CN112673092B - 工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途 - Google Patents

工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了递送的免疫刺激细菌，其具有增强的定植肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤‑驻留免疫细胞，以及增强的抗肿瘤活性。通过缺失编码鞭毛的基因或修饰基因来修饰免疫刺激性细菌，使得不产生功能性鞭毛，和/或通过缺失pagP或修饰pagP来修饰以产生无活性的PagP产物。结果，免疫刺激性细菌是鞭毛蛋白‑和/或pagP‑。免疫刺激性细菌任选地具有额外的基因组修饰，使得细菌为腺苷或嘌呤营养缺陷型。所述细菌任选地是asd‑、purI‑和msbB‑中的一种或多种。免疫刺激性细菌，例如沙门菌属物种，经修饰以编码赋予肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫的免疫刺激性蛋白，和/或经修饰以使细菌优先感染肿瘤微环境中的免疫细胞或肿瘤‑驻留免疫细胞和/或在免疫细胞中比在其他细胞中诱导更少的细胞死亡。还提供了通过施用免疫刺激性细菌来抑制实体瘤生长或减少实体瘤体积的方法。

Description

工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途
相关申请
本申请要求于2018年7月11日提交并于2019年1月17日以WO 2019/014398公布的国际专利申请号PCT/US2018/041713以及于2018年7月11日提交并于2019年1月17日以美国公开号U.S.2019/0017050Al公开的共同未决的美国专利申请序列号16/033,187的优先权权益，每个均为申请人Actym Therapeutics,Inc.，发明人Christopher D.Thanos、LauraHix Glickman和Justin Skoble；并且每个标题均为“工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途("ENGINEERED IMMUNO STIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF)”。
还要求于2019年1月08日提交的美国临时申请序列号62/789,983的优先权权益，申请人Actym Therapeutics,Inc.，发明人Christopher D.Thanos、Laura Hix Glickman、Justin Skoble和Alexandre Charles Michel Iannello；并且标题为“工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途("ENGINEERED IMMUNO STIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USESTHEREOF)”。还要求于2019年4月03日提交的美国临时申请序列号62/828,990的优先权权益，申请人Actym Therapeutics,Inc.，发明人Christopher D.Thanos、Laura HixGlickman、Justin Skoble和Alexandre Charles Michel Iannello；并且标题为“Salmonella Strains Engineered To Colonize Tumors And The TumorMicroenvironment”。
在这些申请的每一个中提供的免疫刺激性细菌可以如本申请所述进行修饰，并且这样的细菌在此引入作为参考。在允许的情况下，这些申请中的每一个的主题均通过引用以其整体并入。
通过引用并入以电子方式提供的序列表
与此一起提交序列表的电子版本，其内容通过引用以其整体并入。该电子文件创建于2019年7月10日，大小为457千字节，并且名称为l704SEQPC.txt。
背景技术
如通过抗CTLA4、抗PD-1和抗PD-Ll免疫检查点抗体的临床成功所证明的，癌症免疫疗法领域已经取得了巨大的进展(参见，例如Buchbinder et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3377-3383；Hodi et al.(2010)N.Engl.J.Med.363(8):711-723；和Chen et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3384-3391)。肿瘤已进展出极度的免疫抑制性环境。它们启动多种机制来逃逸免疫监视，重编程抗肿瘤免疫细胞以抑制免疫，并且不断突变出对最新癌症疗法的抗性(参见，例如，Mahoney et al.(2015)Nat.Rev.Drug Discov.l4(8):56l-584)。设计克服免疫耐受和逃逸的同时限制当前免疫疗法的自身免疫相关毒性的免疫疗法挑战了免疫肿瘤学领域。因此，需要额外的和创新的免疫疗法和其他疗法。
发明内容
提供了被修饰为免疫刺激性以用于抗癌疗法的细菌。如本文提供的免疫刺激性细菌提供了抗肿瘤治疗的多面方法。细菌提供了一种平台，在该平台中存在许多用于引起抗肿瘤免疫刺激活性的途径。如本文所提供的，通过增加细菌在肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境(TME)中积累或靶向肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境(TME)的能力，将细菌(诸如沙门菌属(Salmonella)物种)微调为具有有效的抗肿瘤活性。这通过修饰实现，该修饰例如改变它们可以感染的细胞的类型(向性)、它们的毒性、它们逃逸免疫系统(诸如补体、和/或它们可以复制的环境)的能力。免疫刺激性细菌还可以编码例如增强或激发免疫应答的产物，和治疗性产物。本文提供的免疫刺激性细菌凭借它们改善的肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤-驻留免疫细胞的定植，以及它们对补体和其它抗细菌免疫应答的抗性，可以全身施用。
本文提供的细菌的基因组被修饰为在肿瘤中和在肿瘤-驻留免疫细胞中以及在肿瘤微环境中积累增加。这在本文中通过使负责非肿瘤细胞(诸如上皮细胞)的感染或侵袭的基因缺失或失效，和/或降低细菌对特别是免疫细胞和肿瘤-驻留免疫细胞的细胞病原性来实现。
细菌就其本性而言刺激免疫系统；细菌感染诱导免疫和炎症途径和应答，其中一些是抗肿瘤治疗所期望的，而另一些是不期望的。通过缺失或修饰导致不期望的炎症应答的基因和产物，以及添加或修饰诱导期望的免疫刺激性抗肿瘤应答的基因和产物进行的细菌修饰，提高细菌的抗肿瘤活性。
细菌在肿瘤细胞和组织中积累，并且通过在其中的复制，能够裂解细胞。细菌从施用部位迁移并可在其它肿瘤和肿瘤细胞中积累以提供伴随远隔效应。本文提供的细菌被修饰使得它们优先感染肿瘤-驻留免疫细胞、肿瘤和肿瘤微环境并在其中积累。
在此，细菌的所有这些性质被利用来生产具有多种抗肿瘤活性并具有可以单独地和协同地起作用的性质的可证实的免疫刺激性细菌。
提供了调节对疾病治疗(包括对癌症治疗)的免疫应答的组合物，其用途和方法。所述组合物含有本文提供的免疫刺激性细菌。还提供了治疗方法和所述细菌用于治疗的用途。治疗的对象包括人和其他灵长类、宠物诸如狗和猫，以及其他动物诸如马。
提供了用于治疗疾病和病症，特别是增殖性病症，诸如肿瘤，包括实体瘤和恶性血液肿瘤的含有免疫刺激性细菌的药物组合物，及其方法和用途。
还提供了通过施用免疫刺激性细菌或药物组合物，或使用供治疗的所述组合物来抑制实体瘤的生长或减少实体瘤的体积的方法。例如，提供了对患有实体瘤癌症的对象(诸如人患者)施用或使用组合物的方法，所述组合物针对单一剂量含有有效量的减毒沙门菌属物种。应理解，对细菌的基因组的所有修饰，诸如抗肿瘤治疗剂，以及所述细菌基因组和质粒的其它修饰，可以以任何期望的组合进行组合。
提供了具有增强的肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤-驻留免疫细胞定植，以及增强的抗肿瘤活性的免疫刺激性细菌。通过缺失编码鞭毛的基因或修饰所述基因使得不产生功能性鞭毛，和/或缺失pagP或修饰pagP以产生失活的PagP产物来修饰所述免疫刺激性细菌。结果，所述免疫刺激性细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和/或pagP-。或者或另外，所述免疫刺激性细菌可以是pagP-/msbB-。
免疫刺激性细菌可以是鞭毛蛋白缺陷的，例如通过缺失或破坏编码鞭毛的(一个或多个)基因。例如，提供了免疫刺激性细菌，该免疫刺激性细菌含有编码鞭毛蛋白亚单位fliC和fljB之一或两者的基因的缺失，由此该细菌是鞭毛缺陷的，并且其中野生型细菌表达鞭毛。免疫刺激性细菌具有编码核酸内切酶I(endA)的基因的缺失或修饰，由此抑制或消除endA活性。
所述免疫刺激性细菌任选地具有额外的基因组修饰，使得所述细菌是腺苷或嘌呤营养缺陷型。所述细菌任选为asd-、purI-和msbB-中的一种或多种。所述免疫刺激性细菌，例如沙门菌属物种，被修饰以编码赋予肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的免疫刺激性蛋白，和/或被修饰以使得所述细菌优先感染肿瘤微环境中的免疫细胞或肿瘤-驻留免疫细胞，和/或在免疫细胞中比在其他细胞中诱导更少的细胞死亡。还提供了通过施用免疫刺激性细菌来抑制实体瘤的生长或减少实体瘤的体积的方法。
提供了通过将免疫刺激性细菌的基因组修饰为鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和/或pagP-来增加免疫刺激性细菌诸如沙门菌属物种的肿瘤定植的方法。
所述细菌还含有编码治疗性产物的质粒，诸如抗肿瘤剂、增加对象的免疫应答的蛋白质以及靶向免疫检查点的抑制性RNA(RNAi)。例如，质粒可以编码增加对象中的抗肿瘤应答的免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子、趋化因子和共刺激分子。所述细菌含有编码抗癌治疗剂的质粒，诸如RNA(包括微RNA、shRNA和siRNA)，和抗体及其抗原结合片段(其被设计为阻抑、抑制、破坏免疫检查点基因和产物以及在免疫抑制性途径中起作用的其它靶标或使免疫检查点基因和产物以及在免疫抑制性途径中起作用的其它靶标沉默)。所述细菌还可以在质粒上编码肿瘤抗原和肿瘤新抗原(neoantigen)以刺激针对所述肿瘤的免疫应答。所编码的蛋白在被真核生物(诸如哺乳动物和动物)识别的启动子或病毒启动子的控制下表达。
提供了一种免疫刺激性细菌，其包含编码治疗性产物(诸如抗癌治疗剂)的质粒；免疫刺激性细菌的基因组被修饰，以使得其优先感染肿瘤-驻留免疫细胞和/或使得其在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡。
提供了一种免疫刺激性细菌，其包含在真核启动子控制下的编码产物(通常是治疗性产物(诸如抗癌治疗性产物))的质粒，其中免疫刺激性细菌的基因组被修饰，由此所述细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和/或pagP-，并且由此野生型细菌具有鞭毛。所述细菌可以是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-之一或二者。这些免疫刺激性细菌表现出增加的肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤-驻留免疫细胞定植，并且具有增加的抗肿瘤活性。
在这些免疫刺激性细菌中有为鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)的那些，并且其中治疗性产物是抗癌产物。在一些实施方案中，所述细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)，并且所述产物是抗癌治疗性蛋白或核酸。
在这些免疫刺激性细菌中是其中治疗性产物是TGF-β拮抗剂多肽的那些，其中免疫刺激性细菌的基因组被修饰以使得其优先感染所述肿瘤-驻留免疫细胞，和/或免疫刺激性细菌的基因组被修饰以使得其在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡(减少细胞焦亡(pyroptosis))，由此免疫刺激性细菌在肿瘤中或在肿瘤微环境中或在肿瘤-驻留免疫细胞中积累，从而将TGF-β拮抗剂多肽递送至肿瘤微环境。TGF-β拮抗剂可以选自抗TGF-β抗体、抗TGF-β受体抗体和可溶性TGF-β拮抗剂多肽。编码TGF-β拮抗剂多肽的核酸可以包括编码用于分泌所编码的多肽的信号序列的核酸，使得其释放到肿瘤细胞、肿瘤-驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境中。
在本文所提供的免疫刺激性细菌中的任一种的其他实施方案中，质粒编码免疫刺激性蛋白，该免疫刺激性蛋白赋予、增强或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答。赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫的免疫刺激性蛋白的示例选自以下中的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-36γ、已经减弱与IL-2Ra的结合的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、经修饰以使得其不与IL-2Ra结合的IL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞募集/持久性的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、CD28、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族成员、CD47拮抗剂、TGF-β多肽拮抗剂，以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
在本文提供的免疫刺激性细菌的其他实施方案中，治疗性产物是抗体或其抗原结合片段。这样的示例是Fab、Fab′、F(ab′)2、单链Fv(scFv)、Fv、二硫化物稳定化的Fv(dsFv)、纳米抗体、双抗体片段和单链抗体。抗体或其抗原结合片段可以是人源化的或人的。抗体或其抗原结合片段的示例是PD-I、PD-L1、CTLA-4、VEGF、VEGFR2或IL-6的拮抗剂。
本文提供的免疫刺激性细菌(包括以上描述的那些)可以包含在真核启动子控制下的编码治疗性产物的质粒；免疫刺激性细菌的基因组被修饰，由此所述细菌是pagP-/msbB-，和任选的鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)。
免疫刺激性细菌的示例是包含编码免疫刺激性蛋白的质粒的那些，其中：当在哺乳动物对象中表达时，免疫刺激性蛋白赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫；在真核启动子的控制下在细菌中的质粒上编码免疫刺激性蛋白；并且免疫刺激性细菌的基因组被修饰，以使得其优先感染肿瘤-驻留免疫细胞。在其他实施方案中，免疫刺激性细菌包含编码免疫刺激性蛋白的核苷酸序列，其中当在哺乳动物对象中表达时，免疫刺激性蛋白赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫；在真核启动子的控制下在细菌中的质粒上编码免疫刺激性蛋白；并且免疫刺激性细菌的基因组被修饰，以使得其在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡。示例性免疫刺激性蛋白包括细胞因子和趋化因子，以及其他免疫刺激性蛋白，例如以下中的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-36γ、已经减弱与IL-2Ra的结合的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、经修饰以使得其不与IL-2Ra结合的IL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞募集/持久性的蛋白质、CD40、CD40配体、CD28、OX40、OX40配体、4-1BB、4-1BB配体、B7-CD28家族成员、CD47拮抗剂、TGF-β多肽拮抗剂，以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
这些免疫刺激性细菌可包括在免疫刺激性细菌的基因组中的修饰，使得该细菌表现出优先感染肿瘤-驻留免疫细胞和在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡之一或二者。免疫刺激性细菌还可以包括基因组中的突变，该突变减低宿主中非免疫细胞的毒性或感染性。
细菌基因组的修饰包括pagP-，或pagP-和鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)。在其他实施方案中，免疫刺激性细菌是purI-(purM-)、msbB-、purD-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-、adrA-、CsgD-、QseC-和hilA-中的一种或多种，诸如鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)/pagP-/msbB-/purI-或鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)/pagP-/msbB-/purI-/hilA-。在其他实施方案中，免疫刺激性细菌是hilA-和/或鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)或pagP-或pagP-/msbB-，或者免疫刺激性细菌是hilA-，或者免疫刺激性细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。除其它性质外，基因组修饰可增加对肿瘤微环境和/或肿瘤-驻留免疫细胞的靶向或定植，和/或使细菌基本上或完全抵抗补体的失活。这些性质改善了细菌作为治疗剂的用途，并且允许全身施用。
在本文提供的免疫刺激性细菌中，编码治疗性产物的核酸可操作地连接至编码分泌信号的核酸以进行表达，由此在宿主中表达时分泌治疗性产物。治疗性产物可以是蛋白质，诸如免疫刺激性蛋白，或核酸，诸如CRISPR盒或RNAi。
在所有实施方案中，免疫刺激性细菌对于腺苷或对于腺苷和腺嘌呤呈营养缺陷型。本文提供的免疫刺激性细菌可以包括基因组中的修饰，由此所述细菌优先感染肿瘤-驻留免疫细胞，和/或免疫刺激性细菌的基因组被修饰以使得其在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡(减少细胞焦亡)，由此免疫刺激性细菌在肿瘤中或在肿瘤微环境中或在肿瘤-驻留免疫细胞中积累，从而递送编码的治疗性产物。
在免疫刺激性细菌中，质粒在真核启动子的控制下编码治疗性产物，使得其在真核宿主(诸如人或其他哺乳动物)中表达。治疗性产物通常是抗癌治疗剂，诸如刺激宿主的免疫系统的抗癌治疗性蛋白。其它治疗性产物包括抗体及其抗原结合片段，和核酸，诸如RNAi。这些产物可以被设计成抑制、阻抑或破坏靶标，诸如免疫检查点和损害对象的免疫系统识别肿瘤细胞的能力的其他此类靶标。
未修饰的免疫刺激性细菌可以是野生型菌株或减毒菌株。本文提供和描述的基因组修饰使肿瘤微环境或肿瘤外部的细菌减毒；除其它性质之外，这些修饰改变了细菌的感染性。可以如本文所述被修饰的细菌的示例是沙门菌属(Salmonella)，诸如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)菌株。示例性鼠伤寒沙门菌菌株是减毒和野生型菌株，例如衍生自命名为AST-100、VNP20009、YS1646(ATCC#202165)、RE88、SL7207、χ8429、χ8431、χ8468的菌株或ATCC保藏号14028的野生型菌株的鼠伤寒沙门菌菌株。
如上所述，提供了免疫刺激性细菌，其包含在真核启动子控制下的编码产物的质粒，其中免疫刺激性细菌的基因组被修饰，由此所述细菌是pagP-/msbB-。msbB的缺失改变脂多糖(LPS，革兰氏阴性菌的外膜的主要成分)的脂质A结构域的酰基组成，使得细菌主要产生五酰化LPS而不是更有毒和促炎性的六酰化LPS。在野生型鼠伤寒沙门菌中，pagP的表达导致七酰化脂质A，而在msbB-突变体中，pagP的诱导导致六酰化LPS。因此，pagP-/msbB-突变体仅产生五酰化LPS，导致较低的促炎细胞因子的诱导和提高的耐受性，这允许在人中更高的剂量。更高的剂量导致增加的肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和肿瘤微环境的定植。由于所得的细菌膜和结构的改变，宿主免疫应答诸如补体活性被改变，使得细菌在全身施用时不被消除。例如，本文显示，pagP-/msbB-突变体菌株具有增加的补体失活抗性和增强的在人血清中的稳定性。这些细菌也可以是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)，其进一步增强耐受性、对补体失活的抗性和肿瘤/TME/肿瘤-驻留免疫细胞定植。所述细菌还可包含本文所述的其它修饰，包括改变它们可感染的细胞的修饰，从而导致在肿瘤微环境、肿瘤和肿瘤-驻留免疫细胞中的积累。因此，本文提供的免疫刺激性细菌可以被全身施用并且表现出高水平的肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤-驻留免疫细胞定植。所述免疫刺激性细菌可以是purI-(purM-)，以及asd-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-之一或二者中的一种或多种。
诸如由于全部或部分的编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的破坏或缺失，免疫刺激性细菌可是天冬氨酸-半醛脱氢酶-(asd-)，由此不表达内源asd。这些免疫刺激性细菌可以被修饰以在细菌启动子的控制下在质粒上编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)，使得所述细菌可以在体外产生。
可以使免疫刺激性细菌对于在肿瘤微环境中富集或积累的特定营养物(诸如腺苷和腺嘌呤)呈营养缺陷型。而且，可以将它们修饰为对于这些营养物为营养缺陷型，以降低或消除它们复制的能力。失活/缺失的细菌基因组基因可以通过在宿主识别的启动子的控制下在质粒上提供它们来互补。
在用于在真核生物(诸如人宿主)中表达的质粒上编码的产物处于真核调节序列的控制下，所述真核调节序列包括真核启动子，诸如RNA聚合酶II或III识别的启动子。这些包括哺乳动物RNA聚合酶II启动子。也可以使用病毒启动子。示例性病毒启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、Epstein-Barr病毒(EBV)启动子、疱疹病毒启动子和腺病毒启动子。其它RNA聚合酶II启动子包括但不限于延伸因子-1(EF1)α启动子、UbC启动子(慢病毒)、PGK(3-磷酸甘油酸激酶)启动子和合成启动子诸如CAGG(或CAG)启动子。合成CAG启动子含有巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件(C)；启动子、鸡β-肌动蛋白基因(A)的第一外显子和第一内含子；和兔β-球蛋白基因(G)的剪接受体。可以使用其它强的可调节或组成型启动子。调节序列还包括终止子、增强子，以及分泌信号和其它运输信号。
包括在免疫刺激性细菌中的质粒可以诸如通过选择导致中等至低拷贝数的复制起点(诸如低拷贝数的复制起点)以低拷贝数或中等拷贝数存在。本文显示，当所述质粒以低至中等拷贝数存在时，所述细菌的抗肿瘤活性和其它性质得到改善，其中中等拷贝数小于150，或小于约150且大于20或约20，或在20或25与150个拷贝之间，并且低拷贝数小于25，或小于20，或小于约25，或小于约20个拷贝。
这些免疫刺激性细菌可以被修饰以使得所述细菌优先感染肿瘤-驻留免疫细胞，和/或免疫刺激性细菌的基因组可被修饰以使得它们在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡(减少细胞焦亡)，由此免疫刺激性细菌在肿瘤中或在肿瘤微环境中或在肿瘤-驻留免疫细胞中积累。
如上所述，免疫刺激性细菌的基因组还被修饰以使得所述细菌优先感染免疫细胞，诸如肿瘤-驻留免疫细胞，诸如髓样细胞，诸如为CD45+的细胞，和/或基因组被修饰以使得所述细菌比未修饰的细菌在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡(减少细胞焦亡)。结果，免疫刺激性细菌比没有修饰的那些在肿瘤中或在肿瘤微环境中或在肿瘤-驻留免疫细胞中在更大程度上积累，从而递送治疗性产物或在质粒上编码的产物。所述细菌可以是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-和msbB-中的一种或多种，并且可以包括本文所述的其它这样的修饰。所述细菌可以对腺苷呈营养缺陷型和/或purI-(purM-)和/或asd-。
本文提供的免疫刺激性细菌可以包括细菌基因组的修饰，其中所述细菌在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡；和/或细菌基因组的修饰，其中所述细菌在肿瘤、肿瘤微环境或肿瘤-驻留免疫细胞(诸如肿瘤驻留D45+细胞和髓样细胞)中更有效地积累。
例如，免疫刺激性细菌可以包括参与SPI-1侵袭(和/或SPI-2)的一个或多个基因或操纵子的缺失或修饰，由此所述免疫刺激性细菌不侵袭或感染上皮细胞。可被缺失或失活的示例性基因是avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaP、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB和sptP中的一种或多种。感染上皮细胞的能力的消除也可以通过使本文的免疫刺激性细菌工程化以包含编码参与SPI-1非依赖性侵袭的蛋白的基因的敲除或缺失来实现，诸如选自rck、pagN、hlyE、pefI、srgD、srgA、srgB和srgC的基因中的一个或多个基因。类似地，免疫刺激性细菌可以包括在SPI-2中的基因和/或操纵子中的缺失，例如，以使所述细菌工程化为逃逸含有沙门菌属的囊泡(SCV)。这些基因包括例如sifA、sseJ、sseL、sopD2、pipB2、sseF、sseG、spvB和steA。
本文提供的免疫刺激性细菌包含编码免疫刺激性蛋白的核苷酸的序列，当在哺乳动物对象中表达时，所述免疫刺激性蛋白赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫；在真核启动子的控制下在细菌中的质粒上编码免疫刺激性蛋白。示例性启动子包括但不限于延伸因子-1(EF1)α启动子，或UbC启动子，或PGK启动子，或者CAGG或CAG启动子。
另外，免疫刺激性细菌的基因组被修饰，以使得其优先感染肿瘤-驻留免疫细胞。这通过缺失或破坏在细菌的侵袭性或感染性中起作用和/或在诱导细胞死亡中起作用的细菌基因来实现。相比于未修饰的细菌，所述细菌被修饰以优先感染肿瘤-驻留免疫细胞，和/或在肿瘤-驻留免疫细胞中比在细菌可以感染的其他细胞中诱导更少的细胞死亡。
免疫刺激性细菌还可以编码治疗性产物，诸如抑制性RNA(RNAi))、免疫刺激性蛋白(诸如细胞因子、趋化因子和共刺激分子)、增加对象中的免疫应答的其他蛋白、以及当在哺乳动物对象中表达时赋予或有助于抗肿瘤免疫的其他抗肿瘤剂。在真核启动子的控制下在细菌中的质粒上编码治疗性产物。免疫刺激性细菌的基因组被修饰，以使得其在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡。所述质粒通常以低或中等拷贝数存在。
还提供的是在真核启动子控制下的在细菌的质粒上编码免疫刺激性蛋白的免疫刺激性细菌，当在哺乳动物对象中表达时，该免疫刺激性蛋白赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫。免疫刺激性细菌被修饰以具有降低的致病性，由此相对于没有所述修饰的细菌，上皮和/或其他非免疫细胞的感染降低。这些包括3型分泌系统(T3SS)或4型分泌系统(T4SS)的修饰，诸如如本文所述和举例说明的沙门菌属的SPI-1途径的修饰。可以诸如通过缺失或破坏编码脂质A棕榈基转移酶(pagP)的核酸来进一步修饰所述细菌以诱导较少的细胞死亡，这降低了所述细菌的毒力。
可以修饰本文提供的免疫刺激性细菌的基因组以增加或促进感染免疫细胞，特别是肿瘤微环境中的免疫细胞诸如吞噬细胞。这包括减少非免疫细胞诸如上皮细胞的感染，或增加免疫细胞的感染。还可以修饰所述细菌以减少免疫细胞中的细胞焦亡。细菌基因组的许多修饰可以进行增加免疫细胞的感染和减少细胞焦亡之一或二者。本文提供的免疫刺激性细菌包括这样的修饰，例如缺失和/或破坏参与SPI-1T3SS途径的基因，诸如破坏或缺失hilA，和/或破坏/缺失编码鞭毛蛋白、杆状蛋白(PrgJ)、针状蛋白(PrgI)和QseC的基因。
免疫刺激性细菌可以是purI-(purM-)、msbB-、purD-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-、adrA-、CsgD-、QseC-和hilA-中的一种或多种，并且特别是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和/或pagP-，和/或msbB-/pagP-。例如，免疫刺激性细菌可以包括基因组中的突变，诸如减低宿主中非免疫细胞的毒性或感染性的基因缺失或破坏。例如，免疫刺激性细菌可以是pagP-。作为另一实例，免疫刺激性细菌可以是hilA-和/或鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)，并且还可以是pagP-。因此，例如，免疫刺激性细菌可以编码免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子，并且细菌可以被修饰，使得它们在肿瘤微环境(TME)中积累并表达细胞因子，从而将免疫治疗性抗肿瘤产物递送到在其中其具有有益活性的环境中，并且避免在其他细胞/环境中表达的不良或毒性副作用。编码免疫刺激性蛋白的核酸可以可操作地连接至编码分泌信号的核酸以进行表达，由此，当在宿主中表达时，免疫刺激性蛋白被分泌到肿瘤微环境中。
本文提供的免疫刺激性细菌包括在共同未决的美国申请序列号16/033,187或公开的国际申请号PCT/US2018/041713(以WO 2019/014398公布)中的菌株和细菌中的任一种，其进一步被修饰以表达免疫刺激性蛋白和/或优先感染如本文所描述和例示的肿瘤微环境中的免疫细胞或者肿瘤-驻留免疫细胞，和/或在如本文所描述和例示的肿瘤微环境中的免疫细胞或者肿瘤-驻留免疫细胞中毒性较低。
诸如由于全部或部分的编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的破坏或缺失，免疫刺激性细菌可以是天冬氨酸-半醛脱氢酶-(asd-)，由此不表达内源asd。免疫刺激性细菌可以被修饰以在细菌启动子的控制下在质粒上编码用于体外生长细菌的天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)，使得细菌将具有有限的体内复制。
本文提供的免疫刺激性细菌可以在质粒上编码作为治疗性产物的免疫刺激性蛋白。所述免疫刺激性蛋白可以是细胞因子诸如趋化因子或共刺激分子。免疫刺激性蛋白的示例是IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-36γ、IL-18、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞募集/持久性的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族成员，以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
免疫刺激性细菌任选地可以包括编码抑制性RNA(RNAi)的核苷酸的序列，所述RNAi抑制、阻抑或破坏免疫检查点的表达。可以在细菌中的质粒上编码RNAi。编码免疫刺激性蛋白的核苷酸，和任选的RNAi，可以在以低至中等拷贝数存在的质粒上。
免疫刺激性细菌还可以编码治疗性产物，诸如RNAi或CRISPR盒，该RNAi或CRISPR盒抑制、阻抑或破坏免疫检查点或其他靶标的表达，其他靶标的抑制、阻抑或破坏增加对象中的抗肿瘤免疫应答；在细菌中的质粒上编码所述RNAi或CRISPR盒。其它治疗性产物包括例如结合至免疫检查点以抑制其活性的抗体。
RNAi包括可用于使靶向的核酸的表达沉默的所有形式的双链RNA。RNAi包括shRNA、siRNA和微RNA(miRNA)。这些形式中的任一种可在本文所公开和描述的实施方案中互换。通常，在细菌中的质粒上编码RNAi。该质粒可以包括编码以下的其它异源核酸：调节活性或产物或向所述细菌添加活性或产物的感兴趣的产物，或可以调节用所述细菌治疗的对象的免疫系统的其它此类产物。也可以加入、缺失或破坏细菌基因。这些基因可以编码用于细菌生长和复制的产物，或编码也调节宿主对细菌的免疫应答的产物。
本文提供的免疫刺激性细菌也可对于腺苷或对于腺苷和腺嘌呤呈营养缺陷型。
携带本文所述的质粒的、用于如本文所述修饰的细菌物种包括，但不限于，例如沙门菌属、志贺菌属(Shigella)、利斯特菌属(Listeria)、大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌(Bifidobacteriae)的菌株。例如，物种包括宋内志贺菌(Shigella sonnei)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌、鸡沙门菌(Salmonella gallinarum)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)。
物种包括，例如，沙门菌属、志贺菌属、大肠杆菌、双歧杆菌、立克次体属(Rickettsia)、弧菌属(Vibrio)、利斯特菌属(Listeria)、克雷伯菌属(Klebsiella)、博德特菌属(Bordetella)、奈瑟球菌属(Neisseria)、气单胞菌属(Aeromonas)、弗朗西丝菌属(Francisella)、霍乱(Cholera)、棒杆菌属(Corynebacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜血菌属(Haemophilus)、布鲁杆菌属(Brucella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、军团病杆菌属(Legionella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、螺杆菌属(Helicobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和丹毒丝菌属(Erysipelothrix)的菌株，或前述细菌菌株列表中任一种的其减毒菌株或其修饰菌株。
其他合适的细菌物种包括立克次体属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、弧菌属、芽孢杆菌属和丹毒丝菌属。例如，Rickettsia Rikettsiae、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、Rickettsia tsutsugamuchi、摩氏立克次体(Rickettsia mooseri)、西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、Aeromonaseucrenophila、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、Franciesella tularensis、假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、Haemophilus sornnus、流产布鲁杆菌(Brucella abortus)、细胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)、马红球菌(Rhodococcus equi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼬螺杆菌(Helicobacter mustelae)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、五日热罗克利马体菌(Rochalimaea quintana)、以及Agrobacterium tumerfacium。
本文例举了沙门菌属，特别是鼠伤寒沙门菌菌株。沙门菌属可以是野生型物种或减毒物种。一些减毒物种的示例是命名为YS1646(ATCC#202165)或VNP20009的菌株。其它菌株包括RE88、SL7207、χ8429、χ8431和χ8468。野生型或未减毒物种的示例包括，例如，以ATCC14028保藏的野生型菌株，或具有ATCC 14028所有鉴定特征的菌株。本文的修饰通过阻抑细菌可以感染的细胞或它们可以在其中复制的细胞来减毒任何菌株。
这些菌株可被进一步修饰以编码免疫刺激性蛋白和/或免疫调节蛋白质。例如，免疫刺激性细菌可以编码增加肿瘤微环境中的免疫应答的免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子。如本文所述，免疫刺激性细菌也可以被修饰为优先感染肿瘤微环境中的免疫细胞或感染肿瘤-驻留免疫细胞，和/或在此类免疫细胞中诱导较少的细胞死亡。在具体实施方式、实施例和序列表中提供其序列和描述。免疫刺激性细菌可以衍生自细菌的减毒菌株，或者它们通过本文所述的修饰(诸如asd的缺失)而减毒，由此体内复制受限。
应当理解，在本文中修饰并引用细菌基因的情况下，引用它们在沙门菌属物种中的命名(名称)，沙门菌属物种是可以产生免疫刺激性细菌的细菌的示例。本领域技术人员认识到其他物种具有相应的蛋白质，但是它们的命名或名称可以与沙门菌属的名称不同。然而，本文的一般性公开内容可应用于其它细菌物种。例如，如本文所示，沙门菌属中的鞭毛蛋白(fliC-/fljB-)和/或pagP的缺失或失活导致增加的肿瘤定植。可以在其他细菌物种中修饰编码鞭毛的类似基因或用于感染的类似功能以实现增加的肿瘤定植。类似地，本文所述的细菌产物(诸如pagP和/或msbB的产物)的失活/缺失可以降低补体活化和/或其他炎症应答，从而增加对肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和肿瘤微环境的靶向。可以缺失参与活化补体途径或其他炎性途径的在其他物种中的相应基因，如在此对于沙门菌属所示例的。
本文提供的免疫刺激性细菌编码降低抗肿瘤免疫应答的各种基因的抑制剂，和/或表达有助于抗肿瘤免疫应答的基因和/或基因产物和/或刺激免疫系统的产物，诸如免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子、趋化因子和共刺激分子，从而是免疫刺激性的。腺苷营养缺陷是免疫刺激性的。可以在质粒上编码的其它治疗性产物是核酸，诸如抑制性RNA(RNAi)，诸如shRNA或微RNA或siRNA，其靶向用于破坏或抑制TREX1、PD-L1、VISTA(编码T细胞活化V-结构域Ig抑制因子的基因)、TGF-β和CTNNB1(编码β-连环蛋白的基因)，尤其是其组合的表达，及其与抑制、阻抑或破坏其它免疫抑制基因表达的任何RNAi的组合，所述免疫抑制基因的表达通过肿瘤或肿瘤微环境(TME)活化或增强。这些RNA的表达开发了两个独立的免疫刺激性途径，并且在单一疗法中导致增强的肿瘤定植。本文提供的对腺苷呈营养缺陷型的菌株增强了该组合的作用，其在富含腺苷的免疫抑制肿瘤微环境中优先积累或募集到其中。减少此类TME中的腺苷进一步增强免疫刺激性作用。已知的或可被工程化用于治疗性施用的任何细菌菌株中的性状的此类组合提供类似的免疫刺激性作用。
靶标之中是TGF-β，其具有三种同种型：1、2和3。靶标之中是TGF-β，特别是同种型1，而不是同种型2和3。毒性与同种型2和3的抑制有关。例如，心脏瓣膜毒性与同种型2的抑制有关。同种型1存在于大多数癌症中(参见，例如，TCGA数据库)。仅抑制同种型1是有利的。RNAi可有利地用于此目的，因为其可被设计成非常特异性地识别靶标。对于TGF-β，同种型1的特异性抑制可通过靶向同种型1特有的不存在于同种型2或3中的序列来实现，或选择靶向同种型1和3而不是同种型2的序列来实现。还提供的是免疫刺激性细菌，其中所述质粒编码特异性地抑制、阻抑或破坏TGF-β同种型1而不是TGF-β同种型2或TGF-β同种型3的表达的shRNA或微RNA；或者所述质粒编码特异性抑制、阻抑或破坏TGF-β同种型1和3而不是TGF-β同种型2的表达的shRNA或微RNA。
RNAi(诸如本文提供的免疫刺激性细菌对PD-L1的miRNA-或shRNA-介导的基因破坏)也改善了肿瘤、TME和/或肿瘤-驻留免疫细胞的定植。已经表明，PD-L1的敲除增强了鼠伤寒沙门菌感染。例如，已经观察到PD-L1敲除小鼠中的细菌载量比野生型小鼠中的高至少10倍，表明PD-L1对鼠伤寒沙门菌感染有保护性(参见例如，Lee el al.(2010)Immunol.185:2442-2449)。
工程化的免疫刺激性细菌，诸如本文提供的鼠伤寒沙门菌免疫刺激性细菌，含有多种协同模式以诱导冷肿瘤的免疫再活化，从而促进肿瘤抗原特异性免疫应答，同时抑制肿瘤用来推翻和逃逸耐久的抗肿瘤免疫的免疫检查点途径。在实施方案中包括腺苷营养缺陷和增强的血管破坏。这种通过腺苷营养缺陷和增强的血管破坏在肿瘤靶向的改善增加了功效，同时局部化炎症以限制全身性细胞因子暴露和用其它免疫疗法模式观察到的自身免疫毒性。
在真核宿主细胞转录机制所识别的启动子(诸如RNA聚合酶II(RNAPII)和RNA聚合酶III(RNAPIII)启动子)的控制下，在质粒上表达异源治疗性蛋白和其他产物，诸如免疫刺激性蛋白、抗体和RNA。RNAP III启动子通常在真核宿主中组成型地表达；可以调节RNAP II启动子。在细菌稳定表达的质粒上编码治疗性产物。此类细菌的示例是沙门菌属菌株，通常是减毒菌株，通过传代或其它方法减毒，或者凭借本文所述的修饰诸如腺苷营养缺陷而减毒。示例性沙门菌属菌株是具有缺陷的asd基因的经修饰的鼠伤寒沙门菌菌株。这些细菌可以被修饰为包括在引入的质粒上携带功能性asd基因；这维持了对质粒的选择，使得不需要基于抗生素的质粒维持/选择系统。在质粒上不含有功能性asd基因的asd缺陷菌株在宿主中是自溶的。
可以针对肿瘤细胞的环境选择启动子，例如在肿瘤微环境(TME)中表达的启动子、在缺氧条件下表达的启动子，或在pH小于7的条件下表达的启动子。
质粒可以以许多拷贝或更少的拷贝存在。这可以通过选择元件例如复制起点来控制。低、中等和高拷贝数的质粒和复制起点是本领域技术人员熟知的并且可以选择。在本文的免疫刺激性细菌的实施方案中，质粒可以以低至中等拷贝数存在，诸如约150或150和更少个拷贝，至低拷贝数，所述低拷贝数小于约25或约20或25个拷贝。示例性复制起点是衍生自pBR322、p15A、pSC101、pMB1、colE1、colE2、pPS10、R6K、R1、RK2和pUC的那些。
质粒可以包括RNAi，使得RNA抑制、阻抑或破坏免疫检查点或其它靶标和另外地它们的产物的表达。质粒还可以包括编码缺少信号序列的listeriolysin O(LLO)蛋白(cytoLLO)、CpG基序、DNA核靶向序列(DTS)、和视黄酸诱导型基因-I(RIG-I)结合元件的核酸序列。包含核酸的免疫刺激性细菌可以包括被toll样受体9(TLR9)识别的CpG基序。CpG基序可以在质粒上编码。CpG基序可以包括在细菌基因中，或者是细菌基因的一部分，所述细菌基因在质粒上被编码。例如，包含CpG的基因可以是在质粒上编码的asd。本文提供的免疫刺激性细菌可以包括CpG基序、用于质粒维持的asd基因选择标记和DNA核靶向序列中的一个或多个。
本文提供的免疫刺激性细菌可以编码：抑制、阻抑或破坏免疫检查点表达的两种或更多种不同的RNA分子，和/或编码代谢物的抑制剂(其为免疫抑制性的或处于免疫抑制途径中)的RNA分子。
本文提供的免疫刺激性细菌可以是天冬氨酸-半醛脱氢酶-(asd-)，其允许在补充有二氨基庚二酸(DAP)的培养基中生长，但当施用给对象用于治疗时，限制体内复制。这样的细菌将是自限性的，其可有利于治疗。由于全部或部分的编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的内源基因(asd)的破坏或缺失，该细菌可以是asd-，由此不表达内源asd。在其它实施方案中，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的基因可以包括在质粒上用于体内表达。
本文提供的免疫刺激性细菌中的任一种通常可以在质粒上包括核酸，其包括CpG基序或CpG岛，其中CpG基序被toll样受体9(TLR9)识别。编码CpG基序或岛的核酸在原核生物中是丰富的，并且因此，CpG基序可以包括在细菌基因中，或者是细菌基因的一部分，所述细菌基因在质粒上被编码。例如，细菌基因asd含有免疫刺激性CpG。
本文提供的免疫刺激性细菌可对于腺苷或者腺苷和腺嘌呤呈营养缺陷型。可以使本文的任何细菌为腺苷自养型，这可以有利地增加抗肿瘤活性，因为腺苷在许多肿瘤中积累，并且是免疫抑制性的。
本文提供的免疫刺激性细菌可以是鞭毛蛋白缺陷的，其中野生型细菌包含鞭毛。通过破坏或缺失编码鞭毛的一种或多种基因的全部或部分，它们可以成为鞭毛蛋白缺陷的。例如，提供了免疫刺激性细菌，该免疫刺激性细菌具有编码鞭毛蛋白亚单位fliC和fljB之一或两者的基因的缺失，由此该细菌是鞭毛缺陷的。
本文提供的免疫刺激性细菌可以包括编码cytoLLO的核酸，所述cytoLLO是缺少周质分泌信号序列的listeriolysin O(LLO)蛋白，使得其在细胞质中积累。这种突变有利地与asd-细菌组合。LLO是来自单核细胞增生利斯特菌的胆固醇依赖性成孔溶血素，其介导细菌的吞噬体逃逸。当将自溶菌株引入荷瘤宿主(诸如人)时，细菌被吞噬性免疫细胞摄取，并进入囊泡。在该环境中，DAP的缺乏阻止细菌复制，并导致囊泡中细菌的自溶。然后裂解释放质粒，并且积累的LLO在含胆固醇的囊泡膜中形成孔，并允许将质粒递送到宿主细胞的胞质溶胶中。
免疫刺激性细菌可以包含在质粒上编码的DNA核靶向序列(DTS)，诸如SV40 DTS。
免疫刺激性细菌可以具有编码核酸内切酶-1(endA)的基因的缺失或修饰，由此抑制或消除endA活性。这些的示例是免疫刺激性细菌，该免疫刺激性细菌含有CpG基序、用于质粒维持的asd基因选择标记和DNA核靶向序列中的一个或多个。
免疫刺激性细菌可以包含在质粒上的核酸，该质粒编码：抑制、阻抑或破坏免疫检查点表达的两种或更多种不同的RNA分子，和/或编码代谢物的抑制剂(其为免疫抑制性的或处于免疫抑制途径中)的RNA分子。
编码RNAi(诸如shRNA或miRNA或siRNA)的核酸，可以在RNA编码核酸之后包括转录终止子。在所有实施方案中，在免疫刺激性细菌中的质粒上编码的RNAi可以是短发夹RNA(shRNA)或微RNA(miRNA)。
免疫刺激性细菌可另外编码治疗性产物，诸如抑制、阻抑、破坏或沉默免疫检查点和其他靶标(其抑制、阻抑、破坏或沉默是免疫刺激性的)的表达的RNAi，或抑制这些靶标表达的抗体或其它结合蛋白。这些靶标包括但不限于以下中的一种或多种：three primerepair exonuclease 1(TREX1)、PD-l、PD-L1(B7-H1)、VEGF、TGF-β同种型1、β-连环蛋白、CTLA-4、PD-L2、PD-2、IDO1、IDO2、SIRPα、CD47、VISTA(B7-H5)、LIGHT、HVEM、CD28、LAG3、TIM3、TIGIT、Galectin-9、CEACAM1、CD155、CD112、CD226、CD244(2B4)、B7-H2、B7-H3、ICOS、GITR、B7-H4、B7-H6、CD27、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD137(4-1BB)、CD200、CD272(BTLA)、CD160、CD39、CD73、A2a受体、A2b受体、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4、OX40、OX-40L、KIR、TIM1、TIM4、STAT3、Stabilin-l(CLEVER-l)、DNase II和RNaseH2。例如，任何免疫刺激性细菌可以含有抑制、阻抑或破坏TREX1、PD-L1、VISTA、TGF-β(诸如TGF-β同种型1或同种型1和3)、β-连环蛋白、SIRP-α、VEGF、RNase H2、DNaseII和CLEVER-l/Stabilin-l中的一种或组合的表达的RNA。分化簇47(CD47)，也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)，是属于蛋白质的免疫球蛋白超家族的跨膜受体。CD47在细胞上普遍表达，并作为自我识别的标记，从而防止吞噬作用。CD47通过与几种其他蛋白质(包括凝血酶敏感蛋白(TSP)和信号调节蛋白-α(SIRPα))相互作用来介导其作用。吞噬细胞上的SIRPα与靶细胞上的CD47之间的相互作用有助于确保靶细胞不会被吞噬细胞吞食。某些癌症通过增加CD47在癌细胞的细胞表面上的表达来共选择(co-opt)基于CD47的细胞免疫逃逸机制，从而避免被免疫系统清除。靶向对象中表达CD47的细胞导致毒性。在本文提供的免疫刺激性细菌中的质粒上编码CD47抑制分子，诸如抗体或抗体片段，诸如纳米抗体(参见，例如，Sockoloskyet al.(2016)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.113:E2646-E2654)导致抗CD47产物在肿瘤微环境或肿瘤中的表达。已经在细菌如瘤内施用的大肠杆菌中编码抗CD47抗体片段(参见例如Chowdhury et al.(2019)Nature Medicine 25:1057-1063)。本文的细菌具有改善的对肿瘤微环境、肿瘤和/或肿瘤-驻留免疫细胞的靶向和定植，因此可以更有效地递送抗CD47抗体或抗体片段。本文提供的免疫刺激性细菌可以被全身施用以定植于肿瘤和肿瘤微环境。
提供了免疫刺激性细菌，其中所述质粒包含编码治疗性产物的核苷酸的序列，所述治疗性产物抑制免疫检查点或其他免疫抑制靶标。靶标包括但不限于TREX1、PD-L1、VISTA、TGF-β同种型1、β-连环蛋白、SIRP-α、VEGF、RNase H2、DNase II、CLEVER-l/Stabilin-l和CD47。待抑制、阻抑或破坏的其他靶标选自CTLA-4、PD-L2、PD-l、PD-2、IDO1、IDO2、LIGHT、HVEM、CD28、LAG3、TIM3、TIGIT、Galectin-9、CEACAM1、CD155、CD112、CD226、CD244(2B4)、B7-H2、B7-H3、ICOS、GITR、B7-H4、B7-H6、CD27、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD137(4-1BB)、CD200、CD272(BTLA)、CD160、CD39、CD73、A2a受体、A2b受体、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4、OX40、OX-40L、KIR、TIM1、TIM4和STAT3中的任一种。其示例是人PD-L1(SEQ ID NO:31)、人β-连环蛋白(SEQ ID NO:32)、人SIRPα(SEQ IDNO:33)、人TREX1(SEQ ID NO:34)、人VISTA(SEQ ID NO:35)、人TGF-β同种型1(SEQ ID NO:193)、和人VEGF(SEQ ID NO:194)。RNA可以靶向或含有SEQ ID NO：1-30、36-40和195-217的任一个中示出的免疫检查点核酸的序列。免疫刺激性细菌中任一种的质粒也可以编码核苷酸的序列，所述核苷酸是视黄酸诱导型基因I(RIG-I)或RIG-I结合元件的激动剂。
例如，免疫刺激性细菌可以包括基因缺失中的一种或多种，细菌可以是purI-(purM-)、msbB-、purD-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-、adrA-、CsgD-和hilA-中的一种或多种。例如，免疫刺激性细菌可以是msbB-。例如，免疫刺激性细菌可以包含purI缺失、msbB缺失、asd缺失、adrA缺失和任选的CsgD缺失。细菌基因缺失/修饰的示例是以下的任一种：
一种或多种选自以下的基因的突变，其改变脂多糖的生物合成：rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptA和lpxT中的一种或多种；和/或
一种或多种选自以下的突变，其引入自杀基因：sacB、nuk、hok、gef、kil或phlA中的一种或多种；和/或
一种或多种选自以下的突变，其引入细菌裂解基因：hly和cly之一或二者；和/或
一种或多种毒力因子的突变，所述毒力因子选自IsyA、pag、prg、iscA、virG、plc和act；和/或
一种或多种选自以下的基因的突变，其修饰应激应答：recA、htrA、htpR、hsp和groEL；和/或
min的突变，其破坏细胞周期；和/或
一种或多种选自以下的基因的突变，其破坏或失活调节功能：cya、crp、phoP/phoQ和ompR。
免疫刺激性细菌可以是沙门菌属、志贺菌属、大肠杆菌、双歧杆菌、立克次体属、弧菌属、利斯特菌属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、霍乱、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、芽孢杆菌属或丹毒丝菌属的菌株、或前述细菌菌株列表中任一种的其减毒菌株或其修饰菌株。
免疫刺激性细菌的示例是其中质粒含有编码缺少信号序列的listeriolysin O(LLO)蛋白(cytoLLO)、CpG基序、DNA核靶向序列(DTS)、和视黄酸诱导型基因-I(RIG-I)结合元件的一种或多种核酸的序列的那些。
其他示例性免疫刺激性细菌包括对腺苷呈营养缺陷型的那些并且包含：编码鞭毛的基因缺失；endA的缺失；编码CytoLLO的质粒；核定位序列；asd质粒互补系统；并且编码抑制、阻抑或破坏免疫检查点或其它靶标的表达的RNA，所述免疫检查点或其它靶标的抑制、阻抑或破坏增加对象中的抗肿瘤免疫应答。
这种免疫刺激性细菌包括沙门菌属的菌株，诸如野生型鼠伤寒沙门菌菌株，诸如以ATCC保藏号14028保藏的菌株，或具有以ATCC保藏#14028保藏的菌株的所有鉴定特征的菌株。其它菌株包括例如选自命名为AST-100、VNP20009的菌株、或者菌株YS1646(ATCC#202165)、RE88、SL7207、χ8429、χ8431和χ8468的减毒鼠伤寒沙门菌菌株。
免疫刺激性细菌除了增加肿瘤细胞、TME和/或肿瘤-驻留免疫细胞中的积累的修饰，和/或减少免疫细胞死亡的修饰之外，可以包含purI缺失、msbB缺失、asd缺失和adrA缺失中的一种或多种，并可以编码如本文所述的免疫刺激性蛋白或其他治疗性产物。免疫刺激性细菌还可包括：
一种或多种选自以下的基因的突变，其改变脂多糖的生物合成：rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptA和lpxT中的一种或多种；和/或
一种或多种选自以下的突变，其引入自杀基因：sacB、nuk、hok、gef、kil和phlA中的一种或多种；和/或
一种或多种选自以下的突变，其引入细菌裂解基因：hly和cly之一或二者；和/或
一种或多种毒力因子的突变，所述毒力因子选自IsyA、pag、prg、iscA、virG、plc和act；和/或
一种或多种选自以下的基因的突变，其修饰应激应答：recA、htrA、htpR、hsp和groEL；和/或
min的突变，其破坏细胞周期；和/或
一种或多种选自以下的基因的突变，其破坏或失活调节功能：cya、crp、phoP/phoQ和ompR。
菌株可以是msbB-、asd-、hilA-和/或鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和/或pagP-中的一种或多种。特别地，所述菌株是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)，诸如鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、msbB-、purI-/M-和任选的asd-和/或hilA-。所述细菌对于腺苷、或腺苷和腺嘌呤可以呈营养缺陷型。如本文所述，治疗性产物诸如RNAi和/或免疫刺激性蛋白，和/或抗体或其片段，在宿主识别的启动子诸如RNAP III启动子或RNAP II启动子的控制下表达。免疫刺激性细菌可以是沙门菌属、志贺菌属、大肠杆菌、双歧杆菌、立克次体属、弧菌属、利斯特菌属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、霍乱、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、芽孢杆菌属或丹毒丝菌属的菌株、或前述细菌菌株列表中的任一种的其减毒菌株或其修饰菌株。通常，该菌株是在宿主中减毒的菌株。沙门菌属菌株，例如鼠伤寒沙门菌是细菌的示例。示例性菌株包括衍生自命名为AST 100、VNP20009的菌株，或菌株YS1646(ATCC#202165)、RE88、SL7207、χ8429、χ8431、χ8468和野生型菌株ATCC#14028的鼠伤寒沙门菌菌株。
提供了含有所述免疫刺激性细菌的组合物。此类组合物含有细菌和药学上可接受的赋形剂或媒介物。免疫刺激性细菌包括本文所述或者并入本文的专利/申请中所描述的或本领域技术人员已知的任一种。所述细菌编码治疗性产物，通常是抗癌产物，诸如免疫检查点抑制剂或增加肿瘤微环境或肿瘤中的抗肿瘤活性的免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子或趋化因子或共刺激分子。所述细菌的基因组可以被修饰以具有增加的免疫细胞的感染性，和/或降低的非免疫细胞的感染性，和/或降低的诱导免疫细胞细胞死亡的能力。因此，如本文所述来修饰细菌以在肿瘤或肿瘤微环境或肿瘤-驻留免疫细胞中积累，和/或以递送促进抗肿瘤活性的免疫刺激性蛋白和其它治疗性产物。免疫刺激性细菌可以另外包含编码治疗性抗癌产物(诸如RNAi，诸如miRNA或shRNA，或CRISPR盒)的质粒，该治疗性抗癌产物靶向免疫检查点，或以其他方式增强细菌的抗肿瘤活性。
对于治疗其中免疫刺激影响治疗的疾病或病症，单剂量是治疗有效的。这种刺激的示例是免疫应答，该免疫应答包括但不限于特异性免疫应答和非特异性免疫应答之一或二者、特异性和非特异性免疫应答二者、先天应答、初级免疫应答、获得性免疫、次级免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞活化、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。
提供了含有免疫刺激性细菌中任一种的药物组合物。正如其用于治疗癌症的用途和治疗癌症的方法。方法和用途包括治疗患有癌症的对象，包括向对象诸如人施用免疫刺激性细菌或药物组合物。提供了一种治疗患有癌症的对象的方法，包括施用免疫刺激性细菌。
方法或用途包括其中施用第二抗癌剂或治疗的组合疗法。第二抗癌剂是产生胞质DNA的化学治疗剂，或放射疗法，或抗免疫检查点抑制剂(诸如抗PD-l、或抗PD-Ll或抗CTLA4抗体)，或CAR-T细胞或其他治疗性细胞(诸如干细胞、TIL细胞和用于癌症治疗的修饰细胞)。组合疗法还可以包括抗VEGF或抗VEGFR、或抗VEGFR2抗体或其片段，或抗IL6抗体或其片段，或溶瘤病毒疗法，或癌症疫苗。
施用可以通过任何合适的途径，诸如胃肠外，并且可以包括可以促进或增强递送的另外的物质。施用可以是口服或直肠，或通过气雾剂进入肺，或可以是瘤内、静脉内、肌内或皮下的。
癌症包括实体瘤(solid tumors)和恶性血液肿瘤(hematologic malignancies)，诸如但不限于淋巴瘤(lymphoma)、白血病(leukemia)、胃癌(gastric cancer)，以及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、结肠直肠、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
免疫刺激性细菌可以配制成供施用的组合物，诸如悬浮剂。它们可以被干燥并以粉末形式储存。还提供了免疫刺激性细菌与其它抗癌剂的组合。
提供了用于治疗癌症和恶性肿瘤的组合疗法。免疫刺激性细菌可在其它癌症疗法之前或同时施用，所述其它癌症疗法包括放射疗法、化学疗法，特别是产生胞质DNA的基因毒性化学疗法，以及免疫疗法，诸如抗检查点抑制剂抗体，包括抗PD-1抗体、抗PD-Ll抗体和抗CTLA4抗体，以及其它此类免疫疗法。其它癌症疗法还包括抗-VEGF、抗-VEGFR、抗-VEGFR2或抗-IL6抗体或其片段、癌症疫苗和溶瘤病毒。
施用可以通过任何合适的途径，包括全身或局部或表面，诸如胃肠外，包括例如口服或直肠、或通过气雾剂进入肺，或瘤内、静脉内、肌内或皮下。
还提供了通过免疫刺激性细菌增加肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境的定植的方法。该方法包括，例如，修饰细菌的基因组以提供细菌鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和/或pagP-。本文显示，这样的(一种或多种)修饰显著增强肿瘤/肿瘤微环境/肿瘤-驻留免疫细胞定植。
所使用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且使用这些术语和表达并非意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等价物，但是应认识到，可以考虑各种修改。
附图说明
图1描述了用于从菌株YS1646中缺失asd基因的方法的示意图。使用如Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))中所述的λ衍生的Red重组系统从鼠伤寒沙门菌菌株YS1646中缺失asd基因。
图2描述了IT施用AST-104后经注射且远端的肿瘤中的肿瘤定植水平。将BALB/c小鼠(6-8周龄)在右侧和左侧协腹(n＝10/组)上植入双重CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤。将具有已建立的肿瘤的小鼠用5×106CFU的含有TREX1 shRNA质粒的YS1646菌株(AST-104)IT注射到右侧协腹中。在肿瘤植入后35天(末次给药AST-104后12天)，处死三只小鼠，将经注射且远端的肿瘤均质化(GentleMACsTM，Miltenyi Biotec)并铺板于LB平板上，以计算每克肿瘤组织的集落形成单位(CFU)数。该图描绘了每克组织的平均CFU，±SD。
图3描绘了CpG加扰质粒(scrambled plasmid)具有免疫刺激性抗肿瘤性质。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。在箭头指示的天数，用5×106CFU的YS1646菌株(AST-100)，或含有加扰shRNA对照质粒的YS1646菌株(AST-103)，或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。TGI计算为1-(平均测试肿瘤体积/平均对照肿瘤体积)×100。该图描绘了每组的平均肿瘤生长，±SEM。**p<0.01，学生t检验。
图4描绘了用于缺失fliC基因的方法的示意图。使用lambda衍生的Red重组系统从鼠伤寒沙门菌菌株AST-101(YS 1646的asd缺失菌株)中缺失fliC基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))。
图5描绘了鞭毛蛋白缺失菌株在LB中正常生长。该图描述了菌株AST-108ASD(pATI-shTREX1)和AST-112ASD/FLG(pATI-shTREX1)在37℃在LB培养液中的生长，如使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)通过OD600测量的。
图6描绘了鞭毛蛋白敲除提高了抗肿瘤功效。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。在箭头指示的天数，用5×106CFU的含有pATIshTREX1质粒的asd/fljB/fliC敲除菌株(AST-113)，或含有pATI shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-110)，或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。TGI计算为1-(平均测试肿瘤体积/平均对照肿瘤体积)×100。该图描绘了每组的平均肿瘤生长，±SEM。*p<0.05，学生t检验。
图7描绘了鞭毛蛋白敲除显示出增加的IFN-γ标记。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。用5×106CFU的含有pATI shTREX1质粒的asd/fljB/fliC敲除菌株(AST-113)，或含有pATI shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-110)，或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。在第一次给药后6小时对小鼠取血，并通过Luminex 200装置(Luminex Corporation)和小鼠流式微球阵列(BD微球阵列，FACSFortessa，FCAP软件，所有均为BD Biosciences)测试全身血清细胞因子。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，学生t检验。
图8描绘了鞭毛蛋白对于肿瘤定植不是所需的。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。用5×106CFU的含有pATI shTREX质粒的asd/fljB/fliC敲除菌株(AST-113)，或含有pATI shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-110)，或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。在肿瘤植入后35天(D35)(末次给药工程化的沙门菌属疗法后12天)，处死每组的三只小鼠，将肿瘤均质化(GentleMACsTM，Miltenyi Biotec)并铺板于LB平板上，以计算每克肿瘤组织的集落形成单位(CFU)数。该图描绘了每克组织的平均集落形成单位CFU，±SD。
图9描绘了表达cytoLLO的菌株在体外正常生长。该图描述了菌株AST-110(含有(pATI-shTREX1)的asd缺失的YS1646)和AST-115(含有(pATI-shTREX1)的asd缺失并且敲入cytoLLO表达盒的YS1646)在37℃在LB培养液中的生长，如使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)通过OD600测量的。
图10描述了AST-115(携带shTREX1质粒的ASD敲除+CytoLLO敲入菌株)在小鼠CT26肿瘤模型中显示有效的单剂量功效。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。在箭头指示的天数，用5×106CFU的AST-115(含有(pATI-shTREX1)的asd缺失并在asd及基因座敲入cytoLLO表达盒的YS1646)，或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。TGI计算为1-(平均测试肿瘤体积/平均对照肿瘤体积)×100。该图描绘了每组的平均肿瘤生长，±SEM。**p<0.01，学生t检验。
图11描述了菌株YS1646生长需要腺苷的肿瘤微环境水平。菌株YS1646(purI-/msbB-)和野生型亲代菌株ATCC 14028在37℃在LB培养液中的生长，如使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)通过OD600测量的。
图12描述了ASD、FLG和CytoLLO工程化的菌株生长需要高腺苷。显示了菌株AST-117(含有低拷贝shTREX-1质粒的YS1646Δasd)、AST-118(含有低拷贝shTREX-1质粒的YS1646Δasd/Δflic/ΔfljB)，和AST-119(含有低拷贝shTREX-1质粒的YS1646Δasd:LLO)在37℃在LB培养液中的生长，如使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)通过OD600测量的。
图13描述了具有低拷贝复制起点的编码asd的质粒的菌株比具有高拷贝复制起点的编码asd的质粒的菌株具有更优的生长动力学。显示了菌株YS1646、AST-117(含有低拷贝的具有功能性asd基因的shTREX-1质粒的YS1646Δasd)、AST-104(含有低拷贝的不具有asd基因的pEQ shTREX-1质粒的YS1646)，和AST-110(含有高拷贝的具有功能性asd基因的pATI-shTREX-1质粒的YS1646Δasd)在37℃在LB培养液中的生长，如使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)通过OD600测量的。
图14描述了在小鼠肿瘤细胞中具有低拷贝asd质粒的菌株比具有高拷贝asd质粒的菌株更合适。在B16F.10小鼠黑素瘤细胞和CT26小鼠结肠癌细胞中示出了菌株AST-117(含有低拷贝的具有功能性asd基因的shTREX-1质粒的YS1646Δasd)和AST-110(含有高拷贝的具有功能性asd基因的pATI-shTREX-1质粒的YS1646Δasd)的胞内生长。在MOT为5时将24孔皿中的5×105个细胞用鼠伤寒沙门菌菌株感染。感染30分钟后，用含有庆大霉素的培养基替换培养基以杀死胞外细菌。在指定的时间点，通过渗透压休克裂解细胞单层，将细胞裂解物稀释并铺板在LB琼脂上，以计数CFU。
图15描述了在体内asd基因互补系统导致感染鼠伤寒沙门菌的肿瘤中质粒的保留。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。用5×106CFU的含有pATI shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-110)，或含有不具有asd基因的pEQshTREX-1质粒的YS1646(AST-104)来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。在肿瘤植入后35天(末次给药工程化的沙门菌属疗法后12天)，处死每组的三只小鼠，使用GentleMACsTM均质仪(Miltenyi Biotec)将肿瘤均质化并铺板于LB琼脂板或者具有50ug/mL卡那霉素的LB琼脂板上。该图描绘了肿瘤组织均质中卡那霉素抗性CFU的百分比，±SD。
图16描述了含有具有asd基因互补系统和shTREX1的质粒的菌株(AST-110)的治疗功效得到改善。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。在箭头指示的天数，用5×106CFU的含有pATI-shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-110)，或含有pATI-加扰质粒的asd敲除菌株(AST-109)，或者含有不具有asd基因的pEQ-shTREX-1质粒的YS1646菌株(AST-104)或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长×宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。TGI计算为1-(平均测试肿瘤体积/平均对照肿瘤体积)×100。该图描绘了每组的平均肿瘤生长，±SEM。
图17描绘了含有低拷贝shTREX1质粒的菌株(AST-117)与含有高拷贝质粒的菌株(AST-110)相比具有优异的抗肿瘤性质。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。在箭头指示的天数，用5×106CFU的含有具有低拷贝数复制起点的pATI-shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-110)，或含有具有低拷贝数复制起点的pATI-shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-117)，或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长×宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。TGI计算为1-(平均测试肿瘤体积/平均对照肿瘤体积)×100。该图描绘了每组的平均肿瘤生长，±SEM。*p<0.05，学生t检验。
图18A和图18B描绘了AST-117低拷贝质粒菌株比AST-110高拷贝质粒菌株更好地定植于肿瘤并且具有更高的肿瘤与脾定植比率。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。用5×106CFU的含有具有低拷贝数复制起点的pATI-shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-110)，或含有具有低拷贝数复制起点的pATI-shTREX1质粒的asd敲除菌株(AST-117)来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。在肿瘤植入后35天(末次给药工程化的沙门菌属疗法后12天)，处死每组的3只小鼠，使用GentleMACsTM均质仪(Miltenyi Biotec)将肿瘤均质化并铺板于LB板以计算每克肿瘤组织的CFU数。图18A描绘了每克肿瘤组织的平均CFU，±SD。图18B描绘了肿瘤与脾定植比率。
图19描述了自溶菌株(AST-120)在没有DAP的情况下不能生长。该图描绘了含有不包含asd基因的pEQU6-shTREX1质粒的Δasd:cytoLLO菌株(AST-120)随时间在单独的LB培养液中，或在补充有50μg/mL DAP的LB培养液中的生长，如使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)通过OD600测量的。
图20描绘了自溶菌株(AST-120)的抗肿瘤活性。将BALB/c小鼠(6-8周龄)植入单个CT26(2×105个细胞)皮下协腹肿瘤(n＝9/组)。在箭头指示的天数，用5×106CFU的含有不包含asd基因的pEQU6-shTREX1质粒的Δasd:cytoLLO菌株(AST-120)，或PBS对照来IV注射具有已建立的肿瘤的小鼠。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长×宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。TGI计算为1-(平均测试肿瘤体积/平均对照肿瘤体积)×100。该图描绘了每组的平均肿瘤生长，±SEM。*p<0.05，学生t检验。
图21描述了在SPI-1途径中在HilA下游起作用的蛋白质。
图22描述了SPI-1T3SS以及SPI-1编码的蛋白质的功能性分类(改编自Kimbroughand Miller(2002)Microbes Infect.4(l):75-82)。
图23描绘了SPI-1T3SS对巨噬细胞的作用。通过NAIP5/6检测鞭毛蛋白，通过NAIP1/2检测棒和针蛋白，这导致NLRC4炎性小体和胱天蛋白酶-l的活化，从而导致IL-lβ和IL-18的释放和细胞焦亡。
图24描述了T3SS-1介导的细菌进入上皮细胞和SCV。
图25描述了TLR5对细菌鞭毛蛋白和TLR4对LPS的识别，以及鞭毛蛋白、LPS、HilA、PrgI和PrgJ在宿主细胞感染、细胞因子释放、炎性小体活化和细胞凋亡中的作用。
具体实施方式
大纲
A.定义
B.免疫刺激性细菌的概述
C.癌症免疫疗法
1.免疫疗法
2.获得性免疫疗法
3.癌症疫苗和溶瘤病毒
D.细菌癌症免疫疗法
1.细菌疗法
2.细菌和病毒免疫应答的比较
3.沙门菌属疗法
a.嗜肿瘤细菌。
b.肠炎沙门菌亚属血清亚型(Salmonella enterica serovar Typhimurium)鼠伤寒沙门菌
c.细菌减毒
i.msbB-突变体
ii.purI-突变体
iii.减毒突变的组合
iv.VNP20009和其他减毒和野生型鼠伤寒沙门菌菌株
v.工程化以递送大分子的鼠伤寒沙门菌
4.增强免疫刺激性细菌以增加治疗指数
a.asd基因缺失
b.腺苷营养缺陷型
c.鞭毛蛋白缺陷菌株
d.工程化以逃逸含有沙门菌属的囊泡(SCV)的沙门菌属
e.生物膜形成所需的沙门菌属基因的缺失
f.LPS生物合成途径中基因的缺失
g.SPI-1和SPI-2基因的缺失
h.增加质粒递送的核酸内切酶(endA)突变
i.RIG-I抑制
j.DNase II抑制
k.RNase H2抑制
l.Stabilin-l/CLEVER-1抑制
5.免疫刺激性蛋白
6.增加免疫细胞对革兰氏阴性菌如沙门菌属的摄取并减少免疫细胞死亡的修饰
7.细菌培养条件
E.细菌减毒和定植
1.缺失鞭毛蛋白(fliC-/fljB-)
2.缺失LPS生物合成途径中基因
3.定植
F.构建编码治疗性蛋白的示例性质粒
1.免疫刺激性蛋白
2.抗体和抗体片段
3.干扰RNA(RNAi)
a.shRNA
b.微RNA
4.复制起点和质粒拷贝数
5.CpG基序和CPG岛
6.质粒维持/选择成分
7.RNA聚合酶启动子
8.DNA核靶向序列
9.CRISPR
G.含有针对示例性免疫靶基因的RNAi以刺激抗肿瘤免疫的肿瘤靶向免疫刺激性细菌
1.TREX1
2.PD-L1
3.VISTA
4.SIRPα
5.β-连环蛋白
6.TGF-β
7.VEGF
8.额外的示例性检查点靶标
H.药物生产、组合物和制剂
1.制备
a.细胞库制备
b.原料药(drug substance)制备
c.药物产品制备
2.组合物
3.制剂
a.流体、注射剂、乳剂
b.干燥的热稳定制剂
4.用于其它施用途径的组合物
5.剂量和施用
6.包装和制品
I.治疗方法和用途
1.肿瘤
2.施用
3.监测
J.实例
A.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，否则本文整个公开内容中所指的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其他公开的材料均通过引用整体并入。在本文的术语有多种定义的情况下，以本节中的定义为准。在提到URL或其他这样的标识符或地址的地方，应当理解，这样的标识符可改变并且互联网上的特定信息可以来来去去，但是可以通过检索互联网来找到等价信息。对其的引用证明了此类信息的可得性和公开传播。
如本文所用，治疗性细菌是当施用于对象诸如人时实现治疗诸如癌症或抗肿瘤治疗的细菌。
如本文所用，免疫刺激性细菌是治疗性细菌，当被引入对象中时，其会积累在免疫豁免组织和细胞中，诸如肿瘤中，并复制和/或表达免疫刺激的产物或导致免疫刺激的产物。例如，由于免疫刺激性细菌不能复制和/或表达产物(或具有降低的复制/产物表达)(除了主要在免疫豁免环境中之外)，所以由于降低的毒性或致病性和/或由于所编码的降低的毒性或致病性的产物，免疫刺激性细菌在宿主中被减毒。本文提供的免疫刺激性细菌被修饰以编码一种或多种产物或表现出使其具有免疫刺激性的性状或性质。这样的产物、性质和性状包括但不限于例如以下中的至少一种：免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子、趋化因子或共刺激分子；靶向、破坏或抑制免疫检查点基因(诸如TREX1和/或PD-L1)的RNAi，诸如siRNA(shRNA和微RNA)或CRISPR；或免疫检查点的抑制剂，诸如抗免疫检查点抗体。免疫刺激性细菌还可以包括修饰，该修饰使细菌对有免疫抑制性或处于免疫抑制途径的代谢物诸如腺苷呈营养缺陷型。
如本文所用，菌株名称VNP20009(参见例如国际PCT申请公开号WO 99/13053，也参见美国专利号6,863,894)和YS1646和41.2.9可互换使用，并且各自是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)且指定保藏号为202165的菌株。VNP20009是鼠伤寒沙门菌的改良减毒菌株，其包含msbB和purI缺失，并且是由野生型菌株ATCC#14028产生的。
如本文所用，可互换地使用菌株名称YS1456和8.7，并且各自是指保藏于美国典型培养物保藏中心且指定保藏号为202164的菌株(参见美国专利号6,863,894)。
如本文所用，复制起点是在染色体、质粒或病毒上发起复制的DNA序列。对于小DNA，包括细菌质粒和小病毒，单个起点就足够了。
复制起点确定载体拷贝数，该拷贝数取决于所选复制起点。例如，如果表达载体衍生自低拷贝数质粒pBR322，则其在约25-50个拷贝/细胞之间，并且如果衍生自高拷贝数质粒pUC，则其可以为150-200个拷贝/细胞。
如本文所用，细胞中质粒的中等拷贝数为约150或为150或小于150，低拷贝数为15-30，诸如20或小于20。低至中等拷贝数小于150。高拷贝数大于150个拷贝/细胞。
如本文所用，CpG基序是包括被在中央CpG侧翼(在其3′和5′侧上)的至少一个碱基包围的未甲基化的中央CpG(“p”是指连续的C和G核苷酸之间的磷酸二酯键)的碱基模式。CpG寡聚脱氧核苷酸是长度至少约十个核苷酸并且包括未甲基化的CpG的寡聚脱氧核苷酸。5′CG 3′中至少C是未甲基化的。
如本文所用，RIG-I结合序列是指直接的5′三磷酸(5′ppp)结构，或者从聚(dA-dT)序列由RNA pol III合成的5′三磷酸(5′ppp)结构，这是由于与RIG-I的相互作用可以通过RIG-I途径活化I型IFN。RNA包括至少四个A核糖核苷酸(A-A-A-A)；它可以包含4、5、6、7、8、9、10或更多个。将RIG-I结合序列引入细菌中的质粒中以转录成polyA。
如本文所用，免疫刺激性蛋白是赋予、促进、增强或增加免疫应答的蛋白，特别是在肿瘤微环境中，诸如在肿瘤和/或在肿瘤-驻留免疫细胞中。免疫刺激性蛋白包括但不限于细胞因子、趋化因子、共刺激分子以及其他免疫调节蛋白和产物。因此，如本文所用，“免疫刺激性蛋白”是在肿瘤微环境中赋予、展示或促进抗肿瘤免疫应答的蛋白质。此类蛋白质的示例是细胞因子、趋化因子和共刺激分子，诸如但不限于GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15/IL-15Rα链复合体、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL3、CCL4、CCL5、参与T细胞的潜在募集/持久性的分子、CD40、CD40配体(CD40L)、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族成员，CD47拮抗剂、TGF-β多肽拮抗剂，以及TNFR超家族成员。
如本文所用，“细胞因子”是在细胞信号传导中重要的小蛋白(～5-20kDa)的宽泛和松散类别。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子是细胞信号传导分子，其有助于免疫应答中的细胞通信，并刺激细胞向炎症、感染和创伤部位移动。
如本文所用，“趋化因子”是指化学引诱(趋化性)细胞因子，其与趋化因子受体结合，并且包括从天然来源分离的蛋白质以及如通过重组手段或化学合成而合成制备的那些蛋白质。示例性趋化因子包括但不限于IL-8、IL-10、GCP-2、GRO-α、GRO-β、GRP-γ、ENA-78、PBP、CTAP III、NAP-2、LAPF-4、MIG(CXCL9)、CXCL10、CXCL11、PF4、IP-10、SDF-1α、SDF-1β、SDF-2、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MIP-5、MDC、HCC-1、ALP、lungkine、Tim-1、嗜酸细胞活化趋化因子-1、嗜酸细胞活化趋化因子-2、I-309、SCYA17、TRAC、RANTES(CCL5)、DC-CK-1、淋巴细胞趋化因子、ALP、lungkine和fractalkine以及其他本领域技术人员已知的。趋化因子参与免疫细胞向炎症部位的迁移，以及免疫细胞的成熟和获得性免疫应答的产生。
如本文所用，经修饰以使得其“在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡”或“在免疫细胞中诱导较少的细胞死亡”的细菌是比未经修饰的细菌毒性小的细菌，或是与未经修饰的细菌相比具有降低的毒力的细菌。这种修饰的示例是减少/消除细胞焦亡和改变细菌上的脂多糖(LPS)谱的那些修饰。这些修饰包括一种或多种破坏或缺失鞭毛蛋白基因、pagP，或SPI-1途径的一种或多种成分诸如hilA、杆状蛋白、针状蛋白和QseC。
如本文所用，“经修饰以使得其优先感染肿瘤-驻留免疫细胞”或“经修饰以使其优先感染免疫细胞”的细菌在其基因组中具有修饰，从而降低了其感染除免疫细胞以外的细胞的能力。这种修饰的示例是破坏3型分泌系统或4型分泌系统或影响细菌侵袭非免疫细胞的能力的其他基因或系统的修饰。例如，破坏/缺失SPI-1成分，该SPI-1成分是沙门菌属感染细胞诸如上皮细胞所需要的但不影响沙门菌属对免疫细胞例如吞噬细胞的感染。
如本文所用，“修饰”是指多肽的氨基酸序列或核酸分子中核苷酸序列的修饰，并且分别包括氨基酸或核苷酸的缺失、插入和替换。修饰多肽的方法是本领域技术人员常规的，诸如通过使用重组DNA方法。
如本文所用，对细菌基因组或质粒或基因的修饰包括缺失、替换和插入核酸。
如本文所用，RNA干扰(RNAi)是生物学过程，其中RNA分子通过中和靶向的mRNA分子以抑制翻译并由此抑制靶向的基因的表达来抑制基因表达或翻译。
如本文所用，通过RNAi起作用的RNA分子由于其靶向的基因的表达的沉默而被称为抑制性的。使表达沉默是指靶向的基因的表达降低或被阻抑或抑制。
如本文所用，经由RNAi的基因沉默据说是抑制、阻抑、破坏或沉默靶向的基因的表达。靶向的基因包含与抑制性RNA中的序列相对应的核苷酸序列，从而抑制性RNA使mRNA的表达沉默。
如本文所用，抑制、阻抑、破坏或沉默靶向的基因是指改变靶向的基因的表达，诸如翻译，由此降低了由靶向的基因所编码的产物的活性或表达的过程。降低包括完全敲除或部分敲除，由此提及本文提供的免疫刺激性细菌和本文的施用时，治疗得以实现。
如本文所用，小干扰RNA(siRNA)是通常约21个核苷酸长的小片段的双链(ds)RNA，在每个末端处带有3′突出部分(2个核苷酸)，该3′突出部分可用于通过在特定序列处结合并促进信使RNA(mRNA)的降解来“干扰”蛋白质的翻译。这样做时，siRNA会根据其相应mRNA的核苷酸序列阻止特定蛋白质的产生。该过程称为RNA干扰(RNAi)，并且也称为siRNA沉默或siRNA敲低。
如本文所用，短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)是具有紧的发夹弯的人工RNA分子，该发夹可用于通过RNA干扰(RNAi)使靶基因表达沉默。shRNA在细胞中的表达通常通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来完成。
如本文所用，肿瘤微环境(TME)是肿瘤存在的细胞环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓衍生的炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(ECM)。存在的状况包括但不限于血管生成增加、缺氧、低pH、乳酸浓度增加、丙酮酸浓度增加、间质液压力增加以及代谢物或代谢改变，诸如较高的腺苷水平，这指示肿瘤。
如本文所用，人I型干扰素(IFN)是调节免疫系统的活性的干扰素蛋白的亚组。所有I型IFN都与特定的细胞表面受体复合物(例如IFN-α受体)结合。除了别的之外，I型干扰素包括IFN-α和IFN-β。IFN-β蛋白是由成纤维细胞产生的，并且具有主要参与先天性免疫应答的抗病毒活性。两种类型的IFN-β是IFN-β1(IFNB1)和IFN-β3(IFNB3)。
如本文所使用的，核酸或编码的RNA靶向基因的表述是指其通过任何机制抑制或阻抑或沉默基因的表达。通常，此类核酸包括与靶向的基因互补的至少一部分，其中该部分足以与互补部分形成杂交体。
如本文所用，“缺失”当指核酸或多肽序列时，是指与序列例如靶多核苷酸或多肽或天然或野生型序列相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失。
如本文所用，“插入”当指核酸或氨基酸序列时，描述了在靶标、天然、野生型或其他相关序列内包含一个或多个另外的核苷酸或氨基酸。因此，与野生型序列相比包含一个或多个插入的核酸分子在序列的线性长度内包含一个或多个另外的核苷酸。
如本文所用，向核酸和氨基酸序列“添加”描述了与另一序列相比向任一末端添加核苷酸或氨基酸。
如本文所用，“取代”或“替代”是指用可选的核苷酸或氨基酸替换天然、靶标、野生型或其他核酸或多肽序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸，而不改变分子的长度(如残基数所述的)。因此，分子中的一个或多个取代不会改变分子的氨基酸残基或核苷酸的数目。与特定多肽相比的氨基酸替换可以依据沿着多肽序列长度的氨基酸残基的数目表达。
如本文所用，“在对应于……的位置”或核苷酸或氨基酸位置”对应于”所公开序列中(诸如序列表中所述的)的核苷酸或氨基酸位置的表述，是指在使用标准比对算法(诸如GAP算法)与所公开的序列比对以使相同性最大化时识别的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守且相同的氨基酸残基作为指导来识别相应的残基。通常，为了识别相应位置，将氨基酸序列进行比对，使得获得最高阶的匹配(参见例如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,NewYork,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,和and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；以及Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，序列的比对是指使用同源性来比对两个或更多个核苷酸或氨基酸的序列。通常，将以50％或更多相同性相关的两个或多个序列进行比对。比对的序列组是指在相应位置进行比对的并且可以包括与基因组DNA序列比对的衍生自RNA的比对序列(诸如EST和其他cDNA)的2个或更多个序列。相关或变体多肽或核酸分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这样的方法通常使匹配最大化，并且包括诸如使用手动比对以及通过使用许多可用的比对程序(例如，BLASTP)的方法，和本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽或核酸的序列，本领域技术人员可以使用保守且相同的氨基酸残基作为指导来识别相似的部分或位置。此外，本领域技术人员还可以使用保守的氨基酸或核苷酸残基作为指导，以在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸或核苷酸残基。相应的位置也可以基于结构比对，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构的比对。在其他情况下，可以识别相应的区域。本领域技术人员还可以使用保守的氨基酸残基作为指导，以在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸残基。
如本文所用，多肽诸如抗体的“性质”是指多肽表现出的任何性质，包括但不限于结合特异性、结构构型或构象、蛋白质稳定性、对蛋白水解的抗性、构象稳定性、耐热性和对pH条件的耐受性。性质的改变可以改变多肽的“活性”。例如，抗体多肽的结合特异性的改变可以改变结合抗原的能力和/或多肽的各种结合活性，诸如亲和性或亲和力，或体内活性。
如本文所用，多肽诸如抗体的“活性”或“功能性活性”是指该多肽表现出的任何活性。这些活性可以凭经验确定。示例性活性包括但不限于例如通过抗原结合、DNA结合、配体结合或二聚作用或酶活性(例如激酶活性或蛋白水解活性)与生物分子相互作用的能力。对于抗体(包括抗体片段)，活性包括但不限于特异性结合特定抗原的能力、抗原结合的亲和性(例如，高或低亲和性)、抗原结合的亲和力(例如，高或低亲和力)、结合率(on-rate)、解离率(off-rate)、效应功能(诸如促进抗原中和或清除、病毒中和的能力)、以及体内活性(诸如防止病原体感染或侵袭，或促进清除，或穿透体内的特定组织、流体或细胞的能力)。可以使用公认的测定(诸如ELISA、流式细胞仪、表面等离振子共振或等价测定)来测量结合率或解离率、免疫组织化学和免疫荧光组织学和显微镜检查、基于细胞的测定、流式细胞仪和结合测定(例如淘选测定(panning assay))来在体外或体内评估活性。
如本文所用，“结合(bind)”、“结合(bound)”或其语法上的变化是指分子参与与另一分子的任何有吸引力的相互作用，从而导致其中两个分子彼此紧邻的稳定缔合。结合包括但不限于非共价结合、共价结合(例如可逆和不可逆的共价结合)，并且包括分子(诸如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子，诸如包括药物在内的化合物)之间的相互作用。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分或完全合成的，诸如重组产生的，包括包含免疫球蛋白分子的可变重链和轻区的至少一部分的其任何片段，该免疫球蛋白分子足以形成抗原结合位点，并且在组装时足以特异性结合抗原。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。例如，抗体是指包含两个重链(其可以表示为H和H′)和两个轻链(其可以表示为L和L′)的抗体，其中每个重链可以是足以形成抗原结合位点的全长免疫球蛋白重链或其一部分(例如，重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每个轻链可以是足以形成抗原结合位点的全长轻链或其一部分(例如，轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每个重链(H和H′)与一个轻链(分别为L和L′)配对。通常，抗体最少地包括可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)的全部或至少一部分。抗体还可以包括恒定区的全部或一部分。
出于本文的目的，术语抗体包括全长抗体及其部分，包括抗体片段，诸如抗EGFR抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、纳米抗体(诸如骆驼科抗体)片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd′片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(anti-idiotypic，anti-Id)抗体或上述任何一种的抗原结合片段。抗体还包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类别(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。用于人类治疗的抗体通常是人类抗体或是人源化的。
如本文所用，“抗体片段”是指(i)包含抗体的可变重链和/或轻链或功能片段并且缺乏Fc部分的单价和单特异性抗体衍生物；(ii)BiTE(串联scFv)、DART、双抗体和单链双抗体(scDB)。因此，抗体片段包括：Fab、Fab′、scFab、scFv、Fv片段、纳米抗体(参见，例如，衍生自Camelus bactriamus、Calelus dromaderius或Lama paccos的抗体)(参见，例如，U.S.Pat.No.5,759,808；和Stijlemans et al.(2004)J.Biol.Chem.279:1256-1261)、VHH、dAb、最小识别单元、单链双抗体(scDb)、BiTE和DART。所述抗体片段具有低于60kDa的分子量。
如本文所用，“核酸”是指通常通过磷酸二酯键连接在一起的至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。术语“核酸”中还包括核酸的类似物，诸如肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA和其他此类类似物和衍生物或其组合。核酸还包括DNA和RNA衍生物，所述DNA和RNA衍生物含有例如核苷酸类似物或“主链”键而不是磷酸二酯键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。该术语还包括作为等价物的由核苷酸类似物、单(有义或反义)和双链核酸制成的RNA或RNA的衍生物、变体和类似物。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。
如本文所用，分离的核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分开的核酸分子。当通过重组技术生产时，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，可以基本上不含其他细胞材料或培养基，或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学品。本文提供的示例性分离的核酸分子包括编码提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
如本文所用，提及核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”是指核酸区域在功能上彼此相关。例如，可以将编码前导肽的核酸可操作地连接至编码多肽的核酸，由此可以转录和翻译该核酸以表达功能性融合蛋白，其中前导肽影响融合多肽的分泌。在一些情况下，将编码第一多肽(例如，前导肽)的核酸与编码第二多肽的核酸可操作地连接，并且将核酸转录为单个mRNA转录物，但是mRNA转录物的翻译可以产生被表达的两个多肽之一。例如，琥珀终止密码子可以位于编码第一多肽的核酸与编码第二多肽的核酸之间，使得当引入到部分琥珀抑制细胞中时，所得单个mRNA转录物可以被翻译以产生含有第一和第二多肽的融合蛋白，或者可以被翻译以仅产生第一多肽。在另一个实例中，启动子可以与编码多肽的核酸可操作地连接，由此该启动子调节或介导核酸的转录。
如本文所用，提及例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用，天然存在的α-氨基酸的残基是在自然界中发现的那些20个α-氨基酸的残基，该残基在人类中通过负载tRNA分子与其同源mRNA密码子的特异性识别而掺入蛋白质中。
如本文所用，“多肽”是指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用。
如本文所用，“肽”是指长度为2至约40或40个氨基酸的多肽。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基的有机化合物。多肽包含两个或多个氨基酸。出于本文的目的，所提供的抗体中所含的氨基酸包括二十种天然存在的氨基酸(见下表)、非天然氨基酸和氨基酸类似物(例如，其中α-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，存在于本文中出现的多肽的各种氨基酸序列中的氨基酸是根据其公知的三字母或一字母缩写来识别的(参见下表)。存在于各种核酸分子和片段中的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母名称来命名。
如本文所用，“氨基酸残基”是指在多肽的在其肽键处的化学消化(水解)时形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基通常为“L”异构形式。只要多肽保留了期望的功能性质，“D”异构形式的残基就可以取代任何L-氨基酸残基。NH2是指存在于多肽氨基末端处的游离氨基。COOH是指存在于多肽的羧基末端处的游离羧基。按照J Biol.Chem.,243:3557-59(1968)中描述并在37C.F.R.§§1.821-1.822下接受的标准多肽命名法，氨基酸残基的缩写如下表所示：
对应表
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本文中由式表示的氨基酸残基的所有序列在氨基末端至羧基末端的常规方向上具有从左至右的方向。短语“氨基酸残基”定义为包括在以上对应表中列出的氨基酸，修饰的、非天然的和非常见氨基酸。氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列或与氨基末端基团(诸如NH2)或与羧基末端基团(诸如COOH)的肽键。
在肽或蛋白质中，氨基酸的合适的保守取代是本领域技术人员已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物学活性(参见，例如，Watson etal.,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/CummingsPub.Co.,p.224)。
可以根据下表中列出的示例性取代进行此类取代：
示例性的保守氨基酸取代
原始残基 示例性保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
其他取代也是允许的，并且可以凭经验确定或与其他已知的保守或非保守取代一致。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指存在于多肽中的20个L-氨基酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸相似的结构但已被结构修饰以模仿天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。因此，非天然存在的氨基酸包括例如除20种天然存在的氨基酸以外的氨基酸或氨基酸类似物，并且包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性的非天然氨基酸是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于2-氨基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(bAad)、β-丙氨酸/β-氨基丙酸(Bala)、2-氨基丁酸(Abu)、4-氨基丁酸/哌啶酸(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(Baib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2,4-二氨基丁酸(Dbu)、锁链素(Des)、2,2′-二氨基庚二酸(Dpm)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟基赖氨酸(Hyl)、别羟基赖氨酸(Ahyl)、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、异锁链素(Ide)、别异亮氨酸(Aile)、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(MeGly)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、N-甲基缬氨酸(MeVal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)和鸟氨酸(Orn)。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链、线性或环状DNA分子，其包含以自然界中未发现的方式组合且并列的DNA区段。DNA构建体是人类操纵的结果，包括操纵分子的克隆和其他拷贝。
如本文所用，DNA区段是具有特定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA区段是较长DNA分子的一部分，诸如质粒或质粒片段，当从5′到3′方向读取时，其编码特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5′至3′端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源中分离、体外合成、或由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文中根据核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)给出。在上下文允许的情况下，术语核苷酸用于单链和双链分子。当将该术语应用于双链分子时，其用于表示整个长度，并且应理解为等价于术语碱基对。本领域技术人员将认识到，双链多核苷酸的两条链在长度上可以略有不同，并且其末端可以是交错的；因此，双链多核苷酸分子中的所有核苷酸不能配对。这样的未配对末端在长度上通常将不超过20个核苷酸。
如本文所用，通过重组方法的生产是指使用分子生物学的熟知的方法来表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，“异源核酸”是编码产物(即RNA和/或蛋白质)的核酸，在体内，该产物不由通常其所表达的细胞产生，或者核酸处于通常其不存在于其中的基因座中，或核酸介导或编码介质(其通过影响转录、翻译或其他可调节的生化过程来改变内源核酸(如DNA)的表达)的核酸。异源核酸，诸如DNA，也称为外来核酸。本领域技术人员会认识到或认为对于表达核酸(诸如DNA)的细胞而言是异源或外来的任何核酸(诸如DNA)，在本文中均被异源核酸所包含；异源核酸包括也内源表达的外源添加的核酸。异源核酸通常对于其所引入的细胞而言不是内源的，而是已经从另一细胞获得或合成地制备或被引入基因组基因座中(异源核酸并非天然存在于该基因组基因座中，或异源核酸表达处于调节序列或者不同于一种或多种天然调节序列的序列的控制下)。
本文的异源核酸的实例包括但不限于编码以下的核酸：RNAi或免疫刺激性蛋白(诸如细胞因子，其在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫)、或编码抗体、抗体片段或其他治疗性产物或治疗性蛋白质。在免疫刺激性细菌中，通常在所引入的质粒上编码异源核酸，但是可以将其引入细菌的基因组中，例如改变细菌产物表达的启动子。异源核酸，诸如DNA，包括可以以某种方式介导编码治疗性产物的DNA表达的核酸，或者其可以编码以某种方式直接或间接介导治疗性产物的表达的产物，例如肽或RNA。
如本文所用，细胞疗法涉及将细胞递送至对象以治疗疾病或病症。可以是同种异体或自体的细胞例如通过用本文提供的免疫刺激性细菌感染细胞被离体修饰，使得它们在引入对象时递送或表达产物。
如本文所用，基因疗法涉及将异源核酸，诸如DNA转移到患有寻求这样治疗的疾病或病症的哺乳动物特别是人的某些细胞，例如靶细胞中。将核酸诸如DNA以使得异源核酸诸如DNA被表达并产生由此编码的治疗性产物的方式引入所选择的靶细胞中。基因疗法还可用于递送编码基因产物的核酸，该基因产物替代缺陷基因或补充由哺乳动物或细胞(在其中引入了核酸)产生的基因产物。所引入的核酸可以编码通常不在哺乳动物宿主中产生或不以治疗有效量或在治疗上有用的时间产生的治疗性化合物，诸如生长因子或其抑制剂、或肿瘤坏死因子或其抑制剂诸如其受体。编码治疗性产物的异源核酸，诸如DNA，可以在引入到患病宿主的细胞之前被修饰，以增强或以其他方式改变产物或其表达。基因疗法还可涉及递送基因表达的抑制剂或阻遏物或其他调节剂。
如本文所用，“表达”是指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。可以使用本领域已知的任何方法来评估多肽的表达水平，包括例如确定由宿主细胞产生的多肽的量的方法。这样的方法可以包括但不限于通过ELISA、凝胶电泳后的考马斯蓝染色、Lowry蛋白测定和Bradford蛋白测定来定量细胞裂解物中的多肽。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接收、维持、复制和/或扩增载体的细胞。宿主细胞也可用于表达由载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所包含的核酸被复制，从而扩增核酸。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当将载体转化到合适的宿主细胞中时，可以由该可复制的核酸表达一种或多种异源蛋白质。提及载体，包括通常通过限制性消化和连接可将编码多肽或其片段的核酸引入载体中的那些载体。提及载体，还包括含有编码多肽(诸如修饰的抗EGFR抗体)的核酸的那些载体。载体用于将编码多肽的核酸引入宿主细胞中，以扩增核酸或表达/展示由核酸编码的多肽。载体通常保持游离状态，但是可以设计成实现基因或其部分整合到基因组染色体中。还考虑了作为人工染色体的载体，诸如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些媒介物的选择和使用是本领域技术人员熟知的。载体还包括“病毒载体”或“病毒性载体”。病毒性载体是工程病毒，其可与外源基因操作地连接，以将外源基因(作为媒介物或穿梭物)传递进入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达与调节序列(诸如启动子区域)可操作地连接的DNA的载体，所述调节序列能够实现此类DNA片段的表达。这样的另外的区段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可以包含两者的元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，诸如质粒、噬菌体、重组病毒或其他在引入到合适的宿主细胞中后导致克隆的DNA的表达的载体。合适的表达载体是本领域技术人员熟知的，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些以及保持游离状态的那些或整合入宿主细胞基因组中的那些。
如本文所用，“一级序列”是指多肽中的氨基酸残基的序列或核酸分子中的核苷酸的序列。
如本文所用，“序列相同性”是指在测试与参考多肽或多核苷酸之间的比较中相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基的数目。序列相同性可以通过核酸或蛋白质序列的序列比对以识别相似性或相同性区域来确定。出于本文的目的，通常通过比对以鉴定相同残基来确定序列相同性。比对可以是局部的也可以是全局的。可以在比较的序列之间识别出匹配、错配和空位。空位是在比对序列的残基之间插入空氨基酸或核苷酸使得相同或相似的字符被比对。通常，可能存在内部和末端空位。当使用空位罚分时，可以确定序列相同性而对端空位不罚分(例如，对末端空位不罚分)。可选地，可以在不考虑空位的情况下将序列相同性确定为总比对序列的相同位置/长度的数目×100。
如本文所用，“全局比对”是这样的比对，其从头到尾比对两个序列，从而使每个序列中的每个字母仅比对一次。无论序列之间是否存在相似性或相同性，都会产生比对。例如，基于“全局比对”的50％序列相同性是指在每个在长度上为100个核苷酸的两个比较的序列的全序列的比对中，50％的残基是相同的。应该理解，即使比对序列的长度不同，全局比对也可以用于确定序列相同性。除非选择“对端空位无罚分”，否则在确定序列相同性时将考虑序列末端的差异。通常，全局比对用于在其大部分长度上具有显著相似性的序列。用于进行全局比对的示例性算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443)。用于进行全局比对的示例性程序是可公开获得的，并且包括可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)上获得的全局序列比对工具，以及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的程序。
如本文所用，“局部比对”是比对两个序列，但是仅比对序列的具有相似性或相同性的那些部分的比对。因此，局部比对确定一个序列的子区段是否存在于另一序列中。如果不存在相似性，则不会返回任何比对。局部比对算法包括BLAST或Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))。例如，基于“局部比对”的50％序列相同性是指在任意长度的两个比较序列的全序列的比对中，长度为100个核苷酸的相似性或相同性的区域在该相似性或相同性区域中具有50％的相同的残基。出于本文的目的，可以用每个供应商建立的默认空位罚分通过标准比对算法程序来确定序列相同性。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(含有对于相同性，为1的值，和对于非相同性，为0的值)；和Gribskov etal.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,pp.353-358(1979)所述；(2)对每个空位，罚分为3.0，并且对每个空位中的每个符号，附加的0.10罚分；和(3)对于端空位，无罚分。无论任何两个核酸分子具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其他类似变体的核苷酸序列，还是任何两个多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其他类似变体的氨基酸序列，可以使用基于局部或全局比对的已知计算机算法来确定(参见，例如，wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software,其提供了数十个已知和公众可得的比对数据库和程序的链接)。通常，出于本文的目的，使用基于全局比对的计算机算法来确定序列相同性，诸如可从NCBI/BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&Page_TYPE＝BlastHome)获得的Needleman-Wunsch全局序列比对工具；LAlign(实施Huang和Miller算法的WilliamPearson(Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357))；和可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的来自Xiaoqui Huang的程序。通常，所比较的多肽或核苷酸中的每一个的全长序列在全局比对中在每个序列的全长进行比对。当所比较的序列为基本相同的长度时，也可以使用局部比对。
因此，如本文所用，术语“相同性”表示测试与参考多肽或多核苷酸之间的比较或比对。在一个非限制性实例中，“与……至少90％相同”是指相对于参考多肽或多核苷酸为90％至100％的百分比相同性。在90％或更高水平的相同性表明以下事实：假设出于示例目的，比较了长度为100个氨基酸或核苷酸的测试和参考多肽或多核苷酸，不超过10％(即100中有10个)的测试多肽或多核苷酸中的氨基酸或核苷酸不同于参考多肽的那些。可以在测试和参考多核苷酸之间进行类似的比较。这样的差异可以表示为在氨基酸序列的整个长度上随机分布的点突变，或者它们可以聚集在一个或多个可变长度的位置上，直至最大允许的氨基酸差异，例如10/100个氨基酸差异(约90％相同性)。差异也可能是由于氨基酸残基的缺失或截短。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。取决于所比较序列的长度，在约85-90％以上的同源性或相同性水平，结果可以独立于程序和空位参数设置；通常无需依赖软件即可轻松评估出这种高水平的相同性。
如本文所用，“疾病或病症”是指由原因或状况(包括但不限于感染、获得性状况、遗传状况)引起的生物体中的病理状况，并且特征在于可识别的症状。
如本文所用，“治疗”患有疾病或状况的对象是指该对象的症状在治疗后被部分或全部减轻或保持静止。
如本文所用，治疗是指改善疾病或病症的症状的任何作用。治疗包括预防、治疗和/或治愈。治疗还包括本文提供的任何免疫刺激性细菌或组合物的任何药物用途。
如本文所用，预防是指预防潜在疾病和/或预防疾病的症状或进展恶化。
如本文所用，“预防(prevention)”或预防(prophylaxis)及其语法等价形式是指降低发展成疾病或状况的风险或可能性的方法。
如本文所用，“药物有效物质”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂和常规治疗药，包括小分子药物和治疗性蛋白。
如本文所用，“治疗作用”是指由对象的治疗所产生的改变、通常提高或改善疾病或状况的症状或治愈疾病或状况的作用。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，该量至少足以在施用于对象后产生治疗作用。因此，它是预防、治愈、改善、阻止或部分阻止疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用，“治疗功效”是指物质、化合物，材料或包含化合物的组合物在已施用了物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的对象中产生治疗作用的能力。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”是指当施用于对象时具有预期的预防作用(预防或延迟疾病或症状的发作或复发，降低疾病或症状的发作或复发的可能性或降低病毒感染的发生率)的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。完全的预防作用不一定通过一次剂量施用而发生，而是可能在一系列剂量施用后才发生。因此，可以以一次或多次施用来施用预防有效量。
如本文所用，通过治疗诸如通过施用药物组合物或其他治疗剂来改善特定疾病或病症的症状是指可以归因于组合物或治疗剂的施用或与组合物或治疗剂的施用有关的任何症状的减轻(无论永久或是暂时，持续或短暂)。
如本文所用，“抗癌剂”是指对恶性细胞和组织具有破坏性或毒性的任何物质。例如，抗癌剂包括杀死癌细胞或以其他方式抑制或损害肿瘤或癌细胞的生长的物质。示例性抗癌剂是化学治疗剂。
如本文所用，“治疗活性”是指治疗性多肽的体内活性。通常，治疗活性是与疾病或状况的治疗相关的活性。
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物，诸如人。
如本文所用，患者是指人类对象。
如本文所用，动物包括任何动物，诸如但不限于灵长类，包括人、大猩猩和猴子；啮齿动物，诸如小鼠和大鼠；禽类，诸如鸡；反刍动物，诸如山羊、牛、鹿、绵羊；猪和其他动物。非人类动物排除人类作为预期的动物。本文提供的多肽来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数多肽是动物来源的，包括哺乳动物来源的。
如本文所用，“组合物”是指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，“组合”是指两种或更多种物品之间或之中的任何关联。所述组合可以是两种或更多种单独的物品，诸如两种组合物或两种集合物品，其混合物，诸如两种或更多种物品的单个混合物，或其任意变体。组合的元件通常在功能上关联或相关。
如本文所用，组合疗法是指两种或更多种不同治疗剂的施用。可以分开、顺序、间歇地提供和施用不同的治疗剂，或者可以以单一组合物提供。
如本文所用，出于包括但不限于生物活性或性质的活化、管理、诊断和评估的目的，试剂盒是包装的组合，其任选地包括其他元件，诸如另外的试剂和该组合或其元件的使用说明。
如本文所用，“单位剂型”是指适用于人和动物对象并且如本领域中已知单独地包装的物理上离散的单位。
如本文所用，“单一剂量制剂”是指用于直接施用的制剂。
如本文所用，多剂量制剂是指包含多剂量的治疗剂并且可以直接施用以提供数个单剂量的治疗剂的制剂。剂量可以在几分钟、几小时、几周、几天或几个月的时间内施用。多剂量制剂可以允许剂量调节、剂量合并和/或剂量拆分。由于随着时间的推移使用了多剂量制剂，因此它们通常包含一种或多种防腐剂以防止微生物生长。
如本文所用，“制备品”是制备和销售的产品。如在本申请中通篇使用的，该术语旨在涵盖包装物品中包含的本文提供的任何组合物。
如本文所用，“流体”是指可以流动的任何组合物。因此，流体包括半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、霜剂和其他此类组合物的形式的组合物。
如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白质(例如，分离的抗体或其抗原结合片段)或其生物活性部分(例如，分离的抗原结合片段)基本上不含细胞物质或其他来自细胞或组织(蛋白质所衍生自该细胞或组织)的蛋白质污染，或基本不含化学合成时的化学前体或其他化学品。如果如通过本领域技术人员用来评估此类纯度的标准分析方法(诸如薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC))所确定的那样，制备物表现为不含容易检测到的杂质，或者制备物足够纯净以至于进一步纯化不会可检测地改变该物质的物理和化学性质(诸如酶和生物活性)，则可以确定制备物为基本不含。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可能提高化合物的比活性。如本文所用，“细胞提取物”或“裂解物”是指由裂解或破坏的细胞制成的制备物或级分。
如本文所用，“对照”是指与测试样品基本相同的样品，除了其不使用测试参数进行处理，或者，如果是血浆样品，则其可以来自未受感兴趣的状况影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对包含“免疫球蛋白结构域”的多肽的提及包括具有一个或多个免疫球蛋白结构域的多肽。
如本文所用，除非明确指出仅可选方案或可选方案是互斥的，否则术语“或”用于表示“和/或”。
如本文所用，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。约还包括确切的量。因此，“约5个氨基酸”是指“约5个氨基酸”以及“5个氨基酸”。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和不发生的情况。例如，任选的变体部分是指该部分是变体或非变体。
除非另有说明，否则如本文所用的针对任何保护基、氨基酸和其他化合物的缩写应与它们的常用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生化命名委员会一致(参见，Biochem.(1972)11(9):1726-1732)。
出于清楚公开而不是通过限制的方式，具体实施方式分为随后的小节。
B.免疫刺激性细菌的概述
提供了经修饰的细菌，在本文中称为免疫刺激性细菌，其在肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境(TME)中积累和/或复制(例如定植)；和/或在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡；和/或编码靶向基因的治疗性产物，诸如抗肿瘤剂、免疫刺激性蛋白和抑制性RNA(RNAi)诸如shRNA和微RNA(miRNA)，该基因的抑制、阻抑或沉默影响肿瘤治疗。用于修饰的细菌菌株适合于治疗用途。本文提供的经修饰的免疫刺激性细菌用于治疗癌症的用途和方法。修饰该细菌用于此类用途和方法。
通过缺失或修饰细菌基因来修饰本文提供的免疫刺激性细菌，以减弱其炎症应答，增加其耐受性，增加其对补体的抗性，增加其对肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或TME的感染性、积累或者定植，减少它们对免疫细胞死亡的诱导(例如，减少细胞焦亡)，并增强用细菌治疗的宿主的抗肿瘤免疫应答。修饰还可以位于细菌中的在质粒上编码的基因中。例如，细菌可以是对腺苷或腺苷和腺嘌呤呈营养缺陷型的，并且在细菌中包括编码治疗性产物(诸如免疫刺激性蛋白、抗体或抑制宿主中的免疫检查点基因的RNAi)的质粒。可以通过缺失msbB基因(其降低宿主中的TNF-α)和/或敲除鞭毛蛋白基因和/或pagP的缺失/突变来实现对细菌的炎症应答的减弱。修饰细菌以刺激宿主抗肿瘤活性，例如，通过添加编码免疫刺激性蛋白(诸如细胞因子、趋化因子和共刺激分子)的质粒或靶向宿主免疫检查点的RNAi，并通过添加具有CpGs/CpG基序的核酸。
细菌菌株可以是减毒菌株，或者通过标准方法减毒的菌株，或者凭借本文提供的修饰而减毒(就其定植能力主要限于免疫豁免组织和器官，特别是免疫和肿瘤细胞，包括实体瘤而言)的菌株。细菌包括但不限于例如沙门菌属、志贺菌属、利斯特菌属、大肠杆菌和双歧杆菌的菌株。例如，物种包括宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌、单核细胞增生利斯特菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡沙门菌和肠炎沙门菌。其他合适的细菌物种包括立克次体属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、弧菌属、芽孢杆菌属和丹毒丝菌属。例如，RickettsiaRikettsiae、普氏立克次体、Rickettsia tsutsugamuchi、摩氏立克次体、西伯利亚立克次体、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、Aeromonas eucrenophila、杀鲑气单胞菌、Franciesella tularensis、假结核棒杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎衣原体、Haemophilus sornnus、流产布鲁杆菌、细胞内分枝杆菌、嗜肺军团病杆菌、马红球菌、铜绿假单胞菌、鼬螺杆菌、霍乱弧菌、枯草芽孢杆菌、红斑丹毒丝菌、小肠结肠炎耶尔森菌、五日热罗克利马体菌和Agrobacterium tumerfacium。
细菌由于一种或多种性质而积累，该一种或多种性质包括向免疫豁免组织或器官或环境、提供营养或对于其呈营养缺陷型的其他分子的环境、和/或包含复制细胞(其提供适合于细菌的进入和复制的环境)的环境的扩散、迁移和趋化性。本文提供的免疫刺激性细菌和实现这种疗法的物种包括沙门菌属、利斯特菌属和大肠杆菌的物种。
细菌包含编码治疗性蛋白(诸如免疫刺激性蛋白或免疫检查点抑制剂或其他免疫刺激或免疫抑制阻断产物)的质粒。产物包括抗体(诸如抗体片段和纳米抗体)、RNAi(诸如一种或多种短发夹(sh)RNA构建体、微RNA或其他RNAi形式)，其表达会抑制或破坏或阻抑靶向的基因的表达，或者以其他方式增加免疫应答或降低免疫阻抑。治疗性产物在真核启动子诸如RNA聚合酶(RNAP)II或III启动子的控制下表达。通常，RNAP III(也称为POLIII)启动子是组成型的，并且可以调节RNAP II(也称为POLII)。在一些实例中，shRNA靶向基因TREX1，以抑制其表达。
在一些实施方案中，质粒可以编码多种治疗性产物，包括免疫刺激性蛋白(诸如细胞因子)和RNAi分子(诸如shRNA)和抗体(包括纳米抗体)，该治疗性产物抑制两个或更多个免疫检查点基因，诸如TREX1、PD-L1、VISTA、SIRPα、CTNNB1、TGF-βeta、CD47和/或VEGF，以及任何其他本领域技术人员已知的。在编码多种治疗性产物的情况下，每种治疗性产物的表达通常在不同启动子的控制下。
在本文提供的细菌中，是经修饰以使得其对腺苷呈营养缺陷型的细菌。这可以通过修饰或缺失参与嘌呤合成、代谢或转运的基因来实现。例如，沙门菌属物种诸如伤寒沙门菌中tsx基因的破坏导致腺苷营养缺陷。腺苷是免疫抑制性的，并在肿瘤中积累至高浓度；因为细菌在富含腺苷的组织中选择性地复制，腺苷营养缺陷提高了细菌的抗肿瘤活性。
还提供了经修饰使得它们具有有缺陷的asd基因的细菌。对这些体内使用的细菌进行修饰，以包括在引入的质粒上携带功能性asd基因；这维持了对质粒的选择，使得不需要基于抗生素的质粒维持/选择系统。还提供了在质粒上使用不含功能性asd基因的asd缺陷菌株，因此被工程化为在宿主中是自溶的。
还提供了经修饰使得它们不能产生鞭毛的细菌。这可以通过缺失编码鞭毛蛋白亚基的基因来修饰细菌而实现。缺乏鞭毛蛋白的经修饰细菌的炎症较少，因此耐受性更好，并诱导更有效的抗肿瘤应答。
还提供了被修饰以产生listeriolysin O(LLO)的细菌，其改善了在吞噬细胞中的质粒递送。
还提供了经修饰以携带低拷贝、含CpG的质粒的细菌。质粒可以进一步包括其他修饰，并且可以编码治疗性产物，诸如免疫刺激性蛋白、抗体及其片段和RNAi。
还可以将细菌修饰为以使得该细菌(在沙门菌属物种的情况下)表达较少的毒性SPI-1(沙门菌属致病岛-l)基因。在沙门菌属中，负责毒力、侵袭、存活和肠外扩散的基因位于沙门菌属致病岛(SPI)中。
细菌包括编码RNAi的质粒，诸如shRNA或微RNA，该RNAi抑制检查点，诸如仅PD-L1或TREX1，或TREX1和一个或多个第二免疫检查点。可以针对其他期望的性状(包括质粒维持的选择，特别是没有抗生素情况下的选择)对细菌进行进一步修饰，以制备菌株。免疫刺激性细菌可任选地编码治疗性多肽，包括抗肿瘤治疗性多肽和物质。
本文提供的免疫刺激性细菌的示例是沙门菌属的物种。如本文所述用于修饰的细菌的示例是鼠伤寒沙门菌的工程化菌株，诸如用质粒工程化以互补asd基因敲除和无抗生素质粒维持的菌株YS1646(ATCC目录号202165；也称为VNP20009，参见国际PCT申请公开号WO 99/13053)。
本文提供了使对腺苷呈营养缺陷型的经修饰的免疫刺激性细菌菌株，正如包含此类菌株的药物组合物一样，所述药物组合物被配制用于施用给对象(诸如人)，用于治疗肿瘤和癌症的方法。
还提供了免疫刺激性细菌或包含该细菌的药物组合物的方法或用途，其中治疗包括组合治疗，其中施用第二抗癌剂或治疗。第二抗癌剂或治疗可在免疫刺激性细菌或药物组合物之前、同时、之后或间歇地施用，并且包括免疫疗法，诸如抗体或抗体片段；溶瘤病毒治疗；放射/放射疗法；和化学疗法。免疫疗法可包括例如施用抗PD-l、或抗PD-Ll或抗CTLA4、或抗IL6、或抗VEGF、或抗VEGFR、或抗VEGFR2抗体，或其片段。组合疗法也可以包括手术。
本文提供的工程化的免疫刺激性细菌包含多种协同模式，以诱导冷肿瘤的免疫再活化并促进肿瘤抗原特异性免疫应答，同时抑制肿瘤用来颠覆和逃逸持久的抗肿瘤免疫的免疫检查点途径。通过腺苷营养缺陷改善的肿瘤靶向和增强的血管破坏具有提高的功效，同时局部化炎症以限制其他免疫疗法模式观察到的全身性细胞因子暴露和自身免疫毒性。如此修饰的细菌的实例是鼠伤寒沙门菌菌株(包括菌株YS1646，特别是asd-菌株的这种修饰)。
例如，如本文所提供的是提供shRNA介导的PD-L1基因破坏的免疫刺激性细菌。在小鼠中已经显示，PD-L1的基因破坏可以改善肿瘤定植。例如，已经显示PD-L1敲除小鼠中的鼠伤寒沙门菌感染导致细菌载量比野生型小鼠高10倍(参见，Lee et al.(2010)Immunol.185:2442-2449)。因此，PD-L1对鼠伤寒沙门菌感染具有保护作用。本文提供了免疫刺激性细菌，诸如鼠伤寒沙门菌，其携带能够RNAi介导的基因敲低TREX1、PD-L1或PD-L1和TREX1的质粒。由于两种独立途径的结合，此类细菌提供了抗肿瘤作用，这导致在单一疗法中增强和持续的抗肿瘤免疫应答。
C.癌症免疫疗法
在肿瘤微环境(TME)中发现的免疫抑制性环境是肿瘤发生和进展的驱动力。在免疫系统无法控制并包含肿瘤后，就会出现癌症。多种肿瘤特异性机制创造了肿瘤环境，其中免疫系统被迫耐受肿瘤及其细胞，而不是消除它们。癌症免疫疗法的目标是挽救免疫系统消除肿瘤的天然能力。几个世纪以来，根据观察与微生物感染有关的急性炎症与自发消除肿瘤有关。
1.免疫疗法
几种临床癌症免疫疗法已寻求扰动免疫阻抑与抗肿瘤免疫之间的平衡。通过直接施用细胞因子诸如IL-2和IFN-α刺激免疫的策略已在少数患者中出现适度的临床反应，同时诱导严重的全身性炎症相关毒性(Sharma et al.(2011)Nat.Rev.Cancer 11:805-812)。免疫系统已经发展了多种限制自身免疫的检查和平衡，诸如T细胞上的程序性细胞死亡蛋白1(PD-l)的上调及其与其同源配体程序性死亡配体1(PD-L1)的结合，该程序性细胞死亡蛋白1在抗原呈递细胞(APC)和肿瘤细胞上均表达。PD-L1与PD-l的结合干扰CD8+T细胞信号传导途径，从而损害CD8+T细胞的增殖和效应功能，并诱导T细胞耐受性。PD-1和PD-L1是许多通过下调免疫应答起作用的抑制性“免疫检查点”的两个实例。其他抑制性免疫检查点包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、信号调节蛋白α(SIRPα)、T细胞活化V-结构域Ig抑制因子(VISTA)、程序性死亡配体2(PD-L2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)1和2、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、Galectin-9，具有Ig和HIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域-3(TIM-3，也称为甲肝病毒细胞受体2(HAVCR2))、疱疹病毒侵入介质(HVEM)、CD39、CD73、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4、CD47、CD48、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD155、CD160、CD244(2B4)、B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减剂(BTLA或CD272)和癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(CEACAM1或CD66a)。
设计用于阻断免疫检查点的抗体，诸如抗-PD-l(例如派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab))和抗-PD-L1(例如阿妥珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab))，在预防T细胞无反应性和破坏免疫耐受中具有持久的成功。只有一小部分经治疗的患者表现出临床获益，且那些经常如此的患者表现出自身免疫相关毒性(参见例如，Ribas(2015)N Engl J Med 373:1490-1492；Topalian etal.(2012)N Engl J Med 366:3443-3447)。这进一步证明需要本文提供的更有效且毒性更低的疗法。
另一种检查点阻断策略是抑制T细胞上CTLA-4的诱导，其结合并抑制APC上的共刺激受体(诸如CD80或CD86)，从而与结合相同的受体但亲和性较低的共刺激簇分化28(CD28)竞争。这阻断了来自CD28的刺激信号，同时传递了来自CTLA-4的抑制信号，从而阻止了T细胞活化(参见，Phan et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:8372-8377)。抗CTLA-4疗法(例如伊匹木单抗(ipilimumab))在某些患者中具有临床成功和持久性，同时表现出严重的免疫相关不良事件的甚至更高发生率(参见，例如Hodi et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:711-723；Schadendorf et al.(2015)J.Clin.Oncol.33:1889-1894)。还已经显示出肿瘤对抗免疫检查点抗体产生抗性，突出了对更持久的抗癌疗法的需求，并且在本文中提供。
2.获得性免疫疗法
在寻求再活化冷肿瘤以使其更具免疫原性中，一类称为获得性细胞疗法(adaptive cell therapy,ACT)的免疫疗法涵盖了多种利用免疫细胞并将其重编程为具有抗肿瘤活性的策略(Hinrichs et al.(2011)Immunol.Rev.240:40-51)。基于树突细胞的疗法引入了具有更多免疫刺激性质的遗传工程化树突细胞(DC)。这些疗法没有成功，因为它们不能破坏对癌症的免疫耐受性(参见，例如，Rosenberg et al.(2004)Nat.Med.12:127)。由于缺乏破坏肿瘤耐受性的能力，在临床上同样失败的是使用含有内源性肿瘤抗原和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以刺激DC募集的全辐照肿瘤细胞的方法(称为GVAX)(Copier et al.(2010)Curr.Opin.Mol.Ther.12:647-653)。一种单独的基于自体细胞的疗法Sipuleucel-T(Provenge)在2010年被FDA批准用于去势抗性前列腺癌。它利用APC，该APC从患者中取出并重新武装以表达前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原，以刺激T细胞应答，然后在淋巴消融后重新引入。不幸的是，它的广泛采用受到观察到的低客观反应率和成本高的限制，并且其使用仅限于前列腺癌的早期阶段(Anassi et al.(2011)P T.36(4):197-202)。类似地，自体T细胞疗法(ATC)收获患者自身的T细胞，然后在体外对其再活化以克服肿瘤耐受性，然后在淋巴消融后将其重新引入患者。ATC获得了有限的临床成功，并且仅在黑素瘤中获得有限的临床成功，同时产生了限制了其实用性的严重安全性和可行性问题(Yee etal.(2013)Clin.Cancer Res.19:1-3)。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法是从患者中收获的T细胞，该T细胞经过重新工程化以表达T细胞受体和抗体Ig可变胞外结构域之间的融合蛋白。这赋予它们以抗体的抗原识别性质与活化T细胞的溶细胞性质(Sadelain(2015)Clin.Invest.125:3392-4000)。成功已经限于B细胞和血液系统恶性肿瘤，以致命的免疫相关的不良事件为代价(Jackson etal.(2016)Nat.Rev.Clin.Oncol.13:370-383)。肿瘤也可以突变以逃逸靶抗原的识别，包括CD 19(Ruella et al.,(2016)Comput Struct Biotechnol J.14:357-362)和EGFRvIII(O′Rourke et al.(2017)Sci Transl Med.Jul l9；9:399)，从而促进免疫逃逸。此外，尽管CAR-T疗法已获批准并已在血液恶性肿瘤方面获得批准，但它们对于治疗实体瘤可行性面临着重大障碍：克服实体瘤微环境的高度免疫抑制性质。需要对现有CAR-T疗法的许多其他修饰来潜在地提供针对实体瘤的可行性(Kakarla et al.(2014)Cancer J.Mar-Apr；20(2):151-155)。当CAR-T的安全性得到显著改善，并且其功效扩展至实体瘤时，与这些劳动密集型疗法相关的可行性和成本将继续限制其更广泛的应用。
3.癌症疫苗和溶瘤病毒
冷肿瘤缺乏T细胞和树突细胞(DC)浸润，并且是非T细胞发炎的(Sharma et al.(2017)Cell 9；168(4):707-723)。在寻求使冷肿瘤再活化以变得更具免疫原性时，另一类免疫疗法利用可以天然地或凭借工程化而积累在肿瘤中的微生物。这些包括设计为刺激免疫系统以表达肿瘤抗原的病毒，从而活化和重编程免疫系统以排斥肿瘤。基于病毒的癌症疫苗在临床上已因多种因素在很大程度上失败，包括对病毒载体本身的既往存在或获得的免疫力，以及对表达的肿瘤抗原缺乏足够的免疫原性(Larocca et al.(2011)Cancer J.17(5):359-371)。缺乏适当的APC辅助活化也阻碍了其他非病毒载体癌症疫苗，例如DNA疫苗。相反，溶瘤病毒试图在健康组织中的分裂肿瘤细胞中优先复制，接着随后的肿瘤细胞裂解导致免疫原性肿瘤细胞死亡和进一步的病毒传播。溶瘤病毒Talimogene laherparepvec(T-VEC)(其将修饰的单纯疱疹病毒与DC募集细胞因子GM-CSF组合使用)已获得FDA批准用于转移性黑素瘤(Bastin et al.(2016)Biomedicines 4(3):21)。尽管证明了某些黑素瘤患者中的临床获益，并且与其他免疫疗法相比具有更低的免疫毒性，但受限于肿瘤内施用途径和制备条件，以及其对远端肿瘤疗效和对其他肿瘤类型的更广泛应用的缺乏。其他基于溶瘤病毒(OV)的疫苗(诸如除了别的之外，利用副粘病毒、呼肠孤病毒和小核糖核酸病毒的那些)在诱导全身性抗肿瘤免疫方面遇到了类似的限制(Chiocca et al.(2014)CancerImmunol.Res.2(4):295-300)。对溶瘤病毒的全身性施用提出了独特的挑战。在I.V施用后，病毒被迅速稀释，因此需要可能导致肝毒性的高滴度。此外，如果存在预先存在的免疫，则病毒会在血液中被迅速中和，然后所获得的免疫会限制重复给药(Maroun et al.(2017)Future Virol.12(4):193-213)。
在基于病毒的疫苗载体和溶瘤病毒的限制中，最大的限制可能是病毒本身。与肿瘤抗原相比，病毒抗原对人T细胞受体(TCR)具有显著更高的亲和性(Aleksic et al.(2012)Eur J Immunol.42(l2):3174-3179)。在甚至高度活化的APC的表面上，由MHC-l与病毒载体抗原一起呈现的肿瘤抗原对于与TCR结合是胜出的，从而导致非常差的抗原特异性抗肿瘤免疫。如本文提供的本身不提供高亲和性T细胞表位的肿瘤靶向免疫刺激性载体可以规避这些限制。
D.细菌癌症免疫疗法
1.细菌疗法
细菌具有抗癌活性的认识追溯到19世纪，在那时几位医生观察到感染化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的患者的肿瘤消退。William Coley开始了第一项利用细菌治疗晚期癌症的研究，并开发了一种由化脓性链球菌和粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)组成的疫苗，该疫苗已成功用于治疗各种癌症，包括肉瘤(sarcomas)、癌、淋巴瘤和黑素瘤。从那时起，已经研究了许多细菌，包括梭菌属(Clostridium)、分枝杆菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、利斯特菌属(诸如单核细胞增生利斯特菌属)和埃希氏菌属物种，作为抗癌疫苗的来源(参见，例如，国际PCT申请公开号WO1999/013053；国际PCT申请公开号WO 2001/025399；Bermudes et al.(2002)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5:194-199；Patyar et al.(2010)Journal of Biomedical Science 17:21；Pawelek et al.(2003)Lancet Oncol.4:548-556)。
细菌可以感染动物和人类细胞，有些细菌具有将DNA递送到细胞胞质溶胶中的先天能力，这些细菌是基因疗法的候选载体。细菌也适用于治疗，因为它们可以口服施用，它们可以在体内和体外容易繁殖，并且可以冻干状态储存和运输。细菌遗传学容易操纵，并且许多菌株的完整基因组已经得到充分表征(Felgner et al.(2016)mbio 7(5):e01220-16)。结果，细菌已被用于递送和表达多种基因，包括编码细胞因子、血管生成抑制剂、毒素和前药转化酶的基因。例如，沙门菌属已用于在肿瘤中表达免疫刺激分子如IL-18(Loeffler et al.(2008)Cancer Gene Ther.15(12):787-794)、LIGHT(Loeffler et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(31):12879-12883)和Fas配体(Loeffler et al.(2008)J.Natl.Cancer Inst.100:1113-1116)。细菌载体也比病毒载体更便宜和更易于生产，并且细菌递送优于病毒递送，因为如果需要的话，它可以被抗生素迅速消除，从而使其成为更安全的可选品。
然而，为了使用菌株，菌株本身不得是致病的，或者经过修饰后用作治疗剂不是致病的。例如，在癌症的治疗中，必须将治疗性细菌菌株减毒或使其充分无毒以免引起全身性疾病和/或感染性休克，但仍保持一定水平的感染力以有效地定植于肿瘤。已经描述了遗传修饰的细菌，其用作抗肿瘤剂以引起直接的杀肿瘤效果和/或递送杀肿瘤分子(Clairmontet al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Bermudes,D.et al.(2002)Curr.Opin.DrugDiscov.Devel.5:194-199；Zhao,M.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:755-760；Zhao,M.et al.(2006)Cancer Res.66:7647-7652)。这些之中是肠炎沙门菌亚属血清亚型(鼠伤寒沙门菌)的生物工程化菌株。与在正常组织中相比，这些细菌优先在肿瘤中>1,000倍积累，并在肿瘤组织中均匀分散(Pawelek,J.et al.(1997)Cancer Res.57:4537-4544；Low,K.B.et al.(1999)Nat.Biotechnol.17:37-41)。优先复制使细菌直接在肿瘤内产生并以高浓度直接递送各种抗癌治疗剂，同时使对正常组织的毒性最小化。当静脉内施用时，这些减毒细菌在小鼠、猪和猴子中是安全的(Zhao,M.et al.(2005)Proc Natl Acad Sci USA102:755-760；Zhao,M.et al.(2006)Cancer Res66:7647-7652；Tjuvajev J.et al.(2001)J.Control Release 74:313-315；Zheng,L.et al.(2000)Oncol.Res.12:127-135)，并且某些活的减毒沙门菌属菌株在人类临床试验中，在口服施用后已显示出耐受良好(Chatfield,S.N.et al.(1992)Biotechnology 10:888-892；DiPetrillo,M.D.et al.(1999)Vaccine 18:449-459；Hohmann,E.L.et al.(1996)J.Infect.Dis.173:1408-1414；Sirard,J.C.et al.(1999)Immunol.Rev.171:5-26)。鼠伤寒沙门菌phoP/phoQ操纵子是一种由膜相关传感器激酶(PhoQ)和细胞质转录调节因子(PhoP)组成的典型细菌双组分调节系统(Miller,S.I.et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:5054-5058；Groisman,E.A.et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA86:7077-7081)。PhoP/phoQ是毒力所必需的，并且其缺失会导致该细菌在巨噬细胞中的较差生存和在小鼠和人类中的明显减毒(Miller,S.I.et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:5054-5058；Groisman,E.A.etal.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:7077-7081；Galan,J.E.and Curtiss,R.III.(1989)Microb Pathog 6:433-443；Fields,P.I.et al.(1986)Proc Natl Acad Sci USA83:189-193)。PhoP/phoQ缺失菌株已被用作有效的疫苗递送媒介物(Galan,J.E.andCurtiss,R.III.(1989)Microb Pathog 6:433-443；Fields,P.I.et al.(1986)Proc NatlAcad Sci USA 83:189-193；Angelakopoulos,H.and Hohmann,E.L.(2000)Infect Immun68:213-241)。减毒沙门菌属已用于靶向递送杀肿瘤蛋白(Bermudes,D.et al.(2002)CurrOpin Drug Discov Devel 5:194-199；Tjuvajev J.et al.(2001)J Control Release 74:313-315)。
基于细菌的癌症疗法已显示出有限的临床益处。各种细菌物种，包括诺维梭菌(Clostridium novyi)(Dang et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(26):15155-15160；美国专利公开号2017/0020931、2015/0147315；美国专利号7,344,710；3,936,354)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(美国专利公开号2015/0224151、2015/0071873)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)(Kimura et al.(1980)Cancer Res.40:2061-2068)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Yasutake et al.(1984)Med MicrobiolImmunol.173(3):113-125)、单核球增多性斯特菌(Le et al.(2012)Clin.Cancer Res.l8(3):858-868；Starks et al.(2004)J.Immunol.173:420-427；美国专利公开号2006/0051380)和大肠杆菌(美国专利号9,320,787)已被研究作为抗癌疗法的可能物质。
例如，卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin(BCG))菌株已被批准用于治疗人类膀胱癌，并且比通常被用作一线治疗的膀胱内化疗更有效(Gardlik et al.(2011)Genetherapy 18:425-431)。另一方法利用单核细胞增生利斯特菌，一种能够在小鼠中诱导有效的CD8+T细胞启动至表达的肿瘤抗原的活的减毒细胞内细菌(Le et al.(2012)Clin.Cancer Res.l8(3):858-868)。在初免-加强方法中，在掺入肿瘤抗原间皮素的基于利斯特菌属的疫苗以及基于同种异体胰腺癌的GVAX疫苗的临床试验中，与单独用GVAV疫苗处理的患者的3.9个月的中位生存期相比，在晚期胰腺癌患者中记录了6.1个月的中位生存期(Le et al.(2015)J.Clin.Oncol.33(12):1325-1333)。这些结果并未在较大的2b期研究中得到重复，可能表明在尝试诱导对低亲和性自身抗原(诸如间皮素)的免疫方面存在困难。
细菌菌株可以如本文所述和例示进行修饰以表达抑制或破坏TREX1和/或PD-L1和任选的一个或多个其他免疫检查点基因的抑制性RNA(RNAi)，诸如shRNA和微RNA。可以通过标准方法和/或通过基因的缺失或修饰，以及通过改变或引入使细菌能够主要在免疫豁免环境(诸如TME)、在肿瘤细胞和实体瘤中在体内生长的基因，来对菌株减毒。如本文所述用于修饰的菌株可以选自例如志贺菌属、利斯特菌属、大肠杆菌、双歧杆菌和沙门菌属。例如，宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌、单核细胞增生利斯特菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡沙门菌和肠炎沙门菌。其他合适的细菌物种包括立克次体属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、弧菌属、芽孢杆菌属和丹毒丝菌属。例如，Rickettsia Rikettsiae、普氏立克次体、Rickettsia tsutsugamuchi、摩氏立克次体、西伯利亚立克次体、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、Aeromonas eucrenophila、杀鲑气单胞菌、Franciesellatularensis、假结核棒杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎衣原体、Haemophilus sornnus、流产布鲁杆菌、细胞内分枝杆菌、嗜肺军团病杆菌、马红球菌、铜绿假单胞菌、鼬螺杆菌、霍乱弧菌、枯草芽孢杆菌、红斑丹毒丝菌、小肠结肠炎耶尔森菌、五日热罗克利马体菌和Agrobacterium tumerfacium。可以如本文所述修饰任何已知的治疗性细菌，包括免疫刺激性细菌。
2.细菌和病毒免疫应答的比较
细菌与病毒一样，具有天然免疫刺激的优势。已知细菌和病毒包含称为病原体相关分子模式(PAMP)的保守结构，该保守结构通过宿主细胞模式识别受体(PRR)感测。PRR对PAMP的识别触发下游信号传导级联反应，这导致诱导细胞因子和趋化因子，和启动导致病原体清除的免疫应答(Iwasaki and Medzhitov(2010)Science 327(5963):291-295)。PAMP与先天免疫系统结合的方式，以及来自哪种类型的传染原，决定了与侵袭病原体作斗争的适当的获得性免疫应答。
一类称为Toll样受体(TLR)的PRR识别衍生自细菌和病毒来源的PAMP，并且位于细胞内的各个区室中。TLR结合一系列配体，包括脂多糖(TLR4)、脂蛋白(TLR2)、鞭毛蛋白(TLR5)、DNA中的未甲基化CpG基序(TLR9)、双链RNA(TLR3)和单链RNA(TLR7和TLR8)(Akiraet al.(2001)Nat.Immunol.2(8):675-680；Kawai and Akira(2005)Curr.Opin.Immunol.17(4):338-344)。例如，鼠伤寒沙门菌的宿主监测主要通过TLR2、TLR4和TLR5介导(Arpaia et al.(2011)Cell 144(5):675-688)。这些TLR通过MyD88和TRIF衔接分子发出信号，以介导NF-κB依赖性促炎细胞因子(诸如TNF-α、IL-6和IFN-γ)的诱导(Pandey et al.(2015)Cold Spring Harb Per spect Biol 7(1):a016246)。
另一类的PRR是nod样受体(NLR)家族。这些受体驻留在宿主细胞的胞质溶胶中并识别细胞内PAMPS。例如，鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白显示出活化NLRC4/NAIP5炎性小体途径，导致胱天蛋白酶-l的裂解和促炎细胞因子IL-1β和IL-18的诱导，从而导致所感染的巨噬细胞的焦亡性细胞死亡(Fink et al.(2007)Cell Microbiol.9(11):2562-2570)。
虽然TLR2、TLR4、TLR5和炎性小体的结合诱导介导细菌清除的促炎细胞因子，但它们活化了主要由NF-κB驱动的信号传导级联反应，该级联反应导致中性粒细胞、巨噬细胞和CD4+T细胞的募集和活化，而不是抗肿瘤免疫所需的DC和CD8+T细胞的募集和活化(Lui etal.(2017)Signal Transduct Target Ther.2:17023)。为了活化CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫，IRF3/IRF7依赖性I型干扰素信号传导对于DC活化和肿瘤抗原的交叉呈递以促进CD8+T细胞启动至关重要(Diamond et al.(2011).J.Exp.Med.208(10):1989-2003；Fuertes etal.(2011).J.Exp.Med.208(l0):2005-20l6)。I型干扰素(IFN-α，IFN-β)是由两种不同的TLR依赖性和TLR非依赖性信号传导途径诱导的标记细胞因子。用于诱导IFN-β的TLR依赖性途径在病原体胞吞后发生，从而TLR3、7、8和9检测胞内体中病原体衍生的DNA和RNA元件。TLR 7和8识别病毒核苷和核苷酸，并且这些的合成激动剂，诸如雷西莫特(resiquimod)和咪喹莫特(imiquimod)已在临床上得到验证(Chi et al.(2017)Frontiers inPharmacology 8:304)。合成的dsRNA，诸如聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(I:C))和聚ICLC(由polyL赖氨酸配制以抵抗RNase消化的类似物)是TLR3和MDA5途径的激动剂，和IFN-β的强大诱导剂(Caskey et al.(2011)J.Exp.Med.208(12):2357-66)。病毒和细菌DNA中存在的胞内体CpG基序的TLR9检测也可以通过IRF3诱导IFN-β。另外，已经显示TLR4通过IRF3的MyD88非依赖性TRIF活化来诱导IFN-β(Owen et al.(2016)mBio.7：1e02051-15)。随后显示DC的TLR4活化与I型IFN无关，因此TLR4通过I型IFN活化DC的能力可能是生物学无关的(Hu et al.(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112:45)。此外，尚未显示TLR4信号传导直接募集或活化CD8+T细胞。
在TLR非依赖性I型IFN途径中，一种途径是由胞质溶胶中的单链(ss)和双链(ds)RNA的宿主识别而介导的。这些由RNA解旋酶(包括视黄酸诱导基因I(RIG-1)、黑素瘤分化相关基因5(MDA-5))，并且通过IFN-β启动子刺激物1(IPS-l；也称为线粒体抗病毒信号蛋白或MAVS)衔接蛋白介导的IRF-3转录因子的磷酸化而感测到，从而导致IFN-β的诱导(Iretonand Gale(2011)Viruses 3(6)：906-919)。还已经在常见的慢病毒shRNA载体中无意中发现了在U6启动子转录起始位点处以AA二核苷酸序列形式的合成RIG-I结合元件。其随后在质粒中的缺失防止混淆脱靶I型IFN活化(Pebemard et al.(2004)Differentiation 72:103-111)。
TLR非依赖性I型干扰素诱导途径的第二种类型是通过干扰素基因的刺激剂(STING)(一种胞质ER驻留衔接蛋白，现已被认为是从感染性病原体或异常宿主细胞损伤中感测胞质dsDNA的中心介质)介导的(Barber(2011)Immunol.Rev 243(1)：99-108)。STING信号活化TANK结合激酶(TBK1)/IRF3轴和NF-κB信号传导轴，从而导致诱导IFN-β和其他强烈活化先天性和获得性免疫的促炎细胞因子和趋化因子(Burdette et al.(2011)Nature478(7370):515-518)。通过STING感测胞质dsDNA需要环状GMP-AMP合酶(cGAS)，一种直接结合dsDNA的宿主细胞核苷酸转移酶，并且作为响应，合成环状二核苷酸(CDN)第二信使环状GMP-AMP(cGAMP)(其结合并活化STING)(Sun et al.(2013)Science339(6121):786-791；Wuet al.(2013)Science 339(6121):826-830)。衍生自细菌的CDA，诸如由细胞内单核细胞增生利斯特菌产生的c-di-AMP也可以直接结合鼠STING，但是仅结合5个人STING等位基因中的3个。不像由细菌产生的CDN(其中两个嘌呤核苷通过具有3′-3′键的磷酸桥连接)，由哺乳动物cGAS合成的cGAMP中的核苷酸间磷酸桥通过非规范2′-3′键连接。这些2′-3′分子以比细菌3′-3′CDN好300倍的亲和性与STING结合，因此是人STING的更有效生理配体(参见，例如Civril et al.(2013)Nature 498(7454):332-337；Diner et al.(2013)Cell Rep.3(5):1355-1361；Gao et al.(2013)Sci.Signal 6(269):p11；Ablasser et al.(2013)Nature 503(7477):530-534)。
人类中的cGAS/STING信号传导途径可能已随时间而发展，以优先响应病毒性病原体而不是细菌病原体，并且这可以解释为什么携带宿主肿瘤抗原的细菌疫苗已成为人类中差的CD8+T细胞启动载体。来自常规DC的STING依赖性I型IFN信号传导对CD8+T细胞的TLR非依赖性活化是检测病毒的主要机制，其中仅在STING途径被病毒失活时才操作由类浆细胞DC进行的TLR依赖性I型IFN产生(Hervas-Stubbs et al.(2014)J Immunol.193:1151-1161)。此外，对于鼠伤寒沙门菌之类的细菌，虽然能够通过TLR4诱导IFN-β，但CD8+T细胞既不被诱导也不被清除或保护性免疫需要(Lee et al.(2012)Immunol Lett.148(2):138-143)。许多细菌菌株(包括鼠伤寒沙门菌)缺乏生理相关的CD8+T表位，既阻碍了细菌疫苗的开发，也阻碍了对随后感染的保护性免疫，即使来自相同的遗传菌株也是如此(Lo et al.(1999)J.Immunol.162:5398-5406)。因此，基于细菌的癌症免疫疗法在其诱导I型IFN募集和活化CD8+T细胞的能力受到生物学限制，该能力是促进肿瘤抗原交叉呈递和持久的抗肿瘤免疫所必需的。因此，使本文提供的细菌免疫疗法工程化以诱导病毒样TLR非依赖性I型IFN信号传导，而不是TLR依赖性细菌免疫信号传导，将优先诱导CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。
STING响应于感测胞质溶胶中的核酸而活化先天免疫。下游信号传导通过CDN的结合而被活化，该CDN是细菌或宿主酶cGAS响应与胞质dsDNA的结合而合成的。细菌和宿主产生的CDN具有独特的磷酸盐桥结构，这区分了它们活化STING的能力。IFN-β是所活化STING的标记细胞因子，并且病毒诱导的I型IFN而不是病毒诱导的IFN是有效的CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫所需要的。本文提供的免疫刺激性细菌包括作为STING激动剂的那些。
3.沙门菌属疗法
沙门菌属是可以用作癌症治疗剂的细菌属的示例。本文所例举的沙门菌属是一种减毒物种，或者凭借修饰用作癌症治疗剂的物种，其具有降低的毒性。
a.嗜肿瘤细菌
当从远端部位注射时，许多细菌物种已证明在实体瘤内优先复制。这些包括但不限于沙门菌属、双歧杆菌属、梭菌属和埃希氏杆菌属的物种。细菌的天然肿瘤归巢性质与宿主对细菌感染的先天免疫应答相结合，被认为介导抗肿瘤应答。已经表明这种肿瘤组织嗜性不同程度地减小肿瘤的尺寸。这些细菌物种的肿瘤嗜性的一个促成因素是在缺氧或缺氧环境中复制的能力。已经对许多这些天然的嗜肿瘤细菌进一步工程化，以提高其抗肿瘤应答的功效(在Zu et al.(2014)Crit Rev Microbiol.40(3):225-235；和Felgner et al.(2017)Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078中进行了综述)。
b.肠炎沙门菌亚属血清亚型
肠炎沙门菌亚属血清亚型(鼠伤寒沙门菌)是用作抗癌治疗剂的细菌物种的示例。使用细菌刺激宿主对癌症的免疫的一种方法是通过革兰氏阴性兼性厌氧菌鼠伤寒沙门菌，其优先积累在体内的缺氧和坏死区域，包括肿瘤微环境。由于来自组织坏死的营养物的可用性、漏的肿瘤脉管系统以及它们在逃逸免疫系统的肿瘤微环境中生存的可能性增加，鼠伤寒沙门菌在这些环境中积累(Baban et al.(2010)Bioengineered Bugs 1(6):385-294)。鼠伤寒沙门菌能够在有氧和厌氧条件下生长；因此，它能够定植于不太缺氧的小肿瘤和更缺氧的大肿瘤。
鼠伤寒沙门菌是通过粪-口途径传播的革兰氏阴性兼性病原体。它不仅引起局部胃肠道感染，而且在口摄入后进入血液和淋巴系统，从而感染全身组织，诸如肝脏、脾和肺。野生型鼠伤寒沙门菌的全身施用过度刺激TNF-α诱导，从而导致细胞因子级联反应和感染性休克，如果不进行治疗，可能会致命。结果，必须对致病细菌菌株诸如鼠伤寒沙门菌进行减毒，以防止全身感染，而不完全抑制其有效地定植于肿瘤组织的能力。通常通过使可引发免疫应答的细胞结构(诸如细菌外膜)突变或限制其在没有补充营养物的情况下复制的能力来实现减毒。
鼠伤寒沙门菌是一种细胞内病原体，其可被髓样细胞(诸如巨噬细胞)迅速摄取，或可诱导自身摄取到非吞噬细胞(诸如上皮细胞)中。一旦在细胞内部，它就可以在含有沙门菌属的囊泡(SCV)中复制，并且也可以逃逸到某些上皮细胞的胞质溶胶中。已经鉴定了鼠伤寒沙门菌致病性的许多分子决定因素，并且这些基因聚集在沙门菌属致病岛(SPI)中。两个最佳表征的致病岛是负责介导非吞噬细胞的细菌侵袭的SPI-1和在SCV中复制所需的SPI-2(Agbor and McCormick(2011)Cell Microbiol.13(12):1858-1869)。这些致病岛均编码称为三型分泌系统(T3SS)的大分子结构，该结构可将效应子蛋白跨宿主膜转运(Galanand Wolf-Watz(2006)Nature 444:567-573)。
c.细菌减毒
以癌症治疗施用的治疗性细菌应被减毒。用于细菌病原体减毒的各种方法是本领域已知的。例如，营养缺陷型突变使细菌无法合成必需的营养物，并且广泛使用了基因的缺失/突变，诸如aro、pur、gua、thy、nad和asd(美国专利公开号2012/0009153)。由涉及这些基因的生物合成途径产生的营养物通常在宿主细胞中不可用，并且因此细菌存活是一项挑战。例如，沙门菌属和其他物种的减毒可以通过缺失aroA基因(其是莽草酸酯(shikimate)途径的一部分)来实现，从而将糖酵解与芳族氨基酸的生物合成联系起来(Felgner et al.(2016)MBio 7(5):e01220-16)。因此，缺失aroA导致细菌对芳族氨基酸呈营养缺陷型和随后的减毒(美国专利公开号2003/0170276、2003/0175297、2012/0009153、2016/0369282；国际申请公开号WO 2015/032165和WO 2016/025582)。类似地，已经缺失了参与芳族氨基酸的生物合成途径的其他酶，包括aroC和aroD，以实现减毒(美国专利公开号2016/0369282；国际专利申请公开号WO 2016/025582)。例如，鼠伤寒沙门菌菌株SL7207是芳族氨基酸营养缺陷型(aroA-突变体)；A1和A1-R菌株是亮氨酸-精氨酸营养缺陷型。VNP20009是嘌呤营养缺陷型(purI-突变体)。如本文所示，其对于免疫抑制性核苷腺苷也呈营养缺陷型。
使细菌减毒的突变还包括但不限于改变脂多糖的生物合成的基因的突变例如rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptA和lpxT；引入自杀基因的突变例如sacB、nuk、hok、gef、kil或phlA；引入细菌裂解基因的突变例如hly和cly；毒力因子的突变例如IsyA、pag、prg、iscA、virG、plc和act；修饰应激应答的突变例如recA、htrA、htpR、hsp和groEL；破坏细胞周期的突变min；破坏或失活调节功能的突变例如cya、crp、phoP/phoQ和ompR(美国专利公开号2012/0009153、2003/0170276、2007/0298012；美国专利号6,190,657；国际申请公开号：WO 2015/032165；Felgner et al.(2016)Gut microbes 7(2):171-177；Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178；Frahm et al.(2015)mBio 6(2):e00254-15；Kong et al.(2011)Infection andImmunity 79(12):5027-5038；Kong et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109(47):19414-19419)。理想地，遗传减毒包括基因缺失而不是点突变，以防止自发性补偿突变，该自发性补偿突变可能导致回复至强毒表型。
i.msbB-突变体
鼠伤寒沙门菌中的msbB基因所编码的酶脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶催化末端肉豆蔻基基团加成到脂多糖(LPS)的脂质A结构域中(Low et al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。因此，msbB的缺失改变LPS(革兰氏阴性细菌外膜的主要成分)的脂质A结构域的酰基组成。这种修饰显著降低了LPS诱导感染性休克的能力，使细菌菌株减毒并减少了TNFα的潜在有害产生，从而降低全身毒性。鼠伤寒沙门菌msbB突变体保持其优先于小鼠中的其他组织定植肿瘤的能力并保留抗肿瘤活性，从而提高基于沙门菌属的免疫治疗剂的治疗指数(美国专利公开号2003/0170276、2003/0109026、2004/0229338、2005/0225088、2007/0298012)。
例如，鼠伤寒沙门菌VNP20009菌株中msbB的缺失导致产生主要是五酰化的LPS，其毒性低于天然六酰化的LPS，并允许全身递送而不会引起毒性休克(Lee et al.(2000)International Journal of Toxicology 19:19-25)。可以将其他LPS突变引入本文提供的细菌菌株中，包括沙门菌属菌株，其显著降低毒力，从而提供较低的毒性，并允许施用较高剂量。
ii.purI-突变体
使用免疫刺激性细菌，该免疫刺激性细菌可以通过使它们对一种或多种必需营养素(诸如嘌呤(例如，腺嘌呤)、核苷(例如，腺苷)或氨基酸(例如，精氨酸和亮氨酸))呈营养缺陷型而被减毒。特别地，在本文提供的免疫刺激性细菌(诸如鼠伤寒沙门菌)的实施方案中，使优先在肿瘤微环境中积累的细菌对腺苷呈营养缺陷型。因此，本文所述的免疫刺激性细菌菌株被减毒，因为它们需要腺苷来生长，并且它们优先定植于TME，TME如下所述具有大量的腺苷。
嘌呤的生物合成途径涉及磷酸核糖酰氨基咪唑合成酶，一种由purI基因(与purM基因同义)编码的酶。因此，purI基因的破坏使细菌对嘌呤呈营养缺陷型。除了被减毒外，purI-突变体在肿瘤环境中富集并具有显著的抗肿瘤活性(Pawelek et al.(1997)CancerResearch 57:4537-4544)。先前已经描述了由于它们的快速细胞更新，这种定植由肿瘤间质液中存在的高浓度嘌呤造成。由于purI-细菌无法合成嘌呤，因此它们需要外部来源的腺嘌呤，并且据认为这将导致它们在富含嘌呤的肿瘤微环境中生长受限(Rosenberg et al.(2002)J.Immunotherapy 25(3):218-225)。虽然最初报道VNP20009菌株含有purI基因的缺失(Low et al.(2003)Methods in Molecular Medicine Vol.90,Suicide Gene Therapy：47-59)，但随后对VNP20009的整个基因组的分析表明，purI基因没有缺失，但是由于染色体倒置而被破坏(Broadway et al.(2014)Journal of Biotechnology 192:177-178)。整个基因包含在侧翼是插入序列的VNP20009染色体的两个部分中(其中一个具有活性转座酶)。
本文表明，purI突变体鼠伤寒沙门菌菌株对于在肿瘤微环境高度富含的核苷腺苷呈营养缺陷型。因此，当使用VNP20009时，无需引入任何其他修饰即可实现腺苷营养缺陷。对于其他菌株和细菌，purI基因可以像在VNP20009中一样被破坏，或者可以包含purI基因的全部或部分缺失，以防止回复至野生型基因。
iii.减毒突变的组合
通过染色体的不同区域上的基因缺失而具有多种遗传减毒的细菌对细菌免疫疗法是期望的，因为可以增加减毒，同时降低通过与野生型遗传物质的同源重组来获得基因回复至强毒表型的可能性。通过同源重组恢复毒力将需要在同一生物体内发生两个单独的重组事件。理想情况下，选择用于免疫治疗剂的减毒突变的组合在不降低功效的情况下增加耐受性，从而增加治疗指数。例如，鼠伤寒沙门菌VNP20009菌株中msbB和purI基因的破坏已被用于肿瘤靶向和生长抑制，并在动物模型中引发了低毒性(Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Bermudes et al.(2000)Cancer Gene Therapy:PastAchievements and Future Challenges,edited by Habib Kluwer Academic/PlenumPublishers,New York,pp.57-63；Low et al.(2003)Methods in Molecular Medicine,Vol.90,Suicide Gene Therapy:47-59；Lee el al.(2000)International Journal ofToxicology 19:19-25；Rosenberg et al.(2002)J.Immunotherapy 25(3):218-225；Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178；Loeffler et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104(31):12879-12883；Luo et al.(2002)OncologyResearch 12:501-508)。当将VNP20009(msbB-/purI-)施用给带有同系或人异种移植肿瘤的小鼠时，该细菌优先以超过300-1000：1的比率在肿瘤的细胞外成分内积累，减少TNFα诱导，并证明了肿瘤消退和与对照小鼠相比延长的生存期(Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。然而，来自人类的1期临床试验的结果表明，尽管VNP20009相对安全且耐受良好，但在人类黑素瘤肿瘤中观察到了差的积累，并且显示出微乎其微的抗肿瘤活性(Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。由于毒性，表现出任何抗肿瘤活性所需的更高剂量是不可能的。
因此，需要进一步的改进。本文提供的免疫刺激性细菌解决了这个问题。
iv.VNP20009和其他减毒的和野生型鼠伤寒沙门菌菌株
起始菌株可以是野生型非减毒菌株，诸如具有ATCC 14028所有鉴定特征的菌株。然后修饰菌株以增加其对肿瘤微环境或肿瘤细胞和/或肿瘤-驻留免疫细胞特异性或靶向性。也可以将其修饰为对腺苷呈营养缺陷型。可以使该菌株为鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)，和任选地msbB-、purI-/M-、和pagP-中的一个或多个。该菌株也可以asd-。在哺乳动物宿主识别的启动子诸如RNA聚合酶II或III的控制下，经修饰的菌株编码通常以低至中等拷贝数存在于质粒上的治疗性产物。还可以包括用以控制肿瘤微环境中的表达和细胞中的运输的其他调节序列。
可以如本文所述进行修饰的治疗细菌的示例是命名为VNP20009(ATCC#202165，YS1646)的菌株，其衍生自ATCC保藏号14028的菌株。命名为VNP20009(ATCC#202165，YS1646)的菌株是临床候选物，并且通过缺失msbB和purI基因对于安全性至少减毒50,000倍(Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Low et al.(2003)Methodsin Molecular Medicine,Vol.90,Suicide Gene Therapy Al-59；Lee et al.(2000)International Journal of Toxicology 19:19-25)。还考虑了减毒的沙门菌属的类似菌株。如上所述，缺失msbB改变了脂多糖(革兰氏阴性细菌外膜的主要成分)的脂质A结构域的组成((Low et al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。这可以防止脂多糖诱导的感染性休克，对细菌菌株减毒并降低全身毒性，同时减少可能有害的TNFα产生(Dinarello,C.A.(1997)Chest 112(6Suppl):321S-329S；Low et al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。purI基因的缺失使细菌对嘌呤呈营养缺陷型，这进一步使细菌减毒并使其在肿瘤微环境中富集(Pawelek et al.(1997)Cancer Res.57:4537-4544；Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)。
VNP20009在肿瘤中的积累取决于各因素的组合，包括：亲代菌株的固有侵袭性、ATCC保藏号14028、其在缺氧环境中复制的能力，以及对存在于肿瘤间质液中的高浓度嘌呤的需求。本文显示VNP20009也对核苷腺苷呈营养缺陷型，其可以在肿瘤微环境中积累至病理上的高水平并有助于免疫抑制性肿瘤微环境(Peter Vaupel and Amulf Mayer OxygenTransport to Tissue XXXVII,Advances in Experimental Medicine and Biology876chapter 22,pp.177-183)。将VNP20009施用给患有同系或人异种移植肿瘤的小鼠，该细菌优先以超过300-1000：1的比率在肿瘤的细胞外成分内积累，并证明了肿瘤生长抑制以及与对照小鼠相比延长的生存期(Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。来自1期临床试验的结果表明，尽管VNP20009相对安全且耐受良好，但在人类黑素瘤肿瘤中观察到了差的积累，并且显示出微乎其微的抗肿瘤活性(Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。由于与高水平的促炎细胞因子相关的毒性，影响任何抗肿瘤活性的较高剂量是不可能的。本文提供的修饰，包括鞭毛蛋白缺失(fliC-/fljB-)和可选的pagP-和/或hilA-修饰，显著增加了免疫刺激性细菌在肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤-驻留免疫细胞(诸如，髓样细胞)中的积累。增加对免疫细胞的靶向性，并消除感染其他细胞(诸如上皮细胞)的其他修饰增加了细菌在肿瘤和在肿瘤微环境中的积累。使野生型细菌对腺苷呈营养缺陷型的其他修饰进一步增加了肿瘤微环境中的积累。
鼠伤寒沙门菌的其他菌株可以用于肿瘤靶向递送治疗性蛋白和治疗，例如亮氨酸-精氨酸营养缺陷型A-1(Zhao et al.(2005)PNAS 102(3):755-760；Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；美国专利号8,822,194；美国专利公开号2014/0178341)及其衍生物AR-l(Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；Kawagushi et al.(2017)Oncotarget 8(12):19065-19073；Zhao et al.(2006)Cancer Res.66(15):7647-7652；Zhao et al.(2012)Cell Cycle 11(1):187-193；Tome et al.(2013)AnticancerResearch 33:97-102；Murakami et al.(2017)Oncotarget 8(5):8035-8042；Liu et al.(2016)Oncotarget 7(16):22873-22882；Binder et al.(2013)Cancer Immunol Res.1(2):123-133)；aroA-突变体鼠伤寒沙门菌菌株SL7207(Guo et al.(2011)Gene therapy18:95-105；美国专利公开号2012/0009153、2016/0369282和2016/0184456)及其专性厌氧菌衍生物YB1(WO 2015/032165；Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；Leschneret al.(2009)PLoS ONE 4(8):e6692；Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436)；aroA-/aroD-突变体鼠伤寒沙门菌菌株BRD509(一种SL1344(WT)菌株的衍生物)(Yoon etal.(2017)European J.of Cancer 70:48-61)；asd-/cya-/crp-突变体鼠伤寒沙门菌菌株c4550(Sorenson et al.(2010)Biology:Targets&Therapy 4:61-73)和phoP-/phoQ-鼠伤寒沙门菌菌株LH430(WO 2008/091375)。
在涉及患有晚期黑素瘤的患者的研究中，菌株VNP20009未能显示出临床益处，但将治疗安全地施用于晚期癌症患者。建立了最大耐受剂量(MTD)。因此，该菌株以及其他类似工程细菌菌株，可用作靶向肿瘤的治疗性递送媒介物的起始材料。本文提供的修饰提供了通过增加治疗剂的抗肿瘤效率和/或安全性和耐受性来增加功效的策略。
v.工程化以递送大分子的鼠伤寒沙门菌
鼠伤寒沙门菌也已被修饰以将肿瘤相关抗原(TAA)存活蛋白(SVN)递送至APC以启动获得性免疫(美国专利公开号2014/0186401；Xu et al.(2014)Cancer Res.74(21):6260-6270)。SVN是凋亡蛋白的抑制剂(IAP)，其延长细胞存活并提供细胞周期控制，并且在所有实体瘤中均过表达，在正常组织中表达较差。这项技术利用沙门菌属致病岛2(SPI-2)及其III型分泌系统(T3SS)将TAA递送到APC的胞质溶胶中，该APC然后被活化以诱导TAA特异性CD8+T细胞和抗肿瘤免疫(Xu et al.(2014)Cancer Res.74(21):6260-6270)。与基于利斯特菌属的TAA疫苗类似，这种方法在小鼠模型中显示出了希望，但尚未在人类中证明有效的肿瘤抗原特异性T细胞启动。
除基因递送外，鼠伤寒沙门菌也已用于递送小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)，以用于癌症治疗。例如，减毒的鼠伤寒沙门菌已被修饰以表达某些shRNA，诸如靶向STAT3和IDO1的那些(PCT/US2007/074272，和美国专利号9,453,227)。用针对免疫抑制基因吲哚胺脱氧酶(IDO)的shRNA质粒转化的VNP20009在鼠黑素瘤模型中成功使IDO表达沉默，导致肿瘤细胞死亡和中性粒细胞的显著肿瘤浸润(Blache et al.(2012)CancerRes.72(24):6447-6456)。将此载体与共施用透明质酸酶(诸如PEG化的可溶性PH20(PEGPH20；一种消耗细胞外透明质酸的酶))相组合显示出在治疗胰腺导管腺癌肿瘤方面的积极结果(Manuel et al.(2015)Cancer Immunol.Res.3(9):1096-1107；美国专利公开号2016/0184456)。在另一项研究中，发现因phoP/phoQ缺失而减毒并表达信号传导和转录活化因子3(STAT3)-特异性shRNA的鼠伤寒沙门菌抑制肿瘤生长并减少转移性器官的数量，从而延长C57BL6小鼠的寿命(Zhang et al.(2007)Cancer Res.67(12):5859-5864)。在另一实例中，鼠伤寒沙门菌菌株SL7207已用于递送靶向CTNNB1的shRNA，所述CTNNB1是编码β-连环蛋白的基因(Guo et al.(2011)Gene therapy 18:95-105；美国专利公开号2009/0123426、2016/0369282)，而鼠伤寒沙门菌菌株VNP20009已用于递送靶向STAT3的shRNA(Manuel et al.(2011)Cancer Res.71(12):4183-4191；美国专利公开号2009/0208534、2014/0186401、2016/0184456；WO 2008/091375；WO 2012/149364)。已经使用鼠伤寒沙门菌菌株A1-R和VNP20009将靶向自噬基因Atg5和Beclin1的siRNA递送至肿瘤细胞(Liu et al.(2016)Oncotarget 7(16):22873-22882)。需要改进这些菌株，使得它们更有效地定植于肿瘤、TME和/或肿瘤-驻留免疫细胞，并且还刺激免疫应答，并具有其他有利的性质，诸如本文提供的免疫刺激性细菌。在国际PCT申请公开号WO 2019/014398和美国公开号2019/0017050A1中描述了各种细菌的修饰。还可对这些出版物的每一个中描述(以及如本文所述)的细菌如本文所述进行修饰，以进一步改善免疫刺激和肿瘤靶向性质。
可以如本文所述修饰细菌以具有减少的炎症作用，并且因此毒性较小。结果，例如，可以施用更高的剂量。沙门菌属的这些菌株以及本领域技术人员已知和/或上文和本文所列的其他细菌物种中的任何一种均可如本文所述进行修饰，例如通过引入腺苷营养缺陷，一种编码治疗性产物(诸如免疫刺激性蛋白和/或RNAi，诸如miRNA或shRNA，或其抗体或抗体片段)的质粒，用于抑制免疫检查点，以及引入本文所述的其他修饰。示例是本文所述的鼠伤寒沙门菌物种。
本文提供的细菌菌株被工程化以递送治疗性分子。本文的菌株递送在肿瘤微环境中促进抗肿瘤免疫应答的免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子。菌株还可以包含减少吞噬细胞的细胞焦亡的基因组修饰，从而提供更强大的免疫应答，和/或减少或消除感染/侵袭上皮细胞的能力，但保留感染/侵袭吞噬细胞的能力，因此它们在肿瘤和肿瘤-驻留免疫细胞中更有效地积累。细菌菌株还可以修饰为编码治疗性产物，包括例如靶向并抑制免疫检查点以及其他此类靶标的RNAi。
4.增强免疫刺激性细菌以增加治疗指数
本文提供了对降低毒性并改善抗肿瘤活性的免疫刺激性细菌的增强。这种增强的示例如下。它们是针对沙门菌属，特别是鼠伤寒沙门菌描述的，应该理解，本领域技术人员可以在其他细菌物种和其他沙门菌属菌株中实现类似的增强。
a.asd基因缺失
细菌中的asd基因编码天冬氨酸-半醛脱氢酶。鼠伤寒沙门菌的asd-突变体对二氨基庚二酸(DAP)具有专性要求，这是细胞壁合成所必需的，并将在DAP剥夺的环境进行裂解。当asd基因在质粒上反式互补时，这种DAP营养缺陷可用于质粒选择和质粒体内稳定性的维持，而无需使用抗生素。基于非抗生素的质粒选择系统是有利的，并且允许1)在不良症状的事件下施用抗生素用作快速清除机制的用途，和2)在通常避免这种用途的情况下允许无抗生素的大规模生产。asd基因互补系统提供了这种选择(Galán el al.(1990)Gene 28:29-35)。预期使用asd基因互补系统将质粒维持在肿瘤微环境中，以增加经工程化以递送编码基因或干扰RNA的质粒的鼠伤寒沙门菌的功效。
鼠伤寒沙门菌的asd突变体的可选用途是利用DAP营养缺陷产生自溶(或自杀)菌株，用于将大分子递送至感染的细胞，而无需持久地定植于宿主肿瘤的能力。在体外或体内生长时，asd基因的缺失使细菌对DAP呈营养缺陷型。本文所述的实例提供了一种asd缺失菌株，该菌株对DAP呈营养缺陷型，并包含适合于递送RNAi(诸如shRNA或mi-RNA)的质粒，该质粒不包含asd互补基因，从而产生体内复制有缺陷的菌株。该菌株在DAP存在下在体外繁殖并正常生长，然后作为免疫治疗剂施用于不存在DAP的哺乳动物宿主。自杀菌株能够侵袭宿主细胞，但是由于在哺乳动物组织中不存在DAP而不能复制，从而自动裂解并递送其胞质内容物(例如质粒或蛋白质)。在本文提供的实例中，VNP20009的asd基因缺失菌株被进一步修饰以表达缺少其内源周质分泌信号序列的LLO蛋白，从而使其在沙门菌属的细胞质中积累。LLO是来自单核细胞增生利斯特菌的胆固醇依赖性成孔溶血素，其介导细菌的噬菌体逃逸。当将自溶菌株引入荷瘤小鼠时，细菌被吞噬性免疫细胞摄取，并进入含沙门菌属的囊泡(SCV)。在这种环境下，缺乏DAP将阻止细菌复制，并导致SCV中细菌的自溶。然后，自杀菌株的裂解将允许释放质粒和积累的LLO，该LLO将在含胆固醇的SVC膜上形成孔，并允许将质粒递送到宿主细胞的胞质溶胶中。
b.腺苷营养缺陷
衍生自色氨酸和ATP/腺苷途径的代谢产物是在肿瘤内形成免疫抑制环境的主要驱动力。以游离形式存在于细胞内部和外部的腺苷是免疫功能的效应物。腺苷降低T细胞受体诱导的NF-κB的活化，并抑制IL-2、IL-4和IFN-γ。腺苷降低T细胞的细胞毒性，增加T细胞的无反应性，并增加T细胞向Foxp3+或Lag-3+调节(T-reg)T细胞的分化。在NK细胞上，腺苷降低IFN-γ产生，并抑制NK细胞的细胞毒性。腺苷阻断中性粒细胞的粘附和外渗，减少吞噬作用，并降低超氧化物和一氧化氮的水平。腺苷还降低巨噬细胞上TNF-α、IL-12和MIP-1α的表达，减弱II类MHC的表达，并增加IL-10和IL-6的水平。腺苷免疫调节活性在其释放到肿瘤的细胞外空间并活化靶免疫细胞、癌细胞或内皮细胞的表面上的腺苷受体(ADR)后发生。肿瘤微环境中高腺苷水平导致局部免疫抑制，这限制了免疫系统消除癌细胞的能力。
细胞外腺苷是由膜相关的外酶CD39和CD73的顺序活性产生的，该膜相关的外酶在肿瘤基质细胞上表达，从而通过由死细胞或垂死细胞产生的ATP或ADP的磷水解作用共同产生腺苷。CD39将细胞外ATP(或ADP)转化为5’AMP，由5’MP转化为腺苷。内皮细胞上的CD39和CD73的表达在肿瘤微环境的缺氧条件下增加，从而增加腺苷水平。肿瘤缺氧可以由血液供应不足和肿瘤脉管系统紊乱造成，从而削弱氧气递送(Carroll and Ashcroft(2005)Expert.Rev.Mol.Mecl.7(6):1-16)。发生在肿瘤微环境中的缺氧也抑制腺苷酸激酶(AK)(其可将腺苷转化为AMP)，从而导致非常高的细胞外腺苷浓度。缺氧肿瘤微环境中腺苷的细胞外浓度已测量为10-100μM，这比约0.1μM的典型细胞外腺苷浓度高多大约100-1000倍(Vaupel et al.(2016)Adv Exp Med Biol.876:177-183；Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。由于肿瘤中的缺氧区域远离微血管，因此腺苷在肿瘤某些区域的局部浓度可能高于其他区域。
为了指导抑制免疫系统的效应，腺苷还可以通过对癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响来控制癌细胞的生长和扩散。例如，腺苷可以主要通过刺激A2A和A2B受体来促进血管生成。刺激内皮细胞上的受体可以调节细胞间粘附分子1(ICAM-1)和E-选择素在内皮细胞上的表达，维持血管完整性并促进血管生长(Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。腺苷活化各种细胞上的A2A、A2B或A3中的一种或多种可以刺激促血管生成因子的产生，诸如血管内皮生长因子(VEGF)、白介素8(IL-8)或血管生成素2(Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。
腺苷还可以通过与癌细胞上的受体相互作用来直接调节肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移。例如，研究表明A1和A2A受体的活化促进某些乳腺癌细胞系中的肿瘤细胞增殖，并且A2B受体的活化在结肠癌细胞中具有促进癌症生长的性质(Antoni oli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。腺苷还可以触发癌细胞的凋亡，并且各种研究已经将该活性与通过A3的外在凋亡途径或通过A2A和A2B的固有凋亡途径的活化相关联(Antoni oli et al.(2013))。通过增加细胞运动性、与细胞外基质的粘附，以及促进细胞运动和运动性的细胞粘附蛋白和受体的表达，腺苷可促进肿瘤细胞的迁移和转移。
三磷酸腺苷(ATP)的细胞外释放发生于受刺激的免疫细胞以及受损、垂死或受压的细胞。当受到这种ATP的胞外释放的刺激时，含NLR家族pyrin域蛋白3(NLR family pyrindomain-containing 3,NLRP3)炎性小体活化胱天蛋白酶-l，并导致细胞因子IL-1β和IL-18的分泌，其进而活化先天性和获得性免疫应答(Stagg and Smyth(2010)Oncogene 29：5346-5358)。ATP通过CD39和CD73酶分解代谢为腺苷。活化的腺苷通过负反馈机制充当高度免疫抑制的代谢产物，并且在缺氧肿瘤微环境中对多种免疫细胞类型具有多重效应(Staggand Smyth(2010)Oncogene 29:5346-5358)。腺苷受体A2A和A2B在多种免疫细胞上表达，并被腺苷刺激以促进cAMP介导的信号传导变化，从而导致T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和NKT细胞的免疫抑制表型。结果，腺苷水平可在病理组织诸如实体瘤中积累至其正常浓度的一百倍以上，该组织已显示过表达胞外核苷酸酶，诸如CD73。腺苷也已显示出促进肿瘤血管生成和发展。因此，对腺苷呈营养缺陷型的工程细菌将表现出增强的肿瘤靶向和定植。
可以通过缺失tsx基因(Bucarey et al.(2005)Infection and Immunity 73(10):6210-621)或通过缺失purD(Husseiny(2005)Infection and Immunity 73(3):1598-1605)使免疫刺激性细菌诸如伤寒沙门菌变成对腺苷呈营养缺陷型。在革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)中，purD基因敲除显示出对腺苷呈营养缺陷型(Parkel al.(2007)FEMS Microbiol Lett 276:55-59)。如本文所例示，鼠伤寒沙门菌菌株VNP20009由于其purI缺失而对腺苷呈营养缺陷型，因此，不需要进一步修饰使其对腺苷呈营养缺陷型。因此，本文提供的免疫刺激性细菌菌株的实施方案对腺苷呈营养缺陷型。这种营养缺陷型细菌选择性地在肿瘤微环境中复制，进一步增加所施用细菌在肿瘤中的积累和复制，并降低了肿瘤内和周围的腺苷的水平，从而减少或消除由腺苷积累引起的免疫抑制。本文提供的此类细菌的示例是含有purI-/msbB-突变以提供腺苷营养缺陷的鼠伤寒沙门菌的修饰菌株。
c.鞭毛蛋白缺陷菌株
鞭毛是细菌表面上的细胞器，其由通过钩子连接到旋转马达的长丝组成，该旋转马达可以顺时针或逆时针方式旋转以提供移位的手段。由于通过肠胃道的黏液层介导运动的能力，鼠伤寒沙门菌中的鞭毛对于趋化性和对于通过口服途径建立感染很重要。虽然鞭毛已被证明是趋化性和肿瘤椭圆柱体外定植所必需的(Kasinskas and Forbes(2007)Cancer Res.67(7):3201-3209)，并且运动性已被证明对肿瘤穿透很重要(Toley andForbes(2012)Integr Biol(Camb).4(2):165-176)，但当细菌通过静脉内施用时，鞭毛对于在动物内进行肿瘤定植是不需要的(Stritzker el al.(2010)International Journal ofMedical Microbiology 300:449-456)。每个鞭毛丝由成千上万个鞭毛蛋白亚基组成。鼠伤寒沙门菌染色体包含两个基因，fliC和fljB，它们编码抗原不同的鞭毛蛋白单体。当通过口服感染途径施用时，fliC和fljB均缺陷的突变体是非动性和无毒性的，但当在胃肠外施用时，则保持毒力。
鞭毛蛋白是沙门菌属的主要促炎性决定因子(Zeng et al.(2003)J Immunol171:3668-3674)，并直接被细胞表面上的TLR5和胞质溶胶中的NLCR4识别(Lightfield etal.(2008)Nat.Immunol.9(10):1171-1178)。两种途径均导致促炎应答，从而导致分泌细胞因子，包括IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6。试图通过将细菌工程化为分泌创伤弧菌(Vibriovulnificus)鞭毛蛋白B来增加对鞭毛蛋白的促炎反应，从而使基于沙门菌属的癌症免疫疗法更加有效，该创伤弧菌鞭毛蛋白B与fliC和fljB编码的鞭毛蛋白相比，诱导更大的炎症(Zheng et al.(2017)Sci.Transl.Med.9(376):eaak9537)。
在本文中，沙门菌属细菌鼠伤寒沙门菌被工程化为缺乏鞭毛蛋白亚基fliC和fljB，以减少促炎信号传导。例如，如本文所示，将缺乏msbB的沙门菌属菌株(其导致减少的TNF-α诱导)与fliC和fljB敲除组合。这导致具有TNF-α诱导降低和TLR5识别降低组合的沙门菌属菌株。这些修饰可以与msbB-、fliC-和fljB-组合，并用免疫刺激性质粒(任选包含CpG和靶向免疫检查点(TREX1、PD-L1、VISTA、SIRP-α、TGF-β、β-连环蛋白、CD47、VEGF及其组合)的治疗性分子(诸如抗体或RNAi分子))转化。所得细菌具有降低的促炎信号传导，但具有强大的抗肿瘤活性。
例如，如本文提供的，在鼠伤寒沙门菌VNP20009的asd缺失菌株中构建了fliC和fljB双突变体。还将通过破坏purI/purM而毒力减弱的VNP20009进行工程化，以包含msbB缺失，该缺失导致产生比野生型脂质A产毒更低的脂质A亚基。与具有野生型脂质A的菌株相比，这导致静脉内施用后的小鼠模型中降低的TNF-α产生。所得菌株是这种菌株的示例，该菌株通过修饰脂质A以减少TLR2/4信号传导以及缺失鞭毛蛋白亚基以降低TLR5识别和炎性小体诱导来使细菌炎症减弱。鞭毛蛋白亚基的缺失与LPS的修饰相组合允许宿主中更高的耐受性，并引导朝向针对TME中所需靶标的RNA干扰递送的免疫刺激性应答，这引发抗肿瘤应答并促进对肿瘤的获得性免疫应答。
d.工程化以逃逸含有沙门菌属的囊泡(SCV)的沙门菌属
沙门菌属(诸如鼠伤寒沙门菌)是细胞内病原体，其主要在称为含沙门菌属的囊泡(SCV)的膜结合区室中复制。在某些上皮细胞系中，鼠伤寒沙门菌显示出逃逸到胞质溶胶中，在那里它们可以复制。因为SCV的脂质双层是潜在的屏障，被工程化为以更高效率逃逸SCV的沙门菌属在递送大分子(诸如质粒)方面更有效。本文提供的是具有提高的SCV逃逸频率的沙门菌属和方法。这是通过缺失沙门菌属诱导的细丝(SIF)形成所需的基因来实现的。这些突变体具有增加的SCV逃逸频率，并且可以在胞质溶胶中复制。
例如，已经证明使用鼠伤寒沙门菌的sifA突变体进行增强的质粒递送。sifA基因编码SPI-2、T3SS-2分泌的效应蛋白，该效应蛋白模拟或活化宿主GTP酶的RhoA家族(Ohlsonel al.(2008)Cell Host&Microbe 4:434-446)。可以靶向编码参与SIF形成的分泌效应物的其他基因。这些包括，例如，sseJ、sseL、sopD2、pipB2、sseF、sseG、spvB和steA。通过防止SIF形成来增强鼠伤寒沙门菌的逃逸将活细菌释放到胞质溶胶中，在那里它们可以复制。
增强鼠伤寒沙门菌从SCV中逃逸并增加大分子(诸如质粒)递送的另一种方法是异源溶血素的表达，该异源溶血素导致SCV膜中的孔形成或者SCV膜破裂。一种这样的溶血素是来自单核细胞增生利斯特菌的listeriolysin O蛋白(LLO)，其由hlyA基因编码。LLO是一种胆固醇依赖性成孔溶细胞素，其由单核细胞增生利斯特菌属分泌，并主要负责吞噬体逃逸和进入宿主细胞的胞质溶胶。从鼠伤寒沙门菌分泌LLO可导致细菌逃逸并在胞质溶胶中复制。为了防止完整的鼠伤寒沙门菌逃逸SCV并在胞质溶胶中复制，可以从基因中除去编码信号序列的核苷酸。以这种方式，活性LLO包含在鼠伤寒沙门菌的细胞质内，并且LLO仅在细菌进行裂解时释放。如本文提供的，VNP20009被工程化以表达cytoLLO以增强用于表达针对靶标(诸如TREX1)的干扰RNA的质粒的递送，其可以增加免疫刺激性细菌的治疗功效。
e.生物膜形成所需的沙门菌属基因的缺失
细菌和真菌能够形成称为生物膜的多细胞结构。细菌生物膜被包裹在分泌的和细胞壁相关的多糖、糖蛋白和糖脂以及细胞外DNA(统称为细胞外聚合物质)的混合物中。这些细胞外聚合物质保护细菌免受多种伤害，诸如清洁剂、抗生素和抗微生物肽。细菌生物膜允许表面定植，并且是大量假体感染的原因，例如注射口和导管。生物膜还可以在感染过程中在组织中形成，这导致细菌持久性和脱落持续时间增加，并限制了抗生素疗法的有效性。生物膜中细菌的长期持续存在与增加的肿瘤发生有关，例如在胆囊的伤寒沙门菌(S.typhi)感染中(Di Domenico et al.(2017)Int.J Mol.Sci.18:1887)。
鼠伤寒沙门菌生物膜形成受CsgD调控。CsgD活化csgBAC操纵子，这导致curli菌毛亚基CsgA和CsgB的产生增加(Zakikhani et al.(2010)Molecular Microbiology 77(3):77l-786)。CsgA被TLR2识别为PAMP，并诱导人巨噬细胞产生IL-8(Tukel et al.(2005)Molecular Microbiology 58(1):289-304)。此外，CsgD通过活化编码二鸟苷酸环化酶的adrA基因间接增加纤维素产生。由AdrA产生的小分子环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是在几乎所有细菌物种中都普遍存在的第二信使。AdrA介导的c-di-GMP的增加会增强纤维素合成酶基因bcsA的表达，其转而通过刺激bcsABZC和bcsEFG操纵子来增加纤维素产生。免疫刺激性细菌诸如鼠伤寒沙门菌形成生物膜的能力降低可通过缺失参与生物膜形成的基因来实现，例如csgD、csgA、csgB、adrA、bcsA、bcsB、bcsZ、bcsE、bcsF、bcsG、dsbA或dsbB(Anwar el al.(2014)Plos One 9(8):e106095)。
鼠伤寒沙门菌可在实体瘤中形成生物膜，以防止宿主免疫细胞吞噬。不能形成生物膜的沙门菌属突变体可以更快地被宿主吞噬细胞摄取，并从感染的肿瘤中清除(Crullet al.(2011)Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。如本文所述，吞噬细胞内细胞内定位的这种增加可减少细胞外细菌的持久性，并增强质粒递送和通过RNA干扰的基因敲低的有效性。被工程化以减少生物膜形成的免疫刺激性细菌将增加从肿瘤/组织的清除率，并且因此增加了治疗的耐受性，并且将防止在患者假体中的定植，从而增加了这些菌株的治疗益处。腺苷模拟物可以抑制鼠伤寒沙门菌生物膜形成，表明肿瘤微环境中高腺苷浓度可以促进肿瘤相关生物膜形成(Koopman et al.(2015)Antimicrob Agents Chemother59:76-84)。如本文所提供的，活的细菌减毒菌株诸如鼠伤寒沙门菌，被工程化以递送编码干扰RNA的质粒以刺激强烈的抗肿瘤免疫应答，该活的细菌减毒菌株包含purI破坏(并且因此定植于富含腺苷的肿瘤)，并且还通过缺失生物膜形成所需的一个或多个基因而被阻止形成生物膜。
adrA基因编码产生c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶，其是鼠伤寒沙门菌生物膜形成所需的。c-di-GMP与宿主胞质蛋白STING结合并且是宿主胞质蛋白STING的激动剂。如上所述，将STING激动剂用作抗癌治疗、疫苗佐剂和经工程化以分泌环状二核苷酸以用于免疫疗法的细菌(Libanova2012,Synlogic 2018AACR poster)。通过缺失adrA而减少c-di-GMP产生的免疫刺激性细菌是违反直觉的，但是无法形成生物膜的细菌突变体(如鼠伤寒沙门菌突变体)(包括adrA突变体)已在小鼠肿瘤模型中显示出降低的治疗潜力(Crull et al.(2011)Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。STING的几个人等位基因难于结合细菌产生的3′3′CDN(Corrales et al.(2015)Cell Reports 11:1022-1023)。
如本文所述，细菌菌株诸如鼠伤寒沙门菌促进强烈的抗肿瘤免疫应答，该细菌菌株被工程化为腺苷营养缺陷型，并且通过LPS的修饰和/或鞭毛蛋白的缺失和/或生物膜形成所需基因的缺失而降低他们诱导促炎细胞因子的能力，并且被进一步修饰以传递干扰RNA。
f.LPS生物合成途径基因的缺失
革兰氏阴性细菌的LPS是细菌膜外叶的主要成分。它由三个主要部分组成：脂质A、非重复核心寡糖和O抗原(或O多糖)。O抗原是LPS的最外部分，并作为防止细菌渗透的保护部分，但是，O抗原的糖组成在菌株之间差异很大。脂质A和核心寡糖变化较小，并且更通常在相同物种的菌株中是保守的。脂质A是LPS的包含内毒素活性的部分。它通常是装饰有多种脂肪酸的二糖。这些疏水性脂肪酸链将LPS锚定在细菌膜中，其余LPS从细胞表面突出。脂质A结构域是革兰氏阴性细菌大部分毒性的原因。通常，血液中的LPS被认为是重要的病原体相关分子模式(PAMP)，并诱导深刻的促炎应答。LPS是包含CD14、MD2和TLR4的膜结合受体复合物的配体。TLR4是一种跨膜蛋白，其可以通过MyD88和TRIF途径发出信号，以刺激NFκB途径并导致促炎细胞因子(诸如TNF-α和IL-1β)的产生，其结果可能是内毒素性休克，这可能是致命的。哺乳动物细胞的胞质溶胶中的LPS可以直接与胱天蛋白酶4、5和11的CARD结构域结合，从而导致自体活化和焦亡性细胞死亡(Hagar et al.(2015)Cell Research 25:149-150)。脂质A的组成和脂质A变体的产毒作用已得到充分证明。例如，单磷酸化脂质A的炎性比具有多个磷酸基团的脂质A小得多。脂质A上的酰基链的数目和长度也可以对毒性程度产生深远的影响。来自大肠杆菌的规范脂质A具有六个酰基链，并且这种六酰化作用具有潜在毒性。鼠伤寒沙门菌脂质A与大肠杆菌相似；它是一种带有四个伯羟酰基链和两个仲羟酰基链的葡糖胺二糖(Raetz and Whitfield(2002)Annu Rev Biochem.71:635-700)。
如上所述，鼠伤寒沙门菌的msbB-突变体不能经历其LPS的末端肉豆蔻酰化，并且主要产生毒性比六酰化的脂质A显著更低的五酰化的LPS。用棕榈酸酯修饰脂质A是通过棕榈基转移酶(PagP)催化的。pagP基因的转录在PhoP/PhoQ系统的控制下，该系统由例如在SCV内部的低浓度镁活化。因此，鼠伤寒沙门菌的酰基含量是可变的，并且对于野生型细菌，其可以是六酰化或五酰化的。鼠伤寒沙门菌使其脂质A棕榈酸酯化的能力提高了对分泌到吞噬溶酶体中的抗菌肽的抗性。
在野生型鼠伤寒沙门菌中，pagP的表达产生七酰化的脂质A。在msbB突变体中(其中无法添加脂质A的末端酰基链)，pagP的诱导产生六酰化的LPS(Kong et al.(2011)Infection and Immunity 79(12):5027-5038)。六酰化的LPS已被证明是最促炎的。虽然其他基团已试图利用这种促炎信号，例如通过缺失pagP以仅允许产生六酰化的LPS(Felgneret al.(2016)Gut Microbes 7(2):171-177；Felgner et al.(2018)Oncoimmunology 7(2):e1382791)，但由于TNF-α介导的LPS的促炎性质和反常较低的获得性免疫，这可能导致较差的耐受性(Kocijancic et al.(2017)Oncotarget 8(30):49988-50001)。
LPS是有效的TLR-4激动剂，该激动剂诱导TNF-α和IL-6。在I.V.VNP20009临床试验(Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)中以1E9 CFU/m2的剂量限制毒性是细胞因子介导的(发烧性低血压)，其中2小时时血清中的TNF-α水平>100,000pg/mL，IL-6水平>10,000pg/mL。尽管VNP20009中的msbB缺失以及其降低的产热原性，但可能是由于六酰化LPS的存在，LPS在高剂量下仍可能有毒性。因此，pagP-/msbB-菌株在较高剂量下耐受性更好，因为它不能产生六酰化的LPS，并且可以在人类中以1E9 CFU/m2或更高给药。更高剂量可以导致肿瘤定植增加，从而增强免疫刺激性细菌的治疗功效。
本文提供的是活的减毒沙门菌属菌株，诸如鼠伤寒沙门菌的示例性菌株，其仅能产生五酰化的LPS，其含有msbB基因的缺失(如上所述，阻止了脂质A的末端肉豆蔻酰化)，且其进一步通过缺失pagP进行修饰(防止棕榈酰化)。当进一步修饰以表达针对免疫检查点(诸如TREX1)的干扰RNA时，经修饰以产生五酰化的LPS的菌株允许较低水平的促炎细胞因子、增加的对抗菌肽的敏感性、增强的耐受性和提高的抗肿瘤免疫。
g.SPI-1和SPI-2基因的缺失
如上所述，某些细菌物种中的发病机理，包括沙门菌属，诸如鼠伤寒沙门菌，涉及称为沙门菌属致病岛(SPI；见图22)的基因簇。称为SPI-1的SPI介导上皮细胞的侵袭。操纵子和基因及其功能如图22所示。SPI-1基因包括但不限于：avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaP、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB和sptP。缺失这些基因中的一种或多种降低或减消除细菌感染上皮细胞的能力，但不影响其感染或侵袭吞噬细胞(包括吞噬免疫细胞)的能力。
沙门菌属使用沙门菌属致病岛1编码的3型分泌系统(T3SS)侵袭非吞噬性肠上皮细胞，该系统形成将效应蛋白直接注入宿主细胞的胞质溶胶中的针样结构。这些效应蛋白导致真核细胞细胞骨架的重排以促进肠上皮细胞的侵袭，并且还诱导促炎细胞因子。SPI-1基因座包括编码该侵袭系统的成分的39个基因(参见图22，由Kimbrough and Miller(2002)Microbes Infect.4(1):75-82重制)。
SPI-1编码3型分泌系统(T3SS)，该系统负责将效应蛋白易位到宿主细胞的胞质溶胶中，这可引起导致沙门菌属的摄取的肌动蛋白的重排。SPI-1T3SS对于穿过肠道上皮层是必不可少的，但当胃肠外注射细菌时，对于感染是非必要的。某些蛋白质和针状复合物本身的注射也可以诱导炎性小体活化和吞噬细胞的细胞焦亡。这种促炎性细胞死亡可通过直接诱导抗原呈递细胞(APC)死亡以及修饰细胞因子环境来阻止记忆性T细胞生成来限制强大的获得性免疫应答的启动。SPI-1基因包含许多操纵子，包括：sitABCD、sprB、avrA、hilC、orgABC、prgKJIH、hilD、hilA、iagB、sptP、sicC、iacP、sipADCB、sicA、spaOPQRS、invFGEABCIJ和invH。
T3SS是通过以ATP依赖性方式将细菌蛋白效应物直接注入宿主细胞而在革兰氏阴性菌的感染性中发挥重要作用的复合物。T3SS复合物穿过内部和外部细菌膜，并在与宿主细胞接触时在真核细胞膜上形成孔。它们由输出装置、针状复合物和位于针尖的易位子组成(图22)。针状复合物包括针状蛋白PrgI(一种基体)，其将复合物锚定在细菌膜中，并由蛋白质PrgH、PrgK和InvG以及其他蛋白质(包括InvH、PrgJ(杆状蛋白)和InvJ)组成。形成宿主细胞中的孔的易位子是蛋白质SipB、SipC和SipD的复合物。允许效应蛋白易位的输出装置由蛋白质SpaP、SpaQ、SpaR、SpaS、InvA、InvC和OrgB组成。建立蛋白质分泌特定顺序的细胞质分选平台由蛋白质SpaO、OrgA和OrgB组成(Manon et al.(2012),Salmonella,Chapter17,eds.Annous and Gurtler,Rijeka,pp.339-364)。
通过T3SS-1易位到宿主细胞中的效应物包括Sip A、SipC、SopB、SopD、SopE、SopE2和SptP，这对于细胞侵袭是必不可少的。例如，鼠伤寒沙门菌sipA突变体显示出60-80％的侵袭减少，sipC缺失导致95％的侵袭减少，并且sopB缺失导致50％的侵袭减少(Manon etal.(2012),Salmonella,Chapter 17,eds.Annous and Gurtler,Rijeka,pp.339-364)。其他效应物包括AvrA，其控制沙门菌属诱导的炎症。结合分泌蛋白并将它们维持在胜任分泌的构造中的伴侣蛋白包括SicA、InvB和SicP。转录调节因子包括HilA、HilD、InvF、SirC和SprB。在III型分泌中具有各种功能的未分类T3SS SPI-1蛋白包括OrgC、InvE、InvI、IacP和IagB(参见图22，改编自Kimbrough et al.(2002)Microbes Infect.4(l):75-82)。
因此，通过参与SPI-1途径的一个或多个基因的失活或敲除使SPI-1依赖性侵袭失活，消除了细菌感染上皮细胞的能力。这些基因包括但不限于以下中的一种或多种：avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaP、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB和sptP。
缺乏T3SS-1的沙门菌属突变体已显示出通过T3SS-1非依赖性侵袭机制侵袭许多细胞系/类型，涉及几种蛋白质，包括侵袭素Rck、PagN和HlyE。rck操纵子包含6个开放阅读框：pefI、srgD、srgA、srgB、rck和srgC。pefI编码pef操纵子的转录调节因子，该转录调节因子参与Pef菌毛的生物合成。这些菌毛参与生物膜形成、与鼠小肠的粘附以及婴儿小鼠内的流体积累。SrgA氧化PefA的二硫键，Pef菌毛的主要结构亚基。srgD编码推定的转录调节因子；SrgD与PefI一起工作诱导鞭毛基因表达的协同负调节。srgB编码推定的外膜蛋白，srgC编码推定的转录调节因子(Manon et al.(2012),Salmonella,Chapter 17,eds.Annousand Gurtler,Rijeka,pp.339-364)。
Rck是由肠炎沙门菌(S.Enteritidis)和鼠伤寒沙门菌的大毒力质粒编码的l7kDa外膜蛋白，其诱导与上皮细胞的粘附和上皮细胞的侵袭，并通过防止膜攻击复合物的形成，赋予对补体中和的高水平的抗性。与野生型菌株相比，rck突变体表现出在上皮细胞侵袭中降低2-3倍，而Rck过表达导致侵袭增加。Rck通过受体介导的过程诱导细胞进入，促进局部肌动蛋白重塑以及薄弱且紧密粘附的膜扩展。因此，沙门菌属可以通过两种不同的机制进入细胞：由T3SS-1复合物介导的触发机制和由Rck诱导的拉链机制(Manon et al.(2012),Salmonella,Chapter 17,eds.Annous and Gurtler,Rijeka,pp.339-364)。
侵袭素PagN是一种外膜蛋白，其也已显示出它在沙门菌属侵袭中起作用。pagN表达受phoP调控。通过PhoQ感测特定刺激，例如酸化的巨噬细胞吞噬体环境或低Mg2+浓度，然后活化PhoP以调节特定基因。已经显示，鼠伤寒沙门菌中pagN的缺失导致肠细胞侵袭减少3倍，而不改变细胞粘附。尽管还没有完全了解PagN介导的进入机制，但已经表明肌动蛋白聚合是侵袭所必需的。研究表明，PagN是BALB/c小鼠中沙门菌属存活所必需的，并且pagN突变体相比于亲本菌株对于定植于小鼠的脾脏不太有竞争性。因为pagN被PhoP活化，所以它主要在细胞内表达，其中编码T3SS-1的SPI-1岛被下调。因此，可能的是，离开上皮细胞或巨噬细胞的细菌具有最佳的PagN表达水平，但具有较低的T3SS-1表达，这可以介导与宿主细胞破坏后遇到的其他细胞的后续相互作用，表明PagN在沙门菌属发病机理中的作用(Manonet al.(2012),Salmonella,Chapter 17,eds.Annous and Gurtler,Rijeka,pp.339-364)。
hlyE与大肠杆菌HlyE(ClyA)溶血素共享超过90％的序列相同性。当通过外膜泡囊释放从细菌细胞输出时，HlyE蛋白裂解上皮细胞，并参与上皮细胞侵袭。HlyE也参与全身性沙门菌属感染的建立(Manon et al.(2012),Salmonella,Chapter 17,eds.Annous andGurtler,Rijeka,pp.339-364)。
消除感染上皮细胞的能力也可以通过将本文的免疫刺激性细菌工程化为包含敲除或缺失编码参与SPI-1非依赖性侵袭的蛋白质的基因(例如基因rck、pagN、hlyE、pefI、srgD、srgA、srgB和srgC中的一种或多种)。
如本文所述，提供了免疫刺激性细菌，该免疫刺激性细菌被修饰为使得它们不感染上皮细胞，但保留了感染吞噬细胞(包括肿瘤-驻留免疫细胞)的能力，从而将免疫刺激性细菌有效地靶向肿瘤微环境。这是通过缺失或敲除SPI-1中的任何蛋白质来实现的，包括但不限于以下一种或多种的缺失：avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaP、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB和sptP，以及rck、pagN、hlyE、pefI、srgD、srgA、srgB、rck和srgC。
可以如本文所述进一步修饰不感染上皮细胞的免疫刺激性细菌，以编码刺激免疫系统的产物，包括例如细胞因子。细菌通常具有asd缺失，以使它们无法在哺乳动物宿主中复制。
例如，提供了鼠伤寒沙门菌的菌株，该菌株通过缺失一个或多个SPI-1基因被修饰，并且还通过purI缺失、msbB缺失和asd缺失中的一种或多种被修饰，并且通过递送编码刺激免疫系统的蛋白质(诸如编码免疫刺激性细胞因子的基因)的质粒被修饰。例如，提供了具有表达SPI-1相关的3型分泌系统(T3SS-1)、T3SS-1结构基因(例如invG或prgH)和/或T3SS-1效应基因(例如sipA或avrA)所需的调节基因(例如hilA或invF)缺失的细菌。如上所述，该分泌系统负责将效应蛋白注入非吞噬性宿主细胞(诸如上皮细胞)的胞质溶胶中，其引起细菌摄取；这些基因中的一个或多个的缺失消除了上皮细胞的感染/侵袭。缺失一种或多种基因(诸如hilA-)提供免疫刺激性细菌，该免疫刺激性细菌可以通过静脉内或肿瘤内施用，从而导致吞噬细胞的感染，这不需要SPI-1T3SS用于摄取，并且还延长这些吞噬细胞的寿命。hilA突变还减少了促炎细胞因子的数量，从而提高了治疗的耐受性以及获得性免疫应答的质量。
沙门菌属还具有编码另一T3SS的沙门菌属致病岛2(SPI-2)，其在细菌进入宿主细胞后被活化，并干扰吞噬体成熟，从而导致形成专门的含沙门菌属的囊泡(SCV)，沙门菌属在细胞内存活和复制期间驻留在该专门的含沙门菌属的囊泡。SPI-2T3SS效应物包括SseB、SseC、SseD和SpiC，它们负责在细胞内细菌周围装配F-肌动蛋白外衣；这种肌动蛋白外衣促进SCV与含肌动蛋白的囊泡或肌动蛋白驱动的囊泡融合，并防止其与不利的区室融合。SifA负责沙门菌属诱导的细丝(SIF)的形成，该细丝是连接感染细胞中各个SCV的小管。sifA对维持SCV的完整性至关重要，并且sifA突变体被释放到宿主细胞的胞质溶胶中。SseF和SseG是SPI-2T3SS的成分，它们参与SCV定位和细胞运输过程，这些过程将细菌存活和复制所需的材料引导至SCV。SseF和SseG也参与SIF形成。其他SPI-2T3SS效应物包括：PipB2、SopD2和SseJ，它们参与SIF和SCV的形成以及囊泡完整性的维持；SpvC、SseL和SspH1，它们参与宿主免疫信号传导；和SteC、SspH2、SrfH/Sse1和SpvB，它们参与SCV F-肌动蛋白网状组织的形成、受感染吞噬细胞的迁移、肌动蛋白聚合的抑制以及受感染细胞中P体的分解(Cobum etal.(2007)Clinical Microbiology Reviews 20(4):535-549；Figueira and Holden(2012)Microbiology 158:1147-1161)。
本文的免疫刺激性细菌可包括SPI-2T3SS基因中任何的缺失或修饰，该SPI-2T3SS影响SCV及其相关结构(诸如SIF)的形成或完整性。这些突变体具有增加的SCV逃逸频率，并且可以在胞质溶胶中复制。例如，因为SCV的脂质双层是潜在的屏障，被工程化为逃逸SCV的免疫刺激性细菌(诸如沙门菌属物种)在递送大分子(诸如质粒)方面更有效。这是通过缺失或突变沙门菌属诱导的细丝(SIF)形成所需的基因(包括sifA、sseJ、sseL、sopD2、pipB2、sseF、sseG、spvB和steA)来实现的。
可以如这里所述进一步修饰可以逃逸SCV的免疫刺激性细菌，以编码刺激免疫系统的产物，包括例如细胞因子。细菌通常具有asd缺失，以使它们无法在哺乳动物宿主中复制。
h.增加质粒递送的核酸内切酶(endA)突变
endA基因(例如SEQ ID NO:250)编码核酸内切酶(例如SEQ ID NO:25l)，该核酸内切酶介导双链DNA在革兰氏阴性细菌的周质中的降解。实验室大肠杆菌的最常见菌株是endA-，因为endA基因的突变允许质粒DNA的更高产量。该基因在物种之间是保守的。为了促进完整质粒DNA的递送，工程免疫刺激性细菌的endA基因被缺失或突变以防止其核酸内切酶活性。此类突变的示例是E208K氨基酸取代(Durfee,et al.(2008)J Bacteriol.190(7):2597-2606)或感兴趣的物种中的相应突变。endA(包括E208)在包括沙门菌属在内的细菌物种中是保守的。因此，E208K突变可用于消除包括沙门菌属物种在内的其他物种中的核酸内切酶活性。本领域技术人员可以引入其他突变或缺失以消除endA活性。在本文的免疫刺激性细菌(诸如沙门菌属)中，进行此突变或缺失或破坏基因以消除endA的活性，提高完整质粒DNA递送的效率，从而提高在质粒中编码的靶向任何或两个或多个免疫检查点的RNA(诸如shRNA和/或miRNA)的表达，从而增加RNAi介导的检查点基因的敲低并增强抗肿瘤功效。
i.RIG-I抑制
在TLR非依赖性I型IFN途径中，一种途径是由胞质溶胶中的单链(ss)和双链(ds)RNA的宿主识别而介导的。这些由RNA解旋酶(包括视黄酸诱导基因I(RIG-I)、黑素瘤分化相关基因5(MDA-5))而感测到，并且通过IFN-β启动子刺激物1(IPS-l)衔接蛋白介导的IRF-3转录因子的磷酸化，从而导致I型IFN的诱导(Ireton and Gale(2011)Viruses 3(6):906-9l9)。RIG-I识别带有5′-三磷酸的dsRNA和ssRNA。该部分可以直接结合RIG-I，或通过聚DNA依赖性RNA聚合酶III(Pol III)从聚(dA-dT)模板合成(Chiu,Y.H.et al.(2009)Cell 138(3):576-91)。包含两个AA二核苷酸序列的聚(dA-dT)模板出现在通用慢病毒shRNA克隆载体的U6启动子转录起始位点处。其随后在质粒中的缺失阻止了I型IFN的活化(Pebernardet al.(2004)Differentiation.72:103-111)。RIG-I结合序列可包含在本文提供的质粒中；包括可增加免疫刺激，该免疫刺激增加本文的免疫刺激性细菌的抗肿瘤活性。
j.DNase II抑制
负责降解外来和自身DNA的另一种核酸酶是DNase II，一种驻留在胞内体区室中，并在凋亡后降解DNA的核酸内切酶。缺乏DNase II(在小鼠中为Dnase2a)导致胞内体DNA的积累，该DNA逃逸到胞质溶胶并活化cGAS/STING信号传导(Lan YY et al.(2014)CellRep.9(1):180-192)。与TREX1相似，人类中DNase II缺乏表现为自身免疫性I型干扰素疾病。在癌症中，被肿瘤驻留巨噬细胞吞噬的垂死肿瘤细胞通过DNase II消化胞内体区室中的DNA来阻止cGAS/STING活化和潜在的自身免疫性(Ahn et al.(2018)Cancer Cell 33:862-873)。因此，如本文提供的免疫刺激性细菌菌株的实施方案编码抑制、阻抑或破坏DNase II的表达的RNAi(诸如shRNA或miRNA)，其可在肿瘤微环境中抑制DNase II，从而引起内吞的凋亡性肿瘤DNA在胞质溶胶中的积累，在该胞质溶胶中其可以作为有效的cGAS/STING激动剂。
k.RNase H2抑制
尽管TREX1和DNase II用来清除异常的DNA积累，但RNase H2类似地用来消除胞质溶胶中RNA:DNA杂交体的致病性积累。与TREX1相似，RNase H2的缺乏也有助于Aicardi-Goutières综合征的自身免疫表型(Rabe,B.(2013)J Mol Med.91:1235-1240)。具体而言，已证明RNase H2的丢失和随后RNA:DNA杂交体或基因组嵌入的核糖核苷酸底物的积累活化cGAS/STING信号传导(MacKenzie et al.(2016)EMBO J.Apr15；35(8):83l-44)。因此，如本文提供的免疫刺激性细菌菌株的实施方案编码抑制、阻抑或破坏RNAse H2的表达的RNAi(诸如shRNA或miRNA)，从而抑制RNase H2，从而导致肿瘤衍生的RNA:DNA杂交体及其衍生物(其活化cGAS/STING信号传导和抗肿瘤免疫)。
l.Stabilin-l/CLEVER-1抑制
主要在单核细胞上表达并参与调节免疫的另一种分子是stabilin-1(基因名称STAB1，也称为CLEVER-1、FEEL-1)。Stabilin-l是一种I型跨膜蛋白，其在炎症后在内皮细胞和巨噬细胞上(特别在肿瘤相关的巨噬细胞上)被上调(Kzhyshkowska et al.(2006)J.Cell.Mol.Med.10(3):635-649)。炎症活化后，stabilin-l充当清除剂并帮助伤口愈合和凋亡小体清除，并可以防止组织损伤，诸如肝纤维化(Rantakari et al.(2016)PNAS 113(33):9298-9303)。stabilin-l的上调直接抑制了抗原特异性T细胞应答，并且单核细胞中被siRNA敲低显示出增强其促炎功能(Palani,S.et al.(2016)J Immunol.196:115-123)。因此，如本文提供的免疫刺激性细菌菌株的实施方案编码抑制、阻抑或破坏Stabilin-l/CLEVER-l在肿瘤微环境中的表达的RNAi(诸如shRNA或miRNA)，从而增强肿瘤驻留巨噬细胞的促炎功能。
5.免疫刺激性蛋白
可以修饰本文的免疫刺激性细菌以编码促进或诱导或增强抗肿瘤应答的免疫刺激性蛋白。可以在真核启动子(诸如被RNA聚合酶II识别的启动子)的控制下，在细菌中的质粒上编码免疫刺激性蛋白，以在真核对象中表达，特别是在要施用免疫刺激性细菌的对象(诸如人)中表达。除真核启动子外，编码免疫刺激性蛋白的核酸还可包括其他用于在细胞中表达或运输(例如用于在细胞表面上分泌或表达)的调节信号。
免疫刺激性蛋白是在适当的环境(例如肿瘤微环境(TME))中可以促进或参与或增强施用免疫刺激性细菌的对象的抗肿瘤应答的那些。免疫刺激性蛋白包括但不限于细胞因子、趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，诸如但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18；趋化因子，诸如但不限于CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11；和/或共刺激分子，诸如但不限于CD40、CD40L、OX40、OX40L、4-1BB、4-1BBL、TNF/TNFR超家族成员和B7-CD28家族成员。本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可以促进、增强或以其他方式增加或引起抗肿瘤应答的其他此类免疫刺激性蛋白预期用于在本文提供的免疫刺激性细菌中编码。
还可以修饰本文提供的免疫刺激性细菌的基因组以增加或促进免疫细胞，特别是肿瘤微环境中的免疫细胞，诸如吞噬细胞的感染。还可以修饰所述细菌以减少免疫细胞中的细胞焦亡。免疫刺激性细菌包括，例如，具有破坏/抑制SPI-1途径的修饰的那些，诸如破坏或缺失hilA，和/或破坏或缺失鞭毛蛋白基因、杆状蛋白、针状蛋白和/或如本文其他地方详述和例示的pagP。
编码细胞因子和趋化因子的免疫刺激性细菌
在一些实施方案中，本文的免疫刺激性细菌被工程化为表达细胞因子以刺激免疫系统，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12(IL-12p70(IL12p40+IL-12p35))、IL-15(和IL-15:IL-15Rα链复合物)和IL-18。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，可以将免疫刺激性细菌工程化为表达趋化因子，例如CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11。
IL-2
白介素2(IL-2)，第一种被批准用于治疗癌症的细胞因子，与通过几种机制活化免疫系统有关，包括活化和促进CTL生长、产生淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞、促进Treg细胞生长和增殖、刺激TIL以及促进T细胞、B细胞和NK细胞增殖和分化。重组IL-2(rIL-2)已获得FDA批准用于治疗转移性肾细胞癌(RCC)和转移性黑素瘤(Sheikhi et al.(2016)IranJ.Immunol.13(3):148-166)。
IL-7
IL-7是IL-2超家族的成员，与T细胞的存活、增殖和自我平衡有关。已显示IL-7受体的突变会导致T细胞的丢失，以及严重的组合免疫缺陷症(SCID)的发展，突显了IL-7在T细胞发育中的关键作用。IL-7是一种自我平衡细胞因子，其向静止的初始T细胞和记忆T细胞提供连续信号，并且其在淋巴球减少症的状况期间积累，从而导致T细胞增殖和T细胞储备多样性的增加。与IL-2相比，IL-7在CD4+FOXP3+调节性T细胞上对扩增CD8+T细胞具有选择性。在小鼠中进行疫苗接种和获得性细胞疗法后，重组IL-7已显示出增强抗原特异性T细胞应答。IL-7在造血干细胞移植化疗后也起到促进T细胞恢复的作用。对患有晚期恶性肿瘤的患者的早期临床试验表明，重组IL-7耐受良好，并且在生物活性剂量下(即，其中循环CD4+和CD8+T细胞数量增加3-4倍)具有有限的毒性(Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers3:3856-3893)。IL-7显示出在肿瘤诸如神经胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、前列腺癌和胶质母细胞瘤中具有抗肿瘤作用，并且在鼠模型中体内施用IL-7导致癌细胞生长减少。IL-7还显示出在大鼠神经胶质瘤肿瘤中增强IFN-γ的抗肿瘤作用，并诱导单核细胞产生IL-1α、IL-1β和TNF-α，这导致黑素瘤生长的抑制。另外，在治疗小儿肉瘤后施用重组IL-7导致促进免疫恢复(Lin et al.(2017)Anticancer Research 37:963-968)。
IL-12(IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)
促进细胞介导的免疫的生物活性IL-12(IL-12p70)是由p35和p40亚基组成的异二聚体，而IL-12p40单体和同型二聚体充当IL-12拮抗剂。抗原呈递细胞分泌的IL-12促进从NK和T细胞分泌IFN-γ，抑制肿瘤血管生成，导致NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化和增殖，增强CD4+Th0细胞分化为Th1细胞，并促进针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。IL-12显示出在黑素瘤、结肠癌、乳腺癌和肉瘤的鼠模型中表现出抗肿瘤作用(Kalinski et al.(2001)Blood 97:3466-3469；Sheikhi et al.(2016)IranJ.Immunol.13(3):148-166；Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
IL-15和IL-15:IL-15Rα
IL-15在结构上与IL-2类似，并且虽然IL-2和IL-15都为T细胞的增殖和活化提供了早期刺激，但IL-15阻断了IL-2诱导的细胞凋亡，这是导致消除所刺激的T细胞和诱导T细胞耐受性的一个过程，从而限制记忆T细胞应答，并可能单独限制IL-2的治疗功效。IL-15还支持记忆性CD8+T细胞的持久性用于维持长期抗肿瘤免疫，并已通过以抗原非依赖性方式直接活化CD8+效应T细胞在临床前鼠模型中显示出显著的抗肿瘤活性。除CD8+T细胞外，IL-15还负责效应自然杀伤(NK)细胞的发育、增殖和活化(Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893；Han et al.(2011)Cytokine56(3):804-810)。
IL-15和IL-15受体α(IL-15Rα)由抗原呈递细胞(诸如单核细胞和树突细胞)协调表达，并且IL-15由IL-15Rα反式呈递至CD8+T细胞和NK细胞的表面上表达的IL-15Rβγc受体复合物。可溶性IL-15:IL15Rα复合物已经显示出通过IL-15Rβγc复合物调节免疫应答，并且已经显示出通过将其施用于IL-15和可溶性IL-15Rα的预先形成复合物中而IL-15的生物活性增加了50倍，其与单独的IL-15相比，具有增加的半衰期。在鼠肿瘤模型中已经证明通过与IL-15Rα预先缔合，IL-15的治疗功效显著提高(Han et al.(2011)Cytokine 56(3):804-8l0)。
IL-18
IL-18诱导NK和CD8+T细胞分泌IFN-γ，从而增强其毒性。IL-18还活化巨噬细胞并刺激Th1辅助CD4+T细胞的发育。IL-18在几种临床前小鼠模型中显示出有希望的抗肿瘤活性。例如，重组IL-18(rIL-18)的施用通过活化CD4+T细胞和/或NK细胞介导的反应，导致同系小鼠的黑素瘤或肉瘤消退。其他研究表明，IL-18的抗肿瘤作用是由IFN-γ介导的，并且涉及抗血管生成机制。IL-18与其他细胞因子(诸如IL-12)或与共刺激分子(诸如CD80)的组合增强IL-18介导的抗肿瘤作用。在患有晚期实体瘤和淋巴瘤的患者中进行的I期临床试验表明，IL-18施用是安全的，并且其导致免疫调节活性，和患者血清IFN-γ和GM-CSF水平的升高以及适度的临床反应。临床试验表明，IL-18可与其他抗癌治疗剂组合使用，诸如单克隆抗体、细胞毒性药物或疫苗(Fabbi et al.(2015)J.Leukoc.Biol.97:665-675；Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
发现被工程化以表达IL-18的鼠伤寒沙门菌的减毒菌株抑制了同系小鼠中的s.c.肿瘤或肺转移的生长，而在全身施用后无任何毒性作用。用这种工程细菌进行治疗诱导T细胞、NK细胞和粒细胞在肿瘤中积累，并导致细胞因子的肿瘤内产生(Fabbi et al.(2015)J.Leukoc.Biol.97:665-675)。
趋化因子
趋化因子是一类小细胞因子，其介导白细胞迁移至损伤或炎症区域，并参与介导免疫和炎症反应。趋化因子根据其序列中半胱氨酸残基的位置分为四个亚科，即XC-、CC-、CXC-和CX3C-趋化因子配体，或XCL、CCL、CXCL和CX3CL。趋化因子配体与其同源受体结合并调节免疫细胞的循环、归巢和保留，其中每个趋化因子配体-受体对选择性调节特定类型的免疫细胞。不同的趋化因子吸引不同的白细胞群，并在体内形成浓度梯度，其中吸引的免疫细胞通过该梯度朝着较高的趋化因子浓度移动(Argyle D.and Kitamura,T.(2018)Front.Immunol.9:2629；Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335)。趋化因子可通过增加免疫细胞向肿瘤的浸润并促进抗原呈递细胞(APC)向肿瘤引流淋巴结的移动来改善抗肿瘤免疫应答，这启动初始T细胞和B细胞(Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340)。可将本文的免疫刺激性细菌工程化为编码趋化因子，包括但不限于CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11。
CCL3、CCL4、CCL5
CCL3、CCL4和CCL5具有高度的同源性，并且在人和小鼠中的几种细胞类型(包括未成熟的DC和T细胞)上与CCR5(CCL3、CCL4和CCL5)和CCR1(CCL3和CCL5)结合。治疗性T细胞已经显示出通过CCL3、CCL4和CCL5的肿瘤特异性分泌诱导先天性免疫细胞对肿瘤部位的趋化性(Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335)。
诱导1型T辅助细胞(Th1)应答释放CCL3。小鼠的体内和体外研究表明，CCL3对中性粒细胞和单核细胞均具有趋化作用；具体而言，CCL3可介导髓样前体细胞(MPC)从骨髓动员，并具有MPC调节和刺激作用。用CCL3转染的人卵巢癌细胞在肿瘤内显示出增强的T细胞浸润和巨噬细胞，从而导致改善的抗肿瘤应答，并表明CCL3介导的中性粒细胞趋化性抑制了肿瘤生长。通过CCL3募集的用肿瘤抗原人黑素瘤相关基因(MAGE)-1转染的DC在小鼠黑素瘤模型中表现出优异的抗肿瘤作用，包括增加的淋巴细胞增殖、细胞溶解能力、存活和降低的肿瘤生长。CCL3与针对MAGE-1的抗原特异性平台的组合使用也已用于治疗胃癌。CT26(一种高度免疫原性鼠结肠肿瘤)的CCL3产生减慢了体内肿瘤的生长；表明该过程是由自然杀伤(NK)细胞的CCL3依赖性积累以及因此IFNγ驱动的，从而导致CXCL9和CXLC10的产生(Allen et al.(2017)Oncoimmunology 7(3):e1393598；Schaller et al.(2017)ExpertRev.Clin.Immunol.13(11):1049-1060)。
CCL3已被用作治疗癌症的佐药。在小鼠肝细胞癌中进行射频消融后，施用CCL3活性变体ECI301增加了肿瘤特异性应答，并且进一步证明该机制依赖于CCR1的表达。CCL3还显示出在全身性癌症中作为佐药的成功，因此在白血病/淋巴瘤模型中疫苗接种CCL3和IL-2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的小鼠表现出提高的存活(Schaller et al.(2017)Expert Rev.Clin.Immunol.13(11):1049-1060)。
CCL3和CCL4在引导CD8+T细胞浸润原发肿瘤部位如黑素瘤和结肠癌中发挥作用。CCL4的肿瘤产生导致CD103+DC的积累；通过WNT/β-连环蛋白依赖性途径抑制CCL4阻止了黑素瘤肿瘤的CD103+DC浸润(Spranger et al.(2015)Nature 523(7559):231-235)。在结肠癌的小鼠模型中，CCL3还被证明增强CD4+和CD8+T细胞对原发肿瘤部位的浸润(Allen etal.(2017)Oncoimmunology 7(3):e1393598)。
CCL3或CCL5与其受体(分别为CCR1和CCR5)的结合将未成熟的DC、单核细胞以及记忆和T效应细胞从循环转移到炎症或感染部位。例如，CCL5在大肠肿瘤中的表达有助于T淋巴细胞的化学引诱和存活。CCL3和CCL5已被单独使用或以组合疗法在几种临床前模型中诱导肿瘤消退和免疫。例如，研究表明，皮下注射经遗传修饰以表达CCL3的中国仓鼠卵巢细胞导致肿瘤抑制和中性粒细胞浸润。在另一项研究中，重组溶瘤腺病毒表达CCL5(Ad-RANTES-E1A)在乳癌鼠模型中导致原发性肿瘤消退并阻滞了转移(Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340)。
在结肠直肠癌的转化研究中，CCL5诱导了巨噬细胞中的“抗病毒反应模式”。由于结肠直肠癌中肝转移的侵袭边缘处的CXCR3介导的淋巴细胞的迁移，产生了CCL5。阻滞CCR5(CCL5受体)导致肿瘤死亡，这是由产生IFN和活性氧的巨噬细胞驱动的。当巨噬细胞存在于肿瘤微环境中时，CCR5抑制诱导从M2到Ml表型的表型转变。CCR5阻滞也导致结肠直肠癌患者的临床应答(Halama et al.(2016)Cancer Cell 29(4):587-601)。
CCL3、CCL4和CCL5可用于治疗以下状况，包括淋巴肿瘤、膀胱癌、结肠直肠癌、肺癌、黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或肝癌(美国专利公开号US 2015/0232880；国际专利公开号WO 2015/059303、WO 2017/043815、WO 2017/156349和WO 2018/191654)。
CXCL9、CXCL10、CXCL11
通过产生IFN-γ诱导CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)和CXCL11(ITAC)。这些趋化因子结合CXCR3(优先在活化的T细胞上表达)，并在血管生成(angiostatically)以及白细胞的募集和活化中起作用。结肠直肠癌的预后与肿瘤浸润性T细胞特别是Th1和CD8+效应T细胞密切相关；CXCL9、CXCL10和CXCL11在肿瘤内高表达表明预后良好。例如，在163名结肠癌患者的样本中，具有高水平CXCL9或CXCL11的那些患者显示增加的术后生存，而具有高CXC表达的患者具有显著较高数量的CD3+T细胞、CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。在结肠直肠癌患者的肝转移中，CXCL9和CXCL10水平在侵袭边缘处增加，并与效应T细胞密度相关。通过CXCL9和CXCL10对CXCR3的作用来刺激淋巴细胞迁移，导致在侵袭边缘处产生CCL5(Halama et al.(2016)Cancer Cell 29(4):587-601；Kistner el al.(2017)Oncotarget8(52):89998-90012)。
在体内，CXCL9用作肿瘤浸润性淋巴细胞、活化的外周血淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞和Th1淋巴细胞的化学引诱物。CXCL9对T细胞介导的皮肤肿瘤的抑制也至关重要。例如，当与全身性IL-2组合时，CXCL9显示出通过增加的CXCR3+单核细胞的肿瘤内浸润来抑制肿瘤生长。在鼠结肠癌模型中，huKS1/4-IL-2融合蛋白与CXCL9基因疗法的组合通过CD8+和CD4+T淋巴细胞的化学引诱和活化实现了优异的抗肿瘤作用并延长了寿命(Dubinett etal.(2010)Cancer J.16(4):325-335；Ruelmann et al.(2001)Cancer Res.61(23):8498-8503)。
由活化的单核细胞、纤维细胞、内皮细胞和角化细胞产生的CXCL10对活化的T细胞有趋化性，并且可以在体内充当血管生成的抑制剂。已经证明CXCL10在结肠直肠肿瘤中的表达有助于细胞毒性T淋巴细胞的化学引诱和更长的生存。免疫刺激性细胞因子(诸如IL-12)的施用已显示出增强CXCL10产生的抗肿瘤作用。用肿瘤细胞裂解物启动并用CXCL10转染的DC疫苗在小鼠中具有增强的免疫保护作用和有效性；动物显示出对肿瘤攻击的抵抗力、肿瘤生长的减慢和更长的生存时间。与未用CXCL1O-粘蛋白-GPI融合蛋白治疗的肿瘤相比，使用CXCL1O-粘蛋白-GPI融合蛋白在小鼠中进行的体内和体外研究导致肿瘤具有更高水平的募集的NK细胞。干扰素(其可以由浆细胞样树突细胞产生；这些细胞与原发性黑素瘤病变相关，并且可以通过CCL20募集到肿瘤部位)可以作用于肿瘤DC亚群，例如CD103+DC，其已被证明小鼠黑素瘤模型中产生CXCL9/10，并与与人类疾病中的CXCL9/10相关。CXCL10也显示出相对于原发性黑素瘤样品，在人转移性黑素瘤样品中更高的表达。在治疗上，辅助性IFN-α黑素瘤疗法上调CXCL10产生，而化疗物质顺铂诱导CXCL9和CXCL10(Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335；Kuo et al.(2018)Front.Med.(Lausanne)5:271；Li etal.(2007)Scand.J.Immunol.65(1):8-13；Muenchmeier et al.(2013)PLoS One 8(8):e72749)。
已在衍生自基底细胞癌(BCC)的人角化细胞中建立了CXCL10/11和CXCR3表达。CXCL11还能够促进在人基底细胞癌中的免疫抑制性吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)表达，以及增强角化细胞增殖，这可以降低任何浸润性CXCR3+效应T细胞的抗肿瘤活性(Kuo et al.(2018)Front.Med.(Lausanne)5:271)。
可以在溶瘤病毒中编码CXCL9、CXCL10和CXCL11以治疗癌症(美国专利公开号US2015/0232880；国际专利公开号WO 2015/059303)。假型溶瘤病毒或编码CXCL10基因的遗传工程化细菌也可以用于治疗癌症(国际专利公开号WO 2018/006005和WO 2018/129404)。
共刺激分子
共刺激分子增强对肿瘤细胞的免疫应答，并且共刺激途径被肿瘤细胞抑制以促进肿瘤发生。本文的免疫刺激性细菌可以被工程化以表达共刺激分子，例如CD40、CD40L、4-1BB、4-1BBL、OX40(CD134)、OX40L(CD252)、TNFR超家族的其他成员(例如CD27、GITR、CD30、Fas受体、TRAIL-R、TNF-R、HVEM、RANK)、B7和CD28。本文的免疫刺激性细菌也可以被工程化为表达针对共刺激分子的激动性抗体以增强抗肿瘤免疫应答。
TNF受体超家族
TNF超家族配体(TNFSF)及其受体(TNFRSF)参与肿瘤和免疫效应细胞的增殖、分化、活化和存活。该家族的成员包括诱导凋亡的CD30、Fas-L、TRAIL-R和TNF-R，以及调节B和T细胞免疫应答的CD27、OX40L、CD40L、GITR-L和4-1BBL。其他成员包括疱疹病毒进入介质(HVEM)和CD27。本文的免疫刺激性细菌的TNFSF和TNFRSF的表达可以增强抗肿瘤免疫应答。例如，已经显示出4-1BBL在鼠肿瘤中的表达增强了免疫原性，并且瘤内注射具有增加的OX40L表达的树突细胞(DC)可以导致鼠模型中的肿瘤排斥。研究还表明，向B16黑素瘤细胞注射表达重组GITR的腺病毒促进T细胞浸润并减少肿瘤体积。免疫刺激性细菌还可以编码针对分子诸如4-1BB、OX40和GITR的刺激性抗体，以刺激免疫系统。例如，激动性抗4-1BB单克隆抗体已经显示出增强抗肿瘤CTL应答，并且激动性抗OX40抗体已经显示出增加可移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性。此外，激动性抗GITR抗体已经显示出增强抗肿瘤应答和免疫(Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；Peggs et al.(2009)Clinicaland Experimental Immunology 157:9-19)。
CD40和CD40L
CD40是TNF受体超家族的成员，由APC和B细胞表达，而其配体CD40L(CD154)由活化的T细胞表达。CD40和CD40L之间的相互作用刺激B细胞产生细胞因子，从而导致T细胞活化和肿瘤细胞死亡。研究表明，由于T细胞上的CD40L或树突细胞上CD40的表达减少，抗肿瘤免疫应答受损。CD40在几种B细胞肿瘤的表面上表达，诸如滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、淋巴母细胞性白血病(lymphoblasticleukemia)和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)，并且其与CD40L的相互作用已显示出增加CD40+肿瘤细胞中的B7.1/CD80、B7.2/CD86和II类HLA分子的表达，以及增强其抗原呈递能力。CD40L在多发性骨髓瘤(multiple myeloma)小鼠模型中的转基因表达导致CD4+和CD8+T细胞的诱导、局部和全身性抗肿瘤免疫应答以及减少的肿瘤生长。抗CD40激动性抗体也诱导抗肿瘤T细胞应答(Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11:39；Dotti et al.(2002)Blood 100(1):200-207；Murugaiyanet al.(2007)J.Immunol.178:2047-2055)。
4-1BB和4-1BBL
4-1BB(CD137)是一种可诱导共刺激受体，其由T细胞、NK细胞和APC(包括DC、B细胞和单核细胞)表达，并结合其配体4-1BBL以触发免疫细胞增殖和活化。4-1BB导致活化的T细胞的更长和更广泛的传播应答。抗4-1BB激动剂和4-1BBL融合蛋白已显示出增加由CD4+和CD+T细胞介导的例如针对肉瘤和肥大细胞瘤(mastocytoma)肿瘤的免疫介导的抗肿瘤活性，以及肿瘤特异性CTL活性(Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11:39)。
OX40和OX40L
OX40(CD134)是在活化的效应T细胞上表达的TNF受体超家族的成员，而其配体OX40L在APC(包括DC、B细胞和巨噬细胞)上表达，随后通过TLR激动剂和CD40-CD40L信号传导进行活化。OX40-OX40L信号传导导致T细胞的活化、增强、增殖和存活，以及NK细胞功能的调节和Treg抑制性活性的抑制。通过OX40的信号传导还导致细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ)的分泌，从而增强了Th1和Th2细胞应答。TIL对肿瘤抗原的识别导致TIL对OX40的增加表达，这与改善的预后相关。研究表明，在黑素瘤、肉瘤、结肠癌和乳腺癌的鼠模型中，用抗OX40激动剂抗体或Fc-OX40L融合蛋白进行的治疗导致增强的肿瘤特异性CD4+T细胞应答和提高的存活，而掺入肿瘤细胞疫苗的Fc-OX40L保护小鼠免于随后的乳腺癌细胞的攻击(Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11:39)。
B7-CD28家族
CD28是在T细胞表面表达的一种共刺激分子，其充当B7-1(CD80)和B7-2(CD86)(它们是在抗原呈递细胞上表达的共刺激分子)的受体。CD28-B7信号传导是T细胞活化和存活以及防止T细胞无反应性所必需的，并导致白介素(诸如IL-6)的产生。
最佳的T细胞启动需要两个信号：(1)MHC呈递抗原的T细胞受体(TCR)识别和(2)由T细胞CD28与在APC上表达的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)连接产生的共刺激信号。在T细胞活化后，诱导CTLA-4受体，其然后胜出CD28与B7-1和B7-2配体的结合。由于其缺乏表达共刺激分子诸如B7-1/CD80和B7-2/CD86，因此肿瘤细胞的抗原呈递是差的，从而导致无法活化T细胞受体复合物。结果，肿瘤细胞表面上这些分子的上调可以增强其免疫原性。B7已成功地诱导了实体瘤和恶性血液肿瘤的免疫疗法，例如，通过B7的肿瘤细胞表达或可溶性B7-免疫球蛋白融合蛋白。B7与其他共刺激性配体(诸如ICAM-3和LFA-3)组合的病毒介导的肿瘤表达已在临床前和临床试验中成功用于治疗慢性淋巴细胞白血病和转移性黑素瘤。此外，可溶性B7融合蛋白已经表明在实体瘤的免疫疗法中作为单一物质免疫疗法的有前途的结果(Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；Dotti et al.(2002)Blood100(1):200-207)。
6.增加免疫细胞对革兰氏阴性菌如沙门菌属的摄取并减少免疫细胞死亡的修饰
可以修饰本文提供的免疫刺激性细菌的基因组以增加或促进免疫细胞，特别是肿瘤微环境中的免疫细胞诸如吞噬细胞的感染。这包括减少非免疫细胞诸如上皮细胞的感染，或增加免疫细胞的感染。还可以修饰所述细菌以减少免疫细胞中的细胞焦亡。细菌基因组的许多修饰可以进行增加免疫细胞的感染和减少细胞焦亡之一或二者。本文提供的免疫刺激性细菌包括这些修饰，例如参与SPI-1T3SS途径的基因的缺失和/或破坏，诸如hilA的破坏或缺失，和/或编码鞭毛蛋白、杆状蛋白和针状蛋白的基因的破坏/缺失。
革兰氏阴性细菌(诸如沙门菌属)的侵袭性表型可能来自促进宿主细胞侵袭的途径中编码的基因的活性。沙门菌属的侵袭相关沙门菌属致病岛-1(SPI-1)是示例性的。SPI-1诱导3型分泌系统(T3SS)，该系统负责将效应蛋白易位到宿主细胞的胞质溶胶中。这些蛋白质可引起导致沙门菌属的摄取的肌动蛋白重排。T3SS效应物介导鼠伤寒沙门菌摄取到非吞噬宿主细胞(诸如上皮细胞)中。SPI-1T3SS已经显示出对于穿过肠道上皮层是必不可少的，但例如当胃肠外注射细菌时，对于感染是非必要的。SPI-1突变体在上皮细胞侵袭中具有缺陷，从而显著降低口服毒力，但通常被吞噬细胞，诸如巨噬细胞摄取(Kong et al.(2012)Proc.Natl.Acad.ScU.S.A.109(47):19414-19419)。可以用SPI-1T3SS基因的突变对本文提供的免疫刺激性鼠伤寒菌株进行工程化，防止其被上皮细胞摄取，并使它们集中于免疫细胞诸如巨噬细胞，从而增强抗肿瘤免疫应答。
T3SS效应物还活化巨噬细胞中的NLRC4炎性小体，从而活化胱天蛋白酶-l，并通过细胞焦亡导致细胞死亡。细胞焦亡是程序性细胞的高度炎性形式，其在细胞内病原体感染后最常发生，并在抗菌应答中起作用。这种促炎性细胞死亡可通过直接诱导抗原呈递细胞(APC)死亡以及修饰细胞因子环境来阻止记忆性T细胞生成来限制强大的获得性免疫应答的启动。SPI-1通过注射鞭毛蛋白、针状蛋白和杆状蛋白(PrgI/J)来诱导细胞焦亡，而细胞外鞭毛蛋白刺激TLR5信号传导。因此，使本文的免疫刺激性细菌工程化以包含参与细胞焦亡的基因的突变可以通过减少免疫细胞诸如巨噬细胞中的细胞死亡来增强抗肿瘤免疫作用。
巨噬细胞焦亡
在先天免疫和抗微生物应答中起作用的巨噬细胞NLRC4炎性小体，是一种大型的多蛋白复合物，其识别胞质病原体并提供胱天蛋白酶-1的自催化活化。胱天蛋白酶-l的活化诱导促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和释放，并触发细胞焦亡，一种巨噬细胞死亡的快速炎性形式。在由Stm致病岛1III型分泌系统(SPI-1T3SS)易位到宿主细胞胞质溶胶后，某些编码3或4型分泌系统的革兰氏阴性细菌(诸如鼠伤寒沙门菌和铜绿假单胞菌)的感染在识别细菌配体(诸如针状蛋白、杆状蛋白和鞭毛蛋白)后，触发NLRC4炎性小体的活化。细胞焦亡不局限于巨噬细胞；在用沙门菌属感染后，在树突细胞中观察到胱天蛋白酶-1依赖性死亡(Li et al.(2016)Scientific Reports 6:37447；Chen et al.(2014)CellReports 8:570-582；(Fink and Cookson(2007)Cellular Microbiology 9(11):2562-2570))。如本文中所示，沙门菌属基因组中参与诱导细胞焦亡的基因的敲除增强了抗肿瘤免疫应答。这防止细菌感染后免疫细胞(包括巨噬细胞)的丢失。例如，可以在本文提供的免疫刺激性细菌中敲除/破坏编码hilA、杆状蛋白(PrgJ)、针状蛋白(PrgI)、鞭毛蛋白和/或QseC的基因。
hilA
侵袭相关沙门菌属致病岛-1(SPI-1)，包括3型分泌系统(T3SS)，负责将效应蛋白易位到宿主细胞的胞质溶胶中，从而引起导致沙门菌属的摄取的肌动蛋白重排。hilA是SPI-1基因的转录活化因子，并且其表达受环境信号诸如氧气、渗量、pH和生长期的调节。欠佳的条件抑制hilA的表达，从而抑制细菌的侵袭表型(Kong el al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109(47):19414-19419)。T3SS效应物介导鼠伤寒沙门菌摄取到非吞噬宿主细胞(诸如上皮细胞)中。SPI-1T3SS对于穿过肠道上皮层是必不可少的，但诸如当胃肠外注射细菌时，对于感染是非必要的。SPI-1突变体在上皮细胞侵袭中具有缺陷，从而降低口服毒力，但通常被吞噬细胞，诸如巨噬细胞摄取。本文提供的免疫刺激性细菌包括在T3SS途径中具有hilA基因和/或其他基因缺失或破坏的那些细菌。当施用这些细菌时，诸如静脉内或肿瘤内施用，感染集中于不需要SPI-1T3SS用于摄取的吞噬细胞，诸如巨噬细胞和树突细胞。这增强了本文提供的免疫刺激性细菌的安全性谱。它防止脱靶细胞侵袭并防止粪口传播。
除了减少非吞噬细胞(诸如上皮细胞)摄取沙门菌属，此途径中的hilA和/或其他基因的缺失或破坏也通过阻止巨噬细胞的细胞焦亡而延长吞噬细胞的寿命，从而与不包含hilA缺失的细菌相比，诱导人巨噬细胞中更少的细胞死亡。例如，hilA缺陷型沙门菌属菌株通过阻止炎性小体活化来预防细胞焦亡，但维持TLR5信号传导。hilA缺失/破坏还允许细胞因子的延长分泌，例如由本文提供的免疫刺激性细菌编码的那些，以及允许巨噬细胞向肿瘤的运输，从而提高了免疫刺激性细菌的功效。例如，与含有完整的hilA的鼠伤寒沙门菌(诸如VNP20009)相比，本文示例的hilA缺失突变体进一步减少了促炎细胞因子(诸如IL-6)的量，从而增加治疗的耐受性以及获得性免疫应答的质量。
鞭毛蛋白
除SPI-1T3SS外，细菌(诸如沙门菌属)鞭毛蛋白对于触发巨噬细胞中的细胞焦亡是必需的，并且可以被巨噬细胞NLRC4炎性小体检测到。鞭毛蛋白是鞭毛的主要成分，可被TLR5识别。沙门菌属编码两种鞭毛蛋白基因fliC和fljB；消除鞭毛蛋白亚基可减少巨噬细胞的细胞焦亡。例如，与野生型菌株相比，具有fliC和fljB缺失的鼠伤寒沙门菌导致显著降低的IL-1β分泌，而细菌的细胞摄取和细胞内复制保持不受影响。这表明鞭毛蛋白在炎性小体活化中起重要作用。此外，发现工程化为组成型表达FliC的鼠伤寒沙门菌菌株诱导巨噬细胞凋亡(Li et al.(2016)Scientific Reports 6:37447；Fink and Cookson(2007)Cellular Microbiology 9(11):2562-2570；Winter et al.(2015)Infect.Immun.83(4):1546-1555)。可以修饰本文的免疫刺激性细菌的基因组以使鼠伤寒沙门菌中的鞭毛蛋白基因fliC和fljB缺失或突变，从而导致肿瘤-驻留免疫细胞(诸如巨噬细胞)的细胞死亡减少，并增强免疫刺激性细菌的抗肿瘤免疫应答。
杆状蛋白(PrgJ)
NLRC4还检测无鞭毛的鼠伤寒沙门菌。发现鞭毛蛋白非依赖性应答是由于检测到PrgJ，其是鼠伤寒沙门菌中的SPI-1T3SS杆状蛋白。向巨噬细胞胞质溶胶的递送纯化的PrgJ蛋白导致快速的NLRC4依赖性胱天蛋白酶-1活化以及IL-1β的分泌，这与鞭毛蛋白诱导的作用相似(Miao et al.(2010)PNAS 107(7):3076-3080)。因此，鼠伤寒沙门菌中编码PrgJ的基因的突变或敲除可以通过保留易于被细菌杀死的免疫细胞来减少巨噬细胞细胞焦亡(其增强免疫刺激性细菌的抗肿瘤免疫作用)。
针状蛋白(PrgI)
PrgI是鼠伤寒沙门菌中的SPI-1T3SS针状蛋白，也被NLRC4识别并活化NLRC4。递送鼠伤寒沙门菌PrgI至人原代单核细胞衍生的巨噬细胞的胞质溶胶导致IL-1β分泌和随后的细胞死亡，而表达PrgI但不是鞭毛蛋白的沙门菌属突变体显示出在比表达鞭毛蛋白的菌株晚的时间点活化原代单核细胞衍生的巨噬细胞中的炎性小体(Kortmann el al.(2015)J.Immunol.195:815-819)。可以对本文提供的免疫刺激性细菌进行修饰，以使鼠伤寒沙门菌中编码针状蛋白的基因突变或缺失，从而防止免疫细胞焦亡，并增强抗肿瘤免疫作用。
QseC
QseC是在许多革兰氏阴性细菌中发现的高度保守的膜组氨酸传感器激酶，对环境有反应并调节多种毒力因子的表达，包括flhDC基因，该基因编码鼠伤寒沙门菌中鞭毛生物合成的主要调节因子；sopB基因，其编码一种在非吞噬细胞的侵袭、含沙门菌属的囊泡(SCV)的早期成熟和运输调节、以及SCV-溶酶体融合的抑制中起作用的蛋白质；和sifA基因，其是SCV维持和膜完整性所必需的。已经显示LED209对QseC的选择性抑制通过抑制与毒力有关的基因表达(例如，flhDC、sifA和sopB)的QseC介导的活化来抑制细菌毒力而不抑制鼠伤寒沙门菌的生长，并部分保护小鼠在感染鼠伤寒沙门菌或Franciesella tularensis后免于死亡。发现QseC阻滞通过抑制感染的巨噬细胞中过度的炎性小体活化来抑制胱天蛋白酶-l活化、IL-1β释放和鼠伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞焦亡。抑制QseC还抑制鞭毛基因表达和运动性，并抑制鼠伤寒沙门菌在上皮细胞中的侵袭和复制能力(Li et al.(2016)Scientific Reports 6:37447)。因此，修饰本文的免疫刺激性细菌以将编码QseC的基因突变或敲除，可以通过将鼠伤寒沙门菌感染集中于非上皮细胞，以及通过减少免疫细胞中的细胞死亡(诸如通过预防巨噬细胞中的细胞焦亡)来增强抗肿瘤免疫应答。
7.细菌培养条件
细菌的培养条件可影响其基因表达。已有文献报道鼠伤寒沙门菌可以通过涉及PI-l及其相关的T3SS-1的机制在感染的30至60分钟内诱导巨噬细胞而不是上皮细胞的快速促炎性胱天蛋白酶依赖性细胞死亡(Lundberg et.Al(1999)Journal of Bacteriology181(11):3433-3437)。现已知道，该细胞死亡是由炎性小体的活化介导的，该炎性小体随后活化胱天蛋白酶-l，这促进了IL-1β和IL-18的成熟和释放，并引发了称为细胞焦亡的新的细胞死亡形式(Broz and Monack(2011)Immunol Rev.243(1):174-190)。可以通过使用对数期细菌来诱导这种焦亡活性，而稳定期细菌不会在巨噬细胞中诱导这种快速的细胞死亡。在对数期生长期间诱导SPI-1基因。因此，通过收获处于稳定期的待使用的鼠伤寒沙门菌，可以防止巨噬细胞的快速细胞焦亡。巨噬细胞是先天免疫系统的重要介质，并且它们可以用于分泌对建立适当的抗肿瘤应答至关重要的细胞因子。另外，限制促炎细胞因子诸如IL-1β和IL-18的分泌将改善所施用的鼠伤寒沙门菌疗法的耐受性。如本文所提供的，在稳定期收获的免疫刺激鼠伤寒沙门菌将用于诱导抗肿瘤应答。
E.细菌减毒和定植
1.缺失鞭毛蛋白(fliC-/fljB-)
提供了免疫刺激性细菌，诸如沙门菌属物种鼠伤寒沙门菌，其被工程化为缺乏鞭毛蛋白亚基fliC和fljB，以减少促炎信号传导。例如，如本文所示，将缺乏msbB(其导致减少的TNF-α诱导)的沙门菌属菌株与fliC和fljB敲除组合。所得沙门菌属具有TNF-α诱导降低和TLR5识别降低的组合。这些修饰msbB-、fliC-和fljB-，可以与细菌质粒(任选包含CpGs)，以及cDNA表达盒组合，以在真核启动子的控制下提供治疗性蛋白(例如免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子或趋化因子，诸如IL-2)、和/或还有抑制性分子(诸如抗体，包括抗体片段，诸如纳米抗体)、和/或靶向免疫检查点(诸如TREX1、PD-L1、VISTA、SIRP-α、TGF-β、β-连环蛋白、CD47、VEGF及其组合)的RNAi分子的表达。所得细菌具有降低的促炎信号传导和强大的抗肿瘤活性。
例如，如本文所举例说明，在鼠伤寒沙门菌菌株VNP20009的asd缺失菌株中或在野生型鼠伤寒沙门菌(诸如具有以ATCC保藏号14028保藏的菌株的所有鉴定特征)中构建fliC-和fljB-双突变体。VNP20009(其为ATCC 14028的衍生物)通过破坏purI/purM来减弱毒力，并且还被工程化为包含msbB缺失，导致产生LPS的脂质A亚基，其产毒低于野生型脂质A。与具有野生型脂质A的菌株相比，该结果导致静脉施用后小鼠模型中的TNF-α产生降低。
fliC-和fljB-双突变体是在鼠伤寒沙门菌的野生型菌株上构建的，并且还工程化为包含asd、purI/purM和msbB缺失。该细菌任选地是pagP-。所得菌株是通过修饰脂质A以减少TLR2/4信号传导并且缺失鞭毛蛋白亚基以减少TLR5识别和炎性小体诱导而减弱细菌炎症的菌株的示例。鞭毛蛋白亚基的缺失与LPS的修饰相组合允许宿主中更大的耐受性，并且将免疫刺激反应导向免疫刺激性蛋白的产生。由经修饰的细菌针对TME中所需靶标进行RNA干扰的递送引发抗肿瘤应答并促进对肿瘤的获得性免疫应答。
2.缺失LPS生物合成途径中的基因
革兰氏阴性细菌的LPS是细菌膜外叶的主要成分。它由三个主要部分组成：脂质A、非重复核心寡糖和O抗原(或O多糖)。O抗原是LPS的最外部分，并作为防止细菌渗透的保护部分，但是，O抗原的糖组成在菌株之间差异很大。脂质A和核心寡糖变化较小，并且更通常在相同物种的菌株中是保守的。脂质A是LPS的包含内毒素活性的部分。它通常是装饰有多种脂肪酸的二糖。这些疏水性脂肪酸链将LPS锚定在细菌膜中，其余LPS从细胞表面突出。脂质A结构域是革兰氏阴性细菌大部分毒性的原因。通常，血液中的LPS被认为是重要的病原体相关分子模式(PAMP)，并诱导深刻的促炎反应。LPS是包含CD14、MD2和TLR4的膜结合受体复合物的配体。TLR4是一种跨膜蛋白，其可以通过MyD88和TRIF途径发出信号，以刺激NFκB途径并导致促炎细胞因子(诸如TNF-α和IL-1β)的产生，其结果可能是内毒素性休克，这可能是致命的。哺乳动物细胞的胞质溶胶中的LPS可以直接与胱天蛋白酶4、5和11的CARD结构域结合，从而导致自体活化和焦亡性细胞死亡(Hagar et al.(2015)Cell Research 25:149-150)。脂质A的组成和脂质A变体的产毒性已得到充分证明。例如，单磷酸化脂质A的炎性比具有多个磷酸基团的脂质A小得多。脂质A上的酰基链的数目和长度也可以对毒性程度产生深远的影响。来自大肠杆菌的规范脂质A具有六个酰基链，并且这种六酰化作用具有潜在毒性。鼠伤寒沙门菌脂质A与大肠杆菌相似；它是一种带有四个伯羟酰基链和两个仲羟酰基链的葡糖胺二糖(Raetz and Whitfield(2002)Annu Rev Biochem.71:635-700)。如上所述，鼠伤寒沙门菌的msbB-突变体不能经历其LPS的末端肉豆蔻酰化，并且主要产生毒性比六酰化的脂质A显著更低的五酰化的LPS。用棕榈酸酯修饰脂质A是通过棕榈基转移酶(PagP)催化的。pagP基因的转录在PhoP/PhoQ系统的控制下，该系统由例如在SCV内部的低浓度镁活化。因此，鼠伤寒沙门菌的酰基含量是可变的，并且对于野生型细菌，其可以是六酰化或五酰化的。鼠伤寒沙门菌使其脂质A棕榈酸酯化的能力提高了对分泌到吞噬溶酶体中的抗菌肽的抗性。
在野生型鼠伤寒沙门菌中，pagP的表达产生七酰化的脂质A。在msbB-突变体中(其中无法添加脂质A的末端酰基链)，pagP的诱导产生六酰化的LPS(Kong et al.(2011)Infection and Immunity 79(12):5027-5038)。六酰化的LPS已被证明是最促炎的。虽然其他基团已试图利用这种促炎信号，例如通过缺失pagP以仅允许产生六酰化的LPS(Felgneret al.(2016)Gut Microbes 7(2):171-177；Felgner et al.(2018)Oncoimmunology 7(2):e1382791)，但由于TNF-α介导的LPS的促炎性质和反常较低的获得性免疫，这可能导致较差的耐受性(Kocijancic et al.(2017)Oncotarget 8(30):49988-50001)。本文例示的是鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株，其仅能产生五酰化的LPS，含有msbB基因的缺失(如上所述，阻止了脂质A的末端肉豆蔻酰化)，并进一步通过缺失pagP(防止棕榈酰化)进行修饰。当进一步修饰以表达异源性免疫刺激性蛋白和/或针对免疫检查点的干扰RNA时，经修饰以产生五酰化的LPS的菌株允许较低水平的促炎细胞因子、提高的血液稳定性和对补体固定的抗性、增加的对抗菌肽的敏感性、增强的耐受性和提高的抗肿瘤免疫。
如本文所提供的，还在鼠伤寒沙门菌VNP20009或野生型鼠伤寒沙门菌的asd、msbB、purI/purM和flic/fljB缺失菌株上构建了pagP-突变体。所得菌株是通过修饰脂质A以减少TLR2/4信号传导并且缺失鞭毛蛋白亚基以减少TLR5识别和炎性小体诱导以及缺失pagP以产生五酰化的LPS而减弱细菌炎症的菌株的示例。鞭毛蛋白亚基的缺失与LPS的修饰相组合允许宿主中更大的耐受性，和更高的血液稳定性和对补体固定的抗性，提供向肿瘤部位的改善运输，以将免疫刺激反应引向任何基因产物(诸如免疫刺激性蛋白)的产生，和/或递送针对TME中所需靶标的RNA干扰，以引发抗肿瘤应答并促进对肿瘤的获得性免疫应答。
3.定植
VNP20009是一种基于减毒鼠伤寒沙门菌的微生物癌症疗法，其开发用于治疗癌症。VNP20009通过缺失基因msbB和purI(purM)而减毒。purI缺失使微生物对嘌呤或腺苷呈营养缺陷型。msbB基因的缺失通过防止末端肉豆蔻基基团加成到脂质A结构域而降低与脂多糖(LPS)相关的毒性(Kahn et al.,(1998)Mol.Microbiol.29:571-579)。
小鼠和人类之间的VNP20009定植肿瘤的能力有所不同。VNP20009的全身施用导致小鼠肿瘤的定植；而在人类患者中VNP20009的全身施用则导致微乎其微的定植。已经显示在小鼠中，VNP20009在全身施用后显示出高度的肿瘤定植(Clairmont et al.,(2000)JInfect Dis.181:1996-2002；和Bermudes et al.(2001)Biotechnol Genet Eng Rev.18:219-33)。然而，在一项晚期黑素瘤患者的1期研究中，静脉输注30分钟后，在人类肿瘤中几乎检测不到VNP20009(参见Toso et al,(2002)J Clin Oncol.20:142-52)。参加到评估VNP20009的更长的四小时输注的随访研究的患者在肿瘤活检后也表现出缺乏可检测的VNP20009(Heimann et al.(2003)J Immunother.26:179-180)。肿瘤内施用后，检测到VNP20009衍生物的定植(Nemunaitis et al.(2003)Cancer Gene Ther.100:737-44)。将VNP20009直接瘤内施用给人肿瘤导致肿瘤定植，表明人肿瘤可以高水平定植，并且小鼠和人之间的肿瘤定植差异仅在全身施用后才会发生。
本文显示(参见，例如，实施例25)VNP20009被人补体灭活，这导致低的肿瘤定植。提供了提供改善的对补体的抗性的菌株。这些菌株在细菌基因组中包含修饰，并且还可以携带质粒(通常以低或中等拷贝数)以编码提供用于复制的基因(在真核启动子的控制下的asd)，和编码(一种或多种)治疗性产物的(一种或多种)核酸，诸如但不限于RNAi、免疫刺激性蛋白(诸如细胞因子)，以及其他此类治疗性基因，如本文其他地方所述。下表总结了细菌的基因型/修饰、其功能作用以及作用/益处。
本文提供的菌株是ΔFLG和/或ΔPagP。另外，菌株是Δpur-(ΔpurM)、ΔmsbB和Δasd(在细菌基因组中)中的一种或多种。修饰质粒以在宿主识别的启动子(例如，真核启动子，诸如RNA聚合酶II启动子，包括来自真核生物和动物病毒的那些)的控制下编码产物。质粒可以编码允许体内复制的asd，以及具有其他有益功能的核酸和基因产物，如本文其他地方所述。
免疫刺激性细菌衍生自合适的细菌菌株。细菌菌株可以是减毒菌株，或者通过标准方法减毒的菌株或者凭借本文提供的修饰而被减毒使得它们的定植能力主要限于免疫豁免组织和器官(特别是免疫和肿瘤细胞，包括实体瘤)的菌株。细菌包括但不限于例如沙门菌属、志贺菌属、利斯特菌属、大肠杆菌和双歧杆菌的菌株。例如，物种包括宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌、单核细胞增生利斯特菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡沙门菌和肠炎沙门菌。其他合适的细菌物种包括立克次体属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、弧菌属、芽孢杆菌属和丹毒丝菌属。例如，Rickettsia Rikettsiae、普氏立克次体、Rickettsiatsutsugamuchi、摩氏立克次体、西伯利亚立克次体、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、Aeromonas eucrenophila、杀鲑气单胞菌、Franciesella tularensis、假结核棒杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎衣原体、Haemophilus sornnus、流产布鲁杆菌、细胞内分枝杆菌、嗜肺军团病杆菌、马红球菌、铜绿假单胞菌、鼬螺杆菌、霍乱弧菌、枯草芽孢杆菌、红斑丹毒丝菌、小肠结肠炎耶尔森菌、五日热罗克利马体菌、以及Agrobacteriumtumerfacium。
本文提供的免疫刺激性细菌的示例是沙门菌属的物种。如本文所述的用于修饰的细菌的实例是沙门菌属的野生型菌株，诸如具有以ATCC保藏号14028保藏的菌株的所有鉴定特征的菌株。鼠伤寒沙门菌的工程菌株，诸如菌株YS1646(ATCC目录号202165；也称为VNP20009，参见国际申请公开号WO 99/13053)，其用质粒工程化以互补asd基因敲除和无抗生素质粒维持。然后修饰菌株以缺失鞭毛蛋白基因和/或缺失pagP。该菌株还对嘌呤，特别是对腺苷呈营养缺陷型，并且是asd-和msbB-。可以在质粒上提供asd基因，以在真核宿主中复制。这些缺失和质粒在本文其他地方描述。质粒上可包含本文其他地方描述和/或本领域技术人员已知的任何编码治疗性产物和免疫刺激性蛋白及产物的核酸。如本文其他地方所述，质粒通常以低至中等拷贝数存在。治疗性产物包括在肿瘤微环境促进抗肿瘤免疫应答的免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子，和本文所述的其他这种产物。
F.构建编码治疗性蛋白的示例性质粒
修饰本文提供的免疫刺激性细菌。它们包括对细菌基因组以及细菌表达和宿主细胞侵袭的修饰，如下所述，诸如以改善或增加针对肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和肿瘤微环境的靶向或在肿瘤中、肿瘤-驻留免疫细胞和肿瘤微环境中的积累，以及以还包括编码产物的质粒，所述产物通过包含细菌启动子而在细菌中表达，或通过包含适当的真核启动子和视情况而定其他合适的调控区而在宿主中表达。本文显示作为鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和/或pagP-以及任选的hilA-的免疫刺激性细菌表现出增加的肿瘤定植，并且因此可以克服VNP20009先前遇到的问题(未能在人的肿瘤中充分定植)。VNP20009的临床活性令人失望，部分原因是其差的定植于人类肿瘤的能力(Nemunaitis et al.(2003)Cancer GeneTher.10(10):737-744；Toso et al.(2002)J Clin.Oncol.20(1):142-152；Heimann etal.(2003)J.Immunother.26(2):179-180)。
为了引入质粒，使用常规方法，诸如电穿孔，利用用常规的分子生物学工具和方法(DNA合成、PCR扩增、DNA限制性内切酶消化和兼容的粘性末端片段与连接酶的连接)构建的纯化DNA质粒转化该细菌。如贯穿全文所讨论的，在宿主识别的启动子的控制下，质粒编码一种或多种治疗性产物，包括蛋白质，诸如抗体及其片段，和免疫刺激性蛋白质，诸如白介素。所编码的免疫刺激性蛋白刺激免疫系统，特别是在肿瘤微环境中。抗体，包括抗体片段和单链抗体，可以抑制免疫检查点。
质粒可以编码例如为以下中的一种或多种的治疗性产物或治疗性蛋白质：GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-15/IL-15Rα链复合物、已经减弱与IL-2Ra的结合的IL-2、IL-18、IL-36γ、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞募集/持久性的蛋白质、CD40、CD40配体、OX40、OX40配体、4-1BB、4-1BB配体、B7-CD28家族成员、TGF-β多肽拮抗剂、CD47拮抗剂、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ，或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
细菌可以在质粒上编码其他产物，诸如一种或多种短发夹(sh)RNA构建体，或其他抑制性RNA形式，其表达抑制、阻抑或破坏靶向的基因的表达。在真核启动子(诸如RNA聚合酶(RNAP)II或III启动子)的控制下表达治疗性产物，诸如免疫刺激性蛋白、抗体和RNAi，诸如shRNA或微RNA构建体。通常，RNAPIII(也称为POLIII)启动子是组成型的，并且可以调节RNAP II(也称为POLII)。在一些实例中，shRNA靶向基因TREX1，以抑制其表达。在一些实施方案中，质粒编码多种治疗性产物。在编码多种产物(例如RNAi)的情况下，每种产物的表达可以在不同启动子的控制下，或者产物可以多顺反子地编码。
编码治疗性产物/蛋白质的核酸可以在真核启动子的控制下，所述真核启动子是RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子。RNA聚合酶II启动子可以是病毒启动子或哺乳动物RNA聚合酶II启动子。病毒启动子可以是选自熟知的病毒启动子中的一种。这样的示例是巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、Epstein-Barr病毒(EBV)启动子、疱疹病毒启动子和腺病毒启动子。
该治疗性产物可以在真核RNA聚合酶II(RNAP II)启动子的控制下。许多这样的启动子是熟知的。这些启动子的示例是选自以下的RNAPII启动子：例如延伸因子-1(EF1)α启动子、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)启动子、CAG启动子(其由以下组成：(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；(A)启动子，鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子；以及(G)兔β-球蛋白基因的剪接受体)、EIF4a1(真核起始因子4A)启动子、CBA启动子(鸡β肌动蛋白)、MND启动子、GAPDH启动子和CD68启动子。MND是一种合成启动子，其包含带有骨髓组织增生性肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)增强子(鼠白血病病毒衍生的MND启动子(骨髓组织增生性肉瘤病毒增强子，阴性对照区域缺失，dl587rev引物结合位点被取代，参见Li et al.(2010)J.Neurosci.Methods vol.189:56-64)的经修饰的MoMuLV LTR的U3区。
如本文所提供，将细菌菌株，诸如沙门菌属的菌株，包括鼠伤寒沙门菌，修饰或鉴定为在肿瘤微环境中对腺苷呈营养缺陷型，和/或对免疫刺激性细菌的基因组进行修饰使得其优先感染肿瘤-驻留免疫细胞和/或使得其在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导更少的细胞死亡，以及对细菌进行修饰以携带编码治疗性产物(诸如免疫刺激性蛋白、抗体或抗体片段，诸如抗肿瘤抗体或其片段或抗检查点抗体，以及其他产物，诸如RNAi)的质粒。
1.免疫刺激性蛋白
如下文和本文其他地方所讨论的，提供了免疫刺激性细菌，其包含编码基因产物(诸如免疫刺激性蛋白)的核苷酸序列，以赋予\增加或增强肿瘤微环境中的免疫应答。修饰这些免疫刺激性细菌以优先感染包括肿瘤-驻留免疫细胞在内的肿瘤，和/或修饰免疫刺激性细菌的基因组，使得其在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导更少的细胞死亡，由此使免疫刺激性细菌在肿瘤细胞中积累从而将免疫刺激性蛋白递送至靶向的细胞以刺激针对肿瘤的免疫应答。免疫刺激性细菌可以进一步编码肿瘤抗原以增强针对特定肿瘤的应答。本文提供的以及上文和下文所述的任何免疫刺激性细菌均可被修饰以编码免疫刺激性蛋白。通常，免疫刺激性蛋白在RNA聚合酶II(RNAPII)启动子的控制下，并且还在质粒中被编码以在表达后分泌到肿瘤微环境中。本文所述的用于修饰的任何细菌，诸如沙门菌属、志贺菌属、大肠杆菌、双歧杆菌、立克次体属、弧菌属、利斯特菌属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、霍乱、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、芽孢杆菌属和丹毒丝菌属的菌株，或它们的减毒菌株或它们的经修饰菌株中的任一种编码免疫刺激性蛋白，使得其在感染的对象细胞中表达。免疫刺激性细菌包括如本文所述被修饰以在肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或TME中定植、积累，或优先感染肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或TME的那些。
如在D5节以及本文其他地方所讨论的，特别是当在肿瘤、微环境和/或肿瘤-驻留免疫细胞中表达时，免疫刺激性细菌可以编码增强或刺激或引起抗肿瘤免疫应答的免疫刺激性蛋白，诸如细胞因子，包括趋化因子，。
可以修饰本文的免疫刺激性细菌以编码促进或诱导或增强抗肿瘤应答的免疫刺激性蛋白。可以在真核启动子(诸如被RNA聚合酶II识别的启动子)的控制下，在细菌中的质粒上编码免疫刺激性蛋白，以在真核对象中表达，特别是在要施用免疫刺激性细菌的对象(诸如人)中表达。除真核启动子外，编码免疫刺激性蛋白的核酸还可包括其他调节信号，用于在细胞中表达或运输，例如用于在细胞表面上分泌或表达。
免疫刺激性蛋白是在适当的环境(诸如肿瘤微环境(TME))中可以促进或参与或增强施用免疫刺激性细菌的对象的抗肿瘤应答的那些。免疫刺激性蛋白包括但不限于细胞因子、趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，诸如但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18；趋化因子，诸如但不限于CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11；和/或共刺激分子，诸如但不限于CD40、CD40L、OX40、OX40L、4-1BB、4-1BBL、GM-CSF、TNF/TNFR超家族成员和B7-CD28家族成员。本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可以促进、增强或以其他方式增加或引起抗肿瘤应答的其他此类免疫刺激性蛋白预期用于在本文提供的免疫刺激性细菌中编码。
在一些实施方案中，本文的免疫刺激性细菌被工程化为表达细胞因子以刺激免疫系统，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12(IL-12p70(IL12p40+IL-12p35))、IL-15(和IL-15:IL-15Rα链复合物)和IL-18。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，可以将免疫刺激性细菌工程化为表达趋化因子，诸如例如CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11。这些修饰和编码它们的细菌在上面讨论，并在下面举例说明。
2.抗体和抗体片段
提供了免疫刺激性细菌，其包含编码基因产物(诸如抗体和抗体片段)的核苷酸序列，以赋予、增加或增强抗肿瘤免疫应答。除了其他之外，这些包括靶向免疫检查点(诸如CTLA-4、PD-l、PD-Ll、CD47)或靶向肿瘤抗原和肿瘤新抗原(包括从待治疗对象的肿瘤中鉴定出的那些)的抗体和抗体片段，以及例如，调节特别是抑制免疫抑制的抗IL-6抗体。可以在真核调节序列和信号(包括真核启动子，诸如被RNA聚合酶II识别的启动子)的控制下，在细菌中的质粒上编码抗体或其片段，诸如scFv和其他单链抗体，诸如骆驼科抗体和纳米抗体，以在真核对象中表达，特别是在要施用免疫刺激性细菌的对象(诸如人)中表达。除真核启动子外，编码抗体和抗体片段的核酸可包括其他调节信号，用于在细胞中表达和/或运输，例如用于在细胞表面上分泌或表达。
这些免疫刺激性细菌是本文提供的那些，其基因组被修饰以优先感染肿瘤，包括肿瘤-驻留免疫细胞，和/或消除非靶细胞的细胞感染，和/或使得它们在肿瘤-驻留免疫细胞中诱导更少的细胞死亡，由此使免疫刺激性细菌在肿瘤细胞中积累从而将抗体或抗体片段递送至靶向的细胞以刺激针对肿瘤的免疫应答。免疫刺激性细菌还可以或替代地可以编码肿瘤抗原或新抗原，以增强针对特定肿瘤的应答。本文提供的以及上文和下文所述的任何免疫刺激性细菌均可被修饰以编码抗体或抗体片段。通常，抗体或其片段在RNA聚合酶II(RNAPII)启动子的控制下，并且还在质粒中编码抗体或其片段以在表达后分泌到肿瘤微环境中。本文所述的用于修饰的任何细菌，诸如沙门菌属、志贺菌属、大肠杆菌、双歧杆菌、立克次体属、弧菌属、利斯特菌属、克雷伯菌属、博德特菌属、奈瑟球菌属、气单胞菌属、弗朗西丝菌属、霍乱、棒杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团病杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、芽孢杆菌属和丹毒丝菌属的菌株，或它们的减毒菌株或它们的经修饰菌株中的任一种编码抗体或其片段，使得其在感染的对象细胞中表达。免疫刺激性细菌包括如本文所述被修饰以在肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或TME中定植、积累，或优先感染的肿瘤、肿瘤-驻留免疫细胞和/或TME。
治疗性抗体及其片段是熟知的。例如，存在过多的抗CTLA4、抗-PD-1和抗PD-Ll抗体及其抗原结合片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、单链Fv(scFv)、Fv、二硫键稳定的Fv(dsFv)、纳米抗体和骆驼科抗体、双抗体片段、单链抗体以及已知的人源化抗体和人类抗体。例如，与PD-1或PD-Ll结合并抑制PD-1抑制活性的抗体，和已经用于抗肿瘤免疫疗法的抗体是已知的。示例性抗-PD-1抗体包括但不限于美国专利号7,943,743、8,008,449和8,735,553；美国公开号2005/0180969和2007/0166281；国际专利申请公开号WO 2008/156712中描述的那些中的任一种。抗PD-Ll抗体包括但不限于美国公开号2013/0034559和2013/0045202；美国专利号7,943,743、8,217,149、8,679,767和8,779,108；和国际申请公开号WO 2010/077634和WO 2013/019906中描述的那些中的任一种。已经描述了与CTLA-4结合并抑制CTLA-4活性的几种抗体，并已经用于抗肿瘤免疫疗法中。抗CTLA4抗体包括但不限于美国专利号6,682,736和6,984,720；美国申请号2002/0086014和2009/0074787号；欧洲专利号EP 1262193；和国际专利申请公开号WO 2000/037504中描述的那些中的任一种。抗CTLA4抗体包括伊匹木单抗(Ipilimumab)(也称为MDX-010或10D1)和曲美木单抗(Tremelimumab)(也称为Ticilimumab或CP-675,206)。这些抗CTLA4抗体已参与了许多用于治疗癌症的临床试验。伊匹木单抗已获得FDA批准用于治疗黑素瘤，并且已经在其他癌症的临床试验中使用，诸如前列腺癌、肺癌和肾细胞癌(RCC)。在用于治疗结肠直肠癌(CRC)、胃癌、黑素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)的临床试验中已对曲美木单抗进行了研究。示例性检查点抑制剂包括但不限于抗CTLA4物质、抗-PD-1物质、抗PD-Ll物质等，其示例如下：
可以对本文提供的免疫刺激性细菌进行工程化以表达任何抗体/其抗原结合片段，包括但不限于本文所述的并且为本领域技术人员已知的抗检查点抗体(检查点拮抗剂/抑制剂)。
3.干扰RNA(RNAi)
如上所述，本文的免疫刺激性细菌菌株中的质粒编码靶向免疫检查点和其他感兴趣的靶标的RNAi核酸。RNAi包括shRNA、siRNA和微RNA。RNA干扰(RNAi)允许使用小干扰RNA(siRNA)来序列-选择性阻抑真核细胞中的基因表达，该小干扰RNA是短的、合成的、具有与靶基因同源的序列的dsRNA分子。RNAi技术为消除疾病相关转录物提供了强大的工具。
a.shRNA
siRNA通常为约19-29个碱基对长，通过降解特定的宿主mRNA序列起作用，从而阻止了翻译成它们相应的蛋白质产物，有效地使靶向的基因的表达沉默。包含紧密发夹环的短发夹RNA(shRNA)已广泛用于RNAi。shRNA包含两个互补的RNA序列，每个序列长19-29bp，由4-15个核苷酸的环间隔子连接。与靶基因序列互补的RNA序列(并且因此与mRNA序列相同)被称为“有义”链，而与mRNA互补的链(并与靶基因序列相同)被称为“反义”或“引导”链。shRNA转录物被称为Dicer的RNase III酶加工成siRNA双链体。然后将产物与Argonaute(Ago)蛋白和其他RNA结合蛋白一起装载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上。然后，RISC将反义链定位或“引导”至其随后被Ago切割的互补mRNA序列(美国专利号9,624,494)。shRNA的使用优选于siRNA，因为它更具成本效益，高的细胞内siRNA浓度与脱靶效应相关，并且因为siRNA的浓度会在细胞分裂时被稀释。另一方面，shRNA的使用导致稳定的长期基因敲低，而无需进行多轮转染(Moore et al.(2010)Methods Mol.Bio.629:141-158)。
RNAi的感兴趣靶标，诸如微RNA和siRNA/shRNA介导的沉默，包括但不限于发育基因，诸如细胞因子及其受体、周期素激酶抑制剂、神经递质及其受体、生长/分化因子及其受体；癌基因，诸如BCL2、ERBA、ERBB、JUN、KRAS、MYB、MYC；肿瘤抑制基因诸如BRCA1、BRCA2、MCC、p53；以及酶诸如ACC合成酶和氧化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、过氧化氢酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、激酶、乳糖酶和脂肪酶(美国专利号7,732,417、8,829,254、8,383,599、8,426,675、9,624,494；美国专利公开号2012/0009153)。特别令人感兴趣的是免疫检查点靶标，诸如PD-l、PD-2、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、IDO 1和2、CTNNB1(β-连环蛋白)、SIRPα、VISTA、RNase H2、DNase II、CLEVER-l/Stabilin-l、LIGHT、HVEM、LAG3、TIM3、TIGIT、Galectin-9、KIR、GITR、TIM1、TIM4、CEACAM1、CD27、CD47、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD112、CDl37(4-1BB)、CD155、CD160、CD200、CD226、CD244(2B4)、CD272(BTLA)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、ICOS、A2aR、A2bR、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4、OX40和OX-40L。其他靶标包括MDR1、精氨酸酶1、iNOs、IL-10、TGF-β、pGE2、STAT3、VEGF、VEGFR、KSP、HER2、Ras、EZH2、NIPP1、PP1、TAK1和PLKl(美国专利公开号2008/091375、2009/0208534、2014/0186401、2016/0184456、2016/0369282；国际申请公开号WO 2012/149364、WO 2015/002969、WO 2015/032165、WO 2016/025582)。
只要转录了shRNA，所表达的RNAi(诸如shRNA)就会介导其靶转录物的长期稳定敲低。取决于所需的表达类型，RNA Pol II和III启动子用于驱动shRNA构建体的表达。与它们在产生大量内源性小RNA中的正常细胞作用一致，Pol III启动子(诸如U6或H1)驱动高水平的组成型shRNA表达，并且它们的转录起始点和终止信号(4-6胸苷)得到了很好的定义。PolII启动子驱动的shRNA可以组织特异性地表达，并转录为较长前体，该较长前体模仿pri-miRNA并具有必须处理的cap和polyA信号。此类人工miRNA/shRNA可有效地整合到RISC中，从而有助于靶基因表达的更有效抑制；这允许较低水平的shRNA表达，并可能防止RNAi途径中成分的饱和。Pol II启动子的另一个优点是单个转录物可以同时表达多个miRNA并模拟shRNA。该多路复用策略可用于同时敲除两个或更多个治疗靶标的表达，或靶向单个基因产物中的几个位点(参见，例如，美国公开号2009/0208534)。
b.微RNA
微RNA(miRNA)是短的非编码单链RNA分子，其约为20-24个核苷酸长或为20-24个核苷酸长。天然存在的miRNA参与基因表达的转录后调控；miRNA不编码基因。miRNA已显示出调节细胞增殖和存活以及细胞分化。miRNA通过与共享序列互补性的靶mRNA结合而抑制翻译或促进RNA降解。它们影响mRNA的稳定性和翻译；miRNA通过与共享序列互补性的靶mRNA结合而抑制翻译和/或促进RNA降解。存在于真核生物中的miRNA被RNA Pol II转录为加帽的和含聚腺苷酸化发夹的初级转录物，称为初级miRNA或pri-miRNA。这些pri-miRNA被酶Drosha核糖核酸酶III及其辅因子Pasha/DGCR8裂解为～70个核苷酸长的前体miRNA发夹，称为前体miRNA或pre-miRNA，其然后从细胞核转运到细胞质中并通过Dicer核糖核酸酶III裂解为miRNA:miRNA*双链体，其中正义和反义链产物为约22个核苷酸长。成熟的miRNA被掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，该复合物通过与miRNA的不完美碱基配对，识别并结合通常位于3′非翻译区(UTR)的靶mRNA，从而抑制靶mRNA的翻译，或去稳定化/降解靶mRNA(参见例如Auyeung et al.(2013)Cell 152(4):844-85)。
如本文所述，通过RNA干扰(RNAi)调节基因表达通常使用短发夹RNA(shRNA)以抑制、破坏或其他干扰靶向的基因的表达。尽管有利地使用并在本文中使用，但在某些情况下，shRNA可能是小的RNA生物发生因子的不良底物，它们可以被加工成小RNA的异质混合物，并且它们的前体转录物可以在细胞中积累，从而导致诱导序列非依赖性非特异性效应，并导致体内毒性。考虑将miRNA用于本文。miRNA类支架或人工miRNA(amiRNA)可用于减少序列非依赖性非特异性效应(Watanabe el al.(2016)RNA Biology 13(1):25-33；Fellmannet al.(2013)Cell Reports 5:1704-1713)。除了改善的安全性外，amiRNA比shRNA更容易被Pol II转录，从而允许调控的和细胞特异性的表达。与shRNA相比，人工miRNA(amiRNA)可以有效地使基因表达沉默且在某些情况下更有效地使基因表达沉默而不会产生大量抑制性RNA(McBride et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(15):5868-5873)。确定该效果是由于相比于来自shRNA转录物，siRNA更有效地加工来自pre-miRNA前体的siRNA(Boden et al.(2004)Nucl.Acid Res.32(3):1154-1158)。
miRNA已显示出调节多种细胞过程，包括细胞增殖和存活、细胞内信号传导、细胞代谢和细胞分化。在1993年，在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中鉴定了第一个miRNA(Lee etal.(1993)Cell 75:843-854)，然后鉴定了哺乳动物miRNA(Pasquinelli et al.(2000)Nature 408(6808):86-89)。已在142个物种中鉴定出17,000多个miRNA，其中在人类中鉴定出1900多个miRNA，其中许多与各种疾病相关，包括癌症(例如B-CLL中的miR-l5和miR-l6，乳腺癌中的miR-125b、miR-145、miR-21、miR-155和miR-210，肺癌中的miR-155和let-7a，胃癌中的miR-145，肝癌中的miR-29b)；病毒感染(例如，HCV感染中的miR-122和miR-155，HIV-l感染中的mir-28、miR-125b、miR-150、miR-223和miR-382，流感病毒感染中的miR-21和miR-223病毒感染)；免疫相关疾病(例如，多发性硬化症(multiple sclerosis)中的miR-145、miR-34a、miR-155和miR-326，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)中的miR-146a，II型糖尿病(type II diabetes)中的miR-144、miR-146a、miR-150、miR-182、miR-103和miR-107，非酒精性脂肪肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease)中的miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-122、miR-451和miR-27，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis)中的miR-29c、miR-34a、miR-155和miR-200b)；和神经退行性疾病(neurodegenerative disease)(例如，帕金森氏病(Parkinson′s disease)中的miR-30b、miR-30c、miR-26a、miR-133b、miR-184*和let-7，阿尔茨海默氏病(Alzheimer′sdisease)中的miR-29b-1、miR-29a和miR-9)(Li and Kowdley(2012)Genomics ProteomicsBioinformatics10：246-253)。
研究表明，特定的内源性miRNA在某些癌症中被上调或下调。例如，在非小细胞肺癌(NSCLC)中miR-140被下调，并且发现其过度表达抑制PD-L1(Xie et al.(2018)CellPhysiol.Biochem.46:654-663)；在基于铂的化疗耐药性NSCLC中，miR-197被下调，从而导致化学抵抗、致肿瘤性和转移(Fujita et al.(2015)Mol.Ther.23(4):717-727)；已发现几种miRNA在癌细胞中被下调以允许PD-Ll表达，包括miR-200、miR-34a和miR-138(Yee etal.(2017)J.Biol.Chem.292(50):20683-20693)。在肺癌中几种miRNA也被上调，例如miR-21、miR-17和miR-221(Xie et al.(2018)Cell Physiol.Biochem.46:654-663)。
由于遗传毒性应激和辐射后DNA损伤，微RNA-103(miR-103)被认为是内皮细胞中上调最高的微RNA。发现miR-103导致TREX1、TREX2和FANCF基因的下调，并且TREX1表达的降低被鉴定是miR-103介导细胞死亡并抑制血管生成的主要机制(Wilson et al.(2016)Nature Communications 7:13597)。由于TREX1的丢失导致dsDNA和ssDNA的积累、缺陷DNA修复和细胞因子的释放，所以miR-103表达显著上调促炎性趋化因子IP-10、RANTES、MIG和细胞因子IL-15、IL-12和IFN-γ，而这种上调是由于miR-103介导的TREX1水平降低。研究还显示，在4T1肿瘤中，共刺激受体CD40和CD160显著增加，且PD-Ll+巨噬细胞和中性粒细胞的数量减少。因此，TREX1的miR-103调节是免疫TME的有效调节因子。靶向TREX1的其他miRNA包括miR-107(美国专利号9,242,000)、miR-27a和miR-148b(美国专利号8,580,757)。miRNA-103可用于本文的质粒中以抑制TREX1。
人工miRNA(amiRNA)可以递送到细胞中，并通过创建基于微RNA的siRNA或shRNA载体(shRNAmir)来使靶基因沉默。miR-30a骨架经常用于哺乳动物，并且载体中包含约200-300个碱基的初级miRNA转录物，其中miRNA发夹位于片段的中心，且天然miRNA茎序列被替换为感兴趣的siRNA/shRNA编码序列。可以使用病毒启动子，诸如CMV、MSCV和TLR启动子；细胞启动子，诸如EIF-la；诱导型嵌合启动子，诸如tet-CMV；组织特异性启动子(Chang etal.(2013)Cold Spring Harb Protoc doi:10.1101/pdb.prot07585)。可以使用的其他miRNA包括miR-16-2(Watanabe et al.(2016)RNA Biology 13(1):25-33)、miR-155(Chunget al.(2006)Nuc Acids Res 34:e53)、miR17-92(Liu et al.(2008)Nuc.Acids Res.36(9):2811-2824)、miR-15a、miR-16、miR-19b、miR-20、miR-23a、miR-27b、miR-29a、miR-30b、miR-30c、miR-104、miR-132s、miR-181、miR-191、miR-223(美国专利号8,426,675)，和Let-7miRNA(WO 2009/006450；WO 2015/032165)。
shRNAmir受计算预测的shRNA序列的低有效性限制，特别是在低拷贝或单拷贝条件下表达时。已开发出第三代人工miRNA，诸如miR-E(基于miR-30a)和miR-3G(基于miR-16-2)，并发现由于精确定义的引导RNA的增强处理和积累，与shRNAmir相比，它们在基于PolII-和Pol III的表达载体中均表现出更强的基因沉默。miR-E是通过发现保守的CNNC基序(其增强茎3p侧翼序列中miRNA的加工)而开发的，它在三个方面与内源性miR-30a不同：miR-E的茎不具有隆起并且在反向链上具有预期引导；在环侧翼的两个保守碱基对从CU/GG突变为UA/UA；和Xhol/EcoRI限制位点被引入到侧翼区域以进行shRNA克隆(Fellmann etal.(2013)Cell Reports 5:1704-1713)。发现miR-E比miR-30a更有效，但是miR-30a的3p和5p链的对称处理都不利于使引导链递送优于随从链递送，这不是最佳的。此外，使用超过100nt的寡核苷酸克隆到miR-E中既昂贵又费时(Watanabe et al.(2016)RNA Biology 13(1):25-33)。
命名为miR-16-2的amiRNA(参见例如Watanabe et al.(2016)RNA Biology 13(1):25-33，参见图1)是第三代(3G)amiRNA支架的替代品；它在几种组织中表达，是天然不对称的(成熟链仅衍生自茎的5p或3p臂)，其茎和环区段小而刚性，从而简化了载体克隆。通过将包含天然miR-16-2茎和环的～175bp片段以及茎任一侧上的侧翼35bp克隆到载体中来生成miR-3G。miR-3G包括通过将克隆位点(诸如MluI和EcoRI)分别引入5p和3p臂-侧翼序列，并对引导(反义)和随从(有义)链茎进行完全碱基配对(除了相对于引导链的位置1处的错配之外)，来对miR-16-2的进一步修饰。限制位点允许通过88-mer双链体DNA寡核苷酸产生新的靶向构建体，而不损害miR-16-2发夹和侧翼元件的预测二级结构。另外，在miR-16-2的3p侧翼序列中修饰两个CNNC基序之一和GHG基序(小RNA加工增强子)。然后将靶向(一个或多个)感兴趣的基因的siRNA与成熟的5p引导和3p随从序列的前21个核苷酸交换。研究确定miR-E和miR-3G具有同等功效。miR-3G提供有吸引力的RNAi系统，因为其表达盒的较小尺寸(～175nt对miR-E的～375)和其生产的简化且划算的单步克隆方法。与shRNA一样，细菌可以用作微RNA体内递送的载体。例如，已显示减毒鼠伤寒沙门菌可用作在具有炎症小鼠中口服递送表达针对CCL22的miRNA的质粒的载体。在异位性皮炎(atopic dermatitis)的小鼠模型中，通过这种方法下调CCL22基因表达在体外和体内都是成功的(Yoon el al.(2012)DNA and Cell Biology 31(3):289-296)。出于本文的目的，miRNA16-2可用于产生将代替shRNA使用的miRNA。shRNA的序列可用于设计miRNA。
将编码用于破坏和/或抑制和/或靶向任何选择的靶基因(诸如本文所述或本领域技术人员已知的任何免疫检查点)的RNAi的DNA插入微RNA骨架，诸如SEQ ID NO:249和以下所示的微RNA骨架。可以使用技术人员已知的任何合适的微RNA骨架；通常，这些骨架基于天然存在的微RNA，并经修饰以表达RNAi。这种骨架的示例是基于miR-16-2(SEQ ID NO:248)。修饰的微RNA骨架的序列为：
其中N表示互补的通常为18-26，诸如19-24、19-22、19-20个碱基对长的反义或有义核苷酸序列，该核苷酸序列靶向待沉默的基因并且插入微RNA环之前和之后。RNA诸如ARI-205(SEQ ID NO:214)和ARI-206(SEQ ID NO:215)是基于SEQ ID NO:249的微RNA骨架的示例性构建体，其分别编码21和22个碱基对的同源序列。ARI-207(SEQ ID NO：216)和ARI-208(SEQ ID NO：217)是基于SEQ ID NO:249的微RNA骨架的示例性构建体，其编码19个碱基对的同源序列。另一个实例是命名为ARI-201的构建体，其是微RNA构建体ARI-205，其中N被靶向小鼠PD-L1的核苷酸序列替换。命名为ARI-202的构建体代表微RNA构建体ARI-206，其中N替换为靶向小鼠PD-L1的序列。技术人员可以容易地使用miR-16-2骨架或本领域技术人员已知的其他合适的骨架来构建包含在本文所述和例示的质粒中的微RNA。
4.复制起点和质粒拷贝数
质粒是自主复制的染色体外环状双链DNA分子，其通过复制起点保持在细菌内。拷贝数影响质粒稳定性。当在细胞分裂中发生随机分配时，高拷贝数通常导致质粒的更大稳定性。大量质粒通常降低生长速率，因此可能允许具有很少质粒的细胞主导培养，因为它们生长更快。复制起点还决定了质粒的兼容性：与同一细菌细胞内的另一质粒一起复制的能力。利用相同复制系统的质粒不能共存于同一细菌细胞中。据说它们属于同一兼容性组。以来自同一兼容性组的第二个质粒的形式引入新的起点，模拟了存留质粒的复制结果。因此，在将两个质粒分离到不同的细胞以产生正确的复制前拷贝数之前，阻止任何进一步的复制。
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许多细菌复制起点是本领域技术人员已知的。可以选择起点以获得所需的拷贝数。复制起点包含通过DNA依赖性DNA聚合酶被识别为质粒复制起始位点的序列(Solar etal.(1998)Microbiology And Molecular Biology Reviews 62(2):434-464)。不同的复制起点在每个细胞内提供了不同的质粒拷贝水平，并且可以为1至数百个拷贝/细胞。常用的细菌质粒复制起点包括但不限于pMB1衍生的起点(其具有非常高的拷贝衍生物)、ColE1起点、p15A、pSC101、pBR322以及具有低拷贝数的其他起点。这样的起点是本领域技术人员熟知的。pUC19起点导致每个细胞500-700个拷贝的拷贝数。pBR322起点具有15-20的已知拷贝数。这些起点仅因单个碱基对而异。ColE1起点拷贝数为15-20，并且衍生物(诸如pBluescript)具有300-500个拷贝数。例如，pACYC184中的p15A起点导致约10的拷贝数。pSC101起点赋予约5的拷贝数。可以从其获得起点的其他低拷贝数载体包括，例如pWSK29、pWKS30、pWKS129和pWKS130(参见，Wang et al.(1991)Gene 700:195-199)。中等至低拷贝数小于150，或小于100。低拷贝数小于20、25或30。本领域技术人员可以鉴定具有低或高拷贝数的质粒。例如，为了通过实验确定，无论拷贝数是高还是低均进行小量制备。高拷贝质粒每1ml的LB培养物应产生3-5μg DNA；低拷贝质粒每ml的LB培养物将产生0.2-1μg DNA。
细菌质粒的序列，包括复制起点的鉴定和序列，是熟知的(参见，例如，snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/)。
选择高拷贝质粒用于蛋白质的体外异源表达，因为相对于染色体基因基因剂量增加，蛋白质的特异性产量更高，并且对于治疗性细菌，所编码治疗剂的治疗剂量更高。然而，本文显示，为了递送编码RNA干扰(RNAi)的质粒，诸如通过本文所述的鼠伤寒沙门菌，尽管高拷贝质粒看起来在治疗上合乎理想地合适，但是低拷贝是更有效的。
如果表达的分子对生物体有毒，那么细菌维持高拷贝质粒的需求就可能成为一个问题。维持这些质粒的代谢要求可能以体内复制适应性为代价。用于递送干扰RNA的最佳质粒拷贝数可以取决于工程化以递送质粒的菌株的减毒机制。如果需要，鉴于本文的公开内容，技术人员可以为细菌的特定免疫刺激物种和菌株选择合适的拷贝数。本文显示，低拷贝数可能是有利的。
5.CpG基序和CPG岛
未甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷(CpG)基序普遍存在于细菌而不是脊椎动物的基因组DNA中。含有CpG基序的致病性DNA和合成的寡聚脱氧核苷酸(ODN)活化宿主防御机制，从而导致先天和获得性免疫应答。未甲基化的CpG基序包含中央未甲基化的CG二核苷酸加上侧翼区域。在人类中，根据结构和它们所诱导的免疫应答性质的差异，已鉴定出四类不同的CpG ODN。K型ODN(也称为B型)通常在硫代磷酸酯骨架上包含1至5个CpG基序。D型ODN(也称为A型)具有混合的磷酸二酯/硫代磷酸酯骨架，并具有侧翼是允许形成茎-环结构的回文序列以及在3′和5′末端处的poly G基序的单个CpG基序。C型ODN具有硫代磷酸酯骨架，并包含可形成茎环结构或二聚体的多个回文CpG基序。P类CpG ODN具有硫代磷酸酯骨架，并包含多个具有双回文的CpG基序，该回文可以在其富含GC的3′端形成发夹(Scheiermann andKlinman(2014)Vaccine 32(48):6377-6389)。出于本文的目的，在质粒DNA中编码CpG；它们可以作为基序或以基因引入。
Toll样受体(TLR)是用于感测病原体相关分子模式(PAMP)和活化针对病原体的先天免疫的关键受体(Akira et al.(2001)Nat.Immunol.2(8):675-680)。TLR9识别原核生物DNA中的低甲基化CpG基序，该基序在哺乳动物DNA中不是天然存在的(McKelvey et al.(2011)J.Autoimmunity 36:76-86)。在病原体吞噬到免疫细胞亚群中的胞内体后，CpG基序的识别诱导IRF7依赖性I型干扰素信号传导，并活化先天性和获得性免疫。
本文提供的免疫刺激性细菌(诸如沙门菌属物种，诸如鼠伤寒沙门菌)菌株携带含有CpG岛的质粒的菌株。这些细菌可以活化TLR9并诱导I型IFN介导的先天性和获得性免疫。如本文所例举的，含有低甲基化CpG岛的细菌质粒与在质粒中编码的RNAi(诸如靶向免疫检查点的RNAi，诸如靶向TREX1的shRNA或miRNA)组合可以引发先天性和获得性抗肿瘤免疫应答，并且因此，TREX1介导的STING途径活化可能具有协同或增强的抗肿瘤活性。例如，asd基因(SEQ ID NO:48)编码高频率的低甲基化CpG岛。CpG基序可与本文描述的或从本文明显的任何RNAi组合在一起包括在免疫刺激性细菌中，从而增强或改善所治疗对象的抗肿瘤免疫应答。
通过包括通常来自细菌基因的编码基因产物的核酸，并且还通过添加编码CpG基序的核酸，可以在质粒中包括免疫刺激性CpG。本文的质粒可包含CpG基序。示例性CpG基序是已知的(参见，例如，美国专利号8,232,259、8,426,375和8,241,844)。这些包括，例如，合成的免疫刺激性寡核苷酸，其碱基对长在10至100之间，10至20之间，10至30之间，10至40之间、10至50之间，10至75之间，其中通式为：
(CpG)n，其中n是重复的数。
通常，使用至少一个或两个重复；可以穿插非CG碱基。本领域技术人员非常熟悉通过调节TLR特别是TLR9来诱导免疫应答的CpG基序的一般用途。
6.质粒维持/选择成分
通常通过在质粒上包含抗生素抗性基因并在生长培养基中使用抗生素来确保质粒在实验室环境中的维持。如上所述，在质粒上使用与功能性asd基因互补的asd缺失突变体允许在不使用抗生素的情况下在体外进行质粒选择，并且允许在体内进行质粒维持。asd基因互补系统提供了这样的选择/维持(Galán et al.(1990)Gene 28:29-3)。使用asd基因互补系统将质粒维持在肿瘤微环境中提高了鼠伤寒沙门菌和其他免疫刺激性细菌菌株的功效，这些菌株被工程化以递送编码治疗性产物(诸如免疫刺激性蛋白、抗体、抗体片段或干扰RNA)的质粒。
7.RNA聚合酶启动子
如上所述，本文提供的质粒被设计为编码靶向免疫检查点和如上所述的其他靶标的干扰RNA。RNA表达盒包含用于在人细胞中转录的启动子，诸如H1启动子或U6启动子，或CMV启动子。U6和H1是RNA聚合酶III(RNAP III)启动子，其用于生产和处理小RNA。CMV启动子被RNA聚合酶II识别，并且比RNAP III更适合长RNA节段的表达。如上所述，启动子先于干扰RNA，诸如shRNA、siRNA或miRNA。
在真核细胞中，DNA被三种类型的RNA聚合酶转录：RNA Pol I、II和III。RNA Pol I仅转录核糖体RNA(rRNA)基因，RNA Pol II将DNA转录成mRNA和小核RNA(snRNA)，并且RNAPol III将DNA转录成核糖体5S rRNA(I型)、转运RNA(tRNA)(II型)和其他小RNA诸如U6snRNA(III型)。shRNA通常在真核III型RNAPol III启动子(诸如转录剪接体的U6 snRNA成分的人U6启动子和转录RNase P的RNA成分的H1人启动子)的控制下在体内转录。U6和H1启动子比其他Pol III或Pol II启动子更适合，因为它们结构简单，具有明确的转录起始位点，并自然地驱动小RNA的转录。U6和H1启动子没有携带用于转录来自转录起始位点下游的任何内容所必需的序列(Makinen et al.(2006)J.Gene Med.8:433-441)。因此，它们是用于shRNA表达的最直接的启动子。
使用其他启动子(例如II型pol III tRNA启动子)，虽然成功表达shRNA，但产生更长的dsRNA转录物，这可以诱导干扰素应答。也可以使用RNA pol II启动子，诸如人巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号8,202,846和8,383,599)，但更常用于表达长RNA节段。研究表明，在U6启动子附近添加来自CMV启动子增强子可以增加其活性，从而增加shRNA合成并改善基因沉默(Xia et al.(2003)Nucleic Acids Res.31(17):e100；Nie et al.(2010)Genomics Proteomics Bioinformatics 8(3):170-179)。由于细胞质DNA的产生，通常在shRNA转录中避免RNA pol II启动子，这导致促炎性干扰素应答。在这种情况下，鼠伤寒沙门菌感染的肿瘤细胞中的细胞质DNA介导的干扰素应答具有抗肿瘤益处，尤其是在如本文所提供的TREX1抑制的情况下。当细菌细胞中发生转录时，可以利用包括T7、pBAD和pepT启动子在内的原核启动子(Guo et al.(2011)Gene therapy 18:95-105；美国专利公开号2012/0009153、2016/0369282；国际申请公开号WO 2015/032165、WO 2016/025582)。
RNApol III启动子通常用于组成性shRNA表达。为了诱导表达，使用RNA pol II启动子。实例包括被L-阿拉伯糖诱导的pBAD启动子；四环素诱导型启动子，诸如TRE-tight、IPT、TRE-CMV、Tet-ON和Tet-OFF；逆转录病毒LTR；IPTG诱导型启动子，诸如LacI、Lac-O响应型启动子；LoxP-stop-LoxP系统启动子(美国专利号8,426,675；国际专利公开号WO 2016/025582)；和pepT，其是缺氧诱导型启动子(Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436)。这些启动子是熟知的。这些启动子的示例是人U6(SEQ ID NO:73)和人H1(SEQ ID NO:74)。
组织特异性启动子包括用于黑素瘤细胞和生黑色素细胞的TRP2启动子；用于乳腺和乳腺癌细胞的MMTV启动子或WAP启动子、用于肠细胞的Villin启动子或FABP启动子、用于胰腺β细胞的RIP启动子、用于角化细胞的角蛋白启动子、用于前列腺上皮的Probasin启动子、用于CNS细胞/癌症的巢蛋白启动子或GFAP启动子、用于神经元的酪氨酸羟化酶S100启动子或神经丝启动子、用于肺癌的克拉拉细胞分泌蛋白启动子，以及心脏细胞中的α肌球蛋白启动子(美国专利号8,426,675)。
8.DNA核靶向序列
DNA核靶向序列(DTS)(诸如SV40 DTS)介导DNA序列通过核孔复合物的易位。据报道，这种转运机制依赖于包含核定位序列的DNA结合蛋白的结合。已经证明在质粒上包含DTS以增加核转运和表达(Dean,D.A.et al.(1999)Exp.Cell Res.253(2):713-722)，并已被用于增加鼠伤寒沙门菌递送的质粒的基因表达(Kong et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109(47):19414-19419)。
Rho非依赖性的或I类转录终止子，诸如大肠杆菌的rrnB基因的T1终止子，包含DNA序列，这些序列形成导致转录延伸复合物的解离的二级结构。质粒中应包含转录终止子，以防止鼠伤寒沙门菌转录机制表达干扰RNA。这确保了编码的干扰RNA(诸如shRNA、微RNA和siRNA)的表达仅限于宿主细胞转录机制。
作为本文所述的癌症疗法，用于转化沙门菌属(诸如鼠伤寒沙门菌)的质粒包含以下所有或部分属性：1)CpG岛，2)细菌复制起点，3)用于质粒维持的asd基因选择标记，4)一个或多个人干扰RNA表达盒，5)DNA核靶向序列和6)转录终止子。
9.CRISPR
编码CRISPR盒的免疫刺激性细菌可用于感染人类免疫细胞、髓样细胞或造血细胞，以位点特异性地敲除感兴趣的靶基因。所使用的菌株可以是asd-，并且可以包含缺少互补asd盒并且包含kan盒的质粒。为了使菌株在液体培养基中体外生长，添加了DAP以互补asd-遗传缺陷。感染人细胞后，该菌株将不再复制，并递送CRISPR盒编码的质粒。该菌株也可以是减少或防止吞噬细胞的细胞焦亡(炎症介导的细胞死亡)的hilA-或缺乏SPI-1的一个或多个部分、或缺乏鞭毛蛋白或其任何组合。
G.含有针对示例性免疫靶基因的RNAi以刺激抗肿瘤免疫的肿瘤靶向免疫刺激性细菌
可以在质粒中编码针对任何免疫靶标的RNAi。这些包括但不限于本文公开内容中讨论的任何内容以及本领域技术人员已知的任何内容。以下讨论描述了示例性靶标。质粒可包含针对此类靶标的任何RNAi，包括但不限于shRNA、siRNA和微RNA。
1.TREX1
在本文提供的某些实施方案中，免疫刺激性细菌编码抑制性RNA，诸如shRNA，其抑制或破坏或阻抑TREX1表达。位于cGAS上游的TREX1编码的酶产物是I型干扰素途径的介质。TREX1编码哺乳动物细胞中主要的3′DNA核酸外切酶(也称为DNase III)。人TREX1蛋白与细菌核酸外切酶一样是催化有效的(Mazur and Perrino(2001)J.Biol.Chem.276:17022-17029)。本文也考虑了通过除RNA沉默以外的方法抑制TREX1表达的免疫刺激性细菌。
对于本文提供的免疫刺激性细菌，诸如表达针对TREX1的shRNA的那些细菌，TREX1活性的丧失和随后的cGAS/STING诱导的血管破坏的活化增强了鼠伤寒沙门菌的肿瘤定植。TREX1基因编码蛋白质，该蛋白质为314个氨基酸长(Mazur et al.(2001)J.Biol.Chem276:17022-17029)，以同型二聚体存在，并且缺乏核酸内切酶活性。TREX1在参与DNA修复的几种蛋白质之中，该DNA受到外源性遗传毒性应激的破坏，包括紫外线辐射和破坏DNA的化合物。TREX1可以通过从3′末端切除错配对的核苷酸来充当DNA polβ的编辑核酸外切酶(Mazur et al.(2001)J.Biol.Chem 276:17022-17029)。ssDNA的降解比dsDNA更有效3-4倍(Lindahl et al.(2009)Biochem Soc Trans 37(Pt 3),535-538)。经常与自身免疫性疾病相关的残基D18和D200的突变使TREX1酶无法降解dsDNA，并降低了其降解ssDNA的能力。DNA受损后，TREX1酶从内质网转移到细胞核，表明其参与了受损DNA的复制。由于小鼠成纤维细胞的UVC暴露，已观察到TREX1的启动子活化和上调，并且TREX1空小鼠细胞已证明对UVC光超敏(Tomicic et al.(2013)Bioch.Biophys.Acta 7533:1832-1843)。
已在遗传性罕见疾病Aicardi-Goutieres综合征(AGS)的患者中鉴定出导致TREX1丢失的突变，该综合征具有与自身免疫性疾病系统性红斑狼疮(SLE)和冻疮样狼疮(chilblain lupus)重叠的表型(Aicardi and Goutieres,(2000)Neuropediatrics 31(3):113)。TREX1的突变也与伴有脑白质营养不良(cerebral leukodystrophy)的视网膜血管病变(retinal vasculopathy)有关。TREX1介导的自身免疫性疾病与细胞无法通过降解在细胞质中积累的ssDNA和dsDNA以阻止自身免疫有关。TREX1空小鼠患有炎性心肌炎(inflammatory myocarditis)，导致循环衰竭，这是由慢性细胞因子产生引起的(Moritaet al.(2004)Mol Cell Biol 24(15):6719-6727；Yang et al.(2007)Cell 131(5):873-886；Tomicic et al.(2013)Bioch.Biophys.Acta 1833(8):1832-1843)。因此，TREX1缺乏会在DNA的细胞质积累后诱导先天免疫，从而导致炎症应答(Wang et al.(2009)DNARepair(Amst)8:1179-1189)。发现在TREX1缺陷细胞的胞质溶胶中积累的DNA的来源部分衍生自逃逸受损细胞核的内源性逆转录因子，因为已知TREX1代谢逆转录(RT)DNA(Stetsonet al.(2008)Cell 134(4):587-598)。在HIV感染中，HIV RT DNA积累在被感染的T细胞和巨噬细胞的胞质溶胶中，并且通常触发cGAS/STING活化抗病毒免疫。TREX1消化这种病毒DNA并允许HIV免疫逃逸(Yan et al.(2010)Nat.Immunol.11(11):1005-1013)。因此，TREX1充当STING的负调节因子，并且可被利用来逃逸多种逆转录病毒的检测，诸如鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和许多其他病毒(Hasan et al.(2014)Front.Microbiol.5:193)。
像STING一样，TREX1在大多数哺乳动物细胞类型中都表达，而TREX1空小鼠中的细胞因子的主要生产者则来自巨噬细胞和树突细胞(Ahn et al.(2014)J.Immunol.193(9):4634-4642)。数据表明TREX1负责降解自身DNA，该DNA可能从受损的细胞核泄漏到胞质溶胶中，在那里它将以其他方式结合并活化cGAS并导致自身免疫(Barber(2015)Nat.Rev.Immunol.15(12):760-770)。为了支持这一点，也缺乏cGAS的TREX1空小鼠和TREX1缺陷细胞受到完全保护免于I型干扰素活化和致命性自身免疫(Ablasser et al.(2014)J.Immunol.192(12):5993-5997；Gray et al.(2015)J.Immunol.195(5):1939-1943)。在负反馈回路中，I型干扰素和II型IFNγ也可诱导TREX1，因此TREX1可用于限制异常的自身免疫活化(Tomicic et al.(2013)Bioch.Biophys.Acta 1833:1832-1843)。
发现衍生自Aicardi-Goutieres综合征患者的含有突变的TREX1的淋巴细胞抑制血管生成和成神经细胞瘤细胞的生长，这种作用因IFN-α的存在而得到增强(Pulliero etal.(2012)Oncology Reports 27:1689-1694)。使用微RNA-103也已显示抑制TREX1的表达，破坏DNA修复和血管生成，并导致体内肿瘤生长降低(参见，Cheresh等人的美国专利公开号2014/0127284)。
TREX1是巨噬细胞活化和促炎功能的负调节因子。发现TREX1空巨噬细胞显示出增加的TNF-α和IFN-α产生，更高的CD86水平，和增加的抗原呈递给T细胞以及受损凋亡T细胞清除(Pereira-Lopes et al.(2013)J.Immunol.191:6128-6135)。无法充分消化TREX1空巨噬细胞中的凋亡DNA产生大量异常的胞质溶胶DNA，该DNA结合cGAS并活化STING途径以产生更高水平的I型干扰素(Ahn et al.(2014)J.Immunol.793:4634-4642)。然而，并非所有的细胞类型都对TREX1敲低的免疫刺激作用敏感。在对单个细胞类型的研究中，发现TREX1敲低后，树突细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和角化细胞产生I型干扰素，而B细胞、心肌细胞、神经元和星形胶质细胞则不产生(Peschke et al.(2016)J.Immunol.197:2157-2166)。因此，抑制吞噬了鼠伤寒沙门菌的吞噬细胞中的TREX1的功能将增强其促炎活性，同时驱动来自吞噬的肿瘤细胞中的胞质DNA的积累，这然后可以活化cGAS/STING途径。微RNA-103的使用抑制了TREX1的表达，破坏DNA修复和血管生成，并导致体内肿瘤生长降低(参见，Cheresh等人的美国公开号2014/0127284)。
研究发现，在超过三分之一的结肠直肠癌中，cGAS和/或STING的表达受到抑制，而在许多原发性和转移性黑素瘤和HPV+癌中，STING的表达丧失。STING信号传导在连续采样TME抗原环境的所有肿瘤-驻留APC中均保持完整，包括将肿瘤抗原交叉呈递给CD8+T细胞的Batf3-lineage CD103/CD8α+DC，这些APC也容易吞噬鼠伤寒沙门菌或被具有吞噬的含有TREX1基因敲低的鼠伤寒沙门菌的邻近巨噬细胞的I型IFN活化。
TREX1的失活通过允许dsDNA的胞质积累以与酶环状GMP-AMP(cGAMP)合酶(cGAS)(一种通过活化STING信号传导途径而触发I型干扰素和其他细胞因子产生的胞质DNA传感器)结合而增强免疫应答(Sun et al.(2013)Science 339(6121):786-791；Wu et al.(2013)Science 339(6121):826-830)。已显示STING途径的活化诱导有效的先天性和获得性抗肿瘤免疫(Corrales et al.(2015)Cell Reports 11:1018-1030)。
因此，如本文提供的免疫刺激性细菌菌株的实施方案被施用以抑制肿瘤-驻留APC中的TREX1并诱导cGAS/STING活化，从而活化这些DC以将宿主肿瘤抗原交叉呈递至CD8+T细胞并诱导局部和全身性肿瘤消退和持久的抗肿瘤免疫(Corrales et al.(2015)CellReports 11:1018-1030；Zitvogel et al.(2015)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.16:393-405)。
本文提供的免疫刺激性细菌表达针对TREX1的RNAi，并且TREX1的丢失和随后cGAS/STING诱导的血管破坏的活化增强了鼠伤寒沙门菌的肿瘤定植。
2.PD-L1
程序性细胞死亡蛋白1(PD-l)是一种免疫抑制受体，其参与免疫应答的负调节。其同源配体，程序性死亡配体1(PD-L1)在APC上表达，并且在与T细胞上的PD-1结合后，导致CD8+T细胞效应功能丧失，从而诱导T细胞耐受性。在某些人类癌症中，PD-L1的表达通常与肿瘤侵略和降低的存活相关(Gao et al.(2009)Clin.Cancer Res.15(3):971-979)。
设计用于阻断免疫检查点的抗体，例如抗-PD-l(例如派姆单抗、纳武单抗)和抗-PD-L1(例如阿妥珠单抗、阿维单抗、度伐利尤单抗)抗体在预防T细胞无反应性和破坏免疫耐受性中具有持久的成功。仅一小部分经治疗的患者表现出临床获益，且那些表现出临床获益的患者表现出自身免疫相关毒性(Ribas(2015)N.Engl.J.Med.373(16):1490-1492；Topalian et al.(2012)N.Engl.J.Med.366(26):2443-54)。除获得毒性外，PD-1/PD-L1疗法还经常导致耐药性，并且同时使用抗CTLA-4抗体(例如伊匹木单抗(ipilimumab))在临床试验中因明显的累加毒性而具有有限的成功。为了限制毒性并增强PD-L1阻断的功效，如本文所提供的具有针对PD-L1的shRNA的免疫刺激性细菌将与免疫细胞的TLR活化协同作用，从而活化和增强抗肿瘤免疫。
3.VISTA
免疫活化中的其他非冗余检查点可以与PD-1/PD-L1和CTLA-4协同作用，诸如T细胞活化V域免疫球蛋白(Ig)抑制因子(VISTA)。VISTA主要在APC上表达，特别是在肿瘤浸润性髓样细胞和髓样衍生的抑制细胞(MDSC)上表达，而在调节性T细胞(CD4+Foxp3+Treg)上表达较少(Wang et al.(2011)J.Exp.Med.208(3):577-592)。与PD-L1相似，VISTA上调直接抑制T细胞增殖和细胞毒性功能(Liu et al.(2015)PNAS 112(21):6682-6687)。靶向VISTA的单克隆抗体已显示出重塑小鼠中的肿瘤微环境，增加APC活化并增强抗肿瘤免疫(LeMercier et al.(2014)Cancer Res.74(7):1933-1944)。临床上，在用抗CTLA-4疗法治疗前列腺癌后，在肿瘤-驻留巨噬细胞上VISTA表达上调，从而证明免疫检查点的代偿性调节(Gao et al.(2017)Nat.Med.23(5):551-555)。据称大多数VISTA表达位于髓样细胞的细胞内区室中，而不是位于表面上，这可能会限制单克隆抗体方法的有效性(Deng et al.(2016)J.Immunother.Cancer 4:86)。如本文所提供的，使用包含针对VISTA的shRNA的肿瘤靶向细菌在APC内抑制VISTA的能力将更有效且完全地抑制VISTA的T细胞抑制功能，从而导致T细胞介导的抗肿瘤免疫的活化和肿瘤消退。
4.SIRPα
肿瘤细胞逃逸清除的一种机制是防止它们被先天免疫细胞吞噬。吞噬作用受到在造血和非造血细胞上广泛表达的CD47表面表达的抑制(Liu et al.(2015)PLoS ONE 10(9):e0137345)。一旦CD47结合其受体，就会启动信号调节蛋白α(SIRPα)，一种用于吞噬作用的抑制信号。SIRPα在吞噬细胞(包括巨噬细胞、粒细胞和DC)上大量表达。这样，CD47和SIRPα之间的蛋白质-蛋白质相互作用代表了APC特有的另一类免疫检查点，尤其是肿瘤-驻留巨噬细胞。CD47预防吞噬作用的有效性由以下事实证明：它经常在多种肿瘤中上调，从这使它们避免在肿瘤微环境中被APC吞噬(Liu et al.(2015)Nat.Med.21(10):1209-1215)。已经研究了几种阻断CD47/SIRPα相互作用的方法，包括开发抗CD47或抗SIRPα抗体或抗体片段、使用结合任一蛋白质或敲低CD47表达的小肽(美国专利号2013/0142786、2014/0242095；国际专利公开号WO 2015/191861；McCracken et al.(2015)Clin.Cancer Res.21(16):3597-3601)。为此，正在临床开发几种直接靶向SIRPα的单克隆抗体，其无论是单独使用还是与肿瘤靶向抗体(例如利妥昔单抗(Rituximab)、达雷木单抗(Daratumumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、西妥昔单抗(Cetuximab))组合使用，均可在称为抗体-依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的过程中增强抗体-受调理素作用的(antibody-opsonized)的肿瘤细胞的吞噬作用(McCracken et al.(2015)Clin.Cancer Res.21(16):3597-3601；Yanagita et al.(2017)JCI Insight 2(1):e89140)。
CD47/SIRPα相互作用还通过防止其吞噬作用消除而用以保持红细胞的寿命(Murata et al.(2014)J.Biochem.155(6):335-344)。因此，全身施用疗法，诸如广泛破坏这种相互作用的抗CD47抗体，已经导致了贫血毒性(Huang et al.(2017).J.Thorac.Dis.9(2):E168-E174)。基于SIRPα的全身疗法还有不良事件的风险，诸如通过产生全身性超吞噬自食性巨噬细胞而损害器官。如本文所提供的，使用含有针对SIRPα的shRNA的靶向肿瘤的免疫刺激性细菌将使CD47/SIRPα破坏局限于肿瘤微环境并消除这些不良事件。此外，在细菌活化TLR介导的促炎性信号传导途径的情况下抑制SIRPα将有效活化这些巨噬细胞，以使其对邻近的肿瘤细胞具有超吞噬作用(Bian et al.(2016)PNAS.113(37):E5434-E5443).
5.β-连环蛋白
免疫检查点途径例示了存在以防止免疫超活化和自身免疫的多层调节作用，以及颠覆这些途径以促进抗肿瘤免疫的困难。肿瘤演变为对于检查点疗法是难治性的一种机制是由于缺乏T细胞和树突细胞(DC)浸润，被称为非T细胞发炎或“冷肿瘤”(Sharma et al.(2017)Cell 9；168(4):707-723)。已经鉴定了几种肿瘤内在机制，这些机制导致抗肿瘤T细胞的排斥和对免疫疗法的抗性。特别是在黑素瘤中，检查点疗法难治性肿瘤的分子谱显示了升高的β-连环蛋白及其下游靶基因的特征，这与肿瘤浸润淋巴细胞的缺乏有关(Gajewski et al.(2011)Curr.Opin.Immunol.23(2):286-292)。
CTNNB1是编码β-连环蛋白的癌基因，并且可以诱导基因c-Myc和细胞周期蛋白D1的表达，从而导致肿瘤增殖。CTNNB1中的突变与某些癌症有关。使用鼠伤寒沙门菌shRNA载体对CTNNB1/β-连环蛋白进行基因沉默可用于治疗癌症(Guo el al.(2011)Gene therapy18:95-105；美国专利公开号2012/0009153/2016/0369282；国际专利公开号WO 2015/032165)。例如，当与对照细胞比较时，使用鼠伤寒沙门菌SL7207作为递送载体对CTNNB1进行shRNA沉默，减少了SW480异种移植小鼠中的肿瘤增殖和生长，并降低了c-Myc和细胞周期蛋白D1的表达(Guo el al.(2011)Gene therapy 18:95-105)。在有或没有针对免疫检查点PD-l和PD-L1的抗体治疗剂的情况下，使用miRNA也可以实现CTNNB1沉默以治疗肝母细胞瘤(hepatoblastoma)(国际申请公开号WO 2017/005773)。通过替代载体(例如脂质体)递送的靶向CTNNB1的siRNA或shRNA用于治疗CTNNB1相关癌症(包括腺癌(adenocarcinomas)和鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas))也会受到影响(美国专利公开号2009/0111762、2012/0294929)。
升高的β-连环蛋白信号传导直接抑制趋化因子CCL4募集Batf3-lineage CD103/CD8α+DC，从而阻止它们启动肿瘤抗原特异性CD8+T细胞(Spranger et al.(2015)Nature523(7559):231-235)。β-连环蛋白是WNT信号传导途径的主要下游介质，一种对成体组织再生、体内平衡和造血也至关重要的关键胚胎发育途径(Clevers et al.(2012)Cell 149(6):1192-1205)。过量的WNT/β-连环蛋白信号传导已牵涉到多种癌症中(Tai et al.(2015)Oncologist 20(10):1189-1198)。因此，已经采取了几种靶向WNT/β-连环蛋白信号传导的策略，但是由于缺乏对肿瘤微环境的特异性而阻碍了成功，导致对肠干细胞、骨骼更新和造血的脱靶毒性(Kahn(2014)Nat.Rev.Drug Dis.13(7):513-532)。本文提供的免疫刺激性细菌克服了这些问题。
例如，使用如本文所提供的具有针对β-连环蛋白的shRNA的免疫刺激性细菌的优势是增强T细胞启动的DC的趋化因子介导的浸润以及将冷肿瘤转化为T细胞发炎的肿瘤微环境，而无需现有治疗方式的全身毒性。此外，TLR先天性免疫信号传导途径的细菌活化与β-连环蛋白抑制协同作用，以进一步促进免疫活化和抗肿瘤免疫。
6.TGF-β
转化生长因子β(TGF-β)是一种在胚胎形成、伤口愈合、血管生成和免疫调节中具有多种作用的多效细胞因子。它以三种亚型存在于哺乳动物细胞中，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1是免疫细胞中最主要的(Esebanmen et al.(2017)Immunol Res.65:987-994)。TGF-β作为免疫抑制剂的作用可以说是其最主要的功能。特别是在肿瘤微环境中，其从潜在形式的活化对DC及其耐受抗原特异性T细胞的能力具有深远的免疫抑制作用。TGF-β也可以直接将Th1 CD4+T细胞转化为免疫抑制性Treg，从而进一步促进肿瘤耐受性(Traviset al.(2014)Annu Rev Immunol.32:51-82)。基于其肿瘤特异性免疫抑制功能，并且不管其已知的癌细胞生长和转移促进性质如何，抑制TGF-β都是癌症治疗的靶标。在多种人类肿瘤类型中已证明了高TGF-β信号传导，包括CRC、HCC、PDAC和NSCLC(Colak et al.(2017)Trends in Cancer 3:1)。TGF-β的全身性抑制可导致不可接受的自身免疫毒性，并且其抑制作用应局限于肿瘤微环境。这样，本文提供的具有针对TGF-β的RNAi(诸如shRNA)或针对TGF-βRII的shRNA的肿瘤靶向免疫刺激性细菌破坏了肿瘤免疫耐受性并刺激了抗肿瘤免疫。
7.VEGF
血管生成或新血管的发展，是建立任何肿瘤微环境的重要步骤。血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞增殖和血管生成的关键促分裂原，在肿瘤微环境中抑制VEGF显著降低肿瘤血管，从而使肿瘤的血液供应不足(Kim et al.(1993)Nature 362(6423):841-4)。这项早期研究导致了VEGF的单克隆抗体抑制剂贝伐单抗(bevacizumab)(Avastin；Genentech)的开发，其与化学疗法相组合已成为转移性CRC的治疗标准。贝伐单抗的全身施用也显示出显著的毒性，包括主要是由于出血造成的NSCLC的II期临床试验中的多起死亡。因此，已经评估了几种下一代抗血管生成药，诸如抗VEGF受体2抗体雷莫芦单抗(ramucirumab)(Cyramza，Imclone)和抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂阿昔替尼(axitinib)(Inlyta，Pfizer)，但没有一种能够克服全身毒性或明显改善无进展生存(Alshangiti etal.(2018)Curr.Oncol.25(Suppl 1):S45-S58)。尽管抗VEGF疗法的抗肿瘤活性已显示出一定的希望，但全身毒性显然是限制性的。这样，本文提供的仅靶向肿瘤微环境的疗法，例如具有针对VEGF的shRNA的免疫刺激性肿瘤靶向细菌，在防止全身毒性的同时提供了局部抗血管生成疗法。这种治疗方式具有被摄取到髓样细胞中的额外优势，该髓样细胞主要在肿瘤微环境中产生VEGF，在那里它将对肿瘤进展产生最大影响(Osterberg et al.(2016)Neuro-Oncology.18(7):939-949)。
8.额外的示例性检查点靶标
可以制备或在本文举例说明的RNAi(诸如微RNA和shRNA)的示例性检查点靶标包括但不限于：
其他示例性目标包括但不限于：
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H.药物生产、组合物和制剂
本文提供了包含本文提供的任何免疫刺激性细菌和药学上可接受的赋形剂或添加剂的制备方法、药物组合物和制剂。药物组合物可用于治疗疾病，诸如过度增生性疾病或状况，诸如肿瘤或癌症。免疫刺激性细菌可以单物质疗法施用，也可以与其他物质或治疗的组合疗法施用。可以将组合物配制成单剂量施用或多剂量施用。可以将物质配制成直接施用。所述组合物可以液体或干燥制剂提供。
1.制备
a.细胞库制备
由于本文所述免疫治疗剂的活性成分由工程化的自我复制细菌组成，因此所选的组合物将扩展为一系列细胞库，这些细胞库将维持长期保存并用作制备原料药的起始材料。根据美国联邦法规(CFR)21第211部分或其他相关监管机构的规定，在适当的制备工厂中根据当前的良好生产规范(cGMP)生产细胞库。由于免疫疗法的活性剂是活细菌，因此，从定义上讲，本文所述的产物是未经灭菌的并且不能进行最终灭菌。必须注意确保在整个制备过程中使用无菌程序以防止污染。因此，在制备过程中使用之前，必须对所有原材料和溶液进行灭菌。
通过对所选细菌菌株进行连续系列单菌落分离来生产主细胞库(MCB)，以确保起始材料中不存在污染物。用单个良好分离的细菌菌落接种含有无菌培养基(可以是复合培养基，例如LB或MSBB或确定培养基，例如补充有适当营养素的M9)的无菌培养容器，并允许细菌复制，例如通过在37℃摇晃孵化。然后通过将悬浮在含有一种或多种冷冻保护剂的溶液中来制备用于冷冻保存的细菌。
冷冻保护剂的实例包括：蛋白质诸如人或牛血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白；碳水化合物，包括单糖(半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等)及其非还原性衍生物(例如甲基葡葡萄糖甙)、二糖(海藻糖、蔗糖等)、环糊精和多糖(棉子糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐等)；氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或组氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)；甲胺，诸如甜菜碱；多元醇，诸如三羟或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；表面活性剂，例如普朗尼克(pluronic)；或有机硫化合物(诸如二甲亚砜(DMSO))及其组合。冷冻保存溶液可以在溶液中包含一种或多种冷冻保护剂，该溶液还可以包含盐(例如氯化钠、氯化钾、硫酸镁，和或缓冲剂诸如磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)，以及其他本领域技术人员已知的缓冲剂。
可以通过在培养材料中添加一种或多种浓缩的冷冻保护剂以达到冷冻和解冻过程中保持细菌的活力的最终浓度(例如，0.5％至20％丙三醇最终浓度)，或通过收获细菌(例如通过离心)并将其悬浮在含有适当终浓度冷冻保护剂的冷冻保存液中而将细菌悬浮在冷冻保存液中。然后将细菌在冷冻保存溶液中的悬浮液装入具有容器封闭系统的合适的无菌小瓶(塑料或玻璃)中，该容器封闭系统能够在冷冻条件下保持封闭完整性(例如丁基塞子和压接密封)。然后将主细胞库的小瓶冷冻(通过控制速率的冷冻机缓慢地冷冻，或通过直接放入冷冻机快速地冷冻)。然后将MCB冷冻保存在保持长期活力的温度(例如-60℃或更低)。解冻的主细胞库材料经充分表征，以使确保组成、纯度和活性按照相应当局的规定。
工作细胞库(WCB)以与主细胞库相同的方式生产，但起始材料来自MCB。MCB材料可以直接转移到含有无菌培养基的发酵容器中，并如上所述扩增。然后将细菌悬浮在冷冻保存液中，装入容器中，密封并在-20℃或以下冷冻。可以由MCB材料生产多个WCB，并且WCB材料可以用于制备另外的细胞库(例如制造商的工作细胞库MWCB)。将WCB冷冻保存并表征以确保组成、纯度和活性。WCB材料通常是用于生产诸如工程菌之类的生物学原料药的起始材料。
b.原料药制备
如上所述，在cGMP下使用无菌工艺制备原料药。工作细胞库材料通常用作在cGMP下制备原料药的起始材料，然而也可以使用其他细胞库(例如MCB或MWCB)。无菌加工用于所有细胞疗法的生产，包括基于细菌细胞的疗法。来自细胞库的细菌通过发酵扩增，这可以通过产生预培养物(例如在摇瓶中)或通过直接接种发酵罐来实现。发酵是在无菌的生物反应器或烧瓶中完成的，该反应器或烧瓶可以是一次性使用的或可重复使用的。通过浓缩(例如，通过离心、连续离心或切向流过滤)收获细菌。通过用缓冲剂交换培养基(例如，通过渗滤)从培养基成分和细菌代谢物中纯化浓缩的细菌。散装药物产品被配制并保存为中间体(例如，通过冷冻或干燥)或直接加工成药物产品。测试原料药的组成、强度、纯度、功效和质量。
c.药物产品制备
药物产品定义为其最终容器中所含活性物质的最终制剂。药物产品是根据cGMP使用无菌工艺生产的。药物产品是由原料药生产的。如有必要，可将原料药解冻或重构，然后以适当的目标强度配制。因为药物产品的活性成分是活的工程菌，所以强度取决于悬浮液中所含CFU的数量。如下所述，将散装产品稀释成适合于储存和使用的最终制剂。装满容器，并用容器封闭系统密封，并对药物产品贴标签。药物产品保存在适当的温度下以保持稳定性，并测试其组成、强度、纯度、功效和质量，并且如果符合指定的接受标准，则释放以供人使用。
2.组合物
药学上可接受的组合物是根据经监管机构或其他机构的批准而制备的，其根据公认的用于动物和人类的药典制备。所述组合物可以以溶液剂、混悬剂、粉剂或缓释制剂制备。通常，使用本领域熟知的技术和程序将化合物配制成药物组合物(参见例如AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,126)。该制剂应适合于施用方式。
可以将组合物配制为通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、皮下、瘤内、硬膜外、鼻腔、口服、阴道、直肠、表面、局部、耳道、吸入、颊(例如舌下)和经皮施用或任何途径。也可以考虑其他施用方式。取决于治疗的部位，施用可以是局部、表面或全身的。可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、表面应用(例如与手术后的伤口敷料结合)，通过注射，借助于导管，借助于栓剂或借助于植入物来局部施用到需要治疗的区域。组合物也可以与其他生物活性剂顺序地、间歇地或以在相同组合物中一起施用。施用还可以包括控释系统，包括控释制剂和装置控释，诸如通过泵。
在任何给定情况下，最合适的途径取决于多种因素，诸如疾病的性质、疾病的进展、疾病的严重程度以及所使用的特定组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂型。特别地，可以将组合物配制成用于全身、局部腹膜内、口服或直接施用的任何合适的药物制剂。例如，可以将组合物配制成用于皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内施用。可以采用施用方法来减少活性剂暴露于降解过程，诸如通过抗原和免疫原性应答的免疫干预。此类方法的实例包括在治疗部位的局部施用或连续输注。
可以将免疫刺激性细菌配制成合适的药物制备物，诸如用于口服施用的溶液剂、混悬剂、片剂、分散片、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂，以及透皮贴剂制备物和粉吸入剂。通常，使用本领域熟知的技术和程序将化合物配制成药物组合物(参见例如AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,126)。通常，制剂的模式取决于施用途径。可以将组合物配制成干燥(冻干的或其他玻璃化形式)或液体形式。当组合物以干燥形式提供时，它们可以在即将使用之前通过添加适当的缓冲剂诸如无菌盐溶液而重构。
3.制剂
a.液体、注射剂、乳剂
通常将制剂制成适合于施用途径。本文考虑了通常以皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内注射或输注为特征的胃肠外施用。用于胃肠外施用的细菌制备物包括预备注射(直接施用)的悬浮液或在使用前解冻的冷冻悬浮液、准备在使用前与再悬浮溶液组合的干燥的可溶性产品(如冻干粉)，以及乳剂。干燥的热稳定制剂诸如冻干制剂可用于储存单位剂量以备后用。
药物制剂可以是冷冻液体形式，例如悬浮液。如果以冷冻液体形式提供，则药物产品可以以浓缩制备物的形式提供，以在使用前解冻并稀释至治疗有效浓度。
药物制备物也可以以不需要解冻或稀释即可使用的剂型提供。这样的液体制备物可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂酌情制备，诸如悬浮剂(例如山梨糖醇、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如杏仁油、油性酯或分馏植物油)；和适用于微生物治疗剂的防腐剂。药物制备物可以干燥形式存在，诸如冻干或喷雾干燥的，以在使用前用水或其他无菌的合适媒介物重构。
合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖或丙三醇。溶液可以是水性或非水性的。如果静脉内施用，则合适的载剂包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及用于静脉内水合作用的其他缓冲溶液。对于瘤内施用，包含增稠剂诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇的溶液、油乳剂及其混合物的溶液可以适合于维持注射器的定位。
药物组合物可以包括载剂或其他赋形剂。例如，本文提供的药物组合物可包含稀释剂、佐剂、抗粘剂、粘合剂、包衣、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、清洁剂或吸附剂及其组合或与修饰的治疗性细菌一起施用的媒介物中的任何一种或多种。例如，胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载剂或赋形剂包括水性媒介物、非水媒介物、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂或赋形剂制备包括液体制备物在内的制剂。
药物组合物可以包括载剂，诸如稀释剂、佐剂、赋形剂或与组合物一起施用的媒介物。合适的药物载剂的实例在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中进行了描述。这样的组合物将包含治疗有效量的通常为纯化形式或部分纯化形式的化合物或物质，以及合适量的载剂，以提供适当施用于患者的形式。这样的药物载剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。水是典型的载剂。盐溶液以及右旋糖和丙三醇水溶液也可以用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。组合物除了活性成分还可包含：稀释剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；和粘合剂，诸如淀粉、天然树胶诸如阿拉伯胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其他本领域技术人员已知的这种粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水和乙醇。例如，合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、丙三醇或乙醇。如果需要的话，组合物还可包含其他少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其他此类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载剂包括水性媒介物、非水媒介物、抗菌剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格注射液(RingersInjection)，等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液(LactatedRingers Injection)。非水性胃肠外载剂包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括例如聚山梨酯，例如聚山梨酯80(吐温80)。可以包括金属离子的掩蔽剂或螯合剂，诸如EDTA。药物载剂还包括用于水混溶性媒介物的聚乙二醇和丙二醇，以及用于调节pH值的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可以包括非抗微生物防腐剂。
药物组合物还可包含其他少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其他此类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。本文还预期植入缓释或持续释放系统，使得维持恒定剂量水平(参见，例如，美国专利号3,710,795)。此类胃肠外组合物中包含的活性化合物的百分比高度取决于其特定性质以及化合物的活性和对象的需求。
b.干燥的热稳定制剂
可以干燥细菌。干燥的热稳定制剂，诸如冻干或喷雾干燥的粉末和玻璃化的玻璃，可以重构用于以溶液、乳剂和其他混合物形式施用。干燥的热稳定制剂可以由任何液体制剂诸如上述悬浮液制备。药物制备物可以冻干或玻璃化形式存在，以在使用前用水或其他合适的媒介物重构。
通过用无菌溶液重构干燥的化合物来制备热稳定制剂以用于施用。溶液可以包含赋形剂，其可以改善由粉末制备的活性物质或重构溶液的稳定性或其他药理学性质。通过将赋形剂(诸如右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的物质)溶解在合适的缓冲剂(诸如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其他本领域技术人员已知的这种缓冲剂)中来制备热稳定制剂。然后，将原料药加入到所得混合物中，并搅拌直至混合。将所得混合物分配到小瓶中用于干燥。每个小瓶将包含单个剂量，其包含l×105至l×1011个CFU。干燥后，用容器封闭系统密封产品瓶，防止水分或污染物进入密封的瓶中。干燥的产品可以在适当的条件下存储，例如-20℃、4℃或室温下。用水或缓冲溶液对该干燥的制剂进行重构提供了用于胃肠外施用的制剂。精确量取决于所治疗的适应症和所选化合物。该量可以根据经验确定。
4.用于其它施用途径的组合物
取决于所治疗的状况，本文还考虑了除胃肠外以外的其他施用途径，诸如表面施用、透皮贴剂，口服和直肠施用。上述悬浮液和粉剂可以口服施用，也可以重构以口服施用。用于直肠施用的药物剂型是直肠栓剂、胶囊和片剂以及用于全身作用的凝胶胶囊。直肠栓剂包括用于插入直肠的固体，其在体温下熔化或软化，释放一种或多种药学或治疗活性成分。直肠栓剂中的药学上可接受的物质是基质或媒介物以及提高熔点的物质。基质的实例包括可可脂(可可油)、甘油-明胶、碳蜡(聚氧乙二醇)和脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的适当混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的物质包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过模制来制备。直肠栓剂的典型重量约为2至3克。使用与口服施用制剂相同的药学上可接受的物质并通过相同的方法制备用于直肠施用的片剂和胶囊。适于直肠施用的制剂可以以单位剂量的栓剂提供。这些可以通过将原料药与一种或多种常规固体载剂例如可可脂混合，然后使所得混合物成形来制备。
对于口服施用，药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，该片剂或胶囊通过常规方式用药学上可接受的赋形剂而制备，诸如粘合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羧乙酸钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以通过本领域公知的方法将片剂包衣。
适用于颊(舌下)施用的制剂包括，例如，在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中含有活性化合物的糖锭；以及在惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中含有化合物的锭剂。
如针对局部和全身施用所述制备表面混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，并配制成霜剂、凝胶、软膏剂、乳剂、溶液剂、酏剂、洗剂、悬浮剂、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或其他适合表面施用的制剂。
所述组合物可以配制成用于表面应用的气雾剂，诸如通过吸入(参见，例如，美国专利号4,044,126；4,414,209和4,364,923，它们描述了用于递送用于治疗肺部疾病的类固醇的气雾剂)。这些用于施用到呼吸道的制剂可以单独或与惰性载剂如乳糖一起以气雾剂或喷雾剂溶液的形式，或以供吹入的微粉的形式。在这种情况下，制剂的颗粒通常将具有小于50微米或小于10微米的直径。
可以将化合物配制成用于局部或表面施用，例如以凝胶、霜剂和洗剂的形式表面应用于皮肤和粘膜(诸如眼)，并应用于眼睛或用于intracistemal或脊柱内应用。预期表面施用用于透皮递送并且还用于向眼或粘膜施用或用于吸入疗法。也可以单独或与其他药学上可接受的赋形剂组合地施用活性化合物的鼻溶液。
提供了适合于透皮施用的制剂。它们可以以任何合适的形式提供，诸如适合于与接受者的表皮保持紧密接触延长的时间段的离散贴剂。这样的贴剂在活性化合物为例如0.1至0.2M浓度的任选缓冲水溶液中包含活性化合物。适于透皮施用的制剂也可以通过电离子透入疗法递送(参见例如Tyle,P,(1986)Pharmaceutical Research 3(6):318-326)，并且通常采取活性化合物的任选缓冲水溶液的形式。
药物组合物也可以通过控释制剂和/或递送装置施用(参见例如美国专利号3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,916,899；4,008,719；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,591,767；5,639,476；5,674,533和5,733,566)。
5.剂量和施用
可以将组合物配制成用于单剂量或多剂量施用的药物组合物。可以以足以在不对所治疗的患者产生不良副作用的情况下发挥治疗有用效果的量包含免疫刺激性细菌。例如，调节药物活性化合物的浓度，使得注射剂提供有效量以产生所需的药理作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统中测试免疫刺激性细菌来凭经验确定，诸如通过使用本文所述或本领域已知的测定法。例如，可以采用标准的临床技术。可以采用体外测定法和动物模型来帮助确定最佳剂量范围。可以凭经验确定的确切剂量可以取决于患者或动物的年龄、体重、体表面积和状况、所施用的特定免疫刺激性细菌、施用途径、待治疗的疾病类型和疾病的严重性。
因此，可以理解的是，精确的剂量和治疗持续时间取决于所治疗疾病，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据推断而凭经验确定。浓度和剂量值也可以随要缓解的状况的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定的对象，应根据个体需要和施用组合物或指导组合物的施用的人员的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，并且本文列出的浓度范围仅作为示例，并不意图限制包含它们的组合物和组合的范围或用途。所述组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年或一次施用。通常，选择剂量方案以限制毒性。应该注意的是，主治医生会知道如何以及何时终止、中断或调整治疗，以由于毒性、骨髓、肝、肾或其他组织功能障碍而降低剂量。相反，如果临床反应不足(排除毒性副作用)，主治医师也将知道如何以及何时将治疗调整到更高的水平。
免疫刺激性细菌以足以发挥治疗有用效果的量包含在组合物中。例如，该量是在过度增殖性疾病或状况诸如癌症的治疗中达到治疗效果的量。
药物和治疗活性化合物及其衍生物通常以单位剂型或多剂型配制和施用。每个单位剂量包含预定量的与所需的药物载剂、媒介物或稀释剂一起足以产生所需治疗效果的治疗活性化合物。单位剂量形式包括但不限于包含合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物的片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胃肠外混悬剂和口服溶液剂或混悬剂，以及油水乳剂。单位剂量形式可以装在小瓶、安瓿瓶和注射器中，或者是独立包装的片剂或胶囊剂。单位剂量形式可以其分数或倍数施用。多剂量形式是包装在单个容器中以便以分开的单位剂型施用的多个相同的单位剂量形式。多剂量形式的实例包括小瓶、片剂或胶囊瓶或品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是未在包装中分开的多个单位剂量。通常，可以制备包含0.005％至100％范围的活性成分，其余部分由无毒载剂补齐的剂型或组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂量形式。
单位剂量的胃肠外制备物包装在安瓿瓶、小瓶或带针头的注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液或重构粉末制备物的体积取决于要治疗的疾病和选择用于包装的特定制品。如本领域已知和实践的，用于胃肠外施用的所有制备物必须是无菌的。
如所指出的，本文提供的组合物可以配制为本领域技术人员已知的任何途径，包括但不限于皮下、肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳道、透皮施用或任何施用途径。适用于这种途径的制剂是本领域技术人员已知的。组合物也可以与其他生物活性物质顺序地、间歇地或在相同组合物中一起施用。
药物组合物可以通过控释制剂和/或递送装置来施用(参见，例如，美国专利号3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770；3,916,899；4,008,719；4,687,660；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,354,556；5,591,767；5,639,476；5,674,533和5,733,566)。各种递送系统是已知的，并且可以用于施用选择的组合物，预期在本文中使用，并且可以容易地制备这种颗粒。
6.包装和制品
还提供了包含包装材料、本文提供的任何药物组合物和指示该组合物将用于治疗本文所述的疾病或状况的标签的制品。例如，标签可以指示该治疗是针对肿瘤或癌症的。
本文所述的免疫刺激性细菌和另一种治疗剂的组合也可以包装在制品中。在一个实例中，所述制品包含药物组合物，所述药物组合物包含免疫刺激性细菌组合物，并且不包含其他物质或治疗。在其他实例中，制品还包括另外治疗剂，诸如不同的抗癌剂。在该实例中，可以将物质一起或分开提供，以作为制品包装。
本文提供的制品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料是本领域技术人员熟知的。参见，例如，美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，其每一个都整体并入本文。药物包装材料的实例包括但不限于罩板包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合于选定制剂和预期施用方式和治疗方式的任何包装材料。制品的示例是包括单室和双室容器的容器。容器包括但不限于管、瓶和注射器。容器可以进一步包括用于静脉内施用的针。
包装的选择取决于物质，以及这些组合物是一起包装还是分开包装。通常，包装与其中所含的组合物不反应。在其他实例中，某些成分可以以混合物的形式包装。在其他实例中，所有成分均单独包装。因此，例如，可以将各成分包装为单独的组合物，在刚好在施用前混合，可以将它们直接一起施用。或者，可以将各成分包装为单独的组合物以分别施用。
包括其制品的选定组合物也可以以试剂盒的形式提供。试剂盒可以包括本文所述的药物组合物和以制品的形式提供用于施用的物品。组合物可以包含在用于施用的物品中，或者可以单独提供以在以后添加。该试剂盒可以任选地包括使用说明，包括剂量、给药方案和给药方式说明。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。
I.治疗方法和用途
本文提供的方法包括施用或使用免疫刺激性细菌用于治疗患有疾病或状况的对象的方法，该对象的症状可通过施用此类细菌来改善或减轻，例如癌症。在特定的实例中，疾病或状况是肿瘤或癌症。另外，还提供了与一种或多种其他用于治疗的物质(诸如抗癌剂如溶瘤病毒、免疫治疗剂和/或抗透明质酸剂诸如透明质酸酶)的组合疗法的方法。细菌可以通过任何合适的途径施用，包括但不限于胃肠外、全身、表面和局部，诸如瘤内、静脉内、直肠、口服、肌肉内、粘膜和其他途径。由于本文所述细菌的修饰，解决了与全身施用有关的问题。提供了适合于每种施用途径的制剂。本领域技术人员可以建立合适的方案和剂量并选择途径。
1.肿瘤
本文提供的免疫刺激性细菌、组合、用途和方法适用于治疗所有类型的肿瘤，包括癌症，特别是实体瘤，包括肺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。该方法也可用于血液学癌症。
通过本文提供的用途和方法进行治疗的肿瘤和癌症包括但不限于源自免疫系统、骨骼系统、肌肉和心脏、乳房、胰腺、胃肠道、中枢和周围神经系统、肾脏系统、生殖系统、呼吸系统、皮肤、结缔组织系统(包括关节、脂肪组织)和循环系统(包括血管壁)的那些。可以用本文提供的免疫刺激性细菌治疗的肿瘤的实例包括癌(carcinoma)、神经胶质瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤(liposarcoma))、腺癌(adenocarcinomas)、腺肉瘤(adenosarcomas)和腺瘤(adenomas)。此类肿瘤几乎可以发生在身体的所有部位，包括，例如乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏。
骨骼系统的肿瘤包括例如肉瘤和母细胞瘤(blastomas)，例如骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)和软骨母细胞瘤(chondroblastoma)。肌肉和心脏肿瘤包括骨骼肌和平滑肌的肿瘤，例如平滑肌瘤(leiomyomas)(平滑肌良性肿瘤)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcomas)、横纹肌瘤(rhabdomyomas)(骨骼肌良性肿瘤)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcomas)和心脏肉瘤(cardiac sarcoma)。胃肠道的肿瘤包括例如口腔、食道、胃、小肠、结肠和结肠直肠的肿瘤，以及胃肠道分泌器官(诸如唾腺、肝、胰腺和胆道)的肿瘤。中枢神经系统的肿瘤包括脑、视网膜和脊髓的肿瘤，也可以起源于相关的结缔组织、骨骼、血管或神经组织。还考虑了周围神经系统肿瘤的治疗。周围神经系统的肿瘤包括恶性周围神经鞘肿瘤(malignant peripheral nerve sheath tumors)。肾脏系统的肿瘤包括肾脏的那些肿瘤，例如肾细胞癌(renal cell carcinoma)，以及输尿管和膀胱的肿瘤。生殖系统的肿瘤包括子宫颈、子宫、卵巢、前列腺、睾丸和相关分泌腺的肿瘤。免疫系统的肿瘤既包括基于血液的肿瘤和实体瘤，包括淋巴瘤，例如霍奇金(Hodgkin′s)和非霍奇金(non-Hodgkin′s)。呼吸系统的肿瘤包括鼻道、细支气管和肺的肿瘤。乳腺肿瘤包括例如小叶癌和导管癌(lobular and ductal carcinoma)。
可以通过本文提供的免疫刺激性细菌和方法治疗的肿瘤的其他实例包括卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、中枢神经系统肿瘤(CNS neoplasms)、神经母细胞瘤(neuroblastomas)、毛细血管性血管母细胞瘤(capillary hemangioblastomas)、脑膜瘤(meningiomas)和转移性脑肿瘤(cerebral metastases)、黑素瘤、胃肠道和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤(glioblastoma)(例如多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme))和平滑肌肉瘤。如本文提供的可以治疗的其他癌症的实例包括但不限于淋巴瘤、母细胞瘤(blastoma)、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors)、间皮瘤(mesothelioma)、神经鞘瘤(schwannoma)、脑膜瘤(meningioma)、黑素瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤(lymphoid malignancies)。此类癌症的实例包括恶性血液肿瘤，诸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)；非霍奇氏金淋巴瘤(伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’slymphoma)、小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)/慢性淋巴细胞白血病、蕈样真菌病(mycosis fungoides)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)、边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)和淋巴浆细胞白血病(lymphoplasmacytic leukemia))；淋巴细胞前体细胞的肿瘤，包括B细胞型急性淋巴母细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia)/淋巴瘤，和T细胞型急性淋巴母细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)/淋巴瘤，胸腺瘤(thymoma)，成熟T和NK细胞的肿瘤，包括外周T细胞白血病(peripheral T-cell leukemias)、成年T细胞白血病(adult T-cell leukemia)/T细胞淋巴瘤以及巨粒淋巴细胞白血病(largegranular lymphocytic leukemia)；朗格汉斯细胞组织细胞增多症(Langerhans cellhistocytosis)；骨髓瘤形成(myeloid neoplasias)诸如急性髓性白血病(acutemyelogenous leukemias)，包括成熟型AML(AML with maturation)、无分化型AML(AMLwithout differentiation)、急性前髓细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia)、急性骨髓单核细胞性白血病(acute myelomonocytic leukemia)和急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemias)；骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes)和慢性骨髓增生性病症(chronic myeloproliferative disorders)，包括慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)；中枢神经系统的肿瘤，诸如神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、星形细胞瘤(astrocytoma)、成神经管细胞瘤(medulloblastoma)、室管膜瘤(ependymoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)；头颈部的实体瘤(例如，鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、唾腺癌(salivary gland carcinoma)和食道癌(esophagealcancer))、肺癌(例如，小细胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小细胞肺癌、肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)和肺鳞癌(squamous carcinoma of the lung))、消化系统癌症(例如胃或胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃肠道癌(gastrointestinalcancer)、胆管或胆道癌(cancer of the bile duct or biliary tract)、结肠癌(coloncancer)、直肠癌(rectal cancer)、结肠直肠癌和肛门癌(anal carcinoma))、生殖系统癌(例如睾丸、阴茎或前列腺癌，子宫、阴道、外阴、子宫颈、卵巢和子宫内膜癌)、皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、光化性角化病(actinic keratosis)、皮肤黑素瘤(cutaneous melanom))、肝癌(例如肝癌(liver cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)和肝细胞瘤(hepatoma))、骨癌(例如破骨细胞瘤(osteoclastoma)和溶骨性骨癌(osteolyticbone cancers))，其他组织和器官的癌症(例如胰腺癌、膀胱癌、肾脏癌或肾癌(kidney或renal cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、乳腺癌、腹膜癌(cancer of theperitoneum)和卡波西肉瘤)、血管系统的肿瘤(例如，血管肉瘤(angiosarcoma)和血管外皮细胞瘤(hemangiopericytoma))、威尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤(osteosarcoma)和尤因氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)。
2.施用
在实践本文的用途和方法中，可以将本文提供的免疫刺激性细菌施用于对象，包括患有肿瘤或具有赘生性细胞的对象或待免疫的对象。可以在向对象施用免疫刺激性细菌之前、同时或之后进行一个或多个步骤，包括但不限于以适合于施用免疫刺激性细菌的条件诊断对象，确定对象的免疫能力，对对象进行免疫，用化学治疗剂治疗对象，用放射治疗对象或手术治疗对象。
对于包括出于治疗目的而向荷瘤对象施用免疫刺激性细菌的实施方案，通常先前已经诊断出该对象患有赘生性状况。诊断方法还可包括确定赘生性状况的类型，确定赘生性状况的阶段，确定对象中一种或多种肿瘤的尺寸，确定对象的淋巴结中存在或不存在转移性或赘生性细胞，或确定对象存在转移。
用于向对象施用免疫刺激性细菌的治疗方法的一些实施方案可以包括确定原发肿瘤的尺寸或赘生性疾病的阶段的步骤，并且如果原发肿瘤的尺寸等于或大于阈值体积，或如果赘生性疾病的阶段处于或超过阈值阶段，则向对象施用免疫刺激性细菌。在类似的实施方案中，如果原发肿瘤的尺寸低于阈值体积，或者如果赘生性疾病的阶段处于或低于阈值阶段，则免疫刺激性细菌尚未施用于对象；此类方法可包括监测对象直至肿瘤尺寸或赘生性疾病阶段达到阈值量，然后将免疫刺激性细菌施用于对象。阈值尺寸可以根据几个因素而变化，包括肿瘤的生长速率、免疫刺激性细菌感染肿瘤的能力以及对象的免疫能力。通常，阈值尺寸将是足以使免疫刺激性细菌在肿瘤内或附近积累和复制而不会被宿主的免疫系统完全去除的尺寸，并且通常还将是足以维持细菌感染足够长的时间以使宿主对肿瘤细胞产生免疫应答的尺寸，通常约一个星期或更长时间，大约十天或更长时间或大约两个星期或更长时间。示例性阈值阶段是超过最低阶段的任何阶段(例如，I阶段或等价阶段)，或者是原发肿瘤大于阈值尺寸的任何阶段，或者是检测到转移性细胞的任何阶段。
可以使用向对象施用微生物的任何方式，条件是施用方式允许免疫刺激性细菌进入肿瘤或转移灶。施用方式可包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、肿瘤内、多次穿刺、吸入、鼻内、口服、腔内(例如，通过导管施用到膀胱，通过栓剂或灌肠剂施用到肠道)、耳、直肠和眼部施用。
本领域技术人员可以选择与对象和细菌相容，并且也有可能导致细菌到达肿瘤和/或转移灶的任何施用方式。本领域技术人员可以根据多种因素中的任何一种来选择施用途径，包括疾病的性质、肿瘤的类型以及药物组合物中所含的特定细菌。可以例如通过弹道式递送以胶体分散系统的形式施用到目标部位，或者可以通过注射入动脉来进行全身施用。
剂量方案可以是多种方法和量中的任一种，并且可以由本领域技术人员根据已知的临床因素确定。对于治疗其中免疫刺激影响治疗的疾病或病症，单一剂量可以是治疗有效的。这种刺激的示例是免疫应答，其包括但不限于特异性免疫应答和非特异性免疫应答之一或二者、特异性和非特异性应答、先天应答、初级免疫应答、获得性免疫、次级免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞活化、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。
如医学领域所知，对象的剂量可以取决于许多因素，包括对象的种类、尺寸、体表面积、年龄、性别、免疫能力和一般健康状况、要施用的特定细菌、施用持续时间和途径、疾病的种类和阶段(诸如肿瘤尺寸)以及同时施用的其他化合物(例如药物)。除了上述因素之外，如本领域技术人员可以确定的，这种水平还可以受到细菌的感染性和细菌的性质的影响。在本发明的方法中，细菌的合适的最小剂量水平可以是足以使细菌在肿瘤或转移灶中存活、生长和复制的水平。向65kg人施用细菌的示例性最低水平可包括至少约5×106菌落形成单位(CFU)、至少约1×107CFU、至少约5×107CFU、至少约1×108CFU、或至少约1×109CFU。在本发明的方法中，细菌的合适的最大剂量水平可以是对宿主无毒的水平，不引起3倍或更大的脾肿大的水平，在约1天后或约3天后或约7天后不会在正常组织或器官中产生菌落或菌斑的水平。向65kg人施用细菌的示例性最大水平可以包括不超过约5×1011CFU、不超过约1×1011CFU、不超过约5×1010CFU、不超过约1×1010CFU，或不超过约1×109CFU。
本文提供的方法和用途可包括向对象单次施用免疫刺激性细菌或向对象多次施用免疫刺激性细菌或其他各种方案，包括与其他抗肿瘤治疗剂和/或治疗的组合疗法。这些包括细胞疗法，诸如施用经修饰的免疫细胞；CAR-T疗法；CRISPR疗法；免疫疗法，诸如免疫检查点抑制剂，诸如抗体和抗体片段；化疗和化学治疗性化合物，诸如核苷类似物；手术；溶瘤病毒疗法；和放疗。
免疫刺激性细菌或包含所述免疫刺激性细菌的药物组合物可以用于治疗方法，其中所述治疗包括组合疗法，其中施用第二抗癌剂或治疗。第二抗癌剂或治疗在免疫刺激性细菌或药物组合物之前、同时、之后或间歇地施用，并且可以是例如免疫疗法、溶瘤病毒疗法、放疗、化疗或手术。免疫疗法可以是抗体或抗体片段，诸如抗原结合片段，包括抗PD-l、或抗PD-Ll、或抗CTLA4、或抗IL6、或抗VEGF、或抗VEGFR、或抗VEGFR2抗体，或其片段。
在一些实施方案中，单次施用足以在肿瘤中建立免疫刺激性细菌，在那里细菌可以在对象中定植并可以引起或增强抗肿瘤应答。在其他实施方案中，可以在不同的情况下施用提供用于本文的方法中的免疫刺激性细菌，其时间间隔通常至少一天。在先前的施用可能无法有效地将细菌递送到肿瘤或转移灶的情况下，分开施用可以增加将细菌递送到肿瘤或转移灶的可能性。在实施方案中，分开施用可以增加肿瘤或转移灶上可能发生细菌定植/增殖的位置，或者可以以其他方式增加肿瘤中积累的细菌的滴度，这可以增加引发或增强宿主抗肿瘤免疫应答。
当进行分开施用时，每次施用可以是相对于其他施用剂量的量相同或不同的剂量的量。在一个实施方案中，所有施用剂量的量是相同的。在其他实施方案中，第一剂量的量可以是比一个或多个后续剂量的量更大的剂量的量，例如，比后续剂量的量大至少10x，大至少100x或大至少1000x。在其中第一剂量的量大于一个或多个后续剂量的量的分开施用方法的一个实例中，所有后续剂量的量可以是相对于第一次施用而言相同的，较小的量。
分开施用可以包括两次或多次施用中的任意数目，包括两次、三次、四次、五次或六次施用。根据本领域已知的用于监测治疗方法的方法和本文提供的其他监测方法，本领域技术人员可以容易地确定进行的施用次数，或进行一种或多种其他施用的需求。因此，本文提供的方法包括向对象提供免疫刺激性细菌的一次或多次施用的方法，其中可以通过监测对象，并基于监视的结果确定是否要提供一次或多次其他施用来确定施用的次数。可以基于多种监测结果来决定是否提供一种或多种其他施用，包括但不限于肿瘤生长的指示或肿瘤生长的抑制、新转移灶的出现或转移灶的抑制、对象的抗细菌抗体滴度、对象的抗肿瘤抗体滴度、对象的整体健康状况和对象的体重。
施用之间的时间段可以是多种时间段中的任何一个。施用之间的时间段可以取决于多种因素中的任何一个，包括关于施用次数所述的监测步骤、对象产生免疫应答的时间段，对象清除正常组织中的细菌的时间段，或者肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段。在一个实例中，时间段可以取决于对象产生免疫应答的时间段；例如，该时间段可以大于对象产生免疫应答的时间段，诸如大于约一周，大于约十天，大于大约两周或大于约一个月；在另一个实例中，该时间段可以小于对象产生免疫应答的时间段，诸如小于约一周，小于约十天，小于约两周或小于约一个月。在另一个实例中，时间段可以取决于肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段；例如，该时间段可以大于施用表达可检测标记的微生物后在肿瘤或转移灶中产生可检测信号的时间量，诸如约3天，约5天，约一周，约十天，约两周或约一个月。
也可以通过施用含有本文提供的免疫刺激性细菌的组合物，诸如混悬液和其他制剂来进行本文所用的方法。这样的组合物包含如本文提供的或本领域技术人员已知的细菌和药学上可接受的赋形剂或媒介物。
如上所述，本文所提供的用途和方法还可以除了向对象施用免疫刺激性细菌外，还包括向对象施用一种或多种治疗性化合物，诸如抗肿瘤化合物或其他癌症治疗剂。治疗性化合物可以独立地或与免疫刺激性细菌一起发挥作用，以达到肿瘤治疗效果。可以独立起作用的治疗性化合物包括各种已知的化学治疗性化合物中的任一种，该化学治疗性化合物可以抑制肿瘤生长、抑制转移灶生长和/或形成、减小肿瘤或转移灶的尺寸、消除肿瘤或转移灶而不降低免疫刺激性细菌在肿瘤中积累、在肿瘤中复制，并引起或增强对象的抗肿瘤免疫应答的能力。此类化学治疗剂的实例包括但不限于烷基化剂，诸如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和对哌泊舒凡(piposulfan)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carubicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗雌激素包括，例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托米芬(toremifine)(Fareston)；抗代谢物诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；氮丙啶类(aziridines)诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙基蜜胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylmelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylol melamine)；叶酸补充物(folic acid replenisher)诸如亚叶酸；氮芥类(nitrogen mustards)诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophos-phamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧二氯甲基二乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；铂类似物诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；蛋白质类诸如精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)和天冬酰胺酶(asparaginase)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮鸟苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；紫杉烷类(taxanes)，诸如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel)以及其白蛋白化形式(即，nab-紫杉醇和nab-多烯紫杉醇)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；胸苷酸合酶抑制剂(如Tomudex)；其他化学治疗剂，包括乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine,DMFO)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰胼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)；丙亚胺(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2′2′,2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)、去甲长春碱(Navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；Xeloda；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-ll；视黄酸；esperamycin；卡培他滨(capecitabine)；和扑异构酶抑制剂诸如伊立替康(irinotecan)。可以使用上述中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
与免疫刺激性细菌一起起作用的治疗性化合物包括，例如，通过例如增加RNAi(诸如shRNA和miRNA，其抑制、阻抑或破坏检查点基因诸如PD-L1或TREX1或其他检查点基因的表达)的表达来增加细菌的免疫应答引发性质的化合物，或者可以进一步增强细菌定植/增殖的化合物。例如，改变基因表达的化合物可以诱导或增加细菌中基因的转录，例如外源基因，例如编码抑制、阻抑或破坏一个或多个检查点基因表达，从而引起免疫应答的shRNA的外源基因。可以改变基因表达的多种化合物中的任何一种都是本领域已知的，包括IPTG和RU486。其表达可被上调的示例性基因包括蛋白质和RNA分子，包括毒素、可将前药转化为抗肿瘤药的酶、细胞因子、转录调节蛋白、shRNA、siRNA和核糖酶。在其他实施方案中，可以与免疫刺激性细菌一起起作用以增加细菌的定植/增殖或免疫应答引发性质的治疗性化合物是可以与细菌表达的基因产物相互作用的化合物，并且这种相互作用可以导致对象中增加的肿瘤细胞杀死或增加的抗肿瘤免疫应答。可以与细菌表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可以包括例如前药或其他化合物，其以对象施用的形式几乎没有或没有毒性或具有其他生物活性，但是在与细菌表达的基因产物相互作用之后，该化合物可产生导致肿瘤细胞死亡的性质，包括但不限于细胞毒性、诱导凋亡的能力或触发免疫应答的能力。本领域已知多种前药样物质，包括更昔洛韦(ganciclovir)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、6-甲基嘌呤脱氧核苷、头孢菌素-阿霉素(ganciclovir)、4-[(2-氯乙基)(2-甲硫氧基乙基))氨基]苯甲酰-L-谷氨酸(4-[(2-chloroethyl)(2-mesuloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutamicacid)、对乙酰氨基酚、吲哚-3-乙酸、CB1954、7-乙基l0-[4-(l-哌啶基)-l-哌啶基]羰基氧喜树碱(7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-l-piperidino]carbonyloxycampotothecin)、双-(2-氯乙基)氨基-4-羟基苯基氨基甲酮28(bis-(2-chloroethyl)amino-4-hydroxyphenylaminomethanone 28)、1-氯甲基-5-羟基-1,2-二羟基-3H-苯并[e]吲哚(1-chloromethyl-5-hydroxy-1,2-dihyro-3Hbenz[e]indole)、表柔比星-葡糖苷酸(epirubicin-glucoronide)、5′-脱氧5-氟尿苷、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)和亚麻苦苷(linamarin)。
3.监测
本文提供的方法可进一步包括监测对象、监测肿瘤和/或监测向对象施用的免疫刺激性细菌的一个或多个步骤。本文提供的方法中可以包括多个监测步骤中的任一个，包括但不限于监测肿瘤尺寸、监测转移灶的存在和/或尺寸、监测对象的淋巴结、监测对象的体重或其他健康指标(包括血液或尿液标记物)、监测抗菌抗体滴度、监测可检测基因产物的细菌表达以及直接监测对象的肿瘤、组织和器官中的细菌滴度。
监测的目的可以简单地用于评估对象的健康状态或对象的治疗性治疗的进展，或者可以用于确定是否需要进一步施用相同或不同的免疫刺激性细菌，或者用于确定何时或是否将化合物施用于对象，其中该化合物可起到增加治疗方法的功效的作用，或者化合物可起到降低施用于对象的细菌的致病性的作用。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括监测一种或多种细菌表达的基因。细菌，诸如本文提供的或本领域其他已知的细菌，可以表达一种或多种可检测的基因产物，包括但不限于可检测的蛋白质。
如本文所提供的，在细菌中表达的可检测基因产物的测量可以提供对象中存在的细菌水平的准确测定。如本文进一步提供的，例如通过包括断层摄影方法的成像方法进行可检测基因产物的位置的测量可以确定细菌在对象中的定位。因此，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定对象的一个或多个器官或组织中细菌的存在或不存在，和/或对象的肿瘤或转移灶中细菌的存在或不存在。此外，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定存在于一个或多个器官、组织、肿瘤或转移灶中的细菌的滴度。包括监测对象中细菌的定位和/或滴度的方法可用于确定细菌的致病性，因为正常组织和器官的细菌感染，尤其是感染水平可指示细菌的致病性。可以在多个时间点进行包括监测对象中免疫刺激性细菌的定位和/或滴度的方法，并且因此可以确定对象中的细菌复制速率，包括对象的一个或多个器官或组织中的细菌复制速率；因此，包括监测细菌基因产物的方法可以用于确定细菌的复制能力。本文提供的方法还可以用于定量存在于各种器官或组织以及肿瘤或转移灶中的免疫刺激性细菌的量，并且从而可以指示细菌在对象中优先积累的程度；因此，细菌基因产物监测可用于确定细菌优先于正常组织或器官在肿瘤或转移灶中积累的能力的方法。由于本文提供的方法中使用的免疫刺激性细菌可以在整个肿瘤中积累或可以在肿瘤中的多个部位积累，并且也可以在转移灶中积累，因此本文提供的用于监测细菌基因产物的方法可用于确定肿瘤的尺寸或存在于对象中的转移灶的数目。这种监测一段时间内肿瘤或转移灶中细菌基因产物的存在可用于评估肿瘤或转移灶的变化，包括肿瘤的生长或缩小，或新转移灶的发展或转移灶的消失，并且也可以用于确定肿瘤的生长或缩小的速率，或新转移灶的发展或转移灶的消失，或肿瘤的生长或缩小的速率变化，或新转移灶的发展或转移灶的消失。因此，通过确定肿瘤的生长或缩小的速率、或新转移灶的发展或转移灶的消失、或肿瘤的生长或缩小的速率变化、或新转移灶的发展或转移灶的消失，监测细菌基因产物可用于监测对象的赘生性疾病，或确定治疗赘生性疾病的功效。
可以通过监测来检测多种可检测蛋白质中的任何一种，其示例是多种荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质)中的任一种、多种荧光素酶中的任一种、转移蛋白质或其他铁结合蛋白质；或受体、结合蛋白质和抗体，其中特异性地结合受体、结合蛋白或抗体的化合物可以是可检测物质或者可以用可检测物质(例如放射性核素或显像剂)进行标记。
肿瘤和/或转移灶尺寸可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种进行监测，包括外部评估方法或断层扫描或磁成像方法。除了本领域已知的方法，本文提供的方法例如监测细菌基因表达可用于监测肿瘤和/或转移灶尺寸。
在几个时间点监测尺寸可以提供有关肿瘤或转移灶的尺寸增加或减少的信息，并且还可以提供有关对象中其他肿瘤和/或转移灶的存在的信息。在多个时间点监测肿瘤尺寸可以提供有关对象中赘生性疾病发展的信息，包括治疗对象中赘生性疾病的功效。
本文提供的方法还可以包括监测对象中的抗体滴度，包括响应于向对象施用免疫刺激性细菌而产生的抗体。本文提供的方法中施用的细菌可以引发对内源性细菌抗原的免疫应答。在本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对由细菌表达的外源基因的免疫应答。本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对细菌抗原、细菌表达的外源基因产物或肿瘤抗原的抗体滴度可用于监测细菌的毒性，从而监测治疗方法的功效或监测用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。
监测抗体滴度可用于监测细菌的毒性。在将细菌施用于对象后的一段时间内，针对细菌的抗体滴度可能会有所不同，其中在某些特定时间点，较低的抗-(细菌抗原)抗体滴度可以表明较高的毒性，而在其他时间点，高的抗-(细菌抗原)抗体滴度可表明较高的毒性。本文提供的方法中使用的细菌可以是免疫原性的，因此可以在将细菌施用于对象后立即引发免疫应答。通常，当对象的免疫系统可以从所有正常器官或组织中去除细菌时，对象的免疫系统可以对免疫刺激性细菌产生强烈免疫应答的免疫刺激性细菌可以是具有低毒性的细菌。因此，在一些实施方案中，在将细菌施用于对象之后不久，针对细菌抗原的高抗体滴度可以表明细菌的低毒性。
在其他实施方案中，监测抗体滴度可用于监测治疗方法的功效。在本文提供的方法中，抗体滴度诸如抗-(肿瘤抗原)抗体滴度可以指示治疗方法(诸如治疗赘生性疾病的治疗方法)的功效。本文提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答。因此，通过监测抗-(肿瘤抗原)抗体的滴度，可以监测治疗方法引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答的功效。
在其他实施方案中，监测抗体滴度可用于监测用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。如本文所提供的，通过在肿瘤中积累的微生物中表达外源基因，方法可用于产生蛋白质、RNA分子或其他化合物，特别是RNA分子，诸如shRNA。监测针对蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体滴度可以指示肿瘤积累的微生物产生蛋白质、RNA分子或其他化合物的水平，并且也可以直接指示对这种蛋白质、RNA分子或其他化合物特异的抗体水平。
本文提供的方法还可以包括监测对象健康的方法。本文提供的一些方法是治疗方法，包括赘生性疾病治疗方法。如本领域中已知的，监测对象的健康可以用于确定治疗方法的功效。本文提供的方法还可以包括向对象施用本文提供的免疫刺激性细菌的步骤。监测对象的健康可以用于确定施用于对象的免疫刺激性细菌的致病性。如本领域中已知的，可以监测用于监测疾病诸如赘生性疾病、传染性疾病或免疫相关疾病的多种健康诊断方法中的任何一种。例如，对象的体重、血压、脉搏、呼吸、颜色、温度或其他可观察到的状态可以指示对象的健康。另外，来自对象的样品中一种或多种成分的存在或不存在或水平可以指示对象的健康。典型的样品可以包括血液和尿液样品，其中一种或多种成分的存在或不存在或水平可以通过进行例如血液panel或尿液panel诊断测试来确定。指示对象健康的示例性成分包括但不限于白细胞计数、血细胞比容和c-反应蛋白浓度。
本文提供的方法可以包括监测治疗，其中治疗决策可以基于监测的结果。本文提供的治疗方法可以包括向对象施用免疫刺激性细菌，其中细菌可以优先在肿瘤和/或转移灶中积累，并且其中细菌可以引起或增强抗肿瘤免疫应答。这样的治疗方法可以包括多个步骤，包括多次施用特定的免疫刺激性细菌，施用第二免疫刺激性细菌或施用治疗性化合物。可以基于监测对象的一种或多种结果来确定要施用于对象的免疫刺激性细菌或化合物的量、时间或类型。例如，对象中的抗体滴度可用于确定是否需要施用免疫刺激性细菌和任选的化合物，要施用的细菌和/或化合物的量以及要施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如，低抗体滴度可指示期望施用额外的免疫刺激性细菌、不同的免疫刺激性细菌和/或治疗性化合物，诸如诱导细菌基因表达的化合物或独立于免疫刺激性细菌有效的治疗性化合物。
在另一个实例中，对象的总体健康状况可以用于确定是否需要施用免疫刺激性细菌和任选的化合物、要施用的细菌或化合物的量以及要施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如，确定对象是健康的可指示期望施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物，诸如诱导细菌基因(例如抑制一个或多个检查点基因的shRNA)表达的化合物。在另一个实例中，监测可检测的细菌表达基因产物可以用于确定是否需要施用免疫刺激性细菌和任选的化合物、要施用的细菌或化合物的量以及要施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如，确定对象是健康的可指示期望施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物，诸如诱导细菌基因(例如抑制一个或多个检查点基因的shRNA)表达的化合物。这样的监测方法可以用于确定治疗方法是否有效，治疗方法是否对对象致病，细菌是否已在肿瘤或转移灶中积累，以及细菌是否在正常组织或器官中积累。基于这样的确定，可以得出进一步治疗方法的期望和形式。
在另一个实例中，监测可以确定免疫刺激细菌是否已经在对象的肿瘤或转移灶中积累。根据这样的确定，可以决定向对象进一步施用额外的细菌、不同的免疫刺激性细菌和任选的化合物。
J.实施例
仅用于说明目的包括以下实施例，并不旨在限制本发明的范围。
一些示例性工程化的免疫刺激性细菌菌株和命名的总结：
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可以理解，列出了这些菌株以供参考；在野生型鼠伤寒沙门菌菌株，诸如以ATCC保藏号#14028保藏的菌株，或具有其所有鉴定特征的菌株中，可以实现相同的缺失和插入。可以通过适当的选择或缺失另外使野生型菌株对腺苷呈营养缺陷型。这些菌株的构建和使用在公开的国际PCT申请号WO 2019/014398和美国申请公开号2019/0017050中进行了描述。
实施例1沙门菌属asd基因敲除菌株工程化
制备菌株AST-101。它是衍生自菌株YS1646(可从ATCC，目录号202165购得)的减毒鼠伤寒沙门菌菌株，已被工程化为asd-(asd基因敲除)。在该实施例中，鼠伤寒沙门菌菌株YS1646 asd-基因缺失是通过如图1所示并且如下面所描述的Datsenko和Wanner方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))的修饰进行工程化。该实施例和以下所有实施例中的方法和所得产物可用于其他起始细菌，诸如野生型鼠伤寒沙门菌，诸如以ATCC保藏号#14028保藏的菌株。
将λ-Red辅助质粒引入YS1646
如先前所述(Sambrook J.,(1998)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory)通过在LB中生长培养物并浓缩100倍并且用冰冷的10％丙三醇洗涤三次将YS1646菌株制备为电感受态。使用λ-Red辅助质粒pKD46(SEQ ID NO:218)在以下设置下使用0.2cm间隙比色皿对该电感受态菌株进行电穿孔：2.5kV，186ohms，50μF。在30℃将携带pKD46的转化株在含氨苄青霉素和1mML-阿拉伯糖的5mL SOC培养基中生长，并在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行选择。然后如以上针对YS1646所述将含有λ-Red辅助质粒pKD46的YS1646克隆制备电感受态。
asd基因敲除盒的构建
来自YS1646的基因组的asd基因(Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)用于设计asd基因敲除盒。将含有分别与asd基因的左手和右手区域同源的204和203bp的质粒转化到DH5-α感受态细胞中。将侧翼是lox P位点的卡那霉素基因盒克隆到该质粒中。然后使用引物asd-l和asd-2(表1)对asd基因敲除盒进行PCR扩增，并进行凝胶纯化。
执行asd基因缺失
用凝胶纯化的线性asd基因敲除盒对携带质粒pKD46的YS1646菌株进行电穿孔。在SOC培养基中回收电穿孔的细胞，并将其铺板于补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/ml)的LB琼脂平板上。在该步骤期间，λ-Red重组酶诱导染色体asd基因与kan盒的同源重组(由于存在于染色体asd基因上游和下游的同源侧翼序列)，并且发生asd基因的染色体拷贝的敲除。通过用来自断裂位点侧翼的YS1646基因组的引物(引物asd-3)和来自多克隆位点的引物(引物scFv-3)进行PCR扩增证实了所选的卡那霉素抗性克隆中存在被破坏的asd基因(表1)。将菌落也影印接种在有和没有补充DAP的LB平板上，以证明DAP营养缺陷。在没有补充DAP的情况下，所有具有asd基因缺失的克隆均无法生长，这表明DAP营养缺陷。
表1.引物信息
引物名称 引物序列 SEQ ID NO.
asd-1 ccttcctaacgcaaattccctg 219
asd-2 ccaatgctctgcttaactcctg 220
asd-3 gcctcgccatgtttcagtacg 221
asd-4 ggtctggtgcattccgagtac 222
scFv-3 cataatctgggtccttggtctgc 223
卡那霉素基因盒移除
通过使用Cre/loxP位点特异性重组系统来去除kan选择性标记。用pJWT68(表达cre重组酶的温度敏感质粒，SEQ ID NO:224)转化YS1646 asd-基因KanR突变体。在30℃选择AmpR菌落；pJWT68随后通过在42℃生长而消除。然后通过影印接种在具有和不具有卡那霉素的LB琼脂平板上来测试所选克隆(AST-101)的kan丢失，并使用来自在断裂位点侧翼的YS1646基因组的引物(引物asd-3和asd-4，引物序列见表1)通过PCR验证进行确认。
asd缺失突变体菌株AST-101的表征
asd突变体AST-101无法在37℃的LB琼脂平板上生长，但能够在包含50μg/mL二氨基庚二酸(DAP)的LB平板上生长。在LB液体培养基中评估asd突变体生长速率，并且其无法在液体LB中生长，但能够在补充有50μg/mL DAP的LB中生长，如通过在600nM测量吸光度所测定的。
asd基因缺失后AST-101asd基因座序列的序列确认
使用引物asd-3和asd-4通过DNA测序来验证AST-101asd基因缺失菌株。对在asd基因座侧翼的区域进行测序，并且该序列证实了asd基因已从YS1646染色体上缺失。
实施例2来自野生型鼠伤寒沙门菌的修饰的鼠伤寒沙门菌菌株的生成
使用如Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))中所述的λ衍生的Red重组系统从野生型鼠伤寒沙门菌菌株ATCC 14028的基因组中分别缺失purI、msbB和asd基因，以产生命名为14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd的基础菌株。随后将鞭毛蛋白基因fljB和fliC缺失以产生菌株14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/Δflic，然后将pagP基因缺失以产生菌株14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/Δflicl/ΔpagP。用含有功能性asd基因的质粒对菌株14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/Δflic和14028:ΔpurI/ΔmsbB/Δasd/ΔfljB/Δflicl/ΔpagP进行电穿孔，以互补asd的染色体缺失并确保质粒体内维持，且真核表达盒在EFl-α启动子的控制下编码红色荧光蛋白mCherry。
实施例3多种同系鼠肿瘤模型中修饰的鼠伤寒沙门菌靶标显示出强劲的肿瘤生长抑制PD-L1
免疫系统已发展出多种检查和平衡，以限制自身免疫。程序性细胞死亡蛋白1(PD-l)和程序性死亡配体1(PD-L1)是许多通过下调免疫应答起作用的抑制性“免疫检查点”的两个实例。PD-L1与PD-l的结合干扰CD8+T细胞信号传导途径，从而损害CD8+T细胞的增殖和效应功能，并诱导T细胞耐受性(Topalian et al.(2012)N Engl J Med 366:3443-3447)。
递送shRNA以敲低PD-L1基因的修饰的鼠伤寒沙门菌菌株的肿瘤定植破坏了其与PD-1的结合，和其对CD8+T细胞功能的抑制。PD-L1/PD-1检查点抑制与包含CpG质粒DNA的免疫刺激性鼠伤寒沙门菌全部以一种治疗方式很好地协同作用。代替RNAi，可以修饰免疫刺激性细菌以编码抑制PD-L1或PD-l以抑制PD-l途径的抗原结合片段或单链抗体。
为了证明YS1646菌株((其包含编码针对PD-L1的shRNA的质粒)(AST-105)，或者PD-L1或PD-l途径的其他抑制剂)的体内功效，将该菌株与AST-102菌株(含有对照质粒，该对照质粒也包含CpG基序)相比在鼠结肠癌模型中进行了评估。对于该实验，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)在右侧胁腹中SC接种CT26鼠结肠癌(100μL PBS中2×105个细胞)。将带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠用5×106CFU的AST-105或AST-102静脉内(IV)注射两次，间隔4天，或者IV施用抗PD-Ll抗体(4mg/kg，BioXCell clone 10F.9G2)。首个IV剂量六小时后，给小鼠放血，收集血浆，并使用小鼠炎症流式微球阵列(Mouse InflammationCytometric Bead Array)试剂盒评估促炎细胞因子，并通过FACS(BD Biosciences)进行分析。
与用含质粒的对照菌株AST-102的处理相比，用菌株AST-105的处理显示出统计学上显著的肿瘤控制(69％TGI，p＝0.05，第25天)。与全身施用抗PD-Ll抗体相比，用AST-105(表达shPD-Ll)的处理的肿瘤生长抑制也较大(68％TGI vs PD-Ll)。
比较IV注射后6小时先天性促炎细胞因子的产生，菌株AST-105引发的细胞因子显著高于抗PD-Ll抗体(p<0.05)，并且远高于来自AST-102的那些。这些数据表明，与全身施用抗PD-L抗体相比，在肿瘤微环境中抑制PD-L1独特地活化强效促炎细胞因子，诱导抗肿瘤免疫并促进结肠癌鼠模型中的肿瘤生长抑制。
实施例4修饰的鼠伤寒沙门菌shTREX1的肿瘤内施用在双肋腹鼠结肠癌模型中提供远端肿瘤定植和完全抗肿瘤应答
诱导对肿瘤的获得性免疫的标志是诱导未处理的远端肿瘤消退的能力。为了评估包含pEQU6shRNA质粒的YS1646菌株在双侧腹鼠结肠癌模型中诱导原发性和远端肿瘤生长抑制的能力，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)用CT26鼠结肠癌(100μL PBS中2×105个细胞)在左右侧胁腹中SC接种。将带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠用5×106CFU的AST-104(YS1646中的pEQU6shTREX1)、AST-105(YS1646中的pEQU6 shPD-Ll)或AST-102(YS1646中的质粒对照)间隔四天瘤内(IT)注射到右侧胁腹肿瘤两次，并与PBS对照进行比较。
与PBS对照相比，IT注射AST-104和AST-105在所注射的肿瘤中诱导了显著的肿瘤生长抑制(AST-105-60.5％TGI，p＝0.03；AST-104-61.4％TGI，p＝0.03，第25天)。与AST-105不同，仅AST-104诱导了与PBS相比对未处理的远端肿瘤的显著生长抑制(60％TGI，p<0.0001，第25天)，和与含质粒对照的AST-102相比显著的远端肿瘤生长抑制(p＝0.004，第25天)。与PBS对照(p＝0.0076，对数秩(Mantel-Cox)检验)相比，AST-104菌株还表现出明显的肿瘤消退和增加的生存期，其中2/10完全缓解。
为了确定细菌是否定植于所注射的肿瘤以及远端肿瘤，处死用AST-104处理的荷瘤小鼠并收集肿瘤。将所注射的肿瘤和远端肿瘤转移至M管中，并使用gentleMACSTM分离器(Miltenyi Biotec)在PBS中均质化。连续稀释肿瘤均质并将其铺在LB琼脂平板上，并在37℃孵育以进行菌落形成单位(CFU)测定。如图2所示，远端肿瘤以与所注射的肿瘤以相同的程度被定植，这表明用瘤内施用途径给药的工程沙门菌属菌株能够转移并定植于远端病变。这些数据证明了瘤内施用免疫刺激性细菌的功效，其具有优先于其他器官全身定植于远端肿瘤病变的能力，和活化STING I型干扰素途径导致全身肿瘤消退和完全缓解的功效。
实施例5与YS1646亲代菌株相比，具有含CpG元件的质粒的经修饰的鼠伤寒沙门菌菌株显示出增强的抗肿瘤活性
Toll样受体(TLR)是用于感测病原体相关分子模式(PAMP)和活化针对病原体的先天免疫的关键受体(Akira et al.(2001)Nat.Immunol.2(8):675-680)。其中TLR9负责识别致病DNA中的低甲基化CpG基序，该基序在哺乳动物DNA中不是天然存在的(McKelvey etal.(2011)J.Autoimmunity 36:76)。在病原体吞噬到免疫细胞亚群中的胞内体后，CpG基序的识别诱导IRF7依赖性I型干扰素信号传导，并活化先天性和获得性免疫。本文显示，与不含质粒的YS1646菌株相比，携带含有CpG基序质粒的经修饰的鼠伤寒沙门菌(YS1646 pEQU6加扰)的鼠伤寒沙门菌菌株YS1646类似地活化TLR9并诱导I型IFN介导的先天性和获得性免疫。
表2显示了此处使用的工程质粒中的CpG基序。AST-103菌株中的pEQU6 shSCR(非同源shRNA)质粒具有362个CpG基序，表明与缺乏利用这种质粒进行转化的相同沙门菌属相比，基于沙门菌属的质粒递送可以是免疫刺激性的并具有抗肿瘤作用。为了评估YS1646内含CpG的质粒在鼠结肠癌模型中诱导肿瘤生长抑制的能力，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组9只小鼠)在右侧胁腹中皮下(SC)接种CT26(100μL PBS中2×105个细胞)。对带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠每周IV注射三剂5×106CFU的YS1646(AST-100)或含有具有CpG基序的shRNA加扰质粒的YS1646(AST-103)，并与PBS对照进行比较。
表2.工程质粒中的CpG基序
序列名称 CpG基序数 SEQ ID NO.
pBR322Origin 80 243
pEQU6(shSCR) 362 244
Asd Gene ORF 234 242
pATI-2.0 538 245
如图3所示，与PBS相比，YS1646(AST-100)菌株表现出适度的肿瘤控制(32％TGI，p＝ns，第28天)。AST-103菌株(其与YS1646的区别仅在于添加编码非同源加扰shRNA的含CpG的质粒)与单独的未转化且因此缺乏质粒的YS1646相比，表现出非常显著的肿瘤生长抑制作用(p＝0.004，第32天)。
asd基因具有234个CpG基序(表2)，表明包含它的质粒可以具有免疫刺激性质。如图16所示，与单独的PBS相比，AST-109(具有加扰shRNA的YS1646-ASD)具有51％的肿瘤生长抑制，表明具有强烈的免疫刺激作用。
这些数据证明了在肿瘤靶向的减毒鼠伤寒沙门菌菌株中含有TLR9活化CpG基序的质粒DNA的有效免疫刺激性质。
实施例6载体合成通过质粒的asd表达来互补asd缺失
化学合成质粒(pATIU6)并组装(SEQ ID NO:225)。该质粒包含以下特征：高拷贝(pUC19)起点或复制、用于驱动短发夹表达的U6启动子、侧翼是用于后续去除的Hindlll限制性位点的氨苄青霉素抗性基因，以及包含85个碱基对的在起始密码子上游的序列的asd基因(SEQ ID NO：246)。通过用SpeI和XhoI进行限制性消化并连接和克隆到大肠杆菌DH5-α中，将靶向鼠TREX1的shRNA或加扰的非同源shRNA序列引入该载体。将所得的质粒(分别命名为pATI-shTREX1和pATI-shSCR)在大肠杆菌中扩增并纯化，并通过电穿孔以转化为asd敲除菌株AST-101，并进行LB amp平板上的克隆选择以分别产生菌株AST-108和AST-107。在没有DAP的情况下，互补有pATIU6衍生质粒的asd-突变体能够在LB琼脂和液体培养基上生长。
在随后的迭代中，将来自pATI-shTREX1的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)替换为卡那霉素抗性基因。这通过用HindIII消化pATI-shTREX1质粒，接着进行凝胶纯化以去除AmpR基因来完成。使用引物APR-001和APR-002(SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:227)进行卡那霉素抗性基因(KanR)的PCR扩增，利用HindIII的消化和连接到凝胶纯化、消化的pATIU6质粒中。
在随后的迭代中，使用定点诱变(Site-Directed Mutagenesis)试剂盒(NewEngland Biolabs)和引物APR-003(SEQ ID NO:228)和APR-004(SEQ ID NO:229)将位置148处的核甘酸T改变为C来将单点突变在pUC19复制起点引入pATIKan质粒。该突变使复制起点与pBR322复制起点同源，以减少质粒拷贝数。
pATI2.0
设计并合成了包含以下特征的质粒：pBR322复制起点、SV40 DNA核靶向序列(DTS)、rrnB终止子、用于驱动shRNA表达随后侧接用于克隆启动子和shRNA或微RNA的限制性位点的U6启动子、asd基因、rrnG终止子，以及侧翼是用于处理的Hindlll位点的卡那霉素抗性基因和多克隆位点(SEQ ID NO：247)。另外，设计并合成了质粒，用于表达两个单独的shRNA或微RNA。该质粒包含以下特征：pBR322复制起点、SV40 DNA核靶向序列(DTS)、rrnB终止子、用于驱动shRNA表达随后侧接用于克隆启动子和shRNAs或微RNA的限制性位点的U6启动子、用于驱动第二shRNA或微RNA表达的H1启动子、位于H1和U6启动子之间的450bp随机生成填充序列、asd基因、rrnG终止子，以及侧翼是用于处理的Hindlll位点的卡那霉素抗性基因和多克隆位点(SEQ ID NO:245)。
实施例7通过缺失fliC和fljB基因进行的鼠伤寒沙门菌鞭毛基因敲除菌株工程化
在本文的实施例中，鼠伤寒沙门菌菌株被工程化为缺乏鞭毛蛋白亚基fliC和fljB以减少促炎信号传导。将fliC和fljB缺失依次工程化到YS1646(AST-101)的asd基因缺失菌株的染色体中。
缺失fliC
在该实施例中，使用实施例1中所详细描述并且在图4中示例性地示出的Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))的方法的修饰将fliC从AST-101菌株的染色体中缺失。排序了合成的fliC基因同源臂序列，其在fliC基因侧翼包含224和245个碱基的同源序列，克隆到称为pSL0147的质粒中(SEQ ID NO:230)。然后将侧翼是cre/lox p位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0147中，然后用引物fliC-l(SEQ ID NO:232)和fliC-2(SEQ ID NO:233)对fliC基因敲除盒进行PCR扩增并凝胶纯化，并通过电穿孔引入到带有温度敏感性λ-Red重组质粒pKD46的AST-101菌株中。在SOC+DAP培养基中回收电穿孔的细胞，并铺板在补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/mL)的LB琼脂板上。选择菌落并筛选以通过使用引物fliC-3(SEQ ID NO:234)和fliC-4(SEQ ID NO:235)的PCR进行敲除片段的插入。然后通过在42℃培养所选的卡那霉素抗性菌株并筛选氨苄青霉素抗性丧失来处理pKD46。然后，通过电穿孔表达Cre重组酶的温度敏感质粒(pJW1680)来处理卡那霉素抗性标记，并在30℃选择AmpR菌落；随后通过在42℃生长培养物来消除pJW1680。然后通过使用破坏位点侧翼的引物(fliC-3和flic-4)进行的PCR和琼脂糖凝胶上的电泳迁移率的评估来测试选定的fliC敲除克隆的卡那霉素标记丢失。
缺失fljB
然后，使用上述方法的修饰，在asd/fliC缺失的YS1646菌株中缺失fljB。合成了合成的fljB基因同源臂序列(其包含fliC基因侧翼的分别为249和213个碱基的左侧和右侧序列)，并将其克隆到称为pSL0148的质粒中(SEQ ID NO:231)。然后将侧翼是cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0148中，然后用引物fljB-l(SEQ ID NO:236)和fljB-2(SEQ IDNO:237)对fljB基因敲除盒进行PCR扩增并凝胶纯化，并通过电穿孔引入到带有温度敏感性λ-Red重组质粒pKD46的AST-101菌株中。然后如上所述通过cre-介导的重组来处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非容许温度下进行生长来处理温度敏感性质粒。通过使用引物fliC-3和fliC-4或fljB-3(SEQ ID NO:238)和fljB-4(SEQ ID NO:239)的PCR来扩增fliC和fljB基因敲除序列，并通过DNA测序进行验证。将YS1646的该asd-/fliC-/fljB-突变衍生物命名为AST-111。
引物序列信息
引物序列信息
引物名称 引物序列 SEQ ID NO.
flic-1 CGTTATCGGCAATCTGGAGGC 232
flic-2 CCAGCCCTTACAACAGTGGTC 233
flic-3 GTCTGTCAACAACTGGTCTAACGG 234
flic-4 AGACGGTCCTCATCCAGATAAGG 235
fijb-1 TTCCAGACGACAAGAGTATCGC 236
fijb-2 CCTTTAGGTTTATCCGAAGCCAGAATC 237
fijb-3 CACCAGGTTTTTCACGCTGC 238
fijb-4 ACACGCATTTACGCCTGTCG 239
工程鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白敲除菌株的体外表征
通过将10微升的过夜培养物点样到游泳平板(含有0.3％琼脂和50mg/mL DAP的LB)上来评估含有fliC和fljB缺失的YS1646衍生的asd-突变菌株(在本文称为AST-111或ASD/FLG)的游泳运动性。尽管观察到了YS1646和asd缺失的菌株AST-101的运动性，但asd/fliC/fljB缺失的菌株AST-111明显没有运动性。然后将AST-111菌株用pATIshTREX1(含有asd基因和靶向TREX1的shRNA的质粒)进行电穿孔以产生AST-112，并且评估其在没有DAP下的生长速率。如图5所示，ASD/FLG(pATI-shTREX1)菌株AST-112能够在不存在补充DAP的情况下在LB中复制，并且以与包含pATIshTREX的asd菌株(AST-108)相当的速率生长。这些数据表明，鞭毛蛋白的消除不会降低鼠伤寒沙门菌在体外的适应性(fitness)。
消除鞭毛蛋白亚基减少巨噬细胞中的细胞焦亡。为了证明这一点，在庆大霉素保护试验中以MOI约100用含有低拷贝shTREX1质粒的asd/fliC/fljB缺失菌株(命名为AST-118)，或用含有相同质粒的asd缺失菌株(AST-117)感染5×105个小鼠RAW-dualTM巨噬细胞(InvivoGen,San Diego,Ca.)。感染24小时后，使用PierceTMLDH细胞毒性测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Ma.)，收集培养物上清液并评估作为细胞死亡的标志的乳酸脱氢酶释放。AST-117诱导75％的最大LDH释放，而AST-118诱导54％的最大LDH释放，这表明鞭毛蛋白基因的缺失降低了鼠伤寒沙门菌诱导的细胞焦亡。
与亲代asd菌株相比，含有shTREX1质粒的ASD/FLG敲除菌株在小鼠中显示出增强的抗肿瘤活性、增强的干扰素γ反应和增加的肿瘤定植。
为了评估在鼠结肠癌模型中施用的鞭毛蛋白敲除菌株的影响，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)在右侧胁腹中SC接种CT26(100μL PBS中2×105个细胞)。对带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠每周IV注射三剂的5×106CFU的含pATIKan-shTREX1质粒的ASD/FLG菌株(AST-113)或具有相同pATIKan-shTREX1质粒的ASD菌株(AST-110)，并与PBS对照进行比较。首个IV剂量六小时后，给小鼠放血，收集血浆，并使用小鼠炎症流式微球阵列试剂盒评估促炎细胞因子，并通过FACS(BD Biosciences)进行分析。
如图6所示，与亲代ASD pATI-shTREX1菌株AST-110相比，不能产生鞭毛并且含有pATIshTREX1质粒(ASD/FLG pATI-shTREX1)的AST-113菌株表现出增强的肿瘤控制，并且与PBS对照相比表现出显著的肿瘤控制(54％TGI，p＝0.02，第17天)。
比较IV注射后6小时的全身血清细胞因子水平，与能够产生鞭毛的亲代AST-110菌株相比，AST-113菌株引发的细胞因子TNF-α和IL-6是相当的。与AST-110相比，AST-113的有效抗肿瘤或免疫细胞因子IFN-γ的水平显著更高，表明鞭毛蛋白缺陷型菌株可提供比亲代asd敲除菌株更优越的抗肿瘤功效(图7)。
在肿瘤植入后35天(末次给药工程化的沙门菌属疗法后12天)，将每组的三只小鼠安乐死，将肿瘤均质化并铺板于LB平板上，以计算如上所述的每克肿瘤组织的菌落形成单位(CFU)数。如图8所示，缺失fliC和fljB并含有pATIshTREX1质粒的AST-113菌株能够很好地定植肿瘤，至少就像只有asd基因缺失并含有相同质粒的菌株(AST-110)一样。具有平均1.2×107CFU/g组织的AST-113定植的肿瘤与AST-110的平均2.1×106CFU/g肿瘤相比，表明鞭毛蛋白的缺失会导致肿瘤定植增加是具有功能性鞭毛的菌株的5倍以上。总之，这些数据表明，与本领域的期望相反，鞭毛不仅不是肿瘤定植所必需的，而且其丢失可以增强肿瘤定植和抗肿瘤免疫。
实施例8被工程化为表达cytoLLO以增强质粒递送的鼠伤寒沙门菌
在该实施例中，实施例1中所述的YS1646的asd缺失菌株(AST-101)被进一步修饰以表达缺乏信号序列的listeriolysin O(LLO)蛋白(在本文中称为cytoLLO)，其在沙门菌属菌株的细胞质中积累。LLO是一种胆固醇依赖性成孔溶细胞素，其从单核细胞增生利斯特菌分泌，并介导细菌的吞噬体逃逸。利用经优化以在沙门菌属中表达的密码子来合成编码LLO的基因，其具有密码子2-24缺失。cytoLLO的开放阅读框的序列在SEQ ID NO:240中。将cytoLLO基因置于诱导在鼠伤寒沙门菌中转录的启动子的控制下(SEQ ID NO:241，在下面再现)。使用实施例1中所述的Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:6640-6645)的方法的修饰，将cytoLLO表达盒以单拷贝插入asd缺失菌株AST-101的敲除的asd基因座中。
驱动cytoLLO表达的启动子的序列
LLO启动子 attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtataatgcageaag SEQ ID NO:241
带有在asd基因座处插入cytoLLO表达盒的asd缺失菌株(在本文中称为ASD/LLO或AST-114)通过用编码asd基因(其允许菌株在没有外源性DAP下生长并且选择用于质粒维持)的pATI质粒进行电穿孔被进一步修饰，并且还包含如实施例6中所述驱动shTREX1表达的U6启动子(本文称为ASD/LLO(pATI-shTREX1)或AST-115)。如图9所示，ASD/LLO(pATI-shTREX1)菌株AST-115以与含有相同质粒(pATI-shTREX1))的asd缺失菌株AST-110相当的速率生长，证明LLO敲入不会影响体外细菌适应性。
工程化为产生cytoLLO的鼠伤寒沙门菌表现出强大的抗肿瘤活性
为了确定cytoLLO基因敲入是否提供抗肿瘤功效，在鼠结肠癌模型中评估了ASD/LLO(pATI-shTREX1)菌株AST-115。对于本研究，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组8只小鼠)的右侧胁腹SC接种CT26(100μL PBS中2×105个细胞)。用单剂量的5×106CFU的AST-115IV注射具有已建立的胁腹肿瘤的小鼠，并与PBS对照进行比较。
如图10所示，与PBS对照相比，向asd-菌株ASD/LLO(pATI-shTREX1)中添加cytoLLO基因显示出了非常显著的肿瘤控制(76％TGI，p＝0.002，第28天)，并且在单次剂量后与先前的研究(其中含有TRLXl shRNA质粒的菌株以多剂给药)具有相当的功效。这些数据证明了将更多的质粒递送到细胞质中的cytoLLO介导的优势，导致更大的基因敲低，从而提高了RNAi对靶标诸如TRLX1的治疗功效。
实施例9鼠伤寒沙门菌的腺苷营养缺陷型菌株
将本文提供的菌株工程化为对腺苷呈营养缺陷型。结果，它们在体内减毒，因为它们不能在正常组织的低腺苷浓度下复制，因此定植主要发生在腺苷水平高的实体瘤微环境中。沙门菌属菌株YS1646(AST-100)是野生型菌株ATCC 14028的衍生物，并且由于purI基因的破坏而被工程化为对嘌呤呈营养缺陷型(Low et al.,(2004)Methods Mol.Med.90:47-60)。随后对YS1646的整个基因组进行的分析表明purI基因(与purM同义)实际上并未缺失，而是被染色体倒置破坏了(Broadway et al.(2014)J.Biotechnol.20:177-178)，并且整个基因仍包含在侧翼是插入序列的YS1646染色体的两个部分中(其中一个具有活性转座酶)。通过染色体重新结合(reengagement)被破坏的purI基因的完整遗传序列的存在为回复至野生型基因提供了可能性。尽管先前已经证明YS1646的嘌呤营养缺陷型在体外连续传代后是稳定的，但是不清楚回复率是多少(Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。
本文显示，当提供腺苷时，YS1646能够在基本培养基中复制；而野生型亲代菌株ATCC 14028可以在不补充腺苷的基本培养基中生长。YS1646在LB培养基中过夜生长，用M9基本培养基洗涤，并稀释到不含腺苷或腺苷浓度增加的M9基本培养基中。使用M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃测量生长，每15分钟读取OD600。
如图11所示，当以11至300微摩尔的浓度提供腺苷时，菌株YS1646能够复制，但是在单独的M9或补充有130纳摩尔腺苷的M9中完全不能复制。这些数据表明，purI突变体能够在肿瘤微环境中发现的腺苷浓度下复制，但在正常组织中发现的浓度下不能复制。本文示例的工程腺苷营养缺陷型菌株包括其中所有或部分的purI开放阅读框都从染色体上缺失以防止回复至野生型的菌株。可以使用如实施例1中所述的λ-Red系统来实现这种基因缺失。
还评估了以下含有purI破坏的沙门菌属菌株在M9基本培养基中的生长：其如实施例1所述被进一步工程化为包含asd基因缺失(ASD)，或者如实施例7所述含有asd基因缺失被进一步工程化为具有fliC和fljB缺失(ASD/FLG)，或如实施例8所述asd-突变体被进一步工程化为表达cytoLLO(ASD/LLO)，和如实施例6所述互补有表达asd的低拷贝数质粒(pATIlow)(分别为菌株AST-117、AST-118和AST-119)。图12中的数据表明，当以11至300微摩尔的浓度提供腺苷时，每个菌株都能够复制，但是在单独的M9或补充有130纳摩尔的腺苷的M9中完全不能复制。
实施例10具有asd基因互补的菌株的asd基因互补系统体外生长的表征和用途
为了评估含有质粒的细菌菌株的适应性，在37℃使用Spectramax读板仪在LB液体培养基中绘制生长曲线，每15分钟读取OD600。如图13所示，含有低拷贝质粒pEQU6-shTREX1的菌株YS1646(AST-104)与不含质粒的菌株YS1646(AST-100)相当地生长。含有高拷贝shTREX1质粒(其带有可以与asd缺失互补的asd基因)的asd-突变体菌株(AST-110)能够在不存在DAP的情况下在LB中复制，但生长得比菌株YS1646慢。包含shTREX-1表达质粒(其具有低拷贝数复制起点和可与asd缺失互补的asd基因)(pATIlow-shTREX1)的asd缺失菌株，菌株AST-117，生长得比AST-110更快。这些数据表明，与asd基因缺失互补的低拷贝数质粒优于高拷贝数质粒，因为它们允许鼠伤寒沙门菌在体外的更快复制速率。
asd互补菌株的细胞内生长
为了测量用高拷贝和低拷贝质粒上的asd互补的asd-突变体的适应性，使用庆大霉素保护试验评估了细菌菌株在小鼠肿瘤细胞系中在细胞内复制的能力。在此分析中，将小鼠黑素瘤B16.F10细胞或小鼠结肠癌CT26细胞用含有包含互补性asd基因并具有高复制复制起点的质粒的asd-突变体沙门菌属菌株AST-110(ASD pATI-shTREX1)或具有低拷贝复制起点的质粒的asd-突变体沙门菌属菌株AST-117(ASD pATI low copy-shTREX1)感染。以每个细胞约5个细菌的复数感染细胞30分钟，然后用PBS洗涤细胞，并添加含有庆大霉素的培养基以杀死细胞外细菌。庆大霉素不能杀死细胞内细菌，因为它不能穿过细胞膜。在感染后的各个时间点，通过用水进行渗透休克来裂解细胞单层，并且将细胞裂解物稀释并铺板在LB琼脂上，以计数存活的菌落形成单位(CFU)。
如图14所示，互补有高拷贝质粒的asd-突变体菌株AST-110具有最初的CFU下降，但能够在B16.F10细胞而不是CT26细胞中生长，表明asd基因互补系统足以支持在哺乳动物肿瘤细胞内部的生长。包含低拷贝质粒的asd-突变体菌株AST-117能够侵袭并在两种细胞类型中复制，表明低拷贝质粒上的asd基因互补可以使asd-突变体在哺乳动物细胞内强劲生长。与具有高拷贝质粒的菌株相比，具有低拷贝质粒的菌株在两种肿瘤细胞类型中均以较高数量复制。这表明具有低拷贝质粒的沙门菌属菌株比具有高拷贝质粒的菌株具有增强的适应性。
使用asd互补系统在肿瘤中的质粒维持
在该实施例中，用含有表达靶向TREX1的shRNA的质粒(pEQU6-TREX1)的菌株YS1646菌株AST-104或含有具有功能性asd基因和靶向TREX1的shRNA的质粒(pATI-shTREX1)的YS1646的asd缺失菌株菌株AST-110对携带CT26肿瘤的小鼠进行处理。在最后一次沙门菌属注射后第12天，将肿瘤均质化，将均质连续稀释并铺板在LB琼脂平板上以对存在的CFU的总数进行计数，或铺板在含有卡那霉素的LB板上以对卡那霉素抗性菌落的数量进行计数。
如图15所示，由于卡那霉素抗性(KanR)菌落的百分比小于10％，因此没有选择性压力来维持shRNA质粒的鼠伤寒沙门菌AST-104表明质粒丢失。使用asd基因互补系统进行质粒维持的菌株AST-110具有几乎相同数量的卡那霉素抗性和卡那霉素敏感性CFU。这些数据证明，asd基因互补系统足以在小鼠肿瘤微环境的环境中维持质粒。
使用asd互补系统的增强抗肿瘤功效
asd互补系统设计为防止质粒丢失并增强鼠伤寒沙门菌菌株体内递送的抑制性RNA抗肿瘤功效。为了对此进行测试，将含有shTREX1质粒的asd缺失菌株(AST-110)或含有功能性asd基因盒的加扰对照(AST-109)与含有pEQU6-shTREX1的YS1646(AST-104，一种缺少asd基因盒并因此不具有质粒维持机制的质粒)针对鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效进行了比较。对于该实验，将6-8周龄的雌性B ALB/c小鼠(每组8只小鼠)在右侧胁腹中SC接种CT26(在100μL PBS中2×105个细胞)。在第8天和第18天，用5×106CFU的AST-109(用pATI-sh加扰转化的ASD)、AST-110(用pATI-shTREX1转化的ASD)或AST-104(用pEQU6-shTREX1转化的YS1646)对带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠IV注射两次，并与PBS对照进行比较。
如图16所示，与PBS相比YS1646菌株AST-104表现出肿瘤控制(70％TGI，第28天)，尽管其表现出随时间的质粒丢失。与PBS相比，含有具有asd基因互补系统的pATI质粒的加扰对照的asd-菌株(AST-109)显示出肿瘤控制(51％TGI，第25天)，表明CpG质粒的持续递送刺激了抗肿瘤应答。与PBS相比，含有带有asd基因互补系统和shTREX1的质粒的asd-菌株(AST-110)显示出最高的肿瘤生长抑制(82％TGI，p＝0.002，第25天)。这些数据表明，与含有不具有基因互补系统或shTREX1的质粒的YS1646相比，通过使用asd互补系统和递送shTREX1防止质粒丢失实现了改善的功效。与高拷贝质粒相比，具有低拷贝质粒的鼠伤寒沙门菌菌株显示出优异的抗肿瘤功效和肿瘤定植。
为了比较具有asd互补系统的低拷贝shTREX1质粒相对于高拷贝shTREX1质粒在鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效，对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)在右胁腹中SC接种CT26(在100μL PBS中2×105个细胞)。用每周两剂的5×106CFU的AST-117(ASD(pATILow-shTREX1))或AST-110(ASD(pATI-shTREX1)IV注射具有已建立的胁腹肿瘤的小鼠，并与作为阴性对照的PBS注射进行比较。如图17所示，与具有高拷贝质粒的菌株AST-110相比，具有低拷贝质粒的菌株AST-117表现出优异的抗肿瘤功效(高：59％TGI，低：79％TGI，p＝0.042，第25天)。
在该肿瘤生长抑制研究结束时，对每组的4只小鼠实施安乐死，并如上所述对肿瘤和脾脏均质化，以评估肿瘤定植和肿瘤与脾脏定植的比率。如图18A所示，含有低拷贝质粒的菌株AST-117以比具有高拷贝质粒的菌株AST-110高100倍的水平定植于肿瘤中。当计算从肿瘤和脾脏中回收的菌落比例时，与AST-110相比，AST-117具有高大于10倍的肿瘤与脾脏定植比率(图18B)，表明具有低拷贝质粒的菌株比具有高拷贝质粒的菌株具有更高的对肿瘤定植的特异性。
这些数据证明了以前未知的属性，即，当质粒具有低拷贝数的复制起点时，经工程化以递送编码干扰RNA的质粒的鼠伤寒沙门菌具有改善的肿瘤定植能力和抗肿瘤功效。
实施例11递送RNAi的自溶鼠伤寒沙门菌菌株的工程化
如上所述，鼠伤寒沙门菌中的asd基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶。当体外或体内生长时，该基因的缺失使细菌对二氨基庚二酸(DAP)呈营养缺陷型。该实施例使用asd缺失菌株(在实施例1中描述)，该asd缺失菌株对DAP呈营养缺陷型并且含有适于递送不包含asd互补基因的RNAi的质粒，使得该菌株在体内复制有缺陷。该菌株在DAP存在下在体外繁殖并正常生长，然后作为免疫治疗剂施用于不存在DAP的哺乳动物宿主，这导致细菌自溶。自溶菌株能够侵袭宿主细胞，但由于哺乳动物组织中缺乏DAP而无法复制；这种属性组合允许RNAi介导的基因敲低和相对于复制菌株的增加的安全性。
在该实施例中，将YS1646的asd缺失菌株(AST-101，在实施例1中描述)进一步修饰以表达cytoLLO以产生菌株AST-114(在实施例8中描述)，将其电穿孔以包含编码ARI-203(靶向TREX1的微RNA)的质粒，以制成菌株AST-120(ASD/LLO(pEQU6-miTREX1))。当将此菌株引入荷瘤小鼠中时，细菌被宿主细胞摄取并进入含沙门菌属的囊泡(SCV)。在这种环境中，缺乏DAP阻止复制，并导致SCV中细菌的溶解。AST-120的溶解允许释放质粒，以及在含胆固醇的SVC膜中形成孔的积累的cytoLLO，从而将质粒有效地递送到宿主细胞的胞质溶胶中。
使用M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃，每15分钟读取OD600，评估自溶菌株AST-120在存在或不存在DAP下在LB中复制的能力。如图19所示，AST-120能够在补充有50μg/mL DAP的LB中稳健生长，但不能在单独的LB中复制。
小鼠中的自溶鼠伤寒沙门菌的增加的减毒
为了确定是否对工程化为递送cytoLLO和靶向TREX1的微RNA的自溶菌株AST-120进行毒力减弱，进行了半数致死剂量(LD50)研究。对C57BL/6小鼠(对LPS高度敏感的小鼠品系)IV施用增加剂量的AST-120，剂量范围为1×106至5×107CFU。IV施用后，所有剂量的AST-120耐受性良好，其中单次剂量后观察到短暂的体重减轻。单次剂量后7天进行第二剂，发现处于最高剂量水平(5×107CFU)的四只小鼠中的一只濒死并且需要安乐死。施用AST-120的所有其他小鼠都经历了短暂的体重减轻，但恢复了。这些数据表明，递送靶向TREX1的微RNA的鼠伤寒沙门菌的自溶菌株(AST-120)的LD50大于5×107CFU。在C57BL/6小鼠中，已知VNP20009菌株的LD50为约5×106CFU(Lee et al.(2000)International Journal ofToxicology 19:19-25)，表明与VNP20009相比，AST-120减毒至少10倍。
自溶鼠伤寒沙门菌的抗肿瘤活性
为了确定经工程化以递送cytoLLO和靶向TREX1的微RNA的自溶菌株AST-120是否能够提供抗肿瘤应答，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)在右侧胁腹中SC接种CT26(在100μL PBS中2×105个细胞)。用单剂量的5×106CFU的自溶菌株AST-120(ASD/LLO(pEQU6-miTREX1))注射具有已建立的胁腹肿瘤的小鼠，并与作为对照的PBS进行比较。如图20所示，与仅用PBS处理的动物相比，只单次剂量后检测到抗肿瘤应答(52.4％TGI，p＝0.02，第17天)。这些数据一起表明，工程化为通过DAP营养缺陷而自溶和工程化为包含用于递送靶向TREX1的RNAi的质粒的鼠伤寒沙门菌，可以被精巧地减毒，并且可以引发抗肿瘤应答。
实施例12工程化用于提高的耐受性的示例性菌株
adrA或csgD缺失
在该实施例中，鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株(其含有purI缺失、msbB缺失、asd基因缺失，并工程化为递送编码干扰RNA的质粒)被进一步修饰以缺失adrA，一种鼠伤寒沙门菌生物膜形成所需的基因。不能形成生物膜的沙门菌属被宿主吞噬细胞摄取得更快，并被更快地清除。细胞内定位的这种增加增强了质粒递送和通过RNA干扰的基因敲低的有效性。从肿瘤/组织清除的增加速率增加了治疗的耐受性，并且缺乏生物膜形成阻止了患者假体和胆囊的定植。在另一个实施例中，鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株(其含有purI缺失、msbB缺失、asd基因缺失，并工程化为递送编码干扰RNA的质粒)被进一步修饰以缺失csgD。该基因负责adrA的活化，并诱导curli菌毛，一种TLR2激动剂的表达。csgD的丢失也阻止了生物膜的形成，具有抑制TLR2活化的额外好处，从而进一步降低细菌毒力并增强RNAi的递送。
pagP缺失
在该实施例中，鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株(其含有purI缺失、msbB缺失和asd基因缺失，并工程化为递送编码干扰RNA的质粒)被进一步修饰以缺失pagP。pagP基因在鼠伤寒沙门菌的感染生命周期中被诱导，并编码使脂质A棕榈酸酯化的酶。在野生型鼠伤寒沙门菌中，pagP的表达产生七酰化的脂质A。在msbB-突变体中(其中无法添加脂质A的末端酰基链)，pagP的表达产生六酰化的LPS。六酰化的LPS已被证明是最促炎的。在该实施例中，缺失pagP和msbB的菌株仅可产生五酰化的LPS，从而当细菌被工程化以递送干扰RNA时，允许较低的促炎细胞因子、增强的耐受性和增强的获得性免疫。
hilA缺失
在该实施例中，鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株(其含有purI缺失、msbB缺失和asd基因缺失，并工程化为递送编码干扰RNA的质粒)被进一步修饰以缺失hilA。hilA是表达沙门菌属致病岛1(SPI-1)相关的3型分泌系统(T3SS)所需的调节基因。该分泌系统负责将效应蛋白注入引起修饰的鼠伤寒沙门菌摄取的非吞噬性宿主细胞(诸如上皮细胞)的胞质溶胶中。SPI-1T3SS已经显示出对于穿过肠道上皮层是必不可少的，但当胃肠外注射细菌时，对于感染是非必要的。某些蛋白质和针状复合物本身的注射也可以诱导炎性小体活化和吞噬细胞的细胞焦亡。这种促炎性细胞死亡可通过直接诱导抗原呈递细胞(APC)死亡以及修饰细胞因子环境来阻止记忆性T细胞生成来限制强大的获得性免疫应答的启动。在该实施例中，从静脉内或肿瘤内施用的治疗性鼠伤寒沙门菌菌株额外缺失hilA基因使鼠伤寒沙门菌感染集中于不需要SPI-1T3SS进行摄取的吞噬细胞，然后延长了这些吞噬细胞的寿命。hilA突变减少了促炎性细胞因子的数量，增加治疗的耐受性以及获得性免疫应答的质量。
实施例13 hilA缺失突变体在体外正常生长
使用如Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))中所述的λ衍生的Red重组系统从具有asd基因缺失的鼠伤寒沙门菌的YS1646菌株、和缺失asd和鞭毛蛋白基因fljB和fliC的YS1646菌株中缺失hilA基因，以分别制备菌株HilA/ASD和HilA/FLG/ASD。然后用含有功能性asd基因的质粒(以互补缺失的asd基因并确保质粒体内维持)和含有U6启动子(其驱动靶向鼠TREX-1的微RNA的表达)的真核表达盒的质粒(pATI-miTREX1)对这些菌株进行电穿孔。然后确定37℃在LB培养液中的菌株HilA/ASD(pATI-miTREX1)和HilA/FLG/ASD(pATI-miTREX1)的体外生长速率，并将其与菌株ASD(pATI-miTREX1)和YS1646进行比较，如使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)通过OD600测量的。每个修饰的菌株在体外以与亲代YS1646菌株相当的速率生长，表明hilA缺失不降低细菌的体外适应性。
实施例14 hilA缺失突变体在人类单核细胞中诱导较少的细胞死亡
为了评估hilA缺失突变体是否比能够产生SPI-1的菌株诱导更少的细胞焦亡，将人THP-l单核细胞用菌株YS1646、ASD(pATI-miTREX1)、FLG/ASD(pATI-miTREX1)和HilA/ASD(pATI-miTREX1)以1000个细菌的感染复数(MOI)进行感染。感染1小时后，去除细胞外细菌，并将培养基用含有100μg/mL庆大霉素的培养基进行替换以杀死细胞外细菌。感染后4小时，收获细胞并使用CellTiter-Glo(Promega)试剂摄取并且使用Spectramax 96孔板读板仪(Molecular devices)测量发光来评估THP-l细胞活力。虽然感染YS1646导致86％的细胞死亡，但感染HilA/ASD HilA/ASD(pATI-miTREX1)仅导致46％的细胞死亡。ASD(pATI-miTREX1)和FLG/ASD(pATI-miTREX1)菌株的死亡细胞％分别表现出77％和68％细胞死亡的中间表型。这些数据证明，与能表达SPI-1的鼠伤寒沙门菌菌株相比，hilA缺失菌株在人单核细胞中诱导较少的细胞死亡。
实施例15 hilA缺失突变体感染人上皮细胞的能力降低
用菌株YS1646、ASD(pATI-miTREX1)、FLG/ASD(pATI-miTREX1)和HilA/ASD(pATI-miTREX1)以500个细菌的感染复数来感染HeLa细胞。1小时后，去除细胞外细菌，并将培养基用含有100μg/mL庆大霉素的培养基进行替换以杀死细胞外细菌。感染后4小时，收获细胞并通过渗透休克进行裂解，并通过连续稀释并铺板在LB琼脂平板上来计数细菌的存活菌落形成单位的数目。用YS1646回收4.6×103CFU每孔，并且用HilA/ASD(pATI-miTREX1)菌株仅回收2.0×102CFU。菌株ASD(pATI-miTREX1)和FLG/ASD(pATI-miTREX1)表现出分别回收8.0×102CFU和6.0×102CFU的中间表型。这些数据表明，与能表达SPI-1的鼠伤寒沙门菌菌株相比，hilA缺失菌株在人上皮细胞中诱导较少的摄取。
实施例16 PagP缺失突变体具有五酰化的LPS并诱导减少的炎性细胞因子
使用如Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))中所述的λ衍生的Red重组系统从鼠伤寒沙门菌YS1646(其含有purI/M和msbB缺失)的asd基因缺失菌株中缺失pagP基因以生产菌株PagP/ASD。然后用含有功能性asd基因的质粒(以互补缺失的asd基因并确保质粒体内维持)和含有U6启动子(其驱动靶向鼠TREX-1的微RNA的表达)的真核表达盒的质粒(pATI-miTREX1)对该菌株进行电穿孔以生成菌株PagP/ASD(pATI-miTREX1)。然后从该菌株中提取脂质A，并通过基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI MS)进行评估，并与野生型鼠伤寒沙门菌ATCC14028、菌株YS1646(已缺失msbB和purM)和缺失asd基因并互补有pATI-miTREX1质粒的YS1646菌株进行比较。由于存在功能性msbB和purM基因，野生型沙门菌属分别具有与七酰化和六酰化物种分别相对应的质量为2034的脂质A次峰和质量为1796的主峰。msbB缺失菌株YS1646和ASD(pATI-miTREX1)在1828和1585处具有主峰，其对应于六酰化和五酰化LPS的混合物。msbB和pagP缺失菌株PagP/ASD(pATI-TREX1)仅具有质量为1585的单峰。这些数据表明pagP的缺失阻止了LPS的棕榈酰化，从而将其限制为单一五酰化物种。
为了确定来自pagP突变体菌株的五酰化LPS是否降低了TLR-4信号传导，将来自上述菌株的4μg纯化的LPS添加至THP-l人单核细胞，并且在24小时后使用流式微珠阵列(CBA)试剂盒(BD Biosciences)对上清液评估炎性细胞因子的存在。与野生型LPS相比，来自PagP-菌株的LPS诱导1/4的TNF-α的量，并且诱导比野生型少7倍的IL-6。pagP-突变体LPS诱导的IL-6比YS1646少22倍，表明来自pagP-突变体的五酰化LPS物种在人细胞中的炎性明显更低，并且表明pagP-突变体在人体内的耐受性更好。
实施例17在小鼠中，FLG、HilA和PagP缺失突变体比菌株YS1646减毒更多
为了确定上述修饰的菌株是否比菌株YS1646减毒更多，进行了半数致死量(LD50)研究。向C57BL/6小鼠静脉内注射浓度递增的菌株YS1646、FLG/ASD(pATI-TREX1)、HilA/ASD(pATI-TREX1)或PagP/ASD(pATI-TREX1)。发现YS1646的LD50为1.6×106CFU，与该菌株的公开报道一致。确定HilA/ASD(pATI-TREX1)菌株的LD50为5.3×106CFU，表明毒力降低了3倍。确定PagP/ASD(pATI-TREX1)菌株的LD50为6.9×106CFU，表明毒力降低了4倍。确定FLG/ASD(pATI-TREX1)菌株的LD50为>7×106CFU，表明与菌株YS1646相比毒力降低了>4.4倍。这些数据表明，上述基因修饰降低了鼠伤寒沙门菌治疗的毒力，并将导致人类的耐受性增加。在VNP20009的I期临床试验中(Toso et al.(2002)J Clin.Oncol.20(1):142-152)，仅在以下两个测试的最高剂量部分观察到了患者肿瘤中细菌的存在：3E8 CFU/m2(33％存在)和1E9CFU/m2(50％存在)，表明VNP20009的耐受剂量太低，无法实现定植。通过上述修饰改进了菌株的耐受性，可以施用比VNP20009更高的剂量。这改善肿瘤被定植的患者比例和每个肿瘤的治疗定植水平。
实施例18 hilA缺失突变体表现出小鼠中显著的抗肿瘤活性和与fljB/fliC缺失突变体可比的活性
hilA-突变应防止T3SS的上调，并防止感染的巨噬细胞的焦亡性细胞死亡。这应该增强含质粒的靶菌株的体内耐受性和抗肿瘤功效。为了对此进行测试，将含有miTREX1质粒的ΔhilA/Δasd菌株(HilA/ASD(pATI-miTREX1))或媒介物对照与含有miTREX1质粒的ΔfljB/Δflic/Δasd菌株(FLG/ASD(pATI-miTREX1))对鼠结肠癌模型中的肿瘤功效进行比较。将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组9只小鼠)在右侧胁腹中SC接种MC38(在100μL PBS中5×105个细胞)。带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠在第8天用3×105CFU的菌株HilA/ASD(pATI-miTREX1)、FLG/ASD(pATI-miTREX1)或PBS媒介物对照进行IV注射。每周两次测量体重和肿瘤。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。
数据表明，与PBS相比，HilA/ASD(pATI-miTREX1)菌株诱导有效的肿瘤控制(83.6％TGI，第25天)，包括1/9完全肿瘤消退。与PBS相比，这些数据与FLG/ASD(pATI-miTREX1)菌株观察到的那些相当(82.8％TGI，第25天)。因此，ΔhilA菌株在鼠肿瘤模型中提供与ΔfljB/Δflic菌株相当或更高的功效。
实施例19 hilA缺失突变体表现出比亲代VNP20009菌株明显更低的系统细胞因子，和与fljB/fliC缺失突变体相比增加的定植
为了测试ΔhilA/Δasd和ΔfljB/Δflic/Δasd菌株与亲代VNP20009菌株相比对肿瘤定植和耐受性的影响，在鼠结肠癌模型中评估了含有miTREX1质粒的这些菌株。将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组3只小鼠)在右侧胁腹中SC接种MC38细胞(在100μL PBS中5×105个细胞)。带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠在第8天用3×105和1×105CFU的HilA/ASD(pATI-miTREX1)、FLG/ASD(pATI-miTREX1)、VNP20009或PBS媒介物对照进行IV注射。给药后2小时将小鼠放血，并通过小鼠炎性流式微珠阵列(BD Biosciences)在流式细胞仪(Novocyte)上评估血清的全身性细胞因子。在IV给药后第3天，处死小鼠，收获肿瘤、脾脏和肝脏并称重。将组织在10mL无菌PBS(M管，GentleMacs,Miltenyi Biotec)中均质化，然后进行10倍连续稀释，并铺板在含有LB+卡那霉素(Sigma)的LB(Luria Broth)琼脂板上。第二天，对菌落形成单(CFU)进行计数，并评估每克组织的总CFU。
小鼠中的血清细胞因子IL-6水平已显示出是临床耐受性最准确的相关因素。与PBS对照的基线18pg/mL相比，VNP20009在3e5 CFU剂量的IL-6水平平均为11,755pg/mL。3e5CFU剂量的HilA/ASD(pATI-miTREX1)和FLG/ASD(pATI-miTREX1)IL-6水平均显著低于VNP20009水平(分别为3,570pg/mL和3,850pg/mL)。这些数据证明与亲代VNP20009菌株相比，突变体菌株的耐受性显著提高。IV给药1e5 CFU后3天比较肿瘤、脾脏和肝脏的定植，HilA/ASD(pATI-miTREX1)和FLG/ASD(pATI-miTREX1)之间的脾脏的总定植是相当的(HilA:2.1e4 CFU/g对FLG:l.2e4 CFU/g)，而FLG/ASD(pATI-miTREX1)菌株在肝脏中具有偏低的定植(HilA:7.4e3 CFU/g对FLG:1.5e3 CFU/g)。HilA/ASD(pATI-miTREX1)菌株的肿瘤定植显示出平均为2.6e4 CFU/g，这明显高于在相同时间点在FLG/ASD(pATI-miTREX1)肿瘤中发现的不可检测水平。这些数据证明了ΔhilA/Δasd菌株的高度耐受性和增强的肿瘤定植性质。
实施例20鼠伤寒沙门菌免疫调节菌株证明在人单核细胞中表达异源蛋白
如上所述，从具有asd基因缺失的鼠伤寒沙门菌的YS1646菌株中缺失hilA基因和鞭毛蛋白基因fljB和fliC，从而分别产生菌株HilA/ASD和FLG/ASD。此外，进一步修饰FLG/ASD菌株，以表达缺乏信号序列的listeriolysin O(LLO)蛋白(cytoLLO)(其在沙门菌属菌株(FLG/ASD/cLLO)的细胞质中积累)。用含有EF1α启动子和鼠细胞因子IL-2的表达盒的质粒(muIL-2)对这些菌株进行电穿孔。另外，用IL-15δ的表达质粒作为非同源细胞因子的对照对FLG/ASD菌株进行电穿孔。使用CMV启动子创建其他构建体。
为了确定这些含有表达质粒的菌株是否可以感染人单核细胞并诱导鼠IL-2的产生，在感染前一天将THP-1人单核细胞以50,000个细胞/孔铺板在RPMI(Coming)+10％NuSerum(Gibco)中。在RPMI中以50的MOI将细胞感染1小时，然后用PBS洗涤3次，并重悬于RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中。48小时后，从96孔板收集上清液，并通过ELISA(R&DSystems)评估鼠IL-2的浓度。发现在FLG/ASD-IL15δ对照孔中检测到的IL-2浓度正如预期那样非常低，并且可能反映了与内源性人IL-2(6.52pg/mL)的一些交叉反应性。相反，FLG/ASD-IL-2菌株平均诱导35.1pg/mL IL-2，而FLG/ASD/cLLO菌株测得的IL-2浓度甚至更高，为59.8pg/mL。在HilA/ASD-IL-2菌株中检测到最高水平，为103.4pg/mL。这些数据证明了从鼠伤寒沙门菌免疫调节因子平台菌株表达和分泌功能性异源蛋白质(诸如IL-2)的可行性。
实施例21ΔhilA突变体的细胞感染导致更少的人类上皮细胞感染
为了证明hilA缺失的鼠伤寒沙门菌菌株感染上皮细胞的能力降低，将HeLa宫颈癌细胞用以下鼠伤寒沙门菌菌株进行感染：YS1646、YS1646Δasd和YS1646Δasd/ΔhilA，其包含编码用于质粒维持的功能性asd基因的质粒。将1×106HeLa细胞置于带有DMEM和10％FBS的24孔培养皿中。用鼠伤寒沙门菌的对数期培养物感染细胞1小时，然后用PBS洗涤细胞，并将培养基用含有50μg/mL庆大霉素的培养基进行替换以杀死细胞外细菌。4小时后，将HeLa细胞单层用PBS洗涤并用1％Triton×100裂解缓冲剂裂解以释放细胞内细菌。将裂解物连续稀释并铺板在LB琼脂平板上以定量细胞内细菌的数量。与具有功能性hilA基因的菌株相比，具有hilA缺失的菌株具有90％的降低的回收CFU，这表明hilA的缺失显著降低了鼠伤寒沙门菌感染上皮衍生的细胞。
实施例22用ΔhilA或ΔfljB/Δflic突变体感染细胞导致人巨噬细胞的细胞焦亡
为了证明ΔhilA或ΔfljB/Δflic鼠伤寒沙门菌菌株导致巨噬细胞细胞死亡的能力降低，将THP-l人巨噬细胞用以下鼠伤寒沙门菌菌株进行感染：YS1646、YS1646Δasd、YS1646Δasd/ΔfljB/Δflic和YS1646Δasd/ΔhilA，其包含编码用以确保质粒维持的功能性asd基因的质粒。将5×104个细胞置于带有DMEM和10％FBS的96孔培养皿中。以每细胞100CFU的MOI用洗涤的鼠伤寒沙门菌的对数期培养物感染细胞1小时，然后用PBS洗涤细胞，并将培养基用含有50μg/mL的用以杀死细胞外细菌的庆大霉素和50ng/mL干扰素γ的培养基进行替换。24小时后，用试剂(Promega)对THP-l细胞染色，并使用发光细胞活力测定(使用Spectramax读板仪来定量发光)来确定存活细胞的百分比。感染了hilA缺失菌株的细胞具有约72％存活细胞，而感染YS1646的细胞仅具有38％活力，表明hilA的缺失防止人巨噬细胞的细胞死亡。用含质粒的菌株YS1646Δasd和YS1646Δasd/ΔfljB/Δflic感染的细胞分别具有40％和51％活力，这表明鞭毛蛋白基因的缺失也防止人巨噬细胞的细胞死亡。
实施例23用包含编码IL-2表达盒的质粒的免疫刺激鼠伤寒沙门菌感染人巨噬细胞导致IL-2的分泌
用以下鼠伤寒沙门菌菌株感染人THP-l巨噬细胞感染：YS1646Δasd/ΔfljB/Δflic、YS1646Δasd-cytoLLO和YS1646Δasd/ΔhilA，其含有在真核启动子下编码鼠IL-2表达盒的质粒，和确保质粒维持的功能性asd基因。将5×104个细胞置于带有DMEM和10％FBS的96孔培养皿中。以每细胞50CFU的MOI用洗涤的鼠伤寒沙门菌的对数期培养物感染细胞1小时，然后用PBS洗涤细胞，并将培养基用含有50μg/mL庆大霉素的培养基进行替换以杀死细胞外细菌。48小时后，取出细胞上清液，并使用R&D SystemsTMMouse IL-2QuantikineELISA试剂盒测试鼠IL-2。其余的细胞用试剂(Promega)进行染色，并使用发光细胞活力测定(使用Spectramax读板仪来定量发光)来确定存活细胞的百分比。YS1646Δasd/ΔfljB/Δflic、YS1646Δasd-cytoLLO和YS1646Δasd/ΔhilA菌株(含有编码鼠IL-2的表达盒的质粒)分别表达35pg/mL、60pg/mL和103pg/mL的IL-2。
实施例24表达鼠IL-2的鼠伤寒沙门菌菌株在体内表现出有效的肿瘤生长抑制
将在鼠伤寒沙门菌YS1646菌株中包含hilA或鞭毛蛋白基因fljB和fliC缺失的免疫刺激鼠伤寒沙门菌菌株与asd基因缺失相组合以分别形成菌株YS1646Δasd/ΔhilA和YS1646Δasd/ΔfljB/Δflic。用含有EF1α启动子和鼠细胞因子IL-2的表达盒的质粒对这些菌株进行电穿孔。
为了显示含有IL-2表达质粒的鼠伤寒沙门菌菌株诱导抗肿瘤功效，将含有muIL-2质粒的Δasd/ΔhilA菌株或含有muIL-2质粒的Δasd/ΔfljB/Δflic菌株与媒介物对照进行比较。将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧胁腹中SC接种MC38细胞(在100μL PBS中5×105个细胞)。将带有已建立的胁腹肿瘤的小鼠在第8天用5×105CFU的Δasd/ΔhilA(pATI-muIL-2)、Δasd/ΔfljB/Δflic(pATI-muIL-2)或PBS媒介物对照进行IV注射。每周两次测量体重和肿瘤。使用电子卡尺(Fowler，Newton，MA)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积。根据IACUC法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。
实验证明，与PBS相比，Δasd/ΔhilA(pATI-muIL-2)菌株引发了显著的肿瘤控制(P＝0.003，第21天)。这些数据与Δasd/ΔfljB/Δflic(pATI-muIL-2)菌株观察到的数据相当，该菌株与PBS相比也显示出显著的肿瘤生长抑制(P＝0.005，第21天)。因此，在结肠直肠癌模型中，两种菌株均显示出表达的IL-2有效抑制肿瘤生长的抑制能力。
实施例25 pagP-、fljB-/fliC-和pagP-/fljB-/fliC-菌株与VNP20009(YS1646)相比，在人血清中的活力显著较高
如本文所述，VNP20009(YS1646)在全身施用后在人类中表现出有限的肿瘤定植。本文显示VNP20009被人血中的补体因子灭活。为了证明这一点，将菌株YS1646和大肠杆菌D10B与本文提供的示例性免疫刺激性细菌进行了比较，所述免疫刺激性细菌包含改变细菌表面的其他突变。这些菌株是YS1646(pagP-)、YS1646(fljB-/fliC-)和YS1646(pagP-/fljB-/fliC-)。除YS1646和大肠杆菌D10B培养物外，还将这三种菌株与来自合并的小鼠血液或合并的健康人类供体(n＝3)的血清或热灭活(HI)血清在37℃孵育3小时。与血清一起孵育后，将细菌连续稀释并铺板在LB琼脂平板上，并测量菌落形成单位(CFU)。
在小鼠血清中，所有菌株均保持100％存活，并且完全抵抗补体失活。在人血清中，所有菌株在热灭活的血清中为100％存活。在全人血清中3小时后，完全消除了大肠杆菌D10B菌株。YS1646菌株仅表现出6.37％的活菌落，表明由于人血中补体失活，YS1646临床菌株的肿瘤定植受到限制。对于YS1646(fljB-/fliC-)菌株，在与人血清孵育3小时后，保留31.47％的活菌落，并且对于YS1646(pagP-)菌株，保留72.9％的活菌落。组合的YS1646(pagP-/fljB-/fliC-)菌株对人血清中的补体完全抵抗。
这些数据解释了为什么VNP20009在全身给药时具有非常低的肿瘤定植。本文显示，VNP20009(YS1646)对人血清而非小鼠血清中的补体失活高度敏感。这些数据解释了为什么在人类中观察到有限的肿瘤定植，而以高水平定植小鼠肿瘤的原因。fljB/fliC或pagP缺失或这些突变的组合部分或完全拯救了该表型。因此，用fljB/fliC、pagP或pagP/fljB/fliC缺失菌株在人血清中观察到的增强的稳定性提供了增加的人肿瘤定植。
这些数据和本文提供的其他数据(参见，例如，以上实施例7、16和17)表明，鞭毛和/或pagP的缺失增加了肿瘤定植，改善了耐受性，并增加了免疫刺激性细菌的抗肿瘤活性。实施例16证明，来自pagP-的免疫刺激性细菌的LPS诱导的IL-6比来自YS1646的LPS少22倍，并且因此pagP-细菌在人细胞中的炎症较少。实施例17表明，FLG、HilA和PagP缺失突变体中的每一个和所有均比YS1646更加减毒。
为鞭毛蛋白-和pagP-之一或两者的免疫刺激性细菌，诸如沙门菌属菌株，包括野生型菌株，表现出增加肿瘤/肿瘤微环境定植和增加抗肿瘤活性的性质。这样的菌株可以用于递送治疗性有效载荷，诸如免疫治疗产物和/或其他抗肿瘤产物，并且还可以包括改善治疗性质的修饰，诸如hilA和/或msbB的缺失、腺苷营养缺陷和如本文其他地方所述的其他性质。通过改变在肿瘤环境中提供的感染性、对某些细胞的毒性和营养要求(诸如嘌呤营养缺陷)的修饰，将所得菌株更有效地靶向于肿瘤/肿瘤微环境。
实施例26 fljB-/fliC-免疫刺激性细菌菌株显示了体内肿瘤髓样细胞特异性定植
如前所述，使用如先前所述的λ衍生的Red重组系统(参见Datsenko and Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645)从YS1646菌株(其为purI/msbB)中缺失asd和鞭毛蛋白(fliC/fljB)基因，以产生菌株YS1646ΔFLG/ΔASD。然后用细菌质粒pRPSM-mCherry电穿孔来转化菌株YS1646ΔFLG/ΔASD，该质粒包含1)功能性asd表达盒，以互补asd的染色体缺失以体内维持质粒，和2)在细菌rpsm启动子控制下的组成性mCherry表达盒(rpsm-mCherry)。由于表达了mCherry红色荧光蛋白，用该质粒转化的细菌菌落明显呈红色。为了评估肿瘤定植，在鼠结肠癌模型中体内测试了转化的细菌菌株(YS1646ΔFLG/ΔASD(pRPSM-mCherry))。将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组3只小鼠)在右侧胁腹中SC接种MC38细胞(在100μL PBS中5×105个细胞)。将带有大的、已建立的胁腹肿瘤的小鼠静脉内注射1×106CFU的YS1646ΔFLG/ΔASD(pRPSM-mCherry)。3天后收获肿瘤，并解离成单细胞悬液(Miltenyi Biotec)。用Zombie AquaTM可固定的活力染料(fixable viability dye)(BioLegend)对细胞进行染色，该染料穿透死亡细胞，而不是活细胞。将细胞与以下抗体一起孵育：Brilliant Violet 510TM抗小鼠CD45(克隆30-F11，BioLegend)；Brilliant Violet421TM抗小鼠CD8a(克隆53-6.7，BioLegend)；PE抗小鼠CD3ε(克隆145-2C111，BioLegend)；FITC抗小鼠CD4(克隆RM4-5，BioLegend)；PE/Cy7抗小鼠/人CD1lb(克隆M1/70，BioLegend)；Brilliant Violet 785TM抗小鼠Ly6C(克隆HK1.4，BioLegend)；Brilliant Violet 605TM抗小鼠Ly6G(克隆1A8，BioLegend)；APC抗小鼠F4/80(克隆BM8，BioLegend)；和PercP/Cy5.5抗小鼠CD24(克隆M1/69，Biolegend)。然后使用各种表面标记和mCherry+(PE Texas Red)通过流式细胞仪(Novocyte)对细胞进行分选，以确定/定位收获细胞对细菌的摄取。
CD45-细胞(其包括基质细胞和肿瘤细胞)未显示出可检测的细菌定植，其中与0.067％的背景染色水平相比，0.076％的细胞对mCherry呈阳性。CD45+肿瘤浸润性髓样细胞对mCherry呈阳性，其中7.27％的单核细胞、3.33％的树突细胞(DC)、8.96％的巨噬细胞对mCherry呈阳性，表明摄取YS1646ΔFLG/ΔASD(pRPSM-mCherry)细菌。平行测试包含完整鞭毛的对照菌株。与ΔFLG菌株不同，鞭毛蛋白+对照菌株感染CD45-细胞，其中0.36％的CD45-细胞对mCherry呈阳性，比背景染色(0.067％)大5.37倍。鞭毛蛋白+对照菌株还感染了CD45+髓样群体，其中5.71％的单核细胞、5.56％的DC和9.52％的巨噬细胞对mCherry呈阳性。这些数据表明鞭毛敲除菌株在肿瘤的髓样细胞群体中积累，但在肿瘤或基质细胞中不积累，而具有完整鞭毛的菌株感染所有细胞类型。因此，鞭毛敲除菌株表现出体内肿瘤髓样特异性定植。
实施例27鞭毛敲除(ΔfljB/ΔfliC)和ΔpagP菌株表明在体内增强的耐受性和降低的免疫原性
从鼠伤寒沙门菌菌株YS1646ΔASD和YS1646ΔFLG/ΔASD中缺失了pagP基因，从而分别产生菌株YS1646ΔPagP/ΔASD和YS1646ΔPagP/ΔFLG/ΔASD。菌株YS1646ΔFLG/ΔASD、YS1646ΔPagP/ΔASD和YS1646ΔPagP/ΔFLG/ΔASD通过用编码asd基因以及鼠IL-2(muIL-2)的真核表达盒的质粒进行电穿孔而被转化。为了测试这些菌株的体内耐受性，在6-8周龄的雌性BALB/c小鼠中进行LD50研究。用3×105、l×106、3×106、l×107或3×107CFU的菌株YS1646、YS1646ΔFLG/ΔASD(muIL-2)、YS1646ΔPagP/ΔASD(muIL-2)或YS1646ΔPagP/ΔFLG/ΔASD(muIL-2)对小鼠进行静脉内注射。然后监测小鼠的发病率和死亡率，并计算LD50值。结果如下表所示。
细菌菌株 LD50(CFU)
YS1646 7.24×106
YS1646ΔFLG/ΔASD(muIL-2) 2.07×107
YS1646ΔPagP/ΔASD(mulL-2) 1.39×107
YS1646ΔPagP/ΔFLG/ΔASD(mulL-2) 未计算
YS1646ΔFLG/ΔASD(muIL-2)和YS1646ΔPagP/ΔASD(muIL-2)菌株的LD50值高于亲代YS1646菌株的LD50值，表明鞭毛蛋白-和pagP缺失突变体(表达鼠IL-2)的耐受性在体内较高。未计算YS1646ΔPagP/ΔFLG/ΔASD(muIL-2)菌株的LD50，因为在研究期间没有动物死亡，但大于6.2×107CFU，代表与亲代YS1646菌株相比耐受性提高了近10倍。
为了比较不同细菌菌株的免疫原性，在静脉内给药后第40天将3×106CFU剂量存活的小鼠(N＝5，除其中N＝4的YS1646之外)放血，并滴定抗沙门菌属血清抗体。将用各种突变体细菌菌株处理过的小鼠的血清和对照小鼠的血清接种到96孔PCR板中，并在PBS中连续稀释。将含有pRPSM-mCherry质粒的鼠伤寒沙门菌菌株的培养物离心并洗涤，然后重悬于流式细胞仪固定缓冲剂中。为了进行测定，将25μl含1×106CFU的mCherry+细菌培养物添加到血清中，并在室温孵育25分钟。孵育后，将细菌样品通过将他们以4000RPM旋转5分钟离心并用PBS洗涤两次，然后重悬于含有第二山羊抗小鼠Fc Alexa 488抗体的PBS中(原液的1/400稀释)，并在黑暗中于室温孵育25分钟。然后将样品以4,000RPM旋转5分钟来用PBS洗涤三次，重悬于PBS中，并通过流式细胞仪(Novocyte)进行分析。结果显示，注射亲代菌株YS1646的小鼠具有最高的血清抗体滴度，其中平均中值荧光强度(MFI)为29,196±20,730。注射了菌株YS1646ΔFLG/ΔASD(muIL-2)的小鼠的血清具有7,941±9,290的MFI；注射了菌株YS1646ΔPagP/ΔASD(muIL-2)的小鼠的血清具有3,454±3,860的MFI；注射了菌株YS1646ΔPagP/ΔFLG/ΔASD(muIL-2)的小鼠的血清具有最低血清抗体滴度，其中MFI为2,295±2,444。数据表明，与没有缺失的亲代菌株相比，编码鞭毛的基因(fljB/fliC)或pagP的缺失导致菌株具有降低的免疫原性，并且突变(ΔPagP/ΔFLG)的组合进一步降低免疫原性。
总体而言，数据表明ΔFLG和ΔPagP菌株的耐受性提高，免疫原性降低，其中ΔPagP/ΔFLG/ΔASD菌株表现出最有利的耐受性和最低的免疫原性。
由于修饰对于本领域技术人员将是明显的，因此意图是本发明仅由所附权利要求的范围来限制。
序列表
<110> 阿克蒂姆治疗有限公司
<120> 工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途
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tgtctttgga ctctcaggaa tctttcagat gctgcaacta aacaggaagg gatggaaggt 1200
ctccttggga ctcttgttca gcttctgggt tcagatgata taaatgtggt cacctgtgca 1260
gctggaattc tttctaacct cacttgcaat aattataaga acaagatgat ggtctgccaa 1320
gtgggtggta tagaggctct tgtgcgtact gtccttcggg ctggtgacag ggaagacatc 1380
actgagcctg ccatctgtgc tcttcgtcat ctgaccagcc gacaccaaga agcagagatg 1440
gcccagaatg cagttcgcct tcactatgga ctaccagttg tggttaagct cttacaccca 1500
ccatcccact ggcctctgat aaaggctact gttggattga ttcgaaatct tgccctttgt 1560
cccgcaaatc atgcaccttt gcgtgagcag ggtgccattc cacgactagt tcagttgctt 1620
gttcgtgcac atcaggatac ccagcgccgt acgtccatgg gtgggacaca gcagcaattt 1680
gtggaggggg tccgcatgga agaaatagtt gaaggttgta ccggagccct tcacatccta 1740
gctcgggatg ttcacaaccg aattgttatc agaggactaa ataccattcc attgtttgtg 1800
cagctgcttt attctcccat tgaaaacatc caaagagtag ctgcaggggt cctctgtgaa 1860
cttgctcagg acaaggaagc tgcagaagct attgaagctg agggagccac agctcctctg 1920
acagagttac ttcactctag gaatgaaggt gtggcgacat atgcagctgc tgttttgttc 1980
cgaatgtctg aggacaagcc acaagattac aagaaacggc tttcagttga gctgaccagc 2040
tctctcttca gaacagagcc aatggcttgg aatgagactg ctgatcttgg acttgatatt 2100
ggtgcccagg gagaacccct tggatatcgc caggatgatc ctagctatcg ttcttttcac 2160
tctggtggat atggccagga tgccttgggt atggacccca tgatggaaca tgagatgggt 2220
ggccaccacc ctggtgctga ctatccagtt gatgggctgc cagatctggg gcatgcccag 2280
gacctcatgg atgggctgcc tccaggtgac agcaatcagc tggcctggtt tgatactgac 2340
ctg 2343
<210> 33
<211> 1512
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> signal regulatory protein alpha (SIRP-alpha)
isoform 1
<400> 33
atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60
gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120
aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactgc gacctctctg 180
atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccggga attaatctac 240
aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagacctcac aaagagaaac 300
aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360
tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 420
gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 480
acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 540
accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 600
gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 660
gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 720
cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa 780
cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc 840
cagagactac agctgacctg gttggagaat ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca 900
accgttacag agaacaagga tggtacctac aactggatga gctggctcct ggtgaatgta 960
tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg 1020
gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc 1080
gccgctgaga acactggatc taatgaacgg aacatctata ttgtggtggg tgtggtgtgc 1140
accttgctgg tggccctact gatggcggcc ctctacctcg tccgaatcag acagaagaaa 1200
gcccagggct ccacttcttc tacaaggttg catgagcccg agaagaatgc cagagaaata 1260
acacaggaca caaatgatat cacatatgca gacctgaacc tgcccaaggg gaagaagcct 1320
gctccccagg ctgcggagcc caacaaccac acggagtatg ccagcattca gaccagcccg 1380
cagcccgcgt cggaggacac cctcacctat gctgacctgg acatggtcca cctcaaccgg 1440
acccccaagc agccggcccc caagcctgag ccgtccttct cagagtacgc cagcgtccag 1500
gtcccgagga ag 1512
<210> 34
<211> 1108
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TREX1 isoform 1
<400> 34
aatgggccct ggagctcgca gacagggcag gattgtgcag ggaaggcctg agatgtgctt 60
ctgcccaccc cctaccccac tccctcccct tcggatctta acactgggca ctcacacacc 120
caccccatgc tcctctccag gctcagcagc aggtacgtac ccaaccatgg gctcgcaggc 180
cctgcccccg gggcccatgc agaccctcat ctttttcgac atggaggcca ctggcttgcc 240
cttctcccag cccaaggtca cggagctgtg cctgctggct gtccacagat gtgccctgga 300
gagccccccc acctctcagg ggccacctcc cacagttcct ccaccaccgc gtgtggtaga 360
caagctctcc ctgtgtgtgg ctccggggaa ggcctgcagc cctgcagcca gcgagatcac 420
aggtctgagc acagctgtgc tggcagcgca tgggcgtcaa tgttttgatg acaacctggc 480
caacctgctc ctagccttcc tgcggcgcca gccacagccc tggtgcctgg tggcacacaa 540
tggtgaccgc tacgacttcc ccctgctcca agcagagctg gctatgctgg gcctcaccag 600
tgctctggat ggtgccttct gtgtggatag catcactgcg ctgaaggccc tggagcgagc 660
aagcagcccc tcagaacacg gcccaaggaa gagctatagc ctaggcagca tctacactcg 720
cctgtatggg cagtcccctc cagactcgca cacggctgag ggtgatgtcc tggccctgct 780
cagcatctgt cagtggagac cacaggccct gctgcggtgg gtggatgctc acgccaggcc 840
tttcggcacc atcaggccca tgtatggggt cacagcctct gctaggacca agccaagacc 900
atctgctgtc acaaccactg cacacctggc cacaaccagg aacactagtc ccagccttgg 960
agagagcagg ggtaccaagg atcttcctcc agtgaaggac cctggagccc tatccaggga 1020
ggggctgctg gccccactgg gtctgctggc catcctgacc ttggcagtag ccacactgta 1080
tggactatcc ctggccacac ctggggag 1108
<210> 35
<211> 933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> V-domain Ig suppressor of T cell activation
(VISTA)
<400> 35
atgggcgtcc ccacggccct ggaggccggc agctggcgct ggggatccct gctcttcgct 60
ctcttcctgg ctgcgtccct aggtccggtg gcagccttca aggtcgccac gccgtattcc 120
ctgtatgtct gtcccgaggg gcagaacgtc accctcacct gcaggctctt gggccctgtg 180
gacaaagggc acgatgtgac cttctacaag acgtggtacc gcagctcgag gggcgaggtg 240
cagacctgct cagagcgccg gcccatccgc aacctcacgt tccaggacct tcacctgcac 300
catggaggcc accaggctgc caacaccagc cacgacctgg ctcagcgcca cgggctggag 360
tcggcctccg accaccatgg caacttctcc atcaccatgc gcaacctgac cctgctggat 420
agcggcctct actgctgcct ggtggtggag atcaggcacc accactcgga gcacagggtc 480
catggtgcca tggagctgca ggtgcagaca ggcaaagatg caccatccaa ctgtgtggtg 540
tacccatcct cctcccagga tagtgaaaac atcacggctg cagccctggc tacgggtgcc 600
tgcatcgtag gaatcctctg cctccccctc atcctgctcc tggtctacaa gcaaaggcag 660
gcagcctcca accgccgtgc ccaggagctg gtgcggatgg acagcaacat tcaagggatt 720
gaaaaccccg gctttgaagc ctcaccacct gcccagggga tacccgaggc caaagtcagg 780
caccccctgt cctatgtggc ccagcggcag ccttctgagt ctgggcggca tctgctttcg 840
gagcccagca cccccctgtc tcctccaggc cccggagacg tcttcttccc atccctggac 900
cctgtccctg actctccaaa ctttgaggtc atc 933
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence for huPD-L1
<400> 36
gtagagtatg gtagcaatat ctagagtatt gctaccatac tctac 45
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence for huCTNNB1
<400> 37
gacagactgc cttcaaattt ctagagaatt tgaaggcagt ctgtc 45
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence for huSIRPalpha
<400> 38
gccaggtgag gaagttctat ctagagtaga acttcctcac ctggc 45
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence for huTREX1
<400> 39
gcagcgcatg ggcgtcaatt ctagagattg acgcccatgc gctgc 45
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence for huVISTA
<400> 40
gaccaccatg gcaacttctt ctagagagaa gttgccatgg tggtc 45
<210> 41
<211> 3220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEQU6 vector
<400> 41
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccaa ggtcgggcag gaagagggcc 720
tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta 780
gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 840
aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta 900
ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaact 960
agttttttct cgagtagcta gagaattcat ggtaatagcg atgactaata cgtagatgta 1020
ctgccaagta ggaaagtccc ataaggtcat gtactgggca taatgccagg cgggccattt 1080
accgtcattg acgtcaatag ggggcgtact tggcatatga tacacttgat gtactgccaa 1140
gtgggcagtt taccgtaaat agtccaccca ttgacgtcaa tggaaagtcc ctattggcgt 1200
tactatggga acatacgtca ttattgacgt caatgggcgg gggtcgttgg gcggtcagcc 1260
aggcgggcca tttaccgtaa gttatgtaac gcggaactcc atatatgggc tatgaactaa 1320
tgaccccgta attgattact attaataact agacccagct ttcttgtaca aagttggcat 1380
tataagaaag cattgcttat caatttgttg caacgaacag gtcactatca gtcaaaataa 1440
aatcattatt tgccatccag ctgatatccc ctatagtgag tcgtattaca tggtcatagc 1500
tgtttcctgg cagctctggc ccgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa 1560
aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt 1620
tatgagccat attcaacggg aaacgtcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 1680
tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 1740
cttgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 1800
caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 1860
gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc 1920
cggaaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga 1980
tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa 2040
cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga 2100
tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat 2160
gcataaactt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga 2220
taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat 2280
cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 2340
attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca 2400
gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta atcagaattg gttaattggt tgtaacactg 2460
gcagagcatt acgctgactt gacgggacgg cgcaagctca tgaccaaaat cccttaacgt 2520
gagttacgcg tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 2580
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 2640
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 2700
cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 2760
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 2820
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 2880
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 2940
caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 3000
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 3060
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 3120
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 3180
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 3220
<210> 42
<211> 3802
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEQU6-H1 Vector
<400> 42
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac catatttgca tgtcgctatg 720
tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 780
gtatgagacc actccctagg tttttgtcga cagatctggc gcgccatagt ggccagcggc 840
cgcaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt 900
agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct 960
caggtctgcc cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag 1020
ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg 1080
actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggccca 1140
agttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 1200
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 1260
atcttatcat gtctggatcc aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt 1320
catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa 1380
acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg 1440
cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt 1500
tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa ctagtttttt ctcgagtagc 1560
tagagaattc atggtaatag cgatgactaa tacgtagatg tactgccaag taggaaagtc 1620
ccataaggtc atgtactggg cataatgcca ggcgggccat ttaccgtcat tgacgtcaat 1680
agggggcgta cttggcatat gatacacttg atgtactgcc aagtgggcag tttaccgtaa 1740
atagtccacc cattgacgtc aatggaaagt ccctattggc gttactatgg gaacatacgt 1800
cattattgac gtcaatgggc gggggtcgtt gggcggtcag ccaggcgggc catttaccgt 1860
aagttatgta acgcggaact ccatatatgg gctatgaact aatgaccccg taattgatta 1920
ctattaataa ctagacccag ctttcttgta caaagttggc attataagaa agcattgctt 1980
atcaatttgt tgcaacgaac aggtcactat cagtcaaaat aaaatcatta tttgccatcc 2040
agctgatatc ccctatagtg agtcgtatta catggtcata gctgtttcct ggcagctctg 2100
gcccgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac 2160
aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg 2220
ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 2280
ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgcttgtatg ggaagcccga 2340
tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga 2400
gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 2460
ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa cagcattcca 2520
ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 2580
gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg 2640
tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 2700
cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt 2760
ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga 2820
ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga 2880
tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt 2940
tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga 3000
tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac 3060
ttgacgggac ggcgcaagct catgaccaaa atcccttaac gtgagttacg cgtcgttcca 3120
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3180
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3240
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3300
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3360
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3420
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3480
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3540
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3600
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3660
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 3720
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 3780
ggccttttgc tggccttttg ct 3802
<210> 43
<211> 3263
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEQU6-shPDL1-shRNA Vector
<400> 43
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccaa ggtcgggcag gaagagggcc 720
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gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3600
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 3660
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3720
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3780
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3840
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgct 3888
<210> 47
<211> 3888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEQU6-shPDL1-H1-shVISTA
<400> 47
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac catatttgca tgtcgctatg 720
tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 780
gtatgagacc actccctagg accaccatgg caacttcttc tagagagaag ttgccatggt 840
ggtctttttt cgacagatct ggcgcgccat agtggccagc ggccgcaggt aagccagccc 900
aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag agtagcctgc atccagggac 960
aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt cctcaggtct gcccgggtgg 1020
catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc 1080
accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat 1140
aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc ccaagttaac ttgtttattg 1200
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 1260
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga 1320
tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga 1380
tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta 1440
caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt 1500
tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta 1560
tatatcttgt ggaaaggacg aaactaggta gagtatggta gcaatatcta gagtattgct 1620
accatactct acttttttcg agtagctaga gaattcatgg taatagcgat gactaatacg 1680
tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg 1740
ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt 1800
actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct 1860
attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc 1920
ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta 1980
tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag acccagcttt cttgtacaaa 2040
gttggcatta taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt 2100
caaaataaaa tcattatttg ccatccagct gatatcccct atagtgagtc gtattacatg 2160
gtcatagctg tttcctggca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 2220
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 2280
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 2340
gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 2400
atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 2460
agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 2520
cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 2580
gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 2640
attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 2700
ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt 2760
ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg 2820
aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc 2880
tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 2940
gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 3000
tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 3060
aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat cagaattggt taattggttg 3120
taacactggc agagcattac gctgacttga cgggacggcg caagctcatg accaaaatcc 3180
cttaacgtga gttacgcgtc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3240
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3300
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3360
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 3420
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3480
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3540
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3600
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 3660
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3720
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3780
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3840
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgct 3888
<210> 48
<211> 1104
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> Strain LT2 Aspartate-semialdehyde dehydrogenase
(asd)
<400> 48
atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggaatggtcg gctctgttct catgcaacgc 60
atggtagagg agcgcgattt cgacgctatt cgccctgttt tcttttctac ctcccagttt 120
ggacaggcgg cgcccacctt cggcgacacc tccaccggca cgctacagga cgcttttgat 180
ctggatgcgc taaaagcgct cgatatcatc gtgacctgcc agggcggcga ttataccaac 240
gaaatttatc caaagctgcg cgaaagcgga tggcagggtt actggattga tgcggcttct 300
acgctgcgca tgaaagatga tgccattatt attctcgacc cggtcaacca ggacgtgatt 360
accgacggcc tgaacaatgg cgtgaagacc tttgtgggcg gtaactgtac cgttagcctg 420
atgttgatgt cgctgggcgg tctctttgcc cataatctcg ttgactgggt atccgtcgcg 480
acctatcagg ccgcctccgg cggcggcgcg cgccatatgc gcgagctgtt aacccagatg 540
ggtcagttgt atggccatgt cgccgatgaa ctggcgacgc cgtcttccgc aattcttgat 600
attgaacgca aagttacggc attgacccgc agcggcgagc tgccggttga taactttggc 660
gtaccgctgg cgggaagcct gatcccctgg atcgacaaac agctcgataa cggccagagc 720
cgcgaagagt ggaaaggcca ggcggaaacc aacaagattc tcaatactgc ctctgtgatt 780
ccggttgatg gtttgtgtgt gcgcgtcggc gcgctgcgct gtcacagcca ggcgttcacc 840
atcaagctga aaaaagaggt atccattccg acggtggaag aactgctggc ggcacataat 900
ccgtgggcga aagtggtgcc gaacgatcgt gatatcacta tgcgcgaatt aaccccggcg 960
gcggtgaccg gcacgttgac tacgccggtt ggtcgtctgc gtaagctgaa catggggcca 1020
gagttcttgt cggcgtttac cgtaggcgac cagttgttat ggggcgccgc cgagccgctg 1080
cgtcgaatgc tgcgccagtt ggcg 1104
<210> 49
<211> 861
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> Strain LT2 TSX
<400> 49
atgaaaaaaa ctttactcgc agtcagcgca gcgctggcgc tcacctcatc ttttactgct 60
aacgcagcag aaaatgatca gccgcagtat ttgtccgact ggtggcacca gagcgtaaac 120
gtggtaggca gctaccatac ccgtttctcg ccgaaattga acaacgacgt ctatctggaa 180
tatgaagcat ttgccaaaaa agactggttt gatttctacg gctatatcga tattcccaaa 240
acctttgatt ggggtaacgg caacgataaa ggtatctggt ccgacggttc tccgctgttc 300
atggaaatcg aaccgcgttt ctcaattgat aagctgaccg gcgcagacct gagcttcggc 360
ccgtttaaag agtggtattt cgccaacaac tacatctacg atatgggcga taacaaagcc 420
agccgccaga gcacgtggta tatgggtctg gggaccgata tcgacaccgg cctgccgatg 480
ggtctgtcgc tgaacgtgta tgcgaaatat cagtggcaaa actacggcgc gtccaatgaa 540
aacgaatggg acggctaccg tttcaaagtg aaatacttcg tccccatcac cgatctgtgg 600
ggcggtaaac tgagctatat cggctttacc aactttgact ggggatctga tttaggcgac 660
gatccgaacc gtaccagcaa ctccatcgct tccagccata tcctggcgct gaactacgat 720
cactggcact actcggtcgt tgcgcgttac ttccataacg gcggacagtg gcagaatggc 780
gcaaaactga actggggcga cggcgatttc agcgcgaaat ctaccggctg gggcggctac 840
ctggtcgtgg gttacaactt c 861
<210> 50
<211> 864
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> programmed cell death protein 1 (PD-1)
<400> 50
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540
ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600
ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660
gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720
tgtgtccctg agcagacgga gtatgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780
tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840
gatggacact gctcttggcc cctc 864
<210> 51
<211> 933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> programmed cell death protein 2 (PD-2), isoform 1
<400> 51
atggctgccg ccggggccag gcctgtggag ctgggcttcg ccgagtcggc gccggcgtgg 60
cgactgcgca gcgagcagtt ccccagcaag gtgtatgcgc cgctgcctgg ccgcccggac 120
gccttccacc gctgcatctt cctcttctgc tgccgcgagc agccgtgctg tgccggcctg 180
cgagttttta ggaatcaact acccaggaaa aacgattttt actcatatga gccaccttct 240
gagaatcctc ccccagaaac aggagaatca gtgtgtctcc agcttaagtc tggtgctcat 300
ctctgcaggg tttgtggctg tttaggcccc aaaacgtgct ccagatgcca caaagcatat 360
tactgcagca aggagcatca gaccctagac tggagattgg gacataagca ggcttgtgca 420
caaccagatc atctggacca tataattcca gaccacaact tcctttttcc agaatttgaa 480
attgtaatag aaacagaaga tgagattatg cctgaggttg tggaaaagga agattactca 540
gagattatag ggagcatggg tgaagcactt gaggaagaac tggattccat ggcaaaacat 600
gaatccaggg aagataaaat ttttcagaag tttaaaactc agatagccct tgaaccagaa 660
cagattctta gatatggcag aggtattgcc cccatctgga tttctggtga aaatattcct 720
caagaaaagg atattccaga ttgcccctgt ggtgccaaga gaatattgga attccaggtc 780
atgcctcagc tcctaaacta cctgaaggct gacagactgg gcaagagcat tgactggggc 840
atcctggctg tcttcacctg tgctgagagc tgcagcttgg gtactggcta tacagaagaa 900
tttgtgtgga agcaggatgt aacagataca ccg 933
<210> 52
<211> 819
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> programmed death-ligand 2 (PD-L2), isoform 1
<400> 52
atgatcttcc tcctgctaat gttgagcctg gaattgcagc ttcaccagat agcagcttta 60
ttcacagtga cagtccctaa ggaactgtac ataatagagc atggcagcaa tgtgaccctg 120
gaatgcaact ttgacactgg aagtcatgtg aaccttggag caataacagc cagtttgcaa 180
aaggtggaaa atgatacatc cccacaccgt gaaagagcca ctttgctgga ggagcagctg 240
cccctaggga aggcctcgtt ccacatacct caagtccaag tgagggacga aggacagtac 300
caatgcataa tcatctatgg ggtcgcctgg gactacaagt acctgactct gaaagtcaaa 360
gcttcctaca ggaaaataaa cactcacatc ctaaaggttc cagaaacaga tgaggtagag 420
ctcacctgcc aggctacagg ttatcctctg gcagaagtat cctggccaaa cgtcagcgtt 480
cctgccaaca ccagccactc caggacccct gaaggcctct accaggtcac cagtgttctg 540
cgcctaaagc caccccctgg cagaaacttc agctgtgtgt tctggaatac tcacgtgagg 600
gaacttactt tggccagcat tgaccttcaa agtcagatgg aacccaggac ccatccaact 660
tggctgcttc acattttcat cccctcctgc atcattgctt tcattttcat agccacagtg 720
atagccctaa gaaaacaact ctgtcaaaag ctgtattctt caaaagacac aacaaaaaga 780
cctgtcacca caacaaagag ggaagtgaac agtgctatc 819
<210> 53
<211> 669
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
(CTLA-4), isoform 1
<400> 53
atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctac caggacctgg 60
ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120
gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180
gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240
gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300
tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360
gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420
ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480
gacttcctcc tctggatcct tgcagcagtt agttcggggt tgttttttta tagctttctc 540
ctcacagctg tttctttgag caaaatgcta aagaaaagaa gccctcttac aacaggggtc 600
tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660
cccatcaat 669
<210> 54
<211> 969
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD47 transcript variant 1
<400> 54
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420
gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480
ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540
gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600
gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660
atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720
atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780
gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840
gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 900
cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt aatgcattca aagaatcaaa aggaatgatg 960
aatgatgaa 969
<210> 55
<211> 1209
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) 1
<400> 55
atggcacacg ctatggaaaa ctcctggaca atcagtaaag agtaccatat tgatgaagaa 60
gtgggctttg ctctgccaaa tccacaggaa aatctacctg atttttataa tgactggatg 120
ttcattgcta aacatctgcc tgatctcata gagtctggcc agcttcgaga aagagttgag 180
aagttaaaca tgctcagcat tgatcatctc acagaccaca agtcacagcg ccttgcacgt 240
ctagttctgg gatgcatcac catggcatat gtgtggggca aaggtcatgg agatgtccgt 300
aaggtcttgc caagaaatat tgctgttcct tactgccaac tctccaagaa actggaactg 360
cctcctattt tggtttatgc agactgtgtc ttggcaaact ggaagaaaaa ggatcctaat 420
aagcccctga cttatgagaa catggacgtt ttgttctcat ttcgtgatgg agactgcagt 480
aaaggattct tcctggtctc tctattggtg gaaatagcag ctgcttctgc aatcaaagta 540
attcctactg tattcaaggc aatgcaaatg caagaacggg acactttgct aaaggcgctg 600
ttggaaatag cttcttgctt ggagaaagcc cttcaagtgt ttcaccaaat ccacgatcat 660
gtgaacccaa aagcattttt cagtgttctt cgcatatatt tgtctggctg gaaaggcaac 720
ccccagctat cagacggtct ggtgtatgaa aggttctggg aagacccaaa ggagtttgca 780
gggggcagtg caggccaaag cagcgtcttt cagtgctttg acgtcctgct gggcatccag 840
cagactgctg gtggaggaca tgctgctcag ttcctccagg acatgagaag atatatgcca 900
ccagctcaca ggaacttcct gtgctcatta gagtcaaatc cctcagtccg tgagtttgtc 960
ctttcaaaag gtgatgctgg cctgcgggaa gcttatgacg cctgtgtgaa agctctggtc 1020
tccctgagga gctaccatct gcaaatcgtg actaagtaca tcctgattcc tgcaagccag 1080
cagccaaagg agaataagac ctctgaagac ccttcaaaac tggaagccaa aggaactgga 1140
ggcactgatt taatgaattt cctgaagact gtaagaagta caactgagaa atcccttttg 1200
aaggaaggt 1209
<210> 56
<211> 1260
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) 2
<400> 56
atgttgcatt ttcattatta tgatacttca aacaaaataa tggagcccca cagaccgaat 60
gtgaagacag cagtgccatt gtctttggaa agctatcaca tatctgaaga gtatggcttt 120
cttcttccag attctctgaa agaacttcca gatcattata ggccttggat ggaaattgcc 180
aacaaacttc ctcaattgat tgatgctcac cagcttcaag ctcatgtgga caagatgccc 240
ctgctgagct gccagttcct gaagggtcac cgggagcagc gcctggccca cctggtcctg 300
agcttcctca ccatgggtta tgtctggcag gaaggagagg cgcagcctgc agaggtcctg 360
ccaaggaatc ttgcccttcc atttgtcgaa gtctccagga acttggggct ccctcctatc 420
ctggtccact cagacttggt gctgacgaac tggaccaaaa aagatccaga cggattcctg 480
gaaattggga acctggagac catcatctca tttcctgggg gagagagcct gcatggtttt 540
atactggtga ctgctttggt agagaaagaa gcagtgcctg ggataaaggc tcttgttcag 600
gccacgaatg ctatcttgca gcccaaccag gaggccctgc tccaagccct gcagcgactg 660
agactgtcta ttcaggacat caccaaaacc ttaggacaga tgcatgatta tgtagatcca 720
gacatatttt atgcaggcat ccggatcttt ctctctggat ggaaagacaa cccagcaatg 780
cctgcagggc tgatgtatga aggagtttcc caagagcccc tgaaatactc cggcgggagt 840
gcagctcaga gcacagtgct tcatgccttt gatgagttct taggcattcg tcatagcaag 900
gaaagtggtg actttctgta cagaatgagg gattacatgc ctccttccca taaggccttc 960
atagaagaca tccactcagc accttccctg agggactaca tcctgtcatc tggacaggac 1020
cacttgctga cagcttataa ccagtgtgtg caggccctgg cagagctgcg gagctatcac 1080
atcaccatgg tcaccaaata cctcatcaca gctgcagcca aggcaaagca tgggaagcca 1140
aaccatctcc cagggcctcc tcaggcttta aaagacaggg gcacaggtgg aaccgcagtt 1200
atgagctttc ttaagagtgt cagggataag accttggagt caatccttca cccacgtggt 1260
<210> 57
<211> 2310
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> signal transducer and activator of transcription 3
(STAT3)
<400> 57
atggcccaat ggaatcagct acagcagctt gacacacggt acctggagca gctccatcag 60
ctctacagtg acagcttccc aatggagctg cggcagtttc tggccccttg gattgagagt 120
caagattggg catatgcggc cagcaaagaa tcacatgcca ctttggtgtt tcataatctc 180
ctgggagaga ttgaccagca gtatagccgc ttcctgcaag agtcgaatgt tctctatcag 240
cacaatctac gaagaatcaa gcagtttctt cagagcaggt atcttgagaa gccaatggag 300
attgcccgga ttgtggcccg gtgcctgtgg gaagaatcac gccttctaca gactgcagcc 360
actgcggccc agcaaggggg ccaggccaac caccccacag cagccgtggt gacggagaag 420
cagcagatgc tggagcagca ccttcaggat gtccggaaga gagtgcagga tctagaacag 480
aaaatgaaag tggtagagaa tctccaggat gactttgatt tcaactataa aaccctcaag 540
agtcaaggag acatgcaaga tctgaatgga aacaaccagt cagtgaccag gcagaagatg 600
cagcagctgg aacagatgct cactgcgctg gaccagatgc ggagaagcat cgtgagtgag 660
ctggcggggc ttttgtcagc gatggagtac gtgcagaaaa ctctcacgga cgaggagctg 720
gctgactgga agaggcggca acagattgcc tgcattggag gcccgcccaa catctgccta 780
gatcggctag aaaactggat aacgtcatta gcagaatctc aacttcagac ccgtcaacaa 840
attaagaaac tggaggagtt gcagcaaaaa gtttcctaca aaggggaccc cattgtacag 900
caccggccga tgctggagga gagaatcgtg gagctgttta gaaacttaat gaaaagtgcc 960
tttgtggtgg agcggcagcc ctgcatgccc atgcatcctg accggcccct cgtcatcaag 1020
accggcgtcc agttcactac taaagtcagg ttgctggtca aattccctga gttgaattat 1080
cagcttaaaa ttaaagtgtg cattgacaaa gactctgggg acgttgcagc tctcagagga 1140
tcccggaaat ttaacattct gggcacaaac acaaaagtga tgaacatgga agaatccaac 1200
aacggcagcc tctctgcaga attcaaacac ttgaccctga gggagcagag atgtgggaat 1260
gggggccgag ccaattgtga tgcttccctg attgtgactg aggagctgca cctgatcacc 1320
tttgagaccg aggtgtatca ccaaggcctc aagattgacc tagagaccca ctccttgcca 1380
gttgtggtga tctccaacat ctgtcagatg ccaaatgcct gggcgtccat cctgtggtac 1440
aacatgctga ccaacaatcc caagaatgta aactttttta ccaagccccc aattggaacc 1500
tgggatcaag tggccgaggt cctgagctgg cagttctcct ccaccaccaa gcgaggactg 1560
agcatcgagc agctgactac actggcagag aaactcttgg gacctggtgt gaattattca 1620
gggtgtcaga tcacatgggc taaattttgc aaagaaaaca tggctggcaa gggcttctcc 1680
ttctgggtct ggctggacaa tatcattgac cttgtgaaaa agtacatcct ggccctttgg 1740
aacgaagggt acatcatggg ctttatcagt aaggagcggg agcgggccat cttgagcact 1800
aagcctccag gcaccttcct gctaagattc agtgaaagca gcaaagaagg aggcgtcact 1860
ttcacttggg tggagaagga catcagcggt aagacccaga tccagtccgt ggaaccatac 1920
acaaagcagc agctgaacaa catgtcattt gctgaaatca tcatgggcta taagatcatg 1980
gatgctacca atatcctggt gtctccactg gtctatctct atcctgacat tcccaaggag 2040
gaggcattcg gaaagtattg tcggccagag agccaggagc atcctgaagc tgacccaggt 2100
agcgctgccc catacctgaa gaccaagttt atctgtgtga caccaacgac ctgcagcaat 2160
accattgacc tgccgatgtc cccccgcact ttagattcat tgatgcagtt tggaaataat 2220
ggtgaaggtg ctgaaccctc agcaggaggg cagtttgagt ccctcacctt tgacatggag 2280
ttgacctcgg agtgcgctac ctcccccatg 2310
<210> 58
<211> 1575
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> lymphocyte-activation gene 3 (LAG3)
<400> 58
atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttctgcagc cgctttgggt ggctccagtg 60
aagcctctcc agccaggggc tgaggtcccg gtggtgtggg cccaggaggg ggctcctgcc 120
cagctcccct gcagccccac aatccccctc caggatctca gccttctgcg aagagcaggg 180
gtcacttggc agcatcagcc agacagtggc ccgcccgctg ccgcccccgg ccatcccctg 240
gcccccggcc ctcacccggc ggcgccctcc tcctgggggc ccaggccccg ccgctacacg 300
gtgctgagcg tgggtcccgg aggcctgcgc agcgggaggc tgcccctgca gccccgcgtc 360
cagctggatg agcgcggccg gcagcgcggg gacttctcgc tatggctgcg cccagcccgg 420
cgcgcggacg ccggcgagta ccgcgccgcg gtgcacctca gggaccgcgc cctctcctgc 480
cgcctccgtc tgcgcctggg ccaggcctcg atgactgcca gccccccagg atctctcaga 540
gcctccgact gggtcatttt gaactgctcc ttcagccgcc ctgaccgccc agcctctgtg 600
cattggttcc ggaaccgggg ccagggccga gtccctgtcc gggagtcccc ccatcaccac 660
ttagcggaaa gcttcctctt cctgccccaa gtcagcccca tggactctgg gccctggggc 720
tgcatcctca cctacagaga tggcttcaac gtctccatca tgtataacct cactgttctg 780
ggtctggagc ccccaactcc cttgacagtg tacgctggag caggttccag ggtggggctg 840
ccctgccgcc tgcctgctgg tgtggggacc cggtctttcc tcactgccaa gtggactcct 900
cctgggggag gccctgacct cctggtgact ggagacaatg gcgactttac ccttcgacta 960
gaggatgtga gccaggccca ggctgggacc tacacctgcc atatccatct gcaggaacag 1020
cagctcaatg ccactgtcac attggcaatc atcacagtga ctcccaaatc ctttgggtca 1080
cctggatccc tggggaagct gctttgtgag gtgactccag tatctggaca agaacgcttt 1140
gtgtggagct ctctggacac cccatcccag aggagtttct caggaccttg gctggaggca 1200
caggaggccc agctcctttc ccagccttgg caatgccagc tgtaccaggg ggagaggctt 1260
cttggagcag cagtgtactt cacagagctg tctagcccag gtgcccaacg ctctgggaga 1320
gccccaggtg ccctcccagc aggccacctc ctgctgtttc tcatccttgg tgtcctttct 1380
ctgctccttt tggtgactgg agcctttggc tttcaccttt ggagaagaca gtggcgacca 1440
agacgatttt ctgccttaga gcaagggatt caccctccgc aggctcagag caagatagag 1500
gagctggagc aagaaccgga gccggagccg gagccggaac cggagcccga gcccgagccc 1560
gagccggagc agctc 1575
<210> 59
<211> 903
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> T cell immunoglobulin and mucin-domain
containing-3 (TIM-3)
<400> 59
atgttttcac atcttccctt tgactgtgtc ctgctgctgc tgctgctact acttacaagg 60
tcctcagaag tggaatacag agcggaggtc ggtcagaatg cctatctgcc ctgcttctac 120
accccagccg ccccagggaa cctcgtgccc gtctgctggg gcaaaggagc ctgtcctgtg 180
tttgaatgtg gcaacgtggt gctcaggact gatgaaaggg atgtgaatta ttggacatcc 240
agatactggc taaatgggga tttccgcaaa ggagatgtgt ccctgaccat agagaatgtg 300
actctagcag acagtgggat ctactgctgc cggatccaaa tcccaggcat aatgaatgat 360
gaaaaattta acctgaagtt ggtcatcaaa ccagccaagg tcacccctgc accgactcgg 420
cagagagact tcactgcagc ctttccaagg atgcttacca ccaggggaca tggcccagca 480
gagacacaga cactggggag cctccctgat ataaatctaa cacaaatatc cacattggcc 540
aatgagttac gggactctag attggccaat gacttacggg actctggagc aaccatcaga 600
ataggcatct acatcggagc agggatctgt gctgggctgg ctctggctct tatcttcggc 660
gctttaattt tcaaatggta ttctcatagc aaagagaaga tacagaattt aagcctcatc 720
tctttggcca acctccctcc ctcaggattg gcaaatgcag tagcagaggg aattcgctca 780
gaagaaaaca tctataccat tgaagagaac gtatatgaag tggaggagcc caatgagtat 840
tattgctatg tcagcagcag gcagcaaccc tcacaacctt tgggttgtcg ctttgcaatg 900
cca 903
<210> 60
<211> 732
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains
(TIGIT), isoform 1
<400> 60
atgcgctggt gtctcctcct gatctgggcc caggggctga ggcaggctcc cctcgcctca 60
ggaatgatga caggcacaat agaaacaacg gggaacattt ctgcagagaa aggtggctct 120
atcatcttac aatgtcacct ctcctccacc acggcacaag tgacccaggt caactgggag 180
cagcaggacc agcttctggc catttgtaat gctgacttgg ggtggcacat ctccccatcc 240
ttcaaggatc gagtggcccc aggtcccggc ctgggcctca ccctccagtc gctgaccgtg 300
aacgatacag gggagtactt ctgcatctat cacacctacc ctgatgggac gtacactggg 360
agaatcttcc tggaggtcct agaaagctca gtggctgagc acggtgccag gttccagatt 420
ccattgcttg gagccatggc cgcgacgctg gtggtcatct gcacagcagt catcgtggtg 480
gtcgcgttga ctagaaagaa gaaagccctc agaatccatt ctgtggaagg tgacctcagg 540
agaaaatcag ctggacagga ggaatggagc cccagtgctc cctcaccccc aggaagctgt 600
gtccaggcag aagctgcacc tgctgggctc tgtggagagc agcggggaga ggactgtgcc 660
gagctgcatg actacttcaa tgtcctgagt tacagaagcc tgggtaactg cagcttcttc 720
acagagactg gt 732
<210> 61
<211> 1065
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> GALECTIN-9/LGALS9, isoform 1
<400> 61
atggccttca gcggttccca ggctccctac ctgagtccag ctgtcccctt ttctgggact 60
attcaaggag gtctccagga cggacttcag atcactgtca atgggaccgt tctcagctcc 120
agtggaacca ggtttgctgt gaactttcag actggcttca gtggaaatga cattgccttc 180
cacttcaacc ctcggtttga agatggaggg tacgtggtgt gcaacacgag gcagaacgga 240
agctgggggc ccgaggagag gaagacacac atgcctttcc agaaggggat gccctttgac 300
ctctgcttcc tggtgcagag ctcagatttc aaggtgatgg tgaacgggat cctcttcgtg 360
cagtacttcc accgcgtgcc cttccaccgt gtggacacca tctccgtcaa tggctctgtg 420
cagctgtcct acatcagctt ccagaacccc cgcacagtcc ctgttcagcc tgccttctcc 480
acggtgccgt tctcccagcc tgtctgtttc ccacccaggc ccagggggcg cagacaaaaa 540
cctcccggcg tgtggcctgc caacccggct cccattaccc agacagtcat ccacacagtg 600
cagagcgccc ctggacagat gttctctact cccgccatcc cacctatgat gtacccccac 660
cccgcctatc cgatgccttt catcaccacc attctgggag ggctgtaccc atccaagtcc 720
atcctcctgt caggcactgt cctgcccagt gctcagaggt tccacatcaa cctgtgctct 780
gggaaccaca tcgccttcca cctgaacccc cgttttgatg agaatgctgt ggtccgcaac 840
acccagatcg acaactcctg ggggtctgag gagcgaagtc tgccccgaaa aatgcccttc 900
gtccgtggcc agagcttctc agtgtggatc ttgtgtgaag ctcactgcct caaggtggcc 960
gtggatggtc agcacctgtt tgaatactac catcgcctga ggaacctgcc caccatcaac 1020
agactggaag tggggggcga catccagctg acccatgtgc agaca 1065
<210> 62
<211> 720
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> LIGHT/TNSF14
<400> 62
atggaggaga gtgtcgtacg gccctcagtg tttgtggtgg atggacagac cgacatccca 60
ttcacgaggc tgggacgaag ccaccggaga cagtcgtgca gtgtggcccg ggtgggtctg 120
ggtctcttgc tgttgctgat gggggccggg ctggccgtcc aaggctggtt cctcctgcag 180
ctgcactggc gtctaggaga gatggtcacc cgcctgcctg acggacctgc aggctcctgg 240
gagcagctga tacaagagcg aaggtctcac gaggtcaacc cagcagcgca tctcacaggg 300
gccaactcca gcttgaccgg cagcgggggg ccgctgttat gggagactca gctgggcctg 360
gccttcctga ggggcctcag ctaccacgat ggggcccttg tggtcaccaa agctggctac 420
tactacatct actccaaggt gcagctgggc ggtgtgggct gcccgctggg cctggccagc 480
accatcaccc acggcctcta caagcgcaca ccccgctacc ccgaggagct ggagctgttg 540
gtcagccagc agtcaccctg cggacgggcc accagcagct cccgggtctg gtgggacagc 600
agcttcctgg gtggtgtggt acacctggag gctggggaga aggtggtcgt ccgtgtgctg 660
gatgaacgcc tggttcgact gcgtgatggt acccggtctt acttcggggc tttcatggtg 720
<210> 63
<211> 849
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HVEM/TNSFR14 (receptor for LIGHT ligand)
<400> 63
atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccaa aaccgacgtc 60
ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg 120
tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt 180
tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca 240
ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 300
ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 360
tgcagcccag gccacttctg catcgtccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct 420
tacgccacct ccagcccggg ccagagggtg cagaagggag gcaccgagag tcaggacacc 480
ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tctcccaatg ggaccctgga ggaatgtcag 540
caccagacca agtgcagctg gctggtgacg aaggccggag ctgggaccag cagctcccac 600
tgggtatggt ggtttctctc agggagcctc gtcatcgtca ttgtttgctc cacagttggc 660
ctaatcatat gtgtgaaaag aagaaagcca aggggtgatg tagtcaaggt gatcgtctcc 720
gtccagcgga aaagacagga ggcagaaggt gaggccacag tcattgaggc cctgcaggcc 780
cctccggacg tcaccacggt ggccgtggag gagacaatac cctcattcac ggggaggagc 840
ccaaaccac 849
<210> 64
<211> 660
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
<400> 64
atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60
attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120
aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180
agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240
aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300
aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360
ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 420
tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 480
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 540
agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 600
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 660
<210> 65
<211> 1578
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> carcinoembryonic antigen-related cell adhesion
molecule 1 (CEACAM1, or CD66a)
<400> 65
atggggcacc tctcagcccc acttcacaga gtgcgtgtac cctggcaggg gcttctgctc 60
acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg cccagctcac tactgaatcc 120
atgccattca atgttgcaga ggggaaggag gttcttctcc ttgtccacaa tctgccccag 180
caactttttg gctacagctg gtacaaaggg gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattgta 240
ggatatgcaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg caaacagcgg tcgagagaca 300
atatacccca atgcatccct gctgatccag aacgtcaccc agaatgacac aggattctac 360
accctacaag tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggaca gttccatgta 420
tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccctgt ggaggacaag 480
gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggaca caacctacct gtggtggata 540
aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600
actctactca gtgtcacaag gaatgacaca ggaccctatg agtgtgaaat acagaaccca 660
gtgagtgcga accgcagtga cccagtcacc ttgaatgtca cctatggccc ggacaccccc 720
accatttccc cttcagacac ctattaccgt ccaggggcaa acctcagcct ctcctgctat 780
gcagcctcta acccacctgc acagtactcc tggcttatca atggaacatt ccagcaaagc 840
acacaagagc tctttatccc taacatcact gtgaataata gtggatccta tacctgccac 900
gccaataact cagtcactgg ctgcaacagg accacagtca agacgatcat agtcactgag 960
ctaagtccag tagtagcaaa gccccaaatc aaagccagca agaccacagt cacaggagat 1020
aaggactctg tgaacctgac ctgctccaca aatgacactg gaatctccat ccgttggttc 1080
ttcaaaaacc agagtctccc gtcctcggag aggatgaagc tgtcccaggg caacaccacc 1140
ctcagcataa accctgtcaa gagggaggat gctgggacgt attggtgtga ggtcttcaac 1200
ccaatcagta agaaccaaag cgaccccatc atgctgaacg taaactataa tgctctacca 1260
caagaaaatg gcctctcacc tggggccatt gctggcattg tgattggagt agtggccctg 1320
gttgctctga tagcagtagc cctggcatgt tttctgcatt tcgggaagac cggcagggca 1380
agcgaccagc gtgatctcac agagcacaaa ccctcagtct ccaaccacac tcaggaccac 1440
tccaatgacc cacctaacaa gatgaatgaa gttacttatt ctaccctgaa ctttgaagcc 1500
cagcaaccca cacaaccaac ttcagcctcc ccatccctaa cagccacaga aataatttat 1560
tcagaagtaa aaaagcag 1578
<210> 66
<211> 864
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD80/B7-1
<400> 66
atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60
cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120
gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180
caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240
atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300
attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360
tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420
gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480
atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540
gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600
agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660
ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720
gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780
tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840
agaagggaaa gtgtacgccc tgta 864
<210> 67
<211> 995
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD86/B7-2
<400> 67
cagccaaaat ggatccccag tgcactatgg gactgagtaa cattctcttt gtgatggcct 60
tcctgctctc tggtgctgct cctctgaaga ttcaagctta tttcaatgag actgcagacc 120
tgccatgcca atttgcaaac tctcaaaacc aaagcctgag tgagctagta gtattttggc 180
aggaccagga aaacttggtt ctgaatgagg tatacttagg caaagagaaa tttgacagtg 240
ttcattccaa gtatatgggc cgcacaagtt ttgattcgga cagttggacc ctgagacttc 300
acaatcttca gatcaaggac aagggcttgt atcaatgtat catccatcac aaaaagccca 360
caggaatgat tcgcatccac cagatgaatt ctgaactgtc agtgcttgct aacttcagtc 420
aacctgaaat agtaccaatt tctaatataa cagaaaatgt gtacataaat ttgacctgct 480
catctataca cggttaccca gaacctaaga agatgagtgt tttgctaaga accaagaatt 540
caactatcga gtatgatggt attatgcaga aatctcaaga taatgtcaca gaactgtacg 600
acgtttccat cagcttgtct gtttcattcc ctgatgttac gagcaatatg accatcttct 660
gtattctgga aactgacaag acgcggcttt tatcttcacc tttctctata gagcttgagg 720
accctcagcc tcccccagac cacattcctt ggattacagc tgtacttcca acagttatta 780
tatgtgtgat ggttttctgt ctaattctat ggaaatggaa gaagaagaag cggcctcgca 840
actcttataa atgtggaacc aacacaatgg agagggaaga gagtgaacag accaagaaaa 900
gagaaaaaat ccatatacct gaaagatctg atgaagccca gcgtgttttt aaaagttcga 960
agacatcttc atgcgacaaa agtgatacat gtttt 995
<210> 68
<211> 1095
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD244/2B4
<400> 68
atgctggggc aagtggtcac cctcatactc ctcctgctcc tcaaggtgta tcagggcaaa 60
ggatgccagg gatcagctga ccatgtggtt agcatctcgg gagtgcctct tcagttacaa 120
ccaaacagca tacagacgaa ggttgacagc attgcatgga agaagttgct gccctcacaa 180
aatggatttc atcacatatt gaagtgggag aatggctctt tgccttccaa tacttccaat 240
gatagattca gttttatagt caagaacttg agtcttctca tcaaggcagc tcagcagcag 300
gacagtggcc tctactgcct ggaggtcacc agtatatctg gaaaagttca gacagccacg 360
ttccaggttt ttgtatttga taaagttgag aaaccccgcc tacaggggca ggggaagatc 420
ctggacagag ggagatgcca agtggctctg tcttgcttgg tctccaggga tggcaatgtg 480
tcctatgctt ggtacagagg gagcaagctg atccagacag cagggaacct cacctacctg 540
gacgaggagg ttgacattaa tggcactcac acatatacct gcaatgtcag caatcctgtt 600
agctgggaaa gccacaccct gaatctcact caggactgtc agaatgccca tcaggaattc 660
agattttggc cgtttttggt gatcatcgtg attctaagcg cactgttcct tggcaccctt 720
gcctgcttct gtgtgtggag gagaaagagg aaggagaagc agtcagagac cagtcccaag 780
gaatttttga caatttacga agatgtcaag gatctgaaaa ccaggagaaa tcacgagcag 840
gagcagactt ttcctggagg ggggagcacc atctactcta tgatccagtc ccagtcttct 900
gctcccacgt cacaagaacc tgcatataca ttatattcat taattcagcc ttccaggaag 960
tctggatcca ggaagaggaa ccacagccct tccttcaata gcactatcta tgaagtgatt 1020
ggaaagagtc aacctaaagc ccagaaccct gctcgattga gccgcaaaga gctggagaac 1080
tttgatgttt attcc 1095
<210> 69
<211> 1251
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD155/PVR
<400> 69
atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60
tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120
ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180
gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240
acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300
gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360
tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420
gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480
gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540
tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600
actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660
tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720
tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780
gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840
acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900
cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960
cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020
tcccgtaacg ccatcatctt cctggttctg ggaatcctgg tttttctgat cctgctgggg 1080
atcgggattt atttctattg gtccaaatgt tcccgtgagg tcctttggca ctgtcatctg 1140
tgtccctcga gtacagagca tgccagcgcc tcagctaatg ggcatgtctc ctattcagct 1200
gtgagcagag agaacagctc ttcccaggat ccacagacag agggcacaag g 1251
<210> 70
<211> 1614
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD122/nectin-2
<400> 70
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg 60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180
cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240
aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc 300
gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc 360
caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc 420
gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc 480
aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg 540
gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg 600
gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc 660
agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg 720
gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct 780
cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc 840
ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca 900
ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac 960
agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020
gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc aacacagcag gcgcaggggc cacaggcggc 1080
atcatcgggg gcatcatcgc cgccatcatt gctactgctg tggctgccac gggcatcctt 1140
atctgccggc agcagcggaa ggagcagacg ctgcaggggg cagaggagga cgaagacctg 1200
gagggacctc cctcctacaa gccaccgacc ccaaaagcga agctggaggc acaggagatg 1260
ccctcccagc tcttcactct gggggcctcg gagcacagcc cactcaagac cccctacttt 1320
gatgctggcg cctcatgcac tgagcaggaa atgcctcgat accatgagct gcccaccttg 1380
gaagaacggt caggaccctt gcaccctgga gccacaagcc tggggtcccc catcccggtg 1440
cctccagggc cacctgctgt ggaagacgtt tccctggatc tagaggatga ggagggggag 1500
gaggaggaag agtatctgga caagatcaac cccatctatg atgctctgtc ctatagcagc 1560
ccctctgatt cctaccaggg caaaggcttt gtcatgtccc gggccatgta tgtg 1614
<210> 71
<211> 1008
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD226 antigen
<400> 71
atggattatc ctactttact tttggctctt cttcatgtat acagagctct atgtgaagag 60
gtgctttggc atacatcagt tccctttgcc gagaacatgt ctctagaatg tgtgtatcca 120
tcaatgggca tcttaacaca ggtggagtgg ttcaagatcg ggacccagca ggattccata 180
gccattttca gccctactca tggcatggtc ataaggaagc cctatgctga gagggtttac 240
tttttgaatt caacgatggc ttccaataac atgactcttt tctttcggaa tgcctctgaa 300
gatgatgttg gctactattc ctgctctctt tacacttacc cacagggaac ttggcagaag 360
gtgatacagg tggttcagtc agatagtttt gaggcagctg tgccatcaaa tagccacatt 420
gtttcggaac ctggaaagaa tgtcacactc acttgtcagc ctcagatgac gtggcctgtg 480
caggcagtga ggtgggaaaa gatccagccc cgtcagatcg acctcttaac ttactgcaac 540
ttggtccatg gcagaaattt cacctccaag ttcccaagac aaatagtgag caactgcagc 600
cacggaaggt ggagcgtcat cgtcatcccc gatgtcacag tctcagactc ggggctttac 660
cgctgctact tgcaggccag cgcaggagaa aacgaaacct tcgtgatgag attgactgta 720
gccgagggta aaaccgataa ccaatatacc ctctttgtgg ctggagggac agttttattg 780
ttgttgtttg ttatctcaat taccaccatc attgtcattt tccttaacag aaggagaagg 840
agagagagaa gagatctatt tacagagtcc tgggatacac agaaggcacc caataactat 900
agaagtccca tctctaccag tcaacctacc aatcaatcca tggatgatac aagagaggat 960
atttatgtca actatccaac cttctctcgc agaccaaaga ctagagtt 1008
<210> 72
<211> 545
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD160 antigen
<400> 72
ggatgctgtt ggaacccggc agaggctgct gtgccctggc catcctgctg gcaattgtgg 60
acatccagtc tggtggatgc attaacatca ccagctcagc ttcccaggaa ggaacgcgac 120
taaacttaat ctgtactgta tggcataaga aagaagaggc tgaggggttt gtagtgtttt 180
tgtgcaagga caggtctgga gactgttctc ctgagaccag tttaaaacag ctgagactta 240
aaagggatcc tgggatagat ggtgttggtg aaatatcatc tcagttgatg ttcaccataa 300
gccaagtcac accgttgcac agtgggacct accagtgttg tgccagaagc cagaagtcag 360
gtatccgcct tcagggccat tttttctcca ttctattcac agagacaggg aactacacag 420
tgacgggatt gaaacaaaga caacaccttg agttcagcca taatgaaggc actctcagtt 480
caggcttcct acaagaaaag gtctgggtaa tgctggtcac cagccttgtg gcccttcaag 540
ctttg 545
<210> 73
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> human U6 RNA Pol III promoter
<400> 73
aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac 60
aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120
aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt 180
aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat 240
atcttgtgga aaggacgaaa ctag 264
<210> 74
<211> 99
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> human H1 RNA Pol III promoter
<400> 74
atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60
tgggaatctt ataagttctg tatgagacca ctccctagg 99
<210> 75
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence targeting muPD-L1
<400> 75
ccggccgaaa tgatacacaa ttcgactcga gtcgaattgt gtatcatttc ggtttttg 58
<210> 76
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence targeting muSIRPA
<400> 76
ccggccacaa ctggaatgtc ttcatctcga gatgaagaca ttccagttgt ggttttt 57
<210> 77
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence targeting muTREX1, clone 1
<400> 77
ccggacaacc aacctaaggc cacatctcga gatgtggcct taggttggtt gttttttg 58
<210> 78
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA-encoding sequence targeting muTREX1, clone 2
<400> 78
ccggcctaga tggtaccttc tgtgtctcga gacacagaag gtaccatcta ggtttttg 58
<210> 79
<211> 3966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector1-human shTREX1-1_shPDL1-1
<400> 79
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac 600
catatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat 660
ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actccctagg cagcgcatgg gcgtcaattc 720
tagagattga cgcccatgcg ctgctttttt cgacagatct ggcgcgccat agtggccagc 780
ggccgcaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 840
agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 900
cctcaggtct gcccgggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg 960
aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt 1020
ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc 1080
ccaagttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 1140
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 1200
tgtatcttat catgtctgga tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc 1260
cttcatattt gcatatacga tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg 1320
taaacacaaa gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt 1380
ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt 1440
atttcgattt cttggcttta tatatcttgt ggaaaggacg aaactaggta gagtatggta 1500
gcaatatcta gagtattgct accatactct acttttttcg agtagctaga gaattcatgg 1560
taatagcgat gactaatacg tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt 1620
actgggcata atgccaggcg ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg 1680
gcatatgata cacttgatgt actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt 1740
gacgtcaatg gaaagtccct attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca 1800
atgggcgggg gtcgttgggc ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc 1860
ggaactccat atatgggcta tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag 1920
ccatccagct gatatcccat ggtcatagct gtttcctggc agctctggcc cgtgtctcaa 1980
aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aaaactgtct 2040
gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc 2100
ggaatggtcg gctctgttct catgcaacgc atggtagagg agcgcgattt cgacgctatt 2160
cgccctgttt tcttttctac ctcccagttt ggacaggcgg cgcccacctt cggcgacacc 2220
tccaccggca cgctacagga cgcttttgat ctggatgcgc taaaagcgct cgatatcatc 2280
gtgacctgcc agggcggcga ttataccaac gaaatttatc caaagctgcg cgaaagcgga 2340
tggcagggtt actggattga tgcggcttct acgctgcgca tgaaagatga tgccattatt 2400
attctcgacc cggtcaacca ggacgtgatt accgacggcc tgaacaatgg cgtgaagacc 2460
tttgtgggcg gtaactgtac cgttagcctg atgttgatgt cgctgggcgg tctctttgcc 2520
cataatctcg ttgactgggt atccgtcgcg acctatcagg ccgcctccgg cggcggcgcg 2580
cgccatatgc gcgagctgtt aacccagatg ggtcagttgt atggccatgt cgccgatgaa 2640
ctggcgacgc cgtcttccgc aattcttgat attgaacgca aagttacggc attgacccgc 2700
agcggcgagc tgccggttga taactttggc gtaccgctgg cgggaagcct gatcccctgg 2760
atcgacaaac agctcgataa cggccagagc cgcgaagagt ggaaaggcca ggcggaaacc 2820
aacaagattc tcaatactgc ctctgtgatt ccggttgatg gtttgtgtgt gcgcgtcggc 2880
gcgctgcgct gtcacagcca ggcgttcacc atcaagctga aaaaagaggt atccattccg 2940
acggtggaag aactgctggc ggcacataat ccgtgggcga aagtggtgcc gaacgatcgt 3000
gatatcacta tgcgcgaatt aaccccggcg gcggtgaccg gcacgttgac tacgccggtt 3060
ggtcgtctgc gtaagctgaa catggggcca gagttcttgt cggcgtttac cgtaggcgac 3120
cagttgttat ggggcgccgc cgagccgctg cgtcgaatgc tgcgccagtt ggcgtagtca 3180
gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcgca 3240
agctcatgac caaaatccct taacgtgagt tacgcgtcgt tccactgagc gtcagacccc 3300
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3360
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3420
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3480
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3540
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3600
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3660
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga 3720
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3780
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3840
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3900
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3960
tttgct 3966
<210> 80
<211> 3972
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector2-mouse shTREX1-1_shPDL1-1
<400> 80
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac 600
catatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat 660
ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actccctaga caaccaacct aaggccacat 720
ctcgagatgt ggccttaggt tggttgtttt tttcgacaga tctggcgcgc catagtggcc 780
agcggccgca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc 840
tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct 900
cttcctcagg tctgcccggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc 960
tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt 1020
tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg 1080
ggcccaagtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 1140
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 1200
caatgtatct tatcatgtct ggatccaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga 1260
ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga 1320
ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt 1380
agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa 1440
agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaactag ccgaaatgat 1500
acacaattcg actcgagtcg aattgtgtat catttcggtt ttttcgagta gctagagaat 1560
tcatggtaat agcgatgact aatacgtaga tgtactgcca agtaggaaag tcccataagg 1620
tcatgtactg ggcataatgc caggcgggcc atttaccgtc attgacgtca atagggggcg 1680
tacttggcat atgatacact tgatgtactg ccaagtgggc agtttaccgt aaatagtcca 1740
cccattgacg tcaatggaaa gtccctattg gcgttactat gggaacatac gtcattattg 1800
acgtcaatgg gcgggggtcg ttgggcggtc agccaggcgg gccatttacc gtaagttatg 1860
taacgcggaa ctccatatat gggctatgaa ctaatgaccc cgtaattgat tactattaat 1920
aactagccat ccagctgata tcccatggtc atagctgttt cctggcagct ctggcccgtg 1980
tctcaaaatc tctgatgtta cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa 2040
ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga aaaatgttgg ttttatcggc 2100
tggcgcggaa tggtcggctc tgttctcatg caacgcatgg tagaggagcg cgatttcgac 2160
gctattcgcc ctgttttctt ttctacctcc cagtttggac aggcggcgcc caccttcggc 2220
gacacctcca ccggcacgct acaggacgct tttgatctgg atgcgctaaa agcgctcgat 2280
atcatcgtga cctgccaggg cggcgattat accaacgaaa tttatccaaa gctgcgcgaa 2340
agcggatggc agggttactg gattgatgcg gcttctacgc tgcgcatgaa agatgatgcc 2400
attattattc tcgacccggt caaccaggac gtgattaccg acggcctgaa caatggcgtg 2460
aagacctttg tgggcggtaa ctgtaccgtt agcctgatgt tgatgtcgct gggcggtctc 2520
tttgcccata atctcgttga ctgggtatcc gtcgcgacct atcaggccgc ctccggcggc 2580
ggcgcgcgcc atatgcgcga gctgttaacc cagatgggtc agttgtatgg ccatgtcgcc 2640
gatgaactgg cgacgccgtc ttccgcaatt cttgatattg aacgcaaagt tacggcattg 2700
acccgcagcg gcgagctgcc ggttgataac tttggcgtac cgctggcggg aagcctgatc 2760
ccctggatcg acaaacagct cgataacggc cagagccgcg aagagtggaa aggccaggcg 2820
gaaaccaaca agattctcaa tactgcctct gtgattccgg ttgatggttt gtgtgtgcgc 2880
gtcggcgcgc tgcgctgtca cagccaggcg ttcaccatca agctgaaaaa agaggtatcc 2940
attccgacgg tggaagaact gctggcggca cataatccgt gggcgaaagt ggtgccgaac 3000
gatcgtgata tcactatgcg cgaattaacc ccggcggcgg tgaccggcac gttgactacg 3060
ccggttggtc gtctgcgtaa gctgaacatg gggccagagt tcttgtcggc gtttaccgta 3120
ggcgaccagt tgttatgggg cgccgccgag ccgctgcgtc gaatgctgcg ccagttggcg 3180
tagtcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 3240
ggcgcaagct catgaccaaa atcccttaac gtgagttacg cgtcgttcca ctgagcgtca 3300
gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 3360
tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 3420
ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 3480
ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 3540
gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 3600
ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 3660
tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 3720
cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 3780
agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 3840
agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 3900
gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 3960
tggccttttg ct 3972
<210> 81
<211> 1281
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> aroA
<400> 81
atggaatccc tgacgttaca acccatcgcg cgggtcgatg gcgccattaa tttacctggc 60
tccaaaagtg tttcaaaccg tgctttgctc ctggcggctt tagcttgtgg taaaaccgct 120
ctgacgaatc tgctggatag cgatgacgtc cgccatatgc tcaatgccct gagcgcgttg 180
gggatcaatt acaccctttc tgccgatcgc acccgctgtg atatcacggg taatggcggc 240
gcattacgtg cgccaggcgc tctggaactg tttctcggta atgccggaac cgcgatgcgt 300
ccgttagcgg cagcgctatg tctggggcaa aatgagatag tgttaaccgg cgaaccgcgt 360
atgaaagagc gtccgatagg ccatctggtc gattcgctgc gtcagggcgg ggcgaatatt 420
gattacctgg agcaggaaaa ctatccgccc ctgcgtctgc gcggcggttt taccggcggc 480
gacattgagg ttgatggtag cgtttccagc cagttcctga ccgctctgct gatgacggcg 540
ccgctggccc ctaaagacac aattattcgc gttaaaggcg aactggtatc aaaaccttac 600
atcgatatca cgctaaattt aatgaaaacc tttggcgtgg agatagcgaa ccaccactac 660
caacaatttg tcgtgaaggg aggtcaacag tatcactctc caggtcgcta tctggtcgag 720
ggcgatgcct cgtcagcgtc ctattttctc gccgctgggg cgataaaagg cggcacggta 780
aaagtgaccg gaattggccg caaaagtatg cagggcgata ttcgttttgc cgatgtgctg 840
gagaaaatgg gcgcgaccat tacctggggc gatgatttta ttgcctgcac gcgcggtgaa 900
ttgcacgcca tagatatgga tatgaaccat attccggatg cggcgatgac gattgccacc 960
acggcgctgt ttgcgaaagg aaccacgacg ttgcgcaata tttataactg gcgagtgaaa 1020
gaaaccgatc gcctgttcgc gatggcgacc gagctacgta aagtgggcgc tgaagtcgaa 1080
gaagggcacg actatattcg tatcacgccg ccggcgaagc tccaacacgc ggatattggc 1140
acgtacaacg accaccgtat ggcgatgtgc ttctcactgg tcgcactgtc cgatacgcca 1200
gttacgatcc tggaccctaa atgtaccgca aaaacgttcc ctgattattt cgaacaactg 1260
gcgcgaatga gtacgcctgc c 1281
<210> 82
<211> 1094
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> aroC
<400> 82
acggagccgt gatggcagga aacacaattg gacaactctt tcgcgtaacc actttcggcg 60
aatcacacgg gctggcgctt gggtgtatcg tcgatggcgt gccgcccggc atcccgttga 120
cggaggccga tctgcaacac gatctcgaca gacgccgccc cggcacctcg cgctatacta 180
cccagcgccg cgaaccggac caggtaaaaa ttctctccgg cgtgtttgat ggcgtgacga 240
ccggcaccag cattggccta ctgattgaaa acaccgatca gcgctcgcag gactacagcg 300
cgattaaaga tgtttttcgt ccgggacacg cggattacac ctatgagcag aaatacggcc 360
tgcgcgatta ccgtggcggt ggacgttctt ccgcgcgtga aaccgcgatg cgcgtagcgg 420
caggggcgat cgccaagaaa tacctggcgg aaaagttcgg catcgaaatc cgcggctgcc 480
tgacccagat gggcgacatt ccgctggaga ttaaagactg gcgtcaggtt gagcttaatc 540
cgttcttttg tcccgatgcg gacaaacttg acgcgctgga cgaactgatg cgcgcgctga 600
aaaaagaggg tgactccatc ggcgcgaaag tgacggtgat ggcgagcggc gtgccggcag 660
ggcttggcga accggtattt gaccgactgg atgcggacat cgcccatgcg ctgatgagca 720
ttaatgcggt gaaaggcgtg gagatcggcg aaggatttaa cgtggtggcg ctgcgcggca 780
gccagaatcg cgatgaaatc acggcgcagg gttttcagag caaccacgct ggcggcatcc 840
tcggtggcat cagtagcggg caacacattg tggcgcatat ggcgctgaaa cctacctcca 900
gcattaccgt gccgggacgt acgatcaacc gggcaggtga agaagtcgaa atgatcacca 960
aagggcgcca cgatccgtgt gtggggattc gcgcagtgcc gatcgcagaa gccatgctgg 1020
cgatcgtgct gatggatcac ctgctgcgcc atcgggcaca gaatgcggat gtaaagacag 1080
agattccacg ctgg 1094
<210> 83
<211> 767
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> aroD
<400> 83
aagggtacca aatgaaaacc gtaactgtaa gagatctcgt ggttggcgaa ggcgcgccaa 60
agatcattgt gtcgctaatg ggaaaaacca ttaccgatgt gaaatcggaa gcactcgcct 120
accgtgaagc ggatttcgat attctggagt ggcgcgttga ccattttgcc aacgtgacaa 180
cggcggaaag cgtacttgag gccgccggcg ccatccggga gattattacc gataaaccct 240
tgctatttac cttccgcagc gcgaaagaag gcggcgaaca ggcgctaacc accggacagt 300
atatcgatct gaatcgtgca gcggttgaca gcggtctggt cgatatgatc gatcttgagc 360
tttttaccgg cgacgatgag gtgaaagcca ccgtcggcta tgctcatcaa cacaatgttg 420
cggtgatcat gtctaaccat gattttcata aaacgcccgc agcggaagag attgttcagc 480
gtctgcgtaa aatgcaggaa ctgggcgctg atattccgaa gatcgccgtc atgccacaga 540
ctaaagccga tgtcctgacc ttacttaccg ccactgtaga aatgcaggag cgctatgcgg 600
atcgtccgat tattaccatg tcgatgtcga aaaccggggt aatatctcgt cttgccggcg 660
aagtgttcgg ttctgcggca acgtttggcg cggtgaaaaa agcatctgcg ccgggacaaa 720
tatcggtagc cgatctgcgt accgtattaa ctatattgca ccaggcg 767
<210> 84
<211> 684
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> PhoP
<400> 84
aagggagaag agatgatgcg cgtactggtt gtagaggata atgcattatt acgccaccac 60
ctgaaggttc agctccagga ttcaggtcac caggtcgatg ccgcagaaga tgccagggaa 120
gctgattact accttaatga acaccttccg gatatcgcta ttgtcgattt aggtctgccg 180
gatgaagacg gcctttcctt aatacgccgc tggcgcagca gtgatgtttc actgccggtt 240
ctggtgttaa ccgcgcgcga aggctggcag gataaagtcg aggttctcag ctccggggcc 300
gatgactacg tgacgaagcc attccacatc gaagaggtaa tggcgcgtat gcaggcgtta 360
atgcgccgta atagcggtct ggcctcccag gtgatcaaca tcccgccgtt ccaggtggat 420
ctctcacgcc gggaattatc cgtcaatgaa gaggtcatca aactcacggc gttcgaatac 480
accattatgg aaacgcttat ccgtaacaac ggtaaagtgg tcagcaaaga ttcgctgatg 540
cttcagctgt atccggatgc ggaactgcgg gaaagtcata ccattgatgt tctcatgggg 600
cgtctgcgga aaaaaataca ggcccagtat ccgcacgatg tcattaccac cgtacgcgga 660
caaggatatc tttttgaatt gcgc 684
<210> 85
<211> 1461
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> PhoQ
<400> 85
atgaataaat ttgctcgcca ttttctgccg ctgtcgctgc gggttcgttt tttgctggcg 60
acagccggcg tcgtgctggt gctttctttg gcatatggca tagtggcgct ggtcggctat 120
agcgtaagtt ttgataaaac cacctttcgt ttgctgcgcg gcgaaagcaa cctgttttat 180
accctcgcca aatgggaaaa taataaaatc agcgttgagc tgcctgaaaa tctggacatg 240
caaagcccga ccatgacgct gatttacgat gaaacgggca aattattatg gacgcagcgc 300
aacattccct ggctgattaa aagcattcaa ccggaatggt taaaaacgaa cggcttccat 360
gaaattgaaa ccaacgtaga cgccaccagc acgctgttga gcgaagacca ttccgcgcag 420
gaaaaactca aagaagtacg tgaagatgac gatgatgccg agatgaccca ctcggtagcg 480
gtaaatattt atcctgccac ggcgcggatg ccgcagttaa ccatcgtggt ggtcgatacc 540
attccgatag aactaaaacg ctcctatatg gtgtggagct ggttcgtata cgtgctggcc 600
gccaatttac tgttagtcat tcctttactg tggatcgccg cctggtggag cttacgccct 660
atcgaggcgc tggcgcggga agtccgcgag cttgaagatc atcaccgcga aatgctcaat 720
ccggagacga cgcgtgagct gaccagcctt gtgcgcaacc ttaatcaact gctcaaaagc 780
gagcgtgaac gttataacaa ataccgcacg accctgaccg acctgacgca cagtttaaaa 840
acgccgctcg cggttttgca gagtacgtta cgctctttac gcaacgaaaa gatgagcgtc 900
agcaaagctg aaccggtgat gctggaacag atcagccgga tttcccagca gatcggctat 960
tatctgcatc gcgccagtat gcgcggtagc ggcgtgttgt taagccgcga actgcatccc 1020
gtcgcgccgt tgttagataa cctgatttct gcgctaaata aagtttatca gcgtaaaggg 1080
gtgaatatca gtatggatat ttcaccagaa atcagttttg tcggcgagca aaacgacttt 1140
gtcgaagtga tgggcaacgt actggacaac gcttgtaaat attgtctgga gtttgtcgag 1200
atttcggctc gccagaccga cgatcatttg catattttcg tcgaagatga cggcccaggc 1260
attccccaca gcaaacgttc cctggtgttt gatcgcggtc agcgcgccga taccctacga 1320
ccaggacaag gcgtggggct ggctgtcgcg cgcgagatta cggaacaata cgccgggcag 1380
atcattgcca gcgacagtct gctcggtggc gcccgtatgg aggtcgtttt tggccgacag 1440
catcccacac agaaagagga a 1461
<210> 86
<211> 2731
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> Adenylate cyclase (cyaA)
<400> 86
tctttcttta cggtcaatga gcaaggtgtt aaattgatca cgttttagac cattttttcg 60
tcggtattag ataaaaatat gcaggcgaga aagggtaacg gttatttttg acatacggtt 120
tatcccgaat ggcgacggtc aagtactgac ctgcaccatg acgggtagca acatcaggcg 180
atacgtcttg tacctctata ttgagactct gaaacagaga ctggatgcca taaatcaact 240
gcgtgtggat cgcgcgcttg ctgccatggg acccgctttt cagcaggttt acagtcttct 300
gccgacatta ttgcactatc accatccact gatgccgggt taccttgatg gtaacgttcc 360
cagcggtatt tgcttctaca cgcctgatga aacccaacgc cactatctga acgaacttga 420
gctgtaccgc ggtatgacgc cgcaggaccc gccgaagggc gagctgccga ttaccggcgt 480
ttacaccatg ggcagcacct cctcggtcgg gcagagctgc tcgtccgacc tggatatctg 540
ggtgtgccat cagtcctggc tcgacggcga agagcgtcag ttgctgcaac gtaagtgtag 600
cctgctggaa agctgggccg cctcgcttgg cgttgaggtg agcttcttcc tgatcgacga 660
gaaccgtttc cgccataacg aaagcggcag tctgggcggg gaagactgtg gttctacgca 720
gcatatcctg ttgcttgatg agttttatcg taccgctgtg cgcctggccg ggaagcgtat 780
cctgtggagt atggtgccgt gcgacgaaga agagcattac gacgactatg tcatgacgct 840
ctatgcgcag ggcgtattaa cgccaaacga atggctggat ctggggggct taagctcgct 900
ctccgccgaa gagtactttg gcgccagcct gtggcagcta tacaagagca ttgactcgcc 960
gtacaaagcg gtgctgaaaa cgctgctgct ggaagcctat tcatgggaat atcctaaccc 1020
acgtctgctg gcgaaagata ttaaacaacg tctgcatgac ggtgaaatcg tatcgtttgg 1080
actcgatccc tactgcatga tgctggaacg ggtcactgaa tacctgacgg cgattgaaga 1140
tccgacgcgg ctggatttag tccgccgctg cttttacctg aaagtgtgcg agaaattaag 1200
tcgcgagcgt gcctgcgtag gctggcgtcg ggaagtatta agccagttag tcagcgagtg 1260
gggatgggac gacgcgcgtc tgaccatgct cgataatcgc gcaaactgga aaatcgatca 1320
ggtgcgcgaa gcccacaacg aattgctcga cgccatgatg caaagctatc gtaatctgat 1380
tcgctttgcg cggcgcaaca acctcagcgt gagtgccagc ccgcaggata tcggcgtact 1440
gacgcgtaag ctgtacgcgg cttttgaagc gttgccgggt aaagtcacgc tggtgaaccc 1500
gcagatatcg ccggatctgt ccgagccgaa tttaaccttt atccatgtgc cgccgggacg 1560
cgccaaccgt tcaggctggt atctctacaa ccgcgcgccg aacatggatt ccatcatcag 1620
ccatcagccg ctggaatata accgttatct taataagctg gtcgcgtggg cgtggttcaa 1680
cggcctgctg acgtcgcgaa cgcatctgtt tattaagggc aacggtattg tcgacctgcc 1740
taagttacag gagatggtcg ccgatgtttc gcaccatttc ccgctgcgct tgcctgctcc 1800
gacgccgaaa gcgctctaca gcccctgtga aattcgccat ctggcgatta tcgttaacct 1860
cgaatatgac ccgacggcgg cgtttcgcaa taaagtggtc cattttgact tccgtaagct 1920
ggacgttttc agctttggcg aagagcaaaa ctgtctgata ggcagtatcg acttgttata 1980
tcgcaactcg tggaacgaag tgcgtactct gcactttaac ggcgagcagg cgatgatcga 2040
agcgctgaaa acgattctgg ggaaaatgca ccaggatgcc gcgccgccgg atagcgtgga 2100
ggtgttctgc tacagtcagc atcttcgcgg cctgattcgc acccgtgtgc agcaactggt 2160
ctccgaatgt attgagctac gtctttccag cacccgtcag gagaccggtc gcttcaaggc 2220
gctgcgggtt tccgggcaga cgtgggggct attcttcgaa cgcttgaatg tctcggtgca 2280
gaagctggag aacgctatcg aattctacgg cgcgatttcg cataacaagc tgcacgggct 2340
gtcggtacag gtggaaacca accaggtgaa attgccgtca gtggtggatg gcttcgccag 2400
cgaagggatt atccagttct tctttgaaga aacaggcgat gagaaaggct ttaacattta 2460
tattctggat gaaagtaacc gggcggaagt atatcaccac tgcgaaggta gcaaggaaga 2520
actggtgcgc gacgtcagtc gcttctattc gtcatcgcac gatcgcttca cgtatggctc 2580
cagttttatc aactttaacc tgccgcagtt ctaccagata gtgaaaaccg atggccgcgc 2640
gcaggtgatc ccattccgta cgcagcctat caacaccgtg ccgccagcaa accaggatca 2700
tgacgcgccg ctattgcagc agtatttttc g 2731
<210> 87
<211> 826
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> cAMP-activated global transcriptional regulator
(crp)
<400> 87
aagctatgct aaaacagaca agatgctaca gtaatacatt gacgtactgc atgtatgcag 60
aggacatcac attacaggct acaatctatt ttcgtagccc ccttcccagg tagcgggaag 120
tatatttttg caaccccaga gacagtgccg ttttctggct ctggagacag cttataacag 180
aggataaccg cgcatggtgc ttggcaaacc gcaaacagac ccgactcttg aatggttctt 240
gtctcattgc cacattcata agtacccgtc aaagagcacg ctgattcacc agggtgaaaa 300
agcagaaacg ctgtactaca tcgttaaagg ctccgtggca gtgctgatca aagatgaaga 360
agggaaagaa atgatccttt cttatctgaa tcagggtgat tttattggtg aactgggcct 420
gtttgaagaa ggccaggaac gcagcgcctg ggtacgtgcg aaaaccgcat gtgaggtcgc 480
tgaaatttcc tacaaaaaat ttcgccaatt aatccaggtc aacccggata ttctgatgcg 540
cctctcttcc cagatggctc gtcgcttaca agtcacctct gaaaaagtag gtaacctcgc 600
cttccttgac gtcaccgggc gtatcgctca gacgctgctg aatctggcga aacagcccga 660
tgccatgacg cacccggatg ggatgcagat caaaatcact cgtcaggaaa tcggccagat 720
cgtcggctgc tcccgcgaaa ccgttggtcg tattttgaaa atgctggaag atcaaaacct 780
gatctccgcg catggcaaga ccatcgtcgt ctacggcacc cgttaa 826
<210> 88
<211> 1566
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS), isoform 1
<400> 88
atgcagcctt ggcacggaaa ggccatgcag agagcttccg aggccggagc cactgccccc 60
aaggcttccg cacggaatgc caggggcgcc ccgatggatc ccaccgagtc tccggctgcc 120
cccgaggccg ccctgcctaa ggcgggaaag ttcggccccg ccaggaagtc gggatcccgg 180
cagaaaaaga gcgccccgga cacccaggag aggccgcccg tccgcgcaac tggggcccgc 240
gccaaaaagg cccctcagcg cgcccaggac acgcagccgt ctgacgccac cagcgcccct 300
ggggcagagg ggctggagcc tcctgcggct cgggagccgg ctctttccag ggctggttct 360
tgccgccaga ggggcgcgcg ctgctccacg aagccaagac ctccgcccgg gccctgggac 420
gtgcccagcc ccggcctgcc ggtctcggcc cccattctcg tacggaggga tgcggcgcct 480
ggggcctcga agctccgggc ggttttggag aagttgaagc tcagccgcga tgatatctcc 540
acggcggcgg ggatggtgaa aggggttgtg gaccacctgc tgctcagact gaagtgcgac 600
tccgcgttca gaggcgtcgg gctgctgaac accgggagct actatgagca cgtgaagatt 660
tctgcaccta atgaatttga tgtcatgttt aaactggaag tccccagaat tcaactagaa 720
gaatattcca acactcgtgc atattacttt gtgaaattta aaagaaatcc gaaagaaaat 780
cctctgagtc agtttttaga aggtgaaata ttatcagctt ctaagatgct gtcaaagttt 840
aggaaaatca ttaaggaaga aattaacgac attaaagata cagatgtcat catgaagagg 900
aaaagaggag ggagccctgc tgtaacactt cttattagtg aaaaaatatc tgtggatata 960
accctggctt tggaatcaaa aagtagctgg cctgctagca cccaagaagg cctgcgcatt 1020
caaaactggc tttcagcaaa agttaggaag caactacgac taaagccatt ttaccttgta 1080
cccaagcatg caaaggaagg aaatggtttc caagaagaaa catggcggct atccttctct 1140
cacatcgaaa aggaaatttt gaacaatcat ggaaaatcta aaacgtgctg tgaaaacaaa 1200
gaagagaaat gttgcaggaa agattgttta aaactaatga aatacctttt agaacagctg 1260
aaagaaaggt ttaaagacaa aaaacatctg gataaattct cttcttatca tgtgaaaact 1320
gccttctttc acgtatgtac ccagaaccct caagacagtc agtgggaccg caaagacctg 1380
ggcctctgct ttgataactg cgtgacatac tttcttcagt gcctcaggac agaaaaactt 1440
gagaattatt ttattcctga attcaatcta ttctctagca acttaattga caaaagaagt 1500
aaagaatttc tgacaaagca aattgaatat gaaagaaaca atgagtttcc agtttttgat 1560
gaattt 1566
<210> 89
<211> 1137
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Stimulator of Interferon Genes (STING)(H232 Allele)
<400> 89
atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60
gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120
gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180
aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240
tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300
ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360
cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420
ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480
tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540
acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600
ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660
ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccatgctg gcatcaagga tcgggtttac 720
agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780
tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840
cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900
gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960
agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020
gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080
cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctct 1137
<210> 90
<211> 972
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> lipid A biosynthesis myristoyltransferase (msbB)
<400> 90
ttatttgatg ggataaagat ctttacgctt atacggctga atctcgcctg gcttgcgggt 60
tttgagcagc ttcaggatcc aggtgtactg ttccggatgc gggccgacaa aaatttcgac 120
ctcttcgttc atccgtctgg cgatagtgtg gtcgtcagcc gtgagcagat cgtccattgg 180
cgggcgaatc tggatagtca ggcgatgcgt tttaccatta tacaccggga aaagcggtat 240
cacgcgtgcg cggcacactt tcatcagccg accaattgca ggcagcgtcg ctttgtatgt 300
cgcaaagaaa tcaacgaatt cactatgctc cgggccgtga tcctggtccg gcaggtagta 360
accccagtag ccctgacgaa cagactgaat aaagggttta atcccgtcat tacgcgcatg 420
caaacgtccg ccgaaacgcc gacgcactgt gttccagata tagtcaaaaa ccggattacc 480
ctgattatga aacatcgccg ccattttttg cccctgagag gccatcagca tggctggaat 540
gtcgacgccc cagccatgcg gtacgagaaa aatgactttt tcgtcgttac gacgcatctc 600
ctcgataatc tccagacctt cccagtcaac acgctgttga atttttttcg gaccgcgcat 660
cgccaactca gccatcatcg ccattgcctg tggcgcggtg gcgaacatct catcgacaat 720
cgcttcgcgc tcagcttcgc tacgctgcgg aaagcacaac gacagattaa ttagcgcccg 780
gcgacgagaa ctcttcccca gccgtccggc aaaacgcccc agcgtcgcca gcaaagggtc 840
gcggaatgat gccggtgtta atgcgatccc cgccattgcc gccgcgccca accaggcgcc 900
ccaatactgt ggatagcgaa aggatttttc gaattcaggg atatactcac tattattttt 960
tttggtttcc at 972
<210> 91
<211> 1038
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> Phosphoribosylaminoimidazole synthetase (purI)
<400> 91
ttattcaata accacacgct gttcggaatc agaggctttg atgataccga ttttccatgc 60
gttttcacct ttctcgttta gcagagcaag cgctttgtcc gcttccggag cggagagcgc 120
aatcaccatg ccgacgccgc agttaaaggt acggtacatt tcatgtcggc tgacattacc 180
ggcggtttgc agccaggtaa agatggcggg ccactgccag gacgactcat taattaccgc 240
ctgggtattc tccggcagaa cgcgcggaat attttcccaa aagcccccgc cggtgaggtg 300
ggcgatagcg tgtacatcga cgttttcaat cagttccaga accgatttta cgtagatacg 360
ggtcggttca agcagatgat cggccagcgg cttcccttcc agcagagtgg tttgtgggtc 420
gcagccgcta acgtcaataa ttttccgcac cagcgaatat ccattcgagt gcgggccgct 480
ggagccgagt gcaatcagca cgtcgccttc ggcaacccgg gagccgtcga tgatttctga 540
tttttcgact acgccgacgc agaaacccgc cacatcgtaa tcttcgccgt gatacatgcc 600
cggcatttcc gccgtctcgc cgccgaccag cgcgcagccg gattgcaggc agccttcggc 660
aataccgttg atcacgctgg cggcggtatc gacatccagt ttacccgtgg catagtaatc 720
gaggaaaaac agcggttccg cgccctgaac gaccagatcg tttacgcaca ttgccaccag 780
atcaataccg atagcgtcgt gacgctttaa gtccatcgcc aggcgaagtt tggtacctac 840
gccgtcagtg ccggaaacca gtaccggttc acgatatttt tgcggcaacg cgcacagcgc 900
accgaaaccg cccagaccgc ccataacctc cgggcggcga gttttcttca ctacgccttt 960
gattcgatca accagagcgt tacccgcatc aatatcgacg ccggcatctt tatagctaag 1020
agaggtctta tcggtcac 1038
<210> 92
<211> 426
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Survivin (SVN)/BIRC5, isoform 1
<400> 92
atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60
acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120
gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180
ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240
tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300
tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360
aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420
atggat 426
<210> 93
<211> 285
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> araBAD promoter (pBAD)
<400> 93
aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60
tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120
aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180
attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240
atcttacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccat 285
<210> 94
<211> 459
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Interleukin 2 (IL-2)
<400> 94
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact 459
<210> 95
<211> 567
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Interferon (IFN) alpha
<400> 95
atggcctcgc cctttgcttt actgatggtc ctggtggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60
tctctgggct gtgatctccc tgagacccac agcctggata acaggaggac cttgatgctc 120
ctggcacaaa tgagcagaat ctctccttcc tcctgtctga tggacagaca tgactttgga 180
tttccccagg aggagtttga tggcaaccag ttccagaagg ctccagccat ctctgtcctc 240
catgagctga tccagcagat cttcaacctc tttaccacaa aagattcatc tgctgcttgg 300
gatgaggacc tcctagacaa attctgcacc gaactctacc agcagctgaa tgacttggaa 360
gcctgtgtga tgcaggagga gagggtggga gaaactcccc tgatgaatgc ggactccatc 420
ttggctgtga agaaatactt ccgaagaatc actctctatc tgacagagaa gaaatacagc 480
ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ccctctcttt atcaacaaac 540
ttgcaagaaa gattaaggag gaaggaa 567
<210> 96
<211> 729
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD48, isoform 1
<400> 96
atgtgctcca gaggttggga ttcgtgtctg gctctggaat tgctactgct gcctctgtca 60
ctcctggtga ccagcattca aggtcacttg gtacatatga ccgtggtctc cggcagcaac 120
gtgactctga acatctctga gagcctgcct gagaactaca aacaactaac ctggttttat 180
actttcgacc agaagattgt agaatgggat tccagaaaat ctaagtactt tgaatccaaa 240
tttaaaggca gggtcagact tgatcctcag agtggcgcac tgtacatctc taaggtccag 300
aaagaggaca acagcaccta catcatgagg gtgttgaaaa agactgggaa tgagcaagaa 360
tggaagatca agctgcaagt gcttgaccct gtacccaagc ctgtcatcaa aattgagaag 420
atagaagaca tggatgacaa ctgttatctg aaactgtcat gtgtgatacc tggcgagtct 480
gtaaactaca cctggtatgg ggacaaaagg cccttcccaa aggagctcca gaacagtgtg 540
cttgaaacca cccttatgcc acataattac tccaggtgtt atacttgcca agtcagcaat 600
tctgtgagca gcaagaatgg cacggtctgc ctcagtccac cctgtaccct ggcccggtcc 660
tttggagtag aatggattgc aagttggcta gtggtcacgg tgcccaccat tcttggcctg 720
ttacttacc 729
<210> 97
<211> 1602
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD276/B7-H3, isoform 1
<400> 97
atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca 60
ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca 120
ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg 180
gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct 240
gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg 300
gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc 360
acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct 420
ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg 480
gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat 540
gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc 600
ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgc 660
ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccag 720
agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg 780
ggcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacag 840
ctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggc 900
cgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa 960
ggcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgc 1020
ttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac 1080
tcgaagccca gcatgaccct ggagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgacc 1140
atcacgtgct ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgggcag 1200
ggtgtgcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgttt 1260
gatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtg 1320
cgcaaccccg tgctgcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatg 1380
acattccccc cagaggccct gtgggtgacc gtggggctgt ctgtctgtct cattgcactg 1440
ctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaat 1500
gcaggagctg aggaccagga tggggaggga gaaggctcca agacagccct gcagcctctg 1560
aaacactctg acagcaaaga agatgatgga caagaaatag cc 1602
<210> 98
<211> 846
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> B7-H4/VTCN1
<400> 98
atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct 60
ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact 120
actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct 180
gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc 240
catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg 300
acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg 360
caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat 420
gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat 480
gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc 540
tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag 600
ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac 660
aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg 720
acagaatcgg agatcaaaag gcggagtcac ctacagctgc taaactcaaa ggcttctctg 780
tgtgtctctt ctttctttgc catcagctgg gcacttctgc ctctcagccc ttacctgatg 840
ctaaaa 846
<210> 99
<211> 867
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BTLA/CD272, isoform 1
<400> 99
atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60
ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120
aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180
aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240
aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300
cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360
tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420
gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct 480
ttggggggat tgcctctact catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg 540
caccaaggaa agcaaaatga actctctgac acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat 600
gctcacctta agagtgagca aacagaagca agcaccaggc aaaattccca agtactgcta 660
tcagaaactg gaatttatga taatgaccct gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct 720
gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg 780
aaccattctg tcattggacc gaactcaaga ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca 840
gaatatgcat ccatatgtgt gaggagt 867
<210> 100
<211> 276
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Chemokine (C-C motif) ligand 4 (CCL4)
<400> 100
atgaagctct gcgtgactgt cctgtctctc ctcatgctag tagctgcctt ctgctctcca 60
gcgctctcag caccaatggg ctcagaccct cccaccgcct gctgcttttc ttacaccgcg 120
aggaagcttc ctcgcaactt tgtggtagat tactatgaga ccagcagcct ctgctcccag 180
ccagctgtgg tattccaaac caaaagaagc aagcaagtct gtgctgatcc cagtgaatcc 240
tgggtccagg agtacgtgta tgacctggaa ctgaac 276
<210> 101
<211> 3537
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD103/ITGAE
<400> 101
atgtggctct tccacactct gctctgcata gccagcctgg ccctgctggc cgctttcaat 60
gtggatgtgg cccggccctg gctcacgccc aagggaggtg cccctttcgt gctcagctcc 120
cttctgcacc aagaccccag caccaaccag acctggctcc tggtcaccag ccccagaacc 180
aagaggacac cagggcccct ccatcgatgt tcccttgtcc aggatgaaat cctttgccat 240
cctgtagagc atgtccccat ccccaagggg aggcaccggg gagtgaccgt tgtccggagc 300
caccacggtg ttttgatatg cattcaagtg ctggtccggc ggcctcacag cctcagctca 360
gaactcacag gcacctgtag cctcctgggc cctgacctcc gtccccaggc tcaggccaac 420
ttcttcgacc ttgaaaatct cctggatcca gatgcacgtg tggacactgg agactgctac 480
agcaacaaag aaggcggtgg agaagacgat gtgaacacag ccaggcagcg ccgggctctg 540
gagaaggagg aggaggaaga caaggaggag gaggaagacg aggaggagga ggaagctggc 600
accgagattg ccatcatcct ggatggctca ggaagcattg atcccccaga ctttcagaga 660
gccaaagact tcatctccaa catgatgagg aacttctatg aaaagtgttt tgagtgcaac 720
tttgccttgg tgcagtatgg aggagtgatc cagactgagt ttgaccttcg ggacagccag 780
gatgtgatgg cctccctcgc cagagtccag aacatcactc aagtggggag tgtcaccaag 840
actgcctcag ccatgcaaca cgtcttagac agcatcttca cctcaagcca cggctccagg 900
agaaaggcat ccaaggtcat ggtggtgctc accgatggtg gcatattcga ggaccccctc 960
aaccttacga cagtcatcaa ctcccccaaa atgcagggtg ttgagcgctt tgccattggg 1020
gtgggagaag aatttaagag tgctaggact gcgagggaac tgaacctgat cgcctcagac 1080
ccggatgaga cccatgcttt caaggtgacc aactacatgg cgctggatgg gctgctgagc 1140
aaactgcggt acaacatcat cagcatggaa ggcacggttg gagacgccct tcactaccag 1200
ctggcacaga ttggcttcag tgctcagatc ctggatgagc ggcaggtgct gctcggcgcc 1260
gtcggggcct ttgactggtc cggaggggcg ttgctctacg acacacgcag ccgccggggc 1320
cgcttcctga accagacagc ggcggcggcg gcagacgcgg aggctgcgca gtacagctac 1380
ctgggttacg ctgtggccgt gctgcacaag acctgcagcc tctcctacat cgcgggggct 1440
ccacggtaca aacatcatgg ggccgtgttt gagctccaga aggagggcag agaggccagc 1500
ttcctgccag tgctggaggg agagcagatg gggtcctatt ttggctctga gctgtgccct 1560
gtggacattg acatggatgg aagcacggac ttcttgctgg tggctgctcc attttaccac 1620
gttcatggag aagaaggcag agtctacgtg taccgtctca gcgagcagga tggttctttc 1680
tccttggcac gcatactgag tgggcacccc gggttcacca atgcccgctt tggctttgcc 1740
atggcggcta tgggggatct cagtcaggat aagctcacag atgtggccat cggggccccc 1800
ctggaaggtt ttggggcaga tgatggtgcc agcttcggca gtgtgtatat ctacaatgga 1860
cactgggacg gcctctccgc cagcccctcg cagcggatca gagcctccac ggtggcccca 1920
ggactccagt acttcggcat gtccatggct ggtggctttg atattagtgg cgacggcctt 1980
gccgacatca ccgtgggcac tctgggccag gcggttgtgt tccgctcccg gcctgtggtt 2040
cgcctgaagg tctccatggc cttcaccccc agcgcactgc ccatcggctt caacggcgtc 2100
gtgaatgtcc gtttatgttt tgaaatcagc tctgtaacca cagcctctga gtcaggcctc 2160
cgcgaggcac ttctcaactt cacgctggat gtggatgtgg ggaagcagag gagacggctg 2220
cagtgttcag acgtaagaag ctgtctgggc tgcctgaggg agtggagcag cggatcccag 2280
ctttgtgagg acctcctgct catgcccaca gagggagagc tctgtgagga ggactgcttc 2340
tccaatgcca gtgtcaaagt cagctaccag ctccagaccc ctgagggaca gacggaccat 2400
ccccagccca tcctggaccg ctacactgag ccctttgcca tcttccagct gccctatgag 2460
aaggcctgca agaataagct gttttgtgtc gcagaattac agttggccac caccgtctct 2520
cagcaggagt tggtggtggg tctcacaaag gagctgaccc tgaacattaa cctaactaac 2580
tccggggaag attcctacat gacaagcatg gccttgaatt accccagaaa cctgcagttg 2640
aagaggatgc aaaagcctcc ctctccaaac attcagtgtg atgaccctca gccggttgct 2700
tctgtcctga tcatgaactg caggattggt caccccgtcc tcaagaggtc atctgctcat 2760
gtttcagtcg tttggcagct agaggagaat gcctttccaa acaggacagc agacatcact 2820
gtgactgtca ccaattccaa tgaaagacgg tctttggcca acgagaccca cacccttcaa 2880
ttcaggcatg gcttcgttgc agttctgtcc aaaccatcca taatgtacgt gaacacaggc 2940
caggggcttt ctcaccacaa agaattcctc ttccatgtac atggggagaa cctctttgga 3000
gcagaatacc agttgcaaat ttgcgtccca accaaattac gaggtctcca ggttgtagca 3060
gtgaagaagc tgacgaggac tcaggcctcc acggtgtgca cctggagtca ggagcgcgct 3120
tgtgcgtaca gttcggttca gcatgtggaa gaatggcatt cagtgagctg tgtcatcgct 3180
tcagataaag aaaatgtcac cgtggctgca gagatctcct gggatcactc tgaggagtta 3240
ctaaaagatg taactgaact gcagatcctt ggtgaaatat ctttcaacaa atctctatat 3300
gagggactga atgcagagaa ccacagaact aagatcactg tcgtcttcct gaaagatgag 3360
aagtaccatt ctttgcctat catcattaaa ggcagcgttg gtggacttct ggtgttgatc 3420
gtgattctgg tcatcctgtt caagtgtggc ttttttaaaa gaaaatatca acaactgaac 3480
ttggagagca tcaggaaggc ccagctgaaa tcagagaatc tgctcgaaga agagaat 3537
<210> 102
<211> 1671
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD19, isoform 1
<400> 102
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960
aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020
ggaagcgggc cccagaacca gtacgggaac gtgctgtctc tccccacacc cacctcaggc 1080
ctcggacgcg cccagcgttg ggccgcaggc ctggggggca ctgccccgtc ttatggaaac 1140
ccgagcagcg acgtccaggc ggatggagcc ttggggtccc ggagcccgcc gggagtgggc 1200
ccagaagaag aggaagggga gggctatgag gaacctgaca gtgaggagga ctccgagttc 1260
tatgagaacg actccaacct tgggcaggac cagctctccc aggatggcag cggctacgag 1320
aaccctgagg atgagcccct gggtcctgag gatgaagact ccttctccaa cgctgagtct 1380
tatgagaacg aggatgaaga gctgacccag ccggtcgcca ggacaatgga cttcctgagc 1440
cctcatgggt cagcctggga ccccagccgg gaagcaacct ccctggcagg gtcccagtcc 1500
tatgaggata tgagaggaat cctgtatgca gccccccagc tccgctccat tcggggccag 1560
cctggaccca atcatgagga agatgcagac tcttatgaga acatggataa tcccgatggg 1620
ccagacccag cctggggagg agggggccgc atgggcacct ggagcaccag g 1671
<210> 103
<211> 579
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Interleukin 18 (IL-18), isoform 1
<400> 103
atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60
aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120
cttgaatcta aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 180
ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa tgcaccccgg 240
accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta gaggtatggc tgtaactatc 300
tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag 360
gaaatgaatc ctcctgataa catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga 420
agtgtcccag gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 480
ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga ggatgaattg 540
ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagac 579
<210> 104
<211> 1005
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Fas ligand
<400> 104
atgctgggca tctggaccct cctacctctg gttcttacgt ctgttgctag attatcgtcc 60
aaaagtgtta atgcccaagt gactgacatc aactccaagg gattggaatt gaggaagact 120
gttactacag ttgagactca gaacttggaa ggcctgcatc atgatggcca attctgccat 180
aagccctgtc ctccaggtga aaggaaagct agggactgca cagtcaatgg ggatgaacca 240
gactgcgtgc cctgccaaga agggaaggag tacacagaca aagcccattt ttcttccaaa 300
tgcagaagat gtagattgtg tgatgaagga catggcttag aagtggaaat aaactgcacc 360
cggacccaga ataccaagtg cagatgtaaa ccaaactttt tttgtaactc tactgtatgt 420
gaacactgtg acccttgcac caaatgtgaa catggaatca tcaaggaatg cacactcacc 480
agcaacacca agtgcaaaga ggaaggatcc agatctaact tggggtggct ttgtcttctt 540
cttttgccaa ttccactaat tgtttgggtg aagagaaagg aagtacagaa aacatgcaga 600
aagcacagaa aggaaaacca aggttctcat gaatctccaa ctttaaatcc tgaaacagtg 660
gcaataaatt tatctgatgt tgacttgagt aaatatatca ccactattgc tggagtcatg 720
acactaagtc aagttaaagg ctttgttcga aagaatggtg tcaatgaagc caaaatagat 780
gagatcaaga atgacaatgt ccaagacaca gcagaacaga aagttcaact gcttcgtaat 840
tggcatcaac ttcatggaaa gaaagaagcg tatgacacat tgattaaaga tctcaaaaaa 900
gccaatcttt gtactcttgc agagaaaatt cagactatca tcctcaagga cattactagt 960
gactcagaaa attcaaactt cagaaatgaa atccaaagct tggtc 1005
<210> 105
<211> 1023
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> firA/SSC
<400> 105
atgccttcaa ttcgactggc tgacttagca gaacagttgg atgcagaatt acacggtgat 60
ggcgatatcg tcatcaccgg cgttgcgtcc atgcaatctg caacaacagg ccacattacg 120
tttatggtga atcctaagta ccgtgaacac ttaggtttat gccaggcttc tgcggttgtc 180
atgacgcagg acgatcttcc ttttgctaag agtgcggcgc tggtagttaa aaatccctac 240
ctgacctacg cgcgcatggc gcaaatttta gatactacgc cgcagcccgc gcagaatatc 300
gcgccaagcg ccgtgattga tgcgacggca acgctgggta gcaatgtttc agtcggcgcg 360
aatgcggtga ttgaatctgg cgtacaactg ggcgataacg tggttatcgg cgcaggctgt 420
ttcgtcggaa aaaatagcaa aatcggggcg ggttcacgct tgtgggcgaa cgtaacgatt 480
taccacgaca ttcagatcgg tgagaattgc ctgatccagt ccagtacggt gatcggcgcg 540
gacggttttg gctacgctaa cgatcgtggc aactgggtga agatcccaca actgggccgg 600
gtcattattg gcgatcgtgt cgagatcggc gcttgtacca ccattgaccg tggcgcgttg 660
gatgatactg ttattggcaa tggcgtgatt attgataatc agtgccagat tgcacataac 720
gtcgtgattg gcgacaatac ggcagttgcc ggtggcgtca ttatggcggg tagcctgaag 780
attggccgtt actgcatgat tggcggcgcc agcgtgatca atgggcatat ggaaatatgc 840
gacaaagtca cggtaactgg catgggtatg gtgatgcgtc ccatcacgga accgggcgtc 900
tactcctcag gcattccgct gcaacccaac aaagtatggc gtaaaactgc tgcactggtg 960
atgaacattg atgatatgag caagcgtctc aaagcgattg agcgcaaggt taatcaacaa 1020
gac 1023
<210> 106
<211> 918
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> htrB
<400> 106
atgacgaatc tacccaagtt ctccaccgca ctgcttcatc cgcgttattg gttaacctgg 60
ttgggtattg gcgtactttg gttagtcgtg caattgccct acccggttat ctaccgcctc 120
ggttgtggat taggaaaact ggcgttacgt tttatgaaac gacgcgcaaa aattgtgcat 180
cgcaacctgg aactgtgctt cccggaaatg agcgaacaag aacgccgtaa aatggtggtg 240
aagaatttcg aatccgttgg catgggcctg atggaaaccg gcatggcgtg gttctggccg 300
gaccgccgaa tcgcccgctg gacggaagtg atcggcatgg aacacattcg tgacgtgcag 360
gcgcaaaaac gcggcatcct gttagttggc atccattttc tgacactgga gctgggtgcg 420
cggcagtttg gtatgcagga accgggtatt ggcgtttatc gcccgaacga taatccactg 480
attgactggc tacaaacctg gggccgtttg cgctcaaata aatcgatgct cgaccgcaaa 540
gatttaaaag gcatgattaa agccctgaaa aaaggcgaag tggtctggta cgcaccggat 600
catgattacg gcccgcgctc aagcgttttc gtcccgttgt ttgccgttga gcaggctgcg 660
accacgaccg gaacctggat gctggcacgg atgtccggcg catgtctggt gcccttcgtt 720
ccacgccgta agccagatgg caaagggtat caattgatta tgctgccgcc agagtgttct 780
ccgccactgg atgatgccga aactaccgcc gcgtggatga acaaagtggt cgaaaaatgc 840
atcatgatgg caccagagca gtatatgtgg ttacaccgtc gctttaaaac acgcccggaa 900
ggcgttcctt cacgctat 918
<210> 107
<211> 717
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> ompR
<400> 107
atgcaagaga attataagat tctggtggtt gatgacgata tgcgtctgcg ggcgctactg 60
gaacgttatc tgaccgagca gggcttccag gttcgaagcg tcgctaacgc tgagcagatg 120
gatcgtctgc tgacccgtga atctttccat ctcatggtac tggatttaat gctgccaggt 180
gaagatggtc tgtcgatttg tcgtcgcctg cgtagtcaaa gtaatccaat gccgatcatt 240
atggtcacgg cgaagggtga agaggttgac cgtatcgtcg ggctggaaat cggcgccgat 300
gactacattc ctaaaccgtt taacccgcgc gagctgttgg cgcgtattcg gcccgtgtta 360
cgtcgtcagg caaacgaact gcccggcgcg ccgtcgcagg aagaggccgt tatcgcgttc 420
ggtaagttta aactgaacct cggtacgcgc gagatgttcc gtgaagatga accgatgccg 480
ctgaccagcg gggagtttgc ggtactgaaa gcgttagtca gccatccgcg cgagccgctc 540
tctcgcgata agctgatgaa tctggcccgt ggccgcgagt attccgcgat ggaacgctcc 600
atcgacgtcc agatctcccg cctgcgccgt atggtggaag aagatccggc acatccgcgt 660
tatattcaga ccgtctgggg cctgggctac gtctttgtac cggacggttc taaagca 717
<210> 108
<211> 498
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Inteferon (IFN) gamma
<400> 108
atgaaatata caagttatat cttggctttt cagctctgca tcgttttggg ttctcttggc 60
tgttactgcc aggacccata tgtaaaagaa gcagaaaacc ttaagaaata ttttaatgca 120
ggtcattcag atgtagcgga taatggaact cttttcttag gcattttgaa gaattggaaa 180
gaggagagtg acagaaaaat aatgcagagc caaattgtct ccttttactt caaacttttt 240
aaaaacttta aagatgacca gagcatccaa aagagtgtgg agaccatcaa ggaagacatg 300
aatgtcaagt ttttcaatag caacaaaaag aaacgagatg acttcgaaaa gctgactaat 360
tattcggtaa ctgacttgaa tgtccaacgc aaagcaatac atgaactcat ccaagtgatg 420
gctgaactgt cgccagcagc taaaacaggg aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 480
ggtcgaagag catcccag 498
<210> 109
<211> 699
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Tumor necrosis factor (TNF) alpha
<400> 109
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240
tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360
gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420
aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540
accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600
cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctg 699
<210> 110
<211> 825
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Atg5 long isoform
<400> 110
atgacagatg acaaagatgt gcttcgagat gtgtggtttg gacgaattcc aacttgtttc 60
acgctatatc aggatgagat aactgaaagg gaagcagaac catactattt gcttttgcca 120
agagtaagtt atttgacgtt ggtaactgac aaagtgaaaa agcactttca gaaggttatg 180
agacaagaag acattagtga gatatggttt gaatatgaag gcacaccact gaaatggcat 240
tatccaattg gtttgctatt tgatcttctt gcatcaagtt cagctcttcc ttggaacatc 300
acagtacatt ttaagagttt tccagaaaaa gaccttctgc actgtccatc taaggatgca 360
attgaagctc attttatgtc atgtatgaaa gaagctgatg ctttaaaaca taaaagtcaa 420
gtaatcaatg aaatgcagaa aaaagatcac aagcaactct ggatgggatt gcaaaatgac 480
agatttgacc agttttgggc catcaatcgg aaactcatgg aatatcctgc agaagaaaat 540
ggatttcgtt atatcccctt tagaatatat cagacaacga ctgaaagacc tttcattcag 600
aagctgtttc gtcctgtggc tgcagatgga cagttgcaca cactaggaga tctcctcaaa 660
gaagtttgtc cttctgctat tgatcctgaa gatggggaaa aaaagaatca agtgatgatt 720
catggaattg agccaatgtt ggaaacacct ctgcagtggc tgagtgaaca tctgagctac 780
ccggataatt ttcttcatat tagtatcatc ccacagccaa cagat 825
<210> 111
<211> 1350
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Beclin1
<400> 111
atggaagggt ctaagacgtc caacaacagc accatgcagg tgagcttcgt gtgccagcgc 60
tgcagccagc ccctgaaact ggacacgagt ttcaagatcc tggaccgtgt caccatccag 120
gaactcacag ctccattact taccacagcc caggcgaaac caggagagac ccaggaggaa 180
gagactaact caggagagga gccatttatt gaaactcctc gccaggatgg tgtctctcgc 240
agattcatcc ccccagccag gatgatgtcc acagaaagtg ccaacagctt cactctgatt 300
ggggaggcat ctgatggcgg caccatggag aacctcagcc gaagactgaa ggtcactggg 360
gacctttttg acatcatgtc gggccagaca gatgtggatc acccactctg tgaggaatgc 420
acagatactc ttttagacca gctggacact cagctcaacg tcactgaaaa tgagtgtcag 480
aactacaaac gctgtttgga gatcttagag caaatgaatg aggatgacag tgaacagtta 540
cagatggagc taaaggagct ggcactagag gaggagaggc tgatccagga gctggaagac 600
gtggaaaaga accgcaagat agtggcagaa aatctcgaga aggtccaggc tgaggctgag 660
agactggatc aggaggaagc tcagtatcag agagaataca gtgaatttaa acgacagcag 720
ctggagctgg atgatgagct gaagagtgtt gaaaaccaga tgcgttatgc ccagacgcag 780
ctggataagc tgaagaaaac caacgtcttt aatgcaacct tccacatctg gcacagtgga 840
cagtttggca caatcaataa cttcaggctg ggtcgcctgc ccagtgttcc cgtggaatgg 900
aatgagatta atgctgcttg gggccagact gtgttgctgc tccatgctct ggccaataag 960
atgggtctga aatttcagag ataccgactt gttccttacg gaaaccattc atatctggag 1020
tctctgacag acaaatctaa ggagctgccg ttatactgtt ctggggggtt gcggtttttc 1080
tgggacaaca agtttgacca tgcaatggtg gctttcctgg actgtgtgca gcagttcaaa 1140
gaagaggttg agaaaggcga gacacgtttt tgtcttccct acaggatgga tgtggagaaa 1200
ggcaagattg aagacacagg aggcagtggc ggctcctatt ccatcaaaac ccagtttaac 1260
tctgaggagc agtggacaaa agctctcaag ttcatgctga cgaatcttaa gtggggtctt 1320
gcttgggtgt cctcacaatt ttataacaaa 1350
<210> 112
<211> 2352
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Toll-like receptor 2 (TLR2)
<400> 112
atgccacata ctttgtggat ggtgtgggtc ttgggggtca tcatcagcct ctccaaggaa 60
gaatcctcca atcaggcttc tctgtcttgt gaccgcaatg gtatctgcaa gggcagctca 120
ggatctttaa actccattcc ctcagggctc acagaagctg taaaaagcct tgacctgtcc 180
aacaacagga tcacctacat tagcaacagt gacctacaga ggtgtgtgaa cctccaggct 240
ctggtgctga catccaatgg aattaacaca atagaggaag attctttttc ttccctgggc 300
agtcttgaac atttagactt atcctataat tacttatcta atttatcgtc ttcctggttc 360
aagccccttt cttctttaac attcttaaac ttactgggaa atccttacaa aaccctaggg 420
gaaacatctc ttttttctca tctcacaaaa ttgcaaatcc tgagagtggg aaatatggac 480
accttcacta agattcaaag aaaagatttt gctggactta ccttccttga ggaacttgag 540
attgatgctt cagatctaca gagctatgag ccaaaaagtt tgaagtcaat tcagaatgta 600
agtcatctga tccttcatat gaagcagcat attttactgc tggagatttt tgtagatgtt 660
acaagttccg tggaatgttt ggaactgcga gatactgatt tggacacttt ccatttttca 720
gaactatcca ctggtgaaac aaattcattg attaaaaagt ttacatttag aaatgtgaaa 780
atcaccgatg aaagtttgtt tcaggttatg aaacttttga atcagatttc tggattgtta 840
gaattagagt ttgatgactg tacccttaat ggagttggta attttagagc atctgataat 900
gacagagtta tagatccagg taaagtggaa acgttaacaa tccggaggct gcatattcca 960
aggttttact tattttatga tctgagcact ttatattcac ttacagaaag agttaaaaga 1020
atcacagtag aaaacagtaa agtttttctg gttccttgtt tactttcaca acatttaaaa 1080
tcattagaat acttggatct cagtgaaaat ttgatggttg aagaatactt gaaaaattca 1140
gcctgtgagg atgcctggcc ctctctacaa actttaattt taaggcaaaa tcatttggca 1200
tcattggaaa aaaccggaga gactttgctc actctgaaaa acttgactaa cattgatatc 1260
agtaagaata gttttcattc tatgcctgaa acttgtcagt ggccagaaaa gatgaaatat 1320
ttgaacttat ccagcacacg aatacacagt gtaacaggct gcattcccaa gacactggaa 1380
attttagatg ttagcaacaa caatctcaat ttattttctt tgaatttgcc gcaactcaaa 1440
gaactttata tttccagaaa taagttgatg actctaccag atgcctccct cttacccatg 1500
ttactagtat tgaaaatcag taggaatgca ataactacgt tttctaagga gcaacttgac 1560
tcatttcaca cactgaagac tttggaagct ggtggcaata acttcatttg ctcctgtgaa 1620
ttcctctcct tcactcagga gcagcaagca ctggccaaag tcttgattga ttggccagca 1680
aattacctgt gtgactctcc atcccatgtg cgtggccagc aggttcagga tgtccgcctc 1740
tcggtgtcgg aatgtcacag gacagcactg gtgtctggca tgtgctgtgc tctgttcctg 1800
ctgatcctgc tcacgggggt cctgtgccac cgtttccatg gcctgtggta tatgaaaatg 1860
atgtgggcct ggctccaggc caaaaggaag cccaggaaag ctcccagcag gaacatctgc 1920
tatgatgcat ttgtttctta cagtgagcgg gatgcctact gggtggagaa ccttatggtc 1980
caggagctgg agaacttcaa tccccccttc aagttgtgtc ttcataagcg ggacttcatt 2040
cctggcaagt ggatcattga caatatcatt gactccattg aaaagagcca caaaactgtc 2100
tttgtgcttt ctgaaaactt tgtgaagagt gagtggtgca agtatgaact ggacttctcc 2160
catttccgtc tttttgatga gaacaatgat gctgccattc tcattcttct ggagcccatt 2220
gagaaaaaag ccattcccca gcgcttctgc aagctgcgga agataatgaa caccaagacc 2280
tacctggagt ggcccatgga cgaggctcag cgggaaggat tttgggtaaa tctgagagct 2340
gcgataaagt cc 2352
<210> 113
<211> 2517
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TLR4, isoform 1
<400> 113
atgatgtctg cctcgcgcct ggctgggact ctgatcccag ccatggcctt cctctcctgc 60
gtgagaccag aaagctggga gccctgcgtg gaggtggttc ctaatattac ttatcaatgc 120
atggagctga atttctacaa aatccccgac aacctcccct tctcaaccaa gaacctggac 180
ctgagcttta atcccctgag gcatttaggc agctatagct tcttcagttt cccagaactg 240
caggtgctgg atttatccag gtgtgaaatc cagacaattg aagatggggc atatcagagc 300
ctaagccacc tctctacctt aatattgaca ggaaacccca tccagagttt agccctggga 360
gccttttctg gactatcaag tttacagaag ctggtggctg tggagacaaa tctagcatct 420
ctagagaact tccccattgg acatctcaaa actttgaaag aacttaatgt ggctcacaat 480
cttatccaat ctttcaaatt acctgagtat ttttctaatc tgaccaatct agagcacttg 540
gacctttcca gcaacaagat tcaaagtatt tattgcacag acttgcgggt tctacatcaa 600
atgcccctac tcaatctctc tttagacctg tccctgaacc ctatgaactt tatccaacca 660
ggtgcattta aagaaattag gcttcataag ctgactttaa gaaataattt tgatagttta 720
aatgtaatga aaacttgtat tcaaggtctg gctggtttag aagtccatcg tttggttctg 780
ggagaattta gaaatgaagg aaacttggaa aagtttgaca aatctgctct agagggcctg 840
tgcaatttga ccattgaaga attccgatta gcatacttag actactacct cgatgatatt 900
attgacttat ttaattgttt gacaaatgtt tcttcatttt ccctggtgag tgtgactatt 960
gaaagggtaa aagacttttc ttataatttc ggatggcaac atttagaatt agttaactgt 1020
aaatttggac agtttcccac attgaaactc aaatctctca aaaggcttac tttcacttcc 1080
aacaaaggtg ggaatgcttt ttcagaagtt gatctaccaa gccttgagtt tctagatctc 1140
agtagaaatg gcttgagttt caaaggttgc tgttctcaaa gtgattttgg gacaaccagc 1200
ctaaagtatt tagatctgag cttcaatggt gttattacca tgagttcaaa cttcttgggc 1260
ttagaacaac tagaacatct ggatttccag cattccaatt tgaaacaaat gagtgagttt 1320
tcagtattcc tatcactcag aaacctcatt taccttgaca tttctcatac tcacaccaga 1380
gttgctttca atggcatctt caatggcttg tccagtctcg aagtcttgaa aatggctggc 1440
aattctttcc aggaaaactt ccttccagat atcttcacag agctgagaaa cttgaccttc 1500
ctggacctct ctcagtgtca actggagcag ttgtctccaa cagcatttaa ctcactctcc 1560
agtcttcagg tactaaatat gagccacaac aacttctttt cattggatac gtttccttat 1620
aagtgtctga actccctcca ggttcttgat tacagtctca atcacataat gacttccaaa 1680
aaacaggaac tacagcattt tccaagtagt ctagctttct taaatcttac tcagaatgac 1740
tttgcttgta cttgtgaaca ccagagtttc ctgcaatgga tcaaggacca gaggcagctc 1800
ttggtggaag ttgaacgaat ggaatgtgca acaccttcag ataagcaggg catgcctgtg 1860
ctgagtttga atatcacctg tcagatgaat aagaccatca ttggtgtgtc ggtcctcagt 1920
gtgcttgtag tatctgttgt agcagttctg gtctataagt tctattttca cctgatgctt 1980
cttgctggct gcataaagta tggtagaggt gaaaacatct atgatgcctt tgttatctac 2040
tcaagccagg atgaggactg ggtaaggaat gagctagtaa agaatttaga agaaggggtg 2100
cctccatttc agctctgcct tcactacaga gactttattc ccggtgtggc cattgctgcc 2160
aacatcatcc atgaaggttt ccataaaagc cgaaaggtga ttgttgtggt gtcccagcac 2220
ttcatccaga gccgctggtg tatctttgaa tatgagattg ctcagacctg gcagtttctg 2280
agcagtcgtg ctggtatcat cttcattgtc ctgcagaagg tggagaagac cctgctcagg 2340
cagcaggtgg agctgtaccg ccttctcagc aggaacactt acctggagtg ggaggacagt 2400
gtcctggggc ggcacatctt ctggagacga ctcagaaaag ccctgctgga tggtaaatca 2460
tggaatccag aaggaacagt gggtacagga tgcaattggc aggaagcaac atctatc 2517
<210> 114
<211> 2574
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TLR5
<400> 114
atgggagacc acctggacct tctcctagga gtggtgctca tggccggtcc tgtgtttgga 60
attccttcct gctcctttga tggccgaata gccttttatc gtttctgcaa cctcacccag 120
gtcccccagg tcctcaacac cactgagagg ctcctgctga gcttcaacta tatcaggaca 180
gtcactgctt catccttccc ctttctggaa cagctgcagc tgctggagct cgggagccag 240
tataccccct tgactattga caaggaggcc ttcagaaacc tgcccaacct tagaatcttg 300
gacctgggaa gtagtaagat atacttcttg catccagatg cttttcaggg actgttccat 360
ctgtttgaac ttagactgta tttctgtggt ctctctgatg ctgtattgaa agatggttat 420
ttcagaaatt taaaggcttt aactcgcttg gatctatcca aaaatcagat tcgtagcctt 480
taccttcatc cttcatttgg gaagttgaat tccttaaagt ccatagattt ttcctccaac 540
caaatattcc ttgtatgtga acatgagctc gagcccctac aagggaaaac gctctccttt 600
tttagcctcg cagctaatag cttgtatagc agagtctcag tggactgggg aaaatgtatg 660
aacccattca gaaacatggt gctggagata ctagatgttt ctggaaatgg ctggacagtg 720
gacatcacag gaaactttag caatgccatc agcaaaagcc aggccttctc tttgattctt 780
gcccaccaca tcatgggtgc cgggtttggc ttccataaca tcaaagatcc tgaccagaac 840
acatttgctg gcctggccag aagttcagtg agacacctgg atctttcaca tgggtttgtc 900
ttctccctga actcacgagt ctttgagaca ctcaaggatt tgaaggttct gaaccttgcc 960
tacaacaaga taaataagat tgcagatgaa gcattttacg gacttgacaa cctccaagtt 1020
ctcaatttgt catataacct tctgggggaa ctttacagtt cgaatttcta tggactacct 1080
aaggtagcct acattgattt gcaaaagaat cacattgcaa taattcaaga ccaaacattc 1140
aaattcctgg aaaaattaca gaccttggat ctccgagaca atgctcttac aaccattcat 1200
tttattccaa gcatacccga tatcttcttg agtggcaata aactagtgac tttgccaaag 1260
atcaacctta cagcgaacct catccactta tcagaaaaca ggctagaaaa tctagatatt 1320
ctctactttc tcctacgggt acctcatctc cagattctca ttttaaatca aaatcgcttc 1380
tcctcctgta gtggagatca aaccccttca gagaatccca gcttagaaca gcttttcctt 1440
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ctttctcatc ttcaagttct gtatttgaat cataactatc ttaattccct tccaccagga 1560
gtatttagcc atctgactgc attaagggga ctaagcctca actccaacag gctgacagtt 1620
ctttctcaca atgatttacc tgctaattta gagatcctgg acatatccag gaaccagctc 1680
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tcccttttca ttgtatgcac tgtcactctg actctgttcc tcatgaccat cctcacagtc 1980
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agcaaagact tcacatgggt gcagaatgct ttgctcaaac acctggacac tcaatacagt 2160
gaccaaaaca gattcaacct gtgctttgaa gaaagagact ttgtcccagg agaaaaccgc 2220
attgccaata tccaggatgc catctggaac agtagaaaga tcgtttgtct tgtgagcaga 2280
cacttcctta gagatggctg gtgccttgaa gccttcagtt atgcccaggg caggtgctta 2340
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gatctccagg atgttggctg gtttcttcat aaactctctc aacagatact aaagaaagaa 2520
aaagaaaaga agaaagacaa taacattccg ttgcaaactg tagcaaccat ctcc 2574
<210> 115
<211> 2712
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TLR3, isoform 1
<400> 115
atgagacaga ctttgccttg tatctacttt tgggggggcc ttttgccctt tgggatgctg 60
tgtgcatcct ccaccaccaa gtgcactgtt agccatgaag ttgctgactg cagccacctg 120
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gatgtaggat ttaacaccat ctcaaaactg gagccagaat tgtgccagaa acttcccatg 300
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aatccctttg tcaagcagaa gaatttaatc acattagatc tgtctcataa tggcttgtca 480
tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540
aataaaattc aagcgctaaa aagtgaagaa ctggatatct ttgccaattc atctttaaaa 600
aaattagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660
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ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcatt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780
tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaatctcac tatgctcgat 840
ctttcctaca acaacttaaa tgtggttggt aacgattcct ttgcttggct tccacaacta 900
gaatatttct tcctagagta taataatata cagcatttgt tttctcactc tttgcacggg 960
cttttcaatg tgaggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020
gcctcactcc ccaagattga tgatttttct tttcagtggc taaaatgttt ggagcacctt 1080
aacatggaag ataatgatat tccaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140
ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc gaactttgac aaatgaaaca 1200
tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260
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aactctgtac at 2712
<210> 116
<211> 3096
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TLR9
<400> 116
atgggtttct gccgcagcgc cctgcacccg ctgtctctcc tggtgcaggc catcatgctg 60
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gacctgtcgg acaaccgcat cagcggagct tcggagctga cagccaccat gggggaggca 1320
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acccggctcc ggaggctgga tgtcagctgc aacagcatca gcttcgtggc ccccggcttc 2160
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atctttgcac aggacctgcg cctctgcctg gatgaggccc tctcctggga ctgtttcgcc 2460
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<210> 117
<211> 3147
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TLR7
<400> 117
atggtgtttc caatgtggac actgaagaga caaattctta tcctttttaa cataatccta 60
atttccaaac tccttggggc tagatggttt cctaaaactc tgccctgtga tgtcactctg 120
gatgttccaa agaaccatgt gatcgtggac tgcacagaca agcatttgac agaaattcct 180
ggaggtattc ccacgaacac cacgaacctc accctcacca ttaaccacat accagacatc 240
tccccagcgt cctttcacag actggaccat ctggtagaga tcgatttcag atgcaactgt 300
gtacctattc cactggggtc aaaaaacaac atgtgcatca agaggctgca gattaaaccc 360
agaagcttta gtggactcac ttatttaaaa tccctttacc tggatggaaa ccagctacta 420
gagataccgc agggcctccc gcctagctta cagcttctca gccttgaggc caacaacatc 480
ttttccatca gaaaagagaa tctaacagaa ctggccaaca tagaaatact ctacctgggc 540
caaaactgtt attatcgaaa tccttgttat gtttcatatt caatagagaa agatgccttc 600
ctaaacttga caaagttaaa agtgctctcc ctgaaagata acaatgtcac agccgtccct 660
actgttttgc catctacttt aacagaacta tatctctaca acaacatgat tgcaaaaatc 720
caagaagatg attttaataa cctcaaccaa ttacaaattc ttgacctaag tggaaattgc 780
cctcgttgtt ataatgcccc atttccttgt gcgccgtgta aaaataattc tcccctacag 840
atccctgtaa atgcttttga tgcgctgaca gaattaaaag ttttacgtct acacagtaac 900
tctcttcagc atgtgccccc aagatggttt aagaacatca acaaactcca ggaactggat 960
ctgtcccaaa acttcttggc caaagaaatt ggggatgcta aatttctgca ttttctcccc 1020
agcctcatcc aattggatct gtctttcaat tttgaacttc aggtctatcg tgcatctatg 1080
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gtctttaaag agttgaaaag ctttaacctc tcgccattac ataatcttca aaatcttgaa 1200
gttcttgatc ttggcactaa ctttataaaa attgctaacc tcagcatgtt taaacaattt 1260
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gaagttggct tctgctcaaa tgccagaact tctgtagaaa gttatgaacc ccaggtcctg 1380
gaacaattac attatttcag atatgataag tatgcaagga gttgcagatt caaaaacaaa 1440
gaggcttctt tcatgtctgt taatgaaagc tgctacaagt atgggcagac cttggatcta 1500
agtaaaaata gtatattttt tgtcaagtcc tctgattttc agcatctttc tttcctcaaa 1560
tgcctgaatc tgtcaggaaa tctcattagc caaactctta atggcagtga attccaacct 1620
ttagcagagc tgagatattt ggacttctcc aacaaccggc ttgatttact ccattcaaca 1680
gcatttgaag agcttcacaa actggaagtt ctggatataa gcagtaatag ccattatttt 1740
caatcagaag gaattactca tatgctaaac tttaccaaga acctaaaggt tctgcagaaa 1800
ctgatgatga acgacaatga catctcttcc tccaccagca ggaccatgga gagtgagtct 1860
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tccctaagtt tcttgccttc tggagttttt gatggtatgc ctccaaatct aaagaatctc 2040
tctttggcca aaaatgggct caaatctttc agttggaaga aactccagtg tctaaagaac 2100
ctggaaactt tggacctcag ccacaaccaa ctgaccactg tccctgagag attatccaac 2160
tgttccagaa gcctcaagaa tctgattctt aagaataatc aaatcaggag tctgacgaag 2220
tattttctac aagatgcctt ccagttgcga tatctggatc tcagctcaaa taaaatccag 2280
atgatccaaa agaccagctt cccagaaaat gtcctcaaca atctgaagat gttgcttttg 2340
catcataatc ggtttctgtg cacctgtgat gctgtgtggt ttgtctggtg ggttaaccat 2400
acggaggtga ctattcctta cctggccaca gatgtgactt gtgtggggcc aggagcacac 2460
aagggccaaa gtgtgatctc cctggatctg tacacctgtg agttagatct gactaacctg 2520
attctgttct cactttccat atctgtatct ctctttctca tggtgatgat gacagcaagt 2580
cacctctatt tctgggatgt gtggtatatt taccatttct gtaaggccaa gataaagggg 2640
tatcagcgtc taatatcacc agactgttgc tatgatgctt ttattgtgta tgacactaaa 2700
gacccagctg tgaccgagtg ggttttggct gagctggtgg ccaaactgga agacccaaga 2760
gagaaacatt ttaatttatg tctcgaggaa agggactggt taccagggca gccagttctg 2820
gaaaaccttt cccagagcat acagcttagc aaaaagacag tgtttgtgat gacagacaag 2880
tatgcaaaga ctgaaaattt taagatagca ttttacttgt cccatcagag gctcatggat 2940
gaaaaagttg atgtgattat cttgatattt cttgagaagc cctttcagaa gtccaagttc 3000
ctccagctcc ggaaaaggct ctgtgggagt tctgtccttg agtggccaac aaacccgcaa 3060
gctcacccat acttctggca gtgtctaaag aacgccctgg ccacagacaa tcatgtggcc 3120
tatagtcagg tgttcaagga aacggtc 3147
<210> 118
<211> 3177
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TLR8, isoform 1
<400> 118
atgaaggagt catctttgca aaatagctcc tgcagcctgg gaaaggagac taaaaaggaa 60
aacatgttcc ttcagtcgtc aatgctgacc tgcattttcc tgctaatatc tggttcctgt 120
gagttatgcg ccgaagaaaa tttttctaga agctatcctt gtgatgagaa aaagcaaaat 180
gactcagtta ttgcagagtg cagcaatcgt cgactacagg aagttcccca aacggtgggc 240
aaatatgtga cagaactaga cctgtctgat aatttcatca cacacataac gaatgaatca 300
tttcaagggc tgcaaaatct cactaaaata aatctaaacc acaaccccaa tgtacagcac 360
cagaacggaa atcccggtat acaatcaaat ggcttgaata tcacagacgg ggcattcctc 420
aacctaaaaa acctaaggga gttactgctt gaagacaacc agttacccca aataccctct 480
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aaagagggca tttcaagact tataaacttg aaaaatctct atttggcctg gaactgctat 600
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ttggagttgc tatcactatc tttcaattct ctttcacacg tgccacccaa actgccaagc 720
tccctacgca aactttttct gagcaacacc cagatcaaat acattagtga agaagatttc 780
aagggattga taaatttaac attactagat ttaagcggga actgtccgag gtgcttcaat 840
gccccatttc catgcgtgcc ttgtgatggt ggtgcttcaa ttaatataga tcgttttgct 900
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atttacttgt cagaaaacag aatatcaccg ttggtaaaag atacccggca gagttatgca 1380
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ccacattcga acttttatca tttcacccgt cctttaataa agccacaatg tgctgcttat 1500
ggaaaagcct tagatttaag cctcaacagt attttcttca ttgggccaaa ccaatttgaa 1560
aatcttcctg acattgcctg tttaaatctg tctgcaaata gcaatgctca agtgttaagt 1620
ggaactgaat tttcagccat tcctcatgtc aaatatttgg atttgacaaa caatagacta 1680
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tataattcac actatttcag aatagcaggc gtaacacatc atctagaatt tattcaaaat 1800
ttcacaaatc taaaagtttt aaacttgagc cacaacaaca tttatacttt aacagataag 1860
tataacctgg aaagcaagtc cctggtagaa ttagttttca gtggcaatcg ccttgacatt 1920
ttgtggaatg atgatgacaa caggtatatc tccattttca aaggtctcaa gaatctgaca 1980
cgtctggatt tatcccttaa taggctgaag cacatcccaa atgaagcatt ccttaatttg 2040
ccagcgagtc tcactgaact acatataaat gataatatgt taaagttttt taactggaca 2100
ttactccagc agtttcctcg tctcgagttg cttgacttac gtggaaacaa actactcttt 2160
ttaactgata gcctatctga ctttacatct tcccttcgga cactgctgct gagtcataac 2220
aggatttccc acctaccctc tggctttctt tctgaagtca gtagtctgaa gcacctcgat 2280
ttaagttcca atctgctaaa aacaatcaac aaatccgcac ttgaaactaa gaccaccacc 2340
aaattatcta tgttggaact acacggaaac ccctttgaat gcacctgtga cattggagat 2400
ttccgaagat ggatggatga acatctgaat gtcaaaattc ccagactggt agatgtcatt 2460
tgtgccagtc ctggggatca aagagggaag agtattgtga gtctggagct aacaacttgt 2520
gtttcagatg tcactgcagt gatattattt ttcttcacgt tctttatcac caccatggtt 2580
atgttggctg ccctggctca ccatttgttt tactgggatg tttggtttat atataatgtg 2640
tgtttagcta aggtaaaagg ctacaggtct ctttccacat cccaaacttt ctatgatgct 2700
tacatttctt atgacaccaa agatgcctct gttactgact gggtgataaa tgagctgcgc 2760
taccaccttg aagagagccg agacaaaaac gttctccttt gtctagagga gagggattgg 2820
gacccgggat tggccatcat cgacaacctc atgcagagca tcaaccaaag caagaaaaca 2880
gtatttgttt taaccaaaaa atatgcaaaa agctggaact ttaaaacagc tttttacttg 2940
gctttgcaga ggctaatgga tgagaacatg gatgtgatta tatttatcct gctggagcca 3000
gtgttacagc attctcagta tttgaggcta cggcagcgga tctgtaagag ctccatcctc 3060
cagtggcctg acaacccgaa ggcagaaggc ttgttttggc aaactctgag aaatgtggtc 3120
ttgactgaaa atgattcacg gtataacaat atgtatgtcg attccattaa gcaatac 3177
<210> 119
<211> 636
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Interleukin 6 (IL-6)
<400> 119
atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60
gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagta cccccaggag aagattccaa agatgtagcc 120
gccccacaca gacagccact cacctcttca gaacgaattg acaaacaaat tcggtacatc 180
ctcgacggca tctcagccct gagaaaggag acatgtaaca agagtaacat gtgtgaaagc 240
agcaaagagg cactggcaga aaacaacctg aaccttccaa agatggctga aaaagatgga 300
tgcttccaat ctggattcaa tgaggagact tgcctggtga aaatcatcac tggtcttttg 360
gagtttgagg tatacctaga gtacctccag aacagatttg agagtagtga ggaacaagcc 420
agagctgtgc agatgagtac aaaagtcctg atccagttcc tgcagaaaaa ggcaaagaat 480
ctagatgcaa taaccacccc tgacccaacc acaaatgcca gcctgctgac gaagctgcag 540
gcacagaacc agtggctgca ggacatgaca actcatctca ttctgcgcag ctttaaggag 600
ttcctgcagt ccagcctgag ggctcttcgg caaatg 636
<210> 120
<211> 951
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MyD88, isoform 1
<400> 120
atgcgacccg accgcgctga ggctccagga ccgcccgcca tggctgcagg aggtcccggc 60
gcggggtctg cggccccggt ctcctccaca tcctcccttc ccctggctgc tctcaacatg 120
cgagtgcggc gccgcctgtc tctgttcttg aacgtgcgga cacaggtggc ggccgactgg 180
accgcgctgg cggaggagat ggactttgag tacttggaga tccggcaact ggagacacaa 240
gcggacccca ctggcaggct gctggacgcc tggcagggac gccctggcgc ctctgtaggc 300
cgactgctcg agctgcttac caagctgggc cgcgacgacg tgctgctgga gctgggaccc 360
agcattgagg aggattgcca aaagtatatc ttgaagcagc agcaggagga ggctgagaag 420
cctttacagg tggccgctgt agacagcagt gtcccacgga cagcagagct ggcgggcatc 480
accacacttg atgaccccct ggggcatatg cctgagcgtt tcgatgcctt catctgctat 540
tgccccagcg acatccagtt tgtgcaggag atgatccggc aactggaaca gacaaactat 600
cgactgaagt tgtgtgtgtc tgaccgcgat gtcctgcctg gcacctgtgt ctggtctatt 660
gctagtgagc tcatcgaaaa gaggttggct agaaggccac ggggtgggtg ccgccggatg 720
gtggtggttg tctctgatga ttacctgcag agcaaggaat gtgacttcca gaccaaattt 780
gcactcagcc tctctccagg tgcccatcag aagcgactga tccccatcaa gtacaaggca 840
atgaagaaag agttccccag catcctgagg ttcatcactg tctgcgacta caccaacccc 900
tgcaccaaat cttggttctg gactcgcctt gccaaggcct tgtccctgcc c 951
<210> 121
<211> 807
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Interleukin 1-beta (IL-1beta)
<400> 121
atggcagaag tacctgagct cgccagtgaa atgatggctt attacagtgg caatgaggat 60
gacttgttct ttgaagctga tggccctaaa cagatgaagt gctccttcca ggacctggac 120
ctctgccctc tggatggcgg catccagcta cgaatctccg accaccacta cagcaagggc 180
ttcaggcagg ccgcgtcagt tgttgtggcc atggacaagc tgaggaagat gctggttccc 240
tgcccacaga ccttccagga gaatgacctg agcaccttct ttcccttcat ctttgaagaa 300
gaacctatct tcttcgacac atgggataac gaggcttatg tgcacgatgc acctgtacga 360
tcactgaact gcacgctccg ggactcacag caaaaaagct tggtgatgtc tggtccatat 420
gaactgaaag ctctccacct ccagggacag gatatggagc aacaagtggt gttctccatg 480
tcctttgtac aaggagaaga aagtaatgac aaaatacctg tggccttggg cctcaaggaa 540
aagaatctgt acctgtcctg cgtgttgaaa gatgataagc ccactctaca gctggagagt 600
gtagatccca aaaattaccc aaagaagaag atggaaaagc gatttgtctt caacaagata 660
gaaatcaata acaagctgga atttgagtct gcccagttcc ccaactggta catcagcacc 720
tctcaagcag aaaacatgcc cgtcttcctg ggagggacca aaggcggcca ggatataact 780
gacttcacca tgcaatttgt gtcttcc 807
<210> 122
<211> 3075
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MDA5/IFIH1, isoform 1
<400> 122
atgtcgaatg ggtattccac agacgagaat ttccgctatc tcatctcgtg cttcagggcc 60
agggtgaaaa tgtacatcca ggtggagcct gtgctggact acctgacctt tctgcctgca 120
gaggtgaagg agcagattca gaggacagtc gccacctccg ggaacatgca ggcagttgaa 180
ctgctgctga gcaccttgga gaagggagtc tggcaccttg gttggactcg ggaattcgtg 240
gaggccctcc ggagaaccgg cagccctctg gccgcccgct acatgaaccc tgagctcacg 300
gacttgccct ctccatcgtt tgagaacgct catgatgaat atctccaact gctgaacctc 360
cttcagccca ctctggtgga caagcttcta gttagagacg tcttggataa gtgcatggag 420
gaggaactgt tgacaattga agacagaaac cggattgctg ctgcagaaaa caatggaaat 480
gaatcaggtg taagagagct actaaaaagg attgtgcaga aagaaaactg gttctctgca 540
tttctgaatg ttcttcgtca aacaggaaac aatgaacttg tccaagagtt aacaggctct 600
gattgctcag aaagcaatgc agagattgag aatttatcac aagttgatgg tcctcaagtg 660
gaagagcaac ttctttcaac cacagttcag ccaaatctgg agaaggaggt ctggggcatg 720
gagaataact catcagaatc atcttttgca gattcttctg tagtttcaga atcagacaca 780
agtttggcag aaggaagtgt cagctgctta gatgaaagtc ttggacataa cagcaacatg 840
ggcagtgatt caggcaccat gggaagtgat tcagatgaag agaatgtggc agcaagagca 900
tccccggagc cagaactcca gctcaggcct taccaaatgg aagttgccca gccagccttg 960
gaagggaaga atatcatcat ctgcctccct acagggagtg gaaaaaccag agtggctgtt 1020
tacattgcca aggatcactt agacaagaag aaaaaagcat ctgagcctgg aaaagttata 1080
gttcttgtca ataaggtact gctagttgaa cagctcttcc gcaaggagtt ccaaccattt 1140
ttgaagaaat ggtatcgtgt tattggatta agtggtgata cccaactgaa aatatcattt 1200
ccagaagttg tcaagtcctg tgatattatt atcagtacag ctcaaatcct tgaaaactcc 1260
ctcttaaact tggaaaatgg agaagatgct ggtgttcaat tgtcagactt ttccctcatt 1320
atcattgatg aatgtcatca caccaacaaa gaagcagtgt ataataacat catgaggcat 1380
tatttgatgc agaagttgaa aaacaataga ctcaagaaag aaaacaaacc agtgattccc 1440
cttcctcaga tactgggact aacagcttca cctggtgttg gaggggccac gaagcaagcc 1500
aaagctgaag aacacatttt aaaactatgt gccaatcttg atgcatttac tattaaaact 1560
gttaaagaaa accttgatca actgaaaaac caaatacagg agccatgcaa gaagtttgcc 1620
attgcagatg caaccagaga agatccattt aaagagaaac ttctagaaat aatgacaagg 1680
attcaaactt attgtcaaat gagtccaatg tcagattttg gaactcaacc ctatgaacaa 1740
tgggccattc aaatggaaaa aaaagctgca aaagaaggaa atcgcaaaga acgtgtttgt 1800
gcagaacatt tgaggaagta caatgaggcc ctacaaatta atgacacaat tcgaatgata 1860
gatgcgtata ctcatcttga aactttctat aatgaagaga aagataagaa gtttgcagtc 1920
atagaagatg atagtgatga gggtggtgat gatgagtatt gtgatggtga tgaagatgag 1980
gatgatttaa agaaaccttt gaaactggat gaaacagata gatttctcat gactttattt 2040
tttgaaaaca ataaaatgtt gaaaaggctg gctgaaaacc cagaatatga aaatgaaaag 2100
ctgaccaaat taagaaatac cataatggag caatatacta ggactgagga atcagcacga 2160
ggaataatct ttacaaaaac acgacagagt gcatatgcgc tttcccagtg gattactgaa 2220
aatgaaaaat ttgctgaagt aggagtcaaa gcccaccatc tgattggagc tggacacagc 2280
agtgagttca aacccatgac acagaatgaa caaaaagaag tcattagtaa atttcgcact 2340
ggaaaaataa atctgcttat cgctaccaca gtggcagaag aaggtctgga tattaaagaa 2400
tgtaacattg ttatccgtta tggtctcgtc accaatgaaa tagccatggt ccaggcccgt 2460
ggtcgagcca gagctgatga gagcacctac gtcctggttg ctcacagtgg ttcaggagtt 2520
atcgaacatg agacagttaa tgatttccga gagaagatga tgtataaagc tatacattgt 2580
gttcaaaata tgaaaccaga ggagtatgct cataagattt tggaattaca gatgcaaagt 2640
ataatggaaa agaaaatgaa aaccaagaga aatattgcca agcattacaa gaataaccca 2700
tcactaataa ctttcctttg caaaaactgc agtgtgctag cctgttctgg ggaagatatc 2760
catgtaattg agaaaatgca tcacgtcaat atgaccccag aattcaagga actttacatt 2820
gtaagagaaa acaaagcact gcaaaagaag tgtgccgact atcaaataaa tggtgaaatc 2880
atctgcaaat gtggccaggc ttggggaaca atgatggtgc acaaaggctt agatttgcct 2940
tgtctcaaaa taaggaattt tgtagtggtt ttcaaaaata attcaacaaa gaaacaatac 3000
aaaaagtggg tagaattacc tatcacattt cccaatcttg actattcaga atgctgttta 3060
tttagtgatg aggat 3075
<210> 123
<211> 1620
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IPS-1/MAVS, isoform 1
<400> 123
atgccgtttg ctgaagacaa gacctataag tatatctgcc gcaatttcag caatttttgc 60
aatgtggatg ttgtagagat tctgccttac ctgccctgcc tcacagcaag agaccaggat 120
cgactgcggg ccacctgcac actctcaggg aaccgggaca ccctctggca tctcttcaat 180
acccttcagc ggcggcccgg ctgggtggag tacttcattg cggcactgag gggctgtgag 240
ctagttgatc tcgcggacga agtggcctct gtctaccaga gctaccagcc tcggacctcg 300
gaccgtcccc cagacccact ggagccaccg tcacttcctg ctgagaggcc agggcccccc 360
acacctgctg cggcccacag catcccctac aacagctgca gagagaagga gccaagttac 420
cccatgcctg tccaggagac ccaggcgcca gagtccccag gagagaattc agagcaagcc 480
ctgcagacgc tcagccccag agccatccca aggaatccag atggtggccc cctggagtcc 540
tcctctgacc tggcagccct cagccctctg acctccagcg ggcatcagga gcaggacaca 600
gaactgggca gtacccacac agcaggtgcg acctccagcc tcacaccatc ccgtgggcct 660
gtgtctccat ctgtctcctt ccagcccctg gcccgttcca cccccagggc aagccgcttg 720
cctggaccca cagggtcagt tgtatctact ggcacctcct tctcctcctc atcccctggc 780
ttggcctctg caggggctgc agagggtaaa cagggtgcag agagtgacca ggccgagcct 840
atcatctgct ccagtggggc agaggcacct gccaactctc tgccctccaa agtgcctacc 900
accttgatgc ctgtgaacac agtggccctg aaagtgcctg ccaacccagc atctgtcagc 960
acagtgccct ccaagttgcc aactagctca aagccccctg gtgcagtgcc ttctaatgcg 1020
ctcaccaatc cagcaccatc caaattgccc atcaactcaa cccgtgctgg catggtgcca 1080
tccaaagtgc ctactagcat ggtgctcacc aaggtgtctg ccagcacagt ccccactgac 1140
gggagcagca gaaatgagga gaccccagca gctccaacac ccgccggcgc cactggaggc 1200
agctcagcct ggctagacag cagctctgag aataggggcc ttgggtcgga gctgagtaag 1260
cctggcgtgc tggcatccca ggtagacagc ccgttctcgg gctgcttcga ggatcttgcc 1320
atcagtgcca gcacctcctt gggcatgggg ccctgccatg gcccagagga gaatgagtat 1380
aagtccgagg gcacctttgg gatccacgtg gctgagaacc ccagcatcca gctcctggag 1440
ggcaaccctg ggccacctgc ggacccggat ggcggcccca ggccacaagc cgaccggaag 1500
ttccaggaga gggaggtgcc atgccacagg ccctcacctg gggctctgtg gctccaggtg 1560
gctgtgacag gggtgctggt agtcacactc ctggtggtgc tgtaccggcg gcgtctgcac 1620
<210> 124
<211> 2775
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> RIG-1/DDX58, isoform 1
<400> 124
atgaccaccg agcagcgacg cagcctgcaa gccttccagg attatatccg gaagaccctg 60
gaccctacct acatcctgag ctacatggcc ccctggttta gggaggaaga ggtgcagtat 120
attcaggctg agaaaaacaa caagggccca atggaggctg ccacactttt tctcaagttc 180
ctgttggagc tccaggagga aggctggttc cgtggctttt tggatgccct agaccatgca 240
ggttattctg gactttatga agccattgaa agttgggatt tcaaaaaaat tgaaaagttg 300
gaggagtata gattactttt aaaacgttta caaccagaat ttaaaaccag aattatccca 360
accgatatca tttctgatct gtctgaatgt ttaattaatc aggaatgtga agaaattcta 420
cagatttgct ctactaaggg gatgatggca ggtgcagaga aattggtgga atgccttctc 480
agatcagaca aggaaaactg gcccaaaact ttgaaacttg ctttggagaa agaaaggaac 540
aagttcagtg aactgtggat tgtagagaaa ggtataaaag atgttgaaac agaagatctt 600
gaggataaga tggaaacttc tgacatacag attttctacc aagaagatcc agaatgccag 660
aatcttagtg agaattcatg tccaccttca gaagtgtctg atacaaactt gtacagccca 720
tttaaaccaa gaaattacca attagagctt gctttgcctg ctatgaaagg aaaaaacaca 780
ataatatgtg ctcctacagg ttgtggaaaa acctttgttt cactgcttat atgtgaacat 840
catcttaaaa aattcccaca aggacaaaag gggaaagttg tcttttttgc gaatcagatc 900
ccagtgtatg aacagcagaa atctgtattc tcaaaatact ttgaaagaca tgggtataga 960
gttacaggca tttctggagc aacagctgag aatgtcccag tggaacagat tgttgagaac 1020
aatgacatca tcattttaac tccacagatt cttgtgaaca accttaaaaa gggaacgatt 1080
ccatcactat ccatctttac tttgatgata tttgatgaat gccacaacac tagtaaacaa 1140
cacccgtaca atatgatcat gtttaattat ctagatcaga aacttggagg atcttcaggc 1200
ccactgcccc aggtcattgg gctgactgcc tcggttggtg ttggggatgc caaaaacaca 1260
gatgaagcct tggattatat ctgcaagctg tgtgcttctc ttgatgcgtc agtgatagca 1320
acagtcaaac acaatctgga ggaactggag caagttgttt ataagcccca gaagtttttc 1380
aggaaagtgg aatcacggat tagcgacaaa tttaaataca tcatagctca gctgatgagg 1440
gacacagaga gtctggcaaa gagaatctgc aaagacctcg aaaacttatc tcaaattcaa 1500
aatagggaat ttggaacaca gaaatatgaa caatggattg ttacagttca gaaagcatgc 1560
atggtgttcc agatgccaga caaagatgaa gagagcagga tttgtaaagc cctgttttta 1620
tacacttcac atttgcggaa atataatgat gccctcatta tcagtgagca tgcacgaatg 1680
aaagatgctc tggattactt gaaagacttc ttcagcaatg tccgagcagc aggattcgat 1740
gagattgagc aagatcttac tcagagattt gaagaaaagc tgcaggaact agaaagtgtt 1800
tccagggatc ccagcaatga gaatcctaaa cttgaagacc tctgcttcat cttacaagaa 1860
gagtaccact taaacccaga gacaataaca attctctttg tgaaaaccag agcacttgtg 1920
gacgctttaa aaaattggat tgaaggaaat cctaaactca gttttctaaa acctggcata 1980
ttgactggac gtggcaaaac aaatcagaac acaggaatga ccctcccggc acagaagtgt 2040
atattggatg cattcaaagc cagtggagat cacaatattc tgattgccac ctcagttgct 2100
gatgaaggca ttgacattgc acagtgcaat cttgtcatcc tttatgagta tgtgggcaat 2160
gtcatcaaaa tgatccaaac cagaggcaga ggaagagcaa gaggtagcaa gtgcttcctt 2220
ctgactagta atgctggtgt aattgaaaaa gaacaaataa acatgtacaa agaaaaaatg 2280
atgaatgact ctattttacg ccttcagaca tgggacgaag cagtatttag ggaaaagatt 2340
ctgcatatac agactcatga aaaattcatc agagatagtc aagaaaaacc aaaacctgta 2400
cctgataagg aaaataaaaa actgctctgc agaaagtgca aagccttggc atgttacaca 2460
gctgacgtaa gagtgataga ggaatgccat tacactgtgc ttggagatgc ttttaaggaa 2520
tgctttgtga gtagaccaca tcccaagcca aagcagtttt caagttttga aaaaagagca 2580
aagatattct gtgcccgaca gaactgcagc catgactggg gaatccatgt gaagtacaag 2640
acatttgaga ttccagttat aaaaattgaa agttttgtgg tggaggatat tgcaactgga 2700
gttcagacac tgtactcgaa gtggaaggac tttcattttg agaagatacc atttgatcca 2760
gcagaaatgt ccaaa 2775
<210> 125
<211> 1494
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IRF5, transcript variant 2
<400> 125
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300
cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgaggtc 360
tgctccaatg gccctgctcc cacagactcc cagccccctg aggattactc ttttggtgca 420
ggagaggagg aggaagaaga ggaagagctg cagaggatgt tgccaagcct gagcctcaca 480
gaggatgtca agtggccgcc cactctgcag ccgcccactc tgcggccgcc tactctgcag 540
ccgcccactc tgcagccgcc cgtggtgctg ggtccccctg ctccagaccc cagccccctg 600
gctcctcccc ctggcaaccc tgctggcttc agggagcttc tctctgaggt cctggagcct 660
gggcccctgc ctgccagcct gccccctgca ggcgaacagc tcctgccaga cctgctgatc 720
agcccccaca tgctgcctct gaccgacctg gagatcaagt ttcagtaccg ggggcggcca 780
ccccgggccc tcaccatcag caacccccat ggctgccggc tcttctacag ccagctggag 840
gccacccagg agcaggtgga actcttcggc cccataagcc tggagcaagt gcgcttcccc 900
agccctgagg acatccccag tgacaagcag cgcttctaca cgaaccagct gctggatgtc 960
ctggaccgcg ggctcatcct ccagctacag ggccaggacc tttatgccat ccgcctgtgt 1020
cagtgcaagg tgttctggag cgggccttgt gcctcagccc atgactcatg ccccaacccc 1080
atccagcggg aggtcaagac caagcttttc agcctggagc attttctcaa tgagctcatc 1140
ctgttccaaa agggccagac caacacccca ccacccttcg agatcttctt ctgctttggg 1200
gaagaatggc ctgaccgcaa accccgagag aagaagctca ttactgtaca ggtggtgcct 1260
gtagcagctc gactgctgct ggagatgttc tcaggggagc tatcttggtc agctgatagt 1320
atccggctac agatctcaaa cccagacctc aaagaccgca tggtggagca attcaaggag 1380
ctccatcaca tctggcagtc ccagcagcgg ttgcagcctg tggcccaggc ccctcctgga 1440
gcaggccttg gtgttggcca ggggccctgg cctatgcacc cagctggcat gcaa 1494
<210> 126
<211> 1284
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IRF3, isoform 1
<400> 126
accatgggaa ccccaaagcc acggatcctg ccctggctgg tgtcgcagct ggacctgggg 60
caactggagg gcgtggcctg ggtgaacaag agccgcacgc gcttccgcat cccttggaag 120
cacggcctac ggcaggatgc acagcaggag gatttcggaa tcttccaggc ctgggccgag 180
gccactggtg catatgttcc cgggagggat aagccagacc tgccaacctg gaagaggaat 240
ttccgctctg ccctcaaccg caaagaaggg ttgcgtttag cagaggaccg gagcaaggac 300
cctcacgacc cacataaaat ctacgagttt gtgaactcag gagttgggga cttttcccag 360
ccagacacct ctccggacac caatggtgga ggcagtactt ctgataccca ggaagacatt 420
ctggatgagt tactgggtaa catggtgttg gccccactcc cagatccggg acccccaagc 480
ctggctgtag cccctgagcc ctgccctcag cccctgcgga gccccagctt ggacaatccc 540
actcccttcc caaacctggg gccctctgag aacccactga agcggctgtt ggtgccgggg 600
gaagagtggg agttcgaggt gacagccttc taccggggcc gccaagtctt ccagcagacc 660
atctcctgcc cggagggcct gcggctggtg gggtccgaag tgggagacag gacgctgcct 720
ggatggccag tcacactgcc agaccctggc atgtccctga cagacagggg agtgatgagc 780
tacgtgaggc atgtgctgag ctgcctgggt gggggactgg ctctctggcg ggccgggcag 840
tggctctggg cccagcggct ggggcactgc cacacatact gggcagtgag cgaggagctg 900
ctccccaaca gcgggcatgg gcctgatggc gaggtcccca aggacaagga aggaggcgtg 960
tttgacctgg ggcccttcat tgtagatctg attaccttca cggaaggaag cggacgctca 1020
ccacgctatg ccctctggtt ctgtgtgggg gagtcatggc cccaggacca gccgtggacc 1080
aagaggctcg tgatggtcaa ggttgtgccc acgtgcctca gggccttggt agaaatggcc 1140
cgggtagggg gtgcctcctc cctggagaat actgtggacc tgcacatttc caacagccac 1200
ccactctccc tcacctccga ccagtacaag gcctacctgc aggacttggt ggagggcatg 1260
gatttccagg gccctgggga gagc 1284
<210> 127
<211> 1275
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TANK
<400> 127
atggataaaa acattggcga gcaactcaat aaagcgtatg aagccttccg gcaggcatgc 60
atggatagag attctgcagt aaaagaatta cagcaaaaga ctgagaacta tgagcagaga 120
atacgtgaac aacaggaaca gctgtcactt caacagacta ttattgacaa gctaaaatct 180
cagttacttc ttgtgaattc cactcaagat aacaattatg gctgtgttcc tctgcttgaa 240
gacagtgaaa caagaaagaa taatttgact cttgatcagc cacaagataa agtgatttca 300
ggaatagcaa gagaaaaact accaaaggta agaagacaag aggtttcttc tcctagaaaa 360
gaaacttcag caaggagtct tggcagtcct ttgctccatg aaaggggtaa tatagagaag 420
actttctggg atctgaaaga agaatttcat aaaatatgca tgctagcaaa agcacagaaa 480
gaccacttaa gcaaacttaa tataccagac actgcaactg aaacacagtg ctctgtgcct 540
atacagtgta cggataaaac agataaacaa gaagcgctgt ttaagcctca ggctaaagat 600
gatataaata gaggtgcacc atccatcaca tctgtcacac caagaggact gtgcagagat 660
gaggaagaca cctcttttga atcactttct aaattcaatg tcaagtttcc acctatggac 720
aatgactcaa ctttcttaca tagcactcca gagagacccg gcatccttag tcctgccacg 780
tctgaggcag tgtgccaaga gaaatttaat atggagttca gagacaaccc agggaacttt 840
gttaaaacag aagaaacttt atttgaaatt cagggaattg accccatagc ttcagctata 900
caaaacctta aaacaactga caaaacaaag ccctcaaatc tcgtaaacac ttgtatcagg 960
acaactctgg atagagctgc gtgtttgcca cctggagacc ataatgcatt atatgtaaat 1020
agcttcccac ttctggaccc atctgatgca ccttttccct cactcgattc cccgggaaaa 1080
gcaatccgag gaccacagca gcccatttgg aagccctttc ctaatcaaga cagtgactcg 1140
gtggtactaa gtggcacaga ctcagaactg catatacctc gagtatgtga attctgtcaa 1200
gcagttttcc caccatccat tacatccagg ggggatttcc ttcggcatct taattcacac 1260
ttcaatggag agact 1275
<210> 128
<211> 2136
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TRIF/TICAM1
<400> 128
atggcctgca caggcccatc acttcctagc gccttcgaca ttctaggtgc agcaggccag 60
gacaagctct tgtatctgaa gcacaaactg aagaccccac gcccaggctg ccaggggcag 120
gacctcctgc atgccatggt tctcctgaag ctgggccagg aaactgaggc caggatctct 180
ctagaggcat tgaaggccga tgcggtggcc cggctggtgg cccgccagtg ggctggcgtg 240
gacagcaccg aggacccaga ggagccccca gatgtgtcct gggctgtggc ccgcttgtac 300
cacctgctgg ctgaggagaa gctgtgcccc gcctcgctgc gggacgtggc ctaccaggaa 360
gccgtccgca ccctcagctc cagggacgac caccggctgg gggaacttca ggatgaggcc 420
cgaaaccggt gtgggtggga cattgctggg gatccaggga gcatccggac gctccagtcc 480
aatctgggct gcctcccacc atcctcggct ttgccctctg ggaccaggag cctcccacgc 540
cccattgacg gtgtttcgga ctggagccaa gggtgctccc tgcgatccac tggcagccct 600
gcctccctgg ccagcaactt ggaaatcagc cagtccccta ccatgccctt cctcagcctg 660
caccgcagcc cacatgggcc cagcaagctc tgtgacgacc cccaggccag cttggtgccc 720
gagcctgtcc ccggtggctg ccaggagcct gaggagatga gctggccgcc atcgggggag 780
attgccagcc caccagagct gccaagcagc ccacctcctg ggcttcccga agtggcccca 840
gatgcaacct ccactggcct ccctgatacc cccgcagctc cagaaaccag caccaactac 900
ccagtggagt gcaccgaggg gtctgcaggc ccccagtctc tccccttgcc tattctggag 960
ccggtcaaaa acccctgctc tgtcaaagac cagacgccac tccaactttc tgtagaagat 1020
accacctctc caaataccaa gccgtgccca cctactccca ccaccccaga aacatcccct 1080
cctcctcctc ctcctcctcc ttcatctact ccttgttcag ctcacctgac cccctcctcc 1140
ctgttccctt cctccctgga atcatcatcg gaacagaaat tctataactt tgtgatcctc 1200
cacgccaggg cagacgaaca catcgccctg cgggttcggg agaagctgga ggcccttggc 1260
gtgcccgacg gggccacctt ctgcgaggat ttccaggtgc cggggcgcgg ggagctgagc 1320
tgcctgcagg acgccataga ccactcagct ttcatcatcc tacttctcac ctccaacttc 1380
gactgtcgcc tgagcctgca ccaggtgaac caagccatga tgagcaacct cacgcgacag 1440
gggtcgccag actgtgtcat ccccttcctg cccctggaga gctccccggc ccagctcagc 1500
tccgacacgg ccagcctgct ctccgggctg gtgcggctgg acgaacactc ccagatcttc 1560
gccaggaagg tggccaacac cttcaagccc cacaggcttc aggcccgaaa ggccatgtgg 1620
aggaaggaac aggacacccg agccctgcgg gaacagagcc aacacctgga cggtgagcgg 1680
atgcaggcgg cggcactgaa cgcagcctac tcagcctacc tccagagcta cttgtcctac 1740
caggcacaga tggagcagct ccaggtggct tttgggagcc acatgtcatt tgggactggg 1800
gcgccctatg gggctcgaat gccctttggg ggccaggtgc ccctgggagc cccgccaccc 1860
tttcccactt ggccggggtg cccgcagccg ccacccctgc acgcatggca ggctggcacc 1920
cccccaccgc cctccccaca gccagcagcc tttccacagt cactgccctt cccgcagtcc 1980
ccagccttcc ctacggcctc acccgcaccc cctcagagcc cagggctgca acccctcatt 2040
atccaccacg cacagatggt acagctgggg ctgaacaacc acatgtggaa ccagagaggg 2100
tcccaggcgc ccgaggacaa gacgcaggag gcagaa 2136
<210> 129
<211> 381
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Batf3
<400> 129
atgtcgcaag ggctcccggc cgccggcagc gtcctgcaga ggagcgtcgc ggcgcccggg 60
aaccagccgc agccgcagcc gcagcagcag agccctgagg atgatgacag gaaggtccga 120
aggagagaaa aaaaccgagt tgctgctcag agaagtcgga agaagcagac ccagaaggct 180
gacaagctcc atgaggaata tgagagcctg gagcaagaaa acaccatgct gcggagagag 240
atcgggaagc tgacagagga gctgaagcac ctgacagagg cactgaagga gcacgagaag 300
atgtgcccgc tgctgctctg ccctatgaac tttgtgccag tgcctccccg gccggaccct 360
gtggccggct gcttgccccg a 381
<210> 130
<211> 459
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL-4, isoform 1
<400> 130
atgggtctca cctcccaact gcttccccct ctgttcttcc tgctagcatg tgccggcaac 60
tttgtccacg gacacaagtg cgatatcacc ttacaggaga tcatcaaaac tttgaacagc 120
ctcacagagc agaagactct gtgcaccgag ttgaccgtaa cagacatctt tgctgcctcc 180
aagaacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 240
agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac 300
aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc tctggggcct ggcgggcttg 360
aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta 420
aagacgatca tgagagagaa atattcaaag tgttcgagc 459
<210> 131
<211> 534
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL-10
<400> 131
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60
ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120
cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180
ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240
caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300
caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360
ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420
caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480
tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaac 534
<210> 132
<211> 759
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL-12 alpha
<400> 132
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcc 759
<210> 133
<211> 986
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL-12 beta
<400> 133
agatgtgtca ccagcagttg gtcatctctt ggttttccct ggtttttctg gcatctcccc 60
tcgtggccat atgggaactg aagaaagatg tttatgtcgt agaattggat tggtatccgg 120
atgcccctgg agaaatggtg gtcctcacct gtgacacccc tgaagaagat ggtatcacct 180
ggaccttgga ccagagcagt gaggtcttag gctctggcaa aaccctgacc atccaagtca 240
aagagtttgg agatgctggc cagtacacct gtcacaaagg aggcgaggtt ctaagccatt 300
cgctcctgct gcttcacaaa aaggaagatg gaatttggtc cactgatatt ttaaaggacc 360
agaaagaacc caaaaataag acctttctaa gatgcgaggc caagaattat tctggacgtt 420
tcacctgctg gtggctgacg acaatcagta ctgatttgac attcagtgtc aaaagcagca 480
gaggctcttc tgacccccaa ggggtgacgt gcggagctgc tacactctct gcagagagag 540
tcagagggga caacaaggag tatgagtact cagtggagtg ccaggaggac agtgcctgcc 600
cagctgctga ggagagtctg cccattgagg tcatggtgga tgccgttcac aagctcaagt 660
atgaaaacta caccagcagc ttcttcatca gggacatcat caaacctgac ccacccaaga 720
acttgcagct gaagccatta aagaattctc ggcaggtgga ggtcagctgg gagtaccctg 780
acacctggag tactccacat tcctacttct ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca 840
agagcaagag agaaaagaaa gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct 900
gccgcaaaaa tgccagcatt agcgtgcggg cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga 960
gcgaatgggc atctgtgccc tgcagt 986
<210> 134
<211> 276
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MIP-1 alpha/ CCL3
<400> 134
atgcaggtct ccactgctgc ccttgctgtc ctcctctgca ccatggctct ctgcaaccag 60
ttctctgcat cacttgctgc tgacacgccg accgcctgct gcttcagcta cacctcccgg 120
cagattccac agaatttcat agctgactac tttgagacga gcagccagtg ctccaagccc 180
ggtgtcatct tcctaaccaa gcgaagccgg caggtctgtg ctgaccccag tgaggagtgg 240
gtccagaaat atgtcagcga cctggagctg agtgcc 276
<210> 135
<211> 1530
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD39/ENTPD1, isoform 1
<400> 135
atggaagata caaaggagtc taacgtgaag acattttgct ccaagaatat cctagccatc 60
cttggcttct cctctatcat agctgtgata gctttgcttg ctgtggggtt gacccagaac 120
aaagcattgc cagaaaacgt taagtatggg attgtgctgg atgcgggttc ttctcacaca 180
agtttataca tctataagtg gccagcagaa aaggagaatg acacaggcgt ggtgcatcaa 240
gtagaagaat gcagggttaa aggtcctgga atctcaaaat ttgttcagaa agtaaatgaa 300
ataggcattt acctgactga ttgcatggaa agagctaggg aagtgattcc aaggtcccag 360
caccaagaga cacccgttta cctgggagcc acggcaggca tgcggttgct caggatggaa 420
agtgaagagt tggcagacag ggttctggat gtggtggaga ggagcctcag caactacccc 480
tttgacttcc agggtgccag gatcattact ggccaagagg aaggtgccta tggctggatt 540
actatcaact atctgctggg caaattcagt cagaaaacaa ggtggttcag catagtccca 600
tatgaaacca ataatcagga aacctttgga gctttggacc ttgggggagc ctctacacaa 660
gtcacttttg taccccaaaa ccagactatc gagtccccag ataatgctct gcaatttcgc 720
ctctatggca aggactacaa tgtctacaca catagcttct tgtgctatgg gaaggatcag 780
gcactctggc agaaactggc caaggacatt caggttgcaa gtaatgaaat tctcagggac 840
ccatgctttc atcctggata taagaaggta gtgaacgtaa gtgaccttta caagaccccc 900
tgcaccaaga gatttgagat gactcttcca ttccagcagt ttgaaatcca gggtattgga 960
aactatcaac aatgccatca aagcatcctg gagctcttca acaccagtta ctgcccttac 1020
tcccagtgtg ccttcaatgg gattttcttg ccaccactcc agggggattt tggggcattt 1080
tcagcttttt actttgtgat gaagttttta aacttgacat cagagaaagt ctctcaggaa 1140
aaggtgactg agatgatgaa aaagttctgt gctcagcctt gggaggagat aaaaacatct 1200
tacgctggag taaaggagaa gtacctgagt gaatactgct tttctggtac ctacattctc 1260
tccctccttc tgcaaggcta tcatttcaca gctgattcct gggagcacat ccatttcatt 1320
ggcaagatcc agggcagcga cgccggctgg actttgggct acatgctgaa cctgaccaac 1380
atgatcccag ctgagcaacc attgtccaca cctctctccc actccaccta tgtcttcctc 1440
atggttctat tctccctggt ccttttcaca gtggccatca taggcttgct tatctttcac 1500
aagccttcat atttctggaa agatatggta 1530
<210> 136
<211> 1722
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD73/NT5E, isoform 1
<400> 136
atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60
tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120
ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180
gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240
ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300
gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360
gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420
agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480
tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540
accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600
caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660
tcgggttttg aaatggataa actcatcgct cagaaagtga ggggtgtgga cgtcgtggtg 720
ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780
gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840
tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900
atctcttccc atggaaatcc cattcttcta aacagcagca ttcctgaaga tccaagcata 960
aaagcagaca ttaacaaatg gaggataaaa ttggataatt attctaccca ggaattaggg 1020
aaaacaattg tctatctgga tggctcctct caatcatgcc gctttagaga atgcaacatg 1080
ggcaacctga tttgtgatgc aatgattaac aacaacctga gacacacgga tgaaatgttc 1140
tggaaccacg tatccatgtg cattttaaat ggaggtggta tccggtcgcc cattgatgaa 1200
cgcaacaatg gcacaattac ctgggagaac ctggctgctg tattgccctt tggaggcaca 1260
tttgacctag tccagttaaa aggttccacc ctgaagaagg cctttgagca tagcgtgcac 1320
cgctacggcc agtccactgg agagttcctg caggtgggcg gaatccatgt ggtgtatgat 1380
ctttcccgaa aacctggaga cagagtagtc aaattagatg ttctttgcac caagtgtcga 1440
gtgcccagtt atgaccctct caaaatggac gaggtatata aggtgatcct cccaaacttc 1500
ctggccaatg gtggagatgg gttccagatg ataaaagatg aattattaag acatgactct 1560
ggtgaccaag atatcaacgt ggtttctaca tatatctcca aaatgaaagt aatttatcca 1620
gcagttgaag gtcggatcaa gttttccaca ggaagtcact gccatggaag cttttcttta 1680
atatttcttt cactttgggc agtgatcttt gttttatacc aa 1722
<210> 137
<211> 297
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL-8 (CXCL8)
<400> 137
atgacttcca agctggccgt ggctctcttg gcagccttcc tgatttctgc agctctgtgt 60
gaaggtgcag ttttgccaag gagtgctaaa gaacttagat gtcagtgcat aaagacatac 120
tccaaacctt tccaccccaa atttatcaaa gaactgagag tgattgagag tggaccacac 180
tgcgccaaca cagaaattat tgtaaagctt tctgatggaa gagagctctg tctggacccc 240
aaggaaaact gggtgcagag ggttgtggag aagtttttga agagggctga gaattca 297
<210> 138
<211> 1596
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ICAM1
<400> 138
atggctccca gcagcccccg gcccgcgctg cccgcactcc tggtcctgct cggggctctg 60
ttcccaggac ctggcaatgc ccagacatct gtgtccccct caaaagtcat cctgccccgg 120
ggaggctccg tgctggtgac atgcagcacc tcctgtgacc agcccaagtt gttgggcata 180
gagaccccgt tgcctaaaaa ggagttgctc ctgcctggga acaaccggaa ggtgtatgaa 240
ctgagcaatg tgcaagaaga tagccaacca atgtgctatt caaactgccc tgatgggcag 300
tcaacagcta aaaccttcct caccgtgtac tggactccag aacgggtgga actggcaccc 360
ctcccctctt ggcagccagt gggcaagaac cttaccctac gctgccaggt ggagggtggg 420
gcaccccggg ccaacctcac cgtggtgctg ctccgtgggg agaaggagct gaaacgggag 480
ccagctgtgg gggagcccgc tgaggtcacg accacggtgc tggtgaggag agatcaccat 540
ggagccaatt tctcgtgccg cactgaactg gacctgcggc cccaagggct ggagctgttt 600
gagaacacct cggcccccta ccagctccag acctttgtcc tgccagcgac tcccccacaa 660
cttgtcagcc cccgggtcct agaggtggac acgcagggga ccgtggtctg ttccctggac 720
gggctgttcc cagtctcgga ggcccaggtc cacctggcac tgggggacca gaggttgaac 780
cccacagtca cctatggcaa cgactccttc tcggccaagg cctcagtcag tgtgaccgca 840
gaggacgagg gcacccagcg gctgacgtgt gcagtaatac tggggaacca gagccaggag 900
acactgcaga cagtgaccat ctacagcttt ccggcgccca acgtgattct gacgaagcca 960
gaggtctcag aagggaccga ggtgacagtg aagtgtgagg cccaccctag agccaaggtg 1020
acgctgaatg gggttccagc ccagccactg ggcccgaggg cccagctcct gctgaaggcc 1080
accccagagg acaacgggcg cagcttctcc tgctctgcaa ccctggaggt ggccggccag 1140
cttatacaca agaaccagac ccgggagctt cgtgtcctgt atggcccccg actggacgag 1200
agggattgtc cgggaaactg gacgtggcca gaaaattccc agcagactcc aatgtgccag 1260
gcttggggga acccattgcc cgagctcaag tgtctaaagg atggcacttt cccactgccc 1320
atcggggaat cagtgactgt cactcgagat cttgagggca cctacctctg tcgggccagg 1380
agcactcaag gggaggtcac ccgcaaggtg accgtgaatg tgctctcccc ccggtatgag 1440
attgtcatca tcactgtggt agcagccgca gtcataatgg gcactgcagg cctcagcacg 1500
tacctctata accgccagcg gaagatcaag aaatacagac tacaacaggc ccaaaaaggg 1560
acccccatga aaccgaacac acaagccacg cctccc 1596
<210> 139
<211> 1488
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> angiopoietin 2, isoform 1
<400> 139
atgtggcaga ttgttttctt tactctgagc tgtgatcttg tcttggccgc agcctataac 60
aactttcgga agagcatgga cagcatagga aagaagcaat atcaggtcca gcatgggtcc 120
tgcagctaca ctttcctcct gccagagatg gacaactgcc gctcttcctc cagcccctac 180
gtgtccaatg ctgtgcagag ggacgcgccg ctcgaatacg atgactcggt gcagaggctg 240
caagtgctgg agaacatcat ggaaaacaac actcagtggc taatgaagct tgagaattat 300
atccaggaca acatgaagaa agaaatggta gagatacagc agaatgcagt acagaaccag 360
acggctgtga tgatagaaat agggacaaac ctgttgaacc aaacagcgga gcaaacgcgg 420
aagttaactg atgtggaagc ccaagtatta aatcagacca cgagacttga acttcagctc 480
ttggaacact ccctctcgac aaacaaattg gaaaaacaga ttttggacca gaccagtgaa 540
ataaacaaat tgcaagataa gaacagtttc ctagaaaaga aggtgctagc tatggaagac 600
aagcacatca tccaactaca gtcaataaaa gaagagaaag atcagctaca ggtgttagta 660
tccaagcaaa attccatcat tgaagaacta gaaaaaaaaa tagtgactgc cacggtgaat 720
aattcagttc ttcagaagca gcaacatgat ctcatggaga cagttaataa cttactgact 780
atgatgtcca catcaaactc agctaaggac cccactgttg ctaaagaaga acaaatcagc 840
ttcagagact gtgctgaagt attcaaatca ggacacacca cgaatggcat ctacacgtta 900
acattcccta attctacaga agagatcaag gcctactgtg acatggaagc tggaggaggc 960
gggtggacaa ttattcagcg acgtgaggat ggcagcgttg attttcagag gacttggaaa 1020
gaatataaag tgggatttgg taacccttca ggagaatatt ggctgggaaa tgagtttgtt 1080
tcgcaactga ctaatcagca acgctatgtg cttaaaatac accttaaaga ctgggaaggg 1140
aatgaggctt actcattgta tgaacatttc tatctctcaa gtgaagaact caattatagg 1200
attcacctta aaggacttac agggacagcc ggcaaaataa gcagcatcag ccaaccagga 1260
aatgatttta gcacaaagga tggagacaac gacaaatgta tttgcaaatg ttcacaaatg 1320
ctaacaggag gctggtggtt tgatgcatgt ggtccttcca acttgaacgg aatgtactat 1380
ccacagaggc agaacacaaa taagttcaac ggcattaaat ggtactactg gaaaggctca 1440
ggctattcgc tcaaggccac aaccatgatg atccgaccag cagatttc 1488
<210> 140
<211> 2766
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> NLRP3, isoform 2
<400> 140
atgaagatgg caagcacccg ctgcaagctg gccaggtacc tggaggacct ggaggatgtg 60
gacttgaaga aatttaagat gcacttagag gactatcctc cccagaaggg ctgcatcccc 120
ctcccgaggg gtcagacaga gaaggcagac catgtggatc tagccacgct aatgatcgac 180
ttcaatgggg aggagaaggc gtgggccatg gccgtgtgga tcttcgctgc gatcaacagg 240
agagaccttt atgagaaagc aaaaagagat gagccgaagt ggggttcaga taatgcacgt 300
gtttcgaatc ccactgtgat atgccaggaa gacagcattg aagaggagtg gatgggttta 360
ctggagtacc tttcgagaat ctctatttgt aaaatgaaga aagattaccg taagaagtac 420
agaaagtacg tgagaagcag attccagtgc attgaagaca ggaatgcccg tctgggtgag 480
agtgtgagcc tcaacaaacg ctacacacga ctgcgtctca tcaaggagca ccggagccag 540
caggagaggg agcaggagct tctggccatc ggcaagacca agacgtgtga gagccccgtg 600
agtcccatta agatggagtt gctgtttgac cccgatgatg agcattctga gcctgtgcac 660
accgtggtgt tccagggggc ggcagggatt gggaaaacaa tcctggccag gaagatgatg 720
ttggactggg cgtcggggac actctaccaa gacaggtttg actatctgtt ctatatccac 780
tgtcgggagg tgagccttgt gacacagagg agcctggggg acctgatcat gagctgctgc 840
cccgacccaa acccacccat ccacaagatc gtgagaaaac cctccagaat cctcttcctc 900
atggacggct tcgatgagct gcaaggtgcc tttgacgagc acataggacc gctctgcact 960
gactggcaga aggccgagcg gggagacatt ctcctgagca gcctcatcag aaagaagctg 1020
cttcccgagg cctctctgct catcaccacg agacctgtgg ccctggagaa actgcagcac 1080
ttgctggacc atcctcggca tgtggagatc ctgggtttct ccgaggccaa aaggaaagag 1140
tacttcttca agtacttctc tgatgaggcc caagccaggg cagccttcag tctgattcag 1200
gagaacgagg tcctcttcac catgtgcttc atccccctgg tctgctggat cgtgtgcact 1260
ggactgaaac agcagatgga gagtggcaag agccttgccc agacatccaa gaccaccacc 1320
gcggtgtacg tcttcttcct ttccagtttg ctgcagcccc ggggagggag ccaggagcac 1380
ggcctctgcg cccacctctg ggggctctgc tctttggctg cagatggaat ctggaaccag 1440
aaaatcctgt ttgaggagtc cgacctcagg aatcatggac tgcagaaggc ggatgtgtct 1500
gctttcctga ggatgaacct gttccaaaag gaagtggact gcgagaagtt ctacagcttc 1560
atccacatga ctttccagga gttctttgcc gccatgtact acctgctgga agaggaaaag 1620
gaaggaagga cgaacgttcc agggagtcgt ttgaagcttc ccagccgaga cgtgacagtc 1680
cttctggaaa actatggcaa attcgaaaag gggtatttga tttttgttgt acgtttcctc 1740
tttggcctgg taaaccagga gaggacctcc tacttggaga agaaattaag ttgcaagatc 1800
tctcagcaaa tcaggctgga gctgctgaaa tggattgaag tgaaagccaa agctaaaaag 1860
ctgcagatcc agcccagcca gctggaattg ttctactgtt tgtacgagat gcaggaggag 1920
gacttcgtgc aaagggccat ggactatttc cccaagattg agatcaatct ctccaccaga 1980
atggaccaca tggtttcttc cttttgcatt gagaactgtc atcgggtgga gtcactgtcc 2040
ctggggtttc tccataacat gcccaaggag gaagaggagg aggaaaagga aggccgacac 2100
cttgatatgg tgcagtgtgt cctcccaagc tcctctcatg ctgcctgttc tcatgggttg 2160
gggcgctgtg gcctctcgca tgagtgctgc ttcgacatct ccttggtcct cagcagcaac 2220
cagaagctgg tggagctgga cctgagtgac aacgccctcg gtgacttcgg aatcagactt 2280
ctgtgtgtgg gactgaagca cctgttgtgc aatctgaaga agctctggtt ggtgaattct 2340
ggccttacgt cagtctgttg ttcagctttg tcctcggtac tcagcactaa tcagaatctc 2400
acgcaccttt acctgcgagg caacactctc ggagacaagg ggatcaaact actctgtgag 2460
ggactcttgc accccgactg caagcttcag gtgttggaat tagacaactg caacctcacg 2520
tcacactgct gctgggatct ttccacactt ctgacctcca gccagagcct gcgaaagctg 2580
agcctgggca acaatgacct gggcgacctg ggggtcatga tgttctgtga agtgctgaaa 2640
cagcagagct gcctcctgca gaacctgggg ttgtctgaaa tgtatttcaa ttatgagaca 2700
aaaagtgcgt tagaaacact tcaagaagaa aagcctgagc tgaccgtcgt ctttgagcct 2760
tcttgg 2766
<210> 141
<211> 831
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD40, isoform 1
<400> 141
atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca 60
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 120
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt 180
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac 240
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 300
accatctgca cctgtgaaga aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc 360
ctgcaccgct catgctcgcc cggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat 420
accatctgcg agccctgccc agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa 480
tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 540
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggctgagag ccctggtggt gatccccatc 600
atcttcggga tcctgtttgc catcctcttg gtgctggtct ttatcaaaaa ggtggccaag 660
aagccaacca ataaggcccc ccaccccaag caggaacccc aggagatcaa ttttcccgac 720
gatcttcctg gctccaacac tgctgctcca gtgcaggaga ctttacatgg atgccaaccg 780
gtcacccagg aggatggcaa agagagtcgc atctcagtgc aggagagaca g 831
<210> 142
<211> 783
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD40 ligand (CD40L)
<400> 142
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360
caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420
gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480
ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540
cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600
ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660
caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720
gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780
ctc 783
<210> 143
<211> 579
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD-70 antigen, isoform 1
<400> 143
atgccggagg agggttcggg ctgctcggtg cggcgcaggc cctatgggtg cgtcctgcgg 60
gctgctttgg tcccattggt cgcgggcttg gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc 120
ttcgcacagg ctcagcagca gctgccgctc gagtcacttg ggtgggacgt agctgagctg 180
cagctgaatc acacaggacc tcagcaggac cccaggctat actggcaggg gggcccagca 240
ctgggccgct ccttcctgca tggaccagag ctggacaagg ggcagctacg tatccatcgt 300
gatggcatct acatggtaca catccaggtg acgctggcca tctgctcctc cacgacggcc 360
tccaggcacc accccaccac cctggccgtg ggaatctgct ctcccgcctc ccgtagcatc 420
agcctgctgc gtctcagctt ccaccaaggt tgtaccattg cctcccagcg cctgacgccc 480
ctggcccgag gggacacact ctgcaccaac ctcactggga cacttttgcc ttcccgaaac 540
actgatgaga ccttctttgg agtgcagtgg gtgcgcccc 579
<210> 144
<211> 765
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD137 (4-1BB, TNFRSF9)
<400> 144
atgggaaaca gctgttacaa catagtagcc actctgttgc tggtcctcaa ctttgagagg 60
acaagatcat tgcaggatcc ttgtagtaac tgcccagctg gtacattctg tgataataac 120
aggaatcaga tttgcagtcc ctgtcctcca aatagtttct ccagcgcagg tggacaaagg 180
acctgtgaca tatgcaggca gtgtaaaggt gttttcagga ccaggaagga gtgttcctcc 240
accagcaatg cagagtgtga ctgcactcca gggtttcact gcctgggggc aggatgcagc 300
atgtgtgaac aggattgtaa acaaggtcaa gaactgacaa aaaaaggttg taaagactgt 360
tgctttggga catttaacga tcagaaacgt ggcatctgtc gaccctggac aaactgttct 420
ttggatggaa agtctgtgct tgtgaatggg acgaaggaga gggacgtggt ctgtggacca 480
tctccagccg acctctctcc gggagcatcc tctgtgaccc cgcctgcccc tgcgagagag 540
ccaggacact ctccgcagat catctccttc tttcttgcgc tgacgtcgac tgcgttgctc 600
ttcctgctgt tcttcctcac gctccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaaactc 660
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 720
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactg 765
<210> 145
<211> 807
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD200, isoform 1
<400> 145
atggagaggc tggtgatcag gatgcccttc tctcatctgt ctacctacag cctggtttgg 60
gtcatggcag cagtggtgct gtgcacagca caagtgcaag tggtgaccca ggatgaaaga 120
gagcagctgt acacacctgc ttccttaaaa tgctctctgc aaaatgccca ggaagccctc 180
attgtgacat ggcagaaaaa gaaagctgta agcccagaaa acatggtcac cttcagcgag 240
aaccatgggg tggtgatcca gcctgcctat aaggacaaga taaacattac ccagctggga 300
ctccaaaact caaccatcac cttctggaat atcaccctgg aggatgaagg gtgttacatg 360
tgtctcttca atacctttgg ttttgggaag atctcaggaa cggcctgcct caccgtctat 420
gtacagccca tagtatccct tcactacaaa ttctctgaag accacctaaa tatcacttgc 480
tctgccactg cccgcccagc ccccatggtc ttctggaagg tccctcggtc agggattgaa 540
aatagtacag tgactctgtc tcacccaaat gggaccacgt ctgttaccag catcctccat 600
atcaaagacc ctaagaatca ggtggggaag gaggtgatct gccaggtgct gcacctgggg 660
actgtgaccg actttaagca aaccgtcaac aaaggctatt ggttttcagt tccgctattg 720
ctaagcattg tttccctggt aattcttctc gtcctaatct caatcttact gtactggaaa 780
cgtcaccgga atcaggaccg agagccc 807
<210> 146
<211> 1236
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> A2aR (ADORA2A)
<400> 146
atgcccatca tgggctcctc ggtgtacatc acggtggagc tggccattgc tgtgctggcc 60
atcctgggca atgtgctggt gtgctgggcc gtgtggctca acagcaacct gcagaacgtc 120
accaactact ttgtggtgtc actggcggcg gccgacatcg cagtgggtgt gctcgccatc 180
ccctttgcca tcaccatcag caccgggttc tgcgctgcct gccacggctg cctcttcatt 240
gcctgcttcg tcctggtcct cacgcagagc tccatcttca gtctcctggc catcgccatt 300
gaccgctaca ttgccatccg catcccgctc cggtacaatg gcttggtgac cggcacgagg 360
gctaagggca tcattgccat ctgctgggtg ctgtcgtttg ccatcggcct gactcccatg 420
ctaggttgga acaactgcgg tcagccaaag gagggcaaga accactccca gggctgcggg 480
gagggccaag tggcctgtct ctttgaggat gtggtcccca tgaactacat ggtgtacttc 540
aacttctttg cctgtgtgct ggtgcccctg ctgctcatgc tgggtgtcta tttgcggatc 600
ttcctggcgg cgcgacgaca gctgaagcag atggagagcc agcctctgcc gggggagcgg 660
gcacggtcca cactgcagaa ggaggtccat gctgccaagt cactggccat cattgtgggg 720
ctctttgccc tctgctggct gcccctacac atcatcaact gcttcacttt cttctgcccc 780
gactgcagcc acgcccctct ctggctcatg tacctggcca tcgtcctctc ccacaccaat 840
tcggttgtga atcccttcat ctacgcctac cgtatccgcg agttccgcca gaccttccgc 900
aagatcattc gcagccacgt cctgaggcag caagaacctt tcaaggcagc tggcaccagt 960
gcccgggtct tggcagctca tggcagtgac ggagagcagg tcagcctccg tctcaacggc 1020
cacccgccag gagtgtgggc caacggcagt gctccccacc ctgagcggag gcccaatggc 1080
tatgccctgg ggctggtgag tggagggagt gcccaagagt cccaggggaa cacgggcctc 1140
ccagacgtgg agctccttag ccatgagctc aagggagtgt gcccagagcc ccctggccta 1200
gatgaccccc tggcccagga tggagcagga gtgtcc 1236
<210> 147
<211> 723
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> GITR/TNFRSF18, isoform 1
<400> 147
atggcacagc acggggcgat gggcgcgttt cgggccctgt gcggcctggc gctgctgtgc 60
gcgctcagcc tgggtcagcg ccccaccggg ggtcccgggt gcggccctgg gcgcctcctg 120
cttgggacgg gaacggacgc gcgctgctgc cgggttcaca cgacgcgctg ctgccgcgat 180
tacccgggcg aggagtgctg ttccgagtgg gactgcatgt gtgtccagcc tgaattccac 240
tgcggagacc cttgctgcac gacctgccgg caccaccctt gtcccccagg ccagggggta 300
cagtcccagg ggaaattcag ttttggcttc cagtgtatcg actgtgcctc ggggaccttc 360
tccgggggcc acgaaggcca ctgcaaacct tggacagact gcacccagtt cgggtttctc 420
actgtgttcc ctgggaacaa gacccacaac gctgtgtgcg tcccagggtc cccgccggca 480
gagccgcttg ggtggctgac cgtcgtcctc ctggccgtgg ccgcctgcgt cctcctcctg 540
acctcggccc agcttggact gcacatctgg cagctgagga gtcagtgcat gtggccccga 600
gagacccagc tgctgctgga ggtgccgccg tcgaccgaag acgccagaag ctgccagttc 660
cccgaggaag agcggggcga gcgatcggca gaggagaagg ggcggctggg agacctgtgg 720
gtg 723
<210> 148
<211> 1362
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> B7-H6 (NCR3LG1)
<400> 148
atgacgtgga gggctgccgc ctccacgtgc gcggcgctcc tgattctgct gtgggcgctg 60
acgaccgaag gtgatctgaa agtagagatg atggcagggg ggactcagat cacacccctg 120
aatgacaatg tcaccatatt ctgcaatatc ttttattccc aacccctcaa catcacgtct 180
atgggtatca cctggttttg gaagagtctg acgtttgaca aagaagtcaa agtctttgaa 240
ttttttggag atcaccaaga ggcattccga cctggagcca ttgtgtctcc atggaggctg 300
aagagtgggg acgcctcact gcggctgcct ggaatccagc tggaggaagc aggagagtac 360
cgatgtgagg tggtggtcac ccctctgaag gcacagggaa cagtccagct tgaagttgtg 420
gcttccccag ccagcagatt gttgctggat caagtgggca tgaaagagaa tgaagacaaa 480
tatatgtgtg agtcaagtgg gttctaccca gaggctatta atataacatg ggagaagcag 540
acccagaagt ttccccatcc catagagatt tctgaggatg tcatcactgg tcccaccatc 600
aagaatatgg atggcacatt taatgtcact agctgcttga agctgaactc ctctcaggaa 660
gaccctggga ctgtctacca gtgtgtggta cggcatgcgt ccttgcatac ccccttgagg 720
agcaacttta ccctgactgc tgctcggcac agtctttctg aaactgagaa gacagataat 780
ttttccattc attggtggcc tatttcattc attggtgttg gactggtttt attaattgtt 840
ttgattcctt ggaaaaagat atgtaacaaa tcatcttcag cctatactcc tctcaagtgc 900
attctgaaac actggaactc ctttgacact cagactctga agaaagagca cctcatattc 960
ttttgcactc gggcatggcc gtcttaccag ctgcaggatg gggaggcttg gcctcctgag 1020
ggaagtgtta atattaatac tattcaacaa ctagatgttt tctgcagaca ggagggcaaa 1080
tggtccgagg ttccttatgt gcaagccttc tttgccttgc gagacaaccc agatctttgt 1140
cagtgttgta gaattgaccc tgctctccta acagttacat caggcaagtc catagatgat 1200
aattccacaa agtctgagaa acaaacccct agggaacact cggatgcagt tccggatgcc 1260
ccaatccttc ctgtctcccc tatctgggaa cctcctccag ccacaacatc aacaactcca 1320
gttctatcct cccaaccccc aactttactg ttacccctac ag 1362
<210> 149
<211> 597
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ICOS, isoform 1
<400> 149
atgaagtcag gcctctggta tttctttctc ttctgcttgc gcattaaagt tttaacagga 60
gaaatcaatg gttctgccaa ttatgagatg tttatatttc acaacggagg tgtacaaatt 120
ttatgcaaat atcctgacat tgtccagcaa tttaaaatgc agttgctgaa aggggggcaa 180
atactctgcg atctcactaa gacaaaagga agtggaaaca cagtgtccat taagagtctg 240
aaattctgcc attctcagtt atccaacaac agtgtctctt tttttctata caacttggac 300
cattctcatg ccaactatta cttctgcaac ctatcaattt ttgatcctcc tccttttaaa 360
gtaactctta caggaggata tttgcatatt tatgaatcac aactttgttg ccagctgaag 420
ttctggttac ccataggatg tgcagccttt gttgtagtct gcattttggg atgcatactt 480
atttgttggc ttacaaaaaa gaagtattca tccagtgtgc acgaccctaa cggtgaatac 540
atgttcatga gagcagtgaa cacagccaaa aaatctagac tcacagatgt gacccta 597
<210> 150
<211> 906
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ICOS ligand, isoform 1
<400> 150
atgcggctgg gcagtcctgg actgctcttc ctgctcttca gcagccttcg agctgatact 60
caggagaagg aagtcagagc gatggtaggc agcgacgtgg agctcagctg cgcttgccct 120
gaaggaagcc gttttgattt aaatgatgtt tacgtatatt ggcaaaccag tgagtcgaaa 180
accgtggtga cctaccacat cccacagaac agctccttgg aaaacgtgga cagccgctac 240
cggaaccgag ccctgatgtc accggccggc atgctgcggg gcgacttctc cctgcgcttg 300
ttcaacgtca ccccccagga cgagcagaag tttcactgcc tggtgttgag ccaatccctg 360
ggattccagg aggttttgag cgttgaggtt acactgcatg tggcagcaaa cttcagcgtg 420
cccgtcgtca gcgcccccca cagcccctcc caggatgagc tcaccttcac gtgtacatcc 480
ataaacggct accccaggcc caacgtgtac tggatcaata agacggacaa cagcctgctg 540
gaccaggctc tgcagaatga caccgtcttc ttgaacatgc ggggcttgta tgacgtggtc 600
agcgtgctga ggatcgcacg gacccccagc gtgaacattg gctgctgcat agagaacgtg 660
cttctgcagc agaacctgac tgtcggcagc cagacaggaa atgacatcgg agagagagac 720
aagatcacag agaatccagt cagtaccggc gagaaaaacg cggccacgtg gagcatcctg 780
gctgtcctgt gcctgcttgt ggtcgtggcg gtggccatag gctgggtgtg cagggaccga 840
tgcctccaac acagctatgc aggtgcctgg gctgtgagtc cggagacaga gctcactggc 900
cacgtt 906
<210> 151
<211> 1344
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> gp49B/LILRB4, isoform 1
<400> 151
atgatcccca ccttcacggc tctgctctgc ctcgggctga gtctgggccc caggacccac 60
atgcaggcag ggcccctccc caaacccacc ctctgggctg agccaggctc tgtgatcagc 120
tgggggaact ctgtgaccat ctggtgtcag gggaccctgg aggctcggga gtaccgtctg 180
gataaagagg aaagcccagc accctgggac agacagaacc cactggagcc caagaacaag 240
gccagattct ccatcccatc catgacagag gactatgcag ggagataccg ctgttactat 300
cgcagccctg taggctggtc acagcccagt gaccccctgg agctggtgat gacaggagcc 360
tacagtaaac ccaccctttc agccctgccg agtcctcttg tgacctcagg aaagagcgtg 420
accctgctgt gtcagtcacg gagcccaatg gacacttttc ttctgatcaa ggagcgggca 480
gcccatcccc tactgcatct gagatcagag cacggagctc agcagcacca ggctgaattc 540
cccatgagtc ctgtgacctc agtgcacggg gggacctaca ggtgcttcag ctcacacggc 600
ttctcccact acctgctgtc acaccccagt gaccccctgg agctcatagt ctcaggatcc 660
ttggagggtc ccaggccctc acccacaagg tccgtctcaa cagctgcagg ccctgaggac 720
cagcccctca tgcctacagg gtcagtcccc cacagtggtc tgagaaggca ctgggaggta 780
ctgatcgggg tcttggtggt ctccatcctg cttctctccc tcctcctctt cctcctcctc 840
caacactggc gtcagggaaa acacaggaca ttggcccaga gacaggctga tttccaacgt 900
cctccagggg ctgccgagcc agagcccaag gacgggggcc tacagaggag gtccagccca 960
gctgctgacg tccagggaga aaacttctgt gctgccgtga agaacacaca gcctgaggac 1020
ggggtggaaa tggacactcg gcagagccca cacgatgaag acccccaggc agtgacgtat 1080
gccaaggtga aacactccag acctaggaga gaaatggcct ctcctccctc cccactgtct 1140
ggggaattcc tggacacaaa ggacagacag gcagaagagg acagacagat ggacactgag 1200
gctgctgcat ctgaagcccc ccaggatgtg acctacgccc ggctgcacag ctttaccctc 1260
agacagaagg caactgagcc tcctccatcc caggaagggg cctctccagc tgagcccagt 1320
gtctatgcca ctctggccat ccac 1344
<210> 152
<211> 1896
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> PIR-B/LILRB3, isoform 1
<400> 152
atgacgcccg ccctcacagc cctgctctgc cttgggctga gtctgggccc caggacccgc 60
atgcaggcag ggcccttccc caaacccacc ctctgggctg agccaggctc tgtgatcagc 120
tgggggagcc ccgtgaccat ctggtgtcag gggagcctgg aggcccagga gtaccaactg 180
gataaagagg gaagcccaga gccctgggac agaaataacc cactggaacc caagaacaag 240
gccagattct ccatcccatc catgacacag caccatgcag ggagataccg ctgccactat 300
tacagctctg caggctggtc agagcccagc gaccccctgg agctggtgat gacaggattc 360
tacaacaaac ccaccctctc agccctgccc agccctgtgg tggcctcagg ggggaatatg 420
accctccgat gtggctcaca gaagggatat caccattttg ttctgatgaa ggaaggagaa 480
caccagctcc cccggaccct ggactcacag cagctccaca gtggggggtt ccaggccctg 540
ttccctgtgg gccccgtgac ccccagccac aggtggaggt tcacatgcta ttactattat 600
acaaacaccc cctgggtgtg gtcccacccc agtgaccccc tggagattct gccctcaggc 660
gtgtctagga agccctccct cctgaccctg cagggccctg tcctggcccc tgggcagagc 720
ctgaccctcc agtgtggctc tgatgtcggc tacgacagat ttgttctgta taaggagggg 780
gaacgtgact tcctccagcg ccctggccag cagccccagg ctgggctctc ccaggccaac 840
ttcaccctgg gccctgtgag ccgctcctac gggggccagt acaggtgcta tggtgcacac 900
aacctctcct ccgagtggtc ggcccccagt gaccccctgg acatcctgat cacaggacag 960
atctatgaca ccgtctccct gtcagcacag ccgggcccca cagtggcctc aggagagaac 1020
atgaccctgc tgtgtcagtc acgggggtat tttgacactt tccttctgac caaagaaggg 1080
gcagcccatc ccccactgcg tctgagatca atgtacggag ctcataagta ccaggctgaa 1140
ttccccatga gtcctgtgac ctcagcccac gcggggacct acaggtgcta cggctcacgc 1200
agctccaacc cccacctgct gtctttcccc agtgagcccc tggaactcat ggtctcagga 1260
cactctggag gctccagcct cccacccaca gggccgccct ccacacctgg tctgggaaga 1320
tacctggagg ttttgattgg ggtctcggtg gccttcgtcc tgctgctctt cctcctcctc 1380
ttcctcctcc tcctccgtca gcgtcacagc aaacacagga catctgacca gagaaagact 1440
gatttccagc gtcctgcagg ggctgcggag acagagccca aggacagggg cctgctgagg 1500
aggtccagcc cagctgctga cgtccaggaa gaaaacctct atgctgctgt gaaggacaca 1560
cagtctgagg acagggtgga gctggacagt cagcagagcc cacacgatga agacccccag 1620
gcagtgacgt atgccccggt gaaacactcc agtcctagga gagaaatggc ctctcctccc 1680
tcctcactgt ctggggaatt cctggacaca aaggacagac aggtggaaga ggacaggcag 1740
atggacactg aggctgctgc atctgaagcc tcccaggatg tgacctacgc ccagctgcac 1800
agcttgaccc ttagacggaa ggcaactgag cctcctccat cccaggaagg ggaacctcca 1860
gctgagccca gcatctacgc cactctggcc atccac 1896
<210> 153
<211> 1014
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-G alpha chain
<400> 153
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctgctct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccggagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360
tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggacgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420
gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480
gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600
gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660
tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840
tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900
tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gcctggttgt ccttgcagct 960
gtagtcactg gagctgcggt cgctgctgtg ctgtggagaa agaagagctc agat 1014
<210> 154
<211> 1092
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TIM1/HAVCR1
<400> 154
atgcatcctc aagtggtcat cttaagcctc atcctacatc tggcagattc tgtagctggt 60
tctgtaaagg ttggtggaga ggcaggtcca tctgtcacac taccctgcca ctacagtgga 120
gctgtcacat ccatgtgctg gaatagaggc tcatgttctc tattcacatg ccaaaatggc 180
attgtctgga ccaatggaac ccacgtcacc tatcggaagg acacacgcta taagctattg 240
ggggaccttt caagaaggga tgtctctttg accatagaaa atacagctgt gtctgacagt 300
ggcgtatatt gttgccgtgt tgagcaccgt gggtggttca atgacatgaa aatcaccgta 360
tcattggaga ttgtgccacc caaggtcacg actactccaa ttgtcacaac tgttccaacc 420
gtcacgactg ttcgaacgag caccactgtt ccaacgacaa cgactgttcc aatgacgact 480
gttccaacga caactgttcc aacaacaatg agcattccaa cgacaacgac tgttctgacg 540
acaatgactg tttcaacgac aacgagcgtt ccaacgacaa cgagcattcc aacaacaaca 600
agtgttccag tgacaacaac tgtctctacc tttgttcctc caatgccttt gcccaggcag 660
aaccatgaac cagtagccac ttcaccatct tcacctcagc cagcagaaac ccaccctacg 720
acactgcagg gagcaataag gagagaaccc accagctcac cattgtactc ttacacaaca 780
gatgggaatg acaccgtgac agagtcttca gatggccttt ggaataacaa tcaaactcaa 840
ctgttcctag aacatagtct actgacggcc aataccacta aaggaatcta tgctggagtc 900
tgtatttctg tcttggtgct tcttgctctt ttgggtgtca tcattgccaa aaagtatttc 960
ttcaaaaagg aggttcaaca actaagtgtt tcatttagca gccttcaaat taaagctttg 1020
caaaatgcag ttgaaaagga agtccaagca gaagacaata tctacattga gaatagtctt 1080
tatgccacgg ac 1092
<210> 155
<211> 1134
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TIM4/TIMD4, isoform 1
<400> 155
atgtccaaag aacctctcat tctctggctg atgattgagt tttggtggct ttacctgaca 60
ccagtcactt cagagactgt tgtgacggag gttttgggtc accgggtgac tttgccctgt 120
ctgtactcat cctggtctca caacagcaac agcatgtgct gggggaaaga ccagtgcccc 180
tactccggtt gcaaggaggc gctcatccgc actgatggaa tgagggtgac ctcaagaaag 240
tcagcaaaat atagacttca ggggactatc ccgagaggtg atgtctcctt gaccatctta 300
aaccccagtg aaagtgacag cggtgtgtac tgctgccgca tagaagtgcc tggctggttc 360
aacgatgtaa agataaacgt gcgcctgaat ctacagagag cctcaacaac cacgcacaga 420
acagcaacca ccaccacacg cagaacaaca acaacaagcc ccaccaccac ccgacaaatg 480
acaacaaccc cagctgcact tccaacaaca gtcgtgacca cacccgatct cacaaccgga 540
acaccactcc agatgacaac cattgccgtc ttcacaacag caaacacgtg cctttcacta 600
accccaagca cccttccgga ggaagccaca ggtcttctga ctcccgagcc ttctaaggaa 660
gggcccatcc tcactgcaga atcagaaact gtcctcccca gtgattcctg gagtagtgtt 720
gagtctactt ctgctgacac tgtcctgctg acatccaaag agtccaaagt ttgggatctc 780
ccatcaacat cccacgtgtc aatgtggaaa acgagtgatt ctgtgtcttc tcctcagcct 840
ggagcatctg atacagcagt tcctgagcag aacaaaacaa caaaaacagg acagatggat 900
ggaataccca tgtcaatgaa gaatgaaatg cccatctccc aactactgat gatcatcgcc 960
ccctccttgg gatttgtgct cttcgcattg tttgtggcgt ttctcctgag agggaaactc 1020
atggaaacct attgttcgca gaaacacaca aggctagact acattggaga tagtaaaaat 1080
gtcctcaatg acgtgcagca tggaagggaa gacgaagacg gcctttttac cctc 1134
<210> 156
<211> 831
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> OX-40/CD134/TNFRSF4
<400> 156
atgtgcgtgg gggctcggcg gctgggccgc gggccgtgtg cggctctgct cctcctgggc 60
ctggggctga gcaccgtgac ggggctccac tgtgtcgggg acacctaccc cagcaacgac 120
cggtgctgcc acgagtgcag gccaggcaac gggatggtga gccgctgcag ccgctcccag 180
aacacggtgt gccgtccgtg cgggccgggc ttctacaacg acgtggtcag ctccaagccg 240
tgcaagccct gcacgtggtg taacctcaga agtgggagtg agcggaagca gctgtgcacg 300
gccacacagg acacagtctg ccgctgccgg gcgggcaccc agcccctgga cagctacaag 360
cctggagttg actgtgcccc ctgccctcca gggcacttct ccccaggcga caaccaggcc 420
tgcaagccct ggaccaactg caccttggct gggaagcaca ccctgcagcc ggccagcaat 480
agctcggacg caatctgtga ggacagggac cccccagcca cgcagcccca ggagacccag 540
ggccccccgg ccaggcccat cactgtccag cccactgaag cctggcccag aacctcacag 600
ggaccctcca cccggcccgt ggaggtcccc gggggccgtg cggttgccgc catcctgggc 660
ctgggcctgg tgctggggct gctgggcccc ctggccatcc tgctggccct gtacctgctc 720
cggagggacc agaggctgcc ccccgatgcc cacaagcccc ctgggggagg cagtttccgg 780
acccccatcc aagaggagca ggccgacgcc cactccaccc tggccaagat c 831
<210> 157
<211> 549
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> OX-40L/CD252/TNFSF4, isoform 1
<400> 157
atggaaaggg tccaacccct ggaagagaat gtgggaaatg cagccaggcc aagattcgag 60
aggaacaagc tattgctggt ggcctctgta attcagggac tggggctgct cctgtgcttc 120
acctacatct gcctgcactt ctctgctctt caggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa 180
agtatcaaag tacaatttac cgaatataag aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa 240
aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt 300
tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc caggaagtca acattagcct tcattaccag 360
aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg 420
gcctctctga cttacaaaga caaagtctac ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg 480
gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc 540
tgtgtcctt 549
<210> 158
<211> 1950
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ILT-2/LILRB1, isoform 1
<400> 158
atgaccccca tcctcacggt cctgatctgt ctcgggctga gtctgggccc ccggacccac 60
gtgcaggcag ggcacctccc caagcccacc ctctgggctg aaccaggctc tgtgatcacc 120
caggggagtc ctgtgaccct caggtgtcag gggggccagg agacccagga gtaccgtcta 180
tatagagaaa agaaaacagc accctggatt acacggatcc cacaggagct tgtgaagaag 240
ggccagttcc ccatcccatc catcacctgg gaacacacag ggcggtatcg ctgttactat 300
ggtagcgaca ctgcaggccg ctcagagagc agtgaccccc tggagctggt ggtgacagga 360
gcctacatca aacccaccct ctcagcccag cccagccccg tggtgaactc aggagggaat 420
gtaaccctcc agtgtgactc acaggtggca tttgatggct tcattctgtg taaggaagga 480
gaagatgaac acccacaatg cctgaactcc cagccccatg cccgtgggtc gtcccgcgcc 540
atcttctccg tgggccccgt gagcccgagt cgcaggtggt ggtacaggtg ctatgcttat 600
gactcgaact ctccctatga gtggtctcta cccagtgatc tcctggagct cctggtccta 660
ggtgtttcta agaagccatc actctcagtg cagccaggtc ctatcgtggc ccctgaggag 720
accctgactc tgcagtgtgg ctctgatgct ggctacaaca gatttgttct gtataaggac 780
ggggaacgtg acttccttca gctcgctggc gcacagcccc aggctgggct ctcccaggcc 840
aacttcaccc tgggccctgt gagccgctcc tacgggggcc agtacagatg ctacggtgca 900
cacaacctct cctccgagtg gtcggccccc agcgaccccc tggacatcct gatcgcagga 960
cagttctatg acagagtctc cctctcggtg cagccgggcc ccacggtggc ctcaggagag 1020
aacgtgaccc tgctgtgtca gtcacaggga tggatgcaaa ctttccttct gaccaaggag 1080
ggggcagctg atgacccatg gcgtctaaga tcaacgtacc aatctcaaaa ataccaggct 1140
gaattcccca tgggtcctgt gacctcagcc catgcgggga cctacaggtg ctacggctca 1200
cagagctcca aaccctacct gctgactcac cccagtgacc ccctggagct cgtggtctca 1260
ggaccgtctg ggggccccag ctccccgaca acaggcccca cctccacatc tggccctgag 1320
gaccagcccc tcacccccac cgggtcggat ccccagagtg gtctgggaag gcacctgggg 1380
gttgtgatcg gcatcttggt ggccgtcatc ctactgctcc tcctcctcct cctcctcttc 1440
ctcatcctcc gacatcgacg tcagggcaaa cactggacat cgacccagag aaaggctgat 1500
ttccaacatc ctgcaggggc tgtggggcca gagcccacag acagaggcct gcagtggagg 1560
tccagcccag ctgccgatgc ccaggaagaa aacctctatg ctgccgtgaa gcacacacag 1620
cctgaggatg gggtggagat ggacactcgg agcccacacg atgaagaccc ccaggcagtg 1680
acgtatgccg aggtgaaaca ctccagacct aggagagaaa tggcctctcc tccttcccca 1740
ctgtctgggg aattcctgga cacaaaggac agacaggcgg aagaggacag gcagatggac 1800
actgaggctg ctgcatctga agccccccag gatgtgacct acgcccagct gcacagcttg 1860
accctcagac gggaggcaac tgagcctcct ccatcccagg aagggccctc tccagctgtg 1920
cccagcatct acgccactct ggccatccac 1950
<210> 159
<211> 1794
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ILT-4/LILRB2, isoform 1
<400> 159
atgaccccca tcgtcacagt cctgatctgt ctcgggctga gtctgggccc caggacccgc 60
gtgcagacag ggaccatccc caagcccacc ctgtgggctg agccagactc tgtgatcacc 120
caggggagtc ccgtcaccct cagttgtcag gggagccttg aagcccagga gtaccgtcta 180
tatagggaga aaaaatcagc atcttggatt acacggatac gaccagagct tgtgaagaac 240
ggccagttcc acatcccatc catcacctgg gaacacacag ggcgatatgg ctgtcagtat 300
tacagccgcg ctcggtggtc tgagctcagt gaccccctgg tgctggtgat gacaggagcc 360
tacccaaaac ccaccctctc agcccagccc agccctgtgg tgacctcagg aggaagggtg 420
accctccagt gtgagtcaca ggtggcattt ggcggcttca ttctgtgtaa ggaaggagaa 480
gatgaacacc cacaatgcct gaactcccag ccccatgccc gtgggtcgtc ccgcgccatc 540
ttctccgtgg gccccgtgag cccgaatcgc aggtggtcgc acaggtgcta tggttatgac 600
ttgaactctc cctatgtgtg gtcttcaccc agtgatctcc tggagctcct ggtcccaggt 660
gtttctaaga agccatcact ctcagtgcag ccgggtcctg tcatggcccc tggggaaagc 720
ctgaccctcc agtgtgtctc tgatgtcggc tatgacagat ttgttctgta caaggagggg 780
gaacgtgacc ttcgccagct ccctggccgg cagccccagg ctgggctctc ccaggccaac 840
ttcaccctgg gccctgtgag ccgctcctac gggggccagt acagatgcta cggtgcacac 900
aacctctcct ctgagtgctc ggcccccagc gaccccctgg acatcctgat cacaggacag 960
atccgtggca cacccttcat ctcagtgcag ccaggcccca cagtggcctc aggagagaac 1020
gtgaccctgc tgtgtcagtc atggcggcag ttccacactt tccttctgac caaggcggga 1080
gcagctgatg ccccactccg tctaagatca atacacgaat atcctaagta ccaggctgaa 1140
ttccccatga gtcctgtgac ctcagcccac gcggggacct acaggtgcta cggctcactc 1200
aactccgacc cctacctgct gtctcacccc agtgagcccc tggagctcgt ggtctcagga 1260
ccctccatgg gttccagccc cccacccacc ggtcccatct ccacacctgc aggccctgag 1320
gaccagcccc tcacccccac tgggtcggat ccccaaagtg gtctgggaag gcacctgggg 1380
gttgtgatcg gcatcttggt ggccgtcgtc ctactgctcc tcctcctcct cctcctcttc 1440
ctcatcctcc gacatcgacg tcagggcaaa cactggacat cgacccagag aaaggctgat 1500
ttccaacatc ctgcaggggc tgtggggcca gagcccacag acagaggcct gcagtggagg 1560
tccagcccag ctgccgacgc ccaggaagaa aacctctatg ctgccgtgaa ggacacacag 1620
cctgaagatg gggtggagat ggacactcgg gctgctgcat ctgaagcccc ccaggatgtg 1680
acctacgccc agctgcacag cttgaccctc agacggaagg caactgagcc tcctccatcc 1740
caggaaaggg aacctccagc tgagcccagc atctacgcca ccctggccat ccac 1794
<210> 160
<211> 717
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BCL-2 isoform alpha
<400> 160
atggcgcacg ctgggagaac agggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60
tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120
ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180
gcatcccggg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240
gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc 300
ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360
ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420
ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480
agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540
ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600
ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660
ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctggg ccacaag 717
<210> 161
<211> 4050
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MDR1/ABCB1, isoform 1
<400> 161
atgagtgtca acttgcaagg ggaccagaga ggtgcaacgg aagccagaac attcctcctg 60
gaaattcaac ctgtttcgca gtttctcgag gaatcagcat tcagtcaatc cgggccggga 120
gcagtcatct gtggtctttc cactaaagtc ggagtatctt cttccaaaat ttcacgtctt 180
ggtggccgtt ccaaggagcg cgaggtcgga atggatcttg aaggggaccg caatggagga 240
gcaaagaaga agaacttttt taaactgaac aataaaagtg aaaaagataa gaaggaaaag 300
aaaccaactg tcagtgtatt ttcaatgttt cgctattcaa attggcttga caagttgtat 360
atggtggtgg gaactttggc tgccatcatc catggggctg gacttcctct catgatgctg 420
gtgtttggag aaatgacaga tatctttgca aatgcaggaa atttagaaga tctgatgtca 480
aacatcacta atagaagtga tatcaatgat acagggttct tcatgaatct ggaggaagac 540
atgaccaggt atgcctatta ttacagtgga attggtgctg gggtgctggt tgctgcttac 600
attcaggttt cattttggtg cctggcagct ggaagacaaa tacacaaaat tagaaaacag 660
ttttttcatg ctataatgcg acaggagata ggctggtttg atgtgcacga tgttggggag 720
cttaacaccc gacttacaga tgatgtctcc aagattaatg aaggaattgg tgacaaaatt 780
ggaatgttct ttcagtcaat ggcaacattt ttcactgggt ttatagtagg atttacacgt 840
ggttggaagc taacccttgt gattttggcc atcagtcctg ttcttggact gtcagctgct 900
gtctgggcaa agatactatc ttcatttact gataaagaac tcttagcgta tgcaaaagct 960
ggagcagtag ctgaagaggt cttggcagca attagaactg tgattgcatt tggaggacaa 1020
aagaaagaac ttgaaaggta caacaaaaat ttagaagaag ctaaaagaat tgggataaag 1080
aaagctatta cagccaatat ttctataggt gctgctttcc tgctgatcta tgcatcttat 1140
gctctggcct tctggtatgg gaccaccttg gtcctctcag gggaatattc tattggacaa 1200
gtactcactg tattcttttc tgtattaatt ggggctttta gtgttggaca ggcatctcca 1260
agcattgaag catttgcaaa tgcaagagga gcagcttatg aaatcttcaa gataattgat 1320
aataagccaa gtattgacag ctattcgaag agtgggcaca aaccagataa tattaaggga 1380
aatttggaat tcagaaatgt tcacttcagt tacccatctc gaaaagaagt taagatcttg 1440
aagggtctga acctgaaggt gcagagtggg cagacggtgg ccctggttgg aaacagtggc 1500
tgtgggaaga gcacaacagt ccagctgatg cagaggctct atgaccccac agaggggatg 1560
gtcagtgttg atggacagga tattaggacc ataaatgtaa ggtttctacg ggaaatcatt 1620
ggtgtggtga gtcaggaacc tgtattgttt gccaccacga tagctgaaaa cattcgctat 1680
ggccgtgaaa atgtcaccat ggatgagatt gagaaagctg tcaaggaagc caatgcctat 1740
gactttatca tgaaactgcc tcataaattt gacaccctgg ttggagagag aggggcccag 1800
ttgagtggtg ggcagaagca gaggatcgcc attgcacgtg ccctggttcg caaccccaag 1860
atcctcctgc tggatgaggc cacgtcagcc ttggacacag aaagcgaagc agtggttcag 1920
gtggctctgg ataaggccag aaaaggtcgg accaccattg tgatagctca tcgtttgtct 1980
acagttcgta atgctgacgt catcgctggt ttcgatgatg gagtcattgt ggagaaagga 2040
aatcatgatg aactcatgaa agagaaaggc atttacttca aacttgtcac aatgcagaca 2100
gcaggaaatg aagttgaatt agaaaatgca gctgatgaat ccaaaagtga aattgatgcc 2160
ttggaaatgt cttcaaatga ttcaagatcc agtctaataa gaaaaagatc aactcgtagg 2220
agtgtccgtg gatcacaagc ccaagacaga aagcttagta ccaaagaggc tctggatgaa 2280
agtatacctc cagtttcctt ttggaggatt atgaagctaa atttaactga atggccttat 2340
tttgttgttg gtgtattttg tgccattata aatggaggcc tgcaaccagc atttgcaata 2400
atattttcaa agattatagg ggtttttaca agaattgatg atcctgaaac aaaacgacag 2460
aatagtaact tgttttcact attgtttcta gcccttggaa ttatttcttt tattacattt 2520
ttccttcagg gtttcacatt tggcaaagct ggagagatcc tcaccaagcg gctccgatac 2580
atggttttcc gatccatgct cagacaggat gtgagttggt ttgatgaccc taaaaacacc 2640
actggagcat tgactaccag gctcgccaat gatgctgctc aagttaaagg ggctataggt 2700
tccaggcttg ctgtaattac ccagaatata gcaaatcttg ggacaggaat aattatatcc 2760
ttcatctatg gttggcaact aacactgtta ctcttagcaa ttgtacccat cattgcaata 2820
gcaggagttg ttgaaatgaa aatgttgtct ggacaagcac tgaaagataa gaaagaacta 2880
gaaggttctg ggaagatcgc tactgaagca atagaaaact tccgaaccgt tgtttctttg 2940
actcaggagc agaagtttga acatatgtat gctcagagtt tgcaggtacc atacagaaac 3000
tctttgagga aagcacacat ctttggaatt acattttcct tcacccaggc aatgatgtat 3060
ttttcctatg ctggatgttt ccggtttgga gcctacttgg tggcacataa actcatgagc 3120
tttgaggatg ttctgttagt attttcagct gttgtctttg gtgccatggc cgtggggcaa 3180
gtcagttcat ttgctcctga ctatgccaaa gccaaaatat cagcagccca catcatcatg 3240
atcattgaaa aaaccccttt gattgacagc tacagcacgg aaggcctaat gccgaacaca 3300
ttggaaggaa atgtcacatt tggtgaagtt gtattcaact atcccacccg accggacatc 3360
ccagtgcttc agggactgag cctggaggtg aagaagggcc agacgctggc tctggtgggc 3420
agcagtggct gtgggaagag cacagtggtc cagctcctgg agcggttcta cgaccccttg 3480
gcagggaaag tgctgcttga tggcaaagaa ataaagcgac tgaatgttca gtggctccga 3540
gcacacctgg gcatcgtgtc ccaggagccc atcctgtttg actgcagcat tgctgagaac 3600
attgcctatg gagacaacag ccgggtggtg tcacaggaag agattgtgag ggcagcaaag 3660
gaggccaaca tacatgcctt catcgagtca ctgcctaata aatatagcac taaagtagga 3720
gacaaaggaa ctcagctctc tggtggccag aaacaacgca ttgccatagc tcgtgccctt 3780
gttagacagc ctcatatttt gcttttggat gaagccacgt cagctctgga tacagaaagt 3840
gaaaaggttg tccaagaagc cctggacaaa gccagagaag gccgcacctg cattgtgatt 3900
gctcaccgcc tgtccaccat ccagaatgca gacttaatag tggtgtttca gaatggcaga 3960
gtcaaggagc atggcacgca tcagcagctg ctggcacaga aaggcatcta tttttcaatg 4020
gtcagtgtcc aggctggaac aaagcgccag 4050
<210> 162
<211> 990
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Arginase1, isoform 1
<400> 162
atgagcgcca agtccagaac catagggatt attggagctc ctttctcaaa gggacagcca 60
cgaggagggg tggaagaagg ccctacagta ttgagaaagg ctggtctgct tgagaaactt 120
aaagaacaag taactcaaaa ctttttaatt ttagagtgtg atgtgaagga ttatggggac 180
ctgccctttg ctgacatccc taatgacagt ccctttcaaa ttgtgaagaa tccaaggtct 240
gtgggaaaag caagcgagca gctggctggc aaggtggcag aagtcaagaa gaacggaaga 300
atcagcctgg tgctgggcgg agaccacagt ttggcaattg gaagcatctc tggccatgcc 360
agggtccacc ctgatcttgg agtcatctgg gtggatgctc acactgatat caacactcca 420
ctgacaacca caagtggaaa cttgcatgga caacctgtat ctttcctcct gaaggaacta 480
aaaggaaaga ttcccgatgt gccaggattc tcctgggtga ctccctgtat atctgccaag 540
gatattgtgt atattggctt gagagacgtg gaccctgggg aacactacat tttgaaaact 600
ctaggcatta aatacttttc aatgactgaa gtggacagac taggaattgg caaggtgatg 660
gaagaaacac tcagctatct actaggaaga aagaaaaggc caattcatct aagttttgat 720
gttgacggac tggacccatc tttcacacca gctactggca caccagtcgt gggaggtctg 780
acatacagag aaggtctcta catcacagaa gaaatctaca aaacagggct actctcagga 840
ttagatataa tggaagtgaa cccatccctg gggaagacac cagaagaagt aactcgaaca 900
gtgaacacag cagttgcaat aaccttggct tgtttcggac ttgctcggga gggtaatcac 960
aagcctattg actaccttaa cccacctaag 990
<210> 163
<211> 3459
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> nitric oxide synthase, inducible (iNOS/NOS2),
isoform 1
<400> 163
atggcctgtc cttggaaatt tctgttcaag accaaattcc accagtatgc aatgaatggg 60
gaaaaagaca tcaacaacaa tgtggagaaa gccccctgtg ccacctccag tccagtgaca 120
caggatgacc ttcagtatca caacctcagc aagcagcaga atgagtcccc gcagcccctc 180
gtggagacgg gaaagaagtc tccagaatct ctggtcaagc tggatgcaac cccattgtcc 240
tccccacggc atgtgaggat caaaaactgg ggcagcggga tgactttcca agacacactt 300
caccataagg ccaaagggat tttaacttgc aggtccaaat cttgcctggg gtccattatg 360
actcccaaaa gtttgaccag aggacccagg gacaagccta cccctccaga tgagcttcta 420
cctcaagcta tcgaatttgt caaccaatat tacggctcct tcaaagaggc aaaaatagag 480
gaacatctgg ccagggtgga agcggtaaca aaggagatag aaacaacagg aacctaccaa 540
ctgacgggag atgagctcat cttcgccacc aagcaggcct ggcgcaatgc cccacgctgc 600
attgggagga tccagtggtc caacctgcag gtcttcgatg cccgcagctg ttccactgcc 660
cgggaaatgt ttgaacacat ctgcagacac gtgcgttact ccaccaacaa tggcaacatc 720
aggtcggcca tcaccgtgtt cccccagcgg agtgatggca agcacgactt ccgggtgtgg 780
aatgctcagc tcatccgcta tgctggctac cagatgccag atggcagcat cagaggggac 840
cctgccaacg tggaattcac tcagctgtgc atcgacctgg gctggaagcc caagtacggc 900
cgcttcgatg tggtccccct ggtcctgcag gccaatggcc gtgaccctga gctcttcgaa 960
atcccacctg accttgtgct tgaggtggcc atggaacatc ccaaatacga gtggtttcgg 1020
gaactggagc taaagtggta cgccctgcct gcagtggcca acatgctgct tgaggtgggc 1080
ggcctggagt tcccagggtg ccccttcaat ggctggtaca tgggcacaga gatcggagtc 1140
cgggacttct gtgacgtcca gcgctacaac atcctggagg aagtgggcag gagaatgggc 1200
ctggaaacgc acaagctggc ctcgctctgg aaagaccagg ctgtcgttga gatcaacatt 1260
gctgtgctcc atagtttcca gaagcagaat gtgaccatca tggaccacca ctcggctgca 1320
gaatccttca tgaagtacat gcagaatgaa taccggtccc gtgggggctg cccggcagac 1380
tggatttggc tggtccctcc catgtctggg agcatcaccc ccgtgtttca ccaggagatg 1440
ctgaactacg tcctgtcccc tttctactac tatcaggtag aggcctggaa aacccatgtc 1500
tggcaggacg agaagcggag acccaagaga agagagattc cattgaaagt cttggtcaaa 1560
gctgtgctct ttgcctgtat gctgatgcgc aagacaatgg cgtcccgagt cagagtcacc 1620
atcctctttg cgacagagac aggaaaatca gaggcgctgg cctgggacct gggggcctta 1680
ttcagctgtg ccttcaaccc caaggttgtc tgcatggata agtacaggct gagctgcctg 1740
gaggaggaac ggctgctgtt ggtggtgacc agtacgtttg gcaatggaga ctgccctggc 1800
aatggagaga aactgaagaa atcgctcttc atgctgaaag agctcaacaa caaattcagg 1860
tacgctgtgt ttggcctcgg ctccagcatg taccctcggt tctgcgcctt tgctcatgac 1920
attgatcaga agctgtccca cctgggggcc tctcagctca ccccgatggg agaaggggat 1980
gagctcagtg ggcaggagga cgccttccgc agctgggccg tgcaaacctt caaggcagcc 2040
tgtgagacgt ttgatgtccg aggcaaacag cacattcaga tccccaagct ctacacctcc 2100
aatgtgacct gggacccgca ccactacagg ctcgtgcagg actcacagcc tttggacctc 2160
agcaaagccc tcagcagcat gcatgccaag aacgtgttca ccatgaggct caaatctcgg 2220
cagaatctac aaagtccgac atccagccgt gccaccatcc tggtggaact ctcctgtgag 2280
gatggccaag gcctgaacta cctgccgggg gagcaccttg gggtttgccc aggcaaccag 2340
ccggccctgg tccaaggtat cctggagcga gtggtggatg gccccacacc ccaccagaca 2400
gtgcgcctgg aggccctgga tgagagtggc agctactggg tcagtgacaa gaggctgccc 2460
ccctgctcac tcagccaggc cctcacctac ttcctggaca tcaccacacc cccaacccag 2520
ctgctgctcc aaaagctggc ccaggtggcc acagaagagc ctgagagaca gaggctggag 2580
gccctgtgcc agccctcaga gtacagcaag tggaagttca ccaacagccc cacattcctg 2640
gaggtgctag aggagttccc gtccctgcgg gtgtctgctg gcttcctgct ttcccagctc 2700
cccattctga agcccaggtt ctactccatc agctcctccc gggatcacac gcccacagag 2760
atccacctga ctgtggccgt ggtcacctac cacacccgag atggccaggg tcccctgcac 2820
cacggcgtct gcagcacatg gctcaacagc ctgaagcccc aagacccagt gccctgcttt 2880
gtgcggaatg ccagcggctt ccacctcccc gaggatccct cccatccttg catcctcatc 2940
gggcctggca caggcatcgc gcccttccgc agtttctggc agcaacggct ccatgactcc 3000
cagcacaagg gagtgcgggg aggccgcatg accttggtgt ttgggtgccg ccgcccagat 3060
gaggaccaca tctaccagga ggagatgctg gagatggccc agaagggggt gctgcatgcg 3120
gtgcacacag cctattcccg cctgcctggc aagcccaagg tctatgttca ggacatcctg 3180
cggcagcagc tggccagcga ggtgctccgt gtgctccaca aggagccagg ccacctctat 3240
gtttgcgggg atgtgcgcat ggcccgggac gtggcccaca ccctgaagca gctggtggct 3300
gccaagctga aattgaatga ggagcaggtc gaggactatt tctttcagct caagagccag 3360
aagcgctatc acgaagatat ctttggtgct gtatttcctt acgaggcgaa gaaggacagg 3420
gtggcggtgc agcccagcag cctggagatg tcagcgctc 3459
<210> 164
<211> 3765
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Her2
<400> 164
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080
atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140
tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200
gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260
gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320
tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380
ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440
ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500
gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560
tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620
gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680
ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 1980
attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag 2040
aagatccgga agtacacgat gcggagactg ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg 2100
acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg 2160
aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct tttggcacag tctacaaggg catctggatc 2220
cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc 2280
cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca 2340
tatgtctccc gccttctggg catctgcctg acatccacgg tgcagctggt gacacagctt 2400
atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag 2460
gacctgctga actggtgtat gcagattgcc aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg 2520
ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa 2580
attacagact tcgggctggc tcggctgctg gacattgacg agacagagta ccatgcagat 2640
gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc 2700
caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc 2760
aaaccttacg atgggatccc agcccgggag atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg 2820
ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg 2880
attgactctg aatgtcggcc aagattccgg gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc 2940
agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg 3000
gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct 3060
gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg 3120
ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca 3180
ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg 3240
gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc 3300
ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg aggaccccac agtacccctg 3360
ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg 3420
aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc 3480
cgacctgctg gtgccactct ggaaaggccc aagactctct ccccagggaa gaatggggtc 3540
gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag 3600
ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc 3660
tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac ccagcacctt caaagggaca 3720
cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc cagtg 3765
<210> 165
<211> 567
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> KRAS
<400> 165
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60
atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120
aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180
caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240
gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300
aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360
ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420
tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag agagtggagg atgcttttta tacattggtg 480
agggagatcc gacaatacag attgaaaaaa atcagcaaag aagaaaagac tcctggctgt 540
gtgaaaatta aaaaatgcat tataatg 567
<210> 166
<211> 1809
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> PLK1
<400> 166
atgagtgctg cagtgactgc agggaagctg gcacgggcac cggccgaccc tgggaaagcc 60
ggggtccccg gagttgcagc tcccggagct ccggcggcgg ctccaccggc gaaagagatc 120
ccggaggtcc tagtggaccc acgcagccgg cggcgctatg tgcggggccg ctttttgggc 180
aagggcggct ttgccaagtg cttcgagatc tcggacgcgg acaccaagga ggtgttcgcg 240
ggcaagattg tgcctaagtc tctgctgctc aagccgcacc agagggagaa gatgtccatg 300
gaaatatcca ttcaccgcag cctcgcccac cagcacgtcg taggattcca cggctttttc 360
gaggacaacg acttcgtgtt cgtggtgttg gagctctgcc gccggaggtc tctcctggag 420
ctgcacaaga ggaggaaagc cctgactgag cctgaggccc gatactacct acggcaaatt 480
gtgcttggct gccagtacct gcaccgaaac cgagttattc atcgagacct caagctgggc 540
aaccttttcc tgaatgaaga tctggaggtg aaaatagggg attttggact ggcaaccaaa 600
gtcgaatatg acggggagag gaagaagacc ctgtgtggga ctcctaatta catagctccc 660
gaggtgctga gcaagaaagg gcacagtttc gaggtggatg tgtggtccat tgggtgtatc 720
atgtatacct tgttagtggg caaaccacct tttgagactt cttgcctaaa agagacctac 780
ctccggatca agaagaatga atacagtatt cccaagcaca tcaaccccgt ggccgcctcc 840
ctcatccaga agatgcttca gacagatccc actgcccgcc caaccattaa cgagctgctt 900
aatgacgagt tctttacttc tggctatatc cctgcccgtc tccccatcac ctgcctgacc 960
attccaccaa ggttttcgat tgctcccagc agcctggacc ccagcaaccg gaagcccctc 1020
acagtcctca ataaaggctt ggagaacccc ctgcctgagc gtccccggga aaaagaagaa 1080
ccagtggttc gagagacagg tgaggtggtc gactgccacc tcagtgacat gctgcagcag 1140
ctgcacagtg tcaatgcctc caagccctcg gagcgtgggc tggtcaggca agaggaggct 1200
gaggatcctg cctgcatccc catcttctgg gtcagcaagt gggtggacta ttcggacaag 1260
tacggccttg ggtatcagct ctgtgataac agcgtggggg tgctcttcaa tgactcaaca 1320
cgcctcatcc tctacaatga tggtgacagc ctgcagtaca tagagcgtga cggcactgag 1380
tcctacctca ccgtgagttc ccatcccaac tccttgatga agaagatcac cctccttaaa 1440
tatttccgca attacatgag cgagcacttg ctgaaggcag gtgccaacat cacgccgcgc 1500
gaaggtgatg agctcgcccg gctgccctac ctacggacct ggttccgcac ccgcagcgcc 1560
atcatcctgc acctcagcaa cggcagcgtg cagatcaact tcttccagga tcacaccaag 1620
ctcatcttgt gcccactgat ggcagccgtg acctacatcg acgagaagcg ggacttccgc 1680
acataccgcc tgagtctcct ggaggagtac ggctgctgca aggagctggc cagccggctc 1740
cgctacgccc gcactatggt ggacaagctg ctgagctcac gctcggccag caaccgtctc 1800
aaggcctcc 1809
<210> 167
<211> 876
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> dapA, strain LT2
<400> 167
atgttcacgg gaagtattgt cgcgcttgtt acgccgatgg atgagaaagg taacgtcagt 60
aggtcttgcc tgaaaaaact cattgattat catgtcgcca acggtacctc ggcgattgtt 120
tcggttggca ctaccggcga gtctgccacg ctaagccatg atgaacatgg cgatgtcgtg 180
atgatgacgc tggaactggc tgacggacgt attccggtta tcgccggcac gggcgcaaac 240
gcgaccgcgg aagcgattag cctgacgcag cgttttaacg atagcggtat tgtaggctgc 300
ctgacggtaa cgccgtacta caatcgcccc acgcaggaag gtttgttcca gcatttcaaa 360
gccatcgcgg aacacactga cttgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtaccggt 420
tgcgatatgt tgccggaaac cgtgggtcgt ctggcggaaa taaaaaatat tatcgctatc 480
aaagaggcga cagggaactt aacccgcgtt caccagatca aagagctggt ttcagacgat 540
tttattctgc ttagcggcga tgacgcgtct gcgctggact ttatgcaact gggtggtcat 600
ggcgtgattt ccgttacggc taacgtagcg gcgcgcgaga tggctgacat gtgcaaactg 660
gcggcggaag ggcaatttgc cgaggcgcgc gctatcaacc agcgtctgat gccgttacac 720
aacaaactat ttgtcgaacc caatcctatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggcattgggt 780
cttgtggcga ccgacacgct gcgcctgcca atgacgccta tcacggacca tggtcgtgac 840
atcgtcaaag cagcgcttca gcatgctggc ctgctg 876
<210> 168
<211> 819
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> dapB, strain LT2
<400> 168
atgcatgaag cacaaatccg cgtcgccatt gccggcgccg gtggccgcat gggacggcag 60
ttaatccagg ccgccatggc gatggaaggt gttcagctgg gtgccgcgct ggagcgcgaa 120
ggctcttcct tgctgggcag cgatgctggc gaactggcag gggcgggaaa gtccggcgtg 180
atcgttcaaa gcagccttga ggcggtaaaa gatgattttg acgttttcat cgattttacc 240
cgtccggaag gcacgttgac gcatctggcg ttttgccgcc agcatggtaa agggatggtg 300
attggtacta ccggctttga cgacgccggt aaacaagcca ttcgcgaggc gtcacaagag 360
attgcgatcg ttttcgccgc aaactttagc gtcggcgtta acgtcatgct caagctgctg 420
gagaaagccg cgaaggtaat gggcgactat agcgatattg aaattattga agcgcaccac 480
cgccataaag tggatgcacc gtcgggtacg gcgctggcaa tgggcgaggc aatcgccggg 540
gcgctggata aaaatctgaa ggactgcgcg gtctactcgc gtgaaggtta taccggcgag 600
cgcgtagcgg gcacgattgg ctttgcgacc gttcgggcgg gcgacatcgt cggcgaacat 660
accgcgatgt ttgccgatat tggcgagcgc gtagagatta cgcataaagc ttccagccgc 720
atgacgtttg caaatggcgc gttgcgatcg gcgttatggc taaaaacgaa gaaaaatggg 780
ctatttgaca tgcgggatgt gctggggctg gatgtatta 819
<210> 169
<211> 876
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> dapA
<400> 169
atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg taatgtctgt 60
cgggctagct tgaaaaaact gattgattat catgtcgcca gcggtacttc ggcgatcgtt 120
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atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac 240
gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc 300
ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa 360
gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc 420
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<211> 819
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> dapB
<400> 170
atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg gggggcgtat gggccgccag 60
ttgattcagg cggcgctggc attagagggc gtgcagttgg gcgctgcgct ggagcgtgaa 120
ggatcttctt tactgggcag cgacgccggt gagctggccg gagccgggaa aacaggcgtt 180
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gcccttgata aagatctgaa agattgcgcg gtctacagtc gtgaaggcca caccggtgaa 600
cgtgtgcctg gcaccattgg ttttgccacc gtgcgtgcag gtgacatcgt tggtgaacat 660
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atgacatttg ctaacggcgc ggtaagatcg gctttgtggt tgagtggtaa ggaaagcggt 780
ctttttgata tgcgagatgt acttgatctc aataatttg 819
<210> 171
<211> 1218
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> dapC
<400> 171
atggcaattg aacaaacagc aattacacgc gcgactttcg atgaagtgat cctgccgatt 60
tatgctccgg cagagtttat tccggtaaaa ggtcagggca gccgaatctg ggatcagcaa 120
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gcgaaggtgg ttggggcg 1218
<210> 172
<211> 822
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> dapD
<400> 172
atgcagcagt tacagaacat tattgaaacc gcttttgaac gccgtgccga gatcacgcca 60
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gaaatccact acggtcgcgt tccggcgggg tctgtggttg tttcaggtaa tctgccgtca 720
aaagatggca aatacagcct ctactgtgcg gttatcgtta agaaagttga cgcgaaaact 780
cgcggcaaag tcggcattaa cgaactgctg cgtaccatcg ac 822
<210> 173
<211> 1125
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> dapE
<400> 173
atgtcgtgcc cggttattga gctgacacaa cagcttattc gccgcccttc cctgagtcct 60
gatgatgcag gatgccaggc tttgttgatt gaacgtttgc aggcgatcgg ttttaccgtt 120
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cagggcaatg aattcttccc ggcgaccagt atgcagattg ccaatattca ggcgggaacg 720
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ctacttgccc gtatgtatca acgtatcatg gaacagctcg tcgcc 1125
<210> 174
<211> 1179
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> p53
<400> 174
atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60
gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120
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aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagac 1179
<210> 175
<211> 1470
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ERBA
<400> 175
atggaacaga agccaagcaa ggtggagtgt gggtcagacc cagaggagaa cagtgccagg 60
tcaccagatg gaaagcgaaa aagaaagaac ggccaatgtt ccctgaaaac cagcatgtca 120
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<210> 176
<211> 1317
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> myc
<400> 176
atgcccctca acgttagctt caccaacagg aactatgacc tcgactacga ctcggtgcag 60
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<210> 177
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MYB
<400> 177
atggcccgaa gaccccggca cagcatatat agcagtgacg aggatgatga ggactttgag 60
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cagagacact ataatgatga agaccctgag aaggaaaagc gaataaagga attagaattg 900
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accattctgg ataatgttaa gaacctctta gaatttgcag aaacactcca atttatagat 1200
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> JUN
<400> 178
atgactgcaa agatggaaac gaccttctat gacgatgccc tcaacgcctc gttcctcccg 60
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caactcatgc taacgcagca gttgcaaaca ttt 993
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<211> 3633
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ERBB
<400> 179
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120
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tttgctgaca ttcagagtga agaaatttta caacataacc aaaatatgtc tggattggag 5820
aaagtttcta aaatatcacc ttgtgatgtt agtttggaaa cttcagatat atgtaaatgt 5880
agtataggga agcttcataa gtcagtctca tctgcaaata cttgtgggat ttttagcaca 5940
gcaagtggaa aatctgtcca ggtatcagat gcttcattac aaaacgcaag acaagtgttt 6000
tctgaaatag aagatagtac caagcaagtc ttttccaaag tattgtttaa aagtaacgaa 6060
cattcagacc agctcacaag agaagaaaat actgctatac gtactccaga acatttaata 6120
tcccaaaaag gcttttcata taatgtggta aattcatctg ctttctctgg atttagtaca 6180
gcaagtggaa agcaagtttc cattttagaa agttccttac acaaagttaa gggagtgtta 6240
gaggaatttg atttaatcag aactgagcat agtcttcact attcacctac gtctagacaa 6300
aatgtatcaa aaatacttcc tcgtgttgat aagagaaacc cagagcactg tgtaaactca 6360
gaaatggaaa aaacctgcag taaagaattt aaattatcaa ataacttaaa tgttgaaggt 6420
ggttcttcag aaaataatca ctctattaaa gtttctccat atctctctca atttcaacaa 6480
gacaaacaac agttggtatt aggaaccaaa gtgtcacttg ttgagaacat tcatgttttg 6540
ggaaaagaac aggcttcacc taaaaacgta aaaatggaaa ttggtaaaac tgaaactttt 6600
tctgatgttc ctgtgaaaac aaatatagaa gtttgttcta cttactccaa agattcagaa 6660
aactactttg aaacagaagc agtagaaatt gctaaagctt ttatggaaga tgatgaactg 6720
acagattcta aactgccaag tcatgccaca cattctcttt ttacatgtcc cgaaaatgag 6780
gaaatggttt tgtcaaattc aagaattgga aaaagaagag gagagcccct tatcttagtg 6840
ggagaaccct caatcaaaag aaacttatta aatgaatttg acaggataat agaaaatcaa 6900
gaaaaatcct taaaggcttc aaaaagcact ccagatggca caataaaaga tcgaagattg 6960
tttatgcatc atgtttcttt agagccgatt acctgtgtac cctttcgcac aactaaggaa 7020
cgtcaagaga tacagaatcc aaattttacc gcacctggtc aagaatttct gtctaaatct 7080
catttgtatg aacatctgac tttggaaaaa tcttcaagca atttagcagt ttcaggacat 7140
ccattttatc aagtttctgc tacaagaaat gaaaaaatga gacacttgat tactacaggc 7200
agaccaacca aagtctttgt tccacctttt aaaactaaat cacattttca cagagttgaa 7260
cagtgtgtta ggaatattaa cttggaggaa aacagacaaa agcaaaacat tgatggacat 7320
ggctctgatg atagtaaaaa taagattaat gacaatgaga ttcatcagtt taacaaaaac 7380
aactccaatc aagcagcagc tgtaactttc acaaagtgtg aagaagaacc tttagattta 7440
attacaagtc ttcagaatgc cagagatata caggatatgc gaattaagaa gaaacaaagg 7500
caacgcgtct ttccacagcc aggcagtctg tatcttgcaa aaacatccac tctgcctcga 7560
atctctctga aagcagcagt aggaggccaa gttccctctg cgtgttctca taaacagctg 7620
tatacgtatg gcgtttctaa acattgcata aaaattaaca gcaaaaatgc agagtctttt 7680
cagtttcaca ctgaagatta ttttggtaag gaaagtttat ggactggaaa aggaatacag 7740
ttggctgatg gtggatggct cataccctcc aatgatggaa aggctggaaa agaagaattt 7800
tatagggctc tgtgtgacac tccaggtgtg gatccaaagc ttatttctag aatttgggtt 7860
tataatcact atagatggat catatggaaa ctggcagcta tggaatgtgc ctttcctaag 7920
gaatttgcta atagatgcct aagcccagaa agggtgcttc ttcaactaaa atacagatat 7980
gatacggaaa ttgatagaag cagaagatcg gctataaaaa agataatgga aagggatgac 8040
acagctgcaa aaacacttgt tctctgtgtt tctgacataa tttcattgag cgcaaatata 8100
tctgaaactt ctagcaataa aactagtagt gcagataccc aaaaagtggc cattattgaa 8160
cttacagatg ggtggtatgc tgttaaggcc cagttagatc ctcccctctt agctgtctta 8220
aagaatggca gactgacagt tggtcagaag attattcttc atggagcaga actggtgggc 8280
tctcctgatg cctgtacacc tcttgaagcc ccagaatctc ttatgttaaa gatttctgct 8340
aacagtactc ggcctgctcg ctggtatacc aaacttggat tctttcctga ccctagacct 8400
tttcctctgc ccttatcatc gcttttcagt gatggaggaa atgttggttg tgttgatgta 8460
attattcaaa gagcataccc tatacagtgg atggagaaga catcatctgg attatacata 8520
tttcgcaatg aaagagagga agaaaaggaa gcagcaaaat atgtggaggc ccaacaaaag 8580
agactagaag ccttattcac taaaattcag gaggaatttg aagaacatga agaaaacaca 8640
acaaaaccat atttaccatc acgtgcacta acaagacagc aagttcgtgc tttgcaagat 8700
ggtgcagagc tttatgaagc agtgaagaat gcagcagacc cagcttacct tgagggttat 8760
ttcagtgaag agcagttaag agccttgaat aatcacaggc aaatgttgaa tgataagaaa 8820
caagctcaga tccagttgga aattaggaag gccatggaat ctgctgaaca aaaggaacaa 8880
ggtttatcaa gggatgtcac aaccgtgtgg aagttgcgta ttgtaagcta ttcaaaaaaa 8940
gaaaaagatt cagttatact gagtatttgg cgtccatcat cagatttata ttctctgtta 9000
acagaaggaa agagatacag aatttatcat cttgcaactt caaaatctaa aagtaaatct 9060
gaaagagcta acatacagtt agcagcgaca aaaaaaactc agtatcaaca actaccggtt 9120
tcagatgaaa ttttatttca gatttaccag ccacgggagc cccttcactt cagcaaattt 9180
ttagatccag actttcagcc atcttgttct gaggtggacc taataggatt tgtcgtttct 9240
gttgtgaaaa aaacaggact tgcccctttc gtctatttgt cagacgaatg ttacaattta 9300
ctggcaataa agttttggat agaccttaat gaggacatta ttaagcctca tatgttaatt 9360
gctgcaagca acctccagtg gcgaccagaa tccaaatcag gccttcttac tttatttgct 9420
ggagattttt ctgtgttttc tgctagtcca aaagagggcc actttcaaga gacattcaac 9480
aaaatgaaaa atactgttga gaatattgac atactttgca atgaagcaga aaacaagctt 9540
atgcatatac tgcatgcaaa tgatcccaag tggtccaccc caactaaaga ctgtacttca 9600
gggccgtaca ctgctcaaat cattcctggt acaggaaaca agcttctgat gtcttctcct 9660
aattgtgaga tatattatca aagtccttta tcactttgta tggccaaaag gaagtctgtt 9720
tccacacctg tctcagccca gatgacttca aagtcttgta aaggggagaa agagattgat 9780
gaccaaaaga actgcaaaaa gagaagagcc ttggatttct tgagtagact gcctttacct 9840
ccacctgtta gtcccatttg tacatttgtt tctccggctg cacagaaggc atttcagcca 9900
ccaaggagtt gtggcaccaa atacgaaaca cccataaaga aaaaagaact gaattctcct 9960
cagatgactc catttaaaaa attcaatgaa atttctcttt tggaaagtaa ttcaatagct 10020
gacgaagaac ttgcattgat aaatacccaa gctcttttgt ctggttcaac aggagaaaaa 10080
caatttatat ctgtcagtga atccactagg actgctccca ccagttcaga agattatctc 10140
agactgaaac gacgttgtac tacatctctg atcaaagaac aggagagttc ccaggccagt 10200
acggaagaat gtgagaaaaa taagcaggac acaattacaa ctaaaaaata tatc 10254
<210> 182
<211> 2487
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MCC
<400> 182
atgaattccg gagttgccat gaaatatgga aacgactcct cggccgagct gagtgagctc 60
cattcagcag ccctggcatc actaaaggga gatatagtgg aacttaataa acgtctccag 120
caaacagaga gggaacggga ccttctggaa aagaaattgg ccaaggcaca gtgcgagcag 180
tcccacctca tgagagagca tgaggatgtc caggagcgaa cgacgcttcg ctatgaggaa 240
cgcatcacag agctccacag cgtcattgcg gagctcaaca agaagataga ccgtctgcaa 300
ggcaccacca tcagggagga agatgagtac tcagaactgc gatcagaact cagccagagc 360
caacacgagg tcaacgagga ctctcgaagc atggaccaag accagacctc tgtctctatc 420
cccgaaaacc agtctaccat ggttactgct gacatggaca actgcagtga cctgaactca 480
gaactgcaga gggtgctgac agggctggag aatgttgtct gcggcaggaa gaagagcagc 540
tgcagcctct ccgtggccga ggtggacagg cacattgagc agctcaccac agccagcgag 600
cactgtgacc tggctattaa gacagtcgag gagattgagg gggtgcttgg ccgggacctg 660
tatcccaacc tggctgaaga gaggtctcgg tgggagaagg agctggctgg gctgagggaa 720
gagaatgaga gcctgactgc catgctgtgc agcaaagagg aagaactgaa ccggactaag 780
gccaccatga atgccatccg ggaagagcgg gaccggctcc ggaggcgggt cagagagctt 840
caaactcgac tacagagcgt gcaggccaca ggtccctcca gccctggccg cctcacttcc 900
accaaccgcc cgattaaccc cagcactggg gagctgagca caagcagcag cagcaatgac 960
attcccatcg ccaagattgc tgagagggtg aagctatcaa agacaaggtc cgaatcgtca 1020
tcatctgatc ggccagtcct gggctcagaa atcagtagca taggggtatc cagcagtgtg 1080
gctgaacacc tggcccactc acttcaggac tgctccaata tccaagagat tttccaaaca 1140
ctctactcac acggatctgc catctcagaa agcaagatta gagagtttga ggtggaaaca 1200
gaacggctga atagccggat tgagcacctc aaatcccaaa atgacctcct gaccataacc 1260
ttggaggaat gtaaaagcaa tgctgagagg atgagcatgc tggtgggaaa atacgaatcc 1320
aatgccacag cgctgaggct ggccttgcag tacagcgagc agtgcatcga agcctacgaa 1380
ctcctcctgg cgctggcaga gagtgagcag agcctcatcc tggggcagtt ccgagcggcg 1440
ggcgtggggt cctcccctgg agaccagtcg ggggatgaaa acatcactca gatgctcaag 1500
cgagctcatg actgccggaa gacagctgag aacgctgcca aggccctgct catgaagctg 1560
gacggcagct gtgggggagc ctttgccgtg gccggctgca gcgtgcagcc ctgggagagc 1620
ctttcctcca acagccacac cagcacaacc agctccacag ccagtagttg cgacaccgag 1680
ttcactaaag aagacgagca gaggctgaag gattatatcc agcagctcaa gaatgacagg 1740
gctgcggtca agctgaccat gctggagctg gaaagcatcc acatcgatcc tctcagctat 1800
gacgtcaagc ctcggggaga cagccagagg ctggatctgg aaaacgcagt gcttatgcag 1860
gagctcatgg ccatgaagga ggagatggcc gagttgaagg cccagctcta cctactggag 1920
aaagagaaga aggccctgga gctgaagctg agcacgcggg aggcccagga gcaggcctac 1980
ctggtgcaca ttgagcacct gaagtccgag gtggaggagc agaaggagca gcggatgcga 2040
tccctcagct ccaccagcag cggcagcaaa gataaacctg gcaaggagtg tgctgatgct 2100
gcctccccag ctctgtccct agctgaactc aggacaacgt gcagcgagaa tgagctggct 2160
gcggagttca ccaacgccat tcgtcgagaa aagaagttga aggccagagt tcaagagctg 2220
gtgagtgcct tggagagact caccaagagc agtgaaatcc gacatcagca atctgcagag 2280
ttcgtgaatg atctaaagcg ggccaacagc aacctggtgg ctgcctatga gaaagcaaag 2340
aaaaagcatc aaaacaaact gaagaagtta gagtcgcaga tgatggccat ggtggagaga 2400
catgagaccc aagtgaggat gctcaagcaa agaatagctc tgctagagga ggagaactcc 2460
aggccacaca ccaatgaaac ttcgctt 2487
<210> 183
<211> 2253
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> EZH2, isoform 1
<400> 183
atgggccaga ctgggaagaa atctgagaag ggaccagttt gttggcggaa gcgtgtaaaa 60
tcagagtaca tgcgactgag acagctcaag aggttcagac gagctgatga agtaaagagt 120
atgtttagtt ccaatcgtca gaaaattttg gaaagaacgg aaatcttaaa ccaagaatgg 180
aaacagcgaa ggatacagcc tgtgcacatc ctgacttctg tgagctcatt gcgcgggact 240
agggagtgtt cggtgaccag tgacttggat tttccaacac aagtcatccc attaaagact 300
ctgaatgcag ttgcttcagt acccataatg tattcttggt ctcccctaca gcagaatttt 360
atggtggaag atgaaactgt tttacataac attccttata tgggagatga agttttagat 420
caggatggta ctttcattga agaactaata aaaaattatg atgggaaagt acacggggat 480
agagaatgtg ggtttataaa tgatgaaatt tttgtggagt tggtgaatgc ccttggtcaa 540
tataatgatg atgacgatga tgatgatgga gacgatcctg aagaaagaga agaaaagcag 600
aaagatctgg aggatcaccg agatgataaa gaaagccgcc cacctcggaa atttccttct 660
gataaaattt ttgaagccat ttcctcaatg tttccagata agggcacagc agaagaacta 720
aaggaaaaat ataaagaact caccgaacag cagctcccag gcgcacttcc tcctgaatgt 780
acccccaaca tagatggacc aaatgctaaa tctgttcaga gagagcaaag cttacactcc 840
tttcatacgc ttttctgtag gcgatgtttt aaatatgact gcttcctaca tcgtaagtgc 900
aattattctt ttcatgcaac acccaacact tataagcgga agaacacaga aacagctcta 960
gacaacaaac cttgtggacc acagtgttac cagcatttgg agggagcaaa ggagtttgct 1020
gctgctctca ccgctgagcg gataaagacc ccaccaaaac gtccaggagg ccgcagaaga 1080
ggacggcttc ccaataacag tagcaggccc agcaccccca ccattaatgt gctggaatca 1140
aaggatacag acagtgatag ggaagcaggg actgaaacgg ggggagagaa caatgataaa 1200
gaagaagaag agaagaaaga tgaaacttcg agctcctctg aagcaaattc tcggtgtcaa 1260
acaccaataa agatgaagcc aaatattgaa cctcctgaga atgtggagtg gagtggtgct 1320
gaagcctcaa tgtttagagt cctcattggc acttactatg acaatttctg tgccattgct 1380
aggttaattg ggaccaaaac atgtagacag gtgtatgagt ttagagtcaa agaatctagc 1440
atcatagctc cagctcccgc tgaggatgtg gatactcctc caaggaaaaa gaagaggaaa 1500
caccggttgt gggctgcaca ctgcagaaag atacagctga aaaaggacgg ctcctctaac 1560
catgtttaca actatcaacc ctgtgatcat ccacggcagc cttgtgacag ttcgtgccct 1620
tgtgtgatag cacaaaattt ttgtgaaaag ttttgtcaat gtagttcaga gtgtcaaaac 1680
cgctttccgg gatgccgctg caaagcacag tgcaacacca agcagtgccc gtgctacctg 1740
gctgtccgag agtgtgaccc tgacctctgt cttacttgtg gagccgctga ccattgggac 1800
agtaaaaatg tgtcctgcaa gaactgcagt attcagcggg gctccaaaaa gcatctattg 1860
ctggcaccat ctgacgtggc aggctggggg atttttatca aagatcctgt gcagaaaaat 1920
gaattcatct cagaatactg tggagagatt atttctcaag atgaagctga cagaagaggg 1980
aaagtgtatg ataaatacat gtgcagcttt ctgttcaact tgaacaatga ttttgtggtg 2040
gatgcaaccc gcaagggtaa caaaattcgt tttgcaaatc attcggtaaa tccaaactgc 2100
tatgcaaaag ttatgatggt taacggtgat cacaggatag gtatttttgc caagagagcc 2160
atccagactg gcgaagagct gttttttgat tacagataca gccaggctga tgccctgaag 2220
tatgtcggca tcgaaagaga aatggaaatc cct 2253
<210> 184
<211> 1053
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> NIPP1/PPP1R8, isoform alpha
<400> 184
atggcggcag ccgcgaactc cggctctagc ctcccgctgt tcgactgccc aacctgggca 60
ggtaagcccc ctcccggttt acatctggat gtagtcaaag gagacaaact aattgagaaa 120
ctgattattg atgagaagaa gtattactta tttgggagaa accctgattt gtgtgacttt 180
accattgacc accagtcttg ctctcgggtc catgctgcac ttgtctacca caagcatctg 240
aagagagttt tcctgataga tctcaacagt acacacggca ctttcttggg tcacattcgg 300
ttggaacctc acaagcctca gcaaattccc atcgattcca cggtctcatt tggcgcatcc 360
acaagggcat acactctgcg cgagaagcct cagacattgc catcggctgt gaaaggagat 420
gagaagatgg gtggagagga tgatgaactc aagggcttac tggggcttcc agaggaggaa 480
actgagcttg ataacctgac agagttcaac actgcccaca acaagcggat ttctaccctt 540
accattgagg agggaaatct ggacattcaa agaccaaaga ggaagaggaa gaactcacgg 600
gtgacattca gtgaggatga tgagatcatc aacccagagg atgtggatcc ctcagttggt 660
cgattcagga acatggtgca aactgcagtg gtcccagtca agaagaagcg tgtggagggc 720
cctggctccc tgggcctgga ggaatcaggg agcaggcgca tgcagaactt tgccttcagc 780
ggaggactct acgggggcct gccccccaca cacagtgaag caggctccca gccacatggc 840
atccatggga cagcactcat cggtggcttg cccatgccat acccaaacct tgcccctgat 900
gtggacttga ctcctgttgt gccgtcagca gtgaacatga accctgcacc aaaccctgca 960
gtctataacc ctgaagctgt aaatgaaccc aagaagaaga aatatgcaaa agaggcttgg 1020
ccaggcaaga agcccacacc ttccttgctg att 1053
<210> 185
<211> 990
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> PPP1CA, isoform 1
<400> 185
atgtccgaca gcgagaagct caacctggac tcgatcatcg ggcgcctgct ggaagtgcag 60
ggctcgcggc ctggcaagaa tgtacagctg acagagaacg agatccgcgg tctgtgcctg 120
aaatcccggg agatttttct gagccagccc attcttctgg agctggaggc acccctcaag 180
atctgcggtg acatacacgg ccagtactac gaccttctgc gactatttga gtatggcggt 240
ttccctcccg agagcaacta cctctttctg ggggactatg tggacagggg caagcagtcc 300
ttggagacca tctgcctgct gctggcctat aagatcaagt accccgagaa cttcttcctg 360
ctccgtggga accacgagtg tgccagcatc aaccgcatct atggtttcta cgatgagtgc 420
aagagacgct acaacatcaa actgtggaaa accttcactg actgcttcaa ctgcctgccc 480
atcgcggcca tagtggacga aaagatcttc tgctgccacg gaggcctgtc cccggacctg 540
cagtctatgg agcagattcg gcggatcatg cggcccacag atgtgcctga ccagggcctg 600
ctgtgtgacc tgctgtggtc tgaccctgac aaggacgtgc agggctgggg cgagaacgac 660
cgtggcgtct cttttacctt tggagccgag gtggtggcca agttcctcca caagcacgac 720
ttggacctca tctgccgagc acaccaggtg gtagaagacg gctacgagtt ctttgccaag 780
cggcagctgg tgacactttt ctcagctccc aactactgtg gcgagtttga caatgctggc 840
gccatgatga gtgtggacga gaccctcatg tgctctttcc agatcctcaa gcccgccgac 900
aagaacaagg ggaagtacgg gcagttcagt ggcctgaacc ctggaggccg acccatcacc 960
ccaccccgca attccgccaa agccaagaaa 990
<210> 186
<211> 1818
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TAK1/MAP3K7, isoform 1B
<400> 186
atgtctacag cctctgccgc ctcctcctcc tcctcgtctt cggccggtga gatgatcgaa 60
gccccttccc aggtcctcaa ctttgaagag atcgactaca aggagatcga ggtggaagag 120
gttgttggaa gaggagcctt tggagttgtt tgcaaagcta agtggagagc aaaagatgtt 180
gctattaaac aaatagaaag tgaatctgag aggaaagcgt ttattgtaga gcttcggcag 240
ttatcccgtg tgaaccatcc taatattgta aagctttatg gagcctgctt gaatccagtg 300
tgtcttgtga tggaatatgc tgaagggggc tctttatata atgtgctgca tggtgctgaa 360
ccattgccat attatactgc tgcccacgca atgagttggt gtttacagtg ttcccaagga 420
gtggcttatc ttcacagcat gcaacccaaa gcgctaattc acagggacct gaaaccacca 480
aacttactgc tggttgcagg ggggacagtt ctaaaaattt gtgattttgg tacagcctgt 540
gacattcaga cacacatgac caataacaag gggagtgctg cttggatggc acctgaagtt 600
tttgaaggta gtaattacag tgaaaaatgt gacgtcttca gctggggtat tattctttgg 660
gaagtgataa cgcgtcggaa accctttgat gagattggtg gcccagcttt ccgaatcatg 720
tgggctgttc ataatggtac tcgaccacca ctgataaaaa atttacctaa gcccattgag 780
agcctgatga ctcgttgttg gtctaaagat ccttcccagc gcccttcaat ggaggaaatt 840
gtgaaaataa tgactcactt gatgcggtac tttccaggag cagatgagcc attacagtat 900
ccttgtcagt attcagatga aggacagagc aactctgcca ccagtacagg ctcattcatg 960
gacattgctt ctacaaatac gagtaacaaa agtgacacta atatggagca agttcctgcc 1020
acaaatgata ctattaagcg cttagaatca aaattgttga aaaatcaggc aaagcaacag 1080
agtgaatctg gacgtttaag cttgggagcc tcccgtggga gcagtgtgga gagcttgccc 1140
ccaacctctg agggcaagag gatgagtgct gacatgtctg aaatagaagc taggatcgcc 1200
gcaaccacag cctattccaa gcctaaacgg ggccaccgta aaactgcttc atttggcaac 1260
attctggatg tccctgagat cgtcatatca ggcaacggac agccaagacg tagatccatc 1320
caagacttga ctgtaactgg aacagaacct ggtcaggtga gcagtaggtc atccagtccc 1380
agtgtcagaa tgattactac ctcaggacca acctcagaaa agccaactcg aagtcatcca 1440
tggacccctg atgattccac agataccaat ggatcagata actccatccc aatggcttat 1500
cttacactgg atcaccaact acagcctcta gcaccgtgcc caaactccaa agaatctatg 1560
gcagtgtttg aacagcattg taaaatggca caagaatata tgaaagttca aacagaaatt 1620
gcattgttat tacagagaaa gcaagaacta gttgcagaac tggaccagga tgaaaaggac 1680
cagcaaaata catctcgcct ggtacaggaa cataaaaagc ttttagatga aaacaaaagc 1740
ctttctactt actaccagca atgcaaaaaa caactagagg tcatcagaag tcagcagcag 1800
aaacgacaag gcacttca 1818
<210> 187
<211> 204
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> CMV promoter
<400> 187
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 188
<211> 1212
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Caspase-1, isoform alpha
<400> 188
atggccgaca aggtcctgaa ggagaagaga aagctgttta tccgttccat gggtgaaggt 60
acaataaatg gcttactgga tgaattatta cagacaaggg tgctgaacaa ggaagagatg 120
gagaaagtaa aacgtgaaaa tgctacagtt atggataaga cccgagcttt gattgactcc 180
gttattccga aaggggcaca ggcatgccaa atttgcatca catacatttg tgaagaagac 240
agttacctgg cagggacgct gggactctca gcagatcaaa catctggaaa ttaccttaat 300
atgcaagact ctcaaggagt actttcttcc tttccagctc ctcaggcagt gcaggacaac 360
ccagctatgc ccacatcctc aggctcagaa gggaatgtca agctttgctc cctagaagaa 420
gctcaaagga tatggaaaca aaagtcggca gagatttatc caataatgga caagtcaagc 480
cgcacacgtc ttgctctcat tatctgcaat gaagaatttg acagtattcc tagaagaact 540
ggagctgagg ttgacatcac aggcatgaca atgctgctac aaaatctggg gtacagcgta 600
gatgtgaaaa aaaatctcac tgcttcggac atgactacag agctggaggc atttgcacac 660
cgcccagagc acaagacctc tgacagcacg ttcctggtgt tcatgtctca tggtattcgg 720
gaaggcattt gtgggaagaa acactctgag caagtcccag atatactaca actcaatgca 780
atctttaaca tgttgaatac caagaactgc ccaagtttga aggacaaacc gaaggtgatc 840
atcatccagg cctgccgtgg tgacagccct ggtgtggtgt ggtttaaaga ttcagtagga 900
gtttctggaa acctatcttt accaactaca gaagagtttg aggatgatgc tattaagaaa 960
gcccacatag agaaggattt tatcgctttc tgctcttcca caccagataa tgtttcttgg 1020
agacatccca caatgggctc tgtttttatt ggaagactca ttgaacatat gcaagaatat 1080
gcctgttcct gtgatgtgga ggaaattttc cgcaaggttc gattttcatt tgagcagcca 1140
gatggtagag cgcagatgcc caccactgaa agagtgactt tgacaagatg tttctacctc 1200
ttcccaggac at 1212
<210> 189
<211> 885
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> cyclin-D1/CCND1
<400> 189
atggaacacc agctcctgtg ctgcgaagtg gaaaccatcc gccgcgcgta ccccgatgcc 60
aacctcctca acgaccgggt gctgcgggcc atgctgaagg cggaggagac ctgcgcgccc 120
tcggtgtcct acttcaaatg tgtgcagaag gaggtcctgc cgtccatgcg gaagatcgtc 180
gccacctgga tgctggaggt ctgcgaggaa cagaagtgcg aggaggaggt cttcccgctg 240
gccatgaact acctggaccg cttcctgtcg ctggagcccg tgaaaaagag ccgcctgcag 300
ctgctggggg ccacttgcat gttcgtggcc tctaagatga aggagaccat ccccctgacg 360
gccgagaagc tgtgcatcta caccgacaac tccatccggc ccgaggagct gctgcaaatg 420
gagctgctcc tggtgaacaa gctcaagtgg aacctggccg caatgacccc gcacgatttc 480
attgaacact tcctctccaa aatgccagag gcggaggaga acaaacagat catccgcaaa 540
cacgcgcaga ccttcgttgc cctctgtgcc acagatgtga agttcatttc caatccgccc 600
tccatggtgg cagcggggag cgtggtggcc gcagtgcaag gcctgaacct gaggagcccc 660
aacaacttcc tgtcctacta ccgcctcaca cgcttcctct ccagagtgat caagtgtgac 720
ccggactgcc tccgggcctg ccaggagcag atcgaagccc tgctggagtc aagcctgcgc 780
caggcccagc agaacatgga ccccaaggcc gccgaggagg aggaagagga ggaggaggag 840
gtggacctgg cttgcacacc caccgacgtg cgggacgtgg acatc 885
<210> 190
<211> 996
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> A2b receptor (ADORA2B)
<400> 190
atgctgctgg agacacagga cgcgctgtac gtggcgctgg agctggtcat cgccgcgctt 60
tcggtggcgg gcaacgtgct ggtgtgcgcc gcggtgggca cggcgaacac tctgcagacg 120
cccaccaact acttcctggt gtccctggct gcggccgacg tggccgtggg gctcttcgcc 180
atcccctttg ccatcaccat cagcctgggc ttctgcactg acttctacgg ctgcctcttc 240
ctcgcctgct tcgtgctggt gctcacgcag agctccatct tcagccttct ggccgtggca 300
gtcgacagat acctggccat ctgtgtcccg ctcaggtata aaagtttggt cacggggacc 360
cgagcaagag gggtcattgc tgtcctctgg gtccttgcct ttggcatcgg attgactcca 420
ttcctggggt ggaacagtaa agacagtgcc accaacaact gcacagaacc ctgggatgga 480
accacgaatg aaagctgctg ccttgtgaag tgtctctttg agaatgtggt ccccatgagc 540
tacatggtat atttcaattt ctttgggtgt gttctgcccc cactgcttat aatgctggtg 600
atctacatta agatcttcct ggtggcctgc aggcagcttc agcgcactga gctgatggac 660
cactcgagga ccaccctcca gcgggagatc catgcagcca agtcactggc catgattgtg 720
gggatttttg ccctgtgctg gttacctgtg catgctgtta actgtgtcac tcttttccag 780
ccagctcagg gtaaaaataa gcccaagtgg gcaatgaata tggccattct tctgtcacat 840
gccaattcag ttgtcaatcc cattgtctat gcttaccgga accgagactt ccgctacact 900
tttcacaaaa ttatctccag gtatcttctc tgccaagcag atgtcaagag tgggaatggt 960
caggctgggg tacagcctgc tctcggtgtg ggccta 996
<210> 191
<211> 1242
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HHLA2, isoform 1
<400> 191
atgaaggcac agacagcact gtctttcttc ctcattctca taacatctct gagtggatct 60
caaggcatat tccctttggc tttcttcatt tatgttccta tgaatgaaca aatcgtcatt 120
ggaagacttg atgaagatat aattctccct tcttcatttg agaggggatc cgaagtcgta 180
atacactgga agtatcaaga tagctataag gttcacagtt actacaaagg cagtgaccat 240
ttggaaagcc aagatcccag atatgcaaac aggacatccc ttttctataa tgagattcaa 300
aatgggaatg cgtcgctatt tttcagaaga gtaagccttc tggacgaagg aatttacacc 360
tgctatgtag gaacagcaat tcaagtgatt acaaacaaag tggtgctaaa ggtgggagtt 420
tttctcacac ccgtgatgaa gtatgaaaag aggaacacaa acagcttctt aatatgcagc 480
gtgttaagtg tttatcctcg tccaattatc acgtggaaaa tggacaacac acctatctct 540
gaaaacaaca tggaagaaac agggtctttg gattcttttt ctattaacag cccactgaat 600
attacaggat caaattcatc ttatgaatgt acaattgaaa attcactgct gaagcaaaca 660
tggacagggc gctggacgat gaaagatggc cttcataaaa tgcaaagtga acacgtttca 720
ctctcatgtc aacctgtaaa tgattatttt tcaccaaacc aagacttcaa agttacttgg 780
tccagaatga aaagtgggac tttctctgtc ctggcttact atctgagctc ctcacaaaat 840
acaattatca atgaatcccg attctcatgg aacaaagagc tgataaacca gagtgacttc 900
tctatgaatt tgatggatct taatctttca gacagtgggg aatatttatg caatatttct 960
tcggatgaat atactttact taccatccac acagtgcatg tagaaccgag ccaagaaaca 1020
gcttcccata acaaaggctt atggattttg gtgccctctg cgattttggc agcttttctg 1080
ctgatttgga gcgtaaaatg ttgcagagcc cagctagaag ccaggaggag cagacaccct 1140
gctgatggag cccaacaaga aagatgttgt gtccctcctg gtgagcgctg tcccagtgca 1200
cccgataatg gcgaagaaaa tgtgcctctt tcaggaaaag ta 1242
<210> 192
<211> 1128
<212> DNA
<213> Herpes simplex
<220>
<223> herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK)
<400> 192
atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatgtcg ggggggaggc tgggagttca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggtggga ggattgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080
atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaac 1128
<210> 193
<211> 1173
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform 1
<400> 193
atgccgccct ccgggctgcg gctgctgccg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60
ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120
gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180
agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240
tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300
gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360
tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420
cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480
aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540
tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600
accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660
gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720
accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780
atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840
gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900
gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960
ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020
gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080
ctggagccgc tgcccatcgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140
aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173
<210> 194
<211> 699
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human VEGF
<400> 194
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 480
aagtcctgga gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa tgccctggag cctccctggc 540
ccccatccct gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt tgtttgtaca agatccgcag 600
acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta 660
aacgaacgta cttgcagatg tgacaagccg aggcggtga 699
<210> 195
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform 1 shRNA target 1
<400> 195
gaaacccaca acgaaatct 19
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 2
<400> 196
gtacacacag catatatat 19
<210> 197
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 3
<400> 197
ctgctgaggc tcaagttaa 19
<210> 198
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 4
<400> 198
gtggagctgt accagaaat 19
<210> 199
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 5
<400> 199
gactcgccag agtggttat 19
<210> 200
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 6
<400> 200
gagccgtgga ggggaaatt 19
<210> 201
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 7
<400> 201
cctgtgacag cagggataa 19
<210> 202
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 8
<400> 202
gccctggaca ccaactatt 19
<210> 203
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 9
<400> 203
ccctgtacaa ccagcataa 19
<210> 204
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human VEGF shRNA target 1
<400> 204
gagatcgagt acatcttca 19
<210> 205
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human VEGF shRNA target 2
<400> 205
gcagattatg cggatcaaa 19
<210> 206
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human VEGF shRNA target 3
<400> 206
gatagagcaa gacaagaaa 19
<210> 207
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human VEGF shRNA target 4
<400> 207
ggagaaagca tttgtttgt 19
<210> 208
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human VEGF shRNA target 5
<400> 208
gatccgcaga cgtgtaaat 19
<210> 209
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human VEGF shRNA target 6
<400> 209
gcgaggcagc ttgagttaa 19
<210> 210
<211> 3888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARI-134
<400> 210
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac catatttgca tgtcgctatg 720
tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 780
gtatgagacc actccctagg ccacactgta tggactattc tagagatagt ccatacagtg 840
tggctttttt cgacagatct ggcgcgccat agtggccagc ggccgcaggt aagccagccc 900
aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag agtagcctgc atccagggac 960
aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt cctcaggtct gcccgggtgg 1020
catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc 1080
accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat 1140
aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc ccaagttaac ttgtttattg 1200
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 1260
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga 1320
tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga 1380
tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta 1440
caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt 1500
tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta 1560
tatatcttgt ggaaaggacg aaactaggcc gactacaagc gaattatcta gagtaattcg 1620
cttgtagtcg gcttttttcg agtagctaga gaattcatgg taatagcgat gactaatacg 1680
tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg 1740
ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt 1800
actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct 1860
attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc 1920
ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta 1980
tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag acccagcttt cttgtacaaa 2040
gttggcatta taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt 2100
caaaataaaa tcattatttg ccatccagct gatatcccct atagtgagtc gtattacatg 2160
gtcatagctg tttcctggca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 2220
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 2280
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 2340
gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 2400
atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 2460
agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 2520
cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 2580
gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 2640
attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 2700
ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt 2760
ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg 2820
aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc 2880
tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 2940
gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 3000
tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 3060
aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat cagaattggt taattggttg 3120
taacactggc agagcattac gctgacttga cgggacggcg caagctcatg accaaaatcc 3180
cttaacgtga gttacgcgtc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3240
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3300
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3360
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 3420
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3480
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3540
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3600
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 3660
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3720
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3780
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3840
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgct 3888
<210> 211
<211> 3888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARI-135
<400> 211
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
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aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 4020
caatgtatct tatcatgtct ggatccagtc gactgaattg gttcctttaa agcctgcttt 4080
tttgtacaaa gttggcatta taaaaaagca ttgctcatca atttgttgca acgaacaggt 4140
cactatcagt caaaataaaa tcattatttg gggcccgagc ttaagactgg ccgtcgtttt 4200
acaacgtcgt gactgggaaa acatccatgc tagcgttaac gcgagagtag ggaactgcca 4260
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<211> 22
<212> DNA
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ccaatgctct gcttaactcc tg 22
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
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<210> 222
<211> 21
<212> DNA
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<210> 223
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<212> DNA
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<223> scFv-3 primer
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<210> 224
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pJW168 plasmid
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<210> 225
<211> 3736
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pATIU6 plasmid
<400> 225
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60
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agagagataa ttagaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga 240
cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac 300
tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg 360
aaaggacgaa actagttttt tctcgagtag ctagagaatt cttaagccag ccccgacacc 420
cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 480
aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 540
gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 600
tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gaagcttcgc ggaaccccta 660
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 720
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 780
ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 840
aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 900
acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 960
ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1020
gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1080
atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1140
acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1200
tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1260
ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1320
aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1380
aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1440
ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1500
atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1560
aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taaaagcttc 1620
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 1680
aaaggatcta ggtgaagatc ctttatggtg aaggatgcgc cacaggatac tggcgcgcat 1740
acacagcaca tctctttgca ggaaaaaaac gctatgaaaa atgttggttt tatcggctgg 1800
cgcggaatgg tcggctctgt tctcatgcaa cgcatggtag aggagcgcga tttcgacgct 1860
attcgccctg ttttcttttc tacctcccag tttggacagg cggcgcccac cttcggcgac 1920
acctccaccg gcacgctaca ggacgctttt gatctggatg cgctaaaagc gctcgatatc 1980
atcgtgacct gccagggcgg cgattatacc aacgaaattt atccaaagct gcgcgaaagc 2040
ggatggcagg gttactggat tgatgcggct tctacgctgc gcatgaaaga tgatgccatt 2100
attattctcg acccggtcaa ccaggacgtg attaccgacg gcctgaacaa tggcgtgaag 2160
acctttgtgg gcggtaactg taccgttagc ctgatgttga tgtcgctggg cggtctcttt 2220
gcccataatc tcgttgactg ggtatccgtc gcgacctatc aggccgcctc cggcggcggc 2280
gcgcgccata tgcgcgagct gttaacccag atgggtcagt tgtatggcca tgtcgccgat 2340
gaactggcga cgccgtcttc cgcaattctt gatattgaac gcaaagttac ggcattgacc 2400
cgcagcggcg agctgccggt tgataacttt ggcgtaccgc tggcgggaag cctgatcccc 2460
tggatcgaca aacagctcga taacggccag agccgcgaag agtggaaagg ccaggcggaa 2520
accaacaaga ttctcaatac tgcctctgtg attccggttg atggtttgtg tgtgcgcgtc 2580
ggcgcgctgc gctgtcacag ccaggcgttc accatcaagc tgaaaaaaga ggtatccatt 2640
ccgacggtgg aagaactgct ggcggcacat aatccgtggg cgaaagtggt gccgaacgat 2700
cgtgatatca ctatgcgcga attaaccccg gcggcggtga ccggcacgtt gactacgccg 2760
gttggtcgtc tgcgtaagct gaacatgggg ccagagttct tgtcggcgtt taccgtaggc 2820
gaccagttgt tatggggcgc cgccgagccg ctgcgtcgaa tgctgcgcca gttggcgtag 2880
ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 2940
ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 3000
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 3060
ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag 3120
tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 3180
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 3240
actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 3300
cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 3360
gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 3420
tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 3480
ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 3540
ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 3600
cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 3660
cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 3720
gcgaggaagc ggaaga 3736
<210> 226
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APR-001 Kan PrimerF
<400> 226
aaaaaagctt gcagctctgg cccgtg 26
<210> 227
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APR-002 Kan PrimerR
<400> 227
aaaaaagctt ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatga 38
<210> 228
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APR-003 pATI ori T148CF
<400> 228
acactagaag gacagtattt ggtatctg 28
<210> 229
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APR-004 pATI ori T148CR
<400> 229
agccgtagtt aggccacc 18
<210> 230
<211> 3203
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSL0147 plasmid
<400> 230
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctc ggcgcgccat tgggatggaa cgcgttatcg gcaatctgga 2280
ggcaaagttt aatgataatt ttgcaaaaat aatgcgcgga ataatgatgc ataaagcggc 2340
tatttcgccg cctaagaaaa agatcggggg aagtgaaaaa ttttctaaag ttcgaaattc 2400
aggtgccgat acaagggtta cggtgagaaa ccgtgggcaa cagcccaata acatcaagtt 2460
gtaattgata aggaaaagat catgggctag cctcaataag cttcttgcct ttctgcagac 2520
caaggaccca gattatgttg cagcaggccg gtacctccgt tctggcgcag gcgaaccagg 2580
ttccgcaaaa cgtcctctct ttactgcgtt aatccggcga ttgattcacc gacacgtggt 2640
acacaatcaa ggcagcgaaa gctgcctttt ttaattccgg agcctgtgta atgaaagaaa 2700
tcaccgtcac tgaacctgcc tttgtcaccc gcttttcctg ttctggctcg gcctgtcgcg 2760
accactgttg taagggctgg aaagttccat cccaatacgc gtcaattcac tggccgtcgt 2820
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 2880
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 2940
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 3000
cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 3060
aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 3120
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 3180
accgtcatca ccgaaacgcg cga 3203
<210> 231
<211> 3196
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSL0148 plasmid
<400> 231
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctc ggcgcgccat tgggatggaa cttccagacg acaagagtat 2280
cgcctttatt tacatacttt aacgctcgtt tcaggccggg gcggtttgca atcttgccac 2340
tgatacggtc ctcaaaaatg cggtcacaat ttgcactagt aagcgcatta cgctgtaaat 2400
cgatattttg gtcaattgtt gacacccgaa tatacccaat agtagccatg attttctcct 2460
ttacatcaga taaggaagaa ttttagtcgc ttttctcatg gaggattgct gctagcctca 2520
ataagcttct tgcctttctg cagaccaagg acccagatta tgtatggaat gtatggctgt 2580
aaatgatatt tcctacgggc gagaagctga aatatggccg cgggattatt ctatgcttgc 2640
tcgtcgagtt caatttctac gttttaatga tatccctgtt cgattggtga gtaataatgc 2700
ccggataatc acaggctaca ttgcgaagtt taatccgaag gaaaatttga ttctggcttc 2760
ggataaacct aaaggagttc catcccaata cgcgtcaatt cactggccgt cgttttacaa 2820
cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 2880
ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 2940
agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 3000
tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 3060
ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 3120
gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 3180
tcaccgaaac gcgcga 3196
<210> 232
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flic-1 primer
<400> 232
cgttatcggc aatctggagg c 21
<210> 233
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flic-2 primer
<400> 233
ccagccctta caacagtggt c 21
<210> 234
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flic-3 primer
<400> 234
gtctgtcaac aactggtcta acgg 24
<210> 235
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flic-4 primer
<400> 235
agacggtcct catccagata agg 23
<210> 236
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fljb-1 primer sequence
<400> 236
ttccagacga caagagtatc gc 22
<210> 237
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fljb-2 primer
<400> 237
cctttaggtt tatccgaagc cagaatc 27
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fljb-3 primer
<400> 238
caccaggttt ttcacgctgc 20
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fljb-4 primer
<400> 239
acacgcattt acgcctgtcg 20
<210> 240
<211> 1518
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cytoLLO ORF
<400> 240
atgaaagacg cctccgcgtt taacaaggag aactccatca gctccatggc cccgcccgct 60
tccccgccgg cgagccctaa aaccccgatc gagaaaaagc acgccgacga gattgacaaa 120
tatattcaag gtttagacta caataagaac aacgtgctgg tgtatcacgg cgatgcggtg 180
accaatgttc cgccgcgcaa gggctacaaa gatggtaacg aatatatcgt ggttgagaaa 240
aagaaaaaaa gcatcaacca gaacaacgcc gatatccaag ttgtgaacgc catcagctct 300
ttaacctatc cgggcgcgct ggtgaaagcc aacagcgaac tggtggaaaa ccagcccgat 360
gtgctgccgg tgaaacgcga ttctttaacg ctgagcattg atttaccggg catgacgaac 420
caagataaca aaatcgtggt gaagaacgcg accaagtcca acgtgaacaa cgcggtgaac 480
acgctggtgg aacgctggaa cgaaaaatac gcccaagctt acccgaacgt gagcgcgaag 540
attgactacg acgacgaaat ggcctacagc gagagccagc tgatcgcgaa attcggcacc 600
gcgttcaaag cggtgaacaa ctctttaaac gtgaactttg gcgcgatcag cgaaggcaaa 660
atgcaagaag aggtgatcag ctttaaacaa atctattata acgtgaatgt taacgagccg 720
acgcgtccga gccgcttttt cggcaaagcg gtgacgaagg aacagctgca agcgcttggc 780
gtgaacgcgg aaaaccctcc ggcctatatt tccagcgtgg cgtatggccg ccaagtttat 840
ctgaagctga gcacgaacag ccacagcacc aaagttaagg cggcctttga tgcggcggtg 900
agcggcaaaa gcgttagcgg cgacgttgag ctgacgaaca tcatcaagaa cagctccttt 960
aaagcggtga tctatggcgg tagcgcgaaa gacgaagtgc agatcatcga cggcaattta 1020
ggtgatctgc gcgatatttt aaaaaagggc gccaccttca accgtgagac gcccggtgtg 1080
ccgatcgcct acaccaccaa ctttttaaag gataacgagc tggccgtgat caaaaacaat 1140
tccgaatata tcgaaaccac gagcaaggcg tataccgatg gcaagatcaa cattgaccac 1200
agcggtggct atgtggcgca gttcaacatc agctgggatg aagtgaacta tgatccggag 1260
ggcaacgaga tcgtgcagca caagaactgg tccgagaaca acaaatccaa gctggcgcat 1320
ttcaccagca gcatctatct gccgggcaac gcgcgcaaca ttaatgtgta cgcgaaagag 1380
tgcacgggtc ttgcgtggga atggtggcgc accgtgatcg atgatcgcaa tttaccgctg 1440
gtgaaaaacc gcaacatctc catctggggc accactttat acccgaaata ttccaacaaa 1500
gttgataacc ctattgag 1518
<210> 241
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LLO promoter
<400> 241
attatgtctt gacatgtagt gagtgggctg gtataatgca gcaag 45
<210> 242
<211> 1176
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asd Gene ORF
<400> 242
ctacgccaac tggcgcagca ttcgacgcag cggctcggcg gcgccccata acaactggtc 60
gcctacggta aacgccgaca agaactctgg ccccatgttc agcttacgca gacgaccaac 120
cggcgtagtc aacgtgccgg tcaccgccgc cggggttaat tcgcgcatag tgatatcacg 180
atcgttcggc accactttcg cccacggatt atgtgccgcc agcagttctt ccaccgtcgg 240
aatggatacc tcttttttca gcttgatggt gaacgcctgg ctgtgacagc gcagcgcgcc 300
gacgcgcaca cacaaaccat caaccggaat cacagaggca gtattgagaa tcttgttggt 360
ttccgcctgg cctttccact cttcgcggct ctggccgtta tcgagctgtt tgtcgatcca 420
ggggatcagg cttcccgcca gcggtacgcc aaagttatca accggcagct cgccgctgcg 480
ggtcaatgcc gtaactttgc gttcaatatc aagaattgcg gaagacggcg tcgccagttc 540
atcggcgaca tggccataca actgacccat ctgggttaac agctcgcgca tatggcgcgc 600
gccgccgccg gaggcggcct gataggtcgc gacggatacc cagtcaacga gattatgggc 660
aaagagaccg cccagcgaca tcaacatcag gctaacggta cagttaccgc ccacaaaggt 720
cttcacgcca ttgttcaggc cgtcggtaat cacgtcctgg ttgaccgggt cgagaataat 780
aatggcatca tctttcatgc gcagcgtaga agccgcatca atccagtaac cctgccatcc 840
gctttcgcgc agctttggat aaatttcgtt ggtataatcg ccgccctggc aggtcacgat 900
gatatcgagc gcttttagcg catccagatc aaaagcgtcc tgtagcgtgc cggtggaggt 960
gtcgccgaag gtgggcgccg cctgtccaaa ctgggaggta gaaaagaaaa cagggcgaat 1020
agcgtcgaaa tcgcgctcct ctaccatgcg ttgcatgaga acagagccga ccattccgcg 1080
ccagccgata aaaccaacat ttttcatagc gtttttttcc tgcaaagaga tgtgctgtgt 1140
atgcgcgcca gtatcctgtg gcgcatcctt caccat 1176
<210> 243
<211> 589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBR322 Origin
<400> 243
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589
<210> 244
<211> 3269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEQU6 shSCR
<400> 244
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
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cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
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ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
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tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta 780
gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 840
aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta 900
ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaact 960
agcaacaaga tgaagagcac caattctaga gattggtgct cttcatcttg ttgttttttc 1020
gagtagctag agaattcatg gtaatagcga tgactaatac gtagatgtac tgccaagtag 1080
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cgtcaatagg gggcgtactt ggcatatgat acacttgatg tactgccaag tgggcagttt 1200
accgtaaata gtccacccat tgacgtcaat ggaaagtccc tattggcgtt actatgggaa 1260
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ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 1740
ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga 1800
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cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 2040
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ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 2340
accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 2400
ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 2460
tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta 2520
cgctgacttg acgggacggc gcaagctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttacgcgt 2580
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 2640
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ggttcctggc cttttgctgg ccttttgct 3269
<210> 245
<211> 4642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pATI2.0 U6-H1 Plasmid
<400> 245
accggtctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 60
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ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt 300
ccgactgagc ctttcgtttt atttgggccg gccatgcctg gcagttccct actctcgcgt 360
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atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt tgggaatctt ataagttctg tatgagacca 540
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acacatgagg ttcctttttt aaacctgaac ctttagttca cacaggtggc tgcgccgccg 780
tgaatggtgg cagtagttac ttctaatcaa gctcaatccc tcggctctga agaggacata 840
gtagacctca tctggtcttt cgactacggg gggtaacaga tgtcggtggt ataacaatcc 900
tccacgagat catttcacgt aagcatgact tttacaccta tcggaatcat ataactgtta 960
ggcaatggtt tatgattggg cgacagacgt cagatcggcg aacctttacg tagccccccg 1020
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actccatata tgggctatga actaatgacc ccgtaattga ttactattaa taactagcca 1380
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gttatcaacc ggcagctcgc cgctgcgggt caatgccgta actttgcgtt caatatcaag 1920
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ggatacccag tcaacgagat tatgggcaaa gagaccgccc agcgacatca acatcaggct 2100
aacggtacag ttaccgccca caaaggtctt cacgccattg ttcaggccgt cggtaatcac 2160
gtcctggttg accgggtcga gaataataat ggcatcatct ttcatgcgca gcgtagaagc 2220
cgcatcaatc cagtaaccct gccatccgct ttcgcgcagc tttggataaa tttcgttggt 2280
ataatcgccg ccctggcagg tcacgatgat atcgagcgct tttagcgcat ccagatcaaa 2340
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ggaggtagaa aagaaaacag ggcgaatagc gtcgaaatcg cgctcctcta ccatgcgttg 2460
catgagaaca gagccgacca ttccgcgcca gccgataaaa ccaacatttt tcatagcgtt 2520
tttttcctgc aaagagatgt gctgtgtatg cgcgccagta tcctgtggcg catccttcac 2580
cataaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 2640
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtc tgcaggatat cccatgggca ttggcgcaga 2700
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ttaaccatgg aagctttgca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 2880
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 2940
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 3000
gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 3060
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agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 3180
cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 3240
gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 3300
attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 3360
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ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg 3480
aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc 3540
tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 3600
gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 3660
tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 3720
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cccttaacgt gagttacgcg tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 3960
gatcttcatc gatttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 4020
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agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 4320
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agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 4500
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 4560
aaatcgattc cggaaacgcc aggctcttcc aacgcggcct ttttacggtt gaagagccct 4620
ggccttttgc tggccttttg ct 4642
<210> 246
<211> 1261
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASD gene orf + 85 bp upstream
<400> 246
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cgaccagttg ttatggggcg ccgccgagcc gctgcgtcga atgctgcgcc agttggcgta 1260
g 1261
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<211> 4112
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pATI2.0 synthetic v26 scramble pBR322ori.dna
<400> 247
accggtctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 60
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gtcctgcccg ccaccctccg ggccgttgct tcacaacgtt caaatccgct cccggcggat 240
ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt 300
ccgactgagc ctttcgtttt atttgggccg gccatgcctg gcagttccct actctcgcgt 360
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aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt 600
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taactagcca tccagctgat atccgccggc gctgcagcta cgccaactgg cgcagcattc 900
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ccgccgccgg ggttaattcg cgcatagtga tatcacgatc gttcggcacc actttcgccc 1080
acggattatg tgccgccagc agttcttcca ccgtcggaat ggatacctct tttttcagct 1140
tgatggtgaa cgcctggctg tgacagcgca gcgcgccgac gcgcacacac aaaccatcaa 1200
ccggaatcac agaggcagta ttgagaatct tgttggtttc cgcctggcct ttccactctt 1260
cgcggctctg gccgttatcg agctgtttgt cgatccaggg gatcaggctt cccgccagcg 1320
gtacgccaaa gttatcaacc ggcagctcgc cgctgcgggt caatgccgta actttgcgtt 1380
caatatcaag aattgcggaa gacggcgtcg ccagttcatc ggcgacatgg ccatacaact 1440
gacccatctg ggttaacagc tcgcgcatat ggcgcgcgcc gccgccggag gcggcctgat 1500
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cggtaatcac gtcctggttg accgggtcga gaataataat ggcatcatct ttcatgcgca 1680
gcgtagaagc cgcatcaatc cagtaaccct gccatccgct ttcgcgcagc tttggataaa 1740
tttcgttggt ataatcgccg ccctggcagg tcacgatgat atcgagcgct tttagcgcat 1800
ccagatcaaa agcgtcctgt agcgtgccgg tggaggtgtc gccgaaggtg ggcgccgcct 1860
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ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa 2400
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ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc 2520
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ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat 2880
gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga 2940
acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca 3000
tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga 3060
tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct 3120
cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc 3180
tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaaa gctttcagaa 3240
ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcgcaagc 3300
tcatggatcc caattggcgg ccgcttaatt aaacatgtga gctcgatgta cattcgaagg 3360
accccaaaat cccttaacgt gagttacgcg tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 3420
aagatcaaag gatcttcatc gatttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3480
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3540
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3600
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3660
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3720
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3780
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 3840
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3900
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3960
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 4020
agcctatgga aaatcgattc cggaaacgcc aggctcttcc aacgcggcct ttttacggtt 4080
gaagagccct ggccttttgc tggccttttg ct 4112
<210> 248
<211> 165
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-16-2
<400> 248
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacttgttcc actctagcag 60
cacgtaaata ttggcgtagt gaaatatata ttaaacacca atattactgt gctgctttag 120
tgtgacaggg atacagcaac tattttatca attgtttgcg tcgac 165
<210> 249
<211> 165
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)...(75)
<223> n may be any nucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)...(117)
<223> n may be any nucleotide
<220>
<221> source
<222> (1)...(165)
<223> microRNA backbone where Ns represent inserted
anti-sense and sense microRNAs
<400> 249
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnngtagt gaaatatata ttaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnntac 120
ggtaacgcgg aattcgcaac tattttatca attttttgcg tcgac 165
<210> 250
<211> 708
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> endA
<400> 250
atgtaccgta atttctcttt tgccgctgtg ttgctggccg cagcgttttc aggccaggcc 60
ctggccgatg gcattaacaa tttttctcag gccaaagcgg cgagcgtcaa agtcaatgct 120
gacgcgcccg gcagctttta ctgcgggtgc caaatccgct ggcagggtaa aaaaggcgtc 180
gtagacctgg agtcctgcgg ctataaggtg cgtaaaaacg agaatcgcgc cagacgcatt 240
gagtgggagc acgttgtccc cgcctggcaa ttcggtcatc agcgccagtg ctggcaggac 300
ggcgggcgaa aaaactgcgc taaagacccg gtctaccgca aaatggaaag cgatatgcat 360
aacctgcaac ccgcgattgg cgaagtgaat ggcgatcgcg gcaactttat gtatagccag 420
tggaacggcg gcgaaggtca gtacgggcag tgcgccatga aagtagattt caaagcgaag 480
ctcgccgagc cgcccgcccg cgcccgtggc gcaatcgccc gcacttattt ttatatgcgc 540
gaccaatacc aactgaaact ttcccgccaa caaacgcagc tttttaacgt ctgggataag 600
cagtaccccg ttaccgcctg ggagtgcgag cgcgatgcgc gtatcgcgaa ggtccagggt 660
aatcataatc cctatgtgca acgcgcttgc caggcgcgaa agagctaa 708
<210> 251
<211> 235
<212> PRT
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<223> endA
<400> 251
Met Tyr Arg Asn Phe Ser Phe Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gly Gln Ala Leu Ala Asp Gly Ile Asn Asn Phe Ser Gln Ala Lys
20 25 30
Ala Ala Ser Val Lys Val Asn Ala Asp Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Cys
35 40 45
Gly Cys Gln Ile Arg Trp Gln Gly Lys Lys Gly Val Val Asp Leu Glu
50 55 60
Ser Cys Gly Tyr Lys Val Arg Lys Asn Glu Asn Arg Ala Arg Arg Ile
65 70 75 80
Glu Trp Glu His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Arg Gln
85 90 95
Cys Trp Gln Asp Gly Gly Arg Lys Asn Cys Ala Lys Asp Pro Val Tyr
100 105 110
Arg Lys Met Glu Ser Asp Met His Asn Leu Gln Pro Ala Ile Gly Glu
115 120 125
Val Asn Gly Asp Arg Gly Asn Phe Met Tyr Ser Gln Trp Asn Gly Gly
130 135 140
Glu Gly Gln Tyr Gly Gln Cys Ala Met Lys Val Asp Phe Lys Ala Lys
145 150 155 160
Ile Ala Glu Pro Pro Ala Arg Ala Arg Gly Ala Ile Ala Arg Ile Tyr
165 170 175
Phe Tyr Met Arg Asp Gln Tyr Gln Leu Lys Leu Ser Arg Gln Gln Thr
180 185 190
Gln Leu Phe Asn Val Trp Asp Lys Gln Tyr Pro Val Thr Ala Trp Glu
195 200 205
Cys Glu Arg Asp Ala Arg Ile Ala Lys Val Gln Gly Asn His Asn Pro
210 215 220
Tyr Val Gln Arg Ala Cys Gln Ala Arg Lys Ser
225 230 235
<210> 252
<211> 78
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> microRNA-103a1 (miR-103a1)
<400> 252
tactgccctc ggcttcttta cagtgctgcc ttgttgcata tggatcaagc agcattgtac 60
agggctatga aggcattg 78
<210> 253
<211> 71
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> microRNA-30a (miR-30a)
<400> 253
gcgactgtaa acatcctcga ctggaagctg tgaagccaca gatgggcttt cagtcggatg 60
tttgcagctg c 71
<210> 254
<211> 615
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMB1 origin of replication
<400> 254
aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 60
ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 120
gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta 180
ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 240
ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 300
ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 360
gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 420
cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 480
cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 540
cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 600
aacgccagca acgcg 615
<210> 255
<211> 913
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p15A origin of replication
<400> 255
gcgctagcgg agtgtatact ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg 60
cttcatgtgg caggagaaaa aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga 120
tatattccgc ttcctcgctc actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg 180
aaatggctta cgaacggggc ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg 240
aagtgagagg gccgcggcaa agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca 300
cgaaatctga cgctcaaatc agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 360
gtttccccct ggcggctccc tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt 420
cattccgctg ttatggccgc gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg 480
cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct 540
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag 600
cagccactgg taattgattt agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa 660
actgaaagga caagttttgg tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag 720
ttggtagctc agagaacctt cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag 780
caagagatta cgcgcagacc aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa 840
tatttctaga tttcagtgca atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata 900
cgatataagt tgt 913
<210> 256
<211> 223
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSC101 origin of replication
<400> 256
gagttataca cagggctggg atctattctt tttatctttt tttattcttt ctttattcta 60
taaattataa ccacttgaat ataaacaaaa aaaacacaca aaggtctagc ggaatttaca 120
gagggtctag cagaatttac aagttttcca gcaaaggtct agcagaattt acagataccc 180
acaactcaaa ggaaaaggac tagtaattat cattgactag ccc 223
<210> 257
<211> 602
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> ColE1 origin of replication
<400> 257
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 60
accgctacca acggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 120
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagtcggg 180
ccactacttc aagaactctg tagcaccgtt tgtgccatca tcgctctgct aatccggtta 240
ccagtggctg ctgccagtgg cgttaaggcg tgccttaccg ggttggactc aagacgatag 300
ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 360
gagcgaacga cctacaccga actgagatac caacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 420
cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 480
cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 540
cacctctgac ttgagcgtct atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 600
aa 602
<210> 258
<211> 201
<212> DNA
<213> Pseudomonas syringae
<220>
<223> pPS10 origin of replication
<400> 258
acctgaccgg cgcggaagcg ctcttgatct ttttttcttg tttttacttg ttgttccttg 60
ttttcgtaat tttaactata tgatttataa gaaaaaaaag ggtttaaagg ggacagattc 120
agggtttaaa ggggacagat tcagggttta aaggggacag attcagggtt taaaggggac 180
agattcaggc tgatatccac a 201
<210> 259
<211> 617
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> RK2 origin of replication
<400> 259
ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60
aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga taccacgcgg 120
aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180
ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240
cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300
caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360
gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgatga cagatgaggg gcgcacctat 420
tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480
ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540
tttttaacca gggctgcgcc ctggcgcgtg accgcgcacg ccgaaggggg gtgccccccc 600
ttctcgaacc ctcccgg 617
<210> 260
<211> 639
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> R6K alpha origin of replication
<400> 260
tcttacttct ttgcgtagct gttaaataca gcgttgtttt gataaaatca tcattatcat 60
cgataatgct ttcttcaatt tttttatcct tactctttaa taaagcactt gctaataact 120
tcataccttt tgcaactgtc aaatttggtt catcagggta aatgctttta aggcatacta 180
acaaataatc atggtcttca tcttcaactc taaactgaat ttttttcatc ataactccca 240
acaagaaccg actgtaggtc accgggcaaa cgctgaaaaa taacgtcgaa tgacgtcatt 300
ttgcggcgtt tgccctatcc tgcatcgcag tagaaaatgc cacaactgaa attgtgcttc 360
agtatgtaca gaaatgcaaa atctgaggga tttcgtagct gaaagatcgc cagtcttcga 420
ccgtaaggat aggagttgct gtaagacctg tgcggggcgt tcgcttcgcg aacgggtctg 480
gcagggggca caagcgctgt gctgtgatat atgcaaaaga agccacccac gaacgggagg 540
gcttcggcga atcgactata gtgatctatt tacccggctg attgtcgcct tctagccctc 600
gcgggcatca tgcaaccagt gcctgaattt agttatatg 639
<210> 261
<211> 1027
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> R6K beta origin of replication
<400> 261
tgaagctttt tttatgaatt tatctgaagc tgatgcagct tttctcaagg tatttgatga 60
aaccgtacct cccaaaaaag ctaaggggtg atatatggct aaaatttacg atttccctca 120
aggagccgaa cgccgcagga tgcaccgcaa aatccagtgg aacaacgctg taaaattatc 180
taaaaatggc tggagtaagc cagaggttaa acgctggtct tttttagcat tcatctcaac 240
tggctggtat tactttcgcc tttcggtagc agtcattttc catatcatta ctatttgtgg 300
tttagctgtg ctcgcggcgt taagcaatac gatattctgg attggtggcg cgatatgtct 360
tgtaacctgg tatacaaatg accatcaaat ttggagtact aacaatctta ctatccctat 420
tgttttcgga ctttgggtgt taagtttagt agctgcacca ctcatagatt ttttcagtca 480
aaaattgccc ttttatcgtc ttcttgtgcc tgatgcgaag cgtgaggaag tgggcgaaga 540
tgattcttaa agccctgccc tgtacggctt taacgccttc tcgcggtaga tctatggatg 600
ttgagaatgt agtatggtta tactgcgatg caggataggg caaacgccgt aaaatgacgt 660
ctttgacgtt atttttcagc gcttgcccgg tgacctacag tcggtgcttg ttgggagatt 720
ttatgaagtt tactagtaaa ggattttatc agtgataaat atgcaaaggc tattaacatt 780
ttaaatgata accttaaaga aaactactat gttttttatg gtgtaaggtt aagtgaaatt 840
ctttttcctg caagtgatta tggtacagat gattttttta aggagtttga ggaaataaac 900
aacgttacct tgcctttagt tgtttttgaa ataaatgaac gtgaacctgt gattgtaatt 960
ggttttgatg aaataaatcc tgcgattctt atagagaaat ccggtataaa ggttttagta 1020
atcggac 1027
<210> 262
<211> 442
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> R6K gamma origin of replication
<400> 262
gatcgctagt ttgttttgac tccatccatt agggcttcta aaacgccttc taaggccatg 60
tcagccgtta agtgttcctg tgtcactgaa aattgctttg agaggctcta agggcttctc 120
agtgcgttac atccctggct tgttgtccac aaccgttaaa ccttaaaagc tttaaaagcc 180
ttatatattc ttttttttct tataaaactt aaaaccttag aggctattta agttgctgat 240
ttatattaat tttattgttc aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga gagcttagta 300
cgttagccat gagagcttag tacgttagcc atgagggttt agttcgttaa acatgagagc 360
ttagtacgtt aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga gagcttagta cgtactatca 420
acaggttgaa ctgctgatct tc 442
<210> 263
<211> 242
<212> DNA
<213> Enterobacteria phage P1
<220>
<223> P1 origin of plasmid replication oriR
<400> 263
tttcccgtca acacacatcc tatatcccgc cagcacacat tagcaacccg tcagcacaca 60
tttttatccc tccagcacac atcgttttcc ctccagcaca catcgcgata cacttctaag 120
ccagacgtgg cgcggcctgc aacgatcagg gatctatatg gatctaattg ggatctgtat 180
ggacctgatt attggatcta tccagtggat aatgtggata agtgaaaaac cggccaacgt 240
ag 242
<210> 264
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R1 origin of replication
<400> 264
ttatccacat ttaactgcaa gggacttccc cataaggtta caaccgttca tgtcataaag 60
cgccagccgc cagtcttaca gggtgcaatg tatcttttaa acacctgttt atatctcctt 120
taaactactt aattacattc atttaaaaag aaaacctatt cactgcctgt cctgtggaca 180
gacagatatg cacctcccac cgcaagcggc gggccccgac cggagccact ttagttacaa 240
cacacaaaaa caacctccag aaaaaccccg gtccagcgca gaaccgaaac cacaaagccc 300
ctccctcata actgaaaagc ggccccgccc cggcccaaag ggccggaaca gagtcgcttt 360
taattatgaa tgttgtaact acatcttcat cgctgtcagt cttctcgctg gaagttctca 420
gtacacgctc gtaagcggcc ctcacggccc gctaacgcgg agatacgccc cgacttcggg 480
taaaccctcg tcgggaccac tccgaccgcg cacagaagct ctctcatggc tgaaagcggg 540
tatggtctgg cagggctggg gatgggtaag gtgaaatcta tcaatcagta ccggcttacg 600
ccgggcttcg gcggttttac tcctgtatca tatgaaacaa cagagtgccg ccttccatgc 660
cgctgatgcg gcatatcctg gtaacgatat ctgaattgtt atacatgtgt atatacgtgg 720
taatgacaaa aataggacaa gttaaaaatt tacaggcgat gcaatgattc aaacacgtaa 780
tcaatatctg ca 792
<210> 265
<211> 2920
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pWSK origin of replication
<400> 265
ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact 60
atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca gggtgccggc 120
agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct 180
gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc 240
caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc atggcggccg acgcgctggg 300
ctacgtcttg ctggcgttcg cgacgcgagg ctggatggcc ttccccatta tgattcttct 360
cgcttccggc ggcatcggga tgcccgcgtt gcaggccatg ctgtccaggc aggtagatga 420
cgaccatcag ggacagcttc aaggatcgct cgcggctctt accagcctaa cttcgatcat 480
tggaccgctg atcgtcacgg cgatttatgc cgcctcggcg agcacatgga acgggttggc 540
atggattgta ggcgccgccc tataccttgt ctgcctcccc gcgttgcgtc gcggtgcatg 600
gagccgggcc acctcgacct gaatggaagc cggcggcacc tcgctaacgg attcaccact 660
ccgcagaccc gccataaaac gccctgagaa gcccgtgacg ggcttttctt gtattatggg 720
tagtttcctt gcatgaatcc ataaaaggcg cctgtagtgc catttacccc cattcactgc 780
cagagccgtg agcgcagcga actgaatgtc acgaaaaaga cagcgactca ggtgcctgat 840
ggtcggagac aaaaggaata ttcagcgatt tgcccgagct tgcgagggtg ctacttaagc 900
ctttagggtt ttaaggtctg ttttgtagag gagcaaacag cgtttgcgac atccttttgt 960
aatactgcgg aactgactaa agtagtgagt tatacacagg gctgggatct attcttttta 1020
tcttttttta ttctttcttt attctataaa ttataaccac ttgaatataa acaaaaaaaa 1080
cacacaaagg tctagcggaa tttacagagg gtctagcaga atttacaagt tttccagcaa 1140
aggtctagca gaatttacag atacccacaa ctcaaaggaa aaggactagt aattatcatt 1200
gactagccca tctcaattgg tatagtgatt aaaatcacct agaccaattg agatgtatgt 1260
ctgaattagt tgttttcaaa gcaaatgaac tagcgattag tcgctatgac ttaacggagc 1320
atgaaaccaa gctaatttta tgctgtgtgg cactactcaa ccccacgatt gaaaacccta 1380
caaggaaaga acggacggta tcgttcactt ataaccaata cgctcagatg atgaacatca 1440
gtagggaaaa tgcttatggt gtattagcta aagcaaccag agagctgatg acgagaactg 1500
tggaaatcag gaatcctttg gttaaaggct ttgagatttt ccagtggaca aactatgcca 1560
agttctcaag cgaaaaatta gaattagttt ttagtgaaga gatattgcct tatcttttcc 1620
agttaaaaaa attcataaaa tataatctgg aacatgttaa gtcttttgaa aacaaatact 1680
ctatgaggat ttatgagtgg ttattaaaag aactaacaca aaagaaaact cacaaggcaa 1740
atatagagat tagccttgat gaatttaagt tcatgttaat gcttgaaaat aactaccatg 1800
agtttaaaag gcttaaccaa tgggttttga aaccaataag taaagattta aacacttaca 1860
gcaatatgaa attggtggtt gataagcgag gccgcccgac tgatacgttg attttccaag 1920
ttgaactaga tagacaaatg gatctcgtaa ccgaacttga gaacaaccag ataaaaatga 1980
atggtgacaa aataccaaca accattacat cagattccta cctacataac ggactaagaa 2040
aaacactaca cgatgcttta actgcaaaaa ttcagctcac cagttttgag gcaaaatttt 2100
tgagtgacat gcaaagtaag tatgatctca atggttcgtt ctcatggctc acgcaaaaac 2160
aacgaaccac actagagaac atactggcta aatacggaag gatctgaggt tcttatggct 2220
cttgtatcta tcagtgaagc atcaagacta acaaacaaaa gtagaacaac tgttcaccgt 2280
tacatatcaa agggaaaact gtccatatgc acagatgaaa acggtgtaaa aaagatagat 2340
acatcagagc ttttacgagt ttttggtgca ttcaaagctg ttcaccatga acagatcgac 2400
aatgtaacag atgaacagca tgtaacacct aatagaacag gtgaaaccag taaaacaaag 2460
caactagaac atgaaattga acacctgaga caacttgtta cagctcaaca gtcacacata 2520
gacagcctga aacaggcgat gctgcttatc gaatcaaagc tgccgacaac acgggagcca 2580
gtgacgcctc ccgtggggaa aaaatcatgg caattctgga agaaatagcg ctttcagccg 2640
gcaaaccggc tgaagccgga tctgcgattc tgataacaaa ctagcaacac cagaacagcc 2700
cgtttgcggg cagcaaaacc cgtacttttg gacgttccgg cggttttttg tggcgagtgg 2760
tgttcgggcg gtgcgcgcaa gatccattat gttaaacggg cgagtttaca tctcaaaacc 2820
gcccgcttaa caccatcaga aatcctcagc gcgattttaa gcaccaaccc ccccccgtaa 2880
cacccaaatc catactgaaa gtggctttgt tgaataaatc 2920
<210> 266
<211> 37
<212> DNA
<213> E. coli
<220>
<223> ColE2 origin of replication
<400> 266
aaaatgagac cagataagcc ttatcagata acagcgc 37
<210> 267
<211> 668
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC origin of replication
<400> 267
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 60
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 120
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 180
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 240
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 300
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 360
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 420
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 480
tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 540
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 600
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 660
ttttctac 668
<210> 268
<211> 457
<212> DNA
<213> Bacteriophage F1
<220>
<223> F1 origin of replication
<400> 268
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaattt 457
<210> 269
<211> 534
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL-7
<400> 269
atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60
ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120
ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180
aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240
ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300
gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360
gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420
aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480
caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca ctga 534
<210> 270
<211> 987
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL12B
<400> 270
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987
<210> 271
<211> 762
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL12A
<400> 271
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762
<210> 272
<211> 489
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL-15
<400> 272
atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60
ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120
gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180
gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240
cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300
gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360
agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420
gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480
acttcttga 489
<210> 273
<211> 804
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IL15RA
<400> 273
atggccccgc ggcgggcgcg cggctgccgg accctcggtc tcccggcgct gctactgctg 60
ctgctgctcc ggccgccggc gacgcggggc atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa 120
cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc ttgtactcca gggagcggta catttgtaac 180
tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc 240
acgaatgtcg cccactggac aacccccagt ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt 300
caccaaaggc cagcgccacc ctccacagta acgacggcag gggtgacccc acagccagag 360
agcctctccc cttctggaaa agagcccgca gcttcatctc ccagctcaaa caacacagcg 420
gccacaacag cagctattgt cccgggctcc cagctgatgc cttcaaaatc accttccaca 480
ggaaccacag agataagcag tcatgagtcc tcccacggca ccccctctca gacaacagcc 540
aagaactggg aactcacagc atccgcctcc caccagccgc caggtgtgta tccacagggc 600
cacagcgaca ccactgtggc tatctccacg tccactgtcc tgctgtgtgg gctgagcgct 660
gtgtctctcc tggcatgcta cctcaagtca aggcaaactc ccccgctggc cagcgttgaa 720
atggaagcca tggaggctct gccggtgact tgggggacca gcagcagaga tgaagacttg 780
gaaaactgct ctcaccacct atga 804
<210> 274
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CXCL9
<400> 274
atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60
caaggaaccc cagtagtgag aaagggtcgc tgttcctgca tcagcaccaa ccaagggact 120
atccacctac aatccttgaa agaccttaaa caatttgccc caagcccttc ctgcgagaaa 180
attgaaatca ttgctacact gaagaatgga gttcaaacat gtctaaaccc agattcagca 240
gatgtgaagg aactgattaa aaagtgggag aaacaggtca gccaaaagaa aaagcaaaag 300
aatgggaaaa aacatcaaaa aaagaaagtt ctgaaagttc gaaaatctca acgttctcgt 360
caaaagaaga ctacataa 378
<210> 275
<211> 297
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CXCL10
<400> 275
atgaatcaaa ctgccattct gatttgctgc cttatctttc tgactctaag tggcattcaa 60
ggagtacctc tctctagaac tgtacgctgt acctgcatca gcattagtaa tcaacctgtt 120
aatccaaggt ctttagaaaa acttgaaatt attcctgcaa gccaattttg tccacgtgtt 180
gagatcattg ctacaatgaa aaagaagggt gagaagagat gtctgaatcc agaatcgaag 240
gccatcaaga atttactgaa agcagttagc aaggaaaggt ctaaaagatc tccttaa 297
<210> 276
<211> 285
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CXCL11
<400> 276
atgagtgtga agggcatggc tatagccttg gctgtgatat tgtgtgctac agttgttcaa 60
ggcttcccca tgttcaaaag aggacgctgt ctttgcatag gccctggggt aaaagcagtg 120
aaagtggcag atattgagaa agcctccata atgtacccaa gtaacaactg tgacaaaata 180
gaagtgatta ttaccctgaa agaaaataaa ggacaacgat gcctaaatcc caaatcgaag 240
caagcaaggc ttataatcaa aaaagttgaa agaaagaatt tttaa 285
<210> 277
<211> 465
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CCL5
<400> 277
atgaaggtct ccgcggcagc cctcgctgtc atcctcattg ctactgccct ctgcgctcct 60
gcatctgcct ccccatattc ctcggacacc acaccctgct gctttgccta cattgcccgc 120
ccactgcccc gtgcccacat caaggagtat ttctacacca gtggcaagtg ctccaaccca 180
gcagtcgtcc acaggtcaag gatgccaaag agagagggac agcaagtctg gcaggatttc 240
ctgtatgact cccggctgaa caagggcaag ctttgtcacc cgaaagaacc gccaagtgtg 300
tgccaaccca gagaagaaat gggttcggga gtacatcaac tctttggaga tgagctagga 360
tggagagtcc ttgaacctga acttacacaa atttgcctgt ttctgcttgc tcttgtccta 420
gcttgggagg cttcccctca ctatcctacc ccacccgctc cttga 465
<210> 278
<211> 765
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 4-1BB Ligand
<400> 278
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765
<210> 279
<211> 1368
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF1A
<400> 279
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccactgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga 120
gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc 180
aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac 240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc 300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac 360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt 420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag 480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc 540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag 600
aatgttaagg gcactgagga ctcaggcacc acagtgctgt tgcccctggt cattttcttt 660
ggtctttgcc ttttatccct cctcttcatt ggtttaatgt atcgctacca acggtggaag 720
tccaagctct actccattgt ttgtgggaaa tcgacacctg aaaaagaggg ggagcttgaa 780
ggaactacta ctaagcccct ggccccaaac ccaagcttca gtcccactcc aggcttcacc 840
cccaccctgg gcttcagtcc cgtgcccagt tccaccttca cctccagctc cacctatacc 900
cccggtgact gtcccaactt tgcggctccc cgcagagagg tggcaccacc ctatcagggg 960
gctgacccca tccttgcgac agccctcgcc tccgacccca tccccaaccc ccttcagaag 1020
tgggaggaca gcgcccacaa gccacagagc ctagacactg atgaccccgc gacgctgtac 1080
gccgtggtgg agaacgtgcc cccgttgcgc tggaaggaat tcgtgcggcg cctagggctg 1140
agcgaccacg agatcgatcg gctggagctg cagaacgggc gctgcctgcg cgaggcgcaa 1200
tacagcatgc tggcgacctg gaggcggcgc acgccgcggc gcgaggccac gctggagctg 1260
ctgggacgcg tgctccgcga catggacctg ctgggctgcc tggaggacat cgaggaggcg 1320
ctttgcggcc ccgccgccct cccgcccgcg cccagtcttc tcagatga 1368
<210> 280
<211> 1386
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF1B
<400> 280
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60
cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc 120
cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc 180
caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac 240
agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt 300
agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc 360
aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg 420
cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg 480
tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg 540
ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc 600
acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660
tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720
ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cttcgctctt 780
ccagttggac tgattgtggg tgtgacagcc ttgggtctac taataatagg agtggtgaac 840
tgtgtcatca tgacccaggt gaaaaagaag cccttgtgcc tgcagagaga agccaaggtg 900
cctcacttgc ctgccgataa ggcccggggt acacagggcc ccgagcagca gcacctgctg 960
atcacagcgc cgagctccag cagcagctcc ctggagagct cggccagtgc gttggacaga 1020
agggcgccca ctcggaacca gccacaggca ccaggcgtgg aggccagtgg ggccggggag 1080
gcccgggcca gcaccgggag ctcagattct tcccctggtg gccatgggac ccaggtcaat 1140
gtcacctgca tcgtgaacgt ctgtagcagc tctgaccaca gctcacagtg ctcctcccaa 1200
gccagctcca caatgggaga cacagattcc agcccctcgg agtccccgaa ggacgagcag 1260
gtccccttct ccaaggagga atgtgccttt cggtcacagc tggagacgcc agagaccctg 1320
ctggggagca ccgaagagaa gcccctgccc cttggagtgc ctgatgctgg gatgaagccc 1380
agttaa 1386
<210> 281
<211> 1308
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> LTBR
<400> 281
atgctcctgc cttgggccac ctctgccccc ggcctggcct gggggcctct ggtgctgggc 60
ctcttcgggc tcctggcagc atcgcagccc caggcggtgc ctccatatgc gtcggagaac 120
cagacctgca gggaccagga aaaggaatac tatgagcccc agcaccgcat ctgctgctcc 180
cgctgcccgc caggcaccta tgtctcagct aaatgtagcc gcatccggga cacagtttgt 240
gccacatgtg ccgagaattc ctacaacgag cactggaact acctgaccat ctgccagctg 300
tgccgcccct gtgacccagt gatgggcctc gaggagattg ccccctgcac aagcaaacgg 360
aagacccagt gccgctgcca gccgggaatg ttctgtgctg cctgggccct cgagtgtaca 420
cactgcgagc tactttctga ctgcccgcct ggcactgaag ccgagctcaa agatgaagtt 480
gggaagggta acaaccactg cgtcccctgc aaggccgggc acttccagaa tacctcctcc 540
cccagcgccc gctgccagcc ccacaccagg tgtgagaacc aaggtctggt ggaggcagct 600
ccaggcactg cccagtccga cacaacctgc aaaaatccat tagagccact gcccccagag 660
atgtcaggaa ccatgctgat gctggccgtt ctgctgccac tggccttctt tctgctcctt 720
gccaccgtct tctcctgcat ctggaagagc cacccttctc tctgcaggaa actgggatcg 780
ctgctcaaga ggcgtccgca gggagaggga cccaatcctg tagctggaag ctgggagcct 840
ccgaaggccc atccatactt ccctgacttg gtacagccac tgctacccat ttctggagat 900
gtttccccag tatccactgg gctccccgca gccccagttt tggaggcagg ggtgccgcaa 960
cagcagagtc ctctggacct gaccagggag ccgcagttgg aacccgggga gcagagccag 1020
gtggcccacg gtaccaatgg cattcatgtc accggcgggt ctatgactat cactggcaac 1080
atctacatct acaatggacc agtactgggg ggaccaccgg gtcctggaga cctcccagct 1140
acccccgaac ctccataccc cattcccgaa gagggggacc ctggccctcc cgggctctct 1200
acaccccacc aggaagatgg caaggcttgg cacctagcgg agacagagca ctgtggtgcc 1260
acaccctcta acaggggccc aaggaaccaa tttatcaccc atgactga 1308
<210> 282
<211> 1008
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> FAS
<400> 282
atgctgggca tctggaccct cctacctctg gttcttacgt ctgttgctag attatcgtcc 60
aaaagtgtta atgcccaagt gactgacatc aactccaagg gattggaatt gaggaagact 120
gttactacag ttgagactca gaacttggaa ggcctgcatc atgatggcca attctgccat 180
aagccctgtc ctccaggtga aaggaaagct agggactgca cagtcaatgg ggatgaacca 240
gactgcgtgc cctgccaaga agggaaggag tacacagaca aagcccattt ttcttccaaa 300
tgcagaagat gtagattgtg tgatgaagga catggcttag aagtggaaat aaactgcacc 360
cggacccaga ataccaagtg cagatgtaaa ccaaactttt tttgtaactc tactgtatgt 420
gaacactgtg acccttgcac caaatgtgaa catggaatca tcaaggaatg cacactcacc 480
agcaacacca agtgcaaaga ggaaggatcc agatctaact tggggtggct ttgtcttctt 540
cttttgccaa ttccactaat tgtttgggtg aagagaaagg aagtacagaa aacatgcaga 600
aagcacagaa aggaaaacca aggttctcat gaatctccaa ctttaaatcc tgaaacagtg 660
gcaataaatt tatctgatgt tgacttgagt aaatatatca ccactattgc tggagtcatg 720
acactaagtc aagttaaagg ctttgttcga aagaatggtg tcaatgaagc caaaatagat 780
gagatcaaga atgacaatgt ccaagacaca gcagaacaga aagttcaact gcttcgtaat 840
tggcatcaac ttcatggaaa gaaagaagcg tatgacacat tgattaaaga tctcaaaaaa 900
gccaatcttt gtactcttgc agagaaaatt cagactatca tcctcaagga cattactagt 960
gactcagaaa attcaaactt cagaaatgaa atccaaagct tggtctag 1008
<210> 283
<211> 903
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF6B
<400> 283
atgagggcgc tggaggggcc aggcctgtcg ctgctgtgcc tggtgttggc gctgcctgcc 60
ctgctgccgg tgccggctgt acgcggagtg gcagaaacac ccacctaccc ctggcgggac 120
gcagagacag gggagcggct ggtgtgcgcc cagtgccccc caggcacctt tgtgcagcgg 180
ccgtgccgcc gagacagccc cacgacgtgt ggcccgtgtc caccgcgcca ctacacgcag 240
ttctggaact acctagagcg ctgccgctac tgcaacgtcc tctgcgggga gcgtgaggag 300
gaggcacggg cttgccacgc cacccacaac cgtgcctgcc gctgccgcac cggcttcttc 360
gcgcacgctg gtttctgctt ggagcacgca tcgtgtccac ctggtgccgg cgtgattgcc 420
ccgggcaccc ccagccagaa cacgcagtgc cagccgtgcc ccccaggcac cttctcagcc 480
agcagctcca gctcagagca gtgccagccc caccgcaact gcacggccct gggcctggcc 540
ctcaatgtgc caggctcttc ctcccatgac accctgtgca ccagctgcac tggcttcccc 600
ctcagcacca gggtaccagg agctgaggag tgtgagcgtg ccgtcatcga ctttgtggct 660
ttccaggaca tctccatcaa gaggctgcag cggctgctgc aggccctcga ggccccggag 720
ggctggggtc cgacaccaag ggcgggccgc gcggccttgc agctgaagct gcgtcggcgg 780
ctcacggagc tcctgggggc gcaggacggg gcgctgctgg tgcggctgct gcaggcgctg 840
cgcgtggcca ggatgcccgg gctggagcgg agcgtccgtg agcgcttcct ccctgtgcac 900
tga 903
<210> 284
<211> 783
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD27
<400> 284
atggcacggc cacatccctg gtggctgtgc gttctgggga ccctggtggg gctctcagct 60
actccagccc ccaagagctg cccagagagg cactactggg ctcagggaaa gctgtgctgc 120
cagatgtgtg agccaggaac attcctcgtg aaggactgtg accagcatag aaaggctgct 180
cagtgtgatc cttgcatacc gggggtctcc ttctctcctg accaccacac ccggccccac 240
tgtgagagct gtcggcactg taactctggt cttctcgttc gcaactgcac catcactgcc 300
aatgctgagt gtgcctgtcg caatggctgg cagtgcaggg acaaggagtg caccgagtgt 360
gatcctcttc caaacccttc gctgaccgct cggtcgtctc aggccctgag cccacaccct 420
cagcccaccc acttacctta tgtcagtgag atgctggagg ccaggacagc tgggcacatg 480
cagactctgg ctgacttcag gcagctgcct gcccggactc tctctaccca ctggccaccc 540
caaagatccc tgtgcagctc cgattttatt cgcatccttg tgatcttctc tggaatgttc 600
cttgttttca ccctggccgg ggccctgttc ctccatcaac gaaggaaata tagatcaaac 660
aaaggagaaa gtcctgtgga gcctgcagag ccttgtcgtt acagctgccc cagggaggag 720
gagggcagca ccatccccat ccaggaggat taccgaaaac cggagcctgc ctgctccccc 780
tga 783
<210> 285
<211> 1788
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF8
<400> 285
atgcgcgtcc tcctcgccgc gctgggactg ctgttcctgg gggcgctacg agccttccca 60
caggatcgac ccttcgagga cacctgtcat ggaaacccca gccactacta tgacaaggct 120
gtcaggaggt gctgttaccg ctgccccatg gggctgttcc cgacacagca gtgcccacag 180
aggcctactg actgcaggaa gcagtgtgag cctgactact acctggatga ggccgaccgc 240
tgtacagcct gcgtgacttg ttctcgagac gacctcgtgg agaagacgcc gtgtgcatgg 300
aactcctccc gtgtctgcga atgtcgaccc ggcatgttct gttccacgtc tgccgtcaac 360
tcctgtgccc gctgcttctt ccattctgtc tgtccggcag ggatgattgt caagttccca 420
ggcacggcgc agaagaacac ggtctgtgag ccggcttccc caggggtcag ccctgcctgt 480
gccagcccag agaactgcaa ggaaccctcc agtggcacca tcccccaggc caagcccacc 540
ccggtgtccc cagcaacctc cagtgccagc accatgcctg taagaggggg cacccgcctc 600
gcccaggaag ctgcttctaa actgacgagg gctcccgact ctccctcctc tgtgggaagg 660
cctagttcag atccaggtct gtccccaaca cagccatgcc cagaggggtc tggtgattgc 720
agaaagcagt gtgagcccga ctactacctg gacgaggccg gccgctgcac ggcctgcgtg 780
agctgttctc gagatgacct tgtggagaag acgccatgtg catggaactc ctcccgcacc 840
tgcgaatgtc gacctggcat gatctgtgcc acatcagcca ccaactcctg tgcccgctgt 900
gtcccctacc caatctgtgc agcagagacg gtcaccaagc cccaggatat ggctgagaag 960
gacaccacct ttgaggcgcc acccctgggg acccagccgg actgcaaccc caccccagag 1020
aatggcgagg cgcctgccag caccagcccc actcagagct tgctggtgga ctcccaggcc 1080
agtaagacgc tgcccatccc aaccagcgct cccgtcgctc tctcctccac ggggaagccc 1140
gttctggatg cagggccagt gctcttctgg gtgatcctgg tgttggttgt ggtggtcggc 1200
tccagcgcct tcctcctgtg ccaccggagg gcctgcagga agcgaattcg gcagaagctc 1260
cacctgtgct acccggtcca gacctcccag cccaagctag agcttgtgga ttccagaccc 1320
aggaggagct caacgcagct gaggagtggt gcgtcggtga cagaacccgt cgcggaagag 1380
cgagggttaa tgagccagcc actgatggag acctgccaca gcgtgggggc agcctacctg 1440
gagagcctgc cgctgcagga tgccagcccg gccgggggcc cctcgtcccc cagggacctt 1500
cctgagcccc gggtgtccac ggagcacacc aataacaaga ttgagaaaat ctacatcatg 1560
aaggctgaca ccgtgatcgt ggggaccgtg aaggctgagc tgccggaggg ccggggcctg 1620
gcggggccag cagagcccga gttggaggag gagctggagg cggaccatac cccccactac 1680
cccgagcagg agacagaacc gcctctgggc agctgcagcg atgtcatgct ctcagtggaa 1740
gaggaaggga aagaagaccc cttgcccaca gctgcctctg gaaagtga 1788
<210> 286
<211> 1407
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF10A
<400> 286
atggcgccac caccagctag agtacatcta ggtgcgttcc tggcagtgac tccgaatccc 60
gggagcgcag cgagtgggac agaggcagcc gcggccacac ccagcaaagt gtggggctct 120
tccgcgggga ggattgaacc acgaggcggg ggccgaggag cgctccctac ctccatggga 180
cagcacggac ccagtgcccg ggcccgggca gggcgcgccc caggacccag gccggcgcgg 240
gaagccagcc ctcggctccg ggtccacaag accttcaagt ttgtcgtcgt cggggtcctg 300
ctgcaggtcg tacctagctc agctgcaacc atcaaacttc atgatcaatc aattggcaca 360
cagcaatggg aacatagccc tttgggagag ttgtgtccac caggatctca tagatcagaa 420
catcctggag cctgtaaccg gtgcacagag ggtgtgggtt acaccaatgc ttccaacaat 480
ttgtttgctt gcctcccatg tacagcttgt aaatcagatg aagaagagag aagtccctgc 540
accacgacca ggaacacagc atgtcagtgc aaaccaggaa ctttccggaa tgacaattct 600
gctgagatgt gccggaagtg cagcagaggg tgccccagag ggatggtcaa ggtcaaggat 660
tgtacgccct ggagtgacat cgagtgtgtc cacaaagaat caggcaatgg acataatata 720
tgggtgattt tggttgtgac tttggttgtt ccgttgctgt tggtggctgt gctgattgtc 780
tgttgttgca tcggctcagg ttgtggaggg gaccccaagt gcatggacag ggtgtgtttc 840
tggcgcttgg gtctcctacg agggcctggg gctgaggaca atgctcacaa cgagattctg 900
agcaacgcag actcgctgtc cactttcgtc tctgagcagc aaatggaaag ccaggagccg 960
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gcagaagctg aagggtctca gaggaggagg ctgctggttc cagcaaatgg tgctgacccc 1080
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acagcaggcc caggggatgc cttgtatgca atgctgatga aatgggtcaa caaaactgga 1260
cggaacgcct cgatccacac cctgctggat gccttggaga ggatggaaga gagacatgca 1320
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acaggctctg ccgtgtcctt ggagtga 1407
<210> 287
<211> 1323
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF10B
<400> 287
atggaacaac ggggacagaa cgccccggcc gcttcggggg cccggaaaag gcacggccca 60
ggacccaggg aggcgcgggg agccaggcct gggccccggg tccccaagac ccttgtgctc 120
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ctagctcccc agcagagagc ggccccacaa caaaagaggt ccagcccctc agagggattg 240
tgtccacctg gacaccatat ctcagaagac ggtagagatt gcatctcctg caaatatgga 300
caggactata gcactcactg gaatgacctc cttttctgct tgcgctgcac caggtgtgat 360
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gaaggcacct tccgggaaga agattctcct gagatgtgcc ggaagtgccg cacagggtgt 480
cccagaggga tggtcaaggt cggtgattgt acaccctgga gtgacatcga atgtgtccac 540
aaagaatcag gtacaaagca cagtggggaa gtcccagctg tggaggagac ggtgacctcc 600
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gcagccgtag tcttgattgt ggctgtgttt gtttgcaagt ctttactgtg gaagaaagtc 720
cttccttacc tgaaaggcat ctgctcaggt ggtggtgggg accctgagcg tgtggacaga 780
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cccacccagg tccctgagca ggaaatggaa gtccaggagc cagcagagcc aacaggtgtc 900
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tgcttcgatg actttgcaga cttggtgccc tttgactcct gggagccgct catgaggaag 1080
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cacttgttga gctctggaaa gttcatgtat ctagaaggta atgcagactc tgccatgtcc 1320
taa 1323
<210> 288
<211> 780
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF10C
<400> 288
atggcccgga tccccaagac cctaaagttc gtcgtcgtca tcgtcgcggt cctgctgcca 60
gtcctagctt actctgccac cactgcccgg caggaggaag ttccccagca gacagtggcc 120
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gaacatactg gagcctgtaa cccgtgcaca gagggtgtgg attacaccaa cgcttccaac 240
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gagacaatga acaccagccc agggactcct gccccagctg ctgaagagac aatgaccacc 600
agcccgggga ctcctgcccc agctgctgaa gagacaatga ccaccagccc ggggactcct 660
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ctctcatgca ccatcgtagg gatcatagtt ctaattgtgc ttctgattgt gtttgtttga 780
<210> 289
<211> 1161
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF10D
<400> 289
atgggacttt ggggacaaag cgtcccgacc gcctcgagcg ctcgagcagg gcgctatcca 60
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atcattttag ctgtggttgt ggttggcttt tcatgtcgga agaaattcat ttcttacctc 720
aaaggcatct gctcaggtgg tggaggaggt cccgaacgtg tgcacagagt ccttttccgg 780
cggcgttcat gtccttcacg agttcctggg gcggaggaca atgcccgcaa cgagaccctg 840
agtaacagat acttgcagcc cacccaggtc tctgagcagg aaatccaagg tcaggagctg 900
gcagagctaa caggtgtgac tgtagagttg ccagaggagc cacagcgtct gctggaacag 960
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<210> 290
<211> 1851
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF11A
<400> 290
atggccccgc gcgcccggcg gcgccgcccg ctgttcgcgc tgctgctgct ctgcgcgctg 60
ctcgcccggc tgcaggtggc tttgcagatc gctcctccat gtaccagtga gaagcattat 120
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cacccgttgc agctcaacaa ggacacagtg tgcaaacctt gccttgcagg ctacttctct 480
gatgcctttt cctccacgga caaatgcaga ccctggacca actgtacctt ccttggaaag 540
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aaggagtcct caggtgacag ttgtgtcagt acacacacgg caaactttgg tcagcaggga 840
gcatgtgaag gtgtcttact gctgactctg gaggagaaga catttccaga agatatgtgc 900
tacccagatc aaggtggtgt ctgtcagggc acatgtgtag gaggtggtcc ctacgcacaa 960
ggcgaagatg ccaggatgct ctcattggtc agcaagaccg agatagagga agacagcttc 1020
agacagatgc ccacagaaga tgaatacatg gacaggccct cccagcccac agaccagtta 1080
ctgttcctca ctgagcctgg aagcaaatcc acacctcctt tctctgaacc cctggaggtg 1140
ggggagaatg acagtttaag ccagtgcttc acggggacac agagcacagt gggttcagaa 1200
agctgcaact gcactgagcc cctgtgcagg actgattgga ctcccatgtc ctctgaaaac 1260
tacttgcaaa aagaggtgga cagtggccat tgcccgcact gggcagccag ccccagcccc 1320
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gaagaagaag ccagcaggac ggaggccaga gaccagcccg aggatggggc tgatgggagg 1500
ctcccaagct cagcgagggc aggtgccggg tctggaagct cccctggtgg ccagtcccct 1560
gcatctggaa atgtgactgg aaacagtaac tccacgttca tctccagcgg gcaggtgatg 1620
aacttcaagg gcgacatcat cgtggtctac gtcagccaga cctcgcagga gggcgcggcg 1680
gcggctgcgg agcccatggg ccgcccggtg caggaggaga ccctggcgcg ccgagactcc 1740
ttcgcgggga acggcccgcg cttcccggac ccgtgcggcg gccccgaggg gctgcgggag 1800
ccggagaagg cctcgaggcc ggtgcaggag caaggcgggg ccaaggcttg a 1851
<210> 291
<211> 1206
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF11B
<400> 291
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
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cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
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aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
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gtcactcaga gtctaaagaa gaccatcagg ttccttcaca gcttcacaat gtacaaattg 1140
tatcagaagt tatttttaga aatgataggt aaccaggtcc aatcagtaaa aataagctgc 1200
ttataa 1206
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<212> DNA
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<210> 293
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF13B
<400> 293
atgagtggcc tgggccggag caggcgaggt ggccggagcc gtgtggacca ggaggagcgc 60
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catctcctga gggactgcat cagctgtgcc tccatctgtg gacagcaccc taagcaatgt 300
gcatacttct gtgagaacaa gctcaggagc ccagtgaacc ttccaccaga gctcaggaga 360
cagcggagtg gagaagttga aaacaattca gacaactcgg gaaggtacca aggattggag 420
cacagaggct cagaagcaag tccagctctc ccggggctga agctgagtgc agatcaggtg 480
gccctggtct acagcacgct ggggctctgc ctgtgtgccg tcctctgctg cttcctggtg 540
gcggtggcct gcttcctcaa gaagaggggg gatccctgct cctgccagcc ccgctcaagg 600
ccccgtcaaa gtccggccaa gtcttcccag gatcacgcga tggaagccgg cagccctgtg 660
agcacatccc ccgagccagt ggagacctgc agcttctgct tccctgagtg cagggcgccc 720
acgcaggaga gcgcagtcac gcctgggacc cccgacccca cttgtgctgg aaggtggggg 780
tgccacacca ggaccacagt cctgcagcct tgcccacaca tcccagacag tggccttggc 840
attgtgtgtg tgcctgccca ggaggggggc ccaggtgcat aa 882
<210> 294
<211> 555
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF13C
<400> 294
atgaggcgag ggccccggag cctgcggggc agggacgcgc cagcccccac gccctgcgtc 60
ccggccgagt gcttcgacct gctggtccgc cactgcgtgg cctgcgggct cctgcgcacg 120
ccgcggccga aaccggccgg ggccagcagc cctgcgccca ggacggcgct gcagccgcag 180
gagtcggtgg gcgcgggggc cggcgaggcg gcgctgcccc tgcccgggct gctctttggc 240
gcccccgcgc tgctgggcct ggcactggtc ctggcgctgg tcctggtggg tctggtgagc 300
tggaggcggc gacagcggcg gcttcgcggc gcgtcctccg cagaggcccc cgacggagac 360
aaggacgccc cagagcccct ggacaaggtc atcattctgt ctccgggaat ctctgatgcc 420
acagctcctg cctggcctcc tcctggggaa gacccaggaa ccaccccacc tggccacagt 480
gtccctgtgc cagccacaga gctgggctcc actgaactgg tgaccaccaa gacggccggc 540
cctgagcaac aatag 555
<210> 295
<211> 852
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF14
<400> 295
atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccaa aaccgacgtc 60
ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg 120
tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt 180
tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca 240
ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 300
ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 360
tgcagcccag gccacttctg catcgtccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct 420
tacgccacct ccagcccggg ccagagggtg cagaagggag gcaccgagag tcaggacacc 480
ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tctcccaatg ggaccctgga ggaatgtcag 540
caccagacca agtgcagctg gctggtgacg aaggccggag ctgggaccag cagctcccac 600
tgggtatggt ggtttctctc agggagcctc gtcatcgtca ttgtttgctc cacagttggc 660
ctaatcatat gtgtgaaaag aagaaagcca aggggtgatg tagtcaaggt gatcgtctcc 720
gtccagcgga aaagacagga ggcagaaggt gaggccacag tcattgaggc cctgcaggcc 780
cctccggacg tcaccacggt ggccgtggag gagacaatac cctcattcac ggggaggagc 840
ccaaaccact ga 852
<210> 296
<211> 1284
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> NGFR
<400> 296
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc 120
ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac 180
cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc 240
gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccgtgcgtg 300
gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg 360
cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac 420
aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac 480
gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc 540
acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca 600
cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa 660
caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg cagctcccag 720
cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc catcctggct 780
gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga ggtggaacag ctgcaagcag 840
aacaagcaag gagccaacag ccggccagtg aaccagacgc ccccaccaga gggagaaaaa 900
ctccacagcg acagtggcat ctccgtggac agccagagcc tgcatgacca gcagccccac 960
acgcagacag cctcgggcca ggccctcaag ggtgacggag gcctctacag cagcctgccc 1020
ccagccaagc gggaggaggt ggagaagctt ctcaacggct ctgcggggga cacctggcgg 1080
cacctggcgg gcgagctggg ctaccagccc gagcacatag actcctttac ccatgaggcc 1140
tgccccgttc gcgccctgct tgcaagctgg gccacccagg acagcgccac actggacgcc 1200
ctcctggccg ccctgcgccg catccagcga gccgacctcg tggagagtct gtgcagtgag 1260
tccactgcca catccccggt gtga 1284
<210> 297
<211> 555
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF17
<400> 297
atgttgcaga tggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgct 60
tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat 120
tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cgattctctg gacctgtttg 180
ggactgagct taataatttc tttggcagtt ttcgtgctaa tgtttttgct aaggaagata 240
aactctgaac cattaaagga cgagtttaaa aacacaggat caggtctcct gggcatggct 300
aacattgacc tggaaaagag caggactggt gatgaaatta ttcttccgag aggcctcgag 360
tacacggtgg aagaatgcac ctgtgaagac tgcatcaaga gcaaaccgaa ggtcgactct 420
gaccattgct ttccactccc agctatggag gaaggcgcaa ccattcttgt caccacgaaa 480
acgaatgact attgcaagag cctgccagct gctttgagtg ctacggagat agagaaatca 540
atttctgcta ggtaa 555
<210> 298
<211> 1254
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF19
<400> 298
atggctttaa aagtgctact agaacaagag aaaacgtttt tcactctttt agtattacta 60
ggctatttgt catgtaaagt gacttgtgaa tcaggagact gtagacagca agaattcagg 120
gatcggtctg gaaactgtgt tccctgcaac cagtgtgggc caggcatgga gttgtctaag 180
gaatgtggct tcggctatgg ggaggatgca cagtgtgtga cgtgccggct gcacaggttc 240
aaggaggact ggggcttcca gaaatgcaag ccctgtctgg actgcgcagt ggtgaaccgc 300
tttcagaagg caaattgttc agccaccagt gatgccatct gcggggactg cttgccagga 360
ttttatagga agacgaaact tgtcggcttt caagacatgg agtgtgtgcc ttgtggagac 420
cctcctcctc cttacgaacc gcactgtgcc agcaaggtca acctcgtgaa gatcgcgtcc 480
acggcctcca gcccacggga cacggcgctg gctgccgtta tctgcagcgc tctggccacc 540
gtcctgctgg ccctgctcat cctctgtgtc atctattgta agagacagtt tatggagaag 600
aaacccagct ggtctctgcg gtcacaggac attcagtaca acggctctga gctgtcgtgt 660
tttgacagac ctcagctcca cgaatatgcc cacagagcct gctgccagtg ccgccgtgac 720
tcagtgcaga cctgcgggcc ggtgcgcttg ctcccatcca tgtgctgtga ggaggcctgc 780
agccccaacc cggcgactct tggttgtggg gtgcattctg cagccagtct tcaggcaaga 840
aacgcaggcc cagccgggga gatggtgccg actttcttcg gatccctcac gcagtccatc 900
tgtggcgagt tttcagatgc ctggcctctg atgcagaatc ccatgggtgg tgacaacatc 960
tctttttgtg actcttatcc tgaactcact ggagaagaca ttcattctct caatccagaa 1020
cttgaaagct caacgtcttt ggattcaaat agcagtcaag atttggttgg tggggctgtt 1080
ccagtccagt ctcattctga aaactttaca gcagctactg atttatctag atataacaac 1140
acactggtag aatcagcatc aactcaggat gcactaacta tgagaagcca gctagatcag 1200
gagagtggtg ctgtcatcca cccagccact cagacgtccc tccaggaagc ttaa 1254
<210> 299
<211> 1293
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> RELT
<400> 299
atgaagccaa gtctgctgtg ccggcccctg tcctgcttcc ttatgctgct gccctggcct 60
ctcgccaccc tgacatcaac aaccctttgg cagtgcccac ctggggagga gcccgacctg 120
gacccagggc agggcacatt atgcaggccc tgccccccag gcaccttctc agctgcatgg 180
ggctccagcc catgccagcc ccatgcccgt tgcagccttt ggaggaggct ggaggcccag 240
gtgggcatgg caactcgaga tacactctgt ggagactgct ggcctgggtg gtttgggcct 300
tggggggttc cccgcgttcc atgtcaacca tgttcctggg cacctctggg tactcatggc 360
tgtgatgagt gggggcggcg ggcccgacgt ggcgtggagg tggcagcagg ggccagcagc 420
ggtggtgaga cacggcagcc tgggaacggc acccgggcag gtggcccaga ggagacagcc 480
gcccagtacg cggtcatcgc catcgtccct gtcttctgcc tcatggggct gttgggcatc 540
ctggtgtgca acctcctcaa gcggaagggc taccactgca cggcgcacaa ggaggtcggg 600
cccggccctg gaggtggagg cagtggaatc aaccctgcct accggactga ggatgccaat 660
gaggacacca ttggggtcct ggtgcgcttg atcacagaga agaaagagaa tgctgcggcc 720
ctggaggagc tgctgaaaga gtaccacagc aaacagctgg tgcagacgag ccacaggcct 780
gtgtccaagc tgccgccagc gcccccgaac gtgccacaca tctgcccgca ccgccaccat 840
ctccacaccg tgcagggcct ggcctcgctc tctggcccct gctgctcccg ctgtagccag 900
aagaagtggc ccgaggtgct gctgtcccct gaggctgtag ccgccactac tcctgttccc 960
agccttctgc ctaacccgac cagggttccc aaggccgggg ccaaggcagg gcgtcagggc 1020
gagatcacca tcttgtctgt gggcaggttc cgcgtggctc gaattcctga gcagcggaca 1080
agttcaatgg tgtctgaggt gaagaccatc acggaggctg ggccctcgtg gggtgatctc 1140
cctgactccc cacagcctgg cctcccccct gagcagcagg ccctgctagg aagtggcgga 1200
agccgtacaa agtggctgaa gcccccagca gagaacaagg ccgaggagaa ccgctatgtg 1260
gtccggctaa gtgagagcaa cctggtcatc tga 1293
<210> 300
<211> 1968
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF21
<400> 300
atggggacct ctccgagcag cagcaccgcc ctcgcctcct gcagccgcat cgcccgccga 60
gccacagcca cgatgatcgc gggctccctt ctcctgcttg gattccttag caccaccaca 120
gctcagccag aacagaaggc ctcgaatctc attggcacat accgccatgt tgaccgtgcc 180
accggccagg tgctaacctg tgacaagtgt ccagcaggaa cctatgtctc tgagcattgt 240
accaacacaa gcctgcgcgt ctgcagcagt tgccctgtgg ggacctttac caggcatgag 300
aatggcatag agaaatgcca tgactgtagt cagccatgcc catggccaat gattgagaaa 360
ttaccttgtg ctgccttgac tgaccgagaa tgcacttgcc cacctggcat gttccagtct 420
aacgctacct gtgcccccca tacggtgtgt cctgtgggtt ggggtgtgcg gaagaaaggg 480
acagagactg aggatgtgcg gtgtaagcag tgtgctcggg gtaccttctc agatgtgcct 540
tctagtgtga tgaaatgcaa agcatacaca gactgtctga gtcagaacct ggtggtgatc 600
aagccgggga ccaaggagac agacaacgtc tgtggcacac tcccgtcctt ctccagctcc 660
acctcacctt cccctggcac agccatcttt ccacgccctg agcacatgga aacccatgaa 720
gtcccttcct ccacttatgt tcccaaaggc atgaactcaa cagaatccaa ctcttctgcc 780
tctgttagac caaaggtact gagtagcatc caggaaggga cagtccctga caacacaagc 840
tcagcaaggg ggaaggaaga cgtgaacaag accctcccaa accttcaggt agtcaaccac 900
cagcaaggcc cccaccacag acacatcctg aagctgctgc cgtccatgga ggccactggg 960
ggcgagaagt ccagcacgcc catcaagggc cccaagaggg gacatcctag acagaaccta 1020
cacaagcatt ttgacatcaa tgagcatttg ccctggatga ttgtgctttt cctgctgctg 1080
gtgcttgtgg tgattgtggt gtgcagtatc cggaaaagct cgaggactct gaaaaagggg 1140
ccccggcagg atcccagtgc cattgtggaa aaggcagggc tgaagaaatc catgactcca 1200
acccagaacc gggagaaatg gatctactac tgcaatggcc atggtatcga tatcctgaag 1260
cttgtagcag cccaagtggg aagccagtgg aaagatatct atcagtttct ttgcaatgcc 1320
agtgagaggg aggttgctgc tttctccaat gggtacacag ccgaccacga gcgggcctac 1380
gcagctctgc agcactggac catccggggc cccgaggcca gcctcgccca gctaattagc 1440
gccctgcgcc agcaccggag aaacgatgtt gtggagaaga ttcgtgggct gatggaagac 1500
accacccagc tggaaactga caaactagct ctcccgatga gccccagccc gcttagcccg 1560
agccccatcc ccagccccaa cgcgaaactt gagaattccg ctctcctgac ggtggagcct 1620
tccccacagg acaagaacaa gggcttcttc gtggatgagt cggagcccct tctccgctgt 1680
gactctacat ccagcggctc ctccgcgctg agcaggaacg gttcctttat taccaaagaa 1740
aagaaggaca cagtgttgcg gcaggtacgc ctggacccct gtgacttgca gcctatcttt 1800
gatgacatgc tccactttct aaatcctgag gagctgcggg tgattgaaga gattccccag 1860
gctgaggaca aactagaccg gctattcgaa attattggag tcaagagcca ggaagccagc 1920
cagaccctcc tggactctgt ttatagccat cttcctgacc tgctgtag 1968
<210> 301
<211> 1254
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TNFRSF25
<400> 301
atggagcagc ggccgcgggg ctgcgcggcg gtggcggcgg cgctcctcct ggtgctgctg 60
ggggcccggg cccagggcgg cactcgtagc cccaggtgtg actgtgccgg tgacttccac 120
aagaagattg gtctgttttg ttgcagaggc tgcccagcgg ggcactacct gaaggcccct 180
tgcacggagc cctgcggcaa ctccacctgc cttgtgtgtc cccaagacac cttcttggcc 240
tgggagaacc accataattc tgaatgtgcc cgctgccagg cctgtgatga gcaggcctcc 300
caggtggcgc tggagaactg ttcagcagtg gccgacaccc gctgtggctg taagccaggc 360
tggtttgtgg agtgccaggt cagccaatgt gtcagcagtt cacccttcta ctgccaacca 420
tgcctagact gcggggccct gcaccgccac acacggctac tctgttcccg cagagatact 480
gactgtggga cctgcctgcc tggcttctat gaacatggcg atggctgcgt gtcctgcccc 540
acgagcaccc tggggagctg tccagagcgc tgtgccgctg tctgtggctg gaggcagatg 600
ttctgggtcc aggtgctcct ggctggcctt gtggtccccc tcctgcttgg ggccaccctg 660
acctacacat accgccactg ctggcctcac aagcccctgg ttactgcaga tgaagctggg 720
atggaggctc tgaccccacc accggccacc catctgtcac ccttggacag cgcccacacc 780
cttctagcac ctcctgacag cagtgagaag atctgcaccg tccagttggt gggtaacagc 840
tggacccctg gctaccccga gacccaggag gcgctctgcc cgcaggtgac atggtcctgg 900
gaccagttgc ccagcagagc tcttggcccc gctgctgcgc ccacactctc gccagagtcc 960
ccagccggct cgccagccat gatgctgcag ccgggcccgc agctctacga cgtgatggac 1020
gcggtcccag cgcggcgctg gaaggagttc gtgcgcacgc tggggctgcg cgaggcagag 1080
atcgaagccg tggaggtgga gatcggccgc ttccgagacc agcagtacga gatgctcaag 1140
cgctggcgcc agcagcagcc cgcgggcctc ggagccgttt acgcggccct ggagcgcatg 1200
gggctggacg gctgcgtgga agacttgcgc agccgcctgc agcgcggccc gtga 1254
<210> 302
<211> 1347
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> EDAR
<400> 302
atggcccatg tgggggactg cacgcagacg ccctggctcc ccgtcctggt ggtgtctctg 60
atgtgctcag cccgagcgga atactcaaac tgcggtgaga acgagtacta caaccagact 120
acggggctgt gccaggagtg ccccccgtgt gggccgggag aggagcccta cctgtcctgt 180
ggctacggca ccaaagacga ggactacggc tgcgtcccct gcccggcgga gaagttttcc 240
aaaggaggct accagatatg caggcgtcac aaagactgtg agggcttctt ccgggccacc 300
gtgctgacac caggggacat ggagaatgac gctgagtgtg gcccttgcct ccctggctac 360
tacatgctgg agaacagacc gaggaacatc tatggcatgg tctgctactc ctgcctcctg 420
gcacccccca acaccaagga atgtgtggga gccacttcag gagcttctgc caacttccct 480
ggcacctcgg gcagcagcac cctgtctccc ttccagcacg cccacaaaga actctcaggc 540
caaggacacc tggccactgc cctgatcatt gcaatgtcca ccatcttcat catggccatc 600
gccatcgtcc tcatcatcat gttctacatc ctgaagacaa agccctctgc cccagcctgt 660
tgcaccagcc acccggggaa gagcgtggag gcccaagtga gcaaggacga ggagaagaaa 720
gaggccccag acaacgtggt gatgttctcc gagaaggatg aatttgagaa gctgacagca 780
actccagcaa agcccaccaa gagcgagaac gatgcctcat ccgagaatga gcagctgctg 840
agccggagcg tcgacagtga tgaggagccc gcccctgaca agcagggctc cccggagctg 900
tgcctgctgt cgctggttca cctggccagg gagaagtctg ccaccagcaa caagtcagcc 960
gggattcaaa gccggaggaa aaagatcctc gatgtgtatg ccaacgtgtg tggagtcgtg 1020
gaaggtctta gccccacgga gctgccattt gattgcctcg agaagactag ccgaatgctc 1080
agctccacgt acaactctga gaaggctgtt gtgaaaacgt ggcgccacct cgccgagagc 1140
ttcggcctga agagggatga gattgggggc atgacagacg gcatgcaact ctttgaccgc 1200
atcagcacgg caggctacag catccctgag ctactcacaa aactggtgca gattgagcgg 1260
ctggatgctg tggagtcctt gtgtgcagac atactggagt gggcgggggt tgtgccacct 1320
gcctcccagc cacatgctgc atcctga 1347
<210> 303
<211> 894
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> EDA2R
<400> 303
atggattgcc aagaaaatga gtactgggac caatggggac ggtgtgtcac ctgccaacgg 60
tgtggtcctg gacaggagct atccaaggat tgtggttatg gagagggtgg agatgcctac 120
tgcacagcct gccctcctcg caggtacaaa agcagctggg gccaccacag atgtcagagt 180
tgcatcacct gtgctgtcat caatcgtgtt cagaaggtca actgcacagc tacctctaat 240
gctgtctgtg gggactgttt gcccaggttc taccgaaaga cacgcattgg aggcctgcag 300
gaccaagagt gcatcccgtg cacgaagcag acccccacct ctgaggttca atgtgccttc 360
cagttgagct tagtggaggc agatacaccc acagtgcccc ctcaggaggc cacacttgtt 420
gcactggtga gcagcctgct agtggtgttt accctggcct tcctggggct cttcttcctc 480
tactgcaagc agttcttcaa cagacattgc cagcgtggag gtttgctgca gtttgaggct 540
gataaaacag caaaggagga atctctcttc cccgtgccac ccagcaagga gaccagtgct 600
gagtcccaag tgagtgagaa catctttcag acccagccac ttaaccctat cctcgaggac 660
gactgcagct cgactagtgg cttccccaca caggagtcct ttaccatggc ctcctgcacc 720
tcagagagcc actcccactg ggtccacagc cccatcgaat gcacagagct ggacctgcaa 780
aagttttcca gctctgcctc ctatactgga gctgagacct tggggggaaa cacagtcgaa 840
agcactggag acaggctgga gctcaatgtg ccctttgaag ttcccagccc ttaa 894
<210> 304
<211> 1184
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elongation factor 1 (EF1) alpha promoter
<400> 304
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184

Claims (68)

1.一种免疫刺激性细菌，其包含在真核启动子控制下的编码治疗性产物的质粒，其中：
所述治疗性产物是抗癌治疗性产物；
所述免疫刺激性细菌的基因组被修饰，由此所述细菌缺失鞭毛且是pagP-/msbB-；且
野生型细菌包含鞭毛。
2.一种免疫刺激性细菌，其包含编码治疗性产物的质粒，其中：
所述治疗性产物是抗癌治疗性产物；
所述免疫刺激性细菌的基因组被修饰，由此所述细菌缺失鞭毛且是pagP-/msbB-且；
野生型细菌包含鞭毛。
3.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述细菌包含基因组修饰，由此所述细菌是msbB-、pagP-、csgD-，且缺失鞭毛。
4.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述免疫刺激性细菌包含基因组修饰，由此所述细菌是purI-(purM-)、msbB-、purD-、adrA-、csgD-、qseC-和hilA-中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的免疫刺激性细菌，其中所述免疫刺激性细菌包含基因组修饰，由此所述细菌是purI-(purM-)、purD-、adrA-、csgD-、qseC-和hilA-中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述细菌对腺苷呈营养缺陷型，或对腺苷和腺嘌呤呈营养缺陷型。
7.根据权利要求5所述的免疫刺激性细菌，其中所述细菌对腺苷呈营养缺陷型。
8.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中由于全部或部分的编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的破坏或缺失，所述细菌不表达内源天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。
9.根据权利要求8所述的免疫刺激性细菌，其在所述质粒上编码在细菌启动子的控制下的天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。
10.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌是asd-、purI-、msbB-、pagP-且缺失鞭毛。
11.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其对腺苷呈营养缺陷型。
12.根据权利要求10所述的免疫刺激性细菌，其对腺苷呈营养缺陷型。
13.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其包含包括CpG基序的核酸，其中：
所述CpG基序被toll样受体9(TLR 9)识别；且
所述包括CpG基序的核酸任选地在所述质粒上编码，或所述CpG基序包括在细菌基因中或者是细菌基因的一部分，所述细菌基因在所述质粒上编码。
14.根据权利要求13所述的免疫刺激性细菌，其中：
所述CpG基序是细菌基因的一部分；且
包含CpG基序的所述细菌基因是asd，其中在质粒上编码所述asd。
15.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中：
所述免疫刺激性细菌是沙门菌属(Salmonella)物种；
所述免疫刺激性细菌是腺苷营养缺陷型，并且是msbB-；并且
在所述质粒上编码的所述抗癌治疗性产物在真核调节序列的控制下表达。
16.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述质粒以小于150的拷贝数存在。
17.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述治疗性产物的表达在真核调节序列的控制下。
18.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中编码所述治疗性产物的所述核酸可操作地连接编码分泌信号的核酸以进行表达，由此在宿主中表达时，所述治疗性产物被分泌。
19.根据权利要求17所述的免疫刺激性细菌，其中编码所述治疗性产物的所述质粒包含构建体，所述构建体包括增强子、启动子、编码所述治疗性产物的开放阅读框和polyA尾。
20.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述真核启动子是RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子。
21.根据权利要求17所述的免疫刺激性细菌，其中编码所述治疗性产物的所述核酸包含终止子，所述终止子选自SV40终止子、来自编码人生长激素(hGH)的基因的终止子、来自编码牛生长激素(BGH)的基因的终止子和来自编码兔β-球蛋白(rbGlob)的基因的终止子。
22.根据权利要求20所述的免疫刺激性细菌，其中所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、Epstein-Barr病毒(EBV)启动子、疱疹病毒启动子、腺病毒启动子、EF-1α启动子、EIF4Al启动子、CAG启动子、MND启动子、GAPDH启动子、CBA(鸡β肌动蛋白)启动子、PGK启动子、UBC启动子和CD68启动子。
23.根据权利要求20所述的免疫刺激性细菌，其中所述启动子在真核对象的肿瘤微环境(TME)中有活性。
24.根据权利要求23所述的免疫刺激性细菌，其中所述启动子在缺氧条件下或在pH小于7的条件下是有活性的。
25.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物刺激宿主的免疫系统。
26.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是免疫刺激性蛋白，所述免疫刺激性蛋白赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答。
27.根据权利要求10所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是免疫刺激性蛋白，所述免疫刺激性蛋白赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答。
28.根据权利要求26所述的免疫刺激性细菌，其中赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答的所述免疫刺激性蛋白是细胞因子或趋化因子。
29.根据权利要求25所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是核酸或蛋白质。
30.根据权利要求26所述的免疫刺激性细菌，其中在所述质粒上编码赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答的所述免疫刺激性蛋白，当表达时，其是膜锚定的。
31.根据权利要求26所述的免疫刺激性细菌，其中赋予或有助于肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答的所述免疫刺激性蛋白选自以下中的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-36γ、已经减弱与IL-2Ra的结合的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-18、IL-21、IL-23、经修饰以使得其已经减弱与IL-2Ra的结合或不与IL-2Ra结合的IL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞募集和/或持久性的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、CD28、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族成员、CD47拮抗剂、TGF-β拮抗剂多肽、以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
32.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是IL-15/IL-15Rα链复合物。
33.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中：
所述抗癌治疗性产物是TGF-β拮抗剂，所述TGF-β拮抗剂选自抗TGF-β抗体、抗TGF-β受体抗体和可溶性TGF-β拮抗剂多肽；并且
任选地，编码所述TGF-β拮抗剂的核酸包含编码用于分泌所编码的治疗性产物的信号序列的核酸。
34.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是抗体或其抗原结合片段。
35.根据权利要求34所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、纳米抗体、双抗体片段和单链抗体的抗原结合片段。
36.根据权利要求34所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是双特异性抗体、胞内抗体、嵌合抗体或其抗原结合部分。
37.根据权利要求34所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是抗体或其部分，所述抗体或其部分是DART抗体或是串联scFv(双特异性T细胞衔接器(BiTE))。
38.根据权利要求34所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的或是人的。
39.根据权利要求35所述的免疫刺激性细菌，其中：
所述抗体或其抗原结合片段是PD-1、PD-L1、CTLA-4、VEGF、VEGFR2或IL-6的拮抗剂；或
所述抗体是抗PD-l、抗PD-Ll、抗CTLA-4、抗VEGF、抗VEGFR或抗IL6抗体，或其抗原结合片段。
40.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是抗肿瘤抗体或其抗原结合片段，或者所述抗癌治疗性产物包含细胞毒素。
41.根据权利要求40所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物包含细胞毒素，所述细胞毒素选自蓖麻毒素、皂草素和志贺毒素。
42.根据权利要求40所述的免疫刺激性细菌，其中所述抗癌治疗性产物是抗肿瘤抗体或其抗原结合片段，所述抗肿瘤抗体或其抗原结合片段为免疫检查点抑制剂。
43.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述细菌编码和表达肿瘤抗原。
44.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述质粒编码抑制性RNA(RNAi)或CRISPR盒，其中：
在真核启动子的控制下在所述细菌中的质粒上编码所述RNAi或CRISPR盒；并且
所述RNAi或CRISPR盒抑制或破坏或阻抑免疫检查点。
45.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述细菌是沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、双歧杆菌(Bifidobacteriae)、立克次体属(Rickettsia)、弧菌属(Vibrio)、利斯特菌属(Listeria)、克雷伯菌属(Klebsiella)、博德特菌属(Bordetella)、奈瑟球菌属(Neisseria)、气单胞菌属(Aeromonas)、弗朗西丝菌属(Francisella)、霍乱(Cholera)、棒杆菌属(Corynebacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜血菌属(Haemophilus)、布鲁杆菌属(Brucella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、军团病杆菌属(Legionella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、螺杆菌属(Helicobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)或丹毒丝菌属(Erysipelothrix)的菌株、或所述细菌是前述列表的细菌菌株中任一种的其减毒菌株、或所述细菌是前述列表的细菌菌株中任一种的其修饰菌株。
46.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中未修饰细菌是减毒细菌，或未修饰细菌是野生型菌株。
47.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其是沙门菌属的菌株。
48.根据权利要求47所述的免疫刺激性细菌，其是鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
49.根据权利要求48所述的免疫刺激性细菌，其中所述免疫刺激性细菌衍生自鼠伤寒沙门菌菌株，所述鼠伤寒沙门菌菌株选自命名为AST-100、VNP20009、YS1646(ATCC#202165)、RE88、SL7207、χ8429、χ8431、χ8468的菌株或野生型菌株ATCC 14028。
50.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述质粒包含编码两种治疗性产物的核酸。
51.根据权利要求50所述的免疫刺激性细菌，其中：
不同的启动子和终止子控制每种治疗性产物的表达；或
编码所述治疗性产物的所述核酸由单一启动子表达并包含单一终止子，并且编码每种产物的序列包含内部核糖体进入位点(IRES)，由此编码核酸是多顺反子性的。
52.根据权利要求1所述的免疫刺激性细菌，其中所述细菌已经用多粘菌素处理以降低产热原性。
53.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的媒介物中的权利要求1-52中任一项所述的免疫刺激性细菌。
54.根据权利要求53所述的药物组合物，其用于治疗对象中的癌症，所述癌症包含实体瘤或恶性血液肿瘤。
55.根据权利要求53所述的药物组合物，其配制用于在不稀释的情况下施用，或其以单剂量的形式配制，或其被配制用于胃肠外施用，或其被配制用于全身施用，或其被配制用于瘤内施用，或其被配制用于腹膜内施用。
56.根据权利要求1-52中任一项所述的免疫刺激性细菌，其用于治疗对象中的癌症，所述癌症包含实体瘤或恶性血液肿瘤。
57.根据权利要求56所述的免疫刺激性细菌，其中所述治疗包含第二抗癌剂或治疗。
58.根据权利要求57所述的免疫刺激性细菌，其中所述第二抗癌剂或治疗包含免疫疗法、溶瘤病毒疗法、放疗或化疗，或所述第二抗癌剂或治疗包含抗体或抗原结合抗体片段。
59.根据权利要求57所述的免疫刺激性细菌，其中所述第二抗癌剂或治疗是免疫疗法，所述免疫疗法包含施用抗PD-l、或抗PD-Ll、或抗CTLA4、或抗IL6、或抗VEGF、或抗VEGFR2抗体，或其抗原结合片段。
60.根据权利要求56所述的免疫刺激性细菌，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、胃癌、结直肠癌，以及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
61.根据权利要求56所述的免疫刺激性细菌，其中所述免疫刺激性细菌是：
(a)沙门菌属、志贺菌属、利斯特菌属或大肠杆菌物种；或
(b)鼠伤寒沙门菌菌株；或
(c)衍生自具有以ATCC保藏号14028保藏的菌株的所有鉴定特征的野生型鼠伤寒沙门菌菌株，或者是以ATCC保藏号14028保藏的菌株。
62.根据权利要求56所述的免疫刺激性细菌，其中所述免疫刺激性细菌包含基因组修饰，由此所述细菌是鞭毛蛋白-和pagP-/msbB-。
63.根据权利要求53所述的药物组合物，其进一步包含另外的抗癌剂或治疗。
64.一种分离的细胞或培养的细胞，其包含权利要求1-52中任一项所述的免疫刺激性细菌。
65.根据权利要求64所述的分离的细胞或培养的细胞，其中一种或多种所述细胞是免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞、原代细胞系或T细胞，或一种或多种所述细胞包含免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞、原代细胞系或T细胞。
66.根据权利要求65所述的分离的细胞或培养的细胞，其用于治疗对象中的癌症，所述癌症包含实体瘤或恶性血液肿瘤。
67.根据权利要求66所述的分离的细胞或培养的细胞，其中所述癌症选自淋巴瘤、白血病、胃癌、结直肠癌，以及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
68.根据权利要求54所述的药物组合物，其中所述癌症选自淋巴瘤、白血病、胃癌、结直肠癌，以及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
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