KR20160009039A - “인터페론 유전자의 자극기”-의존성 신호전달을 활성화하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 STING(인터페론 유전자의 자극기)로 알려진 최근 발견된 세포질 수용체를 통하여 DC를 활성화시키는 고도로 활성인 사이클릭-디-뉴클레오티드 (CDN) 면역 자극기를 제공한다. 특히 본 발명의 CDN은 STING-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도하는 하나 이상의 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드를 포함하는 조성물 형태로 제공되며, 여기서 상기 조성물에 존재하는 상기 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 2',5',2',5' 및 2',5',3',5' CDN, 및 바람직하게는 이들의 Rp,Rp 입체이성질체이다.

Description

“인터페론 유전자의 자극기”-의존성 신호전달을 활성화하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING “STIMULATOR OF INTERFERON GENE”-DEPENDENT SIGNALLING}

본 발명은 2013.05.18. 출원된 미국 가출원 61/825,005 및 2013.11.08. 출원된 미국 가출원 61/902,125에 대하여 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 여기에 수록된다.

하기 발명의 배경의 논의는 단지 독자의 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며 본 발명의 선행기술을 설명하거나 구성하는 것을 허용하지 않는다.

인간 면역계는 일반적으로 두 개의 분류, 즉 "내재 면역(innate immunity)"과 "적응 면역(adaptive immunity)"으로 나뉘어질 수 있다. 면역계의 내재 분류는 주로 보체계(complement system) 및 케모카인(chemokine)/사이토카인(cytokine) 시스템을 포함하는 수많은 가용성 인자(soluble factor); 및 비만세포(mast cells), 대식세포(macrophages), 수지상 세포(DC), 및 자연 살해 세포(natural killer cells)를 포함하는 수많은 특성화된 세포 유형을 통한 초기 염증 반응을 담당한다. 이와 대조적으로, 적응 면역 분류는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응과 함께 연장되고 더 오래 지속하는 항체 반응을 포함하며, 이는 항원에 대한 면역 기억에서 중요한 역할을 한다. 면역계의 세 번째 분류는 NKT 세포 및 MAIT 세포와 같은 제한된(limited) T 세포 수용체 레퍼토리(repertoires)와 함께 γδ T 세포 및 T 세포를 포함하는 것으로 식별될 수 있다.

항원에 대한 효과적인 면역 반응을 위하여, 항원 제시 세포(antigen presenting cells, APCs)는 T 세포에 대하여 적절한 MHC 요소로서 항원을 가공하고 표시해야 하며, 이는 그 후 세포독성(cytotoxic) 및 헬퍼 T 세포 중 어느 하나의 T 세포 자극을 야기할 것이다. 이어서 APCs와 T 세포들 두 가지 모두에 대한 공동-자극 분자들의 성공적인 항원 제시 상호작용이 일어나야 하거나 또는 활성이 중지될 것이다. GM-CSF 및 IL-12는 많은 종양 모델에서 효과적인 전-염증성 분자(pro-inflammatory molecule)로서 작용한다. 예를 들면, GM-CSF는, 비록 추가 신호가 T 세포의 활성에 필요한 효과적인 항원-제시 세포로의 이들의 성숙을 활성화시키는데 필요함에도 불구하고, 골수 전구 세포가 증식하고 수지상 세포(DC)로 분화하도록 유도한다. 효과적인 면역 치료법에 대한 장벽은 적절한 크기 및 기능의 세포독성 CD8 T 세포의 유도를 제한할 수 있는 표적 항원에 대한 내성, 악성 세포 위치에 대한 생성된 T 세포의 나쁜 이동성(trafficking), 및 유도된 T 세포 반응의 나쁜 영속성(persistence)을 포함한다.

종양-세포 조각을 식세포작용하는(phagocytose) DCs는 주 조직접합 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 제시를 위하여 물질을 가공하고, 공동자극 분자들의 발현을 상향조절하고, 종양-특이성 림프구(lymphocytes)를 자극하기 위하여 부위 림프절로 이동한다. 이러한 경로는 종양-관련 항원에 반응하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식과 활성을 야기한다. 실제로, 이러한 세포들은 환자의 혈액, 림프 조직, 및 악성 변병에서 자주 탐지될 수 있다.

면역 체크포인트 억제제 또는 또 다른 치료법과의 결합을 통하여-직접 또는 간접적으로- 치료적 백신화의 효능을 강화시키는 결합 치료 요법과 함께, 면역-회피(immune-evasion)를 경감시키는(underlying) 메커니즘에 대한 새로운 통찰이 효과적인 항종양 면역(antitumor immunity)을 유도하는 백신 개발을 위하여 기초로서 제공되어왔다. CDN 사이클릭-di-AMP (리스테리아 모노사이토제니즈(Listeria monocytogenes)에 의해 생성됨) 및 이의 유사 사이클릭-di-GMP (레지오넬리 폐렴군(Legionella pneumophila)에 의해 생성됨)는 PAMP (병원체 관련 분자 패턴, Pathogen Associated Molecular Pattern)으로서 숙주 세포에 의해 인식되며, 이는 STING으로 알려진 PRR (병원체 인식 수용체, Pathogen Recognition Receptor)에 결합한다. STING는 숙주 포유동물 세포의 세포질 내 어댑터 단백질이며 이는 TANK 결합 키나아제 (TBK1)-IRF3 신호전달 축(signaling axis)을 활성화시켜, 내재 면역(innate immunity)을 강하게 활성화하는 IFN-β 및 또 다른 IRF-3 의존성 유전자 생성물을 야기한다. STING는 숙주 세포질성 생존 경로의 한 성분이며, 이는 세포내 병원체에 의한 감염을 감지하고, 이에 대한 반응으로 IFN-β의 생성을 유도하여, 병원체-특이성 항체뿐만 아니라 항원-특이성 CD4 및 CD8 T 세포 둘 모두로 구성된 적응형 보호 병원체-특이성 면역 반응의 개발을 야기하는 것이 현재 고려된다. 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드의 예시들은 예컨대 미국 특허 7,709458 및 7,592,326; WO2007/054279; 및 Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18 5631 (2008)에 상세하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로서 여기에 수록된다.

암과 같이 종래 치료적 접근법이 감당하기 어려울 수 있는 질병 치료에 대한 면역학적 전략을 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명의 하나의 목적은 질병에 대한 면역 반응을 조절하는 조성물을 제공하는 것이다.

첫 번째 양상에서, 본 발명은 인터페론 유전자의 자극기("STING")-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도하는 하나 이상의 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드("CDN")를 포함하는 조성물을 제공한다. 이하에서 설명하듯이, 본 발명에서 수많은 CDN가 사용된다. 바람직한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는, 비제한적으로, c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP, c-GMP-IMP, 및 이들의 유사체 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 나열은 제한적인 것을 의미하는 것이 아니다.

본 발명에 따르는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드의 일반적인 구조는 다음과 같다:

, 여기서 R1 및 R2는 각각 푸린이며, 구조

는 리보오스의 2' 또는 3' 위치 중 어느 하나에 대한 인산염 연결을 반영하는 것으로 의도되며, 사이클릭 연결에 참여하지 않는 나머지 2' 또는 3' 위치는 -OH이다. 본 발명은 2',5',2',5' CDN 및 2',5',3',5' CDN를 고려한다. 예시로서, 2'-5' 연결을 갖는 c-di-GMP 는 R1 및 R2가 각각 구아닌이고, 각각의 인산염 연결이 2'-내지-5'인 앞서 언급된 분자를 의미한다.

본 발명의 목적을 위하여, 이러한 일반적인 구조는 치환체를 도입하도록 더욱 변형될 수 있으며 이러한 치환체는 STING에 결합하는 능력을 수여하고 STING-의존성 신호발생 단계(STING-dependent signaling cascade)를 유도하고 (가장 바람직하게는 인간 STING-의존성 신호발생 단계를 유도하고), 그리고 이에 따라 STING-의존성 유형 I 인터페론 생성 및 또 다른 공동-조절된 유전자를 유도한다. 예시로서, 본 발명은 아래 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다:

, 여기서 각각의 X는 독립적으로 O 또는 S이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 H이거나 또는 1 내지 18개 탄소 및 0 내지 3개 헤테로원자의 선택적으로 치환된 직쇄 알킬, 1-9개 탄소의 선택적으로 치환된 알켄일, 1-9개 탄소의 선택적으로 치환된 알킨일, 또는 선택적으로 치환된 아릴이며, 여기서 치환체(들)는, 존재하는 경우, 독립적으로 C_1-6 알킬 직쇄 또는 측쇄, 벤질, 할로겐, 트리할로메틸, C_1-6 알콕시, -NO₂, -NH₂, -OH, =O, -COOR' 여기서 R'는 H 또는 저급 알킬, -CH₂OH, 및 -CONH₂, 로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 R3 및 R4 모두가 H인 것이 아니다.

바람직한 구체 예에서, R3 및 R4 중 하나 또는 둘 모두가 독립적으로 세포 에스터라아제(cellular esterase)에 의해 제거되는 전구약물 이탈기를 포함한다. 일부 구체 예에서, R3 및 R4 중 하나 또는 둘 모두가 C6 내지 C18 지방산 에스테르이다. 일부 구체 예에서, R3 및 R4 중 하나 또는 둘 모두가 미리스토일(myristoyl), 펜타노일(pentanoyl), 헥사노일(hexanoyl), 헵타노일(heptanoyl), 등으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 구체 예에서, 각각의 X는 S이다. 바람직한 구체 예에서 각각의 X가 S일 때, 상기 조성물은 하나 이상의 실질적으로 순수한 Sp,Sp, Rp,Rp, Sp,Rp, 또는 Rp,Sp 입체이성질체를 포함한다.

일부 구체 예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 아데닌, 구아닌, 이노신, 및 크산틴 또는 이들의 유사체로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, R1 및 R2는 각각 독립적으로 아데닌 또는 구아닌이다.

이하에서 설명하듯이, 본 발명에 따르는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물은 3'-5' 연결을 갖는 c-di-GMP와 비교하여 적어도 2배, 및 더욱 바람직하게는 5배 또는 10배, 또는 그 이상인 STING-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도할 수 있다. 여기에 기재되듯이, 가장 바람직하게는 STING는 인간 STING이다. 바람직한 구체 예에서, 본 발명에 따르는 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물은 인간 STING를 활성화시키지만, 단지 bis-(3',5') 연결을 갖는 대응하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 그러하지 아니하다.

보조제(adjuvants)로서의 이들의 역할에서, 일부 구체 예에서 본 조성물은 백신(들)을 사용하는 치료적 또는 예방적 전략에서 보조제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실질적으로 순수한 CDN, 또는 이들의 전구약물 또는 약학적으로 수용가능한 염은 하나 이상의 소정의 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위하여 하나 이상의 선택된 백신과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 실질적으로 순수한 CDN, 또는 이들의 전구약물 또는 약학적으로 수용가능한 염은 이러한 백신과 함께, 또는 이러한 백신에 부가하여 제공될 수 있다.

이러한 백신(들)은 관심대상 항원, 정제된 항원, 생존 바이러스성 또는 박테리아성 전달 벡터를 포함하는 비활성화된 또는 감쇄된 박테리아 또는 바이러스를 포함할 수 있으며, 상기 전달 벡터는 항원, 세포를 포함하는 항원 제시 세포 (APC) 벡터를 발현하거나 및/또는 분비하도록 재조합적으로 설계되며, 상기 항원 제시 세포 (APC) 벡터는 항원을 인코딩하는 핵산, 리포좀 항원 전달 운반체, 또는 항원을 인코딩하는 네이키드 핵산 벡터를 포함하는 조성물에 형질감염되거나 또는 항원에 로딩되는 세포를 포함한다. 이러한 나열은 제한적인 것을 의미하는 것이 아니다. 예시로서, 이러한 백신(들)은 또한 GM-CSF, CCL20, CCL3, IL-12p70, FLT-3 리간드 중 하나 이상을 발현하고 분비하는 비활성 종양 세포를 포함할 수도 있다.

본 발명의 실질적으로 순수한 CDN, 또는 이들의 전구약물 또는 약학적으로 수용가능한 염은, 약학적으로 수용가능한 담체, 보조제 및 운반체(vehicle)를 함유하는 제제(formulation)로 다양한 비경구 및 비경구외 경로에 의해 이를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 비경구적인 것이나, 비제한적으로 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 피내(intradermal), 경막내(intrathecal) 및 경막외(epidural) 투여 중 하나 이상을 포함한다. 종양 내(Intra-tumor) 경로가 또한 선호된다. 특히 선호되는 것은 피하 투여(subcutaneous administration)에 의한 투여이다. 바람직한 약학 조성물은 수성 또는 수중유(oil-in-water) 에멀젼으로 제제화된다.

본 발명의 조성물은, 1종 이상의 부가적인 약학적으로 활성 성분 예컨대 보조제, 지질, 층간 가교된 다중라멜라 소포체(interbilayer crosslinked multilamellar vesicles), 생분해성 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) [PLGA]-기반 또는 폴리 무수물-기반 나노입자 또는 마이크로입자, 및 나노다공성 입자-지지된 지질 이중층, CTLA-4 및 PD-1 경로 길항제, PD-1 경로 차단제, 내재 면역(예컨대, 비활성화된 또는 감쇄된 리스테리아 모노사이토제니즈)을 유도하는 비활성 박테리아, 조성물로서 톨 유사(Toll-like) 수용체 (TLR), (NOD)-유사 수용체 (NLR), 레티노산 유도가능 유전자-기반 (RIG)-I-유사 수용체 (RLR), C-타입 렉틴 수용체 (CLR), 병원체-관련 분자 패턴 ("PAMP"), 화학치료제 등을 통하여 내재 면역 활성을 중재하는 상기 조성물 등을 포함할 수 있거나, 이들과 함께 투여될 수 있다.

관련된 한 양상에서, 본 발명은 개체 내 면역 반응을 유도하는 방법, 자극하는 방법, 또는 보조(adjuvant)하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법들은 본 발명의 실질적으로 순수한 CDN, 또는 이들의 전구약물 또는 약학적으로 수용가능한 염을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 투여 경로는 비경구(parenteral)적인 것이다. 전술한 바와 같이, 특히 선호되는 것은 이러한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드의 티오포스페이트 유도체이다.

일부 구체 예에서, 상기 방법은 암 치료 방법이다. 예시로서, 본 발명의 실질적으로 순수한 CDN, 또는 이들의 전구약물 또는 약학적으로 수용가능한 염은 단독으로, 또는 해당 분야에 공지된 1종 이상의 암 백신 조성물과 함께 또는 이에 부가하여 제공될 수 있다. 이러한 치료를 제공받는 환자는 대장암 세포, 호흡-소화 편평암, 폐암, 뇌암, 간암, 위암, 육종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 자궁암, 유방암, 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 및 신장 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는 암을 앓고 있을 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 상기 방법은 병원체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법, 자극하는 방법, 또는 보조하는 방법이다.

암을 앓고 있는 포유동물의 치료와 관련하여, 여기에 기재된 상기 방법은 본 발명의 실질적으로 순수한 CDN, 또는 이들의 전구약물 또는 약학적으로 수용가능한 염의 효과량을, 선택사항으로서 암 항원을 발현하는 암 세포를 제거 또는 사멸시키기 위해 포유동물에 투여되는 초기 치료 이전에 또는 그 이후에, 포유동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 선행보조 치료(neoadjuvant therapy)로서 제공될 수 있으나; 그렇지만 바람직한 구체 예에서, 본 발명의 조성물은 초기 치료(primary therapy)에 후속하여 투여된다. 여러 구체 예에서, 상기 초기 치료는 상기 포유동물로부터 암 세포를 제거하기 위한 수술, 상기 포유동물 내 암 세포를 사멸시키기 위한 방사선 치료, 또는 수술 및 방사선 치료 둘 모두를 포함한다.

또 다른 구체 예에서, 여기에 기재된 상기 방법은, Th1에서 Th2 면역으로의 이동이 임상적 이점을 유발하는 장애 치료를 위하여 본 발명의 실질적으로 순수한 CDN의 효과량을 포유동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 세포-매개성 면역(Cell-mediated immunity, CMI)은 사이토카인 IL-2, 인터페론 (IFN)-γ 및 종양 괴사 인자 (TNF)-α를 생성하는 TH1 CD4+ T 림프구(lymphocytes)와 관련되어 있다. 이와 대조적으로, 체액성 면역은 IL-4, IL-6 및 IL-10을 생성하는 TH2 CD4+ T 림프구와 관련되어 있다. TH1 반응에 대한 면역 편위(Immune deviation)는 전형적으로 세포독성 T-세포 림프구 (cytotoxic T-cell lymphocyte, CTL), 자연 살해 (natural killer, NK) 세포, 대식세포(macrophages) 및 단핵구의 활성을 생성한다. 일반적으로, TH1 반응은 세포내 병원체(숙주 세포 내에 있는 바이러스 및 박테리아) 및 종양에 대항하여 더욱 효과적이며, 한편 Th2 반응은 기생충(helminth) 및 독소(toxin)를 포함하는 기생생물(parasite), 세포외 박테리아에 대항하여 더욱 효과적이다. 더욱이, 내재 면역의 활성은 T-헬퍼 유형 1 및 2 (Th1/Th2) 면역계 균형을 정상화하는 것 및 면역글로불린 (Ig) E-의존성 알레르기 및 알레르기성 천식을 일으키는 Th2 유형 반응의 과도한 반응을 억제하는 것이 예상된다.

도 1은 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 ("CDN")-매개 신호전달을 도시한다. CDN (예컨대, c-di-AMP 또는 c-di-GMP)은, 세포질성 수용체 STING (인터페론 유전자의 자극기)에 결합하고, TBK-1/IRF-3 경로를 통하여 신호전달을 유도하고, IFN 수용체에 대한 결합을 통하여 DC의 자기분비(autocrine) 및 측분비(paracrine) 활성 둘 모두를 유발하고 후속하여 신호전달함으로써 IFN-β의 생성을 유도한다.
도 2A는 c-[G(2',5')pG(3',5')p] 및 디티오 유도체에 대한 합성 계획을 도시한다.
도 2B는 c-[A(2',5')pA(3',5')p] 및 디티오 유도체에 대한 합성 계획을 도시한다.
도 2C는 화합물 10, 20, 21, 22, 및 23의 구조를 도시한다.
도 3A는 화합물 9a에 대한 ¹H-NMR 결과를 도시한다.
도 3B는 화합물 9a에 대한 COSY (3.5-6.0 ppm ¹H-축) 결과를 도시한다.
도 3C는 화합물 9a에 대한 HMBC (3.0-5.5 ppm ¹H-축) 결과를 도시한다.
도 3D는 화합물 21에 대한 ¹H-NMR 결과를 도시한다.
도 3E는 화합물 21에 대한 COSY (3.5-6.0 ppm ¹H-축) 결과를 도시한다.
도 3F는 화합물 21에 대한 HMBC (0-9.5 ppm ¹H-축) 결과를 도시한다.
도 3G는 화합물 21에 대한 HMBC (3.5-5.5 ppm ¹H-축) 결과를 도시한다.
도 3H는 화합물 19b에 대한 분석 HPLC (2-20% ACN/10 mM TEAA 완충액 - 20분) 결과를 도시한다.
도 4는 c-[G(2',5')pG(3',5')p] 및 디티오 리보오스 O-치환된 유도체를 도시한다.
도 5는 c-[A(2',5')pA(3',5')p] 및 디티오 리보오스 O-치환된 유도체를 도시한다.
도 6은 c-[G(2',5')pA(3',5')p] 및 디티오 리보오스 O-치환된 유도체를 도시한다.
도 7은 다양한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자에 의한 자극 이후 THP-1 세포 내 유형 1 인터페론 생성을 도시한다.
도 8은 다양한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자에 의한 자극 이후 독립 기증자로부터 인간 PBMC 내 유형 1 인터페론 및 인터페론 감마의 정상화된 RNA 발현 수준을 도시한다.
도 9 (A - C)는 다양한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자에 의한 자극 이후 독립 기증자로부터 인간 PBMC 내 유형 1 인터페론 알파 및 베타 단백질 그리고 인터페론 감마 단백질의 수준을 도시한다.
도 10은 다양한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자에 의한 처리 이후 보조제 효능의 표시로서 인간 세포 내 IFN-β 유도를 나타낸다.
도 11(a)-(c)는 다양한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자에 의한 처리 이후 면역 활성의 표시로서, 각각 자연 살해 (natural killer, NK) 세포, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 표면 CD69 발현의 상향조절을 도시한다.
도 12는 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase) 처리에 대한 다양한 CDN 유도체의 저항을 도시한다.
도 13은 다양한 공지된 STING 변종을 도시한다.
도 14는 IFNβ-LUC 리포터의 배수 유도(fold induction)를 측정함으로써 인간 STING 변형 대립유전자(alleles)를 인코딩하는 HEK293 세포주의 자극을 도시한다.
도 15A는 자극된 인간 수지상 세포에 의한 MHC 클래스 I (HLA-ABC), CD80, CD83 및 CD86의 표면 발현을 도시한다.
도 15B는 LPS 또는 CDN 자극 이후 인간 DC 내 CD80, CD86, CD83 및 MHC 클래스 I (HLA-ABC) 발현의 대표적인 그래프를 도시한다.
도 16은 사이클릭 디뉴클레오티드 보조된 OVA 단백질로 백신접종된 이후 7일째 C57BL/6 생쥐(mice)에서 PBMC 내 OVA-특이성 CD8 T 세포 면역을 도시한다.
도 17은 사이클릭 디뉴클레오티드 보조된 OVA 단백질로 백신접종된 이후 7일째 C57BL/6 또는 골든틱(goldentickt) (STING^-/-) 생쥐에서 PBMC 내 OVA-특이성 CD8 T 세포 면역을 도시한다.
도 18은 다양한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자로 처리된 이후 B16 흑색종 모델 내 종양 체적(tumor volume)을 도시한다.
도 19는 다양한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자로 처리된 이후 CT26 종양 모델 내 생존 곡선(survival curve)을 도시한다.
도 20A은 HBSS 및 CpG 디뉴클레오티드를 접종한 대조군 생쥐와 비교하여 ML RR-CDN 투여 이후 야생형(wild-type) C57BL/6 생쥐에서의 종양 억제를 도시한다.
도 20B는 STING 결핍 생쥐에서 획득된 결과를 도시한다.
도 21A는 ML RR-CDN 투여 이후 기존 CT26 대장암(colon carcinomas)의 거부(rejection)를 도시한다.
도 21B는 ML RR-CDA로 처리된 생쥐로부터의 IFN-γ유도를 도시한다.
도 22A는 ML RR-CDN 투여 이후 기존 4T1 유방암(mammary carcinomas)의 거부(rejection)를 도시한다.
도 22B는 CT26 종양 세포에 의한 재시도에 대한 보호를 도시한다.
도 23은 HBSS 운반체 대조군과 비교하여, ML RR-CDA 투여 이후 CT26 (A) 및 4T1 (B) 종양-보유 동물 둘 모두에서의 처리된 일차 종양(primary tumor)의 억제를 도시한다.
도 24A는 ML RR-CDA 투여 이후 B16 흑색종에서의 처리된 일차 종양의 억제를 도시한다.
도 24B 및 C는 그래픽 형태(B)로 그리고 사진 형태(C)로 폐 조직 자체에서 HBSS 운반체 대조군과 비교하여, ML RR-CDA 투여 이후 말초 폐 종양 결절(distal lung tumor nodule)의 성장 억제를 도시한다.

본 발명은 STING(인터페론 유전자의 자극기)로 알려진 최근 발견된 세포질 수용체를 통하여 DC를 활성화시키는 신규하고 고도로 활성인 사이클릭-디-뉴클레오티드 (CDN) 면역 자극기에 관한 것이다. 특히 본 발명의 CDN은 STING-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도하는 하나 이상의 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드를 포함하는 조성물 형태로 제공되며, 여기서 상기 조성물에 존재하는 상기 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 2',5',2',5' 및 2',5',3',5' CDN이다.

보조제의 설계 및 개발에 대한 최근의 통찰은, 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)으로 알려진 보존된 미생물 구조가 숙주 세포 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 감지되어, 후속 신호전달 단계를 개시하고 사이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine)의 유도, 및 특정한 적응 면역 반응의 개시를 야기한다는 기본적 이해에 의해 알려진다. 내재 면역계가 미생물의 PAMP 보체에 의해 관여되는 방법이, 침입 병원체와 싸워서 질병 유발을 방지하기에 적절한 적응 반응의 개발을 형상화한다. 보조제(adjuvant) 설계의 목적은 원하는 반응을 개시하는 지정된 PRR에 특화된 합성 분자 또는 소정의 PAMP를 선택하는 것이다. 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 CpG와 같은 보조제는 톨 유사(Toll-like) 수용체 (TLR)에 의해 인지되는 PAMP이며, 이는 MyD88 및 Trif 어댑터 분자를 통해 신호전달하고 NF-kB 의존성 전염증성(proinflammatory) 사이토카인의 유도를 매개하는 일종의 막횡단 PRR이다. MPL (TLR-4 효능제) 및 CpG (TLR-9 효능제)는 임상적으로 발전된 보조제이며, FDA에 의해 승인되거나 승인 심사중인 백신 성분이다. 세포 표면에 존재하는 TLR(예컨대, TLR-4) 및 엔도솜(예컨대, CpG)이 세포외 및 액포 병원체를 감지하는 반면, 바이러스 및 세포내 박테리아를 포함하는 다중 병원체의 생산성 성장 사이클은 사이토졸 내에서 일어난다. 세포외, 액포, 및 세포질성 PRR의 구획화가, 내재 면역계가 사이토졸을 모니터링함으로써 병원체성 미생물과 비-병원체성 미생물을 구별한다는 가설을 유도했다. 세포질성 생존 경로를 포함하는 PRR에 대하여 특이적인 효능제가 세포내 병원체에 대한 보호 면역의 개발을 개시하고 백신 설계에 관련이 있다는 것은 해당 기술의 통상의 기술자에게 명백하다. 이러한 동일한 표적 리간드가 또한 악성종양을 표적으로 하는 효과적인 백신 개발에 필수적이며, 종양-특이성 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 요구하는 것으로 알려져 있다.

세포질성 생존 경로(Cytosolic Surveillance Pathway, CSP)의 활성화는 세포내 병원체에 대한 보호 면역의 개발에 통합된다. CSP는 박테리아성, 바이러스성, 및 원생생물(protozoan)성 병원체를 탐지하여, TANK 결합 키나아제 (TBK-1)/IRF-3 신호전달 축(signaling axis)의 활성 및 IFN-β와 기타 공동-조절된 유전자의 유도를 야기한다. 바이러스성 및 박테리아성 핵산 둘 모두는 이러한 경로를 활성화시키며, IFN-β의 유도는 MyD88 및 Trif 의존성이다. 유형 I 인터페론이 종종 숙주 항-바이러스성 반응으로서 주된 것으로 고려되는 한편, IFN-β의 유도는 세포내 박테리아, 리스테리아 모노사이토게네스 ( Listeria monocytogenes , Lm)로 감염된 대식세포 내에서의 세포질 성장의 표시이다. 생쥐 리스테리아증 모델에서 공지된 이분법(dichotomy)은 다음과 같다: 야생형(wild-type) Lm이 박테리아성 도전에 대해 생쥐를 보호하는 강한 CD4 및 CD8 T-세포 면역을 주된 것으로 하는 반면, 리스테리오라이신 O (LLO)-삭제된 Lm은 기능성 T 세포를 유도하지 못하거나 보호 면역을 유발하지 못한다. 이러한 차이는 기능성 T-세포 매개 보호 면역을 유도하기 위한 Lm에 의한 숙주 세포 유전자 및 세포질성 접근의 발현에 대한 필요성의 증거이다. 감염된 숙주 세포 내 IFN-β의 수준은 Lm 다중약물 유출 펌프(multidrug efflux pump, MDR)에 의해 조절되며, 이는 항생물질을 포함하여, 구조적으로 관계없는 소분자를 분비한다. IFN-β는 포식리소좀에 한정된 Lm LLO 돌연변이에 감염된 숙주 세포에서 유도되지 않는다. IFN-β의 정상 수준은 모든 TLR-매개 신호전달가 결핍된 감염된 MyD88 ^-/- Trif ^-/- 대식세포 내에서 유도된다. 이러한 데이터는 비록 Lm이 TLR에 관여하지만, 야생형 Lm의 감염에 반응하여, 숙주 세포 CSP가 IFN-β와 상호관련된 보호 면역의 개발에 필요하다는 것을 증명한다.

사이클릭-디-뉴클레오티드 (CDN)는 세포질성 PRR, STING에 직접 결합함으로써 세포질성 생존 경로를 활성화시킨다. Lm 및 또 다른 세포내 박테리아에 의한 감염에 대한 유형 I 인터페론 반응은 c-di-AMP 또는 이의 관련된 사이클릭 디뉴클레오티드(CDN), c-di-GMP의 분비, 및 DDX41 및 DEAD (아스파르테이트-글루타메이트-알라닌-아스파르테이트(aspartate-glutamate-alanine-aspartate)) 박스 헬리카제 및 세포질성 생존 경로의 최근 정의된 수용체인 STING (인터페론 유전자의 자극기)에 대한 직접적 결합을 야기한다. CDN은 대부분의 박테리아에 의해 발현되는 제2 메신저이며 생체막의 운동성 및 형성을 포함하여 다양한 프로세스를 조절한다. TBK-1/IRF-3 신호전달 경로를 활성화시키는 것에 추가하여, 결합 CDN에 반응하여 STING는 또한 IkB 키나아제를 활성화시켜, NF-kB 전사 인자의 세포핵으로의 이동을 야기하고, 이는 다중 전-염증성 유전자의 발현을 활성화시킨다.

최근까지, STING가 세포질 DNA를 감지하는 것은 어렵다고 여겨져 왔다. dsDNA에 직접 결합하는 AIM2와 달리, STING는 모든 명백한 DNA-결합 도메인이 부족하다. DDX41, DNA-PK 및 DAI 키나아제와 같은 또 다른 후보군 DNA 센서가 TING를 통한 dsDNA 신호전달의 필수적 매개체인지 여부는 불명확하였다. 이러한 난제는 사이클릭 GMP-AMP 신타아제 (cGAS), 결합 dsDNA에 반응하여 제2 메신저를 합성하는 숙주 세포 뉴클레오티딜 전이효소, STING에 직접 결합하여 TBK-1/IRF-3 축을 통하여 신호전달 단계를 개시하여 IFN의 유도를 야기하는 사이클릭 di-GMP-AMP의 발견으로 해결되었다. 또한, cGAS 내재 면역 DNA 센서는 STING 신호전달을 활성화시키는 비-정규 사이클릭 디-뉴클레오티드를 생성한다. 뉴클레오티드간 포스페이트 연결에 bis-(3', 5') 결합이 참여하는, 박테리아에 의해 생성된 사이클릭 디뉴클레오티드 제2 메신저와는 달리, cGAS에 의해 합성된 사이클릭-GMP-AMP 내 뉴클레오티드간 포스페이트 연결에는 c[G(2',5')pA(3',5')p]로 표현되는 비-전형적 2', 5' 및 3',5' 연결이 참여한다. 따라서, STING (인터페론 유전자의 자극기)는 세포내 박테리아⁶에 의해 분비되는 사이클릭 디뉴클레오티드(CDN)의 직접 결합을 통하여, 또는 결합 세포질성 병원체 핵산에 반응하여 숙주 세포 사이클릭 GMP-AMP 신타아제(cGAS)에 의해 합성되는 c-GMP-AMP 제2 메신저의 결합을 통하여, 세포질성 병원체 핵산를 감지하기 위한 중앙 경로로서 제시된다.

상기 선천적 CDN 분자를 함유하는 백신 제제를 취하는 숙주 세포, 예를 들면 항원 제시 세포 내에 존재하는 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase)에 의한 분해에 민감하다. 보조제가 자신의 정의된 PRR 표적에 결합하여 활성화시킬 수 없게 됨에 따라, 정의된 보조제의 능력은 이러한 분해에 의해 감소될 수 있다. 저급 보조제 능력은, 예를 들면, 측정된 항원-특이성 면역 반응의 크기에 의해 정의되며, 더 약한 백신 능력과 상호관련되는, 내재 면역 표지 분자(예컨대, IFN-β)의 유도된 발현의 저급 용량에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에서, 실질적으로 순수한 2',5',2',5' 및 2',5',3',5' CDN, 그리고 특히 2',5',2',5' 및 2',5',3',5' c-di-AMP 및 c-di-GMP의 디티오-디포스페이트 유도체가 제공된다. 상기 c-di-AMP 및 c-di-GMP 분자의 디티오-디포스페이트 유도체에 대한 합성 공정은 c-di-AMP 및 c-di-GMP 분자의 Rp,Rp, Sp,Sp, SpRp, 및 Rp,Sp 디티오-디포스페이트 유도체를 포함하여 부분입체이성질체의 혼합물을 야기한다. 이러한 개체 종은 분리될 수 있고, 자신들의 약학적 특징의 실질적인 차이점을 나타낸다.

정의

인간, 포유동물, 포유동물 객체, 동물, 수의용 객체, 플라시보 객체(placebo subject), 연구 객체, 실험 객체, 세포, 조직(tissue), 기관(organ), 또는 생물학적 유체와 관련하여 여기에서 사용되는 "투여"는 비제한적으로 외인성 리간드, 시약(reagent), 플라시보, 소분자, 약제(pharmaceutical agent), 치료제, 진단제, 또는 조성물을 객체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체, 및 이와 유사한 것에 접촉시키는 것을 의미한다. "투여"는 예를 들어 치료적, 약동학적(pharmacokinetic), 진단학적, 연구, 플라시보, 및 실험적 방법을 의미할 수 있다. 세포 치료는 세포에 대한 시약의 접촉, 뿐만 아니라 유체에 대한 시약의 접촉을 포함하며, 여기서 유체는 세포와 접촉하여 있는 것이다. "투여"는 또한 시약, 진단, 결합 조성물, 또는 또 다른 세포에 의한 예컨대 세포의 체외 및 생체 처리를 포함한다. "함께 투여되는"은 둘 또는 그 이상의 시약이 단일 조성물로서 투여되는 것을 의도하는 것은 아니다. 비록 단일 조성물로서의 투여가 본 발명에서 고려되지만, 이러한 시약은 별도의 투여에 의해 단일 객체에 전달될 수 있으며, 이는 동일한 시간 또는 상이한 시간일 수 있으며, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의한 것일 수 있다.

리간드 및 수용체와 관련된 "효능제"는 수용체를 자극하는, 분자, 분자의 결합체, 복합체, 또는 시약의 결합체를 포함한다. 예를 들면, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 효능제는 GM-CSF, GM-CSF의 변이체 또는 유도체, GM-CSF의 펩티드 모방체, GM-CSF의 생물학적 기능을 모방하는 소분자, 또는 GM-CSF 수용체를 자극하는 항체를 포함할 수 있다.

리간드 및 수용체와 관련된 "길항제"는 수용체를 억제하거나, 대응하거나, 하향조절하거나, 및/또는 둔감하게 하는, 분자, 분자의 결합체, 또는 복합체를 포함한다. "길항제"는 수용체의 구성적 활성을 억제하는 모든 시약을 포함한다. 구성적 활성은 리간드/수용체 상호작용 부재시의 적하목록 중 하나이다. "길항제"는 또한 수용체의 자극된 (또는 조절된) 활성을 억제하거나 방지하는 모든 시약을 포함한다. 예시로서, GM-CSF 수용체의 길항제는, 비제한적으로, 리간드(GM-CSF)에 결합하여 이것이 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체, 또는 수용체에 결합하여 리간드가 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체를 포함하거나, 또는 항체가 비활성 형태로 수용체를 락킹(lock)한다.

본 발명의 CDN과 관련하여 "실질적으로 순수한"은, 중량으로, 해당 종(species)이 조성물에 존재하는 CDN 활성의 적어도 50%를 나타내거나, 더욱 종종 적어도 60%를 나타내거나, 전형적으로 적어도 70%를 나타내거나, 더욱 전형적으로 적어도 75%를 나타내거나, 가장 전형적으로 적어도 80%를 나타내거나, 일반적으로 적어도 85%를 나타내거나, 더욱 일반적으로 적어도 90%를 나타내거나, 가장 일반적으로 적어도 95%를 나타내거나, 및 전통적으로 적어도 98%를 나타내거나, 또는 그 이상을 나타내는 것을 의미한다. 물, 완충액, 염, 세제, 환원제, 프로테아제 억제제, 멸균제(알부민과 같은 부가 단백질 포함), 및 부형제의 중량은 일반적으로 순도 결정에 사용되지 않는다.

"특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다는 것은, 리간드/수용체, 핵산/상보 핵산, 항체/항원, 또는 또 다른 결합 쌍(예컨대, 사이토카인 대 사이토카인 수용체)(이들은 각각 여기서 일반적으로 "표적 생체분자" 또는 "표적"으로 칭함)에 대하여 언급될 때, 단백질 및 또 다른 생물제제의 이종 집단 내 표적의 존재에 관련된 결합 반응을 지시한다. 특이성 결합은, 고려된 방법의 결합 화합물, 핵산 리간드, 항체, 또는 항체의 항원-결합 위치로부터 유래된 결합 조성물이, 비-표적 분자에 의한 친화도에 비하여, 종종 적어도 25% 더 많은, 더욱 종종 적어도 50% 더 많은, 가장 종종 적어도 100% (2-배) 더 많은, 일반적으로 적어도 10배 더 많은, 더욱 일반적으로 적어도 20-배 더 많은, 및 가장 일반적으로 적어도 100-배 더 많은 친화도로 자신의 표적에 결합하는 것을 의미한다.

"리간드"는 표적 생체분자에 결합하는, 소분자, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 사카라이드, 폴리사카라이드, 글리칸, 당단백질, 당지질, 또는 이들의 조합을 의미한다. 이러한 리간드는 수용체의 효능제 또는 길항제일 수 있는 한편, 리간드는 또한 효능제 또는 길항제가 아니거나, 또는 효능제 또는 길항제 성질을 갖지 않는 결합제를 포함한다. 자신의 동족 표적(cognate target)에 대한 리간드의 특이성 결합은 종종 "친화도"라는 용어로 표현된다. 바람직한 구체 예에서, 본 발명의 리간드는 약 10⁴ M^-1 내지 약 10⁸ M^-1의 친화도로 결합한다. 친화도는 K_d = k_off/k_on 에 의해 계산된다(k_off 는 해리 속도 상수(dissociation rate constant)이며, K_on 은 결합 속도 상수(association rate constant)이며 K_d 는 평형 상수(equilibrium constant)이다).

친화도는 여러 농도(c)에서 지표된 리간드의 분획 결합(fraction bound)(r)을 측정함으로써 평형에서 결정될 수 있다. 데이터는 스캐차드 방정식(Scatchard equation): r/c = K(n-r)을 사용하여 그래프화되며: 여기서 r = 평형에서 결합된 리간드의 몰(mole)/수용체의 몰(mole); c = 평형에서 자유 리간드 농도; K = 평형 결합 상수; 그리고 n = 수용체 분자 당 리간드 결합 위치의 수이다. 그래프 분석에 의해, r/c는 X-축상의 r에 대해 Y-축상에 도시되어, 스캐차드 플롯(Scatchard plot)을 생성한다. 스캐차드 분석에 의한 친화도 측정은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대 다음을 참조하라, van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput . Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988. 대안으로, 친화도는 등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry, ITC)에 의해 측정될 수 있다. 전형적인 ITC 실험에서, 리간드 용액은 자신의 동족 표적 용액 내로 적정된다. 이들의 상호작용에서 방출되는 열(ΔH)이 시간에 따라 관찰된다. 리간드의 연속적인 양이 ITC 셀로 적정됨에 따라, 흡수되거나 방출되는 열의 양은 결합의 양과 직접 비례한다. 시스템이 포화에 도달함에 따라, 열 신호는 단지 희석 열이 관찰될 때까지 감소한다. 따라서 결합 곡선은 세포 내 리간드와 결합 파트너의 비율에 대한 각각의 주입량으로부터 열의 플롯으로부터 획득된다. 결합 곡선은 K_B, n 및 ΔH를 결정하기 위한 적절한 결합 모델로 분석된다. K_B = 1/K_d임을 주목하라.

여기서 사용되는 용어 "객체"는 인간 또는 비-인간 기관(organism)을 의미한다. 따라서, 여기에 기재된 방법 및 조성물은 인간 및 동물 질병(veterinary disease) 모두에 적용가능하다. 일부 구체 예에서, 객체는 질병 또는 질환에 대한 의료 관리를 받는 환자, 예컨대 생존 인간이다. 이는 병리학적 지표를 위해 연구중인 정의되지 않은 질병을 가진 사람을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 표적이 되는 기존의 특정 암의 진단법을 갖는 객체가 바람직하다. 여기에 기재된 조성물에 의한 치료에 대한 바람직한 암은 비제한적으로 전립선암, 신장암, 흑색종, 췌장암, 자궁암, 난소암, 대장암, 두경부암, 폐암 및 유방암을 포함한다.

"치료적 효과량"은 환자의 이익을 제시하기에 충분한, 즉 치료되는 질환의 증상의 감소, 예방, 또는 완화를 유발하기에 충분한, 시약 또는 약학 조성물의 용량으로 정의된다. 시약 또는 약학 조성물이 진단제를 포함할 때, "진단적 효과량"은 신호, 이미지, 또는 또 다른 진단적 파라미터를 생성하기에 충분한 용량으로 정의된다. 약학적 제제의 효과량은 개체의 감수성 등급, 연령, 성별,및 개체의 중량, 및 개체의 특이적 반응과 같은 요인에 따라 달라질 것이다. "효과량"은 비제한적으로 의학적 질환 또는 장애 또는 이들의 원인성 프로세스의 증상 또는 표지를 완화, 역전, 경감, 예방 또는 진단할 수 있는 용량을 포함한다. 명백하게 또는 문맥상 다른 표시가 없는 한, "효과량"은 질환을 완화시키기에 충분한 최소한의 용량으로 한정되는 것은 아니다.

"치료" 또는 "치료하는"(질환 또는 질병과 관련하여)은 바람직한 임상적 결과를 포함하여 이익 또는 원하는 결과를 획득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 질병과 관련하여 이익이 되거나 바람직한 결과는 비제한적으로 다음 중 한가지 이상을 포함한다: 질병 예방하기, 질병과 관련된 질환 개선하기, 질병 치료하기, 질병의 심각도 감소시키기, 질병의 진행 지연시키기, 질병과 관련된 하나 이상의 증상 완화시키기, 질병을 앓고 있는 개체의 삶의 질 개선하기, 및/또는 생존 연장시키기. 이와 유사하게, 본 발명의 목적을 위하여, 질환과 관련하여 이익이 되거나 바람직한 결과는 비제한적으로 다음 중 한가지 이상을 포함한다: 질환 예방하기, 질환 개선하기, 질환 치료하기, 질환의 심각도 감소시키기, 질환의 진행 지연시키기, 질환과 관련된 하나 이상의 증상 완화시키기, 질환을 앓고 있는 개체의 삶의 질 개선하기, 및/또는 생존 연장시키기. 예를 들어, 여기에 기재된 조성물이 암의 치료를 위하여 사용되는 구체 예에서, 이익이 되거나 바람직한 결과는 비제한적으로 다음 중 한가지 이상을 포함한다: 종양 또는 암 세포를 (파괴시키거나) 이의 증식을 감소시키기, 암에서 발견되는 종양 세포의 전이 감소시키기, 종양의 크기 감소시키기, 암으로부터 야기되는 증상 감소시키기, 암을 앓는 개체의 삶의 질 개선하기, 질병을 치료하기 위해 요구되는 또 다른 의약의 복용량 감소시키기, 암의 진행 지연시키기, 및/또는 암을 갖고 있는 환자의 생존 연장시키기. 문맥에 따라, 개체의 "치료"는 개체가 치료를 요구하는 상태, 예컨대 개체가 시약의 투여에 의해 완화되는 것이 예상되는 장애를 포함하는 상황에 있다는 것을 암시할 수 있다.

"백신"은 예방적 백신을 포함한다. 백신은 또한 치료적 백신, 예컨대 백신에 의해 제공되는 항원 또는 에피토프와 관련된 질환 또는 장애를 포함하는 포유동물에 투여되는 백신을 포함한다.

사이클릭 푸린 디뉴클레오티드

원핵 뿐만 아니라 진핵 세포는 세포 신호전달 및 세포내 및 세포간 소통을 위하여 다양한 소분자를 사용한다. cGMP, cAMP, 등과 같은 사이클릭 뉴클레오티드는 프로- 및 진핵 세포 내에 조절 및 개시 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 진핵 세포와 달리, 원핵 세포는 또한 조절 분자로서 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드를 사용한다. 원핵생물에서, 두 가지 GTP 분자의 축합은 c-diGMP를 제공하는 효소 디구아닐레이트 시클라제(enzyme diguanylate cyclase, DGC)에 의한 촉매이며, 이는 박테리아 내에서 중요한 조절자를 제시한다.

최근 연구에 의하면, 사이클릭 diGMP 또는 이의 유사체는 또한 환자 내 면역 또는 염증 반응을 자극하거나 증강시킬 수 있거나 또는 포유동물 내에서 보조제로서 역할을 함으로써 백신에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 병원체-유래 DNA의 세포질 검출은 TANK 결합 키나아제 1 (TBK1) 및 이의 하류 전사 인자(downstream transcription factor), IFN-조절 인자 3 (IRF3)를 통한 신호전달을 요구한다. STING (IFN 유전자의 자극기; 또한 MITA, ERIS, MPYS 및 TMEM173로 알려져 있음)라 불리는 막횡단 단백질은 이들 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드를 위한 신호전달 수용체로서 작용을 하며, TBK1-IRF3 신호발생 축 및 STING-의존성 유형 I 인터페론 반응의 자극을 야기한다. 예컨대 도 1을 참조하라. Burdette et al., Nature 478: 515-18, 2011은 STING가 사이클릭 디구아닐레이트 모노포스페이트에는 직접 결합하지만, 또 다른 관련없는 뉴클레오티드 또는 핵산에는 그렇지 않다는 것을 증명했다.

본 발명의 CDN을 유도하기 위한 전구체로서의 용도를 위한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 예컨대 다음 문헌에 일부 자세하게 기재된다: Gao et al., Cell (2013) 153: doi: 10.1016/j.cell.2013.04.046; 미국 특허 7,709458 및 7,592,326; WO2007/054279; 및 Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18: 5631 (2008), 이들 각각은 참조로서 여기에 수록된다. 이러한 CDN은 본 발명의 CDN을 생성하기 위하여 표준 유기 화학 기술을 사용하여 개량될 수도 있다.

바람직한 푸린은 비제한적으로 아데닌, 구아닌, 이노신, 하이포크산틴, 크산틴, 이소구아닌, 등을 포함한다. 본 발명의 CDN은 바람직하게는 포스포로티오에이트 유사체이며, 가장 바람직하게는 이의 실질적으로 순수한 Sp,Sp, Rp,Rp, SpRp, 또는 Rp,Sp 입체이성질체이다.

구조에서 명시되듯이, 각각의 리보오스는 치환될 수도 있는 2' 또는 3' 하이드록실을 포함한다. 이하에서 기재되듯이, 본 발명의 CDN은 이러한 2' 또는 3' 하이드록실(고리 연결 부분이 아닌 것) 중 하나 또는 둘 모두에서의 치환을 포함할 수 있으며 이는 전구약물 이탈기를 제공하거나 또는 활성, 용해도, 생체활용도, 등에 영향을 미치는 또 다른 개량을 제공한다. 여기에 사용되듯이 용어 "전구약물"은 고려된 화합물의 개량체를 의미하며, 여기서 개량된 화합물은 (개량된 화합물과 비교하여) 낮은 약리학적 활성을 나타내며, 여기서 개량된 화합물은 몸체(예컨대 표적 세포 또는 표적 기관) 내에서 효소적 또는 비-효소적 반응을 통해 비개량된 형태로 복귀하여 전환된다. 일부 구체 예에서, 하나의 리보오스 상의 하이드록실은 전구약물 이탈기를 포함한다. 전구약물은 약물의 물리화학적, 생체의학적, 그리고 약동학적 성질을 개량시킬 수 있다. 전통적인 전구약물은 생체 내 진행중인 변형에 의해 활성화되어 활성 약물을 형성하는 약물로서 분류된다. 전구약물 개발에 대한 이유는 전형적으로 모체 약물(parent drug)과 관련된 나쁜 수성 용해도, 화학적 불안정성, 낮은 경구 생체활용도, 혈액 뇌 장벽 침투 부족, 및 높은 처음 통과 대사(first pass metabolism)이다. 적절한 전구약물 부분은 예를 들면 다음 문헌에 기재된다: "Prodrugs and Targeted Delivery," J. Rautico, Ed., John Wiley & Sons, 2011.

바람직한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 유사체이며, 여기서 "티오포스페이트"로 불린다. 포스포로티오에이트는 정상 뉴클레오티드의 변형인데, 비연결(nonbridging) 산소 중 하나가 황으로 대체된 것이다. 뉴클레오티드간 결합의 황화(sulfurization)는 5' 에서 3' 및 3' 에서 5' DNA POL 1 엑소뉴글레아제, 뉴글레아제 S1 및 P1, RN아제(RNases), 혈청 뉴글레아제 및 뱀 독 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase)를 포함하여, 엔도- 및 엑소뉴클레아제의 활성을 극적으로 감소시킨다. 또한, 지질 이중층을 횡단하는 능력이 증가한다.

포스포로티오에이트 연결은 본질적으로 키랄(chiral)이다. 통상의 기술자는 이러한 구조 내의 포스페이트가 각각 R 또는 S 형태로 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, Rp,Rp, Sp,Sp, Sp,Rp, 및 Rp,Sp 형태가 가능하다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 CDN의 2'-O- 및 3'-O- 치환 형태, 및 특히 CDN 티오포스페이트를 포함한다. 부가적인 안정성 및 생체활용도가 리보오스 부분의 2'-OH의 치환에 의해 제공될 수 있다. 여기서 가능한 치환체 그룹은 비제한적으로 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알켄일, 알킨일, 아실 (-C(O)R_aa), 카르복실 (-C(O)0-R_aa), 지방족 그룹, 지환족 그룹, 알콕시, 치환된 옥시(-0-R_aa), 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아미노 (-N(R_bb)(R_cc)), 이미노(=NR_bb), 아미도 (-C(O)N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)C(O)R_aa), 아지도 (-N₃), 니트로 (-N0₂), 시아노 (-CN), 카르브아미도 (-OC(O)N(R_bb)(R_cc) 또는 -N(R_bb)C(O)OR_aa), 우레이도 (-N(R_bb)C(O)-N(Rbb)(Rcc)), 티오우레이도 (-N(R_bb)C(S)N(R_bb)(R_cc)), 구아니딘일 (-N(R_bb)C(=NR_bb)N(R_bb)(R_cc)), 아미딘일 (-C(=NR_bb)N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)C(=NR_bb)(R_aa)), 티올 (-SR_bb), 설핀일 (-S(O)R_bb), 설폰일 (-S(O)₂R_b ) 및 설폰아미딜 (-S(O)₂N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)S(O)₂R_bb)을 포함한다. 여기서 각각의 R_aa, R_bb 및 R_cC는 독립적으로 H; 선택적으로 연결된 화학적 작용기; 또는 비제한적으로, H, 알킬, 알켄일, 알킨일, 지방족, 알콕시, 아실, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 지환족, 헤테로사이클릭 및 헤테로아릴알킬을 포함하는 바람직한 리스트를 갖는 추가 치환 그룹이다. 여기에 기재된 화합물 내에서 선택된 치환체는 반복적 등급으로 존재한다.

여기에 사용된 용어 "알킬"은 최대 24개 탄소 원자를 함유하는 포화 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬 그룹의 예는 비제한적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, n-헥실, 옥틸, 데실, 도데실 및 이와 유사한 것을 포함한다. 알킬 그룹은 전형적으로 1개 내지 약 24개 탄소 원자, 더욱 전형적으로 1개 내지 약 12개 탄소 원자를 포함하며, 1개 내지 약 6개 탄소 원자가 더욱 바람직하다. 여기에 사용된 용어 "저급 알킬"은 1개 내지 약 6개 탄소 원자를 포함한다. 여기에 사용된 알킬 그룹은 하나 또는 그 이상의 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "알켄일"은 최대 24개 탄소 원자를 함유하고 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 사슬 라디칼을 의미한다. 알켄일 그룹의 예는 비제한적으로 에텐일, 프로펜일, 부텐일, l-메틸-2-부텐-l-일, 1,3 -부타디엔과 같은 디엔 및 이와 유사한 것을 포함한다. 알켄일 그룹은 전형적으로 2개 내지 약 24개 탄소 원자, 더욱 전형적으로 2개 내지 약 12개 탄소 원자를 포함하며, 2개 내지 약 6개 탄소 원자가 더욱 바람직하다. 여기에 사용된 알켄일 그룹은 하나 또는 그 이상의 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "알킨일"은 최대 24개 탄소 원자를 함유하고 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킨일 그룹의 예는 비제한적으로 에틴일, 1-프로핀일, 1-부틴일, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 알킨일 그룹은 전형적으로 2개 내지 약 24개 탄소 원자, 더욱 전형적으로 2개 내지 약 12개 탄소 원자를 포함하며, 2개 내지 약 6개 탄소 원자가 더욱 바람직하다. 여기에 사용된 알킨일 그룹은 하나 또는 그 이상의 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "아실"은 유기산으로부터 하이드록실 그룹을 제거하여 형성된 라디칼을 의미하며 일반식 -C(O)-X를 가지며 여기서 X는 전형적으로 지방족, 지환족 또는 방향족이다. 예에는 지방족 카르보닐, 방향족 카르보닐, 지방족 설폰일, 방향족 설핀일, 지방족 설핀일, 방향족 포스페이트, 지방족 포스페이트 및 이와 유사한 것이 포함된다. 여기에 사용된 아실 그룹은 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

용어 "지환족"은 고리가 지방족인 환형 고리 시스템을 의미한다. 고리 시스템은 적어도 하나의 고리가 지방족인 하나 이상의 고리를 포함할 수 있다. 바람직한 지환족은 고리 내에 약 5개 내지 약 9개 탄소 원자를 갖는 고리를 포함한다. 여기에 사용된 지환족은 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "지방족"은 최대 24개 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미하는데 여기서 임의 두 개의 탄소 원자 사이의 포화는 단일, 이중, 또는 삼중 결합이다. 지방족 그룹은 바람직하게는 1개 내지 약 24개 탄소 원자, 더욱 전형적으로 1개 내지 약 12개 탄소 원자를 함유하며, 1개 내지 약 6개 탄소 원자가 더욱 바람직하다. 지방족 그룹의 직쇄 또는 측쇄에는 질소, 산소, 황 및 인을 포함하는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자가 삽입될 수 있다. 헤테로원자가 삽입된 이러한 지방족 그룹은 폴리알콕시, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민, 및 폴리이민을 포함한다. 여기에 사용된 지방족 그룹은 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "알콕시"는 알킬 그룹과 산소 원자 사이에 형성된 라디칼을 의미하여 여기서 산소 원자는 알콕시 그룹을 모분자에 부착시키기 위해 사용된다. 알콕시 그룹의 예는 비제한적으로 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시, 네오펜톡시, n-헥스옥시 및 이와 유사한 것을 포함한다. 여기에 사용된 알콕시 그룹은 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "아미노알킬"은 아미노 치환된 C＼-Cn 알킬 라디칼을 의미한다. 상기 라디칼의 알킬 부분은 모분자와 공유 결합을 형성한다. 아미노 그룹은 임의 위치에 위치할 수 있으며 아미노알킬 그룹은 알킬 및/또는 아미노 부분에서 추가 치환체 그룹으로 치환될 수 있다.

여기에 사용된 용어 "아르알킬" 및 "아릴알킬"은 C＼-Cn 알킬 라디칼에 공유결합으로 연결된 방향족 그룹을 의미한다. 야기된 아르알킬 (또는 아릴알킬)의 알킬 라디칼 부분은 모분자와 공유 결합을 형성한다. 예로는 비제한적으로 벤질, 펜에틸 및 이와 유사한 것이 포함된다. 여기에 사용된 아르알킬 그룹은 선택적으로, 라디칼 그룹을 형성하는 알킬, 아릴 또는 두 그룹 모두에 결합된 추가 치환체 그룹을 포함할 수 있다.

여기에 사용된 용어 "아릴" 및 "방향족"은 하나 또는 그 이상의 방향족 고리를 갖는 모노- 또는 폴리 사이클릭 카르보사이클릭 고리 시스템 라디칼을 의미한다. 아릴 그룹의 예는 비제한적으로 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인단일, 이덴일 및 이와 유사한 것을 포함한다. 바람직한 아릴 고리 시스템은 하나 또는 그 이상의 고리 내에 약 5개 내지 약 20개 탄소 원자를 갖는다. 여기에 사용된 아릴 그룹은 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "할로" 및 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 및 요오드로부터 선택되는 원자를 의미한다.

여기에 사용된 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로방향족"은 고리 중 적어도 하나가 방향족이고 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 포함하는 모노- 또는 폴리-사이클릭 방향족 고리, 고리 시스템 또는 융합 고리 시스템을 포함하는 라디칼을 의미한다. 헤테로아릴은 또한 융합 고리 중 하나 또는 그 이상이 헤테로원자를 함유하지 않는 시스템을 포함하는 융합 고리 시스템을 포함하는 것으로 의미된다. 헤테로아릴 그룹은 전형적으로 황, 질소 또는 산소로부터 선택된 하나의 고리 원자를 포함한다. 헤테로아릴 그룹의 예는 비제한적으로 피리딘일, 피라진일, 피리미딘일, 피롤일, 피라졸일, 이미다졸일, 티아졸일, 옥사졸일, 이소옥사졸일, 티아디아졸일, 옥사디아졸일, 티오페닐, 푸란일, 퀴놀린일, 이소퀴놀린일, 벤즈이미다졸일, 벤조옥사졸일, 퀴녹살린일 및 이와 유사한 것을 포함한다. 헤테로아릴 라디칼은 직접 또는 예컨대 지방족 그룹 또는 헤테로 원자와 같은 결합 부분을 통하여 모분자에 결합될 수 있다. 여기에 사용된 헤테로아릴 그룹은 추가 치환체 그룹을 포함할 수도 있다.

여기에 사용된 용어 "헤테로아릴알킬"은 앞서 정의되고 공유결합으로 연결된 C₁-C₁₂ 알킬 라디칼을 더욱 포함하는 헤테로아릴 그룹을 의미한다. 야기된 헤테로아릴알킬 그룹의 알킬 라디칼 부분은 모분자와 공유 결합을 형성할 수 있다. 예로는 비제한적으로 피리딘일메틸, 피리미딘일에틸, 나프티리딘일프로필 및 이와 유사한 것이 포함된다. 여기에 사용된 헤테로아릴알킬 그룹은 헤테로아릴 또는 알킬 부분 중 하나 또는 둘 모두에 추가 치환체 그룹을 선택적으로 포함할 수 있다.

전술한 바와 같이, 바람직한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 또한 CDN의 전구약물 형태, 특히 CDN 티오포스페이트를 포함한다. 전구약물은 약물의 물리화학적, 생체의학적, 그리고 약동학적 성질을 개량시킬 수 있다. 전통적인 전구약물은 생체 내 진행중인 변형에 의해 활성화되어 활성 약물을 형성하는 약물로서 분류된다. 전구약물 개발에 대한 이유는 전형적으로 모체 약물(parent drug)과 관련된 나쁜 수성 용해도, 화학적 불안정성, 낮은 경구 생체활용도, 혈액 뇌 장벽 침투 부족, 및 높은 처음 통과 대사(first pass metabolism)이다. 적절한 전구약물 부분은 예를 들면 다음 문헌에 기재된다: "Prodrugs and Targeted Delivery," J. Rautico, Ed., John Wiley & Sons, 2011.

사이클릭 푸린 디뉴클레오티드와 관련하여 여기에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 앞서 도면에 지시된 키랄 중심에서 또 다른 가능한 입체화학에 비하여 적어도 75% 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 형태를 의미한다. 예시로서, "실질적으로 순수한 Rp,Rp c-di-GMP 티오포스페이트"는 c-di-GMP 티오포스페이트의 Rp,Sp 및 Sp,Sp 형태와 관련하여 적어도 75% 순수일 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 적어도 85% 순수, 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 97% 순수, 및 적어도 99% 순수일 수 있다. 본 발명의 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 제조물이 "입체화학적 순수"한 것이지만, 이것이 이러한 키랄 중심에서 특정 입체화학을 갖는 제조물 내 모든 CDN이 다른 방식으로 동일하다는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들면, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 제조물은 Rp,Rp c-di-GMP 티오포스페이트 및 Rp,Rp c-di-AMP 티오포스페이트의 조합을 함유할 수 있으며, 이는 여전히 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 제조물이다. 제조물 내 모든 CDN이 이러한 키랄 중심에서 특정 입체화학을 갖는다면, 이러한 제조물은 또한 환자 치료를 위하여 도움이 되는 후술하는 또 다른 성분을 포함할 수도 있다.

여기에 기재된 CDN 조성물은, 적절한 면역 반응을 유도하거나, 개량하거나, 또는 자극하기 위한 충분한 용량으로, 단독으로 또는 약학적으로 수용가능한 부형제와 함께, 숙주에 투여될 수 있다. 면역 반응은 비제한적으로 특이성 면역 반응, 비-특이성 면역 반응, 특이성 및 비-특이성 반응 둘 모두, 내재 반응, 1차 면역 반응, 적응 면역, 2차 면역 반응, 기억 면역 반응, 면역 세포 활성화, 면역 세포 증식, 면역 세포 분화, 및 사이토카인 발현을 포함할 수 있다. 일부 구체 예에서, CDN 조성물은 1종 이상의 소정의 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 의도된 백신; 보조제; CTLA-4 및 PD-1 경로 길항제, 지질, 리포좀, 화학치료제, 면역조절 세포주, 등을 포함하는 하나 이상의 부가 조성물과 함께 투여된다.

CDN 조성물은 부가적인 치료적 또는 예방적 조성물 또는 방법 이전에, 이후에, 및/또는 이와 함께 투여될 수도 있다. 이들은 비제한적으로 B7 공동자극 분자, 인터루킨-2, 인터페론-γ, GM-CSF, CTLA-4 길항제, OX-40/OX-40 리간드, CD40/CD40 리간드, 사르그라모스팀(sargramostim), 레바미솔(levamisol), 백신 바이러스, 바실레 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin, BCG), 리포좀, 알럼(alum), 프로인트 완전 또는 불완전 보조제(Freund's complete or incomplete adjuvant), 해독된 내독소(detoxified endotoxin), 미네랄 오일, 표면 활성 물질 예컨대 리포레시틴(lipolecithin), 플루로닉(pluronic) 폴리올, 다음이온(polyanion), 펩티드, 및 오일 또는 탄화수소 에멀젼을 포함한다. 바람직하게는 세포용해성(cytolytic) T 세포 반응 대 항체 반응을 자극하는 T 세포 면역 반응을 유도하기 위한 담체가 선호되지만, 이들 두 가지 유형의 반응 모두를 자극하는 것이 또한 사용될 수도 있다. 시약이 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드 자체 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 투여될 수 있다. 담체는 항원 제시 세포 (APC) 또는 수지상 세포와 같은 세포일 수 있다. 항원 제시 세포는 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포와 같은 세포 유형을 포함한다. 또 다른 전문적인 항원-제시 세포는 단핵구, 한계 영역 쿠퍼 세포, 마이크로글리아, 랑게르한스 세포, 상호맞물린 수지상 세포(interdigitating dendritic cell), 모낭(follicular) 수지상 세포, 및 T 세포를 포함한다. 조건적 항원-제시 세포가 또한 사용될 수 있다. 조건적(facultative) 항원-제시 세포의 예는 성상세포(astrocyte), 모낭 세포(follicular cell), 내피세포(endothelium) 및 섬유아세포(fibroblast)를 포함한다. 담체는 폴리펩티드를 발현시키거나 또는 백신접종된 개체의 세포 내에서 후발적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해 변형되는 박테리아성 세포일 수 있다. 보조제, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트가 추가되어 면역 반응을 개시하거나, 증강시키거나, 또는 연장시키는 백신의 능력을 증가시킬 수 있다. 추가적인 재료 예컨대 사이토카인, 케모카인, 및 박테리아성 핵산 서열, 유사 CpG, 톨 유사(Toll-like) 수용체 (TLR) 9 효능제 뿐만 아니라 TLR 2, TLR 4, TLR 5, TLR 7, TLR 8, TLR9에 대한 부가적인 효능제, 예컨대 지질단백질, LPS, 모노포스포릴 지질 A, 리포테이코익산(lipoteichoic acid), 이미퀴모드(imiquimod), 레시퀴모드(resiquimod), 및 부가적인 레티노산-유도가능 유전자 I (RIG-I) 효능제 예컨대 폴리 I:C가 전술한 조성물에 개별적으로 또는 결합되어 사용될 수 있으며 이들이 또한 잠재적 보조제이다. 보조제의 또 다른 대표적인 예는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria) 및 코리네박테리아 포자층(Corynebacterium parvum)의 나무피(bark)로부터 정제된 균질 사포닌을 함유하는 합성 보조제 QS-21을 포함한다(McCune et al., Cancer, 1979; 43:1619). 보조제가 최적화되는 것은 이해될 것이다. 환언하면, 통상의 기술자는 사용될 최선의 보조제를 결정하기 위한 반복적인 실험에 종사할 수 있다.

부가적인 치료제와 함께 투여하기 위한 방법이 또한 해당 기술분야에 공지되어 있다(Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).

본 발명의 화합물의 보조제 성질 때문에, 이들의 사용은 또 다른 백신, 보조제, 항원, 항체, 및 면역 조절제를 포함하는 또 다른 치료제와 결합될 수 있다. 예시가 이하에서 제시된다.

보조제

전술한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드(들)에 추가하여, 본 발명의 조성물은 자신의 특성으로 인하여, 비활성 종양 세포(들)에 존재하는 암 항원에 대응하여 면역계를 자극하거나 다른 방식으로 활용할 수 있는 1종 이상의 추가 물질을 더욱 포함할 수 있다. 이러한 보조제는 비제한적으로 지질, 리포좀, 내재 면역(예컨대, 비활성화된 또는 감쇄된 리스테리아 모노사이토게네스 ( Listeria monocytogenes ))을 유도하는 비활성 박테리아, 톨 유사(Toll-like) 수용체 (TLR), (NOD)-유사 수용체 (NLR), 레티노산 유도가능 유전자-기반 (RIG)-I-유사 수용체 (RLR), 및/또는 C-타입 렉틴 수용체 (CLRs)를 통해 내재 면역 활성을 매개하는 조성물을 포함한다. PAMP의 예는 지질단백질, 지질폴리펩티드, 펩티도글리칸, 지모산(zymosan), 리포폴리사카라이드, 네이세리알 포린(neisserial porin), 플라젤린(flagellin), 프로필린(profillin), 갈락토세르아마이드, 무라밀 디펩티드를 포함한다. 펩티도글리칸, 지질단백질, 및 리포테이코익산(lipoteichoic acid)이 그람-양성(Gram-positive)의 세포 벽 성분이다. 리포폴리사카라이드는 한 예로서 MPL와 함께, 대부분의 박테리아에 의해 발현된다. 플라젤린(flagellin)은 병원체성 및 공생적 박테리아에 의해 분비되는 박테리아성 플라젤라의 구조적 성분이다. α-갈락토실세라마이드(α-GalCer)는 자연 살해 T (NKT) 세포의 활성제이다. 무라밀 디펩티드는 모든 박테리아에 일반적인 생물활성 펩티도글리칸 모티브이다. 이러한 나열은 제한적인 것을 의미하는 것이 아니다. 바람직한 보조제 조성물을 이하에서 설명한다.

CTLA-4 및 PD-1 경로 길항제

CTLA-4는 적응 면역 반응의 중요한 음성 조절자로 인식된다. 활성화된 T 세포는 CTLA-4를 상향조절하며, 이는 CD28보다 더 큰 친화도로 항원-제시 세포 상의 CD80와 CD86에 결합하여, T-세포 자극, IL-2 유전자 발현 및 T-세포 증식을 억제한다. CTLA4 봉쇄의 항-종양 효과는 대장암, 전이성 전립선암, 및 전이성 흑색종의 쥐 모델에서 관찰되었다.

이필리무마브(ipilimumab) (Yervoy^TM) 및 트레멜리무마브(tremelimumab)는 인간 CTLA4에 결합하고 CD80 및 CD86과의 상호작용을 방지하는 인간화 단일클론 항체이다. 이필리무마브(ipilimumab) 및 트레멜리무마브(tremelimumab)를 사용하는 단계 I 및 II 연구가 암 환자의 임상 활성도를 실증하였다. 유사한 전략에 의해 표적이 될 수 있는 또 다른 음성 면역 조절자는 예정된 세포 사멸 1, B 및 T 림프구 감쇠기, 전환 성장 인자 베타 β, 인터루킨-10, 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한다.

PD-1은 활성화된 T-세포 상에서 발현되는 적응 면역 반응의 또 다른 음성 조절자이다. PD-1은 B7-H1 및 B7-DC에 결합하고, PD-1의 개입은 T-세포 활성을 억제한다. 항-종양 효과는 PD-1 경로 봉쇄에서 실증되었다. BMS-936558, MK3475, CT-011, AMP-224 및 MDX-1106은 본 발명에서 용도를 발견할 수도 있는 PD-1 경로 봉쇄자의 예가 되는 것으로 문헌에서 보고되었다.

TLR 효능제

여기에 사용된 용어 "톨 유사(Toll like) 수용체" (즉 "TLR")는 미생물 생성물을 감지하거나 및/또는 적응 면역 반응을 개시하는 단백질 또는 이의 단편의 톨 유사(Toll-like) 수용체 패밀리의 멤버를 의미한다. 한 구체 예에서, TLR은 수지상 세포(DC)를 활성화시킨다. 톨 유사 수용체(TLR)는 미생물 병원체를 인지하는 내재 면역계의 센서로서 초기에 식별되는 패턴 인식 수용체의 패밀리이다. TLR은 류신-풍부 반복단의 엑토도메인(ectodomain), 막횡단 도메인 및 세포내 TIR (Toll/IL-1R) 도메인을 함유하는 보존된 막 스패닝 분자(conserved membrane spanning molecule)의 패밀리를 포함한다. TLR은 종종 "PAMP"(병원체 관련 분자 패턴)으로 불리는, 미생물 내 구별된 구조를 인지한다. TLR에 결합하는 리간드는 염증 및 면역에 포함되는 인자의 생성을 유도하는, 분자-내 신호전달 경로의 단계를 호출한다.

인간에 있어서, 10개 TLR이 식별되었다. 세포 표면에서 발현되는 TLR은 TLR-1,-2,-4,-5, 및 -6을 포함하며, 한편 TLR-3, -7/8, 및 -9은 ER 구획에서 발현된다. 인간 수지상 세포 서브세트는 구별되는 TLR 발현 패턴에 기초하여 식별될 수 있다. 예시로서, DC의 골수(myeloid) 또는 "전통적"인 서브세트(mDC)는 자극받을 때 TLR 1-8을 발현하고, 활성화 마커(예를 들면 CD80, CD86, MHC 클래스 I 및 II, CCR7), 전-염증성 사이토카인, 및 케모카인의 단계(cascade)가 생성된다. 이러한 자극 및 야기되는 발현의 결과는 항원-특이성 CD4+ 및 CD8+ T 세포 프라이밍(priming)이다. 이들 DC는 항원을 취하는 증강된 능력을 획득하여 적절한 형태로 T 세포에게 이들을 제시한다. 이와 대조적으로, DC의 형질(plasmacytoid) 서브세트(pDC)는 활성화될 때 단지 TLR7 및 TLR9를 발현하며, NK 세포뿐만 아니라 T-세포의 활성을 야기한다. 사멸하는 종양 세포가 DC 기능에 부정적 영향을 미칠 수 있기 때문에, TLR 효능제로 DC를 활성화시키는 것이 암의 치료를 위한 면역요법 접근법에서 항-종양 면역을 프라이밍하기에 유효한 것으로 제안되어 왔다. 또한 방사선 및 화학치료법을 사용하는 성공적인 유방암 치료가 TLR4 활성화를 요구하는 것으로 제안되어 왔다.

해당 기술분야에서 공지되고 본 발명에서 그 용도를 찾는 TLR 효능제는 비제한적으로 다음을 포함한다:

Pam3Cys, TLR-1/2 효능제;

CFA, TLR-2 효능제;

MALP2, TLR-2 효능제;

Pam2Cys, TLR-2 효능제;

FSL-1, TLR-2 효능제;

Hib-OMPC, TLR-2 효능제;

폴리리보시닉:폴리리보시티딕 산 (폴리 I:C), TLR-3 효능제;

폴리아데노신-폴리유리딜릭 산 (폴리 AU), TLR-3 효능제;

폴리-L-리신 및 카르복시메틸셀룰로오스로 안정화된 폴리이노시닉-폴리시티딜릭 산 (Hiltonol®), TLR-3 효능제;

모노포스포릴 지질 A (MPL), TLR-4 효능제;

LPS, TLR-4 효능제;

박테리아성 플라젤린(flagellin), TLR-5 효능제;

시알일(sialyl)-Tn (STn), 다수의 인간 암 세포 및 TLR-4 효능제 상에서 MUC1 뮤신과 연합된 탄수화물;

이미퀴모드(imiquimod), TLR-7 효능제;

레시퀴모드(resiquimod), TLR-7/8 효능제;

록소리빈(loxoribine), TLR-7/8 효능제; 및

비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드 (CpG-ODN), TLR-9 효능제.

이들의 보조제 성질로 인하여, TLR 효능제는 바람직하게는 또 다른 백신, 보조제 및/또는 면역 변조기와 결합되어 사용되며, 다양한 조합으로 결합될 수 있다. 따라서, 일부 구체 예에서, 전술한 바와 같이, STING에 결합하고 STING-의존성 TBK1 활성을 유도하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드, 및 수지상 세포 유도, 동원(recruitment) 및/또는 성숙(maturation)을 자극하는 하나 이상의 사이토카인을 발현하고 분비하는 비활성 종양 세포가 치료적 목적을 위하여 1종 이상의 TLR 효능제와 함께 투여될 수 있다.

항체 치료법

항체-의존성 세포-매개 세포독성(Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity, ADCC)은 세포-매개 면역 방어의 메커니즘인데 이에 의해 면역계의 주효 세포(effector cell)가 표적 세포를 용해하며, 이의 막-표면 항원은 특정 항체에 의해 결합되어 있다. 이는 항체가 체액성 면역 반응의 일부로서 감염을 제한하고 함유하도록 작용할 수 있는 메커니즘 중 하나이다. 전통적인 ADCC는 자연 살해(natural killer, NK) 세포에 의해 매개되며; 대식세포(macrophages), 호중구(neutrophils) 및 호산성백혈구(eosinophils)가 또한 ADCC를 매개할 수 있다. ADCC는 종양에 대항하여, 트라스트주마브(trastuzumab) 및 리툭시매브(rituximab)를 비롯한 치료적 단일클론 항체 활동의 중요한 메커니즘이다. 본 발명의 화합물은 ADCC를 증강시키도록 작용할 수 있다.

이하는 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있는 항체의 예시적인 목록이다.

무로모나브(Muromonab)-CD3: 기관, 예컨대 신장, 이식의 극심한 거부를 방지하기 위하여 사용됨. 인간화 유형은 유형 1 진성 당뇨병(diabetes mellitus)에서 베타 세포의 자가면역 파괴를 억제하는데 있어서의 가능성을 나타낸다.

인플릭시마브(infliximab) (Remicade®) 및 아달리무마브(adalimumab) (Humira®): 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)에 결합함. 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis), 크론병(Crohns disease)과 같은 일부 염증성 질병에서 사용됨.

오말리주마브(Omalizumab) (Xolair®). IgE에 결합하여 IgE가 비만세포(mast cells)에 결합하는 것을 방지함. 알레르기성 천식에 사용됨.

다클리주마브(Daclizumab)(Zenapax®). 활성화된 T 세포의 표면에서 노출된 IL-2 수용체의 일부에 결합함. 이식된 신장의 극심한 거부를 방지하기 위하여 사용됨.

리툭시매브(rituximab) (상표명 = Rituxan®). 대부분의 B-세포에서 발견되는 CD20 분자에 결합하고 B-세포 림프종(lymphomas)을 치료하기 위해 사용됨.

이브리투모마브(ibritumomab) (상표명 = Zevalin®). 이것은 동위원소에 켠쥬게이트된 B 세포 (및 림프종) 상의 CD20 분자에 대항하는 단일클론 항체이다. 리툭산(Rituxan)에 의해 보충되는 림프종 환자에게 제공됨.

토시투모마브(Tositumomab) (Bexxar®). 이는 CD20 및 방상선 동위원소 요드-131(131I)에 대한 단일클론 항체의 콘쥬게이트이다.

세툭시마브(Cetuximab) (Erbitux®). HER1, 즉 일부 종양 세포(일부 유방암, 림프종)에서 발견되는 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF)에 대한 수용체를 봉쇄함.

트라스트주마브(trastuzumab) (Herceptin®). HER2, 즉 일부 유방암의 20%에서 과발현되는 성장 인자 수용체를 봉쇄함.

Adcetris®. 단일클론 항체의 콘쥬게이트로서, CD30 즉 일부 림프종 세포에 의해 발현되는 세포-표면 분자에 결합하지만, 골수(bone marrow)를 재생산하는데 필요한 정상 줄기 세포 상에는 발견되지 않음.

알렘투주마브(Alemtuzumab)(Campath-1H®). CD52 즉 림프구 상에서 발견되는 분자에 결합하여 T 세포 및 B 세포 둘 모두를 고갈시킴. 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)의 완벽한 진정을 생성하였으며 신장 이식 거부를 예방하는데 가능성을 제시함.

림(Lym)-1 (Oncolym®). 림프종 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있는 HLA-DR-인코딩된 조직적합 항원에 결합함.

종양에 대한 신체의 면역 반응을 증강시키도록 작용하는 이필리무마브(ipilimumab) (Yervoy®).

비탁신(Vitaxin). 종양의 혈관에서 발견되고 정상 조직을 제공하는 혈관에서는 발견되지 않는 혈관 인테그린(vascular integrin) (알파-v/베타-3)에 결합함. 단계 II 임상 시험에서, 비탁신(Vitaxin)은 유해한 부작용 없이 고형 종양을 축소시키는 일부 가능성을 제시했다.

베바시주마브(Bevacizumab) (Avastin®). 자신의 수용체에 결합하는 것을 방지하는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 결합함. 대장암의 치료에 사용됨.

이브식시마브(Abciximab) (ReoPro®). 통상 피브리노겐에 의해 연결되는 자신의 표면에서 수용체에 결합하여 혈소판의 응집을 억제함. 혈관형성술(angioplasty)을 수행한 환자의 관상 동맥의 재봉쇄(reclogging)를 방지하는데 유용함.

전달제

리포좀은 인지질의 하나("단일라멜라") 또는 그보다 많은("다중라멜라") 층으로부터 형성되는 소포체이다. 인지질 형성 블록의 양친매성(amphipathic) 특징으로 인하여, 리포좀은 전형적으로 친수성 외부면을 제공하고 친수성 코어를 밀봉하는 친수성 층을 포함한다. 친수성/소수성 성분의 포함, 이들의 비-독성 설질, 생물분해성, 생체적합성, 보조성(adjuvanticity), 세포 면역의 유도, 대식 세포에 의한 지속적 방출 및 즉각적 흡수에 있어서 리포좀의 융통성이 이들을 항원 전달에 대한 매력적인 후보로 만든다.

그 전체가 여기서 참조로서 수록되는 WO2010/104833이 적절한 리포좀 제조를 기재한다. 이러한 리포좀 제제(liposomal formulation)는, 여기서 VesiVax® (Molecular Express, Inc.)라 불리는데, 전술한 "면역원(immunogenic) 폴리펩티드(들) 또는 탄수화물(들)"이 있거나 또는 없이, 1종 이상의 부가 성분 예컨대 펩티도글리칸, 지질펩티드, 리포폴리사카라이드, 모노포스포릴 지질 A, 리포테이코익산(lipoteichoic acid), 레시퀴모드(resiquimod), 이미퀴모드(imiquimod), 플라젤린(flagellin), 올리고뉴클레오티드 함유 비메틸화된 CpG 모티브, 베타-갈락토실세라마이드, 무라밀 디펩티드, 전체-트란스(trans) 레티노산, 이중-가닥 바이러스 RNA, 열 충격 단백질, 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드, 양이온 계면활성제, 톨 유사(Toll-like) 수용체 효능제, 디미리스토일(dimyristoyl)트리메틸암모늄프로판, 및 노드-유사(nod-like) 수용체 효능제를 함유할 수 있다. 유리하게는, 이러한 리포좀 제제는 본 발명에 따르는 하나 이상의 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드를 전달하도록 사용될 수 있다.

더욱이, 전술한 리포좀 제제가 면역원 폴리펩티드 또는 탄수화물을 리포좀에 부착하기 위한 앵커(anchor)로서 "스테로이드 유도체"를 사용하는 한편, 스테로이드는 단순히 비컨쥬게이트된 스테로이드 예컨대 콜레스테롤로서 제공될 수 있다.

지질 혼합물로부터 리포좀을 제조하는 적절한 방법은 해당 분야에서 공지되어 있다. 예컨대 다음을 참조하라, Basu & Basu, Liposome Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2002; Gregoriadis, Liposome Technology, 3 ^rd Edition, Informa HealthCare, 2006. 바람직한 방법은 상기 문헌에 기재된 압출, 균질화, 및 초음파 방법을 포함한다. 본 발명에서의 사용을 위한 예시적인 리포좀 제조 방법은 WO2010/104833에 개시되며, 이는 지질 혼합물을 건조시키고, 후속하여 수성 운반체 내에서의 수화(hydration) 및 초음파(sonication)에 의해 리포좀을 형성하는 것을 포함한다.

일부 구체 예에서, 리포좀은 특정 평균 크기 범위 내에서 제공된다. 리포좀 크기는 예를 들면, 사전선택된 공극 크기를 갖는 막을 통하여 리포좀을 포함하는 수성 운반체를 압출하고, 상기 막을 통하여 흐르는 물질을 수집함으로써 선택될 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 리포좀은 실질적으로 직경이 50 내지 500 nm, 더욱 바람직하게는 실질적으로 직경이 50 내지 200 nm, 및 가장 바람직하게는 실질적으로 직경이 50 내지 150 nm가 되도록 선택된다. 본 문맥 내에서 여기에 사용된 용어 "실질적으로"는 리포좀의 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 지정된 범위 내에 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 또 다른 지질 및 지질-유사 보조제는 수중유(oil-in-water, o/w) 에멀젼(예컨대 다음문헌 참조, Muderhwa et al., J. Pharmaceut. Sci. 88: 1332-9, 1999)), VesiVax® TLR (Molecular Express, Inc.), 디기토닌(digitonin) (예컨대 다음문헌 참조,미국 특허 5,698,432), 및 글루코피라노실(glucopyranosyl) 지질(예컨대 다음문헌 참조, 미국 특허 출원 20100310602)을 포함한다.

나노입자는 또한 대부분의 투여 경로에 대하여 적절한 약물 전달 시스템을 제시한다. 수년 동안, 다양한 천연 및 합성 폴리머가 나노입자 제조를 위하여 개발되었으며, 이들 중 폴리(락틱산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 및 이들의 공중합체(PLGA)가 광범위하게 연구되었는데 이는 이들의 생체적합성 및 생물분해성 때문이다. 나노입자 및 또 다른 나노담체는 일부 유형의 약물 예컨대 항암제, 항고혈압제, 면역조절제, 및 호르몬; 및 거대분자 예컨대 핵산, 단백질, 펩티드, 및 항체를 위한 유능한 담체로서 작용한다. 예컨대 다음문헌 참조, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 21:387-422, 2004; Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 1:22-30, 2005.

화학치료제

또 다른 구체 예에서 방법은 부가적인 치료로서 1종 이상의 화학치료제의 효과량을 객체에게 투여하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체 예에서 상기 1종 이상의 화학치료제는 아비라테론(abiraterone) 아세테이트, 알트레타민(altretamine), 안하이드로빈블라스틴(anhydrovinblastine), 아우리스타틴(auristatin), 벡사로텐(bexarotene), 비칼루타마이드, BMS 184476, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐)벤젠 설폰아마이드, 블레오마이신, N,N-디메틸-L-발일-L-발일-N-메틸-L-발일-L-프로일- 1-L프롤린(Lproline)-t-부틸아마이드, 카켁틴(cachectin), 세마도틴(cemadotin), 클로람부실(chlorambucil), 사이클로포스파마이드, 3',4'-디데하이드로-4'-데옥시-8'-노르빈-칼루코블라스틴, 도세탁솔(docetaxol), 도제탁셀(doxetaxel), 사이클로포스파마이드, 카르보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(carmustine), 시스플라틴(cisplatin), 크립토피신(cryptophycin), 사이클로포스파마이드, 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine, DTIC), 닥티노미신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데시타빈(decitabine) 돌라스타틴(dolastatin), 독소루비신(doxorubicin) (아드리아미신(adriamycin)), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실, 피나스테리드(finasteride), 플루타마이드, 하이드록시우레아 및 하이드록시우레아탁산, 인포스파마이드, 리아로졸(liarozole), 로니다민(lonidamine), 로무스틴(lomustine) (CCNU), MDV3100, 메클로레타민(mechlorethamine) (니트로젠 머스타드), 멜팔란(melphalan), 미보불린 이세티오네이트(mivobulin isethionate), 리좆ㄱ신(rhizoxin), 세르테네프(sertenef), 스트렙토조신(streptozocin), 미토미신(mitomycin), 메토트렉사이트(methotrexate), 타자네스(taxanes), 닐룩타마이드, 오나프리스톤(onapristone), 파클리탁셀(paclitaxel), 프레드니무스틴(prednimustine), 프로카르바진(procarbazine), RPR109881, 스트라무스틴(stramustine) 포스페이트, 타목시펜(tamoxifen), 타소네르민(tasonermin), 탁솔(taxol), 트레티노인(tretinoin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신 설페이트(vindesine sulfate), 및 빈플루닌(vinflunine)으로부터 선택된다.

면역조절 세포주

"비활성 종양 세포"는 세포의 분열을 방지하도록 처리된 종양 세포(환자에 대하여 "자가유래(autologous)" 또는 "동종이계(allogeneic)"인) 종양 세포를 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 이러한 세포는 자신의 면역원성(immunogenicity) 및 자신의 대사 활동을 유지한다. 이러한 종양 세포는 암 치료의 일부로서 환자에서 발현되는 이식유전자(transgene)를 발현하도록 유전적으로 변조된다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 백신은 치료를 받고 있는 환자에 대하여 자가유래(autologous) 또는 동종이계(allogeneic)인 신생물(neoplastic)(예컨대, 종양) 세포를 포함한다. 예를 들면, 흑색종을 앓고 있는 환자에게는 전형적으로 흑색종으로부터 유래된 유전적으로 변조된 세포가 투여될 것이다. 예컨대 방사선 사용과 같은 본 발명에서의 사용을 위한 종양 세포를 비활성화시키는 방법은 해당 분야에서 공지되어 있다.

본 발명의 비활성 종양 세포는 1종 이상의 공동자극 분자들 또는 시약과 함께 환자에게 투여된다. 바람직한 공동자극 시약은 수지상 세포 유도, 동원, 및/또는 성숙을 자극하는 1종 이상의 사이토카인을 포함한다. 이러한 공동자극 시약을 평가하는 방법은 문헌에 공지되어 있다. DC의 유도 및 성숙은 전형적으로 자극 이후, 일부 막 분자(membrane molecule) 예컨대 CD80 및 CD86의 증가된 발현, 및/또는 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인, 예컨대 IL-12 및 유형 I 인터페론의 분비에 의해 평가된다.

바람직한 구체 예에서, 비활성 종양 세포 자신은 수지상 세포 유도, 동원, 및/또는 성숙을 자극하는 1종 이상의 사이토카인을 발현하고 분비하도록 변조된다. 본 발명은 GM-CSF의 사용에 대한 예시에 대하여 기재된다. 따라서, 예시로서, 종양 세포는 GM-CSF를 인코딩하는 이식유전자를 발현하며 이는 미국 특허번호 5,637,483, 5,904,920, 6,277,368 및 6,350,445, 뿐만 아니라 미국 특허 공개번호 20100150946에 기재되어 있으며, 이들은 여기에 참조로서 명백하게 수록된다. 췌장암 치료를 위한 GM-CSF-발현 유전적 변조 암 세포 또는 "사이토카인-발현 세포 백신"의 형태가 미국 특허번호 6,033,674 및 5,985,290에 기재되며, 이들 둘 모두는 여기에 참조로서 명백하게 수록된다.

GM-CSF를 대체하여 또는 이와 함께 비활성 종양 세포 및/또는 방관자 세포에 의해 발현될 수 있는 또 다른 적절한 사이토카인은 비제한적으로 CD40 리간드, IL-12, CCL3, CCL20, 및 CCL21 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 나열은 제한적인 것을 의미하는 것이 아니다.

객체에 투여되는 비활성 종양 세포가 1종 이상의 해당 사이토카인을 발현하는 것이 바람직한 한편, 종양 세포주는 비활성화된 방관자 세포주에 의해 동반될 수 있는데 이는 수지상 세포 유도, 동원, 및/또는 성숙을 자극하는 1종 이상의 사이토카인을 발현하고 분비한다. 방관자 세포주는 수지상 세포 유도, 동원, 및/또는 성숙을 자극하는 모든 사이토카인을 제공할 수 있거나, 또는 비활성 종양 세포에 의해 발현되고 분비되는 수지상 세포 유도, 동원, 및/또는 성숙을 자극하는 사이토카인을 보완할 수 있다. 예시로서, 면역조절 사이토카인-발현 방관자 세포주는 미국 특허번호 6,464,973, 및 8,012,469, Dessureault et al., Ann. Surg. Oncol. 14: 869-84, 2007, 및 Eager and Nemunaitis, Mol. Ther. 12: 18-27, 2005에 기재되어 있으며, 이들 각각은 여기에 참조로서 명백하게 수록된다.

"과립구-대식세포 집락 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 폴리펩티드"는 면역조절 활성을 갖고 유전자은행 가입 번호 AAA52122.1에 대해 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 사이토카인 또는 이의 단편을 의미한다.

백신

일부 구체 예에서, CDN 조성물은 1종 이상의 소정의 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 의도된 1종 이상의 백신과 함께 투여된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표적 항원의 예가 아래 표에 수록된다. 표적 항원은 또한 표에 수록된 항원의 면역학적으로 활성 부분을 포함하는 단편 또는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 나열은 제한적인 것을 의미하는 것이 아니다.

표 1. 항원.
항원	참조
종양 항원
메소텔린(mesothelin)	유전자은행 가입 번호 NM_005823; U40434; NM_013404; BC003512 (또한 예컨대 다음문헌 참조, Hassan, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:3937-3942; Muminova, et al. (2004) BMC Cancer 4:19; Iacobuzio-Donahue, et al. (2003) Cancer Res. 63:8614-8622).
윌름(Wilms) 종양-1 관련 단백질(Wt-1), 동종체(isoform)　A; 동종체　B; 동종체 C; 동종체　D를 포함함.	WT-1 동종체 A (유전자은행 가입 번호 NM_000378; NP_000369). WT-1 동종체　B (유전자은행 가입 번호 NM_024424; NP_077742). WT-1 동종체　C (유전자은행 가입 번호 NM_024425; NP_077743). WT-1 동종체　D (유전자은행 가입 번호 NM_024426; NP_077744).
각질층 키모트립신형 효소(Stratum corneum chymotryptic enzyme, SCCE), 및 이의 변종.	유전자은행 가입 번호 NM_005046; NM_139277; AF332583. 또한 예컨대 다음문헌 참조, Bondurant, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:3446-3454; Santin, et al. (2004) Gynecol. Oncol. 94:283-288; Shigemasa, et al. (2001) Int. J. Gynecol. Cancer 11:454-461; Sepehr, et al. (2001) Oncogene 20:7368-7374.
MHC　클래스　I 사슬-관련 단백질　A (MICA); MHC　클래스　I 사슬-관련 단백질　A (MICB).	예컨대 다음문헌 참조, Groh, et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:6461-6466; 유전자은행 가입 번호 NM_000247; BC_016929; AY750850; NM_005931.
가스트린 및 가스트린으로부터 유래한 펩티드; 가스트린/CCK-2 수용체 (또한 CCK-B로 알려져 있음).	Harris, et al. (2004) Cancer Res. 64:5624-5631; Gilliam, et al. (2004) Eur. J. Surg. Oncol. 30:536-543; Laheru and Jaffee (2005) Nature Reviews Cancer 5:459-467.
글리피칸(Glypican)-3 (예컨대, 간암(hepatocellular carcinoma) 및 흑색종의 항원).	유전자은행 가입 번호 NM_004484. Nakatsura, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:16-25; Capurro, et al. (2003) Gasteroenterol. 125:89-97; Nakatsura, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:6612-6621).
코악토신(Coactosin)-유사 단백질.	Nakatsura, et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:826-836; Laheru and Jaffee (2005) Nature Reviews Cancer 5:459-467.
전립선 줄기 세포 항원 (PSCA).	유전자은행 가입 번호 AF043498; AR026974; AR302232 (또한 예컨대 다음문헌 참조, Argani, et al. (2001) Cancer Res. 61:4320-4324; Christiansen, et al. (2003) Prostate 55:9-19; Fuessel, et al. (2003) 23:221-228).
전립선 산성 포스파타아제 (PAP); 전립성-특이성 항원 (PSA); PSM; PSMA.	Small, et al. (2000) J. Clin. Oncol. 18:3894-3903; Altwein and Luboldt (1999) Urol. Int. 63:62-71; Chan, et al. (1999) Prostate 41:99-109; Ito, et al. (2005) Cancer 103:242-250; Schmittgen, et al. (2003) Int. J. Cancer 107:323-329; Millon, et al. (1999) Eur. Urol. 36:278-285.
전립선의 6-막횡단 상피 항원(STEAP).	예컨대 다음문헌 참조, Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442; 유전자은행 가입 번호 NM_018234; NM_001008410; NM_182915; NM_024636; NM_012449; BC011802.
전립선 암 종양 항원-1 (PCTA-1).	예컨대 다음문헌 참조, Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442; 유전자은행 가입 번호 L78132.
전립선 종양-유도 유전자-1 (PTI-1).	예컨대 다음문헌 참조, Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442).
G　단백질-커플링된 수용체에 상동인 전립선-특이성 유전자.	예컨대 다음문헌 참조, Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442).
프로스타아제(Prostase) (안트로겐 조절된 세린 프로테아제).	예컨대 다음문헌 참조, Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442; 유전자은행 가입 번호 BC096178; BC096176; BC096175.
프로테이나아제(Proteinase)　3.	유전자은행 가입 번호 X55668.
암-정소(testis) 항원, 예컨대, NY-ESO-1; SCP-1; SSX-1; SSX-2; SSX-4; GAGE, CT7; CT8; CT10; MAGE-1; MAGE-2; MAGE-3; MAGE-4; MAGE-6; LAGE-1.	유전자은행 가입 번호 NM_001327 (NY-ESO-1) (또한 예컨대 다음문헌 참조, Li, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:1809-1814; Chen, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101(25):9363-9368; Kubuschok, et al. (2004) Int. J. Cancer. 109:568-575; Scanlan, et al. (2004) Cancer Immun. 4:1; Scanlan, et al. (2002) Cancer Res. 62:4041-4047; Scanlan, et al. (2000) Cancer Lett. 150:155-164; Dalerba, et al. (2001) Int. J. Cancer 93:85-90; Ries, et al. (2005) Int. J. Oncol. 26:817-824.
MAGE-A1, MAGE-A2; MAGE-A3; MAGE-A4; MAGE-A6; MAGE-A9; MAGE-A10; MAGE-A12; GAGE-3/6; NT-SAR-35; BAGE; CA125.	Otte, et al. (2001) Cancer Res. 61:6682-6687; Lee, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2651-2656; Sarcevic, et al. (2003) Oncology 64:443-449; Lin, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5708-5716.
GAGE-1; GAGE-2; GAGE-3; GAGE-4; GAGE-5; GAGE-6; GAGE-7; GAGE-8; GAGE-65; GAGE-11; GAGE-13; GAGE-7B.	De Backer, et al. (1999) Cancer Res. 59:3157-3165; Scarcella, et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:335-341.
HIP1R; LMNA; KIAA1416; Seb4D; KNSL6; TRIP4; MBD2; HCAC5; MAGEA3.	Scanlan, et al. (2002) Cancer Res. 62:4041-4047.
유전자의 DAM 패밀리, 예컨대, DAM-1; DAM-6.	Fleishhauer, et al. (1998) Cancer Res. 58:2969-2972.
RCAS1.	Enjoji, et al. (2004) Dig. Dis. Sci. 49:1654-1656.
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대장암 관련 항원, 예컨대, NY-CO-8; NY-CO-9; NY-CO-13; NY-CO-16; NY-CO-20; NY-CO-38; NY-CO-45; NY-CO-9/HDAC5; NY-CO-41/MBD2; NY-CO-42/TRIP4; NY-CO-95/KIAA1416; KNSL6; seb4D.	Scanlan, et al. (2002) Cancer Res. 62:4041-4047.
N-아세틸글루코사민일-트란퍼라아제(Acetylglucosaminyl-tranferase) V (GnT-V).	Dosaka-Akita, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:1773-1779.
연장 인자 2 돌연변이 (Elongation factor 2 mutated, ELF2M).	Renkvist, et al. (2001) Cancer Immunol Immunother. 50:3-15.
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SAGE; HAGE.	Sasaki, et al. (2003) Eur. J. Surg. Oncol. 29:900-903.
RAGE.	예컨대 다음 참조, Li, et al. (2004) Am. J. Pathol. 164:1389-1397; Shirasawa, et al. (2004) Genes to Cells 9:165-174.
MUM-1 (흑색종 유비쿼터스 돌연변이); MUM-2; MUM-2 Arg-Gly 돌연변이; MUM-3.	Gueguen, et al. (1998) J. Immunol. 160:6188-6194; Hirose, et al. (2005) Int. J. Hematol. 81:48-57; Baurain, et al. (2000) J. Immunol. 164:6057-6066; Chiari, et al. (1999) Cancer Res. 59:5785-5792.
흑색종의 LDLR/FUT 융합 단백질 항원.	Wang, et al. (1999) J. Exp. Med. 189:1659-1667.
신장암 항원의 NY-REN 시리즈.	Scanlan, et al. (2002) Cancer Res. 62:4041-4047; Scanlan, et al. (1999) Cancer Res. 83:456-464.
유방암 항원의 NY-BR 시리즈, 예컨대, NY-BR-62; NY-BR-75; NY-BR-85; NY-BR-62; NY-BR-85.	Scanlan, et al. (2002) Cancer Res. 62:4041-4047; Scanlan, et al. (2001) Cancer Immunity 1:4.
BRCA-1; BRCA-2.	Stolier, et al. (2004) Breast J. 10:475-480; Nicoletto, et al. (2001) Cancer Treat Rev. 27:295-304.
DEK/CAN 융합 단백질.	Von Lindern, et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:1687-1697.
Ras, 예컨대, 야생형 ras, 코돈 12, 13, 59, 또는 61에서 돌연변이를 갖는 ras, 예컨대 돌연변이 G12C; G12D; G12R; G12S; G12V; G13D; A59T; Q61H. K-RAS; H-RAS; N-RAS.	유전자은행 가입 번호 P01112; P01116; M54969; M54968; P01111; P01112; K00654. 또한 예컨대 다음문헌 참조, 유전자은행 가입 번호 M26261; M34904; K01519; K01520; BC006499; NM_006270; NM_002890; NM_004985; NM_033360; NM_176795; NM_005343.
BRAF (RAF의 동종체).	Tannapfel, et al. (2005) Am. J. Clin. Pathol. 123:256-260l; Tsao and Sober (2005) Dermatol. Clin. 23:323-333.
흑색종 항원, HST-2 흑색종 세포 항원을 포함함.	유전자은행 가입 번호 NM_206956; NM_206955; NM_206954; NM_206953; NM_006115; NM_005367; NM_004988; AY148486; U10340; U10339; M77481. 예컨대 다음 참조, Suzuki, et al. (1999) J. Immunol. 163:2783-2791.
서바이빈(Survivin)	유전자은행 가입 번호 AB028869; U75285 (또한 예컨대 다음문헌 참조, Tsuruma, et al. (2004) J. Translational Med. 2:19 (11 pages); Pisarev, et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:6523-6533; Siegel, et al. (2003) Br. J. Haematol. 122:911-914; Andersen, et al. (2002) Histol. Histopathol. 17:669-675).
MDM-2	NM_002392; NM_006878 (또한 예컨대 다음문헌 참조, Mayo, et al. (1997) Cancer Res. 57:5013-5016; Demidenko and Blagosklonny (2004) Cancer Res. 64:3653-3660).
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NA88-A.	Moreau-Aubry, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1617-1624.
히스톤 데아세틸라아제 (HDAC), 예컨대, HDAC5.	Waltregny, et al. (2004) Eur. J. Histochem. 48:273-290; Scanlan, et al. (2002) Cancer Res. 62:4041-4047.
사이클로필린(Cyclophilin)　B (Cyp-B).	Tamura, et al. (2001) Jpn. J. Cancer Res. 92:762-767.
CA　15-3; CA 27.29.	Clinton, et al. (2003) Biomed. Sci. Instrum. 39:408-414.
열 충격 단백질 Hsp70.	Faure, et al. (2004) Int. J. Cancer 108:863-870.
GAGE/PAGE 패밀리, 예컨대, PAGE-1; PAGE-2; PAGE-3; PAGE-4; XAGE-1; XAGE-2; XAGE-3.	Brinkmann, et al. (1999) Cancer Res. 59:1445-1448.
MAGE-A, B, C, 및 D 패밀리. MAGE-B5; MAGE-B6; MAGE-C2; MAGE-C3; MAGE-3; MAGE-6.	Lucas, et al. (2000) Int. J. Cancer 87:55-60; Scanlan, et al. (2001) Cancer Immun. 1:4.
키네신(Kinesin)　2; TATA 요소 조절 인자　1; 종양 단백질 D53; NY	Scanlan, et al. (2001) Cancer Immun. 30:1-4.
알파-태아단백질(fetoprotein) (AFP)	Grimm, et al. (2000) Gastroenterol. 119:1104-1112.
SART1; SART2; SART3; ART4.	Kumamuru, et al. (2004) Int. J. Cancer 108:686-695; Sasatomi, et al. (2002) Cancer 94:1636-1641; Matsumoto, et al. (1998) Jpn. J. Cancer Res. 89:1292-1295; Tanaka, et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91:1177-1184.
흑색종의 바람직하게 발현된 항원 (PRAME).	Matsushita, et al. (2003) Leuk. Lymphoma 44:439-444; Oberthuer, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:4307-4313.
암배아성(Carcinoembryonic) 항원 (CEA), CAP1-6D 증강 효능제 펩티드.	유전자은행 가입 번호 M29540; E03352; X98311; M17303 (또한 예컨대 다음문헌 참조, Zaremba (1997) Cancer Res. 57:4570-4577; Sarobe, et al. (2004) Curr. Cancer Drug Targets 4:443-454; Tsang, et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:2439-2449; Fong, et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8809-8814).
HER-2/neu.	Disis, et al. (2004) J. Clin. Immunol. 24:571-578; Disis and Cheever (1997) Adv. Cancer Res. 71:343-371.
Cdk4; cdk6; p16 (INK4); Rb　단백질.	Ghazizadeh, et al. (2005) Respiration 72:68-73; Ericson, et al. (2003) Mol. Cancer Res. 1:654-664.
TEL; AML1; TEL/AML1.	Stams, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:2974-2980.
텔로머라아제(Telomerase) (TERT).	Nair, et al. (2000) Nat. Med. 6:1011-1017.
707-AP.	Takahashi, et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:1363-1370.
안넥신(Annexin), 예컨대, 안넥신(Annexin)　II.	Zimmerman, et al. (2004) Virchows Arch. 445:368-374.
BCR/ABL; BCR/ABL p210; BCR/ABL p190; CML-66; CML-28.	Cobaldda, et al. (2000) Blood 95:1007-1013; Hakansson, et al. (2004) Leukemia 18:538-547; Schwartz, et al. (2003) Semin. Hematol. 40:87-96; Lim, et al. (1999) Int. J. Mol. Med. 4:665-667.
BCL2; BLC6; CD10　단백질.	Iqbal, et al. (2004) Am. J. Pathol. 165:159-166.
CDC27 (이것은 흑색종 항원이다).	Wang, et al. (1999) Science 284:1351-1354.
정자 단백질 17 (Sperm protein 17, SP17); 14-3-3-제타; MEMD; KIAA0471; TC21.	Arora, et al. (2005) Mol. Carcinog. 42:97-108.
티로시나아제(Tyrosinase)-관련 단백질 1 및　2 (TRP-1 및 TRP-2).	유전자은행 가입 번호 NM_001922. (또한 예컨대 다음문헌 참조, Bronte, et al. (2000) Cancer Res. 60:253-258).
Gp100/pmel-17.	유전자은행 가입 번호 AH003567; U31798; U31799;U31807;　U31799 (또한 예컨대 다음문헌 참조, Bronte, et al. (2000) Cancer Res. 60:253-258).
TARP.	예컨대 다음 참조, Clifton, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:10166-10171; Virok, et al. (2005) Infection Immunity 73:1939-1946.
티로시나아제(Tyrosinase)-관련 단백질 1 및　2 (TRP-1 및 TRP-2).	유전자은행 가입 번호 NM_001922. (또한 예컨대 다음문헌 참조, Bronte, et al. (2000) Cancer Res. 60:253-258).
멜라노코르틴(Melanocortin)　1　수용체 (MC1R); MAGE-3; gp100; 티로시나아제(Tyrosinase); 도파크롬 토토머라아제(dopachrome tautomerase) (TRP-2); MART-1.	Salazar-Onfray, et al. (1997) Cancer Res. 57:4348-4355; Reynolds, et al. (1998) J. Immunol. 161:6970-6976; Chang, et al. (2002) Clin. Cancer Res. 8:1021-1032.
MUC-1; MUC-2.	예컨대 다음 참조, Davies, et al. (1994) Cancer Lett. 82:179-184; Gambus, et al. (1995) Int. J. Cancer 60:146-148; McCool, et al. (1999) Biochem. J. 341:593-600.
Spas-1.	U.S. Published Pat. Appl. No. 20020150588 of Allison, et al.
CASP-8; FLICE; MACH.	Mandruzzato, et al. (1997) J. Exp. Med. 186:785-793.
CEACAM6; CAP-1.	Duxbury, et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 317:837-843; Morse, et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:1331-1338.
HMGB1 (DNA 결합 단백질 및 사이토카인).	Brezniceanu, et al. (2003) FASEB J. 17:1295-1297.
ETV6/AML1.	Codrington, et al. (2000) Br. J. Haematol. 111:1071-1079.
선종 용종증 대장균(adenomatous polyposis coli, APC)의 돌연변이 및 야생형 형태; 베타-카테닌(catenin); c-met; p53; E-카드헤린(cadherin); 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase)-2 (COX-2).	Clements, et al. (2003) Clin. Colorectal Cancer 3:113-120; Gulmann, et al. (2003) Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 11:230-237; Jungck, et al. (2004) Int. J. Colorectal. Dis. 19:438-445; Wang, et al. (2004) J. Surg. Res. 120:242-248; Abutaily, et al. (2003) J. Pathol. 201:355-362; Liang, et al. (2004) Br. J. Surg. 91:355-361; Shirakawa, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:4342-4348.
mAB G250에 의해 결합된 신장 세포 암 항원.	Mulders, et al. (2003) Urol. Clin. North Am. 30:455-465; Steffens, et al. (1999) Anticancer Res. 19:1197-1200.
EphA2	예컨대 다음 참조, U.S. Patent Publication No. 2005/0281783 A1; 유전자은행 가입 번호 NM_004431 (human); 유전자은행 가입 번호 NM_010139 (Mouse); 유전자은행 가입 번호 AB038986 (Chicken, partial sequence); 유전자은행 가입 번호 NP_004422, AAH37166, and AAA53375 (human); 유전자은행 가입 번호 NP_034269 (mouse), AAH06954 (mouse), XP_345597 (rat), and BAB63910 (chicken).
EGFRvIII	예컨대 다음 참조, WO/2012/068360
프란시셀라 투라렌시스 ( Francisella tularensis ) 항원
프란시셀라 투라렌시스 ( Francisella tularensis) A　및　B.	Complete genome of subspecies Schu　S4 (유전자은행 가입 번호 AJ749949); of subspecies Schu　4 (유전자은행 가입 번호 NC_006570). Outer membrane protein (43 kDa) Bevanger, et al. (1988) J. Clin. Microbiol. 27:922-926; Porsch-Ozcurumez, et al. (2004) Clin. Diagnostic. Lab. Immunol. 11:1008-1015). Antigenic components of F. tularensis include, e.g., 80 antigens, including 10　kDa and 60　kDa chaperonins (Havlasova, et al. (2002) Proteomics 2:857-86), nucleoside diphosphate kinase, isocitrate dehydrogenase, RNA-binding protein Hfq, the chaperone ClpB (Havlasova, et al. (2005) Proteomics 5:2090-2103). 또한 예컨대 다음문헌 참조, Oyston and Quarry (2005) Antonie Van Leeuwenhoek 87:277-281; Isherwood, et al. (2005) Adv. Drug Deliv. Rev. 57:1403-1414; Biagini, et al. (2005) Anal. Bioanal. Chem. 382:1027-1034.
말라리아 항원
포자소체 단백질(Circumsporozoite protein, CSP); SSP2; HEP17; P. 팔시파룸(P.　falciparum)에서 발견되는 Exp-1 오솔로그(ortholog); 및 LSA-1.	예컨대 다음 참조, Haddad, et al. (2004) Infection Immunity 72:1594-1602; Hoffman, et al. (1997) Vaccine 15:842-845; Oliveira-Ferreira and Daniel-Ribeiro (2001) Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 96:221-227. CSP (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AB121024). SSP2 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AF249739). LSA-1 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 Z30319).
링-감염된 적혈구 표면 단백질(Ring-infected erythrocyte surface protein, RESA); 낭충 표면 단백질 2(merozoite surface protein　2, MSP2); Spf66; 낭충 표면 단백질　1(MSP1); 195A; BVp42.	예컨대 다음 참조, Stirnadel, et al. (2000) Int. J. Epidemiol. 29:579-586; Krzych, et al. (1995) J. Immunol. 155:4072-4077. 또한 다음 참조, Good, et al. (2004) Immunol. Rev. 201:254-267; Good, et al. (2004) Ann. Rev. Immunol. 23:69-99. MSP2 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 X96399; X96397). MSP1 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 X03371). RESA (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 X05181; X05182).
정단막(Apical membrane) 항원　1 (AMA1).	예컨대 다음 참조, Gupta, et al. (2005) Protein Expr. Purif. 41:186-198. AMA1 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 A`13; AJ494905; AJ490565).
바이러스 및 바이러스 항원
간염 A	유전자은행 가입 번호, e.g., NC_001489; AY644670; X83302; K02990; M14707.
간염 B	Complete genome (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AB214516; NC_003977; AB205192; AB205191; AB205190; AJ748098; AB198079; AB198078; AB198076; AB074756).
간염 C	Complete genome (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_004102; AJ238800; AJ238799; AJ132997; AJ132996; AJ000009; D84263).
간염 D	유전자은행 가입 번호 예컨대 NC_001653; AB118847; AY261457.
인간 유두종바이러스로서, 모든 200+ 하부유형 (16 그룹으로 분류됨), 예컨대 고위험 하부유형 16, 18, 30, 31, 33, 45를 포함함.	예컨대 다음 참조, Trimble, et al. (2003) Vaccine 21:4036-4042; Kim, et al. (2004) Gene Ther. 11:1011-1018; Simon, et al. (2003) Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 109:219-223; Jung, et al. (2004) J. Microbiol. 42:255-266; Damasus-Awatai and Freeman-Wang (2003) Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 15:473-477; Jansen and Shaw (2004) Annu. Rev. Med. 55:319-331; Roden and Wu (2003) Expert Rev. Vaccines 2:495-516; de Villiers, et al. (2004) Virology 324:17-24; Hussain and Paterson (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:577-586; Molijn, et al. (2005) J. Clin. Virol. 32 (Suppl. 1) S43-S51. 유전자은행 가입 번호 AY686584; AY686583; AY686582; NC_006169; NC_006168; NC_006164; NC_001355; NC_001349; NC_005351; NC_001596).
인간 T-세포 림프친화 바이러스(Human T-cell lymphotropic virus, HTLV) 유형 I 및 II로서, HTLV　유형　I 하부유형 코스모폴리탄(Cosmopolitan), 중앙 아프리카, 및 오스트로-멜라네시안(Austro-Melanesian), 및 HTLV　유형　II 하부유형 Iia, Iib, Iic, 및 Iid를 포함함.	예컨대 다음 참조, Capdepont, et al. (2005) AIDS Res. Hum. Retrovirus 21:28-42; Bhigjee, et al. (1999) AIDS Res. Hum. Restrovirus 15:1229-1233; Vandamme, et al. (1998) J. Virol. 72:4327-4340; Vallejo, et al. (1996) J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 13:384-391. HTLV type I (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY563954; AY563953. HTLV type　II (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 L03561; Y13051; AF139382).
코로나바이러스과(Coronaviridae)로서, 코로나바이러스, 예컨대 SARS-코로나바이러스 (SARS-CoV), 및 토로바이러스(Toroviruses)를 포함함.	예컨대 다음 참조, Brian and Baric (2005) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 287:1-30; Gonzalez, et al. (2003) Arch. Virol. 148:2207-2235; Smits, et al. (2003) J. Virol. 77:9567-9577; Jamieson, et al. (1998) J. Infect. Dis. 178:1263-1269 (유전자은행 가입 번호 AY348314; NC_004718; AY394850).
풍진 바이러스(Rubella virus).	유전자은행 가입 번호 NC_001545; AF435866.
볼거리 바이러스(Mumps virus)로서, 유전자형 A, C, D, G, H, 및 I를 포함함.	예컨대 다음 참조, Orvell, eta l. (2002) J. Gen. Virol. 83:2489-2496. 예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY681495; NC_002200; AY685921; AF201473.
콕사키 바이러스 A(Coxsackie virus　A)로서, 혈청형(serotype) 1, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 및 24 (또한 인간 장내바이러스 C(Human enterovirus C); HEV-C로 알려져 있음)를 포함함.	예컨대 다음 참조, Brown, et al. (2003) J. Virol. 77:8973-8984. 유전자은행 가입 번호 AY421768; AY790926: X67706.
콕사키 바이러스　B로서, 하부유형 1-6을 포함함.	예컨대 다음 참조, Ahn, et al. (2005) J. Med. Virol. 75:290-294; Patel, et al. (2004) J. Virol. Methods 120:167-172; Rezig, et al. (2004) J. Med. Virol. 72:268-274. 유전자은행 가입 번호 X05690.
인간 장내바이러스로서, 예컨대 예컨대 인간 장내바이러스 A (HEV-A, CAV2 to CAV8, CAV10, CAV12, CAV14, CAV16, 및 EV71)를 포함하며, 또한 HEV-B (CAV9, CBV1 내지 CBV6, E1 내지 E7, E9, E11 내지 E21, E24 내지 E27, E29 내지 E33, 그리고 EV69 및 E73), 뿐만 아니라 HEV를 포함함.	예컨대 다음 참조, Oberste, et al. (2004) J. Virol. 78:855-867. 인간 장내바이러스　A (유전자은행 가입 번호 NC_001612); 인간 장내바이러스　B (NC_001472); 인간 장내바이러스　C (NC_001428); 인간 장내바이러스　D (NC_001430). 유인원 장내바이러스(Simian enterovirus)　A (유전자은행 가입 번호 NC_003988).
폴리오바이러스(Polioviruses)로서 PV1, PV2, 및 PV3을 포함함.	예컨대 다음 참조, He, et al. (2003) J. Virol. 77:4827-4835; Hahsido, et al. (1999) Microbiol. Immunol. 43:73-77. 유전자은행 가입 번호 AJ132961 (type　1); AY278550 (type　2); X04468 (type　3).
바이러스성 엔세팔리티드(encephalitide) 바이러스, 말뇌염(equine encephalitis), 베네스웰라형 말뇌염(Venezuelan equine encephalitis) (VEE) (서브유형 IA, IB, IC, ID, IIIC, IIID 포함), 동부형 말뇌염(Eastern equine encephalitis) (EEE), 서부형 말뇌염(Western equine encephalitis) (WEE), 세인트 루이스 뇌염(St.　Louis encephalitis), 머레이벨리(Murray Valley) (Australian) 뇌염(encephalitis), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 및 진드기-감염 뇌염(tick-born encephalitis) 포함함.	예컨대 다음 참조, Hoke (2005) Mil. Med. 170:92-105; Estrada-Franco, et al. (2004) Emerg. Infect. Dis. 10:2113-2121; Das, et al. (2004) Antiviral Res. 64:85-92; Aguilar, et al. (2004) Emerg. Infect. Dis. 10:880-888; Weaver, et al. (2004) Arch. Virol. Suppl. 18:43-64; Weaver, et al. (2004) Annu. Rev. Entomol. 49:141-174. Eastern equine encephalitis (유전자은행 가입 번호 NC_003899; AY722102); Western equine encephalitis (NC_003908).
인간 헤르페스바이러스, 다음을 포함함: 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) (CMV), 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus) (EBV), 인간 헤르페스바이러스 (human herpesvirus)-1 (HHV-1), HHV-2, HHV-3, HHV-4, HHV-5, HHV-6, HHV-7, HHV-8, 헤르페스 B 바이러스(herpes B virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 1 및 2 (HSV-1, HSV-2), 및 수두 바이러스(varicella zoster virus) (VZV).	예컨대 다음 참조, Studahl, et al. (2000) Scand. J. Infect. Dis. 32:237-248; Padilla, et al. (2003) J. Med. Virol. 70 (Suppl. 1) S103-S110; Jainkittivong and Langlais (1998) Oral Surg. Oral Med. 85:399-403. GenBank Nos. NC_001806 (herpesvirus　1); NC_001798 (herpesvirus　2); X04370 and NC_001348 (herpesvirus　3); NC_001345 (herpesvirus　4); NC_001347 (herpesvirus　5); X83413 and NC_000898 (herpesvirus　6); NC_001716 (herpesvirus　7). Human herpesviruses types 6 and 7 (HHV-6; HHV-7) are disclosed by, e.g., Padilla, et al. (2003) J. Med. Virol. 70 (Suppl. 1)S103-S110. Human herpesvirus　8 (HHV-8), including subtypes A-E, are disclosed in, e.g., Treurnicht, et al. (2002) J. Med. Virul. 66:235-240.
그룹 M (서브유형 A 내지 J 포함) 및 그룹 O (모든 구별가능한 서브유형 포함) 포함하는 HIV-1 (HIV-2, 서브유형 A-E 포함).	예컨대 다음 참조, Smith, et al. (1998) J. Med. Virol. 56:264-268. 또한 예컨대 다음문헌 참조, 유전자은행 가입 번호 DQ054367; NC_001802; AY968312; DQ011180; DQ011179; DQ011178; DQ011177; AY588971; AY588970; AY781127; AY781126; AY970950; AY970949; AY970948; X61240; AJ006287; AJ508597; 및 AJ508596.
엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus) (EBV), 서브유형 A 및 B 포함.	예컨대 다음 참조, Peh, et al. (2002) Pathology 34:446-450. Epstein-Barr　virus strain B95-8 (유전자은행 가입 번호 V01555).
레보바이러스(Reovirus), 혈청형 및 스트레인 1, 2, 및 3, 유형　1 랑(Lang), 유형 2 존스(Jones), 및 유형　3 디어링(Dearing) 포함.	예컨대 다음 참조, Barthold, et al. (1993) Lab. Anim. Sci. 43:425-430; Roner, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12362-12366; Kedl, et al. (1995) J. Virol. 69:552-559. 유전자은행 가입 번호 K02739 (sigma-3 gene surface protein).
시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) (CMV) 서브유형은 CMV　서브유형 I-VII 포함함.	예컨대 다음 참조, Chern, et al. (1998) J. Infect. Dis. 178:1149-1153; Vilas Boas, et al. (2003) J. Med. Virol. 71:404-407; Trincado, et al. (2000) J. Med. Virol. 61:481-487. 유전자은행 가입 번호 X17403.
리보바이러스(Rhinovirus), 모든 혈청형 포함.	Human rhinovirus　2 (유전자은행 가입 번호 X02316); Human rhinovirus　B (유전자은행 가입 번호 NC_001490); Human rhinovirus 89 (유전자은행 가입 번호 NC_001617); Human rhinovirus　39 (유전자은행 가입 번호 AY751783).
아데노바이러스(Adenovirus), 모든 혈청형 포함.	AY803294; NC_004001; AC_000019; AC_000018; AC_000017; AC_000015; AC_000008; AC_000007; AC_000006; AC_000005; AY737798; AY737797; NC_003266; NC_002067; AY594256; AY594254; AY875648; AJ854486; AY163756; AY594255; AY594253; NC_001460; NC_001405; AY598970; AY458656; AY487947; NC_001454; AF534906; AY45969; AY128640; L19443; AY339865; AF532578.
필로바이러스, 다음 포함: 마르버그 바이러스(Marburg virus) 및 에볼라 바이러스(Ebola virus), 및 스트레인 예컨대 에볼라-수단(Ebola-Sudan) (EBO-S), 에볼라-자이르(Ebola-Zaire) (EBO-Z), 및 에볼라-레스톤(Ebola-Reston) (EBO-R) 포함.	예컨대 다음 참조, Geisbert and Jahrling (1995) Virus Res. 39:129-150; Hutchinson, et al. (2001) J. Med. Virol. 65:561-566. Marburg virus (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_001608). Ebola virus (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_006432; AY769362; NC_002549; AF272001; AF086833).
아레나바이러스, 다음 포함: 림프구성 맥락수막염(lymphocytic choriomeningitis, LCM) 바이러스, 라사(Lassa) 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 및 마추포(Machupo) 바이러스.	Junin virus, segment S (유전자은행 가입 번호 NC_005081); Junin virus, segment L (유전자은행 가입 번호 NC_005080).
라비에스(Rabies) 바이러스.	예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_001542; AY956319; AY705373; AF499686; AB128149; AB085828; AB009663.
아르보바이러스, 다음 포함: 서부 나일(West Nile) 바이러스, 덴구(Dengue) 바이러스 1 내지 4, 콜로라도 진드기 열 바이러스(Colorado tick fever virus), 신드비스(Sindbis) 바이러스, 토가비라이다에(Togaviraidae), 필라비비리다에(Flaviviridae), 부니아비리다에(Bunyaviridae), 레보비리다에(Reoviridae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 및 이와 유사한 것.	Dengue virus type 1 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AB195673; AY762084). Dengue virus type 2 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_001474; AY702040; AY702039; AY702037). Dengue virus type 3 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY923865; AT858043). Dengue virus type　4 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY947539; AY947539; AF326573). Sindbis virus (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_001547; AF429428; J02363; AF103728). West Nile virus (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_001563; AY603654).
수두바이러스, 다음 포함: 진성두창바이러스 (천연두 바이러스, 원숭이두창 바이러스, 우두 바이러스, 우두 바이러스), 야타폭스바이러스(yatapoxvirus) (타나폭스바이러스, 야바 원숭이 종양 바이러스), 파라폭스바이러스, 및 몰루스시폭스바이러스.	Viriola virus (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_001611; Y16780; X72086; X69198).
황열병.	예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_002031; AY640589; X03700.
한타바이러스, 다음 포함: 혈청형 한탄(serotypes Hantaan) (HTN), 서울 (SEO), 도브라바 (DOB), 신 놈브레(Sin Nombre) (SN), 푸말라 (PUU), 및 도브라바-유사 사아레마(SAAV).	예컨대 다음 참조, Elgh, et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1122-1130; Sjolander, et al. (2002) Epidemiol. Infect. 128:99-103; Zeier, et al. (2005) Virus Genes 30:157-180. 유전자은행 가입 번호 NC_005222 and NC_005219 (Hantavirus). 또한 예컨대 다음문헌 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_005218; NC_005222; NC_005219.
플라비바이러스, 다음 포함: 덴구(Dengue) 바이러스, 일본 뇌염(Japanese encephalitis) 바이러스, 서부 나일(West Nile) 바이러스, 및 황열병 바이러스.	예컨대 다음 참조, Mukhopadhyay, et al. (2005) Nature Rev. Microbiol. 3:13-22. GenBank Acc. Nos NC_001474 and AY702040 (Dengue). 유전자은행 가입 번호 NC_001563 및 AY603654.
홍역 바이러스.	예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AB040874 및 AY486084.
인간 파라인플루엔자바이러스(HPV), 다음 포함: HPV 유형 1-56.	Human parainfluenza virus　2 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AB176531; NC003443). Human parainfluenza virus 3 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 NC_001796).
인플루엔자 바이러스, 다음 포함: 인플루엔자 바이러스 유형 A, B, 및　C.	Influenza nucleocapsid (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY626145). Influenza hemagglutinin (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY627885; AY555153). Influenza neuraminidase (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY555151; AY577316). Influenza matrix protein　2 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY626144(. Influenza basic protein　1 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY627897). Influenza 폴리merase acid protein (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY627896). Influenza nucleoprotein (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY627895).
인플루엔자 A 바이러스 서브유형, 예컨대 돼지 바이러스 (SIV): H1N1 인플루엔자 A 및 돼지 인플루엔자 바이러스.	Hemagglutinin of H1N1 (유전자은행 가입 번호 S67220). Influenza A virus matrix protein (유전자은행 가입 번호 AY700216). Influenza virus A H5H1 nucleoprotein (유전자은행 가입 번호 AY646426). H1N1 haemagglutinin (유전자은행 가입 번호 D00837). 또한 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 BD006058; BD006055; BD006052. 또한 예컨대 다음문헌 참조, Wentworth, et al. (1994) J. Virol. 68:2051-2058; Wells, et al. (1991) J.A.M.A. 265:478-481.
호흡기 합포체 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV), 다음 포함: 서브그룹 A 및 서브그룹 B.	Respiratory syncytial virus (RSV) (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY353550; NC_001803; NC001781).
로타바이러스, 다음 포함: 인간 로타바이러스 A 내지 E, 소 로타바이러스(bovine rotavirus), 레수스 원숭이 로타바이러스(rhesus monkey rotavirus), 및 인간-RVV 재배열.	Human rotavirus C segment 8 (유전자은행 가입 번호 AJ549087); Human rotavirus G9 strain outer capsid protein (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 DQ056300); Human rotavirus B strain non-structural protein 4 (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY548957); human rotavirus A strain major inner capsid protein (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY601554).
폴리오마바이러스, 다음 포함: 유인원 바이러스　40 (SV40), JC 대 (JCV) 및 BK 바이러스 (BKV).	예컨대 다음 참조, Engels, et al. (2004) J. Infect. Dis. 190:2065-2069; Vilchez and Butel (2004) Clin. Microbiol. Rev. 17:495-508; Shivapurkar, et al. (2004) Cancer Res. 64:3757-3760; Carbone, et al. (2003) Oncogene 2:5173-5180; Barbanti-Brodano, et al. (2004) Virology 318:1-9) (SV40 complete genome in, e.g., 유전자은행 가입 번호 NC_001669; AF168994; AY271817; AY271816; AY120890; AF345344; AF332562).
콜티바이러스, 다음 포함: 콜로라도 진드기 열 바이러스, 이야치(Eyach) 바이러스.	Attoui, et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:2481-2489. Segments of Eyach virus (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AF282475; AF282472; AF282473; AF282478; AF282476; NC_003707; NC_003702; NC_003703; NC_003704; NC_003705; NC_003696; NC_003697; NC_003698; NC_003699;　NC_003701; NC_003706; NC_003700; AF282471; AF282477).
칼시바이러스, 다음 포함: 제노그룹, 스노우 마운틴 그룹(Snow Mountain group) (SMA), 및 사포로(Saaporo).	Snow Mountain virus (예컨대 다음 참조, 유전자은행 가입 번호 AY134748).
파보비리다에(Parvoviridae), 다음 포함: 디펜도바이러스(dependovirus), 파르보바이러스(parvovirus) (파르보바이러스 B19 포함), 및 에리트로바이러스(erythrovirus).	예컨대 다음 참조, Brown (2004) Dev. Biol. (Basel) 118:71-77; Alvarez-Lafuente, et al. (2005) Ann. Rheum. Dis. 64:780-782; Ziyaeyan, et al. (2005) Jpn. J. Infect. Dis. 58:95-97; Kaufman, et al. (2005) Virology 332:189-198.

항원으로 적절한 또 다른 미생물은 해당 분야에 공지되어 있으며 비제한적으로 다음을 포함한다: Chlamydia trachomatis , Streptococcus pyogenes (그룹 A 연쇄상구균), Streptococcus agalactia (그룹 B연쇄상구균), Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Haemophilus influenzae , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrheae , Vibrio cholerae , Salmonella 종 (typhi, typhimurium 포함), 장(enterica) ( Helicobactor pylori Shigella flexneri 및 또 다른 그룹 D shigella 종 포함), Burkholderia mallei , Burkholderia pseudomallei , Klebsiella pneumonia, Clostridium 종 (C. difficile 포함), Vibrio parahaemolyticus 및 V. vulnificus. 이러한 나열은 제한적인 것을 의미하는 것이 아니다.

약학 조성물

여기에 사용된 용어 "약학적"은 질병의 치유, 치료, 또는 예방에서의 사용을 위하여 의도된 화학 물질을 의미하며 이는 처방 또는 일반 의약품으로서 미국 식품의약품국(U.S. Food and Drug Administration) (또는 미국외 지역의 동등 기관)에 의한 승인 절차를 거치게 된다. 이러한 조성물의 제제화 및 투여를 위한 기술에 대한 상세사항은 다음 문헌에서 찾을 수 있다: Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21^st Edition (Mack Publishing Co., Easton, PA) and Nielloud and Marti-Mestres, Pharmaceutical Emulsions and Suspensions: 2^nd Edition (Marcel Dekker, Inc, New York).

본 문헌의 목적을 위하여, 약학 조성물은 약학적으로 수용가능한 담체, 보조제 및 운반체를 함유하는 제제로, 경구적, 비경구적, 흡입 스프레이, 국소적, 또는 직장으로의 수단을 포함하여 다양한 수단에 의해 투여될 수 있다. 여기에 사용된 용어 비경구(parenteral)는 비제한적으로 다양한 주입 기술에 의한 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 피내(intradermal), 경막내(intrathecal) 및 경막외(epidural) 주입을 포함한다. 여기에 사용되듯이 동맥내 및 정맥내 주입은 카테테르(catheters)를 통한 투여를 포함한다. 광상동맥내 스텐트 및 관상동맥 저장조(intracoronary reservoir)를 통한 투여가 또한 고려된다. 본 발명의 화합물의 종양-내 투여(intra-tumoral administration)는 국부적 침윤성 DC를 직접 활성화시키거나, 종양 세포 아포프토시스(apoptosis)를 직접 촉진하거나 또는 세포독성 시약에 대하여 종양 세포를 민감하게 만들수 있다. 여기에 사용된 용어 경구(oral)는 비제한적으로 경구 주입, 또는 혀밑(sublingual) 또는 구강(buccal) 경로에 의한 전달을 포함한다. 경구 투여는 액상 드링크(fluid drinks), 에너지 바(energy bars), 뿐만 아니라 알약 제제(pill formulation)를 포함한다.

약학 조성물은 의도된 투여 방법에 대하여 적절한 모든 형태일 수 있다. 경구 사용을 위하여 사용될 때 예를 들면, 태블릿(tablets), 트로키(troches), 로젠지(lozenges), 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경성 또는 연성 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)가 제조될 수 있다. 경구 용도로 의도된 조성물은 약학 조성물의 제조를 위하여 해당 분야에 공지된 임의 방법에 따라 제조될 수 있으며 이러한 조성물은 입에 맞는 제조물을 제공하기 위하여 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 포함하여 1종 이상의 시약을 함유할 수 있다. 태블릿의 제조를 위하여 적합한 무독성의 약학적으로 수용가능한 부형제(excipient)와 혼합된 약물 화합물을 함유하는 태블릿이 적용가능하다. 이들 부형제는, 예를 들면, 불활성 희석제, 예컨대 칼슘 또는 소듐 카보네이트, 락토스, 칼슘 또는 소듐 포스페이트; 과립화 및 분해 시약, 예컨대 옥수수 전분(maize starch), 또는 알긴산(alginic acid); 결합제, 예컨대 전분, 겔라틴 또는 아카시아; 및 윤활제; 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산(stearic acid) 또는 탈크(talc)일 수 있다. 태블릿은, 위장관(gastrointestinal tract) 내에서 분해 및 흡착을 지연시키거나 및/또는 더 긴 기간 동안 지속되는 활성을 제공하기 위하여, 장 코팅(enteric coating), 결장 코팅(colonic coating), 또는 마이크로캡슐화(microencapsulation)를 비롯하여 공지된 기술에 의해 코팅되거나, 또는 코팅되지 않을 수 있다. 예를 들면, 시간 지연 물질 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 단독으로 또는 왁스와 함께 사용될 수 있다.

경구용 제제는 또한 비활성 고형 희석제, 예컨대 칼슘 포스페이트 또는 카올린(kaolin)과 함께 약물 화합물이 혼합되는 경성 겔라틴 캡슐로서 제공될 수 있거나, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예컨대 피넛 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합되는 연성 겔라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.

약학 조성물은 수성-현탁액의 제조에 적합한 부형제가 미리 혼합된 수성 현탁액으로서 제제화될 수 있다. 이러한 부형제는, 현탁제(suspending agent), 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 소듐 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트래거캔스(gum tragacanth) 및 검 아카시아, 및 분산제 또는 습윤제 예컨대 자연적으로 존재하는 포스파타이드(phosphatide) (예컨대, 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물(예컨대, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 긴 사슬 지방족 알코올의 축합 생성물(예컨대, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래한 부분적 에스테르의 축합 생성물(예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 포함한다. 수성 현탁액은 또한 1종 이상의 보존제 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시-벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향미제 및 1종 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.

유성 현탁액은 식물성 오일, 예컨대 땅콩 오일, 올리브 오일, 참기름(sesame oil) 또는 코코넛 오일, 또는 미네랄 오일(mineral oil) 예컨대 액상 파라핀(liquid paraffin)에 활성 성분을 현탁시켜서 제제화될 수 있다. 경구용 현탁액은 증점제, 예컨대 밀랍(beeswax), 경성 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 예컨대 앞서 제시한 것들과 같은 감미제, 및 향미제가 맛좋은 경구용 제조를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 항산화제 예컨대 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조를 위하여 적절한 문헌의 분산성 분말 및 과립은 분산 또는 습윤 시약, 현탁제, 및 1종 이상의 보존제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적절한 분산 또는 습윤 시약 및 현탁제는 앞서 제시한 것들에 의해 예시된다. 부가적인 부형제, 예를 들면 감미제, 향미제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.

본 문헌의 약학 조성물은 한 수중유(oil-in-water) 에멀젼 형태일 수 있다. 오일 상은 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 땅콩 오일, 미네랄 오일 예컨대 액상 파라핀, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적절한 유화제(emulsifying agent)는 자연-발생 검(gum), 예컨대 검 아카시아 및 검 트래거캔스(tragacanth), 자연 발생 포스파티드, 예컨대 쏘이빈 렉시틴(soybean lecithin), 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래한 에스테르 또는 부분적 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레에이트, 및 이들 부분적 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 에멀젼은 감미제 및 향미제를 또한 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭실제(elixirs)는 감미제, 예컨대 글리세롤, 소르비톨 또는 수크로스와 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 또한 진통제(demulcent), 보존제, 향미제 또는 착색제를 함유할 수 있다.

본 문헌의 약학 조성물은 멸균 주사제, 예컨대 멸균 주사용 수성(aqueous) 또는 유지성(oleaginous) 현탁액 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 앞서 언급된 이러한 적절한 분산 또는 습윤 시약 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 상기 멸균 주사제는 또한 무독성인 비경구적으로 수용가능한 희석제 또는 용매 예컨대 1,3-부탄-디올 내 용액일 수 있거나 또는 동결건조된 분말로서 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 수용가능한 운반체 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이 있다. 또한, 멸균 지방유(fixed oil)가 전통적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 비롯하여 모든 완하성 지방유(bland fixed oil)가 사용될 수 있다. 또한, 지방산 예컨대 올레산이 유사하게 주사제 제조에 사용될 수 있다.

단일 복용 형태를 생성하기 위해 담체 물질에 결합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 양상에 따라 변할 것이다. 예를 들면, 인간에 대한 경구 투여를 위하여 의도된 서방성 제제(time-release formulation)는 전체 조성물의 약 5 내지 약 95%로 변할 수 있는 담체 물질의 적절하고 편리한 용량과 합성되는 약 20 내지 500 mg의 활성 물질을 함유할 수 있다. 투여를 위하여 쉽게 측정 가능한 용량을 제공하도록 약학 조성물이 제조되는 것이 바람직하다. 전형적으로, 전신에(systemically) 투여될 효과량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg이며 객체(예컨대, 인간과 같은 포유동물)의 연령 및 무게, 치료가 필요한 정확한 질환 및 그 심각도, 투여 경로를 포함하여 다양한 요인에 따라 변하며, 최종적으로는 주치의 또는 주치수의사의 재량에 따를 것이다. 그렇지만, 모든 특정 환자에 대한 구체적인 복용 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 치료되는 개체의 연령, 몸무게, 전체적인 건강, 성별 및 식습관; 투여 시간 및 경로; 분비 속도; 미리 투여된 또 다른 약물; 및 치료 중인 특정 질환의 심각도를 포함하여 다양한 종류의 요인에 따라 변할 것이라는 것이 이해될 것이며, 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해될 것이다.

전술한 바와 같이, 경구 투여에 적절한 본 문헌의 제제는 분말 또는 과립으로서, 각각 소정 용량의 활성 성분을 함유하는 예컨대 캡슐, 카셰(cachet) 또는 태블릿과 같은 개별 유닛으로; 수성 또는 비-수성 액상 내 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유(oil-in-water) 액상 에멀젼 또는 유중수(water-in-oil) 액상 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 약학 조성물은 또한 볼루스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트(paste)로서 투여될 수 있다.

태블릿(tablet)은 선택적으로 1종 이상의 부성분과 함께, 압축 또는 몰딩에 의해 제조될 수 있다. 압축된 태블릿은 선택적으로 결합제(예컨대, 포비돈, 겔라틴, 하이드록시프로필 에틸 셀룰로오스), 윤활유, 불활성 희석제, 보존제, 붕괴제(disintegrant) (예컨대, 소듐 스타치 글리콜레이트, 가교된 포비돈, 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스) 표면 활성제 또는 분산제와 함께 혼합시켜, 예컨대 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태로 활성 성분을 적절한 기계에서 압축시켜 제조될 수 있다. 몰딩된 태블릿은 비활성 액상 희석제에 의해 습윤화된 분말 화합물의 혼합물을 사용하여 적절한 기계에서 제조될 수 있다. 태블릿은 선택적으로 코팅되거나 금이 그어질 수 있으며(score) 그리고 원하는 방출 특성을 제공하도록 가변적인 비율로 그 안에 예를 들면, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스를 사용하여 활성 성분의 느린 또는 제어된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 태블릿에는 위 이외의 소화관 일부에서의 방출을 제공하기 위해 장 또는 결장 코팅이 제공될 수 있다. 화학식 1 화합물이 특히 유리할 수 있는데 이는 이러한 화합물이 산성 분해되기 쉬울 때 그러하다.

입으로 국부 투여되기 적절한 제제는 향미 베이스, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스 내에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenges); 비활성 베이스 예컨대 겔라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 내에 활성 성분을 포함하는 파스틸(pastille); 및 적절한 액상 담체 내에 활성 성분을 포함하는 구강세척제(mouthwashe)를 포함한다.

직장 투여(rectal administration)용 제제는 예를 들어 코코아 버터(cocoa butter) 또는 살리실레이트(salicylate)를 포함하는 적절한 베이스를 갖는 좌약(suppository)으로서 제시될 수 있다.

질내 투여(aginal administration)용으로 적합한 제제는 질좌약(pessaries), 탐폰(tampon), 크림(cream), 젤(gel), 페이스트(paste), 발포체(foam) 또는 활성 성분에 부가하여 적합하다고 해당 분야에 공지된 담체를 함유하는 스프레이 제제로서 제시될 수 있다.

비경구적 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 세균발육저지제(bacteriostat) 및 상기 제제가 의도된 수용체의 혈액과 등장을 이루도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 등장 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함다. 제제는 유닛-복용 또는 멀티-복용 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알 안에 들어서 제시될 수 있으며, 사용 직전에 단지 멸균 액상 담체, 예를 들면 주사용 물의 추가만을 요구하는 건조-동결(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 주사 용액 및 현탁액은 앞서 설명한 종류의 멸균 분말, 과립 및 태블릿으로부터 제조될 수 있다.

여기서 사용되듯이, 약학적으로 수용가능한 염은 비제한적으로 다음을 포함한다: 아세테이트, 피리딘, 암모늄, 피페라진, 디에틸아민, 니코틴아마이드, 포르믹, 우레아, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 아연, 리튬, 신나믹, 메틸아미노, 메탄설포닉, 피크릭, 타르타릭, 트리에틸아미노, 디메틸아미노, 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄. 부가적인 약학적으로 수용가능한 염은 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

특정 환자에 대한 효과량은 치료될 질환, 환자의 전반적인 건강상태, 투여 경로 및 복용량 및 부작용의 심각도 등과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 치료 및 진단 방법에 대한 지침은 구입가능하다(참조, 예컨대, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

효과량은 1회 복용으로 제공될 수도 있으나, 1회 복용에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 투여는 약학 조성물의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 투여일 수 있다. 본 방법에서 약학 조성물의 1회 투여보다 많은 경우, 투여는 1분, 2분, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상 분의 시간 간격, 약 1시간, 2시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 시간, 등의 간격으로 이격될 수 있다. 시간(hour) 문맥에서, 용어 "약"은 30분 이내의 임의 시간 간격의 마이너스 또는 플러스를 의미한다. 투여는 또한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 및 이들의 조합의 시간 간격에 의해 이격될 수 있다. 본 발명은 동등한 시간으로 이격되는 복용 간격에 한정되지 않으며, 비-동등 간격에서의 복용을 포함한다.

예를 들면, 1회/주, 2회/주, 3회/주, 4회/주, 5회/주, 6회/주, 7회/주, 2주당 1회, 3주당 1회, 4주당 1회, 5주당 1회, 및 이와 유사한 것의 복용 계획이 본 발명에서 적용가능하다. 복용 계획은 예를 들면, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 및 12개월의 전체 시간 기간 동안의 복용을 포함한다.

상기 복용 계획의 순환이 제공된다. 순환은 약, 예컨대, 7일 마다; 14일 마다; 21일 마다; 28일 마다; 35일 마다; 42일 마다; 49일 마다; 56일 마다; 63일 마다; 70일 마다; 및 이와 유사한 것의 반복일 수 있다. 복용 중지 간격은 1회 순환 사이에 발생할 수 있으며, 여기서 간격은 약, 예컨대, 7 일; 14 일; 21 일; 28 일; 35 일; 42 일; 49 일; 56 일; 63 일; 70 일; 및 이와 유사한 것일 수 있다. 본 문맥에서, 용어 "약"은 플러스 또는 마이너스 1일, 플러스 또는 마이너스 2일, 플러스 또는 마이너스 3일, 플러스 또는 마이너스 4, 플러스 또는 마이너스 5일, 플러스 또는 마이너스 6일, 또는 플러스 또는 마이너스 7일을 의미한다.

부가적인 치료제와 함께 투여하기 위한 방법이 또한 해당 기술분야에 공지되어 있다(Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).

전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 비경구적(parenteral) 또는 장관(enteral) 전달을 위한 약학 조성물로서 제제화된다. 동물에 대한 투여를 위한 전형적인 약학 조성물은 염, 보존제, 완충제 및 이와 유사한 것을 비롯하여 약학적으로 수용가능한 운반체 예컨대 수용액, 무독성 부형제를 포함한다. 예컨대 다음 참조, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Easton ed. , Mack Publishing Co., pp 1405-1412 and 1461- 1487 (1975); The National Formulary XIV, 14th Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, DC (1975) . 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르 에컨대 에틸올레이트(ethyloleate)이다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 식염수, 비경구용 운반체 예컨대 소듐 클로라이드, 링거 덱스트로수(Ringer's dextrose), 등을 포함한다. 정맥내 운반체(vehicle)는 유체 및 영양 보충제를 포함한다. 보존제는 항균제(antimicrobial agent), 항산화제(anti-oxidant), 킬레이팅제(chelating agent) 및 비활성 기체를 포함한다. 약학 조성물의 여러 성분의 pH 및 정확한 농도는 해당 분야의 통상적인 기술에 따라 조절된다.

특정 백신의 반복된 투여(상동 증폭(homologous boosting))는 체액성 반응을 증폭시키는데 효과적인 것으로 알려져 있다. 이러한 접근법은 세포 면역을 증폭시키는데 있어서 효과적이지 않을 수 있는데 왜냐하면 벡터에 대한 사전 면역이 왕성한 항원 제시 및 적절한 염증성 신호의 발생을 악화시키는 경향이 있기 때문이다. 이러한 문제점을 회피하는 한 가지 접근법은 상이한 항원-전달 시스템(이종 증폭(heterologous boosting))을 사용하는 백신의 순차적 투여이었다. 이종 증폭 요법에 있어서, 적어도 하나의 프라임(prime) 또는 부스트(boost) 전달은 여기에 개시된 비활성 종양 세포/사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물의 전달을 포함한다. 요법 중 이종 요법 지류는 다음 전략 중 하나 이상을 사용하는 항원의 전달을 포함할 수 있다:

해당 항원을 포함하는 비활성화된 또는 감쇄된 박테리아 또는 바이러스, 이는 이들을 병원체 침투를 유발하는데 비효과적 또는 비효율적으로 만들기 위하여 일부 변성 조건으로 처리된 입자임;

정제된 항원, 이는 전형적으로 병원체 또는 병원체를 함유하는 조직 샘플, 또는 이들의 재조합 버전의 세포 배양으로부터 정제된 자연적으로-생성된 항원임;

객체의 숙주 세포 내에서 항원을 발현 및/또는 분비하도록 제조합적으로 설계된, 생존하는 바이러스성 또는 박테리아성 전달 벡터. 이러한 전략들은 비-병원체성 및 무독성이 되는 바이러스성 또는 박테리아성 벡터를 감쇠(예컨대, 유전 공학을 통한)시키는 것에 의존함;

항원 제시 세포 (APC) 벡터, 예컨대 수지상 세포 (DC) 벡터, 이들은 항원이 부과되거나, 또는 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물(거세-저항성(castration-resistant) 전이성 전립선 암의 치료를 위한 예컨대, Provenge® (Dendreon Corporation))로 감염된 세포를 포함함;

리포좀 항원 전달 운반체; 및

네이키드(naked) DNA 벡터 및 네이키드 RNA 벡터 이들은 유전자 총, 전기천공법(electroporation), 박테리아성 고스트(bacterial ghost), 미소구체(microsphere), 마이크로입자, 리포좀, 폴리양이온성 나노입자, 및 이와 유사한 것에 의해 투여될 수 있다.

프라임 백신(prime vaccine) 및 부스트 백신(boost vaccine)은 다음 경로 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 투여될 수 있다. 한 양상에서, 프라임 백신 및 부스트 백신은 동일 경로에 의해 투여된다. 또 다른 양상에서, 프라임 백신 및 부스트 백신은 상이한 경로에 의해 투여된다. 용어 "상이한 경로"는 비제한적으로 신체의 상이한 부위를 포함하며, 예를 들면, 부위는 구강(oral), 비-구강(non-oral), 장관(enteral), 비경구(parenteral), 직장(rectal), 인트라노드(림프절), 정맥내(intravenous), 동맥(arterial), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 종양내(intratumor), 종양주위(peritumor), 종양내(intratumor), 주입(infusion), 점막(mucosal), 비강(nasal), 뇌척수 공간(cerebrospinal space) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 내, 등이며 이 뿐만 아니라 상이한 모드, 예를 들면, 구강, 정맥내, 및 근육내에 의한 것이다.

프라임 또는 부스트 백신의 효과량은 1회 복용으로 제공될 수도 있으나, 1회 복용에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 투여는 백신의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 투여일 수 있다. 본 방법에서 백신의 1회 투여보다 많은 경우, 투여는 1분, 2분, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상 분의 시간 간격, 약 1시간, 2시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 시간, 등의 간격으로 이격될 수 있다. 시간(hour) 문맥에서, 용어 "약"은 30분 이내의 임의 시간 간격의 마이너스 또는 플러스를 의미한다. 투여는 또한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 및 이들의 조합의 시간 간격에 의해 이격될 수 있다. 본 발명은 동등한 시간으로 이격되는 복용 간격에 한정되지 않으며, 동등하지 않은 간격, 예컨대 단지 비-제한적 예를 제공하기 위하여, 1일, 4일, 7일, 및 25일에서의 투여로 구성되는 프라이밍 계획에서의 복용을 포함한다.

실시예

아래 실시예들은 본 발명을 실증하기 위해 사용된다. 이들 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1. 일반적 방법

용액 상태 올리고뉴클레오티드 합성에 적절한 무수 용매 및 시약을 구입하여 무수 기술을 사용하는 드라이 아르곤 또는 질소 하에서 조작하였다. 아미다이트(Amidite) 커플링 반응 및 고리화를 드라이 아르곤 또는 질소 하에서 무수 아세토니트릴 또는 피리딘 내에서 수행하였다. 드라이 피리딘 내에서의 모든 반응을 위한 출발 물질을 피리딘으로부터 농축시켜(3회) 건조시켰다. 예비 실리카겔 플래시 크로마토그래피(Preparative silica gel flash chromatography)를 디클로로메탄 내 메탄올의 구배를 사용하는 플루카(Fluka) 60A 고순도 그레이드 또는 머크 그레이드(Merck Grade) 9385 실리카를 사용하여 수행하였다. 분석 HPLC를 바리안 마이크로보르브(Varian Microsorb) 10 마이크론 C18 250x4.6mm 또는 바리안(Varian) 3마이크론C18 100x4.6mm 칼럼과 10 mM TEAA 및 아세토니트릴의 구배를 사용하여 254nm에서 모니터링하는 프로스타(ProStar) 330 포토다이오드 어레이 검출기를 구비한 바리안 프로스타(Varian ProStar) 210 HPLC 시스템에서 수행하였다. 예비 PLC를 50 ml/분의 유속에서 10 mM TEAA 및 아세토니트릴의 구배를 사용하는 바리안 마이크로보르브(Varian Microsorb) 60-8 C-18 41.6 x 250 mm 칼럼의 254nm에서 모니터링하는 SPD-20A UV/Vis 검출기가 장착된, 시마드주 예비(Shimadzu preparative) LC20-AP HPLC 시스템에서 수행하였다. C-18 Sep-Pak (Waters)를 사용하는 고체상 추출을 3% (wt/wt)의 부하(loadings)에서 수행하였다. LC/MS (ESI/APCI)를 시마드주(Shimadzu) LC20D 분석 HPLC를 사용하여 PDA, MS, 및 ELSD 검출을 구비한 단일 사극자(single quadrapole) 시마드주(Shimadzu) 2010EV 장치에서 획득하였다. 고해상도 FT-ICR 질량 분석을 WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory at Yale University in New Haven, CT, 및 QB3/Chemistry Mass Spect Lab at UC Berkeley로부터 획득하였다.

¹H, ³¹P, ¹H-¹H COSY (2D NMR 상관 분광기법(correlation spectroscopy)), ¹H-³¹P HMBC (이종핵 다중-결합 상관 분광기법(heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy)) 스펙트럼을, 1H에 대하여 500 MHz에서 그리고 31P에 대하여 202 MHz에서 작동시킨 바리안(Varian) INOVA-500 NMR 분광계 상에서, 10 uL D₂O (D₂O 첨가 후 16시간 지연)를 갖는 d6-DMSO 내에서 45 ℃에서 획득하였다. 산출된 FID를 PC로 전송시켜 애크론(Acorn) NMR Inc.사의 NUTS NMR 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 화학적 이동값(chemical shift)을 1H에 대하여 2.50 ppm에서, DMSO 용매에 참조시켰다. NMR 스펙트라 1의 참조에 대한 IUPAC 권고에 따라, 31P 화학적 이동값(chemical shift)을 "통합 척도(unified scale)"를 사용하여 0 ppm의 절대 1H 주파수(absolute 1H frequency)와 참조시켰다. 1H 및 31P 스펙트럼의 일부를 1H에 대하여 400 MHz에서 그리고 31P에 대하여 162 MHz에서 작동시킨 JEOL ECX-400 NMR 분광계에서 획득하였다.

구배 COSY 스펙트럼을 직접 디멘션에서 2048 데이터 포인트를 사용하고 간접 디멘션에서 256 시간 포인트를 사용하는 절대 값 모드에서 획득하였다. 두 디멘션 모두 사인벨 제곱 함수(sinebell squared function)를 사용하여 아포다이즈되었다(apodized). 간접 디멘션을 제로 충전(zero filled)하여 두 디멘션에서 2048x2048 포인트의 최종 매트릭스 크기 및 3.91 Hz/data 포인트의 해상도를 산출하였다.

포스포디에스테르 연결에서 입체화학의 할당: ¹H-³¹P HMBC (및 일부 경우 아인산 디커플링) 실험과 결합한 1H-1H COSY를 사용하여 포스포디에스테르 연결의 입체화학이 2', 5'-3', 5'라는 것의 직접적인 증거를 제공했다( 9a 에 대한 실험에서의 논의 및 도 3A-G 참조). 유사한 ¹H-³¹P HMBC 실험으로 최종 실일 탈보호 또는 이온 교환 이후 모든 합성 사이클릭 디-뉴클레오티드의 포스포디에스테르 연결에서의 비-정규 입체화학(2', 5'-3', 5')을 확인하였다.

RR- 및 RS-부분입체이성질체(합성 절차의 주된 CDN 생성물)의 할당은 문헌의 방법을 따랐다(Zhao et al. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 289:352-378, 2009).

모든 CDN 생성물(도 2A-2C)은 C18 역상(reverse phase) HPLC 분석(254nm에서 UV 검출)에 의해 표시된 바에 따르면 > 95%이었다.

약어 및 머리글자: 구아닌 = G. 이소부티릴 구아닌 = G^ib. 4,4-디메톡시트리틸 = DMT. OCH₂CH₂CN = CEO. tert-부틸디메틸실일 = TBS. 아데닌 = A. 벤조일 아데닌 = A^Bz. 사이클릭-[A(2',5')pA(3',5')p] = ML-CDA = 19a(TEA 염). 디티오-[R _P, R _P]-사이클릭-[A(2',5')pA(3',5')p] = ML-RR-CDA = 19b (TEA 염); 21 (소듐 염); 22 (암모늄 염). 디티오-[R _P, S _P]-사이클릭-[A(2',5')pA(3',5')p] = ML-RS-CDA = 19c(TEA 염). 사이클릭-[G(2',5')pG(3',5')p] = ML-CDG = 9a(TEA 염). 디티오-[R _P, R _P]-사이클릭-[G(2',5')pG(3',5')p] = ML-RR-CDG = 9b (TEA 염). 디티오-[R _P, S _P]-사이클릭-[G(2',5')pG(3',5')p] = ML-RS-CDG = 9c (TEA 염). 사이클릭[G(2',5')pA(3',5')p] = ML-cGAMP. 디티오-[R _P, R _P]-사이클릭-[G(2',5')pA(3',5')p] = ML-RR-cGAMP = 20 (TEA 염). 모노티오-사이클릭-[A(2',5')pA(3',5')Rp] = ML-3',5'-R-CDA = 19d (TEA 염). 2'-O-미리스토일(myristoyl)- 사이클릭-[G(2',5')pG(3',5')p] = C14-ML-CDG = 10 (TEA 염). ML-cGAMP = 2',3'-cGAMP = 사이클릭-[G(2',5')pA(3',5')p] = 23 (TEA 염)

ML-cGAMP(도 2c의 구조 23)는 세포 cGAS로부터 효소로 처리하고 예비 HPLC로 정제하여 제조하였다.

실시예 2. ML-CDG 시리즈(도 2a)에 대한 일반적인 실험: 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] 9a 의 합성.

1) 3 의 제조. 25ml 아세토니트릴에 용해된 4.87 g (5.0 mmol) N²-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-tert-부틸디메틸실일-3'-O-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필아미노피닐]구아노신(1)의 용액에 0.18ml (10 mmole) 물과 1.23g (6 mmole) 피리디늄 트리플루로아세테이트를 첨가하였다. 실온에서 5분 교반 이후 25 ml t-부틸아민을 첨가하였고 반응을 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 발포체(foam)로서 2 를 수득하였고 그 후 아세토니트릴(2x50 ml)로 공동-증발(co-evaporate)시켰다. 60ml 디클로로메탄에 용해된 2 의 용액에 0.9 ml (50 mmole) 물과 디클로로메탄(44 mmol)에 용해된 6% (v/v) 디클로로아세트산 60 ml를 첨가하였다. 실온에서 10분 후 반응에 피리딘(7.0 ml, 87 mmol)을 첨가하여 급냉시켰다. 반응 혼합물을 농축시켜 오일이 되도록 하고 이를 40 ml 무수 아세토니트릴로 3회 공동-증발시켜 건조하였으며, 마지막에 12 ml 부피의 3 이 남았다.

2) 4 의 드라이 용액의 제조. N²-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-tert-부틸디메틸실일-2'-O-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필아미노피닐]구아노신 (4, 6.33 g, 6.5 mmole)을 40 ml 무수 아세토니트릴에 용해시키고 40ml 무수 아세토니트릴로 3회 공동-증발시켰으며, 마지막에 20 ml가 남았다. 10개 3Å 분자체(molecular sieve)를 첨가하고 용액을 사용할때까지 아르곤 하에서 저장하였다.

3) 사후 산화를 제공하기 위한 3 과 4 의 커플링 및 2',5'선형 디머(linear dimer) 6a 의 디트리틸레이션(detritylation). 20 ml 아세토니트릴 내 아제오(azeo) 건조된 4 (6.5 mmole)를 주사기를 사용하여 3 (5.0mmole)에 첨가하였다. 실온에서 5분 교반 이후, 데칸에 용해된 5.5 M t-부틸하이드로퍼옥사이드 2.37 ml (15 mmole)를 첨가하고 반응을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 반응을 그 후 0 ℃까지 냉각시키고, 2.5 ml 물에 용해된 1.25 g NaHSO₃를 첨가하고, 얼음 욕조를 제거하고, 반응을 5분 동안 교반시켰다. 반응을 농축시켜 발포체로 만들고, 그 후 80 ml 디클로로메탄에 넣었다. 0.9 ml 물 및 디클로로메탄에 용해된 6% (v/v) 디클로로아세트산 80ml를 첨가하고, 반응을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 50 ml 피리딘을 첨가하여 상기 디클로로아세트산을 급랭시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 고체로서 미정제 6a 를 산출하였다.

4) 6a 의 고리화에 의한 7a산출하기. 6a 를 50 ml 드라이 피리딘에 용해시키고 5 ml (전체 반응물의 1/10^th, 약 0.5 mmole)를 주사기를 사용하여 150 ml 드라이 피리딘으로 옮겼다. 이를 농축시켜 약 100 ml 부피로 만들었다. 2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2-디옥사포스포리난-2-옥사이드 (DMOCP, 0.35 g ,1.8 mmole)를 그 후 첨가하고 반응을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 0.32 ml 물을 첨가하고 그 직후 0.16 g 아이오딘을 첨가하고, 반응을 실온에서 5분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 그 후 0.1 g NaHSO₃를 함유한 350 ml 물에 부었고 반응을 실온에서 5분 동안 교반시켰다. 2 g의 NaHCO3를 교반하면서 천천히 첨가하고, 그 후 400 ml 1:1 에틸 아세테이트:디에틸에테르로 추출시켰다. 수성 층을 400ml 1:1 에틸 아세테이트:디에틸에테르로 다시 추출하고, 유기 층을 합쳐서, 소듐 설페이트로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 완전하게-보호된 사이클릭-[G(2',5')pG(3',5')p]인 7a 를 함유하는 혼합물 0.75g을 수득하였다.

5) 메틸아민으로 미정제 7a 를 탈보호(deprotection)하여 미정제 8a 산출하기. 750 mg의 7a 에 무수 에탄올에 용해된 메틸아민 (33 중량%) 18 ml를 첨가하고 혼합물을 90분 동안 교반하였으며 이 시점에서 HPLC에 의한 분석이 반응이 완료되었음을 지시하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 오일을 산출하고 10 ml의 헥산/에틸 아세테이트 (50:50)로 처리하여 황백색(off-white) 고체를 생산했다. 배산(trituration)/세척 용매를 따라 버리고 잔류 용매를 감압 하에서 제거하여 240 mg의 황백색 고체를 산출하였다.

6) 미정제 8a 의 예비 HPLC. 미정제 8a 의 120 mg 부분을 5 ml의 CH3CN/10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트(20/80)에 넣었다. 0.45 미크론 PTFE 여과 후 주입 샘플을 C-18 다이나맥스(Dynamax) 칼럼(40x250mm)에 적용시켰다. 용리(elution)를 아세토니트릴 및 10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트(20% 에서 50% CH₃CN 20분 동안 50 ml/분 흐름)의 구배를 사용하여 수행하였다. 2회 HPLC 수행으로부터 얻고 순수한 8a 를 함유하는 HPLC 분획물을 모으고, 증발시켜 CH₃CN을 제거하고 동결건조시켜 대부분의 잔류 물과 휘발성 완충액을 제거하고 아세토니트릴 (3x4ml)로 공비 건조(azeotropic drying) 이후 42 mg의 순수 8a 를 비스--트리에틸암모늄 염으로 산출하였다. (또한 예비 HPLC 정제를 마지막 단계까지 미루는 것도 가능하다). HRMS (FT-ICR) m/z: C₃₂H₅₁N₁₀O₁₄P₂Si₂에 대한 [M-H]- 계산치 917.2606; 측정치 917.2622. ¹H NMR (DMSO-d₆+ 트레이스 D₂O) 45 ℃ δ 8.22 (1H, s), 7.85 (1H, s), 5.76-5.79 (2H, dd), 5.21 (1H, m), 4.85 (1H, m), 4.58 (1H, t), 4.49 (1H, d), 4.31 (1H, m), 4.21 (1H, m), 3.97 (1H, d), 3.83 (3H, m), 2.94 (12H, m), 1.12(18H, t), 0.90 (9H, s), 0.72 (9H, s), 0.14 (6H, d), 0.09 (3H, s), -0.02 (3H, s). ³¹P NMR (DMSO-d₆+ 트레이스 D₂O) 45 ℃. δ -1.26, -2.02 (도 3a-3c).

7) 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드를 사용한 8a 의 TBS 그룹의 탈보호, TEAB에 의한 중화, 및 C-l8 Sep-Pak에 의한 고체상 추출로 순수 9a 를 비스-트리에틸암모늄 염으로서 산출하기. 40 mg의 8a 에 1.0 ml의 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30 시간 동안 교반하였다. 분석 HPLC에 의해 반응의 완료를 확인한 이후, 샘플을 12 ml의 냉각된 1M 트리에틸암모늄 바이카보네이트에 한방울씩 첨가하여 중화시켰다. 중화된 용액을 워터스(Waters) C-18 Sep-Pak에서 탈염시키고 생성물을 CH3CN/10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트(1:1)로 용리시켰다. CH₃CN을 감압하에서 증발시키고 남은 수성 용액을 동결시키고 하룻밤 동결건조시켰다. 메탄올(3x3 ml)로부터 여러번 증발시키고 마지막으로 메탄올에 용해된 50% 아세토니트릴(1x3 ml)로부터 증발시켜 29.3 mg의 사이클릭-[G(2',5')pG(3',5')p] (9a) 를 비스-트리에틸암모늄 염으로서 산출하였다. HRMS (FT-ICR) m/z: [M-H]^- C₂₀H₂₃N₁₀O₁₄P₂에 대한 계산치 689.0876; 측정치 689.0874. ¹H NMR (DMSO-d₆+ 트레이스 D₂O) 45 ℃ δ 7.92 (1H, s), 7.90 (1H, s), 5.82 (1H, d), 5.80 (1H, d), 4.97 (1H, m), 4.85 (1H, m), 4.68 (1H, m), 4.31 (1H, d), 4.21 (1H, t), 4.10 (2H, m), 3.79 (3H, m), 2.91 (14H, m), 1.13 (22H, t). ³¹P NMR (DMSO-d₆) 45 ℃. δ 1.80, -1.05.

10 mM 트리에틸암모늄 아세테이트에 용해된 2 에서 20% CH3CN의 구배를 20분 동안 C-18 칼럼 (3 마이크론, 100x4.6 mm, 0.6 ml/분) 상에서 사용하여 c-di-GMP에 대한 9.3분과 비교하여 9a 의 HPLC 체류 시간은 7.25분이다. HRMS(FT-ICR)로 예상된 원소 화학식을 확인하였다: C₂₀H₂₃N₁₀O₁₄P₂에 대한 [M-H]^- 계산치 689.0876; 측정치 689.0874. 9a 의 31-P NMR은 2.03 및 -0.95 ppm에서 2개의 피크를 나타냈으며(적분치 1:1) 이는 2',5'/3',5' 혼합된 연결에 일치한다( c[G(3',5')pG(3',5')p] 및 c[G(2',5')pG(2',5')p] 둘 모두는, 예를 들면, 대칭 때문에 단지 1개의 31-P NMR 신호를 나타낸다). 포스포디에스테르 연결의 입체화학의 직접적인 증거는 아인산 디커플링 실험(phosphorous decoupling experiment)과 결합된 1H-1H COSY에 의해, 그리고 ¹H-³¹P HMBC 2-차원 NMR에 의해 획득되었다(도 3b 및 3c). 아노머 (H-1) 양성자는 5.82 ppm에서 중첩된 더블릿의 더블릿으로 나타난다. "A" 표시를 다운필드 아노머 (H-1) 양성자에 부여하였고 "B"를 이것보다 약간 업필드에 위치한 아노머 양성자에 부여하였다.　 "A" 및 "B" 리보오스 둘 모두 내의 아노머 양성자로 시작하여 1H-1H COSY 실험(도 3b)으로 H-2A (4.96 ppm), H-3A (4.31 ppm), 뿐만 아니라 H-2B (4.67 ppm) 및 H-3B (4.84 ppm)의 할당을 가능하게 했다.　 다운필드 아인산 (2.03 ppm)의 조사(irradiation)는 H-3B 멀티릿을 더블릿으로 전환시켰으며, 한편 업필드 아인산(-0.95 ppm)의 조사(irradiation)는 H-2A의 복잡한 멀티릿의 단순화를 야기했다. 5' 리보오스 메틸렌 멀티플릿의 양쪽 디커플링 실험 단순화가 또한 관찰되었다. 2-차원 ¹H-³¹P HMBC로 디커플링 실험의 결과를 확인하였다. 1H-1H COSY는 아인산 디커플링 및 ¹H-³¹P HMBC 실험의 결합을 유발하며 이에 따라 포스포디에스테르 연결의 입체화학이 2',5'/3',5' 이며 9a 가 사이클릭[G(2',5')pG(3',5')p]이라는 직접적인 증거를 제공한다.

실시예 3. ML-CDA 시리즈(도 2b)에 대한 일반적인 실험: 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] Na 염(21)의 합성(화합물 도 2c 참조).

1) 13 의 제조.

25ml 아세토니트릴에 용해된 5 g (5.15 mmol) N⁶-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-tert-부틸디메틸실일-3'-O-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필아미노피닐]아데노신 (11) 의 용액에 0.18ml (10 mmole) 물과 1.20g (6.2 mmole) 피리디늄 트리플루오로아세테이트를 첨가하였다. 실온에서 5분 교반 이후 25 ml tert-부틸아민을 첨가하였고 반응을 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 발포체(foam)로서 12 를 수득하였고 그 후 아세토니트릴(2x50 ml)로 공동-증발(co-evaporate)시켰고, 그 후 60 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 이러한 용액에 물(0.9 ml, 50 mmole) 및 디클로로메탄에 용해된 6% (v/v) 디클로로아세트산(44 mmol) 60 ml를 첨가하였다. 실온에서 10분 후 반응에 피리딘(7.0 ml, 87 mmol)을 첨가하여 급냉(quench)시켰고, 농축시켜 오일을 수득하였고 이를 40 ml 무수 아세토니트릴로 3회 공동-증발시켜 건조하였으며, 마지막에 12 ml 부피로 13 이 남았다.

2) 14 의 건조 용액 제조.

N⁶-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-tert-부틸디메틸실일-2'-O-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필아미노피닐]아데노신(14, 6.4 g, 6.6 mmole)을 40 ml 무수 아세토니트릴에 용해시키고 40ml 무수 아세토니트릴로 3회 공동-증발시켰으며, 마지막에 20 ml가 남았다. 10개 3Å 분자체(molecular sieve)를 첨가하고 용액을 사용할때까지 아르곤 하에서 저장하였다.

3) 2',5'-모노티오-선형 디머 16 의 제조.

20 ml 아세토니트릴에 용해된 아제오(azeo) 건조된 14 (6.4 g, 6.6 mmole)를 주사기를 통해 12 ml의 무수 아세토니트릴에 용해된 13 (5.15 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 5분 교반 이후, 1.14g (5.6 mmol)의 3-((N,N-디메틸아미노메틸이덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-5-티온 (DDTT)을 첨가하고 반응을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응을 농축시키고 잔류 오일을 80 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 물(0.9 ml, 50 mmol) 및 디클로로메탄에 용해된 6% (v/v) 디클로로아세트산(58 mmol)의 80ml를 첨가하고, 반응을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 50 ml 피리딘을 첨가하여 상기 디클로로아세트산을 급랭시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 고체로서 미정제 16b 을 고체로서 산출하였다.

4) 16b 의 고리화 및 황화(sulfurization)에 의해, 보호된 사이클릭-디티오 부분입체이성질체 17b 및 17c산출하기.

16b 을 150 ml 드라이 피리딘에 용해시키고 이를 농축시켜 약 100 ml의 부피로 줄였다. 2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2-디옥사포스포리난-2-옥사이드 (DMOCP, 3.44 g, 18 mmole)를 그 후 첨가하고 반응을 실온에서 5분 동안 교반시켰다. 3.2 ml 물을 첨가하고 그 직후 3-H-1,2-벤조디티올-3-온 (1.3 g, 7.7 mmole)을 첨가하고, 반응을 실온에서 5분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 그 후 20 g NaHCO₃를 함유하는 700 ml 물에 붓고 실온에서 5분 동안 교반하고, 그 후 분별 깔때기에 부어서 800 ml 1:1 에틸 아세테이트:디에틸 에테르로 추출하였다. 수성 층을 600 ml 1:1 에틸 아세테이트:디에틸 에테르로 다시 추출하였다. 유기 층을 합치고 감압 하에서 농축시켜 부분입체이성질체 17b 및 17c 를 함유하는 약 11 g의 오일을 수득하였다.

5) 17b 및 17c 를 함유하는 미정세 혼합물의 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피.

상기 미정제 혼합물을 디클로로메탄에 용해시키고 250 g 실리카 칼럼에 적용시켰다. 원하는 부분입체이성질체를 디클로로메탄에 용해된 메탄올의 구배(0-10%)를 사용하는 칼럼으로부터 용리시켰다. 원하는 부분입체이성질체 17b 및 17c 를 함유하는 분획물을 합치고 농축시켜, 2.26 g의 약 50% 17b 및 50% 17c 를 산출하였다.

6) 완전하게-보호된 사이클릭 부분입체이성질체 17b 및 17c 의 미정제 18b 및 18c 로의 탈 보호화.

실리카 겔 칼럼으로부터 얻은 2.26g의 미정제 17b 및 17c 를 두꺼운-벽 유리 압력 튜브로 옮겼다. 60 ml 메탄올 및 60 ml 농축 수성 암모니아를 첨가하고 튜브를 50℃의 오일 욕조에서 16 시간 동안 교반하면서 가열시켰다(최근 운행은 12 시간이었으며 이 때 출발 물질이 소모된다). 반응 혼합물을 거의 주변 온도까지 냉각시키고, 질소 기체 스트림을 30분 동안 주입시키고, 그 후 큰 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. 대부분의 휘발물질을 감압 하에서 발포 및 범핑을 피하기 위해 조심스럽게 제거하였다. 물이 아직 존재하는 경우 잔류물을 동결시키고 건조상태로 동결건조시켰다.

7) 미정제 18b 및 18c 의 예비 HPLC 정제로 순수 18b 산출하기.

18b 및 18c 를 함유하는 동결건조된 미정제 혼합물을 약 50ml의 CH3CN/10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트(60/40)에 넣었다. 0.45 미크론 PTFE 여과 후, 4-5ml 샘플 부분을 C-18 다이나맥스(Dynamax) 칼럼(40x250mm)에 적용시켰다. 용리(elution)를 아세토니트릴 및 10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트(30% 에서 50% CH₃CN 20분 동안 50 ml/분 흐름)의 구배를 사용하여 수행하였다. 순수 18b 를 함유하고 예비 HPLC 수행으로부터 얻은 분획물을 모으고, 증발시켜 CH₃CN을 제거하고 동결건조시켜 360mg의 순수 18b (R _P R _P-부분입체이성질체)를 비스-트리에틸암모늄 염으로서 산출하였다.

8) 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드를 사용한 18b 의 2개 TBS 그룹의 탈보호, TEAB에 의한 중화, 및 C-l8 Sep-Pak에 의한 고체상 추출 및 동결건조로 순수 9b 를 비스-트리에틸암모늄 염으로서 산출하기.

8a) 270 mg (0.24 mmol)의 18b 에 5.0 ml의 니트 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 첨가하기. 혼합물을 실온에서 약 40 시간 동안 교반하였다. 분석 HPLC에 의해 반응의 완료를 확인한 이후, 샘플을 45 ml의 냉각되고 교반된 1M 트리에틸암모늄 바이카보네이트에 한방울씩 첨가하여 중화시켰다. 중화된 용액을 워터스(Waters) C-18 Sep-Pak에서 탈염시키고 생성물을 CH3CN/10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트(5:1)로 용리시켰다. CH₃CN을 감압하에서 증발시키고 남은 수성 용액을 동결시키고 동결건조시켰다. 물로부터의 여러번의 동결건조를 통하여 122 mg (57%)의 디티오-(Rp,Rp)-[사이클릭-A(2',5')pA(3',5')p] (19b)를 비스-트리에틸암모늄 염으로서 산출하였다.

8b) 90 mg (0.08 mmol)의 18b 를 10ml 건조 아세토니트릴로 3회 공동증발시켰다. 건조된 잔류물을 0.4ml 무수 피리딘에 넣었다. 배출 바늘(vent needle)을 구비한 플라스크를 50℃의 오일 욕조 내에 위치시키고, 0.62ml 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 및 1.0ml 트리에틸아민을 교반 중인 혼합물에 동시에 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 분석 HPLC에 의해 반응의 완료를 확인한 이후, 샘플을 25 ml의 냉각되고 교반된 1M 트리에틸암모늄 바이카보네이트에 한방울씩 첨가하여 중화시켰다. 중화된 용액을 워터스(Waters) C-18 Sep-Pak에서 탈염시키고 생성물을 CH3CN/10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트(1:4)로 용리시켰다. CH₃CN을 감압하에서 증발시키고 남은 수성 용액을 동결시키고 동결건조시켰다. 물로부터의 여러번의 동결건조를 통하여 54 mg (76%)의 디티오-(Rp,Rp)-[사이클릭-A(2',5')pA(3',5')p] (19b)를 비스-트리에틸암모늄 염으로서 산출하였다.

8c) 45 ℃의 니트 TEA-HF에서의 가열에 의한 다양한 TEA-HF 탈보호, 후속하여 TEAB 중화, Sep-Pak 탈염 및 동결건조.

TEAㆍ3HF (1 mL, 6.1 mmol)를 배출 바늘이 장착된 플라스크 내에서 18b (41 mg, 0.04 mmol)에 첨가하고 혼합물을 45 ℃에서 교반시켰다. 반응 진행을 LC로 모니터링하고 출발 물질 및 모노-TBS 유사체가 소모되었을 때(~2 시간) 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 0 ℃의 1 M TEAB (4.9 mL) 및 TEA (1.6 mL)의 용액으로 천천히 피펫으로 옮기고 pH 종이로 약한 염기성 pH임을 확인하였다. 중화된 용액을 워터스(Waters) C-18 Sep-Pak(10 g)에서 탈염시키고 생성물을 15% CH3CN/10 mM 수성 트리에틸암모늄 아세테이트로 용리시켰다. 동결건조시켜 21 mg (64%)의 19b (비스-트리에틸암모늄 염)를 백색 고체로서 산출하였다. 분석 HPLC (2-20% 아세토니트릴/10 nM TEAA 완출액 - 20분)에 의한 분석으로 > 95% 순도를 나타냈다(도 3h). ¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 8.58 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 6.12 (d, J = 8.0, 1H), 5.92 (d, J = 7.0, 1H), 5.30 (td, J = 8.5, 4.0, 1H), 5.24-5.21 (m, 1H), 5.03 (dd, J = 7.5, 4.5, 1H), 4.39 (d, J = 4, 1H), 4.23 (dd, J = 10.5, 4.0, 1H) , 4.18 (s, 1H) , 4.14-4.08 (m, 2H) , 3.85-3.83 (m, 1H) , 3.73 (d, J = 12.0, 1H) , 3.06 (q, J = 7.5, 12H) , 1.15 (t, J = 7.5, 1H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 58.81, 52.54; HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₄O₁₀N₁₀P₂S₂ (M - H)^- 에 대한 계산치 689.0521, 측정치 689.0514.

8d) Gaffney et al. 2010에 개시된 바에 따라 아세톤 침전을 통한 TEA-HF 반응의 워크-업이 또한 가능하지만, 우리는 전술한 섹션 8a-8c에 개시된 개량법을 사용하여 다소 더 깨끗한 생성물을 획득하였다.

10) 소듐 염으로의 전환

ML-RR-CDA 비스-TEA 염(19b)은 후술하는 바에 따라 이온 교환에 의해 약학적으로 수용가능한 소듐 염 (21)으로 쉽게 전환된다.

ML-RR-CDAㆍ2Na⁺ (21). BT AG ® 50W-X2 레진(Resin) 100-200 메쉬(Mesh), 하이드로겐 형태(100 mg)를 DI 워터와 함께 슬러리 패킹하여 Bio-spin ® 칼럼에 넣었다. 과량의 DI 워터는 중력에 의해 배출되었다. 3 층부피(bed volume)의 1 M NaOH (1 mL)를 중력을 이용하여 상기 칼럼에 통과시키고 그 후 5 층부피(bed volume)의 DI 워터(2 mL)를 통과시켰다. 중력을 통하여 과량의 DI 워터를 배출시킨 후 DI 워터(1 mL)에 용해된 ML-RR-CDAㆍ2TEA (19b, 10 mg)의 용액을 칼럼에 부과하였다. 칼럼을 5 층부피(bed volume)의 DI 워터(2 mL)로 용리시키고, 분획물을 수집하고 TLC 플레이트 및 UV 램프를 통하여 UV 활성을 확인하였다. 관심있는 분획물을 모으고, 동결시키고, 하룻밤 동안 동결건조시켜 ML-RR-CDAㆍ2Na⁺ 를 정량적으로 산출하였다. ¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-30μL D₂O) δ 8.54 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.167 (s, 1H), 6.09 (d, J = 8.0, 1H), 5.92 (d, J = 8.0, 1H), 5.26 (td, J = 8.5, 4.5, 1H), 5.21-5.19 (m, 1H), 5.01 (dd, J = 7.5, 4.5, 1H), 4.42 (d, J = 4, 1H), 4.23 (dd, J = 10.5, 5.0, 1H) , 4.17 (s, 1H) , 4.15-4.00 (m, 2H) , 3.90-3.82 (m, 1H) , 3.73-3.70 (m, 1H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-30μL D₂O) δ 58.85, 51.53 (도 3d-3g); HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₃O₁₀N₁₀P₂S₂ (M - H)^-에 대한 계산치 689.0521, 측정치 689.0503.

포스포디에스테르 연결의 입체화학의 직접적인 증거를 ML-CDG 시리즈 실험([문단 19])과 유사하게 ¹H-³¹P HMBC 2-차원 NMR (도 3e - 3g)과 결합된 1H-1H COSY에 의해 획득하였다.

ML-RR-CDG (9b). 화합물 9b 를 ML-CDG 시리즈 실험(문단 [0011])의 과정과 후속하는 개량(도 2a)에 따라 ML-CDG와 유사하게 합성하였다: e) DDTT; h) 3-H-1,2-벤조디티올-3-온; n) TEA 염으로서 수득함, 이온 교환 불필요.

¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 7.98 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 5.85 (d, J = 9.0, 1H), 5.80 (d, J = 7.5, 1H), 5.25-5.23 (m, 1H), 5.12 (dd, J = 8.5, 4.5, 1H), 4.73 (dd, J = 8.0, 4.5, 1H), 4.42 (d, J = 4.0, 1H), 4.22 (t, J = 7.5, 1H), 4.14-4.10 (m, 2H), 3.94-3.90 (m, 2H) , 3.77-3.73 (m, 1H) , 3.05 (q, J = 7.0, 12H) , 1.160 (t, J = 7.0, 1H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 59.09, 50.37; HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₃O₁₂N₁₀P₂S₂ (M - H)^-에 대한 계산치 721.0419, 측정치 721.0410.

ML- RS -CDG (9c). 화합물 9c 를 ML-CDG 시리즈 실험(문단 [0011])의 과정과 후속하는 개량(도 2a)에 따라 ML-CDG와 유사하게 합성하였다: e) DDTT; h) 3-H-1,2-벤조디티올-3-온; k) [Rp, Sp] 부분입체이성질체 8c 를 수집하였음; n) TEA 염으로서 획득함, 이온 교환 불필요.

¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 8.01 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 5.86 (d, J = 8.5, 1H), 5.79 (d, J = 8.0, 1H), 5.29 (dd, J = 8.5, 4.0, 1H), 5.20-5.19 (m, 1H), 4.68 (dd, J = 8.5, 4.0, 1H), 4.21-4.18 (m, 2H), 4.10-4.05 (m, 3H), 3.71-3.68 (m, 2H), 2.96 (q, J = 7.0, 12H) , 1.13 (t, J = 7.0, 18H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 59.89, 57.17; HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₄O₁₂N₁₀P₂S₂ (M - H)^-에 대한 계산치 721.041904, 측정치 721.04143.

C14-ML-CDG (10): 화합물 10 (도 2c)를 ML-CDG 시리즈 실험(문단 [0011])의 과정과 후속하는 개량(도 2a)에 따라 ML-CDG와 유사하게 합성하였다: n) 미리스트산 무수물(myristic anhydride), DMF.

9a 의 비스-트리에틸아민 염(0.260 g, 0.291 mmol)에 3.7 ml DMF, 0.3 ml 피리딘, 및 128 mg(0.292 mmol) 의 미리스트산 무수물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 전체 5 시간 동안 60 ℃에서 가열하였고, 실온으로 냉각하고 100 ul의 MeOH로 급냉시켰다. LC 트레이스가 주된 신규 물질로의 25% 전환을 나타냈고 물질의 나머지는 출발 물질의 체류 시간 범위에 표시되었다. 주된 생성물의 질량은 음성 모드에서 LC/MS에 의한 C14-아실화된 생성물로서 확인되었으며, m/z (M-1)는 899 이었다(C₃₄H₄₉N₁₀O₁₅P₂ ^-에 대한 계산치: 889.3). 증발 이후 잔류물을 2ml CH3CN, 3 ml 0.1 M TEAA 및 충분한 MeOH에 넣어서 대부분의 물질을 용액으로 만들었다. 원심력을 이용한 단순 스핀 다운을 통해 소랴의 입자 물질을 제거한 이후 용액을 10 mM TEAA 내 25% -> 50% CH3CN의 구배를 20분동안 사용하는 C18-예비 HPLC를 통하여 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획물을 합치고 동결건조시켜 건조물로 만들어서 36 mg의 C14-ML-CDG 10 (트리에틸암모늄 염)을 백색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 8.00 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 5.98 (d, J = 7.5, 1H), 5.83 (d, J = 8.5, 1H), 5.76 (dd, J = 7.5, 4.5, 1H), 5.15-5.10 (m, 1H), 4.90-4.85 (m, 1H), 4.36 (d, J = 4.5, 1H), 4.30-4.27 (m, 1H), 4.07 (s, 1H), 3.94-3.90 (m, 3H) , 3.82-3.78 (m, 1H) , 3.04 (q, J = 7.0, 12H), 2.37-2.23 (m, 2H), 1.51-1.43 (m, 2H), 1.28-1.14 (m, 38H). 0.85 (t, J = 7.0, 3H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ -1.36, -2.12; HRMS (FT-ICR) m / z C₃₄H₄₉O₁₅N₁₀P₂ (M - H)^-에 대한 계산치 899.2860, 측정치 899.2834.

ML- CDA (19a). 화합물 19a 를 ML-CDA 시리즈 실험(문단 [0020])의 과정과 후속하는 개량(도 2b)에 따라 ML-RR-CDA와 유사하게 합성하였다: e) t-BuOOH; h) I₂/H₂O; n) TEA 염으로서 획득함, 이온 교환 불필요.

¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 8.44 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 6.08 (d, J = 8.0, 1H), 5.90 (d, J = 7.5, 1H), 5.10-5.0 (m, 3H), 4.30 (d, J = 4.5, 1H), 4.3-4.19 (m, 1H), 4.14 (d, J = 1.5, 1H), 4.05 (q, J = 11.5, 2H) , 3.78-3.75 (m, 2H) , 2.90 (q, J = 7.5, 18H) , 1.08 (t, J = 7.0, 27H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 1.67, -0.47; HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₄O₁₂N₁₀P₂ (M - H)^-에 대한 계산치 657.097763, 측정치 657.09680.

ML- RS - CDA (19c). 화합물 19c 를 ML-CDA 시리즈 실험(문단 [0020])의 과정과 후속하는 개량(도 2b)에 따라 ML-RR-CDA와 유사하게 합성하였다: k) [Rp, Sp] 부분입체이성질체 18c 를 수집하였음; n) TEA 염으로서 획득함, 이온 교환 불필요.

¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 8.52 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 6.10 (d, J = 8.5, 1H), 5.90 (d, J = 7.5, 1H), 5.45 (dd, J = 8.5, 4.5, 1H), 5.31-5.26 (m, 1H), 5.00 (dd, J = 8.5, 4.5, 1H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.22 (d, J = 5.0, 1H) , 4.14-4.07 (m, 3H) , 3.70-3.67 (m, 3H) , 2.84 (q, J = 7.0, 19H) , 1.08 (t, J = 7.5, 29H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 59.98, 57.35; HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₄O₁₀N₁₀P₂S₂ (M -2 H+Na)^-에 대한 계산치 711.0340, 측정치 711.0316.

ML-3'-5'-R- CDA (19e). 화합물 19e 를 ML-CDA 시리즈 실험(문단 [0020])의 과정과 후속하는 개량(도 2b)에 따라 ML-RR-CDA와 유사하게 합성하였다: e) t-BuOOH; h) 3-H-1,2-벤조디티올-3-온; n) TEA 염으로서 획득함, 이온 교환 불필요.

¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 8.49 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 6.09 (d, J = 8.5, 1H), 5.90 (d, J = 7.5, 1H), 5.23 (dd, J = 8.0, 5.0, 1H), 5.12-5.04 (m, 2H), 4.31 (d, J = 4.5, 1H), 4.21-4.14 (m, 3H), 4.10 (q, J = 11.0, 1H), 3.80-3.71 (m, 2H), 2.85 (q, J = 7.0, 18H), 1.08 (t, J = 7.5, 27H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-15μL D₂O) δ 59.32,-0.37; HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₃O₁₁N₁₀P₂S (M - H)^-에 대한 계산치 673.0749, 측정치 673.0729.

암모니아 염으로서 ML-RR- CDA (22). 화합물 22 를 ML-CDA 시리즈 실험(문단 [0020])의 과정과 후속하는 개량(도 2b)에 따라 ML-RR-CDA와 유사하게 합성하였다: n) BT AG ® 50W-X2 레진(Resin) 100-200 메쉬(Mesh), 하이드로겐 형태, 1 M NH₄OH. ¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-30μL D₂O) δ 8.80 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.39 (s, 2H), 6.45 (d, J = 10.0, 1H), 6.34 (s, 1H), 5.50 (td, J = 10.5, 4.5, 1H), 5.21-5.15 (m, 1H), 5.02 (d, J = 4.0, 1H), 4.92 (d, J = 4.5, 1H), 4.61-4.49 (m, 2H) , 4.30-4.27 (m, 2H); ¹HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₃O₁₀N₁₀P₂S₂ (M - H)^-에 대한 계산치 689.0521, 측정치 689.0504.

ML-RR- cGAMP (20). 화합물 20 (도 2c)를 ML-CDA 시리즈 실험(문단 [0020])의 과정과 후속하는 개량(도 2b)에 따라 ML-RR-CDA와 유사하게 합성하였다: d) pyr, 4; n) TEA 염으로서 획득함, 이온 교환 불필요.

¹H NMR (500 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-30μL D₂O) δ 8.34 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 5.91 (d, J = 7.5, 1H), 5.86 (d, J = 8.5, 1H), 5.29-5.23 (m, 1H), 5.17-5.14 (m, 1H), 5.02 (dd, J = 7.5, 4.0, 1H), 4.41 (d, J = 4.5, 1H), 4.25 (dd, J = 5.0, 10.5, 1H), 4.13-4.03 (m, 3H), 3.95-3.85 (m, 1H) , 3.78-3.74 (m, 1H) , 2.84 (q, J = 7.5, 18H) , 1.08 (t, J = 7.5, 28H); ³¹P NMR (200 MHz, 45 ℃, (CD₃)₂SO-30μL D₂O) δ 58.81, 50.91; HRMS (FT-ICR) m / z C₂₀H₂₃O₁₁N₁₀P₂S₂ (M - H)^-에 대한 계산치 705.0470, 측정치 705.0451.

실시예 4. 리보오스 2'- 및 3- 치환된 유도체

본 발명에서의 용도를 발견하는 유도체의 예들이 도 4-6에 도시된다.

실시예 5. CDN-유래 유형 I 인터페론 발현

보조제 능력의 표시로서 천연 및 유도 분자 각각에 의해 인간 세포에서 유래된 유형 I 인터페론의 상대적 수준을 결정하기 위하여, 4x10⁵ THP1-Blue™ ISG 세포(IRF-유도가능하게 분비된 배아(embryonic) 알카라인 포스파타아제 리포터 유전자(인비보겐)로 감염된 인간 단핵구 세포주, 이는 5개 IFN-자극된 반응 원소로 구성된 프로모터의 조절 하에 알카라인 포스파타아제를 발현함)를 100 μM의 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] (CDG), 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (혼합된 연결, 또는 ML-CDG), 또는 HBSS와 함께 30분 동안 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이팅 시켰다. 30분 후, 세포를 세척하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 매질 내 96-웰 디쉬에 놓고 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이팅 시켰다. 각 샘플로부터 세포 배양 상청액을 하룻밤 인큐베이션 이후에 수집하였고, 20 μL의 세포 배양 상청액을 180 μL QUANTI-블루(Blue) 시약(인비보겐)에 첨가하고 45분 동안 인큐베이팅하여 유형 I 인터페론 단백질 수준을 평가하였다. 베르사 맥스(Versa Max) 키네틱(kinetic) 분광광도계(분자 진단)를 사용하여 흡광도 655 nm에서의 눈금값을 3분마다 측정하였다.

도 7에 제시된 바와 같이, 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)은 시간 포인트의 넓은 범위에 걸쳐서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]보다 상당히 더 높은 IFN-β 수준을 유발하였다. 이러한 결과는 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]의 정제된 제조물이 인간 단핵구 세포주 내에서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]가 하는 것보다 더욱 크게 내재 면역 반응을 활성화시킨다는 것을 입증한다.

내재 면역을 활성화시키는 능력의 표시로서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]와 비교하여 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)에 의해 유도되는 IFN-α, -β 및 -γ 의 수준을 결정하기 위하여, 4명의 독립 인간 공여자로부터 분리된 1x 10⁶ 프라이머리 인간 PBMC를 96 웰 U 바닥 플레이트 내에서 30분 동안 37℃에서, 5% CO₂를 사용하여, 5 또는 0.5 μM의 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] (CDG) 또는 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG), 1 μg/mL의 인터페론 자극기 DNA (ISD), 또는 4 μg/mL의 폴리 (I:C)와 함께 이펙텐(Effectene) 감염(transfection) 시약(퀴아겐, Qiagen)을 사용하여 인큐베이팅시켜서 분자를 PBMC로 전환시켰다. ISD(인터페론 자극 DNA)는 TLR 독립성이고(Stetston, D.B. et. al. Immunity 24, 93-103, January 2006) cGAS를 통하여 신호전달하며, 따라서 STING-의존성인 반면, 폴리 (I:C)는 TLR3 및 RIG-I 경로를 통하여 신호전달할 수 있으며, 따라서 STING-독립성이다. 30분 후, 세포를 세척하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 매질로 대체시키고, 37℃에서, 5% CO₂로 인큐베이팅 시켰다. 6시간 인큐베이션 이후, 세포의 일부를 수확해서 유형 I 사이토카인 인터페론 알파 2 (IFNA2) 및 인터페론 베타 1 (IFNB1), 그리고 유형 II 사이토카인 유전자 인터페론 감마(IFNG)의 유전자 발현에 대하여 실시간 정량적 RT-PCR에 의해 평가하였다. 유전자 발현은 프라임 PCR RNA 정제 및 cDNA 분석 시스템을 사용하여 실시간 정량적 RT-PCR에 의해 결정되었고, CFX96 유전자 사이클러(모두 BioRad) 상에서 수행되었다. 정규화된 발현을 각각에 대하여 결정하였고, 이는 표적(E_표적) 및 참조(E_참조)에 대한 PCR 증폭의 상이한 영향력을 설명하며, 로그 규모(logarithmic scaled) 원 데이터(raw data) 단위 사이클 문턱값(Cycle Threshold, CT)을 정규화된 표현의 선형 단위로 전환시킨다. 사용된 참조 유전자는 GUSB 및 PGK1이었으며, 유전자는 0.5 미만의 계수 변수(coefficient variable, CV) 및 1 미만의 M 값을 갖는 것으로 확인되었으며, 따라서 상이한 처리 조건에 따라 변하지 않았다. 이들 사이토카인의 상관적 분비 단백질 수준을 평가하기 위하여, 24시간 인큐베이션 이후 잔류 세포로부터 상청액을 수확하고, IFN-α 및 -γ 수준을 사이토메트릭 비드 어레이(Cytometric Bead Array(CBA), BD Biosciences)에 의해 결정하였으며, 한편 IFN-β 수준을 ELISA(PBL)에 의해 결정하였다.

도 8에 제시된 바와 같이, 인터페론 알파 2 (IFNA2)의 유전자 발현은 모든 4명의 공여자에 걸쳐서 5 μM에서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]에 대한 것보다 5 μM에서 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]에 대한 것이 훨씬 더 높았다. 유사하게, 인터페론 베타 1 (IFNB1)의 유전자 발현은 모든 4명의 공여자에 있어서 5 μM에서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]에 대한 것보다 5 μM에서 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]에 대한 것이 훨씬 더 높았다. 인터페론 감마(IFNG)에 대한 유전자 발현은 모든 4명의 공여자에 걸쳐서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]에 대한 것보다 5 μM에서 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]에 대하여 훨씬 더 높은 수준을 유발하였다. 이러한 데이터는 여러 인간 공여자에 있어서 임계 내재 면역 사이토카인의 유전자 발현을 유발하는 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]와 비교한 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]의 증가된 능력을 입증한다.

도 9(a)에 제시된 바와 같이, 모든 4명의 공여자에 걸쳐서 5 μM에서 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]에 의해 프라이머리 인간 PBMC 내에서 유도된 분비 IFN-α 의 수준이 동일 또는 더 낮은 복용에서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] 보다 더 높다. 도 9(b)에서, 모든 4명의 공여자에 있어서, 5 μM에서 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]에 대하여, ELISA에 의해 평가된 바에 따라, IFN-β의 수준이 또한 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] 유도된 수준, 뿐만 아니라 ISD 및 폴리 I:C 대조군에 의한 것보다 더 높았다. 9(c)는 CBA에 의해 평가된 바에 따라, IFN-γ의 분비에 대한 유사한 관측을 입증한다. 모든 4명의 공여자에 걸쳐서, 5 μM 및 0.5 μM 둘 모두에서, 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]은 동일 복용에서 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]보다 IFN-γ 의 더 높은 수준을 유발하였고, ISD 및 폴리 I:C 대조군보다 더 높은 수준을 유발하였다. 이러한 데이터는 인간 공여자의 광범위한 샘플링에 걸쳐서, 내재 면역의 유도에 중요한, 유형 I 및 II IFN 생성을 자극하는 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p]와 비교한 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p]의 증가된 능력을 입증한다.

보조제 능력의 표시로서 천연 및 유도 분자 각각에 의해 인간 세포 내에서 유래된 IFN-β 의 상대적 수준을 결정하기 위하여, 4x10⁵ THP1-블루(Blue) 세포, 즉 IRF-유도가능하게 분비된 배아 알카라인 포스파타아제 리포터 유전자(인비보겐)로 감염된 인간 단핵구 세포주를 50 μM의 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] (CDG), 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (혼합된 연결, 또는 ML-CDG), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG)로, [A(3',5')pA(3',5')p] (CDA), 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (혼합된 연결, 또는 ML-CDA), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA), 또는 매질 대조군과 비교하여, 30분 동안 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이팅 시켰다. 30분 후, 세포를 세척하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 매질 내 96-웰 디쉬에 놓고 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이팅 시켰다. 각 샘플로부터 세포 배양 상청액을 하룻밤 인큐베이션 이후에 수집하였고, 20 μL의 세포 배양 상청액을 180 μL QUANTI-블루(Blue) 시약(인비보겐)에 첨가하고 45분 동안 인큐베이팅하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 분광광도계(분자 진단)를 사용하여 15분에 흡광도 655 nm에서의 눈금값을 측정하였다.

도 10에 제시된 바와 같이, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG) 유도체는 개량안된 사이클릭 c-di-GMP (CDG) 또는 개량된 CDG 분자보다 IFN-β 의 훨씬 더 높은 수준을 유발하였다. 유사하게, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 분자는 개량안된 CDA 또는 ML CDA 분자보다 훨씬 더 높은 IFN-β 수준을 유발하였다. 이러한 결과는 ML RR-CDN 유도체의 정제된 제조물이 인간 단핵구 세포주 내에서 모체 CDN 분자보다 내재 면역 반응을 더욱 크게 활성화시키는 것을 입증한다.

면역 반응을 활성화시키는 유도체 분자의 상대적인 능력을 결정하기 위하여, CDN 화합물을 6-8주 연령 암컷 BALB/c 생쥐에게 (HBSS 내 전체 부피 100 μL) 50, 5 및 0.5 μM의 복용량으로, 피하 주사로 꼬리의 기저부 내로 투여하였다. 생쥐를, IgG1 동기준(isotype) 대조군과 비교하여, 자연 살해(NK) 세포, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 상에서 표면 CD69 발현의 상향조절에 대한 형광 활성 세포 분류(fluorescent activated cell sorting, FACS)에 의하여 림프구 면역 세포 활성화에 대하여 24시간 후에 평가하였다.

도 11(a-c)에 제시된 바와 같이, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG) 분자는 복용량-의존성 방식으로 NK 및 T 세포의 유능한 면역 활성을 유발하였다. Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 분자는 또한 NK 및 T 세포 활성을 유발하였으나, ML RR-CDG 분자보다는 더 적은 정도이었다. 두 ML RR-CDN 분자들 모두 모든 복용량에서 ML CDN 분자들보다 더 많은 면역 세포 활성을 유발하였다. 이들 데이터는 ML CDN 분자와 비교하여 ML RR-CDN 분자의 증가된 면역 활성 특성을 입증하며, 특히 유능한 면역 세포 활성화를 유발하는 ML RR-CDG 분자의 능력을 강조한다.

실시예 6. 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase)에 대한 Rp,Rp 디티오 CDN의 증강된 내성

인간 세포 내에서 유형 I 인터페론의 유발을 측정하여 처리안된 그리고 포스포디에스터라아제-처리된 옥소, Rp 모노티오 및 Rp, Rp 디티오 유도체의 능력을 평가하였다. 5개 화합물 (사이클릭[A(3',5')pA(3',5')p] (CDA), 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML-CDA), Rp 모노티오 (Rp, 모노티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML R-CDA), Rp, Rp 디티오 (Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(3',5')pA(3',5')p] (RR-CDA), 및 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA)를 Crotalus adamanteus (Sigma)로부터 얻은 160 μg의 스네이크 베놈 포스포디에스터라아제(SVPD), Penicillium citrinum (Sigma)로부터 얻은 2.5 mU의 뉴글레아제 P1 (NP1)로 처리하거나 또는 모형 처리하였다. 7 μg의 각 화합물을 SVPD 완충액(1X PBS 및 0.6 mM MgCl₂), NP1 완충액(30 mM Na 아세테이트, pH 5.3, 2 mM ZnCl₂) 로 희석하거나 처리하지 않고 방치하고 그 후 2시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하고, 후속하여 10분 동안 끓여서 뉴글레아제를 비활성화시켰다. 4x10⁵ THP1-Blue™ ISG 세포(IRF-유도가능하게 분비된 배아 알카라인 포스파타아제 리포터 유전자(인비보겐)로 감염된 인간 단핵구 세포주, 이는 5개 IFN-자극된 반응 원소로 구성된 프로모터의 조절 하에 알카라인 포스파타아제를 발현함)를 50 μM의 모형 처리된 것, SVPD 처리된 것 또는 NP1-처리된 분자로 인큐베이팅하였다. 30분 후, 세포를 세척하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 매질 내 96-웰 디쉬에 놓고 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이팅시켰다. 각 샘플로부터 세포 배양 상청액을 16시간 인큐베이션 이후에 수집하였고, 20 μL의 세포 배양 상청액을 180 μL QUANTI-블루(Blue) 시약(인비보겐)에 첨가하고 25분 동안 인큐베이팅하여 유형 I 인터페론 단백질 수준을 평가하였다. 베르사 맥스(Versa Max) 분광광도계(분자 진단)를 사용하여 흡광도 655 nm에서의 눈금값을 측정하였다.

도 12에 제시된 바와 같이, 처리안된 Rp, Rp 디티오 화합물, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(3',5')pA(3',5')p] (RR-CDA) 및 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA)는 옥소 (사이클릭[A(3',5')pA(3',5')p] (CDA) 및 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML-CDA) 및 Rp 모노티오보다 유형 I 인터페론의 더욱 유능한 유발자이다. (Rp, 모노티오 사이클릭[A(2',5')pA(3',5')p] (ML R-CDA) CDN 유도체 분자. 우리는 2'-5' 및 3'-5' 포스포디에스테르 연결 둘 모두를 절단하는 포스포디에스터라아제 SVPD, 또는 NP1으로 처리한 이후 CDN 유도체의 활성을 평가하였으며, 이는 3'-5'포스포디에스테르 연결을 선택적으로 분해한다(Pino, et al, (2008) Journal of Biological Cheimistry , 283, 36494-36503). 도 12가 제시하듯이 Rp, Rp 디티오 화합물, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(3',5')pA(3',5')p] (RR-CDA) 및 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA)는 SVPD 및 NP1 처리 이후에 자신들의 능력을 유지하는 한편, 옥소 (사이클릭[A(3',5')pA(3',5')p] (CDA) 및 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML-CDA) 는 SVPD 및 NP1에 의한 분해 이후 활성을 상실하였다. 3'-5 포스포디에스테르 연결에서 단일 티오 치환체를 함유하는 Rp 모노티오 유도체(Rp, 모노티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML R-CDA)는 NP1 분해 이후 활성을 유지하였으나, SVPD 처리에 민감하였으며, 이는 2'-5' 포스포디에스터 연결을 절단한다. SVPD 또는 NP1 분해에 대한 옥소, Rp 모노티오 및 Rp, Rp 디티오 유도체의 차등 민감도는 Rp 모노티오 및 Rp, Rp 디티오 유도체의 구조를 확인한다. 이러한 결과는 또한 혈청 및/또는 숙주 세포에 존재하는, 포스포디에스터라아제에 의한 분해에 대한 이들의 내성으로 인한 Rp, Rp 디티오 유도체의 유용성을 입증하며, 이에 따라 여기에 제시된 바와 같이 내재 면역 신호전달의 더욱 유능한 활성화, 및 체내에서의 증가된 치료적 항-종양 효과를 야기한다.

실시예 7. 합성 CDN 유도체 분자는 모든 인간 STING 대립유전자(alleles)의 신호전달을 강력하게 활성화시킨다.

천연 및 유도체 분자에 대한 5가지 공지된 자연적 인간 STING 변종(WT, REF, HAQ, AQ 및 Q로 칭함)의 반응성(responsiveness)을 결정하기 위하여, 인간 STING 대립유전자를 발현한 일단의 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK) 293T 세포주를 발생시켰다. 모체 HEK 293T 세포주는 내인성 STING를 발현하지 않으며, 따라서 외인성으로 발현된 STING 대립유전자의 반응성이 평가될 수 있다. hSTING(REF)-GFP, hSTING(WT)-GFP, hSTING(HAQ)-GFP, hSTING(Q)-GFP 및 mSTING(WT)-GFP를 인코딩하는 MSCV2.2 플라스미드를 UC Berkeley의 Vance Laboratory로부터 획득하였다. hSTING(AQ)-GFP는 QuickChange Site-Directed Mutagenesis 키트(Stratagene)를 사용하여 hSTING(Q)-GFP로부터 유도되었다. hSTING(REF) 대립유전자의 서열은 바버 대립유전자(Barber allele)와 같이 또한 공지되어 있고(Ishikawa , H., and Barber, G.N . (2008). Nature 455, 674-678), NCBI 참조 서열(Reference Sequence) NP_938023.1을 갖는다. hSTING(REF)와 또 다른 WT, HAQ, AQ 및 Q 인간 STING 대립유전자 사이의 아미노산 차이는 도 13에 제시되고, 이는 Yi et al., Plos One 8: e77846 (2013)로부터 인용되었다. 개체 인간 STING 대립유전자 각각을 발현하는 안정한 HEK 293T-유래 세포주를 UC Berkeley의 Cancer Research Laboratory Flow Cytometry Facility에서 Mo Flo 세포 정렬자(sorter)를 사용하는 GFP 양성 세포의 FACS 정렬에 의해 발생시켰다. 1x10⁴ HEK293T STING 세포를 96-웰 플레이트에서 묘종(seed)하였고 루시페라아제 리포터의 상류에 있는 인간 IFN-β 프로모터를 발현하는 50 ng의 인간 IFN-β 리포터 플라스미드 (pLuc-IFN-β) 및 정규화를 위한 10 ng의 TK-레닐라(renilla)를 일시적으로 감염시켰다(Lipofectamine 2000 사용). 24시간 이후, 세포를 디기토닌 투과화를 사용하여 천연 및 합성 CDN 유도체 분자로 자극시켜 일정한 흡수를 확보하였다. 각각의 STING 세포주를 25 ul 디기토닌 완충액(50 mM HEPES, 100 mM KCL, 3 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 85 mM 수크로스, 0.2% BSA, 1 mM ATP, 0.1 mM GTP, 10 ug/ml 디기토닌)에 용해된 10 μM의 사이클릭 [G(3',5')pA(3',5')p] (cGAMP), 사이클릭 [G(2',5')pA(3',5')p] (ML-cGAMP), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-cGAMP), 사이클릭[A(3',5')pA(3',5')p] (CDA), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(3',5')pA(3',5')p] (RR-CDA), 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML-CDA), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA), 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] (CDG), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] (RR-CDG), 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG) 또는 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG)를 사용하여 자극시켰다. 20분 후에, 자극 혼합물을 제거하고 200 ul의 표준 RPMI 매질을 첨가하였다. 6시간 동안의 자극 이후, 세포 용해물(lysate)을 제조하였고 리포터 유전자 활성을 스펙트라맥스(Spectramax) M3 광도계 상에서 이중 루시페라아제 검정 시스템(Dual Luciferase Assay System)(Promega)을 사용하여 측정하였다.

도 14는 IFNβ-LUC 리포터의 배수 유도(fold induction)를 측정함으로써 인간 STING 변형 대립유전자를 인코딩하는 HEK293 세포주의 자극을 도시한다(y-축 상에 표시된 RLU). 도 14에 제시된 바와 같이, Rp, Rp 디티오 혼합 연결 화합물, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-cGAMP), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG) 및 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA)는 모든 인간 STING 대립유전자에 의한 IFNβ 리포터 활성을 강하게 유발시킨다. 불응기 인간 STING 대립유전자, hSTING (REF) 및 hSTING (Q)는 전형적 인터뉴클레오티드 포스페이트 브릿지 연결을 갖는 천연 분자에 의한 자극에 저조하게 반응하였다: 사이클릭 [G(3',5')pA(3',5')p] (cGAMP), 사이클릭[A(3',5')pA(3',5')p] (CDA); 및, 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] (CDG). 현저히 대조적으로, 불응기 인간 STING 대립유전자를 발현하는 세포주는 합성 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA): ML RR-CDA; ML RR-CDG; 및, ML RR-cGAMP에 의한 자극에 반응하였다. 생쥐 STING를 발현하는 세포는 테스트된 모든 분자에 반응하였으며, 이는 개량된 합성 CDN 유도체 분자가 인간 STING 신호전달 경로의 활성에 관련있는 것을 입증한다. 이러한 결과는 Rp, Rp 디티오 혼합 연결 화합물, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-cGAMP), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG) 및 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA)이 테스트된 모든 인간 STING 대립유전자를 강력하게 활성화시키는 것을 입증하며, 이는 이러한 분자가 광범위한 인간 개체에 걸쳐서 내재 면역을 효과적으로 유발할 것을 나타낸다.

합성 CDN 유도체 분자가 인간 수지상 세포(DC)의 성숙을 유발하였음을 입증하기 위하여, 인간 PBMC로부터 취한 CD14⁺ 단핵구를 6일 동안 50 ng/ml GM-CSF 및 25 ng/ml IL-4로 처리하였다. 7일 이후, 단핵구-유래 DC를 매질에 직접적으로 첨가된 LPS (1 μg/ml) 또는 CDN (50 μM)으로 자극시켰다. 48시간 이후, MHC 클래스 I (HLA-ABC), CD80, CD83 및 CD86의 표면 발현은 CD11c⁺ DC 개체 상에 게이트된 FACS에 의해 결정되었다. 도 15A는 도면에 표시된 CDN 분자에 의한 자극 이후 중앙 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)의 평균을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 또한 도 15B에 제시된 것은 인간 DC에서의 CD80, CD86, CD83 및 MHC 클래스 I (HLA-ABC) 발현의 대표적인 그래프이다. 채워진 그래프는 자극안된 세포에 대응하며, 점선은 LPS 자극을 나타내며, 실선은 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 자극을 나타낸다. 이러한 결과는 2'-5, 3'-5' 비전형 또는 혼합 연결(ML) 포스페이트 브릿지 구조와 결합된 인터뉴클레오티드 포스페이트 브릿지의 비-브릿징(non-bridging) 산소 원자의 Rp, Rp 디티오 치환을 포함하는 구조를 갖는 합성 CDN 분자가 모든 인간 STING 대립유전자에서의 신호전달을 활성화하고, 인간 DC의 성숙을 강력하게 활성화하는 것을 입증한다.

실시예 8. CDN-유래 항원-특이성 T-세포 반응

상이한 사이클릭 디뉴클레오티드 분자에 의해 유발된 OVA-특이성 CD8 T 세포 반응을 결정하기 위하여, C57BL/6 생쥐(n=5)를 10 μg 오발부민 단백질을 함유하는 2% 스쿠알렌-및-물에서 제제화된 0 μg (CDN 없음) 또는 5 μg 또는 25 μg [G(2',5')pG(3',5')p] (혼합 연결 또는 ML-CDG) 를 사용하여 피하로 면역시켰다. 백신화로부터 7일 이후, 혈액을 각 동물로부터 수집하여, PBMC를 제조하였다. 5x10⁴ PBMC를 매질을 갖는 IFNγ ELISpot 애세이 내에서 단독으로(자극 안됨) 또는 배양보조 세포(feeder cell)로서 1x10⁵ 천연 지라세포(naive splenocyte)의 존재하에 1 μM OVA_{257 -264} 펩티드와 함께 하룻밤 자극시켰다. IFNγ ELISpots을 성장시키고 CTL 플레이트 리더 및 ImmunoSpot 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.

도 16에 제시된 바와 같이, 두 가지 복용의 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)가 C57BL/6 생쥐에서 OVA-특이성 CD8 면역 반응을 유발한다. 이러한 반응은 자극안된 대조군 또는 CDN 없는 대조군 그룹에 의해 유발된 반응보다 훨씬 더 높다. 이러한 결과는 항원을 동반한 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)의 제제가 체내(in vivo) 항원-특이성 CD8 T 세포 반응을 자극할 수 있음을 입증한다.

OVA-특이성 CD8 T 세포 반응을 유발하기 위해 STING 신호전달이 c[G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG) 에 요구되는지 여부를 결정하기 위해, C57BL/6 생쥐(n=3 또는 5) 및 골든티켓(goldenticket) 생쥐(n=3)를 10 μg 오발부민 단백질을 함유하는 2% 스쿠알렌-및-물에서 제제화된 0 μg (CDN 없음) 또는 25 μg c[G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)를 사용하여 피하로 면역시켰다. 백신화로부터 7일 이후, 혈액을 각 동물로부터 수집하여, PBMC를 제조하였다. 5x10⁴ PBMC를 매질을 갖는 IFNγ ELISpot 애세이 내에서 단독으로(자극 안됨) 또는 배양보조 세포(feeder cell)로서 1x10⁵ 천연 지라세포(naive splenocyte)의 존재하에 1 μM OVA_{257 -264} 펩티드와 함께 하룻밤 자극시켰다. IFNγ ELISpots을 성장시키고 CTL 플레이트 리더 및 ImmunoSpot 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.

도 17은 c[G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)가 기능 STING 분자의 존재에 의존성인 OVA-특이성 CD8 T 세포 반응을 유발하는 것을 나타낸다. 기능 STING 분자를 갖는 야생형 C57BL/6 생쥐에 있어서, c[G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG) 및 오발부민 단백질의 제제는 자극안된 대조군 및 CDN 없는 대조군과 비교하여 상당한 OVA_{257 -264} 면역 반응을 유발한다. 기능 STING 분자를 발현하지 않는(Sauer, Infection and Immunity 2011) 골든티켓 생쥐에 있어서, c[G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)에 의해 유발된 OVA-특이성 반응은 CDN을 포함하지 않는(CDN 없는) 대조군 제제에 의해 유발된 OVA-특이성 반응과 크게 다르지 않다. 이러한 결과는 c[G(2',5')pG(3',5')p] (ML-CDG)에 의해 유발된 면역 반응이 기능 STING 분자를 요구하는 것을 나타낸다.

실시예 9. 여러 CDN 유도체의 비교 데이터

항-종양 면역을 증진하는 유도체 분자의 능력을 평가하기 위하여, B16 흑색종 세포(100 μL PBS 내 5x10⁴ 세포)를 6-8주 연령 암컷 C57BL/6 생쥐(그룹당 8마리 생쥐)의 아래쪽 등에 피하로 이식하였다. 종양이 약 75 mm³ 부피에 도달할 때 치료를 시작하였으며, 그 날은 종양 이식 후 14일째이었다. CDN 화합물을 27 게이지 바늘을 사용하여 종양의 중앙에 피하 주사로 투여하였다(전체 부피 40 μL HBSS 내 25 μg). 전체 3회 종양내 주사를 위하여, 주사를 3일 마다 반복하였다. 테스트된 CDN은 사이클릭 [G(3',5')pG(3',5')p] (CDG); 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (혼합된 연결, 또는 ML CDG); Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG); 사이클릭 [A(3',5')pA(3',5')p] (CDA); 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (혼합된 연결, 또는 ML CDA); 및 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA)이었다.

도 18에 제시된 바와 같이, ML RR-CDG 및 ML RR-CDA 유도체는 사이클릭 ML CDG 및 사이클릭 ML CDA 사이클릭 디뉴클레오티드 분자와 비교하여, 강력한 항-종양 효능을 유발하였다. ML RR-CDA 분자는 ML CDA 유도체(P = 0.0004, 스튜던트 t-검정)보다 훨씬 더 많은 종양 거부를 유발하였고, 생쥐들은 종양 이식 후 44일까지 ML RR-CDG 종양 그룹에서 거의 종양-없이 잔류하였다. 이러한 데이터는 ML CDN 유도체 분자와 비교하여 ML RR-CDN 유도체의 증강된 능력을 입증하며, B16 흑색종 생쥐 모델에서 ML RR-CDN 분자의 상당한 항-종양 효능을 입증한다.

항-종양 면역을 증진하는 유도체 분자의 능력을 추가 평가하기 위하여, CT26 결장암 세포(100 μL PBS 내 2x10⁵ 세포)를 6-8주 연령 암컷 BALB/c 생쥐에 정맥내 주사로 이식하였으며 전체 생존 동안 평가하였다. CDN 화합물(전체 부피 100 μL의 HBSS 내 25 μg)을 종양 이식 1일 이후 꼬리의 기저부에 피하 주사로 투여하였다. 생쥐를 전체 2회 백신화를 위하여 1주일 후 추가 주사를 실시하여 촉진시켰다.

도 19A에 도시된 바와 같이, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG)은 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML CDG) 분자(P = 0.0018, 로그-랭크 테스트)와 비교하여 훨씬 더 높은 생존률을 유발하였으며, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA)는 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML CDA) 분자(P = 0.0005, 로그-랭크 테스트)와 비교하여 훨씬 더 높은 생존률을 유발하였다. 이는 CT26 폐 전이(lung metastasis) 생존 모델에서 ML CDN 유도체 분자와 비교하여 ML RR-CDN 유도체의 상당한 항-종양 효능을 입증한다. 이러한 결과는 CDN 유도체 분자가 피하로 성공적으로 투여될 수 있음을 입증한다.

CDN 유도체 분자에 의해 유발된 항-종양 효능 및 종양-개시된 T 세포 프라이밍의 활성화가 단일 종양 유형 및 마우스 유전자 배경에 제한되지 않는다는 것을 입증하기 위하여, 또 다른 종양 모델에서 항-종양 면역을 증진하는 합성 CDN의 능력을 시험하였다. CT26 결장암 세포(100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포) 또는 4T1 유방암 세포(mammary carcinoma cells) (100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포)를 6-8주 연령 암컷 BALB/c 생쥐(그룹 당 8마리 생쥐)의 측면에 피하로 이식하였다. 종양이 약 75 mm³ 부피에 도달할 때 치료를 시작하였으며, 그 날은 종양 이식 후 약 14일째이었다. 화합물 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 또는 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG) 화합물 (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 25 μg), 또는 HBSS 운반체 대조군, 및 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 50 μg) 또는 HBSS 운반체 대조군을 27 게이지 바늘을 사용하여 종양의 중앙에 피하 주사로 투여하였다. 전체 3회 종양내 주사를 위하여, 주사를 3일 마다 반복하였다.

도 19B에 제시된 바와 같이, ML RR-CDG는 8마리 중 7마리 생쥐에서 완전하게 종양 성장을 억제하였으며, 한편 ML RR-CDA는 모든 성장된 CT26 종양의 종양 성장을 완전하게 억제했다. 도 19C에 제시된 바와 같이, ML RR-CDA 유도체는 모든 성장된 4T1 유방암의 종양 성장을 완전하게 억제했다. 이러한 데이터는 여러 종양 모델에서 합성 혼합 연결 RpRp 디티오 사이클릭 디뉴클레오티드 (ML RR-CDN) 유도체의 놀라운 능력 및 지속적 항-종양 효능을 입증한다.

실시예 10. CDN 유래 항-종양 효능은 STING-의존성이다

유도체 분자의 효과가 STING-의존성인지 여부를 결정하기 위하여, B16 흑색종 세포(100 μL PBS 내 5x10⁴ 세포)를 6-8주 연령 암컷 골든티켓 STING^-/- 생쥐, 또는 야생형 C57BL/6 대조군 생쥐(그룹당 5마리 생쥐)의 오른쪽 측면에 이식하였다. 종양이 약 75 mm³ 부피에 도달할 때 치료를 시작하였으며, 그 날은 종양 이식 후 14일째이었다. 투여된 화합물은 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [G(2',5')pG(3',5')p] (ML RR-CDG) (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 25 μg), Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 50 μg), TLR9 효능제 CpG 1668 (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 50 μg), 또는 HBSS 운반체 대조군이었다. 생쥐를 27 게이지 바늘을 사용하여 단지 종양의 중앙에 피하로 주사하여 처리하였다. 전체 3회 종양내 주사를 위하여, 주사를 3일 마다 반복하였다.

도 20A에 제시된 바와 같이, 유도체 ML RR-CDN은 HBSS 대조군과 비교하여 야생형 C57BL/6 생쥐에서 드라마틱한 종양 억제를 유발하였으며, TLR9 효능제 CpG 1668(P = 0.03, 스튜던트 t-검정) 보다 훨씬 더 많은 종양 억제를 유발하였다. 도 20B에서, 종양 성장은 ML RR-CDG 또는 ML RR-CDA에 의해 억제되지 않았는데, 이는 야생형 C57BL/6 생쥐에서 관찰된 항-종양 효능(도 20A)이 기능적 STING 신호전달 경로에 전적으로 의존하였다는 것을 입증한다. 이와 대조적으로, CpG 1668의 종양 성장은 야생형 및 STING^-/- 생쥐 둘 모두와 유사하였으며, HBSS 대조군(P = 0.03, 스튜던트 t-검정)과 비교하여, 이러한 화합물의 작용이 STING-독립성이라는 것을 입증한다.

실시예 11. CDN 유도체는 지속적이고 효과적인 항-종양 특이성 T-세포 면역을 유발한다

합성 유도체 CDN 분자가 지속적이고 효과적인 항-종양 T-세포 면역을 유발하는지 여부를 결정하기 위하여, 6-8주 연령 암컷 BALB/c 생쥐(그룹 당 8마리 생쥐)에게 CT26 결장암 세포(100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포)를 이식시켰다. 생쥐를 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 화합물 (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 50 μg) 또는 HBSS 운반체 대조군으로 처리하고, 종양 성장을 앞선 실시예처럼 관찰하였다. 생쥐를 종양 이식 18일째 되는 날 채혈하였으며 PBMC를 피콜 구배(Ficoll gradient) (Miltenyi Biotech)에 의해 분리하였다. 5x10⁴ PBMC를 매질을 갖는 IFNγ ELISpot 애세이 내에서 단독으로(자극 안됨), 또는 배양보조 세포로서 1x10⁵ 천연 지라세포(naive splenocyte)의 존재하에 1 μM의 내인성 H-2 L^d-제한적 종양 거부 항원 AH1 펩티드와 함께 하룻밤 자극시켰다. IFN-γ ELISpot 플레이트를 성장시키고 CTL 플레이트 리더 및 ImmunoSpot 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 종양 이식 후 55일째 날, 생존 생쥐 및 연령-일치하는 천연(naive) 대조군 생쥐에게 CT26 또는 4T1 (둘 모두 100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포) 종양 세포를 대측성 측면에 이식하고(그룹 당 4마리 생쥐), 종양 성장을 관찰하였다.

도 21A에 제시된 바와 같이, ML RR-CDA로 처리된 모든 생쥐는 성장한 CT26 대장암의 성장을 거부하였다. 효과가 적응형 T 세포 면역 반응의 CDN-매개 유도에 의해 매개되었는지 여부를 결정하기 위하여, PBMC를 종양 유발 후 18일째 날 내인성 종양 항원 AH1에 의한 자극에 대한 반응에서, ELISpot 에세이에 의한 IFN-γ 생성에 대하여 평가하였다. 도 21B에 제시된 바와 같이, ML RR-CDA로 처리된 생쥐로부터 분리한 PBMC는 HBSS-처리된 대조군 그룹(P = 0.003, 스튜던트 t-검정)과 비교하여, AH1 펩티드 자극에 대한 반응에서 훨씬 더 높은 IFN-γ를 발생시켰다. 또한, 도 21C에서, 반대쪽 종양으로 다시-시도된 생존 생쥐는 동일한 CT26 종양 유형에 대한 완전한 보호를 나타냈으나, 한편 4T1 종양 유형의 성장 억제는 나타내지 않았다. 이러한 데이터는 지속적이고 효과적인 종양-특이성 T 세포-매개 항-종양 면역을 유발하는 ML RR-CDA의 능력을 입증하며 이는 처리된 종양의 거부, 및 종양 도전을 거부할 수 있는 안정한 종양-항원 특이성 기억 T 세포 개체를 야기한다.

CDN 유도체 분자가 효과적이고 지속적인 항-종양 면역을 또 다른 종양 모델에서 유발하는지 여부를 결정하기 위하여, 6-8주 연령 암컷 BALB/c 생쥐(그룹 당 8마리 생쥐)에게 4T1 유방암 세포(100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포)를 이식하였다. 생쥐를 앞선 실험에 따라, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 화합물 (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 50 μg) 또는 HBSS 운반체 대조군으로 처리하였다. 종양 이식 후 35일째 날, 생존 생쥐 및 연령-일치하는 천연(naive) 대조군 생쥐에게 CT26 또는 4T1 (둘 모두 100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포) 종양 세포를 대측성 측면에 이식하고(그룹 당 4마리 생쥐), 종양 성장을 관찰하였다.

도 22A에 제시된 바와 같이, 그리고 앞서 입증한 바와 같이, ML RR-CDA에 의한 처리는 성장된 4T1 유방암의 종양 성장을 완전하게 억제하였다. 또한, 도 22B에서, 대측성 측면에 대한 4T1 종양 세포의 재시도가 완전한 보호를 유발하였다. 더욱 면역성인 CT26 종양에 의한 재시도가 또한 완전한 보호를 유발하였으며, 이는 이러한 종양이 유사한 종양 항원을 공유하는 것을 나타내며, 또한 합성 CDN 유도체 분자의 능력의 추가 증거를 제공한다.

실시예 12. CDN 합성 유도체의 종양내 주사에 의한 종양-개시 T 세포 프라이밍의 활성화는 앱스코팔(abscopal) 종양 억제를 유발한다.

여기에 제시된 실시예는 합성 CDN 유도체의 종양내(IT) 주입이 현저하고 지속적인 종양 파괴를 유발하는 것을 입증하는데, 이는 효과적인 종양 -특이성 T 세포 면역의 개발을 촉진하기 위한, 전-염증성 사이토카인의 STING-의존성 활성화때문이다. 종양-특이성 T 세포 면역의 STING-의존성 유발은 자가유래(autologous) 종양에 의한 후속 도전에 대항하여 동물을 보호한다. 진행암이 전이성이라는 것, 및 효과적이기 위해서, 치료법이 말단 덩어리의 과성장을 억제해야만 한다는 것은 해당 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 말단 미처리 종양 덩어리의 종양 과성장을 억제하는 하나 또는 선택된 병변의 치료는 앱스코팔 효과(abscopal effect)로 알려져 있다. 합성 CDN 유도체 분자를 선택된 종양에 IT 주입하는 것이 말단 미처리 종양의 종양 과성장을 억제하였는지 여부를 테스트하기 위하여, (A) CT26 결장암 세포 (100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포) 및 (B) 4T1 유방암 세포(100 μL PBS 내 1x10⁵ 세포)를 6-8주 연령 암컷 BALB/c 생쥐 (그룹 당 8마리 생쥐)의 대측성 측면에 피하로 이식하였다. 종양이 약 75 mm³ 부피에 도달할 때 치료를 시작하였으며, 그 날은 종양 이식 후 13일째이었다. Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 화합물(전체 부피 40 μL의 HBSS 내 50 μg), 또는 HBSS 운반체 대조군을 27 게이지 바늘을 사용하여 단지 일차 (오른쪽 측면) 종양의 중앙에 피하 주사로 투여하였다. 전체 3회 종양내 주사를 위하여, 주사를 3일 마다 반복하였다.

도 23에 제시된 바와 같이, Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) 화합물은 HBSS 운반체 대조군과 비교하여, CT26 (도 23A) 및 4T1 (도 23B) 종양-보유 동물 둘 모두에서 상기 처리된 일차 종양의 완전한 억제를 유발하였다. 또한, 두 종양 모델에서 대측면(처리안된) 종양의 과성장이 또한 HBSS 대조군(도 23A P = 0.0011, 도 23B P = 0.0019, 스튜던트 t-검정)과 비교하여, 상당히 억제되었다. 이러한 데이터는 일차 종양에 주입될 때 ML RR-CDA 유도체의 상당한 항-종양 효능, 뿐만 아니라 이의 상당한 앱스코팔(abscopal) 항-종양 면역 효과를 입증한다.

합성 CDN 유도체 분자가 또 다른 종양 모델 및 생쥐 유전자 배경에서 앱스코팔 항-종양 면역을 증진하는지 여부를 결정하기 위하여, 6-8주 연령 암컷C57BL/6 생쥐(그룹 당 8마리 생쥐)에게 B16 흑색종 세포(100 μL PBS 내 5x10⁴ 세포)를 오른쪽 측면에 이식하였다. 1주 후, 생쥐에게, 천연(naive) 연령-일치 대조군 생쥐와 함께, 폐에 서식시키기 위해 1x10⁵ B16 흑색종 세포를 정맥내로 이식하였다. 피하 측면 종양이 13일째 약 75 mm³에 도달하였을 때, 생쥐를 Rp, Rp 디티오 사이클릭 [A(2',5')pA(3',5')p] (ML RR-CDA) (전체 부피 40 μL의 HBSS 내 50 μg) 또는 HBSS 운반체 대조군으로, 전술한 방법에 따라 3회 주입을 위하여, 종양내로 처리하였다. 피하 종양 이식 이후 28일째(i.v. 이식 후 21일), 생쥐를 안락사시키고 폐를 수확하여 고정시키고(10% 중성 완충된 포르말린), 폐 종양 혹의 숫자를 해부 현미경를 사용하여 카운트하였다.

도 24A에 제시된 바와 같이, 그리고 전술한 실험에서와 같이, ML RR-CDA에 의한 처리는 HBSS 대조군 그룹(P < 0.001, 스튜던트 t-검정)과 비교하여, 일차 측면 종양의 종양 성장을 상당히 억제시켰다. 또한, 도 24B에서 그리고 도 24C에 도시된 바와 같이, CDN 유도체에 의한 처리는 HBSS 및 천연(naive) (단지 i.v.) 종양 그룹과 비교하여, 말초 폐 종양 결절의 성장을 상당히 억제시켰다. 여기에 제시된 결과는 합성 CDN 유도체의 종양내(IT) 주입이 상기 처리된 종양의 파괴에 의해 입증된 것과 같이 앱스코팔 항-종양 효과를 야기하며, 이는 전-염증성 사이토카인 STING-의존성 활성 및 효과적인 종양-특이성 T 세포 면역의 개선 때문이며, 그 후 처리안된 말단 종양의 과성장을 억제하는 것을 입증한다.

해당 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 목적을 수행하기 위해 용이하게 적용되며 언급된 목적 및 장점뿐만 아니라 여기에 본질적인 것들을 획득한다는 것을 용이하게 이해한다. 여기에 제공된 실시예는 바람직한 구체 예의 대표적인 것이며, 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명은 후속하는 설명에 제시되거나 도면에 도시된 성분의 배열 및 구성의 상세사항에 한정되지 않음이 이해될 것이다. 본 발명은 설명된 것에 부가하여 예시될 수 있으며 다양한 방법으로 실현되거나 수행될 수 있다. 또한, 여기에 사용된 어법 및 용어, 뿐만 아니라 요약은 설명 목적을 위한 것이며, 제한적으로 이해되어서는 안된다는 것이 이해될 것이다.

이와 같이, 해당 분야의 통상의 기술자는 본 문헌이 기초로 하는 개념이 본 발명의 여러 목적을 수행하기 위하여 또 다른 구조, 방법 및 시스템의 설계를 위한 기초로서 용이하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 청구항이 이러한 균등 구조를 포함하는 것으로 고려되는 것이 중요하다.

본 발명이 본 발명을 실현하고 사용하도록 해당 분야의 통상의 기술자에게 충분히 상세하게 설명되고 예시되는 한편, 여러 대안, 개량, 및 개선이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 것이 명백하다. 여기에 제공된 실시예는 바람직한 구체 예의 대표적인 것이며, 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 여기에 제시된 개량 및 또 다른 용도가 해당 분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 이러한 개량은 본 발명의 사상에 포함되며 청구항의 범위에 의해 정의된다.

치환 및 개량의 변형이 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 여기에 기재된 발명에 대해 이루어질 수 있음이 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.

명세서에 기재된 모든 특허 및 공개문헌들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술 수준을 나타낸다. 각각의 개별 공개문헌이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 여기에 수록되는 것으로 표시되는 것과 같이 모든 특허 및 공개문헌은 동일한 정도로 참조로서 여기에 수록된다.

여기에 적절하게 예시적으로 개시된 발명은 여기에 구체적으로 개시되지 않은 임의 요소 또는 요소들, 한정 또는 한정들의 부재에서도 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 여기서 각각의 예에서 용어 "포함하는", "본질적으로 구성된", 및 "구성된"은 나머지 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 설명 용어로 사용되나 한정적 용어로 사용되는 것은 아니며, 제시되거나 설명된 도면 또는 그 일부분의 임의 균등물을 제외하는 용어 및 표현으로 사용하는 의도가 없으며, 청구된 발명의 범위 내에서 여러 변형이 가능하다는 것이 인지된다. 따라서, 비록 본 발명이 바람직한 구체 예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 기재되었으나, 여기에 개시된 사상의 개량 및 변형이 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 재구성될 수 있으며, 이러한 개량 및 변형이 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 범위 내로 고려된다는 것이 이해되어야 한다.

또 다른 구체 예들이 이하의 청구항에서 제시된다.

Claims (48)

1. STING-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도하는 하나 이상의 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드, 또는 이의 전구약물 또는 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 조성물로서, 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드는 다음 구조를 갖는 것인 조성물:
   

   

   (b)에 공유결합으로 연결된
   

   

   (a)
   식 중,
   R3은 (b)의 5' 탄소에 대한 공유 결합이고,
   R4는 (b)의 2' 또는 3' 탄소에 대한 공유 결합이고,
   R1은 자신의 N9 질소를 통하여 (a)의 리보오스 고리에 연결된 푸린이고,
   R5는 자신의 N9 질소를 통하여 (b)의 리보오스 고리에 연결된 푸린이고,
   X₁ 및 X₂ 각각은 독립적으로 O 또는 S이고,
   R2는 H이거나, 또는 1 내지 18개의 탄소 및 0 내지 3개의 헤테로원자의 선택적으로 치환된 직쇄 알킬, 1-9개의 탄소의 선택적으로 치환된 알켄일, 1-9개의 탄소의 선택적으로 치환된 알킨일, 또는 선택적으로 치환된 아릴이며, 여기서 치환체(들)는, 존재하는 경우, 독립적으로 C_1-6 알킬 직쇄 또는 측쇄, 벤질, 할로겐, 트리할로메틸, C_1-6 알콕시, -NO₂, -NH₂, -OH, =O, -COOR' (여기서 R'는 H 또는 저급 알킬임), -CH₂OH 및 -CONH₂로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며,
   (a)와 공유 결합하지 않는 (b)의 2' 또는 3' 탄소는 -O-R6이며, 여기서 R6은 H이거나, 또는 1 내지 18개의 탄소 및 0 내지 3개의 헤테로원자의 선택적으로 치환된 직쇄 알킬, 1-9개의 탄소의 선택적으로 치환된 알켄일, 1-9개의 탄소의 선택적으로 치환된 알킨일, 또는 선택적으로 치환된 아릴이며, 여기서 치환체(들)는, 존재하는 경우, 독립적으로 C_1-6 알킬 직쇄 또는 측쇄, 벤질, 할로겐, 트리할로메틸, C_1-6 알콕시, -NO₂, -NH₂, -OH, =O, -COOR' (여기서 R'는 H 또는 저급 알킬임), -CH₂OH 및 -CONH₂로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
2. 제 1 항에 있어서, R4가 (b)의 2' 탄소에 대한 공유 결합인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, R4가 (b)의 3' 탄소에 대한 공유 결합인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 R6 둘 모두가 H인 것은 아닌, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, R2 및 R6 중 하나 또는 둘 모두가 세포 에스터라아제(cellular esterase)에 의해 제거되는 전구약물 이탈기를 포함하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 전구약물 이탈기가 C6 내지 C18 지방산 에스테르인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
7. 제 5 항에 있어서, R2 및 R6 중 하나 또는 둘 모두가 미리스토일(myristoyl)인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
8. 제 5 항에 있어서, R2 및 R6 중 하나 또는 둘 모두가 펜타노일(pentanoyl)인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
9. 제 5 항에 있어서, R2 및 R6 중 하나 또는 둘 모두가 헥사노일(hexanoyl)인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
10. 제 5 항에 있어서, R2 및 R6 중 하나 또는 둘 모두가 헵타노일(heptanoyl)인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, X₁ 및 X₂ 둘 모두가 S인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
12. 제 14 항에 있어서, 상기 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드가 하나 이상의 실질적으로 순수한 Sp,Sp, Rp,Rp, Sp,Rp 또는 Rp,Sp 입체이성질체를 포함하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R5가 독립적으로 아데닌, 구아닌, 이노신 및 크산틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
14. 제 13 항에 있어서, R1 및 R5 중 하나 또는 둘 모두가 아데닌인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
15. 제 13 항에 있어서, R1 및 R5 중 하나 또는 둘 모두가 구아닌인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
16. 제 13 항에 있어서, R1이 아데닌이고 R5가 구아닌인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-5' 연결을 갖는 c-di-GMP와 비교하여, 적어도 2배, 더욱 바람직하게는 5배 또는 10배의 STING-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도하는, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
18. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드가 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드의 세포 흡수 및/또는 안정성을 증강시키는 전달 운반체와 함께 제제화되는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 전달 운반체가 지질, 층간 가교된 다중라멜라 소포체(interbilayer crosslinked multilamellar vesicle), 생분해성 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) [PLGA]-기반 또는 폴리 무수물-기반 나노입자 또는 마이크로입자, 및 나노다공성 입자-지지된 지질 이중층으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, CTLA-4 길항제, TLR 효능제, CpG 및/또는 모노포스포릴 지질 A를 더 포함하는, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 수지상 세포 유도, 동원(recruitment) 및/또는 성숙(maturation)을 자극하는 하나 이상의 사이토카인(cytokine)을 발현하고 분비하는 비활성 종양 세포를 더 포함하는, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 비활성 종양 세포가 GM-CSF를 발현하고 분비하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
23. 제 21 항에 있어서, 상기 비활성 종양 세포가 CCL20을 발현하고 분비하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
24. 제 21 항에 있어서, 상기 비활성 종양 세포가 CCL3을 발현하고 분비하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
25. 제 21 항에 있어서, 상기 비활성 종양 세포가 IL-12p70을 발현하고 분비하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
26. 제 21 항에 있어서, 상기 비활성 종양 세포가 FLT-3 리간드를 발현하고 분비하는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
27. 제 21 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포가 방사선 치료에 의해 비활성화되는 것인, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
28. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 개체에 투여될 때 항원(들)에 대항하는 면역 반응을 유도하기 위해 선택되는 하나 이상의 항원을 더 포함하는, 실질적으로 순수한 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드 조성물.
29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 면역 반응을 유도하는 방법.
30. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 STING-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도하기에 충분한 용량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 STING-의존성 유형 I 인터페론 생성을 유도하는 방법.
31. 암 항원을 발현하는 암 세포를 제거하거나 사멸시키기 위해 암에 걸린 포유동물에 제공되는 초기 요법 이전에 또는 이후에, 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 효과량을 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 포유동물의 치료 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 조성물이 초기 요법 이후에 투여되는 것인 방법.
33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 초기 요법이 상기 포유동물로부터 암 세포를 제거하기 위한 수술, 상기 포유동물 내 암 세포를 사멸시키기 위한 방사선 요법, 또는 수술 및 방사선 요법 둘 모두를 포함하는 것인 방법.
34. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 효과량을 암에 걸린 포유동물에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 포유동물의 치료 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 비경구적 투여가 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular) 또는 피내(intradermal) 투여인 방법.
36. 제 34 항에 있어서, 상기 비경구적 투여가 종양 덩어리(tumor mass) 내로 직접 수행되는 것인 방법.
37. 제 29 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드의 X₁ 및 X₂ 둘 모두가 S인 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드가 하나 이상의 실질적으로 순수한 Sp,Sp, Rp,Rp, Sp,Rp 또는 Rp,Sp 입체이성질체를 포함하는 것인 방법.
39. 제 38 항에 있어서, 상기 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드가 실질적으로 순수한 Rp,Rp 입체이성질체를 포함하는 것인 방법.
40. 제 29 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, CTLA-4 길항제, PD-1 경로 길항제 및 TLR 효능제 중 하나 이상을 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
41. 제 29 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 치료용 항체를 상기 포유동물에 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
42. 항체-의존성 세포독성(cellular cytotoxicity)을 유도하는 1종 이상의 치료용 항체와 함께 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 항체-의존성 세포독성을 자극하는 방법.
43. 제 42 항에 있어서, 상기 투여가 비경구적 투여인 방법.
44. 제 43 항에 있어서, 상기 투여가 피하, 근육내 또는 피내 투여인 방법.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 비경구적 투여가 종양 덩어리 내로 직접 수행되는 것인 방법.
46. 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드의 X₁ 및 X₂ 둘 모두가 S인 방법.
47. 제 46 항에 있어서, 상기 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드가 하나 이상의 실질적으로 순수한 Sp,Sp, Rp,Rp, Sp,Rp 또는 Rp,Sp 입체이성질체를 포함하는 것인 방법.
48. 제 47 항에 있어서, 상기 조성물 내에 존재하는 사이클릭 푸린 디뉴클레오티드가 실질적으로 순수한 Rp,Rp 입체이성질체를 포함하는 것인 방법.

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