KR20080030956A - 개선된 조절 발현 체계를 사용한 질병의 치료 - Google Patents

개선된 조절 발현 체계를 사용한 질병의 치료 Download PDF

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테리 허미스톤
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Abstract

본 발명은, 질병의 치료에서 사용하기 위하여, 피험자의 세포에서 코드화 단백질 또는 핵산 치료 분자의 조절 발현을 위한 개선된 발현 체계를 제공한다. 특히, 본 발명은 개선된 조절 유전자 발현 체계, 및 질병의 치료를 위한 제약학적 조성물 및 그의 용도를 제공한다.
Figure P1020077029586
개선된 조절 발현 체계, 치료 분자, 조절인자 분자, 핵산 서열, 제약학적 조성물.

Description

개선된 조절 발현 체계를 사용한 질병의 치료 {TREATMENT OF DISEASE USING AN IMPROVED REGULATED EXPRESSION SYSTEM}
본 출원은 미국 가출원 60/682,761호 (2005년 5월 19일 출원) (본 명세서에서 그 전체내용이 참고문헌으로 포함됨)의 우선권주장을 청구한다.
본 발명은, 질병의 치료에서 사용하기 위하여, 코드화된 단백질 또는 핵산 치료 분자의 조절 발현을 위해 개선된 발현 체계에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 개선된 조절 유전자 발현 체계 및 질병의 치료를 위한 제약학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
질병의 치료를 위한 치료 분자 (TM)를 코드화하는 핵산의 전달은, 통상적인 치료 방법에 비하여 치료 방식으로서 매우 큰 잠재력을 제공하는 것으로 생각된다. 특히, 유전자 요법에서, 치료 단백질을 코드화하는 핵산의 전달은 덩어리 단백질의 투여를 필요로 하는 통상적인 치료법에 비하여 상당한 장점을 제공할 잠재력을 갖고 있다. 이러한 잠재적인 장점은 예를 들어 환자의 세포에서 TM의 장기간 및 조절 발현을 포함하고, 그 결과 최대 치료 효능 및 최소 부작용이 얻어지며 독성 및 감염성 불순물 및 전신 불순물을 피할 수 있다.
예를 들어, 질병의 치료를 위한 덩어리 단백질의 전달은 감염성 및 독성 불순물, 전신 독성, 주사-부위 괴사, 인플루엔자-유사 증상, 오한, 열, 피로, 식욕부진 및 체중 감소에 관련된 것을 포함하여 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 일부 경우에, 이러한 사건은 투여량이 제한적이고 대체로 치료의 중단을 유발할 수도 있다. 또한, 일부 단백질 치료법에 연속 노출되면 장 기간에 걸쳐 내성이 일어날 수도 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 동적인 적정약물 농도 내에서 TM의 수준을 빠르게 감소 또는 조절하기 위한 수단의 추가의 특징과 함께, 지속 또는 장기간에 걸쳐 치료적으로 효과적인 수준의 TM을 제공할 수 있는 조절 발현 체계가 요구되고 있다. 더욱 특별하게는, TM의 농도가 잠재적으로 독성인 수준에 이르를 경우에, 중단될 수 있는 가능성을 가진 조절 발현 체계가 요구되고 있다. 또한, 시간에 걸쳐 TM에 대한 내성이 증가될 잠재력이 존재한다면, TM의 수준을 적정하는 능력이 투여 용량을 조절할 수 있을 것이다.
특히 중요하고 요구되는 것은, 질병을 일으키거나 질병에 의해 유발되는 병을 치료하거나, 또는 질병의 진행을 멈추거나 느리게 하기 위하여, 표적 환자 세포에서 발현될 수 있는 치료 단백질을 코드화하는 유전자의 전달이다. 예를 들어, 많은 질병 상태의 병인학은 하나 이상의 결함 유전자 생성물의 발현 또는 하나 이상의 유전자 생성물의 발현 결함, 예를 들어 돌연변이된 단백질의 발현, 또는 단백질의 발현 과다 또는 발현 부족의 결과이다. 따라서, 통상적인 치료 방법은 결함이 있는 단백질 발현 또는 결함 단백질의 발현을 보정하기 위해 재조합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 환자에게 단백질 치료제를 투여하면 단백질에 대항한 항체가 생성되고 환자 면역 체계에 의한 이질로서의 거부가 일어나는 것으로 알려져 있다.
다발 경화증(MS)을 위한 공지된 치료 방법은 IFN-β 단백질 치료제의 투여를 포함한다. MS는 북미에서 대략 40만 명의 환자 및 전 세계에 걸쳐 대략 백만명의 환자에게 걸리는 중추 신경계의 만성 염증 자가면역 질환이다. MS는 남성보다 여성에서 더 많이 걸리는 질병이고 전형적으로 20 내지 40세의 연령에서 발병한다. 또한, 질병은 진행성이고, 초기 단계에서 수 시간 내지 수 일에 걸쳐 아-급성이고 이어서 수 개월간의 개선 기간이 지속될 수 있는 신경계 기능부전의 "공격" 또는 "재발"을 특징으로 하는 재발 및 완화 단계를 특징으로 한다 [B.M.Keegan 등, (2002) Annu.Rev.Med. 53: 258-302; J.Noseworthy (2000) 343: 938-52]. 증상은 예를 들어, 눈, 사지, 및 축 근육의 조화 운동이 붕괴되어 마비를 일으키는 것을 포함한다. 질병의 과정은 수년간에 걸쳐 환자가 심하게 무능하게 될 때까지 악화되는 신경계 증상과 함께 진전될 수도 있다. MS의 증상 및 징후는, 뇌에서의 신경세포 축삭의 수초탈락에 의해서 축삭을 따른 신경 흥분의 전도도 손상을 일으키는 것을 반영할 수 있다. 또한, MS의 병리학은, 예를 들어 만성 다병소 경화 플라크를 결국 일으키는 급성 국소 염증 수초탈락 및 축삭 손실로서 그 자체로 나타날 수 있고, 그로부터 질병의 이름을 얻게 된다 [A Compston and A. Coles (2002) Lancet 359: 1221-31; L.Steinman (1996) Cell 85: 299-302].
이제까지, MS를 위한 치료가 존재하지 않았고, 실제로 모든 승인된 치료법은 질병의 염증 성분을 표적으로 하였다. 쉐링(Schering) AG에 의해 1993년에 처음으 로 도입된 재조합 인터페론 베타(IFN-β)는, MS 환자에서 재발 수를 감소시키는데 명백한 장점을 나타내고 (해마다 총 30 내지 37% 만큼), 진행을 느리게 하고 질병과 관련된 무능을 감소시킴으로써, MS의 치료에서 획기적인 약전을 나타내었다. 이러한 효과는 자기 공명 영상(MRI)에 의해 결정되는 바와 같이 치료된 MS 환자의 뇌에서 수초탈락 병변의 수가 현저히 감소되는 것에 의해 드러난다.
MS의 재발-완화 형태를 위해 승인된 현재 3개의 IFN-β 생성물: 1) 베타세론(Betaseron)(R) 또는 베타페론(Betaferon)(R) (쉐링); 2) 아보넥스(Avonex)(R) (바이오겐); 및 3) 레비프(Rebif)(R) (세로노)가 존재한다. 추가로, 베타세론(Betaseron)(R)이 EU, 캐나다 및 유럽에서 속발성 진행성 MS를 위해 승인되었다. 이러한 승인된 IFN-β 생성물은 정제된 재조합 단백질 제제이다. 베타세론(R)/베타페론(R) (IFN-β 1b)의 경우에, 재조합 단백질은 단백질을 발현하는 세균 세포 배양물 (예. 이.콜리)로부터 정제될 수도 있다. 아보넥스(R) 및 레비프(R) (IFN-β 1a)의 경우에, 단백질을 발현하는 포유동물 세포 배양물로부터 재조합 단백질이 정제된다. MS를 위한 이러한 IFN-β 생성물은, 1주 1회 내지 격일의 빈도로 덩어리 단백질 용액을 피하(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 주사함으로써 투여될 수 있다.
또한, MS에 추가로 여러 암 및 바이러스성 질병 징후를 포함하는 몇몇 징후를 위하여 유형 I 인터페론(예, IFN-β)이 승인되었다. 그러나, 이러한 IFN 단백 질 치료제는 환자에서 용량-의존성 부작용, 예를 들어 인플루엔자-유사 증상, 오심 및 백혈구감소증을 유발할 수 있다 [E.U.Walther (1999) Neurology 53: 1622-27]. 이러한 부작용은 추가의 IFN 요법에 대한 불내성을 가져올 수 있다. 또한, 피하(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 주사를 받은 일부 환자는 괴사될 수 있는 국소 주사 부위 반응을 경험하고, 그 결과 IFN 요법을 중단할 수 있는 것으로 알려져 있다 [A.Bayas and R.Gold (2003) J.Neurol. 250(4): IV3-IV8]. 또한, MS를 위해 IFN-β 요법을 받은 일부 MS 환자는 시간에 걸쳐 약물의 치료 장점을 제한할 수 있는 중화 항체를 생성하는 것으로 알려졌다 [S.M.Malucchi (2004) Neurology 62: 2031-37]. 마지막으로, 약동학적 연구는, 환자에게 재조합 단백질을 덩어리 전달한 후 수 시간 내에 검출될 수 없는 수준으로 IFN이 순환기에서 짧은 반감기를 갖는다는 것을 밝혀내었다 [R.Wils.Clin.Pharmacokinet. 19: 390-99; P.Salmon 등, J.Interferon Cytokine Res. 16: 759-64; P.-A. Buchwalder 등 (2000) J.Interferon Cytokine Res. 20: 57-66].
따라서, 단백질의 조절된 장-기간 발현을 제공하여 그 결과 용량-제한적 독성 부작용을 최소화하면서 치료 효능을 얻는, 질병의 치료를 위한 치료 단백질의 유전자-기초 전달이 요구되고 있다. 이러한 조절 발현 체계는 현재의 단백질 치료법과 연관된 다수의 주요 제한 인자를 피할 수 있다. 그러나, 대부분의 공지된 핵산 전달 체계는 임상 사용을 위해 적절하지 않고 세포에서 조절 또는 장기간 발현을 부여하지 못한다. 단지 몇 가지의 공지된 핵산 전달 체계가 실험실 조건 하에서 트랜스유전자 발현을 조절하는 능력을 가진 것으로 보고되었으나, 임상 사용을 위해 이러한 전달 체계의 적합성 및 작업성은 알려져 있지 않다 (예를 들어, 문헌[M.Gossen and H.Bujard Science 268: 1766-69]; [D.No 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-51]; [J.F.Amara 등 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10618-23]; [Y.Wang (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180-84]; [J.L.Nordstron, (2002) 13: 453-58] 참조).
발명의 요약
본 발명은, TM의 치료 효능이 최대화될 수 있고 부작용이 최소화되도록, 질병의 치료에서 사용하기 위해 코드화 단백질 또는 핵산 치료 분자(TM)의 조절 발현을 위한 개선된 발현 체계를 제공한다. 특히, 본 발명은 개선된 조절 유전자 발현 체계, 및 제약학적 조성물 및 질병의 치료 방법을 제공한다. 코드화된 TM은 질병을 갖고 있거나 질병에 걸릴 수 있는 피험자에게 치료적 장점을 제공하는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 이러한 치료적 장점 또는 활성은, 이에 제한되지 않지만 질병 또는 질병의 증상을 개선, 조절, 감소, 안정화 또는 예방하는 것을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은, 피험자의 세포에 전달될 때 코드화된 TM이 발현되고 TM의 발현 및/또는 활성이 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 조절되도록 하는, TM을 코드화하는 핵산 서열을 가진 적어도 첫 번째 발현 카세트를 포함하는 개선된 조절 발현 체계를 제공한다. 이러한 조절의 예는, 이에 한정되지 않지만, RM의 존재 하에서 TM 발현 및/또는 활성의 유도, 억제, 증가 또는 저하를 포함한다.
본 발명의 하나의 측면에서, TM의 발현 및/또는 활성은 용량-반응성 또는 용 량-의존성 방식으로, 예를 들어 피험자의 세포에 존재하거나 피험자에게 투여되는 RM의 양에 따라서 조절된다. 다른 측면에서, TM의 발현 및/또는 활성은 용량-반응성 또는 용량-의존성 방식으로, 예를 들어 피험자의 세포에 존재하거나 피험자에게 투여된 활성인자 분자(AM) 또는 불활성인자 분자(IM)의 양에 따라서 조절된다.
본 발명의 다른 측면에서, TM의 발현 및/또는 활성은 배향-의존성이다. 예를 들어, 하나의 측면에서, 세포에서 TM의 발현 및/또는 활성은, TM을 코드화하는 발현 카세트의 5'에서 3'로의 배향, 또는 코드화된 TM의 전사 또는 번역의 5'에서 3'로의 배향에 대해 조정된다. 결국, TM을 코드화하는 발현 카세트의 특정한 배향 또는 TM의 전사 또는 번역의 배향을 선택함으로써 TM 발현 및/또는 활성이 조정될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 조절 발현 체계는, 피험자의 세포에 전달될 때 코드화된 RM이 발현되고 그의 존재가 TM의 발현 및/또는 활성을 조절하도록, RM을 코드화하는 두 번째 발현 카세트를 더욱 포함한다. 바람직한 측면에서, TM을 코드화하는 첫 번째 발현 카세트 및 본 발명의 RM을 코드화하는 두 번째 발현 카세트는 단일 벡터에 존재한다. 다른 바람직한 측면에서, 단일 벡터는 pGT23, pGT24, pGT25, pGT26, pGT27, pGT28, pGT29 또는 pGT30이다. 또 다른 바람직한 측면에서, 단일 벡터는 pGT54, pGT57, pGT713, pGT15 또는 pGT16이다.
본 발명의 TM은 핵산 서열에 의해 코드화되고 치료 활성을 갖는 단리된 DNA, RNA 또는 단백질 또는 이들의 변형체일 수 있다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 TM은 변형, 합성 또는 재조합 DNA, RNA 또는 단백질일 수 있다. 본 발명의 다른 측 면에서, 코드화된 TM은 치료 활성을 갖는 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 코드화된 TM은 RNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA이다. 본 발명의 다른 측면에서, 코드화된 TM은 치료 활성을 갖는 단백질, 바람직하게는 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 하나의 측면에서, 코드화된 TM은 치료 활성을 가진 단클론성 항체이다. 하나의 측면에서, 코드화된 TM은 단클론성 항체, CAMPATH(R)이다. 다른 측면에서, 이러한 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 유전자 또는 유전자 단편이다. 하나의 측면에서, 코드화된 TM은 과립구 포식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF) 또는 GMCSF의 변형체 (예, 류킨(Leukine)(R))이다. 다른 측면에서, 코드화된 TM은 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파 (IFN-α) 또는 인터페론-베타 (IFN-β), 더욱 특별하게는 IFN-β-1a이다.
본 발명의 RM은 자연-발생 분자 또는 그의 변형체 또는 단리된 분자일 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 RM은 합성 또는 재조합 분자이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 발명의 RM은 화학 화합물, DNA, RNA 또는 단백질이다. 또한, 일부 측면에서, 본 발명의 RM은 변형된 분자이다. 하나의 측면에서, RM은 인간화 단백질이다. 다른 측면에서, RM은 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 예를 들어, 하나의 측면에서, RM은 전사 활성인자, 예를 들어 스테로이드 수용체, 더욱 특별하게는 프로게스테론 수용체이다. 하나의 측면에서, RM은 전이활성(transactivation) 도메인 (예를 들어, VP16 또는 p65 전이활성 도메인)을 포함한다. 다른 측면에서, RM은 리간드-결합 도메인(LBD)을 포함한다. 또한, 하나의 측면에서, AM은 RM의 LBD에 결합하고, 이에 의해 활성화된 RM의 존재가 TM 발현 및/또는 활성을 조절하도록 RM을 활성화시킨다. 다른 측면에서, RM은 DBD, 예를 들어 GAL-4 DBD를 포함한다. 하나의 측면에서, RM은 TM을 코드화하는 핵산에 작동적으로 연결되고 이에 의해 TM 발현을 조절하는 (예를 들어, TM 발현을 유도하는) 기능성 서열 (예, 프로모터 서열)에 결합하는 DBD를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 RM은 활성화되고 이에 의해 활성화된 RM의 존재하에서 TM 발현 및/또는 활성이 조절된다. 하나의 측면에서, 본 발명의 RM은 불활성화 형태로 피험자의 세포에 발현되거나 존재하고, AM의 존재 하에서 활성화되며, 이에 의해 TM 발현 및/또는 활성이 활성화된 RM에 의해 조절된다. 하나의 측면에서, AM은 생체마커이다. 추가의 측면에서, AM은 질병 또는 병을 위한 생체마커이고, 더욱 특별하게는 질병 상태 또는 병 또는 그의 증상을 위한 생체마커이다. 하나의 측면에서, AM은 형태적 변화, 효소 처리 또는 변형, 특이적 결합, 또는 RM의 이량체화를 촉진하거나 억제함으로써 RM을 활성화시킨다. 바람직한 측면에서, AM은 RM의 단독이량체화를 촉진함으로써 RM을 활성화시킨다.
본 발명의 AM은 자연-발생 분자 또는 그의 변형체 또는 단리된 분자일 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 AM은 합성 또는 재조합 분자이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 발명의 AM은 화학 화합물, DNA, RNA 또는 단백질이다. 또한, 일부 측면에서, 본 발명의 AM은 변형된 분자이다. 하나의 측면에서, AM은 인간화 단백질이다. 다른 측면에서, AM은 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 하나의 측면에서, AM은 화학 화합물, 예를 들어 안티프로게스틴이다. 바람직한 측면에서, AM 은 미페프리스톤이다.
다른 측면에서, 본 발명의 RM은 불활성화되고, 이에 의해 불활성화 RM의 존재하에서 TM 발현 및/또는 활성이 조절된다. 하나의 측면에서, 본 발명의 RM은 발현되거나 피험자의 세포에 활성화 형태로 존재하고, IM의 존재하에서 불활성화되며, 이에 의해 TM 발현 및/또는 활성이 불활성화 RM에 의해 조절된다. 하나의 측면에서, IM은 생체마커이다. 추가의 측면에서, IM은 질병 또는 병을 위한 생체마커이고, 더욱 특별하게는 질병 상태 또는 병 또는 그의 증상을 위한 생체마커이다. 하나의 측면에서, IM은 형태적 변화, 효소 처리, 특이적 결합, 또는 RM의 이량체화를 촉진하거나 억제함으로써 RM을 불활성화시킨다. 바람직한 측면에서, IM은 RM의 단독이량체화를 억제함으로써 RM을 불활성화시킨다.
본 발명의 IM은 자연-발생 분자 또는 그의 변형체 또는 단리된 분자일 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 IM은 합성 또는 재조합 분자이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 발명의 IM은 화학 화합물, DNA, RNA 또는 단백질이다. 또한, 일부 측면에서, 본 발명의 IM은 변형 분자이다. 하나의 측면에서, IM은 인간화 단백질이다. 다른 측면에서, IM은 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 바람직한 측면에서, IM은 화학 화합물이다.
본 발명의 TM, RM, AM 또는 IM의 발현은 구조적이거나 일시적일 수 있다. 일부 측면에서, TM, RM, AM 또는 IM의 발현이 조절되거나 조직-특이적 (예, 근육-특이적)이다. 조절된 RM의 예는, 이에 한정되지 않지만 AM에 의해 활성화되거나 IM에 의해 불활성화되는 RM을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 TM, RM, AM 또는 IM의 발현은 조절된 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터에 의해 조종된다. 추가의 측면에서, 조절 또는 조직-특이적 프로모터가 RM의 존재하에서 조절되며, 더욱 특별하게는 프로모터에 RM을 결합시킴으로써 조절된다. 예를 들어, 하나의 측면에서, 본 발명의 RM이 TM을 코드화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터에 결합되고, 이에 의해 피험자의 세포에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 코드화된 TM의 발현을 조절한다. 하나의 측면에서, TM을 코드화하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터는 적어도 하나의 GAL-4 DNA-결합 부위(DBS)를 포함하고, 바람직하게는 3 내지 18개 GAL-4 DBS를 포함한다. 다른 측면에서, 프로모터는 Pol II 또는 Pol III 프로모터이다. 하나의 측면에서, 프로모터는 Pol II 프로모터 U6H1이다. 다른 측면에서, 프로모터는 근육 크레아틴 키나아제 프로모터(MCK), 저산소증 반응성 요소를 포함한 프로모터 (HRE 프로모터), 내피세포 백혈구 유착 분자(ELAM) 프로모터, 키메라 프로모터 (예, CMV/액틴 키메라 프로모터), 사이클린 A 프로모터 및 cdc6 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 Pol II 프로모터이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 개선된 조절 발현 체계를 포함하는 질병 또는 병의 치료를 위한 제약학적 조성물 및 방법을 제공한다. 특별한 측면에서, 본 발명은 질병 또는 병을 치료하거나; TM의 발현을 조절하거나; TM을 투여하거나; TM을 전달하거나; 또는 피험자의 세포에서 TM을 발현하기 위한 제약학적 조성물 및 방법을 제공하고, 이 방법은 코드화된 TM이 세포 내에서 발현되도록 세포를 본 발명의 조절 발현 체계와 접촉시키는 것을 포함하고, 이러한 TM 발현은 RM의 존재하에서 조절된다. 하나의 측면에서, 본 발명은 백혈병, 흑색종, 간염, 또는 심근병증의 치료를 위한 제약학적 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계의 코드화된 TM은 백혈병, 흑색종, 간염, 및 심근병증의 치료를 위한 IFN, 예를 들어 IFN-α 또는 IFN-β이다.
본 발명의 제약학적 조성물은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 발현 체계, 특히 본 발명의 TM 및 RM의 적어도 하나, 더욱 특별하게는 본 발명의 벡터의 적어도 하나 (예를 들어 pGT23, pGT24, pGT25, pGT26, pGT27, pGT28, pGT29, pGT30, pGT54, pGT57, pGT713, pGT715, pGT716, pTR-m IFN-β 또는 pTR-hlFN-β)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 AM 또는 IM을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 적어도 하나의 TM 및/또는 RM을 코드화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 본 발명의 TM, RM, AM 및 IM은 당 기술분야에 공지되거나 본 명세서에 기재된 적절한 투여 수단을 사용하여 별개로 또는 함께 생체외 또는 생체내에서 피험자에게 투여될 수 있다. 적절한 투여 수단의 예는, 이에 한정되지 않지만 주사 (예, 피하 주사), 경구 투여 및 전기천공(electroporation)을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 TM 및 RM은 단일 벡터에 존재하고, RM을 활성화하는 AM으로부터 별도로 투여된다 (이에 의해 활성화 RM의 존재는 TM 발현 및/또는 활성을 조절한다). 추가의 측면에서, AM은 경구 투여되는 화합물 (예, 미페프리스톤)이고, TM 및 RM을 코드화하는 단일 벡터는 피험자 (예, 골격근 세포)의 세포에 주사 또는 전기천공에 의해 투여되는 단일 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명의 개선된 조절 발현 체계를 포함하는 벡터 및 키트 를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 각각의 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는 적어도 하나의 발현 카세트를 가진 단일 벡터를 포함하고, 더욱 바람직하게는 적어도 2개의 발현 카세트를 포함한다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는, TM을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열의 삽입을 위해 적어도 하나의 클론화 부위를 가진 첫 번째 발현 카세트, 및 RM을 코드화하는 두 번째 핵산 서열의 삽입을 위해 적어도 하나의 클론화 부위를 가진 두 번째 발현 카세트를 포함하는 단일 벡터를 포함한다. 다른 측면에서, 벡터는 바이러스, 예를 들어 아데노-결합 바이러스(AAV) 서틀 플라스미드, 더욱 특별하게는 AAV-1 서틀 플라스미드를 제조하기 위해 사용되는 벡터이다. 하나의 측면에서, 본 발명의 벡터는 비바이러스성 벡터 (즉, 바이러스를 생성하지 않는 벡터), 예를 들어 바이러스를 생성하지 않는 플라스미드 벡터이다. 바람직한 측면에서, 벡터는 TM을 코드화하는 서열을 포함한 핵산 서열의 삽입을 위해 클론화 부위를 포함하는 본 발명의 플라스미드 벡터이다. 본 발명의 이러한 플라스미드 벡터의 예는 이에 한정되지 않지만 pGT1, pGT2, pGT3, pGT4, pGT11, pGT12, pGT13 또는 pGT14를 포함한다.
본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 코드화 분자, 예를 들어 TM, RM, AM 또는 IM의 발현을 위해 기능성 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 카세트는 본 발명의 분자를 코드화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 기능성 서열을 포함한다. 기능성 서열의 예는, 이에 한정되지 않지만 5' 또는 3' 비번역 영역 (예, UT12), 인트론 (예, IVS8), 폴리(A) 부위 (예, SV40 또는 hGH 폴리(A) 부위), 또는 DNA-결합 부위(DBS) (예, GAL-4 DBS)를 포함한다. 하나의 측면에서, 기능성 서열은 적어도 하나의 GAL-4 DBS를 포함하고, 바람직하게는 GAL-4 DBS의 다량체 (예, 3-18 GAL-4 DBS)를 포함한다. 이러한 기능성 서열은 예를 들어, 본 발명의 발현 카세트에서 기능성 서열에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 의해 코드화되는 분자의 조절 또는 조직-특이적 발현을 각각 촉진하는 조절 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터를 코드화하는 서열을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 분자, 예를 들어 TM, RM, AM 또는 IM를 코드화하는 핵산 서열의 삽입을 위해 적어도 하나의 클론화 부위, 더욱 바람직하게는 다수 클론화 부위(MCS)를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 첫 번째 발현 카세트는, 첫 번째 핵산 서열이 MCS에 삽입될 때 이러한 기능성 서열이 서열에 작동적으로 연결되도록, TM을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열의 삽입을 위한 MCS, 적어도 하나의 DBS를 포함하는 유도성 프로모터 (예, 3-18 GAL-4 DBS), 5' 비번역 영역 (예, UT12), 인트론 (예, IVS8) 및 hGH 폴리(A) 부위를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명의 두 번째 발현 카세트는, 두 번째 핵산 서열이 MCS에 삽입될 때 이러한 기능성 서열이 이 서열에 작동적으로 연결되도록, 조절 RM 및 SV40 폴리(A) 부위를 코드화하는 두 번째 핵산 서열의 삽입을 위해 MCS를 포함한다. 바람직한 측면에서, 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트가 단일 벡터에 존재한다.
본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 본 발명의 발현 체계의 적어도 하나, 더욱 특별하게는 본 발명의 제약학적 조성물, 벡터 또는 분자 (예, TM, RM, AM 또는 IM)의 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 상기 및 기타 목적, 그의 다양한 특징뿐만 아니라 본 발명 자체는 첨부된 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 충분히 이해될 수 있다.
도 1은 본 발명의 조절 발현 체계의 비제한적 예를 나타낸다. 도 1A는 1) 치료 분자(TM)를 코드화하는 첫 번째 핵산 서열 및 DNA-결합 부위(DBS) 및 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 TATA 서열을 코드화하는 첫 번째 프로모터 서열을 포함하는 첫 번째 발현 카세트; 2) 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열 및 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 프로모터 서열을 포함하는 두 번째 발현 카세트; 3) DNA-결합 도메인(DBD), 리간드-결합 도메인(LBD) 및 조절 도메인(RD)을 포함하는 융합 또는 키메라 단백질인 발현된 RM; 및 4) RM을 활성화하거나 RM을 불활성화하는 활성인자 또는 불활성인자 분자(A/IM)를 포함하는 본 발명의 조절 발현 체계의 비제한적 예를 나타낸다. 하나의 구현양태에서, 활성인자 분자(AM)가 RM에 결합하고 RM을 활성화시키며, 이에 의해 활성화된 RM이 TM 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열의 DBS에 결합하고, 그 결과 세포 (예, 포유동물 세포)에서 TM 발현이 유도된다. 다른 구현양태에서, 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트가 하나의 벡터에 존재한다.
도 1B는 1) TM을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열 및 DBS 및 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 TATA 서열을 코드화하는 첫 번째 프로모터 서열을 포함하 는 첫 번째 발현 카세트; 2) 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열 및 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 프로모터 서열을 포함하는 두 번째 발현 카세트; 3) DBD, LBD 및 활성화 도메인(AD)을 포함하는 융합 또는 키메라 단백질인 발현된 RM; 및 4) 활성인자 또는 불활성인자 분자(A/IM)을 포함하는 본 발명의 조절 발현 체계의 비제한적 예를 나타낸다. 하나의 구현양태에서, 활성인자 분자(AM)가 RM에 결합하고 RM을 활성화시키며, 이에 의해 활성화된 RM이 TM 서열에 작동적으로 연결된 프로모터의 DBS에 결합하는 단독이량체를 형성하고, 그 결과 세포 (예, 포유동물 세포)에서 TM 발현이 유도된다. 다른 구현양태에서, 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트가 하나의 벡터에 존재한다.
도 2는 재조합 단백질의 생성을 위한 생쥐 IFN-β 및 인간 IFN-β 플라스미드 벡터를 나타낸다. 도 2A 및 B는 재조합 단백질의 생성을 위한 생쥐 IFN-β 발현 벡터 (A, pGER90 (pCEP4/mIFN) 및 유전자-기초 전달 연구를 위한 생쥐 IFN-β 발현 벡터 (B, pGER101 (pgWiz/mIFN)를 나타낸다. pGER90에 존재하는 CMV 프로모터 및 인핸서는 5' UTR 또는 인트론을 갖지 않는 전사 개시 부위에 대해 -831 bp 내지 +1 bp로 뻗어 있다. pGER101에 존재하는 CMV 서열은 프로모터, 인핸서, 5'UTR 및 -674 bp 내지 +942 bp의 천연 인트론 A을 포함한다. 도 2C 및 D는 재조합 단백질의 생성을 위한 인간 IFN-β 발현 벡터 (C, pGER123 (pCEP4/hIFN) 및 유전자-기초 전달 연구를 위한 인간 IFN-β 발현 벡터 (D, pGER125 (pgWiz/hIFN)을 나타낸다.
도 3은 생쥐에서 인간 IFN-β1a 단백질의 주사 후에 약동학적 프로파일을 나 타낸다. C57BI/6 생쥐에게 i.v. 또는 i.m. 주사에 의하여 재조합 hIFN-β 1a 단백질의 25 ng (저 용량) 또는 250 ng (고 용량)을 투여하였다. 인간 IFN-β 수준은 주사 후 표시된 시점 (시점 당 n=4 생쥐)에서 생쥐의 말단 사혈 후에 수득된 혈청 샘플 중에서 ELISA (토라이-퓨지 바이오(Toray-Fugi Bio), 바이오소스 인터내셔날)에 의해 결정되었다. 각각의 데이타 포인트는 평균 값 ±표준 편차를 나타낸다.
도 4는 생쥐에서 AAV-1-hIFN-β 의 근육내 주사 후 약동학적 프로파일을 나타낸다. C57BI/6 생쥐 (군 당 n=6)를 AAV-1-hIFN-β의 0.5×1010, 1.0×1010 또는 5.0×1010 바이러스 입자로 i.m. 주사하였다. 주사 후 표시된 시점에서 혈액 샘플을 취하고, ELISA에 의해 hIFN-β 혈청 수준을 결정하였다. 각각의 데이타 포인트는 평균 값 ±표준 편차를 나타낸다.
도 5는 mIFN-β에 의하여 시험관내 (L929 세포에서) Mx1 RNA 유도를 나타낸다. 6 웰 플레이트에서 L929 세포를 5×105 세포로 접종하고, 증가하는 양의 정제된 재조합 mIFN-β 단백질로 자극하였다. 처리 후 4시간에 세포를 수집하고 RNA를 단리하고 태그맨(Taqman) 분석에 의해 Mx1 RNA를 정량화하였다. GAPDH RNA에 대한 배(fold) 증가로서 Mx1 RNA 발현을 그래프화하였다.
도 6은 mIFN-β 단백질의 i.v. (A) 또는 i.m. 주사 (B) 후에 Mx1 RNA 유도를 나타낸다. C57BI/6 생쥐에게 i.v. (꼬리 정맥을 통해) 또는 i.m. 주사 (군 당 n=3 생쥐)에 의하여 15, 150 또는 500 ng의 정제된 재조합 mIFN-β 단백질 (비활성 - 2.0×108 단위/mg)을 투여하였다. 주사 후 특정한 시점에서, 생쥐를 사혈하고, PBMC로부터 RNA를 단리하였다. 정량적 RT-PCR에 의해 Mx1 RNA를 측정하였다. 동일한 샘플에서 측정된 GAPDH에 대해 Mx1 RNA에서의 배 증가를 표현한다. 대조는 미경험 생쥐(N), 및 부형제 완충액으로 주입한 다음 주사 후 2시간(V2h) 또는 4시간 (V4h)에서 Mx1 분석한 생쥐를 포함한다. 각각의 컬럼은 평균 값 ±표준 편차를 나타낸다.
도 7은 생쥐 IFN-β 단백질의 i.v. 또는 i.m. 주사 후 IP-10 (A) 및 JE (B)의 유도 수준을 나타낸다. C57BI/6 생쥐에게 i.v. (꼬리 정맥을 통해) 또는 i.m. 주사 (군 당 n=3 생쥐)에 의하여 15, 150 또는 500 ng의 정제된 재조합 mIFN-β 단백질 (비활성 = 2.0×108 단위/mg)을 투여하였다. 주사 후 2, 4, 6, 12, 24 및 48 시간에 생쥐를 사혈하고, ELISA에 의해 IP-10 및 JE의 혈장 수준을 측정하였다 (R&D 시스템스).
도 8은 생쥐에서 전기천공(EP)에 의해 AAV-1 mIFN-β DNA 또는 mIFN-β 플라스미드 DNA의 근육내 주사 후에 IP-10의 유도를 나타낸다. 정상 생쥐 (C57BI/6)를 AAV-1-mIFN-β (5×109 바이러스 입자) 또는 mIFN-β 플라스미드 DNA (150 ug)로 전기천공에 의해 i.m. 주사하였다. 생쥐를 표시된 시점에서 사혈하고 ELISA에 의해 혈장 내의 IP-10 수준을 결정하였다. 각각의 컬럼은 평균 값 ± 표준 편차를 나타낸다 (군 당 n=5 생쥐)
도 9는 mIFN-β 플라스미드 DNA의 근육내 주사 후에 Mx1 mRNA의 유도를 나타 낸다. 생쥐를 mIFN-β를 코드화하는 상이한 양의 플라스미드 DNA (62.5 125, 250 또는 500 ug)로 뒷다리 장딴지 및 정강이 근육 내에 i.m. 주사하였다. 주사 후 특정한 시점에서 생쥐를 사혈하고, PBMC로부터 RNA를 단리하고 정량적 RT-PCR에 의해 Mx1 발현을 결정하였다. Mx1 RNA 수준을 GAPDH 발현에 대해 표준화하고, 비처리 대조 (대조, n=4)에 비해 0일에서 측정된 배경에 비하여 배 유도로서 표시한다. 각각의 컬럼은 평균 값 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 생쥐에서 전기천공에 의해 AAV-1-mIFN-β 바이러스 또는 mIFN-β 플라스미드 DNA의 근육내 주사 후 Mx1 mRNA의 유도를 나타낸다. 정상적인 생쥐 (C57BI/6)를 AAV-1-mIFN-β (5×1010 바이러스 입자) 또는 mIFN-β 플라스미드 DNA (150 ug)로 전기천공에 의해 i.m. 주사하였다. 대조는 PBS 주사된 생쥐 (i.m. 대조), 및 SEAP 플라스미드 (pSEAP) 또는 AAV-1 발현 SEAP (AAV-SEAP)로 주사된 생쥐를 포함하였다. 생쥐를 표시된 시점에서 사혈하고 PBMC로부터 단리된 NA 중의 정량적 RT-PCR에 의하여 Mx1 RNA 수준을 결정하였다. Mx1 RNA 발현을 GAPDH 발현에 대해 표준화하고 PBS 주사된 대조 생쥐에서 0일에 측정된 배경에 대해 배 유도로서 표시한다. 각각의 컬럼은 평균 값 ± 표준 편차를 나타낸다 (군 당 n=5 생쥐).
도 11은 생쥐 급성 EAE 모델에서 IFN-β 단백질의 효능을 나타낸다 (실시예 5 및 재료 및 방법 소항목 A에 기재됨). IFN-β의 100K 단위로 처리된 생쥐는 부형제 처리된 생쥐 (p=0.0046)에 비하여 상당히 저하된 EAE의 임상 점수를 나타내었다. 30K 단위의 IFN-β로 처리된 생쥐는, 이러한 저하가 통계적 유의치에 이르지 않긴 하지만, 부형제 처리된 생쥐에 비하여 저하된 임상 점수를 나타내었다. 이 연구에서 포지티브 대조, 메조프람 및 프레드니졸론은 임상 점수를 상당히 저하시켰다.
도 12는 생쥐 급성 EAE 모델에서 mIFN-β의 유전자-기초 전달의 효능을 나타낸다. 재료 및 방법에 충분히 설명된 바와 같이 1일에 암컷 SJL 생쥐를 PLP/백일해 독소로 면역화하였다. 연구 2일에, 생쥐의 군 (군 당 n=10)을 PBS, null 플라스미드(pNull) + 전기천공(EP) (pNull+EP, 120 ug) 또는 mIFN-β를 코드화하는 플라스미드 DNA (pmIFN-β) + EP (pmIFN-β + EP, 120 ug)로 주사하였다. 단백질 전달을 위하여, 연구 1일에 시작하여 격일로 s.c. 주사에 의해 재조합 mIFN-β 단백질 (100,000 단위)을 다른 동물 군에 투여하였다. pmINF-β + EP 대 pNull+EP 대조 군 (p=0.0171)에서 질병 중증도의 상당한 감소가 관찰되었다. 연구 결과는 재료 및 방법에 충분히 설명된다.
도 13은 실시예 5 및 재료 및 방법에 충분히 설명된 바와 같이 생쥐 급성 EAE 모델에서 IFN-β 단백질의 효능을 나타낸다.
도 14는 플라스미드 벡터 pGT1, pGT2, pGT3 및 pGT4 (각각 A, B, C, D)를 나타내고, 이것은 본 발명의 1-플라스미드 조절 발현 벡터의 비제한적 예이다. 이러한 실시예에서, 본 발명의 조절 발현 벡터는 하나의 플라스미드 벡터에서 1) 치료 분자(TM)을 코드화하는 핵산의 삽입을 위해 다수의 클론화 부위 (MCS)를 가진 첫 번째 발현 카세트; 및 2) 조절 분자(RM)를 코드화하는 핵산의 삽입을 위해 클론화 부위를 가진 두 번째 발현 카세트를 함유한다. 4개의 벡터는 각각, 여기에 기재되 고 도시된 바와 같이, 상호 간에 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트의 상이한 배향을 제공한다. 첫 번째 발현 카세트에서, 골격근 프로모터 (sk 액틴 pro), 비번역 영역 12 (UT 12), 플라스미드 pLC 1674로부터의 개입 서열 8 (IV 8)이 MCS의 상류 및 인간 성장 호르몬 폴리(A) 부위 (hGH 폴리A)의 상류에 위치한다. 주요 치료 분자(TM)를 포함하는 핵산, 예를 들어 트랜스유전자가 MCS에 삽입될 수 있다.
도 15는 생쥐 IFN-β (pGT23, pGT24, pGT25 및 pGT26) (A) 또는 인간 IFN-β (pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30) (B)의 유전자-기초 전달을 위해 본 발명의 조절 발현 플라스미드 벡터의 비제한적 예를 나타낸다. 이러한 실시예에서, 본 발명의 조절 발현 벡터는 하나의 플라스미드 벡터에서 1) 다수의 클론화 부위(MCS) 및 인간 IFN-β 유전자 또는 생쥐 IFN-β 유전자를 코드화하는 MCS에 삽입된 핵산을 가진 첫 번째 발현 카세트; 및 2) 클론화 부위 및 프로게스테론 수용체의 변형된 LBD (예를 들어, SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하고 SEQ ID NO:21의 핵산 서열에 의해 코드화됨)를 함유하는 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 부위에 삽입된 핵산을 가진 두 번째 발현 카세트를 함유한다. 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이, 이러한 벡터는 각각 서로에 대해 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트의 상이한 배향을 제공한다.
도 16은 실시예 6, 소항목 C에 충분히 기재된 바와 같이 생쥐 근육 세포에서 본 발명의 hIFN-β 조절 발현 플라스미드 벡터의 시험관내 확인을 나타낸다. 구성 (pGER125) 및 유도 (pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30) hINF-β 플라스미드 벡터를 생쥐 근육 C2C12 세포에 형질감염시키고, MFP (10nM)로 처리하고 배지를 수집하였다. ELISA에 의하여 hIFN-β에 대해 배지를 분석하였다. 2개의 독립적 형질감염의 평균을 나타낸다. 플라스미드 벡터 pGS1694 + pGER129는, 본 발명자들이 hIFN-β 유전자를 삽입한 발렌티스(Valentis)의 2-플라스미드 체계이다. RM 카세트의 상류 또는 하류에서 순 (hIFN,→) 또는 역 (hIFNr,←) 방향으로 hIFN-β 유전자와 함께 본 발명의 조절 발현 벡터를 구축하였다.
도 17은 실시예 6, 소항목 C에 충분히 기재된 바와 같이 생쥐 골격근 세포에서 본 발명의 mIFN-β 조절 발현 플라스미드 벡터의 시험관내 확인을 나타낸다. 구성 (pGER101) 및 유도 (pGT23, pGT24, pGT25 및 pGT26) mIFN-β 발현 플라스미드를 생쥐 근육 C2C12 세포 내에 형질감염시켰다. MFP(10nM)를 갖거나 갖지 않은 새로운 배지로 형질감염한 후 24시간에 배지를 교체하였다. 배지를 24시간 후에 수집하고 리포터 유전자 분석에 의하여 mIFN-β에 대해 측정하였다. 도표는 3개의 독립적 형질감염의 평균을 나타낸다. pGS1694 + pGER127은 본 발명자들이 mIFN-β 유전자를 삽입한 발렌티스의 2-플라스미드 체계이다. RM 카세트의 상류 또는 하류에서 순 (mIFN,→) 또는 역 (mIFNr,←)방향으로 mIFN-β 유전자와 함께 본 발명의 조절 발현 벡터를 구축하였다.
도 18은 본 발명의 pBRES-1 mIFN-β 조절 발현 체계를 사용하여 생체내에서 Mx1 RNA 유도를 나타낸다. 구성 (pGER101) 및 유도 조절 발현 (pGT26) mIFN-β 플라스미드 벡터를 생쥐의 정강이 및 장딴지 근육에 주사하고 에렉트로포레이트하였다 (동물 당 150 ug). 혈액을 주사 후 7일에 수집하였다. 주사 후 7 내지 10일에 생쥐를 경구 위관영양법에 의해 하루 한번 MFP (0.33mg/kg)으로 처리하였다. 혈액 을 주사 후 11 및 18일에 수집하였다. 혈액으로부터 PBMC를 단리하고, PBMC로부터 RNA를 제조하고 RT-PCR에 의해 분석하여 Mx1 RNA의 수준을 결정하였다. Mx1 발현 수준을 GAPDH에 표준화하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물)±표준 편차로서 표시하며, 7일에 MFP의 부재 하에서 pBRES-1 mIFN을 사용하여 Mx1 RNA의 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않고, 재료 및 방법, 소항목 C에 충분히 기재된 바와 같이 11일에 MFP의 존재하에서 CMV-mIFN을 사용할 때보다 더 높은 수준으로 강력하게 유도되었다. 18일에, MFP의 부재 하에서, Mx1 RNA가 거의 기준선으로 저하되었다.
도 19는 본 발명의 pBRES-1 mIFN-β 조절 발현 체계를 가진 IP-10 및 JE 유도를 나타낸다. 구성 (pGER101) 및 유도 pBRES-1 (pGT26) mIFN 발현 플라스미드를 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고 에렉트로포레이트하였다. 동물을 사혈하고 7일 (MFP의 부재), 11일 (MFP의 경구 투여의 연속 4일 후) 및 18일에 ELISA에 의하여 케모카인 IP-10 및 JE에 대해 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물)±표준 편차로서 표시하고, 재료 및 방법, 소항목 C에 충분히 나타낸 바와 같이 7일에 MFP의 부재 하에서 pBRES-1-mIFN을 사용할 때 케모카인 (IP-10 및 JE)의 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았으며 11일에 MFP의 존재 하에서 CMV-mIFN에 비해서 더 높은 수준으로 강력하게 유도되었다. 18일에, MFP의 부재 하에서 케모카인 수준이 기준선으로 되돌아갔다.
도 20은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 pGER (pgWiz/mIFN) (C)의 구축에서 사용된 플라스미드 벡터 pbSER189 (A) 및 pgWIZ(B)를 나타낸다.
도 21은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 pGER125 (pgWiz/hIFN)을 나타낸다.
도 22는 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 pGene/V5-HisA을 나타낸다.
도 23은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 pGene-mIFN (pGER127)을 나타낸다.
도 24은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 pGene-hIFN (pGER129)을 나타낸다.
도 25은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 p스위치(Switch) (인비트로겐)을 나타낸다.
도 26은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 pGS1694을 나타낸다.
도 27은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 플라스미드 벡터 pLC1674을 나타낸다.
도 28은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 pGT-hGMCSF 및 pGT-mGMCSF 서틀 플라스미드 및 그의 구조를 나타낸다.
도 29은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 pZac2.1-RM-hGMCSF 및 pZac2.1-RM-mGMCSF(A) 및 pZac2.1-CMV-hGMCSF (pGT713) 및 pZac2.1-CMV-mGMCSF (pGT714) (B) 서틀 플라스미드 및 그의 구조를 나타낸다.
도 30은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 pZac2.1-RM- hGMCSF 및 pZac2.1-RM-mGMCSF의 구조에서 사용된 pORF-hGMCSF 및 pORF9-mGMCSF를 나타낸다.
도 31은 재료 및 방법, 소항목 F에 충분히 기재된 바와 같이 pGT715(A) 및 pGT716(B) 서틀 플라스미드를 나타낸다.
도 32는 본 발명의 mIFN-β 조절 발현 플라스미드 벡터에 의한 생체내 IP-10 유도를 나타낸다. 유도 (pGT23, pGT24, pGT25 및 pGT26) mIFN-β 발현 플라스미드를 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육 내에 주사하고 에렉트로포레이트하였다. 동물을 사혈하고 7일 (MFP의 부재), 11일 (4일 연속 MFP의 경구 투여 후) 및 18일에 ELISA에 의하여 케모카인 IP-10에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물) ± 표준 편차로서 나타낸다.
도 33은 본 발명의 hIFN-β 조절 발현 플라스미드 벡터에 의해 생체내 hIFN 유도를 나타낸다. 구성 (pGER125) 및 유도 (pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30) hINF-β 발현 플라스미드를 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고 에렉트로포레이트하였다. 동물을 사혈하고 7일 (MFP의 부재), 11일 (4일 연속 MFP의 경구 투여 후) 및 18일에 ELISA에 의하여 hIFN에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물) ± 표준 편차로서 나타낸다.
도 34A은 본 발명의 hEPO 조절 발현 플라스미드 벡터에 의해 생체내 hEPO 유도를 나타낸다. 유도 2-플라스미드 (pGS1694 + pEP1666) 및 1-플라스미드 BRES-1 (pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30) hEPO 발현 플라스미드를 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고 에렉트로포레이트하였다. 연속 4일 (7-10일) 동안 복강내 주사에 의해 각각의 군의 5마리 동물에게 MFP를 투여하고, 마지막 MFP 주사 후 6시간에 모두 사혈하였다. 각각의 군의 나머지 5마리 동물을 MFP 처리의 부재 하에서 10일에 사혈하였다. ELISA에 의하여 hEPO에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물) ± 표준 편차로서 나타낸다.
도 34B는 본 발명의 hEPO 조절 발현 플라스미드 벡터에 의해 생체내에서 적혈구용적율 수의 유도를 나타낸다. 유도 2-플라스미드 (pGS1694 + pEP1666) 및 1-플라스미드 BRES-1 (pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30) hEPO 발현 플라스미드를 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고 에렉트로포레이트하였으며, 동물을 MFP로 처리하거나, 상기 기재된 바와 같이 처리하지 않고 놓아두고 사혈하였다. 혈액이 응고되고 미세모세관에서 원심분리되었으며 % 적혈구 세포(RBC)를 측정하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물) ± 표준 편차로서 나타낸다.
도 35는 본 발명의 hIFN-β 조절 발현 AAV 벡터에 의해 생체내에서 장기간 지속성의 다수 hIFN 유도를 나타낸다. 유도 hIFN-β 발현 AAV 벡터 AAV-1-GT58을 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하였다. 동물을 사혈하고 나타낸 바와 같이 (i.p 주사의 4일 연속) MFP의 부재 또는 존재하에서 ELISA에 의해 hIFN에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물) ± 표준 편차로서 나타낸다.
도 36은 본 발명의 mIFN-β 조절 발현 플라스미드 벡터의 반복 투여에 의해 생체내에서 MFP의 증가하는 용량에 대해 반응하는 장기간 지속성의 다수 IP-10 유도를 나타낸다. 유도 mIFN-β 발현 플라스미드 pGT26을 0일에 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고 에렉트로포레이트하였다. 4일 연속 (7-10일 및 63-66일) 동 안 i.p. 주사에 의해 다양한 농도로 MFP를 투여한 다음, 그 다음날 (11일 및 67일)에 동물을 사혈하였다. 플라스미드 DNA를 77일 및 189일에 재-주사하였다. 플라스미드 재-주사 후 MFP 처리는 각각 84-87일 및 196-199일이었다. 88일 및 200일에 각각 혈액을 취하였다. ELISA에 의하여 케모카인 IP-10에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물)으로서 나타낸다.
도 37A는 본 발명의 hIFN-β 조절 발현 AAV 벡터에 의해 생체내에서 hIFN 유도의 동역학을 나타낸다. 유도 hIFN-β 발현 AAV 벡터 AAV-1GT58을 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하였다. 연속 4일 동안 i.p. 주사에 의해 동물에게 MFP를 투여하고 이어서 도표에 나타낸 바와 같이 첫 번째 MFP 주사 후에 다양한 시간에서 사혈하였다. ELISA에 의하여 hIFN에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물) ± 표준 편차로서 나타낸다.
도 37B는 본 발명의 hIFN-β 조절 발현 AAV 벡터에 의해 생체내에서 hIFN 탈-유도의 동역학을 나타낸다. 유도성 hIFN-β 발현 AAV 벡터 AAV-1GT58을 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하였다. 연속 4일 동안 i.p. 주사에 의해 동물에게 MFP를 투여하고 이어서 도표에 나타낸 바와 같이 마지막 MFP 주사 후에 다양한 시간에서 사혈하였다. ELISA에 의하여 hIFN에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물) ± 표준 편차로서 나타낸다.
도 37C는 박동성 또는 만성 MFP 치료에 대해 mIFN 유도 및 탈유도 반응의 동역학, 및 본 발명의 mIFN-β 조절 발현 플라스미드 벡터에 의해 수 개월에 걸친 유전자 발현의 지속성을 나타낸다. 구성 (pGER101, CMV) 및 유도 (BRES-1, pGT26) mIFN 발현 플라스미드를 전기천공에 의해 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고, 동물을 도표에 나타낸 것과 같은 MFP 치료 전, 동안 또는 후에 다양한 시점에서 사혈하였다. ELISA에 의하여 케모카인 IP-10에 대해 혈청을 분석하였다. 결과를 평균 (군 당 n=5 동물)으로 나타낸다.
도 38은 본 발명의 mIFN-β 조절 발현 플라스미드 벡터에 의한 생체내 Mx-1 유도를 나타낸다. 유도 mIFN-β 발현 플라스미드 pBRES-1 mIFN (pGT26) 또는 pBRES-1 Null-MFP (대조) 플라스미드를 급성 EAE를 가진 SJL 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고 에렉트로포레이트하였다. 플라스미드 주사 후 하루 한번(d) 또는 삼일에 한번(etd) i.p. 주사에 의해 MFP (0.33 mg/kg)으로 생쥐를 처리하였다. 혈액을 주사 후 5일에 수집하였다. PBMC를 혈액으로부터 단리하고, RNA를 제조하고 RT-PCR에 의해 분석하여 Mx1 RNA의 수준을 결정하였다. Mx1 발현 수준을 GAPDH로 표준화하였다. 결과를 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.
예를 들어 특허, 특허 출원, 잡지, 서적 및 웹-사이트 공개를 포함하여 여기에 언급된 참고문헌들은 그 전체내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 포함된다.
약어
AAV (아데노-결합 바이러스)
AAV-1 (아데노-결합 바이러스, 혈청형 1)
AAV-2 (아데노-결합 바이러스, 혈청형 2)
AM (활성인자 분자)
AMP (암피실린)
bp (염기 쌍)
BRES-1 (버렉스 조절 발현 체계-1)
BGH (소 성장 호르몬)
CMV (사이토메갈로바이러스)
DBD (DNA-결합 도메인)
DNA (데옥시리보핵산)
EAE (실험적 알레르기성 뇌척수염)
enh (증진인자)
E1b TATA (아데노바이러스 E1b 유전자 프로모터 TATA 박스)
EBNA-1 (엡스테인-바르 바이러스 핵 항원)
EDTA (에틸렌 디아민 테트라아세트산)
EF-1α (신장 인자-1 알파)
ELAM (내피세포 백혈구 유착 분자)
ELISA (효소 면역 측정법)
EP (전기천공)
EPO (에리트로포이에틴)
GAL-4 (효모 GAL-4 단백질)
6x GAL-4 (GAL-4 DNA 결합 부위의 6개 카피)
GAPDH (글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소)
GMCSF (과립구 포식세포 자극 인자)
hGMCSF (인간 과립구 포식세포 콜로니-자극 인자)
hIFN (인간 인터페론)
hIFN-β (인간 인터페론-β)
hr (시간)
HR (저산소증 반응성 요소)
hGH (인간 성장 호르몬)
hPR (인간 프로게스테론 수용체)
HTLV (인간 T-세포 림프친화성 바이러스)
HSV (헤르페스 심플렉스 바이러스)
Hygro (히그로마이신)
IFN-β (인터페론-β)
IFN-β1a (인터페론-β 1a)
IFNβ1b (인터페론-β 1b)
IFN sig seq (인터페론 시그날 서열)
IgK (면역글로블린 카파)
i.m. 또는 IM (근육내)
inj. (주사)
INR 또는 inr (전사 개시인자 요소)
IP-10 또는 IP-10 (인터페론-알파 유도성 단백질 10)
ITR (역방위 말단 반복)
i.p. 또는 IP (복강내)
IVS8 (개재 서열 또는 인트론 8)
i.v. 또는 IV (정맥내)
JE (MCP-1의 생쥐 유사체)
kDA (킬로달톤)
kan (카나마이신)
KanR (카나마이신 내성 유전자)
LBD (리간드-결합 도메인)
MCP-1 (단핵구 화학유인물질 단백질)
MCS (다수 클론화 부위)
MFP (미페프린스톤)
mg (밀리그램)
mGMCSF (생쥐 과립구 포식세포 콜로니-자극 인자)
mlFN (생쥐 인터페론)
mlFN-β (생쥐 인터페론-베타)
ml (밀리리터)
min (분)
MCK (근육 크레아틴 키나아제)
Mx1 (MxA의 생쥐 상동체)
MxA (인간 믹소바이러스 단백질)
ng (나노그램)
ORF (개방 판독 프레임)
Ori (복제 기원)
OriP (엡스테인 바르 바이러스의 복제 기원)
pBRES (플라스미드 버렉스 조절 발현 체계)
p65 (NF카파B p65 단백질의 전사 조절 도메인)
PBS (포스페이트 완충 염수)
PEG (폴리에틸렌 글리콜)
PINC (보호 상호작용 비-축합 중합체)
pg (피코그램)
pk (약동학)
폴리A 또는 폴리(A) (폴리아데닐화 부위)
PR (프로게스테론 수용체)
pro (프로모터)
P TK (헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 유전자의 프로모터)
pUC ori (pUC 플라스미드의 복제 기원)
r (역)
RM (조절인자 분자)
RNA(리보핵산)
rpm (분 당 회전)
RT (실온)
s.c. 또는 SC (피하)
SEAP (분비된 알칼리성 포스파타제)
SHR (스테로이드 호르몬 수용체)
shRNA (짧은 헤어핀 RNA)
siRNA (작은 간섭 RNA)
sk 액틴 pro (골격근 프로모터)
SkM 또는 Sk (골격근)
SV40 (시미안 바이러스 40)
TK (티미딘 키나아제)
TKpA (티미딘 키나아제 폴리 A)
TM (치료 분자)
UbiB (유비퀴틴 B)
ug (마이크로그램)
5'UTR (5' 비번역 영역)
UT 12 (비번역 영역 12)
VP-16 (헤르페스 바이러스 VP-16 전이활성화 도메인)
vol. (부피)
WPRE (우드쳐크 전사-후 조절인자 요소)
기술 및 과학 용어
본 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 이해되는 의미를 갖는다. 당 기술 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방법이 본 명세서에서 언급된다. 공지된 방법을 설명하는 출판물 및 기타 자료는, 그것이 자세히 설명되긴 하였으나, 본 명세서에서 그 전체 내용이 참고문헌으로 포함된다. 재조합 DNA 기술의 일반적 원리를 설명하는 표준 참고문헌은 [Sambrook, J. 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y.; McPherson, M.J., Ed. (1991) Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Jones, J. (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford; Austen, B.M. and Westwood, O.M.R. (1991) Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford]를 포함한다. 당업자에게 공지된 적절한 재료 및/또는 방법은 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다; 그러나, 바람직한 재료 및/또는 방법이 설명된다. 하기 상세한 설명 및 실시예에서 언급된 재료, 시약 등은, 달리 언급되지 않는 한, 시판 공급원으로부터 수득될 수 있다.
조절 발현 체계
본 발명의 개선된 조절 발현 체계는, 피험자의 세포에 전달되고 세포에서 발현될 수 있는 치료 분자(TM)를 코드화하는 핵산을 제공하는 매우 혁신적인 기술이며, 따라서 발현된 TM의 발현 및/또는 활성이 조절가능하고 질병의 치료를 위해 피험자에게 치료적 장점을 제공한다. 본 발명의 조절 발현 체계의 장점은, 이것이 피험자의 세포에서 치료 분자 (TM), 예를 들어 단백질 또는 핵산의 엄격하게 조정된 발현을 제공한다는 것이다. 본 발명의 추가의 장점은, 이것이 용량-의존성 또는 배향-의존성 방식 (여기에 기재됨)으로, 예를 들어 피험자에 존재하거나 피험자에게 투여된 조절 분자(RM)의 양 또는 TM을 코드화하는 핵산의 배향에 의존하여, 피험자의 세포에서 TM의 발현 및/또는 활성을 제공한다는 점이다. 결국, 본 발명의 조성물 및 방법의 다른 장점은, 이것이 피험자의 질병 또는 질병 상태에 특이적인 방식으로 치료법을 최적화하기 위해 사용될 수 있다는 것이다. 본 발현 체계의 추가의 장점은, 이것이 단일 주입를 통해 피험자에게 투여될 수 있는 단일 핵산 벡터를 포함할 수 있다는 것이다. 따라서, 본 발명의 발현 체계는 공지된 핵산-기초 치료법 또는 덩어리 단백질-기초 치료법에 비해 상당한 장점을 제공한다.
특히, 본 발명의 발현 체계는 피험자의 세포에서 TM (예, 단백질 또는 핵산)의 조절된 장-기간 발현을 제공하고, 그 결과 용량-제한적 부작용을 최소화하면서 치료 효능이 얻어진다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 발현 체계를 사용하는 유전자 요법은 단백질의 조절된 장기간 발현을 제공할 수 있고, 이에 의해 용량-제한적 부작용을 최소화하고 피험자에서 질병의 치료를 위한 단백질의 치료 효능을 최대화한다. 예를 들어, 인터페론 베타(IFN-β)는 질병의 중증도를 감소시키고 그의 진행을 느리게 한다는 점에서 다발 경화증(MS)을 가진 피험자를 위해 효과적인 단백질 약물인 것으로 밝혀졌다. 그러나, IFN-β가 순환에서 짧은 반감기를 갖는 것으로 알려졌다. 또한, 단백질의 빈번한 국소 투여는 용량-의존적 부작용을 유발할 수도 있다. 그러나, 본 발명의 조절 발현 체계를 사용하여, IFN-β (예를 들어, IFN-β-1a)를 코드화하는 핵산을 피험자의 세포에 투여할 수 있고, 세포에서 코드화된 IFN-β의 발현이 장기간 조절될 수 있으며 MS의 치료를 위해 최대 치료 효능 및 IFN-β 약물의 최소 용량-제한적 부작용을 달성하기 위해 최적화된다.
하나의 구현양태에서, 경구 이용가능한 환제의 형태에서 소 분자 활성인자인 AM은 프로모터 유도를 조절하고 이어서 본 발명의 조절 발현 체계의 핵산 서열에 의해 코드화되는 TM의 발현을 조절한다. 이러한 방식으로, 피험자의 순환에서 발현된 TM (예를 들어, 단백질 또는 핵산)의 수준이 온/오프 방식으로 및/또는 용량-의존적 방식으로 엄격하게 조절될 수 있다. 본 발명의 AM은 TM의 발현을 직접적 또는 간접적으로 조절할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, AM은 RM을 활성화하고, 이에 의해 활성화된 RM의 존재는 피험자의 세포에서 TM의 발현을 조정 (예, 유도)한다. 따라서, 본 발명의 조절 발현 체계의 다른 장점은, 부작용을 최소화하면서 TM의 치료 효능을 최적화하기 위하여 피험자의 세포에서 발현된 TM의 연속 대 박동성 요법을 선택할 수 있고, TM의 발현 수준을 조정할 수 있다는 것이다. 특히, 본 발명의 조절 발현 체계는 처음으로 MS 피험자에서 박동성에 대하여 연속적이고 지속적인 IFN-β 단백질 요법을 위한 선택할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 다른 장점은, TM을 코드화하는 핵산 벡터의 반복된 투여에 의하여, 피험자의 세포에서 TM의 재생가능한 발현을 제공할 수 있다는 것이다.
더욱 특별하게는, 본 발명의 조절 발현 체계는 최대 치료 효능 및 최소 부작용을 달성하기 위하여 피험자의 세포에서 TM의 발현 수준을 조정 및 최적화함으로써 피험자-특이적 또는 질병-특이적 요법을 가능하게 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "피험자-특이적" 또는 "질병-특이적" 요법이란 특정한 질병, 질병 단계, 또는 질병 상태 또는 증상을 가진 피험자에게 특이적인 치료를 가리킨다. 예를 들어, 본 발명의 조절 발현 체계를 사용하여, MS의 특이적 상태, 증상 또는 단계 (예, 재발, 완화, 원발성 진행성 또는 속발성 진행성)의 치료를 위해, 또는 IFN-β에 대한 피험자의 반응 또는 내성에 따라서 최대 치료 효능 및 최소 부작용을 달성하기 위하여 MS를 가진 피험자의 세포에서 발현된 IFN-β의 수준을 조정하고 최적화할 수 있다.
더욱 특별하게는, 본 발명은 개선된 조절된 유전자 발현 체계, 및 질병의 치료를 위한 제약학적 조성물 및 방법을 제공한다. 코드화된 TM은 질병을 갖거나 걸리기 쉬운 피험자에게 치료적 장점을 제공하는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료 장점" 또는 "치료 활성"은, 이에 한정되지 않지만, 질병 또는 질병의 증상 또는 병의 개시 또는 진행을 개선, 조정, 감소, 억제, 안정화 또는 방지, 지연 또는 느리게 하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "피험자"는 포유동물 (예, 인간), 더욱 특별하게는 질병의 치료가 필요한 포유동물을 가리킨다. "치료", "치료하는", "치료한다" 또는 그의 문법적 동등어는 질병의 단계, 증상 또는 병을 포함하여 질병을 위해 피험자에게 치료적 장점을 제공하는 것을 가리킨다. 본 명세서에서 사용된 "질병"은 질병의 단계, 증상, 병 또는 병변, 또는 질병을 위한 유전적 소인을 포함한다. 이러한 질병은 자가면역 또는 염증성 질병일 수 있다. 일부 구현양태에서, 질병은 암이다. 일부 구현양태에서, 질병은 예를 들어 다발 경화증, 백혈병, 흑색종, 간염 또는 심근병증이다. 또한, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는, 동물 모델에서의 유전자 기능이 정확히 분석되고 인간 질병의 신뢰할 수 있는 동물 모델 (예, 생쥐 모델)이 발생될 수 있도록, 동물 게놈 (예, 생쥐 게놈)에서의 변화를 조작하기 위한 새로운 접근법을 제공한다. 특히, 본 발명의 체계를 사용하여 동물 게놈에서 표적 분자, 예를 들어 표적 유전자 (또는 본 발명의 다른 분자)의 발현이 일시적으로 및 공간-특이적 방식으로 조절될 수 있기 때문에, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는 생물의학적 연구를 위해 매우 귀중한 수단을 제공한다.
또한, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는 시험관내 및 생체내에서 표적 shRNA의 선택적 또는 특유적 발현을 위한 신규의 접근법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 조절 발현 체계를 사용하여, 표적 shRNA를 선택적으로 또는 특유하게 생성하기 위하여 폴리머라제 II (POL II) 기초 발현 체계를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 표적 shRNA를 특유하게 생성하기 위하여, 인트론-함유 유전자에 POL II 프로모터를 작동적으로 연결시킴으로써 본 발명의 조절 발현 체계를 변형시킬 수 있고 shRNA를 생성하기 위해 사용할 수 있으며, 표적 shRNA를 발현하기 위해 MIR 서열을 포함시키는 것에 의해 스플라이스 인트론이 처리된다. 예를 들어, p65 전이활성인자를 폴리머라제 III (POL III) 활성인자 (예, Oct-2Q)와 교환시키는 추가의 잠재적인 변형과 함께, RM-반응성 체계를 생성하기 위하여, 본 명세서에 기재된 본 벡터 및 발현 카세트의 RM 단백질-표적화 GAL-4 결합 부위가 U6 프로모터의 상류에 삽입될 수 있다.
하나의 구현양태에서, 본 발명은, 피험자의 세포에 전달될 때 코드화된 TM이 발현되고 TM의 발현 및/또는 활성이 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 조절되도록, TM을 코드화하는 핵산 서열을 가진 적어도 첫 번째 발현 카세트를 포함하는 개선된 조절 발현 체계를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 본 발명의 분자 (예, TM)의 활성 및/또는 발현의 "조절"이란, 예를 들어 이러한 분자의 활성 및/또는 발현의 유도, 억제, 증가 또는 감소를 가져오는 분자의 발현 및/또는 활성의 조정을 가리킨다. 이러한 조절의 다른 예는, 이에 한정되지 않지만 본 발명의 분자 (예, TM)의 양, 배위, 신호 전달, 결합 특이성, 반감기, 안정성 또는 기타 세포 변형 또는 처리의 조정을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 본 발현 체계의 TM은 조절된다. 그러나, 본 발현 체계에서 조절을 위해 적절한 다른 분자의 예는, 이에 한정되지 않지만 본 명세서에 기재된 RM, 활성인자 분자(AM) 및 불활성인자 분자(IM)를 포함한다.
본 발명의 하나의 구현양태에서, TM의 발현 및/또는 활성은 용량-반응성 또는 용량-의존성 방식으로, 예를 들어 피험자의 세포에 존재하거나 피험자에게 투여되는 RM의 양에 따라서 조절된다. 다른 구현양태에서, TM의 발현 및/또는 활성은 용량-반응성 또는 용량-의존성 방식으로, 예를 들어 피험자의 세포에 존재하거나 피험자에게 투여되는 활성인자 분자(AM) 또는 불활성인자 분자(IM)의 양에 따라서 조절된다. 하나의 구현양태에서, TM의 발현 및/또는 활성은 용량-반응성 또는 용량-의존성 방식으로, 피험자의 세포에 존재하거나 피험자에게 투여되는 동일한 TM 또는 상이한 TM의 양에 따라 조절된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "용량-반응성" 또는 "용량-의존성"이란 두 번째 분자의 특정한 용량 또는 양이 피험자의 세포에 존재하거나 이것을 피험자의 세포에 투여함에 있어서 본 발명의 분자 (예, TM)의 발현 및/또는 활성의 상관관계를 가리킨다. 이러한 두 번째 분자의 예는, RM, AM, IM 또는 TM에 한정되지 않지만 이것을 포함한다. 두 번째 분자의 추가의 예는 세포 분자, 예를 들어 생체마커 (예, 질병과 관련된 생체마커)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "피험자의 세포"는, 피험자로부터의 자가 세포 또는 피험자로부터 유래되지 않지만 본 명세서에 기재된 바와 같이 피험자에게 전달 또는 투여되는 이종 세포 (또는 공여체 세포)를 가리킨다. 바람직하게는, 자가 세포는 피험자에 존재하고, 이종 세포가 피험자에게 전달되고 피험자에 존재한다. 바람직한 구현양태에서, 코드화된 분자가 피험자에 존재하는 세포에서 발현되도록, 본 발명의 조성물, 예를 들어 TM 및/또는 RM을 코드화하는 벡터를 생체내에서 피험자의 자가 세포에 전달한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 조성물, 예를 들어 TM 및/또는 RM을 코드화하는 벡터를 생체외에서 피험자의 자가 또는 이종 세포에 전달하고, 이어서 코드화된 분자가 피험자에 존재하는 세포에서 발현되도록 처리된 세포를 피험자에게 전달한다.
본 발명의 다른 구현양태에서, TM의 발현 및/또는 활성은 배향-의존성이다. 본 명세서에서 사용된 "배향-의존성"은 본 발명의 TM을 코드화하는 발현 카세트의 5'에서 3'으로의 배향, 또는 5'에서 3'으로의 본 발명의 코드화된 TM의 전사 또는 번역 방향을 가리키고; 일부 구현양태에서 배향은 발현 카세트를 포함하거나 또는 TM을 코드화하는 벡터에 관해서; 동일한 벡터 위의 다른 발현 카세트의 배향에 관해서; 또는 동일한 벡터에 의해 코드화되는 다른 분자의 발현의 배향에 관해서이다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, TM을 코드화하는 발현 카세트의 5'에서 3'로의 배향, 또는 코드화된 TM의 전사 또는 번역의 5'에서 3'로의 배향에 관해서, 세포에서 TM의 발현 및/또는 활성이 조정된다. 결국, TM을 코드화하는 발현 카세트의 특정한 배향 또는 TM의 전사 또는 번역의 배향을 선택함으로써 TM 발현 및/또는 활성이 조정될 수 있다.
본 발명의 조절 발현 체계는 TM을 코드화하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고, 본 발명의 하나 이상의 분자, 예를 들어 TM, RM, AM 또는 IM을 코드화하는 추가의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 발현 카세트는 단일 벡터에 또는 하나 이상의 벡터에 존재할 수 있다. 또한, 본 발명은 단일 TM, RM, AM 또는 IM에 제한되지 않고, 본 발명의 하나 이상 또는 다수의 TM, RM, AM 또는 IM을 가진 구현양태를 포함하고, 이것은 하나의 벡터 또는 하나 이상의 벡터에 단독으로 또는 함께 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 본 발명의 하나 이상의 분자, 예를 들어 TM, RM, AM 또는 IM를 코드화하는 핵산 서열을 세포에 삽입하고 발현하기 위해 적절한 핵산을 가리킨다. 본 명세서에서 사용된 "발현 카세트"는 본 발명의 분자 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 TM, RM, AM 또는 IM)의 세포에서 발현을 위한 필수 성분 또는 기능성 서열을 코드화하는 핵산을 가리키고, 이 경우에 분자는 (예를 들어 발현 카세트의 클론화 부위에서) 발현 카세트에 작동적으로 삽입되고 발현 카세트의 기능성 서열에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 의해 코드화된다. 본 명세서에서 사용된 "작동적으로 연결된" 또는 "작동적으로 삽입된" 서열 또는 서열들은, 각각의 서열이 의도하고 알려진 대로 기능하고 및/또는 특정한 결과를 달성하도록, 다른 서열과 함께 융합되거나 연결되거나 부착되거나 또는 다른 방식으로 함께 소집되는 서열 또는 서열들을 가리킨다 (예를 들어, 프로모터 서열은 코드화된 유전자의 전사를 촉진하기 위해 유전자 서열에 작동적으로 연결된다).
도 1A 및 도 1B는, 1) 치료 분자(TM)를 코드화하는 첫 번째 핵산 서열 및 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 DNA-결합 부위(DBS) 및 TATA 서열을 코드화하는 첫 번째 프로모터 서열을 포함하는 첫 번째 발현 카세트; 2) 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열 및 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 프로모터 서열을 포함하는 두 번째 발현 카세트, 여기에서 RM은 DNA-결합 도메인(DBD), 리간드-결합 도메인(LBD), 및 조절 도메인(RD), 및 더욱 특별하게는 도 1B에서 활성화 도메인(AD)을 포함한다; 및 4) 활성화 또는 불활성화 RM의 존재가 TM의 발현 및/또는 활성을 조절하도록 각각 RM을 활성화하거나 RM을 불활성화하는 활성인자 또는 불활성인자 분자(A/IM)를 포함하는, 본 발명의 조절 발현 체계의 비제한적 예를 도시한다.
하나의 구현양태에서, 첫 번째 발현 카세트는 다음과 같은 작동적으로 연결된 기능성 서열: 6x GAL-4 DBS, E1b TATA 및 전사 출발 부위 (예, SEQ ID NO:1), 5' 비번역 영역 UT12 (예, SEQ ID NO:2), 합성 인트론 IVS8 (예, SEQ ID NO:3), 다수 클론화 부위 (예, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5), 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 (폴리(A)) 부위 (예, SEQ ID NO:6)를 포함하고; 두 번째 발현 카세트는 다음과 같은 작동적으로 연결된 기능성 서열: 닭 골격근 알파-액틴 프로모터 (예, SEQ ID NO:7) 및 SV40 폴리(A) 부위 (예, SEQ ID NO: 8)을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트가 하나의 벡터에 존재한다 (예를 들어, 도 1A 내지 B에 도식적으로 나타냄). 다른 바람직한 구현양태에서, 벡터는 단일 플라스미드 벡터, 예를 들어 pGT1 (SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:4 의 서열 포함), pGT2 (SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO:4의 서열 포함), pGT3 (SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:4의 서열 포함) 또는 pGT4 (SEQ ID NO:12)이고, 여기에서 각각의 벡터는 IVS8의 3' 및 hGH 폴리(A) 부위의 5'에 위치한 다수 클론화 부위 (SEQ ID NO:4) (예를 들어, 도 14A-D에 개략적으로 나타냄), 또는 pGT11 (SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함), pGT12 (SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함), pGT13 (SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함) 또는 pGT14 (SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함)을 포함하고, 여기에서 각각의 벡터는 IVS8의 3' 및 hGH 폴리(A) 부위의 5'에 위치한 다수 클론화 부위 (SEQ ID NO:5)를 포함한다.
또한, 바람직한 구현양태에서, TM은 IFN-β 또는 GMCSF이다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, 첫 번째 핵산 서열은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IFN-β 1a이고, SEQ ID NO:14의 핵산 서열에 의해 코드화되는 TM을 코드화한다. 다른 구현양태에서, 첫 번째 핵산 서열은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 생쥐 IFN-β인 TM을 코드화하고, 이것은 SEQ ID NO:16의 핵산 서열에 의해 코드화된다. 다른 구현양태에서, 첫 번째 핵산 서열은 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GMCSF이고, SEQ ID NO:18의 핵산 서열에 의해 코드화된다. 다른 구현양태에서, 첫 번째 핵산 서열은 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 생쥐 GMCSF인 TM을 코드화하고, SEQ ID NO:20의 핵산 서열에 의해 코드화된다. 또한, 바람직한 구현양태에서, RM은 야생형 또는 자연-발생 프로게스테론 수용체(PR)의 변형체이다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, 두 번째 핵산은 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 PR인 RM을 코드화하고, 이것은 SEQ ID NO:21의 핵산 서열에 의해 코드화된다.
바람직한 구현양태에서, TM을 코드화하는 핵산 서열이 단일 플라스미드 벡터의 첫 번째 발현 카세트의 MCS의 SpeI 및 NotI 제한 효소 부위 내에 삽입되거나 클론화된다. 하나의 구현양태에서, TM을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 플라스미드 벡터는 예를 들어 pGT23 (SEQ ID NO:23), pGT24 (SEQ ID NO:24), pGT25 (SEQ ID NO:25) 또는 pGT26 (SEQ ID NO:26)이고, 여기에서 코드화된 TM은 생쥐 IFN-β (예, SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 SEQ ID NO:16을 포함하는 핵산 서열에 의해 코드화됨)이고, 코드화된 TM 및 삽입된 핵산 서열의 전사의 5'-3' 배향을 도 15A에 개략적으로 도시한다 (화살표 참조). 다른 구현양태에서, TM을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 하나의 플라스미드 벡터는 예를 들어 pGT27 (SEQ ID NO:27), pGT28(SEQ ID NO:28), pGT29 (SEQ ID NO:29) 또는 pGT30 (SEQ ID NO:30)이고, 여기에서 코드화된 TM은 인간 IFN-β (예, SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 SEQ ID NO:14을 포함하는 핵산 서열에 의해 코드화됨)이고, 코드화된 TM 및 삽입된 핵산 서열의 전사의 배향을 도 15B에 개략적으로 도시한다 (화살표 참조).
또한, 하나의 구현양태에서, 단일 플라스미드 벡터는 벡터 주쇄의 핵산 서열 (예, SEQ ID NO:12), MCS (예, SEQ ID NO:31) 및 SpeI-NotI 단편 (SEQ ID NO:31)을 포함하고, 여기에서 단편은 생쥐 IFN-β인 TM을 코드화하고 MCS에서 SpeI-NotI 부위에서 단편의 삽입을 위해 적합한 5' 말단에서 SpeI 서열 및 3' 말단에서 NotI 서열을 갖고, MCS의 SpeI-NotI 부위에 삽입된다. 또한, 하나의 구현양태에서, 단일 플라스미드 벡터는 벡터 주쇄의 핵산 서열 (예를 들어, SEQ ID NO:12), MCS (예, SEQ ID NO:32) 및 SpeI-NotI 단편 (SEQ ID NO:31)을 포함하고, 여기에서 단편은 인간 IFN-β인 TM을 코드화하고, MCS에서 SpeI-NotI 부위에서 단편의 삽입을 위해 적합한 5' 말단에서 SpeI 서열 및 3' 말단에서 NotI 서열을 가지며, MCS의 SpeI-NotI 부위에 삽입된다.
또한, 하나의 구현양태에서, AM은 RM에 결합하고 RM을 활성화하며, 이에 의해 활성화된 RM이 TM 서열에 작동적으로 연결되는 프로모터 서열의 DBS에 결합하며, 그 결과 세포 (예, 포유동물 세포)에서 TM 발현 및/또는 활성이 유도된다. 그러나, 다른 구현양태에서, 불활성인자 분자(IM)는 RM에 결합하여 RM을 불활성화시키고, 이에 의해 불활성화된 RM이 TM 프로모터의 DBS에 결합하지 않고 그 결과 TM 발현 및/또는 활성의 유도가 억제되거나 결여된다. 도 1B에 도시된 실시예의 하나의 구현양태에서, 활성인자 분자(AM)가 RM의 LBD에 결합하고 RM을 활성화시키며, 이에 의해 활성화된 RM이 TM 서열에 작동적으로 연결되는 프로모터의 DBS에 결합하는 단독이량체를 형성하고, 그 결과 세포 (예, 포유동물 세포)에서 TM 발현 및/또는 활성을 유도한다. 도 1A 및 1B에 도시된 실시예의 다른 구현양태에서, 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트가 단일 벡터에 존재한다. 다른 바람직한 구현양태에서, TM을 코드화하는 첫 번째 발현 카세트 및 본 발명의 RM을 코드화하는 두 번째 발현 카세트가 단일 벡터 (예, pGT23 (SEQ ID NO:23), pGT24 (SEQ ID NO:24), pGT25 (SEQ ID NO:25), pGT26 (SEQ ID NO:26), pGT27 (SEQ ID NO:27), pGT28 (SEQ ID NO:28), pGT29(SEQ ID NO:29) 또는 pGT30 (SEQ ID NO:30))에 존재한다.
본 명세서에서 사용된 "치료 분자" 또는 "TM"은 치료 활성을 갖거나 치료 장점을 제공하는 분자를 가리킨다. 본 발명의 TM은 핵산 서열에 의해 코드화되고 치료 활성을 갖는 단리된 DNA, RNA, 또는 단백질, 또는 그의 변형체일 수 있다. 여기에서 사용된 "변형체"는, 뮤테인, 예를 들어 단리된 DNA, RNA, 단백질 또는 화학 화합물의 뮤테인을 포함한다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 TM은 변형, 합성 또는 재조합 DNA, RNA 또는 단백질일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "변형"은, 예를 들어 돌연변이, 융합 또는 키메라 분자를 포함하여 화학적, 합성적 또는 재조합 기술에 의해 변형되는 분자를 포함한다. 하나의 구현양태에서, 코드화된 TM은 피험자의 세포에서 발현되고 절단되거나 처리된 단백질이고, 이에 의해 다수의 TM, 또는 활성화 TM, 또는 발현되고 절단되지 않거나 처리되지 않은 TM과 상이한 TM이 얻어진다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 코드화된 TM은 치료 활성을 갖는 핵산 (예, RNA)이다. 하나의 구현양태에서, 코드화된 RNA는 피험자의 세포에서 증배되거나 차별적으로 스플라이스된 다수의 스플라이스 부위를 코드화한다. 일부 구현양태에서, 증배- 또는 차별적으로 스플라이스된 RNA는 상이하거나 또는 변형된 단백질을 코드화하거나, 또는 유사하거나 별도의 치료 활성을 가진 상이하거나 변형된 RNA를 포함한다. 일부 구현양태에서, 증배- 또는 차별적으로-스플라이스된 RNA는 특이적 인자, 질병, 병 또는 조직의 존재에 반응하여 스플라이스된다.
본 발명의 다른 구현양태에서, 코드화된 TM은 치료 활성을 가진 단백질이고 바람직하게는 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 추가의 구현양태에서, 이러한 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 유전자 또는 유전자 단편이다. 하나의 구현양태에서, TM은 과립구 포식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF)이다. 다른 구현양태에서, TM은 인터페론, 예를 들어 인터페론-베타 (IFN-β), 더욱 특별하게는 IFN-β 1a 또는 IFN-β 1b이다. 일부 구현양태에서, 코드화된 TM은 항체이고 바람직하게는 단클론성 항체 (예, CAMPATH)이다. 단클론성 항체를 코드화하는 적절한 서열은 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 동정되거나 형성될 수 있고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 조절 발현 체계의 벡터 내에 삽입된다. 단클론성 항체의 치료 활성이 보고되어 있다 (예를 들어, [Gatto,B. (2004) 4:411-414; Groner 등 (2004) 4:539-547] 참조.
본 명세서에서 사용된 "조절인자 분자" 또는 "RM"은 본 발명의 TM의 발현 및/또는 활성을 조절하는 분자를 가리킨다. 본 발명의 RM에 의한 이러한 조절의 예는, 이에 한정되지 않지만 본 발명의 RM에 의한 TM 발현 및/또는 활성의 조절, 더욱 특별하게는 TM 발현 및/또는 활성의 증가, 저하, 활성화 (또는 유도) 또는 불활성화 (또는 억제)를 포함한다. 또한, 본 발명의 RM에 의한 TM 발현 및/또는 활성의 조정은 직접적 (예, RM과 TM의 직접적 접촉에 의해) 또는 간접적 (예, TM 발현 및/또는 활성의 조정을 가져오는 신호 전달 경로에서 RM이 분자에 영향을 미치는 경우)일 수 있다. 본 발명의 조절 발현 체계에서 사용하기 위해 적절한 RM의 예는, 이에 한정되지 않지만 본 발명의 TM의 세포 발현, 활성 또는 처리에 영향을 미치는 분자를 포함한다. 이러한 적절한 RM의 예는, 이에 한정되지 않지만 전사 조절 분자 (예를 들어, 발현된 TM의 RNA의 전사를 활성화하거나, 불활성화하거나, 저하시키거나 증가시키는 분자); RNA 처리 분자 (예, RNA 스플라이싱, 폴리아데닐화 또는 발현된 TM의 RNA의 절단과 같이 RNA 처리를 활성화하거나, 불활성화하거나, 감소시키거나 증가시키는 분자); 또는 단백질의 단백질 번역 또는 후-번역 처리에 영향을 미치는 분자 (예, 발현된 TM의 단백질의 특정한 배위 또는 다량체 형태의 포스포릴화, 절단 또는 형성을 활성화하거나, 불활성화하거나, 감소시키거나, 증가시키는 분자)를 포함한다.
본 발명의 RM은 자연-발생 또는 단리된 분자 또는 그의 변형체일 수 있다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 RM은 합성 또는 재조합 분자이다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 본 발명의 RM은 화학 화합물, DNA, RNA 또는 단백질이다. 또한, 추가의 구현양태에서, 본 발명의 RM은 변형된 분자이다. 하나의 구현양태에서, RM은 인간화 단백질이다. 다른 구현양태에서, RM은 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, RM은 전사 활성인자, 예를 들어 스테로이드 수용체, 더욱 특별하게는 프로게스테론 수용체이다. 하나의 구현양태에서, RM은 전이활성화 도메인 (예, VP16 또는 p65 전이활성화 도메인, 예를 들어 [Schmitz 등 (1991) EMBO J 10: 3805-3817; Moore 등 (1993) Molec and Cell Biol 13:1666; Blair 등 (1994) Molec and Cell Biol 14: 7226-7234], 및/또는 공동-활성인자 (예, p300/CBP)의 기타 작용성 도메인 (예, 기본 인자 상호작용 도메인), 기본 전사 인자 (예, TFIIB), 또는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (예, p300/CBP 또는 P/CAF)를 포함한다 [Latchman, D. (2004) Eukaryotic Transcription Factors, Elsevier Academic Press, London; Goodman 등 (2000) Genes & Devl 14: 1553-1577; Shikama 등 (1997) Trends in Cell Bio 7: 230-236]. 다른 구현양태에서, RM은 리간드-결합 도메인(LBD)을 포함한다. 또한, 하나의 구현양태에서, AM은 RM의 LBD에 결합하고, 이에 의해 활성화된 RM의 존재가 TM 발현 및/또는 활성을 조절하도록 RM을 활성화시킨다. 다른 구현양태에서, RM은 DBD, 예를 들어 GAL-4 DBD를 포함한다. 하나의 구현양태에서, RM은 TM을 코드화하는 핵산에 작동적으로 연결된 기능성 서열 (예, 프로모터 서열)에 결합하는 DBD를 포함하고, 이에 의해 TM 발현을 조절한다 (예를 들어, TM 발현을 유도한다).
다른 구현양태에서, 본 발명의 RM은 활성인자 분자(AM)에 의해 활성화되고, 이에 의해 활성화된 RM의 존재하에서 TM 발현 및/또는 활성이 조절된다. 본 명세서에서 사용된 "활성인자 분자" 또는 "AM"은 본 발명의 RM의 발현 및/또는 활성을 유도하거나 증가시키는 분자를 가리킨다. AM에 의한 활성화의 예는, 이에 한정되지 않지만 본 발명의 RM의 발현 및/또는 활성에서의 유도 또는 증가를 포함한다. 본 발명의 AM에 의한 RM 발현 및/또는 활성의 활성화는 직접적 (예를 들어, AM과 RM의 직접적 접촉에 의해) 또는 간접적 (예를 들어, AM이 신호 전달 경로에서 분자에 영향을 미쳐서 RM 발현 및/또는 활성의 조정을 가져오는 경우)일 수 있다. 본 발명의 조절 발현 체계에서 사용하기 위해 적절한 AM의 추가의 예는, 이에 한정되지 않지만 본 발명의 RM의 세포 처리에 영향을 미치는 분자를 포함한다 (이러한 세포 처리의 예는 예를 들어 상기 기재된 바와 같다).
하나의 구현양태에서, AM은 생체마커이다. 추가의 구현양태에서, AM은 질병 또는 병을 위한 생체마커이고, 더욱 특별하게는 질병 상태 또는 병 또는 그의 증상을 위한 생체마커이다. 하나의 구현양태에서, AM은 형태 변화, 효소 처리 또는 변형, 특이적 결합 또는 RM의 이량체화를 촉진하거나 억제함으로써 RM을 활성화한다. 바람직한 구현양태에서, AM은 RM의 단독이량체화를 촉진함으로써 RM을 활성화한다. 하나의 구현양태에서, AM은 RM에 결합하고, 더욱 특별하게는 RM의 기능성 도메인, 예를 들어 RM의 AD에 결합함으로써 RN을 활성화시킨다.
본 발명의 AM은 자연-발생 또는 단리된 분자 또는 그의 변형체일 수 있다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 AM은 합성 또는 재조합 분자이다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 본 발명의 AM은 화학 화합물, DNA, RNA 또는 단백질이다. 또한, 일부 구현양태에서, 본 발명의 AM은 변형 분자이다. 하나의 구현양태에서, AM은 인간화 단백질이다. 다른 구현양태에서, AM은 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 하나의 구현양태에서, AM은 화학 화합물, 예를 들어 안티프로게스틴이다. 바람직한 구현양태에서, AM은 미페프리스톤이다.
하나의 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계는 1) 첫 번째 핵산 서열의 상류에 위치하고 이것에 작동적으로 연결된, TM을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열 및 적어도 하나의 GAL-4 DNA-결합 부위(DBS), 더욱 특별하게는 6개의 GAL-4 DBS (6XGAL-4 DBS)를 가진 첫 번째 발현 카세트; 2) VP-16 AD 또는 p65 AD (예를 들어, SEQ ID NO:39의 핵산 서열을 포함하는 p65 AD 또는 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열), 프로게스테론(PR) LBD, 및 GAL-4 DBD를 포함하는 변형 프로게스테론 수용체인 RM을 코드화하는 두 번째 핵산 서열, 및 두 번째 핵산 서열의 상류에 위치하고 이것에 작동적으로 연결된 액틴 프로모터 서열을 갖는 두 번째 발현 카세트; 및 3) 피험자에게 경구 투여될 때 피험자의 세포에서 발현된 RM을 활성화하고 이에 의해 활성화된 RM이 6XGAL-4 DBS에 결합된 이량체를 형성하고 코드화된 TM의 발현을 유도하는 소 분자 유도제, 예를 들어 미페프리스톤(MFP)인 AM을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트가 단일 벡터에 존재한다.
다른 구현양태에서, 본 발명의 RM은 전사 조절인자, 더욱 특별하게는 돌연변이된 스테로이드 수용체이다. 하나의 구현양태에서, RM은 돌연변이된 인간 PR (hPR)이고, 돌연변이된 hPR 수용체 LBD (예를 들어, 약 19-66개 아미노산의 C-말단 결실을 가짐)를 포함하고, 여기에서 RM은 돌연변이 PR이 유래되는 야생형 PR의 길항제인 AM의 존재하에서 활성화된다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 RM은 조절 도메인(RD), 예를 들어 활성화 도메인(AD), 더욱 특별하게는 전이활성화 도메인(TD)을 포함한다. 본 발명의 RM에서 사용하기 위한 적절한 조절 도메인의 예는 이에 한정되지 않지만 당 기술분야에 공지되거나 본 명세서에 기재된 것을 포함한다 (예, TAF-1, TAF-2, TAU-1 및 TAU-2).
다른 구현양태에서, 본 발명의 RM은 불활성화되고, 이에 의해 TM 발현 및/또는 활성은 불활성화 RM의 존재 하에서 조절된다. 본 명세서에서 사용된 "불활성인자 분자" 또는 "IM"이란 본 발명의 RM의 발현 및/또는 활성을 불활성화시키는 분자를 가리킨다. IM에 의한 이러한 불활성화의 예는, 이에 한정되지 않지만 본 발명의 RM의 발현 및/또는 활성에서의 억제 또는 감소를 포함한다. 또한, 본 발명의 IM에 의한 RM 발현 및/또는 활성에서의 불활성화는 직접적 (예를 들어 IM과 RM의 직접 접촉에 의해) 또는 간접적 (예, RM 발현 및/또는 활성의 불활성화를 일으키는 신호 전달 경로에서 IM이 분자에 영향을 미치는 경우)일 수 있다. 본 발명의 조절 발현 체계에서 사용하기 위해 적절한 IM의 추가의 예는, 이에 한정되지 않지만 본 발명의 RM의 세포 처리에 영향을 미치는 분자를 포함한다 (이러한 세포 처리의 예는 본 명세서, 예를 들어 상기에 기재되어 있다).
하나의 구현양태에서, 본 발명의 RM은 활성화된 형태로 피험자의 세포에서 발현되거나 존재하고, 불활성인자 분자(IM)의 존재 하에서 불활성화되며, 이에 의해 TM 발현 및/또는 활성이 불활성화 RM에 의해 조절된다. 다른 구현양태에서, IM은 생체마커이다. 추가의 구현양태에서, IM은 질병 또는 상태를 위한 생체마커이고, 더욱 특별하게는 질병 상태 또는 병 또는 그의 증상을 위한 생체마커이다. 하나의 구현양태에서, IM은 형태 변화, 효소 처리, 특이적 결합 또는 RM의 이량체화를 촉진하거나 억제함으로써 RM을 불활성화한다. 바람직한 구현양태에서, IM은 RM의 단독이량체화를 억제함으로써 RM을 불활성화한다. 하나의 구현양태에서, IM은 RM에, 더욱 특별하게는 RM의 기능성 도메인, 예를 들어 RM의 AD에 결합함으로써 RM을 불활성화한다.
본 발명의 IM은 자연-발생 또는 단리된 분자, 또는 그의 변형체일 수 있다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 IM은 합성 또는 재조합 분자이다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 본 발명의 IM은 화학 화합물, DNA, RNA 또는 단백질이다. 또한, 일부 구현양태에서, 본 발명의 IM은 변형된 분자이다. 하나의 구현양태에서, IM은 인간화 단백질이다. 다른 구현양태에서, IM은 인간 단백질 또는 그의 변형체이다. 바람직한 구현양태에서, IM은 화학 화합물이다.
본 발명의 TM, RM, AM 또는 IM의 발현은 구조적이거나 일시적일 수 있다. 일부 구현양태에서, TM, RM, AM 또는 IM의 발현은 조절되거나 조직-특이적 (예를 들어, 근육-특이적)이다. 조절된 RM의 예는, 이에 한정되지 않지만 AM에 의해 활성화되거나 IM에 의해 불활성화되는 RM을 포함한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 TM, RM, AM 또는 IM의 발현은 조절된 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터에 의해 조종된다. 추가의 구현양태에서, 조절 또는 조직-특이적 프로모터는 RM의 존재 하에서 조절되고, 더욱 특별하게는 RM을 프로모터에 결합시킴으로써 조절된다. 하나의 구현양태에서, 조직-특이적 프로모터는 근육-특이적 프로모터이고, 더욱 특별하게는 액틴 프로모터이다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 RM은 TM을 코드화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터에 결합되고, 이에 의해 피험자의 세포에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 코드화된 TM의 발현을 조절한다.
본 발명의 TM, RM, AM 또는 IM은 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산, 단백질 및 화학 화합물을 위해 공지된 방법 및 분석을 사용하여 단리되고, 생성되고, 변형될 수 있다.
제약학적 조성물 및 치료 방법
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 개선된 조절 발현 체계를 포함하는 각종 질병을 치료하기 위한 제약학적 조성물 및 방법을 제공한다.
특정한 구현양태에서, 본 발명은, 코드화된 TM이 피험자의 세포 내에서 발현되고 이러한 TM 발현이 RM의 존재하에서 조절되도록 피험자의 세포를 본 발명의 조절 발현 체계와 접촉시키는 것을 포함하는, 피험자의 세포 내에서 TM의 발현을 조절하거나; TM을 투여하거나; TM을 전달하거나; 또는 TM을 발현하는, 질병 또는 병을 치료하기 위한 제약학적 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 TM, RM, AM 또는 IM을 포함하고, 일부 구현양태에서 이러한 분자를 코드화하는 핵산 서열은 단일 벡터에서 또는 하나 이상의 벡터에서 단독으로 또는 함께 존재한다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 하나 이상의 각각의 TM, RM, AM 또는 IM 및 그의 1 종류 이상을 포함할 수 있다 (예를 들어, 첫 번째 및 두 번째 TM, RM, AM 및/또는 IM). 더욱 특별하게는, 본 발명의 제약학적 조성물은 하나 이상의 각각의 TM, RM, AM 또는 IM을 코드화하는 핵산 서열 및 그의 1 종류 이상을 포함할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 벡터 (예를 들어, pGT23 (SEQ ID NO:23), pGT24 (SEQ ID NO:24), PGT25 (SEQ ID NO:25), pGT26 (SEQ ID NO:26), pGT27 (SEQ ID NO:27), pGT28 (SEQ ID NO:28), pGT29 (SEQ ID NO:29) 또는 pGT30 (SEQ ID NO:30))를 포함한다.
일부 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 AM 또는 IM을 포함한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 적어도 하나의 TM 및/또는 RM을 코드화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 본 발명의 TM, RM, AM 및 IM은 별도로 또는 함께 피험자에게 투여될 수 있고, 여기에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 적절한 투여 방식을 사용하여 생체외 또는 생체내 투여될 수 있다. 이러한 적절한 투여 수단의 예는, 이에 한정되지 않지만 주사 (예, 근육내 또는 피하 주사), 경구 투여 및 전기천공을 포함한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 TM 및 RM이 단일 벡터에 존재하고, RM을 활성화하는 AM으로부터 별도로 투여된다 (이에 의해, 활성화 RM의 존재는 TM 발현 및/또는 활성을 조절한다). 추가의 구현양태에서, AM은 피험자에게 경구 투여되는 화합물 (예, 미페프리스톤)이고, TM 및 RM을 코드화하는 단일 벡터는 피험자의 세포 (예, 골격근 세포)에 주사에 의해 또는 전기천공에 의해 투여되는 단일 벡터이다. 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 적절한 수단의 예는 조성물, 예를 들어 TM 및/또는 RM을 코드화하는 핵산 벡터를 피험자의 세포에 생체외 전달하고, 이어서 처리된 세포를 피험자에게 전달하여 코드화된 분자가 피험자의 세포에서 발현되도록 하는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Studeny 등 (2004) J Natl Cancer Inst 96(21): 1593-1603]; [Studeny 등 (2002) Cancer Res 62(13): 3603-3608] 참조).
하나의 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계는 주사에 의해 피험자에게 투여된 치료 유전자 (예, IFN-β 유전자)를 코드화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "치료 유전자"란 TM, 예를 들어 치료 활성을 가진 단백질을 코드화하는 유전자를 가리킨다 (예를 들어, IFN-β 1a 또는 1b). 특정한 구현양태에서, 유전자는 IFN-β 1a이고, 본 발명의 벡터를 사용하여 단일 근육내 주사로서 주기적으로, 예를 들어 3 내지 6개월에 투여된다. 다른 구현양태에서, 치료 유전자는 매 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 6 내지 9개월, 또는 9 내지 12개월에 투여된다. 다른 구현양태에서, 발현된 단백질의 순환 수준의 조절은 표적 피험자 세포 또는 조직에서 코드화된 단백질의 발현을 조종하는 프로모터의 조절된 유도에 의해 달성될 수 있다.
바람직한 구현양태에서, RM은 경구 이용가능한 환제의 형태에서 TM, 더욱 특별하게는 치료 유전자의 프로모터 유도 및 이후의 발현을 조절하는 소 분자 활성인자 이다. 이러한 방식으로, 순환에서 발현된 TM (예, 단백질 또는 핵산)의 수준이 온/오프 방식으로 및/또는 용량-의존적 방식으로 엄격하게 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조절 발현 체계는 TM (예, 단백질 또는 핵산)의 연속 대 박동성 요법의 선택을 처음으로 가능하게 하고, 부작용을 최소화하면서 TM의 치료적 효능을 최적화하기 위하여 TM의 발현 수준을 조정할 수 있다. 특히, 본 발명의 조절 발현 체계는 피험자에서 연속 대 박동성 TM 요법의 선택을 처음으로 가능하게 하고, 더욱 특별하게는 질병의 치료를 위해 최대의 치료 효능 및 최소의 부작용을 달성하기 위해 피험자의 세포 내에서 TM의 발현 수준을 조정하고 최적화함으로써 피험자-특이적 요법을 가능하게 한다.
본 발명의 조절 발현 체계를 사용하여, TM (예, 단백질 또는 핵산)을 코드화하는 핵산이 질병의 치료를 위해 피험자의 표적 세포에 전달될 수 있다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 조절 발현 체계를 사용하여, TM을 코드화하는 핵산을 피험자의 표적 세포에 전달할 수 있고, 그 결과 발현된 TM이 치료적 유효 용량 또는 양으로 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 TM의 "치료적 유효 용량" 또는 "치료적 유효 량"은 질병의 치료가 필요한 피험자의 세포에 존재할 때 피험자에게 치료 장점을 얻게 되는(즉, 질병의 치료를 얻게 되는) 용량 또는 양이다. 또한, 피험자에게 투여되거나 피험자의 세포에 존재하는 TM을 코드화하는 핵산의 적절한 양 또는 용량; 또는 피험자의 세포에서 TM을 존재시키거나 및/또는 TM의 치료적 유효 량을 가져오는, 피험자의 세포에 투여되고/되거나 피험자의 세포에 존재하는 RM, AM 또는 IM, 또는 RM, AM 또는 IM을 코드화하는 핵산의 양 또는 용량은, 당업자에 의해서 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, 피험자에게 투여되는 RM 또는 RM을 코드화하는 핵산의 적절한 용량 또는 양은, 치료적 유효 용량이 달성되도록 피험자의 세포에서 TM의 발현 및/또는 활성을 조절 (예, 유도)하는 용량 또는 양이다.
치료적 유효 용량을 구성하는 TM의 양에 영향을 미치는 인자는, 이에 한정되지 않지만, 치료되어질 질병의 중증도 및 병력, 및 치료를 받는 피험자의 연령, 건강 및 신체 조건을 포함한다. 본 발명의 TM의 치료적 유효 용량은 치료를 받는 피험자에서 질병의 투여 빈도 및 중증도에 의존할 수 있다. 원하는 효과, 예를 들어 질병, 질병과 연관된 증상, 질병 중증도 및/또는 질병의 재발의 주기성의 예방 및/또는 개선을 달성하기 위해 필요한 이상, 본 발명의 TM의 투여 섭생법을 계속할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 1년 이하 내지 무기한의 기간 동안, 예컨대 1개월 내지 30년 동안, 약 3개월 내지 약 20년, 약 6개월 내지 약 10년 동안 투여 섭생법을 계속한다.
본 발명의 조절 발현 체계에서 사용하기 위해 적절한 핵산의 예는, 이에 한정되지 않지만 치료 활성을 가진 호르몬, 성장 인자, 효소, 사이토카인, 수용체 또는 MHC 분자를 위한 유전자를 코드화하는 핵산을 포함한다. 추가로, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절한 유전자는, 주요 단백질을 코드화하는 핵산이 도입될 수 있는 세포에 외인성 또는 내인성인 핵산 서열을 포함한다. 질병을 치료하기 위한 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 특히 중요하고 적합한 것은, 부재하거나, 감소된 양으로 생성되거나 또는 유전자 질병을 갖고 있거나 유전자 질병에 민감한 피험자에서 돌연변이 형태로 생성되는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자이다. 이러한 유전자 질병의 예는 이에 한정되지 않지만 망막모세포종, 윌름즈 종양, 아데노신 데아미나제 결핍(ADA), 지중해빈혈, 낭성섬유증, 시클 세포 질병, 헌팅톤 무도병, 뒤시엔느 근위축증, 페닐케톤뇨증, 레쉬-니한(Lesch-Nyhan) 증후군, 고쉐 질병 및 타이-사크(Tay-Sach) 질병을 포함한다.
또한, 질병의 치료를 위한 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 특히 중요하고 적합한 것은 종양 억제인자 유전자를 코드화하는 핵산이다. 이러한 적절한 종양 억제인자 유전자의 예는 이에 한정되지 않지만 망막모세포종, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 인간 성장 호르몬(HGH), TNF, TGF-β, TGF-α, 헤모글로빈, 인터류킨, 동시-자극 인자 B7, 인슐린, 인자 VIII, 인자 IX, PDGF, EGF, NGF, EPO 및 β-글로빈 뿐만 아니라 이러한 유전자에 의해 코드화되는 단백질의 생물학적 또는 치료 활성 뮤테인을 포함한다. 표적 세포에 전달하기 위해 적절한 유전자는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으나, 바람직하게는 포유동물 종, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있다. 또한, 적절한 유전자의 원천으로서 바람직한 종은, 본 발명의 방법 및 조성물, 예를 들어 포유동물 종, 바람직하게는 인간을 사용하여주요 유전자가 전달되어지는 종이다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절한 핵산의 예는 이에 한정되지 않지만 항염증, 항바이러스 또는 항암 활성을 가진 단백질 또는 핵산 TM을 코드화하는 것을 포함한다. 이러한 적절한 핵산의 예는, 이에 한정되지 않지만 항암 활성을 가진 과립구 포식세포 자극 콜로니 인자(GMCSF) 또는 그의 변형체 (예, 류킨(Leukine)(R) 또는 인간 GMCSFLeu23Asp27Glu39)를 코드화하는 것을 포함한다 (예를 들어 미국 특허 5,032,676호; 5,391,485호; 및 5,393,870호의 GMCSF 돌연변이체 참조). 또한, 예를 들어, 적절한 핵산은 이에 한정되지 않지만 항염증 또는 항바이러스 활성을 가진 인터페론, 예를 들어 인터페론, 특히 IFN-β, 더욱 특별하게는 IFN-β 1a 또는 IFN-β 1b를 코드화하는 것을 포함한다.
바람직한 구현양태에서, 치료를 필요로 하는 피험자에게 IFN-β, 더욱 바람직하게는 IFN-β 1a인 TM을 코드화하는 핵산을 전달하여 IFN-β가 피험자의 세포에서 발현되고 IFN-β의 발현 및/또는 활성이 RM에 의해 조절되도록 함으로써, MS를 치료하기 위하여 본 발명의 조성물 및 방법이 사용된다.
MS는 중추 신경계(CNS)에서 국소 염증을 특징으로 하는 만성 중증 질병이다 (예를 들어, 문헌 [Hemmer 등 (2002) Neuroscience 3: 291-301]; [Keegan 등 (2002) Ann.Rev.Med. 53: 285-302]; [Young,V. Wee (2002) Neurology 59: 802-808]; [Goodin 등 (2001) Am.Academy of Neurology 58: 169-178] 참조). 신경 세포의 수초 주위로부터 수초를 절연시키는 것 (수초탈락)과 수초의 변성의 조합된 소실이 질병의 현저한 특징이다. 국소 염증으로부터 유발되어, 성상세포 증식은 백색질에서 경화성 병변의 형성을 유도한다 (예를 들어, [Prineas (1985) Demyelinating Disease, Elsvevier: Amsterdam; Raine (1983) Multiple Sclerosis, Williams and Winkins: Baltimore; Raine 등 (1988) J.Neuroimmunol. 20: 189-201]; 및 [Martin (1997) J.Neural Transmission (Suppl) 49: 53-67] 참조).
질병의 개시에서 MS 피험자 집단의 2개의 주된 유형이 존재한다: 재발-완화 MS를 가진 피험자 및 원발성 진행성 MS를 가진 환자. 재발-완화 MS는, 새로운 신경학적 결핍이 발생하거나 기존의 신경학적 결핍이 악화되고 임상 증상이 안정화되거나 감소되는 완화 기간이 존재하는 에피소드 (이른바, 재발 또는 악화)를 특징으로 하는 반면, 원발성 진행성 MS 피험자는 악화 없이 진행하는 신경학적 황폐를 겪는다. 재발-완화 MS를 가진 피험자의 큰 집단은, 중복되는 재발과 함께 또는 중복되는 재발 없이, 질병 과정 동안에 재발과는 무관하게 신경학적 증상의 악화를 경험한다. 질병의 이 단계에 이르르면, 이것은 속발성 진행성 MS라 일컬어진다.
MS의 임상적 증상은, 뇌 및 척수 내로 염증성 침윤물의 도입을 가능하게 하는 혈액-뇌 장벽(BBB)에서의 국소 파괴로부터 비롯되는 것으로 생각된다. 또한, 이러한 침윤물은 수초탈락, 축삭변성 및 흉터 조직 형성 및 CNS 미엘린 생성에 필수적인 희소돌기아교세포의 변성을 유도하는 다양한 림프구 및 포식세포로 구성되는 것으로 생각된다 (예를 들어, [Martin (1997) J.Neural Transmission (Suppl) 49: 53-67] 참조). 결국, 신경-절연 미엘린 및 손상된 미엘린을 복구하는 희소돌기아교세포의 능력이 심각하게 손상된다 (예를 들어, 문헌 [Scientific American 269 (1993): 106-114] 참조). 이러한 MS의 증상은 팔과 다리에서 통증 및 저림, 국소 및 전신 무감각, 근육 연축 및 약화, 서있거나 보행 시의 균형 곤란, 말하고 삼키는 것의 곤란, 인지 결핍, 피로, 및 창자 및 방광 기능부전을 포함한다.
MS를 위한 치료가 알려져 있지 않지만, MS를 가진 피험자에서 근원적 질병의 중증도를 감소시키는데 있어서 인터페론을 사용한 면역조정 요법이 성공적인 것으로 입증되었다. 인터페론은 항바이러스, 항증식 및 면역조정 활성을 특징으로 하는 중요한 사이토카인이다. 이러한 활성은 다발 경화증을 가진 피험자의 치료에서 관찰되는 임상적 장점을 위한 기초를 형성한다. 인터페론은 유형 I 및 유형 II 부류로 나뉜다. IFN-β는 유형 I 인터페론의 부류에 속하고, 이것은 또한 인터페론 알파, 타우 및 오메가를 포함하는 반면, 인터페론 감마는 뚜렷한 유형 II 부류의 유일하게 알려진 요소이다.
인간 IFN-β는 166개 아미노산 잔기로 구성된 22kDa의 분자량을 가진 조절 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 바이러스 감염 또는 기타 생물제제로의 노출에 대해 반응하여 신체에서 대부분의 세포, 특히 섬유모세포에 의해 생성될 수 있다. 또한, IFN-β는 다량체 세포 표면 수용체에 결합하고, 생성 수용체 결합은 IFNB 유도성 유전자의 발현을 이끄는 세포내 사건의 연쇄 반응으로 귀착되며, 이것은 다시 항바이러스, 항증식 및 면역조정으로서 분류될 수 있는 효과를 일으킨다.
인간 IFN-β는 특징화된 폴리펩티드이다. 인간 IFN-β의 아미노산 서열은 공지되어 있다 (예를 들어,[Gene 10: 11-15, 1980] 및 EP 83069, EP 41313 및 미국 특허 4,686,191 참조). 또한, 인간 및 생쥐 IFN-β를 위하여 결정 구조가 보고되어 있다 (예를 들어, [Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94: 11813-11818, 1997]. [J.Mol.Biol. 253: 187-207, 1995]; [Cell Mol.Life Sci. 54: 1203-1206, 1998] 참조). 또한, IFN-β의 단백질-조작된 변형체가 보고되어 있다 (예를 들어, WO 9525170, WO 9848018, 미국 특허 5,545,723, 미국 특허 4,914,033호, EP 260350호, 미국 특허 4,588,585호, 미국 특허 4,769,233호, 문헌[Stewart 등, DNA, Vol. 6, No.2 1987, pp. 119-128] [Runkel 등, 1998, Jour.Biol.Chem. 273, No.14, pp.8003-8008] 참조). 또한 CHO 세포에서 IFN-β의 발현이 보고되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 4,966,843호, 미국 특허 5,376,567호 및 미국 특허 5,795,779호 참조). 또한 IFN-β 융합 단백질이 예를 들어 WO 00/23472호에 기록되어 있다.
MS를 가진 피험자의 치료를 위하여 IFN-β의 상업적 제제가 승인되었으며, 상표명 베타세론(Betaseron)(R) (비-글리코실화되고, 재조합 세균 세포를 사용하여 생성되며, N-말단 메티오닌 잔기의 결실 및 C17S 돌연변이를 갖는, 베타페론(R) 또는 IFN-β 1bser17로 명명됨), 아보넥스(Avonex)(R) 및 레비프(R) (또한, 글리코실화되고, 재조합 포유동물 세포를 사용하여 생성되는 IFN-β 1a로 명명됨)으로 시판된다. 또한, 구조 및 기능의 측면에서 IFN-β 1a 및 IFN-β 1b의 비교가 문헌 [Pharm.Res. 15:641-649, 1998]에 나타나 있다.
IFN-β는 MS의 진행을 지연시키는 것으로 밝혀진 첫 번째 치료 시술이다. 또한, IFN-β의 승인된 용량이 MS의 악화 속도를 감소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 더 많은 피험자들이 위약-처리된 피험자에 비하여 장기간에 걸쳐 악화되지 않은 채로 유지된다. 또한, 장애의 집적 속도가 감소된다 (예를 들어, [Neurol. 51: 682-689, 1998].
IFN-β는 백혈구 및 항원 전달의 확산에 억제 효과를 갖는다. 또한, IFN-β는 항-염증 표현형에 대한 사이토카인 생성의 프로파일을 조정할 수도 있다. 마지막으로, IFN-β은 T-세포 기질 메탈로프로테아제의 활성을 억제함으로써 T-세포 이동을 감소시킬 수 있다. 이러한 IFN-β 활성들은 MS를 가진 피험자의 치료에서 IFN-β의 유익한 효과를 설명하기 위해 제휴하여 작용하는 것으로 보인다 (예를 들어 [Neurol. 51: 682-689, 1998] 참조).
바람직한 구현양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은, 이에 한정되지 않지만 재발-완화 MS, 상이한 유형의 진행성 MS (이에 한정되지 않지만 예를 들어 원발성 및 속발성 진행성 MS, 진행성-재발 MS 포함), 및 MS를 암시하는 임상적으로 단리된 증상을 포함하여, MS의 다양한 임상적으로 인식된 형태를 앓고 있는 피험자의 치료에서 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재발-완화" MS는, 기존의 증상이 더욱 심각해지고/거나 새로운 증상이 출현하는 동안에, 명백하게 한정된 산발성 악화 또는 재발을 특징으로 하는 MS의 임상 과정이다. 이러한 악화 또는 재발에 이어서 부분 회복이 따를 수 있거나 또는 완전히 회복되고 완화될 수도 있다. 이러한 산발성 악화 또는 재발 사이의 시간 길이는 수 개월 또는 수 년일 수도 있고, 이 동안에 염증 병변, 수초탈락, 축삭 소실, 및 상처 형성이 여전히 진행될 수도 있다. MS의 재발-완화는 MS의 가장 일반적인 시작 단계이고, 이 경우의 약 50%가 10 내지 15년 이내에 진행되는 것으로 기록되었으며 발병 25년 이내에 다른 40%가 진행된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "원발성-진행성" MS는, 고조기 또는 완화 없이 또는 간헐성 고조기 및 매우 단 기간의 약간의 개선과 함께, 진행성 질병에 의한 시작을 특징으로 하는 MS의 임상 과정이다. 질병이 진행됨에 따라서, 피험자는, 재발-완화 MS의 뚜렷한 염증성 공격 특징이 부재하면서, 보행에 곤란함을 경험하고, 운동 기술이 꾸준히 저하되며 수 개월 및 수 년에 걸쳐 장애의 증가를 경험할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "속발성-진행성" MS는 초기에 재발-완화되고, 이어서 재발과는 무관한 가변 속도로 진행되는 임상 과정이다. 이러한 유형의 MS를 경험한 피험자는 염증성 공격 또는 악화를 계속 경험할 수도 있긴 하지만, 결국 악화 및 완화 기간이 감소될 수도 있고, 이 질병은 원발성-진행성 MS에서 관찰되는 특징적인 저하를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 "진행성-재발성" MS는 질병의 발병으로부터 영구적인 신경학적 황폐를 나타낼 수도 있지만 재발-완화 MS에서와 유사하게 보이는 명백한 급성 악화 또는 재발을 갖는 MS의 임상 과정이다. 이러한 환자를 위하여, 소실된 기능이 결코 복귀될 수 없다. 이러한 유형의 MS는 치료하지 않을 경우 높은 사망률을 갖는 것으로 보고되어 있다.
MS을 암시하는 임상적으로 단리된 증상은, 이에 한정되지 않지만 조기 발병 다발 경화증 및 단일증상 MS를 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "다발 경화증"은 달리 규정되지 않는 한 질병의 임상적 소견 및 MS를 암시하는 임상적으로 단리된 증상을 포함하는 것으로 해석된다. 예를 들어, MS를 갖거나 MS와 연관된 증상을 갖는 피험자는 MS 또는 MS의 관련 증상의 치료가 필요한 피험자이다. 하나의 구현양태에서, MS를 앓고 있는 피험자가 본 발명의 제약학적 조성물 및 방법에 따라 치료를 받을 때, 치료에 의해 MS 질병 증상, 질병 중증도 및/또는 질병의 재발 주기성을 예방하고/하거나 개선할 수 있고, 다시 말해서 본 발명의 조성물 및 방법을 사용한 MS의 치료에 의하여, 증상이 나타내는 에피소드 사이의 기간을 연장시킬 수 있고/있거나 질병과 관련된 진행 중인 면역 또는 자가면역 반응을 억제할 수 있고, 치료되지 않은 채로 놓아두면 질병 진행 및 장애를 증진시킬 수 있다.
추가로, 피험자는 제약학적 조성물로 예비-치료될 수 있거나, 또는 본 발명의 제약학적 조성물 또는 방법을 사용한 치료에 앞서서 제약학적 조성물로 예비- 치료되지 않은 미경험 피험자일 수 있다. 예를 들어, MS의 치료를 위하여, 예비- 치료된 피험자는 본 발명의 조성물 또는 방법으로 치료되기에 앞서서 IFN-β 단백질 약물 (예, IFN-β 1a) 또는 IFN-β 변형체 (예, IFN-β 1b)로 예비 치료된 피험자일 수 있다. 예를 들어, 피험자를 예비-치료하기 위하여 승인된 용량의 베타세론(R), 아보넥스(R) 또는 레비프(R)가 사용될 수 있다. 따라서, 예비-치료된 미경험 피험자의 치료에서 본 발명의 제약학적 조성물 및 방법이 적절하다.
질병과 관련된 생리학적 및 병원성 황폐, 예를 들어 뇌 및 신경계의 다른 부위에서의 염증 반응, 혈액-뇌 장벽의 파괴 또는 붕괴, 뇌 병변의 출현, 조직 파괴, 수초탈락, 자가면역 염증 반응, 급성 또는 만성 염증 반응, 신경세포 사멸 및/또는 신경아교세포 사멸을 차단하거나 감소시키기 위하여 본 발명의 제약학적 조성물 및 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물 및 방법의 유익한 효과는, 이에 한정되지 않지만, 질병을 예방하고, 확립된 질병의 발병을 느리게 하고, 질병의 증상을 개선하고, 악화 속도를 감소시키고, 질병의 진행을 느리게 하고, 인지 감소, 고용 손실, 입원, 및 마지막으로 사망을 포함한 장애를 미루거나 예방하는 것을 포함한다. 특정한 유형의 질병 (예. MS)의 에피소드 재발은 예를 들어 에피소드와 관련된 증상 (예컨대 상기 기재된 증상)의 중증도를 저하시킴으로써 또는 에피소드의 발생 사이의 기간, 예를 들어 수 일, 수 주일, 수 개월, 또는 수 년을 길게 함으로써 처리될 수 있으며, 여기에서 에피소드는 예를 들어 MS에서 질병 증상의 재연 및 악화, 또는 뇌 염증 병변의 출현을 예방하거나 느리게하는 것을 특징으로 할 수 있다 (예를 들어 신경학적 염증 병변의 설명을 위하여 [Adams (1993) Principles of Neurology, 777면] 참조).
또한, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절한 핵산은 융합 또는 키메라 단백질인 TM, 또는 융합 또는 키메라 핵산 (예, RNA)을 코드화할 수 있다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 TM은 유전자 생성물의 발현을 조절할 수 있거나 생물학적 경로에서 하나 이상의 단계 (예를 들어, 패혈증 경로)를 차단할 수 있고, 이에 의해 치료적 장점을 제공한다. 또한, 핵산은 TM에 융합된 독소 (예를 들어, 수용체 리간드 유전자 또는, 종양 세포 또는 바이러스와 같은 표적에 융합된 독소를 지정하는 항체)를 코드화할 수 있고, 이에 의해 치료 효과를 갖는다. 본 발명의 핵산 서열을 작동적으로 삽입하고/융합하거나, 또는 아미노산 서열을 아미노산 서열에 삽입하기 위해 적절한 방법은 본 명세서 및 당 기술분야에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; [Ausubel 등 (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1987)] 참조).
일부 질병 치료 섭생법에 기인한 부작용은 당 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, [Munschauer 등 (1997) Clinical Therapeutics 19(5): 883-893]; [Walther 등 (1999) Neurology 53: 1622-1627]; [Lublin 등 (1996) 46: 12-18]; [Bayas 등 (2000) 2: 149-159]; [Ree 등 (2002) 8: 15-18]; [Walther 등 (1998) 5(2): 65-70] 참조). 예를 들어, MS의 치료에 기인한 일부 부작용은 이에 한정되지 않지만 예를 들어 감기와 유사한 증상; 증가된 경직 또는 신경학적 증상의 황폐; 월경장애; 실험 이상 (예를 들어, 헤모글로빈, 백혈구, 과립구, 림프구 또는 혈소판의 비정상적인 혈액 수/수치); 간 효소를 위한 비정상 실험 수치 (예를 들어, 빌리루빈, 트랜스아미나제, 또는 알칼리성 포스파타제); 주사 부위 반응 (예를 들어, 염증, 통증 또는 홍반); 피부 또는 피하 괴사; 및 우울증을 포함한다. 질병 (예를 들어 MS)의 치료에 기인한 부작용을 치료하기 위하여, 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 적절한 공동-약제 및 이러한 공동-약제의 사용은, 이러한 효과의 치료를 위해 당 기술분야에 공지된 공동-약제에 따라 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Munschauer 등 (1997) Clinical Therapeutics 19(5): 883-893]; [Walther 등 (1999) Neurology 53: 1622-1627]; [Lublin 등 (1996) 46: 12-18]; [Bayas 등 (2000) 2: 149-159]; [Ree 등 (2002) 8: 15-18]; [Walther 등, (1998) 5(2): 65-70]. 이러한 공동-약제의 용량 및 투여 섭생법은 일반적으로 알려져 있다. 이러한 공동-투약은 당 기술분야에 공지되어 있고, 이에 한정되지 않지만 질병에 기인하거나 질병의 치료에 기인한 부작용을 경감시키거나 완화시키는데 도움이 되는 것을 포함할 수도 있다. 이러한 공동-약제의 예는, 이에 한정되지 않지만 진통제, 비-스테로이드성 항염 약물(NSAID) 및 스테로이드를 포함한다.
공동-약제의 다른 적절한 예는, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 이부프로펜, 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 프레드니존, 펜톡시필린, 바클로펜, 스테로이드, 항균제, 및 항우울제를 포함한다 (예를 들어 [Walther 등 (1999) Neurology 52: 1622-1627] 참조). 예를 들어, 감기와 유사한 증상을 NSAID (예를 들어, 이부프로펜 또는 아세틸살리실산)으로 치료하거나 파라세타몰 또는 펜톡시필린으로 치료할 수도 있고; 증가된 경직 또는 신경학적 증상의 황폐를 NSAID 및/또는 근육 이완제 (예, 바클로펜)로 치료할 수도 있고; 월경장애를 경구 피임제로 치료할 수도 있고; 주사 부위 반응을 전신 NSAID 및/또는 스테로이드 (예, 히드로코티존)으로 치료할 수도 있고; 피부 또는 피하 괴사를 항균제로 치료할 수도 있고; 우울증을 항우울제로 치료할 수도 있다 (예를 들어 [Walther 등 (1999) Neurology 53: 1622-1627] 참조).
특정한 질병의 치료에서 효과적이고 상이한 유해 사례 프로파일을 가진 다른 약물과의 조합 요법은 치료 효과를 증가시킬 수도 있고, 유해 사례 프로파일을 안전한 상태로 만든다. MS의 치료를 위하여, 조합 요법의 예는 이에 한정되지 않지만 예를 들어 글라티라머 아세테이트 (코팍손), 미톡산트론, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, 클라드리빈, 단클론성 항체 (예, 캠파스-H1(R) 또는 안테그렌(R)/나타줄리맵(R)) 및 스타틴을 포함한다.
예를 들어 MS의 치료를 위하여 본 발명의 방법을 사용한 피험자에서의 질병의 효과적인 치료를 예를 들어 EDSS (확장 장애 상태 척도) 점수, 기능성 복합 점수, 인지 시험, 악화 징조, 또는 MRI를 포함하여 몇 가지 대안적인 방식으로 시험할 수 있다. EDSS는 MS에 기인한 임상적 손상의 등급을 매기는 수단이다 (예를 들어 [Kurtzke (1983) Neurology 33: 1444]. 신경학적 손상의 유형 및 중증도에 대하여, 8개의 기능적 체계, 보행 범위, 보행 능력, 및 자기-돌봄 기능을 유지하는 능력을 평가한다. 예를 들어, 치료에 앞서서, 하기 체계에서의 손상을 평가한다: 피라미드세포, 소뇌, 뇌간, 감각, 창자 및 방광, 시력, 대뇌 및 기타 등등. 보행 범위, 보조 장치를 사용하거나 사용하지 않은 채로의 보행 능력, 및 자기-보호 기능을 유지하기 위한 능력의 평가와 함께, 최종 EDSS 점수를 계산한다. 이어서, 한정된 치료 간격에서 추적조사 점수를 수득한다. 등급 눈금은 예를 들어 0 (정상) 내지 10 (MS에 기인한 사망)의 범위일 수도 있다. 하나의 전체 단계 (또는 더욱 높은 기준선 EDSS 점수에서 1/2 단계)의 증가가 질병 진행을 한정할 수도 있다 (예를 들어 [Kurtzke (1994) Ann.Neurol. 36: 573-79, Goodkin (1991) Neurology 41: 332] 참조).
MS의 치료를 위하여, 악화는 MS에 기인할 수도 있고 적절한 새로운 신경학적 비정상에 의해 수반되는 새로운 증상의 출현으로서 정의될 수 있다 (예를 들어, IFN-β MS 연구 단체 참조). 악화는 전형적으로 적어도 24시간 동안 지속되고, 그보다 앞서 적어도 30일간 안정화 또는 개선되거나 마지막 사건의 발병으로부터 적어도 30일간 분리된다. 표준 신경학적 시험에 의하여 신경학적 등급화 척도에서의 변화 (예를 들어, [Sipe 등 (1984) Neurology 34: 1368] 참조) 및/또는 EDSS 점수 또는 평가하는 의사의 의견에서의 변화에 따라서 악화를 경증, 중등도 또는 중증으로 분류할 수도 있다. 연간 악화 속도 (또는 재발 빈도를 위한 기타 척도, 예를 들어 반복되는 재발의 위해 비율), 악화되지 않는 피험자의 비율, 및 질병 활성을 위한 기타 재발-기초 척도를 결정하고, 이러한 측정의 어느 것에 대하여 치료 군과 위약 군 간에 치료법의 효율성을 평가한다.
또한, 질병을 치료하기 위한 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절한 벡터는 최소의 면역학적 독성을 갖는 것, 예를 들어 플라스미드 또는 AAV 벡터이다. 예를 들어, CMV 프로모터의 조절 하에서 TGF-β 또는 IL-4를 코드화하는 플라스미드 벡터는, 최소의 면역학적 독성을 가진 미엘린 기초 단백질 (MBP) 유도 EAE로부터 생쥐를 보호하는 것으로 보고되어 있다 (예를 들어 [C.A.Piccirillo and G.J.Prud'homme (1999) Human Gene Therapy 10: 1915-22] 참조). 또한, 다양한 벡터 및 표적 조직은, 수막강내 투여 후에 IL-4, IL-10 또는 IL-1 길항제를 발현하는 비-복제 헤르페스 심플렉스(HSV) 유형-1 벡터를 포함하여, EAE 모델에서 사이토카인을 발현하기 위해 사용하는데 적절한 것으로 보고되었다 (예를 들어 [G.Martino 등 (2000) J.Neuroimmunol. 107: 184-90] 참조).
질병 (예, MS)의 치료를 진단하고 관리하기 위하여 다수의 새로운 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 질병 및 질병 활성의 동반하는 표시장치로서 자기 공명 영상화(MRI) 스캐닝을 사용할 수 있고, 진단 도구로서 사용할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Paty 등 (1993) Neurology 43: 662-667]; [Frank 등 (1994) Ann.Neurology 36 (Suppl): S 86-S90; (1995) Neurology 45: 1277-1285]; [Filippi 등 (1994) Neurology 44: 635-641] 참조). 예를 들어, MS의 치료를 위하여, 예를 들어 가돌리늄-DPTA-증진 T1-가중 영상화 (예를 들어, [McDonald 등 (2001) Ann.Neurol. 50:121-127] 참조) 또는 T2-가중 및 T1-가중 기술을 사용한 병변의 위치 또는 정도를 사용하여 활성 병변을 측정하기 위해 MRI를 사용할 수 있다. 기준선 MRI를 수득할 수 있고, 그 후에 각각의 연속된 연구를 위하여 동일한 영상화 면 및 피험자 위치를 사용할 수 있다. MS를 위하여, 병변의 위치를 윤곽을 표시하고 전체 병변 부위에 대해 조각조각으로 모아서 다양한 기준, 예를 들어 1) 새로운 병변의 증거; 2) 활성 또는 새로운 병변의 출현 속도; 및 3) 병변 부위 또는 병변 부피의 변화를 시험할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Paty 등 (1993) Neurology 43:665] 참조). 따라서, 예를 들어 기준선에 비해 개별 피험자에서 또는 처리 군 대 위약 군에서 통계적으로 상당한 개선이 존재할 때, 치료법에 기인한 개선을 확인할 수도 있다.
조성물의 제형 및 투여
바람직한 구현양태에서, 피험자의 세포에 투여하거나 전달하기 위해 본 발명의 핵산 조성물을 제형한다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 핵산 조성물을 비-이온성 및/또는 음이온성 중합체와 제형한다. 이러한 중합체는 핵산에 의해 코드화되는 분자의 형질감염 효율 및 발현을 증진시킬 수 있고 핵산이 분해되는 것으로부터 보호할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제형된 핵산 조성물을 사용하여 형질감염 효율 또는 발현이 증진되는 일부 구현양태에서, 소량의 핵산 조성물 (예, 본 발명의 분자, 예를 들어 본 발명의 TM 및/또는 RM을 코드화하는 벡터)을 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "생분해성 중합체"는 피험자에 의해 생체 내에서 대사되거나 제거될 수 있고 피험자에 대해 독성 효과 또는 부작용을 전혀 또는 최소로 갖는 중합체를 가리킨다.
본 명세서에서 사용된 "음이온성 중합체"는 예를 들어 중성 pH에서 순 음 전하를 가진 이온화 카르복실, 포스페이트 또는 설페이트 기를 포함하는 반복 소단위를 가진 중합체를 가리킨다. 본 발명에서 사용하기 위해 적절한 음이온성 중합체의 예는, 이에 한정되지 않지만 폴리아미노 기 (예, 폴리-글루탐산, 폴리-아스파르트산 및 이들의 조합), 폴리-핵산, 폴리-아크릴산, 폴리-갈락투론산 및 폴리-비닐 설페이트를 포함한다. 일부 구현양태에서, 중합체가 중합체 산인 경우에 중합체가 염 형태로서 사용된다. 다른 중합체의 예는, 이에 한정되지 않지만 PVP, PVA 및 키토산을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "폴리-L-글루탐산"은 "폴리-L-글루탐산, 소듐 염", "소듐 폴리-L-글루타메이트" 및 "폴리-L-글루타메이트"와 서로 바꾸어 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "폴리-L-글루타메이트"는 폴리-L-글루탐산의 나트륨 염을 가리킨다. 또한, 바람직한 구현양태에서, 폴리글루탐산의 L 입체이성질체가 본 발명의 조성물에서 사용되지만, 다른 구현양태에서 본 발명의 조성물에서 사용하기 위하여 다른 입체이성질체 또는 이성질체의 라세믹 혼합물이 적절하다. 또한, 일부 구현양태에서, 본 발명의 조성물에서 사용하기 위하여 음이온성 아미노산 중합체의 다른 염이 적절하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "음이온성 아미노산 중합체"는 주어진 음이온성 아미노산의 중합체 형태, 예를 들어 폴리-글루탐산 또는 폴리-아스파르트산을 가리킨다. 일부 구현양태에서, 음이온성 아미노산, 예를 들어 글루탐산 및 아스파르트산의 혼합물로 형성된 중합체는 본 발명의 조성물에서 사용하기 위해 동일하게 적절할 수도 있다.
제약학적 조성물을 제형하기 위한 방법은 일반적으로 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 제약학적으로 허용가능한 담체, 안정화제 및 이소몰라이트(isomolyte)의 제형 및 선택에 대한 완벽한 언급을 위하여 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18. sup.ed.: Mack Pub. Co.: Eaton,Pa, 1990] 참조. (예를 들어, 미국 특허 4,588,585호; 5,183,746호; 5,795,779호; 및 5,814,485호; 미국 출원번호 10/190,838호, 10/035,397호; 및 PCT 국제 출원번호 PCT/US02/21464호 및 PCT/US01/51074호 참조).
제약학적으로 허용가능한 담체 및 기타 성분 (예, 공동-약제)이 본 발명의 제약학적 조성물 및 방법에서 사용될 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "제약학적으로 허용가능한 담체"는 제약학적 조성물의 치료 성분의 저장, 투여 및/또는 원하는 효과를 촉진하기 위해 당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 담체 또는 희석제이다. 담체는 본 발명의 제약학적 조성물을 피험자에게 투여하거나 전달할 때의 좋지 못한 부작용을 감소시킬 수도 있다. 적절한 담체는 바람직하게는 안정하고, 예를 들어 제제 중의 다른 성분과 반응할 수 없다. 또한, 적절한 담체는 바람직하게는 치료를 위해 사용되는 용량 및 농도에서 피험자에서 상당한 국소 또는 전신 부작용을 일으키지 않는다. 이러한 담체는 일반적으로 당 기술분야에 알려져 있다.
적절한 제약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어 본 발명의 제약학적 조성물의 상용불가능한 성분이 아닌 용매, 분산 매질, 항균 및 항진균제, 미소캡슐, 리포좀, 양이온성 지질 담체, 등장성 및 흡수 지연제 등이다. 치료적으로 효과적이거나 활성인 물질을 위해 이러한 매질 및 약제의 사용이 당 기술분야에 알려져 있다. 보충 활성 성분은 본 발명의 제약학적 조성물 내에 혼입될 수도 있고 본 발명의 방법에서 사용된다.
본 발명의 제약학적 조성물에서 사용하기 위해 제약학적으로 적절한 담체의 추가의 예는 안정한 거대분자, 예컨대 알부민, 젤라틴, 콜라겐, 다당류, 단당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 불휘발성 유, 에틸 올레에이트, 리포좀, 글루코스, 슈크로스, 락토스, 만노스, 덱스트로스, 덱스트란, 셀룰로스, 만니톨, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 헤파린 알기네이트 등이다. 저속-방출 담체, 예컨대 히알루론산이 또한 적절할 수도 있다.
안정성을 증진시키기 위하여, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 덱스트로스, 트레할로스, 티오글리세롤 및 디티오트레이톨(DTT)과 같은 안정화 시약을 본 발명의 제약학적 조성물에 첨가할 수도 있다. 적절한 안정화 시약은, 이에 한정되지 않지만 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 그의 염의 하나, 예컨대 디소듐 EDTA; 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 예를 들어 폴리소르베이트 80 (트윈 80), 폴리소르베이트 20 (트윈 20); 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들어 플루로닉 F68 및 플루로닉 F127; 폴리옥시에틸렌 알콜, 예를 들어 Brij 35; 세메티콘; 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 PEG400; 리소포스파티딜콜린; 및 폴리옥시에틸렌-p-t-옥틸페놀, 예를 들어 트리톤 X-100을 포함한다. 계면활성제에 의한 제약학적 조성물의 안정화는 일반적으로 당 기술분야에 알려져 있다 (예를 들어 [Levine 등 (1991) J.Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160-165] 참조).
본 발명의 제약학적 조성물의 기타 허용가능한 성분은 이에 한정되지 않지만 물, 염수, 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산, 아스파테이트 및 기타 유기 산 또는 그들의 염을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 제약학적 조성물은 조성물을 체액과 등장성으로 만들기에 충분한 양으로 비-이온성 긴장화 제를 포함한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 당 기술분야에 일반적으로 공지된 다수의 비-이온성 긴장성 변형 제, 예를 들어 다양한 부류의 탄수화물(예를 들어, 문헌[Voet and Voet (1990) Biochemistry (John Wiley & Sons, New York)]; 알도스로서 분류된 단당류 (예, 글루코스, 만노스, 아라비노스), 및 리보스, 뿐만 아니라 케토스로서 분류된 것 (예를 들어, 프럭토스, 소르보스 및 자일룰로스); 이당류 (예, 슈크로스, 말토스, 트레할로스 및 락토스); 및 알디톨 (비고리형 폴리히드록시알콜), 예를 들어 글리세롤, 만니톨, 자일리톨 및 소르비톨과 등장성이 될 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 비-이온성 긴장화 제는 트레할로스, 슈크로스 및 만니톨 또는 이들의 조합이다.
바람직하게는, 비-이온성 긴장화 제를 제제를 체액과 등장성으로 만들기에 충분한 양으로 첨가한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물 (예를 들어, HSA-비함유 제약학적 조성물 포함)에 혼입될 때, 비-이온성 긴장화 제가 사용되는 약제에 의존하여 약 1% 내지 약 10%의 농도로 존재한다 (예를 들어, 미국 출원번호 10/190,838, 10/035,397; 및 PCT 국제출원번호 PCT/US02/21464 및 PCT/US01/51074 참조).
또한, 본 발명의 바람직한 제약학적 조성물은 주사로부터의 국소 통증 및 자극을 감소시키는 완충액을 포함할 수도 있거나 또는 본 발명의 제약학적 조성물의 성분의 용해도 또는 안정성을 향상시킬 수도 있다 (예를 들어 TM, RM, AM 및/또는 IM을 포함하고/하거나 코드화함). 이러한 완충액은 이에 한정되지 않지만 예를 들어 저-포스페이트, 아스파테이트 및 숙시네이트 완충액을 포함한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 조성물의 성분의 용해도를 증진시킬 수 있는 가용성 화합물 또는 제제를 추가로 포함할 수도 있다. 적절한 가용성 화합물은 예를 들어 구아니디늄 기, 바람직하게는 아르기닌을 함유하는 화합물을 포함한다. 적절한 가용성 화합물의 추가의 예는 이에 한정되지 않지만 예를 들어 본 발명의 IFN-β 뮤테인의 가용성을 증진시키는 능력을 보유하는 아미노산 아르기닌 또는 아르기닌의 아미노산 유사체를 포함한다. 이러한 아미노산 유사체의 예는 이에 한정되지 않지만 예를 들어 아르기닌을 함유하는 디펩티드 및 트리펩티드를 포함한다. 적절한 가용화 화합물의 추가의 예는 미국 특허 4,816,440호; 4,894,330호; 5,005,605호; 5,183,746호; 5,643,566호 및 문헌 [Wang 등 (1980) J.Parenteral Drug Assoc. 34: 452-462]에 언급되어 있다.
바람직한 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물 (예, TM, RM, AM 및/또는 IM을 포함하고/하거나 코드화함)이 단위 용량으로 용액, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 주사가능한 형태로 또는 투여에 앞서서 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 전환될 수 있는 동결건조 분말의 형태로 제형된다. 본 발명의 제약학적 조성물은 막 여과에 의해 살균될 수도 있고, 이것은 응집물을 제거하며 단위-용량 또는 다-용량 용기, 예컨대 밀봉된 바이알, 앰플 또는 주사기에 보관된다.
다른 구현양태에서, 본 발명의 AM 또는 IM은 경구 투여를 위해 제형된다. 하나의 구현양태에서, 주사 또는 전기천공에 의해 투여하기 위하여 본 발명의 TM 및/또는 RM을 코드화하는 핵산을 제형하고, 본 발명의 AM 및/또는 IM을 경구 투여를 위해 제형한다. 예를 들어, 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계는 피험자의 세포에 주사 또는 전기천공에 의해 전달하기 위해 제형된 적어도 TM 및 RM과 피험자에게 경구 투여하기 위해 제형되는 AM을 코드화하는 단일 벡터를 포함하며, 그 결과 피험자의 세포에서 AM의 존재는 RM을 활성화하고 이에 의해 RM이 피험자의 세포에서 TM의 발현을 유도한다.
본 발명의 액체, 동결건조 또는 분무-건조된 제약학적 조성물은 예를 들어 본 발명의 방법에 따라서 피험자에게 투여하기 위한 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액으로서 당 기술분야에 공지된 바와 같이 제조될 수도 있다. 이러한 제약학적 조성물의 각각은 치료적 또는 예방적 유효 또는 활성 성분을 포함할 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 치료적 또는 예방적 "유효" 또는 "활성" 성분은, 본 발명의 제약학적 조성물 및 방법을 사용하여, 치료가 필요한 피험자에서 질병 또는 병을 치료, 예방 또는 진단하는 것에 관해 바람직한 치료 또는 예방 반응을 일으키는 본 발명의 제약학적 조성물에 포함된 본 발명의 분자 (예를 들어 TM, RM, AM 및/또는 IM을 포함하고/하거나 코드화함)의 양이다. 바람직하게는, 본 발명의 제약학적 조성물은 제조 및 저장 동안에 생물학적 또는 치료 활성의 소실과 연관된 문제점을 최소화하기 위하여 적절한 안정화제, 벌크화 제, 또는 양쪽 모두를 포함한다.
본 발명의 제약학적 조성물의 제제는 바람직하게는 제조 및 저장 상태 하에서 안정하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존된다. 미생물 오염의 예방 방법이 잘 알려져 있고, 다양한 항균 및 항진균제의 첨가를 통해 달성될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물의 적절한 형태는 무균 수용액 또는 분산액, 및 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수도 있다. 적절한 형태는 바람직하게는 쉽게 취할 수 있고 주사기를 통해 쉽게 주사할 수 있는 정도까지 무균성 및 유체이다. 전형적인 담체는 예를 들어 수 완충 수용액 (즉, 생체적합성 완충액), 에탄올, 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 적절한 혼합물, 계면활성제 또는 식물성 유를 함유하는 용매 또는 분산 매질을 포함할 수도 있다. 이에 한정되지 않지만 여과 또는 항균 또는 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산 또는 티메로살의 첨가를 포함하여 당 기술분야에 인식된 기술에 의하여 살균을 달성할 수도 있다. 또한, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장성 제가 주제 조성물에 혼입될 수도 있다.
본 발명의 제약학적 조성물을 함유하는 무균 주사 용액의 제조는, 원한다면 다양한 성분 (예를 들어, 여기에 열거된 성분)과의 적절한 제형에 원하는 양으로 조성을 혼입하고 이어서 살균함으로써 달성될 수 있다. 무균 분말을 수득하기 위하여, 상기 용액을 필요에 따라 진공-건조시키거나 동결-건조시킬 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 치료적 유효 용량의 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제약학적 유효 량으로 편리하고 효과적인 투여를 위해 배합될 수 있다. 인간에게 적용하기 위해 본 발명의 조성물 및 방법의 정확한 치료적 유효 량은, 연령, 체중, 염증 세포에 의한 세포 침윤 정도, 및 MS 피험자의 상태의 개인적 차이를 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
투여 용이성 및 용량 균일성을 위하여 투여 단위 형태로 비경구 조성물을 제형하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용된 단위 투여 형태란 치료되어지는 포유동물 피험자를 위해 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 가리키며: 각각의 단위는 원하는 제약학적 담체와 함께 바람직한 투여 효과를 생성하기 위해 계산된 소정 량의 활성 물질을 함유한다.
본 명세서에 기재된 투여 단위 형태에서 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 치료적 유효 량의 편리하고 효과적인 투여를 위하여 주요 활성 성분을 배합할 수도 있다. 또한, 공동-약제들은 당 기술분야에 일반적으로 공지된 양으로 단위 투여 형태에 함유된다. 보조적 활성 성분, 예를 들어 공동-약제를 함유하는 조성물의 경우에, 예를 들어 성분들의 투여 방식 및 공지된 투여를 참조하여 용량을 결정할 수도 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 치료적 유효 량으로 투여 제형에서 상용성인 방식으로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 제약학적 조성물은 치료되어지는 질병의 특정한 유형 또는 단계 또는 관련되는 증상에 의존될 수도 있고 의학적으로 허용가능한 방식으로 투여될 수 있다. 가능한 투여 경로는 비경구 경로, 예컨대 혈관내, 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 종양내, 복강내, 심실내, 경막내 또는 기타에 의한 주사뿐만 아니라 경구, 코, 눈, 직장, 국소 또는 흡입에 의한 것을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 투여 경로는 근육내이다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 매 3 내지 12개월마다 근육내 투여된다. 다른 바람직한 구현양태에서, 근육내 투여는 제약학적 조성물의 자동 또는 수동 주사 (예를 들어 주사기 사용)를 통해 이루어진다. 지속 방출 투여는 예를 들어 침식가능한 이식물을 사용하여 수행된다.
특히, 본 발명의 핵산 제약학적 조성물은 예를 들어 주사 또는 기타 적절한 수단을 포함하여 당 기술분야에 공지되거나 기재된 수단을 사용하여 피험자의 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 물리적 수단에 의해 핵산을 세포에 전달하는 공지된 방법은 사용하기 적절하며, 이에 한정되지 않지만 전기천공, 소노포레이션(sonoporation) 및 압력을 포함한다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 핵산 조성물의 전달은 전기천공에 의한 것이고, 세포 막에서 일시적인 구멍을 만들기 위해 파동 전기장을 적용하여, 이에 의해 외인성 분자, 예를 들어 본 발명의 핵산 조성물을 세포에 전달하는 것을 포함한다. 전기천공 시스템에 의해 생성된 전기 파동을 조절함으로써, 이러한 절차 동안에 생성되는 세포 내의 경로 또는 구멍을 통해 핵산 분자가 자신의 길을 찾을 수 있다는 것이 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 5,704,908호 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "파동 전압 장치" 또는 "파동 전압 주입 장치"란, 전기의 국소화 파동을 세포에 방출함으로써 피험자의 세포 내에 핵산 분자의 흡수를 일으킬 수 있거나 일으키고 이에 의해 세포 막을 불안정화시키고 그 결과 세포 막에 경로 또는 구멍을 형성시키는 장치를 가리킨다. 이러한 유형의 통상적인 장치는 본 발명의 핵산 조성물의 전달을 위해 사용하기에 적절하다. 일부 구현양태에서, 당업자가 바람직한 전압 크기 및/또는 파동 전압의 지속 시간을 선택 및/또는 조절할 수 있도록 장치를 눈금조정한다. 파동 전압 핵산 전달 장치는 예를 들어 미국 특허 5,439,440호, 미국 특허 5,704,908호, 미국 특허 5,702,384호, PCT No WO 96/12520, PCT No. WO 96/12006, PCT No. WO 95/19805, 또는 PCT No. WO 97/07826호에 기재된 바와 같이 전기천공 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물의 활성 성분을 함유하기 위해 사용되는 포장 재료는 유리, 플라스틱, 금속 또는 기타 적절한 불활성 물질을 포함할 수 있고, 바람직하게는 그 안에 함유된 성분의 어느 것과도 화학적으로 반응하지 않는 포장 재료이다. 하나의 구현양태에서, 제약학적 조성물을 깨끗한 유리, 1회 사용 바이알에 포장하고; 희석제를 함유하는 별개의 바이알이 각각의 약물 바이알에 포함된다. 다른 바람직한 구현양태에서, 희석제를 주사기에 공급한다 (즉 주사기를 희석제로 예비 충진한다). 또 다른 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물을 주사기 중에 용액으로 제공하고 (다시 말해서, 주사기를 용액 상태의 제약학적 조성물로 예비 충진하고) 사용을 위해 준비한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물을 2℃ 내지 8℃ (36℉ 내지 46℉)에 냉장 하에 보관할 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 제약학적 조성물을 실온에서 보관한다.
벡터 및 키트
본 발명은 또한 질병의 치료를 위해 본 발명의 개선된 조절 발현 체계를 포함하는 벡터 및 키트를 더욱 제공한다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 각각의 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는 적어도 하나의 발현 카세트를 갖고, 더욱 바람직하게는 적어도 2개의 발현 카세트를 갖는 단일 벡터를 포함한다.
본 발명의 조절 발현 체계에서 사용하기 위해 적절한 벡터는, 이에 한정되지 않지만, 피험자의 세포에 투여할 때, 코드화된 TM 및/또는 본 발명의 다른 코드화된 분자 (예를 들어, RM, AM, 또는 IM)를 발현할 수 있는 것을 포함한다. 적절한 벡터의 예는, 이에 한정되지 않지만 바이러스를 생성하기 위한 벡터 및 비바이러스성 벡터 (바이러스를 생성하지 않는 벡터)를 포함하여 본 명세서에 기재된 것 및 당 기술분야에 공지된 것을 포함한다. 예를 들어, 적절한 벡터의 하나의 부류는, 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 자율적 복제 염색체외 플라스미드를 제공하는 DNA 요소를 사용한다. 또한, 바이러스를 생성하기 위해 공지된 벡터 (예를 들어, [Wang 등, Gene Therapy, 4: 432-441, 1997]; [Oligino 등, Gene Therapy, 5: 491-496, 1998]는 본 발명의 조절 발현 체계에서 사용하기 위해 변형되고 적응될 수도 있다. 또한, 코드화된 분자의 최적의 발현을 위해 추가의 기능적 및 작동적으로 연결된 서열을 포함하도록 본 발명의 벡터를 변형시킬 수 있다. 적절한 기능적 서열의 예는, 이에 한정되지 않지만, 스플라이싱, 폴리아데닐화 및 기타 유형의 RNA 처리 서열; 및 전사 프로모터, 인핸서 및 종료 서열을 포함한다. 이러한 기능성 서열을 포함하는 적절한 cDNA 발현 벡터는 문헌 [Okayama,H., Mol.Cell.Biol. 3: 280 (1983)] 에 기재된 것 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "플라스미드"는 보통 DNA의 원형 이중사슬의 염색체외 유전 물질을 포함하는 조성물을 가리키고, 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있다. 플라스미드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 벡터로서 사용될 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 "벡터"란 표적 세포의 형질전환 또는 형질감염을 지정하도록 설계된 유전 물질을 포함하는 조성물 (예, 핵산 구조물)을 가리킨다. 또한, 본 발명의 코드화된 분자가 전사될 수 있고 필요한 경우 형질감염되거나 형질전환된 세포에서 번역되도록, 벡터는 벡터의 다른 서열에 대해 위치적으로 및 연속적으로 배향된 다수의 기능성 서열을 함유할 수도 있다. 벡터 또는 발현 카세트가 본 발명의 분자를 코드화하는 경우에 (예를 들어, TM, RM, AM 또는 IM), 이것은 본 명세서에 기재된 본 발명의 조절 발현 체계에 따라 이종 세포 (예를 들어, 피험자의 세포)에서 코드화된 분자의 발현을 위하여 필수 성분 (예를 들어, 프로모터, 폴리(A) 부위, 전사 출발 및 정지 부위)를 포함한다.
바람직한 구현양태에서, 본 발명의 개선된 조절 발현 체계는 TM을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열의 삽입을 위해 적어도 하나의 클론화 부위를 갖는 첫 번째 발현 카세트, 및 RM을 코드화하는 두 번째 핵산 서열의 삽입을 위해 적어도 하나의 클론화 부위를 갖는 두 번째 발현 카세트를 포함하는 하나의 벡터를 포함한다. 다른 구현양태에서, 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같이 피험자의 세포에 전달하기 위해 본 발명의 분자 (예, TM 및/또는 RM)를 코드화하는 바이러스를 생성하기 위한 벡터, 예를 들어 서틀 플라스미드, 더욱 특별하게는 AAV-1 서틀 플라스미드이다 (예를 들어 표 8 참조).
다른 바람직한 구현양태에서, 벡터는 단일 플라스미드 벡터, 예를 들어 pGT1 (SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:4의 서열 포함), pGT2 (SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:4의 서열 포함), pGT3 (SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:4의 서열 포함) 또는 pGT4 (SEQ ID NO:12)이고, 여기에서 각각의 벡터는 IVS8의 3' 및 hGH 폴리(A) 부위의 5'에 위치한 다수의 클론화 부위 (SEQ ID NO:4) (예를 들어, 도 14A-D에 개략적으로 도시됨) 또는 pGT11 (SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함), pGT12 (SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함), pGT13 (SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함), 또는 pGT14 (SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:5의 서열 포함)를 포함하고, 여기에서 각각의 벡터는 IVS8의 3' 및 hGH 폴리(A) 부위의 5'에 위치한 다수의 클론화 부위 (SEQ ID NO:5)를 포함한다.
본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 코드화 분자, 예를 들어 TM, RM, AM 또는 IM의 발현을 위한 기능성 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 발현 카세트는 본 발명의 분자를 코드화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 기능성 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "기능성 서열"이란 세포에서 기능 또는 활성, 예를 들어 세포 발현, 처리, 또는 분자의 클론화에 관련된 기능 또는 활성, 또는 분자의 생물학적 또는 세포 활성 또는 기능을 가진 핵산 또는 아미노산 서열을 가리킨다. 기능성 서열의 예는 본 발명의 분자 (예, TM, RM, AM 또는 IM)를 코드화하는 서열, 프로모터, 단백질 또는 핵산 결합 부위, 스플라이스 부위, 전사 정지 부위, 조절 도메인 (예, 활성화 도메인), 전사 출발 부위, 단백질 또는 핵산 안정화 부위, 개입 서열, 제한 효소 부위 또는 클론화 부위, 바이러스 패키징 시그날, 또는 기타 세포, 단백질 또는 핵산 처리 또는 조절 시그날 (예, 시그날 전달 서열 또는 조직-특이적 서열)을 포함한다. 기능성 서열의 추가의 예는 이에 한정되지 않지만 5' 또는 3' 비번역 영역 (예, UT12, SEQ ID NO:2), 인트론 (예, IVS8, SEQ ID NO:3), 폴리아데닐화 (폴리(A) 부위 (예, SV40, SEQ ID NO:8 또는 hGH 폴리(A) 부위, SEQ ID NO:6), 또는 DNA-결합 부위 (DBS) (예, SEQ ID NO:49)이다.
이러한 기능성 서열은, 예를 들어 본 발명의 발현 카세트에 있는 기능성 서열에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 의해 코드화되는 분자의 조절 또는 조직-특이적 발현을 촉진하는 조절된 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터를 코드화하는 서열을 포함한다. 적절한 프로모터의 예는 이에 한정되지 않지만 CMV 프로모터, 근육-특이적 프로모터 (예, 액틴 프로모터 또는 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 프로모터), 상태-특이적 (예, 저산소증 또는 염증) 프로모터 또는 요소 (예, ELAM 프로모터 또는 HRE), 구성 프로모터 (예, 유비퀴틴, PGK 또는 EF1α 프로모터), 합성 또는 키메라 프로모터 (예, CMV/액틴 프로모터), 세포-주기 특이적 프로모터 (예, 시클린 A 또는 cdc6 프로모터)를 포함한다. 하나의 구현양태에서, 프로모터는 생리적 반응 프로모터, 예를 들어 염증에 반응성인 프로모터, 바람직하게는 사이토카인 또는 케모카인, 또는 질병 또는 병의 발병 또는 존재를 암시하는 기타 세포 또는 생물학적 분자의 존재에 반응성인 프로모터이다. 적절한 프로모터의 추가의 예를 하기 표 1에 나타낸다.
프로모터 플라스미드/공급원 설명 참고문헌
EF-1α pdrive-chef1 (인비보겐) 침팬지 EF-1α 프로모터 예, KimDW 등, 1990 Gene 91(2): 217-23; Guo ZS 등 1996 Gene Ther. 3(9): 802-810
EF-1α/RU5 pdrive-chef1ru5 (인비보겐) 침팬지 EF-1α 프로모터 + HTLV 5'UTR 예, KimDW 등, 1990 Gene 91(2): 217-23; Guo ZS 등 1996 Gene Ther. 3(9): 802-810; Takebe Y. 등 1998 Mol Cell Bio 8(1): 466-472
UbiB pdrive-hubib (인비보겐) 인간 유비퀴틴 B 프로모터 예, Ciechanover A. 및 Schwartz AL. 1998 PNAS 95(6): 2727-30; Yew NS 등 2001 Mol Ther 4(1): 75-82
Sk 프로모터 pGS1694 (발렌티스) 골격근 액틴 프로모터 + UT12 5'UTR+IVS8 인트론 예, PCT 출원번호 PCT/US01/30305
MCK 프로모터 생쥐 게놈 DNA 생쥐 근육 크레아틴 키나아제 예, Jaynes JB 등, 1986 Mol Cell Biol Aug; 6(8): 2855-64, Hauser 등 2000, Mol Ther 2:16-25
EF-1α/RU5 pORF-htrail (인비보겐) 인간 EF-1α+ HTLV 5'UTR 및 세균 프로모터 예, KimDW 등, 1990 Gene 91(2): 217-23; Guo ZS 등, 1996 Gene Ther. 3(9): 802-810; Takebe Y 등, 1998 Mol Cell Bio 8(1): 466-472
TK프로모터 phRL-TK (프로메가) HSV 티미딘 키나아제 프로모터 예, Wagner EF 등, 1985 EMBO J(4) 663-6; Stewart CL 등, 1987 EMBO J(6) 383-8
하나의 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계는, 융합 또는 키메라 단백질인 본 발명의 분자를 코드화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 CMV 프로모터 서열을 가진 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 프로모터는 코드화된 분자 (예, TM, RM, AM 또는 IM)의 발현을 조종한다. 일부 구현양태에서, 적절한 프로모터는 피험자의 세포에서 코드화된 분자의 지속적인 발현 수준을 제공하는 것일 것이다. 하나의 구현양태에서, 핵산 벡터는 피험자의 세포에서 지속적인 발현을 제공하는 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 분자 (예, TM, RM, AM 또는 IM)를 코드화하고, 분자가 세포에서, 바람직하게는 투여 부위에서 발현되도록 전기천공을 통해 피험자의 세포에 핵산 벡터를 투여한다. 바람직한 구현양태에서, 코드화 분자는 TM이다.
다른 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계는, 본 발명의 TM을 코드화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된, 적어도 하나의 GAL-4 DBS를 포함하는 프로모터 서열을 가진 첫 번째 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 하나의 구현양태에서, 프로모터 서열은 GAL-4 DBS의 다량체, 예를 들어 3-18개 GAL-4 DBS를 포함한다.
또한, 본 발명의 발현 카세트는 원하는 핵산 서열의 삽입을 위해 클론화 부위를 포함하도록 적절히 변형될 수 있다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 분자, 예를 들어 TM, RM, AM 또는 IM을 코드화하는 핵산 서열의 삽입을 위하여 적어도 하나의 클론화 부위, 더욱 바람직하게는 다수 클론화 부위(MCS)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "클론화 부위"는, 핵산 서열이 삽입되거나, 작동적으로 연결되거나 또는 예를 들어 의도하는 목적을 위해 서열이 기능하도록 당 기술분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 달리 부착되는, 핵산에서의 효소 부위 또는 기타 부위를 가리킨다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 첫 번째 발현 카세트는 TM을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열의 삽입을 위한 MCS, 적어도 하나의 DBS (예, 3 - 18 GAL-4 DBS)를 포함하는 유도성 프로모터, 5' 비번역 영역 (예, UT12, SEQ ID NO:2), 인트론 (예, IVS8, SEQ ID NO:3), 및 hGH 폴리(A) 부위 (예, SEQ ID NO:6)을 포함하고, 그 결과 첫 번째 핵산 서열이 MCS (예, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5)에 삽입될 때, 이러한 기능성 서열이 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 두 번째 발현 카세트는 조절된 RM 및 SV40 폴리(A) 부위를 코드화하는 두 번째 핵산 서열 (예, SEQ ID NO:8)의 삽입을 위해 MCS를 포함하고, 그 결과 두 번째 핵산 서열이 MCS에 삽입될 때, 이러한 기능성 서열이 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 바람직한 구현양태에서, 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트가 단일 벡터에 존재한다.
본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 본 발명의 발현 체계의 적어도 하나, 더욱 특별하게는 본 발명의 제약학적 조성물, 벡터 또는 분자 (예, TM, RM, AM 또는 IM)의 적어도 하나를 포함한다.
조성물의 단리 및 구성
본 발명의 조성물은 예를 들어 화학 화합물, 단백질 및 핵산 (예, DNA 또는 RNA 분자), 특히 단백질 또는 RNA를 코드화하는 핵산을 포함한다. 본 명세서 및 당 기술분야에 설명된 바와 같이, 본 발명의 화합물, 핵산 및 단백질 조성물은 통상적인 방법 및 분석을 사용하여 단리되거나, 구성되거나 및/또는 시험될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "단백질" 또는 "아미노산 분자"는 펩티드, 전체-길이 단백질, 또는 전체-길이 단백질의 단편 또는 일부를 가리킨다. 또한, 본 발명의 단백질은 융합, 키메라, 변형, 단리, 합성 또는 재조합 아미노산일 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절한 단백질의 예는, 이에 한정되지 않지만 야생형, 전체-길이 단백질 (그의 분비된 형태 포함), 또는 생물학적 또는 치료 활성을 가진 그의 유사체, 유도체 또는 변형체를 포함한다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 단백질 변형체는 뮤테인, 즉 변형체가 생물학적 또는 치료 활성을 유지하거나 갖도록 돌연변이, 예를 들어 단일 또는 다수 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 뮤테인일 수 있다. 단백질을 코드화하는 서열은, 예를 들어 야생형 단백질 서열의 코돈-최적화 변형체 또는 인간화 서열을 포함할 수도 있다. 인간에서 최적의 코돈 사용은 발현된 인간 유전자를 위한 코돈 사용 빈도로부터 확인될 수 있고, 당 기술분야, 예를 들어 [program "Human High.codN", Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8.1, Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨]에 공지된 방법에 의해 결정될 수도 있다. 예를 들어, 고 발현 인간 유전자에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 인간 피험자의 세포에서 발현하기 위한 최적의 코돈일 수도 있고, 따라서 합성 코드화 서열을 구성하기 위한 기본으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 분자에 관련하여 본 명세서에서 사용된 "핵산"은 핵산 분자, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 또는 융합, 키메라, 변형, 단리, 합성 또는 재조합 형태를 가리킨다. 특히, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절한 핵산의 예는, 이에 한정되지 않지만 야생형, 단백질을 코드화하는 전체-길이 DNA 또는 RNA (예, mRNA), 또는 생물학적 또는 치료 활성을 가진 기타 핵산 분자 (예, shRNA, siRNA, 리보자임, 안티센스 RNA 또는 DNA, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드) 또는 그의 유사체, 유도체 또는 변형체를 포함한다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 핵산 변형체는 뮤테인, 즉 변형체가 생물학적 또는 치료 활성을 유지하거나 갖도록 돌연변이, 예를 들어 단일 또는 다수 핵산 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 뮤테인일 수 있다.
또한, 본 명세서 또는 당 기술분야에 기재된 바와 같이 통상적인 방법 및 분석을 사용하여 본 발명의 조절 발현 체계의 변형을 수행하고 시험할 수 있다.
(예를 들어, TM, RM, AM 및/또는 IM을 포함하고/하거나 코드화하는) 본 발명의 분자와 관련하여 본 명세서에서 사용된 "변형"이란, 본 발명의 원하는 조성물 또는 분자를 얻기 위해 대조 핵산, 아미노산 또는 화학 분자의 변화 또는 변경을 가져오는 반응 또는 조작을 가리킨다 (예를 들어, 특정한 생물학적 및/또는 치료 활성을 가진 바람직한 변형체를 얻기 위한 야생형 단백질 또는 핵산의 돌연변이; 바람직한 인간화 서열을 얻기 위한 단백질 또는 핵산 서열의 돌연변이; 또는 바람직한 화학 구조 및/또는 생물학적 및/또는 치료 활성을 얻기 위한 화학 화합물의 돌연변이). 예를 들어, 본 발명의 바람직한 조성 또는 분자를 얻기 위하여 본 발명의 분자에 작동적으로 연결되거나 이것을 코드화하는 서열을 포함하는 (예를 들어, 벡터 서열 또는 전사 조절 서열을 포함하는) 본 발명의 분자의 기능성 도메인 또는 기능성 서열을 변형시킬 수 있다.
특히, 본 명세서에 기재된 바와 같이 질병의 치료에서 사용하기 위한 (예를 들어, 특정한 조직, 병, 질병, 또는 생체마커 또는 기타 분자에 특이적인) 특정한 특이성, 엄격성, 또는 조절, 발현 및/또는 활성의 양을 달성하기 위하여 본 발명의 조절 발현 체계를 변형시키거나 최적화할 수 있다. 예를 들어, 1) RM의 LBD에 대해 바람직한 결합 특이성을 가진 신규 또는 변형 AM 및 IM; 2) 신규 또는 변형 AD, LBD (예를 들어, 신규 또는 변형 AM 또는 IM에 결합), 및/또는 DBD (예를 들어, 신규 또는 변형 프로모터 서열에 결합)을 가진 RM; 3) 특정한 RM의 존재에 대해 고 특이성이고 반응성인 활성을 가진 프로모터 (특정한 RM의 존재하에서, 예를들어 특정한 RM의 결합에 의하여 특이적으로 활성화되거나 불활성화됨); 4) 충분히 인간화된 서열 (예를 들어, 서열이 충분히 인간화되도록 GAL-4 DBD 및 GAL-4 DBS를 코드화하는 변형 서열); 5) RNA의 발현을 위한 발현 카세트 (예, shRNA, siRNA, 리보자임, 또는 안티센스 RNA), 특히 RNA TM; 및 6) 프로모터 또는 기타 기능성 서열에 작동적으로 연결되는 서열에 의해 코드화된 TM의 비-특이적 발현을 감소시키기 위한 변형 프로모터 또는 기타 기능성 서열을 단리 또는 구성함으로써, 이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 조절 발현 체계를 변형하거나 최적화할 수 있다.
하나의 구현양태에서, RM의 투여에 대한 신뢰도를 증가시키기 위해 TM의 기본 발현이 상당히 감소되고, 이에 의해 투여된 플라스미드의 용량에 대한 의존성을 통해서 라기보다는 비구조적으로 제어된 TM 발현을 통해 증가된 안정성 한계를 제공하도록 본 발명의 조절 발현 체계를 변형시킨다. 예를 들어, GAL-4 DBD을 가진 RM의 존재 (예를 들어 결합)에 의해 프로모터 (및 얻어지는 TM 발현)의 반응성이 조정될 수 있도록, GAL-4 DBS의 다수의 카피를 위해, TM을 코드화하는 핵산 코드화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 변형시키고 최적화할 수도 있다. 또한, 예를 들어, 표준 방법을 사용하여 최소 프로모터를 구성하거나 변형할 수 있고 TM의 기본 발현을 감소시키기 위해 TM에 작동적으로 연결시킬 수 있다.
또한, 일부 구현양태에서, TM은 피험자의 세포에 전달되고/되거나 존재할 때 TM이 낮은 수준으로 발현되는 핵산 서열에 의해 코드화된다. 일부 구현양태에서, 피험자의 세포에 전달되고/되거나 존재하는 TM을 코드화하는 핵산의 고유한 성질에 의하여 TM 발현의 수준을 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, TM을 코드화하는 핵산의 양이 증가함에 따라서 피험자의 세포에서 기본 TM 발현의 수준이 증가하기 때문에, 약한 프로모터를 사용함으로써 피험자의 세포에서 발현된 TM 단백질의 양을 감소시키는 것이 바람직할 수도 있다.
프로모터 영역에서 특유의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여, 본 발명의 RM의 존재 또는 부재 하에서 TM의 발현에 대한 효과를 가질 수도 있는 서열을 결실시키기 위해, 프로모터의 상이한 영역 및 5'UTR을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 다른 구현양태에서, TM을 코드화하는 서열에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터의 고유 활성이 변형되도록, 예를 들어 활성이 저하되거나 증가되도록, 전사 개시 영역(inr)을 코드화하는 서열에서 결실이 만들어진다. 다른 구현양태에서, 전사 개시 영역(inr)의 하류는 UT12 (CMV의 5' 비번역 영역, +1 내지 +112)를 코드화하는 작동적으로-연결된 서열이다.
다른 구현양태에서, TATA 박스 서열에 작동적으로 연결된 6X GAL-4 DBS을 가진 유도성 프로모터 서열 (예, SEQ ID NO:1)에 작동적으로 연결되는 핵산 서열에 의해 TM이 코드화된다. 아데노바이러스 유형 2의 Elb 영역 (NCBI 수탁 번호 JO1917의 잔기 1665-1677)으로부터 TATA 박스를 함유하는 -33 내지 -22의 서열이 본 발명의 구현양태에서 사용하기 위해 적절하다. 다른 구현양태에서, 프로모터 서열은 Ad EIb TATA 박스 서열에 작동적으로 연결된 6X GAL-4 DBS 및 CMV 프로모터의 추정 개시인자(inr) 영역을 함유하는 CMV 서열을 포함하여 [Macias 등, Journ. of Virol. 70(6): 3628 (1996)], 이러한 기능성 서열이 TM을 코드화하는 핵산에 작동적으로 연결되도록 한다.
일부 구현양태에서, 17 뉴클레오티드 서열 5'-TGGAGTACTGTCCTCCG-3' 또는 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3' (예를 들어 SEQ ID NO:49의 공통 GAL-4 DBS)을 포함하는 GAL-4 DBS의 다중 카피에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 의해 TM이 코드화된다. 하나의 구현양태에서, 예를 들어 SEQ ID NO:50에서와 같이, 뉴클레오티드 서열 5'-AGTTTAAAAG-3'를 가진 10개 뉴클레오티드 스페이서에 의해 분리된 17개 뉴클레오티드 서열 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3'를 각각 포함하는 GAL-4 DBS의 4개 카피에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 의하여 TM이 코드화된다. 다른 구현양태에서, GAL-4 DBS의 각각 3개 카피를 가진 2개 군에 배열된 GAL-4 DBS의 6개 카피에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 의하여 TM이 코드화되고; 여기에서 1) (GAL-4 DBS의 3개 카피를 함유하는) 각각의 군에서 GAL-4 DBS의 두 번째 카피는 17개 뉴클레오티드 서열 5'-TGGAGTACTGTCCTCCG-3'를 포함하고, GAL-4 DBS의 첫 번째 및 세 번째 카피는 각각 17개 뉴클레오티드 서열 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3)을 포함하며; 2) 3개 카피 군 내의 각각의 카피는 2개 뉴클레오티드 5'-AG-3'에 의해 분리되고; 3) 3개 카피의 2개 군 사이에서 더욱 긴 스페이서 서열 5'-AGTCGAGGGTCGAAG-3' (예를 들어, 기재된 것과 같이 6개 카피의 GAL-4 DBS를 포함하는 SEQ ID NO:51의 서열)이 존재한다.
일부 구현양태에서, 특정한 조직 내의 발현을 원하는 경우에, 조직-특이적 프로모터를 포함하도록 본 발명의 조절 발현 체계를 변형시킬 수도 있다. 예를 들어, TM 발현을 위한 표적 조직이 근육이라면, TM을 코드화하는 핵산 서열을 근육-특이적 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 서열에 작동적으로 연결시킬 수도 있다. 조직-특이적 프로모터 (예, 근육-특이적 프로모터)는 코드화된 TM의 발현의 충실도를 증가시킬 수도 있다. 일부 구현양태에서, 조직-특이적 프로모터는 가지돌기 및 기타 항원-제시 세포에서 감소된 발현 장점을 제공할 수도 있고, 따라서 발현된 TM에 대한 면역 반응을 피할 수 있다 (예를 들어, 단백질 또는 핵산).
하나의 구현양태에서, 특히 핵산 전달에 대한 염증 반응이 존재하는 경우에, TM을 코드화하는 핵산의 전달 (예, 벡터)과 TM 발현의 유도 사이에 지체 시간을 부여하기 위해 본 발명의 조절 발현 체계를 변형시킨다. 이러한 구현양태에서, 염증 반응의 감소가 존재할 때까지 TM 발현이 지연될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 예를 들어 12 내지 54일의 지체 시간의 길이 (TM 발현을 유도하기 전 시간)를 증가시킴으로써, 항-TM 항체 생성의 발병률을 저하시킬 수 있다. 또한, 일부 구현양태에서, TM을 코드화하는 핵산의 도입과 피험자의 세포에서 TM의 발현 및/또는 활성을 조절하는 AM (예, MFP)의 투여 사이의 지연을 길게 하는 것이 바람직하다 (예를 들어, AM이 RM을 활성화시키고, 이에 의해 활성화된 RM의 존재가 TM 발현 및/또는 활성을 조절하는 경우). 하나의 구현양태에서, 지체 기간은 12일, 바람직하게는 20일, 더욱 바람직하게는 55일 또는 면역 반응이 저하될 때까지이다.
하나의 구현양태에서, TM 발현 및/또는 활성의 특이성, 선택성, 정확한 시간 및/또는 수준이 RM의 존재하에서 조정되도록 조절 발현 체계를 변형시킨다. 추가의 구현양태에서, RM은 본 발명의 RM을 투여한 피험자에서 빠르게 제거된다.
하나의 구현양태에서, RM은 단백질이고, 특이적 또는 동종 리간드의 존재하에서 활성화되도록 변형되고, 이에 의해 활성화된 RM의 존재는 TM의 발현 및/또는 활성을 조절한다. 또한, AM의 부재하에서 이량체를 형성하는 경향을 최소화하기 위하여 RM의 GAL-4 DBD의 돌연변이에 의해 RM의 활성화의 특이성 및 엄격성을 최적화할 수 있다. 더욱 특별하게는, (예를 들어, AM의 부재 하에서) RM의 비-특이적 활성화 및/또는 이량체 형성을 최소화하기 위하여, GAL-4 DBD의 C-말단 부위 (예, 20C- 말단 잔기)를 결실시키거나 달리 돌연변이시킴으로써 GAL-4 도메인의 돌연변이에 의해 RM을 변형시킬 수 있고, 이에 의해 GAL-4 단독이량체 형성에 기여하는 것으로 예측되는 꼬여진 코일 구조의 길이를 감소시킨다.
일부 구현양태에서, GAL-4 DNA 결합 도메인 ("GAL-4 DBD")는 GAL-4의 N-말단 DBD의 아미노산 1-93의 일부 또는 단편을 포함한다 (예를 들어, 아미노산 2-93의 서열이 SEQ ID NO:37이고 아미노산 1이 메티오닌인 경우). 예를 들어, 일부 구현양태에서, GAL-4 DBD는 GAL-4의 N-말단 DBD의 아미노산 2-93을 포함한다 (예를 들어, SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하거나 SEQ ID NO:37의 핵산 서열에 의해 코드화됨). 하나의 구현양태에서, GAL-4 DBD는 GAL-4의 N-말단 DBD의 아미노산 2-93 및 SEQ ID NO:46에서와 같이 작동적으로 연결된 (또는 SEQ ID NO:45의 핵산 서열에 의해 코드화되는) N-말단 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 예를 들어 N-말단 펩티드 서열 다음에 바로 GAL-4의 N-말단 DBD의 아미노산 2-93이 온다. 다른 구현양태에서, GAL-4 DBD는 GAL-4의 N-말단 DNA 결합 도메인의 아미노산 2-74를 포함한다 (예를 들어 SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 포함하거나 SEQ ID NO:47의 핵산 서열에 의해 코드화됨). 일부 구현양태에서, 적절한 GAL-4 DBD는 핵산 서열 또는 아미노산 서열에서의 변형을 갖고, 그 결과 표준 17량체 결합 부위, CGGAAGACTCTCCTCCG에 결합하는 능력을 보유하지만 자가이량체화를 위해 필요한 나선형 3차 구조를 형성하는 능력이 감소된 GAL-4 DBD의 돌연변이가 얻어진다. 일부 구현양태에서, GAL-4 DBD 서열의 아미노산 75 내지 93 및/또는 54 내지 74에 걸친 영역에 돌연변이 또는 결실이 만들어진다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, 돌연변이된 GAL-4 DBD를 포함하는 RM의 꼬여진 코일 영역을 통해 자가이량체화가 최소화되도록, GAL-4 DBD 서열의 아미노산 54 내지 64 또는 65 내지 75에서 결실이 만들어진다.
하나의 구현양태에서, 하나 이상의 기능성 도메인, 예를 들어 DNA 결합 도메인(DBD), 리간드-결합 도메인(LBD) 및/또는 조절 도메인(RD) (예, 활성화 도메인)을 포함하는 융합 또는 키메라 단백질을 코드화하도록 RM의 핵산 서열이 변형된다. 본 발명의 융합 또는 키메라 단백질에서 사용하기 위해 적절한 기능성 도메인의 예는 이에 한정되지 않지만 GAL-4 DBD, 인간 프로게스테론 수용체(hPR) LBD 및 NF카파B p65 AD를 포함한다.
본 발명의 RM에서 사용하기 위해 적절한 조절 도메인(RD)의 예는, 이에 한정되지 않지만 NF카파 Bp65, VP-65, TAF-1, TAF-2, TAU-1, TAU-2, ORF-10, TEF-1 및 조절 기능 (예를 들어 본 발명의 분자의 발현 및/또는 활성을 조절함), 더욱 특별하게는 전사 조절 기능을 가진 기타 핵산 또는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, [Pham 등 (1992) 6(7):1043-50 Mol.Endocrinol.]; [Dahlman-Wright 등 (1994) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91, 1619-1623]; [Milhon 등 (1997) Mol.Endocrinol. II (12): 1795-805]; [Moriuchi 등 (1995) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92(20):9333-7]; [Hwang 등 (1993) EMBO J 12(6): 2337-48] 참조). 하나의 구현양태에서, 바람직한 RD는 인간 전이활성화 도메인 (예, NF카파B p65)이다. 다른 구현양태에서, RM, 특히 RM의 기능성 도메인 (예, RD)이 인간화된다.
하나의 구현양태에서, 본 발명의 RM의 LBD는 스테로이드-수용체 계, 예를 들어 프로게스테론 수용체(PR), 더욱 특별하게는 인간 프로게스테론 수용체(hPR)에서 수용체의 야생형 LBD에 상관되는 아미노산 서열로부터 유래된다. 다른 구현양태에서, RM은 스테로이드 수용체이고, 스테로이드 수용체의 LBD의 아미노산 서열 (예, PR, 및 더욱 특별하게는 hPR)을 돌연변이시켜, 프로게스틴 대신에 안티프로게스틴인 AM에 선택적으로 결합하는 돌연변이된 스테로이드-수용체 LBD (예, 돌연변이된 hPR LBD)를 얻는다. 따라서, 이러한 구현양태에서, 돌연변이된 스테로이드-수용체 LBD인 RM (예, 돌연변이된 hPR LBD)를 자연 프로게스틴 대신에 안티프로게스틴인 AM에 의해 선택적으로 활성화할 수 있다. 특히, 하나의 구현양태에서, 안티프로게스틴이 자연 PR에 결합하지만 길항제로서 작용한다.
하나의 구현양태에서, 프로게스틴이 야생형 PR에 결합하고 효능제로서 작용하며, 끝이 절단되거나 돌연변이된 PR에 결합하지 않는다. 다른 구현양태에서, 돌연변이된 PR은 안티프로게스틴을 결합하지만 효능제로서 반응하는 능력을 보유한다. 바람직한 구현양태에서, 안티프로게스틴이 RM인 돌연변이 PR에 결합할 때, 돌연변이 PR 단백질이 활성화되고 이량체를 형성한다. 이러한 구현양태에서, 이량체-안티프로게스틴 착물이 프로모터 서열의 DBS에 결합하고, 이에 의해 TM을 코드화하는 핵산 서열의 전사를 유도하며, 이 경우에 핵산 서열이 프로모터에 작동적으로 결합한다.
하나의 구현양태에서, 안티-프로게스틴 MFP (RU486)의 존재 하에서, 키메라 RM이 TM을 코드화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 17량체 GAL-4 DBS에 결합하고, 그 결과 TM 발현의 효율적인 리간드-유도성 전이활성화가 얻어진다. RM의 변형된 스테로이드-호르몬 LBD는 카르복시 말단 아미노산의 결실, 바람직하게는 약 1 내지 120 카르복시 말단 아미노산의 결실에 의해 변형될 수도 있다. 리간드가 투여될 때 바람직한 리간드에 대한 선택성 및 높은 유도성 양쪽 모두를 달성하기 위해 표준 분자생물학적 기술을 사용하여 원하는 결실 정도가 수득될 수 있다. 하나의 구현양태에서, 약 1 내지 약 60 카르복시 말단 아미노산의 결실에 의하여 돌연변이된 스테로이드 호르몬 수용체 LBD가 돌연변이된다. 다른 구현양태에서, 42 카르복시 말단 아미노산이 결실된다. 또 다른 구현양태에서, 높은 선택성 및 높은 유도성 양쪽 모두를 가지기 위해서, 19개 카르복시 말단 아미노산이 결실된다.
하나의 구현양태에서, RM의 핵산 서열은 끝이 절단된 GAL-4 DBD를 코드화하는 서열, 19개 아미노산의 C-말단 결실을 가진 돌연변이된 프로게스테론 수용체, 및 p65 전이활성화 도메인 (예, SEQ ID NO:39)를 포함한다. 다른 구현양태에서, RM의 핵산 서열은 돌연변이된 프로게스테론-수용체 리간드-결합 도메인, 끝이 절단된 GAL-4 DNA 결합 도메인, 및 VP16 또는 p65 전사조절 도메인을 가진 키메라 수용체를 코드화하는 서열을 포함하고, 여기에서 p65 전사조절 도메인은 인간 p65 단백질의 활성화 도메인; NF카파B 착물의 성분의 일부이다. VP16을 각종 인간-유래 활성화 도메인, 예를 들어 인간 p65의 잔기 286-550으로 대체함으로써, 단백질을 "인간화"하면서 또는 바이러스성 VP16 성분에 기인한 외래 단백질 면역 반응의 잠재력을 감소시키면서 키메라 수용체의 강력한 유도성이 유지될 수 있다.
본 발명의 RM의 DBD는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된 GAL-4 DBD로 한정되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 적절한 DBD는 결합 부위를 인지하기 위해 필수적이 아니지만 그의 2차 구조에 의하여 자가이량체화에 기여할 것으로 예측될 수 있는 서열을 제거하기 위해 변형되어진 것이다. 이렇게 변형되고 적절할 수 있는 다른 DBD는, 예를 들어 스테로이드-수용체 계의 요소의 공지된 DBD (예, 글루코코르티코이드 수용체, 프로게스테론 수용체, 레티논산 수용체, 티로이드 수용체, 안드로겐 수용체, 엑디손 수용체) 또는 기타 세포 DNA-결합 단백질, 예컨대 cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB) 또는 아연 핑거 DNA 결합 단백질, 예컨대 SP1을 포함한다.
유전자 조절 단백질의 스테로이드-수용체 계는 본 발명의 RM의 구성을 위해 적절하다. 스테로이드 수용체는 리간드-활성화 전사 인자이며, 여기에서 리간드는 레티노이드, 지방산, 비타민, 티로이드 호르몬 및 기타 현재 확인되지 않은 소 분자의 범위일 수 있다. 이러한 화합물은 수용체에 결합하고, 스테로이드-조절된 유전자의 발현을 상향-조절 또는 하향-조절한다. 화합물은 기존의 메카니즘에 의해 신체로부터 제거되고 이것은 보통 비-독성이다. 본 발명에서, 스테로이드 수용체의 리간드는, 예를 들어 스테로이드 수용체의 LBD에 결합함으로써 또는 이것과 상호작용함으로써, 스테로이드 수용체를 활성화하는 화합물 또는 분자일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "스테로이드-호르몬 수용체"는 스테로이드 수용체의 상과에서 스테로이드-호르몬 수용체를 가리킨다. 스테로이드-호르몬 수용체 과의 대표적인 예는 이에 한정되지 않지만 에스트로겐, 프로게스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 안드로겐, 티로이드 호르몬, 레티논산, 레티노이드 X, 비타민 D, COUP-TF, 엑디손, Nurr-1 및 고아 수용체를 포함한다. 스테로이드/티로이드/레티노이드 슈퍼유전자 과에서 호르몬을 위한 수용체는, 그들의 전사를 증진하거나 억제하기 위해, 호르몬-민감성 유전자의 조절 영역에서 표적 서열에 결합하는 전사 인자이다. 이러한 수용체는 리간드 결합 도메인(LBD), DNA 결합 도메인(DBD), 이량체화 도메인 및 하나 이상의 전이활성화 도메인(들)을 포함하여 일련의 개별 구조 도메인에서 유사성을 진화적으로 보존한다.
변형체 스테로이드 수용체 또는 더욱 구체적으로 돌연변이된 스테로이드 수용체를 형성하기 위하여, 상이한 구조 도메인의 아미노산 서열에서 다양한 돌연변이 또는 변화가 생성될 수 있다. 하나의 구현양태에서, 돌연변이된 스테로이드 수용체는 야생형 또는 자연-발생 호르몬 수용체 리간드에 결합하기 보다는 오히려 비-자연 또는 비-천연 리간드에 우선적으로 결합할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 돌연변이된 호르몬 수용체는, 대조 호르몬 수용체 (예, 야생형 또는 자연-발생 호르몬 수용체)의 카르복시 말단에서 아미노산의 결실, 예를 들어 대조 호르몬 수용체의 카르복시 말단으로부터 약 1 내지 약 120개 아미노산의 결실에 의해 발생된다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 돌연변이된 프로게스테론 수용체는 대조 프로게스테론 수용체 (예, 야생형 또는 자연-발생 호르몬 수용체)의 약 1 내지 약 60개 아미노산의 카르복시 말단 결실을 포함한다. 다른 구현양태에서, 돌연변이된 프로게스테론 수용체는 대조 프로게스테론 수용체(예, 야생형 또는 자연-발생 호르몬 수용체)의 19개 아미노산의 카르복시 말단 결실을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 변형 및/또는 사용을 위해 변형되거나 돌연변이된 스테로이드-호르몬 수용체의 추가의 예는, 예를 들어 (1) "변형된 스테로이드 호르몬 수용체의 아데노바이러스성 벡터-매개 전달 및 관련된 생성물 및 방법" 국제 특허공개 WO 0031286 (PCTAJS99/26802); (2) "변형된 글루코코르티코이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체/프로게스테론 수용체 하이브리드" 국제 특허공개 WO9818925 (PCTAJS97/19607); (3) "유전자 요법을 위한 변형 스테로이드 호르몬 및 그들의 사용 방법" 국제 특허공개 WO9640911 (PCT/US96/0432); (4) "돌연변이된 스테로이드 호르몬 수용체, 그의 사용 방법 및 유전자 요법을 위한 분자 스위치" 국제 특허공개 WO 9323431 (PCTAJS93/0439); (5) "C-말단 호르몬 결합 도메인 끝 절단을 가진 프로게스테론 수용체" 미국 특허 5,364,791호; (6) "변형된 스테로이드 호르몬 수용체, 그의 사용 방법 및 유전자 요법을 위한 분자 스위치" 미국 특허 5,874,534호; 및 (7) "변형된 스테로이드 호르몬 수용체, 그의 사용 방법 및 유전자 요법을 위한 분자 스위치" 미국 특허 5,935,934호에 기재되어 있다.
또한, 야생형 수용체에 대한 효능제의 존재 하에서 돌연변이체 수용체를 활성화하는 야생형 스테로이드-호르몬 수용체의 길항제의 능력을 기초로 하여, 돌연변이된 스테로이드-호르몬 수용체 LBD를 선택할 수도 있다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, 프로게스테론은 프로게스테론 수용체에 대한 정상적인 리간드이고, 수용체를 위해 강력한 효능제로서 기능한다. 항-프로게스틴, MFP (RU486)은 프로게스테론 수용체를 위해 비-자연 또는 비-천연 리간드이다. 야생형 프로게스테론 수용체에 대한 효능제 효과를 발휘할 수 있긴 하지만 MFP가 프로게스테론의 효능제 효과를 억제하기 때문에 MFP는 "항-프로게스틴"으로 간주된다. 따라서, 정상적인 효능제의 존재 하에서, 다시 말해서 MFP 및 프로게스테론 양쪽 모두가 야생형 프로게스테론 수용체의 존재하에 함께 있을 때, MFP는 야생형 프로게스테론 수용체를 위한 "길항제"로 간주될 수도 있다. 그러나, 본 발명의 하나의 구현양태에서, 돌연변이된 프로게스테론 스테로이드-호르몬 수용체는 프로게스테론 (야생형 수용체를 위한 효능제)에 의해 활성화되지 않지만, MFP의 존재하에서 활성화된다 (야생형 수용체를 위한 "길항제"). 또한, 하나의 구현양태에서, 프로게스테론은 MFP에 의해 돌연변이된 스테로이드-호르몬 수용체의 활성화를 차단하지 않는다. 따라서, 돌연변이된 수용체는 야생형 프로게스테론 수용체에 대한 효능제 (예, 프로게스테론)의 존재 하에서도 야생형 수용체에 대한 길항제 (예, MFP)에 결합할 때 활성화된 것으로 특징화될 수도 있다.
하나의 구현양태에서, 돌연변이된 스테로이드 수용체는 야생형 스테로이드 호르몬 수용체를 위한 길항제의 존재하에서 원하는 TM의 전사를 활성화한다. 일부 구현양태에서, 길항제는 야생형 스테로이드 수용체 (예를 들어, 야생형 스테로이드 호르몬 수용체)의 길항제로서 작용하는 비-자연 발생 또는 비-야생형 리간드이다. 하나의 구현양태에서, 야생형 스테로이드 호르몬 수용체의 길항제는 야생형 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용하거나 이것에 결합하고 수용체의 효능제의 활성을 차단하는 분자이다. 다른 구현양태에서, 야생형 스테로이드 호르몬 수용체의 효능제는 피험자의 세포에서 TM의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위해 야생형 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용하는 분자이다. 이러한 효능제의 예는 이에 한정되지 않지만 프로게스테론 수용체(10)를 위한 프로게스테론 또는 프로게스틴을 포함하고, 프로게스테론은 프로게스테론-조절 유전자의 전사를 활성화하기 위해 야생형 프로게스테론 수용체에 결합한다.
하나의 구현양태에서, 적절한 프로게스테론 수용체 효능제는 프로게스테론을 모방하는 화학 화합물이다. 예를 들어, 미페프리스톤(MFP) 또는 기타 RU486으로 공지된 것은 야생형 프로게스테론 수용체에 결합하고 결합을 위해 프로게스테론과 경쟁하는 비-자연 리간드이다. 하나의 구현양태에서, 프로게스테론 및 야생형 프로게스테론 수용체의 존재 하에서, MFP는 프로게스테론에 의해 수용체의 활성화를 차단함으로써 수용체에 대한 길항 효과를 발휘한다.
프로게스테론 수용체(PR)는 예를 들어 프로게스테론 수용체의 LBD 중에서 변형될 수도 있고, 그 결과 이것은 MFP에만 결합하고 프로게스테론에 결합하지 않는다. 예를 들어, MFP의 결합이 프로게스테론 수용체를 활성화하도록 프로게스테론 수용체의 LBD가 돌연변이될 수도 있다. 하나의 구현양태에서, PR의 DBD에 의해 인지된 프로모터에 의하여 조종되는 TM 발현 및/또는 활성을 전이활성화하기 위해 MFP의 결합이 RM을 선택적으로 활성화하도록, 돌연변이된 PR LBD, 또는 더욱 일반적으로 다른 돌연변이된 스테로이드 수용체 LBD를 특정한 DBD (예, GAL-4 DBD)와 융합시킨다. 따라서, 일부 구현양태에서, 본 발명의 돌연변이된 스테로이드 수용체는 야생형 스테로이드 수용체를 위한 효능제의 존재하에서 활성화되지 않지만 그 대신 돌연변이된 스테로이드 수용체가 비-자연 리간드의 존재하에서 활성화된다.
용어 "비-자연 리간드" 또는 "비-천연 리간드"란 수용체의 리간드 결합 도메인에 결합하는 비-야생형 또는 비 자연-발생 리간드인 화합물을 가리킨다. 비-자연 리간드의 예는 선택적 프로게스테론 수용체 조정인자(SPRM) 또는 메조프로게스틴이다 (예를 들어, [Chwalisz 등 (2002) Ann NY Acad Sci 955:373-388]; [Elger 등 (2000) Steroids 65(10-11): 713-723]; [Chwalisz 등 (2004) Semin Reprod Med 22(2): 113-119]; [DeManno 등 (2003) 68(10-13): 1019-1032]; [Fuhrmann 등 (2000) J Med Chem 43(26): 5010-5016] 참조). SPRM 또는 메조프로게스틴의 예가 기재되어 있고 하기 표 2에 나타낸다 (화합물 1-16).
[표 2]
1. 명칭: 17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-11β-메톡시페닐-4,9-에스트라-디엔-3-온
구조:
Figure 112007090997218-PCT00001
화학식: C28H36O4
분자량: 436.60 g/mol
mp.: 184-186 ℃ (디클로로메탄)
2. 명칭: 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4.9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-[O-(에톡시)카르보닐]옥심
구조:
Figure 112007090997218-PCT00002
화학식: C31H39NO6
분자량: 521.66 g/mol
mp.: 143-151 ℃ (분해 메탄올)
3. 명칭: 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-옥심 아세테이트
구조:
Figure 112007090997218-PCT00003
화학식: C30H37NO5
분자량: 491.63 g/mol
mp.: 110-119 ℃ (에틸 아세테이트)
4. 명칭: 4-[17α-(에톡시메톡시)-17β-메톡시-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-옥심
구조:
Figure 112007090997218-PCT00004
화학식: C29H37NO4
분자량: 463.62 g/mol
mp.: 90-95 ℃ (메틸 tert 부틸 에테르)
순도 HPLC: 98.9 면적% (264nm)
5. 명칭: 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-티오세미카르바존
구조:
Figure 112007090997218-PCT00005
화학식: C29H37N3O3S
분자량: 507.69 g/mol
mp.: 217-236 ℃ (메탄올)
6. 명칭: 4-[17β-히드록시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-옥심 아세테이트
구조:
Figure 112007090997218-PCT00006
화학식: C29H35NO5
분자량: 477.61
mp.: 112 ℃ (아세톤, 분해), αD= +209℃ (CHCl3)
7. 명칭: 4-[17β-히드록시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-[O-(에틸아미노)카르보닐]옥심
구조:
Figure 112007090997218-PCT00007
화학식: C30H38N2O5
분자량: 505.65 g/몰
mp.: 184-190 ℃ (메틸렌클로라이드/에틸 아세테이트)
8. 명칭: 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-[O-(메톡시)카르보닐]옥심 (ZK280993)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00008
화학식: C30H37NO6
분자량: 507.63 g/몰
mp.: 110 ℃ (mtbe, 분해).
9. 명칭: 4-[17β-히드록시-17α-메틸-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-옥심 (ZK280999)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00009
화학식: C26H31NO3
분자량: 405.53 g/몰
mp.: 163-165 ℃ (에탄올/물).
10. 명칭: 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-[O-(에틸티오)카르보닐]옥심 (ZK190425)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00010
화학식: C31H39NO5S
분자량: 537.72 g/몰
mp.: 148-155 ℃ 분해 (아세톤/n-헥산).
11. 명칭: 4-[17β-히드록시-17α-(2-프로폭시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-옥심 (ZK281100)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00011
화학식: C29H37NO4
분자량: 463.62 g/몰
mp.: 192-196 ℃ (디에틸에테르, 분해).
12. 명칭: 4-(4'-브롬-17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-옥심 (ZK281117)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00012
화학식: C28H34BrNO4
분자량: 528.48 g/몰
mp.: 138-141 ℃ (디에틸에테르/n-헥산).
13. 명칭: 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]아세토페논 11β-(4-아세틸페닐)17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-4,9-에스트라디엔-3-온 (ZK139905)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00013
화학식: C29H36O4
분자량: 448.61 g/몰
mp.: 133-137 ℃ (디에틸에테르/메틸렌클로라이드)
14. 명칭: 11β-[4-(디메틸아미노)페닐]-17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-4,9-에스트라디엔-3-온 (ZK281317)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00014
화학식: C29H39NO3
분자량: 449.64
발포체 (헥산), αD = +184° (CHCl3)
15. 명칭: 4-[17α-에티닐-17β-메톡시-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1(E)-옥심 (ZK281527)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00015
화학식: C28H31NO3
분자량: 429.56 g/몰
mp.: 149-157 ℃ (아세톤)
16. 명칭: 4-[9α,10α-에폭시-17β-히드록시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스테르-3-엔-11β-일]벤즈알데히드-(E)-옥심 (ZK234965)
구조:
Figure 112007090997218-PCT00016
화학식: C27H33NO5
분자량: 451.57
mp.: 110 ℃ 분해 (아세톤/메틸 tert-부틸 에테르)
또한, 비-자연 리간드 및 비-천연 리간드의 예는 다음을 포함하는 항-호르몬이다: 11-(4-디메틸아미노페닐)-17-히드록시-17c-프로피닐-4,9-에스트라디엔-3-온 (RU38486 또는 미페프리스톤); 11-(4-디메틸아미노페닐)-17o-히드록시-17-(3-히드록시프로필)-13-메틸-4,9-고나디엔-3-온 (ZK98299 또는 오나프리스톤); 11-(4-아세틸페닐)-17-히드록시-17c-(1-프로피닐)-4.9-에스트라디엔-3-온 (ZK112993); 11-(4-디메틸아미노페닐)-17-히드록시-17(z-(3-히드록시-1(Z)-프로페닐-에스트라-4,9-디엔-3-온 (ZK98734); (7,11,17)-11-(4-디메틸아미노페닐)-7-메틸-4',5'-디히드로스피로[에스테르-4,9-디엔-17,2'(3'H)푸란]-3-온 (Org31806); (11, 14, 17c)-4',5'-디히드로-11-(4-디메틸아미노페닐)-[스피로에스트라-4,9-디엔-17,2'(3'H)-푸란]-3-온 (Org31376); 5-c-프레그난-3,2-디온, Org 33628 [Kloosterboer 등 (1995) Ann N Y Acad Sci Jun 12; 761:192-201], Org 33245 [Schoonen 등 (1998) J Steroid Biochem Mol Biol Feb; 64(3-4): 157-70]. 이러한 리간드의 추가의 예는 예를 들어 본 발명의 RM의 유도인자로서 작용하는 비-스테로이드성 프로게스테론 수용체-결합 리간드이다.
아미노산 또는 핵산 변형 (예를 들어, 결실, 삽입, 점 돌연변이, 융합 포함)을 위한 표준 방법을 사용하여, 이러한 조절, 발현 및/또는 활성을 위하여, 본 발명의 분자 (예, TM, RM, AM, IM, 또는 TM, RM, AM 또는 IM을 코드화하는 핵산)의 단백질 도메인 (예, AD, LBD, DBD) 또는 기능성 핵산 서열 (예, 단백질, RNA, 프로모터, 스플라이스 부위, 인트론, DNA 결합 부위 또는 폴리(A) 부위를 코드화하는 서열)을 변형시키거나 최적화할 수 있다. 또한, 분자의 발현 및/또는 활성이 일시적이거나 구조적이 되도록 본 발명의 분자 (예, TM, RM, AM, IM 또는 TM, RM, AM 또는 IM을 코드화하는 핵산)를 변형시킬 수 있고/있거나, 특정한 조건, 질병, 생체마커 또는 기타 분자의 존재에 의해 조절하거나 또는 자가-조절할 수 있다. 더욱 특별하게는, 특정한 엄격성, 특이성 또는 결합의 양, 활성화, 불활성화 또는 형태를 달성하기 위해 본 발명의 핵산 또는 아미노산 분자 또는 화학 화합물의 1차, 2차 또는 3차 구조를 변형시킬 수 있다 (예를 들어, 단독- 또는 이종-이량체 또는 기타 다량체를 형성하거나 특이적 또는 동종 리간드 또는 부위를 결합하기 위해).
예를 들어, 작동적으로 연결되고, 코드화되고 발현된 분자의 발현 및/또는 활성의 특이성, 수준 및 신뢰도를 최적화하거나 개선하는 후-전사 요소 (예, UTR, 스플라이스 부위, 인트론 및/또는 폴리(A) 신호)를 포함하도록 본 발명의 발현 카세트의 전사된 부분을 변형시킬 수 있다. 또한, 코드화된 분자의 발현이 예를 들어 일시적 또는 구조적이거나, 유도가능 또는 억제가능하거나, 및/또는 특정한 조건 또는 분자의 존재에 의해 조정 또는 달리 조절될 수 있도록, 본 발명의 분자를 코드화하는 작동적으로 연결된 서열의 프로모터 서열을 변형시킬 수 있다.
코드화된 분자 (예, TM, RM, AM 또는 IM)의 발현 및/또는 활성을 최적화하기 위하여 본 발명의 발현 카세트의 다양한 기능성 서열을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 서열로부터 RNA 전사의 매우 효율적이고 정확한 스플라이싱을 최적화하기 위해 인트론 서열을 변형시킬 수 있다. 이에 의해, 잠재 스플라이싱이 최소화될 수 있고, 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 원하는 분자 (예, TM, RM, AM 또는 IM)의 발현이 최대화될 수 있다. 본 발명의 조성물에서 사용하기 위해 적절한 합성 인트론의 예는, 이에 한정되지 않지만 5' 스플라이스 부위, 3' 스플라이스 부위 및/또는 분지 점을 위한 공통 서열을 포함한다. 5' 스플라이스 부위는 U1 snRNA와 쌍을 이루는 것으로 보고되어 있다. 적절한 5' 스플라이스 부위 공통 서열은, U1 RNA와 합성 5' 스플라이스 부위, 예를 들어 5'-CAGGUAAGU-3'을 포함하는 5' 스플라이스 부위 서열 간에 나선 형성의 자유 에너지를 최소화하기 위해 최적화된 것이다. 또한, 하나의 팽창된 A 잔기를 제외하고는 분지 점(BP) 서열은 U2 snRNA와 쌍을 이루는 것으로 보고되어 있다. 따라서, U2 RNA와 서열 간의 나선 형성의 자유 에너지를 최소화하기 위하여 분지 점 서열을 최적화할 수 있다. BP는 전형적으로 3' 스플라이스 부위와 18-38 nts 부위에 위치한다. 하나의 구현양태에서, 합성 인트론의 BP 서열이 3' 스플라이스 부위로부터 24 nts 상류에 위치하고, 예를 들어 5' UACUAC 3'를 포함하는 BP 서열이다. 또한, 3' 스플라이스 부위 기능을 위하여, 3' 스플라이스 부위를 위한 공통 서열의 폴리피리미딘 트랙을 최적화할 수 있다. 예를 들어, 적어도 5개 연속 우라실 잔기가 3' 스플라이스 부위 기능을 위해 최적이라는 것이 보고되어 있고, 따라서 일부 구현양태에서 본 발명의 합성 인트론의 폴리피리미딘 트랙은 7개 연속 우라실 잔기를 갖는다.
유사하게, 인트론의 길이를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 자연-발생 인트론은 90 내지 200 nt 길이일 수도 있는 것으로 공지되어 있다. 하나의 구현양태에서, 얻어지는 내부 엑손의 길이는 300 뉴클레오티드 미만이다. 하나의 구현양태에서, 합성 인트론은 IVS8 (예, SEQ ID NO:3)이고, 제한 효소 부위, BbsI 및 EarI (합성 인트론 내에 위치), 및 PstI 및 NheI를 포함한다. 5' 스플라이스 부위에서 정확하게 DNA를 절단하기 위하여 제한 효소 BbsI를 사용할 수도 있고, 3' 스플라이스 부위에서 정확하게 DNA를 절단하기 위해 EarI을 사용할 수도 있다. 또한, 합성 인트론을 본 발명의 분자를 코드화하는 핵산 서열의 여러 위치에 삽입할 수도 있다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 다수의 인트론을 포함하도록 본 발명의 분자를 코드화하는 핵산 서열이 변형된다.
다른 구현양태에서, 합성 인트론에 추가로, UT 12, 발현 조절 요소 (예를 들어, SEQ ID NO:2)라 불리우는 CMV 5' UTR를 코드화하는 핵산 서열을 포함하도록 본 발명의 IVS8 (예를 들어 SEQ ID NO:3) 발현 카세트를 변형시킨다. 다른 구현양태에서, SV40 폴리(A) 시그날을 코드화하는 핵산 서열 (예를 들어 SEQ ID NO:8)을 포함하도록 본 발명의 발현 카세트를 변형시킨다. 다른 구현양태에서, 인간 성장 호르몬 ("hGH") 폴리(A) 시그날을 코드화하는 핵산 서열 (예를 들어 SEQ ID NO:6)을 포함하도록 본 발명의 발현 카세트를 변형시킨다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 핵산 서열에 의해 코드화되는 (예를 들어 발현 카세트 또는 벡터의 핵산 서열에 의해 코드화되는) 코드화 분자 (예, TM, RM, AM, IM)의 발현 수준 및 충실도를 최적화하기 위하여 본 명세서에 기재된 상기 및 기타 변형을 사용할 수도 있다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "인트론"이란, RNA 폴리머라제에 의해 RNA 분자로 전사되지만 성숙한 메신저 RNA을 형성하기 위해 스플라이싱에 의해 제거되는 DNA 서열에 코드화된 서열을 가리킨다. "합성 인트론"은 자연-발생 인트론 서열로부터 초기에 복제되지 않고 일반적으로 자연-발생 서열을 갖지 않지만 정상적인 후-전사 처리 동안에 RNA 전사물로부터 제거되어지는 서열을 가리킨다. 이러한 합성 인트론은 각종 상이한 특징을 갖도록 설계될 수 있고, 특히 원하는 강도의 스플라이스 부위 및 바람직한 길이를 갖도록 이러한 인트론을 설계할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현양태에서, 분자 스위치 발현 카세트 및 치료 유전자 발현 카세트 양쪽 모두가 합성 인트론을 포함한다. 합성 인트론은 5' 스플라이스 부위, 3' 스플라이스 부위 및 분지 점을 위한 공통 서열을 포함한다. 치료 유전자를 발현하기 위해 설계된 진핵 벡터 내에 혼입될 때, 합성 인트론은 매우 효율적이고 정확한 방식으로 RNA 전사물의 스플라이싱을 지정할 것이고, 이에 의해 잠재 스플라이싱을 최소화하고 원하는 유전자 생성물의 생성을 최대화한다.
또한, 공지된 방법을 사용하여, 단백질의 활성을 최적화하기 위하여 단백질의 도메인을 코드화하는 기능성 서열을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분자 모델링을 사용하여, GAL-4 DBD를 가진 단백질의 서열-특이적 DNA 결합 활성을 유지하면서 낮은 이량체화 잠재력이 존재하도록 끝이 절단된 돌연변이체를 설계할 수 있다. GAL-4 DBD는 앞뒤상동 염기서열 17량체 GAL-4 DBS (CGGAAGACTCTCCTCCG)에 이량체로서 결합하는 것으로 보고되어 있으며, 보고에 따르면 이러한 이량체 결합에 의해 GAL-4 DBS를 가진 유도성 프로모터가 활성화된다. 따라서, 조절되지 않거나 (예, AM-독립적) 또는 원하지 않는 이량체화를 감소시키기 위해 GAL-4 DBD의 3차 구조가 최적화되도록 GAL-4 DBD를 가진 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 변형시킬 수 있고, 그 결과 유도성 프로모터가 활성화된다.
GAL-4 DBD 서열의 구조 및 기능이 알려져 있다 (예, PCT/US01/30305). 예를 들어, 아연을 킬레이트함에 있어서 시스테인(C)이 연관될 수도 있고; 이량체화 요소를 형성하는 꼬여진 코일 구조는 잔기 54-74 및 86-93을 포함하고; 일반적으로 소수성 아미노산은 각각의 헵타드 반복 서열의 첫 번째 및 네 번째 위치에 있고; 잔기 Ser47 및 Arg51은 이량체를 형성하는 단백질 사슬 사이에서 수소 결합을 형성하는 것으로 보고되어 있고; 잔기 8-40은 Zn 결합 도메인 또는 DNA 인식 단위를 형성하는 것으로 보고되어 있다. 이러한 DNA 인식 단위는 조밀한 공모양 구조를 형성하는 2개의 알파 나선 도메인을 가지며, Zn의 존재 하에서 아연 핑커보다는 이핵 금속 이온 클러스터인 구조가 얻어지며, 다시 말해서 시스테인-풍부 아미노산 서열 (CysXa-Xaa2-Cys14-Xaaa-CysZ1-Xaa6-CysZS-Xaa2-Cys31-Xaaa-Cys38)이 2개의 Zn(II) 이온을 결합한다 [Pan and Coleman (1990) PNAS 87: 2077-81]. Zn 클러스터는 17량체 결합 부위의 제일 말단에서 3bp의 주요 홈과 접촉하는 원인이 될 수도 있고; 26에서의 프롤린 (시스 프롤린)은 아연 클러스터 도메인의 2개 알파-나선 도메인을 연결하는 루프를 형성하는 것으로 보고되어 있고 이러한 기능을 위해 중요하다. 또한, 나선 41-49은 DNA 인식 단위 및 이량체 요소, 잔기 54-74 및 86-93을 연결하는 것으로 보고되어 있다.
일단 이량체화되면, 이량체의 잔기 47-51은 DNA 표적의 포스페이트와 상호작용할 수 있다. 잔기 50-64가 약한 이량체화에 연관될 수도 있다. 이량체는 친양쪽성 알파-나선을 형성하는 짧은 꼬여진 코일로 구성되고, 2개의 알파-나선이 류신 지퍼와 유사한 평행한 꼬여진 코일로 압축된다. 잔기 54-74 내에서 발견되는 3개 쌍의 류신 및 한 쌍의 발린의 소수성 상호작용에 추가로, 2개 쌍의 Arg-Glu 2O 염 연결이 존재하고, 하나의 단량체의 Arg51과 다른 단량체의 Ser47 사이에서 수소 결합이 존재한다. 잔기 65-93은 강력한 이량체화 도메인을 형성할 수도 있다. 잔기 65-71의 구조는 하나의 헵타드 반복을 위한 꼬여진 코일 구조의 연속이다. 잔기 72-78은 프롤린을 함유하고 따라서 친양쪽성 나선을 붕괴시킨다. 그러나, 잔기 79-99는 3개 이상의 더욱 잠재적으로 알파-나선 헵타드 서열을 함유한다 [Marmorstein 등 (1992) Nature 356: 408-414]. 또한 GAL-4 잔기 1-100의 결합을 위한 Kd는 3nM인 것으로 보고되어 있다 [Reece and Ptashne (1993) Science 261: 909-911].
GAL-4 DBD 서열의 구조 및 기능의 측면에서, GAL-4 도메인의 영역에 다수의 가능한 변형을 행할 수 있다. 일부 구현양태에서, 기본 발현의 제거 또는 감소 및 서열-특이적 DNA 결합의 체류를 최적화하기 위하여 GAL-4 영역을 변형시킨다. 더욱 특별하게는, 일부 구현양태에서, GAL-4 DBD의 상호작용하는 꼬여진 코일 서열을 함유하는 영역의 길이 (예를 들어, 잔기 54-74 및 잔기 86-93)가 결실에 의해, 예를 들어 아미노산 서열 54-64, 65-74, 54-74 또는 86-93을 결실시킴으로써 짧아질 수 있다. 또한, 꼬여진 코일 영역의 하나를 결실시킴으로써, 단지 하나의 꼬여진 코일 영역을 가진 GAL-4 돌연변이체가 만들어질 수 있다. 추가로, 예를 들어 알파-나선 헵타드 서열의 각각의 접합점에 위치한 특유의 제한효소 부위를 사용하여 돌연변이체 또는 인공 서열을 GAL-4 도메인에 삽입할 수 있다. 따라서, 알파-나선 헵타드 서열을 점진적으로 감소시키는 GAL-4 도메인의 변형된 변형체가 생성될 수 있다.
일부 구현양태에서, N-말단 메티오닌을 제거하기 위해 천연 GAL-4 서열을 변형시키고, 서열의 N-말단에 추가의 아미노산을 첨가한다. 이러한 구현양태에서, 이들이 Zn 결합 도메인의 잔기 8-40의 3차 구조에 영향을 미치지 않는 한, 천연 GAL-4 서열의 N-말단 아미노산에 대한 변형은 중요하지 않다. 또한, 일부 구현양태에서, 단백질의 이량체화를 개시하기 위하여, GAL-4 DBD (예, RM)을 가진 단백질의 돌연변이된 hPR LBD에 대한 소 분자 AM, 예를 들어 MFP의 특이적 결합은 단백질에서의 형태적 변화를 촉발시킨다. 추가로, 일부 구현양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 SEQ ID NO:37의 GAL-4 DBD 서열의 잔기 2-93을 코드화하는 핵산 서열을 포함한다. 또한, 하나의 구현양태에서, GAL-4 DBD의 DNA 인식 서열은 SEQ ID NO:37의 GAL-4 DBD의 잔기 9-40을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현양태에서, GAL-4 도메인은 GAL-4 DBD의 C-말단 부위에서 19 아미노산의 결실에 의해 끝이 절단되고, SEQ ID NO:37의 GAL-4 DBD 서열의 잔기 75-93을 포함한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 RM은 SEQ ID NO:37의 GAL-4 DBD 서열의 잔기 2-74를 포함하는 돌연변이된 프로게스테론 수용체 및 AM의 존재하에서 특이적으로 활성화되는 돌연변이된 프로게스테론 수용체 LBD를 포함한 키메라 단백질이다. 또한, AM의 부재 하에서, RM 활성화가 거의 또는 전혀 존재하지 않고, 그 결과 GAL-4 DBS을 가진 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사가 유도되거나 활성화되지 않는다.
언급된 바와 같이, 천연 분자 (예, 단백질 또는 핵산)의 변형체를 코드화하는 핵산은 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절하다. 예를 들어, 특히 MS의 처리를 위하여, IFN-β (예, IFN-β 1b)의 변형체가 본 발명의 조성물 및 방법에서 TM으로서 사용하기 위해 적절하다. 바람직하게는, IFN-β 변형체는 천연 인간 IFN-β의 변형체이다. 자연-발생적 (예, IFN-β 좌에서 발생하는 대립 변형체)이거나 또는 재조합에 의해 또는 합성에 의해 생성될 수도 있는, 천연 인간 IFN-β의 변형체는 성숙한 천연 IFN-β 서열과 유사하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 조성물 및 방법, 예를 들어 IFN-β 1a (예를 들어, SEQ ID NO:14)에서 사용하기 위하여 천연 인간 IFN-β (예, SEQ ID NO:13의 아미노산 서열 포함)을 코드화하는 핵산이 적절하다. 또한, 본 발명의 조성물 및 방법 (예를 들어, IFN-β 1b)에서 사용하기 위하여 인간 IFN-β 변형체를 코드화하는 핵산이 적절하다 (예를 들어, 미국 특허 4,588,585호, 4,737,462호 및 4,959,314호 참조). 변형체는 생물학적 또는 치료 활성을 보유하는 천연 분자 (예, 단백질 또는 핵산)의 단편 또는 끝이 절단된 형태를 코드화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 핵산은 천연 단백질의 생물학적 활성 단편 또는 끝이 절단된 형태를 코드화한다. 또한, 일부 구현양태에서, 본 발명의 발현된 단백질은 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수도 있다.
또한, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 적절한 단백질 또는 핵산 변형체는 이에 한정되지 않지만 조류, 개, 소, 돼지, 말 및 인간을 포함하는 포유동물 종의 천연 또는 야생형 단백질 또는 핵산의 변형체이다. 본 발명에 의해 포함되는(예를 들어, 핵산에 의해 코드화되는) IFN-β 변형체의 비-제한적인 예는 다음에 기재되어 있다 (예를 들어 [Nagata 등 (1980) Nature 284: 316-320]; [Goeddel 등 (1980) Nature 287: 411-416]; [Yelverton 등 (1981) Nucleic Acids Res. 9:731-741; Streuli 등 (1981) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 78:2848-2852; EP 028033B1, 및 EP109748B1]. 또한, 예를 들어 미국 특허 4,518,584; 4,569,908; 4,588,585; 4,738,844; 4,753,795; 4,760,233; 4,793,995; 4,914,033; 4,959,314; 5,545,723; 및 5,814,485 참조. 이러한 기준은 생물학적 활성의 손실 없이 변경될 수 있는 IFN-β 단백질의 잔기 및 영역에 관한 지침을 제공한다.
본 발명의 발현된 단백질 및 핵산 (예, RNA)의 변화 또는 변형은 이들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열 내로의 돌연변이에 의해 도입될 수 있고, 이에 의해 발현된 분자의 생물학적 또는 치료 활성을 변경시키지 않으면서 발현된 단백질 또는 핵산 서열의 아미노산 서열에서의 변화가 일어난다. 예를 들어, 대조 또는 출발 단백질을 위해 아미노산 서열과는 상이한 서열을 가진 변형체 단백질을 코드화하는 단리된 핵산 분자는, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 상응하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써 생성될 수 있으며 (IFN-β 변형체를 위하여, 예를 들어 미국 특허 5,588,585, 미국 특허 4,959,314; 4,737,462; [L.Lin (1998) Dev.Biol.Stand. 96: 97-104] 참조), 그 결과 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 대조 또는 출발 단백질을 코드화하는 서열 내에 도입되고, 이에 의해 코드화 단백질이 발현될 때 변형체 단백질이 얻어진다. 예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열을 변형시키기 위한 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 돌연변이가 도입될 수 있다.
또한, 하나 이상의 예측되고 바람직하게는 비필수적인 아미노산 잔기에서 보존 아미노산 치환을 코드화하도록, 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 변형시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 또는 치료 활성을 변경시키지 않으면서 단백질의 대조 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 이러한 활성을 위해 요구된다. 본 명세서에서 사용된 "보존 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 과는 당 기술분야에 정의되어 있다. 이러한 과는 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 가진 아미노산 (예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 보존된 아미노산 잔기를 위해 또는 보존된 모티프 내에 있는 아미노산을 위해 이러한 치환이 만들어지지 않는다.
또한, 포화 돌연변이유발에 의하여 대조 분자의 코드화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 돌연변이를 도입함으로써 변형체 분자의 뉴클레오티드 서열이 만들어질 수 있으며, 생물학적 또는 치료 활성을 위하여 얻어진 돌연변이체를 선별할 수 있다. 돌연변이유발에 따라서, 코드화된 단백질을 재조합에 의해 발현할 수 있고, 여기에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 표준 분석 기술을 사용하여 단백질의 활성을 결정할 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 생물학적 또는 치료 활성 단백질 변형체는 대조 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 약 90% 내지 약 95% 또는 그 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 내지 약 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 이것은 비교 또는 대조를 위한 기초로서 작용한다. 본 명세서에서 사용된 "서열 동일성"은, 변형체의 아미노산 서열의 특정한 인접 세그먼트를 대조 분자의 아미노산 서열과 정렬하고 비교할 때, 변형체 단백질 및 대조로서 작용하는 단백질 분자 내에서 발견되는 동일한 아미노산 잔기이다.
예를 들어, 수학적 연산을 사용하여 2개 서열 간의 퍼센트 동일성의 결정이 달성될 수 있다. 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 연산의 한가지 바람직한 비-제한적 예는 예를 들어 문헌 [Myers and Miller (1988) Comput.Appl.Biosci. 4:11-7]의 연산이다. 이러한 연산이 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)에서 사용되고, 이것은 GCG 정렬 소프트웨어 패키지의 일부이다. 아미노산 서열과 비교할 때, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭(gap) 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 ALIGN 프로그램과 함께 사용할 수 있다. 2개 서열을 비교함에 있어서 사용하기 위한 수학적 연산의 다른 바람직한 비-제한적 예는 문헌 [Karlin and Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5873-5877]의 연산이고, 이것은 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5873-5877]으로서 변형된다. 이러한 연산을 문헌 [Altschul 등 (1990) J.Mol.Biol. 215: 403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내에 포함시킨다. 주요 단백질과 유사한 아미노산 서열을 수득하기 위하여 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3을 사용하여 BLAST 아미노산 서열 연구를 수행할 수 있다.
비교 목적을 위해 갭드(gapped) 정렬을 수득하기 위하여, 문헌 [Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 갭드 BALST를 사용할 수 있다. 대안적으로, 분자들 간의 먼 관계를 검출하는 통합 연구를 수행하기 위해 PSI-BLAST를 사용할 수 있다 (예를 들어, Altschul 등 (1997) 상동 참조). BLAST, 갭드 BLAST 또는 PSI-BLAST 프로그램을 사용할 때, 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다 (예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 또한, 예를 들어 ALIGN 프로그램 (Dayhoff (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl.3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) 및 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지 버젼 8에서의 프로그램 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.), 예를 들어 GAP 프로그램 (프로그램의 디폴트 매개변수가 사용되는 경우) 참조.
아미노산 서열 동일성의 퍼센트를 고려할 때, 보존 아미노산 치환의 결과로서 일부 아미노산 잔기 위치가 상이할 수도 있으며, 이것은 단백질 기능의 성질에 영향을 미치지 않는다. 이러한 경우에, 보존적으로 치환된 아미노산에서의 유사성을 고려하여 퍼센트 서열 동일성을 상향 조절할 수도 있다. 이러한 조절은 당 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 [Myers and Miller (1988) Comput.Appl.Biosci. 4:11-17] 참조).
또한, RM, AM 또는 IM이 단백질인 구현양태에서, 단백질을 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 알부민과 공유 결합시킬 수 있다. 이러한 공유 하이브리드 분자는 피험자에게 투여된 후에 바람직한 성질, 예컨대 연장된 혈청 반감기를 가질 수 있다. 본 발명의 단백질과 반응하는 활성화 화합물을 생성하기 위하여, PEG-IFN 부가물의 형성 방법은 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 화학 변형과 연관된다. PEG-연결된 단백질의 제조 및 사용 방법이 예를 들어 문헌 [Delgado 등 (1992) Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst. 9:249-304] (본 명세서에서 배경 기술에 기재됨)에 기록되어 있다. 알부민 융합 단백질의 생성 방법은 주요 단백질의 코드화 서열과 알부민의 융합을 포함하고 예를 들어 미국 특허 5,876,969호에 보고되어 있다.
본 발명에 의해 포함되는 생물학적 또는 치료 활성 단백질 또는 핵산 변형체는 바람직하게는 생물학적 또는 치료 활성을 보유하거나 갖는다. 일부 구현양태에서, 변형체는 대조 분자 (예, 단백질 또는 핵산)의 생물학적 또는 치료 활성의 적어도 약 25%, 약 50%, 약 75%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상을 보유한다. 대조 분자 (예, 단백질 또는 핵산)의 활성과 비교하여 활성이 증가된 변형체가 또한 포함된다. 변형체의 생물학적 또는 치료 활성은 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, [Fellous 등 (1982) Proc.Natl.Acad.Sci, USA 79:3082-3086]; [Czerniecki 등, (1984) J.Virol. 49(2): 490-496]; [Mark 등 (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81: 5662-5666]; [Branca 등 (1981) Nature 277: 221-223]; [Williams 등 (1979) Nature 282: 582-586]; [Herberman 등, (1979) Nature 277: 221-223]; [Anderson 등 (1982) J.Biol.Chem. 257(19): 11301-11304] 참조).
일반적으로, 본 명세서에 기재된 클론화, 시험 및 다른 용도를 위하여, 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 핵산, 단백질 및 화학 조성물을 생성하거나 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 또는 핵산을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 단백질이 생성될 수 있다. 숙주 세포는 뉴클레오티드 서열을 전사할 수 있고 원하는 단백질 또는 핵산을 생성하는 것이고, 원핵세포 (예를 들어, 이.콜리) 또는 진핵세포 (예, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포)일 수 있다. 적절한 발현 벡터를 포함하여 IFN-β의 재조합 생성의 예는 예를 들어 [Mantei 등 (1982) Nature 297: 128]; [Ohno 등 (1982) Nucleic Acids Res. 10: 967]; [Smith 등 (1983) Mol.Cell.Biol. 3:2156]; 및 미국 특허 4,462,940호, 5,702,699호 및 5,814,485호; 미국 특허 5,795,779호에 기재되어 있다.
또한, 재조합 DNA ("rDNA") 기술을 사용하여 유전자를 클론화하였으며, 예를 들어 동물 또는 식물 세포, 또는 트랜스제닉 동물에서 생성되고 시험될 수 있다 (예를 들어 [Nagola 등 (1980) Nature 284: 316]; [Goeddel 등 (1980) Nature 287: 411]; [Yelverton 등, (1981) Nuc.Acid.Res. 9: 731]; [Streuli 등 (1981) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78:2848] 참조). 예를 들어 바이러스성 유도된 인간 세포로부터 폴리-A-풍부 12S 메신저 RNA를 추출하고, 주형으로서 mRNA를 사용하여 이중-가닥 cDNA를 합성하고, cDNA를 적절한 클론화 벡터 내에 도입하고, 적절한 미생물을 벡터로 형질전환하고, 미생물을 수집하고, 그로부터 단백질을 추출함으로써 rDNA 기술에 의해 단백질이 생성될 수도 있다 (예를 들어 유럽 특허출원 28033 (1981년 5월 6일 공개); 32134 (1981년 7월 15일 공개) 및 34307 (1981년 8월 26일 공개)).
또한, 단백질을 화학적으로 합성하고, 펩티드 기술의 숙련가에게 공지된 몇몇 기술에 의하여 단백질을 시험할 수 있다 (예를 들어 [Li 등 (1983) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:2216-2220, Steward and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford III.) and Baraney and Merrifield (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, ed. Gross and Meinhofer, Vol.2 (Academic Press, N.Y. 1980), pp.3-254, discussing solid-phase peptide synthesis techniques]; 및 [Bodansky (1984) Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin) 및 Gross and Meinhofer, eds. (1980), The Peptides.Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 (Academic Press, New York, discussing classical solution synthesis)]). 본 발명의 단백질은 예를 들어 동시 다중 펩티드 합성의 방법에 의해 화학적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Houghten (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 5131-5135]; 및 미국 특허 4,631,211호 참조.
또한, 당업자라면 허용되는 적절한 동물 모델 및 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 질병의 치료를 위하여 본 발명의 조성물을 어떻게 시험하는지를 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 예를 들어 실험적 알레르기 뇌척수염(EAE), 관절염, 루푸스 및 NOD 당뇨병 모델을 포함하여 몇몇 동물 자가면역 질병 모델에서 사이토카인을 전달하기 위하여 유전자 전달 체계가 사용될 수 있는 것으로 보고되어 있다 (예를 들어, [G.C.Tsokos and G.T.Nepom (2000) Clin.Invest. 106: 181-83]; [G.J.Prud'homme (2000) J.Gene Med. 2: 222-32] 참조). EAE는 특정한 CNS 자가-항원, 예를 들어 뇌 유래 단백지질 또는 수초 염기성 단백질과의 면역화 후에 일어나는 중추 신경계 염증의 모델이다. 이것의 과정 및 임상적 소견은 인간에서의 다발 경화증(MS)과 유사하고, MS를 연구하기 위해 허용된 모델이 되었다. 생쥐 및 쥐 EAE 모델에서 단백질(15-20)로서 및 벡터에 의해 전달되는 유형 I IFN의 시험을 설명하고 있는 몇몇 보고서가 존재한다 (예를 들어, [K.Triantaphyllopoulos 등 (1998) Gene Therapy 5: 253-63; J.L.Croxford 등 (1998) J.Immunol. 160: 5181-87]. Yu 등은, mIFN-β 단백질을 투여한 생쥐가 정상 생쥐에 비하여 EAE 질병 유도 시에 장애로의 진행 지연 (임상 점수에 의해 측정), 재발 개시 지연, 및 악화 빈도의 감소를 나타낸다는 것을 밝혀내었다 (예를 들어 [M.Yu 등 (1996) J.Immunol. 64: 91-100]). 이러한 결과는 IFN-β 치료에 의한 인간 결과와 매우 유사하다. 뉴런 특이적 프로모터의 제어 하에서 IFN-β를 CNS에 전달하기 위한 유전자 요법-기초 접근법에서 트리안타필로포울로스(Triantaphyllopoulos)등에 의해 플라스미드 기초 벡터가 사용되었다 ([K.Triantaphyllopoulos 등 (1998) Gene Therapy 5: 253-63] 참조). 이러한 벡터를 EAE의 이펙터 단계 동안에 생쥐 내에 두개내 주입하고, 질병의 임상 증후를 감소시키거나 예방하였다. 생쥐 EAE 모델에서 IFN-β를 사용하여 지금까지 행해진 이러한 연구의 결과는, IFN이 개시를 지연시키고 EAE 모델에서 질병의 소견을 역전시키는데 효과적인 요법임을 증명한다. 이 모델에서 IFN-β를 전달 (국소 두개내 투여)하기 위한 유전자 요법 방법이 효과적인 것으로 밝혀졌다.
하기 실시예는 예증을 위해 제공되고, 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 인간 IFN-β (hIFN-β) 및 생쥐 IFN-β (mIFN-β) 발현 벡터를 구축하고, 혈청에서 IFN-β를 직접적으로 측정하기 위해 분석을 개발하고, 생체내에서 IFN-β 발현과 상관관계를 갖는 생체마커를 동정하였다. 또한, 정상 생쥐에서 IFN-β의 유전자-기초 전달을 덩어리 단백질 전달과 비교하여 약동학적 연구를 수행하였으며, 비-바이러스성 플라스미드 DNA 또는 IFN-β를 코드화하는 아데노-관련 바이러스성(AAV) 벡터의 근육내 주사를 사용하여 뛰어난 약동학적 프로파일을 증명하였다. 또한, 거의 6개월 동안 hIFN-β를 발현하는 AAV-1 벡터를 사용하여 hIFN-β의 안정한 발현을 관찰하였다. 또한, mlFN-β를 코드화하는 플라스미드 DNA의 1회 근육내 주사는 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 생쥐 모델에서 효능적인 것으로 밝혀졌으며, mIFN-β 단백질의 격일 주사만큼 동일하게 효능적이었다. 하기 설명된 바와 같이, 본 발명의 조절 발현 체계의 예를 구 축하고 시험하였다. 예를 들어, 본 발명의 조절 발현 체계를 사용하여 정상 생쥐에서 IFN-β의 조절 발현을 증명하였으며, 이 경우에 TM 및 RM이 단일 플라스미드 벡터에 함유된다.
이 실시예에 기재된 연구로부터의 데이타는, 질병의 치료를 위하여 핵산 코드화 TM의 전달을 위해 본 발명의 조절 발현 체계의 잠재력을 증명한다. 특히, 이러한 실시예는, MS의 치료를 위해 단백질의 장기간 조절 발현을 위하여, 장 기간 동안 IFN-β (예, IFN-β 1a)를 코드화하는 핵산의 전달을 위해 본 발명의 조절 발현 체계의 사용 가능성을 증명한다. 하나의 구현양태에서, 전달 벡터는 TM (예, IFN-β) 및 RM을 코드화하는 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트를 포함하는 단일 플라스미드 벡터이고, 이들은 각각 AM, 예를 들어 소 분자 유도인자(예, MFP)의 경구 투여 후에 지속적이고 (예를 들어 3개월 이상) 재생가능한 발현을 제공하고, 또한 벡터는 근육내 주사에 의해 투여를 반복할 수 있다.
실시예 1: IFN -β 또는 GMCSF 유전자 요법에서 사용하기 위한 벡터의 구축
A. 플라스미드 벡터: 5' 프라이머에 첨가된 면역글로블린 카파 (IgK) (단백질 정제를 위해) 또는 mIFN-β (유전자 요법을 위해) 시그날 서열에 의하여 세균 발현 벡터 pbSER189로부터 생쥐 IFN-β (mIFN-β) 유전자를 PCR 증폭시켰다. 재조합체 단백질 발현 및 정제를 위하여 pGER90 (도 2A)를 생성하기 위해 발현 벡터 pCEP4/WPRE에서, 그리고 유전자 요법을 위하여 pGER101 (도 2B)를 생성하기 위해 pgWiz에서, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 하류에 PCR 생성물을 삽입하였다.
세균 발현 벡터 pbSER178로부터의 인간 IFN-β 유전자를, mIFN-β 유전자에서와 동일한 절차에 의하여 PCR 증폭시키고 (유전자 요법 벡터를 위한 hIFN 시그날 서열 제외), 재조합체 단백질 발현 및 정제를 위하여 pGER123 (도 2C)을 생성하기 위해 pCEP4/WPRE 내에, 그리고 유전자 요법을 위하여 pGER125 (도 2D)를 생성하기 위해 pgWiz 내에 삽입하였다.
플라스미드 벡터의 구축은 방법 및 재료 항목, 소항목 F에서 충분히 설명된다.
B. AAV-1 벡터: hIFN-β를 코드화하는 pGWIZ/hIFN-β의 블런트 HincII/NotI 단편을 AAV-1 벡터, pTReGFP의 블런트 AgeI-SalI 부위 내에 삽입함으로써, hIFN-를 코드화하는 AAV-1-hIFN-β 서틀 플라스미드를 구축하였다. 얻어진 서틀 플라스미드는 pGT62 (SEQ ID NO:44)로 명명되고 hINF-β를 코드화하는 AAV-1 바이러스를 생성하기 위해 사용된다. 표준 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 AAV-1 바이러스의 2개 회분을 제조하고, 약동학적 연구 (도 4)에서 사용하였다. 2개 바이러스 회분에서 hIFN-β의 발현 수준을 ELISA에 의해 입증하였다.
또한, mGMCSF 또는 hGMCSF를 코드화하는 단편을 벡터 pGENE/V5HisA (인비트로겐) 내에 삽입함으로써, mGMCSF 또는 hGMCSF를 코드화하는 AAV-1-GMCSF 서틀 플라스미드 pGT714 및 pGT713 (도 30B)를 구축하였다. 얻어지는 벡터를 pGT723-GENE/hGMCSF 및 pGT724-GENE/mGMCSF로 명명하였다. KpnI-Xbal로 벡터를 소화시킴으로써 mGM-CSF를 코드화하는 단편을 pGT724-GENE/mGMCSF로부터 잘라내었다. 유사하게, KpnI-Xbal로 벡터를 소화시킴으로써 pGT723-GENE/hGMCSF로부터 hGM-CSF를 코 드화하는 단편을 잘라내었다. 벡터 pZac2.1을 KpnI-Xbal로 소화시키고, 송아지 소장 포스파타제(CIP)로 처리한 다음, mGMCSF 또는 hGMCSF를 코드화하는 잘라낸 단편을 KpnI-Xbal 부위에서 pZac2.1 내에 삽입하였다. 얻어진 서틀 플라스미드는 pGT713 (pZac2.1-CMV-hGMCSF) 및 pGT714 (pZac2.1-CMV-mGMCSF)로 명명된다 (도 30B).
본 발명의 벡터의 구축은 하기 방법 및 재료 항목, 소항목 F에서 충분히 설명된다.
실시예 2: IFN -β 유전자 전달의 약동학적 연구
A. 인간 IFN -β 와의 약동학적 연구: 덩어리 단백질 대 인간 IFN-β (hIFN-β)의 유전자-기초 전달을 비교하기 위하여 정상 생쥐에서 약동학적 연구를 수행하였다.
1) 인간 IFN -β1a 단백질 약동학적 연구: 근육내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.) 주사에 의하여 전달된 재조합 hIFN-β 1a의 일시 주사를 사용하고 hIFN-β의 혈청 수준을 검출하기 위해 통상적으로 이용가능한 ELISA를 사용하여, 약동학적 연구를 C57/BI6 생쥐에서 수행하였다. 도 3은, 25 ng (1 ug/kg) 또는 250 ng (10 ug/kg)의 hIFN-β 1a 단백질을 단일 i.m. 또는 i.v. 주사한 후에, 생쥐의 혈청에서 hIFN-β1a 단백질의 약동학적 프로파일을 나타낸다. i.v. 주사 후에, 첫 번째 시점 (30분)에서 용량 의존적 방식으로 hIFN-β 1a를 혈청에서 검출하고, 6시간까지 수준이 분석의 검출 한계 (LOD) 근처 (LOD=12.5 pg/ml)가 되도록 빠르게 제거하였다. 재조합 hIFN-β1a 단백질의 i.m. 주사 후에, hIFN-β1a 혈청 수준이 주사 후 2시간에 최대 수준에 이르르고, 이어서 6시간까지 약 10배만큼 감소하였다. 6시간에서 혈청에 남아있는 hIFN-β1a의 양은 i.v. 주사에 비해 i.m.주사에서 더 높았다. i.v. 및 i.m. 주사 양쪽 모두에서, 고 용량과 저 용량 사이에서 혈청 hIFN-β1a 수준의 10배 차이가 관찰되었다. 재조합 hIFN-β1a의 일시 주사 후에 나타나는 매우 일시적 동역학은, 인간 및 다른 동물 종에 앞서 보고된 결과와 매우 유사하다 ([Buchwalder, P-A 등, (2000) J Interferon Cytokine Res 20: 57-66]; [Pepinsky, RB 등 (2001) J Pharm Exp Ther 297: 1059-55]).
2) AAV -1- CMV hIFN -β 1a의 유전자-기초 전달의 약동학적 연구: 인간 IFN-β (AAV-1-CMV hIFN-β1a)를 구성적으로 발현하기 위해 AAV-1 벡터를 구축하고, 3개 용량 (0.5×1010, 1.0×1010 또는 5.0×1010 바이러스 입자)에서 C57BI/6 생쥐 내에 i.m. 주사에 의해 전달하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 생쥐 혈청에서 인간 IFN-β 1a 발현은 2일 째에 낮았지만, 10일까지 빠르게 증가되고 이 시점에서 모든 3개 용량-군에서의 혈청 수준이 안정 수준에 이르거나 서서히 증가된다. 증가하는 양의 AAV-1-CMV hIFN-β1a 벡터 투여에서 명백한 용량 반응이 관찰되었다. 2개의 높은 용량에서, 주사 후 171일에 혈청에서 hIFN-β1a 발현의 정상 수준이 검출되었다. 재조합 hIFN-β1a 단백질의 일시 i.m. 주사를 사용한 연구에 대조하여, hIFN-β 1a를 코드화하는 AAV-1 벡터의 유전자-기초 전달을 사용한 연구는, 벡터의 단일 주사 후에 혈청에서 hIFN-β1a의 장기간 발현을 증명한다.
실시예 3: 유전자 요법을 위한 IFN -β 생체마커의 동정 및 용도
A. mIFN -β 생체마커의 발생: 생체 내에서 생쥐 IFN-β (mIFN-β) 활성의 높은 검출 감도를 위하여, mlFN-β 단백질 또는 mIFN-β 코드화 유전자 요법 벡터의 주사 후에 생쥐에서 mIFN-β 활성을 위한 생체마커를 동정하였다. 베타세론 (IFN-β 1b)로 치료한 환자로부터 임상 샘플에서 인간 IFN-β 활성 (IFN-β 1b)을 따르기 위해 생체마커를 사용할 수 있다 (예를 들어 [Amason, BG (1996) Clin Immunol Immunopathol 81: 1-11]; [Deisenhammer, F 등 (2000) Neurology 54: 2055-60]; [Knobler, RL 등 (1993) J Interferon Res 13:333-40]; [Kracke, A 등 (2000) Neurology 541: 193-9] 참조). 유형 I IFN에 의해 특이적으로 유도되기 때문에 (예를 들어, [von Wussow, P 등 (1990) J Imm 20:2015-19] 참조), IFN-β 임상 연구에서 사용된 주요 생체마커의 하나는 MxA이다 (예를 들어, [Kracke, A 등 (2000) Neurology 541: 193-9]; [Bertoloto, A 등 (2001) J Imm Meth 256:141-152] 참조). 본 연구에서, 생물학적 활성 mIFN-β의 존재를 검출하기 위하여 생쥐 말초 혈액 단핵구(PBMC)로부터 단리된 MxA 생쥐 상동체, Mx1의 발현 (예를 들어, [Hug, H 등 Mol Cell Biol 8: 3065-79]; [Pavlovic, J (1993) Ciba Found Symp 176: 233-43] 참조)을 사용하였다.
생쥐 PBMC에서 Mx1 mRNA의 수준을 정량하기 위하여 정량적 PCR/RT-PCR 분석을 개발하였다. 구체적으로, mIFN-β 단백질로 처리되거나 mIFN-β 유전자의 유전자-기초 전달 후에 처리된 생쥐로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하였다. 처리된 생쥐로부터 수득된 혈액 샘플을 2000rpm에서 25분 동안 피콜 쿠션 상에서 원심분리하였다. 정제된 PBMC를 펠릿화하고, 키아겐으로부터 "RNA이지" 미니 추출 키트를 사용하여 Mx1 분석을 위한 RNA를 정제하였다. RNA를 H2O에서 -80℃에서 보관하였다. 태크맨(TaqMan)(R) 화학을 사용하여 Mx1 RT-PCR을 수행하고, 어플라이드 바이오시스템스 (ABI) 프리즘(R) 7700 서열 검출 장치 위에서 분석을 수행하였다. RNA의 역 전사 및 cDNA의 증폭을 위하여, ABI로부터의 "원-스텝 태크맨(R) RNA" 키트를 사용하였다. RNA를 48℃에서 30분 동안 역 전사하였으며, 95℃에서 30초 동안 변성 단계 및 60℃에서 1분 동안 어닐링/신장 단계와 함께 40회 주기로 증폭을 수행하였다. Mx1-특이적 프로브/프라이머 조합과 함께 샘플을 분석하였다. Mx1 발현을 ABI로부터 표준 분석을 사용하여 병렬로 측정된 GAPDH 발현으로 표준화하였다.
정제된 재조합 mIFN-β 단백질로 처리된 생쥐 L929 세포에서 Mx1 RNA 유도를 시험함으로써 시험관내에서 분석을 확인하였다 (도 5). 대략 50 pg/ml mIFN-β의 EC50과 함께 Mx1 RNA의 발현에서 용량 의존적 증가가 관찰되며, 그 결과 Mx1 RNA의 수준에서의 100배 증가가 얻어진다.
B. mIFN -β 단백질의 일시 주사는 생체내에서 일시적 생체마커 반응을 유도한다: 정제된 재조합 mIFN-β의 일시 주사 후 생체마커 반응을 이 연구에서 측정하였다. i.v. 또는 i.m. 투여로 시험된 각각의 IFN-β 농도에서 Mx1 RNA 발현의 유도 (부형제 주사 생쥐에 대해 25- 내지 50-배)가 관찰되었다 (도 6). 주사 후 2시간에 가장 높은 Mx1 발현 수준이 측정되었다. 이 시점에서, mIFN-β가 i.m.으로 전달될 때 명백한 용량 반응이 관찰되었다. Mx1 발현이 빠르게 강하되고 주사 후 12시간을 넘어서는 배경 이상으로 Mx1 RNA 수준이 검출되지 않았다. mIFN-β 가 i.v. 주사되었을 때, 150 ng에서 가장 높은 유도가 관찰되었다. 500 ng 용량에서 Mx1 RNA 유도의 감소된 수준이 존재하였다. 아마도 IFN 유형 I 수용체의 하향 조절에 기인하여, 높은 IFN-β 수준이 생체반응을 명백히 하향-조절시키는 다른 연구에서 이러한 포화 효과가 관찰되었다 (예를 들어 [Mager, DE 및 Jusko, WJ (2002) Pharm Res 19: 1537-43] 참조). i.v. 주사된 생쥐에서 Mx1 RNA 발현은 주사 후 대략 2시간에서 피크를 이루고 그 후에 빨리 강하되었다.
이것은 Mx1 RNA의 발현이 생쥐에서 mIFN-β의 활성에 따르기 위한 생체마커로서 사용되는 첫 번째 경우이다. 결과는 Mx1 RNA가 낮은 수준에서 생쥐 PBMC에서 구성적으로 발현되고 mIFN-β 처리에 의해 강력하게 상향조절될 수 있음을 명백히 나타낸다. 그러나, 상향조절은 단 기간이고 2-24시간 내에 높은 발현 수준으로부터 배경까지 급격히 강하된다. 빠른 동역학은 인간 (예를 들어, [Salmon, P. 등 (1996) J Interferon Cytokine Res 16: 759-64]; [Buchwalder, P-A 등, (2000) J Interferon Cytokine Res 20: 57-66]) 및 기타 동물 종 ([Pepinsky, RB 등 (2001) J Pharm Exp Ther 297: 1059-55]; [Mager, DE 등 (2003) J Pharm Exp Ther 306: 262-70])에서 유형 I 인터페론에 대해 보고된 짧은 반감기에 상응한다.
C. 케모카인 IP -10 및 JE: mIFN-β 단백질로 처리된 생쥐로부터의 혈장 샘플의 분석 동안에, MCP-1의 생쥐 상동체인 2개의 생쥐 케모카인, IP-10 및 JE (단핵 화학유인 단백질, 예를 들어 [Yoshimura, T (1989) FEBS Lett 244: 487-93] 참조) 는 Mx1 RNA로서 mIFN-β에 대해 유사한 반응 및 활성화를 갖는 것으로 동정되었다 (도 7 및 도 8). mIFN-β 단백질의 i.v. 또는 i.m. 투여 후 2시간에 IP-10 및 JE의 강력한 유도가 밝혀졌다. IP-10 수준은 i.v. 전달된 고 용량에서 3000배 증가되었다. 시험된 3개 mIFN-β 용량 각각에서, 24시간까지 IP-10 및 JE의 혈장 수준에서 배경으로의 강력한 강하가 관찰되었다. 양쪽 투여 경로에서 IP-10 및 JE에 대해 명백한 용량 반응이 관찰되었다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명자에 의해 증명될 때까지 IFN-β에 의해 IP-10 및 JE의 강력한 용량 의존성 유도는 앞서 알려져 있지 않았다. IP-10은 프로모터 영역에서 인터페론 반응성 요소 (ISRE)에 의하여 IFN-γ를 위한 생물학적 마커로서 알려져 있긴 하지만 (예를 들어 [Luster, AD 등 (1985) Nature 315: 672-76] 참조), 생쥐에서 mIFN-β를 위해 특이적 생체마커인 것으로 앞서 밝혀지지 않았다.
D. 생체내에서 mIFN -β 유전자 전달 후에 장기간 생체마커 반응
이 연구는 mIFN-β를 코드화하는 플라스미드 DNA 또는 AAV-1 벡터의 근육내 전달 후에 생쥐에서 mIFN-β 생체마커의 유도 측정을 증명한다.
실시예 4: mIFN -β 유전자의 전달
A. mIFN -β 유전자의 플라스미드 전달: 플라스미드 전달을 위하여, mIFN-β를 코드화하는 플라스미드 DNA의 상이한 용량을 생쥐 내에 i.m. 주사한 다음 주사된 근육을 에렉트로포레이트하였다. 각각의 개별 동물로부터 단리된 PBMC로부터 Mx1 발현을 측정하였으며, 대조 군의 배경 수준에 비해 몇 배 증가로서 표현되었다 (도 9). 주사 후 2일에 mIFN-β 플라스미드 DNA를 받은 모든 4개 군에서 Mx1 RNA의 강력한 상향 조절이 존재하였다 (40- 내지 130-배 유도). 모든 4개 군에서 Mx1 발현은 배경에 비해 상당히 높다 (p<0.002). Mx1 발현 데이타는 최적 DNA 농도로서 250㎍에서 용량 반응이 존재함을 나타내었다. 전기천공 후 첫 번째 날에 초기 피크가 존재한 다음 발현이 강하되고 마지막 시점에 발현 수준이 다시 증가하였다. 생체마커 반응에서 이러한 변동은 케모카인 IP-10 및 JE의 수준에서 또한 반영되고 (데이타 도시되지 않음), 이것은 IFN-β의 플라스미드 전달을 사용하는 다른 연구에서 재생가능한 현상인 것으로 보인다. 연구 49일까지 Mx1 유도의 상당한 수준이 관찰되었다.
B. mIFN -β 유전자의 AAV -1 전달: mIFN-β를 코드화하는 pGT61의 DNA로, 또는 mIFNβ를 코드화하는 pGT61로부터 생성된 바이러스로, 또는 SEAP를 코드화하는 pGER75의 DNA로 C57BI/6 생쥐에 주입하였다 (재료 및 방법 항목, 소항목 G 참조).
주사 후 2, 10, 14 및 17일에 생쥐를 사혈하였다. pGT61 DNA를 받은 생쥐는, 2일에서 배경에 비해 Mx1 RNA의 대략 15배 유도를 나타내었다 (도 10). Mx1 발현은 10일까지 배경에 비해 100배 이상으로 계속 증가하였다. 17일까지, Mx1 RNA 발현 수준이 배경에 비해 약 180배이었다. pGER75 DNA를 받은 대조 군에서 Mx1 발현의 증가가 관찰되지 않았다.
pGT61로부터 생성된 바이러스로 주입된 생쥐에서 Mx1 RNA 발현 수준은 pGT61 DNA를 받은 생쥐에 비하여 10일, 14일 및 17일에 약 5배 더 높았다. 이것은 주사된 근육에서 수행되는 IFN-β RNA RT-PCR분석에 의해 뒷받침되었다. 17일에 동물 이 희생될 때, 근육에서 mIFN-β RNA 발현은 바이러스-주사된 근육에서 2.0×106 카피/㎍ RNA에 비하여 DNA-주사된 근육에서 9.0×105 카피/㎍RNA이었다 (데이타 나타내지 않음).
IP-10 및 JE에 대해서 혈장 샘플을 분석하였다 (도 7 및 8). 수득된 결과는 Mx1 RNA 유도에 대해서 수득된 것과 매우 유사하였다. 생쥐가 전기천공에 의해 DNA를 받은 2일에 AAV-1-mIFN-β 발현된 바이러스로 주사된 생쥐에 비해서 더욱 높은 IP-10 혈장 수준을 나타내었다. 그러나, 10일까지 AAV-1-mIFN-β로 주입된 생쥐에서 IP-10 수준은 강력한 증가를 나타내었으며, 플라스미드 mIFN-β 주사된 생쥐에 비해 평균 약 5- 내지 10-배 더 높았다.
C. 요약 및 결론: 인간 IFN- 1a 단백질의 일시 주사 후의 약동학적 프로파일은, 정상적인 인간 지원자 및 환자에게 투여된 hIFN-β1a를 사용한 연구의 앞서 공개된 기록과 매우 유사하다 (예를 들어, [Buchwalder, P-A (2000) J Interferon Cytokine Res 20: 57-66] 참조). i.v. 주사된 인간 IFN-β 1a 단백질은 빠르게 투명해지고, 6시간까지 혈청 수준이 분석의 검출 한계 미만이 된다. 단백질의 i.m. 주사 후에, 피크 값은 낮지만 혈청 반감기는 연장된다. 그러나, 동역학이 매우 빠르고, 혈청 수준이 수 시간내에 검출 한계 미만으로 강하된다. IFN-β1a의 PEG화 형태를 사용하여 생쥐, 쥐 및 원숭이에서 최근의 약동학적 연구는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 20-kDa 중합체의 부착이 반감기(t1 /2)를 대략 1시간 내지 10시간으로 연장시킨다는 것을 나타낸다 (예를 들어, [Pepinsky, RB 등 (2001) J Pharm Exp Ther 297: 1059-66] 참조).
검출가능한 수준의 hIFN-β 단백질이 주사된 근육의 용해물에서의 ELISA에 의해 측정되긴 하지만, 플라스미드 DNA 전달 후에 hIFN-β의 혈청 수준을 측정하는 시도는 아마도 트랜스유전자의 낮은 발현에 기인하여 성공하지 못하였다(데이타 나타내지 않음). 그러나, hIFN-β를 코드화하는 AAV-1 벡터를 사용하여, hIFN-β 단백질의 매우 높은 혈청 수준이 i.m. 주사 후에 용량 의존적 방식으로 hIFN-β ELISA에 의해 검출되었다. 또한, 매우 안정하고 지속적인 수준이 주사 후 거의 6개월까지 측정되었다. 항-hIFN-β 항체의 존재에 관해 혈액을 분석하지 않긴 하지만, 이 모델에서 외래 트랜스유전자로서 hIFN-β 발현에 대한 명백한 면역원성 반응의 부족을 주목하는 것이 중요하다. hIFN-β의 덩어리 단백질 전달은 다른 동물 모델 (예, 원숭이, 참고문헌 33 참조)에서 매우 면역원성인 것으로 보고되었다. 결과는, 연장된 기간에 걸쳐 높은 트랜스유전자 발현을 달성하기 위한 초석으로서 hIFN-β를 코드화하는 AAV-1 벡터의 i.m. 투여가 개발될 수 있음을 제안한다.
3개의 mIFN-β 생체마커를 동정하고 생쥐 IFN-B 단백질 또는 유전자 전달을 사용하여 약동학적 연구를 수행하기 위해 확인하였다. mIFN-β 투여된 생쥐의 PBMC로부터 단리된 Mx1 RNA의 유도를 측정하기 위하여 고 감도 정량적 RT-PCR 분석을 개발하였다. 2개의 생쥐 케모카인, IP-10 및 JE를 민감한 IFN-β 생체마커로서 동정하였으며, 통상적인 ELISA는 Mx1 태그맨 분석에 의해 수득된 결과를 뒷받침하고 빠르게 정량하기 위한 수단이다. 2개의 상이한 유형의 유전자 전달 벡터, 플라스미드 DNA (플러스 전기천공) 및 AAV-1를 시험하였다. 덩어리 mIFN-β 단백질의 i.v. 또는 i.m. 투여는, 대략 2시간의 Tmax에서 모든 3가지 생체마커의 강력하지만 일시적인 유도를 가져온다. 생체마커 수준은 주사 후 12 내지 24시간 내에 배경으로 급강하되었다. mIFN-β을 i.m. 주사할 때 Mx1, IP-10 및 JE에 관하여 용량 반응이 관찰되었다. 생체마커 수준에서 급강하는 덩어리 단백질 투여 후 IFN-β의 빠른 전신 제거를 직접적으로 반영한다.
플라스미드 + 전기천공 또는 AAV-1 벡터를 사용한 mIFN-β의 유전자-기초 전달은, mIFN-β 단백질이 주사될 때 관찰되는 것보다 훨씬 높은 생체마커 반응을 일으킨다. 플라스미드 DNA를 사용하면, 49일까지 생체마커 반응이 측정되고, 63일에 배경 수준으로 내려갔다. 이러한 데이타는, mIFN-β 발현 플라스미드가 적어도 7주일 동안 생물학적 활성 mIFN-β를 발현할 수 있음을 처음으로 증명하였다. 생체마커 반응의 동역학은, mIFN-β DNA가 AAV-1 벡터에 의해 전달될 때 약간 상이하였다. 감염 후 초기에 반응이 비교적 낮았으며 첫 주에 걸쳐 증가하였다. 감염 후 두 번째 및 세 번째 주에서 생체마커 반응에서의 안정화가 높은 수준으로관찰되었다.
요약하면, 생쥐에서 덩어리 단백질 투여에 비하여 인간 및 생쥐 IFN-β 양쪽 모두에 대해 유전자-기초 전달을 위하여 뛰어난 약동학적 프로파일이 증명되었다. 첫 번째로, 발현된 IFN-β의 수준은 혈청에서 직접적으로 측정 시에 또는 IFN-β 생체마커의 유도에 의해 반영 시에 단백질 전달에서 달성되는 수준과 동일하거나 그보다 높다. 두 번째로, 단백질 투여에서 관찰된 일시적 동역학 (시간)에 비하 여, IFN-β 벡터의 단일 주사로부터 IFN-β 발현의 지속 시간이 상당히 길다 (수 주 내지 수 개월 동안 안정한 발현).
실시예 5: mIFN -β의 유전자-기초 전달을 사용한 효능 연구
이러한 연구는, 유전자-기초 전달이 MS의 동물 모델에서 효능적임을 증명한다. 설치류 EAE 모델은 MS의 허용된 모델이고, 이러한 모델에서 IFN-β가 활성임을 증명하는 몇 가지 기록이 있다 [Yu, M 등 (1996) J Imm 64: 91-100]. IFN-B의 유전자-기초 전달이 일부 모델에서 효능이 있음이 또한 보고되어 있다 (예를 들어, [Triantaphyllopoulos, K. 등 (1998) Gene Therapy, 5: 253-63]). 이러한 연구의 결과는 mIFN-β 단백질을 가진 생쥐 EAE 모델을 확인하고, 모델에서 mIFN-β의 유전자-기초 전달 및 단백질 전달을 비교한다.
A. 생쥐 급성 EAE 모델에서 mIFN -β 단백질의 효능: 8주령 암컷 SJL 생쥐를 1일에 단백지질 단백질(PLP)로 면역화한 다음, 연구 과정을 통해 격일로 상이한 용량 (1군 당 10,000, 20,000, 30,000 또는 100,000 단위)의 정제된 재조합 생쥐 IFN-β 단백질의 피하(s.c.) 주사에 의하여 처리하였다. 이 연구를 위해 사용된 포지티브 대조는, 1일 2회 복강내 투여된 메조프람 및 프레드니졸론이었다.
구체적으로, mIFN-β를 코드화하는 유전자를 pCEP4 발현 벡터 (인비트로겐) 내에 클론화하였다. X-트림진(tremeGene) Ro-1539 형질감염 시약(로쉐)을 사용하여, mIFN-β를 코드화하는 발현 플라스미드를 293E 세포 (엣지 바이오시스템스) 내에 일시적으로 형질감염하였다. 이온-교환 크로마토그래피 및 소수성-상호작용 크로마토그래피에 의해 매질로부터 생쥐 IFN-β 단백질을 정제하였다. 생성물을 투 석하고 희석 완충액 (50mM 아세트산나트륨, pH 5.5, 150mM 염화나트륨 및 5% 폴리프로필렌 글리콜)에 대해 농축하고 무균 여과하였다. 정제된 단백질의 분취량을 -80 ℃에서 저장하였다. 액세스 바이오케미칼 (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 통상적인 mIFN-β 대조 표준을 사용하여, 루시퍼라제 리포터 유전자 분석을 사용하여 정제된 단백질의 활성을 평가하였다 [Hardy 등 (2001) Blood 97:473-482]. 정제된 단백질의 비활성은 2×108 단위/mg이었다.
동물 연구를 위하여, 정제된 mIFN-β을 희석 완충액 중에 100 ug/ml로 희석하였다. 동물의 주사 직전에, mIFN-β 원액을 mIFN-β의 원하는 농도로 희석하였다. 이러한 연구에서 사용된 부형제 대조는 희석 완충액 마이너스 mIFN-β이었다.
연구 결과를 도 11에 나타낸다. 100,000 단위의 IFN-β로 처리된 생쥐 (대략 500 ng, 20 ug/kg)는, 부형제 처리된 생쥐 (p=0.0046)에 비하여 EAE의 임상적 점수를 상당히 저하시켰다. 이러한 저하가 통계적 유의치에 이르지 않긴 하지만, IFN-β의 30,000 단위로 처리된 생쥐는 부형제 처리된 생쥐에 비하여 저하된 임상 점수를 나타내었다. 이러한 연구에서의 포지티브 대조인 메조프람 및 프레드니졸론은 임상 점수를 상당히 저하시켰다.
B. mIFN -β의 유전자-기초 전달은 생쥐 급성 EAE 모델에서 효능이 있다:
mIFN-β 단백질이 생쥐 급성 EAE 모델에서 효능이 있음을 증명하는 이전의 연구 결과를 기초로 하여, mIFN-β의 플라스미드 전달을 단백질 전달과 시험하고 비교하기 위하여 두 번째 연구를 수행하였다. 첫 번째 연구에서와 같이, 1일에 PLP로 생쥐를 주사하였다. 유전자 전달을 위하여, PBS, 전기천공 (EP)에 의한 Null 플라스미드 DNA (pNull), mIFN-β 플라스미드 DNA (플러스 EP), 또는 "PINC"라 불리는 중합체 제제로 제형된 mIFN-β 플라스미드 DNA로의 연구의 2일에 생쥐가 근육내 주사를 받았다 [Mumper, RJ 등 (1998) J Controlled Release 52: 191-203]. 단백질 전달을 위하여, 생쥐 IFN-β 단백질 (100,000 단위, 피하 주사) 또는 부형제로 생쥐에 격일로 주사하였다.
이 연구의 결과를 도 12에 나타낸다. 이전의 연구에서와 같이, 100,000 단위의 mIFN-β 단백질로 처리된 생쥐는 부형제 대조 처리된 생쥐에 비해 임상 점수를 상당히 저하시켰다 (p=0.045). mIFN-β+ EP 의 유전자 전달은 pNull & EP (p=0.0171)에 비하여 임상 점수를 상당히 저하시켰다. IFN-β의 PINC 제형을 사용한 유전자 전달은 pNull (데이타 나타내지 않음)에 비하여 임상 점수를 통계적으로 저하시키지 않았다. 이 연구로의 전체 결과를 재료 및 방법 항목, 소항목 A 및 도 13에 기재한다.
C. 요약 및 결론: 연구 과정 동안에 100,000 단위의 mIFN-β의 격일 주사가 부형제 대조에 비하여 질병의 중증도를 상당히 저하시킨다는 것을 증명함으로써 재조합 mIFN-β 단백질을 사용하여 생쥐 급성 EAE 모델을 입증하였다. 전기천공에 의해 mIFN-β를 코드화하는 플라스미드의 유전자-기초 전달은, 질병에 걸린 생쥐에서 임상 점수를 상당히 저하시키는 것으로 밝혀졌다. 연구 2일에서 플라스미드의 단일 주사는, IFN-β 단백질의 격일 주사로서 점수를 감소시키는데 효과적이었다. 이러한 결과는, IFN-β의 유전자-기초 전달이 MS의 동물 모델에서 효능이 있음을 나타낸다.
실시예 6: 조절 발현 체계를 사용하여 생체내에서 IFN -β의 조절 발현
A. 설계, 구축 및 시험관내 확인: 본 발명의 조절 발현 체계는 공지된 발현 체계에 비해 장점을 갖는다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 체계는 주요 치료 분자 (TM) (예, IFN-β 트랜스유전자)를 코드화하는 첫 번째 발현 카세트 및 TM의 발현을 조절하는 조절인자 분자(RM)을 코드화하는 두 번째 발현 카세트를 하나의 벡터에 가짐으로써 몇 가지 개발 및 제조 문제점을 해결한다.
바람직한 구현양태의 예로서, 본 발명자들은 신규의 개선된 조절 발현 체계를 제공한다. 이러한 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계의 발현 카세트가 BRES-1라 불리우는 단일 플라스미드 벡터에 존재한다. BRES-1 단일 벡터는, 상이한 트랜스유전자의 삽입을 위한 다수 클론화 부위(MCS) 뿐만 아니라 조절 단백질의 발현을 조종하기 위해 상이한 프로모터를 포함하여, 그의 설계 내에 포함된 다수의 융통성있는 특징을 갖고 있다. 또한, BRES-1 발현 카세트의 크기는 플라스미드 및 AAV 벡터를 포함하여 매우 상이한 전달 벡터와 상용성이다.
B. 유전자 요법을 위한 mIFN -β 및 hIFN -β 유도성 발현 벡터의 구축
pGER101 및 pGER125로부터 mIFN-β 및 hIFN-β 유전자를, 각각 일련의 4개 BRES-1 벡터 내로 전달하였다 (도 14A-D). 얻어진 플라스미드는 서로에 대해 상이한 4개의 배향으로 생쥐 또는 인간 IFN-β 유전자를 코드화하는 발현 카세트 및 RM 유전자를 코드화하는 발현 카세트를 갖는다 (도 15A-B). mIFN-β를 코드화하는 BRES-1 플라스미드는 pGT23, pGT24, pGT25 및 pGT26으로 명명되고 (도 15A), hINF- 을 코드화하는 BRES-1 플라스미드는 pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30으로 명명된다 (도 15B). 이러한 플라스미드의 구축의 완벽한 설명을 위해 재료 및 방법, 소항목 F 참조.
C. IFN -β 발현 벡터의 시험관내 확인: 구성 (pGER125) 및 유도 (pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30) hIFN-β 발현 플라스미드를 생쥐 근육 C2C12 세포 내에 형질감염하였다. 세포를 유도인자, MFP로 처리하고, 매질을 ELISA에 의해 hIFN-β에 대해 분석하였다 (도 16). 결과는 MFP의 부재 하에서 hIFN-β 발현을 거의 나타내지 않는다. BRES-1-hIFN-β 플라스미드로부터 인간 IFN-β 발현은 CMV 프로모터 (pGER125)로부터 발현된 것의 약 50% 이하 수준까지 대략 20- 내지 90-배로 MFP에 의해 유도된다. 2-플라스미드 발현 체계 (pGS1694+pGER129)에 비하여, BRES-1 체계의 모든 4개 플라스미드 배향은 MFP의 부재하에서 필적하는 기본 활성을 나타내었으며, MFP의 존재하에서 2-플라스미드와 동일하거나 그보다 큰 활성을 유도하였다. mIFN-β BRES-1 플라스미드로 유사한 시험관내 연구를 수행하고 (도 17), 결과는 hIFN-β BRES-1 플라스미드를 사용하여 설명된 것과 매우 유사하였다.
D. 생체내에서 IFN -β의 조절 발현: Sal I에 의한 pGER101의 소화, 클레오누 DNA 폴리머라제로 5' 돌출에서 충진에 의한 블런트-말단화, SpeI 링커의 결찰, SpeI 및 NotI으로의 소화, 및 pGT4의 SpeI 및 NotI 부위 사이에서 mIFN 유전자를 보유한 단편의 삽입에 의하여 구축된 mIFN-β BRES-1 플라스미드 벡터 PGT26을 사용하여, 미경험 C57BI/6 생쥐에서 연구를 수행하였다.
유도인자, MFP의 경구 투여를 통해 오프/온/오프 박동성 방식으로 mIFN-β의 발현이 조절될 수 있는지의 여부를 시험하기 위하여 플라스미드 벡터 pGT26을 사용하였다. 구성 및 유도 BRES-1 mIFN-β 발현 플라스미드를 전기천공에 의해 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하였다. 플라스미드 주사 후 7일에 시작하여 생쥐를 MFP로 연속 4일 동안 처리하였다. 혈액을 주사 후 11일 및 18일에 수집하고, PBMC를 단리하고 RT-PCR에 의하여 Mx1 RNA 수준을 결정하였다. 케모카인 IP-10 및 JE를 위해 혈장 샘플을 분석하였다. Mx1 RNA의 생체마커 분석 및 케모카인 분석을 위한 연구의 결과를 도 18 및 19에 각각 나타낸다. MFP의 부재 하에서, 7일에 생체마커 유도가 거의 또는 전혀 관찰되지 않는다. MFP의 경구 투여 후에, 11일에서 CMV-mIFN-β에 비하여 더욱 높은 수준까지 모든 생체마커가 강력하게 유도되었다. 18일에 케모카인 수준이 기준선으로 되돌아가고 Mx1 RNA 수준이 거의 기준선으로 저하되었다 (재료 및 방법 참조, 연구 및 대조의 설명을 위해 하기 소항목 G 참조).
E. 요약 및 결론: 본 발명자들은 만성 질병, 예를 들어 MS를 치료하기 위하여 2개의 벡터, 즉 치료 분자(TM), 예를 들어 IFN-β 유전자의 전달을 위해 적절한 비-바이러스성 플라스미드 DNA 및 아데노-결합 바이러스 유형 1 (AAV-1)을 동정하였다. 또한, 본 발명자들은 양쪽 벡터들이 근육내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있고 생쥐 동물 모델에서 측정가능하고 지속적인 IFN-β 발현 수준을 생성할 수 있음을 나타낸다. 플라스미드 DNA의 경우에, 본 발명자들은 mIFN-β 코드화된 플라스미드 (전기천공에 의해)의 단일 주사가 효능적이고 MS의 동물 모델에서 mIFN-β 단백질의 격일 주사로서 효과적임을 증명하였다. 본 발명자들은, 단일 플라스 미드 주사 후 적어도 45일 동안 플라스미드 코드화 mIFN-β 발현이 지속됨을 나타내기 위하여, mIFN-β의 생체마커를 개발하였다. AAV-1 벡터의 경우에, 본 발명자들은 인간 IFN-β 코드화 AAV-1 벡터의 단일 근육내 주사가 6개월 동안 지속되는 인간 IFN-β 단백질의 높은 혈청 수준을 가져온다는 것을 밝혀내었다. 플라스미드 및 AAV-1 벡터 양쪽 모두가 본 발명의 BRES-1 조절 발현 체계와 상용성임을 나타내었다. 예를 들어, 본 발명자들은 본 발명의 단일-플라스미드 벡터 BRES-1 조절 발현 체계를 사용하여 생쥐에서 IFN-β의 조절 발현을 증명하였다.
새롭고 개선된 BRES-1 조절 발현 체계의 하나의 구현양태에서, 발현 카세트가 단일 벡터, 예를 들어 단일 플라스미드 벡터에 존재한다. 이러한 구현양태에서, BRES-1 단일 플라스미드 벡터는 하나의 서틀 플라스미드 발현 벡터 위에서 조절인자 분자(RM) (예, 변형 스테로이드 호르몬 수용체와 같은 전사 활성화제) 및 치료적 분자(TM) (예, 인간 또는 생쥐 IFN-β) 양쪽 모두에 대한 발현 카세트를 함유한다. BRES-1 조절 발현 체계의 단일 벡터는 프로모터, 조절 요소 및 트랜스유전자의 플라스미드 주쇄 내로의 삽입 또는 대체를 단순화하기 위하여 다수 클론화 부위(MCS)를 함유한다. 본 발명자들에 의해 증명된 바와 같이, BRES-1 mIFN-β 및 BRES-1 hIFN-β 단일-플라스미드 벡터를 구축하고 시험관 내에서 시험하였으며,활성인자 분자(AM), 소 분자 유도인자 MFP의 부재 하에서 낮은 배경 활성을 가짐을 나타내고, MFP의 존재 하에서 (2-플라스미드 체계에 필적하는) 높은 유도성을 나타내었다.
BRES-1 mIFN-β 플라스미드 벡터 및 MFP의 경구 투여를 사용하여 정상 생쥐 에서 생체내 연구를 수행하였다. mIFN-β 발현 수준을 검출하기 위해 생체마커를 사용하여, 결과는 MFP의 부재 하에서 mIFN-β 생체마커의 낮은 배경 발현, MFP 투여 후에 강력한 유도, 및 MFP의 회수 시에 기본 수준의 발현으로의 복귀를 나타내었다 (도 18 및 19). 이러한 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 본 발명의 조절 발현 체계를 사용하여 생체 내에서 IFN-β의 조절 발현을 달성하였다.
따라서, 이 연구 및 본 발명의 조성물 및 방법의 성과는, 질병 또는 병, 예를 들어 항-염증 질병 또는 병, 더욱 바람직하게는 MS의 치료를 위해 IFN-β의 장기간의 조절 발현을 제공하는 IFN-β를 위한 유전자-기초 전달 체계이다. 본 발명의 유전자 요법 벡터는 질병 또는 병의 치료를 위해 주요한 치료 분자 (TM) (예, IFN-β)의 전달을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조절 발현 체계는 소 분자 유도인자, MFP의 경구 투여를 통하여 장-기간의 재생가능한 발현을 제공할 수 있다. 단일-벡터 BRES-1 체계는 예를 들어 근육내 주사에 의해 투여를 반복할 수 있고, 임상 시에 연속성 대 박동성 IFN-β 요법의 시험을 가능하게 할 것이다.
실시예 7: 후보 벡터의 선택
실시예 7: BRES-1 조절 발현 체계
A. BRES -1 배향: 도 15에 기재된 바와 같이 구성된 4개 BRES-1 배향 중의 하나를 사용하여 생체내 연구를 수행하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이것은 MFP의 존재 하에서 구축물 pGT26이 가장 높은 수준의 트랜스유전자 발현을 갖는다는 것을 나타내는 시험관내 데이타를 근거로 하였다. 트랜스유전자 발현의 최선의 "윈도우"를 제공하는지를 결정하기 위해 본 명세서에 기재된 프로토콜을 사용하여 이러한 4개 BRES-1 배향을 생체내 시험할 수 있다 (예를 들어, 가장 낮은 기본 발현 수준 - MFP 및 가장 높은 유도 발현 수준 + MFP).
i. BRES -1 플라스미드에서 표적 유전자 발현에 대한 배향-의존적 효과
mIFN 발현의 생체마커로서 작용하는 케모카인 IP-10의 수준에 의해 평가되는 바와 같이 mIFN 발현의 수준을 결정하기 위하여, mIFN-β BRES-1 플라스미드 벡터 pGT23, 24, 25 및 26을 사용하여 미경험 C57BI/6 생쥐에서 연구를 수행하였다. 1군 당 15마리 동물을 사용하여, pGT23, pGT24, pGT25 및 pGT26을 전기천공에 의해 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하였다. MFP의 부재 하에서 각각의 군으로부터 5마리 생쥐를 7일째에 사혈하였다. 플라스미드 주사 후 7일째에 시작하여, 각각의 군에서 나머지 10마리 생쥐를 연속 4일동안 MFP로 처리하였다. 주사 후 11일 및 18일에 혈액을 수집하고, 혈장 샘플을 IP-10을 위해 분석하였다 (세부사항을 위해 "실험 설계" 참조). 결과는, 시험관내 결과 (도 32)와 일치하여, pGT26이 낮은 발현 - MFP와 높은 발현 + MFP의 최선의 조합을 제공함을 나타내었다. pGT24는 IP-10 발현의 가장 높은 유도를 가졌으나, MFP의 부재 하에 IP-10 수준은 다른 배향에 비해 더욱 높았다. pGT25는 양쪽 - 및 + MFP의 낮은 IP-10 수준을 가졌으며, pGT23은 pGT26에서와 대략 동일한 IP-10 수준 + MFP를 가졌다. 그러나, pGT24 - MFP를 가진 IP-10 수준은 pGT26에 대해서보다 상당히 높았다. 이러한 결과는 전체적으로 기본 및 유도 표적 유전자 발현 양쪽 모두에 대해 배향-의존성 효과를 나타낸다.
실험 설계: BRES-1/mIFN 플라스미드의 생체내 형질감염 및 pBRES-1/mIFN의 4 개 배향의 비교를 다음과 같이 수행하였다. 정상 C57BI/6 생쥐를 주사하고 단일 벡터 BRES-1 생쥐 IFN 발현 플라스미드로 에렉트로포레이트하였다. 생체마커 반응 및 mIFN RNA 분석에 의해 mIFN 발현을 검사하였다. MFP 처리의 오프/온/오프 주기를 통해 생쥐를 처리하였다.
DNA 용액: 모든 주사된 군에서 각각의 생쥐는 150 ul PBS 중의 250 ug의 플라스미드 DNA를 받았다.
군 플라스미드 설명 n*
1 pGT23 mIFN-RM 15
2 pGT24 mIFN rev-RM 15
3 pGT25 RM-mIFN 15
4 pGT26 RM-mIFN rev 15
*n= 동물의 수
DNA 전달: 0일에, 150 ul PBS 중의 250 ug 플라스미드 DNA로 성체 수컷 C57BI/6 생쥐를 양측에서 주사하였다. DNA 용액을 각각의 뒷다리의 정강이 근육 내에 25 ul 주사하고 장딴지 근육에 50 ul 주사한 다음 캘리퍼로 에렉트로포레이트하였다 (200 V/cm, 1Hz, 20 msec/펄스에서 8펄스).
MFP 치료: 하기 표에 나타낸 것과 같이 군 1-4 (모두 주사된 생쥐)에게 0.33 mg/kg (100 ul의 0.083 mg/참깨유 ml, 신선하게 만듬)으로 경구 섭식에 의해 MFP를 투여하였다.
군/ 플라스미드 n/ 생쥐번호 0일 7일 7-10일 11일 18일
1 pGT23 15 101-115 주사 101-115 말단 사혈 +근육 101-105 MFP 106-115 말단 사혈+근육 106-110 꼬리 사혈 111-115 말단 사혈 + 근육 111-115
2 pGT24 15 201-215 주사 201-215 말단 사혈 +근육 201-205 MFP 206-215 말단 사혈+근육 206-210 꼬리 사혈 211-215 말단 사혈 + 근육 211-215
3 pGT25 15 301-315 주사 301-315 말단 사혈 +근육 301-305 MFP 306-315 말단 사혈+근육 306-310 꼬리 사혈 311-315 말단 사혈 + 근육 311-315
4 pGT26 15 401-415 주사 401-415 말단 사혈 +근육 401-405 MFP 406-415 말단 사혈+근육 406-410 꼬리 사혈 411-415 말단 사혈 + 근육 411-415
5 비주사 5 501-515 말단 사혈 +근육 501-505
7일: MFP의 부재 하에 기준선 수준의 발현과 비교
11일: MFP 치료 후에 유도된 수준의 발현과 비교
18일: MFP 치료 없이 7일 후에 발현과 비교
혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차: 상기 표에 나타낸 시점에서 꼬리 자른자리 또는 심장 천자 (말단 사혈)에 의해 생쥐를 사혈하였다. 혈액을 RT (실온)에서 마이크로테이너 관 (EDTA 함유) 내에 수집하였다. IP-10 측정을 위해 꼬리 사혈로부터 혈장을 수집하였다. PBMC를 분리하고 말단 사혈로부터 수집하고, 나머지 혈장을 ELISA에 의해 IP-10에 대해 측정하였다.
ii . BRES -1 플라스미드에서 표적 유전자 발현에 대한 배향-의존성 효과
상기 기재된 바와 유사한 방식으로 BRES-1/hIFN 플라스미드를 시험하였다. 미경험 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육 내에 전기천공에 의해 구성 (pGER125) 또는 유도 BRES-1/hIFN (pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30) 플라스미드를 주사하였다. 생쥐를 MFP의 부재 하에서 4일에 사혈한 다음, 플라스미드 주사 후 7일에 시작하여 연속 4일 동안 MFP로 처리하였다. 혈액을 주사 후 11일 및 18일에 수집하였다. 응고된 혈액으로부터 혈청을 수집하고, ELISA에 의해 hIFN에 대해 샘플을 측정하였다 (세부사항을 위해 "실험 설계" 참조).
결과는, pGT28이 시험관내 결과와 일치하여 낮은 발현 - MFP와 높은 발현 + MFP의 최선의 조합을 제공함을 나타낸다 (도 33). 4일에서 hIFN- MFP의 발현은 모든 BRES-1/hIFN 플라스미드에 대해 검출불가능하였다. 7일에서 hIFN + MFP의 발현은 pGT27를 위한 CMV 프로모터에서보다 낮았지만, pGT28, 29 및 30을 위해서보다 더 높았다. pGT28로부터 hIFN의 발현은 CMV로부터의 발현에 비해서 5-배 더 높았다. 발현은 18일까지 모든 BRES-1/hIFN 플라스미드에 대해 거의 검출불가능하게 강하되었으며, pGT28은 그 시점에서 가장 낮은 발현을 갖는다. 이러한 결과는 전체적으로 기본 및 유도된 표적 유전자 발현 양쪽 모두에 대해 배향-의존성 효과를 나타낸다.
실험 설계: BRES-1/hIFN 플라스미드의 생체내 형질감염 및 pBRES-1/hIFN의 4개 배향의 비교를 다음과 같이 수행하였다. BRES-1/hIFN 또는 CMV-hIFN 발현 카세트를 보유한 플라스미드 벡터로 정상 성체 C57BI/6 생쥐를 주사하였다. MFP 처리의 오프/온/오프 주기를 통해 인간 IFN 발현을 측정하였다.
플라스미드 DNA 용액: 군 2-6 생쥐 (플라스미드)는 150 ul의 부피로 생쥐 당 250 ug의 DNA를 받았다.
군 플라스미드 설명 n*
2 pGT27 플라스미드 중의 hIFN-RM 5
3 pGT28 플라스미드 중의 hIFN rev-RM 5
4 pGT29 플라스미드 중의 RM-hIFN 5
5 pGT30 플라스미드 중의 RM-hIFN rev 5
6 pGER125 플라스미드 중의 CMV-hIFN 5
*n= 동물의 수
DNA 전달: 2-6군 (플라스미드)를 위하여 25 ul의 DNA 용액을 각각의 뒷다리의 정강이 근육 내에 주사하고 장딴지 근육에 50 ul 주사한 다음 캘리퍼로 에렉트로포레이트하였다 (200 V/cm, 1Hz, 20 msec/펄스에서 8펄스).
MFP 치료: 하기 표에 나타낸 것과 같이 7 내지 10일에 0.33 mg/kg (100 ul의 0.083 mg/참깨유 ml, 신선하게 만듬)으로 복강내 주사에 의해 군 2-5에게 MFP을 투여하였다.
주기 1
군/플라스미드 n/생쥐번호 0일 4일 7-10일 11일 18일
2 pGT27 5 201-205 플라스미드 주사 및 EP 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 말단 사혈 + 근육
3 pGT28 5 301-305 플라스미드 주사 및 EP 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 말단 사혈 +근육
4 pGT29 5 401-405 플라스미드 주사 및 EP 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 말단 사혈 +근육
5 pGT30 5 501-505 플라스미드 주사 및 EP 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 말단 사혈 +근육
6 pGER125 5 601-605 플라스미드 주사 및 EP 꼬리 사혈 꼬리 사혈 말단 사혈 +근육
7 비주사 5 701-705 말단 사혈 +근육
혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차: 상기 표에 나타낸 시점에서 꼬리 자른자리 또는 심장 천자 (말단 사혈)에 의해 생쥐를 사혈하였다. 혈액을 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음) 내에 수집하였다. 혈액으로부터 혈청을 분리 및 수집한 다음 ELISA에 의해 hIFN에 대해 측정하였다.
iii . BRES -1 플라스미드에서 표적 유전자 발현에 대한 배향-의존적 효과
BRES-1/hEPO 플라스미드를 상기와 유사한 방식으로 시험하였다. 군 당 10마리 생쥐를 사용하여, 유도 1-플라스미드 BRES-1/1hEPO (pGT15, pGT16, pGT17 및 pGT18) 또는 2-플라스미드 (pGS1694 + pEP1666) 벡터를, 미경험 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육 내에 전기천공에 의해 주사하였다. 플라스미드 주사 후 7일에 시작하여, 각각의 군으로부터 5마리 생쥐를 연속 4일 동안 MFP로 처리하고, 각각의 군으로부터 5마리는 MFP를 받지 않았다. 주사 후 10일에 마지막 MFP 처리 후 6시간에 혈액을 수집하였다. 혈청을 응고된 혈액으로부터 수집하고, 샘플을 ELISA (세부사항을 위해 하기 실험 설계 참조)에 의해 hEPO에 대해 분석하였다. 결과는, 유도된 발현 수준이 4BRES-1/EPO 플라스미드의 3개에 대해 2개 플라스미드 체계에서보다 더 높다는 것과, 발현 수준이 mIFN 및 hIFN BRES-1 플라스미드 (도 34A)와 일치하여 배향에 따라 변한다는 것을 나타낸다. 결과는 EOP 발현 및 적혈구용적율 수준 사이의 양호한 상관관계를 나타내며 (도 34B), 유도성 EPO 유전자 발현의 생리학적 효과를 증명한다. 이러한 결과는 전체적으로 기본 및 유도된 표적 유전자 발현 양쪽 모두에 대해 배향 효과를 나타낸다.
실험 설계: BRES-1/hEPO 플라스미드의 생체내 형질감염 및 pBRES-1/hEPO의 4개 배향과 2-플라스미드 조절 발현 체계의 비교를 다음과 같이 수행하였다. 정상의 성체 C57BI/6 생쥐를 BRES-1/hEpo 플라스미드 벡터 또는 GS-반응성 표적 유전자로서 Epo와 2-플라스미드 조절 발현 체계로 주사하였다. 인간 Epo 발현을 MFP 처리의 부재 및 존재 하에 측정하였다. 하기 프로토콜은 5개 군의 생쥐 (N=10, "N"은 동물의 수이다)로 구성된다. 각각의 군을 위하여, 10마리 모든 생쥐에 4pBRES-1 플라스미드 또는 2개 플라스미드의 하나를 주사하거나/에렉트로포레이트하였다. 네가티브 대조를 위해 추가 군의 N=10 (군 6)을 주사하지 않았다.
각각의 꼬리 사혈 또는 말단 사혈을 위하여, 10 ul의 혈액을 적혈구용적율 분석을 위해 즉시 수집하고 혈액 나머지로부터의 혈청을 수집하였다. 하기 "혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차" 참조. 각각의 1 내지 5군을 위하여, 7 내지 10일 아침에 5마리 생쥐에게 MFP를 주사하고, 10일 오후에 마지막 MFP 주사 후 약 6 시간에 꼬리 사혈하였다 (유도된 샘플). 각각의 군에서 나머지 5마리 생쥐는 MFP로 유도되지 않았으며 11일에서 마지막으로 사혈하였다 (정확한 비-유도 수준을 위하여 말단 사혈이 필요하다). 11일에 군 6에서 말단 사혈하였다.
따라서, 이 실험에서, pBRES-1 및 2개의 플라스미드 체계를 그들의 MFP- 유도 및 비유도 수준과 비교하였으며, 또한 시간에 걸쳐 일정하게 유도되는 수준을 비교하였다.
플라스미드 DNA 용액: 군 1 생쥐는 150 ul의 부피에서 생쥐 당 각각 100 ug 플라스미드를 받았다. 군 2-5 생쥐는 150 ul의 부피로 생쥐당 200 ug DNA를 받앗다.
군 벡터 설명 n*
1 pGS1694 pEP1666 액틴 프로-GS GS-반응성 Epo 10
2 pGT15 hEpo-RM 10
3 pGT16 hEpo rev-RM 10
4 pGT17 RM-hEpo 10
5 pGT18 RM-hEpo rev 10
* n = 동물의 수
DNA 전달: 25 ul를 각각의 뒷다리의 정강이 근육 내에 주사하고 장딴지 근육에 50 ul 주사한 다음 캘리퍼로 에렉트로포레이트하였다 (200 V/cm, 1Hz, 20 msec/펄스에서 8펄스).
MFP 치료: 100 ul의 MFP 용액 (0.083 mg/참깨유 ml)의 복강내 주사에 의해 생쥐에게 MFP를 투여하였다.
군/플라스미드 n*/생쥐# 0일 7-10일 10일
1) pGS1694 + pEP1666 10 101-110 플라스미드 주사 및 EP MFP i.p. 101-105 꼬리 사혈 101-105 말단 사혈 106-110
2) pGT15 10 201-210 플라스미드 주사 및 EP MFP i.p. 201-205 꼬리 사혈 201-205 말단 사혈 206-210
3) pGT16 10 301-310 플라스미드 주사 및 EP MFP i.p. 301-305 꼬리 사혈 301-305 말단 사혈 306-310
4) pGT17 10 401-410 플라스미드 주사 및 EP MFP i.p. 401-405 꼬리 사혈 401-405 말단 사혈 406-410
5) pGT18 10 501-510 플라스미드 주사 및 EP MFP i.p. 501-505 꼬리 사혈 501-505 말단 사혈 506-510
6) 비주사 10 601-110 말단 사혈 601-610
*n= 동물의 수
혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차: 상기 표에 나타낸 시점에서 꼬리 자른자리 또는 심장 천자 (말단 사혈)에 의해 생쥐를 사혈하였다. 혈액을 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음) 내에 수집하고, 응고시키고 원심분리하고 혈청 수집하였다. 혈청을 ELISA에 의해 hEPO에 대해 측정하였다.
적혈구용적율: 모세관에서 꼬리 자른 자리로부터 대략 10 ul의 혈액을 직접 수집 (흡출)하고, 점토로 밀봉하고 수집 후 10분 이내에 ~10,000g에서 ~5분간 원심분리하였다. 혈액을 모세관에서 3개 층: 즉 바닥에서의 RBC (40 내지 50% 총 부피), 작은 "황갈색 층" (WBC 및 혈소판) 및 나머지 혈장으로 분리하였다. 적혈구용적율 (전체 혈액에 대한 RBC의 퍼센트)을 판독하기 위하여 슬라이딩 게이지를 사용하였다.
B. BRES -1 주쇄: 본 명세서에 기재된 바와 같이, (본 명세서에 기재된 방법에 의해 증명되는 바와 같이) 트랜스유전자 발현의 수준 및/또는 지속기간의 상당한 증가를 증명하는 본 발명의 BRES-1 벡터의 플라스미드 주쇄 변형이 본 발명의 BRES-1 벡터에 포함될 수 있다. 본 발명의 BRES-1 벡터에 대한 추가의 변형은 더욱 강력한 프로모터의 사용을 포함할 수도 있다. 이러한 유형의 변형은 BRES-1 체계의 모듈 설계에 기인하여 비교적 시험이 용이하다.
C. BRES -1/벡터 시험: 본 발명자에 의한 약동학 및 효능 연구는 CMV 프로모터 인핸서를 사용하여 IFN-β 발현 카세트를 사용하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 특정한 치료적 필요에 적합하도록 본 발명의 BRES-1 발현 체계를 조절할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터 또는 발현 카세트의 변화 또는 변형을 C57BI/6 미경험 생쥐에서 시험할 수 있다. 예를 들어 1) 연속적 또는 박동성 치료 활용예를 위해 치료 분자(TM) (예, IFN-β)의 치료 수준을 전신적으로 달성하기 위해 필요한 벡터 및 활성인자(AM) (예, 소 분자 유도인자 MFP)의 최적 용량을 결정하고, 2) 시간에 걸쳐 트랜스유전자 발현의 지속을 결정할 뿐만 아니라 벡터 및 유도인자의 반복 투여를 위한 최적 의 시간을 한정하기 위하여 이러한 연구를 수행할 수 있다. 이러한 매개변수가 생쥐 (또는 기타 적절한 생쥐)에서 일단 확립되면, 다른 종, 바람직하게는 비-인간 영장류에서 최적화된 전달 조건을 사용하여 유전자-기초 전달 대 단백질 전달의 뛰어난 약동학적 프로파일 (예, 발현 수준, 발현 지속성, 재생가능한 발현)이 달성될 수 있다.
실시예 8: 후보 벡터의 선택
이러한 유형의 벡터의 선택은 특정한 연구에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA를 위하여, 치료 분자(TM)의 치료 수준, 예를 들어 IFN-β의 치료 수준을 수득하기 위하여 전기천공이 근육내 주사의 바람직한 성분인지의 여부를 결정할 수 있다. 본 발명의 유전자 요법 벡터의 전기천공에 의한 투여를 원한다면, 여기에 기재되고 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 임상적으로 실행가능하고 허용될 수 있는 장치 및 프로토콜을 설계할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV-1 벡터를 위하여, AAV 벡터를 위해 보고된 잠재적인 면역원성 성질을 기초로 하여, 벡터의 반복 투여가 바람직한지의 여부를 결정할 수 있다. (예를 들어, [Chirmule, N. 등 (2000) J Virol 74: 2420-25].
A. 플라스미드 DNA 를 사용하여 골격근의 형질감염을 개선하기 위한 방법
플라스미드 DNA는 단순하고 비-면역원성이며 생성 및 제조가 용이하기 때문에 유전자-기초 전달을 위해 바람직한 벡터이다. 근육내 주사에 의해 플라스미드 DNA의 골격근(SkM) 형질감염 효능을 증진시키기 위하여 몇몇 상이한 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 전달에 앞서서 근육 및 주변 세포외 기질을 치료하기 위해 히알루로니다제와 같은 효소의 사용 (예를 들어, [Mennuni, C 등 (2002) Hum Gene Ther 13: 355-65] 참조), 다양한 중합체 제형 (예를 들어, [Mumper, RJ 등 (1998) J Controlled Release 52: 191-203]; [Nicol, F 등 (2002) Gene Ther 9: 1351-58] 참조) 뿐만 아니라 전기천공과 같은 장치 (예를 들어, [Aihara, H 등 (1998) Nat.Biotech 16: 867-70; Bloquel, C 등 (2004) J Gene Med 6: S11-S23] 또는 초음파 (예를 들어, [Schratzberger, P 등 (2002) Mol Ther 6: 576-83])의 사용을 포함한다. 고압 및 큰 부피를 사용하여 사지 SkM에 플라스미드 DNA를 혈관내 전달하는 것 ("커프" 방법)은, 이러한 표적 조직에 대한 플라스미드 DNA의 높은 형질감염 및 넓은 분포를 달성하는데 효과적임이 밝혀졌다 (예를 들어, [Budker, V 등 (1998) Gene Ther 5: 272-76]). 이러한 모든 방법들 중에서, 전기천공 및 혈관내 전달이 가장 효과적인 것으로 보고되었으며, 몇몇 동물 모델에서 노출된 NDA 단독에 비하여 2 내지 3배 크기 만큼 플라스미드 DNA의 SkM 내로의 형질감염을 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, [Bloquel, C 등 (2004) J Gene Med. 6: S11-S23]; [Qian, HS 등 (2004) Mol Ther 9: Supp 1, S91] 참조). 본 발명자들은 플라스미드 DNA를 사용하여 플라스미드 DNA의 전달과 함께 전기천공을 사용할 때 검출가능한 수준의 IFN-β 혈청 (혈청에서의 측정가능한 IFN-β 단백질, 생체마커 반응 또는 효능)이 달성될 수 있음을 밝혀내었다.
IFN-β 플라스미드 DNA의 전달에서 임상적으로 사용하기 위해 적절한 전기천공 장치를, 본 명세서에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 토끼 및 기타 큰 동물에서 시험함으로써 평가하고 결정할 수 있다. 이러한 시험 및 사용을 위해 적절할 수도 있는 전기천공 장치는 이노비오(Inovio) AS, 이코르 메디칼 시스템스(Ichor Medical Systems), 제네트로닉스 인코포레이티드(Genetronics, Inc.)에 의해 개발된 것을 포함할 수도 있다. 제네트로닉스는 인간에서 장치의 시험을 보고하였다 (Gordon Research Conference on Bioelectrochemistry, July 25-30, NH에서 비출판 발표). 또한, 이노비오는 인간 후보자에서 전기천공 기술의 시험 결과를 보고하였다 (예를 들어 [Kjelen, R 등 (2004) Mol Ther 9: Supp 1, S60]). 이코르 메디칼 시스템스는 최근에 치료 DNA의 전달을 위해 적절한 전기천공 장치의 개발을 보고하였다 (예를 들어, [Evans, CF 등 (2004) Mol Ther 9: Supp 1. S56].
LacZ 리포터 유전자를 코드화하는 플라스미드를 사용하여, 본 발명자들은 플라스미드 용액의 동맥내 전달을 사용하여 쥐의 뒷다리 골격근에 높은 형질감염 효율을 증명하였다. 마이루스(Mirus)는 최근들어, 당 기술분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 SkM으로의 플라스미드 전달을 위해 시험될 수 있는 감소된 압력 하에서 감소된 부피로 플라스미드 DNA를 전달하기 위한 정맥내 전달 방법을 보고하였다 (예를 들어, [Hagstrom JE 등 (2004) Mole Ther 10: 386-98] 참조).
SkM으로 플라스미드 DNA의 흡수 및 트랜스유전자의 발현을 증진시키기 위하여 전기천공 또는 정맥내 전달 이외의 방법을 시험할 수 있고, 플라스미드 DNA의 전달을 위한 적합성을 여기에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 결정한다. 이러한 측면에서, SkM으로의 벡터 흡수를 증진시키기 위해 보고된 특정한 화학제를 시험할 수 있고, 이것이 중합체 제형 및 안테노페디아(antennopedia) 펩티드(AP)를 포함하여 본 발명의 플라스미드 벡터의 전달에서 사용하기 위해 적절할 수도 있다. 예를 들어, "F68"은 플라스미드 DNA를 제형하고 전달하기 위해 사용될 수 있는 폴록사머 제형이고, 대략 10배 만큼 SkM으로 플라스미드 DNA의 전달을 증진시키는 것으로 기록되어 있다 (예를 들어 [Mumper, RJ 등 (1998) J Controlled Release 52: 191-203]; [Qian, HS 등 (2004) Mol Ther 9: Supp. 1, S91] 참조). 안테나페디아(AP) 펩티드 및 유사한 조성의 기타 펩티드는 세포 막을 가로질러 큰 거대분자의 운반을 촉진하는 것으로 보고되어 있다 (예를 들어, [Bucci, M 등 (2000) Nat. Med 6: 1362-67]; [Gratton, J-P 등 (2003) Nat Med 9: 357-62] 참조).
B. 플라스미드 DNA 벡터로부터 IFN -β 발현의 수준 및 지속기간의 증가 방법
SkM으로 플라스미드 DNA 흡수를 증진시키는 특정한 화학 약제를 평가하는 것에 추가로, 본 발명의 플라스미드 DNA 벡터로부터 트랜스유전자 발현의 수준 및 지속기간을 증가시키기 위해 다양한 접근을 사용할 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트 만을 함유하는 원형 플라스미드 ("작은원형 DNA")를 생성하기 위해 플라스미드 DNA로부터 세균 DNA 서열을 제거하면, 생쥐에서 간의 형질감염 후에 표준 플라스미드 DNA에 비하여 (인자 IX 및 알파 1-안티트립신을 트랜스유전자로 사용하여) 10- 내지 100-배 더 높은 트랜스유전자 발현이 얻어지는 것으로 보고되었다 (예를 들어, [Chen, Z-Y 등 (2003) Mol Ther 8: 495-500]). CpG 영역에서 보강된 세균 DNA 서열의 제거는 트랜스유전자 발현 침묵(silencing)을 저하시키는 것으로 밝혀졌으며, 그 결과 플라스미드 DNA 벡터로부터 더욱 지속적인 발현이 얻어진다 (예를 들어 [Ehrhardt,A 등 (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25]; [Yet, NS (2002) Mol Ther 5: 731-38]; [Chen, ZY 등, (2004) Gene Ther 11: 856-64]). 플라스미드 DNA 벡터의 트랜스유전자 발현 수준을 증가시키고 연장하기 위하여 이러한 접근법을 사용하여 본 발명의 조절 발현 체계를 변형시킬 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 트랜스유전자 발현 수준을 증가시키고 연장하기 위하여 IFN-β 를 코드화하는 BRES-1 플라스미드 벡터를 변형시킨다.
하나의 구현양태에서, 본 발명의 조절 발현 체계에서 IFN-β를 구성적으로 발현하기 위하여 강력한 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 IFN-β 트랜스유전자의 발현을 조종하였다. CMV 프로모터를 사용한 유전자-기초 발현은 생체내에서 프로모터 영역의 광범위한 메틸화를 통해 침묵을 겪는 것으로 보고되어 있다 (예를 들어 [Brooks, A 등 (2004) J Gene Med 6: 395-404] 참조). 또한, BRES-1 유전자 요법 플라스미드 벡터 pGT26-mIFN-β를 사용하여 본 발명자에 의한 생체내 연구로부터의 결과는 CMV 조종된 발현 카세트를 사용하여 달성되는 수준에 비하여 BRES-1 발현 카세트를 사용할 때 더욱 높은 IFN-β 수준을 나타내었다 (예를 들어, 실시예 6 참조). 이러한 결과를 제공한다면, 본 발명의 IFN-β BRES-1 발현 체계는 CMV 조종된 플라스미드 DNA 발현 카세트를 사용하여 관찰된 것에 비하여 상당히 높고 더욱 지속적인 발현 수준을 생성할 수 있으며, 따라서 전기천공 없이 BRES-1 플라스미드 벡터의 전달을 시험하기 위해 적절하다.
바람직한 구현양태에서, 투여 방법은 전기천공의 부재 하에서 IFN-β 플라스미드 용액의 근육내 주사에 의한 것이다. 미경험 생쥐에 근육내 주사에 의하여 플라스미드 벡터를 투여함으로써 혈청에서 IFN-β의 검출가능한 수준이 시험될 수 있다. 발현 수준 및 BRES-1 발현 카세트의 지속성의 완벽한 특징화를 수행할 수 있고 앞서 사용된 CMV 벡터와 비교할 수 있다. SkM 및 이후의 IFN-β 트랜스유전자 발현의 플라스미드 형질감염을 증진하기 위한 능력에 대하여 F68 폴록사머 및 안테나페디아 펩티드를 포함한 플라스미드 제형을 시험할 수 있다. 마지막으로, 트랜스유전자 발현을 증가시키고 연장시키기 위한 수단으로서 플라스미드 벡터 주쇄의 변형 (예, 세균 서열의 제거)을 조사할 수 있다.
C. AAV-1 벡터: 아데노-결합 바이러스(AAV)는 인간으로부터 아데노바이러스 단리물 중의 오염물로서 초기에 단리된 단일 가닥 DNA 바이러스 (파르보바이러스)이다. AAV는 유전자 요법 벡터로서 특히 매력적으로 만드는 다수의 특징을 갖고 있다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에서 비-병원성 및 복제 결여 성질에 추가로, 이것은 단지 2개의 유전자, rep 및 cap로 구성된 매우 단순한 게놈을 함유한다. 재조합 AAV 벡터에서 이러한 유전자는 각각 대략 135 염기쌍을 가진 특징적인 5' 및 3' 역전 말단 반복물 (ITR)에 의해 인접한 바람직한 트랜스유전자로 대체된다. ITR은 벡터 전달을 위해 필요한 AAV 유래의 DNA의 유일하게 남은 성분이다. 지금까지의 연구는, rep 유전자를 갖지 않은 재조합 AAV 벡터가 생체내에서 통합되지 않고 오히려 비-분할 세포에서 에피좀에 유지되는 큰 환상체(concatameric) 구조를 형성하는 것을 밝혀내었다 (예를 들어 [Duan, D 등 (1998) J Virol 72: 8568-77]; [Vincent-Lacaze,N 등 (1999) J Virol 73: 1949-55]; [Schnepp, BC 등 (2003) J Virol 77: 3495-3504] 참조).
AAV는 DNA를 위해 비교적 작은 용량, 대략 4.5kb를 갖지만, 이것은 가장 큰 치료 트랜스유전자를 모두 수용하기에 충분하다. AAV2는 인간 유전자 요법 시험에서 시험되었으며, 장 기간 발현 및 최소의 염증을 제공하는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어 [Silwell, JL 및 Samulski, RJ (2003) Bio Techniques 34: 148-59] 참조). 최근들어, 대안적인 AAV 혈청형은 이러한 벡터 체계의 장기간 발현 특징에 추가로 SkM에 대해 뛰어난 형질감염 효율을 갖는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어 [Grimm, D 및 Kay, MA (2003) Curr Gene Ther 3: 281-304]). CMV 프로모터 하에서 루시퍼라제를 발현하는 AAV-1 벡터를 사용하는 본 발명자들에 의한 연구는 생쥐의 뒷다리 내로 근육내 주사한 후에 12개월 이상동안 지속되는 높은 발현을 나타내었다 (예를 들어, [Qian, HS 등 (2004) Mol Ther 9: Supp 1, S60]). 비-인간 영장류에서 5년까지 hEPO의 지속적인 발현이 보고되어 있다 (예를 들어 [Xiao, W 등 (1999) J Virol 73: 3994-4003] 참조).
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 C57BI/6 생쥐의 뒤쪽 하지 내에 근육내 주사 후에 mIFN-β 생체마커 반응 뿐만 아니라 상당한 수준의 hIFN-β 단백질을 증명하기 위하여 AAV-1 IFN-β 발현 벡터 (CMV 프로모터/인핸서를 사용한 구조적 발현)를 시험하였다.
MS와 같은 만성 질병을 치료하기 위한 바이러스-기초 전달 벡터를 선택함에 있어서, 여기에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 것과 같은 방법을 사용하여, 치료 트랜스유전자의 장기간 발현 뿐만 아니라 유전자의 재-투여 능력을 증명하기 위하여 그들의 능력에 대해 본 발명의 조절 발현 체계를 시험할 수 있다 (예를 들어 [Chirmule, N 등 (2000) J Virol 74: 2420-25]). AAV-1이 재-투여를 위해 적절한 벡터인지를 결정하기 위하여, 예를 들어 후보 벡터 AAV-1 및 인간 집단에서 가장 우세한 것으로 생각되는 혈청형인 AAV-2를 사용하여 연구를 수행할 수 있다. 1) AAV2 또는 AAV-1에 대한 기존의 항체가 AAV-1 벡터에 코드화된 유전자를 전달하고 발현하는 능력에 영향을 미치는지의 여부, 및 2) 생쥐에서 IFN-β의 치료 수준을 유지하기에 충분한 용량으로 AAV-1 벡터를 재투여할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여 이러한 접근이 사용될 수 있다. AAV-1 또는 AAV-2 벡터에서 리포터 유전자 루시퍼라제 또는 치료 유전자, 생쥐 IFN-β를 발현하는 벡터는 상이한 용량으로 근육내 투여될 수 있고, 트랜스유전자 발현을 검사한다. 4주 후에 벡터를 재-투여할 수 있고 다시 트랜스유전자 발현을 검사할 수 있다. 세포-기초 측정에서 바이러스 흡수를 억제하기 위한 면역화 생쥐 혈청의 능력에 의하여 생체외에서 중화 항체를 측정할 수 있다.
i. pBRES -1- hIFN AAV 벡터의 생체내 활성: 생쥐의 뒷다리 근육에 주입된 hIFN-β BRES-1 AAV 벡터 AAV-1 GT58을 사용하여 미경험 C57BI/6 생쥐에서 연구를 수행하였다. 생쥐를 MFP의 부재하에서 4일에 사혈시킨 다음, 플라스미드 주사 후 7일에서 시작하여 연속 4일 동안 MFP로 처리하였다. 주사 후 11일 및 18일에 혈액을 수집하였다. 응고된 혈액으로부터 혈청을 수집하고, ELISA에 의하여 hIFN에 대해 샘플을 측정하였다 (세부사항을 위하여 하기 "실험 설계" 참조). 이어서, MFP 처리의 7회 이상의 주기로 생쥐를 처리하고, 약 6 내지 8주 간격으로 사혈하였다. 각각의 주기는 MFP 처리 전 3일에 사혈한 다음 MFP의 4일에 이어서 MFP의 마지막 날 다음 날에 사혈하고, 이어서 그 후에 7일에 다시 사혈하였다. 결과는 매우 높은 유도성 hIFN 발현을 나타내며, 가장 강력한 BRES-1/hIFN 플라스미드에서 수득되는 것보다 75배 더욱 높은 수준으로 주사 후에 약 3개월에서 피크를 이루었다 (도 35). 시간에 걸쳐 hIFN 발현이 서서히 저하되고, 실험 과정 전체에 걸쳐 배경 발현-MFP가 낮게 유지되었다. 이것은 AAV 벡터로부터 치료 표적 유전자의 장기간, 지속성 (실시예 9B 참조), 유도성 발현을 증명한다.
실험 설계: 다음과 같이 BRES-1/hIFN 발현 카세트를 보유한 AAV 벡터를 정상적인 성체 C57BI/6 생쥐에 주입하였다. MFP 처리의 다수의 오프/온/오프 주기를 통하여 인간 IFN 발현을 분석하였다.
바이러스 용액: 군 1 생쥐 (AAV)는 생쥐 당 75 ul의 부피로 5×1010 바이러스 입자 (vp)를 받았다.
군 벡터 설명 n*
1 AAV-1-GT58 AAV-1 중의 RM-hIFN rev 5
*n = 동물 수
MFP 치료: 하기 표에 나타낸 것과 같이, 7-10일에서 복강내 주사에 의하여 0.33 mg/kg (참깨유 중의 0.083 mg/ml의 100 ul, 신선하게 만듬)으로 군 1에게 MFP를 투여하였다.
주기 1-3: 1-12주
군 n*/생쥐번호 0일 4일 7-10일 11일 18일
AAV-1-GT58 5/ 101-105 바이러스 주사 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
군 n*/생쥐# 39일 42-45일 46일 53일
AAV-1-GT58 5/ 101-105 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
군 n*/생쥐번호 81일 84-87일 88일 95일
AAV-1-GT58 5/ 101-105 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
주기 4-8: 4-11개월
군 n*/생쥐# 123일 126-129일 130일 137일
AAV-1-GT58 5 101-105 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
군 n*/생쥐# 165일 168-171일 172일 178일
AAV-1-GT58 5 101-105 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
군 n*/생쥐# 221일 224-227일 228일 235일
AAV-1-GT58 5 101-105 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
군 n*/생쥐# 284일 287-290일 291일 298일
AAV-1-GT58 5 101-105 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
군/플라스미드 n*/생쥐# 340일 343-346일 347일 354일
AAV-1-GT58 5 101-105 꼬리 사혈 MFP 꼬리 사혈 꼬리 사혈
*n= 동물의 수
혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차: 상기 표에 나타낸 시점에서 꼬리 자른자리에 의해 생쥐를 사혈하였다. 혈액을 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음) 내에 수집하고, 원심분리하고 혈청 수집하였다. 혈청을 ELISA에 의해 hIFN에 대해 측정하였다.
실시예 9: 조절 발현 체계를 사용한 유전자 요법
A. 용량/반응 및 동역학 연구: 플라스미드에 의해 전달되든지 또는 AAV-1에 의해 전달되든지 간에, 생쥐 (또는 기타 적절한 동물) 중의 치료 분자(TM) (예, IFN-β)의 치료 수준을 달성하기 위해 필요한 전달을 위하여 본 발명의 유전자 요법 벡터를 결정하기 위해 용량/반응 연구를 수행할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 치료 수준은 mg/kg 기준으로 인간에게 주어진 치료 단백질 덩어리의 치료 량에 의해 달성되는 치료 단백질의 수준에 동등한, 벡터에 의해 전신적으로 달성되는 치료 분자(TM), 예를 들어 치료 단백질을 코드화하는 트랜스유전자의 유도된 수준으로서 정의된다. 예를 들어, 바람직한 구현양태에서, 치료 수준은, mg/kg 기준으로 인간에게 주어진 덩어리 IFN-β 단백질의 치료 량에 의해 달성되는 IFN-β의 수준과 동등한, 본 발명의 유전자 요법 벡터에 의해 전신적으로 달성되는 IFN-β의 유도된 수준으로서 정의된다. 인간에서, IFN-β 1a의 통상적인 단일 용량은 30 ug 또는 44 ug (Rebif)이다.
또한, AM 투여/반응을 결정하기 위한 활성인자 분자(AM) 뿐만 아니라 AM 투여 후에 TM 발현의 유도의 동역학을 사용하여, 치료 분자(TM)의 완벽한 약동학적 발현 프로파일을 수행할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구현양태에서, MFP 투여 후에 IFN-β 유도의 동역학뿐만 아니라 MFP 용량/반응을 결정하기 위해 유도인자 MFP로 IFN-β 발현의 완벽한 약동학적 프로파일을 수행할 수 있다.
i. 생체내에서 BRES -1/ mIFN 플라스미드로에 의한 MFP 용량/반응 및 플라스미드 재-주사: 케모카인 IP-10의 수준에 의해 측정되는 바와 같이, 다양한 용량의 MFP에 대한 반응에서 mIFN 발현 수준을 결정하기 위하여 mIFN-β BRES-1 플라스미드 벡터 pGT26을 사용하여 미경험 C57BI/6 생쥐에서 연구를 수행하였다. 생쥐의 뒷다리 근육에 전기천공에 의해 pGT26을 주사하고, 플라스미드 주사 후 7 내지 10일에 0.0033 mg/kg 내지 1.0 mg/kg으로 MFP로 동물을 처리하였다. 주사 후 11일에 혈액을 수집하고, IP-10에 대해 혈청 샘플을 측정하였다 (세부사항을 위해 하기 "실험 설계" 참조). 결과는 IP-10 수준에서 MFP 용량-의존성 증가를 나타낸다 (도 36). MFP의 부재 하에서 또는 0.0033 mg/kg에서 배경 IP-10 수준에 비해 증가가 존재하지 않았다. IP-10 수준은 0.01 내지 1.0 mg/kg MFP로 증가한다. 39일 및 67일에서 동일한 농도로 두 번째 및 세 번째 주기의 MFP 유도를 수행하였다. 67일 까지 IP-10의 수준이 11일 수준으로부터 몇 배 저하되었으며, 따라서 플라스미드 DNA를 77일에 재-주사하였다. MFP 처리의 다른 주기를 수행하였으며 생쥐를 88일에 사혈하였다. 결과는 11일에서와 동일한 수준까지 IP-10 발현의 새로운 유도를 나타낸다. 102일 및 137일에서 2 이상의 MFP 주기를 수행하고, 시간에 걸쳐 IP-10 수준이 서서히 저하되면서 MFP 용량-반응이 여전히 관찰되었다. 이어서, 플라스미드 DNA를 189일에 3회 주사하고, 이어서 200일에서 다시 한번의 MFP 주기 및 사혈은 11일 및 88일에서와 동일한 수준까지 재생된 IP-10 발현과 함께 강력한 MFP 용량-반응을 나타내었다. 이것은 유도인자 용량과 표적 유전자 발현의 포지티브 상관관계를 증명하고, 또한 플라스미드 벡터의 반복 투여에 의해 유전자 발현의 지속성 및 재생성을 증명한다 (하기 실시예 9B 참조).
인간에서 안전성 연구를 위하여, AM의 제거 후에 활성인자 분자(AM)와 TM 발현이 중단될 수 있는 속도의 완벽한 특징화를 수행할 수 있다. TM의 정상 상태 수준을 달성하기 위해 필요한 AM 투여의 빈도를 평가할 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 유도인자의 제거 후에 MFP 및 IFN-β 발현이 중단될 수 있는 속도의 완벽한 특징화를 평가할 수 있다. 또한, IFN-β의 정상 상태 수준을 달성하기 위해 필요한 MFP 투여의 빈도를 평가할 수 있다.
실험 설계: 다음과 같이 단일-벡터 BRES-1 생쥐 IFN 발현 플라스미드로 정상적인 C57BI/6 생쥐에 주사하고, 에렉트로포레이트하고, MFP의 다양한 용량으로 처리하였으며, 다음과 같이 생체마커 반응에 의해 mIFN 발현을 측정하였다.
군 MFP (mg/kg) n*
1 0 5
2 0.0033 5
3 0.01 5
4 0.033 5
5 0.10 5
6 0.33 5
7 1.00 5
Figure 112007090997218-PCT00017
군 플라스미드 설명 n*
1-7 pGT26 BRES-1/mIFN rev 35
*n = 동물의 수
DNA 용액: 각각의 생쥐는 150 ul PBS 중에 250 ug의 플라스미드 DNA를 받았다.
DNA 전달: 150 ul PBS 중에서 생쥐 당 250 ug 플라스미드 DNA로 0일에서 성체 수컷 C57BI/6 생쥐에 양측에서 주사하였다. DNA 용액을 각각의 뒷다리의 정강이 근육에 25 ul로 주사하고 장딴지 근육에 50 ul로 주사한 다음, 캘리퍼로 에렉트로포레이트하였다 (200 V/cm, 1Hz, 20 msec/펄스에서 8펄스)
MFP 처리: 상기 및 하기 표에 나타낸 바와 같이, 군 1 내지 7은 7 내지 10일에 복강내 주사에 의하여 100 ul 참깨유 단독 또는 다양한 농도의 MFP를 받았다.
Figure 112007090997218-PCT00018
Figure 112007090997218-PCT00019
Figure 112007090997218-PCT00020
77일에 DNA의 재-주사
각각의 생쥐는 150 ul PBS 중의 플라스미드 DNA 250 ug을 받았다.
군 플라스미드 n*
2-8 pGT26 35
*n= 동물의 수
Figure 112007090997218-PCT00021
Figure 112007090997218-PCT00022
Figure 112007090997218-PCT00023
군 플라스미드 n*
3-9 pGT26 35
Figure 112007090997218-PCT00024
Figure 112007090997218-PCT00025
혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차: 꼬리 자른자리 또는 심장 천자에 의해 생쥐를 사혈하고, 혈액을 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음) 내에 수집하였다. 혈청을 혈액으로부터 분리하고, 수집하고, ELISA에 의해 IP-10에 대해 측정하였다.
ii. 생체내에서 BRES-1 AAV 벡터로부터 hIFN의 유도 및 탈유도 동역학의 결정: 유도 및 탈-유도의 동역학을 시험하기 위하여 hIFN-β BRES-1 AAV 벡터 AAV-1GT58을 사용하여 미경험 C57BI/6 생쥐에서 연구를 수행하였다. AAV-1GT58을 C57BI/6 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고, 동물에게 연속 4일 동안 복강내 주사에 의해 MFP를 투여하였으며, 이 시간 동안에 유도 동역학을 결정하기 위해 첫 번째 MFP 주사 후에 다양한 시점에서 사혈하였다. 이어서, 탈-유도 동역학을 결정하기 위한 마지막 MFP 주사 후에 이들을 다양한 시간에 사혈하였다 (세부사항을 위하여 "실험 설계" 참조). ELISA에 의하여 hIFN에 대해 혈청을 분석하였다. 결과는, 유도 및 탈-유도 동역학이 빠르다는 것을 나타내고, 첫 번째 MFP 처리 후 48 내지 72시간에 hIFN의 피크 수준에 이르르고 (도 37A), MFP 처리 후 96 시간 내에 배경 수준까지 감소된다 (도 37B). 이것은 BRES-1 체계가 생체내에서 빠르게 온 및 오프될 수 있음을 증명한다.
실험 설계: 다음과 같이 BRES-1/hIFN 발현 카세트를 보유한 AAV1 벡터로 정상적인 성체 C57BI/6 생쥐에게 주사하였다. 각각의 군을 위하여, 하기 표에서 나타낸 "수집 시간"에서 5마리 생쥐 (n=5)를 희생시켰다. MFP의 부재하에서, 또는 단일/다수 MFP 투여 후에 ELISA에 의해 혈청에서 인간 IFN 발현을 결정하였다.
군 N* 벡터 처리 (MFP) 수집 시간
1 10 PBS 없음 24, 96시간 (주사 후)
2 30 RM-hIFN AAV1 없음 7, 14, 21, 28, 35, 42일 (주사 후)
3 25 RM-hIFN AAV1 17일 단독 1, 3, 6, 12, 24시간 (MFP 투여 후)
4 5 RM-hIFN AAV1 16, 17일 24시간 (MFP 투여 후)
5 5 RM-hIFN AAV1 15, 16, 17일 24시간 (MFP 투여 후)
6 35 RM-hIFN AAV1 18, 19, 20, 21일 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간 (MFP 투여 후)
바이러스 용액 및 전달: 군 1 생쥐는 75 ul PBS를 받고, 군 2 내지 6 생쥐는 하나의 뒷다리(오른쪽 다리)에서 75 ul PBS의 부피로 생쥐 당 5×1010 바이러스 입자 (vp)를 받았다. 25 ul를 정강이 근육에 주사하고, 장딴지 근육에 50 ul를 주사하였다.
군 벡터 설명 n*
1 없음 10
2 AAV-1-GT58 AAV-1 중의 RM-hIFN rev 30
3 AAV-1-GT58 AAV-1 중의 RM-hIFN rev 25
4 AAV-1-GT58 AAV-1 중의 RM-hIFN rev 5
5 AAV-1-GT58 AAV-1 중의 RM-hIFN rev 5
6 AAV-1-GT58 AAV-1 중의 RM-hIFN rev 35
*n= 동물의 수
MFP 치료: 하기 스케쥴에 따라서 0.33 mg/kg (참깨유 중에서 0.083 mg/ml의 100 ul, 신선하게 만듬)에서 복강내 주사에 의하여 군 3 내지 6에게 MFP를 투여하였다: 군 3 = 17일, 군 4 = 16+17일, 군 5 = 15-17일, 및 군 6 = 18-21일.
혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차: 표 27에 나타낸 시점에서 심장 천자 (말단 사혈)에 의해 생쥐를 사혈하였다. 혈액을 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음) 내에 수집하고, 혈청을 혈액으로부터 분리하고, 수집하고, ELISA에 의해 hINF에 대해 측정하였다.
B. 발현 지속 및 반복 투여 연구: 지금까지 생성된 데이타는, CMV 프로모터-기초 구축물을 사용한 발현이 플라스미드 DNA를 사용하여 적어도 49일 동안, 그리고 AAV-1 벡터를 사용하여 6개월 동안 구조적 IFN-β를 지속한다는 것을 나타내었다. 계획은 적어도 3개월 동안 IFN-β의 지속적일 뿐만 아니라 조절가능한 발현을 증명하기 위하여 BRES-1 체계로 후보 벡터를 사용하여 이러한 연구를 반복하고 연장하는 것이다. 이 연구는 미경험 C57/BI6 생쥐에서 수행될 수 있다.
ELISA에 반응하여 반복되는 생체마커 종료점 또는 활성인자 분자(AM)의 투여를 사용한 투여에 대하여 C57BI/6 생쥐 (또는 기타 적절한 동물)에서 본 발명의 BRES-1 벡터를 시험할 수 있다. BRES-1 벡터, 발현된 치료 분자 (예, 트랜스유전자), 조절인자 분자 (RM) 또는 치료 단백질에 대한 중화 항체의 존재를 검출할 수 있다. 예를 들어, 시간에 걸친 치료 분자(TM)의 발현 수준을 유지하는 능력 뿐만 아니라 AM 투여에 의해 온/오프 방식으로 재생가능한 발현 수준을 제공하는 능력을 평가하기 위하여, 활성인자 분자(AM)를 만성적으로 뿐만 아니라 박동성 방식으로 투여할 수 있다.
하나의 바람직한 구현양태에서, MFP 투여 또는 IFN-β의 투여에 대한 반응에서 반복하는 생체마커 종료점을 위하여 C57BI/6 생쥐 (또는 기타 적절한 동물)에서 본 발명의 IFN-β BRES-1 벡터를 시험할 수 있다. 벡터, IFN 분자 (IFNM) (예, IFN-β 트랜스유전자), 조절인자 분자(RM) 또는 IFN-β 단백질에 대항한 중화 항체의 존재를 검출할 수 있다. 장기간에 걸쳐 IFN-β 발현 수준을 유지할 뿐만 아니라 MFP 용량에서 온/오프 방식으로 재생가능한 표현 수준을 제공하는 능력을 평가하기 위하여, 만성적뿐만 아니라 박동성 방식으로 MFP를 투여할 수 있다.
i. BRES-1 플라스미드, 박동성 및 만성 MFP 처리로부터 mIFN 유도 및 탈-유도의 동역학
mIFN-β BRES-1 플라스미드 벡터로의 유도 및 탈-유도 동역학을 시험하기 위하여 pGT26을 사용하여 미경험 C57BI/6 생쥐에서 연구를 수행하였으며, MFP의 박동성 또는 만성 투여에 대한 반응에서 mIFN 유전자 발현을 비교하고, 수 개월에 걸쳐 유전자 발현의 지속성을 시험한다. 구성 (pGER101, CMV) 또는 유도 (pGT26, BRES-1) mIFN 발현 플라스미드를 전기천공에 의해 1군당 20마리 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하고, 각각의 군의 5마리 생쥐를 MFP의 부재 하에서 7일에 사혈하였다. pGT26을 받은 모든 20마리 생쥐를 플라스미드 주사 후 7-10일에 MFP로 처리하였다. 탈-유도의 동역학을 시험하기 위하여, 주사 후 11, 12, 14, 16 및 18일의 각각에 각 군의 5마리 생쥐로부터 혈액을 수집하였다. 이어서, 모든 20마리 pGT26 생쥐는 21 내지 24일에 MFP를 받았으며, 유도 동역학을 시험하기 위하여 22, 23 및 25일의 각각에 각각의 군의 5마리 생쥐로부터 혈액을 수집하였다 (세부사항을 위해 "실험 설계" 참조). MFP와의 연속 처리에 대한 반응에서 표적 유전자 발현을 시험하기 위하여, pGT26을 받은 생쥐를 35 내지 50일에 매일 MFP로 복강내 주사하고, 각각의 군으로부터 5마리 생쥐를 35일 (MFP 처리 전), 39, 42, 45 및 51일에 이 기간 동안 사혈하였다. 3.5개월 후에 유전자 발현을 시험하기 위하여, 생쥐를 105일에 사혈하고, 105일 내지 108일에 MFP로 처리하고 109 및 116일에 사혈하였다. 혈청 샘플을 mIFN 발현을 위해 생체마커로서 IP-10에 대해 분석하였다.
결과 (도 37C)는, MFP 처리 시에 BRES-1 플라스미드로부터 IFN 발현의 유도가 24시간 이내에 발생하고, 피크 유도 후에 발현이 기준선 24-48시간으로 저하됨을 나타낸다. BRES-1 체계로부터 mIFN의 발현은 CMV 프로모터에 의해 조종되는 것보다 더 높았다. 2 내지 3개월 과정에 걸쳐 mIFN 발현의 모든 3개 주기는 더 높은 수준에 있다. 연속적 MFP 처리는 2주일에 걸쳐 mIFN의 고-수준 발현을 지속시켰다. 3.5개월 후에 IP-10 수준은 초기 MFP 주기에 비해서 약 1/2 내지 2/3 더 낮았지만, 배경 IP-10 수준보다 여전히 더 높고, CMV 프로모터로부터 mIFN의 발현에 의해 생성되는 것보다 상당히 높았으며, 이것은 시간에 걸쳐 대략 동일한 동역학으로 감소된다 (3.5 개월 후에 소실된 발현의 2/3). 전체적으로, 이러한 실험은 빠르게 여러 번 다시 오프 및 온 될 수 있는 능력과 함께, 몇 개월에 걸쳐 연속적인 고-수준 표적 유전자 발현을 위한 BRES-1 체계의 능력을 증명한다.
실험 설계: 다음과 같이 정상적인 C57BI/6 생쥐에게 단일-벡터 BRES-1 및 CMV 프로모터 생쥐 IFN 발현 플라스미드를 주사하고 에렉트로포레이트하였다. mIFN 활성을 위해 종료점 생체마커로서 IP-10을 사용하여, 적어도 수 개월 동안 IFN 발현을 검사하였다. "온" 및 "오프" 반응의 동역학을 결정하기 위하여 MFP 처리 및 사혈을 설계한다.
DNA 용액: 모든 주사된 군에서 각각의 생쥐는 150 ul PBS 중의 250 ug의 플라스미드 DNA를 받았다.
군 플라스미드 설명 n*
1 pGER101 CMV-mIFN 10
2 pGT26 BRES-1/mIFN 20
*n = 동물의 수
DNA 전달: 150 ul PBS 중에서 생쥐 당 250 ug 플라스미드 DNA를 0일에 양측에서 성체 C57BI/6 생쥐에 주사하였다. 25 ul의 DNA 용액을 정강이 근육에 주사하였고, 각각의 뒷다리의 장딴지 근육에 50 ul를 주사한 다음 캘리퍼로 에렉트로포레이트하였다 (200 V/cm, 1Hz, 20msec/펄스에서 8펄스).
MFP 치료: 하기 표에 나타낸 바와 같이 MFP를 0.33 mg/kg (참깨 유 중의 0.083 mg/ml의 100 ul, 신선하게 만듬)으로 군 2에게 복강내 주사에 의해 투여하였다.
계획: 주기 1 (7-18일): "오프" 동역학 결정, 주기 2 (21-25일): "온" 동역학 결정
주기 1
군/플라스미드 n*/생쥐# 0일 7일 7-10일 11일 12일
1 CMV-mIFN 10 101-110 DNA 주사 꼬리 사혈 A (101-105) 꼬리 사혈 B (106-110)
2 BRES1-mIFN 20 201-220 DNA 주사 꼬리 사혈 A (201-205) MFP A-D (201-220) 꼬리 사혈 B (206-210) 꼬리 사혈 C (211-215)
*n = 동물의 수
주기 2
군/플라스미드 14일 16일 18일 21-24일 22일 23일 25일
1 CMV-mIFN 꼬리 사혈 A 꼬리 사혈 B 꼬리 사혈 A 꼬리 사혈 B
2 BRES1-mIFN 꼬리 사혈 D (216-220) 꼬리 사혈 A 꼬리 사혈 B MFP A-D 꼬리 사혈 C 꼬리 사혈 D 꼬리 사혈 A
주기3 연속 MFP 처리
군/플라스미드 35일 35-50일 39일 42일 45일 51일
1 CMV-mIFN 꼬리 사혈 B 꼬리 사혈 A 꼬리 사혈 B 말단 사혈 및 근육 A
2 BRES1-mIFN 꼬리 사혈 A MFP A-D 꼬리 사혈 B 꼬리 사혈 C 꼬리 사혈 D 말단 사혈 및 근육 A
혈액 수집 및 종료점 분석/측정 절차: 상기 표에 나타낸 바와 같은 시점에서 꼬리 자른 자리 또는 심장 천자 (말단 사혈)에 의해 생쥐를 사혈하였다. 혈액을 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음)에 수집하고 분리를 위해 원심분리하고 혈청을 수집하였다. 군 1 및 2로부터 혈청을 ELISA에 의하여 IP-10에 대해 측정하였다.
C. 생체균등성 연구: 예를 들어 상기 기재된 연구에서 설정된 것과 같은 전달 조건 하에서 후보 벡터 및 BRES-1 발현 체계를 사용하여 정상적인 생쥐 및 하나의 다른 종, 바람직하게는 비-인간 영장류에서 약동학적 연구를 수행할 수 있다. "생물학적동등성"은, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 본 발명의 조절 발현 체계가 하기 표에 한정되지는 않지만 여기에 정의된 바와 같이 양쪽 동물 모델에서 IFN-β 단백질 전달에 비하여 IFN-β 유전자-기초 전달을 위해 뛰어난 약동학적 프로파일을 제공한다는 것을 증명할 수 있다.
생물학적동등성 기준의 비-제한적 예
기준 종료점
투여 IM 전달을 위해 임상적으로 실행가능함
발현 수준 덩어리 단백질에서 달성되는 치료 수준*과 동일하거나 그보다 크다
발현 지속성 3개월 초과
반복 투여 벡터 및 유도인자의 반복 투여 시에 재생가능한 발현
연속/박동성 발현 시간에 걸쳐 치료 수준을 달성하고 유지하기 위해 필요한 최적의 MFP 용량; MFP 투여와 함께 재생가능함
* 비제한적 구현양태에서, 동물 모델에서의 "치료 수준"은 mg/kg 기준 위에서 인간에게 투여된 덩어리 IFN-β 1a 단백질의 치료 량에 의해 달성되는 수준과 균등한 IFN-β의 전신 수준으로서 정의된다 (예를 들어, ELISA 및/또는 생체마커 유도에 의해 결정됨).
D. 안전성/독성 연구: AAV-1이 후보 벡터로서 선택된다면, 후보 벡터의 i.m. 투여 후 생체분포 연구를 수행할 수 있다. 종료점은 벡터 DNA 및 발현된 IFN-β RNA 및 표적 조직(근육), 혈액, 림프, 심장, 간, 신장, 폐, 남성 및 여성 생식선(정소, 난소)에 대한 단백질 분포를 포함할 것이다.
E. 질병 또는 병의 치료를 위한 유전자-기초 전달: 이러한 연구로부터의 결과는 치료 분자(TM)의 전달을 위한 유전자-기초 전달 체계, 예를 들어 질병 또는 병의 치료를 위해 치료 단백질을 코드화하는 트랜스유전자이다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명은 MS의 치료를 위하여 IFN-β의 장기간 조절 발현을 제공하는 IFN-β 트랜스유전자의 전달을 위해 조절 발현 체계를 제공한다. 바람직한 구현양태에서, 이 연구의 결과는 본 발명의 BRES-1 벡터가 소 분자 유도인자, MFP의 경구 투여를 통하여 (예를 들어 3개월 이상 동안) 지속적이고 재생가능한 발현을 제공할 수 있고, 근육내 주사에 의해 반복 투여될 수 있다는 것이다.
i. EAE 질병 생쥐에서 BRES-1 mIFN 플라스미드 활성의 특징화: MS의 동물 질병 모델에서 생물학적 효과를 나타내기 위하여, 활성 EAE를 가진 SJL 생쥐에서 연구를 수행하였다. 구성 (pGER101, pmIFN) 또는 유도 (pGT26, pBRES-1/mIFN) mIFN 발현 플라스미드 및 Null 플라스미드 대조를 전기천공에 의해 SJL 생쥐의 뒷다리 근육에 주사하였다. pmIFN의 주사 전날 및 다음날과 pBRES-1/mIFN의 주사 후 7 및 9일에, PLP 139-151/백일해 독소의 주사에 의하여 생쥐에서 EAE를 유도하였다. 플라스미드 주사 후 하루 한번(d) 또는 3일에 한번(etd) 복강내 주사에 의하여 MFP (0.33 mg/kg)로 생쥐를 처리하였다. 주사 후 5일에 혈액을 수집하였다. PBMC를 혈액으로부터 단리하고, Mx1 RNA의 수준을 결정하기 위해 RNA를 제조하고 RT-PCR에 의해 분석하였다 (세부사항을 위해 하기 "실험 설계" 참조). 결과는, pBRES-1/mIFN + 매일 MFP 주사에 의해 Mx1 RNA 수준에서 대략 8배 증가를 나타내고 MFP의 부재 하에서 Null 벡터에 비해 상당한 증가가 없음을 나타낸다 (도 38). 이것은 이 모델에서 효능이 있는 것으로 나타난 것과 유사한 동물 질병 모델에서 생물학적 반응을 증명한다.
실험 설계: 암컷 SJL 생쥐 (8주령, 잭슨 랩스, ~20g)을 12개 군 (1군 당 n=13) 내에 분포시키고, 다음과 같이 확립된 생쥐 A-EAE 프로토콜에 따라서 각각의 군을 PLP 139-151/백일해로 1 및 3일에 주사하였다.
군 1. 비처리됨. 처리 대조군 없음
군 2-3, CMV 플라스미드 + 전기천공(EP): 정강이 (20 ul) 및 장딴지 근육(40 ul) 내에 Null (pgWiz) 또는 mIFN (pGER101) CMV 플라스미드 DNA의 2개의 양측 근육내(im) 주사에 이어서, 즉시 투여 후 2일에 EP 주사.
군 4-9, BRES1 플라스미드 + EP: 정강이 (20 ul) 및 장딴지 근육 (40 ul) 내에 BRES-1 Null(pGT 4) 또는 BRES-1 mIFN(pGT26) 플라스미드 DNA의 2개 양측 근육내(im) 주사에 이어서, 질병의 개시 전 1주일 (-7일)에 EP를 투여하였다. 1일에 시작하는 복강내 주사에 의하여 매일 또는 3일마다 (etd) MFP (0.33 mg/kg)를 투여하였다. MFP "etd"를 받은 동물에게 1일, 4일, 7일, 10일, 13일, 16일, 19일 및 22일에 투여하였다.
군 10-11. 완충액 대조, mIFN 단백질: 1일에 시작하여 sc 주사에 의해 격일로 IFN 단백질 완충액 또는 mIFN 단백질 (100,000 단위 = 500 mg)을 투여하였다.
군 12. 프레드니졸론: 1일에 시작하여 복강내(ip) 주사에 의해 하루 두번 프레드니졸론을 투여하였다.
Figure 112007090997218-PCT00026
Figure 112007090997218-PCT00027
군 11 mIFN 단백질: 100,000 단위 (500ng)/100 ul 주사 × 13 마리 동물 × 15회 주사 = 1.95×107 단위 (97.5 ug)/19.5 ml. mIFN 원액 = 100 ug/ml 또는 2×107 단위/mL. 희석 관은 100 uL × 15 마리 동물 = 1.5 mL (150 mM NaCl, 50mM 아세트산나트륨, pH 5.5% 프로필렌 글리콜을 함유하는 총 15개 희석 관을 만들었다). 75 uL의 원액을 각각의 관에 첨가하였다. 최종 농도 = 106 단위/mL.
종료점 분석 (Mx1 RNA 분석): 군 1 내지 9로부터의 3마리 동물을 5일에 희생시키고 Mx1 RNA 분석을 위해 말단 사혈시켰으며 (EDTA를 함유하는 보라색 관 사용) IFN RNA 분석을 위해 주사된 근육을 수집하였다.
F. 생성: cGMP-제조를 위하여, BRES-1 hIFN-β 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 유전자 요법 벡터의 제조 방법이 적절할 수 있다. 여기에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예비임상 개발 연구를 수행하기 위해 충분한 순도, 효능 및 안정성을 가진 본 발명의 BRES-1 벡터를 만들 수 있다. 본 발명의 유전자 요법 벡터, 바람직하게는 본 발명의 BRES-1 벡터는, 여기에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 플라스미드 주쇄, 캡시드 (전달 벡터로서 AAV의 경우), 트랜스유전자 발현 생성물 (IFN-β) 및 유도제 (MFP)에 대하여 충분히 특징화될 수 있다.
G. 약리학: 동물 모델에서 단백질 전달에서의 생물학적동등성을 증명할 수 있다. 벡터 및 유도인자 또는 활성인자 분자(AM)을 위한 용량/반응 (예, 소 분자 유도인자 MFP)를 생체내에서 특징화하고 최적화할 수 있다. 트랜스유전자 발현의 반복 투여 및 지속성을 충분히 특징화할 수 있다. 후보 벡터에 의해 면역원성 연구를 수행할 수 있다.
H. 약동학/안전성/독성: 발현된 트랜스유전자의 직접적 검출뿐만 아니라 IFN-β 생체마커의 측정을 사용하여, 발현된 IFN-β 트랜스유전자의 약동학적 연구를 수행할 수 있다. AAV-1이 선택된 후보 벡터이라면, 벡터 DNA 및 그의 발현 생성물의 운명을 시험하기 위해 생체분포 연구를 수행할 수 있다.
재료 및 방법
A. 생쥐 급성 EAE 에서 생쥐 IFN -β 단백질의 유전자-기초 전달의 효능
잭슨 랩(Jackson Labs)으로부터 70 마리의 8주령 암컷 SJL 생쥐를, 200 ug M.튜베르쿨로시스 H37Ra로 보충된 불완전 프뢴드 아주반트(IFA)에서 150 ug 단백지질 단백질 (PLP) 139-151을 함유하는 0.1 ml SC (꼬리의 기부와 윗쪽 등 사이에서 나뉨) 주사에 의해 면역화하였다. 3 mg/ml PLP 1:1를 함유하는 염수를 4 mg/ml 분쇄 M. 투베르쿨로리스를 함유하는 IFA와 혼합함으로써 이러한 에멀젼을 수득하였다. 면역화 후에 즉시, 모든 생쥐는 백일해 독소의 0.1 ml IP 주사를 받았다. 면역화 후 2일 (연구의 3일)에, 모든 생쥐는 백일해 독소의 두 번째 IP 주사를 받았다.
연구의 종료 시까지, IFN-β 단백질 또는 그의 부형제 (20nM NaAc, pH 5.5, 150 mM NaCl, 5% 프로필렌 글리콜)로 처리된 생쥐에게 0.1ml를 면역화 일에 시작하여 격일에 한번 SC 투여하였다. 이 연구를 위해 사용된 포지티브 대조는 9 mg/kg 메조프람 (ZK-117137) 및 2.5 mg/kg 프레드니졸론이었다. 양쪽 대조 모두 0.1 ml/주사의 용량 부피를 사용하며, 연구 마지막까지 면역화 일 아침에 시작하여 1일 2회 IP 투여한다.
실험 군 (n=10):
1. 부형제
2. 10K 단위 생쥐 IFN-β
3. 20K 단위 생쥐 IFN-β
4. 30K 단위 생쥐 IFN-β
5. 100K 단위 생쥐 IFN-β
6. 메조프람, 9 mg/kg IP
7. 프레드니졸론, 2.5mg/kg IP
생쥐 급성 EAE의 임상 점수: 하기 점수 체계를 기초로 하여 매일 생쥐의 점수를 매겼다:
0 = 정상
1 = 흐느적거리는 꼬리
2 = 바로서기 곤란함
3 = 뒷다리의 하나 또는 양쪽의 불완전한 마비
4 = 뒷다리의 하나 또는 양쪽의 완전한 마비, 또는 이동가능하지만 질질끄는 뒷다리
5 = 뒷다리의 양쪽의 완전한 마비 & 앞다리의 허약/마비, 활동휴지 또는 사멸
활동휴지 생쥐를 안락사시켰다. 경계선 임상 증상을 나타내는 생쥐에 1/2 점을 더한다. 100K 단위의 IFN-β로 처리된 생쥐는 부형제 처리된 생쥐에 비하여 EAE의 임상 점수를 상당히 감소시켰다 (p = 0.0046). 이러한 감소가 통계적 유의치에 이르지 않긴 하지만, 30K 단위의 IFN-β로 처리된 생쥐는 부형제 처리된 생쥐에 비하여 임상 점수를 감소시켰다. 이 연구에서의 포지티브 대조인 메조프람 및 프레드니졸론은 임상 점수를 상당히 저하시켰다. 실시예 5 및 도 13 참조.
B. 생쥐 급성 EAE 에서 생쥐 IFN -β의 유전자-기초 전달의 효능
잭슨 랩스로부터 130마리의 8주령 암컷 SJL 생쥐를, 200 ug M.투베르쿨로시스 H37Ra로 보충된 불완전 프뢴드 아주반트(IFA) 중에서 150 ug 단백지질 단백질(PLP) 139-151을 함유하는 0.1 ml SC (꼬리의 기부와 윗쪽 등 사이에서 나뉨)주사로 면역화하였다. 이러한 에멀젼은 3 mg/ml PLP 1:1을 함유한 염수를 4 mg/ml 분쇄 M.투베로쿨로시스를 함유하는 IFA와 혼합함으로써 수득되었다. 면역화 후 즉시, 모든 생쥐는 백일해 독소의 0.1ml IP 주사를 받았다. 2일에, 플라스미드 + 전기천공 군에서의 생쥐는 적절한 근육내 주사를 받은 후 즉시 전기천공에 의해 처리하였다. 플라스미드 + PINC 군에서의 생쥐는 적절한 근육내 주사를 받았다. 면역화 후 2일 (연구의 3일)에 모든 생쥐는 백일해 독소의 두 번째 0.1ml IP 주사를 받았다. 5일에, 플라스미드 + PINC 군에서의 생쥐는 2일에서와 동일한 처리를 받았다.
IFN-β 단백질 또는 그의 부형제 (20nM NaAc, pH 5.5, 150mM NaCl, 5% 프로필렌 글리콜)로 처리된 생쥐를 연구 마지막까지 면역화 날에 시작하여 격일에 한번 0.1ml로 피하 투여하였다. 이 연구를 위해 사용된 포지티브 대조는 9 mg/kg 메조프람 (ZK-117137) 및 2.5mg/kg 프레드니졸론이었다. 양쪽 대조는 0.1ml/주사의 용량 부피를 사용하고 양쪽 대조는 연구 마지막까지 면역화 일 아침에 시작하여 매일 2회 IP 투여되었다.
이 연구에서 총 10개 군이 존재하였다. 각각의 군은 13마리를 가졌다. 각각의 군에서 마지막 3마리 생쥐를 Mx 1 RAN 분석을 위해 연구의 6일에 꼬리 자른 자리를 통해 사혈하였다. 6일에 사혈시킨 동일한 3마리 동물을, PBMC로부터 Mx1 RNA 분석을 위해 연구의 13일에 심장 천자를 통해 사혈하고, 분석을 위해 주사된 근육을 수집하였다.
실험 군 (n=13)
1. PBS 대조
2. pNull + EP
3. pmIFN-β + EP
4. pNull + PINC
5. pmIFN-β + PINC
6. IFN-β 단백질 (100K 단위) SC
7. 부형제, SC
8. 메조프람, 9 mg/kg IP
9. 프레드니졸론, 2.5mg/kg IP
10. 비처리
EAE의 임상 점수: 하기 점수 체계를 기초로 하여 매일 생쥐를 점수를 매겼다:
0 = 정상
1 = 흐느적거리는 꼬리
2 = 바로서기 곤란함
3 = 뒷다리의 하나 또는 양쪽의 불완전한 마비
4 = 뒷다리의 하나 또는 양쪽의 완전한 마비, 또는 이동가능하지만 질질끄는 뒷다리
5 = 뒷다리의 양쪽의 완전한 마비 & 앞다리의 허약/마비, 활동휴지 또는 사멸
활동휴지 생쥐를 안락사시켰다. 경계선 임상 증상을 나타내는 생쥐에 1/2 점을 더한다. 100K 단위의 생쥐 IFN-β로 처리된 생쥐는 부형제 대조 처리된 생쥐에 비하여 EAE의 임상 점수를 상당히 감소시켰다 (p = 0.045). 생쥐 IFN-β +EP의 유전자 전달은 pNull & EP의 유전자 전달에 비하여 임상 점수를 상당히 저하시켰다 (p=0.0171). IFN-β의 PINC 제제를 사용한 유전자 전달은 pNull & PINC에 비해 임상 점수를 통계적으로 저하시키지 않았다. 이 연구에서의 포지티브 대조인 메조프람 및 프레드니졸론은 임상 점수를 상당히 저하시켰다.
C. 생체내에서 mIFN -β의 조절 발현
IFN15 - GS5 : BRES -1/ IFN 플라스미드의 생체내 형질감염: 생쥐 근육 내에 에렉트로포레이트된 BRES-1/mIFN-β 플라스미드로부터 미페프리스톤(MFP)-조절된 생쥐 인터페론-베타 (mIFN-β) 발현의 증명
실험 설계: 하기 표 34 및 35에 기재된 바와 같이 정상적인 C57BI/6 생쥐에 본 발명의 BRES-1 단일 벡터 및 대조 플라스미드 DNA를 주사하고 에렉트로포레이트할 수 있다.
플라스미드 설명 일 ug/ul
pGT4 빈 BRES-1 벡터, pGT26을 위한 네가티브 대조 4/23/04 6.35
pGT26 RM/mIFN-β 역. 실험을 위한 BRES-1/mIFN-β 플라스미드 4/14/04 4/16/04 4.73 4.80
pGER101 pgWiz/mIFN-β (CMV/mIFN-β) mIFN-β 발현을 위한 포지티브 대조 2/18/04 5.73
pGT31 SEAP/RM, RM 기능을 위한 포지티브 대조 4/23/04 5.78
Figure 112007090997218-PCT00028
3개 시점에서 생체마커 및 RNA 수준에 의해 mIFN-β 발현을 측정할 수 있다. DNA 주사 후 7일에, 군 1, 3 및 4를 마지막에 수집할 수 있고, 비주사 생쥐 (군 1) 및 빈 BRES-1 벡터를 받은 생쥐 (군 2)에 비교하여 GS/mIFN-MFP를 받은 생쥐 (군 3)에서 비-유도 배경 mIFN- 발현 및 생체마커 활성을 결정하기 위하여 군 2를 꼬리 사혈할 수 있다. CMV/mIFN (군 4)는 포지티브 대조로서 작용한다. SEAP 발현의 비-유도 배경 수준을 결정하기 위하여 군 12를 꼬리 사혈할 수 있다.
군 2, 6, 9, 11 및 12에서의 생쥐를 DNA 주사 후 7 내지 10일에 MFP로 처리할 수 있다. 11일에, CMV/mIFN을 받은 생쥐 (군 7)에 비하여 RM/mIFN + MFP을 받은 생쥐 (군 6)에서 유도된 mIFN 발현 및 생체마커 활성을 결정하기 위하여 군 5 내지 7을 마지막에 수집할 수 있다. 또한, RM/mIFN - MFP를 받은 생쥐 (군 5)에서 비-유도 수준을 측정할 수 있다. MFP가 생체마커 반응을 모방하는지의 여부를 결정하기 위하여 군 2 (빈 BRES-1 벡터)를 말단에서 사혈할 수 있다. 생체마커 활성이 작은 부피의 혈액으로부터 검출가능한지를 결정하고, 18일에 비-유도 수준을 비교하기 위해 동일한 생쥐에서 유도된 시점을 제공하기 위하여, 군 8 내지 10을 꼬리 사혈할 수 있다. MFP가 mIFN 발현에 영향을 미치거나 생체마커 반응을 억제하는지의 여부를 결정하기 위하여 군 11 (CMV/mIFN + MFP)을 마지막에 수집할 수 있다. 군 12를 SEAP 발현의 유도된 수준을 결정하기 위하여 꼬리 사혈할 수 있다. 군 13은 SEAP 발현을 위해 네가티브 대조를 제공할 것이다.
마지막 MFP 처리 후 8일째인 18일에, RM/mIFN-/+/- MFP 군 (군 9)에서 mIFN-β RNA 수준 및 생체마커 활성이, MFP를 결코 받지 않은 RM/mIFN 생쥐 (군 8)에 비교하여 기준선으로 되돌아가는지의 여부를 결정하기 위하여, 군 8 내지 10을 마지막에 수집할 수 있다. CMV/mIFN (군 10)을 다시 포지티브 대조로서 작용한다. 군 12는 SEAP 발현이 기준선으로 되돌아가는지의 여부를 결정하기 위해 말단 사혈할 수 있다.
D. 시약
DNA 용액: 군 2 내지 11에서 각각의 생쥐는 150 PBS 중의 플라스미드 DNA 250 ug을 받을 수 있다. 군 12에서 각각의 생쥐는 150 ul PBS 중의 플라스미드 DNA 25 ug를 받을 수 있다.
Figure 112007090997218-PCT00029
E. 동물 절차
1) DNA 전달 (군 2-12): 0일에서 생쥐 당 150 ul PBS 중의 250 ug (군 2-11) 또는 25 ug (군 12) 플라스미드 DNA로 성체 수컷 C57BI/6 생쥐 (군 당 5 마리)에게 양측 주사할 수 있다. DNA 용액을 각각의 뒷다리의 정강이 근육에 25 ul, 장딴지 근육에 50 ul 주사할 수 있고, 이어서 캘리퍼로 에렉트로포레이트할 수 있다 (200 V/cm, 1Hz, 20msec/펄스에서 8펄스).
2) MFP 치료 (군 2, 6, 9, 11 및 12): 하기 표 37에 나타낸 바와 같이 주사 후 7 내지 10일에 0.33 mg/kg (참깨유 중의 0.083 mg/ml의 100 ul, 신선하게 만듬)으로 경구 위관영양법에 의하여 군 2, 6, 9, 11 및 12의 생쥐에게 MFP를 투여할 수 있다.
군 7일 8일 9일 10일 11일 18일
1) 비주사 말단 사혈 + 근육
2) 빈 벡터 (pGT4) 꼬리 사혈, 이어서 MFP MFP MFP MFP 말단 사혈+근육
3) RM/mIFN (pGT26) -MFP 말단 사혈 + 근육
4) CMV/mIFN (pGER101) 말단 사혈 + 근육
5) RM/mIFN (pGT26) -MFP 말단 사혈+근육
6) RM/mIFN (pGT26) -/+ MFP MFP MFP MFP MFP 말단 사혈+근육
7) CMV/mIFN (pGER101) 말단 사혈+근육
8) RM/mIFN (pGT26) -MFP 꼬리 사혈 말단 사혈 +근육
9) RM/mIFN (pGT26) -/+/-MFP MFP MFP MFP MFP 꼬리 사혈 말단 사혈+근육
10) CMV/mIFN (pGER101) 꼬리 사혈 말단 사혈+근육
11) CMV/mIFN (pGER101) -/+MFP MFP MFP MFP MFP 말단 사혈+근육
12) SEAP/RM (pGT31)* -/+/-MFP 꼬리 사혈, 이어서 MFP MFP MFP MFP 꼬리 사혈 말단 사혈
13) 비주사 말단 사혈
* NheI 및 NotI로 pGER75 (CMV/SEAP)의 소화, 및 pGT1의 SpeI 및 NotI 사이에 SEAP 유전자를 보유하는 단편의 삽입에 의하여 pGT31을 구축하였다.
3) 혈액 및 근육의 수집 (군 1-11): 상기 표 6에 나타낸 바와 같이 DNA 주사 후 적절한 날에, 생쥐를 꼬리 사혈하거나 말단 사혈할 수 있다. 생쥐를 말단 사혈할 때, 주사된 근육을 모을 수 있다.
혈액: RT에서 마이크로테이너 관 (EDTA 함유) 내에 혈액을 수집한 다음 PBMC를 분리하고 수집할 수 있다. 나머지 혈장을 사이토카인 측정을 위해 -20℃에서 보관할 수 있다.
근육: 양쪽 다리의 주사된 근육을 수집하고 함께 모으고 한쪽에서 5mm 이하의 조각으로 절단할 수 있다. 잘게 자른 근육의 대략 1/4을 2ml 관에서 1.5ml의 RNA-Later 용액 내에 넣을 수 있다. 근육의 나머지를 -70℃에서 보관할 수 있다. RNA-Later 용액 중의 근육 샘플로부터 DNA 및 RNA를 추출할 수 있다. 샘플을 적어도 24시간 동안 4℃에서 보관할 수 있고, 이어서 5일 이상 동안 보관할 수 있다면 -20℃로 옮길 수 있다.
혈액 (군 12 및 13): 군 12에서의 생쥐를 7일 및 11일에 꼬리 사혈할수 있고, 황색 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음) 안에 18일에 말단 사혈할 수 있다. 7일에 MFP 처리에 앞서서 생쥐를 사혈할 수 있다. 군 13에서의 생쥐를 11일에 황색 마이크로테이너 관 (항-응고제 없음) 안으로 말단 사혈할 수 있다.
4) 종료점 분석/측정 절차
생체마커 측정의 결과: Mx1 RNA 및 양쪽 케모카인 (IP-10 및 JE)는 7일에 MFP의 부재하에서 BRES-1-mIFN-β (pGT26)에 의해 거의 또는 전혀 활성을 나타내지 않았다. 11일에 MFP의 존재 하에서 모든 생체마커가 CMV-mIFN-에 의해서보다 더 높은 수준까지 강력하게 유도되었다. 18일에, MFP의 부재 하에서, 케모카인 수준이 기준선으로 되돌아가고 Mx1 RNA가 거의 기준선으로 저하되었다. 도 18 및 도 19 참조.
PBMC로부터 Mx1 RNA: 분리된 PBMC로부터 RNA를 제조할 수 있고 태그맨에 의해 Mx1 RNA에 대해 측정하였다.
혈장으로부터 JE 및 IP-10 단백질: ELISA에 의하여 JE 및 IP-10 사이토카인에 대해 혈장을 측정할 수 있다.
근육으로부터 mIFN-β RNA: 주사된 근육으로부터 RNA를 제조할 수 있고 태그맨에 의해 mIFN-β RNA에 대해 측정하였다.
근육으로부터 플라스미드 DNA: 주사된 근육으로부터 DNA를 제조할 수 있고 태그맨에 의해 플라스미드 DNA에 대해 측정하였다. 군 4, 7, 10 및 11로부터의 DNA에 대하여 CMV 프로모터에 대해 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있다. 군 2, 3, 5, 6, 8 및 9에 대하여, 조절인자 단백질의 GAL-4 DNA 결합 도메인에 대해 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있다.
혈청으로부터의 SEAP 단백질: 희석제로서 군 13 생쥐로부터의 혈청을 사용하여, 화학발광 활성 측정에 의해 SEAP 발현에 대해 혈청을 측정할 수 있다.
F. 플라스미드 벡터의 구축
pGER101 ( pgWiz / mIFN ): 5' 프라이머에 대체된 mIFN 신호 서열 및 5' 및 3' 말단에 첨가된 SalI 및 NotI 제한 효소 부위를 사용하여 플라스미드 벡터 pbSER189 (도 20A)로부터의 PCR에 의하여 생쥐 IFN-β (mIFN-β) 유전자를 증폭시켰다. SalI 및 NotI으로 단편을 소화시키고, 플라스미드 벡터 pgWIZ (도 20B)의 SalI 및 NotI 부위 내에 삽입하여 플라스미드 벡터 pGER101을 얻었다 (도 20C).
pGER125 ( pgWiz / hIFN ): 5' 프라이머에 대체된 hIFN 신호 서열 및 5' 및 3' 말단에 첨가된 SalI 및 NotI 제한 효소 부위를 사용하여 플라스미드 벡터 pbSER178로부터 PCR에 의하여 인간 IFN-β (hIFN-β) 유전자를 증폭시켰다. SalI 및 NotI으로 단편을 소화시키고, 플라스미드 벡터 pgWIZ 의 SalI 및 NotI 부위 내에 삽입하여 플라스미드 벡터 pGER125을 얻었다 (도 21).
pGene / V5 - HisA: 플라스미드 벡터를 인비트로겐으로부터 구입하였으며, 최소 프로모터의 상류에 6 GAL-4 결합 부위 (E1b TATA), CMV로부터 유래된 UT12인 5' 비번역 영역 (UTR), 합성 인트론 8 (IVS8), 다수 클론화 부위(MCS) 및 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리(A) 부위를 함유한다. MCS에서 삽입된 유전자를 조절인자 분자(RM)에 의해 조절할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 RM이 GAL-4 부위에 결합할 때, MCS에서 삽입된 유전자를 변형된 프로게스테론 수용체의 활성화된 형태 (예를 들어, SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하거나 SEQ ID NO:21의 핵산 서열에 의해 코드화됨)에 의해 유도할 수 있다.
pGene - mIFN ( pGER127 ): 플라스미드 벡터 pGER101을 SalI으로 소화시키고, 클레노우로 충진시키고, HindIII 링커에 결찰시키고 HindIII 및 NotI으로 소화시켰다. mIFN-β 유전자 단편을 플라스미드 벡터 pGene/V5-HisA의 HindIII 및 NotI 부위 내에 삽입하였으며 그 결과 플라스미드 벡터 pGene-mIFN을 얻었다 (도 23).
pGene - hIFN ( pGER129 ): 플라스미드 벡터 pGER125를 SalI으로 소화시키고, 크클레노우로 충진시키고, HindIII 링커에 결찰시키고 HindIII 및 NotI으로 소화시켰다. mIFN-β 유전자 단편을 플라스미드 벡터 pGene/V5-HisA의 HindIII 및 NotI 부위 내에 삽입하였으며 그 결과 플라스미드 벡터 pGene-hIFN (pGER129)을 얻었다 (도 24).
p스위치: 이 플라스미드 벡터를 인비트로겐으로부터 구입하였으며, CMV로부터 유래된 5' 비번역 영역 12 (UT 12) 및 RM 단백질을 위한 유전자의 발현을 조종하는 합성 인트론 8 (IVS 8)의 상류에 있는 자가유도성 RM-반응성 프로모터 (4XGAL-4 DNA 결합 부위 및 티미딘 키나아제(tk) 프로모터)에 연결된 변형된 프로게스테론 수용체 (예, SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하거나 SEQ ID NO:21의 핵산 서열에 의해 코드화됨)를 코드화한다 (도 25).
pGS1694: 플라스미드 벡터 pGS1694는 발렌티스(Valentis)에 의해 제공되고, 이것은 닭 골격근 액틴 프로모터 (sk 액틴 pro), 5' 비번역 영역 12 (UT12), 및 변형된 프로게스테론 수용체 (예, SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하거나 SEQ ID NO:21의 핵산 서열에 의해 코드화됨)를 코드화하는 유전자의 발현을 조종하는 합성 인트론 8 (IVS8)을 함유한다 (도 26).
pLC1674: 플라스미드 벡터 pGS1674는 발렌티스(Valentis)에 의해 제공되고, 이것은 "RM-반응성" 프로모터 (즉, 변형된 프로게스테론 수용체의 활성 형태에 반응성인 프로모터 (예를 들어, SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하거나 SEQ ID NO:21의 핵산 서열에 의해 코드화됨), 5' 비번역 영역 12 (UT12), 및 개똥벌레 루시퍼라제 유전자(luc)를 코드화하는 유전자의 발현을 조종하는 합성 인트론 8 (IVS8)을 함유한다 (도 27).
G. 바이러스 생성을 위한 벡터의 구축
바이러스 생성을 위한 벡터 (예, 서틀 플라스미드) 및 바이러스 (예, AAV-1 바이러스)의 생성 방법이 당 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 바이러스를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현양태에서, 서틀 플라스미드 (예, 표 38 참조)로부터 본 발명의 바이러스를 생성하고, 이것을 질병의 치료를 위해 피험자의 세포에서 본 발명의 분자 (예, 벡터에 함유된 서열에 의해 코드화된 TM 및/또는 RM)의 전달 및 발현을 위해 사용한다.
pGT2 / mGMCSF 및 pGT / hGMCSF: 서틀 플라스미드 pGT2/mGMCSF 및 pGT/hGMCSF를 다음과 같이 구축하였다 (도 28). 벡터 플라스미드를 AgeI 및 NheI로 소화시킴으로써 pORF9-mGMCSF (도 30)으로부터 생쥐 GMCSF (mGM-CSF)를 코드화하는 단편을 잘라내었다. 이 단편을 블런팅하였다. 유사하게, 벡터 플라스미드를 SgrAI 및 NheI로 소화함으로써 인간 (hGM-CSF)를 코드화하는 단편을 pORF-hGMCSF로부터 잘라내었다 (도 30). 이 단편을 블런트화하였다. mGMCSF 또는 hGMCSF를 코드화하는 잘라내고 블런트화된 단편을 pGT2 벡터 플라스미드의 EcoRV 부위 내에 삽입하였다. 제한효소 소화물 지도화에 의하여 삽입물의 배향을 검사하였다. 얻어진 서틀 플라스미드는 pGT2/mGMCSF (생쥐 GMCSF 코드화) 및 pGT2/hGMCSF (인간 GMCSF 코드화)로 명명되었다 (도 28).
pZac2 .1- RM - hGMCSF 및 pZac2 .1- RM - mGMCSF: 다음과 같이 서틀 플라스미드 pZac2.1-RM-hGMCSF 및 pZac2.1-RM-mGMCSF를 다음과 같이 구축하였다 (도 29A). 플라스미드를 AgeI 및 NheI로 소화시킴으로써 생쥐 GMCSF를 코드화하는 단편을 플라스미드 pORF9-mGMCSF (도 30)로부터 잘라내고, 블런트화하고, 얻어진 블런트화 단편을 플라스미드 pGT2의 EcoRV 부위 내에 삽입하여, 플라스미드 pGT2/mGMCSF가 얻어졌다. 유사하게, 플라스미드를 SgrAI 및 NheI로 소화함으로써 인간 GMCSF를 코드화하는 단편을 플라스미드 pORF-hGMCSF (도 30)으로부터 잘라내고, 블런트화하고, 얻어진 블런트화 단편을 플라스미드 pGT2의 EcoRV 부위 내에 삽입하였으며, 그 결과 플라스미드 pGT2/hGMCSF를 얻었다. 얻어진 벡터 플라스미드에서의 삽입물을 검사하고 제한효소 소화물 지도화에 의해 입증하였다.
벡터 플라스미드 pGT2/hGMCSF 및 pGT2/mGMCSF를 FseI 및 SrfI로 소화시켰다. 이어서 BRES-1-GMCSF 단편을 블런트화하였다. 플라스미드 벡터 pZac2.1을 BgI2 및 ClaI으로 소화시키고 블런트화하였다. 블런트화 BRES-1-GMCSF 단편을 블런트화 pZac2.1 벡터에 결찰시켰다. 제한효소 소화물에 의하여 포지티브 클론을 입증하였다. 얻어진 서틀 플라스미드는 pZac2.1-RM-hGMCSF (인간 GMCSF 코드화) 및 pZac2.1-RM-mGMCSF (생쥐 GMCSF 코드화)로 명명되었다 (도 29A).
pZac2 .1- CMV - mGMCSF 및 pZac2 .1- CMV - hGMCSF: 다음과 같이 서틀 플라스미드 pZac2.1-CMV-mGMCSF 및 pZac2.1-CMV-hGMCSF를 구축하였다 (도 29B). 인간 GMCSF를 코드화하는 단편 및 생쥐 GMCSF를 코드화하는 단편을 각각 플라스미드 벡터 pGENE/V5HisA (인비트로겐)내에 별도로 클론화하였으며, 그 결과 각각 플라스미드 pGT723-GENE/hGMCSF (인간 GMCSF 코드화) 및 pGT724-GENE/mGMCSF (생쥐 GMCSF 코드화)가 얻어졌다. 플라스미드를 KpnI 및 XbaI로 소화함으로써 pGT724/mGMCSF로부터 생쥐 GMCSF를 코드화하는 단편을 잘라내었으며, 플라스미드를 KpnI 및 XbaI으로 소화시킴으로써 pGT723/hGMCSF로부터 인간 GMCSF를 코드화하는 단편을 잘라내었다. 얻어진 단편을 각각 KpnI 및 XbaI로 소화시킨 벡터 pZac2.1의 KpnI/XbaI 부위 내에 별도로 삽입하였으며, 송아지 알칼리성 포스파타제(CIP)로 처리하였다. 얻어진 서틀 플라스미드는, 인간 GMCSF를 코드화하는 pGT713 (또는 pZac2.1-CMV-hGMCSF) 및 생쥐 GMCSF를 코드화하는 pGT714 (또는 pZac2.1-CMV-mGMCSF)로 명명되었다 (도 29B).
추가의 서틀 플라스미드를 하기 표 38에 기재된 바와 같이 구축하였다.
서틀 플라스미드 서틀 플라스미드의 설명 AAV-1 바이러스를 생성하기 위한 서틀 플라스미드의 구축
pGT61 CMV 프로모터에 작동적으로 연결된 mIFN-β 를 코드화하는 AAV-1 서틀 플라스미드 mIFN-β 유전자를 코드화하는 pGT26의 SpeI-AscI 단편을 pZAC2.1의 NheI-MluI 부위 내에 삽입하고, 그 결과 AAV-1GT61 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT61이 얻어졌다.
pGT62 CMV 프로모터에 작동적으로 연결된 hIFN-β 를 코드화하는 AAV-1 서틀 플라스미드 hIFN-β 유전자를 코드화하는 pGT30의 SpeI-AscI 단편을 pZAC2.1의 NheI-MluI 부위 내에 삽입하고, 그 결과 AAV-1GT62 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT62가 얻어졌다.
pGT54 mIFN-β를 코드화하는 BRES-1을 함유하는 AAV-1 서틀 플라스미드 pGT53의 SwaI-SbfI 단편을 BRES-1 서열을 함유하는 pGT26의 SwaI-SbfI 단편에 걸찰시켜, 그 결과 AAV-1 GT54 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT54가 얻어졌다.
pGT57 hIFN-β를 코드화하는 BRES-1을 함유하는 AAV-1 서틀 플라스미드 pGT53의 FseI-SwaI 단편을 BRES-1 서열을 함유하는 pGT28의 FseI-SrfI 단편에 걸찰시켜, 그 결과 AAV-1 GT57 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT57이 얻어졌다.
pGT58 hIFN-β를 코드화하는 BRES-1을 함유하는 AAV-1 서틀 플라스미드 pGT53의 SwaI-SbfI 단편을 BRES-1 서열을 함유하는 pGT30의 SwaI-SbfI 단편에 걸찰시켜, 그 결과 AAV-1 GT58 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT58이 얻어졌다.
pGT714 CMV 프로모터에 작동적으로 연결된 mGMCSF를 코드화하는 AAV-1 서틀 플라스미드 플라스미드 벡터 pORF9-mGMCSF (인비트로겐) (도 30)으로부터 mGMCSF를 코드화하는 단편을 pZAC2.1의 다클론화 부위 내에 삽입하여, 그 결과 AAV-1GT714 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT714 (도 29B, pZac2.1-CMV-mGMCSF)가 얻어졌다
pGT713 CMV 프로모터에 작동적으로 연결된 hGMCSF를 코드화하는 AAV-1 서틀 플라스미드 플라스미드 벡터 pORF9-hGMCSF (인비트로겐) (도 30)으로부터 hGMCSF를 코드화하는 단편을 pZAC2.1의 다클론화 부위 내에 삽입하여, 그 결과 AAV-1GT713 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT713 (도 29B, pZac2.1-CMV-hGMCSF)가 얻어졌다
pGT716 BRES-1 mGMCSF를 함유하는 AAV-1 서틀 플라스미드 mGMCSF를 코드화하는 블런트 말단화 단편을 pGT2의 EcoRV 부위 내에 삽입하여 플라스미드 벡터 pGT712를 얻고, BRES-1-mGMCSF를 함유하는 pGT712의 FseI-SrfI 단편을 블런트 말단화하고 pZAC2.1 내에 삽입하여, AAV-1GT716 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT716(SEQ ID NO:42)이 얻어졌다 (도 31B 참조)
pGT715 BRES-1 hGMCSF를 함유하는 AAV-1 서틀 플라스미드 hGMCSF를 코드화하는 블런트 말단화 단편을 pGT2의 EcoRV 부위 내에 삽입하여 바이러스 벡터 pGT711를 얻고, BRES-1-hGMCSF를 함유하는 pGT711의 FseI-SrfI 단편을 블런트 말단화하고 pZAC2.1 내에 삽입하여, AAV-1GT716 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pGT715 (SEQ ID NO:41)이 얻어졌다 (도 31A 참조)
pTR-mIFN-β CMV 프로모터에 작동적으로 연결된 mIFN-β 를 코드화하는 AAV-1 서틀 플라스미드 mIFN-β를 코드화하는 pgWIZ/WT IFN의 블런트화 HincII-BsrBI 단편을 pTReGFP의 블런트화 AgeI-SalI 부위 내에 삽입하여 pTR-mIFN-β 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pTR-mIFN-β (SEQ ID NO:43)을 얻고, AAV-1TR-mIFN-β 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pTR-mIFN-β가 얻어졌다.
pTR-hIFN-β CMV 프로모터에 작동적으로 연결된 hIFN-β 를 코드화하는 AAV-1 서틀 플라스미드 hIFN-β를 코드화하는 pgWIZ/hIFNb의 블런트화 HincII-NotI 단편을 pTReFGP의 블런트화 AgeI-SalI 부위 내에 삽입하여 AAV-1TR-hIFN-β 바이러스를 생성하는 서틀 플라스미드 pTR-hIFN-β (SEQ ID NO:44)가 얻어졌다.
pGER75 CMV 프로모터에 작동적으로 연결된 SEAP를 코드화하는 플라스미드 주형으로서 pSEAP2 DNA (클론테크)를 사용하여 PCR을 통해 SEAP를 코드화하는 단편을 증폭시키고, 증폭된 단편을 벡터 phRL-CMV (프로메가)의 NheI-XbaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pGER75를 얻었다.
상기 표 38에서, AAV-1-BRES-1 구축물을 위하여, 벡터 내에 BRES-1 서열을 함유하는 단편을 삽입할 수 있게 하기 위하여 MCS에서 pZAC2.1 서틀 플라스미드를 변형시켜 서틀 플라스미드 pGT53을 얻었다. BRES-1 서열을 함유하는 단편을 pGT53 내에 삽입하기 위하여, 적절한 pGT 플라스미드 (표 8에 기재됨)를 제한효소로 소화시켜 각각의 IFN을 코드화하는 전체 BRES-1 서열을 함유하는 단편을 얻었으며, 이러한 단편을 pGT53의 상용성 부위 내에 삽입하였다. AAV-1 바이러스를 생성하기 위한 표준 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 AAV-1 바이러스 준비물을 만들기 위하여 AAV-1 서틀 플라스미드를 사용하였다.
CMV-프로모터-함유 서틀 플라스미드를 위하여, 제한 효소 소화를 통해 적절한 플라스미드 벡터로부터 각각의 IFN 유전자를 코드화하는 단편을 단리하고, 상기 표 8에 기재된 바와 같은 상용성 제한효소 부위(들)에서 pZAC2.1 플라스미드 벡터 내에 삽입하였다.
BRES-1 hGMCSF 서틀 플라스미드를 위하여, hGMCSF를 코드화하는 pORF9-hGMCSF (인비트로겐)의 SrgAI/NheI 단편을 블런트-말단화하고, pGT2의 EcoRV 부위 내에 삽입하여 pGT711을 얻었다. 전체 BRES-1 서열을 함유하는 pGT712의 FseI/SrfI 단편을 블런트-말단화하고 pZAC2.1 내에 삽입하여 pGT715를 얻었다 (도 31A).
BRES-1 mGMCSF 서틀 플라스미드를 위하여, mGMCSF를 코드화하는 pORF9-mGMCSF (인비트로겐)의 AgeI/NheI 단편을 블런트-말단화하고 pGT2 벡터의 EcoRV 부위 내에 삽입하여 pGT712를 얻었다. 전체 BRES-1 서열을 함유하는 pGT712의 FseI/SrfI 단편을 블런트-말단화하고 pZAC2.1에 삽입하여 pGT716를 얻었다 (도 31B).
각각의 pORF9 플라스미드(인비트로겐)로부터의 생쥐 및 인간 GMCSF 유전자를, KpnI/XbaI로 잘라내고 pZAC2.1 내에 클론화할 수 있도록, 플라스미드 pGENE/V5HisA 플라스미드 (인비트로겐)를 통해 클론화하였다.
당업자라면, 본 명세서에 기재된 목적을 수행하고 목표 및 장점뿐만 아니라 본 발명의 고유의 장점을 수득하기 위하여 본 발명의 조성물 및 방법이 적응된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 변화 및 기타 용도가 당업자에게 일어날 것이고, 이러한 변화는 여기에 기재되고 청구된 바와 같이 계획되고 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Bauzon, Maxine Harkins, Rick Hermiston, Terry Kretschmer, Peter Szymanski, Paul <120> Treatment of Disease Using an Improved, Regulated Expression System <130> 53262AWOM1 <150> US 60/682,761 <151> 2005-05-19 <160> 51 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 169 <212> DNA <213> artificial <220> <223> start site <400> 1 agcggagtac tgtcctccga gtggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgagt 60 cgagggtcga agcggagtac tgtcctccga gtggagtact gtcctccgag cggagtactg 120 tcctccgagt cgactctaga gggtatataa tggatctcga gatgcctgg 169 <210> 2 <211> 98 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid <400> 2 gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg 60 cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtg 98 <210> 3 <211> 118 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid intron <400> 3 gtaagtgtct tcctcctgtt tccttcccct gctattctgc tcaaccttcc tatcagaaac 60 tgcagtatct gtatttttgc tagcagtaat actaacggtt ctttttttct cttcacag 118 <210> 4 <211> 69 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid cloning site <400> 4 ggatccgctg atatccggac tagtataaga atgcggccgc taatgaattg gcgcgccaat 60 cgatacgta 69 <210> 5 <211> 79 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid cloning site <400> 5 acatgttaga ggatccgctg atatccggac tagtataaga atgcggccgc taatgaattg 60 gcgcgccaat cgatacgta 79 <210> 6 <211> 191 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid polyA signal <400> 6 gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60 gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120 ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180 acctgtaggg c 191 <210> 7 <211> 434 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid promoter <400> 7 ggggccgctc tagctagagt ctgcctgccc cctgcctggc acagcccgta cctggccgca 60 cgctccctca caggtgaagc tcgaaaactc cgtccccgta aggagccccg ctgccccccg 120 aggcctcctc cctcacgcct cgctgcgctc ccggctcccg cacggccctg ggagaggccc 180 ccaccgcttc gtccttaacg ggcccggcgg tgccggggga ttatttcggc cccggccccg 240 ggggggcccg gcagacgctc cttatacggc ccggcctcgc tcacctgggc cgcggccagg 300 agcgccttct ttgggcagcg ccgggccggg gccgcgccgg gcccgacacc caaatatggc 360 gacggccggg gccgcattcc tgggggccgg gcggtgctcc cgcccgcctc gataaaaggc 420 tccggggccg gcgg 434 <210> 8 <211> 222 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid poly(A) signal <400> 8 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 180 gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222 <210> 9 <211> 1983 <212> DNA <213> artificial <220> <223> vector backbone <400> 9 tcagcatgcc cgggcatcca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 60 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 120 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 180 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 240 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 300 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 360 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 420 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 480 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 540 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 600 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 660 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 720 acgttaaggg attttggtca tgagcgcgcc taggcttttg caaagatcga tcaagagaca 780 ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 840 tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 900 gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 960 ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 1020 gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 1080 ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 1140 atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 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aagctacatt agagagctca tcaaggcaat tggtttgagg 660 caaaaaggag ttgtgtcgag ctcacagcgt ttctatcaac ttacaaaact tcttgataac 720 ttgcatgatc ttgtcaaaca gcttcatctg tactgcttga atacatttat ccagtcccgg 780 gcactgagtg ttgaatttcc agaaatgatg tctgaagtta ttgct 825 <210> 36 <211> 275 <212> PRT <213> artificial <220> <223> vector <400> 36 Lys Lys Phe Asn Lys Val Arg Val Val Arg Ala Leu Asp Ala Val Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gln Pro Val Gly Val Pro Asn Glu Ser Gln Ala Leu Ser Gln 20 25 30 Arg Phe Thr Phe Ser Pro Gly Gln Asp Ile Gln Leu Ile Pro Pro Leu 35 40 45 Ile Asn Leu Leu Met Ser Ile Glu Pro Asp Val Ile Tyr Ala Gly His 50 55 60 Asp Asn Thr Lys Pro Asp Thr Ser Ser Ser Leu Leu Thr Ser Leu Asn 65 70 75 80 Gln Leu Gly Glu Arg Gln Leu Leu Ser Val Val Lys Trp Ser Lys Ser 85 90 95 Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Ile Asp Asp Gln Ile Thr Leu Ile 100 105 110 Gln Tyr Ser Trp Met Ser Leu Met Val Phe Gly Leu Gly Trp Arg Ser 115 120 125 Tyr Lys His Val Ser Gly Gln Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Ile 130 135 140 Leu Asn Glu 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ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 4380 ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 4440 gcgagcgagc gcgcagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 4500 agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 4560 gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 4620 tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 4680 gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 4740 attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccccgata gacggttttt cgccctttga 4800 cgctggagtt cacgttcctc aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 4860 ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggatttttcc gatttcggcc tattggttaa 4920 aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttataa 4980 tttcaggtgg catctttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 5040 tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 5100 gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 5160 cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 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gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 6900 gcgaggaagc ggaag 6915 <210> 42 <211> 6908 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid <400> 42 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 60 cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 120 accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 180 cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 240 ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 300 accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagtaat 360 ggtaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 420 attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 480 ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 540 tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 600 tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 660 gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 720 tttttaattt aaaaggatct 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tctgcgcgct 2280 cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 2340 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 2400 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta 2460 agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 2520 cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 2580 gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 2640 aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccccgata gacggttttt 2700 cgccctttga cgctggagtt cacgttcctc aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 2760 acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggatttttcc gatttcggcc 2820 tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 2880 acgtttataa tttcaggtgg catctttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 2940 tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 3000 caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 3060 ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 3120 gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caatagtggt 3180 aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 3240 ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 3300 atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 3360 gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 3420 gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 3480 atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 3540 aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gtaatggtaa caacgttgcg caaactatta 3600 actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 3660 aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 3720 tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 3780 ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 3840 agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 3900 tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 3960 aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 4020 gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 4080 atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 4140 gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 4200 gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 4260 tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 4320 accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 4380 ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 4440 cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 4500 agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 4560 ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 4620 tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 4680 ttttgctgcg gttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 4740 cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 4800 gagtcagtga gcgaggaagc ggaag 4825 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> peptide <400> 45 atggactccc agcagccaga tctg 24 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> peptide <400> 46 Met Asp Ser Gln Gln Pro Asp Leu 1 5 <210> 47 <211> 219 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Gal4 section <400> 47 aagctactgt cttctatcga acaagcatgc gatatttgcc gacttaaaaa gctcaagtgc 60 tccaaagaaa aaccgaagtg cgccaagtgt ctgaagaaca actgggagtg tcgctactct 120 cccaaaacca aaaggtctcc gctgactagg gcacatctga cagaagtgga atcaaggcta 180 gaaagactgg aacagctatt tctactgatt tttcctcga 219 <210> 48 <211> 73 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Gal4 DBD piece <400> 48 Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys 20 25 30 Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu 35 40 45 Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu 50 55 60 Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg 65 70 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> binding site <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n=t or c <400> 49 nggagtactg tcctccg 17 <210> 50 <211> 98 <212> DNA <213> artificial <220> <223> promoter <400> 50 cggagtactg tcctccgagt ttaaaagcgg agtactgtcc tccgaggata tcagcggagt 60 actgtcctcc gagtcgcgaa gcggagtact gtcctccg 98 <210> 51 <211> 130 <212> DNA <213> artificial <220> <223> promoter <400> 51 agcggagtac tgtcctccga gtggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgagt 60 cgagggtcga agcggagtac tgtcctccga gtggagtact gtcctccgag cggagtactg 120 tcctccgagt 130

Claims (103)

  1. 벡터가
    i) 치료 활성을 가진 치료 분자(TM)을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열의 삽입을 위한 클론화 부위, 및 ii) 상기 첫 번째 클론화 부위에 삽입될 때 상기 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 첫 번째 프로모터 및 첫 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 첫 번째 발현 카세트를 포함하고,
    상기 TM이 피험자의 세포에서 발현되며, 상기 TM 발현 또는 활성이 배향-의존적이고 조절인자 분자(RM)의 존재 하에서 조절되는 것인,
    적어도 상기 벡터를 포함하는 질병의 치료에서 사용하기 위한 조절 발현 체계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 i) 상기 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열의 삽입을 위한 두 번째 클론화 부위, 및 ii) 상기 두 번째 클론화 부위에 삽입될 때 상기 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 프로모터 및 두 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 두 번째 발현 카세트를 더욱 포함하고, 상기 RM이 상기 세포에서 발현되는 것인 조절 발현 체계.
  3. 제1항에 있어서, 상기 첫 번째 클론화 부위에 삽입된 상기 치료적 분자(TM)를 코드화하는 첫 번째 핵산 서열을 더욱 포함하는 조절 발현 체계.
  4. 제3항에 있어서, 상기 첫 번째 클론화 부위에 삽입된 상기 치료 분자(TM)를 코드화하는 첫 번째 핵산 서열, 및 상기 두 번째 클론화 부위에 삽입된 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열을 더욱 포함하는 조절 발현 체계.
  5. 벡터가
    A. i) 치료 활성을 가진 치료 분자(TM)을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열, 및 ii) 상기 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 첫 번째 프로모터 및 첫 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 첫 번째 발현 카세트
    (여기에서 상기 TM은 피험자의 세포에서 발현되고 상기 TM 발현 또는 활성은 용량-의존적이고 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 조절된다); 및
    B. i) 상기 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열, 및 ii) 상기 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 프로모터 및 두 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 두 번째 발현 카세트
    를 포함하는 것인, 적어도 상기 벡터를 포함하는 질병의 치료에서 사용하기 위한 조절 발현 체계.
  6. 벡터가
    A. i) 치료 활성을 가진 치료 분자(TM)을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열, 및 ii) 상기 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 첫 번째 프로모터 및 첫 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 첫 번째 발현 카세트
    (여기에서 상기 TM이 피험자의 세포에서 발현되고 상기 TM 발현 또는 활성은 용량-의존적이고 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 조절된다); 및
    B. i) 상기 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열, 및 ii) 상기 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 프로모터 및 두 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 두 번째 발현 카세트
    (여기에서 상기 RM이 상기 세포에서 발현되고 활성인자 분자(AM)의 존재 하에서 활성화되어 이에 의해 상기 TM 발현 또는 활성을 조절한다)
    를 포함하는 것인, 적어도 상기 벡터를 포함하는 질병의 치료에서 사용하기 위한 조절 발현 체계.
  7. 벡터가
    A. i) 치료 활성을 가진 치료 분자(TM)을 코드화하는 첫 번째 핵산 서열, 및 ii) 상기 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 첫 번째 프로모터 및 첫 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 첫 번째 발현 카세트
    (여기에서 상기 TM은 피험자의 세포에서 발현되고 상기 TM 발현 또는 활성은 용량-의존적이고 활성 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 유도된다); 및
    B. i) 상기 조절인자 분자(RM)를 코드화하는 두 번째 핵산 서열, 및 ii) 상기 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 프로모터 및 두 번째 폴리(A) 부위를 포함하는 두 번째 발현 카세트
    (여기에서 상기 RM은 상기 세포에서 발현되고 활성인자 분자(AM)의 존재 하 에서 활성화되며, 이에 의해 상기 TM 발현 또는 활성을 유도한다)
    를 포함하는 것인, 적어도 상기 벡터를 포함하는 질병의 치료에서 사용하기 위한 조절 발현 체계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조절 발현 체계가 상기 벡터로부터 별도로 투여된 활성인자 분자(AM)를 더욱 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  9. 제5항에 있어서, 상기 TM 발현 또는 활성이 상기 조절인자 분자(RM)의 존재 하에서 유도되는 것인 조절 발현 체계.
  10. 제5항에 있어서, 상기 TM 발현 또는 활성이 상기 조절인자 분자(RM)의 존재 하에서 억제되는 것인 조절 발현 체계.
  11. 제5항에 있어서, 상기 TM 발현 또는 활성이 상기 조절인자 분자(RM)의 존재 하에서 증가되는 것인 조절 발현 체계.
  12. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 활성화되고 이에 의해 상기 TM 발현 또는 활성을 조절하는 것인 조절 발현 체계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 활성인자 분자(AM)의 존재 하에 서 활성화되는 것인 조절 발현 체계.
  14. 제12항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 상기 RM에서의 형태 변화에 의해 활성화되는 것인 조절 발현 체계.
  15. 제12항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 상기 RM의 변형에 의해 활성화되는 것인 조절 발현 체계.
  16. 제13항에 있어서, 활성인자 분자(AM)를 더욱 포함하는 조절 발현 체계.
  17. 제16항에 있어서, 상기 활성인자 분자(AM)가 자연-발생 분자 또는 그의 변형체인 조절 발현 체계.
  18. 제16항에 있어서, 상기 활성인자 분자(AM)가 변형된 분자인 조절 발현 체계.
  19. 제16항에 있어서, 상기 활성인자 분자(AM)가 합성 분자인 조절 발현 체계.
  20. 제16항에 있어서, 상기 활성인자 분자(AM)가 화학 화합물인 조절 발현 체계.
  21. 제20항에 있어서, 상기 화학 화합물이 안티프로게스틴인 조절 발현 체계.
  22. 제21항에 있어서, 상기 안티프로게스틴이 미페프리스톤인 조절 발현 체계.
  23. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)의 발현이 구조적 또는 일시적인 것인 조절 발현 체계.
  24. 제23항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)의 발현이 구조적인 것인 조절 발현 체계.
  25. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)의 발현이 조절되는 것인 조절 발현 체계.
  26. 제25항에 있어서, 상기 두 번째 프로모터가 조절된 프로모터인 조절 발현 체계.
  27. 제5항에 있어서, 상기 두 번째 프로모터가 조직-특이적 프로모터인 조절 발현 체계.
  28. 제27항에 있어서, 상기 두 번째 프로모터가 근육-특이적 프로모터인 조절 발현 체계.
  29. 제28항에 있어서, 상기 두 번째 프로모터가 액틴 프로모터인 조절 발현 체계.
  30. 제9항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 상기 첫 번째 프로모터에 결합하고, 이에 의해 상기 TM 발현 또는 활성을 유도하는 것인 조절 발현 체계.
  31. 제9항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 활성화되고 이에 의해 상기 첫 번째 프로모터에 결합하고 상기 TM 발현 또는 활성을 유도하는 것인 조절 발현 체계.
  32. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 전이활성화(transactivation) 도메인을 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  33. 제32항에 있어서, 상기 전이활성화 도메인이 VP16 또는 p65 전이활성화 도메인인 조절 발현 체계.
  34. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 리간드-결합 도메인(LBD)을 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  35. 제34항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 리간드-결합 도메인(LBD)을 포함하고 상기 활성인자 분자(AM)가 상기 LBD에 결합하고 이에 의해 상기 RM을 활성화하는 것인 조절 발현 체계.
  36. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자가 DNA-결합 도메인(DBD)을 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  37. 제36항에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인(DBD)이 GAL-4 DBD를 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  38. 제5항에 있어서, 상기 두 번째 발현 카세트가 상기 두 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 두 번째 기능성 서열을 더욱 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  39. 제5항에 있어서, 상기 두 번째 폴리(A) 부위가 시미안 바이러스 40 (SV40) 폴리(A) 부위인 조절 발현 체계.
  40. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 자연-발생 분자 또는 그의 변형체인 조절 발현 체계.
  41. 제5항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 변형된 분자인 조절 발현 체계.
  42. 제41항에 있어서, 상기 조절인자 분자(RM)가 단백질인 조절 발현 체계.
  43. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 인간화 단백질인 조절 발현 체계.
  44. 제42항에 있어서, 상기 단백질이 인간 단백질 또는 그의 변형체인 조절 발현 체계.
  45. 제44항에 있어서, 상기 단백질이 전사 활성인자인 조절 발현 체계.
  46. 제45항에 있어서, 상기 전사 활성인자가 핵 스테로이드 수용체인 조절 발현 체계.
  47. 제45항에 있어서, 상기 전사 활성인자가 변형된 핵 스테로이드 수용체인 조절 발현 체계.
  48. 제47항에 있어서, 상기 변형된 핵 스테로이드 수용체가 변형된 프로게스테론 수용체인 조절 발현 체계.
  49. 제5항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)의 발현이 구조적 또는 일시적인 것인 조절 발현 체계.
  50. 제5항에 있어서, 상기 첫 번째 프로모터가 조절된 프로모터인 조절 발현 체계.
  51. 제5항에 있어서, 상기 첫 번째 프로모터가 유도성 프로모터인 조절 발현 체계.
  52. 제5항에 있어서, 상기 첫 번째 프로모터가 조직-특이적 프로모터인 조절 발현 체계.
  53. 제5항에 있어서, 상기 첫 번째 프로모터가 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 프로모터, 저산소증 반응성 요소(HRE) 프로모터, 내피세포 백혈구 유착 분자(ELAM) 프로모터, CMV/액틴 키메라 프로모터, 사이클린 A 프로모터 및 cdc6 프로모터로 구성된 프로모터의 군에서 선택되는 것인 조절 발현 체계.
  54. 제5항에 있어서, 상기 첫 번째 프로모터가 Pol II 프로모터인 조절 발현 체계.
  55. 제54항에 있어서, 상기 Pol II 프로모터가 E1B 프로모터인 조절 발현 체계.
  56. 제36항에 있어서, 상기 첫 번째 프로모터가 상기 조절인자 분자(RM)의 DNA-결합 도메인을 위한 결합 부위를 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  57. 제56항에 있어서, 상기 결합 부위가 적어도 하나의 GAL-4 결합 부위를 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  58. 제57항에 있어서, 상기 결합 부위가 상기 GAL-4 결합 부위의 다량체를 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  59. 제58항에 있어서, 상기 결합 부위가 3-18개의 GAL-4 결합 부위를 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  60. 제5항에 있어서, 상기 첫 번째 폴리(A) 부위가 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리(A) 부위인 조절 발현 체계.
  61. 제5항에 있어서, 상기 첫 번째 발현 카세트가 상기 첫 번째 핵산 서열에 작동적으로 연결된 첫 번째 기능성 서열을 더욱 포함하는 것인 조절 발현 체계.
  62. 제61항에 있어서, 상기 첫 번째 기능성 서열이 5' 비번역 영역 및/또는 인트 론을 코드화하는 것인 조절 발현 체계.
  63. 제62항에 있어서, 상기 첫 번째 기능성 서열이 UT12를 포함하는 5' 비번역 영역을 코드화하는 것인 조절 발현 체계.
  64. 제62항에 있어서, 상기 기능성 서열이 IVS8을 포함한 인트론을 코드화하는 것인 조절 발현 체계.
  65. 제5항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)가 자연-발생 분자의 변형체인 조절 발현 체계.
  66. 제5항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)가 변형된 분자인 조절 발현 체계.
  67. 제5항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)가 합성 또는 재조합 분자인 조절 발현 체계.
  68. 제5항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)가 단백질인 조절 발현 체계.
  69. 제68항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)가 인간 단백질 또는 그의 변형체인 조절 발현 체계.
  70. 제69항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)가 GMCSF, 류킨(R), IFN-α 및 IFN-β 또는 상기 단백질의 변형체로 구성된 단백질의 군에서 선택되는 것인 조절 발현 체계.
  71. 제70항에 있어서, 상기 치료 분자(TM)가 GMCSF인 조절 발현 체계.
  72. 제68항에 있어서, 상기 치료 단백질(TM)이 단클론성 항체인 조절 발현 체계.
  73. 제72항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 CAMPATH(R)인 조절 발현 체계.
  74. 제3항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터인 조절 발현 체계.
  75. 제74항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 pGT1, pGT2, pGT3, pGT4, pGT11, pGT12, pGT13 및 pGT14로 구성된 군에서 선택되는 것인 조절 발현 체계.
  76. 제5항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터인 조절 발현 체계.
  77. 제76항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 pGT23, pGT24, pGT25, pGT26, pGT27, pGT28, pGT29 및 pGT30으로 구성된 군에서 선택되는 것인 조절 발현 체계.
  78. 제3항에 있어서, 상기 벡터가 서틀 플라스미드인 조절 발현 체계.
  79. 제5항에 있어서, 상기 벡터가 서틀 플라스미드인 조절 발현 체계.
  80. 제79항에 있어서, 상기 서틀 플라스미드가 아데노-결합 바이러스성(AAV) 서틀 플라스미드인 조절 발현 체계.
  81. 제80항에 있어서, 상기 AAV가 AAV 혈청형 1 (AAV-1)인 조절 발현 체계.
  82. 제81항에 있어서, 상기 AAV-1 서틀 플라스미드가 pGT53, pGT54, pGT57, pGT58, pGT715 및 pGT716으로 구성된 AAV-1 벡터의 군으로부터 선택되는 것인 조절 발현 체계.
  83. 제13항에 있어서, 상기 활성인자 분자(AM)가 경구 투여되고, 이에 의해 상기 조절인자 분자(RM)을 활성화하는 것인 조절 발현 체계.
  84. 제5항에 있어서, 상기 벡터가 주사에 의해 투여되는 것인 조절 발현 체계.
  85. 제5항에 있어서, 상기 벡터가 생체내 또는 생체외에서 상기 세포를 상기 벡터와 접촉시킴으로써 투여되는 것인 조절 발현 체계.
  86. 제85항에 있어서, 상기 접촉이 생체내에서 주사에 의한 것인 조절 발현 체계.
  87. 제84항에 있어서, 상기 주사가 근육내 주사에 의한 것인 조절 발현 체계.
  88. 제87항에 있어서, 상기 주사가 골격근 세포의 근육내 주사에 의한 것인 조절 발현 체계.
  89. 제85항에 있어서, 상기 접촉이 생체외에서 전기천공(electroporation)에 의한 것인 조절 발현 체계.
  90. 벡터가 pGT1, pGT2, pGT3, pGT4, pGT11, pGT12, pGT13 또는 pGT14인, 조절 발현 체계에서 사용하기 위한 벡터.
  91. 벡터가 pGT23, pGT24, pGT25 또는 pGT26인, 조절 발현 체계에서 사용하기 위한 벡터.
  92. 벡터가 pGT27, pGT28, pGT29 또는 pGT30인, 조절 발현 체계에서 사용하기 위한 벡터.
  93. 벡터가 pGT53, pGT54, pGT57, pGT58, pGT715 및 pGT716인, 조절 발현 체계에서 사용하기 위한 벡터.
  94. 벡터가 pGT53인, 조절 발현 체계에서 사용하기 위한 벡터.
  95. 피험자의 세포를 발현 체계와 접촉시켜, TM이 상기 세포에서 발현되도록 하고 상기 세포에서 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 TM 발현 또는 활성을 조절하는 것을 포함하는, 제5항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 조절 발현 체계를 사용하여 피험자의 세포에서 치료 분자(TM)의 발현을 조절하기 위한 방법.
  96. 피험자의 세포를 발현 체계와 접촉시켜, TM이 상기 세포에서 발현되도록 하고 상기 세포에서 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 TM 발현 또는 활성을 조절하는 것을 포함하는, 제5항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 조절 발현 체계를 사용하여 피험자의 세포에 치료 분자(TM)를 투여하는 방법.
  97. 피험자의 세포를 발현 체계와 접촉시켜, TM이 상기 세포에서 발현되거나 활성화되도록 하고 상기 세포에서 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 TM 발현을 조절하 는 것을 포함하는, 제5항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 조절 발현 체계를 사용하여 피험자의 세포에 치료 분자(TM)를 전달하는 방법.
  98. 피험자의 세포를 발현 체계와 접촉시켜, TM이 상기 세포에서 발현되도록 하고 상기 세포에서 조절인자 분자(RM)의 존재하에서 TM 발현 또는 활성을 조절하는 것을 포함하는, 제5항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 조절 발현 체계를 사용하여 피험자의 세포에서 생체내 또는 생체외에서 치료 분자(TM)를 발현하는 방법.
  99. 제5항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 발현 체계를 포함하는 제약학적 조성물.
  100. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 제약학적 조성물.
  101. 키트가 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 조절 발현 체계를 포함하는 것인, 피험자의 세포에 치료 분자(TM)를 전달하기 위한 키트.
  102. 키트가 제90항에 따른 적어도 하나의 벡터를 포함하는 것인, 피험자의 세포에 치료 분자(TM)를 전달하기 위한 키트.
  103. 키트가 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 벡터를 포 함하는 것인, 피험자의 세포에 치료 분자(TM)를 전달하기 위한 키트.
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