TW201716072A - 治療腹膜癌之組成物和方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於治療個體之腹膜癌的組成物和方法。該方法包括投予經基因修飾以表現嵌合型T細胞受體蛋白之T細胞。該嵌合型T細胞受體蛋白可包括與抗體之腫瘤相關性抗原結合片段融合之T細胞受體信號傳導結構域或與特異性結合腫瘤細胞表面蛋白之天然存在的配體融合的T細胞受體信號傳導結構域。本發明揭示之組成物和方法治療上有效地減少例如腫瘤負荷、腹水、腹膜黏蛋白或血清腫瘤標記物含量。
Description
本申請案主張2015年7月16日提交申請之美國臨時申請案第62/193,217號和2016年2月23日提交申請之美國臨時申請案第62/298,980號的優先權，其全部內容各以引用方式併入本文。
序列表係經由EFS，以文本檔案形式電子提交，其係在2016年7月13日創建且命名為“0962010 125SequenceListing.txt”(13,957字節)，其全部內容以引用方式併入本文。
本發明描述之主題關於經基因工程處理以在表面表現受體蛋白之T細胞的設計和用途，該表現在T細胞表面之受體蛋白結合腫瘤抗原且活化T細胞之活性。該方法包括腹膜內投予嵌合型抗原受體T細胞(CAR-T細胞)以抑制腹膜腔內腫瘤細胞之生長及/或存活。
腹膜假性黏液瘤(Pseudomyxoma peritonei)(PMP)及腹膜轉移癌(PC)為罕見疾病，全世界每年之發病率估計為每百萬人1至2例。PC影響所有結腸直腸癌患者之15%在初期呈現破壞性影響(Coccolini et al,2013,World J Gastroenterol,19：6979-6994)。這些患者通常預後極差且患有許多其疾病之併發症，包括漸進式腸梗阻。最佳治療涉及以溫熱腹膜內化療(hyperthermic intraperitoneal chemotherapy)進行細胞減滅手術(CRS-HIPEC)，此治療法已在具有有限疾病負擔之經高度選擇的患者中獲致一定程度的成功。在CRS-HIPEC期間，切除所有可見之腹膜內腫瘤的塊物體，而殘留之微小疾病係以區域投遞之化療法治療。當CRS後腫瘤負擔小時，CRS-HIPEC為消除任何大於2.5mm之腫瘤結節最有效的方法。結果係取決於腫瘤級別，低級別疾病之5年存活率為63-100%，高級別疾病之5年存活率為0%-65%(Sugarbaker et al.,1999,Ann Surg Oncol,6：727-731)。隨機化之對照試驗證明相較於全身性化療，用於罹患結腸直腸癌PC患者之CRS-HIPEC導致存活率顯著提高(Verwaal et al.,2003,J Clin Oncol,21：3737-3743、Verwaal et al.,2008,Ann Surg Oncol,15：2426-2432)。不幸的是，大多數PC患者並非CRS-HIPEC之候選者且最終疾病進展並死於該疾病(Coccolini et al.,2013,World J
Gastroenterol,19：6979-6994；Cao et al.,2009,Ann Surg Oncol,16：2152-2165)。即使如此，以CRS-HIPEC治療PC的結果表明區域投遞之治療劑為解決此大的、未被滿足之臨床需要的可靠方法。
用於末期實體腫瘤之免疫療法近年來已頗受注意(Hodi et al.,2010,N Engl J Med,363：711-723；Kantoff et al.,2010,N Engl J Med,363：411-422；Khan et al.,2014,J Surg Res,191：189-195；Saied et al.,2014,J Surg Res,187：525-535)。目前之免疫療法有幾種類型，包括疫苗、抗體及免疫細胞注入。用於實體腫瘤之細胞性免疫療法透過施用嵌合型抗原受體T細胞(CAR-T)已有很大的進展。CAR-T特別令人感興趣係部分基於其廣泛適用性，因為其可為幾乎任何患者製造且不受主要組織相容性複合體類型之限制(Eshhar,2010,Curr Opin Mol Ther,12：55-63)。
最近在第I期肝轉移免疫療法臨床試驗(HITM)中測試靶向癌胚抗原(CEA)的CAR-T(NCT01373047，NCT02416466)，檢查這些對抗結腸直腸癌LM之細胞的安全性和臨床活性(Katz et al.,2015,Clin Cancer Res,21：3149-3159)。由於腹膜腔為第IV期CRC患者另一常見的失敗位點，測試區域投遞CAR-T給PC是值得的。雖然區域投遞可增強CAR-T之抗腫瘤效力，瘤內免疫抑制將可能出現另外的挑戰。轉移性實體腫瘤微環境含有許多抑制CAR-T之免疫抑制細胞類型，包
括髓源抑制細胞(MDSC)及調節性T細胞(Treg)(Kershaw et al.,2013,Nat Rev Cancer,13：525-541)。先前已證明MDSC抑制CAR-T細胞並抑制肝B細胞之抗原呈遞功能(Thorn et al.,2014,J Leukoc Biol,96：883-894)。MDSC透過PD-1/PD-L1軸及IDO完成此免疫抑制功能(Burga et al.,2015,Cancer Immunol Immunother,64：817-829)。Treg亦在腫瘤微環境中被充分研究並顯示出經由PD-L1及CTLA4抑制CAR-T(Lee et al.,2011,Cancer Res,71：2871-2881)。
因此，本發明提供用於注入表現嵌合型T細胞受體之免疫反應性細胞以治療被診斷罹患PMP/PC之個體的方法。提供之資料指出這些經基因編程之細胞攻擊表現特定抗原(諸如表現或特異表現在存在於PMP或PC中之腺癌細胞上的抗原)之腫瘤。再者，該資料支持該用於PC之有效IP CAR-T療法將透過抑制免疫抑制細胞群而被進一步增強的想法。
前述相關技藝之實例及與其相關之限制旨在用於說明而用於非排險。熟習本技藝之人士在閱讀專利說明書和研究附圖之後將會清楚明白該相關技藝之其他限制。
下文中所描述和說明之下列態樣及其施態樣意在示例和說明，而非限制範圍。
於一態樣中，提供治療個體之腹膜內腫瘤或癌症的方法，其包含在該個體之腹腔內注入表現嵌合型T細胞受體之經基因工程處理的淋巴細胞群，該嵌合型T細胞受體與腹腔內之惡性細胞上之腫瘤相關性抗原結合。
於一些實施態樣中，該淋巴細胞群包含T細胞、B細胞及/或NK細胞。於其他實施態樣中，該T細胞包含CD4+細胞、CD8+細胞、γ-δT細胞(γδT細胞)、NK T細胞及/或調節性T細胞(Treg)。
於一些實施態樣中，該嵌合型受體係由免疫球蛋白之抗原結合結構域和T細胞受體信號傳導結構域所組成。於其他實施態樣中，該嵌合型受體係由表現在該惡性細胞之細胞表面上的蛋白質之天然配體和T細胞受體信號傳導結構域所組成。
於一些實施態樣中，該方法包含投予能有效減少個體腹腔內之惡性細胞數目的經基因工程處理之淋巴細胞量。於其他實施態樣中，該方法包含投予能有效減少個體腹腔內之惡性細胞團塊的經基因工程處理之淋巴細胞量。再於其他實施態樣中，該腹腔內之惡性細胞的數目及/或團塊係藉由成像測量。
於一些實施態樣中，該方法包含投予能有效減少個體腹腔外之惡性細胞數目的經基因工程處理之淋巴細胞量。於其他實施態樣中，該方法包含投予能有效減少個體腹腔外之惡性細胞團塊的經基因工程處理之淋巴細胞量。再於他實施態樣中，該腹腔外之惡性細胞的數目及/
或質量係藉由成像測量。
於一些實施態樣中，該包含注入經基因工程處理之淋巴細胞的方法導致該腹膜腫瘤細胞之數目減少。於其他實施態樣中，該方法導致該腫瘤之尺寸較第一次投予經基因工程處理之淋巴細胞時或之前縮小至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
於一些實施態樣中，該包含注入經基因工程處理之淋巴細胞的方法導致該腹膜腫瘤之尺寸縮小。於其他實施態樣中，該方法導致腹膜腫瘤之尺寸較第一次投予該嵌合型受體T細胞時或之前縮小至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
於一些實施態樣中，該包含注入經基因工程處理之淋巴細胞的方法導致該腹膜體積較第一次投予經基因工程處理之淋巴細胞時或之前所測量者縮小至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
於一些實施態樣中，該經基因工程處理之淋巴細胞係每週一次、每2週一次、每3週一次、或每4週一次注入個體之腹腔內。
於一些實施態樣中，該經基因工程處理之淋巴細胞為個體之自體細胞。於其他實施態樣中，該經基因工程處理之淋巴細胞並非個體之自體細胞。
於一些實施態樣中，在個體腹腔內注入該經基因工程處理之淋巴細胞包含注入106至1011個經基因工程處理之淋巴細胞。
於一些實施態樣中，該方法包含注入經基因工程處理之淋巴細胞及醫藥上相容之溶液的組成物，該醫藥上相容之溶液在具有或不具有10%之DMSO的生理鹽水中包含嵌合型T細胞受體，其中該組成物之總體積為約100ml至500ml。
於一些實施態樣中，該嵌合型T細胞受體蛋白包含特異性結合表現在腺癌、肉瘤或神經內分泌瘤細胞表面上之腫瘤相關性抗原的胞外結構域。於其他實施態樣中，該腺癌、肉瘤或神經內分泌瘤細胞係存在個體之腹膜腔內。於其他實施態樣中，該腺癌、肉瘤或神經內分泌瘤細胞係存在於個體之腹膜腔外。
於一些實施態樣中，該方法進一步包含在該個體之腹腔內注入第二治療劑。於其他實施態樣中，該第二治療劑為阻斷抑制性細胞內之免疫抑制途徑的免疫抑制細胞抑制劑。再於其他實施態樣中，該抑制性細胞為髓源抑制細胞(MDSC)或調節性T細胞(Treg)。於一些實施態樣中，該第二治療劑抑制由PD-1、PD-L1、PD-L2、IDO、STAT3、GM-CSF、IL 10或TGFβ介導之免疫抑制。再於其他實施態樣中，該第二治療劑為結合PD-1、PD-L1、PD-L2、IDO、STAT3、GM-CSF、IL 10或TGFβ之抗體或其片段。
於一些實施態樣中，該第二治療劑之注入係在注入該表現嵌合型受體蛋白之淋巴細胞之前、期間或之後進行。於其他實施態樣中，該第二治療劑係注入腹腔或
經由靜脈內途徑注入。
第1A和1B圖提供各種抗CEA CAR-T構建體之示意圖。
第2圖顯示由未經轉導之脾細胞及經嵌合型受體轉導之淋巴細胞進行之細胞溶解。
第3A圖顯示帶有腫瘤且已藉由腹膜內(IP)或尾靜脈(TV)注射而被投予經嵌合型受體轉導之淋巴細胞的動物之發光。
第3B圖顯示帶有腫瘤且已藉由腹膜內(IP)或尾靜脈(TV)注射而被投予經嵌合型受體轉導之淋巴細胞的動物之腫瘤體積縮小。
第4A圖顯示帶有腫瘤且已藉由腹膜內(IP)或尾靜脈(TV)注射投予經嵌合型受體轉導之淋巴細胞進行治療且以腫瘤細胞再挑戰之動物的發光。
第4B和4C圖顯示腫瘤在體內被表現嵌合型受體蛋白質(第4B圖)或具有效應子記憶表型之白血球(第4C圖)浸潤。
第5A圖說明IP注入嵌合型受體T細胞對腹膜腔外之腫瘤的治療效果。
第5B圖顯示在TV相對於IP投予嵌合型受體T細胞後，經由生物發光顯示之IP腫瘤縮小。
第5C圖顯示在TV相對於IP投予嵌合型受體
T細胞後，經由測量顯示之側腹腫瘤負擔減少。
第5D圖顯示在IP投予嵌合型受體T細胞後之全身性IFNγ量。
第6A和6B圖顯示在IP腫瘤和脾內存有CD11b+及MDSC(Ly6G+)細胞。
第7A和7B圖顯示在IP腫瘤和脾內存有MDSC Ly6G+和MDSC PD-L1+細胞。
第8A和8B圖顯示在IP腫瘤和脾內存有Treg(FoxP3+)及CD4 T細胞。
第9A圖顯示TV和IP注入嵌合型受體T細胞後第8天對腫瘤負擔的影響。
第9B圖顯示投予結合PD-L1、Gr-1或GITR之抗體對IP注入嵌合型受體T細胞後第8天之效果的影響。
第10A圖顯示TV和IP注入嵌合型受體T細胞後第14天對腫瘤負擔的影響。
第10B圖顯示投予結合PD-L1、Gr-1或GITR之抗體對IP注入嵌合型受體T細胞後第14天之效果的影響。
第11圖顯示投予結合PD-L1、Gr-1或GITR之抗體對IP注入嵌合型受體T細胞後的14天內之效果的影響。
下文中將更詳細地描述各種態樣。然而，該等態樣可以許多不同形式體現且不應被解釋為侷限於本文所闡述之實施態樣；而是，提供這些實施態樣，將使得本發明詳盡且完整，並將本發明之範圍充分傳達給本技藝之技術熟習人士。
除非上下文另有明確說明，如本專利說明書所使用之單數形式“一(a、an)”及“該(the)”包括複數指稱。因此，例如，提及之“聚合物”係包括單一聚合物及二或多個相同或不同的聚合物，提及之“賦形劑”包括單一賦形劑及二或多個相同或不同之賦形劑，等。
當提供一個數值範圍時，其意指介於該範圍之上限和下限之間的每個中間值且該陳述之範圍內的任何其他陳述數值或中間值係包含在本發明之內。例如，若陳述1μm至8μm之範圍，其意指2μm、3μm、4μm、5μm、6μm和7μm，以及大於或等於1μm之數值的範圍和小於或等於8μm之數值的範圍亦被明確揭示。
本文所使用之術語“本本質上純質的”或“本質上經純化的”意指該CAR-T細胞之純度盡可能如藉由本發明所屬之技藝的一般技術人士通常已知的標準技術和方法所取得的純度。然而，對欲為本質上純質之單核細胞而言70%、80%、90%或更高之純度是必要的。
本文所使用之術語“腹膜腔”係指介於體壁和內臟腹膜之間的中空或空間或潛在之空間。
本文所用之術語“腹膜內癌”、“腹膜內腫瘤”、“腹膜內惡性腫瘤”，等係指位於腹膜腔內之惡性腫瘤，包括，例如腫瘤塊或一或多個腫瘤細胞。腹膜癌、惡性腫瘤或腫瘤為起源於腹膜或腹膜腔內之惡性腫瘤。
本文中，術語“患者”、“受試者”、“個體”，等可互換使用且係指適用於本文所描述之方法的任何動物或其細胞，無論是在玻管內或原位。於某些非限制性之實施態樣中，該患者、受試者或個體為人。
如本文所使用之術語“治療有效的”當應用於劑量或量時係指包含本發明之嵌合型受體且進一步包含足以在投予有此需要之個體時導致所需活性之抗藥性多肽的化合物或醫藥組成物(例如，包含免疫細胞，諸如T淋巴細胞及/或NK細胞之組成物)之量。在本發明之背景下，術語“治療有效的”係指足以延遲該病症之表現、阻止進展、緩解或減輕至少一種症狀的化合物或醫藥組成物的量。注意，當投予活性成分之組合物時，該組合物之有效量可包括或可不包括各成分在單獨投予時將為有效之量。
如本文所使用之術語“嵌合型受體”係定義為包含組合在一起之胞外配體結合結構域、跨膜結構域及一或多個胞質共刺激信號傳導結構域的細胞表面受體，該等結構域之組合並不會天然共同存在於單一蛋白質上。尤
其是，這包括其中之胞外結構域及胞質結構域並不會天然共同存在於單一蛋白質上的受體。本發明之嵌合型受體主要欲與T細胞和天然殺手(NK)細胞一起使用。本發明描述之嵌合型受體在此亦可指嵌合型抗原受體(CAR)、嵌合型配體受體或嵌合型T細胞受體。
本文所使用之術語“腫瘤相關性抗原”或“抗原”係指由腫瘤細胞特異表現或由腫瘤細胞以較相同組織類型之非腫瘤細胞更高的頻率或密度表現之抗原。腫瘤相關性抗原可為通常不由該宿主表現之抗原；其可為宿主正常表現之分子的突變、截短、錯誤折疊或其他異常表現；其可與正常表現之分子完全相同但以異常高之水準表現；或者其可在異常的背景或環境中表現。腫瘤相關性抗原可為，例如蛋白質或蛋白質片段、複合碳水化合物、神經節苷脂、半抗原、核酸或這些或其他生物分子之任何組合。
術語“免疫抑制細胞抑制劑”係指能夠減少或抑制哺乳動物之免疫抑制細胞的數量或功能的物質。免疫抑制細胞之實例包括調節性T細胞(“T reg”)、骨髓源性抑制細胞(MDSC)及腫瘤相關性巨噬細胞。
本文所使用之術語“抗體”係指與抗原特異性結合之免疫球蛋白分子。抗體可為源自天然來源或來自重組來源之完整免疫球蛋白且可為完整免疫球蛋白之免疫反應性蛋白。本發明之抗體可以各種形式存在，包括，例如多株抗體、單株抗體、Fv、Fab和F(ab)2，以及單鏈抗
體和人化抗體(Harlow，等人，1999，在：Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow，等人，1989，在Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston，等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird，等人，1988，Science 242：423-426)。
術語“抗體片段”係指完整抗體之一部分且係指完整抗體之抗原決定可變區。
如本文所用之術語“源自抗體之靶向結構域”或“抗原結合結構域”係指含有完整抗原識別和結合位點之最小抗體片段。“Fv”結構域亦指含有完整之抗原識別和結合位點且係由一個重鏈和一個輕鏈可變結構域之緊密、非共價結合的二聚體所組成的最小抗體片段。此構形中各可變結構域之三個高變區交互作用以在VH-VL二聚體之表面上界定一個抗原結合位點。總括而言，該六個高變區賦予該抗體抗原結合特異性。然而，即使是單一可變結構域(或僅包含三個特異於抗原之高度可變區的半個Fv)亦具有識別和結合抗原之能力，儘管係以親和力低於整個結合位點。
如本文所使用之術語“天然配體”係指特異性結合另一天然蛋白質之天然蛋白質。“天然配體”包含全長蛋白質及其特異性結合相同之天然蛋白質之片段二者。如本文所使用之天然配體可經重組產生或合成。
本文所使用之術語“抗原”或“Ag”係定義為激發免疫反應之分子。此免疫反應可能涉及抗體製造或特異性免疫活性(immunologically competent)細胞之活化或此二者。本技藝之技術熟習人士將理解任何大分子(包括幾乎所有的蛋白質或肽)均可作為抗原。再者，抗原可源自重組或基因組DNA。本技藝之技術熟習人士將理解包含編碼引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任一DNA因此而編碼“抗原”(如本文所使用之術語)。
如本文所使用之關於嵌合型T細胞受體的表述“特異性結合”意指嵌合型T細胞受體以大於其與結構上不同之蛋白貿結合之親和力結合其靶蛋白。
如本文所使用之表述“腫瘤負荷”或“腫瘤負擔”係指個體體內之癌細胞數、腫瘤大小或癌症的量。
在研發用於治療彌散性腫瘤(諸如腹膜內腫瘤)的療法中，利用腫瘤選擇性治療劑是有利的。經基因工程處理以表現能識別並結合腫瘤相關性抗原之嵌合型受體(例如CAR T細胞)之免疫治療性細胞越來越多證據證明其為可靠之癌症治療方法。儘管該經基因工程處理之細胞具有靶向腫瘤細胞之能力，然而全身血管內投予仍可能導致腫瘤細胞對CAR-T細胞之暴露不足，及由於CAR-T細胞與正常細胞結合所導致之不良副作用。因此，提供
將CAR-T細胞直接投予至含有該腫瘤之器官或解剖空間的方法是有利的。於本發明之一些態樣中，提供包含腹膜內投予如本發明描述之嵌合型受體淋巴細胞的方法。於一些實施態樣中，該淋巴細胞為T細胞。
目前之CAR T療法涉及將經基因工程處理之細胞經由全身注入投予患者。然而，該等投予方法可能遭遇疾病部位之細胞濃度降低或由於細胞活性而呈現不良副作用。本發明提供用於腹膜內(IP)注入經基因工程處理之免疫細胞以治療經診斷罹患腹膜內癌之患者的組成物和方法，如下述之實驗顯示當與全身注入之細胞相比較，局部IP注入細胞可導致針對腹膜腫瘤之優異保護。再者，投予接受IP細胞(IPC)療法之患者免疫途徑抑制劑可進一步提高治療腹膜轉移之療效。
癌症研究越來越聚焦、在使用免疫系統組分對抗惡性疾病。例如，許多治療性抗體已經證明能成功治療癌症且目前已銷售至全球。最近，基於細胞之免疫療法浮現成為可靠之癌症治療方法，在此治療方法中患者自身之免疫細胞經基因工程處理以識別並攻擊其體內之腫瘤。個體具有惡性腫瘤之診斷可包括測定何種腫瘤抗原蛋白(腫瘤相關性抗原)表現在腫瘤細胞表面上。然後，可以經基因工程處理以靶向並結合腫瘤相關性抗原之抗腫瘤免疫細胞治療個體，最終導致該免疫細胞及可能地，其他共
同投予之細胞或治療劑滅殺腫瘤細胞。本發明揭示經由腹膜內注入經基因工程處理之免疫細胞來治療腹腔內之腫瘤的組成物和方法。
於一態樣中為已經基因工程處理以表現嵌合型受體之淋巴細胞。該用於根據本發明方法使用之淋巴細胞群包括，但不限於T細胞、B細胞和NK細胞。於一些實施態樣中，該T細胞包含CD4+細胞、CD8+細胞、γδT細胞、NK T細胞及/或調節性T細胞(Treg)。特別令人感興趣的為表現嵌合型受體之T細胞(“嵌合型受體T細胞”)。該嵌合型受體免疫細胞係經設計以經由該嵌合型受體蛋白結合該表現細胞表面蛋白之病態或惡性細胞。例如，在腹膜腔內之惡性細胞可表現該癌胚抗原(CEA，GenBank登錄編號NP_04354及其相關同種型)、KIT酪胺酸激酶受體蛋白(GenBank登錄編號P10721)、上皮細胞黏附分子蛋白(EpCAM；GenBank登錄編號NP_002345及其相關同種型)或黏蛋白1蛋白(MUC1，GenBank登錄編號NP_001018016及其相關同種型)(例如Yamamoto et al.,2014,J Cancer Res Clin Oncol,140：607-612；Joensuu,2006,Ann Oncol,17：x280-x286；Chauhan et al.,2009,J Ovarian Res,2：21-29；Flatmark et al.,2013,Int J Cancer,133：1497-1506)。表現在癌細胞上且目前正在研究之用於CAR-T細胞療法的其他抗原靶的實例包括CD20或GD2(濾泡性淋巴瘤)、CD171(神經母細胞瘤)、CD20(非何杰金氏淋巴瘤)、CD19(淋
巴瘤)、IL13Rα 2(膠質母細胞瘤)及CD19(慢性淋巴細胞性白血病或CLL和急性淋巴細胞性白血病或ALL)。病毒特異性CAR-T細胞亦已經研發以攻擊庇藏病毒(諸如HIV)之細胞。例如，使用特異於Gp100之CAR來起始臨床試驗以治療HIV(Chicaybam et al(2011)Int Rev Immunol 30：294-311)。應理解的是，本發明之方法和組成物包括，但不限於上列之抗原靶的。
嵌合型受體蛋白及表現這些蛋白之免疫細胞的產製方法為本技藝所周知並結合配體或抗體或其片段之靶向功能和特異性與免疫細胞之抗腫瘤活性。參見，例如Sadelain et al.,2013,Cancer Discov,3：388-398。該嵌合型受體蛋白從N端至C端之方向包含特異性結合表現在患病之靶細胞(例如存在於腹膜腔內之癌細胞或惡性細胞)表面上之蛋白質的靶的結合結構域、鉸鏈結構域、跨膜結構域及免疫調節性信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該構建體進一步包含與靶的結合結構域之N端融合的信號肽。
於一些實施態樣中，該嵌合型受體蛋白之靶的結合結構域包含免疫球蛋白之抗原結合部分，其中該免疫球蛋白結合在患病細胞之表面上的蛋白質。此構建體在本文中或可稱為嵌合型抗原受體(CAR)。該抗原結合結構域可為結合該細胞表面抗原之任何結構域，包括，但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體、人抗體、人化抗體及其片段。於較佳之實施態樣中，當為CAR構建體的一
部分，該CAR之抗原結合結構域為能夠特異性結合該抗原之抗體片段。在一些情況下，該抗原結合結構域係源自與最終將使用該CAR之物種相同的物種是有利的。例如，用於人類時，該CAR之抗原結合結構域包含人或人化抗體之片段可能是有利的。因此，於一些實施態樣中，CAR之抗原結合結構域部分包含人或人化抗體之腫瘤抗原結合片段。於這些實施態樣之各實施態樣中，該抗體之抗原結合結構域(諸如單鏈可變片段(scFv或Fab))係與T細胞受體之跨膜結構域和信號傳導胞內結構域(endodomain)融合。通常，間隔子或鉸鏈係被引入胞外抗原結合結構域和跨膜結構域之間，以提供允許該抗原結合結構域定向在不同方向的靈活性來促進抗原識別和結合。
於一些實施態樣中，該嵌合型抗原T細胞受體之抗原結合部分的一部分係靶向CEA抗原且包含抗體之CEA結合結構域(其已被證明結合表現在細胞表面上之CEA)。該嵌合型受體構建體可根據本技藝之一般技術人士已知之方法和組成物產生。例如，下列實施例中所使用之CEA CAR-T構建體包含人化MN14抗體之可變結構域之部分(描述於美國專利案第5,874,540號中，該篇之全部內容以引用方式併入本文)。Fab或scFv構建體可根據Nolan等人之方法(1999,Clinical Canc Res,5：3928-3941)從CEA抗體產生以包括該CEA抗體之CEA結合結構域。於一些實施態樣中，該CEA CAR-T構建體包含如
下所示之SEQ ID NO：1的胺基酸序列：
(SEQ ID NO：1)
於一些實施態樣中，該CEA CAR-T構建體進一步包含在SEQ ID NO：1之N端的信號序列，其係在該CEA CAR-T構建體在體內表現後從該構建體裂解。於其他實施態樣中，該信號序列具有序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：2)。然後，該Fab或scFv結構域可與鉸鏈結構域(諸如來自CD8鉸鏈結構域者(參見GenBank登錄編號NP_001759))融合。然後，該鉸鏈結構域可在其C端與跨膜結構域融合。於一實施態樣中，該跨膜結構域係來自CD3 ζ鏈(例如GenBank登錄編號NP_000725)或來自CD28蛋白(例如GenBank登錄編號NP_006130)。然後，該嵌合型構建體之跨膜結構域可與CD3 ζ鏈(例如GenBank登錄編號NP_000725)之信號傳導結構域在其C端融合。
於一些實施態樣中，該CEA結合結構域為來自結合CEA之抗體的scFv或Fab結構域且該嵌合型受體構建體(從N端至C端之方向)包含：CEA結合結構域(例如SEQ ID NO：1)、CD8鉸鏈結構域、ζ跨膜結構域及ζ胞質信號傳導結構域。於其他實施態樣中，該嵌合型受體構建體(從N端至C端之方向)包含：CEA結合結構域(例如SEQ ID NO：1)、CD8鉸鏈域、包含(從
N端至C端之方向)CD28胞外結構域之一部分的結構域、CD28跨膜結構域和CD28胞質共刺激結構域，及ζ胞質信號傳導結構域。
於替代之實施態樣中，已知之表現在腫瘤細胞表面上之蛋白質的配體與T細胞受體信號傳導結構域融合以產生在本文中或稱為“嵌合型配體T細胞受體”或“嵌合型配體受體”者。如同CAR-T細胞，表現嵌合型配體T細胞受體蛋白之T細胞在表現靶的配體受體蛋白之細胞的存在下被活化，導致該經活化之T-細胞以非MHC依賴性方式攻擊該靶細胞。於一些實施態樣中，嵌合型配體受體係經特別設計以包括KIT配體的胞外結構域，該KIT配體為表現在胃腸道間質瘤(GIST)細胞之表面上的結合酪胺酸蛋白激酶KIT蛋白之細胞因子(cKIT受體或CD117)。依PCT刊物第WO 2014/121264號中之描述(亦參見Katz et al.,J Transl Med.,2013,11：46)將嵌合型T細胞受體進行基因工程處理。該抗KIT嵌合型受體表現在T細胞之表面上，該經基因工程處理之細胞當與KIT+腫瘤細胞共同培養時能夠增殖並產生IFNγ。再者，具有已建立之GIST異種移植物並以抗KIT嵌合型配體受體T細胞治療之小鼠顯示出腫瘤生長速率顯著降低。因此，可理解的是，該等嵌合型配體受體T細胞可根據本文所描述之方法用於治療腹膜癌。第1A和1B圖中提供二種用於本文所描述之方法中的替代之CAR-T構建體的示意圖。
該嵌合型T細胞受體之細胞內信號傳導結構域係在CAR之抗原結合結構域或嵌合型配體受體之配體部分與靶的抗原結合時被活化。一般而言，該內源性CD3 T細胞受體之ζ結構域係作為信號傳導結構域。然而，最近，第二代CAR分子已經被設計成進一步包括另一來自共刺激受體(諸如CD28，41BB或ICOS)之胞內信號傳導結構域以提供額外之信號予該經基因工程處理之T細胞，此可提高其效力及/或存活力。第三代嵌合型T細胞受體組合多個信號傳導結構域或附加區以提供新穎之功能。因此，於一些實施態樣中，該胞質結構域進一步包含一或多個選自由下列所組成之群組的共刺激結構域：OX-40共刺激結構域、HVEM共刺激結構域、41BB共刺激結構域、ICOS共刺激結構域，OX40共刺激結構域及CD27共刺激結構域。於一實施態樣中，該另外之共刺激結構域係位在CD28共刺激結構域和CD3-ζ信號傳導結構域之間。
以嵌合型受體基因工程處理以高度特異性地識別和滅殺腫瘤之淋巴細胞在獲致可靠的臨床效果後已獲得相當大的關注(Grupp et al.,2013,N Eng J Med,368：1509-1518；Porter et al.,2011,N Eng J Med,365：725-
733；Sadelain et al.,2009,Curr Opin Immunol,21：215-223)。可用於本發明之方法中的淋巴細胞類型包括，但不限於經基因工程修飾以表現嵌合型受體之外周血供體淋巴細胞(Sadelain,M.,et al.2003,Nat Rev Cancer 3：35-45)、源自腫瘤活組織檢查中之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的淋巴細胞培養(Panelli,M.C.,et al.2000 J Immunol 164：495-504；Panelli,M.C.,et al.2000 J Immunol 164：4382-4392)及採用人工抗原遞呈細胞(AAPC)或脈衝之樹突狀細胞選擇性地在玻管內擴充的抗原特異性外周血白血球(Dupont,J.,et al.2005 Cancer Res 65：5417-5427；Papanicolaou,G.A.,et al.2003 Blood 102：2498-2505)。T細胞可為自體的、非自體的(例如同種異體)或在玻管內從經基因工程處理之祖代細胞或幹細胞衍生者。T細胞可依通常以外周血淋巴細胞(PBL)或腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)執行之方法大量製備。T細胞可使用，例如CD4、CD8、CD62L純化。
免疫反應細胞(例如T細胞、CTL細胞、NK細胞)之基因修飾可藉由以重組DNA或RNA構建體轉導本質上同質之細胞組成物來完成。較佳地，採用逆轉錄病毒載體(無論是γ逆轉錄病毒或慢病毒(lentiviral))將DNA或RNA構建體引入宿主細胞基因組。例如，可將編碼與抗原(例如腫瘤抗原或其變體或其片段)結合之受體的多核苷酸選殖入逆轉錄病毒載體，並可從其內源啟動子、從逆轉錄病毒長端重複子或從另一內部啟動子驅動該
多核苷酸表現。亦可使用非病毒載體或RNA。可使用隨機染色體整合、或靶向整合(例如使用核酶、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)及/或群集之規律間隔的短回文重複序列(palindromic repeats)(CRISPR))或轉基因表現(例如使用天然或經化學修飾之RNA)。
在初次細胞基因修飾以提供嵌合型受體表現細胞方面，通常採用逆轉錄病毒載體來用於轉導，然而可使用任何其他合適之病毒載體或非病毒投遞系統。在接續之細胞基因修飾以提供包含抗原呈遞複合物(其包含至少二個共刺激配體)之細胞方面，逆轉錄病毒基因轉移(轉導)同樣證明是有效的。逆轉錄病毒載體與適當之包裝線的組合亦合適，其中該殼體(capsid)蛋白將具有感染人細胞之功能。
再於另一態樣中，本發明係針對協助投予如本文所描述之經轉導的T細胞予有此需要之個體的醫藥組成物。根據本發明之經轉導的T細胞可與適當之載體或稀釋劑(其進一步可為醫藥上可接受的)一起製成醫藥組成物或製成適合體內投予之植入物。製造該等組成物或植入物之方式在本技藝中已有描述(參見，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack,ed.(1980))。在適當情況下，該經轉導之T細胞可以通常方式配製成半固體或液體形式之製劑，諸如膠囊劑、溶液、注射劑、吸入劑或霧化劑以用於各別投予途徑。本技藝已知之方式可
用於預防或使該組成物之釋出和吸收最小化直到其到達靶的組織或器官，或確保該組成物之定時釋出。然而，理想的是採用不會使該表現嵌合型受體之細胞失效的醫藥上可接受之形式。因此，理想的是該經轉導之T細胞可被製成含有平衡之鹽溶液(較佳為Hanks'平衡鹽溶液或生理鹽水)之醫藥組成物。例如，該組成物可與生理學上可接受之載體或賦形劑一起配製以製備醫藥組成物。該載體和組成物可為無菌的。該調製劑應適合該投予模式。
合適之醫藥上可接受之載體包括，但不限於：水、鹽溶液(例如氯化鈉)、鹽水、經緩衝之鹽水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯膠、植物油、苄醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(諸如乳糖、直鏈澱粉或澱粉、右旋糖)、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、芳香油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮，等，以及彼等之組合。若需要時，該醫藥製劑可與佐劑混合，該佐劑為，例如不會有害地與該活性化合物反應之潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳香物質，等。
若需要時，該組成物亦可含有少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩衡劑。該組成物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、持續釋出之調製劑或粉末。該組成物可與習知黏合劑和載體(諸如甘油三酯)一起被配製成栓劑。口服調製劑可包括標準載體，諸如製藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖
精鈉、纖維素、碳酸鎂，等。
該組成物可根據常規程序配製成適於投予人類的醫藥組成物。例如，用於靜脈內投予之組成物通常為在無菌等張水性緩衝液中之溶液。當需要時，該組成物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑以減輕注射部位之疼痛。一般而言，該成分係單獨提供或一起混合在單位劑型中，例如為在密封容器(諸如指示該活性化合物之量的安瓿或小袋)中之凍乾粉末或無水濃縮物。當欲藉由注入投予該組成物時，其可以含有無菌製藥級水、鹽水或右旋糖/水之輸液瓶配發。當該組成物係藉由注射投予時，可提供無菌注射用水或鹽水之安瓿，從而可在投予前混合該成分。
本發明之包含經基因修飾的免疫反應性細胞之組成物可方便地以無菌液體製劑(例如等滲水溶液、懸浮液、乳劑、分散劑)或黏性組成物之形式提供，該無菌液體製劑可經緩衝成選定之pH。液體製劑通常較凝膠、其他黏性組成物和固體組成物容易製備。此外，液體組成物較方便投予，尤其是藉由注射。另一方面，黏性組成物可被配製成在合適之黏度範圍內以與特定組織接觸較長之時間。液體或黏性組成物可包含載體，該載體可為含有，例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝之鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇，等)及彼等之合適混合物的溶劑或分散介質。
本技藝之技術熟習人士將認知該組成物之組分應選擇為化學惰性且不會影響如本發明描述之經基因修
飾的免疫反應性細胞的存活力或效力。這對化學和製藥技藝之技術熟習人士將不會有問題，或者問題可經由參考標準教科書或藉由來自本發明及本文所引用之文獻的簡單實驗(不涉及過度的實驗)而輕易地避免。
本發明描述用於腹膜內注入淋巴細胞的組成物和方法，該淋巴細胞表現嵌合型受體T細胞並藉此靶向和結合腹膜腔內之惡性細胞，從而抑制腫瘤細胞生長或腫瘤細胞死亡。腹膜內投予可在該腫瘤位置提供較高之治療劑濃度以將療效最大化並將該治療性細胞之全身性毒性減至最低。本文所提供之數據顯示出與全身注入相比較，經由IP注入投予時經基因工程處理之淋巴細胞具有顯著較大之效力。這些細胞之治療效力藉由使用免疫抑制性細胞之抑制劑增強。
嵌合型受體淋巴細胞之治療用途涉及從經診斷患有癌症之個體收穫白血球，分離並培養該淋巴細胞，以含有該嵌合型受體基因之載體轉化該淋巴細胞，並對個體投予所產生之經基因工程處理的淋巴細胞。製備之用於投予個體的細胞可包含經純化之細胞群，例如CD4+T細胞。本技藝之一般技術人士可使用各種已知方法，諸如螢光活化之細胞分選(FACS)輕易地測定該經基因工程修飾之淋巴細胞在群體中的百分比。
該嵌合型受體T細胞可在任何生理上可接受
之載劑中投予。於一些實施態樣中，投予約具1×106至1×1011、1×106至1×1010、1×106至1×109、1×107至1×1011、1×107至1×1010、1×107至1×109或1×108至1×109個細胞之劑量。於其他實施態樣中，投予約具1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010或1×1011個細胞之劑量。被認為有效之劑量的精確測定可根據每一個體之個別因素，包括其大小、年齡、性別、體重及該特定個體之狀況。劑量可由本技藝之技術熟習人士從本發明和本技藝之知識輕易地確定和輕易地調整。包含嵌合型受體T細胞之群體的較佳純度範圍為約70至約75%、約75至約80%、約80至約85%；且更佳地，該純度為約85至約90%、約90至約95%及約95至約100%。該細胞可藉由，例如注射或導管投予。細胞亦可藉由微創外科技術投予。
該嵌合型受體T細胞係在一段期間內經由腹膜內注入投予患者一次、2次、3次、4次或5次。該期間可為約1個月、2個月、3個月、4個月或5個月。例如，在一週之期間內投予該嵌合型受體T細胞之劑量一次、二次、三次或四次。此外，該一週給藥方案係每週、每隔一週、或每3週或每個月進行。或者，該一週給藥方案係每隔一週進行。於一實施態樣中，該嵌合型受體T細胞之劑量係每週、每隔一週投予3次。該給藥方案係持續到腫瘤負荷相對於投予第一個嵌合型受體T細胞劑量前之腫瘤負荷減少達至少5%、10%、15%、20%、25%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
於一些實施態樣中，該嵌合型受體T細胞係投予曾經歷縮減腫塊手術之患者以使患者成為手術所可能達到之無疾病狀態。緊接在手術後，或手術後1、2或5天之內，該患者接受腹膜內注入CAR-T細胞。
有效之嵌合型受體T細胞療法係部分藉由測定該嵌合型受體T細胞之最佳劑量實現。嵌合型受體T細胞治療之治療有效劑量可，例如藉由CT或PET掃描或MRI成像為患者之腹部照像來測定。治療有效劑量將減少藉由成像測定之惡性腫瘤的體積及/或數量達至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%、或100%。治療有效劑量預期將在投予第一個嵌合型受體T細胞劑量後約5天、1週、2週、4週、6週或10週內減小腹部惡性腫瘤之體積及/或數量。或者，治療有效劑量將在給藥期間內減少惡性腹水及/或腹膜內黏蛋白之量或體積達至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。治療有效劑量亦將在給藥期間內減少血清腫瘤標記物(若適用於該標靶腫瘤類型)達至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。
使用本文所描述之方法，藉由IP注入嵌合型受體淋巴細胞證明嵌合型受體T細胞的效力。在藉由IP注入未經修飾之T細胞或抗-CEA CAR-T細胞治療的小鼠中，與未經治療或以未經修飾之T細胞治療的動物相比
較，腫瘤負荷顯著減少。本技藝之一般技術人士將理解本文描述之方法可使用任何嵌合型受體T細胞(例如CAR-T細胞或嵌合型配體受體T細胞)來減少腫瘤負荷，該嵌合型受體T細胞已經基因工程處理以經由該嵌合型T細胞受體特異性結合表現在該腫瘤細胞之表面上的靶蛋白或抗原。
如下列實施例所示，在具有PC之小鼠中直接IP注入CAR-T對控制腫瘤較全身注入更有效。在IP注入後可在腹膜腫瘤內檢測到CAR-T，然而在全身注射後CAR-T並不存在於腹膜腫瘤內。使用如本文所描述之IP CAR-T注入法治療惡性腫瘤同樣導致不利的副作用減少。
本文所描述之組成物和方法係用於治療被診斷具有腹膜內腫瘤之患者。該患者首先接受診斷性腹腔鏡術(laparoscopy)以溶解任何腹膜黏連，以確保在IP注入CAR-T後之最佳CAR-T分佈。此診斷性腹腔鏡術亦可用於評估疾病、取得治療前細胞或組織標本及/或放置腹膜透析導管。該IP CAR-T注入可在同一天稍後或在第二天進行。
IP注入CAR-T包含注入具有約1×109至1×1011或約1×1010個細胞之初始劑量入腹膜腔。該CAR-T細胞係懸浮於生理溶液，諸如生理鹽水中。於一些實施態樣中，該溶液含有約5%至15%或約10%之二甲亞碸(DMSO)。於一些實施態樣中，在IP注入CAR-T前不久，從腹膜腔排出腹水。於其他實施態樣中，在注射
CAR-T細胞之劑量前進行抽吸以確認無血液及/或腸內容物存在。
IP注入CAR-T細胞之劑量可以手工及在室溫下進行。於一些實施態樣中，該劑量係在約5分鐘至60分鐘、約30分鐘至120分鐘、約5分鐘至30分鐘、約5分鐘至20分鐘、或約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘之期間內注入。注入可在門診設置中進行。
在初次IP注入後可投予一或多個CAR-T細胞之額外劑量。例如，可每週、每3天或每5天投予一個額外之劑量，其中該額外劑量係投予一次、二次或三次。於其他實施態樣中，每週、每3天或每5天投予一個額外劑量，直到注入後評估無法在腹膜腔內檢測到惡性腫瘤。於一些實施態樣中，該額外劑量等於該初始劑量。於其他實施態樣中，就CAR-T細胞之數目而言，該額外劑量為該初始劑量之約75%、90%、120%或150%。於一較佳之實施態樣中，每週IP投予該患者一次具有約1×1010個細胞之額外劑量，共2至3週。
於一些實施態樣中，提供用於治療其中腫瘤細胞係位於腹膜腔外之惡性腫瘤的方法。進行研究以測定IP注入CAR-T是否能減少或抑制具有同時發生之PC的小鼠之側腹腫瘤生長。IP注入CAR-T能顯著限制遠端側腹腫瘤生長，同時誘導顯著之IP反應(參見實施例6)。CAR-T未在該側腹腫瘤內檢測到，這表明該側腹腫瘤反應
係由IFNγ激增，此係在IP CAR-T治療後4天檢測到(第7D圖)。IP注入CAR-T而重大破壞腹膜腫瘤可能已引起類似於在放射療法中所見到之伴隨遠隔效應(abscopal effect)的現象(Park et al.,2015,Cancer Immunol Res,3：610-619)。或者，CAR-T可能在較早之時間點已滲入該側腹腫瘤。令人驚訝地，全身注入亦未導致有意義之側腹腫瘤反應，此可能反映藉由此路徑之CAR-T給藥不足，因為大多數細胞可能流至結節、肺和脾。重要的是，根據血清IFNγ含量短暫激增，遠端皮下腫瘤之反應較IP腫瘤之反應不持久。在腹腔外疾病之背景下，依序之局部和全身性療法可能提高對PC之療效。因此，於一些實施態樣中，提供藉由IP注入嵌合型受體淋巴細胞，接著全身注入嵌合型受體淋巴細胞來治療被診斷患有腹膜惡性腫瘤之個體的治療方法。
由於PC可具有延長之自然史，檢查IP注入CAR-T後防止IP腫瘤生長的持久性(參見實施例4)。在重複IP CAR-T給藥後，小鼠免於重複IP CAR-T挑戰長達另外10天。長達28天後仍可在PC內檢測到CAR-T。此發現表明CAR-T在腹膜腔內的持久性，CAR-T可能取得效應子記憶特性。與第10天相比較，第28天在IP腫瘤內所檢測到之具有效應子記憶表型(CD44+CD62L-CCR7-)之CAR-T的比例較多。這些數據表明在初次IP注入後，CAR-T經受效應子記憶編程，這可能係由於腹膜腔內之長期抗腫瘤保護作用。
嵌合型受體的T細胞注入之治療效力可能被導致免疫抑制之因素(例如腫瘤殺傷細胞受抑制或抗腫瘤細胞因子之表現減少)影響。考慮在癌之存在下腹膜腔之免疫環境的影響，並據此治療接受嵌合型受體T細胞療法之患者是重要的。
免疫抑制性調節性T細胞(Treg)和源自骨髓之抑制細胞(MDSC)在腫瘤微環境內積聚代表發展有效之抗腫瘤免疫療法的可能重大障礙(Weiss et al.,2014,J Immunol.,192：5821-5829)。排除MDSC已證明能顯著改善荷瘤小鼠和癌症患者之免疫反應(Ostrong-Rosenberg et al.,2009,J Immunol,182：4499-4506)；Talmadge,2007,Clin Cancer Rres,13：5243-5248)。本發明提供藉由，例如Treg和MDSC抑制接受嵌合型受體T細胞療法之患者的免疫抑制之方法，其中該患者亦被投予抑制免疫抑制細胞功能之試劑。
為了檢查以嵌合型受體T細胞治療時免疫抑制活性之程度，在攜帶MC38腫瘤細胞之C57BL/6小鼠中決定Treg和MDSC之特徵。具體地說，就Treg和MDSC之被認為參與抑制活性作用的細胞表面標記物、細胞因子及酶來決定彼等之特徵。如下列實施例7中所示，研究證明MDSC和Treg可能同時在IP腫瘤內被檢測到。MDSC和Treg二者已被完善描述為內源性T細胞和CAR-T抗腫
瘤反應之抑制劑(Khaled et al.,2013,Immunol Cell Biol,91：493-502；Burkholder et al.,2014,Biochim,Biophys Acta,1845：182-201)。IP MDSC亦表現高水準之PD-L1(程序性死亡-1受體配體)，該PD-L1先前被證明為抑制CAR-T之重要介導子(Burga et al.,2015,64：817-829)。添加結合Gr1(粒細胞性骨髓標記物蛋白)之MDSC耗盡抗體或PD-L1阻斷抗體治療可增強IP CAR-T在腫瘤滅殺方面的性能。IP CAR-T和抑制細胞靶向之促進性加成效果提供組合策略在研發固體腫瘤免疫療法上的正當性。因此，於一些實施態樣中，提供用於治療經診斷患有腹膜癌之個體的方法，其中係經由IP注入來投予個體如本文所描述之表現嵌合型受體的淋巴細胞群且其中亦投予該個體抑制該抑制性T細胞(諸如MDSC或Treg)之活性的免疫抑制劑。
於一些實施態樣中，該免疫抑制劑為結合IL10、PD-1(程序性死亡-1受體)、PD-L1(程序性死亡-1受體配體1)、PD-L2(程序性死亡-1受體配體2)、IDO(吲哚胺2,3-dexoygenase)、STAT3(信號轉導子及轉錄活化子3)、GM-CSF、CD25、GITR(糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白)、TGF-β或CTLA4的抗體。於其他實施態樣中，該免疫抑制劑係在IP投予嵌合型受體淋巴細胞之前投予個體。再於其他實施態樣中，該免疫抑制劑係在IP投予嵌合型受體淋巴細胞之後投予個體。該免疫抑制劑可在IP投予該嵌合型受體淋巴細胞之後，例如
每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天或每週(每7天)投予多次或1次。該免疫抑制劑可在IP投予嵌合型受體淋巴細胞之同一天投予。該免疫抑制劑可在IP投予該嵌合型受體淋巴細胞之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更久前投予。可投予患者一個以上之免疫抑制劑，例如可將結合CD25之抗體和結合GR1之抗體共同投予或依次投予個體。
本發明之嵌合型受體T細胞可單獨使用或與其他療法組合使用。免疫調節劑可包括，但不限於介白素，例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL7、IL12、IL21以及其他10種白介素、集落刺激因子，諸如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，及干擾素，諸如γ干擾素和紅血球生成素(erythropoietin)。其他免疫調節劑可包括經過設計以靶向免疫抑制途徑之單株抗體或小分子，諸如分別結合TGFβ或IL 10，從而阻斷TGFβ或IL 10之功能的抗體或其片段。
於一較佳之實施態樣中，嵌合型受體T細胞之投予係聯合投予一或多種如上列之抑制嵌合型受體T細胞抑制子途徑的藥劑。例如，有此需要之患者同時接受腹膜內注入嵌合型受體T細胞及能增加該嵌合型受體T細胞在腹膜內注入後之原位存活力的試劑。於一較佳之實施態樣中，該患者係經投予嵌合型受體T細胞及IL 2之劑
量。增加該嵌合型受體T細胞之存活力的試劑可在投予嵌合型受體T細胞之前、期間或之後投予。
下列實施例本質上為說明性且不欲在任一方面作為限制。
根據Emtage等人之方法(2008,Clin Cancer Res,14：8112-8122)預先產生用於本文所描述之實施例中的抗CEA scFv-CD28/CD3 ζ(串聯)嵌合型抗原受體。簡單地說，串聯分子係藉由將hMN14 sFv-CD8鉸鏈節段與特異性結合編碼胞質結構域之構建體的CEA上游之單株抗體進行分子融合來產生，該構建體包含(從N端至C端之方向)人CD28胞外結構域、CD28胞質結構域及ζ胞質結構域。將所產生之嵌合型構建體選殖入逆轉錄病毒載體並藉由限制性酶切和測序驗證。
在本研究方面，從Jackson實驗室購買6至8週齡之B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(CD45.1)小鼠以用於產生當在活體外從組織分離時可區別的CAR-T。根據機構護理和使用委員會之指導原則，在無病原體之條件下，將小鼠安置在Roger Williams醫療中心的動物設施中。以無菌方式收穫CD45.1小鼠脾臟，然後粉碎之。將紅血球溶
解並使用MACS免疫磁珠分離法(Miltenyi公司)分離出T細胞。將T細胞培養在帶有IL-2(500IU/mL)和抗CD3/CD28 T-活化劑Dynabeads(Life Technologies公司)之完全培養基中48小時，以達到活化。使用庇藏hMN14 sFv-CD8 α-CD28/CD3 ζ CAR之Phoenix Ecotropic細胞(Emtage等人，2008，臨床癌症研究，14：8112-8122)來產生用於轉導之上清液。將經活化之T細胞培養在逆轉錄病毒上清液中並進行二次離心感染(spinfection)。在IL-2(500IU/mL)之存在下培養並擴增該經轉導之T細胞，在轉導後48小時檢查CAR之表現水準。
在轉導後48小時，使用流式細胞術，藉由測量CD3+細胞上之CAR表現和特異性結合CEA CAR-T分子之sFv部分的抗體來確認鼠脾細胞之轉導。使用標準門控策略來鑑定可存活之表現CD3的單一細胞和嵌合型抗CEA CAR-T。結果顯示出病毒轉導效力為約73%(數據未顯示)。
使用以編碼人CEA之基因穩定地轉染之MC38細胞作為靶細胞和螢火蟲螢光素酶在玻管內測試由該經轉導之CAR-T細胞進行的滅殺。首先，以人類CEA基因穩定地轉染MC38細胞來產生MC38CEA+細胞。以pLenti-III-UbC-螢光素酶(應用生物材料公司，加拿大卑
詩省Richmond)轉染MC38CEA+細胞來產生MC38-luc。效應子細胞為依實施例1中之描述產生的CEA CAR-T細胞或為未經轉導之脾T細胞(其係作為效應子細胞之陰性對照組)。進行生物發光分析，其中將CAR-T或未經轉導之T細胞與MC38CEA-luc在各種效應子：靶的之比率下共同培養。在分析前，將效應子培養在具有IL-2(500IU/mL)之完全培養基中。在各種效應子：靶的之比率下將細胞平皿接種在96孔光學盤中之完全培養基中並培育一整夜。培育後，丟棄培養基並在96孔光學盤中之孔中加入螢光素(150μg/mL)。在IVIS 100中分析該光學盤。收集上清液並測量發光活性，依100×[(實驗滅殺-自發性發光)/(最大滅殺-自發性發光)計算特異性細胞溶解%。從第2圖可知，經轉導之CAR-T細胞以明顯較未經轉染之細胞為高的速率引起細胞溶解。在低至0.03：1之效應子：靶的比率下，特異性細胞溶解為40%並明顯高於經活化之未經轉導的T細胞(p=0.02)。
為了證明與全身性尾靜脈(TV)注入相比較，IP投遞改善CAR-T在具有腹膜癌(PC)之小鼠中的效力，在具有已建立之IP腫瘤的小鼠中研究二種注入方法。藉由IP注射MC38CEA-luc細胞來產生庇藏CEA+PC之小鼠。
從Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)購得6至8週齡之C57B1/6J小鼠並用於所有體內模型中。在第0天，使用連接1ml注射器之26 x½”針頭，經由腹膜內途徑為小鼠注射2.5×106個MC38CEA-Luc細胞。細胞已被再懸浮於注射用之生理鹽水中並在室溫下進行注射。將針頭穿過中線筋膜至高於恥骨聯合之2至3mm，在注射前先回吸以確認無血液或腸內容物存在。體內工作進行為期14天。在第3和6天，經由IP或IV注入以CAR-T(2.5×106個細胞)治療荷瘤小鼠。第3天開始，每日投予所有小鼠IL-2(1000IU/注射)連同第一個CAR-T注射。在第3和6天以未經轉導之脾細胞治療對照組小鼠或以單獨之IL-2治療之。在生物發光方面，在注射200μL之15mg/mL螢光素後，在體內研究之偶數日在IVIS 100成像台(Caliper Life Science)上為小鼠照像。
數據呈現於第3A和3B圖中。第3A圖中，圖上的每一條線代表4隻小鼠之平均值。在比較TV與IP CAR-T投遞之體內研究的第4至14天之間計算腫瘤發光之減少倍數，結果顯示在於第3B圖中。第3A和3B圖中之誤差棒代表SEM值。使用學生t檢驗計算P值。
局部投遞IP CAR-T之單次治療導致腫瘤負擔顯著減少(p<0.01)，且在隨後之各個時間點與未經治療之動物相比較時，這差異仍是顯著的。在第二次CAR-T治療後長達8天內，IP注入CAR-T保持較全身性TV CAR-T更有效。相對於IP CAR-T，與未經治療之動物相
比較下，TV CAR-T直到第14天對腫瘤生長並無顯著影響(p=0.04)。經IP CAR-T治療之小鼠顯現出在第4至14天之間腫瘤負擔降低37倍，然而經TV CAR-T治療之小鼠顯現出在相同期間內腫瘤負擔僅降低3倍(p=0.05)(第3B圖)。在4隻以局部投遞之IP CAR-T治療的小鼠中，在第14天驗屍時無可檢測到之腫瘤。然而，在同一天藉由生物發光監視時仍可檢測到顯微腫瘤。相反地，所有經TV治療之動物在驗屍時均具有目視可見之IP腫瘤。
已經證實IP CAR-T注入優於全身性投予，進行研究以評估該針對IP腫瘤挑戰之保護作用的經久性。在IP CAR-T注入治療後，以IP腫瘤注射重新挑戰小鼠並藉由生物發光監測腫瘤進展。在此研究中，小鼠在第2、4、6和8天接受CAR-T，並在第10天接受一個2.5×106 MC38CEA-luc之再挑戰劑量。依實施例3中之描述，藉由生物發光測定腫瘤生長。
已接受先前CAR-T IP注入之小鼠證明與未接受先前CAR-T治療之小鼠相比較，腫瘤生長顯著下降(p=0.02)。在腫瘤再挑戰後，防止IP腫瘤生長之保護作用可延長達10天(p=0.01)(第4A圖)。比較在第10天(n=5)和28天(n=3)二個時間點從IP腫瘤組織回收
之CAR+淋巴細胞之頻率。收穫少量之可見腫瘤且發現CAR-T在第10天包含69%之腫瘤內白血球，在第28天包含47%(第4B圖)。在第10天(n=5)和28天(n=3)二個時間點使用流式細胞術檢查CAR+表型之記憶表型，其中將腫瘤內CAR-T進行免疫表型分類。以針對CD62L(MEL-14，BD Bioscience公司)、CCR7(4B12，BD Bioscience公司)及CD44(IM7，BD Bioscience公司)之抗體使用標準門控策略。在腫瘤內CAR-T細胞中檢測到具有效應子記憶表型(CAR+CD44+CD62L-CCR7-)之CAR-T的比例增加(第4C圖)，這表明初次IP注入後，CAR-T的細胞經歷效應子記憶編程。
考慮具有IP腫瘤之患者可能在其他解剖部位患有疾病，進行研究以測定IP注入CAR-T是否防止皮下側腹腫瘤生長。為小鼠同時在IP和左側腹注射1.0×106個MC38CEA-luc細胞。以側徑器測量側腹腫瘤之二維尺寸(mm2)。在體內研究期間，依實施例3之描述在注射200微升之15mg/mL螢光素後，在體內研究之偶數日在IVIS 100(Caliper Life Science)上為小鼠照像。
在第3和6天的二次治療後，與未經治療之動物(p<0.05)和接受未經轉導之脾T細胞的動物(數據未顯示)相比較，IP CAR-T導致IP和側腹腫瘤負擔減
少。當與經由TV接受CAR-T之小鼠和僅接受IL-2支持之小鼠相比較，腫瘤減少亦趨向正面。此對應於經IP CAR-T治療之小鼠與在同一天未經治療之動物相比較時，側腹腫瘤面積顯著較少(p=0.03，第5A、5B和5C圖)。CAR-T在用於全血、側腹腫瘤組織或左腹股溝淋巴結中之運輸的流式細胞儀染色後未做回收。然而，IP注入CAR-T確實導致治療後第4天之高水準的全身性IFNγ(第5D圖)。
雖然IP注入CAR-T可在具有PC之小鼠中介導持久反應，免疫抑制細胞可能限制CAR-T功能是值得考慮的。MDSC和Treg(其先前已在結腸直腸癌LM模型中被證明能夠抑制CAR-T(Burga et al.,2015,Cancer Immunol Immunother,64：817-829))可在IP腫瘤內檢測到。
依實施例3中之描述使用流式細胞術進行腫瘤白血球內容之免疫表型分類以檢測是否存有抑制細胞群。用於這些表面標記之抗體：CD4(RM4-5，BD Bioscience公司)、CD11b(M1/17，BD Bioscience公司)、Ly6C(AL-21，BD Bioscience公司)、Ly6G(1AB，BD Bioscience公司)、PD-L1(MIH5，BD Bioscience公司)。以小鼠FoxP3滲透套組(BD Bioscience公司)
進行胞內FoxP3染色。每次實驗使用單染色和同種型對照。以FlowJo軟體(Tree Star公司，奧勒岡州Ashland)分析取得之流動樣本。
進行腫瘤白血球內容之免疫表型分類以檢測是否存有抑制性細胞群。在CD11b、Ly6C和Ly6G染色之後，在腫瘤中發現MDSC。代表性點狀圖顯示出來自IP腫瘤之MDSC，連同條形圖比較來自腫瘤及未經治療之相同動物之脾臟的MDSC群。在所有活細胞中之CD11b+細胞的百分比和CD11b+細胞中之MDSC(Gr-1+)的百分比顯示於第6A和6B圖中。亦進行MDSC之免疫表型分類以分析該免疫抑制性標記PD-L1之表現(第7A和7B圖)。代表性腫瘤點狀圖顯示出亦在IP腫瘤內找到Treg(以CD3+CD4+T細胞中之FoxP3+細胞的百分比表示)。在相同動物之脾臟內發現較小之群體(第8A和8B圖)。條形圖代表每組3隻小鼠。誤差棒代表性SEM值。P值係使用學生t檢驗計算。
平均而言，與來自相同動物之脾臟的11%相比較，CD11b+細胞代表在IP腫瘤中之57%白血球(p<0.01)。Ly6G+顆粒細胞性MDSC(gMDSC)及Ly6C+單核細胞性MDSC(mMDSC)均可在IP腫瘤(43%)和脾臟(41%)中找到(第6A和6B圖)。免疫抑制性標記PD-L1表現在MDSC之二組子集合上且表現水準一樣高，無論其係源自腫瘤或脾臟(第7A和7B圖)。與來自相同動物之脾臟中的7%相比較，Treg
(FoxP3+)被發現包含腫瘤內之82%之CD4 T細胞(p<0.01)(第8A和8B圖)。
進行測試以研究IP注入CAR-T合併抑制細胞耗竭或阻斷PD-1/PD-L1免疫抑制途徑的可能療效。投予已被注射MC38CEA-luc之小鼠IP CAR-T合併針對MDSC和Treg之消耗抗體或阻斷針對PD-L1途徑之抗體。投予之消耗抗體為抗PD-L1和抗Gr1抗體(其結合MDSC之表面上的PD-L1和Gr1蛋白)及抗GITR抗體(其結合Treg細胞表面上之GITR蛋白)。依實施例3中之描述藉由生物發光監測腫瘤在14天內之縮減情形。
條形圖比較在治療後第8天局部IP CAR-T相對於全身性TV CAR-T之效力(第9A圖)和單獨之IP CAR-T相對於IP CAR-T合併抗體之效力(第9B圖)，及在第14天研究結束時局部IP CAR-T相對於全身性TV CAR-T之效力(第10A圖)和單獨之IP CAR-T相對於IP CAR-T合併抗體的效力(第10B圖)。條形圖代表每組4隻動物。誤差棒代表SEM值。P值使用學生t檢驗計算。亦分析肉眼檢查圖像及生物發光圖像(數據未顯示)。
與未經治療之動物相比較，單獨之IP CAR-T及與抗PD-L1、抗Gr1或抗GITR抗體合併使用時導致腫瘤負擔顯著減少。在第14天，與未經治療之小鼠、接受
未經轉導之T細胞的小鼠及每日接受單獨之IL-2劑量相比較，單獨之CAR-T顯著減少腫瘤負擔(第10A圖，p<0.05)。CAR-T合併耗竭Treg顯示出甚至較單獨之CAR-T治療進一步減少負擔(第10B圖，p<0.01)，如同合併CAR-T與MDSC耗竭(p=0.017)(第10A和10B圖)。腫瘤負擔一直測量至第14天，結果顯示於第11圖中。合併CAR-T和抗Gr-1整體來說最為有效，在第8和10天顯示出未檢測到生物發光。第14天，肉眼檢查時，在任何接受IP CAR-T之小鼠中均未發現可檢測到之腫瘤(數據未顯示)。
白血球提取法(leukapheresis)係在經驗證之血液中心進行。在良好生產規範(GMP)設施中，以用於加工、製造、擴充、劑量收穫、標籤、儲存和分銷之標準操作程序(SOP)製備CAR-T。簡單地說，使用Ficoll，從白血球提取產物分離出患者之外周血單核細胞(PBMC)。然後，將PBMC在含有輔以5%之無菌人類AB血清、50ng/mL之抗CD3單株抗體和300至3000U/mL之IL2的AIM V培養基(Life Technologies公司，紐約州格蘭德島)的組織培養瓶中活化48至72小時。
使用離心接種(spinoculation)法(例如Quintas-Cardama et al.,2007,Hum Gene Ther,18：1253-
1260)，將7.2至14.4×108個T細胞在經retronectin塗層之6孔盤中，在含有5%之人類AB血清、3000U/mL之IL2及魚精蛋白的AIM V培養基中，在室溫，低速離心下轉導1小時。在24小時內共進行該轉導步驟二至三。轉導後，在培養基中洗滌細胞並在37℃下培育48至72小時。將CAR-T在Lifecell組織培養袋(Baxter，伊利諾州Deerfield)中進一步擴增10至14天。定期檢查CAR-T之生長曲線和細胞存活率並依需要更換細胞生長培養基。以特異於CD3、CD4、CD8之經螢光標記的抗體及抗CAR抗體，藉由流式細胞術檢測CAR-T。流式細胞術係在CyAn(Beckman Coulter公司，加州Brea)或LSR-II(BD Biosciences公司，加州聖荷西)機器上進行。藉由生物發光細胞毒性分析測量患者產物之玻管內活性。將具有適當靶的之表現螢光素酶的腫瘤細胞與特異性CAR-T以各種比率在96孔圓底盤中混合並測量從每個孔損失之生物發光(Karimi et al.,2014,PLoS One,9：e89357)。
使用Fenwal細胞收穫器系統(Baxter，伊利諾州Deerfield)在含有PlasmaLyte(Baxter)、20%人牛白蛋白、10% DMSO及IL2之冷凍培養基中製備臨床劑量。分別監測細菌和真菌培養14天和28天。使用LAL內毒素分析套組(Lonza，馬利蘭州Walkersville)分析細菌內毒素。將臨床劑量保存在液氮中並在注入前不久解凍之。
執行動物研究以鑑定達成滅殺IP腫瘤細胞所必要之CAR-T細胞的最小劑量。藉由在C57BL/6小鼠中注射表現腫瘤抗原之腫瘤細胞來產生癌病之小鼠模型。該抗原表現腫瘤細胞係從MC38細胞系(源自初級小鼠結腸癌之結腸直腸癌細胞系)製造(Rosenberg et al.,1986,Science,233：1318-1321)。使用逆轉錄病毒表現載體，以全長人抗原cDNA轉導MC38細胞。亦以螢光素酶基因穩定地轉染MC38細胞。經由腹膜內途徑為C57BL/6小鼠注射2.5×106個小鼠結腸直腸癌細胞。注射腫瘤細胞後七天，使用直接插入腹膜腔的針為小鼠注入2.5×106、107、或108個特異性CAR-T細胞。注入CAR-T後的每一天，每隻小鼠接受皮下注射IL2(200μl之1.5μg/mL)。
注入CAR-T細胞後，使用，例如IVIS系統(PerkinElmer)，藉由測量生物發光來監測小鼠之腫瘤生長和對治療的反應。為了評估腹膜外或脫靶CAR-T投遞，對周圍血液、肝、肺、腎、結腸和胃執行流式細胞術以測量CAR+T細胞在這些位點之頻率。亦仔細監測和繪製動物之存活圖表。
若根據實施例3中描述之研究治療的小鼠無
法達成對單次IP注入CAR-T的完全反應，結束研究以測定單次IP注入後CAR-T在IP腫瘤中持續之期間並測試多次注入CAR-T之治療效果。
使用實施例3中描述之小鼠模型測定單次IP注入後CAR-T在IP腫瘤中之持續期間。使用如實施例3中測定之最佳劑量，以IP注入之特異性CAR-T治療十隻具有已建立之MC38 IP腫瘤的小鼠。在治療後1、2、4、7、14、21天使用特異於CAR之單株抗體，藉由流式細胞術分析腫瘤和腹水。
基於CAR-T持續之期間及根據實施例3測定之單劑量之抗CAR-T對腫瘤進展的效果，鑑定用於多次CAR-T注入之給藥時間表並用於多次注入治療方案中。
若CAR-T在IP腫瘤中之持續時間特別短(<2至3天)，採用全身放射照射預處理策略來促進CAR-T植入宿主動物中。
按照優良臨床試驗規範(Good Clinical Practice)指南對患者IP投遞CAR-T。患者先在手術室接受診斷性腹腔鏡術以進行腹膜黏連之細胞溶解、疾病評估、取得治療前之生物標本，並置入腹膜透析導管。在手術後第1天，注入約1×1010個在200ml具有10%二甲基亞碸(DMSO)之生理鹽水(NS)中的CAR-T。注入係在
床邊，在15分鐘內藉由手動注射進行並持續監測生命體徵。以間隔1週之期間給予另外二個具1×1010個細胞之CAR-T劑量。
第一個CAR-T劑量後六週，患者回到手術室進行診斷性腹腔鏡術以評估疾病反應並取得治療後之生物標本。
使用類似上述那些方法在小鼠模型中研究化療劑環磷醯胺對CAR-T細胞之療效的影響。經由腹膜內途徑為C57BL/6小鼠注射2.5×106個腫瘤細胞。此次注射後七天，小鼠接受IP注射依實施例1之描述產生的CAR-T細胞。小鼠亦接受IP注射環磷醯胺。該環磷醯胺係在注入CAR-T前1天投予，然後在投予CAR-T後每2天投予一次，總共4個劑量之該抗體。相對於注入CAR-T，對照組小鼠經由相同給藥時間表接受鹽水注射。藉由測量生物發光及小鼠之存活來測量每一治療之療效。
雖然上文中已討論許多示例性態樣和實施態樣，本技藝之技術熟習人士將識別某些修改、置換、添加及彼等之次組合。因此，下文所附之申請專利範圍及此後引入之申請專利範圍意圖被解釋為包括所有在其真實精神和範圍內的該等修改、置換、添加及次組合。
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Junghans,Richard
<120> 治療腹膜癌之組成物和方法
<130> 096201-0125/8002.WO00
<140> 尚未指定
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<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 1
Claims (9)
- 一種治療個體之腹膜癌之方法，其包含：在該個體之腹腔內注入包含本質上純質之經基因工程處理的T細胞群之組成物，該經基因工程處理的T細胞群表現嵌合型抗原或嵌合型配體T細胞受體蛋白，其中該嵌合型抗原或嵌合型配體T細胞受體蛋白與表現在惡性細胞上之抗原結合。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該惡性細胞係存在於腹腔內。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該惡性細胞係存在於腹腔外。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其進一步包含在該個體之腹腔內注入第二治療劑。
- 如申請專利範圍第4項之方法，其中該第二治療劑之注入係在注入該包含該經基因工程處理之T細胞的組成物之前、期間或之後進行。
- 如申請專利範圍第4或5項之方法，其中該第二治療劑為GM-CSF、STAT3、PD-1、PD-L1、IL 10或TGFβ活性之抑制劑。
- 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該組成物每週一次、每2週一次、每3週一次或每4週一次注入該個體之腹腔。
- 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中注入該組成物至該個體之腹腔係注入106至1011個經基因工程 處理之T細胞。
- 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中注入該組成物導致腹膜腫瘤之數目及/或大小、腹水、腹膜黏蛋白及/或血清腫瘤標記物之含量減少。
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