JP2022506777A - がんの処置において使用するための微生物および免疫モジュレーターの併用療法 - Google Patents

がんの処置において使用するための微生物および免疫モジュレーターの併用療法 Download PDF

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Abstract

微生物および免疫モジュレーターを含む併用療法、ならびにがんをモジュレートおよび処置する方法が開示される。本開示は、１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーと組み合わせて、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする細菌の組成物、方法、および使用を提供する。本明細書に記載の細菌は、野生型細菌、例えばプロバイオティクス細菌、または非天然免疫モジュレーター遺伝子を含まないおよび／もしくは非天然免疫モジュレータータンパク質もしくは分子を発現しない細菌シャシー（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｈａｓｓｉｓ）であり得る。

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１１月８日に出願した米国仮出願第６２／７５７，４５２号および２０１９年５月１５日に出願した米国仮出願第６２／８４８，２９４号に対する優先権を主張し、これらのそれぞれの内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年３月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは１２６０４６－０５０２０＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付け、１，７８４キロバイトのサイズである。
背景
現在のがん治療は、典型的には、免疫療法、外科手術、化学療法、放射線療法、またはこれらのいくつかの組合せの使用を用いる（米国がん協会）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）。これらの薬物はがん患者に対して大きな利益を示してきたが、多くのがんは従来の治療を使用して処置するのが困難なままである。現在、多くの従来のがん治療は全身的に投与され、健常組織に有害な影響を及ぼし、重大な副作用をもたらしている。例えば、多くのがん治療は、免疫系を活性化させ、患者の抗がん応答をブーストすることに重点を置いている（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。しかし、このような治療にも関わらず、腫瘍の周囲の微小環境は非常に免疫抑制的なままである。さらに、全身的な免疫調節の変更は、日和見自己免疫障害および免疫関連有害事象の開始を含む免疫不全を惹起する。
がん細胞を特異的に標的とする細胞傷害性薬物を開発するために、過去数十年にわたって大きな努力がなされてきた。近年、腫瘍学においてパラダイムシフトが存在し、そこでは、がんの臨床的問題が、がん細胞における遺伝的異常の蓄積であるだけではなく、免疫系によるこれらの異常細胞の寛容でもあると考えられている。その結果、最近の抗がん治療は、がん細胞よりも免疫系を特異的に標的とするように設計されている。このような治療は、がん免疫寛容を回復させることおよび有効な抗腫瘍免疫応答を刺激することを目標とする。例えば、現行の免疫療法は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストである免疫刺激分子、または腫瘍微小環境に浸潤する様々な免疫細胞集団を標的とする免疫刺激モノクローナル抗体を含む。しかし、これらの免疫標的設計にもかかわらず、これらの治療は、これらが免疫療法の全身投与（例えば、２～３週間ごとの静脈内注入）に依拠する従来の抗がん薬であるかのように、臨床開発されてきた。結果として、多くの現行の免疫療法は、高い投薬要求量に起因する毒性に悩まされ、望ましくない自己免疫応答または他の免疫関連有害事象をもたらすことも多い。
よって、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域を標的とすることができ、がん性細胞を特異的に標的とする一方、正常組織への影響を最小限にし、がん免疫寛容を回避するかまたは逆転させることを含む、免疫系をブーストして腫瘍と闘わせる、有効ながん治療に対するまだ対処されていない需要が存在する。
要旨
本開示は、１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーと組み合わせて、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする細菌の組成物、方法、および使用を提供する。本明細書に記載の細菌は、野生型細菌、例えばプロバイオティクス細菌、または非天然免疫モジュレーター遺伝子を含まないおよび／もしくは非天然免疫モジュレータータンパク質もしくは分子を発現しない細菌シャシー（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｈａｓｓｉｓ）である。しかし、一部の実施形態では、細菌シャシーは、１つまたは複数の栄養要求性、抗生物質耐性カセット、および／または内在性ファージの欠失を含み得る。野生型細菌および細菌シャシーを、少なくとも１つの免疫モジュレーターと組み合わせて使用することは、安全であり、治療用組成物の標的化送達および局所的送達をもたらす。本明細書に記載の細菌は、驚くべきことに、免疫モジュレーター単独での投与、または細菌単独での投与と比較して、免疫モジュレーターの効果を補強する。一部の実施形態では、効果は相乗的である。例えば、免疫応答の誘導は、本明細書においてより詳細に議論されるように、細菌のファゴサイトーシスによって相乗的に増強される。
一態様では、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物が本明細書において開示される。
一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターは、少なくとも１つの免疫イニシエーターである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、腫瘍溶解を増強すること、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化すること、ならびに／またはＴ細胞をプライミングおよび活性化することが可能である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニスト、アルギニン、５－ＦＵ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ１、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＲＰα、ＧＭＣＳＦ、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体、４－１ＢＢＬ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、またはアズリンである。一態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、またはｃ－ｄｉＧＭＰである医薬組成物が開示される。一実施形態では、免疫イニシエーターは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作された化学療法、または溶解性ペプチドである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、５－ＦＵである。
一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターは、少なくとも１つの免疫サステナーである。一実施形態では、免疫サステナーは、Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤を増強すること、Ｔ細胞によるがん細胞の認識を増強すること、エフェクターＴ細胞応答を増強すること、および／または免疫抑制を克服することが可能である。一実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換因子、アルギニン、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはＧＩＴＲＬ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはＯＸ４０Ｌ、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体もしくは４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５ ｓｕｓｈｉ、ＩＦＮγ、またはＩＬ－１２である。一実施形態では、免疫サステナーは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、またはＴ細胞共刺激受容体リガンドである。一実施形態では、少なくとも１つの免疫サステナーは、キヌレニン分解酵素である。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニンである。一実施形態では、免疫サステナーは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、またはｃ－ｄｉＧＭＰである。
一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターは、少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーを含む。一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターは、細菌によって産生されない。
一実施形態では、細菌は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌である。
一実施形態では、細菌シャシーは、１つまたは複数の栄養要求性をもたらす、遺伝子における少なくとも１つの突然変異または欠失を含む細菌である。一実施形態では、細菌シャシーは、ｔｈｙＡ栄養要求性および／またはｄａｐＡ栄養要求性を含む細菌である。一実施形態では、細菌シャシーは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃ． ｎｏｖｙｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏ ｂｏｖｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌である。一実施形態では、細菌シャシーは、ファージ欠失をさらに含む。
一実施形態では、医薬組成物が腫瘍内投与用に製剤化される。一実施形態では、組成物は、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌は、野生型細菌または細菌シャシーである。
一態様では、医薬組成物を含むシリンジであって、組成物が、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、シリンジが本明細書において開示される。
一態様では、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物と、それを使用するための使用説明書とを含むキットが本明細書において開示される。
一態様では、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物を含むシリンジと、それを使用するための使用説明書とを含むキットが本明細書において開示される。
一態様では、ｉ）単離された細菌を含む第１の組成物であって、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、第１の組成物と、ｉｉ）免疫モジュレーターを含む第２の組成物と、ｉｉｉ）それらを使用するための使用説明書とを含むキットが本明細書に開示される。一実施形態では、第１の組成物は、凍結乾燥された組成物である。一実施形態では、使用するための使用説明書は、第１の組成物が第２の組成物の前に対象に投与するためであるか、第２の組成物が第１の組成物の前に対象に投与するためであるか、または第１および第２の組成物が対象への投与の前に組み合わされるかを示す。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物を投与するステップを含み、それによって、対象におけるがんを処置する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一実施形態では、投与するステップは、経口投与ではない。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、対象に、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物を投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一実施形態では、投与するステップは、経口投与ではない。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。
一態様では、腫瘍を有する対象においてアブスコパル効果を誘導する方法であって、対象に、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物を投与するステップを含み、それによって、対象においてアブスコパル効果を誘導する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一実施形態では、投与するステップは、経口投与ではない。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。
一態様では、腫瘍を有する対象において免疫学的記憶を誘導する方法であって、対象に、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物を投与するステップを含み、それによって、対象において免疫学的記憶を誘導する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一実施形態では、投与するステップは、経口投与ではない。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。
一態様では、対象の腫瘍の部分的退縮を誘導する方法であって、対象に単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物を投与するステップを含み、それによって、対象の腫瘍の部分的退縮を誘導する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、部分的退縮は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％の腫瘍サイズの減少である。一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一実施形態では、投与するステップは、経口投与ではない。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。
一態様では、対象の腫瘍の完全退縮を誘導する方法であって、対象に、単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含み、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物を投与するステップを含み、それによって、対象の腫瘍の完全退縮を誘導する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、腫瘍は、薬学的に許容される組成物の投与後に対象において検出不能である。一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一態様では、対象の腫瘍の完全退縮を誘導する方法であって、投与するステップが経口投与ではない、方法が本明細書に開示される。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、細菌を投与するステップであって、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、ステップと、対象に、少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップであって、それによって、対象におけるがんを処置する、ステップとを含む方法が本明細書に開示される。一実施形態では、投与するステップが同時に実施されるか、対象に細菌を投与するステップが、対象に少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップの前に行われるか、または対象に少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップが、対象に細菌を投与するステップの前に行われる。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一実施形態では、細菌を投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、投与するステップは、経口投与ではない。一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップは、静脈内注射である。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターは、少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーを含む。一実施形態では、少なくとも１つの免疫イニシエーターは表５に列挙された免疫イニシエーターから選択され、少なくとも１つの免疫サステナーは表６に列挙された免疫サステナーから選択される。一実施形態では、少なくとも１つの免疫イニシエーターはＳＴＩＮＧアゴニストであり、少なくとも１つの免疫サステナーはキヌレニン分解酵素である。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、対象に、細菌を投与するステップであって、細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、ステップと、対象に、少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップであって、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、ステップとを含む方法が本明細書に開示される。一実施形態では、対象に細菌を投与するステップは、対象に少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップの前に行われるか、または対象に少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップは、対象に細菌を投与するステップの前に行われる。一実施形態では、本方法は、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、細菌は、対象の腫瘍にコロニー形成する。一実施形態では、細菌を投与するステップは、腫瘍内注射である。一実施形態では、投与するステップは、経口投与ではない。一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップは、静脈内注射である。一実施形態では、細菌は、予め定義された細菌の均一集団を含む。一実施形態では、予め定義された細菌の均一集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む。一実施形態では、少なくとも１つの免疫モジュレーターは、少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーを含む。一実施形態では、少なくとも１つの免疫イニシエーターは表５に列挙された免疫イニシエーターから選択され、少なくとも１つの免疫サステナーは表６に列挙された免疫サステナーから選択される。一実施形態では、少なくとも１つの免疫イニシエーターはＳＴＩＮＧアゴニストであり、少なくとも１つの免疫サステナーはキヌレニン分解酵素である。
ある特定の態様では、微生物は、細菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、ならびに本明細書において提供される他の例示的な細菌株である。一部の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境に選択的にホーミングすることができる。よって、ある特定の実施形態では、微生物は、例えば、経口投与、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射または他の手段によって全身投与され、腫瘍部位に選択的にコロニー形成することができる。
別の態様では、免疫イニシエーター、例えば、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作された化学療法、または溶解性ペプチド、および微生物を含む組成物が本明細書に開示される。さらに別の態様では、免疫サステナー、例えば、ケモカイン、サイトカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、またはＴ細胞共刺激受容体リガンド、および第１の微生物を含む組成物が本明細書に開示される。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、腫瘍溶解を増強すること、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化すること、ならびに／またはＴ細胞をプライミングおよび活性化することが可能である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、腫瘍溶解を増強することが可能である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＡＰＣを活性化することが可能である。さらに別の実施形態では、免疫イニシエーターは、Ｔ細胞をプライミングおよび活性化することが可能である。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＲＮＡ干渉、ｍｉｃｒｏＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子の調節、標的タンパク質の結合、または遺伝子編集を媒介する核酸分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作された化学療法、または溶解性ペプチドである。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニスト、アルギニン、５－ＦＵ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ１、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＲＰα、ＧＭＣＳＦ、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体、４－１ＢＢＬ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、またはアズリンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、５－ＦＵである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦαである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮγである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮβ１である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＩＲＰαである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＣＤ４０Ｌである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＭＣＳＦである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＯＸＯ４０Ｌである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、４－１ＢＢＬである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＩＴＲＬである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤ１抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤＬ１抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アズリンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、５－ＦＵである。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ｄｉＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ＧＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ｄｉＧＭＰである。
一実施形態では、免疫サステナーは、Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤を増強すること、Ｔ細胞によるがん細胞の認識を増強すること、エフェクターＴ細胞応答を増強すること、および／または免疫抑制を克服することが可能である。一実施形態では、免疫サステナーは、Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤を増強することが可能である。一実施形態では、免疫サステナーは、Ｔ細胞によるがん細胞の認識を増強することが可能である。一実施形態では、免疫サステナーは、エフェクターＴ細胞応答を増強することが可能である。一実施形態では、免疫サステナーは、免疫抑制を克服することが可能である。
一実施形態では、免疫サステナーは、治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、ＲＮＡ干渉、ｍｉｃｒｏＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子の調節、標的タンパク質の結合、または遺伝子編集を媒介する核酸分子である。
一実施形態では、免疫サステナーは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、または分泌もしくは提示されたペプチドである。
一実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換因子、アルギニン、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはＧＩＴＲＬ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはＯＸ４０Ｌ、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体もしくは４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５ ｓｕｓｈｉ、ＩＦＮγ、またはＩＬ－１２である。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニンである。
一実施形態では、免疫サステナーは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、またはｃ－ｄｉＧＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ｄｉＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ＧＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ｄｉＧＭＰである。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーと同一ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーと異なる。
一実施形態では、細菌は、細菌が腫瘍内に存在する場合に補完されない遺伝子における栄養要求株である。一実施形態では、細菌が腫瘍内に存在する場合に補完されない遺伝子は、ｄａｐＡ遺伝子である。一実施形態では、細菌は、細菌が腫瘍内に存在する場合に補完される遺伝子における栄養要求株である。一実施形態では、細菌が腫瘍内に存在する場合に補完される遺伝子は、ｔｈｙＡ遺伝子である。
一実施形態では、細菌は、内在性プロファージにおける突然変異または欠失をさらに含む。
一実施形態では、細菌は非病原性である。一実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅである。
別の態様では、免疫モジュレーターは、分泌タグ配列を含むかまたは含まない、リンカー配列によってｐ４０ ＩＬ－１２サブユニット遺伝子配列に連結されたｐ３５ ＩＬ－１２サブユニット遺伝子配列を含む二量体化ＩＬ－１２である。一実施形態では、分泌タグ配列は、配列番号１２３５、１１４６～１１５４、１１５６、および１１６８からなる群から選択される。一実施形態では、リンカー配列は、配列番号１１９４を含む。一実施形態では、ｐ３５ ＩＬ－１２サブユニット遺伝子配列は配列番号１１９２を含み、ｐ４０ ＩＬ－１２サブユニット遺伝子配列は配列番号１１９３を含む。一実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１１６９～１１７９からなる群から選択される配列を含む。
別の態様では、免疫モジュレーターは、ｓｕｓｈｉドメイン配列に融合したＩＬ－１５遺伝子配列などのＩＬ－１５融合タンパク質である。一実施形態では、配列は、配列番号１１９５～１１９８からなる群から選択される。
一実施形態では、本明細書に開示される微生物は細菌である。一実施形態では、本明細書に開示される微生物は酵母である。一実施形態では、微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。一実施形態では、微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌である。
一実施形態では、本明細書に開示される微生物は、１つまたは複数の栄養要求性をもたらす、遺伝子における少なくとも１つの突然変異または欠失を含む。一実施形態では、少なくとも１つの欠失または突然変異は、ｄａｐＡ遺伝子および／またはｔｈｙＡ遺伝子中にある。
一実施形態では、本明細書に開示される微生物は、ファージ欠失を含む。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ１、ＧＭＣＳＦ、抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、アゴニスト抗４１ＢＢ抗体、４１ＢＢＬ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、および／またはアズリンではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦαではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮγではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮβ１ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＣＤ４０抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＣＤ４０Ｌではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＭＣＳＦではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＯＸＯ４０Ｌではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、４－１ＢＢＬではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＩＴＲＬではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤ１抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤＬ１抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アズリンではない。
一実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５ ｓｕｓｈｉ、ＩＦＮγ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体、４－１ＢＢＬ、またはＩＬ－１２ではない。一実施形態では、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣから選択される。一実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニンではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ１抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤＬ１抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗ＣＴＬＡ４抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＧＩＴＲＬではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ－１５ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ－１５ ｓｕｓｈｉではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＦＮγではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＯＸ４０Ｌではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、４－１ＢＢＬではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ－１２ではない。
単鎖抗ＣＴＬＡ－４抗体を構築する際に使用するための例示的な核酸配列は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２号に記載されている。一実施形態では、免疫モジュレーターは、配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６から選択される配列を含むポリペプチドを含む。さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６から選択される配列からなる。
一態様では、本明細書に開示される微生物、１つまたは複数の免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物が本明細書に開示される。一態様では、本明細書に開示される組成物、および薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物が本明細書に開示される。一実施形態では、組成物は、腫瘍内注射用に製剤化される。別の実施形態では、薬学的に許容される組成物は、がんを有する対象を処置する際に使用するためのものである。別の実施形態では、薬学的に許容される組成物は、対象において免疫応答を誘導およびモジュレートする際に使用するためのものである。
一態様では、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物、およびそれを使用するための使用説明書を含むキットが本明細書に開示される。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物を投与するステップを含み、それによって、対象におけるがんを処置する方法が本明細書に開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、対象に、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物を投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する方法が本明細書に開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、対象に、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物を投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する方法が本明細書に開示される。
一態様では、腫瘍を有する対象においてアブスコパル効果を誘導する方法であって、対象に、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物を投与するステップを含み、それによって、対象においてアブスコパル効果を誘導する方法が本明細書に開示される。
一態様では、腫瘍を有する対象において免疫学的記憶を誘導する方法であって、対象に、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物を投与するステップを含み、それによって、対象において免疫学的記憶を誘導する方法が本明細書に開示される。
一態様では、対象の腫瘍の部分的退縮を誘導する方法であって、対象に、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物を投与するステップを含み、それによって、対象の腫瘍の部分的退縮を誘導する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、部分的退縮は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％の腫瘍サイズの減少である。
一態様では、対象の腫瘍の完全退縮を誘導する方法であって、対象に、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物を投与するステップを含み、それによって、対象の腫瘍の完全退縮を誘導する方法が本明細書に開示される。一実施形態では、腫瘍は、薬学的に許容される組成物の投与後に対象において検出不能である。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、第１の微生物を投与するステップと、対象に、免疫モジュレーター、例えば免疫サステナーおよび／または免疫イニシエーターを投与するステップとを含み、それによって、対象におけるがんを処置する方法が本明細書に開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、対象に、第１の微生物を投与するステップと、対象に、免疫モジュレーター、例えば免疫サステナーおよび／または免疫イニシエーターを投与するステップとを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する方法が本明細書に開示される。
一実施形態では、投与するステップは同時に実施される。一実施形態では、対象に第１の微生物を投与するステップは、対象に免疫モジュレーターを投与するステップの前に行われる。一実施形態では、対象に免疫モジュレーターを投与するステップは、対象に第１の微生物を投与するステップの前に行われる。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、第１の微生物を投与するステップと、対象に、免疫モジュレーター、例えば免疫サステナーおよび／または免疫イニシエーターを投与するステップを含み、それによって、対象におけるがんを処置する方法が本明細書に開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、対象に、第１の微生物を投与するステップと、対象に、免疫モジュレーター、例えば免疫サステナーおよび／または免疫イニシエーターを投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する方法が本明細書に開示される。
一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。
したがって、本開示は、１つまたは複数の細菌および１つまたは複数の免疫モジュレーターを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、例えば、腫瘍溶解、樹状細胞もしくはマクロファージによる抗原提示、またはＴ細胞の活性化もしくはプライミングをモジュレート、例えば促進することができる免疫イニシエーターである。このような免疫イニシエーターの例としては、サイトカインもしくはケモカイン、例えばＴＮＦα、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＦＮ－ベータ１、単鎖抗体、例えば抗ＣＤ４０抗体、または（３）リガンド、例えばＳＩＲＰαもしくはＣＤ４０Ｌ、代謝酵素（生合成または異化）、例えばＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、または（５）細胞傷害性化学療法が挙げられる。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト、例えばｃ－ジ－ＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰおよび／またはｃ－２’３’－ｃＧＡＭＰである。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、以下に限定されないが、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４１ＢＢを含む共刺激受容体である。
一部の実施形態では、組成物は、腫瘍浸潤もしくはＴ細胞応答をモジュレート、例えば増強するか、または免疫抑制をモジュレート、例えば軽減することができる、１つまたは複数の免疫サステナーをさらに含む。このようなサステナーは、サイトカインまたはケモカイン、単鎖抗体アンタゴニストペプチドまたはリガンド、および代謝酵素経路から選択することができる。
免疫維持サイトカインの例としては、ＩＬ－１５およびＣＸＣＬ１０が挙げられ、これらは、腫瘍微小環境中に分泌され得る。単鎖抗体の非限定的な例としては、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ－４が挙げられる。
一部の実施形態では、組成物は、特定の代謝物の栄養要求株である細菌を含み、例えば、細菌は、微生物が腫瘍内に存在する場合に補完されない遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、ＤａｐＡ遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、組成物は、特定の代謝物に対する栄養要求株である細菌を含み、例えば、細菌は、微生物が腫瘍内に存在する場合に補完される遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、ＴｈｙＡ遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、ＴｒｐＥ遺伝子における栄養要求株である。
一部の実施形態では、細菌は、グラム陽性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、偏性嫌気性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、通性嫌気性細菌である。本開示において企図される細菌の非限定的な例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍが挙げられる。一部の実施形態では、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２から選択される。
一部の実施形態では、細菌は、抗生物質耐性遺伝子配列を含む。
さらに、１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビター、例えばＣＴＬＡ－４インヒビター、ＰＤ－１インヒビター、およびＰＤ－Ｌ１インヒビターをさらに含む、医薬組成物が提供される。このようなチェックポイントインヒビターは、細菌と組み合わせて、逐次的にまたは同時に投与されてもよい。
さらに、共刺激受容体、例えばＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／または４１ＢＢに結合することが可能であるリガンドまたはアゴニスト抗体などのアゴニスト分子を含むがこれらに限定されない、共刺激受容体、例えばＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／または４１ＢＢの１つまたは複数のアゴニストをさらに含む医薬組成物が提供される。このようなアゴニスト分子は、細菌と組み合わせて、逐次的にまたは同時に投与されてもよい。
これらの実施形態のいずれかでは、細菌の組合せは、従来のがん治療、例えば外科手術、化学療法、標的療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、治療、ならびに血液製剤輸血および輸注、ならびに腫瘍溶解性ウイルスなどの、従来のがん治療と併用することができる。これらの実施形態のいずれかでは、細菌をがんまたは腫瘍ワクチンと併用することができる。
図１は、マウスモデルのＢ１６－Ｆ１０腫瘍における発光細菌（ＳＹＮ５３５３）の局在化のための研究設計を示す概略図を示す。
図２は、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍における野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅのコロニー形成を示す。発光細菌（ＳＹＮ－ＢｉｏＬｕｍ、５０μＬ）をマウスに注射し、Ｎｉｓｓｌｅ細菌の特異的なコロニー形成およびスプレッディングを注射後の２４時間に腫瘍全体にわたって示す。
図３Ａは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅのＢ１６－Ｆ１０腫瘍周囲の皮下スペースへの腫瘍内注射後の間質圧力を示す。圧力は、最初の注射の２０～３０分後に測定した。図３Ｂは、注射後の７２時間の野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの浸潤および特異的コロニー形成を示す。図３Ｃは、注射後の７日および１５日の野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの特異的コロニー形成を示す。 同上。 同上。
図４Ａは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定した場合に、様々な腫瘍モデルからの約１×１０６ＣＦＵのＥｃＮによる腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後の７２時間における用量および腫瘍ホモジネート内の細菌存在量を示す。図４Ｂは、生理食塩水を注射した対照と比較した、１×１０６ＣＦＵのＥｃＮ－ＬｕｘＡＢＣＤＥによるｉ．ｔ．注射後の指定した時点におけるＣＴ２６腫瘍からのＣＦＵによって測定した細菌存在量（左側の軸）および相対生物発光量（ＲＬＵ）（右側の軸）を示す。図４Ｃは、１×１０６または１×１０７ＣＦＵのＥｃＮで処置したＣＴ２６腫瘍保有マウスに関する腫瘍ホモジネート（塗りつぶされた円）または血液（中空円）内の細菌存在量を示す。
図５は、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍における、ＳＹＮＢ（細菌シャシー：ジアミノピメリン酸およびチミジンに対する二重栄養要求性、ならびに内在性ファージの欠失を含有する野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を含む）およびＳＹＮＢ１８９１（ＳＹＮＢ Ｎｉｓｓｌｅ株およびＳＴＩＮＧアゴニストｃｉ－ジ－ＡＭＰを産生するゲノム中に組み込まれたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＦＮＲ誘導性ｄａｃＡを含む）のｉｎ ｖｉｖｏ活性ならびに平均腫瘍成長を示す。マウスにＳＹＮＢおよびＳＹＮＢ１８９１株を注射し、平均腫瘍成長を２１日間測定した。
図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、生理食塩水対照（図６Ａ）に対して注射後のＳＹＮＢ株（図６Ｂ）およびＳＹＮＢ１８９１株（図６Ｃ）の個々の腫瘍成長を示す。
図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＢＭＤＣによるＳＹＮＢ１８９１－ｇｆｐのファゴサイトーシスを示す。ＢＭＤＣを、対照培地中で予め誘導したＳＹＮＢ１８９１－ｇｆｐ（ＭＯＩ：２５）と１時間インキュベートするか（図７Ａおよび７Ｂ）または細菌のインキュベーション前にサイトカラシンＤ（１０μＭ）で１時間前処置した（図７Ｃ）。
図７Ｄ～７Ｊは、対照ＥｃＮ（ＭＯＩ：２５）、予め誘導したＳＹＮ１８９１（ＭＯＩ：２５）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）またはｓｍＳＴＩＮＧアゴニスト（５μｇ／ｍＬ）で４時間処置したＲＡＷ ２６４．７マクロファージまたはＷＴ ＢＭＤＣにおけるｍＲＮＡレベルを示し、ファゴサイトーシス依存性およびＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型ＩＦＮ産生ならびにＳＹＮＢ１８９１によるサイトカイン産生におけるシャシー由来ＬＰＳの効果を実証する。指定した群において、細胞をサイトカラシンＤ（１０μＭ）で１時間前処置した。培地のみでインキュベートしたマクロファージまたはＢＭＤＣは陰性対照としての役割を果たした。Ｉｆｎｂ１ ｍＲＮＡおよびＩｌ６ ｍＲＮＡの上方調節について細胞を分析した（図７Ｄ～７Ｇ）。ＷＴ、ＴＬＲ４－／－およびＳＴＩＮＧ－／－のＢＭＤＣを対照ＥｃＮ（ＭＯＩ：２５）、予め誘導したＳＹＮ１８９１（ＭＯＩ：２５）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、またはｓｍＳＴＩＮＧアゴニスト（５μｇ／ｍＬ）で４時間処置した。Ｉｆｎｂ１ ｍＲＮＡ、Ｉｌ６ ｍＲＮＡおよびＩｌ１２ａ ｍＲＮＡの上方調節について細胞を分析した（図７Ｈ～７Ｊ）。データは、示された平均および標準偏差を有する２つまたはそれより多い独立した実験の代表例である。＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１；指定した群を比較する両側の対応のないスチューデントのｔ検定。 同上。 同上。 同上。
図８は、生理食塩水または１×１０９ＣＦＵのＳＹＮＢ１８９１－ｃｍＲ（クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するＳＹＮＢ１８９１）のいずれかで処置したＡ２０腫瘍保有マウスに関するＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘログランク検定を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、処置開始の１日前および対照として注射したアイソタイプを用いる研究全体を通して週に２回、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体のｉ．ｐ．投与によって枯渇させた。長期生存率が示されている。データは、２つまたはそれより多い独立した実験の代表例である。
図９は、ルミネセンス（ＲＬＵ）および倍率ＩＲＦ誘導によるＩＲＦレポーターの活性化を示す。ＩＲＦルシフェラーゼレポーターおよび内在性ＨＡＱ ＴＭＥＭ１７３（ＳＴＩＮＧ）対立遺伝子、ＷＴもしくはＲ２３２Ｈ対立遺伝子のノックインまたはＴＭＥＭ１７３遺伝子のノックアウトのいずれかを含有するＴＨＰ－１不死化ヒト単球細胞を、予め誘導したＳＹＮＢ１８９１（ＭＯＩ：１００）または培地単独で終夜処置した。培地単独で個別にインキュベートした各遺伝子型に由来するＢＭＤＣは、陰性対照としての役割を果たした。データは、示された平均および標準偏差を有する２つまたはそれより多い独立した実験の代表例である。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１；指定した群を比較する片側の対応のないスチューデントのｔ検定。
詳細な説明
ある特定の腫瘍は、従来の治療を使用して管理することが特に困難である。低酸素症は、がん性細胞が非常に低い酸素濃度で存在する固形腫瘍に特有の特徴である。低酸素症の領域は、多くの場合、壊死組織を包囲し、固形のがんがそれらの脈管構造より大きくなると発生する。血管供給が、腫瘍の代謝要求を満たすことができない場合、腫瘍の微小環境は酸欠になる。腫瘍内の複数のエリアは、正常組織内の３～１５％の酸素と比較して、１％未満の酸素しか含有せず（Ｖａｕｐｅｌ ａｎｄ Ｈｏｃｋｅｌ， １９９５）、無血管領域が腫瘍塊の２５～７５％を占めることもある（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。腫瘍のおよそ９５％は、ある程度まで低酸素である（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。全身送達される抗がん剤は、腫瘍脈管構造に依拠して送達されるが、不良な脈管形成が、急速に分裂する細胞への酸素供給を妨げ、その結果、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域における細胞増殖を標的とする治療に対するそれらの細胞の感受性が低くなる。放射線療法は、酸素が放射線誘導細胞死の必要エフェクターであるため、低酸素細胞を死滅させることができない。低酸素細胞には、放射線療法に対して、正常な酸素レベルを有する細胞の３倍までの抵抗性がある（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００３；Ｔｉｅｃｈｅｒ， １９９５； Ｗａｃｈｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。これらの理由のすべてに対して、切除不能な局所進行腫瘍は、従来の治療を使用して管理することが特に困難である。
低酸素環境を標的とすることに関連する課題に加えて、がんを特異的に標的とし、破壊する治療は、低酸素症および壊死のエリアを有する不均質な塊をもたらす遺伝的変更および病態生理学的変化を含む、正常組織と悪性組織の間の差を認識しなければならない。
本開示は、１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば１つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび／または１つもしくは複数の免疫サステナー、ならびに１つまたは複数の微生物、例えば細菌を含む組合せ、その医薬組成物、およびがんをモジュレートまたは処置する方法に関する。ある特定の実施形態では、細菌は、腫瘍細胞に局所的に送達される。ある特定の実施形態では、細菌は、がん性細胞を標的とすることが可能である。ある特定の実施形態では、細菌は、特に低酸素条件下で、例えば低酸素腫瘍環境下で、がん性細胞を標的とすることが可能である。
本開示は、がんを処置するための、免疫モジュレーターの局所的送達および腫瘍特異的送達のための組成物および治療方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば本明細書において提供されるエフェクター分子のいずれかなどの免疫モジュレーターと組み合わせて、がん性細胞を標的とすることが可能である微生物に関する。既存の従来の治療とは対照的に、腫瘍の低酸素エリアは嫌気性細菌の成長にとって完璧なニッチを提供し、その使用は、周囲の脈管形成良好な正常酸素状態の組織を温存して、進行した局所腫瘍を正確に根絶する機会をもたらす。
一部の態様では、本開示は、微生物および１つまたは複数のエフェクター分子、例えば免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーなどの免疫モジュレーターの、腫瘍細胞または腫瘍微小環境への送達を提供する。一部の態様では、本開示は、局所的に、例えば局所的腫瘍内投与によって送達される微生物、ならびに１つまたは複数のエフェクター分子、例えば免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーに関する。一部の態様では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを腫瘍細胞に選択的に送達し、それによって、全身的細胞傷害性または全身的免疫機能不全、例えば自己免疫事象または他の免疫関連有害事象の開始を低減することができる。
本開示をより容易に理解することができるように、特定の用語を最初に定義する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして、かつ当業者に理解されるように読まれるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって示されている。
がんに対する免疫の生成は、「がん－免疫サイクル」（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｍｅｌｌｍａｎ， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｍｅｅｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ－Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｃｙｃｌｅ； Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１３） ３９，：１－１０）と称されている潜在的に自己伝播性の周期的プロセスであり、これにより、Ｔ細胞応答の広範化および増幅がもたらされ得る。サイクルは、サイクルの様々なステップにおいて免疫調節性フィードバック機序をもたらし、発達を停止させるかまたは免疫を制限し得る、阻害因子によって妨害される。
サイクルは、本質的に、抗がん免疫応答の開始が成功するために起こる必要のある一連のステップを含む。サイクルには、免疫応答が開始されるために起こる必要のあるステップと、免疫応答が維持される（すなわち、進行および拡大することが可能となり、衰えない）ために、続いて起こる必要のある第２の一連の事象とが含まれる。これらのステップは、「がん－免疫サイクル」（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｍｅｌｌｍａｎ， ２０１３）と称されており、本質的には、以下のものである。
１．腫瘍細胞内容物の放出（腫瘍溶解）および／または獲得：腫瘍細胞が破壊され、その内容物が流出し、結果としてネオ抗原の放出が起こり、それらが、プロセシングのために抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージ）によって取り込まれる。あるいは、抗原提示細胞が、能動的に、腫瘍細胞に直接貧食してもよい。
２．抗原提示細胞（ＡＰＣ）（樹状細胞およびマクロファージ）の活性化：上記の第１のステップに加えて、次のステップは、抗原提示細胞の活性化およびそれに続く抗がんＴ細胞応答をもたらすために、瀕死の腫瘍細胞からのＤＡＭＰまたはＰＡＭＰの放出の結果として、炎症促進性サイトカインの放出または炎症促進性サイトカインの生成を伴わなければならない。抗原提示細胞の活性化は、腫瘍由来抗原に対する末梢寛容を回避するために重要である。適正に活性化されると、抗原提示細胞は、その表面で以前に内部移行された抗原を、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ分子の状況下で、適正な共刺激シグナル（ＣＤ８０／８６、サイトカインなど）と共に提示して、Ｔ細胞をプライミングおよび活性化する。
３．Ｔ細胞のプライミングおよび活性化：ＤＣおよびマクロファージによる抗原提示は、免疫系によって「外来」として認識されるがん特異的抗原に対するエフェクターＴ細胞応答のプライミングおよび活性化をもたらす。このステップは、エフェクターＴ細胞の量および質ならびに調節性Ｔ細胞の寄与を決定することにより、抗がん免疫応答の強度および範囲にとって重要である。加えて、Ｔ細胞の適正なプライミングは、より優れたメモリーＴ細胞の形成および永続的な免疫をもたらし得る。
４．トラフィキングおよび浸潤：次に、活性化エフェクターＴ細胞は、腫瘍にトラフィキングし、腫瘍に浸潤しなければならない。
５．Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識、ならびにエフェクターＴ細胞応答の増強および拡大：腫瘍部位に到達すると、Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してがん細胞を認識し、それに結合することができ、ＴＣＲは、がん細胞上にＭＨＣ分子の状況で提示されるそれらのコグネート抗原に特異的に結合し、続いて、標的がん細胞を死滅させる。がん細胞の死滅により、腫瘍細胞の溶解によって腫瘍関連抗原が放出され、サイクルが再度開始され、それによって、サイクルの後続の回における応答容量が増加する。ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩのいずれかに制限されるＴ細胞による抗原認識は、さらなるエフェクター機能、例えば、ケモカインおよびエフェクターサイトカインの放出をもたらし、強固な抗腫瘍応答をさらに強化し得る。
６．免疫抑制の克服：最後に、がんに対する免疫応答におけるある特定の欠損を克服することおよび／またはがんの防御戦略を克服すること、すなわち、がんが免疫応答と闘う際に用いる弱点を克服することは、サイクルにおける別の重要なステップとして解釈することができる。一部の事例では、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化が生じたとしても、他の免疫抑制細胞サブセット、すなわち、調節性Ｔ細胞または骨髄系由来サプレッサー細胞が、腫瘍微小環境に対して能動的に動員および活性化される。他の事例では、Ｔ細胞は、適正に腫瘍にホーミングするための正しいシグナルを受容しない可能性があるか、または腫瘍に浸潤することから能動的に除外される可能性がある。最後に、腫瘍微小環境には、サイクルの結果として産生されるエフェクター細胞を抑制または抑止することが可能な、ある特定の機序が存在する。このような耐性機序には、通常、免疫寛容を媒介し、がん組織損傷を弱める、免疫チェックポイントと称されることも多い免疫阻害経路が組み入れられている（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）， Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ； Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ｖｏｌｕｍｅ １２， ｐａｇｅｓ ２５２－２６４を参照されたい）。
１つの重要な免疫チェックポイント受容体は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）であり、これは、Ｔ細胞活性化の振幅をダウンモジュレートする。一部の免疫チェックポイント受容体、例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）は、組織内のエフェクターＴ細胞の機能を制限する。ＰＤ１に対するリガンドを上方調節することによって、腫瘍細胞および抗原提示細胞は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を遮断する。複数の追加の免疫チェックポイント受容体およびリガンド（それらのうちのいくつかは様々な種類の腫瘍細胞において選択的に上方調節される）は、特に、抗腫瘍免疫応答の開始または活性化を増強するアプローチとの組合せにおいて、遮断のための主要な標的である。
６つのステップのうちの１つまたは複数において、がん－免疫サイクルを経ての進行を促進および支持するための治療が開発されている。これらの治療は、広義には、免疫応答の開始を促進する治療および免疫応答を維持するのに役立つ治療として分類することができる。
本明細書で使用される場合、「免疫開始」または「免疫応答を開始すること」という用語は、免疫応答の生成および確立をもたらすステップを通じた前進を指す。例えば、これらのステップには、上記がん免疫サイクルの最初の３つのステップ、すなわち、抗原獲得のプロセス（ステップ（１））、樹状細胞およびマクロファージの活性化（ステップ（２））、ならびに／またはＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「免疫維持」または「免疫応答を維持すること」という用語は、免疫応答が、経時的に広範化および強化されるのを確実にし、免疫応答の減弱または抑制を防止するステップを通じた前進を指す。例えば、これらのステップには、記載されるサイクルのステップ４から６、すなわち、Ｔ細胞のトラフィキングおよび腫瘍浸潤、ＴＣＲを通じたがん細胞の認識、ならびに免疫抑制を克服すること、すなわち、調節性Ｔ細胞の枯渇または阻害およびエフェクター応答の他の能動的な抑制の確立を防止することが含まれ得る。
したがって、一部の実施形態では、組成物は、サイクル内のステップのうちの１つまたは複数をモジュレートすること、例えば、活性化すること、促進すること、支持することによって、がん免疫サイクルをモジュレートすること、例えば、前進させることが可能である。一部の実施形態では、組成物は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化するステップを、モジュレートすること、例えば、促進することが可能である。一部の実施形態では、組成物は、免疫応答の維持を増強するサイクル内のある特定のステップを、モジュレートすること、例えば、ブーストすることが可能である。一部の実施形態では、組成物は、免疫応答の開始をモジュレートすること、例えば、強化すること、および免疫応答の持続をモジュレートすること、例えば、増強することが可能である。
したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば免疫モジュレーターは、免疫応答の開始をモジュレート、例えば強化する。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば免疫モジュレーターは、免疫応答の維持をモジュレート、例えば増強する。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば免疫モジュレーターは、免疫応答の開始をモジュレート、例えば強化し、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば免疫モジュレーターは、免疫応答の維持をモジュレート、例えば増強する。
「エフェクター」、「エフェクター物質」または「エフェクター分子」は、目的の１つまたは複数の分子、治療用物質、または薬物を指す。一実施形態では、「エフェクター」は、微生物、例えば細菌と組み合わせて投与され、微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される。別の実施形態では、本明細書に記載の微生物は、少なくとも２つのエフェクターと組み合わせて投与され、微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される。
このようなエフェクターまたはエフェクター分子の非限定的な例は、「免疫モジュレーター」であり、本明細書に記載される免疫サステナーおよび／または免疫イニシエーターが含まれる。一部の実施形態では、組成物は、２つまたはそれより多いエフェクター分子または免疫モジュレーターを含む。一部の実施形態では、組成物は、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のエフェクター分子または免疫モジュレーターを含む。一部の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、がんのモジュレーションまたは処置に有用である治療用分子である。
一部の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、治療用分子である。一部の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、ＲＮＡ干渉、ｍｉｃｒｏＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子の調節、標的タンパク質の結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、またはＣＲＩＳＰＲ干渉などの遺伝子編集を媒介する核酸分子であってもよい。他の種類のエフェクターおよび免疫モジュレーターは、本明細書に記載および列挙されている。
エフェクター分子および／または免疫モジュレーターの非限定的な例としては、免疫チェックポイントインヒビター（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤＬ－１抗体）、細胞傷害剤（例えば、Ｃｌｙ Ａ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦα）、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激分子（例えば、ＯＸ４０抗体またはＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＣＬ２１、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２１、ＴＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ）、抗原および抗体（例えば、腫瘍抗原、ネオ抗原、ＣｔｘＢ－ＰＳＡ融合タンパク質、ＣＰＶ－ＯｍｐＡ融合タンパク質、ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍抗原、ＲＡＦ１、免疫サプレッサー分子に対する抗体、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＸＲ４／ＣＸＣＬ１２、抗ＧＬＰ１、抗ＧＬＰ２、抗ガレクチン１、抗ガレクチン３、抗Ｔｉｅ２、抗ＣＤ４７、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインおよびケモカインに対する抗体）、ＤＮＡ転移ベクター（例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン－１、ＴＲＡＩＬ、ＳＭＡＣ、Ｓｔａｔ３、Ｂｃｌ２、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＡＦＰ、ＶＥＧＦＲ２）、ならびに酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤ、ＨＳＶ－ＴＫ）、免疫刺激性代謝物およびそれらを産生する生合成経路の酵素（ＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、ｃ－ｄｉＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、および２’３’－ｃＧＡＭＰ、アルギニン、トリプトファン）が挙げられる。
エフェクターにはまた、免疫抑制性または腫瘍成長促進性代謝物、例えば、キヌレニン、アデノシンおよびアンモニアの異化をもたらす、酵素もしくは他のポリペプチド（例えば、トランスポータートランスポーターまたは調節タンパク質）または他の改変（例えば、ある特定の内在性遺伝子、例えば、栄養要求体の不活性化）も含まれ得る。
免疫モジュレーターは、とりわけ、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーを含む。
本明細書で使用される場合、「免疫イニシエーター」または「イニシエーター」という用語は、あるクラスのエフェクターまたは分子、例えば、免疫モジュレーター、または物質を指す。免疫イニシエーターは、（１）腫瘍細胞の溶解（腫瘍溶解）、（２）ＡＰＣ（樹状細胞およびマクロファージ）の活性化、ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化を含む、がん免疫サイクルの１つまたは複数のステップをモジュレート、例えば、強化または増強し得る。一実施形態では、免疫イニシエーターは、本開示の微生物と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本明細書に記載の微生物は、微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される以外の少なくとも１つの免疫イニシエーターと組み合わせて投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の微生物は、微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される以外の少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーと組み合わせて投与される。このような免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書においてさらに詳細に記載される。
一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、治療用分子である。このような治療用分子の非限定的な例は、本明細書に記載されており、以下に限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体（アゴニストまたはアンタゴニスト）、リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）、同時刺激受容体／リガンドなどを含む。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、異化経路の少なくとも１つの酵素である。このような異化経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、以下に限定されないが、有害な代謝物の異化に関与する酵素を含む。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、生合成経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの分子である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、代謝変換因子である。他の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＲＮＡ干渉、ｍｉｃｒｏＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子の調節、標的タンパク質の結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉などの遺伝子編集を媒介する核酸分子であってもよい。
特定の実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、１つまたは複数のステップ（１）腫瘍細胞の溶解および／もしくは腫瘍抗原の取り込み、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化をモジュレート、例えば強化する。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、１つまたは複数のステップ（１）腫瘍細胞の溶解および／もしくは腫瘍抗原の取り込み、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化をモジュレート、例えば強化する。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、１つまたは複数のステップ（１）腫瘍溶解および／もしくは腫瘍抗原の取り込み、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化をモジュレート、例えば強化する。任意の免疫イニシエーターを、がん免疫サイクルにおける同一のまたは異なるステップをモジュレートする１つまたは複数の追加の同一のまたは異なる免疫イニシエーターと組み合わせてもよい。
一実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、腫瘍溶解または腫瘍抗原の取り込みをモジュレートする（ステップ（１））。抗原の獲得をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、溶解性ペプチド、ＣＤ４７遮断抗体、ＳＩＲＰ－アルファおよびバリアント、ＴＮＦα、ＩＦＮ－γおよび５ＦＵを含む。一実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、ＡＰＣの活性化をモジュレートする（ステップ（２））。ＡＰＣの活性化をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＤ４０Ｌ、およびＧＭ－ＣＳＦを含む。一実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化をモジュレート、例えば増強する（ステップ（３））。Ｔ細胞のプライミングおよび活性化をモジュレート、例えば増強する免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、抗ＯＸ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、抗４１ＢＢ抗体、４１ＢＢＬ、抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１２などを含む。
本明細書で使用される場合、「免疫サステナー」または「サステナー」という用語は、あるクラスのエフェクターまたは分子、例えば免疫モジュレーター、または物質を指す。免疫サステナーは、（４）トラフィキングおよび浸潤、（５）Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力を含む、がん免疫サイクルの１つまたは複数のステップをモジュレート、例えばブーストまたは増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、本明細書に記載の微生物と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に記載の微生物は、微生物および／または免疫サステナーの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される以外の免疫サステナーと組み合わせて投与される。
一部の実施形態では、免疫サステナーは、治療用分子である。このような治療用分子の非限定的な例は、本明細書に記載されており、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体（アゴニストまたはアンタゴニスト）、リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）などを含む。別の実施形態では、免疫サステナーは、酵素によって産生される治療用分子である。このような酵素の非限定的な例は、本明細書に記載される。別の実施形態では、免疫サステナーは、生合成経路または異化経路の少なくとも１つの酵素である。このような生合成経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、以下に限定されないが、アルギニンの産生に関与する酵素を含み、このような異化経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、以下に限定されないが、キヌレニンの触媒作用に関与する酵素またはアデノシンの触媒作用に関与する酵素を含む。別の実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換因子である。他の実施形態では、免疫サステナーは、ＲＮＡ干渉、ｍｉｃｒｏＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子の調節、標的タンパク質の結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、またはＣＲＩＳＰＲ干渉などの遺伝子編集を媒介する核酸分子であってもよい。
具体的なの実施形態では、「免疫サステナー」という用語は、有害な分子の低減または排除も指し得る。このような例では、「免疫サステナー」という用語は、有害な代謝物を破壊する異化経路の１つまたは複数の酵素を指すためにも使用され得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、１つまたは複数のステップ（４）Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えばブーストする。任意の免疫サステナーを、同一のまたは異なるステップをモジュレートする１つまたは複数の追加の免疫サステナーと組み合わせてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、１つまたは複数のステップ（４）Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えばブーストする。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、１つまたは複数のステップ（４）Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えばブーストする。
一実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤をモジュレートする（ステップ（４））。Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤をモジュレートする免疫サステナーの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０などのケモカインまたはこのようなサイトカインの発現を誘導する上流の活性化因子を含む。一実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識をモジュレートする（ステップ（５））。Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識をモジュレートする免疫サステナーの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１抗体（アンタゴニスト）、抗ＣＴＬＡ－４抗体（アンタゴニスト）、キヌレニン消費、アデノシン消費、抗ＯＸ４０抗体（アゴニスト）、抗４１ＢＢ抗体（アゴニスト）、および抗ＧＩＴＲ抗体（アゴニスト）を含む。一実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えば増強する（ステップ（６））。免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えば増強する免疫サステナーの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２ならびにこれらのバリアントを含む。
任意の１つまたは複数の免疫イニシエーターを、任意の１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせてもよい。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、１つまたは複数のステップ（１）腫瘍溶解、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化を、１つまたは複数のステップ（４）Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えば、ブーストする、１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせて、モジュレート、例えば強化する。
一部の実施形態では、ある特定の免疫モジュレーターは、がん免疫サイクルの複数の段階、例えば、免疫開始の１つもしくは複数の段階、または免疫維持の１つもしくは複数、または免疫開始の１つもしくは複数の段階および免疫維持の１つもしくは複数の段階で作用する。
本明細書で使用される場合、「代謝変換」は、酵素に触媒される反応の結果である化学的形質変換を指す。酵素に触媒される反応は、自然には生合成または異化のいずれかであり得る。
本明細書で使用される場合、「代謝変換因子」という用語は、化学的形質変換を触媒する、すなわち、代謝物を消費、産生または変換する、１つまたは複数の酵素を指す。一部の実施形態では、「代謝変換因子」という用語は、生合成経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの分子を指す。代謝変換因子は、毒性もしくは免疫抑制代謝物を消費するかまたは抗がん代謝物を産生するか、あるいはその両方であり得る。代謝変換因子の非限定的な例としては、キヌレニン消費物質、アデノシン消費物質、アルギニン産生物質および／またはアンモニア消費物質、すなわち、キヌレニンもしくはアデノシンの消費またはアルギニンの産生および／もしくはアンモニアの消費のための酵素が挙げられる。一実施形態では、代謝変換因子は、例えば、ヒトキヌレニン分解酵素であってもよい（例えば、ＥＣ ３．７．１．３）。別の実施形態では、代謝変換因子は、腫瘍中で、化学的形質変換を触媒する、すなわち、代謝物を消費、産生または変換する酵素の内在性発現を増加または減少させる、核酸、例えばＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマー、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子であってもよい。
本明細書で使用される場合、「野生型」は、改変されていない細菌を指す。例えば、野生型細菌は、遺伝子操作を使用して改変されていない。例えば、野生型細菌は、非天然遺伝子を発現するために、または栄養要求性を含むために改変されていない。一実施形態では、野生型細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌である。
「細菌シャシー」または「シャシー」は、本明細書で使用される場合、栄養要求性の改変、例えば、ｄａｐＡ、ｔｈｙＡ、もしくはその両方の突然変異もしくは欠失、および／またはファージの欠失を含んでもよく、自然免疫応答を刺激してもよいが、非天然核酸もしくは遺伝子を含むようにも、または非天然タンパク質を発現するようにも改変されていない細菌を指す。言い換えれば、細菌シャシーは、非天然免疫モジュレーター遺伝子を含むようにも、または非天然免疫モジュレータータンパク質を発現するようにも改変されていない細菌を指す。一部の実施形態では、シャシーは、栄養要求性の改変、例えば、ｄａｐＡ、ｔｈｙＡ、またはその両方における突然変異または欠失を含んでもよく、かつ自然免疫応答を刺激してもよいが、非天然遺伝子を含むかもしくは非天然タンパク質を発現するように改変されていない、例えば、非天然免疫モジュレーター核酸もしくは遺伝子を含むかまたは非天然免疫モジュレータータンパク質を発現するように改変されていない、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌の株を指す。
本明細書で使用される場合、「非天然の」は、微生物中に通常は存在しない核酸もしくはタンパク質、例えば、内在性配列の余剰コピー、あるいは異種配列、例えば、細菌もしくはウイルスの異なる種、株もしくは亜株からの配列、または同じサブタイプの細菌もしくはウイルスからの改変されていない配列と比較して改変されたおよび／もしくは突然変異した配列を指す。一部の実施形態では、非天然核酸配列は、合成の、天然に存在しない配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１３を参照されたい）。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセット内の１つもしくは複数の遺伝子であってもよい。一部の実施形態では、「非天然の」は、自然には、互いに同じ関係性で見出されない２つまたはそれより多い核酸配列を指す。非天然核酸配列は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
本明細書で使用される場合、「異種」遺伝子または「異種配列」は、自然では、所与の細胞内に通常は見られないヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される場合、異種配列は、所与の細胞中に外因的に導入される核酸配列を包含する。「異種遺伝子」は、対応する天然の遺伝子とは異なる形態で、宿主細胞中に導入された、天然遺伝子、またはその断片を含む。例えば、異種遺伝子は、宿主細胞中に再度組み込まれる非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード配列を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード配列を含み得る。異種遺伝子は、非天然宿主細胞中に導入される天然遺伝子、またはその断片も含み得る。よって、異種遺伝子は、レシピエント細胞；所与の細胞中に自然に見られるが、それがコードする不自然な量の核酸および／もしくはポリペプチドを発現する核酸配列；ならびに／または自然には互いに同一の関係において見られない２つもしくはそれより多い核酸配列に対して外来であるかまたは天然であり得る。
本明細書で使用される場合、「内在性遺伝子」という用語は、生物のゲノム中のその自然の位置における天然遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、宿主生物、例えば宿主細菌細胞、ゲノム中に導入された遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「部分的退縮」という用語は、微生物および／または免疫モジュレーターの、腫瘍を有する対象への投与の後の、腫瘍の成長の阻害、および／または腫瘍の、例えば、サイズにおける、退縮を指す。一実施形態では、「部分的退縮」は、腫瘍の、例えば、サイズにおける、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の退縮を指し得る。別の実施形態では、「部分的退縮」は、腫瘍サイズの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の減少を指し得る。一実施形態では、「部分的退縮」は、腫瘍の、例えば、サイズにおける、退縮を指すが、腫瘍は、対象において依然として検出可能である。
本明細書で使用される場合、「完全退縮」という用語は、微生物および／または免疫モジュレーターの、腫瘍を有する対象への投与の後の、腫瘍の、例えば、サイズにおける、完全退縮を指す。「完全退縮」が起こる場合、腫瘍は対象において検出不能である。
本明細書で使用される場合、「応答パーセント」という用語は、対象集団における、微生物および／または免疫モジュレーターの投与の後に、本明細書に定義される部分的退縮または完全退縮のいずれかを示す対象のパーセンテージを指す。例えば、一実施形態では、対象集団における対象のうちの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％が、部分奏功または完全奏功を示す。
本明細書で使用される場合、「安定疾患」という用語は、成長も収縮もしていないがんまたは腫瘍を指す。「安定疾患」は、新しい腫瘍が発生しておらず、がんまたは腫瘍が、例えば、転移によって、身体のいずれの新しい領域またはエリアにも拡がっていない疾患状態も指す。
「腫瘍内投与」は、腫瘍内部位への微生物送達についての任意のおよびすべての意味を含むことを意味し、腫瘍内注射手段に限定されない。微生物に関する送達手段の例は、本明細書において詳細に議論される。
「がん」または「がん性の」は、非調節細胞成長によって特徴付けられる生理状態を指すために使用される。一部の実施形態では、がんは腫瘍を指す。「腫瘍」は、任意の新生物細胞成長もしくは増殖または任意の前がん性もしくはがん性細胞もしくは組織を指すために使用される。腫瘍は、悪性であることもあり、または良性であることもある。がんの種類としては、以下に限定されないが、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、喉のがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。がん処置の副作用としては、以下に限定されないが、日和見自己免疫障害、全身毒性、貧血、食欲減退、膀胱内膜の炎症、出血および内出血（血小板減少）、味覚または嗅覚の変化、便秘、下痢、口内乾燥、嚥下障害、浮腫、疲労、毛髪脱落（脱毛症）、感染、不妊、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、う歯、尿路感染症、ならびに／または記憶および集中力に関する問題を挙げることができる（国立がん研究所）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。
本明細書で使用される場合、「アブスコパル」および「アブスコパル効果」は、腫瘍の局部的処置が、処置される腫瘍を収縮させるかまたはそうでなければ影響を及ぼすだけではなく、局部的処置の範囲外の他の腫瘍も収縮させるかまたはそうでなければ影響を及ぼす効果を指す。一部の実施形態では、細菌は、アブスコパル効果を惹起することができる。一部の実施形態では、細菌の投与時にアブスコパル効果が観察されない。
アブスコパル効果が観察されるこれらの実施形態のいずれかでは、投与部位に対して遠位である同じ種類の腫瘍における腫瘍成長のタイミングは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、同じ種類から少なくとも約０から２日、少なくとも約２から４日、少なくとも約４から６日、少なくとも約６から８日、少なくとも約８から１０日、少なくとも約１０から１２日、少なくとも約１２から１４日、少なくとも約１４から１６日、少なくとも約１６から１８日、少なくとも約１８から２０日、少なくとも約２０から２５日、少なくとも約２５から３０日、少なくとも約３０から３５日遅延する。
アブスコパル効果が観察されるこれらの実施形態のいずれかでは、同じ種類の遠位腫瘍における腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０から２週、少なくとも約２から４週、少なくとも約４から６週、少なくとも約６から８週、少なくとも約８から１０週、少なくとも約１０から１２週、少なくとも約１２から１４週、少なくとも約１４から１６週、少なくとも約１６から１８週、少なくとも約１８から２０週、少なくとも約２０から２５週、少なくとも約２５から３０週、少なくとも約３０から３５週、少なくとも約３５から４０週、少なくとも約４０から４５週、少なくとも約４５から５０週、少なくとも約５０から５５週、少なくとも約５５から６０週、少なくとも約６０から６５週、少なくとも約６５から７０週、少なくとも約７０から８０週、少なくとも約８０から９０週、または少なくとも約９０から１００遅延する。
アブスコパル効果が観察されるこれらの実施形態のいずれかでは、投与部位に対して遠位の同じ種類の腫瘍において腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０から２年、少なくとも約２から４年、少なくとも約４から６年、少なくとも約６から８年、少なくとも約８から１０年、少なくとも約１０から１２年、少なくとも約１２から１４年、少なくとも約１４から１６年、少なくとも約１６から１８年、少なくとも約１８から２０年、少なくとも約２０から２５年、少なくとも約２５から３０年、少なくとも約３０から３５年、少なくとも約３５から４０年、少なくとも約４０から４５年、少なくとも約４５から５０年、少なくとも約５０から５５年、少なくとも約５５から６０年、少なくとも約６０から６５年、少なくとも約６５から７０年、少なくとも約７０から８０年、少なくとも約８０から９０年、または少なくとも約９０から１００遅延する。
さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約１．０～１．２倍、少なくとも約１．２～１．４倍、少なくとも約１．４～１．６倍、少なくとも約１．６～１．８倍、少なくとも約１．８～２倍、または少なくとも約２倍高くなる。さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約２から３倍、少なくとも約３から４倍、少なくとも約４から５倍、少なくとも約５から６倍、少なくとも約６から７倍、少なくとも約７から８倍、少なくとも約８から９倍、少なくとも約９から１０倍、少なくとも約１０から１５倍、少なくとも約１５から２０倍、少なくとも約２０から３０倍、少なくとも約３０から４０倍、もしくは少なくとも約４０から５０倍、少なくとも約５０から１００倍、少なくとも約１００から５００００倍、または少なくとも約５００から１０００倍高い。この例では、「腫瘍再チャレンジ」には、がん進行のある特定の段階において対象に生じ得る転移形成も含まれてもよい。
免疫学的記憶は、哺乳動物における免疫応答の重要な側面を表す。記憶応答は、がん細胞に対するワクチンの有効性の基礎を形成する。本明細書で使用される場合、「免疫記憶」または「免疫学的記憶」という用語は、長期生存抗原特異的リンパ球が、利用可能であり、特定の抗原への反復的曝露により、応答を急速に開始することが可能である状態を指す。がん免疫療法における免疫学的記憶の重要性は公知であり、メモリーＴ細胞のトラフィキング特性および長期持続的抗腫瘍能力は、悪性腫瘍の制御および転移または再発の防止に極めて重要な役割を果たす。免疫学的記憶は、Ｂリンパ球およびＴ細胞の両方に存在し、現在では、ＮＫ細胞、マクロファージ、および単球を含む、広範な種類の他の免疫細胞に存在すると考えられている。（例えば、Ｆａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｏｒｙ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｓｔ ａｎｄ ａ ｌｏｏｋ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ（Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６） １６： １２４－１２８を参照されたい）。メモリーＢ細胞は、長時間抗体を産生することができる形質細胞である。メモリーＢ細胞は、既に、クローン拡大増殖および分化ならびに親和性成熟を受けており、そのため、数倍急速に分裂し、はるかに高い親和性を有する抗体を産生することができる。メモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方であり得る。これらのメモリーＴ細胞は、増殖するためにさらなる抗原刺激を必要とせず、したがって、ＭＨＣを介したシグナルを必要としない。
免疫学的記憶は、例えば、微生物による処置の際に完全退縮を達成して動物モデルを再チャレンジすることによって、動物モデルにおいて測定することができる。次いで、動物に、がん細胞系からがん細胞を植え込み、成長をモニターし、以前に腫瘍に曝露されなかった同じ種類の年齢が一致するナイーブ動物と比較する。このような腫瘍再チャレンジは、腫瘍細胞に対する全身的かつ長期的な免疫性を示すために使用され、将来的な再発または転移の形成に対抗する能力を表すことができる。そのような実験は、実施例のＡ２０腫瘍モデルを使用して本明細書に記載されている。免疫学的記憶は、ナイーブ動物と比較して、再チャレンジした動物における腫瘍の再発を防止するかまたは遅らせるであろう。細胞レベルでは、免疫学的記憶の形成は、腫瘍抗原特異的メモリーＴ細胞またはエフェクターメモリーＴ細胞の拡大増殖および／または存続性によって測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、免疫学的記憶が対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、免疫学的記憶ががん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、完全奏功が対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、完全奏功ががん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、完全退縮が対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、完全退縮ががん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、部分奏功が対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、部分奏功ががん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、安定疾患が対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、部分奏功ががん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、群内の対象のサブセットによって、部分または完全奏功が達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与時に、群内の患者のサブセットによって、部分的または完全奏功が達成される。
免疫学的記憶が観察されるこれらの実施形態のいずれかでは、腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０から２日、少なくとも約２から４日、少なくとも約４から６日、少なくとも約６から８日、少なくとも約８から１０日、少なくとも約１０から１２日、少なくとも約１２から１４日、少なくとも約１４から１６日、少なくとも約１６から１８日、少なくとも約１８から２０日、少なくとも約２０から２５日、少なくとも約２５から３０日、少なくとも約３０から３５日遅延する。
免疫学的記憶が観察されるこれらの実施形態のいずれかでは、腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０から２週、少なくとも約２から４週、少なくとも約４から６週、少なくとも約６から８週、少なくとも約８から１０週、少なくとも約１０から１２週、少なくとも約１２から１４週、少なくとも約１４から１６週、少なくとも約１６から１８週、少なくとも約１８から２０週、少なくとも約２０から２５週間、少なくとも約２５から３０週、少なくとも約３０から３５週、少なくとも約３５から４０週、少なくとも約４０から４５週、少なくとも約４５から５０週、少なくとも約５０から５５週、少なくとも約５５から６０週、少なくとも約６０から６５週、少なくとも約６５から７０週、少なくとも約７０から８０週、少なくとも約８０から９０週、または少なくとも約９０から１００遅延した。
免疫学的記憶が観察されるこれらの実施形態のいずれかでは、腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０から２年、少なくとも約２から４年、少なくとも約４から６年、少なくとも約６から８年、少なくとも約８から１０年、少なくとも約１０から１２年、少なくとも約１２から１４年、少なくとも約１４から１６年、少なくとも約１６から１８年、少なくとも約１８から２０年、少なくとも約２０から２５年、少なくとも約２５から３０年、少なくとも約３０から３５年、少なくとも約３５から４０年、少なくとも約４０から４５年、少なくとも約４５から５０年、少なくとも約５０から５５年、少なくとも約５５から６０年、少なくとも約６０から６５年、少なくとも約６５から７０年、少なくとも約７０から８０年、少なくとも約８０から９０年、または少なくとも約９０から１００遅延した。
さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約１．０～１．２倍、少なくとも約１．２～１．４倍、少なくとも約１．４～１．６倍、少なくとも約１．６～１．８倍、少なくとも約１．８～２倍、または少なくとも約２倍高い。さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約２から３倍、少なくとも約３から４倍、少なくとも約４から５倍、少なくとも約５から６倍、少なくとも約６から７倍、少なくとも約７から８倍、少なくとも約８から９倍、少なくとも約９から１０倍、少なくとも約１０から１５倍、少なくとも約１５から２０倍、少なくとも約２０から３０倍、少なくとも約３０から４０倍、もしくは少なくとも約４０から５０倍、少なくとも約５０から１００倍、少なくとも約１００から５００００倍、または少なくとも約５００から１０００倍高い。
本明細書で使用される場合、「ホット腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ）」は、Ｔ細胞が炎症状態にある、すなわち、腫瘍中に浸潤するＴ細胞の高い存在量に関連する腫瘍を指す。「コールド腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）」は、腫瘍に浸潤するエフェクターＴ細胞の非存在によって特徴付けられ、免疫細胞が腫瘍に誘引されるが、腫瘍微小環境に浸潤することができない「免疫遮断（ｉｍｍｕｎｅ ｅｘｃｌｕｄｅｄ）」腫瘍と、免疫細胞の動員が全く生じない「免疫無視（ｉｍｍｕｎｅ ｉｇｎｏｒｅｄ）」表現型とにさらに群分けされる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ： ａ Ｒｏａｄｍａｐ ｆｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１７ Ｎｏｖ；３（１１）：７９７－８０８においてさらに検討された）。
「低酸素」は、酸欠環境を生じさせる結果となる生理的レベルと比較して、低減した組織への酸素供給量を指すために使用される。「酸素正常状態」は、組織への生理的酸素供給レベルを指す。低酸素は、固形腫瘍の顕著な特徴であり、不十分な灌流に起因する酸素に乏しい領域および壊死領域によって特徴付けられる（Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。
本明細書で使用される場合、「酸素に乏しい」という用語は、大気中に存在する酸素のレベル、量、または濃度より少ない（例えば、＜２１％のＯ２；＜１６０ｔｏｒｒのＯ２））、酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味する。よって、「１つまたは複数の酸素に乏しい条件」または「酸素に乏しい環境」という用語は、大気中に存在するより低いレベルの酸素を含有する条件または環境を指す。
一部の実施形態では、「酸素に乏しい」という用語は、哺乳動物の消化管、例えば、内腔、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、結腸、遠位Ｓ状結腸、直腸、および肛門管に見られる酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味する。一部の実施形態では、「酸素に乏しい」という用語は、それらの任意のおよびすべての増分分率（例えば、０．２ｍｍＨｇ、０．５ｍｍＨｇのＯ２、０．７５ｍｍＨｇのＯ２、１．２５ｍｍＨｇのＯ２、２．１７５ｍｍＨｇのＯ２、３．４５ｍｍＨｇのＯ２、３．７５ｍｍＨｇのＯ２、４．５ｍｍＨｇのＯ２、６．８ｍｍＨｇのＯ２、１１．３５ｍｍＨｇのＯ２、４６．３ｍｍＨｇのＯ２、５８．７５ｍｍＨｇなど（それらの例示的分率は、説明を目的としてここに列挙されており、決して制限することは意味しない））を含む、０～６０ｍｍＨｇのＯ２（０～６０ｔｏｒｒのＯ２）（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５，４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０ｍｍＨｇのＯ２）であるＯ２のレベル、量、または濃度を指すことを意味する。一部の実施形態では、「酸素に乏しい」は、約６０ｍｍＨｇのＯ２またはそれ未満（例えば、０～約６０ｍｍＨｇのＯ２）を指す。「酸素に乏しい」という用語は、０～６０ｍｍＨｇのＯ２の間（両端の値を含む）、例えば、０～５ｍｍＨｇのＯ２、＜１．５ｍｍＨｇのＯ２、６～１０ｍｍＨｇ、＜８ｍｍＨｇ、４７～６０ｍｍＨｇなどの、Ｏ２レベル、量または濃度の範囲を指すこともあり、この列挙された例示的範囲は、説明を目的としてここに列挙されおり、決して制限することを意味しない。例えば、Ａｌｂｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １４７（５）： １０５５－１０６３（２０１４）；Ｂｅｒｇｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ４１（１１）： １９７１－ １９８０（１９６２）；Ｃｒｏｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ．， ４３： ４７３－４７８（１９６５）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ９６： ４５８６－４５９１（１９９９）；ＭｃＫｅｏｗｎ， Ｂｒ． Ｊ． Ｒａｄｉｏｌ．， ８７：２０１３０６７６（２０１４）（ｄｏｉ： １０．１２５９／ｂｒｊ．２０１３０６７６）を参照されたく、そのそれぞれでは、様々な種の哺乳動物の消化管に見られる酸素レベルについて議論され、このそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、「酸素に乏しい」という用語は、酸素（Ｏ２）が低減したレベルで、例えば、低酸素または無酸素レベルで存在する、消化管以外の哺乳動物の臓器または組織、例えば、尿生殖路、腫瘍組織などに見られる酸素のレベル、量、または濃度を指すことを意味する。一部の実施形態では、「酸素に乏しい」は、部分好気、半好気、微好気、非好気、微有酸素、低酸素、無酸素、および／または嫌気条件で存在する、酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味する。例えば、表１では、様々な臓器および組織に存在する酸素量についてまとめられている。一部の実施形態では、酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度は、溶存酸素（「ＤＯ」）の量として表され、これは、液体中に存在する遊離、非化合物酸素（Ｏ２）のレベルを指し、典型的には、１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）、百万分率（ｐｐｍ；１ｍｇ／Ｌ＝１ｐｐｍ）、またはマイクロモル（ｕｍｏｌ）（１ｕｍｏｌのＯ２＝０．０２２３９１ｍｇ／ＬのＯ２）で報告される。Ｆｏｎｄｒｉｅｓｔ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ， Ｉｎｃ．， ”Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ”， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ， １９ Ｎｏｖ ２０１３， ｗｗｗ．ｆｏｎｄｒｉｅｓｔ．ｃｏｍ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ－ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ／ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ／ｗａｔｅｒ－ｑｕａｌｉｔｙ／ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ－ ｏｘｙｇｅｎ／＞。
一部の実施形態では、「酸素に乏しい」という用語は、約６．０ｍｇ／Ｌまたはそれ未満のＤＯ、例えば、６．０ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、または０ｍｇ／Ｌ、ならびにそれらの内の任意の分率、例えば、３．２５ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌおよび０．１ｍｇ／ＬのＤＯである、酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、例示的分率は、例示目的でここに列挙され、決して制限することを意味しない。液体または溶液中の酸素レベルは、空気飽和度のパーセンテージとして、または酸素飽和度のパーセンテージ（溶液中の溶存酸素（Ｏ２）の濃度の、ある特定の温度、圧力、および塩分で、安定平衡下で、溶液に溶解するであろう酸素の最大量に対する比）として報告されることもある。酸素産生物質も消費物質も含まない、十分に曝気された溶液（例えば、混合および／または撹拌に供された溶液）は、１００％空気飽和されている。
一部の実施形態では、「酸素に乏しい」という用語は、空気飽和度４０％またはそれ未満、例えば、空気飽和度４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、および０％を、これらの任意のおよびすべての増分分率（例えば、３０．２５％、２２．７０％、１５．５％、７．７％、５．０％、２．８％、２．０％、１．６５％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）、ならびに０～４０％の間（両端の値を含む）の任意の空気飽和レベル範囲（例えば、０～５％、０．０５～０．１％、０．１～０．２％、０．１～０．５％、０．５～２．０％、０～１０％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％など）を含めて、指すことを意味する。
ここに列挙された例示的分率および範囲は、例示を目的とし、決して制限することを意味しない。一部の実施形態では、「酸素に乏しい」という用語は、Ｏ２飽和度９％またはそれ未満、例えば、Ｏ２飽和度９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０％を、それらの任意のおよびすべての増分分率（例えば、６．５％、５．０％、２．２％、１．７％、１．４％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）、および０～９％の間（両端の値を含む）の任意のＯ２飽和レベルの範囲（例えば、０～５％、０．０５～０．１％、０．１～０．２％、０．１～０．５％、０．５～２．０％、０～８％、５～７％、０．３～４．２％のＯ２など）を含めて、指すことを意味する。ここに列挙された例示的分率および範囲は、例示を目的とし、決して制限することを意味しない。
表１．
Figure 2022506777000001
本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、天然に存在する配列、人工配列、およびコドン最適化配列を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の配列を指す。「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、とりわけ、内在性遺伝子の改変、例えば、欠失、突然変異、ならびに天然および非天然の遺伝子の、それらが、通常、自然には関連していないプロモーターの制御下での発現を含む。
本明細書で使用される場合、「遺伝子カセット」および「回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）」または「回路（ｃｉｒｃｕｉｔｙ）」という用語は、とりわけ、内在性遺伝子の改変、例えば、欠失、突然変異、ならびに天然および非天然の遺伝子の、それらが、通常、自然には関連していないプロモーターの制御下での発現を含む、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、天然に存在する配列、人工配列、およびコドン最適化配列を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の配列を指す。
抗体は、一般的に、対応する抗原に非共有結合により、可逆的に、および特異的様式で結合することが可能である、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドまたは免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを指す。例示的抗体構造ユニットは、ジスルフィド結合によって接続された同一の２対のポリペプチド鎖であって、各対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有するポリペプチド鎖で構成される四量体を含む。
本明細書で使用される場合、「抗体（単数または複数）」という用語は、１つまたは複数の特定の結合特異性を有する抗体およびそれらの断片のすべてのバリエーションを包含することを意味する。よって、「抗体（単数または複数）」という用語は、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ、ラクダ科動物）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、これらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ、ＶＨＨ断片）、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、ナノボディ、ダイアボディ、およびミニボディを含むことを意味する。抗体は、１つより多くの結合特異性を有することができ、例えば、二特異性であり得る。「抗体」という用語は、いわゆる抗体模倣物、すなわち、抗原に特異的に結合することができるが抗体関連構造を有さないものを含むことも意味する。
「単鎖抗体（単数または複数）」は、典型的には、免疫グロブリンの重鎖と、免疫グロブリンの軽鎖と、必要に応じてリンカーまたは結合、例えばジスルフィド結合とを含むペプチドを指す。単鎖抗体は、伝統的な抗体に見られる定常Ｆｃ領域を欠いている。一部の実施形態では、単鎖抗体は、天然に存在する単鎖抗体、例えば、ラクダ科抗体である。一部の実施形態では、単鎖抗体は、合成の、操作された、または改変された単鎖抗体である。一部の実施形態では、単鎖抗体は、リンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することが可能である。一部の態様では、単鎖抗体は、例えば米国特許第４，９４６，７７８号（この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、１０から約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで必要に応じて接続される、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の（いずれの定常領域も含まない）融合タンパク質を指す、「ｓｃＦｖ抗体」であってもよい。Ｆｖ断片は、抗体の結合部位を保持する最小の断片であり、その結合部位は、一部の態様では、元の抗体の特異性を維持し得る。単鎖抗体の産生技術は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド（単数または複数）」も含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）によって直鎖状に連結されたアミノ酸単量体で構成されている分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２またはそれより多いアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、生成物の特定の長さを指さない。よって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２もしくはそれより多いアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」という用語は、以下に限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むポリペプチドの発現後改変産物を指すことも意図される。本発明のポリペプチドは、約３もしくはそれより多い、５もしくはそれより多い、１０もしくはそれより多い、２０もしくはそれより多い、２５もしくはそれより多い、５０もしくはそれより多い、７５もしくはそれより多い、１００もしくはそれより多い、２００もしくはそれより多い、５００もしくはそれより多い、１，０００もしくはそれより多い、または２，０００もしくはそれより多いアミノ酸サイズのものであってもよい。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体は、その自然環境に存在しないポリペプチドを指す。特定の精製レベルは必要とされない。細菌または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明のために単離されたと考えられ、任意の好適な技法によって分離された、分画された、または部分的にもしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドも同様である。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技法によって産生された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された細胞、微生物または哺乳動物の細胞から産生された、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質またはペプチドは、典型的には、グリカンを含まない。前述のポリペプチドの断片、誘導体、アナログまたはバリアント、およびそれらの任意の組合せも、ポリペプチドとして含まれる。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「アナログ」は、元のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似しているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する元のポリペプチドの少なくとも１つまたは複数の特性を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片はもちろん、欠失断片も含む。断片は、本明細書に記載の任意のポリペプチドに由来する特異的抗体または生物活性断片または免疫学的活性断片も含む。バリアントは、天然に存在しても天然に存在しなくてもよい。天然に存在しないバリアントは、当技術分野で公知の突然変異誘発法を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含む場合もある。
ポリペプチドは、融合タンパク質も含む。本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、元のペプチドまたは元のペプチドに十分に類似する配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、２つまたはそれより多い異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的には、融合タンパク質は、周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技法から得られる。融合タンパク質は、融合タンパク質の構成成分である個々の元のタンパク質と、類似の構造機能（必ずしも同程度にではないが）、および／または類似の調節機能（必ずしも同程度にではないが）、および／または類似の生化学機能（必ずしも同程度にではないが）および／または免疫学的活性（必ずしも同程度にではないが）を有し得る。「誘導体」は、以下に限定されないが、２０種の標準アミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含む。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。１つのペプチドのアミノ酸は、第２のペプチドの対応するアミノ酸と、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合に類似している。保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ． Ｏ．， ｅｄ．， Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９７８）， ａｎｄ ｉｎ Ａｒｇｏｓ， ＥＭＢＯ Ｊ． ８（１９８９）， ７７９－７８５に記載されているものを含む。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を表す：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕ。
これらの組合せの実施形態のいずれかでは、免疫モジュレーターは安定化ポリペプチドに融合されていてもよい。このような安定化ポリペプチドは、当技術分野で公知であり、Ｆｃタンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質はＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質またはＩｇＡ Ｆｃ融合タンパク質などのＦｃ融合タンパク質である。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ペプチドリンカーまたはペプチド結合を介して安定化ポリペプチドに共有結合により融合されている。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ１定常領域の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域および免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドは、配列［ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ］ｎ（ここで、ｎは、１、２、３、４、５または６である）（配列番号１２４５）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰα ＩｇＧ ＦＣ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰα ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１２１）を含む。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαのＮ末端は、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１２１）を含むペプチドリンカーを介してＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端に共有結合により融合されている。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは多量体ポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは二量体である。二量体タンパク質の非限定的な例としては、ＩＬ－１５（ヘテロ二量体）などのサイトカインが挙げられる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、第１のモノマーおよび第２のモノマーを含む１つまたは複数のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１のモノマーポリペプチドは、ペプチドリンカーまたはペプチド結合を介して第２のモノマーポリペプチドに共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーはグリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、第１および第２のモノマーは、同一のポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１および第２のモノマーはそれぞれ、異なるポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１のモノマーはＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドであり、第２のモノマーはＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１２４４）を含む。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、配列番号１１１７のうちの１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｈＩｇＧ４部分を含むｈＩｇＧ４融合タンパク質である。別の実施形態では、ｈＩｇＧ４部分は、配列番号１１１７を含む。さらに別の実施形態では、ポリペプチドのｈＩｇＧ４部分は、配列番号１１１７からなる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１２１のうちの１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するリンカー部分を含む。別の実施形態では、リンカー部分は配列番号１１２１を含む。さらに別の実施形態では、ポリペプチドのリンカー部分は配列番号１１２１からなる。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターのエフェクター機能は、エフェクター機能を助長する別のポリペプチドへの融合によって改善され得る。このような融合の非限定的な例は、本明細書に記載されている、ＩＬ－１５のＩＬ－１５ＲアルファのＳｕｓｈｉドメインへの融合である。したがって、一部の実施形態では、第１のモノマーポリペプチドはＩＬ－１５モノマーであり、第２のモノマーはＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインポリペプチドである。
本明細書で使用される場合、「十分に類似する」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸配列と比較して同一または同等のアミノ酸残基を、十分なまたは最小の数含有する、第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書において定義される。好ましくは、バリアントは、本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似することになる。このようなバリアントは、一般的に、本発明のペプチドの機能活性を保持する。バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸欠失、付加、および／または置換によって、それぞれ天然および野生型のペプチドとアミノ酸配列が異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在するバリアントはもちろん、人工的に設計されたものであってもよい。
本明細書で使用される場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を接続または連結する、例えば２つのポリペプチドドメインを連結する、合成のまたは非天然のまたは天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、「合成の」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的なリンカーが本明細書に記載されている。追加の例示的なリンカーは、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４００７９７０１に提供される。一部の実施形態では、リンカーはグリシンリッチリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎである。一部の実施形態では、リンカーは配列番号９７９を含む。
免疫系は、典型的には、最も広くは、自然免疫と適応免疫との２つのカテゴリーに分けられるが、これらの免疫に関連する免疫応答は、相互排他的ではない。「自然免疫」は、体内での外来作用因子または抗原の出現から直ちにまたは数時間以内に活性化される非特異的防御機序を指す。これらの機序は、物理的バリア、例えば皮膚、血液中の化学物質、ならびに体内の外来作用因子または細胞を攻撃する、樹状細胞（ＤＣ）、白血球、食細胞、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）などの免疫系細胞を含み、外来作用因子の存在に対して残りの免疫系を変更する。自然免疫応答中に、免疫学的抗原の提示と組み合わせて、適応免疫細胞を活性化し、完全に作動する免疫応答が開始化するように働くサイトカインおよびケモカインが産生される。「適応免疫」または「獲得免疫」は、抗原特異的免疫応答を指す。抗原は、最初に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセシングまたは提示されなければならない。抗原提示細胞またはアクセサリー細胞は、それらの表面に、直接または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成して、抗原を提示する細胞である。マクロファージ、Ｂ細胞、および樹状細胞を含むプロフェッショナル抗原提示細胞は、ＭＨＣ－ＩＩ制限様式で外来抗原のヘルパーＴ細胞への提示を専門に扱い、一方、他の細胞型は、細胞内で発生する抗原をＭＨＣ－Ｉ制限様式で細胞傷害性Ｔ細胞に提示することができる。抗原が提示され、認識されると、適応免疫系が、抗原を攻撃するように特異的に設計された大量の免疫細胞を活性化する。自然系と同様に、適応系は、液性免疫構成成分（Ｂリンパ球細胞）と細胞媒介性免疫（Ｔリンパ球細胞）構成成分との両方を含む。Ｂ細胞が活性化されて抗体を分泌し、これらの抗体が、血流を通って移動し、外来抗原と結合する。ヘルパーＴ細胞（調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋細胞）は、それらのＴ細胞受容体が抗原結合ＭＨＣ分子と相互作用すると活性化される。サイトカインおよび共刺激分子は、Ｔ細胞成熟を助け、さらにはこれらの成熟細胞がサイトカインを産生し、これにより、応答を維持するさらなるＴ細胞のプライミングおよび拡大増殖の産生が可能になる。一旦活性化されると、ヘルパーＴ細胞はサイトカインを放出し、これらのサイトカインが、ＡＰＣ、マクロファージ、好中球、および他のリンパ球を含む異なる免疫細胞型の活性を調節および指示し、標的細胞を死滅させ、除去する。ヘルパーＴ細胞は、免疫応答の維持の助けともなる細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を支援する余分なシグナルも分泌する。活性化されると、ＣＴＬは、クローン選択され、その際に機能を獲得し、迅速に分裂して活性化された大量のエフェクター細胞を産生し、将来の脅威に急速に応答する準備の整った長期生存型メモリーＴ細胞を形成する。次いで、活性化されたＣＴＬは、体中を移動して、特有のＭＨＣクラスＩおよび抗原を保有する細胞を探索する。エフェクターＣＴＬは、標的細胞の原形質膜に孔を形成する細胞毒を放出して、アポトーシスを引き起こす。適応免疫は、特定の抗原に対する将来の応答をより効率的にする「メモリー」も含む。感染が解消されると、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は死滅し、食細胞により一掃されるが、これらの細胞のうちの少数はメモリー細胞として残存する。後になって同一の抗原に遭遇する場合、これらのメモリー細胞は迅速にエフェクター細胞に分化し、有効な応答を開始するのに必要な時間を短縮する。
「免疫チェックポイントインヒビター」または「免疫チェックポイント」は、１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質を完全または部分的に低減する、それ阻害する、それと干渉する、またはそれをモジュレートする分子を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化または機能を調節し、かつ当技術分野で公知である。非限定的な例としては、ＣＴＬＡ－４およびそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＰＤ－１およびそのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激性または阻害性相互作用に関与し、自己寛容および生理的免疫応答を調節および維持する。
「共刺激」分子または「共刺激因子」は、免疫応答または炎症応答を刺激するシグナルを増大させるかまたは活性化する免疫モジュレーターである。
本明細書で使用される場合、がん性細胞を「阻害する」免疫モジュレーターは、対照、例えば、未処置対照と比較して少なくとも約１０％から２０％、２０％から２５％、２５％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、６０％から７０％、７０％から７５％、７５％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９０％から９５％、９５％から９９％、またはそれより高い割合で、細胞増殖を低減すること、腫瘍成長を低減すること、および／または腫瘍体積を低減することが可能である分子を指す。
本明細書で使用される場合、生体分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、免疫モジュレーション代謝物、または任意の他の免疫モジュレーション剤、因子もしくは分子を「活性化する」または「刺激する」免疫モジュレーターは、その生体分子の生物活性、生物学的機能、および／または数を、同じ条件下で、対照、例えば未処置対照と比較して活性化する、増加させる、増強する、または促進することが可能である免疫モジュレーターを指す。
「腫瘍内投与のための細菌」は、それら自体をがん性細胞に方向付けることが可能である細菌を指す。腫瘍内投与のための細菌は、天然に、それら自体をがん性細胞、壊死組織、および／または低酸素組織に方向付けることが可能であってもよい。
一部の実施形態では、天然にそれら自体をがん性細胞、壊死組織、および／または低酸素組織に方向付けることが不可能である細菌は、それら自体をがん性細胞、壊死組織、および／または低酸素組織に方向付けるように遺伝子操作される。腫瘍内投与のための細菌をさらに操作して、所望の生物学的特性を増強もしくは向上させる、全身毒性を弱める、および／または臨床的安全性を確実にすることができる。これらの種、株、および／またはサブタイプは、弱毒化されてもよく、例えば、毒性遺伝子を欠失してもよい。
一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は低い感染能を有する。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は運動性である。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は、標準的処置が届かない腫瘍中に深く浸透することが可能である。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は、悪性腫瘍の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％にコロニー形成することが可能である。腫瘍内投与のための細菌の例としては、以下に限定されないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＶｉｂｒｉｏ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ－５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａが挙げられる（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｆｏｒｂｅｓ， ２００６；Ｊａｉｎ ａｎｄ Ｆｏｒｂｅｓ， ２００１；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１０；Ｎｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１３；Ｐａｔｙａｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０；Ｃｒｏｎｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１０； １８：１３９７－４０７）。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は非病原性細菌である。一部の実施形態では、腫瘍内投与は注射によりなされる。
「微生物」は、典型的には単一細胞からなる顕微鏡的な、顕微鏡でも見えないほど微小な、または超顕微鏡的なサイズの、生物または微小生物を指す。微生物の例としては、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、ある特定の藻類、原虫、および酵母が挙げられる。一部の態様では、微生物は、ナイーブな状態から改変される（「改変された微生物」）。ある特定の実施形態では、改変された微生物は改変された細菌である。一部の実施形態では、改変された微生物は遺伝子操作された細菌である。ある特定の実施形態では、改変された微生物は改変された酵母である。他の実施形態では、改変された微生物は遺伝子操作された酵母である。
本明細書で使用される場合、「組換え微生物」という用語は、その天然状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌、酵母、もしくはウイルス細胞、または細菌、酵母もしくはウイルスを指す。よって、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」は、その天然状態から遺伝子改変された細菌細胞または細菌を指す。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡ中に導入された、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再配列、およびヌクレオチド修飾を有してもよい。これらの遺伝子改変は、細菌もしくは細菌細胞の染色体内、または細菌もしくは細菌細胞におけるプラスミド上に存在してもよい。本明細書で開示される組換え細菌細胞は、プラスミド上に外因性ヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、組換え細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含んでもよい。
「プログラムされたかまたは操作された微生物」は、特定の機能を遂行するようにその天然状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌、酵母、もしくはウイルス細胞、または細菌、酵母もしくはウイルスを指す。よって、「プログラムされたもしくは細菌の細胞」または「プログラムされたもしくは細菌」は、特定の機能を遂行するためにその天然状態から遺伝子改変された細菌細胞または細菌を指す。ある特定の実施形態では、プログラムされたまたは細菌の細胞は、１つまたは複数のタンパク質、例えば、治療活性を有するかまたは治療目的に役立つ１つまたは複数のタンパク質を発現するように改変されている。プログラムされたまたは細菌の細胞は、目的のタンパク質が一旦発現されると成長を停止させるまたはそれ自体を破壊する能力をさらに有してもよい。
「非病原性細菌」は、宿主において疾患または有害な応答を引き起こすことが不可能である細菌を指す。一部の実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。一部の実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。一部の実施形態では、非病原性細菌はリポ多糖（ＬＰＳ）を含有しない。一部の実施形態では、非病原性細菌は共生細菌である。非病原性細菌の例としては、以下に限定されないが、ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに属するある特定の株、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；米国特許第６，８３５，３７６号、米国特許第６，２０３，７９７号、米国特許第５，５８９，１６８号、米国特許第７，７３１，９７６号）。
「プロバイオティクス」は、微生物の適切な量を含有する宿主生物に健康上の恩恵をもたらすことができる、生存している非病原性微生物、例えば、細菌を指すために使用される。一部の実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。一部の実施形態では、宿主生物はヒトである。一部の実施形態では、プロバイオティクス細菌はグラム陰性細菌である。一部の実施形態では、プロバイオティクス細菌はグラム陽性細菌である。非病原性細菌のいくつかの種、株、および／またはサブタイプは、現在、プロバイオティクス細菌として認知されている。プロバイオティクス細菌の例としては、以下に限定されないが、ｇｅｎｕｓ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに属するある特定の株、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられる（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクスクは、細菌のバリアントまたは突然変異株であってもよい（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｃｕｅｖａｓ－Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０；Ｏｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。
「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現を可能にする、例えばｃｉｓで作用する様式で、調節領域配列に接合されている核酸配列を指す。調節領域は、目的の遺伝子の転写を指示することができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、ならびにイントロンを含んでもよい。
「誘導性プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結した調節領域であって、遺伝子の発現が前記調節領域のインデューサーの存在下で増加される、調節領域を指す。一実施形態では、誘導性プロモーターはサリチレートプロモーターである。別の実施形態では、誘導性プロモーターはクメート（ｃｕｍａｔｅ）プロモーターである。別の実施形態では、誘導性プロモーターはフマレートおよびニトラーゼ（ｎｉｔｒａｓｅ）還元酵素プロモーターである。
「外因性環境条件」は、本明細書に記載のプロモーターが誘導される設定または状況を指す。一部の実施形態では、外因性環境条件は、がん性細胞を含有する悪性成長、例えば腫瘍に特異的である。「外因性環境条件」という語句は、無傷の（溶解されていない）操作された微生物の外部の、しかし腫瘍環境または宿主対象環境に対して内在性または天然の、環境条件を指すことを意味する。よって、「外因性」および「内在性」は、哺乳動物体に対して内在性であるが、無傷の微生物細胞の外部であるかまたはそれに対して外因性である、環境条件を指すために交換可能に使用されてもよい。一部の実施形態では、外因性環境条件は、酸素に乏しい、微好気性の、または嫌気性の条件、例えば、低酸素および／または壊死組織である。一部の固形腫瘍は、低い細胞内および／または細胞外ｐＨを伴い、一部の実施形態では、外因性環境条件は、低ｐＨ環境である。一部の態様では、細菌は、酸素レベルを感知することが可能である転写因子を発達させてきた。異なるシグナル伝達経路は、異なる酸素レベルによって誘発されてもよく、異なる動態で生じてもよい。「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することが可能である核酸配列であって、対応する転写因子の結合および／または活性化が、下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を指す。
酸素レベル依存性転写因子の例としては、以下に限定されないが、ＦＮＲ（フマレートおよびニトレート還元酵素）、ＡＮＲ、およびＤＮＲが挙げられる。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ（嫌気硝酸呼吸）応答性プロモーター、およびＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）応答性プロモーターは当技術分野で公知であり（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９；Ｇａｌｉｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１；Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｈｏｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３；Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３を参照されたい）、非限定的な例は表２に示される。
非限定的な例では、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、酸素に乏しいかまたは無環境酸素の条件下で高度に発現されることが公知であるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅのフマレートおよびニトレート還元酵素遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来した（Ｄｕｒａｎｄ ａｎｄ Ｓｔｏｒｚ， ２０１０；Ｂｏｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ， ２０１０）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、自然でＮｉｓｓｌｅにおいて見られる包括的転写調節因子ＦＮＲによって、嫌気条件下で活性化される。嫌気条件下で、ＦＮＲは、二量体を形成し、その制御下で特定の遺伝子のプロモーター中の特定の配列と結合し、それによってそれらの発現を活性化する。しかし、好気条件下では、酸素は、ＦＮＲ二量体中の鉄－硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形態に変換する。このように、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本出願において、ＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ－ＦＮＲＳプロモーターおよびプロモーターＰｆｎｒＳを示すための他のそのような関連する呼称と交換可能に使用される。
表２． 転写因子ならびに応答遺伝子および調節領域の例
Figure 2022506777000002
「構成的プロモーター」は、その制御下でおよび／またはそれが作動可能に連結した、コード配列または遺伝子の連続転写を助長することが可能であるプロモーターを指す。構成的プロモーターおよびバリアントは、当技術分野で周知であり、構成的プロモーターの非限定的な例は、本明細書および２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、このようなプロモーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培養、拡大増殖および／または製造条件下で活性である。一部の実施形態では、このようなプロモーターは、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ環境、例えば、消化管および／または腫瘍微小環境において見られる条件下で活性である。
本明細書で使用される場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌またはウイルスは、非天然遺伝物質が保持され、発現され、遺伝されるように、非天然遺伝物質を有する細菌またはウイルス宿主細胞を指すために使用される。安定な細菌またはウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、ならびに／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、低酸素および／もしくは壊死組織において、生存および／または成長することが可能である。例えば、安定な細菌またはウイルスは、非天然遺伝物質を含む遺伝子操作された細菌であって、非ネイティブ遺伝物質を有するプラスミドまたは染色体が、細菌またはウイルスにおいて安定に維持され、その結果、非天然遺伝物質によってコードされたタンパク質が、細菌またはウイルス中で発現されてもよく、細菌またはウイルスが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで生存および／または成長することが可能である、細菌であってもよい。
本明細書で使用される場合、「モジュレートする」および「処置する」という用語ならびにそれらの同語源語は、がん、またはその少なくとも１つの認識できる症状の改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、患者によって必ずしも認識され得るとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、身体的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）、または両方で、がんの進行を阻害することを指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、がんの進行を緩徐化することまたは進行を好転させることを指す。本明細書で使用される場合、「防止する」およびその同語源語は、所与のがんの獲得の開始を遅らせることまたはその獲得リスクを低減させることを指す。
処置を必要とする者は、特定のがんを既に有する個体はもちろん、がんを有するリスクがあるか、または最終的にがんに罹る可能性がある個体を含み得る。処置の必要性は、例えば、がんの発症に関連する１つもしくは複数のリスク因子（例えば、アルコール使用、タバコ使用、肥満、紫外線への過度の曝露、高いエストロゲンレベル、家族歴、遺伝的感受性）の存在、がんの存在もしくは進行、または可能性としてがんを有する対象の処置に対する受容性によって評定される。がんは、ゲノム不安定性および罹患細胞内の高い突然変異率によって引き起こされる。がんを処置することは、がんに関連する症状を排除することならびに／または対象の腫瘍の成長および／もしくは体積をモジュレートすることを包含してもよく、がんの根底にある原因、例えば、根底にある遺伝的素因の排除を必ずしも包含しない。
本明細書で使用される場合、「従来のがん処置」または「従来のがん治療」という用語は、ほとんどの医療専門家によって広く受入れられ、使用されている処置または治療を指す。それは、幅広く使用されていない代替または補完療法とは異なる。がんのための従来の処置の例としては、外科手術、化学療法、標的療法、放射線治療、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、治療、ならびに血液製剤輸血および輸注が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および／または賦形剤のような他の構成成分と共に、本開示の少なくとも１つの微生物および／または少なくとも１つの免疫モジュレーターの調製物を指す。
交換可能に使用することができる「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対して大きな刺激を与えず、かつ投与される細菌性またはウイルス性化合物の生物活性および生物学的特性を消失させない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの語句のもとに含まれる。
「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、以下に限定されないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０を含む）が挙げられる。
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、状態の、例えばがんの防止、症状開始の遅延、または症状の改善をもたらす、化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、がん性細胞に関連する障害の１つもしくは複数の症状の処置、予防、重症度の低減、開始遅延、および／または発生リスクの低減に十分であり得る。治療有効量、および治療に有効な投与頻度は、当技術分野において公知の方法および以下で議論される方法によって決定することができる。
一部の実施形態では、「治療用分子」という用語は、状態の、例えばがんの防止、症状開始の遅延、または症状の改善をもたらす分子または化合物を指す。一部の実施形態では、治療用分子は、とりわけ、例えば、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、例えば、アルギニン、キヌレニン消費物質、もしくはアデノシン消費物質、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作された化学療法、または溶解性ペプチドであってもよい。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書で使用される場合、相反する明確な指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
リスト内の要素間に使用される場合の「および／または」という語句は、（１）列挙された単一の要素のみが存在すること、または（２）リストの１つより多い要素が存在することのいずれかを意味することが意図される。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、選択が、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、またはＡ、ＢおよびＣであり得ることを示す。「および／または」という語句は、リスト中の要素「の少なくとも１つ」または「のうちの１つもしくは複数」と交換可能に使用することができる。
細菌
一実施形態では、微生物は細菌である。細菌は、全身的に、経口的に、局所的におよび／または腫瘍内に投与することができる。一部の実施形態では、細菌は、がん性細胞、特に、腫瘍の低酸素領域のがん性細胞を標的とすることが可能であり、例えば、本明細書において提供される免疫モジュレーター、例えば、免疫刺激因子または免疫サステナーと組み合わせて投与される。
一部の実施形態では、腫瘍を標的とする微生物は、自然に、それ自体をがん性細胞、壊死組織、および／または低酸素組織に方向付けることが可能である細菌である。例えば、腫瘍の細菌コロニー形成は、細菌または宿主において、いかなる特異的遺伝子改変もなく達成することができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、自然に、それ自体をがん性細胞、壊死組織、および／または低酸素組織に方向付けることが不可能であるが、そうするように遺伝子操作されている細菌である。一部の実施形態では、細菌は、血行性に拡散して標的腫瘍に到達する。細菌感染は、腫瘍退縮と関連しており（Ｈａｌｌ， １９９８； Ｎａｕｔｓ ａｎｄ ＭｃＬａｒｅｎ， １９９０）、ある特定の細菌種は、壊死性哺乳動物腫瘍に局在し、それらを溶解することが示されている（Ｊａｉｎ ａｎｄ Ｆｏｒｂｅｓ， ２００１）。腫瘍を標的とする細菌の非限定的な例は、表３に示される。
表３． 腫瘍を標的とする能力を有する細菌
Figure 2022506777000003
Figure 2022506777000004
一部の実施形態では、細菌は、免疫療法の有効性を増強する。最近の研究によって、マウスにおけるある特定の種類の消化管微小生物の存在が、毒性副作用を増加させることなくがん免疫療法の抗腫瘍効果を増強することができることが示唆されている（Ｍ． Ｖｅｔｉｚｏｕ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ＣＴＬＡ－４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｄｏｉ：１０．１１２６／ａａｄ１３２９， ２０１５；Ａ． Ｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ ｅｆｆｉｃａｃｙ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｄｏｉ：０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｃ４２５５， ２０１５）。これらのマウス研究で同定された消化管微生物種がヒトにおいて同じ効果を有するかどうかは、明らかでない。Ｖｅｔｉｚｏｕら（２０１５）には、マウスおよび患者においてＣＴＬＡ－４遮断の有効性と関連付けられた、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なＴ細胞応答について記載されている。Ｓｉｖａｎら（２０１５）は、黒色腫のマウスモデルにおいて、抗腫瘍免疫、および（ＰＤ－１リガンド）有効性に対する抗ＰＤ－Ｌ１抗体にとっての、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの重要性を示す。
一部の実施形態では、細菌はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである。一部の実施形態では、細菌はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。一部の実施形態では、細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅである。一部の実施形態では、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴである。一部の実施形態では、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉである。
ある特定の実施形態では、微生物は偏性嫌気性細菌である。ある特定の実施形態では、細菌は通気性嫌気性細菌である。ある特定の実施形態では、細菌は好気性細菌である。一部の実施形態では、細菌はグラム陽性細菌であり、ＬＰＳを欠く。一部の実施形態では、細菌はグラム陰性細菌である。一部の実施形態では、細菌はグラム陽性の偏性嫌気性細菌である。一部の実施形態では、細菌はグラム陽性の通気性嫌気性細菌である。一部の実施形態では、細菌は非病原性細菌である。一部の実施形態では、細菌は共生細菌である。一部の実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。
例示的な細菌としては、以下に限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ－５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、および表３に示されている細菌が挙げられる。ある特定の実施形態では、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが使用される。静脈内注射されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉは、腫瘍内に蓄積し、これが、一般に使用されるＮＯ供与体であるニトログリセリン（ＮＧ）により、おそらく乏血管性腫瘍への血流を増加させる上でのＮＯの役割に起因して増強されたことが判明している（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１６（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１６；１４０９：９－２３． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ Ｎｉｔｒｏｇｌｙｃｅｒｉｎ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＰＲ Ｅｆｆｅｃｔ）。
一部の実施形態では、細菌は偏性嫌気性菌である。一部の実施形態では、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉａである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、胞子を産生し、自然にコロニー形成すること、および一部の事例では、低酸素腫瘍を溶解することが可能である偏性嫌気性細菌である（Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。実験的モデルにおいて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、プロドラッグ変換酵素を送達し、放射線療法を増強するために使用されている（Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。一部の実施形態では、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉからなる群から選択される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。一部の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、天然に非病原性である。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｕｍは、病原性であり、腫瘍細胞を溶解することが可能である。代替の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、天然に病原性であるが、病原性を低減または排除するように改変される。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉは、天然に病原性であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴは、致死性毒素を除去するように改変される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓは、単鎖ＨＩＦ－１α抗体を送達してがんを処置するために使用されており、「優れた腫瘍コロニー形成性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株」である（Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。
一部の実施形態では、細菌は通性嫌気性菌である。一部の実施形態では、細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、通性嫌気性菌である、非胞子形成性グラム陰性細菌である。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、天然に病原性であるが、病原性を低減または排除するように改変される。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、病原性部位を除去するように改変される（弱毒化される）。一部の実施形態では、細菌はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、グラム陽性の、分岐状嫌気性細菌である。一部の実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、天然に非病原性である。代替の実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、天然に病原性であるが、病原性を低減または排除するように改変される。ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、腫瘍の低酸素領域および壊死領域を優先的に標的とし、そこで複製することが示されている（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。
一部の実施形態では、細菌はグラム陰性細菌である。一部の実施形態では、細菌はＥ．ｃｏｌｉである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、経口投与または静脈内投与のいずれかの後に、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍組織に優先的にコロニー形成することが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２およびＤａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。Ｅ．ｃｏｌｉは、強健な腫瘍特異的複製を示すことも示されている（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。一部の実施形態では、細菌は、「最もよく特徴付けがなされたプロバイオティクスのうちの１つに進化した」Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅファミリーのグラム陰性細菌である（Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）である。この株は、その完全な無害性（Ｓｃｈｕｌｔｚ， ２００８）によって特徴付けられ、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認められる）状態（強調を加えたＲｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）を有する。
一部の実施形態では、細菌は反復投与される。一部の実施形態では、細菌は１回投与される。
好適な細菌のさらなる例は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開ＷＯ／２０１４／０４３５９３に記載されている。一部の実施形態では、このような細菌は、１つまたは複数の毒性因子を弱毒化するように突然変異されている。他の細菌は、少なくともＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１８、およびＬｕｋａｓｉｅｗｉｃｚ ａｎｄ Ｆｏｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１８， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２３９７８０８に記載されている。
一部の実施形態では、本開示の細菌は、増殖し腫瘍にコロニー形成する。一部の実施形態では、コロニー形成は、数日間、数週間、数カ月間、数年間または無期限に持続する。一部の実施形態では、細菌は、腫瘍において増殖せず、細菌の数は、注射後すぐに、例えば注射後１週間も経たずに、検出できなくなるまで低下する。
必須遺伝子および栄養要求株
本明細書で使用される場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞成長および／または生存に対して必要な遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は、当業者にとって周知であり、遺伝子の定方向欠失および／またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定することができる（例えば、それらそれぞれの内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｌｉｎ， ２００９， ＤＥＧ ５．０， ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３７：Ｄ４５５－Ｄ４５８およびＧｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｐｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １７（５）：４４８－４５６を参照されたい）。
「必須遺伝子」は、生物が生きている状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、その修飾、またはその切除は、栄養要求株となる本開示の組換え細菌をもたらし得る。栄養要求性の改変は、生存または成長に必須の外因的に添加される栄養素の非存在下では、細菌が当該必須栄養素の生成に必要な遺伝子を欠くため、細菌を死滅させることを意図する。
栄養要求性の改変は、生存または成長に必須の外因的に添加される栄養素の非存在下では、細菌が当該必須栄養素の生成に必要な遺伝子を欠くため、細菌を死滅させることを意図する。一部の実施形態では、本明細書に記載の細菌のいずれかは、細胞の生存および／または成長に必要とされる遺伝子における欠失または突然変異も含む。一実施形態では、必須遺伝子は、ＤＮＡ合成遺伝子、例えばｔｈｙＡである。別の実施形態では、必須遺伝子は、細菌細胞壁合成遺伝子、例えばｄａｐＡである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡまたはｍｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されないのであれば、以下に限定されないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含む、細胞の生存および／または成長に必要とされる任意の遺伝子を標的としてもよい。栄養要求性株を生産するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子は、その内容全体が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。これらは、以下に限定されないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要とされる遺伝子を含む。表４は、栄養要求性株を生産するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子を列挙する。これらは、以下に限定されないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要とされる遺伝子を含む。
表４． 栄養要求株の生成に有用な細菌遺伝子の非限定的な例
Figure 2022506777000005
Figure 2022506777000006
栄養要求性突然変異は、自然の生態系における細菌の意図されない増殖の防止に生物学的封じ込め戦略が必要とされ得る一部の事例において有用である。上記のまたは当技術分野で公知の必須遺伝子、例えば、ＤＮＡ合成遺伝子、アミノ酸合成遺伝子、または細胞壁の合成のための遺伝子におけるいずれかの栄養要求性突然変異が、この目的に対して有用となり得る。したがって、一部の実施形態では、細菌は、例えば、自然環境における細菌の成長および増殖を防止するために、１つまたは複数の栄養要求性遺伝子において、改変、例えば、突然変異または欠失を含む。一部の実施形態では、改変は、非コード領域に位置してもよい。一部の実施形態では、改変は、転写または翻訳の減弱をもたらす。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失によって、必須遺伝子の転写が低減するかもしくはもたらされない、または翻訳が低減するかもしくはもたらされない。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失によって、必須遺伝子の非機能的バージョンの転写および／または翻訳がもたらされる。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失によって、必須遺伝子のトランケートされた転写または翻訳がもたらされ、トランケートされたポリペプチドがもたらされる。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異は、遺伝子のコード領域内に位置する。
自然の生態系において成長することができないが、ある特定の栄養要求性突然変異によって、細菌が投与された哺乳動物宿主における、例えば腫瘍環境における、成長および増殖が可能となる場合がある。例えば、栄養要求性突然変異によって非機能的にされる必須経路は、腫瘍微小環境内で宿主による代謝物の産生によって補完され得る。結果として、宿主に投与された細菌は、環境から代謝物を取り入れることができ、増殖し腫瘍にコロニー形成することができる。よって、一部の実施形態では、栄養要求性遺伝子は、代謝物の産生のための必須遺伝子であり、この代謝物は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、腫瘍状況において哺乳動物宿主によっても産生される。一部の実施形態では、宿主腫瘍による代謝物の産生は、細菌による代謝物の取込みを可能にすることができ、腫瘍内での細菌の生存および／または増殖を許容する。一部の実施形態では、このような栄養要求性突然変異を含む細菌は、栄養要求性突然変異を有さない同じサブタイプの細菌と同じ程度まで、増殖し腫瘍にコロニー形成することが可能である。
一部の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境において、コロニー形成および増殖することが可能である。一部の実施形態では、腫瘍コロニー形成細菌は、１つまたは複数の栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、腫瘍コロニー形成細菌は、１つまたは複数の栄養要求性の改変または突然変異を含まない。非限定的な例では、対象に当初注射された数よりも多数の細菌が、２４時間および７２時間後に検出される。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約１から２ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約２から３ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約３から４ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約４から５ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約５から６ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約１から２ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約２から３ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約３から４ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約４から５ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約５から６ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、ＣＦＵは、注射後のより遅い時点、例えば、少なくとも１週間後、少なくとも２週間後またはそれよりも後、少なくとも１カ月後、少なくとも２カ月後またはそれよりも後で測定することができる。
増殖および腫瘍へのコロニー形成を可能にするこのような栄養要求性遺伝子の非限定的な例は、本明細書に示す通り、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡである。したがって、一部の実施形態では、本開示の細菌は、ｔｈｙＡ遺伝子において、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含んでもよい。一部の実施形態では、本開示の細菌は、ｕｒａＡ遺伝子において、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含んでもよい。一部の実施形態では、本開示の細菌は、ｔｈｙＡ遺伝子およびｕｒａＡ遺伝子において、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含んでもよい。
あるいは、栄養要求性遺伝子は、宿主が腫瘍内で産生することができない代謝物の産生のための必須遺伝子であり、すなわち、栄養要求性突然変異は、腫瘍微小環境内で宿主による代謝物の産生によって補完されない。結果として、この突然変異は、成長し腫瘍にコロニー形成する細菌の能力に影響を及ぼす可能性があり、細菌計数は経時的に減少する。この種の栄養要求性突然変異は、例えば腫瘍内で、免疫モジュレーターのｉｎ ｖｉｖｏ活性または免疫モジュレーターの活性の持続時間のモジュレーションに有用となり得る。免疫モジュレーター放出のレベルおよびタイミングを微調整するこの方法の例は、ｄａｐＡにおける栄養要求性改変、例えば、突然変異を使用して本明細書に記載される。ジアミノピメリン酸（Ｄａｐ）は、例えば、グラム陰性細菌の、ある特定の細菌細胞壁の特徴的な構成成分である。ジアミノピメリン酸なしで、細菌は、プロテオグリカンを形成することができず、そのような訳で成長することができない。ＤａｐＡは哺乳動物細胞によって産生されず、したがって、ＤａｐＡの代替供給源は腫瘍において提供されない。そのような訳で、ｄａｐＡ栄養要求性は、腫瘍における細菌の存在のタイミングおよび程度ならびに／または免疫モジュレーターの発現および産生のレベルおよびタイミングをモジュレートおよび微調整するための特に有用な戦略を提示することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示の細菌は、宿主が腫瘍内で産生することができない代謝物の産生のための必須遺伝子において突然変異を含む。一部の実施形態では、栄養要求性突然変異は、当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の細菌細胞壁の産生および維持に必須の遺伝子に存在するか、または細菌に特有であり、哺乳動物細胞に存在しない別の構造に必須の遺伝子における突然変異である。一部の実施形態では、このような栄養要求性突然変異を含む細菌は、栄養要求性突然変異を有さない同じサブタイプの細菌よりも実質的に少ない程度まで、増殖し腫瘍にコロニー形成することが可能である。細菌成長（およびエフェクターレベルの程度）の制御は、本明細書に記載の代謝物または化学的誘導性プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の調節戦略とさらに組み合わせることができる。
非限定的な例では、対象に当初注射された数よりも少数の細菌が、２４時間および７２時間後に検出される。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約１から２ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約２から３ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約３から４ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約４から５ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後２４時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約５から６ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約１から２ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後の７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約２から３ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約３から４ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約４から５ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射後７２時間に検出されるＣＦＵは、投与時よりも少なくとも約５から６ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、ＣＦＵは、注射後のより遅い時点、例えば、少なくとも１週間後、少なくとも２週間後またはそれよりも後、少なくとも１カ月後、少なくとも２カ月後またはそれよりも後で測定することができる。
一部の実施形態では、本開示の細菌は、ｄａｐＡにおいて、栄養要求性改変、例えば突然変異を含む。ｔｒｐＥは、本明細書に記載の別の栄養要求性突然変異である。この突然変異を有する細菌は、トリプトファンを産生することができない。一部の実施形態では、細菌は、１つの必須遺伝子において栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、２つの必須遺伝子に栄養要求性突然変異を含む（二重栄養要求性）。一部の実施形態では、細菌は、３つまたはそれより多い必須遺伝子において栄養要求性突然変異を含む。
一部の実施形態では、細菌は、ｄａｐＡおよびｔｈｙＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｄａｐＡおよびｕｒａＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｄａｐＡ、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。
一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥおよびｔｈｙＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥおよびｄａｐＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥおよびｕｒａＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥ、ｄａｐＡおよびｔｈｙＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥ、ｄａｐＡおよびｕｒａＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥ、ｄａｐＡ、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡにおいて、栄養要求性突然変異を含む。
別の非限定的な例では、条件付き栄養要求株を生成することができる。ｄａｐＡまたはｔｈｙＡの染色体コピーがノックアウトされる。ｔｈｙＡまたはｄａｐＡの別のコピーが、例えば、低酸素プロモーターの制御下で導入される。嫌気的条件下で、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡ（場合によっては）が発現され、株は、ｄａｐまたはチミジンの非存在下で成長することができる。好気的条件下で、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡ発現は打ち切られ、株は、ｄａｐまたはチミジンの非存在下で成長することができない。このような戦略を用いて、嫌気的条件、例えば、消化管または腫瘍微小環境の条件下での細菌の生存を可能にするが、好気的条件下での生存を防止することもできる。
一部の実施形態では、本開示の細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ成長する、１つまたは複数の必須遺伝子における突然変異を有する合成栄養要求株である（その内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｌｏｐｅｚ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ ｗｉｔｈ Ｌｉｇａｎｄ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ａ ＢＬ２１（ＤＥ３ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｓｔｒａｉｎ， ”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５） ＤＯＩ： １０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５を参照されたい）。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
免疫モジュレーター
腫瘍溶解および自然免疫応答の活性化
ある特定の実施形態では、本開示の免疫モジュレーターは、自然抗腫瘍免疫応答を生じる。ある特定の実施形態では、免疫モジュレーターは、局所抗腫瘍免疫応答を生じる。一部の態様では、免疫モジュレーターは、遠位がん細胞に対する全身抗腫瘍免疫を活性化することができる。ある特定の実施形態では、免疫モジュレーターは、全身または適応抗腫瘍免疫応答を生じる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、長期免疫学的記憶をもたらす。好適な免疫モジュレーター、例えば免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーの例は、本明細書に記載されている。
他の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターは、微生物と組み合わせて投与することができる。あるいは、１つまたは複数の第１の免疫モジュレーターは、微生物および１つまたは複数の第２の免疫モジュレーターと組み合わせて投与することができる。
腫瘍微小環境に見られる多くの免疫細胞は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現し、この受容体は、炎症促進性シグナル伝達経路の活性化、食細胞応答（マクロファージ、好中球および樹状細胞）の刺激または分泌タンパク質としての微生物との結合により、自然免疫応答において重要な役割を果たす。ＰＲＲは、以下の２つのクラスの分子：微生物病原体に関連する（ＰＡＭＰ）と、細胞損傷、死滅ストレス、または組織傷害中に放出される細胞構成成分に関連する、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）とを認識する。ＰＡＭＰは、各病原体に特有であり、病原体の生存に必要とされる必須の分子構造、例えば、細菌細胞壁分子（例えば、リポタンパク質）、ウイルスカプシドタンパク質、ならびにウイルスおよび細菌のＤＮＡである。ＰＲＲは、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、および原虫を含む、種々の微生物病原体を特定することができる。ＰＲＲは、主として、自然免疫系の細胞、例えば、抗原提示マクロファージおよび樹状細胞によって発現されるが、他の細胞（免疫細胞と非免疫細胞の両方）によって発現されることもあり、細胞表面に局在して細胞外病原体を検出するか、またはエンドソームおよび細胞基質内に局在し、そこで細胞内に侵入するウイルスを検出する。
ＰＲＲの例としては、感染病原体を検出する細胞外ドメインを有する１型膜貫通受容体である、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が挙げられる。ＴＬＲ１、２、４、および６は、細菌脂質を認識し、ＴＬＲ３、７および８は、ウイルスＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は、細菌ＤＮＡを認識し、ＴＬＲ５および１０は、細菌または寄生虫タンパク質を認識する。ＰＲＲの他の例としては、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、例えば、群Ｉのマンノース受容体および群ＩＩのアシアロ糖タンパク質受容体、細胞質（細胞内）ＰＲＲ、ヌクレオチドオリゴマー化（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、例えば、ＮＯＤ１およびＮＯＤ２、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－１）様受容体（ＲＬＲ）、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、およびＤＤＸ３、ならびに分泌ＰＲＲ、例えば、コレクチン、ペントラキシン、フィコリン、脂質トランスフェラーゼ、ペプチドグリカン認識タンパク質（ＰＧＲ）およびロイシンリッチリピート受容体（ＬＲＲ）が挙げられる。
ＰＲＲは、共刺激分子および炎症促進性サイトカイン、例えば、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＬ－６、ＴＮＦ、およびＩＬ－１２の産生を刺激する、ＮＦ－カッパＢ経路などの、シグナル伝達経路の活性化を開始し、この機序は、感染性病原体に対して開始される炎症および免疫応答の活性化の一因となる。このような応答は、適応免疫応答に関与する腫瘍微小環境に存在する免疫細胞（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、Ｂ細胞、ＤＣ、ＴＡＭ、および他の骨髄系由来サプレッサー細胞）の活性化を誘発する。最近のエビデンスは、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰによって活性化される免疫機序が、腫瘍細胞に対する免疫応答の活性化においても、役割を果たすことを示す（ＬｅＭｅｒｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃ Ｒｅｓ， ７３：４６２９－４０（２０１３）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １１９：３５５－６３（２０１２））。
別のＰＲＲサブファミリーは、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）であり、これは、ウイルス感染時の二本鎖ウイルスＲＮＡのセンサーであると考えられており、腫瘍内免疫刺激の標的とされ得る。刺激されると、例えば、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内に送達されると、ＲＬＲは、宿主細胞によるＩ型ＩＦＮの放出を誘発し、アポトーシスによるその死滅をもたらす。このようなサイトカインおよび腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の放出は、抗腫瘍免疫応答の活性化ももたらす。ＲＬＲがすべての腫瘍型において内在的に発現されることを考えると、ＲＬＲは、普遍的な免疫原性促進性治療標的であり、腫瘍溶解性ウイルスの局所送達により生成される免疫応答に特に関連性がある。
一部の態様では、細菌シャシーそれ自体が、ＰＲＲ受容体、例えば、ＴＬＲまたはＲＩＧＩのうちの１つまたは複数を活性化し、自然免疫応答を刺激することができる。
一部の実施形態では、細菌は腫瘍内投与され、５－ＦＣは全身投与される。一部の実施形態では、細菌と５－ＦＣとの両方が全身投与される。
これらの組合せの実施形態のいずれかでは、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、またはその両方において、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれかでは、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージにおいて、ファージの改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれかでは、細菌は、１つまたは複数の抗生物質耐性サーキットをさらに含み得る。
ファゴサイトーシス回避の阻害－ＣＤ４７－ＳＩＲＰα経路
がんには、腫瘍進行を促進するために、プログラム細胞死およびプログラム細胞除去の一部として誘導された内在性の「私を食べて（ｅａｔ ｍｅ）」シグナルの回避を可能にするように「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルを上方調節する能力がある。
ＣＤ４７は、細胞遊走ならびにＴ細胞および樹状細胞活性化に関与する細胞表面分子である。加えて、ＣＤ４７は、チロシンホスファターゼ活性化および貧食シナプスの膜直下集合部位でのミオシン蓄積の阻害につながる、食細胞上に発現されるシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）のライゲーションによって、ファゴサイトーシスのインヒビターとして機能する。結果として、ＣＤ４７は、「私を食べないでシグナル」を伝達する。ＣＤ４７の喪失は、加齢および損傷細胞の恒常的ファゴサイトーシスをもたらす。
腫瘍がファゴサイトーシスの回避によって自然免疫系を回避することを可能にする、ＣＤ４７発現レベルの上昇が、複数のヒト腫瘍型で観察される。このプロセスは、腫瘍細胞上のＣＤ４７が食細胞上のＳＩＲＰαと結合し、よって、ファゴサイトーシスの阻害および腫瘍生存を促進することによって起こる。
抗ＣＤ４７抗体は、多くの異なるヒトのがんに対する前臨床活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏとマウス異種移植モデルとの両方において実証している（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１２ Ａｐｒ； ２４（２）： ２２５－２３２． Ｔｈｅ ＣＤ４７－ＳＩＲＰα Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、およびその中の参考文献）。ＣＤ４７に加えて、治療戦略としてＳＩＲＰαを標的とすることもでき、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与された抗ＳＩＲＰα抗体は、マクロファージによる腫瘍細胞のファゴサイトーシスを引き起こした（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。
第３のアプローチでは、ヒトＳＩＲＰαの単一の１４ｋＤａのＣＤ４７結合ドメイン（膜貫通部分を有さない可溶性形態）をヒトＣＤ４７に対する競合的アンタゴニストとして使用する、ＣＤ４７標的療法が開発されている（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰα ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３ Ｊｕｌ ５； ３４１（６１４１）： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３８８５６に記載の通りであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。野生型ＳＩＲＰαはＣＤ４７に対して比較的低い親和性を示したため、突然変異ＳＩＲＰαが酵母表面提示によるｉｎ ｖｉｔｒｏ進化によって生成され、それらは、ＣＤ４７の強力な結合剤およびアンタゴニストとして作用することが示された。これらのバリアントは、ＣＶ１（コンセンサスバリアント１）および高親和性バリアントＦＤ６、ならびにこれらのバリアントのＦｃ融合タンパク質を含む。 親和性増加をもたらすアミノ酸変化は、ヒトＳＩＲＰαのｄ１ドメインに位置する。ＳＩＲＰαバリアントの非限定的な例は、ＷＯ／２０１３／１０９７５２にも記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターはＣＤ４７を阻害するおよび／またはＳＩＲＰαを阻害するおよび／またはマクロファージ上に発現されたＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を阻害もしくは防止する。例えば、免疫モジュレーターは、ＣＤ４７に対する抗体および／またはＳＩＲＰαに対する抗体、例えば、ＣＤ４７に対する単鎖抗体および／またはＳＩＲＰαに対する単鎖抗体であってもよい。別の非限定的な例では、免疫モジュレーターは、ＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインを含む競合的アンタゴニストポリペプチドであってもよい。このような競合的アンタゴニストポリペプチドは、ＣＤ４７の競合的結合によって機能して、ＣＤ４７の、マクロファージ上に発現されたＳＩＲＰαとの相互作用を防止することができる。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインの野生型形態であってもよい。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインの突然変異またはバリアント形態であってもよい。一部の実施形態では、バリアント形態は、ＣＶ１ ＳＩＲＰαバリアントである。一部の実施形態では、バリアント形態は、ＦＤ６バリアントである。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαバリアントは、Ｗｅｉｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．、および／または国際特許出願公開ＷＯ／２０１３／１０９７５２に記載されるバリアントである。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、安定化ポリペプチドと融合したＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインまたはそのバリアントであってもよい。非限定的な例では、野生型ＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインポリペプチドに融合した安定化ポリペプチドは、Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、野生型ＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインポリペプチドに融合した安定化ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分である。一部の実施形態では、野生型ＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインポリペプチドに融合した安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４のＦｃ部分である。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、安定化ポリペプチドに融合したＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインの突然変異またはバリアント形態であってもよい。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドに融合したバリアント形態は、ＣＶ１ ＳＩＲＰαバリアントである。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドに融合したバリアント形態は、Ｆ６バリアントである。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドに融合したＳＩＲＰαバリアントは、Ｗｅｉｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．、および／または国際特許出願公開ＷＯ／２０１３／１０９７５２に記載されるバリアントである。非限定的な例では、バリアントＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインポリペプチドに融合した安定化ポリペプチドは、Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、バリアントＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインポリペプチドに融合した安定化ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分である。一部の実施形態では、バリアントＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインポリペプチドに融合した安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４のＦｃ部分である。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体であってもよい。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、競合的アンタゴニストＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴまたはＣＤ４７親和性を改善するために突然変異した）であってもよい。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体であってもよい。これらの実施形態のいずれかでは、微生物は、Ｆｃ媒介性機能、例えばＡＤＣＣ、ならびに／またはＭ－ＣＳＦおよび／もしくはＧＭ－ＣＳＦを刺激することが可能であり、その結果、ファゴサイトーシス阻害を遮断する、１つまたは複数の免疫モジュレーターと共に投与することもできる。
免疫モジュレーターは、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用の阻害または防止に関する、任意の好適な抗ＣＤ４７抗体、抗ＳＩＲＰα抗体または競合的ＳＩＲＰα ＣＤ４７結合ドメインポリペプチド（野生型またはＣＤ４７結合親和性が改善された突然変異バリアント）であってもよい。
これらの実施形態のいずれかでは、ＳＩＲＰαもしくはそのバリアントまたは抗ＣＤ４７ポリペプチドを、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストと組み合わせることができる。
これらの組合せの実施形態のいずれかでは、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、またはその両方において、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含んでもよい。これらの実施形態のいずれかでは、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージにおいて、ファージの改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含み得る。
抗原提示細胞の活性化
ＳＴＩＮＧアゴニスト
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質は、ＤＮＡウイルス、細菌、および腫瘍由来のＤＮＡに由来する細胞質性核酸によって誘発されるシグナル伝達の重要なメディエーターであることが示された。ＳＴＩＮＧが、Ｉ型インターフェロン産生を誘導する能力は、抗腫瘍免疫応答の状況下での研究を導き、結果として、ＳＴＩＮＧは、抗腫瘍免疫療法における強力な標的となる可能性があることが判明した。ＳＴＩＮＧ活性化によって引き起こされる抗腫瘍効果の大部分は、ＡＰＣによるＩＦＮ－βの産生およびこれらの細胞による抗原提示の改善に依存する可能性があり、このことは、腫瘍関連抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを促進する。しかし、ＳＴＩＮＧタンパク質はまた、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）およびがん細胞それ自体を含む、様々な細胞型でも広範に発現され、それらにおいて、経路の機能は依然として十分に特徴付けされていない（Ｓｏｋｏｌｏｗｓｋａ， Ｏ． ＆ Ｎｏｗｉｓ， Ｄ； ＳＴＩＮＧ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ： Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｏｒ Ｎｏｔ？； Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ； Ａｒｃｈ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｅｘｐ．（２０１８） ６６： １２５）。
膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）、インターフェロン調節因子３活性化メディエーター（ＭＩＴＡ）、ＭＰＹＳまたは小胞体インターフェロン刺激因子（ＥＲＩＳ）としても公知の、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、主としてマクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞、内皮細胞、ならびにある特定の線維芽細胞および上皮細胞において発現される二量体タンパク質である。ＳＴＩＮＧは、自然免疫応答において重要な役割を果たす－ＳＴＩＮＧを欠くマウスは、種々の微小生物への曝露後に生存可能であるが、致死性感染に罹りやすい。ＳＴＩＮＧは、サイトゾルサイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、例えば、ｃＧＡＭＰおよび細菌の二次メッセンジャーｃ－ｄｉＧＭＰおよびｃ－ジ－ＡＭＰの形態の二次メッセンジャーに対するサイトゾル受容体として機能する。ＣＤＮによって刺激されると、ＳＴＩＮＧに立体構造の変化が生じる。ＳＴＩＮＧは、ＥＲからゴルジ体へと移動し、そのカルボキシ末端が遊離する。これは、ＴＢＫ１（ＴＡＮＫ結合キナーゼ１）／ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）、ＮＦ－κＢ、およびＳＴＡＴ６シグナル伝達経路の活性化をもたらし、それによって、Ｉ型インターフェロンおよび炎症促進性サイトカイン応答が促進される。ＣＤＮは、正規のサイクリックｄｉ－ＧＭＰ（ｃ［Ｇ（３０－５０）ｐＧ（３０－５０）ｐ］）またはサイクリックジ－ＡＭＰまたはサイクリックＧＡＭＰ（ｃＧＭＰ－ＡＭＰ）を含む（Ｂａｒｂｅｒ， ＳＴＩＮＧ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ； Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１４ Ｆｅｂ；３５（２）：８８－９３）。
ＣＤＮは、外因的に（すなわち、細菌によって）および／または内在的に（すなわち、ｄｓＤＮＡへの曝露時に宿主酵素によって宿主内で）産生され得る。ＳＴＩＮＧは、様々な細菌の二次メッセンジャー分子であるサイクリックジグアニル酸一リン酸（ｃ－ｄｉＧＭＰ）およびサイクリックジアデニル酸一リン酸（ｃ－ｄｉＡＭＰ）を認識することができ、この認識によって、自然免疫シグナル伝達応答が誘発される（Ｍａ ｅｔ ａｌ．， ． Ｔｈｅ ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ； Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ １９， Ｆｅｂｒｕａｒｙ １０， ２０１６）。加えて、サイクリックＧＭＰＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）はまた、ＳＴＩＮＧに結合し、ＩＲＦ３の不活性化およびβ－インターフェロン産生をもたらし得る。Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅによって産生される３’５’－３’５’ｃＧＡＭＰ（３’３’ｃＧＡＭＰ）と後生動物の二次メッセンジャーサイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’５’）］（２’３’ ｃＧＡＭＰ）とはいずれも、ＳＴＩＮＧ経路を通じて自然免疫応答を活性化することができる（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＳＴＩＮＧ Ｃａｎ Ａｆｆｅｃｔ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｃｙｃｌｉｃ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； ＰＬＯＳ Ｏｎｅ（２０１３）． ８（１０）ｅ７７８４６、その中の参考文献）。細菌および後生動物（例えば、ヒト）のｃ－ジ－ＧＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）は、ＧＴＰおよびＡＴＰを利用して、ＳＴＩＮＧ活性化の可能なｃＧＡＭＰを生成する。２つの正規の３０～５０ホスホジエステル連結を有する原核生物のＣＤＮとは対照的に、ヒトのｃＧＡＳ生成物は、特有の２０～５０結合を含有し、その結果、２’，３’ｃＧＡＭＰとして表される混合連結型のサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ分子をもたらす（Ｋｒａｎｚｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｃｉｅｎｔ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ２’，３’ ｃＧＡＭＰ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５９， ８９１－９０３， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １７， ２０１５、およびその中の参考文献に記載される）。細菌Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅは、ｃＧＡＳの構造ホモログであるＤｎｃＶと呼ばれる酵素をコードし、正規の３’－５’結合を有する関連二次メッセンジャー（３’，３’ｃＧＡＭＰ）を合成する。
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路の構成成分は、免疫系による腫瘍細胞の検出に重要な役割を果たす。前臨床研究では、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、天然に存在するまたは合理的に設計された合成誘導体は、攻撃的な抗腫瘍応答を促進することができる。例えば、ＳＴＩＮＧＶＡＸ形態の放射線照射ＧＭ－ＣＳＦ分泌全細胞ワクチンと合剤にされた場合、合成ＣＤＮは、抗腫瘍有効性を増大させ、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＳＴＩＮＧＶＡＸは、コロニー形成腫瘍の退縮を誘導した（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．， ＳＴＩＮＧ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｃａｎ ｃｕｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ； Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１５ Ａｐｒ １５； ７（２８３）： ２８３ｒａ５２）。別の例では、Ｓｍｉｔｈらは、ＳＴＩＮＧアゴニストが、免疫応答を刺激して、養子移入されたリンパ球によって認識されない腫瘍細胞を排除することによってＣＡＲ Ｔ療法を増強し、それによって、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性を向上させることができることを示す研究を行った（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＳＴＩＮＧ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｃａｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒｓ； Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１７ Ｊｕｎ １；１２７（６）：２１７６－２１９１）。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＳＴＩＮＧアゴニストである。ＳＴＩＮＧアゴニストの非限定的な例としては、３’３’ｃＧＡＭＰ、２’３’ｃＧＡＭＰ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、２’２’－ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（２’，５’）ｐ］）、２’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］）、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ／Ｓｐ）、３’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］）、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ｄｉＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリックジアデニル酸一リン酸Ｔｈ１／Ｔｈ２応答）、２’３’－ｃ－ｄｉＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ、Ｒｐ）（ｃ－ｄｉＡＭＰのビスホスホロチオエートアナログ、Ｒｐ異性体）、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ、Ｒｐ）ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）、ｃ－ｄｉＧＭＰ、ｃ－ｄｉＧＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、およびｃ－ｄｉ－ＩＭＰが挙げられる。
ＣＤ４０
ＣＤ４０は、抗原提示細胞上に見られる共刺激タンパク質であり、それらの活性化のために必要とされる。ヘルパーＴ細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）のＣＤ４０への結合によって、抗原提示細胞が活性化され、種々の下流免疫刺激作用が誘導される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ４０のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、およびＣＤ４０Ｌポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。
ＧＭＣＳＦ
コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても公知の、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞および線維芽細胞によって分泌される単量体糖タンパク質である。ＧＭ－ＣＳＦは、免疫系の発達を助長しかつ感染に対する防御を促進するサイトカインとして機能する、白血球成長因子である。例えば、ＧＭ－ＣＳＦは、顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球を産生するように幹細胞を刺激し、単球は、血行路を出て組織に遊走し、そこですぐに成熟して、マクロファージおよび樹状細胞になる。ＧＭ－ＣＳＦは、免疫／炎症カスケードの一部であり、その活性化によって、少数のマクロファージの数が急速に増加され、このプロセスは、感染との闘いにとって重要である。ＧＭ－ＣＳＦは、シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子であるＳＴＡＴ５を介して、またはＳＴＡＴ３（マクロファージを活性化する）を介して、シグナルを伝達する。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは樹状細胞の活性化をモジュレートする。一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＧＭ－ＣＳＦである。
エフェクター免疫細胞（免疫刺激因子）の活性化およびプライミング
サイトカインおよびサイトカイン受容体
ＣＤ４（４）は、免疫細胞、例えば、細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞の表面に見られる糖タンパク質である。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、他の種類の免疫細胞にシグナルを送ることによって、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて、他の免疫細胞を支援するように機能する白血球である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示される場合に活性化される。活性化されると、ヘルパーＴ細胞は分裂し、活性免疫応答を調節または支援するサイトカインを分泌する。ヘルパーＴ細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨ細胞を含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、これらは異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を助長する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、それらの表面でＣＤ８糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。細胞傷害性Ｔ細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と会合している抗原と結合することにより、それらの標的を認識する。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、１つまたは複数のエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞をモジュレートする。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、１つまたは複数のエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の分化を活性化する、刺激する、および／または誘導する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、エフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の分化を活性化する、刺激する、および／または誘導するサイトカインである。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＴＮＦ、およびＩＦＮ－ガンマから選択される。
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、別のサイトカインまたは他の免疫モジュレーション分子に連結されたペプチドを介して融合されている、１つまたは複数のサイトカインを含む融合タンパク質を含む。例としては、以下に限定されないが、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５融合タンパク質が挙げられる。一般に、本明細書に記載のすべてのアゴニストおよびアンタゴニストを、ペプチドリンカーを介して目的の別のポリペプチドと融合させて、それらの機能を改善または変更してもよい。このような融合タンパク質の非限定的な例は、抗体ポリペプチドに作動可能に連結した１つまたは複数のサイトカインポリペプチドを含み、抗体は腫瘍特異的抗原を認識し、それによって、サイトカインを腫瘍と近接させる。
インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、その作用が自然免疫と適応免疫との間の相互接続を生じさせる、サイトカインである。ＩＬ－１２は、活性化樹状細胞、単球、マクロファージ、および好中球、ならびに他の細胞型を含む、いくつかの免疫細胞によって分泌される。ＩＬ－１２は、ｐ３５およびｐ４０サブユニットからなるヘテロ二量体タンパク質（ＩＬ－１２－ｐ７０；ＩＬ－１２－ｐ３５／ｐ４０）であり、ＩＬ－１２Ｒ－β１およびＩＬ－１２Ｒ－β２という２つのサブユニットで構成されている受容体に結合する。ＩＬ－１２受容体は、ＮＫ細胞、Ｔ、およびＢリンパ球を含む、いくつかの免疫細胞上に、構成的または誘導的に発現される。ＩＬ－１２の結合の際に、受容体は活性化され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介した下流のシグナル伝達が開始され、結果としてＩＬ－１２に対する細胞応答が生じる。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２作用の最も強力なメディエーターであるＩＦＮ－γのＮＫ細胞およびＴ細胞からの産生を増加させることによって作用する。加えて、ＩＬ－１２は、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の成長および細胞傷害性を促進し、ＣＤ４＋Ｔｈ０細胞の分化をＴｈ１表現型にシフトさせる。さらに、ＩＬ－１２は、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、およびＩｇＧの誘導およびＢ細胞からのＩｇＥ産生の抑制を増強する。加えて、ＩＬ－１２はまた、骨髄系由来サプレッサー細胞の再プログラミングにおいて役割を果たし、Ｔｈ１型免疫応答を指示し、ＭＨＣクラスＩ分子の発現の増加を助ける（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ Ｍａｒｃｈ ２０１５ ３； ２１９に概説されている）。
よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＩＬ－１２である。一部の実施形態では、ＩＬ－１２は、ｐ３５およびｐ４０サブユニットを含む。一部の実施形態では、インターロイキン－１２モノマーサブユニット（ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０））は、リンカーによって共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーはセリングリシンリッチリンカーである。一実施形態では、「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」（配列番号１２４７）のアミノ酸数１５のリンカーが、強制二量体ヒトＩＬ－１２（ｄｉＩＬ－１２）融合タンパク質を産生するように、２つの単量体サブユニット（ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０））の間に挿入されている。
ＩＬ－１５は、自然免疫系と適応免疫系の両方の恒常性における多面的機能を示し、３つのサブユニットから構成されるヘテロ三量体受容体であるＩＬ－１５受容体に結合する。アルファサブユニットはＩＬ－１５に対して特異的であるが、ベータ（ＣＤ１２２）およびガンマ（ＣＤ１３２）サブユニットはＩＬ－２受容体と共有され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を通るシグナル伝達の共有を可能にする。ＩＬ－１５は、樹状細胞、単球およびマクロファージを含むいくつかの細胞型によって産生される。同じ細胞内で産生されたＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５との同時発現によって、ＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒαへの細胞内結合が可能となり、次いで、複合体として細胞表面にトラフィキングされる。次いで、細胞表面で、これらの細胞のＩＬ－１５Ｒαが、ＩＬ－１５を発現しないＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫ－Ｔ細胞のＩＬ－１５Ｒβ－γｃに、ＩＬ－１５をトランス提示することができ、これにより、いわゆる免疫学的シナプスの形成が誘導される。マウスおよびヒトのＩＬ－１５Ｒαは両方とも、結合した膜中に存在し、可溶性形態でも存在する。可溶性ＩＬ－１５Ｒα（ｓＩＬ－１５Ｒα）は、膜貫通受容体からタンパク質分解的切断によって構成的に生成される。
ＩＬ－１５は、特定のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の集団において、リンパ球発生および自然免疫細胞の末梢維持ならびにＴ細胞、特に、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の免疫学的記憶にとって非常に重要である。ＩＬ－２とは対照的に、ＩＬ－１５はＴｒｅｇの維持を促進せず、さらに、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２により媒介される活性化誘導細胞死からエフェクターＴ細胞を保護することが示されている。
結論として、ＩＬ－１５の送達は、長期にわたる抗腫瘍免疫のための有望な戦略と考えられる。組換えヒトＩＬ－１５のヒトで初めての臨床試験において、ＮＫ細胞の１０倍拡大増殖ならびにγδＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の有意な増加が、処置時に観察された。加えて、サイトカイン－受容体融合複合体を含有するＩＬ－１５スーパーアゴニストが開発され、応答長を増大させることが評価されている。これらは、Ｌ－１５ Ｎ７２Ｄスーパーアゴニスト／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ；ＡＬＴ－８０３）を含む（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ ＩＬ－１５ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－ １５ＲαＳｕ－Ｆｃ； ＡＬＴ－８０３） ｍａｒｋｅｄｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＫ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｒｉｎｅ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）。
よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＩＬ－１５である。
ＩＬ－１５の生体活性は、ＩＬ－１５を融合タンパク質ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃと前もって会合させることによって、または細胞会合ＩＬ－１５ＲαによるＩＬ－１５のトランス提示を模倣するためのＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの直接融合（ハイパーＩＬ－１５）によって大いに改善される。単独でまたはＩＬ－１５Ｒαとの複合体としてのいずれかで投与されたＩＬ－１５は、動物モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ａｎｄ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ； Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２０１４； ３（１１）： ｅ９６３４０９、およびその中の参考文献）。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＩＬ－１５である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＩＬ－１５Ｒａである。
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγまたはＩＩ型インターフェロン）は、ウイルス、一部の細菌および原虫への感染に対する自然または適応免疫にとって重要なサイトカインである。ＩＦＮγは、マクロファージを活性化し、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の発現を誘導する。ＩＦＮγは、ウイルス複製を阻害することができ、免疫系において免疫刺激および免疫モジュレーション効果を有する。ＩＦＮγは、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞により自然免疫応答の一部として、ならびにＣＤ４ Ｔｈ１およびＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞により優先的に産生される。抗原特異的免疫が発生すると、ＩＦＮγは、ヘルパーＴ細胞（特に、Ｔｈ１細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞）およびＮＫ細胞のみによって分泌される。ＩＦＮγは、多数の免疫刺激効果を有し、ＮＫ細胞活性の促進、マクロファージの抗原提示およびリソソーム活性の増加、誘導性一酸化窒素合成酵素ｉＮＯＳの活性化、活性化血漿Ｂ細胞からのある特定のＩｇＧの産生、細胞免疫をもたらすＴｈ１分化の促進を含む免疫系におけるいくつかの異なる役割を果たす。ＩＦＮγはまた、正常細胞の、抗原提示細胞上でのクラスＩ ＭＨＣ分子およびクラスＩＩ ＭＨＣの発現を増加させ、白血球遊走に関連する接着および結合を促進し、細胞内生物を死滅させる際により強力になるようにマクロファージを活性化させることによる肉芽腫形成に関与する。よって、一実施形態では、免疫モジュレーターはＩＦＮ－ガンマである。
インターロイキン－１８（ＩＬ－１８、インターフェロン－ガンマ誘導因子としても公知である）は、ＩＬ－１スーパーファミリーに属する炎症促進性サイトカインであり、マクロファージおよび他の細胞により産生される。ＩＬ－１８は、インターロイキン－１８受容体と結合し、ＩＬ－１２と一緒に、リポ多糖（ＬＰＳ）のような微小生物の産物による感染後に細胞媒介免疫を誘導する。ＩＬ－１８で刺激されると、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびある特定の１型ヘルパーＴ細胞は、マクロファージおよび他の免疫細胞の活性化において役割を果たすインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）またはＩＩ型インターフェロンを放出する。ＩＬ－１８は、重度の炎症反応も誘導することができる。よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＩＬ－１８である。
インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、高い頻度でリンパ球）の活性化を調節するサイトカインである。ＩＬ－２は、微小生物への感染に対する、および外来のもの（「非自己」）と「自己」とを区別する際の、身体の自然応答の一部である。ＩＬ－２は、リンパ球により発現されるＩＬ－２受容体と結合することによってその効果を媒介する。ＩＬ－２は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１も含むサイトカインファミリーのメンバーである。ＩＬ－２は、アルファ、ベータおよびガンマサブユニットからなる複合体であるＩＬ－２受容体を介してシグナルを伝達する。ガンマサブユニットは、このサイトカイン受容体ファミリーのすべてのメンバーによって共有される。ＩＬ－２は、最初のＴ細胞が抗原によって刺激された場合に、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞への分化を促進する。抗原選択Ｔ細胞クローンの数および機能の拡大に依存する、Ｔ細胞の免疫学的記憶の発生におけるその役割によって、ＩＬ－２は細胞媒介免疫においても重要な役割を有する。ＩＬ－２は、食品医薬局（ＦＤＡ）によって、および欧州数カ国で、がん（悪性黒色腫、腎細胞がん）の処置について認可されている。ＩＬ－２は、黒色腫転移を処置するためにも使用され、高い完全奏功率を有する。よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＩＬ－２である。
インターロイキン－２１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含む、免疫系のある特定の細胞に対して強力な調節効果を有するサイトカインである。ＩＬ－２１は、そのこれらの細胞における細胞分裂／増殖を誘導する。ＩＬ－２１は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において発現されるが、ほとんどの他の組織では発現されない。加えて、ＩＬ－２１発現は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２およびＴｈ１７サブセットでは上方調節される。ＩＬ－２１は、これらの細胞の機能を調節するＮＫ Ｔ細胞においても発現される。ＩＬ－２１と結合した場合、ＩＬ－２１受容体は、その標的遺伝子を活性化するためにＪａｋ１とＪａｋ３とＳＴＡＴ３ホモ二量体とを利用する、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路を介して作用する。ＩＬ－２１は、ＩＬ－２産生能力を有する特有のＣＤ２８＋ＣＤ１２７ｈｉ ＣＤ４５ＲＯ＋表現型を有するメモリー型ＣＴＬの集団の濃縮によってヒトＴ細胞の分化プログラミングをモジュレートすることが示されている。ＩＬ－２１は、永続的腫瘍免疫を獲得するための、ＣＤ８＋細胞応答の継続および増加による抗腫瘍効果も有する。ＩＬ－２１は、転移性黒色腫（ＭＭ）および腎細胞癌（ＲＣＣ）患者における第１相臨床試験に関して認可されている。よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＩＬ－２１である。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（カケクチンまたはＴＮＦアルファとしても公知）は、ある特定の腫瘍細胞系の細胞溶解を引き起こすことができ、ある特定の条件下で細胞増殖を刺激し、細胞分化を誘導することができる、サイトカインである。ＴＮＦは、全身性炎症に関与し、急性相反応を構成するサイトカインのうちの１つである。ＴＮＦは、主として活性化マクロファージによって産生されるが、多くの他の細胞型、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞、好中球、マスト細胞、好酸球、およびニューロンによって産生され得る。ＴＮＦの主な役割は、免疫細胞の調節にある。
ＴＮＦは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ受容体１型；ＣＤ１２０ａ；ｐ５５／６０）およびＴＮＦＲ２（ＴＮＦ受容体２型；ＣＤ１２０ｂ；ｐ７５／８０）という、２つの受容体に結合することができる。ＴＮＦＲ１は、ほとんどの組織で発現され、ＴＮＦの膜結合形態と可溶性三量体形態の両方によって完全に活性化され得るが、ＴＮＦＲ２は、免疫系の細胞にしか見られず、ＴＮＦホモ三量体の膜結合形態に応答する。その受容体と結合すると、ＴＮＦは、ＮＦ－κＢおよびＭＡＰＫ経路を活性化することができ、これらの経路は、多数のタンパク質の転写を媒介し、ならびに炎症応答に関与する経路を含む、細胞分化および増殖に関与するいくつかの経路を媒介する。ＴＮＦは、細胞アポトーシスを誘導する経路も調節する。よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターは樹状細胞の活性化をモジュレートする。一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＴＮＦである。
一部の実施形態では、ＴＮＦは、樹状細胞および／またはマクロファージにおけるＣＣＲ７の発現を増加させることが可能である。
一部の実施形態では、ＴＮＦαは、例えば、ＴＮＦ受容体を有する細胞において、ＮＦｋａｐｐａＢ経路を活性化することが可能である。一部の実施形態では、ＴＮＦαは、ＩｋａｐｐａＢａｌｐｈａ分解を誘導することが可能である。一部の実施形態では、ＴＮＦαは、ＩｋａｐｐａＢａｌｐｈａ分解を引き起こす。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、記載されたＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＴＮＦ、およびＩＦＮ－ガンマのうちのいずれか１つまたは複数であってもよい。
これらの組合せの実施形態のいずれかでは、免疫モジュレーターを投与された細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、またはその両方において、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれかでは、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージにおいて、ファージの改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含み得る。
共刺激分子
グルココルチコイドに誘導される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）関連受容体（ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲ１８）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦＲスーパーファミリー．１のメンバーであるＧＩＴＲは、ＣＤ２５＋ ＣＤ４＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞において高レベルで優先的に発現されるが、従来のＣＤ２５－ ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞においても低いレベルで構成的に発現され、活性化後に急速に上方調節される。アゴニスト抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ、ＤＴＡ－１）２，６，７またはＧＩＴＲＬトランスフェクタントおよび可溶性ＧＩＴＲＬ５，８，９を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、ＧＩＴＲ－ＧＩＴＲＬ経路が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（およびそれらの対抗するエフェクター機能にもかかわらず、Ｔｒｅｇ細胞）の活性化をもたらす、正の共刺激シグナルを誘導することが示されている（Ｐｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００９） Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｅｃｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ（ＧＩＴＲＬ） ｏｎ ｔｕｍｏｒｓ； Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １２７， ４８９－４９９、およびその中の参考文献）。一部の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、ＧＩＴＲのアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体断片、ＧＩＴＲリガンドポリペプチド（ＧＩＴＲＬ）、およびＧＩＴＲＬポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。
よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその断片、またはＧＩＴＲリガンドポリペプチドもしくはその断片である。よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその断片、またはＧＩＴＲリガンドポリペプチドもしくはその断片である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその断片、またはＧＩＴＲリガンドポリペプチドもしくはその断片である。
ＧＩＴＲは、活性化Ｔ細胞において、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞生存を促進するように機能するため、ＧＩＴＲアゴニズムは、Ｔ細胞応答を開始することが可能な第２のモダリティ（免疫イニシエーター）と組み合わせることが有利な場合があり、これには、以下に限定されないが、自然免疫刺激因子、例えば、本明細書に記載されるＳＴＩＮＧアゴニストが含まれる。
ＣＤ１３７または４－１ＢＢは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通糖タンパク質であり、これは、活性化Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞）上で発現され、共刺激活性を有する。ＣＤ１３７または４－１ＢＢは、Ｔ細胞増殖、ＩＬ－２分泌生存および細胞溶解活性を増強することが示されている。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体もしくはその断片、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチドもしくはその断片から選択されるアゴニストである。
よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体もしくはその断片、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチドもしくはその断片である。
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）は、活性化されたマウスおよびヒトのＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現される。これは、ＴＮＦＲファミリーのメンバーであり、共刺激および抗アポトーシス機能を媒介し、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞生存を促進する。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞刺激に応じて、刺激後１２時間から最大５日間、上方調節されることが報告されている（Ｗｏｌｆｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１３７ ｐｅｒｍｉｔｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ； ＢＬＯＯＤ， １ ＪＵＬＹ ２００７ ＶＯＬ． １１０， ＮＵＭＢＥＲ １、およびその中の参考文献）。したがって、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）アゴニズムは、Ｔ細胞応答を開始することが可能な第２のモダリティ（免疫イニシエーター）と組み合わせることが有利である場合があり、これには、以下に限定されないが、自然免疫刺激因子（免疫イニシエーター）が含まれる。例示的な自然免疫刺激因子（免疫イニシエーター）は、本明細書に記載されている。
ＯＸ４０、またはＣＤ１３４は、Ｔ細胞の生存を保つこと、およびその後にサイトカイン産生を増加させることに関与するＴ細胞受容体である。ＯＸ４０は、生存を増強するその能力に起因して、免疫応答および記憶応答の維持において重要な役割を有する。ＯＸ４０はまた、Ｔｈ１媒介反応およびＴｈ２媒介反応の両方において重大な役割を果たす。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＯＸ４０のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはその断片、またはＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）もしくはその断片から選択されるアゴニストである。
近年、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）リガンドである非メチル化ＣＧ富化オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）と、抗ＯＸ４０抗体との組合せを腫瘍の１つの部位に局所的に注射することにより、局所的にＴ細胞免疫応答が相乗的に誘発され、次いで、身体全体にわたり、遠位部位のがんを攻撃することが見出された（Ｓａｇｉｖ－Ｂａｒｆｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｂｙ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ； Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． １０， ｅａａｎ４４８８（２０１８））。非メチル化ＣＧ富化オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）は、自然免疫系の構成成分であるＴＬＲ９を活性化する。したがって、免疫系の他の活性化機序は、以下に限定されないが、細菌および自然免疫刺激因子（免疫イニシエーター）を含む、アゴニストＯＸ４０抗体と組み合わせて、同様の結果をもたらすことができる。
ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化および生存に必要とされる共刺激シグナルを提供する、Ｔ細胞上で発現されるタンパク質の１つである。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２８のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０（Ｂ７．１）ポリペプチドまたはそのポリペプチド断片、およびＣＤ８６（Ｂ７．２）ポリペプチドまたはそのポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。
ＩＣＯＳは、ＣＤ２８に構造的かつ機能的に関連する誘導性Ｔ細胞共刺激因子である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＩＣＯＳのアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体もしくはその断片、またはＩＣＯＳリガンドポリペプチドもしくはその断片から選択されるアゴニストである。
ＣＤ２２６は、ナチュラルキラー細胞、血小板、単球、およびＴ細胞のサブセット（例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞）の表面で発現される糖タンパク質であり、これは、そのリガンド、ＣＤ１１２およびＣＤ１５５を有する他の細胞との細胞接着を媒介する。とりわけ、ＣＤ２２６は、免疫シナプス形成に関与し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化を誘発する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２２６のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体またはその断片、ＣＤ１１２もしくはＣＤ１５５ポリペプチドまたはその断片から選択されるアゴニストである。
これらの実施形態のいずれかでは、アゴニスト抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよく、異なるアイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含んでもよい。また、抗体は、ＦｃＲ結合、ＦｃＲｎ結合、補体機能、グリコシル化、Ｃ１ｑ結合などの、エフェクター機能；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節を増加または減少させるように改変されている定常領域を含んでもよい。これらの実施形態のいずれかでは、抗体は、単鎖抗体または単鎖抗体断片であってもよい。
これらの組合せの実施形態のいずれかでは、免疫モジュレーターと組み合わせて投与された細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、またはその両方において、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含み得る。これらの実施形態のいずれかでは、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージにおいて、ファージの改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含み得る。
局所免疫抑制の排除（逆転）
腫瘍細胞は、樹状細胞の抗原提示または成熟に干渉するシグナルを生成し、それらの前駆体を、代わりに免疫抑制細胞型に成熟させることによって、破壊を免れることが多い。したがって、腫瘍部位での免疫抑制の開始、促進、および／または維持に関与する免疫モジュレーション分子の活性を防止または阻害する１つまたは複数の免疫モジュレーターの、単独でのまたは１つもしくは複数の他の免疫モジュレーターとの組合せでの局所送達は、治療利益をもたらす。
免疫チェックポイントインヒビター
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫サプレッサー分子のインヒビター、例えば、免疫チェックポイント分子のインヒビターである。阻害される免疫チェックポイント分子は、任意の公知のまたは後に発見される免疫チェックポイント分子または他の免疫サプレッサー分子であってもよい。一部の実施形態では、阻害される免疫チェックポイント分子、または他の免疫サプレッサー分子は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ－１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲから選択される。ある特定の態様では、本開示は、免疫チェックポイント分子または他の免疫サプレッサー分子を阻害する１つまたは複数の免疫モジュレーターと組み合わせた微生物、例えば、細菌を提供する。
一部の実施形態では、組成物は、がん性細胞増殖、腫瘍成長、および／または腫瘍体積を低減することが可能である。一部の実施形態では、細菌は、がんまたは腫瘍細胞を標的とする。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＴＬＡ－４インヒビター、例えばＣＴＬＡ－４を対象とする抗体である。これらの実施形態のいずれかでは、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、単鎖抗ＣＴＬＡ－４抗体であってもよい。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＰＤ－１インヒビター、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を対象とする抗体である。これらの実施形態のいずれかでは、抗ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１抗体は、単鎖抗ＰＤ－１抗体であってもよい。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ－１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲインヒビターから選択されるインヒビター、例えば、列挙された免疫チェックポイント分子または他のサプレッサー分子のいずれかを対象とする抗体である。このようなチェックポイントインヒビター分子の例は、例えば、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、および２０１８年１月１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６９８に記載されており、これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの実施形態のいずれかでは抗体は、単鎖抗体であってもよい。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、例えば、腫瘍内注射によって局所的に投与される。
単鎖抗ＣＴＬＡ－４抗体を構築する際に使用するための例示的な重鎖および軽鎖アミノ酸配列が示され、本明細書に記載されている（例えば、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４）。
単鎖抗ＰＤ－１抗体を構築する際に使用するための例示的な重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４を含む。
免疫代謝および代謝変換因子
トリプトファンおよびキヌレニン
調節性Ｔ細胞、またはＴｒｅｇは、過剰な免疫反応を防止すること、自己抗原に対する寛容を維持すること、および自己免疫を消失させることによって免疫系をモジュレートする、Ｔ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは、他の細胞の免疫応答を抑制し、例えば、侵入してくる生物の排除に成功した後、免疫応答を停止させる。これらの細胞は、一般的に、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方調節する。ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞）を発現するものを含む、調節性Ｔ細胞の異なる亜集団が存在する。Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞応答を減弱させるのに重要であり、したがって、有効な抗腫瘍応答の主な障害の１つ、および抗腫瘍応答の誘導または強化に頼る現行の治療の失敗を示す。よって、ある特定の実施形態では、本開示の細菌は、Ｔｒｅｇを枯渇させるおよび／またはＴｒｅｇの活性化を阻害もしくは遮断する、１つまたは複数の免疫モジュレーターと組み合わせて投与することができる。
トリプトファン（ＴＲＰ）からキヌレニン（ＫＹＮ）への代謝経路は、自然免疫および適応免疫の重要な調節因子として確立されている。インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）およびＴＲＰ－２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＴＤＯ）による必須アミノ酸であるトリプトファンの分解と、結果として生じるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）を活性化するトリプトファン代謝物、例えば、キヌレニンの生成とはいずれも、多くの種類のがんにおいて免疫抑制性微小環境を維持する中心経路である。例えば、キヌレニンのＡＨＲとの結合は、調節性Ｔ細胞表現型（Ｔｒｅｇ）に有利に働くナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の分化の再プログラミングをもたらす一方で、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）産生Ｔｈ（Ｔｈ１７）細胞への分化の抑制をもたらす。アリール水素受容体の活性化は、樹状細胞における免疫寛容性表現型の促進ももたらす。
一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、トリプトファンを産生する、および／またはキヌレニンを分解することによって、Ｔｒｅｇを枯渇させることまたはＴｒｅｇの活性化を阻害もしくは遮断することが可能である。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、トリプトファンを産生するおよび／またはキヌレニンを分解することによって、ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇの比を増大させることが可能である（例えば、ＴｒｅｇよりＣＤ８＋の産生に有利に働く）。
よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターはトリプトファンである。他の実施形態では、免疫モジュレーターはキヌレニン分解酵素である。
一実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数と、少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数と、少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数と、少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数と、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数の配列を含む。別の実施形態では、キヌレニン分解酵素は、配列番号６５から配列番号６７のうちの１つまたは複数の配列からなる。
プリン作動性の系－ＡＴＰ／アデノシン代謝
がん免疫療法の成功に対する重要な障壁は、腫瘍が抗炎症性サイトカインの産生、調節性免疫サブセットの動員、および免疫抑制性代謝物の産生を含む、免疫回避を容易にするいくつかの機序を用いることである。１つのこのような免疫抑制経路は、ＣＤ７３による、強力な免疫抑制分子である細胞外アデノシンの産生である。損傷したまたは瀕死の細胞および細菌により放出される、免疫刺激性細胞外ＡＴＰは、免疫食細胞の動員を促進し、ＮＬＲＰ３インフラマソームの共活性化因子であるＰ２Ｘ７Ｒを活性化し、次いで、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１８などの炎症促進性サイトカインの産生が誘発される。細胞外ＡＴＰのＡＤＰ、ＡＭＰおよびアデノシンへの異化は、ＡＴＰをＡＭＰに加水分解するＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、Ｅ－ＮＴＰＤａｓｅ１）、およびＡＭＰを脱リン酸化してアデノシンにするＣＤ７３（エクト－５’ヌクレオチダーゼ、Ｅｃｔｏ５’ＮＴａｓｅ）によって制御される。よって、ＣＤ３９およびＣＤ７３は協調して作用し、炎症促進性ＡＴＰを免疫抑制性アデノシンに変換する。その免疫調節性の役割の他に、エクトヌクレオチダーゼ経路は、がん細胞の成長、分化、侵襲、遊走、転移、および腫瘍血管新生のモジュレーションに直接寄与する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、腫瘍微小環境から過剰なアデノシンを除去するための手段を含む。多くの細菌は、合成のサルベージ経路によって、ヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの合成環境から低濃度のヌクレオシドを捕捉する。さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、ヌクレオシドを、成長のための唯一の窒素および炭素の供給源として使用することができる（Ｎｅｕｈａｒｄ Ｊ， Ｎｙｇａａｒｄ Ｐ． Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ｐｕｒｉｎｅｓ ａｎｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ． Ｉｎ： Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ＦＣ， Ｉｎｇｒａｈａｍ ＪＬ， Ｌｏｗ ＫＢ， Ｍａｇａｓａｎｉｋ Ｂ， Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ Ｍ， Ｕｍｂａｒｇｅｒ ＨＥ， ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ： ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ； １９８７． ｐｐ． ４４５－４７３）。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アデノシンを代謝または分解するための手段を含む。アデノシンの分解に有用な例示的酵素は、配列番号７１～７７を含む。
アルギニン／アルギナーゼＩによる代謝
Ｌ－アルギニン（Ｌ－Ａｒｇ）は、免疫応答を含むいくつかの生物システムにおいて中心的役割を果たす非必須アミノ酸である。Ｌ－アルギニンは、アルギナーゼＩ、アルギナーゼＩＩ、および誘導性一酸化窒素合成酵素によって代謝される。アルギナーゼ１は、Ｌ－アルギニンを尿素およびＬ－オルニチンに加水分解し、Ｌ－オルニチンは、悪性腫瘍において急速な細胞周期進行に必要とされるポリアミンの産生のための主要な基質である。腫瘍浸潤骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の別個の亜集団で、腫瘍細胞自体ではないものは、腫瘍微小環境においてそれらにＬ－アルギニン（Ｌ－Ａｒｇ）を急速に組み込ませ、細胞外Ｌ－Ａｒｇを枯渇させる、高レベルのアルギナーゼＩおよびカチオン性アミノ酸トランスポーター２Ｂを産生することが示されている。これらの細胞は、Ｔ細胞受容体発現および抗原特異的Ｔ細胞応答の強力なインヒビターならびに調節性Ｔ細胞の強力なインデューサーである。さらに、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａによる近年の研究により、活性化Ｔ細胞もまた、Ｌ－アルギニンを大量に消費し、それを急速に下流の代謝物へと変換し、これによって、活性化後の細胞内アルギニンレベルの著しい低下がもたらされることが示されている。これらの研究において、外因性Ｌ－アルギニンをＴ細胞培養培地に添加することにより、Ｔ細胞における遊離Ｌ－アルギニンの細胞内レベルが増加し、さらに、Ｌ－アルギニンレベルの増加は、生体エネルギーおよび生存率の増加からｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性に及ぶ、Ｔ細胞の活性化、分化、および機能に多面的な効果を引き起こした（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０１６） Ｌ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ； Ｃｅｌｌ １６７， ８２９－８４２、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、Ｔ細胞によるアルギニンの取込みによって、Ｔ細胞活性化の増強およびより長期の維持をもたらすことができる。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において使用される免疫モジュレーターはアルギニンである。
Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性ケモカイン
ケモカインは、免疫細胞、例えば、免疫応答を活性化するものおよびがん細胞アポトーシスを誘導するものを誘引および動員するのに重要である。ケモカインの標的細胞は、ケモカインが結合して機能を媒介する、対応する受容体を発現する。したがって、ＣＣおよびＣＸＣケモカインの受容体は、それぞれ、ＣＣＲおよびＣＸＣＲと称される。ＣＣケモカインはＣＣケモカイン受容体と結合し、ＣＸＣケモカインはＣＸＣケモカイン受容体と結合する。ほとんどの受容体は、通常、１つより多くのケモカインと結合し、ほとんどのケモカインは、通常、１つより多くの受容体と結合する。
ケモカインインターフェロン－γ誘導性タンパク質１０ｋＤａ（ＣＸＣＬ１０）は、ＣＸＣＲ３受容体と結合してその生物学的効果を発揮するＣＸＣケモカインファミリーのメンバーである。ＣＸＣＬ１０は、走化性、アポトーシスの誘導、細胞成長の調節および血管新生抑制効果の媒介に関与する。ＣＸＣＬ１０は、感染性疾患、慢性炎症、免疫不全、腫瘍発達、転移および播種を含む、種々のヒト疾患に関連する。より重要なことに、ＣＸＣＬ１０は、疾患重症度を媒介する主要な生物学的マーカーとして同定されており、様々な疾患の予後指標として利用することができる。この概説において、本発明者らは、がんの発病におけるＣＸＣＬ１０の新たな役割を解明する現行の調査に重点を置いている。疾患の開始および進行におけるＣＸＣＬ１０の役割を理解することにより、関連するヒト悪性腫瘍についての可能性のあるバイオマーカーおよび治療標的としてＣＸＣＬ１０を開発するための基礎を得ることができる。
ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９はそれぞれ、活性化Ｔリンパ球（Ｔｈ１）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、炎症性樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞上に優先的に発現される、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体である受容体、ＣＸＣＲ３を特異的に活性化する。インターフェロン誘導血管新生抑制性ＣＸＣケモカインおよびインターフェロン誘導性Ｔ細胞化学誘引物質（Ｉ－ＴＡＣ／ＣＸＣＬ１１）も、ＣＸＣＲ３を活性化する。これらのＣＸＣケモカインは、Ｔｈ１リンパ球上に優先的に発現される。
免疫により媒介される組織特異的破壊は、Ｔｈ１極性化、関連するケモカイン（ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ５リガンド、例えば、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９）、および細胞傷害性機序の活性化に関連する遺伝子と関連付けられている。他の研究により、早期乳がん、結腸直腸、肺、肝細胞、卵巣、および黒色腫などのがんにおける長期無病生存率および全体的生存率は、１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞関連因子、例えば、ＩＦＮ－ガンマ、シグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡ１）、ＩＬ－１２、ＩＦＮ調節因子１、転写因子Ｔ－ｂｅｔ、免疫エフェクターまたは細胞傷害性因子（グランザイム）、パーフォリン、およびグラニュライシン、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ６リガンドケモカイン（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＣＬ５）、他のケモカイン（ＣＸＣＬ１およびＣＣＬ２）、ならびに接着分子（ＭＡＤＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１）の活性化に、一貫して関連することが示されている。化学誘引および接着は、腫瘍内免疫細胞の密度を決定する際に重要な役割を果たすことが示されている。他の研究により、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１の上方調節が処置応答性（特に、養子移入療法に対する応答性）を予測することが示されている。さらに他の研究により、リンパ球による腫瘍浸潤を駆動するケモカインが肝細胞癌を有する患者の生存率を予測することが示されている。
がん進行が、がん細胞固有の因子と微小環境の因子の両方によって調節されることが、現在認識されている。ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の存在が、いくつかのがんにおける再燃リスクの低減と相関すること、および炎症促進性腫瘍微小環境が、肝細胞癌を有する患者のコホートにおける生存期間延長と相関することが実証されている。ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２の発現は、Ｔｈ１、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー細胞による腫瘍浸潤と相関することが示されている。データは、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２が、Ｔｈ１、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を腫瘍微小環境へと誘引する主なケモカインであることを示す。また、ＣＸＣＬ１０およびＴＬＲ３（ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２を誘導する）の発現は、がん細胞アポトーシスと相関する。
インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ－１０）または低分子誘導性サイトカインＢ１０としても公知のＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）は、ヒトにおいてＣＸＣＬ１０遺伝子にコードされる８．７ｋＤａのタンパク質である。ＣＸＣＬ１０は、単球、内皮細胞および線維芽細胞を含むいくつかの細胞型によりＩＦＮ－γに応答して分泌されるＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ＣＸＣＬ１０は、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および樹状細胞の化学誘引、内皮細胞へのＴ細胞接着の促進、抗腫瘍活性、ならびに骨髄コロニー形成および血管新生の阻害を含むいくつかの役割を果たす。このケモカインは、細胞表面のケモカイン受容体ＣＸＣＲ３と結合することによってその効果を惹起する。
炎症促進性条件下で、ＣＸＣＬ１０は、白血球、活性化好中球、好酸球、単球、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞（線維芽細胞）およびケラチノサイトなどの様々な細胞から、ＩＦＮ－γに応答して分泌される。インターフェロン応答のこの極めて重要な調節因子は、活性化Ｔｈ１リンパ球を優先的に炎症のエリアに誘引し、その発現はＴｈ１免疫応答と関連する。ＣＸＣＬ１０は、単球、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の化学誘引物質でもある。（Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ， ２０１２， ６１：４２７－４３８）。さらに他の研究により、免疫防御シグネチャー遺伝子、例えば、Ｔｈ１型ケモカインＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、がんにおいて後成的にサイレンシングされ得ることが示されている。（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ １５５２０）。
ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）は、ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）としても公知であるＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ＣＸＣＬ９は、ＩＦＮ－γによって誘導されるＴ細胞化学誘引物質（Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性ケモカイン）である。ＣＸＣＬ９は、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１という２つの他のＣＸＣケモカインに密接に関連している。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１はすべて、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３と相互作用することによってそれらの走化性機能を惹起する。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性ケモカインである１つまたは複数のケモカインである。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＸＣＲ３リガンドケモカインである１つまたは複数のケモカインである。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＣＲ５リガンドケモカインである１つまたは複数のケモカインである。一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＣＸＣＬ９である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＣＸＣＬ１０である。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５もしくは配列番号１２０６から選択される配列、またはその機能性断片に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列からなる。
間質モジュレーション
細胞外基質（ＥＣＭ）構成成分の蓄積は、腫瘍および間質組織の正常な構造を変形させ、血管およびリンパ管の異常な構成の原因となる。腫瘍の治療抵抗性に寄与する可能性のある１つの要因は、血管を著しく圧迫するＥＣＭの剛性であり、この結果として（拡散および対流に関する制約に起因して）灌流が低減され、最終的に腫瘍細胞への治療薬の送達が妨げられる。間質における血管圧迫を低減させて薬物送達を支援する１つの戦略は、一部の間質腫瘍環境において、ヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を豊富に有する高密度の複雑なＥＣＭ中に植え込まれた線維芽細胞、免疫細胞、および内皮細胞からなるＥＣＭ足場を酵素によって破壊することである。ＨＡは、その高いコロイド浸透圧に起因して水を保持する、反復Ｎ－アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸ユニットで構成される大きな直鎖状グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。ＨＡは、腫瘍間質形成および維持において役割を果たすと考えられている。ヒアルロニダーゼ（ＰＥＧＰＨ２０；ｒＨｕＰＨ２０）による酵素的ＨＡ分解は、マウス膵管腺癌（ＰＤＡ）腫瘍において間質液圧を低下させ、血管開存性、薬物送達、および生存が同時に観察されることが示されている（Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ， ２０１２， ２１：４１８－４２９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ， ２０１０， ９：３０５２－６４）。ＰＥＧＰＨ２０は、伸長ポリマーを切断して置換ユニットにすることによって、ＨＡに結合している水を遊離させると考えられている。捕捉された水の放出は、２０～３０ｍｍＨｇの範囲に間質液圧を低下させ、潰れた細動脈および毛細血管の開放を可能にする（Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．）。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、間質をモジュレートする分子である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を分解する酵素である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターはヒアルロニダーゼである。
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１またはその機能性断片から選択される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１またはその機能性断片から選択される１つまたは複数のポリペプチドに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一である。
他の免疫モジュレーター
他の免疫モジュレーターは、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている、治療核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、例えばＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマー、およびＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９分子を含む。よって、一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、例えば、ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマー、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子から選択される核酸分子を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡ免疫モジュレーターである。このような分子は、本明細書で以下に提供される参考文献において例示および議論されている。
免疫イニシエーターと免疫サステナーとの組合せ
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、複数の機序を組み合わせるよう設計されている。例えば、腫瘍微小環境において複数の直交免疫モジュレーション経路を活性化することによって、免疫学的コールド腫瘍は、免疫学的ホット腫瘍へと形質転換される。免疫応答の異なる構成成分に関する影響を有する複数のエフェクターを選択することができる。本明細書に開示される細菌および免疫モジュレーターによって標的とされ得る異なる免疫応答の構成成分は、免疫開始および免疫増大およびＴ細胞拡大増殖（免疫持続）を含む。
一部の実施形態では、微生物および少なくとも第１の免疫モジュレーター、例えば免疫イニシエーターまたは免疫サステナーは、少なくとも第２の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーと組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。
免疫イニシエーターおよびサステナーの非限定的な例は、表５および表６に記載されている。
表５． 免疫イニシエーター
Figure 2022506777000007
 表６． 免疫サステナー
Figure 2022506777000008
一部の組合せの実施形態では、表５の１つまたは複数のエフェクターを表６の１つまたは複数のエフェクターと組み合わせることができる。
免疫応答の異なる構成成分に関する影響を有する複数のエフェクターを選択することができる。本明細書に開示されるエフェクターによって標的とされ得る異なる免疫応答の構成成分は、腫瘍溶解、ＡＰＣの免疫活性化、ならびにＴ細胞の活性化およびプライミング（「免疫イニシエーター」）、トラフィキングおよび浸潤、免疫増強、Ｔ細胞の拡大増殖（「免疫サステナー」）を含む。一部の組合せの実施形態では、「免疫イニシエーター」を「免疫サステナー」と組み合わせる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを間質モジュレーター、例えばヒアルロニダーゼとさらに組み合わせてもよい。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーと同一ではない。免疫イニシエーターがＩＦＮ－ガンマである１つの非限定的な例として、免疫サステナーは、ＩＦＮ－ガンマではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーとは異なる。免疫イニシエーターがＩＦＮ－ガンマである１つの非限定的な例として、免疫サステナーは、ＩＦＮ－ガンマではない。
任意の１つまたは複数の免疫イニシエーターを、がん免疫サイクルにおいて、任意の１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせてもよい。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、がん免疫サイクルの１つまたは複数のステップ（１）腫瘍溶解、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化を、１つまたは複数のステップ（４）Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせて、モジュレート、例えば強化する。ステップ（１）、（２）、および（３）をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は本明細書に提供される。ステップ（４）、（５）、および（６）をモジュレートする免疫サステナーの非限定的な例は本明細書に提供される。したがって、これらの例示的な免疫モジュレーターのいずれも、本明細書に記載される１つまたは複数のがん免疫サイクルのステップをモジュレートすることが可能である疫イニシエーター／免疫サステナーの組合せの一部となってもよい。したがって、免疫イニシエーター／免疫サステナーの組合せは、例えば、以下に示すがん免疫サイクルのステップの組合せをモジュレートすることができる：ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（４）；ステップ（２）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（３）、ステップ（６）。
これらの実施形態およびすべての組合せの実施形態のいずれかでは、本明細書に開示される組成物および方法を、従来のがん治療、例えば、外科手術、化学療法、標的療法、放射線治療、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、ならびに血液製剤輸血および輸注と併用することができる。
医薬組成物および製剤
本発明の微生物および／または免疫モジュレーターを含む医薬組成物を使用して、がんを処置、管理、軽快、および／または防止することができる。単独で、または予防剤、治療剤、および／または薬学的に許容される担体と組み合わせて使用することができる本発明の医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、細菌は、胞子として全身的にまたは腫瘍内に投与される。非限定的な例として、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ株であり、投与は、腫瘍内の低酸素／壊死エリアの選択的コロニー形成をもたらす。一部の実施形態では、胞子は、固形腫瘍に存在する低酸素／壊死領域において排他的に発芽し、他のいかなる身体箇所においても発芽しない。
本発明の医薬組成物は、医薬品使用のための組成物への有効成分の処理を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来様式で製剤化することができる。医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知である（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡを参照されたい）。一部の実施形態では、医薬組成物は、打錠、凍結乾燥、直接圧縮、従来混合、溶解、造粒、水簸、乳化、カプセル化、封入、または噴霧乾燥に付されて、腸溶的にコーティングされていてもコーティングされていなくてもよい錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル剤、マイクロカプセル剤、マイクロ錠剤、ペレット剤、または散剤を形成する。適切な製剤は、投与経路に応じて変わる。
組成物は、いずれかの好適な剤形（例えば、経口投与のための液剤、カプセル剤、サシェ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、錠剤、腸溶コーティングされた錠剤、懸濁剤 散剤、顆粒剤、またはマトリックス持続放出形成）で、いずれかの好適な種類の投与（例えば、経口、局所、注射用、静脈内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲、即時放出、パルス放出、遅延放出、または持続放出）用に、医薬組成物へと製剤化することができる。細菌にとって好適な投薬量は、約１０４～１０１２個の細菌の範囲であり得る。組成物は、毎日、毎週、または毎月１回またはそれより多く投与され得る。組成物は、食事の前、その最中、またはその後に投与することができる。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、食事と同時に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとった後に投与される。
細菌および／または免疫モジュレーターは、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、緩衝剤、表面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透エンハンサー、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物へと製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、以下に限定されないが、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０を含む）の添加を含んでもよい。一部の実施形態では、本発明の細菌は、重炭酸ナトリウムの溶液、例えば、１モルの重炭酸ナトリウム溶液（例えば、胃などの酸性細胞環境を緩衝するために）中で製剤化されてもよい。
組成物は、静脈内に、例えば、注入または注射によって投与されてもよい。あるいは、組成物は、腫瘍内および／または腫瘍周囲に投与されてもよい。他の実施形態では、組成物は、動脈内、筋肉内、または腹腔内に投与されてもよい。一部の実施形態では、細菌は、腫瘍の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くにコロニー形成する。一部の実施形態では、細菌および／または免疫モジュレーターは、腫瘍被膜、コラーゲン、および／または間質の浸透を増強するために腫瘍中隔を破壊するために、ＰＥＧ化形態のｒＨｕＰＨ２０（ＰＥＧＰＨ２０）または他の薬剤と同時投与される。
本開示の微生物および／または免疫モジュレーターは、腫瘍内注射により投与することができる。腫瘍内注射は、強力な局在化された炎症応答と共に、腫瘍細胞に対する適応免疫応答を惹起することができる。一部の実施形態では、腫瘍は、１８ゲージの多叉針（ｍｕｌｔｉｐｒｏｎｇｅｄ ｎｅｅｄｌｅ）（Ｑｕａｄｒａ－Ｆｕｓｅ、Ｒｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて注射される。注射部位は、無菌的に準備される。利用可能であれば、超音波またはＣＴを使用して、注射のための腫瘍の壊死領域を特定してもよい。壊死領域が特定されなければ、注射は、腫瘍の中心に向けられてもよい。針を予め定義された領域に１回挿入し、一定の圧力で分注する。注射針をゆっくり除去し、注射部位を滅菌する。
固形腫瘍への本発明の組成物の直接腫瘍内注射は、静脈内投与と比較して有利となり得る。静脈内注射方法を使用すると、ごく僅かな割合の細菌が、標的腫瘍に達することができる。例えば、４Ｔ１腫瘍を有するマウスの尾静脈へのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ注射後に、ほとんどの細菌（＞９９％）は動物から迅速に取り除かれ、ごく僅かなパーセンテージの投与細菌が腫瘍にコロニー形成する（Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。特に、マウスと比較して相対的に大きい血液体積および相対的に小さい腫瘍を有する大型動物およびヒト患者において、腫瘍内注射が特に有益となり得る。腫瘍への直接的な注射は、より高濃度の治療剤の送達を可能にし、全身性投与からもたらされ得る毒性を回避する。加えて、細菌の腫瘍内注射は、腫瘍内に強健かつ局在化された免疫応答を誘導する。
場所、腫瘍型、および腫瘍サイズに応じて、以下に限定されないが、皮膚、皮下、および経皮注射、治療的超音波内視鏡検査、または気管支内腫瘍内送達を含む、異なる投与技法を使用することができる。腫瘍内投与手順に先立ち、患者の局所麻酔薬ならびに標準心、圧力、および酸素モニタリング、または全身麻酔と組み合わせた鎮静が実施される。
一部の腫瘍に対して、最も侵襲性の低い投与方法である経皮注射を用いることができる。超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または蛍光透視法をガイダンスとして使用して、針を導入および位置決めすることができる。経皮腫瘍内注射は、例えば、Ｌｅｎｃｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０において肝細胞癌について記載されている。皮膚、皮下、および結節性腫瘍の腫瘍内注射は、例えば、後期黒色腫について、ＷＯ／２０１４／０３６４１２（Ａｍｇｅｎ）において記載されている。
単一の挿入ポイントまたは複数の挿入ポイントを経皮注射プロトコールにおいて使用することができる。単一の挿入ポイントを使用して、針の放射状リーチが及ぶ限りにおいて、溶液剤を複数のトラックに沿って経皮注射することができる。他の実施形態では、腫瘍が針の放射状リーチより大きい場合、複数の注射ポイントを使用することができる。総用量が注射および分散されるまで必要な頻度で、針を抜き出さずに引き戻して向きを変更することができる。滅菌性を維持するために、注射ごとに別々の針が使用される。針のサイズおよび長さは、腫瘍の型およびサイズに応じて変動する。
一部の実施形態では、腫瘍は、１８ゲージの多叉針（Ｑｕａｄｒａ－Ｆｕｓｅ、Ｒｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて経皮的に注射される。デバイスは、２０ｃｍの長さの１８ゲージ穿刺針からなる。針は、４個の末端側孔およびコネクタと延長チューブクランプをそれぞれ備える格納式３叉を有する。叉は、針の外側壁から展開される。針を、腫瘍の中心へと経皮導入することができ、腫瘍の最深縁に位置決めすることができる。叉は、腫瘍の縁へと展開される。叉は、最大の長さで展開され、次いで、規定の間隔で格納される。必要に応じて、１回または複数の回転－注射－回転手技を実施することができ、その際、叉が格納され、針が６０度回転し、続いて、叉の反復展開および追加的な注射がなされる。
治療的超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）は、ある特定の他の腫瘍へのアクセスを得る際に固有の解剖学的制約を克服するために用いられる（Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。ＥＵＳガイドされた細針注射（ＥＵＳ－ＦＮＩ）は、頭頸部、食道、膵、肝、および副腎腫瘤の処置のための抗腫瘍療法への使用に成功した（Ｖｅｒｎａ ｅｔ ａｌ， ２００８）。ＥＵＳ－ＦＮＩは、膵がん注射のために広範に使用されている。細針注射には、曲線エコー内視鏡の使用が必要とされる。食道に注意深く挿管され、エコー内視鏡が、胃および十二指腸へと通過し、そこで膵検査が行われ、標的腫瘍が特定される。最も大きい平面を測定し、腫瘍体積を推定し、注射体積が計算される。適切な体積がシリンジ内に引かれる。準備の整った２２ゲージ細針吸引（ＦＮＡ）針が、エコー内視鏡のワーキングチャネルへと通過する。超音波ガイダンス下で、針は、腫瘍へと通過する。腫瘍のサイズに応じて、投与は、腫瘍をセクションへと分割し、次いで体積の対応する画分を各セクションへと注射することにより実施することができる。ドップラー技術によるインストールされた内視鏡超音波プロセッサーの使用によって、腫瘍への針通過に干渉し得る動脈または静脈構造が存在しないことが保証される（Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。一部の実施形態では、ＥＵＳ－ＦＮＩのための「複数注射用針」（ＭＩＮ）を使用して、ストレート型の針と比較して、腫瘍への注射分布を改善することができる（Ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。
非小細胞肺がんなど、肺がんのための腫瘍内投与は、Ｃｅｌｉｋｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００８に記載されている通り、気管支内腫瘍内送達方法により達成することができる。気管支鏡検査（経鼻または経口）は、処置される病変を可視化するために行われる。腫瘍体積は、気管支表面にわたる目に見える長さ－幅高さ測定値から視覚的に推定することができる。次いで、気管支鏡のワーキングチャネルを通して針デバイスが導入される。プラスチックカテーテルに取り付けられた金属製の針からなる針カテーテルは、発展の際にワーキングチャネルへの針による損傷を防止するためにシース内に配置される。針のサイズおよび長さは変動し、腫瘍型および腫瘍のサイズにより決定される。プラスチック製の針は、金属針より硬くなく、ワーキングチャネルにおけるより鋭角な屈曲の辺りを通過し得るため理想的である。針が病変内に挿入され、本発明の細菌が注射される。腫瘍塊が完全に灌流されるまで、針は、いくつかの挿入ポイントに反復的に挿入される。各注射後に、針は、腫瘍から完全に引き抜かれ、次いで、別の場所に埋め込まれる。気管支鏡注射セッションの終わりに、処置に起因するいずれかの壊死性デブリの除去は、機械的解剖、または灌注および吸引を伴う他のアブレーション技法を使用して除去することができる。
一部の実施形態では、組成物は、以下に限定されないが、経皮注射、ＥＵＳ－ＦＮＩ、または気管支内腫瘍内送達方法を含む方法を使用して、腫瘍中に直接投与される。一部の事例では、腹腔鏡または外科的切開技法などの他の技法を使用して、標的腫瘍にアクセスするが、これらの技法は非常に侵襲性が高く、それらの技法には非常に高い疾病率およびより長い入院を伴う。
一部の実施形態では、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅまたは胞子、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴは、全身的または腫瘍内注射のために滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解される。
注射される用量は、腫瘍の型およびサイズに由来する。薬物または細菌の用量は、典型的には、全身的静脈内投与のための用量より低く、例えば、数桁低い。
各病変へと注射される体積は、腫瘍のサイズに基づく。腫瘍体積を得るために、最も大きい平面の測定を行うことができる。次いで、推定される腫瘍体積は、総体積のパーセンテージとして注射体積の決定を通知することができる。例えば、総腫瘍体積のおよそ２０～４０％の注射体積を使用することができる。
例えば、ＷＯ／２０１４／０３６４１２に例えば記載されているように、その最も大きい寸法が５ｃｍより大きい腫瘍に対して、最大４ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が２．５から５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大２ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が２．５から５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大２ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が１．５から２．５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大１ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が０．５から１．５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大０．５ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が０．５に等しいかまたはそれより小さい腫瘍に対して、最大０．１ｍｌを注射することができる。あるいは、超音波スキャンを使用して、周囲の組織へと漏出することなく腫瘍によって取り込まれ得る注射体積を決定することができる。
一部の実施形態では、処置レジメンは、１回または複数の腫瘍内投与を含むことになる。一部の実施形態では、処置レジメンは、初回用量と、それに続く少なくとも１回のその後の用量を含むことになる。１回または複数の用量は、２つまたはそれより多いサイクルで逐次投与することができる。
例えば、第１の用量は、１日目に投与することができ、第２の用量は、１、２、３、４、５、６日または１、２、３もしくは４週間後に、あるいはより長い間隔の後に投与することができる。追加の用量は、１、２、３、４、５、６日後にまたは１、２、３もしくは４週間後に、またはより長い間隔の後に投与することができる。一部の実施形態では、第１およびその後の投与は、同じ投薬量を有する。他の実施形態では、異なる用量が投与される。一部の実施形態では、１日当たり２回以上の用量が投与され、例えば、１日当たり２、３回またはそれより多い用量を投与することができる。
記載されている投与経路および投薬量は、単なるガイドとして意図される。最適な投与経路および投薬量は、当業者であれば容易に決定することができる。投薬量は、様々なパラメーターに従って、特に、腫瘍の場所、腫瘍のサイズ、処置される患者の年齢、体重および状態、ならびに投与の経路および方法に従って決定することができる。
一部の実施形態では、細菌は、第１の経路、例えば腫瘍内注射によって投与され、少なくとも１つの免疫モジュレーターは、第２の経路、例えば経口的に投与される。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、経口投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、肝がんまたは肝臓転移の防止、処置または管理において有用であり得る。例えば、Ｄａｎｉｎｏらは、経口投与されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅが、肝臓転移のマウスモデルにおいて、胃腸管にわたることによって肝臓転移にコロニー形成することができることを示した（その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｕｒｉｎｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ７ （２８９）： １－１０）。
一実施形態では、組成物は、腫瘍内注射によって送達される。一実施形態では、組成物は、胸膜内送達される。一実施形態では、組成物は、皮下送達される。一実施形態では、組成物は、静脈内送達される。一実施形態では、組成物は、胸膜内送達される。
一部の実施形態では、組成物は、複数の注射を必要とするレジメンに従って腫瘍内投与することができる。一部の実施形態では、細菌および少なくとも１つの免疫モジュレーターは、各腫瘍内注射において一緒に投与される。一部の実施形態では、細菌株が最初に注射され、免疫モジュレーターがより後の時点で注射される。他の実施形態では、免疫モジュレーターが最初に注射され、細菌がより後の時点で注射される。追加の注射は、同時にまたは逐次的に、続いて行われる。
本発明の細菌が腫瘍内送達される腫瘍型は、以下に限定されないが、Ｂ、Ｔ、およびＮＫ細胞リンパ腫、結腸および直腸がん、転移性黒色腫を含む黒色腫、菌状息肉症、メルケル癌、肝細胞癌および結腸直腸がんに続発する肝臓転移を含む肝がん、膵がん、乳がん、濾胞性リンパ腫、前立腺がん、不応性肝がん、ならびにメルケル細胞癌を含む、局所的に進行性および転移性の腫瘍を含む。
一部の実施形態では、腫瘍細胞溶解は、腫瘍内注射の一部として起こる。結果として、腫瘍抗原が露出されて、抗腫瘍応答を惹起する。この露出は、細菌によって発現されるエフェクターと協調して、抗腫瘍効果を増強することができる。一部の実施形態では、腫瘍細胞溶解は、腫瘍内注射の一部として起こらない。
投薬量レジメンは、治療応答をもたらすように調整することができる。投与は、疾患の重症度および応答性、投与経路、処置の時間的経過（数日間から数カ月間から数年間）、ならびに疾患の軽快までの時間を含むいくつかの因子に依存し得る。例えば、単一のボーラスを一度に投与することができ、いくつかの分割用量を所定の期間にわたって投与することができ、または治療状況によって示される通りに用量を低減もしくは増加させることができる。投薬量の仕様は、活性化合物の特有の特徴および達成される特定の治療効果によって指示される。投薬量の値は、軽減される状態の種類および重症度と共に変動し得る。いずれかの特定の対象に対して、個々の必要および処置担当の臨床医の専門的判断に従って、特異的な投薬量レジメンを経時的に調整することができる。本明細書に提供される化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または動物モデルにおいて標準的な医薬品手順によって決定することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、およびＩＣ５０を決定することができ、毒性と治療効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として計算することができる。毒性副作用を示す組成物は、潜在的損傷を最小限にして、副作用を低減するための慎重な改変により使用することができる。投与は、細胞培養アッセイおよび動物モデルから初期に推定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。
成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉シールされた容器における乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々に、または単位剤形において一緒に混合して供給される。投与方式が注射によるものである場合、投与に先立ち成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉シールされた容器内にパッケージングすることができる。一実施形態では、医薬組成物のうちの１つまたは複数は、密閉シールされた容器内に乾燥し滅菌された凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象への投与に適切な濃度に復元（例えば、水または生理食塩水で）され得る。ある実施形態では、予防剤もしくは治療剤または医薬組成物のうちの１つまたは複数は、２℃から８℃の間で貯蔵され、復元後１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または１週間以内に投与される、密閉シールされた容器内に乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥剤形のために凍結保護物質、主に０～１０％スクロース（最適には０．５～１．０％）が含まれてもよい。他の好適な凍結保護物質は、トレハロースおよびラクトースを含む。他の好適な増量剤は、グリシンおよびアルギニンを含み、そのいずれかは、０～０．０５％の濃度で含まれてもよく、ポリソルベート－８０（最適には、０．００５～０．０１％の濃度で含まれる）も含まれてもよい。追加の界面活性剤としては、以下に限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。医薬組成物は、注射用溶液として調製することができ、吸収または分散を増加させるために使用される薬剤、例えば、ヒアルロニダーゼなどのアジュバントとして有用な薬剤をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与、腫瘍内投与、または腫瘍周囲投与のために製剤化される。組成物は、デポー調製物として製剤化することができる。このような長時間作用型製剤は、植え込みまたは注射によって投与することができる。例えば、組成物は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂により、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）として製剤化することができる。
処置方法
本発明の別の態様は、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、がんに関連する１つまたは複数の症状を低減、軽快、または排除するための方法を提供する。一部の実施形態では、がんは、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、喉のがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から選択される。一部の実施形態では、それらに関連する症状としては、以下に限定されないが、貧血、食欲不振、膀胱裏層の刺激作用、出血および内出血（血小板減少症）、味覚もしくは嗅覚の変化、便秘、下痢、口渇、嚥下障害、浮腫、疲労、毛髪脱落（脱毛症）、感染症、不妊症、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、う歯、尿路感染症、および／または記憶および集中に関する問題が挙げられる。
本方法は、本明細書に記載の細菌および／または免疫モジュレーターの少なくとも１つの種、株、またはサブタイプにより医薬組成物を調製するステップと、対象に、医薬組成物を治療有効量で投与するステップとを含んでもよい。組成物は、組織もしくは供給を担う血管へと局所的に、例えば、腫瘍内もしくは腫瘍周囲に、または全身的に、例えば、注入もしくは注射により静脈内に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、静脈内、腫瘍内、動脈内、筋肉内、腹腔内、経口、または局所的に投与される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内に、すなわち、全身的に投与される。
ある特定の実施形態では、対象に医薬組成物を投与することにより、対象における細胞増殖、腫瘍成長、および／または腫瘍体積が低減される。一部の実施形態では、本開示の方法は、細胞増殖、腫瘍成長、および／または腫瘍体積を、無処置または対照の対象におけるレベルと比較して、少なくとも約１０％から２０％、２０％から２５％、２５％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、６０％から７０％、７０％から７５％、７５％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９０％から９５％、９５％から９９％、またはそれより高い割合で低減することができる。一部の実施形態では、低減は、医薬組成物の投与前および投与後に、対象における細胞増殖、腫瘍成長、および／または腫瘍体積を比較することによって測定される。一部の実施形態では、対象におけるがんを処置または軽快する方法は、がんの１つまたは複数の症状を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより高い割合で改善させることが可能である。
医薬組成物の投与の前、その間、およびその後に、血液、血清、血漿、尿、腹水、および／または組織もしくは臓器由来の生検などの生体試料において、対象におけるがん性細胞および／またはバイオマーカーを測定することができる。一部の実施形態では、本方法は、対象における腫瘍体積を検出不能なサイズまで、または処置の前に、対象の腫瘍体積の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、もしくは９０％未満まで低減させるために、本発明の組成物の投与を含んでもよい。他の実施形態では、本方法は、対象における細胞増殖速度または腫瘍成長速度を検出不能な速度まで、または処置の前に、速度の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、もしくは９０％未満まで低減させるために、本発明の組成物の投与を含んでもよい。
応答パターンは、伝統的細胞傷害性療法に対するものとは異なる場合がある。例えば、免疫に基づく治療法で処置された腫瘍は、これらが退縮する前に拡大し得る、および／または新たな病変が出現し得る（Ａｇａｒｗａｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。腫瘍サイズの増加は、腫瘍組織には通常存在しないリンパ球およびマクロファージによる重度の浸潤が原因となり得る。さらに、応答時間は、標準療法、例えば、細胞傷害性療法に関連する応答時間より遅くなる場合がある。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの送達は、腫瘍の体積および／またはサイズを一時的に増加させるが、対象の腫瘍の成長をモジュレートするおよび／またはがんの症状を軽快させることができる。
細菌は、例えば、投与の数時間または数日後に、組織もしくは血清における防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９）、またはキルスイッチの活性化によって破壊され得る。よって、医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与することができる。代替の実施形態では、細菌は、投与後数時間または数日以内に破壊されず、腫瘍において繁殖し、腫瘍にコロニー形成することができる。
医薬組成物は、単独で、または１つもしくは複数のさらなる治療剤、例えば、本明細書に記載されており、当技術分野で公知の、例えば、化学療法薬もしくはチェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。１つまたは複数の追加の治療剤を選択する際の重要な考慮は、薬剤が、本発明の細菌と適合性となるべきであり、例えば、薬剤が、細菌を死滅させてはならないことである。一部の研究では、抗がん免疫療法、例えば、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１インヒビターの有効性は、マイクロバイオームにおける特定の細菌株の存在を必要とする（Ｉｌｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１３；Ｖｅｔｉｚｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５；Ｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。一部の実施形態では、細菌を含む医薬組成物は、チェックポイントインヒビターまたは化学療法剤の効果を増大させ、例えば、全身的に投与される化学療法剤または免疫療法剤の用量の低下を可能にする。一部の実施形態では、医薬組成物は、１種もしくは複数の共生またはプロバイオティクス細菌、例えば、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓと共に投与される。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、対象に細菌を投与すること、および対象に少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与することによって、がんを処置するために対象に投与され得る。一部の実施形態では、投与するステップは、同時的に実施される。一部の実施形態では、対象に細菌を投与するステップは、対象に少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップの前に行われる。一部の実施形態では、対象に少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップは、対象に細菌を投与するステップの前に行われる。
化学療法剤
一部の実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の化学療法剤による投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ（登録商標）、Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（登録商標）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（登録商標）、５－フルオロウラシル、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ（登録商標）、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（登録商標）、およびＯｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（登録商標）から選択される１つまたは複数の化学療法剤による投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）による投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、シクロホスファミドによる投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身的にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の医薬組成物は、１つまたは複数の化学療法剤による投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤は全身的に投与され、細菌は腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤および医薬組成物は全身的に投与される。一実施形態では、化学療法剤はシクロホスファミドである。
一部の実施形態では、医薬組成物は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミドまたは本明細書に記載のもしくは当技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、１０％から２０％、２０％から２５％、２５％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、６０％から７０％、７０％から７５％、７５％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９０％から９５％、９５％から９９％またはそれより高い割合で改善することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミドまたは本明細書に記載のもしくは当技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、化学療法単独と比較して、１．０～１．２倍、１．２～１．４倍、１．４～１．６倍、１．６～１．８倍、１．８～２倍、もしくは２倍にまたはそれより高い倍率で改善することができる。
チェックポイント阻害
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数のチェックポイントインヒビター、免疫刺激性抗体（阻害性またはアゴニスト性）または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の他のアゴニストによる投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１つのチェックポイントインヒビター、免疫刺激性抗体（阻害性またはアゴニスト性）または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の他のアゴニストによる投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２つのチェックポイントインヒビター、免疫刺激性抗体（阻害性またはアゴニスト性）または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の他のアゴニストによる投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。
免疫チェックポイントインヒビターの非限定的な例として、ＣＴＬＡ－４抗体（以下に限定されないが、イピリムマブおよびトレメリムマブ（ＣＰ６７５２０６）を含む）、抗４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）抗体（以下に限定されないが、ＰＦ－０５０８２５６６、およびウレルマブを含む）、抗ＯＸ４０抗体（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を含むそれに限定されない抗ＣＤ１３４（ＯＸ４０）抗体、抗ＰＤ－１抗体（以下に限定されないが、ニボルマブ、ピディリズマブ、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５／ＳＣＨ９００４７５）、ランブロリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０、ＰＤ－１（Ａｇｅｎｕｓ）を含む）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（以下に限定されないが、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、およびアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７）を含む）、および抗ＫＩＲ抗体（以下に限定されないが、リリルマブ含む）、ＬＡＧ３抗体（以下に限定されないが、ＢＭＳ－９８６０１６を含む）、抗ＣＣＲ４抗体（以下に限定されないが、モガムリズマブを含む）、抗ＣＤ２７抗体（以下に限定されないが、バルリルマブを含む）、抗ＣＸＣＲ４抗体（以下に限定されないが、ウロクプルマブを含む）が挙げられる。一部の実施形態では、少なくとも１種の細菌細胞は、抗ホスファチジルセリン抗体（以下に限定されないが、バビツクスマブを含む）による投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ＴＬＲ９抗体（以下に限定されないが、ＭＧＮ１７０３ ＰＤ－１抗体（以下に限定されないが、ＳＨＲ－１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ／Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ）を含む）、抗ＯＸ４０抗体（以下に限定されないが、ＯＸ４０（Ａｇｅｎｕｓ）を含む）、抗Ｔｉｍ３抗体（以下に限定されないが、抗Ｔｉｍ３（Ａｇｅｎｕｓ／ＩＮｃｙｔｅ））、抗Ｌａｇ３抗体（以下に限定されないが、抗Ｌａｇ３（Ａｇｅｎｕｓ／ＩＮｃｙｔｅ）を含む）、抗Ｂ７Ｈ３抗体（以下に限定されないが、エノブリツズマブ（ＭＧＡ－２７１）、ＷＯ２００９１０１６１１に記載されている抗ＣＴ－０１１（ｈＢＡＴ、ｈＢＡＴ１）が挙げられる）、抗ＰＤＬ－２抗体（以下に限定されないが、ＡＭＰ－２２４（ＷＯ２０１００２７８２７およびＷＯ２０１１０６６３４２に記載）を含む）、抗ＣＤ４０抗体（以下に限定されないが、ＣＰ－８７０、８９３を含む）、抗ＣＤ４０抗体（以下に限定されないが、ＣＰ－８７０、８９３を含む）から選択される１つまたは複数の抗体による投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。
共刺激分子
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌および／または免疫モジュレーターは、アゴニスト抗体を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のアゴニスト免疫刺激性分子またはアゴニストによる投与と逐次的に、それと同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗体は、抗ＯＸ４０抗体（以下に限定されないが、ＩＮＣＡＧＮ０１９４９（Ａｇｅｎｕｓ）；ＢＭＳ ９８６１７８（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＥＤＩ０５６２（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＧＳＫ３１７４９９８（ＧＳＫ）、ＰＦ－０４５１８６００（Ｐｆｉｚｅｒ）を含む）、抗４１ＢＢ／ＣＤ１３７（以下に限定されないが、ＰＦ－０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）を含む）、および抗ＧＩＴＲ（以下に限定されないが、ＴＲＸ５１８（Ｌｅａｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＭＫ－４１６６（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ－１２４８（Ｍｅｒｃｋ）、ＡＭＧ ２２８（Ａｍｇｅｎ）、ＢＭＳ－９８６１５６（ＢＭＳ）、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６（Ｉｎｃｙｔｅ／Ａｇｅｎｕｓ）、ＭＥＤＩ１８７３（ＡＺ）、ＧＷＮ３２３（ＮＶＳ）を含む）から選択される。
一部の実施形態では、微生物および／または免疫モジュレーターは、他の処置モダリティまたは他のモダリティの組合せを含むレジメンの一部として投与されてもよい。これらのモダリティまたは薬剤の非限定的な例は、従来の治療法（例えば、放射線療法、化学療法）、他の免疫療法、幹細胞療法、および標的化療法（例えば、ＢＲＡＦまたは血管内皮成長因子インヒビター；抗体または化合物）、本明細書に記載の細菌、ならびに腫瘍溶解性ウイルスである。治療法は、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣ療法、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍細胞に連結する二特異性可溶性ｓｃＦｖ（例えば、ＢｉＴＥ）、およびエフェクター機能を有する可溶性ＴＣＲを使用する治療法を含む抗体－免疫係合関連も含む。免疫療法は、ワクチン（例えば、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、ネオ抗原、またはそれらの組合せ）、チェックポイントインヒビター、サイトカイン療法、養子細胞療法（ＡＣＴ）を含む。ＡＣＴとしては、以下に限定されないが、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、天然のまたは操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ－Ｔ療法、ナチュラルキラー細胞療法、および樹状細胞ワクチンまたは他の抗原提示細胞の他のワクチンが挙げられる。標的化療法は、抗体および化学化合物を含み、例えば、血管新生抑制戦略およびＢＲＡＦ阻害を含む。
細菌ＤＮＡの免疫刺激活性は、非メチル化ＣｐＧモチーフを発現する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によって模倣される。Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． ２０１１ Ａｐｒ； １０（４）： ４９９－５１１． ＣｐＧ ＤＮＡ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ。ワクチンアジュバントとして使用される場合、ＣｐＧ ＯＤＮは、プロフェッショナル抗原提示細胞の機能を改善し、液性および細胞性ワクチン特異的免疫応答の生成をブーストする。一部の実施形態では、ＣｐＧは、本発明の細菌と組み合わせて投与することができる。
一実施形態では、微生物は、腫瘍細胞溶解物と組み合わせて投与される。
医薬組成物の投薬量および投与の頻度は、症状の重症度およびがんの進行に基づいて選択することができる。適切な治療有効用量および投与の頻度は、処置担当の臨床医によって選択され得る。
ｉｎ ｖｉｖｏでの処置
細菌および／または少なくとも１つのモジュレーターを含む組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルにおいて評価することができる。がんに関連する疾患または状態の任意の好適な動物モデル、例えば、腫瘍同系または異種移植マウスモデルを使用することができる（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５を参照されたい）。細菌および／または少なくとも１つの免疫モジュレーターは、全身性にまたは局所的に、例えば、経口投与（経管栄養）により、静脈内、もしくは皮下注射によりまたは腫瘍内注射により動物に投与されてもよく、例えば、腫瘍体積を測定することによって、処置有効性が決定されてもよい。
動物モデルの非限定的な例として、Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１、Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１４およびＤａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５に記載されているマウスモデルが挙げられる。
前臨床マウスモデルは、どの免疫療法および併用免疫療法が、異なるがんにおいて、最適な治療指数（最大の抗腫瘍有効性および最小の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ））を生じるかを決定する。
マウス組織部位への様々なヒトがん細胞型に由来する培養細胞または患者の腫瘍塊の植え込みは、がんマウスモデル（異種移植モデリング）の生成に広く使用されてきた。異種移植モデリングにおいて、ヒトの腫瘍または細胞系は、移植片拒絶を回避するために免疫低下宿主動物（例えば、ヌードまたはＳＣＩＤマウス）へと皮下または同所性のいずれかで植え込まれる。本来のヒト腫瘍微小環境は、このようなモデルにおいて再現されないため、免疫モジュレーターを標的とする抗がん剤の活性は、これらのモデルにおいて正確に測定されない可能性があり、したがって、無傷の免疫系を有するマウスモデルがより望ましい。
したがって、同系免疫適格性宿主におけるマウスがん細胞の植え込み（同種移植）を使用して、所与のマウス株と同じ遺伝的背景に由来する腫瘍組織を有するマウスモデルを生成する。同系モデルにおいて、宿主免疫系は正常であり、腫瘍の微小環境の実際の生活状況をより密接に表すことができる。腫瘍細胞またはがん細胞系は、同系免疫適格性宿主動物（例えば、マウス）へと皮下または同所性のいずれかで植え込まれる。免疫チェックポイントベンチマーク評価のための同系マウスモデルにおいて使用することができる代表的なマウス腫瘍細胞系としては、以下に限定されないが、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に列挙された細胞系が挙げられる。ある特定の細胞系に由来する腫瘍に関して、オボアルブミンを添加して、免疫応答をさらに刺激し、これによって、応答ベースラインレベルを増加させることができる。同系マウスモデルにおいて使用することができるマウス株の例は、Ｃ５７ＢＬ／６、ＦＶＢ／Ｎ、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＮＯＤ／ＳｈｉＬＴ、Ａ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪ、ＮＯＤを含む細胞系に依存する。さらに、いくつかのさらに遺伝子操作されたマウス株は、分子レベルと組織学的レベルの両方でヒト腫瘍発生を模倣することが報告されている。これらの遺伝子操作されたマウスモデルも、本分野に優れたツールを提供し、さらに、これらのモデルにおいて発生された侵襲的腫瘍に由来するがん細胞系も、同系腫瘍モデルのための細胞系の良好な供給源である。遺伝子操作された株の例は、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提供される。
多くの場合、潜在的治療用分子は、ヒト免疫モジュレーターと相互作用し、ヒト免疫系を刺激し、そのマウス対応物を検出せず、その逆もまた同じである。治療用分子の研究において、このことを考慮に入れる必要がある。さらに最近では、免疫不全マウスがヒト免疫系により再構成され、マウス免疫系とヒト免疫系との間の差に関する問題の克服に役立ち、ヒト免疫のｉｎ ｖｉｖｏ研究を可能にする、「ヒト化」マウスモデルが開発されている。ＩＬ２受容体ヌルおよび重症を組み合わせた免疫不全突然変異（ｓｃｉｄ）を組み合わせる、重度に免疫不全なマウス（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇヌルマウス）は、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞、または機能的ＮＫ細胞を欠き、サイトカインシグナル伝達が不十分である。これらのマウスは、ヒト造血幹細胞および末梢血単核細胞を生着することができる。ＣＤ３４＋造血幹細胞（ｈｕ－ＣＤ３４）が免疫不全マウスに注射され、長期研究において非常に良好なＴ細胞成熟および機能を含むヒト免疫細胞集団の多系列生着をもたらす。このモデルは、１２カ月間の研究スパンを有し、機能的ヒト免疫系が、宿主に対するドナー細胞免疫反応なしで、Ｔ細胞依存性炎症応答を示す。患者由来異種移植は、これらのモデルにおいて容易に植えこむことができ、ｉｎ ｖｉｖｏ設定において研究される免疫モジュレーション剤の効果は、ヒト腫瘍微小環境をさらに反映する（免疫細胞と非免疫細胞の両方に基づく）（Ｂａｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。ヒト化マウスモデルにおいて使用するための目的のヒト細胞系としては、以下に限定されないが、ＨＣＴ－１１６およびＨＴ－２９結腸がん細胞系が挙げられる。
ラットＦ９８神経膠腫モデルおよび自然発症イヌ腫瘍の有用性は、これらそれぞれの内容全体が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ ２０１４に記載されている。ルシフェラーゼを発現するように操作されたＦ９８ラット神経膠腫細胞の植え込みによって生成される局所侵襲的な腫瘍に、Ｃ．ｎｏｖｙｉ－ＮＴ胞子を腫瘍内注射し、発芽およびルシフェラーゼ活性の急落をもたらした。Ｃ．ｎｏｖｙｉ－ＮＴの発芽は、この細菌の栄養型の出現によって実証された。これらの研究において、Ｃ．ｎｏｖｙｉ－ＮＴは、近隣細胞を温存しつつ、腫瘍へと正確に向かう。
例えば、イヌ軟部組織肉腫は、多くの品種において一般的であり、特に、遺伝的変更および突然変異のスペクトルの観点から、ヒトにおけるものと同様の臨床的、病理組織学的、および遺伝的特色を有する（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ， ２０１４；Ｓｔａｅｄｔｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。Ｒｏｂｅｒｔｓらは、イヌにおける研究を行い、それによると、Ｃ．ｎｏｖｙｉ－ＮＴ胞子は、１～４処置サイクルにおいて、自然発生的な固形腫瘍に腫瘍内注射され（１×１０８個のＣ．ｎｏｖｙｉ－ＮＴ胞子）、９０日間追跡された。強力な炎症応答が観察されており、腫瘍内注射が自然免疫応答を開始したことを示した。
一部の実施形態では、本発明の微生物は、本明細書に記載のモデルのいずれかへと全身性に、例えば、経口的、皮下、静脈内または腫瘍内に投与され、抗腫瘍有効性およびいずれかの処置関連の有害な副作用を評定する。
以下の実施例は、本開示の例示的実施形態を提供する。当業者は、本開示の趣旨または範囲を変更することなく実施することができる多数の改変および変形形態を認識するであろう。このような改変および変形形態は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、本開示をいかなるようにも制限しない。
本開示は、以下の実施例に記載される配列番号のいずれかの配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する配列を本明細書において提供する。
（実施例１）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの腫瘍薬物動態
腫瘍薬物動態をアッセイし、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に提出され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されるように決定した。Ｎｉｓｓｌｅ（１ｅ７および１ｅ８個の細胞／用量）の腫瘍薬物動態を、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して７日にわたって決定した。腫瘍組織内の細菌数は、両方の用量で類似した。血液中ではいずれの時点においても細菌は検出されなかった。
ストレプトマイシン抵抗性ＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ ＤＯＭ突然変異体（ＮｉｓｓｌｅΔＰＡＬ：：ＣｍＲ）の腫瘍薬物動態を、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて比較した。腫瘍組織中の細菌数は両方の株において類似した。血液中に細菌は検出されなかった。これらの結果は、野生型とＤＯＭ変異体Ｎｉｓｓｌｅの両方が腫瘍環境において生存可能であることを示す。
ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅの腫瘍内投与に対するｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン応答を、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して１ｅ６個の細胞／用量（群１）または１ｅ７個の細胞／用量（群２）のいずれかで評定した。指定した用量で、マウスＣＴ－２４モデルにおいてＳＹＮ９４腫瘍内投与後の時間経過において、血清中および腫瘍中のレベルを測定した。結果は、サイトカイン応答は、腫瘍においてより高い用量で惹起されるが、血清中では惹起されないことを示す。より低い用量は、実質的なサイトカイン応答を惹起しない。様々な組織における腫瘍ＰＫ、細菌レベル、およびこれらの組織におけるサイトカインレベルを、ＩＴ投与（１ｅ７個の細胞／用量）後の４８時間で評定した。参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２において認められるように、細菌は、腫瘍中に優先的に存在し、試験した他の組織には存在しなかった。測定したＴＮＦαレベルは、ＳＹＮ９４、生理食塩水処置およびナイーブ群の間ですべての血清、腫瘍および肝臓において類似した。ＴＮＦαレベルは、Ｎｉｓｓｌｅを、ＩＶにより１ｅ８で投与した場合に１．５時間で測定したＴＮＦαレベルと比較して無視できる程度である。しかし、ＩＶ投与でも、ＴＮＦαレベルは４時間で検出不能レベルへと低下する。類似の低レベルのＴＮＦαが、ＳＹＮ９４の１ｅ６ ＩＶ用量で検出される。
（実施例２）
腫瘍モデルにおける操作されたおよび操作されていないＮｉｓｓｌｅ処置の有効性の評価
第１の研究では、ＥｃＮの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射によって、Ｂ１６．Ｆ１０、ＥＬ４、Ａ２０、４Ｔ１およびＣＴ２６を移植可能な腫瘍を含む、多種多様ながんの種類において、拡大増殖およびコロニー形成がもたらされた（図４Ａ）。腫瘍では、ＥｃＮは急速に拡大増殖し、約２４～７２時間の間に定常状態に到達し、細菌が血清中で検出されなかったため、腫瘍に局在化したままであった（図４Ａ～４Ｃ）。ＥｃＮの存続性および代謝活性を評価するために、ＬｕｘＡＢＣＤＥバイオルミネセンスレポーターカセット（ＥｃＮ－Ｌｕｘ）を含有する操作した株を使用した。ｉ．ｔ．注射後に、ＥｃＮ－Ｌｕｘは腫瘍中で拡大増殖し、存続し、最大１４日間一貫した代謝活性を示した（バイオルミネセンスとして測定した）（図４Ｂ）。ＥｃＮによる腫瘍内処置は、早い時点で腫瘍中と血清中の両方で、ＩＬ－６およびＴＮＦαの用量依存的な増加をもたらし（データは示さず）、応答の大きさと持続時間は腫瘍内で実質的により程度が高かった。最後に、ＥｃＮのｉ．ｔ．投与によって、生理食塩水を注射した対照と比較して腫瘍成長が有意に遅延した（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、治療ペイロード、例えばＳＴＩＮＧアゴニストの産生を可能にする腫瘍特異的な局在化および強健な腫瘍内代謝活性を示す免疫治療プラットフォームとしてのＥｃＮの使用を支持する。
Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍モデル（マウス黒色腫）における生理食塩水対照と比較して、経時的に、ＳＹＮＢ（ジアミノピメリン酸およびチミジンに対する二重栄養要求性、ならびに内在性ファージの欠失を含有する野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を含む）およびＳＹＮＢ１８９１（ＳＹＮＢ Ｎｉｓｓｌｅ株およびＳＴＩＮＧアゴニストｃｉ－ジ－ＡＭＰを産生するゲノム中に組み込まれたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＦＮＲ誘導性ｄａｃＡを含む）のｉｎ ｖｉｖｏ活性および有効性を決定するために、第２の研究に着手した。
研究用にＳＹＮＢおよびＳＹＮＢ１８９１細菌細胞を産生するために、ＳＹＮＢおよびＳＹＮＢ１８９１の凍結バイアルを解凍し、終夜の振盪フラスコ培養を開始するために使用し、各培養についてバイオリアクターに接種するのに十分なバイオマスを生成した；終夜の振盪フラスコ培養は、３７℃、３５０ＲＰＭでおよそ１５時間インキュベートした。バイオリアクターは、ＦＭ２発酵培地（１２ｇ／Ｌのダイズ加水分解物、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、１．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１１．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４０ｇ／Ｌのグリセロール、０．１２５ｍｌ／Ｌのアンチフォーム２０４、１０ｍＭのチミジン、および０．３ｇ／Ｌのジアミノピメリン酸）を含有する１．５Ｌの発酵培地を含有し、終夜培養物を使用してＯＤ約０．１で接種した。バイオリアクター培養物を、ＯＤが２０に達するまで、６０％のＤＯ、３７℃、ｐＨ７．０で成長させた。採取するために、細胞を５０００ｒｐｍで３０分間スピンダウンさせ、使用済み培地をデカントし、細胞ペレットを１５％のグリセロール、１００ｍＭのリン酸緩衝液中に再懸濁させ、２ｍＬのクライオバイアルにアリコートし、－８０℃で凍結させた。細胞は、連続プレーティングによって試験した濃度であった。
７週齢の、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍保有雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＳＹＮＢ、ＳＹＮＢ１８９１または生理食塩水のいずれかを３回腫瘍内注射した。実験終了まで、様々な時点で、腫瘍体積を測定した。
簡潔には、Ｂ１６．Ｆ１０細胞を８日前に各動物の右腹部中にＳＣで植え込んだ（ＰＢＳ中１００μＬ当たりマウス１匹当たり２×１０＾５個）。腫瘍が約４０～１００ｍｍ＾３に達するまで、腫瘍成長をモニターした。１日目に、以下のように腫瘍内に投与するために、マウスを群（１群当たりＮ＝１０）に無作為化した：生理食塩水（群１、ビヒクル対照）、ＳＹＮＢ（群２、１×１０＾９ＣＦＵ）およびＳＹＮＢ１８９１（群３、１×１０＾９ＣＦＵ）。腫瘍サイズを測定し、１、４、および７日目に、細菌または生理食塩水をマウスにＩ．Ｔ．注射した。
１、４、および７日目に、群に基づいて適切な細菌または生理食塩水（注射用の対照）を動物に投与した。２回の測定の間に１～２日の間隔を空けて１週間に２回、腫瘍体積および体重を記録した。
平均腫瘍体積を、図５に、２１日まで各実験群について示し、個々のマウスについては、図６Ａ（生理食塩水対照）、図６Ｂ（ＳＹＮＢ）および図６Ｃ（ＳＹＮＢ１８９１）に示した。結果は、操作されていないＳＹＮＢ株単独を投与すると、中程度の効果を有し、腫瘍成長が遅延することを示す。さらに、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する株であるＳＹＮＢ１８９１を投与すると、２１日目まで４０％のマウスが腫瘍を有さず、腫瘍成長の有意な制御がもたらされる。
（実施例３）
Ｂａｌｂ／ｃ－Ａ２０腫瘍モデルにおけるＳＴＩＮＧアゴニスト処置の有効性の評価
ｃ－Ａ２０腫瘍モデル（Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫）における、３つの異なる用量での、およびＰＢＳ対照と比較した、経時的なＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのプラスミドに基づくｔｅｔ誘導性ｄａｃＡを含むＳＴＩＮＧアゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ活性および有効性を判定すること。
研究のための細胞を産生するために、終夜培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８～１．０）に達するまで振盪させながら３７Ｃでインキュベートした。採取するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間スピンダウンさせ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートして、－８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティングによって試験した濃度であった。
６週齢の、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡ２０腫瘍を植え込み、ｃ－ｄｉＡＭＰを産生することが可能な細菌産生酵素の３つの異なる用量を腫瘍内注射した。腫瘍体積を様々な時点で測定する一方、実験終了時に腫瘍を秤量し、処理した。
簡潔には、Ａ－２０細胞を１５日前に各動物の右腹部中にＳＣで植え込んだ（ＰＢＳ中１００μＬ当たりマウス１匹当たり２×１０５個）。腫瘍が約１００ｍｍ＾３に達するまで、腫瘍成長をモニターした。０日目に、以下のように腫瘍内に投与するために、マウスを群（１群当たりＮ＝８）に無作為化した：ＰＢＳ（群１、ビヒクル対照）、ＳＹＮ３５２７（群２、１×＾７ＣＦＵ）、ＳＹＮ３５２７（群３、５×１０＾７ＣＦＵ）、およびＳＹＮ３５２７（群４、５×１０＾８ＣＦＵ）。腫瘍サイズを測定し、０、２、および５日目に、細菌またはＰＢＳをマウスにＩ．Ｔ．注射し、その後、４時間後にＡＴＣ（１ｕｇ、Ｉ．Ｐ．）を注射した。
０、３、および７日目に、群に基づいて適切な細菌または生理食塩水（注射用の対照）を動物に投与した。細菌を投与した４時間後に、マウスを、１０ｕｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）で腹腔内注射によって処置した。２回の測定の間に１～２日の間隔を空けて１週間に３回、腫瘍体積および体重を記録した。
得られた腫瘍体積は、この株の投与がＡ２０リンパ腫モデルにおいて用量依存的腫瘍制御を駆動し得ることを示す。
（実施例４）
ファゴサイトーシスおよびＳＴＩＮＧは、ＳＹＮＢ１８９１により媒介されるＩ型インターフェロン誘導を必要とする
Ｉ型ＩＦＮの誘導におけるＳＹＮＢ１８９１の作用機序を評価するために、細菌のファゴサイトーシスをサイトカラシンＤを使用して遮断した。サイトカラシンＤは、アクチン重合を阻害し、ファゴサイトーシスを防止するが、可溶性低分子のエンドサイトーシス／ピノサイトーシスには最小限の効果しか有さない。マウスの骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の、ＧＦＰを発現するよう改変したＳＹＮＢ１８９１（ＳＹＮＢ１８９１－ｇｆｐ）との共培養によって、ＢＭＤＣに関連し、リソソーム関連膜タンパク質ＬＡＭＰ－１を含有する成熟ファゴソーム内に存在する多くの細菌細胞が示された（図７Ａ～７Ｊ）。サイトカラシンＤによる前処置によって、ＢＭＤＣ内に見られる細菌細胞の数が有意に低減したため、ＳＹＮＢ１８９１はＢＭＤＣによって能動的に内部移行した（図７Ｃ）。ＳＹＮＢ１８９１は、ファゴサイトーシスに依存して、対照のＥｃＮと比較して、ＩＦＮβ１の発現を有意に誘導した（図７Ｄ～７Ｊ）。サイトカラシンＤは、標的細胞において、可溶性ｓｍＳＴＩＮＧアゴニストである２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）によるＩＦＮβ１の誘導に影響を及ぼさなかった。したがって、ＳＹＮＢ１８９１のファゴサイトーシスが、標的細胞における細胞内ＣＤＡ放出およびＳＴＩＮＧ活性化に必要とされ、腫瘍内でのＡＰＣの優先的活性化のための自然な機序を提供する。ＩＦＮβ１に加えて、ＳＹＮＢ１８９１、および対照のＥｃＮは、ＩＬ－６およびＴＮＦαなどの他の炎症性サイトカインの分泌を惹起し（図７Ｈ～７Ｊ）、一方、ｓｍＳＴＩＮＧへの曝露はＩＦＮβ１の発現しかもたらさなかった。ファゴサイトーシスの阻害は、ＴＮＦα産生に有意な影響を及ぼさなかったが、ＩＬ－６の発現は２分の１～３分の１に低下させ（図７Ｈ～７Ｊ）、内部移行がシグナル伝達を最適に増強するために必要ではあるが、ＥｃＮは食細胞の表面からの免疫シグナル伝達を開始し得ることを実証した。
ＳＴＩＮＧ－／－ ＢＭＤＣが高レベルのＩＦＮβ１発現を誘導することができなかったため、ＳＹＮＢ１８９１に応答したＢＭＤＣによるＩ型インターフェロン産生は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達に有意に依存した（図７Ｈ～７Ｊ）。ＥｃＮシャシー自体は、おそらくＬＰＳ／ＴＬＲ４の活性化を介して、ＳＴＩＮＧには依存せず、しかしＴＬＲ４には依存して、中間レベルのＩＦＮβ１発現を誘導した。ｓｍＳＴＩＮＧアゴニストに応答したＩＦＮβ１発現は、ＴＬＲ４－／－ ＢＭＤＣにおいて保存され、ＳＴＩＮＧ－／－ ＢＭＤＣにおいては完全に消失した（図７Ｈ～７Ｊ）。ＬＰＳは、グラム陰性細菌の外膜の不可欠な構成成分であり、そのため、ＴＬＲ４によるＬＰＳ認識は、これらの微小生物による免疫応答の誘導において重要な役割を果たす。実際に、ＴＬＲ４シグナル伝達の欠如は、ＳＹＮＢ１８９１および対照のＥｃＮに応答したＢＭＤＣによるＩＬ－６およびＩＬ－１２ｐ３５などの炎症性サイトカインの発現を有意に鈍化させ（図７Ｈ～７Ｊ）、ＬＰＳがＳＹＮＢ１８９１の免疫刺激機序の重要な構成成分であることを示唆した。
まとめると、これらのデータは、ＡＰＣによるＳＹＮＢ１８９１ファゴサイトーシスが、Ｉ型ＩＦＮ応答のＳＴＩＮＧ依存性誘導に必要であることを実証する。さらに、ＳＹＮＢ１８９１のＥｃＮシャシーは、治療薬のファゴサイトーシスによって増幅されるさらなる炎症性サイトカインの発現をもたらす並行したＴＬＲ４依存性シグナル伝達を活性化する。
（実施例５）
Ｂ－１６腫瘍モデル
経時的な、免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーと組み合わせた様々な細菌のｉｎ ｖｉｖｏでの活性および有効性を決定するために、Ｂ－１６腫瘍モデルを使用する。
Ｂ１６腫瘍をマウスに注射し（ＰＢＳ中４０～８０ｍＬ当たりマウス１匹当たり２×１０５個）、次いで、３回の異なる用量の細菌および／または免疫モジュレーターを３日ごとに１週間、腫瘍内注射する。０日目に、以下のように腫瘍内に投与するために、マウスを群（１群当たりＮ＝１６）に無作為化する：ＰＢＳ（群１、ビヒクル対照）、野生型細菌、野生型細菌および免疫モジュレーター、細菌シャシー、ならびに細菌シャシーおよび免疫モジュレーター。腫瘍を実験の終了時に秤量し処理する一方、様々な時点で、腫瘍毒性（重量）および成長を測定する。
結果は、免疫モジュレーターと組み合わせて投与した野生型細菌および細菌シャシーが、抗腫瘍応答を提供することができることを実証することになる。
（実施例６）
ＳＹＮＢ１８９１は有効な抗腫瘍免疫を生じる
Ａ２０腫瘍モデルにおけるＳＹＮＢ１８９１の有効性に対するＴ細胞の寄与を評価するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を処置開始前および枯渇抗体を使用する研究の過程全体を通して枯渇させた。アイソタイプ対照またはＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇抗体で処置したマウスは４０～５０％の完全奏功率を示したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇抗体を受けているマウスでは長期生存率が０％であった（図８）。
これらのデータは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＳＹＮＢ１８９１の長期有効性に決定的に寄与することを実証する。
（実施例７）
ＳＹＮＢ１８９１はヒト抗原提示細胞において複数のＳＴＩＮＧ対立遺伝子を活性化する
最も普及しているＴＭＥＭ１７３（ＳＴＩＮＧ）バリアントのうちの３つを含有するヒト単球（ＴＨＰ－１）ＩＲＦレポーター細胞系のパネルの中で、ＳＹＮＢ１８９１の活性を評価した。ヒト集団に見られる対立遺伝子のうち、それぞれ、ＷＴは５７．９％を表し、ＨＡＱは２０．４％を表し、Ｒ２３２Ｈは１３．７％を表す。ＳＹＮＢ１８９１による処置によって、３つの対立遺伝子すべてについてＩ型ＩＦＮ経路の誘導がもたらされた（図９）。ＨＡＱ対立遺伝子は最も高レベルの誘導を示し、ＷＴおよびＲ２３２Ｈ対立遺伝子は、それぞれ、中間およびより低い活性を示した。レポーターシグナルはＳＴＩＮＧ－／－細胞において有意に減弱されたため、ＴＨＰ－１細胞における活性はＳＴＩＮＧに依存した（図９）。

Claims (55)

  1. 単離された細菌、少なくとも１つの免疫モジュレーター、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記細菌が、野生型細菌または細菌シャシーである、医薬組成物。
  2. 前記少なくとも１つの免疫モジュレーターが、少なくとも１つの免疫イニシエーターである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記免疫イニシエーターが、腫瘍溶解を増強すること、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化すること、ならびに／またはＴ細胞をプライミングおよび活性化することが可能である、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記免疫イニシエーターが、ＳＴＩＮＧアゴニスト、アルギニン、５－ＦＵ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ１、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＲＰα、ＧＭＣＳＦ、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体、４－１ＢＢＬ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、またはアズリンである、請求項２または３に記載の組成物。
  5. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、またはｃ－ｄｉＧＭＰである、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記免疫イニシエーターが、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作された化学療法、または溶解性ペプチドである、請求項２または３に記載の組成物。
  7. 前記免疫イニシエーターがアルギニンである、請求項２に記載の組成物。
  8. 前記免疫イニシエーターが５－ＦＵである、請求項２に記載の組成物。
  9. 前記少なくとも１つの免疫モジュレーターが、少なくとも１つの免疫サステナーである、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記免疫サステナーが、Ｔ細胞のトラフィキングおよび浸潤を増強すること、Ｔ細胞によるがん細胞の認識を増強すること、エフェクターＴ細胞応答を増強すること、および／または免疫抑制を克服することが可能である、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記免疫サステナーが、代謝変換因子、アルギニン、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはＧＩＴＲＬ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはＯＸ４０Ｌ、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体もしくは４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５ ｓｕｓｈｉ、ＩＦＮγ、またはＩＬ－１２である、請求項９または請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記免疫サステナーが、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、またはＴ細胞共刺激受容体リガンドである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記少なくとも１つの免疫サステナーがキヌレニン分解酵素である、請求項９または請求項１０に記載の組成物。
  14. 前記免疫サステナーがアルギニンである、請求項９または請求項１０に記載の組成物。
  15. 前記免疫サステナーがＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、またはｃ－ｄｉＧＭＰである、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記少なくとも１つの免疫モジュレーターが、少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記少なくとも１つの免疫モジュレーターが、前記細菌によって産生されない、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記細菌が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記細菌シャシーが、１つまたは複数の栄養要求性をもたらす、遺伝子における少なくとも１つの突然変異または欠失を含む細菌である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記細菌シャシーが、ｔｈｙＡ栄養要求性および／またはｄａｐＡ栄養要求性を含む細菌である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記細菌シャシーが、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃ． ｎｏｖｙｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏ ｂｏｖｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌である、請求項２０または請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記細菌シャシーが、ファージ欠失をさらに含む、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 腫瘍内投与のために製剤化される、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物を含むシリンジ。
  26. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物または請求項２５に記載のシリンジ、およびそれらを使用するための使用説明書を含むキット。
  27. ｉ）単離された細菌を含む第１の組成物であって、前記細菌が、野生型細菌または細菌シャシーである、第１の組成物と、
    ｉｉ）免疫モジュレーターを含む第２の組成物と、
    ｉｉｉ）それらを使用するための使用説明書
    を含むキット。
  28. 前記第１の組成物が凍結乾燥された組成物である、請求項２７に記載のキット。
  29. 使用するための前記使用説明書が、
    前記第１の組成物が前記第２の組成物の前に対象に投与するためであるか、
    前記第２の組成物が前記第１の組成物の前に対象に投与するためであるか、または
    前記第１および第２の組成物が対象への投与の前に組み合わされるか
    を示す、請求項２７に記載のキット。
  30. 対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、それによって、前記対象におけるがんを処置する方法。
  31. 対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、前記対象に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する方法。
  32. 前記細菌が、前記対象への投与後にファゴサイトーシスを受ける、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記免疫応答の誘導が、前記細菌のファゴサイトーシスによって相乗的に増強される、請求項３１に記載の方法。
  34. 腫瘍を有する対象においてアブスコパル効果を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記アブスコパル効果を誘導する方法。
  35. 腫瘍を有する対象において免疫学的記憶を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記免疫学的記憶を誘導する方法。
  36. 対象における腫瘍の部分的退縮を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、それによって、前記対象における前記腫瘍の部分的退縮を誘導する方法。
  37. 前記部分的退縮が、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％の前記腫瘍のサイズの減少である、請求項３６に記載の方法。
  38. 対象における腫瘍の完全退縮を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、それによって、前記対象における前記腫瘍の完全退縮を誘導する方法。
  39. 前記腫瘍が、薬学的に許容される組成物の投与後に前記対象において検出不能である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記投与するステップが腫瘍内注射である、請求項３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 対象におけるがんを処置する方法であって、
    前記対象に細菌を投与するステップであって、前記細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、ステップと、
    前記対象に、少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップと
    を含み、それによって、前記対象におけるがんを処置する方法。
  42. 対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、
    前記対象に細菌を投与するステップであって、前記細菌が野生型細菌または細菌シャシーである、ステップと、
    前記対象に、少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップと
    を含み、それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する方法。
  43. 前記投与するステップが同時に実施されるか、
    前記対象に前記細菌を投与するステップが、前記対象に前記少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップの前に行われるか、または
    前記対象に前記少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップが、前記対象に前記細菌を投与するステップの前に行われる、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
  44. 前記細菌および前記少なくとも１つの免疫モジュレーターによる処置から利益を得る対象を選択するステップをさらに含む、請求項３０から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記細菌が、前記対象中の腫瘍にコロニー形成する、請求項３０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記細菌を投与するステップが腫瘍内注射である、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記投与するステップが経口投与ではない、請求項３０から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記少なくとも１つの免疫モジュレーターを投与するステップが、静脈内注射または髄腔内注射である、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記細菌が、予め定義された細菌の均一集団を含む、請求項３０から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 予め定義された細菌の前記均一集団が、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記少なくとも１つの免疫モジュレーターが、少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーを含む、請求項３９から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記少なくとも１つの免疫イニシエーターが表５に列挙された免疫イニシエーターから選択され、前記少なくとも１つの免疫サステナーが表６に列挙された免疫サステナーから選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記少なくとも１つの免疫イニシエーターがＳＴＩＮＧアゴニストであり、前記少なくとも１つの免疫サステナーがキヌレニン分解酵素である、請求項５２に記載の方法。
  54. 対象の腫瘍における抗原提示細胞を活性化する方法であって、前記対象に細菌を投与するステップを含み、前記細菌がＳＴＩＮＧアゴニストを産生する細菌シャシーまたは細菌であり、前記細菌が、前記対象において投与後にファゴサイトーシスを受け、それによって、前記対象の前記腫瘍における抗原提示細胞を活性化する方法。
  55. 少なくとも１つの野生型ＳＴＩＮＧ対立遺伝子、ＨＡＱ ＳＴＩＮＧ対立遺伝子、またはＲ２３２Ｈ ＳＴＩＮＧ対立遺伝子を有する対象を選択するステップをさらに含む、請求項３０から５４のいずれか一項に記載の方法。
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