KR20200130399A - 리스테리아 균주의 약독화 및 감염성을 평가하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

리스테리아 균주의 약독화 및 감염성을 평가하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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어드박시스, 인크.
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Abstract

박테리아 또는 리스테리아 균주, 예컨대 리스테리아 모노시토게네스의 약독화 및/또는 감염성을 평가하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

리스테리아 균주의 약독화 및 감염성을 평가하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 2018년 3월 9일에 출원된 미국 출원 번호62/640,855의 이익을 주장하며, 그 전문은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
파일 528092_SeqListing_ST25.txt로 작성된 서열 목록은 89 킬로바이트이며, 2019년 2월 25일에 생성되었고, 본원에 참조로 포함된다.
리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes: Lm)는 인간에서 리스테리아증(listeriosis)의 원인이 되는 그람-양성(그람-positive), 비-포자 형성 박테리아 유기체이다. Lm-기반 면역요법, 예컨대 암 면역요법을 사용하기 위해서, 박테리아는 약독화되도록 생체 조작되어 종양-특이적 항원을 전달하고 항원-특이적 면역 반응을 생성하지만 리스테리아증을 유발하지 않는데 사용될 수 있다. 1차 대식세포는 시토졸에서 Lm-기반 면역요법이 감염시키고 복제할 수 있는 능력을 평가하는데 사용될 수 있다. 하지만, 리스테리아 균주의 약독화 및 감염성을 평가하기 위해서는 더 나은 방법이 필요하다.
박테리아 또는 리스테리아 균주, 예컨대 리스테리아 모노시토게네스의 약독화 및/또는 감염성을 평가하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 양태에서, 테스트 리스테리아 균주의 약독화 또는 감염성을 평가하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어: (a) 분화된 THP-1 세포를 테스트 리스테리아 균주로 감염시키는 단계로서, THP-1 세포는 테스트 리스테리아 균주로 감염되기 전에 대식세포로 분화되는 단계; (b) THP-1 세포를 용해시키고 용해물을 아가 위에 평판 배양하는 단계; 및 (c) 아가에서 성장하여 THP-1 세포 내부에서 증식한 리스테리아를 계수하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1A. 자격 검정 3을 위해 생존 세포 수 (VCC)에 대한 시간으로서 플롯팅된, 참조 표준 및 야생형 대조군에 대한 박테리아 성장 속도 및 배가 시간을 나타내는 그래프.
도 1B. 자격 검정 4를 위해 생존 세포 수 (VCC)에 대한 시간으로서 플롯팅된, 참조 표준 및 야생형 대조군에 대한 박테리아 성장 속도 및 배가 시간을 나타내는 그래프.
도 1C. 자격 검정 5를 위해 생존 세포 수 (VCC)에 대한 시간으로서 플롯팅된, 참조 표준 및 야생형 대조군에 대한 박테리아 성장 속도 및 배가 시간을 나타내는 그래프.
도 2A. 검정 간 비교를 나타내는 생존 세포 수 (VCC)에 대한 시간으로서 플롯팅된, 야생형에 대한 박테리아 성장 속도 및 배가 시간을 나타내는 그래프.
도 2B. 검정 간 비교를 나타내는 생존 세포 수 (VCC)에 대한 시간으로서 플롯팅된, 참조 표준 ADXS11-001에 대한 박테리아 성장 속도 및 배가 시간을 나타내는 그래프.
도 3. 시점 p-2, p0, p1, p3, 및 p5에 관찰된 미처리 개수 정보를 나타내는 그래프.
도 4. p0에서 보이는 것에 대한 p-2에서의 수의 비율을 나타내는 그래프.
도 5. 야생형에 대한 비율로서 p0에서 보이는 것에 대한 p-2에서의 수의 비율을 나타내는 그래프.
도 6. p0에서 보이는 것에 대한 p3 및 p%에서의 수의 비율을 나타내는 그래프.
도 7. 야생형에 관하여 p0에서 보이는 것에 대한 p3 및 p%에서의 수의 비율을 나타내는 그래프.
도 8. 데이터 실행에 의해 야생형에 관하여 p0에서 보이는 것에 대한 p3 및 p%에서의 수의 비율을 나타내는 그래프.
도 9. 야생형에 관하여 p-2에서 p0까지의 수의 비례 감소에 있어서 계대 수의 영향을 나타내는 그래프.
도 10. 계대 수의 영향을 평가하는데 사용된 회귀 분석을 나타내는 그래프.
도 11. 도 3의 각각의 곡선에 대한 두 개의 결과적인 변수 사이의 관계를 나타내는 그래프.
정의
본원에서 교체 가능하게 사용된 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 말하며, 암호화된 및 비-암호화된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함한다. 용어는 변형된 폴리머, 예컨대 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
단백질은 "N-말단" 및 "C-말단"을 갖는다고 한다. 용어 "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩타이드의 시작에 관한 것으로, 유리 아민 기 (-NH2)를 갖는 아미노산에 의해 종결된다. 용어 "C-말단"은 아미노산 사슬 (단백질 또는 폴리펩타이드)의 단부에 관한 것으로, 유리 카르복실 기 (-COOH)에 의해 종결된다.
용어 "융합 단백질"은 펩타이드 결합 또는 다른 화학적 결합에 의해 함께 연결된 둘 이상의 펩타이드를 포함하는 단백질을 말한다. 펩타이드는 펩타이드 또는 다른 화학적 결합에 의해 함께 직접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 키메라 분자는 재조합에 의해 단일 사슬 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 대안으로, 펩타이드는 둘 이상의 펩타이드 사이에서 "링커", 예컨대 하나 이상의 아미노산 또는 또 다른 적합한 링커에 의해 함께 연결될 수 있다.
본원에서 교체 가능하게 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 말하며, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 그것들의 유사체 또는 변형된 버전을 포함한다. 그것들은 단일-, 이중-, 및 다중-가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드(hybrid), 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 포함한다.
핵산은 모노뉴클레오타이드가 하나의 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스터 연결을 통해 이웃하는 3' 산소에 한 방향으로 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오타이드를 제조하도록 반응되기 때문에 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 갖는다고 한다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 그것의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않으면 "5' 단부"라고 불린다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 그것의 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않으면 "3' 단부"라고 불린다. 핵산 서열은 또한 더 큰 올리고뉴클레오타이드의 내부에서도 5' 및 3' 단부를 가질 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소는 "다운스트림" 또는 3' 요소의 "업스트림" 또는 5'인 것으로 불린다.
"코돈 최적화"는 특정 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 고유한 아미노산 서열을 유지하는 한편 고유한 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 핵산 서열을 변형시키는 공정을 말한다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생한 핵산 서열과 비교하여 주어진 리스테리아 세포 또는 임의의 다른 숙주 세포에서 더 높은 사용 빈도를 가진 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. 코돈 사용 빈도 표는, 예를 들어, "코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database)"에서 쉽게 이용할 수 있다. 각각의 아미노산에 대해 리스테리아 모노시토게네스(L. monocytogenes)에 의해 이용되는 최적의 코돈은 US 2007/0207170 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 나타나있다. 이들 표는 다양한 방식으로 조정될 수 있다. Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 특정 숙주에서의 발현에 대해 특정 서열의 코돈 최적화를 위한 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용 가능하다 (예를 들어, Gene Forge 참조).
용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 박테리아 전달 벡터, 바이러스 벡터 전달 벡터, 펩타이드 면역요법 전달 벡터, DNA 면역요법 전달 벡터, 에피솜 플라스미드, 통합 플라스미드, 또는 파지 벡터를 포함한 임의의 공지된 전달 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 융합 폴리펩타이드를 전달하고, 선택적으로 발현할 수 있는 작제물을 말한다.
용어 "에피솜 플라스미드" 또는 "염색체 외 플라스미드"는 염색체 DNA와 물리적으로 떨어져 있고 (즉, 에피솜 또는 염색체 외이고, 숙주 세포의 게놈으로 통합되지 않음) 염색체 DNA와 독립적으로 복제되는 핵산 벡터를 말한다. 플라스미드는 선형 또는 원형일 수도 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수도 있다. 에피솜 플라스미드는 선택적으로 숙주 세포의 세포질 (예를 들어, 리스테리아)에서 다수의 카피로 지속될 수 있으며, 에피솜 플라스미드 내 임의의 관심 유전자의 증폭을 일으킨다.
용어 "게놈적으로 통합된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈으로 통합되어 그 자손에 의해 유전될 수 있도록 세포로 도입된 핵산을 말한다. 임의의 프로토콜이 세포의 게놈으로의 핵산의 안정한 통합에 사용될 수 있다.
용어 "안정하게 유지되는"은 검출 가능한 손실 없이 적어도 10 세대 동안 선별 (예를 들어, 항생제 선별)의 부재 하에서 핵산 분자 또는 플라스미드의 유지를 말한다. 예를 들어, 기간은 적어도 15 세대, 20 세대, 적어도 25 세대, 적어도 30 세대, 적어도 40 세대, 적어도 50 세대, 적어도 60 세대, 적어도 80 세대, 적어도 100 세대, 적어도 150 세대, 적어도 200 세대, 적어도 300 세대, 또는 적어도 500 세대일 수 있다. 안정하게 유지되는 것은 핵산 분자 또는 플라스미드가 시험관 내(in vitro) (예를 들어, 배양액 내) 세포에서 안정하게 유지되는 것, 생체 내에서(in vivo) 안정하게 유지되는 것, 또는 둘 다를 말할 수 있다.
"오픈 리딩 프레임(open reading frame)" 또는 "ORF"은 잠재적으로 단백질을 암호화할 수 있는 염기의 서열을 함유하는 DNA의 일부이다. 예로서, ORF는 유전자의 시작-암호 서열 (개시 코돈) 및 중지-코돈 서열 (종결 코돈) 사이에 위치할 수 있다.
"프로모터"는 일반적으로 RNA 폴리머라제 II가 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 지시할 수 있는 TATA 박스를 포함하는 조절 영역이다. 프로모터는 추가적으로 전사 개시 속도에 영향을 미치는 다른 영역을 포함할 수 있다. 본원에서 개시된 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본원에서 개시된 세포 유형 (예를 들어, 진핵 세포, 비-인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 만능(pluripotent) 세포, 1세포기 배아, 분화된 세포, 또는 이것들의 조합) 중 하나 이상에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적 활성 프로모터, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터 (예를 들어, 발달 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터 (예를 들어, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는, 예를 들어, WO 2013/176772 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 발견될 수 있다.
"작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 두 구성요소가 정상적으로 기능하고 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소 중 적어도 하나에서 발휘되는 기능을 매개할 가능성을 허용하는, 둘 이상의 구성요소 (예를 들어, 프로모터 및 또 다른 서열 요소)의 병치를 말한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 작동 가능한 연결은 서로 인접하거나 트랜스(trans)로 작용하는 이러한 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 조절 서열은 암호화 서열의 전사를 제어하기 위해 떨어져서 작용할 수 있다).
두 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 창 상에서 최대 상응을 위해 정렬될 때 동일한 두 서열의 잔기를 참조한다. 서열 동일성 퍼센트가 단백질에 관하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치가 종종 보존적 아미노산 치환만큼 상이한 것으로 인식되며, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기에 대해 치환되며 그러므로 분자의 기능적 성질을 바꾸지 않는다. 서열에서 보존적 치환이 상이할 때, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 특성을 수정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환만큼 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 가진다고 한다. 이 조정을 이루기 위한 수단은 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이것은 전체 미스매치(mismatch)가 아니라 부분적 미스매치로서 보존적 치환을 채점하여, 서열 동일성 퍼센트를 증가시키는 것을 수반한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고 비-보존적 치환에 0의 점수가 주어진 경우, 보존적 치환에는 0 내지 1의 점수가 주어진다. 보존적 치환의 점수는, 예를 들어, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)에서 시행된 바와 같이 계산된다.
"서열 동일성 퍼센트"는 비교 창에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열 (완전히 일치된 잔기의 최대 수)을 비교하여 결정된 값을 말하며, 비교 창에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열 (추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 추가 또는 결실 (즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 퍼센트는 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 얻고, 일치된 위치의 수를 비교 창의 총 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 얻음으로써 계산된다. 달리 명시되지 않는 한 (예를 들어, 더 짧은 서열이 연결된 이종성 서열을 포함한다), 비교 창은 비교되는 두 서열 중 더 짧은 것의 전장이다.
달리 언급되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 다음 파라미터를 사용하는 GAP 버전 10을 사용하여 얻어진 값을 말한다: 뉴클레오타이드 서열에 대해 GAP 중량 50 및 길이 중량 3, 및 nwsgapdna.cmp 채점 매트릭스를 사용한 % 동일성 및 % 유사성; 아미노산 서열에 대해 GAP 중량 8 및 길이 중량 2, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용한 % 동일성 및 % 유사성; 또는 그것과 동등한 임의의 프로그램. "동등한 프로그램"은 GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교하여, 문제의 임의의 두 개의 서열에 대해, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 일치 및 동일한 퍼센트 서열 동일성을 가진 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산을 가진 서열에 일반적으로 존재하는 아미노산의 치환을 말한다. 보존적 치환의 예는 비-극성 (소수성) 잔기, 예컨대 아이소류신, 발린, 또는 류신의, 또 다른 비-극성 잔기에 대한 치환을 포함한다. 유사하게, 보존적 치환의 예는 하나의 극성 (친수성) 잔기의, 또 다른 것에 대한 치환, 예컨대 아르기닌 및 리신, 글루타민 및 아스파라긴, 또는 글리신 및 세린 간의 치환을 포함한다. 추가적으로, 염기성 잔기, 예컨대 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘의, 또 다른 것으로의 치환, 또는 하나의 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산의, 또 다른 산성 잔기에 대한 치환이 보존적 치환의 추가적인 예이다. 비-보존적 치환의 예는 비-극성 (소수성) 아미노산 잔기, 예컨대 아이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌의, 극성 (친수성) 잔기, 예컨대 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신에 대한 치환 및/또는 극성 잔기의, 비-극성 잔기에 대한 치환을 포함한다. 전형적인 아미노산 범주화가 하기 요약되어 있다.
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"상동성" 서열 (예를 들어, 핵산 서열)은 공지된 참조 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 서열을 말하며, 공지된 참조 서열과, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하다.
용어 "야생형"은 정상 상태 또는 상황에서 발견된 (돌연변이, 병이 들거나, 달라진 것, 등과는 다른) 구조 및/또는 활성을 가진 실체물을 말한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 종종 여러 상이한 형태 (예를 들어, 대립유전자)로 존재한다.
단백질 및 핵산에 관하여 용어 "단리된"은 단백질 및 폴리뉴클레오타이드의 실질적으로 순수한 조제물까지 포함하여, 일반적으로 제자리에(in situ) 존재할 수 있는 다른 박테리아, 바이러스 또는 세포 구성요소에 관하여 상대적으로 정제된 단백질 및 핵산을 말한다. 용어 "단리된"은 또한 자연 발생한 대응물이 없거나, 화학적으로 합성되어 다른 단백질 또는 핵산에 의해 실질적으로 오염되지 않거나, 또는 자연적으로 동반되는 대부분의 다른 세포 구성요소 (예를 들어, 다른 세포 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 또는 세포 구성요소)로부터 분리 또는 정제된 단백질 및 핵산을 포함한다.
"외인성" 또는 "이종성" 분자 또는 서열은 일반적으로 세포에서 발현되지 않거나 일반적으로 상기 형태로 세포 내에 존재하지 않는 분자 또는 서열이다. 정상적인 존재는 세포의 특정 발달기 및 환경 조건에 관한 존재를 포함한다. 외인성 또는 이종성 분자 또는 서열은, 예를 들어, 세포 내에서 상응하는 내인성 서열의 돌연변이된 버전을 포함할 수 있거나 또는 세포 내에서 내인성 서열에 상응하지만 상이한 형태의 (즉, 염색체 내에 없는) 서열을 포함할 수 있다. 특정 세포에서 외인성 또는 이종성 분자 또는 서열은 또한 세포의 참조 종 이외의 상이한 종 또는 동일한 종 내의 상이한 유기체로부터 유래된 분자 또는 서열일 수 있다. 예를 들어, 이종성 폴리펩타이드를 발현하는 리스테리아 균주의 경우에, 이종성 폴리펩타이드는 리스테리아 균주에 대해 고유하거나 또는 내인성이 아니거나, 일반적으로는 리스테리아 균주에 의해 발현되지 않거나, 리스테리아 균주 이외의 공급원의 것이거나, 동일한 종 내의 상이한 유기체로부터 유래된 폴리펩타이드일 수 있다.
반대로, "내인성" 분자 또는 서열 또는 "고유한" 분자 또는 서열은 일반적으로 특정 환경 조건 하에 특정 발달기에서 특정 세포 내에 상기 형태로 존재하는 분자 또는 서열이다.
용어 "변이체"는 집단 대부분과 상이하지만 여전히 일반적인 방식과 충분히 유사하여 그것들 중 하나인 것으로 간주되는 (예를 들어, 스플라이싱(splice) 변이체) 아미노산 또는 핵산 서열 (또는 유기체 또는 조직)을 말한다.
용어 "아이소폼(isoform)"은 또 다른 아이소폼, 또는 버전 (예를 들어, 동일한 단백질의)과 비교하여 단지 약간의 차이만을 가진 분자 (예를 들어, 단백질)의 버전을 말한다. 예를 들어, 단백질 아이소폼은 상이하지만 관련된 유전자로부터 생산될 수 있거나, 대체 스플라이싱에 의해 동일한 유전자로부터 발생할 수 있거나, 또는 단일 뉴클레오타이드 다형성으로부터 발생할 수 있다.
용어 "단편"은 단백질을 나타낼 때 전장 단백질보다 더 짧거나 더 적은 아미노산을 갖는 단백질을 의미한다. 용어 "단편"은 핵산을 나타낼 때 전장 핵산보다 더 짧거나 더 적은 뉴클레오타이드를 가진 핵산을 의미한다. 단편은, 예를 들어, N-말단 단편 (즉, 단백질의 C-말단부 일부의 제거), C-말단 단편 (즉, 단백질의 N-말단부 일부의 제거), 또는 내부 단편일 수 있다. 단편은 또한, 예를 들어, 기능적 단편 또는 면역원성 단편일 수 있다.
용어 "유사체"는 단백질을 나타낼 때 보존적 아미노산 차이에 의해, 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 변형에 의해, 또는 둘 다에 의해 자연 발생한 단백질과 상이한 단백질을 의미한다.
용어 "기능적"은 생물학적 활성 또는 기능을 나타낼 수 있는 단백질 또는 핵산 (또는 그것들의 단편, 아이소폼, 또는 변이체)의 선천적인 능력을 말한다. 이러한 생물학적 활성 또는 기능은, 예를 들어, 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 포함할 수 있다. 이러한 생물학적 활성 또는 기능은 또한, 예를 들어, 상호작용 파트너에 결합하는 것을 포함할 수 있다. 기능적 단편, 아이소폼, 또는 변이체의 경우에, 이들 생물학적 기능은 실제로는 변경될 수 있지만 (예를 들어, 그것들의 특이성 또는 선택성에 관하여), 기본적인 생물학적 기능은 유지된다.
용어 "면역원성(immunogenicity)" 또는 "면역원성의(immunogenic)"는 대상체에 투여될 때 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 분자 (예를 들어, 단백질, 핵산, 항원, 또는 유기체)의 선천적인 능력을 말한다. 면역원성은, 예를 들어, 분자에 대한 더 많은 수의 항체, 분자에 대한 항체의 더 큰 다양성, 분자에 특이적인 더 많은 수의 T-세포, 분자에 대한 더 큰 세포독성 반응 또는 보조 T-세포 반응, 등에 의해 측정될 수 있다.
용어 "항원"은 본원에서, 대상체 또는 유기체와 접촉될 때 (예를 들어, 대상체 또는 유기체에 존재하거나 그것들에 의해 검출될 때), 대상체 또는 유기체로부터 검출 가능한 면역 반응을 초래하는 물질을 말하는데 사용된다. 항원은, 예를 들어, 지질, 단백질, 탄수화물, 핵산, 또는 이것들의 조합 및 변형일 수 있다. 예를 들어, "항원성 펩타이드"는 대상체 또는 유기체에 존재하거나 그것들에 의해 검출될 때 대상체 또는 유기체에서 면역 반응의 증가로 이어지는 펩타이드를 말한다. 예를 들어, 이러한 "항원성 펩타이드"는 숙주 세포의 표면 상의 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 로딩되고 이것들에 제공되는 숙주의 면역 세포에 의해 인식되거나 검출될 수 있는 단백질을 포함할 수 있으며, 이로 인해 단백질에 대한 면역 반응의 증가로 이어진다. 이러한 면역 반응은 또한 숙주 내 다른 세포, 예컨대 동일한 단백질을 발현하는 병든 세포 (예를 들어, 종양 또는 암 세포)로 확장될 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역 시스템 (예를 들어, 항체가 결합함)에 의해 인식되는 항원 상의 부위를 말한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩(folding)에 의해 병치된 인접한 아미노산 또는 비인접한 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로 형성된 에피토프 (선형 에피토프로도 알려져 있음)는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출시에도 유지되는 반면 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체구조적 에피토프로도 알려져 있음)는 전형적으로 변성 용매로의 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조에서 적어도 3개, 및 더 일반적으로는, 적어도 5 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체구조를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명(2-dimensional nuclear magnetic resonance)을 포함한다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996) (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
용어 "돌연변이"는 유전자 또는 단백질의 구조의 임의의 변화를 말한다. 예를 들어, 돌연변이는 염색체 또는 단백질의 결실, 삽입, 치환, 또는 재배열로부터 초래될 수 있다. "삽입"은 하나 이상의 추가적인 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 추가함으로써 유전자 내 뉴클레오타이드 수 또는 단백질 내 아미노산 수를 변화시킨다. "결실"은 하나 이상의 추가적인 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 감소시킴으로써 유전자 내 뉴클레오타이드 수 또는 단백질 내 아미노산 수를 변화시킨다.
DNA에서 "프레임시프트(frameshift)" 돌연변이는 뉴클레오타이드의 추가 또는 상실이 유전자의 리딩 프레임을 변화시킬 때 일어난다. 리딩 프레임은 하나의 아미노산을 각각 암호화하는 3개의 염기의 군으로 이루어진다. 프레임시프트 돌연변이는 이들 염기의 군을 이동시키고 아미노산에 대한 암호를 변화시킨다. 결과의 단백질은 보통 비기능적이다. 삽입 및 결실은 각각 프레임시프트 돌연변이일 수 있다.
"미스센스(missense)" 돌연변이 또는 치환은 단백질의 하나의 아미노산의 변화 또는 단일 뉴클레오타이드의 점 돌연변이를 말하며 암호화된 아미노산의 변화를 초래한다. 하나의 아미노산의 변화를 초래하는 단일 뉴클레오티드의 점 돌연변이는 DNA 서열의 "비동의적(nonsynonymous)" 치환이다. 비동의적 치환은 또한 코돈이 결과의 단백질의 절단을 초래하는 조기 중지 코돈으로 변화되는 "넌센스(nonsense)" 돌연변이를 초래할 수 있다. 반대로, DNA의 "동의적(synonymous)" 돌연변이는 단백질의 아미노산을 변화시키지 않는 것이다 (코돈 퇴화 때문에).
용어 "체세포 돌연변이"는 생식 세포 (예를 들어, 정자 또는 난자) 이외의 세포에 의해 획득되는 유전적 변화를 포함한다. 이러한 돌연변이는 세포 분열 과정에서 돌연변이된 세포의 자손에게 전달될 수 있지만 유전되는 것은 아니다. 반대로, 생식 세포 돌연변이는 생식 계열에서 일어나고 다음 세대의 자손으로 전달될 수 있다.
용어 "시험관 내"는 인공적인 환경 및 인공적인 환경 (예를 들어, 테스트 튜브) 내에서 일어나는 공정 또는 반응을 말한다.
용어 "생체 내"는 천연 환경 (예를 들어, 세포 또는 유기체 또는 신체) 및 천연 환경 내에서 일어나는 과정 또는 반응을 말한다.
하나 이상의 나열된 요소를 "포함하는" 또는 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 나열되지 않은 다른 요소들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 또는 "포함하는" 조성물은 단독으로 또는 다른 성분과 조합된 단백질을 함유할 수 있다.
값의 범위의 지정은 범위 내의 또는 범위를 한정하는 모든 정수를 포함하고, 모든 부분범위는 그 범위 내의 정수로 한정된다.
문맥상 달리 분명하지 않는 한, 용어 "약"은 언급된 값의 측정 표준 오차 범위 (예를 들어, SEM) 내의 값 또는 명시된 값의 ± 0.5%, 1%, 5%, 또는 10%의 변화를 포함한다.
물품의 단수형 "하나(a)", "하나(an)", 및 "그(the)"는 문맥상 달리 분명하게 나타나지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 항원" 또는 "적어도 하나의 항원"은 그 혼합물을 포함한 복수의 항원을 포함할 수 있다.
통계적으로 유의하다는 것은 p≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개요
본원에서 리스테리아-기반 면역요법의 세포 내 성장을 분석하기 위해 분화된 THP-1 세포를 사용하는 세포-기반 검정이 개시된다. 이러한 검정은, 예를 들어, 야생형 리스테리아와 비교하여 재조합 리스테리아 균주의 약독화를 평가하거나 또는 재조합 리스테리아 균주의 효능 또는 감염성을 평가하는데 사용될 수 있다.
한 특정 예에서, ADXS11-001은 게놈에서 prfA의 비가역적 결실, 및 추가로, 돌연변이된 prfA 유전자 (D133V)와의 상보성으로 인해 약독화된 재조합 리스테리아 모노시토게네스 (Lm) 균주이다. prfA 유전자는 의 생체 내 세포 내 성장 및 생존에 필요한 여러 병독성 유전자, 예컨대 hly (리스테리오리신(Listeriolysin) O 또는 LLO), actA (액틴 핵 형성 인자 A), plcA (포스포리파제 A), 및 plcB (포스포리파제 B)의 전사를 조절한다. ADXS11-001에서 돌연변이된 prfA와의 상보성은 병독성 유전자의 발현 감소를 유발한다. ADXS11-001 면역요법에서 플라스미드는 또한 hly 프로모터의 제어 하에 절단된 리스테리오리신 O (tLLO)에 융합된 인간 파필로마 바이러스(papillomavirus) 단백질 E7을 함유한다. ADXS11-001의 약독화를 평가하기 위해, 대조군으로서 야생형 Lm를 사용하여 대식세포 세포 감염 검정에서 감염 및 복제가 평가된다.
ADXS11-001의 생물학적 활성은 항원 제공 세포 (APC), 예컨대 대식세포 및 수지상세포에 의한 ADXS11-001의 흡수, 포식리소좀으로부터의 탈출, APC의 시토졸에서의 세포 내 복제, tLLO-E7의 발현, E7-특이적 세포독성 T 세포 반응을 자극하기 위해 APC의 표면 상에 tLLO-E7의 처리, 및 제공에 의존한다. 대식세포의 시토졸을 감염시키고 복제할 수 있는 ADXS11-001의 능력을 모니터링하기 위해 분화된 THP-1 세포를 사용하는 것은 1차 대식세포를 사용하는 것에 대한 훌륭한 대안이다. 방법은 또한 그것이 정량적이라는 점에서 유리하다.
II. 리스테리아의 약독화 및 감염성을 평가하는 방법
박테리아의 약독화 및/또는 감염성을 평가하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 박테리아는 리스테리아 균주이다. 일부 구체예에서, 리스테리아 균주는 리스테리아 모노시토게네스 균주이다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노시토게네스 균주는 돌연변이, 재조합, 또는 약독화된 리스테리아 모노시토게네스 균주이다. 이러한 방법에서 사용될 수 있는 재조합 리스테리아 균주의 예는 본원의 다른 곳에서 더 상세히 제공된다. 이러한 방법은 대식세포 세포주 또는 대식세포 표현형을 가진 대식세포-유사 세포주를 이용한다. 이러한 세포는 불멸화된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포주는 인간 단핵구 세포주, 예컨대 THP-1 세포일 수 있다. THP-1은 아동기 경우의 급성 단핵구성 백혈병 (M5 하위유형)의 말초 혈액으로부터 유래된, 자발적으로 불멸화된 단핵구-유사 세포주를 지정한다. THP-1 세포는, 예를 들어, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (일반적으로 PMA 또는 TPA로 알려져 있음)를 사용하여 대식세포-유사 세포로 분화될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 (a) 분화된 THP-1 세포를 테스트 리스테리아 균주로 감염시키는 단계로서, THP-1 세포는 테스트 리스테리아 균주로 감염되기 전에 대식세포로 분화되는 단계; (b) THP-1 세포를 용해시키고 용해물을 아가 위에 평판 배양하는 단계; 및 (c) 아가에서 성장하여 THP-1 세포 내부에서 증식한 리스테리아를 계수하는 단계를 포함한다. 분화된 THP-1 세포는 부착 세포로서 성장할 수 있다. 다른 대식세포-유사 세포가 또한 사용될 수 있다. 다른 대식세포-유사 불멸화된 세포 및/또는 세포주가 또한 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 THP-1 세포를 대식세포로 분화시키는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 이러한 분화는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 단계 (a) 전에 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)를 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, 분화 전에, THP-1 세포에 대한 계대 수는 32 미만이다.
일부 구체예에서, 단계 (a)는 1:1의 감염 다중도 (MOI)에서 분화된 THP-1 세포를 감염시키는 단계를 포함한다. 하지만, 임의의 적합한 감염 다중도가 사용될 수 있다.
선택적으로, 이러한 방법은 단계 (a) 내지 (b)에서 THP-1 세포에 의해 흡수되지 않는 모든 리스테리아를 살해하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 살해는 젠타마이신과 같은 항생제를 사용하여 수행될 수 있다.
선택적으로, 용해 단계 (b)는 감염 후 3시간에 수행된다. 하지만, 용해 단계는 또한 다른 시점에, 예컨대 감염 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10시간에 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 박테리아 균주로 분화된 THP-1 세포를 감염시키는 단계는 1-5 h, 2-3 h, 1 h, 2　h, 3　h, 2 h ± 60 min, 2 h ± 50 min, 2 h ± 40 min, 2 h ± 30 min, 2 h ± 25 min, 2 h ± 20 min, 2 h ± 15 min, 2 h ± 10 min, 2 h ± 5 min, 또는 2 h ± 3 min 동안 분화된 THP-1 세포로 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 박테리아는 리스테리아이다. 일부 구체예에서, 리스테리아는 리스테리아 모노시토게네스이다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노시토게네스는 야생형 리스테리아 모노시토게네스에 비해 약독화된다. 일부 구체예에서, 박테리아를 함유하는 접종 배지가 분화된 THP-1 세포에 추가된다.
일부 구체예에서, 감염 단계는 하나 이상의 세척 단계 및/또는 사멸 단계를 더 포함한다. 세척 단계는 THP-1 세포로부터 박테리아-함유 배지를 제거하는 단계 및 선택적으로 THP-1 세포를 헹궈서, THP-1 세포를 감염시키지 않는 박테리아를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세척 단계는, 사용되는 경우, THP-1 세포와 함께 박테리아를 인큐베이션한 후에 및 용해 단계 전에 수행될 수 있다. 사멸 단계는 THP-1 세포에 박테리아에 유효한 항생제를 추가하여, THP-1 세포에 의해 흡수되지 않는 박테리아 (즉, 세포 외 박테리아)를 사멸시키는 단계를 포함할 수 있다. 항생제는 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 농도로 추가될 수 있다. 사멸 단계는, 사용되는 경우, THP-1 세포와 함께 바테리아를 인큐베이션한 후에 및 용해 단계 전에 수행될 수 있다. 사멸 단계는 세척 단계 후에 또는 전에, 또는 2번의 세척 단계 사이에 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 항생제는 THP-1 세포에 추가되고 15-75 min, 20-60 min, 30-50 min, 또는 약 42-45 min 동안 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 항생제는 젠타마이신이다.
일부 구체예에서, 용해 단계 (b)는 감염 단계 직후 (감염 후 0 h), 감염 후 0-10 h, 감염 후 1 h, 감염 후 2 h, 감염 후 3 h, 감염 후 4 h, 감염 후 5 h, 감염 후 6 h, 감염 후 7 h, 감염 후 8 h, 감염 후 9 h,또는 감염 후 10 h에 수행된다. 일부 구체예에서, 용해 단계는 감염 단계 직후 (p0), 감염 후 1 h (p1), 감염 후 3 h (p3), 또는 감염 후 5 h (p5)에 수행된다. 용해가 감염 단계 직후에 수행되지 않으면, THP-1 세포는 용해될 때까지 성장 배지에서 인큐베이션될 수 있다. 박테리아의 세포 내 성장은 감염 후 인큐베이션 동안에 일어날 수 있다. 용해 단계는 용해물을 형성하기 위해, 물 또는 박테리아를 용해시키지 않지만, THP-1 세포를 용해시킬 수 있는 유사한 용매 중에 THP-1 세포를 수거하는 단계, 및 박테리아의 성장을 지원할 수 있는 배지 상에 용해물을 평판 배양하고 콜로니 형성 단위 (CFU)의 수를 계수하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 용해물은 희석될 수 있다. 일부 구체예에서, 용해물의 하나 이상의 상이한 희석액이 배지에 평판 배양될 수 있다.
일부 구체예에서, 계수 단계는 용해물로부터 CFU의 수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 접종 배지에서 CFU의 수가 결정된다. 일부 구체예에서, CFU의 수는 상이한 감염 후 용해 기간 후에 또는 박테리아 균주에서 결정된다. 일부 구체예에서, 박테리아 균주에 대한 CFU는 접종 배지에 대해 감염 단계 직후에, 감염 후 1회 이상의 시기에 결정된다. 일부 구체예에서, 박테리아 균주에 대한 CFU는 감염 단계 직후에 및 감염 후 3시간에 결정된다. 일부 구체예에서, CFU는 1회 결정되고 감염 후 또 다른 시기에 결정된 CFU와 비교된다. 일부 구체예에서, 흡수율, 또는 감염률은 접종 배지의 CFU를 감염 후 1 h에서의 CFU와 비교함으로써 계산된다. 일부 구체예에서, 세포 내 성장 속도는 감염 후 1-10 h에서의 CFU를 감염 후 0 h에서의 CFU와 비교함으로써 계산된다. 일부 구체예에서, 세포 내 성장 속도는 감염 후 1 h, 3 h, 또는 5 h에서의 CFUff 감염 후 0 h에 결정된 CFU와 비교함으로써 계산된다.
이러한 방법은 테스트 박테리아 균주, 예컨대 돌연변이, 재조합, 또는 약독화된 리스테리아 모노시토게네스 균주의 흡수 및/또는 세포 내 성장을 대조군, 예컨대 야생형 리스테리아 균주, 및/또는 참조 샘플과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
추가적인 구체예는 실시예에서 개시된다.
III. 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주
본원에서 개시된 방법은 박테리아 균주, 예컨대 리스테리아 균주의 약독화 및 감염성을 평가한다. 이러한 박테리아 균주는 재조합 박테리아 균주일 수 있다. 이러한 재조합 박테리아 균주는 본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 균주는 리스테리아 균주, 예컨대 리스테리아 모노시토게네스 (Lm) 균주이다. Lm은 많은 백신 벡터로서 많은 내재적 이점을 갖는다. 박테리아는 특별한 요건 없이 시험관 내에서 매우 효율적으로 성장하고, 그것에는 살모넬라(Salmonella)와 같은 그람-음성 박테리아에서 주요 독성 인자인 LPS가 없다. 유전적으로 약독화된 Lm 벡터는 또한 심각한 부작용의 경우에, 항생제로 쉽게 제거될 수 있기 때문에 추가적인 안전성을 제공하고, 일부 바이러스 벡터와 달리, 숙주 게놈으로의 유전 물질의 통합이 일어나지 않는다.
재조합 리스테리아 균주는 임의의 리스테리아 균주일 수 있다. 적합한 리스테리아 균주의 예는 리스테리아 셀리게리(Listeria seeligeri), 리스테리아 그레이(Listeria grayi), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 머레이(Listeria murrayi), 리스테리아 웰시메리(Listeria welshimeri), 리스테리아 모노시토게네스 (Lm), 또는 임의의 다른 공지된 리스테리아 종을 포함한다. 바람직하게는, 재조합 리스테리아 균주는 리스테리아 모노시토게네스 종의 균주이다. 리스테리아 모노시토게네스 균주의 예는 다음을 포함한다: 리스테리아 모노시토게네스 10403S 야생형 (예를 들어, Bishop and Hinrichs (1987) J Immunol 139:2005-2009; Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177-4186 참조); 파지 경화된 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4056 (예를 들어, Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177-4186); 파지 경화되고 hly 유전자 결실을 갖는 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4027 (예를 들어, Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177- 4186; Jones and Portnoy (1994) Infect Immunity 65:5608-5613 참조); 파지 경화되고 actA 유전자 결실을 갖는 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4029 (예를 들어, Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177-4186; Skoble et al. (2000) J Cell Biol 150:527-538 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4042 (델타 PEST) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci . USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4097 (LLO-S44A) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP- L4364 (델타 lplA; 리포에이트 단백질 리가제) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4405 (델타 inlA) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4406 (델타 inlB) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 CS-LOOOl (델타 actA; 델타 inlB) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 CS-L0002 (델타 actA; 델타 lplA) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 CS-L0003 (LLO L461T; 델타 lplA) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4038 (델타 actA; LLO L461T) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4384 (LLO S44A; LLO L461T) (예를 들어, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); lplA1 결실 (리포에이트 단백질 리가제 LplA1을 암호화함)을 갖는 리스테리아 모노시토게네스 균주 (예를 들어, O'Riordan et al. (2003) Science 302:462-464 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4017 (LLO L461T를 갖는 10403S) (예를 들어, US 7,691,393); 리스테리아 모노시토게네스 EGD (예를 들어, GenBank 기탁 번호 AL591824 참조). 또 다른 구체예에서, 리스테리아 균주는 리스테리아 모노시토게네스 EGD-e (GenBank 기탁 번호 NC_003210; ATCC 기탁 번호 BAA-679 참조); 리스테리아 모노시토게네스 DP-L4029 (actA 결실, 선택적으로 uvrAB 결실과 조합됨 (DP-L4029uvrAB) (예를 들어, US 7,691,393 참조); 리스테리아 모노시토게네스 actA-/inlB- 이중 돌연변이 (예를 들어, ATCC 기탁 번호 PTA-5562 참조); 리스테리아 모노시토게네스 lplA 돌연변이 또는 hly 돌연변이 (예를 들어, US 2004/0013690 참조); 리스테리아 모노시토게네스 dal/dat 이중 돌연변이 (예를 들어, US 2005/0048081 참조)이다. 다른 리스테리아 모노시토게네스 균주는 다음 유전자 중 하나, 또는 그것들의 임의의 조합을 암호화하는 핵산을 함유하도록 변형된 (예를 들어, 플라스미드 및/또는 게놈 통합에 의해) 것들을 포함한다: hly (LLO; 리스테리오리신); iap (p60); inlA; inlB; inlC; dal (알라닌 라세마제); dat (D-아미노산 아미노트랜스퍼라제); plcA; plcB; actA; 또는 성장, 확산, 단일벽 소포의 파괴, 이중벽 소포의 파괴, 숙주 세포로의 결합, 또는 숙주 세포에 의한 흡수를 매개하는 임의의 핵산. 상기 참고문헌 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
재조합 박테리아 또는 리스테리아는 야생형 병독성을 가질 수 있거나, 약독화된 병독성을 가질 수 있거나, 또는 무독성일 수 있다. 예를 들어, 재조합 리스테리아는 식포 또는 포식리소좀을 탈출하고 시토졸로 들어가기에 충분히 병독성일 수 있다. 이러한 리스테리아 균주는 또한 생-약독화된 리스테리아 균주일 수 있으며, 이것은 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 적어도 하나의 약독화 돌연변이, 결실, 또는 비활성화를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 리스테리아는 약독화된 영양요구성 균주이다. 영양요구성 균주는 성장에 필요한 특정 유기 화합물을 합성할 수 없는 것이다. 이러한 균주의 예는 US 8,114,414 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
바람직하게는, 재조합 리스테리아 균주는 항생제 저항 유전자가 없다. 예를 들어, 이러한 재조합 리스테리아 균주는 항생제 저항 유전자를 암호화하지 않는 플라스미드를 포함할 수 있다. 하지만, 본원에서 제공된 일부 재조합 리스테리아 균주는 항생제 저항 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드를 포함한다. 항생제 저항 유전자는 분자 생물학 및 백신 제조에 일반적으로 이용되는 통상적인 선별 및 클로닝 과정에 사용될 수 있다. 예시의 항생제 저항 유전자는 앰피실린, 페니실린, 메티실린, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜 (CAT), 네오마이신, 하이그로마이신, 및 젠타마이신에 대한 저항성을 부여하는 유전자 생성물을 포함한다.
A. 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 박테리아 또는 리스테리아 균주
본원에서 개시된 재조합 박테리아 균주 (예를 들어, 리스테리아 균주)는 본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.
재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 박테리아 또는 리스테리아 균주에서, 핵산은 코돈 최적화될 수 있다. 각각의 아미노산에 대해 리스테리아 모노시토게네스에 의해 이용되는 최적의 코돈의 예는 US 2007/0207170 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 나타나있다. 핵산은 핵산에서 적어도 하나의 코돈이 원래의 서열에서의 코돈 대신에 상기 아미노산에 대해 리스테리아 모노시토게네스에 의해 더 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체되는 경우 코돈-최적화된다.
핵산은 박테리아 또는 리스테리아 균주 내의 에피솜 플라스미드에 존재할 수 있고 및/또는 핵산은 박테리아 또는 리스테리아 균주에서 게놈적으로 통합될 수 있다. 일부 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 본원에서 개시된 바와 같이 2개의 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 2개의 별개의 핵산을 포함한다: 에피솜 플라스미드에서의 하나의 핵산, 및 박테리아 또는 리스테리아 균주에서 게놈적으로 통합된 것.
에피솜 플라스미드는 시험관 내 (세포 배양액 내), 생체 내 (숙주 내), 또는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 안정하게 유지되는 것일 수 있다. 에피솜 플라스미드에서, 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 플라스미드에서 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 박테리아 또는 리스테리아 균주에 게놈적으로 통합된 경우, 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 외인성 프로모터/조절 서열 또는 내인성 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자의 구성적 발현을 구동하는데 유용한 프로모터/조절 서열의 예는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 리스테리아의 hly, hlyA, actA, prfA, 및 p60 프로모터, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) bac 프로모터, 스트렙토미세스 그리세우스(Streptomyces griseus) sgiA 프로모터, 및 바실루스 투린지엔시스(B. thuringiensis) phaZ 프로모터를 포함한다. 어떤 경우에는, 삽입된 관심 유전자가 중단되거나 게놈 DNA로의 통합으로부터 종종 발생하는 조절 제약을 받지 않고, 어떤 경우에는, 삽입된 이종성 유전자의 존재가 세포 자체의 중요한 영역의 재배열 또는 중단으로 이어지지 않는다.
이러한 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 본원의 다른 곳에서 기재된 박테리아 또는 리스테리아 균주 또는 약독화된 박테리아 또는 리스테리아 균주를 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터로 형질전환하여 제조될 수 있다. 플라스미드는 숙주 염색체로 통합되지 않는 에피솜 플라스미드일 수 있다. 대안으로, 플라스미드는 박테리아 또는 리스테리아 균주의 염색체로 통합되는 통합 플라스미드일 수 있다. 본원에서 사용된 플라스미드는 또한 다중 카피 플라스미드일 수 있다. 박테리아를 형질전환시키기 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 칼슘-클로라이드 컴피턴트(competent) 세포-기반 방법, 전기천공 방법, 박테리오파지-매개된 형질도입, 화학적 형질전환 기술, 및 물리적 형질전환 기술을 포함한다. 예를 들어, de Boer et al. (1989) Cell 56:641-649; Miller et al. (1995) FASEB J. 9:190-199; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al. (1997) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Gerhardt et al., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 및 Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (이것들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
게놈적으로 통합된 이종성 핵산을 가진 박테리아 또는 리스테리아 균주는, 예를 들어, 부위-특이적 통합 벡터를 사용하여 제조되며, 통합된 유전자를 포함하는 박테리아 또는 리스테리아는 상동 재조합을 사용하여 생성된다. 통합 벡터는 박테리아 또는 리스테리아 균주를 감염시킬 수 있는 임의의 부위-특이적 통합 벡터일 수 있다. 이러한 통합 벡터는, 예를 들어, PSA attPP' 부위, PSA 인테그라제를 암호화하는 유전자, U153 attPP' 부위, U153 인테그라제를 암호화하는 유전자, A118 attPP' 부위, A118 인테그라제를 암호화하는 유전자, 또는 임의의 다른 공지된 attPP' 부위 또는 임의의 다른 파지 인테그라제를 포함할 수 있다.
통합된 유전자를 포함하는 이러한 박테리아 또는 리스테리아 균주는 또한 이종성 핵산을 박테리아 또는 리스테리아 염색체로 통합시키기 위한 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 상동 재조합을 위한 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, Baloglu et al. (2005) Vet Microbiol 109(1-2):11-17); Jiang et al. 2005) Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 37(1):19-24), 및 US 6,855,320 (이것들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
박테리아 또는 리스테리아 염색체로의 통합은 또한 트랜스포손 삽입을 사용하여 달성될 수 있다. 트랜스포손 삽입을 위한 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, DP-L967의 구성에 대해 Sun et al. (1990) Infection and Immunity 58: 3770-3778 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기재되어 있다. 트랜스포손 돌연변이 유발은 안정한 게놈 삽입을 달성할 수 있지만, 이종성 핵산이 삽입된 게놈 내 위치는 알려지지 않았다.
박테리아 또는 리스테리아 염색체로의 통합은 또한 파지 통합 부위를 사용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, Lauer et al. (2002) J Bacteriol 184(15):4177-4186 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 예를 들어, 인테그라제 유전자 및 박테리오파지 (예를 들어, U153 또는 PSA 리스테리오파지)의 부착 부위는 이종성 유전자를 상응하는 부착 부위로 삽입하는데 사용될 수 있으며, 이것은 게놈에서 임의의 적절한 부위 (예를 들어 arg tRNA 유전자의 comK 또는 3' 단부)일 수 있다. 내인성 프로파지는 이종성 핵산의 통합 전에 이용된 부착 부위로부터 경화될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 단일 카피 통합체를 발생시킬 수 있다. "파지 경화 단계"를 방지하기 위해서, PSA 파지를 기반으로 하는 파지 통합 시스템이 사용될 수 있다 (예를 들어, Lauer et al. (2002) J Bacteriol 184:4177-4186 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 통합된 유전자를 유지하는 것은, 예를 들어, 항생제에 의한 지속적인 선별을 필요로 할 수 있다. 대안으로, 항생제로의 선별을 필요로 하지 않는 파지-기반 염색체 통합 시스템이 확립될 수 있다. 대신에, 영양요구성 숙주 균주가 보완될 수 있다. 예를 들어, 임상 적용을 위한 파지-기반 염색체 통합 시스템이 사용될 수 있으며, 예를 들어, D-알라닌 라세마제를 포함한 필수적인 효소에 대해 영양요구성인 숙주 균주가 사용된다 (예를 들어, Lm dal(-)dat(-)).
유전 물질 및/또는 플라스미드를 박테리아로 도입시키기 위해 컨쥬게이션이 또한 사용될 수 있다. 컨쥬게이션을 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, Nikodinovic et al. (2006) Plasmid 56(3):223-227 및 Auchtung et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(35):12554-12559 (이것들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
특정 예에서, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 내인성 actA 서열 (ActA 단백질을 암호화함) 또는 내인성 hly 서열 (LLO 단백질을 암호화함)을 가진 오픈 리딩 프레임으로서 박테리아 또는 리스테리아 게놈으로 게놈적으로 통합된 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드의 발현 및 분비는 내인성 actA 프로모터 및 ActA 신호 서열의 제어 하에 있을 수 있거나 또는 내인성 hly 프로모터 및 LLO 신호 서열의 제어 하에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 ActA 단백질을 암호화하는 actA 서열 또는 LLO 단백질을 암호화하는 hly 서열을 대체할 수 있다.
재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주의 선별은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항생제 선별이 사용될 수 있다. 항생제 저항 유전자는 분자 생물학 및 백신 제조에 일반적으로 이용되는 통상적인 선별 및 클로닝 과정에 사용될 수 있다. 예시의 항생제 저항 유전자는 앰피실린, 페니실린, 메티실린, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜 (CAT), 네오마이신, 하이그로마이신, 및 젠타마이신에 대한 저항성을 부여하는 유전자 생성물을 포함한다. 대안으로, 영양요구성 균주가 사용될 수 있고, 항생제 저항 유전자 대신에 또는 이것에 더하여 외인성 대사 유전자가 선별에 사용될 수 있다. 예로서, 대사 효소를 암호화하는 플라스미드 또는 본원에서 제공된 보완 유전자를 포함하는 영양요구성 박테리아를 선별하기 위해서, 형질전환된 영양요구성 박테리아는 대사 효소를 암호화하는 유전자 (예를 들어, 아미노산 대사 유전자) 또는 보완 유전자의 발현을 선별하는 배지에서 성장할 수 있다. 대안으로, 온도-민감성 플라스미드가 재조합체를 선별하는데 사용될 수 있거나 재조합체를 선별하기 위한 임의의 다른 공지된 수단이 사용될 수 있다.
B. 박테리아 또는 리스테리아 균주의 약독화
본원에서 개시된 재조합 박테리아 균주 (예를 들어, 재조합 리스테리아 균주)는 약독화될 수 있다. 용어 "약독화"는 숙주 동물에서 질환을 유발하는 박테리아의 능력의 감소를 포함한다. 예를 들어, 약독화된 리스테리아 균주의 병원성 특징은 야생형 리스테리아와 비교하여 줄어들 수 있지만, 약독화된 리스테리아는 배양액에서 성장 및 유지 가능하다. 예로서 약독화된 리스테리아를 이용한 BALB/c 마우스의 정맥내 접종을 사용하여, 일부 구체예에서는, 접종된 동물의 50%가 생존하는 치사 용량 (LD50)이 야생형 리스테리아의 LD50보다 적어도 약 10배, 적어도 약 100배, 적어도 약 1,000배, 적어도 약 10,000배, 또는 적어도 약 100,000배만큼 증가한다. 따라서 리스테리아의 약독화된 균주는 투여되는 동물을 살해하지 않는 것 또는 투여된 박테리아의 수가 동일한 동물을 살해하는데 필요한 야생형 비-약독화된 박테리아의 수보다 훨씬 더 클 때에만 동물을 살해하는 것이다. 약독화된 박테리아는 또한 일반적인 환경에서 성장에 필요한 영양소가 그 안에 존재하지 않기 때문에 복제가 불가능한 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 박테리아는 필요한 영양소가 제공되는 제어된 환경에서 복제로 제한된다. 약독화된 균주는 제어되지 않은 복제가 불가능하다는 점에서 환경적으로 안전하다.
(1) 박테리아 및 리스테리아 균주를 약독화시키는 방법
약독화는 임의의 공지된 수단으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 약독화된 균주는 하나 이상의 내인성 병독성 유전자 또는 하나 이상의 내인성 대사 유전자가 결핍될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 본원에서 개시되어 있고, 약독화는 본원에서 개시된 유전자 중 어느 하나 또는 그것들의 임의의 조합의 비활성화에 의해 달성될 수 있다. 비활성화는, 예를 들어, 결실 또는 돌연변이 (예를 들어, 비활성화 돌연변이)를 통해 달성될 수 있다. 용어 "돌연변이"는 서열 (핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 임의의 유형의 돌연변이 또는 변형을 포함하고 결실, 절단, 삽입, 치환, 붕괴, 또는 전위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 프레임시프트 돌연변이, 단백질의 조기 종결을 유발하는 돌연변이, 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 조절 서열의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이 유발은 재조합 DNA 기술을 사용하여 또는 돌연변이 유발성 화학물질 또는 방사선을 사용하는 전통적인 돌연변이 유발 기술 및 돌연변이의 추후 선별을 사용하여 달성될 수 있다. 동반되는 낮은 회귀 가능성 때문에 결실 돌연변이가 바람직할 수 있다. 용어 "대사 유전자"는 숙주 박테리아에 의해 이용되거나 숙주 박테리아에 필요한 영양소의 합성에 수반되거나 그것에 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 말한다. 예를 들어, 효소는 숙주 박테리아의 지속적인 성장에 필요한 영양소의 합성에 수반되거나 그것에 필요할 수 있다. 용어 "병독성" 유전자는 유기체의 게놈에서의 존재 또는 활성이 유기체의 병원성 (예를 들어, 유기체가 숙주에서 틈새의 콜로니화를 달성할 수 있게 함 (세포로의 부착 포함), 면역 기피 (숙주 면역 반응의 기피), 면역 억제 (숙주 면역 반응의 억제), 세포 내로 진입 및 세포 밖으로의 퇴장, 또는 숙주로부터 영양을 얻음)에 기여하는 유전자를 포함한다.
이러한 약독화된 균주의 특정 예는 리스테리아 모노시토게네스 (Lm) dal(-)dat(-) (Lmdd)이다. 이러한 약독화된 균주의 또 다른 예는 Lm dal(-)dat(-)ΔactA (LmddA)이다. 예를 들어, US 2011/0142791 (모든 목적을 위해 그 번문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. LmddA는 내인성 병독성 유전자 actA의 결실로 인해 약독화된 리스테리아 균주를 기반으로 한다. 이러한 균주는 dal 유전자의 보완에 의한 생체 내 및 시험관 내에서의 항원 발현을 위한 플라스미드를 유지할 수 있다. 대안으로, LmddA는 내인성 dal, dat, 및 actA 유전자에서 돌연변이를 갖는 dal/dat/actA 리스테리아일 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어, 결실 또는 다른 비활성화 돌연변이일 수 있다. 약독화된 균주의 또 다른 특정 예는 Lm prfA(-) 또는 prfA 유전자에서 부분적 결실 또는 비활성화 돌연변이를 갖는 균주이다. PrfA 단백질은 Lm에 의해 척추동물 숙주를 콜로니화하는데 필요한 필수적인 병독성 유전자를 포함하는 레귤론(regulon)의 발현을 제어한다; 따라서 prfA 돌연변이는 PrfA-의존성 병독성 유전자의 발현을 활성화시키는 PrfA 능력을 강력하게 손상시킨다.
약독화된 균주의 또 다른 특정 예는 박테리아의 천연 병독성에 중요한 2개의 유전자 - 인터날린 B 및 act A - 가 결실된 Lm inlB(-)actA(-)이다.
약독화된 박테리아 또는 리스테리아 균주의 다른 예는 하나 이상의 내인성 병독성 유전자가 결핍된 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함한다. 리스테리아에서 이러한 유전자의 예는 actA, prfA, plcB, plcA, inlA, inlB, inlC, inlJ, 및 bsh를 포함한다. 약독화된 리스테리아 균주는 또한 상기 언급된 균주 중 어느 것의 이중 돌연변이 또는 삼중 돌연변이일 수 있다. 약독화된 리스테리아 균주는, 예를 들어, 본원에서 제공된 유전자 (예를 들어, actA, prfA, 및 dal /dat 유전자 포함) 각각의 하나의 돌연변이 또는 결실, 또는 그것들 중 최대 10개의 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다다. 예를 들어, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 인터날린 C (inlC) 유전자의 돌연변이 또는 결실 및/또는 내인성 actA 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다. 대안으로, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 인터날린 B (inlB) 유전자의 돌연변이 또는 결실 및/또는 내인성 actA 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다. 대안으로, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 inlB, inlC, 및 actA 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다. 인접한 세포로의 리스테리아의 전위는 과정에 수반되는 내인성 actA 유전자 및/또는 내인성 inlC 유전자 또는 내인성 inlB 유전자의 결실에 의해 억제되어, 높은 수준의 약독화를 초래하며, 균주 백본으로서 면역원성 및 유용성이 증가한다. 약독화된 리스테리아 균주는 또한 plcA 및 plcB 둘 다의 돌연변이 또는 결실을 포함하는 이중 돌연변이일 수 있다. 어떤 경우에는, 균주는 EGD 리스테리아 백본으로부터 구성될 수 있다.
박테리아 또는 리스테리아 균주는 또한 대사 유전자에서 돌연변이를 갖는 영양요구성 균주일 수 있다. 한 예로서, 균주는 하나 이상의 내인성 아미노산 대사 유전자가 결핍될 수 있다. 예를 들어, D-알라닌이 결핍된 리스테리아의 영양요구성 균주의 생성은, 예를 들어, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 단백질의 조기 종결을 유발하는 돌연변이, 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 조절 서열의 돌연변이를 포함한, 많은 널리 공지된 방법으로 달성될 수 있다. 영양요구성 표현형의 동반되는 낮은 회귀 가능성 때문에 결실 돌연변이가 바람직할 수 있다. 예로서, 본원에서 제공된 프로토콜에 따라 생성된 D-알라닌의 돌연변이는 간단한 실험실 배양 검정에서 D-알라닌의 부재 하에 성장할 수 있는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 이 화합물의 부재 하에 성장할 수 없는 상기 돌연변이가 선별될 수 있다.
내인성 아미노산 대사 유전자의 예는 비타민 합성 유전자, 판토텐산 신타제를 암호화하는 유전자, D-글루탐산 신타제 유전자, D-알라닌 아미노 트랜스퍼라제 (dat) 유전자, D-알라닌 라세마제 (dal) 유전자, dga, 디아미노피멜산 (DAP)의 합성에 수반되는 유전자, 시스테인 신타제 A (cysK)의 합성에 수반되는 유전자, 비타민-B12 독립적 메티오닌 신타제, trpA, trpB, trpE, asnB, gltD, gltB, leuA, argG, 및 thrC를 포함한다. 리스테리아 균주는 둘 이상의 이러한 유전자 (예를 들어, dat 및 dal)가 결힙될 수 있다. D-글루탐산 합성은 알파-케토글루타레이트 + D-ala로의 D-glu + pyr의 전환, 및 역반응에 수반되는 dal 유전자에 의해 부분적으로 제어된다.
또 다른 예로서, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 신타제 유전자, 예컨대 아미노산 합성 유전자가 결핍될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 folP, 디하이드로유리딘 신타제 패밀리 단백질을 암호화하는 유전자, ispD, ispF, 포스페놀피루베이트 신타제를 암호화하는 유전자, hisF, hisH, fliI, 리보솜 거대 서브유닛 슈도유리딘 신타제를 암호화하는 유전자, ispD, 이기능적 GMP 신타제/글루타민 아미도트랜스퍼라제 단백질을 암호화하는 유전자, cobS, cobB, cbiD, 유로포르피린-III C-메틸트랜스퍼라제/유로포르피리노겐-III 신타제를 암호화하는 유전자, cobQ, uppS, truB, dxs, mvaS, dapA, ispG, folC, 시트레이트 신타제를 암호화하는 유전자, argJ, 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 신타제를 암호화하는 유전자, 인돌-3-글리세롤-포스페이트 신타제를 암호화하는 유전자, 안트라닐레이트 신타제/글루타민 아미도트랜스퍼라제 구성요소를 암호화하는 유전자, menB, 메나퀴논-특이적 아이소코리스메이트 신타제를 암호화하는 유전자, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신타제 I 또는 II를 암호화하는 유전자, 포스포리보실아미노이미다졸-숙시노카르복스아미드 신타제를 암호화하는 유전자, carB, carA, thyA, mgsA, aroB, hepB, rluB, ilvB, ilvN, alsS, fabF, fabH, 슈도유리딘 신타제를 암호화하는 유전자, pyrG, truA, pabB, 및 atp 신타제 유전자 (예를 들어, atpC, atpD-2, aptG, atpA-2, 등)를 포함한다.
약독화된 리스테리아 균주는 내인성 phoP, aroA, aroC, aroD, 또는 plcB가 결핍될 수 있다. 또 다른 예로서, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 펩타이드 수송체가 결핍될 수 있다. 예는 ABC 수송체/ATP-결합/퍼미아제 단백질, 올리고펩타이드 ABC 수송체/올리고펩타이드-결합 단백질, 올리고펩타이드 ABC 수송체/퍼미아제 단백질, 아연 ABC 수송체/아연-결합 단백질, 당 ABC 수송체, 포스페이트 수송체, ZIP 아연 수송체, EmrB/QacA 패밀리의 약물 저항성 수송체, 설페이트 수송체, 양성자-의존성 올리고펩타이드 수송체, 마그네슘 수송체, 포르메이트/니트라이트 수송체, 스퍼미딘/푸트레신 ABC 수송체, Na/Pi-공수송체, 당 포스페이트 수송체, 글루타민 ABC 수송체, 주요 촉진자 패밀리 수송체, 글리신 베타인/L-프롤린 ABC 수송체, 몰리브덴 ABC 수송체, 테코산 ABC 수송체, 코발트 ABC 수송체, 암모늄 수송체, 아미노산 ABC 수송체, 세포 분열 ABC 수송체, 망간 ABC 수송체, 철 화합물 ABC 수송체, 말토스/말토덱스트린 ABC 수송체, Bcr/CflA 패밀리의 약물 저항성 수송체, 및 상기 단백질 중 하나의 서브유닛을 암호화하는 유전자를 포함한다.
다른 약독화된 박테리아 및 리스테리아 균주는 박테리아 성장 과정, 복제 과정, 세포벽 합성, 단백질 합성, 지방산 대사, 또는 임의의 다른 성장 또는 복제 과정에 사용되는 아미노산을 대사시키는 내인성 대사 효소가 결핍될 수 있다. 유사하게, 약독화된 균주는 세포벽 합성에 사용된 아미노산의 형성에 촉매 작용할 수 있거나, 세포벽 합성에 사용된 아미노산의 합성에 촉매 작용할 수 있거나, 또는 세포벽 합성에 사용된 아미노산의 합성에 수반될 수 있는 내인성 대사 효소가 결핍될 수 있다. 대안으로, 아미노산은 세포벽 생물 발생(biogenesis)에 사용될 수 있다. 대안으로, 대사 효소는 세포벽 구성요소인 D-글루탐산에 대한 합성 효소이다.
다른 약독화된 리스테리아 균주는 D-글루탐산 합성 유전자, dga, alr (알라닌 라세마제) 유전자에 의해 암호화된 대사 효소, 또는 알라닌 합성에 수반되는 임의의 다른 효소가 결핍될 수 있다. 리스테리아 균주가 결핍될 수 있는 대사 효소의 다른 예는 serC (포스포세린 아미노트랜스퍼라제), asd (아스파르테이트 베타세미알데하이드 데하이드로게나제; 세포벽을 구성하는 디아미노피멜산의 합성에 수반됨), gsaB-글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제 ((S)-4-아미노-5-옥소펜타노에이트로부터의 5-아미노레불리네이트의 형성에 촉매 작용함)를 암호화하는 유전자, hemL ((S)-4-아미노-5-옥소펜타노에이트로부터의 5-아미노레불리네이트의 형성에 촉매 작용함), aspB (L-아스파르테이트 및 2-옥소글루타레이트로부터의 옥살로즈세테이트 및 L-글루타메이트의 형성에 촉매 작용하는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제), argF -1 (아르기닌 생합성에 수반됨), aroE (아미노산 생합성에 수반됨), aroB (3-데하이드로퀴네이트 생합성에 수반됨), aroD (아미노산 생합성에 수반됨), aroC (아미노산 생합성에 수반됨), hisB (히스티딘 생합성에 수반됨), hisD (히스티딘 생합성에 수반됨), hisG (히스티딘 생합성에 수반됨), metX (메티오닌 생합성에 수반됨), proB (프롤린 생합성에 수반됨), argR (아르기닌 생합성에 수반됨), argJ (아르기닌 생합성에 수반됨), thil (티아민 생합성에 수반됨), LMOf2365_1652 (트립토판 생합성에 수반됨), aroA (트립토판 생합성에 수반됨), ilvD (발린 및 아이소류신 생합성에 수반됨), ilvC (발린 및 아이소류신 생합성에 수반됨), leuA (류신 생합성에 수반됨), dapF (리신 생합성에 수반됨), 및 thrB (트레오닌 생합성에 수반됨) (모두 GenBank 기탁 번호 NC_002973)에 의해 암호화된 효소를 포함한다.
약독화된 리스테리아 균주는 다른 대사 효소, 예컨대 tRNA 신테타제의 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 대사 효소는 trpS 유전자에 의해 암호화될 수 있으며, 트립토파닐tRNA 신테타제를 암호화한다. 예를 들어, 숙주 균주 박테리아는 Δ(trpS aroA)일 수 있고, 두 마커는 모두 통합 벡터에 함유될 수 있다.
약독화된 리스테리아 균주를 생성하도록 돌연변이될 수 있는 대사 효소의 다른 예는 murE (디아미노피멜산의 합성에 수반됨; GenBank 기탁 번호: NC_003485), LMOf2365_2494 (테이코산 생합성에 수반됨), WecE (지질다당류 생합성 단백질 rffA; GenBank 기탁 번호: AE014075.1), 또는 amiA (N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제)에 의해 암호화된 효소를 포함한다. 대사 효소의 또 다른 예는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (GenBank 기탁 번호 NP_466347), 또는 세포벽 테이코산 글리코실화 단백질 GtcA를 포함한다.
약독화된 리스테리아 균주를 생성하도록 돌연변이될 수 있는 대사 효소의 다른 예는 펩티도글리칸 구성요소 또는 전구물질에 대한 합성 효소를 포함한다. 구성요소는, 예를 들어, UDP-N-아세틸무라밀펜타펩타이드, UDP-N-아세틸글루코사민, MurNAc-(펜타펩타이드)-피로포스포릴-운데카프레놀, GlcNAc-p-(1,4)-MurNAc-(펜타펩타이드)-피로포스포릴운데카프레놀, 또는 임의의 다른 펩티도글리칸 구성요소 또는 전구물질일 수 있다.
약독화된 리스테리아 균주를 생성하도록 돌연변이될 수 있는 대사 효소의 또 다른 예는 murG, murD, murA -1, 또는 murA -2 (모두 GenBank 기탁 번호 NC_002973에서 제시됨)에 의해 암호화된 대사 효소를 포함한다. 대안으로, 대사 효소는 펩티도글리칸 구성요소 또는 전구물질에 대한 임의의 다른 합성 효소일 수 있다. 대사 효소는 또한 트랜스-글리코실라제, 트랜스-펩티다제, 카르복시-펩티다제, 임의의 다른 클래스의 대사 효소, 또는 임의의 다른 대사 효소일 수 있다. 예를 들어, 대사 효소는 임의의 다른 리스테리아 대사 효소 또는 임의의 다른 리스테리아 모노시토게네스 대사 효소일 수 있다.
다른 박테리아 균주는 다른 박테리아 균주에서 상응하는 이종상동성 유전자를 돌연변이시킴으로써 리스테리아에 대해 상기 기재된 바와 같이 약독화될 수 있다.
(2) 약독화된 박테리아 및 리스테리아 균주를 보완하는 방법
본원에서 개시된 약독화된 박테리아 또는 리스테리아 균주는 보완 유전자를 포함하거나 약독화 돌연변이를 보완하는 (예를 들어, 영양요구성 리스테리아 균주의 영양요구성을 보완하는) 대사 효소를 암호화하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같이 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 오픈 리딩 프레임을 갖는 핵산은 보완 유전자를 포함하거나 보완 대사 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 더 포함할 수 있다. 대안으로, 제1 핵산은 융합 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고 별개의 제2 핵산은 보완 유전자를 포함하거나 또는 보완 대사 효소를 암호화할 수 있다.
보완 유전자는 염색체 외에 있을 수 있거나 또는 박테리아 또는 리스테리아 게놈으로 통합될 수 있다. 예를 들어, 영양요구성 리스테리아 균주는 대사 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 에피솜 플라스미드를 포함할 수 있다. 이러한 플라스미드는 에피솜 또는 염색체 외 방식으로 리스테리아에 함유될 것이다. 대안으로, 영양요구성 리스테리아 균주는 대사 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 통합 플라스미드 (즉, 통합 벡터)를 포함할 수 있다. 이러한 통합 플라스미드는 리스테리아 염색체로의 통합에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 에피솜 플라스미드 또는 통합 플라스미드는 항생제 저항 마커가 없다.
대사 유전자는 항생제 저항 유전자 대신에 또는 그것에 더하여 선별에 사용될 수 있다. 예로서, 본원에서 제공된 대사 효소 또는 보완 유전자를 암호화하는 플라스미드를 포함하는 영양요구성 박테리아를 선별하기 위해서, 형질전환된 영양요구성 박테리아는 대사 효소 (예를 들어, 아미노산 대사 유전자) 또는 보완 유전자를 암호화하는 유전자의 발현을 선별하는 배지에서 성장할 수 있다. 예를 들어, D-글루탐산 합성에 대해 영양요구성인 박테리아는 D-글루탐산 합성을 위한 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환될 수 있고, 영양요구성 박테리아는 D-글루탐산의 부재 하에 성장하는 반면에, 플라스미드로 형질전환되지 않거나, 또는 D-글루탐산 합성을 위한 단백질을 암호화하는 플라스미드를 발현하지 않는 영양요구성 박테리아는 성장하지 않을 것이다. 유사하게, D-알라닌 합성에 대해 영양요구성인 박테리아는 D-알라닌 합성을 위해 형질전환되어 아미노산 대사 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드를 발현할 때 D-알라닌의 부재 하에 성장할 것이다. 필요한 성장 인자, 보충물, 아미노산, 비타민, 항생제, 등을 포함하거나 이것들이 없는 적절한 배지를 제조하기 위한 이러한 방법은 널리 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능하다.
본원에서 제공된 대사 효소 또는 보완 유전자를 암호화하는 플라스미드를 포함하는 영양요구성 박테리아가 적절한 배지에서 선별되면, 박테리아는 선택압의 존재 하에 증식될 수 있다. 이러한 증식은 영양요구성 인자가 없는 배지에서 박테리아를 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 영양요구성 박테리아에서 대사 효소 또는 보완 유전자를 발현하는 플라스미드의 존재는 플라스미드가 박테리아와 함께 복제된다는 것을 확인하며, 따라서 플라스미드를 가지고 있는 박테리아를 계속적으로 선별한다. 박테리아 또는 리스테리아 균주의 생산은 플라스미드를 포함하는 영양요구성 박테리아가 성장하는 배지의 부피를 조정함으로써 쉽게 확장할 수 있다.
한 특정 예에서, 약독화된 균주는 dal 및 dat의 결실 또는 그것들에서 비활성화 돌연변이를 가진 균주 (예를 들어, 리스테리아 모노시토게네스 (Lm) dal(-)dat(-) (Lmdd) 또는 Lm dal(-)dat(-)ΔactA (LmddA))이고, 보완 유전자는 알라닌 라세마제 효소 (예를 들어, dal 유전자에 의해 암호화됨) 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소 (예를 들어, dat 유전자에 의해 암호화됨)를 암호화한다. 예시의 알라닌 라세마제 단백질은 서열 번호: 76 (서열 번호: 78에 의해 암호화됨; GenBank 기탁 번호: AF038438)에서 제시된 서열을 가질 수 있거나 또는 서열 번호: 76의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 또는 아이소폼의 단편일 수 있다. 알라닌 라세마제 단백질은 또한 임의의 다른 리스테리아 알라닌 라세마제 단백질일 수 있다. 대안으로, 알라닌 라세마제 단백질은 임의의 다른 그람-양성 알라닌 라세마제 단백질 또는 임의의 다른 알라닌 라세마제 단백질일 수 있다. 예시의 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질은 서열 번호: 77 (서열 번호: 79에 의해 암호화됨; GenBank 기탁 번호: AF038439)에서 제시된 서열을 가질 수 있거나 또는 서열 번호: 77의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 또는 아이소폼의 단편일 수 있다. D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질은 또한 임의의 다른 리스테리아 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질일 수 있다. 대안으로, D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질은 임의의 다른 그람-양성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질 또는 임의의 다른 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질일 수 있다.
또 다른 특정 예에서, 약독화된 균주는 prfA의 결실 또는 그것에서 비활성화 돌연변이를 가진 균주 (예를 들어, Lm prfA(-))이고, 보완 유전자는 PrfA 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 보완 유전자는 부분적인 PrfA 기능을 회복하는 돌연변이 PrfA (D133V) 단백질을 암호화할 수 있다. 야생형 PrfA 단백질의 예는 서열 번호: 80 (서열 번호: 81에서 제시된 핵산에 의해 암호화됨)에서 제시되고, D133V 돌연변이 PrfA 단백질의 예는 서열 번호: 82 (서열 번호: 83에서 제시된 핵산에 의해 암호화됨)에서 제시된다. 보완 PrfA 단백질은 서열 번호: 80 또는 82의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 또는 아이소폼의 단편일 수 있다. PrfA 단백질은 또한 임의의 다른 리스테리아 PrfA 단백질일 수 있다. 대안으로, PrfA 단백질은 임의의 다른 그람-양성 PrfA 단백질 또는 임의의 다른 PrfA 단백질일 수 있다.
또 다른 예에서, 박테리아 균주 또는 리스테리아 균주는 actA 유전자의 결실 또는 그것에서 비활성화 돌연변이를 포함할 수 있고, 보완 유전자는 돌연변이를 보완하고 리스테리아 균주에 대한 기능을 회복하기 위해 actA 유전자를 포함할 수 있다.
다른 영양요구성 균주 및 보완 시스템이 또한 본원에서 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위해 채택될 수 있다.
IV. 재조합 융합 폴리펩타이드
본원에서 개시된 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주에서 재조합 융합 폴리펩타이드는 임의의 형태로 되어있을 수 있다. 일부 이러한 융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 질환-관련 항원성 펩타이드에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 이러한 재조합 융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 질환-관련 항원성 펩타이드를 포함할 수 있고, 융합 폴리펩타이드는 PEST-함유 펩타이드를 포함하지 않는다.
재조합 융합 폴리펩타이드의 또 다른 예는 N-말단부에서 C-말단부로 박테리아 분비 서열, 유비퀴틴 (Ub) 단백질, 및 하나 이상의 질환-관련 항원성 펩타이드 (즉, 나란히(in tandem), 예컨대 Ub-펩타이드1-펩타이드2)을 포함한다. 대안으로, 둘 이상의 질환-관련 항원성 펩타이드가 사용되면, 각각의 항원성 펩타이드가 그 자체의 분비 서열 및 Ub 단백질 (예를 들어, Ub1-펩타이드1; Ub2-펩타이드2)에 융합되는 별개의 융합 폴리펩타이드의 조합이 사용될 수 있다.
이러한 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 (꼬마유전자(minigene) 작제물이라고 불림)이 또한 개시된다. 이러한 꼬마유전자 핵산 작제물은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이에 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 둘 이상의 오픈 리딩 프레임을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 꼬마유전자 핵산 작제물은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이에서 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2 내지 4개의 오픈 리딩 프레임을 더 포함할 수 있다. 각각의 오픈 리딩 프레임은 상이한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 핵산 작제물에서, 단백질 합성의 종결을 확인하기 위해 융합 폴리펩타이드의 카르복시 말단을 암호화하는 코돈에는 2개의 종결 코돈이 뒤따른다.
박테리아 신호 서열은 리스테리아 신호 서열, 예컨대 Hly 또는 ActA 신호 서열, 또는 임의의 다른 공지된 신호 서열일 수 있다. 다른 경우에, 신호 서열은 LLO 신호 서열일 수 있다. 예시의 LLO 신호 서열은 서열 번호: 97에서 제시된다. 신호 서열은 박테리아의 것일 수 있거나, 숙주 박테리아 (예를 들어, 리스테리아 모노시토게네스, 예컨대 secA1 신호 펩타이드)에 고유할 수 있거나, 또는 숙주 박테리아에 대해 외래의 것일 수 있다. 신호 펩타이드의 특정 예는 Usp45 신호 펩타이드 from 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)로부터의 보호 항원 신호 펩타이드, secA2 신호 펩타이드, 예컨대 리스테리아 모노시토게네스로부터의 p60 신호 펩타이드, 및 Tat 신호 펩타이드, 예컨대 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) Tat 신호 펩타이드 (예를 들어, PhoD)를 포함한다. 특정 예에서, 분비 신호 서열은 리스테리아 단백질의 것, 예컨대 ActA300 분비 신호 또는 ActA100 분비 신호이다. 예시의 ActA 신호 서열은 서열 번호: 98에서 제시된다.
유비퀴틴은, 예를 들어, 전장 단백질일 수 있다. 본원에서 제공된 핵산 작제물로부터 발현되는 유비퀴틴은 숙주 세포 시토졸에 진입시 하이드로라제의 작용을 통해 핵산 작제물로부터 발현된 재조합 융합 폴리펩타이드의 나머지로부터 카르복시 말단에서 분열될 수 있다. 이것은 융합 폴리펩타이드의 아미노 말단을 해방시키고, 숙주 세포 시토졸에서 펩타이드를 생성한다.
융합 폴리펩타이드 내에서 항원성 펩타이드의 선별, 변화, 및 재배열이 본원의 다른 곳에서 더 상세히 논의되고, 질환-관련 항원성 펩타이드의 예가 본원의 다른 곳에서 더 상세히 논의된다.
재조합 융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 태그(tag)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항원성 펩타이드에 대한 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 펩타이드 태그를 포함할 수 있다. 태그는 항원성 펩타이드에 직접적으로 융합되거나 또는 링커 (이것의 예는 본원의 다른 곳에서 개시되어 있음)를 통해 항원성 펩타이드에 연결될 수 있다. 태그의 예는 다음을 포함한다: FLAG 태그; 2xFLAG 태그; 3xFLAG 태그; His 태그, 6xHis 태그; 및 SIINFEKL 태그. 예시의 SIINFEKL 태그는 서열 번호: 16 (서열 번호: 1-15에서 제시된 핵산 중 어느 하나에 의해 암호화됨)에서 제시된다. 예시의 3xFLAG 태그는 서열 번호: 32 (서열 번호: 17-31에서 제시된 핵산 중 어느 하나에 의해 암호화됨)에서 제시된다. 예시의 변이체 3xFLAG 태그는 서열 번호: 99에서 제시된다. 둘 이상의 태그, 예컨대 2xFLAG 태그 및 SIINFEKL 태그, 3xFLAG 태그 및 SIINFEKL 태그, 또는 6xHis 태그 및 SIINFEKL 태그가 함께 사용될 수 있다. 둘 이상의 태그가 사용되면, 그것들은 재조합 융합 폴리펩타이드 내 어느 곳에도 및 임의의 순서로 위치할 수 있다. 예를 들어, 2개의 태그가 재조합 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 있을 수 있거나, 2개의 태그가 재조합 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 수 있거나, 2개의 태그가 재조합 융합 폴리펩타이드 내에서 내부에 위치할 수 있거나, 하나의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 있을 수 있고 하나의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 수 있거나, 하나의 태그는 재조합 폴리펩타이드의 C-말단에 있을 수 있고 하나의 태그는재조합 융합 폴리펩타이드 내에서 내부에 있을 수 있거나, 또는 하나의 태그는 N-말단에 있을 수 있고 하나의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드 내에서 내부에 있을 수 있다. 다른 태그는 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질 (MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신 (TRX), 및 폴리(NANP)를 포함한다. 특정 재조합 융합 폴리펩타이드는 C-말단 SIINFEKL 태그를 포함한다. 이러한 태그는 재조합 융합 단백질의 용이한 검출, 재조합 융합 단백질의 분비 확인, 또는 이들 "태그" 서열 펩타이드에 대한 면역 반응을 추적함으로써 분비된 융합 폴리펩타이드의 면역원성을 추적하는 것을 허용할 수 있다. 이러한 면역 반응은, 예를 들어, 이들 태그에 특이적인 단클론성 항체 및 DNA 또는 RNA 프로브를 포함한, 많은 시약을 사용하여 모니터링될 수 있다.
본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드는 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현될 수 있거나 또는 단백질 발현 및 단리에 사용된 다른 벡터 및 세포 시스템으로부터 발현되고 단리될 수 있다. 이러한 항원성 펩타이드를 발현하는 재조합 리스테리아 균주는, 예를 들어, 이러한 재조합 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물 및 재조합 리스테리아 균주 및 보조제를 포함하는 백신에서 사용될 수 있다. 리스테리아 균주의 숙주 세포 시스템 및 리스테리아 이외의 숙주 세포 시스템에서 비용혈 절단된 형태의 LLO, ActA, 또는 PEST-유사 서열을 가진 융합 폴리펩타이드로서 하나 이상의 항원성 펩타이드의 발현은 항원성 펩타이드의 면역원성의 향상을 초래할 수 있다.
이러한 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 또한 개시되어 있다. 핵산은 임의의 형태로 되어있을 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하거나 또는 그것들로 이루어질 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 플라스미드, 예컨대 에피솜 플라스미드, 다중 카피 에피솜 플라스미드, 또는 통합 플라스미드의 형태로 되어있을 수 있다. 대안으로, 핵산은 바이러스 벡터, 파지 벡터의 형태로, 또는 박테리아 인공 염색체로 되어있을 수 있다. 이러한 핵산은 하나의 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있거나 또는 둘 이상의 오픈 리딩 프레임 (예를 들어, 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임 및 대사 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임)을 가질 수 있다. 한 예에서, 이러한 핵산은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이에 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 둘 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이에서 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2 내지 4개의 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 각각의 오픈 리딩 프레임은 상이한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 핵산에서, 단백질 합성의 종결을 확인하기 위해 융합 폴리펩타이드의 카르복시 단부를 암호화하는 코돈에는 2개의 종결 코돈이 뒤따른다.
A. 항원성 펩타이드
질환-관련 펩타이드는 특정 질환에서 발현되는 단백질의 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 이러한 펩타이드는 병든 조직에서 발현되지만 상응하는 정상 조직에서는 발현되지 않거나, 질환 조직에서 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 단백질로부터 유래될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "질환"은 일반적으로 동의어인 것으로 의도되고, 모두 정상적인 기능을 손상시키는 인간 또는 동물 신체 또는 그 부분 중 하나의 비정상적인 상태를 반영하고, 전형적으로 징후 및 증상을 구별하여 나타나고, 인간 또는 동물의 수명 또는 삶의 질을 감소시킨다는 점에서 용어 "장애" 및 "병태" (의학적 병태에서와 같음)와 교체 가능하게 사용된다. 질환-관련 항원성 펩타이드의 예는 인간 파필로마 바이러스 (HPV) E7 또는 E6, 전립선 특이적 항원 (PSA), 키메라 Her2 항원, Her2/neu 키메라 항원을 포함할 수 있다. 인간 파필로마 바이러스는 HPV 16 또는 HPV 18일 수 있다. 항원성 펩타이드는 또한 나란히 작동 가능하게 연결된 HPV16 E6, HPV16 E7, HPV18 E6, HPV18 E7 항원 또는 HPV 항원성 펩타이드에 나란히 작동 가능하게 연결된 HPV16 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 단일 항원성 펩타이드를 포함할 수 있거나 또는 둘 이상의 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 각각의 항원성 펩타이드는 면역 반응을 유도하기에 충분한 임의의 길이일 수 있고, 각각의 항원성 펩타이드는 동일한 길이일 수 있거나 또는 항원성 펩타이드는 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 항원성 펩타이드는 길이가 5-100, 15-50, 또는 21-27개의 아미노산, 또는 길이가 15-100, 15-95, 15-90, 15-85, 15-80, 15-75, 15-70, 15-65, 15-60, 15-55, 15-50, 15-45, 15-40, 15-35, 15-30, 20-100, 20-95, 20-90, 20-85, 20-80, 20-75, 20-70, 20-65, 20-60, 20-55, 20-50, 20-45, 20-40, 20-35, 20-30, 11-21, 15-21, 21-31, 31-41, 41-51, 51-61, 61-71, 71-81, 81-91, 91-101, 101-121, 121-141, 141-161, 161­181, 181-201, 8-27, 10-30, 10-40, 15-30, 15-40, 15-25, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 1-100, 5­75, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 1-75, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 8-11, 또는 11-16개의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩타이드는 길이가 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개의 아미노산일 수 있다. 항원성 펩타이드의 일부 특정 예는 길이가 21 또는 27개의 아미노산이다. 다른 항원성 펩타이드는 전장 단백질 또는 그것의 단편일 수 있다.
한 예로서, 항원성 펩타이드는 네오에피토프(neoepitope)를 포함할 수 있다. 이들 네오에피토프는, 예를 들어, 환자-특이적 (즉, 대상체-특이적) 암 돌연변이일 수 있다. 네오에피토프를 포함하는 항원성 펩타이드는 정상적인 또는 건강한 샘플과 비교하여 암 샘플에 존재하는 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 확인하기 위해 대상체의 암 샘플로부터 추출된 핵산을 정상적인 또는 건강한 참조 샘플로부터 추출된 핵산과 비교하는 것을 포함하는 개인 맞춤형 면역요법을 생성하기 위한 과정에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 이들 돌연변이 또는 서열 차이는 체세포, 비동의적 미스센스 돌연변이, 또는 체세포 프레임시프트 돌연변이일 수 있고, 발현된 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 이러한 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 발현하는 펩타이드는 "네오에피토프"라고 불릴 수 있다. 암-특이적 네오에피토프는 참조 샘플 (예컨대 비정상 비-암성 또는 생식계열 세포 또는 조직)에 존재하지 않지만 암 샘플에서 발견되는 에피토프를 지칭할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 정상적인 비-암성 또는 생식계열 세포에서 상응하는 에피토프가 발견되지만, 암 세포에서 하나 이상의 돌연변이로 인해, 네오에피토프를 발생시키기 위해 에피토프의 서열이 변화되는 상황을 포함한다. 네오에피토프는 돌연변이된 에피토프를 포함할 수 있고, 돌연변이의 하나 또는 두 측면에서 비-돌연변이된 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 항원성 펩타이드는 재발성 암 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드는 둘 이상의 항원성 펩타이드에 융합된 PEST-함유 펩타이드 (즉, 나란히, 예컨대 PEST-펩타이드1-펩타이드2)를 포함할 수 있거나 또는 PEST-함유 펩타이드에 융합되지 않은 둘 이상의 항원성 펩타이드를 포함할 수 있으며, 각각의 항원성 펩타이드는 단일 재발성 암 돌연변이 (즉, 단백질의 아미노산 서열, 또는 유전자에서 단일의 상이한 비동의적 재발성 암 돌연변이에 의해 암호화된 서열에서 단일 재발성 변화)를 포함하고, 항원성 펩타이드 중 적어도 2개는 상이한 재발성 암 돌연변이를 포함하고 동일한 암-관련 단백질의 단편이다. 대안으로, 각각의 항원성 펩타이드는 상이한 암-관련 단백질로부터의 상이한 재발성 암 돌연변이를 포함할 수 있다. 대안으로, 각각의 항원성 펩타이드가 그 자체의 PEST-함유 펩타이드 (예를 들어, PEST1-펩타이드1; PEST2-펩타이드2)에 융합되는 (또는 융합되지 않는) 별개의 융합 폴리펩타이드의 조합이 사용될 수 있다. 선택적으로, 모든 또는 일부의 단편은 동일한 암-관련 단백질의 비-인접한 단편이다. 비-인접한 단편은 단백질 서열에서 순차적으로 발생하지 않는 단편이다 (예를 들어, 제1 단편은 잔기 10-30으로 이루어지고, 제2 단편은 잔기 100-120으로 이루어지거나; 또는 제1 단편은 잔기 10-30으로 이루어지고, 제2 단편은 잔기 20-40으로 이루어진다). 선택적으로, 각각의 항원성 펩타이드는 단일 유형의 암으로부터의 상이한 재발성 암 돌연변이를 포함한다.
재발성 암 돌연변이는 암-관련 단백질로부터 유래될 수 있다. 용어 "암-관련 단백질"은 다수의 유형의 암에서 발생하거나, 특정 유형의 암을 가진 다수의 대상체에서 발생하거나, 또는 하나 이상의 유형의 암의 발생 또는 진행과 연관성이 있는 돌연변이를 가진 단백질을 포함한다. 예를 들어, 암-관련 단백질은 종양 형성 단백질 (즉, 암 진행에 기여할 수 있는 활성을 가진 단백질, 예컨대 세포 성장을 조절하는 단백질)일 수 있거나, 또는 종양-억제자 단백질 (즉, 전형적으로, 예컨대 세포 주기의 음성 조절을 통해 또는 아폽토시스(apoptosis)를 촉진하여 암 형성에 대한 가능성을 완화하는 작용을 하는 단백질)일 수 있다. 바람직하게는, 암-관련 단백질은 "돌연변이 핫스팟(hotspot)"을 갖는다. 돌연변이 핫스팟은 선별의 부재시 예상되는 것보다 더 빈번하게 돌연변이되는 (바람직하게는 다른 체세포 이상, 예컨대 전위, 증폭, 및 결실 대신에 체세포 치환에 의해) 단백질-암호화 유전자에서의 아미노산 위치이다. 이러한 핫스팟 돌연변이는 다수의 유형의 암에 걸쳐 발생할 수 있고 및/또는 다수의 암 환자 사이에서 공유될 수 있다. 돌연변이 핫스팟은 종양 샘플의 집단에 걸친 선택압을 나타낸다. 종양 게놈은 변화시 종양 세포에 선택적인 성장 이점을 부여하는 유전자 (즉, 종양 구동 유전자)에 영향을 주어 종양 형성을 "구동하는" 재발성 암 돌연변이를 함유한다. 이러한 종양 구동 유전자는, 예를 들어, 백그라운드 돌연변이율로부터 예상된 것보다 더 빈번하게 돌연변이되는 (즉, 재발) 유전자를 확인하거나; 종양 샘플에 걸쳐 양성 선별의 다른 신호 (예를 들어, 침묵 돌연변이에 비해 높은 비율의 비-침묵 돌연변이, 또는 기능적 돌연변이의 축적에 대한 바이어스(bias))를 나타내는 유전자를 확인하거나; 비활성화 돌연변이가 단백질의 서열을 따라 분포되는 반면, 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이는 구체적으로 특정 잔기 또는 도메인에서 발생하는 경향이 있다는 지식에 기초하여 단백질 서열의 특정 영역에서 돌연변이를 지속하는 성향을 이용하거나; 또는 특이적 기능적 잔기, 예컨대 인산화 부위에서 돌연변이의 과다 발현을 이용함으로써 확인될 수 있다. 이들 돌연변이 중 다수는
생물학적 활성 단백질 (예를 들어, 키나제 도메인 또는 결합 도메인)의 기능적 영역에서 빈번하게 발생하거나 활성 부위 (예를 들어, 인산화 부위)를 중단시켜 기능 상실(loss-of-function) 또는 기능 획득 돌연변이를 발생시키거나, 또는 정상적인 기능을 방해할 정도로 단백질의 3차원 구조 및/또는 전하 균형이 충분히 동요되는 방식으로 발생할 수 있다. 다수의 종양의 게놈 분석은 돌연변이가 제한된 수의 아미노산 위치에서 종종 발생한다는 것을 보여준다. 그러므로, 대부분의 일반적인 돌연변이는 상대적으로 적은 수의 잠재적 종양-관련 항원 또는 T 세포 에피토프로 나타낼 수 있다.
"재발성 암 돌연변이"는 특정 유형의 암에서 및/또는 특정 유형의 암에 걸린 대상체에서 발생하는, 단백지의 아미노산 서열의 변화이다. 암과 관련된 이러한 돌연변이는 일반적으로 상응하는 건강한 조직에서는 존재하지 않는 종양-관련 항원을 발생시킬 수 있다.
다수의 암 사이에서 또는 다수의 암 환자 사이에서 발생하는 일반적인 돌연변이를 가진 종양 구동 유전자 및 암-관련 단백질이 공지되어 있으며, 다수의 종양 샘플 및 다수의 종양 유형에 걸친 시퀀싱 데이터가 존재한다. 예를 들어, Chang et al. (2016) Nat Biotechnol 34(2):155-163; Tamborero et al. (2013) Sci Rep 3:2650 (이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
각각의 항원성 펩타이드는 또한 친수성일 수 있거나 최대 특정 수치 임계치 또는 그 아래로 채점될 수 있으며, 이것으로 리스테리아 모노시토게네스 또는 또 다른 관심 박테리아에서의 분비 가능성을 예측할 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩타이드는 카이트 및 두리틀(Kyte and Doolittle) 수치 지표 21 아미노산 창에 의해 채점될 수 있고, 컷오프(cutoff) (대략 1.6)보다 높은 모든 점수는 리스테리아 모노시토게네스에 의한 분비 가능성이 낮기 때문에 배제될 수 있다. 유사하게, 항원성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 조합은 친수성일 수 있거나 최대 특정 수치 임계치 또는 그 아래로 채점될 수 있으며, 이것으로 리스테리아 모노시토게네스 또는 또 다른 관심 박테리아에서의 분비 가능성을 예측할 수 있다.
항원성 펩타이드는 임의의 방식으로 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩타이드는 서로 개재(intervening) 서열 없이 직접적으로 융합될 수 있다. 대안으로, 항원성 펩타이드는 서로 하나 이상의 링커, 예컨대 펩타이드 링커를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 어떤 경우에는, 인접한 항원성 펩타이드의 일부 쌍은 서로 직접적으로 융합될 수 있고, 항원성 펩타이드의 다른 쌍은 서로 하나 이상의 링커를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 동일한 링커가 인접한 항원성 펩타이드의 각각의 쌍 사이에 사용될 수 있거나, 또는 임의의 수의 상이한 링커가 인접한 항원성 펩타이드의 상이한 쌍 사이에 사용될 수 있다. 이에 더하여, 하나의 링커가 인접한 항원성 펩타이드의 쌍 사이에 사용될 수 있거나, 또는 다수의 링커가 인접한 항원성 펩타이드의 쌍 사이에 사용될 수 있다.
임의의 적합한 서열이 펩타이드 링커에 사용될 수 있다. 예로서, 링커 서열은 길이가, 예를 들어, 1 내지 약 50개의 아미노산일 수 있다. 일부 링커는 친수성일 수 있다. 링커는 다양한 목적으로 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 링커는 박테리아 분비를 증가시키거나, 항원 처리를 용이하게 하거나, 융합 폴리펩타이드의 유연성을 증가시키거나, 융합 폴리펩타이드의 강성을 증가시키거나, 또는 어떤 다른 목적으로도 역할을 할 수 있다. 어떤 경우에는, 반복부위를 최소화하기 위해 상이한 아미노산 링커 서열이 항원성 펩타이드 사이에 분포되거나 동일한 아미노산 링커 서열을 암호화하는 상이한 핵산이 항원성 펩타이드 (예를 들어, 서열 번호: 84-94) 사이에 분포된다. 이것은 또한 2차 구조를 감소시켜, Lm 재조합 벡터 균주 집단 내에서 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 (예를 들어, 플라스미드)의 효율적인 전사, 번역, 분비, 유지, 또는 안정화를 허용하는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 다음 인자 중 하나 이상에 기초하여 다른 적합한 펩타이드 링커 서열이 선택될 수 있다: (1) 유연한 연장된 입체구조를 채택할 수 있음; (2) 항원성 펩타이드 상의 기능적 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택할 수 없음; 및 (3) 기능적 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 대전된 잔기의 부족. 예를 들어, 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유할 수 있다. 다른 거의 중성의 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala이 또한 링커 서열에서 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열은 Maratea et al. (1985) Gene 40:39-46; Murphy et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:8258-8262; US 4,935,233; 및 US 4,751,180 (이것들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것들을 포함한다. 링커의 특정 예는 표 2의 것들 (이것들 각각은 그 자체로 링커로서, 서열의 반복부위를 포함하는 링커에서, 또는 표의 다른 서열 중 하나 이상을 더 포함하는 링커에서 사용될 수 있다)을 포함하지만, 다른 것들도 구상될 수 있다 (예를 들어, Reddy Chichili et al. (2013) Protein Science 22:153-167 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 명시되지 않는 한, "n"은 나열된 링커에서 미결정 반복부위 수를 나타낸다.
링커
펩타이드 링커 예 서열 번호: 가상의 목적
(GAS)n GASGAS 33 유연성
(GSA)n GSAGSA 34 유연성
(G)n; n = 4-8 GGGG 35 유연성
(GGGGS)n; n = 1-3 GGGGS 36 유연성
VGKGGSGG VGKGGSGG 37 유연성
(PAPAP)n PAPAP 38 강성
(EAAAK)n; n=1-3 EAAAK 39 강성
(AYL)n AYLAYL 40 항원 처리
(LRA)n LRALRA 41 항원 처리
(RLRA)n RLRA 42 항원 처리
B. PEST-함유 펩타이드
본원에서 개시된 재조합 융합 단백질은 PEST-함유 펩타이드를 포함한다. PEST-함유 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 아미노 말단 (N-말단) 단부 (즉, 항원성 펩타이드에 대해 N-말단)에 있을 수 있거나, 융합 폴리펩타이드의 카르복시 말단 (C-말단) 단부 (즉, 항원성 펩타이드에 대해 C-말단)에 있을 수 있거나, 또는 항원성 펩타이드 내에 내포될 수 있다. 일부 재조합 리스테리아 균주 및 방법에서, PEST 함유 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 일부가 아니며 융합 폴리펩타이드로부터 분리된다. PEST-유사 서열, 예컨대 LLO 펩타이드로의 항원성 펩타이드의 융합은 항원성 펩타이드의 면역원성을 향상시킬 수 있고 세포-매개된 항종양 면역 반응을 증가시킬 수 있다 (즉, 세포-매개된 항-종양 면역력을 증가시킬 수 있다). 예를 들어, Singh et al. (2005) J Immunol 175(6):3663-3673 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
PEST-함유 펩타이드는 PEST 서열 또는 PEST-유사 서열을 포함하는 것이다. 진핵 단백질에서 PEST 서열이 오랫동안 확인되었다. 예를 들어, 프롤린 (P), 글루탐산 (E), 세린 (S) 및 트레오닌 (T)이 풍부한 아미노산 서열을 함유하는 단백질 (PEST)은 항상 그러한 것은 아니지만, 일반적으로 여러 양으로 대전된 아미노산을 함유하는 클러스터에 의해 플랭킹되며(flanked), 빠른 세포 내 반감기를 갖는다 (Rogers et al. (1986) Science 234:364-369 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 또한, 이들 서열은 분해를 위해 단백질을 유비퀴틴-프로테아솜 경로로 표적화시킨다는 것이 보고되었다 (Rechsteiner and Rogers (1996) Trends Biochem. Sci. 21:267-271 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 이 경로는 또한 진핵 세포에 의해 MHC 클래스 I에 결합하는 면역원성 펩타이드를 생성하는데 사용되고 PEST 서열이 면역원성 펩타이드를 발생시키는 진핵 단백질 사이에서 풍부한 것으로 가정되었다 (Realini et al. (1994) FEBS Lett . 348:109-113 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 원핵 단백질은 이 효소 경로를 갖지 않기 때문에 일반적으로는 PEST 서열을 함유하지 않는다. 하지만, 아미노산 프롤린 (P), 글루탐산 (E), 세린 (S) 및 트레오닌 (T)이 풍부한 PEST-유사 서열은 LLO의 아미노 말단에서 보고되었고 리스테리아 모노시토게네스 병원성에 필수적인 것으로 보고되었다 (Decatur and Portnoy (2000) Science 290:992-995 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). LLO에서 이 PEST-유사 서열의 존재는 LLO이 그 기능의 역할을 하고 식포 또는 포식리소좀 액포로부터 리스테리아 모노시토게네스의 탈출을 촉진하면, 세포를 손상시키기 전에 파괴되도록 숙주 세포의 단백질 용해 기작에 의해 파괴되는 단백질을 표적화한다.
PEST 및 PEST-유사 서열의 확인은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, Rogers et al. (1986) Science 234(4774):364-378 및 Rechsteiner and Rogers (1996) Trends Biochem . Sci. 21:267-271 (이것들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. PEST 또는 PEST-유사 서열은 PEST-발견 프로그램을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, PEST-유사 서열은 프롤린 (P), 글루탐산 (E), 세린 (S), 및 트레오닌 (T) 잔기가 풍부한 영역일 수 있다. 선택적으로, PEST-유사 서열은 여러 양으로 대전된 아미노산을 함유하는 하나 이상의 클러스터에 의해 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, PEST-유사 서열은 높은 국소 농도의 프롤린 (P), 아스파르테이트 (D), 글루타메이트 (E), 세린 (S), 및/또는 트레오닌 (T) 잔기를 갖고 길이가 적어도 12개의 아미노산의 친수성 신장부로서 한정될 수 있다. 어떤 경우에는, PEST-유사 서열은 양으로 대전된 아미노산, 즉 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 및 리신 (K)을 함유하지 않는다. 일부 PEST-유사 서열은 하나 이상의 내부 인산화 부위를 함유할 수 있고, 이들 부위에서의 인산화가 단백질 분해에 선행한다.
한 예에서, PEST-유사 서열은 Rogers et al.에서 개시된 알고리즘에 적합하다. 또 다른 예에서, PEST-유사 서열은 Rechsteiner and Rogers에서 개시된 알고리즘에 적합하다. PEST-유사 서열은 또한 명시된 단백질 서열 내에서 양으로 대전된 아미노산 R, H, 및 K에 대한 초기 스캔에 의해 확인될 수 있다. 양으로 대전된 측면 사이의 모든 아미노산이 계수되고, 단지 창-크기 파라미터와 같거나 더 높은 많은 아미노산을 함유하는 상기 모티프(motif)만이 추가로 고려된다. 선택적으로, PEST-유사 서열은 적어도 하나의 P, 적어도 하나의 D 또는 E, 및 적어도 하나의 S 또는 T를 함유해야 한다.
PEST 모티프의 품질은 중요 아미노산의 국소적 풍부화, 뿐만 아니라 모티프 소수성에 기초한 점수 파라미터의 수단에 의해 개선될 수 있다. D, E, P, S, 및 T의 풍부화는 질량 퍼센트 (w/w)로 표현되고 D 또는 E의 하나의 동등물, P의 하나의 동등물, 및 S 또는 T의 하나의 동등물에 대해 교정된다. 소수성의 계산은 또한 원칙적으로 Kyte and Doolittle (1982) J. Mol . Biol . 157:105 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 방법을 따를 수 있다. 단순화된 계산을 위해, 원래 아르기닌에 대한 -4.5에서부터 아이소류신에 대한 +4.5까지의 범위에 있는 카이트-두리틀 수치 지표가 다음 선형 변환을 사용하여 양의 정수로 전환되며, 여기서 아르기닌에 대한 0에서부터 아이소류신에 대한 90까지의 값을 수득한다: 수치 지표 = 10 * 카이트-두리틀 수치 지표 + 45.
잠재적인 PEST 모티프의 소수성은 또한 각각의 아미노산 종에 대한 몰 퍼센트 및 소수성 지수의 곱에 대한 합계로 계산될 수 있다. 원하는 PEST 점수는 다음 방정식으로 나타난 바와 같이 국소적 풍부화 용어 및 소수성 용어의 조합으로 얻어진다: PEST 점수 = 0.55 * DEPST - 0.5 * 소수성 지수.
따라서, PEST-함유 펩타이드는 상기 알고리즘을 사용하여 적어도 +5의 점수를 가진 펩타이드를 지칭할 수 있다. 대안으로, 그것은 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 32, 적어도 35, 적어도 38, 적어도 40, 또는 적어도 45의 점수를 가진 펩타이드를 지칭할 수 있다.
임의의 다른 공지된 이용 가능한 방법 또는 알고리즘이 또한 PEST-유사 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, CaSPredictor (Garay-Malpartida et al. (2005) Bioinformatics 21 Suppl 1:i169-76 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)) 참조. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 다음과 같다: PEST 지수는 아미노산 Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn, 또는 Gln에 1의 값을 할당함으로써 적절한 길이의 각각의 신장부 (예를 들어, 30-35개의 아미노산 신장부)에 대해 계산된다. PEST 잔기 각각에 대한 계수 값 (CV)은 1이고 다른 AA (비-PEST) 각각에 대한 CV는 0이다.
PEST-유사 아미노산 서열의 예는 서열 번호: 43-51에서 제시된 것들이다. PEST-유사 서열의 한 예는 KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (서열 번호: 43)이다. PEST-유사 서열의 또 다른 예는 KENSISSMAPPASPPASPK (서열 번호: 44)이다. 하지만, 임의의 PEST 또는 PEST-유사 아미노산 서열이 사용될 수 있다. PEST 서열 펩타이드는 공지되어 있고, 예를 들어, US 7,635,479; US 7,665,238; 및 US 2014/0186387 (이것들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
PEST-유사 서열은 리스테리아 종, 예컨대 리스테리아 모노시토게네스로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 리스테리아 모노시토게네스 ActA 단백질은 적어도 4개의 이러한 서열 (서열 번호: 45-48)을 함유하며, 이것들 중 어느 것도 본원에서 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합하다. 다른 유사한 PEST-유사 서열은 서열 번호: 52-54를 포함한다. 스트렙토코쿠스 종(sp.)의 스트렙토리신 O 단백질이 또한 PEST 서열을 함유한다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 스트렙토리신 O은 아미노산 35-51에서 PEST 서열 KQNTASTETTTTNEQPK (서열 번호: 49)를 포함하고 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis) 스트렙토리신 O은 아미노산 38-54에서 PEST-유사 서열 KQNTANTETTTTNEQPK (서열 번호: 50)를 포함한다. PEST-유사 서열의 또 다른 예는 리스테리아 셀리게리 시토리신으로부터 유래되며, lso 유전자에 의해 암호화된다: RSEVTISPAETPESPPATP (예를 들어, 서열 번호: 51).
대안으로, PEST-유사 서열은 다른 원핵 유기체로부터 유래될 수 있다. PEST-유사 아미노산 서열이 예상되는 다른 원핵 유기체는, 예를 들어, 다른 리스테리아 종을 포함한다.
(1) 리스테리오리신 O ( LLO )
본원에서 개시된 조성물 및 방법에서 이용될 수 있는 PEST-함유 펩타이드의 한 예는 리스테리오리신 O (LLO) 펩타이드이다. LLO 단백질의 예는 GenBank 기탁 번호 P13128 (서열 번호: 55; 핵산 서열은 GenBank 기탁 번호 X15127에서 제시된다)이 할당되 단백질이다. 서열 번호: 55는 신호 서열을 포함하는 프로단백질(proprotein)이다. 프로단백질의 처음 25개의 아미노산은 신호 서열이고 박테리아에 의해 분비될 때 LLO로부터 분열되어, 신호 서열 없이 504개의 아미노산의 전장 활성 LLO 단백질을 발생시킨다. 본원에서 개시된 LLO 펩타이드는 신호 서열을 포함할 수 있거나 또는 신호 서열을 포함하지 않는 펩타이드를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 예시의 LLO 단백질은 서열 번호: 55에서 제시된 서열 또는 서열 번호: 55의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 아이소폼의 단편을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다. LLO 단백질의 단편 또는 LLO 단백질의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 또는 유사체의 단편을 암호화하는 임의의 서열이 사용될 수 있다. 상동성 LLO 단백질은 참조 LLO 단백질에 대해, 예를 들어, 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%보다 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
LLO 단백질의 또 다른 예는 서열 번호: 56에서 제시된다. 사용될 수 있는 LLO 단백질은 서열 번호: 56에서 제시된 서열 또는 서열 번호: 56의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 아이소폼의 단편을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
LLO 단백질의 또 다른 예는 GenBank 기탁 번호: ZP_01942330 또는 EBA21833에서 제시된 바와 같이, 또는 GenBank 기탁 번호: NZ_AARZ01000015 또는 AARZ01000015.1에서 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 바와 같이 리스테리아 모노시토게네스 10403S 균주로부터의 LLO 단백질이다. LLO 단백질의 또 다른 예는 리스테리아 모노시토게네스 4b F2365 균주 (예를 들어, GenBank 기탁 번호: YP_012823 참조), EGD-e 균주 (예를 들어, GenBank 기탁 번호: NP_463733 참조), 또는 리스테리아 모노시토게네스의 임의의 다른 균주로부터의 LLO 단백질이다. LLO 단백질의 또 다른 예는 from 플라보박테리알레스(Flavobacteriales ) 박테리아 HTCC2170으로부터의 LLO 단백질이다 (예를 들어, GenBank 기탁 번호: ZP_01106747 또는 EAR01433 참조, 또는 GenBank 기탁 번호: NZ_AAOC01000003에 의해 암호화됨). 사용될 수 있는 LLO 단백질은 상기 LLO 단백질 또는 상기 LLO 단백질의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 아이소폼의 단편 중 어느 것도 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어질 수 있다.
LLO, 또는 그것의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 아이소폼의 단편에 대해 상동성인 단백질이 또한 사용될 수 있다. 하나의 이러한 예는 알베오리신이며, 이것은, 예를 들어, 페니바실루스 알베이(Paenibacillus alvei) (예를 들어, GenBank 기탁 번호: P23564 또는 AAA22224 참조, 또는 GenBank 기탁 번호: M62709에 의해 암호화됨)에서 발견될 수 있다. 다른 이러한 상동성 단백질이 공지되어 있다.
LLO 펩타이드는 전장 LLO 단백질 또는 절단된 LLO 단백질 또는 LLO 단편일 수 있다. 유사하게, LLO 펩타이드는 고유한 LLO 단백질의 하나 이상의 기능을 유지하는 것일 수 있거나 고유한 LLO 단백질의 하나 이상의 기능이 없는 것일 수 있다. 예를 들어, 유지되는 LLO 기능은 박테리아 (예를 들어, 리스테리아)가 식포 또는 포식리소좀으로부터 탈출할 수 있게 하거나, 그것이 융합되는 펩타이드의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 유지되는 기능은 또한 용혈 기능 또는 항원 기능일 수 있다. 대안으로, LLO 펩타이드는 비-용혈성 LLO일 수 있다. LLO의 다른 기능은 LLO 기능을 평가하기 위한 방법 및 검정에서와 같이 공지되어 있다.
LLO 단편은 PEST-유사 서열일 수 있거나 또는 PEST-유사 서열을 포함할 수 있다. LLO 단편은 내부 결실, C-말단부로부터의 절단, 및 N-말단부로부터의 절단 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, LLO 단편은 하나 이상의 내부 결실을 포함할 수 있다. 다른 LLO 펩타이드는 하나 이상의 돌연변이를 가진 전장 LLO 단백질일 수 있다. 일부 LLO 단백질 또는 단편은 야생형 LLO에 비해 감소된 용혈 활성을 갖거나 비-용혈성 단편이다. 예를 들어, LLO 단백질은 카르복시 말단에서 활성화 도메인의 결실 또는 돌연변이에 의해, 시스테인 484의 결실 또는 돌연변이에 의해, 또는 또 다른 위치에서의 결실 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성으로 만들어질 수 있다.
다른 LLO 단백질은 US 8,771,702 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 상세히 설명된 바와 같이 콜레스테롤 결합 도메인 (CBD)의 결실 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성으로 만들어진다. 돌연변이는, 예를 들어, 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 전체 CBD가 돌연변이될 수 있거나, CBD의 일부가 돌연변이될 수 있거나, 또는 CBD 내 특정 잔기가 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, LLO 단백질은 서열 번호: 55 (예를 들어, 상응하는 시스테인 또는 트립토판 잔기)와 함께 최적으로 정렬될 때 서열 번호: 55의 잔기 C484, W491, 및 W492 (예를 들어, C484, W491, W492, C484 및 W491, C484 및 W492, W491 및 W492, 또는 3개의 잔기 모두) 또는 상응하는 잔기 중 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예로서, LLO의 잔기 C484, W491, 및 W492가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 LLO 단백질이 생성될 수 있으며, 이것은 야생형 LLO에 비해 용혈 활성을 실질적으로 감소시킬 것이다. C484A, W491A, 및 W492A 돌연변이를 가진 돌연변이 LLO 단백질은 "mutLLO"라고 불린다.
또 다른 예로서, 콜레스테롤-결합 도메인을 포함하는 내부 결실을 가진 돌연변이 LLO 단백질이 생성될 수 있다. 서열 번호: 55의 콜레스테롤-결합 도메인의 서열은 서열 번호: 74에서 제시된다. 예를 들어, 내부 결실은 1-11개의 아미노산 결실, 11-50개의 아미노산 결실, 또는 그 이상일 수 있다. 유사하게, 돌연변이된 영역은 1-11개의 아미노산, 11-50개의 아미노산, 또는 그 이상 (예를 들어, 1-50, 1-11, 2-11, 3-11, 4-11, 5-11, 6-11, 7-11, 8-11, 9-11, 10-11, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 12-50, 11-15, 11-20, 11-25, 11-30, 11-35, 11-40, 11-50, 11-60, 11-70, 11-80, 11-90, 11-100, 11-150, 15-20, 15-25, 15-30, 15-35, 15-40, 15-50, 15-60, 15-70, 15-80, 15-90, 15-100, 15-150, 20-25, 20-30, 20-35, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 20-100, 20-150, 30-35, 30-40, 30-60, 30-70, 30-80, 30-90, 30-100, 또는 30-150개의 아미노산)일 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 55의 잔기 470-500, 470-510, 또는 480-500으로 이루어진 돌연변이된 영역은 CBD를 포함하는 결실된 서열 (서열 번호: 55의 잔기 483-493)을 발생시킬 것이다. 하지만, 돌연변이된 영역은 또한 CBD의 단편일 수 있거나 또는 CBD의 일부와 중첩될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 영역은 서열 번호: 55의 잔기 470-490, 480-488, 485-490, 486-488, 490-500, 또는 486-510으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, CBD의 단편 (잔기 484-492)은 이종성 서열로 대체될 수 있으며, 이것은 야생형 LLO에 비해 용혈 활성을 실질적으로 감소시킬 것이다. 예를 들어, CBD (ECTGLAWEWWR; 서열 번호: 74)는 항원 NY-ESO-1의 CTL 에피토프 (ESLLMWITQCR; 서열 번호: 75)로 대체될 수 있으며, 이것은 NY-ESO-1의 HLA-A2 제한된 에피토프 157-165를 함유한다. 결과로 생성된 LLO는 "ctLLO"라고 불린다.
일부 돌연변이된 LLO 단백질에서, 돌연변이된 영역은 이종성 서열에 의해 대체될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 영역은 같은 수의 이종성 아미노산, 더 적은 수의 이종성 아미노산, 또는 더 많은 수의 아미노산 (예를 들어, 1-50, 1-11, 2-11, 3-11, 4-11, 5-11, 6-11, 7-11, 8-11, 9-11, 10-11, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 12-50, 11-15, 11-20, 11-25, 11-30, 11-35, 11-40, 11-50, 11-60, 11-70, 11-80, 11-90, 11-100, 11-150, 15-20, 15-25, 15-30, 15-35, 15-40, 15-50, 15-60, 15-70, 15-80, 15-90, 15-100, 15-150, 20-25, 20-30, 20-35, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 20-100, 20-150, 30-35, 30-40, 30-60, 30-70, 30-80, 30-90, 30-100, 또는 30-150개의 아미노산)으로 대체될 수 있다. 다른 돌연변이된 LLO 단백질은 하나 이상의 점 돌연변이 (예를 들어, 1개의 잔기, 2개의 잔기, 3개의 잔기, 또는 그 이상의 점 돌연변이)를 갖는다. 돌연변이된 잔기는 인접하거나 인접하지 않을 수 있다.
한 예시의 구체예에서, LLO 펩타이드는 신호 서열에서 결실 및 CBD에서 돌연변이 또는 치환을 가질 수 있다.
일부 LLO 펩타이드는 N-말단 LLO 단편 (즉, C-말단 결실을 가진 LLO 단백질)이다. 일부 LLO 펩타이드는 길이가 적어도 494, 489, 492, 493, 500, 505, 510, 515, 520, 또는 525개의 아미노산 또는 길이가 492-528개의 아미노산이다. 예를 들어, LLO 단편은 LLO 단백질의 대략 처음 440 또는 441개의 아미노산 (예를 들어, 서열 번호: 55 또는 56의 처음 441개의 아미노산, 또는 서열 번호: 55 또는 56과 함께 최적으로 정렬될 때 또 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)으로 이루어질 수 있다. 다른 N-말단 LLO 단편은 LLO 단백질의 처음 420개의 아미노산 (예를 들어, 서열 번호: 55 또는 56의 처음 420개의 아미노산, 또는 서열 번호: 55 또는 56과 함께 최적으로 정렬될 때 또 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)으로 이루어질 수 있다. 다른 N-말단 단편은 LLO 단백질의 대략 아미노산 20-442 (예를 들어, 서열 번호: 55 또는 56의 아미노산 20-442, 또는 또 서열 번호: 55 또는 56과 함께 최적으로 정렬될 때 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)으로 이루어질 수 있다. 다른 N-말단 LLO 단편은 시스테인 484를 포함하는 활성화 도메인이 없는, 특히 시스테인 484가 없는 임의의 ΔLLO를 포함한다. 예를 들어, N-말단 LLO 단편은 LLO 단백질의 처음 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 또는 25개의 아미노산 (예를 들어, 서열 번호: 55 또는 56의 처음 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 또는 25개의 아미노산, 또는 서열 번호: 55 또는 56과 함께 최적으로 정렬될 때 또 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)에 상응한다. 바람직하게는, 단편은 하나 이상의 PEST-유사 서열을 포함한다. LLO 단편 및 절단된 LLO 단백질은 상기 특정 아미노산 범위 중 어느 하나에 상응하는 상동성 LLO 단백질의 잔기를 함유할 수 있다. 잔기 수가 상기 열거된 잔기 수와 정확하게 상응할 필요는 없다 (예를 들어, 상동성 LLO 단백질이 본원에서 개시된 특정 LLO 단백질에 관하여 삽입 또는 결실을 갖는 경우). N-말단 LLO 단편의 예는 서열 번호: 57, 58, 및 59를 포함한다. 사용될 수 있는 LLO 단백질은 서열 번호: 57, 58, 또는 59에서 제시된 서열 또는 서열 번호: 57, 58, 또는 59의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 아이소폼의 단편을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다. 일부 조성물 및 방법에서, 서열 번호: 59에서 제시된 N-말단 LLO 단편이 사용된다. 서열 번호: 59에서 제시된 N-말단 LLO 단편을 암호화하는 핵산의 예는 서열 번호: 60이다.
(2) ActA
본원에서 개시된 조성물 및 방법에서 이용될 수 있는 PEST-함유 펩타이드의 또 다른 예는 ActA 펩타이드이다. ActA는 표면-회합된 단백질이고 감염된 숙주 세포에서 세포질을 통해 리스테리아 모노시토게네스를 몰아가기 위해 숙주 액틴 폴리머의 폴리머화, 조립, 및 활성화를 촉진하기 위한 스캐폴드(scaffold)의 역할을 한다. 포유류 세포 시토졸로의 진입 직후, 리스테리아 모노시토게네스는 숙주 액틴 필라멘트의 폴리머화를 유도하고 액틴 폴리머화에 의해 생성된 힘을 사용하여 먼저 세포 내로, 이어서 세포에서 세포로 이동시킨다. ActA는 액틴 핵 형성 및 액틴-기반 운동성을 매개하는 역할을 한다. ActA 단백질은 숙주 세포골격 구성요소에 대한 다수의 결합 부위를 제공하여, 세포 액틴 폴리머화 기작을 조립하기 위한 스캐폴드의 역할을 한다. ActA의 N-말단은 모노머 액틴에 결합하고 내재적 액틴 핵 형성 활성을 자극함으로써 구성적 활성 핵 형성 촉진 인자의 역할을 한다. actA 및 hly 유전자는 둘 다 전사 활성체 PrfA에 의해 조절되는 10-kb 유전자 클러스터의 구성원이고, actA는 포유류 시토졸에서 대략 226배 상향조절된다. ActA 단백질 또는 ActA 단백질의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 또는 유사체의 단편을 암호화하는 임의의 서열이 사용될 수 있다. 상동성 ActA 단백질은 참조 ActA 단백질과, 예를 들어, 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%보다 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
ActA 단백질의 한 예는 서열 번호: 61에서 제시된 서열을 포함하거나, 근본적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. ActA 단백질의 또 다른 예는 서열 번호: 62에서 제시된 서열을 포함하거나, 근본적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 이들 서열 중 하나에 상응하는 프로단백질의 처음 29개의 아미노산은 신호 서열이고 박테리아에 의해 분비될 때 ActA 단백질로부터 분열된다. ActA 펩타이드는 신호 서열 (예를 들어, 서열 번호: 61 또는 62의 아미노산 1-29)을 포함할 수 있거나, 또는 신호 서열을 포함하지 않는 펩타이드를 포함할 수 있다. ActA 단백질의 다른 예는 서열 번호: 61 또는 62의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 아이소폼의 단편, 또는 유사체의 단편을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
ActA 단백질의 또 다른 예는 리스테리아 모노시토게네스 10403S 균주 (GenBank 기탁 번호: DQ054585), NICPBP 54002 균주 (GenBank 기탁 번호: EU394959), S3 균주 (GenBank 기탁 번호: EU394960), NCTC 5348 균주 (GenBank 기탁 번호: EU394961), NICPBP 54006 균주 (GenBank 기탁 번호: EU394962), M7 균주 (GenBank 기탁 번호: EU394963), S19 균주 (GenBank 기탁 번호: EU394964), 또는 리스테리아 모노시토게네스의 임의의 다른 균주로부터의 ActA 단백질이다. 사용될 수 있는 LLO 단백질은 상기 LLO 단백질 또는 상기 LLO 단백질의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 아이소폼의 단편 중 어느 것을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어질 수 있다.
ActA 펩타이드는 전장 ActA 단백질 또는 절단된 ActA 단백질 또는 ActA 단편 (예를 들어, C-말단 부분이 제거된 N-말단 ActA 단편)일 수 있다. 바람직하게는, 절단된 ActA 단백질은 적어도 하나의 PEST 서열 (예를 들어, 하나 이상의 PEST 서열)을 포함한다. 이에 더하여, 절단된 ActA 단백질은 선택적으로 ActA 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 절단된 ActA 단백질에 함유되는 PEST-유사 서열의 예는 서열 번호: 45-48을 포함한다. 일부 이러한 절단된 ActA 단백질은 서열 번호: 45-48에서 제시된 PEST-유사 서열 또는 그것들의 상동체 중 적어도 2개, 서열 번호: 45-48에서 제시된 PEST-유사 서열 또는 그것들의 상동체 중 적어도 3개, 또는 서열 번호: 45-48에서 제시된 PEST-유사 서열 또는 그것들의 상동체 4개 모두를 포함한다. 절단된 ActA 단백질의 예는 전장 ActA 단백질 서열 (예를 들어, 서열 번호: 62)의 약 잔기 30-122, 약 잔기 30-229, 약 잔기 30-332, 약 잔기 30-200, 또는 약 잔기 30-399를 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진 것들을 포함한다. 절단된 ActA 단백질의 다른 예는 전장 ActA 단백질 서열 (예를 들어, 서열 번호: 62)의 대략 처음 50, 100, 150, 200, 233, 250, 300, 390, 400, 또는 418개의 잔기를 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진 것들을 포함한다. 절단된 ActA 단백질의 다른 예는 전장 ActA 단백질 서열 (예를 들어, 서열 번호: 62)의 대략 잔기 200-300 또는 잔기 300-400을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 절단된 ActA는 US 7,655,238 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기재된 바와 같이 야생형 ActA 단백질의 처음 390개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 예로서, 절단된 ActA는 US 2014/0186387 (모든 목적을 위해 그 번문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기재된 바와 같이 PEST 모티프가 결실되고 비보존적 QDNKR (서열 번호: 73) 치환을 함유하는 ActA-N100 또는 그것의 변형된 버전 (ActA-N100*라고 불림)일 수 있다. 대안으로, 절단된 ActA 단백질은 상기 아미노산 범위 또는 본원에서 개시된 ActA 펩타이드 중 어느 것의 아미노산 범위 중 하나에 상응하는 상동성 ActA 단백질의 잔기를 함유할 수 있다. 잔기 수가 본원에서 결거된 잔기 수와 정확하게 상응할 필요는 없다 (예를 들어, 상동성 ActA 단백질이 본원에서 이용된 ActA 단백질에 관하여 삽입 또는 결실을 갖는 경우, 잔기 수는 그에 따라 조정될 수 있다).
절단된 ActA 단백질의 예는, 예를 들어, 서열 번호: 63, 64, 65, 또는 66에서 제시된 서열 또는 서열 번호: 63, 64, 65, 또는 66의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 변이체의 단편, 아이소폼의 단편, 또는 유사체의 단편을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진 단백질을 포함한다. 서열 번호: 63은 ActA/PEST1이라고 불리고 서열 번호: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-122으로 이루어진다. 서열 번호: 64는 ActA/PEST2 또는 LA229라고 불리고 서열 번호: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-229로 이루어진다. 서열 번호: 65는 ActA/PEST3이라고 불리고 서열 번호: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-332로 이루어진다. 서열 번호: 66은 ActA/PEST4라고 불리고 서열 번호: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-399로 이루어진다. 특정 예로서, 서열 번호: 64에서 제시된 서열로 이루어진 절단된 ActA 단백질이 사용될 수 있다.
절단된 ActA 단백질의 예는, 예를 들어, 서열 번호: 67, 69, 70, 또는 72에서 제시된 서열 또는 서열 번호: 67, 69, 70, 또는 72의 상동체, 변이체, 아이소폼, 유사체, 변이체의 단편, 아이소폼의 단편, 또는 유사체의 단편을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진 단백질을 포함한다. 특정 예로서, 서열 번호: 67에서 제시된 서열로 이루어진 절단된 ActA 단백질 (서열 번호: 68에서 제시된 핵산에 의해 암호화됨)이 사용될 수 있다. 또 다른 특정 예로서, 서열 번호: 70에서 제시된 서열로 이루어진 절단된 ActA 단백질 (서열 번호: 71에서 제시된 핵산에 의해 암호화됨)이 사용될 수 있다. 서열 번호: 71은 리스테리아 모노시토게네스 10403S 균주에서 ActA를 암호화하는 처음 1170개의 뉴클레오타이드이다. 어떤 경우에는, ActA 단편이 이종성 신호 펩타이드에 융합될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 72는 Hly 신호 펩타이드에 융합된 ActA 단편을 제시한다.
C. 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 면역요법 작제물의 생성
또한 본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 면역요법 작제물 또는 본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 생성하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 이러한 방법은 면역요법 작제물에서 포함하도록 항원성 펩타이드를 선별하고 디자인하는 단계 (그리고, 예를 들어, 각각의 항원성 펩타이드의 수치요법을 테스트하고, 점수가 선별된 수치 지표 임계치보다 높으면 항원성 펩타이드를 변형시키거나 선택 해제하는 단계), 선별된 항원성 펩타이드 각각을 포함하는 하나 이상의 융합 폴리펩타이드를 디자인하는 단계, 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 작제물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
항원성 펩타이드는 소수성 또는 친수성에 대해 스크리닝될 수 있다. 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 그것들이 친수성이거나 또는 최대 특정 수치 임계치 또는 그 아래로 채점될 수 있는 경우 선별될 수 있으며, 이것으로 특정 관심 박테리아 (예를 들어, 리스테리아 모노시토게네스)에서의 분비 가능성을 예측할 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩타이드는 21개의 아미노산 창을 이용하여 카이트 및 두리틀 수치 지표에 의해 채점될 수 있고, 컷오프 (대략 1.6)보다 높은 모든 점수는 리스테리아 모노시토게네스에 의한 분비 가능성이 낮기 때문에 배제될 수 있다. 예를 들어, Kyte-Doolittle (1982) J Mol Biol 157(1):105-132 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 대안으로, 선별된 컷오프에 대한 항원성 펩타이드 점수는 변경될 수 있다 (예를 들어, 항원성 펩타이드의 길이의 변화). 사용될 수 있는 다른 슬라이딩 창 크기는, 예를 들어, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27개 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 슬라이딩(sliding) 창 크기는 9-11개의 아미노산, 11-13개의 아미노산, 13-15개의 아미노산, 15-17개의 아미노산, 17-19개의 아미노산, 19-21개의 아미노산, 21-23개의 아미노산, 23-25개의 아미노산, 또는 25-27개의 아미노산일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 컷오프는, 예를 들어, 다음 범위 1.2-1.4, 1.4-1.6, 1.6-1.8, 1.8-2.0, 2.0-2.2 2.2-2.5, 2.5-3.0, 3.0-3.5, 3.5-4.0, 또는 4.0-4.5를 포함하거나, 또는 컷오프는 1.4, 1.5, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.3, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 또는 4.5일 수 있다. 컷오프는, 예를 들어, 융합 폴리펩타이드를 전달하는데 사용되는 박테리아의 속 또는 종에 따라 달라질 수 있다.
다른 적합한 수치요법 플롯 또는 다른 적절한 스케일은, 예를 들어, Rose et al. (1993) Annu Rev Biomol Struct 22:381-415; Biswas et al. (2003) Journal of Chromatography A 1000:637-655; Eisenberg (1984) Ann Rev Biochem 53:595-623; Abraham and Leo (1987) Proteins: Structure, Function and Genetics 2:130-152; Sweet and Eisenberg (1983) Mol Biol 171:479-488; Bull and Breese (1974) Arch Biochem Biophys 161:665-670; Guy (1985) Biophys J 47:61-70; Miyazawa et al. (1985) Macromolecules 18:534-552; Roseman (1988) J Mol Biol 200:513-522; Wolfenden et al. (1981) Biochemistry 20:849-855; Wilson (1981) Biochem J 199:31-41; Cowan and Whittaker (1990) Peptide Research 3:75-80; Aboderin (1971) Int J Biochem 2:537-544; Eisenberg et al. (1984) J Mol Biol 179:125-142; Hopp and Woods (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:3824-3828; Manavalan and Ponnuswamy (1978) Nature 275:673-674; Black and Mould (1991) Anal Biochem 193:72-82; Fauchere and Pliska (1983) Eur J Med Chem 18:369-375; Janin (1979) Nature 277:491-492; Rao and Argos (1986) Biochim Biophys Acta 869:197-214; Tanford (1962) Am Chem Soc 84:4240-4274; Welling et al. (1985) FEBS Lett 188:215-218; Parker et al. (1986) Biochemistry 25:5425-5431; 및 Cowan and Whittaker (1990) Peptide Research 3:75-80 (이것들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 보고된 것들을 포함한다.
선택적으로, 항원성 펩타이드는 대상 인간 백혈구 항원 (HLA) 유형에 결합하는 능력에 대해 채점될 수 있고 (예를 들어, netMHCpan, ANN, SMMPMBEC. SMM, CombLib_Sidney2008, PickPocket, 및 netMHCcons를 포함한, www.iedb.org에서 이용 가능한 면역 에피토프 데이터베이스 (IED)를 사용함으로써) 각각의 항원성 펩타이드로부터의 최고의 MHC 결합 점수로 순위가 정해질 수 있다. 다른 출처는 TEpredict (tepredict.sourceforge.net/help.html) 또는 다른 이용 가능한 MHC 결합 측정 스케일을 포함한다. 컷오프는 상이한 발현 벡터, 예컨대 살모넬라에 대해 상이할 수 있다.
선택적으로, 항원성 펩타이드는 항원성 펩타이드를 선택 해제하거나 또는 면역억제 영향을 막기 위해 면역억제 에피토프 (예를 들어, T-reg 에피토프, IL-10-유도 T 보조 에피토프, 등)에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적으로, 에피토프의 면역원성에 대한 예측 알고리즘이 항원성 펩타이드를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 하지만, 이들 알고리즘은 어떤 펩타이드가 T 세포 반응을 생성하는지를 예측하는데 있어서 최고 20% 정확도를 나타낸다. 대안으로, 비스크리닝/예측 알고리즘이 사용된다. 대안으로, 항원성 펩타이드가 면역원성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 이것은 하나 이상의 T 세포를 항원성 펩타이드와 접촉시키고, 면역원성 T 세포 반응에 대해 분석하는 것을 포함할 수 있으며, 면역원성 T 세포 반응으로 펩타이드가 면역원성 펩타이드로서 확인된다. 이것은 또한 면역원성 검정을 사용하여 CD25, CD44, 또는 CD69 중 적어도 하나의 분비를 측정하거나 또는 하나 이상의 T 세포를 펩타이드와 접촉시킬 때 IFN-γ, TNF-α, IL-1, 및 IL-2를 포함하는 군으로부터 선별된 사이토카인의 분비를 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 증가된 분비로 펩타이드가 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것을 확인한다.
선별된 항원성 펩타이드는 잠재적인 융합 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 후보 순서로 배열될 수 있다. 단일 플라스미드에 적합한 것보다 더 사용 가능한 항원성 펩타이드가 존재하면, 상이한 항원성 펩타이드는 필요한 경우/원하는 경우 우선 순위가 할당될 수 있고 및/또는 상이한 융합 폴리펩타이드로 분할될 수 있다 (예를 들어, 사이한 재조합 리스테리아 균주에 포함). 우선 순위는 번역된 폴리펩타이드의 상대적인 크기, 전사 우선권, 및/또는 전체적인 소수성과 같은 인자에 의해 결정될 수 있다. 항원성 펩타이드는 본원의 다른 곳에서 더 상세히 개시된 바와 같이 항원성 펩타이드의 임의의 수의 쌍 사이에 링커, 또는 임의의 링커 조합 없이 직접적으로 함께 결합되도록 배열될 수 있다. 포함되어야 하는 선형 항원성 펩타이드의 수는 돌연변이 부담에 대하여 필요한 작제물의 수, 단일 플라스미드로부터 다수의 에피토프의 번역 및 분비 효율, 및 플라스미드를 포함하는 각각의 박테리아 또는 Lm에 대해 필요한 MOI를 고려하여 결정될 수 있다.
항원성 펩타이드 또는 전체 융합 폴리펩타이드 (즉, 항원성 펩타이드 및 PEST-함유 펩타이드 및 임의의 태그를 포함함)의 조합은 또한 소수성에 대해 채점될 수 있다. 예를 들어, 전체적인 융합된 항원성 펩타이드 또는 전체 융합 폴리펩타이드는 슬라이딩 21 아미노산 창을 이용한 카이트 및 두리틀 수치 지표에 의해 수치요법에 대해 채점될 수 있다. 임의의 영역이 컷오프 (예를 들어, 대략 1.6)보다 높게 채점되면, 항원성 펩타이드는 항원성 펩타이드의 허용 가능한 순서 (즉, 컷오프보다 높게 채점된 영역이 없는 것)가 발견될 때까지 융합 폴리펩타이드 내에서 재정리되거나 섞일 수 있다. 대안으로, 상이한 크기의 것이 되도록 임의의 문제가 있는 항원성 펩타이드가 제거되거나 재디자인될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 항원성 펩타이드 사이에 하나 이상의 링커가 추가되거나 소수성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 개개의 항원성 펩타이드에 대한 수치요법 테스트와 같이, 다른 창 크기가 사용될 수 있거나, 또는 다른 컷오프가 사용될 수 있다 (예를 들어, 융합 폴리펩타이드를 전달하는데 사용되는 박테리아의 속 또는 종에 따라). 이에 더하여, 다른 적합한 수치요법 플롯 또는 다른 적절한 스케일이 사용될 수 있다.
선택적으로, 항원성 펩타이드의 조합 또는 전체 융합 폴리펩타이드는 항원성 펩타이드를 선택 해제하거나 또는 면역억제 영향을 막기 위해 면역억제 에피토프 (예를 들어, T-reg 에피토프, IL-10-유도 T 보조 에피토프, 등)에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다.
항원성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 후보 조합을 암호화하는 핵산이 디자인되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 서열은 증가된 번역 수준, 발현 기간, 분비 수준, 전사 수준, 및 이것들의 임의의 조합에 대해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 증가는 대조군 비-최적화된 서열에 비해 2배 내지 1000배, 2배 내지 500배, 2배 내지 100배, 2배 내지 50배, 2배 내지 20배, 2배 내지 10배, 또는 3배 내지 5배일 수 있다.
예를 들어, 융합 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 올리고뉴클레오타이드 서열에서 아마도 형성되는 2차 구조의 감소된 수준에 대해 최적화될 수 있거나, 또는 대안으로 서열을 변형시킬 수 있는 임의의 효소의 부착을 방지하도록 최적화될 수 있다. 박테리아 세포에서의 발현은, 예를 들어, 전사 침묵, 낮은 mRNA 반감기, 2차 구조 형성, 올리고뉴클레오타이드 결합 분자, 예컨대 억제물질 및 억제자의 부착 부위, 및 희귀한 tRNA 풀(pool)의 이용 가능성에 의해 방해될 수 있다. 박테리아 발현에서 많은 문제의 출처는 원래의 서열 내에서 발견된다. RNA의 최적화는 씨스(cis) 작용 요소의 변형, GC-함량의 조정, 박테리아 세포의 비-제한적 tRNA 풀에 관한 코돈 바이어스 변형, 및 내부 상동성 영역의 방지를 포함할 수 있다. 따라서, 서열을 최적화하는 것은, 예를 들어, 매우 높은 GC 함량 (> 80%) 또는 매우 낮은 (< 30%) GC 함량의 영역을 조정하는 것을 수반할 수 있다. 서열을 최적화하는 것은 또한, 예를 들어, 다음 씨스 작용 서열 모티프 중 하나 이상을 방지하는 것을 수반한다: 내부 TATA-박스, chi-부위, 및 리보솜 진입 부위; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 신장부; 반복 서열 및 RNA 2차 구조; (잠적(cryptic)) 스플라이싱 공여체 및 수령체 부위; 분지점; 또는 이것들의 조합. 발현을 최적화하는 것은 또한 유전자의 플랭킹 영역에 및/또는 플라스미드의 다른 곳에 서열 요소를 추가하는 것을 수반할 수 있다.
서열을 최적화하는 것은 또한, 예를 들어, 코돈 사용을 숙주 유전자 (예를 들어, 리스테리아 모노시토게네스 유전자)의 코돈 바이어스에 맞춰 조정하는 것을 수반한다. 예를 들어, 하기 코돈이 리스테리아 모노시토게네스에 사용될 수 있다.
코돈
A = GCA G = GGT L = TTA Q = CAA V = GTT
C = TGT H = CAT M = ATG R = CGT W = TGG
D = GAT I = ATT N = AAC S = TCT Y = TAT
E = GAA K = AAA P = CCA T = ACA 종결 = TAA
F = TTC
융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 생성되고 전달 비히클(vehicle), 예컨대 박테리아 균주 또는 리스테리아 균주로 도입될 수 있다. 다른 전달 비히클, 예컨대 우두 바이러스(vaccinia virus) 또는 바이러스-유사 입자가 DNA 면역요법 또는 펩타이드 면역요법에 적합할 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드가 생성되고 박테리아 균주 또는 리스테리아 균주로 도입되면, 박테리아 또는 리스테리아 균주가 배양되고 항원성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 발현 및 분비를 확인하기 위해 특성화될 수 있다.
V. 키트
또한 본원에서 개시된 방법 중 하나를 수행하는데 이용되는 하나 이상의 시약을 포함하는 키트 또는 본원에서 개시된 조성물, 도구, 또는 기구 중 하나를 포함하는 키트가 제공된다.
예를 들어, 이러한 키트는 THP-1 세포 및 선택적으로, THP-1 세포를 분화시키기 위한 하나 이상의 시약 또는 교육 자료를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한 본원에서 개시된 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함할 수 있다. 이에 더하여, 이러한 키트는 본원에서 개시된 방법을 수행하기 위한 THP-1 세포 및/또는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주의 사용을 기재한 교육 자료를 추가적으로 포함할 수 있다. 모델 키트가 하기 기재되지만, 다른 유용한 키트의 내용물은 본 개시내용에 비추어 명백해질 것이다.
상기 또는 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 간행물, 기탁 번호, 등은 개개의 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 통합된 것으로 나타난 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 상이한 버전의 서여리 상이한 시기에 기탁 번호와 연관되는 경우, 본 출원의 유효 출원일의 기탁 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용되는 경우 기탁 번호를 참조하는 우선권 출원의 출원일 중 빠른 것을 의미한다. 유사하게, 상이한 버전의 간행물, 웹사이트 등이 상이한 시기에 공개되면, 달리 지시되지 않는 한 본 출원의 유효 출원일에 가장 최근 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 어떠한 특징, 단계, 요소, 구체예, 또는 양태도 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명이 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 예의 방식으로 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 첨부된 청구범위 내에서 특정 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것은 명백하다.
구체예의 목록
본원에서 개시된 주제는, 제한되는 것이 아니라, 다음 구체예를 포함한다.
1. 테스트 리스테리아 균주의 약독화 또는 감염성을 평가하는 방법으로서,
(a) 분화된 THP-1 세포를 테스트 리스테리아 균주로 감염시키는 단계로서, THP-1 세포는 테스트 리스테리아 균주로 감염되기 전에 대식세포로 분화되는 단계;
(b) THP-1 세포를 용해시키고 용해물을 아가 위에 평판 배양하는 단계; 및
(c) 아가에서 성장하여 THP-1 세포 내부에서 증식한 리스테리아를 계수하는 단계
를 포함하는 방법.
2. 구체예 1의 방법으로서, 단계 (a) 전에 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)를 사용하여 THP-1 세포를 대식세포로 분화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
3. 구체예 1 또는 2의 방법으로서, 분화된 THP-1 세포를 테스트 리스테리아 균주로 감염시키는 단계는 1-5 시간 동안 분화된 THP-1 세포를 테스트 리스테리아 균주로 접종하고 테스트 리스테리아 균주를 분화된 THP-1 세포로 접종하여 감염된 THP1 세포를 형성하는 것을 포함하는 방법.
4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (a)는 1:1의 감염 다중도 (MOI)로 분화된 THP-1 세포를 감염시키는 것을 포함하는 방법.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (a)과 (b) 사이에서 THP-1 세포에 의해 흡수되지 않는 리스테리아를 사멸시키는 단계를 더 포함하는 방법.
6. 구체예 5의 방법으로서, 사멸 단계는 항생제를 사용하여 수행되고, 선택적으로 항생제는 젠타마이신인 방법.
7. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법으로서, 세포 외 리스테리아는 단계 (b) 전에 감염된 THP-1 세포로부터 제거되는 방법.
8. 구체예 7의 방법으로서, 세포 외 리스테리아를 제거하는 단계는 리스테리아에 대해 효과적인 항체를 추가하는 것을 포함하며, 선택적으로 항생제는 젠타마이신인 방법.
9. 구체예 7 또는 8의 방법으로서, 감염된 THP-1 세포는 세포 외 리스테리아를 제거한 후 및 단계 (b) 전에 0-10 시간 동안 성장 배지에서 인큐베이션되는 방법.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (b)는 감염 후 0시간에 수행되는 방법.
11. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (b)는 감염 후 0시간, 감염 후 1시간, 감염 후 3시간 및/또는 감염 후 5시간에 수행되는 방법.
12. 구체예 1 내지 11 중 어느 하나의 방법으로서, 아가는 리스테리아의 성장을 지원할 수 있는 배지를 함유하는 방법.
13. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나의 방법으로서, 테스트 리스테리아 균주의 흡수 및 세포 내 성장을 야생형 리스테리아 균주 및/또는 참조 샘플과 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
14. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 방법으로서, 테스트 리스테리아 균주는 리스테리아 모노시토게네스 균주인 방법.
15. 구체예 1 내지 14 중 어느 하나의 방법으로서, 테스트 리스테리아 균주는
재조합 리스테리아 균주이며, 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 포함하며, 융합 폴리펩타이드는 질환-관련 항원성 펩타이드에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하는 방법.
16. 구체예 15의 방법으로서, PEST-함유 펩타이드는 리스테리오리신 O (LLO) 또는 그것의 단편이고, 질환-관련 항원성 펩타이드는 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 단백질 E7 또는 그것의 단편인 방법.
17. 구체예 15 또는 16의 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주는 prfA의 결실 또는 prfA에서 비활성화 돌연변이를 포함하는 약독화된 리스테리아 모노시토게네스 균주이며, 핵산은 에피솜 플라스미드에 있고 D133V PrfA 돌연변이 단백질을 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 방법.
18. 구체예 15의 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주는 actA, dal, 및 dat의 결실 또는 actA, dal, 및 dat에서 비활성화 돌연변이를 포함하는 약독화된 리스테리아 모노시토게네스 균주이며, 핵산은 에피솜 플라스미드에 있고 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하고, PEST-함유 펩타이드는 리스테리오리신 O (LLO)의 N-말단 단편인 방법.
19. 테스트 박테리아 균주의 약독화 또는 감염성을 평가하는 방법으로서,
(a) THP-1 세포를 분화시키는 단계;
(b) 분화된 THP-1 세포를 테스트 박테리아 균주로 감염시키는 단계로서, 감염 단계는
(i) 분화된 THP-1 세포를 테스트 박테리아 균주로 접종하는 단계;
(ii) 테스트 박테리아 균주를 분화된 THP-1 세포와 함께 1-5 시간 동안 인큐베이션하여 감염된 THP1 세포를 형성하는 단계;
(iii) 감염된 THP-1 세포로부터 세포 외 박테리아를 제거하는 단계; 및
(iv) 감염된 THP-1 세포를 성장 배지에서 0-10 시간 동안 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 단계;
(c) 감염된 THP-1 세포를 용해시켜 용해물을 형성하는 단계;
(d) 박테리아의 성장을 지원할 수 있는 배지를 함유하는 플레이트 상에 용해물 또는 용해물의 희석액을 평판 배양하는 단계; 및
(e) 플레이트 상의 박테리아 콜로니 형성 단위를 계수하는 단계
를 포함하는 방법.
20. 구체예 19의 방법으로서, 분화된 THP-1 세포를 감염시키는 단계는 1:1의 감염 다중도 (MOI)에서 이루어지는 방법.
21. 구체예 19 또는 20의 방법으로서, 세포 외 박테리아를 제거하는 단계는 박테리아에 효과적인 항생제를 추가하는 것을 포함하며, 선택적으로 항생제는 젠타마이신인 방법.
22. 구체예 19 내지 21 중 어느 하나의 방법으로서, 감염된 THP-1 세포는 성장 배지에서 0, 1, 3, 또는 5 시간 동안 인큐베이션되는 방법.
23. 구체예 19 내지 22 중 어느 하나의 방법으로서, 테스트 박테리아 균주는 리스테리아 모노시토게네스 균주인 방법.
서열의 간략한 설명
첨부된 서열 목록에 나열된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대해 표준 문자 약어, 및 아미노산에 대해 3문자 암호를 사용하여 나타난다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부를 향해 정방향으로 (즉, 각 줄에서 왼쪽에서 오른쪽으로) 진행하는 표준 관례를 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열의 단 하나의 가닥이 나타나지만, 상보성 가닥은 표시된 가닥에 대한 참조에 의해 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단을 향해 정방향으로 (즉, 각 줄에서 왼쪽에서 오른쪽으로) 진행하는 표준 관례를 따른다.
서열의 설명
서열 번호 유형 설명
1 DNA SIINFEKL 태그 v1
2 DNA SIINFEKL 태그 v2
3 DNA SIINFEKL 태그 v3
4 DNA SIINFEKL 태그 v4
5 DNA SIINFEKL 태그 v5
6 DNA SIINFEKL 태그 v6
7 DNA SIINFEKL 태그 v7
8 DNA SIINFEKL 태그 v8
9 DNA SIINFEKL 태그 v9
10 DNA SIINFEKL 태그 v10
11 DNA SIINFEKL 태그 v11
12 DNA SIINFEKL 태그 v12
13 DNA SIINFEKL 태그 v13
14 DNA SIINFEKL 태그 v14
15 DNA SIINFEKL 태그 v15
16 단백질 SIINFEKL 태그
17 DNA 3xFLAG 태그 v1
18 DNA 3xFLAG 태그 v2
19 DNA 3xFLAG 태그 v3
20 DNA 3xFLAG 태그 v4
21 DNA 3xFLAG 태그 v5
22 DNA 3xFLAG 태그 v6
23 DNA 3xFLAG 태그 v7
24 DNA 3xFLAG 태그 v8
25 DNA 3xFLAG 태그 v9
26 DNA 3xFLAG 태그 v10
27 DNA 3xFLAG 태그 v11
28 DNA 3xFLAG 태그 v12
29 DNA 3xFLAG 태그 v13
30 DNA 3xFLAG 태그 v14
31 DNA 3xFLAG 태그 v15
32 단백질 3xFLAG 태그
33 단백질 펩타이드 링커 v1
34 단백질 펩타이드 링커 v2
35 단백질 펩타이드 링커 v3
36 단백질 펩타이드 링커 v4
37 단백질 펩타이드 링커 v5
38 단백질 펩타이드 링커 v6
39 단백질 펩타이드 링커 v7
40 단백질 펩타이드 링커 v8
41 단백질 펩타이드 링커 v9
42 단백질 펩타이드 링커 v10
43 단백질 PEST-유사 서열 v1
44 단백질 PEST-유사 서열 v2
45 단백질 PEST-유사 서열 v3
46 단백질 PEST-유사 서열 v4
47 단백질 PEST-유사 서열 v5
48 단백질 PEST-유사 서열 v6
49 단백질 PEST-유사 서열 v7
50 단백질 PEST-유사 서열 v8
51 단백질 PEST-유사 서열 v9
52 단백질 PEST-유사 서열 v10
53 단백질 PEST-유사 서열 v11
54 단백질 PEST-유사 서열 v12
55 단백질 LLO 단백질 v1
56 단백질 LLO 단백질 v2
57 단백질 N-말단 절단된 LLO v1
58 단백질 N-말단 절단된 LLO v2
59 단백질 N-말단 절단된 LLO v3
60 DNA N-말단 절단된 LLO v3을 암호화하는 핵산
61 단백질 ActA 단백질 v1
62 단백질 ActA 단백질 v2
63 단백질 ActA 단편 v1
64 단백질 ActA 단편 v2
65 단백질 ActA 단편 v3
66 단백질 ActA 단편 v4
67 단백질 ActA 단편 v5
68 DNA ActA 단편 v5를 암호화하는 핵산
69 단백질 ActA 단편 v6
70 단백질 ActA 단편 v7
71 DNA ActA 단편 v7을 암호화하는 핵산
72 단백질 Hly 신호 펩타이드에 융합된 ActA 단편
73 단백질 ActA 치환
74 단백질 LLO의 콜레스테롤-결합 도메인
75 단백질 NY-ESO-1로부터의 HLA-A2 제한된 에피토프
76 단백질 Lm 알라닌 라세마제
77 단백질 Lm D-아미노산 아미노트랜스퍼라제
78 DNA Lm 알라닌 라세마제를 암호화하는 핵산
79 DNA Lm D-아미노산 아미노트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산
80 단백질 야생형 PrfA
81 DNA 야생형 PrfA를 암호화하는 핵산
82 단백질 D133V PrfA
83 DNA D133V PrfA를 암호화하는 핵산
84 DNA 4X 글리신 링커 G1
85 DNA 4X 글리신 링커 G2
86 DNA 4X 글리신 링커 G3
87 DNA 4X 글리신 링커 G4
88 DNA 4X 글리신 링커 G5
89 DNA 4X 글리신 링커 G6
90 DNA 4X 글리신 링커 G7
91 DNA 4X 글리신 링커 G8
92 DNA 4X 글리신 링커 G9
93 DNA 4X 글리신 링커 G10
94 DNA 4X 글리신 링커 G11
95 단백질 해독된 리스테리오리신 O (dtLLO)
96 단백질 dtLLO의 변형된 콜레스테롤-결합 도메인
97 단백질 LLO 신호 서열
98 단백질 ActA 신호 서열
99 단백질 변이체 FLAG 태그
실시예
실시예 1. 리스테리아 모노시토게네스의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 THP-1-기반 검정
이 실시예는 야생형 리스테리아 모노시토게네스 및 약독화된, 재조합 리스테리아 모노시토게네스의 감염율 및/또는 세포 내 성장을 정량화하기 위한 방법을 제공한다. 분화된 THP-1 세포를 사용하는 세포-기반 검정을 사용하여 리스테리아 기반 면역요법의 세포 내 성장을 분석하여, 뇌심장 침출 아가 상에서 성장에 의해 감염 후 박테리아의 양을 평가한다. 일부 구체예에서, 기재된 과정은 ADXS11-001 또는 다른 리스테리아 균주의 샘플에 적용 가능하다.
리스테리아 모노시토게네스는 인간에서 리스테리아증의 원인인 그람 양성, 비-포자 형성 박테리아 유기체이다. 리스테리아 모노시토게네스는 인간 대식세포 내에서 식포로부터 탈출하여 생체 내에서 생존한다. 탈출하면, 리스테리아 모노시토게네스는 숙주의 시토졸 내에서 세포 내로 복제할 수 있다. 면역요법 균주 Lm-LLOE7 (예를 들어, ADXS11-001 리스테리아 모노시토게네스, 생 약독화된 균주)은 관심 재조합 단백질 (즉, 절단된 리스테리오리신 O (tLLO)에 융합된 인간 파필로마 바이러스 단백질 E7)의 발현을 위한 플라스미드를 함유한다. Lm-LLOE7 면역요법에 사용된 박테리아 균주는 본질적인 병독성 유전자 prfA가 없는 돌연변이 균주, XFL-7이다. prfA 유전자는 모든 병독성 유전자, 예컨대 actA 및 hly (LLO를 암호화하는 유전자)를 포함하는 많은 유전자에서 작용하는 전사 인자이지만 리스테리아의 시험관 내 배양에 필수적인 것은 아니다. XFL-7은 무독성이고 대식세포에 의해 흡수될 수 있지만 대식세포의 시토졸에서 증식하기 위해 식포를 탈출할 수 없다. Lm-LLOE7의 약독화를 평가하기 위해서, 야생형 리스테리아 모노시토게네스와 병행하여, 대식세포 세포 감염 검정에서 감염 및 복제를 평가한다.
재조합 단백질은 hly 프로모터의 제어 하에 비활성 LLO 및 HPV E7 암호화 서열의 융합체를 함유하는 플라스미드 pGG55로부터 발현되며, 이것은 또한 prfA의 플라스미드 카피의 발현을 구동한다. 이들 유전자는 그람-양성/그람-음성 박테리아 셔틀 플라스미드 pAM401로 도입되며, 이것은 대장균(E. coil), 뿐만 아니라 리스테리아에서도 증폭될 수 있는데 그람-양성 유기체에서는 유전자 조작이 쉽게 수행될 수 없기 때문이다. 그러므로 플라스미드 유전자는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아에 대한 복제 인자, 뿐만 아니라 그람-양성 및 그람-음성 박테리아에 대한 항생제 선별 마커 (클로람페니콜)를 포함한다. 플라스미드는 클로람페니콜에 대한 저항성을 부여하고 클로람페니콜의 존재 하에 배양에 의해 시험관 내에서 유지된다. 생체 내에서, 플라스미드는 XFL-7에서 비활성화된 병독성 인자 PrfA의 트랜스(trans) 상보성에 의해 유지된다.
리스테리아 기반 면역요법의 세포 내 성장을 분석하기 위해 분화된 THP-1 세포를 사용하는 세포-기반 검정이 본원에서 기재된다. THP-1 세포는 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)로 자극하여 대식세포로 분화될 수 있는 인간 단핵구성 세포이다. THP-1 세포를 용해시키고 뇌심장 침출 아가 상에서 박테리아 희석액을 평판 배양하여 감염 전 및 감염 후 특정 시점에 박테리아의 양을 평가하였다. 콜로니 형성 단위 (CFU)는 대식세포 세포 내 환경에서 생존하는 살아있는 유기체를 나타낸다.
ADXS11-0001을 사용한 예시의 과정이 하기 제시된다. 하지만, 이들 과정 및 다른 예에서 기재된 과정은 임의의 리스테리아 균주에 대해 사용할 수 있다. 샘플(들) 및 참조 표준을 해동시키고, 펠릿화하고, 재현탁시키고, 감염 전 표적 세포 수로 희석한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
화학물질/시약
이 검정에서 사용하기 전에, BHI 플레이트를 육안으로 검사하여 심각한 오염이 없는지 및 아가가 고르게 펴졌는지를 확인할 수 있다. 플레이트를 야생형 10403S 및 ADXS11-001으로 스트리킹(streaking)하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 성장 적합성에 대해 체크할 수 있다. 콜로니를 야생형 및 ADXS11-001 둘 다에서 볼 수 있어야 한다.
시약
RPMI 1640 (Sigma, Cat # R8758 또는 동등물)
FBS (Sigma, Cat# F0926 또는 동등물)
L-글루타민 200mM (Cellgro, Cat# 25-005-CL 또는 동등물)
포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA), Sigma, Cat# P8139 또는 동등물
DMSO (Amresco, Cat# 67-68-5 또는 동등물)
10 mg/mL 젠타마이신 (Sigma, Cat# 221465, 또는 동등물)
25 mg/mL 클로람페니콜 (Amresco (VWR), Cat# 56-75-7, 또는 동등물)
뇌 심장 침출 아가 플레이트 (BD, Cat# PA-255003.08, 또는 동등물)
PBS-칼슘 및 마그네슘 없음 (Fisher, Cat# 10010-023, 또는 동등물)
멸균수 (WFI) (Fisher, Cat# BP2470-1 또는 동등물)
야생형: 리스테리아 모노시토게네스 (Lm) (PHE Culture Collections)
THP1 세포주: Sigma, Cat# 88081201
스트렙토마이신, 100 mg/mL (Sigma-Aldrich 56501 또는 동등물)
멸균 주사용수, Cat # BP281-1 또는 동등물
현재 ADXS11-001 참조 표준
시약 제조. 모든 시약 조제물을 필요한 부피를 충족하도록 조정할 수 있다.
완전 RPMI (c- RPMI )
1. RPMI 445 mL에, 다음을 추가한다: (1) FBS 50 mL - 조사됨; (2) L 5 mL - 글루타민 (200 mM).
2. 라벨링하고 5±3℃에서 저장한다. 유효 기간은 제조일로부터 1개월이다.
1.6 mM PMA ( 포르볼 -12- 미리스테이트 -13-아세테이트)
1. 1.6 mM PMA의 최종 농도를 위해 DMSO 1 mL 중에 PMA 1 mg을 재구성한다.
2. 고갈될 때까지 마이크로원심분리 튜브에 10 μL를 앨리쿼트한다.
3. 라벨링하고 -20±10℃에서 저장한다. 유효 기간은 제조일로부터 6개월이다.
25 μg /mL 클로람페니콜
1. 25 μg/mL 클로람페니콜의 최종 농도를 위해 100% 에탄올 20 mL 중에 클로람페니콜 0.5 g을 재구성한다.
2. 라벨링하고 -20±10℃에서 저장한다. 유효 기간은 제조일로부터 1개월이다.
100 μ g /mL 스트렙토마이신
1. 100 μg/mL 스트렙토마이신의 최종 농도로 멸균수 40 mL 중에 스트렙토마이신 4 g을 재구성한다. 0.2 마이크론 필터를 사용하여 멸균한다. 고갈될 때까지 1.5mL 튜브에 1mL을 앨리쿼트한다.
2. 라벨링하고 -20±10℃에서 저장한다. 유효 기간은 제조일로부터 1개월이다.
뇌심장 침출 아가 + 25 μg /mL 클로람페니콜
1. 진행하기 전에 BHI 플레이트에 제조 결함 (오염, 깨진 플레이트, 고르지 않은 아가 등)이 없는지 확인한다.
2. 멸균 PBS 180 μL 및 클로람페니콜 (25 mg/mL) 20 μL를 뇌심장 침출 아가 플레이트에 추가하고 플레이트의 전체 표면을 덮도록 멸균 스프레더를 사용하여 펼친다. 모든 액체가 아가 플레이트에 흡수될 때까지 펼친다.
3. 하나 이상의 플레이트를 제조하는 경우, 클로람페니콜의 작용 스톡(working stock)을 제조할 수 있고 (180　μL x PBS에 대한 플레이트 수 및 20 μL x 클로람페니콜에 대한 플레이트 수) 각 플레이트에 200 μL를 추가하고 멸균 스프레더를 사용하여 펼친다.
4. BHI + 25 μg/mL 클로람페니콜 플레이트의 유효 기간은 제조사에 따른 플레이트의 유효 기간 또는 클로람페니콜 스톡의 유효 기간 중 빠른 것이 될 것이다.
뇌심장 침출 아가 + 100 μg /mL 스트렙토마이신
1. 진행하기 전에 BHI 플레이트에 제조 결함 (오염, 깨진 플레이트, 고르지 않은 아가 등)이 없는지 확인한다.
2. 멸균 PBS 180 μL 및 스트렙토마이신 (100 mg/mL) 20 μL를 뇌심장 침출 아가 플레이트에 추가하고 플레이트의 전체 표면을 덮도록 멸균 스프레더를 사용하여 펼친다. 모든 액체가 아가 플레이트에 흡수될 때까지 펼친다.
3. 하나 이상의 플레이트를 제조하는 경우, 스트렙토마이신의 작용 스톡을 제조할 수 있고 (180　μL x PBS에 대한 플레이트 수 및 20 μL x 스트렙토마이신에 대한 플레이트 수) 각 플레이트에 200 μL를 추가하고 멸균 스프레더를 사용하여 펼친다.
4. BHI + 100 μg/mL 스트렙토마이신 플레이트의 유효 기간은 제조사에 따른 플레이트의 유효 기간 또는 스트렙토마이신 스톡의 유효 기간 중 빠른 것이 될 것이다.
대조군
음성/멸균성 대조군
1. 미접종 : BHI 아가 + 스트렙토마이신 100 μg/mL 및 BHI 아가 + 25 μg/mL 클로람페니콜 각각 3개의 플레이트.
2. 접종: BHI 아가 + 스트렙토마이신 100 μg/mL 및 BHI 아가 + 25 μg/mL 클로람페니콜 각각 3개의 플레이트, 각각 PBS 100 μL로 접종됨.
양성 대조군
1. 야생형: BHI 아가 + 스트렙토마이신 100 μg/mL 상에서 리스테리아 모노시토게네스 (PHE Culture Collections 10403S)로 스트리킹된 2개의 플레이트
2. ADXS11 -001: ADXS11-001 참조 표준으로 스트리킹된 2개의 플레이트가 BHI 아가 + 25 μg/mL 클로람페니콜 상에서 양성 대조군의 역할을 할 것이다.
THP -1 세포의 제조
1. 절차 단계 3에 필요한 정도로 충분한 THP-1 세포 바이알을 해동시킨다.
2. 해동 후 적어도 2회 부분계대한다. 일부 구체예에서, THP-1 세포는 계대 횟수가 32 미만이다.
3. 이미 배양 중인 THP-1 세포는 적절한 세포 배양 참조를 이용하여 검정에 사용될 수 있다.
4. c-RPMI 중에 1.0x106 세포/mL의 농도로 세포 40 mL을 제조한다. 세포 수를 결정한다.
5. 24웰 플레이트 상의 2개의 웰에 각각 세포 현탁액 1 mL을 추가한다 (한 예를 위해 부록 2, 표 9의 플레이트 지도 참조). 웰을 "No PMA"로 라벨링한다. 대략 16 nM PMA의 최종 농도를 위해 나머지 세포 현탁액 (대략 34 mL)에, 16 μM PMA (34 μL)를 추가한다. 잘 혼합한다.
6. 총 10개의 웰에 대해 웰 당 1 mL를 분배한다 (예를 들어, 부록 2, 표 9의 플레이트 지도 참조).
7. 36±1℃, 5±1 % CO2에서 밤새도록 (16-20 h) 인큐베이션한다.
감염. 다음 단계 1-13을 양성 대조군, 야생형 박테리아에 대해 수행하고 참조 표준 및 샘플 박테리아에 대해 반복할 것이다.
1. 적절하게 양성 대조군 야생형 리스테리아 모노시토게네스 또는 참조 표준 또는 샘플 리스테리아 모노시토게네스의 하나의 바이알을 회수한다.
2. 바이알을 완전히 해동시키기 위해, 36±2℃에서 1분 동안 인큐베이션한 후 이어서 실온에서 최대 5분 동안 인큐베이션한다.
3. 주사기 및 바늘을 이용하여 전체 부피를 각각 라벨링된 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
4. 1.0 mL를 각각 라벨링된 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 잔류 물질을 제거한다.
5. 2분 동안 마이크로원심분리를 사용하여 16,100 xg에서 세포 1.0 mL를 펠릿화한다. 상층액을 제거하고 세포를 실온의 c-RPMI 1.0 mL에 재현탁시킨다. 1.0 x 106 CFU/mL의 최종 농도를 위해 c-RPMI를 사용하여 박테리아의 희석액을 제조한다. 이 농도에서 최종 부피는 대략 15 mL가 되어야 한다.
6. THP-1 세포를 함유하는 24웰 플레이트를 얻는다. 적절하게 웰을 야생형으로 또는 샘플 번호로 라벨링한다.
7. 현미경 하에서 세포를 관찰하고 PMA로 처리된 세포와 미처리된 세포 사이에서 차이를 확인한다. 미처리 세포는 가볍게 흔들면 유동성을 나타낼 것이다. 처리된 세포는 가볍게 흔들면 부착된 상태로 유지될 것이다.
8. 피펫을 사용하여 PMA 처리된 세포를 함유하는 모든 웰에서 배지를 빨아낸다 (진공 보조장치가 사용될 수 있다).
9. 제조된 박테리아 (단계 6; 1x106 CFU/mL) 1.0 mL를 플레이트의 웰로 옮긴다.
10. 현미경 상에서 플레이트를 관찰하여 THP-1 세포가 웰의 표면에 여전히 부착되어 있는 것을 확인한다.
11. 36±2℃, 5±1% CO2에서 플레이트를 인큐베이션한다. 인큐베이션 시작 시간을 기록한다. 다음 조작 전에 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션한다.
12. p-2로 지정된 박테리아의 1x106 CFU/mL 희석액의 생존력 테스트를 수행한다. 부록 1에서 약술된 과정을 이용한다. 부록 1에서 약술된 희석 계획을 이용한다. 부록 1에 약술된 양성 및 음성 대조군을 이용한다.
13. 테스트 리스테리아 모노시토게네스 샘플 (예를 들어, ADXS11-001)을 사용하여 단계 1-12를 반복한다.
감염 중지. 다음 단계 1-10을 먼저 양성 대조군, 야생형 박테리아에 대해 수행하고 샘플 박테리아에 대해 반복될 것이다.
1. 20 μg/mL 젠타마이신을 함유하는 c-RPMI를 제조한다.
2. 2시간 후, 36±2℃, 5±1% CO2 인큐베이션 조건으로부터 야생형 또는 샘플을 함유하는 플레이트를 제거한다.
3. 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 함유하는 리스테리아 모노시토게네스를 제거한다 (진공 보조장치가 사용될 수 있다).
4. 20 μg/mL 젠타마이신을 함유하는, 제조된 c-RPMI의 웰 당 1 mL를 조심스럽게 분배하며, 붕괴를 막기 위해 웰의 측면에 천천히 추가한다.
5. 플레이트를 42-45분 동안 인큐베이션 조건 (36±2℃, 5±1% CO2)으로 되돌려놓는다.
6. 인큐베이션 조건으로부터 플레이트를 제거한다.
7. 피펫을 사용하여 각 웰에서 20 μg /mL 젠타마이신을 함유하는 c-RPMI를 제거한다 (진공 보조장치가 사용될 수 있다).
8. 웰마다 젠타마이신이 없는 c-RPMI 1 mL를 추가하여 조심스럽게 세포를 세척하며, 붕괴를 막기 위해 웰의 측면에 천천히 추가한다.
9. 피펫을 사용하여 각 웰에서 c-RPMI를 제거한다 (진공 보조장치가 사용될 수 있다).
10. 붕괴를 막기 위해 웰의 측면에 천천히 추가하여 각 웰에 c-RPMI (젠타마이신 없음) 1 mL를 조심스럽게 분배하고 플레이트를 5-15분 동안 인큐베이션 조건, 36±2　℃, 5±1% CO2에 되돌려놓는다.
11. 단계 1-10을 참조 표준을 함유하는 플레이트를 사용하여 반복하고 샘플 (예를 들어, ADXS11-001)을 함유하는 플레이트를 사용하여 반복한다.
세포 내 리스테리아 모노시토게네스 성장의 검출을 위한 수거 과정
1. 인큐베이션 조건에서 플레이트를 제거하고 시간을 기록한다. 최초 시점은 p0일 것이다. 추후 시점은 p3 (3시간) 및 선택적으로 p5 (5시간)으로 취해진다.
2. 현미경 하에서 웰을 관찰한다. 각 웰에서 PMA 처리된 THP-1 세포의 층이 일관적이고 최소한의 세포가 제거되거나 세포가 제거되지 않고 이전의 흡인 및 분배 단계 동안에 제거되는지를 확인한다. 임의의 웰이 유의한 THP-1 세포 손실을 나타내는 것이 관찰되면, 사용하지 않도록 웰에 "X"라고 표시한다.
3. 시점 "p0" 수거에 사용하기 위해 한 웰을 고른다.
4. 피펫으로 빨아들여 선별된 웰에서 c-RPMI를 제거한다 (진공 보조장치가 사용될 수 있다).
5. 마이크로피펫을 사용하여 멸균수 1 mL를 웰로 분배하고 위아래로 피펫팅하여 웰의 표면으로부터 THP-1 세포를 제거한다.
6. 전체 내용물을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
7. 현미경 하에서 웰을 관찰하여 세포가 성공적으로 제거되었다는 것을 확인한다. THP-1 세포의 상당한 부분이 유지되는 경우, 이전에 1.5 mL 튜브로 옮겨진 멸균수의 일부를 이용하여 위아래로 피펫팅하여 세포를 제거한다. 내용물을 다시 1.5 mL 튜브로 옮기고 현미경 관찰을 통해 THP-1 세포가 제거되었음을 확인한다.
8. 다음 시점에 수거할 준비가 될 때까지 플레이트를 인큐베이션 조건 (36±2℃, 5±1% CO2)으로 되돌러놓는다.
9. 적어도 1분 동안 튜브를 보텍싱(vortex)한다.
10. 생존력 테스트를 수행한다. 부록 1에서 약술된 과정을 이용한다. 부록 1, 표 8에서 약술된 희석 계획을 이용한다.
11. 단계 1-10을 참조 표준을 함유하는 플레이트를 사용하여 반복하고 샘플 (예를 들어, ADXS11-001)을 함유하는 플레이트를 사용하여 반복한다.
계산
1. 야생형에 대한 샘플의 비율로서 흡수 (p-2/p0)
2. 샘플에 대한 야생형의 비율로서 세포 내 성장 (p3/p0)
부록 1 - 생존력 테스트 과정
1. 생존력 테스트의 시작 전에 모든 아가 플레이트가 충분히 건조하다는 것을 확인한다.
2. 다음 음성 대조군을 제조한다: (1) 적절한 아가 유형의 3개의 미접종된 플레이트; 및 (2) PBS 100 μL로 접종되고 멸균 스프레더로 펼쳐진 적절한 아가 유형의 3개의 플레이트.
3. THP-1 세포의 1.0 mL 앨리쿼트를 60 초 동안 최대 속도로 보텍싱한다. p-2 시점 생존력은 PBS에서 제조된 1.0x106 CFU/mL 희석액을 이용할 것이다.
4. 리스테리아 모노시토게네스 세포 유형 (야생형 또는 샘플) 및 테스트되는 시점을 기반으로 단계 희석액을 제조할 것이다. 표 8 참조. 보텍싱된 1.0 mL 앨리쿼트 100 μL를 PBS 900 μL로 옮겨서 제조된 단계 희석액. 필요한 모든 희석액이 얻어질 때까지 이 과정을 반복한다.
5. 각각의 희석액에 대한 접종물을 멸균 스프레더로 적절한 아가 유형에 3배수로 펼친다.
6. 다음 양성 대조군을 제조한다. 10 μL 접종 루프(loop)를 이용하여 적절한 양성 대조군을 적절한 아가에 2배수로 접종할 것이다.
7. 각 플레이트를 뒤집어서 35-38℃의 인큐베이터에 배치하기 전에 적어도 15분 동안 액체를 흡수시키고 뚜껑을 닫고 건조시킨다.
8. 16-24 시간 후, 플레이트를 인큐베이션 조건에서 제거한다. 각 시점에서 모든 리스테리아 모노시토게네스 세포 유형 (야생형 및 샘플)이 동일한 기간 동안 인큐베이션된 것을 확인한다.
9. 총 콜로니 형성 단위 (CFU) 수를 수동으로 계수하고 각 희석액의 각 플레이트에 대해 기록한다.
각 시점에서 야생형 및 샘플의 생존력 테스트에 사용되는 희석배수 (값은 필요에 따라 조정될 수 있다).
작제물 시점 적정할 희석배수
야생형 Lm p-2 101, 102, 103
p0 101, 102, 103
p3 101, 102, 103
ADXS11-001 약품
참조 표준 또는
샘플		 p-2 101, 102, 103
p0 101, 102, 103
p3 101, 102, 103
ADXS11-001 약품
샘플		 p-2 101, 102, 103
p0 101, 102, 103
p3 101, 102, 103
부록 2 - 24웰 플레이트의 제조. 24웰 플레이트의 제조는 아래에 나타나있다. Lm 야생형에 대해 이 플레이트 설정을 수행한 다음 참조 표준 및 샘플 (예를 들어, ADXS11-001)에 대해서 반복한다. 분주 시점 및 테스트되는 시점에 계수된 THP-1 세포 수에 기초하여 플레이트 웰 설정을 조정할 수 있다.
24웰 플레이트 설정
1 2 3 4 5 6
A 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 THP-1
세포
PMA 없음
B 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 16 nM PMA 최종 농도를 나타내는 THP-1 세포 THP-1
세포
PMA 없음
C 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음
D 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음
실시예 2. 리스테리아 모노시토게네스의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 THP-1-기반 검정의 검증
이 정량화 연구를 수행하여 실시예 1에서 기재된 방법이 야생형 리스테리아 모노시토게네스 (Lm)와 비교하여 ADXS11-001 약품의 약독화를 정량화하는데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 방법은 인간 THP-1 세포를 이용하였고 THP-1 세포에서 ADXS11-001 약품 또는 야생형 Lm의 흡수 및 세포 내 성장을 평가하였다. 이 실시예는 정량화 실험으로부터 생성된 데이터를 요약한다.
요약 - 방법 정량화 표
파라미터 결과
정확성
(검정 간 반복 가능성)		 20% 상대 표준 편차 (RSD) 최대 ― 야생형
21% RSD 최대 ― ADXS11-001 참조 표준
성장률에 유의한 차이 없음
중간 정확성
(검정 간 반복 가능성)		 47% RSD 최대 ― 시점마다 야생형 생존 세포 수 (VCC)
23% RSD 최대 ― 시점마다 ADXS11-001 VCC
29% RSD 최대 ― 보고 가능한 값 (p3/p0)
특이성 음성 대조군에서 성장 없음
세포 내 성장 관찰됨
리스테리아 모노시토게네스는 항원 제공 세포 (APC)에서 독특한 생활 주기를 나타내는 그람 양성, 비-포자 형성 박테리아 유기체이다. APC 식포에 의한 Lm의 초기 흡수 이후, 시토리신, 리스테리오리신 O (tLLO)의 발현이 촉발되어, 식포로부터 Lm의 탈출을 매개한다. 탈출하면, Lm은 숙주의 시토졸 내에서 세포 내로 복제 가능하다. 분화된 THP-1 세포를 사용하는 세포-기반 검정을 사용하여 리스테리아 기반 백신의 흡수 및 세포 내 성장을 분석하였다. THP-1 세포는 인간 대식세포 세포이고, 배양 중에 단핵구로서 유지되지만 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)로의 자극에 의해 쉽게 대식세포로 분화될 수 있다. THP-1 세포를 용해시키고 뇌심장 침출 아가 상에서 박테리아 희석액을 평판 배양하여 감염 전 및 감염 후 특정 시점에 박테리아의 양을 평가하였다. 콜로니 형성 단위 (CFU)는 대식세포 세포 내 환경에서 생존하는 살아있는 Lm을 나타낸다.
균주 ADXS11-001은 관심 단백질 (즉, 절단된 리스테리오리신 O (tLLO)에 융합된 인간 파필로마 바이러스 단백질 E7)의 발현을 위한 플라스미드를 함유한다. THP-1 감염 검정을 사용하여 야생형 모 균주 10403S에 관한 ADXS11-001의 약독화를 입증하였다. 이 검정에서, THP1 세포를 1:1의 감염 다중도에서 10403S 또는 ADXS11-001로 감염시키고, 박테리아 CFU의 시험관 내 성장을 상이한 시점, 예컨대 감염 후 1 h, 3 h 및 5 h에 분석하였다. 약독화의 결과로서, 10403S와 비교하여 ADXS11-001의 흡수 및 세포 내 성장의 상당한 감소가 관찰되었다.
대조군 제조. 야생형 Lm 10403S 및 ADXS11-001 DP를 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략히 말하면, 샘플을 36±2℃에서 해동시키고 원심분리하고, 완전 RPMI를 사용하여 농도를 1.0 x 106 세포/mL로 조정하였다.
THP -1 세포 제조. THP-1 세포 은행, 계대 횟수 P33을 1 x 106 생존 세포/ mL의 밀도로 냉동시켰다. THP-1 세포; P33을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략히 말하면, THP-1 세포를 24웰 플레이트에서 16 nM PMA를 함유하는 완전 RPMI 중의 1.0 x 106 세포/mL/웰의 농도로 평판 배양하였다.
샘플 제조 . PMA-분화된 THP-1 세포를 실시예 1에서와 같이 야생형 Lm 10403S 및 ADXS11-001 DP로 감염시켰다. THP-1 세포를 용해시키고 아가 플레이트 상에서 박테리아 희석액을 평판 배양함으로써 감염 전 및 감염 후 특정 시점에 박테리아 콜로니 형성 단위 (CFU)의 양을 평가하였다.
결과. 3회의 독립적인 실험으로부터 결과를 생성하였다. 대조군 및 샘플의 각각의 희석배수 및 각각의 시점으로부터 생성된 CFU를 분석하여 모든 필요한 계산을 캡쳐하였고 정량화 파라미터를 평가하였다. 평균, 표준 편차, 변동 계수, 및 미가공 데이터 산출량의 계산을 검정 내 및 검정 간 정확성에 대해 결정하였고, 특이성을 각 실행에 대해 평가하였다.
계수된 세포 수로 표현되는 생존력은 이 검정의 미가공 데이터 산출량의 역할을 한다. 생존력의 결정을 위해 다음 기준을 사용하였다. 검정의 데이터는 음성 대조군 (미접종 및 PBS 접종된 플레이트)이 콜로니 성장을 나타내지 않는 경우에만 허용 가능한 것으로 간주되었다. 40 미만의 콜로니 형성 단위 (CFU)는 계수하기에 너무 적은 것으로 간주되었고 (Too Few To Count: TFTC) 600 초과의 CFU는 계수하기에 너무 많은 것으로 간주되었따 (Too Numerous To Count: TNTC). 이들 한계 내의 값들만을 정량화하였다.
정확성 (검정 간 반복 가능성)
반복 대조군 및 샘플의 값에 대한 % 상대 표준 편차 (RSD)을 검정 간 정확성에 대해 계산하였다. 각 시점에 3회의 검정 각각에서 3배수 웰에 대한 % RSD는 야생형에 대해 11% 내지 20%의 범위에 있고 ADXS11-001 참조 표준 샘플에 대해 9% 내지 21%의 범위에 있다. 야생형 및 ADXS11-001 참조 표준 둘 다에 대해 모든 시점에 걸쳐 %RSD로 측정된 바와 같이 최대 검정 간 변화는 21%였고 p1 시점에서 관찰되었다. 하지만 p1 값을 보고 가능한 결과를 계산하는데 사용하지 않았다. 검정 간 행렬은 21% RSD 내에 있을 것으로 예상된다.
검정에 대해 보고 가능한 값을 계산하는데 사용된 p0에 대한 값은 야생형에 대해 20% RSD 최대였고 참조 표준에 대해 9% RSD 최대였다. 세포 내 성장 산출량, p3 및 p5는 야생형에 대해 각각 11% 및 17%의 최대 % RSD 및 ADXS11-001 참조 표준에 대해 10% 및 19%의 최대 % RSD를 나타냈다. p3 값은 p5 값보다 더 높은 검정 간 정확성을 나타냈다. 검정 간 정확성에 대한 RSD 값은 표 1에서 요약된다. 추가적으로, 도 1의 곡선에서 입증된 성장 속도는 시간 대 생존 세포 수 (VCC)로서 플롯팅되었으며 모든 곡선이 동일하게 일반적인 형상 및 추세를 나타내기 때문에 웰 간에 분명한 차이가 없는 것을 보여주었다.
각각의 자격 검정에 대한 각 시점에서의 % RSD 값
야생형 시점 검정 # 평균 최대
3 4 5
p-2 15 2 6 8 15
p0 16 20 9 15 20
p1 6 14 3 8 14
p3 11 4 3 6 11
p5 3 17 10 10 17
ADXS11-001
참조 표준		 시점 검정 # 평균 최대
3 4 5
p-2 12 8 8 9 12
p0 5 9 4 6 9
p1 21 12 7 13 21
p3 10 7 8 8 10
p5 13 19 12 15 19
중간 정확성.
2명의 분석가에 의해 여러 날 동안 수행된 3회의 독립적인 검정에 대해 얻어진 값을 사용하여 중간 정확성을 평가하였다. 3개의 THP-1 세포 계대 횟수와 감염을 이용한 3회의 검정과 적정을 실행하였다. 각각의 독립적인 검정 조제물의 각각의 감염 후 시점에 샘플의 3회 반복 측정의 평균 간의 일치를 포함하는, 변동 계수로서 표현된 개개의 테스트 결과 간의 일치의 정도를 평가하였다. 평가는 또한 각각의 독립적인 검정 조제물의 각각의 감염 후 시점에 야생형 대조군의 3회 반복 측정의 평균 간의 일치를 포함한다.
(A) 각 시점에서의 미가공 데이터, VCC. 각 시점에서의 희석배수에 대해 표준화된 VCC 값을 3회의 검정 모두에 대해 계산하였다. 야생형에 대해 관찰된 가장 높은 %RSD는 47%였고 ADXS11-001 참조 표준에 대한 것은 23%였다. 결과는 표 12에 요약되어 있다. 미가공 데이터 %RSD는 보고 가능한 결과를 위해 이들 값이 비율로 추가로 변환되기 때문에 유의한 것은 아니다.
이에 더하여, 도 2의 곡선에서 입증된 바와 같이 성장 속도는 시간 대 생존 세포 수 (VCC)로 플롯팅되었으며 모든 곡선이 동일하게 일반적인 형상 및 추세를 나타내기 때문에 검정 간에 분명한 차이가 없는 것을 보여주었다.
각각의 자격 검정에서 각각의 시점에 대한 희석배수에 대해 표준화된 미가공 데이터 VCC
시점 검정 # 평균 %RSD
3 4 5
A1 적정
A2 감염 		A1 적정
A2 감염 		A2 적정
A1 감염
야생형 p-2 1300000 1236667 1333333 1290000 4%
p0 248667 282667 106333 212556 44%
p1 481167 734667 269000 494944 47%
p3 1776667 2703333 1196667 1892222 40%
p5 7166667 8633333 4853333 6884444 28%
ADXS11-001
참조 표준		 p-2 870000 900000 1080000 950000 12%
p0 5967 8100 7133 7067 15%
p1 7500 10500 10300 9433 18%
p3 16067 16400 19233 17233 10%
p5 33700 51267 53150 46039 23%
A1= 분석가 1
A2 = 분석가 2
(B) 검정 비율 (보고 가능한 값). 각 실험에 대해 보고 가능한 값을 다음과 같이 계산하였다:
Figure pct00004
3회의 검정 모두에 대해 샘플 흡수에 대한 비율은 10보다 크고 세포 내 성장에 대한 비율은 2보다 크다. 최대 %RSD는 3회 검정 모두에서 샘플 흡수에 대해 39%이고 세포 내 성장에 대해 최대 29%이며 이것은 보고 가능한 비율 값이다. 결과는 표 13에서 나타나있다. 이에 더하여, 성장 속도는 도 1의 곡선에서 입증된 바와 같이, 시간 대 생존 세포 수 (VCC)로 플롯팅되며 모든 곡선이 동일하게 일반적인 형상 및 추세를 나타내기 때문에 검정 간에 분명한 차이가 없는 것을 보여주었다.
3회의 자격 검정으로부터의 보고 가능한 값의 결과
보고 가능한 값 검정 # 평균 %RSD
3 4 5
A1 적정
A2 감염 		A1 적정
A2 감염 		A2 적정
A1 감염
샘플에 대한 흡수:
시점 p0에서의 비율		 p-2/p0 28 25 12 22 39%
세포 내 성장:
시점 p3에서의 비율		 p3/p0 3 5 4 4 29%
세포 내 성장:
시점 p3에서의 비율		 p5/p0 5 5 6 5 11%
A1 = 분석가 1
A2 = 분석가 2
(C) 분석가. 검정 3 및 4에 대해 검정의 감염 부분을 분석가 1이 실시하고 분석가 2는 검정 5에서 실시하였다. 검정 3 및 4에 대해 검정의 적정 부분을 분석가 2가 실시하고 분석가 1은 검정 5에서 실시하였다. 데이터는 분석가들 간에 야생형 미가공 데이터 값에서 가능한 차이가 존재할 수 있으며 이는 p-2/p0 비율로 반영된다는 것을 시사한다. 보고 가능한 값, p3/p0 및 p5/p0은 분석가 효과를 나타내지 않았다. 분석가와 독립적인 검정 비율은 흡수에 대해 12 이상이었고 세포 내 성장에 대해 3 초과이며 이것은 야생형 균주 및 ADXS11-001 참조 표준 또는 샘플을 구별하기에 충분한 배수 차이이다. 표 13 참조.
(D) 일. 상이한 날 동안 수행된 검정에 대한 보고 가능한 값에 대해 유의한 효과가 관찰되지 않았다. 검정의 적정 부분 및 감염 부분이 동일한 분석가에 의해 수행되는 검정 3 및 검정 4에 대한 보고 가능한 값은 흡수에 대해 3 유닛 이내이고 (p-2/p0) 세포 내 성장에 대해 2 유닛 이내이다. 모든 값은 흡수에 대해 12 이상이고 세포 내 성장에 대해 2 초과이며 이것은 야생형 균주 및 ADXS11-001 참조 표준 또는 샘플을 구별하기에 충분한 배수 차이이다. 표 13 참조.
(E) THP -1 세포 계대 횟수. 세포 계대 횟수는 검정의 보고 가능한 값에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았다. THP1 세포 계대 P32, P37 및 P39를 이 정량화에 사용하였다. 각각의 계대 횟수는 흡수에 대해 12 이상이고 세포 내 성장에 대해 2 초과인 보고 가능한 값을 제공했으며 이것은 야생형 균주 및 ADXS11-001 참조 표준 또는 샘플을 구별하기에 충분한 배수 차이이다. 표 13 참조.
특이성
THP-1 매트릭스의 미접종된 및 PBS 접종된 블랭크(blank) 샘플을 간섭, 및 선택성에 대해 테스트하였다. 이것은 각 검정에 포함되고 모든 검정에서 블랭크에 대해서는 성장이 관찰되지 않았다 (CFU 없음). 이들 음성 대조군은 또한 오염의 부재를 입증하며 위(false) 음성 또는 위 양성 결과가 없다는 것을 나타낸다.
샘플 및 야생형 대조군 둘 다에서 용해된 THP-1 매트릭스로부터 검출 가능한 CFU를 각 검정에서 생성하였다. 참조 표준 샘플 (ADXS11-001) 및 대조군 (야생형)에 대해 동일한 THP-1 매트릭스의 존재 하에서 각 검정으로부터 CFU를 검출하여 허용 가능한 특이성을 입증한다.
추가적으로, 세포 내 성장은 재조합 Lm 백신 균주가 세포에 들어가서 증식할 수 있다는 지표이며 그러므로 선택성을 지지한다. 야생형 균주와 ADXS11-001 참조 표준 및 샘플 간에 배수 차이를 입증하기에 충분한 3회의 검정 각각에 대해 세포 내 성장을 관찰하고 계산하였다.
결과. 실시예 1에서 제시된 프로토콜은 ADXS11-001에 대해 분화된 THP-1 세포에서 리스테리아 모노시토게네스 감염 및 복제의 분석을 위해 적격화되었다. 방법은 야생형 및 ADXS11-001 간의 흡수 및 세포 내 성장의 배수 차이를 검출한다는 점에서 특이적인 것으로 입증되었다. 방법은 또한 정확하고 반복 가능한 것으로 나타났으며, 보고 가능한 검정 결과는 유사하게 분석가, 검정이 수행된 날, 또는 THP-1 세포 계대 횟수에 독립적이다.
실시예 3. 리스테리아 모노시토게네스의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 THP-1-기반 검정의 최적화
실시예 1에서 제시된 방법을 사용하여 총 13번의 대표적인 테스트 실행으로부터 데이터를 얻었다. 주요 품질 특성을 유지하면서 방법 효율성의 개선을 찾기 위해 데이터를 평가하였으며, 반응의 발달을 위해 짧은 시간 프레임이 합리적인지를 결정하고 (3시간 대 5시간), THP-1 세포의 계대 횟수에 대한 상한을 발견하고, p-2에서 p0까지의 반응에서 베이스라인의 변화에 대한 하한을 발견하고, p1 시점의 유용성을 결정하는 것을 포함한다.
대상 방법은 약독화를 평가하는 부분으로서 ADXS11-001의 감염 및 복제를 평가하기 위한 세포 기반 대식세포 세포 감염 검정이다. 이것은 야생형 (WT) 리스테리아 모노시토게네스 세포, 10403S, 및 특이적 ADXS11-001 샘플 둘 다를 동시에 사용하여 수행된다. 이것은 세포-기반 검정이고 THP-1 세포를 용해시키고 아가에 박테리아 희석액을 평판 배양함으로써 감염 전 및 감염 후 특정 시점에 정량화되는 박테리아를 사용한다. 콜로니 형성 단위 (CFU)는 대식세포 세포 내 환경에서 생존하는 살아있는 유기체의 수를 나타낸다. 상이한 시점에 정량화된 CFU의, 그 자체 및 WT에 대한 비율은 결과를 정량화하기 위한 기회를 제공한다.
방법의 감염 단계의 일부로서, 24웰 플레이트를 사용하여 샘플 및 WT 둘 다에 대한 차등적 반응을 발달시킨 다음, 이것들을 샘플링하고 인큐베이션하여 생존 세포 수를 얻었다. 이 생존 세포 수는 감염 시작, 및 2시간 인큐베이션 시간을 선행하기 때문에 p-2라고 불리며, 그 이후 샘플 및 WT에 대해 다시 측정하였다. 이 2시간 인큐베이션 이후의 측정은 p0이라고 불린다. 후속적인 살아있는 세포 수 측정은 1 h (p1), 3 h (p3) 및 5 h (p5) 인큐베이션 시간 이후에 이루어진다. 방법에서 (a) WT에 대한 샘플의 비율로서 샘플 (p-2/p0)에 대해 업데이트; 및 (b) 샘플에 대한 WT의 비율로서 세포 내 성장 (p3/p0)이 보고된다. 데이터 출처는 표 14에서 제시된다.
분석에 사용된 데이터
실행 출처 계대
(P) 		Lm-10403S
10403S
(야생형) 		ADXS11 -
001# 2008
lot 5230-08-01 RS 		ADXS11 -
001#
2013 		ADXS11 -
001#
2014 		ADXS11 -
001#
2015-01 		ADXS11 -
001#
2015-02
9/10/2015 비-GMP 실행 23 X X X
9/11/2015 비-GMP 실행 24 X X X
9/16/2015 비-GMP 실행 26 X X X X
12/22/2015 정량화 실행 32 X X
1/22/2016 GMP 실행 38 X X
1/30/2016 정량화 실행 39 X X
2/2/2016 정량화 실행 37 X X
2/12/2016 GMP 실행 38 X X
2/25/2016 GMP 실행 41 X X
3/9/2016 추가적인 GMP
실행		 34 X X X
3/11/2016 추가적인 GMP
실행		 34 X X X
3/18/2016 추가적인 GMP
실행		 36 X X X
3/23/2016 추가적인 GMP
실행		 38 X X X
예상에 부합하는지에 대해 결과를 스크리닝하였다. 도 3은 본 방법의 모든 시점 (p-2, p0, p1, p3, 및 p5)에서 관찰된 미처리 개수 정보를 나타낸다. 표 12에서 나타난 각각의 실행은 별도의 하위 플롯에 있고, 키의 각각의 배치에 대한 결과의 곡선은 테스트 결과를 나타낸다. 데이터는 처음 2시간 기간 (p-2 내지 p0)에서 예상되는 하향 변화에 이어서, p0에서 p5까지의 증가를 입증한다.
반응은 예상된 바와 같으며, 샘플은 초기 접종 후 야생형 유기체보다 현저하게 낮은 수를 나타내고, p0 시점 이후 유사한 증가 속도를 나타낸다.
도 4 및 도 5는 야생형 (WT)에 비해 샘플 성장에 대한 흡수의 데이터의 그래픽 묘사를 나타낸다. 도 4는 p0에서 알 수 있는 것에 대한 p-2에서의 수의 비율로서 미가공 데이터를 나타낸다. p-2에서 p0로의 변화량은 샘플에 대해 현저하게 상이하다. 도 5는 동일한 것을 나타내지만, 샘플 결과를 야생형에 대한 비율로 전환한다.
도 5는 샘플 대 야생형에 대한 p-2/p0 반응의 변화율이 실행마다 달라진다는 것을 나타낸다. 변화는 전형적으로 야생형에 비해 샘플에 대해 5배 차이보다 더 크다. 이것은 도 5에서 빨간색 파선으로 나타난다. 야생형에 대한 샘플의 상대적인 반응은 THP-1 세포의 계대 횟수와 관련이 있다 (하기 도시됨).
도 6 및 도 7는 야생형에 대한 비율을 취하기 전에 세포 내 성장 (p3/p0) 및 (p5/p0)에 대한 데이터의 그래픽 묘사를 나타낸다. 도 6은 야생형에 대한 비율을 취하기 전에 샘플의 비율을 나타낸다. 비율을 취하기 전에 p3 및 p5에서의 결과에서 현저한 차이가 존재한다. 도 7은 야생형에 비해 반응의 변화를 나타내기 위해 방법에 따른 데이터를 조정한다. p3, p5 반응에서의 상대적인 반응은 실질적으로 상이하지 않다는 것을 입증한다. 샘플 유형 내에서 (실행마다) 및 샘플 간에 유사한 변화가 관찰된다.
도 8은 도 7에서 나타난 바와 동일한 결과를 플롯팅하지만, 실행별로 데이터를 나눈다. 이 결과 보기는 p3 및 p5에서의 성장 비율의 차이가 샘플 내에서 실행마다 알 수 있는 것보다 더 작다는 것을 보여준다. 데이터는 이를 바탕으로 p3 대 야생형에서의 비례적 성장의 사용을 지지한다.
계대 횟수의 영향을 평가하기 위해, p-2에서 p0까지 수의 비례적 감소 (야생형에 비해)를 상기 실행에서 유기체에 대한 계대 횟수에 대해 각 샘플에 대해 플롯팅하였다. 도 9는 명확한 관계를 나타낸다.
이 그래프를 기반으로, 회귀 분석을 사용하여 계대 횟수의 영향을 정량적으로 평가하였다. 결과는 도 10에 나타나있다. 회귀 방정식은 대략 선형 반응을 입증하고, 32회 계대에서, 개개의 결과에 대한 95% 예측 구간이 10의 상대적인 반응에 있다는 것을 나타낸다 (엄청나게 큰 차이). 이 분석을 기반으로, 상대적인 반응 (p-2에 비해 p0 결과의 비례적 차이)이 10보다 크게 유지되도록 보장하기 위해 최대 32회의 계대 횟수가 사용되는 것을 권장한다.
p1 시점의 유용성을 확립하기 위해, 도 3의 개별 곡선에 대해 다음 단계가 취해진다: (1) 모든 계수는 Log10 규모로 전환되었고; (2) p0, p1 및 p3에서의 반응을 사용하여 기울기를 계산하고; 이것은 3개의 시점 모두를 사용할 때 시간 당 계수의 변화의 정도를 나타내고; 이것은 x-축에서 나타나고; (3) p3 및 p0에서의 반응의 차이를 계산하고, 3으로 나누어 시간 당 변화를 나타내고; 이것은 y-축에서 나타난다.
각 곡선에 대한 2개의 결과의 변수 간의 관계는 도 11에서 플롯팅된다. 단순한 차이가 사용되는지 아니면 3개의 시점 모두를 사용하여 기울기가 계산되는지 여부에 관계없이 시간 당 Log10 (수)의 변화에 대해 본질적으로 동일한 값이 표시된다. p1 시점은 계산에 사용하기에 필수적인 것은 아니다.
데이터의 평가에 기초하여, 다음이 지지된다. 샘플 대 야생형의 상대적인 반응을 평가하기 위해 p5 대 p0 대신에 p3 대 p0을 이용할 수 있다. 테스트는 p3에서 종결될 수 있다. 계대의 효과는 상당할 수 있고, THP-1의 계대 횟수에 32의 상한을 적용하는 것이 권장될 수 있다. 계대 횟수에 이 상한을 적용하는 것은 p-2에서 p0까지의 반응 (야생형 대 샘플)의 베이스라인 변화가 적어도 10배로 유지된다는 확신을 제공하며, 이것이 하한으로 권장된다. p1에서 얻어진 결과가 샘플 또는 야생형에 대한 변화의 정도를 계산하는데 필수적인 것은 아니다.
실시예 4. 리스테리아 모노시토게네스에 대한 THP -1-기반 감염성 검정
ADXS11-001은 주로 자궁경부암, 그리고 외음부암, 질암, 음경암 및 항문암, 뿐만 아니라 인간 파필로마 바이러스 16 및 18, 그리고 31 및 45와 직접적으로 관련이 있는 구강인두암의 세포에서 발견되는 종양 항원인, 리스테리오리신 O (LLO) 및 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 단백질 E7의 융합 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 생 약독화된 리스테리아 모노시토게네스 균주인 암 면역요법 생성물이다.
병원체로서, 리스테리아 모노시토게네스는 식포로 흡수된 후 세포질로 탈출함으로써 비-포식 및 포식 세포를 감염시키는 세포 내 병원체이다. 이것은 단백질 리스테리오리신 O (LLO)의 발현에 의해 달성되며, 포식리소좀을 형성하기 위해 식포와 리소좀의 융합 전에 액포막의 붕괴에 기여한다. 이것은 박테리아가 세포질로 탈출할 수 있게 하며, 세포에서 세포로 직접 증식하고 확산된다. THP-1 세포는 인간 대식세포 세포주이며, 배양 중에 단핵구로서 유지되지만 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)로 자극함으로써 쉽게 대식세포로 분화될 수 있다.
이 실시예에서 기재된 방법은 분화된 THP-1 세포에서 감염 후 별개의 시점에 세포질로의 리스테리아 모노시토게네스 약품 (예를 들어, ADXS11-001)의 진입 및 탈출의 결정을 위한 것이다. PMA 분화된 THP-1 세포를 1:1 감염 다중도 (M01)에서 각각 야생형 대조군 및 약품 ADXS11-001로 접종한다. 감염된 THP-1 세포를 젠타마이신으로 처리하여 세포 외 박테리아를 사멸시킨다. THP-1 세포를 용해시키고 뇌심장 침출 (BHI) 아가 플레이트에 박테리아 희석액을 평판 배양함으로써 감염 전 및 감염 후 특정 시점에 박테리아의 양을 평가한다. 콜로니 형성 단위 (CFU)는 리소좀으로부터의 탈출로 인해 대식세포 세포 내 환경에서 생존하는 살아있는 유기체를 나타낸다.
예시의 검정이 하기 제시된다. 하지만, 검정은 임의의 리스테리아 균주에 사용될 수 있다. 각각의 검정 기회는 참조 표준과 함께 대조군에 대해 최대 2개의 약품 샘플을 평가할 수 있다.
검정 설정
테스트 항목 분석된 시점 시점 당 희석배수의 수 희석배수 당 아가 플레이트의 수
대조군 p-2 p0 p3 3 (1:10;1:100; 1:10000) 3
참조 표준 p-2 p0 p3 3 (1:10; 1:100; 1:10000) 3
샘플 1 p-2 p0 p3 3 (1:10; 1:100; 1:10000) 3
샘플 2 p-2 p0 p3 3 (1:10; 1:100; 1:10000) 3
장비, 시약, 및 소모품
각각의 검정 기회는 참조 표준과 함께 대조군에 대해 최대 2개의 약품 샘플을 평가할 수 있다.
장비
장비 클래스 요건
생물학적 안전성 캐비닛 클래스 II
인큐베이터 37±1℃ & 5%±1 CO2 설정
인큐베이터 37±1℃ CO2 설정 없음
피펫 2-1000 μL
수조 인증된 온도계로 제어된 37℃로 설정되도록
냉장 저장 2-8℃, -20℃, -70℃, -80℃ & LN2
원심분리 N/A
마이크로원심분리 1.5/2.0 mL 에펜도르프 튜브, ~14,500 RCF
보텍싱 N/A
시약
시약/소모품 공급처 카탈로그 암호 저장
포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) Sigma P8139 -20℃
RPMI 1640 Sigma R0883 2-8℃
열 비활성화된 FBS Biosera FB-1001 -20℃
젠타마이신 (50 mg/mL) Thermo Fisher 15750-060 RT
PBS GIBCO 10010-015 RT
뇌심장 침출 아가 플레이트 (BHI) Thermo Fisher P01198A 2-8℃
25 pg/mL 클로람페니콜이 들어있는 뇌심장 침출 아가 플레이트 (BHI) Teknova 81042 2-8℃
L-글루타민 Sigma G7513 -20℃
스트렙토마이신 Sigma S6501 2-8℃
스프레더 Gosselin ETAR-06 N/A
24웰 세포 배양 플레이트 Coming CLS3524 N/A
멸균수 (주사용/관개용) Various N/A RT
DMSO Sigma D2650 RT
트리판 블루(Trypan Blue) (0.4%) Sigma T8154 RT
혈청학 피펫 ― 필요한 부피 다수 다수 N/A
멸균 튜브 ― 적절한 부피 다수 다수 N/A
글리세롤 ThermoFisher
/Sigma		 BP229-1/G2025 RT
시약 제조 설명서
주: 부피/양은 필요에 따라 확장 또는 축소될 수 있다.
일상적인 계대배양을 위한 완전 RPMI (c-RPMI) (500 mL): 445 mL RPMI 1640, 50 mL FBS, 5 mL L-글루타민 (200mM). 2-8℃에서 최대 1개월 동안 저장.
해동을 위한 완전 RRMI (c- RPMI -해동) 505 mL : 400 mL RPMI 1640, 100 mL FBS, 5 mL L-글루타민 (200mM), 2-8℃에서 최대 1개월 동안 저장됨.
냉동 용액 500 mL : 450 mL 열 비활성화된 FBS, 50 mL 글리세롤, 신선하게 제조됨.
1.6 mM PMA : 1.0 mg PMA (Mw: 616.83), 1.0 mL DMSO, -20℃에서 최대 6개월 동안 저장됨. 2 mL 멸균 마이크로원심분리 튜브에 10 μL 앨리쿼트. 각각의 앨리쿼트는 1회용이다.
100 mg /mL 스트렙토마이신: 1 g 스트렙토마이신, 10 mL 멸균수, 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균되고, -20℃에서 최대 1개월 동안 저장됨. 2 mL 멸균 마이크로원심분리 튜브에 1 mL 앨리쿼트를 제조함. 각각의 앨리쿼트는 1회용이다.
뇌심장 침출 아가 + 100
Figure pct00005
g/mL 스트렙토마이신. BHI 플레이트는
진행하기 전에 제조 결함 (오염, 깨진 플레이트, 고르지 않은 아가 등)이 없는지 검증하기 위한 검사자였다. 각각의 아가 플레이트의 부피는 대략 22. 8 mL이 다. 177.2 mL x 아가 플레이트 PBS 수, 22.8 mL x 아가 플레이트 100 mg/mL 스트렙토마이신 100 mg/mL 수. 희석된 스트렙토마이신 200 mL를 각각의 아가 플레이트에 추가한다. 플레이트의 전체 표면을 덮도록 멸균 스프레더를 사용하여 펼친다. 모든 액체가 아가 플레이트에 흡수될 때까지 펼친다. 플레이트를 아가 플레이트 또는 스트렙토마이신의 유효 기간 중 더 짧은 기간까지 2-8℃에 저장한다.
THP -1 세포주 배양
THP -1 세포의 해동. 생물학적 안전성 캐비닛 내에서 무균 상태에서 과정을 수행한다. 멸균이 검증되거나 무균 상태에서 제조된 물질만을 사용한다.
1. 37℃로 설정된 수조에서 c-RPMI-해동 배지를 사전 가온한다.
2. 사전 가온된 c-RPMI-해동 배지 3 mL를 멸균 50 mL 원심분리 튜브로 배치한다.
3. 극저온 저장소에서 THP-1 바이알을 가져와서 내용물이 거의 해동되지만, 소량의 얼음 결정이 튜브에 남아있을 때까지 37℃로 설정된 수조에서 해동시킨다.
4. 소독제로 바이알을 철저하게 청소한다.
5. 해동된 세포를 c-RPMI-해동 배지 3 mL를 함유하는 50 mL 원심분리 튜브에 적가한다.
6. 추가적인 c-RPMI-해동 배지 1 mL로 냉동 바이알을 세척하고 세포를 함유하는 50 mL 튜브로 옮긴다.
7. 계수를 위해 ~100 μL 세포 현탁액을 취한다.
주: 혈구계산기를 사용하여 계수하기 위해서는 0.4% 트리판 블루에서 세포 현탁액 앨리쿼트를 1:2로 희석한다. 부드럽게 피펫팅하여 현탁액이 잘 혼합되었는지 확인한다. 계수를 위해 C-칩을 사용한다. 2회의 독립적인 계수를 실행한다. 세포 생존력 (≥85%) 및 밀도를 결정한다.
8. 세포 현탁액을 RT에서 5분 동안 150 x g로 원심분리한다.
9. 상층액을 제거하고, 사전 가온된 c-RPMI-해동 배지에 세포를 재현탁시켜 1-3 x 105 생 세포/mL의 세포 밀도를 제공한다.
10. 튜브의 내용물을 세포 배양 플라스크 (예를 들어 T75)로 옮기고 37℃ 5% CO2 절대 습도에서 인큐베이션한다.
11. 세포가 지수 성장기에 도달할 때까지 플라스크를 수직 위치로 유지한다.
12. 세포를 일반적으로 2-3일마다 계수한다.
주: 배양이 확립되면 (일반적으로 해동 후 6일), c-RPMI 배지를 사용하여 혈청 농도를 10%로 감소시킨다.
일상적인 THP -1 세포 배양. 멸균이 검증되고 무균 상태에서 제조된 물질을 사용하여 생물학적 안전성 캐비닛 내에서 무균 상태에서 과정을 수행한다.
일부 구체예에서, 일상적인 세포 배양 및 THP-1 검정을 위해서, 세포 계대 횟수는 P32로 제한된다. 새로운 배양 용기로 세포를 옮길 때마다 계대로 간주된다. 지수 성장을 보장하기 위해 동일한 배양 용기에 배지를 추가하는 것은 계대 횟수를 변화시키지 않는다.
세포를 지수 성장 상태로 유지하기 위해서, 배양을 3-8x105 생 세포/mL 사이로 유지한다.
1. 세포를 현미경 하에서 형태학 및 오염에 대해 검사한다.
대부분의 세포가 배양 용기 표면에 부착된 경우 진행해서는 안 된다. 이러한 경우에 배양물을 제거하고 작업용 세포 은행의 또 다른 바이알을 해동시킨다.
2. 총 세포 수 및 생존력을 위해 세포 현탁액 약 1 mL를 바이알로 제거한다.
3. 세포를 지수 성장기로 유지하기 위해서, 세포 현탁액의 부피가 최대 허용 부피에 도달할 때까지 세포에 3x105 세포/mL의 밀도로 신선한 c-RPMI 배지를 보충한 다음 세포 현탁액은 3x105 세포/mL의 분주 밀도로 새롭게 사전 라벨링된 플라스크로 계대될 것이다.
최적의 CO 2 침투를 위해 상이한 크기의 플라스크에 대한 최소 및 최대 부피 범위가 아래 나타나있다 : 775 플라스크: 15 - 37. 5 mL ; T150 플라스크: 30 - 75 mL
4. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양물을 인큐베이션한다.
5. 세포를 일반적으로 2-3일마다 계수한다.
THP -1 세포의 냉동 보존. 멸균이 검증되고 무균 상태에서 제조된 물질을 사용하여 생물학적 안전성 캐비닛 내에서 무균 상태에서 과정을 수행한다.
1. 단계 1 또는 2의 "일상적인 THP-1 세포 배양"을 따른다.
2. 10% (v/v) 글리세롤로 보충된 열 비활성화된 FBS로 이루어진 냉동 배지를 제조한다.
3. 세포를 RT에서 5분 동안 150 xg로 원심분리한다.
4. 상층액을 제거하고 덩어리가 보이지 않을 때까지 튜브를 두드려 세포를 재현탁시킨다. 튜브를 선회시켜 냉동 배지를 천천히 적가하여 2x 최종 냉동 밀도를 제공한다 (최종 냉동 밀도는 2　x　106 세포/mL이다).
5. 제2의 동일한 부피의 냉동 배지를 세포를 함유하는 튜브에 천천히 추가한다. 추가하는 동안 튜브를 부드럽게 선회시켜 완전히 혼합되게 한다.
6. 혈청학 피펫을 사용하여 1 mL 세포 현탁액을 사전 라벨링된 2 mL 냉동 바이알로 앨리쿼트한다.
7. 냉동 바이알을 2-프로판올로 표시된 부분까지 채워진 실온 CoolCell 또는 Mr Frosty 용기에 냉동 바이알을 배치한다.
8. 냉동 용기를 24-72시간 동안 -70℃ 냉동고로 옮긴다.
9. 냉동 바이알을 기상 질소 저장소로 옮긴다.
10. 냉동된 세포 배치의 위치 및 상세한 설명을 기록한다.
THP -1 세포의 제조 및 세포 분화 ( 제1 일 ) 주: 테스트 항목 (대조군, 참조 또는 샘플)마다 1x THP-1 24웰 플레이트를 제조한다. 각각의 플레이트는 최소 7개의 PMA 처리된 웰 및 2개의 미처리 웰을 필요로 한다. 하기 예시된 플레이트 레이아웃을 예시한다.
24웰 플레이트
1 2 3 4 5 6
A 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 No PMA 세포
B PMA 처리된 세포 PMA 처리된 세포 PMA 처리된 세포 PMA 처리된 세포 PMA 처리된 세포 No PMA 세포
C PMA 처리된 세포 PMA 처리된 세포 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음
D 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음 비어있음
플레이트 레이아웃은 비상용 웰을 포함한다.
1. 37℃로 설정된 수조에서 완전 RPMI (c-RPMI) 배지를 사전 가온한다.
2. 인큐베이터로부터 세포를 제거하고, 오염의 징후에 대해 육안으로 검사하고 현미경 하에서 세포를 체크한다.
오염의 경우에는 진행해서는 안 된다. 대부분의 세포가 배양 용기 표면에 부착된 경우 진행해서는 안 된다. 이러한 경우에 배양물을 제거하고 작업용 세포 은행의 또 다른 바이알을 해동시킨다.
3. 세포 현탁액을 위 아래로 몇 번 피펫팅하여 세포를 혼합하고 세포 계수를 위해 소량의 세포를 꺼낸다.
4. 0.4 % 트리판 블루 중의 세포 현탁액의 1/2 희석액을 제조한다. 피펫으로 부드럽게 혼합하여 희석된 세포 현탁액의 적절한 혼합을 확인한다.
5. 총 2회의 독립적인 세포 계수를 위해 C-칩을 제조하고 세포 밀도 및 생존력을 결정한다. 세포 생존률이 적어도 85%인 경우에만 진행한다.
6. 1x106 생 세포/mL로 세포 현탁액을 제조한다: 적절한 부피의 세포 현탁액을 RT에서 5분 동안 150　xg로 원심분리하고, 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 c-RPMI에 재현탁시킨다. 잘 혼합한다. 웰 당 최소 1 mL의 세포 현탁액을 제조한다.
7. 24웰 플레이트의 "NO PMA"로 라벨링된 2개의 웰 중 하나에 세포 현탁액 1 mL를 추가한다(플레이트 레이아웃 참조).
8. 대략 16 nM PMA의 최종 농도를 위해, 나머지 세포 현탁액에 16 pM (1.6 mM 스톡으로부터 1/100 희석) PMA를 추가한다. 잘 혼합한다.
9. 각 플레이트 상에서 최소 7개의 웰에 웰 당 1 mL PMA 처리된 세포 현탁액을 추가한다 (플레이트 레이아웃 참조).
10. 16-24 hrs 동안 37±1℃, 5±1 % CO2에서 세포를 인큐베이션한다.
THP -1 세포의 감염 및 시간 경과 ( 제2 일 )
샘플 및 대조군의 제조. PMA 처리된 THP-1 세포를 함유하는 웰의 모든 조작은 주의해서 다루어야 한다. 배지는 플레이트를 대략 45도 각도로 기울여서 빨아내거나 분배해야 한다. 피펫 팁이 흡인 또는 분배 단계 동안에 웰의 표면을 긁어서는 안 된다.
1. 야생형 리스테리아 모노시토게네스/참조 표준 또는 약품 샘플의 하나의 바이알을 회수한다.
2. 최대 10 min 동안 실온에서 바이알을 해동시키고 샘플이 완전히 해동된 것을 확인한다.
3. 세포 현탁액을 보텍싱하고 각각 라벨링된 2 mL 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브 (1 mL)로 옮긴다. 옮겨진 정확한 양을 기록한다.
4. RT에서 2 min 동안 14500 xg로 세포를 원심분리한다.
5. 조심스럽게 상층액을 제거하고 RT c-RPMI로 펠릿을 재현탁시킨다. 배지의 부피는 단계 3에서 초기에 옮겨진 테스트 항목의 부피와 같아야 한다.
6. c-RPMI를 사용하여 1.0x106 CFU/mL의 최종 농도로 박테리아의 희석액을 제조한다. 이 농도에서의 최종 부피는 대략 대략 15 mL여야 한다.
리스테리아 모노시토게네스가 c-RPMI에서 성장할 수 있기 때문에 바로 다음 섹션을 따른다.
리스테리아 모노시토게네스로 THP -1 세포의 감염
1. 인큐베이터로부터 하나의 24웰 플레이트를 제거한다.
2. 현미경 하에서 THP-1 세포 부착을 확인하고 PMA로 처리된 세포 (가볍게 흔들면 부착된 상태로 유지된다) 및 미처리 세포 (가볍게 흔들면 유동성을 나타낸다) 간의 차이를 확인한다.
3. PMA 처리된 세포를 함유하는 웰에서 배지를 빨아내고 "샘플 및 대조군의 제조"의 단계 7에서 제조된 박테리아 1 mL를 추가한다.
4. 현미경 상에서 플레이트를 관찰하여 THP-1 세포가 웰 표면에 부착되어 있는 것을 확인한다.
5. 플레이트를 37±1℃, 5±1% CO2에서 2 h ± 3 min 동안 인큐베이션한다.
6. "생존력 테스트 과정 - p-2 시점"에 따라 "샘플 및 대조군의 제조"에서 제조된 테스트 항목의 생존력 테스트를 수행한다.
생존력 테스트 과정 - p-2 시점. 생존력 테스트의 시작 전에 모든 아가 플레이트가 충분히 건조하다는 것을 확인한다.
1. 기재된 바와 같이 1.0x106 CFU/mL로 희석된 테스트 항목을 사용한다 (THP 1 세포의 감염 및 시간 경과 (제2 일)).
2. 다음 표에 따라 박테리아 현탁액을 단계 희석한다:
Figure pct00006
3. 적절한 BHI 아가 플레이트로 각 희석액 100 μL를 펼친다. 각각의 희석배수에 대해 3개의 아가 플레이트를 제조한다 (즉, p-2 시점에 대해 테스트 항목마다 총 9개의 아가 플레이트를 생산한다).
야생형 리스테리아 모노시토게네스 대조군에 대해 아가 BHI 플레이트를 사용한다.
ADXS11-001 테스트 항목에 대해 아가 BM + 클로람페니콜을 사용한다.
4. 각 플레이트에서 액체를 흡수시키고 35-38℃에서 16-24시간 동안 CO2 없이 인큐베이터 내에서 뒤집이서 배치되기 전에 적어도 15 min 동안 뚜껑을 닫고 건조시킨다.
감염의 중지
1. 20 pg/mL 젠타마이신을 함유하는 c-RPMI를 제조한다.
2. 2시간 후, 인큐베이터로부터 야생형 또는 샘플을 함유하는 플레이트를 제거한다.
3. 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 함유하는 리스테리아 모노시토게네스를 제거한다.
4. 20 pg/mL 젠타마이신을 함유하는, 제조된 c-RPMI를 웰 당 1 mL을 조심스럽게 분배하고, 붕괴를 막기 위해 웰의 측면에 천천히 추가한다.
5. 플레이트를 37±1℃, 5±1% CO2에서 45 min 동안 인큐베이터에 되돌려놓았다.
6. 피펫을 사용하여 각 웰에서 20 pg/ml 젠타마이신을 함유하는 c-RPMI를 제거한다.
7. 웰마다 젠타마이신이 없는 c-RPMI 1 mL을 추가하여 조심스럽게 세포를 세척한다 (단층의 붕괴를 박기 위해 웰의 측면에 천천히 추가한다).
8. 피펫을 사용하여 각 웰에서 c-RMPI를 제거한다.
9. 붕괴를 박기 위해 웰의 측면에 천천히 추가하여 c-RPMI (젠타마이신 없음) 1 mL을 각 웰에 조심스럽게 분배하고 플레이트를 37±1℃, 5±1% CO2로 설정된 인큐베이터에 적어도 5 min 동안 되돌려놓는다. 인큐베이션 시간의 끝을 p0으로 지정한다.
세포 내 리스테리아 모노시토게네스 성장의 검출 - p0.
1. 시점 "p0" 수거에 사용하기 위해 한 웰을 고른다. 각 웰에서 PMA 처리된 THP-1 세포의 층이 일관적이고 최소한의 세포가 제거되거나 세포가 제거되지 않고 이전의 흡인 및 분배 단계 동안에 제거된다는 것을 확인한다. 임의의 웰이 상당한 THP-1 세포 손실을 나타내는 것으로 관찰된 경우, 웰을 사용하지 않도록 표시한다.
2. 피펫을 이용하여 빨아내어 선택된 웰에서 c-RPMI를 제거한다.
3. 웰로 멸균수 1 mL을 분배한다. 위아래로 피펫팅하여 웰의 표면에서 THP-1 세포를 제거하고 전체 내용물을 2 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
세포가 성공적으로 제거되었는지 확인하기 위해 현미경 하에서 관찰한다. THP-1 세포의 상당 부분이 유지되는 경우, 위아래로 피펫팅하여 세포를 제거하기 위해 이전에 2 mL 튜브로 옮겨진 물의 일부를 이용하고 내용물을 다시 2 mL 튜브로 옮기고 현미경 하에서 THP-1 세포가 제거되었다는 것을 확인한다.
4. 다음 시점을 수거할 준비가 될 때까지 플레이트를 37±1℃, 5±1% CO2 인큐베이터에 되돌려놓는다.
5. 세포 용해물을 적어도 1 min 동안 보텍싱하여 세포 내 박테리아를 방출시키고 "생존력 테스트 과정 - p0/p3 시점"에 따라 생존력 테스트를 실행한다.
세포 내 리스테리아 모노시토게네스 성장의 검출 - p3.
1. p0으로 지정된 시점으로부터 3시간 이후 인큐베이터에서 플레이트를 제거한다 ("감염의 중지", 단계 9).
2. 시점 "p3" 수거에 사용하기 위해 하나의 웰을 고른다.
각 웰에서 PMA 처리된 THP-1 세포의 층이 일관적이고 최소한의 세포가 제거되거나 세포가 제거되지 않고 이전의 흡인 및 분배 단계 동안에 제거된다는 것을 확인한다. 임의의 웰이 상당한 THP-1 세포 손실을 나타내는 것으로 관찰된 경우, 웰을 사용하지 않도록 표시한다.
3. 피펫을 이용하여 빨아내어 선택된 웰에서 c-RPMI를 제거한다.
4. 멸균수 1 mL를 웰로 분배한다. 위아래로 피펫팅하여 웰의 표면에서 THP-1 세포를 제거하고 전체 내용물을 2 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
세포가 성공적으로 제거되었는지 확인하기 위해 현미경 하에서 관찰한다. THP-1 세포의 상당 부분이 유지되는 경우, 위아래로 피펫팅하여 세포를 제거하기 위해 이전에 2 mL 튜브로 옮겨진 물의 일부를 이용하고 내용물을 다시 2 mL 튜브로 옮기고 현미경 하에서 THP-1 세포가 제거되었다는 것을 확인한다.
5. 세포 용해물을 적어도 1 min 동안 보텍싱하여 세포 내 박테리아를 방출시키고 "생존력 테스트 과정 - p0/p3 시점"에 따라 생존력 테스트를 실행한다.
생존력 테스트 과정 - p0/p3 시점.
1. 다음에서 생성된 테스트 항목 용해물을 사용한다:
p0에 대해: "세포 내 리스테리아 모노시토게네스 성장의 검출 - p0, 단계 5
p3에 대해: "세포 내 리스테리아 모노시토게네스 성장의 검출 - p3, 단계 5
2. 다음 표에 따라 박테리아 현탁액을 단계 희석한다:
Figure pct00007
3. 각 희석액 100 μL를 적절한 BHI 아가 플레이트에 펼친다. 각각의 희석배수에 대해 3개의 아가 플레이트를 제조한다 (즉, p-2 시점에 대해 테스트 항목마다 총 9개의 아가 플레이트를 생산한다).
야생형 리스테리아 모노시토게네스 대조군에 대해 아가 BHI 플레이트를 사용한다.
ADXS11-001 테스트 항목에 대해 아가 BHI + 클로람페니콜을 사용한다.
4. 각 플레이트에서 액체를 흡수시키고 35-38℃에서 16-24시간 동안 CO2 없이 인큐베이터 내에서 뒤집이서 배치되기 전에 적어도 15 min 동안 뚜껑을 닫고 건조시킨다.
대조군 플레이트.
1. 각 검정 기회에 대하여 다음 음성 대조군 아가 플레이트를 제조한다:
미접종:
3x BHI 아가 + 100 pg/mL 스트렙토마이신
3x BHI 아가 + 25 pg/mL 클로람페니콜
접종됨:
3x BHI 아가 + 100 pg/mL 스트렙토마이신, 100 μL PBS로 접종됨
3x BHI 아가 + 25 pg/mL 클로람페니콜, 100 μL PBS로 접종됨
2. 각 검정 기회에 대하여 다음 양성 대조군 아가 플레이트를 제조한다:
2x BHI 아가 + 100 pg/mL 스트렙토마이신, 1x106 CFU/mL의 야생형 리스테리아 모노시토게네스 10 μL로 접종됨
2x BHI 아가 + 25 pg/mL 클로람페니콜, 1x106 CFU/mL의 참조 표준 10 μL로 접종됨
3. 플레이트를 16-24시간 동안 35-38℃에서 CO2 없이 검정 아가 플레이트와 함께 인큐베이션한다.
콜로니 계수 ( 제3 일 )
1. 16-24시간, 인큐베이터에서 플레이트를 제거한다.
주: 각 시점에서 모든 리스테리아 모노시토게네스 세포 유형 (야생형, 참조 표준 및 샘플)이 동일한 기간 동안 인큐베이션된다는 것을 확인한다.
2. 콜로니 형성 단위의 총 수를 수동으로 계수하고 워크시트의 각 희석배수의 각 플레이트에 대해 기록한다.
계산
1. 추후 계산을 위해 40-600 이내의 값을 가진 콜로니 수만을 사용한다. 필요한 계산을 수행하기 위해 희석배수 당 최소 2개의 콜로니 수가 범위 내에 있어야 한다. 둘 이상의 플레이트가 40-600 범위를 벗어난 콜로니 수를 갖는 경우, p0 및/또는 p3 시점에서 조정된 희석배수를 사용하여 전체 검정을 반복한다 ("생존력 테스트 과정 - p0/p3 시점", 단계 2).
2. 각 시점에 대해 CFU/mL 값을 계산한다:
Figure pct00008
3. 모든 계산된 CFU/mL 값의 log10 변환을 수행한다.
4. y-축 상에 log10 CFU/mL 및 x-축 상에 시간으로 데이터를 플롯팅한다.
검정 승인 기준
1. 모든 음성 대조군 아가 플레이트에 대한 박테리아 성장의 증거 없음.
2. 콜로니는 모든 양성 대조군 아가 플레이트 상에 존재해야 한다.
3. p-2에서 계산된 대조군에 대한 평균 log10 (CFU/mL)은 6 ± 0.5 내에 있다.
4. 3배수 아가 플레이트에 대한 유효한 콜로니 수 값 사이의 %CV*≤30.
*CV [(표준 편차 / 평균) x 100]
5. 다음 식에 따라 세포주 성능 (CLP) 파라미터를 계산한다:
Figure pct00009
3 이상인 모든 유효한 검정 실행 CLP에 대하여, CLP 값은 추적될 수 있다. P-2, p0 = 각각 시점 p-2 및 p0에 대한 평균 CFU/mL 값.
6. 다음 식을 사용하여 대조군에 대한 참조 반응을 계산한다:
Figure pct00010
2.0 이상인 모든 유효한 검정 실행 RRS에 대하여, RRS 값은 추적될 수 있다. P3, p0 = 각각 시점 p3 및 p0에 대한 평균 CFU/mL 값.
보고 가능한 결과
1. 각 샘플에 대하여 다음 식을 사용하여 보고 가능한 결과를 계산한다:
Figure pct00011
소수점 1자리 (d.p.)까지 보고한다.
2. 특정화에 대한 결과를 평가한다.
실시예 5. 리스테리아 모노시토게네스에 대한 THP -1-기반 감염성 검정의 검증
방법의 일반적인 개요는 실시예 4에서 제공된다.
요약
파라미터 승인 기준 결과 성과
검정 간
정확성		 모든 샘플에 대한 보고 가능한 결과 (%CV≤25%) 8.3% 통과
검정 간
정확성
(중간)		 모든 샘플에 대한 보고 가능한 결과 (%CV≤50%) 18.6% 통과
특이성 야생형 및 참조 샘플의 이원(Two-way) ANOVA 분석은 p-2, p0, 및 p3 시점에 성장 패턴의 유사성을 결정하기 위해 적용될 것이다. p-2 시점에 평균 감염성은 대조군과 참조 간에 동등할 것으로 예상된다. 동등성에 대한 증거는 p0 및 p3 시점에서는 예상되지 않는다. 대조군 및 참조에 대해 동등한 P-2 CFU/mL 값.
동등성에 대한 증거는 p0 및 p3 시점에서는 예상되지 않는다.		 통과
견고성 확인 모든 샘플에 대한 보고 가능한 결과 (%CV≤25%) 17.4% and 9.1% 통과
방법론
검정을 완료하는데 3일이 걸린다. 제1 일에, THP-1 세포를 1x106 생 세포/mL로 24웰 조직 배양 플레이트에 평판 배양한다 (테스트 항목 당 하나의 플레이트 - 상기 참조 (THP 1 세포의 감염 및 시간 경과 (제2 일)). 85%보다 높은 생존력을 가진 세포만을 사용하고 배양물에 대한 계대 횟수를 P32로 제한한다. THP-1 세포를 밤새도록 인큐베이션하는 동안 PMA 용액으로 처리하여 대식세포로의 분화를 자극한다.
다음 날, 광학 현미경을 사용하여 육안으로 분화를 확인하였다. 분화된 세포는 웰 표면에 부착되고 현탁액에 남아있는 미분화 둥근 세포와 형태학적으로 구별된다.
각각의 테스트 항목의 농도를 1x106 CFU/mL (공칭 농도 기반)로 조정하고 10-1, 10-2 및 10- 3로 추가로 단계 희석한다. 각 희석액 100 μL을 BHI 아가 플레이트에 평판 배양하고 16-24시간 동안 인큐베이션하여 콜로니를 성장시킨다. 3개의 플레이트를 제조한다. 콜로니를 수동으로 계수하여 p-2 CFU/mL 값을 생산한다. 이 시점에 감염 전에 고정된 양의 CFU/mL은 6±0.5 log10CFU/mL를 생산하는 것으로 예상된다. 이것은 동일한 양의 테스트 항목이 THP-1 세포에 영향을 미치는데 사용된다는 것을 확인한다.
1x106 CFU/mL로 조정된 테스트 항목을 또한 2시간 ± 3분 동안 분화된 THP-1 세포에 추가하였다. 이 시간 동안 리스테리아 모노시토게네스 박테리아가 THP-1 세포에 들어간다. 배양 배지에 남아있는 모든 박테리아를 45분 동안 젠타마이신의 추가에 의해 사멸시킨다. 젠타마이신은 THP-1 세포의 세포막에 침투할 수 없으며 그러므로 이 단계에서는 세포 외 박테리아만이 제거된다. 리스테리아 모노시토게네스를 가지고 있는 THP-1 세포를 용해시킨다. 용해물을 10-1, 10-2 및 10- 3로 단계 희석하였다. 각 희석액 100 μL를 BHI 아가 플레이트 상에 평판 배양하고 16-24시간 동안 인큐베이션하여 콜로니를 성장시킨다. 각 희석액에 대해 3개의 플레이트를 제조하였다. 콜로니를 수동으로 계수하여 p0 CFU/mL 값을 생산한다. 이 시점에서 각 테스트 항목에 대한 감염 박테리아 세포의 수를 결정한다.
리스테리아 모노시토게네스 감염된 THP-1 세포를 함유하는 여러 웰을 젠타마이신으로 처리 완료 후 3시간 동안 인큐베이터에 놔두었다. 인큐베이션 시간이 끝나면, 세포를 용해시켰다. 용해물을 10-1, 10-2 및 10- 3로 단계 희석하였다. 각 희석액 100 μL를 BHI 아가 플레이트 상에 평판 배양하고 16-24시간 동안 인큐베이션하여 콜로니를 성장시킨다.
각 희석액에 대해 3개의 플레이트를 제조하였다. 콜로니를 수동으로 계수하여 p3 CFU/mL 값을 생산한다. 이 시점에서 각 테스트 항목에 대한 감염 진행을 결정한다.
대조군 플레이트를 또한 제조하여 항생제 저항성 프로파일을 통해 테스트 항목의 무균 기술 및 동일성을 평가하였다. 대조군 플레이트를 p-2, p0, 및 p3 BHI 아가 플레이트와 함께 인큐베이션하였다.
데이터 분석
각각의 BHI 아가 플레이트를 수동으로 계수하였다. 각각의 콜로니는 1 CFU와 같다. 각각의 조제물/용해물 희석액 (즉 10-1, 10-2 및 10- 3)은 3개의 콜로니 계수 값 (즉, CFU)을 제공한다. 적어도 하나의 희석액이 40-600 콜로니/BHI 아가 플레이트 이내 및 %CV < 30%의 콜로니 수를 생산할 것으로 예상된다. 다음 방정식에 기초하여 p-2, p0, 및 p3 시점에 각 테스트 항목에 대한 CFU/mL 값을 계산하였다:
Figure pct00012
대조군에 대하여 p-2에서 Log10 (CFU/mL)은 모든 유효한 검정 실행에 대하여 6±0.5 이내인 것으로 예상된다.
각 테스트 항목의 세포 내 성장을 평가하기 위해 보고 가능한 결과를 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00013
p3, p0 = 각각 시점 p3 및 p0에 대한 평균 CFU/mL
보고 가능한 결과는 소수점 1자리까지 계산된다.
참조 표준 물질에 대한 보고 가능한 결과는 2.0 이상인 것으로 예상된다.
이에 더하여, 세포주 성능 파라미터를 계산함으로써 분화된 THP-1 세포의 감염에 대한 허용을 측정한다:
Figure pct00014
p-2, p0 = 각각 시점 p-2 및 p0에 대한 평균 CFU/mL
세포주 성능 파라미터를 0 d.p.로 계산하였다.
세포주 파라미터는 모든 유효한 검정 실행에 대해 3 이상인 것으로 예상된다.
방법 성능 파라미터의 평가를 위한 방법론
분석 매트릭스
검정 간 정확성 검정 간 정확성 + 견고성 확인
검정 번호 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
테스트 항목 1 대조군 대조군 대조군 대조군 대조군 대조군 대조군
테스트 항목 2 Ref. Ref. Ref. Ref. Ref. Ref. Ref.
테스트 항목 3 Ref. N/A N/A N/A N/A Ref. Ref.
테스트 항목 4 Ref. N/A N/A N/A N/A Ref. Ref.
배양 유형 작업용 세포 은행 (WCB)
검정 상태 동일한 날
및 동일한 분석가		 상이한 날 및 2개의 군의 분석가의 평균
감염 다중도
(MOI)		 1.1
감염 시간 2 h 2 h ± 3 min
THP-1 계대 ≤p32
Ref. = 참조
검정 간 정확성. 검정 간 정확성을 위해, 3배수로 테스트된 참조 물질 (n=3) 및 하나의 대조군 (n=1)으로 이루어진 하나의 검정 기회 (A1)로부터 데이터를 수집하였다. 데이터는 동일한 분석 조건 하에서 변동성을 반영한다. 참조 물질 (n=3) 조제물을 제조하고 동일한 검정 기회 동안 독립적으로 처리하였다.
계산: 참조 표준에 대한 평균/SD 보고 가능한 결과 (검정 A1-A7에서 테스트 항목 2) + %CV; n=7.
특이성. 검정의 특이성을 테스트 시스템이 대조군의 성장 패턴을 참조 물질/샘플과 구별할 수 있는 능력으로 한정하였다.
CFU/mL에 대한 시간 및 항목의 효과를 고려하기 위해, 고정 인자로 항목, 시간 및 그 상호작용을 이용하여 이원 분산 분석 (ANOVA)을 수행하고 반복은 무작위 효과로서 포함된다. 상호작용 효과는 각 항목 내에서 시간 경과의 차이를 기재한다. 분석 전에 데이터를 대수적으로 변환시켰다 (베이스 10).
상기 ANOVA에 따라, 각 항목의 동등성을 2 단측 테스트 방법론 (Two One Side Tests methodology: TOST)을 사용하여 대조군과 비교하였다. 각각의 비교를 위해, 대조군 평균 및 항목 평균 간의 차이에 대한 신뢰 구간을 결정하였다. 평균 간의 차이에 대한 (-0.5, 0.5)의 동등성 구간을 고려하여, 2개의 평균 간의 차이에 대하여 90% 신뢰 구간을 결정하였다. 두 신뢰 한계 모두가 동등성 구간 내에 있으면 두 평균을 명백하게 동등하다.
SAS 소프트웨어 (Proc GLM을 사용하는 버전 9.1.3)를 사용하는 ENVIGO 통계 부서에 의해 계산을 수행하였다.
견고성 확인.
이전 검증 연구의 결과에 기초하여, THP-1 세포의 감염 시간을 2시간 +/- 3분으로 한정하였다. 이 범위가 보고 가능한 결과에 대하여 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하기 위해 감염 시간의 하한 및 상한을 사용하여 2회의 검정을 수행하였다 (A6 및 A7). 검정 A1 (n=3)의 평균 보고 가능한 결과를 검정 A6 (n=3) 및 A7 (n=3)의 평균 보고 가능한 결과와 비교하였다. A1, A6 및 A7에 대한 %CV는 25 이상인 것으로 예상된다.
중요 물질
물질 공급처 공칭 농도 Lot
ADXS11-001 (참조 물질) Advaxis 8.8 x 109 CFU/mL 5265-14-01
야생형 리스테리아 모노시토게네스
(대조군)		 Advaxis 1.7 x 109 CFU/mL NB89p25
결과
검정 승인 기준 평가
승인 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
워크시트 참조 WS /047 WS /048 WS /049 WS /051 WS /054 WS /055 WS /052
최대. %CV 콜로니 (530%
=
통과)		 대조군 (TI-1) p-2 13 4 4 7 7 11 10
대조군 (TI-1) p0 2 2 2/82 11/112 8/152 3 5
대조군 (TI-1) p3 4 3 4 4 5 9 6
참조 (TI-2) p-2 15 11 5 4 7 1 9
참조 (TI-2) p0 6 15 9 3 8 12 8
참조 (TI-3) p3 4 5 5 2 5 5 24
참조 (TI-3) p-2 10 11 2
참조 (TI-3) p0 3 6 6
참조 (TI-3) p3 4 6 10
참조 (TI-4) p-2 6 7 4
참조 (TI-4) p0 6 5 11
참조 (TI-4) p3 4 8 5
CLP (≥3=통과)1 32 48 31 55 27 21 11
RRS (≥2.0=통과)3 4.2 2.8 3.0 3.6 4.1 3.4 4.5
p-2 log10(CFU/mL) 대조군
(5.5 - 6.5 = 통과)		 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.2 6.0
음성 대조군 플레이트 성장
없음		 성장
없음		 성장
없음		 성장
없음		 성장
없음		 성장
없음		 성장
없음
양성 대조군 플레이트 성장
있음		 성장
있음		 성장
있음		 성장
있음		 성장
있음		 성장
있음		 성장
있음
1 CLP는 하나 이상의 참조 테스트 항목을 이용한 검정에 대하여 평균으로 보고된다.
2 각각 10-2 및 10-3 희석에 대한 %CV
3 RRS는 하나 이상의 참조 테스트 항목을 이용한 검정에 대하여 평균으로 보고된다.
검정 간 정확성.
파라미터 테스트 항목 2 테스트 항목 3 테스트 항목 4
워크시트 참조 WS/047 WS/047 WS/047
검정 번호 A1 A1 A1
테스트 항목 유형 참조 참조 참조
보고 가능한 결과 (대조군: 테스트 항목 1A1) 4.2 3.9 4.6
SD/%CV 0.35/8.3%
검증 승인 (%CV≤25%) 통과
검정 간 정확성.
파라미터 테스트 항목 2 테스트 항목 3 테스트 항목 4
워크시트 참조 WS/055 WS/055 WS/055
검정 번호 A6 A6 A6
테스트 항목 유형 참조 참조 참조
보고 가능한 결과 (대조군: 테스트 항목 1 A1) 3.8 2.7 3.6
SD/%CV 0.59/17.4%
검증 승인 (%CV≤25%)1 통과
1 견고성 확인. 검정 A6은 증가된 감염 시간을 평가하였다 (2 h ± 3 min)
검정 간 정확성.
파라미터 테스트 항목 2 테스트 항목 3 테스트 항목 4
워크시트 참조 WS/052 WS/052 WS/052
검정 번호 A7 A7 A7
테스트 항목 유형 참조 참조 참조
보고 가능한 결과 (대조군: 테스트 항목 1A1) 4.8 4.0 4.5
SD/%CV 0.40/9.1%
검증 승인 (%CV≤25%)1 통과
1 견고성 확인. 검정 A7은 감소된 감염 시간을 평가하였다 (2 h ± 3 min).
검정 간 정확성 (중간).
파라미터 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
워크시트 참조 WS/047 WS/048 WS/049 WS/051 WS/054 WS/055 WS/052
테스트 항목 유형 Ref. Ref. Ref. Ref. Ref. Ref. Ref.
보고 가능한 결과 (대조군: 각각의 검정의 테스트 항목 1) 4.2 2.8 3.0 3.6 4.1 3.8 4.8
%CV 0.70/18.6%
검증 승인 (%CV≤50%)1 통과
특이성
비교 시점 차이 하한 CL 상한 CL 동등성
항목 2 대 대조군 -2 -0.12 -0.18 -0.07 예
항목 2 대 대조군 0 -1.55 -1.60 -1.51 아니오
항목 2 대 대조군 3 -2.18 -2.23 -2.13 아니오
항목 3 대 대조군 -2 -0.14 -0.19 -0.10 예
항목 3 대 대조군 0 -1.68 -1.73 -1.64 아니오
항목 3 대 대조군 3 -2.28 -2.32 -2.23 아니오
항목 4 대 대조군 -2 -0.10 -0.15 -0.06 예
항목 4 대 대조군 0 -1.62 -1.67 -1.57 아니오
항목 4 대 대조군 3 -2.28 -2.32 -2.23 아니오
파라미터 테스트 항목 2 테스트 항목 3 테스트 항목 4
워크시트 참조 WS/047 WS/047 WS/047
검정 번호 A1 A1 A1
테스트 항목 1 (대조군)에 대한 2원 ANOVA p-2 동등함을 의미함 동등함을 의미함 동등함을 의미함
p0 동등하지 않음을 의미함 동등하지 않음을 의미함 동등하지 않음을 의미함
p3 동등하지 않음을 의미함 동등하지 않음을 의미함 동등하지 않음을 의미함
성과 통과
Figure pct00015
SEQUENCE LISTING <110> Advaxis, Inc. Molli, Poonam Wallecha, Anu <120> Compositions And Methods For Evaluating Attenuation And Infectivity Of Listeria Strains <130> 062384/528092 <150> 62/640,855 <151> 2018-03-09 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gcacgtagta taatcaactt tgaaaaactg taataa 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 gcacgttcta ttatcaactt cgaaaaacta taataa 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 gcccgcagta ttatcaattt cgaaaaatta taataa 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 gcgcgctcta taattaactt cgaaaaactt taataa 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 gcacgctcca ttattaactt tgaaaaactt taataa 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 gctcgctcta tcatcaattt cgaaaaactt taataa 36 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gcacgtagta ttattaactt cgaaaagtta taataa 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 gcacgttcca tcattaactt tgaaaaacta taataa 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 gctcgctcaa tcatcaactt tgaaaagcta taataa 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 gctcgctcta tcatcaactt cgaaaaattg taataa 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 gctcgctcta ttatcaattt tgaaaaatta taataa 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 gctcgtagta ttattaattt cgaaaaatta taataa 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 gctcgttcga ttatcaactt cgaaaaactg taataa 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 gcaagaagca tcatcaactt cgaaaaactg taataa 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 gcgcgttcta ttattaattt tgaaaaatta taataa 36 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Ala Arg Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 gattataaag atcatgacgg agactataaa gaccatgaca ttgattacaa agacgacgat 60 gacaaa 66 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 gactataaag accacgatgg cgattataaa gaccatgata ttgactacaa agatgatgat 60 gataag 66 <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 gattataaag atcatgatgg cgactataaa gatcatgata tcgattacaa agatgacgat 60 gacaaa 66 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 gactacaaag atcacgatgg tgactacaaa gatcacgaca ttgattataa agacgatgat 60 gacaaa 66 <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 gattacaaag atcacgatgg tgattataag gatcacgata ttgattacaa agacgacgac 60 gataaa 66 <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 gattacaaag atcacgatgg cgattacaaa gatcatgaca ttgactacaa agacgatgat 60 gataaa 66 <210> 23 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 gattacaagg atcatgatgg tgattacaaa gatcacgata tcgactacaa agatgatgac 60 gataaa 66 <210> 24 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 gactacaaag atcatgatgg tgattacaaa gatcatgaca ttgattataa agatgatgat 60 gacaaa 66 <210> 25 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 gattataaag accatgatgg tgattataag gatcatgata tcgattataa ggatgacgac 60 gataaa 66 <210> 26 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 gattataaag atcacgatgg cgattataaa gaccacgata ttgattataa agacgacgat 60 gacaaa 66 <210> 27 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 gactataaag accacgatgg tgattataaa gatcacgaca tcgactacaa agacgatgat 60 gataaa 66 <210> 28 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 gactacaaag atcacgacgg cgattataaa gatcacgata ttgactataa agatgacgat 60 gataaa 66 <210> 29 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 gattataaag accatgatgg agattacaaa gatcatgata ttgactataa agacgacgac 60 gataaa 66 <210> 30 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 gattataaag atcacgatgg tgactacaaa gatcacgata tcgattataa agacgatgac 60 gataaa 66 <210> 31 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 gactacaaag atcacgatgg tgattataaa gaccatgata ttgattacaa agatgatgat 60 gacaaa 66 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 Gly Ala Ser Gly Ala Ser 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 Gly Ser Ala Gly Ser Ala 1 5 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 Ala Tyr Leu Ala Tyr Leu 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 Leu Arg Ala Leu Arg Ala 1 5 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Arg Leu Arg Ala 1 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys 20 25 30 <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Lys <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg 1 5 10 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met 1 5 10 15 Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 20 25 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp 1 5 10 15 Glu Glu Leu Arg 20 <210> 48 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly 1 5 10 15 Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp 20 25 30 Arg <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 Arg Ser Glu Val Thr Ile Ser Pro Ala Glu Thr Pro Glu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Ala Thr Pro <210> 52 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met 1 5 10 15 Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 20 25 <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp 1 5 10 15 Glu Glu Leu Arg 20 <210> 54 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly 1 5 10 15 Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp 20 25 30 Arg <210> 55 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn 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gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080 agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140 gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170 <210> 69 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 69 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly 100 <210> 70 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile 1 5 10 15 Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser 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ggctatgcgg atggattgat tcgtcattac agtggtttcc atgttttagt agacggtgaa 900 ccagctccaa tcattggtcg agtttgtatg gatcaaacca tcataaaact accacgtgaa 960 tttcaaactg gttcaaaagt aacgataatt ggcaaagatc atggtaacac ggtaacagca 1020 gatgatgccg ctcaatattt agatacaatt aattatgagg taacttgttt gttaaatgag 1080 cgcataccta gaaaatacat ccattag 1107 <210> 79 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 79 atgaaagtat tagtaaataa ccatttagtt gaaagagaag atgccacagt tgacattgaa 60 gaccgcggat atcagtttgg tgatggtgta tatgaagtag ttcgtctata taatggaaaa 120 ttctttactt ataatgaaca cattgatcgc ttatatgcta gtgcagcaaa aattgactta 180 gttattcctt attccaaaga agagctacgt gaattacttg aaaaattagt tgccgaaaat 240 aatatcaata cagggaatgt ctatttacaa gtgactcgtg gtgttcaaaa cccacgtaat 300 catgtaatcc ctgatgattt ccctctagaa ggcgttttaa cagcagcagc tcgtgaagta 360 cctagaaacg agcgtcaatt cgttgaaggt ggaacggcga ttacagaaga agatgtgcgc 420 tggttacgct gtgatattaa gagcttaaac cttttaggaa atattctagc aaaaaataaa 480 gcacatcaac aaaatgcttt ggaagctatt 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ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300 gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360 caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgatt tttcgattaa cgggaagctt 420 ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480 ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540 gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600 tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat cttgattatc tcaaaagata tgcccctaaa 660 ttagatgaat ggttttattt agcatgtcct gctacttggg gaaaattaaa ttaa 714 <210> 82 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly 1 5 10 15 Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp 20 25 30 Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu 35 40 45 Thr Ser Ile Ser Glu Asn Gly Thr Ile Met Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys 50 55 60 Gly Ala Phe Val Ile Met Ser Gly Phe Ile Asp Thr Glu Thr Ser Val 65 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gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180 caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240 ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300 gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360 caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgttt tttcgattaa cgggaagctt 420 ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480 ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540 gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600 tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat ctgattatct caaaagatat gcccctaaat 660 tagatgaatg gttttattta gcatgtcctg ctacttgggg aaaattaaat taa 713 <210> 84 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 ggtggtggag ga 12 <210> 85 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 ggtggaggtg ga 12 <210> 86 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 86 ggtggaggag gt 12 <210> 87 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 99 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Lys 20

Claims (18)

  1. 테스트 리스테리아 균주의 약독화 또는 감염성을 평가하는 방법으로서,
    (a) 분화된 THP-1 세포를 테스트 리스테리아 균주로 감염시키는 단계로서, THP-1 세포는 테스트 리스테리아 균주로 감염되기 전에 대식세포로 분화되는 단계;
    (b) THP-1 세포를 용해시키고 용해물을 아가 위에 평판 배양하는 단계; 및
    (c) 아가에서 성장하여 THP-1 세포 내부에서 증식한 리스테리아를 계수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 단계 (a) 전에 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)를 사용하여 THP-1 세포를 대식세포로 분화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 단계 (a)는 1:1의 감염 다중도 (MOI)에서 분화된 THP-1 세포를 감염시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)와 (b) 사이에 THP-1 세포에 의해 흡수되지 않은 리스테리아를 사멸시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4 항에 있어서, 사멸 단계는 항생제를 사용하여 수행되며, 선택적으로 항생제는 젠타마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 감염 후 0시간에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 감염 후 3시간에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 리스테리아 균주의 흡수 및 세포 내 성장을 야생형 리스테리아 균주 및/또는 참조 샘플과 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 리스테리아 균주는 리스테리아 모노시토게네스 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 리스테리아 균주는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 리스테리아 균주이며, 융합 폴리펩타이드는 질환-관련 항원성 펩타이드에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10에 있어서, PEST-함유 펩타이드는 리스테리오리신 O (LLO) 또는 그것의 단편이고, 질환-관련 항원성 펩타이드는 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 단백질 E7 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10 항 또는 제11 항에 있어서, 재조합 리스테리아 균주는 prfA의 결실 또는 그것에서 비활성화 돌연변이를 포함하는, 약독화된 리스테리아 모노시토게네스 균주이며, 핵산은 에피솜 플라스미드 내에 있고 D133V PrfA 돌연변이 단백질을 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10 항에 있어서, 재조합 리스테리아 균주는 actA, dal, 및 dat의 결실 또는 그것들에서 비활성화 돌연변이를 포함하는, 약독화된 리스테리아 모노시토게네스 균주이며, 핵산은 에피솜 플라스미드 내에 있고 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하고, PEST-함유 펩타이드는 리스테리오리신 O (LLO)의 N-말단 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 테스트 박테리아 균주의 약독화 또는 감염성을 평가하는 방법으로서,
    (a) THP-1 세포를 분화시키는 단계;
    (b) 분화된 THP-1 세포를 테스트 박테리아 균주로 감염시키는 단계로서, 감염 단계는
    (i) 분화된 THP-1 세포를 테스트 박테리아 균주로 접종하는 단계;
    (ii) 테스트 박테리아 균주를 분화된 THP-1 세포와 함께 1-5 시간 동안 인큐베이션하여 감염된 THP1 세포를 형성하는 단계;
    (iii) 감염된 THP-1 세포로부터 세포 외 박테리아를 제거하는 단계; 및
    (iv) 감염된 THP-1 세포를 성장 배지에서 0-10 시간 동안 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 단계;
    (c) 감염된 THP-1 세포를 용해시켜 용해물을 형성하는 단계;
    (d) 박테리아의 성장을 지원할 수 있는 배지를 함유하는 플레이트 상에 용해물 또는 용해물의 희석액을 평판 배양하는 단계; 및
    (e) 플레이트 상의 박테리아 콜로니 형성 단위를 계수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  15. 제14 항에 있어서, 분화된 THP-1 세포를 감염시키는 단계는 1:1의 감염 다중도 (MOI)에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14 항 또는 제15 항에 있어서, 세포 외 박테리아를 제거하는 단계는 박테리아에 효과적인 항체를 추가하는 것을 포함하며, 선택적으로 항생제는 젠타마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염된 THP-1 세포는 0, 1, 3, 또는 5 시간 동안 성장 배지에서 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 박테리아 균주는 리스테리아 모노시토게네스 균주인 것을 특징으로 하는 방법.


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