定義 [0015] 在本文中可互換地使用之術語「蛋白質」、「多肽」及「肽」係指具有任何長度的聚合形式之胺基酸，包括編碼及非編碼胺基酸以及以化學方式或生物化學方式經修飾或衍生的胺基酸。術語包括已經修飾之聚合物，諸如具有經修飾之肽主鏈的多肽。 [0016] 蛋白質據稱具有「N端」及「C端」。術語「N端」係關於由具有自由胺基(-NH2)之胺基酸封端的蛋白質或多肽之起點。術語「C端」係關於由自由羧基 (-COOH)封端的胺基酸鏈(蛋白質或多肽)之終點。 [0017] 術語「融合蛋白質」係指包含兩個或超過兩個藉由肽鍵或其他化學鍵連接在一起之肽的蛋白質。肽可以藉由肽鍵或其他化學鍵直接連接在一起。舉例而言，嵌合分子可以單鏈融合蛋白質形式重組表現。替代地，肽可藉由「連接子」連接在一起，諸如兩個或超過兩個肽之間的一或多個胺基酸或另一種適合之連接子。 [0018] 在本文中可互換地使用之術語「核酸」及「多核苷酸」係指具有任何長度的聚合形式之核苷酸，包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或其類似物或經修飾之型式。其包括單股、雙股或多股DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體及包含嘌呤鹼基、嘧啶鹼基或其他天然、經化學修飾、經生物化學修飾、非天然或衍生之核苷酸鹼基的聚合物。 [0019] 核酸據稱具有「5'端」及「3'端」，此係因為使單核苷酸反應以製造寡核苷酸的方式為使得一個單核苷酸戊醣環之5'磷酸酯沿一個方向經由磷酸二酯鍵附接至其相鄰單核苷酸戊醣環之3'氧上。若寡核苷酸之5'磷酸酯不連接於單核苷酸戊醣環之3'氧，則該寡核苷酸之末端被稱為「5'端」。若寡核苷酸之3'氧不連接於另一個單核苷酸戊醣環之5'磷酸酯，則該寡核苷酸之末端被稱為「3'端」。即使處於較大寡核苷酸內部，核酸序列亦可據稱具有5'端及3'端。在線性或環形DNA分子中，不連續的元件被稱為處於「下游」或3'元件之「上游」或5'。 [0020] 「密碼子最佳化」係指一種修飾核酸序列以在特定宿主細胞中得到增強表現之方法，其藉由用在該宿主細胞之基因中更常或最常使用的密碼子替代原生序列之至少一個密碼子，同時維持該原生胺基酸序列來進行。舉例而言，編碼融合多肽之多核苷酸可經修飾以取代在給定李斯特菌細胞或任何其他宿主細胞中比在天然存在之核酸序列中使用頻率更高的密碼子。密碼子使用表為容易地可獲得的，例如在「密碼子使用資料庫」可獲得。由單核球增多性李斯特菌對於每一胺基酸所用的最佳密碼子展示於US 2007/0207170，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。此等表可以多種方式進行修改。參見Nakamura等人(2000)Nucleic Acids Research
28：292，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。用於對特定序列進行密碼子最佳化以在特定宿主中表現的計算機演算法亦為可獲得的(參見例如，基因仿造(Gene Forge))。 [0021] 術語「質體」或「載體」包括任何已知之遞送載體，包括細菌性遞送載體、病毒載體遞送載體、肽免疫治療遞送載體、DNA免疫治療遞送載體、附加型質體、整合型質體或噬菌體載體。術語「載體」係指能夠在宿主細胞中遞送及視情況表現一或多種融合多肽之構築體。 [0022] 術語「附加型質體」或「染色體外質體」係指物理上與染色體DNA分開(亦即，呈附加型或處於染色體外且不整合至宿主細胞基因組中)且獨立於染色體DNA複製的核酸載體。質體可為線性或環形，且其可為單股或雙股。附加型質體可視需要存留在宿主細胞細胞質(例如李斯特菌)中之多個複本中，從而引起所關注之任何基因在附加型質體內擴增。 [0023] 術語「經基因組整合」係指核酸已被引入至細胞中以使得核苷酸序列整合至該細胞之基因組中且能夠由其子代遺傳。任何方案均可用於將核酸穩定併入至細胞基因組中。 [0024] 術語「穩定維持」係指在缺乏選擇(例如抗生素選擇)持續至少10代的情況下維持核酸分子或質體，而無可偵測之損耗。舉例而言，時段可為至少15代、20代、至少25代、至少30代、至少40代、至少50代、至少60代、至少80代、至少100代、至少150代、至少200代、至少300代或至少500代。穩定維持可指核酸分子或質體在細胞中活體外
(例如，在培養物中)維持穩定，活體內維持穩定或兩者。 [0025] 「開讀框」或「ORF」為含有可潛在地編碼蛋白質之鹼基序列的DNA之部分。作為一個實例，ORF可位於基因之開始編碼序列(起始密碼子)與停止密碼子序列(終止密碼子)之間。 [0026] 「啟動子」為DNA之調節區，其通常包含能夠引導RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列之適當轉錄起始位點處起始RNA合成的TATA匣。啟動子可另外包含影響轉錄起始速率之其他區。本文所揭示之啟動子序列調節可操作地連接之多核苷酸的轉錄。啟動子可在一或多種本文所揭示之細胞類型(例如，真核細胞、非人類哺乳動物細胞、人類細胞、嚙齒動物細胞、多能性細胞、單細胞階段胚胎、分化細胞或其組合)中具有活性。啟動子可為例如，構成性活性啟動子、條件性啟動子、誘導性啟動子、時間限制性啟動子(例如發育調節性啟動子)或空間限制性啟動子(例如細胞特異性或組織特異性啟動子)。啟動子之實例可見於例如WO 2013/176772中，其以全文引用的方式併入本文中。 [0027] 「可操作連接」或「可操作地連接」係指兩個或超過兩個組件(例如，啟動子及另一個序列元件)併接以使得兩個組件均正常起作用且允許該等組件中之至少一者可能可介導對其他組件中之至少一者所施加的功能。舉例而言，若啟動子響應於一或多種轉錄調節因子之存在或不存在而控制編碼序列之轉錄水準，則該啟動子可被可操作地連接於編碼序列。可操作連接可包括彼此相鄰之此類序列或異側(in trans)作用之此類序列(例如，調節序列可隔一段距離起作用以控制編碼序列之轉錄)。 [0028] 在兩個多核苷酸或多肽序列之情形下的「序列一致性」或「一致性」參考當在指定比較窗內比對達到最大對應性時，該兩個序列中相同之殘基。當參考蛋白質加以使用序列一致性百分比時，確認不一致之殘基位置的不同之處常常在於保守胺基酸取代，其中胺基酸殘基取代為具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之其他胺基酸殘基且因此不改變分子之功能特性。當序列的不同之處在於保守取代時，序列一致性百分比可向上調節以校正取代之保守性質。不同之處在於此類保守取代的序列據稱具有「序列相似性」或「相似性」。用於進行此調節之方式為熟悉本技藝者所熟知。此通常涉及將保守取代作為部分而非全部失配來進行評分，藉此增加序列一致性百分比。因此，舉例而言，在對一致胺基酸給出1分，且對非保守取代給出0分時，對保守取代給出0與1之間的分數。保守取代之評分例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California)中所實施來加以計算。 [0029] 「序列一致性百分比」係指藉由在比較窗內比較兩個最佳比對序列來測定的值(完全匹配之殘基的最大數目)，其中比較窗中之多核苷酸序列部分相比於用於最佳比對兩個序列之參考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(亦即，間隙)。百分比藉由如下步驟來計算：測定在兩個序列中存在一致核酸鹼基或胺基酸殘基之位置數，得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100，得到序列一致性百分比。除非另外說明(例如，較短序列包括連接之異源序列)，否則比較窗為所比較兩個序列中之較短序列的全長。 [0030] 除非另外陳述，否則序列一致性/相似性值係指使用GAP Version 10使用以下參數獲得之值：核苷酸序列之一致性%及相似性%使用間隙權重50及長度權重3，以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；胺基酸序列之一致性%及相似性%使用間隙權重8及長度權重2，以及BLOSUM62評分矩陣；或其任何等效程序。「等效程序」包括對於所討論之任何兩個序列，產生具有一致核苷酸或胺基酸殘基匹配之比對及當與由GAP Version 10產生之相對應比對相比時之序列一致性一致百分比的任何序列比較程序。 [0031] 術語「保守胺基酸取代」係指用具有類似大小、電荷或極性之不同胺基酸取代通常存在於序列中之胺基酸。保守取代之實例包括將諸如異白胺酸、纈胺酸或白胺酸之非極性(疏水性)殘基取代為另一種非極性殘基。同樣，保守取代之實例包括將一種極性(親水性)殘基取代為另一種，諸如在精胺酸與離胺酸之間、在麩醯胺與天冬醯胺之間或在甘胺酸與絲胺酸之間。另外，將諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸之鹼性殘基取代為另一種，或將一種諸如天冬胺酸或麩胺酸之酸性殘基取代為另一種酸性殘基為保守取代之額外實例。非保守取代之實例包括將諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸或甲硫胺酸之非極性(疏水性)胺基酸殘基取代為諸如半胱胺酸、麩醯胺、麩胺酸或離胺酸之極性(親水性)殘基及/或將極性殘基取代為非極性殘基。典型胺基酸分類概述於下文。[0032] 「同源」序列(例如核酸序列)係指與已知參考序列一致或實質上類似之序列，以使得其與已知參考序列例如至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。 [0033] 術語「野生型」係指具有如在正常(相對於突變、生病、改變或等等)狀態或情形下所見之結構及/或活性的實體。野生型基因及多肽常常以多種不同形式(例如對偶基因)存在。 [0034] 關於蛋白質及核酸之術語「經分離」係指蛋白質及核酸關於通常可能原位存在之其他細菌、病毒或細胞組分為相對純化的，直至(且包括)該蛋白質及該多核苷酸的實質上純之製劑。術語「經分離」亦包括不具有天然存在之對應體，已以化學方式合成且因此實質上未經其他蛋白質或核酸污染，或已與大部分其天然伴隨之其他細胞組分(例如，其他細胞蛋白質、多核苷酸或細胞組分)分離或純化的蛋白質及核酸。 [0035] 「外源性」或「異源」分子或序列為通常不在細胞中表現或通常不以該形式存在於細胞中的分子或序列。通常存在包括關於細胞之特定發育階段及環境條件存在。舉例而言，外源性或異源分子或序列可包括細胞內相對應之內源性序列的經突變型式，或可包括對應於細胞內之內源性序列但呈不同形式的序列(亦即，不在染色體內)。特定細胞中之外源性或異源分子或序列亦可為來源於與該細胞之參考物種不同的物種或來源於相同物種內之不同生物體的分子或序列。舉例而言，在表現異源多肽之李斯特菌屬菌株的情況下，異源多肽可為並非該李斯特菌屬菌株原生或內源性的多肽，通常不由該李斯特菌屬菌株表現之多肽，來自除該李斯特菌屬菌株以外之來源的多肽，來源於相同物種內不同生物體之多肽。 [0036] 相比之下，「內源性」分子或序列或「原生」分子或序列為通常在特定環境條件下在特定發育階段以該形式存在於特定細胞中的分子或序列。 [0037] 術語「變異體」係指與大部分群體不同但仍充分類似於被視為其中之一的常見模式的胺基酸或核酸序列(或生物體或組織)(例如剪接變異體)。 [0038] 術語「同功異型物」係指分子(例如蛋白質)之與(例如相同蛋白質之)另一同功異型物或型式相比僅具有微小差異的型式。舉例而言，蛋白質同功異型物可由不同但相關之基因產生，其可藉由替代性剪接由相同基因產生，或其可由單核苷酸多態性產生。 [0039] 當參考蛋白質時，術語「片段」意謂比全長蛋白質短或具有較少胺基酸之蛋白質。當參考核酸時，術語「片段」意謂比全長核酸短或具有較少核苷酸之核酸。片段可為例如N端片段(亦即，去除蛋白質C端之一部分)、C端片段(亦即，去除蛋白質N端之一部分)或內部片段。片段亦可為例如功能性片段或免疫原性片段。 [0040] 當參考蛋白質時，術語「類似物」意謂與天然存在之蛋白質的不同之處在於保守胺基酸差異、不影響胺基酸序列之修飾或兩者的蛋白質。 [0041] 術語「功能性」係指蛋白質或核酸(或其片段、同功異型物或變異體)展現生物活性或功能之先天性能力。此類生物活性或功能可包括例如當向個體投與時引起免疫反應之能力。此類生物活性或功能亦可包括例如與相互作用搭配物結合。在功能性片段、同功異型物或變異體的情況下，此等生物功能可實際上變化(例如，關於其特異性或選擇性)，但保持基本生物功能。 [0042] 術語「免疫原性(immunogenicity)」或「免疫原性的」係指分子(例如蛋白質、核酸、抗原或生物體)當向個體投與時在該個體中引起免疫反應的先天性能力。免疫原性可例如藉由以下來加以度量：抗體相對於分子之數目更大，抗體相對於分子之多樣性更大，對分子具有特異性之T細胞的數目更大，對分子之細胞毒性或輔助T細胞反應更大及其類似度量方式。 [0043] 術語「抗原」在本文中用以指當與個體或生物體接觸放置時(例如，當存在於個體或生物體中時或當由個體或生物體偵測到時)，引起個體或生物體之可偵測免疫反應的物質。抗原可為例如脂質、蛋白質、碳水化合物、核酸或其組合及變化形式。舉例而言，「抗原肽」係指當存在於個體或生物體中或由個體或生物體偵測到時，在該個體或生物體中引起建立免疫反應之肽。舉例而言，此類「抗原肽」可涵蓋以下蛋白質，其被負載至宿主細胞之表面上的MHC I類及/或II類分子上且在該等分子上呈現，且可由該宿主之免疫細胞識別或偵測，藉此引起建立針對該蛋白質之免疫反應。此類免疫反應亦可擴延至宿主內其他細胞，諸如表現相同蛋白質之生病細胞(例如腫瘤或癌症細胞)。 [0044] 術語「抗原決定基」係指抗原上由免疫系統識別(例如，與抗體結合)之位點。抗原決定基可由藉由一或多個蛋白質之三級摺疊併接的相鄰胺基酸或非相鄰胺基酸形成。由相鄰胺基酸形成之抗原決定基(亦稱為線性抗原決定基)通常在暴露於變性溶劑時保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基(亦稱為構形抗原決定基)通常在用變性溶劑處理時損失。抗原決定基在獨特空間構形中通常包括至少3個，且更通常至少5個或8-10個胺基酸。測定抗原決定基之空間構形的方法包括例如x射線晶體學及2維核磁共振。參見例如，Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, 第 66卷, Glenn E. Morris編, (1996)，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0045] 術語「突變」係指基因或蛋白質結構之任何變化。舉例而言，突變可由染色體或蛋白質之缺失、插入、取代或重排產生。「插入」藉由添加一或多個額外核苷酸或胺基酸而改變基因中之核苷酸數目或蛋白質中之胺基酸數目。「缺失」藉由減少一或多個額外核苷酸或胺基酸而改變基因中之核苷酸數目或蛋白質中之胺基酸數目。 [0046] DNA中之「讀框轉移」突變在核苷酸之添加或失去改變基因之讀框時發生。讀框由各自編碼一個胺基酸的3鹼基之群組組成。讀框轉移突變使此等鹼基之分組移位，且改變胺基酸之編碼。所得蛋白質通常為非功能性的。插入及缺失可各自為讀框轉移突變。 [0047] 「錯義」突變或取代係指蛋白質之一個胺基酸的變化或單核苷酸中引起所編碼胺基酸變化之點突變。單核苷酸中引起一個胺基酸變化之點突變為DNA序列中之「非同義」取代。非同義取代亦可引起「無義」突變，其中密碼子改變為引起所得蛋白質截短之提前停止密碼子。相比之下，DNA中之「同義」突變為不改變蛋白質之胺基酸序列(由於密碼簡併)的突變。 [0048] 術語「體細胞突變」包括由除生殖細胞(例如精子或卵子)以外之細胞獲得的遺傳改變。此類突變可在細胞分裂過程中被傳遞給經突變細胞之子代，但不為可遺傳的。相比之下，生殖突變在生殖細胞系中發生，且可傳遞給後代之下一代。 [0049] 術語「活體外」係指人工環境及在人工環境(例如試管)內發生之過程或反應。 [0050] 術語「活體內」係指天然環境(例如細胞或生物體或身體)及在天然環境內發生之過程或反應。 [0051] 「包含」或「包括」一或多個所敍述要素之組成物或方法可包括未具體敍述之其他要素。舉例而言，「包含」或「包括」蛋白質之組成物可含有單獨或與其他成分組合之該蛋白質。 [0052] 指定值範圍包括該範圍內或界定該範圍之所有整數，以及由該範圍內之整數界定的子範圍。 [0053] 除非另外自上下文顯而易見，否則術語「約」涵蓋所陳述之值之標準量測誤差裕度(例如SEM)內的值或相對於指定值± 0.5%、1%、5%或10%之變化。 [0054] 除非上下文另外明確規定，否則單數形式之冠詞「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個參考物。舉例而言，術語「一種抗原」或「至少一種抗原」可包括複數種抗原，包括其混合物。 [0055] 統計學上顯著意謂p ≤0.05。 I. 概述 [0056] 本文提供包含HPV16抗原肽及HPV18抗原肽之重組融合多肽，其中該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽可操作地以串聯方式連接(例如，與含PEST之肽融合)。視情況，HPV16抗原肽為HPV16 E6抗原肽或HPV16 E7抗原肽，且HPV18抗原肽為HPV18 E6抗原肽或HPV18 E7抗原肽。視情況，HPV16抗原肽為HPV16 E7抗原肽，且HPV18抗原肽為HPV18 E7抗原肽。本文亦提供編碼此類融合多肽之核酸；包含此類融合多肽或此類核酸之重組細菌或李斯特菌屬菌株；包含此類重組細菌或李斯特菌屬菌株之細胞庫；包含此類融合多肽、此類核酸或此類重組細菌或李斯特菌屬菌株之免疫原性組成物、醫藥組成物及疫苗；以及產生此類融合多肽、此類核酸及此類重組細菌或李斯特菌屬菌株之方法。亦提供在個體中誘導抗腫瘤相關抗原免疫反應之方法、在個體中誘導抗腫瘤或抗癌免疫反應之方法、在個體中治療腫瘤或癌症之方法、在個體中預防腫瘤或癌症之方法以及保護個體免於腫瘤或癌症之方法，該等方法使用此類重組融合多肽、核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗來進行。 [0057] 大部分HPV相關癌症可歸因於16型及18型HPV。然而，HPV相關癌症通常對16型HPV及18型HPV兩者不呈陽性。因為罕有HPV16陽性且HPV18二者皆陽性之患者，所以缺少產生同時靶向HPV16特異性及HPV18特異性抗原兩者之免疫治療的動機。此對於基於李斯特菌之免疫治療平台而言尤其正確，該等平台對編碼可插入抗原肽之核酸序列之數目及大小的容量可能受限。然而，提供於本文實施例中之證據展示，經生物工程改造以分泌來自一種HPV類型之抗原肽的基於李斯特菌之免疫治療(例如Lm
技術)可出乎意料地在患有與不同類型之HPV相關之癌症或腫瘤的患者中增加十二個月總存活率。 [0058]Lm
技術具有以下作用機制：其併有強效先天性免疫刺激，將目標肽直接遞送至樹突狀細胞及抗原呈遞細胞之胞溶質中，產生目標T細胞反應，及藉由腫瘤微環境中之調節性T細胞及骨髓衍生性抑制細胞來減少免疫抑制。可在無中和抗體的情況下給出及/或組合多個治療。Lm
技術可使用例如活體、減毒、經生物工程改造之Lm
細菌以刺激免疫系統將腫瘤細胞視為潛在地經細菌感染之細胞且靶向其以達成清除。技術方法可以活減毒之李斯特菌屬菌株開始，且可添加例如編碼融合蛋白質序列之質體的多個複本，該序列包括接合於所關注抗原的例如李斯特菌溶胞素O (LLO，listeriolysin O)分子之片段。此融合蛋白質由抗原呈遞細胞內部之李斯特菌
分泌。此引起先天性及適應性免疫系統分支之刺激，其降低腫瘤防衛機制且使免疫系統更容易攻擊及破壞癌細胞。 II. 重組融合多肽 [0059] 本文揭示重組融合多肽，其包含與HPV16抗原肽及HPV18抗原肽融合的含PEST之肽，其中該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽可操作地以串聯方式連接。 [0060] 本文亦揭示包含HPV16抗原肽及HPV18抗原肽之重組融合多肽，其中該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽可操作地以串聯方式連接，且其中該融合多肽不包含有含PEST之肽。 [0061] 本文亦提供重組融合多肽，其自N端至C端包含細菌分泌序列，泛素(Ub)蛋白質及兩個或超過兩個抗原肽(亦即，以串聯方式，諸如Ub-肽1-肽2)，其中HPV16抗原肽及HPV18抗原肽，其中該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽可操作地以串聯方式連接。替代地，可使用單獨融合多肽之組合，其中各抗原肽與其自身分泌序列及Ub蛋白融合(例如，Ub1-肽1；Ub2-肽2)。 [0062] 亦揭示編碼此類重組融合多肽之核酸(被稱為袖珍基因構築體)。此類袖珍基因核酸構築體可進一步包含兩個或超過兩個開讀框，該等開讀框藉由各開讀框之間的夏因-達爾加諾核糖體結合位點(Shine-Dalgarno ribosome binding site)核酸序列連接。舉例而言，袖珍基因核酸構築體可進一步包含兩個至四個開讀框，該等開讀框藉由各開讀框之間的夏因-達爾加諾核糖體結合位點核酸序列連接。各開讀框可編碼不同多肽。在一些核酸構築體中，編碼融合多肽之羧基端的密碼子後接兩個停止密碼子以確保蛋白質合成終止。 [0063] 細菌信號序列可為李斯特菌信號序列，諸如Hly或ActA信號序列，或任何其他已知信號序列。在其他情況下，信號序列可為LLO信號序列。信號序列可為細菌的，可為宿主細菌原生的(例如，單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes
)，secA1信號肽)，或可為宿主細菌外源的。信號肽之具體實例包括來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis
)之Usp45信號肽；來自炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis
)之保護性抗原信號肽；來自單核球增多性李斯特菌之secA2信號肽，諸如p60信號肽；及Tat信號肽，諸如枯草桿菌(B. subtilis
) Tat信號肽(例如PhoD)。在具體實例中，分泌信號序列來自李斯特菌蛋白質，諸如ActA300
分泌信號或ActA100
分泌信號。 [0064] 泛素可為例如全長蛋白質。自本文所提供之核酸構築體表現的泛素可在進入宿主細胞細胞溶質之胞溶質時經由水解酶作用，在羧基端處由來自核酸構築體表現之重組融合多肽的其餘部分裂解。此釋放融合多肽之胺基端，從而在宿主細胞胞溶質中產生肽。 [0065] 在本文中其他地方詳細論述融合多肽內抗原肽之選擇、變化及排列，且在本文中其他地方更詳細論述HPV16及HPV18抗原肽。 [0066] 重組融合多肽可包含一或多個標籤。舉例而言，重組融合多肽可包含處於HPV16抗原肽及HPV18抗原肽可操作地以串聯方式連接之組合的N端及/或C端的一或多個肽標籤。標籤可與抗原肽直接融合，或經由連接子(其實例揭示於本文其他地方)連接於抗原肽。標籤之實例包括以下：FLAG標籤、3×FLAG標籤；His標籤、6×His標籤；以及SIINFEKL標籤。例示性SIINFEKL標籤闡述於SEQ ID NO：16中(由SEQ ID NO：1-15中所闡述之核酸中的任一者編碼)。例示性3×FLAG標籤闡述於SEQ ID NO：32中(由SEQ ID NO：17-31中所闡述之核酸中的任一者編碼)。其他標籤包括甲殼質結合蛋白(chitin binding protein；CBP)、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein；MBP)、谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase；GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin；TRX)及聚(NANP)。特定重組融合多肽包含C端SIINFEKL標籤。此類標籤可允許容易偵測重組融合蛋白質，確認重組融合蛋白質之分泌，或允許藉由跟蹤針對此等「標籤」序列肽之免疫反應來跟蹤所分泌融合多肽之免疫原性。此類免疫反應可使用許多試劑來監測，包括例如對此等標籤具有特異性之單株抗體及DNA或RNA探針。 [0067] 本文所揭示之重組融合多肽可由重組李斯特菌屬菌株表現，或可經表現且與用於蛋白質表現及分離之其他載體及細胞系統分離。包含表現此類抗原肽之重組李斯特菌屬菌株可用於例如包含此類重組李斯特菌之免疫原性組成物中及包含重組李斯特菌屬菌株及佐劑之疫苗中。在李斯特菌屬菌株中之宿主細胞系統及除李斯特菌以外之宿主細胞系統中，用截短形式之非溶血性LLO、ActA或PEST樣序列將一或多個抗原肽表現為融合多肽可引起抗原肽之免疫原性增強。 [0068] 亦揭示編碼此類重組融合多肽之核酸。核酸可呈任何形式。核酸可包含DNA或RNA或由DNA或RNA組成，且可為單股或雙股的。核酸可呈質體，諸如附加型質體、多複本附加型質體或整合型質體形式。替代地，核酸可呈病毒載體、噬菌體載體形式，或處於細菌人工染色體中。此類核酸可具有一個開讀框或可具有兩個或超過兩個開讀框(例如，編碼重組融合多肽之開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框)。在一個實例中，此類核酸可包含兩個或超過兩個開讀框，該等開讀框藉由各開讀框之間的夏因-達爾加諾核糖體結合位點核酸序列連接。舉例而言，核酸可包含兩個至四個開讀框，該等開讀框藉由各開讀框之間的夏因-達爾加諾核糖體結合位點核酸序列連接。各開讀框可編碼不同多肽。在一些核酸中，編碼融合多肽之羧基端的密碼子後接兩個停止密碼子以確保蛋白質合成終止。 A. 抗原肽 [0069] 本文所用之抗原肽可包括任何HPV16特異性肽及任何HPV18特異性肽之組合。此類肽可為HPV16特異性及HPV18特異性全長蛋白質或其片段。例示性HPV16特異性及HPV18特異性蛋白質包括來自HPV16及HPV18之E6及E7蛋白質。E6及E7蛋白質為藉由刺激許多宿主細胞關鍵性調節蛋白質之破壞而起作用的腫瘤蛋白。HPV16及HPV18 E6及E7蛋白質之實例包括HPV16 E7 (GenBank寄存編號AHK23257及AAD33253；98個胺基酸之蛋白質)、HPV16 E6 (GenBank寄存編號AHK23256及AAD33252；158個胺基酸之蛋白質)、HPV18 E7 (GenBank寄存編號AGM34461及P06788；105個胺基酸之蛋白質)及HPV18 E6 (GenBank寄存編號P06463；158個胺基酸之蛋白質)。例示性HPV16 E7蛋白質闡述於SEQ ID NO：96中(由SEQ ID NO：95中所闡述之DNA序列編碼)，且例示性HPV18 E7蛋白質闡述於SEQ ID NO：98中(由SEQ ID NO：97中所闡述之DNA序列編碼)。適合之HPV16 E7肽可為例如與SEQ ID NO：96中所闡述之序列或其片段至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的蛋白質。適合之HPV18 E7肽可為例如與SEQ ID NO：98中所闡述之序列或其片段至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的蛋白質。 [0070] 融合多肽可包括至少兩個抗原肽。舉例而言，融合多肽可包括2、3、4、5、6、7、8、9或10個抗原肽。各抗原肽可具有足以誘導免疫反應之任何長度，且各抗原肽可為相同長度或該等抗原肽可具有不同長度。舉例而言，本文所揭示之抗原肽的長度可為約10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160或95至160個胺基酸。 [0071] 各抗原肽亦可為親水性的，或可評分達到或低於某一親水性閾值，其可預測在單核球增多性李斯特菌或另一種所關注細菌中之可分泌性。舉例而言，可藉由Kyte及Doolittle親水性指數21胺基酸窗口來對抗原肽進行評分，且可排除高於截止值(大約1.6)之所有評分，因為其不大可能由單核球增多性李斯特菌分泌。同樣，抗原肽或融合多肽之組合可為親水性的，或可評分達到或低於某一親水性閾值，其可預測在單核球增多性李斯特菌或另一種所關注細菌中之可分泌性。 [0072] 抗原肽可以任何方式連接在一起。舉例而言，抗原肽可彼此直接融合而無介入序列。替代地，抗原肽可經由一或多個連接子，諸如肽連接子彼此間接連接。在一些情況下，數對相鄰抗原肽可彼此直接融合，且其他對之抗原肽可經由一或多個連接子彼此間接連接。相同連接子可用於各對相鄰抗原肽之間，或任何數目之不同連接子可用於不同對之相鄰抗原肽之間。另外，一個連接子可用於一對相鄰抗原肽之間，或多個連接子可用於一對相鄰抗原肽之間。 [0073] 任何適合之序列可用於肽連接子。作為一個實例，連接子序列之長度可為例如1至約50個胺基酸。一些連接子可為親水性的。連接子可供不同目的使用。舉例而言，連接子可用以增加細菌分泌，促進抗原加工，提高融合多肽可撓性，提高融合多肽剛性或供任何其他目的使用。在一些情況下，不同胺基酸連接子序列分佈在抗原肽之間，或編碼相同胺基酸連接子序列之不同核酸分佈在抗原肽(例如，SEQ ID NO：84-94)之間，以便使重複減到最少。此亦可用以減少二級結構，藉此允許在Lm
重組載體菌株群體內對編碼融合多肽之核酸(例如質體)的高效轉錄、轉譯、分泌、維持或穩定化其他適合之肽連接子序列可例如基於以下因素中之一或多者來加以選擇：(1)其能夠採用可撓性延伸構形；(2)其不能採用可與抗原肽上之功能性抗原決定基相互作用的二級結構；及(3)缺少可能與功能性抗原決定基反應之疏水性或帶電殘基。舉例而言，肽連接子序列可含有Gly、Asn及Ser殘基。其他接近中性之胺基酸，諸如Thr及Ala亦可用於連接子序列中。可有用地用作連接子之胺基酸序列包括以下中所揭示之彼等胺基酸序列：Maratea等人(1985)Gene
40：39-46；Murphy等人(1986)Proc Natl Acad Sci USA
83：8258-8262；US 4,935,233；及US 4,751,180，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。連接子之具體實例包括下表中之彼等連接子(其中之每一者均可單獨用作連接子，用於包含序列重複之連接子中，或用於進一步包含表中之一或多種其他序列的連接子中)，儘管亦可預見其他連接子(參見例如，Reddy Chichili等人(2013)Protein Science
22：153-167，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。除非指定，否則「n」表示所列連接子中未確定之重複數。B. 含PEST之肽 [0074] 本文所揭示之重組融合蛋白質包含有含PEST之肽。含PEST之肽可處於融合多肽之胺基端(N端) (亦即處於抗原肽之N端)，可處於融合多肽之羧基端(C端) (亦即處於抗原肽之C端)，或可嵌入在抗原肽內。在一些重組李斯特菌屬菌株及方法中，含PEST之肽不為融合多肽之一部分且與融合多肽分開。抗原肽與PEST樣序列(諸如LLO肽)之融合物可增強該抗原肽之免疫原性，且可增加細胞介導及抗腫瘤免疫反應(亦即，增加細胞介導及抗腫瘤免疫性)。參見例如，Singh等人(2005)J Immunol
175(6)：3663-3673，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0075] 含PEST之肽為包含PEST序列或PEST樣序列之肽。真核蛋白質中之PEST序列早已得到鑑別。舉例而言，一般但未必總由含有若干帶正電胺基酸之群集側接的含有富含脯胺酸(P)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)之胺基酸序列(PEST)的蛋白質具有快速細胞內半衰期(Rogers等人(1986)Science
234：364-369，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。另外，已報導此等序列將蛋白質靶向至用於降解之泛素-蛋白酶體路徑(Rechsteiner及Rogers (1996)Trends Biochem. Sci
. 21：267-271，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。此路徑亦由真核細胞使用以產生結合於MHC I類之免疫原性肽，且已假設PEST序列在產生免疫原性肽之真核蛋白質當中豐富(Realini等人(1994)FEBS Lett.
348：109-113，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。原核蛋白質通常不含有PEST序列，此係因為其不具有此酶路徑。然而，富含胺基酸脯胺酸(P)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)之PEST樣序列已在LLO之胺基端處報導，且已據報導對單核球增多性李斯特菌病原性為必需的(Decatur及Portnoy (2000)Science
290：992-995，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。此PEST樣序列在LLO中之存在藉由宿主細胞之蛋白分解機制來靶向用於破壞之蛋白質，以使得一旦LLO已發揮其功能且促進單核球增多性李斯特菌自吞噬體或吞噬溶菌體液泡逃脫，該LLO在其可能損傷細胞之前受破壞。 [0076] PEST及PEST樣序列之鑑別為此項技術中熟知的，且描述於例如Rogers等人(1986)Science
234(4774)：364-378中，及Rechsteiner及Rogers (1996)Trends Biochem. Sci
. 21：267-271中，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。PEST或PEST樣序列可使用PEST尋找程序來加以鑑別。舉例而言，PEST樣序列可為富含脯胺酸(P)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)殘基之區。視情況，PEST樣序列可由一或多個含有若干帶正電胺基酸之簇側接。舉例而言，PEST樣序列可定義為具有較高脯胺酸(P)、天冬胺酸酯(D)、麩胺酸酯(E)、絲胺酸(S)及/或蘇胺酸(T)殘基局部濃度的長度為至少12個胺基酸之親水性延伸部。在一些情況下，PEST樣序列不含有帶正電胺基酸，即精胺酸(R)、組胺酸(H)及離胺酸(K)。一些PEST樣序列可含有一或多個內部磷酸化位點，且在此等位點處之磷酸化先於蛋白質降解進行。 [0077] 在一個實例中，PEST樣序列擬合Rogers等人中所揭示之演算法。在另一實例中，PEST樣序列擬合Rechsteiner及Rogers中所揭示之演算法。PEST樣序列亦可藉由在指定蛋白質序列內初始掃描帶正電之胺基酸R、H及K來加以鑑別。對帶正電之側接序列之間的全部胺基酸計數，且進一步僅考慮含有多個等於或高於窗口大小參數之胺基酸的彼等基元。視情況，PEST樣序列必須含有至少一個P、至少一個D或E及至少一個S或T。 [0078] PEST基元之品質藉助於基於關鍵胺基酸之局部增濃以及基元疏水性的評分參數優化。D、E、P、S及T之增濃以質量百分比(w/w)為單位表示，且針對1當量D或E、1當量P及1當量S或T校正。疏水性之計算亦可原則上遵循Kyte及Doolittle (1982)J. Mol. Biol.
157：105之方法，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。為了簡化計算，將最初介於精胺酸-4.5至異白胺酸+4.5之Kyte-Doolittle親水性指數使用以下線性轉化而轉換成正整數，此得到精胺酸0至異白胺酸90之值：親水性指數 = 10 × Kyte-Doolittle親水性指數 + 45。 [0079] 潛在PEST基元之疏水性亦可經計算為各胺基酸種類之莫耳百分比與疏水性指數的乘積之總和。所要PEST分數以局部增濃項與疏水性項的如由以下方程式表示之組合之形式獲得：PEST分數 = 0.55 × DEPST - 0.5 × 疏水性指數。 [0080] 因此，含PEST之肽可指使用上文演算法之評分為至少+5的肽。替代地，其可指分數為至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少32、至少35、至少38、至少40或至少45之肽。 [0081] 此項技術中已知的任何其他可獲得之方法或演算法亦可用於鑑別PEST樣序列。參見例如，CaSPredictor (Garay-Malpartida等人(2005)Bioinformatics
21增刊1：i169-76，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。可使用之另一種方法為以下：藉由將值1指定給胺基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln計算適當長度之各延伸部(例如30-35個胺基酸之延伸部)之PEST指數。PEST殘基中之每一者的係數值(CV)為1，且其他AA (非PEST)中之每一者的CV為0。 [0082] PEST樣胺基酸序列之實例為SEQ ID NO：43-51中所闡述之彼等。PEST樣序列之一個實例為KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (SEQ ID NO：43)。PEST樣序列之另一實例為KENSISSMAPPASPPASPK (SEQ ID NO：44)。然而，可使用任何PEST或PEST樣胺基酸序列。PEST序列肽為已知的且描述於例如US 7,635,479；US 7,665,238；及US 2014/0186387中，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0083] PEST樣序列可來自李斯特菌物種，諸如來自單核球增多性李斯特菌。舉例而言，單核球增多性李斯特菌ActA蛋白含有至少四個此類序列(SEQ ID NO：45-48)，其中任一者均適合用於本文所揭示之組成物及方法中。其他類似PEST樣序列包括SEQ ID NO：52-54。來自鏈球菌屬(Streptococcus
sp.)之鏈球菌溶血素O亦含有PEST序列。舉例而言，化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes
)鏈球菌溶血素O在胺基酸35-51處包含PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK (SEQ ID NO：49)，且馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis
)鏈球菌溶血素O在胺基酸38-54處包含PEST樣序列KQNTANTETTTTNEQPK (SEQ ID NO：50)。PEST樣序列之另一實例來自由lso
基因編碼之斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri
)細胞溶素：RSEVTISPAETPESPPATP (例如SEQ ID NO：51)。 [0084] 替代地，PEST樣序列可來源於其他原核生物體。其中將預期PEST樣胺基酸序列之其他原核生物體包括例如其他李斯特菌物種。 (1) 李斯特菌溶胞素O (LLO) [0085] 可用於本文所揭示之組成物及方法中的含PEST之肽的一個實例為李斯特菌溶胞素O (LLO)肽。LLO蛋白之一個實例為指定GenBank寄存編號P13128 (SEQ ID NO：55；核酸序列闡述於GenBank寄存編號X15127)中之蛋白質。SEQ ID NO：55為包括信號序列之前蛋白。前蛋白之前25個胺基酸為信號序列且當由細菌分泌時自LLO裂解，藉此產生不具有信號序列的504個胺基酸之全長活性LLO蛋白。本文所揭示之LLO肽可包含信號序列或可包含不包括信號序列之肽。可使用之例示性LLO蛋白包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO：55中所闡述之序列，或SEQ ID NO：55之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段及同功異型物片段。可使用編碼LLO蛋白片段或LLO蛋白之同源物、變異體、同功異型物、類似物、同源物片段、變異體片段或類似物片段的任何序列。同源LLO蛋與參考LLO蛋白之序列一致性可例如大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%。 [0086] LLO蛋白之另一實例闡述於SEQ ID NO：56中。可使用之LLO蛋白可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO：56中所闡述之序列，或SEQ ID NO：56之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段及同功異型物片段。 [0087] LLO蛋白之另一實例為來自如以下GenBank寄存編號中所闡述之單核球增多性李斯特菌10403S菌株的LLO蛋白：ZP_01942330或EBA21833，由如以下GenBank寄存編號中所闡述之核酸序列編碼：NZ_AARZ01000015或AARZ01000015.1。LLO蛋白之另一實例為來自以下之LLO蛋白：單核球增多性李斯特菌4b F2365菌株(參見例如
，GenBank寄存編號：YP_012823)、EGD-e菌株(參見例如
，GenBank寄存編號NP_463733)或單核球增多性李斯特菌之任何其他菌株。LLO蛋白之又另一實例為來自黃桿菌目細菌HTCC2170(參見例如，GenBank寄存編號：ZP_01106747或EAR01433，或由GenBank寄存編號：NZ_AAOC01000003編碼)之LLO蛋白。可使用之LLO蛋白可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：上文LLO蛋白或上文LLO蛋白之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段及同功異型物片段中的任一者。 [0088] 亦可使用與LLO同源之蛋白質或其同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段及同功異型物片段。一個此類實例為蜂房桿菌溶素(alveolysin)，其可見於例如蜂房類芽孢桿菌(參見例如，GenBank寄存編號：P23564或AAA22224，或由GenBank寄存編號：M62709編碼)中。其他此類同源蛋白質為已知的。 [0089] LLO肽可為全長LLO蛋白或截短LLO蛋白或LLO片段。同樣，LLO肽可為保留原生LLO蛋白之一或多種功能性或缺乏原生LLO蛋白之一或多種功能性的LLO肽。舉例而言，所保留之LLO功能性可為允許細菌(例如，李斯特菌)自吞噬體或吞噬溶菌體逃脫，或增強與其融合之肽的免疫原性。所保留之功能性亦可為溶血功能或抗原功能。替代地，LLO肽可為非溶血性LLO。LLO之其他功能為已知的，評估LLO功能性之方法及分析法亦為已知的。 [0090] LLO片段可為PEST樣序列或可包含PEST樣序列。LLO片段可包含內部缺失、自C端截短及自N端截短中之一或多者。在一些情況下，LLO片段可包含超過一個內部缺失。其他LLO肽可為具有一或多個突變之全長LLO蛋白。 [0091] 一些LLO蛋白或片段之溶血活性相對於野生型LLO降低，或為非溶血性片段。舉例而言，LLO蛋白可藉由羧基端處活化結構域之缺失或突變、藉由半胱胺酸484之缺失或突變或藉由另一位置處之缺失或突變而被賦予非溶血性。 [0092] 其他LLO蛋白藉由膽固醇結合域(cholesterol binding domain；CBD)之缺失或突變而被賦予非溶血性，如以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的的US 8,771,702中所詳述。突變可包含例如取代或缺失。整個CBD可經突變，CBD之部分可經突變，或CBD內之特定殘基可經突變。舉例而言，LLO蛋白可包含SEQ ID NO：55序列之殘基C484、W491及W492中之一或多者(例如，C484、W491、W492、C484及W491、C484及W492、W491及W492、或所有三個殘基)的突變，或當與SEQ ID NO：55最佳比對時的相對應殘基(例如相對應之半胱胺酸或色胺酸殘基)的突變。作為一個實例，可產生突變型LLO蛋白，其中LLO之殘基C484、W491及W492經丙胺酸殘基取代，其將使溶血活性相對於野生型LLO顯著降低。具有C484A、W491A及W492A突變之突變型LLO蛋白被稱為「mutLLO」。 [0093] 作為另一實例，可產生具有包含膽固醇結合域之內部缺失的突變型LLO蛋白。SEQ ID NO：55之膽固醇結合域之序列闡述於SEQ ID NO：74中。舉例而言，內部缺失可為1-11個胺基酸之缺失、11-50個胺基酸之缺失或更長。同樣，突變區可為1-11個胺基酸、11-50個胺基酸或更長(例如，1-50、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、12-50、11-15、11-20、11-25、11-30、11-35、11-40、11-50、11-60、11-70、11-80、11-90、11-100、11-150、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-50、15-60、15-70、15-80、15-90、15-100、15-150、20-25、20-30、20-35、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-150、30-35、30-40、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100或30-150個胺基酸)。舉例而言，由SEQ ID NO：55之殘基470-500、470-510或480-500組成之突變區 將產生包含CBD之缺失序列(SEQ ID NO：55之殘基483-493)。然而，突變區亦可為CBD之片段，或可與CBD之一部分重疊。舉例而言，突變區可由SEQ ID NO：55之殘基470-490、480-488、485-490、486-488、490-500或486-510組成。舉例而言，CBD之片段(殘基484-492)可經異源序列替代，其將使溶血活性相對於野生型LLO顯著降低。舉例而言，CBD (ECTGLAWEWWR；SEQ ID NO：74)可經來自抗原NY-ESO-1之CTL抗原決定基(ESLLMWITQCR；SEQ ID NO：75)替代，其含有來自NY-ESO-1之HLA-A2限制性抗原決定基157-165。所得LLO被稱為「ctLLO」。 [0094] 在一些經突變LLO蛋白中，突變區可經異源序列替代。舉例而言，突變區可經相等數目之異源胺基酸、較小數目之異源胺基酸或更大數目之胺基酸(例如， 1-50、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、12-50、11-15、11-20、11-25、11-30、11-35、11-40、11-50、11-60、11-70、11-80、11-90、11-100、11-150、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-50、15-60、15-70、15-80、15-90、15-100、15-150、20-25、20-30、20-35、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-150、30-35、30-40、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100或30-150個胺基酸)替代。其他經突變LLO蛋白具有一或多個點突變(例如，1個殘基、2個殘基、3個殘基或超過3個之點突變)。經突變殘基可為相鄰或不相鄰的。 [0095] 在一個實例具體例中，LLO肽可具有信號序列中之缺失及CBD中之突變或取代。 [0096] 一些LLO肽為N端LLO片段(亦即，具有C端缺失之LLO蛋白)。一些LLO肽之長度為至少494、489、492、493、500、505、510、515、520或525個胺基酸或其長度為492-528個胺基酸。舉例而言，LLO片段可由LLO蛋白之前約440或441個胺基酸(例如，SEQ ID NO：55或56之前441個胺基酸，或當與SEQ ID NO：55或56最佳比對時的另一個LLO蛋白之相對應片段)組成。其他N端LLO片段可由LLO蛋白之前420個胺基酸(例如，SEQ ID NO：55或56之前420個胺基酸，或當與SEQ ID NO：55或56最佳比對時的另一個LLO蛋白之相對應片段)組成。其他N端LLO片段可由LLO蛋白之約胺基酸20-442(例如，SEQ ID NO：55或56之胺基酸20-442，或當與SEQ ID NO：55或56最佳比對時的另一個LLO蛋白之相對應片段)組成。其他N端LLO片段包含不具有包含半胱胺酸484之活化結構域，且尤其不具有半胱胺酸484的任何ΔLLO。舉例而言，N端LLO片段可對應於LLO蛋白之前425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、50或25個胺基酸(例如，SEQ ID NO：55或56之前425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、50或25個胺基酸，或當與SEQ ID NO：55或56最佳比對時的另一個LLO蛋白之相對應片段)。較佳地，片段包含一或多個PEST樣序列。LLO片段及截短LLO蛋白可含有對應於上文特定胺基酸範圍中之任一者的同源LLO蛋白殘基。殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應(例如，若同源LLO蛋白相對於本文所揭示之具體LLO蛋白具有插入或缺失)。N端LLO片段之實例包括SEQ ID NO：57、58及59。可使用之LLO蛋白使用包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO：57、58或59中所闡述之序列，或SEQ ID NO：57、58或59之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段及同功異型物片段。在一些組成物及方法中，使用SEQ ID NO：59中所闡述之N端LLO片段。編碼SEQ ID NO：59中所闡述之N端LLO片段的核酸之實例為SEQ ID NO：60。 (2) ActA [0097] 可用於本文所揭示之組成物及方法中的含PEST之肽的另一實例為ActA肽。ActA為表面相關蛋白質，且在經感染之宿主細胞中充當架構以促進宿主肌動蛋白聚合物之聚合、組裝及活化，以便推動單核球增多性李斯特菌穿過細胞質。在進入哺乳動物細胞胞溶質之後不久，單核球增多性李斯特菌誘導宿主肌動蛋白絲之聚合，且使用由肌動蛋白聚合產生之力來首先在細胞內移動，且隨後在細胞間移動。ActA負責介導肌動蛋白成核及基於肌動蛋白之活動性。ActA蛋白為宿主細胞骨架組件提供多個結合位點，藉此充當架構以組裝細胞肌動蛋白聚合機制。ActA之N端結合於單體肌動蛋白且藉由刺激固有肌動蛋白成核活性來充當構成性活性成核促進因子。actA
及hly
基因兩者均為由轉錄激活子PrfA調節之10 kb基因群集的成員，且actA
在哺乳動物胞溶質中上調大致226倍。可使用編碼ActA蛋白或ActA蛋白之同源物、變異體、同功異型物、類似物、同源物片段、變異體片段或類似物片段的任何序列。同源ActA蛋白與參考ActA蛋白之序列一致性可例如大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%。 [0098] ActA蛋白之一個實例包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO：61中所闡述之序列。ActA蛋白之另一實例包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO：62中所闡述之序列。對應於此等序列中之任一者的前蛋白之前29個胺基酸為信號序列且當由細菌分泌時自ActA蛋白裂解。ActA肽可包含信號序列(例如，SEQ ID NO：61或62之胺基酸1-29)，或可包含不包括信號序列之肽。ActA蛋白之其他實例包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO：61或62之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、同功異型物片段或類似物片段。 [0099] ActA蛋白之另一實例為來自以下之ActA蛋白：單核球增多性李斯特菌10403S菌株(GenBank寄存編號：DQ054585)、NICPBP 54002菌株(GenBank寄存編號：EU394959)、S3菌株(GenBank寄存編號：EU394960)、NCTC 5348菌株(GenBank寄存編號：EU394961)、NICPBP 54006菌株(GenBank寄存編號：EU394962)、M7菌株(GenBank寄存編號：EU394963)、S19菌株(GenBank寄存編號：EU394964)或任何其他單核球增多性李斯特菌菌株。可使用之LLO蛋白可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：上文LLO蛋白或上文LLO蛋白之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段及同功異型物片段中的任一者。 [0100] ActA肽可為全長ActA蛋白或截短ActA蛋白或ActA片段(例如，其中C端部分被去除之N端ActA片段)。較佳地，截短ActA蛋白包含至少一個PEST序列(例如，超過一個PEST序列)。另外，截短ActA蛋白可視情況包含ActA信號肽。截短ActA蛋白中所含有的PEST樣序列之實例包括SEQ ID NO：45-48。一些此類截短ActA蛋白包含SEQ ID NO：45-48中所闡述之PEST樣序列中的至少兩者或其同系物、SEQ ID NO：45-48中所闡述之PEST樣序列中的至少三者或其同系物、或SEQ ID NO：45-48中所闡述之PEST樣序列的所有四者或其同系物。截短ActA蛋白之實例包括包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之彼等：全長ActA蛋白序列(例如SEQ ID NO：62)之約殘基30-122、約殘基30-229、約殘基30-332、約殘基30-200或約殘基30-399。截短ActA蛋白之其他實例包括包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之彼等：全長ActA蛋白序列(例如SEQ ID NO：62)之前約50、100、150、200、233、250、300、390、400或418個殘基。截短ActA蛋白之其他實例包括包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之彼等：全長ActA蛋白序列(例如SEQ ID NO：62)之約殘基200-300或殘基300-400。舉例而言，截短ActA由如US 7,655,238中所描述的野生型ActA蛋白之前390個胺基酸組成，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。作為另一實例，截短ActA可為ActA-N100或其經修飾型式(稱為ActA-N100*)，其中PEST基元已缺失且含有非保守性QDNKR (SEQ ID NO：73)取代，如US 2014/0186387中所描述，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。替代地，截短ActA蛋白可含有對應於上文胺基酸範圍中之一者或本文所揭示之ActA肽中任一者之胺基酸範圍的同源ActA蛋白之殘基。殘基數目無需與本文列舉之殘基數目精確對應(例如，若同源ActA蛋白相對於本文所用之ActA蛋白具有插入或缺失，則殘基數目可據此調節)。 [0101] 截短ActA蛋白之實例包括例如包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之蛋白質：SEQ ID NO：63、64、65或66中所闡述之序列或SEQ ID NO：63、64、65或66之同源物、變異體、同功異型物、類似物、變異體片段、同功異型物片段或類似物片段。SEQ ID NO：63被稱為ActA/PEST1且由SEQ ID NO：62中所闡述之全長ActA序列的胺基酸30-122組成。SEQ ID NO：64被稱為ActA/PEST2或LA229且由SEQ ID NO：62中所闡述之全長ActA序列中所闡述之全長ActA序列的胺基酸30-229組成。SEQ ID NO：65被稱為ActA/PEST3且由SEQ ID NO：62中所闡述之全長ActA序列的胺基酸30-332組成。SEQ ID NO：66被稱為ActA/PEST4且由SEQ ID NO：62中所闡述之全長ActA序列的胺基酸30-399組成。作為一個具體實例，可使用由SEQ ID NO：64中所闡述之序列組成的截短ActA蛋白。 [0102] 截短ActA蛋白之實例包括例如包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之蛋白質：SEQ ID NO：67、69、70或72中所闡述之序列 或SEQ ID NO：67、69、70或72之同源物、變異體、同功異型物、類似物、變異體片段、同功異型物片段或類似物片段。作為一個具體實例，可使用由SEQ ID NO：67中所闡述之序列(由SEQ ID NO：68中所闡述之核酸編碼)組成的截短ActA蛋白。作為另一具體實例，可使用由SEQ ID NO：70中所闡述之序列(由SEQ ID NO：71中所闡述之核酸編碼)組成的截短ActA蛋白。SEQ ID NO：71為編碼單核球增多性李斯特菌
10403S菌株中之ActA的前1170個核苷酸。在一些情況下，ActA片段可與異源信號肽融合。舉例而言，SEQ ID NO：72闡述與Hly信號肽融合之ActA片段。 C. 產生編碼重組融合多肽之免疫治療構築體 [0103] 本文亦提供用於產生編碼本文所揭示之重組融合多肽之免疫治療構築體的方法或包含本文所揭示之重組融合多肽的組成物。舉例而言，此類方法可包含選擇及設計抗原肽以包括在免疫治療構築體中(及例如，測試各抗原肽之親水性，且在其分數高於所選親水性指數閾值的情況下修飾或不選擇抗原肽)，設計一或多種包含所選抗原肽中之每一者的融合多肽，及產生編碼該融合多肽之核酸構築體。 [0104] 抗原肽可針對疏水性或親水性加以篩選。可選擇抗原肽是否為親水性的或其分數是否達到或低於某一親水性閾值，其可預測所關注之特定細菌(例如單核球增多性李斯特菌)中的可分泌性。舉例而言，可藉由具有21胺基酸窗口之Kyte及Doolittle親水性指數來對抗原肽進行評分，且可排除高於截止值(大約1.6)之所有評分，因為其不大可能由單核球增多性李斯特菌分泌。參見例如
，Kyte-Doolittle (1982)J Mol Biol
157(1)：105--132；該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。替代地，可改變關於所選截止值評分之抗原肽(例如，改變抗原肽之長度)。可使用之其他滑動窗大小包括例如9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或超過27個胺基酸。舉例而言，滑動窗大小可為9-11個胺基酸、11-13個胺基酸、13-15個胺基酸、15-17個胺基酸、17-19個胺基酸、19-21個胺基酸、21-23個胺基酸、23-25個胺基酸或25-27個胺基酸。可使用之其他截止值包括例如以下範圍1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2.0、2.0-2.2 2.2-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0或4.0-4.5，或該截止值可為1.4、1.5、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.3、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5。截止值可例如取決於正用以遞送融合多肽之細菌的屬或物種而變化。 [0105] 其他適合之親水性曲線或其他適當量表包括例如以下中所報導之彼等：Rose等人(1993)Annu Rev Biomol Struct
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25：5425-5431；以及Cowan及Whittaker (1990)Peptide Research
3：75-80，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0106] 視情況，可對抗原肽與標的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen；HLA)類型之能力進行評分(例如，藉由使用可在www.iedb.org獲得之免疫抗原決定基資料庫(Immune Epitope Database；IED)，其包括netMHCpan、ANN、SMMPMBEC、SMM、CombLib_Sidney2008、PickPocket及netMHCcons)且藉由各抗原肽之最佳MHC結合來進行評級。其他來源包括TEpredict (tepredict.sourceforge.net/help.html)或其他可獲得之MHC結合量測量表。諸如沙門氏菌(Salmonella
)之不同表現載體之截止值可不同。 [0107] 視情況，抗原肽可針對免疫抑制抗原決定基(例如，T-reg抗原決定基、IL-10誘導T輔助抗原決定基等等)加以篩選以不選擇抗原肽或避免免疫抑制影響。 [0108] 視情況，針對抗原決定基免疫原性之預測演算法可用於篩選抗原肽。然而，此等演算法預測哪個肽將產生T細胞反應準確率最多為20%。替代地，不使用篩選/預測演算法。替代地，抗原肽可針對免疫原性加以篩選。舉例而言，此可包含使一或多個T細胞與抗原肽接觸，及分析免疫原性T細胞反應，其中免疫原性T細胞反應將肽鑑別為免疫原性肽。此亦可包含在使一或多個T細胞與肽接觸後，使用免疫原性分析以量測CD25、CD44或CD69中之至少一者的分泌或量測選自包含IFN-γ、TNF-α、IL-1及IL-2之群之細胞因子的分泌，其中分泌增加將肽鑑別為包含一或多個T細胞抗原決定基。 [0109] 所選抗原肽可被排列成一或多個候選次序以用於潛在融合多肽。若存在比可放入單一質體中更可用之抗原肽，則可按需要/所要指定不同抗原肽之優先順序等級及/或將其分成不同融合多肽(例如，用於包括於不同重組李斯特菌屬菌株中)。優先等級可由以下因素決定，諸如相對大小、轉錄優先順序及/或經轉譯多肽之整體疏水性。抗原肽可被排列成使得其在任何數目的抗原肽對之間不用連接子或任何連接子組合而直接接合在一起，如本文其他地方更詳細地揭示。待包括之線性抗原肽的數目可基於以下考慮因素來決定：所需構築體之數目對比突變負荷、來自單一質體之多個抗原決定基的轉譯及分泌效率、及包含質體之各細菌或Lm
所需的MOI。 [0110] 亦對抗原肽之組合或整個融合多肽(亦即，包含抗原肽及含PEST之肽及任何標籤)的疏水性進行評分。舉例而言，可藉由具有21胺基酸滑動窗之Kyte及Doolittle親水性指數對全部融合抗原肽或整個融合多肽的親水性進行評分。若任何區評分高於截止值(例如大約1.6)，則抗原肽可在融合多肽內重排序或改組，直至發現可接受之抗原肽次序(亦即，其中無區評分高於截止值的次序)為止。替代地，可去除任何有問題之抗原肽或將其重新設計為不同大小。替代地或另外，如本文其他地方所揭示的抗原肽之間的一或多個連接子可經添加或經修飾以改變疏水性。如同用於個別抗原肽之親水性測試，可使用其他窗口大小，或可使用其他截止值(例如，取決於正用以遞送融合多肽之細菌的屬或物種而定)。另外，可使用其他適合之親水性曲線或其他適當量表。 [0111] 視情況，抗原肽之組合或整個融合多肽可進一步針對免疫抑制抗原決定基(例如，T-reg抗原決定基、IL-10誘導T輔助抗原決定基等等)加以篩選以不選擇抗原肽或避免免疫抑制影響。 [0112] 編碼候選抗原肽組合或融合多肽之核酸可隨後經設計及最佳化。舉例而言，序列可經最佳化以達成轉譯水平、表現持續時間、分泌水平、轉錄水平以及其任何組合增加。舉例而言，該增加可為相對於對照組非最佳化序列2倍至1000倍、2倍至500倍、2倍至100倍、2倍至50倍、2倍至20倍、2倍至10倍或3倍至5倍 [0113] 舉例而言，融合多肽或編碼該融合多肽之核酸可經最佳化以達成可能形成於寡核苷酸序列中之二級結構水平降低，或替代地經最佳化以防止任何可修飾序列之酶附接。舉例而言，在細菌細胞中之表現可藉由轉錄靜默、低mRNA半衰期、二級結構形成、諸如壓製子及抑制子之寡核苷酸結合分子之附接位點及可利用稀少tRNA池而受阻。細菌表現中許多問題之來源在原始序列內發現。RNA之最佳化可包括順式作用元件之修飾、其GC含量之修改、關於細菌細胞之非限制性tRNA池改變密碼子偏差及避免內部同源區。因此，使序列最佳化可必然伴有例如調節具有極高(＞ 80%)或極低(＜ 30%) GC含量之區。使序列最佳化可必然伴有例如避免以下順式作用之序列基元中的一或多者：內部TATA匣、χ位點及核糖體進入位點；富含AT或富含GC之序列延伸部；重複序列及RNA二級結構；(隱藏的)剪接供體及受體位點；分支點；或其組合。使表現最佳化亦可必然伴有向基因之側接區及/或質體中之其他地方添加序列元件。 [0114] 使序列最佳化亦可必然伴有例如針對宿主基因(例如單核球增多性李斯特菌基因)之密碼子偏差修改密碼子使用。舉例而言，以下密碼子可用於單核球增多性李斯特菌。[0115] 可產生編碼融合多肽之核酸，且將其引入至諸如細菌菌株或李斯特菌屬菌株之遞送媒劑中。其他遞送媒劑可適合於DNA免疫治療或肽免疫治療，諸如痘瘡病毒或病毒樣顆粒。一旦產生編碼融合多肽之質體且將其引入至細菌菌株或李斯特菌屬菌株中，該細菌或李斯特菌屬菌株可經培養及表徵以確認包含抗原肽之融合多肽的表現及分泌。 III. 重組細菌或李斯特菌屬菌株 [0116] 本文亦提供重組細菌菌株，諸如李斯特菌屬菌株，其包含本文所揭示之重組融合多肽或如本文其他地方所揭示的編碼該重組融合多肽之核酸。較佳地，細菌菌株為李斯特菌屬菌株，諸如單核球增多性李斯特菌(Lm
)菌株。Lm
作為疫苗載體具有多種固有優點。細菌在活體外極高效地生長而無特殊要求，且其缺乏LPS，LPS為革蘭氏陰性細菌，諸如沙門氏菌中之主要毒性因子。由於基因減毒Lm載體在嚴重不良作用之情況下可容易地用抗生素清除，且不同於一些病毒載體，不發生遺傳物質向宿主基因組中之整合，故基因減毒Lm載體亦提供額外安全性。 [0117] 重組李斯特菌屬菌株可為任何李斯特菌屬菌株。適合之李斯特菌屬菌株的實例包括斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌(Listeria grayi
)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii
)、默氏李斯特菌(Listeria murrayi
)、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri
)、單核球增多性李斯特菌(Lm
)或此項技術中已知之任何其他李斯特菌物種。較佳地，重組李斯特菌屬菌株為物種單核球增多性李斯特菌之菌株。單核球增多性李斯特菌菌株之實例包括以下：10403S
野生型單核球增多性李斯特菌(參見例如，Bishop及Hinrichs (1987)J Immunol
139：2005-2009；Lauer等人(2002)J Bact
184：4177-4186)；單核球增多性李斯特菌
DP-L4056，其經噬菌體復癒(參見例如，Lauer等人(2002)J Bact
184：4177-4186)；單核球增多性李斯特菌DP-L4027，其經噬菌體復癒且具有hly
基因缺失(參見例如，Lauer等人(2002)J Bact
184：4177- 4186；Jones及Portnoy (1994)Infect Immunity
65：5608-5613)；單核球增多性李斯特菌DP-L4029，其經噬菌體復癒且具有actA
基因缺失(參見例如，Lauer等人(2002)J Bact
184：4177-4186；Skoble等人(2000)J Cell Biol
150：527- 538)；單核球增多性李斯特菌DP-L4042 (ΔPEST) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci. USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌DP-L4097 (LLO-S44A) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌DP-L4364 (ΔlplA
；硫辛酸蛋白質連接酶) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌DP-L4405 (ΔinlA
) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌DP-L4406 (ΔinlB
) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌CS-LOOOl (ΔactA
；ΔinlB
) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌CS-L0002 (ΔactA
；ΔlplA
) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌CS-L0003 (LLO L461T；ΔlplA
) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌DP-L4038 (ΔactA
；LLO L461T) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；單核球增多性李斯特菌DP-L4384 (LLO S44A；LLO L461T) (參見例如，Brockstedt等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA
101：13832-13837及支持資訊)；具有lplA1
缺失之單核球增多性李斯特菌菌株(編碼硫辛酸蛋白質連接酶LplA1) (參見例如，O'Riordan等人(2003)Science
302：462-464)；單核球增多性李斯特菌DP-L4017 (具有LLO L461T之10403S) (參見例如，US 7,691,393)；單核球增多性李斯特菌EGD (參見例如，GenBank寄存編號AL591824)。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株為單核球增多性李斯特菌EGD-e (see GenBank寄存編號NC_003210；ATCC寄存編號BAA-679)；單核球增多性李斯特菌DP-L4029 (actA
缺失，視情況與uvrAB
缺失組合(DP-L4029uvrAB) (參見例如，US 7,691,393)；單核球增多性李斯特菌actA
-/inlB
-雙重突變體(參見例如，ATCC寄存編號PTA-5562)；單核球增多性李斯特菌lplA
突變體或hly
突變體(參見例如，US 2004/0013690)；單核球增多性李斯特菌dal
/dat
雙重突變體(參見例如，US 2005/0048081)。其他單核球增多性李斯特菌菌株包括經修飾(例如，藉由質體及/或藉由基因組整合)以含有編碼以下基因中之一者或任何組合之核酸的彼等菌株：hly
(LLO；李斯特菌溶胞素)；iap
(p60)；inlA
；inlB
；inlC
；dal
(丙胺酸消旋酶)；dat
(D-胺基酸轉胺酶)；plcA
；plcB
；actA
；或介導單壁囊泡之生長、鋪展、斷裂，雙壁囊泡之斷裂，與宿主細胞之結合或由宿主細胞之吸收的任何核酸。上文參考文獻中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0118] 重組細菌或李斯特菌可具有野生型致病性，可具有減弱之致病性或可為無致病性。舉例而言，重組李斯特菌可具有充分毒性以逃脫吞噬體或吞噬溶菌體且進入胞溶質。此類李斯特菌屬菌株亦可為活減毒之李斯特菌屬菌株，其包含至少一個如本文其他地方所揭示之減毒突變、缺失或失活。較佳地，重組李斯特菌為減毒之營養缺陷型菌株。營養缺陷型菌株為不能合成其生長所需之特定有機化合物的菌株。此類菌株之實例描述於US 8,114,414中，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0119] 較佳地，重組李斯特菌屬菌株缺乏抗生素抗性基因。舉例而言，此類重組李斯特菌屬菌株可包含不編碼抗生素抗性基因之質體。然而，本文所提供之一些重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼抗生素抗性基因之核酸的質體。抗生素抗性基因可用於在分子生物學及疫苗製備中常見採用之習知選擇及選殖方法。例示性抗生素抗性基因包括賦予針對以下之抗性的基因產物：安比西林、青黴素、二甲氧苯青黴素、鏈黴素、紅黴素、卡那黴素、四環素、氯黴素(CAT)、新黴素、濕黴素及慶大黴素。 A. 包含重組融合多肽或編碼重組融合多肽之核酸的細菌或李斯特菌屬菌株 [0120] 本文所揭示之重組細菌菌株(例如，李斯特菌屬菌株)包含本文所揭示之重組融合多肽或如本文其他地方所揭示的編碼該重組融合多肽之核酸。 [0121] 在包含編碼重組融合蛋白質之核酸的細菌或李斯特菌屬菌株中，該核酸可經密碼子最佳化。由單核球增多性李斯特菌對於各胺基酸所用的最佳密碼子之實例展示於US 2007/0207170，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。若核酸中之至少一個密碼子經單核球增多性李斯特菌對於該胺基酸比在原始序列中之密碼子更為頻繁使用的密碼子替代，則該核酸係經密碼子最佳化。 [0122] 核酸可存在於細菌或李斯特菌屬菌株內之附加型質體中，及/或核酸可經基因組整合於細菌或李斯特菌屬菌株中。一些重組細菌或李斯特菌屬菌株包含編碼兩個如本文所揭示之重組融合多肽的兩個單獨核酸：一個核酸處於附加型質體中，且一個核酸經基因組整合於細菌或李斯特菌屬菌株中。 [0123] 附加型質體可為在活體外(在細胞培養物中)、在活體內(在宿主中)或在活體外及活體內穩定維持之質體。若在附加型質體中，則編碼重組融合多肽之開讀框可被可操作地連接於質體中之啟動子/調節序列。若經基因組整合於細菌或李斯特菌屬菌株中，則編碼重組融合多肽之開讀框可被可操作地連接於外源性啟動子/調節序列或可操作地連接於內源性啟動子/調節序列。適用於驅動基因之構成表現的啟動子/調節序列之實例為熟知的，且包括例如李斯特菌之hly
、hlyA
、actA
、prfA
，及p60
啟動子，鏈球菌bac
啟動子，灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus
)sgiA
啟動子及蘇雲金芽孢桿菌(B. thuringiensis
)phaZ
啟動子。在一些情況下，所關注之插入基因不中斷或受到常常在整合至基因組DNA中時發生之調節約束，且在一些情況下，插入異源基因之存在不引起細胞自身重要區之重排或中斷。 [0124] 此類重組細菌或李斯特菌屬菌株可藉由用包含編碼重組融合多肽之核酸的質體或載體對本文其他地方所描述的細菌或李斯特菌屬菌株或減毒之細菌或李斯特菌屬菌株進行轉型來製造。質體可為不整合至宿主染色體中之附加型質體。替代地，質體可為整合至細菌或李斯特菌屬菌株之染色體中的整合型質體。本文所用之質體亦可為多複本質體。用於對細菌進行轉型之方法為熟知的，且包括基於氯化鈣勝任細胞之方法、電穿孔方法、噬菌體介導之轉導、化學轉型技術及物理轉型技術。參見例如，de Boer等人(1989)Cell
56：641-649；Miller等人(1995)FASEB J.
9：190-199；Sambrook等人(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York；Ausubel等人(1997) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York；Gerhardt等人編, 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.；以及Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0125] 具有經基因組整合之異源核酸的細菌或李斯特菌屬菌株可例如藉由使用位點特異性整合載體來製造，其中使用同源重組產生包含整合之基因的細菌或李斯特菌。整合載體可為能夠感染細菌或李斯特菌屬菌株之任何位點特異性整合載體。此類整合載體可包含例如PSA attPP'位點、編碼PSA整合酶之基因、U153 attPP'位點、編碼U153整合酶之基因、A118 attPP' 位點、編碼A118整合酶之基因或任何其他已知attPP'位點或任何其他噬菌體整合酶。 [0126] 包含整合之基因的此類細菌或李斯特菌屬菌株亦可使用用於將異源核酸整合至細菌或李斯特菌
染色體中之任何其他已知方法來產生。用於同源重組之技術為熟知的，且描述於例如Baloglu等人(2005)Vet Microbiol
109(1-2)：11-17)；Jiang等人 2005)Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)
37(1)：19-24)及US 6,855,320中，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0127] 整合至細菌或李斯特菌染色體中亦可使用轉座子插入來達成。用於轉座子插入之技術為熟知的，且例如DP-L967之構築由Sun等人(1990)Infection and Immunity
58：3770-3778描述，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。轉座子突變誘發可達成穩定基因組插入，但基因組中已插入異源核酸之位置為未知的。 [0128] 整合至細菌或李斯特菌染色體中亦可使用噬菌體整合位點來達成(參見例如，Lauer等人(2002)J Bacteriol
184(15)：4177-4186，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。)。舉例而言，噬菌體(例如U153或PSA李斯特菌噬菌體)之整合酶基因及附接位點可用於將異源基因插入至相對應附接位點中，該位點可為基因組中之任何適當位點(例如arg
tRNA基因之comK
或3'端)。內源性原噬菌體可在異源核酸整合之前自所利用之附接位點復癒。此類方法可產生例如單複本整合體。為了避免「噬菌體復癒步驟(phage curing step)」，可使用基於噬菌體整合系統之PSA噬菌體(參見例如，Lauer等人(2002)J Bacteriol
184：4177-4186，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。維持整合之基因可能需要例如藉由抗生素連續選擇。替代地，可確立不需要用抗生素選擇的基於噬菌體之染色體整合系統。實際上，可補充營養缺陷型宿主菌株。舉例而言，可使用用於臨床應用的基於噬菌體之染色體整合系統，其中使用對於必需酶(包括例如D-丙胺酸消旋酶)而言為營養缺陷型之宿主菌株(例如，Lm dal
(-)dat
(-))。 [0129] 結合亦可用於將遺傳物質及/或質體引入至細菌中。用於結合之方法為熟知的，且描述於例如Nikodinovic等人(2006)Plasmid
56(3)：223-227及Auchtung等人(2005)Proc Natl Acad Sci USA
102(35)：12554-12559中，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0130] 在一個具體實例中，重組細菌或李斯特菌屬菌株可包含編碼重組融合多肽之核酸，該核酸經基因組整合至細菌或李斯特菌屬基因組中作為具有內源性actA
序列(編碼ActA蛋白)或內源性hly
序列(編碼LLO蛋白)之開讀框。舉例而言，融合多肽之表現及分泌可處於內源性actA
啟動子及ActA信號序列之控制下或可處於內源性hly
啟動子及LLO信號序列之控制下。作為另一實例，編碼重組融合多肽之核酸可替代編碼ActA蛋白之actA
序列或編碼LLO蛋白之hly
序列。 [0131] 重組細菌或李斯特菌屬菌株之選擇可藉由任何手段來達成。舉例而言，可使用抗生素選擇。抗生素抗性基因可用於在分子生物學及疫苗製備中常見採用之習知選擇及選殖方法。例示性抗生素抗性基因包括賦予針對以下之抗性的基因產物：安比西林、青黴素、二甲氧苯青黴素、鏈黴素、紅黴素、卡那黴素、四環素、氯黴素(CAT)、新黴素、濕黴素及慶大黴素。替代地，可使用營養缺陷型菌株，且代替抗生素抗性基因或除抗生素抗性基因以外，外源性代謝基因可用於選擇。作為一個實例，為了對包含編碼本文所提供代謝酶或補充基因之質體的營養缺陷型細菌進行選擇，可使經轉型之營養缺陷型細菌在將針對編碼代謝酶之基因(例如胺基酸代謝基因)或補充基因之表現進行選擇的培養基中生長。替代地，熱敏質體可用於選擇重組體，或任何其他已知用於選擇重組體的構件。 B. 細菌或李斯特菌屬菌株之減毒 [0132] 本文所揭示之重組細菌菌株(例如重組李斯特菌屬菌株)可經減毒。術語「減毒」涵蓋細菌在宿主動物中引起疾病之能力的減弱。舉例而言，減毒之李斯特菌屬菌株的病原性特徵可相較於野生型李斯特菌減少，不過減毒之李斯特菌能夠在培養物中生長及維持。舉例而言，用減毒之李斯特菌靜脈內接種BALB/c小鼠，50%接種動物存活的致死劑量(LD50
)較佳比野生型李斯特菌的LD50
高至少約10倍，更佳至少約100倍，更佳至少約1,000倍，甚至更佳至少約10,000倍且最佳至少約100,000倍。減毒之李斯特菌屬菌株因此為不會殺死投與其之動物的菌株，或為僅當所投與細菌之數目極大地大於殺死同一動物所需的野生型非減毒細菌之數目時殺死動物的菌株。減毒細菌亦應理解為意謂在通用環境中不能複製之細菌，因為該環境中不存在其生長所需的營養。因此，細菌限於在提供所需營養之受控環境中複製。減毒菌株具有環境安全性，因為其不能不受控複製。 (1) 使細菌及李斯特菌屬菌株減毒之方法 [0133] 減毒可藉由任何已知手段來實現。舉例而言，此類減毒菌株可能缺乏一或多種內源性致病性基因或一或多種內源性代謝基因。此類基因之實例揭示於本文中，且減毒可藉由使本文所揭示之基因中的任一者或任何組合失活來達成。失活可例如經由缺失或經由突變(例如失活突變)來達成。術語「突變」包括對序列(核酸或胺基酸序列)的任何類型之突變或修飾，且可涵蓋缺失、截短、插入、取代、破壞或移位。舉例而言，突變可包括讀框轉移突變、造成蛋白質過早終止之突變或影響基因表現之調節序列突變。突變誘發可使用重組DNA技術或使用利用突變化學物質或輻射且隨後選擇突變體之傳統突變誘發技術來實現。缺失突變體可為較佳的，因為伴隨逆轉機率低。術語「代謝基因」係指編碼合成由宿主細菌利用或需要之營養所涉及或需要之酶的基因。舉例而言，酶可為合成宿主細菌持續生長需要之營養所涉及或需要的。術語「致病性」基因包括其在生物體之基因組中的存在或活性有助於生物體之病原性(例如，使得該生物體能夠達成宿主中生態棲位之定殖(包括與細胞附接)、免疫逃避(逃避宿主之免疫反應)、免疫抑制(抑制宿主之免疫反應)、進入及離開細胞或自宿主獲得營養)的基因。 [0134] 此類減毒菌株之具體實例為單核球增多性李斯特菌(Lm
)dal
(-)dat
(-) (Lmdd
)。
此類減毒菌株之另一實例為Lm dal
(-)dat
(-)ΔactA
(LmddA
)。
參見例如，
US 2011/0142791，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。LmddA
係基於由於缺失內源性致病性基因actA
而減毒之李斯特菌屬菌株。此類菌株可藉由補充dal
基因而保留用於活體內及活體外抗原表現之質體。替代地，LmddA
可為在內源性dal 、 dat
，及actA
基因中具有突變之dal/dat/actA
李斯特菌。此類突變可為例如缺失或其他失活突變。 [0135] 減毒菌株之另一具體實例為Lm prfA
(-)或在prfA
基因中具有部分缺失或失活突變之菌株。PrfA蛋白控制包含Lm
定殖其脊椎動物宿主所需之必需致病性基因的調節子的表現；因此prfA突變強烈損害PrfA使PrfA依賴性毒性基因之表現活化的能力。 [0136] 減毒菌株之又另一具體實例為Lm inlB
(-)actA
(-)，其中細菌天然致病性的兩個關鍵性基因，內化蛋白B
及act A
，係經去除。 [0137] 減毒之細菌或李斯特菌屬菌株的其他實例包括缺乏一或多種內源性致病性基因之細菌或李斯特菌屬菌株。此類基因之實例包括李斯特菌
中之actA
、prfA
、plcB
、plcA
、inlA
、inlB
、inlC
、inlJ
及bsh
。減毒之李斯特菌屬菌株亦可為上文所提及之菌株中的任一者之雙重突變體或三重突變體。減毒之李斯特菌屬菌株可包含本文所提供之每一基因的突變或缺失，或包含例如至多十個本文所提供之任一基因(例如，包括actA
、prfA
及dal/dat
基因)的突變或缺失。舉例而言，減毒之李斯特菌屬菌株可包含內源性內化蛋白C
(inlC
)基因之突變或缺失及/或內源性actA
基因之突變或缺失。替代地，減毒之李斯特菌屬菌株可包含內源性內化蛋白B
(inlB
)基因之突變或缺失及/或內源性actA
基因之突變或缺失。替代地，減毒之李斯特菌屬菌株可包含內源性inlB
、inlC
及actA
基因之突變或缺失。藉由過程中涉及的缺失內源性actA
基因及/或內源性inlC
基因或內源性inlB
基因抑制李斯特菌
向相鄰細胞之移位，藉此引起出乎意料高量之減毒，提高免疫原性且用作菌株主鏈。減毒之李斯特菌屬菌株亦可為包含plcA
及plcB
兩者之突變或缺失的雙重突變體。在一些情況下，菌株可由EGD李斯特菌
主鏈構築。 [0138] 細菌或李斯特菌屬菌株亦可為在代謝基因中具有突變之營養缺陷型菌株。作為一個實例，菌株可缺乏一或多種內源性胺基酸代謝基因。舉例而言，可以熟知之多種方式實現產生例如缺乏D-丙胺酸之李斯特菌屬營養缺陷型菌株，該等方式包括缺失突變、插入突變、讀框轉移突變、引起蛋白質過早終止之突變或影響基因表現之調節序列突變。缺失突變體可為較佳的，因為伴隨營養缺陷型表型逆轉機率低。作為一個實例，可在簡單實驗室培養分析法中測試根據本文所呈現之方案產生的D-丙胺酸之突變體在無D-丙胺酸存在下生長的能力。可選擇不能在此化合物無存在下生長的彼等突變體。 [0139] 內源性胺基酸代謝基因之實例包括維生素合成基因、編碼泛酸合成酶之基因、D-麩胺酸合成酶基因、D-丙胺酸轉胺酶(dat
)基因、D-丙胺酸消旋酶(dal
)基因、dga
、參與二胺基庚二酸(DAP)合成之基因、參與半胱胺酸合成酶A(cysK
)合成之基因、維生素B12非依賴性甲硫胺酸合成酶、trpA
、trpB
、trpE
、asnB
、gltD
、gltB
、leuA
、argG
及thrC
。李斯特菌屬菌株可缺乏兩種或超過兩種此類基因(例如dat
及dal
)。D-麩胺酸合成部分地受dal
基因控制，該基因參與D-glu + pyr向α-酮戊二酸酯 + D-ala之轉化及逆反應。 [0140] 作為另一實例，減毒之李斯特菌屬菌株可缺乏內源性合成酶基因，諸如胺基酸合成基因。此類基因之實例包括folP
、編碼二氫尿苷合成酶家族蛋白質之基因、ispD
、ispF
、編碼磷酸烯醇丙酮酸合成酶之基因、hisF
、hisH
、fliI
、編碼核糖體較大子單元假尿苷合成酶之基因、ispD
、編碼雙官能性GMP合成酶/麩醯胺轉胺酶蛋白質之基因、cobS
、cobB
、cbiD
、編碼尿卟啉-III C-甲基轉移酶/尿卟啉原-III合成酶之基因、cobQ
、uppS
、truB
、dxs
、mvaS
、dapA
、ispG
、folC
、編碼檸檬酸合成酶之基因、argJ
、編碼3-脫氧-7-磷酸庚酮糖酸合成酶之基因、編碼吲哚-3-甘油-磷酸合成酶之基因、編碼鄰胺基苯甲酸合成酶/麩醯胺轉胺酶組件之基因、menB
、編碼甲萘醌特異性異分支酸合成酶之基因、編碼磷酸核糖甲醯基甘胺脒合成酶I或II之基因、編碼磷酸核糖胺基咪唑-琥珀醯甲醯胺合成酶之基因、carB
、carA
、thyA
、mgsA
、aroB
、hepB
、rluB
、ilvB
、ilvN
、alsS
、fabF
、fabH
、編碼假尿苷合成酶之基因、pyrG
、truA
、pabB
及atp合成酶基因(例如，atpC 、 atpD-2 、 aptG 、 atpA-2
等等)。 [0141] 減毒之李斯特菌屬菌株可缺乏內源性phoP
、aroA
、aroC
、aroD
或plcB
。作為又另一實例，減毒之李斯特菌屬菌株可缺乏內源性肽轉運子。實例包括編碼以下之基因：ABC轉運子/ATP結合/透過酶蛋白質、寡肽ABC轉運子/寡肽結合蛋白質、寡肽ABC轉運子/透過酶蛋白質、鋅ABC轉運子/鋅結合蛋白質、糖ABC轉運子、磷酸鹽轉運子、ZIP鋅轉運子、EmrB
/QacA
家族之耐藥性轉運子、硫酸鹽轉運子、質子依賴性寡肽轉運子、鎂轉運子、甲酸鹽/亞硝酸鹽轉運子、亞精胺/腐胺ABC轉運子、a Na/Pi共轉運子、磷酸糖轉運子、麩醯胺ABC轉運子、主要易化子家族轉運子、甘胺酸甜菜鹼/L-脯胺酸ABC轉運子、鉬ABC轉運子、磷壁酸ABC轉運子、鈷ABC轉運子、銨轉運子、胺基酸ABC轉運子、細胞分裂ABC轉運子、錳ABC轉運子、鐵化合物ABC轉運子、麥芽糖/麥芽糊精ABC轉運子、Bcr
/CflA
家族之耐藥性轉運子及上文蛋白質中之一者的子單元。 [0142] 其他減毒之細菌及李斯特菌屬菌株可為缺內源性代謝酶，該內源性代謝酶代謝用於細菌生長過程、複製過程、細胞壁合成、蛋白質合成、脂肪酸代謝、或用於任何其他生長或複製過程的胺基酸。同樣，減毒菌株可缺乏內源性代謝酶，該內源性代謝酶可催化形成細胞壁合成中所用之胺基酸，可催化合成細胞壁合成中所用之胺基酸，或可參與合成細胞壁合成中所用之胺基酸。替代地，胺基酸可用於細胞壁生物發生。替代地，代謝酶為用於D-麩胺酸(一種細胞壁組分)之合成酶。 [0143] 其他減毒之李斯特菌屬菌株可缺乏由D-麩胺酸合成基因、dga
、alr (丙胺酸消旋酶)基因編碼之代謝酶或任何其他參與丙胺酸合成之酶。李斯特菌屬菌株可缺乏之代謝酶的又其他實例包括由以下編碼之酶：serC
(一種磷酸絲胺酸轉胺酶)、asd
(天冬胺酸β半醛脫氫酶；參與合成細胞壁成分二胺基庚二酸)、編碼gsaB-麩胺酸-1-半醛轉胺酶(催化由(S)-4-胺基-5-側氧基戊酸酯形成5-胺基乙醯丙酸酯)之基因、hemL
(催化由(S)-4-胺基-5-側氧基戊酸酯形成5-胺基乙醯丙酸酯)、aspB
(催化由L-天冬胺酸酯及2-側氧基戊二酸酯形成草醯乙酸酯及L-麩胺酸酯之天冬胺酸轉胺酶)、argF-1
(參與精胺酸生物合成)、aroE
(參與胺基酸生物合成)、aroB
(參與3-脫氫奎尼酸酯生物合成)、aroD
(參與胺基酸生物合成)、aroC
(參與胺基酸生物合成)、hisB
(參與組胺酸生物合成)、hisD
(參與組胺酸生物合成)、hisG (參與組胺酸生物合成)、metX
(參與甲硫胺酸生物合成)、proB
(參與脯胺酸生物合成)、argR
(參與精胺酸生物合成)、argJ
(參與精胺酸生物合成)、thil
(參與硫胺素生物合成)、LMOf2365_1652
(參與色胺酸生物合成)、aroA
(參與色胺酸生物合成)、ilvD
(參與纈胺酸及異白胺酸生物合成)、ilvC (參與纈胺酸及異白胺酸生物合成)、leuA (參與白胺酸生物合成)、dapF
(參與離胺酸生物合成)、及thrB
(參與蘇胺酸生物合成) (全部為GenBank寄存編號NC_002973)。 [0144] 減毒之李斯特菌屬菌株可藉由其他代謝酶，諸如tRNA合成酶之突變產生。舉例而言，代謝酶可由trpS
基因編碼，該基因編碼色胺醯基tRNA合成酶。舉例而言，宿主菌株細菌可為Δ(trpS aroA
)，且兩種標記物可含於整合載體中。 [0145] 可經突變以產生減毒之李斯特菌屬菌株的代謝酶之其他實例包括由以下編碼之酶：murE
(參與合成二胺基庚二酸；GenBank寄存編號：NC_003485)、LMOf2365_2494 (參與磷壁酸生物合成)、WecE
(脂多醣生物合成蛋白質rffA；GenBank寄存編號：AE014075.1)或amiA
(一種N-乙醯胞壁醯-L-丙胺酸醯胺酶)。代謝酶之又其他實例包括天冬胺酸轉胺酶、組胺醇-磷酸酯轉胺酶(GenBank寄存編號NP_466347)或細胞壁磷壁酸糖基化蛋白質GtcA。 [0146] 可經突變以產生減毒之李斯特菌屬菌株的代謝酶之其他實例包括用於肽聚糖組分或前驅物之合成酶。組分可為例如UDP-N-乙醯胞壁醯五肽、UDP-N-乙醯葡糖胺、MurNAc-(五肽)-焦磷醯-十一萜醇、GlcNAc-p-(1,4)-MurNAc-(五肽)-焦磷醯十一萜醇或任何其他肽聚糖組分或前驅物。 [0147] 可經突變以產生減毒之李斯特菌屬菌株的代謝酶之又其他實例包括由以下編碼之代謝酶：murG
、murD
、murA-1
或murA-2
(全部闡述於GenBank寄存編號NC_002973中)。替代地，代謝酶可為用於肽聚糖組分或前驅物之任何其他合成酶。代謝酶亦可為轉醣苷酶、轉肽酶、羧肽酶、任何其他類別之代謝酶或任何其他代謝酶。舉例而言，代謝酶可為任何其他李斯特菌屬代謝酶或任何其他單核球增多性李斯特菌代謝酶。 [0148] 其他細菌菌株可如上文對李斯特菌所描述，藉由使該等其他細菌菌株中之相對應直系同源基因突變來減毒。 (2) 補充減毒之細菌及李斯特菌屬菌株的方法 [0149] 本文所揭示的減毒之細菌或李斯特菌屬菌株可進一步包含有包含補充基因或編碼補充減毒突變(例如，補充營養缺陷型李斯特菌屬菌株之營養缺陷性)之代謝酶的核酸。舉例而言，如本文所揭示之具有編碼融合多肽之第一開讀框的核酸可進一步包含有包含補充基因或編碼補充代謝酶之第二開讀框。替代地，第一核酸可編碼融合多肽且單獨之第二核酸可包含補充基因或編碼補充代謝酶。 [0150] 補充基因可處於染色體外或可整合至細菌或李斯特菌屬基因組中。舉例而言，營養缺陷型李斯特菌屬菌株可包含有包含編碼代謝酶之核酸的附加型質體。此類質體將以游離或染色體外方式含於李斯特菌中。替代地，營養缺陷型李斯特菌屬菌株可包含有包含編碼代謝酶之核酸的整合型質體(亦即，整合載體)。此類整合型質體可用於整合至李斯特菌染色體中。較佳地，附加型質體或整合型質體缺乏抗生素抗性標記物。 [0151] 代替抗生素抗性基因或除抗生素抗性基因以外，代謝基因可用於選擇。作為一個實例，為了對包含編碼本文所提供代謝酶或補充基因之質體的營養缺陷型細菌進行選擇，可使經轉型之營養缺陷型細菌在將針對編碼代謝酶之基因(例如胺基酸代謝基因)或補充基因之表現進行選擇的培養基中生長。舉例而言，對於D-麩胺酸合成而言為營養缺陷型之細菌可用包含用於D-麩胺酸合成之基因的質體轉型，且營養缺陷型細菌將在無D-麩胺酸存在下生長，而未使用質體轉型或不表現編碼用於D-麩胺酸合成之蛋白質的質體之營養缺陷型細菌將不生長。類似地，當經轉型且表現包含編碼用於D-丙胺酸合成之胺基酸代謝酶之核酸的質體時，對於D-丙胺酸合成而言為營養缺陷型之細菌將在無D-丙胺酸存在下生長。此類用於製造包含或缺乏必要生長因子、補充劑、胺基酸、維生素、抗生素及其類似物的適當培養基之方法為熟知的，且可商購。 [0152] 一旦已在適當培養基中選擇包含編碼本文所提供代謝酶或補充基因之質體的營養缺陷型細菌，細菌可在選擇壓力存在下繁殖。此類繁殖可包含在無營養缺陷型因子之培養基中生長細菌。營養缺陷型細菌中表現代謝酶或補充基因之質體的存在確保該質體將與細菌一起複製，因此持續選擇含有該質體之細菌。細菌或李斯特菌屬菌株之產生可藉由調節其中生長包含質體之營養缺陷型細菌之培養基的體積而容易地按比例擴大。 [0153] 在一個具體實例中，減毒菌株為具有dal
及dat
之缺失或dal及dat中之失活突變的菌株(例如，單核球增多性李斯特菌(Lm
)dal
(-)dat
(-) (Lmdd
)或Lm dal
(-)dat
(-)ΔactA
(LmddA
))，且補充基因編碼丙胺酸消旋酶(例如，由dal
基因編碼)或D-胺基酸轉胺酶(例如，由dat
基因編碼)。
例示性丙胺酸消旋酶蛋白質可具有SEQ ID NO：76中所闡述之序列(由SEQ ID NO：78編碼；GenBank寄存編號：AF038438)或可為SEQ ID NO：76之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段或同功異型物片段。丙胺酸消旋酶蛋白質亦可為任何其他李斯特菌丙胺酸消旋酶蛋白質。替代地，丙胺酸消旋酶蛋白質可為任何其他革蘭氏陽性丙胺酸消旋酶蛋白質或任何其他丙胺酸消旋酶蛋白質。例示性D-胺基酸轉胺酶蛋白質可具有SEQ ID NO：77中所闡述之序列(由SEQ ID NO：79編碼；GenBank寄存編號：AF038439)或可為SEQ ID NO：77之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段或同功異型物片段。D-胺基酸轉胺酶蛋白質亦可為任何其他李斯特菌
D-胺基酸轉胺酶蛋白質。替代地，D-胺基酸轉胺酶蛋白質可為任何其他革蘭氏陽性D-胺基酸轉胺酶蛋白質或任何其他D-胺基酸轉胺酶蛋白質。 [0154] 在另一個具體實例中，減毒菌株為具有prfA
之缺失或prfA中之失活突變的菌株(例如Lm prfA
(-))，且補充基因編碼PrfA蛋白。舉例而言，補充基因可編碼恢復部分PrfA功能之突變型PrfA (D133V)蛋白。野生型PrfA蛋白之實例闡述於SEQ ID NO：80中(由SEQ ID NO：81中所闡述之核酸編碼)，且D133V突變型PrfA蛋白之實例闡述於SEQ ID NO：82中(由SEQ ID NO：83中所闡述之核酸編碼)。補充PrfA蛋白可為SEQ ID NO：80或82之同源物、變異體、同功異型物、類似物、片段、同源物片段、變異體片段、類似物片段或同功異型物片段。PrfA蛋白亦可為任何其他李斯特菌
PrfA蛋白。替代地，PrfA蛋白可為任何其他革蘭氏陽性PrfA蛋白或任何其他PrfA蛋白。 [0155] 在另一實例中，細菌菌株或李斯特菌屬菌株可包含actA
基因之缺失或actA
基因中之失活突變，且補充基因可包含actA基因以補充該突變且恢復李斯特菌屬菌株之功能。 [0156] 其他營養缺陷型菌株及補充系統亦可用於與本文所提供之方法及組成物一起使用。 C. 細菌或李斯特菌屬菌株之製備及儲存 [0157] 重組細菌菌株(例如李斯特菌屬菌株)視情況已經動物宿主繼代。此類繼代可使李斯特菌屬菌株作為疫苗載體之功效最大化，可使李斯特菌屬菌株之免疫原性穩定，可使李斯特菌屬菌株之致病性穩定，可增加李斯特菌屬菌株之免疫原性，可增加李斯特菌屬菌株之致病性，可去除李斯特菌屬菌株之不穩定子菌株或可減少李斯特菌屬菌株之不穩定子菌株的佔有率。用於使重組李斯特菌屬菌株經動物宿主繼代之方法為此項技術中熟知的，且描述於例如US 2006/0233835中，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0158] 重組細菌菌株(例如李斯特菌屬菌株)可儲存在冷凍細胞庫中或儲存在凍乾細胞庫中。此類細胞庫可為例如主細胞庫、工作細胞庫或優良製造規範(Good Manufacturing Practice；GMP)細胞庫。「優良製造規範」之實例包括由美國聯邦法規法典(United States Code of Federal Regulations)之21 CFR 210-211定義的彼等。然而，「優良製造規範」亦可由用於製造臨床級材料或用於人類消費之其他標準定義，諸如除美國以外的國家之標準。此類細胞庫可意欲用於製造臨床級材料或可符合用於人類使用之管理規範。 [0159] 重組細菌菌株(例如李斯特菌屬菌株)亦可來自疫苗劑批料，來自冷凍原料或來自凍乾原料。 [0160] 此類細胞庫、冷凍原料或疫苗劑批料可例如在解凍後展現大於90%之存活力。解凍可在低溫保存儲存或冷凍儲存24小時之後進行。替代地，儲存可持續例如2天、3天、4天、1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、5個月、6個月、9個月或1年。 [0161] 細胞庫、冷凍原料或疫苗劑批料可例如藉由以下方法低溫保存，該方法包含在營養培養基中生長細菌菌株(例如李斯特菌屬菌株)培養物，在包含甘油之溶液中冷凍該培養物，及在低於-20℃下儲存該李斯特菌屬菌株。溫度可為例如約-70℃或在約-70℃至約-80℃之間。替代地，細胞庫、冷凍原料或疫苗劑批料可例如藉由以下方法低溫保存，該方法包含在成分確定培養基中生長李斯特菌屬菌株培養物，在包含甘油之溶液中冷凍該培養物，及在低於-20℃下儲存該李斯特菌屬菌株。溫度可為例如約 -70℃或在約-70℃至約-80℃之間。任何成分確定之微生物培養基均可用於此方法中。 [0162] 培養物(例如，用於產生李斯特菌疫苗劑批料的李斯特菌屬疫苗菌株之培養物)可自例如細胞庫、自冷凍原料、自起子培養物(starter culture)或自群落接種。培養物可例如在對數生長中期、大致對數生長中期或另一生長期接種。 [0163] 代替甘油或除甘油以外，用於冷凍之溶液視情況含有另一種依數添加劑或具有抗冷凍特性之添加劑。此類添加劑之實例包括例如甘露糖醇、DMSO、蔗糖或任何其他依數添加劑或具有抗冷凍特性之添加劑。 [0164] 用於生長細菌菌株(例如李斯特菌屬菌株)之培養物的營養培養基可為任何適合之營養培養基。適合之培養基的實例包括例如LB；TB；經改質之無動物產品極品培養液(Terrific Broth)；或成分確定培養基。 [0165] 生長步驟可藉由任何已知的生長細菌之手段來進行。舉例而言，生長步驟可執用搖瓶(諸如具有檔板之搖瓶)、分批醱酵器、攪拌槽或燒瓶、氣升醱酵器、分批補料、連續細胞反應器、固定化細胞反應器或任何其他生長細菌之手段來進行。 [0166] 視情況，在培養物生長期間(例如在分批醱酵器中)維持恆定pH。舉例而言，pH可維持在約6.0、約6.5、約7.0、約7.5或約8.0。同樣，pH可為例如約6.5至約7.5、約6.0至約8.0、約6.0至約7.0、約6.0至約7.0或約6.5至約7.5。 [0167] 視情況，可在培養物生長期間維持恆定溫度。舉例而言，溫度可維持在約37℃下或在37℃下。替代地，溫度可維持在25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃或39℃下。 [0168] 視情況，可在培養物生長期間維持恆定溶解氧濃度。舉例而言，溶解氧濃度可維持在20%飽和、15%飽和、16%飽和、18%飽和、22%飽和、25%飽和、30%飽和、35%飽和、40%飽和、45%飽和、50%飽和、55%飽和、60%飽和、65%飽和、70%飽和、75%飽和、80%飽和、85%飽和、90%飽和、95%飽和、100%飽和或接近100%飽和。 [0169] 用於凍乾及低溫保存重組細菌菌株(例如李斯特菌屬菌株的方法為已知的。舉例而言，李斯特菌培養物可在液氮中急驟冷凍，後接在最終冷凍溫度下儲存。替代地，培養物可以更漸進方式冷凍(例如，藉由在培養物小瓶中放置在最終儲存溫度下)。培養物亦可藉由任何其他已知用於冷凍細菌培養物之方法來冷凍。 [0170] 培養物之儲存溫度可例如在-20℃與-80℃之間。舉例而言，溫度可顯著低於-20℃或不高於-70℃。替代地，溫度可為約-70℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-80℃、-30℃至-70℃、-40℃至-70℃、-50℃至-70℃、-60℃至-70℃、-30℃至-80℃、-40℃至-80℃、-50℃至-80℃、-60℃至-80℃或-70℃至-80℃。替代地，溫度可低於-70℃或低於-80℃。 IV. 免疫原性組成物、醫藥組成物及疫苗 [0171] 亦提供免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗，其包含如本文所揭示之重組融合多肽、如本文所揭示的編碼重組融合多肽之核酸或如本文所揭示之重組細菌或李斯特菌屬菌株 包含李斯特菌屬菌株之免疫原性組成物可憑藉其包含李斯特菌屬菌株而具有固有免疫原性且/或組成物亦可進一步包含佐劑。其他免疫原性組成物包含DNA免疫治療或肽免疫治療組成物。 [0172] 術語「免疫原性組成物」係指含有以下抗原之任何組成物，該抗原在暴露於該組成物中後在個體中引起針對該抗原之免疫反應。由免疫原性組成物引起之免疫反應可針對特定抗原或針對該抗原上之特定抗原決定基。 [0173] 免疫原性組成物可包含如本文所揭示之單一重組融合多肽、如本文所揭示的編碼重組融合多肽之核酸或如本文所揭示之重組細菌或李斯特菌屬菌株，或其可包含多個不同的如本文所揭示之重組融合多肽、如本文所揭示的編碼重組融合多肽之核酸或如本文所揭示之重組細菌或李斯特菌屬菌株。舉例而言，若第一重組融合多肽包括第二重組融合多肽不包括之一個抗原肽，則第一重組融合多肽與第二重組融合多肽不同。兩個重組融合多肽可包括一些相同抗原肽，而仍被視為不同的。此類不同重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸或重組細菌或李斯特菌屬菌株可同時向個體或依序向個體投與。當包含本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株(或重組融合多肽或核酸)的原料藥處於不同劑型中(例如，一種藥劑為錠劑或膠囊且另一種藥劑為無菌液體)及/或以不同給藥時程投與(例如，來自混合物之一種組成物至少每日投與且另一種不太頻繁投與，諸如每週一次、每兩週一次或每三週一次)時，依序投與可尤其適用。多個重組融合多肽\編碼重組融合多肽之核酸或重組細菌或李斯特菌屬菌株可各自包含不同抗原肽組。替代地，重組融合多肽\編碼重組融合多肽之核酸或重組細菌或李斯特菌屬菌株中之兩者或超過兩者可包含相同抗原肽組(例如，以不同次序包含相同抗原肽組)。 [0174] 免疫原性組成物可另外包含佐劑(例如，兩種或超過兩種佐劑)、細胞因子、趨化因子或其組合。視情況，免疫原性組成物可另外包含抗原呈遞細胞(antigen presenting cell；APC )，其對個體可為自體或可為同種異體。 [0175] 術語佐劑包括增強針對抗原之免疫反應的化合物或混合物。舉例而言，佐劑可為免疫反應之非特異性刺激劑或允許在個體中產生儲存物之物質，該佐劑當與本文所揭示之免疫原性組成物組合時提供甚至更增強及/或長期之免疫反應。佐劑可促進例如主要Th1介導之免疫反應、Th1型免疫反應或Th1介導之免疫反應。同樣，相對於抗體介導之反應，佐劑可有利於細胞介導之免疫反應。替代地，佐劑可有利於抗體介導之反應。一些佐劑可藉由緩慢釋放抗原而增強免疫反應，而其他佐劑可藉由以下機制中之任一者介導其作用：增加細胞浸潤、炎症及遷移至注射位點，特定言之對於抗原呈遞細胞(APC)；藉由上調共刺激性信號或主要組織相容性複合體(MHC)表現來促進APC之活化狀態；增強抗原呈遞；或誘導細胞因子釋放以用於間接作用。 [0176] 佐劑之實例包括皂素QS21、CpG寡核苷酸、含未甲基化CpG之寡核苷酸、MPL、TLR促效劑、TLR4促效劑、TLR9促效劑、Resiquimod®
、咪喹莫特(imiquimod)、細胞因子或編碼該等細胞因子之核酸、趨化因子或編碼該等趨化因子之核酸、IL-12或編碼IL-12之核酸、IL-6或編碼IL-6之核酸以及脂多醣。適合之佐劑的另一實例為Montanide ISA 51。Montanide ISA 51含有天然可代謝之油及精製乳化劑。適合之佐劑的又另一實例為解毒化李斯特菌溶胞素O (dtLLO)蛋白。適合用作佐劑之dtLLO的一個實例由SEQ ID NO：115編碼。由與SEQ ID NO：115至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列編碼的dtLLO 亦適合用作佐劑。適合之佐劑的其他實例包括顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor；GM-CSF)或編碼GM-CSF之核酸及匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin；KLH)蛋白質或編碼該等蛋白質之核酸。GM-CSF可為例如在酵母(釀酒酵母(S. cerevisiae
))載體中生長之人類蛋白質。GM-CSF促進造血祖細胞、抗原呈遞細胞(APC)、樹突狀細胞及T細胞之無性擴增及分化。佐劑之又其他實例包括生長因子或編碼該等生長因子之核酸、細胞群體、弗氏不完全佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁、卡介苗(bacille Calmette-Guerin；BCG)、明礬、介白素或編碼該等介白素之核酸、羽糖苷(quill glycoside)、單磷醯基脂質A、脂質體、細菌有絲分裂原、細菌毒素或任何其他類型之已知佐劑(參見例如，Fundamental Immunology, 第5版 (2003年8月)：William E. Paul (編者); Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 第43章：疫苗, GJV Nossal，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的)。 [0177] 免疫原性組成物可進一步包含一或多種免疫調節分子。實例包括干擾素γ、細胞因子、趨化因子及T細胞刺激劑。 [0178] 免疫原性組成物可呈疫苗或醫藥組成物形式。術語「疫苗」及「醫藥組成物」為可互換的且係指用於向個體活體內投與的含有免疫原性組成物的醫藥學上可接受之載劑。疫苗可為例如肽疫苗(例如，包含如本文所揭示之重組融合多肽)、DNA疫苗(例如，包含如本文所揭示的編碼重組融合多肽之核酸)或含於細胞內且由細胞遞送之疫苗(例如，如本文所揭示之重組李斯特菌
)。疫苗可防止個體感染或患上疾病或病況，且/或疫苗對於患有疾病或病況之個體可為治療性的。用於製備肽疫苗之方法為熟知的，且描述於例如EP 1408048、US 2007/0154953及Ogasawara等人(1992)Proc. Natl Acad Sci USA
89：8995-8999中，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。視情況，肽演化技術可用於產生具有較高免疫原性之抗原。用於肽演化之技術為熟知的，且描述於例如US 6,773,900中，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0179] 「醫藥學上可接受之載劑」係指以下用於含有免疫原性組成物之媒劑，其可引入至個體中而無顯著不良作用且對該免疫原性組成物無不利作用。亦即，「醫藥學上可接受」係指任何調配物為安全的，且向所要投藥途徑適當遞送有效量的至少一種用於本文所揭示之方法中的免疫原性組成物。醫藥學上可接受之載劑或媒劑或賦形劑為熟知的。適合的醫藥學上可接受之載劑的描述及涉及其選擇之因素見於多種容易獲得之來源中，諸如Remington's Pharmaceutical Sciences,
第18版, 1990，其以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。此類載劑可適合於任何投藥途徑(例如，非經腸、經腸(例如經口)或局部施用)。此類醫藥組成物可經緩衝，舉例而言，其中根據免疫原性組成物之穩定性及投藥途徑，pH維持在範圍介於pH 4.0至pH 9.0之所要特定值。 [0180] 適合的醫藥學上可接受之載劑包括例如無菌水；鹽溶液，諸如生理食鹽水；葡萄糖；緩衝溶液，諸如磷酸鹽緩衝溶液或碳酸氫鹽緩衝溶液；醇；阿拉伯膠；植物油；苯甲醇；聚乙二醇；明膠；碳水化合物(例如乳糖、直鏈澱粉或澱粉)；硬脂酸鎂；滑石；矽酸；黏性石蠟；白色石蠟；甘油；海藻酸鹽；玻尿酸；膠原蛋白；香料油；脂肪酸單酸甘油酯及二酸甘油酯；季戊四醇脂肪酸酯；羥基甲基纖維素；聚乙烯吡咯啶酮及其類似物。醫藥組成物或疫苗亦可包括不與免疫原性組成物有害地反應之助劑，包括例如稀釋劑、穩定劑(例如糖及胺基酸)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、pH緩衝劑、黏度增強添加劑、潤滑劑、影響滲透壓之鹽、緩衝劑、維生素、著色劑、調味劑、芳香族物質及其類似物。 [0181] 舉例而言，對於液體調配物，醫藥學上可接受之載劑可為水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非水性溶劑包括例如丙二醇、聚乙二醇及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括例如水、醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括生理食鹽水及緩衝介質。油之實例包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、葵花油及魚肝油。固體載劑/稀釋劑包括例如膠、澱粉(例如，玉米澱粉、預膠凝化澱粉)、糖(例如，乳糖、甘露糖醇、蔗糖、右旋糖)、纖維素材料(例如，微晶纖維素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸鈣、氧化鎂、滑石或其混合物。 [0182] 視情況，可調配持續或定向釋放之醫藥組成物或疫苗。此可例如經由使用脂質體或其中活性化合物受不同可分解包衣保護(例如，藉由微囊封、多層包衣等等)的組成物來實現。此類組成物可經調配用於即刻或緩慢釋放。亦有可能冷凍乾燥組成物且使用所獲得之凍乾物(例如，用於製備注射用產品)。 [0183] 本文所揭示之免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗亦可包含一或多種有效預防或治療癌症之額外化合物。舉例而言，額外化合物可包含適用於化學療法之化合物，諸如安吖啶(amsacrine)、博萊黴素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、克里沙納塔斯蛋白酶(crisantaspase)、環磷醯胺、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素d (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依託泊苷(etoposide)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他濱(gemcitabine)、gliadel植入物、羥基脲、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺、伊立替康(irinotecan)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、脂質體小紅莓、脂質體道諾黴素、洛莫司汀(lomustine)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Taxol)、培美曲唑(pemetrexed)、噴司他汀(pentostatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、沙鉑(satraplatin)、鏈佐星(streptozocin)、替加氟(tegafur)-尿嘧啶、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、噻替派(thiotepa)、硫鳥嘌呤、拓樸替康(topotecan)、曲奧舒凡(treosulfan)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)或其組合。額外化合物亦可包含其他生物製劑，包括針對HER2抗原之Herceptin®
(曲妥珠單抗(trastuzumab))、針對VEGF之Avastin®
(貝伐單抗(bevacizumab))或針對EGF受體之抗體，諸如Erbitux®
(西妥昔單抗(cetuximab))、德瓦魯單抗(durvalumab) (Medi4736)及Vectibix®
(帕尼單抗(panitumumab))。額外化合物亦可包含例如額外免疫治療。 [0184] 額外化合物亦可包含免疫檢查點抑制劑拮抗劑，諸如PD-1信號傳導路徑抑制劑、CD-80/86及CTLA-4信號傳導路徑抑制劑、T細胞膜蛋白質3(TIM3)信號傳導路徑抑制劑、腺苷A2A受體(A2aR)信號傳導路徑抑制劑、淋巴細胞活化基因3(LAG3)信號傳導路徑抑制劑、殺手免疫球蛋白受體(KIR)信號傳導路徑抑制劑、CD40信號傳導路徑抑制劑或任何其他抗原呈遞細胞/T細胞信號傳導路徑抑制劑。免疫檢查點抑制劑拮抗劑之實例包括抗PD-L1/PD-L2抗體或其片段、抗PD-1抗體或其片段、抗CTLA-4抗體或其片段或抗B7-H4抗體或其片段。 [0185] 抗PD-1抗體之實例為Opdivo (納武單抗(nivolumab))，一種抗PD-1單株抗體。在一個具體例中，包含重組李斯特菌屬菌株及Opdivo (納武單抗)之組合療法用於治療患有轉移性子宮頸癌之個體，該重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸，其中該融合多肽包含與HPV16抗原肽及HPV18抗原肽融合的含PEST之肽，其中該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽可操作地以串聯方式連接，其中HPV16抗原肽為HPV16 E6抗原肽或HPV16 E7抗原肽，且其中該HPV18抗原肽為HPV18 E6抗原肽或HPV18 E7抗原肽。使用納武單抗治療復發性或轉移性子宮頸癌之Advaxis免疫治療(ADVANCE)研究為開發用於患有復發性或轉移性子宮頸癌之女性中一線治療失效者之子宮頸癌的二線治療。ADVANCE研究為隨機階段全球研究，其中超過500名患者經隨機分組以在一線療法失效或無資格接受一線療法的患有復發性或轉移性子宮頸癌之患者中，相較於研究者所選單藥劑化學療法評估ADXS-602 (ADXS-DUAL)與納武單抗組合之安全性及功效。 [0186] 額外化合物亦可包含T細胞刺激劑，諸如與T細胞受體共刺激性分子、結合共刺激性分子之抗原呈遞細胞受體或TNF受體超家族之成員結合的抗體或其功能性片段。T細胞受體共刺激性分子可包含例如CD28或ICOS。結合共刺激性分子之抗原呈遞細胞受體可包含例如CD80受體、CD86受體或CD46受體。TNF受體超家族成員可包含例如糖皮質激素誘導之TNF受體(GITR)、OX40 (CD134受體)、4-1BB (CD137受體)或TNFR25。參見例如
，WO2016100929、WO2016011362及WO2016011357，其中之每一者均以全文引用的方式併入以達成所有目的。 V. 治療方法 [0187] 本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物及疫苗可用於各種方法中。舉例而言，其可用於在個體中誘導抗腫瘤相關抗原免疫反應之方法中、在個體中誘導抗腫瘤或抗癌免疫反應之方法中、在個體中治療腫瘤或癌症之方法中、在個體中預防腫瘤或癌症之方法中或保護個體免於腫瘤或癌症之方法中。其亦可用於提高個體脾臟及腫瘤中T效應細胞與調節性T細胞之比率(Tregs)的方法中，其中T效應細胞靶向腫瘤相關抗原。其亦可用於增加個體中之腫瘤相關抗原T細胞、增加患有腫瘤或癌症之個體的存活時間、延遲個體中之癌症發作或減小個體中之腫瘤或癌轉移大小的方法。以上方法中之任一者中的腫瘤或癌症可為例如HPV相關癌症，諸如子宮頸腫瘤或癌症、肛門腫瘤或癌症、頭頸部腫瘤或癌症或口咽腫瘤或癌症。本文所描述之方法中之任一者中的癌症可為轉移性子宮頸癌。 [0188] 一種在個體中誘導抗HPV16及/或抗HPV18免疫反應之方法可包含例如向該個體投與本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗(例如，包含有包含HPV16及HPV18抗原肽之重組融合多肽或編碼該重組融合多肽之核酸)。可藉此在個體中誘導抗HPV16及/或抗HPV18免疫反應。舉例而言，在重組李斯特菌屬菌株的情況下，該李斯特菌屬菌株可表現融合多肽，藉此在個體中引起免疫反應。免疫反應可包含例如T細胞反應，諸如CD4+FoxP3- T細胞反應、CD8+ T細胞反應或CD4+FoxP3-及CD8+ T細胞反應。此類方法亦可提高個體脾臟及腫瘤微環境中T效應細胞與調節性T細胞之比率(Tregs)，從而允許個體中更深入之抗腫瘤反應。 [0189] 一種在個體中誘導抗腫瘤或抗癌免疫反應之方法可包含例如向該個體投與本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗。可藉此在個體中誘導抗腫瘤或抗癌免疫反應。舉例而言，在重組李斯特菌屬菌株的情況下，該李斯特菌屬菌株可表現融合多肽，藉此在個體中引起抗腫瘤或抗癌反應。 [0190] 一種在個體中治療腫瘤或癌症(例如，其中該腫瘤或癌症表達HPV16及/或HPV18)之方法可包含例如向該個體投與本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗。個體可隨後建立針對表現HPV16及/或HPV18抗原肽之腫瘤或癌症的免疫反應，藉此在該個體中治療腫瘤或癌症。 [0191] 一種在個體中預防腫瘤或癌症或保護個體免於患上腫瘤或癌症(例如，其中該腫瘤或癌症與HPV16及/或HPV18之表現相關)的方法可包含例如向該個體投與本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗。個體可隨後建立針對HPV16及/或HPV18抗原肽之免疫反應，藉此預防腫瘤或癌症或保護個體免於患上腫瘤或癌症。 [0192] 在以上方法中之一些中，投與兩種或超過兩種重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗。可以任何次序或組合依序投與或可以任何組合同時投與多種重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗。作為一個實例，若投與四種不同李斯特菌屬菌株，則其可依序投與，其可同時投與，或其可以任何組合投與(例如，同時投與第一及第二菌株且隨後同時投與第三及第四菌株)。視情況，在依序投藥的情況下，組成物可在同一免疫反應期間，較佳地在彼此0-10天或3-7天內投與。多種重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗可各自包含不同抗原肽組。替代地，兩種或超過兩種可包含相同抗原肽組(例如，以不同次序包含相同抗原肽組)。 [0193] 癌症為特徵通常在於不受調控之細胞生長及增殖的哺乳動物中之生理學病況。HPV相關癌症(例如，由HPV引起之癌症)包括例如陰道、外陰陰莖、肛門、直腸及其他之癌症。舉例而言，HPV相關癌症包括(但不限於)子宮頸癌、肛門癌、頭頸癌及口咽癌。一般而言，認為HPV造成超過90%之肛門癌及子宮頸癌以及超過50%之陰道癌、外陰癌及陰莖癌。頭頸部癌症大多由菸草及酒精引起，但近期研究展示約60%至70%之口咽癌症可能與HPV相關。 [0194] 術語「治療(treat/treating)」係指治療性治療及預防性或防治性措施，其中目標為預防或減輕目標腫瘤或癌症。目標腫瘤或癌症之實例包括(但不限於)子宮頸腫瘤或癌症、肛門腫瘤或癌症、頭頸部腫瘤或癌症或口咽腫瘤或癌症。治療可包括以下中之一或多者：直接影響或治癒、遏制、抑制、預防腫瘤或癌症，降低其嚴重程度、延遲其發作、減緩其進展、使其進展穩定、誘導其緩解、預防或延遲其癌轉移、降低/改善與其相關之症狀或其組合。舉例而言，治療可包括增加預期存活時間或減小腫瘤或癌轉移大小。作用(例如，遏制、抑制、預防、降低嚴重程度、延遲發作、減緩進展、使進展穩定、誘導緩解、預防或延遲癌轉移、降低/改善症狀等等可為相對於未接受治療或接受安慰劑治療之對照個體。術語「治療(treat/treating)」亦可指增加患有腫瘤或癌症之個體的存活機率百分比或增加其預期存活時間(例如，相對於未接受治療或接受安慰劑治療之對照個體)。在一個實例中，「治療」係指延遲進展、加速緩解、誘導緩解、加強緩解、加快恢復、增加替代性治療劑之功效、降低對替代性治療劑之抗性或其組合(例如，相對於未接受治療或接受安慰劑治療之對照個體)。術語「預防」或「防止」可指例如延遲症狀發作、預防腫瘤或癌症復發、減低復發事件之數目或頻率、增加症狀事件之間的潛伏時間、預防腫瘤或癌症之癌轉移或其組合。術語「遏制」或「抑制」可指例如降低症狀嚴重程度、降低急性事件嚴重程度、減少症狀數目、降低疾病相關症狀之發生率、降低症狀潛伏性、改善症狀、減少繼發症狀、減少繼發感染、延長患者存活期或其組合。 [0195] 術語「個體」係指需要用於腫瘤或癌症之療法或易於患上腫瘤或癌症的哺乳動物(例如人類)。術語個體亦係指接受預防性或治療性治療之哺乳動物(例如人類)。個體可包括犬、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠、小鼠、非人類哺乳動物及人類。術語「個體」不一定排除在所有方面均健康且不具有或展示癌症跡象或腫瘤的個體。 [0196] 若個體具有至少一種已知風險因子(例如，遺傳、生化、家族史及情境暴露)，從而使具有該風險因子之個體患上腫瘤或癌症之風險在統計學上比不具有該風險因子之個體顯著更大，則該個體患上腫瘤或癌症之風險增加。 [0197] 「症狀」或「跡象」係指如由醫師觀測到之疾病客觀證據或如由個體所感知之疾病主觀證據，諸如步態改變。症狀或跡象可為疾病之任何表現。症狀可為原發或繼發。術語「原發」係指症狀為特定疾病或病症(例如腫瘤或癌症)之直接結果，而術語「繼發」係指來源於或由原發原因所致之症狀。本文所揭示的重組融合多肽、編碼該等重組融合多肽之核酸、免疫原性組成物、醫藥組成物及疫苗可治療原發或繼發症狀或繼發併發症。 [0198] 在有效方案中投與重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗，該有效方案意謂以下劑量、投藥途徑及投藥頻率，其延遲腫瘤或癌症發作、降低其嚴重程度、抑制其進一步惡化及/或改善其至少一種跡象或症狀。替代地，在有效方案中投與重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗，該有效方案意謂以下劑量、投藥途徑及投藥頻率，其誘導針對重組融合多肽(或由核酸編碼)、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗中之異源抗原的免疫反應，或在重組細菌或李斯特菌屬菌株的情況下，誘導針對細菌或李斯特菌屬菌株自身之免疫反應。若個體已罹患腫瘤或癌症，則方案可稱作治療有效方案。若個體患上腫瘤或癌症之風險相對於一般群體而言升高，但是尚未經歷症狀，則方案可稱作預防性有效方案。在一些情況下，可以在個別患者中相對於同一患者之歷史對照或過去經歷觀測到治療性或預防性功效。在其他情況下，可在臨床前或臨床試驗中在經治療患者群體中相對於未經治療患者之對照群體證明治療性或預防性功效。舉例而言，若個別治療之患者所達成的結果比未藉由本文所描述方法治療之類似患者之對照群體中的平均結果更有利，或若在受控臨床試驗(例如，II期、II/III期或III期試驗)中在經治療患者對比對照患者中以p ＜ 0.05或0.01或甚至0.001水準證明更有利結果，則方案可視為治療性或預防性有效。 [0199] 重組李斯特菌屬菌株之例示性劑量為例如1 × 106
- 1 × 107
CFU、1 × 107
- 1 × 108
CFU、1 × 108
- 3.31 × 1010
CFU、1 × 109
- 3.31 × 1010
CFU、5-500 × 108
CFU、7-500 × 108
CFU、10-500 × 108
CFU、20-500 × 108
CFU、30-500 × 108
CFU、50-500 × 108
CFU、70-500 × 108
CFU、100-500 × 108
CFU、150-500 × 108
CFU、5-300 × 108
CFU、5-200 × 108
CFU、5-15 × 108
CFU、5-100 × 108
CFU、5-70 × 108
CFU、5-50 × 108
CFU、5-30 × 108
CFU、5-20 × 108
CFU、1-30 × 109
CFU、1-20 × 109
CFU、2-30 × 109
CFU、1-10 × 109
CFU、2-10 × 109
CFU、3-10 × 109
CFU、2-7 × 109
CFU、2-5 × 109
CFU及3-5 × 109
CFU。重組李斯特菌屬菌株之其他例示性劑量為例如1 × 107
個生物體、1.5 × 107
個生物體、2 × 108
個生物體、3 × 107
個生物體、4 × 107
個生物體、5 × 107
個生物體、6 × 107
個生物體、7 × 107
個生物體、8 × 107
個生物體、10 × 107
個生物體、1.5 × 108
個生物體、2 × 108
個生物體、2.5 × 108
個生物體、3 × 108
個生物體、3.3 × 108
個生物體、4 × 108
個生物體、5 × 108
個生物體、1 × 109
個生物體、1.5 × 109
個生物體、2 × 109
個生物體、3 × 109
個生物體、4 × 109
個生物體、5 × 109
個生物體、6 × 109
個生物體、7 × 109
個生物體、8 × 109
個生物體、10 × 109
個生物體、1.5 × 1010
個生物體、2 × 1010
個生物體、2.5 × 1010
個生物體、3 × 1010
個生物體、3.3 × 1010
個生物體、4 × 1010
個生物體及5 × 1010
個生物體。劑量可取決於患者之條件及對先前治療(若存在，不論該治療是預防性還是治療性)及其他因素之反應。 [0200] 投藥可藉由任何適合之手段。舉例而言，投藥可為非經腸、靜脈內、經口、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腦室內、腹膜內、局部、鼻內、肌肉內、眼內、直腸內、結膜、經皮、皮內、經陰道、經直腸、瘤內、癌旁、經黏膜、血管內、心室內、吸入(氣霧劑)、經鼻抽吸(噴霧)、舌下、氣霧劑、栓劑或其組合。對於鼻內投藥或藉由吸入施用，在適當載劑存在下混合且氣霧化或霧化的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗之溶液或懸浮液為適合的。此類氣霧劑可包含本文所描述的任何重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗。投藥亦可呈栓劑(例如經直腸栓劑或尿道栓劑)形式、呈用於皮下植入之丸粒(例如，經一段時間提供控制釋放)形式或呈膠囊形式。投藥亦可經由注射至腫瘤位點中或注射至腫瘤中。投藥方案可容易地基於以下因素來決定，諸如待治療之腫瘤或癌症的精確性質及類型、腫瘤或癌症之嚴重程度、個體之年齡及一般生理條件、個體之體重、個別個體之反應及其類似因素。 [0201] 投藥頻率可取決於重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗在個體中的半衰期，個體條件及投藥途徑，以及其他因素。頻率可為例如每日、每週、每月、每季度或響應於個體條件之變化或待治療腫瘤或癌症之進展的不規則時間間隔。治療時程可取決於個體條件及其他因素。舉例而言，治療時程可為若干週、若干個月或若干年(例如高達2年)。舉例而言，重複投藥(給藥)可緊隨第一治療時程進行或在數天、數週或數月之時間間隔之後進行以達成腫瘤消退或腫瘤生長抑制。評定可藉由任何已知技術測定，包括診斷方法，諸如成像技術、血清腫瘤標記分析、生檢，或腫瘤相關症狀之存在、不存在或改善。作為一個具體實例，重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗可每3週投與一次持續高達2年。在一個實例中，本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗以逐漸增加之劑量投與以便增加T效應細胞與調節性T細胞比率及產生更強效抗腫瘤免疫反應。抗腫瘤免疫反應可藉由向個體提供細胞因子，包括例如IFN-γ、TNF-α及已知增強細胞免疫反應之其他細胞因子來進一步加強。參見例如，
US 6,991,785，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0202] 一些方法可進一步包含對個體「追加」額外重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗，或多次投與該等重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗。「追加」係指向個體投與額外劑量。舉例而言，在一些方法中，投與2次追加(或總計3次接種)，投與3次追加，投與4次追加，投與5次追加，或投與6次或超過6次追加。所投與之給藥次數可取決於例如腫瘤或癌症對治療之反應。 [0203] 視情況，在追加劑接種中所用的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗與在最初「初始(priming)」接種中所用的重組融合多肽、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗相同。替代地，追加劑重組融合多肽、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗與初始重組融合多肽、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗不同。視情況，在初始及追加接種中使用相同劑量。替代地，在追加劑中使用較大劑量，或在追加劑中使用較小劑量。在初始與追加接種之間的時段可以實驗方式確定。舉例而言，在初始與追加接種之間的時段可為1週、2週、3週、4週、5週、6-8週或8-10週。 [0204] 異源初始追加策略已有效增強免疫反應及針對許多病原體提供保護。參見例如，Schneider等人(1999)Immunol. Rev.
170：29-38；Robinson (2002)Nat. Rev. Immunol
. 2：239-250；Gonzalo等人(2002)Vaccine
20：1226-1231；及Tanghe (2001)Infect. Immun
. 69：3041-3047，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。在初始及追加注射中以不同形式提供抗原可使針對抗原之免疫反應最大化。DNA疫苗初始後接用含蛋白質之佐劑追加或藉由病毒載體遞送編碼抗原之DNA追加為一種提昇抗原特異性抗體及CD4+
T細胞反應或CD8+
T細胞反應的有效方式。參見例如，Shiver等人(2002)Nature
415：331-335；Gilbert等人(2002)Vaccine
20：1039-1045；Billaut-Mulot等人(2000)Vaccine
19：95-102；及Sin等人(1999)DNA Cell Biol.
18：771-779，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。作為一個實例，當對個體用DNA初始疫苗接種後接追加表現抗原之腺病毒載體時，向編碼該抗原之DNA中添加CRL1005泊洛沙姆(poloxamer) (12 kDa，5% POE)可增強T細胞反應。參見例如
，Shiver等人(2002)Nature
415：331-335，該文獻以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。作為另一實例，可投與編碼抗原之免疫原性部分的載體構築體及包含抗原之免疫原性部分的蛋白質。參見例如，
US 2002/0165172，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。類似地，可藉由同時(例如，在同一免疫反應期間，較佳地在彼此0-10天或3-7天內)投與所關注之多核苷酸及多肽來增強核酸疫苗接種之免疫反應。參見例如
，US 6,500,432，該案以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 [0205] 本文所揭示之治療方法亦可包含投與一或多種有效預防或治療癌症之額外化合物。舉例而言，額外化合物可包含適用於化學療法之化合物，諸如安吖啶(amsacrine)、博萊黴素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、克里沙納塔斯蛋白酶(crisantaspase)、環磷醯胺、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素d (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依託泊苷(etoposide)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他濱(gemcitabine)、gliadel植入物、羥基脲、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺、伊立替康(irinotecan)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、脂質體小紅莓、脂質體道諾黴素、洛莫司汀(lomustine)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Taxol)、培美曲唑(pemetrexed)、噴司他汀(pentostatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、沙鉑(satraplatin)、鏈佐星(streptozocin)、替加氟(tegafur)-尿嘧啶、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、噻替派(thiotepa)、硫鳥嘌呤、拓樸替康(topotecan)、曲奧舒凡(treosulfan)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)或其組合。替代地，額外化合物亦可包含其他生物製劑，包括針對HER2抗原之Herceptin®
(曲妥珠單抗(trastuzumab))、針對VEGF之Avastin®
(貝伐單抗(bevacizumab))或針對EGF受體之抗體，諸如Erbitux®
(西妥昔單抗(cetuximab))及Vectibix®
(帕尼單抗(panitumumab))。替代地，額外化合物可包含其他免疫治療。替代地，額外化合物可為吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)路徑抑制劑，諸如1-甲基色胺酸(1MT)、1-甲基色胺酸(1MT)、壞死抑素-1、吡哆醛異菸鹼醯基腙、依布硒啉(Ebselen)、5-甲基吲哚-3-甲醛、CAY10581 (一種抗IDO抗體)或小分子IDO抑制劑。IDO抑制可增強化學治療劑之功效。本文所揭示之治療方法亦可與輻射(例如，強度調變放射療法(IMRT))、幹細胞治療、外科手術或任何其他治療組合。 [0206] 此類額外化合物或治療可先於投與本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗，跟隨投與本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗，或與投與本文所揭示的重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗同時。 [0207] 靶向免疫調節療法主要致力於共刺激性受體之活化，例如藉由使用靶向腫瘤壞死因子受體超家族之成員(包括4-1BB、OX40及GITR(糖皮質激素誘導之TNF受體相關))的促效劑抗體來進行。已證實在抗腫瘤及疫苗環境中調節GITR的可能性。促效劑抗體之另一目標為用於T細胞活化之共刺激性信號分子。靶向共刺激性信號分子可導致增強T細胞活化及促進更強效免疫反應。共刺激亦可幫助防止檢查點抑制產生的抑制影響及提高抗原特異性T細胞增殖。 [0208] 基於李斯特菌屬之免疫治療藉由誘導從頭產生浸潤及破壞腫瘤之腫瘤抗原特異性T細胞且藉由減低腫瘤微環境中免疫抑制調節性T細胞(Tregs)及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)的數目及活性來起作用。用於T細胞共抑制性或共刺激性受體(例如，檢查點抑制劑CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG3及共刺激劑CD137、OX40、GITR及CD40)的抗體(或其功能性片段)可具有與基於李斯特菌屬之免疫治療的協同作用。 [0209] 因此，一些方法可包含進一步投與包含免疫檢查點抑制劑拮抗劑之組成物，該免疫檢查點抑制劑拮抗劑諸如PD-1信號傳導路徑抑制劑、CD-80/86及CTLA-4信號傳導路徑抑制劑、T細胞膜蛋白質3 (TIM3)信號傳導路徑抑制劑、腺苷A2A受體(A2aR)信號傳導路徑抑制劑、淋巴細胞活化基因3 (LAG3)信號傳導路徑抑制劑、殺手免疫球蛋白受體(KIR)信號傳導路徑抑制劑、CD40信號傳導路徑抑制劑或任何其他抗原呈遞細胞/T細胞信號傳導路徑抑制劑。免疫檢查點抑制劑拮抗劑之實例包括抗PD-L1/PD-L2抗體或其片段、抗PD-1抗體或其片段、抗CTLA-4抗體或其片段或抗B7-H4抗體或其片段。舉例而言，抗PD-1抗體可以每2週5-10 mg/kg、每3週5-10 mg/kg、每3週1-2 mg/kg、每一週1-10 mg/kg、每2週1-10 mg/kg、每3週1-10 mg/kg或每4週1-10 mg/kg向個體投與。 [0210] 同樣，一些方法可進一步包含投與T細胞刺激劑，諸如與T細胞受體共刺激性分子、結合共刺激性分子之抗原呈遞細胞受體或TNF受體超家族之成員結合的抗體或其功能性片段。T細胞受體共刺激性分子可包含例如CD28或ICOS。結合共刺激性分子之抗原呈遞細胞受體可包含例如CD80受體、CD86受體或CD46受體。TNF受體超家族成員可包含例如糖皮質激素誘導之TNF受體(GITR)、OX40 (CD134受體)、4-1BB (CD137受體)或TNFR25。 [0211] 舉例而言，一些方法可進一步包含投與有效量的包含與T細胞受體共刺激性分子結合之抗體或其功能性片段或與結合共刺激性分子之抗原呈遞細胞受體結合之抗體或其功能性片段的組成物。抗體可為例如抗TNF受體抗體或其抗原結合片段(例如，TNF受體超家族成員，糖皮質激素誘導之TNF受體(GITR)、OX40 (CD134受體)、4-1BB (CD137受體)或TNFR25)、抗OX40抗體或其抗原結合片段或抗GITR抗體或其抗原結合片段。替代地，可投與其他促效性分子(例如，GITRL、GITRL之活性片段、含有GITRL之融合蛋白質、含有GITRL之活性片段的融合蛋白質、抗原呈遞細胞(APC)/T細胞促效劑、CD134或其配位體或片段、CD137或其配位體或片段、或誘導性T細胞共刺激物(ICOS)或配位體或其片段、或促效性小分子)。 [0212] 在一個具體實例中，一些方法可進一步包含投與抗CTLA-4抗體或其功能性片段及/或抗CD137抗體或其功能性片段。舉例而言，可在第一次給予重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗之後約72小時時或在第一次給予重組融合多肽、編碼重組融合多肽之核酸、重組細菌或李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗之後約48小時時投與抗CTLA-4抗體或其功能性片段或抗CD137抗體或其功能性片段。抗CTLA-4抗體或其功能性片段或抗CD137抗體或其功能性片段可以例如約0.05 mg/kg及約5 mg/kg之劑量投與。重組李斯特菌屬菌株或包含重組李斯特菌屬菌株之免疫原性組成物可以例如約1 × 109
CFU之劑量投與。一些此類方法可進一步包含投與有效量的抗PD-1抗體或其功能性片段。 [0213] 用於評定癌症免疫治療之功效的方法為熟知的，且描述於例如Dzojic等人(2006)Prostate
66(8)：831-838；Naruishi等人(2006)Cancer Gene Ther.
13(7)：658-663，Sehgal等人(2006)Cancer Cell Int.
6：21)及Heinrich等人(2007)Cancer Immunol Immunother
56(5)：725-730中，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。作為一個實例，對於前列腺癌，前列腺癌模型可為測試本文所揭示之方法及組成物，諸如TRAMP-C2小鼠模型、178-2 BMA細胞模型、PAIII腺癌細胞模型、PC-3M模型或任何其他前列腺癌模型。 [0214] 替代地或另外，可在人類個體中測試免疫治療，且可使用已知者監測功效。此類方法可包括例如直接量測CD4+及CD8+ T細胞反應，或量測疾病進展(例如，藉由測定腫瘤癌轉移之數目或大小，或監測疾病症狀，諸如咳嗽、胸部疼痛、體重減輕等等)。用於在人類個體中評定癌症免疫治療之功效的方法為熟知的，且描述於例如Uenaka等人(2007)Cancer Immun.
7：9及Thomas-Kaskel等人(2006)Int J Cancer
119(10)：2428-2434中，其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。 VI. 套組 [0215] 亦提供包含用於進行本文所揭示之方法的試劑的套組或包含本文所揭示之組成物、工具或器械的套組。 [0216] 舉例而言，此類套組可包含本文所揭示之重組融合多肽、本文所揭示的編碼重組融合多肽之核酸、本文所揭示之重組細菌或李斯特菌屬菌株、本文所揭示之免疫原性組成物、本文所揭示之醫藥組成物或本文所揭示之疫苗。此類套組可另外包含說明材料，其描述使用重組融合多肽、編碼該重組融合多肽之核酸、重組李斯特菌屬菌株、免疫原性組成物、醫藥組成物或疫苗以進行本文所揭示之方法。此類套組可視情況進一步包含施用器。儘管下文描述模型套組，但鑒於本發明揭示內容，其他適用套組之內容物將變得顯而易見。 [0217] 上文或下文引用之所有專利申請、網站、其他公開案、寄存編號及其類似物以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的，其引用程度如同各個別物件特別且個別地指示為以引用的方式併入一般。若在不同時間序列之不同版本與寄存編號相關，則意謂在本申請案之有效申請日時與寄存編號相關之版本。有效申請日意謂若適用，實際申請日或提及寄存編號之優先權申請案之申請日中的較早者。同樣，若在不同時間公開公開案、網站或其類似物之不同版本，則除非另外指明，否則意謂在本申請案之有效申請日時最近公開之版本。除非另外特別指示，否則本發明之任何特徵、步驟、元件、具體例或態樣可與任何其他組合使用。儘管出於清楚及理解之目的已藉助於說明及實施例相當詳細地描述本發明，但顯而易見可在所附申請專利範圍之範疇內實踐某些變化及修改。 具體例之清單 [0218] 本文揭示之標的包括(但不限於)以下具體例： 1. 一種重組李斯特菌屬菌株，其包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸，其中該融合多肽包含與HPV16抗原肽及HPV18抗原肽融合的含PEST之肽，其中該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽可操作地以串聯方式連接。 2. 如具體例1之重組李斯特菌屬菌株，其中，HPV16抗原肽為HPV16-E6抗原肽或HPV16-E7抗原肽，且其中，該HPV18抗原肽為HPV18-E6抗原肽或HPV18-E7抗原肽。 3. 如具體例1之重組李斯特菌屬菌株，其中，該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽彼此直接融合而無介入序列。 4. 如具體例1之重組李斯特菌屬菌株，其中，該HPV-16抗原肽及該HPV-18抗原肽經由肽連接子彼此連接。 5. 如具體例4之重組李斯特菌屬菌株，其中，該肽連接子包含SEQ ID NO：33-42中所闡述之連接子中的一或多者。 6. 如具體例1至5中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，該HPV16抗原肽為HPV16-E7抗原肽，且該HPV18抗原肽為HPV18-E7抗原肽。 7. 如具體例6之重組李斯特菌屬菌株，其中，該HPV16-E7抗原肽包含與SEQ ID NO：96至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列；且/或其中，該HPV18-E7抗原肽包含與SEQ ID NO：98至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列。 8. 如具體例7之重組李斯特菌屬菌株，其中，編碼該HPV16-E7抗原肽的開讀框之區段包含與SEQ ID NO：95至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列 且編碼SEQ ID NO：96中所闡述之肽序列，且/或其中，編碼該HPV18-E7抗原肽的該開讀框之區段包含與SEQ ID NO：97至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列 且編碼SEQ ID NO：98中所闡述之肽序列。 9. 如具體例6至8中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，包含該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽的該融合多肽之區段包含與以下序列中之任一者至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列：SEQ ID NO：100、102、104、106、108、110、112及114。 10. 如具體例9之重組李斯特菌屬菌株，其中，編碼包含該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽的該融合多肽之區段的該開讀框之區段包含與以下序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列：SEQ ID NO：99、101、103、105、107、109、111或113，且分別編碼以下中所闡述之序列：SEQ ID NO：100、102、104、106、108、110、112或114。 11. 如具體例1至5中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，該HPV16抗原肽為HPV16-E6抗原肽，且該HPV18抗原肽為HPV18-E6抗原肽。 12. 如具體例1至5中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，該HPV16抗原肽為HPV16-E6抗原肽，且該HPV18抗原肽為HPV18-E7抗原肽。 13. 如具體例1至5中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，該HPV16抗原肽為HPV16-E7抗原肽，且該HPV18抗原肽為HPV18-E6抗原肽。 14. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽進一步包含處於可操作地以串聯方式連接之該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽的N端及/或C端的一或多個肽標籤。 15. 如具體例14之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多個肽標籤包含以下中之一或多者：3×FLAG標籤；2×FLAG標籤，6×His標籤；以及SIINFEKL標籤。 16. 如具體例15之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽包含處於可操作地以串聯方式連接之該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽的N端的3×FLAG標籤及處於該等抗原肽之C端的SIINFEKL標籤。 17. 如具體例15之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽包含處於可操作地以串聯方式連接之該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽的N端的SIINFEKL標籤及處於該等抗原肽之C端的3×FLAG標籤。 18. 如具體例15之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽包含處於可操作地以串聯方式連接之該HPV16抗原肽及該HPV18抗原肽的C端的3×FLAG標籤及SIINFEKL標籤。 19. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該含PEST之肽處於該融合多肽之N端。 20. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該含PEST之肽為李斯特菌溶胞素O (LLO)蛋白或其片段或ActA蛋白或其片段。 21. 如具體例20之重組李斯特菌屬菌株，其中，該李斯特菌溶胞素O (LLO)蛋白或其片段為LLO之N端片段。 22. 如具體例21之重組李斯特菌屬菌株，其中，該LLO之N端片段具有SEQ ID NO 57-59中之任一者中所闡述的序列。 23. 如具體例20之重組李斯特菌屬菌株，其中，該含PEST之肽為該LLO蛋白或其片段且包含膽固醇結合域中之突變。 24. 如具體例23之重組李斯特菌屬菌株，其中，該LLO突變包含以下中之一者：(1) SEQ ID NO：55之殘基C484、W491或W492的取代 或當該LLO蛋白與SEQ ID NO：55最佳比對時的相對應取代；或(2)SEQ ID NO：55之殘基483-493內的1-11個胺基酸之缺失 或當該LLO蛋白與SEQ ID NO：55最佳比對時的相對應缺失。 25. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸可操作地整合至李斯特菌屬基因組中。 26. 如具體例1至24中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸處於附加型質體中。 27. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸不賦予該重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。 28. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株經減毒。 29. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。 30. 如具體例28或29之重組李斯特菌屬菌株，其中，該減毒之李斯特菌屬菌株在一或多種內源性基因中包含使該一或多種內源性基因失活之突變。 31. 如具體例30之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含prfA
。 32. 如具體例30之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含actA
。 33. 如具體例30之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含actA
及inlB
。 34. 如具體例30之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含actA
、dal
，及dat
。 35. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸包含編碼代謝酶之第二開讀框。 36. 如具體例35之重組李斯特菌屬菌株，其中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉胺酶。 37. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽自hly
啟動子、prfA
啟動子、actA
啟動子或p60
啟動子表現。 38. 如具體例37之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽自hly
啟動子表現。 39. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。 40. 如具體例1至19中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為包含prfA
之缺失或prfA中之失活突變的減毒之單核球增多性李斯特菌
菌株，其中該核酸處於附加型質體中且包含編碼D133V PrfA突變體蛋白之第二開讀框。 41. 如具體例1至19中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為包含actA
、dal
及dat
之缺失或actA、dal及dat中之失活突變的減毒之單核球增多性李斯特菌菌株，其中該核酸處於附加型質體中且包含編碼丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉胺酶之第二開讀框，且其中該含PEST之肽為LLO之N端片段。 42. 如具體例1至19中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中，重組李斯特菌屬菌株為包含actA
及inlB
之缺失或失活突變的減毒之單核球增多性李斯特菌菌株，其中該核酸經基因組整合，且其中該含PEST之肽為ActA蛋白或其片段。 43. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。 44. 如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株能夠逃脫吞噬體。 45. 一種免疫原性組成物，其包含如任一前述具體例之重組李斯特菌屬菌株。 46. 如具體例45之免疫原性組成物，其中，該免疫原性組成物進一步包含佐劑。 47. 如具體例46之免疫原性組成物，其中，該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A、dtLLO或含未甲基化CpG之寡核苷酸。 48. 一種在個體中誘導針對腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與具體例1至44中任一者之重組李斯特菌屬菌株或具體例45至47中任一者之免疫原性組成物。 49. 一種在個體中預防或治療腫瘤或癌症之方法，其包含向該個體投與具體例1至44中任一者之重組李斯特菌屬菌株或具體例45至47中任一者之免疫原性組成物。 50. 如具體例48至49中任一者之方法，其中，該方法進一步包含投與免疫檢查點抑制劑拮抗劑。 51. 如具體例50之方法，其中，該免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體或其抗原結合片段及/或抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段。 52. 如具體例48至51中任一者之方法，其中，該方法進一步包含投與T細胞刺激劑。 53. 如具體例52之方法，其中，該T細胞刺激劑包含抗OX40抗體或其抗原結合片段或抗GITR抗體或其抗原結合片段。 54. 如具體例48至53中任一者之方法，其中，該腫瘤或癌症為子宮頸腫瘤或癌症、肛門腫瘤或癌症、頭頸部腫瘤或癌症或口咽腫瘤或癌症。 55. 如具體例54之方法，其中，該腫瘤或癌症為癌轉移。 56. 如具體例48至55中任一項之方法，其中，該腫瘤或癌症為HPV-16陽性。 57. 如具體例48至55中任一項之方法，其中，該腫瘤或癌症為HPV-18陽性。 58. 一種細胞庫，其包含一或多種具體例1至44中任一者之重組李斯特菌屬菌株。 59. 如具體例58之細胞庫，其中，該細胞庫為冷凍細胞庫或凍乾細胞庫。 序列之簡要說明 [0219] 隨附序列表中列出之核苷酸及胺基酸序列係使用核苷酸鹼基之標準字母縮寫及胺基酸之三字碼展示。核苷酸序列遵循在序列之5'端開始且正向行進(亦即，在各線中自左至右)至3'端之標準公約。僅展示各核苷酸序列之一條股，但互補股理解為藉由對所呈現股之任何參考而包括在內。胺基酸序列遵循在序列之胺基端開始且正向行進(亦即，在各線中自左至右)至羧基端之標準公約。 SIINFEKL標籤 DNA v.1 (SEQ ID NO：1)： GCACGTAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGTAATAA DNA v.2 (SEQ ID NO：2)： GCACGTTCTATTATCAACTTCGAAAAACTATAATAA DNA v.3 (SEQ ID NO：3)： GCCCGCAGTATTATCAATTTCGAAAAATTATAATAA DNA v.4 (SEQ ID NO：4)： GCGCGCTCTATAATTAACTTCGAAAAACTTTAATAA DNA v.5 (SEQ ID NO：5)： GCACGCTCCATTATTAACTTTGAAAAACTTTAATAA DNA v.6 (SEQ ID NO：6)： GCTCGCTCTATCATCAATTTCGAAAAACTTTAATAA DNA v.7 (SEQ ID NO：7)： GCACGTAGTATTATTAACTTCGAAAAGTTATAATAA DNA v.8 (SEQ ID NO：8)： GCACGTTCCATCATTAACTTTGAAAAACTATAATAA DNA v.9 (SEQ ID NO：9)： GCTCGCTCAATCATCAACTTTGAAAAGCTATAATAA DNA v.10 (SEQ ID NO：10)： GCTCGCTCTATCATCAACTTCGAAAAATTGTAATAA DNA v.11 (SEQ ID NO：11)： GCTCGCTCTATTATCAATTTTGAAAAATTATAATAA DNA v.12 (SEQ ID NO：12)： GCTCGTAGTATTATTAATTTCGAAAAATTATAATAA DNA v.13 (SEQ ID NO：13)： GCTCGTTCGATTATCAACTTCGAAAAACTGTAATAA DNA v.14 (SEQ ID NO：14)： GCAAGAAGCATCATCAACTTCGAAAAACTGTAATAA DNA v.15 (SEQ ID NO：15)： GCGCGTTCTATTATTAATTTTGAAAAATTATAATAA 蛋白質(SEQ ID NO：16)： ARSIINFEKL 3×FLAG標籤 DNA v.1 (SEQ ID NO：17)： GATTATAAAGATCATGACGGAGACTATAAAGACCATGACATTGATTACAAAGACGACGATGACAAA DNA v.2 (SEQ ID NO：18)： GACTATAAAGACCACGATGGCGATTATAAAGACCATGATATTGACTACAAAGATGATGATGATAAG DNA v.3 (SEQ ID NO：19)： GATTATAAAGATCATGATGGCGACTATAAAGATCATGATATCGATTACAAAGATGACGATGACAAA DNA v.4 (SEQ ID NO：20)： GACTACAAAGATCACGATGGTGACTACAAAGATCACGACATTGATTATAAAGACGATGATGACAAA DNA v.5 (SEQ ID NO：21)： GATTACAAAGATCACGATGGTGATTATAAGGATCACGATATTGATTACAAAGACGACGACGATAAA DNA v.6 (SEQ ID NO：22)： GATTACAAAGATCACGATGGCGATTACAAAGATCATGACATTGACTACAAAGACGATGATGATAAA DNA v.7 (SEQ ID NO：23)： GATTACAAGGATCATGATGGTGATTACAAAGATCACGATATCGACTACAAAGATGATGACGATAAA DNA v.8 (SEQ ID NO：24)： GACTACAAAGATCATGATGGTGATTACAAAGATCATGACATTGATTATAAAGATGATGATGACAAA DNA v.9 (SEQ ID NO：25)： GATTATAAAGACCATGATGGTGATTATAAGGATCATGATATCGATTATAAGGATGACGACGATAAA DNA v.10 (SEQ ID NO：26)： GATTATAAAGATCACGATGGCGATTATAAAGACCACGATATTGATTATAAAGACGACGATGACAAA DNA v.11 (SEQ ID NO：27)： GACTATAAAGACCACGATGGTGATTATAAAGATCACGACATCGACTACAAAGACGATGATGATAAA DNA v.12 (SEQ ID NO：28)： GACTACAAAGATCACGACGGCGATTATAAAGATCACGATATTGACTATAAAGATGACGATGATAAA DNA v.13 (SEQ ID NO：29)： GATTATAAAGACCATGATGGAGATTACAAAGATCATGATATTGACTATAAAGACGACGACGATAAA DNA v.14 (SEQ ID NO：30)： GATTATAAAGATCACGATGGTGACTACAAAGATCACGATATCGATTATAAAGACGATGACGATAAA DNA v.15 (SEQ ID NO：31)： GACTACAAAGATCACGATGGTGATTATAAAGACCATGATATTGATTACAAAGATGATGATGACAAA 蛋白質(SEQ ID NO：32)： DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK 肽連接子 肽連接子v.1 (SEQ ID NO：33)： (GAS)n
肽連接子v.2 (SEQ ID NO：34)： (GSA)n
肽連接子v.3 (SEQ ID NO：35)： (G)n
；n = 4-8 肽連接子v.4 (SEQ ID NO：36)： (GGGGS)n
；n = 1-3 肽連接子v.5 (SEQ ID NO：37)： VGKGGSGG 肽連接子v.6 (SEQ ID NO：38)： (PAPAP)n
肽連接子v.7 (SEQ ID NO：39)： (EAAAK)n
；n=1-3 肽連接子v.8 (SEQ ID NO：40)： (AYL)n
肽連接子v.9 (SEQ ID NO：41)： (LRA)n
肽連接子v.10 (SEQ ID NO：42)： (RLRA)n
PEST樣序列 PEST樣序列v.1 (SEQ ID NO：43)： KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK PEST樣序列v.2 (SEQ ID NO：44)： KENSISSMAPPASPPASPK PEST樣序列v.3 (SEQ ID NO：45)： KTEEQPSEVNTGPR PEST樣序列v.4 (SEQ ID NO：46)： KESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLK PEST樣序列v.5 (SEQ ID NO：47)： KSEEVNASDFPPPPTDEELR PEST樣序列v.6 (SEQ ID NO：48)： RGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR PEST樣序列v.7 (SEQ ID NO：49)： KQNTASTETTTTNEQPK PEST樣序列v.8 (SEQ ID NO：50)： KQNTANTETTTTNEQPK PEST樣序列v.9 (SEQ ID NO：51)： RSEVTISPAETPESPPATP PEST樣序列v.10 (SEQ ID NO：52)： KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK PEST樣序列v.11 (SEQ ID NO：53)： KNEEVNASDFPPPPTDEELR PEST樣序列v.12 (SEQ ID NO：54)： RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR LLO蛋白 LLO蛋白v.1 (SEQ ID NO：55)：LLO蛋白v.2 (SEQ ID NO：56)：N端截短LLO蛋白v,1 (SEQ ID NO：57)：N端截短LLO蛋白v.2 (SEQ ID NO：58)：N端截短LLO蛋白v.3 (SEQ ID NO：59)：編碼N端截短LLO蛋白v.3之核酸(SEQ ID NO：60)：ActA蛋白 ActA蛋白v.1 (SEQ ID NO：61)ActA蛋白v.2 (SEQ ID NO：62)ActA片段v.1 (SEQ ID NO：63)ActA片段v.2 (SEQ ID NO：64)ActA片段v.3 (SEQ ID NO：65)ActA片段v.4 (SEQ ID NO：66)ActA片段v.5 (SEQ ID NO：67)編碼ActA片段v.5之核酸(SEQ ID NO：68)ActA片段v.6 (SEQ ID NO：69)ActA片段v.7 (SEQ ID NO：70)編碼ActA片段v.7之核酸(SEQ ID NO：71)與Hly信號肽融合之ActA片段(SEQ ID NO：72)ActA取代(SEQ ID NO：73)LLO突變 LLO之膽固醇結合域(SEQ ID NO：74)來自NY-ESO-1之HLA-A2限制性抗原決定基(SEQ ID NO：75) Dal
及Dat Lm
丙胺酸消旋酶(SEQ ID NO：76) Lm
D-胺基酸轉胺酶(SEQ ID NO：77)編碼Lm
丙胺酸消旋酶之核酸(SEQ ID NO：78)編碼Lm
D-胺基酸轉胺酶之核酸(SEQ ID NO：79) PrfA
野生型PrfA (SEQ ID NO：80)編碼野生型PrfA之核酸(SEQ ID NO：81)D133V PrfA (SEQ ID NO：82)編碼D133V PrfA之核酸(SEQ ID NO：83)4×甘胺酸連接子DNA序列 G1 (SEQ ID NO：84)G2 (SEQ ID NO：85)G3 (SEQ ID NO：86)G4 (SEQ ID NO：87)G5 (SEQ ID NO：88)G6 (SEQ ID NO：89)G7 (SEQ ID NO：90)G8 (SEQ ID NO：91)G9 (SEQ ID NO：92)G10 (SEQ ID NO：93)G11 (SEQ ID NO：94)雙重HPV插入序列 編碼16 E7之核酸(SEQ ID NO：95)16 E7 (SEQ ID NO：96)編碼18 E7之核酸(SEQ ID NO：97)18 E7 (SEQ ID NO：98)編碼HPV16 E7-HPV18E7插入物之核酸(SEQ ID NO：99)HPV16 E7-HPV18E7插入物(SEQ ID NO：100)編碼16 E7-4×Gly-18 E7之核酸(SEQ ID NO：101)16 E7-4×Gly-18 E7 (SEQ ID NO：102)編碼16 E7-18 E7-3×FLAG之核酸(SEQ ID NO：103)16 E7-18 E7-3×FLAG (SEQ ID NO：104)編碼16 E7-4×Gly-18 E7-3×FLAG之核酸(SEQ ID NO：105)16 E7-4×Gly-18 E7-3×FLAG (SEQ ID NO：106)編碼16 E7-18 E7-SIINFEKL之核酸(SEQ ID NO：107)16 E7-18 E7-SIINFEKL (SEQ ID NO：108)編碼16 E7-4×Gly-18 E7-SIINFEKL之核酸(SEQ ID NO：109)16 E7-4×Gly-18 E7-SIINFEKL (SEQ ID NO：110)編碼16 E7-18 E7-3×FLAG-SIINFEKL之核酸(SEQ ID NO：111)16 E7-18 E7-3×FLAG-SIINFEKL (SEQ ID NO：112)編碼16 E7-4×Gly-18 E7-3×FLAG-SIINFEKL之核酸(SEQ ID NO：113)16 E7-4×Gly-18 E7-3×FLAG-SIINFEKL (SEQ ID NO：114)dtLLO輔助序列 解毒化李斯特菌溶胞素O (dtLLO) (SEQ ID NO：115)實施例 實施例1. 在AXAL之2期研究GOG-0265中，十二個月總存活率與基因型之關係 [0220] GOG-0265為單一組別、開放標記之2期多中心研究(NCT01266460)，其被設計成在標準西蒙兩期設計(standard Simon two-stage design)中評估axalimogene filolisbac (AXAL)在患有持續或復發轉移性(鱗狀或非鱗狀細胞)子宮頸癌(PRmCC)之患者中的安全性及活性。AXAL為活減毒之單核球增多性李斯特菌(Lm
)，其經生物工程改造以分泌與李斯特菌溶胞素O之截短片段(tLLO)融合的HPV16 E7蛋白質。AXAL靶向經HPV轉型之細胞，從而在腫瘤微環境中誘導抗腫瘤T細胞免疫性且破壞免疫耐受性。研究之第一階段包括六名患者之安全性導入(run-in)且有26名患者入選。第二階段有24名患者入選。 [0221] 對入選GOG-0265之50名患者中的36人之樣品進行HPV基因分型。在患者中的4人中，DNA太差而無法進行基因分型，且在1名患者中，DNA量不足。對患者中之9人未能獲得DNA。在患者中之4人中未偵測到HPV。在剩餘32名患者中，14人對α9家族之HPV為陽性(12名患者對HPV16為陽性；2名患者對HPV33為陽性)，16名患者對α7家族之HPV為陽性(12名患者對HPV18為陽性；4名患者對HPV45為陽性)，且2名患者對α7家族之HPV及α9家族之HPV為陽性(1名患者對HPV16及HPV18兩者陽性，且1名患者對HPV16及HPV45兩者陽性)。 [0222][0223] 總體而言，在所有50名患者中之12個月存活率為38% (19/50)，對α9家族之HPV (HPV16或HPV33)測試為陽性之患者的12個月存活率為57% (14名患者中之8人)，對α7家族之HPV (HPV18或HPV45)測試為陽性之患者的12個月存活率為38% (16名患者中之6人)，且確認為HPV陽性(亦即，去除HPV陰性患者或未能獲得DNA樣品或可獲得較差品質或不足DNA樣品的患者)為44% (36名患者中之15人)。 [0224] 基於入選研究中之患者(n=50)的方案定義預後因子，將預期12個月存活率為25%。將此25%之12個月總存活率與在總研究群體中實際上觀測到的38%之12個月總存活率相比較，用AXAL處理引起預期12個月總存活率增加52%。 [0225] AXAL經生物工程改造以分泌來自HPV16之E7蛋白質。對HPV16呈陽性之患者的12個月總存活率為57%，其顯著地高於預期25%總存活率，與AXAL誘導針對經HPV16轉型之細胞的抗腫瘤免疫反應一致。然而，出乎意料地，儘管事實上HPV16 E7蛋白質與HPV18 E7蛋白質僅42%一致，但對HPV16未測試為陽性而對HPV18或HPV45 (並非HPV16或甚至不與HPV16處於同一HPV家族中之HPV類型)測試為陽性之患者的12個月總存活率為38%，其比25%之預期12個月總存活率增加52%。 實施例2. 構築Lm-LLO-HPV16 E7-HPV18 E7 [0226] 因為HPV16及HPV18僅極少見於同一患者中，所以先前並未意欲將HPV16 E7及HPV18 E7蛋白質兩者一起放在單一免疫治療載體中。然而，鑒於實施例1中所示的出乎意料之結果，將藉由以下來產生表現HPV16 E7及HPV18 E7兩者之李斯特菌屬菌株，將SEQ ID NO：99、101、103、105、107、109、111及113中之任一者接合至處於編碼tLLO蛋白之基因下游且與該基因融合的pGG55或基於pGG55之質體中，該pGG55或基於pGG55之質體的表現由hly啟動子驅動。SEQ ID NO：99、101、103、105、107、109、111及113中所闡述之插入物及其相應編碼之肽提供於表2中。 [0227][0228] 所得質體將電穿孔至適合之李斯特菌屬菌株中。一種適合之李斯特菌屬菌株為缺乏Lm
轉錄激活子PrfA之菌株XFL-7、基於XFL-7之李斯特菌屬菌株或缺乏prfA
之類似李斯特菌屬菌株。HPV18 E7蛋白質之較小尺寸(105個胺基酸；SEQ ID NO：96)及HPV16 E7蛋白質之較小尺寸(97個胺基酸；SEQ ID NO：98)使得有可能產生活減毒之單核球增多性李斯特菌(Lm
)，其經生物工程改造以即使在受平台大小限制的情況下，仍分泌以串聯方式與HPV16 E7及HPV18 E7融合之tLLO蛋白。 [0229] 其他適合之李斯特菌屬菌株描述於例如WO-2009/143167、WO-2016/011353、WO-2016/011320、WO-2010/102140、WO-2011/060260、WO-2013/025925、WO-2015/130810、WO-2015/167748、WO-2012/138377、WO-2012/125551、WO-2016/126876、WO-2013/138337、WO-1996-014087、WO-2006-036550、WO-2008/140812、WO-1999/025376、WO-2001/072329、WO-2007/106476、WO-2007/130455、WO-2008/109155、WO-2010/008782、WO-2004-062597、WO-2015/164121、WO-2015/126921、WO-2015/134722、WO-2016/061182、WO-2016/011362、WO-2016/100924、WO-2016/011357、WO-2016/061277、WO-2016/100929、WO-2016/141121、WO-2016/126878、WO-2016/183361、WO-2016/191545、WO-2006/017856、WO-2008/130551、US-2011/0129499、US-2012/0135033、US-2014/0234370、US-2014/0335120、US-2015/0098964、US-2015/0366955、US-2016/0361401、US-6,051,237、US-6,099,848、US-6,767,542、US-6,855,320、US-7,635,479、US-7,662,396、US-7,794,729、US-7,820,180、US-8,114,414、US-8,337,861、US-8,771,702、US-8,778,329、US-8,791,237、US-9,012,141、US-9,017,660、US-9,017,660、US-9,226,958、US-9,463,227以及PCT申請案第PCT/US2016/051748、PCT/US2016/052322及PCT/US2016/057220號，其藉此以引用之方式併入本文中。 實施例3. ADXS-DUAL (ADXS-602)之活體內實驗 [0230] 使用鼠類HPV+ TC-1腫瘤模型來測試ADXS-DUAL (ADXS-602)控制腫瘤生長及延長動物存活期之能力，該ADXS-DUAL (ADXS-602)表現含有來自HPV-16及HPV-18兩者之E7蛋白質的融合蛋白質。TC-1腫瘤細胞來源於C57BL/6肺上皮細胞系，該細胞系經HPV 16之E6及E7不朽化且經活化ras致癌基因轉型。為了確立原發性腫瘤，將1 × 105個TC-1細胞皮下注射在C57BL/6小鼠之側腹後部中，且使其成長5天，隨後開始治療。帶有腫瘤之小鼠以每週時間間隔接受1 × 108 CFU ADXS-602、1 x 108 CFU XFL7 (缺乏腫瘤相關抗原的ADXS-602之親本菌株)或PBS，持續總計3次給藥(參見圖1)。每週兩次量測腫瘤體積[(長度 × 寬度 × 寬度)/ 2]。殺死腫瘤體積接近2000 mm3之小鼠。 [0231] 當與PBS及XFL-7 (空Lm)載體相比時，ADXS-DUAL展示顯著腫瘤控制(圖2)及存活率(圖3)反應。