KR20210093862A - 유전자 요법 벡터를 제작하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
포유류 숙주 세포 배양물로부터의 재조합 AAV(rAAV) 입자의 제조 및/또는 정제를 위한 방법이 개시된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 9월 21일에 출원된 미국 가출원 제62/734,505호에 대한 우선권을 주장하고; 이것은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자로 제출되고 그 전체가 본원에 참고로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2019년 9월 23일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 NIGH-015/001WO_SL.txt이고, 크기가 308 킬로바이트이다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 인간 치료제, 생물학적 약물 제품, 인간 DNA 서열의 바이러스 전달 및 이를 제조하는 방법의 분야에 간한 것이다.
AAV-기반 전달 벡터 및 이 AAV-기반 전달 벡터의 제조의 개선된 방법에 대한 오래 느끼고 충족되지 않는 수요가 있다
요약
본 개시내용은 포유류 숙주 세포 배양물로부터 재조합 AAV(rAAV: recombinant AAV) 입자를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 복수의 rAAV 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC: hydrophobic interaction chromatography)를 통해 복수의 rAAV 입자를 정제하는 단계; (b) 복수의 rAAV 입자를 포함하는 CEX 용리물을 제조하도록 양이온 교환 크로마토그래피(CEX: cation exchange chromatography)를 통해 (a)의 HIC 용리물을 정제하는 단계; (c) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물을 제조하도록 음이온 교환(AEX: anion exchange) 크로마토그래피에 의해 (b)의 CEX 용리물로부터 복수의 충전 rAAV 입자를 단리하는 단계; 및 (d) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자 및 최종 제형 완충액을 포함하는 최종 조성물을 제조하도록 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration)에 의해 제형 완충액으로 (c)로부터의 AEX 용리물을 정용여과시키고 농축시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 복수의 rAAV 입자, 바이러스 방출 용액 및 수확 배지를 포함하는 조성물을 제조하도록 수확 배지로의 복수의 rAAV 입자의 방출에 적합한 조건 하에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포 및 바이러스 방출 용액을 접촉시키는 단계; 및 복수의 rAAV 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 복수의 rAAV 입자를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 접촉 단계 전에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포를 제조하도록 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 수확 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 단계이되, 복수의 포유류 숙주 세포는 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질주입되는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV는 AAV8 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, AAV는 AAV8 캡시드 단백질 또는 이의 유도체를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's medium), 안정화된 글루타민, 안정화된 글루타민 디펩타이드 및 Benzonase 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 글리신, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스틴 디하이드로클로라이드, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O, L-이소류신, L-류신, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 이나트륨 염 이수화물, L-발린, 콜린 클로라이드, D-칼슘 판테테네이트, 엽산, 니아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, i-이노시톨, 염화칼슘(CaCl2)(무수), 질산제이철(Fe(NO3)3"9H2O), 황산마그네슘(MgSO4)(무수), 염화칼륨(KCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 염화나트륨(NaCl), 일염기성 인산나트륨(NaH2PO4-H2O) 및 D-글루코스(덱스트로스)를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 무혈청 배지를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 무혈청 배지로 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 무단백질 배지를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 무단백질 배지로 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 청징된 배지를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 청징된 배지로 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 (a) 로돕신 키나제 프로모터를 암호화하는 서열; (b) 망막색소변성증 GTPase 조절자 ORF15 동형단백질(RPGRORF15)을 암호화하는 서열; 및 (c) 폴리아데닐화(polyA) 신호를 암호화하는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 로돕신 키나제 프로모터는 GRK1 프로모터이다. 일부 실시형태에서, GRK1 프로모터를 암호화하는 서열은
를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은 코돈 최적화된 인간 RPGRORF15 서열이다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은
의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, polyA 신호를 암호화하는 서열은 소 성장 호르몬(BGH) polyA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, BGH polyA 신호를 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 ATP 결합 카세트, 슈퍼패밀리 구성원 4(ABCA4) 단백질을 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 5' 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 3' 서열 또는 이의 일부를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 프로모터를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 로돕신 키나제(RK) 프로모터를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, RK 프로모터는 GRK1 프로모터이다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, GRK1 프로모터를 암호화하는 서열은
를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CBA 프로모터를 암호화하는 서열은
또는
를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 인간 ABCA4 서열이다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-4500을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들 중 어느 하나의 이의 3' 절두 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701 또는 1-4326을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3000-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들 중 어느 하나의 이의 5' 절두 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3154-6822, 3196-6822, 3494-6822, 3603-6822, 3653-6822, 3678-6822, 3702-6822 또는 3494-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-4326을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3154-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 3196-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 3494-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 3603-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 3653-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 3678-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 3702-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 3494-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
서열 번호 1은 NCBI 기준 서열 NM_000350.2에 상응하는 인간 ABCA4 핵산 서열이다. 서열 번호 1은 NCBI 기준 서열 NM_000350.2와 동일하다. ABCA4 코딩 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 105 내지 6926에 이른다.
서열 번호 2는 하기 돌연변이를 제외하고 서열 번호 1과 동일하다: 뉴클레오타이드 1640 G>T, 뉴클레오타이드 5279 G>A, 뉴클레오타이드 6173 T>C. 이 돌연변이는 암호화된 아미노산 서열을 변경하지 않고, 이에 따라 서열 번호 2에 의해 암호화된 ABCA4 단백질은 서열 번호 1에 의해 암호화된 ABCA4 단백질과 동일하다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 5' 역상 말단 반복부(ITR)를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 AAV(AAV2)의 5' ITR 서열 및 3' ITR 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 AAV2의 5' ITR의 서열 및 3' ITR의 서열과 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 코작 서열(Kozak sequence)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 GGCCACCATG(서열 번호 73)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는
의 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터 또는 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 선별 마커를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 바이러스 Rep 단백질을 암호화하는 서열 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열은 AAV 혈청형 8(AAV8) 바이러스 Rep 단백질로부터 단리되거나 유래된 서열 및 바이러스 Cap 단백질 서열을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 수확 배지는 DMEM, 4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드 및 Benzonase를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 포유류 숙주 세포는 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민(PEI) 조성물), 인산칼슘, 지질, 세포막을 횡단할 수 있는 벡터(예를 들어, 리포솜, 마이셀, 나노입자(예를 들어, 탄소, 실리콘, 중합체 및 금) 중 하나 이상을 포함하는 조성물로 형질주입된다. 일부 실시형태에서, 포유류 숙주 세포는 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 조성물(즉, PEI 조성물)로 형질주입된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 바이러스 방출 용액은 염 및 높은 pH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염은 NaCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 높은 pH는 염기성 pH이다. 일부 실시형태에서, 높은 pH는 7.0 초과이다. 일부 실시형태에서, 높은 pH는 7.0 이상, 7.1, 7.2, 7.3., 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10. 8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11. 8, 11.9, 12.0, 12.1, 12.2, 12.3, 12.4, 12.5, 12.6, 12.7, 12.8, 12.9, 13.0, 13.1, 13.2, 13.3, 13.4, 13.5, 13.6, 13.7, 13.8, 13.9, 14.0의 pH를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 동안 생체내 생리학을 개괄하는 조건에서 포유류 숙주 세포를 항온처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체내 생리학을 개괄하는 조건은 최소로 인간 내부 체온인 온도에서 5% CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건은 10% CO2 이하인 CO2 수준에서 포유류 숙주 세포를 항온처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 내부 체온은 적어도 36℃이다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, (a)의 HIC 단계는 (i) HIC 크로마토그램을 생성하는 단계; 및 (ii) 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 rAAV 입자를 함유하는 HIC 크로마토그램에서의 분획을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, HIC 단계는 HIC 크로마토그램을 생성하기 전에 수확 배지를 고염 완충액으로 희석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자는 단계 구배를 이용하여 용리된다. 일부 실시형태에서, 단계 구배는 각각의 단계 구배에서 염 농도의 감소를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, (b)의 CEX 단계는 (i) CEX 크로마토그램을 생성하는 단계; 및 (ii) 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 CEX 용리물을 제조하도록 rAAV 입자를 함유하는 CEX 크로마토그램으로부터의 분획을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CEX 크로마토그래피는 SO3- 양이온 교환 매트릭스를 포함한다. 일부 실시형태에서, CEX 크로마토그래피 단계는 CEX 크로마토그램을 생성하기 전에 HIC 용리물을 저염 완충액으로 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정은 희석 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정 단계는 TFF 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, TFF 단계는 100kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, TFF 단계는 적어도 70kDa HFF를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, TFF 단계는 적어도 50kDa HFF를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, TFF 단계는 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100kDa HFF 또는 사이의 임의의 수의 kDa를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, HIC 용리물의 pH는 pH 3.0 내지 pH 4.0(종점 포함)으로 조정된다. 일부 실시형태에서, HIC 용리물의 pH는 pH 3.5 내지 pH 3.7(종점 포함)로 조정된다. 일부 실시형태에서, CEX 단계는 HIC 용리물을 여과시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, HIC 용리물을 여과시키는 단계는 0.8/0.45 μm 폴리에테르설폰(PES) 필터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자는 단계 구배를 이용하여 용리된다. 일부 실시형태에서, 단계 구배는 pH 구배, 염 구배 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자는 선형 구배를 이용하여 용리된다. 일부 실시형태에서, 선형 구배는 pH 구배, 염 구배 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEX 단계는 CEX 용리물의 pH를 중화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 중화된 CEX 용리물의 pH는 pH 9.0이다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, (c)의 AEX 크로마토그래피 단계는 (i) AEX 크로마토그램을 생성하는 단계; 및 (ii) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물을 제조하도록 충전 rAAV 입자를 함유하는 AEX 크로마토그램으로부터의 분획을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, AEX 크로마토그래피는 음이온 교환(QA) 매트릭스를 포함한다. 일부 실시형태에서, AEX 크로마토그래피 단계는 AEX 크로마토그램을 생성하기 전에 CEX 용리물을 저염 완충액으로 희석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정은 희석 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정 단계는 TFF 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정 단계는 제1 TFF 단계 및 제2 TFF 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, TFF 단계는 100kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 희석된 CEX 용리물은 pH 9.0이다. 일부 실시형태에서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자는 선형 구배를 이용하여 용리된다. 일부 실시형태에서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자는 단계 구배를 이용하여 용리된다. 일부 실시형태에서, CEX 단계는 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 용리물의 pH를 중화시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, (d)의 TFF 단계는 100kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 (f) 방법은 제2 TFF 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제1 TFF 단계 및 제2 TFF 단계 둘 다는 100kDa HFF를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 최종 제형 완충액은 Tris, MgCl2 및 NaCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 최종 제형 완충액은 pH 8에서의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2 및 200 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 최종 제형 완충액은 0.001%에서의 폴록사머 188을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 폴록사머 188을 최종 조성물에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자 및 최종 제형 완충액을 포함하는 최종 조성물은 -80℃에서 동결된다.
본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 복수의 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함) 및 (b) 50% 미만의 빈 캡시드를 포함한다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL, 또는 1 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함) 및 (b) 30% 미만의 빈 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL, 또는 1 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함) 및 (b) 25% 미만의 빈 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL, 또는 1 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함) 및 (b) 99% 미만, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 또는 사이의 임의의 백분율의 빈 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 약 5 x1012 vg/mL를 포함한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL, 또는 1 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함) 및 (b) 적어도 70%의 충전 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL, 또는 1 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함) 및 (b) 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 충전 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 5 x1012 vg/mL를 포함한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 복수의 rAAV의 일부는 기능적 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 각각의 기능적 벡터 게놈은 형질도입 후 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능적 벡터 게놈을 포함하는 복수의 rAAV의 일부는 비형질도입된 세포에서 상응하는 내인성 서열의 발현의 수준과 비교할 때 2배 증가로 외인성 서열을 발현한다. 일부 실시형태에서, 기능적 벡터 게놈을 포함하는 복수의 rAAV의 일부는 비형질도입된 세포에서 상응하는 내인성 서열의 발현의 수준과 비교할 때 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 또는 사이의 임의의 다른 증분 배수 변화로 외인성 서열을 발현한다.
복수의 rAAV의 일부가 기능적 벡터 게놈을 포함하고, 각각의 기능적 벡터 게놈이 형질도입 후 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 것을 포함하여, 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일하지 않지만, 외인성 서열에 의해 암호화된 단백질 및 내인성 서열에 의해 암호화된 단백질은 동일하다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 내인성 서열과 비교할 때 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물에 의한 세포의 형질도입 후, 외인성 서열은 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열에 의해 암호화된 단백질은 비형질도입된 세포의 상응하는 서열에 의해 암호화된 단백질의 활성 수준과 동일하거나 이보다 큰 활성 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물에 의한 세포의 형질도입 후, 외인성 서열은 단백질을 암호화한다.
상기 방법이 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 수확 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 복수의 포유류 숙주 세포가 접촉 단계 전에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포를 제조하도록 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질주입되는 것을 포함하는, 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 약 0.5:1:1 내지 약 10:1:1, 약 1:1:1 내지 약 10:1:1, 약 2:1:1 내지 약 10:1:1, 또는 약 3:1:1 내지 약 10:1:1, 각각, 선택적으로 약 0.5:1:1, 약 1:1:1, 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 약 9:1:1, 또는 약 10:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 1:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 3:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 10:1:1의 몰비로 제공된다.
상기 방법이 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 수확 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 복수의 포유류 숙주 세포가 접촉 단계 전에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포를 제조하도록 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질주입되는 것을 포함하는, 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터(pITR) 및 헬퍼 플라스미드 벡터(pHELP)는 1:1 내지 20:19 또는 1:20 내지 20:1, 또는 1:20 내지 1:1의 몰비(예를 들어, 표 A에서 하기 기재된 임의의 비)로 제공된다. 일부 실시형태에서, pITR 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터(pREPCAP)의 몰비는 1:1 내지 20:19, 또는 1:20 내지 20:1, 또는 1:20 내지 1:1(예를 들어, 표 A에서 하기 기재된 임의의 비)이다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 3:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 10:1:1의 몰비로 제공된다. 소정의 실시형태에서, 형질주입은 CaPO4 또는 PEI를 사용하여 수행된다. 특정 실시형태에서, 형질주입은 각각 약 1:1 내지 약 5:1, 선택적으로 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 또는 약 2:1의 PEI:DNA 비(mL:mg)로 PEI를 사용하여 수행된다. 소정의 실시형태에서, 형질주입은 PEI를 사용하여 수행되고, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 1:1:1의 몰비로 제공된다. 소정의 실시형태에서, 형질주입은 각각 약 0.5:1 내지 5:1 또는 약 1:1 내지 약 5:1, 선택적으로 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 또는 약 2:1의 PEI:DNA 비(mL:mg)로 PEI를 사용하여 수행되고, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 약 0.5:1:1 내지 약 10:1:1, 약 1:1:1 내지 약 10:1:1, 약 2:1:1 내지 약 10:1:1 선택적으로 약 0.5:1:1, 약 1:1:1, 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 약 9:1:1, 또는 약 10:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 1:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 3:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 10:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 2:1:1, 약 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 또는 약 9:1:1의 몰비로 제공된다.
상기 방법이 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 수확 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 복수의 포유류 숙주 세포가 접촉 단계 전에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포를 제조하도록 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질주입되고, 헬퍼 플라스미드 벡터 또는 RepCap 벡터 중 어느 하나에 대한 플라스미드 벡터의 몰비가 헬퍼 플라스미드 벡터 또는 RepCap 벡터보다 플라스미드 벡터에 더 높은 값을 포함하는 것을 포함하는 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 수확 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 단계는 형질주입제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입제는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입제는 인산칼슘(CaPO4)을 포함한다.
소정의 관련된 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터; (ii) 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터; 및 (iii) 헬퍼 플라스미드 벡터를 갖는 형질주입하는 포유류 숙주 세포를 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제조하는 방법을 제공하고, 포유류 숙주 세포는 약 0.5:1:1 내지 약 10:1:1, 또는 약 1:1:1 내지 약 10:1:1, 각각, 선택적으로 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 약 9:1:1, 또는 약 10:1:1의 몰비로 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 형질주입 배지와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 배지는 폴리에틸렌이민(PEI) 및 CaPO4로부터 선택된 형질주입제를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 형질주입제는 PEI이고, 형질주입 배지는 약 5:1 내지 약 1:1, 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 또는 약 1:1의 비로 PEI 및 DNA를 포함한다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, 외인성 서열은 (a) 로돕신 키나제 프로모터를 암호화하는 서열; (b) 망막색소변성증 GTPase 조절자 ORF15 동형단백질(RPGRORF15)을 암호화하는 서열; 및 (c) 폴리아데닐화(polyA) 신호를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 로돕신 키나제 프로모터는 GRK1 프로모터, 예를 들어
를 포함하거나 이것으로 이루어진 GRK1 프로모터이다.
일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은 비제한적인 예로서 본원에 개시된 임의의 것을 포함하는 코돈 최적화된 인간 RPGRORF15 서열이다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, polyA 신호를 암호화하는 서열은 비제한적인 예로서 본원에 개시된 임의의 것을 포함하는 소 성장 호르몬(BGH) polyA 서열을 포함한다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 5' 역상 말단 반복부(ITR)를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 AAV(AAV2)의 5' ITR 서열 및 3' ITR 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 AAV2의 5' ITR의 서열 및 3' ITR의 서열과 동일한 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, ITR은 야생형 AAV2와 비교하여 하나 이상의 변형, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 소정의 실시형태에서, ITR은 안정화된 ITR을 제조하도록 후속하는 결실과 정방향 및 역방향 배향에서 3' AAV2 ITR로부터 유래된다. 소정의 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, 3' ITR을 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, 외인성 서열은 코작 서열을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 코작 서열은 GGCCACCATG(서열 번호 73)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, 외인성 서열은
의 서열을 포함한다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, 외인성 서열은 ATP 결합 카세트, 슈퍼패밀리 구성원 4(ABCA4) 단백질을 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 5' 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 3' 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 프로모터를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 로돕신 키나제(RK) 프로모터를 암호화하는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, RK 프로모터는 GRK1 프로모터이다. 일부 실시형태에서, GRK1 프로모터를 암호화하는 서열은
를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
소정의 실시형태에서, 외인성 서열은 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CBA 프로모터를 암호화하는 서열은
또는
를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 인간 ABCA4 서열 또는 이의 변이체이다. 소정의 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701 또는 1-4326을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3154-6822, 3196-6822, 3494-6822, 3603-6822, 3653-6822, 3678-6822, 3702-6822 또는 3494-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 이중 벡터 시스템에 따라 사용될 수 있는 상류 및/또는 하류 ABCA4 벡터를 제조하도록 사용된다. 특정 실시형태에서, ABCA4 벡터는 임의의 도 307-335에 개시된 것 또는 여기에 개시된 서열을 포함하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터 또는 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 선별 마커를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 재조합 AAV를 제조하는 방법의 특정 실시형태에서, 바이러스 Rep 단백질을 암호화하는 서열 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열은 이의 변이체를 포함하여 AAV 혈청형 8(AAV8) 바이러스 Rep 단백질로부터 단리되거나 유래된 서열 및 바이러스 Cap 단백질 서열을 포함한다.
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도면의 일부는 크로마토그램이다. 일반적으로, 녹색 선은 형광을 나타내고, 적색 선은 흡광도(260 nm)를 나타내고, 청색 선은 흡광도(280 nm)를 나타내고, 검정색 선은 전도도를 나타낸다. 검정색 및 흰색에서 볼 때, 전도도 선은 전형적으로 낮게 시작하고 시간이 지나면서 증가하고, 흡광도(260 nm) 및 흡광도(280 nm) 선은 서로 대부분 추적한다.
도 1은 제조 공정의 예시적인 세포 배양 및 확장 단계를 요약한 다이어그램이다. 부착성 세포 배양물을 함유하는 혈청에서의 세포가 20개의 HYPERstack(36개의 적층 배양 용기)을 증식시키도록 도시된 단계를 통해 계배배양되고 확장된다.
도 2는 공정내 제한 및 QC 시험을 포함하는 AAV8-RPGR 상류 제조 공정의 도식적 개관이다.
도 3은 세포 해동 단계의 도식적 흐름도이다.
도 4는 세포 해동 공정에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 5는 세포 해동 공정에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 6은 일반 계대배양 절차의 도식적 흐름도이다.
도 7은 세포 계대배양 체계에 대한 포괄적인 가이드라인을 보여주는 표이다.
도 8은 추천된 시약 부피(HBSS, 세포 해리 용액 및 성장 배지) 및 세포 계대배양에 대한 세포 시딩 밀도를 보여주는 표이다.
도 9는 세포 해동 및 계대배양 체계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 10은 제조 공정의 형질주입 및 수확 단계를 요약한 다이어그램이다. 세포는 폴리에틸렌이민(PEI) 기반 형질주입 프로토콜을 사용하여 형질주입된다. (1) DNA 및 PEIpro®는 형질주입 용액에서 별개로 희석된다. (2) PEI 용액은 DNA 용액에 적가되고 실온에서 10분 동안 항온처리된다. (3) DNA/PEI 용액은 이전에 제조된 형질주입 배지(DMEM +4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드 + 10% FBS)에 첨가된다. (4) 성장 배지(DMEM +4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드 + 10% FBS)는 HYPERstack으로부터 제조되고, DNA/PEI를 함유하는 형질주입 배지가 첨가되고, 세포는 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리된다. (5) 형질주입 배지는 HYPERstack으로부터 제거되고, 수확 배지(DMEM + 4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드 + 0% FBS + Benzonase)가 첨가되고, 세포는 72시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리된다. (6) 바이러스 방출 용액은 HYPERstack에 첨가되고, 세포는 AAV 입자를 방출하도록 18시간 동안 5% CO2에서 항온처리된다.
도 11은 5 x 36층 HYPERstack®당 인산칼슘 매개된 형질주입 용액을 생성하기 위한 가이드를 보여주는 표이다.
도 12는 5 x 36층 HYPERstack®당 PEIpro® 매개된 형질주입 용액을 생성하기 위한 가이드를 보여주는 표이다.
도 13은 일시적인 형질주입 및 배지 수확 단계의 도식적 흐름도이다.
도 14는 제조 스케일의 함수로서 초기 배지 변화에 필요한 클로로퀸 및 배지의 부피를 보여주는 표이다.
도 15는 형질주입 및 수확 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 16은 인산칼슘 세포 형질주입 공정에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 17은 PEI 세포 형질주입 공정에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 18은 여과 청징 단계의 도식적 흐름도이다.
도 19는 청징 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 20은 청징 여과 단계에 사용된 핵심재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 21은 제조 공정의 하류 가공 단계(DSP)를 요약한 다이어그램이다. (1) AAV 입자를 함유하는 수확 배지는 HYPERstack으로부터 수집된다. (2) 희석된 수확 배지는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제되고, AAV 입자를 함유하는 피크가 선택되고, 용리물이 수집된다. (3) 희석된 HIC 용리물은 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의해 추가로 정제되고, rAAV 입자를 함유하는 피크가 선택되고, 용리물이 선택된다. (5) 희석된 CEX 용리물은 구배 용리에 의해 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 충전 rAAV 입자에 농후화되고, 충전 rAAV 입자를 함유하는 피크가 선택되고, 용리물이 수집된다. (6) AEX 용리물은 농축되고 100 kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 2의 접선 유동 여과(TFF) 단계를 통해 최종 제형 완충액(FFB)(플루로닉 F-68이 없음)으로 정용여과된다. (7) 플루로닉 F-68(또한 폴록사머 188이라고도 칭함)이 첨가되고, 약물 물질은 -80℃에서 동결된다.
도 22는 QC 시험 및 공정내 제어를 포함하는 AAV8-RPGR 하류 및 충전 및 종료 제조 공정의 도식적 개관이다.
도 23a는 마크로-다공성 크로마토그래피 기법의 이점을 보여주는 표이다.
도 23b는 왼쪽에서 오른쪽으로 막, 모노리스 및 종래의 비드를 보여주는 크로마토그래피 배지의 일련의 3개의 영상이다.
도 24a 및 b는 초기 재료에 대한 HPLC 분석(지문, 총 입자, 빈/충전 입자)(수확)을 도시하는 한쌍의 그래프이다(왼쪽 그래프는 부분 분리 방법 분석을 도시하고, 오른쪽 그래프는 총 분석을 도시한다).
도 25는 rAAV-RPGR 수확 재료의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 26은 수확된 배지 및 청징후 수확된 배지의 샘플로부터의 총 숙주 DNA 및 단백질에 대한 예시적인 결과이다.
도 27은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) AAV 포획 공정을 요약하는 표이다.
도 28은 소수성 조건에 대한 안정성 시험 절차를 기술하는 도식적 다이어그램이다.
도 29는 도 89에 개략화된 HIC 절차로부터의 크로마토그램을 도시하는 그래프이다.
도 30은 도 89에 도시된 바와 같은 조건, OD600을 측정하여 수확에서, 여과 전(BF) 및 여과 후(AF)의 HIC의 결과를 도시하는 표이다.
도 31은 로드의 여과 없이 HIC의 흐름 조건을 도시하는 표이다.
도 32는 도 31의 HIC 흐름 조건에 상응하는 한쌍의 크로마토그래피이다.
도 33은 도 31 및 도 32에 도시된 HIC의 SDS-PAGE 분석을 도시하는 한쌍의 사진이다.
도 34는 인산칼륨(KP) 침전에 의한 HIC를 도시하는 도식적 다이어그램이다. 덜 한 단백질 변성 및 더 높은 단백질 안정성(자연적)에서의 결과.
도 35는 (C4 A 칼럼을 사용하여) 도 34의 HIC 실험에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 36은 (OH 칼럼을 사용한) 도 34의 HIC 실험에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 37은 도 95-97에 도시된 HIC의 SDS-PAGE 분석을 도시하는 일련의 사진이다.
도 38은 C4 A 및 OH 칼럼을 사용한 (NH4)2SO4 및 PK의 결과를 도시하는 일련의 표이다.
도 39는 HIC 조건을 도시하는 도식적 다이어그램이다 - 이 도면에서의 로딩 양은 도 40-96 및 102에 대한 로딩 양이다.
도 40은 도 39의 HIC 실험에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 41은 예를 들어 도 39 및 도 40에 도시된 바와 같은 1 mL 칼럼에서 HIC의 로딩 커패시티를 도시하는 도식적 다이어그램이다.
도 42는 초기 재료의 HPLC 총 분석의 FLD 반응을 도시하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 43은 2개의 HIC 실험에 대한 (각각에 대해 표 및 크로마토그래프) 한쌍의 ddPCR 분석이다. HIC-9는 소르비톨 없이 수행되었다. HIC-10은 소르비톨을 사용하여 수행되었다.
도 44는 2의 HIC 실험에 대한 ddPCR 분석을 도시하는 한쌍의 표이다. HIC-10은 OH 칼럼에서 수행되었다. HIC-10은 C4 A 칼럼에서 수행되었다.
도 45는 HIC 정제 단계에 대한 선형 구배 용리 및 최적화된 단계 용리의 비교를 보여주는 한쌍의 그래프이다.
도 46은 HIC 희석 완충액의 몰농도의 비교에 의해 HIC 실험의 강인성을 도시하는 일련의 크로마토그램이다.
도 47은 2 mL 칼럼(HIC-16 및 HIC-17)에서 HIC 실험의 커패시티를 도시하는 일련의 크로마토그램이다.
도 48은 HIC-18에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 49는 도 48에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 50은 HIC-18로부터의 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램이다(OH 80-mL 커패시티 칼럼에서 실행).
도 51은 HIC-19에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 52는 도 51에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 53은 HIC-19로부터의 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램(단계 용리에 의한 실행)이다.
도 54는 각각 HIC-18 및 HIC-19에 대한 전도도 측정을 제공하는 한쌍의 표 및 도 49, 도 50 및 도 51의 HIC 실험에 상응하는 크로마토그램이다.
도 55는 HIC-20에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 56은 도 55에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 57은 HIC-20으로부터의 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램(OH 80-mL 커패시티 칼럼에서 실행)이다.
도 58은 도 57에 상응하는 HIC-20의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 59는 각각의 20 HIC 실험의 칼럼의 유형, 사용된 완충액 및 목적을 요약한 표이다.
도 60a-b는 예시적인 HIC AAV 포획 단계를 보여주는 각각 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 60a는 80 mL 칼럼으로부터의 크로마토그램을 보여준다. HIC 포획 단계는 1 mL 칼럼으로부터 80 mL 칼럼으로 성공적으로 확대되었다. 도 60b는 HIC 수확 배지, 통과액, 로드 및 용리물 분획의 SDS-PAGE 겔 분석을 보여준다. 레인은 왼쪽에서 오른쪽으로 마커, 유입 수확 배지, 로드, 통과액(FT), W, 분획 E1, E2, 2배 희석된 E2(E2.2X), 2배 희석된 E3(E3.2X), 제자리에서의 세정(CIP), 및 2배 희석된 제자리에서의 세정(CEP.2X)을 보여준다. AAV 입자를 함유하는 E2 분획은 녹색 박스에 있고, 수확 배지 레인은 적색 박스에 있다.
도 61a-b는 HIC 단계에 대한 구배(도 61a) 및 등용매 용리(도 61b) 프로토콜을 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. E1, E2 및 E3 분획은 박스에 있다.
도 62a-b는 3 단계 공정에 대한 2 단계 공정에 대한 합리성을 보여주는 한쌍의 SDS-PAGE 겔이다. 도 62a는 예시적인 HIC 용리를 보여준다. 도 62b는 AEX 충전 대 빈 분리 개념 증명 실행을 보여준다. 캡시드를 함유하는 분획은 적색 박스에 있고(도 62a, 반면 AEX 단계 후 빈 캡시드 및 충전 캡시드를 함유하는 분획은 적색(왼쪽) 및 녹색(오른쪽) 박스에 있다(도 62b). HIC 단계에 대한 순도 및 HIC 및 AEX QA 정제된 생성물의 후속하는 순도는 충분하지 않다. 중간 연마 단계(CEX 양이온 교환, SO3-)가 필요하다.
도 63은 HIC 포획 단계 후인 여과 단계의 최적화를 보여주는 그래프이다. X축에 필터의 상이한 유형이 도시되어 있다: PES = 폴리에테르설폰, CA= 셀룰로스 아세테이트, GF = 유리 섬유, PVDF = 폴리디비닐 플루오라이드, PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌, MV = 혼합 에스테르, RC = 재생 셀룰로스. y축에 각각의 필터 유형에 대한 AAV 입자(%)의 평균 회수가 도시되어 있다. 오렌지 막대는 제한된 확대 옵션을 갖는 필터(PVDF 및 PTFE)를 나타낸다.
도 64a-b는 각각 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용한 rAAV 입자의 포획을 보여주는 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 16a에서, mAU에서의 흡광도는 50의 증분으로 0에서 300으로 y축에 표시된다. rAAV 입자를 함유하는 분획 E2 및 E3은 각각 진한 녹색 및 밝은 녹색의 박스에 있다. 세척, 용리물 및 CIP 분획은 X축에 표시되어 있다. 도 64b는 도 64a로부터 용리된 분획의 순도를 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. rAAV 입자를 함유하는 분획 E2를 보여주는 레인은 박스에 있다. 2x는 2배 희석을 나타낸다.
도 65a-b는 각각 예시적인 HIC 단계의 단계 회수를 보여주는 크로마토그램 및 표이다.
도 66a-b는 각각 HIC를 사용하여 정제된 AAV 입자를 보여주는 크로마토그램 및 주사 전자 현미경검사(TEM) 현미경사진의 3개의 영상이다. 도 66a는 예시적인 HIC 단계에서 정제된 AAV 입자의 용리를 보여주는 크로마토그램이다. AAV 입자를 함유하는 분획 E3, E4 및 E5는 x축에 괄호로 표시된다. 도 66b는 E3, E4 및 E5 분획에서 용리된 AAV 입자의 TEM 현미경사진을 보여준다. 축적바는 200 nm을 나타낸다.
도 67은 2의 상이한 배율에서 E3, E4 및 E5 HIC 분획의 일련의 6개의 TEM 현미경사진이다. 상부 열에서, 축적바는 왼쪽에서 오른쪽으로 0.5 μM, 0.5 μM 및 500 nM을 나타낸다. 하부 열에서, 축적바는 200 nm을 나타낸다.
도 68은 AAV 중간 정제에 대한 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 공정을 요약한 표이다.
도 69는 pH 4.0(SO3-1) 또는 pH 3.5(SO3-2)에서 수행된 개발 중간 정제 단계 SO3을 도시하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 70은 pH 3.5에서 수행된 중간 정제 SO3 단계(SO3-2)의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 71은 SO3-2에 대한 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램이다.
도 72는 SO3-3에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 73은 도 72에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 74는 SO3-3에 대한 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램이다.
도 75는 SO3-4에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 76은 도 75에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 77은 SO3-4의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 78은 pH 3.8(SO3-5) 또는 pH 3.6(SO3-7)에서 수행된 중간 정제 단계 SO3을 도시하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 79는 pH 3.6 ± 0.1이 도 69-78의 조건을 이용하여 HIC 실험에 바람직하거나 최적인 pH라는 것을 보여주는 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 80은 SO3에 대한 칼럼 커패시티 결정의 분석이다.
도 81은 로드 재료의 여과 없이 SO3-9, 커패시티 실행에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 82는 도 135에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 83은 로드 재료의 여과 없이 SO3-10, 커패시티 실행에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 84는 도 135에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 85는 SO3-7, SO3-9 및 SO3-10을 비교하는 일련의 크로마토그램이다.
도 86은 SO3-9 및 SO3-10에 대한 HPLC 분석을 도시하는 한쌍의 표이다.
도 87은 SO3-11에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 88은 도 141에 상응하는 크로마토그램이다.
도 89는 폴록사머 무 SO3-7(왼쪽 그래프 및 크로마토그램) 또는 폴록사머 유 SO3-11(오른쪽 그래프 및 크로마토그램)에 대한 한쌍의 ddPCR 분석이다.
도 90은 SO3-12에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 91은 SO3-12 로드 샘플 및 SO3-12 FT 샘플을 보여주는 사진이다.
도 92는 도 90에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 93은 HIC-20(왼쪽 그래프 및 크로마토그램) 또는 SO3-12(오른쪽 그래프 및 크로마토그램)에 대한 한쌍의 ddPCR 분석이다.
도 94는 SO3-12의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 95는 각각의 12개의 SO3 실험의 칼럼의 유형, 사용된 완충액 및 목적을 요약한 표이다.
도 96은 중간 정제 SO3-12 후에 재료의 충전:빈 비율을 결정하는 HPLC 크로마토그램이다.
도 97a-b는 SO3- 칼럼 매트릭스를 사용한 CEX에 의한 중간 연마 단계를 각각 보여주는 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 97a는 pH 3.6 SO3- 확대 크로마토그램을 보여주고, rAAV 입자를 함유하는 분획은 박스에 있다. 도 97b는 pH 3.5(E2), pH 3.6(SO3 7 E2), pH 3.8(SO3-5 E2) 및 pH 4.0(E2) 샘플의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 모든 겔은 본 샘플에서 모든 단백질 밴드를 노출시키도록 약간 과전개되었다. 더 높은 pH를 갖는 샘플에서보다 더 낮은 pH 샘플에 존재하는 오염물질이 약간 더 적다. 최적 pH는 3.6 +/- 0.1이다.
도 98a-d는 CEX 단계의 pH 최적화를 보여주는 한쌍의 크로마토그램(도 98a, c) 및 크로마토그램에 상응하는 SDS-PAGE 겔의 쌍(도 98b, d)이다. 도 98a, b는 pH 4.0에 있고, 도 98c, d는 pH 3.5에 있다.
도 99a-c는 일련의 2 주사 전자 현미경사진(도 99a-b) 및 SO3 CEX 용리물의 주사 전자 현미경(TEM) 분석을 보여주는 표(도 99c)이다. 샘플에서, AAV의 21.8%는 충전도 아니고 비지도 않았다. 청색 화살표는 충전 캡시드 AAV를 나타내고, 적색 화살표는 빈 캡시드 AAV를 나타내고, 녹색 화살표는 비확실(충전도 아니고 비지도 않음) AAV를 나타낸다.
도 100a-b는 AAV 중간 (연마) 정제 단계에서 AAV 입자 CEX의 용리를 각각 보여주는 크로마토그램 및 SDS page 겔이다. 도 100a에서, y축은 mAU에서의 흡광도를 보여주고, 500의 증분으로 0 내지 2500을 나타낸다. 세척, 용리물 및 CIP 분획은 x축에 표시되어 있다. AAV 입자를 함유하는 분획 E2 및 E3은 각각 어두운 녹색 및 밝은 녹색의 박스에 있다. 도 100b는 도 100a로부터의 용리된 분획의 순도를 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. AAV 입자를 함유하는 분획 E2를 보여주는 레인은 박스에 있다. 2X 및 10X는 각각 2배 및 10배 희석을 나타낸다.
도 101은 rAAV 충전 입자의 농후화를 위한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 공정을 요약한 표이다.
도 102는 MgCl2가 없는 완충액의 상이한 pH를 사용하여 중간 정제(SO3-12) 후 재료의 QA 용리 프로필을 도시하는 HPLC 크로마토그램이다.
도 103a-b는 pH 및 MgCl2 농도의 함수로서 충전 및 빈 피크의 해상을 각각 보여주는 크로마토그램 및 열 도표이다. 도 103a는 다양한 농도의 MgCl2에 의한 pH 9.5에서의 오버레이된 AEX QA 매트릭스 크로마토그램(A260 신호)을 보여준다. 검정색 화살표는 0 mM MgCl2를 나타내고, 오렌지색 화살표는 2 mM MgCl2를 나타내고, 청색 화살표는 1 mM MgCl2를 나타낸다. 도 103a는 충전 입자 및 빈 입자를 분리하는 능력을 예시하는 열 도표이고, pH는 하나의 축에 있고 MgCl2는 다른 축에 있다. 분리는 최소(자주색)에서 최대(백색)의 색상으로 표시된다. 최적 분리는 pH 9.0 및 0 mM MgCl2에서 보인다.
도 104a-b는 AEX를 사용한 충전 AAV 입자의 농후화를 각각 보여주는 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 104a에서, y축은 mAU 단위의 흡광도를 보여주고, 50의 증분으로 0 내지 100을 나타냈다. 분획 E2, E3, E4, E5 및 E6은 X축에 표시된다. 충전 AAV 입자를 함유하는 분획 E3은 박스에 있다. 도 104b는 도 104a로부터의 용리된 분획의 순도를 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. 충전 rAAV 입자를 함유하는 분획 QA2 E3은 박스에 있다.
도 105a-f는 2개의 크로마토그램(도 105a, d), 3개의 표(도 105b, c, f) 및 충전 입자 농후화 단계를 요약하는 SDS-PAGE 겔(도 105e)이다. 도 105a는 예시적인 AEX QA-2 크로마토그램인 반면, 도 105d는 도 105a에서의 크로마토그램의 확대이다. 도 105b는 분광측정에 의한 충전 입자 순도 예측을 요약한 표이다. E3 분획에서 보인 약 1.3의 A260:A280 비는 충전 입자의 높은 백분율을 나타낸다. 도 105c는 QA2 E2 및 E3 AEX 분획의 HPLC에 의한 충전 입자 함량 예측을 요약한 표이다. 도 105e는 QA2 AEX 로드, 용리물 및 CIP 분획을 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. 충전 AAV 입자를 함유하는 분획 E3은 박스에 있다. 도 105f는 HPLC에 의해 각각의 분획에서의 충전 입자 회수를 요약한 표이다.
도 106a-c는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 충전 AAV 입자의 농후화를 각각 보여주는 TEM 현미경사진, 및 2개의 표이다. 도 106a는 rAAV 입자를 보여주는 QA2 E3 분획의 TEM 현미경사진이다. 축적바는 200 nm을 나타낸다. 도 106b는 드랍플렛 디지털 PCR(ddPCR)에 의한 AAV 입자의 역가를 보여준다. E3 분획은 녹색 박스에 표시된다. 도 106c는 분획 AQ2E3에 대해 계수된 바이러스의 수, 백분율에 의한 충전 및 부분 입자의 퍼센트, 및 백분율에 의한 빈/손상된 입자의 예상된 수(QA2 E3라고도 칭함)를 보여준다.
도 107은 제조 공정의 각각의 단계에서의 예상된 수율을 보여주는 표이다.
도 108a-d는 샘플 S03-14 E1, QA-3(a), QA-4(b), QA-5(c) 및 QA-6(d)에 대한 ddPCR 결과를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 109는 QA-3 내지 QA-8에 대한 TEM 결과를 제공하는 차트이다. 모든 샘플은 불순물 없이 투명하고, 입자의 응집체는 샘플 SO3-14, QA-3 E3, QA-6 E3 및 QA-8 E3에서 희귀하게 보였다. 충전 및 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 모든 QA 샘플(71-77%)에서 유사하지만, SO3-14 샘플에서 더 낮았다(46%). 입자의 일부는 충전 또는 빈으로 분류되지 않았다. 바이러스의 제3 그룹이 도입되었다(비분류된). 이 그룹으로부터의 바이러스는 전체 표면에서 전자 투명이 아니고, 표면에 바로 전자 치밀 스팟을 나타냈다. 이러한 바이러스는 충전되거나, 완전히 충전되지 않거나, 정확하게 형성되지 않거나 손상될 수 있었다.
도 110은 QA-7(커패시티) 및 QA-8(정기적 조건) 하에 빈 입자 및 충전 입자의 정제의 비교를 보여주는 크로마토그램 및 상응하는 표이다.
도 111은 QA-8의 정제를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 112a-c는 ddPCR 및 HPLC E/F 결과를 제공하는 일련의 표이다. QA-7 앞으로부터 제조용 실행은 분석 칼럼(2 μm 기공을 갖는 QA-0.1 mL)을 사용하여 수행되었다.
도 113은 각각의 QA-7 및 QA-8에 대해 정제의 각각의 단계에서 발견된 단백질의 존재를 보여주는 한쌍의 SDS-page 분석이다.
도 114는 QA-8로부터의 완전 분획(E3)을 보여주는 한쌍의 TEM 현미경사진 및 상응하는 표이다.
도 115는 S03 15에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 116은 S0315의 정제를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 117a-b는 SO3 15에 대한 HPLC(A) 및 ddPCR(B) 결과를 제공하는 한쌍의 표이다.
도 118은 QA-9에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 119는 QA-9를 사용한 정제를 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 120은 QA-10에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 121은 QA-10을 사용한 정제를 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 122는 QA-11에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 123은 QA-11을 사용한 정제를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 124는 QA-12에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 125는 QA-12를 사용한 정제를 보여주는 크로마토그램이다.
도 126은 QA-9를 사용한 빈/충전 비를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 127은 QA-9를 사용한 빈/충전 비를 보여주는 크로마토그램이다.
도 128은 QA-10을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 129는 QA-10을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 크로마토그램이다.
도 130은 QA-11을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 131은 QA-11을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 크로마토그램이다.
도 132a-c는 QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 ddPCR 및 HPLC 결과를 제공하는 일련의 표이다.
도 132d는 QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 빈/충전 비, 순도, 및 회수를 제공하는 표이다.
도 133은 제조용 실행 QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 용리 특성을 제공하는 표이다.
도 134는 제조용 실행 QA-9, QA-10 및 QA-11을 사용한 단백질 정제를 보여주는 일련의 SDS-page 분석이다.
도 135는 S03-15 E1, QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 정제된 바이러스의 정제 및 TEM 분석 후 바이러스 계수치, 완전 퍼센트, 빈 퍼센트 및 비분류된 퍼센트를 제공하는 표이다. 모든 샘플은 작은 응집체를 함유하였고, 대부분의 손상된 또는 완전히 형성되지 않은 바이러스로 이루어졌다. 충전 및 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 QA-10 및 QA-11 샘플(74%)에서 유사하지만, SO3-14 샘플(45%)에서 더 낮았고 샘플 QA-9 E3에서 더 높았다. 입자의 일부는 충전 또는 빈으로 분류되지 않았다. 바이러스의 제3 그룹이 도입되었다(비분류된). 이 그룹으로부터의 바이러스는 전체 표면에서 전자 투명이 아니고, 표면에 바로 전자 치밀 스팟을 나타냈다. 이러한 바이러스는 충전되고, 완전히 충전되지 않고, 정확하게 형성되지 않거나 손상될 수 있었다.
도 136은 QA-13에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 137은 단편화 방법을 설명하는 QA-13의 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 138은 제형 완충액으로 TFF 교환에 대한 조건을 제공하는 표이다.
도 139는 MALS 검출기 분석과 커플링된 HPLC E/F를 보여주는 크로마토그램의 시리즈이다.
도 140은 MALS 검출기 분석과 커플링된 HPLC E/F를 보여주는 크로마토그램의 시리즈이다.
도 141은 QA-13을 사용한 바이러스 정제의 각각의 단계에 대한 빈/충전 비, 순도 및 회수 백분율을 요약한 표이다.
도 142는 각각의 샘플 S03-14, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, 및 QA-8의 조성을 요약한 표이다(도 142-156과 관련). 주사 전자 현미경검사(TEM)에 의한 분석을 위한 아데노 연관된 바이러스(AAV)의 5개의 샘플 및 하나의 추가의 샘플은 바이러스 통합성을 결정하고 충전/빈 입자 사이의 관계를 평가하기 위해 평가되었다.
도 143은 바이러스가 낮은 배율 하에 관찰될 때 그리드(S03-14)를 통해 균등하게 분포된다는 것을 보여주는 TEM 현미경사진이다. 도 143-170에 대해, 샘플을 네가티브 염색 방법을 사용하여 TEM에 의한 검사를 위해 제조하였다. 해동된 샘플을 온화하게 혼합하고, 5분 동안 새로 글로우 방전된 구리 그리드(400 메시, 포름바(formvar)-탄소 코팅됨)에 적용하고, 세척하고, 우라닐 아세테이트의 1%(w/v) 물 용액의 1 방울로 염색하였다. 2개의 그리드를 각각의 샘플에 대해 제조하였다. 그리드는 80 kV에서 조작되는 주사 전자 현미경 Philips CM 100 (FEI, 네덜란드)에 의해 관찰되었다. 적어도 10개의 그리드 정가각형은 완전히 조사되고, 여러 현미경사진(카메라 ORIUS SC 200, Gatan, Inc.)은 충전 입자와 빈 입자 사이의 비를 평가하도록 취해졌다. 현미경사진은 그리드에서 상이한 위치에서 동시에 취한다.
도 144는 샘플 SO3-14의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 작은 응집체가 존재한다(검정색 화살표). 불순물이 검출되지 않았고, 오직 적은 작은 응집체를 볼 수 있었다.
도 145는 충전도 아니고 빈/손상(흰색 화살표)도 아닌 입자를 보여주는 현미경사진이다.
도 146은 한쌍의 현미경사진은 샘플 QA3-E3에서 더 많은 응집체가 샘플 SO3-14와 비교하여 존재하고 응집체가 약간 더 높을 수 있다는 것을 보여준다. 다른 불순물이 발견될 수 없었다.
도 147은 검정색 화살표로 마킹된 빈/손상된 입자 및 흰색의 화살표로 마킹된 비분류된을 보여주는 한쌍의 현미경사진이다. 비분류된 입자는 충전 바이러스를 나타낼 수 있지만, 이들은 완전하게 보이지 않았다.
도 148은 바이러스(QA-4 E3)가 그리드에 걸쳐 균등하게 분산된다는 것을 보여주는 현미경사진이다. 불순물 또는 응집체가 발견되지 않았다.
도 149는 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-4 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다.
도 150은 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-5 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 불순물 또는 응집체가 발견되지 않았다. 빈/손상된 입자는 검정색 화살표로 마킹되고, 비분류된은 흰색의 화살표로 마킹된다. 비분류된 입자는 충전 바이러스를 나타낼 수 있지만, 이들은 완전하게 보이지 않았다.
도 151은 저배율 하에 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-5 E3의 대표적인 현미경사진을 나타낸다.
도 152는 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-6 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 불순물 또는 응집체가 발견되지 않았다. 바이러스는 균등하게 분산되고(왼쪽 현미경사진); 작은 응집체가 존재한다(오른쪽 현미경사진).
도 153은 충전/빈 비의 평가에 선택된 샘플 QA-6 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 빈/손상된 입자는 검정색 화살표로 마킹되고, 비분류된은 흰색의 화살표로 마킹된다.
도 154는 저배율 하에 관찰된 QA-8 E3 바이러스의 현미경사진이다. 샘플은 불순물이 없지만, 일부 작은 응집체를 함유하였다.
도 155는 샘플 QA-8 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 작은 응집체(검정색 화살표)는 손상된 바이러스를 함유한다.
도 156은 충전 입자와 빈/손상된 입자 사이의 비를 제공하는 표이다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 동일한 배율에서 취한 선택된 현미경사진에서 입자를 계수하여 결정되었다. 샘플 SO3-14는 충전 바이러스의 46%를 함유하지만, 모든 다른 샘플은 충전 바이러스의 더 높은 그리고 보다 유사한 %(71-77%)를 함유하였다. 모든 샘플은 불순물 없이 깨끗하고, 입자의 응집체가 샘플 SO3-14, QA-3 E3, QA-6 E3 및 QA-8 E3에서 희귀하게 보였다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 모든 QA 샘플에서 유사하지만(71-77%), SO3-14 샘플에서 더 낮았다(46%).
도 157은 도 157-169에 대한 분석에 사용된 각각의 샘플의 조성물을 제공하는 표이다.
도 158은 저배율 하에 관찰된 비희석된 샘플의 S03-15 E1 바이러스를 보여주는 대표적인 TEM 현미경사진이다. 바이러스는 도처에 균일하게 분산된다. 샘플은 포지티브 염색 방법을 이용하여 TEM에 의한 검사를 위해 제조하였다. 해동된 샘플을 온화하게 혼합하고, 5분 동안 새로 글로우 방전된 구리 그리드(400 메시, 포름바-탄소 코팅됨)에 적용하고, 세척하고, 우라닐 아세테이트의 1%(w/v) 물 용액의 1 방울로 염색하였다. 2개의 그리드를 각각의 샘플에 대해 제조하였고, 하나는 비희석되고 2개는 희석된 샘플이다. 본 발명자들은 샘플을 0.1 M PB로 희석하였다. 그리드는 80 kV에서 조작되는 주사 전자 현미경 Philips CM 100(FEI, 네덜란드)에 의해 관찰되었다. 적어도 10개의 그리드 정가각형은 완전히 조사되고, 여러 현미경사진(카메라 ORIUS SC 200, Gatan, Inc.)은 충전 입자와 빈 입자 사이의 비를 평가하도록 취해졌다. 현미경사진은 그리드에서 상이한 위치에서 동시에 취한다.
도 159는 샘플 SO3-15의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 왼쪽: 비희석된 샘플; 오른쪽: 희석된 샘플. 바이러스는 그리드에 걸쳐 균등하게 분산된다.
도 160은 샘플 SO3-15의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 왼쪽: 비희석된 샘플; 오른쪽: 희석된 샘플. 바이러스는 그리드에 걸쳐 균등하게 분산되고, 적은 작은 응집체가 비희석된 채 그리고 희석된 샘플에 존재한다(흰색 화살표).
도 161은 저배율 하에 관찰된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-9 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 바이러스는 균등하게 분산되고, 바로 적은 응집체가 발견될 수 있었다. 다른 불순물이 존재하지 않았다.
도 162는 계수에 선택된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-9 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 바이러스는 균등하게 분산되고, 바로 적은 응집체가 발견될 수 있었다. 다른 불순물이 존재하지 않았다.
도 163은 QA-9 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 대부분의 바이러스는 특징적인 형상으로 충전되었다(왼쪽); 작은 응집체는 손상된 입자를 함유하였다(오른쪽).
도 164는 저배율 하에 관찰된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-10 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 샘플 QA-10 E3을 갖는 모든 그리드는 적절한 품질을 나타냈다. 일부 작은 응집체를 제외하고 본 발명자들은 완전히 붕괴되지 않은 바이러스를 나타내는 다른 구조를 발견하였고(도 165, 오른쪽 현미경사진); 이러한 구조는 샘플의 모든 3개의 그리드에 존재하지만, 그리드의 적은 부분에 결합하였다. 샘플 QA-10 E3은 샘플 QA-9 E3과 비교하여 더 손상된 입자를 함유하였다.
도 165는 표시된 거의 완전히 손상된 바이러스(왼쪽)에 의해 희석된 샘플 QA-10 E3의 QA-10 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 오른쪽 현미경사진: 가장 아마 대부분의 파괴된 바이러스.
도 166은 바이러스 계수에 선택된 비희석된 샘플 QA-10 E3의 대표적인 현미경사진이다. 21개의 현미경사진이 입자의 계수 및 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비의 계산을 위해 사용되었다.
도 167은 저배율 하에 관찰된 비희석된 샘플의 QA-11 E3 바이러스의 대표적인 현미경사진이다. 샘플 QA-11 E3은 작은 응집체를 함유하였다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 동일한 배율에서 취한 33 현미경사진에서 입자의 계수에 의해 결정된다.
도 168은 계수에 선택된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-11 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다.
도 169는 각각의 샘플에 대해 충전 입자와 빈/손상된 입자 사이의 비를 제공하는 표이다. 동일한 배율에서 취한 선택된 현미경사진에서 입자를 계수하여 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비. 입자는 3개의 군으로 분류되었다: 함께 충전, 비분류된, 빈 및 손상된. 샘플 SO3-15 E1은 충전 바이러스의 45%를 함유하고, 샘플 QA-9 E3은 80%를 함유하고, 샘플 QA-10 E3 및 QA-11 E3은 충전/빈 비와 관련하여 유사하였다(충전 바이러스의 74%). 보든 샘플은 작은 응집체를 함유하였고, 이들은 대부분 손상되거나 완전히 형성되지 않은 바이러스로 이루어졌다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 QA-10 및 QA-11 샘플에서 유사하지만(74%), SO3-14 샘플에서 더 낮고(45%), 샘플 QA-9 E3에서 더 높았다. 입자의 일부는 충전 또는 빈으로 분류될 수 없어서, 제3 그룹에 비분류된"으로 넣었다. 이 그룹으로부터의 바이러스는 전체 표면에서 전자 투명이 아니고, 표면에 바로 전자 치밀 스팟을 나타냈다. 이러한 바이러스는 충전되고, 완전히 충전되지 않고, 정확하게 형성되지 않거나 손상될 수 있었다.
도 170a-b는 QA-13 및 TFF1 단계에 대한 ddPCR 및 HPLC 결과를 제공하는 한쌍의 표이다.
도 171은 TFF1의 MALS 검출기 분석과 커플링된 HPLC E/F를 제공하는 일련의 차트 및 요약 표이다.
도 172는 정제된 QA-13 바이러스의 SDS 분석이다.
도 173은 QA 및 TFF 후에 바이러스 정제를 비교하는 한쌍의 SDS 분석이다.
도 174는 공정내 한계 및 QC 시험을 포함하는 AAV8-RPGR 상류 제조 공정의 도식적 개관이다.
도 175는 세포 해동 단계의 도식적 흐름도이다.
도 176은 배지 가온에 대한 추천된 최소 가온 기간을 보여주는 표이다.
도 177은 세포 해동 공정에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 178은 세포 해동 공정에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 176은 제조 스케일의 함수로서 초기 배지 변화에 필요한 클로로퀸 및 배지의 부피를 보여주는 표이다.
도 177은 형질주입 및 수확 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 178은 예시적인 계대배양 절차의 도식적 흐름도이다.
도 179는 세포 계대배양 체계에 대한 총칭적 가이드라인을 보여주는 표이다.
도 180은 세포 계대배양에 대한 추천된 시약 부피(HBSS, 세포 해리 용액 및 성장 배지) 및 세포 시딩 밀도를 보여주는 표이다.
도 181은 해동 및 계대배양 체계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 182는 일시적인 형질주입 및 배지 수확 단계의 도식적 흐름도이다.
도 183은 제조 스케일의 함수로서 초기 배지 변화에 필요한 클로로퀸 및 배지의 부피를 보여주는 표이다.
도 184는 형질주입 및 수확 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 185는 5 x 36층 HYPERstack®에 대한 인산칼슘 매개 형질주입 용액을 생성하기 위한 가이드를 보여주는 표이다.
도 186은 여과 청징 단계의 도식적 흐름도를 보여주는 표이다.
도 187은 청징 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 188은 청징 여과 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 189는 대규모 접선 유동 여과 유닛 조작의 도식적 흐름도이다.
도 190은 대규모 접선 유동 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 191은 대규모 접선 유동 여과 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 192는 이오딕사놀 농도 유닛 조작의 도식적 흐름 차트이다.
도 193은 초기 이오딕사놀 농도 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 194는 원심분리 농도 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 195는 이오딕사놀 구배 정제 단계를 완료하는 데 필요한 단계의 도식적 흐름 차트이다.
도 196은 이오딕사놀 구배 정제 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 197은 이오딕사놀 구배 정제 단계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 198은 양이온 교환 크로마토그래피 유닛 조작의 도식적 흐름 차트이다.
도 199는 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 200은 양이온 교환 크로마토그래피 조작 조건을 보여주는 표이다.
도 201은 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 202는 소규모 접선 유동 여과 단계를 완료하는 데 필요한 단계의 도식적 흐름 차트이다.
도 203은 소규모 접선 유동 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 204는 소규모 접선 유동 여과 단계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 205는 무균 여과 및 충전 유닛 조작의 도식적 흐름 차트이다.
도 206은 무균 여과 및 충전 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 207은 무균 여과 및 충전 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 208은 공정내 보유 지점 및 저장 조건을 보여주는 표이다.
도 209는 용액 제조를 위한 바람직한 화학물질의 목록을 보여주는 표이다.
도 210은 실험 A에 대한 청징된 DMEM 배지에서 제형화된 샘플을 보여주는 표이다.
도 211은 실험 A에 대한 제조용 및 분석용 실행에 사용된 완충액을 보여주는 표이다.
도 212는 실험 A에서 HIC 정제에 대한 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 213은 실험 A에서 CEX 정제에 대한 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 214는 실험 A에 대해 60 칼럼 부피(CV)에서 0 내지 100% 이동상 B 및 이후 10 CV 동안 단계 내지 100% MPC로부터의 SOP 선형 구배를 보여주는 표이다.
도 215는 실험 A에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 216은 실험 A에 대한 실행 HIC-25로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승은 0.6 bar였다. 분획은 갈색의 마커로 표기된다. 주요 용리는 E1이다. 로딩 단계에서의 UV 스파이크는 공기 버블 통과 칼럼에 상응하고, 이것은 로딩 후 발생하고 샘플을 더 작은 용기로 옮기도록 중단되었다.
도 217은 실험 A에 대한 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. HIC-25에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 수확; C - 로드; D - 통과액(FT); E - 세척 1(W1); F - 세척 2(W2), G - 용리(E1); H - 세척 3(W3); I - CIP; J - 형광 신호의 오버레이. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도(mS/cm): 검정 곡선. 주요 용리(E1)는 다른 분획과 비교하여 10배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 218은 실험 A에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-25 실행의 회수를 위한 표이다.
도 219는 실험 A에 대한 HIC-25 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과이다. M - 래더. 분획 E1, W3 및 CIP는 각각 5배, 5배 및 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 220은 결합 조건에 일치하도록 제조되고 실험 A를 위해 CEX-SO3 칼럼에 로딩된 E1 HIC-OH에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 221은 실험 A로부터의 실행 SO3-16으로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 부문(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 갈색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력을 상승하지 않는다. 분획은 갈색의 마커로 표기된다. 주요 용리는 E1이다.
도 222는 실험 A로부터의 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. SO3-16에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 로드 BF; C - 로드; D - 통과액 + 세척 1(W1) (FT); E - 세척 2 (W1); F - 용리(E1); G - 세척 3(W3); H - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 100배 희석되지만, 다른 분획은 2.5배 희석 또는 5배 희석(W3 및 CIP)되었다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 223은 실험 A에 대한 제조용 실행 SO3-16에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다.
도 224는 실험 A로부터의 SO3-16 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE이다. M - 래더. 분획 E1은 5배 및 10배 희석되고, 분획 W3 및 CIP는 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 225는 실험 A에서 SO3-16으로부터 전체 용리(E1)를 AEX-QA (QA-14) 칼럼으로 로딩하기 위한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 226은 실험 A에 대한 실행 QA-14로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력이 없었다. 분획은 갈색의 마커로 표기된다. 주요 용리는 (충전 캡시드 AAV) E3이다.
도 227은 실험 A에 대해 QA-14에 대해 HPLC 분석 빈-충전 방법에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. A - SO3-16 E1; B - FT+W; C - E1; D - E2(빈 AAV 캡시드); E - E3(충전 AAV 캡시드); F - E4 (주요 충전 피크의 꼬리 부분); G - E5; H - E6, I - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도(mS/cm): 검정 곡선. 도 A, B, C, F, G, H 및 I는 동일한 스케일에 있고, D는 2배 더 큰 스케일에 있고, E는 4배 더 큰 스케일에 있다. 분획은 20배 희석(사진 A) 또는 10배 희석(사진 H), 다른 것은 5배 희석된다. 비 A260/A280은 상응하는 범위에 제시된다.
도 228은 실험 A에 대한 QA-14 E3 샘플에 대한 TFF의 실행에 의한 농축 및 완충액 교환 조건을 보여주는 표이다.
도 229는 제조용 실행 QA-14 TFF 및 실험 A로부터의 총 DSP 수율에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수의 표를 보여준다.
도 230은 실험 A에 대한 HPLC E/F 분석에 기초한 빈 및 충전 AAV 캡시드 둘 다의 순도의 표를 보여준다.
도 231은 실험 A에 대한 TEM에 의해 평가된 충전 및 빈 AAV의 비의 표를 보여준다.
도 232는 실험 A에 대한 TEM에 의해 평가된 TFF 후 QA-14로부터의 대표적인 분획을 보여준다. E3 분획(상부), E2 분획(하부).
도 233은 실험 A에 대한 QA-14 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E3은 그대로이고 5배 희석되고, 다른 것은 그대로이다. 주요 분획은 E3이다. AAV8 FULLS는 TFF 후 E3 분획이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형에 의해 표시된다.
도 234는 실험 B에 대한 청징된 DMEM 배지에서 제형화된 샘플을 보여주는 표이다.
도 235는 실험 B에 대한 제조용 및 분석적 실행에 사용된 완충액을 보여주는 표이다.
도 236은 실험 B에서 HIC 정제에 대해 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 237은 실험 B에서 CEX 정제에 대한 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 238은 실험 B에 대한 60 칼럼 부피(CV)에서의 0 내지 100% 이동상 B 및 이후 10 CV에 대한 단계 내지 100% MPC의 SOP 선형 구배를 보여주는 표이다.
도 239는 실험 B에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 240은 실험 B에 대한 실행 HIC-26으로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승은 0.5 bar이었다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 241은 실험 B에 대한 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. HIC-26에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 수확; C - 로드; D - 통과액(FT); E - 세척 1(W1); F - 세척 2(W2), G - 용리(E1); H - 세척 3(W3); I - CIP; J - 형광 신호의 오버레이. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 다른 분획과 비교하여 10배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 242는 실험 B에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-26 실행의 회수에 대한 표이다.
도 243은 실험 B로부터의 HIC-26 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과이다. M - 래더. 분획 E1, W3 및 CIP는 각각 5배, 5배 및 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 244는 실험 B를 위해 결합 조건에 일치하도록 제조되고 CEX-SO3 칼럼에 로딩된 E1 HIC-OH에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 245는 실험 B로부터의 실행 SO3-17로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력은 상승하지 않았다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 246은 실험 B로부터의 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. SO3-17에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 로드 BF; C - 로드; D - 통과액 + 세척 1(W1) (FT); E - 세척 2 (W1); F - 용리(E1); G - 세척 3(W3); H - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 100배 희석되는 반면- 다른 분획은 2.5 배 희석 또는 5배 희석된다(W3 및 CIP). 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 247은 실험 B에 대한 제조용 실행 SO3-17에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다.
도 248은 실험 B로부터의 SO3-17 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE이다. M - 래더. 분획 E1은 5배 및 10배 희석되고, 분획 W3 및 CIP는 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 249는 실험 B에서 SO3-17 내지 AEX-QA (QA-15) 칼럼으로부터 전체 용리(E1)를 로딩하기 위한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 250은 실험 B에 대한 실행 QA-15로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 단계-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승이 없다. 분획은 갈색 마커로 표시된다. 주요 용리(충전 캡시드 AAV)는 E3이다.
도 251은 실험 B에 대한 QA-15에 대한 HPLC 분석 빈-충전 방법에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. A - SO3-16 E1; B - FT+W; C - E1; D - E2(빈 AAV 캡시드); E - E3(충전 AAV 캡시드); F - E4(주요 충전 피크의 꼬리 부분); G - E5; H - E6, I - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선, 다각 광 산란 검출기(MALS)는 핑크색 곡선이다. 사진 B, C, G, H 및 I는 동일한 스케일에 있다. A, D, E 및 F는 2배 더 큰 스케일에 있다. 분획은 20배 희석(사진 A) 또는 10배 희석(사진 H)되고, 다른 것은 5배 희석된다. 비 A260/A280은 상응하는 분획에 제시된다.
도 252는 실험 B에 대한 QA-15 E3 샘플에서 TFF의 실행에 의한 농축 및 완충액 교환 조건을 보여주는 표이다.
도 253은 실험 B로부터의 제조용 실행 QA-15 TFF 및 총 DSP 수율에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수의 표를 보여준다.
도 254는 실험 B에 대한 HPLC E/F 분석에 기초한 빈 및 충전 AAV 캡시드 둘 다의 순도의 표를 보여준다.
도 255는 실험 B에 대한 TEM에 의해 평가된 AAV 충전 및 빈의 비의 표를 보여준다.
도 256은 실험 B에 대해 TEM에 의해 평가된 TFF 후 QA-15로부터의 대표적인 분획을 보여준다. QA-15 E3 분획(상기); E5 분획(하기).
도 257은 실험 B에 대한 QA-15 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E3은 그대로이고, 5배 희석되고, 다른 것은 그대로이다. 주요 분획은 E3이다. AAV8 FULLS는 TFF 후 E3 분획이다. Genscript Express Plus 4-20% 겔을 사용하였다.
도 258은 실험 B로부터의 대표적인 HPLC 크로마토그램 지문 방법을 보여준다. 각각의 크로마토그래피 단계의 오버레이가 제시된다. a: HIC-OH 단계의 수확 및 주요 용리물의 오버레이. HIC 용리물은 수확과 비교하여 60배 희석된다. b: 수확 및 주요 SO3 용리물(E1)의 오버레이. SO3 용리물은 수확 재료와 비교하여 200배 희석된다. c: 수확, QA 로드 및 QA 주요 용리물(E3)의 오버레이. 로드는 수확과 비교하여 10배 희석되고 E3은 60배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다. Y축은 260 nm에서의 흡광도이다.
도 259는 ABCA4에 대한 HIC (OH) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 260a-b는 ABCA4에 대한 대표적인 HIC (OH) 크로마토그램 및 벡터 회수 분석이다. (a) 크로마토그램의 확대된 용리 섹션이 도시되어 있다. 용리 단편은 괄호로 표시된다. (b) HPLC 총 입자 분석에 의해 측정된 바대로 HIC 분획에서의 벡터 회수. 전체 단계 수율을 증가시키는 데 필요한 HIC 용리 단계 최적화.
도 261은 ABCA4에 대한 CEX(SO3) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다. 1M Tris, pH9.0의 첨가에 의해 중화된 모든 분획; 총 분획 부피의 10%가 첨가된다.
도 262a-b는 ABCA4에 대한 대표적인 CEX (SO3) 크로마토그램 및 벡터 분석 회수이다. (a)는 확대된 용리를 보여준다. (b)는 HPLC 총 입자 분석에 의해 측정된 바대로 SO3 분획에서 회수된 벡터를 보여준다.
도 263은 ABCA4에 대한 AEX (QA) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다. 1M BTP, pH 6.5의 첨가에 의해 중화된 모든 분획; 총 분획 부피의 5%가 첨가된다.
도 264a-b는 ABCA4에 대한 대표적인 AEX (QA) 크로마토그램 및 벡터 회수 분석이다. (a)는 확대된 용리를 보여주고 빈 입자 및 충전 입자는 괄호에 나타난다. (b)는 총 입자 HPLC 분석에 의해 측정된 바대로 QA 분획에서 빈 입자(상부) 및 충전 입자 (하부)의 벡터 회수를 보여준다.
도 265는 ABCA4에 대한 HPLC 분석에 기초한 (완전:빈) 입자의 순도를 보여주는 표이다. 순도 (E/F) 비의 최적 표시는 FLD 및 MALS 검출기에 의해 주어진다. 충전 AAV 입자의 대략 55%-94%의 농후화가 QA 단계에 의해 달성된다.
도 266a-b는 ABCA4에 대한 TEM에 기초한 입자 (완전:빈)의 대표적인 순도이다. (a)는 샘플 상세내용의 표를 보여준다 (b)는 이오딕사놀에 의해 정제된 샘플(AAV8Y733F)(2개의 왼쪽 패널) 및 QA 크로마토그래피에 의해 정제된 샘플(AAV8 QA-1 E3)(2개의 오른쪽 패널)을 보여준다.
도 267은 ABCA4에 대핸 SDS-PAGE 분석에 의한 대표적인 입자 정제이다.
도 268은 ABCA4에 대한 HIC 크로마토그래피 유닛 조작을 보여주는 도식적 흐름도이다.
도 269는 ABCA4에 대한 HIC 포획 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위를 보여주는 표이다.
도 270은 ABCA4에 대한 HIC 크로마토그래피 조작 매개변수를 보여주는 표이다.
도 271은 로딩, 세척, 용리 및 CIP 단계를 포함하는 ABCA4에 대한 HIC 단계의 대표적인 크로마토그램이다. 범례: 통과액(F1), 로드후 세척(W1), 로드후 세척 2(W2), 용리(E1), 용리후 세척(W3), 제자리에서의 세정(CIP).
도 272는 ABCA4에 대한 HIC 단계의 대표적인 확대된 크로마토그램이다. 범례: 로드후 세척(W1), 로드후 세척 2(W2), 용리(E1), 용리후 세척(W3), 제자리에서의 세정(CIP).
도 273은 ABCA4에 대한 HIC 완충액 조성물 및 표적 사양을 보여주는 표이다.
도 274는 ABCA4에 대해 HIC 크로마토그래피 단계에 사용되는 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 보여주는 표이다.
도 275는 ABCA4에 대한 SO3 크로마토그래피 유닛 조작을 보여주는 도식적 흐름도이다.
도 276은 ABCA4에 대한 SO3 크로마토그래피 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위 / 세트포인트를 보여주는 표이다.
도 277은 ABCA4에 대한 개별 크로마토그래피 단계 및 조작 매개변수를 보여주는 표이다.
도 278은 ABCA4에 대한 대표적인 전형적인 완전 SO3 크로마토그램 실행이다.
도 279는 ABCA4에 대한 크로마토그램의 대표적인 확대된 용리 섹션이다. 적색 직사각형은 주요 용리 피크를 마킹한다. 범례: 로드후 세척 2(W2), 용리(E1), 용리후 세척(W3), 제자리에서의 세정(CIP).
도 280은 ABCA4에 사용된 SO3 완충액 조성물을 보여주는 표이다.
도 281은 ABCA4에 대한 원심분리 농도 단계에 사용된 핵심 재료 /소모품을 보여주는 표이다.
도 282는 ABCA4에 대해 QA 크로마토그래피 유닛 조작 공정 흐름을 보여주는 도식적 흐름도이다.
도 283은 ABCA4에 대해 QA 크로마토그래피 단계에 사요된 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 보여주는 표이다.
도 284는 ABCA4에 대한 크로마토그래피와 연관된 특정 단계를 보여주는 표이다.
도 285는 ABCA4에 대한 선형 구배 용리의 대표적인 완전 QA 크로마토그램이다.
도 286은 구배 용리로 확대된 대표적인 QA 크로마토그램이다. E2 - 빈 입자. E3 - 충전 입자. E4 - 충전, 빈 및 손상된 입자의 혼합물을 함유하는 피크 꼬리.
도 287은 ABCA4에 대한 QA 완충액 조성물 및 표적 사양을 보여주는 표이다.
도 288은 ABCA4에 대한 QA 크로마토그래피 유닛 조작에 사용된 핵심 재료 /소모품을 보여주는 표이다.
도 289는 정제 AAV-ABCA4 벡터에 대한 접선 유동 여과 유닛 조작의 흐름 차트의 도식적 다이어그램이다.
도 290은 정제 AAV-ABCA4 벡터에 대한 TFF 실행에 사용될 수 있는 예시적인 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 기술한 표이다.
도 291은 정제 AAV-ABCA4 벡터에 대한 접선 유동 여과 유닛 조작에 사용될 수 있는 예시적인 재료 및 소모품을 제공하는 표이다.
도 292는 AAV-ABCA4 생성물의 제조 동안 사용될 수 있는 공정내 지점에서의 예시적인 보유 시간을 제공하는 표이다.
도 293은 완전한 ABCA4 전이유전자를 형성하기 위해 조합하는 상류 및 하류 전이유전자 구조를 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 294는 인프레임 AUG 코돈 전에 아웃 오브 프레임 AUG 코돈을 갖는 오버랩 C 서열을 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 295는 오버랩 구역 C 및 B의 예측된 2차 구조를 예시하는 도식이다.
도 296은 예시적인 오버랩하는 벡터를 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 297a-d는 ABCA4 오버랩하는 이중 벡터 시스템에 의한 형질도입 후 전이유전자 결과의 일련의 다이어그램이다. (a) 상류 및 하류 전이유전자 단일-가닥 DNA 형태. 이들은 상보성 전이유전자에서 상동성의 이들의 영역을 통해 단일-가닥 어닐링(SSA)에 의해 어닐링할 수 있고(b), 이후에 완전한 재조합된 큰 전이유전자가 생성될 수 있다(c). 약어: CDS = 코딩 서열; DSB = 이중-가닥 파괴; HR = 상동성 재조합; ITR = 역상 말단 반복부; pA = polyA 신호; SSA = 단일-가닥 어닐링; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 298은 오버랩하는 상류 및 하류 이중 벡터를 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 299는 오버랩하는 상류 및 하류 이중 벡터를 보여주는 일련의 다이어그램이다.
도 300은 이중 벡터 상류 및 하류 변이체 A, B, C, D, E, F, G 및 X를 보여주는 다이어그램이고, 이들은 도시된 AAV2/8 Y733F ABCA4 또는 AAV2/8-ABCA4에 포함될 수 있다. ABCA4의 충전 긴 또는 절두된 버전 (tABCA4)은 이중 벡터 시스템의 오버랩하는 영역에 의해 영향을 받을 수 있다.
도 301은 이중 벡터 오버랩 변이체를 보여주는 도식적 다이어그램이다. ABCA4 코딩 서열(서열 번호 11)의 뉴클레오타이드는 도시된 각각의 전이유전자에 포함된다.
도 302는 상류 전이유전자 변이체 B로부터의 뉴클레오타이드 서열의 분절을 보여주는 다이어그램이다. SwaI 부위로부터의 서열은 모든 상류 전이유전자 변이체와 일치하고, 가능한 은성 폴리 A 신호의 특징이 강조되어 있다.
도 303은 ABCA4 이중 벡터 시스템의 개발의 한쌍의 다이어그램이다. A. 유전적 요소 및 전이유전자 및 벡터 캡시드의 구조 및 용량을 포함하는 벡터 설계의 상이한 양상이 고려되고 평가된다. B. 상이한 오버랩 길이를 보유하는 이중 벡터 변이체는 2개의 전이유전자 사이에 재조합에 대해 최적 영역을 결정하도록 비교되었다. AAV = 아데노-연관된 바이러스; ABCA4 = ATP-결합 카세트 수송체 단백질 패밀리 구성원 4; Do = 하류 전이유전자 변이체; GRK1 = 인간 로돕신 키나제 프로모터; In = 인트론; ITR = 역상 말단 반복부; pA = polyA 신호; Up = 상류 전이유전자 변이체; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 304a-b는 (A) 상류 전이유전자에 의해 제공된 정방향 프라이머 결합 ABCA4 CDS 및 하류 전이유전자에서 역방향 프라이머 결합 ABCA4 CDS가 재조합된 전이유전자로부터 전사체를 증폭시키도록 사용된다는 것을 보여주는 도식적 다이어그램이다. 앰플리콘은 정확한 ABCA4 CDS가 전사체의 오버랩 영역에 걸쳐 함유된다는 것을 확인하도록 시퀀싱되었다. (B) 예측된 GRK1 전사 출발 부위(TSS)의 하류에 정방향 프라이머 결합 및 상류 ABCA4 CDS 내에 역방향 프라이머 결합은 이중 벡터 C 주사된 눈 및 이중 벡터 5'C 주사된 눈으로부터 전사체 형태를 평가하도록 사용되었다.
도 305는 ABCA4 상류 서열의 발현을 유도하도록 사용될 수 있는 프로모터 및 추가의 서열의 다이어그램이다. RK = GRK1 프로모터, IntEx = 인트론 및 엑손 서열, CMV = 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서; CBA = 닭 베타 액틴 프로모터; SA/SD = 스플라이스 억셉터 및 스플라이스 도너
도 306은 ABCA4 상류 서열 또는 GFP를 발현하도록 사용된 AAV 벡터의 다이어그램이다. ITR = 역상 말단 반복부, WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소, GFP = 녹색 형광 단백질, IntEx = 인트론 및 엑손 서열, CBA = 닭 베타 액틴 프로모터, CMV = 사이토메갈로바이러스 인핸서, RK = 로돕신 키나제 프로모터(GRK1 프로모터), RBG = 토끼 베타 글로빈, SA/SD = 스플라이스 억셉터 및 스플라이스 도너 서열.
도 307은 CMVCBA.In.GFP.pA 벡터(서열 번호 17)의 서열이다.
도 308은 CMVCBA.GFP.pA 벡터(서열 번호 18)의 서열이다.
도 309는 CBA.IntEx.GFP.pA 벡터(서열 번호 19)의 서열이다.
도 310은 CAG.GFP.pA 벡터(서열 번호 20)의 서열이다.
도 311은 AAV.5'CMVCBA.In.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 21)의 서열이다.
도 312는 AAV.5'CMVCBA.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 22)의 서열이다.
도 313은 AAV.5'CBA.IntEx.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 23)의 서열이다.
도 314는 본 개시내용의 예시적인 ABCA4 발현 작제물을 도시하는 일련의 도식적 다이어그램이다.
도 315는 5' ITR을 암호화하는 서열 (서열 번호 27), RK 프로모터를 암호화하는 서열(서열 번호 28), 토끼 베타-글로빈(RBG) 인트론/엑손 (Int/Ex)을 암호화하는 서열(서열 번호 39), ABCA4 유전자의 코딩 서열의 5' 부분을 암호화하는 서열(서열 번호 29), 및 3' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 30)을 포함하는 pAAV.RK.5'ABCA4.kan(서열 번호 26)의 ITR 부분에 대한 ITR의 서열이다.
도 316은 5' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 27), ABCA4 유전자의 코딩 서열의 3' 부분을 암호화하는 서열(서열 번호 31), WPRE를 암호화하는 서열(서열 번호 32), bGH polyA를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 33)을 포함하는 pAAV.3'ABCA4.WPRE.kan(서열 번호 30)의 ITR 부분에 대한 ITR의 서열이다.
도 317a-c는 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 의해 암호화된 전이유전자의 단일 가닥 센스 및 안티센스 DNA(ssDNA)로의 전환, 및 AAV 바이러스 입자에서의 ssDNA의 캡시드화를 보여주는 일련의 사진이다.
도 318a-d는 핵에 의해 센스 및 안티센스 ssDNA를 함유하는 AAV 바이러스 입자의 흡수(A), 바이러스 입자로부터의 센스 및 안티센스 가닥의 방출(B), dsDNA를 생성하기 위한 상보성 가닥의 합성(C) 및 전이유전자의 전사(D)를 보여주는 일련의 사진이다.
도 319a-h는 단일 가닥 어닐링 및 제2 가닥 합성을 통해 AAV 이중 벡터 시스템에서 큰 전이유전자의 캡시드화, 형질도입 및 개형을 도시하는 일련의 사진이다. 큰 전이유전자는 초기에 dsDNA(A-B)로서 코딩된다. 후속하여, 큰 전이유전자의 오버랩하는 5' 및 3' 단편의 ssDNA는 AAV 바이러스 입자(C)에 의해 캡시드화된다. 큰 전이유전자의 5' 및 3' 단편의 상보성 가닥을 포함하는 바이러스 입자가 생성되고, 이 ssDNA는 상보성의 영역, 오버랩하는 서열(적색으로 도시)을 포함한다. 이 실시예에서, 5' 단편의 안티센스 ssDNA 및 3'의 센스 가닥이 도시되어 있다. ssDNA를 포함하는 AAV 입자는 형질도입되고(D), ssDNA는 바이러스 입자로부터 핵으로 방출된다(E). 5' 및 3' 단편은 핵 환경에서 상보성, 오버랩하는 서열에서 혼성화하고(F), 전체 큰 전이유전자의 dsDNA는 제2 가닥 합성을 통해 생성되고(G), 이 dsDNA는 후속하여 전사되고 전이유전자 발현된다(H).
도 320은 본 개시내용의 ABCA4 오버랩하는 이중 벡터 시스템의 아웃라인다. 아데노-연관된 바이러스(AAV) 전이유전자의 요소는 2개의 독립 전이유전자 "상류" 및 "하류"에 걸쳐 분할된다. 상류 전이유전자는 ABCA4 코딩 서열의 프로모터 및 상류 단편을 함유하는 반면, 하류 전이유전자는 ABCA4 코딩 서열의 하류 단편과 WPRE 및 소 성장 호르몬(BGH) pA 신호를 함유하였다. 도시된 최적화된 오버랩하는 이중 벡터 시스템에서, 전이유전자 둘 다는 ABCA4 코딩 서열 염기 3,494-3,701로부터 형성된 오버랩의 207bp 영역을 함유하였다. 동일한 숙주 세포 핵 내부에 있으면, 2개의 전이유전자가 오버랩의 영역을 통해 정렬하고 재조합한다. ABCA4 = ATP-결합 카세트 수송체 단백질 패밀리 구성원 4; GRK1 = 인간 로돕신 키나제 프로모터; In = 인트론; ITR = 역상 말단 반복부; pA = polyA 신호; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 321은 시험된 이중 벡터 조합에 대한 전이유전자 상세내용을 보여주는 표이다. 최종 열은 최적화된 오버랩하는 이중 벡터 시스템에 대한 상세내용을 함유한다. ABCA4 = ATP-결합 카세트 수송체 단백질 패밀리 구성원 4; bp = 염기쌍; CDS = 코딩 DNA 서열; GRK1 = 인간 로돕신 키나제 프로모터; pA = polyA 신호; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 322는 AAV-ABCA4, 상류 및/또는 하류 벡터에 대한 제조 공정의 하류 및 충전 및 종료 단계의 개관을 도시하는 도식적 다이어그램이다.
도 323a-b는 대표적인 최적화된 HIC 크로마토그램이다. 최적화된 피크 절단 주석(1.02M 완충액) 및 비최적화된 피크 절단 주석(1.08M 완충액) 둘 다가 도시되어 있다. 핵심: W2 = 로드후 세척 2, E1= 용리 분획, W3 = 용리후 완충액.
도 324a-b는 대표적인 최적화된 CEX 크로마토그램이다. 최적화된 피크 절단 주석(1.33M 완충액) 및 비최적화된 피크 절단 주석(1.3M 완충액) 둘 다가 도시되어 있다. 핵심: W2 = 로드후 세척 2, E1= 용리 분획, W3 = 용리후 완충액.
도 325a-c는 각각 HIC, CEX, 및 QA 단계에 대한 크로마토그램에 걸친 일련의 대표적인 최적화된 조건 실행이다.
도 326은 최적화 공정에 대한 단계 회수를 기술하는 표이다.
도 327a는 MALS에 의한 QA 분리에 대한 충전:빈 AAV 결과를 기술하는 표이다. 도 327b는 MALS 및 TEM.에 의한 QA 분리에 대한 충전:빈 AAV 결과를 기술하는 표이다.
도 328a-d는 AAV-RPGR 이중 벡터에 대해 4개의 확증적인 형질주입 및 정제 실행으로부터의 데이터를 제공하는 개념 증명 표 및 일련의 3개의 그래프이지만, 형질주입 및 정제 실행은 ABCA4를 포함하는 임의의 전이유전자와 사용될 수 있다. 초기 스코핑 연구의 결과로부터 후에 4개의 형질주입 조건(A)이 평가되었다. 벡터 입자(캡시드 ELISA)의 수 및 게놈 인서트(게놈 역가)를 함유하는 입자의 수는 각각의 조건(B)에 대해 정량화되었다.
도 329a-b는 AAV-RPGR에 대한 충전:빈 비를 평가하기 위한 직각 방법의 정량화를 도시하는 개념 증명 그래프(A) 및 표(B)이다, 그러나, 충전:빈 비를 평가하는 직각 방법은 ABCA4를 포함하는 임의의 전이유전자와 사용될 수 있다. 도 328에 제시된 충전 입자 분석은 실제 값을 과소평가할 수 있지만, 경향은 타당하다. 따라서, 4개의 조건으로부터의 샘플은 직각 방법에 의해 추가로 측정되었다. 직각 방법으로부터의 결과는 충전 입자 분석으로부터 보인 경향을 반영하였다(도 328). 상이한 형질주입제(CaPO4)로 생성된 재료로부터의 더 이전의 결과에 의한 비교는 형질주입제의 선택이 충전 대 빈 입자의 비에 효과를 또한 가질 수 있다는 것을 제안한다.
도 330은 AAV 완전:빈 벡터 비에 대한 형질주입 시약(PEI 대 CaPO4)의 효과를 도시하는 그래프이다. PEI 대 CaPO4 비교 형질주입 연구는 HPLC를 사용하여 완전:빈 벡터 비에 대해 분석된 재료를 생성하였다. 이전의 분석에서처럼, 재료는 충전 입자에 농후화하는 공정 단계를 통하지 않았다. 2의 형질주입 조건 사이에 일정하게 유지된 이전의 가변적인 조건은 총 DNA, PEI/DNA 비 및 형질주입 플라스미드의 비였다. 2의 형질주입 시약의 각각에 대해, 왼쪽 막대는 FLD이고, 오른쪽 막대는 MALS이다.
도 331은 5' ITR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 42), 3'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 176-3509, 서열 번호 43), WPRE를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 3516-4108, 서열 번호 44), BGH polyA를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4115-4278, 서열 번호 45) 및 3' IR을 암호화하는 서열(AAV 유래 ITR, 뉴클레오타이드 4422-4542, 서열 번호 46)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbIR.3'ABCA4.WPRE.kan(서열 번호 41)의 주석화된 서열이다. 소정의 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 3'ABCA4-암호화 서열은 뉴클레오타이드 181-3509를 포함하거나 이것으로 이루어지고, WPRE는 뉴클레오타이드 3522-4110을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 그리고/또는 BGH polyA는 뉴클레오타이드 4115-4383을 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 332는 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 48), CBA 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 190-467, 서열 번호 49), 인트론을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 468-590, 서열 번호 50), 엑손을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 591-630, 서열 번호 51), 5'ABCA4 (뉴클레오타이드 650-4351, 서열 번호 52) 및 3' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 4389-4509, 서열 번호 53)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.CBA.InEx.5'ABCA4.kan(서열 번호 47)의 주석화된 서열이다. 소정의 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CBA 프로모터는 뉴클레오타이드 186-468을 포함하거나 이것으로 이루어지고, InEx는 뉴클레오타이드 469-643을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 5'ABCA4는 뉴클레오타이드 650-4350을 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 333은 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 55), CBA 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 190-467, 서열 번호 56), RGB 인트론을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 704-876, 서열 번호 57), 5'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 919-4620, 서열 번호 58) 및 3' IR을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4667-4788, 서열 번호 59)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.CBA.RBG.5'ABCA4.kan(서열 번호 54)의 주석화된 서열이다. 소정의 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CBA는 뉴클레오타이드 186-468을 포함하거나 이것으로 이루어지고, RGB는 뉴클레오타이드 469-881을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 5'ABCA4는 뉴클레오타이드 919-4619을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 3' ITR은 뉴클레오타이드 4658-4778을 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 334는 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 61), CMV 인핸서를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 322-556, 서열 번호 62), CBA 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 571-849, 서열 번호 63), 5'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 856-4557, 서열 번호 64) 및 3' IR을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4667-4788, 서열 번호 65)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.CMV.CBA.5'ABCA4.kan(서열 번호 60)의 주석화된 서열이다. 일부 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CMV 서열은 뉴클레오타이드 186-568을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CBA 서열은 뉴클레오타이드 569-849를 포함하거나 이것으로 이루어지고, 5'ABCA4는 뉴클레오타이드 556-4556을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 3' ITR은 뉴클레오타이드 4595-4715를 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 335는 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 67), RK 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 186-384, 서열 번호 68), 5'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 576-4267, 서열 번호 69) 및 3' IR을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4275-4425, 서열 번호 70)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.RK.5'ABCA4.kan(서열 번호 66)의 주석된 서열이다.
도 336은 ABCA4 HIC(도 336a), CEX(도 336B) 및 AEX(도 336C) 제조용 실행, 및 분석 실행(도 336D)에 대한 완충액의 설명을 제공한다.
도 337은 ABCA4 제조용 실행에 대한 HIC 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 338은 ABCA4 제조용 실행에 대한 CEX (SO3) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 339는 ABCA4 제조용 실행에 대한 AEX 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 340은 OH 칼럼 HPLC 분석 방법을 이용한 HIC에 대한 포획 단계에 대한 조건을 보여주는 표이다. 제조용 실행을 위해, 청징된 수확 재료(1.2 L - 각각 0.6 L를 함유하는 2개의 병으로 나뉨)를 실온에서 해동하고 혼주하고 희석 완충액으로 1:1(1.2 L 수확 + 1.2 L 완충액) 희석하였다. 5 CV/분에서 시스템 펌프를 사용하여 칼럼에 로딩하였다. Tech 이동 실행은 HIC 조건 (HIC-8에 대해 여덟(8) 실행이었다.
도 341a 및 341b는 전체 실행-로딩 단계(도 341a) 및 확대된 용리 섹션(도 341b)에 의한 실행 HIC-8로부터의 크로마토그램이다. 1000에서 도 341a에 대해, 상부 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 다음 선 아래는 전도도이고, 다음 라인 아래는 280 nm에서의 UV 검출이고, 가장 낮은 선은 압력이다. 약 2400에서 도 341b에 대해, 가장 높은 피크는 280 nm에서의 UV 검출이고, 제2의 가장 높은 피크는 260 nm에서의 UV 검출이고, 가장 낮은 선은 전도도이다. 로딩 동안 압력 상승은 0.3 bar이었다. 분획은 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 342a-j는 HIC-8에 대한 HPLC 분석 - 총 방법에 기초한 크로마토그램을 보여준다. 도 342a - 블랭크(완충액) 실행; 도 342b - 수확; 도 342c - 로드; 도 342d - 통과액(FT); 도 342e - 세척 1(W1); 도 342f - 세척 2(W2); 도 342g - 용리(E1); 도 342h - 세척 3(W3); 도 342i - CIP; 도 342j - 형광 및 MALS 신호의 오버레이. 도 342a-i의 각각의 그래프, x축은 보유 시간(분)을 보여주고, y축은 흡광도, 전도도 및 광 산란을 보여준다. y축의 중간 근처에 생기는 선은 형광(Ex 280nm, EM 348nm)이다; y축의 하부 근처에 생기는 2개의 선은 260 nm에서의 280 nm 및 280 nm에서의 280 nm이고; 약 10분 보유 시간이 피크인 선은 전도도(mS/cm)이다. 주요 용리(E1)는 다른 분획과 비교하여 10배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 343은 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-8 실행의 회수를 보여주는 표이다.
도 344는 HIC-8 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 패더. 분획 E1, W3 및 CIP는 각각 5배, 5배 및 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 E1 5x dill에서 직사각형으로 표시된다. 레인. 모든 분획은 탈염되고, 환원 조건 하에 희석되어 겔에 로딩되었다.
도 345는 CIM SO3 칼럼을 사용하여 CEX에서 중간 연마에 대한 조건을 보여주는 표이다. 제조용 실행을 위해, HIC-OH로부터의 전체 용리(E1)는 결합 조건에 일치하도록 제조되고 CEX-SO3 칼럼에 로딩되었다. 실행은 CEX 조건(SO3-7)에 대해 7번째 실행이었다.
도 346a 및 346b는 실행 SO3-7로부터의 크로마토그램을 보여준다. 전체 실행-로딩 단계(도 346a), 확대된 용리 섹션(도 346b). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승이 없었다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 347a-j는 SO3-7에 대한 HPLC 분석-총 방법에 기초한 크로마토그램이다. 도 347a - 블랭크(완충액) 실행; 도 347b - 로드 BF; 도 347c - 로드; 도 347d - 통과액 + 세척 1(FT+W1); 도 347e - 세척 2(W2); 도 347f - 용리(E1); 도 347g - 세척 3(W3); 도 347h - CIP; 도 347i - 형광 신호의 오버레이; 도 347j - MALS 신호의 오버레이. 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 5배 희석되는 반면, 다른 분획은 희석되지 않는다 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 348은 제조용 실행 SO3-7에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다. 출발 HIC-8 E1 재료와 비교하여 중간 연마 단계 CEX-SO3에 대한 회수는 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS)에 대해 90% 및 86%였다. 2의 방법 사이의 불일치가 적었다. HPLC 분석의 경우에, 질량 균형은 100%가 아니다. 2(ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS) 결과의 정규화는 주요 분획에서 AAV의 평균 97% 회수로 더 정확한 값을 제공하였다.
도 349는 SO3-7 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E1은 5배 및 10배 희석되고, 분획 W3 및 CIP는 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 직사각형으로 표시된다.
도 350은 CIM QA 칼럼을 사용한 AEX에 대한 빈 및 충전 AAV 캡시드 분리에 대한 조건을 보여주는 표이다. 제조용 실행 동안, SO3-7로부터의 전체 용리(E1)는 결합 조건에 일치하도록 희석되고, AEX-QA 칼럼에 로딩되었다. 실행은 AEX 조건에 대한 제3 실행(QA-3)이다.
도 351a 및 351b는 실행 QA-3으로부터의 크로마토그램을 보여준다. 전체 실행-로딩 단계(도 351a), 확대된 용리 섹션(도 351b). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이다. 로딩 동안 압력 상승이 없었다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리 (충전 캡시드 AAV)는 E3이다.
도 352a-h는 QA-3에 대해 HPLC 분석-빈 충전 방법에 기초한 크로마토그램을 보여준다. 도 352a - SO3-7 E1; 도 352b - FT+W; 도 352c - E1; 도 352d - E2(빈 AAV 캡시드); 도 352e - E3(충전 AAV 캡시드); 도 352f - E4(주요 충전 피크의 꼬리 부분); 도 352g - E5; 도 352h - E6, 도 352i - CIP, 도 352j - MALS 신호의 오버레이. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선, 다각 광 산란 검출기(MALS)는 핑크색 곡선이다. B, C, D, F 및 G는 동일한 스케일에 있다. A 및 E는 각각 3배 및 8배 더 큰 스케일에 있다. 분획은 20배 희석(사진 I) 또는 10배 희석(사진E 및 H)되고, 다른 것은 5배 희석된다. A260/A280의 비는 상응하는 분획에 제시된다.
도 353은 QA-3 E3 샘플에서 투석을 사용한 완충액 교환을 달성하기 위한 조건을 보여주는 표이다. 샘플의 말단 부피는 3 mL이다.
도 354a-c는 제조용 실행 A-3(도 354a), 게놈 DSP 수율(도 354b), 및 정규화된 DSP 수율(도 354c)에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다.
도 355는 HPLC E/F 분석에 기초한 순도(빈 AAV 캡시드와 충전 AAV 캡시드 사이의 비)를 보여주는 표이다.
도 356은 희석된 및 비희석된 QA-15에서 그리고 TFF 샘플 후 TEM에 의해 평가된 충전 및 빈 AAV 캡시드의 비를 보여주는 표이다.
도 357은 TEM에 의해 평가된 SO3-7 E1(상부 열), QA-3 E3(중간 열) 및 투석 후(하부 열)의 현미경사진을 제공한다. 왼쪽: 저배율, 오른쪽: 계수에 사용되 배율.
도 358은 QA-3 실행에 대한 은-염색된 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E3은 그대로이고 5배 희석되고, CIP(2배) 이외의 다른 것은 그대로이다. 주요 분획은 E3이다. AAV8-PD는 투석 후 E3 분획이다. Biorad TGX 4-20% 겔을 사용하였다, 은 염색 절차.
도 359a 및 b는 HPLC 크로마토그램 - 지문 방법을 보여준다. 각각의 크로마토그래피 단계의 오버레이가 제시된다. 도 359a: A260 신호의 오버레이, 도 359b: 오직 더 큰 입자를 나타내는 MALS 신호의 오버레이, 그리고 이것은 단백질에 의해 영향을 받지 않고, 따라서, E/F의 더 양호한 해상이 얻어진다. 분획은 유사한 반응을 갖도록 부분적으로 희석되었다.
도면의 일부는 크로마토그램이다. 일반적으로, 녹색 선은 형광을 나타내고, 적색 선은 흡광도(260 nm)를 나타내고, 청색 선은 흡광도(280 nm)를 나타내고, 검정색 선은 전도도를 나타낸다. 검정색 및 흰색에서 볼 때, 전도도 선은 전형적으로 낮게 시작하고 시간이 지나면서 증가하고, 흡광도(260 nm) 및 흡광도(280 nm) 선은 서로 대부분 추적한다.
도 1은 제조 공정의 예시적인 세포 배양 및 확장 단계를 요약한 다이어그램이다. 부착성 세포 배양물을 함유하는 혈청에서의 세포가 20개의 HYPERstack(36개의 적층 배양 용기)을 증식시키도록 도시된 단계를 통해 계배배양되고 확장된다.
도 2는 공정내 제한 및 QC 시험을 포함하는 AAV8-RPGR 상류 제조 공정의 도식적 개관이다.
도 3은 세포 해동 단계의 도식적 흐름도이다.
도 4는 세포 해동 공정에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 5는 세포 해동 공정에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 6은 일반 계대배양 절차의 도식적 흐름도이다.
도 7은 세포 계대배양 체계에 대한 포괄적인 가이드라인을 보여주는 표이다.
도 8은 추천된 시약 부피(HBSS, 세포 해리 용액 및 성장 배지) 및 세포 계대배양에 대한 세포 시딩 밀도를 보여주는 표이다.
도 9는 세포 해동 및 계대배양 체계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 10은 제조 공정의 형질주입 및 수확 단계를 요약한 다이어그램이다. 세포는 폴리에틸렌이민(PEI) 기반 형질주입 프로토콜을 사용하여 형질주입된다. (1) DNA 및 PEIpro®는 형질주입 용액에서 별개로 희석된다. (2) PEI 용액은 DNA 용액에 적가되고 실온에서 10분 동안 항온처리된다. (3) DNA/PEI 용액은 이전에 제조된 형질주입 배지(DMEM +4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드 + 10% FBS)에 첨가된다. (4) 성장 배지(DMEM +4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드 + 10% FBS)는 HYPERstack으로부터 제조되고, DNA/PEI를 함유하는 형질주입 배지가 첨가되고, 세포는 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리된다. (5) 형질주입 배지는 HYPERstack으로부터 제거되고, 수확 배지(DMEM + 4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드 + 0% FBS + Benzonase)가 첨가되고, 세포는 72시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리된다. (6) 바이러스 방출 용액은 HYPERstack에 첨가되고, 세포는 AAV 입자를 방출하도록 18시간 동안 5% CO2에서 항온처리된다.
도 11은 5 x 36층 HYPERstack®당 인산칼슘 매개된 형질주입 용액을 생성하기 위한 가이드를 보여주는 표이다.
도 12는 5 x 36층 HYPERstack®당 PEIpro® 매개된 형질주입 용액을 생성하기 위한 가이드를 보여주는 표이다.
도 13은 일시적인 형질주입 및 배지 수확 단계의 도식적 흐름도이다.
도 14는 제조 스케일의 함수로서 초기 배지 변화에 필요한 클로로퀸 및 배지의 부피를 보여주는 표이다.
도 15는 형질주입 및 수확 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 16은 인산칼슘 세포 형질주입 공정에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 17은 PEI 세포 형질주입 공정에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 18은 여과 청징 단계의 도식적 흐름도이다.
도 19는 청징 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 20은 청징 여과 단계에 사용된 핵심재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 21은 제조 공정의 하류 가공 단계(DSP)를 요약한 다이어그램이다. (1) AAV 입자를 함유하는 수확 배지는 HYPERstack으로부터 수집된다. (2) 희석된 수확 배지는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제되고, AAV 입자를 함유하는 피크가 선택되고, 용리물이 수집된다. (3) 희석된 HIC 용리물은 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의해 추가로 정제되고, rAAV 입자를 함유하는 피크가 선택되고, 용리물이 선택된다. (5) 희석된 CEX 용리물은 구배 용리에 의해 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 충전 rAAV 입자에 농후화되고, 충전 rAAV 입자를 함유하는 피크가 선택되고, 용리물이 수집된다. (6) AEX 용리물은 농축되고 100 kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 2의 접선 유동 여과(TFF) 단계를 통해 최종 제형 완충액(FFB)(플루로닉 F-68이 없음)으로 정용여과된다. (7) 플루로닉 F-68(또한 폴록사머 188이라고도 칭함)이 첨가되고, 약물 물질은 -80℃에서 동결된다.
도 22는 QC 시험 및 공정내 제어를 포함하는 AAV8-RPGR 하류 및 충전 및 종료 제조 공정의 도식적 개관이다.
도 23a는 마크로-다공성 크로마토그래피 기법의 이점을 보여주는 표이다.
도 23b는 왼쪽에서 오른쪽으로 막, 모노리스 및 종래의 비드를 보여주는 크로마토그래피 배지의 일련의 3개의 영상이다.
도 24a 및 b는 초기 재료에 대한 HPLC 분석(지문, 총 입자, 빈/충전 입자)(수확)을 도시하는 한쌍의 그래프이다(왼쪽 그래프는 부분 분리 방법 분석을 도시하고, 오른쪽 그래프는 총 분석을 도시한다).
도 25는 rAAV-RPGR 수확 재료의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 26은 수확된 배지 및 청징후 수확된 배지의 샘플로부터의 총 숙주 DNA 및 단백질에 대한 예시적인 결과이다.
도 27은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) AAV 포획 공정을 요약하는 표이다.
도 28은 소수성 조건에 대한 안정성 시험 절차를 기술하는 도식적 다이어그램이다.
도 29는 도 89에 개략화된 HIC 절차로부터의 크로마토그램을 도시하는 그래프이다.
도 30은 도 89에 도시된 바와 같은 조건, OD600을 측정하여 수확에서, 여과 전(BF) 및 여과 후(AF)의 HIC의 결과를 도시하는 표이다.
도 31은 로드의 여과 없이 HIC의 흐름 조건을 도시하는 표이다.
도 32는 도 31의 HIC 흐름 조건에 상응하는 한쌍의 크로마토그래피이다.
도 33은 도 31 및 도 32에 도시된 HIC의 SDS-PAGE 분석을 도시하는 한쌍의 사진이다.
도 34는 인산칼륨(KP) 침전에 의한 HIC를 도시하는 도식적 다이어그램이다. 덜 한 단백질 변성 및 더 높은 단백질 안정성(자연적)에서의 결과.
도 35는 (C4 A 칼럼을 사용하여) 도 34의 HIC 실험에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 36은 (OH 칼럼을 사용한) 도 34의 HIC 실험에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 37은 도 95-97에 도시된 HIC의 SDS-PAGE 분석을 도시하는 일련의 사진이다.
도 38은 C4 A 및 OH 칼럼을 사용한 (NH4)2SO4 및 PK의 결과를 도시하는 일련의 표이다.
도 39는 HIC 조건을 도시하는 도식적 다이어그램이다 - 이 도면에서의 로딩 양은 도 40-96 및 102에 대한 로딩 양이다.
도 40은 도 39의 HIC 실험에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 41은 예를 들어 도 39 및 도 40에 도시된 바와 같은 1 mL 칼럼에서 HIC의 로딩 커패시티를 도시하는 도식적 다이어그램이다.
도 42는 초기 재료의 HPLC 총 분석의 FLD 반응을 도시하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 43은 2개의 HIC 실험에 대한 (각각에 대해 표 및 크로마토그래프) 한쌍의 ddPCR 분석이다. HIC-9는 소르비톨 없이 수행되었다. HIC-10은 소르비톨을 사용하여 수행되었다.
도 44는 2의 HIC 실험에 대한 ddPCR 분석을 도시하는 한쌍의 표이다. HIC-10은 OH 칼럼에서 수행되었다. HIC-10은 C4 A 칼럼에서 수행되었다.
도 45는 HIC 정제 단계에 대한 선형 구배 용리 및 최적화된 단계 용리의 비교를 보여주는 한쌍의 그래프이다.
도 46은 HIC 희석 완충액의 몰농도의 비교에 의해 HIC 실험의 강인성을 도시하는 일련의 크로마토그램이다.
도 47은 2 mL 칼럼(HIC-16 및 HIC-17)에서 HIC 실험의 커패시티를 도시하는 일련의 크로마토그램이다.
도 48은 HIC-18에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 49는 도 48에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 50은 HIC-18로부터의 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램이다(OH 80-mL 커패시티 칼럼에서 실행).
도 51은 HIC-19에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 52는 도 51에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 53은 HIC-19로부터의 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램(단계 용리에 의한 실행)이다.
도 54는 각각 HIC-18 및 HIC-19에 대한 전도도 측정을 제공하는 한쌍의 표 및 도 49, 도 50 및 도 51의 HIC 실험에 상응하는 크로마토그램이다.
도 55는 HIC-20에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 56은 도 55에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 57은 HIC-20으로부터의 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램(OH 80-mL 커패시티 칼럼에서 실행)이다.
도 58은 도 57에 상응하는 HIC-20의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 59는 각각의 20 HIC 실험의 칼럼의 유형, 사용된 완충액 및 목적을 요약한 표이다.
도 60a-b는 예시적인 HIC AAV 포획 단계를 보여주는 각각 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 60a는 80 mL 칼럼으로부터의 크로마토그램을 보여준다. HIC 포획 단계는 1 mL 칼럼으로부터 80 mL 칼럼으로 성공적으로 확대되었다. 도 60b는 HIC 수확 배지, 통과액, 로드 및 용리물 분획의 SDS-PAGE 겔 분석을 보여준다. 레인은 왼쪽에서 오른쪽으로 마커, 유입 수확 배지, 로드, 통과액(FT), W, 분획 E1, E2, 2배 희석된 E2(E2.2X), 2배 희석된 E3(E3.2X), 제자리에서의 세정(CIP), 및 2배 희석된 제자리에서의 세정(CEP.2X)을 보여준다. AAV 입자를 함유하는 E2 분획은 녹색 박스에 있고, 수확 배지 레인은 적색 박스에 있다.
도 61a-b는 HIC 단계에 대한 구배(도 61a) 및 등용매 용리(도 61b) 프로토콜을 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. E1, E2 및 E3 분획은 박스에 있다.
도 62a-b는 3 단계 공정에 대한 2 단계 공정에 대한 합리성을 보여주는 한쌍의 SDS-PAGE 겔이다. 도 62a는 예시적인 HIC 용리를 보여준다. 도 62b는 AEX 충전 대 빈 분리 개념 증명 실행을 보여준다. 캡시드를 함유하는 분획은 적색 박스에 있고(도 62a, 반면 AEX 단계 후 빈 캡시드 및 충전 캡시드를 함유하는 분획은 적색(왼쪽) 및 녹색(오른쪽) 박스에 있다(도 62b). HIC 단계에 대한 순도 및 HIC 및 AEX QA 정제된 생성물의 후속하는 순도는 충분하지 않다. 중간 연마 단계(CEX 양이온 교환, SO3-)가 필요하다.
도 63은 HIC 포획 단계 후인 여과 단계의 최적화를 보여주는 그래프이다. X축에 필터의 상이한 유형이 도시되어 있다: PES = 폴리에테르설폰, CA= 셀룰로스 아세테이트, GF = 유리 섬유, PVDF = 폴리디비닐 플루오라이드, PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌, MV = 혼합 에스테르, RC = 재생 셀룰로스. y축에 각각의 필터 유형에 대한 AAV 입자(%)의 평균 회수가 도시되어 있다. 오렌지 막대는 제한된 확대 옵션을 갖는 필터(PVDF 및 PTFE)를 나타낸다.
도 64a-b는 각각 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용한 rAAV 입자의 포획을 보여주는 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 16a에서, mAU에서의 흡광도는 50의 증분으로 0에서 300으로 y축에 표시된다. rAAV 입자를 함유하는 분획 E2 및 E3은 각각 진한 녹색 및 밝은 녹색의 박스에 있다. 세척, 용리물 및 CIP 분획은 X축에 표시되어 있다. 도 64b는 도 64a로부터 용리된 분획의 순도를 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. rAAV 입자를 함유하는 분획 E2를 보여주는 레인은 박스에 있다. 2x는 2배 희석을 나타낸다.
도 65a-b는 각각 예시적인 HIC 단계의 단계 회수를 보여주는 크로마토그램 및 표이다.
도 66a-b는 각각 HIC를 사용하여 정제된 AAV 입자를 보여주는 크로마토그램 및 주사 전자 현미경검사(TEM) 현미경사진의 3개의 영상이다. 도 66a는 예시적인 HIC 단계에서 정제된 AAV 입자의 용리를 보여주는 크로마토그램이다. AAV 입자를 함유하는 분획 E3, E4 및 E5는 x축에 괄호로 표시된다. 도 66b는 E3, E4 및 E5 분획에서 용리된 AAV 입자의 TEM 현미경사진을 보여준다. 축적바는 200 nm을 나타낸다.
도 67은 2의 상이한 배율에서 E3, E4 및 E5 HIC 분획의 일련의 6개의 TEM 현미경사진이다. 상부 열에서, 축적바는 왼쪽에서 오른쪽으로 0.5 μM, 0.5 μM 및 500 nM을 나타낸다. 하부 열에서, 축적바는 200 nm을 나타낸다.
도 68은 AAV 중간 정제에 대한 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 공정을 요약한 표이다.
도 69는 pH 4.0(SO3-1) 또는 pH 3.5(SO3-2)에서 수행된 개발 중간 정제 단계 SO3을 도시하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 70은 pH 3.5에서 수행된 중간 정제 SO3 단계(SO3-2)의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 71은 SO3-2에 대한 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램이다.
도 72는 SO3-3에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 73은 도 72에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 74는 SO3-3에 대한 ddPCR 결과를 도시하는 한쌍의 표 및 크로마토그램이다.
도 75는 SO3-4에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 76은 도 75에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 77은 SO3-4의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 78은 pH 3.8(SO3-5) 또는 pH 3.6(SO3-7)에서 수행된 중간 정제 단계 SO3을 도시하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 79는 pH 3.6 ± 0.1이 도 69-78의 조건을 이용하여 HIC 실험에 바람직하거나 최적인 pH라는 것을 보여주는 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 80은 SO3에 대한 칼럼 커패시티 결정의 분석이다.
도 81은 로드 재료의 여과 없이 SO3-9, 커패시티 실행에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 82는 도 135에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 83은 로드 재료의 여과 없이 SO3-10, 커패시티 실행에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 84는 도 135에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 85는 SO3-7, SO3-9 및 SO3-10을 비교하는 일련의 크로마토그램이다.
도 86은 SO3-9 및 SO3-10에 대한 HPLC 분석을 도시하는 한쌍의 표이다.
도 87은 SO3-11에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 88은 도 141에 상응하는 크로마토그램이다.
도 89는 폴록사머 무 SO3-7(왼쪽 그래프 및 크로마토그램) 또는 폴록사머 유 SO3-11(오른쪽 그래프 및 크로마토그램)에 대한 한쌍의 ddPCR 분석이다.
도 90은 SO3-12에 대한 크로마토그래피 조건을 도시하는 표이다.
도 91은 SO3-12 로드 샘플 및 SO3-12 FT 샘플을 보여주는 사진이다.
도 92는 도 90에 상응하는 한쌍의 크로마토그램이다.
도 93은 HIC-20(왼쪽 그래프 및 크로마토그램) 또는 SO3-12(오른쪽 그래프 및 크로마토그램)에 대한 한쌍의 ddPCR 분석이다.
도 94는 SO3-12의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 95는 각각의 12개의 SO3 실험의 칼럼의 유형, 사용된 완충액 및 목적을 요약한 표이다.
도 96은 중간 정제 SO3-12 후에 재료의 충전:빈 비율을 결정하는 HPLC 크로마토그램이다.
도 97a-b는 SO3- 칼럼 매트릭스를 사용한 CEX에 의한 중간 연마 단계를 각각 보여주는 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 97a는 pH 3.6 SO3- 확대 크로마토그램을 보여주고, rAAV 입자를 함유하는 분획은 박스에 있다. 도 97b는 pH 3.5(E2), pH 3.6(SO3 7 E2), pH 3.8(SO3-5 E2) 및 pH 4.0(E2) 샘플의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 모든 겔은 본 샘플에서 모든 단백질 밴드를 노출시키도록 약간 과전개되었다. 더 높은 pH를 갖는 샘플에서보다 더 낮은 pH 샘플에 존재하는 오염물질이 약간 더 적다. 최적 pH는 3.6 +/- 0.1이다.
도 98a-d는 CEX 단계의 pH 최적화를 보여주는 한쌍의 크로마토그램(도 98a, c) 및 크로마토그램에 상응하는 SDS-PAGE 겔의 쌍(도 98b, d)이다. 도 98a, b는 pH 4.0에 있고, 도 98c, d는 pH 3.5에 있다.
도 99a-c는 일련의 2 주사 전자 현미경사진(도 99a-b) 및 SO3 CEX 용리물의 주사 전자 현미경(TEM) 분석을 보여주는 표(도 99c)이다. 샘플에서, AAV의 21.8%는 충전도 아니고 비지도 않았다. 청색 화살표는 충전 캡시드 AAV를 나타내고, 적색 화살표는 빈 캡시드 AAV를 나타내고, 녹색 화살표는 비확실(충전도 아니고 비지도 않음) AAV를 나타낸다.
도 100a-b는 AAV 중간 (연마) 정제 단계에서 AAV 입자 CEX의 용리를 각각 보여주는 크로마토그램 및 SDS page 겔이다. 도 100a에서, y축은 mAU에서의 흡광도를 보여주고, 500의 증분으로 0 내지 2500을 나타낸다. 세척, 용리물 및 CIP 분획은 x축에 표시되어 있다. AAV 입자를 함유하는 분획 E2 및 E3은 각각 어두운 녹색 및 밝은 녹색의 박스에 있다. 도 100b는 도 100a로부터의 용리된 분획의 순도를 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. AAV 입자를 함유하는 분획 E2를 보여주는 레인은 박스에 있다. 2X 및 10X는 각각 2배 및 10배 희석을 나타낸다.
도 101은 rAAV 충전 입자의 농후화를 위한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 공정을 요약한 표이다.
도 102는 MgCl2가 없는 완충액의 상이한 pH를 사용하여 중간 정제(SO3-12) 후 재료의 QA 용리 프로필을 도시하는 HPLC 크로마토그램이다.
도 103a-b는 pH 및 MgCl2 농도의 함수로서 충전 및 빈 피크의 해상을 각각 보여주는 크로마토그램 및 열 도표이다. 도 103a는 다양한 농도의 MgCl2에 의한 pH 9.5에서의 오버레이된 AEX QA 매트릭스 크로마토그램(A260 신호)을 보여준다. 검정색 화살표는 0 mM MgCl2를 나타내고, 오렌지색 화살표는 2 mM MgCl2를 나타내고, 청색 화살표는 1 mM MgCl2를 나타낸다. 도 103a는 충전 입자 및 빈 입자를 분리하는 능력을 예시하는 열 도표이고, pH는 하나의 축에 있고 MgCl2는 다른 축에 있다. 분리는 최소(자주색)에서 최대(백색)의 색상으로 표시된다. 최적 분리는 pH 9.0 및 0 mM MgCl2에서 보인다.
도 104a-b는 AEX를 사용한 충전 AAV 입자의 농후화를 각각 보여주는 크로마토그램 및 SDS-PAGE 겔이다. 도 104a에서, y축은 mAU 단위의 흡광도를 보여주고, 50의 증분으로 0 내지 100을 나타냈다. 분획 E2, E3, E4, E5 및 E6은 X축에 표시된다. 충전 AAV 입자를 함유하는 분획 E3은 박스에 있다. 도 104b는 도 104a로부터의 용리된 분획의 순도를 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. 충전 rAAV 입자를 함유하는 분획 QA2 E3은 박스에 있다.
도 105a-f는 2개의 크로마토그램(도 105a, d), 3개의 표(도 105b, c, f) 및 충전 입자 농후화 단계를 요약하는 SDS-PAGE 겔(도 105e)이다. 도 105a는 예시적인 AEX QA-2 크로마토그램인 반면, 도 105d는 도 105a에서의 크로마토그램의 확대이다. 도 105b는 분광측정에 의한 충전 입자 순도 예측을 요약한 표이다. E3 분획에서 보인 약 1.3의 A260:A280 비는 충전 입자의 높은 백분율을 나타낸다. 도 105c는 QA2 E2 및 E3 AEX 분획의 HPLC에 의한 충전 입자 함량 예측을 요약한 표이다. 도 105e는 QA2 AEX 로드, 용리물 및 CIP 분획을 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. 충전 AAV 입자를 함유하는 분획 E3은 박스에 있다. 도 105f는 HPLC에 의해 각각의 분획에서의 충전 입자 회수를 요약한 표이다.
도 106a-c는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 충전 AAV 입자의 농후화를 각각 보여주는 TEM 현미경사진, 및 2개의 표이다. 도 106a는 rAAV 입자를 보여주는 QA2 E3 분획의 TEM 현미경사진이다. 축적바는 200 nm을 나타낸다. 도 106b는 드랍플렛 디지털 PCR(ddPCR)에 의한 AAV 입자의 역가를 보여준다. E3 분획은 녹색 박스에 표시된다. 도 106c는 분획 AQ2E3에 대해 계수된 바이러스의 수, 백분율에 의한 충전 및 부분 입자의 퍼센트, 및 백분율에 의한 빈/손상된 입자의 예상된 수(QA2 E3라고도 칭함)를 보여준다.
도 107은 제조 공정의 각각의 단계에서의 예상된 수율을 보여주는 표이다.
도 108a-d는 샘플 S03-14 E1, QA-3(a), QA-4(b), QA-5(c) 및 QA-6(d)에 대한 ddPCR 결과를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 109는 QA-3 내지 QA-8에 대한 TEM 결과를 제공하는 차트이다. 모든 샘플은 불순물 없이 투명하고, 입자의 응집체는 샘플 SO3-14, QA-3 E3, QA-6 E3 및 QA-8 E3에서 희귀하게 보였다. 충전 및 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 모든 QA 샘플(71-77%)에서 유사하지만, SO3-14 샘플에서 더 낮았다(46%). 입자의 일부는 충전 또는 빈으로 분류되지 않았다. 바이러스의 제3 그룹이 도입되었다(비분류된). 이 그룹으로부터의 바이러스는 전체 표면에서 전자 투명이 아니고, 표면에 바로 전자 치밀 스팟을 나타냈다. 이러한 바이러스는 충전되거나, 완전히 충전되지 않거나, 정확하게 형성되지 않거나 손상될 수 있었다.
도 110은 QA-7(커패시티) 및 QA-8(정기적 조건) 하에 빈 입자 및 충전 입자의 정제의 비교를 보여주는 크로마토그램 및 상응하는 표이다.
도 111은 QA-8의 정제를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 112a-c는 ddPCR 및 HPLC E/F 결과를 제공하는 일련의 표이다. QA-7 앞으로부터 제조용 실행은 분석 칼럼(2 μm 기공을 갖는 QA-0.1 mL)을 사용하여 수행되었다.
도 113은 각각의 QA-7 및 QA-8에 대해 정제의 각각의 단계에서 발견된 단백질의 존재를 보여주는 한쌍의 SDS-page 분석이다.
도 114는 QA-8로부터의 완전 분획(E3)을 보여주는 한쌍의 TEM 현미경사진 및 상응하는 표이다.
도 115는 S03 15에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 116은 S0315의 정제를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 117a-b는 SO3 15에 대한 HPLC(A) 및 ddPCR(B) 결과를 제공하는 한쌍의 표이다.
도 118은 QA-9에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 119는 QA-9를 사용한 정제를 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 120은 QA-10에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 121은 QA-10을 사용한 정제를 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 122는 QA-11에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 123은 QA-11을 사용한 정제를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 124는 QA-12에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 125는 QA-12를 사용한 정제를 보여주는 크로마토그램이다.
도 126은 QA-9를 사용한 빈/충전 비를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 127은 QA-9를 사용한 빈/충전 비를 보여주는 크로마토그램이다.
도 128은 QA-10을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 129는 QA-10을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 크로마토그램이다.
도 130은 QA-11을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 131은 QA-11을 사용한 빈/충전 비를 보여주는 크로마토그램이다.
도 132a-c는 QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 ddPCR 및 HPLC 결과를 제공하는 일련의 표이다.
도 132d는 QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 빈/충전 비, 순도, 및 회수를 제공하는 표이다.
도 133은 제조용 실행 QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 용리 특성을 제공하는 표이다.
도 134는 제조용 실행 QA-9, QA-10 및 QA-11을 사용한 단백질 정제를 보여주는 일련의 SDS-page 분석이다.
도 135는 S03-15 E1, QA-9, QA-10 및 QA-11로부터의 정제된 바이러스의 정제 및 TEM 분석 후 바이러스 계수치, 완전 퍼센트, 빈 퍼센트 및 비분류된 퍼센트를 제공하는 표이다. 모든 샘플은 작은 응집체를 함유하였고, 대부분의 손상된 또는 완전히 형성되지 않은 바이러스로 이루어졌다. 충전 및 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 QA-10 및 QA-11 샘플(74%)에서 유사하지만, SO3-14 샘플(45%)에서 더 낮았고 샘플 QA-9 E3에서 더 높았다. 입자의 일부는 충전 또는 빈으로 분류되지 않았다. 바이러스의 제3 그룹이 도입되었다(비분류된). 이 그룹으로부터의 바이러스는 전체 표면에서 전자 투명이 아니고, 표면에 바로 전자 치밀 스팟을 나타냈다. 이러한 바이러스는 충전되고, 완전히 충전되지 않고, 정확하게 형성되지 않거나 손상될 수 있었다.
도 136은 QA-13에 대한 크로마토그래피 조건을 제공하는 표이다.
도 137은 단편화 방법을 설명하는 QA-13의 한쌍의 크로마토그램이다. 하부 크로마토그램은 상부 크로마토그램의 더 높은 확대이다.
도 138은 제형 완충액으로 TFF 교환에 대한 조건을 제공하는 표이다.
도 139는 MALS 검출기 분석과 커플링된 HPLC E/F를 보여주는 크로마토그램의 시리즈이다.
도 140은 MALS 검출기 분석과 커플링된 HPLC E/F를 보여주는 크로마토그램의 시리즈이다.
도 141은 QA-13을 사용한 바이러스 정제의 각각의 단계에 대한 빈/충전 비, 순도 및 회수 백분율을 요약한 표이다.
도 142는 각각의 샘플 S03-14, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, 및 QA-8의 조성을 요약한 표이다(도 142-156과 관련). 주사 전자 현미경검사(TEM)에 의한 분석을 위한 아데노 연관된 바이러스(AAV)의 5개의 샘플 및 하나의 추가의 샘플은 바이러스 통합성을 결정하고 충전/빈 입자 사이의 관계를 평가하기 위해 평가되었다.
도 143은 바이러스가 낮은 배율 하에 관찰될 때 그리드(S03-14)를 통해 균등하게 분포된다는 것을 보여주는 TEM 현미경사진이다. 도 143-170에 대해, 샘플을 네가티브 염색 방법을 사용하여 TEM에 의한 검사를 위해 제조하였다. 해동된 샘플을 온화하게 혼합하고, 5분 동안 새로 글로우 방전된 구리 그리드(400 메시, 포름바(formvar)-탄소 코팅됨)에 적용하고, 세척하고, 우라닐 아세테이트의 1%(w/v) 물 용액의 1 방울로 염색하였다. 2개의 그리드를 각각의 샘플에 대해 제조하였다. 그리드는 80 kV에서 조작되는 주사 전자 현미경 Philips CM 100 (FEI, 네덜란드)에 의해 관찰되었다. 적어도 10개의 그리드 정가각형은 완전히 조사되고, 여러 현미경사진(카메라 ORIUS SC 200, Gatan, Inc.)은 충전 입자와 빈 입자 사이의 비를 평가하도록 취해졌다. 현미경사진은 그리드에서 상이한 위치에서 동시에 취한다.
도 144는 샘플 SO3-14의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 작은 응집체가 존재한다(검정색 화살표). 불순물이 검출되지 않았고, 오직 적은 작은 응집체를 볼 수 있었다.
도 145는 충전도 아니고 빈/손상(흰색 화살표)도 아닌 입자를 보여주는 현미경사진이다.
도 146은 한쌍의 현미경사진은 샘플 QA3-E3에서 더 많은 응집체가 샘플 SO3-14와 비교하여 존재하고 응집체가 약간 더 높을 수 있다는 것을 보여준다. 다른 불순물이 발견될 수 없었다.
도 147은 검정색 화살표로 마킹된 빈/손상된 입자 및 흰색의 화살표로 마킹된 비분류된을 보여주는 한쌍의 현미경사진이다. 비분류된 입자는 충전 바이러스를 나타낼 수 있지만, 이들은 완전하게 보이지 않았다.
도 148은 바이러스(QA-4 E3)가 그리드에 걸쳐 균등하게 분산된다는 것을 보여주는 현미경사진이다. 불순물 또는 응집체가 발견되지 않았다.
도 149는 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-4 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다.
도 150은 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-5 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 불순물 또는 응집체가 발견되지 않았다. 빈/손상된 입자는 검정색 화살표로 마킹되고, 비분류된은 흰색의 화살표로 마킹된다. 비분류된 입자는 충전 바이러스를 나타낼 수 있지만, 이들은 완전하게 보이지 않았다.
도 151은 저배율 하에 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-5 E3의 대표적인 현미경사진을 나타낸다.
도 152는 충전, 빈 및 비분류된 입자를 보여주는 QA-6 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 불순물 또는 응집체가 발견되지 않았다. 바이러스는 균등하게 분산되고(왼쪽 현미경사진); 작은 응집체가 존재한다(오른쪽 현미경사진).
도 153은 충전/빈 비의 평가에 선택된 샘플 QA-6 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 빈/손상된 입자는 검정색 화살표로 마킹되고, 비분류된은 흰색의 화살표로 마킹된다.
도 154는 저배율 하에 관찰된 QA-8 E3 바이러스의 현미경사진이다. 샘플은 불순물이 없지만, 일부 작은 응집체를 함유하였다.
도 155는 샘플 QA-8 E3의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 작은 응집체(검정색 화살표)는 손상된 바이러스를 함유한다.
도 156은 충전 입자와 빈/손상된 입자 사이의 비를 제공하는 표이다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 동일한 배율에서 취한 선택된 현미경사진에서 입자를 계수하여 결정되었다. 샘플 SO3-14는 충전 바이러스의 46%를 함유하지만, 모든 다른 샘플은 충전 바이러스의 더 높은 그리고 보다 유사한 %(71-77%)를 함유하였다. 모든 샘플은 불순물 없이 깨끗하고, 입자의 응집체가 샘플 SO3-14, QA-3 E3, QA-6 E3 및 QA-8 E3에서 희귀하게 보였다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 모든 QA 샘플에서 유사하지만(71-77%), SO3-14 샘플에서 더 낮았다(46%).
도 157은 도 157-169에 대한 분석에 사용된 각각의 샘플의 조성물을 제공하는 표이다.
도 158은 저배율 하에 관찰된 비희석된 샘플의 S03-15 E1 바이러스를 보여주는 대표적인 TEM 현미경사진이다. 바이러스는 도처에 균일하게 분산된다. 샘플은 포지티브 염색 방법을 이용하여 TEM에 의한 검사를 위해 제조하였다. 해동된 샘플을 온화하게 혼합하고, 5분 동안 새로 글로우 방전된 구리 그리드(400 메시, 포름바-탄소 코팅됨)에 적용하고, 세척하고, 우라닐 아세테이트의 1%(w/v) 물 용액의 1 방울로 염색하였다. 2개의 그리드를 각각의 샘플에 대해 제조하였고, 하나는 비희석되고 2개는 희석된 샘플이다. 본 발명자들은 샘플을 0.1 M PB로 희석하였다. 그리드는 80 kV에서 조작되는 주사 전자 현미경 Philips CM 100(FEI, 네덜란드)에 의해 관찰되었다. 적어도 10개의 그리드 정가각형은 완전히 조사되고, 여러 현미경사진(카메라 ORIUS SC 200, Gatan, Inc.)은 충전 입자와 빈 입자 사이의 비를 평가하도록 취해졌다. 현미경사진은 그리드에서 상이한 위치에서 동시에 취한다.
도 159는 샘플 SO3-15의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 왼쪽: 비희석된 샘플; 오른쪽: 희석된 샘플. 바이러스는 그리드에 걸쳐 균등하게 분산된다.
도 160은 샘플 SO3-15의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 왼쪽: 비희석된 샘플; 오른쪽: 희석된 샘플. 바이러스는 그리드에 걸쳐 균등하게 분산되고, 적은 작은 응집체가 비희석된 채 그리고 희석된 샘플에 존재한다(흰색 화살표).
도 161은 저배율 하에 관찰된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-9 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 바이러스는 균등하게 분산되고, 바로 적은 응집체가 발견될 수 있었다. 다른 불순물이 존재하지 않았다.
도 162는 계수에 선택된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-9 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 바이러스는 균등하게 분산되고, 바로 적은 응집체가 발견될 수 있었다. 다른 불순물이 존재하지 않았다.
도 163은 QA-9 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 대부분의 바이러스는 특징적인 형상으로 충전되었다(왼쪽); 작은 응집체는 손상된 입자를 함유하였다(오른쪽).
도 164는 저배율 하에 관찰된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-10 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다. 샘플 QA-10 E3을 갖는 모든 그리드는 적절한 품질을 나타냈다. 일부 작은 응집체를 제외하고 본 발명자들은 완전히 붕괴되지 않은 바이러스를 나타내는 다른 구조를 발견하였고(도 165, 오른쪽 현미경사진); 이러한 구조는 샘플의 모든 3개의 그리드에 존재하지만, 그리드의 적은 부분에 결합하였다. 샘플 QA-10 E3은 샘플 QA-9 E3과 비교하여 더 손상된 입자를 함유하였다.
도 165는 표시된 거의 완전히 손상된 바이러스(왼쪽)에 의해 희석된 샘플 QA-10 E3의 QA-10 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다; 오른쪽 현미경사진: 가장 아마 대부분의 파괴된 바이러스.
도 166은 바이러스 계수에 선택된 비희석된 샘플 QA-10 E3의 대표적인 현미경사진이다. 21개의 현미경사진이 입자의 계수 및 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비의 계산을 위해 사용되었다.
도 167은 저배율 하에 관찰된 비희석된 샘플의 QA-11 E3 바이러스의 대표적인 현미경사진이다. 샘플 QA-11 E3은 작은 응집체를 함유하였다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 동일한 배율에서 취한 33 현미경사진에서 입자의 계수에 의해 결정된다.
도 168은 계수에 선택된 비희석된(왼쪽) 및 희석된(오론쪽) 샘플의 QA-11 E3 바이러스의 한쌍의 대표적인 현미경사진이다.
도 169는 각각의 샘플에 대해 충전 입자와 빈/손상된 입자 사이의 비를 제공하는 표이다. 동일한 배율에서 취한 선택된 현미경사진에서 입자를 계수하여 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비. 입자는 3개의 군으로 분류되었다: 함께 충전, 비분류된, 빈 및 손상된. 샘플 SO3-15 E1은 충전 바이러스의 45%를 함유하고, 샘플 QA-9 E3은 80%를 함유하고, 샘플 QA-10 E3 및 QA-11 E3은 충전/빈 비와 관련하여 유사하였다(충전 바이러스의 74%). 보든 샘플은 작은 응집체를 함유하였고, 이들은 대부분 손상되거나 완전히 형성되지 않은 바이러스로 이루어졌다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비는 QA-10 및 QA-11 샘플에서 유사하지만(74%), SO3-14 샘플에서 더 낮고(45%), 샘플 QA-9 E3에서 더 높았다. 입자의 일부는 충전 또는 빈으로 분류될 수 없어서, 제3 그룹에 비분류된"으로 넣었다. 이 그룹으로부터의 바이러스는 전체 표면에서 전자 투명이 아니고, 표면에 바로 전자 치밀 스팟을 나타냈다. 이러한 바이러스는 충전되고, 완전히 충전되지 않고, 정확하게 형성되지 않거나 손상될 수 있었다.
도 170a-b는 QA-13 및 TFF1 단계에 대한 ddPCR 및 HPLC 결과를 제공하는 한쌍의 표이다.
도 171은 TFF1의 MALS 검출기 분석과 커플링된 HPLC E/F를 제공하는 일련의 차트 및 요약 표이다.
도 172는 정제된 QA-13 바이러스의 SDS 분석이다.
도 173은 QA 및 TFF 후에 바이러스 정제를 비교하는 한쌍의 SDS 분석이다.
도 174는 공정내 한계 및 QC 시험을 포함하는 AAV8-RPGR 상류 제조 공정의 도식적 개관이다.
도 175는 세포 해동 단계의 도식적 흐름도이다.
도 176은 배지 가온에 대한 추천된 최소 가온 기간을 보여주는 표이다.
도 177은 세포 해동 공정에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 178은 세포 해동 공정에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 176은 제조 스케일의 함수로서 초기 배지 변화에 필요한 클로로퀸 및 배지의 부피를 보여주는 표이다.
도 177은 형질주입 및 수확 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 178은 예시적인 계대배양 절차의 도식적 흐름도이다.
도 179는 세포 계대배양 체계에 대한 총칭적 가이드라인을 보여주는 표이다.
도 180은 세포 계대배양에 대한 추천된 시약 부피(HBSS, 세포 해리 용액 및 성장 배지) 및 세포 시딩 밀도를 보여주는 표이다.
도 181은 해동 및 계대배양 체계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 182는 일시적인 형질주입 및 배지 수확 단계의 도식적 흐름도이다.
도 183은 제조 스케일의 함수로서 초기 배지 변화에 필요한 클로로퀸 및 배지의 부피를 보여주는 표이다.
도 184는 형질주입 및 수확 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 185는 5 x 36층 HYPERstack®에 대한 인산칼슘 매개 형질주입 용액을 생성하기 위한 가이드를 보여주는 표이다.
도 186은 여과 청징 단계의 도식적 흐름도를 보여주는 표이다.
도 187은 청징 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 188은 청징 여과 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 189는 대규모 접선 유동 여과 유닛 조작의 도식적 흐름도이다.
도 190은 대규모 접선 유동 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 191은 대규모 접선 유동 여과 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 192는 이오딕사놀 농도 유닛 조작의 도식적 흐름 차트이다.
도 193은 초기 이오딕사놀 농도 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 194는 원심분리 농도 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 195는 이오딕사놀 구배 정제 단계를 완료하는 데 필요한 단계의 도식적 흐름 차트이다.
도 196은 이오딕사놀 구배 정제 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 197은 이오딕사놀 구배 정제 단계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 198은 양이온 교환 크로마토그래피 유닛 조작의 도식적 흐름 차트이다.
도 199는 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 200은 양이온 교환 크로마토그래피 조작 조건을 보여주는 표이다.
도 201은 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 202는 소규모 접선 유동 여과 단계를 완료하는 데 필요한 단계의 도식적 흐름 차트이다.
도 203은 소규모 접선 유동 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 204는 소규모 접선 유동 여과 단계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 205는 무균 여과 및 충전 유닛 조작의 도식적 흐름 차트이다.
도 206은 무균 여과 및 충전 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 보여주는 표이다.
도 207은 무균 여과 및 충전 단계에 사용된 재료/소모품을 보여주는 표이다.
도 208은 공정내 보유 지점 및 저장 조건을 보여주는 표이다.
도 209는 용액 제조를 위한 바람직한 화학물질의 목록을 보여주는 표이다.
도 210은 실험 A에 대한 청징된 DMEM 배지에서 제형화된 샘플을 보여주는 표이다.
도 211은 실험 A에 대한 제조용 및 분석용 실행에 사용된 완충액을 보여주는 표이다.
도 212는 실험 A에서 HIC 정제에 대한 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 213은 실험 A에서 CEX 정제에 대한 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 214는 실험 A에 대해 60 칼럼 부피(CV)에서 0 내지 100% 이동상 B 및 이후 10 CV 동안 단계 내지 100% MPC로부터의 SOP 선형 구배를 보여주는 표이다.
도 215는 실험 A에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 216은 실험 A에 대한 실행 HIC-25로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승은 0.6 bar였다. 분획은 갈색의 마커로 표기된다. 주요 용리는 E1이다. 로딩 단계에서의 UV 스파이크는 공기 버블 통과 칼럼에 상응하고, 이것은 로딩 후 발생하고 샘플을 더 작은 용기로 옮기도록 중단되었다.
도 217은 실험 A에 대한 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. HIC-25에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 수확; C - 로드; D - 통과액(FT); E - 세척 1(W1); F - 세척 2(W2), G - 용리(E1); H - 세척 3(W3); I - CIP; J - 형광 신호의 오버레이. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도(mS/cm): 검정 곡선. 주요 용리(E1)는 다른 분획과 비교하여 10배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 218은 실험 A에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-25 실행의 회수를 위한 표이다.
도 219는 실험 A에 대한 HIC-25 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과이다. M - 래더. 분획 E1, W3 및 CIP는 각각 5배, 5배 및 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 220은 결합 조건에 일치하도록 제조되고 실험 A를 위해 CEX-SO3 칼럼에 로딩된 E1 HIC-OH에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 221은 실험 A로부터의 실행 SO3-16으로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 부문(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 갈색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력을 상승하지 않는다. 분획은 갈색의 마커로 표기된다. 주요 용리는 E1이다.
도 222는 실험 A로부터의 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. SO3-16에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 로드 BF; C - 로드; D - 통과액 + 세척 1(W1) (FT); E - 세척 2 (W1); F - 용리(E1); G - 세척 3(W3); H - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 100배 희석되지만, 다른 분획은 2.5배 희석 또는 5배 희석(W3 및 CIP)되었다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 223은 실험 A에 대한 제조용 실행 SO3-16에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다.
도 224는 실험 A로부터의 SO3-16 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE이다. M - 래더. 분획 E1은 5배 및 10배 희석되고, 분획 W3 및 CIP는 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 225는 실험 A에서 SO3-16으로부터 전체 용리(E1)를 AEX-QA (QA-14) 칼럼으로 로딩하기 위한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 226은 실험 A에 대한 실행 QA-14로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력이 없었다. 분획은 갈색의 마커로 표기된다. 주요 용리는 (충전 캡시드 AAV) E3이다.
도 227은 실험 A에 대해 QA-14에 대해 HPLC 분석 빈-충전 방법에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. A - SO3-16 E1; B - FT+W; C - E1; D - E2(빈 AAV 캡시드); E - E3(충전 AAV 캡시드); F - E4 (주요 충전 피크의 꼬리 부분); G - E5; H - E6, I - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도(mS/cm): 검정 곡선. 도 A, B, C, F, G, H 및 I는 동일한 스케일에 있고, D는 2배 더 큰 스케일에 있고, E는 4배 더 큰 스케일에 있다. 분획은 20배 희석(사진 A) 또는 10배 희석(사진 H), 다른 것은 5배 희석된다. 비 A260/A280은 상응하는 범위에 제시된다.
도 228은 실험 A에 대한 QA-14 E3 샘플에 대한 TFF의 실행에 의한 농축 및 완충액 교환 조건을 보여주는 표이다.
도 229는 제조용 실행 QA-14 TFF 및 실험 A로부터의 총 DSP 수율에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수의 표를 보여준다.
도 230은 실험 A에 대한 HPLC E/F 분석에 기초한 빈 및 충전 AAV 캡시드 둘 다의 순도의 표를 보여준다.
도 231은 실험 A에 대한 TEM에 의해 평가된 충전 및 빈 AAV의 비의 표를 보여준다.
도 232는 실험 A에 대한 TEM에 의해 평가된 TFF 후 QA-14로부터의 대표적인 분획을 보여준다. E3 분획(상부), E2 분획(하부).
도 233은 실험 A에 대한 QA-14 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E3은 그대로이고 5배 희석되고, 다른 것은 그대로이다. 주요 분획은 E3이다. AAV8 FULLS는 TFF 후 E3 분획이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형에 의해 표시된다.
도 234는 실험 B에 대한 청징된 DMEM 배지에서 제형화된 샘플을 보여주는 표이다.
도 235는 실험 B에 대한 제조용 및 분석적 실행에 사용된 완충액을 보여주는 표이다.
도 236은 실험 B에서 HIC 정제에 대해 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 237은 실험 B에서 CEX 정제에 대한 전용 완충액에 의한 SOP 단계 구배를 보여주는 표이다.
도 238은 실험 B에 대한 60 칼럼 부피(CV)에서의 0 내지 100% 이동상 B 및 이후 10 CV에 대한 단계 내지 100% MPC의 SOP 선형 구배를 보여주는 표이다.
도 239는 실험 B에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 240은 실험 B에 대한 실행 HIC-26으로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승은 0.5 bar이었다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 241은 실험 B에 대한 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. HIC-26에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 수확; C - 로드; D - 통과액(FT); E - 세척 1(W1); F - 세척 2(W2), G - 용리(E1); H - 세척 3(W3); I - CIP; J - 형광 신호의 오버레이. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 다른 분획과 비교하여 10배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 242는 실험 B에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-26 실행의 회수에 대한 표이다.
도 243은 실험 B로부터의 HIC-26 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과이다. M - 래더. 분획 E1, W3 및 CIP는 각각 5배, 5배 및 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 244는 실험 B를 위해 결합 조건에 일치하도록 제조되고 CEX-SO3 칼럼에 로딩된 E1 HIC-OH에 대한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 245는 실험 B로부터의 실행 SO3-17로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 실행-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력은 상승하지 않았다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 246은 실험 B로부터의 HPLC 분석에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. SO3-17에 대한 총 방법. A - 블랭크(완충액) 실행; B - 로드 BF; C - 로드; D - 통과액 + 세척 1(W1) (FT); E - 세척 2 (W1); F - 용리(E1); G - 세척 3(W3); H - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 100배 희석되는 반면- 다른 분획은 2.5 배 희석 또는 5배 희석된다(W3 및 CIP). 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 247은 실험 B에 대한 제조용 실행 SO3-17에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다.
도 248은 실험 B로부터의 SO3-17 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE이다. M - 래더. 분획 E1은 5배 및 10배 희석되고, 분획 W3 및 CIP는 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사각형으로 표시된다.
도 249는 실험 B에서 SO3-17 내지 AEX-QA (QA-15) 칼럼으로부터 전체 용리(E1)를 로딩하기 위한 제조용 실행 조건을 보여주는 표이다.
도 250은 실험 B에 대한 실행 QA-15로부터의 대표적인 크로마토그램이다. 전체 단계-로딩 단계(상기), 확대된 용리 섹션(하기). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승이 없다. 분획은 갈색 마커로 표시된다. 주요 용리(충전 캡시드 AAV)는 E3이다.
도 251은 실험 B에 대한 QA-15에 대한 HPLC 분석 빈-충전 방법에 기초한 대표적인 크로마토그램이다. A - SO3-16 E1; B - FT+W; C - E1; D - E2(빈 AAV 캡시드); E - E3(충전 AAV 캡시드); F - E4(주요 충전 피크의 꼬리 부분); G - E5; H - E6, I - CIP. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선, 다각 광 산란 검출기(MALS)는 핑크색 곡선이다. 사진 B, C, G, H 및 I는 동일한 스케일에 있다. A, D, E 및 F는 2배 더 큰 스케일에 있다. 분획은 20배 희석(사진 A) 또는 10배 희석(사진 H)되고, 다른 것은 5배 희석된다. 비 A260/A280은 상응하는 분획에 제시된다.
도 252는 실험 B에 대한 QA-15 E3 샘플에서 TFF의 실행에 의한 농축 및 완충액 교환 조건을 보여주는 표이다.
도 253은 실험 B로부터의 제조용 실행 QA-15 TFF 및 총 DSP 수율에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수의 표를 보여준다.
도 254는 실험 B에 대한 HPLC E/F 분석에 기초한 빈 및 충전 AAV 캡시드 둘 다의 순도의 표를 보여준다.
도 255는 실험 B에 대한 TEM에 의해 평가된 AAV 충전 및 빈의 비의 표를 보여준다.
도 256은 실험 B에 대해 TEM에 의해 평가된 TFF 후 QA-15로부터의 대표적인 분획을 보여준다. QA-15 E3 분획(상기); E5 분획(하기).
도 257은 실험 B에 대한 QA-15 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E3은 그대로이고, 5배 희석되고, 다른 것은 그대로이다. 주요 분획은 E3이다. AAV8 FULLS는 TFF 후 E3 분획이다. Genscript Express Plus 4-20% 겔을 사용하였다.
도 258은 실험 B로부터의 대표적인 HPLC 크로마토그램 지문 방법을 보여준다. 각각의 크로마토그래피 단계의 오버레이가 제시된다. a: HIC-OH 단계의 수확 및 주요 용리물의 오버레이. HIC 용리물은 수확과 비교하여 60배 희석된다. b: 수확 및 주요 SO3 용리물(E1)의 오버레이. SO3 용리물은 수확 재료와 비교하여 200배 희석된다. c: 수확, QA 로드 및 QA 주요 용리물(E3)의 오버레이. 로드는 수확과 비교하여 10배 희석되고 E3은 60배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다. Y축은 260 nm에서의 흡광도이다.
도 259는 ABCA4에 대한 HIC (OH) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 260a-b는 ABCA4에 대한 대표적인 HIC (OH) 크로마토그램 및 벡터 회수 분석이다. (a) 크로마토그램의 확대된 용리 섹션이 도시되어 있다. 용리 단편은 괄호로 표시된다. (b) HPLC 총 입자 분석에 의해 측정된 바대로 HIC 분획에서의 벡터 회수. 전체 단계 수율을 증가시키는 데 필요한 HIC 용리 단계 최적화.
도 261은 ABCA4에 대한 CEX(SO3) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다. 1M Tris, pH9.0의 첨가에 의해 중화된 모든 분획; 총 분획 부피의 10%가 첨가된다.
도 262a-b는 ABCA4에 대한 대표적인 CEX (SO3) 크로마토그램 및 벡터 분석 회수이다. (a)는 확대된 용리를 보여준다. (b)는 HPLC 총 입자 분석에 의해 측정된 바대로 SO3 분획에서 회수된 벡터를 보여준다.
도 263은 ABCA4에 대한 AEX (QA) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다. 1M BTP, pH 6.5의 첨가에 의해 중화된 모든 분획; 총 분획 부피의 5%가 첨가된다.
도 264a-b는 ABCA4에 대한 대표적인 AEX (QA) 크로마토그램 및 벡터 회수 분석이다. (a)는 확대된 용리를 보여주고 빈 입자 및 충전 입자는 괄호에 나타난다. (b)는 총 입자 HPLC 분석에 의해 측정된 바대로 QA 분획에서 빈 입자(상부) 및 충전 입자 (하부)의 벡터 회수를 보여준다.
도 265는 ABCA4에 대한 HPLC 분석에 기초한 (완전:빈) 입자의 순도를 보여주는 표이다. 순도 (E/F) 비의 최적 표시는 FLD 및 MALS 검출기에 의해 주어진다. 충전 AAV 입자의 대략 55%-94%의 농후화가 QA 단계에 의해 달성된다.
도 266a-b는 ABCA4에 대한 TEM에 기초한 입자 (완전:빈)의 대표적인 순도이다. (a)는 샘플 상세내용의 표를 보여준다 (b)는 이오딕사놀에 의해 정제된 샘플(AAV8Y733F)(2개의 왼쪽 패널) 및 QA 크로마토그래피에 의해 정제된 샘플(AAV8 QA-1 E3)(2개의 오른쪽 패널)을 보여준다.
도 267은 ABCA4에 대핸 SDS-PAGE 분석에 의한 대표적인 입자 정제이다.
도 268은 ABCA4에 대한 HIC 크로마토그래피 유닛 조작을 보여주는 도식적 흐름도이다.
도 269는 ABCA4에 대한 HIC 포획 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위를 보여주는 표이다.
도 270은 ABCA4에 대한 HIC 크로마토그래피 조작 매개변수를 보여주는 표이다.
도 271은 로딩, 세척, 용리 및 CIP 단계를 포함하는 ABCA4에 대한 HIC 단계의 대표적인 크로마토그램이다. 범례: 통과액(F1), 로드후 세척(W1), 로드후 세척 2(W2), 용리(E1), 용리후 세척(W3), 제자리에서의 세정(CIP).
도 272는 ABCA4에 대한 HIC 단계의 대표적인 확대된 크로마토그램이다. 범례: 로드후 세척(W1), 로드후 세척 2(W2), 용리(E1), 용리후 세척(W3), 제자리에서의 세정(CIP).
도 273은 ABCA4에 대한 HIC 완충액 조성물 및 표적 사양을 보여주는 표이다.
도 274는 ABCA4에 대해 HIC 크로마토그래피 단계에 사용되는 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 보여주는 표이다.
도 275는 ABCA4에 대한 SO3 크로마토그래피 유닛 조작을 보여주는 도식적 흐름도이다.
도 276은 ABCA4에 대한 SO3 크로마토그래피 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위 / 세트포인트를 보여주는 표이다.
도 277은 ABCA4에 대한 개별 크로마토그래피 단계 및 조작 매개변수를 보여주는 표이다.
도 278은 ABCA4에 대한 대표적인 전형적인 완전 SO3 크로마토그램 실행이다.
도 279는 ABCA4에 대한 크로마토그램의 대표적인 확대된 용리 섹션이다. 적색 직사각형은 주요 용리 피크를 마킹한다. 범례: 로드후 세척 2(W2), 용리(E1), 용리후 세척(W3), 제자리에서의 세정(CIP).
도 280은 ABCA4에 사용된 SO3 완충액 조성물을 보여주는 표이다.
도 281은 ABCA4에 대한 원심분리 농도 단계에 사용된 핵심 재료 /소모품을 보여주는 표이다.
도 282는 ABCA4에 대해 QA 크로마토그래피 유닛 조작 공정 흐름을 보여주는 도식적 흐름도이다.
도 283은 ABCA4에 대해 QA 크로마토그래피 단계에 사요된 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 보여주는 표이다.
도 284는 ABCA4에 대한 크로마토그래피와 연관된 특정 단계를 보여주는 표이다.
도 285는 ABCA4에 대한 선형 구배 용리의 대표적인 완전 QA 크로마토그램이다.
도 286은 구배 용리로 확대된 대표적인 QA 크로마토그램이다. E2 - 빈 입자. E3 - 충전 입자. E4 - 충전, 빈 및 손상된 입자의 혼합물을 함유하는 피크 꼬리.
도 287은 ABCA4에 대한 QA 완충액 조성물 및 표적 사양을 보여주는 표이다.
도 288은 ABCA4에 대한 QA 크로마토그래피 유닛 조작에 사용된 핵심 재료 /소모품을 보여주는 표이다.
도 289는 정제 AAV-ABCA4 벡터에 대한 접선 유동 여과 유닛 조작의 흐름 차트의 도식적 다이어그램이다.
도 290은 정제 AAV-ABCA4 벡터에 대한 TFF 실행에 사용될 수 있는 예시적인 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 기술한 표이다.
도 291은 정제 AAV-ABCA4 벡터에 대한 접선 유동 여과 유닛 조작에 사용될 수 있는 예시적인 재료 및 소모품을 제공하는 표이다.
도 292는 AAV-ABCA4 생성물의 제조 동안 사용될 수 있는 공정내 지점에서의 예시적인 보유 시간을 제공하는 표이다.
도 293은 완전한 ABCA4 전이유전자를 형성하기 위해 조합하는 상류 및 하류 전이유전자 구조를 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 294는 인프레임 AUG 코돈 전에 아웃 오브 프레임 AUG 코돈을 갖는 오버랩 C 서열을 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 295는 오버랩 구역 C 및 B의 예측된 2차 구조를 예시하는 도식이다.
도 296은 예시적인 오버랩하는 벡터를 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 297a-d는 ABCA4 오버랩하는 이중 벡터 시스템에 의한 형질도입 후 전이유전자 결과의 일련의 다이어그램이다. (a) 상류 및 하류 전이유전자 단일-가닥 DNA 형태. 이들은 상보성 전이유전자에서 상동성의 이들의 영역을 통해 단일-가닥 어닐링(SSA)에 의해 어닐링할 수 있고(b), 이후에 완전한 재조합된 큰 전이유전자가 생성될 수 있다(c). 약어: CDS = 코딩 서열; DSB = 이중-가닥 파괴; HR = 상동성 재조합; ITR = 역상 말단 반복부; pA = polyA 신호; SSA = 단일-가닥 어닐링; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 298은 오버랩하는 상류 및 하류 이중 벡터를 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 299는 오버랩하는 상류 및 하류 이중 벡터를 보여주는 일련의 다이어그램이다.
도 300은 이중 벡터 상류 및 하류 변이체 A, B, C, D, E, F, G 및 X를 보여주는 다이어그램이고, 이들은 도시된 AAV2/8 Y733F ABCA4 또는 AAV2/8-ABCA4에 포함될 수 있다. ABCA4의 충전 긴 또는 절두된 버전 (tABCA4)은 이중 벡터 시스템의 오버랩하는 영역에 의해 영향을 받을 수 있다.
도 301은 이중 벡터 오버랩 변이체를 보여주는 도식적 다이어그램이다. ABCA4 코딩 서열(서열 번호 11)의 뉴클레오타이드는 도시된 각각의 전이유전자에 포함된다.
도 302는 상류 전이유전자 변이체 B로부터의 뉴클레오타이드 서열의 분절을 보여주는 다이어그램이다. SwaI 부위로부터의 서열은 모든 상류 전이유전자 변이체와 일치하고, 가능한 은성 폴리 A 신호의 특징이 강조되어 있다.
도 303은 ABCA4 이중 벡터 시스템의 개발의 한쌍의 다이어그램이다. A. 유전적 요소 및 전이유전자 및 벡터 캡시드의 구조 및 용량을 포함하는 벡터 설계의 상이한 양상이 고려되고 평가된다. B. 상이한 오버랩 길이를 보유하는 이중 벡터 변이체는 2개의 전이유전자 사이에 재조합에 대해 최적 영역을 결정하도록 비교되었다. AAV = 아데노-연관된 바이러스; ABCA4 = ATP-결합 카세트 수송체 단백질 패밀리 구성원 4; Do = 하류 전이유전자 변이체; GRK1 = 인간 로돕신 키나제 프로모터; In = 인트론; ITR = 역상 말단 반복부; pA = polyA 신호; Up = 상류 전이유전자 변이체; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 304a-b는 (A) 상류 전이유전자에 의해 제공된 정방향 프라이머 결합 ABCA4 CDS 및 하류 전이유전자에서 역방향 프라이머 결합 ABCA4 CDS가 재조합된 전이유전자로부터 전사체를 증폭시키도록 사용된다는 것을 보여주는 도식적 다이어그램이다. 앰플리콘은 정확한 ABCA4 CDS가 전사체의 오버랩 영역에 걸쳐 함유된다는 것을 확인하도록 시퀀싱되었다. (B) 예측된 GRK1 전사 출발 부위(TSS)의 하류에 정방향 프라이머 결합 및 상류 ABCA4 CDS 내에 역방향 프라이머 결합은 이중 벡터 C 주사된 눈 및 이중 벡터 5'C 주사된 눈으로부터 전사체 형태를 평가하도록 사용되었다.
도 305는 ABCA4 상류 서열의 발현을 유도하도록 사용될 수 있는 프로모터 및 추가의 서열의 다이어그램이다. RK = GRK1 프로모터, IntEx = 인트론 및 엑손 서열, CMV = 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서; CBA = 닭 베타 액틴 프로모터; SA/SD = 스플라이스 억셉터 및 스플라이스 도너
도 306은 ABCA4 상류 서열 또는 GFP를 발현하도록 사용된 AAV 벡터의 다이어그램이다. ITR = 역상 말단 반복부, WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소, GFP = 녹색 형광 단백질, IntEx = 인트론 및 엑손 서열, CBA = 닭 베타 액틴 프로모터, CMV = 사이토메갈로바이러스 인핸서, RK = 로돕신 키나제 프로모터(GRK1 프로모터), RBG = 토끼 베타 글로빈, SA/SD = 스플라이스 억셉터 및 스플라이스 도너 서열.
도 307은 CMVCBA.In.GFP.pA 벡터(서열 번호 17)의 서열이다.
도 308은 CMVCBA.GFP.pA 벡터(서열 번호 18)의 서열이다.
도 309는 CBA.IntEx.GFP.pA 벡터(서열 번호 19)의 서열이다.
도 310은 CAG.GFP.pA 벡터(서열 번호 20)의 서열이다.
도 311은 AAV.5'CMVCBA.In.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 21)의 서열이다.
도 312는 AAV.5'CMVCBA.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 22)의 서열이다.
도 313은 AAV.5'CBA.IntEx.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 23)의 서열이다.
도 314는 본 개시내용의 예시적인 ABCA4 발현 작제물을 도시하는 일련의 도식적 다이어그램이다.
도 315는 5' ITR을 암호화하는 서열 (서열 번호 27), RK 프로모터를 암호화하는 서열(서열 번호 28), 토끼 베타-글로빈(RBG) 인트론/엑손 (Int/Ex)을 암호화하는 서열(서열 번호 39), ABCA4 유전자의 코딩 서열의 5' 부분을 암호화하는 서열(서열 번호 29), 및 3' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 30)을 포함하는 pAAV.RK.5'ABCA4.kan(서열 번호 26)의 ITR 부분에 대한 ITR의 서열이다.
도 316은 5' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 27), ABCA4 유전자의 코딩 서열의 3' 부분을 암호화하는 서열(서열 번호 31), WPRE를 암호화하는 서열(서열 번호 32), bGH polyA를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 33)을 포함하는 pAAV.3'ABCA4.WPRE.kan(서열 번호 30)의 ITR 부분에 대한 ITR의 서열이다.
도 317a-c는 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 의해 암호화된 전이유전자의 단일 가닥 센스 및 안티센스 DNA(ssDNA)로의 전환, 및 AAV 바이러스 입자에서의 ssDNA의 캡시드화를 보여주는 일련의 사진이다.
도 318a-d는 핵에 의해 센스 및 안티센스 ssDNA를 함유하는 AAV 바이러스 입자의 흡수(A), 바이러스 입자로부터의 센스 및 안티센스 가닥의 방출(B), dsDNA를 생성하기 위한 상보성 가닥의 합성(C) 및 전이유전자의 전사(D)를 보여주는 일련의 사진이다.
도 319a-h는 단일 가닥 어닐링 및 제2 가닥 합성을 통해 AAV 이중 벡터 시스템에서 큰 전이유전자의 캡시드화, 형질도입 및 개형을 도시하는 일련의 사진이다. 큰 전이유전자는 초기에 dsDNA(A-B)로서 코딩된다. 후속하여, 큰 전이유전자의 오버랩하는 5' 및 3' 단편의 ssDNA는 AAV 바이러스 입자(C)에 의해 캡시드화된다. 큰 전이유전자의 5' 및 3' 단편의 상보성 가닥을 포함하는 바이러스 입자가 생성되고, 이 ssDNA는 상보성의 영역, 오버랩하는 서열(적색으로 도시)을 포함한다. 이 실시예에서, 5' 단편의 안티센스 ssDNA 및 3'의 센스 가닥이 도시되어 있다. ssDNA를 포함하는 AAV 입자는 형질도입되고(D), ssDNA는 바이러스 입자로부터 핵으로 방출된다(E). 5' 및 3' 단편은 핵 환경에서 상보성, 오버랩하는 서열에서 혼성화하고(F), 전체 큰 전이유전자의 dsDNA는 제2 가닥 합성을 통해 생성되고(G), 이 dsDNA는 후속하여 전사되고 전이유전자 발현된다(H).
도 320은 본 개시내용의 ABCA4 오버랩하는 이중 벡터 시스템의 아웃라인다. 아데노-연관된 바이러스(AAV) 전이유전자의 요소는 2개의 독립 전이유전자 "상류" 및 "하류"에 걸쳐 분할된다. 상류 전이유전자는 ABCA4 코딩 서열의 프로모터 및 상류 단편을 함유하는 반면, 하류 전이유전자는 ABCA4 코딩 서열의 하류 단편과 WPRE 및 소 성장 호르몬(BGH) pA 신호를 함유하였다. 도시된 최적화된 오버랩하는 이중 벡터 시스템에서, 전이유전자 둘 다는 ABCA4 코딩 서열 염기 3,494-3,701로부터 형성된 오버랩의 207bp 영역을 함유하였다. 동일한 숙주 세포 핵 내부에 있으면, 2개의 전이유전자가 오버랩의 영역을 통해 정렬하고 재조합한다. ABCA4 = ATP-결합 카세트 수송체 단백질 패밀리 구성원 4; GRK1 = 인간 로돕신 키나제 프로모터; In = 인트론; ITR = 역상 말단 반복부; pA = polyA 신호; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 321은 시험된 이중 벡터 조합에 대한 전이유전자 상세내용을 보여주는 표이다. 최종 열은 최적화된 오버랩하는 이중 벡터 시스템에 대한 상세내용을 함유한다. ABCA4 = ATP-결합 카세트 수송체 단백질 패밀리 구성원 4; bp = 염기쌍; CDS = 코딩 DNA 서열; GRK1 = 인간 로돕신 키나제 프로모터; pA = polyA 신호; WPRE = 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소.
도 322는 AAV-ABCA4, 상류 및/또는 하류 벡터에 대한 제조 공정의 하류 및 충전 및 종료 단계의 개관을 도시하는 도식적 다이어그램이다.
도 323a-b는 대표적인 최적화된 HIC 크로마토그램이다. 최적화된 피크 절단 주석(1.02M 완충액) 및 비최적화된 피크 절단 주석(1.08M 완충액) 둘 다가 도시되어 있다. 핵심: W2 = 로드후 세척 2, E1= 용리 분획, W3 = 용리후 완충액.
도 324a-b는 대표적인 최적화된 CEX 크로마토그램이다. 최적화된 피크 절단 주석(1.33M 완충액) 및 비최적화된 피크 절단 주석(1.3M 완충액) 둘 다가 도시되어 있다. 핵심: W2 = 로드후 세척 2, E1= 용리 분획, W3 = 용리후 완충액.
도 325a-c는 각각 HIC, CEX, 및 QA 단계에 대한 크로마토그램에 걸친 일련의 대표적인 최적화된 조건 실행이다.
도 326은 최적화 공정에 대한 단계 회수를 기술하는 표이다.
도 327a는 MALS에 의한 QA 분리에 대한 충전:빈 AAV 결과를 기술하는 표이다. 도 327b는 MALS 및 TEM.에 의한 QA 분리에 대한 충전:빈 AAV 결과를 기술하는 표이다.
도 328a-d는 AAV-RPGR 이중 벡터에 대해 4개의 확증적인 형질주입 및 정제 실행으로부터의 데이터를 제공하는 개념 증명 표 및 일련의 3개의 그래프이지만, 형질주입 및 정제 실행은 ABCA4를 포함하는 임의의 전이유전자와 사용될 수 있다. 초기 스코핑 연구의 결과로부터 후에 4개의 형질주입 조건(A)이 평가되었다. 벡터 입자(캡시드 ELISA)의 수 및 게놈 인서트(게놈 역가)를 함유하는 입자의 수는 각각의 조건(B)에 대해 정량화되었다.
도 329a-b는 AAV-RPGR에 대한 충전:빈 비를 평가하기 위한 직각 방법의 정량화를 도시하는 개념 증명 그래프(A) 및 표(B)이다, 그러나, 충전:빈 비를 평가하는 직각 방법은 ABCA4를 포함하는 임의의 전이유전자와 사용될 수 있다. 도 328에 제시된 충전 입자 분석은 실제 값을 과소평가할 수 있지만, 경향은 타당하다. 따라서, 4개의 조건으로부터의 샘플은 직각 방법에 의해 추가로 측정되었다. 직각 방법으로부터의 결과는 충전 입자 분석으로부터 보인 경향을 반영하였다(도 328). 상이한 형질주입제(CaPO4)로 생성된 재료로부터의 더 이전의 결과에 의한 비교는 형질주입제의 선택이 충전 대 빈 입자의 비에 효과를 또한 가질 수 있다는 것을 제안한다.
도 330은 AAV 완전:빈 벡터 비에 대한 형질주입 시약(PEI 대 CaPO4)의 효과를 도시하는 그래프이다. PEI 대 CaPO4 비교 형질주입 연구는 HPLC를 사용하여 완전:빈 벡터 비에 대해 분석된 재료를 생성하였다. 이전의 분석에서처럼, 재료는 충전 입자에 농후화하는 공정 단계를 통하지 않았다. 2의 형질주입 조건 사이에 일정하게 유지된 이전의 가변적인 조건은 총 DNA, PEI/DNA 비 및 형질주입 플라스미드의 비였다. 2의 형질주입 시약의 각각에 대해, 왼쪽 막대는 FLD이고, 오른쪽 막대는 MALS이다.
도 331은 5' ITR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 42), 3'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 176-3509, 서열 번호 43), WPRE를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 3516-4108, 서열 번호 44), BGH polyA를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4115-4278, 서열 번호 45) 및 3' IR을 암호화하는 서열(AAV 유래 ITR, 뉴클레오타이드 4422-4542, 서열 번호 46)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbIR.3'ABCA4.WPRE.kan(서열 번호 41)의 주석화된 서열이다. 소정의 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 3'ABCA4-암호화 서열은 뉴클레오타이드 181-3509를 포함하거나 이것으로 이루어지고, WPRE는 뉴클레오타이드 3522-4110을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 그리고/또는 BGH polyA는 뉴클레오타이드 4115-4383을 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 332는 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 48), CBA 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 190-467, 서열 번호 49), 인트론을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 468-590, 서열 번호 50), 엑손을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 591-630, 서열 번호 51), 5'ABCA4 (뉴클레오타이드 650-4351, 서열 번호 52) 및 3' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 4389-4509, 서열 번호 53)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.CBA.InEx.5'ABCA4.kan(서열 번호 47)의 주석화된 서열이다. 소정의 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CBA 프로모터는 뉴클레오타이드 186-468을 포함하거나 이것으로 이루어지고, InEx는 뉴클레오타이드 469-643을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 5'ABCA4는 뉴클레오타이드 650-4350을 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 333은 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 55), CBA 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 190-467, 서열 번호 56), RGB 인트론을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 704-876, 서열 번호 57), 5'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 919-4620, 서열 번호 58) 및 3' IR을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4667-4788, 서열 번호 59)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.CBA.RBG.5'ABCA4.kan(서열 번호 54)의 주석화된 서열이다. 소정의 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CBA는 뉴클레오타이드 186-468을 포함하거나 이것으로 이루어지고, RGB는 뉴클레오타이드 469-881을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 5'ABCA4는 뉴클레오타이드 919-4619을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 3' ITR은 뉴클레오타이드 4658-4778을 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 334는 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래된 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 61), CMV 인핸서를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 322-556, 서열 번호 62), CBA 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 571-849, 서열 번호 63), 5'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 856-4557, 서열 번호 64) 및 3' IR을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4667-4788, 서열 번호 65)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.CMV.CBA.5'ABCA4.kan(서열 번호 60)의 주석화된 서열이다. 일부 실시형태에서, ITR은 뉴클레오타이드 1-130을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CMV 서열은 뉴클레오타이드 186-568을 포함하거나 이것으로 이루어지고, CBA 서열은 뉴클레오타이드 569-849를 포함하거나 이것으로 이루어지고, 5'ABCA4는 뉴클레오타이드 556-4556을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 3' ITR은 뉴클레오타이드 4595-4715를 포함하거나 이것으로 이루어진다. IR = ITR.
도 335는 5' IR을 암호화하는 서열(AAV2 유래 ITR, 뉴클레오타이드 16-130, 서열 번호 67), RK 프로모터를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 186-384, 서열 번호 68), 5'ABCA4를 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 576-4267, 서열 번호 69) 및 3' IR을 암호화하는 서열(뉴클레오타이드 4275-4425, 서열 번호 70)을 포함하는 예시적인 플라스미드 pAAV.stbITR.RK.5'ABCA4.kan(서열 번호 66)의 주석된 서열이다.
도 336은 ABCA4 HIC(도 336a), CEX(도 336B) 및 AEX(도 336C) 제조용 실행, 및 분석 실행(도 336D)에 대한 완충액의 설명을 제공한다.
도 337은 ABCA4 제조용 실행에 대한 HIC 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 338은 ABCA4 제조용 실행에 대한 CEX (SO3) 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 339는 ABCA4 제조용 실행에 대한 AEX 크로마토그래피 조건을 보여주는 표이다.
도 340은 OH 칼럼 HPLC 분석 방법을 이용한 HIC에 대한 포획 단계에 대한 조건을 보여주는 표이다. 제조용 실행을 위해, 청징된 수확 재료(1.2 L - 각각 0.6 L를 함유하는 2개의 병으로 나뉨)를 실온에서 해동하고 혼주하고 희석 완충액으로 1:1(1.2 L 수확 + 1.2 L 완충액) 희석하였다. 5 CV/분에서 시스템 펌프를 사용하여 칼럼에 로딩하였다. Tech 이동 실행은 HIC 조건 (HIC-8에 대해 여덟(8) 실행이었다.
도 341a 및 341b는 전체 실행-로딩 단계(도 341a) 및 확대된 용리 섹션(도 341b)에 의한 실행 HIC-8로부터의 크로마토그램이다. 1000에서 도 341a에 대해, 상부 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 다음 선 아래는 전도도이고, 다음 라인 아래는 280 nm에서의 UV 검출이고, 가장 낮은 선은 압력이다. 약 2400에서 도 341b에 대해, 가장 높은 피크는 280 nm에서의 UV 검출이고, 제2의 가장 높은 피크는 260 nm에서의 UV 검출이고, 가장 낮은 선은 전도도이다. 로딩 동안 압력 상승은 0.3 bar이었다. 분획은 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 342a-j는 HIC-8에 대한 HPLC 분석 - 총 방법에 기초한 크로마토그램을 보여준다. 도 342a - 블랭크(완충액) 실행; 도 342b - 수확; 도 342c - 로드; 도 342d - 통과액(FT); 도 342e - 세척 1(W1); 도 342f - 세척 2(W2); 도 342g - 용리(E1); 도 342h - 세척 3(W3); 도 342i - CIP; 도 342j - 형광 및 MALS 신호의 오버레이. 도 342a-i의 각각의 그래프, x축은 보유 시간(분)을 보여주고, y축은 흡광도, 전도도 및 광 산란을 보여준다. y축의 중간 근처에 생기는 선은 형광(Ex 280nm, EM 348nm)이다; y축의 하부 근처에 생기는 2개의 선은 260 nm에서의 280 nm 및 280 nm에서의 280 nm이고; 약 10분 보유 시간이 피크인 선은 전도도(mS/cm)이다. 주요 용리(E1)는 다른 분획과 비교하여 10배 희석된다. 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 343은 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-8 실행의 회수를 보여주는 표이다.
도 344는 HIC-8 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 패더. 분획 E1, W3 및 CIP는 각각 5배, 5배 및 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 E1 5x dill에서 직사각형으로 표시된다. 레인. 모든 분획은 탈염되고, 환원 조건 하에 희석되어 겔에 로딩되었다.
도 345는 CIM SO3 칼럼을 사용하여 CEX에서 중간 연마에 대한 조건을 보여주는 표이다. 제조용 실행을 위해, HIC-OH로부터의 전체 용리(E1)는 결합 조건에 일치하도록 제조되고 CEX-SO3 칼럼에 로딩되었다. 실행은 CEX 조건(SO3-7)에 대해 7번째 실행이었다.
도 346a 및 346b는 실행 SO3-7로부터의 크로마토그램을 보여준다. 전체 실행-로딩 단계(도 346a), 확대된 용리 섹션(도 346b). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이고, 어두운 녹색 선은 압력이다. 로딩 동안 압력 상승이 없었다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리는 E1이다.
도 347a-j는 SO3-7에 대한 HPLC 분석-총 방법에 기초한 크로마토그램이다. 도 347a - 블랭크(완충액) 실행; 도 347b - 로드 BF; 도 347c - 로드; 도 347d - 통과액 + 세척 1(FT+W1); 도 347e - 세척 2(W2); 도 347f - 용리(E1); 도 347g - 세척 3(W3); 도 347h - CIP; 도 347i - 형광 신호의 오버레이; 도 347j - MALS 신호의 오버레이. 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선. 주요 용리(E1)는 5배 희석되는 반면, 다른 분획은 희석되지 않는다 모든 크로마토그램은 동일한 스케일에 있다.
도 348은 제조용 실행 SO3-7에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다. 출발 HIC-8 E1 재료와 비교하여 중간 연마 단계 CEX-SO3에 대한 회수는 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS)에 대해 90% 및 86%였다. 2의 방법 사이의 불일치가 적었다. HPLC 분석의 경우에, 질량 균형은 100%가 아니다. 2(ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS) 결과의 정규화는 주요 분획에서 AAV의 평균 97% 회수로 더 정확한 값을 제공하였다.
도 349는 SO3-7 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E1은 5배 및 10배 희석되고, 분획 W3 및 CIP는 2배 희석된다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 직사각형으로 표시된다.
도 350은 CIM QA 칼럼을 사용한 AEX에 대한 빈 및 충전 AAV 캡시드 분리에 대한 조건을 보여주는 표이다. 제조용 실행 동안, SO3-7로부터의 전체 용리(E1)는 결합 조건에 일치하도록 희석되고, AEX-QA 칼럼에 로딩되었다. 실행은 AEX 조건에 대한 제3 실행(QA-3)이다.
도 351a 및 351b는 실행 QA-3으로부터의 크로마토그램을 보여준다. 전체 실행-로딩 단계(도 351a), 확대된 용리 섹션(도 351b). 범례: 청색 선은 280 nm에서의 UV 검출이고, 적색 선은 260 nm에서의 UV 검출이고, 갈색 선은 전도도이다. 로딩 동안 압력 상승이 없었다. 분획은 갈색의 마커로 표시된다. 주요 용리 (충전 캡시드 AAV)는 E3이다.
도 352a-h는 QA-3에 대해 HPLC 분석-빈 충전 방법에 기초한 크로마토그램을 보여준다. 도 352a - SO3-7 E1; 도 352b - FT+W; 도 352c - E1; 도 352d - E2(빈 AAV 캡시드); 도 352e - E3(충전 AAV 캡시드); 도 352f - E4(주요 충전 피크의 꼬리 부분); 도 352g - E5; 도 352h - E6, 도 352i - CIP, 도 352j - MALS 신호의 오버레이. 범례: 범례: 형광(Ex 280nm, EM 348nm): 녹색 곡선, 260 nm에서의 흡광도: 적색 곡선, 280 nm에서의 흡광도: 청색 곡선, 전도도 (mS/cm): 검정색 곡선, 다각 광 산란 검출기(MALS)는 핑크색 곡선이다. B, C, D, F 및 G는 동일한 스케일에 있다. A 및 E는 각각 3배 및 8배 더 큰 스케일에 있다. 분획은 20배 희석(사진 I) 또는 10배 희석(사진E 및 H)되고, 다른 것은 5배 희석된다. A260/A280의 비는 상응하는 분획에 제시된다.
도 353은 QA-3 E3 샘플에서 투석을 사용한 완충액 교환을 달성하기 위한 조건을 보여주는 표이다. 샘플의 말단 부피는 3 mL이다.
도 354a-c는 제조용 실행 A-3(도 354a), 게놈 DSP 수율(도 354b), 및 정규화된 DSP 수율(도 354c)에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수를 보여주는 표이다.
도 355는 HPLC E/F 분석에 기초한 순도(빈 AAV 캡시드와 충전 AAV 캡시드 사이의 비)를 보여주는 표이다.
도 356은 희석된 및 비희석된 QA-15에서 그리고 TFF 샘플 후 TEM에 의해 평가된 충전 및 빈 AAV 캡시드의 비를 보여주는 표이다.
도 357은 TEM에 의해 평가된 SO3-7 E1(상부 열), QA-3 E3(중간 열) 및 투석 후(하부 열)의 현미경사진을 제공한다. 왼쪽: 저배율, 오른쪽: 계수에 사용되 배율.
도 358은 QA-3 실행에 대한 은-염색된 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M - 래더. 분획 E3은 그대로이고 5배 희석되고, CIP(2배) 이외의 다른 것은 그대로이다. 주요 분획은 E3이다. AAV8-PD는 투석 후 E3 분획이다. Biorad TGX 4-20% 겔을 사용하였다, 은 염색 절차.
도 359a 및 b는 HPLC 크로마토그램 - 지문 방법을 보여준다. 각각의 크로마토그래피 단계의 오버레이가 제시된다. 도 359a: A260 신호의 오버레이, 도 359b: 오직 더 큰 입자를 나타내는 MALS 신호의 오버레이, 그리고 이것은 단백질에 의해 영향을 받지 않고, 따라서, E/F의 더 양호한 해상이 얻어진다. 분획은 유사한 반응을 갖도록 부분적으로 희석되었다.
상세한 설명
본 개시내용은 포유류 숙주 세포 배양물로부터 재조합 AAV(rAAV) 입자를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 성장 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 단계이되, 복수의 포유류 숙주 세포는 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포를 제조하도록 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질주입되는 단계; (b) 복수의 rAAV 입자, 바이러스 방출 용액 및 수확 배지를 포함하는 조성물을 제조하도록 수확 배지로의 rAAV 입자의 방출에 적합한 조건 하에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포 및 바이러스 방출 용액을 접촉시키는 단계; (c) 복수의 rAAV 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 (b)의 조성물로부터의 복수의 rAAV 입자를 정제하는 단계; (d) 복수의 rAAV 입자를 포함하는 CEX 용리물을 제조하도록 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 통해 (b)의 HIC 용리물로부터 복수의 rAAV 바이러스 입자를 정제하는 단계; (e) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물을 제조하도록 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피에 의해 (d)의 CEX 용리물로부터 복수의 충전 rAAV 입자를 단리하는 단계; 및 (f) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자 및 최종 제형 완충액을 포함하는 최종 조성물을 제조하도록 접선 유동 여과(TFF)에 의해 최종 제형 완충액으로 (e)의 AEX 용리물을 정용여과하고 농축시키는 단게를 포함한다.
본 개시내용은 추가로 재조합 AAV(rAAV) 입자를 제조하는 방법에 관한 것이고, (a) 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포를 제조하도록 복수의 포유류 숙주 세포를 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질주입하는 단계이되, 세포는 형질주입 시약으로서 PEI를 사용하여 형질주입되고, 세포는 특정 비율의 플라스미드 벡터에서 PEI 및 벡터와 접촉하는 단계를 포함한다.
AAV-RPGR
본 개시내용은 본 개시내용의 방법을 사용하여 제조된 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 벡터 게놈(vg)/mL 내지 1 x 1013 vg/mL의 복제-결핍 및 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV), (b) 50% 미만의 빈 캡시드; 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 기능적 벡터 게놈의 각각은 형질도입 후 세포에서 RPGRORF15 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 벡터 게놈(vg)/mL 내지 1 x 1013 vg/mL의 복제-결핍 및 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV), (b) 30% 미만의 빈 캡시드; 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 기능적 벡터 게놈의 각각은 형질도입 후 세포에서 RPGRORF15 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 벡터 게놈(vg)/mL 내지 1 x 1013 vg/mL의 복제-결핍 및 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV), (b) 99% 미만, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 또는 빈 캡시드의 사이의 임의의 백분율; 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 기능적 벡터 게놈의 각각은 형질도입 후 세포에서 RPGRORF15 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물에 의한 세포의 형질도입 후, RPGRORF15 서열은 RPGRORF15 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15 서열에 의해 암호화된 단백질은 비형질도입된 세포의 상응하는 서열에 의해 암호화된 RPGRORF15의 활성 수준과 동일하거나 높은 활성 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 외인성 RPGRORF15 서열 및 상응하는 내인성 RPGRORF15 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 외인성 RPGRORF15 서열 및 상응하는 내인성 RPGRORF15 서열은 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 외인성 RPGRORF15 서열 및 상응하는 내인성 RPGRORF15 서열은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함), (b) 적어도 70% 충전 캡시드 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 기능적 벡터 게놈의 각각은 형질도입 후 세포에서 RPGRORF15 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함), (b) 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%, 또는 충전 캡시드 사이의 임의의 백분율 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 기능적 벡터 게놈의 각각은 형질도입 후 세포에서 RPGRORF15 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 0.5 x1011 vg/mL를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 1 x1012 vg/mL를 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 포유류, 및 바람직하게는 인간에 전신 또는 국소 투여에 적합한 치료학적 RPGRORF15 작제물을 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 RPGRORF15 작제물은 RPGRORF15를 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 RPGRORF15 작제물은 인간 RPGRORF15를 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 RPGRORF15 작제물은 유전자 또는 이의 일부의 발현이 가능하게 하거나 향상시키는 조절 요소를 암호화하는 하나 이상의 서열(들)을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 조절 요소는 프로모터, 인트론, 인핸서 요소, 반응 요소(전사후 반응 요소 또는 전사후 조절 요소를 포함), 폴리아데노신(polyA) 서열, 및 전사의 효율적인 종결을 촉진하는 유전자 단편(β-글로빈 유전자 단편 및 토끼 β-글로빈 유전자 단편을 포함)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, RPGRORF15 작제물은 인간 망막색소변성증 GTPase 조절자(RPGR) 단백질 또는 이의 일부에 상응하는 인간 유전자 또는 이의 일부를 포함한다. 인간 RPGR은 다수의 스플라이싱된 동형단백질을 포함한다. 동형단백질 ORF15 RPGR(RPGRORF15)은 광수용체에 국소화한다. 일부 실시형태에서, RPGR 단백질은 RPGRORF15이다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15 작제물은 코돈-최적화된 서열을 포함하는 인간 유전자 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열은 포유류에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 생성물은 RPGRORF15의 cDNA를 암호화하는 정제된 재조합 혈청형 2(rAAV)로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 AAV2 5' 역상 말단 반복부(ITR), 199 bp GRK1 프로모터, 3459 bp 인간 RPGRORF15 cDNA, 270 bp 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH-polyA), 및 AAV2 3' ITR, 및 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다.
일부 실시형태에서, RPGRORF15 작제물은 RPGROR15를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은 인간 RPGRORF15 서열이다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은
의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 99% 동일성하거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. RPGRORF15는 상류 바로에 3'-말단 및 스플라이스 부위에서 고도로 반복적인 퓨린-농후 영역을 함유하고, 이는 AAV.RPGR 벡터를 클로닝하는 데 상당한 도전과제를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 코돈 최적화는 RPGRORF15 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 RPGRORF15 전사체에서 내인성 스플라이스 부위를 망가뜨리고 퓨린-농후 서열을 안정화시키도록 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 번역 후 변형, 예컨대 RPGR 단백질의 글루타밀화는 코돈-최적화 후 보존된다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15 뉴클레오타이드 서열은 포유류에서의 발현에 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, RPGRORF15 뉴클레오타이드 서열은 인간에서의 발현에 코돈 최적화된다.
일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 3459 bp 인간 RPGRORF15 cDNA는
의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70% 동일성, 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 99% 동일성 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 3459 bp 인간 RPGRORF15 cDNA는
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, RPGRORF15 작제물은 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 로돕신 키나제 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 로돕신 키나제 프로모터는 G 단백질-커플링된 수용체 키나제 1(GRK1) 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 GRK1 프로모터이다. 일부 실시형태에서, GRK1 프로모터를 암호화하는 서열은
과 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GRK1 프로모터는
를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, RPGRORF15 작제물은 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 신호를 암호화하는 서열은 소 성장 호르몬(BGH) polyA 신호로부터 단리되거나 유래된 polyA 신호를 포함한다. 일부 실시형태에서, BGH polyA 신호는
의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, BGH polyA를 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, RPGRORF15 작제물은 5' 역상 말단 반복부(ITR)에 상응하는 서열 및 3' 역상 말단 반복부(ITR)에 상응하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 아데노-연관된 바이러스 벡터(AAV2)로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 야생형 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 절두된 야생형 AAV2 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 야생형 AAV2 서열과 비교할 때 변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이는 치환, 삽입, 결실, 역위 또는 전위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이는 야생형 또는 변이체 서열의 절두 또는 연장을 포함한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV는 5' 역상 말단 반복부(ITR)에 상응하는 서열 및 3' 역상 말단 반복부(ITR)에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 아데노-연관된 바이러스 벡터(AAV2)로부터 단리되거나 유래된다 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 야생형 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 절두된 야생형 AAV2 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 야생형 AAV2 서열과 비교할 때 변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이는 치환, 삽입, 결실, 역위, 또는 전위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이는 야생형 또는 변이체 서열의 절두 또는 연장을 포함한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV는 복제-결핍 AAV의 형성에 필수적인 바이러스 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 서열은 5' ITR을 암호화하는 서열 또는 3' ITR을 암호화하는 서열 중 하나 또는 둘 다와 동일한 혈청형의 AAV로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 서열, 5' ITR을 암호화하는 서열 또는 3' ITR을 암호화하는 서열은 AAV2로부터 단리되거나 유래된다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV는 복제-결핍 AAV, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열의 형성에 필수적인 바이러스 서열을 포함하지만, AAV로부터 단리되거나 유래된 임의의 다른 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, AAV는 복제-결핍 AAV, 5' ITR을 암호화하는 서열, 3' ITR을 암호화하는 서열, 및 본 개시내용의 RPGRORF15 작제물을 암호화하는 서열의 형성에 필수적인 바이러스 서열을 포함하는 재조합 AAV(rAAV)이다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포에서 rAAV를 생성하기 위해 사용된 플라스미드 DNA는 선별 마커를 포함한다. 예시적인 선별 마커는 항생제 내성 유전자를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 예시적인 항생제 내성 유전자는 암피실린 및 카나마이신을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 선별 마커는 약물 또는 소분자 내성 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 선별 마커는 dapD 발현을 제어하거나 억제하는 비제한적인 예로서 lacO/P 작제물을 포함하는 dapD 및 억제성 오퍼레이터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 플라스미드 선택은 형질전환된 세포를 투여하거나 억제성 오퍼레이터 적정(ORT)이 가능한 플라스미드와 접촉시켜 수행된다. 예시적인 선별 마커는 ccd 선택 유전자를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, ccd 선택 유전자는 독성 ccdB 유전자를 발현하도록 조작된 숙주 세포주를 구제하는 ccdA 선택 유전자를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 선별 마커는 sacB를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않고, 여기서 RNA는 수크로스 배지에서 sacB 유전자의 발현을 억제하도록 투여되거나 숙주 세포와 접촉된다. 예시적인 선별 마커는 분리적 사멸 기전, 예컨대 Hok(숙주 사멸 유전자) 및 Sok(사멸의 억제)로 이루어진 parAB+ 유전좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
AAV-RPGR 작제물 구조
AAV-RPGRORF15 작제물 생성물은 치료학적 작제물을 암호화하는 cDNA를 암호화하는 정제된 재조합 혈청형 2 아데노-연관된 바이러스 벡터(rAAV)로 이루어진다.
일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 작제물은 혈청형 8 아데노-연관된 바이러스 벡터(AAV8)로부터 단리되고/되거나 유래된 5' ITR을 암호화하는 서열, 3' ITR을 암호화하는 서열 및 캡시드 단백질을 암호화하는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 작제물은 혈청형 8 아데노-연관된 바이러스 벡터(AAV8)로부터 단리되고/되거나 유래된 5' ITR을 암호화하는 서열, 3' ITR을 암호화하는 서열 및 캡시드 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 작제물은 혈청형 2 아데노-연관된 바이러스 벡터(AAV2)로부터 단리되고/되거나 유래된 절두된 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열 및 혈청형 8 아데노-연관된 바이러스 벡터(AAV8)로부터 단리되고/되거나 유래된 캡시드 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV-작제물은 야생형 AAV2 ITR(야생형 5' ITR 및 야생형 3' ITR)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 (a) 5' 역상 말단 반복부(ITR), (b) 포유류 세포에서의 발현에 적합한 프로모터, (c) RPGRORF15를 암호화하는 cDNA, 및 (d) 3' ITR을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열(과 각각의 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 부위)을 함유한다.
일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 (a) 5' 역상 말단 반복부(ITR), (b) 포유류 세포에서의 발현에 적합한 프로모터, (c) RPGRORF15를 암호화하는 cDNA, (c) 폴리아데닐화 신호, 및 (d) bp 3' ITR을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열(과 각각의 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 부위)을 함유한다.
일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 (a) 5' 역상 말단 반복부(ITR), (b) 포유류 세포에서의 발현에 적합한 프로모터, (c) RPGRORF15를 암호화하는 cDNA, (d) 전사후 조절 요소(PRE), (e) 폴리아데닐화 서열(polyA), 및 (f) 3' ITR을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열(과 각각의 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 부위)을 함유한다.
일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 (a) 5' 역상 말단 반복부(ITR), (b) 프로모터, 선택적으로, 199 bp GRK1 프로모터, (c) RPGRORF15를 암호화하는 cDNA, (d) 270 bp 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH-polyA), 및 (e) 3' ITR을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열(과 각각의 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 부위)을 함유한다.
일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 (a) 5' 역상 말단 반복부(ITR), (b) 프로모터, 선택적으로, 199 bp GRK1 프로모터, (c) RPGRORF15를 암호화하는 cDNA, (d) 270 bp 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH-polyA), 및 (e) 3' ITR을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열(과 각각의 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 부위)을 함유한다.
본 개시내용의 AAV 또는 RPGRORF15 작제물은 포유류 세포에서 발현을 할 수 있는 프로모터를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용의 AAV 또는 RPGRORF15 작제물은 인간 세포에서 발현을 할 수 있는 프로모터를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터, 세포-유형 특이적 프로모터, 바이러스 프로모터, 포유류 프로모터, 및 하이브리드 또는 재조합 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-작제물의 치료학적 작제물은 G 단백질-커플링된 수용체 키나제 1(GRK1) 프로모터의 제어 하에 있다.
본 개시내용의 AAV 또는 RPGRORF15 작제물은 폴리아데노신(polyA) 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 polyA 서열은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. BGH-polyA 서열은 유전자 발현을 향상시키도록 사용되고, 다른 polyA 서열, 예컨대 SV40 및 인간 콜라겐 polyA보다 3배 더 높은 발현 수준을 생성하는 것으로 나타났다. 이 증가된 발현은 상류 프로모터 또는 전이유전자의 유형에 주로 독립적이다. BGH-polyA 서열을 사용한 발현 수준의 증가는 주사된 AAV 또는 플라스미드 벡터의 더 낮은 전체 용량을 허용하고, 이는 숙주 면역 반응을 덜 생성할 것이다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 약물 물질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 약물 물질은 본 개시내용의 RPGRORF15 작제물을 포함하는 본 개시내용의 rAAV를 포함한다.
AAV-ABCA4
본 개시내용은 본 개시내용의 방법을 사용하여 제조된 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (a) 0.5 x 1011 벡터 게놈(vg)/mL 내지 5 x 1013 vg, 또는 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL의, 각각 복제-결핍, 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 상류 또는 하류 벡터, (b) 50% 미만의 빈 캡시드; 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 상류 및 하류 기능적 벡터 게놈의 쌍은 형질도입 후에 세포에서 ABCA4 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (a) 0.5 x 1011 벡터 게놈(vg)/mL 내지 5 x 1013 vg/mL, 또는 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL의, 각각 복제-결핍, 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 상류 또는 하류 벡터, (b) 30% 미만의 빈 캡시드; 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 상류 및 하류 기능적 벡터 게놈의 쌍은 형질도입 후에 세포에서 ABCA4 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (a) 0.5 x 1011 벡터 게놈(vg)/mL 내지 5 x 1013 vg/mL, 또는 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL의, 각각 복제-결핍, 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 상류 또는 하류 벡터, (b) 99% 미만, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 또는 사이의 임의의 백분율의 빈 캡시드; 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 상류 및 하류 기능적 벡터 게놈의 쌍은 형질도입 후에 세포에서 ABCA4 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물에 의한 세포의 형질도입 후에, ABCA4 서열은 ABCA4 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, ABCA4 서열에 의해 암호화된 단백질은 비형질도입된 세포의 상응하는 서열에 의해 암호화된 ABCA4의 활성 수준이거나 이보다 높은 활성 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 외인성 ABCA4 서열 및 상응하는 내인성 ABCA4 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 외인성 ABCA4 서열 및 상응하는 내인성 ABCA4 서열은 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 외인성 ABCA4 서열 및 상응하는 내인성 ABCA4 서열은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 5 x 1013 vg/mL, 또는 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함)의 각각 상류 또는 하류 벡터, (b) 적어도 70% 충전 캡시드 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 상류 및 하류 기능적 벡터 게놈의 쌍은 형질도입 후에 세포에서 ABCA4 서열을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 5 x 1013 vg/mL, 또는 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함)의 각각 상류 또는 하류 벡터, (b) 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%, 또는 사이의 임의의 백분율의 충전 캡시드 및 (c) 복수의 기능적 vg/mL를 포함하고, 여기서 상류 및 하류 기능적 벡터 게놈의 쌍은 형질도입 후에 세포에서 ABCA4 서열을 발현할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 포유류, 및 바람직하게는 인간에 대한 전신 또는 국소 투여에 적합한 치료학적 ABCA4 작제물을 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 ABCA4 작제물은 ABCA4를 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 ABCA4 작제물은 인간 ABCA4를 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 ABCA4 작제물은 유전자 또는 이의 일부의 발현이 가능하게 하거나 이를 향상시키는 조절 요소를 암호화하는 하나 이상의 서열(들)을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 조절 요소는 프로모터, 인트론, 인핸서 요소, 반응 요소(전사후 반응 요소 또는 전사후 조절 요소를 포함), 폴리아데노신(polyA) 서열, 및 전사의 효율적인 종결을 수월하게 하는 유전자 단편(β-글로빈 유전자 단편 및 토끼 β-글로빈 유전자 단편을 포함)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 인간 ATP-결합 카세트, 슈퍼패밀리 A, 구성원 4(ABCA4) 단백질 또는 이의 일부에 상응하는 인간 유전자(또는 이의 변이체) 또는 이의 일부를 포함한다. 인간 ABCA4는 광수용체에 국소화한다. 일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 야생형 또는 코돈-최적화된 서열을 포함하는 인간 유전자 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열은 포유류에서의 발현에 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 서열은 인간에서의 발현에 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 상류 ABCA4 작제물은 인간 ABCA4 유전자의 5' 부분을 포함하고, 하류 ABCA4 작제물은 인간 ABCA4 유전자의 3' 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 ABCA4 유전자의 5' 부분 및 인간 ABCA4 유전자의 3' 부분은 각각 다른 것과 "오버랩하는" 서열을 포함하고, 이는 오버랩하는 서열이 인간 ABCA4 유전자의 5' 부분의 오버랩하는 부분의 서열이 인간 ABCA4 유전자의 3' 부분의 오버랩하는 부분의 서열과 상보성인 듀플렉스를 형성한다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서 인간 ABCA4 유전자의 5' 부분의 오버랩하는 부분의 서열은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 사이의 뉴클레오타이드의 임의의 수를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서 인간 ABCA4 유전자의 5' 부분의 오버랩하는 부분의 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서 인간 ABCA4 유전자의 3' 부분의 오버랩하는 부분의 서열은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 사이의 뉴클레오타이드의 임의의 수를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서 인간 ABCA4 유전자의 3' 부분의 오버랩하는 부분의 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 생성물은 ABCA4의 cDNA를 암호화하는 정제된 재조합 혈청형 8(rAAV8)을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 생성물은 돌연변이체 rAAV8이 아미노산 위치 733에서의 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환을 포함하는 정제된 돌연변이체 rAAV8 캡시드 단백질(AAV8 Y773F 돌연변이체)을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 상류 산물은 ABCA4의 5' 부분의 cDNA를 암호화하는 정제된 재조합 혈청형 8(rAAV8)을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 하류 생성물은 ABCA4의 3' 부분의 cDNA를 암호화하는 정제된 재조합 혈청형 8(rAAV8)을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, ABCA4 또는 이의 일부는 인간 ABCA4이다.
본 개시내용의 AAV-ABCA4 생성물의 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 AAV2 5' 역상 말단 반복부(ITR), ABCA4 cDNA 및 AAV2 3' ITR, 및 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다.
본 개시내용의 AAV-ABCA4 상류 산물의 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 AAV2 5' 역상 말단 반복부(ITR), 프로모터, ABCA4 cDNA 및 AAV2 3' ITR, 및 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, ABCA4 cDNA는 인간 ABCA4 유전자의 5' 부분을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 GRK1 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 단독으로 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 및 토끼 베타-글로빈(RBG) 스플라이스 억셉터 부위 중 하나 이상과 조합되어 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터, CMV 인핸서 및 달리 본원에서 "CAG" 프로모터라 칭하는 RBG 스플라이스 억셉터 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 인트론을 암호화하는 서열 및/또는 엑손을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다.
본 개시내용의 AAV-ABCA4 하류 생성물의 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 AAV2 5' 역상 말단 반복부(ITR), ABCA4 cDNA 및 AAV2 3' ITR, 및 요소를 플랭킹하는 짧은 클로닝 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, ABCA4 cDNA는 인간 ABCA4 유전자의 3' 부분을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 전사후 조절 요소(PRE)를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 우드척 PRE(WPRE)를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 각각의 20 nm AAV 비리온은 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 단일 가닥 DNA 인서트 서열을 함유한다.
일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 인간 ABCA4를 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 뉴클레오타이드 서열 또는
의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은 변형된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ABCA4를 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 로돕신 키나제 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 로돕신 키나제 프로모터는 G 단백질-커플링된 수용체 키나제 1(GRK1) 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 GRK1 프로모터이다. 일부 실시형태에서, GRK1 프로모터를 암호화하는 서열은
과 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GRK1 프로모터는
를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, CBA 프로모터를 암호화하는 서열은
와 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CBA 프로모터는
를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 프로모터 변이체, 예를 들어 CMV.CBA 프로모터, CBA.RBG 프로모터 또는 CBA.InEx 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 예를 들어 CMV 인핸서 및 CBA 프로모터를 포함하는 CMV.CBA 프로모터 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, CMV.CBA 프로모터를 암호화하는 서열은
와 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 예를 들어 CBA 프로모터 및 RGB 인트론을 포함하는 CBA.RBG 프로모터 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, CBA.RBG 프로모터를 암호화하는 서열은
와 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 예를 들어 CBA 프로모터, 인트론 및 엑손을 포함하는 CBA.InEx 프로모터 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, CBA.InEx 프로모터를 암호화하는 서열은
와 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성(인트론은 이택릭체임)을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 신호를 암호화하는 서열은 소 성장 호르몬(BGH) polyA 신호로부터 단리되거나 유래된 polyA 신호를 포함한다. 일부 실시형태에서, BGH polyA 신호는
의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, BGH polyA를 암호화하는 서열은
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, ABCA4 작제물은 5' 역상 말단 반복부(ITR)에 상응하는 서열 및 3' 역상 말단 반복부(ITR)에 상응하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 아데노-연관된 바이러스 벡터(AAV2)로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 야생형 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 절두된 야생형 AAV2 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 야생형 AAV2 서열과 비교할 때 변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이는 치환, 삽입, 결실, 역위 또는 전위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이는 야생형 또는 변이체 서열의 절두 또는 연장을 포함한다. 일부 실시형태에서, ITR은 안정화된 ITR을 제조하도록 후속하는 결실과 정방향 및 역방향 배향으로 3' AAV2 ITR로부터 유래된다. 소정의 실시형태에서, 5' ITR은 하기 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
일부 실시형태에서, 3' ITR은 하기 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
일부 실시형태에서, 5' ITR을 암호화하는 서열은
의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 3' ITR을 암호화하는 서열은 AAV2로부터 단리되거나 유래된 야생형 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' ITR을 암호화하는 서열은
의 서열을 포함한다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV는 복제-결핍 AAV의 형성에 필수적인 바이러스 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 서열은 5' ITR을 암호화하는 서열 또는 3' ITR을 암호화하는 서열 중 하나 또는 둘 다에서 동일한 혈청형의 AAV로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 서열, 5' ITR을 암호화하는 서열 또는 3' ITR을 암호화하는 서열은 AAV2로부터 단리되거나 유래된다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV는 복제-결핍 AAV, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열의 형성에 필수적인 바이러스 서열을 포함하지만, AAV로부터 단리되거나 유래된 임의의 다른 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, AAV는 복제-결핍 AAV, 5' ITR을 암호화하는 서열, 3' ITR을 암호화하는 서열, 및 본 개시내용의 ABCA4를 암호화하는 서열 작제물의 형성에 필수적인 바이러스 서열을 포함하는 재조합 AAV(rAAV)이다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포에서 rAAV를 생성하기 위해 사용된 플라스미드 DNA는 선별 마커를 포함한다. 예시적인 선별 마커는 항생제 내성 유전자를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 예시적인 항생제 내성 유전자는 암피실린 및 카나마이신을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 선별 마커는 약물 또는 소분자 내성 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 선별 마커는 비제한적인 예로서 dapD 발현을 제어하거나 억제하는 lacO/P 작제물을 포함하는 dapD 및 억제성 오퍼레이터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 플라스미드 선택은 형질전환된 세포를 투여하거나 오퍼레이터 억제자 적정(ORT)을 할 수 있는 플라스미드와 접촉시켜 수행된다. 예시적인 선별 마커는 ccd 선택 유전자를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, ccd 선택 유전자는 독성 ccdB 유전자를 발현하도록 조작된 숙주 세포주를 구제하는 ccdA 선택 유전자를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 선별 마커는 sacB를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않고, 여기서 RNA는 수크로스 배지에서 sacB 유전자의 발현을 억제하도록 투여되거나 숙주 세포와 접촉된다. 예시적인 선별 마커는 분리성 사멸 기전, 예컨대 Hok(숙주 사멸 유전자) 및 Sok(억제 사멸)로 이루어진 parAB+ 유전좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
AAV-ABCA4 이중 벡터 작제물
AAV는 매우 낮은 면역원성을 제시하고 임의의 공지된 인간 질환과 연관되지 않은 작은 바이러스이다. 연관된 염증성 반응의 결여는 AAV가 눈에 주사될 때 망막 손상을 야기하지 않는다는 것을 의미한다.
그러나, AAV 캡시드의 크기는 이것 내에 패키징될 수 있는 DNA의 양에 한계를 부여한다. AAV 게놈은 대략 4.7 킬로염기(kb) 크기이고, AAV에서 DNA 패키징에 대한 상응하는 상부 크기 제한은 대략 5 kb라고 여겨진다. ABCA4 유전자의 코딩 서열은 대략 6.8 kb 크기여서(추가의 유전적 요소는 유전자 발현에 필요함), 표준 AAV 벡터로 혼입하기에 이것이 너무 크게 한다.
"이중" 벡터
대안적인 접근법은 이중 벡터 시스템을 제조하는 것이고, 여기서 대략 5 kb 제한보다 큰 전이유전자는 확인된 서열의 2개의 별개의 벡터로 대략 반절로 분할된다: 전이유전자의 5' 부분을 함유하는 "상류" 벡터, 및 전이유전자의 3' 부분을 함유하는 "하류" 벡터. 상류 및 벡터 둘 다에 의한 표적 세포의 형질도입은 전장 전이유전자가 다양한 세포내 기전을 이용하여 2개의 단편으로부터 재어셈블링되게 한다. 본원에 개시된 방법은 이중 벡터 시스템의 벡터의 하나 또는 둘 다를 제조하도록 사용될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 이중 벡터 시스템의 벡터의 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 이중 벡터 시스템은 "오버랩하는" 접근법을 이용한다. 오버랩하는 이중 벡터 시스템에서, 상류 코딩 서열 부분의 3' 말단에서의 코딩 서열의 부분은 하류 코딩 서열 부분의 5'에 상동성으로 오버랩한다. 상류 및 벡터에 의한 표적 세포의 형질도입 시, 코딩 서열의 상류와 하류 사이의 상동성 재조합은 전장 전이유전자의 재성성을 허용하고, 이로부터 상응하는 mRNA가 전사되고 전장 단백질이 발현될 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 전장 전이유전자(예를 들어, ABCA4)는 제2 가닥 합성에 의해 오버랩하는 이중 벡터 시스템으로부터 성생되고, 이어서 상동성 재조합이 될 수 있다. 상류 AAV 입자 및 하류 입자에 의한 세포의 형질도입 시, 상응하는 ssDNA 상류 AAV 벡터 및 하류 AAV 벡터는 세포 또는 이의 핵으로부터 방출되고, 전이유전자의 5' (상류) 부분 of 전이유전자 및 3' (하류) 부분을 포함하는 dsDNA는 제2 가닥 합성에 의해 각각의 ssDNA로부터 생성된다. dsDNA는 이후 코딩 서열의 상류 부분과 하류 부분 사이의 오버랩의 영역에서 상동성 재조합을 겪어서, 전장 전이유전자의 재생성을 허용하고, 이로부터 상응하는 mRNA가 전사되고 전장 단백질이 발현될 수 있다. 예를 들어, WO 2014/170480호는 인간 ABCA4 단백질을 암호화하는 이중 AAV 벡터 시스템을 기재한다(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
본 개시내용의 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 5' 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 3' 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드만큼 오버랩한다. 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터는 각각 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 서열 및/또는 ABCA4 코딩 서열에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 서열 및/또는 ABCA4 코딩 서열에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 5' ABCA4 코딩 서열의 서열 및 3' ABCA4 코딩 서열의 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 3' ABCA4 코딩 서열의 서열 및 5' ABCA4 코딩 서열의 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터는 제1 dsDNA AAV 벡터 및 제2 dsDNA AAV 벡터를 생성하도록 제2 가닥 합성을 겪는다. 일부 실시형태에서, 제1 dsDNA AAV 벡터 및 제2 dsDNA AAV 벡터는 상동성 재조합을 통해 전장 ABCA4 전이유전자를 생성한다.
임의의 특정 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 전장 전이유전자는 단일-가닥 어닐링 및 제2 가닥 합성을 통해 오버랩하는 이중 벡터 시스템으로부터 또한 생성될 수 있다. 상류 AAV 벡터 및 하류 AAV 벡터에 의한 세포의 형질도입 시, 상류 AAV 벡터 및 하류 AAV 벡터의 각각은 ssDNA를 포함하고, 상류 AAV 벡터는 전이유전자의 5' 부분을 암호화하는 서열을 포함하고, 하류 AAV 벡터는 전이유전자의 3' 부분을 암호화하는 서열을 포함하고, 상보성 상류 및 하류 벡터는 세포 또는 이의 핵으로 방출된다. 일부 실시형태에서, 상류 AAV 벡터는 전이유전자의 5' 부분을 암호화하는 서열 및 전이유전자의 3' 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상류 AAV 벡터는 전이유전자의 5' 부분을 암호화하는 센스 서열 및 전이유전자의 3' 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상류 AAV 벡터는 전이유전자의 5' 부분을 암호화하는 안티센스 서열 및 전이유전자의 3' 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 AAV 벡터는 전이유전자의 3' 부분을 암호화하는 서열 및 전이유전자의 5' 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 AAV 벡터는 전이유전자의 3' 부분을 암호화하는 안티센스 서열 및 전이유전자의 5' 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 AAV 벡터는 전이유전자의 3' 부분을 암호화하는 센스 서열 및 전이유전자의 5' 부분에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상류 및 하류 벡터는 상보성(오버랩)의 영역에서 혼성화한다. 혼성화 후에, 전장 전이유전자는 제2 가닥 합성에 의해 생성된다.
본 개시내용의 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 5' 부분을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 3' 부분을 포함하고, 5' 부분 및 3' 부분은 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드만큼 오버랩한다. 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터는 각각 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 서열을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열의 서열을 포함하고, 제1 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열에 상보성인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터는 후속하는 제2 가닥 합성에 의해 전장 dsDNA ABCA4 전이유전자를 생성하도록 상보성 오버랩하는 영역에서 어닐링한다. 일부 실시형태에서, 전장 dsDNA ABCA4 전이유전자는 시험관내 또는 생체내 (세포 또는 대상체에서) 생성된다.
본 개시내용은 청구항에 기재된 바와 같은 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템을 제공함으로써 상기 선행 기술 문제를 해결한다.
이중 벡터 접근법은 AAV 유전자 요법의 역량을 증가시키지만, 치료 효과를 달성하기에 불충분할 수 있는 표적 단백질의 수준을 실질적으로 또한 감소시킬 수 있다. 이중 벡터 시스템의 일부 실시형태에서, 이중 벡터의 재조합의 효능은 플러스 가닥과 마이너스 가닥(센스 및 안티센스 가닥) 사이에 DNA 오버랩의 길이에 따라 달라진다. ABCA4 코딩 서열의 크기는 큰 유전자에서 돌연변이에 의해 생긴 장애의 치료를 위한 최적 이중 벡터 전략에 대한 구역을 확인하기 위해 플러스 가닥과 마이너스 가닥 사이의 오버랩의 다앙한 길이의 탐색을 허용한다. 이 전략은 치료 효과를 제공하도록 충분한 표적 단백질을 생성시킬 수 있다. 스타가트(Stargardt) 마우스 모델에서, 치료 효과는 ABCA4인 표적 단백질로서 용이하게 평가될 수 있고, 망막의 광수용체 세포의 풍부도에 필요하고, 이의 부재는 비스레티노이드 화합물의 축적을 유도하고, 이는 결국 790nm 자가형광을 증가시킨다. 오버랩하는 이중 벡터 시스템의 치료 가능성은 이 비스레티노이드 축적의 감소 및 치료 후에 후속하는 790nm 자가형광 수준을 관찰하여 생체내 검증될 수 있다.
유리하게는, 본 개시내용의 AAV 벡터 시스템은 ABCA4의 원치 않는 절두된 단편의 제한된 생성으로 형질도입된 세포에서 전장 ABCA4 단백질의 놀랍게도 높은 수준의 발현을 제공한다. 최적화된 재조합으로, 전장 ABCA4 단백질은 Abca4-/- 마우스에서 광수용체 외부 절편에서 그리고 비스레티노이드 형성을 감소시키고 망막 영상화에서 자가형광 표현형을 보정하기에 충분한 수준에서 발현된다. 이 관찰은 스타가트병을 치료하기 위한 AAV 유전자 요법에 대한 이중 벡터 접근법을 지지한다.
제1 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템을 제공하고, AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고; 여기서 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고, 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 ABCA4 CDS를 포함하고; 제1 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3597에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고; 여기서 제2 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3806 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 서로와의 서열 오버랩의 영역을 포함하고; 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다.
용어 "AAV 벡터 시스템"은 제1 및 제2 AAV 벡터가 상보성 방식으로 함께 일하도록 의도된다는 사실을 수용하도로 사용된다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템의 제1 및 제2 AAV 벡터는 함께 전체 ABCA4 전이유전자를 암호화한다. 따라서, 표적 세포에서의 암호화된 ABCA4 전이유전자의 발현은 제1 (상류) 및 제2 (하류) 벡터 둘 다에 의한 표적 세포의 형질도입을 요한다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템의 AAV 벡터는 전형적으로 AAV 입자(또한 비리온이라고도 칭함)의 형태이다. AAV 입자는 AAV 게놈인 핵산의 코어를 둘러싸는 단백질 코트(캡시드)를 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 AAV 벡터 시스템의 AAV 벡터 게놈을 암호화하는 핵산 서열을 또한 포함한다.
서열 번호 1은 NCBI 기준 서열 NM_000350.2에 상응하는 인간 ABCA4 핵산 서열이다. 서열 번호 1은 NCBI 기준 서열 NM_000350.2와 동일하다. ABCA4 코딩 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 105 내지 6926에 이른다.
서열 번호 2는 하기 돌연변이를 제외하고 서열 번호 1과 동일하다: 뉴클레오타이드 1640 G>T, 뉴클레오타이드 5279 G>A, 뉴클레오타이드 6173 T>C. 이들 돌연변이는 암호화된 아미노산 서열을 변경하지 않고, 이에 따라 서열 번호 2에 의해 암호화된 ABCA4 단백질은 서열 번호 1에 의해 암호화된 ABCA4 단백질과 동일하다.
일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 제1 핵산 서열을 포함한다. ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 이의 5' 말단을 포함하는 ABCA4 CDS의 부분이다. 이것이 오직 CDS의 부분이므로, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 전장 ABCA4 CDS이 아니다(즉, 전체가 아님). 따라서, 제1 핵산 서열(및 이에 따라 제1 AAV 벡터)은 전장 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 제2 핵산 서열을 포함한다. ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 이의 3' 말단을 포함하는 ABCA4 CDS의 부분이다. 이것이 오직 CDS의 부분이므로, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 전장 ABCA4 CDS이 아니다(즉, 전체가 아님). 따라서, 제2 핵산 서열(및 이에 따라 제2 AAV 벡터)은 전장 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 ABCA4 CDS(하기 기재된 바와 같은 서열 오버랩의 영역을 가짐)를 포함한다. 따라서, 전장 ABCA4 CDS는 본 발명의 AAV 벡터 시스템에 함유되고, 제1 AAV 벡터와 제2 AAV 벡터에 걸쳐 분할하고, 제1 및 제2 AAV 벡터에 의한 표적 세포의 형질도입 후 표적 세포에서 재조립될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 바와 같은 제1 핵산 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 105 내지 3597에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. ABCA4 CDS는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105에서 시직한다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 바와 같은 제2 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3806 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
전체 ABCA4 CDS를 포함하기 위해, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 추가로 적어도 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분을 포함하여서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 정렬될 때 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 전체가 포함된다. 따라서, 정렬될 때 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함한다.
게다가, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 본 발명의 제1 및 제2 AAV 벡터로 형질도입된 표적 세포 내부에 전장 전이유전자의 일부로서 전체 ABCA4 CDS의 재작제를 허용하는 서열 오버랩의 영역을 포함한다.
제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 서로에 정렬될 때, 제1 핵산 서열의 3' 말단에서의 영역은 제2 핵산 서열의 5' 말단에서의 상응하는 영역과 오버랩한다. 따라서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열 둘 다는 서열 오버랩의 영역을 형성하는 ABCA4 CDS의 부분을 포함한다.
특히 유리한 결과는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이의 오버랩의 영역이 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분의 적어도 약 20 인접한 뉴클레오타이드를 포함할 때 얻어진다.
오버랩의 영역은 상기 20개의 인접한 뉴클레오타이드의 상류 및/또는 하류로 연장할 수 있다. 따라서, 오버랩의 영역은 20개 초과의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응하는 위치의 상류에 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 게다가, 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3805에 상응하는 위치의 하류에 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
대안적으로, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분 내에 함유될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 20개 내지 550개의 뉴클레오타이드 길이; 바람직하게는 50개 내지 250개의 뉴클레오타이드 길이; 바람직하게는 175개 내지 225개의 뉴클레오타이드 길이; 바람직하게는 195개 내지 215개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 50개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 75개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 100개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 150개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 200개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 모든 208개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에상응하는 뉴클레오타이드에서 시작한다. 용어 "시작한다"는 핵산 서열 오버랩의 영역이 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응하는 뉴클레오타이드로부터 시작하여 5'에서 3' 방향으로 이어진다는 것을 의미한다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역의 가장 5' 뉴클레오타이드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응한다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 벡터 사이의 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응한다.
본 발명의 추가의 이점은 상기 기재된 바와 같은 핵산 서열 오버랩의 영역을 포함하는 이중 AAV 벡터의 작제가 원치 않는 절두된 ABCA4 펩타이드의 번역의 수준을 유리하게는 감소시킬 수 있다는 것이다.
절두된 ABCA4 펩타이드의 번역의 문제는 오직 하류 벡터로부터 유래된 mRNA 전사체로부터 번역이 개시될 때 이중 AAV 벡터 시스템에서 생길 수 있다. 이와 관련하여, AAV ITR, 예컨대 AAV2 5' ITR은 프로모터 활성을 가질 수 있다; 이것은 WPRE 및 bGH 폴리-아데닐화 서열(하기 기재된 바와 같음)의 하류 벡터에서의 존재와 함께 비재조합된 벡터로부터 안정한 mRNA 전사체를 생성시킬 수 있다. 야생형 ABCA4 CDS는 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 다른 코돈에 대해 치환될 수 없는 하류 부분에서 다수의 인프레임 AUG 코돈을 보유한다. 이는 안정한 전사체로부터 생기는 번역의 가능성을 생성시켜서, 절두된 ABCA4 펩타이드의 존재를 발생시킨다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응하는 뉴클레오타이드에서 시작하고, 서열 구역의 출발 서열은 번역 기계가 아웃-오브-프레임 부위로부터의 비재조합된 하류-단독 전사체의 번역을 개시하도록 장려하도록 더 약한 상황에서 인프레임 AUG 코돈 전에 (잠재적인 코작 공통 서열과 관련하여) 양호한 상황에서 아웃-오브-프레임 AUG (시작) 코돈을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 인프레임 AUG 전에 다양한 맥락에서 총 4개의 아웃-오브-프레임 AUG 코돈이 있다. 이들 모두는 10개의 아미노산 내에 중단 코돈으로 번역하여서, 원치 않는 절두된 ABCA4 펩타이드의 번역을 방지한다.
바람직하게는, 제1 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하여서, 상기 기재된 바와 같은 핵산 서열 오버랩의 특히 바람직한 영역을 포함한다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926으로 이루어진다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고, 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고, 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926으로 이루어진다.
용어 "이루어지는"에 따르면, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분 및 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분이 상기 기재된 바와 같은 인접한 뉴클레오타이드의 특정 서열로 이루어지는 실시형태에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 임의의 추가의 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
전형적으로, 각각의 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터는 5' 및 3' 역상 말단 반복부(ITR)를 포함한다.
전형적으로, 자연 유래된 혈청형의 AAV 게놈, AAV의 단리물 또는 클래드는 적어도 하나의 역상 말단 반복부 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능적 복제 기원을 제공하도록 시스로 작용하고, 세포의 게놈으로부터 벡터의 통합 및 절제를 허용한다. AAV ITR은 예를 들어 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 이중 가닥 DNA로의 단일 가닥 벡터 DNA의 전환 후 AAV 감염된 세포의 핵에서 콘카머 형성을 돕는 것으로 여겨진다. 이러한 에피솜 콘카머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호하도록 작용하여서, 생체내 전이유전자의 연장된 발현을 허용할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, ITR은 AAV ITR(즉, AAV 게놈에서 발견된 ITR 서열로부터 유래된 ITR 서열)이다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템의 제1 및 제2 AAV 벡터는 함께 벡터 둘 다의 형질도입 후 표적 세포에서 재조립되는 완전히 기능적인 ABCA4 전이유전자에 필요한 성분을 모두 포함한다. 숙련자는 바이러스 벡터-형질도입된 세포에서 전이유전자 발현을 보장하도록 흔히 사용된 추가의 유전적 요소를 알 것이다. 이들은 발현 제어 서열이라 칭해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 AAV 바이러스 벡터 시스템의 AAV 벡터는 전형적으로 뉴클레오타이드 ABCA4를 암호화하는 서열 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 서열을 포함)을 포함한다.
5' 발현 제어 서열 성분은 바이러스 벡터 시스템의 제1("상류") AAV 벡터에 적합하게 위치하는 반면, 3' 발현 제어 서열은 바이러스 벡터 시스템의 제2("하류") AAV 벡터에 적합하게 위치한다.
따라서, 제1 AAV 벡터는 전형적으로 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 이의 성질상 ABCA4 CDS에 5' 위치하는 것이 요구되어서, 제1 AAV 벡터에 위치한다.
임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있고, 이의 선택은 숙련자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 항시적으로 활성(즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 가동중)일 수 있거나, 대안적으로 오직 특정 숙주 세포 환경에서 작용할 수 있어서, 특정 세포 유형(예를 들어, 조직 특이적 프로모터)에서 전이유전자의 표적화된 발현을 허용한다. 프로모터는 다른 인자, 예를 들어 숙주 세포에 존재하는 인자의 존재에 반응하여 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 벡터가 치료를 위해 투여되는 임의의 사건에서, 프로모터가 표적 세포 배경에서 기능적이어야 하는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 전이유전자가 망막 세포 집단에서 오직 발현되게 하도록 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은 망막-세포 특이적, 예를 들어 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포에 오직 구속될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 프로모터는 선택적으로 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소와 조합된 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터이다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 예시적인 프로모터는 하이브리드 CBA/CAG 프로모터, 예를 들어 rAVE 발현 카세트에 사용된 프로모터(GeneDetect.com)이다. 본원에 개시된 임의의 프로모터를 사용할 수 있다.
망막-특이적 유전자 발현을 유도하는 인간 서열에 기초한 예시적인 프로모터는 간상세포에 대한 로돕신 키나제, 오직 원뿔세포에 대한 PR2.1, 및 망막 색소 상피에 대한 RPE65를 포함한다.
AAV-GRK1-ABCA4 이중 벡터 작제물
본 발명자들은 유전자 발현의 특히 유리한 수준이 GRK1 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 일 실시형태에서, 프로모터는 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터이다.
본 발명의 GRK1 프로모터 서열은 199개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, GRK1 유전자의 뉴클레오타이드 -112 내지 +87를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 또는 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 서열 번호 5의 핵산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
제1 AAV 벡터는 프로모터와 상류 ABCA4 핵산 서열(즉, 5' UTR) 사이에 위치한 비번역된 영역(UTR)을 포함할 수 있다.
임의의 적합한 UTR 서열은 사용될 수 있고, 이의 선택은 기술자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
UTR은 하기 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 갈루스 갈루스(Gallus gallus) β 액틴(CBA) 인트론 1 단편, 오릭톨라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus) β 글로빈(RBG) 인트론 2 단편 및 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 β 글로빈 엑손 3 단편.
UTR은 코작 공통 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 코작 공통 서열은 사용할 수 있고, 이의 선택은 기술자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
바람직한 실시형태에서, UTR은 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 서열 번호 6에 기재된 핵산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
서열 번호 6의 UTR은 186개의 뉴클레오타이드 길이이고, 갈루스 갈루스 β 액틴(CBA) 인트론 1 단편(예상된 스플라이스 도너 부위를 가짐), 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 β 글로빈(RBG) 인트론 2 단편(예상된 분지점 및 스플라이스 억셉터 부위를 가짐) 및 코작 공통 서열 바로 전에 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 β 글로빈 엑손 3 단편을 포함한다.
본 발명자들은 상기 기재된 바와 같은 UTR, 특히 서열 번호 6에 기재된 UTR 서열 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 존재가 유리하게는 ABCA4 전이유전자로부터의 번역 수율을 증가시킨다는 것을 놀랍게도 발견하였다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템의 제2 ("하류") AAV 벡터는 전사후 반응 요소(전사후 조절 요소로도 공지됨) 또는 PRE를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 PRE를 사용할 수 있고, 이의 선택은 기술자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 적합한 PRE의 존재는 ABCA4 전이유전자의 발현을 향상시킬 수 있다.
바람직한 실시형태에서, PRE는 우드척 간염 바이러스 PRE(WPRE)이다. 특히 바람직한 실시형태에서, WPRE는 서열 번호 7에 기재된 바와 같은 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는다.
제2 AAV 벡터는 하류 ABCA4 핵산 서열에 3'에 위치한 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 폴리-아데닐화 서열을 사용할 수 있고, 이의 선택은 기술자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 폴리-아데닐화 서열은 소 성장 호르몬(BGH) 폴리-아데닐화 서열이다. 특히 바람직한 실시형태에서, bGH 폴리-아데닐화 서열은 서열 번호 8에 기재된 바와 같은 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템의 바람직한 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템의 다른 바람직한 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기에 적합하다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 기능적 ABCA4 단백질이 표적 세포에서 발현되도록 표적 세포를 상기 기재된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터로 형질도입하는 단계를 포함한다.
인간 ABCA4 단백질의 발현은 표적 세포가 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터 둘 다로 형질도입될 것을 요하지만; 순서가 중요하지 않다. 따라서, 표적 세포는 임의의 순서로(제1 AAV 벡터, 이어서 제2 AAV 벡터, 또는 제2 AAV 벡터, 이어서 제1 AAV 벡터) 또는 동시에 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터로 형질도입될 수 있다.
표적 세포를 AAV 벡터로 형질도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 기술자에게 친숙할 것이다.
표적 세포는 바람직하게는 눈의 세포, 바람직하게는 망막 세포(예를 들어, 뉴런 광수용체 세포, 간상 세포, 원뿔 세포 또는 망막 색소 상피 세포)이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 제1 AAV 벡터를 제공한다. 상기 정의된 바와 같은 제2 AAV 벡터가 또한 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 여기서 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다. 따라서, 이 AAV 벡터는 인접한 뉴클레오타이드의 상기 서열 이외에 임의의 추가의 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
제1 AAV 벡터는 5' 및 3' ITR, 바람직하게는 AAV ITR; 프로모터, 바람직하게는 GRK1 프로모터; 및/또는 UTR을 포함할 수 있고; 상기 요소는 본 발명의 AAV 벡터 시스템과 관련하여 상기 기재된 바와 같다.
일 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열이되, 단 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1640에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 G인 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열이되, 단 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1640에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 G인 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 여기서 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다. 따라서, 이 AAV 벡터는 인접한 뉴클레오타이드의 상기 서열 이외에 임의의 추가의 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
제2 벡터는 5' 및 3' ITR, 바람직하게는 AAV ITR; PRE, 바람직하게는 WPRE; 및/또는 폴리-아데닐화 서열, 바람직하게는 bGH 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있고; 상기 요소는 본 발명의 AAV 벡터 시스템과 관련하여 상기 기재된 바와 같다.
일 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열이되, 단 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 5279에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 G이고, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 6173에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 T인 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열이되, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 5279에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 G이고, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 6173에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 T인 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 AAV 벡터로부터 유래 가능한 AAV 벡터 게놈을 제공한다.
본 발명의 예시적인 AAV 벡터 시스템은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하고; 여기서 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함하고; 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 예시적인 AAV 벡터 시스템은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하고; 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하고; 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 임의의 하기 벡터에 관한 것이다: CMVCBA.In.GFP.pA 벡터(서열 번호 17); CMVCBA.GFP.pA 벡터(서열 번호 18); CBA.IntEx.GFP.pA 벡터(서열 번호 19); CAG.GFP.pA 벡터(서열 번호 20); AAV.5'CMVCBA.In.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 21); AAV.5'CMVCBA.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 22); 또는 AAV.5'CBA.IntEx.ABCA4.WPRE.kan 벡터(서열 번호 23).
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 임의의 하기 서열에 관한 것이다: (i) 5' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 27), RK 프로모터를 암호화하는 서열(서열 번호 28), Rabbit 베타-글로빈(RBG) 인트론/엑손(Int/Ex)을 암호화하는 서열(서열 번호 39), ABCA4 유전자의 코딩 서열의 5' 부분을 암호화하는 서열(서열 번호 29) 및 3' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 30)을 포함하는 pAAV.RK.5'ABCA4.kan(서열 번호 26)의 ITR 부분에 대한 ITR; 또는 (ii) 5' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 27), ABCA4 유전자의 코딩 서열의 3' 부분을 암호화하는 서열(서열 번호 31), WPRE를 암호화하는 서열(서열 번호 32), bGH polyA를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열(서열 번호 33)을 포함하는 pAAV.3'ABCA4.WPRE.kan(서열 번호 30)의 ITR 부분에 대한 ITR의 서열.
본 발명이 또한 수행될 수 있는데, 여기서 서열 번호 2는 서열 번호 1 대신에 기준 서열로서 사용된다.
이와 관련하여, 서열 번호 2는 하기 돌연변이를 배제하고 서열 번호 1과 동일하다: 뉴클레오타이드 1640 G>T, 뉴클레오타이드 5279 G>A, 뉴클레오타이드 6173 T>C. 이들 돌연변이는 암호화된 아미노산 서열을 변경하지 않고, 이에 따라 서열 번호 2에 의해 암호화된 ABCA4 단백질은 서열 번호 1에 의해 암호화된 ABCA4 단백질과 동일하다.
따라서, 본 발명의 대안적인 실시형태에서, 상기 서열 번호 1의 참조는 서열 번호 2의 참조로 대체될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 임의의 작제물은 대안적으로 상이한 프로모터, 예컨대, 예를 들어 CMV.CBA 프로모터, CBA.RBG 프로모터 또는 CBA.InEx 프로모터를 포함할 수 있다. 유사하게, 임의의 작제물은 서열 번호 6을 포함하거나 이것으로 이루어지는 5' ITR 및/또는 서열 번호 37을 포함하거나 이것으로 이루어지는 3' ITR을 포함할 수 있다.
서열 관련성
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에 상응하는"은 주어진 핵산 서열에서의 뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때 특정 서열 번호의 참조로 뉴클레오타이드 위치를 정의한다. 그러나, 이러한 참조가 이루어질 때, 본 발명이 언급된 특정 서열 번호에 기재된 바와 같은 정확한 서열로 제한되지 않지만, 이의 변이체 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 서열 번호 1에서의 뉴클레오타이드 위치에 상응하는 뉴클레오타이드는 서열 정렬에 의해, 예컨대 서열 정렬 프로그램을 사용하여 용이하게 결정될 수 있고, 이의 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이와 관련하여, 숙련자는 유전 코드의 축퇴성 성질이 주어진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에서의 변이가 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 존재할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 따라서, 다른 ABCA4 코딩 서열에서의 뉴클레오타이드 위치의 확인이 고려된다(즉, 숙련자가 예를 들어 서열 번호 1에서 확인된 위치에 상응함을 고려하는 위치에서의 뉴클레오타이드).
예로서, 서열 번호 2는 상기 기재된 바와 같은 3개의 특정 돌연변이를 배제하고 서열 번호 1과 동일하다(이들 3개의 돌연변이는 암호화된 ABCA4 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하지 않는다). 이 경우에, 숙련자는 따라서 서열 번호 2에서의 주어진 뉴클레오타이드 위치가 서열 번호 1에서의 균등한 넘버링된 뉴클레오타이드 위치에 상응함을 고려할 것이다.
전형적으로, AAV 게놈의 유도체는 적어도 하나의 역상 말단 반복부 서열(ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예컨대 2개 이상의 ITR을 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상은 상이한 혈청형을 갖는 AAV 게놈으로부터 유래될 수 있거나, 키메라 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이체 ITR은 trs의 결실을 갖는 것(말단 용해 부위)이다. 이 결실은 코딩 및 상보성 서열 둘 다를 함유하는 단일-가닥 게놈, 즉 자가 상보성 AAV 게놈을 생성하기 위해 게놈의 계속된 복제를 허용한다. 이는 표적 세포에서 DNA 복제의 바이패스를 허용하고, 그래서 가속된 전이유전자 발현이 가능하게 한다.
본 개시내용의 AAV 벡터는 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 게놈 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드에 패키징된 트랜스캡시드화 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 벡터는 또한 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 비변형된 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 캡시드를 구성하는 모자이크 형태를 포함한다. AAV 벡터는 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 보유하는 화학적으로 변형된 형태를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화하기 위한 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/2), AAV2 게놈 및 AAV5 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/5) 및 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질(AAV2/8)을 갖는 것을 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터는 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 돌연변이체 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다. 바람직하게는 돌연변이체 AAV8 캡시드 단백질은 AAV8 Y733F 캡시드 단백질이다.
AAV-CBA-ABCA4 이중 벡터 작제물
본 개시내용은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템을 제공하고, AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고; 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고, 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; 여기서 제1 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3597에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3806 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 서로와의 서열 오버랩의 영역을 포함하고; 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다.
일반적으로 AAV 벡터는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 숙련가는 분야에서 이의 일반 상식으로부터 이의 제조에 적합한 일반 기법에 친숙하다. 기술자의 지식은 AAV 벡터의 게놈으로 관심 핵산 서열을 혼입하기에 적합한 기법을 포함한다.
용어 "AAV 벡터 시스템"은 제1 및 제2 AAV 벡터가 상보성 방식으로 함께 일하도록 의도된다는 사실을 포함하도록 사용된다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템의 제1 및 제2 AAV 벡터는 함께 전체 ABCA4 전이유전자를 암호화한다. 따라서, 표적 세포에서의 암호화된 ABCA4 전이유전자의 발현은 제1 (상류) 및 제2 (하류) 벡터 둘 다에 의한 표적 세포의 형질도입을 요한다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템의 AAV 벡터는 AAV 입자(비리온이라고도 칭함)의 형태일 수 있다. AAV 입자는 AAV 게놈인 핵산의 코어를 둘러싸는 단백질 코트(캡시드)를 포함한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 AAV 벡터 시스템의 AAV 벡터 게놈을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
서열 번호 1은 NCBI 기준 서열 NM_000350.2에 상응하는 인간 ABCA4 핵산 서열이다. 서열 번호 1은 NCBI 기준 서열 NM_000350.2와 동일하다. ABCA4 코딩 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 6926에 이른다.
제1 AAV 벡터는 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 제1 핵산 서열을 포함한다. ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 이의 5' 말단을 포함하는 ABCA4 CDS의 부분이다. 이것이 오직 CDS의 부분이므로, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 전장이 아닌(즉, 전체가 아님) ABCA4 CDS이다. 따라서, 제1 핵산 서열(및 이에 따라 제1 AAV 벡터)은 전장 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
제2 AAV 벡터는 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 제2 핵산 서열을 포함한다. ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 이의 3' 말단을 포함하는 ABCA4 CDS의 부분이다. 이것이 오직 CDS의 부분이므로, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 전장이 아닌(즉, 전체가 아님) ABCA4 CDS이다. 따라서, 제2 핵산 서열(및 이에 따라 제2 AAV 벡터)은 전장 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS(하기 기재된 바와 같은 서열 오버랩의 영역을 가짐)를 포함한다. 따라서, 전장 ABCA4 CDS는 본 개시내용의 AAV 벡터 시스템에 함유되고, 제1 및 제2 AAV 벡터에 걸쳐 분할하고, 제1 및 제2 AAV 벡터에 의한 표적 세포의 형질도입 후 표적 세포에서 재어셈블링될 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 제1 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3597에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. ABCA4 CDS는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105에서 시작한다.
상기 기재된 바와 같은 제2 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3806 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
전체 ABCA4 CDS를 포함하기 위해, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 적어도 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분을 추가로 포함하여서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 정렬될 때 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 전체가 포함된다. 따라서, 정렬될 때, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함한다.
게다가, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 본 개시내용의 제1 및 제2 AAV 벡터로 형질도입된 표적 세포 내부에 전장 전이유전자의 일부로서 전체 ABCA4 CDS의 작제를 허용하는 서열 오버랩의 영역을 포함한다.
제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 서로와 정렬될 때, 제1 핵산 서열의 3' 말단에서의 영역은 제2 핵산 서열의 5' 말단에서의 상응하는 영역과 오버랩한다. 따라서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열 둘 다는 서열 오버랩의 영역을 형성하는 ABCA4 CDS의 부분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이의 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분의 적어도 약 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 오버랩의 영역은 상기 20개의 인접한 뉴클레오타이드의 상류 및/또는 하류를 연장시킬 수 있다. 따라서, 오버랩의 영역은 20개 초과의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응하는 위치의 상류에 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 게다가, 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3805에 상응하는 위치의 하류에 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
대안적으로, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분 내에 함유될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 20개 내지 550개의 뉴클레오타이드 길이; 바람직하게는 50개 내지 250개의 뉴클레오타이드 길이; 바람직하게는 175개 내지 225개의 뉴클레오타이드 길이; 바람직하게는 195개 내지 215개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 50개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 75개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 100개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 150개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 200개의 인접한 뉴클레오타이드; 바람직하게는 모든 208개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응하는 뉴클레오타이드에서 시작한다. 용어 "시작한다"는 핵산 서열 오버랩의 영역이 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응하는 뉴클레오타이드로부터 시작하여 5'에서 3' 방향으로 흐른다는 것을 의미한다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역의 가장 5' 뉴클레오타이드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598에 상응한다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 벡터 사이의 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 3805에 상응한다.
상기 기재된 바와 같은 핵산 서열 오버랩의 영역을 포함하는 이중 AAV 벡터의 작제는 원치 않는 절두된 ABCA4 펩타이드의 번역의 수준을 감소시킬 수 있다.
번역이 오직 하류 벡터로부터 유래된 mRNA 전사체로부터 개시될 때 절두된 ABCA4 펩타이드의 번역의 문제는 이중 AAV 벡터 시스템에서 생길 수 있다. 이와 관련하여, AAV ITR, 예컨대 AAV2 5' ITR은 프로모터 활성을 가질 수 있고; WPRE 및 bGH 폴리-아데닐화 서열(하기 기재된 바와 같음)의 하류 벡터에서의 존재와 함께 이것은 비재조합된 하류 벡터로부터 안정한 mRNA 전사체를 생성시킬 수 있다. 야생형 ABCA4 CDS는 변경 아미노산 서열 없이 다른 코돈에 치환될 수 없는 이의 하류 부분에서 다수의 인프레임 AUG 코돈을 보유한다. 이것은 안정한 전사체로부터 생기는 번역의 가능성을 생성하여서 절두된 ABCA4 펩타이드의 존재를 발생시킨다.
본 개시내용의 소정의 바람직한 실시형태에서, 핵산 서열 오버랩의 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3598에 상응하는 뉴클레오타이드에서 시작하고, 오버랩 구역의 출발 서열은 아웃 오브 프레임 부위로부터 재조합되지 않은 하류-단독 전사체의 번역을 개시시키기 위해 번역 기계를 보장하도록 더 약한 상황에서 인프레임 AUG 코돈 전에 (잠재적인 코작 공통 서열과 관련하여) 양호한 상황에서 아웃 오브 프레임 AUG (출발) 코돈을 포함한다. 본 개시내용의 소정의 특히 바람직한 실시형태에서, 인프레임 AUG 전에 다양한 맥락에서 총 4개의 아웃 오브 프레임 AUG 코돈이 있다. 이들 모두는 10개의 아미노산 내에 중단 코돈으로 번역되어서, 원치 않는 절두된 ABCA4 펩타이드의 번역을 방지한다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 제1 핵산 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하여서, 상기 기재된 바와 같은 핵산 서열 오버랩의 영역을 포함한다.
따라서, 소정의 바람직한 실시형태에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다.
소정의 바람직한 실시형태에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926으로 이루어진다.
따라서, 소정의 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고, 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고, 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 105 내지 3805로 이루어지고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926으로 이루어진다.
용어 "이루어지는"에 따르면, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분 및 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분이 상기 기재된 바와 같은 인접한 뉴클레오타이드의 특정 서열로 이루어지는 실시형태에서, 이후 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 임의의 추가의 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
소정의 실시형태에서, 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터의 각각은 5' 및 3' 역상 말단 반복부(ITR)를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 자연 유래된 혈청형의 AAV 게놈, AAV의 단리물 또는 클래드는 적어도 하나의 역상 말단 반복부 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능적 복제 기원을 제공하도록 시스로 작용하고, 세포의 게놈으로부터 벡터의 통합 및 절제를 허용한다. AAV ITR은 예를 들어 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 이중-가닥 DNA로 단일-가닥 벡터 DNA의 전환 후 AAV 감염된 세포의 핵에서 콘카머 형성을 돕는 것으로 여겨진다. 이러한 에피솜 콘카머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호하도록 작용하여서, 생체내 전이유전자의 연장된 발현을 허용할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, ITR은 AAV ITR(즉, AAV 게놈에서 발견된 ITR 서열로부터 유래된 ITR 서열)이다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템의 제1 및 제2 AAV 벡터는 함께 완전히 기능적인 ABCA4 전이유전자가 벡터 둘 다에 의해 형질도입 후에 표적 세포에서 재어셈블리되는 데 필요한 성분의 모두를 포함한다. 숙련자는 바이러스 벡터-형질도입된 세포에서 전이유전자 발현을 보장하도록 흔히 사용된 추가의 유전적 요소를 알 것이다. 이들은 발현 제어 서열이라 칭해질 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 AAV 바이러스 벡터 시스템의 AAV 벡터는 뉴클레오타이드 ABCA4를 암호화하는 서열 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 서열을 포함)을 포함할 수 있다.
5' 발현 제어 서열 성분은 바이러스 벡터 시스템의 제1 ("상류") AAV 벡터에 위치할 수 있는 반면, 3' 발현 제어 서열은 바이러스 벡터 시스템의 제2 ("하류") AAV 벡터에 위치할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 성질상 ABCA4 CDS에 5' 위치하는 것이 요구되어서, 제1 AAV 벡터에 위치한다.
임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있고, 이의 선택은 숙련자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 항시적으로 활성(즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 가동중)일 수 있거나, 대안적으로 오직 특정 숙주 세포 환경에서 작용할 수 있어서, 특정 세포 유형(예를 들어, 조직 특이적 프로모터)에서 전이유전자의 표적화된 발현을 허용한다. 프로모터는 다른 인자, 예를 들어 숙주 세포에 존재하는 인자의 존재에 반응하여 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 벡터가 치료를 위해 투여되는 임의의 사건에서, 프로모터가 표적 세포 배경에서 기능적이어야 하는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 전이유전자가 망막 세포 집단에서 오직 발현되게 하도록 망막-세포 특이적 발현을 나타낸다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은 망막-세포 특이적, 예를 들어 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포에 오직 구속될 수 있다.
요소는 ABCA4 단백질의 발현을 증가시키도록 본 개시내용의 상류 및 하류 벡터 둘 다에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 벡터, 예컨대 상류 벡터에서의 인트론의 포함은 그 벡터로부터 관심 RNA 또는 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 인트론은 RNA 성숙 동안 RNA 스플라이싱에 의해 제거된 유전자 내의 뉴클레오타이드 서열이다. 인트론은 10개의 염기 쌍으로부터 다수의 메가염기의 길이로 변할 수 있다. 그러나, 스플라이솜 인트론(즉, 진핵 스플라이솜에 의해 스플라이싱된 인트론)은 인트론의 5' 말단에서의 스플라이스 도너(SD) 부위, 3' 말단 근처의 인트론에서의 분지 부위 및 3' 말단에서의 스플라이스 억셉터(SA) 부위를 포함할 수 있다. 이 인트론 요소는 적절한 인트론 스플라이싱을 촉진한다. SD 부위는 인트론의 5' 말단에서 공통 GU를 포함할 수 있고, 인트론의 3' 말단에서의 SA 부위는 "AG"에 의해 종료할 수 있다. SA 부위의 상류에, 인트론은 대개 피리미딘에서 영역 높은 영역을 함유하고, 이는 분지점 아데닌 뉴클레오타이드와 SA 사이이다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 인트론의 존재는 RNA 전사의 속도, 핵 방출 또는 RNA 전사체 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 인트론의 존재는 또한 mRNA 번역의 효율을 증가시킬 수 있어서, 관심 단백질(예를 들어, ABCA4)을 더 많이 생성한다. 도 309 및 도 310은 ABCA4 이중 벡터, IntEx 및 RBG SA/SD와의 사용을 위해 2개의 예시적인 인트론(및 동반 엑손)을 기재한다. 그러나, 본 개시내용은 유전자 발현을 부스팅하고 진핵 세포에서 스플랑이싱을 촉진하는 임의의 인트론의 본 개시내용의 작제물에서의 용도를 포함한다.
본 개시내용의 벡터의 일부 실시형태에서, 인트론, IntEx 또는 SA/SD(RBD SA/SD를 포함)는 벡터로부터 단백질 발현을 증가시키도록 작용하는 여러 요소 중 하나일 수 있다. 예를 들어, 프로모터 및 선택적으로 인핸서는 유전자 발현의 세포 또는 조직 특이성뿐만 아니라, 벡터로부터 전사된 mRNA의 수준에 영향을 미칠 수 있다. 프로모터는 RNA 전사를 개시시키는 DNA의 영역이다. 프로모터의 특정 서열 요소에 따라, 프로모터는 강도 및 조직 특이성이 변할 수 있다. 인핸서는 RNA 중합효소를 동원하고 전사를 개시시키는 프로모터의 능력에 영향을 미침으로써 프로모터로부터의 전사를 조절하는 DNA 서열이다. 따라서, 벡터에서 프로모터의 선택, 및 선택적으로, 인핸서의 포함 및/또는 인핸서 자체의 선택은 벡터에 의해 암호화된 유전자의 발현에 상당히 영향을 미칠 수 있다. 선택적으로 CMV 인핸서와 조합된 예시적인 프로모터, 예컨대 로돕신 키나제 프로모터 또는 닭 베타 액틴 프로모터는 도 310 및 311에 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 인핸서 요소의 사용을 배제하면서 예시적인 프로모터, 예컨대 로돕신 키나제 프로모터 또는 닭 베타 액틴 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 인핸서 요소, 예컨대 CMV 인핸서 요소의 사용을 배제하면서 예시적인 프로모터, 예컨대 닭 베타 액틴 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 인핸서 요소의 사용을 배제하고 인트론, IntEx 또는 SD/SA를 포함하면서 예시적인 프로모터, 예컨대 로돕신 키나제 프로모터 또는 닭 베타 액틴 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 인핸서 요소, 예컨대 CMV 인핸서 요소의 사용을 배제하고 인트론, IntEx 또는 SD/SA를 포함하면서 예시적인 프로모터, 예컨대 닭 베타 액틴 프로모터를 포함한다.
mRNA 전사체 자체의 비코딩 서열에서의 요소는 또한 벡터에서 암호화된 서열의 단백질 수준에 영향을 미칠 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, mRNA 비번역된 영역(UTR)에서의 서열 요소는 mRNA 안정성에 영향을 미칠 수 있고, 이는 결국 단백질 번역의 수준에 영향을 미친다. 예시적인 서열 요소는 mRNA 안정성을 증가시키는 번역후 조절 요소(PRE)(예를 들어, 우드척 간염 PRE(WPRE))이다. 예시적인 프로모터, 인핸서, PRE, 및 본 개시내용의 벡터에서의 이들 요소의 배열은 도 307-316에 도시되어 있다.
본 개시내용의 제1 AAV 벡터의 일부 실시형태에서, 프로모터는 인트론 및 엑손 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 개시내용의 제1 AAV 벡터의 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 프로모터, 인트론 및 엑손 서열을 포함할 수 있다. 인트론 및 엑손 서열은 프로모터 서열의 하류일 수 있다. 인트론 및 엑손 서열은 프로모터 서열과 상류 ABCA4 핵산 서열(US-ABCA4) 사이에 위치할 수 있다. 인트론 및 엑손의 존재는 단백질 발현의 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 인트론은 프로모터와 엑손 사이에 위치한다. 인트론이 프로모터와 엑손 사이에 위치하는 실시형태를 포함하는 일부 실시형태에서, 엑손은 US-ABCA4 서열의 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 척추동물 유전자로부터 단리되거나 유래된 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 GRK1 프로모터 또는 닭 베타 액틴(CBA) 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV.CBA 프로모터, CBA.RGB 프로모터 또는 CBA.InEx 프로모터이다.
엑손은 코딩 서열, 비코딩 서열, 또는 둘 다의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑손은 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑손은 포유류 유전자로부터 단리되거나 유래된다. 실시형태에서, 포유류는 토끼(오릭톨라구스 쿠니쿨루스)이다. 일부 실시형태에서, 포유류 유전자는 토끼 베타 글로빈 유전자 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엑손은 CTCCTGGGCA ACGTGCTGGT TATTGTGCTG TCTCATCATT TTGGCAAAGA ATT(서열 번호 14)의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 엑손은 CTCCTGGGCA ACGTGCTGGT TATTGTGCTG TCTCATCATT TTGGCAAAGA ATT(서열 번호 14)의 핵산 서열과 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
인트론은 스플라이스 도너 부위, 스플라이스 억셉터 부위 또는 분지점을 포함할 수 있다. 인트론은 스플라이스 도너 부위, 스플라이스 억셉터 부위 및 분지점을 포함할 수 있다. 예시적인 스플라이스 억셉터 부위는 인트론의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 "GT"(pre-mRNA에서의 "GU")를 포함한다. 예시적인 스플라이스 억셉터 부위는 인트론의 3' 말단에서의 "AG"를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분지점은 인트론의 3' 말단의 상류에 20개 내지 40개의 뉴클레오타이드(종점 포함) 사이의 아데노신(A)을 포함한다. 인트론은 인공 또는 비자연 발생 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 인트론은 척추동물 유전자로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 인트론은 2개의 서열의 융합을 암호화하는 서열을 포함할 수 있고, 이들의 각각은 척추동물 유전자로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인트론 핵산 서열 또는 이의 일부가 유래된 척추동물 유전자는 닭(갈루스 갈루스) 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 닭 유전자는 닭 베타 액틴 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론 핵산 서열 또는 이의 일부가 유래된 척추동물 유전자는 토끼(오릭톨라구스 쿠니쿨루스) 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 토끼 유전자는 토끼 베타 글로빈 유전자 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론은
의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인트론은
의 핵산 서열과 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
제1(또는 상류) AAV 벡터의 일부 실시형태에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터(사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서와 닭 베타 액틴(CBA) 프로모터)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CMV 인핸서 서열은
의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 임의의 사이의 백분율 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 제1(또는 상류) AAV 벡터를 암호화하는 서열은 CBA 프로모터을 암호화하는 서열(CMV 인핸서 요소가 없음), 인트론을 암호화하는 서열 및 엑손을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CBA 프로모터 서열은
의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 임의의 사이의 백분율 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CBA 프로모터 서열은
의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 임의의 사이의 백분율 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인트론을 암호화하는 서열은 서열 번호 13의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 엑손을 암호화하는 서열은 서열 번호 14의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
제1 AAV 벡터는 프로모터와 상류 ABCA4 핵산 서열(즉, 5' UTR) 사이에 위치한 비번역된 영역(UTR)을 포함할 수 있다.
임의의 적합한 UTR 서열이 사용될 수 있고, 이의 선택은 숙련자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
UTR은 하기 요소 중 하나 이상을 포함하거나 이들로 이루어진다: 갈루스 β-액틴(CBA) 인트론 1 또는 이의 일부, 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈(RBG) 인트론 2 또는 이의 일부, 및 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈 엑손 3 또는 이의 일부.
UTR은 코작 공통 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 코작 공통 서열을 사용할 수 있다.
소정의 바람직한 실시형태에서, UTR은 서열 번호 6에 기재된 핵산 서열, 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 변이체 또는 이의 일부를 포함한다.
서열 번호 6의 UTR은 186개의 뉴클레오타이드 길이이고, 코작 공통 서열 바로 전에 갈루스 β-액틴(CBA) 인트론 1 단편(예측된 스플라이스 도너 부위를 가짐), 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈(RBG) 인트론 2 단편(예측된 분지점 및 스플라이스 억셉터 부위를 포함) 및 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈 엑손 3 단편을 포함한다.
상기 기재된 바와 같은 UTR, 특히 서열 번호 6에 기재된 바와 같은 UTR 서열 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 존재는 ABCA4 전이유전자로부터의 번역 수율을 증가시킬 수 있다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템의 제2("하류") AAV 벡터는 전사후 반응 요소(전사후 조절 요소로도 공지됨) 또는 PRE를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 PRE가 사용될 수 있고, 이의 선택은 숙련자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 적합한 PRE의 존재는 ABCA4 전이유전자의 발현을 향상시킬 수 있다.
소정의 바람직한 실시형태에서, PRE는 우드척 간염 바이러스 PRE(WPRE)이다. 소정의 특히 바람직한 실시형태에서, WPRE는 서열 번호 7에 기재된 바와 같은 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는다.
제2 AAV 벡터는 하류 ABCA4 핵산 서열의 3'에 위치한 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 폴리-아데닐화 서열이 사용될 수 있고, 이의 선택은 숙련자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 폴리-아데닐화 서열은 소 성장 호르몬(BGH) 폴리-아데닐화 서열이다. 특히 바람직한 실시형태에서, bGH 폴리-아데닐화 서열은 서열 번호 8에 기재된 바와 같은 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열을 암호화하는 서열은
의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 임의의 사이의 백분율 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템의 소정의 바람직한 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템의 소정의 바람직한 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기에 적합할 수 있다.
본 개시내용은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 기능적 ABCA4 단백질이 표적 세포에서 발현되도록 상기 기재된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터로 표적 세포를 형질도입하는 단계를 포함한다.
인간 ABCA4 단백질의 발현은 표적 세포가 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터 둘 다로 형질도입될 것을 요한다. 소정의 실시형태에서, 표적 세포는 임의의 순서로(제1 AAV 벡터, 이어서 제2 AAV 벡터, 또는 제2 AAV 벡터, 이어서 제1 AAV 벡터) 또는 동시에 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터로 형질도입될 수 있다.
AAV 벡터로 표적 세포를 형질도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 숙련자에게 친숙할 것이다.
표적 세포는 눈의 세포, 바람직하게는 망막 세포(예를 들어, 뉴런 광수용체 세포, 간상 세포, 원추 세포, 또는 망막 색소 상피 세포)일 수 있다.
본 개시내용은 또한 상기 정의된 바와 같은 제1 AAV 벡터를 제공한다. 상기 정의된 바와 같은 제2 AAV 벡터가 또한 제공된다.
본 개시내용은 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 105 내지 3805에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, 이 AAV 벡터는 인접한 뉴클레오타이드의 상기 서열 이외에 임의의 추가의 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
제1 AAV 벡터는 5' 및 3' ITR, 바람직하게는 AAV ITR; 프로모터, 예를 들어 GRK1 프로모터; 및/또는 UTR을 포함할 수 있고; 상기 요소는 본 개시내용의 AAV 벡터 시스템과 관련하여 상기 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV.CBA 프로모터, CBA.RGB 프로모터 또는 CBA.InEx 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열이되, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1640에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 G인 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 AAV 벡터는 서열 번호 3의 핵산 서열이되, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1640에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 G인 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
본 개시내용은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 3598 내지 6926에 상응하는 인접한 뉴클레오타이드의 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 이 AAV 벡터는 인접한 뉴클레오타이드의 상기 서열 이외에 임의의 추가의 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.
제2 벡터는 5' 및 3' ITR, 바람직하게는 AAV ITR; PRE, 바람직하게는 WPRE; 및/또는 폴리-아데닐화 서열, 바람직하게는 bGH 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있고; 상기 요소는 본 개시내용의 AAV 벡터 시스템과 관련하여 상기 기재된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함하고, 단 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 5279에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드는 G이고, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 6173에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드는 T, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다.
일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 AAV 벡터는 서열 번호 4의 핵산 서열이되, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 5279에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 G이고, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 6173에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 T인 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같은 AAV 벡터로부터 유래 가능한 AAV 벡터 게놈을 제공한다.
상기 기재된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하는 키트가 또한 제공된다. AAV 벡터는 AAV 입자의 형태로 키트에 제공될 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 핵산 및 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 키트가 추가로 제공된다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같은 AAV 벡터 시스템 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 AAV 벡터 시스템, 본 개시내용의 키트, 및 본 개시내용의 약제학적 조성물이 유전자 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 AAV 벡터 시스템, 본 개시내용의 키트, 및 약제학적 본 개시내용의 조성물은 질환을 예방하거나 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 질환을 예방하거나 치료하기 위한 본 개시내용의 조성물 및 방법의 용도는 ABCA4 단백질의 발현을 제공하도록 표적 세포에 대한 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터의 투여를 포함한다.
일부 실시형태에서, 예방되거나 치료되는 질환은 망막 세포의 분해를 특징으로 한다. 이러한 질환의 예는 스타르가르트병이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제1 및 제2 AAV 벡터는 기능적 ABCA4 단백질이 질환에 존재하는 돌연변이(들)를 보상하도록 발현되도록 환자의 눈, 예를 들어 눈의 망막 조직에 투여될 수 있다.
본 개시내용의 AAV 벡터는 약제학적 조성물 또는 약제로서 제제화될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 AAV 벡터 시스템은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하고; 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함하고; 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 추가의 예시적인 AAV 벡터 시스템은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하고; 제1 AAV 벡터는 서열 번호 9의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하고; 제2 AAV 벡터는 서열 번호 10의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법 및 용도는 또한 서열 번호 2가 서열 번호 1 대신에 기준 서열로서 사용될 때 수행될 수 있다.
이와 관련하여, 서열 번호 2는 하기 돌연변이를 배제하고 서열 번호 1과 동일하다: 뉴클레오타이드 1640 G>T, 뉴클레오타이드 5279 G>A, 뉴클레오타이드 6173 T>C. 이들 돌연변이는 암호화된 아미노산 서열을 변경하지 않고, 이에 따라 서열 번호 2에 의해 암호화된 ABCA4 단백질은 서열 번호 1에 의해 암호화된 ABCA4 단백질과 동일하다.
따라서, 본 개시내용의 대안적인 실시형태, 서열 번호 1에 대한 상기 참조는 서열 번호 2에 대한 참고로 대체될 수 있다.
또한 본원에 개시된 임의의 작제물은 대안적으로 상이한 프로모터, 예컨대, 예를 들어 CMV.CBA 프로모터, CBA.RBG 프로모터 또는 CBA.InEx 프로모터를 포함할 수 있다. 유사하게, 임의의 작제물은 서열 번호 6을 포함하거나 이것으로 이루어지는 5' ITR 및/또는 서열 번호 37을 포함하거나 이것으로 이루어지는 3' ITR을 포함할 수 있다.
서열 관련성
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에 상응하는"은 주어진 핵산 서열에서 뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때 특정 서열 번호에 대한 참조로 뉴클레오타이드 위치를 정의한다. 그러나, 이러한 참조가 이루어질 때, 본 개시내용이 언급된 특정 서열 번호에 기재된 바와 같은 정확한 서열로 제한되지 않고 이의 변이체 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 서열 번호 1에서의 뉴클레오타이드 위치에 상응하는 뉴클레오타이드는 예컨대 서열 정렬 프로그램을 사용하여 서열 정렬에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 이의 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 숙련자는 유전 코드의 축퇴성 성질이 주어진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에서의 변이가 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 존재할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 따라서, 다른 ABCA4 코딩 서열에서의 뉴클레오타이드 위치의 확인이 고려된다(즉, 숙련자가 예를 들어 서열 번호 1에서 확인된 위치에 상응함을 고려하는 위치에서의 뉴클레오타이드).
예로서, 서열 번호 2는 상기 기재된 바와 같은 3개의 특정 돌연변이를 배제하고 서열 번호 1과 동일하다(이들 3개의 돌연변이는 암호화된 ABCA4 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하지 않는다). 이 경우에, 숙련자는 따라서 서열 번호 2에서의 주어진 뉴클레오타이드 위치가 서열 번호 1에서의 균등한 넘버링된 뉴클레오타이드 위치에 상응함을 고려할 것이다.
AAV 벡터
본 개시내용의 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 본 개시내용의 AAV 벡터는 성숙 AAV 입자 또는 비리온, 즉 AAV 단백질 캡시드에 의해 둘러싸인 핵산의 형태일 수 있다.
AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
AAV 게놈은 일부 실시형태에서 AAV 입자의 생성에 대한 기능을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 이 기능은 예를 들어 AAV 입자로의 AAV 게놈의 캡시드화를 포함하는 숙주 세포에서 AAV의 복제 및 패키징 사이클에서 작동하는 것을 포함한다. 자연 발생 AAV는 복제-결핍이고, 복제 및 패키징 사이클의 완료에 대해 트랜스에서 헬퍼 기능의 제공에 의존한다. 따라서, 본 개시내용의 벡터의 AAV 게놈은 복제-결핍일 수 있다.
AAV 게놈은 양성 또는 음성-센스의 단일-가닥 형태, 또는 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 형태의 사용은 표적 세포에서 DNA 복제 단계의 바이패스를 허용하여서 전이유전자 발현을 가속시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터의 AAV 게놈은 단일-가닥 형태일 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 자연 유래된 혈청형, 단리물 또는 클래드 유래일 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 자연 발생 AAV의 완전 게놈일 수 있다. 숙련자에게 공지된 것처럼, 자연에서 생기는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.
AAV는 이의 혈청형의 면에서 칭해질 수 있다. 혈청형은 AAV의 변이체 하위종에 상응하고, 이는 캡시드 표면 항원의 발현의 이의 프로필로 인해 이것을 다른 변이체 하위종으로부터 구별하기 위해 사용될 수 있는 독특한 반응성을 갖는다. 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차반응하지 않는다.
AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 재조합 혈청형, 예컨대 영장류 뇌로부터 최근에 확인된 Rec2 및 Rec3을 포함한다. 임의의 이들 AAV 혈청형은 본 개시내용에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 또는 Rec3 AAV로부터 유래될 수 있다.
AAV 혈청형의 리뷰는 Choi 등 (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 및 Wu 등 (2006) Molecular Therapy 14: 316-27에서 발견될 수 있다. ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함하는 AAV 게놈 또는 AAV 게놈의 요소의 서열은 AAV 전체 게놈 서열에 대한 하기 수탁 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-연관된 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-연관된 바이러스 2 NC_001401; 아데노-연관된 바이러스 3 NC_001729; 아데노-연관된 바이러스 3B NC_001863; 아데노-연관된 바이러스 4 NC_001829; 아데노-연관된 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-연관된 바이러스 6 NC_001862; Avian AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; Avian AAV strain DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.
AAV는 또한 클래드 또는 클론의 면에서 칭해질 수 있다. 이것은 예를 들어 자연 유래된 AAV의 계통발생 관계, 또는 공통 조상으로 다시 추적될 수 있는 AAV의 계통발생 그룹을 지칭하고, 모든 이의 자손을 포함한다. 추가로, AAV는 특정 단리물, 즉 자연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 단리물의 면에서 칭해질 수 있다. 용어 유전적 단리물은 다른 천연 발생 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪어서 유전적 수준에서의 인식가능하게 별개의 집단을 한정하는 AAV의 집단을 기재한다.
숙련자는 이의 일반 상식에 기초하여 본 개시내용에서 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클래드, 클론 또는 단리물을 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전적 색각 결함의 성공적인 보정에 의해 입증된 바대로 효과적으로 원시 원추 광수용체를 형질도입하는 것으로 나타났다(Mancuso 등 (2009) Nature 461: 784-7).
AAV 혈청형은 AAV 바이러스의 감염(또는 굴성)의 조직 특이성을 결정할 수 있다. 따라서, 일부 바람직한 실시형태에서 본 개시내용의 환자에 투여되는 AAV에 사용하기 위한 AAV 혈청형은 눈 내에 표적 세포에 대한 천연 굴성 또는 이의 감염의 높은 효율을 갖는 것이다. 일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하기 위한 AAV 혈청형은 감각신경 망막, 망막 색소 상피 및/또는 맥락막의 세포를 감염시키는 것이다.
일부 실시형태에서, 자연 유래 혈청형의 AAV 게놈, AAV의 단리물 또는 클래드는 적어도 하나의 역상 말단 반복부 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능적 복제 기원을 제공하도록 시스로 작용할 수 있고, 세포의 게놈으로부터 벡터의 통합 및 절제를 허용한다. AAV 게놈은 패키징 유전자, 예컨대 AAV 입자에 대한 패키징 기능을 암호화하는 rep 및/또는 cap 유전자를 또한 포함할 수 있다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 암호화한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예컨대 VP1, VP2 및 VP3 또는 이들의 변이체를 암호화한다. 이 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 구성할 수 있다. 캡시드 변이체는 하기 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 각각의 패키징 유전자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 프로모터의 특정한 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다(Laughlin 등 (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 rep 유전자를 발현하도록 사용될 수 있지만, p40 프로모터는 cap 유전자를 발현하도록 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터에 사용된 AAV 게놈은 따라서 자연 발생 AAV의 완전 게놈일 수 있다. 예를 들어, 충전 AAV 게놈을 포함하는 벡터는 시험관내 AAV 벡터를 제조하도록 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 벡터는 원칙적으로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, AAV 게놈은 환자에 대한 투여의 목적을 위한 유도체일 것이다. 이러한 유도체화는 당해 분야에 공지되어 있고, 본 개시내용은 AAV 게놈의 임의의 공지된 유도체, 및 당해 분야에 공지된 기법을 적용하여 생성될 수 있는 유도체의 사용을 포함한다. AAV 게놈 및 AAV 캡시드의 유도체화는 상기 언급된 Coura 및 Nardi (2007) Virology Journal 4: 99, 및 Choi 등 및 Wu 등에 검토되어 있다.
AAV 게놈의 유도체는 생체내 본 개시내용의 벡터로부터의 전이유전자의 발현을 허용하는 AAV 게놈의 임의의 절두된 또는 변형된 형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 최소 바이러스 서열을 포함하지만 상기 기능을 보유하게 하도록 AAV 게놈을 절두시킬 수 있다. 이것은 야생형 바이러스에 의한 벡터의 재조합의 위험을 감소시키는 것, 및 또한 표적 세포에서 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의해 세포 면역 반응의 촉발을 회피하는 것의 예에 의해 AAV 게놈의 안전성에 기여할 수 있다.
AAV 게놈의 유도체는 적어도 하나의 역상 말단 반복부 서열(ITR)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈의 유도체는 하나 초과의 ITR, 예컨대 2개 이상의 ITR을 포함할 수 있다. ITR 중 하나 이상은 상이한 혈청형을 갖는 AAV 게놈으로부터 유래될 수 있거나, 키메라 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다. 예시적인 돌연변이체 ITR은 trs의 결실을 갖는 것(말단 용해 부위)이다. 이 결실은 코딩 및 상보성 서열 둘 다를 함유하는 단일-가닥 게놈, 즉 자가 상보성 AAV 게놈을 생성하기 위해 게놈의 계속된 복제를 허용한다. 이는 표적 세포에서 DNA 복제의 바이패스를 허용하고, 그래서 가속된 전이유전자 발현이 가능하게 한다.
하나 이상의 ITR의 포함은 예를 들어 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 이중-가닥 DNA로의 단일-가닥 벡터 DNA의 전환 후에 숙주 세포의 핵에서 본 개시내용의 벡터의 콘카타머 형성을 도울 수 있다. 이러한 에피솜 콘카타머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호하여서 생체내 전이유전자의 연장된 발현을 허용한다.
일부 바람직한 실시형태에서, ITR 요소는 오로지 유도체에서 자연적 AAV 게놈으로부터 보유된 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 자연적 게놈의 rep 및/또는 cap 유전자 및 자연적 게놈의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 수 있다. 이는 또한 숙주 세포 게놈으로의 벡터의 통합의 가능성을 감소시킬 수 있다. 추가로, AAV 게놈의 크기의 감소는 전이유전자 이외에 벡터 내에 다른 서열 요소(예컨대 조절 요소)를 혼입하는 데 있어서 증가된 가요성을 허용한다.
하기 부분은 본 개시내용의 유도체에서 제거될 수 있다: 하나의 역상 말단 반복부(ITR) 서열, 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자. 그러나, 일부 실시형태에서, 유도체는 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 AAV 게놈의 다른 바이러스 서열을 추가로 포함할 수 있다. 자연 발생 AAV는 인간 염색체 19에서 특정 부위에서 높은 빈도로 통합하고, 랜덤 통합의 무시할 만한 빈도를 보여주어서, 벡터에서의 통합 커패시티의 보유는 치료학적 설정에서 관용될 수 있다.
유도체가 캡시드 단백질, 즉 VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 자연 발생 AAV의 키메라, 셔플링된 또는 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 본 개시내용은 동일한 벡터(즉, 위형화된 벡터) 내에 AAV의 상이한 혈청형, 클래드, 클론 또는 단리물로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포함한다.
키메라, 셔플링된 또는 캡시드-변형된 유도체는 바이러스 벡터에 대한 하나 이상의 기능을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 이 유도체는 자연 발생 AAV 게놈, 예컨대 AAV2의 것을 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 특정 세포 유형의 유전자 전달, 감소된 면역원성(체액성 또는 세포성), 변경된 굴성 범위 및/또는 개선된 표적화의 증가된 효율을 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 증가된 효율은 세포 표면에서의 개선된 수용체 또는 동시수용체, 개선된 내제화, 세포 내의 및 핵으로의 개선된 통횡, 바이러스 입자의 개선된 비코팅 및 이중-가닥 형태로의 단일-가닥 게놈의 개선된 전환에 의해 실행될 수 있다. 증가된 효율은 또한 특정 세포 집단의 변경된 굴성 범위 또는 표적화와 관련될 수 있어서, 벡터 용량은 이것이 필요하지 않는 조직에 대한 투여에 의해 희석되지 않는다.
키메라 캡시드 단백질은 자연 발생 AAV 혈청형의 2개 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 생성된 것을 포함한다. 이것은 예를 들어 하나의 혈청형의 비감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열로 동시형질주입된 마커 구제 접근법에 의해 수행될 수 있고, 지시된 선택은 원하는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선택하도록 사용된다. 상이한 혈청형의 캡시드 서열은 신규의 키메라 캡시드 단백질을 제조하도록 세포 내에 상동성 재조합에 의해 변경될 수 있다.
본 개시내용의 키메라 캡시드 단백질은 또한 2개 이상의 캡시드 단백질 사이에, 예를 들어 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질 사이에 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기를 이동시키도록 캡시드 단백질 서열의 조작에 의해 생성된 것을 포함한다.
셔플링된 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링 또는 오류 발생이 쉬운 PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련된 AAV 유전자의 서열, 예를 들어 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 코딩하는 것을 랜덤으로 단편화하는 것 및 이후 후속하여 자가-프라이밍 중합효소 반응에서 단편을 재어셈블링하는 것에 의해 생성될 수 있고, 이 반응은 또한 서열 상동성의 영역에서 크로스오버를 야기할 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링함으로써 이러한 방식으로 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리는 원하는 기능을 갖는 바이러스 클론을 확인하도록 스크리닝될 수 있다. 유사하게, 오류 발생이 쉬운 PCR은 원하는 특성에 변이체의 다양한 라이브러리를 생성하도록 AAV 캡시드 유전자를 랜덤으로 돌연변이시키도록 사용될 수 있고, 이 변이체는 이후 원하는 원하는 특성에 대해 선택된다.
캡시드 유전자의 서열은 자연적 야생형 서열과 관련하여 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입하도록 또한 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 오픈 리딩 프레임 내에, 또는 캡시드 코딩 서열의 N 및/또는 C 말단에서 비관련된 단백질 또는 펩타이드의 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다.
비관련된 단백질 또는 펩타이드는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용하는 것일 수 있어서, 표적 세포에 대한 개선된 결합 또는 특정 세포 집단에 대한 벡터의 표적화의 개선된 특이성을 부여한다. 비관련된 단백질은 또한 제조 공정의 일부로서 바이러스 입자의 정제를 보조하는 것, 즉 에피토프 또는 친화도 태그일 수 있다. 삽입의 부위는 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어 내재화, 바이러스 입자의 통횡을 간섭하지 않도록 선택될 수 있다. 숙련자는 이의 일반 상식에 기초하여 적합한 삽입 부위를 확인할 수 있다. 특정 부위는 상기 참조된 Choi 등의 문헌에 개시되어 있다.
본 개시내용은 추가로 자연적 AAV 게놈의 것과 상이한 순서 및 배향의 AAV 게놈의 서열의 제공을 포함한다. 본 개시내용은 또한 다른 바이러스로부터의 서열 또는 하나 초과의 바이러스로부터의 서열로 이루어진 키메라 유전자에 의한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자의 대체를 포함한다. 이러한 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 2개 이상의 관련된 바이러스 단백질로부터의 서열로 이루어질 수 있다.
본 개시내용의 AAV 벡터는 트랜스캡시드화 형태를 포함하는데, 여기서 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 게놈 또는 유도체는 상이한 혈청형의 캡시드에 패키징된다. 본 개시내용의 AAV 벡터는 또한 모자이크 형태를 포함하는데, 여기서 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 비변형된 캡시드 단백질의 혼합물은 바이러스 캡시드를 구성한다. AAV 벡터는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리단드를 보유하는 화학적으로 변형된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화하기 위한 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 개시내용의 AAV 벡터는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/2), AAV2 게놈 및 AAV5 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/5) 및 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/8)을 포함한다.
본 개시내용의 AAV 벡터는 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 벡터는 돌연변이체 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 AAV8 캡시드 단백질은 AAV8 Y733F 캡시드 단백질이다. 일부 실시형태에서, AAV8 Y733F 돌연변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 12의 733번 위치에서의 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환으로 서열 번호 12와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV8 Y733F 돌연변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 12의 733번 위치에서의 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환으로 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
AAV RPGR 약물 제품
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 약물 제품을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 약물 제품은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 대상체에 대한 투여를 위해 제형화된 약물 물질을 포함한다.
본 개시내용의 예시적인 약물 제품의 성분, 이의 기능 및 사양은 표 1A에 기재되어 있다.
표 1A: AAV2-작제물 약물 제품의 조성
AAV-RPGR 투여형
본 개시내용의 조성물은 전신 또는 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 주사 또는 주입을 위한 현택액으로서 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 비제한적인 예로서, 유리체내 주사 또는 주입, 망막하 주사 또는 주입, 또는 맥락막상 주사 또는 주입을 포함하는 임의의 경로에 의한 주사 또는 주입을 위해 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 0.5 x 10^11 DRP/mL 내지 1.0 x 10^12 DRP/mL(종점 포함)의 농도에서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 0.5 x 10^11 또는 0.5 x 10^11 DRP/ml의 농도에서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 0.5 x 10^11 DRP/mL의 농도에서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 1 x 10^12 DRP/mL의 농도에서 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-RPGRORF15 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-작제물 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하지 않다.
표 1A에 기재된 AAV-RPGRORF15 작제물 약물 제품을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 0.5 x 10^11 DRP/mL 내지 1.0 x 10^13 DRP/mL의 AAV 입자(종점 포함)를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 표 1A에 기재된 AAV-RPGRORF15 작제물 약물 제품을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 2.5 x 10^12 DRP/mL 내지 5 x 10^12 DRP/mL DRP/mL의 AAV 입자(종점 포함)를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표 1A에 기재된 AAV-RPGRORF15 약물 제품은 0.5 x 10^11 DRP/mL, 2.5 x 10^12 DRP/mL, 0.5 x 10^12 DRP/mL, 5 x 10^12 DRP/mL 또는 1.0 x 10^13 DRP/mL의 AAV 입자를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 프로토콜에 의해 필요하면, AAV-RPGRORF15 약물 제품은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 클리닉에서(즉, 의학 전문가에 의해) 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 희석제는 AAV-RPGRORF15 약물 제품의 제조에 사용된 동일한 제형 완충액이다.
본 개시내용의 조성물은 충전 및 빈 AAV 입자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 충전 AAV 입자는 본 개시내용의 AAV-RPGRORF15 작제물을 암호화하는 단일 가닥 DNA를 포함한다. 숙련자는 AAV 입자가 예를 들어 주사 전자 현미경 분석, qPCR 또는 ddPCR을 통해 충전 또는 빈인지를 결정할 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 65%, 적어도 67%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 76%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 충전 AAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 70%의 충전 AAV 입자를 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-RPGRORF15 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-RPGRORF15 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하지 않다.
표 1A에 기재된 AAV-RPGRORF15 약물 제품을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 0.5 x 10^11 DRP/mL 내지 1.0 x 10^12 DRP/mL(종점 포함)를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표 1A에 기재된 AAV-RPGRORF15 약물 제품을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 1.0 x 10^12 DRP/mL 내지 5 x 10^12 DRP/mL, 예를 들어, 2.5 x 10^12 DRP/mL 또는 5 x 10^12 DRP/mL를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표 1A에 기재된 AAV-RPGRORF15 약물 제품을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 0.5 x 10^11 DRP/mL, 2.5 x 10^12 DRP/mL, 5 x 10^12 DRP/mL 또는 1.0 x 10^12 DRP/mL를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 프로토콜에 의해 필요하면, AAV-RPGRORF15 약물 제품은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 클리닉에서(즉, 의학 전문가에 의해) 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 희석제는 AAV-RPGRORF15 약물 제품의 제조에 사용된 동일한 제형 완충액이다.
AAV ABCA4 약물 제품
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 약물 제품을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 약물 제품은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 대상체에 대한 투여를 위해 제형화된 약물 물질을 포함한다.
본 개시내용의 예시적인 약물 제품의 성분, 이의 기능 및 사양은 표 1B에 기재되어 있다.
표 1B: AAV2-작제물 약물 제품의 조성
AAV-ABCA4 투여형
본 개시내용의 조성물은 전신 또는 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 주사 또는 주입을 위한 현택액으로서 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 비제한적인 예로서, 유리체내 주사 또는 주입, 망막하 주사 또는 주입, 또는 맥락막상 주사 또는 주입을 포함하는 임의의 경로에 의한 주사 또는 주입을 위해 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 각각 상류 및/또는 하류 벡터에 대해 0.5 x 10^11 DRP/mL 내지 1.0 x 10^12 DRP/mL(종점 포함)의 농도로 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-ABCA4 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-작제물 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하지 않다.
표 1B에 기재된 AAV-ABCA4 작제물 약물 제품을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 각각 상류 및/또는 하류 벡터에 대해 0.5 x 10^11 DRP/mL 내지 1.0 x 10^13 DRP/mL를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 프로토콜에 의해 필요하면, AAV-ABCA4 약물 제품은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 클리닉에서(즉, 의학 전문가에 의해) 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 희석제는 AAV-ABCA4 약물 제품의 제조에 사용된 동일한 제형 완충액이다.
본 개시내용의 조성물은 충전 및 빈 AAV 입자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 충전 AAV 입자는 본 개시내용의 AAV-ABCA4 작제물을 암호화하는 단일 가닥 DNA를 포함한다. 숙련자는 AAV 입자가 예를 들어 주사 전자 현미경 분석, qPCR 또는 ddPCR을 통해 충전 또는 빈인지를 결정할 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 65%, 적어도 67%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 76%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 충전 AAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 70%의 충전 AAV 입자를 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-ABCA4 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하다. 일부 실시형태에서, 희석제는 AAV-ABCA4 약물 제품의 제조에 사용된 제형 완충액과 동일하지 않다.
표 1B에 기재된 AAV-ABCA4 약물 제품을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 각각 상류 및/또는 하류 벡터에 대해 0.5 x 10^11 DRP/mL 및 1.0 x 10^12 DRP/mL의 AAV 입자(종점 포함)를 함유하는 주사를 위한 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 프로토콜에 의해 필요하면, AAV-ABCA4 약물 제품은 본 개시내용의 희석제를 사용한 투여 전에 클리닉에서(즉, 의학 전문가에 의해) 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 희석제는 AAV-ABCA4 약물 제품의 제조에 사용된 동일한 제형 완충액이다.
AAV-RPGR 약제학적 제형
본 개시내용의 조성물은 약물 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 물질은 AAV-RPGRORF15를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 약물 물질은 AAV-RPGRORF15 및 제형 완충액을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제형 완충액은 20 mM Tris, 1 mM MgCl2 및 pH 8에서의 200 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형 완충액은 20 mM Tris, 1 mM MgCl2 및 pH 8에서의 200 mM NaCl과 함께 0.001%에서의 폴록사머 188을 포함한다.
부형제
본 개시내용의 조성물은 약물 제품을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 제품은 약물 물질 및 제형 완충액을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 약물 제품은 제형 완충액 중에 희석된 약물 물질을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 약물 제품은 제형 완충액 중에 최종 약물 제품 AAV-RPGRORF15 벡터 게놈(vg) 농도로 희석된 AAV8-RPGRORF15 약물 물질을 포함하거나 이들로 이루어진다.
눈 제형
본 개시내용의 조성물은 눈 주사 또는 주입을 위한 최적 농도에서 AAV-RPGRORF15 약물 물질을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지거나 이루어지도록 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 AAV의 안정성을 증가시키거나 향상시키도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 AAV의 안정성을 보장하거나 향상시키도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 또한, 본 개시내용의 조성물은 AAV 입자 응집을 방지하거나 감소시키거나 최소화하도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 AAV 입자 응집을 방지하거나 감소시키거나 최소화하도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 중성 또는 약간 염기성 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7 내지 9(종점 포함)의 중성 또는 약간 염기성 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 8의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7.5 내지 8.5의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7.7 내지 8.3의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7.9 및 8.1의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 8의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다.
본 개시내용의 조성물 및 세포의 접촉 후에, AAV-작제물은 유전자 또는 이의 일부를 발현하여서, 유전자 또는 이의 일부에 의해 암호화된 생성물을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 세포는 표적 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 망막 세포이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 뉴런이다. 일부 실시형태에서, 뉴런은 광수용체이다. 일부 실시형태에서, 세포는 생체내, 시험관내, 생체외 또는 인시츄이다. 세포가 생체내인 것을 포함하는 일부 실시형태에서, 접촉은 대상체에 대한 조성물의 투여 후에 발생한다. 일부 실시형태에서, AAV-작제물은 유전자 또는 이의 일부를 발현하여서, 유전자 생성물의 치료학적 유효 수준의 발현에서 유전자 또는 이의 일부에 의해 암호화된 생성물을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 유전자 생성물은 단백질이다.
망막하 배치 제형
본 개시내용의 조성물은 배치당 1 내지 1000 바이알(종점 포함)의 스케일에서 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 50 내지 500 바이알(종점 포함)의 스케일에서 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 100 내지 250 바이알(종점 포함)의 스케일에서 제조될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 배치는 본 개시내용의 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품의 0.01 mL 내지 100 mL(종점 포함)를 포함할 수 있다.
표 2A: AAV-RPGRORF15 약물 제품의 바이알에 대한 예시적인 배체 제제
약물 제품을 제조하기 위한 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 약물 물질은 +35±2℃에서 해동되고, 표적 농도(예를 들어, 0.5 x 10^12 DRP/mL, 5 x 10^12 DRP/mL 또는 1.0 x 10^13 DRP/mL)로 무균 제형 완충액 중에 필요한 바대로 희석된다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 약물 제품의 표적 최종 DRP 역가는 1 x 10^13 DRP/mL이고, 최소 및 최대 허용 가능한 역가는 각각 1.0 x 10^12 DRP/mL 및 3.0 x 10^13 DRP/mL이다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 약물 제품의 표적 최종 DRP 역가는 5 x 10^12 DRP/mL이다. 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 약물 제품은 무균 여과되고, 10X 희석까지의 희석 후 또는 희석 없이 투여를 위해 0.5 ml의 폴리프로필렌 관 또는 0.5 mL Crystal Zenith®(환식 올레핀 중합체) 바이알로 충전된다.
바이알은 이후 -60℃ 이하에서 동결되고 저장된다. QP 출하 및 부지로의 유통 전에 라벨링 및 저장을 위해, 약물 제품은 자격있는 임상 판매사로 이동된다. 약물 제품은 QP 출하 및 유통까지 온도 제어된 동결기에서 -60℃ 이하에서 저장된다.
AAV-RPGRORF15 약물 제품은 망막하 전달을 위한 마이크로전달 장치로 프리필드될 수 있다. 망막하 전달에 적합한 마이크로전달 장치는 마이크로침을 포함할 수 있고, AAV-RPGRORF15 약물 제품은 마이크로전달 장치에서 프리필드된, 실온 또는 프리필드된 저온 저장을 위해 추가로 제형화될 수 있다.
맥락막상 배치 제형
본 개시내용의 조성물은 배치당 1 내지 1000 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 50 내지 500 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 100 내지 250 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 배치는 본 개시내용의 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품의 0.01 mL 및 500 mL(종점 포함)를 포함할 수 있다.
표 3A: AAV-RPGRORF15 약물 제품의 바이알에 대한 예시적인 배체 제제
약물 제품을 제조하기 위한 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 약물 물질은 +35±2℃에서 해동되고, 표적 농도(예를 들어, 0.5 x 10^12 DRP/mL, 5 x 10^12 DRP/mL 또는 1.0 x 10^13 DRP/mL)로 무균 제형 완충액 중에 필요한 바대로 희석된다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 약물 제품의 표적 최종 DRP 역가는 1 x 10^13 DRP/mL이고, 최소 및 최대 허용 가능한 역가는 각각 1.0 x 10^12 DRP/mL 및 3.0 x 10^13 DRP/mL이다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 약물 제품의 표적 최종 DRP 역가는 5 x 10^12 DRP/mL이다. 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 약물 제품은 무균 여과되고, 10X 희석까지의 희석 후 또는 희석 없이 투여를 위해 0.5 ml의 폴리프로필렌 관 또는 0.5 mL Crystal Zenith®(환식 올레핀 중합체) 바이알로 충전된다.
바이알은 이후 -60℃ 이하에서 동결되고 저장된다. QP 출하 및 부지로의 유통 전에 라벨링 및 저장을 위해, 약물 제품은 자격있는 임상 판매사로 이동된다. 약물 제품은 QP 출하 및 유통까지 온도 제어된 동결기에서 -60℃ 이하에서 저장된다.
AAV-RPGRORF15 약물 제품은 맥락막상 전달을 위한 마이크로전달 장치로 프리필드될 수 있다. 맥락막상 전달에 적합한 마이크로전달 장치는 마이크로카테터를 포함할 수 있고, AAV-RPGRORF15 약물 제품은 마이크로전달 장치에서 프리필드된, 실온 또는 프리필드된 저온 저장을 위해 추가로 제형화될 수 있다.
AAV-ABCA4 약제학적 제형
본 개시내용의 조성물은 약물 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 물질은 AAV-ABCA4를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 약물 물질은 AAV-ABCA4 및 제형 완충액을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제형 완충액은 20 mM Tris, 1 mM MgCl2 및 pH 8에서의 200 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형 완충액은 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 및 pH 8에서의 200 mM NaCl과 0.001%에서의 폴록사머 188을 포함한다.
부형제
본 개시내용의 조성물은 약물 제품을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 제품은 약물 물질 및 제형 완충액을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 약물 제품은 제형 완충액 중에 희석된 약물 물질을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 약물 제품은 제형 완충액 중에 최종 약물 제품 AAV-ABCA4 벡터 게놈(vg) 농도로 희석된 AAV8-ABCA4 약물 물질을 포함하거나 이들로 이루어진다.
눈 제형
본 개시내용의 조성물은 눈 주사 또는 주입을 위한 최적 농도에서 AAV-ABCA4 약물 물질을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지거나 이루어지도록 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 AAV의 안정성을 증가시키거나 향상시키도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 AAV의 안정성을 보장하거나 향상시키도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 또한, 본 개시내용의 조성물은 AAV 입자 응집을 방지하거나 감소시키거나 최소화하도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 AAV 입자 응집을 방지하거나 감소시키거나 최소화하도록 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 중성 또는 약간 염기성 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7 내지 9(종점 포함)의 중성 또는 약간 염기성 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 8의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7.5 내지 8.5의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7.7 내지 8.3의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 7.9 및 8.1의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 8의 pH를 유도하거나 유지시키는 하나 이상의 성분을 포함한다.
본 개시내용의 조성물 및 세포의 접촉 후에, AAV-작제물은 유전자 또는 이의 일부를 발현하여서, 유전자 또는 이의 일부에 의해 암호화된 생성물을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 세포는 표적 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 망막 세포이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 뉴런이다. 일부 실시형태에서, 뉴런은 광수용체이다. 일부 실시형태에서, 세포는 생체내, 시험관내, 생체외 또는 인시츄이다. 세포가 생체내인 것을 포함하는 일부 실시형태에서, 접촉은 대상체에 대한 조성물의 투여 후에 발생한다. 일부 실시형태에서, AAV-작제물은 유전자 또는 이의 일부를 발현하여서, 유전자 생성물의 치료학적 유효 수준의 발현에서 유전자 또는 이의 일부에 의해 암호화된 생성물을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 유전자 생성물은 단백질이다.
망막하 배치 제형
본 개시내용의 조성물은 배치당 1 내지 1000 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 50 내지 500 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 100 내지 250 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 배치는 본 개시내용의 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품의 0.01 mL 및 100 mL(종점 포함)를 포함할 수 있다.
표 2B: AAV-ABCA4 약물 제품의 바이안에 대한 예시적인 배치 제제
약물 제품을 제조하기 위한 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 약물 물질은 +35±2℃에서 해동되고, 표적 농도(예를 들어, 0.5 x 10^12 DRP/mL, 5 x 10^12 DRP/mL 또는 1.0 x 10^13 DRP/mL)로 무균 제형 완충액 중에 필요한 바대로 희석된다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-RPGRORF15 약물 제품의 표적 최종 DRP 역가는 1 x 10^13 DRP/mL이고, 최소 및 최대 허용 가능한 역가는 각각 1.0 x 10^12 DRP/mL 및 3.0 x 10^13 DRP/mL이다. 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 약물 제품은 무균 여과되고, 10X 희석까지의 희석 후 또는 희석 없이 투여를 위해 0.5 ml의 폴리프로필렌 관 또는 0.5 mL Crystal Zenith®(환식 올레핀 중합체) 바이알로 충전된다.
바이알은 이후 -60℃ 이하에서 동결되고 저장된다. QP 출하 및 부지로의 유통 전에 라벨링 및 저장을 위해, 약물 제품은 자격있는 임상 판매사로 이동된다. 약물 제품은 QP 출하 및 유통까지 온도 제어된 동결기에서 -60℃ 이하에서 저장된다.
AAV-ABCA4 약물 제품은 망막하 전달을 위한 마이크로전달 장치로 프리필드될 수 있다. 망막하 전달에 적합한 마이크로전달 장치는 마이크로침을 포함할 수 있고, AAV-ABCA4 약물 제품은 마이크로전달 장치에서 프리필드된, 실온 또는 프리필드된 저온 저장을 위해 추가로 제형화될 수 있다.
맥락막상 배치 제형
본 개시내용의 조성물은 배치당 1 내지 1000 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 50 내지 500 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품은 배치당 100 내지 250 바이알(종점 포함)의 스케일로 제조될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 배치는 본 개시내용의 조성물, 약물 물질, 또는 약물 제품의 0.01 mL 및 500 mL(종점 포함)를 포함할 수 있다.
표 3B: AAV-ABCA4 약물 제품의 바이안에 대한 예시적인 배치 제제
약물 제품을 제조하기 위한 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 약물 물질은 +35±2℃에서 해동되고, 표적 농도(예를 들어, 0.5 x 10^12 DRP/mL, 5 x 10^12 DRP/mL 또는 1.0 x 10^13 DRP/mL)로 무균 제형 완충액 중에 필요한 바대로 희석된다.
본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 약물 제품의 표적 최종 DRP 역가는 1 x 10^13 DRP/mL이고, 최소 및 최대 허용 가능한 역가는 각각 1.0 x 10^12 DRP/mL 및 3.0 x 10^13 DRP/mL이다. 일부 실시형태에서, AAV-ABCA4 약물 제품은 무균 여과되고, 10X 희석까지의 희석 후 또는 희석 없이 투여를 위해 0.5 ml의 폴리프로필렌 관 또는 0.5 mL Crystal Zenith®(환식 올레핀 중합체) 바이알로 충전된다.
바이알은 이후 -60℃ 이하에서 동결되고 저장된다. QP 출하 및 부지로의 유통 전에 라벨링 및 저장을 위해, 약물 제품은 자격있는 임상 판매사로 이동된다. 약물 제품은 QP 출하 및 유통까지 온도 제어된 동결기에서 -60℃ 이하에서 저장된다.
AAV-ABCA4 약물 제품은 맥락막상 전달을 위한 마이크로전달 장치로 프리필드될 수 있다. 맥락막상 전달에 적합한 마이크로전달 장치는 마이크로침을 포함할 수 있고, AAV-ABCA4 약물 제품은 마이크로전달 장치에서 프리필드된, 실온 또는 프리필드된 저온 저장을 위해 추가로 제형화될 수 있다.
조성물의 저장
조성물이 약물 제품을 포함하고 조성물이 무균 바이알에 제공되는 것을 포함하는 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 0(℃) 미만에서 저장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약물 제품의 효능 또는 무균 패키징에 대한 통합성의 소실 없이 해동되고 동결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약물 제품의 효능 또는 무균 패키징에 대한 통합성의 소실 없이 다수의 회차의 해동 및 동결을 겪을 수 있다.
조성물이 약물 제품을 포함하고 조성물이 무균 바이알에 제공되는 것을 포함하는 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 조성물은 실온에서 저장될 수 있다.
유기 재료
본 개시내용의 완충액 및 배지의 제조에 사용된 출발 재료는 동물 기원의 재료가 없음이 인증된다.
필터 및 크로마토그래피 매트릭스
약물 물질 및 약물 제품의 여과에 사용된 필터의 비제한적인 예는 Sartopore 0.45 μm 및 0.2 μm 필터이다. 필터는 구매될 때 비무균이고, 오토클레이빙에 의해 접촉 제조사에 의해 인하우스에서 무균된다. 일부 실시형태에서, 필터는터 역치 압력(예를 들어, 3.2 Bars)에서 버블점에 의해 통합성 시험된다.
모든 크로마토그래피 재료는 사용 전에 분석 인증서에 출하된다. 칼럼은 프리패키징되어 구매되고 사용 전에 위생처리된다.
AAV-작제물 약물 제품의 제조 방법
세포 빌드
10 계대배양을 포함하는 예시적인 패키징 프로토콜은 도 1에 도시되어 있다. 간단히, 출발 HEK293 세포를 T25 플라스크 및 성장 배지(배지는 표 7에 요약됨)에서 5일 동안 배양하였다. 5일 후 HEK293 세포를 T175 배양 플라스크로 옮기고, 추가 4일 동안 배양하고, 4개의 T175 플라스크로 분할하였다. 세포를 추가 3일 동안 배양하고, 이후 2개의 CF-1 Cell Factories(예를 들어, NuncTM brand Cell Factories)로 옮겼다. 세포를 추가 4일 동안 배양하고, 2개의 CF-1 Cell Factories로 옮기고, 추가 3일 동안 배양하고, 2개의 CF-1 Cell Factories로 옮기고, 추가 4일 동안 배양하고, 2개의 CF-2 Cell Factories로 옮겼다. 세포를 추가 2일 동안 배양하고, 2개의 CF-10 Cell Factories로 분할하고, 추가 4일 동안 배양하고, 6개의 CF-10 Cell Factories로 분할하고, 추가 3일 동안 배양하고, 20개의 HYPERstack으로 옮겼고, 이것은 36개의 적층된 부착성 세포 배양 용기이다. 세포를 형질주입 전에 HYPERstack에서 추가 3일 동안 배양하였다.
T25 플라스크 내지 T175 플라스크: 배지를 버리고, 세포를 예열된 PBS로 세척하였다. 세포를 TrypLE 세포 해리 시약으로 헐겁게 한다. T-플라스크 또는 세포 Stacks을 37±1℃에서 설정된 항온처리기에서 5 내지 10분 항온처리하고, 세포를 용기를 온화하게 탭핑하면서 완전히 없어지게 한다. 성장 배지를 TrypLE를 억제하도록 첨가한다. 상이한 지지체에 사용된 성장 배지, PBS 및 TrypLE의 부피는 표 6에 제시된다. 모든 세포 현탁액을 이후 혼주한다.
세포 계수치 및 세포 생존능력은 결정되고, 세포를 시딩하고, 항온처리하고, 표 4에 따라 계대배양한다.
본 개시내용의 세포 빌드 공정은 사용된 HYPERstack의 수에 따라 확대 또는 축소 조정될 수 있다 HYPERstack의 사용은 세포 배양의 더 양호한 확장성 및 효율을 제공한다.
형질주입
하기 온도, 기간, 스핀 속도 및 부피는 다른 인자들 중에서 사용된 세포 유형에 따라 최적 결과에 대해 조정될 수 있다. 하기 기재된 예시적인 실시형태에 대해, 조건은 HEK293 세포의 사용에 대해 최적화되었다. 이 방법은 대규모 제조에 최적화될 수 있다.
본 개시내용의 AAV 작제물을 제조하는 데 사용된 예시적인 형질주입 공정은 단계를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 플라스미드 DNA(예를 들어, RPGRORF15 또는 ABCA4 서열을 포함하는 AAV 작제물을 암호화하는 플라스미드, Ad5 헬퍼 기능을 암호화하는 플라스미드 및 AAV8 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 플라스미드) 및 형질주입 조성물(예를 들어, 중합체 또는 PEI를 포함)은 각각 DNA 형질주입 조성물 및 희석된 형질주입 조성물을 제조하도록 형질주입 용액으로 별개로 희석된다. 희석된 형질주입 조성물은 DNA 형질주입 조성물에 첨가되고, 형질주입 가능한 DNA 조성물을 제조하도록 실온에서 항온처리된다. 생성된 형질주입 가능한 DNA 조성물은 형질주입 배지에 첨가된다. 성장 배지는 HYPERstack으로부터 제거되고, 형질주입 가능한 DNA 조성물을 포함하는 형질주입 배지는 빈 HYPERstack에 첨가된다. HYPERstack은 적어도 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 28시간, 32시간, 36시간, 40시간, 44시간 또는 48시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리된다.
본 개시내용의 AAV 작제물을 제조하는 데 사용된 예시적인 형질주입 공정의 요약은 도 10에 도시된다. 플라스미드 DNA(예를 들어, RPGRORF15 또는 ABCA4 서열을 포함하는 AAV 작제물을 암호화하는 플라스미드, 및 AAV8 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 플라스미드) 및 폴리에틸렌이민(PEI) 형질주입 시약, PEIpro®(Polyplus Transfection)는 형질주입 용액에 별개뢰 희석된다. PEIpro® 용액은 DNA 용액에 적가로 첨가되고, 실온에서 10분 동안 항온처리된다. 생성된 DNA/PEIpro® 용액은 형질주입 배지에 첨가된다. 성장 배지는 HYPERstack으로부터 제거되고, DNA/PEIpro® 용액을 포함하는 형질주입 배지는 빈 HYPERstack에 첨가된다. HYPERstack은 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리된다.
플라스미드 및 PEI는 형질주입 배지에 의해 제조된다(표 5).
소정의 실시형태에서, 플라스미드 DNA의 양은 표 6에 제시된다.
특정 실시형태에서, PEIpro® 대 DNA 비(mL:mg)는 각각 약 0.5:1 내지 약 5:1, 또는 약 1:1 내지 약 5:1, 선택적으로 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 또는 약 2:1이다. 소정의 실시형태에서, 형질주입은 PEI를 사용하여 수행되고, 여기서 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 1:1:1의 몰비로 제공된다. 소정의 실시형태에서, 형질주입은 각각 약 0.5:1 내지 5:1 또는 약 1:1 내지 약 5:1, 선택적으로 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 또는 약 2:1의 PEI:DNA 비(mL:mg)에서 PEI를 사용하여 수행되고, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 약 0.5:1:1 내지 약 10:1:1, 약 1:1:1 내지 약 10:1:1, 약 2:1:1 내지 약 10:1:1 선택적으로 약 0.5:1:1, 약 1:1:1, 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 약 9:1:1, 또는 약 10:1:1의 몰비로 제공된다. 소정의 실시형태에서, 형질주입은 각각 약 1:1 내지 약 5:1, 선택적으로 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 또는 약 2:1의 PEI:DNA(mL:mg) 비로 PEI(예를 들어, PEI pro®)를 사용하여 수행되고, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 1:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 3:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 10:1:1의 몰비로 제공된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 또는 약 9:1:1의 몰비로 제공된다.
형질주입 후에, 형질주입 배지는 HYPERstack으로부터 제거되고, 수확 배지가 첨가된다. 세포는 72시간 동안 37℃, 5% CO2에서 수확 배지에서 항온처리된다. 바이러스 방출 용액은 1:20 부피비로 HYPERstack에 첨가되고, 세포는 18시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리된다.
세포를 배양하고, 세포를 형질주입하고, AAV 바이러스 입자를 방출시키기 위해 사용된 상이한 유형의 배지 및 용액의 예시적인 제형은 표 7에 개시된다.
수확
바이러스 방출 용액과의 항온처리 후에, 형질주입된 HEK293 세포로부터 방출된 AAV 바이러스 입자를 함유하는 수확 배지는 HYPERstack으로부터 제거된다. 일부 실시형태에서, AAV 바이러스 입자는 수확 배지로부터 정제된다.
하류 가공
예시적인 하류 가공 단계의 요약은 도 21에 도시되고, 동반 실시예에 기재되어 있다. 간단히, 복수의 AAV 입자를 포함하는 수확 배지를 수집한 후, 복수의 AAV 입자는 복수의 AAV 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 정제된다. HIC 용리물은 희석되고, 복수의 AAV 입자는 복수의 rAAV 입자를 포함하는 CEX 용리물을 제조하도록 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 통해 추가로 정제된다. CEX로부터의 복수의 rAAV 입자는 충전 rAAV 입자를 농후화하도록 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피에 의해 정제된다. 마지막으로, 복수의 정제되고 농후화된 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물은 정용여과되고, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자 및 제형 완충액을 포함하는 최종 조성물을 제조하도록 접선 유동 여과(TFF)에 의해 제형 완충액으로 농축된다. 일부 실시형태에서, 폴록사머 188은 제형 완충액에 첨가되고, 약물 물질은 < -60℃에서 동결된다. 일부 실시형태에서, TFF 단계는 단일 TFF 절차를 포함한다. 일부 실시형태에서, TFF 단계는 2개 이상의 순차적인 TFF 절차를 포함한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 소수성 상호작용을 통해 크로마토그래피 칼럼의 매트릭스에 대한 바이러스 캡시드 단백질의 결합에 기초하여 rAAV 바이러스 입자를 포획한다. 일부 실시형태에서, 높은 염 농도는 소수성 표면의 클러스터링을 촉진하도록 사용된다.
본 개시내용의 제조 공정의 예시적인 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계의 공정 요약은 도 27에 도시되어 있다.
일부 실시형태에서, HIC 단계는 (i) 복수의 방출된 rAAV 입자를 포함하는 수확 배지를 희석하는 단계; (ii) HIC 칼럼에 희석된 수확 배지를 로딩하는 단계; (iii) HIC 크로마토그램을 생성하는 단계; 및 (iv) 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 rAAV 입자를 함유하는 HIC 크로마토그램에서 피크를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HIC 칼럼에 사용된 크로마토그래피 매트릭스는 소수성 상호작용(OH) 매트릭스이다. 일부 실시형태에서, HIC 칼럼은 800 mL 모노리스이다. 일부 실시형태에서, 수확 배지는 고염 완충액으로 희석된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 용리시키기 위한 단계 구배. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 용리시키기 위한 등용매 용리. 예시적인 완충액 조건이 예를 들어 도 212 및 도 336에 제공된다.
일부 실시형태에서, HIC 용리물은 희석되고 추가의 정제 전에, 즉 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 전에 여과된다. 적합한 필터는 여과 동안 rAAV 입자의 손실을 최소화하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, HIC 용리물은 0.8/0.45 μM 폴리에테르설폰 (PES) 필터를 통해 여과된다.
양이온 교환 크로마토그래피
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)는 HIC 단계에 의해 제조된 HIC 용리물에서의 복수의 rAAV 입자를 추가로 정제하도록 사용될 수 있다. CEX는 이온 교환 크로마토그래피의 유형인데, 이것은 이의 순 표면 전하에 기초하여 분자를 분리한다. 일부 실시형태에서, CEX는 양으로 하전된 분자에 대한 친화도로 음으로 하전된 이온 교환 수지를 사용한다. pH가 AAV 입자의 등전점(pI) 미만일 때, AAV 바이러스 입자는 양전하를 갖고, CEX에 의해 정제될 수 있다.
본 개시내용의 제조 공정의 예시적인 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 단계의 공정 요약은 도 68에 도시되어 있다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, CEX 단계는 (i) HIC 단계로부터의 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 HIC 용리물을 희석하고, 선택적으로, HIC 용리물을 여과시키는 단계; (ii) CEX 칼럼에서 희석된 HIC 용리물을 로딩하는 단계; (iii) CEX 크로마토그램을 생성하는 단계; 및 (iv) 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 CEX 용리물을 제조하도록 rAAV 입자를 함유하는 CEX 크로마토그램으로부터 분획을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, CEX 크로마토그래피는 크로마토그래피 칼럼에서 SO3- 양이온 교환 매트릭스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 칼럼은 80 mL 모노리스이다. 일부 실시형태에서, HIC 용리물은 CEX 단계 전에 저염 완충액으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 희석된 HIC 용리물은 pH 3.0-4.0으로 조정된다. 일부 실시형태에서, 희석된 HIC 용리물은 pH 3.6 +/- 0.1로 조정된다. 일부 실시형태에서, 이는 pH가 rAAV 바이러스 입자의 pI의 것보다 낮게 하여서, 양으로 하전된 rAAV 바이러스 입자를 제조한다. 일부 실시형태에서, 단계 구배는 rAAV 입자를 용리시키도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CEX 용리물의 pH를 중화시키는 것을 추가로 포함한다. 예시적인 완충액 조건은 예를 들어 도 213 및 도 336에 제공된다.
음이온 교환 크로마토그래피
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)는 충전 rAAV 입자에 복수의 rAAV 입자를 농후화시키도록 사용될 수 있다. 충전 rAAV 입자는 본 개시내용의 AAV-작제물을 포함하는 단일 가닥 DNA를 포함하는 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, 충전 rAAV 입자는 5' ITR을 암호화하는 서열, GRK1 프로모터를 암호화하는 서열, RPGRORF15을 암호화하는 서열, BGH polyA 신호를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 충전 rAAV 입자는 5' ITR을 암호화하는 서열, ABCA4를 암호화하는 서열 또는 이의 일부 및 3' ITR을 암호화하는 서열을 포함한다.
AEX는 이온 교환 크로마토그래피의 유형인데, 이는 순 표면 전하에 기초하여 분자를 분리한다. 충전, 빈 및 손상된 및/또는 응집된 AAV 바이러스 입자는 상이한 등전점(pI)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 충전 입자 및 빈 입자는 입자의 다른 전하에 기초하여 분리된다. 충전 입자는 DNA 게놈의 존재로 인해 빈 입자보다 약간 더 음으로 하전된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV 입자의 pI보다 높은 pH를 갖는 용액으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 분리는 용액으로부터 MgCl2의 제거에 의해 추가로 향상된다.
본 개시내용의 제조 공정의 예시적인 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 단계의 공정 요약은 도 101에 도시된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, AEX 크로마토그래피 단계는 (i) 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 CEX 용리물을 희석하는 단계; (ii) AEX 칼럼에서 희석된 CEX 용리물을 로딩하는 단계; (iii) AEX 크로마토그램을 생성하는 단계; 및 (iv) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물을 제조하도록 충전 rAAV 입자를 함유하는 AEX 크로마토그램으로부터 분획을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, AEX 크로마토그래피는 크로마토그래피 칼럼에서 음이온 교환(QA) 매트릭스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 칼럼은 80 mL 마크로다공성 매트릭스 조성물이다. 일부 실시형태에서, CEX 용리물은 AEX 단계 전에 저염 완충액으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 선형 구배는 충전 rAAV 입자를 용리시키도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포하하는 용리물의 pH를 중화시키는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 완충액 조건은 예를 들어 도 213 및 도 336에 제공된다.
TFF 농축 및 정용여과
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물은 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 최종 제형 완충액(FFB)으로 정용여과되고 농축된다. 접선 유동 여과는 특정 TFF 실시형태에서 막 다공성에 따라 미세여과 또는 한외여과 공정으로 분류될 수 있는 막 여과 기법이다. TFF에서, 공급 스트림은 하나의 부분이 막을 투과하면서 막 면에 평행하게 통과하는 한편, 보유액은 저장소로 다시 재순환된다. 이 공정은 접선 유동 여과(TFF)의 원칙을 이용하여 부피 감소 및 추가의 정제를 달성한다.
이 공정은 원하는 최종 제형 완충액(선택적으로 0.001%에서의 폴록사머와 20 mM Tris, pH 8, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl)으로 AAV 생성물을 제제화하도록 정용여과를 이용한다.
용리 생성물의 접선 유동 여과는 100 kDa(Spectrum)의 분자량 컷오프를 갖는 중공 섬유 필터(HFF) 카트리지를 사용하여 수행된다. 카트리지 및 시스템은 투과액 측에서 pH 8.0 ± 0.2를 얻도록 Tris 20 mM, MgCl2 1mM, NaCl 200 mM pH 8 완충액으로 평형화된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 2개의 TFF 단계를 포함하고, 제1 및 제2 TFF 둘 다는 100kDa HFF를 사용하여 수행된다.
생성물은 제형 완충액의 최소 6 부피에 대해 연속 방식으로 정용여과 전에 최소 부피로 농축된다. 보유액은 수집된다. 시스템은 제형 완충액으로 세정된다. 이 세정은 상이한 용기에 수집된다.
더 긴 기간 저장(60일 초과)이 필요하면, 장기간 저장 방법의 일부 비제한적인 예에서, 생성물은 0.2 μm 필터를 사용하여 마이크론이하 여과된다. 약물 물질이 완전히 여과되면, 필터는 최종 제형 완충액으로 세정된다.
QC 샘플링 후, 정제된 벌크 약물 물질은 -80℃ 미만에서 저장된다. 선택적으로, 폴록사머 188은 -80℃ 미만에서 동결 및 저장 전에 약물 물질에 첨가된다.
약물 물질로부터 약물 제품을 제조하는 방법
본 개시내용의 조성물은 액체로서 공급될 수 있다. 조성물이 약물 제품을 포함하는 것을 포함하는 본 개시내용의 조성물의 일부 실시형태에서, 약물 제품은 무균 가스 바이알에 공급된다. 일부 실시형태에서, 무균 유리 바이알은 무균 투명 유리 바이알이다. 일부 실시형태에서, 무균 유리 바이알은 스톱퍼가 캡핑된다. 일부 실시형태에서, 스톱퍼는 플라스틱이다. 일부 실시형태에서, 무균 유리 바이알은 캡핑되고 추가로 오프시일로 둘러싸인다.
본 개시내용의 약물 물질의 제어
예시적인 약물 물질은 표 8에 기재된 시험에 의해 규명된다.
분석 절차
물리적 역가:
일부 실시형태에서, 게놈 역가는 qPCR을 이용하여 결정된다. 이 방법은 게놈 카피수의 정량화를 허용한다. 벡터 스톡의 샘플은 완충액에 희석된다. 샘플은 DNase 처리되고, 바이러스 캡시드는 게놈 DNA를 방출하도록 단백분해효소 K로 용해된다. 희석 시리즈가 이후 제조된다. 각각의 샘플의 반복실험은 Taqman 기반 프라이머/프로브 세트를 사용하여 qPCR로 처리된다. 표준 곡선은 표준 플라스미드 희석 시리즈의 선형 범위에서 각각의 점에 대한 평균을 취하고 각각의 점에 대한 평균 CT 값에 대해 로그 카피수를 작도하여 작성된다. 일부 실시형태에서, 표준 곡선에 사용된 플라스미드 DNA는 슈퍼코일링된 구성이고 다른 것에서 이것은 선형 구성이다. 선형화된 플라스미드는 예를 들어 HindIII 제한 효소의 분해에 의해 제조되고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 가시화되고, 제조사의 지시에 따라 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)를 사용하여 정제될 수 있다. 표준 곡선을 생성하도록 사용된 플라스미드 내에 절단하는 다른 제한 효소는 또한 적절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표준품으로서 슈퍼코일링된 플라스미드의 사용은 선형화된 플라스미드의 사용과 비교하여 AAV 벡터의 역가를 증가시켰다. rAAV 벡터의 역가는 표준 곡선으로부터 계산될 수 있고, DNase 저항 입자(DRP)/mL로 표시된다.
일부 실시형태에서, 게놈 역가는 드랍플렛 디지털 PCR(ddPCR)을 이용하여 결정된다. AAV 또는 이의 게놈 DNA의 샘플은 오일/물 에멀션을 포함하는 복수의 나노리터 스케일링된 드랍플렛(예를 들어, 20,000 드랍플렛)으로 분별화될 수 있다. PCR은 복수의 각각의 드랍플렛에서 발생한다. 이 기법은 드랍플렛의 사용 없이 수행된 반응과 비교하여 더 적은 샘플 및 더 적은 부피의 시약을 요하는 이점을 제공한다. PCR 후에, 각각의 드랍플렛이 분석되거나 원래의 샘플에서의 PCR-포지티브 드랍플렛의 분획을 결정하도록 판독된다. 이 데이터는 이후 원래의 샘플에서의 표적 DNA 주형 농도를 결정하도록 포아송(Poisson) 통계를 이용하여 분석된다. 드랍플렛 생성 동안, 주형 분자는 드랍플렛으로 랜덤으로 분포된다. 일부 드랍플렛은 주형을 함유하지 않고, 일부는 하나의 주형 분자를 함유하고, 다른 것은 하나 초과를 함유한다. 파티셔닝의 랜덤 성질로 인해, 증폭 후 형광 데이터는 포아송 분포에 의해 잘 맞는다. 양성 드랍플렛의 수는 샘플에서 표적 서열의 농도에 상응한다. ddPCR 시스템은 다수의 표적이 샘플 드랍플렛에서 증폭되어서 샘플을 정확히 분석할 수 있고, 여기서 반응의 시작 시 드랍플렛당 하나의 주형에 대한 또는 드랍플렛당 표적 카피를 정량화하기 위한 반응 후에 드랍플렛당 하나의 표적에 대한 임의의 필요성을 제거한다. ddPCR은 표준 PCR과 동일한 PCR 시약을 사용할 수 있다.
감염성 단위(IU) 역가: 이 검정은 AAV의 감염성 입자의 수를 정량화한다. 정량화는 헬퍼 기능을 제공하도록 벡터 샘플의 시리즈 희석 및 균일한 농도의 야생형 아데노바이러스로 RC32 세포(AAV8 Rep/Cap를 발현하는 HeLa)를 감염시켜 수행된다. 감염 후 수일에, 세포는 PCR 저해제를 감소시키도록 용리 희석되고, DNase 및 단백분해효소 K 분해가 생략되고 오직 qPCR 부분이 수행된다는 것을 제외하고는 상기 물리적 역가 검정에 기재된 바와 동일한 방식으로 qPCR 검정된다. 개별 웰은 AAV 증폭에 대해 양성 또는 음성으로 점수매겨진다. 점수화된 웰은 Karber 방법을 이용하여 IU/mL 단위의 TCID50 을 결정하도록 사용된다.
총 입자: 검정은 ELISA 기법(AAV8 Titration ELISA KIT)을 이용한다. 조립된 AAV8 캡시드에서 구성적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체는 미량역가 스트립에 코팅되고, 시편으로부터 AAV8 입자를 포획하도록 사용된다. 포획된 AAV 입자는 2 단계에서 검출된다. 처음에 AAV8에 대한 비오틴-접합된 단일클론 항체는 면역 복합체에 결합된다. 제2 단계에서 스트렙타비딘 퍼옥시다제 접합체는 비오틴 분자와 반응한다. 기질 용액의 첨가는 특이적으로 결합된 바이러스 입자의 양에 비례하는 색상 반응을 발생시킨다. 흡광도는 450 nm에서 광도계로 측정된다
충전:빈 비율(투과 전자 현미경검사): AAV2 입자의 충전:빈 비율은 음성 염색 주사 전자 현미경검사(TEM)를 이용하여 결정될 수 있다. 샘플은 고정된 그리드에 적용된다. 샘플을 주사 전자 현미경을 이용하여 가시화하고, 계수치는 이의 형태에 기초하여 충전(즉, DNA를 함유) 및 빈 AAV2 캡시드 입자로 수행된다. 충전:빈 입자의 비율은 입자 계수치로부터 계산된다.
충전:빈 비율(분석적 초원심분리): AAV8 입자의 충전:빈 비율은 분석적 초원심분리(AUC)를 사용하여 결정될 수 있다. AUC는 비파괴적인 다른 방법에 비해 이점을 갖고, 이는 샘플이 추가의 시험을 위해 AUC 후에 회수될 수 있다는 것을 의미한다. 빈 및 충전 AAV8 입자를 포함하는 샘플은 초원심분리 동안 AAV8이 이동하는 액체 조성물에 적용된다. 하나 이상의 AAV8 입자의 침강 속도의 측정은 AAV 입자의 크기 및 형상에 대한 유체역학적 정보를 제공한다. 침강 평형의 측정치는 AAV8 입자의 용액 몰 질량, 화학양론, 회합 상수 및 용액 비이상성에 대한 열역학적 정보를 제공한다. AUC 동안 획득된 예시적인 측정은 방사상 농도 분포 또는 "스캔"이다. 일부 실시형태에서, 스캔은 분(속도 침강에 대해)으로부터 시간(평형 침강에 대해)의 간격으로 획득된다. 본 개시내용의 방법의 스캔은 광학 측정(예를 들어, 광 흡광도, 간섭 및/또는 형광)을 함유할 수 있다. 초원심분리 속도는 10,000 분당 회전수(rpm) 내지 75,000 rpm(종점 포함)의 범위일 수 있다. 충전 AAV8 입자 및 빈 AAV8 입자가 AUC에 의해 구별되는 측정을 나타내므로, 샘플의 충전/빈 비율은 이 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
벡터 동일성(DNA): 이 검정은 바이러스 DNA 서열의 확인을 제공한다. 검정은 바이러스 캡시드를 소화시키고 바이러스 DNA를 정제하여 수행된다. DNA는 가능한 경우 정방향 및 역방향(일부 영역, 예를 들어, ITR은 서열에 문제임) 둘 다의 최소 2배 커버리지로 시퀀싱된다. DNA 시퀀싱 contig는 동일성을 확인하도록 예상된 서열과 비교된다.
총 단백질: 이 검정은 마이크로-BCA 키트를 사용하여 시험 물품에 존재하는 단백질의 총 양을 정량화한다. 제형의 매트릭스 효과를 제거하기 위해 완충액 샘플은 아세톤으로 침전되고, 침전된 단백질은 분석 전에 동일한 부피의 물로 재현탁된다. 단백질 농도 결정은 시험 물품 또는 희석된 시험 물품을 제공된 마이크로-BCA 시약과 혼합하여 수행된다. 동일함이 소 혈청 알부민(BSA) 표준품의 희석물을 이용하여 수행된다. 혼합물은 60℃에서 항온처리되고, 흡광도는 562 nm에서 측정된다. 표준 곡선은 선형 회귀 적합화를 시용하여 표준 흡광도 및 공지된 농도로부터 생성된다. 비공지된 샘플은 선형 회귀에 따라 정량환된다.
순도: 이 검정은 AAV 순도의 반정량적 결정을 제공한다. AAV8 캡시드 입자 ELISA의 결과에 기초하여, 샘플은 SpeedVac에 의해 농축되고, 4 x 10^10 또는 1 x 10^11 입자가 로딩되고, 캡시드 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 분리된다. SYPRO Orange 염색된 겔의 망막 밀도 측정법 분석은 캡시드 단백질에 대해 근사 불순 수준의 계산을 허용한다(Vp1, Vp2 및 Vp3).
복제 유능 AAV: 시험 물품은 야생형 아데노바이러스의 존재 또는 부재 하에 HEK293 세포를 형질도입하도록 사용된다. 3 연속 회차의 세포 증폭이 수행될 것이고, 총 게놈 DNA는 각각의 증폭 단계에서 추출된다.
rcAAV8은 실시간 정량적 PCR에 의해 검출된다. 2개의 서열은 단리된 게놈 DNA인데; 하나는 AAV2 Rep 유전자에 특이적이고 하나는 HEK293 세포(인간 알부민)의 내인성 유전자에 특이적이다. 세포당 Rep 유전자의 상대 카피수가 결정된다. 양성 대조군은 단독으로 또는 rAAV 벡터 제조의 존재 하에 시험된 야생형 AAV 바이러스 혈청형 8이다.
검정의 검출 한계는 각각의 시험된 배치에 대해 시험감염된다. 검출 한계는 시험 샘플의 "Y" 게놈당 "X" rcAAV이다. 시험 샘플이 서열에 음성이면, 이 샘플에 대한 결과는 하기로 보고될 것이다: 복제 무, 시험 샘플의 "Y" 게놈 카피당 < "X" rcAAV. 시험 샘플이 Rep 서열에 양성이면, 이 샘플에 대한 결과는 하기로 보고될 것이다: 복제, 시험 샘플의 "Y" 게놈 카피당 > "X" rcAAV.
HEK293 숙주 세포 단백질: HEK293 숙주 세포 단백질(HCP) 검정은 면역효소측정 검정이다. 정제된 바이러스의 샘플은 친화도 정제된 포획 항체로 코팅된 미량역가 스트립에서 반응한다. 2차 겨자무 과산화효소(HRP) 접합된 효소는 동시에 반응하여서, 고상 항체-HCP-효소 표지된 항체의 샌드위치 복합체를 형성한다. 미량역가 스트립은 임의의 비결합된 시약을 제거하도록 세척된다. HEK293 HCP의 품질은 각각의 웰에 HRP 기질인 3,3',5,5' 테트라메틸 벤지딘 퍼옥사이드의 첨가에 의해 검출된다. 가수분해된 기질의 양은 플레이트 판독기에서 판독되고, 존재하는 HEK293 HCP의 농도에 정비례한다.
총 DNA: 피코그린 시약은 이중-가닥 DNA에 결합하고 고도로 발광성인 복합체를 형성하는 초민감 형광 핵산 염색이다(λ여기 = 480 nm - λ방출 = 520 nm). 이 형광 방출 강도는 용액 중의 dsDNA 분량에 비례한다. 공지된 농도를 갖는 DNA 표준 곡선을 이용하여, 시험 샘플에서의 DNA 함량은 측정된 형광을 전환시켜 얻는다.
HEK293 숙주 세포 DNA: 원래의 공정은 3개의 상이한 앰플리콘의 크기 및 분량을 측정하는 반면, 개선된 공정은 높은 분자량 및 전단된 DNA를 포함하는 총 hcDNA를 측정한다. 정량화 데이터 개선된 공정은 검정이 <10 ng/용량의 용량당 hcDNA를 평가하는 데 있어서 요건을 충족시키도록 특이적이고 충분히 민감하다는 것을 입증한다(WHO Expert Committee on Biological Standardization, 2013).
잔류 BSA: 잔류 BSA는 Bethyl에 의해 제조되고 판매되는 상업적으로 이용 가능한 ELISA를 사용하여 정량화된다. ELISA 키트에 대한 과학적 원칙은 숙주 세포 단백질 ELISA에 설명된 것과 매우 유사하다.
잔류 Benzonase: 이 검정은 샌드위치 ELISA에 의해 시험 샘플에서 잔류 Benzonase를 검출하기 위해 Benzonase 엔도뉴클레아제에 특이적인 정제된 다중클론 항체를 사용한다. 정확한 측정은 샘플의 신호를 동시에 평가된 Benzonase 엔도뉴클레아제 표줌품과 비교하여 달성된다.
생물부담 검정: 이 절차는 샘플에 존재하는 (검출 가능한 경우) 생물부담의 양을 정량적으로 결정하도록 사용된다. 사용된 방법은 2개의 막의 각각에 샘플의 절반의 막 여과를 수반한다. 막은 별개의 한천 배지 플레이트에 배치되고, 이 플레이트를 순차적으로 20-25℃ 및 30-35℃에서 호기성 및 혐기성 조건에서 항온처리한다. 항온처리의 종료 시, 호기균, 혐기균 및 진균 계수치는 샘플의 CFU/mL로서 표현된다.
내독소 검정: 이 검정은 박테리아 내독소가 시험 물품에 존재하는지를 결정하는 것이다. 정량적 절차는 동역학-색소생산성 방법에 의해 수행된다. 공지된 양의 내독소는 박테리아 내독소의 수준의 정확한 결정을 위해 시험 물품에서 동시에 시험된다. 시험 물품에 의한 간섭의 가능성은 특정 수준의 내독소에 의해 시험 물품과 LAL 시약을 스파이킹하여 조사된다. 저해/향상 시험 후에, 시험 물품에 대한 내독소 함량이 결정된다.
정량적 PCR(qPCR): qPCR은 HPLC 크로마토그램 결과를 확인시키도록 사용될 수 있다(실시간 PCR 또는 역전사 PCR이라고도 칭함, 둘 다 RT-PCR로 축약). qPCR은 미리 검증된 프라이머 또는 프라이머/프로브 검정을 이용하여 복잡한 샘플로부터 표적 DNA 단편을 증폭시키기 위해 표준 PCR 반응에서 중합효소(예를 들어, Taq 중합효소)를 사용한다. PCR 반응은 PCR의 매 사이클에서 증폭된 DNA의 생성을 측정하여서 DNA 품질의 절대 또는 상대 측정치를 제공하기 위한 형광 리포터를 사용한다. DNA가 증폭의 log 선형 위상에 있을 때, PCR에 의해 생성된 형광의 양은 배경 위에서 증가한다. 형광이 측정 가능해지는 점은 역치 사이클(CT) 또는 교차점이라 불린다. (공지된 샘플의 일련의 희석을 사용하여) 시험 샘플의 CT를 공지된 샘플 또는 표준 곡선과 비교하여, 시험 샘플에서의 DNA의 양이 결정될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 샘플/시험 DNA의 양은 숙주 세포의 불변 또는 내인성 유전자(예를 들어, 비제한적인 예로서 β-액틴을 포함하는 하우스키핑 유전자)에 대해 비교된다.
드랍플렛 디지털 PCR(ddPCR): ddPCR은 HPLC 크로마토그램 결과를 확인시켜 주도록 사용될 수 있다. ddPCR은 미리 검증된 프라이머 또는 프라이머/프로브 검정을 이용하여 복잡한 샘플로부터 표적 DNA 단편을 증폭시키기 위해 표준 PCR 반응에서 Taq 중합효소를 사용한다. PCR 반응은 증폭 전에 수천개의 개별 반응 용기에 분할되고, 데이터는 반응 말단 점에서 획득된다. ddPCR은 표준 곡선 없이 DNA의 직접적인 및 독립적인 정량화를 제공하고, 정확하고 재현 가능한 데이터를 줄 수 있다. 말단 점 측정은 반응 효율에 독립적으로 핵산 정량화가 가능하게 한다. ddPCR은 일정치 않게 오염된 샘플로부터 극도로 낮은 표적 정량화에 사용될 수 있다.
AAV 조성물의 안정성
본 개시내용의 조성물은 < -60℃에서 저장될 때 장기간 안정성을 유지한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 -80℃ 내지 40℃(대략 인간 체온)(종점 포함)의 온도에서 저장될 때 장기간 안정성을 유지한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 -80℃ 내지 5℃(종점 포함)의 온도에서 저장될 때 장기간 안정성을 유지한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 -80℃, -20℃ 또는 5℃에서 저장될 때 장기간 안정성을 유지한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 액체 또는 현탁액으로서 제형화되고, 하나 이상의 용기(예를 들어, 바이알)로 분취되고, < -60℃에서 저장된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 액체 또는 현탁액으로서 제형화되고, 하나 이상의 용기(예를 들어, 바이알)로 분취되고, -80℃, -20℃ 또는 5℃에서 저장된다.
본 개시내용의 조성물은 < -60℃에서 저장될 때 장기간 안정성을 유지시키기 위한 최적 표면적 대 부피 비로 용기에 제공될 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 -80℃, -20℃ 또는 5℃에서 저장될 때 장기간 안정성을 유지시키기 위한 최적 표면적 대 부피 비로 용기에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 액체 또는 현탁액으로서 제형화되고, 하나 이상의 용기(예를 들어, 바이알)로 분취되고, 모든 저장 요건이 고려되는 한 가능한 큰 표면적 대 부피 비를 갖는 하나 이상의 용기에 저장된다.
본 개시내용의 조성물은 주변 상대 습도에서 저장될 때 장기간 안정성을 유지한다.
실시예
실시예
1
정제 공정의 개발
도 23은 모노리스 대 비드 크로마토그래피의 비교를 보여준다. 마크로-다공성 칼럼(막 및 모노리스)은 마크로분자, 예컨대 rAAV 바이러스 벡터의 정제에 대한 선택의 크로마토그래피 배지로서 나타났다. 종래의 비드에 비해 마크로-다공성 기법의 이점은 더 빠른 결합 동역학 및 감소된 실행 시간으로 이어지는 확산 독립적 표적 결합; 높은 유속에서 실행될 때 감소된 배압으로 이루어지는 더 큰 흐름 채널; 더 높은 결합 역량을 생성시키는 결합 부위에 대한 더 양호한 접근 가능성; 및 감소된 공정내 부피로 이어지는 우수한 흐름 특징을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 종래의 비드 기법이 더 큰 전체 결합 커패시티를 보유하지만, 효과적인 결합 커패시티는 기공 배제 및 확산 추진된 결합과 연관된 제한으로 인해 감소한다. 따라서, 마크로-다공성 기법은 rAAV 바이러스 입자의 정제에 대한 우수한 방법이다. 공정 스케일 모노리스 기술은 모노리스 지지체에 부동화된 결합 화학(보다 막보다 훨씬)의 넓은 범위를 제공한다.
총 입자 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 크로마토그램 이것이 빠른 턴어라운드 시간(24시간 미만)을 가지면서 스크리닝 목적을 위한 바람직한 방법. 이 방법은 실험의 회수 결정에 대한 주요 보고 검정이다. HPLC 결과의 검증은 드랍플렛 디지털 PCR(ddPCR) 측정에 의해 확인된다.
도 60은 1 mL 칼럼에서 80 mL 칼럼으로 확장된 예시적인 HIC 포획 단계를 보여준다. 도 60a에서 세척 E1, E2, E3 및 제자리에서의 세정(CIP) 분획은 x 축에 표시되고, 흡광도(mAU 단위)는 y 축에 표시된다. AAV 입자는 도 60a-b에서 녹색 박스에 의해 표시된 분획 E2에서 용리한다. 용리 조건과 관련하여 민감도 분석은 이것이 강건한 단위 조작이라는 것을 입증하였다. 도 60b는 수확 배지, 통과액, 세척, 용리된 분획 및 CIP의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 분획 E2는 녹색 박스에 의해 표시된다. 양호한 상관관계는 ddPCR과 총 입자 HPLC 방법 사이에 관찰되었다. 80% 초과의 회수는 이 단위 조작에 예상되었다.
HIC 포획 후에, 단백질성 모발-유사 재료는 HIC 용리물에서 관찰되었고, 이는 후속하는 크로마토그래피 단계 동안 지속 가능하지 않은 압력 증가로 이어졌다. 0.45 μm 셀룰로스 아세테이트(CA) 필터는 섬유를 보유하도록 사용되었지만, 이것은 벡터의 50%의 소실로 이어졌다. 후속하여, 필터는 적합한 대안을 발견하도록 rAAV 보유액에 스크리닝되었다(도 63). 0.8/0.45 μm 폴리에테르설폰(PES) 조합 필터는 HIC 용리물의 여과에 선택되었다. 최소 소실은 이 필터의 실행 후 관찰되었다. 필터의 선택은 더 큰 스케일에서의 필터 회수 및 필터 이용 가능성 둘 다엥 기초하였다.
구배 용리 및 등용매 용리 방법 둘 다는 HIC 단계에 시험되었다(도 61). 구배 용리를 등용매 용리로 변환시키는 것은 성공적이었다. 일부 실시형태에서, 등용매 용리는 이것이 보다 강건한 방법이면서 확장에 바람직한 방법이다. 그러나, 용리된 종의 완전한 분배는 등용매 용리 전략에 의해 가능하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 구배 용리가 바람직하다.
HIC 전개는 중간 CEX SO3- 연마 단계를 포함하는 3개의 단계 공정의 필요성을 확인시켜 주었다(도 62). HIC 단계에 대한 순도 및 HIC의 후속하는 순도(도 62a) 및 AEX QA 정제된 생성물(도 62b)은 충분하지 않다. 중간 연마 단계(CEX 양이온 교환, SO3-)가 필요하다.
도 97a는 CEX 및 SO3- 칼럼 매트릭스를 사용한 예시적인 중간 연마 단계의 크로마토그램을 보여준다. 양호한 상관관계가 ddPCR과 총 입자 HPLC 방법 사이에 관찰되었다. 80% 초과의 회수는 단위 조작에 대해 예상되었다. 도 97b는 4개의 상이한 CEX 중간 연마 실행의 분획을 함유하는 AAV 입자를 비교하는 SDS-PAGE 겔을 보여주고, 여기서 pH는 pH 3.5, pH 3.6, pH 4.0 및 pH 4.0으로 조정되었다. 모든 겔은 샘플에 존재하는 모든 단백질 밴드를 노축시키도록 약간 과전개되었다. 더 낮은 pH 샘플은 더 높은 pH 샘플보다 약간 더 적은 오염물질(오렌지 박스)을 함유하였다. 최적 pH는 pH 3.6 +/- 0.1이었다.
도 98은 2개의 예시적인 CEX 크로마토그램 및 상응하는 SDS-PAGE 겔을 보여주는데, 하나는 pH 4.0(상부)이고 다른 것은 pH 3.5(하부)이다. 더 높은 정제가 pH 4.0보다 pH 3.5에 의해 보였다. CEX 중간 연마 단계의 사용은 순도를 적절한 수준으로 증가시켰다. DNA는 통과액 분획(FT)에서 분리되는 반면, 단백질 불순물은 칼럼에 보유되었다. 더 낮은 pH(3.5)의 사용은 정제 인자를 개선하였다. 이는 AAV 입자에서 발견되는 것과 같은 낮은 등전점으로 칼럼에 단백질의 친화도의 증가로 인한다
예시적인 CEX SO3- 용리물 함유 rAAV 입자의 TEM 분석은 27.2%의 입자가 충전되고, 51.1%의 입자가 비거나 손상된다는 것을 밝혀냈다(도 99). 21.8%의 입자는 충전 또는 빈으로 분류될 수 없었다. 이들 입자의 표면은 균일하게 밝지 않고, 일부 어두운 스팟이 존재하고, 이들은 중앙에 백색 스팟을 가지며 회색 원을 나타냈다. 이들 입자는 완전히 비지 않은 것으로 추정되었다. 이 재료는 3' ITR 영역을 포함하는 게놈 플라스미드로부터 생성되었다. 3' ITR은 캡시드화에 영향을 미칠 수 있다. 충전 입자 및 빈 입자를 생성하기 위한 추가의 개발 작업은 상이한 3' ITR을 갖는 새로운 재료를 사용할 것이다.
충전 및 빈 피크의 최적 해상은 MgCl2의 pH 농도에 의존한다. MG2+는 빈 입자와 충전 입자 사이의 분리를 돕는 빈 AAV 입자와의 우선적 상호작용을 갖는 것으로 나타났다. 도 103a는 pH 9.5 및 다양한 농도의 MgCl2에서 AEX QA 칼럼에서 CEX 용리물을 흘려서 생성된 크로마토그램의 오버레이를 보여준다. 가장 날카로운 분리는 0 mM MgCl2(검정색 화살표 및 선)에서 보였다. 도 103a는 열 도표를 보여주는데, 이는 AEX 단계에서 최적 충전 대 빈 분리가 pH 9.0 및 0 mM MgCl2에서 발생한다는 것을 예시한다. 높은 백분율의 충전 입자는 AEX E3 분획에서 회수되었다(도 105). HPLC에 의해, E3 용리물에서 회수된 예상된 96%의 입자는 충전되고, 78-81%의 충전 입자는 E3 용리물에서 회수되었다.
실시예
2
:
rAAV 입자의 정제
본 개시내용의 rAAV 입자의 정제를 보여주는 예시적인 HIC 크로마토그램은 도 64에 도시되어 있다. rAAV 입자를 포함하는 수확 배지는 고염 완충액으로 희석도고, 결합 및 용리 크로마토그래피 모드를 사용하여 소수성 상호작용(OH) 매트릭스로 800 mL HIC 모노리스에서 실행되었다. rAAV 입자는 단계식 구배를 사용하여 용리되었다. 도 64a에서의 크로마토그램은 rAAV 입자가 박스에 있는 E2 및 E3 분획에서 용리된다는 것을 보여준다. 도 64b는, 왼쪽에서 오른쪽으로 마커, 수확 배지, 로드, 통과액(FT), 세척(W), 분획 E1, E2, 2배 희석된 E2(E2.2X), E3, 2배 희석된 E3(E3.2X), 제자리에서의 세정 단계(CIP) 및 2배 희석된 CIP(CIP.2X)를 보여주는 도 64a에서 HIC 단계로부터 회수된 분획의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. E2 및 E2.2X는 rAAV 입자를 함유하고 박스에 있다.
도 65a는 E3, E4 및 E5 분획에서 rAAV 입자의 용리로 예시적인 HIC 크로마토그램을 보여준다. 총 입자의 수율은 HPLC 및 ddPCR에 의해 볼 수 있는 것처럼 E3 분획에서 가장 높았다(도 65b). 도 66b는 분획 E3, E4 및 E5로부터의 rAAV 입자의 주사 전자 현미경사진을 보여준다. 주피크(E3)에서 rAAV 벡터는 균등하게 배열되는데, 대부분은 충전 캡시드이다. 많은 응집체 또는 손상된 입자가 없다. 생성물의 품질, 충전 캡시드, 응집체 및 손상된 입자의 비율의 면에서 둘 다는 각각의 후속하는 분획으로 감소하였다.
도 100a는 CEX를 사용하여 HIC 용리물로부터 정제된 rAAV 입자의 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 대부분의 rAAV 입자는 박스에 있는 분획 E2에서 용리한다. 도 100b는 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로 로딩된다: HIC-20 neut, 로드-BF, 로드, 통과물 + 세척(FT+W), 분획 E1, 2배 희석된 E2(E2.2X), 10배 희석된 E2(E2.10X), E3, CIP, CIP.2X 및 마커. rAAV 입자는 박스에 있는 E2.2X 및 E2.10X에 존재한다.
도 104a는 CEX 용리물의 추가의 정제의 예시적인 AEX 크로마토그램을 보여준다. 충전 rAAV 입자는 박스에 있는 E3 분획에서 농후화된다. 충전 입자 농후화는 입자의 하전에 기초하여 충전 입자 및 빈 입자의 분리에 의해 달성된다. 충전 입자는 DNA 게놈의 존재로 인해 빈 입자보다 매우 약간 더 음으로 하전된다. 분리는 혈청형 AAV8 입자에 대한 완충액으로부터 MgCl2의 제거에 의해 추가로 향상될 수 있다. 도 104b는 SDS-PAGE 겔에 의한 순도를 보여준다. 레인은 왼쪽에서 오른쪽으로 마커, SQ3 13 E2 10X, QA2 로드, QA2 FT+W, 분획 QA2 E1, QA2 E2, QA2 E3, QA2 E4, QA2 E5, QA2 E6, 블랭크 및 QA2 CIP를 보여준다. 도 104a의 크로마토그램으로부터의 분획 QA2 E3의 주사 전자 현미경사진은 E3 분획에서 AAV 입자의 회수를 보여준다(도 106a). 2090개의 충전 입자 및 빈 입자가 계수될 때, 77%가 충전되고, 23%가 비거나 손상되었다(도 106c). 역가가 드랍플렛 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 결정될 때, 분획 E3은 3.1x 10^11 c/mL의 역가, 4.53 mL의 부피 및 1.4 x 10^12 벡터 게놈을 가졌다. 칼럼에 로딩된 유입 샘플의 회수는 60%이고, 초기 출발 재료로부터의 회수는 29%였다(도 106b).
공정에 대한 추정된 공정 회수는 도 107에 도시되어 있다. 3 단계 크로마토그래피 공정에 대한 총 예상된 수율은 40% 내지 65%이다. 이것은 종래의 초원심분리 기반 공정보다 높다.
실시예
3: AAV8-RPGR 제조 공정 설명 - 상류 및 1차
수확
유닛 조작
- PD-USP-001
X-연관 망막색소변성증(XLRP)은 신속한 질환 질행 및 중증 망막 기능이상을 발생시키는 망막색소변성증(RP)의 매우 심한 형태이다. XLRP의 전세계 발병률은 대략 1:30,000 내지 1:40,000이다(Tee 등, 2016). XLRP를 갖는 환자는 전형적으로 10년에 야맹증의 발생을 경험한 후 시야 및 시력이 감소하고 점진적으로 중증 시각 장애가 있다. 대부분의 환자는 40년 말에 법적으로 맹인이다.
현재까지, 3개의 유전자가 XLRP: RP2; RP GTPase 조절자(RPGR) 유전자로도 공지된 RP3; 및 XLRP의 희귀 원인으로 확인된 OFD1로 맵핑되었다(Webb 등, 2012). XLRP의 사례의 대략 75%는 RPGR 변이체로 인하고, RPGR 변이체로 인한 XLRP의 전세계 발병률은 대략 1:40,000 내지 1:53,000이다(Pelletier 등, 2007; Shu 등, 2008). RPGR은 광수용체에서 단백질 분포에 관여되고, 연결섬모에 걸쳐 광-형질도입 성분의 및 다른 외부 분절 단백질의 수송에서 역할을 한다(Tee 등, 2016). 광수용체 생존능력에 필수적인, RPGR 유전자 생성물은 간상세포 광수용체의 외부 분절에 국소화된다(Ferrari 등, 2011). 망막에서의 RPGR 기능의 소실은 간상세포 및 원추세포 시각을 점진적으로 소실시킨다.
Nightstar Therapeutics는 RPGR에서의 돌연변이로 인한 XLRP의 치료를 위해 잠재적인 유전자 요법 의학 제품(GTMP)으로서 AAV8-RPGR을 개발하고 있다. 새로운 및 생존가능 RPGR을 갖는 XLRP 환자에서의 결핍 RPGR의 대체는 망막 퇴행을 느리게 하거나 중지시키고 시각 기능을 유지하거나 개선하는 것으로 예상된다.
본 문헌은 AAV8-RPGR 생성물의 제조에 사용된 상류 및 1차 수확 공정을 기재한다. 본 문헌은 모든 상류 및 1차 수확 가공 단계를 포함한다.
제조 공정 설명 및 공정 제어
배치 정의
플라스미드 DNA를 함유하는 20 Corning 36층 HYPERStack® 용기로 이루어진 단일 제조 캠페인으로 정의된 제품의 배치는 AAV8-RPGR 생물학적 생성물을 생성하는 HEK293 세포를 형질주입하였다. 세포 배양 배지가 20 Corning 36-HYPERStack® 용기로부터 수확되고 혼주되고 단일 정제 공정이 따라졌다.
상류 공정의 요약
세포는 충분한 세포 질량이 벡터 제조를 위해 20개의 HYPERStack® 단위를 시딩하기 위해 생성되게 하도록 Corning 플라스크 및 스택을 사용하여 확장되었다. 세포의 형질주입은 최적화된 인산칼슘 공침전 방법을 이용하여 2-제조 플라스미드 시스템으로 발생한다.
형질주입 후, 배지를 바꾸고, Benzonase® 엔도뉴클레아제를 배지에 존재하는 유리 게놈 및 플라스미드 DNA를 소화시키도록 배지에 첨가한다. 배지로의 벡터 방출을 촉진하도록, 36층 HYPERStack® 단위를 HEPES 완충 NaHPO4 용액으로 스파이킹하고 수확 전에 항온처리하였다. 각각의 36층 HYPERStack®으로부터의 배지를 일회용 바이오공정 백을 사용하여 무균으로 수확하고, 단일 부피(약 82 L)로 혼주하였다.
재조합 AAV(rAAV)를 함유하는 혼주된 배지는 이후 0.65 μm 기공 프리필터의 캡슐, 이어서 0.2 μm 멸균 등급 캡슐 필터를 사용하여 청징되었다.
제조 흐름도
AAV8-RPGR에 대한 제조 공정의 상류 및 1차 회수 단계의 개관은 수행된 현재의 공정 제어 및 QC/분석 시험의 개관과 함께 도 22에 예시되어 있다.
상류 제조 공정 설명
바이알 해동
HEK293 MCB로부터의 바이알을 -150℃ 저장소에서 꺼내고, 후속하여 37±1℃의 온도로 설정된 수욕에서 해동하였다. 시각적 확인은 세포가 해동되는 것을 확인하도록 수행되었다. WCB가 임의의 추가의 제조 실행에 사용될 것으로 기대된다.
해동된 세포를 37±1℃로 예열된 4 mL의 성장 배지(DMEM + 10% 혈청)를 함유하는 T-25 플라스크에 첨가한다. 세포를 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤 CO2 항온처리기에 배치하고, 밤새 두었다. 도 27은 세포 해동 단계의 흐름도를 보여준다. 세포 해동 절차 동안 고수된 매개변수 및 조작 조건은 도 28에 함유된다. 도 29는 세포 해동 공정에 필요한 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 함유한다.
세포 확장
세포를 일련의 계대배양을 통해 초기 T-25 플라스크로부터 36층 HYPERStack® 유닛을 통해 확장시킨다. 세포를 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤 항온처리기에서 성장시킨다. 세포가 포화상태가 80%에 도달할 때 세포를 계대배양하고, 이것은 전형적으로 매 3일 내지 내지 5일이다.
유전적 계대배양 프로토콜은 하기로 이루어진다:
현재의 세포 플라스크/스택으로부터 배지를 제거한다.
- 예열된 행크 균형 염 용액(HBSS)을 사용하여 세포를 세척한다.
- 예열된 세포 1x 해리 용액을 첨가하고 세포 표면이 덮이게 보장하도록 용액을 스왈링한다. 과도한 세포 해리 용액을 제거한다.
- 추가 3-5분 동안 세포 플라스크/스택을 항온처리한다. 조심스런 수동 탭핑을 이용하여 세포를 없앤다.
- 세포를 제거하도록 돕도록 추가의 성장 배지를 첨가한다.
- 중간 저장 용기로 세포를 제거한다.
- 세포 현탁액을 새로운 예열된 성장 배지와 합한다
- 새로운 세포 플라스크/스택을 시딩한다.
- 37℃ 및 5% CO2에서 세포를 항온처리한다.
도 30은 유전적 계대배양 절차의 높은-수준 요약을 제공하지만, 도 31은 세포 계대배양에 대한 유전적 기준을 기술한다. 도 32는 36층 HYPERStack® 유닛까지 각각의 가능한 세포 배양 용기에 대해 계대배양과 관련된 추천된 부피 및 시딩 밀도를 함유한다. 추천된 최소 가온 시간은 도 33에 함유된다. 도 34는 세포 해동에 필요한 핵심 재료 및 소모품 및 일상적 계대배양 단계의 상세내용을 함유한다. 세포는 대략 30회 계대배양 동안 준배양인 것으로 추천된다. 이의 유용한 계대배양 한계에 접근할 때, 오래된 세포가 버려지기 전에 새로운 바이알이 해동되어야 한다.
일시적인 형질주입, Benzonase® 첨가, 배지 방출 및 수확
시딩 후 성장 3일 후, HYPERStack® 배지를 혈청 및 클로로퀸을 함유하는 새로운 DMEM 배지로 대체한다; 이를 형질주입 전 2 - 8시간 수행한다. 세포를 이후 최적화된 인산칼슘 공침전 방법을 이용하여 2개의 제조 플라스미드로 형질주입한다.
충분한 DNA 플라스미드 형질주입 침전물을 5 x 36층 HYPERstack®를 형질주입하도록 생물학적 안정성 캐비닛에서 제조한다. 초기에 벡터 플라스미드, pDP8.ape 헬퍼 플라스미드 및 CaCl2를 함유하는 DNA/칼슘 혼합물을 제조한다. 잘 혼합한 후, 플라스미드/CaCl2 용액을 최적 침전물을 얻도록 일회용 공정 백에서 동시의 온화한 아지테이션으로 2x HEPES 완충 NaHPO4의 동일한 부피에 첨가한다. 용액은 적어도 5분 동안 실온에 있고, 이후 매니폴드와 연관된 5개의 5 HYPERstack®에 첨가된다. 이 절차는 필요한 20 HYPERStack® 유닛의 형질주입을 완료하도록 4회 반복된다.
형질주입 후, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 설정된 항온처리기에서 항온처리한다. 형질주입 후 대략 22시간에서, 배지를 무혈청 DMEM을 사용하여 바꾼다. 이 때에 Benzonase® 엔도뉴클레아제를 배지에 존재하는 유리 게놈 DNA 및 플라스미드 DNA를 분해하도록 90 U/mL의 농도에서 배지에 첨가한다. 이 단계는 최종 벡터 생성물에서 잔류 숙주 세포 DNA의 양을 최소화하도록 수행된다. 세포를 이후 추가 69 - 75시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 설정된 항온처리기에서 항온처리한다. 벡터 방출을 촉진하도록, 36층 HYPERstack®를 HEPES 완충 NaHPO4 용액으로 스파이킹하고, 수확 전에 39℃ 및 5% CO2에서 설정된 항온처리기에서 대략 18시간 동안 항온처리한다. 각각의 36층 HYPERStack®로부터의 배지를 일회용 바이오공정 백을 사용하여 무균으로 수확하고, 단일 부피(~82 L)로 혼주한다. 도 182는 일시적인 형질주입 및 배지 수확 단계의 흐름도를 보여준다. 도 183은 세포 배양 유닛당 클로로퀸의 부피를 함유하고, 도 184는 형질주입 및 수확 단계에 대한 조작 범위를 기술한다. 도 185는 형질주입 공정에 사용된 핵심 소모품 및 재료의 상세내용을 함유한다.
여과에 의한 청징
재조합 AAV(rAAV)를 함유하는 혼주된 배지를 이후 캡슐 프리-필터, 이어서 멸균 등급 캡슐 필터를 통해 청징한다. 제2 백업 프리필터를 여과 셋업의 부분으로서 설치하고, 제1 프리-필터가 사용될 때 유입 압력이 10 psi에 도달하면 사용될 것이다. 프리-필터는 0.65 μm의 기공 크기를 갖고, 유리 섬유로 구성된다. 생물부담 감소 필터는 폴리에테르설폰(PES)으로 구성된 0.2 μm 멸균 등급 필터이다. 최대 회수를 달성하기 위해, 생성물 여과 후, 필터를 무균 블로잉하고, 완충액으로 추척된다. 도 186은 여과 청징 단계의 흐름도를 보여준다. 도 187은 여과 청징 유닛 조작에 대한 조작 매개변수를 함유한다. 도 188은 청징 여과 단계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여준다.
용액 제조를 위한 바람직한 화학물질
컴페디알 또는 멀티-컴페디알 화학물질은 가능할 때마다 사용될 것이다. 도 208은 공정에 바람직한 화학물질 및 연관된 등급의 목록을 제공한다.
실시예 4: AAV8-RPGR 제조 공정 설명 - 상류 및 1차 수확 유닛 조작 - PD-USP-002
X-연관 망막색소변성증(XLRP)은 신속한 질환 질행 및 중증 망막 기능이상을 발생시키는 망막색소변성증(RP)의 매우 심한 형태이다. XLRP의 전세계 발병률은 대략 1:30,000 내지 1:40,000이다(Tee 등, 2016). XLRP를 갖는 환자는 전형적으로 10년에 야맹증의 발생을 경험한 후 시야 및 시력이 감소하고 점진적으로 중증 시각 장애가 있다. 대부분의 환자는 40년 말에 법적으로 맹인이다.
현재까지, 3개의 유전자가 XLRP: RP2; RP GTPase 조절자(RPGR) 유전자로도 공지된 RP3; 및 XLRP의 희귀 원인으로 확인된 OFD1로 맵핑되었다(Webb 등, 2012). XLRP의 사례의 대략 75%는 RPGR 변이체로 인하고, RPGR 변이체로 인한 XLRP의 전세계 발병률은 대략 1:40,000 내지 1:53,000이다(Pelletier 등, 2007; Shu 등, 2008). RPGR은 광수용체에서 단백질 분포에 관여되고, 연결섬모에 걸쳐 광-형질도입 성분의 및 다른 외부 분절 단백질의 수송에서 역할을 한다(Tee 등, 2016). 광수용체 생존능력에 필수적인, RPGR 유전자 생성물은 간상세포 광수용체의 외부 분절에 국소화된다(Ferrari 등, 2011). 망막에서의 RPGR 기능의 소실은 간상세포 및 원추세포 시각을 점진적으로 소실시킨다.
Nightstar Therapeutics는 RPGR에서의 돌연변이로 인한 XLRP의 치료를 위해 잠재적인 유전자 요법 의학 제품(GTMP)으로서 AAV8-RPGR을 개발하고 있다. 새로운 및 생존가능 RPGR을 갖는 XLRP 환자에서의 결핍 RPGR의 대체는 망막 퇴행을 느리게 하거나 중지시키고 시각 기능을 유지하거나 개선하는 것으로 예상된다.
본 문헌은 AAV8-RPGR 생성물의 제조에 사용된 상류 및 1차 수확 공정을 기재한다. 본 문헌은 모든 상류 및 1차 수확 가공 단계를 포함한다.
제조 공정 설명 및 공정 제어
배치 정의
플라스미드 DNA를 함유하는 20 Corning 36층 HYPERStack® 용기로 이루어진 단일 제조 캠페인으로 정의된 제품의 배치는 AAV8-RPGR 생물학적 생성물을 생성하는 HEK293 세포를 형질주입하였다. 세포 배양 배지가 20 Corning 36-HYPERStack® 용기로부터 수확되고 혼주되고 단일 정제 공정이 따라졌다.
상류 공정의 요약
세포는 충분한 세포 질량이 벡터 제조를 위해 20개의 HYPERStack® 단위를 시딩하기 위해 생성되게 하도록 Corning 플라스크 및 스택을 사용하여 확장되었다. 세포의 형질주입은 최적화된 인산칼슘 또는 PEIpro® 매개된 방법을 이용하여 3-제조 플라스미드 시스템으로 발생한다.
형질주입 후, 배지를 바꾸고, Benzonase® 엔도뉴클레아제를 배지에 존재하는 유리 게놈 및 플라스미드 DNA를 소화시키도록 배지에 첨가한다. 배지로의 벡터 방출을 촉진하도록, 36층 HYPERStack® 단위를 HEPES 완충 Na2HPO4 용액으로 스파이킹하고 수확 전에 항온처리하였다. 각각의 36층 HYPERStack®으로부터의 배지를 일회용 바이오공정 백을 사용하여 무균으로 수확하고, 단일 부피(약 82 L)로 혼주하였다.
재조합 AAV(rAAV)를 함유하는 혼주된 배지는 이후 0.65 μm 기공 프리필터의 캡슐, 이어서 0.2 μm 멸균 등급 캡슐 필터를 사용하여 청징되었다.
제조 흐름도
AAV8-RPGR에 대한 제조 공정의 상류 및 1차 회수 단계의 개관은 수행된 현재의 공정 제어 및 QC/분석 시험의 개관과 함께 도 44에 예시되어 있다.
상류 제조 공정 설명
바이알 해동
HEK293 MCB로부터의 바이알을 -150℃ 저장으로부터 제거하고, 후속하여 37±1℃의 온도로 설정된 수욕에서 해동하였다. 시각적 확인은 세포가 해동되는 것을 확인하도록 수행되었다. WCB가 임의의 추가의 제조 실행에 사용될 것으로 기대된다.
해동된 세포를 37±1℃로 예열된 4 mL의 성장 배지(DMEM + 10% 혈청)를 함유하는 T-25 플라스크에 첨가한다. 세포를 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤 CO2 항온처리기에 배치하고, 밤새 두었다. 도 45는 세포 해동 단계의 흐름도를 보여준다. 세포 해동 절차 동안 고수된 매개변수 및 조작 조건은 도 46에 함유된다. 도 47은 세포 해동 공정에 필요한 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 함유한다.
세포 확장
세포를 일련의 계대배양을 통해 초기 T-25 플라스크로부터 36층 HYPERStack® 유닛을 통해 확장시킨다. 세포를 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤 항온처리기에서 성장시킨다. 세포가 포화상태가 80%에 도달할 때 세포를 계대배양하고, 이것은 전형적으로 매 3일 내지 내지 5일이다.
유전적 계대배양 프로토콜은 하기로 이루어진다:
- 현재의 세포 플라스크/스택으로부터 배지를 제거한다.
- 예열된 행크 균형 염 용액(HBSS)을 사용하여 세포를 세척한다.
- 예열된 세포 1x 해리 용액을 첨가하고 세포 표면이 덮이게 보장하도록 용액을 스왈링한다. 과도한 세포 해리 용액을 제거한다.
- 추가 3-5분 동안 세포 플라스크/스택을 항온처리한다. 조심스런 수동 탭핑을 이용하여 세포를 없앤다.
- 세포를 제거하도록 돕도록 추가의 성장 배지를 첨가한다.
- 중간 저장 용기로 세포를 제거한다.
- 세포 현탁액을 새로운 예열된 성장 배지와 합한다
- 새로운 세포 플라스크/스택을 시딩한다.
- 37℃ 및 5% CO2에서 세포를 항온처리한다.
도 178은 유전적 계대배양 절차의 높은-수준 요약을 제공하지만, 도 179는 세포 계대배양에 대한 유전적 기준을 기술한다. 도 180은 36층 HYPERStack® 유닛까지 각각의 가능한 세포 배양 용기에 대해 계대배양과 관련된 추천된 부피 및 시딩 밀도를 함유한다. 추천된 최소 가온 시간은 도 176에 함유된다. 도 181은 세포 해동에 필요한 핵심 재료 및 소모품 및 일상적 계대배양 단계의 상세내용을 함유한다. 세포는 대략 30회 계대배양 동안 준배양인 것으로 추천된다. 이의 유용한 계대배양 한계에 접근할 때, 오래된 세포가 버려지기 전에 새로운 바이알이 해동되어야 한다.
일시적인 형질주입, Benzonase® 첨가, 배지 방출 및 수확
시딩 후 성장 3일 후, HYPERStack® 배지를 혈청 및 클로로퀸을 함유하는 새로운 DMEM 배지로 대체한다(클로로퀸은 인산칼슘 형질주입 방법에 오직 필요함); 이를 형질주입 전 2 - 8시간 수행한다. 세포를 이후 최적화된 인산칼슘 또는 PEIpro® 매개된 방법을 이용하여 3개의 제조 플라스미드로 형질주입한다.
충분한 DNA 플라스미드 형질주입 침전물을 5 x 36층 HYPERstack®를 형질주입하도록 생물학적 안정성 캐비닛에서 제조한다. 인산칼슘 매개된 형질주입 또는 PEIpro®를 사용하는 형질주입을 수행하기 위한 옵션이 존재한다. 방법 둘 다는 공정 설명의 이 부문에 기재될 것이다. 많은 단계는 2개의 방법 사이에 흔할 것이지만, 차이가 있을 때, 형질주입 방법이 설명되는 것에 명확한 설명이 주어질 것이다.
인산칼슘 특이적 형질주입
전이유전자 플라스미드, AV 헬퍼 플라스미드, 캡시드 플라스미드 및 CaCl2를 함유하는 DNA/칼슘 혼합물을 초기에 제조한다. 잘 혼합한 후, 플라스미드/CaCl2 용액을 최적 침전물을 얻도록 일회용 공정 백에서 동시의 온화한 아지테이션으로 2x HEPES 완충 NaHPO4의 동일한 부피에 첨가한다. 용액은 적어도 5분 동안 실온에 있고, 이후 매니폴드와 연관된 5개의 5 HYPERstack®에 첨가된다. 이 절차는 필요한 20 HYPERStack® 유닛의 형질주입을 완료하도록 4회 반복된다.
PEIpro® 특이적 형질주입
전이유전자 플라스미드, AV 헬퍼 플라스미드 및 캡시드 플라스미드 DNA를 무혈청 배지에 희석하고 온화하게 교반한다. 희석된 PEIpro®를 DNA 용액에 한번에 첨가한다. 생성된 용액은 이후 온화하게 교반되고 실온에 평행되게 정치될 필요가 있다. PEIpro®/DNA 복합 용액을 이후 매니폴드에 연결된 5의 HYPERstack®에 첨가한다. 이 절차는 20 HYPERStack® 유닛의 형질주입을 완료하도록 4회 반복된다.
형질주입 후, 세포를 37℃ 및 5% CO2로 설정된 항온처리기에서 항온처리한다. 형질주입 후 대략 22시간에, 배지를 무혈청 DMEM을 사용하여 바꾼다. 이때에 Benzonase® 엔도뉴클레아제를 배지에 존재하는 유리 게놈 DNA 및 플라스미드 DNA를 소화시키도록 90 U/mL의 농도로 배지에 첨가한다. 이 단계는 최종 벡터 생성물에서 잔류 숙주 세포 DNA의 양을 최소화하도록 수행된다. 세포를 이후 추가 69 - 75시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 설정된 항온처리기에서 항온처리한다. 벡터 방출을 촉진하도록, 36층 HYPERStack®을 HEPES 완충 Na2HPO4 용액으로 스파이킹하고 수확 전에 39℃ 및 5% CO2에서 설정된 항온처리기에서 대략 18시간 동안 항온처리하였다. 각각의 36층 HYPERStack®으로부터의 배지를 일회용 바이오공정 백을 사용하여 무균으로 수확하고, 단일 부피(약 82 L)로 혼주하였다. 도 10은 일시적인 형질주입 및 배지 수확 단계의 흐름도를 보여준다. 도 183은 세포 배양 유닛당 클로로퀸의 부피를 함유하고, 도 184는 형질주입 및 수확 단계의 조작 범위를 기술한다. 형질주입을 생성하기 위한 특정 가이드라인은 각각 인산칼슘 및 PEIpro® 형질주입 방법에 대해 도 11 및 도 12에 함유된다. PEI:DNA 비의 비는 도 12에서의 2:1 비로 주어지지만, 이것은 다른 비, 예를 들어 1:1 내지 4:1의 범위의 비를 사용하기에 허용 가능하다. 도 16은 인산칼슘 형질주입 공정에 사용된 핵심 소모품 및 재료의 상세내용을 함유한다. 도 17은 PEI 형질주입 공정에 사용된 핵심 소모품 및 재료의 상세내용을 함유한다.
여과에 의한 청징
재조합 AAV(rAAV)를 함유하는 혼주된 배지는 이후 캡슐 프리필터, 이어서 멸균 등급 캡슐 필터를 사용하여 청징되었다. 제2 배압 프리필터는 여과 설정의 부분으로서 설치되고, 제1 프리필터가 사용될 때 유입 압력이 10 psi에 도달하면 사용될 것이다. 프리-필터는 0.65 μm의 기공 크기를 갖고, 유리 섬유로 구성된다. 생물부담 감소 필터는 폴리에테르설폰(PES)으로 구성된 0.2 μm 멸균 등급 필터이다. 최대 회수를 달성하기 위해, 생성물 여과 후, 필터를 무균 블로잉하고, 완충액으로 추척된다. 도 186은 여과 청징 단계의 흐름도를 보여준다. 도 187은 여과 청징 유닛 조작에 대한 조작 매개변수를 함유한다. 도 188은 청징 여과 단계에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여준다.
용액 제조를 위한 바람직한 화학물질
컴페디알 또는 멀티-컴페디알 화학물질은 가능할 때마다 사용될 것이다. 도 208은 공정에 바람직한 화학물질 및 연관된 등급의 목록을 제공한다.
실시예 5: AAV8-RPGR 제조 공정 설명 - 하류 및 충전 및 종료 유닛 조작
X-연관 망막색소변성증(XLRP)은 신속한 질환 질행 및 중증 망막 기능이상을 발생시키는 망막색소변성증(RP)의 매우 심한 형태이다. XLRP의 전세계 발병률은 대략 1:30,000 내지 1:40,000이다(Tee 등, 2016). XLRP를 갖는 환자는 전형적으로 10년에 야맹증의 발생을 경험한 후 시야 및 시력이 감소하고 점진적으로 중증 시각 장애가 있다. 대부분의 환자는 40년 말에 법적으로 맹인이다.
현재까지, 3개의 유전자가 XLRP: RP2; RP GTPase 조절자(RPGR) 유전자로도 공지된 RP3; 및 XLRP의 희귀 원인으로 확인된 OFD1로 맵핑되었다(Webb 등, 2012). XLRP의 사례의 대략 75%는 RPGR 변이체로 인하고, RPGR 변이체로 인한 XLRP의 전세계 발병률은 대략 1:40,000 내지 1:53,000이다(Pelletier 등, 2007; Shu 등, 2008). RPGR은 광수용체에서 단백질 분포에 관여되고, 연결섬모에 걸쳐 광-형질도입 성분의 및 다른 외부 분절 단백질의 수송에서 역할을 한다(Tee 등, 2016). 광수용체 생존능력에 필수적인, RPGR 유전자 생성물은 간상세포 광수용체의 외부 분절에 국소화된다(Ferrari 등, 2011). 망막에서의 RPGR 기능의 소실은 간상세포 및 원추세포 시각을 점진적으로 소실시킨다.
Nightstar Therapeutics는 RPGR에서의 돌연변이로 인한 XLRP의 치료를 위해 잠재적인 유전자 요법 의학 제품(GTMP)으로서 AAV8-RPGR을 개발하고 있다. 새로운 및 생존가능 RPGR을 갖는 XLRP 환자에서의 결핍 RPGR의 대체는 망막 퇴행을 느리게 하거나 중지시키고 시각 기능을 유지하거나 개선하는 것으로 예상된다.
본 문헌은 AAV8-RPGR 생성물의 제조에 사용된 상류 및 1차 수확 공정을 기재한다. 본 문헌은 모든 하류 및 1차 충전 및 종료 가공 단계를 포함한다.
제조 공정 설명 및 공정 제어
배치 정의
플라스미드 DNA를 함유하는 20 Corning 36층 HYPERStack® 용기로 이루어진 단일 제조 캠페인으로 정의된 제품의 배치는 AAV8-RPGR 생물학적 생성물을 생성하는 HEK293 세포를 형질주입하였다. 세포 배양 배지가 20 Corning 36-HYPERStack® 용기로부터 수확되고 혼주되고 단일 정제 공정이 따라졌다.
하류 공정의 요약
공정 스트림의 청징 후 접선 유동 여과(TFF) 단계는 생성물의 100배 부피측정 농도 인자를 수행하도록 사용되고, 이어서 TMN500T 완충액으로 정용여과 단계가 이어진다. 100 kDA 변형된 폴리에테르설폰(mPES) 막은 이 단계에 사용된다.
TFF 농축 배지는 불연속 이오딕사놀 구배를 이용하여 추가로 정제된다. 이 단계는 이 입자의 차등적 부력 밀도에 기초하여 DNA가 없는 rAAV 입자(빈 입자)의 벌크를 제거하면서 DNA-함유 rAAV 입자에 대한 제조를 농후화하도록 작용한다. 최대 처리량에 대해, 공정은 2개의 구배 단계에서 완료된다.
이오딕사놀 분획은 Sepharose 고성능(SPHP) 칼럼에서 추가로 정제되는, 이는 다른 잔류 불순물 및 이오딕사놀이 공정 스트림으로부터 제거되면서 양으로 하전된 AAV 벡터를 포획하는 양이온 교환 단계이다.
최종 벡터 농축 및 정용여과는 100 kDa, TFF mPES 막을 사용하여 달성된다. 생성물은 최종 제형 완충액(20 mM Tris pH 8.0, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl)으로 정용여과된다. 최종 제형 전에, 공정내 샘플은 벡터 역가 및 DNase 저항 입자(DRP)의 수율을 결정하기 위해 qPCR 방법을 이용하여 벡터 회수에 분석되었다. 이 데이터는 최종 표적 역가를 달성하는데 필요한 최종 부피를 예측하도록 사용된다. 부형제 폴록사머 188은 0.001%(v/v)의 최종 농도로 공정 스트림에 수동으로 첨가된다. 최종 제형 후, 생성물은 정제된 벌크 약물 물질(PBDS)을 생성하도록 0.22 μm 필터를 통해 말단에 무균 여과된다. PBDS의 충전은 공정을 완료시키고 최종 약물 제품(FDP)을 생성시킨다. 방출 시험은 PBDS 및 FDP 둘 다에서 발생한다.
제조 흐름도
AAV8-RPGR에 대한 제조 공정의 하류 및 충전 및 최종 단계의 개관은 제조 공정에 걸쳐 수행된 현재의 공정 제어 및 QC/분석 시험의 개관과 함께 도 63에 예시되어 있다.
하류 제조 공정 설명
대규모 접선 유동 여과
SSS(염 및 계면활성제 용액)는 1 부의 SSS 완충액 대 9 부의 청징된 배지를 사용하여 청징된 수확에 첨가된다. SSS 완충액의 첨가는 청징된 배지에서 단백질의 용해도를 유지시키도록 수행된다. 100 kDA mPES 중공 섬유 막은 생성물의 100배 부피측정 농도를 수행하도록 이용된다. 농축에 생성물을 TMN500T(20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 완충액 교환하는 4의 정용여과가 후행한다. 최종 농도는 표적 부피측정 농도 인자에 도달하도록 정용여과 단계 후 발생한다 도 189는 TFF 단계의 단계의 개관을 보여준다. 도 190은 대규모 TFF 실행에 사용되는 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 기술한다. 도 191은 대규모 접선 유동 여과 유닛 조작에 사용되는 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 함유한다.
추가의 코멘트 - 이것이 생성물의 거품발생을 개시시킬 수 있으므로 최종 농축 단계 동안 흐름 루프로 공기를 허용하지 않도록 주의한다.
초기 이오딕사놀 농도
초기 초원심분리 농도 단계는 부피를 감소시키도록 수행되고, 이는 후속하는 이오딕사놀 구배 단계에서 프로세싱될 것이다. 이오딕사놀 구배 분리의 부피측정 처리량이 제한되므로 부피의 감소가 필요하다.
이전의 TFF 단계로부터의 생성물은 32 mL 부피로 분취되고, 원심분리 관에 놓인다. 1 x TMNK 완충액은 이것이 32 mL 미만일 것 같은 경우에 마지막 원심분리 관을 수위 상승시키도록 사용될 수 있다. 3 mL의 57% 이오딕사놀 용액의 단일 층은 각각의 생성물 함유 관으로 오버레이된다. 원심분리 관은 원심분리기로 로딩되고, 4℃의 온도를 이용하여 30분 동안 65,000 rpm에서 스피닝된다. 원심분리는 전체 생성물 스트림을 가공하기 위해 필요한 바대로 반복될 수 있다. 전체 57% 이오딕사놀 밴드는 1 mL의 57% 계면을 따라 수확된다. 수확된 생성물은 이후 1 x TMNK 완충액으로 희석된다. 도 192는 이오딕사놀 농도 단계의 예시적인 요약을 제공한다. 도 193은 원심분리 농도 단계에 사용되는 매개변수 및 세트포인트를 기술한다. 원심분리 농도 단계에 사용되는 핵심 재료 및 소모품은 도 194에 함유된다.
추가의 코멘트
- 초원심분리 관의 하부로 'Lg TFF 농축물' 풀 샘플을 옮길 때 버블 생성 또는 발포를 피한다.
- 원치 않는 상 혼합을 피하도록 57% 언데레이를 천천히 첨가한다.
- 수확할 때, 생성물을 수집할 때 형성되는 진공을 중단하도록 원심분리 관의 상부를 천공시킨다
이오딕사놀 구배 정제
원심분리된 농축 배지는 불연속 이오딕사놀 구배를 사용하여 추가로 정제된 다. 이 단계는 초원심분리 후 이오딕사놀 구배 배지에서 이 입자의 차등적 부력 밀도에 기초하여 DNA가 없는 rAAV 입자(빈 입자)의 벌크를 제거하면서 DNA-함유 rAAV 입자에 대한 제조를 농후화하도록 작용한다. 불연속 구배는 25, 40 및 57% 이오딕사놀 상으로 형성된다. 원심분리 후 DNA 농후화된 벡터는 40/57% 계면 바로 아래로부터 수확된다. 빈 입자의 벌크는 25/40% 계면에 함유된다. 수확된 혼주된 벡터는 AAV 벡터의 응집을 막도록 1xTMNK 완충액에 희석된다. 도 195는 이오딕사놀 구배 정제 단계를 완료하기 위해 필요한 단계의 그래프상 개관을 제공한다. 도 196은 이오딕사놀 구배 원심분리 단계에 사용된 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 기술하지만, 도 197은 연관된 핵심 재료 및 소모품을 함유한다.
추가의 코멘트
- 첨가하는 이오딕사놀 밴드를 옮길 때 버블 생성 또는 발포를 피한다.
- 원치 않는 상 혼합을 피하도록 이오딕사놀 용액을 천천히 첨가한다.
- 수확할 때, 생성물을 수집할 때 형성되는 진공을 중단하도록 원심분리 관의 상부를 천공시킨다
양이온 교환 크로마토그래피
이오딕사놀 수확 분획은 이오딕사놀을 포함하는 잔류 오염물질을 제거하도록 작용하는 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 칼럼 위에서 정제된다.
이오딕사놀 풀은 처음에 희석 완충액(6:1 비 - 희석 완충액 대 이오딕사놀 풀)을 사용하여 7배 희석된다. 이것은 이후 WFI(1:1 비 - WFI 대 희석된 이오딕사놀 풀)를 사용하여 2배 희석이 뒤따른다. 이오딕사놀 풀의 희석은 벡터가 전도도를 감소시키고 샘플의 pH를 저하시킴으로써 양이온 교환 칼럼에 결합하게 하는 데 필요하다.
14배, 완전히 희석된, 이오딕사놀 풀은 SP Sepharose™ HP 수지를 이용하는 양이온 교환 단계에 대한 로드가 된다. 벡터의 결합은 낮은 전도도 및 낮은 pH 시트레이트계 완충액에서 발생하고, 용리는 고염 완충액의 사용에 의해 달성된다. 용리 피크를 함유하는 벡터는 후속하는 가공 전에 2-8℃에서 저장하기 전에 이후 AMPD 완충액(1:9 비 - AMPD 완충액 대 CEX 용리물)으로 희석된다. CEX 유닛 조작의 개관은 도 198에 예시되는 반면, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 완전 조작 매개변수는 도 199 및 도 200에 함유된다. CEX 단계의 성공적인 실행에 필요한 핵심 재료 및 소모품은 이의 연관된 상세내용과 함께 도 201에 기술된다.
소규모 접선 유동 여과 및 부형제 첨가
최종 벡터 제형은 100 kDa, TFF mPES 막을 사용하여 달성된다. 최종 제형 전에, 공정내 샘플은 벡터 역가 및 DNase 저항 입자(DRP)의 수율을 결정하기 위해 qPCR 방법을 이용하여 벡터 회수에 분석된다. 이 데이터는 최종 표적 역가를 달성하는데 필요한 최종 부피를 예측하도록 사용된다. 생성물은 최종 제형 완충액(20 mM Tris pH 8.0, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl)으로 정용여과된다. 부형제 폴록사머 188은 0.001%(v/v)의 최종 농도로 수동으로 첨가된다. 도 202는 소규모 접선 유동 여과 단계를 완료하는 데 필요한 단계의 그래프 개관을 제공한다. 도 203은 소규모 TFF 실행에 사용되는 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 기술한다. 도 204는 소규모 접선 유동 여과 유닛 조작에 사용되는 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 함유한다.
무균 여과 및 바이알링
최종 제형 후, 최종 역가가 결정되고, 이후 생성물은 정제된 벌크 약물 물질(PBDS)을 생성하도록 0.22 μm 필터를 통해 말단에 무균 여과된다. PBDS는 무균 관으로 충전되고, 이때 생성물은 최종 약물 제품(FDP)이 된다. FDP는 -60℃ 미만에서 저장되기 전에 조사된다. 도 204는 무균 여과 및 충전 유닛 조작의 흐름 차트를 보여준다. 도 205는 무균 여과 및 충전 조작에 사용되는 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 기술한다. 도 206은 무균 여과 및 충전 단계에 사용되는 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 함유한다.
공정내 유지 조건
도 207은 AAV8-RPGR 생성물의 제조 동안 사용된 공정내 지점에서 보유 시간의 상세내용을 함유한다. 더 많은 정보가 이용 가능하므로, 공정내 보유 시간은 가장 최근의 데이터를 반영하도록 개선될 것이다.
용액 제조를 위한 바람직한 화학물질
컴페디알 또는 멀티-컴페디알 화학물질은 가능할 때마다 사용될 것이다. 도 208은 공정에 바람직한 화학물질 및 연관된 등급의 목록을 제공한다.
실시예 6: AAV8-RPGR 제조를 위한 하류 공정
프로젝트의 목표는 rAAV8 RPGR 마지막 단계 임상 및 상업적 프로그램에 대한 산업적 크로마토그래피 하류 공정(DSP)을 개발하는 것이었다. 프로젝트는 모든 개발된 단계 - 클라이언트의 프로토콜에 따른 포획, 중간 연마 및 마크로-다공성 OH, SO3 및 QA 칼럼을 사용한 빈-충전(E/F) AAV8 캡시드의 분리, 및 접선 흐름 여과(TFF)를 포함하였다. 개발은 청징된 수확 재료에 기초하고, 여기서 인산칼슘은 형질주입제로서 사용되었다.
재료 및 방법
샘플
샘플은 청징된 DMEM 배지에서 제형화되었다. 2개의 상이한 실험 실행은 상이한 일자에 수행되었다. 실험 A 및 실험 B. 도 210은 실험 A의 샘플 상세내용을 함유한다. 도 234는 실험 B의 샘플 상세내용을 함유한다.
FPLC 시스템(제조용 실행)
FPLC 2:
- GE Healthcare Akta Explorer 100, UV 유세포 2 mm
- 0.75 mm I.D. 모세관(8 및 80 mL 칼럼과 사용됨)
- 샘플 로딩: 시스템 펌프를 통해 로딩
- 검출: UV 280 nm, UV 260nm, 전도도, pH
HPLC 시스템(분석 실행)
HPLC 1:
- PATfix™, 10 mL 펌프 헤드, 0.25 mm I.D. 모세관
- 샘플 로딩: 500 μL 샘플 루프
- 검출: UV 280 nm, UV 260 nm, 형광 280/348 (FLU, FLD), 전도도, MALS
- 유속: 1-2 mL/분
모노리스 정지상
분석 실행(3 칼럼):
- 마크로-다공성 아데노-0.1
- 마크로-다공성 SO3-0.1
- 마크로-다공성 AAV 빈/완전-0.1
제조용 실행(3칼럼):
- 마크로-다공성 OH-80
- 마크로-다공성 SO3-8
- 마크로-다공성 QA-8
완충액
완충액을 새로운 정제수에서 제조하고, 0.22 μm 필터를 통해 여과시켰다. 도 211은 실험 A에 대한 제조용 및 분석용 실행에 사용된 완충액을 보여준다. 도 235는 실험 B에 대한 제조용 및 분석용 실행에 사용된 완충액을 보여준다.
크로마토그래피 방법
제조용 실행:
- HIC 단계 - HIC 정제 단계는 하류 가공 SOP에 기재된 바대로 수행되었다. 도 212는 실험 A에 대한 전용 완충액으로 SOP 단계 구배를 보여준다. 도 236은 실험 B에 대한 전용 완충액으로 SOP 단계 구배를 보여준다.
- CEX 단계 - CEX 정제 단계는 하류 가공 SOP에 기재된 바대로 수행되었다. 도 213은 실험 A에 대한 전용 완충액으로 SOP 단계 구배를 보여준다. 도 237은 실험 B에 대한 전용 완충액으로 SOP 단계 구배를 보여준다.
- AEX 단계 - AEX 정제 단계는 하류 가공 SOP에 기재된 바대로 수행되었다. 도 214는 실험 A에 대한 60 칼럼 부피(CV)에서 0 내지 100% 이동상 B 및 이후 10 CV에 대한 단계 내지 100% MPC의 SOP 선형 구배를 보여준다. 도 238은 실험 B에 대한 60 칼럼 부피(CV)에서 0 내지 100% 이동상 B 및 이후 10 CV에 대한 단계 내지 100% MPC의 SOP 선형 구배를 보여준다
분석 실행:
- 부분 분리 - 50 CV에서의 0 내지 35% 이동상 B, 이후 5 CV에서의 35 내지 100%의 선형 구배. 부분 분리 방법은 분석 HPLC SOP에 기재된 바대로 수행되었다.
- 총 - 50 CV에서의 0 내지 100% 이동상 B의 선형 구배. 총 방법은 분석 HPLC SOP에 기재된 바대로 수행되었다.
- 빈/충전 - 50 칼럼 부피(CV)에서의 0 내지 40% 이동상 B, 이후 10CV에서의 40 내지 100%의 선형 구배.
총 단백질 검정
샘플은 2의 검정에 따라 총 단백질 농도에 대해 시험되었다. BCA Pierce 방법 또는 Bradford 방법 중 어느 하나는 완충액 조성물에 따라 사용되었다. 제조사 프로토콜이 따라졌다.
총 DNA 검정
샘플에서의 총 DNA 정량화를 위해, Quant-IT™ PicoGreen® 검정이 사용되었다. 제조사 프로토콜이 따라졌다.
SDS-PAGE
SDS-PAGE는 제조사의 지시(Bio-Rad)에 따라 환원 조건 하에 4-20% 구배 겔을 사용하여 Mini-Protean II 전기영동 세포(Bio-Rad)에서 수행되었다. 겔은 불연속 Tris-글리신 완충 시스템을 사용하여 35분 동안 200 V에서 실행되었다. 단백질 밴드는 Plus one Silver 염색 시약(GE Healthcare)에 의해 가시화되었다. 10-200 kDa 분자량 표준품(Fermentas Life Sciences)이 사용되었다. 적절한 희석 중의 매번 20 ul의 샘플을 웰에 로딩하였다.
TEM
샘플은 음성 염색 방법을 이용하여 TEM에 의한 실험을 위해 제조되었다. 해동된 샘플은 온화하게 혼합되고, 5분 동안 새로 글로우 방전된 구리 그리드(400 메시, 포름바-탄소 코팅됨)에 적용되고, 세척되고, 우라닐 아세테이트의 1%(w/v)의 물 용액의 1 방울로 염색되었다.
그리드는 80 kV에서 조작되는 주사 전자 현미경 Philips CM 100(FEI, 네덜란드)에 의해 관찰되었다. 적어도 10 그리드 정가각형은 완전히 조사되고, 여러 현미경사진(카메라 ORIUS SC 200, Gatan, Inc.)은 충전 입자와 빈 입자 사이의 비를 평가하도록 취해졌다. 현미경사진은 그리드에서 상이한 위치에서 동시에 취한다.
ddPCR
샘플(및 대조군)은 DNAze 처리되고, 이중으로 3회 희석되었다(각각의 샘플에 대해 6 반응). 반응 혼합물: 프로브에 대한 ddPCR Supermix(dUTP 무). 반응 부피: 20 uL, DNA 부피 5 uL, 액적 부피 0.000739. 사용된 장비: Bio-Rad QX100™ Droplet Digital™ PCR 시스템, Bio-Rad QX200™ AutoDG™ Droplet Digital™ PCR 시스템, Fluidigm Biomark HD. 클라이언트 추천에 기초하여 사용된 프라이머 및 프로브.
마크로-다공성 OH 칼럼 HPLC 분석 방법을 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에서의 포획 단계
제조용 실행
청징된 수확 재료(1 L 병에 나눠진 8 L)를 실온에서 밤새 해동한다. 다음날 이것을 혼주하고 400 mL/분의 속도로 연동 펌프를 사용하여 희석 완충액으로 1:1(8L 수확 + 8L 완충액) 희석한다. 1 CV/분에서 시스템 펌프를 사용하여 칼럼에 로딩한다. Tech 이동 실행은 실험 A에 대한 HIC 조건(HIC-25)에 대해 이십오(25) 실행이었다. 도 215는 실험 A에 대한 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 216은 실험 A에 대한 실행 HIC-25로부터의 예시적인 크로마토그램을 보여준다. Tech 이동 실행은 실험 B에 대한 HIC 조건(HIC-26)에 대해 이십육(26) 실행이었다. 도 239는 실험 B에 대한 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 240은 실험 B에 대한 실행 HIC-26으로부터의 예시적인 크로마토그램을 보여준다.
HPLC 총 분석
총 입자 분석은 크로마토그래피 회수의 결정을 위해 HPLC에 사용되었다. 분획은 Amicon Ultra 0.5를 사용하여 탈염되었다. 주요 용리는 주사 전에 추가로 10x 희석되었다. 도 217은 실험 A에 대한 HPLC 분석에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 217로부터 본 발명자들은 모든 AAV가 칼럼에 결합하고, 분획 W2, E1 및 W3에서 용리한다는 것을 확인할 수 있다. 사진 J(overlay)를 관찰할 때 본 발명자들은 분획 W2 및 W3 둘 다가 주요 E1 용리와 비교하여 존재하는 다른 단백질 불순물을 갖는다는 것을 볼 수 있다. 본 발명자들은 또한 분획 E1이 다른 2개와 비교하여 10배 희석되어서, 용리물을 둘러싼 분획에서의 벡터의 소실이 무시할만하다는 것을 간주해야 한다. 피크의 면적은 회수를 결정하기 위해 로드 및 수확 면적 피크와 비교되었다.
도 241은 실험 B에 대한 HPLC 분석에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 241로부터 본 발명자들은 모든 AAV가 칼럼에 결합하고, 분획 W2, E1 및 W3에서 용리한다는 것을 확인할 수 있다. 사진 J(overlay)를 관찰할 때 본 발명자들은 분획 W2 및 W3 둘 다가 주요 E1 용리와 비교하여 존재하는 다른 단백질 불순물을 갖는다는 것을 볼 수 있다. 본 발명자들은 또한 분획 E1이 다른 2개와 비교하여 10배 희석되어서, 용리물을 둘러싼 분획에서의 벡터의 소실이 무시할만하다는 것을 간주해야 한다. 피크의 면적은 회수를 결정하기 위해 로드 및 수확 면적 피크와 비교되었다.
제조용 실행의 회수
출발 청징된 수확 재료와 비교하는 포획 단계 HIC-OH에 대한 회수는 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 대해 102% 및 68%이었다. 2의 방법 사이의 불일치는 주로 샘플에서의 높은 염 농도에 의해 주로 생기고, 더구나 질량 균형은 두 경우에 100%가 아니여서, 2의 정규화가 주요 분획에서 AAV의 평균 80-90% 회수로 보다 정확한 결과를 생성시킬 것이다. 도 218은 실험 A로부터의 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-25 실행의 회수를 기술한다. 도 242는 실험 B로부터의 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-26 실행의 회수를 기술한다. 도 219는 실험 A에 대한 HIC-25 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과이다. M - 래더. 분획 E1, W3 및 CIP는 각각 5배, 5배 및 2배 희석되었다. 주요 분획은 E1이다. VP1-VP3 단백질은 적색 직사격형으로 표시된다.
SDS-PAGE
모든 분획은 처음에 탈염되고 이후 그대로 또는 환원 조건 하에 희석되어 겔에 로딩되었다. 도 218은 AAV의 농도를 보여주고 성공적인 포획이 실험 A에 대한 청징된 수확 재료로부터 달성된다. HIC 단계 후 주요 용리는 다음의 크로마토그래피 단계 CEX-SO3에 의해 제거된 많은 단백질 불순물을 갖는다. HIC-25 실행으로부터의 SDS-PAGE 결과. 도 242는 AAV의 농도를 보여주고 성공적인 포획이 실험 B에 대한 청징된 수확 재료로부터 달성된다. HIC 단계 후 주요 용리는 다음의 크로마토그래피 단계 CEX-SO3에 의해 제거된 많은 단백질 불순물을 갖는다. HIC-26 실행으로부터의 SDS-PAGE 결과.
마크로-다공성 SO3 칼럼을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 대한 중간 연마
제조용 실행
HIC-OH로부터의 전체 용리(E1)는 결합 조건에 일치하도록 제조되고 CEX-SO3 칼럼에 로딩되었다. Tech 이동 실행은 실험 A에 대한 CEX 조건(SO3-16)에 대해 열여섯(16) 실행이었다. 도 220은 실험 A에 대한 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 221은 실험 A에 대한 실행 SO3-16으로부터의 예시적인 크로마토그램을 보여준다.
Tech 이동 실행은 실험 B에 대한 CEX 조건(SO3-17)에 대해 열일곱(17) 실행이었다. 도 244는 실험 B에 대한 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 245는 실험 B에 대한 실행 SO3-17로부터의 예시적인 크로마토그램을 보여준다.
HPLC 총 분석
총 입자 분석은 크로마토그래피 회수의 결정을 위해 HPLC에 사용되었다. 분획은 주사 전에 100배 (E1) 또는 2.5배 (다른 분획) 희석되었다. 도 222는 실험 A에 대한 SO3-16에 대한 HPLC 분석-총 방법에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 222로부터 본 발명자들은 모든 AAV가 칼럼에 결합하고, 분획 E1 및 W3에서 용리한다는 것을 확인할 수 있다. 본 발명자들은 분획 E1이 비교하여 100배 희석되고 W3이 5배 희석되어서 W3 분획에서의 벡터의 소실이 무시할만하다. 피크의 면적은 회수를 결정하도록 로드 및 초기 HIC-25 E1 재료와 비교되었다. 도 223은 실험 A에 대한 제조용 실행 SO3-16에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 기술한다. 출발 HIC-28 E1 재료와 비교하는 중간 연마 단계 CEX-SO3에 대한 회수는 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 대해 99% 및 87%이다. 2의 방법 사이의 불일치가 작다. HPLC 분석의 경우에, 질량 균형은 100%가 아니다.
도 246은 실험 B에 대한 SO3-17에 대한 HPLC 분석-총 방법에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 246으로부터 본 발명자들은 모든 AAV가 칼럼에 결합하고, 분획 E1 및 W3에서 용리한다는 것을 확인할 수 있다. 본 발명자들은 분획 E1이 비교하여 100배 희석되고 W3이 5배 희석되어서 W3 분획에서의 벡터의 소실이 무시할만하다. 피크의 면적은 회수를 결정하도록 로드 및 초기 HIC-26 E1 재료와 비교되었다. 도 247은 실험 B에 대한 제조용 실행 SO3-17에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 기술한다. 출발 HIC-28 E1 재료와 비교하는 중간 연마 단계 CEX-SO3에 대한 회수는 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 대해 99% 및 87%이다. 2의 방법 사이의 불일치가 작다. HPLC 분석의 경우에, 질량 균형은 100%가 아니다.
SDS-PAGE
모든 분획은 그대로 또는 환원 조건 하에 희석되어 겔에 로딩되었다. 도 224는 실험 A에 대한 SO3-16 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 도 224는 HIC로부터 CEX 단계로 10배 더 낮은 칼럼 크기가 사용되므로 AAV의 추가의 농축을 나타낸다. HIC 단계 후 주요 용리는 AAV 바이러스 밴드로부터 멀리 존재하는 다른 단백질 불순물을 갖는다. 세척 3에서 AAV 밴드의 작은 부분이 가시적이다. 대부분의 숙주 세포 단백질은 CIP에 의한 스트립에 의해 제거된다.
도 248은 실험 B에 대한 SO3-17 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 도 248은 HIC로부터 CEX 단계로 10배 더 낮은 칼럼 크기가 사용되므로 AAV의 추가의 농축을 나타낸다. HIC 단계 후 주요 용리는 AAV 바이러스 밴드로부터 멀리 존재하는 다른 단백질 불순물을 갖는다. 세척 3에서 AAV 밴드의 작은 부분이 가시적이다. 대부분의 숙주 세포 단백질은 CIP에 의한 스트립에 의해 제거된다.
마크로-다공성 QA 칼럼을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에서의 빈 및 충전 AAV 캡시드 분리
제조용 실행
SO3-16으로부터의 전체 용리(E1)는 실험 A에 대해 결합 조건에 일치하도록 희석되고 AEX-QA 칼럼에 로딩되었다. Tech 이동 실행은 AEX 조건(QA-14)에 대해 열네개(14) 실행이었다. 도 225는 실험 A에 대한 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 226은 실험 A에 대한 실행 QA-14로부터의 예시적인 크로마토그램을 보여준다.
SO3-17로부터의 전체 용리(E1)는 실험 B에 대해 결합 조건에 일치하도록 희석되고 AEX-QA 칼럼에 로딩되었다. Tech 이동 실행은 AEX 조건(QA-15)에 대해 열다섯(15) 실행이었다. 도 249는 실험 B에 대한 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 250은 실험 B에 대한 실행 QA-15로부터의 예시적인 크로마토그램을 보여준다.
HPLC 빈-충전 분석
빈-충전 방법은 크로마토그래피 회수 및 순도(E/F 캡시드의 비)의 결정을 위해 HPLC에 사용되었다. 분획은 주사 전에 희석되었다. 도 227은 실험 A로부터 QA-14에 대한 HPLC 분석- 빈-충전 방법에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 227로부터 본 발명자들은 FT+W 분획에서 피크가 가시적이지 않으므로 모든 AAV가 칼럼에 결합한다는 것을 확인할 수 있다. 전하에서의 약간의 차이로 인해 빈 캡시드는 처음에 용리하기 시작하고(E2), 이어 이어 E3에서 발견되는 충전 캡시드가 후행한다. A260/A280 비의 차이는 AAV가 빈 또는 충전 캡시드에서 순수하다는 것을 확인시켜준다. A260/A280 비에서의 0.6의 값은 주로 단백질 조성물로 빈 캡시드에 상응하고, 여기서 DNA 인서트를 갖는 충전 캡시드는 순도에 따라 1.3 이상의 값을 제공한다. 다음의 용리 피크로부터 빈 캡시드 오염으로 인해 더 낮은 순도가 얻어지므로 분획 E4가 수집된다. E5 분획은 주로 빈, 응집된 및 손상된 캡시드(2개의 피크)를 갖고, E6 분획에서 AAV 용리가 없다. 피크의 면적은 회수 및 순도를 결정하도록 로드 및 초기 SO3-16 E1 재료와 비교되었다.
도 251은 실험 B로부터의 QA-15에 대한 HPLC 분석 - 빈-충전 방법에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 251로부터 본 발명자들은 FT+W 분획에서 피크가 가시적이지 않으므로 모든 AAV가 칼럼에 결합한다는 것을 확인할 수 있다. 전하에서의 약간의 차이로 인해 빈 캡시드는 처음에 용리하기 시작하고(E2), 이어 이어 E3에서 발견되는 충전 캡시드가 후행한다. A260/A280 비의 차이는 AAV가 빈 또는 충전 캡시드에서 순수하다는 것을 확인시켜준다. A260/A280 비에서의 0.6의 값은 주로 단백질 조성물로 빈 캡시드에 상응하고, 여기서 DNA 인서트를 갖는 충전 캡시드는 순도에 따라 1.3 이상의 값을 제공한다. 다음의 용리 피크로부터 빈 캡시드 오염으로 인해 더 낮은 순도가 얻어지므로 분획 E4가 수집된다. E5 분획은 주로 빈, 응집된 및 손상된 캡시드(2개의 피크)를 갖고, E6 분획에서 AAV 용리가 없다. 피크의 면적은 회수 및 순도를 결정하도록 로드 및 초기 SO3-17 E1 재료와 비교되었다.
접선 흐름 여과
농축 및 완충액 교환은 실험 A에 대해 QA-14 E3 샘플에서 TFF의 실행에 의해 달성되었다. 샘플의 말단 부피는 25 mL였다(10 mL 샘플 + 15 mL 시스템 홀드업 부피). 도 228은 실험 A에 대한 접선 흐름 여과 조건을 기술한다.
농축 및 완충액 교환은 실험 B에 대해 QA-15 E3 샘플에서 TFF의 실행에 의해 달성되었다. 샘플의 말단 부피는 35 mL였다(10 mL 샘플 + 25 mL 시스템 홀드업 부피). 도 252는 실험 B에 대한 접선 흐름 여과 조건을 기술한다.
제조용 실행의 회수
출발 SO3-16 E1 재료를 비교하는 충전 캡시드 옹후화 단계(빈 및 충전 분리) 단계 AEX-QA에 대한 회수는 실험 A에 대해 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 대해 73% 및 67%였다. 2의 방법 사이의 불일치가 작다. HPLC 분석의 경우에, ddPCR 질량 균형은 100%가 아니다. 형광이 DNA (인서트) 켄칭 FLD 신호로 인해 충전 AAV 캡시드 회수의 더 낮은 반응을 주므로 HPLC E/F 분석에 대해 오직 A260 및 A280 면적이 고려된다. TFF 후 대략 60-70% 회수가 얻어져서, 이는 QA 용리물을 청징된 수확 재료에 비교하여 전체 하류 수율이 43% 또는 73%라는 것을 의미한다. 도 229는 실험 A에 대한 제조용 실행 QA-14 TFF 및 총 DSP 수율에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수를 기술한다.
출발 SO3-17 E1 재료를 비교하는 충전 캡시드 농후화 단계(빈 및 충전 분리) 단계 AEX-QA에 대한 회수는 실험 B에 대해 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 대해 62% 및 64%였다. 2의 방법 사이의 불일치가 작다. HPLC 분석의 경우에, ddPCR 질량 균형은 100%가 아니다. 형광이 DNA (인서트) 켄칭 FLD 신호로 인해 충전 AAV 캡시드 회수의 더 낮은 반응을 주므로 HPLC E/F 분석에 대해 오직 A260 및 A280 면적이 고려된다. TFF 후 대략 대략 70-80% 회수가 얻어져서, 이는 QA 용리물을 청징된 수확 재료에 비교하여 전체 하류 수율이 55% 또는 82%라는 것을 의미한다. 도 253은 실험 B에 대한 제조용 실행 QA-15 TFF 및 총 DSP 수율에 대한 ddPCR 및 HPLC E/F 분석에 기초한 회수를 기술한다.
순도(빈 및 충전 AAV 캡시드 사이의 비)
도 230은 실험 A에 대한 HPLC E/F 분석에 기초한 빈 및 충전 AAV 캡시드 둘 다의 순도를 기술한다. 도 230은 FLD가 고려되면 주요 E3 분획의 순도(충전 캡시드의 백분율)가 87%라는 것을 나타낸다. 흡광도 둘 다에 대한 흡광 계수가 알려지지 않으므로, 본 발명자들은 이의 신호에 의존할 수 없다; 이는 FLD를 가장 실뢰할만한 값으로 만든다. 비율은 주요 피크 용리(분획 E4)에 기초하여 급격히 변하고, 여기서 비율은 불과 55%이다. 오직 3.5CV(대략 80% 피크)의 수집에 대한 이유는 E3에서 더 높은 순도 및 벡터(E4)의 오직 적은 소실(7%)을 달성하는 것이다.
도 254는 실험 B에 대해 HPLC E/F 분석에 기초한 빈 및 충전 AAV 캡시드 둘 다의 순도를 기술한다. 도 254는 MALS 및 FLD 둘 다가 고려되면 주요 E3 분획의 순도(충전 캡시드의 백분율)가 90%라는 것을 나타낸다. 흡광도 둘 다에 대한 흡광 계수가 알려지지 않으므로, 본 발명자들은 이의 신호에 의존할 수 없다; 이것이 입자의 직경을 측정하므로 이는 MALS를 가장 실뢰할만한 검출기로 만든다. 정확도에 관하여 FLD 검출기가 두번째이다. 비율은 주요 피크 용리(분획 E4)에 기초하여 급격히 변하고, 여기서 비율은 불과 60-70%이다. 오직 3.5CV(대략 80% 피크)의 수집에 대한 이유는 E3에서 더 높은 순도 및 벡터(E4)의 오직 적은 소실(6%)을 달성하는 것이다.
실험 A에 대해, 순도는 E2(빈 캡시드) 및 E3(충전 캡시드)에 대해 TEM에 의해 추가로 시험되지만, 충전 캡시드에 대해 TFF 후 상이한 단계 - QA-14 E3 샘플이 평가되었다. 샘플 TFF AAV8-RPGR FULLS는 손상된 입자의 오직 적은 응집체를 함유하는 샘플 QA-14 E2와 비교하여 불순물의 상이한 종류를 함유하였다. 충전 바이러스와 빈/손상된 바이러스 사이의 비율은 샘플 둘 다에서 유사하고, 샘플 TFF AAV8-RPGR FULLS에서 62%이고 샘플 QA-14 E2에서 65%이다. 비교적 높은 백분율은 비분류된 입자를 나타냈다. 이 군으로부터의 바이러스는 전체 표면에서 전자 투명하지 않지만, 표면에서 바로 전자 밀집 스팟을 나타냈다. 이러한 바이러스는 완전히 충전되지 않고, 정확히 형성되거나 손상될 수 있었다. 도 231은 실험 A에 대해 TEM에 의해 평가된 충전 및 빈 AAV의 비율을 기술한다. 도 232는 TEM에 의해 평가된 TFF 후 QA-14 E3 분획, 실험 A에 대해 QA-14 E2 분획을 보여준다.
사상성 불순물은 TFF 후 샘플에서 오직 발견되고, 이는 적절히 위생처리되지 않은 TFF로부터 유래되었다는 것이 나중에 확인되었다. 빈 피크에서 발견된 충전 캡시드의 많은 부분은 분획 수집 접근법에 의해 설명되고, 여기서 E2 분획은 충전 입자가 이미 용리하고 따라서 빈 분획 E2를 오염시키는 흡광도 교차가지 연장된다.
실험 B에 대해, 순도는 QA-15 E3(충전 캡시드) 및 TFF 후 샘플(TT BB RPGR-FULLS)에 대해 TEM에 의해 추가로 시험되었다. 샘플 TT BB AAV8-RPGR FULLS 및 QA-15 E3은 손상된 입자의 오직 적은 응집체를 함유하였다. 샘플 둘 다에서 일부 응집체는 또한 보통 디스크라 불리는 구조를 포함하고 가장 아마 단백질을 나타냈다. 샘플 둘 다에서 충전 입자가 만연하지만, 그리드 실험의 시간에 본 발명자들은 비희석된 샘플과 희석된 샘플 사이에 샘플 QA-15 E3의 차이를 확인하였다. 본 발명자들은 비희석된 샘플과 희석된 샘플에 대해 별개로 입자를 계수하고 계산하였다. 본 발명자들은 비희석된 샘플로부터의 계산만이 고려된다고 제안한다. 샘플 TT BB AAV8-RPGR FULLS는 충전 입자의 76%를 함유하고, 샘플 QA-15 E3은 충전 입자의 84%를 함유하였다. 도 255는 실험 B에 대해 TEM에 의해 평가된 충전 및 빈 AAV의 비율을 기술한다. 도 256은 TEM에 의해 평가된 TFF 후 QA-15 E3 분획, 실험 B에 대해 QA-14 E2 분획을 보여준다.
SDS-PAGE
모든 분획은 그대로 또는 환원 조건 하에 희석되어 겔에 로딩되었다. 도 233은 실험 A로부터의 QA-14 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 도 233은 E2 내지 E6으로부터의 모든 분획이 AAV를 함유한다는 것을 나타낸다. E3 및 E4 분획에 존재하는 200kDa 마크 초과의 단백질 밴드는 충전 캡시드에서 오직 발견된 DNA 인서트에 상응하며, 오직 이들 2의 분획이 HPLC E/F 분석 결과를 보완하는 충전 캡시드를 함유한다는 것을 나타낸다. 다른 단백질 불순물은 VP1-VP3 이외에 E3 분획에서 발견된다. 이 불순물은 TFF(AAV8 FULLS)에 의해 부분적으로 제거되지만 다른 단백질은 TEM에 의해 또한 확인된 바대로 여전히 존재한다. 추가의 단백질 밴드는 TFF 시스템의 부적절한 위생처리로 인해 존재한다.
도 257은 실험 B로부터의 QA-15 실행에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 도 257은 E2 내지 E6으로부터의 모든 분획이 AAV를 함유한다는 것을 나타낸다. E3 및 E4 분획에 존재하는 200kDa 마크 초과의 단백질 밴드는 충전 캡시드에서 오직 발견된 DNA 인서트에 상응하며, 오직 이들 2의 분획이 HPLC E/F 분석 결과를 보완하는 충전 캡시드를 함유한다는 것을 나타낸다. 다른 단백질 불순물은 VP1-VP3 이외에 E3 분획에서 발견된다. 이 불순물은 TFF (AAV8 FULLS)에 의해 부분적으로 제거되었다.
HPLC 분석 - 부분 분리 방법
도 258은 실험 B에 대한 부분 분리 방법을 사용한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 258로부터 본 발명자들은 대부분의 불순물이 HIC 단계에 의해 제거된다(사진 A)는 것을 관찰할 수 있다. 샘플은 빈 캡시드 및 충전 캡시드의 분리를 달성하도록 충분히 순수하지 않아서, 추가의 연마가 CEX-SO3에서 수행된다. 이 단계로부터의 용리물은 주로 순수하고 고도로 농축되지만, 여전히 빈 캡시드 및 충전 캡시드 둘 다로 이루어진다. 마지막 AEX-QA 단계는 2개의 캡시드를 분리하고, 따라서 충전 캡시드를 단리시키고 농후화한다. 수확 재료를 QA 주요 분획과 비교하여, 출발 재료로부터 AAV 피크를 확인할 수 있다.
결론
심리스 하류 정제 실행은 출발 재료로서 청징된 수확을 사용하여 수행되었다. AAV의 포획 및 농도는 HIC-OH 단계에 의해 달성되었고, 여기서 단백질은 통과액에서 발견되고, AAV는 칼럼에 결합하였다. 단백질 불순물은 W2 또는 W3 분획에서 제거되었다.
단백질 불순물의 많은 부분은 HIC 단계 후 주요 용리 분획(E1)에 여전히 존재한다. 대부분의 단백질 불순물은 CEX-SO3 칼럼을 사용하여 중간 연마 단계에 의해 제거되고, 여기서 AAV의 추가의 농축은 10배 더 낮은 칼럼 스케일의 실행에 의해 달성되었다. 이 단계에서의 충전 캡시드의 백분율은 실험 A에 대해 대략 55%이고 실험 B에 대해 34%여서, AEX-QA를 사용한 충전 입자 농후화가 수행되었다.
빈 캡시드로부터 충전 캡시드를 분리한 후 제형 완충액으로의 완충액 교환이 TFF를 사용하여 수행되었다. 청징된 수확으로부터 TFF의 종료까지 전체 하류 공정 수율은 실험 A에 대해 청징된 수확으로부터 QA 충전 입자 농후화 단계의 완료까지 43% 및 73%였다. 청징된 수확으로부터 TFF의 완료까지 전체 하류 공정 수율은 실험 B에 대해 청징된 수확으로부터 QA 충전 입자 농후화 단계의 완료까지 55% 및 82%였다.
실시예 7: ABCA4 정제 공정 적합성 연구
본 개시내용은 Stargardt(ABCA4) 마지막 단계 임상 및 상업적 프로그램에 대한 산업적 크로마토그래피 하류 공정(DSP)을 제공한다. 프로젝트는 모든 개발된 단계 - 포획, 중간 연마 및 마크로-다공성 OH, SO3 및 QA 칼럼을 사용한 빈-충전 (E/F) AAV8 캡시드의 분리, 및 접선 흐름 여과(TFF)를 포함하였다.
적합성 연구는 ABACA4 벡터에 대해 수행되었고, 여기서 프록시 벡터가 사용되었다. 프록시 벡터는 ABCA4 벡터와 동일한 캡시드(AAV8/Y733F)를 가졌다. 캡시드는 HIC 및 SO3 단계에 걸쳐 벡터의 거동에 대한 결정 인자이다. 도 259는 HIC (OH) 크로마토그래피 조건을 기술한다. 도 260은 HPLC 총 입자 분석에 의해 측정된 바대로 예시적인 HIC (OH) 크로마토그램 및 벡터 회수 분석을 보여준다.
도 261은 CEX (SO3) 크로마토그래피 조건을 기술한다. 도 262는 CEX (SO3) 예시적인 크로마토그램 및 벡터 회수 분석을 보여준다.
패키징된 게놈은 베스트로핀-1 유전자(ABCA4 유전자보다 작고 이중 벡터를 요하지 않아서, 벡터 자체에 개념 증명 연구를 허용)를 포함하는 작제물이다. 패키징된 게놈은 QA 단계에 대해 거동에 대한 효과를 갖는다. 이 단계는 선형 구배를 이용하고, 따라서 ABCA4 전이유전자가 사용될 때 QA 단계에 대한 조작 조건이 변화가 없을 것이라고 기대된다. 도 263은 AEX (QA) 크로마토그래피 조건을 기술한다. 도 264는 QA 분획에서 빈 입자 및 충전 입자의 예시적인 크로마토그램 및 벡터 회수 분석을 보여준다.
순도 (E/F) 비의 최적 표시는 FLD 및 MALS 검출기에 의해 주어진다. 충전 AAV 입자의 대략 55%로부터 94%의 농후화는 QA 단계에 의해 달성된다. 도 265는 HPLC 분석에 기초한 (완전:빈) 입자의 순도를 기술한다. 도 266은 TEM에 기초한 순도(완전:빈)를 보여준다. 도 267은 SDS-PAGE 분석에 의한 순도를 보여준다.
실시예 8: AAV-ABCA4 생성에 대한 하류 공정
AAV-ABCA4 벡터에 대한 하류 공정은 AAV 벡터 정제에 효율적이고 강건한 용액의 기초를 형성하는 상이한 화학물질의 3개의 모노리스 크로마토그래피 칼럼의 사용에 대해 집중한다. 모노리스는 특히 리간드-표적 상호작용이 상이한 독립적 방식으로 발생하게 하도록 이의 큰 흐름 채널로 인해 마크로분자 예컨대 바이러스 벡터의 정제에 적합한다.
정제 트레인에서의 제1 유닛 조작은 결합 및 용리 방식으로 조작하는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 포획 단계이다. 칼럼에 대한 벡터의 결합을 촉진하기 위해 높은 몰농도 스톡 용액으로 공급된 스트림의 희석에 의해 염석 물질의 농도를 증가시키는 것이 필요하다. 생성물 용리는 더 낮은 몰농도 염 완충액으로 단계를 이용하여 달성된다.
HIC 단계 후, 공급물 스트림은 벡터가 음으로 하전된 강한 양이온 교환(CEX SO3) 칼럼에 결합하게 하는 추가의 컨디셔닝을 요한다. 컨디셔닝 완충액은 AAV 벡터를 양성자화하고 반대 이온 농도를 감소시켜서, 벡터가 음으로 하전된 리간드에 결합하게 한다. 여과 단계는 임의의 미립자를 제거하고 SO3 크로마토그래피 칼럼의 유효성을 보존하도록 공급 컨디셔닝 후 수행된다. SO3 단계는 또한 염 농도에서의 단계 증가 하에 발생하는 용리와 결합 및 용리 방식으로 조작된다.
충전 AAV 입자에 대한 농후화는 충전 입자와 빈 입자 사이에 존재하는 작은 전하 변동을 조사하여 달성된다. 강한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX QA) 칼럼을 이용하는 선형 염 구배 용리는 충전 종과 빈 종 사이의 적절한 해상을 허용한다. 모든 다른 유닛 조작에서와 같이, 공급물의 컨디셔닝은 벡터가 크로마토그래피 지지체에 결합하게 하는 데 필요하다.
최종 벡터 농축 및 정용여과는 100 kDa, TFF mPES 막을 사용하여 달성된다. 생성물은 최종 제형 완충액(20 mM Tris pH 8.0, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.001% 폴록사머 188)으로 정용여과된다. 최종 제형 전에, 공정내 샘플은 벡터 역가 및 DNase 저항 입자(DRP)의 수율을 결정하도록 qPCR 방법을 이용하여 벡터 회수에 대해 분석되었다. 이 데이터는 최종 표적 역가를 달성하는 데 필요한 최종 부피를 예측하도록 사용된다. 부형제 폴록사머 188은 0.001%(v/v)의 최종 농도로 공정 스트림에 수동으로 첨가된다. 최종 제형 후, 생성물은 정제된 Bulk 약물 물질(PBDS)을 생성하도록 0.22 μm 필터를 통해 말단에 무균 여과된다. PBDS의 충전은 공정을 완료시키고 최종 약물 제품(FDP)을 생성시킨다. 방출 시험은 PBDS 및 FDP 둘 다에서 발생한다.
하류 제조 공정 설명
소수성 상호작용 크로마토그래피 포획 단계
청징된 수확 재료의 포획 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행된다. 벡터가 소수성 지지체에 결합하는지를 보장하기 위해, 몰농도의 증가가 필요하고, 2.6 M 인산칼륨, 2% 소르비톨, pH 7 스파이크 완충액의 첨가에 의해 달성된다. 1:1 부피측정 첨가는 희석 완충액을 청징된 수확에 첨가하여 수행되는 반면, 생성된 용액은 완전히 아지테이션되었다.
OH 모노리스 칼럼(2 μm 기공)은 이 유닛 단계에 대한 크로마토그래피 유닛으로서 사용된다. 펄스 시험은 칼럼의 통합성이 손상되지 않도록 보장하기 전에 칼럼에 수행될 것이다.
칼럼의 위생처리 및 평형화 후, 생성물을 모노리스에 로딩한다. 더 낮은 몰농도 염 완충액(0.73 M 인산칼륨, 1% 소르비톨, pH 7)으로의 등용매 변화를 사용하여 생성물 용리가 달성되기 전에 2의 세척은 감소하는 몰농도의 순서로 수행된다.
용리물은 정방향 가공(결정되는 저장 조건의 한계) 전에 밤새 2-8℃에서 저장될 수 있다.
도 268은 HIC 크로마토그래피 유닛 조작과 연관된 공정 흐름을 보여준다. 도 269는 HIC 포획 단계에 사용된 매개변수 및 연관된 조작 범위 또는 세트포인트를 보여준다. 도 270은 크로마토그래피 절차에 특이적으로 필요한 단계를 보여준다.
도 271은 전형적인 완전 크로마토그래피 HIC 프로필을 예시하는 대표적인 크로마토그램을 보여준다. 도 272는 세척, 용리 및 CIP 단계에서 확대에 의해 더욱 명확성을 제공하는 대표적인 크로마토그램을 보여준다.
도 273은 도 270에 기재된 단계에 상응하는 완충액의 상세내용을 보여준다. 도 274는 HIC 크로마토그래피 단계에 사용되는 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 보여준다.
양이온 교환 크로마토그래피
양이온 교환 기반 중간 연마 크로마토그래피 단계는 공정 불순물을 추가로 감소시키다. HIC 단계로부터의 용리물은 벡터가 음으로 하전된 리간드에 결합하게 하도록 컨디셔닝될 필요가 있다. 컨디셔닝의 제1 부분은 등전점(pI) 아래에 있을 것이 요구되는 공정 스트림의 pH 저하를 수반하여서, 벡터에 전체 양의 표면 전하를 제공한다. 희석 단계는 또한 로드의 전도도를 감소시켜서, 용액에서 반대 이온으로부터 경쟁적 결합을 감소시킨다. 공정 스트림의 조정 후, 여과 단계(0.8/0.45 μm 조합 필터)는 임의의 미립자를 제거하고 SO3 크로마토그래피 칼럼의 유효성을 보존하도록 수행된다. 중화 완충액은 pH를 생리학적 수준 근처로 회복시키도록 첨가된다. 용리물은 정방향 가공(결정되는 저장 기간의 제한) 전에 밤새 2-8℃에서 저장될 수 있다. 도 275는 SO3 크로마토그래피 유닛 조작을 수행하는 데 필요한 단계를 아웃라인한다.
SO3 모노리스 칼럼(2 μm 기공)은 이 유닛 단계에 대해 크로마토그래피 유닛으로서 사용된다. 펄스 시험은 칼럼의 통합성이 손상되도록 보장하도록 사용 전에 칼럼에서 수행된다. 도 275는 SO3 크로마토그래피 유닛 조작의 흐름 차트를 보여준다. 도 276 및 도 277은 SO3 크로마토그래피 단계에 사용된 매개변수 및 조작 범위/세트포인트를 기술한다.
도 278은 대표적인 전형적인 완전 크로마토그램을 보여준다. 도 279는 로드 후 활성, 즉 칼럼 세척에 대한 집중을 보여준다. 용리 및 CIP 단계. 도 280은 이 단계에 사용된 완충액의 세부사향을 보여준다. 도 281은 원심분리 농축 단계에 사용된 예시적인 재료 및 소모품의 세부사향을 보여준다.
QA 크로마토그래피 단계
충전 AAV 입자에 대한 농후화는 충전 입자와 빈 입자 사이에 존재하는 작은 전하 변동을 조사하여 달성된다. 강한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX QA) 칼럼을 이용하는 선형 염 구배 용리는 충전 종과 빈 종 사이의 적절한 해상을 허용하고, 이는 피크 절단 방법이 사용되게 한다. 존재하는 최소 전하 변동으로 인해, 단계 용리는 강건한 분리 조작에 기초하여 형성되지 않을 것이다. UV 흡광도 신호를 모니터링하는 능력과 함께 정확하게 그리고 재현 가능하게 구배를 형성할 수 있는 바이오공정 시스템은 용리 프로필이 효과적으로 형성되게 모니터링되게 하는 데 필요하다. 중화 완충액은 pH를 생리학적 수준 근처로 회복시키도록 첨가된다. 용리물은 정방향 가공(결정되는 저장 기간의 제한) 전에 밤새 2-8℃에서 저장될 수 있다.
QA 모노리스 칼럼(2 μm 기공)은 이 유닛 단계에 대해 크로마토그래피 유닛으로서 사용된다. 펄스 시험은 칼럼의 통합성이 손상되도록 보장하도록 사용 전에 칼럼에서 수행된다. 도 282는 QA 크로마토그래피 유닛 조작의 흐름 차트를 보여준다. 도 283은 QA 크로마토그래피 단계에 사용된 매개변수 및 연관된 조작 범위 및 세트포인트를 기술한다. 도 284는 크로마토그래피 실행과 연관된 특정 단계를 보여준다. 도 285 및 도 286은 대표적인 크로마토그램(각각 완전 및 구배 용리)을 보여준다.
용리 수집 기준은 A260 및 A280 파장을 이용하여 개발되었다. 수집의 시작은 A260 및 A280 트레이스의 교차점에서 개시되고, 이는 E3 분획에 상응한다. 주의: A260 및 A280 파장은 기준이 의미 있도록 동일한 스케일에서 나타날 필요가 있다. 피크 수집의 말단은 수집의 시작 후 3.5 CV에 발생한다. 동일한 목표를 달성하지만 상이한 방법을 이용하는 수집 기준은 허용 가능하고; 이는 오직 하나의 파장이 모니터링될 수 있는 경우일 것이다. 도 287은 QA 완충액 조건 및 표적 사양을 보여준다. 도 288은 QA 크로마토그래피 유닛 조작에 사용된 핵심 재료/소모품을 보여준다.
접선 유동 여과 및 부형제 첨가
최종 벡터 제형은 100 kDa, TFF mPES 막을 사용하여 달성된다. 최종 제형 전에, 공정내 샘플은 벡터 역가 및 DNase 저항 입자(DRP)의 수율을 결정하기 위해 qPCR 방법을 이용하여 벡터 회수에 분석된다. 이 데이터는 최종 표적 역가를 달성하는데 필요한 최종 부피를 예측하도록 사용된다. 생성물은 최종 제형 완충액(20 mM Tris pH 8.0, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.001% 폴록사머 188)으로 정용여과된다. 도 289는 접선 유동 여과 단계를 완료하는 데 필요한 단계의 그래프 개관을 보여준다. 도 290은 접선 유동 여과 단계에 대한 매개변수 및 조작 범위를 보여준다. 도 291은 접선 유동 여과 유닛 조작. 에 사용되는 핵심 재료 및 소모품의 상세내용을 함유한다.
공정내 유지 조건
도 292는 AAV 생성물의 공정 개발 동안 사용된 공정내 지점에서 보유 시간의 상세내용을 함유한다.
실시예 9: ABCA4 정제 공정 최적화
프록시 벡터
프록시 벡터는 적합성 연구에 사용되었다. 프록시 벡터는 ABCA4 벡터와 동일한 캡시드(AAV8/Y773F)를 갖는다. 캡시드는 HIC 및 SO3 단계에 걸쳐 벡터의 거동에 대한 결정 인자이다. 패키징된 게놈은 QA 단계에 대해 거동에 대한 효과를 갖는다. 사용된 예시적인 패키징된 게놈은 이의 작은 크기로 인해 야생형 베스트로핀-1이다. 이 단계는 선형 구배를 이용하고, 따라서 예를 들어, ABCA4 전이유전자 또는 유사한 크기의 다른 전이유전자를 사용할 때 QA 단계에 대한 조작 조건의 변경이 없을 것이다.
HIC 포획 단계의 최적화
ABCA4 벡터에 대한 크로마토그래피 공정의 최적화가 수행되었다. HIC 공정에 대한 세척 완충액 및 CEX 공정에 대한 용리 완충액에 변화가 이루어졌다. 도 323은 구배 용리 실행의 사용에 의해 최적화된 HIC 단계 매개변수를 기술하고, 예시적인 HIC 크로마토그램을 보여준다. 최적화된 피크 절단 주석은 1.02M 완충액이다. 비화된 피크 절단 주석은 1.08M 완충액이다. 로드 후 세척 2 완충액(W2)은 1.08 M 인산칼륨, 1% 소르비톨, pH 7.0 내지 1.02M 인산칼륨, 1% 소르비톨, pH 7.0로부터 조정되었다. 로드 후 W2 완충액의 몰농도의 감소는 용리 분획으로의 공정 관련 불순물의 캐리오버를 감소시킨다. 모든 다른 조작 매개변수는 일정하게 있는다. 특정 실시형태에서, RPGR 벡터에 사용된 HIC 세척 완충액은 1.08 M K2HPO4 + KH2PO4 + 1% 소르비톨, pH 7.0이고, ABCA4 벡터에 사용된 HIC 세척 완충액은 1.02 M K2HPO4 + KH2PO4 + 1% 소르비톨, pH 7.0이다.
CEX 단계의 최적화
CEX 단계는 구배 용리 실행의 사용에 의해 최적화된다. 도 324는 최적화된 용리 완충액(E1)을 사용한 CEX 실행의 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 최적화된 피크 절단 주석은 1.33M 완충액이고, 비최적화된 피크 절단 주석은 1.3M 완충액이다. E1 완충액은 50 mM 아세테이트, 1.3M NaCL, 0.1% 폴록사머 188, pH 3.6 내지 50mM 아세테이트, 1.33M NaCl, 0.1% 폴록사머 188, pH 3.6으로부터 변샜다. 대부분의 E1의 증가는 CEX 단계의 단계 회수를 개선한다. 특정 실시형태에서, RPGR에 사용된 CEX 용리 완충액은 0.05 M 아세테이트 + 1.3 M NaCl + 0.1% 폴록사머 188, pH 3.6 ± 0.05이고, ABCA4 벡터에 사용된 CEX 용리 완충액은 0.05 M 아세테이트 + 1.33 M NaCl + 0.1% 폴록사머 188, pH 3.6 ± 0.05이다.
도 325는 최적화된 HIC 및 CEX 크로마토그래피 단계 둘 다를 사용한 예시적인 최적화된 조건 실행을 보여준다. 예시적인 QA 크로마토그램은 이의 작은 크기로 인해 야생형 BEST-1의 예시적인 패킹된 게놈을 사용한 실행이다. 도 326은 각각의 용리에 대한 단계 회수를 기술한다. 도 327a는 MALS에 의한 QA 분리 단계에 대한 충전:빈 벡터 결과를 기술한다. 도 327b는 MALS 및 TEM에 의한 QA 분리 단계에 비해 충전:빈 벡터 결과를 기술한다.
실시예 10: AAV 생성물 품질에 대한 형질주입 조건의 효과
이 프로젝트의 목적은 고품질 AAV 생성물을 생성하는 형질주입 조건을 확인하는 것이다. HEK293 세포를 폴리에틸렌이민(PEI) 형질주입 시약, PEIpro®(Polyplus 형질주입)를 사용하여 플라스미드 DNA(즉, RPGRORF15 서열(ITR)을 포함하는 AAV 작제물을 암호화하는 플라스미드, AAV8 rep 및 cap 유전자(RepCap)를 암호화하는 플라스미드, 및 p헬퍼 플라스미드)의 다양한 비로 형질주입하였다. 플라스미드 DNA/PEIpro® 혼합물을 세포에 첨가하고, 이것을 수확 전 96시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하고, 생성된 AAV 바이러스 입자를 평가하였다. 4개의 형질주입 조건을 평가하고, 벡터 입자(캡시드 ELISA)의 수 및 게놈 인서트(게놈 역가)를 함유하는 입자의 수는 각각의 조건에 정량화되었다. 도 328a는 PEI:DNA(mL:mg) 비 및 평가된 플라스미드 몰비를 포함하는 시험된 형질주입 조건을 보여준다. 도 328b는 계산되고 조건 사이의 차이를 강조하는 캡시드 ELISA의 비 및 게놈 역가 결과로부터 추론된 충전 입자의 백분율을 정량화하는 그래프를 보여준다. 도 328c 및 도 328d는 각각 도 323a에 도시된 것처럼 형질주입 조건 1, 2, 3 및 4로부터 생긴 게놈 역가(GC/mL) 및 캡시드 ELISA(입자/mL)에 대한 정량화 값의 그래프를 보여준다.
직각 충전 대 빈 정량화
도 328(a-d)에서의 충전 입자 분석는 실제 값을 과소평가하지만, 그 경향은 유요하다고 생각된다. 따라서, 이들 4의 조건(도 328b)으로부터의 샘플은 직각 방법에 의해 측정되었다. 도 329a는 직각 방법을 이용하여 평가된 바대로 충전 입자 대 빈 입자의 정량화의 대표적인 그래프를 보여준다. 도 329b는 실험 조건 및 결과의 표를 보여준다. 결과는 도 328(a-d)에서의 경항을 반영하였다. 상이한 형질주입 시약(CaPO4)으로 생성된 재료를 사용한 더 이전의 결과와의 비교는 형질주입제의 선택이 또한 완전:빈 입자의 비에 효과를 갖고, PEI의 사용이 3개의 플라스미드의 몰비를 사용하여 향상될 수 있는 충전 입자의 더 높은 백분율을 생성시킨다는 것을 제안하고, 여기서 Rep-Cap 또는 pHelp 플라스미드와 비교하여 및/또는 4:1 이하, 예를 들어, 2:1의 PEI:DNA (mL:mg) 비를 사용하여 ITR의 더 높은 상대 양이 있다.
AAV 충전 대 빈 비율에 대한 형질주입제(PEI 대 CaPO
4
)의 효과
PEI 대 CaPO4 비교 형질주입 연구는 시약이 우수한 생성물을 생성시키는지를 결정하도록 수행되었다. PEI 형질주입 또는 CaPO4를 사용하여 생성된 재료는 HPLC에 의해 충전 대 빈 벡터 비를 정량화하도록 사용되었다. 재료는 충전 입자를 농후화하는 공정 단계를 통하지 않았다. 이전의 가변적인 조건은 총 DNA, PEI/DNA 비 및 형질주입 플라스미드의 비를 포함하여 2의 형질주입 조건 사이에 일정하게 유지되었다. 도 330은 FLD(각각의 시약에 대해 왼쪽 막대) 또는 MALS(각각의 시약에 대해 오른쪽 막대)에 의해 측정된 바대로 CaPO4 대 PEI 형질주입의 함수로 충전 벡터 입자 (%) 분석의 비교를 보여주는 대표적인 그래프이다. 이 사이드 바이 사이드 연구로부터의 결과는 CaPO4 대신에 형질주입제로서 PEI를 사용하는 것이 충전 벡터 입자의 더 높은 비율을 생성시킨다는 것을 추가로 입증한다.
실시예 11: AAV8-ABCA4 제조에 대한 하류 공정
프로젝트의 목적은 rAAV/Y733F ABCA4 후기 단계 임상 및 상업적 프로그램에 대한 산업적 크로마토그래피 하류 공정(DSP)을 개발하는 것이었다. 프로젝트는 모든 개발된 단계 - 포획, 중간 연마 및 마크로-다공성 OH, SO3 및 QA 칼럼을 사용한 빈-충전 (E/F) AAV8 캡시드의 분리, 및 투석에 의해 달성된 완충액 교환을 포함하였다. 개발은 미정제 수확 재료에 기초하고, 여기서 PEI는 형질주입제로서 사용되었다.
재료 및 방법
샘플
샘플은 Berzonase™ 처리되고 DMEM 배지에서 제형화되었다. 샘플은 ABCA4 벡터와 동일한 캡시드(AAV8/Y733F)를 갖는 ABCA4 프록시 벡터이다. 선적된 부피는 4 L이고, 역가는 2.24E+10 vp/mL이고, 총 벡터는 8.96+13 벡터 게놈(vg)였다.
FPLC 시스템(제조용 실행)
FPLC 1:
- GE Healthcare Akta Explorer 100, UV 유세포 2 mm
- 0.75 mm I.D. 모세관 (8 mL 및 1 mL 칼럼과 사용됨)
- 샘플 로딩: 시스템 펌프를 통한 로딩
- 검출: UV 280 nm, UV 260nm, 전도도, pH
HPLC 시스템(분석용 실행)
HPLC 1:
- PATfix™, 10 mL 펌프 헤드, 0.25 mm I.D. 모세관
- 샘플 로딩: 500 μL 샘플 루프
- 검출: UV 280 nm, UV 260 nm, 형광 280/348 (FLU, FLD), 전도도, MALS
- 유속: 1-2 mL/분
모노리스 정지상
분석 실행(2 칼럼):
- 마크로-다공성 아데노-0.1
- 마크로-다공성 SO3-0.1
제조용 실행(3 칼럼):
- 마크로-다공성 OH-80
- 마크로-다공성 SO3-1
- 마크로-다공성 QA-1
완충액
완충액은 새로운 정제수에서 제조되고, 0.22 μm 필터를 통해 여과되었다. 도 336은 제조용 및 분석용 실행에 사용된 완충액을 보여준다.
크로마토그래피 방법
제조용 실행:
- HIC 단계 - HIC 정제 단계는 단계 구배를 사용하여 도 337에 도시된 바대로 전용 완충액으로 수행되었다.
- CEX 단계 - CEX 정제 단계는 단계 구배를 사용하여 도 338에 도시된 바대로 전용 완충액으로 수행되었다.
- AEX 단계 - AEX 정제 단계는 도 339에 도시된 바대로 60 칼럼 부피(CV)에서 0 내지 100% 이동상 B의 선형 구배를 이용하여 수행되고, 이후 10 CV에 대해 100% MPC으로 스텝핑되었다.
분석용 실행:
- 지문 - 50 CV 중의 0 내지 35% 이동상 B, 이후 5 CV 중의 35 내지 100%의 선형 구배; CIMac™ 아데노-0.1 칼럼이 사용되었다.
- 총 - 50 CV 중의 0 내지 100% 이동상 B의 선형 구배; CIMac™ SO3-0.1 칼럼이 사용되었다.
- 빈/충전 - 50 칼럼 부피(CV) 중의 0 내지 40% 이동상 B, 이후 10 CV 중의 40 내지 100%의 선형 구배; CIMac™ 아데노-0.1 칼럼이 사용되었다.
SDS-PAGE
SDS-PAGE는 제조사의 지시(Bio-Rad)에 따라 환원 조건 하에 4-20% 구배 겔을 사용하여 Mini-Protean II 전기영동 세포(Bio-Rad)로 수행되었다. 겔은 불연속 Tris-글리신 완충 시스템을 사용하여 35분 동안 200 V에서 실행되었다. 단백질 밴드는 Plus one Silver 염색 시약(GE Healthcare)에 의해 가시화되었다. 10-200 kDa 분자량 표준품을 사용하였다(PageRuler™ Unstained, thermos Fisher Scientific). 매번 적절한 희석에서 20ul의 샘플을 웰에 로딩하였다.
TEM
샘플을 음성 염색 방법을 이용하여 TEM으로 검사에 의해 제조하였다. 해동된 샘플을 온화하게 혼합하고, 5분 동안 새로 글로우 방전된 구리 그리드(400 메시, 포름바-탄소 코팅됨)에 적용하고, 세척하고, 우라닐 아세테이트의 1%(w/v) 물 용액의 1 방울로 염색하였다.
그리드는 80 kV에서 조작되는 주사 전자 현미경 Philips CM 100(FEI, 네덜란드)에 의해 관찰되었다. 적어도 10 그리드 정가각형은 완전히 조사되고, 여러 현미경사진(카메라 ORIUS SC 200, Gatan, Inc.)은 충전 입자와 빈 입자 사이의 비를 평가하도록 취해졌다. 현미경사진은 그리드에서 상이한 위치에서 동시에 취한다.
ddPCR
샘플(및 대조군)은 DNAze 처리되고, 이중으로 3 지점에서 희석되었다(각각의 샘플에 대해 6 반응). 반응 혼합물: 프로브에 대해 ddPCR Supermix(dUTP 무). 반응 부피: 20uL, DNA 부피 5uL, 드랍플렛 부피 0.000739. 사용된 장비: Bio-Rad QX100™ Droplet Digital™ PCR 시스템, Bio-Rad QX200™ AutoDG™ Droplet Digital™ PCR 시스템, Fluidigm Biomark HD. 프라이머 및 프로브는 검출된 표적에 기초하여 결정되었다.
결과 및 결론
마크로-다공성 OH 칼럼 HPLC 분석 방법을 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에서의 포획 단계
제조용 실행
청징된 수확 재료(각각 0.6 L를 함유하는 2개의 병에 나뉜 1.2 L)를 실온에서 해동하고, 혼주하고, 희석 완충액으로 1:1(1.2 L 수확 + 1.2 L 완충액) 희석한다. 5 CV/분에서 시스템 펌프를 사용하여 칼럼에 로딩한다. 실행은 HIC 조건 (HIC-8)에 대해 여섯(8) 실행이었다. 도 340은 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 341a 및 b는 실행 HIC-8로부터의 크로마토그램을 보여준다.
HPLC 총 분석
총 입자 방법은 크로마토그래피 회수의 결정을 위해 HPLC에 사용된다. 분획은 Amicon Ultra 0.5를 사용하여 탈염된다. 주요 용리는 주사 전에 추가로 10x 희석된다. 도 342a-j는 HPLC 분석에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 342j로부터, 모든 AAV가 칼럼에 걸폅하고 분획 W2, E1 및 W3에서 용리한다는 것이 확인되었다. 도 342j(오버레이)를 관찰할 때, 분획 W2 및 W3 둘 다가 주요 E1 용리와 비교하여 존재하는 다른 단백질 불순물을 갖는다는 것이 관찰되었다. 다른 2개와 비교하여 10배 희석되어서, 용리물을 둘러싼 분획에서의 벡터의 소실이 무시할만하다는 것이 고려되어야 한다. 피크의 면적은 회수를 결정하기 위해 로드 및 수확 면적 피크와 비교되었다.
제조용 실행의 회수
출발 청징된 수확 재료와 비교하는 포획 단계 HIC-OH에 대한 회수는 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS)에 대해 76% 및 71%였다. 다른 검출기(A260, A280, FLD)에서의 다른 방법 사이의 차이는 샘플에서 높은 염 농도에 의해 주로 생겼고, 게다가 질량 균형은 두 경우에 100%가 아니어서, 2의 정규화(ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS)은 주요 분획에서 AAV의 평균 72% + 2% 회수로 보다 정확한 결과를 생성시킬 것이다. 도 343은 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 HIC-8 실행의 회수를 기술한다. 도 344는 HIC-8 실행에 대한 대표적인 SDS-PAGE 결과이다. 도 344는 AAV의 농축 및 성공적인 포획이 청징된 수확 재료로부터 달성될 수 있다는 것을 나타낸다. HIC 단계 후 주요 용리는 고도로 농축되지만, 많은 단백질 불순물을 갖고, 이것은 다음의 크로마토그래피 단계 CEX-SO3에 의해 제거되었다.
SO3 칼럼을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에서의 중간 연마
HIC-OH로부터의 전체 용리(E1)는 결합 조건에 일치하도록 제조되고, CEX-SO3 칼럼(SO3-7)에 로딩되었다. 도 345는 실행의 매개변수의 상세내용을 제공한다. 도 346a 및 b는 실행 S03-7로부터의 크로마토그램을 제공한다. 도 347a-j는 SO3-7에 대한 HPLC 분석 - 총 방법에 기초한 크로마토그램을 제공한다. 도 347a-j로부터, 모든 AAV가 칼럼에 결합하고, 분획 E1 및 W3에서 용리한다는 것이 확인될 수 있다. 분획 E1이 W3과 비교하여 5배 희석되어서 W3에서의 분획의 소실이 무시할만하다는 것이 고려되어야 한다. 피크의 면적은 회수를 결정하도록 로드 및 초기 HIC-26 E1 재료와 비교되었다. 도 348은 제조용 실행 SO3-7에 대한 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 기초한 회수를 제공한다. 출발 HIC-8 E1 재료와 비교하여 중간 연마 단계 CEX-SO3에 대한 회수는 각각 ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS)에 대해 ddPCR 및 HPLC 총 분석에 대해 90% 및 86%였다. 2의 방법 사이의 불일치가 작다. HPLC 분석의 경우에, 질량 균형은 100%가 아니다. 2의 정규화(ddPCR 및 HPLC 총 분석(MALS))는 주요 분획에서 AAV의 평균 97% 회수로 보다 정확한 결과를 생성시킬 것이다.
HPLC 총 분석
총 입자 방법은 크로마토그래피 회수의 결정을 위해 HPLC에 사용되었다. 분획 E1은 주사 전에 5배 희석되었다.
SDS-PAGE
모든 분획은 그대로 또는 환원 조건 하에 희석되어 겔에 로딩되었다. 8배 더 낮은 칼럼 크기가 HIC로부터 CEX 단계에 사용되므로, 도 349는 AAV의 추가의 농축을 나타낸다. HIC 단계 후 주요 용리는 HIC 내지 CEX 단계와 별도로 존재하는 다른 단백질 불순물을 갖는다. 세척 3에서, 적은 부분의 AAV 밴드가 가시적이다. 대부분의 숙주 세포 단백질은 CIP로 스트립에 의해 제거된다.
CIM QA 칼럼을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에서의 빈 및 충전 AAV 캡시드 분리
제조용 실행
SO3-7로부터의 전체 용리(E1)는 결합 조건에 일치하도록 희석되고, AEX-QA 칼럼에 로딩되었다. 실행은 AEX 조건에 대한 제3(3) 실행이다(QA-3). 도 350은 제조용 실행 조건을 기술한다. 도 351a 및 b는 실행 SO3-7로?愾痼? 예시적인 크로마토그램을 보여준다.
HPLC 총 분석
빈-충전 방법은 크로마토그래피 회수 및 순도(E.F 캡시드의 비)의 결정을 위해 HPLC에 사용되었다. 분획은 주사 전에 희석되었다. 도 352a-h는 SO3-7에 대한 HPLC 분석-총 방법에 기초한 예시적인 크로마토그램을 보여준다. 도 352a-h로부터, 본 발명자들은 FT+W 분획에 피크가 가시적이지 않으므로 모든 AAV가 칼럼에 결합한다는 것을 확인할 수 있다. 전하에서의 약간의 차이로 인해 빈 캡시드는 처음에 용리하기 시작하고(E2), 이어 이어 E3에서 발견되는 충전 캡시드가 후행한다. A260/A280 비의 차이는 AAV가 빈 또는 충전 캡시드에서 순수하다는 것을 확인시켜준다. A260/A280 비에서의 0.6의 값은 주로 단백질 조성물로 빈 캡시드에 상응하고, 여기서 DNA 인서트를 갖는 충전 캡시드는 순도에 따라 1.3 이상의 값을 제공한다. 다음의 용리 피크로부터 빈 캡시드 오염으로 인해 더 낮은 순도가 얻어지므로 분획 E4는 별개로 수집되었다. E5 분획은 주로 주로 비고, 응집되고 손상된 캡시드(2개의 피크)이고, E6 분획에서 AAV 용리가 없었다. 피크의 면적은 회수 및 순도를 결정하도록 로드 및 초기 SO3-7 E1 재료와 비교되었다.
투석
완충액 교환은 QA-3 E3 샘플에서 투석의 실행에 의해 달성되었다. 투석 방법의 상세내용은 도 353에 의해 제공되었다. 샘플의 말단 부피는 3 mL이다.
제조용 실행의 회수
제조용 실행에 대한 회수는 도 354a-c에 요약되어 있다. 출발 SO3-7 E1 재료를 비교하는 충전 캡시드 농후화 단계(빈 및 충전 분리) 단계 AEX-QA에 대한 회수는 ddPCR에 대해 72% 및 MALS 검출에 기초한 HPLC 총 분석에 대해 61%였다(도 354a). 두 경우에서, (ddPCR 및 HPLC 분석), 질량 균형은 100%에 도달하지 않았다. 주요 분획의 백분율이 상응하는 검출기/검정에 대한 질량 균형 백분율에 정규화되면, 83% + 3%의 값이 얻어졌다. 투석 후 대략 61% 회수가 얻어졌다(샘플 소실(0.66 mL)을 고려하지 않음).
오직 초기 부피 및 말단 부피 및 이의 게놈 값에 기초하여 28%(투석 후) 또는 45%(QA 주 분획)의 DSP 수율이 얻어졌지만, 각각의 정제 단계 후 주요 분획의 샘플링이 더 적은 규모에서 전체 회수에 상당한 영향을 갖고, 여기서 말단 부피가 낮음을 고려해야 한다. DSP 수율의 보다 정확한 표시는 각각의 정제 단계 후 소실을 고려하여 달성된다. 정규화된 값(도 354c)을 고려하여, 크로마토그래피 단계 후 대략 58% 및 투석 후 42%의 총 DSP 수율이 도달되었다.
순도
도 355는 MALS 및 FLD 둘 다가 고려되면 주요 E3 분획의 순도(충전 캡시드의 백분율)가 대략 100%라는 것을 나타낸다. 흡광도 둘 다에 대한 흡광 계수가 알려지지 않으므로, 이는 MALS가 입자의 직경을 측정하므로 가장 실뢰할만한 검출기로 만든다. 라인에서의 다음은 FLD 기록 정확성이다. 비는 평균 피크 용리(분획 E4)에 기초하여 변하고 여기서 비는 오직 80-83%이다. 불과 3.5% CV(대략 80% 피크)의 수집에 대한 이유는 E3에서 더 높은 순도 및 벡터(E4)의 오직 적은 소실을 달성하는 것이다(11% -도 354a-c).
순도는 SO3 중간 단계 후 비에 대해, 투석 후 QA-3 E3(충전 캡시드) 및 최종 샘플(충전 AAV)에 대해 TEM에 의해 추가로 시험되었다. 모든 그리드는 관찰에 대한 적절한 품질을 나타냈고, 모든 3개의 샘플, SO3-7 E1, 충전 AAV, 및 QA-3 E3은 불순물 없이 입자의 응집 없이 깨끗하였다. 샘플 SO3-7 E1은 불과 50%의 충전 입자를 함유하지만, 다른 2개의 샘플에서의 충전 입자의 백분율은 더 높았다(샘플 충전 AAV에서 79% 및 샘플 QA-3 E3에서 88%; 도 356). 도 357은 TEM에 의해 평가된 SO3-7 E1(상부; A 및 B), QA-3 E3(중간; C 및 D) 및 투석 후(하부; E 및 F)를 보여준다. 왼쪽(A, C 및 E): 저배율, 오른쪽(B, D 및 F): 계수에 사용된 확대.
SDS-PAGE
모든 분획을 그대로 또는 환원 조건 하에 희석하여 겔에 로딩하였다. 도 358은 E2 내지 E5의 모든 분획이 AAV를 함유한다는 것을 나타낸다. E3 및 E4 분획에 존재하는 200kDa 마크 초과의 단백질 밴드는 충전 캡시드에서 오직 발견된 DNA 인서트에 상응하며, 오직 이들 2의 분획이 HPLC E/F 분석 결과를 보완하는 충전 캡시드를 함유한다는 것을 나타낸다. 다른 단백질 불순물은 VP1-VP3 이외에 E3 분획에서 발견된다. 이 불순물은 투석에 의해 제거되지 않지만(AAV8-PD), MWCO 100 kDa를 갖는 TFE가 사용되는 더 높은 스케일에서, 추가의 밴드가 성공적으로 제한되는 것으로 예상되지 않았다.
HPLC 분석 - 지문 방법
도 359a 및 b는 대부분의 불순물이 HIC 단계에 의해 제거된다는 것을 보여준다(도 359a). 샘플은 CEX-SO3에서 연마하여 추가로 정제되었다. 이 단계로부터의 용리물은 주로 순수하고 고도로 농축되었지만, 여전히 빈 캡시드 및 충전 캡시드 둘 다로 이루어졌다. 마지막 AEX-QA 단계는 2개의 캡시드를 분리하고, 따라서 충전 캡시드에 대해 단리되고 농후화되었다. 수확 재료를 QA 주요 분획과 비교하여, 출발 재료로부터의 AAV가 확인되었다.
결론
하류 정제 실행은 출발 재료로서 정징된 수확을 사용하여 수행되었다.
AAV의 포획 및 농축은 HIC-OH 단계에 의해 달성되고, 여기서 단백질은 통과액에서 발견되고, AAV는 칼럼에 결합하였다. 단백질 불순물은 W2 또는 W3 분획에서 제거되었다. HIC 단계 후 주요 용리 분획(E1)에 남은 대부분의 단백질 불순물은 CEX-SO3 칼럼을 사용하여 중간 연마 단계에 의해 제거되고, 여기서 AAV의 추가의 농축은 8배 더 낮은 칼럼 스케일의 실행에 의해 달성되었다. 이 상태에서의 완전 캡시드의 백분율은 대략 50-65%여서, AEX-QA를 사용한 완전 입자 농후화가 수행되었다. 빈 캡시드로부터 완전 캡시드를 분리한 후, 제형 완충액으로의 완충액 교환은 투석을 사용하여 수행되었다. 투석을 완료하기 위한 정징된 수확으로부터의 전체 하류 공정 수율은 42%이고(크로마토그래피 단계 후 - 58%), 대략 90% 충전 AAV 캡시드의 순도가 도달되었다. 공정은 제조 규모에서 성공적으로 수행되었다.
참조에 의한 포함
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다른 실시형태
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<110> NightstaRx Limited
Hanak, Julian
Truran, Richard
Laherty, Carol
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MANUFACTURING GENE THERAPY VECTORS
<130> NIGH-015/01WO 330366-3147
<150> US 62/734,505
<151> 2018-09-21
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aggacacagc gtccggagcc agaggcgctc ttaacggcgt ttatgtcctt tgctgtctga 60
ggggcctcag ctctgaccaa tctggtcttc gtgtggtcat tagcatgggc ttcgtgagac 120
agatacagct tttgctctgg aagaactgga ccctgcggaa aaggcaaaag attcgctttg 180
tggtggaact cgtgtggcct ttatctttat ttctggtctt gatctggtta aggaatgcca 240
acccgctcta cagccatcat gaatgccatt tccccaacaa ggcgatgccc tcagcaggaa 300
tgctgccgtg gctccagggg atcttctgca atgtgaacaa tccctgtttt caaagcccca 360
ccccaggaga atctcctgga attgtgtcaa actataacaa ctccatcttg gcaagggtat 420
atcgagattt tcaagaactc ctcatgaatg caccagagag ccagcacctt ggccgtattt 480
ggacagagct acacatcttg tcccaattca tggacaccct ccggactcac ccggagagaa 540
ttgcaggaag aggaatacga ataagggata tcttgaaaga tgaagaaaca ctgacactat 600
ttctcattaa aaacatcggc ctgtctgact cagtggtcta ccttctgatc aactctcaag 660
tccgtccaga gcagttcgct catggagtcc cggacctggc gctgaaggac atcgcctgca 720
gcgaggccct cctggagcgc ttcatcatct tcagccagag acgcggggca aagacggtgc 780
gctatgccct gtgctccctc tcccagggca ccctacagtg gatagaagac actctgtatg 840
ccaacgtgga cttcttcaag ctcttccgtg tgcttcccac actcctagac agccgttctc 900
aaggtatcaa tctgagatct tggggaggaa tattatctga tatgtcacca agaattcaag 960
agtttatcca tcggccgagt atgcaggact tgctgtgggt gaccaggccc ctcatgcaga 1020
atggtggtcc agagaccttt acaaagctga tgggcatcct gtctgacctc ctgtgtggct 1080
accccgaggg aggtggctct cgggtgctct ccttcaactg gtatgaagac aataactata 1140
aggcctttct ggggattgac tccacaagga aggatcctat ctattcttat gacagaagaa 1200
caacatcctt ttgtaatgca ttgatccaga gcctggagtc aaatccttta accaaaatcg 1260
cttggagggc ggcaaagcct ttgctgatgg gaaaaatcct gtacactcct gattcacctg 1320
cagcacgaag gatactgaag aatgccaact caacttttga agaactggaa cacgttagga 1380
agttggtcaa agcctgggaa gaagtagggc cccagatctg gtacttcttt gacaacagca 1440
cacagatgaa catgatcaga gataccctgg ggaacccaac agtaaaagac tttttgaata 1500
ggcagcttgg tgaagaaggt attactgctg aagccatcct aaacttcctc tacaagggcc 1560
ctcgggaaag ccaggctgac gacatggcca acttcgactg gagggacata tttaacatca 1620
ctgatcgcac cctccgcctg gtcaatcaat acctggagtg cttggtcctg gataagtttg 1680
aaagctacaa tgatgaaact cagctcaccc aacgtgccct ctctctactg gaggaaaaca 1740
tgttctgggc cggagtggta ttccctgaca tgtatccctg gaccagctct ctaccacccc 1800
acgtgaagta taagatccga atggacatag acgtggtgga gaaaaccaat aagattaaag 1860
acaggtattg ggattctggt cccagagctg atcccgtgga agatttccgg tacatctggg 1920
gcgggtttgc ctatctgcag gacatggttg aacaggggat cacaaggagc caggtgcagg 1980
cggaggctcc agttggaatc tacctccagc agatgcccta cccctgcttc gtggacgatt 2040
ctttcatgat catcctgaac cgctgtttcc ctatcttcat ggtgctggca tggatctact 2100
ctgtctccat gactgtgaag agcatcgtct tggagaagga gttgcgactg aaggagacct 2160
tgaaaaatca gggtgtctcc aatgcagtga tttggtgtac ctggttcctg gacagcttct 2220
ccatcatgtc gatgagcatc ttcctcctga cgatattcat catgcatgga agaatcctac 2280
attacagcga cccattcatc ctcttcctgt tcttgttggc tttctccact gccaccatca 2340
tgctgtgctt tctgctcagc accttcttct ccaaggccag tctggcagca gcctgtagtg 2400
gtgtcatcta tttcaccctc tacctgccac acatcctgtg cttcgcctgg caggaccgca 2460
tgaccgctga gctgaagaag gctgtgagct tactgtctcc ggtggcattt ggatttggca 2520
ctgagtacct ggttcgcttt gaagagcaag gcctggggct gcagtggagc aacatcggga 2580
acagtcccac ggaaggggac gaattcagct tcctgctgtc catgcagatg atgctccttg 2640
atgctgctgt ctatggctta ctcgcttggt accttgatca ggtgtttcca ggagactatg 2700
gaaccccact tccttggtac tttcttctac aagagtcgta ttggcttggc ggtgaagggt 2760
gttcaaccag agaagaaaga gccctggaaa agaccgagcc cctaacagag gaaacggagg 2820
atccagagca cccagaagga atacacgact ccttctttga acgtgagcat ccagggtggg 2880
ttcctggggt atgcgtgaag aatctggtaa agatttttga gccctgtggc cggccagctg 2940
tggaccgtct gaacatcacc ttctacgaga accagatcac cgcattcctg ggccacaatg 3000
gagctgggaa aaccaccacc ttgtccatcc tgacgggtct gttgccacca acctctggga 3060
ctgtgctcgt tgggggaagg gacattgaaa ccagcctgga tgcagtccgg cagagccttg 3120
gcatgtgtcc acagcacaac atcctgttcc accacctcac ggtggctgag cacatgctgt 3180
tctatgccca gctgaaagga aagtcccagg aggaggccca gctggagatg gaagccatgt 3240
tggaggacac aggcctccac cacaagcgga atgaagaggc tcaggaccta tcaggtggca 3300
tgcagagaaa gctgtcggtt gccattgcct ttgtgggaga tgccaaggtg gtgattctgg 3360
acgaacccac ctctggggtg gacccttact cgagacgctc aatctgggat ctgctcctga 3420
agtatcgctc aggcagaacc atcatcatgt ccactcacca catggacgag gccgacctcc 3480
ttggggaccg cattgccatc attgcccagg gaaggctcta ctgctcaggc accccactct 3540
tcctgaagaa ctgctttggc acaggcttgt acttaacctt ggtgcgcaag atgaaaaaca 3600
tccagagcca aaggaaaggc agtgagggga cctgcagctg ctcgtctaag ggtttctcca 3660
ccacgtgtcc agcccacgtc gatgacctaa ctccagaaca agtcctggat ggggatgtaa 3720
atgagctgat ggatgtagtt ctccaccatg ttccagaggc aaagctggtg gagtgcattg 3780
gtcaagaact tatcttcctt cttccaaata agaacttcaa gcacagagca tatgccagcc 3840
ttttcagaga gctggaggag acgctggctg accttggtct cagcagtttt ggaatttctg 3900
acactcccct ggaagagatt tttctgaagg tcacggagga ttctgattca ggacctctgt 3960
ttgcgggtgg cgctcagcag aaaagagaaa acgtcaaccc ccgacacccc tgcttgggtc 4020
ccagagagaa ggctggacag acaccccagg actccaatgt ctgctcccca ggggcgccgg 4080
ctgctcaccc agagggccag cctcccccag agccagagtg cccaggcccg cagctcaaca 4140
cggggacaca gctggtcctc cagcatgtgc aggcgctgct ggtcaagaga ttccaacaca 4200
ccatccgcag ccacaaggac ttcctggcgc agatcgtgct cccggctacc tttgtgtttt 4260
tggctctgat gctttctatt gttatccctc cttttggcga ataccccgct ttgacccttc 4320
acccctggat atatgggcag cagtacacct tcttcagcat ggatgaacca ggcagtgagc 4380
agttcacggt acttgcagac gtcctcctga ataagccagg ctttggcaac cgctgcctga 4440
aggaagggtg gcttccggag tacccctgtg gcaactcaac accctggaag actccttctg 4500
tgtccccaaa catcacccag ctgttccaga agcagaaatg gacacaggtc aacccttcac 4560
catcctgcag gtgcagcacc agggagaagc tcaccatgct gccagagtgc cccgagggtg 4620
ccgggggcct cccgcccccc cagagaacac agcgcagcac ggaaattcta caagacctga 4680
cggacaggaa catctccgac ttcttggtaa aaacgtatcc tgctcttata agaagcagct 4740
taaagagcaa attctgggtc aatgaacaga ggtatggagg aatttccatt ggaggaaagc 4800
tcccagtcgt ccccatcacg ggggaagcac ttgttgggtt tttaagcgac cttggccgga 4860
tcatgaatgt gagcgggggc cctatcacta gagaggcctc taaagaaata cctgatttcc 4920
ttaaacatct agaaactgaa gacaacatta aggtgtggtt taataacaaa ggctggcatg 4980
ccctggtcag ctttctcaat gtggcccaca acgccatctt acgggccagc ctgcctaagg 5040
acaggagccc cgaggagtat ggaatcaccg tcattagcca acccctgaac ctgaccaagg 5100
agcagctctc agagattaca gtgctgacca cttcagtgga tgctgtggtt gccatctgcg 5160
tgattttctc catgtccttc gtcccagcca gctttgtcct ttatttgatc caggagcggg 5220
tgaacaaatc caagcacctc cagtttatca gtggagtgag ccccaccacc tactgggtga 5280
ccaacttcct ctgggacatc atgaattatt ccgtgagtgc tgggctggtg gtgggcatct 5340
tcatcgggtt tcagaagaaa gcctacactt ctccagaaaa ccttcctgcc cttgtggcac 5400
tgctcctgct gtatggatgg gcggtcattc ccatgatgta cccagcatcc ttcctgtttg 5460
atgtccccag cacagcctat gtggctttat cttgtgctaa tctgttcatc ggcatcaaca 5520
gcagtgctat taccttcatc ttggaattat ttgagaataa ccggacgctg ctcaggttca 5580
acgccgtgct gaggaagctg ctcattgtct tcccccactt ctgcctgggc cggggcctca 5640
ttgaccttgc actgagccag gctgtgacag atgtctatgc ccggtttggt gaggagcact 5700
ctgcaaatcc gttccactgg gacctgattg ggaagaacct gtttgccatg gtggtggaag 5760
gggtggtgta cttcctcctg accctgctgg tccagcgcca cttcttcctc tcccaatgga 5820
ttgccgagcc cactaaggag cccattgttg atgaagatga tgatgtggct gaagaaagac 5880
aaagaattat tactggtgga aataaaactg acatcttaag gctacatgaa ctaaccaaga 5940
tttatccagg cacctccagc ccagcagtgg acaggctgtg tgtcggagtt cgccctggag 6000
agtgctttgg cctcctggga gtgaatggtg ccggcaaaac aaccacattc aagatgctca 6060
ctggggacac cacagtgacc tcaggggatg ccaccgtagc aggcaagagt attttaacca 6120
atatttctga agtccatcaa aatatgggct actgtcctca gtttgatgca attgatgagc 6180
tgctcacagg acgagaacat ctttaccttt atgcccggct tcgaggtgta ccagcagaag 6240
aaatcgaaaa ggttgcaaac tggagtatta agagcctggg cctgactgtc tacgccgact 6300
gcctggctgg cacgtacagt gggggcaaca agcggaaact ctccacagcc atcgcactca 6360
ttggctgccc accgctggtg ctgctggatg agcccaccac agggatggac ccccaggcac 6420
gccgcatgct gtggaacgtc atcgtgagca tcatcagaga agggagggct gtggtcctca 6480
catcccacag catggaagaa tgtgaggcac tgtgtacccg gctggccatc atggtaaagg 6540
gcgcctttcg atgtatgggc accattcagc atctcaagtc caaatttgga gatggctata 6600
tcgtcacaat gaagatcaaa tccccgaagg acgacctgct tcctgacctg aaccctgtgg 6660
agcagttctt ccaggggaac ttcccaggca gtgtgcagag ggagaggcac tacaacatgc 6720
tccagttcca ggtctcctcc tcctccctgg cgaggatctt ccagctcctc ctctcccaca 6780
aggacagcct gctcatcgag gagtactcag tcacacagac cacactggac caggtgtttg 6840
taaattttgc taaacagcag actgaaagtc atgacctccc tctgcaccct cgagctgctg 6900
gagccagtcg acaagcccag gactgatctt tcacaccgct cgttcctgca gccagaaagg 6960
aactctgggc agctggaggc gcaggagcct gtgcccatat ggtcatccaa atggactggc 7020
cagcgtaaat gaccccactg cagcagaaaa caaacacacg aggagcatgc agcgaattca 7080
gaaagaggtc tttcagaagg aaaccgaaac tgacttgctc acctggaaca cctgatggtg 7140
aaaccaaaca aatacaaaat ccttctccag accccagaac tagaaacccc gggccatccc 7200
actagcagct ttggcctcca tattgctctc atttcaagca gatctgcttt tctgcatgtt 7260
tgtctgtgtg tctgcgttgt gtgtgatttt catggaaaaa taaaatgcaa atgcactcat 7320
cacaaa 7326
<210> 2
<211> 7326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
aggacacagc gtccggagcc agaggcgctc ttaacggcgt ttatgtcctt tgctgtctga 60
ggggcctcag ctctgaccaa tctggtcttc gtgtggtcat tagcatgggc ttcgtgagac 120
agatacagct tttgctctgg aagaactgga ccctgcggaa aaggcaaaag attcgctttg 180
tggtggaact cgtgtggcct ttatctttat ttctggtctt gatctggtta aggaatgcca 240
acccgctcta cagccatcat gaatgccatt tccccaacaa ggcgatgccc tcagcaggaa 300
tgctgccgtg gctccagggg atcttctgca atgtgaacaa tccctgtttt caaagcccca 360
ccccaggaga atctcctgga attgtgtcaa actataacaa ctccatcttg gcaagggtat 420
atcgagattt tcaagaactc ctcatgaatg caccagagag ccagcacctt ggccgtattt 480
ggacagagct acacatcttg tcccaattca tggacaccct ccggactcac ccggagagaa 540
ttgcaggaag aggaatacga ataagggata tcttgaaaga tgaagaaaca ctgacactat 600
ttctcattaa aaacatcggc ctgtctgact cagtggtcta ccttctgatc aactctcaag 660
tccgtccaga gcagttcgct catggagtcc cggacctggc gctgaaggac atcgcctgca 720
gcgaggccct cctggagcgc ttcatcatct tcagccagag acgcggggca aagacggtgc 780
gctatgccct gtgctccctc tcccagggca ccctacagtg gatagaagac actctgtatg 840
ccaacgtgga cttcttcaag ctcttccgtg tgcttcccac actcctagac agccgttctc 900
aaggtatcaa tctgagatct tggggaggaa tattatctga tatgtcacca agaattcaag 960
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atggtggtcc agagaccttt acaaagctga tgggcatcct gtctgacctc ctgtgtggct 1080
accccgaggg aggtggctct cgggtgctct ccttcaactg gtatgaagac aataactata 1140
aggcctttct ggggattgac tccacaagga aggatcctat ctattcttat gacagaagaa 1200
caacatcctt ttgtaatgca ttgatccaga gcctggagtc aaatccttta accaaaatcg 1260
cttggagggc ggcaaagcct ttgctgatgg gaaaaatcct gtacactcct gattcacctg 1320
cagcacgaag gatactgaag aatgccaact caacttttga agaactggaa cacgttagga 1380
agttggtcaa agcctgggaa gaagtagggc cccagatctg gtacttcttt gacaacagca 1440
cacagatgaa catgatcaga gataccctgg ggaacccaac agtaaaagac tttttgaata 1500
ggcagcttgg tgaagaaggt attactgctg aagccatcct aaacttcctc tacaagggcc 1560
ctcgggaaag ccaggctgac gacatggcca acttcgactg gagggacata tttaacatca 1620
ctgatcgcac cctccgcctt gtcaatcaat acctggagtg cttggtcctg gataagtttg 1680
aaagctacaa tgatgaaact cagctcaccc aacgtgccct ctctctactg gaggaaaaca 1740
tgttctgggc cggagtggta ttccctgaca tgtatccctg gaccagctct ctaccacccc 1800
acgtgaagta taagatccga atggacatag acgtggtgga gaaaaccaat aagattaaag 1860
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ctgtctccat gactgtgaag agcatcgtct tggagaagga gttgcgactg aaggagacct 2160
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ctgagtacct ggttcgcttt gaagagcaag gcctggggct gcagtggagc aacatcggga 2580
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gttcaaccag agaagaaaga gccctggaaa agaccgagcc cctaacagag gaaacggagg 2820
atccagagca cccagaagga atacacgact ccttctttga acgtgagcat ccagggtggg 2880
ttcctggggt atgcgtgaag aatctggtaa agatttttga gccctgtggc cggccagctg 2940
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tccagagcca aaggaaaggc agtgagggga cctgcagctg ctcgtctaag ggtttctcca 3660
ccacgtgtcc agcccacgtc gatgacctaa ctccagaaca agtcctggat ggggatgtaa 3720
atgagctgat ggatgtagtt ctccaccatg ttccagaggc aaagctggtg gagtgcattg 3780
gtcaagaact tatcttcctt cttccaaata agaacttcaa gcacagagca tatgccagcc 3840
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acactcccct ggaagagatt tttctgaagg tcacggagga ttctgattca ggacctctgt 3960
ttgcgggtgg cgctcagcag aaaagagaaa acgtcaaccc ccgacacccc tgcttgggtc 4020
ccagagagaa ggctggacag acaccccagg actccaatgt ctgctcccca ggggcgccgg 4080
ctgctcaccc agagggccag cctcccccag agccagagtg cccaggcccg cagctcaaca 4140
cggggacaca gctggtcctc cagcatgtgc aggcgctgct ggtcaagaga ttccaacaca 4200
ccatccgcag ccacaaggac ttcctggcgc agatcgtgct cccggctacc tttgtgtttt 4260
tggctctgat gctttctatt gttatccctc cttttggcga ataccccgct ttgacccttc 4320
acccctggat atatgggcag cagtacacct tcttcagcat ggatgaacca ggcagtgagc 4380
agttcacggt acttgcagac gtcctcctga ataagccagg ctttggcaac cgctgcctga 4440
aggaagggtg gcttccggag tacccctgtg gcaactcaac accctggaag actccttctg 4500
tgtccccaaa catcacccag ctgttccaga agcagaaatg gacacaggtc aacccttcac 4560
catcctgcag gtgcagcacc agggagaagc tcaccatgct gccagagtgc cccgagggtg 4620
ccgggggcct cccgcccccc cagagaacac agcgcagcac ggaaattcta caagacctga 4680
cggacaggaa catctccgac ttcttggtaa aaacgtatcc tgctcttata agaagcagct 4740
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tcccagtcgt ccccatcacg ggggaagcac ttgttgggtt tttaagcgac cttggccgga 4860
tcatgaatgt gagcgggggc cctatcacta gagaggcctc taaagaaata cctgatttcc 4920
ttaaacatct agaaactgaa gacaacatta aggtgtggtt taataacaaa ggctggcatg 4980
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tgattttctc catgtccttc gtcccagcca gctttgtcct ttatttgatc caggagcggg 5220
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ccaacttcct ctgggacatc atgaattatt ccgtgagtgc tgggctggtg gtgggcatct 5340
tcatcgggtt tcagaagaaa gcctacactt ctccagaaaa ccttcctgcc cttgtggcac 5400
tgctcctgct gtatggatgg gcggtcattc ccatgatgta cccagcatcc ttcctgtttg 5460
atgtccccag cacagcctat gtggctttat cttgtgctaa tctgttcatc ggcatcaaca 5520
gcagtgctat taccttcatc ttggaattat ttgagaataa ccggacgctg ctcaggttca 5580
acgccgtgct gaggaagctg ctcattgtct tcccccactt ctgcctgggc cggggcctca 5640
ttgaccttgc actgagccag gctgtgacag atgtctatgc ccggtttggt gaggagcact 5700
ctgcaaatcc gttccactgg gacctgattg ggaagaacct gtttgccatg gtggtggaag 5760
gggtggtgta cttcctcctg accctgctgg tccagcgcca cttcttcctc tcccaatgga 5820
ttgccgagcc cactaaggag cccattgttg atgaagatga tgatgtggct gaagaaagac 5880
aaagaattat tactggtgga aataaaactg acatcttaag gctacatgaa ctaaccaaga 5940
tttatccagg cacctccagc ccagcagtgg acaggctgtg tgtcggagtt cgccctggag 6000
agtgctttgg cctcctggga gtgaatggtg ccggcaaaac aaccacattc aagatgctca 6060
ctggggacac cacagtgacc tcaggggatg ccaccgtagc aggcaagagt attttaacca 6120
atatttctga agtccatcaa aatatgggct actgtcctca gtttgatgca atcgatgagc 6180
tgctcacagg acgagaacat ctttaccttt atgcccggct tcgaggtgta ccagcagaag 6240
aaatcgaaaa ggttgcaaac tggagtatta agagcctggg cctgactgtc tacgccgact 6300
gcctggctgg cacgtacagt gggggcaaca agcggaaact ctccacagcc atcgcactca 6360
ttggctgccc accgctggtg ctgctggatg agcccaccac agggatggac ccccaggcac 6420
gccgcatgct gtggaacgtc atcgtgagca tcatcagaga agggagggct gtggtcctca 6480
catcccacag catggaagaa tgtgaggcac tgtgtacccg gctggccatc atggtaaagg 6540
gcgcctttcg atgtatgggc accattcagc atctcaagtc caaatttgga gatggctata 6600
tcgtcacaat gaagatcaaa tccccgaagg acgacctgct tcctgacctg aaccctgtgg 6660
agcagttctt ccaggggaac ttcccaggca gtgtgcagag ggagaggcac tacaacatgc 6720
tccagttcca ggtctcctcc tcctccctgg cgaggatctt ccagctcctc ctctcccaca 6780
aggacagcct gctcatcgag gagtactcag tcacacagac cacactggac caggtgtttg 6840
taaattttgc taaacagcag actgaaagtc atgacctccc tctgcaccct cgagctgctg 6900
gagccagtcg acaagcccag gactgatctt tcacaccgct cgttcctgca gccagaaagg 6960
aactctgggc agctggaggc gcaggagcct gtgcccatat ggtcatccaa atggactggc 7020
cagcgtaaat gaccccactg cagcagaaaa caaacacacg aggagcatgc agcgaattca 7080
gaaagaggtc tttcagaagg aaaccgaaac tgacttgctc acctggaaca cctgatggtg 7140
aaaccaaaca aatacaaaat ccttctccag accccagaac tagaaacccc gggccatccc 7200
actagcagct ttggcctcca tattgctctc atttcaagca gatctgcttt tctgcatgtt 7260
tgtctgtgtg tctgcgttgt gtgtgatttt catggaaaaa taaaatgcaa atgcactcat 7320
cacaaa 7326
<210> 3
<211> 4464
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - upstream vector sequence, comprising 5' ITR,
promoter, CDS, 3' ITR
<400> 3
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
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cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 540
ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattaccacc atgggcttcg tgagacagat 600
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ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc tggttaagga atgccaaccc 720
gctctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg atgccctcag caggaatgct 780
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aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc atcttggcaa gggtatatcg 900
agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag caccttggcc gtatttggac 960
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tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg aaggacatcg cctgcagcga 1200
ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc ggggcaaaga cggtgcgcta 1260
tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata gaagacactc tgtatgccaa 1320
cgtggacttc ttcaagctct tccgtgtgct tcccacactc ctagacagcc gttctcaagg 1380
tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg tcaccaagaa ttcaagagtt 1440
tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc aggcccctca tgcagaatgg 1500
tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct gacctcctgt gtggctaccc 1560
cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat gaagacaata actataaggc 1620
ctttctgggg attgactcca caaggaagga tcctatctat tcttatgaca gaagaacaac 1680
atccttttgt aatgcattga tccagagcct ggagtcaaat cctttaacca aaatcgcttg 1740
gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac actcctgatt cacctgcagc 1800
acgaaggata ctgaagaatg ccaactcaac ttttgaagaa ctggaacacg ttaggaagtt 1860
ggtcaaagcc tgggaagaag tagggcccca gatctggtac ttctttgaca acagcacaca 1920
gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta aaagactttt tgaataggca 1980
gcttggtgaa gaaggtatta ctgctgaagc catcctaaac ttcctctaca agggccctcg 2040
ggaaagccag gctgacgaca tggccaactt cgactggagg gacatattta acatcactga 2100
tcgcaccctc cgccttgtca atcaatacct ggagtgcttg gtcctggata agtttgaaag 2160
ctacaatgat gaaactcagc tcacccaacg tgccctctct ctactggagg aaaacatgtt 2220
ctgggccgga gtggtattcc ctgacatgta tccctggacc agctctctac caccccacgt 2280
gaagtataag atccgaatgg acatagacgt ggtggagaaa accaataaga ttaaagacag 2340
gtattgggat tctggtccca gagctgatcc cgtggaagat ttccggtaca tctggggcgg 2400
gtttgcctat ctgcaggaca tggttgaaca ggggatcaca aggagccagg tgcaggcgga 2460
ggctccagtt ggaatctacc tccagcagat gccctacccc tgcttcgtgg acgattcttt 2520
catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg ctggcatgga tctactctgt 2580
ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg cgactgaagg agaccttgaa 2640
aaatcagggt gtctccaatg cagtgatttg gtgtacctgg ttcctggaca gcttctccat 2700
catgtcgatg agcatcttcc tcctgacgat attcatcatg catggaagaa tcctacatta 2760
cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc tccactgcca ccatcatgct 2820
gtgctttctg ctcagcacct tcttctccaa ggccagtctg gcagcagcct gtagtggtgt 2880
catctatttc accctctacc tgccacacat cctgtgcttc gcctggcagg accgcatgac 2940
cgctgagctg aagaaggctg tgagcttact gtctccggtg gcatttggat ttggcactga 3000
gtacctggtt cgctttgaag agcaaggcct ggggctgcag tggagcaaca tcgggaacag 3060
tcccacggaa ggggacgaat tcagcttcct gctgtccatg cagatgatgc tccttgatgc 3120
tgctgtctat ggcttactcg cttggtacct tgatcaggtg tttccaggag actatggaac 3180
cccacttcct tggtactttc ttctacaaga gtcgtattgg cttggcggtg aagggtgttc 3240
aaccagagaa gaaagagccc tggaaaagac cgagccccta acagaggaaa cggaggatcc 3300
agagcaccca gaaggaatac acgactcctt ctttgaacgt gagcatccag ggtgggttcc 3360
tggggtatgc gtgaagaatc tggtaaagat ttttgagccc tgtggccggc cagctgtgga 3420
ccgtctgaac atcaccttct acgagaacca gatcaccgca ttcctgggcc acaatggagc 3480
tgggaaaacc accaccttgt ccatcctgac gggtctgttg ccaccaacct ctgggactgt 3540
gctcgttggg ggaagggaca ttgaaaccag cctggatgca gtccggcaga gccttggcat 3600
gtgtccacag cacaacatcc tgttccacca cctcacggtg gctgagcaca tgctgttcta 3660
tgcccagctg aaaggaaagt cccaggagga ggcccagctg gagatggaag ccatgttgga 3720
ggacacaggc ctccaccaca agcggaatga agaggctcag gacctatcag gtggcatgca 3780
gagaaagctg tcggttgcca ttgcctttgt gggagatgcc aaggtggtga ttctggacga 3840
acccacctct ggggtggacc cttactcgag acgctcaatc tgggatctgc tcctgaagta 3900
tcgctcaggc agaaccatca tcatgtccac tcaccacatg gacgaggccg acctccttgg 3960
ggaccgcatt gccatcattg cccagggaag gctctactgc tcaggcaccc cactcttcct 4020
gaagaactgc tttggcacag gcttgtactt aaccttggtg cgcaagatga aaaacatcca 4080
gagccaaagg aaaggcagtg aggggacctg cagctgctcg tctaagggtt tctccaccac 4140
gtgtccagcc cacgtcgatg acctaactcc agaacaagtc ctggatgggg atgtaaatga 4200
gctgatggat gtagttctcc accatgttcc agaggcaaag ctggtggagt gcattggtca 4260
agaacttatc ttccttcttc catttaaatt agggataaca gggtaatggc gcgggccgca 4320
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4380
cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg 4440
agcgcgcaga gagggagtgg ccaa 4464
<210> 4
<211> 4581
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - downstream vector sequence, comprising 5' ITR, CDS,
post-transcriptional response element, poly-adenylation sequence,
3' ITR
<400> 4
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgcggc aattcagtcg ataactataa cggtcctaag 180
gtagcgattt aaataacatc cagagccaaa ggaaaggcag tgaggggacc tgcagctgct 240
cgtctaaggg tttctccacc acgtgtccag cccacgtcga tgacctaact ccagaacaag 300
tcctggatgg ggatgtaaat gagctgatgg atgtagttct ccaccatgtt ccagaggcaa 360
agctggtgga gtgcattggt caagaactta tcttccttct tccaaataag aacttcaagc 420
acagagcata tgccagcctt ttcagagagc tggaggagac gctggctgac cttggtctca 480
gcagttttgg aatttctgac actcccctgg aagagatttt tctgaaggtc acggaggatt 540
ctgattcagg acctctgttt gcgggtggcg ctcagcagaa aagagaaaac gtcaaccccc 600
gacacccctg cttgggtccc agagagaagg ctggacagac accccaggac tccaatgtct 660
gctccccagg ggcgccggct gctcacccag agggccagcc tcccccagag ccagagtgcc 720
caggcccgca gctcaacacg gggacacagc tggtcctcca gcatgtgcag gcgctgctgg 780
tcaagagatt ccaacacacc atccgcagcc acaaggactt cctggcgcag atcgtgctcc 840
cggctacctt tgtgtttttg gctctgatgc tttctattgt tatccctcct tttggcgaat 900
accccgcttt gacccttcac ccctggatat atgggcagca gtacaccttc ttcagcatgg 960
atgaaccagg cagtgagcag ttcacggtac ttgcagacgt cctcctgaat aagccaggct 1020
ttggcaaccg ctgcctgaag gaagggtggc ttccggagta cccctgtggc aactcaacac 1080
cctggaagac tccttctgtg tccccaaaca tcacccagct gttccagaag cagaaatgga 1140
cacaggtcaa cccttcacca tcctgcaggt gcagcaccag ggagaagctc accatgctgc 1200
cagagtgccc cgagggtgcc gggggcctcc cgccccccca gagaacacag cgcagcacgg 1260
aaattctaca agacctgacg gacaggaaca tctccgactt cttggtaaaa acgtatcctg 1320
ctcttataag aagcagctta aagagcaaat tctgggtcaa tgaacagagg tatggaggaa 1380
tttccattgg aggaaagctc ccagtcgtcc ccatcacggg ggaagcactt gttgggtttt 1440
taagcgacct tggccggatc atgaatgtga gcgggggccc tatcactaga gaggcctcta 1500
aagaaatacc tgatttcctt aaacatctag aaactgaaga caacattaag gtgtggttta 1560
ataacaaagg ctggcatgcc ctggtcagct ttctcaatgt ggcccacaac gccatcttac 1620
gggccagcct gcctaaggac aggagccccg aggagtatgg aatcaccgtc attagccaac 1680
ccctgaacct gaccaaggag cagctctcag agattacagt gctgaccact tcagtggatg 1740
ctgtggttgc catctgcgtg attttctcca tgtccttcgt cccagccagc tttgtccttt 1800
atttgatcca ggagcgggtg aacaaatcca agcacctcca gtttatcagt ggagtgagcc 1860
ccaccaccta ctgggtaacc aacttcctct gggacatcat gaattattcc gtgagtgctg 1920
ggctggtggt gggcatcttc atcgggtttc agaagaaagc ctacacttct ccagaaaacc 1980
ttcctgccct tgtggcactg ctcctgctgt atggatgggc ggtcattccc atgatgtacc 2040
cagcatcctt cctgtttgat gtccccagca cagcctatgt ggctttatct tgtgctaatc 2100
tgttcatcgg catcaacagc agtgctatta ccttcatctt ggaattattt gagaataacc 2160
ggacgctgct caggttcaac gccgtgctga ggaagctgct cattgtcttc ccccacttct 2220
gcctgggccg gggcctcatt gaccttgcac tgagccaggc tgtgacagat gtctatgccc 2280
ggtttggtga ggagcactct gcaaatccgt tccactggga cctgattggg aagaacctgt 2340
ttgccatggt ggtggaaggg gtggtgtact tcctcctgac cctgctggtc cagcgccact 2400
tcttcctctc ccaatggatt gccgagccca ctaaggagcc cattgttgat gaagatgatg 2460
atgtggctga agaaagacaa agaattatta ctggtggaaa taaaactgac atcttaaggc 2520
tacatgaact aaccaagatt tatccaggca cctccagccc agcagtggac aggctgtgtg 2580
tcggagttcg ccctggagag tgctttggcc tcctgggagt gaatggtgcc ggcaaaacaa 2640
ccacattcaa gatgctcact ggggacacca cagtgacctc aggggatgcc accgtagcag 2700
gcaagagtat tttaaccaat atttctgaag tccatcaaaa tatgggctac tgtcctcagt 2760
ttgatgcaat cgatgagctg ctcacaggac gagaacatct ttacctttat gcccggcttc 2820
gaggtgtacc agcagaagaa atcgaaaagg ttgcaaactg gagtattaag agcctgggcc 2880
tgactgtcta cgccgactgc ctggctggca cgtacagtgg gggcaacaag cggaaactct 2940
ccacagccat cgcactcatt ggctgcccac cgctggtgct gctggatgag cccaccacag 3000
ggatggaccc ccaggcacgc cgcatgctgt ggaacgtcat cgtgagcatc atcagagaag 3060
ggagggctgt ggtcctcaca tcccacagca tggaagaatg tgaggcactg tgtacccggc 3120
tggccatcat ggtaaagggc gcctttcgat gtatgggcac cattcagcat ctcaagtcca 3180
aatttggaga tggctatatc gtcacaatga agatcaaatc cccgaaggac gacctgcttc 3240
ctgacctgaa ccctgtggag cagttcttcc aggggaactt cccaggcagt gtgcagaggg 3300
agaggcacta caacatgctc cagttccagg tctcctcctc ctccctggcg aggatcttcc 3360
agctcctcct ctcccacaag gacagcctgc tcatcgagga gtactcagtc acacagacca 3420
cactggacca ggtgtttgta aattttgcta aacagcagac tgaaagtcat gacctccctc 3480
tgcaccctcg agctgctgga gccagtcgac aagcccagga ctgaaagctt atcgataatc 3540
aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt 3600
ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg 3660
ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 3720
ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt 3780
ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg 3840
ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg 3900
gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct 3960
gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc 4020
cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc 4080
ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcatgcc gctgatcagc 4140
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 4200
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 4260
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 4320
ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 4380
ggaaagaacc agctggggat ttaaattagg gataacaggg taatggcgcg ggccgcagga 4440
acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc 4500
ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc 4560
gcgcagagag ggagtggcca a 4581
<210> 5
<211> 199
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggg 199
<210> 6
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - UTR including CBA and RBG fragments
<400> 6
gtgccgcagg gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg 60
cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta 120
cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattacca 180
ccatgg 186
<210> 7
<211> 593
<212> DNA
<213> Woodchuck hepatitis virus
<400> 7
atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 60
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 120
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 180
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 240
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 300
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 360
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 420
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 480
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 540
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc ccc 593
<210> 8
<211> 269
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 8
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 60
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 120
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 180
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 240
gcttctgagg cggaaagaac cagctgggg 269
<210> 9
<211> 4087
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - partial upstream vector sequence, comprising
promoter, CDS
<400> 9
ggtaccgggc cccagaagcc tggtggttgt ttgtccttct caggggaaaa gtgaggcggc 60
cccttggagg aaggggccgg gcagaatgat ctaatcggat tccaagcagc tcaggggatt 120
gtctttttct agcaccttct tgccactcct aagcgtcctc cgtgaccccg gctgggattt 180
agcctggtgc tgtgtcagcc ccgggtgccg cagggggacg gctgccttcg ggggggacgg 240
ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat 300
gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 360
catcattttg gcaaagaatt accaccatgg gcttcgtgag acagatacag cttttgctct 420
ggaagaactg gaccctgcgg aaaaggcaaa agattcgctt tgtggtggaa ctcgtgtggc 480
ctttatcttt atttctggtc ttgatctggt taaggaatgc caacccgctc tacagccatc 540
atgaatgcca tttccccaac aaggcgatgc cctcagcagg aatgctgccg tggctccagg 600
ggatcttctg caatgtgaac aatccctgtt ttcaaagccc caccccagga gaatctcctg 660
gaattgtgtc aaactataac aactccatct tggcaagggt atatcgagat tttcaagaac 720
tcctcatgaa tgcaccagag agccagcacc ttggccgtat ttggacagag ctacacatct 780
tgtcccaatt catggacacc ctccggactc acccggagag aattgcagga agaggaatac 840
gaataaggga tatcttgaaa gatgaagaaa cactgacact atttctcatt aaaaacatcg 900
gcctgtctga ctcagtggtc taccttctga tcaactctca agtccgtcca gagcagttcg 960
ctcatggagt cccggacctg gcgctgaagg acatcgcctg cagcgaggcc ctcctggagc 1020
gcttcatcat cttcagccag agacgcgggg caaagacggt gcgctatgcc ctgtgctccc 1080
tctcccaggg caccctacag tggatagaag acactctgta tgccaacgtg gacttcttca 1140
agctcttccg tgtgcttccc acactcctag acagccgttc tcaaggtatc aatctgagat 1200
cttggggagg aatattatct gatatgtcac caagaattca agagtttatc catcggccga 1260
gtatgcagga cttgctgtgg gtgaccaggc ccctcatgca gaatggtggt ccagagacct 1320
ttacaaagct gatgggcatc ctgtctgacc tcctgtgtgg ctaccccgag ggaggtggct 1380
ctcgggtgct ctccttcaac tggtatgaag acaataacta taaggccttt ctggggattg 1440
actccacaag gaaggatcct atctattctt atgacagaag aacaacatcc ttttgtaatg 1500
cattgatcca gagcctggag tcaaatcctt taaccaaaat cgcttggagg gcggcaaagc 1560
ctttgctgat gggaaaaatc ctgtacactc ctgattcacc tgcagcacga aggatactga 1620
agaatgccaa ctcaactttt gaagaactgg aacacgttag gaagttggtc aaagcctggg 1680
aagaagtagg gccccagatc tggtacttct ttgacaacag cacacagatg aacatgatca 1740
gagataccct ggggaaccca acagtaaaag actttttgaa taggcagctt ggtgaagaag 1800
gtattactgc tgaagccatc ctaaacttcc tctacaaggg ccctcgggaa agccaggctg 1860
acgacatggc caacttcgac tggagggaca tatttaacat cactgatcgc accctccgcc 1920
ttgtcaatca atacctggag tgcttggtcc tggataagtt tgaaagctac aatgatgaaa 1980
ctcagctcac ccaacgtgcc ctctctctac tggaggaaaa catgttctgg gccggagtgg 2040
tattccctga catgtatccc tggaccagct ctctaccacc ccacgtgaag tataagatcc 2100
gaatggacat agacgtggtg gagaaaacca ataagattaa agacaggtat tgggattctg 2160
gtcccagagc tgatcccgtg gaagatttcc ggtacatctg gggcgggttt gcctatctgc 2220
aggacatggt tgaacagggg atcacaagga gccaggtgca ggcggaggct ccagttggaa 2280
tctacctcca gcagatgccc tacccctgct tcgtggacga ttctttcatg atcatcctga 2340
accgctgttt ccctatcttc atggtgctgg catggatcta ctctgtctcc atgactgtga 2400
agagcatcgt cttggagaag gagttgcgac tgaaggagac cttgaaaaat cagggtgtct 2460
ccaatgcagt gatttggtgt acctggttcc tggacagctt ctccatcatg tcgatgagca 2520
tcttcctcct gacgatattc atcatgcatg gaagaatcct acattacagc gacccattca 2580
tcctcttcct gttcttgttg gctttctcca ctgccaccat catgctgtgc tttctgctca 2640
gcaccttctt ctccaaggcc agtctggcag cagcctgtag tggtgtcatc tatttcaccc 2700
tctacctgcc acacatcctg tgcttcgcct ggcaggaccg catgaccgct gagctgaaga 2760
aggctgtgag cttactgtct ccggtggcat ttggatttgg cactgagtac ctggttcgct 2820
ttgaagagca aggcctgggg ctgcagtgga gcaacatcgg gaacagtccc acggaagggg 2880
acgaattcag cttcctgctg tccatgcaga tgatgctcct tgatgctgct gtctatggct 2940
tactcgcttg gtaccttgat caggtgtttc caggagacta tggaacccca cttccttggt 3000
actttcttct acaagagtcg tattggcttg gcggtgaagg gtgttcaacc agagaagaaa 3060
gagccctgga aaagaccgag cccctaacag aggaaacgga ggatccagag cacccagaag 3120
gaatacacga ctccttcttt gaacgtgagc atccagggtg ggttcctggg gtatgcgtga 3180
agaatctggt aaagattttt gagccctgtg gccggccagc tgtggaccgt ctgaacatca 3240
ccttctacga gaaccagatc accgcattcc tgggccacaa tggagctggg aaaaccacca 3300
ccttgtccat cctgacgggt ctgttgccac caacctctgg gactgtgctc gttgggggaa 3360
gggacattga aaccagcctg gatgcagtcc ggcagagcct tggcatgtgt ccacagcaca 3420
acatcctgtt ccaccacctc acggtggctg agcacatgct gttctatgcc cagctgaaag 3480
gaaagtccca ggaggaggcc cagctggaga tggaagccat gttggaggac acaggcctcc 3540
accacaagcg gaatgaagag gctcaggacc tatcaggtgg catgcagaga aagctgtcgg 3600
ttgccattgc ctttgtggga gatgccaagg tggtgattct ggacgaaccc acctctgggg 3660
tggaccctta ctcgagacgc tcaatctggg atctgctcct gaagtatcgc tcaggcagaa 3720
ccatcatcat gtccactcac cacatggacg aggccgacct ccttggggac cgcattgcca 3780
tcattgccca gggaaggctc tactgctcag gcaccccact cttcctgaag aactgctttg 3840
gcacaggctt gtacttaacc ttggtgcgca agatgaaaaa catccagagc caaaggaaag 3900
gcagtgaggg gacctgcagc tgctcgtcta agggtttctc caccacgtgt ccagcccacg 3960
tcgatgacct aactccagaa caagtcctgg atggggatgt aaatgagctg atggatgtag 4020
ttctccacca tgttccagag gcaaagctgg tggagtgcat tggtcaagaa cttatcttcc 4080
ttcttcc 4087
<210> 10
<211> 4203
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - partial downstream vector sequence, comprising CDS,
post transcriptional response element, poly-adenylation sequence
<400> 10
acatccagag ccaaaggaaa ggcagtgagg ggacctgcag ctgctcgtct aagggtttct 60
ccaccacgtg tccagcccac gtcgatgacc taactccaga acaagtcctg gatggggatg 120
taaatgagct gatggatgta gttctccacc atgttccaga ggcaaagctg gtggagtgca 180
ttggtcaaga acttatcttc cttcttccaa ataagaactt caagcacaga gcatatgcca 240
gccttttcag agagctggag gagacgctgg ctgaccttgg tctcagcagt tttggaattt 300
ctgacactcc cctggaagag atttttctga aggtcacgga ggattctgat tcaggacctc 360
tgtttgcggg tggcgctcag cagaaaagag aaaacgtcaa cccccgacac ccctgcttgg 420
gtcccagaga gaaggctgga cagacacccc aggactccaa tgtctgctcc ccaggggcgc 480
cggctgctca cccagagggc cagcctcccc cagagccaga gtgcccaggc ccgcagctca 540
acacggggac acagctggtc ctccagcatg tgcaggcgct gctggtcaag agattccaac 600
acaccatccg cagccacaag gacttcctgg cgcagatcgt gctcccggct acctttgtgt 660
ttttggctct gatgctttct attgttatcc ctccttttgg cgaatacccc gctttgaccc 720
ttcacccctg gatatatggg cagcagtaca ccttcttcag catggatgaa ccaggcagtg 780
agcagttcac ggtacttgca gacgtcctcc tgaataagcc aggctttggc aaccgctgcc 840
tgaaggaagg gtggcttccg gagtacccct gtggcaactc aacaccctgg aagactcctt 900
ctgtgtcccc aaacatcacc cagctgttcc agaagcagaa atggacacag gtcaaccctt 960
caccatcctg caggtgcagc accagggaga agctcaccat gctgccagag tgccccgagg 1020
gtgccggggg cctcccgccc ccccagagaa cacagcgcag cacggaaatt ctacaagacc 1080
tgacggacag gaacatctcc gacttcttgg taaaaacgta tcctgctctt ataagaagca 1140
gcttaaagag caaattctgg gtcaatgaac agaggtatgg aggaatttcc attggaggaa 1200
agctcccagt cgtccccatc acgggggaag cacttgttgg gtttttaagc gaccttggcc 1260
ggatcatgaa tgtgagcggg ggccctatca ctagagaggc ctctaaagaa atacctgatt 1320
tccttaaaca tctagaaact gaagacaaca ttaaggtgtg gtttaataac aaaggctggc 1380
atgccctggt cagctttctc aatgtggccc acaacgccat cttacgggcc agcctgccta 1440
aggacaggag ccccgaggag tatggaatca ccgtcattag ccaacccctg aacctgacca 1500
aggagcagct ctcagagatt acagtgctga ccacttcagt ggatgctgtg gttgccatct 1560
gcgtgatttt ctccatgtcc ttcgtcccag ccagctttgt cctttatttg atccaggagc 1620
gggtgaacaa atccaagcac ctccagttta tcagtggagt gagccccacc acctactggg 1680
taaccaactt cctctgggac atcatgaatt attccgtgag tgctgggctg gtggtgggca 1740
tcttcatcgg gtttcagaag aaagcctaca cttctccaga aaaccttcct gcccttgtgg 1800
cactgctcct gctgtatgga tgggcggtca ttcccatgat gtacccagca tccttcctgt 1860
ttgatgtccc cagcacagcc tatgtggctt tatcttgtgc taatctgttc atcggcatca 1920
acagcagtgc tattaccttc atcttggaat tatttgagaa taaccggacg ctgctcaggt 1980
tcaacgccgt gctgaggaag ctgctcattg tcttccccca cttctgcctg ggccggggcc 2040
tcattgacct tgcactgagc caggctgtga cagatgtcta tgcccggttt ggtgaggagc 2100
actctgcaaa tccgttccac tgggacctga ttgggaagaa cctgtttgcc atggtggtgg 2160
aaggggtggt gtacttcctc ctgaccctgc tggtccagcg ccacttcttc ctctcccaat 2220
ggattgccga gcccactaag gagcccattg ttgatgaaga tgatgatgtg gctgaagaaa 2280
gacaaagaat tattactggt ggaaataaaa ctgacatctt aaggctacat gaactaacca 2340
agatttatcc aggcacctcc agcccagcag tggacaggct gtgtgtcgga gttcgccctg 2400
gagagtgctt tggcctcctg ggagtgaatg gtgccggcaa aacaaccaca ttcaagatgc 2460
tcactgggga caccacagtg acctcagggg atgccaccgt agcaggcaag agtattttaa 2520
ccaatatttc tgaagtccat caaaatatgg gctactgtcc tcagtttgat gcaatcgatg 2580
agctgctcac aggacgagaa catctttacc tttatgcccg gcttcgaggt gtaccagcag 2640
aagaaatcga aaaggttgca aactggagta ttaagagcct gggcctgact gtctacgccg 2700
actgcctggc tggcacgtac agtgggggca acaagcggaa actctccaca gccatcgcac 2760
tcattggctg cccaccgctg gtgctgctgg atgagcccac cacagggatg gacccccagg 2820
cacgccgcat gctgtggaac gtcatcgtga gcatcatcag agaagggagg gctgtggtcc 2880
tcacatccca cagcatggaa gaatgtgagg cactgtgtac ccggctggcc atcatggtaa 2940
agggcgcctt tcgatgtatg ggcaccattc agcatctcaa gtccaaattt ggagatggct 3000
atatcgtcac aatgaagatc aaatccccga aggacgacct gcttcctgac ctgaaccctg 3060
tggagcagtt cttccagggg aacttcccag gcagtgtgca gagggagagg cactacaaca 3120
tgctccagtt ccaggtctcc tcctcctccc tggcgaggat cttccagctc ctcctctccc 3180
acaaggacag cctgctcatc gaggagtact cagtcacaca gaccacactg gaccaggtgt 3240
ttgtaaattt tgctaaacag cagactgaaa gtcatgacct ccctctgcac cctcgagctg 3300
ctggagccag tcgacaagcc caggactgaa agcttatcga taatcaacct ctggattaca 3360
aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 3420
acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 3480
ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 3540
gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 3600
cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 3660
tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 3720
tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 3780
ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt 3840
cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga 3900
gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atgccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 3960
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4020
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 4080
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 4140
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 4200
ggg 4203
<210> 11
<211> 6822
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60
caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120
tggttaagga atgccaaccc gctctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg 180
atgccctcag caggaatgct gccgtggctc caggggatct tctgcaatgt gaacaatccc 240
tgttttcaaa gccccacccc aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc 300
atcttggcaa gggtatatcg agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag 360
caccttggcc gtatttggac agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg 420
actcacccgg agagaattgc aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa 480
gaaacactga cactatttct cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt 540
ctgatcaact ctcaagtccg tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg 600
aaggacatcg cctgcagcga ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc 660
ggggcaaaga cggtgcgcta tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata 720
gaagacactc tgtatgccaa cgtggacttc ttcaagctct tccgtgtgct tcccacactc 780
ctagacagcc gttctcaagg tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg 840
tcaccaagaa ttcaagagtt tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc 900
aggcccctca tgcagaatgg tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct 960
gacctcctgt gtggctaccc cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat 1020
gaagacaata actataaggc ctttctgggg attgactcca caaggaagga tcctatctat 1080
tcttatgaca gaagaacaac atccttttgt aatgcattga tccagagcct ggagtcaaat 1140
cctttaacca aaatcgcttg gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac 1200
actcctgatt cacctgcagc acgaaggata ctgaagaatg ccaactcaac ttttgaagaa 1260
ctggaacacg ttaggaagtt ggtcaaagcc tgggaagaag tagggcccca gatctggtac 1320
ttctttgaca acagcacaca gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta 1380
aaagactttt tgaataggca gcttggtgaa gaaggtatta ctgctgaagc catcctaaac 1440
ttcctctaca agggccctcg ggaaagccag gctgacgaca tggccaactt cgactggagg 1500
gacatattta acatcactga tcgcaccctc cgcctggtca atcaatacct ggagtgcttg 1560
gtcctggata agtttgaaag ctacaatgat gaaactcagc tcacccaacg tgccctctct 1620
ctactggagg aaaacatgtt ctgggccgga gtggtattcc ctgacatgta tccctggacc 1680
agctctctac caccccacgt gaagtataag atccgaatgg acatagacgt ggtggagaaa 1740
accaataaga ttaaagacag gtattgggat tctggtccca gagctgatcc cgtggaagat 1800
ttccggtaca tctggggcgg gtttgcctat ctgcaggaca tggttgaaca ggggatcaca 1860
aggagccagg tgcaggcgga ggctccagtt ggaatctacc tccagcagat gccctacccc 1920
tgcttcgtgg acgattcttt catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg 1980
ctggcatgga tctactctgt ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg 2040
cgactgaagg agaccttgaa aaatcagggt gtctccaatg cagtgatttg gtgtacctgg 2100
ttcctggaca gcttctccat catgtcgatg agcatcttcc tcctgacgat attcatcatg 2160
catggaagaa tcctacatta cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc 2220
tccactgcca ccatcatgct gtgctttctg ctcagcacct tcttctccaa ggccagtctg 2280
gcagcagcct gtagtggtgt catctatttc accctctacc tgccacacat cctgtgcttc 2340
gcctggcagg accgcatgac cgctgagctg aagaaggctg tgagcttact gtctccggtg 2400
gcatttggat ttggcactga gtacctggtt cgctttgaag agcaaggcct ggggctgcag 2460
tggagcaaca tcgggaacag tcccacggaa ggggacgaat tcagcttcct gctgtccatg 2520
cagatgatgc tccttgatgc tgctgtctat ggcttactcg cttggtacct tgatcaggtg 2580
tttccaggag actatggaac cccacttcct tggtactttc ttctacaaga gtcgtattgg 2640
cttggcggtg aagggtgttc aaccagagaa gaaagagccc tggaaaagac cgagccccta 2700
acagaggaaa cggaggatcc agagcaccca gaaggaatac acgactcctt ctttgaacgt 2760
gagcatccag ggtgggttcc tggggtatgc gtgaagaatc tggtaaagat ttttgagccc 2820
tgtggccggc cagctgtgga ccgtctgaac atcaccttct acgagaacca gatcaccgca 2880
ttcctgggcc acaatggagc tgggaaaacc accaccttgt ccatcctgac gggtctgttg 2940
ccaccaacct ctgggactgt gctcgttggg ggaagggaca ttgaaaccag cctggatgca 3000
gtccggcaga gccttggcat gtgtccacag cacaacatcc tgttccacca cctcacggtg 3060
gctgagcaca tgctgttcta tgcccagctg aaaggaaagt cccaggagga ggcccagctg 3120
gagatggaag ccatgttgga ggacacaggc ctccaccaca agcggaatga agaggctcag 3180
gacctatcag gtggcatgca gagaaagctg tcggttgcca ttgcctttgt gggagatgcc 3240
aaggtggtga ttctggacga acccacctct ggggtggacc cttactcgag acgctcaatc 3300
tgggatctgc tcctgaagta tcgctcaggc agaaccatca tcatgtccac tcaccacatg 3360
gacgaggccg acctccttgg ggaccgcatt gccatcattg cccagggaag gctctactgc 3420
tcaggcaccc cactcttcct gaagaactgc tttggcacag gcttgtactt aaccttggtg 3480
cgcaagatga aaaacatcca gagccaaagg aaaggcagtg aggggacctg cagctgctcg 3540
tctaagggtt tctccaccac gtgtccagcc cacgtcgatg acctaactcc agaacaagtc 3600
ctggatgggg atgtaaatga gctgatggat gtagttctcc accatgttcc agaggcaaag 3660
ctggtggagt gcattggtca agaacttatc ttccttcttc caaataagaa cttcaagcac 3720
agagcatatg ccagcctttt cagagagctg gaggagacgc tggctgacct tggtctcagc 3780
agttttggaa tttctgacac tcccctggaa gagatttttc tgaaggtcac ggaggattct 3840
gattcaggac ctctgtttgc gggtggcgct cagcagaaaa gagaaaacgt caacccccga 3900
cacccctgct tgggtcccag agagaaggct ggacagacac cccaggactc caatgtctgc 3960
tccccagggg cgccggctgc tcacccagag ggccagcctc ccccagagcc agagtgccca 4020
ggcccgcagc tcaacacggg gacacagctg gtcctccagc atgtgcaggc gctgctggtc 4080
aagagattcc aacacaccat ccgcagccac aaggacttcc tggcgcagat cgtgctcccg 4140
gctacctttg tgtttttggc tctgatgctt tctattgtta tccctccttt tggcgaatac 4200
cccgctttga cccttcaccc ctggatatat gggcagcagt acaccttctt cagcatggat 4260
gaaccaggca gtgagcagtt cacggtactt gcagacgtcc tcctgaataa gccaggcttt 4320
ggcaaccgct gcctgaagga agggtggctt ccggagtacc cctgtggcaa ctcaacaccc 4380
tggaagactc cttctgtgtc cccaaacatc acccagctgt tccagaagca gaaatggaca 4440
caggtcaacc cttcaccatc ctgcaggtgc agcaccaggg agaagctcac catgctgcca 4500
gagtgccccg agggtgccgg gggcctcccg cccccccaga gaacacagcg cagcacggaa 4560
attctacaag acctgacgga caggaacatc tccgacttct tggtaaaaac gtatcctgct 4620
cttataagaa gcagcttaaa gagcaaattc tgggtcaatg aacagaggta tggaggaatt 4680
tccattggag gaaagctccc agtcgtcccc atcacggggg aagcacttgt tgggttttta 4740
agcgaccttg gccggatcat gaatgtgagc gggggcccta tcactagaga ggcctctaaa 4800
gaaatacctg atttccttaa acatctagaa actgaagaca acattaaggt gtggtttaat 4860
aacaaaggct ggcatgccct ggtcagcttt ctcaatgtgg cccacaacgc catcttacgg 4920
gccagcctgc ctaaggacag gagccccgag gagtatggaa tcaccgtcat tagccaaccc 4980
ctgaacctga ccaaggagca gctctcagag attacagtgc tgaccacttc agtggatgct 5040
gtggttgcca tctgcgtgat tttctccatg tccttcgtcc cagccagctt tgtcctttat 5100
ttgatccagg agcgggtgaa caaatccaag cacctccagt ttatcagtgg agtgagcccc 5160
accacctact gggtgaccaa cttcctctgg gacatcatga attattccgt gagtgctggg 5220
ctggtggtgg gcatcttcat cgggtttcag aagaaagcct acacttctcc agaaaacctt 5280
cctgcccttg tggcactgct cctgctgtat ggatgggcgg tcattcccat gatgtaccca 5340
gcatccttcc tgtttgatgt ccccagcaca gcctatgtgg ctttatcttg tgctaatctg 5400
ttcatcggca tcaacagcag tgctattacc ttcatcttgg aattatttga gaataaccgg 5460
acgctgctca ggttcaacgc cgtgctgagg aagctgctca ttgtcttccc ccacttctgc 5520
ctgggccggg gcctcattga ccttgcactg agccaggctg tgacagatgt ctatgcccgg 5580
tttggtgagg agcactctgc aaatccgttc cactgggacc tgattgggaa gaacctgttt 5640
gccatggtgg tggaaggggt ggtgtacttc ctcctgaccc tgctggtcca gcgccacttc 5700
ttcctctccc aatggattgc cgagcccact aaggagccca ttgttgatga agatgatgat 5760
gtggctgaag aaagacaaag aattattact ggtggaaata aaactgacat cttaaggcta 5820
catgaactaa ccaagattta tccaggcacc tccagcccag cagtggacag gctgtgtgtc 5880
ggagttcgcc ctggagagtg ctttggcctc ctgggagtga atggtgccgg caaaacaacc 5940
acattcaaga tgctcactgg ggacaccaca gtgacctcag gggatgccac cgtagcaggc 6000
aagagtattt taaccaatat ttctgaagtc catcaaaata tgggctactg tcctcagttt 6060
gatgcaattg atgagctgct cacaggacga gaacatcttt acctttatgc ccggcttcga 6120
ggtgtaccag cagaagaaat cgaaaaggtt gcaaactgga gtattaagag cctgggcctg 6180
actgtctacg ccgactgcct ggctggcacg tacagtgggg gcaacaagcg gaaactctcc 6240
acagccatcg cactcattgg ctgcccaccg ctggtgctgc tggatgagcc caccacaggg 6300
atggaccccc aggcacgccg catgctgtgg aacgtcatcg tgagcatcat cagagaaggg 6360
agggctgtgg tcctcacatc ccacagcatg gaagaatgtg aggcactgtg tacccggctg 6420
gccatcatgg taaagggcgc ctttcgatgt atgggcacca ttcagcatct caagtccaaa 6480
tttggagatg gctatatcgt cacaatgaag atcaaatccc cgaaggacga cctgcttcct 6540
gacctgaacc ctgtggagca gttcttccag gggaacttcc caggcagtgt gcagagggag 6600
aggcactaca acatgctcca gttccaggtc tcctcctcct ccctggcgag gatcttccag 6660
ctcctcctct cccacaagga cagcctgctc atcgaggagt actcagtcac acagaccaca 6720
ctggaccagg tgtttgtaaa ttttgctaaa cagcagactg aaagtcatga cctccctctg 6780
caccctcgag ctgctggagc cagtcgacaa gcccaggact ga 6822
<210> 12
<211> 737
<212> PRT
<213> Adeno-associated virus 8
<400> 12
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210 215 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
260 265 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275 280 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290 295 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
305 310 315 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325 330 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340 345 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355 360 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370 375 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385 390 395 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
405 410 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420 425 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435 440 445
Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
450 455 460
Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
485 490 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
500 505 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
515 520 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
530 535 540
Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
545 550 555 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565 570 575
Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
580 585 590
Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595 600 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610 615 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625 630 635 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645 650 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
660 665 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675 680 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690 695 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705 710 715 720
Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725 730 735
Asn
<210> 13
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab
<400> 13
gtgccgcagg gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg 60
cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta 120
cag 123
<210> 14
<211> 53
<212> DNA
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 14
ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga att 53
<210> 15
<211> 235
<212> DNA
<213> Human betaherpesvirus 5
<400> 15
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtca 235
<210> 16
<211> 372
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 16
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gcgctgcctt 300
cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg 360
ttactcccac ag 372
<210> 17
<211> 7496
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - CMVCBA.In.GFP.pA vector
<400> 17
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60
ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg 120
cggcaattca gtcgataact ataacggtcc taaggtagcg atttaaatac gcgctctctt 180
aaggtagccc cgggacgcgt caattgccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 240
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 300
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 360
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 420
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct 480
tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat 540
tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc 600
ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg 660
cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa 720
gcgcgcggcg ggcgtgccgc agggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg 780
gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt 840
cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg 900
caaagaattg ccaccatgag caagggcgag gaactgttca ctggcgtggt cccaattctc 960
gtggaactgg atggcgatgt gaatgggcac aaattttctg tcagcggaga gggtgaaggt 1020
gatgccacat acggaaagct caccctgaaa ttcatctgca ccactggaaa gctccctgtg 1080
ccatggccaa cactggtcac taccctgacc tatggcgtgc agtgcttttc cagataccca 1140
gaccatatga agcagcatga ctttttcaag agcgccatgc ccgagggcta tgtgcaggag 1200
agaaccatct ttttcaaaga tgacgggaac tacaagaccc gcgctgaagt caagttcgaa 1260
ggtgacaccc tggtgaatag aatcgagctg aagggcattg actttaagga ggatggaaac 1320
attctcggcc acaagctgga atacaactat aactcccaca atgtgtacat catggccgac 1380
aagcaaaaga atggcatcaa ggtcaacttc aagatcagac acaacattga ggatggatcc 1440
gtgcagctgg ccgaccatta tcaacagaac actccaatcg gcgacggccc tgtgctcctc 1500
ccagacaacc attacctgtc cacccagtct gccctgtcta aagatcccaa cgaaaagaga 1560
gaccacatgg tcctgctgga gtttgtgacc gctgctggga tcacacatgg catggacgag 1620
ctgtacaagt gagagctcct cgaggcggcc cgctcgagtc tagagggccc ttcgaaggta 1680
agcctatccc taaccctctc ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc 1740
accattgagt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 1800
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1860
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1920
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1980
atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag atcctctctt aaggtagcat 2040
cgagatttaa attagggata acagggtaat ggcgcgggcc gcaggaaccc ctagtgatgg 2100
agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 2160
cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agcgcgcaga 2220
gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag 2280
aggccgaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag 2340
aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg 2400
ttgctgacta attgagatgc atgctttgca tacttctgcc tgctggggag cctggggact 2460
ttccacacct ggttgctgac taattgagat gcatgctttg catacttctg cctgctgggg 2520
agcctgggga ctttccacac cctaactgac acacattcca cagctgcatt aatgaatcgg 2580
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 2640
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 2700
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 2760
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 2820
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 2880
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 2940
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 3000
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 3060
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 3120
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 3180
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 3240
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 3300
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 3360
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 3420
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 3480
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 3540
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 3600
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact cctgcaaacc acgttgtgtc tcaaaatctc 3660
tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa caataaaact gtctgcttac 3720
ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc ttgctcgagg 3780
ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat 3840
gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg 3900
tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta 3960
aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat 4020
gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt attagaagaa 4080
tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat 4140
tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg 4200
caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc 4260
tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc accggattca 4320
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atcctgtctg acctcctgtg tggctacccc gagggaggtg gctctcgggt gctctccttc 1920
aactggtatg aagacaataa ctataaggcc tttctgggga ttgactccac aaggaaggat 1980
cctatctatt cttatgacag aagaacaaca tccttttgta atgcattgat ccagagcctg 2040
gagtcaaatc ctttaaccaa aatcgcttgg agggcggcaa agcctttgct gatgggaaaa 2100
atcctgtaca ctcctgattc acctgcagca cgaaggatac tgaagaatgc caactcaact 2160
tttgaagaac tggaacacgt taggaagttg gtcaaagcct gggaagaagt agggccccag 2220
atctggtact tctttgacaa cagcacacag atgaacatga tcagagatac cctggggaac 2280
ccaacagtaa aagacttttt gaataggcag cttggtgaag aaggtattac tgctgaagcc 2340
atcctaaact tcctctacaa gggccctcgg gaaagccagg ctgacgacat ggccaacttc 2400
gactggaggg acatatttaa catcactgat cgcaccctcc gccttgtcaa tcaatacctg 2460
gagtgcttgg tcctggataa gtttgaaagc tacaatgatg aaactcagct cacccaacgt 2520
gccctctctc tactggagga aaacatgttc tgggccggag tggtattccc tgacatgtat 2580
ccctggacca gctctctacc accccacgtg aagtataaga tccgaatgga catagacgtg 2640
gtggagaaaa ccaataagat taaagacagg tattgggatt ctggtcccag agctgatccc 2700
gtggaagatt tccggtacat ctggggcggg tttgcctatc tgcaggacat ggttgaacag 2760
gggatcacaa ggagccaggt gcaggcggag gctccagttg gaatctacct ccagcagatg 2820
ccctacccct gcttcgtgga cgattctttc atgatcatcc tgaaccgctg tttccctatc 2880
ttcatggtgc tggcatggat ctactctgtc tccatgactg tgaagagcat cgtcttggag 2940
aaggagttgc gactgaagga gaccttgaaa aatcagggtg tctccaatgc agtgatttgg 3000
tgtacctggt tcctggacag cttctccatc atgtcgatga gcatcttcct cctgacgata 3060
ttcatcatgc atggaagaat cctacattac agcgacccat tcatcctctt cctgttcttg 3120
ttggctttct ccactgccac catcatgctg tgctttctgc tcagcacctt cttctccaag 3180
gccagtctgg cagcagcctg tagtggtgtc atctatttca ccctctacct gccacacatc 3240
ctgtgcttcg cctggcagga ccgcatgacc gctgagctga agaaggctgt gagcttactg 3300
tctccggtgg catttggatt tggcactgag tacctggttc gctttgaaga gcaaggcctg 3360
gggctgcagt ggagcaacat cgggaacagt cccacggaag gggacgaatt cagcttcctg 3420
ctgtccatgc agatgatgct ccttgatgct gctgtctatg gcttactcgc ttggtacctt 3480
gatcaggtgt ttccaggaga ctatggaacc ccacttcctt ggtactttct tctacaagag 3540
tcgtattggc ttggcggtga agggtgttca accagagaag aaagagccct ggaaaagacc 3600
gagcccctaa cagaggaaac ggaggatcca gagcacccag aaggaataca cgactccttc 3660
tttgaacgtg agcatccagg gtgggttcct ggggtatgcg tgaagaatct ggtaaagatt 3720
tttgagccct gtggccggcc agctgtggac cgtctgaaca tcaccttcta cgagaaccag 3780
atcaccgcat tcctgggcca caatggagct gggaaaacca ccaccttgtc catcctgacg 3840
ggtctgttgc caccaacctc tgggactgtg ctcgttgggg gaagggacat tgaaaccagc 3900
ctggatgcag tccggcagag ccttggcatg tgtccacagc acaacatcct gttccaccac 3960
ctcacggtgg ctgagcacat gctgttctat gcccagctga aaggaaagtc ccaggaggag 4020
gcccagctgg agatggaagc catgttggag gacacaggcc tccaccacaa gcggaatgaa 4080
gaggctcagg acctatcagg tggcatgcag agaaagctgt cggttgccat tgcctttgtg 4140
ggagatgcca aggtggtgat tctggacgaa cccacctctg gggtggaccc ttactcgaga 4200
cgctcaatct gggatctgct cctgaagtat cgctcaggca gaaccatcat catgtccact 4260
caccacatgg acgaggccga cctccttggg gaccgcattg ccatcattgc ccagggaagg 4320
ctctactgct caggcacccc actcttcctg aagaactgct ttggcacagg cttgtactta 4380
accttggtgc gcaagatgaa aaacatccag agccaaagga aaggcagtga ggggacctgc 4440
agctgctcgt ctaagggttt ctccaccacg tgtccagccc acgtcgatga cctaactcca 4500
gaacaagtcc tggatgggga tgtaaatgag ctgatggatg tagttctcca ccatgttcca 4560
gaggcaaagc tggtggagtg cattggtcaa gaacttatct tccttcttcc atttaaatta 4620
gggataacag ggtggtggcg cgggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 4680
tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 4740
tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactagaat 4800
taattccgtg tattctatag tgtcacctaa atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt 4860
attaattgta gccgcgttct aacgacaata tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct 4920
tagcggccgc ctaccgtcaa acagtcaatc ccgttctacg ccatttgaca cataacgccc 4980
gggataacag agctgaattt gacggactac gatattgctt atgtgccacc aatcaacagt 5040
taacgaacac gtggcggcgc ggaacgcctc cggccaggcc gcgcgcttcg catatttact 5100
tcgagcagtg taggtgtgac aacgtagcat gcagccacat ccctagcttg aaccggagat 5160
aaaggtctac gcgcgcgacg tccacattca cacggttcag attcctggtg ctacccaaaa 5220
caaagtccat aggtttttca ttgggactac ggcgcgaagc taagtggttt cacacctaca 5280
agggaaacat gcccaaacta tgaggacaac atcgtccgca gaaacaatcg gccgcgatag 5340
gggttgcacg ttgtcagatg aaagagccac actcggggag cagtccgcgg acgccacctc 5400
gtgcaacttc ggctaaccat ataatctaaa aaagttgagg tttgcagttg tcggggcgag 5460
atcaaaccca agtatatagt cctgtccgga gccttagttc acgtactcgc gacccttgaa 5520
agcgcgtcaa gcttatcgct cactgactag ctcaatgtgt ggcaatctaa gtaggaggtc 5580
tgtcgcaagg caaaaatgct aattattggt agcaagctta gataaggtgg agggattgca 5640
caattcagaa ggcgtcttct ctgctacacc cgagcggggt gctttatcaa ggggaagctt 5700
gatgtcccac gggatgaacg agagcctcca tggcatctca cgacctactt aacttcgggg 5760
gatgggtaga agttagctga acatacaaat gggaatagga ttgtgccctc ggacgagact 5820
gaacggatcg cagtcaaccc gcgcaaagtt tacatattaa ttcttacggc gtgtcagaga 5880
ggcaatggct tgacttgtgg tggatcacag tttgtgagta acggcaagat gcggtaaaca 5940
ctgtaatgcg agcttcattg actcggctta aagttcctgg taccataatg aatacacggt 6000
ggttagttgt caattgcttg tgcaccgccg caccttgcgg tcctcggtcc agcctgcgca 6060
gggtataaat gaagcacgtc ccacccagac tgttccatcg tacctccaaa tacggattca 6120
acctggcgtc tatttccaga tatgggccct aggggtgata gactcccaag tctaaggact 6180
accatgggat atgtttcacg tatccaaaaa gtaaccataa tactgcgttt ccgttcaccc 6240
aagtgaggat gttgcctttg tactggtttc atagtcctgc cgtaccaggc gtcttcctta 6300
gccggcgcta cttccagccc ggaactgtct tgtttctcga tgtgagaccc ttgtcagccg 6360
cccgcggtgg tgcacgtaaa agccgattgg agtattaagt atttacaact ccgaatctta 6420
agagccctgc tctagtttgg attcatatat cagcataggc ttcgcaacct agtgaatgag 6480
cggtacgaac tttcgcggag tgcgaaaagc gaccgagcaa tcgagatacg taccgttaga 6540
ttcacgctcc agacagcact ctgagtcttt gatttataac catcgaagga atcgacttca 6600
cgtccctagc gtgttgagtc atccgcagaa gagacgatga gggctcgccc cccgaaatag 6660
ttctgcttca aactataggc tgccctactt ggtctccgag gtactatggg gtcctcgacg 6720
gttcgaggcc cccaacccat gttcaatcag ctcgtatgtc taccctcgag ctaacacagg 6780
aaccagctga gacttgcctg gcgtcacttg ggcacgttcc atatacataa tgaagtacgc 6840
cgcagggtct ctccgttacc gaactgtgct cgacctaaag tccggtaccc atcggcgtcc 6900
tgtcacattt gtggcattag gtatgaacta actctggggg gcttctacga ccatggtaaa 6960
agttttgtgc tgccagacaa ctgttaataa acatgtcgct gcgtagaacg ccaagaacca 7020
gctgggatga gtgccttatt taccccgcgc gaggtgggtc tgagtaggta gcatcgaggt 7080
ttacgcctaa gttggaccgc aaatataggc cctttgccgg gatccccact atctgtgaat 7140
tgtgaaaccc gttggcaccc tgtacaaagt gcatagctac atcattggta acaagacgta 7200
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cgcgcatgga aagggccggg aagtaactct ggccttcacg gaacgataag ttacaatttg 7320
ggaacagtcg gagagcgcca ctacgtgctt ttttggctta cctcatatct cgtagttggt 7380
gagggttaaa attcgcggga gaagatccag cctaagtata tggttacatc gcggccgcct 7440
gaagcagacc ctatcatctc tctcgtaaac tgccgtcaga gtcggtttgg ttggacgaac 7500
cttctgagtt tctggtaacg ccgtcccgca cccggaaatg gtcagcgaac caatcagcag 7560
ggtcatcgct agccagatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 7620
aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 7680
cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccgcc cttagaaaaa 7740
ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt 7800
ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc 7860
aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt 7920
cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg 7980
tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg 8040
ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc 8100
gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg 8160
gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa 8220
tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt 8280
acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac 8340
catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg 8400
cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg 8460
agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca 8520
agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga 8580
cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg 8640
agacacaacg tggtttgcag gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 8700
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 8760
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 8820
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 8880
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 8940
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 9000
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 9060
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 9120
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 9180
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cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 9300
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ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 9420
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 9480
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 9540
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 9600
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 9660
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 9720
taatgcagct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 9780
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag 9840
gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 9900
cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 9960
atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat 10020
tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag 10070
<210> 22
<211> 9895
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - AAV.5'CMVCBA.ABCA4.WPRE.kan vector
<400> 22
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgcggc aattcagtcg ataactataa cggtcctaag 180
gtagcgattt aaatggtacc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 300
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc 480
tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt 540
gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg 600
aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc 660
gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc 720
ggcgggcgac caccatgggc ttcgtgagac agatacagct tttgctctgg aagaactgga 780
ccctgcggaa aaggcaaaag attcgctttg tggtggaact cgtgtggcct ttatctttat 840
ttctggtctt gatctggtta aggaatgcca acccgctcta cagccatcat gaatgccatt 900
tccccaacaa ggcgatgccc tcagcaggaa tgctgccgtg gctccagggg atcttctgca 960
atgtgaacaa tccctgtttt caaagcccca ccccaggaga atctcctgga attgtgtcaa 1020
actataacaa ctccatcttg gcaagggtat atcgagattt tcaagaactc ctcatgaatg 1080
caccagagag ccagcacctt ggccgtattt ggacagagct acacatcttg tcccaattca 1140
tggacaccct ccggactcac ccggagagaa ttgcaggaag aggaatacga ataagggata 1200
tcttgaaaga tgaagaaaca ctgacactat ttctcattaa aaacatcggc ctgtctgact 1260
cagtggtcta ccttctgatc aactctcaag tccgtccaga gcagttcgct catggagtcc 1320
cggacctggc gctgaaggac atcgcctgca gcgaggccct cctggagcgc ttcatcatct 1380
tcagccagag acgcggggca aagacggtgc gctatgccct gtgctccctc tcccagggca 1440
ccctacagtg gatagaagac actctgtatg ccaacgtgga cttcttcaag ctcttccgtg 1500
tgcttcccac actcctagac agccgttctc aaggtatcaa tctgagatct tggggaggaa 1560
tattatctga tatgtcacca agaattcaag agtttatcca tcggccgagt atgcaggact 1620
tgctgtgggt gaccaggccc ctcatgcaga atggtggtcc agagaccttt acaaagctga 1680
tgggcatcct gtctgacctc ctgtgtggct accccgaggg aggtggctct cgggtgctct 1740
ccttcaactg gtatgaagac aataactata aggcctttct ggggattgac tccacaagga 1800
aggatcctat ctattcttat gacagaagaa caacatcctt ttgtaatgca ttgatccaga 1860
gcctggagtc aaatccttta accaaaatcg cttggagggc ggcaaagcct ttgctgatgg 1920
gaaaaatcct gtacactcct gattcacctg cagcacgaag gatactgaag aatgccaact 1980
caacttttga agaactggaa cacgttagga agttggtcaa agcctgggaa gaagtagggc 2040
cccagatctg gtacttcttt gacaacagca cacagatgaa catgatcaga gataccctgg 2100
ggaacccaac agtaaaagac tttttgaata ggcagcttgg tgaagaaggt attactgctg 2160
aagccatcct aaacttcctc tacaagggcc ctcgggaaag ccaggctgac gacatggcca 2220
acttcgactg gagggacata tttaacatca ctgatcgcac cctccgcctt gtcaatcaat 2280
acctggagtg cttggtcctg gataagtttg aaagctacaa tgatgaaact cagctcaccc 2340
aacgtgccct ctctctactg gaggaaaaca tgttctgggc cggagtggta ttccctgaca 2400
tgtatccctg gaccagctct ctaccacccc acgtgaagta taagatccga atggacatag 2460
acgtggtgga gaaaaccaat aagattaaag acaggtattg ggattctggt cccagagctg 2520
atcccgtgga agatttccgg tacatctggg gcgggtttgc ctatctgcag gacatggttg 2580
aacaggggat cacaaggagc caggtgcagg cggaggctcc agttggaatc tacctccagc 2640
agatgcccta cccctgcttc gtggacgatt ctttcatgat catcctgaac cgctgtttcc 2700
ctatcttcat ggtgctggca tggatctact ctgtctccat gactgtgaag agcatcgtct 2760
tggagaagga gttgcgactg aaggagacct tgaaaaatca gggtgtctcc aatgcagtga 2820
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cgatattcat catgcatgga agaatcctac attacagcga cccattcatc ctcttcctgt 2940
tcttgttggc tttctccact gccaccatca tgctgtgctt tctgctcagc accttcttct 3000
ccaaggccag tctggcagca gcctgtagtg gtgtcatcta tttcaccctc tacctgccac 3060
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gcctggggct gcagtggagc aacatcggga acagtcccac ggaaggggac gaattcagct 3240
tcctgctgtc catgcagatg atgctccttg atgctgctgt ctatggctta ctcgcttggt 3300
accttgatca ggtgtttcca ggagactatg gaaccccact tccttggtac tttcttctac 3360
aagagtcgta ttggcttggc ggtgaagggt gttcaaccag agaagaaaga gccctggaaa 3420
agaccgagcc cctaacagag gaaacggagg atccagagca cccagaagga atacacgact 3480
ccttctttga acgtgagcat ccagggtggg ttcctggggt atgcgtgaag aatctggtaa 3540
agatttttga gccctgtggc cggccagctg tggaccgtct gaacatcacc ttctacgaga 3600
accagatcac cgcattcctg ggccacaatg gagctgggaa aaccaccacc ttgtccatcc 3660
tgacgggtct gttgccacca acctctggga ctgtgctcgt tgggggaagg gacattgaaa 3720
ccagcctgga tgcagtccgg cagagccttg gcatgtgtcc acagcacaac atcctgttcc 3780
accacctcac ggtggctgag cacatgctgt tctatgccca gctgaaagga aagtcccagg 3840
aggaggccca gctggagatg gaagccatgt tggaggacac aggcctccac cacaagcgga 3900
atgaagaggc tcaggaccta tcaggtggca tgcagagaaa gctgtcggtt gccattgcct 3960
ttgtgggaga tgccaaggtg gtgattctgg acgaacccac ctctggggtg gacccttact 4020
cgagacgctc aatctgggat ctgctcctga agtatcgctc aggcagaacc atcatcatgt 4080
ccactcacca catggacgag gccgacctcc ttggggaccg cattgccatc attgcccagg 4140
gaaggctcta ctgctcaggc accccactct tcctgaagaa ctgctttggc acaggcttgt 4200
acttaacctt ggtgcgcaag atgaaaaaca tccagagcca aaggaaaggc agtgagggga 4260
cctgcagctg ctcgtctaag ggtttctcca ccacgtgtcc agcccacgtc gatgacctaa 4320
ctccagaaca agtcctggat ggggatgtaa atgagctgat ggatgtagtt ctccaccatg 4380
ttccagaggc aaagctggtg gagtgcattg gtcaagaact tatcttcctt cttccattta 4440
aattagggat aacagggtgg tggcgcgggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca 4500
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cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact 4620
agaattaatt ccgtgtattc tatagtgtca cctaaatcgt atgtgtatga tacataaggt 4680
tatgtattaa ttgtagccgc gttctaacga caatatgtac aagcctaatt gtgtagcatc 4740
tggcttagcg gccgcctacc gtcaaacagt caatcccgtt ctacgccatt tgacacataa 4800
cgcccgggat aacagagctg aatttgacgg actacgatat tgcttatgtg ccaccaatca 4860
acagttaacg aacacgtggc ggcgcggaac gcctccggcc aggccgcgcg cttcgcatat 4920
ttacttcgag cagtgtaggt gtgacaacgt agcatgcagc cacatcccta gcttgaaccg 4980
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caaaacaaag tccataggtt tttcattggg actacggcgc gaagctaagt ggtttcacac 5100
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gataggggtt gcacgttgtc agatgaaaga gccacactcg gggagcagtc cgcggacgcc 5220
acctcgtgca acttcggcta accatataat ctaaaaaagt tgaggtttgc agttgtcggg 5280
gcgagatcaa acccaagtat atagtcctgt ccggagcctt agttcacgta ctcgcgaccc 5340
ttgaaagcgc gtcaagctta tcgctcactg actagctcaa tgtgtggcaa tctaagtagg 5400
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cgggggatgg gtagaagtta gctgaacata caaatgggaa taggattgtg ccctcggacg 5640
agactgaacg gatcgcagtc aacccgcgca aagtttacat attaattctt acggcgtgtc 5700
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aaacactgta atgcgagctt cattgactcg gcttaaagtt cctggtacca taatgaatac 5820
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<210> 23
<211> 10057
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - AAV.5'CBA.IntEx.ABCA4.WPRE.kan vector
<400> 23
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
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gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 9960
tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 10020
aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaag 10057
<210> 24
<211> 279
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 24
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcg 279
<210> 25
<211> 263
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 25
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 60
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 120
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 180
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 240
gcttctgagg cggaaagaac cag 263
<210> 26
<211> 4464
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - pAAV.RK.5'ABCA4.kan
<400> 26
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgcggc aattcagtcg ataactataa cggtcctaag 180
gtagcgattt aaatggtacc gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg 240
aaaagtgagg cggccccttg gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag 300
cagctcaggg gattgtcttt ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac 360
cccggctggg atttagcctg gtgctgtgtc agccccgggt gccgcagggg gacggctgcc 420
ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 480
cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 540
ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattaccacc atgggcttcg tgagacagat 600
acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg caaaagattc gctttgtggt 660
ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc tggttaagga atgccaaccc 720
gctctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg atgccctcag caggaatgct 780
gccgtggctc caggggatct tctgcaatgt gaacaatccc tgttttcaaa gccccacccc 840
aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc atcttggcaa gggtatatcg 900
agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag caccttggcc gtatttggac 960
agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg actcacccgg agagaattgc 1020
aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa gaaacactga cactatttct 1080
cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt ctgatcaact ctcaagtccg 1140
tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg aaggacatcg cctgcagcga 1200
ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc ggggcaaaga cggtgcgcta 1260
tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata gaagacactc tgtatgccaa 1320
cgtggacttc ttcaagctct tccgtgtgct tcccacactc ctagacagcc gttctcaagg 1380
tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg tcaccaagaa ttcaagagtt 1440
tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc aggcccctca tgcagaatgg 1500
tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct gacctcctgt gtggctaccc 1560
cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat gaagacaata actataaggc 1620
ctttctgggg attgactcca caaggaagga tcctatctat tcttatgaca gaagaacaac 1680
atccttttgt aatgcattga tccagagcct ggagtcaaat cctttaacca aaatcgcttg 1740
gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac actcctgatt cacctgcagc 1800
acgaaggata ctgaagaatg ccaactcaac ttttgaagaa ctggaacacg ttaggaagtt 1860
ggtcaaagcc tgggaagaag tagggcccca gatctggtac ttctttgaca acagcacaca 1920
gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta aaagactttt tgaataggca 1980
gcttggtgaa gaaggtatta ctgctgaagc catcctaaac ttcctctaca agggccctcg 2040
ggaaagccag gctgacgaca tggccaactt cgactggagg gacatattta acatcactga 2100
tcgcaccctc cgccttgtca atcaatacct ggagtgcttg gtcctggata agtttgaaag 2160
ctacaatgat gaaactcagc tcacccaacg tgccctctct ctactggagg aaaacatgtt 2220
ctgggccgga gtggtattcc ctgacatgta tccctggacc agctctctac caccccacgt 2280
gaagtataag atccgaatgg acatagacgt ggtggagaaa accaataaga ttaaagacag 2340
gtattgggat tctggtccca gagctgatcc cgtggaagat ttccggtaca tctggggcgg 2400
gtttgcctat ctgcaggaca tggttgaaca ggggatcaca aggagccagg tgcaggcgga 2460
ggctccagtt ggaatctacc tccagcagat gccctacccc tgcttcgtgg acgattcttt 2520
catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg ctggcatgga tctactctgt 2580
ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg cgactgaagg agaccttgaa 2640
aaatcagggt gtctccaatg cagtgatttg gtgtacctgg ttcctggaca gcttctccat 2700
catgtcgatg agcatcttcc tcctgacgat attcatcatg catggaagaa tcctacatta 2760
cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc tccactgcca ccatcatgct 2820
gtgctttctg ctcagcacct tcttctccaa ggccagtctg gcagcagcct gtagtggtgt 2880
catctatttc accctctacc tgccacacat cctgtgcttc gcctggcagg accgcatgac 2940
cgctgagctg aagaaggctg tgagcttact gtctccggtg gcatttggat ttggcactga 3000
gtacctggtt cgctttgaag agcaaggcct ggggctgcag tggagcaaca tcgggaacag 3060
tcccacggaa ggggacgaat tcagcttcct gctgtccatg cagatgatgc tccttgatgc 3120
tgctgtctat ggcttactcg cttggtacct tgatcaggtg tttccaggag actatggaac 3180
cccacttcct tggtactttc ttctacaaga gtcgtattgg cttggcggtg aagggtgttc 3240
aaccagagaa gaaagagccc tggaaaagac cgagccccta acagaggaaa cggaggatcc 3300
agagcaccca gaaggaatac acgactcctt ctttgaacgt gagcatccag ggtgggttcc 3360
tggggtatgc gtgaagaatc tggtaaagat ttttgagccc tgtggccggc cagctgtgga 3420
ccgtctgaac atcaccttct acgagaacca gatcaccgca ttcctgggcc acaatggagc 3480
tgggaaaacc accaccttgt ccatcctgac gggtctgttg ccaccaacct ctgggactgt 3540
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gtgtccacag cacaacatcc tgttccacca cctcacggtg gctgagcaca tgctgttcta 3660
tgcccagctg aaaggaaagt cccaggagga ggcccagctg gagatggaag ccatgttgga 3720
ggacacaggc ctccaccaca agcggaatga agaggctcag gacctatcag gtggcatgca 3780
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acccacctct ggggtggacc cttactcgag acgctcaatc tgggatctgc tcctgaagta 3900
tcgctcaggc agaaccatca tcatgtccac tcaccacatg gacgaggccg acctccttgg 3960
ggaccgcatt gccatcattg cccagggaag gctctactgc tcaggcaccc cactcttcct 4020
gaagaactgc tttggcacag gcttgtactt aaccttggtg cgcaagatga aaaacatcca 4080
gagccaaagg aaaggcagtg aggggacctg cagctgctcg tctaagggtt tctccaccac 4140
gtgtccagcc cacgtcgatg acctaactcc agaacaagtc ctggatgggg atgtaaatga 4200
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cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg 4440
agcgcgcaga gagggagtgg ccaa 4464
<210> 27
<211> 145
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 27
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 28
<211> 199
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggg 199
<210> 29
<211> 3703
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
catgggcttc gtgagacaga tacagctttt gctctggaag aactggaccc tgcggaaaag 60
gcaaaagatt cgctttgtgg tggaactcgt gtggccttta tctttatttc tggtcttgat 120
ctggttaagg aatgccaacc cgctctacag ccatcatgaa tgccatttcc ccaacaaggc 180
gatgccctca gcaggaatgc tgccgtggct ccaggggatc ttctgcaatg tgaacaatcc 240
ctgttttcaa agccccaccc caggagaatc tcctggaatt gtgtcaaact ataacaactc 300
catcttggca agggtatatc gagattttca agaactcctc atgaatgcac cagagagcca 360
gcaccttggc cgtatttgga cagagctaca catcttgtcc caattcatgg acaccctccg 420
gactcacccg gagagaattg caggaagagg aatacgaata agggatatct tgaaagatga 480
agaaacactg acactatttc tcattaaaaa catcggcctg tctgactcag tggtctacct 540
tctgatcaac tctcaagtcc gtccagagca gttcgctcat ggagtcccgg acctggcgct 600
gaaggacatc gcctgcagcg aggccctcct ggagcgcttc atcatcttca gccagagacg 660
cggggcaaag acggtgcgct atgccctgtg ctccctctcc cagggcaccc tacagtggat 720
agaagacact ctgtatgcca acgtggactt cttcaagctc ttccgtgtgc ttcccacact 780
cctagacagc cgttctcaag gtatcaatct gagatcttgg ggaggaatat tatctgatat 840
gtcaccaaga attcaagagt ttatccatcg gccgagtatg caggacttgc tgtgggtgac 900
caggcccctc atgcagaatg gtggtccaga gacctttaca aagctgatgg gcatcctgtc 960
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tgaagacaat aactataagg cctttctggg gattgactcc acaaggaagg atcctatcta 1080
ttcttatgac agaagaacaa catccttttg taatgcattg atccagagcc tggagtcaaa 1140
tcctttaacc aaaatcgctt ggagggcggc aaagcctttg ctgatgggaa aaatcctgta 1200
cactcctgat tcacctgcag cacgaaggat actgaagaat gccaactcaa cttttgaaga 1260
actggaacac gttaggaagt tggtcaaagc ctgggaagaa gtagggcccc agatctggta 1320
cttctttgac aacagcacac agatgaacat gatcagagat accctgggga acccaacagt 1380
aaaagacttt ttgaataggc agcttggtga agaaggtatt actgctgaag ccatcctaaa 1440
cttcctctac aagggccctc gggaaagcca ggctgacgac atggccaact tcgactggag 1500
ggacatattt aacatcactg atcgcaccct ccgccttgtc aatcaatacc tggagtgctt 1560
ggtcctggat aagtttgaaa gctacaatga tgaaactcag ctcacccaac gtgccctctc 1620
tctactggag gaaaacatgt tctgggccgg agtggtattc cctgacatgt atccctggac 1680
cagctctcta ccaccccacg tgaagtataa gatccgaatg gacatagacg tggtggagaa 1740
aaccaataag attaaagaca ggtattggga ttctggtccc agagctgatc ccgtggaaga 1800
tttccggtac atctggggcg ggtttgccta tctgcaggac atggttgaac aggggatcac 1860
aaggagccag gtgcaggcgg aggctccagt tggaatctac ctccagcaga tgccctaccc 1920
ctgcttcgtg gacgattctt tcatgatcat cctgaaccgc tgtttcccta tcttcatggt 1980
gctggcatgg atctactctg tctccatgac tgtgaagagc atcgtcttgg agaaggagtt 2040
gcgactgaag gagaccttga aaaatcaggg tgtctccaat gcagtgattt ggtgtacctg 2100
gttcctggac agcttctcca tcatgtcgat gagcatcttc ctcctgacga tattcatcat 2160
gcatggaaga atcctacatt acagcgaccc attcatcctc ttcctgttct tgttggcttt 2220
ctccactgcc accatcatgc tgtgctttct gctcagcacc ttcttctcca aggccagtct 2280
ggcagcagcc tgtagtggtg tcatctattt caccctctac ctgccacaca tcctgtgctt 2340
cgcctggcag gaccgcatga ccgctgagct gaagaaggct gtgagcttac tgtctccggt 2400
ggcatttgga tttggcactg agtacctggt tcgctttgaa gagcaaggcc tggggctgca 2460
gtggagcaac atcgggaaca gtcccacgga aggggacgaa ttcagcttcc tgctgtccat 2520
gcagatgatg ctccttgatg ctgctgtcta tggcttactc gcttggtacc ttgatcaggt 2580
gtttccagga gactatggaa ccccacttcc ttggtacttt cttctacaag agtcgtattg 2640
gcttggcggt gaagggtgtt caaccagaga agaaagagcc ctggaaaaga ccgagcccct 2700
aacagaggaa acggaggatc cagagcaccc agaaggaata cacgactcct tctttgaacg 2760
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ctgtggccgg ccagctgtgg accgtctgaa catcaccttc tacgagaacc agatcaccgc 2880
attcctgggc cacaatggag ctgggaaaac caccaccttg tccatcctga cgggtctgtt 2940
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ggctgagcac atgctgttct atgcccagct gaaaggaaag tcccaggagg aggcccagct 3120
ggagatggaa gccatgttgg aggacacagg cctccaccac aagcggaatg aagaggctca 3180
ggacctatca ggtggcatgc agagaaagct gtcggttgcc attgcctttg tgggagatgc 3240
caaggtggtg attctggacg aacccacctc tggggtggac ccttactcga gacgctcaat 3300
ctgggatctg ctcctgaagt atcgctcagg cagaaccatc atcatgtcca ctcaccacat 3360
ggacgaggcc gacctccttg gggaccgcat tgccatcatt gcccagggaa ggctctactg 3420
ctcaggcacc ccactcttcc tgaagaactg ctttggcaca ggcttgtact taaccttggt 3480
gcgcaagatg aaaaacatcc agagccaaag gaaaggcagt gaggggacct gcagctgctc 3540
gtctaagggt ttctccacca cgtgtccagc ccacgtcgat gacctaactc cagaacaagt 3600
cctggatggg gatgtaaatg agctgatgga tgtagttctc caccatgttc cagaggcaaa 3660
gctggtggag tgcattggtc aagaacttat cttccttctt cca 3703
<210> 30
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(145)
<223> 3' ITR
<400> 30
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145
<210> 31
<211> 3334
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
aaataacatc cagagccaaa ggaaaggcag tgaggggacc tgcagctgct cgtctaaggg 60
tttctccacc acgtgtccag cccacgtcga tgacctaact ccagaacaag tcctggatgg 120
ggatgtaaat gagctgatgg atgtagttct ccaccatgtt ccagaggcaa agctggtgga 180
gtgcattggt caagaactta tcttccttct tccaaataag aacttcaagc acagagcata 240
tgccagcctt ttcagagagc tggaggagac gctggctgac cttggtctca gcagttttgg 300
aatttctgac actcccctgg aagagatttt tctgaaggtc acggaggatt ctgattcagg 360
acctctgttt gcgggtggcg ctcagcagaa aagagaaaac gtcaaccccc gacacccctg 420
cttgggtccc agagagaagg ctggacagac accccaggac tccaatgtct gctccccagg 480
ggcgccggct gctcacccag agggccagcc tcccccagag ccagagtgcc caggcccgca 540
gctcaacacg gggacacagc tggtcctcca gcatgtgcag gcgctgctgg tcaagagatt 600
ccaacacacc atccgcagcc acaaggactt cctggcgcag atcgtgctcc cggctacctt 660
tgtgtttttg gctctgatgc tttctattgt tatccctcct tttggcgaat accccgcttt 720
gacccttcac ccctggatat atgggcagca gtacaccttc ttcagcatgg atgaaccagg 780
cagtgagcag ttcacggtac ttgcagacgt cctcctgaat aagccaggct ttggcaaccg 840
ctgcctgaag gaagggtggc ttccggagta cccctgtggc aactcaacac cctggaagac 900
tccttctgtg tccccaaaca tcacccagct gttccagaag cagaaatgga cacaggtcaa 960
cccttcacca tcctgcaggt gcagcaccag ggagaagctc accatgctgc cagagtgccc 1020
cgagggtgcc gggggcctcc cgccccccca gagaacacag cgcagcacgg aaattctaca 1080
agacctgacg gacaggaaca tctccgactt cttggtaaaa acgtatcctg ctcttataag 1140
aagcagctta aagagcaaat tctgggtcaa tgaacagagg tatggaggaa tttccattgg 1200
aggaaagctc ccagtcgtcc ccatcacggg ggaagcactt gttgggtttt taagcgacct 1260
tggccggatc atgaatgtga gcgggggccc tatcactaga gaggcctcta aagaaatacc 1320
tgatttcctt aaacatctag aaactgaaga caacattaag gtgtggttta ataacaaagg 1380
ctggcatgcc ctggtcagct ttctcaatgt ggcccacaac gccatcttac gggccagcct 1440
gcctaaggac aggagccccg aggagtatgg aatcaccgtc attagccaac ccctgaacct 1500
gaccaaggag cagctctcag agattacagt gctgaccact tcagtggatg ctgtggttgc 1560
catctgcgtg attttctcca tgtccttcgt cccagccagc tttgtccttt atttgatcca 1620
ggagcgggtg aacaaatcca agcacctcca gtttatcagt ggagtgagcc ccaccaccta 1680
ctgggtaacc aacttcctct gggacatcat gaattattcc gtgagtgctg ggctggtggt 1740
gggcatcttc atcgggtttc agaagaaagc ctacacttct ccagaaaacc ttcctgccct 1800
tgtggcactg ctcctgctgt atggatgggc ggtcattccc atgatgtacc cagcatcctt 1860
cctgtttgat gtccccagca cagcctatgt ggctttatct tgtgctaatc tgttcatcgg 1920
catcaacagc agtgctatta ccttcatctt ggaattattt gagaataacc ggacgctgct 1980
caggttcaac gccgtgctga ggaagctgct cattgtcttc ccccacttct gcctgggccg 2040
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ggagcactct gcaaatccgt tccactggga cctgattggg aagaacctgt ttgccatggt 2160
ggtggaaggg gtggtgtact tcctcctgac cctgctggtc cagcgccact tcttcctctc 2220
ccaatggatt gccgagccca ctaaggagcc cattgttgat gaagatgatg atgtggctga 2280
agaaagacaa agaattatta ctggtggaaa taaaactgac atcttaaggc tacatgaact 2340
aaccaagatt tatccaggca cctccagccc agcagtggac aggctgtgtg tcggagttcg 2400
ccctggagag tgctttggcc tcctgggagt gaatggtgcc ggcaaaacaa ccacattcaa 2460
gatgctcact ggggacacca cagtgacctc aggggatgcc accgtagcag gcaagagtat 2520
tttaaccaat atttctgaag tccatcaaaa tatgggctac tgtcctcagt ttgatgcaat 2580
cgatgagctg ctcacaggac gagaacatct ttacctttat gcccggcttc gaggtgtacc 2640
agcagaagaa atcgaaaagg ttgcaaactg gagtattaag agcctgggcc tgactgtcta 2700
cgccgactgc ctggctggca cgtacagtgg gggcaacaag cggaaactct ccacagccat 2760
cgcactcatt ggctgcccac cgctggtgct gctggatgag cccaccacag ggatggaccc 2820
ccaggcacgc cgcatgctgt ggaacgtcat cgtgagcatc atcagagaag ggagggctgt 2880
ggtcctcaca tcccacagca tggaagaatg tgaggcactg tgtacccggc tggccatcat 2940
ggtaaagggc gcctttcgat gtatgggcac cattcagcat ctcaagtcca aatttggaga 3000
tggctatatc gtcacaatga agatcaaatc cccgaaggac gacctgcttc ctgacctgaa 3060
ccctgtggag cagttcttcc aggggaactt cccaggcagt gtgcagaggg agaggcacta 3120
caacatgctc cagttccagg tctcctcctc ctccctggcg aggatcttcc agctcctcct 3180
ctcccacaag gacagcctgc tcatcgagga gtactcagtc acacagacca cactggacca 3240
ggtgtttgta aattttgcta aacagcagac tgaaagtcat gacctccctc tgcaccctcg 3300
agctgctgga gccagtcgac aagcccagga ctga 3334
<210> 32
<211> 593
<212> DNA
<213> Woodchuck hepatitis viurs
<400> 32
atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 60
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 120
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 180
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 240
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 300
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 360
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 420
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 480
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 540
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc ccc 593
<210> 33
<211> 269
<212> DNA
<213> Adeno-associated viurs 2
<400> 33
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 60
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 120
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 180
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 240
gcttctgagg cggaaagaac cagctgggg 269
<210> 34
<211> 119
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 34
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60
ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcct 119
<210> 35
<211> 130
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 35
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 36
<211> 130
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 36
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 37
<211> 121
<212> DNA
<213> Adeno associated virus 2
<400> 37
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 120
g 121
<210> 38
<211> 270
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 38
tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 60
cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 120
aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 180
cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 240
ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 270
<210> 39
<211> 188
<212> DNA
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 39
agccccgggt gccgcagggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg 60
gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct 120
ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag 180
aattacca 188
<210> 40
<211> 2273
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Gly Phe Val Arg Gln Ile Gln Leu Leu Leu Trp Lys Asn Trp Thr
1 5 10 15
Leu Arg Lys Arg Gln Lys Ile Arg Phe Val Val Glu Leu Val Trp Pro
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Ile Trp Leu Arg Asn Ala Asn Pro Leu
35 40 45
Tyr Ser His His Glu Cys His Phe Pro Asn Lys Ala Met Pro Ser Ala
50 55 60
Gly Met Leu Pro Trp Leu Gln Gly Ile Phe Cys Asn Val Asn Asn Pro
65 70 75 80
Cys Phe Gln Ser Pro Thr Pro Gly Glu Ser Pro Gly Ile Val Ser Asn
85 90 95
Tyr Asn Asn Ser Ile Leu Ala Arg Val Tyr Arg Asp Phe Gln Glu Leu
100 105 110
Leu Met Asn Ala Pro Glu Ser Gln His Leu Gly Arg Ile Trp Thr Glu
115 120 125
Leu His Ile Leu Ser Gln Phe Met Asp Thr Leu Arg Thr His Pro Glu
130 135 140
Arg Ile Ala Gly Arg Gly Ile Arg Ile Arg Asp Ile Leu Lys Asp Glu
145 150 155 160
Glu Thr Leu Thr Leu Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Leu Ser Asp Ser
165 170 175
Val Val Tyr Leu Leu Ile Asn Ser Gln Val Arg Pro Glu Gln Phe Ala
180 185 190
His Gly Val Pro Asp Leu Ala Leu Lys Asp Ile Ala Cys Ser Glu Ala
195 200 205
Leu Leu Glu Arg Phe Ile Ile Phe Ser Gln Arg Arg Gly Ala Lys Thr
210 215 220
Val Arg Tyr Ala Leu Cys Ser Leu Ser Gln Gly Thr Leu Gln Trp Ile
225 230 235 240
Glu Asp Thr Leu Tyr Ala Asn Val Asp Phe Phe Lys Leu Phe Arg Val
245 250 255
Leu Pro Thr Leu Leu Asp Ser Arg Ser Gln Gly Ile Asn Leu Arg Ser
260 265 270
Trp Gly Gly Ile Leu Ser Asp Met Ser Pro Arg Ile Gln Glu Phe Ile
275 280 285
His Arg Pro Ser Met Gln Asp Leu Leu Trp Val Thr Arg Pro Leu Met
290 295 300
Gln Asn Gly Gly Pro Glu Thr Phe Thr Lys Leu Met Gly Ile Leu Ser
305 310 315 320
Asp Leu Leu Cys Gly Tyr Pro Glu Gly Gly Gly Ser Arg Val Leu Ser
325 330 335
Phe Asn Trp Tyr Glu Asp Asn Asn Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Ile Asp
340 345 350
Ser Thr Arg Lys Asp Pro Ile Tyr Ser Tyr Asp Arg Arg Thr Thr Ser
355 360 365
Phe Cys Asn Ala Leu Ile Gln Ser Leu Glu Ser Asn Pro Leu Thr Lys
370 375 380
Ile Ala Trp Arg Ala Ala Lys Pro Leu Leu Met Gly Lys Ile Leu Tyr
385 390 395 400
Thr Pro Asp Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ile Leu Lys Asn Ala Asn Ser
405 410 415
Thr Phe Glu Glu Leu Glu His Val Arg Lys Leu Val Lys Ala Trp Glu
420 425 430
Glu Val Gly Pro Gln Ile Trp Tyr Phe Phe Asp Asn Ser Thr Gln Met
435 440 445
Asn Met Ile Arg Asp Thr Leu Gly Asn Pro Thr Val Lys Asp Phe Leu
450 455 460
Asn Arg Gln Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr Ala Glu Ala Ile Leu Asn
465 470 475 480
Phe Leu Tyr Lys Gly Pro Arg Glu Ser Gln Ala Asp Asp Met Ala Asn
485 490 495
Phe Asp Trp Arg Asp Ile Phe Asn Ile Thr Asp Arg Thr Leu Arg Leu
500 505 510
Val Asn Gln Tyr Leu Glu Cys Leu Val Leu Asp Lys Phe Glu Ser Tyr
515 520 525
Asn Asp Glu Thr Gln Leu Thr Gln Arg Ala Leu Ser Leu Leu Glu Glu
530 535 540
Asn Met Phe Trp Ala Gly Val Val Phe Pro Asp Met Tyr Pro Trp Thr
545 550 555 560
Ser Ser Leu Pro Pro His Val Lys Tyr Lys Ile Arg Met Asp Ile Asp
565 570 575
Val Val Glu Lys Thr Asn Lys Ile Lys Asp Arg Tyr Trp Asp Ser Gly
580 585 590
Pro Arg Ala Asp Pro Val Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Trp Gly Gly Phe
595 600 605
Ala Tyr Leu Gln Asp Met Val Glu Gln Gly Ile Thr Arg Ser Gln Val
610 615 620
Gln Ala Glu Ala Pro Val Gly Ile Tyr Leu Gln Gln Met Pro Tyr Pro
625 630 635 640
Cys Phe Val Asp Asp Ser Phe Met Ile Ile Leu Asn Arg Cys Phe Pro
645 650 655
Ile Phe Met Val Leu Ala Trp Ile Tyr Ser Val Ser Met Thr Val Lys
660 665 670
Ser Ile Val Leu Glu Lys Glu Leu Arg Leu Lys Glu Thr Leu Lys Asn
675 680 685
Gln Gly Val Ser Asn Ala Val Ile Trp Cys Thr Trp Phe Leu Asp Ser
690 695 700
Phe Ser Ile Met Ser Met Ser Ile Phe Leu Leu Thr Ile Phe Ile Met
705 710 715 720
His Gly Arg Ile Leu His Tyr Ser Asp Pro Phe Ile Leu Phe Leu Phe
725 730 735
Leu Leu Ala Phe Ser Thr Ala Thr Ile Met Leu Cys Phe Leu Leu Ser
740 745 750
Thr Phe Phe Ser Lys Ala Ser Leu Ala Ala Ala Cys Ser Gly Val Ile
755 760 765
Tyr Phe Thr Leu Tyr Leu Pro His Ile Leu Cys Phe Ala Trp Gln Asp
770 775 780
Arg Met Thr Ala Glu Leu Lys Lys Ala Val Ser Leu Leu Ser Pro Val
785 790 795 800
Ala Phe Gly Phe Gly Thr Glu Tyr Leu Val Arg Phe Glu Glu Gln Gly
805 810 815
Leu Gly Leu Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ser Pro Thr Glu Gly Asp
820 825 830
Glu Phe Ser Phe Leu Leu Ser Met Gln Met Met Leu Leu Asp Ala Ala
835 840 845
Val Tyr Gly Leu Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Gln Val Phe Pro Gly Asp
850 855 860
Tyr Gly Thr Pro Leu Pro Trp Tyr Phe Leu Leu Gln Glu Ser Tyr Trp
865 870 875 880
Leu Gly Gly Glu Gly Cys Ser Thr Arg Glu Glu Arg Ala Leu Glu Lys
885 890 895
Thr Glu Pro Leu Thr Glu Glu Thr Glu Asp Pro Glu His Pro Glu Gly
900 905 910
Ile His Asp Ser Phe Phe Glu Arg Glu His Pro Gly Trp Val Pro Gly
915 920 925
Val Cys Val Lys Asn Leu Val Lys Ile Phe Glu Pro Cys Gly Arg Pro
930 935 940
Ala Val Asp Arg Leu Asn Ile Thr Phe Tyr Glu Asn Gln Ile Thr Ala
945 950 955 960
Phe Leu Gly His Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Leu Ser Ile Leu
965 970 975
Thr Gly Leu Leu Pro Pro Thr Ser Gly Thr Val Leu Val Gly Gly Arg
980 985 990
Asp Ile Glu Thr Ser Leu Asp Ala Val Arg Gln Ser Leu Gly Met Cys
995 1000 1005
Pro Gln His Asn Ile Leu Phe His His Leu Thr Val Ala Glu His
1010 1015 1020
Met Leu Phe Tyr Ala Gln Leu Lys Gly Lys Ser Gln Glu Glu Ala
1025 1030 1035
Gln Leu Glu Met Glu Ala Met Leu Glu Asp Thr Gly Leu His His
1040 1045 1050
Lys Arg Asn Glu Glu Ala Gln Asp Leu Ser Gly Gly Met Gln Arg
1055 1060 1065
Lys Leu Ser Val Ala Ile Ala Phe Val Gly Asp Ala Lys Val Val
1070 1075 1080
Ile Leu Asp Glu Pro Thr Ser Gly Val Asp Pro Tyr Ser Arg Arg
1085 1090 1095
Ser Ile Trp Asp Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Arg Thr Ile
1100 1105 1110
Ile Met Ser Thr His His Met Asp Glu Ala Asp Leu Leu Gly Asp
1115 1120 1125
Arg Ile Ala Ile Ile Ala Gln Gly Arg Leu Tyr Cys Ser Gly Thr
1130 1135 1140
Pro Leu Phe Leu Lys Asn Cys Phe Gly Thr Gly Leu Tyr Leu Thr
1145 1150 1155
Leu Val Arg Lys Met Lys Asn Ile Gln Ser Gln Arg Lys Gly Ser
1160 1165 1170
Glu Gly Thr Cys Ser Cys Ser Ser Lys Gly Phe Ser Thr Thr Cys
1175 1180 1185
Pro Ala His Val Asp Asp Leu Thr Pro Glu Gln Val Leu Asp Gly
1190 1195 1200
Asp Val Asn Glu Leu Met Asp Val Val Leu His His Val Pro Glu
1205 1210 1215
Ala Lys Leu Val Glu Cys Ile Gly Gln Glu Leu Ile Phe Leu Leu
1220 1225 1230
Pro Asn Lys Asn Phe Lys His Arg Ala Tyr Ala Ser Leu Phe Arg
1235 1240 1245
Glu Leu Glu Glu Thr Leu Ala Asp Leu Gly Leu Ser Ser Phe Gly
1250 1255 1260
Ile Ser Asp Thr Pro Leu Glu Glu Ile Phe Leu Lys Val Thr Glu
1265 1270 1275
Asp Ser Asp Ser Gly Pro Leu Phe Ala Gly Gly Ala Gln Gln Lys
1280 1285 1290
Arg Glu Asn Val Asn Pro Arg His Pro Cys Leu Gly Pro Arg Glu
1295 1300 1305
Lys Ala Gly Gln Thr Pro Gln Asp Ser Asn Val Cys Ser Pro Gly
1310 1315 1320
Ala Pro Ala Ala His Pro Glu Gly Gln Pro Pro Pro Glu Pro Glu
1325 1330 1335
Cys Pro Gly Pro Gln Leu Asn Thr Gly Thr Gln Leu Val Leu Gln
1340 1345 1350
His Val Gln Ala Leu Leu Val Lys Arg Phe Gln His Thr Ile Arg
1355 1360 1365
Ser His Lys Asp Phe Leu Ala Gln Ile Val Leu Pro Ala Thr Phe
1370 1375 1380
Val Phe Leu Ala Leu Met Leu Ser Ile Val Ile Pro Pro Phe Gly
1385 1390 1395
Glu Tyr Pro Ala Leu Thr Leu His Pro Trp Ile Tyr Gly Gln Gln
1400 1405 1410
Tyr Thr Phe Phe Ser Met Asp Glu Pro Gly Ser Glu Gln Phe Thr
1415 1420 1425
Val Leu Ala Asp Val Leu Leu Asn Lys Pro Gly Phe Gly Asn Arg
1430 1435 1440
Cys Leu Lys Glu Gly Trp Leu Pro Glu Tyr Pro Cys Gly Asn Ser
1445 1450 1455
Thr Pro Trp Lys Thr Pro Ser Val Ser Pro Asn Ile Thr Gln Leu
1460 1465 1470
Phe Gln Lys Gln Lys Trp Thr Gln Val Asn Pro Ser Pro Ser Cys
1475 1480 1485
Arg Cys Ser Thr Arg Glu Lys Leu Thr Met Leu Pro Glu Cys Pro
1490 1495 1500
Glu Gly Ala Gly Gly Leu Pro Pro Pro Gln Arg Thr Gln Arg Ser
1505 1510 1515
Thr Glu Ile Leu Gln Asp Leu Thr Asp Arg Asn Ile Ser Asp Phe
1520 1525 1530
Leu Val Lys Thr Tyr Pro Ala Leu Ile Arg Ser Ser Leu Lys Ser
1535 1540 1545
Lys Phe Trp Val Asn Glu Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ile Gly
1550 1555 1560
Gly Lys Leu Pro Val Val Pro Ile Thr Gly Glu Ala Leu Val Gly
1565 1570 1575
Phe Leu Ser Asp Leu Gly Arg Ile Met Asn Val Ser Gly Gly Pro
1580 1585 1590
Ile Thr Arg Glu Ala Ser Lys Glu Ile Pro Asp Phe Leu Lys His
1595 1600 1605
Leu Glu Thr Glu Asp Asn Ile Lys Val Trp Phe Asn Asn Lys Gly
1610 1615 1620
Trp His Ala Leu Val Ser Phe Leu Asn Val Ala His Asn Ala Ile
1625 1630 1635
Leu Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Arg Ser Pro Glu Glu Tyr Gly
1640 1645 1650
Ile Thr Val Ile Ser Gln Pro Leu Asn Leu Thr Lys Glu Gln Leu
1655 1660 1665
Ser Glu Ile Thr Val Leu Thr Thr Ser Val Asp Ala Val Val Ala
1670 1675 1680
Ile Cys Val Ile Phe Ser Met Ser Phe Val Pro Ala Ser Phe Val
1685 1690 1695
Leu Tyr Leu Ile Gln Glu Arg Val Asn Lys Ser Lys His Leu Gln
1700 1705 1710
Phe Ile Ser Gly Val Ser Pro Thr Thr Tyr Trp Val Thr Asn Phe
1715 1720 1725
Leu Trp Asp Ile Met Asn Tyr Ser Val Ser Ala Gly Leu Val Val
1730 1735 1740
Gly Ile Phe Ile Gly Phe Gln Lys Lys Ala Tyr Thr Ser Pro Glu
1745 1750 1755
Asn Leu Pro Ala Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu Tyr Gly Trp Ala
1760 1765 1770
Val Ile Pro Met Met Tyr Pro Ala Ser Phe Leu Phe Asp Val Pro
1775 1780 1785
Ser Thr Ala Tyr Val Ala Leu Ser Cys Ala Asn Leu Phe Ile Gly
1790 1795 1800
Ile Asn Ser Ser Ala Ile Thr Phe Ile Leu Glu Leu Phe Glu Asn
1805 1810 1815
Asn Arg Thr Leu Leu Arg Phe Asn Ala Val Leu Arg Lys Leu Leu
1820 1825 1830
Ile Val Phe Pro His Phe Cys Leu Gly Arg Gly Leu Ile Asp Leu
1835 1840 1845
Ala Leu Ser Gln Ala Val Thr Asp Val Tyr Ala Arg Phe Gly Glu
1850 1855 1860
Glu His Ser Ala Asn Pro Phe His Trp Asp Leu Ile Gly Lys Asn
1865 1870 1875
Leu Phe Ala Met Val Val Glu Gly Val Val Tyr Phe Leu Leu Thr
1880 1885 1890
Leu Leu Val Gln Arg His Phe Phe Leu Ser Gln Trp Ile Ala Glu
1895 1900 1905
Pro Thr Lys Glu Pro Ile Val Asp Glu Asp Asp Asp Val Ala Glu
1910 1915 1920
Glu Arg Gln Arg Ile Ile Thr Gly Gly Asn Lys Thr Asp Ile Leu
1925 1930 1935
Arg Leu His Glu Leu Thr Lys Ile Tyr Pro Gly Thr Ser Ser Pro
1940 1945 1950
Ala Val Asp Arg Leu Cys Val Gly Val Arg Pro Gly Glu Cys Phe
1955 1960 1965
Gly Leu Leu Gly Val Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Phe Lys
1970 1975 1980
Met Leu Thr Gly Asp Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Ala Thr Val
1985 1990 1995
Ala Gly Lys Ser Ile Leu Thr Asn Ile Ser Glu Val His Gln Asn
2000 2005 2010
Met Gly Tyr Cys Pro Gln Phe Asp Ala Ile Asp Glu Leu Leu Thr
2015 2020 2025
Gly Arg Glu His Leu Tyr Leu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Val Pro
2030 2035 2040
Ala Glu Glu Ile Glu Lys Val Ala Asn Trp Ser Ile Lys Ser Leu
2045 2050 2055
Gly Leu Thr Val Tyr Ala Asp Cys Leu Ala Gly Thr Tyr Ser Gly
2060 2065 2070
Gly Asn Lys Arg Lys Leu Ser Thr Ala Ile Ala Leu Ile Gly Cys
2075 2080 2085
Pro Pro Leu Val Leu Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Met Asp Pro
2090 2095 2100
Gln Ala Arg Arg Met Leu Trp Asn Val Ile Val Ser Ile Ile Arg
2105 2110 2115
Glu Gly Arg Ala Val Val Leu Thr Ser His Ser Met Glu Glu Cys
2120 2125 2130
Glu Ala Leu Cys Thr Arg Leu Ala Ile Met Val Lys Gly Ala Phe
2135 2140 2145
Arg Cys Met Gly Thr Ile Gln His Leu Lys Ser Lys Phe Gly Asp
2150 2155 2160
Gly Tyr Ile Val Thr Met Lys Ile Lys Ser Pro Lys Asp Asp Leu
2165 2170 2175
Leu Pro Asp Leu Asn Pro Val Glu Gln Phe Phe Gln Gly Asn Phe
2180 2185 2190
Pro Gly Ser Val Gln Arg Glu Arg His Tyr Asn Met Leu Gln Phe
2195 2200 2205
Gln Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala Arg Ile Phe Gln Leu Leu Leu
2210 2215 2220
Ser His Lys Asp Ser Leu Leu Ile Glu Glu Tyr Ser Val Thr Gln
2225 2230 2235
Thr Thr Leu Asp Gln Val Phe Val Asn Phe Ala Lys Gln Gln Thr
2240 2245 2250
Glu Ser His Asp Leu Pro Leu His Pro Arg Ala Ala Gly Ala Ser
2255 2260 2265
Arg Gln Ala Gln Asp
2270
<210> 41
<211> 9819
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 41
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggcaattc agtcgataac tataacggtc ctaaggtagc gatttaaata 180
acatccagag ccaaaggaaa ggcagtgagg ggacctgcag ctgctcgtct aagggtttct 240
ccaccacgtg tccagcccac gtcgatgacc taactccaga acaagtcctg gatggggatg 300
taaatgagct gatggatgta gttctccacc atgttccaga ggcaaagctg gtggagtgca 360
ttggtcaaga acttatcttc cttcttccaa ataagaactt caagcacaga gcatatgcca 420
gccttttcag agagctggag gagacgctgg ctgaccttgg tctcagcagt tttggaattt 480
ctgacactcc cctggaagag atttttctga aggtcacgga ggattctgat tcaggacctc 540
tgtttgcggg tggcgctcag cagaaaagag aaaacgtcaa cccccgacac ccctgcttgg 600
gtcccagaga gaaggctgga cagacacccc aggactccaa tgtctgctcc ccaggggcgc 660
cggctgctca cccagagggc cagcctcccc cagagccaga gtgcccaggc ccgcagctca 720
acacggggac acagctggtc ctccagcatg tgcaggcgct gctggtcaag agattccaac 780
acaccatccg cagccacaag gacttcctgg cgcagatcgt gctcccggct acctttgtgt 840
ttttggctct gatgctttct attgttatcc ctccttttgg cgaatacccc gctttgaccc 900
ttcacccctg gatatatggg cagcagtaca ccttcttcag catggatgaa ccaggcagtg 960
agcagttcac ggtacttgca gacgtcctcc tgaataagcc aggctttggc aaccgctgcc 1020
tgaaggaagg gtggcttccg gagtacccct gtggcaactc aacaccctgg aagactcctt 1080
ctgtgtcccc aaacatcacc cagctgttcc agaagcagaa atggacacag gtcaaccctt 1140
caccatcctg caggtgcagc accagggaga agctcaccat gctgccagag tgccccgagg 1200
gtgccggggg cctcccgccc ccccagagaa cacagcgcag cacggaaatt ctacaagacc 1260
tgacggacag gaacatctcc gacttcttgg taaaaacgta tcctgctctt ataagaagca 1320
gcttaaagag caaattctgg gtcaatgaac agaggtatgg aggaatttcc attggaggaa 1380
agctcccagt cgtccccatc acgggggaag cacttgttgg gtttttaagc gaccttggcc 1440
ggatcatgaa tgtgagcggg ggccctatca ctagagaggc ctctaaagaa atacctgatt 1500
tccttaaaca tctagaaact gaagacaaca ttaaggtgtg gtttaataac aaaggctggc 1560
atgccctggt cagctttctc aatgtggccc acaacgccat cttacgggcc agcctgccta 1620
aggacaggag ccccgaggag tatggaatca ccgtcattag ccaacccctg aacctgacca 1680
aggagcagct ctcagagatt acagtgctga ccacttcagt ggatgctgtg gttgccatct 1740
gcgtgatttt ctccatgtcc ttcgtcccag ccagctttgt cctttatttg atccaggagc 1800
gggtgaacaa atccaagcac ctccagttta tcagtggagt gagccccacc acctactggg 1860
taaccaactt cctctgggac atcatgaatt attccgtgag tgctgggctg gtggtgggca 1920
tcttcatcgg gtttcagaag aaagcctaca cttctccaga aaaccttcct gcccttgtgg 1980
cactgctcct gctgtatgga tgggcggtca ttcccatgat gtacccagca tccttcctgt 2040
ttgatgtccc cagcacagcc tatgtggctt tatcttgtgc taatctgttc atcggcatca 2100
acagcagtgc tattaccttc atcttggaat tatttgagaa taaccggacg ctgctcaggt 2160
tcaacgccgt gctgaggaag ctgctcattg tcttccccca cttctgcctg ggccggggcc 2220
tcattgacct tgcactgagc caggctgtga cagatgtcta tgcccggttt ggtgaggagc 2280
actctgcaaa tccgttccac tgggacctga ttgggaagaa cctgtttgcc atggtggtgg 2340
aaggggtggt gtacttcctc ctgaccctgc tggtccagcg ccacttcttc ctctcccaat 2400
ggattgccga gcccactaag gagcccattg ttgatgaaga tgatgatgtg gctgaagaaa 2460
gacaaagaat tattactggt ggaaataaaa ctgacatctt aaggctacat gaactaacca 2520
agatttatcc aggcacctcc agcccagcag tggacaggct gtgtgtcgga gttcgccctg 2580
gagagtgctt tggcctcctg ggagtgaatg gtgccggcaa aacaaccaca ttcaagatgc 2640
tcactgggga caccacagtg acctcagggg atgccaccgt agcaggcaag agtattttaa 2700
ccaatatttc tgaagtccat caaaatatgg gctactgtcc tcagtttgat gcaatcgatg 2760
agctgctcac aggacgagaa catctttacc tttatgcccg gcttcgaggt gtaccagcag 2820
aagaaatcga aaaggttgca aactggagta ttaagagcct gggcctgact gtctacgccg 2880
actgcctggc tggcacgtac agtgggggca acaagcggaa actctccaca gccatcgcac 2940
tcattggctg cccaccgctg gtgctgctgg atgagcccac cacagggatg gacccccagg 3000
cacgccgcat gctgtggaac gtcatcgtga gcatcatcag agaagggagg gctgtggtcc 3060
tcacatccca cagcatggaa gaatgtgagg cactgtgtac ccggctggcc atcatggtaa 3120
agggcgcctt tcgatgtatg ggcaccattc agcatctcaa gtccaaattt ggagatggct 3180
atatcgtcac aatgaagatc aaatccccga aggacgacct gcttcctgac ctgaaccctg 3240
tggagcagtt cttccagggg aacttcccag gcagtgtgca gagggagagg cactacaaca 3300
tgctccagtt ccaggtctcc tcctcctccc tggcgaggat cttccagctc ctcctctccc 3360
acaaggacag cctgctcatc gaggagtact cagtcacaca gaccacactg gaccaggtgt 3420
ttgtaaattt tgctaaacag cagactgaaa gtcatgacct ccctctgcac cctcgagctg 3480
ctggagccag tcgacaagcc caggactgaa agcttatcga taatcaacct ctggattaca 3540
aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 3600
acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 3660
ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 3720
gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 3780
cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 3840
tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 3900
tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 3960
ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt 4020
cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga 4080
gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atgccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 4140
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4200
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 4260
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 4320
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 4380
gggatttaaa ttagggataa cagggtaatg gcgcgggccg caggaacccc tagtgatgga 4440
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 4500
ccgacgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agctagaatt aattccgtgt 4560
attctatagt gtcacctaaa tcgtatgtgt atgatacata aggttatgta ttaattgtag 4620
ccgcgttcta acgacaatat gtacaagcct aattgtgtag catctggctt agcggccgcc 4680
taccgtcaaa cagtcaatcc cgttctacgc catttgacac ataacgcccg ggataacaga 4740
gctgaatttg acggactacg atattgctta tgtgccacca atcaacagtt aacgaacacg 4800
tggcggcgcg gaacgcctcc ggccaggccg cgcgcttcgc atatttactt cgagcagtgt 4860
aggtgtgaca acgtagcatg cagccacatc cctagcttga accggagata aaggtctacg 4920
cgcgcgacgt ccacattcac acggttcaga ttcctggtgc tacccaaaac aaagtccata 4980
ggtttttcat tgggactacg gcgcgaagct aagtggtttc acacctacaa gggaaacatg 5040
cccaaactat gaggacaaca tcgtccgcag aaacaatcgg ccgcgatagg ggttgcacgt 5100
tgtcagatga aagagccaca ctcggggagc agtccgcgga cgccacctcg tgcaacttcg 5160
gctaaccata taatctaaaa aagttgaggt ttgcagttgt cggggcgaga tcaaacccaa 5220
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cttatcgctc actgactagc tcaatgtgtg gcaatctaag taggaggtct gtcgcaaggc 5340
aaaaatgcta attattggta gcaagcttag ataaggtgga gggattgcac aattcagaag 5400
gcgtcttctc tgctacaccc gagcggggtg ctttatcaag gggaagcttg atgtcccacg 5460
ggatgaacga gagcctccat ggcatctcac gacctactta acttcggggg atgggtagaa 5520
gttagctgaa catacaaatg ggaataggat tgtgccctcg gacgagactg aacggatcgc 5580
agtcaacccg cgcaaagttt acatattaat tcttacggcg tgtcagagag gcaatggctt 5640
gacttgtggt ggatcacagt ttgtgagtaa cggcaagatg cggtaaacac tgtaatgcga 5700
gcttcattga ctcggcttaa agttcctggt accataatga atacacggtg gttagttgtc 5760
aattgcttgt gcaccgccgc accttgcggt cctcggtcca gcctgcgcag ggtataaatg 5820
aagcacgtcc cacccagact gttccatcgt acctccaaat acggattcaa cctggcgtct 5880
atttccagat atgggcccta ggggtgatag actcccaagt ctaaggacta ccatgggata 5940
tgtttcacgt atccaaaaag taaccataat actgcgtttc cgttcaccca agtgaggatg 6000
ttgcctttgt actggtttca tagtcctgcc gtaccaggcg tcttccttag ccggcgctac 6060
ttccagcccg gaactgtctt gtttctcgat gtgagaccct tgtcagccgc ccgcggtggt 6120
gcacgtaaaa gccgattgga gtattaagta tttacaactc cgaatcttaa gagccctgct 6180
ctagtttgga ttcatatatc agcataggct tcgcaaccta gtgaatgagc ggtacgaact 6240
ttcgcggagt gcgaaaagcg accgagcaat cgagatacgt accgttagat tcacgctcca 6300
gacagcactc tgagtctttg atttataacc atcgaaggaa tcgacttcac gtccctagcg 6360
tgttgagtca tccgcagaag agacgatgag ggctcgcccc ccgaaatagt tctgcttcaa 6420
actataggct gccctacttg gtctccgagg tactatgggg tcctcgacgg ttcgaggccc 6480
ccaacccatg ttcaatcagc tcgtatgtct accctcgagc taacacagga accagctgag 6540
acttgcctgg cgtcacttgg gcacgttcca tatacataat gaagtacgcc gcagggtctc 6600
tccgttaccg aactgtgctc gacctaaagt ccggtaccca tcggcgtcct gtcacatttg 6660
tggcattagg tatgaactaa ctctgggggg cttctacgac catggtaaaa gttttgtgct 6720
gccagacaac tgttaataaa catgtcgctg cgtagaacgc caagaaccag ctgggatgag 6780
tgccttattt accccgcgcg aggtgggtct gagtaggtag catcgaggtt tacgcctaag 6840
ttggaccgca aatataggcc ctttgccggg atccccacta tctgtgaatt gtgaaacccg 6900
ttggcaccct gtacaaagtg catagctaca tcattggtaa caagacgtaa acggaggttc 6960
gctcactccc acttcggaaa gataaccggg gaactaggag ggtatggtgc gcgcatggaa 7020
agggccggga agtaactctg gccttcacgg aacgataagt tacaatttgg gaacagtcgg 7080
agagcgccac tacgtgcttt tttggcttac ctcatatctc gtagttggtg agggttaaaa 7140
ttcgcgggag aagatccagc ctaagtatat ggttacatcg cggccgcctg aagcagaccc 7200
tatcatctct ctcgtaaact gccgtcagag tcggtttggt tggacgaacc ttctgagttt 7260
ctggtaacgc cgtcccgcac ccggaaatgg tcagcgaacc aatcagcagg gtcatcgcta 7320
gccagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 7380
ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 7440
tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccgccc ttagaaaaac tcatcgagca 7500
tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc 7560
gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt 7620
atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa 7680
aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca 7740
aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa 7800
aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata 7860
cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca 7920
ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg 7980
ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat 8040
gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg 8100
taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct 8160
tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat 8220
acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctcgagcaa gacgtttccc 8280
gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac agttttattg 8340
ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacaacgt 8400
ggtttgcagg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 8460
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 8520
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 8580
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 8640
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 8700
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 8760
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 8820
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 8880
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 8940
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ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 9060
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gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 9180
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aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 9300
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 9360
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 9420
agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 9480
tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg 9540
caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 9600
ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact 9660
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 9720
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 9780
tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaag 9819
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 42
gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60
cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 120
<210> 43
<211> 3334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 43
aaataacatc cagagccaaa ggaaaggcag tgaggggacc tgcagctgct cgtctaaggg 60
tttctccacc acgtgtccag cccacgtcga tgacctaact ccagaacaag tcctggatgg 120
ggatgtaaat gagctgatgg atgtagttct ccaccatgtt ccagaggcaa agctggtgga 180
gtgcattggt caagaactta tcttccttct tccaaataag aacttcaagc acagagcata 240
tgccagcctt ttcagagagc tggaggagac gctggctgac cttggtctca gcagttttgg 300
aatttctgac actcccctgg aagagatttt tctgaaggtc acggaggatt ctgattcagg 360
acctctgttt gcgggtggcg ctcagcagaa aagagaaaac gtcaaccccc gacacccctg 420
cttgggtccc agagagaagg ctggacagac accccaggac tccaatgtct gctccccagg 480
ggcgccggct gctcacccag agggccagcc tcccccagag ccagagtgcc caggcccgca 540
gctcaacacg gggacacagc tggtcctcca gcatgtgcag gcgctgctgg tcaagagatt 600
ccaacacacc atccgcagcc acaaggactt cctggcgcag atcgtgctcc cggctacctt 660
tgtgtttttg gctctgatgc tttctattgt tatccctcct tttggcgaat accccgcttt 720
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cagtgagcag ttcacggtac ttgcagacgt cctcctgaat aagccaggct ttggcaaccg 840
ctgcctgaag gaagggtggc ttccggagta cccctgtggc aactcaacac cctggaagac 900
tccttctgtg tccccaaaca tcacccagct gttccagaag cagaaatgga cacaggtcaa 960
cccttcacca tcctgcaggt gcagcaccag ggagaagctc accatgctgc cagagtgccc 1020
cgagggtgcc gggggcctcc cgccccccca gagaacacag cgcagcacgg aaattctaca 1080
agacctgacg gacaggaaca tctccgactt cttggtaaaa acgtatcctg ctcttataag 1140
aagcagctta aagagcaaat tctgggtcaa tgaacagagg tatggaggaa tttccattgg 1200
aggaaagctc ccagtcgtcc ccatcacggg ggaagcactt gttgggtttt taagcgacct 1260
tggccggatc atgaatgtga gcgggggccc tatcactaga gaggcctcta aagaaatacc 1320
tgatttcctt aaacatctag aaactgaaga caacattaag gtgtggttta ataacaaagg 1380
ctggcatgcc ctggtcagct ttctcaatgt ggcccacaac gccatcttac gggccagcct 1440
gcctaaggac aggagccccg aggagtatgg aatcaccgtc attagccaac ccctgaacct 1500
gaccaaggag cagctctcag agattacagt gctgaccact tcagtggatg ctgtggttgc 1560
catctgcgtg attttctcca tgtccttcgt cccagccagc tttgtccttt atttgatcca 1620
ggagcgggtg aacaaatcca agcacctcca gtttatcagt ggagtgagcc ccaccaccta 1680
ctgggtaacc aacttcctct gggacatcat gaattattcc gtgagtgctg ggctggtggt 1740
gggcatcttc atcgggtttc agaagaaagc ctacacttct ccagaaaacc ttcctgccct 1800
tgtggcactg ctcctgctgt atggatgggc ggtcattccc atgatgtacc cagcatcctt 1860
cctgtttgat gtccccagca cagcctatgt ggctttatct tgtgctaatc tgttcatcgg 1920
catcaacagc agtgctatta ccttcatctt ggaattattt gagaataacc ggacgctgct 1980
caggttcaac gccgtgctga ggaagctgct cattgtcttc ccccacttct gcctgggccg 2040
gggcctcatt gaccttgcac tgagccaggc tgtgacagat gtctatgccc ggtttggtga 2100
ggagcactct gcaaatccgt tccactggga cctgattggg aagaacctgt ttgccatggt 2160
ggtggaaggg gtggtgtact tcctcctgac cctgctggtc cagcgccact tcttcctctc 2220
ccaatggatt gccgagccca ctaaggagcc cattgttgat gaagatgatg atgtggctga 2280
agaaagacaa agaattatta ctggtggaaa taaaactgac atcttaaggc tacatgaact 2340
aaccaagatt tatccaggca cctccagccc agcagtggac aggctgtgtg tcggagttcg 2400
ccctggagag tgctttggcc tcctgggagt gaatggtgcc ggcaaaacaa ccacattcaa 2460
gatgctcact ggggacacca cagtgacctc aggggatgcc accgtagcag gcaagagtat 2520
tttaaccaat atttctgaag tccatcaaaa tatgggctac tgtcctcagt ttgatgcaat 2580
cgatgagctg ctcacaggac gagaacatct ttacctttat gcccggcttc gaggtgtacc 2640
agcagaagaa atcgaaaagg ttgcaaactg gagtattaag agcctgggcc tgactgtcta 2700
cgccgactgc ctggctggca cgtacagtgg gggcaacaag cggaaactct ccacagccat 2760
cgcactcatt ggctgcccac cgctggtgct gctggatgag cccaccacag ggatggaccc 2820
ccaggcacgc cgcatgctgt ggaacgtcat cgtgagcatc atcagagaag ggagggctgt 2880
ggtcctcaca tcccacagca tggaagaatg tgaggcactg tgtacccggc tggccatcat 2940
ggtaaagggc gcctttcgat gtatgggcac cattcagcat ctcaagtcca aatttggaga 3000
tggctatatc gtcacaatga agatcaaatc cccgaaggac gacctgcttc ctgacctgaa 3060
ccctgtggag cagttcttcc aggggaactt cccaggcagt gtgcagaggg agaggcacta 3120
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ctcccacaag gacagcctgc tcatcgagga gtactcagtc acacagacca cactggacca 3240
ggtgtttgta aattttgcta aacagcagac tgaaagtcat gacctccctc tgcaccctcg 3300
agctgctgga gccagtcgac aagcccagga ctga 3334
<210> 44
<211> 593
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 44
atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 60
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 120
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 180
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 240
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 300
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 360
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 420
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 480
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 540
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc ccc 593
<210> 45
<211> 174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 45
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 60
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 120
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt gggg 174
<210> 46
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 46
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 120
g 121
<210> 47
<211> 9786
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 47
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
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gtacccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 240
ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 300
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aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcgtg ccgcaggggg 480
acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 540
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gtatgccaac gtggacttct tcaagctctt ccgtgtgctt cccacactcc tagacagccg 1440
ttctcaaggt atcaatctga gatcttgggg aggaatatta tctgatatgt caccaagaat 1500
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acctgcagca cgaaggatac tgaagaatgc caactcaact tttgaagaac tggaacacgt 1920
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tagtggtgtc atctatttca ccctctacct gccacacatc ctgtgcttcg cctggcagga 3000
ccgcatgacc gctgagctga agaaggctgt gagcttactg tctccggtgg catttggatt 3060
tggcactgag tacctggttc gctttgaaga gcaaggcctg gggctgcagt ggagcaacat 3120
cgggaacagt cccacggaag gggacgaatt cagcttcctg ctgtccatgc agatgatgct 3180
ccttgatgct gctgtctatg gcttactcgc ttggtacctt gatcaggtgt ttccaggaga 3240
ctatggaacc ccacttcctt ggtactttct tctacaagag tcgtattggc ttggcggtga 3300
agggtgttca accagagaag aaagagccct ggaaaagacc gagcccctaa cagaggaaac 3360
ggaggatcca gagcacccag aaggaataca cgactccttc tttgaacgtg agcatccagg 3420
gtgggttcct ggggtatgcg tgaagaatct ggtaaagatt tttgagccct gtggccggcc 3480
agctgtggac cgtctgaaca tcaccttcta cgagaaccag atcaccgcat tcctgggcca 3540
caatggagct gggaaaacca ccaccttgtc catcctgacg ggtctgttgc caccaacctc 3600
tgggactgtg ctcgttgggg gaagggacat tgaaaccagc ctggatgcag tccggcagag 3660
ccttggcatg tgtccacagc acaacatcct gttccaccac ctcacggtgg ctgagcacat 3720
gctgttctat gcccagctga aaggaaagtc ccaggaggag gcccagctgg agatggaagc 3780
catgttggag gacacaggcc tccaccacaa gcggaatgaa gaggctcagg acctatcagg 3840
tggcatgcag agaaagctgt cggttgccat tgcctttgtg ggagatgcca aggtggtgat 3900
tctggacgaa cccacctctg gggtggaccc ttactcgaga cgctcaatct gggatctgct 3960
cctgaagtat cgctcaggca gaaccatcat catgtccact caccacatgg acgaggccga 4020
cctccttggg gaccgcattg ccatcattgc ccagggaagg ctctactgct caggcacccc 4080
actcttcctg aagaactgct ttggcacagg cttgtactta accttggtgc gcaagatgaa 4140
aaacatccag agccaaagga aaggcagtga ggggacctgc agctgctcgt ctaagggttt 4200
ctccaccacg tgtccagccc acgtcgatga cctaactcca gaacaagtcc tggatgggga 4260
tgtaaatgag ctgatggatg tagttctcca ccatgttcca gaggcaaagc tggtggagtg 4320
cattggtcaa gaacttatct tccttcttcc atttaaatta gggataacag ggtggtggcg 4380
cgggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 4440
cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 4500
cgcgcagagc tagaattaat tccgtgtatt ctatagtgtc acctaaatcg tatgtgtatg 4560
atacataagg ttatgtatta attgtagccg cgttctaacg acaatatgta caagcctaat 4620
tgtgtagcat ctggcttagc ggccgcctac cgtcaaacag tcaatcccgt tctacgccat 4680
ttgacacata acgcccggga taacagagct gaatttgacg gactacgata ttgcttatgt 4740
gccaccaatc aacagttaac gaacacgtgg cggcgcggaa cgcctccggc caggccgcgc 4800
gcttcgcata tttacttcga gcagtgtagg tgtgacaacg tagcatgcag ccacatccct 4860
agcttgaacc ggagataaag gtctacgcgc gcgacgtcca cattcacacg gttcagattc 4920
ctggtgctac ccaaaacaaa gtccataggt ttttcattgg gactacggcg cgaagctaag 4980
tggtttcaca cctacaaggg aaacatgccc aaactatgag gacaacatcg tccgcagaaa 5040
caatcggccg cgataggggt tgcacgttgt cagatgaaag agccacactc ggggagcagt 5100
ccgcggacgc cacctcgtgc aacttcggct aaccatataa tctaaaaaag ttgaggtttg 5160
cagttgtcgg ggcgagatca aacccaagta tatagtcctg tccggagcct tagttcacgt 5220
actcgcgacc cttgaaagcg cgtcaagctt atcgctcact gactagctca atgtgtggca 5280
atctaagtag gaggtctgtc gcaaggcaaa aatgctaatt attggtagca agcttagata 5340
aggtggaggg attgcacaat tcagaaggcg tcttctctgc tacacccgag cggggtgctt 5400
tatcaagggg aagcttgatg tcccacggga tgaacgagag cctccatggc atctcacgac 5460
ctacttaact tcgggggatg ggtagaagtt agctgaacat acaaatggga ataggattgt 5520
gccctcggac gagactgaac ggatcgcagt caacccgcgc aaagtttaca tattaattct 5580
tacggcgtgt cagagaggca atggcttgac ttgtggtgga tcacagtttg tgagtaacgg 5640
caagatgcgg taaacactgt aatgcgagct tcattgactc ggcttaaagt tcctggtacc 5700
ataatgaata cacggtggtt agttgtcaat tgcttgtgca ccgccgcacc ttgcggtcct 5760
cggtccagcc tgcgcagggt ataaatgaag cacgtcccac ccagactgtt ccatcgtacc 5820
tccaaatacg gattcaacct ggcgtctatt tccagatatg ggccctaggg gtgatagact 5880
cccaagtcta aggactacca tgggatatgt ttcacgtatc caaaaagtaa ccataatact 5940
gcgtttccgt tcacccaagt gaggatgttg cctttgtact ggtttcatag tcctgccgta 6000
ccaggcgtct tccttagccg gcgctacttc cagcccggaa ctgtcttgtt tctcgatgtg 6060
agacccttgt cagccgcccg cggtggtgca cgtaaaagcc gattggagta ttaagtattt 6120
acaactccga atcttaagag ccctgctcta gtttggattc atatatcagc ataggcttcg 6180
caacctagtg aatgagcggt acgaactttc gcggagtgcg aaaagcgacc gagcaatcga 6240
gatacgtacc gttagattca cgctccagac agcactctga gtctttgatt tataaccatc 6300
gaaggaatcg acttcacgtc cctagcgtgt tgagtcatcc gcagaagaga cgatgagggc 6360
tcgccccccg aaatagttct gcttcaaact ataggctgcc ctacttggtc tccgaggtac 6420
tatggggtcc tcgacggttc gaggccccca acccatgttc aatcagctcg tatgtctacc 6480
ctcgagctaa cacaggaacc agctgagact tgcctggcgt cacttgggca cgttccatat 6540
acataatgaa gtacgccgca gggtctctcc gttaccgaac tgtgctcgac ctaaagtccg 6600
gtacccatcg gcgtcctgtc acatttgtgg cattaggtat gaactaactc tggggggctt 6660
ctacgaccat ggtaaaagtt ttgtgctgcc agacaactgt taataaacat gtcgctgcgt 6720
agaacgccaa gaaccagctg ggatgagtgc cttatttacc ccgcgcgagg tgggtctgag 6780
taggtagcat cgaggtttac gcctaagttg gaccgcaaat ataggccctt tgccgggatc 6840
cccactatct gtgaattgtg aaacccgttg gcaccctgta caaagtgcat agctacatca 6900
ttggtaacaa gacgtaaacg gaggttcgct cactcccact tcggaaagat aaccggggaa 6960
ctaggagggt atggtgcgcg catggaaagg gccgggaagt aactctggcc ttcacggaac 7020
gataagttac aatttgggaa cagtcggaga gcgccactac gtgctttttt ggcttacctc 7080
atatctcgta gttggtgagg gttaaaattc gcgggagaag atccagccta agtatatggt 7140
tacatcgcgg ccgcctgaag cagaccctat catctctctc gtaaactgcc gtcagagtcg 7200
gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg gtaacgccgt cccgcacccg gaaatggtca 7260
gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg 7320
gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg 7380
aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag 7440
gccgccctta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat 7500
tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc 7560
agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa 7620
tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag 7680
tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa 7740
caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc 7800
gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag 7860
gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat 7920
caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc 7980
atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca 8040
gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt 8100
tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt 8160
gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta 8220
atcgcggcct cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac 8280
tgtttatgta agcagacagt tttattgttc atgatgatat atttttatct tgtgcaatgt 8340
aacatcagag attttgagac acaacgtggt ttgcaggagt caggcaacta tggatgaacg 8400
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 8460
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 8520
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 8580
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 8640
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 8700
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 8760
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 8820
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 8880
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 8940
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 9000
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 9060
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 9120
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 9180
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 9240
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 9300
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 9360
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 9420
gcgttggccg attcattaat gcagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc 9480
ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg 9540
tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 9600
tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 9660
gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc 9720
tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc 9780
aaaaag 9786
<210> 48
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> 5' ITR
<222> (1)..(115)
<400> 48
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 60
gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 115
<210> 49
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> CBA
<222> (1)..(278)
<400> 49
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggc 278
<210> 50
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> Intron
<222> (1)..(123)
<400> 50
gtgccgcagg gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg 60
cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta 120
cag 123
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> exon
<222> (1)..(40)
<400> 51
ctc ctg ggc aac gtg ctg gtt att gtg ctg tct cat cat t 40
Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Ile Val Leu Ser His His
1 5 10
<210> 52
<211> 3702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 52
atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60
caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120
tggttaagga atgccaaccc gctctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg 180
atgccctcag caggaatgct gccgtggctc caggggatct tctgcaatgt gaacaatccc 240
tgttttcaaa gccccacccc aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc 300
atcttggcaa gggtatatcg agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag 360
caccttggcc gtatttggac agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg 420
actcacccgg agagaattgc aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa 480
gaaacactga cactatttct cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt 540
ctgatcaact ctcaagtccg tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg 600
aaggacatcg cctgcagcga ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc 660
ggggcaaaga cggtgcgcta tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata 720
gaagacactc tgtatgccaa cgtggacttc ttcaagctct tccgtgtgct tcccacactc 780
ctagacagcc gttctcaagg tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg 840
tcaccaagaa ttcaagagtt tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc 900
aggcccctca tgcagaatgg tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct 960
gacctcctgt gtggctaccc cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat 1020
gaagacaata actataaggc ctttctgggg attgactcca caaggaagga tcctatctat 1080
tcttatgaca gaagaacaac atccttttgt aatgcattga tccagagcct ggagtcaaat 1140
cctttaacca aaatcgcttg gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac 1200
actcctgatt cacctgcagc acgaaggata ctgaagaatg ccaactcaac ttttgaagaa 1260
ctggaacacg ttaggaagtt ggtcaaagcc tgggaagaag tagggcccca gatctggtac 1320
ttctttgaca acagcacaca gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta 1380
aaagactttt tgaataggca gcttggtgaa gaaggtatta ctgctgaagc catcctaaac 1440
ttcctctaca agggccctcg ggaaagccag gctgacgaca tggccaactt cgactggagg 1500
gacatattta acatcactga tcgcaccctc cgccttgtca atcaatacct ggagtgcttg 1560
gtcctggata agtttgaaag ctacaatgat gaaactcagc tcacccaacg tgccctctct 1620
ctactggagg aaaacatgtt ctgggccgga gtggtattcc ctgacatgta tccctggacc 1680
agctctctac caccccacgt gaagtataag atccgaatgg acatagacgt ggtggagaaa 1740
accaataaga ttaaagacag gtattgggat tctggtccca gagctgatcc cgtggaagat 1800
ttccggtaca tctggggcgg gtttgcctat ctgcaggaca tggttgaaca ggggatcaca 1860
aggagccagg tgcaggcgga ggctccagtt ggaatctacc tccagcagat gccctacccc 1920
tgcttcgtgg acgattcttt catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg 1980
ctggcatgga tctactctgt ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg 2040
cgactgaagg agaccttgaa aaatcagggt gtctccaatg cagtgatttg gtgtacctgg 2100
ttcctggaca gcttctccat catgtcgatg agcatcttcc tcctgacgat attcatcatg 2160
catggaagaa tcctacatta cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc 2220
tccactgcca ccatcatgct gtgctttctg ctcagcacct tcttctccaa ggccagtctg 2280
gcagcagcct gtagtggtgt catctatttc accctctacc tgccacacat cctgtgcttc 2340
gcctggcagg accgcatgac cgctgagctg aagaaggctg tgagcttact gtctccggtg 2400
gcatttggat ttggcactga gtacctggtt cgctttgaag agcaaggcct ggggctgcag 2460
tggagcaaca tcgggaacag tcccacggaa ggggacgaat tcagcttcct gctgtccatg 2520
cagatgatgc tccttgatgc tgctgtctat ggcttactcg cttggtacct tgatcaggtg 2580
tttccaggag actatggaac cccacttcct tggtactttc ttctacaaga gtcgtattgg 2640
cttggcggtg aagggtgttc aaccagagaa gaaagagccc tggaaaagac cgagccccta 2700
acagaggaaa cggaggatcc agagcaccca gaaggaatac acgactcctt ctttgaacgt 2760
gagcatccag ggtgggttcc tggggtatgc gtgaagaatc tggtaaagat ttttgagccc 2820
tgtggccggc cagctgtgga ccgtctgaac atcaccttct acgagaacca gatcaccgca 2880
ttcctgggcc acaatggagc tgggaaaacc accaccttgt ccatcctgac gggtctgttg 2940
ccaccaacct ctgggactgt gctcgttggg ggaagggaca ttgaaaccag cctggatgca 3000
gtccggcaga gccttggcat gtgtccacag cacaacatcc tgttccacca cctcacggtg 3060
gctgagcaca tgctgttcta tgcccagctg aaaggaaagt cccaggagga ggcccagctg 3120
gagatggaag ccatgttgga ggacacaggc ctccaccaca agcggaatga agaggctcag 3180
gacctatcag gtggcatgca gagaaagctg tcggttgcca ttgcctttgt gggagatgcc 3240
aaggtggtga ttctggacga acccacctct ggggtggacc cttactcgag acgctcaatc 3300
tgggatctgc tcctgaagta tcgctcaggc agaaccatca tcatgtccac tcaccacatg 3360
gacgaggccg acctccttgg ggaccgcatt gccatcattg cccagggaag gctctactgc 3420
tcaggcaccc cactcttcct gaagaactgc tttggcacag gcttgtactt aaccttggtg 3480
cgcaagatga aaaacatcca gagccaaagg aaaggcagtg aggggacctg cagctgctcg 3540
tctaagggtt tctccaccac gtgtccagcc cacgtcgatg acctaactcc agaacaagtc 3600
ctggatgggg atgtaaatga gctgatggat gtagttctcc accatgttcc agaggcaaag 3660
ctggtggagt gcattggtca agaacttatc ttccttcttc ca 3702
<210> 53
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> 3' ITR
<222> (1)..(121)
<400> 53
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 120
g 121
<210> 54
<211> 10055
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 54
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggcaattc agtcgataac tataacggtc ctaaggtagc gatttaaatg 180
gtacccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 240
ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 300
gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 360
cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 420
aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 480
cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 540
ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 600
tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 660
ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 720
ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 780
agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 840
ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattggat cctagcttga tatcgaattc 900
ctgcagcccg gcaccaccat gggcttcgtg agacagatac agcttttgct ctggaagaac 960
tggaccctgc ggaaaaggca aaagattcgc tttgtggtgg aactcgtgtg gcctttatct 1020
ttatttctgg tcttgatctg gttaaggaat gccaacccgc tctacagcca tcatgaatgc 1080
catttcccca acaaggcgat gccctcagca ggaatgctgc cgtggctcca ggggatcttc 1140
tgcaatgtga acaatccctg ttttcaaagc cccaccccag gagaatctcc tggaattgtg 1200
tcaaactata acaactccat cttggcaagg gtatatcgag attttcaaga actcctcatg 1260
aatgcaccag agagccagca ccttggccgt atttggacag agctacacat cttgtcccaa 1320
ttcatggaca ccctccggac tcacccggag agaattgcag gaagaggaat acgaataagg 1380
gatatcttga aagatgaaga aacactgaca ctatttctca ttaaaaacat cggcctgtct 1440
gactcagtgg tctaccttct gatcaactct caagtccgtc cagagcagtt cgctcatgga 1500
gtcccggacc tggcgctgaa ggacatcgcc tgcagcgagg ccctcctgga gcgcttcatc 1560
atcttcagcc agagacgcgg ggcaaagacg gtgcgctatg ccctgtgctc cctctcccag 1620
ggcaccctac agtggataga agacactctg tatgccaacg tggacttctt caagctcttc 1680
cgtgtgcttc ccacactcct agacagccgt tctcaaggta tcaatctgag atcttgggga 1740
ggaatattat ctgatatgtc accaagaatt caagagttta tccatcggcc gagtatgcag 1800
gacttgctgt gggtgaccag gcccctcatg cagaatggtg gtccagagac ctttacaaag 1860
ctgatgggca tcctgtctga cctcctgtgt ggctaccccg agggaggtgg ctctcgggtg 1920
ctctccttca actggtatga agacaataac tataaggcct ttctggggat tgactccaca 1980
aggaaggatc ctatctattc ttatgacaga agaacaacat ccttttgtaa tgcattgatc 2040
cagagcctgg agtcaaatcc tttaaccaaa atcgcttgga gggcggcaaa gcctttgctg 2100
atgggaaaaa tcctgtacac tcctgattca cctgcagcac gaaggatact gaagaatgcc 2160
aactcaactt ttgaagaact ggaacacgtt aggaagttgg tcaaagcctg ggaagaagta 2220
gggccccaga tctggtactt ctttgacaac agcacacaga tgaacatgat cagagatacc 2280
ctggggaacc caacagtaaa agactttttg aataggcagc ttggtgaaga aggtattact 2340
gctgaagcca tcctaaactt cctctacaag ggccctcggg aaagccaggc tgacgacatg 2400
gccaacttcg actggaggga catatttaac atcactgatc gcaccctccg ccttgtcaat 2460
caatacctgg agtgcttggt cctggataag tttgaaagct acaatgatga aactcagctc 2520
acccaacgtg ccctctctct actggaggaa aacatgttct gggccggagt ggtattccct 2580
gacatgtatc cctggaccag ctctctacca ccccacgtga agtataagat ccgaatggac 2640
atagacgtgg tggagaaaac caataagatt aaagacaggt attgggattc tggtcccaga 2700
gctgatcccg tggaagattt ccggtacatc tggggcgggt ttgcctatct gcaggacatg 2760
gttgaacagg ggatcacaag gagccaggtg caggcggagg ctccagttgg aatctacctc 2820
cagcagatgc cctacccctg cttcgtggac gattctttca tgatcatcct gaaccgctgt 2880
ttccctatct tcatggtgct ggcatggatc tactctgtct ccatgactgt gaagagcatc 2940
gtcttggaga aggagttgcg actgaaggag accttgaaaa atcagggtgt ctccaatgca 3000
gtgatttggt gtacctggtt cctggacagc ttctccatca tgtcgatgag catcttcctc 3060
ctgacgatat tcatcatgca tggaagaatc ctacattaca gcgacccatt catcctcttc 3120
ctgttcttgt tggctttctc cactgccacc atcatgctgt gctttctgct cagcaccttc 3180
ttctccaagg ccagtctggc agcagcctgt agtggtgtca tctatttcac cctctacctg 3240
ccacacatcc tgtgcttcgc ctggcaggac cgcatgaccg ctgagctgaa gaaggctgtg 3300
agcttactgt ctccggtggc atttggattt ggcactgagt acctggttcg ctttgaagag 3360
caaggcctgg ggctgcagtg gagcaacatc gggaacagtc ccacggaagg ggacgaattc 3420
agcttcctgc tgtccatgca gatgatgctc cttgatgctg ctgtctatgg cttactcgct 3480
tggtaccttg atcaggtgtt tccaggagac tatggaaccc cacttccttg gtactttctt 3540
ctacaagagt cgtattggct tggcggtgaa gggtgttcaa ccagagaaga aagagccctg 3600
gaaaagaccg agcccctaac agaggaaacg gaggatccag agcacccaga aggaatacac 3660
gactccttct ttgaacgtga gcatccaggg tgggttcctg gggtatgcgt gaagaatctg 3720
gtaaagattt ttgagccctg tggccggcca gctgtggacc gtctgaacat caccttctac 3780
gagaaccaga tcaccgcatt cctgggccac aatggagctg ggaaaaccac caccttgtcc 3840
atcctgacgg gtctgttgcc accaacctct gggactgtgc tcgttggggg aagggacatt 3900
gaaaccagcc tggatgcagt ccggcagagc cttggcatgt gtccacagca caacatcctg 3960
ttccaccacc tcacggtggc tgagcacatg ctgttctatg cccagctgaa aggaaagtcc 4020
caggaggagg cccagctgga gatggaagcc atgttggagg acacaggcct ccaccacaag 4080
cggaatgaag aggctcagga cctatcaggt ggcatgcaga gaaagctgtc ggttgccatt 4140
gcctttgtgg gagatgccaa ggtggtgatt ctggacgaac ccacctctgg ggtggaccct 4200
tactcgagac gctcaatctg ggatctgctc ctgaagtatc gctcaggcag aaccatcatc 4260
atgtccactc accacatgga cgaggccgac ctccttgggg accgcattgc catcattgcc 4320
cagggaaggc tctactgctc aggcacccca ctcttcctga agaactgctt tggcacaggc 4380
ttgtacttaa ccttggtgcg caagatgaaa aacatccaga gccaaaggaa aggcagtgag 4440
gggacctgca gctgctcgtc taagggtttc tccaccacgt gtccagccca cgtcgatgac 4500
ctaactccag aacaagtcct ggatggggat gtaaatgagc tgatggatgt agttctccac 4560
catgttccag aggcaaagct ggtggagtgc attggtcaag aacttatctt ccttcttcca 4620
tttaaattag ggataacagg gtggtggcgc gggccgcagg aacccctagt gatggagttg 4680
gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga 4740
cgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagct agaattaatt ccgtgtattc 4800
tatagtgtca cctaaatcgt atgtgtatga tacataaggt tatgtattaa ttgtagccgc 4860
gttctaacga caatatgtac aagcctaatt gtgtagcatc tggcttagcg gccgcctacc 4920
gtcaaacagt caatcccgtt ctacgccatt tgacacataa cgcccgggat aacagagctg 4980
aatttgacgg actacgatat tgcttatgtg ccaccaatca acagttaacg aacacgtggc 5040
ggcgcggaac gcctccggcc aggccgcgcg cttcgcatat ttacttcgag cagtgtaggt 5100
gtgacaacgt agcatgcagc cacatcccta gcttgaaccg gagataaagg tctacgcgcg 5160
cgacgtccac attcacacgg ttcagattcc tggtgctacc caaaacaaag tccataggtt 5220
tttcattggg actacggcgc gaagctaagt ggtttcacac ctacaaggga aacatgccca 5280
aactatgagg acaacatcgt ccgcagaaac aatcggccgc gataggggtt gcacgttgtc 5340
agatgaaaga gccacactcg gggagcagtc cgcggacgcc acctcgtgca acttcggcta 5400
accatataat ctaaaaaagt tgaggtttgc agttgtcggg gcgagatcaa acccaagtat 5460
atagtcctgt ccggagcctt agttcacgta ctcgcgaccc ttgaaagcgc gtcaagctta 5520
tcgctcactg actagctcaa tgtgtggcaa tctaagtagg aggtctgtcg caaggcaaaa 5580
atgctaatta ttggtagcaa gcttagataa ggtggaggga ttgcacaatt cagaaggcgt 5640
cttctctgct acacccgagc ggggtgcttt atcaagggga agcttgatgt cccacgggat 5700
gaacgagagc ctccatggca tctcacgacc tacttaactt cgggggatgg gtagaagtta 5760
gctgaacata caaatgggaa taggattgtg ccctcggacg agactgaacg gatcgcagtc 5820
aacccgcgca aagtttacat attaattctt acggcgtgtc agagaggcaa tggcttgact 5880
tgtggtggat cacagtttgt gagtaacggc aagatgcggt aaacactgta atgcgagctt 5940
cattgactcg gcttaaagtt cctggtacca taatgaatac acggtggtta gttgtcaatt 6000
gcttgtgcac cgccgcacct tgcggtcctc ggtccagcct gcgcagggta taaatgaagc 6060
acgtcccacc cagactgttc catcgtacct ccaaatacgg attcaacctg gcgtctattt 6120
ccagatatgg gccctagggg tgatagactc ccaagtctaa ggactaccat gggatatgtt 6180
tcacgtatcc aaaaagtaac cataatactg cgtttccgtt cacccaagtg aggatgttgc 6240
ctttgtactg gtttcatagt cctgccgtac caggcgtctt ccttagccgg cgctacttcc 6300
agcccggaac tgtcttgttt ctcgatgtga gacccttgtc agccgcccgc ggtggtgcac 6360
gtaaaagccg attggagtat taagtattta caactccgaa tcttaagagc cctgctctag 6420
tttggattca tatatcagca taggcttcgc aacctagtga atgagcggta cgaactttcg 6480
cggagtgcga aaagcgaccg agcaatcgag atacgtaccg ttagattcac gctccagaca 6540
gcactctgag tctttgattt ataaccatcg aaggaatcga cttcacgtcc ctagcgtgtt 6600
gagtcatccg cagaagagac gatgagggct cgccccccga aatagttctg cttcaaacta 6660
taggctgccc tacttggtct ccgaggtact atggggtcct cgacggttcg aggcccccaa 6720
cccatgttca atcagctcgt atgtctaccc tcgagctaac acaggaacca gctgagactt 6780
gcctggcgtc acttgggcac gttccatata cataatgaag tacgccgcag ggtctctccg 6840
ttaccgaact gtgctcgacc taaagtccgg tacccatcgg cgtcctgtca catttgtggc 6900
attaggtatg aactaactct ggggggcttc tacgaccatg gtaaaagttt tgtgctgcca 6960
gacaactgtt aataaacatg tcgctgcgta gaacgccaag aaccagctgg gatgagtgcc 7020
ttatttaccc cgcgcgaggt gggtctgagt aggtagcatc gaggtttacg cctaagttgg 7080
accgcaaata taggcccttt gccgggatcc ccactatctg tgaattgtga aacccgttgg 7140
caccctgtac aaagtgcata gctacatcat tggtaacaag acgtaaacgg aggttcgctc 7200
actcccactt cggaaagata accggggaac taggagggta tggtgcgcgc atggaaaggg 7260
ccgggaagta actctggcct tcacggaacg ataagttaca atttgggaac agtcggagag 7320
cgccactacg tgcttttttg gcttacctca tatctcgtag ttggtgaggg ttaaaattcg 7380
cgggagaaga tccagcctaa gtatatggtt acatcgcggc cgcctgaagc agaccctatc 7440
atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg 7500
taacgccgtc ccgcacccgg aaatggtcag cgaaccaatc agcagggtca tcgctagcca 7560
gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg 7620
cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag 7680
cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccgcccttag aaaaactcat cgagcatcaa 7740
atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt 7800
ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg 7860
gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat 7920
aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag 7980
cttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc 8040
actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg 8100
atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc 8160
cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt 8220
tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt 8280
gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac 8340
atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc 8400
atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc 8460
atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg tttcccgttg 8520
aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca 8580
tgatgatata tttttatctt gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca caacgtggtt 8640
tgcaggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 8700
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 8760
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 8820
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 8880
ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 8940
ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 9000
actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 9060
caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 9120
gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 9180
ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 9240
cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 9300
cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 9360
acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 9420
ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 9480
gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 9540
tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 9600
accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 9660
cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctgtgga 9720
atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 9780
gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 9840
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc 9900
ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 9960
tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 10020
gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaag 10055
<210> 55
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 55
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 60
gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 115
<210> 56
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 56
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggc 278
<210> 57
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 57
ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt 60
gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag 120
ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga att 173
<210> 58
<211> 3702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 58
atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60
caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120
tggttaagga atgccaaccc gctctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg 180
atgccctcag caggaatgct gccgtggctc caggggatct tctgcaatgt gaacaatccc 240
tgttttcaaa gccccacccc aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc 300
atcttggcaa gggtatatcg agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag 360
caccttggcc gtatttggac agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg 420
actcacccgg agagaattgc aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa 480
gaaacactga cactatttct cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt 540
ctgatcaact ctcaagtccg tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg 600
aaggacatcg cctgcagcga ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc 660
ggggcaaaga cggtgcgcta tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata 720
gaagacactc tgtatgccaa cgtggacttc ttcaagctct tccgtgtgct tcccacactc 780
ctagacagcc gttctcaagg tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg 840
tcaccaagaa ttcaagagtt tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc 900
aggcccctca tgcagaatgg tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct 960
gacctcctgt gtggctaccc cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat 1020
gaagacaata actataaggc ctttctgggg attgactcca caaggaagga tcctatctat 1080
tcttatgaca gaagaacaac atccttttgt aatgcattga tccagagcct ggagtcaaat 1140
cctttaacca aaatcgcttg gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac 1200
actcctgatt cacctgcagc acgaaggata ctgaagaatg ccaactcaac ttttgaagaa 1260
ctggaacacg ttaggaagtt ggtcaaagcc tgggaagaag tagggcccca gatctggtac 1320
ttctttgaca acagcacaca gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta 1380
aaagactttt tgaataggca gcttggtgaa gaaggtatta ctgctgaagc catcctaaac 1440
ttcctctaca agggccctcg ggaaagccag gctgacgaca tggccaactt cgactggagg 1500
gacatattta acatcactga tcgcaccctc cgccttgtca atcaatacct ggagtgcttg 1560
gtcctggata agtttgaaag ctacaatgat gaaactcagc tcacccaacg tgccctctct 1620
ctactggagg aaaacatgtt ctgggccgga gtggtattcc ctgacatgta tccctggacc 1680
agctctctac caccccacgt gaagtataag atccgaatgg acatagacgt ggtggagaaa 1740
accaataaga ttaaagacag gtattgggat tctggtccca gagctgatcc cgtggaagat 1800
ttccggtaca tctggggcgg gtttgcctat ctgcaggaca tggttgaaca ggggatcaca 1860
aggagccagg tgcaggcgga ggctccagtt ggaatctacc tccagcagat gccctacccc 1920
tgcttcgtgg acgattcttt catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg 1980
ctggcatgga tctactctgt ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg 2040
cgactgaagg agaccttgaa aaatcagggt gtctccaatg cagtgatttg gtgtacctgg 2100
ttcctggaca gcttctccat catgtcgatg agcatcttcc tcctgacgat attcatcatg 2160
catggaagaa tcctacatta cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc 2220
tccactgcca ccatcatgct gtgctttctg ctcagcacct tcttctccaa ggccagtctg 2280
gcagcagcct gtagtggtgt catctatttc accctctacc tgccacacat cctgtgcttc 2340
gcctggcagg accgcatgac cgctgagctg aagaaggctg tgagcttact gtctccggtg 2400
gcatttggat ttggcactga gtacctggtt cgctttgaag agcaaggcct ggggctgcag 2460
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cagatgatgc tccttgatgc tgctgtctat ggcttactcg cttggtacct tgatcaggtg 2580
tttccaggag actatggaac cccacttcct tggtactttc ttctacaaga gtcgtattgg 2640
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gagcatccag ggtgggttcc tggggtatgc gtgaagaatc tggtaaagat ttttgagccc 2820
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ttcctgggcc acaatggagc tgggaaaacc accaccttgt ccatcctgac gggtctgttg 2940
ccaccaacct ctgggactgt gctcgttggg ggaagggaca ttgaaaccag cctggatgca 3000
gtccggcaga gccttggcat gtgtccacag cacaacatcc tgttccacca cctcacggtg 3060
gctgagcaca tgctgttcta tgcccagctg aaaggaaagt cccaggagga ggcccagctg 3120
gagatggaag ccatgttgga ggacacaggc ctccaccaca agcggaatga agaggctcag 3180
gacctatcag gtggcatgca gagaaagctg tcggttgcca ttgcctttgt gggagatgcc 3240
aaggtggtga ttctggacga acccacctct ggggtggacc cttactcgag acgctcaatc 3300
tgggatctgc tcctgaagta tcgctcaggc agaaccatca tcatgtccac tcaccacatg 3360
gacgaggccg acctccttgg ggaccgcatt gccatcattg cccagggaag gctctactgc 3420
tcaggcaccc cactcttcct gaagaactgc tttggcacag gcttgtactt aaccttggtg 3480
cgcaagatga aaaacatcca gagccaaagg aaaggcagtg aggggacctg cagctgctcg 3540
tctaagggtt tctccaccac gtgtccagcc cacgtcgatg acctaactcc agaacaagtc 3600
ctggatgggg atgtaaatga gctgatggat gtagttctcc accatgttcc agaggcaaag 3660
ctggtggagt gcattggtca agaacttatc ttccttcttc ca 3702
<210> 59
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 59
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 120
g 121
<210> 60
<211> 9992
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 60
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggcaattc agtcgataac tataacggtc ctaaggtagc gatttaaatg 180
gtaccctcag atctgaattc ggtacctagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 240
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 300
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 360
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 420
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 480
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 540
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact 600
ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt 660
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cggcgggcga ccaccatggg cttcgtgaga cagatacagc ttttgctctg gaagaactgg 900
accctgcgga aaaggcaaaa gattcgcttt gtggtggaac tcgtgtggcc tttatcttta 960
tttctggtct tgatctggtt aaggaatgcc aacccgctct acagccatca tgaatgccat 1020
ttccccaaca aggcgatgcc ctcagcagga atgctgccgt ggctccaggg gatcttctgc 1080
aatgtgaaca atccctgttt tcaaagcccc accccaggag aatctcctgg aattgtgtca 1140
aactataaca actccatctt ggcaagggta tatcgagatt ttcaagaact cctcatgaat 1200
gcaccagaga gccagcacct tggccgtatt tggacagagc tacacatctt gtcccaattc 1260
atggacaccc tccggactca cccggagaga attgcaggaa gaggaatacg aataagggat 1320
atcttgaaag atgaagaaac actgacacta tttctcatta aaaacatcgg cctgtctgac 1380
tcagtggtct accttctgat caactctcaa gtccgtccag agcagttcgc tcatggagtc 1440
ccggacctgg cgctgaagga catcgcctgc agcgaggccc tcctggagcg cttcatcatc 1500
ttcagccaga gacgcggggc aaagacggtg cgctatgccc tgtgctccct ctcccagggc 1560
accctacagt ggatagaaga cactctgtat gccaacgtgg acttcttcaa gctcttccgt 1620
gtgcttccca cactcctaga cagccgttct caaggtatca atctgagatc ttggggagga 1680
atattatctg atatgtcacc aagaattcaa gagtttatcc atcggccgag tatgcaggac 1740
ttgctgtggg tgaccaggcc cctcatgcag aatggtggtc cagagacctt tacaaagctg 1800
atgggcatcc tgtctgacct cctgtgtggc taccccgagg gaggtggctc tcgggtgctc 1860
tccttcaact ggtatgaaga caataactat aaggcctttc tggggattga ctccacaagg 1920
aaggatccta tctattctta tgacagaaga acaacatcct tttgtaatgc attgatccag 1980
agcctggagt caaatccttt aaccaaaatc gcttggaggg cggcaaagcc tttgctgatg 2040
ggaaaaatcc tgtacactcc tgattcacct gcagcacgaa ggatactgaa gaatgccaac 2100
tcaacttttg aagaactgga acacgttagg aagttggtca aagcctggga agaagtaggg 2160
ccccagatct ggtacttctt tgacaacagc acacagatga acatgatcag agataccctg 2220
gggaacccaa cagtaaaaga ctttttgaat aggcagcttg gtgaagaagg tattactgct 2280
gaagccatcc taaacttcct ctacaagggc cctcgggaaa gccaggctga cgacatggcc 2340
aacttcgact ggagggacat atttaacatc actgatcgca ccctccgcct tgtcaatcaa 2400
tacctggagt gcttggtcct ggataagttt gaaagctaca atgatgaaac tcagctcacc 2460
caacgtgccc tctctctact ggaggaaaac atgttctggg ccggagtggt attccctgac 2520
atgtatccct ggaccagctc tctaccaccc cacgtgaagt ataagatccg aatggacata 2580
gacgtggtgg agaaaaccaa taagattaaa gacaggtatt gggattctgg tcccagagct 2640
gatcccgtgg aagatttccg gtacatctgg ggcgggtttg cctatctgca ggacatggtt 2700
gaacagggga tcacaaggag ccaggtgcag gcggaggctc cagttggaat ctacctccag 2760
cagatgccct acccctgctt cgtggacgat tctttcatga tcatcctgaa ccgctgtttc 2820
cctatcttca tggtgctggc atggatctac tctgtctcca tgactgtgaa gagcatcgtc 2880
ttggagaagg agttgcgact gaaggagacc ttgaaaaatc agggtgtctc caatgcagtg 2940
atttggtgta cctggttcct ggacagcttc tccatcatgt cgatgagcat cttcctcctg 3000
acgatattca tcatgcatgg aagaatccta cattacagcg acccattcat cctcttcctg 3060
ttcttgttgg ctttctccac tgccaccatc atgctgtgct ttctgctcag caccttcttc 3120
tccaaggcca gtctggcagc agcctgtagt ggtgtcatct atttcaccct ctacctgcca 3180
cacatcctgt gcttcgcctg gcaggaccgc atgaccgctg agctgaagaa ggctgtgagc 3240
ttactgtctc cggtggcatt tggatttggc actgagtacc tggttcgctt tgaagagcaa 3300
ggcctggggc tgcagtggag caacatcggg aacagtccca cggaagggga cgaattcagc 3360
ttcctgctgt ccatgcagat gatgctcctt gatgctgctg tctatggctt actcgcttgg 3420
taccttgatc aggtgtttcc aggagactat ggaaccccac ttccttggta ctttcttcta 3480
caagagtcgt attggcttgg cggtgaaggg tgttcaacca gagaagaaag agccctggaa 3540
aagaccgagc ccctaacaga ggaaacggag gatccagagc acccagaagg aatacacgac 3600
tccttctttg aacgtgagca tccagggtgg gttcctgggg tatgcgtgaa gaatctggta 3660
aagatttttg agccctgtgg ccggccagct gtggaccgtc tgaacatcac cttctacgag 3720
aaccagatca ccgcattcct gggccacaat ggagctggga aaaccaccac cttgtccatc 3780
ctgacgggtc tgttgccacc aacctctggg actgtgctcg ttgggggaag ggacattgaa 3840
accagcctgg atgcagtccg gcagagcctt ggcatgtgtc cacagcacaa catcctgttc 3900
caccacctca cggtggctga gcacatgctg ttctatgccc agctgaaagg aaagtcccag 3960
gaggaggccc agctggagat ggaagccatg ttggaggaca caggcctcca ccacaagcgg 4020
aatgaagagg ctcaggacct atcaggtggc atgcagagaa agctgtcggt tgccattgcc 4080
tttgtgggag atgccaaggt ggtgattctg gacgaaccca cctctggggt ggacccttac 4140
tcgagacgct caatctggga tctgctcctg aagtatcgct caggcagaac catcatcatg 4200
tccactcacc acatggacga ggccgacctc cttggggacc gcattgccat cattgcccag 4260
ggaaggctct actgctcagg caccccactc ttcctgaaga actgctttgg cacaggcttg 4320
tacttaacct tggtgcgcaa gatgaaaaac atccagagcc aaaggaaagg cagtgagggg 4380
acctgcagct gctcgtctaa gggtttctcc accacgtgtc cagcccacgt cgatgaccta 4440
actccagaac aagtcctgga tggggatgta aatgagctga tggatgtagt tctccaccat 4500
gttccagagg caaagctggt ggagtgcatt ggtcaagaac ttatcttcct tcttccattt 4560
aaattaggga taacagggtg gtggcgcggg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc 4620
actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc 4680
ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagctaga attaattccg tgtattctat 4740
agtgtcacct aaatcgtatg tgtatgatac ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt 4800
ctaacgacaa tatgtacaag cctaattgtg tagcatctgg cttagcggcc gcctaccgtc 4860
aaacagtcaa tcccgttcta cgccatttga cacataacgc ccgggataac agagctgaat 4920
ttgacggact acgatattgc ttatgtgcca ccaatcaaca gttaacgaac acgtggcggc 4980
gcggaacgcc tccggccagg ccgcgcgctt cgcatattta cttcgagcag tgtaggtgtg 5040
acaacgtagc atgcagccac atccctagct tgaaccggag ataaaggtct acgcgcgcga 5100
cgtccacatt cacacggttc agattcctgg tgctacccaa aacaaagtcc ataggttttt 5160
cattgggact acggcgcgaa gctaagtggt ttcacaccta caagggaaac atgcccaaac 5220
tatgaggaca acatcgtccg cagaaacaat cggccgcgat aggggttgca cgttgtcaga 5280
tgaaagagcc acactcgggg agcagtccgc ggacgccacc tcgtgcaact tcggctaacc 5340
atataatcta aaaaagttga ggtttgcagt tgtcggggcg agatcaaacc caagtatata 5400
gtcctgtccg gagccttagt tcacgtactc gcgacccttg aaagcgcgtc aagcttatcg 5460
ctcactgact agctcaatgt gtggcaatct aagtaggagg tctgtcgcaa ggcaaaaatg 5520
ctaattattg gtagcaagct tagataaggt ggagggattg cacaattcag aaggcgtctt 5580
ctctgctaca cccgagcggg gtgctttatc aaggggaagc ttgatgtccc acgggatgaa 5640
cgagagcctc catggcatct cacgacctac ttaacttcgg gggatgggta gaagttagct 5700
gaacatacaa atgggaatag gattgtgccc tcggacgaga ctgaacggat cgcagtcaac 5760
ccgcgcaaag tttacatatt aattcttacg gcgtgtcaga gaggcaatgg cttgacttgt 5820
ggtggatcac agtttgtgag taacggcaag atgcggtaaa cactgtaatg cgagcttcat 5880
tgactcggct taaagttcct ggtaccataa tgaatacacg gtggttagtt gtcaattgct 5940
tgtgcaccgc cgcaccttgc ggtcctcggt ccagcctgcg cagggtataa atgaagcacg 6000
tcccacccag actgttccat cgtacctcca aatacggatt caacctggcg tctatttcca 6060
gatatgggcc ctaggggtga tagactccca agtctaagga ctaccatggg atatgtttca 6120
cgtatccaaa aagtaaccat aatactgcgt ttccgttcac ccaagtgagg atgttgcctt 6180
tgtactggtt tcatagtcct gccgtaccag gcgtcttcct tagccggcgc tacttccagc 6240
ccggaactgt cttgtttctc gatgtgagac ccttgtcagc cgcccgcggt ggtgcacgta 6300
aaagccgatt ggagtattaa gtatttacaa ctccgaatct taagagccct gctctagttt 6360
ggattcatat atcagcatag gcttcgcaac ctagtgaatg agcggtacga actttcgcgg 6420
agtgcgaaaa gcgaccgagc aatcgagata cgtaccgtta gattcacgct ccagacagca 6480
ctctgagtct ttgatttata accatcgaag gaatcgactt cacgtcccta gcgtgttgag 6540
tcatccgcag aagagacgat gagggctcgc cccccgaaat agttctgctt caaactatag 6600
gctgccctac ttggtctccg aggtactatg gggtcctcga cggttcgagg cccccaaccc 6660
atgttcaatc agctcgtatg tctaccctcg agctaacaca ggaaccagct gagacttgcc 6720
tggcgtcact tgggcacgtt ccatatacat aatgaagtac gccgcagggt ctctccgtta 6780
ccgaactgtg ctcgacctaa agtccggtac ccatcggcgt cctgtcacat ttgtggcatt 6840
aggtatgaac taactctggg gggcttctac gaccatggta aaagttttgt gctgccagac 6900
aactgttaat aaacatgtcg ctgcgtagaa cgccaagaac cagctgggat gagtgcctta 6960
tttaccccgc gcgaggtggg tctgagtagg tagcatcgag gtttacgcct aagttggacc 7020
gcaaatatag gccctttgcc gggatcccca ctatctgtga attgtgaaac ccgttggcac 7080
cctgtacaaa gtgcatagct acatcattgg taacaagacg taaacggagg ttcgctcact 7140
cccacttcgg aaagataacc ggggaactag gagggtatgg tgcgcgcatg gaaagggccg 7200
ggaagtaact ctggccttca cggaacgata agttacaatt tgggaacagt cggagagcgc 7260
cactacgtgc ttttttggct tacctcatat ctcgtagttg gtgagggtta aaattcgcgg 7320
gagaagatcc agcctaagta tatggttaca tcgcggccgc ctgaagcaga ccctatcatc 7380
tctctcgtaa actgccgtca gagtcggttt ggttggacga accttctgag tttctggtaa 7440
cgccgtcccg cacccggaaa tggtcagcga accaatcagc agggtcatcg ctagccagat 7500
cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc 7560
ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc 7620
ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccg cccttagaaa aactcatcga gcatcaaatg 7680
aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg 7740
taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc 7800
tgcgattccg actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag 7860
gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt 7920
atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact 7980
cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc 8040
gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag 8100
cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt 8160
cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat 8220
ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc 8280
attggcaacg ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata 8340
caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg cgagcccatt tatacccata 8400
taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg cggcctcgag caagacgttt cccgttgaat 8460
atggctcata acaccccttg tattactgtt tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga 8520
tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca tcagagattt tgagacacaa cgtggtttgc 8580
aggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 8640
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 8700
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 8760
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 8820
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 8880
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 8940
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 9000
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 9060
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 9120
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 9180
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 9240
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 9300
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 9360
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 9420
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 9480
cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 9540
gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 9600
ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctgtggaatg 9660
tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 9720
tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 9780
gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 9840
tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 9900
ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 9960
gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa ag 9992
<210> 61
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 61
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 60
gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 115
<210> 62
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> CMV Enhancer
<222> (1)..(235)
<400> 62
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtca 235
<210> 63
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<220>
<221> CBA promoter
<222> (1)..(278)
<400> 63
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggc 278
<210> 64
<211> 3702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 64
atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60
caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120
tggttaagga atgccaaccc gctctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg 180
atgccctcag caggaatgct gccgtggctc caggggatct tctgcaatgt gaacaatccc 240
tgttttcaaa gccccacccc aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc 300
atcttggcaa gggtatatcg agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag 360
caccttggcc gtatttggac agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg 420
actcacccgg agagaattgc aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa 480
gaaacactga cactatttct cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt 540
ctgatcaact ctcaagtccg tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg 600
aaggacatcg cctgcagcga ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc 660
ggggcaaaga cggtgcgcta tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata 720
gaagacactc tgtatgccaa cgtggacttc ttcaagctct tccgtgtgct tcccacactc 780
ctagacagcc gttctcaagg tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg 840
tcaccaagaa ttcaagagtt tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc 900
aggcccctca tgcagaatgg tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct 960
gacctcctgt gtggctaccc cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat 1020
gaagacaata actataaggc ctttctgggg attgactcca caaggaagga tcctatctat 1080
tcttatgaca gaagaacaac atccttttgt aatgcattga tccagagcct ggagtcaaat 1140
cctttaacca aaatcgcttg gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac 1200
actcctgatt cacctgcagc acgaaggata ctgaagaatg ccaactcaac ttttgaagaa 1260
ctggaacacg ttaggaagtt ggtcaaagcc tgggaagaag tagggcccca gatctggtac 1320
ttctttgaca acagcacaca gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta 1380
aaagactttt tgaataggca gcttggtgaa gaaggtatta ctgctgaagc catcctaaac 1440
ttcctctaca agggccctcg ggaaagccag gctgacgaca tggccaactt cgactggagg 1500
gacatattta acatcactga tcgcaccctc cgccttgtca atcaatacct ggagtgcttg 1560
gtcctggata agtttgaaag ctacaatgat gaaactcagc tcacccaacg tgccctctct 1620
ctactggagg aaaacatgtt ctgggccgga gtggtattcc ctgacatgta tccctggacc 1680
agctctctac caccccacgt gaagtataag atccgaatgg acatagacgt ggtggagaaa 1740
accaataaga ttaaagacag gtattgggat tctggtccca gagctgatcc cgtggaagat 1800
ttccggtaca tctggggcgg gtttgcctat ctgcaggaca tggttgaaca ggggatcaca 1860
aggagccagg tgcaggcgga ggctccagtt ggaatctacc tccagcagat gccctacccc 1920
tgcttcgtgg acgattcttt catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg 1980
ctggcatgga tctactctgt ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg 2040
cgactgaagg agaccttgaa aaatcagggt gtctccaatg cagtgatttg gtgtacctgg 2100
ttcctggaca gcttctccat catgtcgatg agcatcttcc tcctgacgat attcatcatg 2160
catggaagaa tcctacatta cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc 2220
tccactgcca ccatcatgct gtgctttctg ctcagcacct tcttctccaa ggccagtctg 2280
gcagcagcct gtagtggtgt catctatttc accctctacc tgccacacat cctgtgcttc 2340
gcctggcagg accgcatgac cgctgagctg aagaaggctg tgagcttact gtctccggtg 2400
gcatttggat ttggcactga gtacctggtt cgctttgaag agcaaggcct ggggctgcag 2460
tggagcaaca tcgggaacag tcccacggaa ggggacgaat tcagcttcct gctgtccatg 2520
cagatgatgc tccttgatgc tgctgtctat ggcttactcg cttggtacct tgatcaggtg 2580
tttccaggag actatggaac cccacttcct tggtactttc ttctacaaga gtcgtattgg 2640
cttggcggtg aagggtgttc aaccagagaa gaaagagccc tggaaaagac cgagccccta 2700
acagaggaaa cggaggatcc agagcaccca gaaggaatac acgactcctt ctttgaacgt 2760
gagcatccag ggtgggttcc tggggtatgc gtgaagaatc tggtaaagat ttttgagccc 2820
tgtggccggc cagctgtgga ccgtctgaac atcaccttct acgagaacca gatcaccgca 2880
ttcctgggcc acaatggagc tgggaaaacc accaccttgt ccatcctgac gggtctgttg 2940
ccaccaacct ctgggactgt gctcgttggg ggaagggaca ttgaaaccag cctggatgca 3000
gtccggcaga gccttggcat gtgtccacag cacaacatcc tgttccacca cctcacggtg 3060
gctgagcaca tgctgttcta tgcccagctg aaaggaaagt cccaggagga ggcccagctg 3120
gagatggaag ccatgttgga ggacacaggc ctccaccaca agcggaatga agaggctcag 3180
gacctatcag gtggcatgca gagaaagctg tcggttgcca ttgcctttgt gggagatgcc 3240
aaggtggtga ttctggacga acccacctct ggggtggacc cttactcgag acgctcaatc 3300
tgggatctgc tcctgaagta tcgctcaggc agaaccatca tcatgtccac tcaccacatg 3360
gacgaggccg acctccttgg ggaccgcatt gccatcattg cccagggaag gctctactgc 3420
tcaggcaccc cactcttcct gaagaactgc tttggcacag gcttgtactt aaccttggtg 3480
cgcaagatga aaaacatcca gagccaaagg aaaggcagtg aggggacctg cagctgctcg 3540
tctaagggtt tctccaccac gtgtccagcc cacgtcgatg acctaactcc agaacaagtc 3600
ctggatgggg atgtaaatga gctgatggat gtagttctcc accatgttcc agaggcaaag 3660
ctggtggagt gcattggtca agaacttatc ttccttcttc ca 3702
<210> 65
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 65
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 120
g 121
<210> 66
<211> 9702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 66
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggcaattc agtcgataac tataacggtc ctaaggtagc gatttaaatg 180
gtaccgggcc ccagaagcct ggtggttgtt tgtccttctc aggggaaaag tgaggcggcc 240
ccttggagga aggggccggg cagaatgatc taatcggatt ccaagcagct caggggattg 300
tctttttcta gcaccttctt gccactccta agcgtcctcc gtgaccccgg ctgggattta 360
gcctggtgct gtgtcagccc cgggtgccgc agggggacgg ctgccttcgg gggggacggg 420
gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg 480
ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc 540
atcattttgg caaagaatta ccaccatggg cttcgtgaga cagatacagc ttttgctctg 600
gaagaactgg accctgcgga aaaggcaaaa gattcgcttt gtggtggaac tcgtgtggcc 660
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cctgtctgac tcagtggtct accttctgat caactctcaa gtccgtccag agcagttcgc 1140
tcatggagtc ccggacctgg cgctgaagga catcgcctgc agcgaggccc tcctggagcg 1200
cttcatcatc ttcagccaga gacgcggggc aaagacggtg cgctatgccc tgtgctccct 1260
ctcccagggc accctacagt ggatagaaga cactctgtat gccaacgtgg acttcttcaa 1320
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attgatccag agcctggagt caaatccttt aaccaaaatc gcttggaggg cggcaaagcc 1740
tttgctgatg ggaaaaatcc tgtacactcc tgattcacct gcagcacgaa ggatactgaa 1800
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tgtcaatcaa tacctggagt gcttggtcct ggataagttt gaaagctaca atgatgaaac 2160
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attccctgac atgtatccct ggaccagctc tctaccaccc cacgtgaagt ataagatccg 2280
aatggacata gacgtggtgg agaaaaccaa taagattaaa gacaggtatt gggattctgg 2340
tcccagagct gatcccgtgg aagatttccg gtacatctgg ggcgggtttg cctatctgca 2400
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tacttccagc ccggaactgt cttgtttctc gatgtgagac ccttgtcagc cgcccgcggt 6000
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ccagacagca ctctgagtct ttgatttata accatcgaag gaatcgactt cacgtcccta 6240
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<210> 67
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 67
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<210> 68
<211> 199
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 68
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<210> 69
<211> 3702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 69
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
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aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 120
g 121
<210> 71
<211> 119
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 71
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60
ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcct 119
<210> 72
<211> 130
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 72
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 73
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Consensus Kozak sequence
<400> 73
ggccaccatg 10
<210> 74
<211> 4450
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis
<400> 74
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60
ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg 120
cggcaattca gtcgataact ataacggtcc taaggtagcg atttaaatac gcgctctctt 180
aaggtagccc cgggacgcgt caattggggc cccagaagcc tggtggttgt ttgtccttct 240
caggggaaaa gtgaggcggc cccttggagg aaggggccgg gcagaatgat ctaatcggat 300
tccaagcagc tcaggggatt gtctttttct agcaccttct tgccactcct aagcgtcctc 360
cgtgaccccg gctgggattt agcctggtgc tgtgtcagcc ccggggccac catgagagag 420
ccagaggagc tgatgccaga cagtggagca gtgtttacat tcggaaaatc taagttcgct 480
gaaaataacc caggaaagtt ctggtttaaa aacgacgtgc ccgtccacct gtcttgtggc 540
gatgagcata gtgccgtggt cactgggaac aataagctgt acatgttcgg gtccaacaac 600
tggggacagc tggggctggg atccaaatct gctatctcta agccaacctg cgtgaaggca 660
ctgaaacccg agaaggtcaa actggccgct tgtggcagaa accacactct ggtgagcacc 720
gagggcggga atgtctatgc caccggaggc aacaatgagg gacagctggg actgggggac 780
actgaggaaa ggaatacctt tcacgtgatc tccttcttta catctgagca taagatcaag 840
cagctgagcg ctggctccaa cacatctgca gccctgactg aggacgggcg cctgttcatg 900
tggggagata attcagaggg ccagattggg ctgaaaaacg tgagcaatgt gtgcgtccct 960
cagcaggtga ccatcggaaa gccagtcagt tggatttcat gtggctacta tcatagcgcc 1020
ttcgtgacca cagatggcga gctgtacgtc tttggggagc ccgaaaacgg aaaactgggc 1080
ctgcctaacc agctgctggg caatcaccgg acaccccagc tggtgtccga gatccctgaa 1140
aaagtgatcc aggtcgcctg cgggggagag catacagtgg tcctgactga gaatgctgtg 1200
tataccttcg gactgggcca gtttggccag ctggggctgg gaaccttcct gtttgagaca 1260
tccgaaccaa aagtgatcga gaacattcgc gaccagacta tcagctacat ttcctgcgga 1320
gagaatcaca ccgcactgat cacagacatt ggcctgatgt atacctttgg cgatggacga 1380
cacgggaagc tgggactggg actggagaac ttcactaatc attttatccc caccctgtgt 1440
tctaacttcc tgcggttcat cgtgaaactg gtcgcttgcg gcgggtgtca catggtggtc 1500
ttcgctgcac ctcatagggg cgtggctaag gagatcgaat ttgacgagat taacgataca 1560
tgcctgagcg tggcaacttt cctgccatac agctccctga cttctggcaa tgtgctgcag 1620
agaaccctga gtgcaaggat gcggagaagg gagagggaac gctctcctga cagtttctca 1680
atgcgacgaa ccctgccacc tatcgaggga acactgggac tgagtgcctg cttcctgcct 1740
aactcagtgt ttccacgatg tagcgagcgg aatctgcagg agtctgtcct gagtgagcag 1800
gatctgatgc agccagagga acccgactac ctgctggatg agatgaccaa ggaggccgaa 1860
atcgacaact ctagtacagt ggagtccctg ggcgagacta ccgatatcct gaatatgaca 1920
cacattatgt cactgaacag caatgagaag agtctgaaac tgtcaccagt gcagaagcag 1980
aagaaacagc agactattgg cgagctgact caggacaccg ccctgacaga gaacgacgat 2040
agcgatgagt atgaggaaat gtccgagatg aaggaaggca aagcttgtaa gcagcatgtc 2100
agtcagggga tcttcatgac acagccagcc acaactattg aggctttttc agacgaggaa 2160
gtggagatcc ccgaggaaaa agagggcgca gaagattcca aggggaatgg aattgaggaa 2220
caggaggtgg aagccaacga ggaaaatgtg aaagtccacg gaggcaggaa ggagaaaaca 2280
gaaatcctgt ctgacgatct gactgacaag gccgaggtgt ccgaaggcaa ggcaaaatct 2340
gtcggagagg cagaagacgg accagaggga cgaggggatg gaacctgcga ggaaggctca 2400
agcggggctg agcattggca ggacgaggaa cgagagaagg gcgaaaagga taaaggccgc 2460
ggggagatgg aacgacctgg agagggcgaa aaagagctgg cagagaagga ggaatggaag 2520
aaaagggacg gcgaggaaca ggagcagaaa gaaagggagc agggccacca gaaggagcgc 2580
aaccaggaga tggaagaggg cggcgaggaa gagcatggcg agggagaaga ggaagagggc 2640
gatagagaag aggaagagga aaaagaaggc gaagggaagg aggaaggaga gggcgaggaa 2700
gtggaaggcg agagggaaaa ggaggaagga gaacggaaga aagaggaaag agccggcaaa 2760
gaggaaaagg gcgaggaaga gggcgatcag ggcgaaggcg aggaggaaga gaccgagggc 2820
cgcggggaag agaaagagga gggaggagag gtggagggcg gagaggtcga agagggaaag 2880
ggcgagcgcg aagaggaaga ggaagagggc gagggcgagg aagaagaggg cgagggggaa 2940
gaagaggagg gagagggcga agaggaagag ggggagggaa agggcgaaga ggaaggagag 3000
gaaggggagg gagaggaaga gggggaggag ggcgaggggg aaggcgagga ggaagaagga 3060
gagggggaag gcgaagagga aggcgagggg gaaggagagg aggaagaagg ggaaggcgaa 3120
ggcgaagagg agggagaagg agagggggag gaagaggaag gagaagggaa gggcgaggag 3180
gaaggcgaag agggagaggg ggaaggcgag gaagaggaag gcgagggcga aggagaggac 3240
ggcgagggcg agggagaaga ggaggaaggg gaatgggaag gcgaagaaga ggaaggcgaa 3300
ggcgaaggcg aagaagaggg cgaaggggag ggcgaggagg gcgaaggcga aggggaggaa 3360
gaggaaggcg aaggagaagg cgaggaagaa gagggagagg aggaaggcga ggaggaagga 3420
gagggggagg aggagggaga aggcgagggc gaagaagaag aagagggaga agtggagggc 3480
gaagtcgagg gggaggaggg agaaggggaa ggggaggaag aagagggcga agaagaaggc 3540
gaggaaagag aaaaagaggg agaaggcgag gaaaaccgga gaaataggga agaggaggaa 3600
gaggaagagg gaaagtacca ggagacaggc gaagaggaaa acgagcggca ggatggcgag 3660
gaatataaga aagtgagcaa gatcaaagga tccgtcaagt acggcaagca caaaacctat 3720
cagaagaaaa gcgtgaccaa cacacagggg aatggaaaag agcagaggag taagatgcct 3780
gtgcagtcaa aacggctgct gaagaatggc ccatctggaa gtaaaaaatt ctggaacaat 3840
gtgctgcccc actatctgga actgaaataa gagctcctcg aggcggcccg ctcgagtcta 3900
gagggccctt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat tctacgcgta 3960
ccggtcatca tcaccatcac cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt 4020
ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 4080
ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 4140
gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 4200
atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagat 4260
cctctcttaa ggtagcatcg agatttaaat tagggataac agggtaatgg cgcgggccgc 4320
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 4380
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 4440
gagcgcgcag 4450
<210> 75
<211> 199
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 75
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggg 199
<210> 76
<211> 372
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 76
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gcgctgcctt 300
cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg 360
ttactcccac ag 372
<210> 77
<211> 279
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 77
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcg 279
<210> 78
<211> 1152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Met Arg Glu Pro Glu Glu Leu Met Pro Asp Ser Gly Ala Val Phe Thr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe
20 25 30
Lys Asn Asp Val Pro Val His Leu Ser Cys Gly Asp Glu His Ser Ala
35 40 45
Val Val Thr Gly Asn Asn Lys Leu Tyr Met Phe Gly Ser Asn Asn Trp
50 55 60
Gly Gln Leu Gly Leu Gly Ser Lys Ser Ala Ile Ser Lys Pro Thr Cys
65 70 75 80
Val Lys Ala Leu Lys Pro Glu Lys Val Lys Leu Ala Ala Cys Gly Arg
85 90 95
Asn His Thr Leu Val Ser Thr Glu Gly Gly Asn Val Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn
115 120 125
Thr Phe His Val Ile Ser Phe Phe Thr Ser Glu His Lys Ile Lys Gln
130 135 140
Leu Ser Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ala Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg
145 150 155 160
Leu Phe Met Trp Gly Asp Asn Ser Glu Gly Gln Ile Gly Leu Lys Asn
165 170 175
Val Ser Asn Val Cys Val Pro Gln Gln Val Thr Ile Gly Lys Pro Val
180 185 190
Ser Trp Ile Ser Cys Gly Tyr Tyr His Ser Ala Phe Val Thr Thr Asp
195 200 205
Gly Glu Leu Tyr Val Phe Gly Glu Pro Glu Asn Gly Lys Leu Gly Leu
210 215 220
Pro Asn Gln Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Pro Gln Leu Val Ser Glu
225 230 235 240
Ile Pro Glu Lys Val Ile Gln Val Ala Cys Gly Gly Glu His Thr Val
245 250 255
Val Leu Thr Glu Asn Ala Val Tyr Thr Phe Gly Leu Gly Gln Phe Gly
260 265 270
Gln Leu Gly Leu Gly Thr Phe Leu Phe Glu Thr Ser Glu Pro Lys Val
275 280 285
Ile Glu Asn Ile Arg Asp Gln Thr Ile Ser Tyr Ile Ser Cys Gly Glu
290 295 300
Asn His Thr Ala Leu Ile Thr Asp Ile Gly Leu Met Tyr Thr Phe Gly
305 310 315 320
Asp Gly Arg His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Asn Phe Thr Asn
325 330 335
His Phe Ile Pro Thr Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Phe Ile Val Lys
340 345 350
Leu Val Ala Cys Gly Gly Cys His Met Val Val Phe Ala Ala Pro His
355 360 365
Arg Gly Val Ala Lys Glu Ile Glu Phe Asp Glu Ile Asn Asp Thr Cys
370 375 380
Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asn
385 390 395 400
Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met Arg Arg Arg Glu Arg Glu
405 410 415
Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg Thr Leu Pro Pro Ile Glu
420 425 430
Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu Pro Asn Ser Val Phe Pro
435 440 445
Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser Val Leu Ser Glu Gln Asp
450 455 460
Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Met Thr Lys
465 470 475 480
Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val Glu Ser Leu Gly Glu Thr
485 490 495
Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met Ser Leu Asn Ser Asn Glu
500 505 510
Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln Thr
515 520 525
Ile Gly Glu Leu Thr Gln Asp Thr Ala Leu Thr Glu Asn Asp Asp Ser
530 535 540
Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ser Glu Met Lys Glu Gly Lys Ala Cys Lys
545 550 555 560
Gln His Val Ser Gln Gly Ile Phe Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Ile
565 570 575
Glu Ala Phe Ser Asp Glu Glu Val Glu Ile Pro Glu Glu Lys Glu Gly
580 585 590
Ala Glu Asp Ser Lys Gly Asn Gly Ile Glu Glu Gln Glu Val Glu Ala
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Val Lys Val His Gly Gly Arg Lys Glu Lys Thr Glu
610 615 620
Ile Leu Ser Asp Asp Leu Thr Asp Lys Ala Glu Val Ser Glu Gly Lys
625 630 635 640
Ala Lys Ser Val Gly Glu Ala Glu Asp Gly Pro Glu Gly Arg Gly Asp
645 650 655
Gly Thr Cys Glu Glu Gly Ser Ser Gly Ala Glu His Trp Gln Asp Glu
660 665 670
Glu Arg Glu Lys Gly Glu Lys Asp Lys Gly Arg Gly Glu Met Glu Arg
675 680 685
Pro Gly Glu Gly Glu Lys Glu Leu Ala Glu Lys Glu Glu Trp Lys Lys
690 695 700
Arg Asp Gly Glu Glu Gln Glu Gln Lys Glu Arg Glu Gln Gly His Gln
705 710 715 720
Lys Glu Arg Asn Gln Glu Met Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu His Gly
725 730 735
Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Arg Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu
740 745 750
Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Val Glu Gly Glu Arg
755 760 765
Glu Lys Glu Glu Gly Glu Arg Lys Lys Glu Glu Arg Ala Gly Lys Glu
770 775 780
Glu Lys Gly Glu Glu Glu Gly Asp Gln Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu
785 790 795 800
Thr Glu Gly Arg Gly Glu Glu Lys Glu Glu Gly Gly Glu Val Glu Gly
805 810 815
Gly Glu Val Glu Glu Gly Lys Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu
820 825 830
Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu
835 840 845
Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu
850 855 860
Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu
865 870 875 880
Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu
885 890 895
Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly
900 905 910
Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly
915 920 925
Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Asp Gly
930 935 940
Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Trp Glu Gly Glu Glu Glu
945 950 955 960
Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu
965 970 975
Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu
980 985 990
Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu
995 1000 1005
Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Val Glu Gly
1010 1015 1020
Glu Val Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu
1025 1030 1035
Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Arg Glu Lys Glu Gly Glu Gly Glu
1040 1045 1050
Glu Asn Arg Arg Asn Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Lys
1055 1060 1065
Tyr Gln Glu Thr Gly Glu Glu Glu Asn Glu Arg Gln Asp Gly Glu
1070 1075 1080
Glu Tyr Lys Lys Val Ser Lys Ile Lys Gly Ser Val Lys Tyr Gly
1085 1090 1095
Lys His Lys Thr Tyr Gln Lys Lys Ser Val Thr Asn Thr Gln Gly
1100 1105 1110
Asn Gly Lys Glu Gln Arg Ser Lys Met Pro Val Gln Ser Lys Arg
1115 1120 1125
Leu Leu Lys Asn Gly Pro Ser Gly Ser Lys Lys Phe Trp Asn Asn
1130 1135 1140
Val Leu Pro His Tyr Leu Glu Leu Lys
1145 1150
<210> 79
<211> 3459
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 79
atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60
aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120
tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180
agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240
gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300
gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360
cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420
aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480
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tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600
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aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720
attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780
aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840
tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900
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gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020
actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080
atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140
aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200
gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260
tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320
tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380
tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440
gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500
aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560
cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620
aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680
caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740
gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800
atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860
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gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980
gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040
aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100
gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160
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gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400
acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460
gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520
gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580
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gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa 2760
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gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaaga ggaaggggaa 3060
gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaaga ggaaggagag 3120
gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaacaggag gaacagagaa 3180
gaggaggagg aagaagaggg gaagtatcag gagacaggcg aagaagagaa tgaaaggcag 3240
gatggagagg agtacaaaaa agtgagcaaa ataaaaggat ctgtgaaata tggcaaacat 3300
aaaacatatc aaaaaaagtc agttactaac acacagggaa atgggaaaga gcagaggtcc 3360
aaaatgccag tccagtcaaa acgactttta aaaaacgggc catcaggttc caaaaagttc 3420
tggaataatg tattaccaca ttacttggaa ttgaagtaa 3459
<210> 80
<211> 3459
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Codon optimized RPGR ORF15
<400> 80
atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct 60
aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg 120
tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg 180
tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc 240
gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg 300
gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga 360
ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat 420
aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc 480
ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg 540
tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat 600
catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga 660
aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag 720
atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag 780
aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg 840
tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt 900
tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc 960
gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc 1020
accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcgg cgggtgtcac 1080
atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatt tgacgagatt 1140
aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgac ttctggcaat 1200
gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacg ctctcctgac 1260
agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggact gagtgcctgc 1320
ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcagga gtctgtcctg 1380
agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatga gatgaccaag 1440
gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactac cgatatcctg 1500
aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaact gtcaccagtg 1560
cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgc cctgacagag 1620
aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaa agcttgtaag 1680
cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattga ggctttttca 1740
gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaa ggggaatgga 1800
attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacgg aggcaggaag 1860
gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtc cgaaggcaag 1920
gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatgg aacctgcgag 1980
gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaaggg cgaaaaggat 2040
aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggc agagaaggag 2100
gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagca gggccaccag 2160
aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcga gggagaagag 2220
gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaagga ggaaggagag 2280
ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaa agaggaaaga 2340
gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcga ggaggaagag 2400
accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcgg agaggtcgaa 2460
gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgagga agaagagggc 2520
gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaa gggcgaagag 2580
gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag ggggaggagg gcgaggggga aggcgaggag 2640
gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa ggcgaggggg aaggagagga ggaagaaggg 2700
gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga gagggggagg aagaggaagg agaagggaag 2760
ggcgaggagg aaggcgaaga gggagagggg gaaggcgagg aagaggaagg cgagggcgaa 2820
ggagaggacg gcgagggcga gggagaagag gaggaagggg aatgggaagg cgaagaagag 2880
gaaggcgaag gcgaaggcga agaagagggc gaaggggagg gcgaggaggg cgaaggcgaa 2940
ggggaggaag aggaaggcga aggagaaggc gaggaagaag agggagagga ggaaggcgag 3000
gaggaaggag agggggagga ggagggagaa ggcgagggcg aagaagaaga agagggagaa 3060
gtggagggcg aagtcgaggg ggaggaggga gaaggggaag gggaggaaga agagggcgaa 3120
gaagaaggcg aggaaagaga aaaagaggga gaaggcgagg aaaaccggag aaatagggaa 3180
gaggaggaag aggaagaggg aaagtaccag gagacaggcg aagaggaaaa cgagcggcag 3240
gatggcgagg aatataagaa agtgagcaag atcaaaggat ccgtcaagta cggcaagcac 3300
aaaacctatc agaagaaaag cgtgaccaac acacagggga atggaaaaga gcagaggagt 3360
aagatgcctg tgcagtcaaa acggctgctg aagaatggcc catctggaag taaaaaattc 3420
tggaacaatg tgctgcccca ctatctggaa ctgaaataa 3459
<210> 81
<211> 3459
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Codon optimized RPGR ORF15
<400> 81
atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct 60
aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg 120
tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg 180
tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc 240
gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg 300
gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga 360
ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat 420
aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc 480
ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg 540
tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat 600
catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga 660
aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag 720
atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag 780
aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg 840
tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt 900
tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc 960
gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc 1020
accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcgg cgggtgtcac 1080
atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatt tgacgagatt 1140
aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgac ttctggcaat 1200
gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacg ctctcctgac 1260
agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggact gagtgcctgc 1320
ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcagga gtctgtcctg 1380
agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatga gatgaccaag 1440
gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactac cgatatcctg 1500
aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaact gtcaccagtg 1560
cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgc cctgacagag 1620
aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaa agcttgtaag 1680
cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattga ggctttttca 1740
gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaa ggggaatgga 1800
attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacgg aggcaggaag 1860
gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtc cgaaggcaag 1920
gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatgg aacctgcgag 1980
gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaaggg cgaaaaggat 2040
aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggc agagaaggag 2100
gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagca gggccaccag 2160
aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcga gggagaagag 2220
gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaagga ggaaggagag 2280
ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaa agaggaaaga 2340
gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcga ggaggaagag 2400
accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcgg agaggtcgaa 2460
gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgagga agaagagggc 2520
gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaa gggcgaagag 2580
gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag ggggaggagg gcgaggggga aggcgaggag 2640
gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa ggcgaggggg aaggagagga ggaagaaggg 2700
gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga gagggggagg aagaggaagg agaagggaag 2760
ggcgaggagg aaggcgaaga gggagagggg gaaggcgagg aagaggaagg cgagggcgaa 2820
ggagaggacg gcgagggcga gggagaagag gaggaagggg aatgggaagg cgaagaagag 2880
gaaggcgaag gcgaaggcga agaagagggc gaaggggagg gcgaggaggg cgaaggcgaa 2940
ggggaggaag aggaaggcga aggagaaggc gaggaagaag agggagagga ggaaggcgag 3000
gaggaaggag agggggagga ggagggagaa ggcgagggcg aagaagaaga agagggagaa 3060
gtggagggcg aagtcgaggg ggaggaggga gaaggggaag gggaggaaga agagggcgaa 3120
gaagaaggcg aggaaagaga aaaagaggga gaaggcgagg aaaaccggag aaatagggaa 3180
gaggaggaag aggaagaggg aaagtaccag gagacaggcg aagaggaaaa cgagcggcag 3240
gatggcgagg aatataagaa agtgagcaag atcaaaggat ccgtcaagta cggcaagcac 3300
aaaacctatc agaagaaaag cgtgaccaac acacagggga atggaaaaga gcagaggagt 3360
aagatgcctg tgcagtcaaa acggctgctg aagaatggcc catctggaag taaaaaattc 3420
tggaacaatg tgctgcccca ctatctggaa ctgaaataa 3459
<210> 82
<211> 199
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 82
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggg 199
<210> 83
<211> 269
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 83
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 60
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 120
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 180
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 240
gcttctgagg cggaaagaac cagctgggg 269
<210> 84
<211> 664
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis - CMV-CBA promoter variant
<400> 84
ctcagatctg aattcggtac ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 60
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 120
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 180
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 240
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 300
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 360
cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc 420
catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc 480
agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg 540
gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa 600
gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 660
ggcg 664
<210> 85
<211> 686
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis - CBA-RBG promoter variant
<400> 85
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120
ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180
cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240
ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg cgctgccttc 300
gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt 360
tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg 420
tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagg 480
gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg ccttcggggg 540
ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 600
aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 660
ctgtctcatc attttggcaa agaatt 686
<210> 86
<211> 440
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant synthesis - CBA-InEx promoter variant
<400> 86
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120
ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180
cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240
ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcgtg ccgcaggggg acggctgcct 300
tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc 360
ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt 420
tattgtgctg tctcatcatt 440
Claims (160)
- 포유류 숙주 세포 배양물로부터 재조합 AAV(rAAV) 입자를 정제하는 방법으로서,
(a) 복수의 rAAV 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC: hydrophobic interaction chromatography)를 통해 복수의 rAAV 입자를 정제하는 단계;
(b) 복수의 rAAV 입자를 포함하는 CEX 용리물을 제조하도록 양이온 교환 크로마토그래피(CEX: cation exchange chromatography)를 통해 (a)의 HIC 용리물을 정제하는 단계;
(c) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물을 제조하도록 음이온 교환(AEX: anion exchange) 크로마토그래피에 의해 (b)의 CEX 용리물로부터 복수의 충전 rAAV 입자를 단리하는 단계; 및
(d) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자 및 최종 제형 완충액을 포함하는 최종 조성물을 제조하도록 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration)에 의해 제형 완충액으로 (c)로부터의 AEX 용리물을 정용여과시키고 농축시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 방법은
복수의 rAAV 입자, 바이러스 방출 용액 및 수확 배지를 포함하는 조성물을 제조하도록 수확 배지로의 복수의 rAAV 입자의 방출에 적합한 조건 하에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포 및 바이러스 방출 용액을 접촉시키는 단계; 및
복수의 rAAV 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 복수의 rAAV 입자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제2항에 있어서, 상기 방법은
접촉 단계 전에 복수의 형질주입된 포유류 숙주 세포를 제조하도록 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 수확 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 단계이되, 복수의 포유류 숙주 세포는 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질주입되는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서, 수확 배지는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 안정화된 글루타민, 안정화된 글루타민 디펩타이드 및 Benzonase 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 수확 배지는 글리신, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스틴 디하이드로클로라이드, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O, L-이소류신, L-류신, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 이나트륨 염 이수화물, L-발린, 콜린 클로라이드, D-칼슘 판테테네이트, 엽산, 니아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, i-이노시톨, 염화칼슘(CaCl2)(무수), 질산제이철(Fe(NO3)3"9H2O), 황산마그네슘(MgSO4)(무수), 염화칼륨(KCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 염화나트륨(NaCl), 일염기성 인산나트륨(NaH2PO4-H2O) 및 D-글루코스(덱스트로스)를 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 수확 배지는 4 mM 안정화된 글루타민 또는 안정화된 글루타민 디펩타이드를 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수확 배지는 무혈청 배지를 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수확 배지는 무혈청 배지로 이루어지는, 방법.
- 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수확 배지는 무단백질 배지를 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수확 배지는 무단백질 배지로 이루어지는, 방법.
- 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 수확 배지는 청징된 배지를 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 수확 배지는 청징된 배지로 이루어지는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은
(a) 로돕신 키나제 프로모터를 암호화하는 서열;
(b) 망막색소변성증 GTPase 조절자 ORF15 동형단백질(RPGRORF15)을 암호화하는 서열; 및
(c) 폴리아데닐화(polyA) 신호를 암호화하는 서열을 포함하는, 방법. - 제13항에 있어서, 로돕신 키나제 프로모터는 GRK1 프로모터인, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은 코돈 최적화된 인간 RPGRORF15 서열인, 방법.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, polyA 신호를 암호화하는 서열은 소 성장 호르몬(BGH) polyA 서열을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은 ATP 결합 카세트, 슈퍼패밀리 구성원 4(ABCA4) 단백질을 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 5' 서열 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 3' 서열 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 외인성 서열은 프로모터를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 외인성 서열은 로돕신 키나제(RK) 프로모터를 암호화하는 서열을 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, RK 프로모터는 GRK1 프로모터인, 방법.
- 제24항에 있어서, 외인성 서열은 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, ABCA4를 암호화하는 서열은 인간 ABCA4 서열인, 방법.
- 제30항에 있어서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701 또는 1-4326을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3154-6822, 3196-6822, 3494-6822, 3603-6822, 3653-6822, 3678-6822, 3702-6822 또는 3494-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 5' 역상 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 AAV(AAV2)의 5' ITR 서열 및 3' ITR 서열로부터 유래된, 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 AAV2의 5' ITR의 서열 및 3' ITR의 서열과 동일한 서열을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은 코작 서열을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 코작 서열은 GGCCACCATG(서열 번호 73)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터 또는 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 선별 마커를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 Rep 단백질을 암호화하는 서열 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열은 AAV 혈청형 8(AAV8) 바이러스 Rep 단백질로부터 단리되거나 유래된 서열 및 바이러스 Cap 단백질 서열을 포함하는, 방법.
- 제2항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 숙주 세포는 중합체, 인산칼슘, 지질 및 세포막을 횡단할 수 있는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 조성물로 형질주입된, 방법.
- 제42항에 있어서, 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는, 방법.
- 제43항에 있어서, 세포막을 횡단할 수 있는 벡터는 리포솜, 마이셀 또는 나노입자를 포함하는, 방법.
- 제43항에 있어서, 나노입자는 탄소, 실리콘 또는 금을 포함하는, 방법.
- 제45항에 있어서, 나노입자는 중합체를 포함하는, 방법.
- 제2항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 방출 용액은 염 및 높은 pH를 포함하는, 방법.
- 제47항에 있어서, 염은 NaCl을 포함하는, 방법.
- 제47항 또는 제48항에 있어서, 높은 pH는 7.1보다 크거나 이와 같은 pH를 포함하는, 방법.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 높은 pH는 9.0보다 크거나 이와 같은 pH를 포함하는, 방법.
- 제2항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건은 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 포유류 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
- 제2항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건은 10% CO2이거나 이보다 적은 CO2 수준에서 포유류 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 HIC 단계는
(i) HIC 크로마토그램을 생성하는 단계; 및
(ii) 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 HIC 용리물을 제조하도록 rAAV 입자를 함유하는 HIC 크로마토그램에 분획을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서, HIC 크로마토그램을 생성하기 전에 고염 완충액으로 수확 배지를 희석하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제53항 또는 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 rAAV 입자는 단계 구배를 이용하여 용리되는, 방법.
- 제55항에 있어서, 단계 구배는 각각의 단계 구배에서의 염 농도의 감소를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 CEX 단계는
(i) CEX 크로마토그램을 생성하는 단계; 및
(ii) 복수의 rAAV 바이러스 입자를 포함하는 CEX 용리물을 제조하도록 rAAV 입자를 함유하는 CEX 크로마토그램으로부터 분획을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제57항에 있어서, CEX 크로마토그래피는 SO3- 양이온 교환 매트릭스를 포함하는, 방법.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, CEX 크로마토그램을 생성하기 전에 저염 완충액으로 HIC 용리물을 조정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제59항에 있어서, 조정은 희석 단계를 포함하는, 방법.
- 제59항에 있어서, 조정 단계는 TFF 단계를 포함하는, 방법.
- 제61항에 있어서, TFF 단계는 100kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제61항에 있어서, TFF 단계는 70kDa HFF를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제61항에 있어서, TFF 단계는 50kDa HFF를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제61항에 있어서, TFF 단계는 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100kDa HFF 또는 사이의 임의의 수의 kDa를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, HIC 용리물의 pH는 pH 3.0 내지 pH 4.0(종점 포함)으로 조정되는, 방법.
- 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, HIC 용리물의 pH는 pH 3.5 내지 pH 3.7(종점 포함)로 조정되는, 방법.
- 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, HIC 용리물을 여과시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제68항에 있어서, HIC 용리물을 여과시키는 것은 0.8/0.45 μm 폴리에테르설폰(PES) 필터를 포함하는, 방법.
- 제57항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 rAAV 입자는 단계 구배를 사용하여 용리되는, 방법.
- 제70항에 있어서, 단계 구배는 pH 구배, 염 구배 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제57항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 rAAV 입자는 선형 구배를 사용하여 용리되는, 방법.
- 제72항에 있어서, 선형 구배는 pH 구배, 염 구배 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제57항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 용리물의 pH를 중화시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 중화된 CEX 용리물의 pH는 pH 9.0인, 방법.
- 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 AEX 크로마토그래피 단계는
(i) AEX 크로마토그램을 생성하는 단계; 및
(ii) 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 AEX 용리물을 제조하도록 충전 rAAV 입자를 함유하는 AEX 크로마토그램으로부터 분획을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제76항에 있어서, AEX 크로마토그래피는 음이온 교환(QA) 매트릭스를 포함하는, 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, AEX 크로마토그램을 생성하기 전에 저염 완충액으로 CEX 용리물을 조정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제78항에 있어서, 조정은 희석 단계를 포함하는, 방법.
- 제78항에 있어서, 조정 단계는 TFF 단계를 포함하는, 방법.
- 제80항에 있어서, 조정 단계는 제1 TFF 단계 및 제2 TFF 단계를 포함하는, 방법.
- 제80항에 있어서, TFF 단계는 100kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제81항에 있어서, 제1 TFF 단계 및 제2 TFF 단계 둘 다는 100kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 희석된 CEX 용리물은 pH 9.0인, 방법.
- 제76항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자는 선형 구배를 사용하여 용리되는, 방법.
- 제76항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자는 단계 구배를 사용하여 용리되는, 방법.
- 제76항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자를 포함하는 용리물의 pH를 중화시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 TFF 단계는 100kDa 중공 섬유 필터(HFF)를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제88항에 있어서, 상기 방법은 제2 TFF를 추가로 포함하고, 제1 TFF 단계 및 제2 TFF 단계 둘 다는 100kDa HFF를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 제형 완충액은 Tris, MgCl2 및 NaCl을 포함하는, 방법.
- 제90항에 있어서, 최종 제형 완충액은 20 mM Tris, 1 mM MgCl2 및 pH 8에서의 200 mM NaCl을 포함하는, 방법.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 최종 제형 완충액은 0.001%로서 폴록사머(폴록사머) 188을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 조성물에 플루로닉(pluronic) F-68을 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제93항에 있어서, 정제되고 농후화된 복수의 충전 rAAV 입자 및 최종 제형 완충액을 포함하는 최종 조성물은 -80℃에서 동결된, 방법.
- 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 복수의 rAAV 입자를 포함하는, 조성물.
- 제95항에 있어서, 상기 조성물은
(a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함); 및
(b) 30% 미만의 빈 캡시드를 포함하는, 조성물. - 제95항에 있어서, 상기 조성물은
(a) 0.5 x 1011 vg/mL 내지 1 x 1013 vg/mL(종점 포함); 및
(b) 25% 미만의 빈 캡시드를 포함하는, 조성물. - 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5 x1011 vg/mL를 포함하는, 조성물.
- 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 조성물은 약 1.0 x 1013 vg/mL를 포함하는, 조성물.
- 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 조성물은 약 5 x1012 vg/mL를 포함하는, 조성물.
- 제96항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 rAAV의 일부는 기능적 벡터 게놈을 포함하고, 각각의 기능적 벡터 게놈은 형질도입 후에 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는, 조성물.
- 제101항에 있어서, 기능적 벡터 게놈을 포함하는 복수의 rAAV의 일부는 비형질도입된 세포에서 상응하는 내인성 서열의 발현의 수준과 비교할 때 2배 증가로 외인성 서열을 발현하는, 조성물.
- 제101항에 있어서, 기능적 벡터 게놈을 포함하는 복수의 rAAV의 일부는 비형질도입된 세포에서 상응하는 내인성 서열의 발현의 수준과 비교할 때 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 또는 사이의 임의의 다른 증분 배수 증가로 외인성 서열을 발현하는, 조성물.
- 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일하지 않은, 조성물.
- 제102항 또는 제103항에 있어서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일하지 않지만, 외인성 서열에 의해 암호화된 단백질 및 내인성 서열에 의해 암호화된 단백질은 동일한, 조성물.
- 제104항 또는 제105항에 있어서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는, 조성물.
- 제95항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은 내인성 서열과 비교할 때 코돈-최적화된, 조성물.
- 제107항에 있어서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는, 조성물.
- 제95항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 의한 세포의 형질도입 후에, 외인성 서열은 단백질을 암호화하는, 조성물.
- 제109항에 있어서, 외인성 서열에 의해 암호화된 단백질은 비형질도입된 세포의 상응하는 서열에 의해 암호화된 단백질의 활성 수준이거나 이보다 높은 활성 수준을 갖는, 조성물.
- 제110항에 있어서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일한, 조성물.
- 제110항에 있어서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 동일하지 않은, 조성물.
- 제112항에 있어서, 외인성 서열 및 상응하는 내인성 서열은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 동일성의 사이의 임의의 백분율을 갖는, 조성물.
- 제95항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 의한 세포의 형질도입 후에, 외인성 서열은 단백질을 암호화하는, 조성물.
- 제3항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 0.5:1:1 내지 약 10:1:1 또는 약 1:1:1 내지 약 10:1:1, 선택적으로 각각 약 1:1:1, 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 약 9:1:1, 또는 약 10:1:1의 몰비이고, 선택적으로 세포는 PEI를 사용하여 형질주입된, 방법.
- 제3항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 3:1:1의 몰비로 제공되고, 선택적으로 세포는 PEI를 사용하여 형질주입된, 방법.
- 제3항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터, 및 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 각각 약 10:1:1의 몰비로 제공되고, 선택적으로 세포는 PEI를 사용하여 형질주입된, 방법.
- 제3항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터(pITR) 대 헬퍼 플라스미드 벡터(pHELP)의 몰비는 1:1 내지 20:19이고, 선택적으로 세포는 PEI를 사용하여 형질주입된, 방법.
- 제3항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, pITR 대 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터(pREPCAP)의 몰비는 1:1 내지 20:19이고, 선택적으로 세포는 PEI를 사용하여 형질주입된, 방법.
- 제115항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 rAAV 입자의 형성에 적합한 조건 하에 수확 배지에서 복수의 포유류 숙주 세포를 배양하는 것은 형질주입제의 존재 하에 배양하는 것을 포함하는, 방법.
- 제120항에 있어서, 형질주입제는 인산칼슘(CaPO4)을 포함하는, 방법.
- 제120항에 있어서, 형질주입제는 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는, 방법.
- 제122항에 있어서, 형질주입제는 PEI 및 DNA를 각각 약 5:1 내지 약 1:1(mL:mg), 선택적으로 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 또는 약 2:1의 비로 포함하는, 방법.
- 제122항 또는 제123항에 있어서, 형질주입제는 PEI 및 DNA를 포함하고, DNA는 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 및 헬퍼 플라스미드를 각각 약 0.5:1:1 내지 약 10:1:1 또는 약 1:1:1 내지 약 10:1:1, 선택적으로 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 약 9:1:1, 또는 약 10:1:1의 몰비로 포함하는, 방법.
- 재조합 AAV 벡터를 제조하는 방법으로서, 포유류 숙주 세포를
(i) 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터;
(ii) 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터; 및
(iii) 헬퍼 플라스미드 벡터로 형질주입하는 단계를 포함하고,
포유류 숙주 세포는 각각 약 1:1:1 내지 약 10:1:1, 선택적으로 약 2:1:1, 약 3:1:1, 약 4:1:1, 약 5:1:1, 약 6:1:1, 약 7:1:1, 약 8:1:1, 약 9:1:1, 또는 약 10:1:1의 몰비로 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 형질주입 배지와 접촉하는, 방법. - 제125항에 있어서, 형질주입 배지는 폴리에틸렌이민(PEI) 및 CaPO4로부터 선택된 형질주입제를 포함하는, 방법.
- 제126항에 있어서, 형질주입제는 PEI이고, 형질주입 배지는 PEI 및 DNA를 약 5:1 내지 약 1:1, 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 또는 약 1:1의 비로 포함하는, 방법.
- 제125항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은
(a) 로돕신 키나제 프로모터를 암호화하는 서열;
(b) 망막색소변성증 GTPase 조절자 ORF15 동형단백질(RPGRORF15)을 암호화하는 서열; 및
(c) 폴리아데닐화(polyA) 신호를 암호화하는 서열을 포함하는, 방법. - 제128항에 있어서, 로돕신 키나제 프로모터는 GRK1 프로모터인, 방법.
- 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, RPGRORF15를 암호화하는 서열은 코돈 최적화된 인간 RPGRORF15 서열인, 방법.
- 제128항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 5' 역상 말단 반복부(ITR)를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제128항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 AAV(AAV2)의 5' ITR 서열 및 3' ITR 서열로부터 유래된, 방법.
- 제128항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 AAV2의 5' ITR의 서열 및 3' ITR의 서열과 동일한 서열을 포함하는, 방법.
- 제128항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은 코작 서열(Kozak sequence)을 암호화하는 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로 코작 서열은 GGCCACCATG(서열 번호 73)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 제125항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은 ATP 결합 카세트, 슈퍼패밀리 구성원 4(ABCA4) 단백질을 암호화하는 서열 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제142항에 있어서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 5' 서열 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제142항에 있어서, 외인성 서열은 ABCA4 단백질을 암호화하는 3' 서열 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제142항에 있어서, 외인성 서열은 프로모터 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제145항에 있어서, 외인성 서열은 로돕신 키나제(RK) 프로모터 서열, 선택적으로 GRK1 프로모터 서열을 포함하는, 방법.
- 제145항에 있어서, 외인성 서열은 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터 서열을 포함하는, 방법.
- 제142항에 있어서, 외인성 서열은 CMV.CBA 프로모터 서열, CBA.RBG 프로모터 서열, 또는 CBA.InEx 프로모터 서열을 포함하는, 방법.
- 제142항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, ABCA4를 암호화하는 서열은 인간 ABCA4 서열 또는 이의 변이체인, 방법.
- 제151항에 있어서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1-3701 또는 1-4326을 포함하는 5' 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 제151항에 있어서, ABCA4를 암호화하는 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3154-6822, 3196-6822, 3494-6822, 3603-6822, 3653-6822, 3678-6822, 3702-6822 또는 3494-6822를 포함하는 3' 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 제142항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 5' 역상 말단 반복부(ITR)를 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제154항에 있어서, 5' ITR을 암호화하는 서열 및 3' ITR을 암호화하는 서열은 혈청형 2의 AAV(AAV2)의 5' ITR 서열 및 3' ITR 서열 또는 이의 변이체로부터 유래된, 방법.
- 제142항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열은 3' ITR을 포함하는, 방법.
- 제125항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열을 포함하는 플라스미드 벡터, 헬퍼 플라스미드 벡터 또는 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 벡터는 선별 마커를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 방법.
- 제125항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 Rep 단백질을 암호화하는 서열 및 바이러스 Cap 단백질을 암호화하는 서열은 AAV 혈청형 8(AAV8) 바이러스 Rep 단백질 및 바이러스 Cap 단백질 서열로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함하는, 방법.
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AU2021375404A1 (en) * | 2020-11-03 | 2023-06-08 | Pfizer Inc. | Methods for purification of aav vectors by anion exchange chromatography |
GB202104611D0 (en) * | 2021-03-31 | 2021-05-12 | Univ Oxford Innovation Ltd | Gene therapy for retinal disease |
IL309351A (en) * | 2021-06-17 | 2024-02-01 | Meiragtx Uk Ii Ltd | AAV production methods |
WO2022272297A1 (en) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | Oxford Biomedica Solutions Llc | Adeno-associated virus packaging systems |
GB202117844D0 (en) * | 2021-12-09 | 2022-01-26 | Oxford Biomedica Ltd | Purification method |
US20230323395A1 (en) * | 2021-12-15 | 2023-10-12 | Homology Medicines, Inc. | Methods and compositions for the production of adeno-associated virus |
WO2023139224A1 (en) * | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Sartorius Xell GmbH | METHOD FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF ADENO-ASSOCIATED VIRUSES (AAVs) USING AN AFFINITY MATRIX |
WO2024011203A2 (en) * | 2022-07-07 | 2024-01-11 | Intergalactic Therapeutics, Inc. | Ocular vectors and uses thereof |
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