CN113286615A - 用于治疗癌症的微生物和免疫调节剂的组合疗法 - Google Patents

用于治疗癌症的微生物和免疫调节剂的组合疗法 Download PDF

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Abstract

公开了包含微生物和免疫调节剂的组合疗法，以及调节和治疗癌症的方法。

Description

用于治疗癌症的微生物和免疫调节剂的组合疗法
相关申请
本申请要求2018年11月8日提交的美国临时申请号62/757,452，和2019年5月15日提交的美国临时申请号62/848,294的优先权，前述申请各自的全部内容通过引用明确地并入本文。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝创建于2019年3月15日，名称为126046-05020_ST25.txt，大小为1,784千字节。
背景技术
前的癌症疗法通常采用使用免疫疗法、外科手术、化疗、放射治疗或其某种组合(美国癌症协会)。虽然这些药物对癌症患者显示出巨大的益处，但许多癌症仍然难以使用常规疗法治疗。目前，许多常规癌症疗法全身施用并对健康组织产生不利影响，导致显著的副作用。例如，许多癌症疗法专注于激活免疫系统以增强患者的抗肿瘤反应(Kong等，2014)。然而，尽管有这样的疗法，肿瘤周围的微环境仍然具有高度免疫抑制作用。此外，全身改变的免疫调节引发免疫功能失调，包括机会性自身免疫疾病和免疫相关的不良事件的发作。
在过去几十年中已经做出了重大努力来开发特异性靶向癌细胞的细胞毒性药物。近年来，肿瘤学已经发生了范式转变，其中癌症的临床问题不仅被认为是癌细胞中基因异常的积累，而且还被认为是免疫系统对这些异常细胞的耐受性。因此，最近的抗癌疗法专门被设计为靶向免疫系统而非癌细胞。这样的疗法旨在逆转癌症免疫耐受性并刺激有效的抗肿瘤免疫应答。例如，目前的免疫疗法包括免疫刺激分子，其是靶向渗入肿瘤微环境的各种免疫细胞群的模式识别受体(PRR)激动剂或免疫刺激性单克隆抗体。然而，尽管它们具有免疫靶向设计，但这些疗法已经在临床上开发为犹如它们是依赖于免疫治疗剂的全身施用(例如每2-3周静脉内输注)的常规抗癌药物。结果是许多目前的免疫疗法由于高剂量需求而遭受毒性，并且还经常导致不期望的自身免疫应答或其他免疫相关的不良事件。
因此，对于能够靶向血管化不良的缺氧肿瘤区域、特异性靶向癌细胞，同时最小程度地影响正常组织并增强免疫系统以对抗肿瘤，包括避免或逆转肿瘤免疫耐受的有效癌症治疗存在未满足的需求。
发明内容
本公开提供了选择性靶向肿瘤和肿瘤细胞的细菌与一种或多种免疫调节剂(例如免疫引发剂和/或免疫维持剂)组合的组合物、方法和用途。本文所述的细菌是野生型细菌(例如益生菌)或细菌底盘，其不包含非天然免疫调节剂基因和/或表达非天然免疫调节剂蛋白或分子。然而，在一些实施方式中，所述细菌底盘可以包含一种或多种营养缺陷型、抗生素抗性表达盒和/或内源性噬菌体的缺失。所述野生型细菌和所述细菌底盘与至少一种免疫调节剂的组合使用是安全的，并提供了治疗性组合物的靶向和局部递送。与单独施用免疫调节剂或单独施用细菌相比，本文所述的细菌出人意料地增强了免疫调节剂的作用。在一些实施方式中，该作用是协同的。例如，通过细菌的吞噬作用协同增强免疫应答的诱导，如在本文中更加详细地讨论的。
在一个方面中，本文公开的是一种药物组合物，其包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘(bacterialchassis)。
在一个实施方式中，所述至少一种免疫调节剂是至少一种免疫引发剂。在一个实施方式中，所述免疫引发剂能够增强溶瘤作用、激活抗原呈递细胞(APC)和/或引发和激活T细胞。在一个实施方式中，免疫引发剂是STING激动剂、精氨酸、5-FU、TNFα、IFNγ、IFNβ1、激动性抗CD40抗体、CD40L、SIRPα、GMCSF、激动性抗OXO40抗体、OXO40L、激动性抗4-1BB抗体、4-1BBL、激动性抗GITR抗体、GITRL、抗PD1抗体、抗PDL1抗体或天青蛋白。在一个方面中，本文公开的是一种药物组合物，其中所述STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。在一个实施方式中，免疫引发剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化的化学疗法或裂解肽。在一个实施方式中，免疫引发剂是精氨酸。在一个实施方式中，免疫引发剂是5-FU。
在一个实施方式中，至少一种免疫调节剂是至少一种免疫维持剂。在一个实施方式中，所述免疫维持剂能够增强T细胞的运输和浸润、增强T细胞对癌细胞的识别、增强效应T细胞应答和/或克服免疫抑制。在一个实施方式中，所述免疫维持剂是代谢转化剂、精氨酸、STING激动剂、CXCL9、CXCL10、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、激动性抗GITR抗体或GITRL、激动性抗OX40抗体或OX40L、激动性抗4-1BB抗体或4-1BBL、IL-15、IL-15sushi、IFNγ或IL-12。在一个实施方式中，所述免疫维持剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体或T细胞共刺激受体配体。在一个实施方式中，所述至少一种免疫维持剂是犬尿氨酸酶。在一个实施方式中，所述免疫维持剂是精氨酸。在一个实施方式中，所述免疫维持剂是STING激动剂。在一个实施方式中，所述STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。
在一个实施方式中，所述至少一种免疫调节剂包含至少一种免疫引发剂和至少一种免疫维持剂。在一个实施方式中，所述至少一种免疫调节剂不是由所述细菌产生的。
在一个实施方式中，所述细菌是野生型大肠杆菌Nissle细菌。
在一个实施方式中，所述细菌底盘是包含导致一种或多种营养缺陷型的基因中的至少一个突变或缺失的细菌。在一个实施方式中，所述细菌底盘是包含thyA营养缺陷型和/或dapA营养缺陷型的细菌。在一个实施方式中，所述细菌底盘是大肠杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、沙门氏菌属、李斯特菌属、乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属细菌、诺维梭菌、酿脓链球菌、牛分枝杆菌或克雷伯氏菌属细菌。在一个实施方式中，所述细菌底盘还包含噬菌体缺失。
在一个实施方式中，所述组合物被配制成用于瘤内施用。在一个实施方式中，所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。
在一个方面中，本文公开的是一种注射器，其包含药物组合物，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。
在一个方面中，本文公开的是一种试剂盒，其包含药物组合物及其使用说明书，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。
在一个方面中，本文公开的是一种试剂盒，其包含含有药物组合物的注射器及其使用说明书，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。
在一个方面中，本文公开的是一种试剂盒，其包含i)包含分离的细菌的第一组合物，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘，ii)包含免疫调节剂的第二组合物，和iii)其使用说明书。在一个实施方式中，所述第一组合物是冻干的组合物。在一个实施方式中，所述使用说明书表明所述第一组合物用于在所述第二组合物之前向受试者施用；所述第二组合物用于在所述第一组合物之前向受试者施用；或者所述第一组合物和所述第二组合物在向受试者施用之前组合。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，从而在所述受试者中治疗癌症，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。在一个实施方式中，所述施用式瘤内注射。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个实施方式中，所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用细菌，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘；和向所述受试者施用至少一种免疫调节剂，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。在一个实施方式中，所述施用式瘤内注射。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个实施方式中，所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。
在一个方面中，本文公开的是一种在患有肿瘤的受试者中诱导远端效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，从而在所述受试者中诱导所述远端效应，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。在一个实施方式中，所述施用式瘤内注射。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个实施方式中，所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。
在一个方面中，本文公开的是一种在患有肿瘤的受试者中诱导免疫记忆的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，从而在所述受试者中诱导所述免疫记忆，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。在一个实施方式中，所述施用式瘤内注射。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会将从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个实施方式中，所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导肿瘤的部分消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述药物组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的所述部分消退，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。在一个实施方式中，所述部分消退是所述肿瘤的尺寸缩小至少约10％、至少约25％、至少约50％或至少约75％。在一个实施方式中，所述施用式瘤内注射。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个实施方式中，所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导肿瘤的完全消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述药物组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的所述完全消退，其中所述组合物包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘。在一个实施方式中，在施用所述药学上可接受的组合物之后在所述受试者中无法检测到所述肿瘤。在一个实施方式中，所述施用式瘤内注射。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导肿瘤的完全消退的方法，其中所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用细菌，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘；和向所述受试者施用至少一种免疫调节剂，从而在所述受试者中治疗癌症。在一个实施方式中，其中所述施用步骤是同时进行的；向所述受试者施用所述细菌发生在向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂之前；或者向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂发生在向所述受试者施用所述细菌之前。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个实施方式中，所述细菌的所述施用是瘤内注射。在一个实施方式中，所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述至少一种免疫调节剂的所述施用是静脉内注射。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。在一个实施方式中，所述至少一种免疫调节剂包含至少一种免疫引发剂和至少一种免疫维持剂。在一个实施方式中，所述至少一种免疫引发剂选自表5中列出的所述免疫引发剂，并且所述至少一种免疫维持剂选自表6中列出的所述免疫维持剂。在一个实施方式中，所述至少一种免疫引发剂是STING激动剂，并且所述至少一种免疫维持剂是犬尿氨酸酶。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用细菌，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘；和向所述受试者施用至少一种免疫调节剂，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。在一个实施方式中，向所述受试者施用所述细菌发生在向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂之前；或向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂发生在向所述受试者施用所述细菌之前。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择会从所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。在一个实施方式中，所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。在一个实施方式中，所述细菌的施用是瘤内注射。在一个实施方式中，所述施用不是口服施用。在一个实施方式中，所述至少一种免疫调节剂的所述施用是静脉内注射。在一个实施方式中，所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。在一个实施方式中，所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。在一个实施方式中，所述至少一种免疫调节剂包含至少一种免疫引发剂和至少一种免疫维持剂。在一个实施方式中，所述至少一种免疫引发剂选自表5中列出的所述免疫引发剂，并且所述至少一种免疫维持剂选自表6中列出的所述免疫维持剂。在一个实施方式中，所述至少一种免疫引发剂是STING激动剂，并且所述至少一种免疫维持剂是犬尿氨酸酶。
在某些方面中，所述微生物是细菌，例如，鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌Nissle、诺维梭菌NT和丁酸梭菌miyairi，以及本文提供的其他示例性细菌菌株。在一些实施方式中，所述细菌能够选择性地归巢至肿瘤微环境。因此，在某些实施方式中，全身施用工程化微生物，例如，通过口服施用、静脉内注射、皮下注射、肿瘤内注射或其他手段，并且能够选择性地定植肿瘤位点。
在另一个方面中，本文公开的是一种组合物，其包含免疫引发剂，例如，细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化化学疗法或裂解肽；和微生物。在又一个方面中，本文公开的是一种组合物，其包含免疫维持剂，例如，趋化因子、细胞因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体或T细胞共刺激受体配体；和第一微生物。
在一个实施方式中，所述免疫引发剂能够增强溶瘤作用、激活抗原呈递细胞(APC)和/或引发和激活T细胞。在另一个实施方式中，免疫引发剂能够增强溶瘤作用。在另一个实施方式中，免疫引发剂能够激活APC。在又一个实施方式中，免疫引发剂能够引发和激活T细胞。
在一个实施方式中，免疫引发剂是治疗性分子。在一个实施方式中，免疫引发剂是介导RNA干扰、微RNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合或基因编辑的核酸分子。在一个实施方式中，免疫引发剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化化学疗法或裂解肽。
在一个实施方式中，免疫引发剂是STING激动剂、精氨酸、5-FU、TNFα、IFNγ、IFNβ1、激动性抗CD40抗体、CD40L、SIRPα、GMCSF、激动性抗OXO40抗体、OXO40L、激动性抗4-1BB抗体、4-1BBL、激动性抗GITR抗体、GITRL、抗PD1抗体、抗PDL1抗体或天青蛋白。在一个实施方式中，免疫引发剂是STING激动剂。
在一个实施方式中，免疫引发剂是精氨酸。在一个实施方式中，免疫引发剂是5-FU。在一个实施方式中，免疫引发剂是TNFα。在一个实施方式中，免疫引发剂是IFNγ。在一个实施方式中，免疫引发剂是IFNβ1。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗CD40抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是SIRPα。在一个实施方式中，免疫引发剂是CD40L。在一个实施方式中，免疫引发剂是GMCSF。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗OXO40抗体。在另一个实施方式中，免疫引发剂是OXO40L。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗4-1BB抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是4-1BBL。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗GITR抗体。在另一个实施方式中，免疫引发剂是GITRL。在一个实施方式中，免疫引发剂是抗PDF1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是抗PDL1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是天青蛋白。在一个实施方式中，免疫引发剂是精氨酸。在一个实施方式中，免疫引发剂是5-FU。
在一个实施方式中，免疫引发剂是STING激动剂。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-GAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diGMP。
在一个实施方式中，所述免疫维持剂能够增强T细胞的运输和浸润、增强T细胞对癌细胞的识别、增强效应T细胞应答和/或克服免疫抑制。在一个实施方式中，所述免疫维持剂能够增强T细胞的运输和浸润。在一个实施方式中，所述免疫维持剂能够增强T细胞对癌细胞的识别。在一个实施方式中，所述免疫维持剂能够增强效应T细胞应答。在一个实施方式中，所述免疫维持剂能够克服免疫抑制。
在一个实施方式中，所述免疫维持剂是治疗性分子。在一个实施方式中，所述免疫维持剂是介导RNA干扰、微RNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合或基因编辑的核酸分子。
在一个实施方式中，所述免疫维持剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体或者分泌或展示肽。
在一个实施方式中，所述免疫维持剂是代谢转化剂、精氨酸、STING激动剂、CXCL9、CXCL10、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、激动性抗GITR抗体或GITRL、激动性抗OX40抗体或OX40L、激动性抗4-1BB抗体或4-1BBL、IL-15、IL-15sushi、IFNγ或IL-12。在一个实施方式中，所述免疫维持剂是精氨酸。
在一个实施方式中，所述免疫维持剂是STING激动剂。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-GAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diGMP。
在一个实施方式中，所述免疫引发剂与所述免疫维持剂是不同的。在一个实施方式中，免疫引发剂不同于免疫维持剂。
在一个实施方式中，所述细菌在某一基因中是营养缺陷型，当所述细菌在肿瘤中存在时，该基因不足(complemented)。在一个实施方式中，当所述细菌在肿瘤中存在时，不足的基因是dapA基因。在一个实施方式中，所述细菌在某一基因中是营养缺陷型，当所述细菌在肿瘤中存在时，该基因是充足的。在一个实施方式中，当所述细菌在肿瘤中存在时，充足的基因是thyA基因。
在一个实施方式中，所述细菌还包含在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一个实施方式中，所述细菌是非致病性的。在一个实施方式中，所述细菌是大肠杆菌Nissle。
在另一个方面中，所述免疫调节剂式二聚化IL-12，其包含通过接头序列与p40IL-12亚基基因序列连接的p35 IL-12亚基基因序列，带有或不带有分泌标签序列。在一个实施方式中，所述分泌标签序列选自以下：SEQ ID NO：1235、1146-1154、1156和1168。在一个实施方式中，所述接头序列包含SEQ ID NO：1194。在一个实施方式中，所述p35 IL-12亚基基因序列包含SEQ ID NO：1192，并且其中所述p40 IL-12亚基因序列包含SEQ ID NO：1193。在一个实施方式中，所述基因序列包含选自以下的序列：SEQ ID NO：1169-1179。
在另一个方面中，所述免疫调节剂式IL-15融合蛋白，如与suchi结构域序列融合的IL-15基因序列。在一个实施方式中，所述序列选自以下：SEQ ID NO：1195-1198。
在一个实施方式中，本文公开的微生物是细菌。在一个实施方式中，本文公开的微生物是酵母。在一个实施方式中，所述微生物是大肠杆菌细菌。在一个实施方式中，所述微生物是大肠杆菌Nissle细菌。
在一个实施方式中，本文公开的微生物包含导致一种或多种营养缺陷型的基因中的至少一个突变或缺失。在一个实施方式中，所述至少一种缺失或突变是在dapA基因和/或thyA基因中。
在一个实施方式中，本文公开的微生物包含噬菌体缺失。
在一个实施方式中，免疫引发剂不是精氨酸、TNFα、IFNγ、IFNβ1、GMCSF、抗CD40抗体、CD40L、激动性抗OX40抗体、OXO40L、激动性抗41BB抗体、41BBL、激动性抗GITR抗体、GITRL、抗PD1抗体、抗PDL1抗体和/或天青蛋白。在一个实施方式中，免疫引发剂不是精氨酸。在一个实施方式中，免疫引发剂不是TNFα。在一个实施方式中，免疫引发剂不是IFNγ。在一个实施方式中，免疫引发剂不是IFNβ1。在一个实施方式中，免疫引发剂不是抗CD40抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是CD40L。在一个实施方式中，免疫引发剂不是GMCSF。在一个实施方式中，免疫引发剂不是激动性抗OXO40抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是OXO40L。在一个实施方式中，免疫引发剂不是激动性抗4-1BB抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是4-1BBL。在一个实施方式中，免疫引发剂不是激动性抗GITR抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是GITRL。在一个实施方式中，免疫引发剂不是抗PD1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是抗PDL1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是天青蛋白。
在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶、腺苷消耗途径的至少一种酶、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、IL-15、IL-15sushi、IFNγ、激动性抗GITR抗体、GITRL、激动性抗OX40抗体、OX40L、激动性抗4-1BB抗体、4-1BBL或IL-12。在一个实施方式中，腺苷消耗途径的至少一种酶add、xapA、deoD、xdhA、xdhB和xdhC。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是精氨酸。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是腺苷生物合成途径的至少一种酶。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是抗PD1抗体。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是抗PDL1抗体。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是抗CTLA4抗体。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是激动性抗GITR抗体。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是GITRL。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是IL-15。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是IL-15sushi。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是IFNγ。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是激动性抗OX40抗体。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是OX40L。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是激动性抗4-1BB抗体。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是4-1BBL。在一个实施方式中，所述免疫维持剂不是IL-12。
在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了用于构建单链抗CTLA-4抗体的示例性核酸序列，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，所述免疫调节剂包含多肽，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ ID NO:768、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:770、SEQ IDNO:771、SEQ ID NO:772、SEQ ID NO:773、SEQ ID NO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776。在又一个实施方式中，所述多肽由选自以下的序列组成：SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ ID NO:768、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:770、SEQ ID NO:771、SEQID NO:772、SEQ ID NO:773、SEQ ID NO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776。
在一个方面中，本文公开的是一种药学上可接受的组合物，其包含本文公开的微生物、一种或多种免疫调节剂和药学上可接受的载体。在一个方面中，本文公开的是一种药学上可接受的组合物，其包含本文公开的组合物和药学上可接受的载体。在一个实施方式中，所述组合物是用于瘤内注射的制剂。在另一个实施方式中，所述药学上可接受的组合物用于治疗患有癌症的受试者。在另一个实施方式中，所述药学上可接受的组合物用于在受试者中诱导和调节免疫应答。
在一个方面中，本文公开的是一种试剂盒，其包含本文公开的药学上可接受的组合物及其使用说明书。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中治疗癌症。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
在另一个方面中，本文公开的是一种在患有肿瘤的受试者中诱导远端效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述远端效应。
在一个方面中，本文公开的是一种在患有肿瘤的受试者中诱导免疫记忆的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述免疫记忆。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导肿瘤的部分消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的所述部分消退。在一个实施方式中，所述部分消退是所述肿瘤的尺寸缩小至少约10％、至少约25％、至少约50％或至少约75％。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导肿瘤的完全消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的所述完全消退。在一个实施方式中，在施用所述药学上可接受的组合物之后在所述受试者中无法检测到所述肿瘤。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一微生物，和向所述受试者施用免疫调节剂(例如免疫维持剂和/或免疫引发剂)，从而在所述受试者中治疗癌症。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一微生物，和向所述受试者施用免疫调节剂(例如免疫维持剂和/或免疫引发剂)，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
在一个实施方式中，同时进行所述施用步骤。在一个实施方式中，向所述受试者施用所述第一微生物发生在向所述受试者施用所述免疫调节剂之前。在一个实施方式中，向所述受试者施用所述免疫调节剂发生在向所述受试者施用所述第一微生物之前。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一微生物，和向所述受试者施用免疫调节剂(例如免疫维持剂和/或免疫引发剂)，从而在所述受试者中治疗癌症。
在一个方面中，本文公开的是一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一微生物，和向所述受试者施用免疫调节剂(例如免疫维持剂和/或免疫引发剂)，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
在一个实施方式中，所述施用是瘤内注射。
因此，本公开提供了包含一种或多种细菌和一种或多种免疫调节剂的组合物。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是免疫引发剂，例如其可以调节，例如促进肿瘤裂解、树突状细胞或巨噬细胞的抗原提呈或者T细胞激活或初免。这样的免疫引发剂的实例包括细胞因子或趋化因子，例如TNFα、IFN-γ和IFN-β1，单链抗体，例如抗-CD40抗体，或(3)配体，例如SIRPα或CD40L，代谢酶(生物合成或分解代谢)，例如生产STING激动剂的酶，或(5)细胞毒性化学治疗剂。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是一种或多种STING激动剂，如c-di-AMP、3’3’-cGAMP和/或c-2’3’-cGAMP。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是共刺激受体，包括但不限于OX40、GITR、41BB。
在一些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种免疫维持剂，其可以调节(例如增强)肿瘤浸润或T细胞应答，或调节(例如减轻)免疫抑制。此类维持剂可以选自细胞因子或趋化因子、单链抗体、拮抗性肽或配体以及代谢酶途径。
免疫维持细胞因子的实例包括IL-15和CXCL10，其可以分泌进入肿瘤微环境中。单链抗体的非限制性实例包括抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4。
在一些实施方式中，所述组合物包含对于特定代谢产物而言是营养缺陷型的细菌，例如，所述细菌在某一基因中是营养缺陷型，当所述微生物在肿瘤中存在时，该基因不足(complemented)。在一些实施方式中，所述细菌在DapA基因中是营养缺陷的。在一些实施方式中，所述组合物包含对于特定代谢产物而言是营养缺陷型的细菌，例如，所述细菌在某一基因中是营养缺陷型，当所述微生物在肿瘤中存在时，该基因充足。在一些实施方式中，所述细菌在ThyA基因中是营养缺陷的。在一些实施方式中，所述细菌在TrpE基因中是营养缺陷的。
在一些实施方式中，所述细菌是革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，所述细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，所述细菌是专性厌氧细菌。在一些实施方式中，所述细菌是兼性厌氧细菌。本公开中涉及的细菌的非限制性实例包括诺维梭菌NT、丁酸梭菌和长双歧杆菌。在一些实施方式中，所述细菌选自大肠杆菌Nissle和大肠杆菌K-12。
在一些实施方式中，所述细菌包含抗生素抗性基因序列。
另外，提供了药物组合物，其还包含一种或多种免疫检查点抑制剂，如CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。此类检查点抑制剂可以与所述细菌组合、顺序或同时施用。
另外，提供了药物组合物，其还包含一种或多种共刺激受体的激动剂，如OX40、GITR和/或41BB，包括但不限于激动性分子，如能够与共刺激受体结合的配体或激动性抗体如OX40、GITR和/或41BB。此类激动性分子可以与所述细菌组合、顺序或同时施用。
在任何这些实施方式中，可以将细菌组合与常规癌症疗法组合，如手术、化疗、靶向疗法、放疗、断层疗法、免疫疗法、癌症疫苗、激素疗法、热疗、干细胞移植(外周血、骨髓和脐带血移植)、光动力疗法、疗法和血制品捐赠和输血以及溶瘤病毒。在任何这些实施方式中，可以将细菌用于与癌症或肿瘤疫苗组合。
附图说明
图1描述了显示发光细菌(SYN5353)在小鼠模型的B16-F10肿瘤中的定位的研究设计的示意图。
图2描述了在B16-F10肿瘤中野生型大肠杆菌Nissle的定植。将发光细菌(SYN-BioLum，50μL)注射到小鼠体内，并且在注射后24小时后在整个肿瘤中显示了Nissle细菌的特异性定植和播散。
图3A描述了将野生型大肠杆菌Nissle瘤内注射到B16-F10肿瘤周围的皮下空间后的间质压力。在开始注射后20-30分钟测量压力。图3B描述了注射后72小时野生型大肠杆菌Nissle的浸润和特异性定植。图3C描述了在注射后7天和15天野生型大肠杆菌Nissle的特异性定植。
图4A描述了通过集落形成单位(CFU)测定测量的来自各种肿瘤模型的约1x106CFUEcN在瘤内注射(i.t.)后72小时在剂量和肿瘤匀浆中的细菌丰度。图4B描述了与生理盐水注射的对照相比，在使用1x106CFU的EcN-LuxABCDE i.t.注射后的所示时间点，来自CT26肿瘤的通过CFU测量的细菌丰度(左轴)和相对生物发光单位(RLU)(右轴)。图4C描述了针对使用1x106或1x107CFU EcN治疗的CT26荷瘤小鼠，肿瘤匀浆(实心圆圈)或血液(空心圆圈)中的细菌丰度。
图5描述了在B16.F10肿瘤中SYNB(包含细菌底盘：野生型大肠杆菌Nissle菌株，含有二氨基庚二酸和胸苷的双重营养缺陷，并缺失内源性噬菌体)和SYNB1891(包含SYNBNissle菌株和来自整合到基因组中的单核细胞增生李斯特菌的FNR诱导型dacA以产生STING激动剂ci-di-AMP)的体内活性和平均肿瘤生长情况。给小鼠注射SYNB和SYNB1891菌株，并且测量21天平均肿瘤生长情况。
图6A、图6B和图6C描述了与盐水对照相比(图6A)SYNB(图6B)和SYNB1891(图6C)菌株注射后各肿瘤生长情况。
图7A、图7B和图7C描述了BMDC对SYNB1891-gfp的吞噬作用。BMDC与预诱导的SYNB1891-gfp(MOI:25)在对照培养基中孵育1h(图7A和图7B)或者在细菌孵育前用细胞松弛素D(10μM)预处理1h(图7C)。
图7D-7J描述了用对照EcN(MOI:25)、预诱导的SYN1891(MOI:25)、LPS(100ng/mL)或smSTING激动剂(5μg/mL)处理4小时的RAW 264.7巨噬细胞或WT BMDC的mRNA水平，证明了吞噬作用依赖性和STING依赖性I型IFN的产生以及底盘衍生的LPS对于SYNB1891的细胞因子产生的作用。在所示组中，使用细胞松弛素D(10μM)预处理细胞1h。将仅在培养基中孵育的巨噬细胞或BMDC作为阴性对照。针对Ifnb1和Il6 mRNA的上调对细胞进行分析(图7D-7G)。将WT、TLR4-/-和STING-/-BMDC用对照EcN(MOI:25)、预诱导的SYN1891(MOI:25)、LPS(100ng/mL)或smSTING激动剂(5μg/mL)处理4小时。针对Ifnb1、Il6和Il12a mRNA的上调对细胞进行分析(图7H-7J)。数据以两次或更多次独立实验的平均值和标准偏差表示。**P<0.005；***P<0.0005；****P<0.00001；双侧非配对Student t检验，与所示组比较。
图8描述了对用盐水和1x109CFU SYNB1891-cmR(包含氯霉素抗性基因的SYNB1891)治疗的A20荷瘤小鼠的Mantel-Cox对数秩检验。在治疗开始前1天i.p.施用抗CD4或抗CD8抗体耗竭CD4+和CD8+T细胞和研究期间每周两次注射同种型作为对照。显示了长期存活。数据以两次或更多次独立的实验表示。
图9描述了通过发光(RLU)和IRF诱导倍数确定的IRF报告基因的活性。含有IRF荧光素酶报告基因和内源性HAQ TMEM173(STING)等位基因、WT或R232H等位基因敲入或TMEM173基因敲除的THP-1永生化人单核细胞用预诱导的SYNB1891(MOI：100)或单独的培养基处理过夜。将各种基因型的BMDC在培养基中单独孵育作为阴性对照。数据以两次或更多次独立实验的平均值和标准偏差表示。**P<0.005；***P<0.0005；****P<0.00001；单侧非配对Student t检验，与所示组比较。
具体实施方式
使用常规疗法特别难以控制某些肿瘤。缺氧是实体瘤的特征性特征，其中癌细胞在非常低的氧浓度下存在。缺氧区域通常围绕坏死组织并且作为实体形式的癌症发展过大而不适于其脉管系统。当血管供应不能满足肿瘤的代谢需求时，肿瘤的微环境变得缺氧。肿瘤内的多个区域含有<1％的氧气，而正常组织中的氧气含量为3-15％(Vaupel和Hockel，1995)，无血管区域可构成肿瘤质量的25-75％(Dang等，2001)。大约95％的肿瘤在某种程度上是缺氧的(Huang等，2004)。全身递送的抗癌剂依赖于肿瘤脉管系统来递送，然而，不良的血管形成阻碍了向快速分裂的细胞供氧，使得它们对在血管化不良的低氧性肿瘤区域中靶向细胞增殖的治疗剂不太敏感。放射疗法不能杀死缺氧细胞，因为氧气是辐射诱导的细胞死亡所需的效应物。与具有正常氧水平的细胞相比，缺氧细胞对放射治疗的抗性高达三倍(Bettegowda等，2003；Tiecher，1995；Wachsberger等，2003)。由于所有这些原因，使用常规疗法特别难以管理不可切除的局部晚期肿瘤。
除了与靶向缺氧环境相关的挑战之外，特异性靶向和摧毁癌症的疗法必须识别正常组织和恶性组织之间的差异，包括导致具有缺氧和坏死区域的异质肿块的遗传改变和病理生理学变化。
本公开涉及组合，其包含一种或多种免疫调节剂(例如一种或多种免疫引发剂和/或一种或多种免疫维持剂)，以及一种或多种微生物(例如细菌)，其药物组合物，和调节或治疗癌症的方法。在某些实施方式中，所述细菌能够靶向癌细胞。在某些实施方式中，所述细菌能够靶向癌细胞，特别式在低氧条件下，如在缺氧的肿瘤环境中。
本公开涉及局部和肿瘤特异性递送免疫调节剂以治疗癌症的组合物和治疗方法。在某些方面中，本公开涉及能够靶向癌细胞的微生物与一种或多种效应分子(例如免疫调节剂，如本文提供的任何效应分子)的组合。与现有的常规疗法相反，肿瘤的缺氧区域为厌氧细菌的生长提供了完美的生态位，厌氧细菌的使用提供了以精确方式根除晚期局部肿瘤的机会，从而不伤害周围良好血管化的含氧量正常的组织。
在一些方面中，本公开提供了向肿瘤细胞或肿瘤微环境递送微生物和一种或多种效应分子，例如免疫调节剂，例如免疫引发剂和/或免疫维持剂。在一些方面中，本公开涉及局部递送的微生物，例如，通过瘤内施用，和一种或多种效应分子，例如，免疫引发剂和/或免疫维持剂。在一些方面中，本文公开的组合物和方法可用于将一种或多种效应分子，例如，免疫引发剂和/或免疫维持剂，选择性地递送至肿瘤细胞，从而减少全身细胞毒性或系统性免疫功能障碍，例如自身免疫事件或其他免疫相关不良事件的发作。
为了更容易理解本公开，首先定义某些术语。应根据本公开的其余部分并且如本领域普通技术人员所理解的那样阅读这些定义。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
对癌症产生免疫力是一个潜在的自我传播的循环过程，其被称为“癌症免疫循环”(Chen和Mellman,Oncology Meets Immunology:The Cancer-Immunity Cycle；Immunity(2013)39,:1-10)，并且其能够导致T细胞应答的放宽和放大。该循环被抑制因子所抵消，这些抑制因子在循环的不同步骤中导致免疫调控反馈机制，并且能够阻止发育或限制免疫力。
该循环主要包括一系列步骤，成功进行抗癌免疫应答需要进行这一系列步骤。该循环包括为引发免疫应答而必须发生的步骤，以及随后必须发生的第二系列事件，以使得免疫应答得以持续(即，允许其进行并扩展而不衰减)。这些步骤被称为“癌症免疫循环”(Chen和Mellman,2013)，并且基本上如下所示：
1.释放(溶瘤)和/或获取肿瘤细胞内容物；肿瘤细胞破裂并溢出其内容物，导致新抗原的释放，新抗原被抗原提呈细胞(树突状细胞和巨噬细胞)吸收进行加工。或者，抗原提呈细胞可以直接主动吞噬肿瘤细胞。
2.激活抗原提呈细胞(APC)(树突状细胞和巨噬细胞)；除了上述第一步以外，下一步必需涉及促炎性细胞因子的释放或促炎性细胞因子的产生，从而导致从濒死肿瘤细胞释放DAMP或PAMP，以使得抗原提呈细胞激活以及随后的抗癌T细胞应答。抗原提呈细胞激活对于避免肿瘤来源抗原的外周耐受至关重要。如果被正确激活，则抗原呈递细胞会在MHCI和MHCII分子的背景下将先前内化的抗原呈递给适当的共刺激信号(CD80/86、细胞因子等)以初免和激活T细胞。
3.T细胞的初免和激活：由DC和巨噬细胞呈递的抗原引起针对癌症特异性抗原的效应T细胞反应的初免和激活，这些抗原被免疫系统视为是“外来的”。通过确定效应T细胞的数量和质量以及调节性T细胞的贡献，这一步骤对于抗癌免疫应答的强度和广度至关重要。此外，适当的T细胞初免能够导致优异的记忆T细胞形成和长寿命的免疫力。
4.运输和浸润：接下来，激活的效应T细胞必需运输至肿瘤并浸润肿瘤。
5.由T细胞和T细胞支持识别癌细胞，以及增强和扩展效应T细胞应答：一旦到达肿瘤部位，T细胞就可以通过其T细胞受体(TCR)识别并与癌细胞结合，后者与癌细胞中MHC分子内呈递的其同源抗原特异性结合，并随后杀死靶癌细胞。杀死癌细胞通过肿瘤细胞的裂解释放肿瘤相关抗原，并重新开始循环，从而增加随后几轮循环中应答的量。MHC-I或MHC-II限制性T细胞对抗原的识别能够导致其他效应功能，如趋化因子和效应细胞因子的释放，从而进一步增强强大的抗肿瘤应答。
6.克服免疫抑制：最后，克服对癌症的免疫应答中的某些缺陷和/或克服癌症的防御策略，即克服癌症在抵抗免疫应答中所采用的突破，可以被视为是在该循环中的另一个关键步骤。在一些情况下，即使已经发生了T细胞的初免和激活，其他免疫抑制细胞子集也被主动募集并激活至肿瘤微环境中，即调节性T细胞或髓系来源的抑制性细胞。在其他情况下，T细胞可能没有收到正确的信号以正确归巢于肿瘤，或者可能被从浸润肿瘤中主动排除。最后，在肿瘤微环境中存在某些机制，这些机制能够抑制或阻遏由该循环产生的效应细胞。此类抗性机制共同选择了通常被称为免疫检查点的免疫抑制途径，该途径通常介导免疫耐受并减轻癌症组织损伤(参见例如，Pardoll(2012),The blockade of immunecheckpoints in cancer immunotherapy；Nature Reviews Cancer第12卷，第252-264页)。
一个重要的免疫检查点受体是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，其下调T细胞激活的幅度。一些免疫检查点受体(例如程序性细胞死亡蛋白1(PD1))，会限制组织内T细胞的效应功能。通过上调PD1的配体，肿瘤细胞和抗原提呈细胞在肿瘤微环境中阻断了抗肿瘤免疫应答。多种其他的免疫检查点受体和配体(其中的一些在各种类型的肿瘤细胞中选择性上调)是阻断的主要靶点，特别是与增强抗肿瘤免疫应答的启动或激活的方法结合使用时。
已开发出在6个步骤中的一个或多个促进和支持癌症免疫循环进展的疗法。这些疗法可大致分为促进免疫应答引发的疗法和有助于维持免疫应答的疗法。
如本文所用，术语“免疫引发”或“引发免疫应答”是指通过导致免疫应答产生和建立的步骤进行的进展。例如，这些步骤可以包括上文所述的癌症免疫循环的前三个步骤，即抗原获取过程(步骤(1))，树突状细胞和巨噬细胞的激活(步骤(2))，和/或T细胞的初免和激活(步骤(3))。
如本文所用，术语“免疫维持”或“维持免疫应答”是指通过某些步骤进行的进展，所述步骤确保免疫应答随着时间的推移而扩大和增强，并防止免疫应答的减弱或抑制。例如，这些步骤可以包括所述循环的步骤4至6，即细胞运输和肿瘤浸润，通过TCR识别癌细胞，以及克服免疫抑制，即耗竭或抑制调节性T细胞以及阻止效应物应答的其他活性抑制的建立。
因此，在一些实施方式中，所述组合物能够通过调节(例如激活、促进支持)循环中的一个或多个步骤调节(例如推进)癌症免疫循环。在一些实施方式中，所述组合物能够调节(例如促进)调节(例如增强)免疫应答引发的步骤。在一些实施方式中，所述组合物能够调节(例如激发)循环中增强免疫应答维持的某些步骤。在一些实施方式中，所述组合物能够调节(例如强化)免疫应答引发和调节(例如增强)免疫应答维持。
因此，在一些实施方式中，所述一种或多种效应分子(例如免疫调节剂)调节(例如强化)免疫应答的引发。因此，在一些实施方式中，所述一种或多种效应分子(例如免疫调节剂)调节(例如增强)免疫应答的维持。因此，在一些实施方式中，所述一种或多种效应分子(例如免疫调节剂)调节(例如强化)免疫应答的引发和一种或多种效应分子(例如免疫调节剂)调节(例如增强)免疫应答的维持。
“效应物”、“效应物质”或“效应分子”指一种或多种目标分子、治疗性物质或药物。在一个实施方式中，“效应物”是由微生物(例如细菌)生产的。在另一个实施方式中，将能够生产本文所述的第一效应物的微生物与第二效应物组合施用，例如第二效应物不是由微生物生产的，但是在生产第一效应物的微生物施用之前、同时或之后施用。
此类效应物或效应分子的非限制性实例是“免疫调节剂”，其包括本文所述的免疫维持剂和/或免疫引发剂。在一些实施方式中，所述组合物包含两种或更多种效应分子或免疫调节剂。在一些实施方式中，所述组合物包含3、4、5、6、7、8、9或10种效应分子或免疫调节剂。在一些实施方式中，效应分子或免疫调节剂是用于调节或治疗癌症的治疗性分子。
在一些实施方式中，效应物或免疫调节剂是治疗性分子。在一些实施方式中，效应分子或免疫调节剂可以是介导RNA干扰、微RNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合(适体或诱饵寡核苷酸)或基因编辑(例如CRISPR干扰)的核酸分子。本文描述和列出了其他类型的效应物和免疫调节剂。
效应分子和/或免疫调节剂的非限制性实例包括免疫检查点抑制剂(例如CTLA-4抗体、PD-1抗体、PDL-1抗体)，细胞毒性剂(例如ClyA、FASL、TRAIL、TNFα)，免疫刺激细胞因子和共刺激分子(例如OX40抗体或OX40L、CD28、ICOS、CCL21、IL-2、IL-18、IL-15、IL-12、IFN-γ、IL-21、TNF、GM-CSF)，抗原和抗体(例如肿瘤抗原、新抗原、CtxB-PSA融合蛋白、CPV-OmpA融合蛋白、NY-ESO-1肿瘤抗原、RAF1、抗免疫抑制分子抗体、抗VEGF、抗CXR4/CXCL12、抗GLP1、抗GLP2、抗半乳糖凝集素1、抗半乳糖凝集素3、抗Tie2、抗CD47、抗免疫检查点的抗体、抗免疫抑制细胞因子和趋化因子的抗体)，DNA转移载体(例如内皮抑素、血小板反应蛋白-1、TRAIL、SMAC、Stat3、Bcl2、FLT3L、GM-CSF、IL-12、AFP、VEGFR2)和酶(例如大肠杆菌CD、HSV-TK)，产生其的免疫刺激性代谢物和生物合成途径酶(STING激动剂，例如c-di-AMP、3’3’-cGAMP和2’3’-cGAMP；精氨酸、色氨酸)。
效应物还可以包括酶或其他多肽(例如转运蛋白或调控蛋白)或其他修饰(例如某些内源性基因的失活，例如营养缺陷型)，其导致免疫抑制性或促进肿瘤生长的代谢产物的(例如犬尿氨酸、腺苷和氨)的分解代谢。
免疫调节剂尤其包括免疫引发剂和免疫维持剂。
如在本文中所使用的，术语“免疫引发剂”或“引发剂”指一类效应物或分子(例如免疫调节剂或物质)。免疫引发剂可以调节(例如强化或增强)癌症免疫循环的一个或多个步骤，包括(1)裂解肿瘤细胞(溶瘤)；(2)激活APC(树突状细胞和巨噬细胞)；和/或(3)初免和激活T细胞。在一个实施方式中，免疫引发剂可以由本文所述的微生物(例如细菌)生产，或者可以与本文公开的微生物组合施用。例如，将能够生产本文所述第一免疫引发剂或免疫维持剂的微生物与第二免疫引发剂组合施用，例如第二免疫引发剂不是由微生物生产的，但是在生产第一免疫引发剂或免疫维持剂的微生物之前、同时或之后施用。此类免疫引发剂的非限制性实例在本文中进一步详细描述。
在一些实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的治疗性分子。本文描述了此类治疗性分子的非限制性实例，并且包括但不限于细胞因子、趋化因子、单链抗体(激动性或拮抗性)、配体(激动性或拮抗性)、共刺激受体/配体等。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子。本文描述了此类酶的非限制性实例，并且包括但不限于DacA和cGAS，其生产STING激动剂。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的生物合成途径的至少一种酶。本文描述了此类生物合成途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与生产精氨酸的酶。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的分解代谢途径的至少一种酶。本文描述了此类分解代谢途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与有害代谢产物分解代谢的酶。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的生物合成途径的至少一种酶生产的至少一种分子。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由新陈代谢转化生产的治疗性分子，即免疫引发剂是新陈代谢转化剂。在其他实施方式中，免疫引发剂可以是介导RNA干扰、微RNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合(适体或诱饵寡核苷酸)、基因编辑(例如CRISPR干扰)的核酸分子。
在一个特定实施方式中，所述一种或多种免疫引发剂调节(例如强化)一个或多个下述步骤(1)裂解肿瘤细胞和/或摄取肿瘤抗原，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞。在一些实施方式中，所述微生物包含用于生产一种或多种免疫引发剂的基因回路，其调控(例如强化)一个或多个下述步骤：(1)裂解肿瘤细胞和/或摄取肿瘤抗原，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞。在一些实施方式中，所述细菌包含编码一种或多种免疫引发剂的一种或多种基因，其调控(例如强化)一个或多个下述步骤：(1)裂解肿瘤细胞和/或摄取肿瘤抗原，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞。可以将免疫引发剂与一种或多种其他相同或不同的免疫引发剂组合，其调节癌症免疫循环中的相同或不同步骤。
在一个实施方式中，所述一种或多种免疫引发剂，其调节溶瘤或肿瘤抗原摄取(步骤(1))。调节抗原获取的免疫引发剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于裂解肽、CD47阻断抗体、SIRP-α和变体、TNFα、IFN-γ和5FU。在一个实施方式中，所述微生物生产一种或多种免疫引发剂，其调节APC的激活(步骤(2))。调节APC激活的免疫引发剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于Toll样受体激动剂、STING激动剂、CD40L和GM-CSF。在一个实施方式中，所述微生物生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如增强)T细胞的初免和激活(步骤(3))。调节(例如增强)T细胞的初免和激活的免疫引发剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于抗-OX40抗体、OXO40L、抗-41BB抗体、41BBL、抗-GITR抗体、GITRL、抗-CD28抗体、抗-CTLA4抗体、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、IL-15和IL-12等。
如本文所用，术语“免疫维持剂”或“维持剂”指一类效应物或分子(例如免疫调节剂或物质)。免疫维持剂可以调节(例如激发或增强)癌症免疫循环的一个或多个步骤，包括(4)运输和浸润；(5)由T细胞和T细胞支持识别癌细胞；和/或(6)能够克服免疫抑制。在一个实施方式中，所述免疫维持剂可以与本文所述的微生物组合施用。例如，本文所述的微生物与免疫维持剂组合施用，但在施用微生物和/或免疫维持剂之前、同时或之后施用。
在一些实施方式中，所述免疫维持剂是治疗性分子。本文描述了此类治疗性分子的非限制性实例，并且包括细胞因子、趋化因子、单链抗体(激动性或拮抗性)、配体(激动性或拮抗性)等。在另一个实施方式中，所述免疫维持剂是由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子。本文描述了此类酶的非限制性实例，并且包括但不限于表8中描述的那些。在另一个实施方式中，所述免疫维持剂是由至少一种基因编码的生物合成途径或分解代谢途径中的至少一种酶。本文描述了此类生物合成途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与生产精氨酸的酶；以及本文描述了此类分解代谢途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与犬尿氨酸催化作用的酶或参与腺苷催化作用的酶。在另一个实施方式中，所述免疫维持剂是由至少一种基因编码的生物合成、生物化学或分解代谢途径的至少一种酶生产的至少一种分子。在另一个实施方式中，所述免疫维持剂是由新陈代谢转化生产的治疗性分子，即免疫引发剂是新陈代谢转化剂。在其他实施方式中，所述免疫维持剂可以是介导RNA干扰、微RNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合(适体或诱饵寡核苷酸)、基因编辑(例如CRISPR干扰)的核酸分子。
在一个特定实施方式中，术语“免疫维持剂”还可以指减少或消除有害的分子。在这种情况下，术语“免疫维持剂”还用于指分解代谢途径的一种或多种酶，其分解有害代谢产物。
在一些实施方式中，所述一种或多种免疫维持剂调节(例如激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。可以将免疫维持剂与一种或多种其他免疫维持剂组合，其调节相同或不同步骤。在一些实施方式中，所述微生物包含用于生产一种或多种免疫维持剂的基因回路，其调节(例如激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。在一些实施方式中，所述微生物包含编码一种或多种免疫维持剂的一种或多种基因，其调节(例如激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。
在一个实施方式中，所述一种或多种免疫维持剂调节T细胞运输和浸润(步骤(4))。调节T细胞运输和浸润的免疫维持剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于趋化因子(例如CXCL9和CXCL10)或上游激活剂，其诱导此类细胞因子的表达。在一个实施方式中，所述微生物生产一种或多种免疫维持剂，其调节由T细胞和T细胞支持识别癌细胞(步骤(5))。调节由T细胞和T细胞支持识别癌细胞的免疫维持剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于抗-PD1/PD-L1抗体(拮抗性)、抗-CTLA-4抗体(拮抗性)、犬尿氨酸消耗、腺苷消耗、抗-OX40抗体(激动性)、抗-41BB抗体(激动性)和抗-GITR抗体(激动性)。在一个实施方式中，所述微生物生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如增强)克服免疫抑制的能力(步骤(6))。调节(例如增强)克服免疫抑制的能力的免疫维持剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于IL-15和IL-12及其变体。
任意一种或多种免疫引发剂可以与任意一种或多种免疫维持剂组合。因此，在一些实施方式中，将能够生产一种或多种免疫引发剂的微生物与一种或多种免疫维持剂组合，所述免疫引发剂调节(例如强化)一个或多个下述步骤(1)溶瘤，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞，所述免疫维持剂调节(例如激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。
在一些实施方式中，某些免疫调节剂在癌症免疫循环的多个阶段起作用，例如免疫起始的一个或多个阶段，或者免疫维持的一个或多个阶段，或者免疫起始的一个或多个阶段和免疫维持的一个或多个阶段。
如本文所用，“代谢转化”指作为酶催化反应结果的化学转化。酶催化反应在性质上可以是生物合成的或分解代谢的。
如本文所用，术语“代谢转化剂”指一种或多种酶，其催化化学转化，即其消耗、生产化转化代谢产物。在一些实施方式中，术语“代谢转化剂”指由生物合成途径的至少一种酶产生的至少一种分子。代谢转化剂可以消耗有毒或免疫抑制代谢物或产生抗癌代谢物，或两者兼而有之。代谢转化剂的非限制性实例包括犬尿氨酸消耗剂、腺苷消耗剂、精氨酸产生剂和/或氨消耗剂，即，用于消耗犬尿氨酸或腺苷或者用于生产精氨酸和/或消耗氨的酶。在一个实施方式中，代谢转化剂可以是例如人犬尿氨酸酶(例如EC 3.7.1.3)。在另一个实施方式中，代谢转化剂可以是核酸，例如，RNAi分子(siRNA、miRNA、dsRNA)、mRNA、反义分子、适体或CRISPR/Cas 9分子，其增加或减少在肿瘤中催化化学转化(即，其消耗、产生或转化代谢产物)的一种或多种内源性酶的表达。
如本文所用，“野生型”指未经修饰的细菌。例如，野生型细菌尚未使用基因工程进行改造。例如，野生型细菌尚未被修饰以表达肺天然基因或包含营养缺陷型。在一个实施方式中，野生型细菌是大肠杆菌Nissle细菌。
如本文所用，“细菌底盘”或“底盘”指可以包含营养缺陷型修饰的细菌，例如，在dapA、thyA或者这两者中突变或缺失，和/或噬菌体缺失，并且可以刺激先天性免疫应答；但是细菌未被修饰以包含非天然核酸或基因或者表达非天然蛋白。换言之，细菌底盘是指未被修饰以包含非天然免疫调节剂基因或表达非天然免疫调节剂蛋白的细菌。在一些实施方式中，底盘指大肠杆菌Nissle细菌，其可以包含营养缺陷修饰，例如，在dapA、thyA或者这两者中突变或缺失，并且可以刺激先天性免疫应答，但是未被修饰以包含非天然基因或表达非天然蛋白，例如，未被修饰以包含肺天然免疫调节剂核酸或基因或者表达非天然免疫调节剂蛋白。
如本文所用，“非天然”指通常不存在于微生物中的核酸或蛋白，例如，内源性序列的额外拷贝，或异源序列，如来自细菌或病毒的不同种、株或亚株的序列，或与来自相同亚型的细菌或病毒的未经修饰的序列相比修饰和/或突变的序列。在一些实施方式中，非天然核酸序列是合成的、非天然存在的序列(参见例如Purcell等，2013)。非天然核酸序列可以是调控区、启动子、基因和/或在基因表达盒中的一个或多个基因。在一些实施方式中，“非天然”指在自然界中未发现彼此具有相同关系的两个或多个核酸序列。非天然核酸序列可以存在于质粒或染色体上。
如本文所用，“异源”基因或“异源序列”指在自然界中通常不存在于给定细胞中的核苷酸序列。如本文所用，异源序列包括外源引入给定细胞的核酸序列。“异源基因”包括以不同于相应天然基因的形式引入宿主细胞的天然基因或其片段。例如，异源基因可以包括作为嵌合基因的一部分的天然编码序列，以包括作为嵌合基因的一部分的天然编码序列，以包括重新引入宿主细胞的非天然调控区。异源基因还可以包括引入非天然宿主细胞的天然基因或其片段。因此，异源基因相对于受体细胞可以是外来的或天然的；在给定细胞中天然存在但表达非天然量的核酸和/或其编码的多肽的核酸序列；和/或两个或多个在自然界中彼此不具有相同关系的核酸序列。
如本文所用，术语“内源性基因”指在生物体基因组中位于其天然位置的天然基因。如本文所用，术语“转基因”指已被引入宿主生物(例如宿主细菌细胞)基因组中的基因。
如本文所用，术语术语“部分消退”指在向患有肿瘤的受试者施用微生物和/或免疫调节剂后，肿瘤生长抑制和/或肿瘤消退(例如在尺寸上)。在一个实施方式中，“部分消退”可以指肿瘤消退(例如在尺寸上)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或者至少约90％。在另一个实施方式中，“部分消退”可以指肿瘤尺寸减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％或者至少约90％。在一个实施方式中，“部分消退”指肿瘤消退(例如在尺寸上)，但是其中肿瘤在受试者中仍是可检测的。
如本文所用，术语术语“完全消退”指向患有肿瘤的受试者施用微生物和/或免疫调节剂后，肿瘤完全消退(例如在尺寸上)。当发生“完全消退”时，肿瘤在受试者中无法检测到。
如本文所用，术语术语“应答百分比”指施用微生物和/或免疫调节剂之后，在受试者人类群体中显示出如本文所定义的部分消退或完全消退的受试者的百分比。例如，在一个实施方式中，在受试者群体中约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或者约95％的受试者显示出部分应答或完全应答。
如本文所用，术语“病情稳定”指癌症或肿瘤既不生长也不缩小。“病情稳定”还指其中没有发展成新的肿瘤，并且癌症或肿瘤没有(例如通过转移)扩散到身体的任何新区域或面积的疾病状态。
“瘤内施用”意在包括将微生物递送至肿瘤内部位的任何和所有手段，并且不限于瘤内注射方式。本文详细讨论了用于微生物的递送方式的实例。
“癌症”或“癌的(cancerous)”用于指以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。在一些实施方式中，癌症是指肿瘤。“肿瘤”用于指任何肿瘤细胞生长或增殖或任何癌前或癌细胞或组织。肿瘤可以是恶性的或良性的。癌症的类型包括但不限于肾上腺癌，肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌(例如尤文肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)，脑癌(例如星形细胞瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤)，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，乳腺癌，Castleman病，宫颈癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，胆囊癌，胃肠道癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞疾病，心脏癌，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌，下咽癌，白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病)，肝癌，肺癌，淋巴瘤(例如艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，鼻腔癌，鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，横纹肌样瘤，唾液腺癌，肉瘤，皮肤癌(例如基底细胞癌、黑色素瘤)，小肠癌，胃癌，畸胎瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺癌，甲状腺癌，不寻常的儿童癌症，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。癌症治疗的副作用可能包括但不限于机会性自身免疫性疾病，全身毒性，贫血，食欲不振，膀胱内层刺激，出血和瘀伤(血小板减少症)，味觉或嗅觉改变，便秘，腹泻，口干，吞咽困难，水肿，疲劳，脱发(脱发)，感染，不孕，淋巴水肿，口腔溃疡，恶心，疼痛，周围神经病变，蛀牙，尿路感染和/或记忆和注意力问题(National Cancer Institute)。
如本文所用，“远端”和“远端效应”是指其中肿瘤的局部治疗不仅缩小或以其他方式影响所治疗的肿瘤，而且还缩小或以其他方式影响局部治疗范围之外的其他肿瘤的效应。在一些实施方式中，所述细菌可引起远端效应。在一些实施方式中，在施用细菌时未观察到远端效应。
在观察到远端效应的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中相同类型的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，在远离施用部位的相同类型肿瘤中肿瘤生长时间延迟至少约0至2天、至少约2至4天、至少约4至6天、至少约6至8天、至少约8至10天、至少约10至12天、至少约12至14天、至少约14至16天、至少约16至18天、至少约18至20天、至少约20至25天、至少约25至30天、至少约30至35天。
在观察到远端效应的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中相同类型的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，在相同类型的远端肿瘤中以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2周、至少约2至4周、至少约4至6周、至少约6至8周、至少约8至10周、至少约10至12周、至少约12至14周、至少约14至16周、至少约16至18周、至少约18至20周、至少约20至25周、至少约25至30周、至少约30至35周、至少约35至40周、至少约40至45周、至少约45至50周、至少约50至55周、至少约55至60周、至少约60至65周、至少约65至70周、至少约70至80周、至少约80至90周或者至少约90至100周。
在观察到远端效应的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，在远离施用部位的相同类型肿瘤中以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2年、至少约2至4年、至少约4至6年、至少约6至8年、至少约8至10年、至少约10至12年、至少约12至14年、至少约14至16年、至少约16至18年、至少约18至20年、至少约20至25年、至少约25至30年、至少约30至35年、至少约35至40年、至少约40至45年、至少约45至50年、至少约50至55年、至少约55至60年、至少约60至65年、至少约65至70年、至少约70至80年、至少约80至90年或者至少约90至100年。
在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约1.0-1.2倍、至少约1.2-1.4倍、至少约1.4-1.6倍、至少约1.6-1.8倍、至少约1.8-2倍或者至少约2倍。在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约2至3倍、至少约3至4倍、至少约4至5倍、至少约5至6倍、至少约6至7倍、至少约7至8倍、至少约8至9倍、至少约9至10倍、至少约10至15倍、至少约15至20倍、至少约20至30倍、至少约30至40倍或者至少约40至50倍、至少约50至100倍、至少约100至500倍或者至少约500至1000倍。在该实例中，“肿瘤再次挑战”还可以包括转移形成，其可以在处于癌症进展某个阶段的受试者中出现。
免疫记忆代表了在哺乳动物中免疫应答的一个重要方面。记忆应答形成了对抗癌细胞的疫苗的效力的基础。如在本文中所使用的，术语“免疫记忆(immune memory/immunological memory)”指其中长寿命的抗原特异性淋巴细胞是可用的并且在重复暴露于特定抗原后能够迅速引发应答的状态。免疫记忆在癌症免疫治疗中的重要性是众所周知的，并且记忆T细胞的转运性质和持久的抗肿瘤能力在控制恶性肿瘤以及防止转移或复发中起着至关重要的作用。B淋巴细胞和T细胞均存在免疫记忆，并且目前认为其存在于多种其他免疫细胞中，包括NK细胞、巨噬细胞和单核细胞。(参见例如，Farber等，Immunologicalmemory:lessons from the past and a look to the future.Nat.Rev.Immunol.(2016)16:124-128)。记忆B细胞是能够长时间产生抗体的浆细胞。记忆B细胞已经经历了克隆扩增和分化以及亲和性成熟，因此其能够更快地分裂多次并产生具有更高亲和性的抗体。记忆T细胞可以是CD4+和CD8+。这些记忆T细胞不需要进一步的抗原刺激即可增殖，从而其不需要通过MHC发出信号。
例如，可以通过在给予微生物达到完全消退后通过对动物模型进行再次挑战来在动物模型中测量免疫记忆。然后，向动物移植来自癌细胞系的癌细胞并监测其生长情况，并与此前未暴露于肿瘤的相同类型的年龄匹配的天然动物进行比较。将此类肿瘤再次挑战用于证明针对抗肿瘤细胞的全身性和长期免疫力，并且其可能代表了抵抗未来复发或转移形成的能力。本文在实施例中使用A20肿瘤模型描述了此类实验。与天然动物相比，免疫记忆将阻止或减缓在再次挑战的动物中肿瘤的复发。在细胞水平上，可以通过肿瘤抗原特异性记忆或效应记忆T细胞的扩增和/或持久性测量免疫记忆的形成。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的组合物在受试者中实现免疫记忆。在一些实施方式中，通过使用本文所述的组合物在癌症患者中实现免疫记忆。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的组合物在受试者中实现完全应答。在一些实施方式中，通过使用本文所述的组合物在癌症患者中实现完全应答。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的组合物在受试者中实现完全缓解。在一些实施方式中，通过使用本文所述的组合物在癌症患者中实现完全缓解。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的组合物在受试者中实现部分应答。在一些实施方式中，通过使用本文所述的组合物在癌症患者中实现部分应答。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的组合物在受试者中实现病情稳定。在一些实施方式中，通过使用本文所述的组合物在癌症患者中实现部分应答。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的组合物在组内的受试者子集中实现部分或完全应答。在一些实施方式中，通过施用本文所述的组合物在组内的患者子集中实现部分或完全应答。
在观察到免疫记忆的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，肿瘤生长时间延迟至少约0至2天、至少约2至4天、至少约4至6天、至少约6至8天、至少约8至10天、至少约10至12天、至少约12至14天、至少约14至16天、至少约16至18天、至少约18至20天、至少约20至25天、至少约25至30天、至少约30至35天。
在观察到免疫记忆的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2周、至少约2至4周、至少约4至6周、至少约6至8周、至少约8至10周、至少约10至12周、至少约12至14周、至少约14至16周、至少约16至18周、至少约18至20周、至少约20至25周、至少约25至30周、至少约30至35周、至少约35至40周、至少约40至45周、至少约45至50周、至少约50至55周、至少约55至60周、至少约60至65周、至少约65至70周、至少约70至80周、至少约80至90周或者至少约90至100周。
在观察到免疫记忆的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2年、至少约2至4年、至少约4至6年、至少约6至8年、至少约8至10年、至少约10至12年、至少约12至14年、至少约14至16年、至少约16至18年、至少约18至20年、至少约20至25年、至少约25至30年、至少约30至35年、至少约35至40年、至少约40至45年、至少约45至50年、至少约50至55年、至少约55至60年、至少约60至65年、至少约65至70年、至少约70至80年、至少约80至90年或者至少约90至100年。
在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约1.0-1.2倍、至少约1.2-1.4倍、至少约1.4-1.6倍、至少约1.6-1.8倍、至少约1.8-2倍或者至少约2倍。在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约2至3倍、至少约3至4倍、至少约4至5倍、至少约5至6倍、至少约6至7倍、至少约7至8倍、至少约8至9倍、至少约9至10倍、至少约10至15倍、至少约15至20倍、至少约20至30倍、至少约30至40倍或者至少约40至50倍、至少约50至100倍、至少约100至500倍或者至少约500至1000倍。
如本文所用，“热肿瘤”指T细胞发炎的肿瘤，即与浸润到肿瘤中的大量T细胞相关。“冷肿瘤”的特征在于不存在浸润肿瘤的效应T细胞，并进一步分为“免疫排斥”肿瘤，其中免疫细胞被肿瘤吸引但不能浸润肿瘤微环境，以及“免疫忽略”表型，其中根本没有发生募集免疫细胞(在Van der Woude等，Migrating into the Tumor:a Roadmap for TCells.Trends Cancer.2017Nov；3(11):797-808)中进行了进一步综述。
“缺氧”用于指相比生理水平降低的组织氧供应，从而产生缺氧环境。“常氧”指的是组织氧供应的生理水平。缺氧是实体瘤的标志，其特征在于由于灌注不足而导致的低氧和坏死区域(Groot等，2007)。
如本文所用，术语“低氧”是指氧气(O2)的水平、量或浓度低于大气中存在的氧气的水平、量或浓度(例如<21％O2；<160托O2)。因此，术语“低氧条件或条件”或“低氧环境”是指含有比大气中存在的氧气的水平低的氧气的条件或环境。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指在哺乳动物肠道(例如腔、胃、小肠、十二指肠、空肠、回肠、大肠、盲肠、结肠、远端乙状结肠、直肠和肛管)中发现的氧气(O2)的水平、量或浓度。在一些实施方式中，术语“低氧”是指O2的水平、量或浓度为0-60mmHg O2(0-60托O2)(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60mmHg O2)，包括任何和所有其增量部分(例如0.2mmHg、0.5mmHg O2、0.75mmHg O2、1.25mmHg O2、2.175mmHg O2、3.45mmHg O2、3.75mmHg O2、4.5mmHgO2、6.8mmHg O2、11.35mmHg O2、46.3mmHg O2、58.75mmHg等，这些示例性的部分在此列出用于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制)。在一些实施方式中，“低氧”是指约60mmHg O2或更低(例如0至约60mmHg O2)。术语“低氧”也可以指的是0-60mmHg O2(含端点)之间范围O2水平、量或浓度，例如0-5mmHg O2、<1.5mmHg O2、6-10mmHg、<8mmHg，47-60mmHg等，这些示例性的范围在此列出用于说明目的，并不意味着以任何方式进行限制。参见例如Albenberg等，Gastroenterology，147(5)：1055-1063(2014)；Bergofsky等，JClin.Invest.，41(11)：1971-1980(1962)；Crompton等，J Exp.Biol.，43：473-478(1965)；He等，PNAS(USA)，96：4586-4591(1999)；McKeown，Br.J.Radiol.，87：20130676(2014)(doi：10.1259/brj.20130676)，其各自讨论了在各种物种的哺乳动物肠中发现的氧水平，并且其各自全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指在除肠以外的哺乳动物器官或组织(例如泌尿生殖道、肿瘤组织等)中发现的氧(O2)的水平、量或浓度，其中氧以降低的水平存在，例如在低氧(hypoxic)或缺氧(anoxic)水平。在一些实施方式中，“低氧”是指存在于部分需氧、半需氧、微需氧、无氧、微氧、低氧、缺氧和/或厌氧条件下的氧气(O2)的水平、量或浓度。例如，表1总结了各种器官和组织中存在的氧气量。在一些实施方式中，氧气(O2)的水平、量或浓度表示为溶解氧的量(“DO”)，其是指液体中存在的游离的非化合物氧(O2)的水平和通常以毫克/升(mg/L)，百万分率(ppm；1mg/L＝1ppm)或微摩尔(μmole)(1μmol O2＝0.022391mg/L O2)报告。Fondriest Environmental,Inc.,“Dissolved Oxygen”,Fundamentals of Environmental Measurements，2013年11月19日，www.fondriest.com/environmental-measurements/parameters/water-quality/dissolved-oxygen/>。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指氧(O2)的水平、量或浓度为约6.0mg/L DO或更低，例如6.0mg/L、5.0mg/L、4.0mg/L、3.0mg/L、2.0mg/L、1.0mg/L或0mg/L，及其中任何部分，例如3.25mg/L、2.5mg/L、1.75mg/L、1.5mg/L、1.25mg/L、0.9mg/L、0.8mg/L、0.7mg/L、0.6mg/L、0.5mg/L、0.4mg/L、0.3mg/L、0.2mg/L和0.1mg/L DO，这里列出的示例性部分用于说明目的，并不意味着以任何方式进行限制。氧的液体或溶液水平也可以被报告为空气饱和度的百分比或氧饱和度的百分比(在稳定平衡下在某个温度、压力和盐度下溶液中的溶解氧(O2)的浓度与将溶解于溶液中的氧的最大量的比率)。没有氧气生产者或消费者的充分通气的溶液(例如经受混合和/或搅拌的溶液)是100％空气饱和的。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指40％或更低的空气饱和度，例如40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％和0％的空气饱和度，包括其中任何和所有增量部分(例如30.25％、22.70％、15.5％、7.7％、5.0％、2.8％、2.0％、1.65％、1.0％、0.9％、0.8％、0.75％、0.68％、0.5％。0.44％、0.3％、0.25％、0.2％、0.1％、0.08％、0.075％、0.058％、0.04％。0.032％、0.025％、0.01％等)和在0-40％之间(含端点)(例如0-5％、0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.1-0.5％、0.5-2.0％、0-10％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％等)的任何范围的空气饱和度水平。
这里列出的示例性部分和范围是出于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。在一些实施方式中，术语“低氧”意指9％的O2饱和度或更低，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0％的O2饱和度，包括其任何和所有增量分数(例如6.5％、5.0％、2.2％、1.7％、1.4％、0.9％、0.8％、0.75％、0.68％、0.5％、0.44％、0.3％、0.25％、0.2％、0.1％、0.08％、0.075％、0.058％、0.04％。0.032％、0.025％、0.01％等)和在0-9％之间(含端点)(例如0-5％、0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.1-0.5％、0.5-2.0％、0-8％、5-7％、0.3-4.2％的O2等)的任何范围的O2饱和度水平。这里列出的示例性部分和范围是出于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。
表1.
隔室 氧气张力
胃 ～60托(例如58+/-15托)
十二指肠和空肠的第一部分 ～30托(例如32+/-8托)；环境空气中～20％的氧气
回肠(小肠中段) ～10托；环境空气中～6％的氧气(例如11+/-3托)
远端乙状结肠 ～3托(例如3+/-1托)
结肠 <2托
盲肠腔 <1托
肿瘤 <32托(大多数肿瘤<15托)
如本文所用，术语“基因”或“基因序列”是指表达多肽或蛋白质的任何序列，包括基因组序列，cDNA序列，天然存在的序列，人工序列和密码子优化的序列。术语“基因”或“基因序列”尤其包括内源基因的修饰，例如在自然界中通常不与之相关的启动子的控制下的天然和非天然基因的缺失，突变和表达。
如本文所用，术语“基因盒”和“回路”或“回路”尤其是指表达多肽或蛋白质的任何序列，包括基因组序列，cDNA序列，天然存在的序列，人工序列，和密码子优化的序列，包括内源基因的修饰，例如在自然界中通常不与之相关的启动子的控制下的天然和非天然基因的缺失，突变和表达。
抗体通常是指免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，其能够非共价地、可逆地和以特异性方式结合相应的抗原。示例性抗体结构单元包含四聚体，其由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)，通过二硫键连接。
如本文所用，术语“抗体”或“抗体”意在包括具有一种或多种特定结合特异性的抗体及其片段的所有变体。因此，术语“抗体”或“抗体”意指包括全长抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体(ScFv，骆驼科)，Fab，Fab’，这些片段的多聚体形式(例如F(ab’)2)，单域抗体(sdAB，VHH片段)，重链抗体(HCAb)，纳米抗体，双抗体和微抗体。抗体可具有一种以上的结合特异性，例如是双特异性的。术语“抗体”还意味着包括所谓的抗体模拟物，即可以特异性结合抗原但不具有抗体相关结构。
“单链抗体”或“单链抗体”通常是指包含免疫球蛋白的重链，免疫球蛋白的轻链和任选的接头或键(例如二硫键)的肽。单链抗体缺乏传统抗体中发现的恒定Fc区。在一些实施方式中，所述单链抗体是天然存在的单链抗体，例如骆驼科抗体。在一些实施方式中，所述单链抗体是合成的，工程化的或修饰的单链抗体。在一些实施方式中，尽管添加了接头并去除了恒定区，但与原始免疫球蛋白相比，单链抗体能够保留基本上相同的抗原特异性。在一些方面，所述单链抗体可以是“scFv抗体”，其是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白(没有任何恒定区)，任选地连接有10至约25个氨基酸的短接头肽，例如美国专利号4,946,778中描述的，其内容通过引用整体并入本文。Fv片段是保持抗体的结合位点的最小片段，该结合位点可以在一些方面维持原始抗体的特异性。用于产生单链抗体的技术描述于美国专利号4,946,778中。
如本文所用，术语“多肽”包括“多肽”以及“多肽”，并且是指由通过酰胺键(即肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指特定长度的产物。因此，“肽”，“二肽”，“三肽”，“寡肽”，“蛋白质”，“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可用于代替这些术语中的任何术语，或与这些术语中的任何术语互换。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，衍生化，蛋白水解切割或非天然存在的氨基酸修饰。在一些实施方式中，所述多肽由本发明的基因工程化细菌产生。本发明的多肽可具有约3或更多、5或更多、10或更多、20或更多、25或更多、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500或更多、1,000或更多或2,000或更多个氨基酸。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。特定水平的纯化是不需要的。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质，包括但不限于细菌或哺乳动物细胞，被认为出于本发明的目的是分离的，如是已被通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽。重组肽、多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的肽、多肽或蛋白质，即由通过编码多肽的外源重组DNA表达构建体转化的微生物或哺乳动物细胞产生的。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽通常不含聚糖。还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合作为多肽。术语“片段”，“变体”，“衍生物”和“类似物”包括具有与原始肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的多肽，并且包括保留相应的原始多肽的至少一种或多种性质的任何多肽。本发明的多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。片段还包括衍生自本文所述任何多肽的特异性抗体或生物活性片段或免疫活性片段。变体可以天然存在或非天然存在。可以使用本领域已知的诱变方法产生非天然存在的变体。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸置换，缺失或添加。
多肽还包括融合蛋白。如本文所用，术语“变体”包括融合蛋白，其包含原始肽的序列或与原始肽足够相似。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序列的嵌合蛋白质。通常，融合蛋白由众所周知的体外重组技术产生。融合蛋白可具有与作为融合蛋白的组分的个体原始蛋白质相似的结构功能(但不一定到了相同的程度)，和/或类似的调节功能(但不一定到了相同的程度)，和/或类似的生化功能(但不一定到了相同的程度)和/或免疫活性(但不一定到了相同的程度)。“衍生物”包括但不限于肽，其含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。通过比较一个肽的氨基酸序列与第二个肽的序列来确定两种肽之间的“相似性”。如果一个肽的氨基酸是相同的或保守的氨基酸置换，则其与第二个肽的相应氨基酸相似。保守置换包括在Dayhoff，MO编著，The Atlas of Protein Sequence and Structure 5，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，DC(1978)和Argos，EMBO J.8(1989)，779-785中描述的那些。例如，属于下组之一的氨基酸代表保守的变化或置换：-Ala，Pro，Gly，Gln，Asn，Ser，Thr；-Cys，Ser，Tyr，Thr；-Val，Ile，Leu，Met，Ala，Phe；-Lys，Arg，His；-Phe，Tyr，Trp，His；和-Asp，Glu。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码一种或多种融合蛋白的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与稳定化多肽融合的效应物例如免疫调节剂的基因序列。此类稳定化多肽是本领域已知的并且包括Fc蛋白。在一些实施方式中，由基因工程化细菌编码的融合蛋白是Fc融合蛋白，例如IgG Fc融合蛋白或IgA Fc融合蛋白。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂通过肽接头或肽键与稳定化多肽共价融合。在一些实施方式中，所述稳定化多肽包含免疫球蛋白Fc多肽。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc多肽包含至少一部分免疫球蛋白重链CH2恒定区。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH1恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区，免疫球蛋白重链CH2恒定区和免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。根据权利要求2-64和权利要求112-122中任一项的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽是人IgG Fc多肽。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc多肽是人IgG4 Fc多肽。在一些实施方式中，所述接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽包含序列[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n为1，2，3，4，5或6(SEQ ID NO:1245)。在一些实施方式中，所述融合蛋白包含SIRPαIgG FC融合多肽。在一些实施方式中，所述融合蛋白包含SIRPαIgG4 Fc多肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1121)。在一些实施方式中，SIRPα的N末端通过包含SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1121)的肽接头与IgG4Fc的C末端共价融合。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是多聚体多肽。在一些实施方式中，所述多肽是二聚体。二聚体蛋白质的非限制性实例包括细胞因子，例如IL-15(异二聚体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种多肽的一种或多种基因，其中所述一种或多种多肽包含第一单体和第二单体。在一些实施方式中，第一单体多肽通过肽接头或肽键与第二单体多肽共价连接。在一些实施方式中，所述接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，第一和第二单体具有相同的多肽序列。在一些实施方式中，第一和第二单体各自具有不同的多肽序列。在一些实施方式中，第一单体是IL-12p35多肽，第二单体是IL-12p40多肽。在一些实施方式中，所述接头包含GGGGSGGGS(SEQ ID NO:1244)。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是hIGg4融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:1117中的一个或多个具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的hIgG4部分。在另一个实施方式中，所述hIgG4部分包含SEQ ID NO:1117。在又一个实施方式中，所述多肽的hIgG4部分由SEQ ID NO:1117组成。
在一些实施方式中，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:1121中的一个或多个具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的接头部分。在另一个实施方式中，所述接头部分包含SEQ ID NO:1121。在又一个实施方式中，所述多肽的接头部分由SEQ ID NO:1121组成。
在一些实施方式中，可以通过与促进效应物功能的另一多肽融合来改善所述免疫调节剂的效应物功能。这种融合的非限制性实例是IL-15与IL-15Rα的Sushi结构域的融合，如本文所述。因此，在一些实施方式中，所述第一单体多肽是IL-15单体，所述第二单体是IL-15Rαsushi结构域多肽。
如本文所用，术语“足够相似”是指第一氨基酸序列，其相对于第二氨基酸序列含有足够或最少数量的相同或等同的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同一性的共同结构域的氨基酸序列在本文中定义为足够相似。优选地，变体与本发明的肽的氨基酸序列足够相似。这些变体通常保留了本发明的肽的功能活性。变体包括氨基酸序列分别与天然肽和野生型肽相差一个或多个氨基酸缺失，添加和/或置换的肽。这些可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
如本文所用，术语“接头”，“接头肽”或“肽接头”或“接头”是指连接或连接两个多肽序列，例如，连接两个多肽域的合成的或非天然或非天然存在的氨基酸序列。如本文所用，术语“合成的”是指非天然存在的氨基酸序列。本文描述了示例性接头。另外的示例性接头在US20140079701中提供，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，所述接头是富含甘氨酸的接头。在一些实施方式中，所述接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n。在一些实施方式中，所述接头包含SEQ ID NO:979。
免疫系统最广义地通常分为两类，固有免疫和适应性免疫，尽管与这些免疫相关的免疫反应并不相互排斥。“固有免疫”是指在外来因子或抗原在体内出现时立即或在数小时内激活的非特异性防御机制。这些机制包括物理屏障，例如皮肤，血液中的化学物质，以及免疫系统细胞，例如树突状细胞(DC)，白细胞，吞噬细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和自然杀伤细胞(NK)，它们攻击身体中的外来物质或细胞和改变免疫系统对于外来物质存在的静止。在固有免疫应答期间，产生细胞因子和趋化因子，与免疫抗原呈递组合以激活适应性免疫细胞和引发完全展开的免疫应答。“适应性免疫”或“获得性免疫”是指抗原特异性免疫应答。必须首先通过抗原呈递细胞(APC)处理或呈递抗原。抗原呈递细胞或辅助细胞是在其表面上展示直接或与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞。专业的抗原呈递细胞，包括巨噬细胞，B细胞，和树突细胞，专门用于将外来抗原以MHC-II限制性方式呈递给T辅助细胞，而其他细胞类型可以将来自细胞内的抗原以MHC-I限制性方式呈递给细胞毒性T细胞。一旦抗原被呈递并被识别，适应性免疫系统就会激活一群专门设计用于攻击该抗原的免疫细胞。与先天系统一样，适应性系统包括体液免疫组分(B淋巴细胞)和细胞介导的免疫(T淋巴细胞)组分。B细胞被激活以分泌抗体，其通过血流并与外来抗原结合。辅助T细胞(调节性T细胞，CD4+细胞)和细胞毒性T细胞(CTL，CD8+细胞)在其T细胞受体与抗原结合的MHC分子相互作用时被激活。细胞因子和共刺激分子帮助T细胞成熟，成熟细胞反过来产生细胞因子，从而产生额外的T细胞的初免和扩增，维持应答。一旦被激活，辅助T细胞释放细胞因子，其调节和指导不同免疫细胞类型(包括APC，巨噬细胞，中性粒细胞和其他淋巴细胞)的活性，以杀死和去除靶细胞。辅助T细胞还分泌额外的信号，有助于帮助维持免疫应答的细胞毒性T细胞的激活。激活后，CTL经历克隆选择，其中它获得功能、快速分裂以产生激活的效应细胞团和形成准备好快速应答于将来的威胁的长效记忆T细胞。然后，激活的CTL遍布全身，寻找具有独特MHC I类和抗原的细胞。效应器CTL释放细胞毒素，在靶细胞的质膜中形成孔，引起细胞凋亡。适应性免疫还包括“记忆”，使得针对特定抗原的未来反应更有效。在感染消退后，T辅助细胞和细胞毒性T细胞死亡并被吞噬细胞清除，然而，这些细胞中的一些仍然作为记忆细胞。如果稍后遇到相同的抗原，则这些记忆细胞迅速分化成效应细胞，缩短了产生有效反应所需的时间。
“免疫检查点抑制剂”或“免疫检查点”是指完全或部分减少，抑制，干扰或调节一种或多种免疫检查点蛋白质的分子。免疫检查点蛋白调节T细胞激活或功能，并且是本领域已知的。非限制性实例包括CTLA-4及其配体CD80和CD86，以及PD-1及其配体PD-L1和PD-L2。免疫检查点蛋白负责T细胞反应的共刺激或抑制相互作用，并调节和维持自身耐受性和生理免疫反应。
“共刺激”分子或“共刺激子”是免疫调节剂，其增加或激活刺激免疫应答或炎症反应的信号。
如本文所用，“抑制”癌细胞的免疫调节子，是指与对照(例如未处理的对照)相比，能够减少细胞增殖，减少肿瘤生长和/或减少肿瘤体积的分子至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
如本文所用，“激活”或“刺激”生物分子的免疫调节剂，例如细胞因子，趋化因子，免疫调节代谢物或任何其他免疫调节剂，因子或分子，是指与对照相比，例如，在相同条件下的未处理的对照，能够激活，增加，增强或促进该生物分子的生物活性，生物学功能和/或数量的免疫调节剂。
“用于肿瘤内施用的细菌”是指能够将其自身引导至癌细胞的细菌。用于肿瘤内施用的细菌可以天然地能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。
在一些实施方式中，不是天然能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌经基因工程改造以将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。可以进一步改造用于肿瘤内施用的细菌以增强或改善所需的生物学特性，减轻全身毒性和/或确保临床安全性。这些物种，菌株和/或亚型可以减毒，例如，缺失毒素基因。
在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌具有低感染能力。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌是运动的。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌能够深入渗透到肿瘤中，在那里标准治疗无法到达。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌能够定植至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的恶性肿瘤。用于肿瘤内施用的细菌的实例包括但不限于双歧杆菌属、柄杆菌属、梭菌属、大肠杆菌、李斯特菌属、分支杆菌属、沙门氏菌属、链球菌属和弧菌属，例如青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌UCC2003、婴儿型双歧杆菌、长双歧杆菌、丙酮丁醇梭菌、丁酸梭菌、丁酸梭菌M-55、丁酸梭菌miyairi、耳蜗梭菌、费地浸麻梭菌、溶组织梭菌、多酶梭菌、诺维梭菌NT、副腐化梭菌、巴斯德梭菌、蚀果胶梭菌、产气荚膜梭菌、玫瑰色梭菌、产芽孢梭菌、第三梭菌、破伤风梭菌、酪丁酸梭菌、短小棒状杆菌、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌Nissle 1917、单核细胞增生性李斯特菌、牛分支杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和霍乱弧菌(Cronin等，2012；Forbes,2006；Jain和Forbes,2001；Liu等，2014；Morrissey等，2010；Nuno等，2013；Patyar等，2010；Cronin,等，Mol Ther 2010；18:1397-407)。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌是非致病细菌。在一些实施方式中，肿瘤内施用通过注射进行。
“微生物”是指微观，亚显微或超微尺寸的生物或微生物，其通常由单个细胞组成。微生物的实例包括细菌、病毒、寄生虫、真菌、某些藻类、原生动物和酵母。在一些方面，将微生物修饰(“修饰微生物”)从其天然状态以产生一种或多种效应物或免疫调节剂。在某些实施方式中，修饰微生物是修饰细菌。在一些实施方式中，修饰微生物是基因工程化细菌。在某些实施方式中，修饰微生物是修饰的酵母。在其他实施方式中，修饰的微生物是基因工程化酵母。
如本文所用，术语“重组微生物”是指微生物，例如细菌，酵母或病毒细胞，或细菌，酵母或病毒，其已经从其天然状态进行遗传修饰。因此，“重组细菌细胞”或“重组细菌”是指已经从其天然状态进行基因工程化细菌细胞或细菌。例如，重组细菌细胞可以具有引入其DNA的核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸重排和核苷酸修饰。这些遗传修饰可以存在于细菌或细菌细胞的染色体中，或存在于细菌或细菌细胞中的质粒上。本文公开的重组细菌细胞可包含质粒上的外源核苷酸序列。或者，重组细菌细胞可包含稳定引入其染色体中的外源核苷酸序列。
“编程或工程微生物”是指微生物，例如细菌，酵母或病毒细胞，或细菌，酵母或病毒，其已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能。因此，“编程或工程化细菌细胞”或“编程或工程化细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能的细菌细胞或细菌。在某些实施方式中，编程或工程化细菌细胞已被修饰以表达一种或多种蛋白质，例如，一种或多种具有治疗活性或用于治疗目的的蛋白质。编程或工程化细菌细胞可另外具有一旦表达感兴趣的一种或多种蛋白质就停止生长或自我破坏的能力。
“非致病性细菌”是指不能在宿主中引起疾病或有害反应的细菌。在一些实施方式中，非致病细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，非致病细菌是革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，非致病细菌不含有脂多糖(LPS)。在一些实施方式中，非致病细菌是共生细菌。非致病性细菌的实例包括，但不限于属于以下属的某些菌株：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、酵母菌属和葡萄球菌属，例如凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、枯草拟杆菌、多形拟杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿型双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、丁酸梭菌、屎肠球菌、大肠杆菌Nissle、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌和布拉氏酵母菌(Sonnenborn等，2009；Dinleyici等，2014；美国专利号6,835,376；美国专利号6,203,797；美国专利号5,589,168；美国专利号7,731,976)。
“益生菌”用于指活的非致病微生物，例如细菌，其可赋予含有适量微生物的宿主生物以健康益处。在一些实施方式中，宿主生物是哺乳动物。在一些实施方式中，宿主生物是人。在一些实施方式中，益生菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，益生菌是革兰氏阳性细菌。目前，一些非致病细菌的物种，菌株和/或亚型被认为是益生菌。益生菌细菌的实例包括，但不限于属于以下属的某些菌株：双歧杆菌属、大肠杆菌、乳杆菌属和酵母菌属，例如两歧双歧杆菌、屎肠球菌、大肠杆菌Nissle、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和布拉氏酵母菌(Dinleyici等，2014；美国专利号5,589,168；美国专利号6,203,797；美国专利号6,835,376)。益生菌可以是细菌的变体或突变菌株(Arthur等，2012；Cuevas-Ramos等，2010；Olier等，2012；Nougayrede等，2006)。
“可操作地连接”指以允许核酸序列表达的方式连接至调控区序列的核酸序列，例如顺式作用。所述调节区是核酸，其可以引导感兴趣的基因的转录，并且可以包含启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、可诱导元件、启动子控制元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列和内含子。
“诱导型启动子”是指与一个或多个基因可操作地连接的调节区，其中基因的表达在所述调节区的诱导物的存在下增加。在一个实施方式中，诱导型启动子是水杨酸启动子。在另一个实施方式中，诱导型启动子是cumate启动子。在另一个实施方式中，诱导型启动子是富马酸-和-硝化酶还原酶启动子。
“外源环境条件”是指诱导本文所述启动子的环境或环境。在一些实施方式中，外源环境条件对含有癌细胞(例如肿瘤)的恶性生长是特异性的。短语“外源环境条件”意指完整(未溶解的)工程微生物外部的环境条件，但是对于肿瘤环境或宿主受试者环境是内源的或天然的。因此，“外源的”和“内源的”可互换使用，指其中环境条件对哺乳动物体为内源，但对完整微生物细胞是外部或外源的环境条件。在一些实施方式中，外源环境条件是低氧，微需氧或厌氧条件，例如低氧和/或坏死组织。一些实体瘤与低细胞内和/或细胞外pH相关；在一些实施方式中，外源环境条件是低pH环境。在一些实施方式中，本公开的基因工程微生物包含pH依赖性启动子。在一些实施方式中，本公开的基因工程微生物包含氧水平依赖性启动子。在一些方面，细菌已经进化出能够感测氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可以由不同的氧水平触发并且以不同的动力学发生。“氧水平依赖性启动子”或“氧水平依赖性调节区”是指一种或多种氧水平感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或激活激活下游基因表达。
氧水平依赖性转录因子的实例包括但不限于FNR(富马酸盐和硝酸盐还原酶)，ANR和DNR。相应的FNR响应性启动子，ANR(厌氧硝酸盐呼吸)-响应性启动子和DNR(异化硝酸盐呼吸调节剂)-响应性启动子是本领域已知的(参见，例如，Castiglione等，2009；Eiglmeier等，1989；Galimand等，1991；Hasegawa等，1998；Hoeren等，1993；Salmon等，2003)，非限制性实例示于表2中。
在一个非限制性实施例中，启动子(PfnrS)衍生自大肠杆菌Nissle富马酸和硝酸盐还原酶基因S(fnrS)，已知其在低环境氧或无环境氧条件下高度表达(Durand和Storz，2010；Boysen等，2010)。PfnrS启动子在厌氧条件下被天然存在于Nissle中的全局转录调节因子FNR激活。在厌氧条件下，FNR形成二聚体并与其控制下的特定基因的启动子中的特定序列结合，从而激活它们的表达。然而，在有氧条件下，氧与FNR二聚体中的铁-硫簇反应并将它们转化为无活性形式。以这种方式，采用PfnrS诱导型启动子来调节蛋白质或RNA的表达。PfnrS在本申请中与FNRS，fnrs，FNR，P-FNRS启动子和其他此类相关名称可互换使用以指示启动子PfnrS。
表2：转录因子和响应基因和调节区的实例
Figure BDA0003145696170000501
“组成型启动子”是指能够促进在其控制下和/或与其可操作连接的编码序列或基因连续转录的启动子。组成型启动子和变体在本领域是熟知的，并且本文和2017年1月11日提交以WO2017/123675公开的国际专利申请PCT/US2017/013072描述了组成型启动子的非限制性实例，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，此类启动子在体外具有活性，例如在培养、扩增和/或制造条件下。在一些实施方式中，此类启动子在体内具有活性，例如在体内环境中发现的条件下，例如肠和/或肿瘤微环境。
如本文所用，“稳定维持的”或“稳定的”细菌或病毒用于指携带非天然遗传物质的细菌或病毒宿主细胞，例如免疫调节剂，使得非天然遗传物质是保留，表达和传播。稳定的细菌或病毒能够在体外存活和/或生长，例如在培养基中和/或体内，例如在缺氧和/或坏死组织中。例如，稳定细菌或病毒可以是基因工程化细菌，其包含编码免疫调节剂的非天然遗传物质，其中携带非天然遗传物质的质粒或染色体稳定地保持在细菌或病毒中，使得免疫调节剂可以在细菌或病毒中表达，并且细菌或病毒能够在体外和/或体内存活和/或生长。
如本文所用，术语“调节”和“治疗”及其同源物是指癌症或其至少一种可辨别的症状的改善。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指至少一种可测量的物理参数的改善，不一定是患者可辨别的。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指在物理上(例如，可辨别的症状的稳定)，生理学上(例如，物理参数的稳定化)或两者来抑制癌症的进展。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指减缓癌症的进展或逆转癌症的进展。如本文所用，“预防”及其同源性是指延迟发作或降低获得给定癌症的风险。
需要治疗的那些可以包括已经患有特定癌症的个体，以及处于患有所述癌症的风险的那些，或可以最终患有所述癌症的那些。例如，通过与癌症的发生相关的一种或多种风险因素的存在(例如，酒精使用，烟草使用，肥胖，过度暴露于紫外线，高水平的雌激素，家族史，遗传易感性)，癌症的存在或进展，或患有癌症的受试者对治疗的可能接受，来评估治疗需求。癌症是由受影响细胞内的基因组不稳定性和高突变率引起的。治疗癌症可以包括消除与癌症相关的症状和/或调节受试者肿瘤的生长和/或体积，并且不一定包括消除癌症的潜在原因，例如潜在的遗传易感性。
如本文所用，术语“常规癌症治疗”或“常规癌症疗法”是指被大多数医疗保健专业人员广泛接受和使用的治疗或疗法。它与替代或补充疗法不同，后者没有广泛使用。常规癌症治疗的实例包括手术，化学疗法，靶向疗法，放射疗法，螺旋断层放疗(Tomotherapy)，免疫疗法，癌症疫苗，激素疗法，体温过高，干细胞移植(外周血、骨髓和脐带血移植)，光动力疗法，疗法，和血液制品捐赠和输血。
如本文所用，“药物组合物”是指本公开的基因工程微生物与其他组分(生理学上合适的载体和/或赋形剂)的制剂。
可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用的细菌或病毒化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语包括佐剂。
术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。实例包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。
术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指导致预防，延迟症状发作或改善病症(例如癌症)症状的化合物的量。治疗有效量可以例如足以治疗、预防、降低严重性、延迟发作和/或降低与癌细胞相关的病症的一种或多种症状发生的风险。治疗有效量以及治疗有效的给药频率可以通过本领域已知的方法确定并在下面讨论。
在一些实施方式中，术语“治疗性分子”指导致预防、延迟症状发作或减轻病况(例如癌症)的分子或化合物。在一些实施方式中，例如，治疗性分子可以是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂(例如精氨酸、犬尿氨酸消耗剂或腺苷消耗剂)、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化的化学疗法或裂解肽等等。
除非另有明确说明，否则本文所用的冠词“一”和“一个”应理解为表示“至少一个”。
当在列表中的要素之间使用时，短语“和/或”旨在表示(1)仅存在单个列出的要素，或(2)存在列表的多于一个要素。例如，“A，B和/或C”表示选择可以仅A；仅B；仅C；A和B；A和C；B和C；或A，B和C。短语“和/或”可以与列表中的要素中的“至少一个”或“一个或多个”互换使用。
细菌
在一个实施方式中，所述微生物可以是细菌。细菌可以全身，口服，局部和/或肿瘤内给药。在一些实施方式中，所述细菌能够靶向癌细胞，特别是在肿瘤的缺氧区域，并且与例如本文提供的免疫调节剂(例如免疫刺激剂或维持剂)组合施用。
在一些实施方式中，所述肿瘤靶向微生物是天然能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌。例如，可以在细菌或宿主中没有任何特异性遗传修饰的情况下实现肿瘤的细菌定植(Yu等，2008)。在一些实施方式中，所述肿瘤靶向细菌是天然不能将其自身引导至癌细胞、坏死组织和/或缺氧组织的细菌，但是经基因工程改造以这样做。在一些实施方式中，所述细菌血行传播以到达靶向肿瘤。细菌感染与肿瘤消退有关(Hall，1998；Nauts和McLaren，1990)，并且已经显示某些细菌物种定位并裂解坏死的哺乳动物肿瘤(Jain和Forbes，2001)。所述肿瘤靶向细菌的非限制性实例显示在表3中。
表3：具有肿瘤靶向能力的细菌
Figure BDA0003145696170000531
Figure BDA0003145696170000541
在一些实施方式中，所述细菌增强免疫疗法的有效性。最近的研究表明，某些类型的肠道微生物在小鼠中的存在可以增强癌症免疫治疗的抗肿瘤作用，而不增加毒副作用(M.Vétizou等，“Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gutmicrobiota,”Science,doi:10.1126/aad1329,2015；A.Sivan等，“CommensalBifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti–PD-L1efficacy,”Science,doi:0.1126/science.aac4255,2015)。在这些小鼠研究中鉴定的肠道微生物物种是否在人类中具有相同的效果尚不清楚。Vetizou等(2015)描述了特异性针对多形拟杆菌或脆弱拟杆菌的T细胞应答，其与小鼠和患者中CTLA-4阻断的功效相关。Sivan等(2015)说明了双歧杆菌对黑素瘤小鼠模型中抗肿瘤免疫和抗PD-L1抗体(PD-1配体)功效的重要性。
在一些实施方式中，所述细菌是拟杆菌属。在一些实施方式中，所述细菌是双歧杆菌属。在一些实施方式中，所述细菌是大肠杆菌Nissle。在一些实施方式中，所述细菌是诺维梭菌NT.在一些实施方式中，所述细菌是丁酸梭菌miyairi。
在某些实施方式中，所述微生物是专性厌氧菌。在某些实施方式中，所述细菌是兼性厌氧菌。在某些实施方式中，所述细菌是需氧细菌。在一些实施方式中，所述细菌是革兰氏阳性细菌并且缺乏LPS。在一些实施方式中，所述细菌是革兰氏阴性细菌并且缺乏LPS。在一些实施方式中，所述细菌是革兰氏阳性和专性厌氧细菌。在一些实施方式中，所述细菌是革兰氏阳性和兼性厌氧细菌。在一些实施方式中，所述细菌是非致病细菌。在一些实施方式中，所述细菌是共生细菌。在一些实施方式中，所述细菌是益生菌。
示例性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、茎杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、李斯特菌属、分支杆菌属、酵母菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、弧菌属、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、枯草拟杆菌、多形拟杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌UCC2003、婴儿型双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、丙酮丁醇梭菌、丁酸梭菌、丁酸梭菌M-55、丁酸梭菌miyairi、耳蜗梭菌、费地浸麻梭菌、溶组织梭菌、多酶梭菌、诺维梭菌NT、副腐化梭菌、巴斯德梭菌、蚀果胶梭菌、产气荚膜梭菌、玫瑰色梭菌、产芽孢梭菌、第三梭菌、破伤风梭菌、酪丁酸梭菌、短小棒状杆菌、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌Nissle 1917、单核细胞增生性李斯特菌、牛分支杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌和表3中所示的细菌。在某些实施方式中，所述细菌选自以下：屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌和布拉氏酵母菌。在某些实施方式中，所述细菌选自以下：脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、枯草拟杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿型双歧杆菌、乳双歧杆菌、丁酸梭菌、大肠杆菌Nissle、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和乳酸乳球菌。
在一些实施方式中，使用了乳杆菌属。已经发现静脉注射的干酪乳杆菌在肿瘤中积聚，这通过常用的NO供体硝酸甘油(NG)增强，这可能是由于NO在增加血流到血供不足的肿瘤中的作用(Fang等，2016(Methods Mol Biol.2016；1409:9-23，Enhancement ofTumor-Targeted Delivery of Bacteria with Nitroglycerin Involving Augmentationof the EPR Effect)。
在一些实施方式中，所述细菌是专性厌氧菌。在一些实施方式中，所述细菌是梭菌属。梭菌属属于专性厌氧细菌，其产生孢子并且天然能够定植并且在一些情况下溶解缺氧肿瘤(Groot等，2007)。在实验模型中，梭菌属已用于递送前药转化酶并增强放射治疗(Groot等，2007)。在一些实施方式中，所述细菌选自诺维梭菌NT、溶组织梭菌、破伤风梭菌、溶瘤梭菌、产芽胞梭菌和拜氏梭菌(Liu等，2014)。在一些实施方式中，梭菌属天然是非致病性的。例如，溶瘤梭菌是致病性的并且能够裂解肿瘤细胞。在替代性实施方式中，梭菌属是天然致病性的但经过修饰以降低或消除致病性。例如，诺维梭菌是天然致病性的，并且诺维梭菌NT被修饰以去除致死毒素。诺维梭菌NT和产芽胞梭菌已用于递送单链HIF-1α抗体以治疗癌症，并且是“优良的肿瘤定植梭菌属菌株”(Groot等，2007)。
在一些实施方式中，所述细菌兼性厌氧菌。在一些实施方式中，所述细菌是沙门氏菌属，例如鼠伤寒沙门氏菌。沙门氏菌属是非孢子形成的革兰氏阴性细菌，是兼性厌氧菌。在一些实施方式中，沙门氏菌属是天然致病性的，但经过修饰以减少或消除致病性。例如，对鼠伤寒沙门氏菌进行修饰以去除致病位点(减毒)。在一些实施方式中，所述细菌是双歧杆菌属。双歧杆菌属是革兰氏阳性、分支的厌氧细菌。在一些实施方式中，双歧杆菌属是天然非致病性的。在替代性实施方式中，双歧杆菌属是天然致病性的，但经过修饰以降低或消除致病性。已显示双歧杆菌属和沙门氏菌属优先靶向并在肿瘤的缺氧和坏死区域中复制(Yu等，2014)。
在一些实施方式中，所述细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，所述细菌是大肠杆菌。例如，已显示大肠杆菌Nissle在口服或静脉内给药后优先在体内定植肿瘤组织(Zhang等，2012和Danino等，2015)。大肠杆菌也显示出强大的肿瘤特异性复制(Yu等，2008)。在一些实施方式中，所述细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(大肠杆菌Nissle)，肠杆菌科的革兰氏阴性细菌，“已经进化为最佳表征的益生菌之一”(Ukena等，2007)。该菌株的特征在于其完全无害(Schultz，2008)，并且具有GRAS(通常识别为安全)状态(Reister等，2014，强调)。
在一些实施方式中，重复施用所述细菌。在一些实施方式中，所述细菌施用一次。
适合的细菌的其他实例描述于国际专利公开WO/2014/043593中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，突变此类细菌以减弱一种或多种毒力因子。至少在以下中描述了其他细菌：Song等，Infectious Agents and Cancer,2018；和Lukasiewicz和Fol,J.Immunol.Research,2018,文章ID 2397808。
在一些实施方式中，本公开的细菌在肿瘤中增殖和定植。在一些实施方式中，定植持续数天、数周、数月、数年或无限期。在一些实施方式中，所述细菌不在肿瘤中增殖，并且注射后细菌计数迅速下降(例如少于注射后一周)直至不再能够检测到。
必需基因和营养缺陷型
如本文所用，术语术语“必需基因”是指细胞生长和/或存活所必需的基因。细菌必需基因是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以通过定向缺失基因和/或随机诱变和筛选来鉴定(参见，例如，Zhang和Lin,2009,DEG 5.0,a database of essential genes inboth prokaryotes and eukaryotes,Nucl.Acids Res.,37:D455-D458和Gerdes等，Essential genes on metabolic maps,Curr.Opin.Biotechnol.,17(5):448-456，其中每一个的全部内容通过引用明确地并入本文中)。
“必需基因”可能取决于生物体所处的环境和环境。例如，必需基因的突变，修饰或切除可导致本公开的重组细菌成为营养缺陷型。营养缺陷型修饰旨在使细菌在没有外源添加的生存或生长必需营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养素所必需的基因。
营养缺陷型修饰旨在使细菌在没有外源添加的生存或生长必需营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养素所必需的基因。在一些实施方式中，本文所述的任何基因工程化细菌还包含细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变。在一个实施方式中，必需基因是DNA合成基因，例如thyA。在另一个实施方式中，必需基因是细菌细胞壁合成基因，例如dapA。在另一个实施方式中，必需基因是氨基酸基因，例如serA或MetA。可以靶向细胞存活和/或生长所需的任何基因，包括但不限于cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proAB和thi1，只要相应的野生型基因产物不在细菌中产生。示例性细菌基因可被破坏或缺失以产生营养缺陷型菌株，如在2017年11月1日提交的公开为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072中所述，其全部内容通过引用并入本文。这些包括但不限于寡核苷酸合成，氨基酸合成和细胞壁合成所需的基因。表4列出了可以被破坏或缺失以生产营养缺陷型菌株的示例性细菌基因。这些包括但不限于寡核苷酸合成、氨基酸合成和细胞壁合成所需的基因。
表4：用于产生营养缺陷型的细菌基因的非限制性实例
Figure BDA0003145696170000581
Figure BDA0003145696170000591
营养缺陷型突变在一些情况下很有用，在某些情况下，可能需要采用生物控制策略来防止基因工程化细菌在自然生态系统中意外繁殖。可以将上文所述的或本领域公知的在必需基因中的任何营养缺陷型突变用于此目的，例如DNA合成基因、氨基酸合成基因或用于细胞壁合成的基因。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含在一个或多个营养缺陷型基因中的一种或多种突变或缺失，例如以阻止细菌在自然环境中生长和增殖。在一些实施方式中，修饰可以位于非编码区。在一些实施方式中，修饰导致转录或翻译减弱。在一些实施方式中，修饰(例如突变或缺失)导致必需基因的转录减少或不转录或者翻译减少或不翻译。在一些实施方式中，修饰(例如突变或缺失)导致必需基因的无功能形式的转录和/或翻译。在一些实施方式中，修饰(例如突变或缺失)导致必需基因截短的转录或翻译，从而产生截短的多肽。在一些实施方式中，修饰(例如突变)位于基因的编码区内。
虽然不能在自然生态系统中生长，但某些营养缺陷型突变可以允许在施用细菌的哺乳动物宿主中(例如在肿瘤环境中)生长和增殖。例如，由营养缺陷型突变使之失去功能的必需途径可以由肿瘤微环境中宿主产生的代谢产物来补充。结果，施用于宿主的细菌可以从环境吸收代谢产物，并且可以增殖和定植于肿瘤中。因而，在一些实施方式中，营养缺陷型基因是产生代谢产物的必需基因，所述代谢产物也由哺乳动物宿主体内(例如在肿瘤环境中)产生。在一些实施方式中，宿主肿瘤产生的代谢产物可允许细菌吸收代谢产物，并允许细菌在肿瘤内存活和/或增殖。在一些实施方式中，包含这种营养缺陷型突变的细菌能够以与不携带营养缺陷型突变的相同亚型细菌相同的程度增殖和定植于肿瘤。
在一些实施方式中，所述细菌能够在肿瘤微环境中定植和增殖。在一些实施方式中，所述肿瘤定植细菌包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述肿瘤定植细菌不包含一种或多种营养缺陷型修饰或突变。在一个非限制性实施例中，在24小时和72小时后检测到的细菌数量要比最初注入受试者的细菌数量多。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约5至6个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约5至6个对数。在一些实施方式中，可以在随后的的时间点(例如注射后至少一个星期之后、至少两个或更多个星期之后、至少一个月之后、至少两个或更多个月之后)测量CFU。
如本文所示，允许肿瘤增殖和定植的这类营养缺陷型基因的非限制性实例是thyA和uraA。因此，在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌可以在thyA基因中包含营养缺陷型修饰(例如突变或缺失)。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌可以在uraA基因中包含营养缺陷型修饰(例如突变或缺失)。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌可以在thyA基因和uraA基因中包含营养缺陷型修饰(例如突变或缺失)。
或者，所述营养缺陷型基因是用于产生代谢产物的必需基因，所述代谢产物不能由肿瘤内的宿主产生，即营养缺陷型突变不能与肿瘤微环境中的宿主产生的代谢产物互补。结果，这种突变可能影响细菌生长和定殖于肿瘤中的能力，并且细菌计数随着时间的推移而减少。可以将这种类型的营养缺陷型突变用于调节免疫调节剂的体内活性或免疫调节剂活性的持续时间，例如在肿瘤内。本文描述了使用dapA中的营养缺陷性修饰(例如突变)来微调免疫调节剂释放的水平和时间的方法的实例。二氨基庚二酸(Dap)是某些细菌细胞壁(例如革兰氏阴性细菌)的特征性组分。没有二氨基庚二酸，细菌不能形成蛋白聚糖，因此无法生长。DapA不是由哺乳动物细胞产生的，因此在肿瘤中没有提供DapA的替代来源。这样，dapA营养缺陷型可能呈现出特别有用的策略，以调节和微调肿瘤中细菌存在的时机和程度和/或免疫调节剂表达和产生的水平和时机。因此，在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌包含必需基因中的突变，所述必需基因用于产生代谢产物，所述代谢产物不能由肿瘤内的宿主产生。在一些实施方式中，营养缺陷型突变是在本领域公知或本文所述的细菌细胞壁的产生和维持所必需的基因中，或在对细菌特有且不在哺乳动物细胞中存在的另一种结构所必需的基因中的突变。在一些实施方式中，与不带有营养缺陷型突变的相同亚型的细菌相比，包含这类营养缺陷型突变的细菌能够以较小的程度在肿瘤中增殖和定植。细菌生长的控制(和通过效应物水平的程度)可以进一步与其他调控策略组合，包括但不限于本文所述的代谢产物或化学诱导型启动子。
在一个非限制性实施例中，在24小时和72小时后，检测的细菌数量比最初注射至受试者的细菌少。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约5至6个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约5至6个对数。在一些实施方式中，可以在随后的的时间点(例如注射后至少一个星期之后、至少两个或更多个星期之后、至少一个月之后、至少两个或更多个月之后)测量CFU。
在一些实施方式中，本文公开的细菌在dapA中包含营养缺陷型修饰(例如突变)。trpE是本文所述的另一个营养缺陷型突变。携带这一突变的细菌不能产生色氨酸。在一些实施方式中，所述细菌在一个必需基因中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在两个必需基因中包含一种或多种营养缺陷型突变(双营养缺陷型)。在一些实施方式中，所述细菌在三个或更多个必需基因中包含一种或多种应用缺陷型突变。
在一些实施方式中，所述细菌在dapA和thyA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在dapA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在dapA、thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。
在一些实施方式中，所述细菌在trpE中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在trpE和thyA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在trpE和dapA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在trpE和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在trpE、dapA和thyA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在trpE、dapA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，所述细菌在trpE、thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE、dapA、thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。
在另一个非限制性实施例中，可以产生条件性营养缺陷型。将dapA或thyA的染色体拷贝敲除。引入thyA或dapA的另一个拷贝，例如在低氧启动子的控制下。在厌氧条件下，可以表达dapA或thyA(视情况而定)，并且该菌株可以在没有dap或胸腺嘧啶的情况下生长。在有氧条件下，dapA或thyA表达被关闭，并且在没有dap或胸腺嘧啶的情况下菌株无法生长。还可以采用这样的策略以允许细菌在厌氧条件下，例如肠道或肿瘤微环境的条件下存活，但是阻止其在有氧条件下的存活。
在一些实施方式中，本公开的细菌是合成的配体依赖性必需基因(SLiDE)细菌细胞。SLiDE细菌细胞是合成的营养缺陷型，在一种或多种必需基因中发生突变，只在特定配体存在下生长(Lopez和Anderson“Synthetic Auxotrophs with Ligand-DependentEssential Genes for a BL21(DE3 Biosafety Strain,”ACS Synthetic Biology(2015)DOI:10.1021/acssynbio.5b00085，其全部内容通过引用明确地并入本文中)。在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了SLiDE细菌细胞，其全部内容通过引用并入本文。
免疫调节剂
溶瘤作用和先天性免疫应答的激活
在某些实施方式中，本公开的一种或多种免疫调节剂产生先天性抗肿瘤免疫应答。在某些实施方式中，所述一种或多种免疫调节剂产生了局部抗肿瘤免疫应答。在一些方面中，所述免疫调节剂能够激活针对远距离肿瘤细胞的系统性抗肿瘤免疫力。在某些实施方式中，所述一种或多种免疫调节剂产生系统性或适应性抗肿瘤免疫应答。在一些实施方式中，所述一种或多种免疫调节剂导致长期免疫记忆。一种或多种适宜的免疫调节剂的实例(例如免疫引发剂和/或免疫维持剂)如本文所述。
在其他实施方式中，所述一种或多种免疫调节剂可以与微生物组合施用。或者，一种或多种第一免疫调节剂可以与微生物和一种或多种第二免疫调节剂组合施用。
在肿瘤微环境中发现的许多免疫细胞表达模式识别受体(PRR)，这些受体通过激活促炎信号传导通路、刺激吞噬反应(巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)或作为分泌蛋白质结合微生物而在先天性免疫应答中发挥关键作用。PRR识别两类分子：与微生物病原体相关的病原体相关分子模式(PAMP)，和与在细胞损伤、死亡应激或组织损伤过程中释放的细胞组分相关的损伤相关分子模式(DAMP)。PAMP对于每种病原体是独特的，并且是病原体存活所需的必需分子结构，例如细菌细胞壁分子(例如脂蛋白)、病毒衣壳蛋白以及病毒和细菌DNA。PRR可以识别各种微生物病原体，包括细菌、病毒、寄生虫、真菌和原生动物。PRR主要由先天性免疫系统的细胞(例如抗原呈递巨噬细胞和树突状细胞)表达，但也可以由其他细胞(免疫细胞和非免疫细胞两者)表达，并且定位于细胞表面以检测细胞外病原体或定位于内体和细胞基质内，在那里它们检测细胞内入侵病毒。
PRR的实例包括Toll样受体(TLR)，其是具有检测感染病原体的细胞外结构域的1型跨膜受体。TLR1、2、4和6识别细菌脂质，TLR3、7和8识别病毒RNA，TLR9识别细菌DNA，TLR5和10识别细菌或寄生虫蛋白。PRR的其他实例包括C型凝集素受体(CLR)，例如I组甘露糖受体和II组脱唾液酸糖蛋白受体，细胞质(细胞内)PRR，核苷酸寡聚化(NOD)样受体(NLR)，例如NOD1和NOD2，视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体(RLR)，例如RIG-I、MDA5和DDX3，以及分泌的PRR，例如集合素、五聚蛋白、纤维凝胶、脂质转移酶、肽聚糖识别蛋白(PGR)和富含亮氨酸的重复受体(LRR)。
RR启动信号通路(例如刺激共刺激分子和促炎细胞因子(例如I型IFN、IL-6、TNF和IL-12)的产生的NF-κB通路)的激活的机制在激活针对感染性病原体的炎症和免疫应答中起作用。这样的应答引发参与适应性免疫应答的肿瘤微环境中存在的免疫细胞(例如抗原提呈细胞(APC)，例如B细胞、DC、TAM和其他髓系来源的抑制细胞)的激活。最近的证据表明，由PAMP和DAMP激活的免疫机制也在激活针对肿瘤细胞的免疫应答中起作用(LeMercier等，Canc Res,73:4629-40(2013)；Kim等，Blood,119:355-63(2012))。
另一种PRR亚家族是被认为是在病毒感染时的双链病毒RNA的感测子和可以被靶向用于肿瘤内免疫刺激的RIG-I样受体(RLR)。在刺激时，例如在肿瘤内递送溶瘤病毒时，RLR触发宿主细胞释放I型IFN并导致其通过细胞凋亡而死亡。这样的细胞因子和肿瘤相关抗原(TAA)释放也导致抗肿瘤免疫应答的激活。鉴于RLR在所有肿瘤类型中内源表达，它们是通用的免疫原性治疗靶点，并且与通过局部递送溶瘤病毒产生的免疫应答尤其相关。
在一些方面中，所述细菌底盘本身可以激活一种或多种RRR受体(例如TLR或RIGI)，并且刺激固有免疫应答。
在一些实施方式中，所述细菌是瘤内施用和5-FC是全身施用。在一些实施方式中，所述细菌和5-FC两者均是全身施用。
在这些组合实施方式的任一个中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，所述细菌还可以包含噬菌体修饰，例如，在如本文所述的原噬菌体中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，所述细菌还可以包含一个或多个抗生素抗性回路(circuit)。
吞噬作用逃逸的抑制-CD47-SIRPα途径
癌症具有上调“不要吃我”信号的能力，以允许逃避内源性“吃我”信号，这些信号是作为程序性细胞死亡和程序性细胞去除的一部分诱导的，以促进肿瘤进展。
CD47是涉及细胞迁移和T细胞和树突细胞激活的细胞表面分子。此外，CD47通过结合在吞噬细胞上表达的信号调节蛋白α(SIRPα)起到吞噬作用的抑制剂的作用，导致酪氨酸磷酸酶激活和抑制吞噬细胞突触的亚膜组装位点处的肌球蛋白积累。结果，CD47传达了“不要吃我的信号”。CD47的缺失导致老化或受损细胞的稳态吞噬作用。
在多种人肿瘤类型中观察到升高的CD47表达水平，允许肿瘤通过吞噬吞噬作用逃离固有免疫系统。该过程通过肿瘤细胞上的CD47与吞噬细胞上的SIRPα结合而发生，从而促进吞噬作用和肿瘤存活的抑制。
抗CD47抗体已经在体外和小鼠异种移植模型中证实了针对许多不同人类癌症的临床前活性(Chao等，CurrOpinImmunol.2012年4月；24(2)：225-232.The CD47-SIRPαPathway in Cancer Immune Evasion and Potential Therapeutic Implications，以及其中的参考文献)。除CD47外，SIRPα也可作为治疗策略的靶点；例如，体外施用的抗SIRPα抗体引起巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用(Chao等，2012)。
在第三种方法中，使用人SIRPα的单个14kDa CD47结合结构域(不含跨膜部分的可溶形式)作为人CD47的竞争性拮抗剂开发了CD47靶向疗法(例如Weiskopf等，EngineeredSIRPαvariants as immunotherapeutic adjuvants to anti-cancer antibodies；Science.2013Jul 5；341(6141):10.1126/science.1238856，其全部内容通过引用并入本文)。因为野生型SIRPα对CD47显示出相对低的亲和力，所以通过酵母表面展示的体外进化产生突变的SIRPα，其显示作为CD47的强结合物和拮抗剂。这些变体包括CV1(共有变体1)和高亲和力变体FD6，以及这些变体的Fc融合蛋白。导致亲和力增加的氨基酸变化位于人SIRPα的d1结构域中。SIRPα变体的非限制性实例也描述于WO/2013/109752中，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方式中，所述一种或多种免疫调节剂抑制CD47和/或抑制SIRPα和/或抑制或阻止巨噬细胞上表达的CD47和SIRPα之间的相互作用。例如，免疫调节剂可以是针对CD47的抗体和/或针对SIRPα的抗体，例如针对CD47的单链抗体和/或针对SIRPα的单链抗体。在另一个非限制性实施例中，所述免疫调节剂可以是竞争性拮抗剂多肽，其包含SIRPαCD47结合结构域。此类竞争性拮抗剂多肽能够通过与CD47的竞争结合发挥作用，从而阻止巨噬细胞上表达的CD47与SIRPα的相互作用。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是SIRPαCD47结合结构域的野生型形式。在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是SIRPαCD47结合结构域的突变或变体形式。在一些实施方式中，所述变体形式是CV1 SIRPα变体。在一些实施方式中，所述变体形式是FD6变体。在一些实施方式中，SIRPα变体是在Weiskopf等，和/或国际专利公开号WO/2013/109752中描述的变体。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是与稳定多肽融合的SIRPαCD47结合结构域或其变体。在非限制性实施例中，与野生型SIRPαCD47结合结构域多肽融合的稳定多肽是Fc部分。在一些实施方式中，与野生型SIRPαCD47结合结构域多肽融合的稳定多肽是IgGFc部分。在一些实施方式中，与野生型SIRPαCD47结合结构域多肽融合的稳定多肽是IgG4Fc部分。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是与稳定多肽融合的SIRPαCD47结合结构域的突变或变体形式。在一些实施方式中，与稳定多肽融合的变体形式是CV1 SIRPα变体。在一些实施方式中，与稳定多肽融合的变体形式是F6变体。在一些实施方式中，与稳定多肽融合的SIRPα变体是在Weiskopf等，和/或国际专利公开号WO/2013/109752中描述的变体。在非限制性实施例中，与变体SIRPαCD47结合结构域多肽融合的稳定多肽是Fc部分。在一些实施方式中，与变体SIRPαCD47结合结构域多肽融合的稳定多肽是IgG Fc部分。在一些实施方式中，与变体SIRPαCD47结合结构域多肽融合的稳定多肽是IgG4 Fc部分。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或突变以改善CD47亲和性)。在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如，单链抗体。在任何这些实施方式中，所述微生物还可以与一种或多种免疫调节剂一起施用，所述免疫调节剂能够刺激Fc介导的功能，如ADCC、和/或M-CSF和/或GM-CSF，导致吞噬作用抑制的阻断。
所述免疫调节剂可以是用于抑制或阻止CD47-SIRPα相互作用的任何合适的抗CD47抗体、抗SIRPα抗体或竞争性SIRPαCD47结合域多肽(具有改善的CD47结合亲和性的野生型或突变变体)。
在任何这些实施方式中，所述SIRPα或其变体或抗CD47多肽可以与如本文所述的一种或多种STING激动剂组合。
在这些组合实施方式的任一个中，所述细菌可以包含营养缺陷型修饰，例如DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，所述细菌还可以包含噬菌体修饰，例如，在如本文所述的内源性原噬菌体中的突变或缺失。
抗原呈递细胞的激活
STING激动剂
干扰素基因刺激物(STING)蛋白已显示出是由来源于DNA病毒、细菌的胞质核酸以及来源于肿瘤的DNA触发的信号传导的关键媒介物。STING诱导I型干扰素产生的能力导致了在抗肿瘤免疫应答方面的研究，结果，STING已成为抗肿瘤免疫治疗中潜在的强有力的靶点。由STING激活引起的大部分抗肿瘤作用可能取决于由APC产生IFN-β，以及由这些细胞改善抗原提呈，其促进了针对肿瘤相关抗原的CD8+T细胞初免。然而，STING蛋白还在包括来源于髓系的抑制细胞(MDSC)和癌细胞本身在内的多种细胞类型中广泛表达，该途径的功能尚未被很好地表征(Sokolowska,O.&Nowis,D；STING Signaling in Cancer Cells:Important or Not？；Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis；Arch.Immunol.Ther.Exp.(2018)66:125)。
干扰素基因刺激物(STING)，也称为跨膜蛋白173(TMEM173)、干扰素调节因子3激活介质(MITA)、MPYS或内质网干扰素刺激因子(ERIS)，是一种二聚体蛋白，主要在巨噬细胞、T细胞、树突细胞、内皮细胞和某些成纤维细胞和上皮细胞中表达。STING在先天性免疫反应中起着重要作用-缺乏STING的小鼠虽然在接触各种微生物后容易发生致命性感染但仍然存活。STING以细胞溶质环状二核苷酸(CDN)(例如cGAMP和细菌第二信使c-di-GMP和c-di-AMP)的形式作为第二信使的细胞溶质受体起作用。在CDN刺激后，STING发生构象变化。STING从ER转运到高尔基体，其羧基末端被释放，这导致TBK1(TANK结合激酶1)/IRF3(干扰素调节因子3)，NF-κB和STAT6信号转导途径，从而促进I型干扰素和促炎细胞因子应答。CDNs包括经典的环状二-GMP(c[G(30-50)pG(30-50)p]或环状二-AMP或环状GAMP(cGMP-AMP)(Barber,STING-dependent cytosolic DNA sensing pathways；TrendsImmunol.2014年2月；35(2):88-93)。
CDN可以是外源(即细菌)和/或内源产生的(即在暴露于dsDNA时通过宿主酶在宿主内)。STING能够识别各种细菌第二信使分子环二鸟苷酸一磷酸(c-di-GMP)和环二腺苷酸一磷酸(c-di-AMP)，其触发固有免疫信号传导应答(Ma等，The cGAS-STING DefensePathway and Its Counteraction by Viruses；Cell Host&Microbe 19,2016年2月10日)。另外，环状GMPAMP(cGAMP)也可以与STING结合并导致IRF3失活和β-干扰素产生。由霍乱弧菌产生的3’5’-3’5’cGAMP(3’3’cGAMP)和后生动物第二信使循环[G(2’,5’)pA(3’5’)](2’3’cGAMP)两者均能够通过STING途径激活固有免疫应答(Yi等，Single NucleotidePolymorphisms of Human STING Can Affect Innate Immune Response to CyclicDinucleotides；PLOS One(2013).8(10)e77846，以及其中的参考文献)。细菌和后生动物(例如人)c-di-GAMP合成酶(cGAS)利用GTP和ATP产生能够STING激活的cGAMP。与具有两个经典30-50磷酸二酯键的原核CDN相比，人cGAS产物含有独特的20-50键，产生混合连接环GMP-AMP分子，表示为2’,3’cGAMP(例如Kranzusch等，Ancient Origin of cGAS-STINGReveals Mechanism of Universal 2’,3’cGAMP Signaling；Molecular Cell 59,891–903，2015年9月17日；及其中的参考文献)。细菌霍乱弧菌编码一种名为DncV的酶，它是cGAS的结构同源物，并通过规范的3’-5’键(3’,3’cGAMP)合成相关的第二信使。
干扰素基因(STING)途径的刺激物成分在免疫系统检测肿瘤细胞中起重要作用。在临床前研究中，环状二核苷酸(CDN)，天然存在的或合理设计的合成衍生物，能够促进侵袭性抗肿瘤反应。例如，当与STINGVAX形式的经辐射的GM-CSF分泌的全细胞疫苗共同配制时，合成的CDN增加了抗肿瘤效力，并且STINGVAX结合PD-1阻断诱导已建立肿瘤的消退(Fu等，STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumorsresistant to PD-1 blockade；Sci Transl Med.2015年4月15日；7(283):283ra52)。在另一个实例中，Smith等进行了一项研究，显示STING激动剂可通过刺激免疫反应来增强CART治疗，从而消除过继转移的淋巴细胞无法识别的肿瘤细胞，从而提高CART细胞治疗的有效性(Smith等，Biopolymers co-delivering engineered T cells and STING agonistscan eliminate heterogeneous tumors；J Clin Invest.2017年6月1日；127(6):2176-2191)。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是STING激动剂。STING激动剂的非限制性实例包括3’3’cGAMP、2’3’cGAMP、2’2’-cGAMP、2’2’-cGAMP VacciGradeTM(环[G(2’,5’)pA(2’,5’)p])、2’3’-cGAMP、2’3’-cGAMP VacciGradeTM(环[G(2’,5’)pA(3’,5’)p])、2’3’-cGAM(PS)2(Rp/Sp)、3'3'-cGAMP、3’3’-cGAMP VacciGradeTM(环[G(3’,5’)pA(3’,5’)p])、c-di-AMP、c-di-AMP VacciGradeTM(Th1/Th2应答的环二腺苷酸单磷酸盐)、2'3'-c-di-AMP、2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)(c-di-AMP的双硫代磷酸酯类似物，Rp异构体)、2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)VacciGradeTM、c-di-GMP、c-di-GMP VacciGradeTM、2’3’-c-di-GMP和c-di-IMP。
CD40
CD40是在抗原提呈细胞上发现的共刺激蛋白，并且是其激活所必需的。CD154(CD40L)在T辅助细胞上与CD40的结合激活抗原提呈细胞并诱导多种下游免疫刺激作用。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是CD40的激动剂，其例如选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体(CD40L)多肽的激动剂和CD40L多肽片段。
GMCSF
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的单体糖蛋白。GM-CSF是一种白细胞生长因子，可作为细胞因子发挥作用，促进免疫系统的发育并增强抵抗感染的能力。例如，GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞，其中单核细胞退出循环并迁移进入组织，随后其成熟为巨噬细胞和树突状细胞。GM-CSF是免疫/炎症级联反应的一部分，通过其少量巨噬细胞的激活迅速导致其数量增加，这一过程对于抵抗感染至关重要。GM-CSF通过信号转导物和转录激活因子STAT5或STAT3(其激活巨噬细胞)发出信号。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂调节树突状细胞激活。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是GM-CSF。
效应免疫细胞的激活和初免(免疫刺激剂)
细胞因子和细胞因子受体
CD4(4)是在免疫细胞如细胞，单核细胞，巨噬细胞和树突细胞表面上发现的糖蛋白。CD4+T辅助细胞是白细胞，其功能是向其他类型的免疫细胞发送信号，从而在免疫过程中协助其他免疫细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。当T细胞辅助细胞通过MHC II类分子呈递肽抗原时，它们被激活，所述MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦被激活，T辅助细胞分裂并分泌调节或辅助主动免疫应答的细胞因子。T辅助细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9或TFH细胞，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8+T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。细胞毒性T细胞通过结合与MHCI类分子相关的抗原识别它们的靶标，所述MHC I类分子存在于所有有核细胞的表面上。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂调节一种或多种T效应细胞，例如，CD4+细胞和/或CD8+细胞。在一些实施方式中，所述免疫调节剂激活、刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞)分化在一些实施方式中，所述免疫调节剂是激活、刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞)分化的细胞因子。在一些实施方式中，所述细胞因子选自IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和IFN-γ。
如本文所用，术语“细胞因子”包括包含一种或多种细胞因子的融合蛋白，所述细胞因子通过肽连接至另一细胞因子或其他免疫调节分子。实例包括但不限于IL-2和IL-15融合蛋白。在通常情况下，本文所述的所有激动剂和拮抗剂可以通过肽接头融合至另一目标多肽，以改善或改变其功能。此类融合蛋白的非限制性实例包括可操作地连接至抗体多肽的一种或多种细胞因子多肽，其中所述抗体识别肿瘤特异性抗原，从而使细胞因子接近肿瘤。
白细胞介素12(IL-12)是一种细胞因子，其作用在固有和适应性免疫之间产生相互作用。IL-12由许多免疫细胞(包括激活的树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞以及其他细胞类型)分泌。IL-12是由p35和p40亚基组成的异二聚体蛋白(IL-12-p70；IL-12-p35/p40)，并与由两个亚基IL-12R-β1和IL-12R-β2组成的受体结合。IL-12受体在许多免疫细胞上组成型或诱导型表达，包括NK细胞，T细胞和B淋巴细胞。在IL-12结合后，受体被激活并且通过JAK/STAT途径启动下游信号传导，导致对IL-12的细胞应答。IL-12通过增加来自NK和T细胞的IFN-γ的产生而起作用，IFN-γ是IL-12作用的最有效的介质。此外，IL-12促进激活的NK细胞，CD8+和CD4+T细胞的生长和细胞毒性，并将CD4+Th0细胞的分化转向Th1表型。此外，IL-12增强针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和IgG的诱导以及B细胞产生IgE的抑制。此外，IL-12还在骨髓衍生的抑制细胞的重编程中起作用，指导Th1型免疫应答并有助于增加MHCI类分子的表达(例如在Waldmann等，Cancer ImmunolResMarch2015.3；219中综述)。
因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是IL-12。在一些实施方式中，IL-12包含p35和p40亚基。在一些实施方式中，白介素-12单体亚基(IL-12A(p35)和IL-12B(p40))通过接头共价连接。在一些实施方式中，所述接头是富含丝氨酸甘氨酸的接头。在一个实施方式中，“GGGGSGGGGSGGGGS”(SEQ ID NO:1247)的15个氨基酸接头插入两个单体亚基IL-12A(p35)和IL-12B(p40)之间以产生强制二聚体人IL-12(diIL-12)融合蛋白。
IL-15在固有和适应性免疫系统的体内平衡中显示多效功能，并与IL-15受体结合，IL-15受体是由三个亚基组成的异源三聚体受体。α亚基特异于IL-15，而β(CD122)和γ(CD132)亚基与IL-2受体共享，并允许通过JAK/STAT途径共享信号传导。IL-15由几种细胞类型(包括树突细胞、单核细胞和巨噬细胞)产生。在同一细胞中产生的IL-15Rα和IL-15的共表达允许IL-15与IL-15Rα的细胞内结合，然后IL-15Rα作为复合物穿梭至细胞表面。一旦进入细胞表面，那么这些细胞的IL-15Rα能够将IL-15转运至不表达IL-15的CD8T细胞、NK细胞和NK-T细胞的IL-15Rβ-γc，诱导形成所谓的免疫突触。鼠和人IL-15Rα以膜结合和可溶形式存在。可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)通过蛋白水解切割从跨膜受体组成型产生。
IL-15对于淋巴样发育和固有免疫细胞的外周维持和T细胞的免疫记忆至关重要，特别是天然杀伤(NK)和CD8+T细胞群。与IL-2相反，IL-15不促进Treg的维持，此外，已显示IL-15保护效应T细胞免受IL-2介导的激活诱导的细胞死亡。
因此，IL-15的递送被认为是长期抗肿瘤免疫的有希望的策略。在重组人IL-15的第一次人体临床试验中，在处理时观察到NK细胞的10倍扩增并显著增加γδT细胞和CD8+T细胞的增殖。此外，已开发出含有细胞因子-受体融合复合物的IL-15超级激动剂，并进行评估以增加反应的长度。这些包括L-15N72D超级激动剂/IL-15RαSushi-Fc融合复合物(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)(Kim等，2016IL-15超激动剂/IL-15RαSushi-Fc融合复合物(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)显著增强NK和记忆CD8+T细胞的特异性亚群，并介导针对鼠乳腺癌和结肠癌的有效抗肿瘤活性)。
因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是IL-15。
通过将IL-15与融合蛋白IL-15Rα-Fc预先结合或通过与IL-15Rα的sushi结构域(hyper-IL-15)直接融合以模拟反式呈递，IL-15的生物活性得到极大改善。细胞相关的IL-15Rα对IL-15的影响IL-15单独施用或作为与IL-15Rα的复合物施用，在动物模型中显示出有效的抗肿瘤活性(Cheng等，Immunotherapy of metastatic and autochthonous livercancer with IL-15/IL-15Rαfusion protein；Oncoimmunology.2014；3(11):e963409，以及其中的参考文献)。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是IL-15。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是IL-15Ra。
干扰素γ(IFNγ或II型干扰素)是一种对固有和适应性免疫至关重要的细胞因子对抗病毒，一些细菌和原生动物感染。IFNγ激活巨噬细胞并诱导II类主要组织相容性复合物(MHC)分子表达。IFNγ可以抑制病毒复制，并在免疫系统中具有免疫刺激和免疫调节作用。IFNγ主要由天然杀伤(NK)和天然杀伤T(NKT)细胞产生，作为固有免疫应答的一部分，并由CD4Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生。一旦IFNγ由T辅助细胞(特别是Th1细胞)、细胞毒性T细胞(TC细胞)和NK细胞分泌，抗原特异性免疫发展。其具有多种免疫刺激作用，在免疫系统中起着不同的作用，包括促进NK细胞活性，增加巨噬细胞的抗原呈递和溶酶体活性，诱导一氧化氮合酶iNOS的激活，从激活的血浆B细胞产生某些IgG，促进导致细胞免疫的Th1分化。其还可以使正常细胞增加表达I类MHC分子以及抗原呈递细胞上的II类MHC促进与白细胞迁移相关的粘附和结合，并且通过激活巨噬细胞参与肉芽肿形成，使得它们在杀死细胞内生物方面变得更强大。因此，在一个实施方式中，所述免疫调节剂是IFN-γ。
白细胞介素-18(IL18，也称为干扰素-γ诱导因子)是一种促炎细胞因子，属于IL-1超家族，由巨噬细胞产生。和其他细胞。IL-18结合至白细胞介素-18受体，与IL-12一起，在脂多糖等微生物产物感染后诱导细胞免疫(LPS)。用IL-18刺激后，自然杀伤(NK)细胞和某些T辅助细胞1型细胞释放干扰素-γ(IFN-γ)或II型干扰素，其在激活巨噬细胞和其他免疫细胞中起作用。IL-18也能诱导严重炎症反应。因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是IL-18。
白细胞介素-2(IL-2)是细胞因子调节的活动的白血细胞(白细胞，经常淋巴细胞)。IL-2是人体对微生物的自然反应的一部分感染，区分外国(“非自我”)和“自我”。IL-2通过与淋巴细胞表达的IL-2受体结合来介导其作用。IL-2是细胞因子家族的成员，其还包括IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21。IL-2通过IL-2受体发出信号，IL-2受体是由α，β和γ亚单位组成的复合物。γ亚基由该细胞因子受体家族的所有成员共享。当初始T细胞被抗原刺激时，IL-2促进T细胞分化为效应T细胞并进入记忆T细胞。通过其在T细胞免疫记忆发展中的作用，其取决于抗原选择的T细胞克隆的数量和功能的扩展，它还在细胞介导的免疫中起关键作用。IL-2已经被美国食品药品管理局(FDA)和几个欧洲国家批准用于治疗癌症(恶性黑素瘤，肾细胞癌)。IL-2也用于治疗黑素瘤转移，并具有高完全反应率。因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是IL-2。
白细胞介素-21是一种细胞因子，对免疫系统的某些细胞具有强大的调节作用，包括自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞。IL-21诱导细胞分裂/增殖在这些细胞中。IL-21在激活的人中表达CD4+T细胞，但在大多数其他组织中没有。此外，IL-21表达在T辅助细胞的Th2和Th17亚群中上调。IL-21也表达于NKT细胞调节这些细胞的功能。当与IL-21结合时，IL-21受体通过Jak/STAT途径起作用，利用Jak1和Jak3以及STAT3同型二聚体激活其靶基因。已经显示IL-21通过富集具有IL-2产生能力的独特CD28+CD127hiCD45RO+表型的记忆型CTL群来调节人T细胞的分化程序。IL-21还通过持续和增加的CD8+细胞应答具有抗肿瘤作用，以实现持久的肿瘤免疫。IL-21已被批准用于转移性的1期临床试验黑素瘤(MM)和肾细胞癌(RCC)患者。因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是IL-21。
肿瘤坏死因子(TNF)(也称为cachectin或TNFα)是一种可引起细胞溶解的细胞因子在某些条件下，某些肿瘤细胞系可刺激细胞增殖并诱导细胞分化。TNF参与系统性疾病炎症是构成急性期反应的细胞因子之一。它主要是通过激活产生的巨噬细胞虽然可以由许多其他细胞类型(例如CD4+淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和神经元)产生。TNF的主要作用是调节免疫细胞。
TNF可以结合两种受体，TNFR1(TNF受体1型；CD120a；p55/60)和TNFR2(TNF受体2型；CD120b；p75/80)。TNFR1在大多数组织中表达，并且可以被膜结合的和可溶的三聚体形式的TNF完全激活，而TNFR2仅在免疫系统的细胞中发现，并且对TNF同源三聚体的膜结合形式起反应。在与其受体结合后，TNF可以激活NF-κB和MAPK途径，其介导许多蛋白质的转录并介导参与细胞分化和增殖的几种途径，包括涉及炎症反应的那些途径。TNF还调节诱导细胞凋亡的途径。因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂诱导树突状细胞激活。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是TNF。
在一些实施方式中，所述TNF能够增加在树突状细胞和/或巨噬细胞上CCR7的表达。
在一些实施方式中，所述TNFα能够激活NFκB通路，例如，在具有TNF受体的细胞中。在一些实施方式中，所述TNFα能够诱导IκBα降解。在一些实施方式中，所述TNFα引起IκBα降解。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂可以是所述的IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和IFN-γ的任何一个或多个。
在这些组合实施方式的任一个中，与免疫调节剂一起施用的细菌可以包含营养缺陷型修饰，例如DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，所述细菌还可以包含噬菌体修饰，例如，在如本文所述的内源性原噬菌体中的突变或缺失。
共刺激分子
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关受体(GITR，TNFR18)是I型跨膜蛋白，是TNFR超家族的成员。1GITR主要在CD25+CD4+调节性T(Treg)细胞上高水平表达，但在常规CD25-CD4+和CD8+T细胞上也以低水平组成型表达，并在激活后迅速上调。使用激动性抗GITR单克隆抗体(mAb；DTA-1)2,6,7或GITRL转染子和可溶性GITRL5,8,9进行的体外研究表明，GITR–GITRL途径诱导阳性共刺激信号，导致激活CD4+和CD8+效应T细胞(以及Treg细胞，尽管其具有相反的效应功能)(Piao等，(2009)Enhancement of T-cell-mediatedanti-tumour immunity via the ectopically expressed glucocorticoid-inducedtumour necrosis factor receptor-related receptor ligand(GITRL)on tumours；Immunology,127,489-499，以及其中的参考文献)。在一些实施方式中，效应物或免疫调节剂是GITR的激动剂，例如选自以下的激动剂：激动性抗-GITR抗体、激动性抗-GITR抗体片段、GITR配体多肽(GITRL)和GITRL多肽片段。
因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是激动性抗GITR抗体或其片段，或者GITR配体多肽或其片段。因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是激动性抗GITR抗体或其片段，或者GITR配体多肽或其片段。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是抗GITR抗体或其片段，或者GITR配体多肽或其片段。
由于GITR的功能是在激活的T细胞中促进T细胞增殖和T细胞存活，因而GITR激动作用可以有利地与能够引发T细胞应答的第二种方式(免疫引发剂)结合使用，包括但不限于如本文所述先天性免疫刺激剂，例如STING激动剂。
CD137或4-1BB是属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白，其表达并对激活的T淋巴细胞(例如CD8+和CD4+细胞)具有共刺激活性。已显示其增强T细胞增殖，IL-2分泌存活和细胞溶解活性。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是CD137(4-1BB)的激动剂，例如，选自激动性抗CD137抗体或其片段，或CD137配体多肽或其片段的激动剂。
因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是激动性抗CD137抗体或其片段，或CD137配体多肽或其片段。
CD137(4-1BB)是在激活的小鼠和人CD8+和CD4+T细胞上表达的。其是TNFR家族的成员，介导共刺激和抗凋亡功能，促进T细胞增殖和T细胞存活。据报道，取决于T细胞刺激情况，CD137在刺激后12小时到5天上调(Wolfl等，Activation-induced expression ofCD137 permits detection,isolation,and expansion of the full repertoire of CD8T cells responding to antigen without requiring knowledge of epitopespecificities；BLOOD,2007年7月1日，第110卷，第1期，以及其中的参考文献)。因此，CD137(4-1BB)激动作用可以有利地与能够引发T细胞应答的第二种方式(免疫引发剂)结合使用，其包括但不限于先天性免疫刺激剂(免疫引发剂)。示例性先天性免疫刺激剂(免疫引发剂)如本文所述。
OX40或CD134是T细胞受体，参与保持T细胞的存活并随后增加细胞因子的产生。OX40由于其提高存活率的能力，在维持免疫应答和记忆应答方面发挥着关键作用。其还在Th1和Th2介导的反应中起重要作用。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是OX40的激动剂，例如，选自激动性抗-OX40抗体或其片段，或者OX40配体(OX40L)或其片段的激动剂。
最近，发现未甲基化的富含CG的寡聚脱氧核苷酸(CpG)(Toll样受体9(TLR9)的配体)与局部注射到肿瘤一个部位的抗OX40抗体的组合可协同触发局部T细胞免疫应答，从而然后攻击全身在远端部位的癌症(Sagiv-Barfi等，Eradication of spontaneousmalignancy by local immunotherapy；Sci.Transl.Med.10,eaan4488(2018))。未甲基化的富含CG的寡聚脱氧核苷酸(CpG)激活TLR9，固有免疫系统的一种成分。因此，激活免疫系统的其他机制与激动性OX40抗体组合可以产生相似的结果，包括但不限于细菌和先天性免疫刺激剂(免疫引发剂)。
CD28是一种在T细胞上表达的蛋白，其提供T细胞激活和存活所需的共刺激信号。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是CD28的激动剂，例如，选自激动性抗-CD28抗体、激动性抗-CD28抗体片段、CD80(B7.1)多肽或其多肽片段以及CD86(B7.2)多肽或其多肽片段的激动剂。
ICOS是结构和功能上与CD28相关的诱导型T细胞共刺激剂。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是ICOS的激动剂，例如，选自激动性抗-ICOS抗体或其片段或者ICOS配体多肽或其片段的激动剂。
CD226是在天然杀伤细胞、血小板、单核细胞和T细胞子集(例如CD8+和CD4+细胞)的表面上表达的糖蛋白，其介导细胞与携带其配体CD112和CD155的其他细胞的粘附。除了其他以外，其参与免疫突触形成和触发自然杀伤(NK)细胞激活。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是CD226的激动剂，例如，选自激动性抗-CD226抗体或其片段，CD112或CD155多肽或其片段的激动剂。
在任何这些实施方式中，所述激动性抗体可以是人抗体或人源化抗体，并且可以包含不同的同种型，例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。此外，所述抗体可以包含恒定区，其被修饰以增加或降低效应物功能，例如FcR结合，FcRn结合，补体功能，糖基化，C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)。在任何这些实施方式中，所述抗体可以是单链抗体或单链抗体片段。
在这些组合实施方式的任一个中，与免疫调节剂一起施用的细菌可以包含营养缺陷型修饰，例如DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，所述细菌还可以包含噬菌体修饰，例如，在如本文所述的内源性原噬菌体中的突变或缺失。
消除(逆转)局部免疫抑制
肿瘤细胞通常通过产生干扰树突状细胞的抗原提呈或成熟的信号来逃避破坏，从而导致它们的前体成熟为免疫抑制细胞类型。因此，一种或多种免疫调节剂的局部递送，其预防或抑制免疫调节分子的活性，所述免疫调节分子参与在肿瘤部位引发、促进和/或维持免疫抑制，单独或与一种或多种其他免疫调节剂组合，提供治疗益处。
免疫检查点抑制剂
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是免疫抑制分子的抑制剂，例如免疫检查点分子的抑制剂。待抑制的免疫检查点分子可以是任何已知的或后来发现的免疫检查点分子或其他免疫抑制分子。在一些实施方式中，待抑制的免疫检查点分子或其他免疫抑制分子选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR。在某些方面中，本公开提供了一种与一种或多种免疫调节剂组合的微生物(例如细菌)，所述免疫调节剂抑制免疫检查点或其他免疫抑制性分子。
在一些实施方式中，所述组合物能够减少癌细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积。在一些实施方式中，所述细菌靶向癌或肿瘤细胞。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是CTLA-4抑制剂，例如针对CTLA-4的抗体。在任何这些实施方式中，所述抗CTLA-4抗体可以是单链抗CTLA-4抗体。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是PD-1抑制剂，例如针对PD-1或PD-L1的抗体。在任何这些实施方式中，抗PD-1或PD-L1抗体可以是单链抗PD-1抗体。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是选自以下的抑制剂：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR抑制剂，例如针对任何所列的免疫检查点或其他抑制性分子的抗体。在例如2019年1月11日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)和2018年1月1日提交的PCT/US2018/012698中描述了此类检查点抑制剂分子的实例，其每一个的全部内容通过引用并入本文。在任何这些实施方式中，所述抗体可以是单链抗体。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是例如通过瘤内注射局部施用的。
本文描述了用于构建单链抗CTLA-4抗体的示例性重链和轻链氨基酸序列(例如SEQ ID NO:761、SEQ ID NO:762、SEQ ID NO:763、SEQ ID NO:764)。
用于构建单链抗PDF-1抗体的示例性重链和轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。
免疫代谢和代谢转化剂
色氨酸和犬尿氨酸
T调节细胞或Treg是T细胞的亚群，其通过防止过度免疫反应，维持对自身抗原的耐受性和消除自身免疫来调节免疫系统。Treg抑制其他细胞的免疫应答，例如，在成功消除入侵生物后关闭免疫应答。这些细胞通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。存在不同的调节性T细胞亚群，包括表达CD4、CD25、和Foxp3的那些亚群(CD4+CD25+调节性T细胞)。Treg是抑制效应T细胞应答的关键，因此代表了有效抗肿瘤应答的主要障碍之一，以及依赖于抗肿瘤应答的诱导或增强的现有疗法的失败。因而，在某些实施方式中，本公开的基因工程化细菌产生一种或多种消除Treg和/或抑制或阻断Treg激活的免疫调节剂。
色氨酸(TRP)至犬尿氨酸(KYN)代谢途径被确立为固有和适应性免疫的关键调节因子。通过吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)和TRP-2,3-双加氧酶2(TDO)降解必需氨基酸色氨酸，以及产生芳烃受体(AHR)激活色氨酸代谢产物(如犬尿氨酸)，是在许多类型的癌症中维持免疫抑制微环境的主要途径。例如，犬尿氨酸与AHR的结合导致重编程幼稚CD4+T-辅助(Th)细胞的分化，其有利于调节性T细胞表型(Treg)，同时抑制分化为产生白介素17(IL-17)的Th(Th17)细胞。芳基氢受体的激活还导致在树突细胞上促进耐受性表型。
在一些实施方式中，本公开的组合物和方法能够通过产生色氨酸和/或降解犬尿氨酸来消耗Treg或者抑制或阻断Treg激活。在一些实施方式中，本文公开的组合物能够通过产生色氨酸和/或降解犬尿氨酸增加CD8+:Treg的比例(例如有利于产生CD8+而非Treg)。
因此，在一些实施方式中，所述免疫调节剂是色氨酸。在其他实施方式中，所述免疫调节剂是犬鸟氨酸。
在一个实施方式中，所述犬尿氨酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的一个或多个具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，所述犬尿氨酸与SEQ ID NO:65至SEQ IDNO:67的一个或多个具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，所述犬尿氨酸与SEQ IDNO:65至SEQ ID NO:67的一个或多个具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，所述犬尿氨酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的一个或多个具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，所述犬尿氨酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的一个或多个具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，所述犬尿氨酸与SEQ ID NO:65至SEQID NO:67的一个或多个具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，所述犬尿氨酸包含SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，所述犬尿氨酸由SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的一个或多个序列组成。
嘌呤能系统—ATP/腺苷代谢
成功的癌症免疫疗法的一个重要障碍是肿瘤采用许多机制来促进免疫逃逸，包括产生抗炎细胞因子，调节免疫子集的募集和免疫抑制代谢产物的产生。一种这样的免疫抑制途径是通过CD73产生细胞外腺苷，一种有效的免疫抑制分子。由受损或垂死的细胞和细菌释放的免疫刺激性细胞外ATP促进免疫吞噬细胞的募集并激活P2X7R，这是NLRP3炎性体的共激活因子，然后引发促炎性细胞因子如IL-1β和IL-18的产生。细胞外ATP分解为ADP、AMP和腺苷的分解代谢受CD39(外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，E-NTPDase1)控制，将ATP水解成AMP，然后通过CD73(ecto-5’-核苷酸酶，Ecto5’NTase)将其去磷酸化为腺苷。因此，CD39和CD73协同作用以将促炎性ATP转化为免疫抑制性腺苷。除其免疫调节作用外，外核苷酸酶途径直接有助于调节癌细胞生长、分化、侵袭、迁移、转移和肿瘤血管生成。
在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括从肿瘤微环境中去除过量腺苷的方法。很多细菌从环境中清除低浓度的核苷，以通过补救合成途径合成核苷酸和脱氧核苷酸。此外，在大肠杆菌中，核苷可用作生长的唯一氮和碳的来源(Neuhard J,NygaardP.Biosynthesis and conversion of nucleotides,purines and pyrimidines.In:Neidhardt FC,Ingraham JL,Low KB,Magasanik B,Schaechter M,Umbarger HE编著。Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and molecularbiology.Washington DC:ASM Press；1987，第445–473页)。
在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括用于代谢或降解腺苷的方法。用于腺苷降解的示例性酶包括SEQ ID NO:71-77。
精氨酸/精氨酸酶I代谢
L-精氨酸(L-Arg)是一种非必需氨基酸，在包括免疫应答在内的多种生物系统中起着核心作用。L-精氨酸被精氨酸酶I、精氨酸酶II和诱导型一氧化氮合酶代谢。精氨酸酶1将L-精氨酸水解为尿素和L-鸟氨酸，后者是生产多胺的主要底物，而多胺是恶性肿瘤中细胞周期快速发展所必需的。肿瘤浸润的髓系来源的抑制细胞(MDSC)的独特亚群，而不是肿瘤细胞本身，可产生高水平的精氨酸酶I和阳离子氨基酸转运蛋白2B，从而使它们能够在肿瘤微环境中快速整合L-精氨酸(L-Arg)并耗尽胞外L-Arg。这些细胞是T细胞受体表达和抗原特异性T细胞应答的有效抑制剂，以及调节性T细胞的有效诱导剂。而且，Lanzavecchia及其同事的最新研究表明，激活的T细胞还大量消耗L-精氨酸并将其迅速转化为下游代谢产物，从而导致激活后细胞内精氨酸水平显著下降。在这些研究中，向T细胞培养基中添加外源L-精氨酸会增加T细胞中细胞内游离L-精氨酸的水平，此外L-精氨酸水平的提高也会对T细胞的激活、分化和功能产生多效效应，其影响范围从生物能量和存活率的提高到体内抗肿瘤活性(Geiger等，(2016)L-精氨酸Modulates T Cell Metabolism and EnhancesSurvival and Anti-tumor Activity；Cell 167,829–842，其全部内容通过引用并入本文)。因此，T细胞对精氨酸的摄取，可能导致T细胞激活增强和更为持久。
因此，在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法中使用的免疫调节剂是是精氨酸。
吸引Th1/CD8的趋化因子
趋化因子对于吸引和募集免疫细胞至关重要，例如那些激活免疫应答的免疫细胞和诱导癌细胞凋亡的免疫细胞。趋化因子的靶细胞表达趋化因子结合并介导功能的相应受体。因此，CC和CXC趋化因子的受体分别称为CCR和CXCR。CC趋化因子与CC趋化因子受体结合，CXC趋化因子与CXC趋化因子受体结合。大多数受体通常与多于一种趋化因子结合，并且大多数趋化因子通常与多于一种受体结合。
趋化因子干扰素-γ诱导蛋白10kDa(CXCL10)是CXC趋化因子家族的成员，其与CXCR3受体结合以发挥其生物学作用。CXCL10参与趋化性，诱导细胞凋亡，调节细胞生长和介导血管生成抑制作用。CXCL10与多种人类疾病有关，包括传染病，慢性炎症，免疫功能障碍，肿瘤发展、转移和播散。更重要的是，CXCL10已被确定为介导疾病严重程度的主要生物学标记，可用作各种疾病的预后指标。在这篇综述中，我们关注当前的研究，阐明CXCL10在癌症发病机制中的新兴作用。了解CXCL10在疾病发生和发展中的作用可能为开发CXCL10作为相关人类恶性肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点奠定基础。
CXCL10和CXCL9各自特异性激活一种受体CXCR3，这是一种七跨膜跨膜G蛋白偶联受体，主要在激活的T淋巴细胞(Th1)，自然杀伤细胞(NK)，炎症树突细胞，巨噬细胞和B细胞上表达。干扰素诱导的血管生成抑制CXC趋化因子和干扰素诱导的T细胞化学引诱物(I-TAC/CXCL11)也激活CXCR3。这些CXC趋化因子优先在Th1淋巴细胞上表达。
免疫介导的组织特异性破坏与Th1极化，相关趋化因子(CXCR3和CCR5配体，例如CXCL10和CXCL9)以及与细胞毒性机制的激活相关的基因相关。其他研究表明，早期乳腺癌，结直肠癌，肺癌，肝细胞癌，卵巢癌和黑色素瘤等癌症的长期无病生存率和总生存率始终与T辅助细胞1型(Th1)细胞相关因子的激活有关，如IFN-γ，信号转导和转录激活因子1(STA1)，IL-12，IFN-调节因子1，转录因子T-bet，免疫效应因子或细胞毒性因子(颗粒酶)，穿孔素和颗粒溶素，CXCR3和CCR6配体5趋化因子(CXCL9，CXCL10和CCL5)，其他趋化因子(CXCL1和CCL2)和粘附分子(MADCAM1，ICAM1，VCAM1)。已显示化学吸引和粘附在确定肿瘤内免疫细胞的密度中起关键作用。其他研究表明，CXCL9，CXCL10和CXCL11的上调可预测治疗反应性(特别对过继转移疗法有应答)。还有其他研究表明，驱动淋巴细胞浸润的趋化因子预示着肝细胞癌患者的存活。
现在认识到癌症进展受癌细胞内在和微环境因素的调节。已经证实T辅助细胞1(Th1)和/或细胞毒性T细胞的存在与几种癌症中复发的风险降低相关，并且促炎性肿瘤微环境与肝细胞癌患者群体中延长的存活相关。已显示CXCL10，CCL5和CCL2表达与Th1，CD8+T细胞和天然杀伤细胞的肿瘤浸润相关。数据显示CXCL10，CCL5和CCL2是吸引Th1，CD8+T细胞和NK细胞进入肿瘤微环境的主要趋化因子。此外，CXCL10和TLR3(诱导CXCL10，CCL5和CCL2)表达与癌细胞凋亡相关。
CXC基序趋化因子10(CXCL10)，也称为干扰素γ诱导的蛋白质10(IP-10)或小诱导型细胞因子B10，是人类中由CXCL10基因编码的8.7kDa蛋白质。CXCL10是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，其由几种细胞类型响应IFN-γ分泌，包括单核细胞，内皮细胞和成纤维细胞。CXCL10具有多种作用，包括单核细胞/巨噬细胞、T细胞、NK细胞和树突细胞的化学吸引，促进T细胞与内皮细胞的粘附、抗肿瘤活性，以及抑制骨髓集落形成和血管生成。该趋化因子通过与细胞表面趋化因子受体CXCR3结合而引发其作用。
在促炎条件下，CXCL10由多种细胞(例如白细胞、激活的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、基质细胞(成纤维细胞)和角质形成细胞)分泌以响应IFN-γ。这种干扰素反应的关键调节剂，优先吸引激活的Th1淋巴细胞进入炎症区域，其表达与Th1免疫应答有关。CXCL10也是单核细胞，T细胞和NK细胞的化学引诱物。(Chew等，Gut,2012,61:427-438)。还有其他研究表明，免疫保护特征基因(例如Th1型趋化因子CXCL10和CXCL9)可能在癌症中表观遗传沉默。(Peng等，Nature,2015,doi:10.1038/nature 15520)。
趋化因子(CXC基序)配体9(CXCL9)是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，也称为由γ干扰素(MIG)诱导的单核因子。CXCL9是由IFN-γ诱导的T细胞化学引诱物(Th1/CD8吸引趋化因子)。它与另外两种CXC趋化因子CXCL10和CXCL11密切相关。CXCL9，CXCL10和CXCL11都通过与趋化因子受体CXCR3相互作用引发其趋化功能。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是吸引Th1/CD8趋化因子的一种或多种趋化因子。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是一种或多种趋化因子，其是CXCR3配体趋化因子。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是一种或多种趋化因子，其是CCR5配体趋化因子。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是CXCL9。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是CXCL10。
在一些实施方式中，所述CXCL10多肽与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，所述CXCL10多肽与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，所述CXCL10多肽与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，所述CXCL10多肽与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列或其功能性片段具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，所述CXCL10多肽包含选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列。在又一个实施方式中，所述CXCL10多肽由选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列组成。
基质调节
细胞外基质(ECM)成分的积累可以扭曲肿瘤和基质组织的正常结构，导致血液和淋巴管的异常构型。可能有助于肿瘤治疗抗性的一个因素是ECM的刚性，其显著压缩血管，导致灌注减少(由于扩散和对流的限制)，最终阻碍治疗剂向肿瘤细胞的递送。减少基质中的血管压缩和辅助药物递送的一种策略是酶促分解ECM支架，其在一些基质肿瘤环境中由成纤维细胞，免疫细胞和嵌入密集且复杂的ECM中的内皮细胞组成，具有丰富的透明质酸或透明质酸(HA)。HA是一种大的线性糖胺聚糖(GAG)，由重复的N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸单元组成，由于其高胶体渗透压而保留水。HA在维持组织的结构，完整性和可塑性方面起着重要作用，特别是在胚胎发生和肿瘤发生等动态过程中。据信HA在肿瘤基质形成和维持中起作用。透明质酸酶(PEGPH20；rHuPH20)的酶促HA降解已被证明可降低小鼠胰腺导管腺癌(PDA)肿瘤中的间质液压，同时观察血管通畅，给药和存活(Provenzano等，Cancer Cell,2012,21:418-429；Thompson等，Mol Cancer Ther,2010,9:3052-64)。据信PEGPH20通过将延伸的聚合物裂解成取代基单元而释放与HA结合的水。被困水的释放将组织间液压降低至20-30mmHg的范围，使得小动脉和毛细血管塌陷(Provenzano等)。
在一些实施方式中，所述免疫调节剂是调节基质的分子。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是一种降解透明质酸(Hyaluronan)或透明质酸(HA)的酶。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是透明质酸酶。
在一些实施方式中，所述透明质酸酶多肽选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ ID NO:1129、SEQ ID NO:1130、SEQ ID NO:1131或其功能性片段。在一些实施方式中，所述透明质酸酶多肽与选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ ID NO:1129、SEQ IDNO:1130、SEQ ID NO:1131的一种或多种多肽或其功能性片段具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少约99％的同一性。
其他免疫调节剂
其他免疫调节剂包括治疗性核酸(RNA和DNA)，例如RNAi分子(例如siRNA、miRNA、dsRNA)，mRNA，反义分子，适体和CRISPER/Cas9分子，例如在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中所述的，其全部内容通过引用并入本文。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于生产一种或多种免疫调节剂的一种或多种序列，所述免疫调节剂是RNA或DNA调节剂，例如包括选自下述的核酸分子：RNAi分子(siRNA、miRNA、dsRNA)，mRNA，反义分子，适体和CRISPR/Cas9分子。这些分子在下文提供的参考文献中举例说明和讨论。
免疫引发剂和免疫维持剂的组合
在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法旨在组合多种机制。例如，通过激活肿瘤微环境中的多个正交免疫调节途径，将免疫学上的冷肿瘤转化为免疫上热肿瘤。可以选择多种效应物，其对免疫应答的不同组分具有影响。可被本文公开的细菌和免疫调节剂靶向的不同免疫应答组分包括免疫起始和免疫增强以及T细胞扩增(免疫维持)。
在一些实施方式中，可以将微生物和至少第一种免疫调节剂(例如免疫引发剂或免疫维持剂)与至少一种第二免疫调节剂(例如免疫引发剂或免疫维持剂)组合施用(例如在之前、同时或之后)。
在表5和表6中描述了免疫引发剂和维持剂的非限制性实例。
表5：免疫引发剂
Figure BDA0003145696170000891
表6：免疫维持剂
Figure BDA0003145696170000892
Figure BDA0003145696170000901
在一些组合实施方式中，可以将表5中的一种或多种效应物与表6中的一种或多种效应物组合。
可以选择多种效应物，其对免疫应答的不同组分具有影响。可本文公开的效应物靶向的不同免疫应答组分包括溶瘤、APC的免疫激活、T细胞的激活和初免(“免疫引发剂”)，运输和浸润、免疫增强，T细胞扩增(“免疫维持剂”)。在一些组合实施方式中，所述“免疫引发剂”与所述“免疫维持剂”组合。在一些实施方式中，所述免疫引发剂和/或免疫维持还可以与基质调节剂(例如透明质酸酶)组合。
在一个实施方式中，所述免疫引发剂与所述免疫维持剂是不同的。作为一个非限制性实例，其中所述免疫引发剂是IFN-γ，所述免疫维持剂不是IFN-γ。在一个实施方式中，所述免疫引发剂与所述免疫维持剂是不同的。作为一个非限制性实例，其中所述免疫引发剂是IFN-γ，所述免疫维持剂不是IFN-γ。
在癌症免疫循环中，任何一种或多种免疫引发剂可以与任何一种或多种免疫维持剂组合。因此，在一些实施方式中，所述一种或多种免疫引发剂调节(例如强化)癌症免疫循环的一个或多个下述步骤(1)溶瘤，(2)APC的激活和/或(3)T细胞的初免和激活与一种或多种免疫维持剂组合，其调节(例如激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。本文提供了调节步骤(1)、(2)和(3)的免疫引发剂的非限制性实例。本文提供了调节步骤(4)、(5)和(6)的免疫维持剂的非限制性实例。因此，任何这些示例性免疫调节剂可以是免疫引发剂/免疫维持剂组合的一部分，其能够调节如本文所述的一个或多个癌症免疫循环步骤。因此，一种或多种免疫引发剂/一种或多种免疫维持剂的组合能够调节癌症免疫循环步骤的组合，例如，如下所示：步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(4)；步骤(2)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(4)；步骤(3)、步骤(5)；步骤(3)、步骤(6)。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，可以将本文公开的组合物和方法与常规癌症疗法(例如手术，化学疗法，靶向疗法，放射疗法，断层疗法，免疫疗法，癌症疫苗，激素疗法，热疗，干细胞移植(外周血、骨髓和脐血移植)，光动力疗法，溶瘤病毒疗法以及献血和输血)组合。
药物组合物和制剂
包含本发明的微生物和/或免疫调节剂的药物组合物可以用于治疗、控制、改善和/或预防癌症。本发明的药物组合物可以单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合。
在一些实施方式中，所述细菌作为孢子全身或肿瘤内施用。作为非限制性实例，所述细菌是梭菌菌株，并且施用导致肿瘤内缺氧/坏死区域的选择性定植。在一些实施方式中，孢子仅在存在于实体瘤中的缺氧/坏死区域中萌发，而在体内其他任何地方都不发芽。
本发明的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成药用组合物。配制药物组合物的方法是本领域已知的(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，MackPublishing Co.，Easton，PA)。在一些实施方式中，将药物组合物进行压片，冷冻干燥，直接压片，常规混合，溶解，制粒，研磨，乳化，包封，包埋或喷雾干燥，以形成片剂，颗粒，纳米颗粒，纳米胶囊，微胶囊，微片，丸剂。或粉末，可以是肠溶包衣或未包衣的。适当的配方取决于施用途径。
基因工程微生物可以以任何合适的剂型配制成药物组合物(例如用于口服给药的液体、胶囊、小药囊、硬胶囊、软胶囊、片剂、肠溶衣片剂、悬浮粉末、颗粒或基质缓释形式)。并且用于任何合适类型的给药(例如口服、局部、注射、静脉内、皮下、肿瘤内、肿瘤周围、立即释放、脉冲释放、延迟释放或持续释放)。基因工程化细菌的合适剂量可以为约104至1012个细菌。组合物可以每天，每周或每月施用一次或多次。可以在餐前，餐中或餐后施用组合物。在一个实施方式中，所述药物组合物在受试者进餐前施用。在一个实施方式中，所述药物组合物目前与膳食一起施用。在一个实施方式中，所述药物组合物在受试者吃饭后施用。
可以将细菌和/或一种或多种免疫调节剂配制成药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、缓冲剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或药剂。例如，药物组合物可包括但不限于添加碳酸氢钙、碳酸氢钠、磷酸钙、各种糖和类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌可以配制在碳酸氢钠溶液中，例如1摩尔碳酸氢钠溶液中(以缓冲例如胃的酸性细胞环境)。
所述组合物可以静脉内施用，例如通过输注或注射。或者，所述组合物可以通过肿瘤内和/或肿瘤周围施用。在其他实施方式中，所述组合物可以动脉内、肌肉内或腹膜内施用。在一些实施方式中，所述细菌定殖约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的肿瘤。在一些实施方式中，所述细菌与聚乙二醇化形式的rHuPH20(PEGPH20)或其他试剂共同施用以破坏肿瘤隔膜以增强肿瘤囊、胶原和/或基质的渗透。
本文公开的微生物和/或一种或多种免疫调节剂可以通过瘤内注射施用。肿瘤内注射可引起有效的局部炎症反应以及针对肿瘤细胞的适应性免疫应答。在一些实施方式中，用18号多头针(Quadra-Fuse，RexMedical)注射肿瘤。注射部位是无菌制备的。如果可用，可以使用超声或CT来鉴定注射用肿瘤的坏死区域。如果未识别出坏死区域，则可以将注射引导至肿瘤的中心。将针插入预定区域一次，并均匀分配压力。缓慢取出注射针，并对注射部位进行消毒。
与静脉内施用相比，将本发明的组合物直接瘤内注射到实体瘤中可能是有利的。使用静脉内注射方法，只有一小部分细菌可能到达目标肿瘤。例如，在大肠杆菌Nissle注入4T1荷瘤小鼠的尾静脉后，大多数细菌(>99％)迅速从动物身上清除，只有一小部分施用的细菌在肿瘤中定殖(Stritzker等，2007)。特别地，在与小鼠相比具有相对大的血容量和相对小的肿瘤的大型动物和人类患者中，肿瘤内注射可能是特别有益的。直接注射到肿瘤中允许递送更高浓度的治疗剂并避免可由全身施用引起的毒性。此外，细胞瘤内注射诱导肿瘤内强烈和局部的免疫反应。
取决于位置、肿瘤类型和肿瘤大小，可以使用不同的施用技术，包括但不限于皮肤、皮下和经皮注射，治疗性内窥镜超声波检查或支气管内肿瘤内递送。在肿瘤内给药程序之前，进行镇静与局部麻醉以及标准心脏、压力和氧气监测，或对患者的全麻醉。
对于一些肿瘤，可以采用经皮注射，这是侵入性最小的给药方法。超声、计算机断层扫描(CT)或荧光检查可用作引导和定位针的引导。例如在Lencioni等，2010中描述了经皮肿瘤内注射用于肝细胞癌。肿瘤内，皮下和淋巴结肿瘤的肿瘤内注射例如在WO/2014/036412(Amgen)中描述，用于晚期黑素瘤。
单个插入点或多个插入点可用于经皮注射方案。使用单个插入点，可以沿着多个轨道经皮注射溶液，只要针的径向范围允许。在其他实施例中，如果肿瘤大于针的径向范围，则可以使用多个注射点。针可以在不离开的情况下被拉回，并且根据需要重新定向直到注射和分散全剂量。为了保持无菌状态，每次注射使用单独的针头。针的大小和长度取决于肿瘤类型和大小。
在一些实施方式中，用18号多头针(Quadra-Fuse，RexMedical)经皮注射肿瘤。该装置由一个20cm长的18号穿刺针组成。针头有三个可伸缩的插脚，每个插头有四个端子侧孔和一个带延长管夹的连接器。尖头从针的侧壁展开。针可以经皮引入肿瘤的中心，并且可以定位在肿瘤的最深边缘。尖头部署在肿瘤的边缘。尖头以最大长度展开，然后以规定的间隔缩回。可选地，可以执行一个或多个旋转-注射-旋转操纵，其中，尖头缩回，针旋转60度，然后重复展开尖头和另外的注射。
治疗性内镜超声检查(EUS)用于克服获得某些其他肿瘤的固有解剖学限制(Shirley等，2013)。EUS引导下的细针注射(EUS-FNI)已成功用于治疗头颈部，食管，胰腺，肝脏和肾上腺肿块的抗肿瘤治疗(Verna等，2008)。EUS-FNI已被广泛用于胰腺癌注射。细针注射需要使用曲线回声镜。小心插管食管，将回声内窥镜送入发生胰腺检查的胃和十二指肠，并确定目标肿瘤。测量最大平面以估计肿瘤体积并计算注射体积。将适当的体积吸入注射器中。将准备好的22号细针抽吸(FNA)针头送入回声镜的工作通道。在超声引导下，针头进入肿瘤。根据肿瘤的大小，可以通过将肿瘤分成切片然后将相应的体积部分注射到每个切片中来进行给药。使用安装有多普勒技术的内窥镜超声处理器确保没有动脉或静脉结构可能干扰针进入肿瘤(Shirley等，2013)。在一些实施方式中，与直型针相比，EUS-FNI的“多次注射针”(MIN)可用于改善肿瘤的注射分布(Ohara等，2013)。
如Celikoglu等，2008中所述，可以通过支气管内肿瘤内递送方法实现肺癌的瘤内施用，例如非小细胞肺癌。进行支气管镜检查(经鼻或口腔)以观察待治疗的病变。可以通过支气管表面上的可见长度-宽度高度测量来目测估计肿瘤体积。然后通过支气管镜的工作通道引入针装置。由连接到塑料导管的金属针组成的针导管放置在护套内，以防止在推进过程中针对工作通道的损坏。针的大小和长度是变化的，并根据肿瘤的类型和大小确定。由塑料制成的针头比金属针头的刚性小，并且是理想的，因为它们可以在工作通道中绕过更尖锐的弯曲。将针插入病变部位并注射本发明的基因工程化细菌。在几个插入点处重复插入针，直到完全灌注肿瘤块为止。每次注射后，针头完全从肿瘤中取出，然后嵌入另一个位置。在支气管镜注射期结束时，可以使用机械解剖或伴随灌洗和抽吸的其他消融技术去除由治疗引起的任何坏死碎片的移除。
在一些实施方式中，使用包括但不限于经皮注射，EUS-FNI或支气管内肿瘤内递送方法的方法将组合物直接施用于肿瘤。在某些情况下，其他技术，如腹腔镜或开放手术技术被用于进入目标肿瘤，然而，这些技术更具侵入性，并带来更大的发病率和更长的住院时间。
在一些实施方式中，将细菌(例如大肠杆菌Nissle)或孢子(例如诺维梭菌NT)溶解于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用于全身或肿瘤内注射。
要注射的剂量来源于肿瘤的类型和大小。药物或细菌的剂量通常比全身静脉内给药的剂量低，例如低几个数量级。
注入每个病变的体积基于肿瘤的大小。为了获得肿瘤体积，可以进行最大平面的测量。然后，估计的肿瘤体积可以将注射体积的确定通知为总体积的百分比。例如，可以使用总肿瘤体积的约20-40％的注射体积。
例如，如WO/2014/036412中所述，对于其最大尺寸大于5cm的肿瘤，可注射至多4ml。对于最大尺寸为2.5至5cm的肿瘤，可注射最多2ml的肿瘤。对于最大尺寸为2.5至5cm的肿瘤，可注射最多2ml的肿瘤。对于最大尺寸在1.5至2.5cm之间的肿瘤，可以注射高达1ml的肿瘤。对于最大尺寸在0.5和1.5cm之间的肿瘤，可以注射高达0.5ml的肿瘤。对于最大尺寸等于或小于0.5的肿瘤，可注射高达0.1ml的肿瘤。或者，超声扫描可用于确定肿瘤可以吸收的注射体积而不会泄漏到周围组织中。
在一些实施方式中，所述治疗方案将包括一次或多次瘤内施用。在一些实施方式中，所述治疗方案将包括初始剂量，其后是至少一个后续剂量。可以在两个或更多个循环中按序施用一个或多个剂量。
例如，第一剂可以在第1天施用，第二剂可以在1、2、3、4、5、6天，1、2、3或4周后或更长的间隔后施用。另外的剂量可以在1、2、3、4、5、6天后或1、2、3或4周或更长的间隔后施用。在一些实施方式中，第一次和随后的施用具有相同的剂量。在其他实施方式中，施用不同剂量。在一些实施方式中，每天施用超过一个剂量，例如可以每天施用两个、三个或更多个剂量。
所描述的施用途径和剂量仅用作指导。最佳施用途径和剂量可由熟练的从业者容易地确定。剂量可根据各种参数(尤其是根据肿瘤的位置，肿瘤的大小，待治疗患者的年龄、体重和状况以及施用途径和方法)来确定。
在一些实施方式中，所述细菌是通过第一途径(例如瘤内注射)施用的，并且所述至少一种免疫调节剂是通过第二途径(例如口服)施用的。
在一些实施方式中，本公开的组合物可以口服施用。在一些实施方式中，所述组合物可用于预防，治疗或控制肝癌或肝转移。例如，Danino等表明口服大肠杆菌Nissle能够通过在肝转移的小鼠模型中穿过胃肠道来定植肝转移灶(Danino等，Programmableprobiotics for detection of cancer in urine.Science Translational Medicine,7(289):1-10，其内容通过引用整体并入本文)。
在一个实施方式中，所述组合物通过瘤内注射递送的。在一个实施方式中，所述组合物是胸腔内递送的。在一个实施方式中，所述组合物是皮下递送的。在一个实施方式中，所述组合物是静脉内递送的。在一个实施方式中，所述组合物是胸膜内递送的。
在一些实施方式中，所述组合物可以根据按需要多次注射的方案在肿瘤内施用。在一些实施方式中，每次瘤内注射一起施用细胞和至少一种免疫调节剂。在一些实施方式中，首先注射细菌菌株，然后在稍后的时间点注射免疫调节剂。在其他实施方式中，首先注射免疫调节剂，并在稍后的时间点注射细菌。可以同时或顺序进行额外的注射。
本发明的细菌在肿瘤内递送的肿瘤类型包括局部晚期和转移性肿瘤，包括但不限于B、T和NK细胞淋巴瘤，结肠和直肠癌，黑素瘤，包括转移性黑素瘤，蕈样肉芽肿，Merkel癌，包括继发于结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、滤泡性淋巴瘤、前列腺癌、难治性肝癌和Merkel细胞癌的肝细胞癌和肝转移。
在一些实施方式中，所述肿瘤细胞溶解是肿瘤内注射的一部分。结果，肿瘤抗原可以暴露以激发抗肿瘤应答。这种暴露可以与细菌表达的效应物一起起作用以增强抗肿瘤作用。在一些实施方式中，所述肿瘤细胞裂解不会发生作为瘤内注射的一部分。
可以调整剂量方案以提供治疗反应。给药可取决于若干因素，包括疾病的严重性和反应性、施用途径、治疗的时间过程(数天至数月至数年)和改善疾病的时间。例如，可以一次施用单次推注，可以在预定时间段内施用几次分开的剂量，或者可以如治疗情况所示减少或增加剂量。剂量的规格取决于活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果。剂量值可能随待缓解病症的类型和严重程度而变化。对于任何特定受试者，可以根据个体需要和治疗临床医生的专业判断随时间调整特定剂量方案。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养或动物模型中的标准药学方法确定。例如，可以确定LD50、ED50、EC50和IC50，并且可以计算毒性和治疗效果之间的剂量比(LD50/ED50)作为治疗指数。可以使用表现出毒副作用的组合物，经过仔细修改以最小化潜在的损害以减少副作用。最初可以从细胞培养测定和动物模型估计剂量。从体外和体内测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。
成分单独或以单位剂量形式混合在一起供应，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，在密封容器如安瓿或小袋中，表明活性剂的量。如果给药方式是注射，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前混合各成分。
药物组合物可以包装在气密密封的容器中，例如安瓿或小药囊，表明药剂的量。在一个实施方式中，所述一种或多种药物组合物作为干燥灭菌的冻干粉末或无水浓缩物在密封容器中提供，并且可以重构(例如用水或盐水)至适当的浓度以施用于受试者。在一个实施方式中，所述一种或多种预防或治疗剂或药物组合物作为干燥的无菌冻干粉末在密封的容器中提供，储存在2℃至8℃之间，并在1小时内、3小时内、5小时内、6小时内、12小时内、24小时内、48小时内、72小时内或重建后一周内给药。可以包括冷冻保护剂用于冻干剂型，主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。其它合适的增量剂包括甘氨酸和精氨酸，其中任一种都可以以0-0.05％的浓度包含，和聚山梨醇酯-80(最佳地包括在0.005-0.01％的浓度下)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。药物组合物可以制备成可注射溶液，并且可以进一步包含可用作佐剂的试剂，例如用于增加吸收或分散的试剂，例如透明质酸酶。
在一些实施方式中，所述组合物被配制成用于静脉内施用、肿瘤内施用或肿瘤周围施用。所述组合物可被配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入或注射给药。例如，所述组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如作为微溶盐)。
治疗方法
本发明的另一方面提供了治疗癌症的方法。在一些实施方式中，本发明提供用于减少、改善或消除与癌症相关的一种或多种症状的方法。在一些实施方式中，所述癌症选自肾上腺癌，肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌(例如尤文肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)，脑癌(例如星形细胞瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤)，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，乳腺癌，Castleman病，宫颈癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，胆囊癌，胃肠癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞疾病，心脏癌，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌，下咽癌，白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病)，肝脏癌症，肺癌，淋巴瘤(例如艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增多性异常综合征，鼻腔癌，鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌癌症，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，横纹肌样瘤，唾液腺癌，肉瘤，皮肤癌(例如基底细胞癌、黑色素瘤)，小肠癌，胃癌，畸胎瘤，睾丸癌，咽喉癌癌症，胸腺癌，甲状腺癌，不寻常的儿童癌症，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。在一些实施方式中，与其相关的症状包括但不限于贫血，食欲不振，膀胱内层刺激，出血和瘀伤(血小板减少症)，味觉或嗅觉改变，便秘，腹泻，口干，吞咽困难，水肿，疲劳，脱发(脱发)，感染，不孕，淋巴水肿，口腔溃疡，恶心，疼痛，周围神经病，蛀牙，尿路感染和/或记忆和注意力问题。
该方法可包括制备具有至少一种本文所述的物种，菌株或亚型细菌和/或免疫调节剂的药物组合物，并以治疗有效量将该药物组合物给予受试者。所述组合物可以局部施用，例如肿瘤内或肿瘤周围施用到组织或供应容器中，或全身施用，例如通过输注或注射静脉内施用。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内、肿瘤内、动脉内、肌肉内、腹膜内、口服或局部施用。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内给药，即全身施用。
在某些实施方式中，向所述受试者施用所述药物组合物减少了所述受试者中的细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积。在一些实施方式中，与未处理或对照受试者的水平相比，本公开所述的方法可以将细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，通过在施用所述药物组合物之前和之后比较受试者中的细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积来测量减少。在一些实施方式中，治疗或改善受试者中的癌症的方法允许癌症的一种或多种症状改善至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
在施用所述药物组合物之前、期间和之后，可以在生物样品中测量受试者中的癌细胞和/或生物标记物，例如血液，血清，血浆，尿液，腹膜液和/或来自的活组织检查。组织或器官。在一些实施方式中，所述方法可包括施用本发明的组合物以将受试者中的肿瘤体积减少至不可检测的大小，或减少至小于所述受试者在治疗前的肿瘤体积的约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％。在其他实施方式中，所述方法可包括施用本发明的组合物以将受试者中的细胞增殖速率或肿瘤生长速率降低至不可检测的速率，或降低至小于治疗前的所述速率的约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％。
应答模式可能与传统的细胞毒性疗法不同。例如，用免疫疗法治疗的肿瘤可能在它们消退之前扩大，和/或可能出现新的病变(Agarwala等，2015)。肿瘤大小增加可能是由于肿瘤组织中通常不存在的淋巴细胞和巨噬细胞的严重浸润。另外，响应时间可能比与标准疗法相关的响应时间慢，例如细胞毒性疗法。在一些实施方式中，所述免疫调节剂的递送可以调节受试者肿瘤的生长和/或改善癌症的症状，同时暂时增加肿瘤的体积和/或大小。
在施用后数小时或数天，可以被破坏，例如，通过组织或血清中的防御因子(Sonnenborn等，2009)，或通过激活杀灭开关。因此，包含用于产生免疫调节剂的基因或基因盒的药物组合物可以以治疗有效剂量和频率重新施用。在备选实施方式中，所述细菌在施用后数小时或数天内不被破坏，并且可以在肿瘤中繁殖并定殖肿瘤。
药物组合物可以单独施用或与一种或多种另外的治疗剂组合施用，例如化学治疗药物或检查点抑制剂，例如，如本文所述和本领域已知的。选择一种或多种另外的治疗剂的重要考虑因素是所述药剂应与本发明的细菌相容，例如，所述药剂不得杀死细菌。在一些研究中，抗癌免疫疗法(例如CTLA-4或PD-1抑制剂)的功效需要在微生物组中存在特定的细菌菌株(Ilda等，2013；Vetizou等，2015；Sivan等，2015)。在一些实施方式中，包含细菌的药物组合物增强了检查点抑制剂或化学治疗剂的作用，例如，允许降低全身施用的化学治疗剂或免疫治疗剂的剂量。在一些实施方式中，所述药物组合物与一种或多种共生或益生菌一起施用，例如双歧杆菌或拟杆菌。
在某些实施方式中，可以向所述受试者施用药物组合物以治疗癌症，通过向所述受试者施用细菌，和向所述受试者施用至少一种免疫调节剂。在一些实施方式中，施用步骤同时进行。在一些实施方式中，向所述受试者施用所述细菌发生在向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂之前。在一些实施方式中，向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂发生在向所述受试者施用所述细菌之前。
化学治疗剂
在一些实施方式中，所述药物组合物与一种或多种化学治疗剂的给药按序、同时或随后施用。在一些实施方式中，所述药物组合物与选自以下的一种或多种化学治疗剂的给药按序、同时或随后施用：曲
Figure BDA0003145696170001021
Figure BDA0003145696170001022
和
Figure BDA0003145696170001023
在一些实施方式中，所述药物组合物与吉西他滨(健泽)的给药按序、同时或随后施用。在一些实施方式中，所述药物组合物与环磷酰胺的给药按序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，所述一种或多种细菌全身或口服或瘤内施用。
在一些实施方式中，所述一种或多种药物组合物与一种或多种化学治疗剂的给药顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，所述化学治疗剂是全身施用的，并且所述细菌是瘤内施用的。在一些实施方式中，所述化学治疗剂和所述药物组合物是全身施用的。在一个实施方式中，所述化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，与在相同条件下单独的化学疗法相比，所述药物组合物能够改善共同施用的化学治疗剂(例如环磷酰胺)的抗肿瘤活性(例如肿瘤增殖、大小、体积、重量)例如10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与在相同条件下单独的化学疗法相比，所述药物组合物能够改善共同施用的化学治疗剂(例如环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如肿瘤增殖、大小、体积、重量)例如1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍或更多。
检查点抑制
在某些实施方式中，所述药物组合物与本领域公知的或本文公开的一种或多种检查点抑制剂、免疫刺激抗体(抑制性或激动性)或其他激动剂的给药顺序、同时或随后施用。在某些实施方式中，所述药物组合物与本领域公知的或本文公开的一种检查点抑制剂、免疫刺激抗体(抑制性或激动性)或其他激动剂的给药顺序、同时或随后施用。在某些实施方式中，所述药物组合物与本领域公知的或本文所述的两种检查点抑制剂、免疫刺激抗体(抑制性或激动性)或其他激动剂的给药顺序、同时或随后施用。
免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4抗体(包括但不限于伊匹单抗和曲美木单抗(CP675206))，抗-4-1BB(CD137，TNFRSF9)抗体(包括但不限于PF-05082566和乌瑞芦单抗)，抗CD134(OX40)抗体，包括但不限于抗OX40抗体(Providence Health andServices)，抗PD-1抗体(包括但不限于纳武单抗，匹地利珠单抗，派姆单抗(MK-3475/SCH900475，兰博利珠单抗)，REGN2810，PD-1(Agenus))，抗PD-L1抗体(包括但不限于度伐利尤单抗(MEDI4736)，阿维单抗(MSB0010718C)和阿特珠单抗(MPDL3280A、RG7446、RO5541267))，和抗KIR抗体(包括但不限于利瑞鲁单抗)，LAG3抗体(包括但不限于BMS-986016)，抗CCR4抗体(包括但不限于莫格利珠单抗)，抗CD27抗体(包括但不限于伐利鲁单抗)，抗CXCR4抗体(包括但不限于乌洛鲁单抗)。在一些实施方式中，所述至少一种细菌细胞与抗磷脂酰丝氨酸抗体(包括但不限于巴维昔单抗)按序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，所述药物组合物与选自以下的一种或多种抗体的给药顺序、同时或随后施用：TLR9抗体(包括但不限于MGN1703)、PD-1抗体(包括但不限于SHR-1210(Incyte/Jiangsu Hengrui))、抗OX40抗体(包括但不限于OX40(Agenus))、抗Tim3抗体(包括但不限于抗Tim3(Agenus/Incyte))、抗Lag3抗体(包括但不限于抗Lag3(Agenus/Incyte))、抗B7H3抗体(包括但不限于依诺妥珠单抗(MGA-271))、如WO2009101611所述的抗CT-011(hBAT，hBAT1)、抗PDL-2抗体(包括但不限于AMP-224(描述于WO2010027827和WO2011066342中))、抗CD40抗体(包括但不限于CP-870、893)、抗CD40抗体(包括但不限于CP-870，893)。
共刺激分子
在某些实施方式中，所述一种或多种细菌和/或免疫调节剂与一种或多种激动性免疫刺激分子或激动剂(包括但不限于激动性抗体)的给药顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，所述一种或多种抗体选自抗OX40抗体(包括但不限于INCAGN01949(Agenus)；BMS 986178(Bristol-Myers Squibb)，MEDI0562(Medimmune)，GSK3174998(GSK)，PF-04518600(Pfizer))，抗41BB/CD137(包括但不限于PF-05082566(Pfizer)，urelumab(BMS-663513；Bristol-Myers Squibb)和抗GITR(包括但不限于TRX518(Leap Therapeutics)、MK-4166(Merck)、MK-1248(Merck)、AMG 228(Amgen)、BMS-986156(BMS)、INCAGN01876(Incyte/Agenus)、MEDI1873(AZ)、GWN323(NVS))。
在一些实施方式中，所述微生物和/或免疫调节剂可以作为方案的一部分施用，其包括其他治疗方式或其他方式的组合。这些方式或药剂的非限制性实例是常规疗法(例如放射疗法、化学疗法)，其他免疫疗法，干细胞疗法和靶向疗法(例如BRAF或血管内皮生长因子抑制剂；抗体或化合物)，本文所述的细菌和溶瘤病毒。治疗还包括与抗体-免疫接合相关，包括Fc介导的ADCC治疗，使用将细胞毒性T细胞与肿瘤细胞(例如BiTE)连接的双特异性可溶性scFv的治疗，以及具有效应功能的可溶性TCR。免疫疗法包括疫苗(例如病毒抗原、肿瘤相关抗原、新抗原或其组合)，检查点抑制剂，细胞因子疗法，过继性细胞疗法(ACT)。ACT包括但不限于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法，天然或工程化TCR或CAR-T疗法，天然杀伤细胞疗法和树突细胞疫苗或其他抗原呈递细胞的其他疫苗。靶向治疗包括抗体和化学化合物，并且包括例如抗血管生成策略和BRAF抑制。
通过表达未甲基化的CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)模拟细菌DNA的免疫刺激活性。Bode等，Expert Rev Vaccines.2011年4月；10(4):499–511。CpG DNA作为疫苗佐剂。当用作疫苗佐剂时，CpG ODN改善专职抗原呈递细胞的功能并促进体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。在一些实施方式中，CpG可以与本发明的细菌组合施用。
在一个实施方式中，所述微生物与肿瘤细胞裂解物组合施用。
可以基于症状的严重程度和癌症的进展来选择药物组合物的剂量和给药频率。适当的治疗有效剂量和给药频率可由治疗临床医生选择。
体内治疗
包含细菌和/或至少一种免疫调节剂的组合物可以在体内评估，例如在动物模型中。可以使用与癌症相关的疾病或病症的任何合适的动物模型，例如肿瘤同系或异种移植小鼠模型(参见，例如，Yu等，2015)。细菌和/或至少一种免疫调节剂可以全身或局部施用至动物，例如，通过口服施用(强饲)、静脉内或皮下注射或通过肿瘤内注射，并且例如通过测量肿瘤体积来确定治疗功效。
非限制性的动物模型的实例包括描述于Dang等，2001，Heap等，2014和Danino等，2015中的小鼠模型。
临床前小鼠模型确定哪种免疫疗法和组合免疫疗法将在不同的癌症中产生最佳治疗指数(最大抗肿瘤功效和最小免疫相关不良事件(irAE))。
将衍生自各种人癌细胞类型或患者肿瘤块的培养细胞植入小鼠组织部位已被广泛用于产生癌症小鼠模型(异种移植建模)。在异种移植建模中，将人肿瘤或细胞系皮下或原位植入免疫受损的宿主动物(例如裸鼠或SCID小鼠)中以避免移植排斥。因为在这样的模型中没有再现原始人肿瘤微环境，所以在这些模型中可能无法准确测量靶向免疫调节剂的抗癌剂的活性，使得具有完整免疫系统的小鼠模型是更加期望的。
因此，同系免疫活性宿主中的鼠癌细胞(同种异体移植)的植入被用于生成具有衍生自作为给定小鼠品系的相同遗传背景的肿瘤组织的小鼠模型。在同系模型中，宿主免疫系统是正常的，这可以更接近地代表肿瘤微环境的真实情况。将肿瘤细胞或癌细胞系皮下或原位植入同系免疫活性宿主动物(例如小鼠)中。可以在同系小鼠模型中用于免疫检查点基准测试的代表性小鼠肿瘤细胞系包括但不限于在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中列出的细胞系，其全部内容通过引用并入本文。
对于来源于某些细胞系的肿瘤，可以添加卵清蛋白以进一步刺激免疫应答，从而增加应答的基线水平。取决于细胞系，可在同系小鼠模型中使用的小鼠品系的实例包括C57BL/6、FVB/N、Balb/c、C3H/HeJ、C3H/HeJ、NOD/ShiLT、A/J、129S1/SvlmJ、NOD。此外，多种进一步基因工程化小鼠品系已被报道在分子和组织学水平两者上都模拟人类肿瘤发生。这些基因工程化小鼠模型也为本领域提供了极佳的工具，此外，这些模型中产生的侵袭性肿瘤来源的癌细胞系也是同系肿瘤模型细胞系的良好资源。在01/11/2017提交的以WO2017/123675公开的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中提供了基因工程化菌株的实例，其全部内容通过引用并入本文。
通常，潜在的治疗性分子会与人的免疫调节剂相互作用并刺激人的免疫系统，而不会检测到它们的鼠类对应物，反之亦然。在研究治疗性分子时，有必要考虑到这一点。最近，已经开发出“人源化”小鼠模型，其中免疫缺陷小鼠用人免疫系统重建，并且帮助克服了与小鼠和人免疫系统之间的差异相关的问题，允许进行体内研究。组合IL2受体无效和严重组合免疫缺陷突变(scid)的严重免疫缺陷小鼠(NOD-scid IL2Rg裸小鼠)缺乏成熟T细胞、B细胞或功能性NK细胞，并且缺乏细胞因子信号传导。这些小鼠可以被植入人造血干细胞和外周血单核细胞。将CD34+造血干细胞(hu-CD34)注射到免疫缺陷小鼠中，导致包括用于长期研究的非常好的T细胞成熟和功能的人免疫细胞群的多谱系植入。该模型具有12个月的研究期，其具有显示T细胞依赖性炎症应答而对宿主没有供体细胞免疫反应性的功能性人免疫系统。患者来源的异种移植物可以很容易地植入这些模型中，并且免疫调节剂的作用在更能反映人类肿瘤微环境(基于免疫和非免疫细胞两者)的体内环境中进行研究(Baia等，2015)。在人源化小鼠模型中使用的感兴趣的人细胞系包括但不限于HCT-116和HT-29结肠肿瘤细胞系。
如Roberts等，2014所述，大鼠F98神经胶质瘤模型和自发性犬肿瘤的效用，其全部内容通过引用整体并入本文。通过植入工程化以表达荧光素酶的F98大鼠神经胶质瘤细胞产生的局部侵袭性肿瘤被肿瘤内注射诺维梭菌NT孢子，导致萌发和荧光素酶活性的快速下降。诺维梭菌NT萌发通过细菌的营养形式的出现来证明。在这些研究中，诺维梭菌NT被精确地训练成针对肿瘤，放过附近的细胞。
犬软组织肉瘤例如在许多品种中很常见，并且具有与人类相似的临床、组织病理学和遗传学特征(Roberts等，2014；Staedtke等，2015)，特别是在遗传方面变异和突变谱方面。Roberts等在狗中进行了一项研究，其中将诺维梭菌NT孢子在1至4个治疗周期中肿瘤内注射(1×108个诺维梭菌孢子)到自发发生的实体瘤中90天。观察到有效的炎症应答，表明肿瘤内注射增加了先天免疫应答。
在一些实施方式中，将本发明的微生物全身施用至本文所述的任何模型中，例如口服、皮下、静脉内或肿瘤内施用，以评估抗肿瘤功效和任何治疗相关的不良副作用。
实施例
下面的实施例提供本公开的说明性实施方式。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本公开的精神或范围的情况下可以进行的多种修改和变化。这样的修改和变化包含在本公开的范围内。实施例不以任何方式限制本公开。
本公开提供了与在下文实施例中描述的任何SEQ ID NO的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少约99％同源性的序列。
实施例1：大肠杆菌Nissle的肿瘤药代动力学
如于2017年1月11日提交的公布为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072所述对肿瘤药代动力学进行测定和确定，其全部内容通过引用并入本文。使用CT26肿瘤模型在7天内测定Nissle(1e7和1e8个细胞/剂量)的肿瘤药代动力学。肿瘤组织中的细菌计数在这两个剂量下相似。在任何时间点在血液中都未检测到细菌。
在CT26肿瘤模型中比较链霉素抗性Nissle和Nissle DOM突变体(NissleΔPAL::CmR)的肿瘤药代动力学。肿瘤组织中的细菌计数在这两个菌株中相似。在血液中未检测到细菌。这些结果表明野生型和DOM突变体Nissle两者都可以在肿瘤环境中存活。
使用CT26肿瘤模型于1e6(组1)或1e7细胞/剂量(组2)下评估链霉素抗性Nissle对肿瘤内施用的体内细胞因子响应。在指定剂量下在小鼠CT-24模型中在SYN94肿瘤内施用后的时间过程中测量在血清和肿瘤中的水平。结果表明，在肿瘤中但不在血清中于较高剂量下引发细胞因子应答。较低剂量不引起实质性细胞因子反应。
在IT给药(1e7个细胞/剂量)后在48小时评估肿瘤PK、在各种组织中细菌的水平和在这些组织中的细胞因子水平。如在国际专利申请PCT/US2017/013072(通过引用并入本文)中所见，所述细菌主要存在于肿瘤中而在测试的其他组织中不存在。在所有血清、肿瘤和肝脏中测量的TNFα水平在SYN94、盐水处理和初始组之间类似。当Nissle通过IV以1e8施用时，TNFα水平相对于在1.5小时测量的TNFα水平可忽略不计。然而，即使是IV施用，TNFα水平在4小时时降低至不可检测的水平。在SYN94的1e6 IV剂量下检测到TNFα的类似低水平。
实施例2：在肿瘤模型中工程化和非工程化Nissle治疗的疗效评价
在第一项研究中，EcN的瘤内(i.t.)注射导致多种癌症类型的扩增和定植，包括B16.F10、EL4、A20、4T1和CT26可移植肿瘤(图4A)。在肿瘤中，EcN迅速扩增，在～24-72小时之间达到稳态，并仍定位于肿瘤，因为在血浆中未检测到细菌(图4A-4C)。为评价EcN的持久性和代谢活性，使用了包含LuxABCDE生物发光报告基因盒(EcN-Lux)的工程化菌株。i.t.注射后，EcN-Lux在肿瘤中扩增、持续并表现出一致的代谢活性，长达14天(以生物发光测量)(图4B)。EcN的瘤内治疗导致在较早时间点在肿瘤和血清中IL-6和TNFα的剂量依赖性增加(数据未显示)，肿瘤内应答的幅度和持续时间明显更高。最后，与盐水注射对照相比，EcN的i.t.施用导致肿瘤生长的显著推迟(数据未显示)。总的来说，这些数据支持使用EcN作为免疫治疗平台，该平台表现出肿瘤特异性定位和强大的肿瘤内代谢活性，这将能够产生治疗有效载荷，如STING激动剂。
在B16.F10肿瘤模型(小鼠黑色素瘤)中，进行第二项研究，以确定随着时间的推移，与盐水对照相比，SYNB(包含野生型大肠杆菌Nissle菌株，其含有二氨基庚二酸和胸苷双重营养缺陷型，以及内源性噬菌体的缺失)和SYNB1891(包含SYNB Nissle菌株以及整合至基因组中的来自单核细胞增生性李斯特菌的FNR诱导型dacA，以产生STING激动剂ci-di-AMP)的体内活性和疗效。
为生产用于研究的SYNB和SYNB1891细菌细胞，将SYNB和SYNB1891的冻存管解冻，并用于开始过夜药瓶培养以产生足够的生物量来接种每个培养物的生物反应器；将过夜药瓶培养物在37℃，350RPM下孵育约15小时。生物反应器含有1.5L发酵培养基，其中含有FM2发酵培养基(12g/L大豆水解物、24g/L酵母提取物、1.7g/L KH2PO4、11.4g/L K2HPO4、40g/L甘油、0.125ml/L消泡剂204、10mM胸腺嘧啶和0.3g/L二氨基庚二酸)，并且使用过夜培养物以OD～0.1接种。在60％DO、37℃、pH 7.0下培养生物反应器培养物，直至OD达到20。为了收获，将细胞以5000rpm离心30min，倾析用过的培养基，将细胞球团重悬在2mL冻存管中等分的含15％甘油的100mM磷酸盐缓冲液中并在-80C下冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度检测。
使用SYNB、SYNB1891或盐水对7周龄的B16.F10肿瘤荷瘤雌性C57BL/6小鼠进行三次瘤内注射。在不同时间点测量肿瘤体积，直至实验结束为止。
简言之，在第-8天，将B16.F10细胞SC植入(2x105个/小鼠/100μL于PBS)每只动物的右侧肋腹部。监测肿瘤生长直至肿瘤达到～40-100mm^3。在第1天时，将小鼠随机分组(每组N＝10只)，用于肿瘤内给药如下：PBS(组1，载剂对照)，SYNB(组2，1X10^9CFU)和SYNB1891(组3，1X10^9CFU)。在第1、4和7天时，测量肿瘤尺寸并向小鼠I.T.注射细菌或盐水。
在第1、4和7天，根据组使用适当细菌或盐水(注射用对照)给予动物。每周两次记录肿瘤体积和体重，两次测量之间有1-2天的间隔。
在图5中显示了长达21天的每个实验组的平均肿瘤体积，在图6A(盐水对照)、图6B(SYNB)和图6C(SYNB1891)中显示了各只小鼠的。结果表明，仅施用未工程化SYNB菌株具有中等效果并减缓肿瘤生长。此外，施用STING激动剂生产菌株SYNB1891显著控制肿瘤生长，到第21天时40％的小鼠无肿瘤。
实施例3：在Balb/c-A20肿瘤模型中STING激动剂治疗的疗效评价
为确定STING激动剂(包含基于质粒的来自单核细胞增多性李斯特氏菌的tet-诱导型dacA)的体内活性和功效，在c-A20肿瘤模型(A20 B细胞淋巴瘤)中，随着时间的推移将其以三个剂量给药并与PBS对照进行比较。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
将A20肿瘤植入6周龄的雌性Balb/c小鼠中，瘤内注射三个不同剂量的产生能够产生c-diAMP的酶的细菌。在不同时间点测量肿瘤体积，同时在实验结束时对肿瘤称重并进行处理。
简言之，在第-15天时将A-20细胞(2x105个/小鼠/100μL于PBS)SC植入每只动物的右侧肋腹部。监测肿瘤生长直至肿瘤达到～100mm^3。在第0天时，将小鼠随机分组(每组N＝8只)，用于肿瘤内给药如下：PBS(组1，载剂对照)，SYN3527(组2，1X10^7CFU)，SYN3527(组3，5X10^7CFU)和SYN3527(组4，5X10^8CFU)。在第0、2和5天时，测量肿瘤尺寸并向小鼠I.T.注射细菌或PBS，随后在4小时后进行ATC(1ug I.P.)。
在第0、3和7天时，按照分组向动物施用适宜的细菌或盐水(作为注射对照)。施用细菌后4小时，通过腹膜内注射用10ug ATC(无水四环素)处理小鼠。每周记录三次肿瘤体积和体重，两次测量之间的间隔为1-2天。
所得肿瘤体积将表明在A20淋巴瘤模型中施用该菌株能够产生剂量依赖性肿瘤控制。
实施例4：吞噬STING是SYNB1891介导的I型干扰素诱导所需的为评价SYNB1891在诱导I型IFN中的作用机制，使用细胞松弛素D阻断了细菌的吞噬作用。细胞松弛素D抑制肌动蛋白聚会并阻止吞噬作用，但其对可溶性小分子的内吞作用/胞饮作用的影响很小。小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)与经修饰以表达GFP的SYNB1891(SYNB1891-gfp)的共培养物，显示出很多细菌细胞与BMDC结合，并存在于含有溶酶体相关膜蛋白LAMP-1的成熟吞噬体内(图7A-7J)。SYNB1891被BMDC主动内化，因为用细胞松弛素D预处理显著减少了BMDC出现的细菌细胞数量(图C)。与对照EcN相比，SYNB1891以吞噬依赖性方式诱导显著的IFNβ1表达(图7D-7J)。细胞松弛素D在靶细胞中不影响可溶性smSTING激动剂2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)对IFNβ1的诱导。因此，SYNB1891的吞噬是胞内CDA释放和靶细胞中STING激活所必需的，这为优先激活肿瘤中的APC提供了一种自然机制。除了IFNβ1以外，SYNB1891和对照EcN激发其他炎性细胞因子(例如IL-6和TNFα)的分泌(图7H-7J)，而暴露于smSTING仅导致IFNβ1表达。吞噬作用的抑制未显著影响TNFα产生，但是使IL-6的表达减少2-3倍(图7H-7J)，证明EcN可以从吞噬细胞表面启动免疫信号转导，尽管需要内化以最佳地增强信号转导。
响应于SYNB1891的BMDC的I型干扰素产生显著依赖于STING信号转导，因为STING-/-BMDC未能诱导高水平的IFNβ1表达(图7H-7J)。EcN底盘本身诱导中等水平的IFNβ1表达，其以不依赖于STING，但依赖于TLR4的方式，可能是通过LPS/TLR4激活。响应于smSTING激动剂的IFNβ1表达在TLR4-/-BMDC中得以保留，而在STING-/-BMDC中完全消失(图7H-7J)。LPS是革兰氏阴性菌外膜的一个组成部分，因此TLR4对LPS的识别在这些微生物诱导免疫反应中起着重要作用。事实上，缺乏TLR4信号显着减弱了BMDC响应于SYNB1891和对照EcN对炎症细胞因子(例如IL-6和IL-12p35)的表达(图7H-7J)，表明LPS是SYNB1891免疫刺激机制的重要组成部分。
综上所述，这些数据表明，通过APC的SYNB1891吞噬作用需要STING依赖性的I型IFN应答的诱导。此外，SYNB1891的EcN底盘激活平行的TLR4依赖性信号传导，这导致其他促炎性细胞因子的表达，这些细胞因子通过治疗药物的吞噬作用而放大。
实施例5：B-16肿瘤模型
为确定随着时间的推移各种细菌与免疫调节剂(例如免疫引发剂或免疫维持剂)组合的体内活性和疗效，使用了B-16肿瘤模型。
将B16肿瘤注射至小鼠(2x105个/小鼠/40-80mL，在PBS中)中，然后使用三个不同剂量的细菌和/或免疫调节剂，每三天一次连续一周进行瘤内注射。在第0天，对小鼠进行随机分组(N＝16只/组)，按照如下所示进行瘤内给药：PBS(组1，载剂对照)、野生型细菌、野生型细菌加上免疫调节剂、细菌底盘以及细菌底盘加免疫调节剂。在不同时间点测量肿瘤毒性(重量)和生长，同时在实验结束时称重和处理肿瘤。
结果将表明野生型细菌和细菌底盘与免疫调节剂组合施用能够提供抗肿瘤应答。
实施例6：SYNB1891产生有效的抗肿瘤免疫
为了在A20肿瘤模型中，评价T细胞对SYNB1891疗效的贡献，使用消耗抗体在治疗开始前和整个研究期间将CD4+T细胞或CD8+T细胞耗竭。尽管使用同种型对照或CD4+T细胞耗竭抗体治疗的消除表现出40-50％的完全应答率，但是0％接受CD8+T细胞耗竭抗体的小鼠长期存活(图8)。这些数据表明，CD8+T细胞对SYNB1891的长期功效至关重要。
实施例7：SYNB1891在人抗原呈递细胞中激活多个STING等位基因
评估了在一组人单核细胞(THP-1)IRF报告细胞系中SYNB1891的活性，这些细胞系包含三种最流行的TMEM173(STING)变体。分别地，WT代表57.9％的发现于人类群体中的等位基因，HAQ代表20.4％的发现于人类群体中的等位基因，和R232H代表13.7％的发现于人类群体中的等位基因。针对全部三种等位基因，SYNB1891治疗导致I型IFN通路的诱导(图9)。HAQ等位基因显示最高水平的诱导，WT和R232H等位基因分别显示中等和较低的活性。THP-1细胞中的活性是STING依赖性的，因为在STING-/-细胞中报告基因的信号显著减弱(图9)。

Claims (55)

1.一种药物组合物，其包含分离的细菌、至少一种免疫调节剂和药学上可接受的载体，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘(bacterialchassis)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种免疫调节剂是至少一种免疫引发剂。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫引发剂能够增强溶瘤作用、激活抗原呈递细胞(APC)和/或引发和激活T细胞。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的组合物，其中所述免疫引发剂是STING激动剂、精氨酸、5-FU、TNFα、IFNγ、IFNβ1、激动性抗CD40抗体、CD40L、SIRPα、GMCSF、激动性抗OXO40抗体、OXO40L、激动性抗4-1BB抗体、4-1BBL、激动性抗GITR抗体、GITRL、抗PD1抗体、抗PDL1抗体或天青蛋白。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。
6.根据权利要求2-3中任一项所述的组合物，其中所述免疫引发剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化的化学疗法或裂解肽。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫引发剂是精氨酸。
8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫引发剂是5-FU。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种免疫调节剂是至少一种免疫维持剂。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述免疫维持剂能够增强T细胞的运输和浸润、增强T细胞对癌细胞的识别、增强效应T细胞应答和/或克服免疫抑制。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，其中所述免疫维持剂是代谢转化剂、精氨酸、STING激动剂、CXCL9、CXCL10、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、激动性抗GITR抗体或GITRL、激动性抗OX40抗体或OX40L、激动性抗4-1BB抗体或4-1BBL、IL-15、IL-15sushi、IFNγ或IL-12。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的组合物，其中所述免疫维持剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、代谢转化剂、T细胞共刺激受体或T细胞共刺激受体配体。
13.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，其中所述至少一种免疫维持剂是犬尿氨酸酶。
14.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，其中所述免疫维持剂是精氨酸。
15.根据权利要求9-11中任一项所述的组合物，其中所述免疫维持剂是STING激动剂。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。
17.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种免疫调节剂包含至少一种免疫引发剂和至少一种免疫维持剂。
18.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种免疫调节剂不是由所述细菌产生的。
19.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述细菌是野生型大肠杆菌Nissle细菌。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述细菌底盘是包含导致一种或多种营养缺陷型的基因中的至少一个突变或缺失的细菌。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述细菌底盘是包含thyA营养缺陷型和/或dapA营养缺陷型的细菌。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的组合物，其中所述细菌底盘是大肠杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、沙门氏菌属、李斯特菌属、乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属细菌、诺维梭菌、酿脓链球菌、牛分枝杆菌或克雷伯氏菌属细菌。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的组合物，其中所述细菌底盘进一步包含噬菌体缺失。
24.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于瘤内施用。
25.一种注射器，其包含前述任一项权利要求所述的组合物。
26.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-24中任一项所述的组合物或根据权利要求25所述的注射器及其使用说明书。
27.一种试剂盒，其包含：
i)包含分离的细菌的第一组合物，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘，
ii)包含免疫调节剂的第二组合物，和
iii)其使用说明书。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述第一组合物是冻干的组合物。
29.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述使用说明书表明
所述第一组合物用于在所述第二组合物之前向受试者施用；
所述第二组合物用于在所述第一组合物之前向受试者施用；或者
所述第一组合物和所述第二组合物在向受试者施用之前组合。
30.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，从而在所述受试者中治疗癌症。
31.一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细菌在向所述受试者施用后经历吞噬作用。
33.根据权利要求31所述的方法，其中通过所述细菌的吞噬作用协同增强所述免疫应答的诱导。
34.一种在有肿瘤的受试者中诱导远端效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，从而在所述受试者中诱导所述远端效应。
35.一种在有肿瘤的受试者中诱导免疫记忆的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，从而在所述受试者中诱导所述免疫记忆。
36.一种在受试者中诱导肿瘤的部分消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的所述部分消退。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述部分消退是所述肿瘤的尺寸缩小至少约10％、至少约25％、至少约50％或至少约75％。
38.一种在受试者中诱导肿瘤的完全消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的所述完全消退。
39.根据权利要求38所述的方法，其中在施用所述药学上可接受的组合物之后在所述受试者中无法检测到所述肿瘤。
40.根据权利要求30-39中任一项所述的方法，其中所述施用是瘤内注射。
41.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括
向所述受试者施用细菌，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘；和
向所述受试者施用至少一种免疫调节剂，
从而在所述受试者中治疗癌症。
42.一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括
向所述受试者施用细菌，其中所述细菌是野生型细菌或细菌底盘；和
向所述受试者施用至少一种免疫调节剂，
从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
43.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，
其中所述施用步骤是同时进行的；
其中向所述受试者施用所述细菌发生在向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂之前；或者
其中向所述受试者施用所述至少一种免疫调节剂发生在向所述受试者施用所述细菌之前。
44.根据权利要求30-43中任一项所述的方法，其进一步包括选择会从使用所述细菌和所述至少一种免疫调节剂的治疗中获益的受试者的步骤。
45.根据权利要求30-44中任一项所述的方法，其中所述细菌定植所述受试者中的肿瘤。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述细菌的所述施用是瘤内注射。
47.根据权利要求30-46中任一项所述的方法，其中所述施用不是口服施用。
48.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述至少一种免疫调节剂的所述施用是静脉内注射或鞘内注射。
49.根据权利要求30-48中任一项所述的方法，其中所述细菌包括预先定义细菌的同质群体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述预先定义细菌的同质群体包含大肠杆菌Nissle。
51.根据权利要求39-50中任一项所述的方法，其中所述至少一种免疫调节剂包含至少一种免疫引发剂和至少一种免疫维持剂。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述至少一种免疫引发剂选自表5中列出的所述免疫引发剂，并且所述至少一种免疫维持剂选自表6中列出的所述免疫维持剂。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一种免疫引发剂是STING激动剂，并且所述至少一种免疫维持剂是犬尿氨酸酶。
54.一种在受试者的肿瘤中激活抗原呈递细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用细菌，其中所述细菌是产生STING激动剂的细菌底盘或细菌，其中所述细菌在所述受试者中施用后经历吞噬作用，从而在所述受试者的所述肿瘤中激活抗原呈递细胞。
55.根据权利要求30-54中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括
选择具有至少一种野生型STING等位基因、HAQ STING等位基因或R232H STING等位基因的受试者。
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