WO2024096122A1 - Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節する微生物およびその生産方法 - Google Patents

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大雅 田宮
千晶 石井
亮 奥村
翔子 宮崎
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • This disclosure relates to a microorganism that regulates the activation ability of Toll-Like Receptor 5 (TLR5), and a method for producing the microorganism.
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • ICIs immune checkpoint inhibitors
  • the present disclosure provides: (Item 1) A microorganism, in which at least one gene of a group of flagella-constituting genes in the microorganism has been modified, and the modification regulates the activation ability of Toll-Like Receptor 5 (TLR5) in a host, as compared with a microorganism having the gene that has not been modified. (Item 2) The microorganism described in the preceding item, wherein the flagellum-constituting gene group includes fliC, fliD, flgE, fliF, flgK, flgM, flgN, fliT, and sigD.
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • the microorganism according to any one of the preceding items, wherein the modification comprises a point mutation in the gene.
  • the modification includes a mutation that generates a stop codon.
  • the microorganism according to any one of the preceding items, wherein the modification comprises at least two mutations in the at least one gene.
  • the modification includes at least one mutation in each of at least two genes selected from the group of flagellar component genes.
  • the modification includes at least two mutations in each of at least two genes selected from the group of flagellar component genes.
  • the microorganism comprises enterococcus.
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • a method for producing a microorganism for regulating the activation ability of Toll-Like Receptor 5 (TLR5) in a host comprising: (A) modifying at least one gene of a flagella-constituting gene group in the microorganism, by converting one or more nucleotides of a target nucleic acid sequence of the gene to another nucleotide or deleting the nucleotide, or by inserting one or more nucleotides into the target nucleic acid sequence of the gene in the microorganism; (B) testing the TLR5 activation ability of microorganisms having the modified gene, and selecting microorganisms having an altered TLR5 activation ability by comparing with microorganisms having an unmodified gene; (C) repeating steps (A) and (B) as necessary
  • the flagellum-constituting gene cluster comprises fliC, fliD, flgE, fliF, flgK, flgM, flgN, fliT, and sigD.
  • the regulation of TLR5 activation ability comprises improving TLR5 activation ability.
  • the modification increases the expression level of Flagellin in the host and/or increases the extracellular secretion level of Flagellin, compared to a microorganism having the gene without modification.
  • a pharmaceutical comprising a microorganism, wherein at least one gene in a group of flagella-constituting genes in the microorganism has been modified, and the modification regulates the activation ability of Toll-Like Receptor 5 (TLR5) in a host, as compared to a microorganism having the gene that has not been modified.
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • the pharmaceutical described in the above item, wherein the pharmaceutical is for treating or preventing cancer or an infectious disease.
  • the infectious disease includes an infectious disease caused by at least one selected from the group consisting of bacteria and viruses.
  • (Item C4) The pharmaceutical agent according to any one of the preceding items, wherein the pharmaceutical agent is administered in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor is selected from the group consisting of agents against molecules selected from the group consisting of CTLA-4, PD-1, LAG-3, BTLA, KIR, TIM-3, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, GAL9, CD160, VISTA, BTNL2, TIGIT, PVR, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A2, and CSF-1R, and any combination thereof.
  • a method for treating or preventing cancer or an infectious disease comprising administering a medicament described in any one of the preceding items.
  • the present disclosure makes it possible to regulate the activation ability of Toll-Like Receptor 5 (TLR5) in a host by subjecting a microorganism to specific modifications, thereby obtaining a microorganism with improved TLR5 activation ability. Furthermore, by combining genes targeted for modification, a synergistic effect of improving TLR5 activation ability can be expected.
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • FIG. 1 shows the results of genome editing sites in a microorganism and its TLR5 activation ability in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2-1 shows the results of genome editing sites in a microorganism and its TLR5 activation ability in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2-2 shows the results of genome editing sites in a microorganism and its TLR5 activation ability in one embodiment of the present disclosure.
  • Figures 2-3 show the results of genome editing sites in a microorganism and its TLR5 activation ability in one embodiment of the present disclosure.
  • Figures 2-4 show the genome editing sites of a microorganism and its TLR5 activation ability in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2-5 show the results of genome editing sites in a microorganism and its TLR5 activation ability in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3 is a photograph showing electrophoresis confirming the expression of Flagellin in a microorganism according to one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of TNF ⁇ produced when human macrophage-like THP-1 cells were stimulated with a microorganism according to one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 5 is a graph showing the amounts of TNF ⁇ and IFN ⁇ produced when human peripheral blood mononuclear cells were stimulated with a microorganism according to one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a test design for a simultaneous administration test with an anti-PD-1 antibody in one embodiment of the present disclosure.
  • the diagram shows a case where the administration of the bacterial liquid is started from Day 0 simultaneously with the administration of the anti-PD-1 antibody.
  • FIG. 7 is a graph showing the survival rate of a microorganism according to one embodiment of the present disclosure when administered alone or in combination with an anti-PD-1 antibody.
  • 8 is a graph showing the survival rate when the microorganism according to one embodiment of the present disclosure was administered alone or simultaneously with an anti-PD-1 antibody. A significant difference was confirmed between the administration of the genome-edited strain alone and the administration in combination with an anti-PD-1 antibody.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing a test design for a simultaneous administration test with an anti-PD-1 antibody in one embodiment of the present disclosure.
  • a schematic diagram is shown in which administration of a bacterial liquid is started on Day -14.
  • FIG. 10 is a graph showing survival rate and tumor burden when a microorganism according to an embodiment of the present disclosure is administered alone or in combination with an anti-PD-1 antibody.
  • 11 is a graph showing the survival rate when the microorganism according to one embodiment of the present disclosure is administered alone or simultaneously with an anti-PD-1 antibody. A significant difference was confirmed when the genome-edited strain was administered in combination with an anti-PD-1 antibody.
  • microorganisms refers to minute living organisms, including prokaryotes such as bacteria and actinomycetes, eukaryotes such as yeast and mold, lower algae, fungi, viruses, and even individual, separate cells of multicellular organisms such as animals and plants. Microorganisms also include natural microorganisms, as well as those cultured and artificially propagated, mutated microorganisms, and microorganisms artificially modified by transformation or other techniques.
  • modification of a gene means that a nucleotide (e.g., dC) on a DNA strand is converted to another nucleotide (e.g., dT, dA, or dG) or deleted, or that a nucleotide or nucleotide sequence is inserted or added between certain nucleotides on a DNA strand.
  • “modification” includes the substitution or deletion of one or more nucleotides at a targeted site of double-stranded DNA, or the insertion or addition of one or more nucleotides at a targeted site of double-stranded DNA.
  • the double-stranded DNA to be modified is not particularly limited, but is preferably genomic DNA.
  • the "targeted site" of double-stranded DNA means all or a part of the “target nucleotide sequence” that the nucleic acid sequence recognition module specifically recognizes and binds to, or the vicinity of the target nucleotide sequence (either one or both of the 5' upstream and 3' downstream), and the range can be appropriately adjusted between one base and several hundred bases in length depending on the purpose.
  • the term "gene” is interpreted in the broadest sense to mean a character string of nucleic acids or a sequence of a substance that carries it (e.g., nucleotides such as DNA or RNA), and preferably a sequence or a substance that contains a sequence that exerts some function.
  • it also includes adjacent transcriptional regulatory regions such as promoters and enhancers that control the timing and amount of transcription of the transcript as a transcription factor binding site, and adjacent transcriptional regulatory regions such as promoters and enhancers that control the timing and amount of transcription of the transcript as a transcription factor binding site.
  • flagellum-constituting genes refers to genes or nucleic acid sequences that produce the flagellum structure or a part thereof, factors (transcription factors) that control the expression of genes that produce the flagellum structure or a part thereof, or parts thereof.
  • flagellum-constituting genes include fliC, fliD, flgE, fliF, flgK, flgM, flgN, fliT, and sigD.
  • TLR5 activation ability refers to the ability to activate the signal transduction pathway initiated by TLR5 activation and the resulting immune response, anti-inflammatory function, anti-infectious disease function, anti-tumor function, or anti-allergic function, and any mechanism of activation may be used.
  • the method for evaluating the TLR5 activation ability is not particularly limited, and it can be measured and evaluated by a known method.
  • Examples of methods for evaluating the TLR5 activation ability include a method using the expression level and/or transcription level of a factor present in the signal transduction pathway initiated by TLR5 as an index, and a method of measuring the activity of a reporter gene in vitro using a specific cell that retains a reporter gene (luciferase, alkaline phosphatase, etc.) expressed in response to TLR5 activation on the genome or as a plasmid.
  • a reporter gene luciferase, alkaline phosphatase, etc.
  • regulating the activation ability of TLR5 refers to enhancing, improving, or decreasing the activation ability of TLR5.
  • Regulating the activation ability of TLR5" also includes achieving a desired value or level of TLR5 activation ability.
  • a microorganism in which at least one gene in a group of flagella-constituting genes in the microorganism is modified, and the modification regulates the activation ability of Toll-Like Receptor 5 (TLR5) in a host, compared to a microorganism having the gene that is not modified.
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • the microorganism of the present disclosure is useful as a microbiome drug discovery technology that enhances the effects of cancer immunotherapy using immune checkpoint inhibitors.
  • Immune checkpoint inhibitors bind to immune checkpoint molecules to release immune suppression and activate the cancer immune response.
  • Representative target molecules of ICIs include cytotoxic T-lymphocyte (associated) antigen 4 (CTLA-4), programmed cell death 1 (PD-1), and PD-1 ligand 1 (PD-L1), all of which inhibit the activation of T cells in the cancer immune cycle.
  • CTL-4 cytotoxic T-lymphocyte
  • PD-1 programmed cell death 1
  • PD-1 ligand 1 ligand 1
  • PD-1 and PD-L1 also act to put the brakes on the cancer immune response.
  • the activation ability of TLR5 can be regulated, and preferably improved, by modifying at least one gene in the group of flagella-constituting genes in a microorganism.
  • ICI binds to the PD-1 molecule on human T cells, releasing the brakes on immune activity and indirectly killing cancer cells.
  • Bacterial flagellin is known as one of the microbe-associated molecular patterns (MAMPs) and is recognized by Toll-like receptor 5 (TLR5) expressed on the surface of various host cells, such as epithelial cells, macrophages, dendritic cells, and T cells, and induces downstream immune responses.
  • MAMPs microbe-associated molecular patterns
  • TLR5 Toll-like receptor 5
  • TLR5 interacts with flagellin from some gram-negative and gram-positive bacteria and activates the NF- ⁇ B signaling pathway via the adaptor protein MyD88.
  • the flagellar component gene group may be a gene or nucleic acid sequence that produces a flagellar structure or a part thereof, a factor (transcription factor) that controls the expression of a gene that produces a flagellar structure or a part thereof, or a part thereof, and may be, for example, flagellin (fliC, Gene ID: 15140735 (EC20)), flagellar filament capping protein FliD (fliD, Gene ID: 15140737 (EC20)), flagellar hook protein FlgE (flgE, Gene ID: 15140707 (EC20)), flagellar M-ring protein FliF (fliF, Gene ID: 15140699 (EC20)), flagellar hook-associated protein FliF (fliF, Gene ID: 15140699 (EC20)), or a part thereof.
  • flagellin flagellin
  • FliC flagellar filament capping protein
  • FliD flagellar filament capping protein
  • FliD flagellar filament ca
  • proteins include, but are not limited to, associated protein FlgK (flgK, Gene ID: 15140733 (EC20)), flagella biosynthesis anti-sigma factor FlgM (flgM, Gene ID: 15140731 (EC20)), flagella synthesis protein FlgN (flgN, Gene ID: 15140732 (EC20)), flagella biosynthesis regulatory protein FliT (fliT, Gene ID: 15140738 (EC20)), and RNA polymerase sigma-28 factor SigD (sigD, Gene ID: 15140716 (EC20)). All Gene IDs indicate the Gene IDs assigned to E. cassliflavus EC20, which is used as the Ref_seq for E. casseliflavus. In one embodiment, the gene encoding flagellin may be called hag in some bacterial species (e.g., Gene ID: 936742 for Bacillus subtilis).
  • the expression level of Flagellin in a host can be increased and/or the amount of extracellular secretion of Flagellin can be increased compared to a microorganism having the unmodified gene.
  • Flagellin is a major structural subunit of flagella produced by motile bacteria, and is highly conserved in both gram-negative and gram-positive bacteria. In mammals, TLR5 receives various flagellins and causes activation of innate and acquired immunity.
  • flagellin (FliC) possessed by Salmonella typhimurium is a 494 amino acid protein, and is known to upregulate the production of chemokines and antibacterial substances in human epithelial cells and monocytes, and to induce maturation of dendritic cells.
  • the flagellin protein which has a specific amino acid sequence, activates human TLR5. It is known that the expression of the flagellin protein is controlled in conjunction with the expression of various flagellar component factors, and that the expression of the flagellin protein increases or decreases with the dysfunction of these genes. For example, it is known that when the FliD protein, which forms a cap structure at the tip of the flagellum, is deleted, Flagellin is unable to form a flagellar structure and is secreted outside the cell.
  • base editing is used to induce dysfunction of flagellum-related genes related to the expression and/or secretion of Flagellin in a microorganism, thereby increasing the amount of Flagellin expression or the amount of Flagellin secreted extracellularly, thereby regulating and/or enhancing the ability of the microorganism to activate TLR5 in a host.
  • the microorganisms used in the present disclosure include enterococci, such as E. gallinarum and E. casseliflavus.
  • enterococci such as E. gallinarum and E. casseliflavus.
  • E. gallinarum and E. casseliflavus are known to have flagella and are motile.
  • E. gallinarum and E. casseliflavus have very few reports of being associated with hospital infections and are found only in special and rare situations where the immune system is weakened, making them highly useful as bacterial preparations.
  • the microorganism used in the present disclosure may be a flagellated microorganism, and examples of such microorganisms include those of the genus Listeria (Listeria monocytogenes), Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa PAO1), Shewanella (Shewanella oneidensisMR-1), Salmonella (Salmonella Typhimurium str. LT2), Clostridioides (Clostridioides difficile 630), Enterococcus (Enterococcus saccharolyticus 310, Enterococcus sp. HSIEG1, E. gallinarum MR ⁇ 0518, E. casseliflavus DSM20680, E.
  • Listeria Listeria monocytogenes
  • Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa PAO1
  • Shewanella Shewanella oneidensisMR-1
  • Salmonella Salmonella Typhimurium str. LT2
  • Enterococcus sp.6D12 DIV0197 E. gallinarum DSM100110, Enterococcus sp.8G7 MSG3316, Enterococcus sp.RIT-PI-f, Enterococcus sp.6C8 DIV0013, Lactobacillus genus (Lactobacillus capillatus, Lactobacillus sucicola DSM 21376, Lactobacillus hordei, Lactobacillus satsumensis DSM 16230, Lactobacillus oeni, Lactobacillus aquaticus, Lactobacillus uvarum DSM 19971, Lactobacillus cacaonum DSM 21116, Lactobac illus mali DSM 20444), Vagococcus (Vagococcus penaei, Vagococcus fluvialis), Carnobacterium (Carnobacterium funditum, Carnobacterium mobile, Carnobacterium pleistocenium), Marin
  • NSP9.1 Bacillus sonorensis
  • Anoxybacillus genus (Anoxybacillus flavithermus), Halalkalibacillus genus (Halalkalibacillus halophilus), Marinococcus genus (Marinococcus halophilus), Oxobacter genus (Oxobacter pfennigii), Clostridium genus (Clostridium sp.
  • Clostridium cochlearium Clostridium cochlearium
  • Bacillaceae genus Bacillaceae bacterium EAG3
  • Pontibacillus genus Pontibacillus halophilus, Pontibacillus yanchengensis
  • Halobacillus genus Halobacillus sp.
  • Novibacillus genus Novibacillus genus (Novibacillus thermophilus), B Revibacillus genus (Brevibacillus brevis), Paenibacillus genus (Paenibacillus napythalenovorans), Desulfotomaculum genus (Desulfotomaculum hydrothermale, Desulfofundulus thermocisternus), Mycobacterium genus (Mycobacterium tuberculosis), Acetobacterium genus (Acetobacterium wieringae), Virgibacillus genus (Virgibacillus pantothenticus), Paenibacillus genus (Paenibacillus sp.
  • P1XP2 Sporosarcina genus (Sporosarcina sp. D27), Lysinibacillus genus (Lysinibacillus Examples of bacteria that may be of concern include bacteria from the genus Virgibacillus sinibacillus boronitolerans, Brevibacillus laterosporus, Sediminibacillus halophilus, Terribacillus saccharophilus, Oceanobacillus iheyensis, Oceanobacillus massiliensis, Virgibacillus alimentanus, Lentibacillus sediminis, and Virgibacillus dokdonensis.
  • ATCC700327 can be used as a parent strain for E. casseliflavus
  • JCM8728 can be used as a parent strain for E. gallinarum, to perform base editing to regulate and/or enhance the TLR5 activation ability of the present disclosure.
  • the amount of Flagellin secreted extracellularly can be increased by causing fliD dysfunction by base editing.
  • Deficiency of the flagellar cap component FliD promotes extracellular secretion of Flagellin monomers.
  • the interaction site with TLR5 is not exposed, and so the ability to activate TLR5 is lost.
  • the Flagellin monomer is in a free state, it has high TLR5 activation ability.
  • FliD is a protein with a total length of 433 amino acids, and there are two sites at which stop codons can be introduced, up to the 150th position on the N-terminus. If stop codons are introduced at these positions by base editing, most of FliD is deleted, preventing proper folding and resulting in dysfunction.
  • the expression level of Flagellin can be increased by causing a functional loss of the transcriptional repressor FlgM of the Flagellin component gene fliC by base editing.
  • fliC is negatively controlled by the transcriptional repressor FlgM until the final stage of flagellum formation, so dysfunction of FlgM induces constitutive expression of the fliC gene.
  • FlgM has a total length of 91 amino acid residues, and there are sites at positions 64 and 84 at the N-terminus where stop codons can be introduced, but introduction of a stop codon at position 64 is expected to cause a functional loss.
  • multiple editing is performed on at least two genes selected from the group of flagellum-constituting genes, such as fliC, fliD, flgE, fliF, flgK, flgM, flgN, fliT, and sigD, thereby achieving a further increase in the expression or extracellular secretion of Flagellin.
  • flagellum-constituting genes such as fliC, fliD, flgE, fliF, flgK, flgM, flgN, fliT, and sigD
  • genes related to TLR5 activation can be modified.
  • examples of such genes include mprA (emrR) (DNA-binding transcriptional regulator), hemK (N5-glutamine methyltransferase), and yjeA (Elongation factor P Lys34 lysyltransferase).
  • mprA emrR
  • hemK N5-glutamine methyltransferase
  • yjeA Elongation factor P Lys34 lysyltransferase
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can be achieved by standard molecular biology techniques.
  • the modification can include a point mutation in the gene, and a method for site-specifically and precisely modifying a target double-stranded polynucleotide can be, for example, a method of contacting a target double-stranded polynucleotide with a Cas protein and a guide RNA, or a method of contacting a target double-stranded polynucleotide with a complex of a Cas protein and a nucleic acid base conversion enzyme and a guide RNA.
  • a complex is formed between the Cas9 protein and the guide RNA, and the complex binds to the target double-stranded polynucleotide.
  • the Cas9 protein modifies the base sequence in the target polynucleotide by not cleaving the target double-stranded polynucleotide or by cleaving only one strand, i.e., without causing a double-stranded cleavage.
  • the modification is preferably performed in single-base units.
  • the specific and precise modification of the single base unit is preferably performed using a nucleic acid base conversion enzyme in the complex.
  • the nucleic acid base conversion enzyme include deaminases.
  • deaminases that can be used include cytosine deaminase, cytidine deaminase, adenosine deaminase, and the like.
  • the complex in one embodiment may contain an Indel formation inhibitor such as uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI) to inhibit Indel formation.
  • UBI uracil DNA glycosylase inhibitor
  • the specific and precise modification of the single base unit can also utilize a method using a complex of a nucleic acid sequence recognition module and DNA glycosylase.
  • a complex of a nucleic acid sequence recognition module and DNA glycosylase is expressed from an expression vector or RNA molecule introduced into a cell
  • the nucleic acid sequence recognition module specifically recognizes and binds to a target nucleotide sequence in a double-stranded DNA of interest (e.g., genomic DNA)
  • the action of the DNA glycosylase linked to the nucleic acid sequence recognition module causes an abasic reaction in the sense strand or antisense strand of the targeted site (which can be appropriately adjusted within a range of several hundred bases including all or part of the target nucleotide sequence or their vicinity), resulting in an abasic site (AP site) in one strand of the double-stranded DNA.
  • the base excision repair (BER) system in the cell is activated, and first, an AP endonuclease recognizes the AP site and cuts the phosphate bond of one strand of DNA, and an exonuclease removes the abasic nucleotide. Next, a DNA polymerase inserts a new nucleotide using the opposite strand DNA as a template, and finally, a DNA ligase repairs the splice. When a repair error occurs at any stage of this BER, various mutations are introduced.
  • the CRISPR-Cas system recognizes the sequence of a double-stranded DNA of interest by using a guide RNA complementary to the target nucleotide sequence, so any sequence can be targeted simply by synthesizing an oligo-DNA capable of specifically hybridizing with the target nucleotide sequence, and since the double-stranded DNA is unwound at the targeted site to generate a single-stranded region and an adjacent region having a loosened double-stranded DNA structure, DNA glycosylase can be made to act efficiently in a targeted site-specific manner without combining factors that change the structure of the double-stranded DNA.
  • a CRISPR-Cas system that does not have at least one DNA cleavage ability of Cas (CRISPR-mutant Cas) or a CRISPR-Cas system that does not have both DNA cleavage abilities of Cas (CRISPR-mutant Cas) can be preferably used as the nucleic acid sequence recognition module.
  • the nucleic acid sequence recognition module of the present disclosure using CRISPR-mutant Cas is provided as a complex of an RNA molecule consisting of a guide RNA complementary to a target nucleotide sequence and a tracrRNA required for recruiting the mutant Cas protein, and the mutant Cas protein.
  • the modification can be performed in any environment, in vivo or in vitro. In one embodiment, the modification can also be performed outside the body, i.e., ex vivo or in vitro.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include a mutation that generates a stop codon or a mutation that generates an amino acid substitution by the above-mentioned method. This can regulate and/or improve the activation ability of TLR5 in the host.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include at least two, three, four, five, six, seven, or eight mutations in a gene.
  • the ability to activate TLR5 in a host can be regulated and/or improved.
  • modification of at least one gene in a microorganism is preferably performed by base editing, preferably single base editing.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include at least one mutation in each of at least two genes selected from the flagellar component gene group, and the at least two genes can be independently selected from the flagellar component gene group.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include at least two mutations in each of at least two genes selected from the flagellar component gene group.
  • the microorganisms of the present disclosure can reside in the gut, oral cavity, and/or skin of a subject, e.g., are of a genus that constitutes at least about 0.1%, at least about 0.5%, at least about 1%, at least about 5%, at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, or at least about 40% or more of the total culturable microorganisms in the subject's feces.
  • the microorganisms in the subject's gut or feces can be analyzed by any technique known in the art, including 16S ribosomal sequencing.
  • the microorganisms of the disclosure are capable of stably colonizing the human gut, oral cavity, and/or skin.
  • the microorganisms of the disclosure are capable of colonizing the gut of a subject with, for example, increased abundance, stability, or ease of initial colonization in the gut compared to the same or similar microorganisms that are not modified.
  • the microorganism of the present disclosure may further include a gene for therapeutic use.
  • a gene for therapeutic use may be a gene that the microorganism originally possesses, or a gene that exerts a desired effect may be introduced as is or with a partial modification.
  • the gene for therapeutic use may be a type 1 fimbrin D-mannose specific adhesin (fimH) or the like.
  • the microorganism of the present disclosure may further include a gene for diagnostic use. Such a gene for diagnostic use may be a gene that the microorganism originally possesses, or a gene that exerts a desired effect may be introduced as is or with a partial modification.
  • the gene for diagnostic use may be a bacterial actin-like cytoskeleton protein (cell shape-determining protein (mreB) or the like.
  • the microorganism of the present disclosure may further include a gene for colonization.
  • the gene for colonization may be a DNA-binding transcriptional activator (DNA-binding transcriptional activator) flhD or the like.
  • the transgene can inhibit functional expression of the target protein by the effect of a stop codon introduced as a result of single-base editing.
  • the microorganisms of the present disclosure may be utilized as therapeutic preparations, and such therapeutic preparations may, for example, comprise a therapeutically effective amount of the microorganisms of the present disclosure, for example, at least about 0.01%, about 0.05%, about 0.1%, about 0.2%, about 0.3%, about 0.4%, about 0.5%, about 0.6%, about 0.7%, about 0.8%, about 0.9%, about 1.0%, about 1.5%, about 2.0%, or less by weight of the microorganism.
  • the disease treatable using the microorganism of the present disclosure can include cancer.
  • cancer can include bladder cancer (including aggressive and metastatic bladder cancer), breast cancer (e.g., estrogen receptor positive breast cancer, estrogen receptor negative breast cancer, HER-2 positive breast cancer, HER-2 negative breast cancer, triple negative breast cancer, inflammatory breast cancer), colon cancer (including colorectal cancer), kidney, liver, lung cancer (including small cell lung cancer and non-small cell lung cancer (including adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, bronchioloalveolar carcinoma and large cell carcinoma)), genitourinary tract cancer, such as ovarian cancer (including fallopian tube, endometrial and peritoneal cancer), cervical cancer, prostate cancer (e.g., hormone refractory prostate cancer) and testicular cancer, lymphatic system cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer (including exocrine pancreatic cancer), stomach cancer (e.g., gastroesophageal cancer, upper gastric or lower gas
  • bladder cancer including aggressive and meta
  • the microorganism of the present disclosure can function as a vaccine enhancer or can have the function of improving the effect of a vaccine enhancer.
  • a method for producing a microorganism for regulating the activation ability of Toll-Like Receptor 5 (TLR5) in a host comprising: (A) modifying at least one gene of a group of flagella-constituting genes in the microorganism, by converting one or more nucleotides of a target nucleic acid sequence of the gene to another nucleotide or deleting the gene, or by inserting one or more nucleotides into the target nucleic acid sequence of the gene; (B) testing the TLR5 activation ability of the microorganism having the modified gene, and selecting a microorganism having an altered TLR5 activation ability by comparing it with a microorganism having an unmodified gene; and (C) repeating steps (A) and (B) as necessary if a microorganism having an improved TLR5 activation ability cannot be selected.
  • the method of the present disclosure may have any of the features
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • the method of the present disclosure can include any of the features described elsewhere herein.
  • Short Protocols in Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al. (1999).
  • gene synthesis and fragment synthesis services such as GeneArt, GenScript, Integrated DNA Technologies (IDT) can be used, and other references include, for example, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. (1994).
  • Example 1 Measurement of TLR5 activation ability of genome-edited strains
  • the TLR5 activation ability of each strain was measured using genome-edited strains prepared by modifying the target genes and their editing sites as shown in Figures 1 and 2.
  • the target genes to be edited were fliC, fliD, flgE, fliF, flgK, flgM, flgN, fliT, and sigD, each of which was used alone.
  • the gRNA for each target gene was designed mainly to introduce a stop codon at the 5' end, which induces a complete loss of protein function, and to induce amino acid substitutions in active sites, etc., predicted from protein structure prediction.
  • TLR5 activation ability was measured as follows. The strains to be evaluated were cultured overnight (12-18 hours) at 37°C in Brain Heart infusion medium, washed with Opti-MEM medium, and the turbidity (660 nm) was measured. The turbidity was adjusted to 1.0 with Opti-MEM medium, and then a bacterial solution was prepared by diluting 104 times with Opti-MEM. The following three types of plasmids were introduced into human embryonic kidney cells HEK293T to construct cells for evaluating TLR5 activation ability.
  • the three types of plasmids are a plasmid that forcibly expresses human TLR5, a plasmid that places the NanoLuc (registered trademark) gene under the control of an activation-responsive sequence to evaluate the activation ability of TLR5, and a plasmid that constitutively expresses the firefly luciferase gene that functions as an internal standard.
  • the three types of plasmids were introduced into HEK293T cells, and after 16 to 20 hours, the diluted bacterial solution prepared above was added in an amount of 1/10 of the medium in which the plasmid-introduced cells grew, and the cells were co-cultured at 37°C for 4 hours.
  • the TLR5 activation ability was measured using the activity of NanoLuc as an index using Promega's Nano-Glo (registered trademark) Dual-Luciferase (registered trademark) Reporter Assay System. Following the recommended protocol, the activity of firefly luciferase, which is the internal standard, was measured, and then the activity of NanoLuc, which reflects TLR5 activation, was measured. NanoLuc activity was standardized with firefly luciferase activity to evaluate the TLR5 activation ability of each strain.
  • Example 2 Confirmation of Flagellin expression
  • MTM medium 1% w/v Bacto Peptone, 0.5% w/v NaCl, 0.3% w/v Beet extract
  • the culture was heat-treated at 60°C for 20 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 2,900 x g for 10 minutes, and the supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter. 15 mL of the filtrate was concentrated to 1 mL using an Amicon-15 (MWCO 10k, Millipore).
  • the agarose beads were precipitated by centrifugation at 1,000 ⁇ g for 2 minutes, the supernatant was removed, and the beads were suspended in 500 ⁇ L PBS. This centrifugation and suspension procedure was repeated three times in total, and then the agarose beads were suspended in 45 ⁇ L of 1 ⁇ Laemmli dye and heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes to elute the bound protein from the beads. After centrifugation at 1,000 ⁇ g for 2 minutes, the supernatant was collected and used as a TLR5-binding protein sample.
  • Flagellin-derived bands were detected in the wild-type strain and the flgN-, fliD-, and flgK-edited strains, but no Flagellin bands were detected in the fliC- and fliF-edited strains ( Figure 3).
  • Example 3 Other Genetic Modifications By rendering mprA, a transcription factor, dysfunctional by base editing as in Example 1, the master regulatory factor of the flagellum-related gene group is activated, which is expected to result in increased expression of flagellin and enhanced activation ability of TLR5.
  • Example 4 Evaluation of the antitumor effect of Enterococcus alone or in combination with immune checkpoint inhibitors using a tumor-bearing mouse model
  • a tumor-bearing mouse model was created using a mouse colon cancer cell line, and the E. casseriflavus wild-type strain or its genome-edited strain was administered alone or in combination with an anti-PD-1 antibody (anti-mouse PD-1 [CD279], clone: RMP1-14, Bio X Cell), which is an immune checkpoint inhibitor, to evaluate the antitumor effect.
  • an anti-PD-1 antibody anti-mouse PD-1 [CD279], clone: RMP1-14, Bio X Cell
  • Mouse colon cancer cell line MC38 (Cat. No. ENH204-FP, Kerafast) is a C57BL/6J mouse (6 weeks old, female, Jackson Laboratory Japan Co., Ltd.), and CT26 (Cat. No. CRL-2638, ATCC) is a BALB/c mouse (6 weeks old, female, Jackson Laboratory Japan Co., Ltd.), and 100 ⁇ L of each cell suspended in physiological saline is subcutaneously transplanted into the right flank of each mouse.
  • the tumor diameter of the mouse is measured, and the estimated tumor volume (long diameter x short diameter x short diameter / 2) is calculated. Based on the estimated tumor volume, the group is divided and designated as Day 0. On Days 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21, 23, and 25, E. The E.
  • casseriflavus wild-type strain and its genome-edited strain are prepared in phosphate-buffered saline to give 10 9 CFU/100 ⁇ L, and 100 ⁇ L per individual is forcibly administered orally.
  • the anti-PD-1 antibody is administered into the tail vein at 5 mg/kg per individual on days 0, 3, 7, 10, and 14. Under the above administration conditions of the bacterial solution and anti-PD-1 antibody, the E. casseriflavus wild-type strain or its genome-edited strain alone, or in combination with the anti-PD-1 antibody, is administered.
  • the estimated tumor volume and body weight of the mice are measured twice a week from day 0.
  • Tumor growth is expected to be suppressed in the group administered the genome-edited strain alone and in the group administered the genome-edited strain in combination with an anti-PD-1 antibody.
  • Example 5 Cancer Treatment A strain with enhanced TLR5 activation ability is orally administered to a cancer patient (regardless of the type of cancer) in the form of a tablet or capsule, and the strain is allowed to exist transiently or ideally become established in the intestine of the patient, stimulating the host's immune cells and enhancing the immune response to cancer cells.
  • ICI in combination, it is possible to inhibit the suppressive effect of cancer cells on immune cells, and it is expected that the reactivity of activated immune cells to cancer cells will be enhanced.
  • the timing of administration of the strain can be either simultaneous administration or administration of the strain prior to ICI.
  • the strain may be administered multiple times. Even in patients who have a low response to cancer immunotherapy using ICI alone, it is expected that the response of ICI will be increased by combining it with the strain.
  • THP-1 cells (RCB3686, RIKEN BioResource Research Center) were cultured using 10% FBS-containing RPMI1640 medium. After seeding 2 ⁇ 10 5 cells/well in a 24-well plate, all-trans retinoic acid was added to each well at 100 ⁇ M. After 48 hours of culture in an incubator (5% CO2, 37 ° C.), E. casseriflavus wild-type strain or its genome-edited strain was added to 10 8 CFU/well for stimulation. After 2 hours of stimulation, antibiotics were added to stop the growth of the strain, and the cells were further cultured for 22 hours. The cell culture supernatant was collected, and the amount of TNF ⁇ in the culture supernatant was measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay).
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • the genome-edited strain produced increased amounts of the inflammatory cytokine TNF ⁇ compared to the wild-type strain.
  • Example 7 Reactivity test using human peripheral blood mononuclear cells
  • Human peripheral blood mononuclear cells (CC-2705, Lonza) were cultured using 10% FBS-containing RPMI1640 medium. After seeding in a 96-well plate at 5 x 10 5 cells/well, the cells were cultured for 2 hours in an incubator (5% CO 2 , 37°C). E. casseriflavus wild-type strain or its genome-edited strain was then added at 10 4 CFU/well for stimulation. After 2 hours of stimulation, antibiotics were added to stop the growth of the strain, and the cells were further cultured for 22 hours. The cell culture supernatant was collected, and the amount of TNF ⁇ and IFN ⁇ in the culture supernatant was measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay).
  • the genome-edited strain had increased production of the inflammatory cytokine TNF ⁇ and the immune activating factor IFN ⁇ . This suggests that the genome-edited strain is expected to activate immunity against cancer, infectious diseases, etc. through human immune cells.
  • Mouse colon cancer cell line CT26 (Cat. No. CRL-2638, ATCC) was subcutaneously transplanted into the right flank of BALB/c mice (6 weeks old, female, Jackson Laboratory Japan Co., Ltd.) at 3 x 10 7 cells/mL of each cell suspended in physiological saline, 100 ⁇ L each.
  • the tumor diameter of the mouse was measured, and the estimated tumor volume (long diameter x short diameter x short diameter/2) was calculated. Groups were divided based on the estimated tumor volume and designated as Day 0 (FIGS. 6 and 9).
  • Anti-PD-1 antibody was administered into the tail vein at 5 mg/kg per individual on Days 0, 3, 7, 10, and 14.
  • E. casseriflavus wild-type strains and their genome-edited strains were prepared in phosphate-buffered saline to give 10 9 CFU/100 ⁇ L, and 100 ⁇ L per individual was forcibly administered (FIG. 9).
  • the bacterial liquid administration was started simultaneously with the administration of anti-PD-1 antibody, the bacterial strain administration started on Day 0 (total of 9 times, FIG. 6).
  • E. casseriflavus wild-type strains or their genome-edited strains alone, or in combination with anti-PD-1 antibody were administered.
  • the estimated tumor volume and body weight of the mice were measured twice a week from Day 0.
  • Example 9 Urinary tract infection mouse model A BALB/c mouse (7 weeks old, female, Jackson Laboratory Japan Co., Ltd.) is anesthetized with isoflurane, and the bladder is lightly pressed to drain urine from the bladder. The urethral opening is disinfected with ethanol cotton, and 100 ⁇ L (1 x 10 9 CFU / mL) of E. coli (E. coli ATCC700928) suspension is injected transurethrally into the bladder using a 1 mL syringe with a blunted 26G needle. After infection by injection, the urethral opening is blocked with an eye clip for 4 hours.
  • E. coli E. coli ATCC700928
  • the efficacy of the genome-edited strain is evaluated by raising the mouse normally for 2 hours after removing the clip, and administering 10 9 CFU of the strain transurethrally under isoflurane anesthesia similar to that during infection. After raising the mouse for a certain period of time, the mouse is bled under isoflurane anesthesia, and each organ is aseptically removed, and then a homogenate is prepared to measure the number of bacteria in the organs.
  • Example 10 Influenza virus-infected mouse model BALB/c mice (6 weeks old, female, Jackson Laboratory Japan Co., Ltd.) are used in the experiment after an acclimation period.
  • the influenza virus H1N1 strain is prepared to 4 x 10 4 PFU/mL. Mice are anesthetized with isoflurane and infected by administering 50 ⁇ L of the virus suspension into the nasal cavity.
  • E. casseriflavus wild strain or its genome-edited strain is prepared in phosphate-buffered saline to 10 9 CFU/100 ⁇ L, and 100 ⁇ L per individual is forcibly administered. Mice are observed daily, and mortality, weight loss, and visual score are recorded.
  • blood, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue are collected and stored. Viral RNA is extracted from the lung tissue, and the amount of virus is measured by quantitative PCR.
  • the microorganism disclosed herein can improve the host's immune activity through activation of the host's Toll-Like Receptor 5 (TLR5) in cancer immunotherapy using immune checkpoint inhibitors, and can also enhance the antitumor effects of immune checkpoint inhibitors, so it is expected to have a wide range of applications in the medical field.
  • TLR5 Toll-Like Receptor 5
  • SEQ ID NO:1 Nucleic acid sequence of fliC(hag) of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:2 Nucleic acid sequence of fliD of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:3 Nucleic acid sequence of flgE of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:4 Nucleic acid sequence of fliF of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:5 Nucleic acid sequence of flgK of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:6 Nucleic acid sequence of flgM of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:7 Nucleic acid sequence of flgN of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:8 Nucleic acid sequence of fliT of E_casseliflavus
  • SEQ ID NO:9 Nucleic acid sequence of sigD of E_casseliflavus

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Abstract

本開示は、免疫チェックポイント阻害剤の奏効率改善を目的としたマイクロバイオームを提供する。より詳細には、本開示によれば、微生物であって、該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節するものである、微生物が提供される。

Description

Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節する微生物およびその生産方法
　本開示は、Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節する微生物、およびその微生物を生産する方法に関する。
　免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩｓ：Ｉｍｍｕｎｅ　ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）によるがん免疫療法は、従来の癌治療を上回る効果が期待できる一方、奏効率の低さが世界共通の課題である。近年、遺伝子や代謝産物の網羅的解析技術の飛躍的な進歩により、腸内細菌叢が免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果に影響を及ぼすことが明らかとなり、免疫チェックポイント阻害剤の奏効率改善を目的としたマイクロバイオーム創薬が注目を浴びている。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　微生物であって、該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節するものである、微生物。
（項目２）
　前記鞭毛構成遺伝子群が、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＴ、ｓｉｇＤを含む、上記項目に記載の微生物。
（項目３）
　前記ＴＬＲ５の活性化能の調節が、ＴＬＲ５の活性化能の向上を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目４）
　前記改変が、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＦｌａｇｅｌｌｉｎの発現量を増大させ、および／またはＦｌａｇｅｌｌｉｎの細胞外分泌量を増大させるものである、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目５）
　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目６）
　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目７）
　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目８）
　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目９）
　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目１０）
　前記微生物が腸球菌を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目１１）
　前記微生物がＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓを含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ａ１）
　宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節させるための微生物を生産する方法であって、
　（Ａ）該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子を改変する工程であって、該微生物内において、該遺伝子の標的核酸配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、もしくは欠失させ、または該遺伝子の標的核酸配列に１またはそれ以上のヌクレオチドを挿入する、改変する工程と、
　（Ｂ）改変された該遺伝子を有する微生物について、ＴＬＲ５の活性化能を試験し、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、ＴＬＲ５の活性化能が変化した微生物を選択する工程と、
　（Ｃ）ＴＬＲ５の活性化能が向上した微生物を選択できなかった場合に、必要に応じて、工程（Ａ）および（Ｂ）を繰り返す工程と
を含む、方法。
（項目Ａ２）
　前記鞭毛構成遺伝子群が、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＴ、ｓｉｇＤを含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ３）
　前記ＴＬＲ５の活性化能の調節が、ＴＬＲ５の活性化能の向上を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４）
　前記改変が、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＦｌａｇｅｌｌｉｎの発現量を増大させ、および／またはＦｌａｇｅｌｌｉｎの細胞外分泌量を増大させるものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）
　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６）
　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ７）
　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ８）
　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ９）
　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０）
前記微生物が腸球菌を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１１）
　前記微生物がＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１）
　上記項目のいずれか一項に記載の微生物を投与する工程を含む、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節する方法。
（項目Ｃ１）
　微生物を含む医薬であって、該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節するものである、医薬。
（項目Ｃ２）
　前記医薬はがんまたは感染症を処置または予防するものである、上記項目に記載の医薬。
（項目Ｃ３）
　前記感染症は細菌およびウイルスからなる群より選択される少なくとも１つに起因する感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬。
（項目Ｃ４）
　前記医薬は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与されるものである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬。
（項目Ｃ５）
　前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＣＤ１６０、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＮＬ２、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ３Ａ２、およびＣＳＦ－１Ｒからなる群から選択される分子に対する薬剤、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｃ６）
　がんまたは感染症を処置または予防するための方法であって、上記項目のいずれか一項に記載の医薬を投与する工程を含む、方法。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本開示により、微生物に対して所定の改変を施すことにより、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節することができ、ＴＬＲ５の活性化能を向上させた微生物を得ることができる。また改変の標的となる遺伝子を組み合わせることで、ＴＬＲ５の活性化能向上の相乗効果も期待できる。
図１は、本開示の一実施形態における微生物のゲノム編集箇所およびそのＴＬＲ５活性化能を示した結果である。 図２－１は、本開示の一実施形態における微生物のゲノム編集箇所およびそのＴＬＲ５活性化能を示した結果である。 図２－２は、本開示の一実施形態における微生物のゲノム編集箇所およびそのＴＬＲ５活性化能を示した結果である。 図２－３は、本開示の一実施形態における微生物のゲノム編集箇所およびそのＴＬＲ５活性化能を示した結果である。 図２－４は、本開示の一実施形態における微生物のゲノム編集箇所およびそのＴＬＲ５活性化能を示した結果である。 図２－５は、本開示の一実施形態における微生物のゲノム編集箇所およびそのＴＬＲ５活性化能を示した結果である。 図３は、本開示の一実施形態における微生物におけるＦｌａｇｅｌｌｉｎの発現を確認した泳動写真である。 図４は、本開示の一実施形態における微生物を用いてヒトマクロファージ様ＴＨＰ－１細胞を刺激した場合のＴＮＦαの産生量を示すグラフである。 図５は、本開示の一実施形態における微生物を用いてヒト末梢血単核細胞を刺激した場合のＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生量を示すグラフである。 図６は、本開示の一実施形態における抗ＰＤ－１抗体との同時投与試験の試験デザインを示す模式図である。菌液投与をＤａｙ　０から抗ＰＤ－１抗体投与と同時に開始させる場合の模式図を示す。 図７は、本開示の一実施形態における微生物を用いて、単独投与または抗ＰＤ－１抗体との同時投与を行った場合の生存率を示すグラフである。 図８は、本開示の一実施形態における微生物を用いて、単独投与または抗ＰＤ－１抗体との同時投与を行った場合の生存率を示すグラフである。ゲノム編集株の単独投与および抗ＰＤ－１抗体との併用投与において有意差を確認した。 図９は、本開示の一実施形態における抗ＰＤ－１抗体との同時投与試験の試験デザインを示す模式図である。菌液投与をＤａｙ　－１４から開始させる場合の模式図を示す。 図１０は、本開示の一実施形態における微生物を用いて、単独投与または抗ＰＤ－１抗体との同時投与を行った場合の生存率および腫瘍量を示すグラフである。 図１１は、本開示の一実施形態における微生物を用いて、単独投与または抗ＰＤ－１抗体との同時投与を行った場合の生存率を示すグラフである。ゲノム編集株と抗ＰＤ－１抗体との併用投与において有意差を確認した。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
　本明細書において、「微生物」とは、微小な生物を指し、例えば、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、真菌、ウイルス等の他、動物や植物などの多細胞生物であっても個々に別々に存在する細胞も含まれる。また微生物には、天然の微生物のほか、それらを培養して人為的に増殖させたもの、それらが突然変異したもの、または形質転換その他の手法によって、人為的に改変した微生物等も含まれる。
　本明細書において、遺伝子の「改変」とは、ＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド（例えば、ｄＣ）が、他のヌクレオチド（例えば、ｄＴ、ｄＡ又はｄＧ）に変換されるか、欠失すること、あるいはＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド間にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入もしくは付加されることを意味する。本明細書における「改変」には、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位の１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または二本鎖ＤＮＡの標的化した部位への１以上のヌクレオチドの挿入もしくは付加を含む。ここで、改変される二本鎖ＤＮＡは特に制限されないが、好ましくはゲノムＤＮＡである。また、二本鎖ＤＮＡの「標的化した部位」とは、核酸配列認識モジュールが特異的に認識して結合する「標的ヌクレオチド配列」の全部もしくは一部、又はそれと該標的ヌクレオチド配列の近傍（５’上流及び３’下流のいずれか一方又は両方）を意味し、その範囲は目的に応じて、１塩基～数百塩基長の間で適宜調節することができる。
　本明細書において「遺伝子」とは最広義に解釈され、核酸の文字列またはそれを担う物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのヌクレオチド）の配列をいい、好ましくは、なんらかの機能を発揮する配列または配列を含む物質であって、例えば、タンパク質をコードするもののほか、転写因子結合部位として、転写産物の転写時期と生産量を制御するプロモーターやエンハンサーなどの隣接した転写調節領域、転写因子結合部位として、転写産物の転写時期と生産量を制御するプロモーターやエンハンサーなどの隣接した転写調節領域なども包含される。
　本明細書において、「鞭毛構成遺伝子群」とは、鞭毛の構造体またはその一部を産生する遺伝子または核酸配列、鞭毛の構造体またはその一部を産生する遺伝子の発現を制御する因子（転写因子）、またはそれらの一部をいう。例えば鞭毛構成遺伝子群としては、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＴ、ｓｉｇＤを挙げることができる。
　本明細書において、「ＴＬＲ５の活性化能」とは、ＴＬＲ５活性化によって開始されるシグナル伝達経路や、それによる免疫応答、抗炎症機能、抗感染症機能、抗腫瘍機能、または抗アレルギー機能を活性化することができる能力のことをいい、活性化するメカニズムは何であってもよい。ＴＬＲ５の活性化能の評価方法は特に限定されず、公知の方法で測定して評価することができる。ＴＬＲ５の活性化能の評価方法として、例えば、ＴＬＲ５によって開始されるシグナル伝達経路に存在する因子の発現量および／または転写量を指標にする方法や、ＴＬＲ５の活性化に応答して発現するレポーター遺伝子（ルシフェラーゼやアルカリホスファターゼ等）をゲノム上あるいはプラスミドとして保持するような所定の細胞を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでレポーター遺伝子の活性を測定する方法などが挙げられる。
　本明細書において、「ＴＬＲ５の活性化能の調節」とは、ＴＬＲ５の活性化能を増強させ、向上させ、または低減などすることをいう。「ＴＬＲ５の活性化能の調節」には、目的の値またはレベルのＴＬＲ５活性化能を達成することも含まれる。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
　本開示の一局面において、微生物であって、該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節するものである、微生物が提供される。本開示の微生物は、免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法の効果を高めるマイクロバイオーム創薬技術として有用である。
　免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）は、免疫チェックポイント分子に結合することで免疫抑制を解除し、がん免疫応答を賦活化させる。ＩＣＩの代表的な標的分子は、Cytotoxic　T-lymphocyte（associated）antigen　4（CTLA-4）、Programmed　cell　death　1（PD-1）、またはPD-1　ligand　1（PD-L1）などであり、いずれもがん免疫サイクルのＴ細胞の活性化を阻害する。またＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は、がん免疫応答にブレーキをかける働きも併せ持つ。
　ＩＣＩによるがん免疫療法の効果を高める腸内細菌叢の研究報告は、２０１５年頃より増加しており、例えば無菌マウスや抗菌薬を投与し腸内細菌叢の乱れを起こしたマウスにおいて、抗ＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍効果が減弱することや、Ｂ１６メラノーマモデルにおいて、同系統のマウスにもかかわらずブリーダーの違いにより、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗腫瘍効果が異なり、腸内細菌叢中のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果改善に寄与することが知られている。またヒトにおいても、抗菌薬の投与がＩＣＩ治療中のがん患者の生存期間短縮につながることが知られている。
　限定を意図するものではないが、本開示の一実施形態において、微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子を改変することにより、ＴＬＲ５の活性化能を調節し、好ましくは向上させることができることを見出している。
　ＩＣＩは、ヒトＴ細胞のＰＤ－１分子と結合し、免疫作用へのブレーキを解除することで、間接的に癌細胞を殺傷する作用を有する。細菌のフラジェリンは、微生物関連分子パターン（microbe-associated　molecular　patterns, MAMPs）のひとつとして知られ、上皮細胞、マクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞など、種々の宿主細胞の表面に発現するＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）によって認識され、下流の免疫応答を誘導する。ＴＬＲ５は、一部のグラム陰性菌およびグラム陽性菌のフラジェリンと相互作用し、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８等を介してＮＦ－κＢシグナル伝達経路を活性化させる。この結果、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－３３等の炎症性サイトカインの産生を刺激し、全身の免疫反応を引き起こす可能性が示唆されている。したがって、フラジェリンがＴＬＲ５の活性化を介した炎症性サイトカインの局所的な放出を促進し、抗腫瘍効果を発揮するのみならず、ＩＣＩとの併用時にはＩＣＩの間接的な免疫作用をさらに増強させることが期待される。したがって、理論に縛られるものではないが、本開示の一実施形態において、本開示の微生物によってＴＬＲ５の活性化能を調節し、好ましくは向上させることで、癌免疫応答活性化や癌治療効果を期待することができる。
　一実施形態において、鞭毛構成遺伝子群としては、鞭毛の構造体またはその一部を産生する遺伝子または核酸配列、鞭毛の構造体またはその一部を産生する遺伝子の発現を制御する因子（転写因子）、またはそれらの一部であればよく、例えば、flagellin（ｆｌｉＣ、Gene　ID:15140735　(EC20)）、flagellar　filament　capping　protein　FliD（ｆｌｉＤ、Gene　ID:15140737　(EC20)）、flagellar　hook　protein　FlgE（ｆｌｇＥ、Gene　ID:15140707　(EC20)）、flagellar　M-ring　protein　FliF（ｆｌｉＦ、Gene　ID:15140699　(EC20)）、flagellar　hook-associated　protein　FlgK（ｆｌｇＫ、Gene　ID:15140733　(EC20)）、flagellar　biosynthesis　anti-sigma　factor　FlgM（ｆｌｇＭ、Gene　ID:15140731　(EC20)）、flagella　synthesis　protein　FlgN（ｆｌｇＮ、Gene　ID:15140732　(EC20)）、flagella　biosynthesis　regulatory　protein　FliT（ｆｌｉＴ、Gene　ID:15140738　(EC20)）、RNA　polymerase　sigma-28　factor　SigD（ｓｉｇＤ、Gene　ID:15140716　(EC20)）を挙げることができるが、これらに限られるものではない。いずれのGene　IDもE.　casseliflavusのRef_seqとして用いられているE.　cassliflavus　EC20に割り当てられたGeneIDを示す。また一実施形態において、菌種によってはflagellinをコードする遺伝子をｈａｇと呼ぶ場合がある（例えば、Bacillus　subtilisのGene　ID:936742など）。
　一実施形態において、微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子を改変することで、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＦｌａｇｅｌｌｉｎの発現量を増大させ、および／またはＦｌａｇｅｌｌｉｎの細胞外分泌量を増大させることができる。フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）は運動性細菌が生産する鞭毛の主要な構造サブユニットであり、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌のいずれにおいても高度に保存されている。哺乳類においては、ＴＬＲ５が各種フラジェリンを受容して、自然免疫、獲得免疫の活性化を引き起こす。例えば、サルモネラ・チフィリウムが有するフラジェリン（ＦｌｉＣ）は、４９４アミノ酸のタンパク質であり、ヒトの上皮細胞や単球中でケモカインや抗菌物質の生産をアップレギュレートし、樹状細胞の成熟を誘導することが知られている。
　特定のアミノ酸配列を有するｆｌａｇｅｌｌｉｎタンパク質は、ヒトのＴＬＲ５を活性化する。Ｆｌａｇｅｌｌｉｎタンパク質の発現は様々な鞭毛構成因子の発現に連動する形で制御されており、それらの遺伝子の機能不全に伴い、ｆｌａｇｅｌｌｉｎタンパク質の発現も増減することが知られている。例えば、鞭毛の先端部でキャップ構造をとるＦｌｉＤタンパク質を欠失させると、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎが鞭毛構造体を構築できずに細胞外に分泌されることが知られている。
　本開示の一実施形態においては、微生物を対象に、塩基編集を用いてＦｌａｇｅｌｌｉｎの発現および／または分泌に関連する鞭毛関連遺伝子の機能不全を誘導し、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ発現量あるいはＦｌａｇｅｌｌｉｎの細胞外分泌量を増大させることによって、当該微生物の宿主におけるＴＬＲ５活性化能を調節し、および／または増強することができる。
　一実施形態において、本開示において用いられる微生物は腸球菌を含み、腸球菌としては例えばＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓを挙げることができる。Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓは、鞭毛を有し運動性のあることが知られている。またＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓは他の腸球菌属の菌とは異なり、院内感染に関連するとの報告は極めて少なく免疫機能が低下したような特殊かつ稀な状況下において認められるため、細菌製剤として利用価値が高い。
　一実施形態において、本開示において用いられる微生物は、鞭毛を有する微生物であってもよく、そのような微生物としては、例えば、Listeria属（Listeria　monocytogenes）、Pseudomonas属（Pseudomonas　aeruginosa　PAO1）、Shewanella属（Shewanella　oneidensisMR-1）、Salmonella属（Salmonella　Typhimurium　str.　LT2）、Clostridioides　属（Clostridioides　difficile　630）、Enterococcus属（Enterococcus　saccharolyticus　310、Enterococcus　sp.　HSIEG1、E.　gallinarum　MR×0518、E.　casseliflavus　DSM20680、Enterococcus　sp.6D12　DIV0197、E.　gallinarum　DSM100110、Enterococcus　sp.　8G7　MSG3316、Enterococcus　sp.　RIT-PI-f、Enterococcus　sp.　6C8　DIV0013）、Lactobacillus属　(Lactobacillus　capillatus,　Lactobacillus　sucicola　DSM　21376,　Lactobacillus　hordei,　Lactobacillus　satsumensis　DSM　16230,　Lactobacillus　oeni,　Lactobacillus　aquaticus,　Lactobacillus　uvarum　DSM　19971,　Lactobacillus　cacaonum　DSM　21116,　Lactobacillus　mali　DSM　20444),　Vagococcus属　(Vagococcus　penaei,　Vagococcus　fluvialis),　Carnobacterium属　(Carnobacterium　funditum,　Carnobacterium　mobile,　Carnobacterium　pleistocenium)、Marinilactibacillus属（Marinilactibacillus　sp.　15R）、Carnobacterium属（Carnobacterium　sp.　17-4）、Varibaculum属（Varibaculum　timonense）、Candidatus属（Candidatus　frackibacter）、Thermotoga属（Thermotoga　maritima　MSB8）、Moorella属（Moorella　thermoacetica）、Geobacillus属（Geobacillus　thermoleovorans、Geobacillus　kaustophilus、Geobacillus　sp.　WSUCF-018B）、Bacillus属（Bacillus　caldolyticus、Bacillus　sp.　PS3、Bacillus　sp.　FJAT-45066、Bacillus　sp.　LL01、Bacillus　pseudofirmus、Bacillus　beveridgei、Bacillus　sp.　FJAT-45348、Bacillus　sp.　JCM　19041、Bacillus　circulans、Bacillus　sp.　MKU004、Bacillus　xerothermodurans、Bacillus　siamensis、Bacillus　amyloliquefaciens、Bacillus　subtilis、Bacillus　velezensis、Bacillus　sp.　GZB、Bacillus　sp.　NSP9.1、Bacillus　sonorensis）、Anoxybacillus属（Anoxybacillus　flavithermus）、Halalkalibacillus属（Halalkalibacillus　halophilus）、Marinococcus属（Marinococcus　halophilus）、Oxobacter属（Oxobacter　pfennigii）、Clostridium属（Clostridium　sp.　7243FAA、Clostridium　cochlearium）、Bacillaceae属（Bacillaceae　bacterium　EAG3）、Pontibacillus属（Pontibacillus　halophilus、Pontibacillus　yanchengensis）、Halobacillus属（Halobacillus　sp.　BAB-2008、Halobacillus　massiliensis）、Exiguobacterium属（Exiguobacterium　sibiricum）、Salinibacillus属（Salinibacillus　kushneri）、Domibacillus属（Domibacillus　enclensis）、Desulfotomaculum属（Desulfotomaculum　alkaliphilum）、Anaerosalibacter属（Anaerosalibacter　sp.　Maeseille-P3206）、Novibacillus属（Novibacillus　thermophilus）、Brevibacillus属（Brevibacillus　brevis）、Paenibacillus属（Paenibacillus　napythalenovorans）、Desulfotomaculum属（Desulfotomaculum　hydrothermale、Desulfofundulus　thermocisternus）、Mycobacterium属（Mycobacterium　tuberculosis）、Acetobacterium属（Acetobacterium　wieringae）、Virgibacillus属（Virgibacillus　pantothenticus）、Paenibacillus属（Paenibacillus　sp.　P1XP2）、Sporosarcina属（Sporosarcina　sp.　D27）、Lysinibacillus属（Lysinibacillus　boronitolerans）、Brevibacillus属（Brevibacillus　laterosporus）、Sediminibacillus属（Sediminibacillus　halophilus）、Terribacillus属（Terribacillus　saccharophilus）、Oceanobacillus属（Oceanobacillus　iheyensis）、Oceanobacillus属（Oceanobacillus　massiliensis）、Virgibacillus属（Virgibacillus　alimentanus）、Lentibacillus属（Lentibacillus　sediminis）、Virgibacillus属（Virgibacillus　dokdonensis）などの細菌を挙げることができる。
　一実施形態において、Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓについては、ＡＴＣＣ７００３２７を、またＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍについてはＪＣＭ８７２８を、それぞれ親株として用いて、本開示のＴＬＲ５活性化能を調節し、および／または増強するための塩基編集を行うことができる。
　本開示の一実施形態において、塩基編集によってｆｌｉＤ機能不全を生じさせることにより、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎの細胞外分泌量を増大させることができる。鞭毛キャップ構成因子ＦｌｉＤを機能欠損させると、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ単量体での細胞外分泌が促進する。Ｆｌａｇｅｌｌｉｎは鞭毛構造体を構成している状態では、ＴＬＲ５との相互作用部位は露出していないため、ＴＬＲ５活性化能は消失している。一方で、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ単量体が遊離状態だとＴＬＲ５活性化能が高い。ＦｌｉＤは全長４３３アミノ酸のタンパク質であり、終止コドン導入可能部位はＮ末端側１５０位までに２箇所存在する。塩基編集によりこれらの位置に終止コドンを導入した場合、ＦｌｉＤの大部分が欠失するため、適切にフォールディングできず機能不全となる。
　本開示の一実施形態において、塩基編集によってＦｌａｇｅｌｌｉｎ構成遺伝子ｆｌｉＣの転写抑制因子ＦｌｇＭを機能欠損させることにより、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎの発現量を増大させることができる。通常、ｆｌｉＣは鞭毛構成の最終段階まで転写抑制因子ＦｌｇＭにより負に制御されているため、ＦｌｇＭの機能不全はｆｌｉＣ遺伝子の恒常発現を誘導する。ＦｌｇＭは全長９１アミノ酸残基であり、Ｎ末端６４位および８４位に終止コドン導入可能部位が存在するが、このうち６４位への終止コドンの導入は機能欠損が期待できる。
　本開示の一実施形態において、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＴ、ｓｉｇＤなどの鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子において多重編集を行うことにより、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎの発現もしくは細胞外分泌量のさらなる増大を実現することができる。
　一実施形態において、本開示の微生物において、鞭毛構成遺伝子群に加えて、または鞭毛構成遺伝子群に変えて、ＴＬＲ５の活性化に関連する遺伝子を改変することもできる。そのような遺伝子としては、ｍｐｒＡ（ｅｍｒＲ）(DNA-binding　transcriptional　regulator),　ｈｅｍＫ(N5-glutamine　methyltransferase)、ｙｊｅＡ(Elongation　factor　P　Lys34　lysyltransferase)などを挙げることができる。これらの遺伝子を改変することで、フラジェリンの発現量を増加させることもできる。理論に縛られるものではないが、ＴＬＲ５は宿主（ヒトやマウスなど）の細胞が発現している受容体タンパク質であるため、宿主のシグナル経路上の因子の発現量を上げるなどすることにより、ＴＬＲ５活性化状態、またはそれと類似した状態を誘導することができる。
　一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、標準的な分子生物学の手法を利用することができる。一実施形態において、改変は遺伝子における点変異を含むことができ、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的にかつ正確に修飾するための方法として、例えば標的二本鎖ポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる方法、または標的二本鎖ポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体と、ガイドＲＮＡとを接触させる方法などを用いることができる。このような方法では、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとが複合体を形成し、標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。ここで、Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断して、すなわち、二本鎖切断を起こすことなく、標的ポリヌクレオチド内の塩基配列を修飾する。一実施形態において、修飾は好ましくは一塩基単位で行われる。
　一実施形態において、上記の一塩基単位の特異的かつ正確な修飾（一塩基編集）は、好ましくは、複合体中の核酸塩基変換酵素を用いて行われる。核酸塩基変換酵素としては、デアミナーゼ（脱アミノ化酵素）が挙げられる。デアミナーゼとしては、例えば、シトシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ等を使用することができる。一実施形態における複合体は、係る核酸塩基変換酵素に加えて、Ｉｎｄｅｌ形成を阻害するため、ｕｒａｃｉｌ　ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＵＧＩ）といったＩｎｄｅｌ形成阻害因子を含んでいてもよい。
　一実施形態において、上記の一塩基単位の特異的かつ正確な修飾（一塩基編集）は、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとの複合体を用いた手法を利用することもでき、細胞内に導入された発現ベクター又はＲＮＡ分子から、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとの複合体が発現すると、該核酸配列認識モジュールが目的の二本鎖ＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）内の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して結合し、該核酸配列認識モジュールに連結されたＤＮＡグリコシラーゼの作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はそれらの近傍を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で脱塩基反応が起こり、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に無塩基部位（ＡＰ部位）が生じる。すると、細胞内の塩基除去修復（ＢＥＲ）系が作動し、まずＡＰエンドヌクレアーゼがＡＰ部位を認識してＤＮＡ片鎖のリン酸結合を切断し、エキソヌクレアーゼが脱塩基されたヌクレオチドを除去する。次にＤＮＡポリメラーゼが反対鎖ＤＮＡを鋳型として新たにヌクレオチドを挿入し、最後にＤＮＡリガーゼが繋ぎ目を修復する。このＢＥＲのいずれかの段階で修復ミスが起こることにより、種々の変異が導入される。上述のように、酵素活性を失っているがＡＰ部位への結合能を保持する変異ＡＰエンドヌクレアーゼを併用することにより、細胞内のＢＥＲ機構が阻害され、修復ミスの頻度、したがって変異導入効率を向上させることができる。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドＲＮＡにより目的の二本鎖ＤＮＡの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴＤＮＡを合成するだけで、任意の配列を標的化することができ、しかも標的化された部位において、二本鎖ＤＮＡをほどいて一本鎖構造の領域と、それに隣接する緩んだ二本鎖ＤＮＡ構造をとる領域とを生成するため、二本鎖ＤＮＡの構造を変化させる因子を組み合わせることなく、標的化された部位特異的にＤＮＡグリコシラーゼを効率よく作用させることができる。したがって、本開示のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）、またはＣａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）を好ましく用いることができる。
　ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓを用いた本開示の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的なガイドＲＮＡと、変異Ｃａｓタンパク質のリクルートに必要なｔｒａｃｒＲＮＡとからなるＲＮＡ分子と変異Ｃａｓタンパク質との複合体として提供される。
　一実施形態において、改変はｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、改変は、生体外、すなわちｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うこともできる。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、上記のような手法により、終止コドンを生じさせる変異やアミノ酸置換を生じる変異を含むことができる。これにより、宿主におけるＴＬＲ５の活性化能を調節し、および／または向上させることができる。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、ある１つの遺伝子において少なくとも２ヶ所、３ヶ所、４ヶ所、５ヶ所、６ヶ所、７ヶ所、または８ヶ所の変異を含むことができる。ある１つの遺伝子において少なくとも２ヶ所の変異を生じさせることで、宿主におけるＴＬＲ５の活性化能を調節し、および／または向上させることができる。
　本開示の一実施形態において、微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、塩基編集、好ましくは一塩基編集によって行うことが好ましい。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含むことができ、少なくとも２種の遺伝子は、鞭毛構成遺伝子群から独立して選択されることができる。他の実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含むことができる。少なくとも２種の遺伝子においてそれぞれ少なくとも１ヶ所または少なくとも２ヶ所の変異を生じさせることで、１種の遺伝子を改変させた場合と比較して、宿主におけるＴＬＲ５の活性化能を調節し、および／または向上させることができる。理論に縛られるものではないが、これはＴＬＲ５のリガンドの発現量（細胞内の存在量）あるいは分泌量（細胞外への輸送能）を制御する遺伝子を選択することにより調整可能と考えられるためである。
　一実施形態において、本開示の微生物は、対象の腸内、口腔、および／または皮膚などに生息することができ、例えば、対象の糞便中の全培養可能微生物の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％超を構成する属のものである。対象の腸又は糞便中の微生物は、１６Ｓリボソーム配列決定を含む当技術分野で公知の任意の技術によって分析することができる。
　一実施形態において、本開示の微生物は、ヒト腸内、口腔、および／または皮膚で安定にコロニー形成することができる。本開示の微生物は、例えば、改変されていない同一のまたは類似の微生物と比較して、腸内において増加した存在量、安定性、または初期コロニー形成の容易さで対象の腸内にコロニー形成することができる。
　一実施形態において、本開示の微生物は、治療用の関連遺伝子をさらに含むことができる。このような治療用の関連遺伝子は微生物がもとからもっているものでもよく、または所望の効果を発揮する遺伝子をそのまま、または一部改変して導入することもできる。一実施形態において、治療用の関連遺伝子は、Ｉ型線毛Ｄ－マンノース特異的アドヘシン（Type　1　fimbrin　D-mannose　specific　adhesin：fimH）などを挙げることができる。一実施形態において、本開示の微生物は、診断用の関連遺伝子をさらに含むことができる。このような診断用の関連遺伝子は微生物がもとからもっているものでもよく、または所望の効果を発揮する遺伝子をそのまま、または一部改変して導入することもできる。一実施形態において、診断用の関連遺伝子は、細菌のアクチン様細胞骨格タンパク質(Cell　shape-determining　protein：mreB)などを挙げることができる。一実施形態において、本開示の微生物は、定着性に関する遺伝子をさらに含むことができる。一実施形態において、定着性に関する遺伝子は、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator）ｆｌｈＤなどを挙げることができる。
　一実施形態において、導入遺伝子は、一塩基編集の結果として導入される終止コドンの影響によって、標的タンパク質の機能的発現を阻害することができる。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物は、治療用製剤として利用することもでき、そのような治療用製剤は、例えば治療上有効の量の本開示の微生物を、例えば微生物の重量比で、少なくとも約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％，約１．５％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、約１０．０％、約１１．０％、約１２．０％、約１３．０％、約１４．０％、約１５．０％、約１６．０％、約１７．０％、約１８．０％、約１９．０％、約２０．０％、約２５．０％、約３０．０％、約３５．０％、約４０．０％、約４５．０％、約５０．０％またはそれ以上含むことが可能である。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物を用いて治療可能な疾患は癌を含むことができる。例えば、癌は、膀胱癌（急速進行性および転移性膀胱癌を含む）、乳癌（例えば、エストロゲン受容体陽性乳癌、エストロゲン受容体陰性乳癌、ＨＥＲ－２陽性乳癌、ＨＥＲ－２陰性乳癌、トリプル陰性乳癌、炎症性乳癌）、結腸癌（結腸直腸癌を含む）、腎臓、肝臓、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌（腺癌、扁平上皮癌、細気管支肺胞癌および大細胞癌を含む）を含む）、尿生殖路癌、例えば卵巣癌（卵管、子宮内膜および腹膜癌を含む）、子宮頸癌、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺癌）および精巣癌、リンパ系癌、喉頭癌、膵臓癌（外分泌膵臓癌を含む）、胃癌（例えば、胃食道癌、上部胃癌または下部胃癌）、消化管癌（例えば、肛門癌）、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、卵巣癌（例えば、進行性卵巣癌、白金系薬剤耐性または難治性卵巣癌）、胆嚢癌、甲状腺癌、リンパ腫（例えば、バーキット、ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、ユーイング肉腫、鼻食道癌（ｎａｓｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｃａｎｃｅｒ）、鼻咽頭癌、神経およびグリア細胞癌（例えば、多形神経膠芽腫）、腎細胞癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌（腺癌、扁平上皮癌、細気管支肺胞癌および大細胞癌を含む）を含む）、ならびに頭頸部癌などが含まれる。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物をワクチン増強剤として機能し、またはワクチン増強剤の効果を向上させる機能を有することができる。
　本開示の他の局面において、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節させるための微生物を生産する方法であって、（Ａ）該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子を改変する工程であって、該微生物内において、該遺伝子の標的核酸配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、もしくは欠失させ、または該遺伝子の標的核酸配列に１またはそれ以上のヌクレオチドを挿入する、改変する工程と、（Ｂ）改変された該遺伝子を有する微生物について、ＴＬＲ５の活性化能を試験し、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、ＴＬＲ５の活性化能が変化した微生物を選択する工程と、（Ｃ）ＴＬＲ５の活性化能が向上した微生物を選択できなかった場合に、必要に応じて、工程（Ａ）および（Ｂ）を繰り返す工程とを含む、方法が提供される。本開示の一実施形態において、本開示の方法は、本明細書の他の箇所で説明した任意の特徴を備えることができる。
　本開示の他の局面において、本開示の微生物を投与する工程を含む、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節する方法が提供される。本開示の一実施形態において、本開示の方法は、本明細書の他の箇所で説明した任意の特徴を備えることができる。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
　（実施例１：ゲノム編集株のＴＬＲ５活性化能の測定）
　図１および２に示すとおりの標的遺伝子およびその編集箇所を改変して作製したゲノム編集株を用いて、それぞれの菌株のＴＬＲ５活性化能を測定した。編集を施す標的遺伝子は、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＴ、およびｓｉｇＤをそれぞれ単独で用いた。各標的遺伝子に対するｇＲＮＡの設計は、タンパク質機能の完全な欠損を誘発する５’末端側への終止コドンの導入を主とし、タンパク質の構造予測から想定される活性部位等へのアミノ酸置換を誘発するようにした。
　腸球菌Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ　ＡＴＣＣ７００３２７株において、上記遺伝子のゲノム編集を施した後、安定した菌株を樹立しＴＬＲ５活性化能を測定した。
　＜ＴＬＲ５活性化能の測定＞
　ＴＬＲ５活性化能の測定は以下のとおりに行った。
　評価する菌株はＢｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地で３７℃で一晩培養後（１２～１８時間）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で洗浄し、濁度（６６０ｎｍ）を計測した。濁度が１．０となるようにＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で調整した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで１０４倍希釈した菌液を調製した。ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３Ｔに以下の３種類のプラスミドを導入し、ＴＬＲ５活性化能評価細胞を構築した。
　３種類のプラスミドは、ヒトＴＬＲ５を強制発現させるプラスミド、ＴＬＲ５の活性化能を評価する活性化に対して応答する配列の制御下にＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子を配したプラスミド、そして内部標準として機能するホタルルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現するプラスミドである。３種類のプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、１６～２０時間経過後、上記で調製した希釈菌液をプラスミド導入細胞が生育する培地の１／１０量添加し、３７℃で４時間共培養した。プロメガ社のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを用いてＮａｎｏＬｕｃの活性を指標にＴＬＲ５活性化能を測定した。推奨プロトコルに従い、内部標準であるホタルルシフェラーゼ活性を測定後、ＴＬＲ５活性化を反映するＮａｎｏＬｕｃの活性を測定した。ＮａｎｏＬｕｃ活性をホタルルシフェラーゼ活性で標準化し、各菌株のＴＬＲ５活性化能を評価した。
　結果を図１および図２－1～２－５に示した。これらの図に示すとおり、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎの発現および／または分泌量増強のために構築したゲノム編集腸球菌株のＴＬＲ５活性化能は、野生株のものよりも向上していた。
　（実施例２：Ｆｌａｇｅｌｌｉｎの発現確認）
　対象菌株を２０ｍＬのＭＴＭ培地（１％　ｗ／ｖ　Ｂａｃｔｏ　Ｐｅｐｔｏｎｅ，０．５％　ｗ／ｖ　ＮａＣｌ，　０．３％　ｗ／ｖ　Ｂｅｅｆ　ｅｘｔｒａｃｔ）に植菌し、３７℃で一晩振盪培養（１６～２４時間）した。培養液を６０℃で２０分熱処理した。２，９００×ｇで１０分間遠心し、上清を０．２２μｍフィルターろ過した。ろ液１５ｍＬをＡｍｉｃｏｎ－１５（ＭＷＣＯ　１０ｋ，　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１ｍＬになるまで濃縮した。濃縮液４５０μＬに対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　ＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅ　（Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ）を２０μＬ添加し、４℃で一時間転倒混和した。遠心後、上清を４３０μＬ回収し前処理サンプルとした。１μｇのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏｕｓｅ　ＴＬＲ５　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　ＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅを混合し、複合体を形成させた後、前処理サンプルに添加し、４℃で１～３時間転倒混和した。１，０００×ｇで２分間遠心しアガロースビーズを沈殿させ、上清を除去し、５００μＬ　ＰＢＳで懸濁した。この遠心、懸濁の操作を合計で３回繰り返した後、４５μＬの１×Ｌａｅｍｍｌｉ　ｄｙｅでアガロースビーズを懸濁し、９５℃で５分間熱処理しビーズから結合タンパク質を溶出した。１，０００×ｇで２分間遠心後、上清を回収しＴＬＲ５結合タンパク質サンプルとした。
　１０％　ＴＧＸ　ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にサンプル１５μＬをアプライした。３０ｍＡ／ｇｅｌの定電流で４５～６０分間電気泳動した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色液でゲルを染色し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で洗浄・脱色した。
　その結果、野生株、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＫ編集株ではＦｌａｇｅｌｌｉｎ由来のバンドが検出されたが、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＦ編集株ではＦｌａｇｅｌｌｉｎのバンドは検出されなかった（図３）。
　（実施例３：その他の遺伝子改変）
　転写因子の一つであるｍｐｒＡを実施例１と同様に塩基編集により機能不全とすることで、鞭毛関連遺伝子群のマスター制御因子が活性化され、結果的にｆｌａｇｅｌｌｉｎの発現量が増加し、ＴＬＲ５の活性化能を増強することが期待される。
　（実施例４：担癌マウスモデルを用いたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌の単独、または免疫チェックポイント阻害剤との併用による抗腫瘍効果の評価）
　マウス大腸癌細胞株を用いて作製した担癌マウスモデルにＥ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株、またはそのゲノム編集株を単独、あるいは免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ－１抗体（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＰＤ－１［ＣＤ２７９］，　ｃｌｏｎｅ：ＲＭＰ１－１４，　Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ社）と併用で投与し、抗腫瘍効果を評価する。
　マウス大腸癌細胞株ＭＣ３８（Ｃａｔ．　Ｎｏ．　ＥＮＨ２０４－ＦＰ，　Ｋｅｒａｆａｓｔ社）はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢、雌、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン株式会社）、ＣＴ２６（Ｃａｔ．　Ｎｏ．　ＣＲＬ－２６３８，　ＡＴＣＣ）はＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン株式会社）のそれぞれ右側腹部皮下に対して、生理食塩水に懸濁した３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの各細胞を１００μＬずつ皮下移植する。移植１週間後にマウスの腫瘍径を測定し、推定腫瘍体積（長径×短径×短径／２）を算出する。推定腫瘍体積に基づき群分けを行い、Ｄａｙ　０とする。Ｄａｙ　０，　２，　４，　７，　９，　１１，　１４，　１６，　１８，　２１，　２３，　２５に、Ｅ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株およびそのゲノム編集株を１０９ＣＦＵ／１００μＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水で調製し、１個体当たり１００μＬを強制経口投与する。抗ＰＤ－１抗体はＤａｙ　０，　３，　７，　１０，　１４に１個体当たり５ｍｇ／ｋｇとなるように尾静脈内投与する。以上の菌液および抗ＰＤ－１抗体の投与条件にて、Ｅ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株またはそのゲノム編集株単独、あるいは抗ＰＤ－１抗体との併用投与を実施する。Ｄａｙ　０から週２回、マウスの推定腫瘍体積と体重を測定する。
　ゲノム編集株の単独投与群、ゲノム編集株と抗ＰＤ－１抗体の併用投与群では、腫瘍の増殖抑制が期待される。
　（実施例５：癌治療）
　ＴＬＲ５活性化能が増強された菌株をがん患者（がんの種類は問わない）に錠剤またはカプセルなどにより経口投与し患者の腸内にて当該菌株を一過的に存在あるいは理想的には定着させることで宿主の免疫細胞を刺激し、がん細胞に対する免疫反応を増強する。ＩＣＩを併用することで、がん細胞の免疫細胞に対する抑制作用を阻害することができ、活性化された免疫細胞によるがん細胞への反応性が亢進することが期待される。
　ＩＣＩを併用する場合の菌株投与のタイミングは、同時投与あるいは菌株をＩＣＩに先行して投与する２パターンがある。当該菌株の患者体内での定着性によっては、菌株を複数回投与することもある。ＩＣＩ単独でのがん免疫療法では反応性が低い患者でも、当該菌株との併用によりＩＣＩの反応性を高めることが期待される。
　（実施例６：ヒトマクロファージ様ＴＨＰ－１細胞を用いた反応性試験）
　ＴＨＰ－１細胞（ＲＣＢ３６８６，　理化学研究所バイオリソース研究センター）を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。２４　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに細胞数２×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種後、各ｗｅｌｌにオールトランスレチノイン酸を１００μＭとなるように添加した。インキュベーター（５％　ＣＯ２，　３７℃）にて４８時間培養後、Ｅ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株またはそのゲノム編集株を１０８　ＣＦＵ／ｗｅｌｌとなるように加え刺激した。刺激２時間後、抗生物質を添加し菌株の増殖を止め、さらに２２時間培養した。細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法にて培養上清中のＴＮＦα量を測定した。
　図４に示したとおり、野生株と比較して、ゲノム編集株では炎症性サイトカインであるＴＮＦαの産生量が増加していた。
　（実施例７：ヒト末梢血単核細胞を用いた反応性試験）
　ヒト末梢血単核細胞（ＣＣ－２７０５，　ロンザ）を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに細胞数５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種後、インキュベーター（５％ＣＯ２，　３７℃）にて２時間培養した。その後、Ｅ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株またはそのゲノム編集株を１０４　ＣＦＵ／ｗｅｌｌとなるように加え刺激した。刺激２時間後、抗生物質を添加し菌株の増殖を止め、さらに２２時間培養した。細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法にて培養上清中のＴＮＦα量およびＩＦＮγ量を測定した。
　図５に示したとおり、野生株と比較して、ゲノム編集株では炎症性サイトカインであるＴＮＦαおよび免疫活性化因子であるＩＦＮγの産生量が増加していた。これにより、ゲノム編集株がヒト免疫細胞を介してがんや感染症などに対する免疫を賦活化させることが期待される。
　（実施例８：担がんマウスモデルを用いた評価）
　マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６（Ｃａｔ．　Ｎｏ．　ＣＲＬ－２６３８，　ＡＴＣＣ）を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン株式会社）の右側腹部皮下に対して、生理食塩水に懸濁した３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの各細胞を１００μＬずつ皮下移植した。移植１週間後にマウスの腫瘍径を測定し、推定腫瘍体積（長径×短径×短径／２）を算出した。推定腫瘍体積に基づき群分けを行い、Ｄａｙ　０とした（図６、９）。抗ＰＤ－１抗体はＤａｙ　０，　３，　７，　１０，　１４に１個体当たり５ｍｇ／ｋｇとなるように尾静脈内投与した。Ｄａｙ　－１４，　－１２，　－１０，　－７，　－５，　－３，　０，　２，　４，　７，　９，　１１，　１４，　１６，　１８（合計１５回）に、Ｅ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株およびそのゲノム編集株を１０９ＣＦＵ／１００μＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水で調製し、１個体当たり１００μＬを強制経口投与した（図９）。菌液投与を抗ＰＤ－１抗体投与と同時に開始させる場合には、Ｄａｙ　０から菌株投与を開始した（合計９回、図６）。以上の菌液および抗ＰＤ－１抗体の投与条件にて、Ｅ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株またはそのゲノム編集株単独、あるいは抗ＰＤ－１抗体との併用投与を実施した。Ｄａｙ　０から週２回、マウスの推定腫瘍体積と体重を測定した。
　菌液投与を抗ＰＤ－１抗体投与と同時に開始させた場合の結果を図７および８に示した。この図に示されるとおり、ゲノム編集株と抗ＰＤ－１抗体との同時投与試験を行ったところ、Ｌｏｇ－ｒａｎｋテストにて、野生株では有意差が確認できなかったのに対して、ゲノム編集株の単独投与および抗ＰＤ－１抗体との併用投与では有意差が認められた。　また菌液投与をＤａｙ　－１４から開始させた場合の結果を図１０および１１に示した。この場合にも、野生株の投与では有意差が確認できなかったのに対して、ゲノム編集株ＢＰ５００７株およびＢＰ５０４０株を投与した場合には抗ＰＤ－１抗体の抗腫瘍作用を増強させることが確認できた（図１０）。またＬｏｇ－ｒａｎｋテストにて、野生株では有意差が確認できなかったのに対して、ゲノム編集株（ＢＰ５００７株およびＢＰ５０４０株）と抗ＰＤ－１抗体との併用投与では有意差が認められた（図１１）。
　（実施例９：尿路感染症マウスモデル）
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン株式会社）をイソフルラン麻酔下にて、膀胱を軽く圧迫し膀胱内の尿を排出させる。尿道口をエタノール綿で消毒し、針先を鈍麻した２６Ｇ装着の１ｍＬシリンジを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ７００９２８）懸濁液１００μＬ（１ｘ１０９　ＣＦＵ／ｍＬ）を、経尿道的に膀胱内に注入する。注入感染後、尿道口を目玉クリップで４時間閉塞する。ゲノム編集株の薬効評価はクリップ除去後2時間通常飼育し、感染時と同様のイソフルラン麻酔下で、菌株１０９　ＣＦＵを経尿道的に投与する。一定期間飼育した後にマウスをイソフルラン麻酔下で放血後、無菌的に各臓器を摘出した後、ホモジネート液を作製し臓器内菌数を計測する。
　（実施例１０：インフルエンザウイルス感染マウスモデル）
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン株式会社）を、馴化期間を設けた後に実験に使用する。インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株を４×１０４　ＰＦＵ／ｍＬとなるように調製する。マウスをイソフルランにて麻酔し、ウイルス懸濁液５０μＬを鼻腔内に投与することで感染させる。感染前１０日間および感染後１０日間、Ｅ．　ｃａｓｓｅｒｉｆｌａｖｕｓ野生株またはそのゲノム編集株を１０９ＣＦＵ／１００μＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水で調製し、１個体当たり１００μＬを強制経口投与する。マウスを毎日観察し、死亡率や体重減少、視認スコアを記録する。感染後１０日目に、血液、気管支肺胞洗浄液、肺組織を採取し、保存する。肺組織からウイルスＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲによりウイルス量を測定する。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２２年１１月４日に出願された特願２０２２－１７７７１０、および２０２３年５月２４日に出願され特願２０２３―８５３４７に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
　本開示の微生物によって、免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法において、宿主のＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化を通じて、宿主の免疫活性を向上させ、また免疫チェックポイント阻害剤抗腫瘍効果を増強させることができるため、医療分野において幅広い応用が期待できる。
配列番号１：E_casseliflavusのfliC(hag)の核酸配列
配列番号２：E_casseliflavusのfliDの核酸配列
配列番号３：E_casseliflavusのflgEの核酸配列
配列番号４：E_casseliflavusのfliFの核酸配列
配列番号５：E_casseliflavusのflgKの核酸配列
配列番号６：E_casseliflavusのflgMの核酸配列
配列番号７：E_casseliflavusのflgNの核酸配列
配列番号８：E_casseliflavusのfliTの核酸配列
配列番号９：E_casseliflavusのsigDの核酸配列

Claims (29)

  1. 　微生物であって、該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節するものである、微生物。
  2. 　前記鞭毛構成遺伝子群が、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＴ、ｓｉｇＤを含む、請求項１に記載の微生物。
  3. 　前記ＴＬＲ５の活性化能の調節が、ＴＬＲ５の活性化能の向上を含む、請求項１または２に記載の微生物。
  4. 　前記改変が、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＦｌａｇｅｌｌｉｎの発現量を増大させ、および／またはＦｌａｇｅｌｌｉｎの細胞外分泌量を増大させるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の微生物。
  5. 　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の微生物。
  6. 　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物。
  7. 　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物。
  8. 　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の微生物。
  9. 　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の微生物。
  10. 　前記微生物が腸球菌を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の微生物。
  11. 　前記微生物がＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の微生物。
  12. 　宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節させるための微生物を生産する方法であって、
    　（Ａ）該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子を改変する工程であって、該微生物内において、該遺伝子の標的核酸配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、もしくは欠失させ、または該遺伝子の標的核酸配列に１またはそれ以上のヌクレオチドを挿入する、改変する工程と、
    　（Ｂ）改変された該遺伝子を有する微生物について、ＴＬＲ５の活性化能を試験し、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、ＴＬＲ５の活性化能が変化した微生物を選択する工程と、
    　（Ｃ）ＴＬＲ５の活性化能が向上した微生物を選択できなかった場合に、必要に応じて、工程（Ａ）および（Ｂ）を繰り返す工程と
    を含む、方法。
  13. 　前記鞭毛構成遺伝子群が、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｉＴ、ｓｉｇＤを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記ＴＬＲ５の活性化能の調節が、ＴＬＲ５の活性化能の向上を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 　前記改変が、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＦｌａｇｅｌｌｉｎの発現量を増大させ、および／またはＦｌａｇｅｌｌｉｎの細胞外分泌量を増大させるものである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　前記改変が、前記鞭毛構成遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記微生物が腸球菌を含む、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　前記微生物がＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓを含む請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の微生物を投与する工程を含む、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節する方法。
  24. 　微生物を含む医薬であって、該微生物における鞭毛構成遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、改変していない該遺伝子を有する微生物と比較して、宿主におけるＴｏｌｌ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＴＬＲ５）の活性化能を調節するものである、医薬。
  25. 　前記医薬はがんまたは感染症を処置または予防するものである、請求項２４に記載の医薬。
  26. 　前記感染症は細菌およびウイルスからなる群より選択される少なくとも１つに起因する感染症を含む、請求項２５に記載の医薬。
  27. 　前記医薬は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与されるものである、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の医薬。
  28. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＣＤ１６０、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＮＬ２、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ３Ａ２、およびＣＳＦ－１Ｒからなる群から選択される分子に対する薬剤、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２７に記載の医薬。
  29. 　がんまたは感染症を処置または予防するための方法であって、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の医薬を投与する工程を含む、方法。
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