하는 식세포 수용체(PR) 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산의 발현은 M1 표현형과 유사한 강력한 전구염증 반응을 부여한다.
일부 실시양태에서, 염증 반응을 위한 세포질 도메인은 TLR3, TLR4, TLR9, MYD88, TRIF, RIG-1, MDA5, CD40, IFN 수용체, NLRP-1 내지 NLRP-14, NOD1, NOD2, 피린, AIM2, NLRC4, CD40의 신호 전달도입 도메인 또는 영역일 수 있다.
일부 실시양태에서, 식세포 스캐빈저 수용체(PSR) 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산의 발현은 IL-1 신호전달 캐스케이드의 활성화를 위한 전구염증 세포질 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체(예를 들면, 식세포 수용체(PR) 융합 단백질(CFP))의 세포질 부분은 Toll 유사 수용체의 세포질 도메인, 예컨대, Toll 유사 수용체 3(TLR3), Toll 유사 수용체 4(TLR4), Toll 유사 수용체 7(TLR7), Toll 유사 수용체 8(TLR8), Toll 유사 수용체 9(TLR9)의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 인터류킨-1 수용체 관련 키나제 1(IRAK1)의 적합한 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 분화 1차 반응 단백질(MYD88)의 적합한 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 미엘린 및 림프구 단백질(MAL)의 적합한 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 레티노산 유도성 유전자(RIG-1)의 적합한 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, PSR의 막횡단 도메인은 MYD88, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9, MAL, IRAK1 단백질들 중 어느 한 단백질의 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 PSR 세포내 신호전달 도메인은 식세포로부터 유래한 제1 부분 및 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분을 포함하고, 이때 비-식세포 수용체로부터 유래한 제2 부분은 인산화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 자가인산화 부위에 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 Src 패밀리 키나제에 의한 인산화에 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 인산화 시 키나제의 SH2 도메인에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제 도메인은 제1 세포질 부분 이외에 CFP의 세포질 말단에서 융합된다. 일부 실시양태에서, 인산화는 티로신 인산화이다.
일부 실시양태에서, 제2 세포내 도메인은 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)이다. ITAM 모티프는 포유동물 α 및 β 면역글로불린 단백질, TCR γ 수용체, FCR γ 수용체 서브유닛, CD3 쇄 수용체 및 NFAT 활성화 분자에 존재한다.
일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 1개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 1개 초과의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 2개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 3개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 5개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 6개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 7개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 8개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 9개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP 세포내 도메인은 10개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 식세포 ICD 내의 하나 이상의 도메인은 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 ICD 내의 하나 이상의 도메인은 키나제 결합 도메인의 향상, 인산화 부위의 생성, SH2 도킹 부위의 생성 또는 이들의 조합을 위해 돌연변이를 포함한다.
염증 유전자의 공발현
한 양태에서, 재조합 핵산은 조작된 세포에서 CFP와 공발현되는, 전구염증 유전자에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 유전자는 사이토카인이다. 예는 TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, CSF, GMCSF, 또는 IL-12 또는 인터페론을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
전구염증 유전자를 코딩하는 재조합 핵산은 모노시스트론일 수 있고, 이때 (a) PSP 및 (b) 전구염증 유전자에 대한 2개의 코딩 서열은 독립적인 발현을 위해 전사 후 또는 번역 후 절단된다.
일부 실시양태에서, 상기 2개의 코딩 서열은 예를 들면, P2A 서열을 코딩하는 자가 절단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 2개의 코딩 영역은 IRES 부위에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 상기 2개의 코딩 서열은 바이시스트론 유전 요소에 의해 코딩된다. (a) PSP 및 (b) 전구염증 유전자에 대한 코딩 영역은 단방향적일 수 있고, 이때 각각은 별도의 조절 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 이들 둘 다에 대한 코딩 영역은 양방향적일 수 있고 반대 반향으로 유도된다. 각각의 코딩 서열은 별도의 조절 제어 하에 있다.
전구염증 유전자의 공발현은 대식세포의 강한 염증 자극을 부여하고 염증을 위해 주변 조직을 활성화시키도록 디자인된다.
인테그린 활성화 도메인
세포-세포 및 세포-기질 부착은 인테그린 세포외 도메인과 다양한 단백질 리간드들의 결합에 의해 매개되나; 이 부착 상호작용 및 동적 세포 반응, 예컨대, 세포 확산 또는 이동으로의 이의 번역의 세포 조절은 인테그린 세포질 꼬리를 요구한다. 이 짧은 꼬리는 수용체를 신호전달 경로 및 세포골격 네트워크에 연결하는 세포내 리간드에 결합한다(Calderwood DA, 2004, Integrin Activation, Journal of Cell Science 117, 657-666). 인테그린은 α 서브유닛과 β 서브유닛의 비-공유 회합에 의해 형성된 이종이량체 부착 수용체이다. β4 서브유닛을 제외한 각각의 서브유닛은 비교적 큰 세포외 도메인 및 짧은 세포질 꼬리를 가진 I형 막횡단 당단백질이다. 개별 인테그린 패밀리 구성원은 다수의 리간드들을 인식하는 능력을 가진다. 인테그린은 많은 수의 세포외 매트릭스 단백질들(골 매트릭스 단백질, 콜라겐, 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴 및 폰 빌레브란트 인자)에 결합할 수 있고, 이것은 세포외 매트릭스에의 세포 부착에 있어서 인테그린의 주요 기능을 반영한다. 많은 "반대 수용체들"은 리간드이고, 이것은 세포-세포 상호작용을 매개하는 데 있어서 인테그린의 역할을 반영한다. 인테그린은 리간드 친화성을 증가시키기 위해 입체구조적 변화를 겪는다.
인테그린 β2 서브패밀리는 4개의 상이한 인테그린 수용체인 αMβ2(CD11b/CD18, Mac-1, CR3, Mo-1), αLβ2(CD11a/CD18, LFA-1), αXβ2(CD11c/CD18) 및 αDβ2(CD11d/CD18)로 구성된다. 이 백혈구 인테그린들은 면역 반응, 내피에의 부착 및 내피 관통, 병원체의 식세포작용 및 백혈구 활성화를 포함하는 백혈구 기능의 사실상 모든 양태에 관여한다.
모든 β2 인테그린의 α 서브유닛은 I 또는 A 도메인으로서 지칭되는 약 200개 아미노산의 삽입된 영역을 함유한다. 고도로 보존된 I 도메인은 여러 다른 인테그린 α 서브유닛 및 다른 단백질, 예컨대, 특정 응고 및 보체 단백질에서 발견된다. I 도메인은 단백질-단백질 상호작용을 매개하고, 인테그린에서는 단백질 리간드의 결합에 통합적으로 관여한다. I 도메인이 그의 인테그린의 리간드 결합 기능을 지배하지만, α 서브유닛의 다른 영역은 리간드 인식에 영향을 미친다. 예로서, mAb(OKM1)는 αMβ2에서 I 도메인 외부의 에피토프를 인식하나, αM 서브유닛에서는 리간드 결합을 억제하고; α 서브유닛에서 I 도메인을 가진 인테그린인 αLβ2 및 α2β1에서 EF-핸드(hand) 영역은 리간드 인식에 기여한다. αM 서브유닛 및 아마도 다른 α 서브유닛은 비-단백질 리간드의 개입에 관여하는 렉틴 유사 도메인을 함유하고, 점유는 I 도메인의 기능을 조절할 수 있다.
인테그린은 효소 활성을 결여하기 때문에, 대신에 신호전달은 원형질막의 세포질 면에서의 신호전달 복합체의 어셈블리에 의해 유도된다. 이 복합체의 형성은 두 가지 방식; 첫째, 분자 상호작용의 결합력을 증가시켜 이펙터 분자의 결합 속도를 증가시키는 수용체 클러스터링, 및 둘째, 이펙터 결합 부위를 생성하거나 노출시키는 수용체의 입체구조적 변화의 유도에 의해 달성된다. ECM 내에서, 인테그린은 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 테나신, 비트로넥틴 및 트롬보스폰딘에 결합하는 능력을 가진다. 인테그린/ECM 상호작용의 클러스터는 국소 부착을 형성하여, 세포 내에서 세포골격 성분 및 신호전달 분자를 집중시킨다. 인테그린의 세포질 꼬리는 F-액틴을 막에 고정시키는 데 관여하는 단백질인 빈쿨린(vinculin)을 동원하는 α-액티닌(actinin)과 탈린(talin)에 대한 결합 부위로서 사용된다. 탈린은 단백질 키나제 C(PKCα)와 같은 키나제에 의해 활성화된다.
인테그린은 셀렉틴에 의해 활성화된다. 백혈구는 L-셀렉틴을 발현하고, 활성화된 혈소판은 P-셀렉틴을 발현하고, 활성화된 내피 세포는 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴을 발현한다. P-셀렉틴 매개 부착은 β2 인테그린의 케모카인 또는 혈소판 활성화 인자 유발 활성화를 가능하게 하여, 부착을 안정화시킨다. 또한, 이것은 부착 백혈구로부터의 케모카인의 방출을 용이하게 한다. P-셀렉틴 당단백질 리간드 1의 세포질 도메인은 Nef 관련 인자 1과 함께 항시성 복합체를 형성하였다. P-셀렉틴의 결합 후, Src 키나제는 포스포이노시타이드-3-OH 키나제 p85-p110δ 이종이량체를 동원하고 백혈구 인테그린을 활성화시키는 Nef 관련 인자 1을 인산화하였다. E-셀렉틴 리간드는 β2 인테그린 기능에도 영향을 미치는 신호를 전달도입한다. 셀렉틴은 Src 패밀리 키나제의 활성화를 유발한다. 셀렉틴 개입에 의해 활성화된 SFK는 DAP12 및 FcRγ의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 인산화한다. 일부 양태에서, CD44는 E-셀렉틴으로부터 신호를 전달도입하기에 충분하다. CD44는 인테그린의 내부-외부 신호전달을 유발한다. 인테그린 활성화의 마지막 공통 단계는 탈린과 β 서브유닛의 세포질 꼬리의 결합이다. 세포질 어댑터의 또 다른 기인 킨들린(Kindlin)은 인테그린 β 꼬리의 상이한 영역에 결합한다. 킨들린은 탈린에 의해 활성화된 인테그린의 클러스터링을 증가시킨다. 킨들린은 셀렉틴 신호전달에 반응하나, 킨들린은 주로 호중구와 같은 조혈 세포에서 발견된다. 케모카인 성분에 의한 인테그린 활성화 시 신호전달뿐만 아니라 셀렉틴 신호전달도 SFK, Syk 및 SLP-76을 비롯한 성분을 공유한다.
일부 실시양태에서, 재조합 PSR 융합 단백질의 세포내 도메인은 인테그린 활성화 도메인을 포함한다. 인테그린 활성화 도메인은 셀렉틴, 예를 들면, P-셀렉틴, L-셀렉틴 또는 E-셀렉틴의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 PSR 융합 단백질의 세포내 도메인은 라미닌의 인테그린 활성화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 PSR 융합 단백질의 세포내 도메인은 탈린의 활성화를 위해 인테그린 활성화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 PSR 융합 단백질의 세포내 도메인은 식세포 수용체 ICD 도메인의 세포질 말단에 융합된 인테그린 활성화 도메인을 포함한다.
항원 교차제시를 향상시키는 키메라 수용체
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 항원의 교차제시를 가능하게 하는 도메인을 코딩한다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 세포 내에서 합성되는 자가 또는 병원체 유래 항원을 제시하는 반면, 세포내이입 흡수를 통해 유래한 외생성 항원은 CD4+ T 세포에게 제시되기 위해 MHC 클래스 II 분자에 로딩된다. 펩타이드가 프로테아좀에 의해 생성되는 내생성 항원의 MHC I 제한 제시. 그러나, 일부 경우, DC는 CD8+ T 세포에게 제시하기 위해 외생성 항원을 MHC-I 경로로 처리할 수 있다. 이것은 항원의 교차제시로서 지칭된다. 가용성 또는 외생성 항원 성분은 세포내이입 경로를 따르는 대신에 액포 내의 라이소좀 프로테아제에 의해 분해될 수 있고 DC에 의해 교차제시될 수 있다. 일부 경우, 열 충격 단백질 90(Hsp90)과 같은 샤페론은 특정 APC에 의한 항원의 교차제시를 돕는 것으로 밝혀졌다. HSP-펩타이드 복합체는 유리 폴리펩타이드에 비해 상이한 수용체 군에 의해 내재화되는 것으로 공지되어 있다. 이 수용체는 스캐빈저 수용체 패밀리의 수용체이고, LOX-1, SREC-I/SCARF-I 및 FEEL1/스타빌린(Stabilin)-1을 포함한다. SREC-1 및 LOX-1 둘 다가 분자 샤페론 결합 항원의 교차제시를 매개하고 CD8+ T 림프구의 활성화를 유발하는 것으로 확인되었다.
SREC-1(내피 세포에 의해 발현된 스캐빈저 수용체)은 다른 유형의 스캐빈저 수용체와 유의미한 상동성을 갖지 않지만 독특한 도메인 구조를 가진다. 이것은 세포외 도메인에서 EGF 유사 시스테인 풍부 모티프의 10개 반복부를 함유한다. 최근에, SREC-I의 구조는 아폽토시스 세포를 인식하는 세포 표면 식세포 수용체로서 작용하는, 캐노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 유전자 ced-I에 의해 코딩된 16개의 EGF 유사 반복부를 가진 막횡단 단백질의 구조와 유사한 것으로 밝혀졌다.
클래스-I MHC 경로를 통한 암 항원의 교차제시는 세포독성과 관련되어 있으므로 종양 퇴행에 유리한 CD8+ T 세포 반응을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, CFP의 세포내 도메인은 SREC1 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 세포내 도메인은 SRECII 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, PSR 서브유닛은 SREC1 또는 SRECII로부터의 PSR 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, PSR 서브유닛은 (i) 막횡단 도메인, 및 (ii) SREC1 또는 SRECII로부터의 PSR 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, PSR 서브유닛은 (i) 막횡단 도메인, (ii) PSR 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인, 및 (iii) SREC1 또는 SRECII로부터의 세포외 도메인을 포함한다.
CFP 융합 단백질의 막횡단 도메인
일부 실시양태에서, 재조합 핵산에 의해 코딩된 TM은 스캐빈저 수용체(SR)의 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TM은 렉틴, 덱틴 1, 만노스 수용체(CD206), SRA1, MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, SRCRB4D, SSC5D 및 CD169 중 어느 하나 이상의 수용체의 TM 도메인일 수 있거나 이러한 수용체로부터 유래할 수 있다.
일부 실시양태에서, TM 도메인은 길이가 약 20개 내지 30개 아미노산이다. SR의 TM 도메인은 길이가 약 20개 내지 30개 아미노산이다.
PSP의 TM 도메인 또는 ICD 도메인은 Megf10, Bai1 또는 MerTK로부터 유래하지 않는다. PSR의 ICD는 CD3 제타 세포내 도메인을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, TM은 ICD와 동일한 식세포 수용체로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, TM 영역은 원형질막 단백질로부터 유래한다. TM은 Fc 수용체(FcR)로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 FcR의 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 구축물의 세포 특이적 발현에 사용된다. TM 도메인을 포함하는 FCR 알파 영역은 구축물의 대식세포 특이적 발현에 사용될 수 있다. FcRβ 재조합 단백질은 비만 세포에서 발현된다.
일부 실시양태에서, CFP는 FCR 베타(FcRβ)의 TM을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 FcRβ TM 및 ICD 도메인 둘 다를 포함한다.
일부 실시양태에서, TM 도메인은 CD8로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, TM은 CD2로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, TM은 FCR 알파로부터 유래한다.
CFP 융합 단백질의 세포외 도메인
세포외 도메인은 표적 세포의 하나 이상의 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 표적 결합 도메인은 표적에 특이적이다. 세포외 도메인은 인트라바디, 펩티바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, SMIP 및 다중특이적 항체로부터 선택된 항체 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 Fab 결합 도메인을 포함한다. 다른 이러한 실시양태에서, 세포외 도메인은 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 이들 중 임의의 분자의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 유래한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 이들 중 임의의 분자의 기능적 단편은 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항원은 암 항원이고, 표적 세포는 표적 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 암 세포에 대한 항원은 CD3, CD4, CD5, CD7, CD19, CCR2, CCR4, CD30, CD37, TCRB1/2, TCR□□, TCR□□, CD22, HER2(ERBB2/neu), 메소텔린(Mesothelin), PSCA, CD123, CD30, CD171, CD138, CS-1, CLECL1, CD33, CD79b, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, PSMA, ROR1, FLT3, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3(CD276), KIT(CD117), CD213A2, IL-1 IRa, PRSS21, VEGFR2, CD24, MUC-16, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제(Prostase), PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, FAP, EphA2, GM3, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CD97, CD179a, ALK 및 IGLL1로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 암 항원 표적들은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 암 항원들로부터 선택될 수 있다. 관련된 암 및 세포 유형에 따라, 암 항원은 돌연변이된 천연 단백질이다. 항원 결합 도메인은 천연 항원이 아닌 돌연변이된/암 항원에 대한 특이성에 대해 스크리닝된다.
일부 실시양태에서, 예를 들면, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 하기 돌연변이된/암 항원들 중 하나 이상일 수 있다: MUC16, CCAT2, CTAG1A, CTAG1B, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, PRAME, PCA3, MAGEC1, MAGEC2, MAGED2, AFP, MAGEA8, MAGE9, MAGEA11, MAGEA12, IL13RA2, PLAC1, SDCCAG8, LSP1, CT45A1, CT45A2, CT45A3, CT45A5, CT45A6, CT45A8, CT45A10, CT47A1, CT47A2, CT47A3, CT47A4, CT47A5, CT47A6, CT47A8, CT47A9, CT47A10, CT47A11, CT47A12, CT47B1, SAGE1 및 CT55.
일부 실시양태에서, 예를 들면, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 하기 돌연변이된/암 항원들 중 하나 이상일 수 있고, 이때 암은 T 세포 림프종이다: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20, CD30, CD45, CD56.
일부 실시양태에서, 예를 들면, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 하기 돌연변이된/암 항원들 중 하나 이상일 수 있고, 이때 암은 교모세포종이다: IDH1, ATRX, PRL3 또는 ETBR.
일부 실시양태에서, 예를 들면, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 하기 돌연변이된/암 항원들 중 하나 이상일 수 있고, 이때 암은 난소암이다: CA125, 베타-hCG, 비뇨기 고나도트로핀 단편, AFP, CEA, SCC, 인히빈(inhibin) 또는 엑스트라디올(extradiol).
일부 실시양태에서, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 HER2일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 EGFR 변이체 III일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 CD19일 수 있다.
일부 실시양태에서, SR 서브유닛 영역은 스캐빈저 수용체의 세포외 도메인(ECD)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐빈저 수용체의 ECD는 ICD 및 TM 도메인을 포함하는 SR의 ECD 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, SR-ECD는 식세포와 표적 세포의 결합에 기여하고, 그 다음 활성화되고, 표적 세포의 식세포작용을 활성화시킨다.
일부 실시양태에서, PSR 도메인은 PSR에 혼입된 ICD 및 TM 도메인을 가진 각각의 스캐빈저 수용체의 ECD 도메인 또는 이의 일부를 임의적으로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재조합 핵산에 의해 코딩된 ECD는 렉틴, 덱틴 1, 만노스 수용체(CD206), 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L) 및 CD169 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 포함한다. 대부분의 대식세포 스캐빈저 수용체들의 세포외 도메인은 외래 물질의 비특이적 항체 독립적 인식에 있어서 자가와 비-자가를 구별하는 데 사용될 수 있는 광범위한 결합 특이성을 가진 스캐빈저 수용체를 함유한다. I형 및 II형 클래스 A 스캐빈저 수용체들(SR-AI1 및 SR-AII)은 작은 NH2-말단 세포내 도메인, 및 짧은 스페이서 도메인, α-나선형 코일드-코일 도메인 및 삼중 나선형 콜라겐 도메인을 함유하는 세포외 부분을 가진 삼량체 막 당단백질이다. I형 수용체는 시스테인 풍부 COOH 말단(SRCR) 도메인을 추가로 함유한다. 이 수용체들은 신체 전체에 걸쳐 다양한 조직들에서 대식세포에 존재하고 비정상적으로 광범위한 리간드 결합 특이성을 나타낸다. 이들은 변형된 LDL과 같은 화학적으로 변형된 단백질을 포함하는 매우 다양한 다중음이온에 결합하고, 죽상형성 동안 콜레스테롤 침착에 관여한다. 이들은 대식세포 관련 숙주 방어 및 염증 상태의 세포 부착 과정에서 역할을 할 수도 있다.
일부 실시양태에서, SR ECD는 전구아폽토시스 세포에 결합하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 스캐빈저 수용체 ECD는 암 세포 또는 감염된 세포의 세포 표면 분자에 대한 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, PR 서브유닛의 세포외 도메인은 링커에 의해 표적 세포 결합 도메인, 예컨대, 암 항원에 특이적인 항체 또는 이의 일부에 연결된다.
일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 하나 초과의 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 scFv이다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 세포외 도메인에서 재조합 PR에 융합된다. 일부 실시양태에서, PR의 결합 도메인(예를 들면, scFv)과 세포외 도메인은 링커를 통해 연결된다.
일부 실시양태에서, ECD 항원 결합 도메인은 세포내 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 항원은 암 항원이다.
일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 1000 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 500 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 450 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 400 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 350 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 250 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 200 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 100 nM 미만의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 200 nM 내지 1000 nM의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 300 nM 내지 1.5 mM의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 > 200 nM, > 300 nM 또는 > 500 nM의 친화성으로 표적 리간드에 결합한다.
펩타이드 링커
일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인인 scfv는 링커에 의해 TM 도메인 또는 다른 세포외 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인에서 하나 초과의 scfv가 있는 경우, 하나 초과의 scfv는 링커에 의해 서로 연결된다.
일부 실시양태에서, 링커는 유연하다. 일부 실시양태에서, 링커는 힌지 영역을 포함한다. 링커는 통상적으로 짧은 펩타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신 및 하나 이상의 세린 잔기의 스트레치이다. 짧은 펩타이드 링커에 바람직한 다른 아미노산은 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 프롤린(Pro), 글리신(Gly), 아스파르트산(Asp), 라이신(Lys), 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 페닐알라닌(Phe) 및 글루탐산(Glu)을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 이들 중 Pro, Thr 및 Gln은 천연 링커를 위해 자주 사용되는 아미노산이다. Pro은 매우 제한된 입체구조를 야기하는 환형 측쇄를 가진 독특한 아미노산이다. Pro 풍부 서열은 피루베이트 데하이드로게나제에서 리포일과 E3 결합 도메인 사이의 링커를 비롯한 도메인간 링커로서 사용된다(GA2PA3PAKQEA3PAPA2KAEAPA3PA2KA(서열번호 75)). 본 개시내용의 목적을 위해, 경험적 링커는 유연성 링커, 강성 링커 및 절단 가능한 링커일 수 있다. (G4S)x(서열번호 76)(이때, x는 1, 2, 3, 4 등으로서 표기된, 모이어티의 다중 카피임)와 같은 서열은 유연성 링커 서열을 포함한다. 본원에서 사용된 다른 유연성 서열은 글리신의 여러 반복부, 예를 들면, (Gly)6(서열번호 77) 또는 (Gly)8(서열번호 78)을 포함한다. 다른 한편으로, 강성 링커, 예를 들면, 링커(EAAAK)x(서열번호 79)가 사용될 수 있고, 이때 x는 강성 링커를 생성하는 1, 2, 3, 4 등의 정수이다.
일부 실시양태에서, 링커는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 4개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 5개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 6개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 7개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 8개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 9개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 8개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 10개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 11개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 12개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 13개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 14개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 15개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 16개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 17개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 18개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 19개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 20개의 아미노산을 포함한다.
본원에서 고려되는 바와 같이, 임의의 적합한 ECD, TM 또는 ICD 도메인은 내생성 수용체에 비해 향상된 식세포작용을 가진 단백질을 수득하기 위해 본 개시내용에 기재된 CARP 수용체들 중 어느 한 수용체의 적합한 부분에서 교환 가능하게 클로닝될 수 있다.
융합 단백질의 특성:
CFP는 이를 발현하는 세포의 세포막 내로 구조적으로 혼입될 수 있다. 핵산 구조물의 특정 리더 서열, 예컨대, 신호 펩타이드를 사용하여 코딩된 단백질의 원형질막 발현을 유도할 수 있다. 구축물에 의해 코딩된 막횡단 도메인은 발현된 단백질을 세포의 원형질막 내로 혼입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 대식세포에서 내생성 FcR 감마 수용체와 이량체화하여 대식세포 특이적 발현을 보장하는 FcR 알파 수용체의 TM 도메인을 포함한다.
CFP는 이를 발현하는 세포를 강력한 식세포로 만들 수 있다. CFP를 코딩하는 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 재조합 핵산을 발현하지 않는 세포에 비해 표적 세포의 항원을 가진 표적 세포의 증가된 식세포작용을 나타낼 수 있다. 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 재조합 핵산을 발현하지 않는 세포에 비해 표적 세포의 항원을 가진 표적 세포의 증가된 식세포작용을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 재조합 핵산을 발현하지 않는 세포에 비해 표적 세포의 항원을 가진 표적 세포의 적어도 2배 증가된 식세포작용을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 재조합 핵산을 발현하지 않는 세포에 비해 표적 세포의 항원을 가진 표적 세포의 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 또는 적어도 5배 증가된 식세포작용을 나타낸다.
일부 실시양태에서, SIRP-ΔICD의 발현은 이를 발현하는 세포의 식세포작용을, SIRP-ΔICD를 발현하지 않는 세포에 비해 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상 향상시킨다.
일부 실시양태에서, SIRP-ΔICD와 본원에 기재된 식세포 수용체를 코딩하는 CFP를 공발현하는 세포는 이 단백질들 중 어느 하나를 발현하지 않는 세포에 비해 증강된 식세포작용을 나타낸다. 일부 실시양태에서, SIRP-ΔICD와 본원에 기재된 식세포 수용체를 코딩하는 CFP의 공발현은 SIRP-ΔICD 또는 식세포 수용체를 코딩하는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 (식세포 지수의 배수 변화로 측정된) 식세포 잠재력의 2배 초과, 3배 초과, 4배 초과, 5배 초과, 6배 초과, 7배 초과, 8배 초과, 9배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 150배 초과 또는 200배 초과의 증가를 나타낸다.
일부 실시양태에서, SIRPα의 세포외 도메인 및 식세포 수용체의 세포내 도메인을 차단하는 CD47을 발현하는 CFP 중 어느 하나의 발현은 이를 발현하는 세포의 식세포 활성을, CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 또는 SIRP-ΔICD를 발현하는 세포에 비해 적어도 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상 증강시킨다.
일부 실시양태에서, SIRP-ΔICD를 발현하는 세포에 의한 표적 세포의 식세포작용의 향상은 SIRP-ΔICD를 발현하지 않는 식세포에 비해 크게 증가된다.
일부 실시양태에서, SIRPα의 세포외 도메인 및 식세포 수용체의 세포내 도메인을 차단하는 CD47을 포함하는 CFP를 발현하는 세포에 의한 표적 세포의 식세포작용의 향상은 융합 단백질을 발현하지 않는 대조군 식세포 또는 SIRP-ΔICD를 발현하는 대조군 식세포에 비해 크게 증가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 증가된 사이토카인 생성을 나타낸다. 사이토카인은 IL-1, IL-6, IL-12, IL-23, TNF, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-18, IL-23, IL-27 및 인터페론 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 증가된 세포 이동을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 증가된 면역 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 MHC II의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 CD80의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 CD86의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 증가된 iNOS 생성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산이 세포에서 발현될 때, 세포는 재조합 핵산을 발현하지 않는 세포에 비해 표적 세포의 항원을 발현하는 표적 세포의 감소된 트로고사이토시스(trogocytosis)를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 글리코실화될 수 있고/있거나, 페길화될 수 있고/있거나 다른 방식으로 번역 후 변형될 수 있다. 추가 실시양태에서, 글리코실화, 페길화, 및/또는 다른 번역 후 변형은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있고/있거나 화학적 기법을 이용함으로써 수행될 수 있다. 추가 실시양태에서, 임의의 글리코실화, 페길화 및/또는 다른 번역 후 변형은 N-연결될 수 있거나 O-연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체들 중 어느 한 키메라 수용체는 세포외 도메인이 리간드에 의해 결합될 때 신호가 변환되어 대식세포를 분극화하도록 효소적 또는 기능적 활성을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질(CFP)은 예를 들면, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD5에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(ECD)(CD5 결합 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 CFP는 서열번호 1에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 CD5 결합 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD5에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(ECD)(CD5 결합 도메인)은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 CFP는 서열번호 2에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 CD5 결합 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 예를 들면, 서열번호 8로 기재된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 9로 기재된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 가진, HER2에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(HER2 결합 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 8에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 HER2 결합 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 9에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 HER2 결합 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 ECD를 막횡단(TM)에 연결하는 힌지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 CD8 수용체의 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 가진 힌지(CD8α 쇄 힌지 도메인)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PFP 힌지 영역은 서열번호 7에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 예를 들면, 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 가진 CD8 막횡단 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP TM 영역은 서열번호 6에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 FcR 도메인을 가진 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 3에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 FcR 도메인 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 PI3K 동원 도메인을 가진 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PI3K 동원 도메인은 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, PI3K 동원 도메인은 서열번호 4에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 CD40 세포내 도메인을 가진 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD40 ICD는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD40 ICD는 서열번호 5에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD5 결합 도메인은 (i) 서열번호 1의 가변 중쇄(VH) 서열 또는 서열번호 1에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 가진 가변 중쇄(VH) 서열; 및 (ii) 서열번호 2의 가변 경쇄(VL) 서열 또는 서열번호 2에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 가변 경쇄(VL) 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD5 결합 도메인은 서열번호 33의 서열, 또는 서열번호 33에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, HER2 결합 도메인은 (i) 서열번호 8의 가변 중쇄(VH) 서열 또는 서열번호 8에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 가변 중쇄(VH) 서열; 및 (ii) 서열번호 9의 가변 경쇄(VL) 서열 또는 서열번호 9에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 가변 경쇄(VL) 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD5 결합 도메인은 서열번호 32의 서열, 또는 서열번호 32에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 세포내 도메인을 추가로 포함하고, 이때 세포내 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 세포내 도메인을 포함하는 야생형 단백질은 세포외 도메인을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CD8로부터 유래한 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 이때 상기 힌지 도메인은 막횡단 도메인 및 항-CD5 결합 도메인에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 세포외 힌지 도메인은 서열번호 7의 서열, 또는 서열번호 7에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 30의 막횡단 도메인, 또는 서열번호 30에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 31의 막횡단 도메인, 또는 서열번호 31에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호 6 또는 29의 서열, 또는 서열번호 6 또는 29에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호 18의 서열, 또는 서열번호 18에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호 34의 서열, 또는 서열번호 34에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호 19의 서열, 또는 서열번호 19에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 식세포 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα 및 Bai1 이외의 수용체로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR 및 Bai1 이외의 수용체로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 CD3ζ 이외의 수용체로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRα 또는 FcRε으로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 3, 20, 27 및 28 중 어느 한 서열의 세포내 신호전달 도메인, 또는 서열번호 3, 20, 27 및 28 중 어느 한 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 전구염증 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 PI3-키나제(PI3K) 동원 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 서열번호 4의 서열, 또는 서열번호 4에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 CD40의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 전구염증 신호전달 도메인은 서열번호 5의 서열, 또는 서열번호 5에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 21의 세포내 신호전달 도메인, 또는 서열번호 21에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 23의 세포내 신호전달 도메인, 또는 서열번호 23에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 14의 서열, 또는 서열번호 14에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 15의 서열, 또는 서열번호 15에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 16의 서열, 또는 서열번호 16에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 24의 서열, 또는 서열번호 24에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열번호 25의 서열, 또는 서열번호 25에 대한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 (a) (i) CD5에 특이적으로 결합하는 scFv, 및 (ii) CD8로부터 유래한 힌지 도메인, CD28로부터 유래한 힌지 도메인 또는 CD68의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하는 세포외 도메인; (b) CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD2 막횡단 도메인 또는 CD68 막횡단 도메인; 및 (c) (i) FcRα, FcRγ 또는 FcRε으로부터 유래한 제1 세포내 신호전달 도메인, 및 (ii) (A) PI3K 동원 도메인을 포함하거나 (B) CD40으로부터 유래한 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 (i) 식세포 수용체 세포내 도메인으로부터 유래한 제1 세포내 신호전달 도메인, 및 (ii) (A) PI3K 동원 도메인을 포함하거나 (B) CD40으로부터 유래한 스캐빈저 수용체 식세포 수용체 세포내 도메인으로부터 유래한 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 상기 (c)에 대한 대안으로서 포함한다. 세포내 신호전달 도메인의 기원이 될 수 있는 예시적인 스캐빈저 수용체는 표 2에서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, CFP는 선천성 면역 수용체의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 circRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 바이러스 벡터를 통해 전달된다.
일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD14+ 세포, CD14+/CD16- 세포, CD14+/CD16+ 세포, CD14-/CD16+ 세포, CD14-/CD16- 세포, 수지상 세포, M0 대식세포, M2 대식세포, M1 대식세포 또는 모자이크 골수 세포/대식세포/수지상 세포이다.
한 양태에서, 본원은 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, (a) (i) 항-CD5 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인 및 (ii) 세포외 도메인에 작동 가능하게 연결된 막횡단 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 서열을 포함하는 골수 세포; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것으로서; 이때 골수 세포는 CFP를 발현한다.
일부 실시양태에서, CFP가 대상체의 표적 암 세포에 의해 발현된 CD5에 결합할 때, 골수 세포의 사멸 또는 식세포작용 활성은 CFP를 발현하지 않는 골수 세포에 비해 20% 초과 수준으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 종양의 성장은 인간 대상체에서 억제된다.
일부 실시양태에서, 암은 CD5+ 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 백혈병, T 세포 림프종 또는 B 세포 림프종이다. 일부 실시양태에서, CFP는 하기 표 A 및/또는 표 B에 제시된 하나 이상의 서열을 포함한다.
[표 A]
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
[표 B]
Figure pct00019
IV. 세포의 게놈 내로의 전달 및 혼입을 위한 비코딩 외생성 서열
비코딩 서열은 세포 내로 전달될 수 있고 세포의 게놈 내로 혼입되도록 디자인될 수 있다. 본원에서 사용된 비코딩 서열은 번역된 단백질 생성물을 생성하지 않으나 조절 요소, 예컨대, 전사된 생성물, 예컨대, 억제 RNA를 가질 수 있는 서열이다. 일부 실시양태에서, 이러한 서열은 miRNA 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 siRNA 생성을 위한 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 인트론 서열 또는 생성된 결합 부위를 포함할 수 있으므로, 하나 이상의 DNA 결합 단백질은 상기 부위에 도킹할 수 있고 인접 영역의 성질 및 거동에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 전사 인자 결합 부위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 인핸서 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 토포이소머라제(topoisomerase), 자이라제(gyrase), 역전사효소, 중합효소, 폴리 A 결합 단백질, 구아닐릴 사이클라제(guanylyl cyclase), 리가제(ligase), 제한 효소, DNA 메틸라제(methylase), HDAC 효소 등에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비코딩 서열은 이종염색질을 조작하도록 유도될 수 있다. 본원에서 비코딩 삽입체 서열로서도 지칭될 수 있는 비코딩 서열은 길이가 몇 개의 뉴클레오타이드 내지 5 kB일 수 있다.
V. 삽입체 서열을 포함하는 플라스미드 디자인 및 재조합 핵산 디자인
하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산 구축물물은 전사 및 mRNA 생성을 위해 플라스미드 내로 혼입된다. mRNA는 세포 추출물의 합성 시스템을 사용함으로써 시험관내 시스템에서 전사될 수 있다. 대안적으로, mRNA는 세포에서 생성되고 수거될 수 있다. 세포는 세균 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 전사는 합성 시스템에서 일어난다. 본원은 예시적인 플라스미드 디자인을 제공한다.
본 개시내용의 다양한 양태의 일부 실시양태에서, 플라스미드는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 관심 있는 이종 서열을 포함하는 mRNA 분자를 발현하도록 디자인된다. 플라스미드는 특히, 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 관심 있는 이종 서열의 통합을 위한 게놈 통합 요소에 대한 서열; 숙주 게놈(예를 들면, mRNA가 투여되는 대상체) 내로의 통합 후 숙주에서의 그의 발현을 위해 필요한 그의 별도의 프로모터 및 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 전이 유전자 또는 이의 단편을 포함하는 서열; 예를 들면, 세균 세포 또는 세포 추출물에서 mRNA를 발현시키기 위한 프로모터를 포함하는, mRNA의 전사 및 생성을 위한 하나 이상의 조절 요소, 및 3' 안정화 요소; 하나 이상의 검출 마커 및/또는 선택 마커를 위한 서열을 포함한다.
당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 바와 같이, 플라스미드 골격은 전사된 서열의 최상의 발현을 위해 다양한 방식으로, 예를 들면, 하나 이상의 바람직한 제한 분해 부위를 MCS(다중 클로닝 부위)에 도입하거나, 전체 mRNA 전사를 위한 원하는 프로모터, 예컨대, T7 프로모터를 도입하거나, 플라스미드 벡터 내의 기존 서열을 하나 이상의 원하는 서열로 교체하거나, 선택 마커 서열과 같은 하나 이상의 원하는 분절을 도입함으로써(그러나, 이들로 제한되지 않음) 개선될 수 있는 이용 가능한 벡터, 예컨대, 사내 또는 상업적으로 개발된 벡터일 수 있다.
플라스미드는 5' 영역에서 프로모터와 같은 전사 조절 요소를 포함하고 3' 안정화 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 이. 콜라이 세균 세포와 같은 원하는 세포에서 향상된 mRNA 전사를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 플라스미드의 전사를 위한 프로모터는 T7 프로모터, Sp6 프로모터, pL(람다) 프로모터, T3 프로모터, trp 프로모터, araBad 프로모터, lac 프로모터 또는 Ptac 프로모터로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 T7 프로모터이다. T7 또는 Sp6 프로모터는 항시성 프로모터이고 고수준의 전사 또는 시험관내 전사에 유용하다. 일부 실시양태에서, 3' 안정화 요소는 BGH 3' 요소, WPRE 3' 요소, SV40 요소, hGH 요소 및 기타 요소로부터의 서열이다. 3' 요소는 필요한 폴리 A 및 전사 종결 서열을 포함한다.
예시적인 선택 마커는 항생제 선택 마커 및/또는 발현 검출 마커를 포함한다. 항생제 선택 마커는 앰피실린에 대한 내성을 부여하는 앰피실린 내성 유전자 서열(베타 락타마제(lactamase) 유전자 또는 이의 단편), 예를 들면, G418 선택 마커, 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 테트라사이클린 내성 유전자 서열, 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 카나마이신 내성 유전자 서열, 에리쓰로마이신에 대한 내성을 부여하는 에리쓰로마이신 내성 유전자 서열, 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 클로람페니콜 내성 유전자 서열, 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 내성 유전자 서열 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 발현 검출 마커는 FLAG, HA, GFP 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합된 원하는 단백질 또는 펩타이드의 발현을 위해 대용물로서 작용하는 하나 이상의 코딩 서열에 융합될 수 있는 다른 태그.
일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 20 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 19 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 20 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 18 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 20 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 17 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 20 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 16 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 15 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 14 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 13 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 12 kb 미만이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 길이가 약 15 kb, 약 14 kb, 약 13 kb, 약 12 kb 또는 약 10 kb이다.
일부 실시양태에서, 코돈은 전사 시스템에 적합한 최대화된 전사를 위해 최적화된다.
VI. 생체내에서의 전이 유전자의 발현과 관련된 특징
재조합 핵산 구축물(전이 유전자)에서 전사 조절 요소
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 코딩된 단백질의 원하는 발현 프로파일을 위해 조작될 수 있는 비코딩 영역 내에 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비코딩 영역은 적합한 인핸서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인핸서는 인핸서의 영향 하에서 코딩된 단백질의 발현을 시작하기 위해 세포 또는 세포를 포함하는 시스템에 첨가될 수 있는 조절제 단백질 또는 펩타이드에 대한 결합 영역을 포함한다. 대조적으로, 조절 요소는 동족 단백질과 결합된 상태로 남아 있는 단백질 결합 도메인을 포함할 수 있고, 상기 단백질이 결합된 위치로부터 분리되어 단백질 합성의 시작을 허용하도록 세포외 신호가 제공될 때까지 재조합 단백질의 전사 및/또는 번역을 계속 억제할 수 있다. 예는 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 테트라사이클린 유도성(Tet 유도성 또는 Tet-on) 시스템 및 테트라사이클린 억제성(Tet-off) 시스템을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
대사 스위치를 포함하는 구축물 : 일부 실시양태에서, 구축물의 코딩 영역을 플랭킹하는 5' 및 3' 비번역 영역은 전술된 핵산 구축물에 의해 코딩된 재조합 단백질의 발현을 조절하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 3' UTR은 mRNA를 안정화시키기 위해 삽입되는 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA를 안정화시키거나 불안정화시켜 mRNA 반감기를 조절할 수 있게 하는 RNA 결합 단백질의 결합을 야기하는 AU 풍부 요소(ARE) 서열이 3' UTR에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 3' UTR은 성숙 mRNA 가닥에 결합하여 번역을 방해하는 RNA 결합 단백질(예를 들면, GAPDH)에 대한 보존된 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해당과정은 mRNA 가닥 번역을 허용하는, RNA 결합 단백질(예를 들면, GAPDH)의 분리를 야기한다. 대사 스위치의 원리는 세포가 특정 대사 상태에 들어갈 때 표적 유전자의 발현을 유발하는 것이다. 예를 들면, GAPDH는 휴면 세포에서 RNA 결합 단백질(RBP)이다. 이 단백질은 3' UTR의 ARE 서열에 결합하여, mRNA의 번역을 방해한다. 세포가 해당과정에 들어갈 때, GAPDH는 글루코스를 ATP로 전환시켜, mRNA로부터 빠져나와 단백질 번역이 일어날 수 있게 하는 데 필요하다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산을 포함하는 세포가 존재하는 환경은 유전자 발현에 대한 대사 스위치를 제공한다. 예를 들면, 저산소 상태는 mRNA로부터의 GAPDH의 분리를 유도하는 대사 스위치를 유발할 수 있다. 따라서, mRNA의 발현은 대식세포가 순환계를 떠나 저산소 상태인 종양 환경으로 들어갈 때에만 유도될 수 있다. 이것은 핵산 또는 핵산을 포함하는 세포의 전신 투여를 허용하나, 특히 종양 환경을 특이적으로 표적화하는 국소 발현을 보장한다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 전술된 바와 같이, 예를 들면, 구축물의 일부가 항시성 발현 시스템의 조절 하에서 발현될 수 있게 하는 반면, 핵산의 또 다른 일부가 대사 스위치의 조절 하에서 발현되게 하는 분할 구축물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이시스트론 조절 하에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이시스트론 벡터는 항시적 조절 하에 있을 수 있는 표적 인식 모이어티의 코딩 서열을 포함하는, 제1 조절 제어 하에 있는 제1 코딩 서열; 및 대사 스위치 하에 있을 수 있는 염증 유전자 발현을 코딩하는 제2 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이시스트론 벡터는 단방향 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이시스트론 벡터는 양방향 벡터일 수 있다.
일부 실시양태에서, ARE 서열은 ADK, ALDH18A1, ALDH6A1, ALDOA, ASS1, CCBL2, CS, DUT, ENO1, FASN, FDPS, GOT2, HADHB, HK2, HSD17B10, MDH2, NME1, NQ01, PKM2, PPP1CC, SUCLG1, TP11, GAPDH 또는 LDH에 결합하는, ARE 서열 결합을 위한 단백질 결합 모티프를 포함한다.
약학 조성물 및 면역요법
한 양태에서, 본원은 (i) 전이 유전자, 5' 및 3' 플랭킹 전위 또는 역전위 요소, 발현 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 인트론; 및 전위효소 또는 역전위효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 전위 또는 역전위 시스템 내에 혼입된, 전이 유전자를 코딩하는 핵산, (ii) 핵산 전달 비히클 및 약학적으로 허용되는 염 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된 전이 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 핵산 구축물물은 양이온성 지질의 사용(Goddard, et al, Gene Therapy, 4:1231-1236, 1997; Gorman, et al, Gene Therapy 4:983-992, 1997; Chadwick, et al, Gene Therapy 4:937-942, 1997; Gokhale, et al, Gene Therapy 4:1289-1299, 1997; Gao, and Huang, Gene Therapy 2:710-722, 1995), 바이러스 벡터의 사용(Monahan, et al, Gene Therapy 4:40-49, 1997; Onodera, et al, Blood 91:30-36, 1998), "네이키드 DNA"의 흡수 등에 의해 전달될 수 있다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 세포 형질전환 기법(상기 논의 참조)은 핵산 구축물의 생체외 투여에 사용될 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로 및 용량은 경험적으로 선택될 수 있다(예를 들면, 문헌[Fingl et al., 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 pl] 참조).
일부 실시양태에서, 전이 유전자 및 전위 요소를 포함하는 핵산은 핵산을 세포 내부로 전달하는 공지된 방법, 예컨대, 리포펙타민 또는 인산칼슘의 사용을 통해, 또는 전기천공 또는 핵감염과 같은 물리적 수단을 통해 세포 내로 도입되거나 혼입된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 리포좀 또는 지질 나노입자 내로 캡슐화된다. LNP는 직경이 100 내지 300 nm이고 mRNA를, 대식세포를 포함하는 다양한 세포 유형에게 효율적으로 전달하는 수단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 다른 나노입자에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, CFP의 발현을 위한 벡터는 바이러스로부터 유래한 벡터, 즉 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산을 코딩하는 핵산은 렌티바이러스 벡터에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 사내에서 제조되고 목적을 위해 대규모로 제조된다. 일부 실시양태에서, 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 바와 같이, 상업적으로 입수 가능한 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이다.
이 방법은 외생성 핵산을 표적 세포 내로 도입하는 것이 요구되는 다양한 적용 분야에서 유용하고 표적 세포에서 발현 카세트에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 것이 요구되는 경우 특히 관심을 끌고, 이때 상기 표적 세포 또는 세포들은 다세포 유기체의 일부이다. 전위효소 시스템은 표적화 구축물이 예를 들면, 생체내 또는 생체외 프로토콜을 통해 표적 세포(들)에 들어갈 수 있게 하는 방식으로 유기체 또는 숙주에게 투여될 수 있다. 이러한 세포 또는 장기는 전형적으로 생체로 돌려보내진다.
일부 실시양태에서, 면역 기능과 관련된 융합 단백질을 코딩하는 전이 유전자는 생체외에서 대상체의 살아있는 세포 내로 안정적으로 통합되고, 이어서 상기 전이 유전자를 포함하는 세포는 대상체로 돌려보내진다. 예시적으로 중요하게는, CFP 전이 유전자(식세포 수용체 융합 단백질)는 전이 유전자의 안정한 전달을 위해 재조합 핵산과 생체외에서 접촉되고 대상체의 질환과 싸우기 위해 상기 대상체 내로 재도입된 면역 세포, 예컨대, 골수 세포, 식세포, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포 계통의 세포에서 발현하기 위한 것이다. 고려되는 질환은 감염 질환, 암 및 자가면역 질환을 포함한다. 본원에 기재된 융합 단백질(CFP)을 포함하는 PSR 서브유닛을 코딩하는 핵산은 암 치료를 위해 조작된 식세포를 생성하는 데 사용된다.
암은 T 세포 림프종, 피부 림프종, B 세포암(예를 들면, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증), 중쇄 질환(예를 들면, 알파 쇄 질환, 감마 쇄 질환 및 뮤 쇄 질환), 양성 단일클론 감마병증 및 면역구성 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 대장암, 전립선암(예를 들면, 전이성, 호르몬 불응성 전립선암), 췌장암, 위암, 난소암, 요로방광암, 뇌 또는 중추신경계 암, 말초신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 자궁암 또는 자궁내막암, 구강 또는 후두의 암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장암 또는 충수암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액 조직의 암 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용에 포함되는 방법에 적용될 수 있는 암의 유형의 다른 비제한적 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들면, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암종, 담관 암종, 간암, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌 종양, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들면, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수구성 백혈병(골수모세포성, 전구골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성 적혈구증가증, 림프종(호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄 질환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 상피암, 예컨대, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인과암, 신장암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암 또는 피부암이나, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암 또는 결장암이다. 다른 실시양태에서, 상피암은 비-소세포 폐암, 비유두상 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들면, 장액성 난소 암종) 또는 유방 암종이다. 상피암은 장액성, 자궁내막모양, 점액성, 투명 세포 또는 미분화를 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 다른 방식들로 특징져질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 맨틀 세포 림프종을 포함하나 이것으로 제한되지 않는 림프종 또는 이의 서브타입의 치료, 진단 및/또는 예후에 사용된다. 림프증식성 장애도 증식성 질환인 것으로 간주된다.
일반적으로, 세포 면역요법은 세포가 이식편 대 숙주 질환인 GVHD를 유발하지 않도록 대상체와의 적합성을 위해 HLA 일치되어야 하는 살아있는 세포를 포함하는 의약을 환자에게 제공하는 단계를 포함한다. 전술된 바와 같이 맞춤 의약 및 면역요법을 위해 병원에 도착하는 대상체는 대상체에 의해 발현된 HLA 항원을 확인하기 위해 관용적으로 HLA 유형분류된다.
실시예
본 발명은 지금부터 기재되는 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되고; 오히려, 본 발명은 본원에서 제공된 임의의 모든 적용 및 통상의 기술자의 기술 내의 모든 동등한 변경을 포함하는 것으로 해석되어야 함을 인식해야 한다.
실시예 1. 예시적인 레트로트랜스포존 디자인 구축물 :
본원은 세포의 게놈 내로 혼입하고 예시적인 전이 유전자를 발현시키기 위한 레트로트랜스포존 구축물을 디자인하는 예시적인 전략을 제공한다. 도 1b 및 도 1c는 전이 유전자를 코딩하는 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합하기 위한 다양한 전략적 디자인들을 예시한다. 여기서 박스로 표시된 GFP는 예시적인 전이 유전자이다. 전이 유전자(예를 들면, GFP)를 코딩하는 mRNA는 ORF2p 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 센스 또는 안티센스 방향 중 하나로 공발현될 수 있고; 각각의 코딩 서열은 예시적인 시스 전략 하에 표시된 모노시스트론 또는 바이시스트론 구축물에 존재할 수 있다(도 1b 및 도 1c). CMV/T7은 프로모터이다.
한편, 상기 구축물은 트랜스 방식으로 발현되도록 유도될 수 있다. 트랜스 전략은 바이시스트론 서열의 ORF2p 단백질 또는 ORF1p 및 ORF2p 단백질 둘 다를 코딩하는 서열, 및 임의의 유전자의 3' UTR에서 센스 또는 안티센스 방향으로 GFP를 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 전이 유전자는 전위효소 결합 서열, A 박스 및 B 박스, 및 폴리 A 꼬리를 포함하는 역전위 서열에 의해 플랭킹된다. 도 2a는 구축물을 사용하여 GFP를 코딩하는 서열을 안정적으로 혼입함으로써 예시적인 전이 유전자 GFP를 발현시키기 위한 세 가지 예시적인 디자인을 보여준다. 첫 번째 구축물은 임의의 전위효소 결합 요소의 부재 하에서 L1 5' UTR에 의해 플랭킹된, GFP를 코딩하는 서열; 및 3' UTR의 폴리 A 서열을 포함한다. 두 번째 구축물 및 세 번째 구축물은 GFP를 코딩하는 서열, 3' UTR A 박스 및 B 박스, 및 3' UTR의 폴리 A 서열을 포함한다. 세 번째 구축물은 ORF2p를 코딩하는 추가 서열을 포함한다. 72시간에서 예상된 GFP 발현 수준은 우측에 표시되어 있다. 도 2b는 구축물을 사용하여 GFP를 코딩하는 서열을 안정적으로 혼입함으로써 RFP 또는 ORF2p를 코딩하는 mRNA에서 예시적인 전이 유전자 GFP를 발현시키기 위한 세 가지 예시적인 디자인을 보여준다. 첫 번째 구축물은 임의의 L1 요소의 부재 하에서 RFP를 코딩하는 서열, 및 3' UTR의 폴리 A 서열을 포함한다. 두 번째 및 세 번째 구축물은 A 박스 및 B 박스를 포함하는 3' UTR, 및 3' UTR의 폴리 A 서열을 포함한다. 두 번째 구축물은 RFP를 코딩하는 서열을 포함하고 세 번째 구축물은 ORF2p를 코딩하는 서열을 포함한다. 72시간에서 예상된 RFP 및 GFP 발현 수준은 우측에 표시되어 있다.
실시예 2. 예시적인 circRNA 디자인 구축물 :
이 실시예에서, circRNA를 제조하기 위해 천연 생성 3차 구조를 가진 약 50개 뉴클레오타이드 길이 RNA의 스트레치를 혼입하는, circRNA에 대한 모듈식 디자인을 입증한다. 3차 구조 형성 RNA의 사용은 원형화를 위해 circRNA 형성 과정이 서열 매개 하이브리드화와 무관하게 만든다. 3차 구조를 가진 이 RNA 모티프는 5' 및 3' 상동성 아암 대신에 엑손 및 인트론을 가진 원하는 RNA 내로 혼입됨으로써, 원형화를 위한 말단 RNA 스캐폴드를 형성할 수 있다.
TectoRNA: RNA-RNA 결합 계면은 GNRA 루프/루프-수용체 상호작용 모티프의 쌍을 조합하여, 높은 친화성 및 높은 특이성을 가진 3차 구조를 생성함으로써 구축된다(도 3b). GNRA 루프/루프-수용체 상호작용 모티프 쌍은 헤어핀 리보자임으로부터의 4-방향 연접을 이용함으로써 융합되어, 폐쇄된 협력적 어셈블링 고리 모양 복합체를 형성하는 데 도움이 되는 2가 자가 조립 스캐폴딩 유닛('tectoRNA')을 생성한다. 두 개의 직교 루프/루프-수용체 상호작용 모티프를 사용하여, 평행('위-위') 또는 역평행('위-아래') 어셈블리 모드로 방향성 어셈블리를 할 수 있는 RNA 단량체를 디자인한다. 상호작용하는 분자의 역평행 어셈블리에서, 각각의 혼입된 단량체는 성장하는 쇄의 방향성을 전환하여 그의 고유 굽힘을 보상함으로써, 길고 비교적 곧은 다중유닛 쇄를 생성한다. 대안적 2차 구조의 발생이 최소화된 tectoRNA 스캐폴드를 선택하기 위해, 주어진 RNA 서열의 열역학적으로 선호된 2차 구조를 예측하는 RNA 접힘 프로그램 Mfold(bioinfo.math.rpi.edu/~zukerm/rna/mfold)에 서열을 제출하여 서열을 확인한다. 열역학적으로 선호된 구조는 최소 대안적 2차 구조를 가진 스캐폴딩을 위해 선택된다(배타적으로가 아니라 전형적으로, 에너지 면에서 최저 에너지 구조에 15% 이상 더 가까운 다른 2차 구조는 없다). RNA 분자는 통상의 방법, 예컨대, T7 RNA 중합효소를 사용한 시험관내 런-오프(run-off) 전사에 의해 제조된다. 도 3b는 RL-GAAA 루프 구조를 보여준다. tectoRNA 이종이량체를 프로파일링하기 위해, 형광 기반 칩-유동 조각 시험 방법을 이용한다. 이 방법에서, 구조화된 RNA(칩 조각)의 잠재적 변이체의 라이브러리를 DNA 주형으로서 합성하고 RNAP 시작을 위해 서열분석 어댑터 및 영역을 포함하도록 증폭한다. 각각의 DNA 변이체를 제자리에서 RNA로 전사하여, 서열이 식별된 RNA 클러스터를 서열분석 칩의 표면에 표시할 수 있다. 형광 표지부착된 tectoRNA 결합 파트너인 "유동 조각"을 증가하는 농도로 서열분석 칩 유동 셀에 도입하여, 평형화 후 각각의 RNA 클러스터에 대해 결합된 형광을 정량할 수 있다. 이 형광 값을 이용하여, 해리 상수(K d ) 및 결합 자유 에너지(ΔG = RT log(K d ))의 관점에서 각각의 칩 조각 변이체에 대한 유동 조각의 친화성을 유도한다(도 3c).
3차 구조를 포함하는 선택된 말단 RNA 스캐폴드 분절을, T7 전사를 이용하여 혼입하거나 원형화될 원하는 RNA의 5' 및 3' 말단에서 라이게이션하거나; 임의의 공지되어 있는 분자생물학 기법으로 원하는 RNA 내로 혼입한다.
실시예 3: 향상된 특이성을 가진 예시적인 레트로트랜스포존 디자인
이 실시예에서, 향상된 표적 특이성을 위해 L1 매개 레트로트랜스포존을 위한 핵산 구축물에 대한 디자인을 입증한다. ORF2를 사용하여 관심 있는 유전자를 세포의 게놈 내로 혼입하기 위해 ORF2 코딩 서열 및 관심 있는 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA를 디자인한다. 한 예시적인 디자인에서, 구축물은 더 변형된 ORF2를 포함한다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, ORF2 단백질은 그 자신의 폴리 A 서열에 결합함으로써 역전위를 시작한다. 그러나, 폴리 A는 mRNA에 풍부하게 존재하기 때문에, 비특이적 결합 및 통합이 가능해진다. 특이성을 증가시키기 위해, 이종 단백질의 mRNA 결합 도메인을 포함하는 재조합 ORF2를 디자인하고, 이종 mRNA 결합 도메인에 대한 동족 mRNA 서열을 3' UTR의 폴리 A 서열 및 ORF2 폴리 A 결합 부위 근처에 삽입한다.
이로써, 도 4b에 나타낸 키메라 ORF2가 생성되고, 이때 이종 단백질 코딩 서열의 고친화성 RNA 결합 도메인은 ORF2 서열에 혼입되거나 융합되고, 고친화성 RNA 결합 단백질에 상응하는 동족 RNA 서열은 폴리 A 영역에 근접한 mRNA의 3' UTR 영역 내로 혼입된다. 이 실시예에서, MCP 코트 단백질 MS2(도면에서 M으로서 표시됨)로부터 유래한 이종 고친화성 RNA 결합 도메인은 ORF2 서열 내로 혼입되고 동족 서열인 MS2 헤어핀은 mRNA의 3' UTR 서열에 포함된다(도 4b). MS2는 동족 서열에 결합하여, 포유동물 세포 게놈에서 ORF2 mRNA와 관련된 각각의 서열의 역전사 및 혼입을 위해 그 자신의 mRNA에 대한 키메라 ORF2의 특이성을 증가시킨다(도 4b).
다른 예시적인 디자인에서, ORF2에 의한 표적 세포의 게놈 내로의 전이 유전자의 통합의 특이성을 증가시키려는 시도가 착수된다. 한 예시적인 디자인에서, 도 4c에 나타낸 바와 같이 ORF2에 융합된 Mega TAL 코딩 서열(상부 패널). 이와 함께, ORF2를 돌연변이시켜, 더 낮은 특이성을 가진 RNA 서열을 인식하고 이에 결합하는 능력을 그의 능력을 제거한다. 융합된 단백질은 3' UTR 내로 혼입된 TAL 결합 서열로 향하고 엔도뉴클레아제 기능을 수행한다. Mega TAL DNA 결합 서열은 융합 단백질에 의해 표적화된다. 유사하게, 다른 키메라(도 4c(중간 패널)) 및 특정 DNA 결합 도메인을 가진 융합 단백질(도 4c(하부 패널))을 디자인한다.
실시예 4. 외생성 핵산 서열의 LINE-1 매개 역전위를 위한 예시적인 플라스미드 디자인 및 개발
이 실시예에서, 포유동물 세포 내로 전위될 수 있는 전이 유전자에 작동 가능하게 연결된 ORF2 트랜스포존 요소, 및 mRNA 전사 및 안정화를 위한 조절 요소를 포함하는 재조합 LINE-1 구축물의 전달 및 혼입을 위해 플라스미드 벡터를 생성한다. 시험관내에서 포유동물 세포 내로 도입하거나, 포유동물, 설치류, 양, 돼지 또는 인간과 같은 유기체에게 투여하기 위해 더 처리 및/또는 정제될 수 있는 mRNA는 세균 숙주 세포에서 전사될 수 있다.
임의의 적합한 벡터 골격을 사용하여, 세균 시스템에서 재조합 핵산 서열을 삽입체로서 혼입하고 전사하여 mRNA를 생성하거나; 시험관내 전사 시스템을 사용하여 재조합 핵산 서열을 포함하는 mRNA를 생성할 수 있다. 여러 특징을 플라스미드에 추가한다. 성공적인 확장 가능한 mRNA 생성 및 정제 시, mRNA를 골수 세포와 같은 관심 있는 포유동물 세포 내로 도입할 수 있다.
역전위 연구 분야에서 전통적으로 사용되는 플라스미드는 디자이너 유전자인 유전자 블록을 결여하고, 깁슨(Gibson) 어셈블리 방법을 정기적으로 이용하여 상이한 특징을 삽입하였다. 기존 벡터의 특징을 취하나 새로운 특징을 삽입할 유연성을 가진 신규 벡터는 유전자 전달 시스템으로서 LINE-1 요소의 연구 및 최적화 둘 다에 유리할 수 있다. 플라스미드를 단독으로 사용하거나 플라스미드로부터 전사된 mRNA를 사용하여, 역전위 빈도를 증가시킬 수 있는 기본 특징 및 추가 특징은 아래에 요약되어 있다. 이 특징들 중 임의의 특징을 교체하기 위해 제한 부위 없이 원래의 5' UTR, 3' UTR 및 ORF간 서열을 가진 천연 LINE-1 서열을 함유하는 예시적인 플라스미드 디자인이 도 5(I)에 그래프로 표시되어 있다. 신규 최적화된 플라스미드:
Figure pct00020
CMV 또는 EIF1a 또는 EF1a 프로모터로 대체된, 제거된 Dox 유도성 프로모터
Figure pct00021
mRNA를 만들기 위해 추가된 T7 부위
Figure pct00022
코돈 최적화된 ORF1 및 ORF2
Figure pct00023
mRNA를 안정화시키기 위해 추가된 WPRE 요소
Figure pct00024
단백질 보호를 돕기 위해 ORF2에 추가된 FLAG 태그
Figure pct00025
18 kb에서 14 kb로 감소된 크기
Figure pct00026
삽입을 용이하게 하기 위해 각각의 특징에서 추가된 블런트 제한 부위(블런트 화살표를 가진 점선)
Figure pct00027
포함된 G418 선택 마커
플라스미드는 도(II)에 표시되어 있다.
깁슨을 이용하여, 도 5(Ⅲ)에 나타낸 바와 같이 플라스미드 리포터 유전자용으로 역 분할 GFP를 삽입한다. mRNA 리포터용으로 완전한 역 GFP를 도 5(IV)에서와 같이 삽입한다.
도 5(V)의 플라스미드 구축물을 모체로서 사용하여, 핵 이입을 돕기 위해 ORF2의 N 말단에서 핵 국소화 서열(NLS)을 삽입한다(도 5(VI)). ORF2의 발현을 증가시키기 위해 IRES 또는 또 다른 종결/프로모터 서열을 삽입한다(도 5(VII)). ORF2와 mRNA 사이의 더 강한 상호작용을 용이하게 하기 위해, MS2 헤어핀을 3' UTR에 삽입하고 MS2 코트 단백질 서열을 ORF2 단백질의 N 말단에 삽입한다(도 5(VIII)). 향상된 특이성을 가진 상응하는 예시적인 ORF 및 이의 작용 기작은 이전 실시예 및 도 4b에 개시되어 있다. mRNA와 번역 리보좀의 더 강한 상호작용을 용이하게 하고 신생 ORF2가 mRNA에 더 잘 결합하도록 번역을 정지시키기 위해, Alu 요소를 mRNA의 3' UTR에 삽입한다(도 5(IX)). 활성이 더 높은 ORF2 단백질을 잠재적으로 사용하기 위해, ORF2의 RT 도메인을 II군 인트론의 역전사효소 도메인으로 대체한다(도 5(X)). 또한, 밍크 고래 게놈은 가장 높은 수 및 퍼센트의 활성 LINE 요소를 가진다(480개(3.6% 활성)를 가진 인간에 비해 약 5,000개(60% 활성)). 두 서열들은 67% 동일하며 고래 서열은 활성 엔도뉴클레아제 및 역전사효소 잔기를 가진다. 각각의 밍크 고래 도메인은 천연 ORF2 엔도뉴클레아제 및/또는 RT 도메인을 대체하거나 키메라 도메인을 디자인하는 데 사용될 수 있다.
실시예 5. mRNA 디자인 합성 mRNA 생성
올리고뉴클레오타이드의 올리고합성 및/또는 라이게이션에 의한 합성 생성을 위해 mRNA를 전략적으로 디자인할 수 있다. 추가로, 이러한 디자인은 시험관내 전사(IVT) 매개 mRNA 생성에 유용하다. mRNA 전략은 이전 실시예에서 논의된 플라스미드 전략과 동일한 변이체를 포함할 수 있다. 주요 차이점은 리포터 GFP 서열이 인트론을 포함하지 않고(도 6a) 구축물이 ORF1 코딩 영역 없이 전달될 수 있다는 점(도 6b)이다.
실시예 6. 증가된 mRNA 반감기를 위한 구조적 특징
이 실시예에서, 구조적 특징은 mRNA 반감기를 증가시키기 위해 역전위 요소 및/또는 전이 유전자를 포함하는 mRNA에 도입된다. 목표는 1차 단핵구에서 mRNA로부터의 단백질 발현의 기간을 3일에서 적어도 5일까지 증가시키는 것이고, 이때 궁극적인 목표는 10일이다. 도 7b(좌측)에 나타낸 바와 같이, CD14+ 골수 세포(단핵구) 내로 도입될 때 전이 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA는 번역되고 암 세포의 항원에 결합할 수 있는 키메라 수용체(ATAK 구축물)를 발현한다.
다수의 mRNA 디자인들은 (i) G-사중체, (ii) 5' UTR 내의 바이러스 슈도노트 구조; 및/또는 3' UTR 내의 (iii) 하나 또는 (iv) 더 많은 xrRNA 루프 구조; (v) 도 7a에 나타낸 삼중체 RNA 구조 중 하나 이상을 단독으로 또는 조합으로 포함하는 다양한 유전자 블록들을 합성함으로써 생성되고; 전이 유전자의 코딩 서열에 인접한 각각의 UTR에서 전사 벡터 내로 클로닝된다. 이 구축물들은 외부 판매회사에 의해 개별적으로 제조되고 키메라 수용체의 발현에 의해 측정된 mRNA의 안정성을 측정하기 위해 사내에서 시험된다(예시적인 수용체 및 이의 기능은 도 7b(좌측)에 그래프로 도시되어 있다). 공정 순서도는 도 7b(우측)에 표시되어 있다. 요약하건대, 구축물을 코딩 또는 변형된 폴리 A 꼬리를 가진 플라스미드 내로 클로닝한다. mRNA를 100 ㎍ 규모로 전사하였고 에탄올 침전(Aldevron)으로 정제하였다. 한편, 냉동된 단핵구를 해동시키고 수거한다. 수거된 세포를 정제된 mRNA(5 내지 10 ㎍)로 전기천공하고 1일, 2일, 3일, 5일 동안 배양하였다. 키메라 수용체에 대해 양성인 세포(결합제 양성 세포)를 표적 세포, 또는 표적 항원으로 코팅된 기판에 결합하는 그의 능력으로 검출한다. 예상된 결과는 도 7c에 표시되어 있다. (i) 내지 (v)에 요약된 구조적 특징들 중 하나 이상 또는 이들의 조합을 발현하는 벌크 또는 정제된 mRNA(실선 정사각형으로 표시된 데이터)는 (i) 내지 (v)에 요약된 특징들 중 임의의 특징을 함유하지 않는 상업적으로 입수 가능한 대응물(정삼각형으로 표시된 데이터)을 능가한다.
실시예 7. GFP 유전자의 LINE-1 레트로트랜스포존 플라스미드 매개 전달
이 시험 실행에서, LINE-1 레트로트랜스포존 시스템을 사용하여 GFP 카고의 게놈 통합 및 GFP 단백질의 발현을 검증하였다. LINE-1-GFP 구축물(LINE-1 플라스미드 GFP)은 도 8a에 예시되어 있다: ORF1p(ORF1)를 코딩하는 LINE-1 서열, ORF2p(ORF2)를 코딩하는 서열, 및 ORF에 대해 역방향으로 LINE-1의 3' UTR에 위치한 CMV 프로모터 유도 분할 GFP 유전자를 갖는 플라스미드 구축물. 코딩 서열의 중간에서 비코딩 서열의 통합 및 스플라이싱 매개 제거가 일어난 후에만 GFP가 발현되게 하기 위해, 스플라이스 공여자 부위와 수용자 부위 사이에 삽입된 인트론 서열을 갖도록 분할 GFP를 디자인한다. 이 경우, 카고는 2.1 kb이다. 퓨진(Fugene) 시약을 사용하여 상기 플라스미드로 HEK293T 세포를 형질감염시켰고, 플라스미드 양성 세포를 퓨로마이신으로 선택하였다. 모의 형질감염된 세포에 비해 평균 형광 강도(MFI)(도 8b) 및 GFP 형광 강도를 가진 세포의 비율(도 8c)의 변화로서 표시된 바와 같이, 게놈 내로 통합된 GFP로부터 생성된 mRNA는 성공적으로 번역되고 유세포분석에 의해 측정된다. 모의 형질감염된 세포는 GFP 서열을 결여하는 플라스미드를 받았다.
실시예 8. 키메라 수용체 유전자의 LINE-1 레트로트랜스포존 플라스미드 매개 전달
이 실시예는 세포에서 LINE-1 서열을 사용하여 재조합 유전자를 성공적으로 발현시킬 수 있음을 입증한다. CD5 결합 도메인의 인트론 서열에 의해 불연속된 재조합 수용체 단백질 CD5-인트론-fcr-PI3K(ATAK)를 코딩하는 3 kb 카고 서열과 함께 LINE-1 요소를 가진 플라스미드로 HEK 293 세포를 형질감염시켰다. 카고는 CD5 결합 세포외 도메인, FCRγ 막횡단 도메인, 및 PI3-키나제 동원 도메인을 가진 세포내 도메인을 가진 키메라 수용체이다. 레트로트랜스포존 플라스미드의 도식적 표시는 도 9a에 제시되어 있다. 상기 실험의 디자인에서와 같이, ATAK 수용체는 게놈 내로 통합되고 인트론이 스플라이싱되지 않는 한 발현될 수 없다. HEK293T 세포에서의 형질감염 후, CD5 결합 세포외 도메인에 대한 미끼로서 표지부착된 CD5를 사용하여 수용체 발현을 검출한다. 도 9b 및 9c에 제시된 결과는 수용체의 성공적인 통합 및 발현을 보여준다. 36.5% 세포는 ATAK(CD5 결합제) 양성이었다(도 9c).
추가 변형에서, 불연속되지 않은 재조합 수용체 단백질 CD5-인트론-fcr-PI3K를 코딩하는 더 긴 3.7 kb 카고 서열, 및 수용체와 GFP 서열 사이에 T2A 서열을 가진 불연속된 GFP 서열을 가진 LINE-1 구축물(LINE-1플라스미드-cd5_fcr-pi3k_t2a_GFP인트론)(도 10a). 모의 형질감염된 세포에 대해 정규화되었을 때, ATAK 수용체의 10배 초과의 증가가 있었고 GFP 이중 양성 세포가 인지되었다(도 10b). 실험 실행에 대한 GFP 및 형광 태그부착된 CD5 결합 및 게이팅 정량의 예시적인 형광 식별이 도 10c 및 도 10d에 표시되어 있다.
실시예 9. 카고 유전자의 전달을 위한 LINE-1 레트로트랜스포존을 코딩하는 mRNA
이 어세이에서, LINE-1 역전위 유전자 서열을 mRNA로서 전달하고 발현하는 능력을 시험하였다. ORF1을 코딩하는 mRNA(ORF1-FLAG-mRNA), 및 CMV 프로모터 서열과 안티센스 방향으로 ORF2 및 GFP를 코딩하는 mRNA(ORF2-FLAG-GFPai)를 도 11a에 표시된 바와 같이 디자인한다. 이 어세이에서 카고 크기는 2.4 kb이었고, GFP는 ORF2 서열에 대해 안티센스 방향으로 존재한다. 상기 mRNA를 293T 세포에 전기천공하였고, 리포터 유전자 발현을 도 11b에 나타낸 바와 같이 입증하였다. 이 실험 설정은 ORF1-리드쓰루가 ORF2p의 발현에 필요하지 않으며 상이한 mRNA 분자로부터의 ORF2p의 발현이 ORF2p 및 GFP의 더 높은 발현을 허용할 수 있음을 입증하였다. 이 결과로, mRNA 형태로 LINE-1과 카고의 성공적인 전달을 달성하였다.
ORF1 및 ORF2 mRNA의 상대적 수준이 GFP 발현에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, 다양한 양의 ORF1 및 ORF2 mRNA를 시험할 실험을 설정하였다(도 11a). GFP+ 세포의 증가에 대해 3배 양을 각각 및 함께 시험하고, 결과는 도 12a에 제시되어 있다. 배수 증가는 1배 ORF2-GFP 및 1배 ORF1 mRNA에 비해 상대적인 증가이다. GFP 발현은 3배 ORF1을 1배 ORF2와 함께 사용하였을 때 더 높았으나, 그 반대의 경우는 그러하지 않은 반면; 3배 ORF1 및 3배 ORF2 둘 다를 가진 것은 비교된 세트에서 최대 수준의 GFP 발현을 보여주었다. 이때, 카고 크기는 2.4 kb이다. 도 12b는 레트로트랜스포존 mRNA 전기천공 후 GFP+ 세포의 형광 현미경관찰 영상을 보여준다. 단일 mRNA 분자에서 ORF1 및 ORF2 둘 다를 코딩하는 완전한 LINE-1 mRNA(LINE 1-GFP mRNA 구축물)를 세포 내로의 전달 및 게놈 통합에 대해 시험하였다. mRNA는 3'에서 5'으로 3' UTR 내에 CMV-GFP 서열과 함께 바이시스트론 ORF1 및 ORF2 서열을 함유한다(도 13a). 이 연구에서, 카고 크기는 2.4 kb이다. 도 13b에 나타낸 바와 같이, 전달된 ORF2-cmv-GFP 안티센스(LINE-1 mRNA)의 역전위 시, 좌측에서 세 번째 막대로 표시된 세포는 ORF1과 ORF2가 별도의 mRNA 분자에 있는 경우(그래프 막대 1, 2)에 비해 더 높은 GFP를 발현하였다. LINE-1 완전한 mRNA 이외에 별도의 mRNA에 ORF1을 포함시켰을 경우 LINE-1 단독에 비해 GFP 발현이 증가되었다. ORF2+GFP의 포함은 GFP 카고 코딩 mRNA와 추가 ORF2의 기여일 수 있는 더 높은 GFP를 예상대로 보여주었다.
후속 전기천공이 역전위 효율을 증가시키는지를 시험하기 위해, 세포를 48시간마다 전기천공하였다. 24시간 내지 72시간 동안 배양한 후 유동을 이용하여 GFP 양성 세포를 평가하였다. 형광 데이터를, 단일 전기천공 이벤트를 이용한 세트의 값으로 정규화하였다. 도 14a 및 14b에 나타낸 바와 같이, 다중 전기천공은 전위된 유전자의 발현이 상향되는 추세를 이끌어냈으나, 변화는 완만하였다.
실시예 10. mRNA로 역전위를 향상시키기 위한 ORF2 단백질 서열의 변형
판독값으로서 GFP 리포터를 사용하여 mRNA 전달을 통한 역전위를 향상시키기 위한 LINE-1 서열의 변형을 시험하였다. 다음과 같이 실험을 수행하였다. 모든 변형은 바이시스트론 ORF1 및 ORF2 서열과 관련되었다. (i) C-말단 NLS 서열을 ORF2 서열에 삽입함으로써 ORF2-NLS 융합체를 생성하였다. (ii) 인간 ORF2를 밍크 고래 ORF2로 대체하였다(Ivancevic et al., 2016). (iii) 3' UTR 내로의 Alu 요소의 혼입: LINE-1의 3' UTR에서 Alu 요소의 최소 서열(AJL-H33△; Ahl et al., 2015)을 사용한다. (iv) 3' UTR + ORF2-MCP 융합체에서의 MS2 헤어핀: LINE-1 서열의 3' UTR 내의 MS2 헤어핀 및 ORF2 서열에 융합된 MS2 헤어핀 결합 단백질(MCP)(도 15a). 모의 구축물은 야생형 인간 ORF2 서열을 가졌다.
모의 구축물에 의해 전기천공된 세포에 비해 GFP 양성 세포의 비율의 배수 증가의 정량은 도 15b에 제시되어 있다.
실시예 11. 면역 세포에서의 역전위
이 실험에서, HEK 세포의 형질감염 후 임의의 변화가 GFP 발현을 개선하는지를 확인하기 위해 ORF간 영역을 더 조작한다. LINE-1 플라스미드 GFP를 사용하여 ORF간 영역을 다음과 같이 조작한다: (a) 한 구축물에서, ORF간 영역을 CVB3의 IRES로 대체하고; (b) 또 다른 구축물에서, ORF간 영역을 EV71의 IRES로 대체하고; (c) 3개의 별도의 구축물에서, E2A 또는 P2A 또는 T2A 자가 절단 서열을 ORF간 영역에 삽입한다. 결과는 도 16에 표시된 바와 같다. 특히 T2A 서열 삽입 시, GFP 판독값이 LINE-1 플라스미드 GFP(LINE-1 야생형 플라스미드)에 비해 단지 약간 변화되었다. EV71 IRES 서열의 삽입은 GFP 발현을 개선한 반면, CVB3 IRES는 어떠한 개선도 보이지 않았다.
실시예 12. 면역 세포에서의 역전위
면역 세포에서 역전위를 시험하기 위해, T 세포 림프종 세포주인 Jurkat 세포 내로 전기천공함으로써 CMV-GFP 안티센스 리포터 카고로 LINE-1 플라스미드 및 mRNA를 시험하였다(도 17a 및 17b). GFP 서열을 갖지 않은 플라스미드로 모의 세트를 전기천공하였다. 형질감염된 세포에서 GFP 발현을 평가하였고, 전기천공 후 4일째 날 대표적인 데이터가 도 17b에 표시되어 있다. 모의 형질감염된 세포에 비해 배수 증가를 보고한다. 플라스미드 및 mRNA 전달 방식 둘 다가 성공적인 GFP 발현을 야기하였다.
다음으로, LINE-1 서열, 및 키메라 HER-2 결합 수용체 및 분할 GFP를 코딩하는 3.7 kb 카고를 가진 플라스미드(LINE-1 플라스미드 Her2-Cd3z-T2A-GFP인트론)로 THP-1 세포(골수, 단핵구 세포주)를 전기천공하였다(도 18a). 상기 카고는 HER2 결합 세포외 도메인, CD3z 막횡단 도메인 및 분할 GFP 리포터를 포함하는 키메라 수용체이다. 도 18b에서 입증된 바와 같이, 상기 플라스미드는 성공적으로 게놈 내로 통합되었고 연장된 발현을 보였다. 형질감염 후 6일째 날 대표적인 발현이 도면에 표시되어 있다. 이 연구로부터, LINE-1 매개 유전자 전달이 상피 세포 유형(HEK-293T 세포); T 세포(예를 들면, Jurkat 세포); 및 골수 계통의 세포(예를 들면, THP-1 세포)를 비롯한 다양한 세포 유형에서 성공적인 안정한 게놈 통합을 야기할 수 있고 발현을 연장시킬 수 있음이 입증되었다. 더욱이, 역전위는 프라임(Prime) 편집과 같은 CRISPR 의존적 기술과 달리 큰 유전 카고의 통합을 야기할 수 있고 이러한 카고를 단일 핵산 구축물로서 전달할 수 있다.
실시예 13. 카고 서열의 LINE-1 매개 역전위의 효율을 더 향상시키기 위한 외부 방법
세포 게놈 내로의 카고 서열의 역전위의 효율을 더 향상시키는 방법이 이 단락에 상세히 기재되어 있다.
세포 주기의 특정 단계에 있는 집단 내의 세포의 선택 또는 적합한 작용제에 의한 G1 정지에 의한 세포 주기 동기화는 더 높은 핵산 흡수 효율, 예를 들면, 플라스미드 벡터 형질감염 효율 또는 전기천공 효율로 이어질 수 있다. 이 어세이에서, 세포를 미리 분류하고 각각의 군을 따로 전기천공하여 균일한 전기천공을 보장한다. 이 군들 사이에 전기천공의 효율을 비교하고 GFP 시험 플라스미드 또는 mRNA의 발현에 의해 확인된 최대 효율을 야기하는 세포 주기 단계를 선택한다(도 19).
이 실험의 또 다른 변경에서, 전기천공 전에 몇 시간 동안 세포 주기 정지 시약으로 세포를 처리함으로써, 세포를 분류하거나 분류하지 않으면서 동기화한다. 세포 주기 정지 시약의 예시적인 목록은 표 1에 제공된다. 목록은 완전하지 않고 전구아폽토시스성을 나타낼 수 있는 시약을 포함하므로, 목적, 용량 및 인큐베이션 시간에 적합한 신중한 선택은 특정 상황에서의 사용을 위해 최적화된다.
Figure pct00028
특정 생체외 용도의 경우, 상동 재조합 및 역전사효소를 위한 프라이밍에 대한 기회를 생성하는 조절된 방사선조사를 이용하여, 상기 실시예들 중 임의의 실시예에 기재된 바와 같은 역전위 기구를 발현하는 세포에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 유도함으로써 역전위를 향상시킨다(도 20). 또 다른 예에서, 세포를 LINE-1 플라스미드 GFP 구축물로 형질감염시키고 방사선조사 펄스에 노출시킨다. GFP 발현을 모니터링한다. 더 높은 GFP 발현에 의해 표시된 바와 같이, 최대 이점을 얻기 위해 방사선조사의 강도와 시간을 최적화한다.
또 다른 예에서, LINE-1 플라스미드 GFP에 의해 형질감염된 세포를 다음과 같이 처리된 실험 세트로 나누었다: (i) DSB를 유도하기 위한 방사선조사(전술된 바와 같음); (ii) DNA 리가제를 차단하여 DNA 손상 복구 기구를 억제하는 소분자, 예컨대, SCR7로 이 세트의 세포를 처리함. 보호 복구 기작이 역전위의 진행을 억제하는 것을 방지하는 것은 GFP 발현을 향상시킬 것으로 예상된다: (iii) 세포를 방사선조사한 후, 세포를 SCR7로 처리함, 이들 두 방법의 조합은 더 강력한 효과를 보여줄 것으로 예상된다. GFP 발현을 6일에 걸쳐 모니터링하고, 가장 긴 기간에 걸쳐 최대 GFP 형광을 보이는 세트는 추가 연구에서 채택되는 조건을 표시한다.
실시예 14. 구축물의 추가 변형에 의한 카고 서열의 LINE-1 매개 역전위의 효율 향상
I. 안정성 및 더 높은 발현을 제공하기 위한 구축물의 비코딩 영역의 향상 . 이 실시예에서, 다음과 같이 증가된 GFP 발현에 대해 시험하기 위해 LINE-1 플라스미드-GFP를 더 변형시킨다: (a) 한 구축물에서, 5' UTR을 상보체 유전자의 UTR로 대체하고; (b) 또 다른 구축물에서, 증가된 안정성을 위해 3' UTR을 B-글로빈 유전자의 UTR 서열로 대체하고; (c) 또 다른 구축물에서, ORF간 영역을 CVB3의 IRES로 대체하고; (d) 또 다른 구축물에서, ORF간 영역을 EV71의 IRES로 대체하고; (e) 3개의 별도의 구축물에서, E2A 또는 P2A 또는 T2A 자가 절단 서열을 도 21의 도식적 표시로 나타낸 바와 같이 ORF간 영역에 삽입한다. 전술된 것 이외에, 전술된 바와 동일한 설정을 이용하여 (a) 내지 (e)의 다양한 조합 및 표 2에 나열된 추가 조합을 시험한다. 병렬 시험 세트에서 구축물을 HEK293T 세포 내로 형질감염시킨 후 GFP 발현을 모니터링하여, 이 구축물들 중 어느 구축물이 LINE-1 플라스미드 GFP 단독에 비해 GFP 발현을 증가시켰는지를 확인한다. 개선을 보여주는 조합을 채택한다.
Figure pct00029
II. 핵에서의 ORF의 국소화 및 체류의 향상 . 이 실시예에서, 증가된 GFP 발현에 대해 시험하기 위해 LINE-1 플라스미드-GFP를 다음과 같이 더 변형시킨다: (a) ORF2 코딩 서열을 핵 국소화 서열(NLS)과 융합시킴(도 15a에 그래프로 표시됨, 위에서 두 번째 구축물); (b) ORF1 코딩 서열을 핵 국소화 서열(NLS)과 융합시킴(도 22에 그래프로 표시됨); (c) Alu 결합 서열을 ORF2 역전사효소 코딩 서열의 3'에 삽입함(도 15a에 그래프로 표시됨, 위에서 네 번째 구축물); (d) (a)와 (c) 둘 다와 함께(표시되어 있지 않음); (e) (b)와 (c) 둘 다와 함께, NLS 서열을 ORF1 N-말단에 융합시키고, Alu 결합 서열을 ORF2 역전사효소 코딩 서열의 3'에 삽입함(도 22); 및 (f) SINE 유래 핵 RNA 국소화(SIRLOIN) 서열을 LINE-1 3' UTR 내로 통합시킴. HEK-293T 세포를 구축물 (a) 내지 (f) 및 LINE-플라스미드 GFP 구축물로 동시에 형질감염시켰다. HEK293T 세포 내로 형질감염시킨 후 GFP 발현을 모니터링한다. 가장 긴 기간에 걸쳐 최대 GFP 형광을 보이는 세트를 채택한다.
III. LINE-1-단백질-RNA 복합체와 리보좀의 결합을 증가시키기 위한 구축물의 변형 . 이 실시예에서, LINE-1 단백질 RNA 구축물과 리보좀의 결합을 증가시키기 위해 Alu 요소 또는 리보좀 결합 앱타머인 추가 서열을 LINE-1 구축물의 3' UTR에 삽입한다(도 23).
LINE-1 단백질-RNA 복합체와 리보좀의 결합을 향상시키기 위해, 하기 요소를 mRNA의 3' UTR에 삽입하고 상기 실험과 유사하게 시험한다. Alu 요소의 삽입은 앞서 기재되어 있다. 별도의 구축물에서, Alu 요소 절두체, 리보좀 결합 앱타머(109.2-3) 및 리보좀 확장 분절(ES9S) 결합 서열을 삽입하고 GFP 발현의 증가에 대해 각각 시험한다.
IV. 역전위를 위한 ORF2와 그 자신의 mRNA의 결합 향상 . 이 실시예에서, MS2 결합 루프 구조를 함유하는 서열을 LINE-1의 3' UTR 내로 도입하고, MS2 RNA 결합 도메인을 코딩하는 서열을 ORF2p-RT의 RNA 결합 도메인에 융합시킨다(도 4a와 4b 및 도 24에 그래프로 표시됨, 예시적인 구축물 서열번호 49). 융합된 단백질은 3' UTR에서 MS2 결합 구조 모티프에 특이적으로 부착할 것이므로, 임의의 비특이적 결합 및 역전위가 최소화된다(도 24). HEK293T 세포 내로 형질감염시킨 후 GFP 발현을 모니터링한다. 유사한 디자인에 따라, ORF를 동일한 행의 상응하는 우측 열에 표시된 ORF2의 3' UTR 영역에 삽입된 동족 서열과 조합된, 하기 표 3의 좌측 열에 표시된 단백질 결합 서열과 융합시킨다.
Figure pct00030
V. 레트로트랜스포존의 엔도뉴클레아제 기능의 변형 . 이 실시예에서, GFP 발현의 증가를 시험하기 위해 구축물을 다음과 같이 변형시킨다. 첫 번째 실험 세트에서, LINE-1 플라스미드 GFP를 ORF2의 엔도뉴클레아제 코딩 서열의 3' 말단에서 절단하고, 이종 징크 핑거 단백질(ZFP)의 DNA 결합 도메인(DBD)을 코딩하는 서열을 삽입한다. 또 다른 실험 세트에서, 엔도뉴클레아제 도메인을 CRISPR 뉴클레아제와 융합시킨다. 표 4의 불완전한 목록에 표시된 바와 같이, DNA 결합 도메인 및 절단 도메인을 사용하여 융합 단백질을 생성하여 LINE-1 플라스미드 GFP ORF를 변형시킴으로써 다양한 뉴클레아제들을 시험할 수 있다. 또한, 이량체화를 용이하게 하기 위해 2개의 ORF-2 도메인을 한 세트로 코딩한다. ORF2 엔도뉴클레아제보다 더 높은 GFP 발현을 가진 구축물을 추가로 선택할 수 있다. 플라스미드 디자인은 도 25에 그래프로 표시되어 있다. 플라스미드를 HEK293T 세포 내로 형질감염시킨 후 GFP 발현을 모니터링하고, 가장 좋은 결과를 제공하는 세트를 확인한다.
Figure pct00031
VI. 레트로트랜스포존의 역전사효소 기능의 변형 . 이 실시예에서, ORF2의 역전사효소 도메인을 그의 효율을 증가시키도록 변형한다. 한 실험 세트에서, LINE-1 플라스미드 GFP에서 인간 ORF2를 코딩하는 서열을 잘라내고 MMLV 또는 TGIRTII를 코딩하는 서열로 대체한다. 또 다른 실험 세트에서, ORF2 역전사효소 도메인을 이종 단백질의 DNA 결합 도메인과 융합시킨다. 역전사효소 도메인 및/또는 DNA 결합 도메인을 표 5A 및 표 5B에 제공된 불완전한 목록으로부터 선택할 수 있다. 구축물은 도 26에 그래프로 예시되어 있다. HEK293T 세포 내로 형질감염시킨 후 GFP 발현을 모니터링한다.
[표 5A]
Figure pct00032
[표 5B]
Figure pct00033
VII. 다른 유기체의 LINE-1에 의한 인간 LINE-1의 대체 . 이 실시예에서, 인간 LINE-1을 코딩하는 서열을 상이한 유기체의 LINE-1로 대체한다. 한 예에서, 인간 LINE-1 구축물을, 인간 LINE-1이 밍크 고래 LINE-1 서열로 대체되어 있는 구축물과 비교한다(도 27). 동일한 실험 프레임워크를 이용하여, 다수의 ORF들을 시험한다. 예시적인 불완전한 목록이 하기 표 6에 제공된다. 더 포괄적인 목록은 문헌[Ivancevic A. et al., Genome Biol Evol 8(11):3301-3322]에서 이용 가능하다.
Figure pct00034
또 다른 세트에서, 인간 LINE-1을 GFP 플라스미드에서와 같이 유지하되, 인간 LINE-1 사일런서의 억제제를 사용하여 HUSH 복합체 TASOR 단백질과 같은 내생성 단백질에 의한 인식을 방지한다. 이 경우, TASOR 억제제는 miRNA와 같은 억제 RNA이다.
VIII. 표적 특이성을 위한 LINE-1 융합 단백질. 이 실시예에서, LINE-1 플라스미드 GFP ORF2를 MegaTAL 뉴클레아제, CRISPR-CAS 뉴클레아제, TALEN, R2 역요소 결합 징크 핑거 결합 도메인, 또는 반복 요소, 예컨대, Rep78 AAV에 결합할 수 있는 DNA 결합 도메인과 융합시킨다. 도 28은 디자인을 예시한다. 표 7은 서열 특이적 역전위를 증가시키기 위해 융합될 수 있는 상이한 요소들의 목록을 제공한다.
Figure pct00035
각각의 플라스미드를 HEK293 세포 내로 형질감염시키고, GFP 발현을 모니터링한다.
판독값으로서 GFP를 사용하여 역전위 효율의 증가에 대해 시험하기 위해 이 단락의 (I) 내지 (VIII)에 기재된 변형을 디자인한다. 그 후, (I) 내지 (VIII)의 많은 유용한 변형들을 단일 역전위 구축물 내로 혼입하고, 결과를 위해 삽입체로서 GFP를 사용하여 시험하고, GFP 서열을 원하는 삽입체 서열로 대체한다.
서열목록
다음은 실시예에서 사용된 구축물의 예시적인 서열들이다. 이 서열들은 예시적인 참고 목적을 위한 것이며 당분야에서 숙련된 자가 과도한 실험 없이 생각할 수 있는 서열 변경 및 최적화는 본 개시내용에 의해 예상되고 포함된다. mRNA 서열이 서열 제목에서 언급되는 경우, 구축물은 DNA 주형의 뉴클레오타이드를 언급하고 당분야에서 숙련된 자는 상응하는 mRNA 서열을 쉽게 유도할 수 있다.
Figure pct00036
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SEQUENCE LISTING <110> MYELOID THERAPEUTICS, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENOMIC INTEGRATION <130> 56371-706.601 <140> PCT/US2020/049240 <141> 2020-09-03 <150> 63/039,261 <151> 2020-06-15 <150> 62/908,800 <151> 2019-10-01 <150> 62/895,441 <151> 2019-09-03 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Leu Tyr Cys Arg Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr 1 5 10 15 Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn 20 25 30 Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln 35 40 45 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Arg Ser 1 5 10 15 Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala Asp Ser Tyr 20 25 30 Glu Asn Met 35 <210> 5 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln 1 5 10 15 Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln 35 40 45 Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln 50 55 60 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 7 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe 1 5 10 15 Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 20 25 30 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 35 40 45 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 50 55 60 <210> 8 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr 100 105 110 Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 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<400> 11 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 14 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 35 40 45 Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Met Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ser 65 70 75 80 Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala 85 90 95 Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 100 105 110 Cys Thr Arg Arg 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<400> 29 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 30 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe 1 5 10 15 Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 20 25 30 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 35 40 45 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Ile Tyr 50 55 60 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 65 70 75 80 Val Ile Thr Leu Tyr Cys 85 <210> 31 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe 1 5 10 15 Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 20 25 30 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 35 40 45 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gatgctgcga gccgctcggg aaaagggaag ggtgactttg aagggcaaac ctattcggct 780 gacggttgac cttagcgccg agacactcca ggcacgccgg gaatggggcc ccatctttaa 840 tatcctgaag gagaagaact tccagccacg aatctcttac cctgcaaagt tgagttttat 900 ctccgagggt gagattaagt atttcatcga taaacagatg ctgcgagact tcgtgacaac 960 tcgcccagct ctcaaggaac tgctcaaaga ggctcttaat atggagcgca ataatagata 1020 tcaacccttg cagaaccacg caaagatgga ttataaggat gacgatgata aatga 1075 <210> 36 <211> 5751 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 taatacgact cactataggg agaaagacgc caccatgaca ggttcaaata gtcacattac 60 gattctcact ctgaatataa atgggctgaa ttctgcaatt aaacggcaca ggcttgcttc 120 ctggataaag tctcaagacc cctcagtgtg ctgtattcag gaaacgcatc tcacgtgcag 180 ggacacccat cggctgaaaa taaaaggctg gcggaagatc taccaagcca atggaaaaca 240 aaagaaggct ggggtggcga tacttgtaag cgataaaaca gactttaaac caactaagat 300 caaacgggac aaagagggcc attacatcat ggtaaagggt agtattcaac aagaggagct 360 gactatcctg aatatttatg 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tataaccacc gatcccacag aaattcaaac 1260 aaccatacgc gaatactaca aacacctcta cgccaataaa ctcgaaaatc tcgaggaaat 1320 ggatacattc ctcgacacgt acacccttcc caggctgaac caggaagaag ttgaatcact 1380 gaatcggcct atcacgggga gtgaaatagt agctatcatc aattcactcc ctaccaagaa 1440 gtcacccgga cctgatggat tcaccgccga attctaccag agatacatgg aagaactggt 1500 gcccttcttg ctgaaacttt tccaaagtat tgagaaagag ggaatacttc caaactcatt 1560 ttatgaggca tccatcattc tgatcccgaa gcccggcagg gacacgacca agaaagagaa 1620 ttttcgacca atctcattga tgaacattga tgcaaagatc ctcaataaaa tactggcaaa 1680 tcggattcag cagcacataa agaagctgat ccaccatgat caagtaggct tcatccccgg 1740 tatgcaaggt tggttcaata tacgaaaatc aatcaatgtt atccagcata taaaccgggc 1800 caaagacaag aaccacatga ttattagtat cgatgctgag aaagcctttg acaaaataca 1860 acaacccttc atgctgaaaa cattgaataa gctgggaatt gatggcacct acttcaaaat 1920 catcagagcc atatatgaca aaccaacagc aaatatcatt ctgaatggtc agaaattgga 1980 agcattcccc ttgaaaaccg gcacacggca gggttgccct ctgtcaccac tcctcttcaa 2040 catcgtgttg gaagttcttg cccgcgcaat ccggcaggaa aaggaaatca agggcattca 2100 actgggcaaa gaggaagtta aattgagcct gtttgcagac gacatgatcg tctatttgga 2160 aaaccccata gttagtgcac aaaatctgct gaagttgatc agtaatttct ccaaagtgag 2220 tgggtacaaa atcaatgtgc aaaagagcca agctttcttg tacaccaaca acaggcaaac 2280 tgagtctcaa atcatgggcg aactcccctt cgtgattgca tccaagcgga tcaaatacct 2340 ggggattcaa ttgactcgtg atgtgaagga cctcttcaag gagaactaca aacccctgct 2400 caaggaaatc aaagaggaca caaacaaatg gaagaacatt ccatgctctt gggtgggaag 2460 gatcaatatc gtcaaaatgg ccatcctgcc caaggtaatt tacaggttca atgctatacc 2520 catcaagctc cccatgacat tcttcacaga acttgaaaag acgacgctga agttcatttg 2580 gaaccagaaa cgtgccagga ttgctaaatc tattctctcc caaaagaaca aagctggcgg 2640 aatcacactc ccagacttca aactttacta caaggcgacc gtgacgaaaa cggcttggta 2700 ctggtaccaa aacagggata tagatcaatg gaaccgaacg gagcccagcg aaattatgcc 2760 tcatatatac aactatctga tctttgacaa accggagaag aacaagcaat ggggaaagga 2820 tagtctgttt aataaatggt gctgggaaaa ctggctcgca atctgtagga agctgaaact 2880 ggatccattc ttgacgcctt atacaaagat aaattcccga tggattaaag atctcaacgt 2940 gaaacccaaa acaattaaaa ccctcgagga aaacctgggt attacgattc aggacattgg 3000 ggtgggaaag gacttcatgt ccaaaacccc aaaagcgatg gcaaccaaag acaaaatcga 3060 caaatgggat ctcataaaac ttaagtcatt ttgcacagct aaagaaacga caattagggt 3120 gaaccgacaa ccgaccactt gggagaaaat cttcgcaaca tacagttctg acaaaggcct 3180 gatttccagg atctacaatg aattgaaaca aatttacaag aagaagacga acaaccctat 3240 aaagaaatgg gccaaggaca tgaacagaca cttctctaag gaagacattt atgcagccaa 3300 gaaacacatg aagaaatgca gctcttcact ggcaatcagg gaaatgcaaa tcaaaacaac 3360 aatgagatat catctcacac ccgtcagaat ggccatcatt aagaagagcg gaaacaaccg 3420 gtgctggcgt ggttgcggag aaatcggtac tctccttcac tgttggtggg actgtaaact 3480 cgttcaacca ctgtggaagt ctgtgtggcg gttcctcaga gatctggaac tcgaaatccc 3540 atttgaccca gccatccctc tcctgggtat atacccgaat gagtataaat cctgctgcta 3600 taaagacacc tgcacaagga tgtttattgc agctctcttc acaatcgcga agacgtggaa 3660 ccaacccaaa tgtccgacta tgattgactg gattaagaag atgtggcaca tatacactat 3720 ggaatactat gctgcgatca agaacgatga gttcatatca tttgtgggca catggatgaa 3780 actcgaaacc atcatactct ctaaattgag tcaagaacag aaaactaaac accgtatatt 3840 ttccctgatc ggtgggaatt agctacaaag acgatgacga caaggaccat ggagacggtg 3900 agagacacaa aaaattccaa cacactattg caatgaaaat aaatttcctt tattagccag 3960 aagtcagatg ctcaaggggc ttcatgatgt ccccataatt tttggcagag ggaaaaagat 4020 ctcagtggta tttgtgagcc agggcattgg ccttctgata ggcagcctgc acctgaggag 4080 tgcggccgct ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga 4140 actccagcag gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg 4200 tgctcaggta gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct 4260 ggtagtggtc ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca 4320 ccttgatgcc gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt 4380 actccagctt gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga 4440 tgcggttcac cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt 4500 cgtccttgaa gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga 4560 agtcgtgctg cttcatgtgg tcggggtagc 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ggagggatag cattgggaga tatacctaat 5460 gctagatgac acattagtgg gtgcagcgca ccagcatggc acatgtatac atatgtaact 5520 aacctgcaca atgtgcacat gtaccctaaa acttagagta taatggatcc gcaggcctct 5580 gctagcttga ctgactgaga tacagcgtac cttcagctca cagacatgat aagatacatt 5640 gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt 5700 tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt t 5751 <210> 37 <211> 18285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 cggccgcggg gggaggagcc aagatggccg aataggaaca gctccggtct acagctccca 60 gcgtgagcga cgcagaagac ggtgatttct gcatttccat ctgaggtacc gggttcatct 120 cactagggag tgccagacag tgggcgcagg ccagtgtgtg tgcgcaccgt gcgcgagccg 180 aagcagggcg aggcattgcc tcacctggga agcgcaaggg gtcagggagt tccctttccg 240 agtcaaagaa aggggtgacg gacgcacctg gaaaatcggg tcactcccac ccgaatattg 300 cgcttttcag accggcttaa gaaacggcgc accacgagac tatatcccac acctggctcg 360 gagggtccta cgcccacgga atctcgctga ttgctagcac agcagtctga 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tatctcaata gatgcagaaa aagcctttga caaaattcaa caacccttca tgctaaaaac 3840 tctcaataaa ttaggtattg atgggacgta tttcaaaata ataagagcta tctatgacaa 3900 acccacagcc aatatcatac tgaatgggca aaaactggaa gcattccctt tgaaaaccgg 3960 cacaagacag ggatgccctc tctcaccgct cctattcaac atagtgttgg aagttctggc 4020 cagggcaatc aggcaggaga aggaaataaa gggtattcaa ttaggaaaag aggaagtcaa 4080 attgtccctg tttgcagacg acatgattgt ttatctagaa aaccccatcg tctcagccca 4140 aaatctcctt aagctgataa gcaacttcag caaagtctca ggatacaaaa tcaatgtaca 4200 aaaatcacaa gcattcttat acaccaacaa cagacaaaca gagagccaaa tcatgggtga 4260 actcccattc acaattgctt caaagagaat aaaataccta ggaatccaac ttacaaggga 4320 tgtgaaggac ctcttcaagg agaactacaa accactgctc aaggaaataa aagaggagac 4380 aaacaaatgg aagaacattc catgctcatg ggtaggaaga atcaatatcg tgaaaatggc 4440 catactgccc aaggtaattt acagattcaa tgccatcccc atcaagctac caatgacttt 4500 cttcacagaa ttggaaaaaa ctactttaaa gttcatatgg aaccaaaaaa gagcccgcat 4560 tgccaagtca atcctaagcc aaaagaacaa agctggaggc atcacactac ctgacttcaa 4620 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aagtgtccct gtctgacagc tttgaagaga gcagtggttc tcccagcacg 660 cagctggaga tctgagaacg ggcagactgc ctcctcaagt gggtccctga cccctgaccc 720 ccgagcagcc taactgggag gcacccccca gcaggggcac actgacacct cacacggcag 780 ggtattccaa cagacctgca gctgagggtc ctgtctgtta gaaggaaaac taacaaccag 840 aaaggacatc tacaccgaaa acccatctgt acatcaccat catcaaagac caaaagtaga 900 taaaaccaca aagatgggga aaaaacagaa cagaaaaact ggaaactcta aaacgcagag 960 cgcctctcct cctccaaagg aacgcagttc ctcaccagca acagaacaaa gctggatgga 1020 gaatgatttt gatgagctga gagaagaagg cttcagacga tcaaattact ctgagctacg 1080 ggaggacatt caaaccaaag gcaaagaagt tgaaaacttt gaaaaaaatt tagaagaatg 1140 tataactaga ataaccaata cagagaagtg cttaaaggag ctgatggagc tgaaaaccaa 1200 ggctcgagaa ctacgtgaag aatgcagaag cctcaggagc cgatgcgatc aactggaaga 1260 aagggtatca gcaatggaag atgaaatgaa tgaaatgaag cgagaaggga agtttagaga 1320 aaaaagaata aaaagaaatg agcaaagcct ccaagaaata tgggactatg tgaaaagacc 1380 aaatctacgt ctgattggtg tacctgaaag tgatgtggag aatggaacca agttggaaaa 1440 cactctgcag gatattatcc aggagaactt ccccaatcta gcaaggcagg ccaacgttca 1500 gattcaggaa atacagagaa cgccacaaag atactcctcg agaagagcaa ctccaagaca 1560 cataattgtc agattcacca aagttgaaat gaaggaaaaa atgttaaggg cagccagaga 1620 gaaaggtcgg gttaccctca aaggaaagcc catcagacta acagcggatc tctcggcaga 1680 aaccctacaa gccagaagag agtgggggcc aatattcaac attcttaaag aaaagaattt 1740 tcaacccaga atttcatatc cagccaaact aagcttcata agtgaaggag aaataaaata 1800 ctttatagac aagcaaatgt tgagagattt tgtcaccacc aggcctgccc taaaagagct 1860 cctgaaggaa gcgctaaaca tggaaaggaa caaccggtac cagccgctgc aaaatcatgc 1920 caaaatgtaa agaccatcaa gactaggaag aaactgcatc aactaatgag caaaatcacc 1980 agctaacatc ataatgacag gatcaacttc acacataaca atattaactt taaatataaa 2040 tggactaaat tctgcaatta aaagacacag actggcaagt tggataaaga gtcaagaccc 2100 atcagtgtgc tgtattcagg aaacccatct cacgtgcaga gacacacata ggctcaaaat 2160 aaaaggatgg aggaagatct accaagccaa tggaaaacaa aaaaaggcag gggttgcaat 2220 cctagtctct gataaaacag actttaaacc aacaaagatc aaaagagaca aagaaggcca 2280 ttacataatg gtaaagggat 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tcctttttcc aggggcctgt cggacccagt tcatgccgta 8220 gttggtgaag gtgtagccgc tggcggcaca gctgattctg acagatccgc caggtttcac 8280 aagtccgccg ccagactgaa ccagctggat ctcagagatg ctacaggcca ctgttcccag 8340 cagcagcaga gactgcagcc acatctggtg gcgaattcga agcttgagct cgagatctga 8400 gtccggtagc gctagcggat ctgacggttc actaaaccag ctctgcttat atagacctcc 8460 caccgtacac gcctaccgcc catttgcgtc aatggggcgg agttgttacg acattttgga 8520 aagtcccgtt gattttggtg ccaaaacaaa ctcccattga cgtcaatggg gtggagactt 8580 ggaaatcccc gtgagtcaaa ccgctatcca cgcccattga tgtactgcca aaaccgcatc 8640 accatggtaa tagcgatgac taatacgtag atgtactgcc aagtaggaaa gtcccataag 8700 gtcatgtact gggcataatg ccaggcgggc catttaccgt cattgacgtc aatagggggc 8760 gtacttggca tatgatacac ttgatgtact gccaagtggg cagtttaccg taaatactcc 8820 acccattgac gtcaatggaa agtccctatt ggcgttacta tgggaacata cgtcattatt 8880 gacgtcaatg ggcgggggtc gttgggcggt cagccaggcg ggccatttac cgtaagttat 8940 gtaacgcgga actccatata tgggctatga actaatgacc ccgtaattga ttactattag 9000 cccgggggat ccagacatga 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tgaaaaccaa 1200 ggctcgagaa ctacgtgaag aatgcagaag cctcaggagc cgatgcgatc aactggaaga 1260 aagggtatca gcaatggaag atgaaatgaa tgaaatgaag cgagaaggga agtttagaga 1320 aaaaagaata aaaagaaatg agcaaagcct ccaagaaata tgggactatg tgaaaagacc 1380 aaatctacgt ctgattggtg tacctgaaag tgatgtggag aatggaacca agttggaaaa 1440 cactctgcag gatattatcc aggagaactt ccccaatcta gcaaggcagg ccaacgttca 1500 gattcaggaa atacagagaa cgccacaaag atactcctcg agaagagcaa ctccaagaca 1560 cataattgtc agattcacca aagttgaaat gaaggaaaaa atgttaaggg cagccagaga 1620 gaaaggtcgg gttaccctca aaggaaagcc catcagacta acagcggatc tctcggcaga 1680 aaccctacaa gccagaagag agtgggggcc aatattcaac attcttaaag aaaagaattt 1740 tcaacccaga atttcatatc cagccaaact aagcttcata agtgaaggag aaataaaata 1800 ctttatagac aagcaaatgt tgagagattt tgtcaccacc aggcctgccc taaaagagct 1860 cctgaaggaa gcgctaaaca tggaaaggaa caaccggtac cagccgctgc aaaatcatgc 1920 caaaatgtaa agaccatcaa gactaggaag aaactgcatc aactaatgag caaaatcacc 1980 agctaacatc ataatgacag gatcaacttc acacataaca atattaactt taaatataaa 2040 tggactaaat tctgcaatta aaagacacag actggcaagt tggataaaga gtcaagaccc 2100 atcagtgtgc tgtattcagg aaacccatct cacgtgcaga gacacacata ggctcaaaat 2160 aaaaggatgg aggaagatct accaagccaa tggaaaacaa aaaaaggcag gggttgcaat 2220 cctagtctct gataaaacag actttaaacc aacaaagatc aaaagagaca aagaaggcca 2280 ttacataatg gtaaagggat caattcaaca agaggagcta actatcctaa atatttatgc 2340 acccaataca ggagcaccca gattcataaa gcaagtcctc agtgacctac aaagagactt 2400 agactcccac acattaataa tgggagactt taacacccca ctgtcaacat tagacagatc 2460 aacgagacag aaagtcaaca aggataccca ggaattgaac tcagctctgc accaagcaga 2520 cctaatagac atctacagaa ctctccaccc caaatcaaca gaatatacat ttttttcagc 2580 accacaccac acctattcca aaattgacca catagttgga agtaaagctc tcctcagcaa 2640 atgtaaaaga acagaaatta taacaaacta tctctcagac cacagtgcaa tcaaactaga 2700 actcaggatt aagaatctca ctcaaagccg ctcaactaca tggaaactga acaacctgct 2760 cctgaatgac tactgggtac ataacgaaat gaaggcagaa ataaagatgt tctttgaaac 2820 caacgagaac aaagacacca cataccagaa tctctgggac gcattcaaag 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ggttcaatat 3720 acgcaaatca ataaatgtaa tccagcatat aaacagagcc aaagacaaaa accacatgat 3780 tatctcaata gatgcagaaa aagcctttga caaaattcaa caacccttca tgctaaaaac 3840 tctcaataaa ttaggtattg atgggacgta tttcaaaata ataagagcta tctatgacaa 3900 acccacagcc aatatcatac tgaatgggca aaaactggaa gcattccctt tgaaaaccgg 3960 cacaagacag ggatgccctc tctcaccgct cctattcaac atagtgttgg aagttctggc 4020 cagggcaatc aggcaggaga aggaaataaa gggtattcaa ttaggaaaag aggaagtcaa 4080 attgtccctg tttgcagacg acatgattgt ttatctagaa aaccccatcg tctcagccca 4140 aaatctcctt aagctgataa gcaacttcag caaagtctca ggatacaaaa tcaatgtaca 4200 aaaatcacaa gcattcttat acaccaacaa cagacaaaca gagagccaaa tcatgggtga 4260 actcccattc acaattgctt caaagagaat aaaataccta ggaatccaac ttacaaggga 4320 tgtgaaggac ctcttcaagg agaactacaa accactgctc aaggaaataa aagaggagac 4380 aaacaaatgg aagaacattc catgctcatg ggtaggaaga atcaatatcg tgaaaatggc 4440 catactgccc aaggtaattt acagattcaa tgccatcccc atcaagctac caatgacttt 4500 cttcacagaa ttggaaaaaa ctactttaaa gttcatatgg aaccaaaaaa 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gacaagccgt aaagactgga 11280 tgtccatctc acacgaattt atggctatgg gcaacacata atcctagtgc aatatgatac 11340 tggggttatt aagatgtgtc ccaggcaggg accaagacag gtgaaccatg ttgttacact 11400 ctatttgtaa caaggggaaa gagagtggac gccgacagca gcggactcca ctggttgtct 11460 ctaacacccc cgaaaattaa acggggctcc acgccaatgg ggcccataaa caaagacaag 11520 tggccactct tttttttgaa attgtggagt gggggcacgc gtcagccccc acacgccgcc 11580 ctgcggtttt ggactgtaaa ataagggtgt aataacttgg ctgattgtaa ccccgctaac 11640 cactgcggtc aaaccacttg cccacaaaac cactaatggc accccgggga atacctgcat 11700 aagtaggtgg gcgggccaag ataggggcgc gattgctgcg atctggagga caaattacac 11760 acacttgcgc ctgagcgcca agcacagggt tgttggtcct catattcacg aggtcgctga 11820 gagcacggtg ggctaatgtt gccatgggta gcatatacta cccaaatatc tggatagcat 11880 atgctatcct aatctatatc tgggtagcat aggctatcct aatctatatc tgggtagcat 11940 atgctatcct aatctatatc tgggtagtat atgctatcct aatttatatc tgggtagcat 12000 aggctatcct aatctatatc tgggtagcat atgctatcct aatctatatc tgggtagtat 12060 atgctatcct aatctgtatc cgggtagcat 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tccgagggca aaggaatagg ggagatgggg gaggctaact gaaacacgga 18780 aggagacaat accggaagga acccgcgcta tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc 18840 acgggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc 18900 gataccccac cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc 18960 caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca acgtcggggc ggcaggccct 19020 gccatagcca ctggccccgt gggttaggga cggggtcccc catggggaat ggtttatggt 19080 tcgtgggggt tattattttg ggcgttgcgt ggggtctggt ccacgactgg actgagcaga 19140 cagacccatg gtttttggat ggcctgggca tggaccgcat gtactggcgc gacacgaaca 19200 ccgggcgtct gtggctgcca aacacccccg acccccaaaa accaccgcgc ggatttctgg 19260 cgtgccaagc tagtcgacca attctcatgt ttgacagctt atcatcgcag atccgggcaa 19320 cgttgttgca ttgctgcagg cgcagaactg gtaggtatgg aagatctcta gaagctgggt 19380 accagctgct agcaagcttg ctagcggccg gctcgagttt actccctatc agtgatagag 19440 aacgtatgtc gagtttactc cctatcagtg atagagaacg atgtcgagtt tactccctat 19500 cagtgataga gaacgtatgt cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag 19560 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<210> 43 <211> 7376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 taatacgact cactataggg agaagtactg ccaccatggg caagaagcaa aatcgcaaga 60 cggggaattc caagacacaa tccgctagcc caccacctaa agagcgttct agctcccctg 120 ctactgagca gtcctggatg gaaaacgact tcgatgaact ccgggaagag ggatttaggc 180 gatccaacta ttcagaactc cgcgaagata tccagacaaa ggggaaggaa gtcgagaatt 240 tcgagaagaa cctcgaggag tgcatcaccc gtatcacaaa cactgagaaa tgtctcaaag 300 aactcatgga acttaagaca aaagccaggg agcttcgaga ggagtgtcgg agtctgagat 360 ccaggtgtga ccagctcgag gagcgcgtga gcgcgatgga agacgagatg aacgagatga 420 aaagagaggg caaattcagg gagaagcgca ttaagaggaa cgaacagagt ctgcaggaga 480 tttgggatta cgtcaagagg cctaacctgc ggttgatcgg cgtccccgag agcgacgtag 540 aaaacgggac taaactggag aatacacttc aagacatcat tcaagaaaat tttccaaacc 600 tggctcggca agctaatgtg caaatccaag agatccaacg cacaccccag cggtatagct 660 ctcggcgtgc cacccctagg catattatcg tgcgctttac taaggtggag atgaaagaga 720 agatgctgcg agccgctcgg 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gatcgcagca ccaggcaaaa ggtaaataaa 1620 gacacgcaag agctcaatag cgcactgcat caggcagatc tcattgatat ttatcgcact 1680 cttcatccta agagtaccga gtacacattc ttcagcgccc cacatcatac atactcaaag 1740 atcgatcata tcgtcggctc aaaggctctg ctgtcaaagt gcaagcgcac agagataatt 1800 acaaattacc tgtcagatca tagcgcgatc aagctcgagc tgagaatcaa gaacctgacc 1860 cagagccgga gtaccacttg gaagcttaat aacctgctgc tcaacgatta ttgggtccac 1920 aatgagatga aggcagagat taaaatgttc ttcgaaacaa atgagaataa ggatactacc 1980 tatcaaaacc tttgggatgc ctttaaggcc gtctgcagag gcaagttcat cgccctcaac 2040 gcctataaaa gaaaacaaga gagatctaag atcgatactc tcacctctca gctgaaggag 2100 ttggagaaac aggaacagac ccactccaag gcgtcaagac ggcaggagat cacaaagatt 2160 cgcgccgagt tgaaagagat cgaaacccaa aagactcttc agaaaattaa cgagtctcgt 2220 agttggttct tcgagcggat taataagata gacagacctc tggcacgact gattaagaag 2280 aagcgcgaaa agaaccagat tgataccatc aagaacgaca agggcgacat cactactgac 2340 ccgaccgaga tccagaccac tattcgggag tattataagc atttgtatgc taacaagctt 2400 gagaacctgg aagagatgga cacttttctg gatacctata ctctgccacg gcttaatcaa 2460 gaggaagtcg agtccctcaa ccgcccaatt acaggaagcg agattgtggc cataattaac 2520 tccctgccga caaagaaatc tcctggtccg gacgggttta cagctgagtt ttatcaacgg 2580 tatatggaag agcttgtacc gtttctgctc aagctctttc agtctataga aaaggaaggc 2640 atcttgccca attccttcta cgaagcttct ataatactta ttcccaaacc aggacgcgat 2700 accacaaaga aggaaaactt ccggcccatt agtctcatga atatcgacgc taaaatattg 2760 aacaagattc tcgccaacag aatccaacaa catattaaga aattgataca tcacgaccag 2820 gtggggttta tacctggcat gcagggctgg tttaacatcc ggaagagtat taacgtcatt 2880 caacacatta atagagctaa ggataagaat catatgatca tctctataga cgcggaaaag 2940 gcattcgata agattcagca gccatttatg ctcaagactc tgaacaaact cggcatcgac 3000 ggaacatatt ttaagattat tcgcgcaatt tacgataagc cgactgctaa cattatcctt 3060 aacggccaaa agctcgaggc ctttccgctc aagactggaa cccgccaagg ctgtcccctc 3120 tccccgcttt tgtttaatat tgtactcgag gtgctggcta gggctattcg tcaagagaaa 3180 gagattaaag ggatacagct cgggaaggaa gaggtcaagc tttccttgtt cgccgatgat 3240 atgattgtgt acctggagaa tcctattgtg 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ctcagtggta tttgtgagcc agggcattgg 5820 ccttctgata ggcagcctgc acctgaggag tgcggccgct ttacttgtac agctcgtcca 5880 tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag gaccatgtga tcgcgcttct 5940 cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta gtggttgtcg ggcagcagca 6000 cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc ggcgagctgc acgctgccgt 6060 cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc gttcttctgc ttgtcggcca 6120 tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt gtgccccagg atgttgccgt 6180 cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac cagggtgtcg ccctcgaact 6240 tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa gaagatggtg cgctcctgga 6300 cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg cttcatgtgg tcggggtagc 6360 ggctgaagca ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag ggtgggccag ggcacgggca 6420 gcttgccggt ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc gtaggtggca tcgccctcgc 6480 cctcgccgga cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc gtccagctcg accaggatgg 6540 gcaccacccc ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat ggtggcggga tctgacggtt 6600 cactaaacca gctctgctta tatagacctc 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atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 9000 ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctccaggacg 9060 aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 9120 ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 9180 tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 9240 tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 9300 gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 9360 aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcggatgccc gacggcgagg 9420 atctcgtcgt gacccacggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 9480 tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 9540 tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 9600 tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 9660 tcttctagta tgtaagccct gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 9720 ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 9780 aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 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ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 11520 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cgcgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 11580 acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ctttccaatg atgagcactt 11640 ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 11700 gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ttcaccagtc acagaaaagc 11760 atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 11820 acactgcggc caacttactt ctgacaacga ttggaggacc gaaggagcta accgcttttt 11880 tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 11940 ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca accttgcgta 12000 aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acagttgata gactggatgg 12060 aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 12120 ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 12180 atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 12240 aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taaccgattc 12300 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taccttaaac gtgaatgggt taaatgcccc aaccaagaga 1200 catcggctgg ctgaatggat tcagaaacag gacccctata tttgctgtct gcaggagacc 1260 cacttccgtc ctcgcgacac atacagactg aaagtgaggg gctggaaaaa gatcttccat 1320 gccaatggaa atcaaaagaa agctggagtg gctattctca tctcagataa aattgacttc 1380 aaaataaaga atgttactcg agataaggag ggacactaca taatgatcca ggggtccatc 1440 caagaagagg atataactat tattaatatt tatgcaccca acattggcgc ccctcagtac 1500 atcaggcagc tgcttacagc tatcaaggag gaaatcgaca gtaacacgat tatcgtgggg 1560 gactttaaca ccagccttac tccgatggat agatcatcca aaatgaaaat aaataaggaa 1620 acagaggctc ttaatgacac cattgaccag atagatctga ttgatatata taggacattc 1680 catccaaaaa ctgccgatta cactttcttc agcagtgcgc atggaacctt ctccaggata 1740 gatcacatct tgggtcacaa aagtagcctc agtaagttta agaaaattga aatcattagc 1800 agcatctttt ctgaccataa cgctatgcgc ctggagatga atcacaggga gaagaacgta 1860 aagaagacaa acacctggag gctgaacaat acgctgctaa ataaccaaga gatcactgag 1920 gaaatcaaac aggaaataaa aaaatacttg gagacaaatg acaatgaaaa cacgaccacc 1980 cagaacttgt gggatgcagc 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gagagggtgt ggcgaaaagg gaaccctctt gcattgttgg 4560 tgggagtgta agttgatcca gccactatgg cggaccatat ggaggttcct taaaaaactg 4620 aagattgagc tgccatatga cccagcaatc ccactgctgg gcatataccc ggagaaaacc 4680 gtgattcaga aagacacttg cacccgaatg ttcattgcag cattgtttac aatagccagg 4740 tcatggaagc agcctaagtg cccctcgaca gacgagtgga tcaagaagat gtggtacatt 4800 tatactatgg aatattacag cgccatcaaa cgcaacgaaa ttgggtcttt tctggagacg 4860 tggatggatc tagagactgt catccagagt gaggtaagtc agaaagagaa gaacaaatat 4920 cgtattttaa cgcatatttg tggaacctgg aagaatggta cagatgagcc ggtctgccga 4980 accgagattg agacccagat ggactacaaa gacgatgacg acaagtgaag cgcttctaga 5040 agttgtctcc tcctgcactg actgactgat acaatcgatt tctggatccg caggcctaat 5100 caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct 5160 tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg 5220 gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg 5280 cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt 5340 tggggcattg ccaccacctg 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 56 atgaccggct ctaactcaca tatcaccatc cttacactta acattaacgg cctcaactca 60 gctatcaagc gccatcggct ggccagctgg atcaaatcac aggatccaag cgtttgttgc 120 atccaagaga cccacctgac ctgtagagat actcaccgcc tcaagatcaa gggatggcga 180 aagatttatc aggcgaacgg taagcagaag aaagccggag tcgcaattct ggtctcagac 240 aagacggatt tcaagcccac caaaattaag cgtgataagg aaggtcacta tattatggtg 300 aaaggcagca tacagcagga agaacttacc atattgaaca tctacgcgcc aaacaccggc 360 gcacctcgct ttatcaaaca ggtcctgtcc gatctgcagc gagatctgga ttctcatacg 420 ttgattatgg gtgatttcaa tacaccattg agcaccctgg atcgcagcac caggcaaaag 480 gtaaataaag acacgcaaga gctcaatagc gcactgcatc aggcagatct cattgatatt 540 tatcgcactc ttcatcctaa gagtaccgag tacacattct tcagcgcccc acatcataca 600 tactcaaaga tcgatcatat cgtcggctca aaggctctgc tgtcaaagtg caagcgcaca 660 gagataatta caaattacct gtcagatcat agcgcgatca agctcgagct gagaatcaag 720 aacctgaccc agagccggag taccacttgg aagcttaata acctgctgct caacgattat 780 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gtgatatatc gctttaacgc catcccaatt aaactgccta tgaccttctt tacggagctc 2520 gagaaaacaa cccttaaatt tatatggaat caaaagagag caagaatagc gaagtccatc 2580 ttgagccaga agaataaggc cggtgggatt actttgcctg attttaagtt gtattataaa 2640 gccacagtaa ctaagacagc ctggtattgg tatcagaata gagacatcga ccagtggaat 2700 cggaccgaac catcagagat aatgccccac atctataatt accttatatt cgataagcca 2760 gaaaagaata aacagtgggg caaagacagc ctcttcaaca agtggtgttg ggagaattgg 2820 ctggccatat gccggaaact caagctcgac ccctttctta caccctacac taaaatcaac 2880 agtaggtgga tcaaggactt gaatgtcaag ccaaagacta taaagacact ggaagagaat 2940 cttgggatca caatacaaga tataggcgtc ggcaaagatt ttatgtcaaa gacgcccaag 3000 gccatggcca ctaaggataa gattgataag tgggacctta ttaagctcaa aagcttctgt 3060 actgccaagg agaccacgat cagagttaat aggcagccca ctacatggga aaagattttc 3120 gccacttatt catcagataa ggggttgata agcagaatat ataacgagct gaagcagatc 3180 tacaagaaga aaacgaataa tcccatcaag aagtgggcaa aagatatgaa caggcatttt 3240 agcaaagagg atatctacgc cgcgaagaag catatgaaga agtgtagttc aagcttggcc 3300 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His 290 295 300 Thr Arg Gly Leu Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Leu 325 330 335 Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp 340 345 350 Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr 355 360 365 Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Asp Met 370 375 380 Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln 385 390 395 400 Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met 405 410 415 <210> 71 <211> 437 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Tyr Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 210 215 220 Asp Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe 245 250 255 Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro 260 265 270 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 275 280 285 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 290 295 300 Thr Arg Gly Leu Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Leu Lys 325 330 335 Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly 340 345 350 Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu 355 360 365 Lys His Glu Lys Pro Pro Gln Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 370 375 380 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 385 390 395 400 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 405 410 415 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 420 425 430 Val Gln Glu Arg Gln 435 <210> 72 <211> 438 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Tyr Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 210 215 220 Asp Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe 245 250 255 Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro 260 265 270 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 275 280 285 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 290 295 300 Thr Arg Gly Leu Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Leu 325 330 335 Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp 340 345 350 Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr 355 360 365 Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr 370 375 380 Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro 385 390 395 400 Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu 405 410 415 His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile 420 425 430 Ser Val Gln Glu Arg Gln 435 <210> 73 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Met Arg Asn Lys Lys Ile Leu Lys Glu Asp Glu Leu Leu Ser Glu Thr 1 5 10 15 Gln Gln Ala Ala Phe His Gln Ile Ala Met Glu Pro Phe Glu Ile Asn 20 25 30 Val Pro Lys Pro Lys Arg Arg Asn Gly Val Asn Phe 35 40 <210> 74 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Met Glu Gln Trp Asp His Phe His Asn Gln Gln Glu Asp Thr Asp Ser 1 5 10 15 Cys Ser Glu Ser Val Lys Phe Asp Ala Arg Ser Met Thr Ala Leu Leu 20 25 30 Pro Pro Asn Pro Lys Asn Ser Pro Ser Leu Gln Glu Lys Leu Lys Ser 35 40 45 Phe Lys 50 <210> 75 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Glu Ala Ala Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Lys 20 25 30 Ala <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 1-4 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 76 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 1-4 "Glu Ala Ala Ala Lys" repeating units <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 79 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys 20 <210> 80 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 cuaggaaucu ggaaguaccg aggaaacucg guacuuccug uguccuag 48 <210> 81 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 auauggaaga uccuggggaa cugggaucuu ccuaagu 37 <210> 82 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(17) <223> Dihydrouridine <220> <221> modified_base <222> (37)..(37) <223> a, c, t, g or u <220> <221> modified_base <222> (39)..(39) <223> Pseudouridine <220> <221> modified_base <222> (55)..(55) <223> Pseudouridine <400> 82 gcgcauuuag cucagnnggg agagcgccag acugaananc uggagcuccu gugtncgauc 60 cacagaauuc gcacca 76 <210> 83 <211> 203 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (66)..(185) <223> a, c, u or g <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 83 gcuggguuuu uccuuguucg caccggacac cuccagugac cagacggcaa gguuuuuauc 60 ccagunnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnaaaaa aaaaaaaaaa aaa 203 <210> 84 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gaagguuuuu cuuuuccuga gaaaacaaca cguauuguuu ucucagguuu ugcuuuuugg 60 ccuuuuucua gcuuaaaaaa aaaaaaagca aaa 93 <210> 85 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ggaagguuuu ucuuuuccug aggcgaaagu cucagguuuu gcuuuuuggc cuuucuuaaa 60 aaaaaaaaaa gcaaaa 76

Claims (147)

  1. 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법으로서, mRNA는
    (a) (i) 외생성(exogenous) 서열, 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체(reverse complement)인 서열을 포함하는 삽입체 서열;
    (b) 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열로서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF 단백질에 대한 결합 부위를 포함하는 것인 서열
    을 포함하고, 삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 인간 ORF2p에 대한 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
  3. 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 면역 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법으로서, mRNA는
    (a) (i) 외생성 서열, 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열;
    (b) 5' UTR 서열, 및 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열로서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제 결합 부위 및/또는 역전사효소 결합 부위를 포함하는 것인 서열
    을 포함하고, 전이 유전자 서열이 면역 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 핵산 서열을 면역 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법.
  4. 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법으로서, mRNA는
    (a) (i) 외생성 서열, 또는 (ii) 외생성 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 삽입체 서열;
    (b) 5' UTR 서열, 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 인간 레트로트랜스포존(retrotransposon)의 서열, 및 인간 레트로트랜스포존의 서열의 다운스트림에 있는 3' UTR 서열로서, 이때 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 엔도뉴클레아제 결합 부위 및/또는 역전사효소 결합 부위를 포함하는 것인 서열
    을 포함하고, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역되는 2개의 단백질을 코딩하며,
    삽입체 서열은 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 핵산 서열을 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 ORF2p 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
  6. 제2항 또는 제5항에 있어서, ORF2p 결합 부위는 3' UTR 서열 내의 폴리 A 서열인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 인간 레트로트랜스포존의 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는 것인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 3' UTR 서열의 업스트림에 있는 것인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 2개의 ORF를 함유하는 단일 RNA로부터 번역되는 2개의 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  11. 제4항 또는 제10항에 있어서, 2개의 ORF는 비-중첩 ORF인 방법.
  12. 제4항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 ORF는 ORF1 및 ORF2인 방법.
  13. 제12항에 있어서, ORF1은 ORF1p를 코딩하고, ORF2는 ORF2p를 코딩하는 것인 방법.
  14. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 비-LTR 레트로트랜스포존의 서열을 포함하는 것인 방법.
  15. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 LINE-1 레트로트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, LINE-1 레트로트랜스포존은 인간 LINE-1 레트로트랜스포존인 방법.
  17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소는 ORF2p인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 역전사효소는 II군 인트론 역전사효소 도메인인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소는 밍크 고래 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소인 방법.
  21. 제4항 내지 제16항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은 ORF2p를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 삽입체 서열은 ORF2p의 엔도뉴클레아제 도메인의 특이성을 이용함으로써 폴리 T 부위에서 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 폴리 T 부위는 서열 TTTTTA를 포함하는 것인 방법.
  24. 제4항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 인간 레트로트랜스포존의 서열은 ORF1p를 코딩하는 서열을 포함하거나, (ii) mRNA는 ORF1p를 코딩하는 서열을 포함하지 않거나, 또는 (iii) mRNA는 상보체 유전자의 5' UTR 서열에 의한 ORF1p 코딩 서열의 대체를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 ORF1p를 코딩하는 제1 mRNA 분자, 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 mRNA 분자를 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 ORF1p를 코딩하는 제1 서열, 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열을 포함하는 mRNA 분자인 방법.
  27. 제26항에 있어서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열과 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 링커 서열에 의해 분리된 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 링커 서열은 내부 리보좀 진입 서열(IRES)을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, IRES는 CVB3 또는 EV71의 IRES인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 링커 서열은 자가 절단 펩타이드 서열을 코딩하는 것인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 링커 서열은 T2A, E2A 또는 P2A 서열을 코딩하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 레트로트랜스포존의 서열은, 추가 단백질 서열에 융합된 ORF1p를 코딩하는 서열 및/또는 추가 단백질 서열에 융합된 ORF2p를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, ORF1p 및/또는 ORF2p는 핵 체류(nuclear retention) 서열에 융합된 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 핵 체류 서열은 Alu 서열인 방법.
  35. 제32항에 있어서, ORF1p 및/또는 ORF2p는 MS2 코트 단백질에 융합된 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 적어도 1개, 2개, 3개 이상의 MS2 헤어핀 서열을 포함하는 것인 방법.
  37. 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 mRNA의 폴리 A 꼬리와 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 상호작용을 촉진하거나 향상시키는 서열을 포함하는 것인 방법.
  38. 제17항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 폴리 A 결합 단백질(PABP)과 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 상호작용을 촉진하거나 향상시키는 서열을 포함하는 것인 방법.
  39. 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은, 상기 mRNA에 대한 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소의 특이성을, 세포에 의해 발현된 또 다른 mRNA에 비해 증가시키는 서열을 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 5' UTR 서열 또는 3' UTR 서열은 Alu 요소 서열을 포함하는 것인 방법.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은 동일한 프로모터를 가진 것인 방법.
  42. 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 ORF1p를 코딩하는 제1 서열의 프로모터와 상이한 프로모터를 가진 것인 방법.
  43. 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열의 프로모터와 상이한 프로모터를 가진 것인 방법.
  44. 제26항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및/또는 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은, 유도성 프로모터, CMV 프로모터 또는 전사 시작 부위, T7 프로모터 또는 전사 시작 부위, EF1a 프로모터 또는 전사 시작 부위, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터 또는 전사 시작 부위를 가진 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 유도성 프로모터, CMV 프로모터 또는 전사 시작 부위, T7 프로모터 또는 전사 시작 부위, EF1a 프로모터 또는 전사 시작 부위, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터 또는 전사 시작 부위를 가진 것인 방법.
  46. 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, ORF1p를 코딩하는 제1 서열 및 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 제2 서열은, 인간 세포에서 발현되도록 코돈 최적화된 것인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 WPRE 요소를 포함하는 것인 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 선택 마커를 포함하는 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 친화성 태그를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 친화성 태그는 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열에 연결된 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 3' UTR은 폴리 A 서열을 포함하거나, 또는 폴리 A 서열은 시험관내에서 mRNA에 추가되는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 폴리 A 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있는 것인 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 삽입체 서열은 폴리 A 서열의 업스트림에 있는 것인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 3' UTR 서열은 삽입체 서열을 포함하는 것인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체인 서열을 포함하는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체인 서열의 업스트림에 있는 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 리보좀 좌위는 아닌 좌위에서 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
  60. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 유전자 또는 유전자의 조절 영역 내로 통합됨으로써, 유전자를 파괴하거나 유전자의 발현을 하향조절하는 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 유전자 또는 유전자의 조절 영역 내로 통합됨으로써, 유전자의 발현을 상향조절하는 것인 방법.
  62. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 게놈 내로 통합되고 유전자를 대체하는 것인 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 게놈 내로 안정적으로 통합되는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 게놈 내로 역전위되는 것인 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 mRNA에 의해 코딩된 엔도뉴클레아제에 의한 표적 부위의 DNA 가닥의 절단에 의해 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 표적 프라이밍 역전사(TPRT)를 통해 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
  67. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 게놈의 DNA 표적 부위로의 mRNA의 역스플라이싱을 통해 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
  68. 제1항 및 제4항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 면역 세포인 방법.
  69. 제3항 또는 제68항에 있어서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포인 방법.
  70. 제3항 또는 제68항에 있어서, 면역 세포는 골수 세포인 방법.
  71. 제3항 또는 제68항에 있어서, 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 수지상 전구체 세포 및 대식세포 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 자가 통합 mRNA인 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  74. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 생체외에서 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 세포를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  77. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 면역 반응은 인간 대상체에서 유발되지 않는 것인 방법.
  79. 제76항 또는 제77항에 있어서, mRNA 또는 벡터는 실질적으로 면역원성을 갖지 않는 것인 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 방법.
  81. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 비-LTR 레트로트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
  82. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 인간 L1 요소를 포함하는 것인 방법.
  83. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존 ORF1 유전자를 포함하는 것인 방법.
  84. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존 ORF2 유전자를 포함하는 것인 방법.
  85. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 L1 레트로트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 적어도 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 킬로베이스인 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 최대 약 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5 킬로베이스인 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 또는 RNAse에 의한 mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 것인 방법.
  90. 제88항에 있어서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 G 사중체, 슈도노트(pseudoknot) 또는 삼중체 서열인 방법.
  91. 제88항에 있어서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 플라비바이러스 RNA의 엑소리보뉴클레아제(exoribonuclease) 내성 RNA 구조, 또는 KSV의 ENE 요소인 방법.
  92. 제88항에 있어서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 데아데닐라제(deadenylase)에 의한 mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 것인 방법.
  93. 제88항에 있어서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 mRNA의 폴리 A 꼬리의 내부 또는 말단에서 비-아데노신 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
  94. 제88항에 있어서, mRNA의 분해를 억제하거나 방지하는 서열은 mRNA의 안정성을 증가시키는 것인 방법.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 외생성 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열과 인 프레임(in frame)으로 존재하지 않는 것인 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 엔도뉴클레아제 및/또는 역전사효소를 코딩하는 서열과 인 프레임으로 존재하지 않는 것인 방법.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 외생성 서열은 인트론을 포함하지 않는 것인 방법.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 외생성 서열은 효소, 수용체, 수송 단백질, 구조 단백질, 호르몬, 항체, 수축성 단백질 및 저장 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  100. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 외생성 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 리간드, 항체, 수용체 및 효소로 구성된 군으로부터 선택된 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  101. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 외생성 서열은 조절 서열을 포함하는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 조절 서열은 시스(cis) 작용 조절 서열을 포함하는 것인 방법.
  103. 제101항에 있어서, 조절 서열은 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 프로모터 또는 반응 요소로 구성된 군으로부터 선택된 시스 작용 조절 서열을 포함하는 것인 방법.
  104. 제101항에 있어서, 조절 서열은 트랜스(trans) 작용 조절 서열을 포함하는 것인 방법.
  105. 제101항에 있어서, 조절 서열은 전사 인자를 코딩하는 트랜스 작용 조절 서열을 포함하는 것인 방법.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열의 통합은 세포 건강에 불리하게 영향을 미치지 않는 것인 방법.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제, 역전사효소 또는 이들 둘 다는 삽입체 서열의 부위 특이적 통합을 할 수 있는 것인 방법.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 추가 뉴클레아제 도메인, 또는 ORF2로부터 유래하지 않은 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  109. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 megaTAL 뉴클레아제 도메인, TALEN 도메인, Cas9 도메인, R2 역요소(retroelement)의 징크 핑거(zinc finger) 결합 도메인, 또는 AAV의 Rep78과 같은 반복 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  110. 제17항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 돌연변이를 갖지 않은 엔도뉴클레아제에 비해 엔도뉴클레아제의 활성을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  111. 제110항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 ORF2p 엔도뉴클레아제이고 돌연변이는 S228P인 방법.
  112. 제17항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 역전사효소의 신뢰도 및/또는 진행성을 증가시키는 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  113. 제17항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소는 ORF2 이외의 역요소의 역전사효소, 또는 ORF2p의 역전사효소에 비해 더 높은 신뢰도 및/또는 진행성을 가진 역전사효소인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 역전사효소는 II군 인트론 역전사효소인 방법.
  115. 제114항에 있어서, II군 인트론 역전사효소는 IIA군 인트론 역전사효소, IIB군 인트론 역전사효소, 또는 IIC군 인트론 역전사효소인 방법.
  116. 제114항에 있어서, II군 인트론 역전사효소는 TGIRT-II 또는 TGIRT-III인 방법.
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 Alu 요소 및/또는 리보좀 결합 앱타머를 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  119. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 3' UTR 서열은 바이러스 3' UTR 또는 베타-글로빈 3' UTR로부터 유래한 것인 방법.
  120. 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 포함하는 조성물로서, mRNA는
    (i) 인간 LINE-1 트랜스포존 5' UTR 서열,
    (ii) 인간 LINE-1 트랜스포존 5' UTR 서열의 다운스트림에 있는, ORF1p를 코딩하는 서열,
    (iii) ORF1p를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있는 ORF간 링커 서열,
    (iv) ORF간 링커 서열의 다운스트림에 있는, ORF2p를 코딩하는 서열, 및
    (v) ORF2p를 코딩하는 서열의 다운스트림에 있는, 인간 LINE-1 트랜스포존으로부터 유래한 3' UTR 서열
    을 포함하는 인간 LINE-1 트랜스포존 서열을 포함하고;
    3' UTR 서열은 삽입체 서열을 포함하며, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체, 또는 외생성 조절 요소를 코딩하는 서열의 역상보체인, 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터를 포함하는 조성물.
  121. 제120항에 있어서, 삽입체 서열은 세포 내로 도입될 때 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 조성물.
  122. 제121항에 있어서, 삽입체 서열은 병태 또는 질환과 관련된 유전자 내로 통합됨으로써, 상기 유전자를 파괴하거나 상기 유전자의 발현을 하향조절하는 것인 조성물.
  123. 제121항에 있어서, 삽입체 서열은 유전자 내로 통합됨으로써, 상기 유전자의 발현을 상향조절하는 것인 조성물.
  124. 제121항에 있어서, mRNA는 서열번호 35 내지 50으로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 조성물.
  125. 제121항에 있어서, 재조합 mRNA 또는 mRNA를 코딩하는 벡터는 단리 또는 정제된 것인 조성물.
  126. (a) 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p를 포함하는 긴 산재된 핵 요소(LINE) 폴리펩타이드; 및 (b) 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체, 또는 외생성 조절 요소를 코딩하는 서열의 역상보체인 삽입체 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 실질적으로 면역원성을 갖지 않은 조성물.
  127. 제126항에 있어서, 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p 단백질을 포함하는 조성물.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 핵산과 복합체를 형성한 인간 ORF1p 및 인간 ORF2p를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 포함하는 조성물.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서, 핵산은 mRNA인 조성물.
  130. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물.
  131. 제130항에 있어서, 세포는 면역 세포인 조성물.
  132. 제131항에 있어서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포인 조성물.
  133. 제131항에 있어서, 면역 세포는 골수 세포인 조성물.
  134. 제131항에 있어서, 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 수지상 전구체 세포 및 대식세포 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  135. 제120항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체 서열은 외생성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 역상보체이고, 외생성 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(CAR)인 조성물.
  136. 제120항 내지 제135항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  137. 제136항에 있어서, 유전자 요법에 사용하기 위한 약학 조성물.
  138. 제136항에 있어서, 질환 또는 병태의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 약학 조성물.
  139. 제136항에 있어서, 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  140. 제136항의 약학 조성물을, 질환 또는 병태를 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  141. 제140항에 있어서, 대상체에서 단백질 또는 기능적 RNA의 양 또는 활성을 증가시키는 방법.
  142. 제140항 또는 제141항에 있어서, 대상체는 단백질 또는 기능적 RNA의 결핍된 양 또는 활성을 가진 것인 방법.
  143. 제142항에 있어서, 단백질 또는 기능적 RNA의 결핍된 양 또는 활성은 질환 또는 병태와 관련되어 있거나 질환 또는 병태를 야기하는 것인 방법.
  144. 제140항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제, FAM208A를 억제하는 작용제, 또는 TRIM28을 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  145. 제144항에 있어서, 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제는 페리필린(Periphilin), TASOR 및/또는 MPP8을 억제하는 작용제인 방법.
  146. 제144항에 있어서, 인간 침묵 허브(HUSH) 복합체를 억제하는 작용제는 HUSH 복합체의 어셈블리를 억제하는 것인 방법.
  147. 제140항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 판코니 빈혈 복합체를 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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