JP2021516972A - Listeria株の弱毒化および感染性を評価するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2018年3月9日に出願された米国出願第62/640,855号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
ファイル528092_SeqListing_ST25.txtに記述された配列表は、89キロバイトで、2019年2月25日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーが含まれる。
Listeriaに基づく免疫療法の細胞内成長を分析するために分化したTHP−1細胞を使用する細胞に基づくアッセイが、本明細書に開示される。そのようなアッセイは、例えば、野生型Listeriaと比較した組換えListeria株の弱毒化を評価するため、または組換えListeria株の効力もしくは感染力を評価するために使用することができる。
細菌の弱毒化および/または感染力を評価するための方法および組成物が、提供される。いくつかの実施形態では、細菌は、Listeria株である。いくつかの実施形態では、Listeria株は、Listeria monocytogenes株である。いくつかの実施形態では、L.monocytogenes株は、変異、組換え、または弱毒化L.monocytogenes株である。そのような方法で使用することができる組換えListeria株の例は、本明細書の他の箇所でより詳細に提供されている。そのような方法は、マクロファージ表現型を有するマクロファージ細胞株またはマクロファージ様細胞株を利用する。そのような細胞は、不死化細胞であり得る。例えば、細胞株は、THP−1細胞などのヒト単球細胞株であり得る。THP−1は、急性単球性白血病(M5サブタイプ)の小児症例の末梢血に由来する、自然に不死化した単球様細胞株を示す。THP−1細胞は、例えば、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(一般的にPMAまたはTPAとして知られている)を使用して、マクロファージ様細胞に分化させることができる。
本明細書に開示される方法は、Listeria株などの細菌株の弱毒化および感染性を評価する。そのような細菌株は、組換え細菌株であり得る。そのような組換え細菌株は、本明細書に開示される組換え融合ポリペプチド、または本明細書の他の箇所で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。好ましくは、細菌株は、Listeria株、例えば、Listeria monocytogenes(Lm)株である。Lmは、ワクチンベクターとして、いくつかの固有の利点を有する。この細菌は、特別な要件なしで非常に効率的にインビトロで成長し、グラム陰性菌、例えば、Salmonellaにおいて主要な毒性因子であるLPSが欠如している。抗生物質で容易に除去され得、重篤な有害作用の場合、一部のウイルス性ベクターと異なり、宿主ゲノムへの遺伝物質の組み込みが起こらないため、遺伝子操作で弱毒化されたLmベクターも追加の安全性を示す。
本明細書に開示される組換え細菌株(例えば、Listeria株)は、本明細書に開示される組換え融合ポリペプチド、または本明細書の他の箇所で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
本明細書に開示される組換え細菌株(例えば、組換えListeria株)を、弱毒化することができる。「弱毒化」という用語は、宿主動物において疾患をもたらす細菌の能力の減退を包含する。例えば、弱毒化Listeria株の病原特性は、野生型Listeriaと比較して低下していてもよいが、弱毒化Listeriaを、培養において成長および維持することができる。例として、弱毒化ListeriaでのBALB/cマウスの静脈内接種を用いると、いくつかの実施形態では、接種動物の50%が生き残る致死量(LD50)が、野生型ListeriaのLD50を超えて、少なくとも約10倍、少なくとも約100倍、少なくとも約1,000倍、少なくとも約10,000倍、または少なくとも約100,000倍増加する。したがって、Listeriaの弱毒化株は、投与される動物を死滅させないものであるか、または投与される細菌の数が同じ動物を死滅させるために必要であろう野生型非弱毒化細菌の数よりもかなり多い場合にのみ、動物を死滅させるものである。弱毒化細菌はまた、その成長に必要とされる栄養素がそこに存在しないため、一般の環境では複製することができないものを意味すると解釈されるべきである。したがって、細菌は、必要な栄養素が供給される制御された環境での複製に限定される。弱毒化株は、制御されていない複製ができないという点において、環境的に安全である。
弱毒化を、任意の公知の手段によって達成することができる。例えば、そのような弱毒化株は、1つ以上の内因性病原性遺伝子または1つ以上の内因性代謝遺伝子を欠損し得る。そのような遺伝子の例は、本明細書に開示されており、弱毒化を、本明細書に開示されている遺伝子のうちのいずれか1つまたは任意の組み合わせの不活性化によって達成することができる。不活性化は、例えば、欠失によって、または変異(例えば、不活性化変異)によって達成することができる。「変異」という用語は、配列(核酸またはアミノ酸配列)に対する任意の種類の変異または修飾を含み、欠失、切断、挿入、置換、分裂、または転座を包含し得る。例えば、変異には、フレームシフト変異、タンパク質の未成熟終止をもたらす変異、または遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列の変異が含まれ得る。組換えDNA技法を使用するか、または変異原性化学物質または放射線を使用し、その後に変異体を選択する従来の変異誘発技術を使用して、変異誘発を達成することができる。復帰変異の低い確率を伴うため、欠失変異が好ましいことがある。「代謝遺伝子」という用語は、宿主細菌によって利用されるか、または必要とされる栄養素の合成に関係するか、またはそのために必要とされる酵素をコードする遺伝子を指す。例えば、酵素は、宿主細菌の持続的増殖に必要とされる栄養素の合成に関係し得るか、またはそれに必要とされ得る。「病原性」遺伝子という用語は、生物のゲノムにおけるその存在または活性が生物の病原性(例えば、生物が宿主においてニッチのコロニー形成を達成することができること(細胞への結合を含む))、免疫回避(宿主の免疫応答の回避)、免疫抑制(宿主の免疫応答の阻害)、細胞への侵入およびそこからの脱出、または宿主からの栄養取得)に寄与する遺伝子を含む。
本明細書に開示される弱毒化細菌またはListeria株は、弱毒化変異を相補する(例えば、栄養素要求Listeria株の栄養素要求を相補する)相補的遺伝子を含む、または代謝酵素をコードする核酸をさらに含み得る。例えば、本明細書に開示される融合ポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレームを有する核酸は、相補的遺伝子を含むか、または相補的代謝酵素をコードする第2のオープンリーディングフレームをさらに含み得る。あるいは、第1の核酸は、融合ポリペプチドをコードし得、別の第2の核酸は、相補的遺伝子を含むか、または相補的代謝酵素をコードし得る。
本明細書に開示される組換え細菌またはListeria株における組換え融合ポリペプチドは、任意の形態であり得る。いくつかのそのような融合ポリペプチドは、1つ以上の疾患関連抗原ペプチドに融合したPEST含有ペプチドを含むことができる。他のそのような組換え融合ポリペプチドは、1つ以上の疾患関連抗原ペプチドを含むことができ、融合ポリペプチドは、PEST含有ペプチドを含まない。
疾患関連ペプチドには、特定の疾患で発現するタンパク質由来のペプチドが含まれる。例えば、そのようなペプチドは、疾患組織で発現されるが、対応する正常組織では発現されない、または疾患組織で異常に高いレベルで発現されるタンパク質に由来し得る。本明細書で使用される「疾患」という用語は、「障害」および「状態」(医学的状態など)と一般的に同義であることを意図し、互換的に使用され、それらはすべて、ヒトもしくは動物の体の異常な状態、または正常な機能を害するその一部のうちの1つの異常な状態を反映し、該用語は、典型的に、兆候および症状を区別することに明らかになり、ヒトまたは動物に生命の存続時間または生活の質の低下を引き起こす。疾患関連抗原ペプチドの例には、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7またはE6、前立腺特異抗原(PSA)、キメラHer2抗原、Her2/neuキメラ抗原が含まれ得る。ヒトパピローマウイルスは、HPV16またはHPV18であり得る。抗原ペプチドはまた、タンデムに作動可能に連結されたHPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原、HPV18 E6抗原、HPV18 E7抗原、またはHPV抗原ペプチドにタンデムに作動可能に連結されたHPV16抗原ペプチドを含み得る。
本明細書に開示される組換え融合タンパク質は、PEST含有ペプチドを含む。PEST含有ペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端(N末端)末端(すなわち、抗原ペプチドに対してN末端)にあってもよいか、融合ポリペプチドのカルボキシ末端(C末端)末端(すなわち、抗原ペプチドに対してC末端)にあってもよいか、または抗原ペプチド内に埋め込まれていてもよい。一部の組換えListeria株および方法では、PEST含有ペプチドは、融合ポリペプチドの一部ではなく、それから離れている。LLOペプチドなどのPEST様配列への抗原ペプチドの融合は、抗原ペプチドの免疫原性を増強することができ、細胞媒介性および抗腫瘍免疫応答を増加させることができる(すなわち、細胞媒介性および抗腫瘍免疫を増加させる)。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるSingh et al.(2005)J Immunol 175(6):3663−3673を参照のこと。
本明細書に開示される組成物および方法で利用することができるPEST含有ペプチドの一例は、リステリオリシンO(LLO)ペプチドである。LLOタンパク質の例は、GenBankアクセッション番号P13128(配列番号55;核酸配列は、GenBankアクセッション番号X15127に記載されている)に割り当てられているタンパク質である。配列番号55は、シグナル配列を含むプロタンパク質である。プロタンパク質の最初の25アミノ酸は、シグナル配列であり、細菌によって分泌されるとLLOから切断され、それによって、シグナル配列を含まない504アミノ酸の全長活性LLOタンパク質が生じる。本明細書に開示されるLLOペプチドは、シグナル配列を含み得るか、またはシグナル配列を含まないペプチドを含み得る。使用することができる例示的なLLOタンパク質は、配列番号55に記載される配列、または配列番号55のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、およびアイソフォームの断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。LLOタンパク質の断片またはLLOタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、ホモログの断片、バリアントの断片、または類似体の断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同LLOタンパク質は、例えば、70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、または99%を超える参照LLOタンパク質との配列同一性を有し得る。
本明細書に開示される組成物および方法で利用することができるPEST含有ペプチドの別の例は、ActAペプチドである。ActAは、表面関連タンパク質であり、細胞質全体にListeria monocytogenesを推進するために、感染宿主細胞においてスキャフォールドとして作用して、宿主アクチンポリマーの重合、構築、および活性化を促進する。哺乳動物細胞のサイトゾルへの侵入後すぐに、L.monocytogenesは、宿主アクチンフィラメントの重合を誘導し、アクチン重合によって生じる力を使用して、初めは細胞内に、次いで細胞から細胞へと移動する。ActAは、アクチン核形成およびアクチンをベースとする運動性の媒介を担う。ActAタンパク質は、多数の結合部位を宿主細胞骨格成分に提供し、それによって、細胞のアクチン重合機構を構築するためのスキャフォールドとして作用する。ActAのN末端は、モノマーのアクチンに結合し、固有のアクチン核形成活性を刺激することによって、構成的活性型核形成促進因子として作用する。actAおよびhly遺伝子は両方とも、転写活性化因子PrfAによって調節される10kb遺伝子クラスターのメンバーであり、actAは、哺乳動物サイトゾルにおいて約226倍に上方制御される。ActAタンパク質またはActAタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、ホモログの断片、バリアントの断片、または類似体の断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同ActAタンパク質は、例えば、70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、または99%超の参照ActAタンパク質との配列同一性を有し得る。
本明細書に開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物またはそれを含む組成物を生成するための方法も本明細書で提供する。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含める抗原ペプチドを選択および設計すること(ならびに、例えば、各抗原ペプチドのハイドロパシーを試験すること、および選択されたハイドロパシー指数の閾値を超えるスコアを示す場合、抗原ペプチドを修飾または除外すること)、選択された抗原ペプチドのそれぞれを含む1つ以上の融合ポリペプチドを設計すること、ならびに融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成することを含み得る。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかを行う際に利用される1つ以上の試薬を含むキット、または本明細書に開示される組成物、ツール、もしくは装置のうちのいずれかを含むキットも提供される。
本明細書に開示される主題には、以下の実施形態が含まれるが、これらに限定されない。
(a)分化したTHP−1細胞を試験Listeria株に感染させることであって、THP−1細胞が試験Listeria株に感染する前にマクロファージに分化している、感染させることと、
(b)THP−1細胞を溶解し、寒天上で溶解物を播種することと、
(c)寒天上での成長によりTHP−1細胞内で増殖したListeriaを計数することと、を含む、方法。
(a)THP−1細胞を分化することと、
(b)分化したTHP−1細胞を試験細菌株に感染させることであって、感染が、
(i)分化したTHP−1細胞を試験細菌株に接種することと、
(ii)試験細菌株を分化したTHP−1細胞で1〜5時間インキュベートして、感染したTHP1細胞を形成することと、
(iii)感染したTHP−1細胞から細胞外細菌を除去することと、
(iv)感染したTHP−1細胞を成長培地中で0〜10時間インキュベートすることと、を含む、感染させることと、
(c)感染したTHP−1細胞を溶解して、溶解物を形成することと、
(d)溶解物または溶解物の希釈物を、細菌の成長を支持することができる培地を含むプレート上で藩種することと、
(e)プレート上の細菌のコロニー形成単位を計数することと、を含む、方法。
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端から始まって先へ(すなわち、各行で左から右へ)進み3’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の1本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ(すなわち、各行で左から右へ)進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
この実施例は、野生型Listeria monocytogenesおよび弱毒化された組換えListeria monocytogenesの感染率および/または細胞内成長を定量化するための方法を提供する。分化したTHP−1細胞を使用する細胞に基づくアッセイは、Listeriaに基づく免疫療法の細胞内成長を分析するために使用され、ブレインハートインフュージョン寒天上での成長による感染後の細菌を定量化する。いくつかの実施形態では、記載された手順は、ADXS11−001または他のListeria株のサンプルに適用される。
このアッセイで使用する前に、BHIプレートを目視検査して、巨視的なコンタミネーションがないこと、および寒天が広がっていることを確認することができる。プレートは、野生型10403SおよびADXS11−001でストリーキングし、37℃で24時間インキュベートすることによって、成長の適合性を確認することができる。コロニーは、野生型およびADXS11−001の両方で可視的であり得る。
完全なRPMI(c−RPMI)
1.445mLのRPMIに、(1)50mLのFBS−照射済み、(2)5mLのL−グルタミン(200mM)を添加する。
2.ラベルを貼って、5±3℃で保存する。有効期限は、調製日から1カ月である。
1.6mMのPMA(ホルボール−12−ミリステート13−アセテート)
1.最終濃度が1.6mMのPMAになるように、1mLのDMSOに1mgのPMAを再構成する。
2.枯渇するまでマイクロ遠心チューブに10μLを分注する。
3.ラベルを貼って、−20±10℃で保存する。有効期限は、調製日から6カ月である。
25μg/mLのクロラムフェニコール
1.最終濃度が25μg/mLのクロラムフェニコールになるように、20mLの100%エタノールに0.5gのクロラムフェニコールを再構成する。
2.ラベルを貼って、−20±10℃で保存する。有効期限は、調製日から1カ月である。
100μg/mLのストレプトマイシン
1.最終濃度が100μg/mLのストレプトマイシンになるように、40mLの滅菌水に4gのストレプトマイシンを再構成する。0.2ミクロンフィルターを使用して滅菌する。枯渇するまで1.5mLのチューブに1mLを分注する。
2.ラベルを貼って、−20±10℃で保存する。有効期限は、調製日から1カ月である。
ブレインハートインフュージョン寒天+25μg/mLのクロラムフェニコール
1.開始する前に、BHIプレートに製造上の欠陥(コンタミネーション、プレートの破損、不均一な寒天など)がないことを確認する。
2.180μLの滅菌PBSおよび20μLのクロラムフェニコール(25mg/mL)を、ブレインハートインフュージョン寒天プレートに加え、滅菌スプレッダーを使用してプレートの表面全体を覆うように広げる。すべての液体が寒天プレートによって吸収されるまで広げる。
3.1つを超えるプレートを調製する場合、クロラムフェニコールの作業材料を調製することができ(PBSの場合は180μL×プレート数、クロラムフェニコールの場合は20μL×プレート数)、各プレートに200μLを加え、滅菌スプレッダーを使用して広げる。
4.BHI+25μg/mLのクロラムフェニコールプレートの有効期限は、製造業者によるプレートの有効期限、またはクロラムフェニコール材料の有効期限のいずれか早い方になる。
ブレインハートインフュージョン寒天+100μg/mLのストレプトマイシン
1.開始する前に、BHIプレートに製造上の欠陥(コンタミネーション、プレートの破損、不均一な寒天など)がないことを確認する。
2.180μLの滅菌PBSおよび20μLのストレプトマイシン(100mg/mL)を、ブレインハートインフュージョン寒天プレートに加え、滅菌スプレッダーを使用してプレートの表面全体を覆うように広げる。すべての液体が寒天プレートによって吸収されるまで広げる。
3.1つを超えるプレートを調製する場合、ストレプトマイシンの作業材料を調製することができ(PBSの場合は180μL×プレート数、ストレプトマイシンの場合は20μL×プレート数)、各プレートに200μLを加え、滅菌スプレッダーを使用して広げる。
4.BHI+100μg/mLのストレプトマイシンプレートの有効期限は、製造業者によるプレートの有効期限、またはストレプトマイシン材料の有効期限のいずれか早い方になる。
陰性/滅菌対照
1.未接種:各3枚のプレート、BHI寒天+100μg/mLのストレプトマイシンおよびBHI寒天+25μg/mLのクロラムフェニコール。
2.接種:各3枚のプレート、BHI寒天+100μg/mLのストレプトマイシンおよびBHI寒天+25μg/mLのクロラムフェニコール、それぞれ100μLのPBSを接種
陽性対照
1.野生型:BHI寒天+100μg/mLのストレプトマイシン上でListeria monocytogenes(PHE Culture Collections 10403S)でストリークされた2つのプレート。
2.ADXS11−001:ADXS11−001参照標準でストリークされた2つのプレートは、BHI寒天+25μg/mLのクロラムフェニコール上で陽性対照として機能する
1.手順ステップ3の必要に応じて、THP−1細胞の十分なバイアルを解凍する。
2.解凍後少なくとも2回の副次継代。いくつかの実施形態では、THP−1細胞は、継代数32未満である。
3.すでに培養中のTHP−1細胞は、適切な細胞培養の参照を用いたアッセイに使用することができる。
4.c−RPMI中に1.0×106細胞/mLの濃度で40mLの細胞を調製する。細胞計数を決定する。
5.24ウェルプレートの2つの各ウェルに、1mLの細胞懸濁液を添加する(一例については、別表2の表9のプレートマップを参照)。ウェルに「PMAなし」のラベルを貼る。残りの細胞懸濁液(約34mL)に、16μMのPMA(34μL)を加え、最終濃度が約16nMのPMAになる。よく混ぜる。
6.ウェルあたり1mLを、合計10ウェルに分配する(例えば、別表2の表9のプレートマップを参照)。
7.36±1℃、5±1%CO2で一晩(16〜20時間)インキュベートする。
1.必要に応じて、陽性対照の野生型L.monocytogenesまたは参照標準またはサンプルL.monocytogenesの1つのバイアルを取得する。
2.バイアルを完全に解凍するために、36±2℃で1分間インキュベートした後、室温で5分間までインキュベートする。
3.総体積を、それぞれラベル付けされた1.5mLの遠心チューブにシリンジおよび針で移す。
4.1.0mLを、それぞれラベル付けされた1.5mLの遠心チューブに移す。残留物を廃棄する。
5.マイクロ遠心分離機を2分間使用して、1.0mLの細胞を16,100×gでペレット化する。上清を廃棄し、1.0mLの室温のc−RPMIで細胞を再懸濁する。c−RPMIを使用して、最終濃度が1.0×106CFU/mLになるように細菌の希釈液を調製する。この濃度での最終容量は、約15mLである。
6.THP−1細胞を含む24ウェルプレートを得る。ウェルに、必要に応じて、野生型としてまたはサンプル番号を有するラベルを貼る。
7.顕微鏡下で細胞を観察し、PMAで処理した細胞と未処理の細胞の違いを確認する。未処理の細胞は、軽く振ると流動性を示す。処理した細胞は、軽く振ると付着したままになる。
8.ピペットを使用して、PMA処理細胞を含むすべてのウェルから培地を吸引する(真空補助装置を使用することができる)。
9.1.0mLの調製した細菌(ステップ6;1×106CFU/mL)を、プレートのウェルに移す。
10.顕微鏡でプレートを観察し、THP−1細胞がまだウェルの表面に付着していることを確認する。
11.プレートを、36±2℃、5±1%CO2でインキュベートする。インキュベーション開始時間を記録する。プレートを、次の操作の前に2時間インキュベートする。
12.細菌の1×106CFU/mL希釈液の生存率テストを実行する(p−2と示される)。別表1に概説されている手順を利用する。別表1で概説されている希釈スキームを利用する。別表1に概説されている陽性および陰性対照を調製する。
13.試験L.monocytogenesサンプル(ADXS11−001など)を使用して、ステップ1〜12を繰り返す。
1.20μg/mLのゲンタマイシンを含むc−RPMIを調製する。
2.2時間後、野生型またはサンプルを含むプレートを、36±2℃、5±1%CO2のインキュベーション条件から除去する。
3.ピペットを使用して、各ウェルからL.monocytogenesを含有する培地を除去する(真空補助装置を使用することができる)。
4.20μg/mLのゲンタマイシンを含有する調製したc−RPMIをウェルあたり1mLを慎重に分注し、破壊を避けるためにウェルの側面にゆっくりと加える。
5.プレートを42〜45分間のインキュベーション条件(36±2℃、5±1%CO2)に戻す。
6.プレートをインキュベーション条件から除去する。
7.ピペットを使用して、各ウェルから20μg/mLのゲンタマイシンを含有するc−RPMIを除去する(真空補助装置を使用することができる)。
8.ウェルごとにゲンタマイシンを含まない1mLのc−RPMIを添加し、破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加することによって、細胞を慎重に洗浄する。
9.ピペットを使用して、各ウェルからc−RPMIを除去する(真空補助装置を使用することができる)。
10.(ゲンタマイシンを含まない)1mLのc−RPMIを、破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加することによって、各ウェルに慎重に分注し、プレートを36±2℃、5±1%CO2で5〜15分間のインキュベーション条件に戻す。
11.参照標準を含むプレートを使用して、ステップ1〜10を繰り返し、サンプル(例えば、ADXS11−001)を含むプレートを使用して、繰り返す。
1.プレートをインキュベーション条件から除去し、時間を記録する。最初の時点は、p0である。その後の時点は、p3(3時間)および任意にp5(5時間)で得られる。
2.ウェルを顕微鏡下で観察する。各ウェル中のPMA処理THP−1細胞の層が一貫し、前の吸引ステップおよび分注ステップで細胞が最小限からまったく除去されていないことを確認する。任意のウェルにTHP−1細胞の有意な消失があることが観察された場合、ウェルに「X」で印を付け、それを使用しないようにする。
3.時点「p0」の収集に使用するために、ウェルを1つ選択する。
4.ピペットを用いて吸引することによって、選択したウェルからc−RPMIを除去する(真空補助装置を使用することができる)。
5.ウェルに1mLの滅菌水を分注し、マイクロピペットを使用して、上下にピペッティングすることによって、ウェルの表面からTHP−1細胞を取り除く。
6.内容物全体を1.5mLの遠心チューブに移す。
7.細胞が正常に除去されたことを確認するために、ウェルを顕微鏡下で観察する。THP−1細胞のかなりの部分が残っている場合、1.5mLのチューブにあらかじめ移した滅菌水の一部を利用して、上下にピペッティングすることによって、細胞を取り除く。内容物を1.5mLのチューブに戻し、THP−1細胞が除去されたことを、顕微鏡を介して確認する。
8.次の時点の収集の準備ができるまで、プレートをインキュベーション条件(36±2℃、5±1%CO2)に戻す。
9.チューブを少なくとも1分間ボルテックスする。
10.生存率試験を実行する。別表1に概説されている手順を利用する。別表1の表8で概説されている希釈スキームを利用する。
11.参照標準を含むプレートを使用して、ステップ1〜10を繰り返し、サンプル(例えば、ADXS11−001)を含むプレートを使用して、繰り返す。
1.野生型に対するサンプルの比率としての取り込み(p−2/p0)。
2.野生型に対するサンプルの比率としての細胞内成長(p3/p0)。
1.生存率試験を開始する前に、すべての寒天プレートが十分に乾燥していることを確認する。
2.以下の陰性対照を調製する:(1)適切な寒天タイプの3つの非接種プレート、および(2)100μLのPBSを接種し、滅菌スプレッダーで広げた適切な寒天タイプの3つのプレート。
3.最大速度で60秒間、THP−1細胞の1.0mLのアリコートをボルテックスする。代わりに、p−2時点の生存率は、PBSで調製した1.0×106CFU/mLの希釈液を利用する。
4.連続希釈は、L.monocytogenesの細胞型(野生型またはサンプル)および試験した時点に基づいて調製される。表8を参照のこと。連続希釈は、100μLのボルテックスした1.0mLのアリコートを、900μLのPBSに移すことによって調製した。このプロセスは、必要とされるすべての希釈が得られるまで繰り返す。
5.各希釈液の接種材料は、滅菌スプレッダーを用いて適切な寒天タイプに3重に広げる。
6.以下の陽性対照を調製する。適切な陽性対照を、適切な寒天上に、10μLの接種ループを用いて2重接種する。
7.各プレートは、液体を吸収し、蓋をして少なくとも15分間乾燥させてから、裏返し、35〜38℃のインキュベーターに入れる。
8.16〜24時間後、プレートをインキュベーション条件から除去する。各時点でのすべてのListeria monocytogenes細胞種(野生型およびサンプル)が同じ期間インキュベートされることを確認する。
9.コロニー形成単位(CFU)の総数は、手動で計数され、各希釈液の各プレートについて記録する。
この適格性研究は、実施例1に記載される方法が、野生型Listeria monocytogenes(Lm)と比較したADXS11−001製剤の弱毒化を定量化するために使用され得ることを実証するために行われた。この方法では、ヒトTHP−1細胞を利用し、THP−1細胞におけるADXS11−001製剤または野生型Lmの取り込みおよび細胞内成長を評価した。この実施例は、適格性実験から生成されたデータを要約する。
複製対照およびサンプルの値の相対標準偏差(RSD)の割合(%)は、アッセイ内の精度で計算された。各時点での3つのアッセイのそれぞれにおける3重のウェルのRSD(%)は、野生型では11%〜20%、ADXS11−001参照標準サンプルでは9%〜21%の範囲であった。野生型およびADXS11−001参照標準の両方のすべての時点でRSD(%)によって測定されたアッセイ内の最大変動は、21%であり、p1時点で観察された。しかしながら、p1値は、報告可能な結果の計算には使用されなかった。アッセイ内歳差は、RSDが21%のアッセイの報告可能な値を計算する際に範囲内であると予想される。
2人の分析者が複数日にわたって実施した3つの独立したアッセイで得られた値を使用して、中間精度を評価した。3つのTHP−1細胞の継代数ならびに感染および滴定を利用した3つのアッセイを行った。各独立したアッセイの調製からの感染後の各時点でのサンプルの3つの複製測定の平均間の一致を含む変動係数として表される個々の試験結果間の一致の程度を評価した。評価には、各独立したアッセイの調製からの感染後の各時点での野生型対照の3つの複製測定の平均間の一致も含まれた。
THP−1マトリックスの未接種およびPBS接種したブランクサンプルを干渉および選択性について試験した。これは、各アッセイに含まれており、すべてのアッセイでブランクでの成長(CFU)は観察されなかった。これらの陰性対照はまた、偽陰性または偽陽性の結果がないことを示すコンタミネーションがないことも示す。
データは、実施例1に記載されている方法を使用して、合計13回の代表的な試験実行から得た。このデータは、主要な品質属性を維持しながらメソッド効率の改善を模索するために評価され、これには、応答の開発のためのより短い時間枠が妥当かどうか(3時間対5時間)を判定することと、THP−1細胞の継代数の上限を見出すことと、p−2からp0への応答のベースライン変化の下限を見出すことと、p1時点の有用性を決定することと、が含まれる。
ADXS11−001は、リステリオリシンO(LLO)およびヒトパピローマウイルス(HPV)タンパク質E7の融合タンパク質を発現するように遺伝子改変された、弱毒化Listeria monocytogenesの生菌株である癌免疫療法製品であり、腫瘍抗原は、主に子宮頸部だけでなく、外陰部癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌、ならびにヒトパピローマウイルス16および18、さらには31および45に直接関連する口腔咽頭癌の細胞に見られる。
注記:容積/量は、必要に応じて拡大または縮小することができる。
THP−1細胞の解凍。生物学的安全キャビネット中の無菌条件下で手順を実行する。滅菌であると認定され、無菌で調製された材料のみを使用する。
1.37℃に設定された水浴中でc−RPMI解凍培地を事前に温める。
2.3mLの事前に温めたc−RPMI解凍培地を、滅菌の50mLの遠心チューブに入れる。
3.THP−1バイアルを極低温記憶装置から取り出し、内容物がほぼ解凍されるまで37℃に設定された水浴中で解凍するが、少量の氷の結晶がチューブ内に残る。
4.消毒剤でバイアルを徹底的に洗浄する。
5.3mLのc−RPMI解凍培地を含む50mLの遠心チューブに、解凍した細胞を1滴ずつ添加する。
6.さらに1mLのc−RPMI解凍培地でクライオバイアルを洗浄し、細胞が入った50mLのチューブに移す。
7.計数のために約100μLの細胞懸濁液を取る。
注記:血球計を使用して計数するには、細胞懸濁液のアリコートを0.4%トリパンブルーで1:2に希釈する。穏やかなピペッティングによって懸濁液が十分に混合されていることを確認する。計数にはCチップを使用する。2つの独立した計数を実行する。細胞生存率(≧85%)および密度を決定する。
8.細胞懸濁液を150×gで5分間、室温で遠心分離する
9.上清を廃棄し、事前に温めておいたc−RPMI解凍培地に細胞を再懸濁して、1〜3×105生細胞/mLの細胞密度を得る。
10.チューブの内容物を細胞培養フラスコ(例えばT75)に移し、37℃、5%CO2の絶対湿度でインキュベートする。
11.細胞が指数関数的成長期(exponential phase of growth)に達するまで、フラスコを垂直位置に保つ。
12.細胞は、通常2〜3日ごとに計数する。
注記:培養が確立されると(通常、解凍後6日)、c−RPMI培地を使用して血清濃度を10%に低下させる。
1.顕微鏡下で細胞の形態およびコンタミネーションを検査する。
細胞の大部分が培養容器の表面に付着している場合は、継続しない。そのような場合は、培養物を廃棄し、作業中の細胞バンクの別のバイアルを解凍する。
2.総細胞数および生存率のために、約1mLの細胞懸濁液をバイアルに移す。
3.指数関数的成長期の細胞を保つために、細胞懸濁液の体積が最大許容体積に達するまで、細胞に3×105細胞/mLの密度まで新たにc−RPMI培地を補充し、次いで細胞懸濁液を、3×105細胞/mLの播種密度で事前にラベル付けされたフラスコに継代する。
異なるサイズのフラスコの最小および最大容量範囲を、最適なCO2浸透のために、以下に示す:775フラスコ:15〜37.5mL;T150フラスコ:30〜75mL
4.37℃、5%CO2インキュベーターで培養物をインキュベートする。
5.細胞は、通常2〜3日ごとに計数する。
1.「通常のTHP−1細胞培養」のステップ1〜2に従う。
2.10(v/v)%グリセロールを補充した熱不活性化FBSからなる凍結培地を調製する。
3.細胞を150×gで5分間、室温で遠心分離する。
4.上清を廃棄し、塊が見えなくなるまでチューブを軽くたたくことによって細胞を再懸濁する。ゆっくりと滴下し、2倍の最終凍結密度(最終凍結密度は2×106細胞/mLである)を得るためにチューブを回転させることによって、凍結培地を添加する。
5.細胞を含むチューブに、第2の等量の凍結培地をゆっくりと添加する。完全な混合を可能にするために、添加中にチューブを静かに回転させる。
6.血清ピペットを使用して、1mLの細胞懸濁液を事前にラベル付けされた2mLのクライオバイアルに分注する。
7.クライオバイアルを、2−プロパノールを含む印まで満たされた室温のCoolCellまたはMr Frosty容器に入れる。
8.冷凍容器を−70℃の冷凍庫に24〜72時間移す。
9.クライオバイアルを気相窒素貯蔵に移す。
10.凍結細胞バッチの場所および詳細を記録する。
2.インキュベーターから細胞を取り出し、コンタミネーションの兆候がないか目視検査し、顕微鏡下で細胞を確認する。
コンタミネーションがある場合は、継続しない。細胞の大部分が培養容器の表面に付着している場合は、継続しない。そのような場合は、培養物を廃棄し、作業中の細胞バンクの別のバイアルを解凍する。
3.細胞懸濁液を数回上下にピペッティングして、細胞を混合し、細胞を計数するために少量の細胞を取り出す。
4.0.4%トリパンブルー中で2倍希釈の細胞懸濁液を調製する。ピペットで穏やかに混合することによって、希釈した細胞懸濁液の適切な混合を確保する。
5.合計2つの独立した細胞計数のCチップを調製し、細胞密度および生存率を決定する。細胞生存率が少なくとも85%である場合にのみ継続する。
6.1×106生細胞/mLで細胞懸濁液を調製する:適切な体積の細胞懸濁液を150×gで、室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットをc−RPMIに再懸濁する。よく混ぜる。ウェルあたり最低1mLの細胞懸濁液を調製する。
7.24ウェルプレートの「PMAなし」とラベル付けされた2つのウェルのそれぞれに1mLの細胞懸濁液を添加する(プレートレイアウトを参照)。
8.残りの細胞懸濁液に、16pM(1.6mMのストックから100倍希釈)PMAを添加し、最終濃度を約16nMのPMAにする。よく混ぜる。
9.ウェルごとに1mLのPMA処理細胞懸濁液を、各プレート上の最低7つのウェルに添加する(プレートレイアウトを参照)。
10.細胞を、37±1℃、5±1%CO2で16〜24時間インキュベートする。
サンプルおよび対照の調製。PMAで処理したTHP−1細胞を含むウェルの操作はすべて、注意して取り扱わなければならない。培地は、プレートを約45度の角度で傾けることによって吸引または分注しなければならない。ピペットチップは、吸引または分注のステップ中にウェルの表面をこすってはならない。
1.野生型L.monocytogenes/参照標準または製剤サンプルのうちの1つのバイアルを取り出す。
2.バイアルを室温で最大10分間解凍し、サンプルが完全に解凍されていることを確認する。
3.ボルテックスし、細胞懸濁液をそれぞれラベル付けされた2mLのマイクロ遠心チューブ(1mL)に移す。移した正確な体積を記録する。
4.細胞を14500×gで2分間、室温で遠心分離する
5.上清を慎重に廃棄し、ペレットを室温のc−RPMIで再懸濁する。培地の体積は、ステップ3で最初に移された試験項目の体積と同じでなければならない。
6.c−RPMIを使用して、細菌の希釈液を1.0×106CFU/mLの最終濃度になるように調製する。この濃度での最終体積は、約15mLでなければならない。
L.monocytogenesがc−RPMIで成長する可能性があるため、すぐに次のセクションに進む。
1.インキュベーターから1枚の24ウェルプレートを取り出す。
2.顕微鏡下でTHP−1細胞の付着を観察し、PMAで処理した細胞と未処理の細胞の違いを確認する(軽く振動するときの流動性を示す)。
3.PMAで処理した細胞を含むウェルから培地を吸引し、「サンプルおよび対照の調製」のステップ7で調製した1mLの細菌を添加する。
4.顕微鏡でプレートを観察し、THP−1細胞がまだウェルの表面に付着していることを確認する。
5.37±1℃、5±1%CO2でプレートを2時間±3分間インキュベートする。
6.「生存率試験の手順−p−2時点」に従って、「サンプルおよび対照の調製」で調製された試験項目の生存率試験を実行する。
1.(THP 1細胞の感染および時間的経過(2日目))に説明されているように、1.0×106CFU/mLに希釈した試験項目を使用する
2.表に従って細菌懸濁液を連続的に希釈する。
野生型L.monocytogenes対照には寒天BHIプレートを使用する
ADXS11−001試験項目には寒天BM+クロラムフェニコールを使用する
4.各プレートは、液体を吸収し、蓋をして少なくとも15分間乾燥させてから、裏返し、CO2を使用せずに35〜38℃のインキュベーターに16〜24時間入れる。
1.20pg/mLのゲンタマイシンが入ったc−RPMIを調製する。
2.2時間後、野生型またはサンプルが入ったプレートを、インキュベーターから除去する。
3.ピペットを使用して、各ウェルからL.monocytogenesを含有する培地を除去する。
4.20pg/mLのゲンタマイシンを含有する調製したc−RPMIをウェルあたり1mLを慎重に分注し、破壊を避けるためにウェルの側面にゆっくりと加える。
5.プレートを、インキュベーターに37±1℃、5±1%CO2で45分間戻す。
6.ピペットを使用して、各ウェルから20pg/mLのゲンタマイシンを含有するc−RPMIを除去する。
7.ウェルごとにゲンタマイシンを含まない1mLのc−RPMIを添加する(単分子層の破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加する)ことによって、細胞を慎重に洗浄する。
8.ピペットを使用して、各ウェルからc−RMPIを除去する。
9.1mLのc−RPMI(ゲンタマイシンを含まない)を、破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加することによって、各ウェルに慎重に分注し、プレートを37±1℃、5±1%CO2に設定されたインキュベーターに少なくとも5分間戻す。インキュベーションの終了は、p0と表される。
1.時点「p0」の収集に使用するために、ウェルを1つ選択する。
各ウェル中のPMA処理THP−1細胞の層が一貫し、前の吸引ステップおよび分注ステップで細胞が最小限からまったく除去されていないことを保証する。任意のウェルにTHP−1細胞の有意な消失があることが観察された場合、ウェルに印を付け、それを使用しないようにする。
2.ピペットを用いて吸引することによって、選択したウェルからc−RPMIを除去する。
3.ウェルに1mLの滅菌水を分注する。上下にピペッティングすることによって、ウェルの表面からTHP−1細胞を取り除く。内容物全体を2mLの遠心チューブに移す。
細胞が正常に除去されたことを確認するために、顕微鏡下で観察する。THP−1細胞のかなりの部分が残っている場合、2mLのチューブにあらかじめ移した水の一部を利用して、上下にピペッティングすることによって、細胞を取り除く。内容物を2mLのチューブに戻し、THP−1細胞が除去されたことを顕微鏡下で確認する。
4.次の時点の収集の準備ができるまで、プレートを37±1℃、5±1%CO2のインキュベーターに戻す。
5.細胞溶解物を少なくとも1分間ボルテックスして細胞内細菌を放出し、「生存率試験手順−p0/p3時点」に従って生存率試験を実施する。
1.p0で表わされる時間から3時間後にインキュベーターからプレートを除去する(「感染の停止」、ステップ9)。
2.時点「p3」の収集に使用するために、ウェルを1つ選択する。
各ウェル中のPMA処理THP−1細胞の層が一貫し、前の吸引ステップおよび分注ステップで細胞が最小限からまったく除去されていないことを保証する。任意のウェルにTHP−1細胞の有意な消失があることが観察された場合、ウェルに印を付け、それを使用しないようにする。
3.ピペットを用いて吸引することによって、選択したウェルからc−RPMIを除去する。
4.ウェルに1mLの滅菌水を分注する。上下にピペッティングすることによって、ウェルの表面からTHP−1細胞を取り除く。内容物全体を2mLの遠心チューブに移す。呼び出しが正常に除去されたことを確認するために、ウェルを顕微鏡下で観察する。THP−1細胞のかなりの部分が残っている場合、2mLのチューブにあらかじめ移した水の一部を利用して、上下にピペッティングすることによって、細胞を取り除く。内容物を2mLのチューブに戻し、THP−1細胞が除去されたことを顕微鏡下で確認する。
5.細胞溶解物を少なくとも1分間ボルテックスして細胞内細菌を放出し、「生存率試験手順−p0/p3時点」に従って生存率試験を実施する。
1.
p0の場合:「細胞内L.monocytogenes成長の検出−p0、ステップ5
p3の場合:「細胞内L.monocytogenes成長の検出−p3、ステップ5、において生成された試験項目の溶解物の使用
2.表に従って細菌懸濁液を連続的に希釈する。
野生型L.monocytogenes対照には寒天BHIプレートを使用する。
ADXS11−001試験項目には寒天BHI+クロラムフェニコールを使用する。
4.各プレートは、液体を吸収し、蓋をして少なくとも15分間乾燥させてから、裏返し、CO2を使用せずに35〜38℃のインキュベーターに16〜24時間入れる。
1.各アッセイ時期のために、以下の陰性対照寒天プレートに従って調製する:
未接種:
3×BHI寒天+100pg/mLのストレプトマイシン
3×BHI寒天+25pg/mLのクロラムフェニコール
接種:
3×BHI寒天+100μLのPBSを接種した100pg/mLのストレプトマイシン
3×BHI寒天+100μLのPBSを接種した25pg/mLのクロラムフェニコール
2.各アッセイ時期のために、以下の陽性対照寒天プレートを調製する:
2×BHI寒天+1×106CFU/mLで10μLの野生型L.monocytogenesを接種した100pg/mLのストレプトマイシン。
2×BHI寒天+1×106CFU/mLで10μLの参照標準を接種した25pg/mLのクロラムフェニコール。
3.プレートは、アッセイ寒天プレートと一緒に、CO2を含まない35〜38℃で16〜24時間インキュベートする。
コロニー計数(3日目)
1.16〜24時間後、プレートをインキュベーターから除去する
注記:各時点でのすべてのL.monocytogenes細胞種(野生型、参照、およびサンプル)が同じ期間インキュベートされることを確認する)。
2.コロニー形成単位の総数は、手動で計数され、ワークシート中の各希釈液の各プレートについて記録する。
計算
1.その後の計算には、40〜600の値を有するコロニー計数のみを使用する。必要な計算を実行するには、希釈ごとの最小2コロニー数が範囲内でなければならない。2つを超えるプレートに40〜600の範囲外のコロニー計数がある場合は、p0および/またはp3の時点で調整された希釈を使用してアッセイ全体を繰り返す(「生存率試験の手順−p0/p3の時点」、ステップ2)。
2.各時点で、CFU/mL値を計算する。
4.y軸にlog10CFU/mL、x軸に時間を使用してデータをプロットする。
アッセイの受け入れ基準
1.すべての陰性対照寒天プレート上での細菌成長の証拠はない。
2.コロニーは、すべての陽性対照寒天プレート上に存在していなければならない。
3.p−2で計算された対照の平均log10(CFU/mL)は、6±0.5以内である
4.3重の寒天プレートの有効なコロニー計数値間のCV(%)*30以下。
*CV=[(標準偏差/平均)×100]
5.以下の式に従って、細胞株のパフォーマンス(CLP)パラメーターを計算する。
6.以下の式を使用して、対照に対する参照応答を計算する。
報告可能な結果
1.各サンプルについて、次の式を使用して報告可能な結果を計算する。
2.仕様に対して結果を評価する。
アッセイの完了には3日かかる。1日目に、THP−1細胞を、24ウェル組織培養プレートに1×106生細胞/mLで藩種した(試験項目ごとに1つのプレート−上記を参照(THP 1細胞の感染および時間経過(2日目)))。85%超の生存率を有する細胞のみを使用し、培養の継代数は、P32に制限した。次いで、THP−1細胞を、PMA溶液で処理して、一晩のインキュベーション中にマクロファージへの分化を刺激した。
各BHI寒天プレートを手動で計数した。各コロニーは1 CFUに相当する。各調製物/溶解物希釈物(すなわち、10−1、10−2、および10−3)により、3つのコロニー計数値(すなわち、CFU)を得た。少なくとも1つの希釈で、コロニー計数が40〜600コロニー/BHI寒天プレート内でコロニー計数を生成し、30%未満のCV(%)を有すると予想された。CFU/mL値は、以下の方程式に基づいて、p−2、p0、およびp3の時点で各試験項目について計算した。
報告可能な結果は、1d.pと計算される。
参照標準材料における報告可能な結果は、≧2.0であると予想される。
加えて、分化したTHP−1細胞の感染に対する許容度は、細胞ライナーのパフォーマンスパラメーターを計算することによって測定される。
細胞株のパフォーマンスパラメーターは、0d.pと計算された。
細胞株パラメーターは、すべての有効なアッセイ実行に対して≧3であると予想された。
Claims (18)
- 試験Listeria株の弱毒化または感染性を評価する方法であって、
(a)分化したTHP−1細胞を前記試験Listeria株に感染させることであって、前記THP−1細胞が前記試験Listeria株に感染する前にマクロファージに分化している、感染させることと、
(b)前記THP−1細胞を溶解し、寒天上で前記溶解物を播種することと、
(c)前記寒天上での成長により前記THP−1細胞内で増殖した前記Listeriaを計数することと、を含む、方法。 - ステップ(a)の前に、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)を使用して、前記THP−1細胞をマクロファージに分化させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)が、1:1の感染多重度(MOI)で前記分化したTHP−1細胞を感染させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- ステップ(a)と(b)の間で、前記THP−1細胞によって取り込まれなかったListeriaを死滅させることをさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 抗生物質を使用して、前記死滅が行われ、任意に、前記抗生物質がゲンタマイシンである、請求項4に記載の方法。
- ステップ(b)が、感染後0時間で行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)が、感染後3時間で行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記試験Listeria株の取り込みおよび細胞内成長を野生型Listeria株および/または参照試料と比較することをさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記試験Listeria株が、Listeria monocytogenes株である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記試験Listeria株が、融合ポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えListeria株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合したPEST含有ペプチドを含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記PEST含有ペプチドが、リステリオリシンO(LLO)またはその断片であり、前記疾患関連抗原ペプチドが、ヒトパピローマウイルス(HPV)タンパク質E7またはその断片である、請求項10に記載の方法。
- 前記組換えListeria株が、prfAの欠失または不活性化変異を含む弱毒化Listeria monocytogenes株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、D133V PrfA変異タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレームを含む、請求項10または11に記載の方法。
- 前記組換えListeria株が、actA、dal、およびdatの欠失または不活性化変異を含む弱毒化Listeria monocytogenes株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のオープンリーディングフレームを含み、前記PEST含有ペプチドが、リステリオリシンO(LLO)のN末端断片である、請求項10に記載の方法。
- 試験細菌株の弱毒化または感染性を評価する方法であって、
(a)THP−1細胞を分化することと、
(b)前記分化したTHP−1細胞を前記試験細菌株に感染させることであって、前記感染が、
(i)前記分化したTHP−1細胞を前記試験細菌株に接種することと、
(ii)前記試験細菌株を前記分化したTHP−1細胞で1〜5時間インキュベートして、感染したTHP1細胞を形成することと、
(iii)前記感染したTHP−1細胞から細胞外細菌を除去することと、
(iv)前記感染したTHP−1細胞を成長培地中で0〜10時間インキュベートすることと、を含む、感染させることと、
(c)前記感染したTHP−1細胞を溶解して、溶解物を形成することと、
(d)前記溶解物または前記溶解物の希釈物を、前記細菌の成長を支持することができる培地を含むプレート上で藩種することと、
(e)前記プレート上の前記細菌のコロニー形成単位を計数することと、を含む、方法。 - 前記分化したTHP−1細胞を感染させるステップが、1:1の感染多重度(MOI)である、請求項14に記載の方法。
- 細胞外細菌を除去するステップが、前記細菌に対して有効な抗生物質を添加することを含み、任意に、前記抗生物質がゲンタマイシンである、請求項14または15に記載の方法。
- 前記感染したTHP−1細胞が、成長培地中で0、1、3、または5時間インキュベートされる、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験細菌株がL.monocytogenes株である、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
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