KR20240004253A - 오토펄린 듀얼 벡터 시스템을 사용한 감각신경성 난청을 치료하기 위한 방법 - Google Patents

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닝 팬
아룬 세나파티
조나단 휘튼
시춘 장
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데시벨 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 오토펄린(OTOF) 내의 이대립유전자 돌연변이를 갖는 25세 이상의 대상체를 OTOF 유전자 요법(gene therapy)의 방법으로 치료하기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본 개시내용은 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함하는 다양한 조성물을 제공한다. 이들 벡터는 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 대상체의 난청 또는 청각 신경병증을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

오토펄린 듀얼 벡터 시스템을 사용한 감각신경성 난청을 치료하기 위한 방법
서열목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 이로써 그 전문이 참조로 편입되는 서열 목록을 함유한다. 2022년 2월 18일에 생성된 ASCII 사본(copy)은 51471-008WO2_Sequence_Listing_2_17_22_ST25로 명명되고, 크기가 366,491 바이트이다.
기술분야
오토펄린(OTOF) 유전자 요법(gene therapy)의 방법으로, 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss) 및 청각 신경병증, 특히 25세 이상의 인간 대상체에서 오토펄린(OTOF) 내의 돌연변이와 연관된 질환의 형태를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 기재된다. 본 개시내용은 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함하는 듀얼 벡터 시스템을 제공한다. 이들 벡터는 야생형 OTOF의 발현을 증가시키거나 대상체, 예컨대 감각신경성 난청을 앓고 있는 인간 대상체에 야생형 OTOF를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
감각신경성 난청은 내이(inner ear)의 세포 또는 내이로부터 뇌로 투사하는 신경 경로 내의 결손에 의해 야기되는 난청의 한 유형이다. 감각신경성 난청이 종종 후천적이고, 소음, 감염, 두부 외상, 내이 신경 독성 약물, 또는 노화에 의해 야기될 수 있지만, 또한 상염색체 열성 돌연변이(autosomal recessive mutation)와 연관된 선천적인 형태의 감각신경성 난청 또한 존재한다. 이러한 상염색체 열성 감각신경성 난청의 하나의 형태는 오토펄린(OTOF) 유전자의 돌연변이와 연관되어 있는데, 이는 언어습득기전 비증후군성 난청과 관련이 있다. 최근 몇 년 동안, 난청을 치료하려는 노력은 가능한 해결책으로서 유전자 요법에 점점 더 초점을 맞춰왔다; 그러나, OTOF는 표준 유전자 요법 접근법을 사용한 치료를 허용하기엔 너무 크다. OTOF-관련 감각신경성 난청을 치료하기 위한 새로운 치료법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 난청 및 청각 신경병증을 유발하는 것으로 알려진 이대립유전자 오토펄린(OTOF) 돌연변이를 갖는 25세 이상의 인간 대상을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 조성물은 유전자 요법을 통해 대상체에게 야생형(WT) OTOF를 전달하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 대상체의 난청 및 청각 신경병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 치료하기 위한 유전자 요법은 청각을 회복하기 위해 생후 첫 해 동안 필요한 것으로 생각되지만; 본 발명자들은 유전자 요법이 이대립유전자 OTOF 돌연변이로 인해 상실된 청각을 훨씬 나중에 치료를 시작하더라도 회복시킬 수 있음을 결정하였다. 본원에 기재된 조성물은 또한 검출가능한 이음향방사, 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉(cochlear microphonics) 및/또는 검출가능한 가중전위(Summating Potential)를 갖는 것으로 식별된 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 이대립유전자 오토펄린(OTOF) 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치된 폴리아데닐화(poly(A)) 서열을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함하는 치료적으로 유효량의 듀얼 벡터 시스템을 대상체에게 투여함으로써 OTOF 돌연변이를 갖는 25세 이상의 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공하며; 여기서 제1 및 제2 핵산 벡터 중 어느 것도 전장 OTOF 단백질을 인코딩하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이대립유전자 오토펄린(OTOF) 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치된 폴리아데닐화(poly(A)) 서열을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함하는 치료적으로 유효량의 듀얼 벡터 시스템을 대상체에게 투여함으로써 OTOF 돌연변이를 갖고 검출가능한 이음향방사, 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉 및/또는 검출가능한 가중전위를 갖는 것으로 식별된 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공하며; 여기서 제1 및 제2 핵산 벡터 중 어느 것도 전장 OTOF 단백질을 인코딩하지 않는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 중첩되지 않는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치된 스플라이스 공여자(splice donor) 신호 서열을 포함하고, 제2 핵산 벡터는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치된 스플라이스 수여자(splice acceptor) 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 스플라이스 공여자 신호 서열의 3'에 위치된 제1 재조합유전성 영역을 포함하고, 제2 핵산 벡터는 스플라이스 수여자 신호 서열의 5'에 위치된 제2 재조합유전성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 재조합유전성 영역은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 재조합유전성 영역은 AP 유전자 단편(fragment) 또는 F1 파지 AK 유전자이다. 일부 구현예에서, F1 파지 AK 유전자는 서열번호 19의 서열을 포함하거나 갖는다. 일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 서열번호 62-67 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 갖는다. 일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 서열번호 65의 서열을 포함하거나 갖는다. 일부 구현예에서, 스플라이스 공여자 서열은 서열번호 20 또는 서열번호 68의 서열을 포함하거나 갖는다. 일부 구현예에서, 스플라이스 수여자 서열은 서열번호 21 또는 서열번호 69의 서열을 포함하거나 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 재조합유전성 영역의 3'에 위치된 분해 신호 서열을 추가로 포함하고, 제2 핵산 벡터는 재조합유전성 영역과 스플라이스 수여자 신호 서열 사이에 위치된 분해 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 분해 신호 서열은 서열번호 22의 서열을 포함하거나 갖는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 엑손 경계(exon boundary)에서 분할된다. 일부 구현예에서, OTOF 엑손 경계는 C2 도메인을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 부분 내에 있지 않다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드와 부분적으로 중첩된다. 일부 구현예에서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 1 킬로베이스(kb)만큼 중첩된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드 사이의 중첩 영역은 OTOF 엑손 경계의 중심에 있다. 일부 구현예에서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하고 중첩 영역의 중심에 있는 엑손 경계의 500 bp 3'까지 OTOF N-말단을 포함하고; 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하고 중첩 영역의 중심에 있는 엑손 경계의 500 bp 5’를 OTOF C-말단까지 포함한다. 일부 구현예에서, 중첩 영역의 중심에 있는 OTOF 엑손 경계는 C2 도메인을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 부분 내에 있지 않다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 엑손 경계는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2C 도메인을 인코딩하고 제2 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2D 도메인을 인코딩하도록 선택된다. 일부 구현예에서, OTOF 엑손 경계는 엑손 19/20 경계, 엑손 20/21 경계, 또는 엑손 21/22 경계이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 엑손 경계는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2D 도메인을 인코딩하고 제2 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2E 도메인을 인코딩하도록 선택된다. 일부 구현예에서, OTOF 엑손 경계는 엑손 26/27 경계 또는 엑손 28/29 경계이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 엑손 경계는 C2D 도메인을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 부분 내에 있다. 일부 구현예에서, OTOF 엑손 경계는 엑손 24/25 경계 또는 엑손 25/26 경계이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 각각의 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질 서열의 약 반절을 인코딩한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 OTOF 비번역 영역(UTR)을 포함하지 않는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 OTOF 5' UTR을 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 OTOF 3' UTR을 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질을 인코딩하는 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 인트론(intron)을 포함하지 않는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질을 인코딩하는 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유하지 않는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 포유류 OTOF 단백질이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 뮤린 OTOF 단백질이다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 뮤린 OTOF 단백질은 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 9의 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 6의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 인간 OTOF 단백질이다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 인간 OTOF 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 1의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 3의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 4의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 5의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 인간 OTOF 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 서열 또는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질 변이체에서 10% 이하(10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하)의 아미노산이 보존적 아미노산 치환이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 10-14 중 어느 하나에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 10에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 14에 의해 인코딩된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질은 서열번호 15-18 중 어느 하나에 의해 인코딩된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 1-802번 아미노산을 인코딩하고, 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 803-1997번 아미노산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 1-802번 아미노산을 인코딩하고, 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 803-1997번 아미노산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 1-802번 아미노산을 인코딩하고, 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 803-1997번 아미노산을 인코딩한다.
전술한 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, OTOF 단백질의 N-말단 부분은 서열번호 73의 서열 또는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체로 이루어진다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질 변이체의 N-말단 부분에 있는 10% 이하(10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하)의 아미노산이 보존적 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질의 N-말단 부분은 서열번호 73의 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질의 N-말단 부분은 서열번호 71의 서열에 의해 인코딩된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, OTOF 단백질의 C-말단 부분은 서열번호 74의 서열 또는 하나 이상(예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체로 이루어진다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질 변이체의 C-말단 부분에 있는 아미노산의 10% 이하(10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하)의 아미노산이 보존적 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질의 C-말단 부분은 서열번호 74의 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, OTOF 단백질의 C-말단 부분은 서열번호 72의 서열에 의해 인코딩된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드의 5' 및 프로모터의 3'에 위치된 코작(Kozak) 서열을 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 프로모터는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 치킨 β-액틴 프로모터, 절단된 CMV-치킨 β-액틴 프로모터(smCBA), CB7 프로모터, 하이브리드 CMV 인핸서/인간 β-액틴 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, 신장 인자-1α(EF1α) 프로모터, 또는 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유비쿼터스 프로모터는 smCBA 프로모터이다. 일부 구현예에서, smCBA 프로모터는 서열번호 70의 서열을 갖는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 마이오신 15(Myo15) 프로모터, 마이오신 7A(Myo7A) 프로모터, 마이오신 6(Myo6) 프로모터, POU 클래스 4 호메오박스 3(POU4F3) 프로모터, 아토날(atonal) BHLH 전사 인자 1(ATOH1) 프로모터, LIM 호메오박스 3(LHX3) 프로모터, α9 아세틸콜린 수용체(α9AChR) 프로모터, 또는 α10 아세틸콜린 수용체(α10AChR) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 Myo15 프로모터이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 프로모터는 내유모세-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 내유모세포-특이적 프로모터는 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 프로모터, 소포성 글루타메이트 수송체 3(VGLUT3) 프로모터, OTOF 프로모터, 또는 칼슘 결합 단백질 2(CABP2) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 내유모세포-특이적 프로모터는 CABP2 프로모터이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 프로모터는 짧은 프로모터이다(예를 들어, 1 kb 이하, 예를 들어 대략 1 kb, 950 bp, 900 bp, 850 bp, 800 bp, 750 bp, 700 bp, 650 bp, 600 bp, 550 bp 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp 이하인 프로모터). 일부 구현예에서, 짧은 프로모터는 CAG 프로모터이다. 일부 구현예에서, 짧은 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 구현예에서, 짧은 프로모터는 smCBA 프로모터이다. 일부 구현예에서, 짧은 프로모터는 1kb 이하인 Myo15 프로모터이다(예를 들어, 서열번호 38, 39, 또는 49-60 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 서열을 갖는 Myo15 프로모터).
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 프로모터는 긴 프로모터이다(예를 들어, 1 kb 초과, 예를 들어 1.1 kb, 1.25 kb, 1.5 kb, 1.75 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb 이상인 프로모터). 일부 구현예에서, 긴 프로모터는 1 kb 초과인 Myo15 프로모터이다(예를 들어, 서열번호 36의 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성)을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 Myo15 프로모터).
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 표 4에 나열된 한 쌍의 핵산 벡터이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 75의 2272번 내지 6041번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 75의 2049번 내지 6264번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 77의 182번 내지 3949번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 77의 19번 내지 4115번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 79의 2267번 내지 6014번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 79의 2049번 내지 6237번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 80의 177번 내지 3924번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 80의 19번 내지 4090번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 76의 2267번 내지 6476번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 76의 2049번 내지 6693번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 78의 187번 내지 4396번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 78의 19번 내지 4589번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 81의 235번 내지 4004번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 81의 12번 내지 4227번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 83의 230번 내지 3977번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 83의 12번 내지 4200번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 72의 229번 내지 4438번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 82의 12번 내지 4655번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 핵산 서열의 각 말단에 역 말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 프로모터의 제1 역 말단 반복부(ITR) 서열 5' 및 재조합유전성 영역의 제2 ITR 서열 3'을 포함하고; 제2 벡터는 재조합유전성 영역의 제1 ITR 서열 5' 및 poly(A) 서열의 제2 ITR 서열 3'을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터 내의 ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터 내의 ITR은 AAV2 ITR에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, poly(A) 서열은 소 성장 호르몬(bGH) poly(A) 신호 서열이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제2 핵산 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element; WPRE)를 포함한다. 일부 구현예에서, WPRE는 서열번호 23 또는 서열번호 61의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 핵산 벡터는 중첩 듀얼 벡터이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 핵산 벡터는 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 핵산 벡터는 듀얼 하이브리드 벡터이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 핵산 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV2quad(Y-F), AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, rh10, rh39, rh43, rh74, Anc80, Anc80L65, DJ/8, DJ/9, 7m8, PHP.B, PHP.eb 또는 PHP.S 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV6 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 Anc80 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 Anc80L65 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 DJ/9 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 7m8 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2quad(Y-F) 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 PHP.B 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV8 캡시드를 갖는다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 동일한 캡시드를 갖는다(예를 들어, 제1 및 제2 핵산 벡터 둘 모두는 AAV1 캡시드 또는 AAV9 캡시드를 갖는 AAV 벡터임). 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 상이한 캡시드를 갖는다(예를 들어, 제1 핵산 벡터는 AAV1 캡시드를 갖는 AAV이고, 제2 핵산 벡터는 AAV9 캡시드를 갖는 AAV임).
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 30세 이상이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 35세 이상이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 40세 이상이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 45세 이상이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 50세 이하이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 것으로 식별되었다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체가 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 것으로 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 검출가능한 이음향방사를 갖는 것으로 식별된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체가 검출가능한 이음향방사를 갖는 것으로 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉을 갖는 것으로 식별된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체가 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉을 갖는 것으로 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 검출가능한 가중전위를 갖는 것으로 식별된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체가 검출가능한 가중전위를 갖는 것으로 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체의 청각을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 대상체는 청각장애, 상염색체 열성 9(Deafness, Autosomal Recessive 9; DFNB9)를 갖거나 갖는 것으로 식별된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체의 청각을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템은 중이 또는 내이에 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템은 정원창막(round window membrane)을 통한 주사, 반고리관 내로의 주사, 반고리관 절개술(canalostomy), 정원창막을 통한 카테터 삽입, 고실내 주사(transtympanic injection), 또는 고막내 주사(intratympanic injection)에 의해 투여된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여한 후 대상체의 청각을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 방법은 달팽이관 유모세포에서 OTOF 발현을 증가시킨다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 달팽이관 유모세포는 내유모세포이다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템은 세포(예를 들어, 달팽이관 유모세포)에서 OTOF 발현을 증가시키거나, (예를 들어, 표준 시험, 예컨대 청력 검사, 청성 뇌간 반응(ABR), 전기와우도검사(ECOG), 및 이음향방사에 의해 평가된 바와 같이) 청각을 개선하거나, 난청을 예방 또는 감소시키거나, 난청의 발병을 지연시키거나, 난청의 진행을 느리게 하거나, 어음명료도를 개선하거나, 유모세포 기능을 개선한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템은 달팽이관 유모세포에서 OTOF의 발현을 증가시키거나, 난청을 예방 또는 감소시키거나, 난청의 발병을 지연시키거나, 난청의 진행을 느리게 하거나, (예를 들어, 표준 시험, 예컨대 청력 검사, ABR, ECOG, 및 이음향방사에 의해 평가된 바와 같이) 청각을 개선하거나, 어음명료도를 개선하거나, 유모세포 기능을 개선하기에 충분한 양으로 투여된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 동시에 투여된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 순차적으로 투여된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 1 x 107 벡터 게놈(genome)(VG)/귀 내지 약 2 x 1015 Vg/귀(예를 들어, 1 x 107 VG/귀, 2 x 107 VG/귀, 3 x 107 VG/귀, 4 x 107 VG/귀, 5 x 107 VG/귀, 6 x 107 VG/귀, 7 x 107 VG/귀, 8 x 107 VG/귀, 9 x 107 VG/귀, 1 x 108 VG/귀, 2 x 108 VG/귀, 3 x 108 VG/귀, 4 x 108 VG/귀, 5 x 108 VG/귀, 6 x 108 VG/귀, 7 x 108 VG/귀, 8 x 108 VG/귀, 9 x 108 VG/귀, 1 x 109 VG/귀, 2 x 109 VG/귀, 3 x 109 VG/귀, 4 x 109 VG/귀, 5 x 109 VG/귀, 6 x 109 VG/귀, 7 x 109 VG/귀, 8 x 109 VG/귀, 9 x 109 VG/귀, 1 x 1010 VG/귀, 2 x 1010 VG/귀, 3 x 1010 VG/귀, 4 x 1010 VG/귀, 5 x 1010 VG/귀, 6 x 1010 VG/귀, 7 x 1010 VG/귀, 8 x 1010 VG/귀, 9 x 1010 VG/귀, 1 x 1011 VG/귀, 2 x 1011 VG/귀, 3 x 1011 VG/귀, 4 x 1011 VG/귀, 5 x 1011 VG/귀, 6 x 1011 VG/귀, 7 x 1011 VG/귀, 8 x 1011 VG/귀, 9 x 1011 VG/귀, 1 x 1012 VG/귀, 2 x 1012 VG/귀, 3 x 1012 VG/귀, 4 x 1012 VG/귀, 5 x 1012 VG/귀, 6 x 1012 VG/귀, 7 x 1012 VG/귀, 8 x 1012 VG/귀, 9 x 1012 VG/귀, 1 x 1013 VG/귀, 2 x 1013 VG/귀, 3 x 1013 VG/귀, 4 x 1013 VG/귀, 5 x 1013 VG/귀, 6 x 1013 VG/귀, 7 x 1013 VG/귀, 8 x 1013 VG/귀, 9 x 1013 VG/귀, 1 x 1014 VG/귀, 2 x 1014 VG/귀, 3 x 1014 VG/귀, 4 x 1014 VG/귀, 5 x 1014 VG/귀, 6 x 1014 VG/귀, 7 x 1014 VG/귀, 8 x 1014 VG/귀, 9 x 1014 VG/귀, 1 x 1015 VG/귀, 또는 2 x 1015 Vg/귀)의 농도로 투여된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 제1 벡터 및 제2 벡터 둘 모두를 사용하여 적어도 20%의 대상체의 내유모세포를 형질도입하기에 충분한 양으로 함께 투여된다(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 대상체의 내유모세포가 벡터 둘 모두를 사용하여 형질도입됨).
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 듀얼 벡터는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로 투여된다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 임의로 제1 영역 및 제2 영역 사이에 1개 내지 100개의 뉴클레오티드(예를 들어, 1-5개, 1-10개, 1-15개, 1-20개, 1-25개, 1-30개, 1-35개, 1-40개, 1-45개, 1-50개, 1-60개, 1-70개, 1-80개, 1-90개, 10-20개, 10-30개, 10-40개, 10-50개, 10-60개, 10-70개, 10-80개, 10-90개, 10-100개, 20-30개, 20-40개, 20-50개, 20-60개, 20-70개, 20-80개, 20-90개, 또는 20-100개의 뉴클레오티드)를 포함하는 링커(linker)를 함유하는, 서열번호 31 및/또는 서열번호 32의 서열을 포함하는 서열번호 25에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제2 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체에 작동가능하게 연결된 서열번호 26 및/또는 서열번호 27의 서열을 포함하는 서열번호 24에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제1 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 영역은 서열번호 24의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 영역은 서열번호 25의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 36에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 36의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 38에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 38의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 39에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 39의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 53에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 53의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 54에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 54의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 59에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 59의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 60에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 60의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 임의로 제1 영역 및 제2 영역 사이에 1개 내지 100개의 뉴클레오티드(예를 들어, 1-5개, 1-10개, 1-15개, 1-20개, 1-25개, 1-30개, 1-35개, 1-40개, 1-45개, 1-50개, 1-60개, 1-70개, 1-80개, 1-90개, 10-20개, 10-30개, 10-40개, 10-50개, 10-60개, 10-70개, 10-80개, 10-90개, 10-100개, 20-30개, 20-40개, 20-50개, 20-60개, 20-70개, 20-80개, 20-90개, 또는 20-100개의 뉴클레오티드)를 포함하는 링커를 함유하는, 서열번호 26 및/또는 서열번호 27의 서열을 포함하는 서열번호 24에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제2 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체에 작동가능하게 연결된 서열번호 31 및/또는 서열번호 32의 서열을 포함하는 서열번호 25에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제1 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 영역은 서열번호 25의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 영역은 서열번호 24의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 37에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 37의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 58에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 26 및/또는 서열번호 27의 서열을 포함하는 서열번호 24에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 영역은 서열번호 24의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 31 및/또는 서열번호 32의 서열을 포함하는 서열번호 25에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 영역은 서열번호 25의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 24의 기능적 부분은 서열번호 26의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 24의 기능적 부분은 서열번호 27의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 24의 기능적 부분은 서열번호 26의 서열 및 서열번호 27의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 24의 기능적 부분은 서열번호 28의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 24의 기능적 부분은 서열번호 29의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 24의 기능적 부분은 서열번호 30의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 24의 기능적 부분은 서열번호 50의 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 31의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 32의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 51의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 51의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 31의 서열 및 서열번호 32의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 33의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 34의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 35의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분은 서열번호 55의 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 50-58 중 어느 하나의 핵산 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 50의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 51의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 52의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 53의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 54의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 55의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 56의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 57의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 임의로 제1 영역 및 제2 영역 사이에 1개 내지 400개의 뉴클레오티드(예를 들어, 1-5개, 1-10개, 1-15개, 1-20개, 1-25개, 1-30개, 1-35개, 1-40개, 1-45개, 1-50개, 1-60개, 1-70개, 1-80개, 1-90개, 1-100개, 1-125개, 1-150개, 1-175개, 1-200개, 1-225개, 1-250개, 1-275개, 1-300개, 1-325개, 1-350개, 1-375개, 1-400개, 10-20개, 10-30개, 10-40개, 10-50개, 10-60개, 10-70개, 10-80개, 10-90개, 10-100개, 20-30개, 20-40개, 20-50개, 20-60개, 20-70개, 20-80개, 20-90개, 20-100개, 30-100개, 40-100개, 50-100개, 50-150개, 50-200개, 50-250개, 50-300개, 50-350개, 50-400개, 100-150개, 100-200개, 100-250개, 100-300개, 100-350개, 100-400개, 150-200개, 150-250개, 150-300개, 150-350개, 150-400개, 200-250개, 200-300개, 200-350개, 200-400개, 250-300개, 250-350개, 250-400개, 300-400개, 또는 350-400개의 뉴클레오티드)를 포함하는 링커를 함유하는, 서열번호 43 및/또는 서열번호 44의 서열을 포함하는 서열번호 41에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제2 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체에 이어진(예를 들어, 작동가능하게 연결된), 서열번호 42의 서열을 포함하는 서열번호 40에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제1 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 영역은 서열번호 40의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 영역은 서열번호 41의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 48에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 49에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 임의로 제1 영역 및 제2 영역 사이에 1개 내지 400개의 뉴클레오티드(예를 들어, 1-5개, 1-10개, 1-15개, 1-20개, 1-25개, 1-30개, 1-35개, 1-40개, 1-45개, 1-50개, 1-60개, 1-70개, 1-80개, 1-90개, 1-100개, 1-125개, 1-150개, 1-175개, 1-200개, 1-225개, 1-250개, 1-275개, 1-300개, 1-325개, 1-350개, 1-375개, 1-400개, 10-20개, 10-30개, 10-40개, 10-50개, 10-60개, 10-70개, 10-80개, 10-90개, 10-100개, 20-30개, 20-40개, 20-50개, 20-60개, 20-70개, 20-80개, 20-90개, 20-100개, 30-100개, 40-100개, 50-100개, 50-150개, 50-200개, 50-250개, 50-300개, 50-350개, 50-400개, 100-150개, 100-200개, 100-250개, 100-300개, 100-350개, 100-400개, 150-200개, 150-250개, 150-300개, 150-350개, 150-400개, 200-250개, 200-300개, 200-350개, 200-400개, 250-300개, 250-350개, 250-400개, 300-400개, 또는 350-400개의 뉴클레오티드)를 포함하는 링커를 함유하는, 서열번호 42의 서열을 포함하는 서열번호 40에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제2 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체에 이어진(예를 들어, 작동가능하게 연결된), 서열번호 43 및/또는 서열번호 44의 서열을 포함하는 서열번호 41에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 제1 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 영역은 서열번호 41의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 영역은 서열번호 40의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 42의 서열을 포함하는 서열번호 40에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 영역은 서열번호 40의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 서열번호 43 및/또는 서열번호 44의 서열을 포함하는 서열번호 41에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 영역은 서열번호 41의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 40의 기능적 부분은 서열번호 42의 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 43의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 44의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 43의 서열 및 서열번호 44의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 45의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 46의 서열을 함유한다. 전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 47의 서열을 함유한다.
전술한 양태 중 임의의 일부 구현예에서, Myo15 프로모터는 전이유전자(transgene)에 작동가능하게 연결되고 유모세포에 도입될 때 전이유전자 발현을 유도한다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 기재되는 값의 10% 위 또는 아래 이내인 값을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "투여"는 임의의 효과적인 경로에 의해, 대상체에게 치료제(예를 들어, 오토펄린 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 오토펄린 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제2 핵산 벡터를 함유하는 조성물)를 제공하거나 주는 것을 지칭한다. 예시적인 투여 경로는 본원에서 하기에 기재된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이대립유전자 OTOF 돌연변이"는 OTOF 유전자의 대립유전자(사본) 둘 모두에 돌연변이가 존재하는 병태를 지칭한다. 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 대상체는 동일한 돌연변이를 운반하는 두 개의 OTOF 대립유전자를 가질 수 있거나 각 대립유전자에 대해 상이한 돌연변이를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "내이에 투여하는"은 내이 세포의 형질도입을 허용하는 임의의 경로에 의해 대상체에게 본원에 기재된 치료제를 제공하거나(providing) 제공하는 것(giving)을 지칭한다. 내이에 대한 예시적인 투여 경로는 난원창, 정원창 또는 반고리관(예를 들어, 수평반고리관(horizontal canal))에 대한 또는 이를 통한 외림프 또는 내림프 내로의 투여, 또는 고실내 또는 고막내 주사, 예를 들어 유모세포로의 투여를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 유형"은 유전자 발현 데이터에 기반하여 통계적으로 분리가능한 표현형을 공유하는 세포의 그룹을 지칭한다. 예를 들어, 공통 세포 유형의 세포는 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징, 예컨대 유사한 유전자 활성화 패턴 및 항원 제시 프로파일을 공유할 수 있다. 공통 세포 유형의 세포는 공통 조직(예를 들어, 상피 조직, 신경 조직, 결합 조직, 또는 근육 조직)으로부터 단리된 것들 및/또는 공통 기관, 조직계, 혈관, 또는 유기체 내의 다른 구조 및/또는 영역으로부터 단리되는 것들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "달팽이관 유모세포"는 소리를 감지하는 데에 수반되는 내이에서의 특화된 세포의 그룹을 지칭한다. 2가지 유형의 달팽이관 유모세포가 있다: 내유모세포 및 외유모세포. 달팽이관 유모세포의 손상 및 달팽이관 유모세포 기능을 방해하는 유전적 돌연변이는 난청 및 청각장애와 관련되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 돌연변이", "보존적 치환", 및 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 물리화학적 특성, 예컨대 극성, 정전하, 및 입체 부피를 나타내는 하나 이상의 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 지칭한다. 이러한 특성은 하기 표 1에서 20개의 자연-발생적 아미노산 각각에 대해 요약되어 있다.
표 1: 자연-발생적 아미노산의 대표적인 물리화학적 특성
이 표로부터, 보존적 아미노산 패밀리(family)는 (i) G, A, V, L 및 I; (ii) D 및 E; (iii) C, S 및 T; (iv) H, K 및 R; (v) N 및 Q; 및 (vi) F, Y 및 W를 포함한다는 사실이 이해된다. 그러므로, 보존적 돌연변이 또는 치환은 동일한 아미노산 패밀리의 구성원을 하나의 아미노산으로 치환(예를 들어, Thr에 대해 Ser 또는 Arg에 대해 Lys의 치환)하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분해 신호 서열"은 그것이 함유된 폴리펩티드의 분해를 매개하는 서열(예를 들어, 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열)을 지칭한다. 재조합 및/또는 스플라이싱을 거치지 않은 오토펄린 단백질 부분의 발현을 감소 또는 예방하기 위해 분해 신호 서열이 본 발명의 핵산 벡터에 포함될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 분해 신호 서열은 GCCTGCAAGAACTGGTTCAGCAGCCTGAGCCACTTCGTGATCCACCTG(서열번호 22)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 본원에 기재된 조성물, 벡터 작제물, 또는 바이러스성 벡터의 "유효량", "치료적으로 유효량", 및 "충분한 양"은, 임상 결과를 포함하여, 포유류, 예를 들어 인간을 포함하는, 이의 투여가 필요한 대상체에 투여될 때, 유익하거나 목적하는 결과를 나타내기에 충분한 양을 지칭하며, 그에 따라 "유효량" 또는 이에 대한 동의어는 이것이 적용되는 상황에 따라 달라진다. 예를 들어, 감각신경성 난청을 치료하는 맥락에서, 이것은 조성물, 벡터 작제물, 또는 바이러스성 벡터의 투여 없이 수득되는 반응과 비교하여 치료 반응을 달성하기에 충분한 조성물, 벡터 작제물, 또는 바이러스성 벡터의 양이다. 이러한 양에 상응할 본원에 기재된 주어진 조성물의 양은 다양한 인자, 예컨대 주어진 제제(agent), 약제학적 제형(formulation), 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 대상체의 신원(예를 들어, 연령, 성별, 체중) 또는 치료될 숙주 등에 따라 달라질 것이지만, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 개시내용의 조성물, 벡터 작제물, 또는 바이러스성 벡터의 "치료적으로 유효량"은 대조군과 비교하여 대상체에서 유익하거나 목적하는 결과를 초래하는 양이다. 활성 성분의 조합이 투여될 때, 조합의 유효량은 개별적으로 투여될 때 효과적이었을 각각의 성분의 양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다는 사실에 주의한다. 본원에서 정의되는 바와 같이, 본 개시내용의 조성물, 벡터 작제물, 바이러스성 벡터 또는 세포의 치료적으로 유효량은 당업계에 공지된 일상적인 방법에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투약 양생법(dosage regime)은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성"은 특정한 유기체(예를 들어, 인간)에서 또는 유기체 내의 특정한 장소(예를 들어, 기관, 조직, 또는 세포, 예컨대 인간 세포, 예를 들어, 인간 달팽이관 유모세포)에서 자연적으로 발견되는 분자(예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 또는 공동인자)를 기재한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현하다"는 다음의 사건 중 어느 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산(예를 들어, 전사에 의해); (2) RNA 전사체의 처리(예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 처리에 의해); (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 특정한 유기체(예를 들어, 인간)에서 또는 유기체 내의 특정한 장소(예를 들어, 기관, 조직, 또는 세포, 예컨대 인간 세포, 예를 들어, 인간 달팽이관 유모세포)에서 자연적으로 발견되지 않는 분자(예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 또는 공동인자)를 기재한다. 외인성 재료는 외부성 공급원으로부터 유기체 또는 이들로부터 추출된 배양물에 제공되는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유모세포-특이적 발현"은 내이의 다른 세포 유형(예를 들어, 나선상 신경절 신경, 교세포, 또는 다른 내이 세포 유형)과 비교하여 주로 유모세포(예를 들어, 달팽이관 유모세포) 내에서의 RNA 전사 또는 폴리펩티드의 생산을 지칭한다. 전이유전자의 유모세포-특이적 발현은 임의의 표준 기술(예를 들어, 정량적 RT PCR, 면역화학염색, 웨스턴 블롯 분석, 또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터(예를 들어, GFP)의 형광의 측정)을 사용하여 내이의 다양한 세포 유형 사이에서(예를 들어, 유모세포 대 비-유모세포) 전이유전자 발현(예를 들어, RNA 또는 단백질 발현)을 비교함으로써 확인될 수 있다. 유모세포-특이적 프로모터는 적어도 3가지(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지 이상)의 다음의 내이 세포 유형: 경계 세포(Border cell), 내지상 세포(inner phalangeal cell), 내주 세포(inner pillar cell), 외주 세포, 제1열 다이테르 세포(first row Deiter cell), 제2열 다이테르 세포, 제3열 다이테르 세포, 헨센 세포(Hensen's cell), 클라우디우스 세포(Claudius cell), 내고랑 세포(inner sulcus cell), 외고랑 세포, 나선융기 세포(spiral prominence cell), 근부 세포, 치간 세포, 혈관줄무늬(stria vascularis)의 기저 세포, 혈관줄무늬의 중간 세포, 혈관 줄무의의 변연 세포, 나선신경절 뉴런, 슈반 세포와 비교해 유모세포(예를 들어, 달팽이관 유모세포)에서 적어도 50% 초과(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200% 초과)인, 작동가능하게 연결된 전이유전자의 발현(예를 들어, RNA 또는 단백질 발현)을 유도한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증가하는" 및 "감소하는"은, 각각, 더 많거나 더 적은 양의 참조에 대한 미터단위(metric)의 기능, 발현, 또는 활성을 초래하는 조절을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에서 조성물의 투여 다음에, 본원에 기재된 바와 같은 미터단위의 마커(예를 들어, OTOF 발현 또는 청성 뇌간 반응)의 양은 대상체에서 투여에 앞선 마커의 양에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 증가되거나 감소될 수 있다. 일반적으로, 미터단위는 투여가 인용된 효과를 가졌던 시점, 예를 들어, 치료 양생법이 시작된 후 적어도 1주, 1개월, 3개월, 또는 6개월에 투여 다음에 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인트론"은 상응하는 단백질의 아미노산 서열로 번역되지 않는 뉴클레오티드 서열인, 유전자의 코딩 영역 내의 영역을 지칭한다. 용어 인트론은 또한 유전자로부터 전사된 RNA의 상응하는 영역을 지칭한다. 인트론은 pre-mRNA로 전사되지만, 처리과정 동안 제거되며, 성숙 mRNA 내에 포함되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "국소적으로" 또는 "국소 투여"는 전신 효과가 아닌 국소 효과를 위해 의도된 신체의 특정한 부위에서의 투여를 의미한다. 국소 투여의 예는 경피내, 흡입, 관절내, 척수강내, 질내, 유리체내, 자궁내, 병변-내 투여, 림프절 투여, 종양내 투여, 내이에의 투여, 및 대상체의 점막에의 투여이며, 여기서 투여는 전신 효과가 아닌 국소 효과를 갖도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 제2 분자와 이어질 수 있는 제1 분자를 지칭하며, 여기서 분자는 제1분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 구성요소(예를 들어, 프로모터 및 또다른 서열 요소)의 병치를 포함하여 두 구성요소가 정상적으로 기능하고 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소의 적어도 하나 상에 가해지는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 한다. 두 분자는 단일 인접 분자의 일부일 수도 있고 아닐 수도 있으며 인접할 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 관심 있는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 조절하는 경우에 프로모터는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된다. 추가적인 구현예에서, 전사 조절 요소의 두 부분은, 이들이 이어지는 경우에 한 부분의 전사-활성화 기능성이 다른 부분의 존재에 의해 악영향을 받지 않도록 서로 작동가능하게 연결된다. 두 전사 조절 요소는 링커 핵산(예를 들어, 개재 논-코딩 핵산)의 방법으로 서로 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 개재 뉴클레오티드가 존재하지 않고 서로 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "오토펄린" 및 "OTOF"는 비증후군성 열성 청각장애 DNFB9와 연관된 유전자를 지칭한다. 용어 "오토펄린" 및 "OTOF"는, 인코딩된 OTOF 유사체가 야생형 OTOF의 치료적 기능을 유지하는 조건 하에, 야생형 OTOF 단백질의 변이체 및 동일한 것을 인코딩하는 핵산, 예컨대 야생형 OTOF 단백질의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1-5 중 어느 하나)에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성 이상)을 갖는 변이체 단백질 또는 야생형 OTOF 유전자의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성 이상)을 갖는 폴리뉴클레오티드를 또한 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, OTOF는 당업자가 이해하는 바와 같이 상황에 따라 내유모세포 또는 이 단백질을 인코딩하는 유전자에 국소화된 단백질을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "오토펄린 아이소형 5" 및 "OTOF 아이소형 5"는 비증후군성 열성 청각장애 DFNB9와 연관된 유전자의 아이소형을 지칭한다. 유전자의 인간 아이소형은 참조 서열 NM_001287489과 연관되어 있으며, 전사체는 인간 오토펄린의 1-45번 및 47번 엑손을 포함하지만, OTOF 유전자의 46번 엑손은 결여되어있다. 인간 OTOF 아이소형 5 단백질은 오토펄린 아이소형 e로도 또한 공지되어 있다. 용어 "오토펄린 아이소형 5" 및 "OTOF 아이소형 5"는, 인코딩된 OTOF 아이소형 5 유사체가 야생형 OTOF 아이소형 5의 치료적 기능을 유지하는 조건 하에, 야생형 OTOF 아이소형 5 단백질의 변이체 및 동일한 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 야생형 OTOF 아이소형 5 단백질의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1)에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성 이상)를 갖는 변이체 단백질 또는 야생형 OTOF 아이소형 5 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성 이상)을 갖는 폴리뉴클레오티드를 또한 지칭한다. OTOF 아이소형 5 단백질 변이체는, OTOF 아이소형 5 변이체가 야생형 OTOF 아이소형 5의 치료적 기능을 유지하고 아미노산 서열의 N-말단 부분에서 10% 이하의 아미노산 치환 및 아미노산 서열의 C-말단 부분에서 10% 이하의 아미노산 치환을 갖는 조건 하에, 야생형 OTOF 아이소형 5(예를 들어, 서열번호 1)에 비해 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상)의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, OTOF 아이소형 5는, 맥락에 따라, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 내유모세포에 또는 이 단백질을 인코딩하는 유전자에 국부화된 단백질을 지칭한다. OTOF 아이소형 5는 인간 OTOF 5 또는 또다른 포유류 종으로부터의 동족체(homolog)를 지칭할 수 있다. 뮤린 오토펄린은 인간 오토펄린에 비해 하나의 추가적인 엑손을 함유하며(뮤린 오토펄린에서는 48개 엑손), 인간 OTOF 아이소형 5를 인코딩하는 것과 상응하는 뮤린 오토펄린의 엑손은 1-5번, 7-46번, 및 48번이다. 본원에서 사용되는 엑손 번호화 조약은 현재 인간 OTOF의 공통(consensus) 전사체에 존재할 것으로 이해되는 엑손에 기반한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 결찰될 추가적인 DNA 세그먼트(segment)인 염색체외의 원형 이중 가닥 DNA 분자를 지칭한다. 플라스미드는 벡터의 유형으로, 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 특정한 플라스미드(예를 들어, 세균성 복제 기원을 갖는 세균성 플라스미드 및 에피좀성 포유류 플라스미드)는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 증식(autonomous replication)할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피좀성 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입되면서 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 그럼으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 특정한 플라스미드는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오시드의 폴리머 형태를 지칭한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 포스포다이에스터 결합에 의해 이어진 DNA 또는 RNA(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시사이티딘)에서 자연적으로 발견되는 뉴클레오시드로 구성된다. 그러나, 용어는 자연 발생적 핵산에서 발견되는지 여부에 관계없이 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된 염기, 변형된 골격(backbone) 등을 함유하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 함유하는 분자를 아우르며, 이러한 분자는 특정한 적용법을 위해 바람직할 수 있다. 본 명세서가 폴리뉴클레오티드를 지칭할 때, DNA, RNA 둘 다, 및 각각의 경우에서 단일- 및 이중-가닥 형태(및 각각의 단일-가닥 분자의 보체 둘 다)가 제공되는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 물질 자체 및/또는 특이적인 핵산을 생화학적으로 특징화하는 서열 정보(즉, 염기의 경우 약어로서 사용되는 문자의 연속)를 지칭할 수 있다. 본원에 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열은 달리 지시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 핵산의 "상보성" 또는 "상보적"은 핵산의 한 가닥에 있는 뉴클레오티드 서열이 그 핵염기 그룹의 배향으로 인해 반대되는 핵산 가닥의 또다른 서열과 수소 결합을 형성함을 의미한다. DNA에서 상보적 염기는 전형적으로 A와 T 및 C와 G이다. RNA에서 이들은 전형적으로 C와 G 및 U와 A이다. 상보성은 완벽하거나 실질적일/충분할 수 있다. 두 핵산 사이의 완벽한 상보성은 두 핵산이 두 가닥(duplex)를 형성할 수 있다는 것을 의미하며, 이때 두 가닥에서 모든 염기는 왓슨-크릭 페어링(Watson-Crick pairing)에 의해 상보적인 염기에 결합된다. "실질적인" 또는 "충분한" 상보적은 하나의 가닥 내의 서열이 반대 가닥 내의 서열에 완전히 및/또는 완벽히 상보적이 아니지만, 두 가닥 상의 염기들 사이에 충분한 결합이 일어나 하이브리드화(hybridization) 조건(예를 들어, 염 농도 및 온도)의 세트에서 안정한 하이브리드 복합체(hybrid complex)를 형성하는 것을 의미한다. 이러한 조건은 하이브리드화된 가닥의 서열 및 Tm(융해 온도)를 예측하는 표준 수학적 계산을 사용함으로써, 또는 일상적인 방법을 사용한 Tm의 실증적인 결정에 의해 예측될 수 있다. Tm은 두 핵산 가닥 사이에 형성된 하이브리드화된 복합체의 집단이 50% 변성된(즉, 이중-가닥 핵산 분자의 집단이 단일 가닥으로 절반이 해리된) 온도를 포함한다. Tm 아래의 온도에서, 하이브리드화 복합체의 형성이 선호되는 반면에, Tm 위의 온도에서는, 하이브리드화 복합체 내의 가닥의 융해 또는 분리가 선호된다. Tm은 예를 들어, Tm=81.5+0.41(% G+C)을 사용함으로써, 수성 1M NaCl 용액 내의 공지된 G+C 함량을 갖는 핵산에 대해 추산될 수 있지만, 다른 공지된 Tm 계산은 핵산 구조적 특징을 고려한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라아제에 의해 결합되는 DNA 상의 인식 부위를 지칭한다. 폴리머라아제는 전이유전자의 전사를 유발한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 프로모터는 유비쿼터스 프로모터(예를 들어, CAG 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 및 smCBA라고 불리는 프로모터의 더 작은 버전을 생산하기 위해 하이브리드 치킨 β-액틴/토끼 β-글로빈 인트론이 매우 짧아진, 절단된 형태의 키메릭-CMV-치킨 β-액틴 프로모터(CBA)) 및 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터(예를 들어, 마이오신 15(Myo15) 프로모터, 마이오신 7A(Myo7A) 프로모터, 마이오신 6(Myo6) 프로모터, POU 클래스 4 호메오박스 3(POU4F3) 프로모터) 및 내유모세포-특이적 프로모터(예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 프로모터, 소포성 글루타메이트 수송체 3(VGLUT3) 프로모터 및 OTOF 프로모터)를 포함한다.
참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율(%) 서열 동일성"은 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 핵산 또는 아미노산과 동일한 후보 서열 내의 핵산 또는 아미노산의 백분율로서 정의되며, 필요한 경우에, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 최대 백분율 서열 동일성을 달성한다. 백분율 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 결정하려는 목적의 정렬은 당업자의 능력 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, 또는 Megalign 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 예를 들어, 백분율 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용하여 생성될 수 있다. 예시로서, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대해, 이와 함께, 또는 이와 비교하여, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A의 백분율 서열 동일성(이는 대안적으로 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대해, 이와 함께, 또는 이와 비교하여 소정의 백분율 서열 동일성을 갖는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 (분수 X/Y)
여기서, X는 해당 프로그램의 A 및 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램(예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 매치로 점수가 매겨진 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이고, Y는 B의 총 핵산의 수이다. 핵산 또는 아미노산 서열 A의 길이가 핵산 또는 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, A 대 B의 백분율 서열 동일성은 B 대 A의 백분율 서열 동일성과 같지 않을 것임이 인식될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "유도체"는 상응하는 전장 야생형 핵산, 펩티드, 또는 단백질과 비교하여 하나 이상의 돌연변이 및/또는 화학적 변형을 포함하는 핵산, 펩티드, 또는 단백질 또는 이의 변이체 또는 유사체를 지칭한다. 핵산에 연관된 화학적 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 염기 모이어티(moiety), 당 모이어티, 인산염 모이어티, 인산-당 골격, 또는 이들의 조합물에 대한 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 대상체에 영향을 미치거나 미칠 수 있는 특정한 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 제어하기 위해 대상체, 예컨대 포유류, 예를 들어 인간에게 투여되는, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 임의로 조합되는 치료제를 함유하는 혼합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 합리적인 이익/위험비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 및 다른 문제 합병증 없이 대상체, 예컨대 포유류(예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 포유류, 및 보다 특별히는 인간에서 사용하기 위해 U.S 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 나열된 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합유전성 영역"은 두 상이한 서열 사이의 재조합을 매개하는 상동성(homology)의 영역을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 OTOF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 번역을 제어하는 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 본원에 참조로 편입되는 Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된 표본(예를 들어, 혈액, 혈액 구성요소(예를 들어, 혈청 또는 혈장), 소변, 침, 양수, 뇌척수액, 조직(예를 들어, 태반 또는 피부), 췌장액, 융모막 융모 샘플, 및 세포)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 리포펙션, 칼슘-인산 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 뉴클레오펙션, 스퀴즈-천공(squeeze-poration), 초음파천공, 광학적 형질감염, 마그네토펙션, 임펠펙션 등 중 임의의 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 동물(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간), 가축 동물(예를 들어, 고양이, 개, 소, 말, 양, 돼지 등) 및 질환의 실험 동물 모델(예를 들어, 마우스, 랫트)를 지칭한다. 본원에 기재된 방법에 따라 치료될 대상체는 난청(예를 들어, OTOF 내의 돌연변이와 연관된 난청)으로 진단받은 이거나, 이들 병태가 발병될 위험이 있는 이일 수 있다. 진단은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 기술에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 본 개시내용에 따라 치료될 대상체가 표준 시험을 겪을 수 있었거나, 검사 없이, 질환 혹은 병태와 연관된 하나 이상의 위험 요소의 존재로 인해 위험에 있는 것으로 식별될 수 있었다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질도입" 및 "형질도입하다"는 세포 내로 벡터 작제물 또는 이의 일부를 도입하는 방법을 지칭한다. 벡터 작제물이 바이러스성 벡터, 예컨대 예를 들어 AAV 벡터 내에 함유되는 경우, 형질도입은 세포의 바이러스 감염 및 그 다음의 벡터 작제물 또는 그의 일부의 세포 게놈 내로의 전송 및 통합을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" 및 상태, 장애 또는 병태의 "치료하는 것"은 다음을 포함할 수 있다: (1) 상태, 장애 또는 병태를 앓거나 이에 취약할 수 있지만, 아직 상태, 장애 또는 병태의 임상적 또는 준임상적 증상을 경험하거나 나타내지 않은 대상체에서 발병한 상태, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 임상적 또는 준-임상적 증상의 출현의 발생 및/또는 가능도를 예방, 지연, 또는 감소시키는 것; 또는 (2) 상태, 장애 또는 병태의 억제, 즉, 질환의 발병 또는 이의 재발 또는 이의 적어도 하나의 임상적 또는 준-임상적 증상을 저지, 감소 또는 지연시키는 것; 또는 (3) 질환을 개선하는 것, 즉, 상태, 장애 또는 병태 또는 이의 적어도 하나의 임상적 또는 준-임상적 증상의 퇴보를 야기하는 것. 치료될 대상체에 대한 이점은 통계학적으로 유의하거나 환자에 대해 또는 의사에 대해 적어도 인지가능한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 핵산 벡터, 예를 들어, DNA 벡터, 예컨대 플라스미드, RNA 벡터, 바이러스 또는 다른 적합한 레플리콘(replicon)(예를 들어, 바이러스성 벡터)를 포함한다. 다양한 벡터가 외인성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 원핵세포 또는 진핵세포 내로의 전달을 위해 개발되어왔다. 이러한 발현 벡터의 예는, 예를 들어, 관심있는 유전자의 발현에 적합한 벡터와 관련되는 경우에 본원에 참조로 편입되는; WO94/11026에 개시되어 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 예를 들어, 단백질의 발현 및/또는 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 포유류 세포의 게놈 내로의 통합을 위해 사용되는 추가적인 서열 요소를 함유한다. 본원에 기재된 바와 같이, OTOF의 발현을 위해 사용될 수 있는 특정한 벡터는 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 영역을 함유하는 벡터를 포함하며, 이는 유전자 전사를 지시한다. OTOF의 발현을 위한 다른 유용한 벡터는 이들 유전자의 번역 속도를 향상시키거나 유전자 전사로부터 기인된 mRNA의 안정성 또는 핵 외수송을 개선하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이들 서열 요소는, 예를 들어, 발현 벡터 상에 있는 유전자의 효율적인 전사를 지시하기 위해 5' 및 3' 비번역 영역 및 폴리아데닐화 신호 부위를 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 발현 벡터는 이러한 벡터를 함유하는 세포의 선택을 위한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 함유할 수 있다. 적합한 마커의 예는 항생제, 예컨대 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 또는 누르세오트리신에 대한 내성을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 주어진 유기체에서 특정한 유전자에 대한 빈도가 가장 높은 유전자형을 지칭한다.
도 1은 32 또는 52주령에 처리된 동형접합성 OTOF-Q828X 돌연변이 마우스의 ABR 역치 회복을 나타내는 그래프이다. 동물에게 이소플루란 마취 하에 정원창막을 통해 비히클(n=5/연령 그룹) 또는 듀얼 하이브리드 AAV-Myo15-hOTOF 벡터(n=10/연령 그룹)를 투여하였다. ABR 회복은 처리 4주 후 OTOF 듀얼 벡터로 처리된 32주령 동물의 10/10 및 52주령 동물의 9/10에서 관찰되었다.
도 2a-2b는 동형접합성(Otof-Q828X hom) 및 이형접합성(Otof-Q828X het) Otof-Q828X 마우스에서 시간 경과에 따른 내유모세포 및 외유모세포의 수를 나타내는 일련의 그래프이다. IHC(도 2a) 및 OHC(도 2b)의 수를 5 내지 42주령의 동물 중 50마리의 마우스 귀에서 계수하였다. 수는 5.6 kHz, 8 kHz, 11.3 kHz, 16 kHz, 22.6 kHz, 32 kHz 및 45.2 kHz에 상응하는 달팽이관 영역에 나타내어진다. Otof-Q828X hom 마우스에서 시험된 모든 주파수에 대해 연령이 증가함에 따라 IHC 수에 통계적으로 유의한 손실이 있었다. IHC 수의 유사한 경향이 het 마우스에서 더 낮은 주파수로 관찰되었다(켄달 순위 상관관계). Otof-828X hom 및 het 동물의 IHC 수는 최대 16주까지 안정적이었다. 16주 후부터, Otof-Q828X hom 동물은 22.6-45.2 kHz에서 시작하여 24주 후에 더 낮은 주파수(8-16 kHz)에 IHC 수가 감소하는 것을 나타내었다. Otof-Q828X het 마우스의 IHC 수 손실은 16 및 32 kHz에 대해 24주 후에 시작되었다. 32주 후에는, 대부분의 시험된 주파수(< 45.2 kHz)에 대해 75% 초과의 IHC가 유지되었다(도 2a). Otof-Q828X hom 및 het 마우스의 외유모세포 수는 het 마우스가 연령-관련 개수 감소를 나타낸 8 kHz를 제외하고 모든 주파수에 걸쳐 6개월의 연구 기간 동안 일정하게 유지되었다(켄달 순위 상관관계). 5.6 kHz 및 45.2 kHz의 OHC 수는 보다 큰 변동성과 연관이 있으며, 시험된 연령에 걸쳐 산재된 het와 hom 사이의 수의 차이를 나타낸다. 대부분의 OHC는 32주 후에도 잔류하였다(도 2b).
도 3은 동형접합성 OTOF-Q828X 돌연변이 마우스에서 ABR 역치 회복을 나타내는 그래프이다. 22.6 kHz에서 측정된 ABR 역치는 OTOF 듀얼 벡터 시스템으로 처리된 성체 동형접합성 OTOF-Q828X 돌연변이 마우스에 대한 여러 연구에서 오토펄린을 발현하는 내유모세포(IHC) 백분율에 대해 플롯팅되었다. 측정은 처리 후 ≥ 4주에 수행되었다.
프로모터 및 오토펄린(OTOF) 단백질(예를 들어, 야생형(WT) OTOF 단백질)의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리아데닐화(poly(A)) 서열을 함유하는 제2 핵산 벡터를 대상체에게 투여함으로써 적어도 25세(예를 들어, 25-50세, 25-45세, 25-40세, 25-35세, 25-30세, 30-50세, 30-45세, 30-40세, 30-35세, 35-50세, 35-45세, 35-40세, 40-50세, 40-45세, 또는 45-50세, 예를 들어, 25세, 26세, 27세, 28세, 29세, 30세, 31세, 32세, 33세, 34세, 35세, 36세, 37세, 38세, 39세, 40세, 41세, 42세, 43세, 44세, 45세, 46세, 47세, 48세, 49세, 또는 50세)의 인간 대상체에서 이대립유전자 오토펄린(OTOF) 돌연변이에 의한 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 기재된다. 포유류 세포, 예컨대 달팽이관 유모세포 내로 도입될 때, 두 핵산 벡터에 의해 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 전장 OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 형성하도록 조합될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은, 그러므로, OTOF 결함(예를 들어, OTOF 내의 동형접합성 또는 복합 이형접합성 돌연변이)를 갖는 대상체의 달팽이관 유모세포의 WT OTOF의 발현을 유도하거나 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 또한 검출가능한 이음향방사, 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉 및/또는 검출가능한 가중전위를 갖는 것으로 식별된 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
오토펄린
OTOF는 칼슘, 인지질, 및 단백질 결합과 관련되어 있는 적어도 6개의 C2 도메인을 함유하는 230 kDa 막 단백질이다. 이는 48개 엑손을 함유하는 유전자에 의해 인코딩되며, 전장 단백질은 1,997개 아미노산으로 구성된다. OTOF는 내유모세포의 리본형 시냅스(ribbon synapse)에 위치하며, 여기서 시냅스 소포 융합 시 칼슘 센서로서 기능하여 신경전달물질-함유 소포와 원형질막의 융합을 촉발시키는 것으로 여겨진다. 이것은 또한 소포 보급(replenishment) 및 클라트린-매개 엔도사이토시스(endocytosis)와 관련되어 있으며, 마이오신 VI, Rab8b, SNARE 단백질, 칼슘 채널 Cav1.3, Ergic2, 및 AP-2와 상호작용하는 것으로 나타났다. OTOF가 엑소사이토시스를 매개하는 메커니즘 및 이의 결합 파트너와의 이의 상호작용의 생리적 의의는 결정되어야할 것으로 남아있다.
오토펄린-연관 난청
OTOF는 비-증후군성 형태의 청각장애, 상염색체 열성 청각장애-9(DFNB9)의 유전학을 조사하는 연구에 의해 처음 식별되었다. 내이가 소리를 감지하지만, 소리를 귀에서 뇌로 적절히 전송할 수 없는 장애인 청각 신경병증을 갖는 많은 환자에 OTOF 돌연변이가 있어, OTOF 내의 돌연변이는 전세계의 환자에서 감각신경성 난청을 야기하는 것으로 발견되어 왔다. 이들 환자는 비정상적인 청성 뇌간 반응(ABR) 및 초기의 정상적인 이음향방사와 함께 손상된 어음명료도를 갖는다. OTOF 내의 동형접합성 또는 복합 이형접합성 돌연변이가 있는 환자는 종종 유아기에 난청이 발병하며, 청각 손상의 중증도는 OTOF 내의 돌연변이의 위치 및 유형에 따라 다른 것으로 발견되었다. 절단을 유발하는 돌연변이 및 절단을 유발하지 않는 돌연변이를 포함하여 OTOF에서 적어도 220개의 돌연변이가 식별되었다.
본 발명은 부분적으로 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제2 핵산 벡터를 성체(32주령) 및 중간-연령(52주령) 오토펄린-결핍 마우스에게 투여하는 것은 난청을 구제하는 데 효과적이라는 발견에 기반한다. 이러한 데이터는 성체 및 중간-연령 오토펄린-결핍 마우스에게 오토펄린을 전달하면 오토펄린-결핍 마우스가 나이가 들면서 발생하는 유모세포의 손실에도 불구하고 청각을 회복할 수 있음을 나타내고, 오토펄린 유전자 요법이 비슷한 연령의 인간 대상체를 치료하는 데에도 사용될 수 있음을 시사한다(32주령 및 52주령 마우스는 대략 30-50세 인간 대상체에 상응함). 인간은 또한 연령-의존성 유모세포의 손실을 경험하는데, 이는 노인에서 유전자 요법 접근법의 효능을 제한할 것으로 예상된다. 그러나 본 발명자들은 또한 약 20%의 내유모세포가 오토펄린을 발현할 때 오토펄린-결핍 마우스에서 청각이 회복되었음을 발견했는데, 이는 상대적으로 적은 비율의 내유모세포가 형질도입되더라도 청각이 구제될 수 있음을 나타낸다. 종합하면, 이들 데이터는 이대립유전자 OTOF 돌연변이가 있는 성인 인간 대상체(예를 들어, 25세 이상의 인간 대상체, 예컨대 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, 25-30, 30-50, 30-45, 30-40, 30-35, 35-50, 35-45, 35-40, 40-50, 40-45, 또는 45-50세, 예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50세)가 OTOF를 인코딩하는 듀얼 벡터 시스템을 사용하여 치료될 수 있음을 나타낸다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은, OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제2 핵산 벡터를 투여함으로써 이대립유전자 OTOF 돌연변이에 의해 유발된 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 전장 OTOF 코딩 서열은 너무 커서 유전자 요법에 일반적으로 사용되는 벡터의 유형(예를 들어, 5 kb의 패키징 한계를 갖는 것으로 여겨지는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터)에 포함할 수 없다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은, OTOF 코딩 서열을 전장 OTOF 서열을 재구성하도록 세포 내에서 재조합될 수 있는 2개의 상이한 핵산 벡터 사이에 분할함으로써 이 문제를 극복한다. 이들 조성물 및 방법은 OTOF 유전자에 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, OTOF 발현을 감소시키거나, OTOF 기능을 감소시키거나, 난청과 연관된 OTOF 돌연변이를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 제1 및 제2 핵산 벡터가 조성물로 투여될 때, OTOF의 N-말단 및 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포(예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 달팽이관 유모세포) 내로 조합되어 전장 OTOF 코딩 서열을 함유하는 단일 핵산 분자를 형성할 수 있다(예를 들어, 상동 재조합 및/또는 스플라이싱을 통해).
본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 핵산 벡터는 야생형 OTOF 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 서열, 예컨대, 조합될 때, 야생형 인간 또는 마우스 OTOF의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 핵산 벡터에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 하기 표 2의 OTOF 아미노산 서열의 N-말단 부분 및 C-말단 부분을 인코딩한다(예를 들어, 조합될 때, 표 2에 나열된 전장 OTOF 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호 1-5 중 어느 하나를 인코딩하는 두 부분).
본원에 기재된 방법에 따르면, 대상체는, 인코딩된 OTOF 유사체가 야생형 OTOF의 치료적 기능(예를 들어, 리본형 시냅스에서의 엑소사이토시스를 조절하거나 오토펄린 유전자 결함(예를 들어, OTOF 돌연변이)과 관련된 난청의 동물 모델에서 ABR 반응을 구제하거나 개선하는 능력)을 유지하는 조건으로, 서열번호 1-5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1-5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열동일성)을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1-5 중 어느 하나에 비해 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 보존적 아미노산 치환)을 함유하는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 N-말단 및 C-말단 부분을 각각 함유하는 제1 및 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 함유하는 조성물이 투여될 수 있다. OTOF 단백질의 N-말단 부분 중 아미노산의 10% 이하 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분 중 아미노산의 10% 이하가 보존적 아미노산 치환으로 대체될 수 있다. OTOF 단백질은 서열번호 10-14 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. OTOF 단백질은 인간 대상체에서 비-병원성인 것으로 발견된 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)를 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 또한 인코딩될 수 있다. OTOF 단백질은 인간 OTOF 단백질일 수 있거나 또 다른 포유류 종(예를 들어, 마우스, 랫트, 소, 말, 염소, 양, 당나귀, 고양이, 개, 토끼, 기니피그, 또는 다른 포유류)으로부터의 인간 OTOF 단백질의 동족체일 수 있다. 일부 구현예에서, 인코딩된 OTOF 단백질은 서열번호 1(OTOF 아이소형 1)의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 인코딩된 OTOF 단백질은 서열번호 5(OTOF 아이소형 5)의 서열을 갖는다.
표 2: OTOF 서열
포유류 세포에서 OTOF의 발현
OTOF 내의 돌연변이는 감각신경성 난청 및 청각 신경병증과 연관되었다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은, OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제2 핵산 벡터를 투여를 통해 WT OTOF 단백질의 발현을 증가시킨다. 감각신경성 난청 및 청각 신경병증의 치료에서 치료적 적용을 위한 핵산 벡터를 이용하기 위해, 이들은 세포의 내부로, 및, 특히, 특이적인 세포 유형으로 지시될 수 있다. 포유류 세포로의 단백질의 전달을 위해 및 포유류 세포에서의 단백질을 인코딩하는 유전자의 안정한 발현을 위해 다수의 방법이 확립되어왔다.
OTOF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
포유류 세포에서 OTOF의 치료적으로 효과적인 세포내 농도를 달성하기 위해 사용될 수 있는 하나의 플랫폼은 OTOF를 인코딩하는 유전자의 안정한 발현(예를 들어, 포유류 세포의 핵 또는 미토콘드리아 게놈 내로의 통합에 의해, 또는 포유류 세포의 핵에서 에피좀성 연쇄체 형성을 의해)을 통한 것이다. 유전자는 상응하는 단백질의 1차 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 포유류 세포 내로 외인성 유전자를 도입하기 위해, 유전자는 벡터 내로 혼입될 수 있다. 벡터는 형질전환, 형질감염, 형질도입, 직접 흡수, 발사체 폭격(projectile bombardment)을 포함하는 다양한 방법에 의해, 및 리포좀 내로의 벡터의 캡슐화에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질감염 또는 형질전환시키는 적합한 방법의 예는 인산칼슘 침전, 전기천공, 미세주사, 감염, 리포펙션 및 직접 흡수를 포함한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 그 각각의 개시내용이 본원에 참조로 편입되는 Green, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor University Press, New York 2014); 및 Ausubel, 등, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York 2015)에 더 상세히 기재되어 있다.
OTOF는 OTOF 단백질을 인코딩하는 유전자의 부분을 함유하는 벡터를 세포막 인지질로 표적화함으로써 포유류 세포 내로 또한 도입될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 벡터 분자를 모든 세포막 인지질에 친화도가 있는 바이러스성 단백질인 VSV-G 단백질과 연결함으로써 세포막의 세포외 표면 상의 인지질로 표적화될 수 있다. 이러한 작제물은 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
포유류 RNA 폴리머라아제에 의한 OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인식 및 결합은 유전자 발현에 중요하다. 이와 같이, 한 가지는 RNA 폴리머라아제를 모집하고 전사 개시 부위에서 전사 복합체의 조립을 촉진하는 전사 인자에 대한 높은 친화도를 나타내는 폴리뉴클레오티드 내의 서열 요소를 포함할 수 있다. 이러한 서열 요소는, 예를 들어, 특이적 전사 개시 요소 및 궁극적으로는 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되고 결합될 수 있는 서열인 포유류 프로모터를 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오티드는 포유류 프로모터의 하류 OTOF 단백질을 인코딩하는 것(예를 들어, 포유류 프로모터의 OTOF 단백질 하류의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)을 또한 포함한다. 포유류 세포에서 OTOF 단백질의 발현에 유용한 프로모터는 유비쿼터스 프로모터, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터 및 내유모세포-특이적 프로모터를 포함한다. 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터(예를 들어, CMV 즉시-초기 인핸서 및 프로모터, CMVmini 프로모터, minCMV 프로모터, CMV-TATA+INR 프로모터, 또는 min CMV-T6 프로모터), 치킨 β-액틴 프로모터, smCBA 프로모터, CB7 프로모터, 하이브리드 CMV 인핸서/인간 β-액틴 프로모터, CASI 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, β-글로빈 프로모터(예를 들어, 최소 β-글로빈 프로모터), HSV 프로모터(예를 들어, 최소 HSV ICP0 프로모터 또는 절단된 HSV ICP0 프로모터), SV40 프로모터(예를 들어, SV40 최소 프로모터), EF1α 프로모터, 및 PGK 프로모터를 포함한다. 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 마이오신 15(Myo15) 프로모터, 마이오신 7A(Myo7A) 프로모터, 마이오신 6(Myo6) 프로모터, POU4F3 프로모터, 아토날 BHLH 전사 인자 1(ATOH1) 프로모터, LIM 호메오박스 3(LHX3) 프로모터, α9 아세틸콜린 수용체(α9AChR) 프로모터, 및 α10 아세틸콜린 수용체(α10AChR) 프로모터를 포함한다. 내유모세포-특이적 프로모터는 FGF8 프로모터, VGLUT3 프로모터, OTOF 프로모터, 및 칼슘 결합 단백질 2(CABP2) 프로모터를 포함한다(본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 공개 번호 WO2021/091940에 기재되어 있음). 대안적으로, 바이러스성 게놈으로부터 유래된 프로모터가 포유류 세포에서의 이들 제제의 안정한 발현을 위해 또한 사용될 수 있다. 이들 제제의 포유류 발현을 촉진하기 위해 사용될 수 있는 기능적 바이러스성 프로모터의 예는 아데노바이러스 후기(late) 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니바이러스의 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 및 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터를 포함한다.
뮤린 마이오신 15 프로모터
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 Myo15 프로모터는 유모세포에서 특이적으로 전이유전자를 발현할 수 있는 뮤린 Myo15 유전자좌의 영역으로부터의 핵산 서열, 또는 이의 변이체, 예컨대 유모세포에서 특이적으로 전이유전자를 발현할 수 있는 뮤린 Myo15 유전자좌의 영역에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 이들 영역은 뮤린 Myo15 번역 개시 부위의 바로 앞의 핵산 서열 및 뮤린 Myo15 번역 개시 부위로부터 5 kb 넘어 위치한 상류 조절 요소를 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 Myo15 프로모터는 유모세포에서 특이적으로 전이유전자를 발현할 수 있는 뮤린 Myo15 유전자좌를 작동가능하게 연결하는 링커를 임의로 포함할 수 있거나, 뮤린 Myo15 유전자좌의 영역이 개재 링커 없이 직접적으로 이어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 Myo15 프로모터는, 뮤린 Myo15 번역 개시 부위 바로 앞의 핵산 서열(서열번호 25에 제시된 서열인 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -1 내지 -1157의 핵산)에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성) 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 갖는 제2 영역에 이어진(예를 들어, 작동가능하게 연결된) 뮤린 Myo15 유전자의 제1 논-코딩 엑손(서열번호 24에 제시된 서열인 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -6755 내지 -7209의 핵산) 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 함유하는 영역에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 제1 영역(상류 조절 요소)을 함유한다. 서열번호 24의 기능적 부분은 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -7166 내지 -7091의 핵산의 서열(서열번호 26에 제시됨) 및/또는 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -7077 내지 -6983의 핵산의 서열(서열번호 27에 제시됨)을 가질 수 있다. 제1 영역은 서열번호 28에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 27의 핵산 서열에 융합된 서열번호 26의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 제1 영역은 서열번호 29에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 26의 핵산 서열에 융합된 서열번호 27의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 제1 영역은 내인성 개재 핵산 서열 또는 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 26 및 서열번호 27의 서열을 함유할 수 있다(예를 들어, 제1 영역은 서열번호 30 및 서열번호 50에 제시된 바와 같이, 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -7166 내지 -6983의 핵산의 서열을 갖거나 포함할 수 있다). 제1 영역이 서열번호 26 및 서열번호 27 둘 다를 함유하는 뮤린 Myo15 프로모터에서, 2개의 서열은 임의의 순서(예를 들어, 서열번호 26이 서열번호 27에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있거나, 서열번호 27이 서열번호 26에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있다)로 포함될 수 있다. 서열번호 25의 기능적 부분은 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -590 내지 -509의 핵산의 서열(서열번호 31에 제시됨) 및/또는 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -266 내지 -161의 핵산의 서열(서열번호 32에 제시됨)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 31을 함유하는 서열은 서열번호 51의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호 32를 함유하는 서열은 서열번호 52의 서열을 갖는다. 제2 영역은 서열번호 33에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 32의 핵산 서열에 융합된 서열번호 31의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 제2 영역은 서열번호 34에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 31의 핵산 서열에 융합된 서열번호 32의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 제2 영역은 서열번호 55에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 52의 핵산 서열에 융합된 서열번호 51의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 제2 영역은 개재 핵산 없이 서열번호 51의 핵산 서열에 융합된 서열번호 52의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 제2 영역은 내인성 개재 핵산 서열 또는 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 31 및 서열번호 32의 서열을 함유할 수 있다(예를 들어, 제2 영역은 서열번호 35에 제시된 바와 같이, 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -590 내지 -161의 핵산의 서열을 가질 수 있다). 제2 영역이 서열번호 31 및 서열번호 32 둘 다를 함유하는 뮤린 Myo15 프로모터에서, 2개의 서열은 임의의 순서(예를 들어, 서열번호 31이 서열번호 32에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있거나, 서열번호 32가 서열번호 31에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있다)로 포함될 수 있다.
뮤린 Myo15 프로모터의 제1 영역 및 제2 영역은 직접적으로 이어질 수 있거나 핵산 링커에 의해 이어질 수 있다. 예를 들어, 뮤린 Myo15 프로모터는 개재 핵산 없이 서열번호 25의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 31-35, 51, 52, 및 55 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 31 및 32)에 융합된 서열번호 24의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 26-30 및 50 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 26 및 27)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 24의 서열번호 25와의 직접 융합으로 야기된 뮤린 Myo15 프로모터의 핵산 서열은 서열번호 36에 제시되어 있다. 대안적으로, 링커는 서열번호 24의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 26-30 및 50 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 26 및 27)를 서열번호 25의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 31-35, 51, 52, 및 55 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 31 및 32)에 잇기 위해 사용될 수 있다. 서열번호 24 및 서열번호 25 둘 다의 기능적 부분을 함유하는 예시적인 Myo15 프로모터가 서열번호 38, 39, 53, 54, 59, 및 60에 제공된다.
본원에 기재된 뮤린 Myo15 프로모터에서 사용하기 위한 핵산 링커의 길이는 약 5 kb 이하(예를 들어, 약 5 kb, 4.5, kb, 4, kb, 3.5 kb, 3 kb, 2.5 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15, bp, 10 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 이하)일 수 있다. 본원에 기재된 뮤린 Myo15 프로모터에서 사용될 수 있는 핵산 링커는 본 발명의 뮤린 Myo15 프로모터의, 유모세포에서의 전이유전자 발현을 유도하는 능력을 방해하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호 24의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 26-30 및 50 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 26 및 27)은 서열번호 25의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 31-35, 51, 52, 및 55 중 어느 하나, 예를 들어, 서열번호 31 및 32)에 이어지고(예를 들어, 작동가능하게 연결된다), 일부 구현예에서, 영역의 순서는 역방향일 수 있다(예를 들어, 서열번호 25의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 31-35, 51, 52, 및 55 중 어느 하나, 예를 들어, 서열번호 31 및 32)가 서열번호 24의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 26-30 및 50 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 26 및 27)에 이어진다(예를 들어, 작동가능하게 연결된다). 예를 들어, 서열번호 25의 서열번호 24와의 직접 융합으로 야기된 뮤린 Myo15 프로모터의 핵산 서열은 서열번호 37에 제시되어 있다. 서열번호 25의 기능적 부분 또는 유도체가 서열번호 24의 기능적 부분 또는 유도체의 앞에 있는 뮤린 Myo15 프로모터의 예가 서열번호 58에 제공된다. 순서와 상관없이, 서열번호 24의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체 및 서열번호 25 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체는 상기에 기재된 바와 같이, 직접 융합 또는 핵산 링커에 의해 이어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 뮤린 Myo15 프로모터는, 뮤린 Myo15 유전자의 제1 논-코딩 엑손(서열번호 24에 제시된 서열인 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -6755 내지 -7209의 핵산)을 함유하는 영역에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성) 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 갖는 영역을 함유한다. 서열번호 24의 기능적 부분은 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -7166 내지 -7091의 핵산의 서열(서열번호 26에 제시됨) 및/또는 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -7077 내지 -6983의 핵산의 서열(서열번호 27에 제시됨)의 핵산 서열을 가질 수 있다. 뮤린 Myo15 프로모터는 서열번호 28에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 27의 핵산 서열에 융합된 서열번호 26의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 뮤린 Myo15 프로모터는 서열번호 29에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 26의 핵산 서열에 융합된 서열번호 27의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 뮤린 Myo15 프로모터는 내인성 개재 핵산 서열 또는 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 26 및 서열번호 27의 서열을 함유할 수 있다(예를 들어, 제1 영역은 서열번호 30 및 서열번호 50에 제시된 바와 같이, 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -7166 내지 -6983의 핵산의 서열을 갖거나 포함할 수 있다). 서열번호 26 및 서열번호 27 둘 다를 함유하는 뮤린 Myo15 프로모터에서, 2개의 서열은 임의의 순서(예를 들어, 서열번호 26이 서열번호 27에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있거나, 서열번호 27이 서열번호 26에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있다)로 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 뮤린 Myo15 프로모터는, 뮤린 Myo15 번역 개시 부위의 바로 상류의 핵산 서열(서열번호 25에 제시된 서열인 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -1 내지 -1157의 핵산)에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성) 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 갖는 영역을 함유한다. 서열번호 25의 기능적 부분은 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -590 내지 -509의 핵산의 서열(서열번호 31에 제시됨) 및/또는 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -266 내지 -161의 핵산의 서열(서열번호 32에 제시됨)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 31을 함유하는 서열은 서열번호 51의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호 32를 함유하는 서열은 서열번호 52의 서열을 갖는다. 뮤린 Myo15 프로모터는 서열번호 33에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 32의 핵산 서열에 융합된 서열번호 31의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 뮤린 Myo15 프로모터는 서열번호 34에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 31의 핵산 서열에 융합된 서열번호 32의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 뮤린 Myo15 프로모터는 서열번호 55에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 52의 핵산 서열에 융합된 서열번호 51의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 뮤린 Myo15 프로모터는 개재 핵산 없이 서열번호 31의 핵산 서열에 융합된 서열번호 52의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 뮤린 Myo15 프로모터는 내인성 개재 핵산 서열 또는 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 31 및 서열번호 32의 서열을 함유할 수 있다(예를 들어, 제2 영역은 서열번호 35에 제시된 바와 같이, 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -590 내지 -161의 핵산의 서열을 가질 수 있다). 서열번호 31 및 서열번호 32 둘 다를 함유하는 뮤린 Myo15 프로모터에서, 2개의 서열은 임의의 순서(예를 들어, 서열번호 31이 서열번호 32에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있거나, 서열번호 32가 서열번호 31에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있다)로 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 뮤린 Myo15 프로모터는, 뮤린 Myo15 번역 개시 부위의 바로 상류의 핵산 서열(서열번호 25에 제시된 서열인 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -1 내지 -1157까지의 핵산)에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 영역의 기능적 부분 또는 유도체의 양측에 측방된 Myo15 유전자의 제1 논-코딩 엑손(서열번호 24에 제시된 서열인 뮤린 Myo15 번역 개시 부위에 관해 -6755 내지 -7209의 핵산)을 함유하는 영역에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 영역의 기능적 부분 또는 유도체를 함유한다. 예를 들어, 서열번호 25의 기능적 부분 또는 유도체, 예컨대 서열번호 31 또는 51은, 서열번호 25의 상이한 기능적 부분, 예컨대 서열번호 32 또는 52에 직접적으로 융합되거나 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 24의 부분, 예컨대 서열번호 26-30 및 50 중 어느 하나에 직접적으로 융합되거나 핵산 링커에 의해 이어질 수 있다. 다른 구현예에서, 서열번호 25의 기능적 부분 또는 유도체, 예컨대 서열번호 32 또는 52는, 서열번호 25의 상이한 기능적 부분, 예컨대 서열번호 31 또는 51에 직접적으로 융합되거나 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 24의 부분, 예컨대 서열번호 26-30 및 50 중 어느 하나에 직접적으로 융합되거나 핵산 링커에 의해 이어질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 51, 50, 및 52의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 56의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 52, 50, 및 51의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 57의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 융합될 수 있다.
인간 마이오신 15 프로모터
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 Myo15 프로모터는 유모세포에서 특이적으로 전이유전자를 발현할 수 있는 인간 Myo15 유전자좌 영역의 핵산 서열 또는 이의 변이체, 예컨대 유모세포에서 특이적으로 전이유전자를 발현할 수 있는 인간 Myo15 유전자좌의 영역에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 Myo15 프로모터는 유모세포에서 특이적으로 전이유전자를 발현할 수 있는 인간 Myo15 유전자좌의 영역을 작동가능하게 연결하는 링커를 임의로 포함할 수 있거나, 인간 Myo15 유전자좌의 영역이 개재 링커 없이 직접적으로 이어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 Myo15 프로모터는 서열번호 41에 제시된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 제2 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체에 이어진(예를 들어, 작동가능하게 연결된), 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 제1 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 함유한다. 서열번호 40의 기능적 부분은 서열번호 42에 제시된 서열을 가질 수 있다. 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 43에 제시된 서열 및/또는 서열번호 44에 제시된 서열을 가질 수 있다. 제2 영역은 서열번호 45에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 44의 핵산 서열에 융합된 서열번호 43의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 제2 영역은 서열번호 46에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 43의 핵산 서열에 융합된 서열번호 44의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 제2 영역은 내인성 개재 핵산 서열(서열번호 47에 제시된 바와 같은) 또는 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 43 및 서열번호 44의 서열을 함유할 수 있다. 제2 영역이 서열번호 43 및 서열번호 44 둘 다를 함유하는 인간 Myo15 프로모터에서, 2개의 서열은 임의의 순서(예를 들어, 서열번호 43이 서열번호 44에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있거나, 서열번호 44가 서열번호 43에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있다)로 포함될 수 있다.
인간 Myo15 프로모터의 제1 영역 및 제2 영역은 직접적으로 이어질 수 있거나 핵산 링커에 의해 이어질 수 있다. 예를 들어, 인간 Myo15 프로모터는 개재 핵산 없이 서열번호 41 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 43-47 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 43 및/또는 44)에 융합된 서열번호 40 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 42)를 함유할 수 있다. 대안적으로, 링커는 서열번호 41의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 43-47 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 43 및/또는 44)에 서열번호 23의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 42)를 잇기 위해 사용될 수 있다. 서열번호 40 및 서열번호 41의 둘 다의 기능적 부분을 함유하는 예시적인 인간 Myo15 프로모터가 서열번호 48 및 49에 제공된다.
일부 구현예에서, 서열번호 40의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 42)는 서열번호 41의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 43-47 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 43 및 44)에 이어지고(예를 들어, 작동가능하게 연결된다), 일부 구현예에서, 영역의 순서는 역방향일 수 있다(예를 들어, 서열번호 41의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 43-47 중 어느 하나 이상, 예를 들어, 서열번호 43 및/또는 44)가 서열번호 40의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체(예를 들어, 서열번호 42)에 이어진다(예를 들어, 작동가능하게 연결된다). 순서와 상관없이, 서열번호 40의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체 및 서열번호 41의 서열 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체는 상기에 기재된 바와 같이, 직접 융합 또는 핵산 링커에 의해 이어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 인간 Myo15 프로모터는 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 함유하는 영역을 함유한다. 서열번호 40의 기능적 부분은 서열번호 42에 제시된 핵산의 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 인간 Myo15 프로모터는 서열번호 41에 제시된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 영역 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 함유한다. 서열번호 41의 기능적 부분은 서열번호 43에 제시된 서열 및/또는 서열번호 44에 제시된 서열을 가질 수 있다. 인간 Myo15 프로모터는 서열번호 45에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 44의 핵산 서열에 융합된 서열번호 43의 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 인간 Myo15 프로모터는 서열번호 46에 제시된 바와 같이, 개재 핵산 없이 서열번호 43의 핵산 서열에 융합된 서열번호 44의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 인간 Myo15 프로모터는 내인성 개재 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 47에 제시된 바와 같이) 또는 핵산 링커에 의해 이어진 서열번호 43 및 서열번호 44의 서열을 함유할 수 있다. 서열번호 43 및 서열번호 44 둘 다를 함유하는 인간 Myo15 프로모터에서, 2개의 서열은 임의의 순서(예를 들어, 서열번호 43이 서열번호 44에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있거나, 서열번호 44가 서열번호 43에(예를 들어, 앞에) 이어질 수 있다)로 포함될 수 있다.
본원에 기재된 인간 Myo15 프로모터에서 사용하기 위한 핵산 링커의 길이는 약 5 kb 이하(예를 들어, 약 5 kb, 4.5, kb, 4, kb, 3.5 kb, 3 kb, 2.5 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15, bp, 10 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 이하)일 수 있다. 본원에 기재된 인간 Myo15 프로모터에서 사용될 수 있는 핵산 링커는 본 발명의 인간 Myo15 프로모터의, 유모세포에서의 전이유전자 발현을 유도하는 능력을 방해하지 않는다.
전술한 Myo15 프로모터 서열은 하기의 표 3에 요약되어 있다.
표 3: 본원에 기재된 Myo15 프로모터에서 사용하기 위한 예시적인 뉴클레오티드 서열
본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 추가적인 Myo15 프로모터는 표 3에 제시된 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 분자뿐만 아니라 표 3에 제시된 핵산 서열의 기능적 부분 또는 유도체를 포함한다. 표 3에 나열된 Myo15 프로모터는 본원에 참조로 편입되는 국제 출원 공보 WO2019210181A1 및 WO2020163761A1에서 특징 지어진다.
본원에 기재된 듀얼 벡터 시스템(예를 들어, 듀얼 벡터 시스템 중 제1 벡터)에 smCBA 프로모터가 포함되는 구현예에서, smCBA 프로모터는 본원에 참조로 편입되는 U.S. 특허 번호 8,298,818에 기재된 smCBA 프로모터의 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예예서, smCBA 프로모터는 다음의 서열을 갖는다:
GGTACCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCA(서열번호 70).
일부 구현예에서, smCBA 프로모터는 다음의 서열을 갖는다:
AATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAG(서열번호 84).
OTOF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포유류 세포의 핵 DNA로 혼입되거나 에피좀성 단량체 또는 연쇄체에서 안정화되면, 이 폴리뉴클레오티드의 전사체는 당업계에 공지된 방법에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 발현은 포유류 세포를 외부의 화학 시약, 예컨대 전사 인자의 결합 및/또는 RNA 폴리머라아제의 포유류 프로모터에 대한 결합을 조정하고 그럼으로써 유전자 발현을 조절하는 제제에 노출시킴으로써 유도될 수 있다. 화학 시약은 RNA 폴리머라아제 및/또는 전사 인자의 포유류 프로모터에의 결합을, 예를 들어, 프로모터에 결합한 억제자 단백질을 제거함으로써 촉진시키는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 화학 시약은 포유류 프로모터의 RNA 폴리머라아제 및/또는 전사 인자에 대한 친화도를 향상시킴으로써 프로모터의 하류에 위치한 유전자의 전사 속도가 화학 시약의 존재 하에서 증가되도록 하는 역할을 할 수 있다. 상기 메커니즘에 의한 폴리뉴클레오티드 전사를 강력하게 하는 화학 시약의 예는 테트라사이클린 및 독시사이클린을 포함한다. 이들 시약은 상업적으로 이용 가능하며(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 칼즈배드(Carlsbad), CA), 확립된 프로토콜에 따라 유전자 발현을 촉진하기 위해 포유류 세포에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 핵산 벡터 내에 포함될 수 있는 다른 DNA 서열 요소는 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 DNA가 전사 개시 부위에서 전사 인자 및 RNA 폴리머라아제의 결합에 유리한 3차원 배향을 채택하도록 관심있는 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드에서 형태적 변화를 유도하는 또다른 클래스의 조절 요소를 대표한다. 이에 따라, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질을 인코딩하는 것을 포함하며 추가적으로 포유류 인핸서 서열을 포함한다. 현재 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자로부터 공지되어 있으며, 예는 포유류 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린을 인코딩하는 유전자로부터의 인핸서를 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 인핸서는 진핵 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스의 유전적 물질로부터 유래된 것을 또한 포함한다. 예는 복제 원점(bp 100-270)의 후측(late side) 상의 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵생물 유전자 전사의 활성을 유도하는 추가적인 인핸서 서열은 Yaniv, 등, Nature 297:17 (1982)에 개시되어 있다. 인핸서는, 예를 들어, 이러한 유전자의 5' 위치 또는 3' 위치에서, OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 내로 스플라이싱될 수 있다. 바람직한 배향에서, 인핸서는 프로모터의 5' 측에 위치하며, 차례로 OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 5'에 위치한다.
본원에 기재된 핵산 벡터는 우드척 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함할 수 있다. WPRE는 전사체의 핵 외수송(nuclear export)을 촉진시킴으로써 및/또는 발생기(nascent) 전사체의 폴리아데닐화의 효율을 증가시킴으로써, 이에 따라 세포에서의 mRNA의 총 양을 증가시켜 mRNA 수준에서 작용한다. 벡터에서의 WPRE의 추가는 시험관내 및 생체내 둘 다에서, 여러 상이한 프로모터로부터의 전이유전자 발현의 수준에 상당한 개선을 초래할 수 있다. WPRE는 OTOF 단백질의 C-말단을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 poly(A) 서열 사이에서 제2 핵산 벡터 내에 위치할 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, WPRE는 다음의 서열을 갖는다:
GATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGA(서열번호 23).
다른 구현예예서, WPRE는 다음의 서열을 갖는다:
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAA(서열번호 61).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 핵산 벡터는 리포터 서열을 포함하며, 이는 예를 들어, 특이적인 세포 및 조직에서(예를 들어, 달팽이관 유모세포에서) OTOF 유전자 발현을 확인하는 데에 유용할 수 있다. 전이유전자 내에 제공될 수 있는 리포터 서열은 β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제를 인코딩하는 DNA 서열, 및 다른 당업계에 널리 공지된 다른 것을 포함한다. 이들의 발현을 유발하는 조절 요소와 연관될 때, 리포터 서열은 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 기타 분광 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정, 및 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사면역검정(radioimmunoassay; RIA), 및 면역조직화학을 포함하는 면역학적 검정을 포함하는 종래의 수단에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우에, 신호가 있는 벡터의 존재는 β-갈락토시다아제 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 전이유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라아제일 경우에, 신호가 있는 벡터의 존재는 광도계에서 색 또는 광 생산에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
중첩 듀얼 벡터
포유류 세포에서 큰 단백질을 발현하기 위한 첫 번째 접근법은 중첩 듀얼 벡터를 사용하는 것을 수반한다. 이 접근법은 두 개의 핵산 벡터의 사용을 기반으로 하며, 각각은 관심 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분을 함유하고 다른 폴리뉴클레오티드와 중첩되는 서열 영역이 정의되어 있다. 상동성 재조합은 중첩 영역에서 발생할 수 있으며 전장의 관심 단백질을 인코딩하는 단일 핵산 분자의 형성으로 이어질 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 중첩 듀얼 벡터는 적어도 1 킬로베이스(kb)의 중첩 서열(예를 들어, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb 이상의 중첩 서열)을 함유한다. 핵산 벡터는 중첩 영역이 OTOF 엑손 경계에 중심을 두고 경계 양쪽에서 동일한 양의 중첩이 이루어지도록 설계되었다. 경계는 프로모터의 크기와 OTOF C2 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분의 위치를 기반으로 선택된다. 중첩 영역은 C2C 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 외부(예를 들어, C2C 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 뒤)에서 발생하는 엑손 경계의 중심에 있다. C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 내의 엑손 경계는 중첩 영역의 중심으로 선택될 수 있거나, 또는 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 뒤와 C2E 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 앞에 위치한 엑손 경계는 중첩 영역의 중심 역할을 할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 핵산 벡터는 또한 OTOF 유전자의 대략 반절이 각 벡터 내에 함유되도록 설계된다(예를 들어, 각 벡터는 OTOF 단백질의 대략 반절을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다).
하나의 예시적인 중첩 듀얼 벡터 시스템은 1-28번 엑손 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 28번/29번 엑손 경계의 500개 염기쌍(bp) 3' 바로 앞에 작동가능하게 연결된 CAG 프로모터를 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 28번/29번 엑손 경계의 500 bp 5' 바로 앞 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 경우 29-48번 엑손, 인간 OTOF의 경우 29-45번 및 47번 엑손 또는 29-46번 엑손) 및 poly(A) 서열(예를 들어, 소 성장 호르몬(bGH) poly(A) 신호 서열)을 포함하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 이러한 중첩 듀얼 벡터 시스템에서 중첩 서열은 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 뒤에 있는 28번/29번 엑손 경계에 중심에 위치한다. 또 다른 예시적인 중첩 듀얼 벡터 시스템은 1-24번 엑손 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 24번/25번 엑손 경계의 500 bp 3' 바로 앞에 작동가능하게 연결된 CAG 프로모터를 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 24/25번 엑손 경계의 500 bp 5' 바로 앞을 함유하고 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 경우 25-48번 엑손, 인간 OTOF의 경우 25-45번 및 47번 엑손 또는 25-46번 엑손)은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 포함하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 이러한 중첩 듀얼 벡터 시스템에서 중첩 서열은 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 내에 있는 24번/25번 엑손 경계에 중심에 위치한다. 상기 기재된 두 개의 엑손 경계는 1 kb 이하(예를 들어, 대략 1 kb, 950 bp, 900 bp, 850 bp, 800 bp, 750 bp, 700 bp, 650 bp, 600 bp, 550 bp 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp 이하)의 프로모터와 같은 CAG 프로모터와 유사한 크기의 임의의 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터 또는 smCBA 프로모터)와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 전술한 듀얼 벡터 시스템 중 어느 하나에서 CMV 프로모터 또는 smCBA 프로모터가 CAG 프로모터 대신 사용될 수 있다. CAG 프로모터를 대신하여 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터(예를 들어, 상기 기재된 Myo15 프로모터, 예를 들어 서열번호 38, 39 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)를 사용할 수도 있다. 대안적으로, C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분 내 또는 뒤, 그리고 C2E 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분 앞에 있는 상이한 엑손 경계가 선택될 수 있다. 이 크기의 프로모터를 함유하는 핵산 벡터는 임의로 OTOF UTR을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중첩 영역이 OTOF의 28/29번 엑손 경계에 중심에 위치한 전술한 중첩 듀얼 벡터 시스템에서, 제2 핵산 벡터는 전장 OTOF 3' UTR(예를 들어, 인간 OTOF를 인코딩하는 듀얼 벡터 시스템의 1035 bp 인간 OTOF 3' UTR 또는 마우스 OTOF를 인코딩하는 듀얼 벡터 시스템의 1001 bp 마우스 OTOF 3' UTR)을 함유할 수 있다. 중첩 영역이 OTOF의 24/25번 엑손 경계에 중심에 위치한 전술한 중첩 듀얼 벡터 시스템에서, 제1 핵산 벡터와 제2 핵산 벡터 모두 OTOF UTR을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 중첩 듀얼 벡터 시스템의 제1 핵산 벡터는 긴 프로모터(예를 들어, 1 kb보다 긴 프로모터, 예를 들어 1.1 kb, 1.25 kb, 1.5 kb, 1.75 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb 이상)를 함유한다. 이러한 중첩 듀얼 벡터 시스템에서, 중첩 영역은 C2C 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 뒤와 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분 앞에 위치하는 엑손 경계에 중심에 위치할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 중첩 듀얼 벡터 시스템은 작동가능하게 연결된 1-21번 엑손 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 21번/22번 엑손 경계의 500 bp 3' 바로 앞 및 1 kb(예를 들어, 서열번호 36)보다 긴 Myo15 프로모터를 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 21번/22번 엑손 경계의 500 bp 5' 바로 앞 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 경우 29-48번 엑손, 인간 OTOF의 경우 22-45번 및 47번 엑손 또는 22-46번 엑손) 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 20/21번 엑손 경계는 중첩 영역의 중심으로 선택될 수도 있다. 이러한 중첩 듀얼 벡터 시스템에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터 모두 OTOF UTR을 포함할 수 없다. 짧은 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCBA 프로모터, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터, 예를 들어, 서열번호 38, 39, 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 또한 이러한 듀얼 벡터 시스템(예를 들어, 중첩 영역이 21번/22번 엑손 또는 20번/21번 엑손 경계에 중심을 두는 듀얼 벡터 시스템)에서 사용될 수 있다. 짧은 프로모터를 사용하는 경우, 5' OTOF UTR과 같은 추가 요소를 제1 벡터(예를 들어, 1-21번 엑손 및 21번/22번 엑손 경계의 500 bp 바로 3' 앞 또는 OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-20번 엑손 및 20/21번 엑손 경계의 500 bp 바로 3' 앞을 포함하는 벡터)에 포함할 수 있다.
트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터
포유류 세포에서 큰 단백질을 발현하기 위한 두 번째 접근법은 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터를 사용하는 것이다. 이 접근법에서는 별개의 핵산 서열을 함유하는 두 개의 핵산 벡터가 사용되며, 관심 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 관심 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 중첩되지 않는다. 대신에, 제1 핵산 벡터는 관심 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여자 서열 3'을 포함하고, 제2 핵산 벡터는 관심 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수여자 서열 5'를 포함한다. 제1 및 제2 핵산이 동일한 세포에 존재할 때, 이들의 ITR은 연쇄체화(concatemerize)되어 연쇄체화된 ITR이 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수여자 사이에 위치하는 단일 핵산 구조를 형성할 수 있다. 그런 다음 트랜스-스플라이싱이 전사 중에 발생하여 관심 단백질의 N-말단 및 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연속적으로 존재하는 핵산 분자를 생성하여 전장 코딩 서열을 형성한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터는 OTOF 유전자의 대략 반절이 각각의 벡터 내에 함유되도록(예를 들어, 각각의 벡터는 OTOF 단백질의 대략 반절을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유함) 설계된다. 2개의 핵산 벡터 사이에 폴리뉴클레오티드 서열을 나누는 방법의 결정은 프로모터 크기 및 OTOF C2 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분의 위치에 기반하여 이루어질 수 있다. 짧은 프로모터(예를 들어, 1 kb 이하, 예를 들어, 대략 1 kb, 950 bp, 900 bp, 850 bp, 800 bp, 750 bp, 700 bp, 650 bp, 600 bp, 550 bp 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp 이하인 짧은 프로모터), 예컨대 CAG, CMV 프로모터, smCBA 프로모터, 또는 1 kb 이하의 짧은 서열을 갖는 Myo15 프로모터(예를 들어, 본원의 상기에 기재된 Myo15 프로모터, 예를 들어, 서열번호 38, 39, 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)가 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템에서 사용될 때, OTOF 폴리뉴클레오티드 서열은 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분 뒤와 C2E 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예를 들어, 26번/27번 엑손 경계 앞에 발생하는 엑손 경계에서 2개의 핵산 벡터 사이에 분할될 수 있다. 이 크기의 프로모터를 함유하는 핵산 벡터는 OTOF UTR(예를 들어, 전장 5' 및 3' UTR)을 임의로 함유할 수 있다. 긴 프로모터(예를 들어, 1 kb 이상, 예를 들어, 1.1 kb, 1.25 kb, 1.5 kb, 1.75 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb 이상인 프로모터), 예컨대 1 kb 초과의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36)가 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템에서 사용될 때, OTOF 폴리뉴클레오티드 서열은 C2C 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분 뒤와, C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예컨대, 19번/20번 엑손 경계, 20번/21번 엑손 경계 앞, 또는 21번/22번 엑손, 또는 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예컨대 25번/26번 엑손 경계 내 중 어느 하나에 발생하는 엑손 경계에서 2개의 핵산 벡터 사이에 분할될 수 있다. 짧은 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCBA 프로모터, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터, 예를 들어, 서열번호 38, 39, 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 큰 프로모터를 위해 설계된 듀얼 벡터 시스템에서 또한 사용될 수 있으며, 이 경우 추가적인 요소(예를 들어, OTOF UTR 서열)이 제1 벡터(예를 들어, C2C 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분을 함유하는 벡터) 내에 포함될 수 있다.
짧은 프로모터를 사용하는 하나의 예시적인 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-26번 엑손에 작동가능하게 연결된 CAG 프로모터 및 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3'을 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 경우 27-48번 엑손, 인간 OTOF의 27-45번 및 47번 엑손 또는 27-46번 엑손)의 5' 스플라이스 수여자 서열, 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 대안적인 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-28번 엑손 및 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3'에 작동가능하게 연결된 CAG 프로모터를 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 엑손 29-48번, 또는 인간 OTOF의 29-45번 및 47번 엑손 또는 29-46번 엑손)의 5' 스플라이스 수여자 서열 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. CMV 프로모터, smCBA 프로모터 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터(예를 들어, 상기 기재된 Myo15 프로모터, 예를 들어 서열번호 38, 39 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 CAG 프로모터를 대신하여 전술된 듀얼 벡터 시스템 중 하나를 사용할 수 있다. 이러한 핵산 벡터는 또한 각각 제1 및 제2 핵산 벡터에 전장 5' 및 3' OTOF UTR을 함유할 수 있다(예를 들어, 제1 핵산 벡터는 인간 OTOF를 인코딩하는 듀얼 벡터 시스템에서 5' 인간 OTOF UTR(127 bp) 또는 마우스 OTOF를 인코딩하는 듀얼 벡터 시스템에서 5' 마우스 UTR(134 bp)을 함유할 수 있고; 제2 핵산 벡터는 인간 OTOF를 인코딩하는 듀얼 벡터 시스템에서 3' 인간 OTOF UTR(1035 bp) 또는 마우스 OTOF를 인코딩하는 듀얼 벡터 시스템에서 3' 마우스 OTOF UTR(1001 bp)을 함유할 수 있다).
긴 프로모터를 사용하는 예시적인 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-19번 엑손 또는 1-20번 엑손에 작동가능하게 연결된, 1 kb 이상의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36), 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3'을 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 20-48번 엑손, 또는 인간 OTOF의 20-45번 및 47번 엑손 또는 20-46번 엑손)의 5' 스플라이스 수여자 서열 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 대안적으로, 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-20번 엑손 및 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3'에 작동가능하게 연결된 1 kb 이상의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36)를 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 엑손 21-48번, 또는 인간 OTOF의 21-45번 및 47번 엑손 또는 21-46번 엑손)의 5' 스플라이스 수여자 서열 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 전술한 Myo15 프로모터 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템 중 하나의 제1 핵산 벡터와 제2 핵산 벡터 모두 OTOF UTR을 포함하지 않는다. 짧은 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, smCBA 프로모터, CAG 프로모터, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터, 예를 들어 서열번호 38, 39 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 또한 큰 프로모터용으로 설계된 전술한 듀얼 벡터 시스템에 사용될 수 있다. 이러한 듀얼 벡터 시스템에 짧은 프로모터가 함유되어 있는 경우 제1 벡터에 5' OTOF UTR 또는 유사한 크기의 다른 요소가 또한 포함될 수 있다.
OTOF UTR을 수용하기 위해, OTOF 코딩 서열은 상이한 위치 내에 분할될 수 있다. 예를 들어, 제1 핵산 벡터가 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-25번 엑손에 작동가능하게 연결된, 1 kb 초과의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36) 및 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3'을 함유하고; 제2 핵산 벡터가 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 엑손 26-48번, 또는 인간 OTOF의 엑손 26-45번 및 47번 또는 26-46번)의 5' 스플라이스 수여자 서열 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템에서, 제2 핵산은 전장 OTOF 3' UTR(예를 들어, 1035 bp 인간 OTOF 3' UTR)을 또한 함유할 수 있다. 마우스 OTOF의 경우, 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터 시스템은 제1 핵산 벡터가 OTOF 단백질(예를 들어, 마우스 OTOF, 예를 들어, 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-24번 엑손에 작동가능하게 연결된 1 kb 초과의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36) 및 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3'을 함유하는 경우; 및 제2 핵산 벡터가 OTOF 단백질(예를 들어, 마우스 OTOF, 예를 들어, 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 25-48번 엑손의 스플라이스 수여자 서열 5' 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 경우 3' UTR 또한 함유할 수 있다. 이러한 듀얼 벡터 시스템에서 제2 핵산은 전장 OTOF 3' UTR(예를 들어, 1001 bp 마우스 OTOF 3' UTR) 또한 함유할 수 있다. 짧은 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, smCBA 프로모터, CAG 프로모터, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터, 예를 들어 서열번호 38, 39 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 또한 큰 프로모터용으로 설계된 전술한 듀얼 벡터 시스템에 사용될 수 있다. 이러한 듀얼 벡터 시스템에 짧은 프로모터가 포함되어 있는 경우 제1 벡터에 5' OTOF UTR이 또한 포함될 수 있다.
듀얼 하이브리드 벡터
포유류 세포에서 큰 단백질을 발현하기 위한 세 번째 접근법은 듀얼 하이브리드 벡터를 사용하는 것이다. 이 접근법은 상동성 재조합이 발생할 수 있는 중첩 영역과 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수여자 서열을 둘 다 특징으로 한다는 점에서 중첩 듀얼 벡터 전략과 트랜스-스플라이싱 전략의 요소를 조합한다. 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에서, 중첩 영역은 관심 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 부분이 아닌, 제1 및 제2 핵산 벡터 둘 다에 함유된 재조합유전성 영역이며 - 관심 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 관심 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이 접근법에서 중첩되지 않는다. 재조합유전성 영역은 제1 핵산 벡터의 스플라이스 공여자 서열의 3'이고 제2 핵산 벡터의 스플라이스 수여자 서열의 5'이다. 그 다음에, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 다음 2가지 메커니즘 중 어느 하나에 기반하여 단일 서열을 형성하도록 이어질 수 있다: 1) 중첩 영역에서의 재조합, 또는 2) ITR의 연쇄체화. 나머지 재조합유전성 영역(들) 및/또는 연쇄체화된 ITR은 스플라이싱에 의해 제거되어, 전장 관심 단백질을 인코딩하는 인접 폴리뉴클레오티드 서열의 형성으로 이어진다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 재조합유전성 영역은 GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열번호 19)의 서열을 갖는 F1 파지 AK 유전자 및 본원에 참조로 편입되는 U.S. 특허 번호 8,236,557에 기재된 바와 같은 알칼리 포스파타아제(AP) 유전자 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 다음의 서열을 갖는다:
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCGTATAGGAGGACCGTGTAGGCCTTCCTGTCCCGGGCCTTGCCAGCGGCCAGCCCGATGAAGGAGCTCCCTCGCAGGGGGTAGCCTCCGAAGGAGAAGACGTGGGAGTGGTCGGCAGTGACGAGGCTCAGCGTGTCCTCCTCGCTGGTGAGCTGGCCCGCCCTCTCAATGGCGTCGTCGAACATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGGTAAGCCCTGCTTTCATGATGACCATGGTCGATGCGACCACCCTCCACGAAGAGGAAGAAGCCGCGGGGGTGTCTGCTCAGCAGGCGCAGGGCAGCCTCTGTCATCTCCATCAGGGAGGGGTCCAGTGTGGAGTCTCGGTGGATCTCGTATTTCATGTCTCCAGGCTCAAAGAGACCCATGAGATGGGTCACAGACGGGTCCAGGGAAGCCTGCATGAGCTCAGTGCGGTTCCACACGTACCGGGCACCCTGGCGTTCGCCGAGCCATTCCTGCACCAGATTCTTCCCGTCCAGCCTGGTCCCACCTTGGCTGTAGTCATCTGGGTACTCAGGGTCTGGGGTTCCCATGCGAAACATGTACTTTCGGCCTCCA(서열번호 62).
일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 다음의 서열을 갖는다:
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCGTATAGGAGGACCGTGTAGGCCTTCCTGTCCCGGGCCTTGCCAGCGGCCAGCCCGATGAAGGAGCTCCCTCGCAGGGGGTAGCCTCCGAAGGAGAAGACGTGGGAGTGGTCGGCAGTGACGAGGCTCAGCGTGTCCTCCTCG CTGGTGA(서열번호 63).
일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 다음의 서열을 갖는다:
GCTGGCCCGCCCTCTCAATGGCGTCGTCGAACATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGGTAAGCCCTGCTTTCATGATGACCATGGTCGATGCGACCACCCTCCACGAAGAGGAAGAAGCCGCGGGGGTGTCTGCTCAGCAGGCGCAGGGCAGCCTCTGTCATCTCCATCAGGGAGGGGTCCAGTGTGGAGTCTCGGTGGATCTCGTATTTCATGTCTCCAGGCTCAAAGAGACCCATGAGATGGGTCACAGACGGGTCCAGGGAAGCCTGCATGAGCTCAGTGCGGTTCCACACGTACCGGGCACCCTGGCGTTCGCCGAGCCATTCCTGCACCAGATTCTTCCCGTCCAGCCTGGTCCCACCTTGGCTGTAGTCATCTGGGTACTCAGGGTCTGGGGTTCCCATGCGAAACATGTACTTTCGGCCTCCA(서열번호 64).
일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 다음의 서열을 갖는다:
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTC(서열번호 65)
일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 다음의 서열을 갖는다:
CGTATAGGAGGACCGTGTAGGCCTTCCTGTCCCGGGCCTTGCCAGCGGCCAGCCCGATGAAGGAGCTCCCTCGCAGGGGGTAGCCTCCGAAGGAGAAGACGTGGGAGTGGTCGGCAGTGACGAGGCTCAGCGTGTCCTCCTCGCTGGTGAGCTGGCCCGCCCTCTCAATGGCGTCGTCGAACATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGGTAAGCCCTGCTTTCATGATGACCATGGTCGATGCGACCACCCTCCACGAAGAGGAAGAAGCCGCGGGGGTGTCTGCTCAGCAGG(서열번호 66).
일부 구현예에서, AP 유전자 단편은 다음의 서열을 갖는다:
CGCAGGGCAGCCTCTGTCATCTCCATCAGGGAGGGGTCCAGTGTGGAGTCTCGGTGGATCTCGTATTTCATGTCTCCAGGCTCAAAGAGACCCATGAGATGGGTCACAGACGGGTCCAGGGAAGCCTGCATGAGCTCAGTGCGGTTCCACACGTACCGGGCACCCTGGCGTTCGCCGAGCCATTCCTGCACCAGATTCTTCCCGTCCAGCCTGGTCCCACCTTGGCTGTAGTCATCTGGGTACTCAGGGTCTGGGGTTCCCATGCGAAACATGTACTTTCGGCCTCCA(서열번호 67).
본원에 기재된 방법 및 조성물(예를 들어, 트랜스-스플라이싱 및 듀얼 하이브리드 접근법)에 사용하기 위한 예시적인 스플라이스 공여자 서열은 서열 TAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT(서열번호 20)를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물(예를 들어, 트랜스-스플라이싱 및 듀얼 하이브리드 접근법)에 사용하기 위한 예시적인 스플라이스 수여자 서열은 서열 GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG(서열번호 21)을 갖는다. 스플라이스 공여자 서열 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGA(서열번호 68) 및 스플라이스 수여자 서열 TAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG(서열번호 69)은 또한 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수여자 서열의 추가적인 예는 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 듀얼 하이브리드 벡터는 OTOF의 대략 반절이 각각의 벡터 내에 함유되도록(예를 들어, 각각의 벡터가 OTOF 단백질의 대략 반절을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하도록) 설계된다. 2개의 핵산 벡터 사이에 폴리뉴클레오티드 서열을 나누는 방법의 결정은 프로모터 크기 및 OTOF C2 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분의 위치에 기반하여 이루어진다. 짧은 프로모터(예를 들어, 1 kb 이하, 예를 들어, 대략 1 kb, 950 bp, 900 bp, 850 bp, 800 bp, 750 bp, 700 bp, 650 bp, 600 bp, 550 bp 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp 이하의 짧은 프로모터), 예컨대 CAG, CMV, smCBA, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터(예를 들어, 본원의 상기에 기재된 Myo15 프로모터, 예를 들어, 서열번호 38, 39 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)가 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에서 사용될 때, OTOF 폴리뉴클레오티드 서열은 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분 뒤와 C2E 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예를 들어, 26번/27번 엑손 경계 앞에 발생하는 엑손 경계에서 2개의 핵산 벡터 사이에 분할된다. 이 크기의 프로모터를 함유하는 핵산 벡터는 OTOF UTR(예를 들어, 전장 5' 및 3' UTR)을 임의로 함유할 수 있다. 긴 프로모터(예를 들어, 1 kb 초과, 예를 들어, 1.1 kb, 1.25 kb, 1.5 kb, 1.75 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb 이상의 프로모터), 예컨대 1 kb 이상의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36)가 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에서 사용될 때, OTOF 폴리뉴클레오티드 서열은 C2C 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분 뒤와, C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예컨대, 19번/20번 엑손 경계, 20번/21번 엑손 경계, 21번/22번 엑손 경계 앞 또는 C2D 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예컨대 25번/26번 엑손 경계 내 중 어느 하나에 발생하는 엑손 경계에서 2개의 핵산 벡터 사이에 분할될 것이다. 짧은 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, CAG 프로모터, smCBA 프로모터, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터, 예를 들어, 서열번호 38, 39, 또는 49-60의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 큰 프로모터를 위해 설계된 듀얼 벡터 시스템에서 또한 사용될 수 있으며, 이 경우 추가적인 요소(예를 들어, OTOF UTR 서열)이 제1 벡터(예를 들어, C2C 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분을 함유하는 벡터) 내에 포함될 수 있다.
짧은 프로모터를 사용하는 하나의 예시적인 듀얼 하이브리드 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-26번 엑손에 작동가능하게 연결된 CAG 프로모터, 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3', 및 스플라이스 공여자 서열의 재조합유전성 영역 3'을 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 재조합유전성 영역, 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 27-48번 엑손, 또는 인간 OTOF의 27-45번 및 47번 엑손 또는 27-46번 엑손)을 함유하는 스플라이스 수여자 서열의 폴리뉴클레오티드 3', 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 제1 및 제2 핵산 벡터는 각각 전장 5' 및 3' OTOF UTR을 또한 함유할 수 있다(예를 들어, 127 bp 인간 OTOF 5' UTR은 제1 핵산 벡터 내에 포함될 수 있으며, 1035 bp 인간 OTOF 3' UTR은 제2 핵산 벡터 내에 포함될 수 있다). 짧은 프로모터를 사용하는 또 다른 예시적인 듀얼 하이브리드 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-28번 엑손에 작동가능하게 연결된 CAG 프로모터, 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3', 및 스플라이스 공여자 서열의 재조합유전성 영역 3'을 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 재조합유전성 영역, 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 경우 29-48번, 또는 인간 OTOF의 경우 29-45번 및 47번 엑손 또는 29-46번 엑손)을 함유하는 스플라이스 수여자 서열의 폴리뉴클레오티드 3', 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 제1 및 제2 핵산 벡터는 각각 전장 5' 및 3' OTOF UTR을 또한 함유할 수 있다(예를 들어, 134 bp 마우스 OTOF 5' UTR은 제1 핵산 벡터에 포함될 수 있고, 1001 bp 마우스 OTOF 3' UTR은 제2 핵산 벡터에 포함될 수 있다). CMV 프로모터, smCBA 프로모터 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터(예를 들어, 상기 기재된 Myo15 프로모터, 예를 들어 서열번호 38, 39 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 CAG 프로모터를 대신하여 전술한 듀얼 벡터 시스템 중 하나를 사용할 수 있다.
긴 프로모터를 사용하는 예시적인 듀얼 하이브리드 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-19번 엑손에 작동가능하게 연결된, 1 kb 이상의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36), 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3', 스플라이스 공여자 서열의 재조합유전성 영역 3'을 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 재조합유전성 영역, 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 20-48번 엑손, 또는 인간 OTOF의 20-45번 및 47번 또는 20-46번 엑손)을 함유하는 스플라이스 수여자 서열의 폴리뉴클레오티드 3', 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 긴 프로모터를 사용하는 또 다른 예시적인 듀얼 하이브리드 벡터 시스템은 OTOF 단백질(예를 들어, 마우스 OTOF, 예를 들어, 서열번호 6 또는 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-20번 엑손에 작동가능하게 연결된, 1 kb 이상의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36), 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3', 및 스플라이스 공여자 서열의 재조합유전성 영역 3'을 함유하는 제1 핵산 벡터; 및 재조합유전성 영역, 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', OTOF 단백질(예를 들어, 마우스 OTOF, 예를 들어, 서열번호 6 또는 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 21-48번 엑손, 또는 인간 OTOF의 21-45번 및 47번 또는 20-46번 엑손)을 함유하는 스플라이스 수여자 서열의 폴리뉴클레오티드 3', 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 전술한 Myo15 프로모터 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에서 제1 및 제2 핵산 벡터 중 어느 것도 OTOF UTR을 함유하지 않는다. 짧은 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, smCBA 프로모터, CAG 프로모터, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터, 예를 들어, 서열번호 38, 39, 또는 49-60 중 어느 하나의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 큰 프로모터용으로 설계된 전술한 듀얼 벡터 시스템에서 또한 사용될 수 있다. 이들 듀얼 벡터 시스템이 짧은 프로모터를 함유하는 경우, 이들은 제1 벡터 내에 추가적인 요소(예를 들어, 5' OTOF UTR)을 또한 포함할 수 있다.
OTOF UTR을 수용하기 위해, OTOF 코딩 서열은 상이한 위치 내에 분할될 수 있다. 예를 들어, 제1 핵산 벡터가 OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-25번 엑손에 작동가능하게 연결된, 1 kb 이상의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36), 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3', 및 스플라이스 공여자 서열의 재조합유전성 영역 3'을 함유하고; 제2 핵산 벡터가 재조합유전성 영역, 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', OTOF 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 5, 또는 마우스 OTOF, 예를 들어 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 엑손(예를 들어, 마우스 OTOF의 26-48번 엑손, 또는 인간 OTOF의 26-45번 및 47번 엑손 또는 26-46번 엑손)을 함유하는 스플라이스 수여자 서열의 폴리뉴클레오티드 3', 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에서, 제2 핵산은 전장 OTOF 3' UTR(예를 들어, 1035 bp 인간 OTOF UTR)을 또한 함유할 수 있다. 마우스 OTOF의 경우, 듀얼 하이브리드 벡터 시스템은 제1 핵산 벡터가 OTOF 단백질(예를 들어, 마우스 OTOF, 예를 들어, 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-24번 엑손에 작동가능하게 연결된 1 kb 이상의 Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36), 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3' 및 스플라이스 공여자 서열의 3' 재조합유전성 영역을 함유하는 경우; 및 제2 핵산 벡터가 재조합유전성 영역, 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', OTOF 단백질(예를 들어, 마우스 OTOF, 예를 들어, 서열번호 6)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 25-48번 엑손을 함유하는 스플라이스 수여자 서열의 폴리뉴클레오티드 3' 및 poly(A) 서열(예를 들어, bGH poly(A) 신호 서열)을 함유하는 경우 3' UTR 또한 함유할 수 있다. 이러한 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에서 제2 핵산은 전장 OTOF 3' UTR(예를 들어, 1001bp 마우스 OTOF UTR)을 또한 포함할 수 있다. 짧은 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, smCBA 프로모터, CAG 프로모터, 또는 1 kb 이하의 서열을 갖는 Myo15 프로모터, 예를 들어, 서열번호 38, 39, 또는 49-60의 서열을 갖는 Myo15 프로모터)는 큰 프로모터를 위해 설계된 전술한 듀얼 벡터 시스템에서 또한 사용될 수 있다. 이들 듀얼 벡터 시스템이 짧은 프로모터를 함유하는 경우, 이들은 제1 벡터 내에 추가적인 요소(예를 들어, 5' OTOF UTR)을 또한 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 듀얼 하이브리드 벡터는 임의적으로 제1 및 제2 핵산 벡터 둘 다에 분해 신호 서열을 포함할 수 있다. 분해 신호 서열은 재조합 및/또는 스플라이싱을 거치는 것에 실패한 폴리뉴클레오티드로부터 OTOF 단백질 부분의 발현을 예방 또는 감소시키기 위해 포함될 수 있다. 분해 신호 서열은 제1 핵산 벡터에서 재조합유전성 영역의 3'에 위치하며, 제2 핵산 벡터에서는 재조합유전성 영역과 스플라이스 수여자 사이에 위치한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 분해 신호 서열은 GCCTGCAAGAACTGGTTCAGCAGCCTGAGCCACTTCGTGATCCACCTG(서열번호 22)의 서열을 갖는다.
중첩, 트랜스-스플라이싱 및 듀얼 하이브리드 벡터의 예시적인 쌍이 하기 표 4에 기재되어 있다.
표 4: 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 중첩, 트랜스-스플라이싱 및 하이브리드 듀얼 벡터의 예시적인 쌍
일부 구현예에서, OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열(예를 들어, 인트론을 포함하지 않는 서열)이다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템 내의 제1 및/또는 제2 핵산 벡터는 인트로닉(intronic) 서열을 포함할 수 있다. 인트로닉 서열은 OTOF 코딩 서열 내의 하나 이상의 엑손 사이에 포함될 수 있거나, 또는 인트로닉 서열은 코딩 서열의 엑손과 핵산 벡터의 또다른 구성요소 사이(예를 들어, OTOF 코딩 서열의 엑손과 제1 핵산 서열 내의 스플라이스 공여자 서열 사이 또는 OTOF 코딩 서열의 엑손과 제2 핵산 벡터의 스플라이스 수여자 서열 사이)에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 20번/21번 엑손 경계에서 듀얼 벡터 시스템 내의 제1 및 제2 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 사이에 분할된다. OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 OTOF 아이소형 5를 인코딩하고 20번/21번 엑손 경계에서 제1 및 제2 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 사이에 분할될 때, OTOF의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다음의 서열을 갖는다:
ATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACCGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTG(서열번호 71).
상기 서열은 OTOF 아이소형 1의 1-20번 엑손에도 상응한다.
OTOF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 OTOF 아이소형 5를 인코딩하고 20번/21번 엑손 경계에서 듀얼 벡터 시스템 내의 제1 및 제2 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 사이에 분할될 때, OTOF의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다음의 서열을 갖는다:
GAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGA(서열번호 72).
폴리뉴클레오티드가 OTOF 아이소형 5를 인코딩하고 20번/21번 엑손 경계에서 제1 및 제2 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 사이에 분할되는 구현예에서, OTOF 폴리펩티드의 N-말단 부분은 다음의 서열을 갖는다:
MALLIHLKTVSELRGRGDRIAKVTFRGQSFYSRVLENCEDVADFDETFRWPVASSIDRNEMLEIQVFNYSKVFSNKLIGTFRMVLQKVVEESHVEVTDTLIDDNNAIIKTSLCVEVRYQATDGTVGSWDDGDFLGDESLQEEEKDSQETDGLLPGSRPSSRPPGEKSFRRAGRSVFSAMKLGKNRSHKEEPQRPDEPAVLEMEDLDHLAIRLGDGLDPDSVSLASVTALTTNVSNKRSKPDIKMEPSAGRPMDYQVSITVIEARQLVGLNMDPVVCVEVGDDKKYTSMKESTNCPYYNEYFVFDFHVSPDVMFDKIIKISVIHSKNLLRSGTLVGSFKMDVGTVYSQPEHQFHHKWAILSDPDDISSGLKGYVKCDVAVVGKGDNIKTPHKANETDEDDIEGNLLLPEGVPPERQWARFYVKIYRAEGLPRMNTSLMANVKKAFIGENKDLVDPYVQVFFAGQKGKTSVQKSSYEPLWNEQVVFTDLFPPLCKRMKVQIRDSDKVNDVAIGTHFIDLRKISNDGDKGFLPTLGPAWVNMYGSTRNYTLLDEHQDLNEGLGEGVSFRARLLLGLAVEIVDTSNPELTSSTEVQVEQATPISESCAGKMEEFFLFGAFLEASMIDRRNGDKPITFEVTIGNYGNEVDGLSRPQRPRPRKEPGDEEEVDLIQNASDDEAGDAGDLASVSSTPPMRPQVTDRNYFHLPYLERKPCIYIKSWWPDQRRRLYNANIMDHIADKLEEGLNDIQEMIKTEKSYPERRLRGVLEELSCGCCRFLSLADKDQGHSSRTRLDRERLKSCMREL(서열번호 73).
상기 서열은 또한 1-20번 엑손에 의해 인코딩된 OTOF 아이소형 1 단백질의 N-말단 부분에 상응한다.
폴리뉴클레오티드가 OTOF 아이소형 5를 인코딩하고 20번/21번 엑손 경계에서 제1 및 제2 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 사이에 분할되는 구현예에서, OTOF 폴리펩티드의 C-말단 부분은 다음의 서열을 갖는다:
ENMGQQARMLRAQVKRHTVRDKLRLCQNFLQKLRFLADEPQHSIPDIFIWMMSNNKRVAYARVPSKDLLFSIVEEETGKDCAKVKTLFLKLPGKRGFGSAGWTVQAKVELYLWLGLSKQRKEFLCGLPCGFQEVKAAQGLGLHAFPPVSLVYTKKQAFQLRAHMYQARSLFAADSSGLSDPFARVFFINQSQCTEVLNETLCPTWDQMLVFDNLELYGEAHELRDDPPIIVIEIYDQDSMGKADFMGRTFAKPLVKMADEAYCPPRFPPQLEYYQIYRGNATAGDLLAAFELLQIGPAGKADLPPINGPVDVDRGPIMPVPMGIRPVLSKYRVEVLFWGLRDLKRVNLAQVDRPRVDIECAGKGVQSSLIHNYKKNPNFNTLVKWFEVDLPENELLHPPLNIRVVDCRAFGRYTLVGSHAVSSLRRFIYRPPDRSAPSWNTTVRLLRRCRVLCNGGSSSHSTGEVVVTMEPEVPIKKLETMVKLDATSEAVVKVDVAEEEKEKKKKKKGTAEEPEEEEPDESMLDWWSKYFASIDTMKEQLRQQEPSGIDLEEKEEVDNTEGLKGSMKGKEKARAAKEEKKKKTQSSGSGQGSEAPEKKKPKIDELKVYPKELESEFDNFEDWLHTFNLLRGKTGDDEDGSTEEERIVGRFKGSLCVYKVPLPEDVSREAGYDSTYGMFQGIPSNDPINVLVRVYVVRATDLHPADINGKADPYIAIRLGKTDIRDKENYISKQLNPVFGKSFDIEASFPMESMLTVAVYDWDLVGTDDLIGETKIDLENRFYSKHRATCGIAQTYSTHGYNIWRDPMKPSQILTRLCKDGKVDGPHFGPPGRVKVANRVFTGPSEIEDENGQRKPTDEHVALLALRHWEDIPRAGCRLVPEHVETRPLLNPDKPGIEQGRLELWVDMFPMDMPAPGTPLDISPRKPKKYELRVIIWNTDEVVLEDDDFFTGEKSSDIFVRGWLKGQQEDKQDTDVHYHSLTGEGNFNWRYLFPFDYLAAEEKIVISKKESMFSWDETEYKIPARLTLQIWDADHFSADDFLGAIELDLNRFPRGAKTAKQCTMEMATGEVDVPLVSIFKQKRVKGWWPLLARNENDEFELTGKVEAELHLLTAEEAEKNPVGLARNEPDPLEKPNRPDTAFVWFLNPLKSIKYLICTRYKWLIIKIVLALLGLLMLGLFLYSLPGYMVKKLLGA(서열번호 74).
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 핵산 벡터를 생산하기 위해 사용될 수 있는 전송 플라스미드가 표 5에 제공된다. 이러한 전송 플라스미드는 OTOF 아이소형 5의 발현을 위해 설계되었다. 전송 플라스미드(예를 들어, 핵산 벡터에 의해 전달될, 예를 들어 AAV에 의해 전달될 DNA 서열을 함유하는 플라스미드)는 헬퍼 플라스미드(예를 들어, AAV 제조에 필요한 단백질을 제공하는 플라스미드) 및 rep/cap 플라스미드(예를 들어, AAV 캡시드 및 전송 플라스미드 DNA 서열을 캡시드 쉘 내로 삽입하는 단백질을 제공하는 플라스미드)와 함께 생산자 세포 내로 동시-전달되어 투여를 위한 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 생산할 수 있다. 핵산 벡터(예를 들어, OTOF의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 및 OTOF의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터))가 투여에 앞서 (예를 들어, 단일 제형으로) 조합될 수 있다. 다음의 전송 플라스미드는 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에서의 공동-제형화 또는 공동-투여(예를 들어, 동시에 또는 순차적으로 투여)를 위해 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 생산하도록 설계된다: 서열번호 75 및 서열번호 76; 서열번호 77 및 서열번호 78; 서열번호 79 및 서열번호 76; 서열번호 80 및 서열번호 78; 서열번호 81 및 서열번호 82; 및 서열번호 83 및 서열번호 82.
표 5: 듀얼 하이브리드 벡터 시스템의 생산을 위한 전송 플라스미드
OTOF의 발현을 위한 벡터
전사 및 번역의 높은 비율을 달성하는 것에 더하여, 포유류 세포에서의 외인성 유전자의 안정한 발현은 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드의 포유류 세포의 핵 게놈 내로의 통합에 의해 달성될 수 있다. 포유류 세포의 핵 DNA 내로의, 외인성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 통합을 위한 다양한 벡터가 개발되어왔다. 발현 벡터의 예는 예를 들어, WO 1994/011026에 개시되어 있으며 이는 본원에 참조로 편입된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 발현 벡터는 OTOF의 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 예를 들어, 이들 제제의 발현 및/또는 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 포유류 세포의 게놈 내로의 통합을 위해 사용되는 추가적인 서열 요소를 함유한다. OTOF의 발현을 위해 사용될 수 있는 특정한 벡터는 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 영역을 함유하는 플라스미드를 포함하며, 이는 유전자 전사를 지시한다. OTOF의 발현을 위한 다른 유용한 벡터는 이들 유전자의 번역 속도를 향상시키거나 유전자 전사로부터 기인된 mRNA의 안정성 또는 핵 외수송을 개선하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이들 서열 요소는, 예를 들어, 발현 벡터 상에 있는 유전자의 효율적인 전사를 지시하기 위해 5' 및 3' 비번역 영역 및 폴리아데닐화 신호 부위를 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 발현 벡터는 이러한 벡터를 함유하는 세포의 선택을 위한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 함유할 수 있다. 적합한 마커의 예는 항생제, 예컨대 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 또는 누르세오트리신에 대한 내성을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
핵산 전달을 위한 AAV 벡터
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 핵산은 세포 내로의 이들의 도입을 촉진하기 위해 재조합 AAV(rAAV) 벡터 및/또는 비리온 내로 혼입된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 유용한 rAAV 벡터는 (1) 발현될 이종(heterologous) 서열(예를 들어, OTOF 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및 (2) 이종 유전자의 안정성 및 발현을 촉진하는 바이러스성 서열을 포함하는 재조합 핵산 작제물이다. 바이러스성 서열은 비리온 내로의 DNA의 복제 및 패키징(예를 들어, 기능적 ITR)을 위해 시스(cis)로 요구되는 AAV의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 rAAV 벡터는 마커 또는 리포터 유전자를 또한 함유할 수 있다. 유용한 rAAV 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 AAV 야생형 유전자 중 하나 이상을 갖지만, 기능적인 측방 ITR 서열을 유지한다. AAV ITR은 특별한 적용법에 적합한 임의의 혈청형의 것일 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해, ITR은 AAV2 ITR일 수 있다. rAAV 벡터를 사용하기 위한 방법은, 예를 들어, Tal 등, J. Biomed. Sci. 7:279 (2000), 및 Monahan 및 Samulski, Gene Delivery 7:24 (2000)에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은, 이들이 유전자 전달을 위한 AAV 벡터와 관련이 있는 경우에 본원에 참조로 편입된다.
본원에 기재된 핵산 및 벡터는 핵산 또는 벡터의 세포 내로의 도입을 촉진하기 위해 rAAV 비리온 내로 혼입될 수 있다. AAV의 캡시드 단백질은 비리온의 외부의, 비-핵산 부분을 구성하며 AAV 캡 유전자에 의해 인코딩된다. 캡 유전자는 비리온 조립에 필요한 3개의 바이러스성 코트 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 인코딩한다. rAAV 비리온의 작제물은, 예를 들어, US 5,173,414; US 5,139,941; US 5,863,541; US 5,869,305; US 6,057,152; 및 US 6,376,237; 뿐만 아니라 Rabinowitz 등, J. Virol. 76:791 (2002) 및 Bowles 등, J. Virol. 77:423 (2003)에 기재되어있으며, 이들의 각각의 개시내용은, 이들이 유전자 전달을 위한 AAV 벡터와 관련이 있는 경우에 본원에 참조로 편입된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 rAAV 비리온은 AAV1, AAV2, AAV2quad(Y-F), AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, rh10, rh39, rh43, rh74, Anc80, Anc80L65, DJ/8, DJ/9, 7m8, PHP.B, PHP.eb, 및 PHP.S.를 포함하는 다양한 AAV 혈청형으로부터 유래된 것을 포함한다. 달팽이관 유모세포를 표적화하기 위해, AAV1, AAV2, AAV6, AAV9, Anc80, Anc80L65, DJ/9, 7m8, 및 PHP.B가 특별히 유용할 수 있다. 망막의 형질도입을 위해 진화된 혈청형이 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 또한 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 제1 및 제2 핵산 벡터는 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형을 가질 수 있다. AAV 벡터 및 상이한 혈청형의 AAV 단백질의 작제 및 사용은, 예를 들어, Chao 등, Mol. Ther. 2:619 (2000); Davidson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428 (2000); Xiao 등, J. Virol. 72:2224 (1998); Halbert 등, J. Virol. 74:1524 (2000); Halbert 등, J. Virol. 75:6615 (2001); 및 Auricchio 등, Hum. Molec. Genet. 10:3075 (2001)에 기재되며, 이들의 각각의 개시내용은, 이들이 유전자 전달을 위한 AAV 벡터와 관련이 있는 경우에 본원에 참조로 편입된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 또한 유용한 것은 위형(pseudotyped) rAAV 벡터이다. 위형 벡터는 주어진 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 등)이 아닌 혈청형으로부터 유래된 캡시드 유전자가 있는, 위형의 주어진 혈청형(예를 들어, AAV9)의 AAV 벡터를 포함한다. 위형 rAAV 비리온의 작제 및 사용과 연관된 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Duan 등, J. Virol. 75:7662 (2001); Halbert 등, J. Virol. 74:1524 (2000); Zolotukhin 등, Methods, 28:158 (2002); 및 Auricchio 등, Hum. Molec. Genet. 10:3075 (2001)에 기재된다.
비리온 캡시드 내에 돌연변이를 갖는 AAV 비리온은 비-돌연변이화된 캡시드 비리온보다 효과적으로 특별한 세포 유형을 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 AAV 돌연변이는 특이적 세포 유형에 대한 AAV의 표적화를 가능하게 하기 위한 리간드 삽입 돌연변이를 갖는다. 삽입 돌연변이, 알라닌 스크리닝 돌연변이, 및 에피토프 태그 돌연변이를 포함하는 AAV 캡시드 돌연변이의 작제 및 특징은 Wu 등, J. Virol 74:8635 (2000)에 기재된다. 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 다른 rAAV 비리온은 바이러스의 분자 육종(molecular breeding)에 의해서 뿐만 아니라 엑손 셔플링(shuffling)에 의해 생성되는 캡시드 하이브리드를 포함한다. 예를 들어, Soong 등, Nat. Genet., 25:436 (2000) 및 Kolman 및 Stemmer, Nat. Biotechnol. 19:423 (2001)을 참조한다.
일부 구현예에서, 기능적 OTOF 단백질을 전달하기 위한 AAV 벡터의 사용은 듀얼 벡터 시스템의 사용을 필요로 하는데, 여기서 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원이 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하고 제2 구성원이 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하여, 세포로 듀얼 벡터를 투여하면, 2개의 벡터 내에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이 이어져 전장 OTOF 단백질의 생산을 초래하는 단일 서열을 형성할 수 있도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 OTOF 아이소형 5 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 OTOF 아이소형 1 단백질이다.
일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은, 5'에서 3' 순서로, 제1 역 말단 반복부("ITR"); 프로모터(예를 들어, Myo15 프로모터); 코작 서열; OTOF 코딩 서열의 N-말단 부분; 스플라이스 공여자 서열; AP 유전자 단편(예를 들어, AP 헤드 서열); 및 제2 ITR을 또한 포함할 것이며; 듀얼 벡터 시스템의 제2 구성원은, 5'에서 3' 순서로, 제1 ITR; AP 유전자 단편(예를 들어, AP 헤드 서열); 스플라이스 수여자 서열; OTOF 코딩 서열의 C-말단 부분; polyA 서열; 및 제2 ITR을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, OTOF 코딩 서열의 N-말단 부분 및 OTOF 코딩 서열의 C-말단 부분은 중첩되지 않으며 세포 내에서 (예를 들어, 중첩 영역(AP 유전자 단편)에서의 재조합에 의해, 또는 ITR의 연쇄체화에 의해) 이어져서 서열번호 1에 제시된 바와 같이 전장 OTOF 아미노 서열(예를 들어, OTOF 아이소형 1의 경우 서열번호 1에 제시된 서열, 또는 OTOF 아이소형 5의 경우 서열번호 5에 제시된 서열)을 생산한다. 특별한 구현예에서, OTOF 코딩 서열의 N-말단 부분은 OTOF의 1-802번 아미노산(예를 들어, 서열번호 73에 상응하는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 1-802번 아미노산)을 인코딩하고 OTOF 코딩 서열의 C-말단 부분은 OTOF의 803-1997번 아미노산(예를 들어, 서열번호 1의 803-1997번 아미노산, 또는 서열번호 74에 상응하는 서열번호 5의 803-1997번 아미노산)을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은 OTOF 아이소형 5 단백질의 N-말단 802개 아미노산(서열번호 5의 1-802번 아미노산)을 인코딩하는 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 서열번호 38의 Myo15 프로모터(또한 서열번호 81의 235-1199번 뉴클레오티드에 해당됨)를 포함하며, 이는 그 단백질을 인코딩하는 네이티브(native) 폴리뉴클레오티드 서열의 1-20번 엑손에 의해 인코딩된다. 특정한 구현예예서, OTOF 아이소형 5 단백질의 N-말단 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 81의 1222-3627번 뉴클레오티드이다. 일부 구현예예서, OTOF 아이소형 5 단백질의 N-말단 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 유전자 코드의 중복에 의해, 서열번호 5의 1-802번 아미노산을 인코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열이다. OTOF 아이소형 5 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현을 위해 부분적으로 또는 완전히 코돈-최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은 서열번호 81의 1216-1225번 뉴클레오티드에 상응하는 코작 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은 서열번호 81의 3628-3711번 뉴클레오티드에 상응하는 스플라이스 공여자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은 서열번호 81의 3718-4004번 뉴클레오티드에 상응하는 AP 헤드 서열을 포함한다. 특별한 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은 역 말단 반복부에 의해 5' 및 3' 측의 각각에 측방된 서열번호 81의 235-4004번 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 측방 역 말단 반복부는 AAV2 Rep 유전자가 있는 플라스미드에 의해 캡시드화될 수 있는 AAV2 역 말단 반복부의 임의의 변이체이다. 특정한 구현예에서, 5' 측방 역 말단 반복부는 서열번호 81의 12-141번 뉴클레오티드에 상응하는 서열 또는 이에 대해 적어도 80% 서열 동일성(적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 서열을 가지며; 3' 측방 역 말단 반복부는 서열번호 81의 4098-4227번 뉴클레오티드에 상응하는 서열 또는 이에 대해 적어도 80% 서열 동일성(적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 서열을 갖는다. (전형적으로 바이러스성 벡터 형성을 위해 필요한 AAV 유전자가 있는 다른 플라스미드와 함께 플라스미드로 세포를 형질감염시킴으로써) 바이러스성 벡터를 생성하기 위해 사용되는 전송 플라스미드(예를 들어, 서열번호 75, 77, 79, 80, 81, 또는 83 중 임의의 것) 내의 역 말단 반복부 서열의 임의의 주어진 쌍에 대해, 바이러스성 벡터 내의 상응하는 서열은 재조합 동안 "플립(flip)" 또는 "플랍(flop)" 방향을 채택하는 ITR로 인해 변경될 수 있다는 점이 당업자에게 이해될 것이다. 이에 따라, 전송 플라스미드 내의 ITR의 서열은 필연적으로 그들로부터 제조된 바이러스성 벡터에서 발견되는 동일한 서열이 아니다. 그러나, 일부 매우 특이적인 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은 서열번호 81의 12-4227번 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제2 구성원은 종결 코돈 바로 뒤에 있는 OTOF 아이소형 5 단백질의 C-말단 1195번 아미노산(서열번호 5의 803-1997번 아미노산)을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 구현예예서, OTOF 아이소형 5 단백질의 C-말단 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 82의 587-4174번 뉴클레오티드이다. 일부 구현예예서, OTOF 아이소형 5 단백질의 C-말단 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 유전자 코드의 중복에 의해, 서열번호 5의 803-1997번 아미노산을 인코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열이다. OTOF 아이소형 5 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현을 위해 부분적으로 또는 완전히 코돈-최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제2 구성원은 서열번호 82의 538-586번 뉴클레오티드에 상응하는 스플라이스 수여자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제2 구성원은 서열번호 82의 229-515번 뉴클레오티드에 상응하는 AP 헤드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제2 구성원은 서열번호 82의 4217-4438번 뉴클레오티드에 상응하는 poly(A) 서열을 포함한다. 특별한 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제2 구성원은 역 말단 반복부에 의해 5' 및 3' 측의 각각에 측방된 서열번호 82의 229-4438번 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 측방 역 말단 반복부는 AAV2 Rep 유전자가 있는 플라스미드에 의해 캡시드화될 수 있는 AAV2 역 말단 반복부의 임의의 변이체이다. 특정한 구현예에서, 5' 측방 역 말단 반복부는 서열번호 82의 12-141번 뉴클레오티드에 상응하는 서열 또는 이에 대해 적어도 80% 서열 동일성(적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 서열을 가지며; 3' 측방 역 말단 반복부는 서열번호 82의 4526-4655번 뉴클레오티드에 상응하는 서열 또는 이에 대해 적어도 80% 서열 동일성(적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 서열을 갖는다. (전형적으로 바이러스성 벡터 형성을 위해 필요한 AAV 유전자가 있는 다른 플라스미드와 함께 플라스미드로 세포를 형질감염시킴으로써) 바이러스성 벡터를 만들기 위해 사용되는 전송 플라스미드(예를 들어, 서열번호 76, 78, 또는 82 중 임의의 것) 내의 역 말단 반복부 서열의 임의의 주어진 쌍에 대해, 바이러스성 벡터 내의 상응하는 서열은 재조합 동안 "플립" 또는 "플랍" 방향을 채택하는 ITR로 인해 변경될 수 있다는 점이 당업자에게 이해될 것이다. 이에 따라, 전송 플라스미드 내의 ITR의 서열은 필연적으로 그들로부터 제조된 바이러스성 벡터에서 발견되는 동일한 서열이 아니다. 그러나, 일부 매우 특이적인 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템의 제1 구성원은 서열번호 82의 12-4655번 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템은 AAV1 듀얼 벡터 시스템이다.
일부 구현예에서, 듀얼 벡터 시스템은 AAV9 듀얼 벡터 시스템이다.
약제학적 조성물
본원에 기재된 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는, 본원에 기재된 바와 같이, 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 앓고 있는 환자, 예컨대 인간 환자 내로의 투여를 위해 비히클 내로 혼입될 수 있다. OTOF 단백질의 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 예컨대 바이러스성 벡터를 함유하는 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은, 예를 들어, 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980); 본원에 참조로 편입됨)를 사용하여, 목적하는 형태, 예를 들어 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)의 혼합물은 하나 이상의 부형제, 담체, 또는 희석제와 적합하게 혼합된 물로 제조될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물로 및 오일로 또한 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이러한 조제품은 미생물의 성장을 예방하기 위한 방부제를 함유할 수 있다. 주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(개시내용이 본원에 참조로 편입되는 US 5,466,468에 기재되어 있음). 임의의 경우에 제형은 멸균일 수 있거나 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동적일 수 있다. 제형은 제조 및 보관의 조건 하에서 안정할 수 있으며 미생물, 예컨대 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 일으켜질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제 조성물, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이드 및 젤라틴에서의 사용에 의해 일으켜질 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 함유하는 용액은, 필요한 경우에, 적합하게 완충될 수 있으며, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 포도당으로 등장성이 되도록 만들었다. 이러한 특별한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하, 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투약은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해되어 1000 ml의 피하주사 액체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에서 주사될 수 있다. 투약의 약간의 변화는 치료될 대상체의 병태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 내이에 대한 국소 투여를 위해, 조성물은 합성 외림프 용액을 함유하도록 제형화될 수 있다. 예시적인 합성 외림프 용액은 20-200 mM NaCl, 1-5 mM KCl, 0.1-10 mM CaCl2, 1-10 mM 포도당, 및 2-50 mM HEPE를 포함하며, pH는 약 6 내지 9이고 삼투압은 약 300 mOsm/kg이다. 아무튼, 투여에 책임이 있는 사람은 개별적인 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 게다가, 인간 투여의 경우에, 제제는 FDA 사무국의 생물체제 표준(Biologics standards)에 의해 요구되는 바와 같은 멸균율, 발열원성, 일반적인 안정성, 및 순도 표준을 만족시킬 수 있다.
치료 방법
본원에 기재된 조성물은 다양한 경로, 예컨대 내이로의 국소 투여(예를 들어, 외림프 또는 내림프 내로의 투여, 예를 들어 난원창, 정원창 또는 수평반고리관을 통해 또는 이를 통해 투여, 예를 들어 달팽이관 유모세포에 투여), 정맥내, 비경구, 피내, 경피, 근육내, 비강내, 피하, 피부경유, 기관내, 복강내, 동맥내, 혈관내, 흡입, 관류, 세척, 및 경구 투여에 의해 이대립유전자 OTOF 돌연변이가 있는 대상체에 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 투여에 가장 적합한 경로는 투여되는 특별한 조성물, 환자, 약제학적 제형화 방법, 투여 방법(예를 들어, 투여 시간 및 투여 경로), 환자의 연령, 체중, 성별, 치료 중인 질환의 중증도, 환자의 식이, 및 환자의 배설률에 따라 달라질 것이다. 조성물은 1회, 또는 1회 이상(예를 들어, 1년에 1회, 1년에 2회, 1년에 3회, 2개월에 1회, 월마다, 또는 2주에 1회) 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 동시에(예를 들어, 하나의 조성물로) 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 순차적으로 투여된다(예를 들어, 제2 핵산 벡터가 제1 핵산 벡터의 직후, 또는 제1 핵산 벡터 후 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 8시간, 12시간, 1일, 2일, 7일, 2주, 1개월 이상에 투여된다). 제1 및 제2 핵산 벡터는 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형(예를 들어, AAV 혈청형)을 가질 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있는 대상체는 이대립유전자 OTOF 돌연변이로 인해 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증이 있거나 이의 발병 위험이 있는 25세 이상(예를 들어, 25-50세, 25-45세, 25-40세, 25-35세, 25-30세, 30-50세, 30-45세, 30-40세, 30-35세, 35-50세, 35-45세, 35-40세, 40-50세, 40-45세, 또는 45-50세, 예를 들어, 25세, 26세, 27세, 28세, 29세, 30세, 31세, 32세, 33세, 34세, 35세, 36세, 37세, 38세, 39세, 40세, 41세, 42세, 43세, 44세, 45세, 46세, 47세, 48세, 49세, 또는 50세)의 대상체이다. 대상체는 또한 이대립유전자 OTOF 돌연변이가 있고 외유모세포 완전성(이음향방사 및/또는 달팽이관 마이크로포닉의 존재) 및/또는 내유모세포 완전성(가중전위의 존재)에 대한 검출 가능한 지표를 갖는 것으로 식별된 경우 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있다(예를 들어, 검출가능한 이음향방사, 달팽이관 마이크로포닉 및/또는 치료 전 가중전위가 있는 것으로 식별됨). 따라서, 본원에 기재된 방법은 대상체를 치료하기 전에 외유모세포 완전성 및 내유모세포 완전성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 OTOF 내의 돌연변이(예를 들어, OTOF 기능 또는 발현을 감소시키는 돌연변이, 또는 감각신경성 난청 및 청각 신경병증과 연관된 OTOF 돌연변이)를 갖는 대상체, 상염색체 열성 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증의 가족력(OTOF-관련 난청의 가족력)을 갖는 대상체, 또는 OTOF 돌연변이 상태 및/또는 OTOF 활성 수준을 알 수 없는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 조성물로 치료 또는 이의 투여에 앞서 OTOF 내의 돌연변이에 대해 대상체를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체는 당업자에게 공지된 표준 방법(예를 들어, 유전자 시험)을 사용하여 OTOF 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 조성물로 치료 또는 이의 투여에 앞서 대상체에서의 청각을 평가하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 청각은 표준 시험, 예컨대 청력 검사, ABR, 전기와우도검사(ECOG), 및 이음향방사를 사용하여 평가될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 난청 또는 청각 신경병증이 발병할 위험이 있는 환자. 예를 들어, 유전된 난청의 가족력을 갖는 환자 또는 아직 난청 또는 청각 손상을 나타내지는 않은, OTOF 돌연변이가 있는 환자에 예방적 치료로서 또한 투여될 수 있다.
치료는 본원에 기재된 핵산 벡터(예를 들어, AAV 바이러스성 벡터)를 함유하는 조성물의 다양한 단위 용량의 투여를 포함할 수 있다. 각각의 단위 용량은 대개는 치료적 조성물의 미리결정된 양을 함유할 것이다. 투여될 양, 및 투여 및 제형의 특별한 경로는 임상 분야에서의 기술 범위 내에 있다. 단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요는 없지만 정해진 시간에 걸친 연속적인 주입을 포함할 수 있다. 복용은 달팽이관에 대한 손상을 최소화하기 위해 주입 속도를 제어하도록 주사기 펌프를 사용하여 수행될 수 있다. 핵산 벡터가 AAV 벡터(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV2quad(Y-F), AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, rh10, rh39, rh43, rh74, Anc80, Anc80L65, DJ/8, DJ/9, 7m8, PHP.B, PHP.eb, 또는 PHP.S 벡터)인 경우, AAV 벡터는 예를 들어, 1 μL 내지 200 μL의 부피(예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μL) 중 약 1 x 109 벡터 게놈(VG)/mL 내지 약 1 x 1016 VG/mL(예를 들어, 1 x 109 VG/mL, 2 x 109 VG/mL, 3 x 109 VG/mL, 4 x 109 VG/mL, 5 x 109 VG/mL, 6 x 109 VG/mL, 7 x 109 VG/mL, 8 x 109 VG/mL, 9 x 109 VG/mL, 1 x 1010 VG/mL, 2 x 1010 VG/mL, 3 x 1010 VG/mL, 4 x 1010 VG/mL, 5 x 1010 VG/mL, 6 x 1010 VG/mL, 7 x 1010 VG/mL, 8 x 1010 VG/mL, 9 x 1010 VG/mL, 1 x 1011 VG/mL, 2 x 1011 VG/mL, 3 x 1011 VG/mL, 4 x 1011 VG/mL, 5 x 1011 VG/mL, 6 x 1011 VG/mL, 7 x 1011 VG/mL, 8 x 1011 VG/mL, 9 x 1011 VG/mL, 1 x 1012 VG/mL, 2 x 1012 VG/mL, 3 x 1012 VG/mL, 4 x 1012 VG/mL, 5 x 1012 VG/mL, 6 x 1012 VG/mL, 7 x 1012 VG/mL, 8 x 1012 VG/mL, 9 x 1012 VG/mL, 1 x 1013 VG/mL, 2 x 1013 VG/mL, 3 x 1013 VG/mL, 4 x 1013 VG/mL, 5 x 1013 VG/mL, 6 x 1013 VG/mL, 7 x 1013 VG/mL, 8 x 1013 VG/mL, 9 x 1013 VG/mL, 1 x 1014 VG/mL, 2 x 1014 VG/mL, 3 x 1014 VG/mL, 4 x 1014 VG/mL, 5 x 1014 VG/mL, 6 x 1014 VG/mL, 7 x 1014 VG/mL, 8 x 1014 VG/mL, 9 x 1014 VG/mL, 1 x 1015 VG/mL, 2 x 1015 VG/mL, 3 x 1015 VG/mL, 4 x 1015 VG/mL, 5 x 1015 VG/mL, 6 x 1015 VG/mL, 7 x 1015 VG/mL, 8 x 1015 VG/mL, 9 x 1015 VG/mL, 또는 1 x 1016 VG/mL)의 역가를 가질 수 있다. AAV 벡터는 약 1 x 107 VG/귀 내지 약 2 x 1015 Vg/귀(예를 들어, 1 x 107 VG/귀, 2 x 107 VG/귀, 3 x 107 VG/귀, 4 x 107 VG/귀, 5 x 107 VG/귀, 6 x 107 VG/귀, 7 x 107 VG/귀, 8 x 107 VG/귀, 9 x 107 VG/귀, 1 x 108 VG/귀, 2 x 108 VG/귀, 3 x 108 VG/귀, 4 x 108 VG/귀, 5 x 108 VG/귀, 6 x 108 VG/귀, 7 x 108 VG/귀, 8 x 108 VG/귀, 9 x 108 VG/귀, 1 x 109 VG/귀, 2 x 109 VG/귀, 3 x 109 VG/귀, 4 x 109 VG/귀, 5 x 109 VG/귀, 6 x 109 VG/귀, 7 x 109 VG/귀, 8 x 109 VG/귀, 9 x 109 VG/귀, 1 x 1010 VG/귀, 2 x 1010 VG/귀, 3 x 1010 VG/귀, 4 x 1010 VG/귀, 5 x 1010 VG/귀, 6 x 1010 VG/귀, 7 x 1010 VG/귀, 8 x 1010 VG/귀, 9 x 1010 VG/귀, 1 x 1011 VG/귀, 2 x 1011 VG/귀, 3 x 1011 VG/귀, 4 x 1011 VG/귀, 5 x 1011 VG/귀, 6 x 1011 VG/귀, 7 x 1011 VG/귀, 8 x 1011 VG/귀, 9 x 1011 VG/귀, 1 x 1012 VG/귀, 2 x 1012 VG/귀, 3 x 1012 VG/귀, 4 x 1012 VG/귀, 5 x 1012 VG/귀, 6 x 1012 VG/귀, 7 x 1012 VG/귀, 8 x 1012 VG/귀, 9 x 1012 VG/귀, 1 x 1013 VG/귀, 2 x 1013 VG/귀, 3 x 1013 VG/귀, 4 x 1013 VG/귀, 5 x 1013 VG/귀, 6 x 1013 VG/귀, 7 x 1013 VG/귀, 8 x 1013 VG/귀, 9 x 1013 VG/귀, 1 x 1014 VG/귀, 2 x 1014 VG/귀, 3 x 1014 VG/귀, 4 x 1014 VG/귀, 5 x 1014 VG/귀, 6 x 1014 VG/귀, 7 x 1014 VG/귀, 8 x 1014 VG/귀, 9 x 1014 VG/귀, 1 x 1015 VG/귀, 또는 2 x 1015 Vg/귀)의 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 제1 벡터 및 제2 벡터 둘 다를 사용하여 대상체의 적어도 20%의 내유모세포를 형질도입하기에 충분한 양으로 투여된다(예를 들어, 대상체의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 내유모세포가 듀얼 벡터 시스템의 둘 벡터 모두로 형질도임됨).
본원에 기재된 조성물은 청각을 개선하거나, 어음명료도를 개선하거나, WT OTOF 발현(예를 들어, 달팽이관 유모세포, 예를 들어 내유모세포에서의 OTOF의 발현)을 증가시키거나, OTOF 기능을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다. 청각은 표준 청각 시험(예를 들어, 청력 검사, ABR, 전기와우도검사(ECOG), 및 이음향방사)를 사용하여 평가될 수 있고, 치료에 앞서 수득된 청각 평가와 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상)만큼 개선될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체의 담화를 이해하는 능력을 개선하기에 충분한 양으로 투여된다. 본원에 기재된 조성물은 (예를 들어, OTOF 내의 돌연변이가 있는 대상체, 또는 상염색체 열성 난청의 가족력을 갖지만 청각 손상을 나타내지 않는 대상체에서, 또는 경도와 중등도 사이의 난청을 나타내는 대상체에서) 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증의 발병 또는 진행을 지연 또는 예방하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. OTOF 발현은 면역조직화학, 웨스턴 블롯 분석, 정량적 실시간 PCR, 또는 단백질 또는 mRNA의 검출을 위한 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 평가될 수 있으며, 본원에 기재된 조성물의 투여에 앞선 OTOF 발현과 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상)만큼 증가될 수 있다. OTOF 기능은 직접적으로(예를 들어, 전기생리학적 방법 또는 엑소사이토시스를 평가하는 이미징 방법)을 사용하여 또는 청각 시험에 기반하여 간접적으로 평가될 수 있으며, 본원에 기재된 조성물의 투여에 앞선 OTOF 기능과 비교하여 5% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상)만큼 증가될 수 있다. 이러한 효과는, 본원에 기재된 조성물의 투여에 이어서, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 15주, 20주, 25주 이상 내에 발생할 수 있다. 환자는 용량 및 치료를 위해 사용된 투여 경로에 따라 조성물의 투여에 이어서 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상 평가될 수 있다. 평가의 결과에 따라, 환자는 추가적인 치료를 받을 수 있다.
키트
본원에 기재된 조성물은 (예를 들어, 해당 대상체의 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증을 치료하기 위한) 이대립유전자 OTOF 돌연변이가 있는 25세 이상의 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 키트, 또는 (예를 들어, 해당 대상체의 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증을 치료하기 위한) 검출가능한 이음향방사, 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉 및/또는 검출가능한 가중전위를 갖는 것으로 식별된 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 키트로 제공될 수 있다. 조성물은, 임의로 AAV 바이러스 캡시드(예를 들어, AAV1, AAV9, AAV2, AAV8, Anc80, Anc80L65, DJ/9, 또는 7m8)에 패키징된, 본원에 기재된 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)(예를 들어, OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 벡터 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제2 핵산 벡터)를 포함할 수 있다. 키트는 키트의 사용자, 예컨대 의사에게 본원에 기재된 방법을 수행하도록 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 주사기 또는 조성물을 투여하기 위한 다른 장치를 임의로 포함할 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본원에 기재된 조성물 및 방법이 어떻게 사용되고, 만들어지고, 평가될 수 있는지에 대한 상세한 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명의 순전히 예시인 것으로 의도되고 본 발명자가 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예 1 - OTOF 듀얼 벡터로 처리한 32- 및 52주령 OTOF 결핍 마우스의 ABR 회복
동물은 나이가 들면서 점차 청각을 상실하는데, 이는 부분적으로 외유모세포 기능 손실로 인한 것이다. 오토펄린 결핍 동물은 ABR(내유모세포 기능)이 부재하지만 변조이음향방사(distortion product otoacoustic emission; DPOAE)(외유모세포 기능)을 나타내었다. 다른 노화 동물과 마찬가지로, 오토펄린 널(null) 동물은 나이가 들면서 외유모세포 기능 및 DPOAE를 상실한다.
최대 52주령의 보다 나이 든 OTOF 동형접합성 돌연변이(OTOF-Q828X) 동물에게 3.9 x 1010 vg/귀의 용량으로 듀얼 하이브리드 AAV1-Myo15-hOTOF 벡터를 투여하여 후기 연령의 가능한 외유모세포 손실 및 DPOAE 상승을 고려한 효능의 치료 윈도우를 시험하였다. 제1 벡터는 OTOF 아이소형 5 단백질(서열번호 71), 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3' 및 스플라이스 공여자 서열의 3' AP 재조합유전성 영역(서열번호 65)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-20번 엑손을 함유하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 서열번호 38의 Myo15 프로모터를 함유하고; 제2 벡터는 AP 재조합유전성 영역(서열번호 65), 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', OTOF 아이소형 5 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 72)의 21-45번 및 47번 엑손을 함유하는 스플라이스 수여자 서열의 폴리뉴클레오티드 3', 및 poly(A) 서열을 함유한다.
기준선 DPOAE를 32주령(n=15) 및 52주령(n=15) 동물에서 기록하였다. 32주령 동물에서, 4/15에서 기준선 DPOAE가 상승한 반면, 52주령 동물에서는 7/15에서 기준선 DPOAE가 상승하였다.
동물에게 이소플루란 마취 하에 정원창을 통해 비히클(n=5/연령 그룹) 또는 듀얼 하이브리드 AAV1-Myo15-hOTOF(n=10/연령 그룹)를 투여하였다. 프로토콜에 따라 수술 후 동물을 회복시켰다. DPOAE 및 ABR을 전달 후 4주 및 8주 후에 시험하였다.
ABR 회복은 수술 후 4주 및 8주 둘 모두에 기준선 DPOAE 상승을 보인 동물을 포함하여 10/10의 32주령 바이러스-처리된 동물 및 9/10의 52주령 바이러스-처리된 동물에서 나타나 있다. 처리 후 4주째의 ABR 회복은 도 1에 나타나 있다. 최고의 회복은 22.6 kHz 톤 주파수에서 나타났으며 이는 어린 동물에서 나타나는 것과 유사하였다.
실시예 2 - OTOF-Q828X 마우스 모델의 유모세포 손실의 특성
OTOF-Q828X 마우스 모델을 오토펄린 손실로 인한 인간 선천성 청각장애를 모방하기 위해 개발하였다. 인간 오토펄린 Q829X 돌연변이(참조 SNP rs80356593)는 22번 엑손에서 잘 연구된 종결-이득 돌연변이로, 1997번 아미노산 코딩 서열의 828개 아미노산 다음에 오토펄린 단백질의 절단을 초래하였다. CRISPR-매개 녹-인(knock-in)을 사용하여 이 인간 대립유전자를 모방하는 마우스 OTOF(mOtof)의 표적화된 돌연변이가 있는 FVB 계통 배경에서 Otof-Q828X 마우스 라인을 생성하였다.
동형접합성 Otof-Q828X(Otof-Q828X hom) 및 이형접합성(Otof-Q828X het) 마우스에서 유모세포 손실을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. IHC(도 2a) 및 OHC(도 2b)의 수를 Otof-Q828X het 또는 hom 마우스에 대해 5.6 kHz, 8 kHz, 11.3 kHz, 16 kHz, 22.6 kHz, 32 kHz 및 45.2 kHz에 상응하는 달팽이관 영역에서 5 내지 42주령으로 계산하였다. 개별 IHC 및 OHC를 유모세포-특이적 마커에 대한 염색을 통해 계산하였다. 이 분석을 위해 50개의 귀를 평가하였다.
Otof-Q828X hom 마우스에서 시험한 모든 주파수에 대해 연령이 증가함에 따라 IHC 수에 통계적으로 유의한 손실이 있었다. IHC 수의 유사한 경향이 het 마우스에서 더 낮은 주파수로 관찰되었다(켄달 순위 상관관계). Otof-828X hom 및 het 동물의 IHC 수는 최대 16주까지 안정적이었다(도 2a). 16주 후부터, Otof-Q828X hom 동물은 22.6-45.2 kHz에서 시작하여 24주 후에 더 낮은 주파수(8-16 kHz)에서 IHC 수가 감소하는 것을 보여주었다. Otof-Q828X het 마우스의 IHC 수 손실은 16 및 32 kHz에 대해 24주 후에 시작되었다. 32주 후에는 대부분의 시험된 주파수(< 45.2 kHz)에 대해 75% 초과의 IHC가 유지되었다(도 2a).
Otof-Q828X hom 및 het 마우스의 외유모세포 수는 het 마우스가 연령-관련 수 감소를 나타낸 8 kHz를 제외하고 모든 주파수에 걸쳐 6개월의 연구 기간 동안 일정하게 유지되었다(켄달 순위 상관 관계). 5.6 kHz 및 45.2 kHz의 OHC 수는 보다 큰 변동성과 연관이 있으며, 시험된 연령에 걸쳐 산재된 het와 hom 사이의 수의 차이를 내타내었다. 대부분의 OHC는 32주 후에도 잔류하였다(도 2b).
실시예 3 - 동형접합성 OTOF-Q828X 돌연변이 마우스에서 ABR 역치 회복과 오토펄린-발현 세포 수 사이의 관계
ABR 역치 회복과 오토펄린-발현 세포 수 사이의 관계를 AAV1 또는 AAV2quadYF 캡시드 및 smCBA 또는 Myo15 프로모터를 갖는 오토펄린 듀얼 하이브리드 벡터 시스템을 사용하여 1.0 x 109 내지 6.4 x 1010 vg/귀의 용량을 투여받은 4주령 이상(4주령 내지 34주령)의 n=76 동형접합성 OTOF-Q828X 돌연변이 마우스를 대상으로 한 여러 연구에서 조사하였다. ABR 역치를 마우스가 10주령 내지 44주령일 때 4 내지 34주 후에 측정하였다. 이들 연구 동안 투여된 듀얼 하이브리드 벡터 시스템에는 AAV2quadYF-smCBA(서열번호 70)-mOTOF(34- 및 29주령 마우스에 투여됨), AAV2quadYF-Myo15(서열번호 38)-mOTOF(29주령 마우스에 투여됨), AAV2quadYF-Myo15(서열번호 48)-mOTOF(29주령 마우스에 투여됨), AAV1-smCBA(서열번호 70)-hOTOF(4- 및 8주령 마우스에 투여됨), AAV1-Myo15(서열번호 38)-hOTOF(4- 및 5주령 마우스에 투여됨), 및 AAV1-Myo15(서열번호 38)-mOTOF(9주령 마우스에 투여됨)가 포함되었다.
22 kHz에서 약 20%의 IHC가 오토펄린을 발현했을 때 ABR 역치는 정상 범위(평균 ± 2SD)에 진입하였다(도 3). 오토펄린을 발현하는 IHC의 비율이 높을수록 역치는 더 이상 개선되지 않았다.
실시예 4 - 이대립유전자 OTOF 돌연변이가 있는 25세 초과의 대상체에 대한 OTOF 듀얼 벡터 시스템 투여
본원에 개시된 방법에 따라, 당업자는 난청 또는 청각 신경병증을 예방, 감소 또는 치료하기 위해 25세 초과(예를 들어, 25세-50세, 25세-45세, 25세-40세, 25세-35세, 25세-30세, 30세-50세, 30세-45세, 30세-40세, 30세-35세, 35세-50세, 35세-45세, 35세-40세, 40세-50세, 40세-45세, 또는 45세-50세, 예를 들어, 25세, 26세, 27세, 28세, 29세, 30세, 31세, 32세, 33세, 34세, 35세, 36세, 37세, 38세, 39세, 40세, 41세, 42세, 43세, 44세, 45세, 46세, 47세, 48세, 49세, 또는 50세)의 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 환자를 치료할 수 있다. 이를 위해, 당업자는 OTOF 단백질의 N-말단 부분(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5의 N-말단 부분)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 제1 핵산 벡터(예를 들어, AAV1 또는 AAV9 벡터), 및 OTOF 단백질의 C-말단 부분(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5의 C-말단 부분)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 poly(A) 서열을 함유하는 제2 핵산 벡터(예를 들어, AAV1 또는 AAV9 벡터)를 함유하는 조성물을 인간 환자에게 투여할 수 있다. 듀얼 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 중첩 듀얼 벡터, 트랜스-스플라이싱 듀얼 벡터, 또는 듀얼 하이브리드 벡터일 수 있다. 예를 들어, 벡터는 제1 핵산 벡터가 OTOF 아이소형 5 단백질(예를 들어, 인간 OTOF, 예를 들어, 서열번호 5, 예를 들어, 서열번호 71의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1-20번 엑손에 작동가능하게 연결된, Myo15 프로모터(예를 들어, 서열번호 36, 38, 39, 48, 또는 49), 폴리뉴클레오티드 서열의 스플라이스 공여자 서열 3' 및 스플라이스 공여자 서열의 AP 재조합유전성 영역(예를 들어, 서열번호 62-67 중 어느 하나, 예를 들어, 서열번호 65와 같은 AP 유전자 단편) 3'을 함유하고, 제2 핵산 벡터가 OTOF 아이소형 5 단백질(예를 들어, 인간 OTOF 아이소형 5, 예를 들어, 서열번호 5, 예를 들어 서열번호 72의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 21-45번 및 47번 엑손을 함유하는 스플라이스 수용체 서열의 폴리뉴클레오티드 3', AP 재조합유전성 영역(예를 들어, 서열번호 62-67 중 어느 하나, 예를 들어, 서열번호 65와 같은 AP 유전자 단편), 재조합유전성 영역의 스플라이스 수여자 서열 3', 및 bGH poly(A) 신호 서열을 함유하는 듀얼 하이브리드 벡터일 수 있다. 중첩 듀얼 AAV 벡터를 함유하는 조성물은 예를 들어 내이에 국소 투여(예를 들어, 정원창막을 통한 주사)에 의해 환자에게 투여되어 이대립유전자 OTOF 돌연변이와 관련된 감각신경성 난청 또는 청각 신경병증의 발병을 치료 또는 예방할 수 있다.
환자로의 조성물의 투여에 이어서, 당해 분야의 진료의는 다양한 방법에 의해, 요법에 반응한 환자의 개선을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 의사는 조성물의 투여에 이어서 표준 시험, 예컨대 청력 검사, ABR, 전기와우도검사(ECOG) 및 이음향방사를 수행함으로써, 환자의 청각을 모니터링할 수 있다. 조성물의 투여에 이은 하나 이상의 시험에서 조성물의 투여에 앞선 청각 시험 결과와 비교하여 환자가 개선된 청각을 갖는다는 발견은 환자가 치료에 순조롭게 반응하고 있다는 사실을 나타낸다. 다음의 용량을 결정하고 필요에 따라 투여할 수 있다.
본 발명의 예시적인 구현예가 하기의 열거된 단락에서 기재된다.
E1. 이대립유전자 오토펄린(OTOF) 돌연변이를 갖는 25세 이상의 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 핵산 벡터; 및
OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치하는 poly(A) 서열을 포함하는 제2 핵산 벡터
를 포함하는 치료적으로 유효량의 듀얼 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며;
여기서 제1 및 제2 핵산 벡터 중 어느 것도 전장 OTOF 단백질을 인코딩하지 않는, 방법.
E2. E1에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 중첩되지 않는, 방법.
E3. E1 또는 E2에 있어서, 제1 핵산 벡터는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치하는 스플라이스 공여자 신호 서열을 포함하고, 제2 핵산 벡터는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치하는 스플라이스 수여자 신호 서열을 포함하는, 방법.
E4. E3에 있어서, 제1 핵산 벡터는 스플라이스 공여자 신호 서열의 3'에 위치하는 제1 재조합유전성 영역을 포함하고, 제2 핵산 벡터는 스플라이스 수여자 신호 서열의 5'에 위치하는 제2 재조합유전성 영역을 포함하는, 방법.
E5. E4에 있어서, 제1 및 제2 재조합유전성 영역은 동일한, 방법.
E6. E4 또는 E5에 있어서, 제1 또는 제2 재조합유전성 영역은 AP 유전자 단편 또는 F1 파지 AK 유전자인, 방법.
E7. E6에 있어서, F1 파지 AK 유전자는 서열번호 19의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
E8. E6에 있어서, AP 유전자 단편은 서열번호 62-67 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
E9. E8에 있어서, AP 유전자 단편은 서열번호 65의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
E10. E3 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 스플라이스 공여자 서열은 서열번호 20 또는 서열번호 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
E11. E3 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, 스플라이스 수여자 서열은 서열번호 21 또는 서열번호 69의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
E12. E4 내지 E11 중 어느 하나에 있어서, 제1 핵산 벡터는 재조합유전성 영역의 3'에 위치하는 분해 신호 서열을 추가로 포함하고; 제2 핵산 벡터는 재조합유전성 영역 및 스플라이스 수여자 신호 서열 사이에 위치하는 분해 신호 서열을 추가로 포함하는, 방법.
E13. E12에 있어서, 분해 신호 서열은 서열번호 22의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
E14. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 엑손 경계에서 분할되는, 방법.
E15. E14에 있어서, OTOF 엑손 경계는 C2 도메인을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 부분 내에 있지 않은, 방법.
E16. E1에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드와 부분적으로 중첩되는, 방법.
E17. E16에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 1 킬로베이스(kb)만큼 중첩되는, 방법.
E18. E16 또는 E17에 있어서, 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드 사이의 중첩 영역은 OTOF 엑손 경계의 중심에 있는, 방법.
E19. E18에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하고 중첩 영역의 중심에 있는 엑손 경계의 500 bp 3'까지 OTOF N-말단을 포함하고; 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하고 중첩 영역의 중심에 있는 엑손 경계의 500 bp 5’를 OTOF C-말단까지 포함하는, 방법.
E20. E18 또는 E19에 있어서, 중첩 영역의 중심에 있는 OTOF 엑손 경계는 C2 도메인을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 부분 내에 있지 않은, 방법.
E21. E14, E15 및 E18 내지 E20 중 어느 하나에 있어서, OTOF 엑손 경계는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2C 도메인을 인코딩하고 제2 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2D 도메인을 인코딩하도록 선택되는, 방법.
E22. E14, E15 및 E18 내지 E21 중 어느 하나에 있어서, OTOF 엑손 경계는 엑손 19/20 경계, 엑손 20/21 경계, 또는 엑손 21/22 경계인, 방법.
E23. E14, E15 및 E18 내지 E20 중 어느 하나에 있어서, OTOF 엑손 경계는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2D 도메인을 인코딩하고 제2 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2E 도메인을 인코딩하도록 선택되는, 방법.
E24. E14, E15, E18 내지 E20 및 E23 중 어느 하나에 있어서, OTOF 엑손 경계는 엑손 26/27 경계 또는 엑손 28/29 경계인, 방법.
E25. E14, E18 및 E19 중 어느 하나에 있어서, OTOF 엑손 경계는 C2D 도메인을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 부분 내에 있는, 방법.
E26. E14, E18, E19 및 E25 중 어느 하나에 있어서, OTOF 엑손 경계는 엑손 24/25 경계 또는 엑손 25/26 경계인, 방법.
E27. E1 내지 E26 중 어느 하나에 있어서, 각각의 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질 서열의 약 반절을 인코딩하는, 방법.
E28. E1 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 OTOF 비번역 영역(UTR)을 포함하지 않는, 방법.
E29. E1 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 제1 핵산 벡터는 OTOF 5' UTR을 포함하는, 방법.
E30. E1 내지 E27 및 E29 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 OTOF 3' UTR을 포함하는, 방법.
E31. E1 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질을 인코딩하는 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하지 않는, 방법.
E32. E1 내지 E31 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질은 포유류 OTOF 단백질인, 방법.
E33. E32에 있어서, OTOF 단백질은 인간 OTOF 단백질인, 방법.
E34. E1 내지 E33 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는, 방법.
E35. E34에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 1의 서열을 갖는, 방법.
E36. E34에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 5의 서열을 갖는, 방법.
E37. E1 내지 E33 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 서열 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
E38. E37에 있어서, OTOF 단백질 변이체 중 10% 이하(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하)의 아미노산은 보존적 아미노산 치환인, 방법.
E39. E1 내지 E33 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 10-14 중 어느 하나에 의해 인코딩되는, 방법.
E40. E1 내지 E33 중 어느 하나에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 1-802번 아미노산을 인코딩하고 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 803-1997번 아미노산을 인코딩하는, 방법.
E41. E1 내지 E33 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질의 N-말단 부분은 서열번호 73의 서열 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체로 이루어지는, 방법.
E42. E41에 있어서, OTOF 단백질 변이체의 N-말단 부분 중 10% 이하(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하)의 아미노산은 보존적 아미노산 치환인, 방법.
E43. E41에 있어서, OTOF 단백질의 N-말단 부분은 서열번호 73의 서열로 이루어지는, 방법.
E44. E1 내지 E33 및 E43 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질의 N-말단 부분은 서열번호 71의 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
E45. E1 내지 E33 및 E41 내지 E44 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질의 C-말단 부분은 서열번호 74의 서열 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체로 이루어지는, 방법.
E46. E45에 있어서, OTOF 단백질 변이체의 C-말단 부분 중 10% 이하(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하)의 아미노산은 보존적 아미노산 치환인, 방법.
E47. E45에 있어서, OTOF 단백질의 C-말단 부분은 서열번호 74의 서열로 이루어지는, 방법.
E48. E1 내지 E33, E41 내지 E44 및 E47 중 어느 하나에 있어서, OTOF 단백질의 C-말단 부분은 서열번호 72의 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
E49. E1 내지 E48 중 어느 하나에 있어서, 제1 핵산 벡터는 프로모터의 코작 서열 3' 및 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드의 5'를 포함하는, 방법.
E50. E1 내지 E49 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터인, 방법.
E51. E50에 있어서, 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 치킨 β-액틴 프로모터, 절단된 CMV-치킨 β-액틴 프로모터(smCBA), CB7 프로모터, 하이브리드 CMV 인핸서/인간 β-액틴 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, 신장 인자-1α(EF1α) 프로모터, 또는 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터인, 방법.
E52. E1 내지 E49 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터인, 방법.
E53. E52에 있어서, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 마이오신 15(Myo15) 프로모터, 마이오신 7A(Myo7A) 프로모터, 마이오신 6(Myo6) 프로모터, POU 클래스 4 호메오박스 3(POU4F3) 프로모터, 아토날 BHLH 전사 인자 1(ATOH1) 프로모터, LIM 호메오박스 3(LHX3) 프로모터, α9 아세틸콜린 수용체(α9AChR) 프로모터, 또는 α10 아세틸콜린 수용체(α10AChR) 프로모터인, 방법.
E54. E1 내지 E49 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 내유모세포-특이적 프로모터인, 방법.
E55. E54에 있어서, 내유모세포-특이적 프로모터는 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 프로모터, 소포성 글루타메이트 수송체 3(VGLUT3) 프로모터, OTOF 프로모터, 또는 칼슘 결합 단백질 2(CABP2) 프로모터인, 방법.
E56. E1에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 75의 2272번 내지 6041번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E57. E1 또는 E56에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 75의 2049번 내지 6264번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E58. E1에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 77의 182번 내지 3949번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E59. E1 또는 E58에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 77의 19번 내지 4115번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E60. E1에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 79의 2267번 내지 6014번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E61. E1 또는 E60에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 79의 2049번 내지 6237번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E62. E1에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 80의 177번 내지 3924번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E63. E1 또는 E62에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 80의 19번 내지 4090번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E64. E1, E56, E57, E60 및 E61 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 76의 2267번 내지 6476번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E65. E1, E56, E57, E60, E61 및 E64 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 76의 2049번 내지 6693번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E66. E1, E58, E59, E62 및 E63 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 78의 187번 내지 4396번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E67. E1, E58, E59, E62, E63 및 E66 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 78의 19번 내지 4589번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E68. E1에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 81의 235번 내지 4004번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E69. E1 또는 E62에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 81의 12번 내지 4227번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E70. E1에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 83의 230번 내지 3977번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E71. E1 또는 E70에 있어서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 83의 12번 내지 4200번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E72. E1 및 E68 내지 E71 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 82의 229번 내지 4438번 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E73. E1 및 E68 내지 E72 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 82의 12번 내지 4655번 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
E74. E1 내지 E73 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 핵산 서열의 각 단부에 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는, 방법.
E75. E74에 있어서, ITR은 AAV2 ITR이거나 AAV2 ITR에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는, 방법.
E76. E1 내지 E75 중 어느 하나에 있어서, poly(A) 서열은 소 성장 호르몬(bGH) poly(A) 신호 서열인, 방법.
E77. E1 내지 E76 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하는, 방법.
E78. E77에 있어서, WPRE는 서열번호 23 또는 서열번호 61의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
E79. E1 내지 E78 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
E80. E79에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV2quad(Y-F), AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, rh10, rh39, rh43, rh74, Anc80, Anc80L65, DJ/8, DJ/9, 7m8, PHP.B, PHP.eb, 또는 PHP.S 캡시드를 갖는, 방법.
E81. E1 내지 E80 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 30세 이상인, 방법.
E82. E1 내지 E81 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 35세 이상인, 방법.
E83. E1 내지 E82 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 40세 이상인, 방법.
E84. E1 내지 E83 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 45세 이상인, 방법.
E85. E1 내지 E84 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 50세 이하인, 방법.
E86. E1 내지 E85 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 것으로 식별된, 방법.
E87. E1 내지 E85 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체가 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 것으로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E88. E1 내지 E87 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 검출가능한 이음향방사를 갖는 것으로 식별되는, 방법.
E89. E1 내지 E88 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉을 갖는 것으로 식별되는, 방법.
E90. E1 내지 E89 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 검출가능한 가중전위를 갖는 것으로 식별되는, 방법.
E91. E1 내지 E90 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 청각장애, 상염색체 열성 9(DFNB9)을 갖거나 갖는 것으로 식별되는, 방법.
E92. E1 내지 E91 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체의 청각을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E93. E1 내지 E92 중 어느 하나에 있어서, 듀얼 벡터 시스템은 내이에 투여되는, 방법.
E94. E93에 있어서, 듀얼 벡터 시스템은 정원창막을 통한 주사, 반고리관 내로의 주사, 반고리관 절개술, 정원창막을 통한 카테터 삽입, 고실내 주사, 또는 고막내 주사에 의해 투여되는, 방법.
E95. E1 내지 E94 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여한 후 대상체의 청각을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E96. E1 내지 E95 중 어느 하나에 있어서, 듀얼 벡터 시스템은 난청을 예방 또는 감소시키거나, 난청의 발병을 지연시키거나, 난청의 진행을 느리게 하거나, 청각을 개선하거나, 어음명료도를 개선하거나, 유모세포 기능을 개선하기에 충분한 양으로 투여되는, 방법.
E97. E1 내지 E96 중 어느 하나에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 동시에 투여되는, 방법.
E98. E1 내지 E96 중 어느 하나에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터가 순차적으로 투여되는, 방법.
E99. E1 내지 E98 중 어느 하나에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 약 1 x 107 벡터 게놈(VG)/귀 내지 약 2 x 1015 VG/귀의 농도로 투여되는, 방법.
E100. E1 내지 E99 중 어느 하나에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 제1 벡터 및 제2 벡터 둘 모두를 사용하여 대상체의 적어도 20%의 내유모세포를 형질도입하기에 충분한 양으로 함께 투여되는, 방법.
다른 구현예
본 발명에 기재된 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범주 및 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특이적인 구현예와 관련하여 기재되었지만, 청구된 바와 같이 본 발명이 이러한 특이적인 구현예에 과도하게 제한되지 않아야 한다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 다른 구현예는 청구범위에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Decibel Therapeutics, Inc. <120> METHODS FOR TREATING SENSORINEURAL HEARING LOSS USING OTOFERLIN DUAL VECTOR SYSTEMS <130> 51471-008WO2 <150> US 63/151,589 <151> 2021-02-19 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1997 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Leu Ile His Leu Lys Thr Val Ser Glu Leu Arg Gly Arg 1 5 10 15 Gly Asp Arg Ile Ala Lys Val Thr Phe Arg Gly Gln Ser Phe Tyr Ser 20 25 30 Arg Val Leu Glu Asn Cys Glu Asp Val Ala Asp Phe Asp Glu Thr Phe 35 40 45 Arg Trp Pro Val Ala Ser Ser Ile Asp Arg Asn Glu Met Leu Glu Ile 50 55 60 Gln Val Phe Asn Tyr Ser Lys Val Phe Ser Asn Lys Leu Ile Gly Thr 65 70 75 80 Phe Arg Met Val Leu Gln Lys Val Val Glu Glu Ser His Val Glu Val 85 90 95 Thr Asp Thr Leu Ile Asp Asp Asn Asn Ala Ile Ile Lys Thr Ser Leu 100 105 110 Cys Val Glu Val Arg Tyr Gln Ala Thr Asp Gly Thr Val Gly Ser Trp 115 120 125 Asp Asp Gly Asp Phe Leu Gly Asp Glu Ser Leu Gln Glu Glu Glu Lys 130 135 140 Asp Ser Gln Glu Thr Asp Gly Leu Leu Pro 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cggcatcgca cagacctatt ccatacatgg ctacaatatc 4800 tggagggacc ccatgaagcc cagccagatc ctgacacgcc tctgtaaaga gggcaaagtg 4860 gacggccccc actttggtcc ccatgggaga gtgagggttg ccaaccgtgt cttcacgggg 4920 ccttcagaaa tagaggatga gaatggtcag aggaagccca cagatgagca cgtggcactg 4980 tctgctctga gacactggga ggacatcccc cgggtgggct gccgccttgt gccggaacac 5040 gtggagacca ggccgctgct caaccctgac aagccaggca ttgagcaggg ccgcctggag 5100 ctgtgggtgg acatgttccc catggacatg ccagcccctg ggacacctct ggatatatcc 5160 cccaggaaac ccaagaagta cgagctgcgg gtcatcgtgt ggaacacaga cgaggtggtc 5220 ctggaagacg atgatttctt cacgggagag aagtccagtg acatttttgt gagggggtgg 5280 ctgaagggcc agcaggagga caaacaggac acagatgtcc actatcactc cctcacgggg 5340 gagggcaact tcaactggag atacctcttc cccttcgact acctagcggc cgaagagaag 5400 atcgttatgt ccaaaaagga gtctatgttc tcctgggatg agacggagta caagatccct 5460 gcgcggctca ccctgcagat ctgggacgct gaccacttct cggctgacga cttcctgggg 5520 gctatcgagc tggacctgaa ccggttcccg aggggcgcta agacagccaa gcagtgcacc 5580 atggagatgg ccaccgggga 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cagattggac cagcagggaa ggctgacctg ccccccatca atggcccggt 1320 ggacgtggac cgaggtccca tcatgcccgt gcccatgggc atccggcccg tgctcagcaa 1380 gtaccgagtg gaggtgctgt tctggggcct acgggaccta aagcgggtga acctggccca 1440 ggtggaccgg ccacgggtgg acatcgagtg tgcagggaag ggggtgcagt cgtccctgat 1500 ccacaattat aagaagaacc ccaacttcaa caccctcgtc aagtggtttg aagtggacct 1560 cccagagaac gagctgctgc acccgccctt gaacatccgt gtggtggact gccgggcctt 1620 cggtcgctac acactggtgg gctcccatgc cgtcagctcc ctgcgacgct tcatctaccg 1680 gcccccagac cgctcggccc ccagctggaa caccacgggg gaggttgtgg tgactatgga 1740 gccagaggta cccatcaaga aactggagac catggtgaag ctggacgcga cttctgaagc 1800 tgttgtcaag gtggatgtgg ctgaggagga gaaggagaag aagaagaaga agaagggcac 1860 tgcggaggag ccagaggagg aggagccaga cgagagcatg ctggactggt ggtccaagta 1920 ctttgcctcc attgacacca tgaaggagca acttcgacaa caagagccct ctggaattga 1980 cttggaggag aaggaggaag tggacaatac cgagggcctg aaggggtcaa tgaagggcaa 2040 ggagaaggca agggctgcca aagaggagaa gaagaagaaa actcagagct ctggctctgg 2100 ccaggggtcc 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ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 6180 gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 6240 aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 6300 acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 6360 gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 6420 gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 6480 cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 6540 aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 6600 gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 6660 cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca 6720 atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg 6780 tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat 6840 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 6900 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccagatt taattaagg 6959 <210> 84 <211> 953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 aattcggtac cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 60 tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 120 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 180 ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 240 gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 300 ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 360 catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc 420 cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg 480 ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 540 ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 600 tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 660 cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 720 ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 780 gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 840 ttgaggggct ccgggagcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 900 acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aag 953

Claims (56)

  1. 이대립유전자 오토펄린(OTOF) 돌연변이를 갖는 25세 이상의 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 핵산 벡터; 및
    OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치하는 poly(A) 서열을 포함하는 제2 핵산 벡터
    를 포함하는 치료적으로 유효량의 듀얼 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며;
    여기서 제1 및 제2 핵산 벡터 중 어느 것도 전장 OTOF 단백질을 인코딩하지 않는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 중첩되지 않는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 핵산 벡터는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치하는 스플라이스 공여자(splice donor) 신호 서열을 포함하고 제2 핵산 벡터는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치하는 스플라이스 수여자(splice acceptor) 신호 서열을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제1 핵산 벡터는 스플라이스 공여자 신호 서열의 3'에 위치하는 제1 재조합유전성 영역을 포함하고 제2 핵산 벡터는 스플라이스 수여자 신호 서열의 5'에 위치하는 제2 재조합유전성 영역을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 및 제2 재조합유전성 영역은 동일한, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 제1 또는 제2 재조합유전성 영역은 AP 유전자 단편(fragment) 또는 F1 파지 AK 유전자인, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 벡터는 재조합유전성 영역의 3'에 위치하는 분해 신호 서열을 추가로 포함하고; 제2 핵산 벡터는 재조합유전성 영역과 스플라이스 수여자 신호 서열 사이에 위치하는 분해 신호 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 엑손 경계(exon boundary)에서 분할되는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드와 부분적으로 중첩되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 제2 코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 1 킬로베이스(kb)만큼 중첩되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드 사이의 중첩 영역은 OTOF 엑손 경계의 중심에 있는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제1 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하고 중첩 영역의 중심에 있는 엑손 경계의 500 bp 3'까지 OTOF N-말단을 포함하고; 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질의 C-말단 부분을 인코딩하고 중첩 영역의 중심에 있는 엑손 경계의 500 bp 5'를 OTOF C-말단까지 포함하는, 방법.
  13. 제8항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 엑손 경계는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2C 도메인을 인코딩하고 제2 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2D 도메인을 인코딩하도록 선택되는, 방법.
  14. 제8항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 엑손 경계는 엑손 19/20 경계, 엑손 20/21 경계, 또는 엑손 21/22 경계인, 방법.
  15. 제8항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 엑손 경계는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2D 도메인을 인코딩하고 제2 코딩 폴리뉴클레오티드가 전체 C2E 도메인을 인코딩하도록 선택되는, 방법.
  16. 제8항, 제11항, 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 엑손 경계는 엑손 26/27 경계 또는 엑손 28/29 경계인, 방법.
  17. 제8항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 엑손 경계는 C2D 도메인을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드의 부분 내에 있는, 방법.
  18. 제8항, 제11항, 제12항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 엑손 경계는 엑손 24/25 경계 또는 엑손 25/26 경계인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 OTOF 단백질 서열의 약 반절을 인코딩하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 OTOF 비번역 영역(UTR)을 포함하지 않는, 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 벡터는 OTOF 5' UTR을 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제19항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 벡터는 OTOF 3' UTR을 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 단백질을 인코딩하는 제1 및 제2 코딩 폴리뉴클레오티드는 인트론(intron)을 포함하지 않는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 단백질은 포유류 OTOF 단백질인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, OTOF 단백질은 인간 OTOF 단백질인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 1의 서열을 갖는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 5의 서열을 갖는, 방법.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, OTOF 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 서열 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, OTOF 단백질 변이체 중 10% 이하의 아미노산은 보존적 아미노산 치환인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 벡터는 프로모터의 코작(Kozak) 서열 3' 및 OTOF 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 코딩 폴리뉴클레오티드의 5'를 포함하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 치킨 β-액틴 프로모터, 절단된 CMV-치킨 β-액틴 프로모터(smCBA), CB7 프로모터, 하이브리드 CMV 인핸서/인간 β-액틴 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, 신장 인자-1α(EF1α) 프로모터, 또는 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터인, 방법.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 마이오신 15(Myo15) 프로모터, 마이오신 7A(Myo7A) 프로모터, 마이오신 6(Myo6) 프로모터, POU 클래스 4 호메오박스 3(POU4F3) 프로모터, 아토날(atonal) BHLH 전사 인자 1(ATOH1) 프로모터, LIM 호메오박스 3(LHX3) 프로모터, α9 아세틸콜린 수용체(α9AChR) 프로모터, 또는 α10 아세틸콜린 수용체(α10AChR) 프로모터인, 방법.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 내유모세포-특이적 프로모터인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 내유모세포-특이적 프로모터는 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 프로모터, 소포성 글루타메이트 수송체 3(VGLUT3) 프로모터, OTOF 프로모터, 또는 칼슘 결합 단백질 2(CABP2) 프로모터인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 핵산 서열의 각 단부에 역 말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR)를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, ITR은 AAV2 ITR이거나 AAV2 ITR에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element; WPRE)를 포함하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 30세 이상인, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 35세 이상인, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 40세 이상인, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 45세 이상인, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 50세 이하인, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 것으로 식별된, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 듀얼 벡터 시스템을 투여하기에 앞서 대상체가 이대립유전자 OTOF 돌연변이를 갖는 것으로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 검출가능한 이음향방사를 갖는 것으로 식별되는, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 검출가능한 달팽이관 마이크로포닉(cochlear microphonics)을 갖는 것으로 식별되는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 검출가능한 가중전위(summating potential)를 갖는 것으로 식별되는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 청각장애, 상염색체 열성 9(Deafness, Autosomal Recessive 9; DFNB9)을 갖거나 갖는 것으로 식별되는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 듀얼 벡터 시스템은 내이(inner ear)에 투여되는, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 동시에 투여되는, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 약 1 x 107 벡터 게놈(VG)/귀 내지 약 2 x 1015 VG/귀의 농도로 투여되는, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 제1 벡터 및 제2 벡터 둘 모두를 사용하여 대상체의 적어도 20%의 내유모세포를 형질도입하기에 충분한 양으로 함께 투여되는, 방법.
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