CN111655714A - 来自癌症相关蛋白的免疫原性异变肽及其使用方法 - Google Patents

来自癌症相关蛋白的免疫原性异变肽及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了包括异变突变(heteroclitic mutation)的肿瘤相关抗原性肽和包含此类异变肽(heteroclitic peptide)的融合多肽。还提供了编码此类肽和融合多肽的核酸，包括此类肽、融合多肽或核酸的重组的细菌或李斯特菌属(Listeria)菌株，以及包括此类重组的细菌或李斯特菌属菌株的细胞库。本文还提供了产生此类肽、融合多肽、核酸以及重组的细菌或李斯特菌属菌株的方法。还提供了包括此类肽、融合多肽、核酸或重组的细菌或李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物和疫苗。还提供了在受试者中诱导抗肿瘤相关抗原的免疫应答的方法，在受试者中诱导抗肿瘤或抗癌免疫应答的方法，在受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，在受试者中预防肿瘤或癌症的方法，以及使用此类肽、重组融合多肽、核酸、重组的细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗来保护受试者免于肿瘤或癌症的方法。

Description

来自癌症相关蛋白的免疫原性异变肽及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月8日提交的美国申请号62/583,292和2017年11月30日提交的美国申请号62/592,884的优先权，其每个的全部内容在此通过引用并入以用于所有目的。
对通过EFS Web以文本文件形式提交的序列表的引用
写在文件522598SEQLIST.txt中的序列表为333kb，创建于2018年11月3日，在此通过引用并入。
背景
肿瘤发生涉及获得一系列基本能力，包括不受控制的生长，抗死亡，具有迁移和在远距离位点生长的潜能，以及诱导新血管生长的能力。这些特征的基础是基因组的不稳定性，它会产生加速获得这些能力的遗传变异。肿瘤相关抗原(例如癌症睾丸抗原)将这些能力中的一些赋予给癌细胞，表明它们直接参与肿瘤发生，从而使其成为免疫疗法的潜在靶点。但是，有许多因素会导致肿瘤特异性T细胞在应答用于治疗癌症患者的肽疫苗时发生极小(minimal)扩增，这些因素包括T细胞耐受性、自身抗原对MHC或TCR的低亲和力以及肿瘤的免疫抑制环境。
发明概述
本文提供了用于癌症免疫疗法的方法和组合物。在一个方面，本文提供了分离的肽，所述分离的肽包含癌症相关蛋白的免疫原性片段，其中所述片段包含异变突变(heteroclitic mutation)。在另一个方面，本文提供了重组李斯特菌属(Listeria)菌株，其包含核酸，所述核酸包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含与癌症相关蛋白的一个或多个免疫原性片段融合的含PEST的肽，其中所述片段包含异变突变。本文还提供了此类融合多肽和编码此类分离的肽和融合多肽的核酸。本文还提供了包含此类核酸的重组细菌菌株。
在另一个方面，本文提供了免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，所述免疫原性组合物、药物组合物或疫苗包含此类分离的肽、核酸、融合多肽、重组细菌菌株或重组李斯特菌属菌株。
在另一个方面，本文提供了在受试者中诱导或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用此类分离的肽、核酸、融合多肽、重组细菌菌株或重组李斯特菌属菌株。本文还提供了在受试者中诱导或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，所述免疫原性组合物、药物组合物或疫苗包含此类分离的肽、核酸、融合多肽、重组细菌菌株或重组李斯特菌属菌株。
在另一个方面，本文提供了在受试者中预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用此类分离的肽、核酸、融合多肽、重组细菌菌株或重组李斯特菌属菌株。本文还提供了在受试者中预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，所述免疫原性组合物、药物组合物或疫苗包含此类分离的肽、核酸、融合多肽、重组细菌菌株或重组李斯特菌属菌株。
在另一个方面，本文提供了细胞库，所述细胞库包括一个或多个这样的重组细菌或重组李斯特菌属菌株。
附图简述
图1A和图1B显示WT1小基因(minigene)构建体的示意图。图1A显示被设计用来表达单一WT1嵌合多肽抗原的WT1小基因构建体。图1B显示被设计用来表达三个单独WT1嵌合多肽抗原的WT1小基因构建体。
图2A和图2B显示Lmdda-WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸小基因构建体(图2A)和Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-Ub-异变酪氨酸小基因构建体(图2B)的蛋白质印迹。在图2A中，泳道1是蛋白分子量标准(ladder)，泳道2是Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-Ub-异变酪氨酸小基因构建体(68kDa)，泳道3是阴性对照。在图2B中，泳道1是蛋白分子量标准，泳道2是阴性对照，泳道3是WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸小基因构建体(1号构建体)。
图3显示表达异变突变WT1肽的若干Lm-小基因构建体的菌落PCR结果。突变残基用粗体表示并加下划线。
图4显示用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO：197)和FMFPNAPYL(SEQ ID NO：160)离体刺激的脾细胞进行的ELISPOT测定。脾细胞来自用WT1-F小基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。PBS和LmddA274用作阴性对照。
图5显示用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:197)和YMFPNAPYL(SEQ ID NO:169)离体刺激的脾细胞进行的ELISPOT测定。脾细胞来自用WT1-AH1-Tyr小基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。PBS和LmddA274用作阴性对照。
图6A和图6B显示每百万个用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:197；图6A)和FMFPNAPYL(SEQ ID NO:160；图6B)离体刺激的脾细胞对应的IFN-γ斑点形成细胞(SFC)。脾细胞来自用WT1-F小基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。PBS和LmddA274用作阴性对照。
图7A和图7B显示每百万个用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:197；图7A)和YMFPNAPYL(SEQ ID NO:169；图7B)离体刺激的脾细胞对应的IFN-γ斑点形成细胞(SFC)。脾细胞来自用WT1-AH1-Tyr小基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。PBS和LmddA274用作阴性对照。
图8显示用PBS对照或Lm AH1_HC处理的小鼠中的CT26肿瘤体积。
定义
在本文中可互换使用的术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”是指任何长度的聚合氨基酸形式，包括编码和非编码氨基酸以及化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸。所述术语包括已被修饰的聚合物，诸如具有经修饰肽骨架的多肽。
蛋白质被称为具有“N末端”和“C末端”。术语“N末端”涉及蛋白质或多肽的起始部分，由具有游离胺基团(-NH2)的氨基酸封端。术语“C末端”涉及氨基酸链(蛋白质或多肽)的终止部分，由游离羧基(-COOH)封端。
术语“融合蛋白”是指包含两个或更多个由肽键或其他化学键连接在一起的肽的蛋白质。肽可直接由肽键或其他化学键连接在一起。举例来说，嵌合分子可以单链融合蛋白形式重组表达。或者，肽可由在两个或更多个肽之间的“接头”诸如一个或多个氨基酸或其他适合接头连接在一起。
在本文中可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的聚合核苷酸形式，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物或经修饰形式。它们包括单链、双链和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合物、以及包含嘌呤碱基、嘧啶碱基或其他天然核苷酸碱基、化学修饰的核苷酸碱基、生物化学修饰的核苷酸碱基、非天然核苷酸碱基或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
核酸被称为具有“5’末端”和“3’末端”，因为单核苷酸以使得一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸在一个方向上通过磷酸二酯键连接于它的相邻单核苷酸戊糖环的3’氧的方式反应以产生寡核苷酸。如果寡核苷酸的末端的5’磷酸未连接于单核苷酸戊糖环的3’氧，那么所述末端被称为“5’末端”。如果寡核苷酸的末端的3’氧未连接于另一单核苷酸戊糖环的5’磷酸，那么所述末端被称为“3’末端”。即使在较大寡核苷酸的内部，核酸序列也可被称为具有5’末端和3’末端。在线性或环状DNA分子中，离散元件被称为在“下游”或3’元件的“上游”或5’。
“密码子优化”是指通过用更频繁或最频繁用于宿主细胞的基因中的密码子置换天然序列的至少一个密码子，同时维持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以达成在特定宿主细胞中的表达增强的过程。举例来说，编码融合多肽的多核苷酸可被修饰来用相较于天然存在的核酸序列，在给定李斯特菌属细胞或任何其他宿主细胞中具有更高使用频率的密码子进行取代。密码子使用表例如可易于在“密码子使用数据库(Codon Usage Database)”处获得。各氨基酸的由单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)利用的最优密码子显示于US2007/0207170中，所述专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。这些表可以许多方式改适。参见Nakamura等(2000)Nucleic Acids Research 28:292，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。用于针对在特定宿主中的表达对特定序列进行密码子优化的计算机算法也是可用的(参见例如Gene Forge)。
术语“质粒”或“载体”包括任何已知递送载体，包括细菌递送载体、病毒载体递送载体、肽免疫疗法递送载体、DNA免疫疗法递送载体、游离型质粒、整合型质粒、或噬菌体载体。术语“载体”是指能够将一种或多种融合多肽递送于宿主细胞中，以及任选在宿主细胞中表达一种或多种融合多肽的构建体。
术语“游离型质粒”或“染色体外质粒”是指与染色体DNA物理分离(即处于游离或染色体外，并且未整合至宿主细胞的基因组中)，并且独立于染色体DNA进行复制的核酸载体。质粒可为线性的或环状的，并且它可为单链或双链。游离型质粒可任选以多个拷贝持续存在于宿主细胞的细胞质(例如李斯特菌属细胞质)中，从而导致游离型质粒内的任何目标基因的扩增。
术语“基因组整合”是指核酸已被引入细胞中，以致核苷酸序列整合至所述细胞的基因组中，并且能够由其子代遗传。任何方案都可用于将核酸稳定并入细胞的基因组中。
术语“稳定维持”是指在不存在选择作用(例如抗生素选择作用)下核酸分子或质粒在无可检测损失下维持至少10代。举例来说，时期可为至少15代、20代、至少25代、至少30代、至少40代、至少50代、至少60代、至少80代、至少100代、至少150代、至少200代、至少300代或至少500代。稳定维持可指核酸分子或质粒在体外(例如在培养中)在细胞中得以稳定维持，在体内得以稳定维持，或两者。
“开放阅读框”或“ORF”是DNA的含有可潜在编码蛋白质的碱基序列的部分。作为一实例，ORF可位于基因的起始密码子序列(起始密码子)与终止密码子序列(终止密码子)之间。
“启动子”是通常包含TATA框的DNA调控区，所述TATA框能够指导RNA聚合酶II以使RNA合成在特定多核苷酸序列的适当转录起始位点处起始。启动子可另外包含影响转录起始速率的其他区域。本文公开的启动子序列调节可操作地连接的多核苷酸的转录。启动子可在一个或多个本文公开的细胞类型(例如真核细胞、非人哺乳动物细胞、人细胞、啮齿动物细胞、多能细胞、单细胞期胚胎、分化细胞或其组合)中具有活性。启动子可为例如组成型活性启动子、条件型启动子、诱导型启动子、时间限制启动子(例如发育调控的启动子)、或空间限制启动子(例如细胞特异性或组织特异性启动子)。启动子的实例可例如见于以引用的方式整体并入本文的WO 2013/176772中。
“可操作连接”或“可操作地连接”是指两个或更多个组分(例如启动子和另一序列元件)毗邻以致两个组分均正常起作用，并且使得有可能至少一个组分可介导对至少一个其他组分施加的功能。举例来说，如果启动子应答于存在或不存在一个或多个转录调控因子来控制编码序列的转录水平，那么所述启动子可为可操作地连接于所述编码序列的。可操作连接可包括所述序列彼此邻接，或以反式起作用(例如调控序列可在某一距离下起控制编码序列的转录的作用)。
在两个多核苷酸或多肽序列的情形下的“序列同一性”或“同一性”涉及当历经指定比较窗进行比对以达成最大对应性时两个序列中相同的残基。当蛋白质使用序列同一性百分比时，应认识到不同一的残基位置经常差异在于保守性氨基酸取代，其中氨基酸残基被取代成具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，因此不改变分子的功能性质。当序列差异在于保守性取代时，序列同一性百分比可被调高以关于取代的保守性质加以修正。差异在于所述保守性取代的序列被称为具有“序列类似性”或“类似性”。用于进行这个调整的手段为本领域技术人员所熟知。通常，这涉及将保守性取代作为部分而非完全不匹配进行评分，由此使序列同一性百分比增加。因此，举例来说，当同一氨基酸被给予评分1，并且非保守性取代被给予评分0时，保守性取代被给予在0与1之间的评分。例如如程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California)中所执行来计算保守性取代评分。
“序列同一性百分比”是指通过历经比较窗比较两个最优对准序列(完全匹配残基的数目最大)来确定的值，其中相较于参照序列(其不包含添加或缺失)，比较窗中的多核苷酸序列的一部分可包含添加或缺失(即空位)以达成两个序列的最优比对。通过以下方式来计算百分比：确定同一核酸碱基或氨基酸残基存在于两个序列中所处的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数，以及用100乘以结果以产生序列同一性百分比。除非另外规定(例如较短序列包括连接的异源性序列)，否则比较窗是所比较的两个序列中的较短序列的全长。
除非另外陈述，否则序列同一性/类似性值是指使用第10版GAP利用以下参数获得的值：核苷酸序列的同一性％和类似性％，使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的同一性％和类似性％，使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等效程序。“等效程序”包括对于任何两个所论述的序列，当相较于由第10版GAP产生的相应比对时，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对的任何序列比较程序。
术语“保守性氨基酸取代”是指用具有类似尺寸、电荷或极性的不同氨基酸取代通常存在于序列中的氨基酸。保守性取代的实例包括将非极性(疏水性)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代成另一非极性残基。同样，保守性取代的实例包括将一个极性(亲水性)残基取代成另一残基，诸如在精氨酸与赖氨酸之间，在谷氨酰胺与天冬酰胺之间，或在甘氨酸与丝氨酸之间的取代。另外，将碱性残基诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代成另一残基，或将一个酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸取代成另一酸性残基是保守性取代的额外实例。非保守性取代的实例包括将非极性(疏水性)氨基酸残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸取代成极性(亲水性)残基诸如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸，和/或将极性残基取代成非极性残基。以下概述典型氨基酸分类。
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“同源性”序列(例如核酸序列)是指以下序列：其与已知参照序列同一或大致上类似，以致它与所述已知参照序列例如至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
术语“野生型”是指具有如在正常(与突变、患病、改变等相对比)状态或情形下所见的结构和/或活性的实体。野生型基因和多肽经常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
关于蛋白质和核酸的术语“分离的”是指蛋白质和核酸关于可通常原位存在的其他细菌、病毒或细胞组分是相对纯化的，直至并包括蛋白质和多核苷酸的大致上纯净制剂。术语“分离的”也包括蛋白质和核酸不具有天然存在的对应物，已被化学合成，因此大致上未由其他蛋白质或核酸污染，或已与它们天然地与其相伴的大多数其他细胞组分(例如其他细胞蛋白质、多核苷酸或细胞组分)分离或从所述大多数其他细胞组分纯化。
“外源性”或“异源性”分子或序列是通常不在细胞中表达或通常不以那个形式存在于细胞中的分子或序列。通常存在包括关于细胞的特定发育阶段和环境条件而存在。外源性或异源性分子或序列例如可包括细胞内相应内源性序列的突变形式，或可包括对应于细胞内内源性序列，但呈不同形式(即不在染色体内)的序列。特定细胞中的外源性或异源性分子或序列也可为源于与细胞的参照物种不同的物种或源于同一物种内的不同生物体的分子或序列。举例来说，在表达异源性多肽的李斯特菌属菌株的情况下，所述异源性多肽可为不为所述李斯特菌属菌株所天然具有或不是所述李斯特菌属菌株的内源性多肽，通常不由所述李斯特菌属菌株表达，来自除所述李斯特菌属菌株以外的来源，源于同一物种内的不同生物体的多肽。
相比之下，“内源性”分子或序列或“天然”分子或序列是通常以那个形式在特定发育阶段在特定环境条件下存在于特定细胞中的分子或序列。
术语“变体”是指不同于群体中的大多数，但仍然充分类似于共同模式以被视为它们中的一者的氨基酸或核酸序列(或生物体或组织)(例如剪接变体)。
术语“亚型”是指分子(例如蛋白质)的相较于另一亚型或形式(例如同一蛋白质的另一亚型或形式)，仅具有微小差异的形式。举例来说，蛋白质亚型可由不同但相关基因产生，它们可由同一基因通过选择性剪接来产生，或它们可由于单核苷酸多态性而产生。
术语“片段”在涉及蛋白质时意指相比于全长蛋白质，是较短的或具有较少氨基酸的蛋白质。术语“片段”在涉及核酸时意指相比于全长核酸，是较短的或具有较少核苷酸的核酸。片段可为例如N末端片段(即移除蛋白质的C末端的一部分)、C末端片段(即移除蛋白质的N末端的一部分)、或内部片段。片段也可为例如功能性片段或免疫原性片段。
术语“类似物”在涉及蛋白质时意指由于保守性氨基酸差异、由于不影响氨基酸序列的修饰、或由于这两者而不同于天然存在的蛋白质的蛋白质。
术语“功能性”是指蛋白质或核酸(或其片段、亚型或变体)展现生物活性或功能的先天性能力。所述生物活性或功能可包括例如在向受试者施用时能够引发免疫应答。所述生物活性或功能也可包括例如结合相互作用配偶体。在功能性片段、亚型或变体的情况下，这些生物功能可实际上改变(例如就它们的特异性或选择性而言)，但保留基本生物功能。
术语“免疫原性”或“免疫原性的”是指分子(例如蛋白质、核酸、抗原或生物体)在向受试者施用时在所述受试者中引发免疫应答的先天性能力。免疫原性可例如通过更大数目的针对分子的抗体、更大多样性的针对分子的抗体、更大数目的对分子具有特异性的T细胞、对分子的更大细胞毒性T细胞应答或辅助T细胞应答等来度量。
术语“抗原”在本文中用于指代在置于与受试者或生物体接触时(例如在存在于所述受试者或生物体中时，或在由所述受试者或生物体检测到时)，导致来自所述受试者或生物体的可检测免疫应答的物质。抗原可为例如脂质、蛋白质、碳水化合物、核酸或其组合和变化形式。举例来说，“抗原性肽”是指在存在于受试者或生物体中或由受试者或生物体检测到时，导致在所述受试者或生物体中发生免疫应答的肽。举例来说，这种“抗原性肽”可涵盖以下蛋白质：其装载于宿主细胞的表面上的I类和/或II类MHC分子上并于I类和/或II类MHC分子上呈递，并且可由宿主的免疫细胞识别或检测，由此导致发动针对蛋白质的免疫应答。这种免疫应答也可延伸至宿主内的表达同一蛋白质的其他细胞，诸如患病细胞(例如肿瘤细胞或癌细胞)。
术语“表位”是指抗原上的由免疫系统识别(例如抗体与其结合)的位点。表位可由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠而毗邻的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)在暴露于变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象性表位)在用变性溶剂处理时通常丧失。表位通常包括至少3个，并且更通常至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体照相术和2维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols,in Methods inMolecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编(1996)，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
术语“突变”是指基因或蛋白质的结构的任何变化。举例来说，突变可由染色体或蛋白质的缺失、插入、取代或重排所致。“插入”通过添加一个或多个额外核苷酸或氨基酸来改变基因中的核苷酸数目或蛋白质中的氨基酸数目。“缺失”通过减除一个或多个额外核苷酸或氨基酸来改变基因中的核苷酸数目或蛋白质中的氨基酸数目。
DNA中的“移码”突变发生在添加或丧失核苷酸使基因的阅读框改变时。阅读框由各自编码一个氨基酸的3个碱基的群组组成。移码突变使这些碱基的编组移动，并且改变对氨基酸的编码。所得蛋白质通常是非功能性的。插入和缺失可各自是移码突变。
“错义”突变或取代是指蛋白质的一个氨基酸的变化，或单一核苷酸中的点突变导致所编码氨基酸的变化。单一核苷酸中的导致一个氨基酸的变化的点突变是DNA序列中的“非同义”取代。非同义取代也可导致“无义”突变，其中密码子变为导致所得蛋白质的截短的过早终止密码子。相比之下，DNA中的“同义”突变是不改变蛋白质的氨基酸序列(由于密码子简并性)的突变。
术语“体细胞突变”包括由除生殖细胞(例如精子或卵)以外的细胞获得的遗传改变。所述突变可在细胞分裂的过程中传递至突变细胞的子代，但不可遗传。相比之下，生殖细胞突变存在于生殖系中，并且可传递至下一代后代。
术语“体外”是指人工环境以及发生在人工环境(例如试管)内的过程或反应。
术语“体内”是指天然环境(例如细胞或生物体或身体)以及发生在天然环境内的过程或反应。
“包含”或“包括”一个或多个叙述的要素的组合物或方法可包括未明确叙述的其他要素。举例来说，“包含”或“包括”蛋白质的组合物可含有单独或与其他成分组合的所述蛋白质。
对值的范围的指定包括所述范围内或界定所述范围的所有整数，以及由所述范围内的整数界定的所有子范围。
除非另外根据上下文显而易知，否则术语“约”涵盖在陈述值的标准测量误差界限(例如SEM)内的值或从指定值开始的±0.5％、1％、5％或10％变化形式。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式的冠词“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个(种)指示物。举例来说，术语“一个(种)抗原”或“至少一个(种)抗原”可包括复数个(种)抗原，包括其混合物。
统计显著意指p≤0.05。
发明详述
I.概述
本文提供了包含癌症相关蛋白的免疫原性片段的肽，其中所述片段包含异变突变。有些这样的肽为包含癌症相关蛋白的一个或多个免疫原性片段的重组融合多肽，其中每个片段包含异变突变(例如，与含PEST的肽融合)。本文还提供了编码此类肽的核酸；包含此类肽或核酸的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗；包含此类肽或核酸的重组细菌或李斯特菌属菌株；包含此类重组细菌或李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗；以及产生此类肽、此类核酸和此类重组细菌或李斯特菌属菌株的方法。本文还提供了在受试者中诱导抗肿瘤相关抗原的免疫应答的方法，在受试者中诱导抗肿瘤或抗癌免疫应答的方法，在受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，在受试者中预防肿瘤或癌症的方法，以及使用此类肽、核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗保护受试者免于肿瘤或癌症的方法。
设计和使用源自肿瘤相关抗原基因(例如，来自癌症睾丸抗原(CTA)或癌胚抗原(OFA))的异变序列(即，序列优化的肽)可以增加由I类MHC等位基因进行的呈递。已经表明，异变序列足以引发T细胞应答，以克服中枢耐受性并引发针对野生型肽的成功的交叉反应性免疫应答。在癌症适应症内，OFA和CTA在高达100％的患者中表达，但在成年人的健康组织中不表达(例如，通常仅在胚胎组织中表达)。许多OFA/CTA在肿瘤发生中起主要作用。由于OFA/CTA的组织表达高度限于癌症中，因此它们是免疫疗法的明星靶点。
可以组合此类异变序列，使得一种癌症类型内的总患者覆盖率可以接近100％。使用多种序列优化的专有免疫原性OFA/CTA肽或肿瘤相关抗原性肽(即经过了序列优化以提高免疫原性)可以提供能够产生强烈的T细胞应答的其他靶点，从而无需在治疗前对患者进行测序，因为可以假设它们将表达我们已针对其设计了异变肽以覆盖最普遍的HLA(HLA-A0201、HLA-A0301、HLA-A2402和HLA-B0702)的肿瘤相关抗原。
在本文所述的一些组合物中，所述异变肽表达在单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)载体中。Lm技术具有将强力先天性免疫刺激、直接向树突细胞和抗原呈递细胞的胞质液中递送靶标肽、产生所靶向的T细胞应答、以及使由肿瘤微环境中的调控性T细胞和骨髓源性遏制细胞达成的免疫遏制降低进行合并的作用机理。可将多次治疗加以给予和/或组合，而无中和抗体。Lm技术可使用例如活体减毒经生物工程改造Lm细菌来刺激免疫系统以将肿瘤细胞视为潜在受细菌感染细胞，并且靶向它们以达成消除。技术过程可以李斯特菌属的活体减毒菌株起始，并且可添加例如多个拷贝的编码包括例如LLO(李斯特菌溶素O(listeriolysin O))分子的片段连结于目标抗原的融合蛋白序列的质粒。这个融合蛋白由李斯特菌属在抗原呈递细胞内部分泌。这导致对免疫系统的先天性分支与适应性分支两者的刺激，所述刺激使肿瘤防御机制降低，并且使得免疫系统更易于攻击和破坏癌细胞。
在免疫方面，相较于肽疫苗，基于Lm的载体是一种用于产生CD8+占优势的T细胞应答的更优越平台。首先，不需要添加非格司亭(filgrastim)注射液佐剂。这是因为活体减毒细菌载体固有地触发包括若干TLR、PAMP和DAMP受体的众多先天性免疫活化触发剂，并且具有使抗原呈递细胞的胞质液内的STING受体激动的强大能力。这是免疫微环境的更加广泛改变，所述改变对患者的免疫系统进行初免以达成适应性免疫应答。其次，Lm载体在静脉内输注。相比于可驻留在皮下组织的有限区域中，这允许它到达显著更多抗原呈递细胞。这也消除对皮下注射的需要、对非格司亭的使用、以及延迟型过敏的风险。也有可能较快产生较高T细胞滴度，因为最优CD8+T细胞数目通常在3次治疗，不大于10次治疗之后达到峰值。第三，Lm促进主要CD8+T细胞应答，伴有CD4+交叉反应性以达成T细胞辅助。CD8+T细胞最有效杀灭癌细胞，并且因为Lm载体在APC的细胞质中呈现它们的抗原，所以那些肽被快速转移至蛋白酶体以进行加工，与1类MHC复合，并且运送至APC表面以向主要呈CD8+的T细胞呈递。相比于抗原肽的皮下Montanide呈递，这应带来产生更多CD8+T细胞的优势。第四，Lm载体使肿瘤和周围淋巴结上趋化因子和趋化因子受体的表达增加。这有助于将活化的T细胞吸引至实体肿瘤的附近。第五，Lm载体使可保护肿瘤免遭T细胞攻击的免疫遏制性细胞的相对数目和遏制功能降低，从而更好地使得能够达成T细胞对癌细胞的杀灭。调控性T细胞和骨髓源性遏制细胞的免疫遏制能力的这个降低将更好地使得针对这些肽产生的T细胞能够在实体肿瘤的情况下具有更好活性。第六，Lm载体不产生中和抗体。因此，这些载体可持续延长时期重复施用，而不会由于中和抗体而损失功效以及不显现延迟型过敏或急性过敏，其可包括过敏性反应。
Lm载体通过多个免疫治疗机理来起作用：通过toll样受体(TLR)和病原体相关分子样式(PAMP)(包括干扰素基因刺激物(STING)受体)进行强力先天性免疫刺激、强烈CD8+和CD4+T细胞应答、表位扩展、以及使由肿瘤微环境中的Treg和骨髓源性遏制细胞(MDSC)达成的免疫遏制失能。此外，李斯特菌属的独特细胞内生命周期会避免中和抗体，从而允许重复给药。因为Lm与检查点抑制剂、共刺激性激动剂和其他药剂具有协同作用，所以它也是有利的。它也具有大容量，并且可被改适以靶向许多不同肿瘤类型。作为一实例，Lm的活体减毒菌株可被生物工程改造来分泌包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的抗原-佐剂融合蛋白：具有佐剂性质的李斯特菌溶素O的截短片段(tLLO)和一个或多个肿瘤相关抗原。在输注至患者中后，经生物工程改造Lm可由抗原呈递细胞吞噬，在抗原呈递细胞中，融合蛋白由Lm分泌，被加工，并且于I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)分子上呈递。在抗原呈递细胞的表面上呈递的靶标肽刺激肿瘤相关抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞。活化的CD8+T细胞可接着搜寻出肿瘤相关抗原表达性癌细胞并将其杀灭，并且调节肿瘤微环境以克服免疫遏制。
Lm载体具有一些临床优势。与治疗相关的任何副作用都出现在输注后即刻数小时内而此时患者仍然在诊所中，几乎仅是轻度-中度的并易于对治疗起响应，并且在给药当天消除而无延迟发作、累积毒性或持续后遗症的迹象。实际优势包括以下事实：不需要施用多种药剂以及转换至其他给药位点以进行后续施用。
从制造立场来看，存在若干优势。首先，不需要将个别肽制造成高浓度和高纯度。Lm细菌在细菌内部同时转录多个拷贝的DNA质粒上的DNA，并且将这些肽直接分泌至APC的细胞质中，在细胞质中，它们几乎立刻被运送至蛋白酶体以进行加工。基本上，肽就在用于抗原加工时由细菌制造。其次，Lm载体是高度可缩放的。一旦遗传工程改造完成，细菌即在液体培养中进行自我复制。培养可按比例扩大以极大降低商品成本。第三，不需要在复合载体如Montanide中进行配制或产生乳液。第四，细菌是极其稳定的，一些超过5年，而不用担心可导致肽制剂的效能损失的肽降解或分解产物污染。
在本文公开的一些Lm载体中，如本文其他地方更详细的描述使用小基因构建体。使用本文公开的小基因构建体方法来表达特定I类MHC结合抗原决定簇允许将短肽序列高度高效递送至专职抗原呈递细胞(pAPC)的抗原呈递路径中。小基因技术的一特定优势是它不需要对蛋白酶体介导的较大蛋白质降解以释放可结合和呈递在I类MHC分子上的短肽序列。这导致pAPC的表面上的肽-I类MHC抗原呈递的效率高得多，因此，用于引发抗原特异性T细胞应答的抗原表达的水平高得多。
II.包含异变突变的肿瘤相关抗原性肽和编码此类肽的核酸
本文公开了包含癌症相关蛋白的免疫原性片段的肽，其中所述片段包含异变突变。
术语“异变”是指肽产生识别异变肽所源于的天然肽(例如不含有锚定残基突变的肽)的免疫应答。举例来说，YLMPVNSEV(SEQ ID NO:130)通过对甲硫氨酸进行第2残基突变来从YMMPVNSEV(SEQ ID NO:131)产生。异变肽可产生识别所述异变肽所源于的天然肽的免疫应答。举例来说，通过用异变肽接种疫苗所产生的针对天然肽的免疫应答在量值方面可等于或大于通过用天然肽接种疫苗所产生的免疫应答。免疫应答可例如增加2倍、3倍、5倍、7倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、100倍、150倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更多倍。
本文公开的异变肽可结合一种或多种人白细胞抗原(HLA)分子。HLA分子，也称为主要组织相容性复合物(MHC)分子，结合肽并向免疫细胞呈递它们。肽的免疫原性可部分地由它对HLA分子的亲和力决定。I类HLA分子与通常存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上的CD8分子相互作用。II类HLA分子与通常存在于辅助T淋巴细胞上的CD4分子相互作用。举例来说，本文公开的异变肽可以足以使T细胞前体活化的亲和力，或以足以介导由T细胞达成的识别的亲和力结合HLA分子。
本文公开的异变肽可结合一种或多种II类HLA分子。举例来说，异变肽可结合HLA-DRB分子、HLA-DRA分子、HLA-DQA1分子、HLA-DQB1分子、HLA-DPA1分子、HLA-DPB 1分子、HLA-DMA分子、HLA-DMB分子、HLA-DOA分子或HLA-DOB分子。
本文公开的天然肽或异变肽可结合一种或多种I类HLA分子。举例来说，异变肽可结合HLA-A分子、HLA-B分子、HLA-C分子、HLA-A0201分子、HLA A1、HLA A2、HLA A2.1、HLAA3、HLA A3.2、HLA A11、HLA A24、HLA B7、HLA B27或HLA B8。类似地，异变肽可结合某一超家族的I类HLA分子，诸如A2超家族、A3超家族、A24超家族、B7超家族、B27超家族、B44超家族、C1超家族或C4超家族。在一个具体的实例中，所述异变肽或片段结合以下HLA类型中的一种或多种：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
异变肽可包含相对于相应天然肽，使肽与II类HLA分子的结合增强的突变。或者，或另外，异变肽可包含相对于相应天然肽，使肽与I类HLA分子的结合增强的突变。举例来说，突变残基可为II类HLA基序锚定残基。在另一实施方案中，“锚定基序”或“锚定残基”是指HLA结合序列(例如II类HLA结合序列或I类HLA结合序列)中在特定位置处的一个或一组优选残基。
用于产生具有引发对野生型表位的交叉反应性免疫原性应答的潜力的预测异变表位的各种方法是熟知的。举例来说，为设计具有引发对野生型表位的交叉反应性免疫原性应答的潜力的异变表位，可使用NetMHCpan 3.0服务器(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)确定野生型表位的基线预测肽-MHC结合亲和力。小于或等于1.0的肽-MHC结合亲和力百分比等级被视为可能引发免疫应答的强力结合剂。潜在异变表位通过在但不限于被预测是强力结合剂的野生型表位的位置1、2、3或C末端位置处随机取代1个或更多个氨基酸来产生。接着使用NetMHCpan 3.0服务器估计潜在异变表位的肽-MHC结合亲和力。结合亲和力分级百分比与野生型表位类似，并且小于或等于1.0百分比等级的异变表位可被视为用于进行未来验证的潜在抗原。
用于鉴定I类HLA和II类HLA残基以及用于通过使残基突变来改进HLA结合的其他方法是熟知的。参见例如US 8,765,687、US 7,488,718、US 9,233,149和US 7,598,221，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。举例来说，用于预测II类MHC表位的方法是熟知的。作为一个实例，II类MHC表位可使用TEPITOPE预测(Meister等(1995)Vaccine 13:581-591，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。作为另一实例，II类MHC表位可使用EpiMatrix预测(De Groot等(1997)AIDS Res.Hum.Retroviruses13:529-531，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。作为另一实例，II类MHC表位可使用预测方法(Predict Method)预测(Yu K等(2002)Mol.Med.8:137-148，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。作为另一实例，II类MHC表位可使用SYFPEITHI表位预测算法预测。SYFPEITHI是包含超过4500个已知会结合I类和II类MHC分子的肽序列的数据库。SYFPEITHI提供基于某些氨基酸在沿MHC结合沟槽的某些位置中的存在性的评分。理想氨基酸锚定物以10分赋值，不寻常锚定物值6-8分，辅助锚定物值4-6分，优选残基值1-4分；对结合的负性氨基酸作用评分在-1与-3之间。对于HLA-A*0201，最大评分是36。作为另一实例，II类MHC表位可使用Rankpep预测。Rankpep使用来自各组已知会结合给定MHC分子的比对肽的位置特异性评分矩阵(PSSM)或概况作为MHC-肽结合的预测器。Rankpep包括关于肽的评分和预测肽相对于在采用所选概况的情况下产生最大评分的共有(consensus)序列的评分的最优值百分比或百分位评分的信息。Rankpep包括选择102PSSM和80PSSM以分别预测肽与MHC I分子的结合和肽与MHC II分子的结合。用于预测不同大小的肽结合剂的若干PSSM通常可用于各MHC I分子。作为另一实例，II类MHC表位可使用SVMHC鉴定(Donnes和Elofsson(2002)BMCBioinformatics 11；3:25，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。
用于鉴定I类MHC表位的方法也是熟知的。作为一个实例，I类MHC表位可使用BIMAS软件预测。BIMAS评分基于对MHC-I/β2-微球蛋白/肽复合物的理论半衰期的计算，所述理论半衰期是肽结合亲和力的量度。程序使用关于长度是8-10个氨基酸的HLA-I肽的信息。肽与MHC的结合亲和力越高，这个肽代表表位的可能性越高。BIMAS算法假定肽中的各氨基酸独立地对与I类分子的结合作贡献。对结合至关重要的支配性锚定残基在表中具有显著高于1的系数。不利氨基酸具有小于1的正系数。如果不知氨基酸对结合作有利贡献还是不利贡献，那么将它指定数值1。将对氨基酸指定的所有值相乘，并且将所得运行评分乘以常数以产生解离半衰期的估计值。作为另一实例，I类MHC表位可使用SYFPEITHI鉴定。作为另一实例，I类MHC表位可使用SVMHC鉴定。作为另一实例，I类MHC表位可使用NetMHC-2.0鉴定(Buus等(2003)Tissue Antigens 62:378-384，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。
可使HLA结合基序中的不同残基突变以使MHC结合增强。在一个实例中，使MHC结合增强的突变在I类HLA结合基序的位置1处的残基中(例如突变至酪氨酸、甘氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸)。作为另一实例，突变可在I类HLA结合基序的位置2中(例如突变至亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸)。作为另一实例，突变可在I类HLA结合基序的位置6中(例如突变至缬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或组氨酸)。作为另一实例，突变可在I类HLA结合基序的位置9中或C末端位置中(例如突变至缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸或半胱氨酸)。突变可在主要锚定残基中或次要锚定残基中。举例来说，I类HLA主要锚定残基可为位置2和9，并且次要锚定残基可为位置1和8或位置1、3、6、7和8。在另一实例中，点突变可在选自位置4、5和8的位置中。
类似地，可使II类HLA结合位点中的不同残基突变。举例来说，可修饰II类HLA基序锚定残基。举例来说，可使P1位置、P2位置、P6位置或P9位置突变。或者，可使P4位置、P5位置、P10位置、P11位置、P12位置或P13位置突变。
个别异变突变可基于如在本文中其他地方进一步详细所讨论的任何标准加以选择。举例来说，如果已知个别异变突变或异变肽会产生CD8+T淋巴细胞应答，那么可选择它们。
在鉴定出一组可能的异变突变后，可以选择包含每个异变突变的异变免疫原性肽序列。如本文中其他地方所公开的，可以使用不同大小的肽。例如，可以将异变突变或异变免疫原性肽集中在，例如，由9个氨基酸组成的I类MHC表位上。
可接着对异变抗原性肽的序列进行优化以使与I类MHC分子的结合增强。为对与各HLA的结合进行优化，可由免疫表位数据库和分析资源(Immune Epitope Database andAnalysis Resource)(例如：iedb.org/MHCalleleid/143)评估肽MHC结合基序和氨基酸结合图。可将在锚定位置处的优选氨基酸插入异变抗原性肽序列中(例如NUF2–野生型：YMMPVNSEV(SEQ ID NO:131)；以及NUF2–异变：YLMPVNSEV(SEQ ID NO:130))。
序列优化的异变抗原性肽的结合亲和力可接着例如使用一种以下算法来评估：NetMHC4.0服务器；NetMHCpan4.0服务器；和mhcflurry v0.2.0。举例来说，如果对特定HLA的预测结合亲和力等于或强于相应天然序列，那么异变抗原性肽可被考虑。所选序列优化的异变抗原性肽可接着使用ProImmune的REVEAL测定关于与特定HLA的体外结合加以筛选。举例来说，结合亲和力>＝REVEAL测定的阳性对照肽的45％的异变抗原性肽被视为结合剂。
序列优化的异变抗原性肽的结合亲和力(例如，IC50)可以，例如，小于1000、500、400、300、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1nM。例如，所述结合亲和力(例如，IC50)可以为约0.5-500、0.5-300、0.5-200、0.5-100、0.5-50、0.5-40、0.5-30、0.5-20、0.5-10或0.5-5nM。
也可采用癌症基因组图谱(TCGA)RNAseqV2数据集测量在特定适应症中异变抗原性肽的RNA表达水平。可计算归一化的RNA表达读数大于0的TCGA样品的百分比。在大多数样品中具有TCGA表达的异变抗原性肽可被优先考虑。
在一特定实例中，可进行文献综述来考察适应症特异性肿瘤相关抗原的基因组图景以产生潜在TAA的候选清单。可进行第二文献综述以确定候选清单TAA是否含有产生CD8+T淋巴细胞应答的已知免疫原性肽。这个方法可例如主要集中在由来自TAA的9个氨基酸(9聚体)组成的I类MHC表位上。这个步骤可例如鉴定结合四个HLA类型(HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02)中的一者的呈9聚体形式的潜在靶标肽。
可接着对靶标肽进行序列优化以使与I类MHC分子的结合增强(也称为异变肽)。为对与各HLA的结合进行优化，可由免疫表位数据库和分析资源(例如：iedb.org/MHCalleleid/143)评估肽MHC结合基序和氨基酸结合图。可将在锚定位置处的优选氨基酸插入靶标肽序列中(例如NUF2–野生型：YMMPVNSEV(SEQ ID NO:131)；以及NUF2–异变：YLMPVNSEV(SEQ ID NO:130))。序列优化的靶标肽和野生型靶标肽的结合亲和力可接着例如使用一种以下算法来评估：NetMHC4.0服务器；NetMHCpan4.0服务器；和mhcflurryv0.2.0。举例来说，如果对特定HLA的预测结合亲和力等于或强于野生型靶标肽序列，那么序列优化的靶标肽可被考虑。所选序列优化的靶标肽可接着使用ProImmune的REVEAL测定关于与特定HLA的体外结合加以筛选。举例来说，结合亲和力>＝REVEAL测定的阳性对照肽的45％的靶标肽可被视为结合剂。最后，可采用TCGA RNAseqV2数据集测量在特定适应症中靶标肽的RNA表达水平。举例来说，可计算归一化的RNA表达读数大于0的TCGA样品的百分比。举例来说，在大多数样品中具有TCGA表达的靶标肽可被优先考虑。
术语“癌症相关蛋白”包括具有存在于多个类型的癌症中，存在于患有特定类型的癌症的多个受试者中，或与一个或多个类型的癌症的发生或进展相关的突变的蛋白质。举例来说，癌症相关蛋白可为致癌性(oncogenic)蛋白质(即具有可促进癌症进展的活性的蛋白质，诸如调控细胞生长的蛋白质)，或它可为肿瘤遏制蛋白(即通常起使癌形成潜力缓和的作用的蛋白质，诸如通过负性调控细胞周期或通过促进凋亡)。
术语“癌症相关蛋白”在异变肽的情形下是指其表达与一个或多个类型的癌症的发生或进展相关的蛋白质。任选地，所述蛋白质包括具有存在于多个类型的癌症中，存在于患有特定类型的癌症的多个受试者中，或与一个或多个类型的癌症的发生或进展相关的突变的蛋白质。举例来说，癌症相关蛋白可为致癌性蛋白质(即具有可促进癌症进展的活性的蛋白质，诸如调控细胞生长的蛋白质)，或它可为肿瘤遏制蛋白(即通常起使癌形成潜力缓和的作用的蛋白质，诸如通过负性调控细胞周期或通过促进凋亡)。优选地，异变肽所源于的癌症相关蛋白是在特定类型的癌症中表达，但通常不在健康成人组织中表达的蛋白质(即具有癌症特异性表达、癌症限制表达、肿瘤特异性表达、或肿瘤限制表达的蛋白质)。然而，癌症相关蛋白不必须具有癌症特异性表达、癌症限制表达、肿瘤特异性表达、或肿瘤限制表达。被视为癌症特异性蛋白质或癌症限制蛋白质的蛋白质的实例是癌症睾丸抗原或癌胚抗原。癌症睾丸抗原(CTA)是在不同组织学来源的人肿瘤中表达，但除男性生殖细胞之外不在正常组织中表达的一大家族的肿瘤相关抗原。在癌症中，这些发育抗原可被重新表达，并且可充当免疫活化的位置。癌胚抗原(OFA)是通常仅在胎儿发育期间存在，但见于患有某些种类的癌症的成人中的蛋白质。CTA和OFA的表达的肿瘤限制样式使得它们成为肿瘤特异性免疫疗法的理想靶标。大多数OFA/CTA蛋白在肿瘤发生方面起关键作用。
举例来说，癌症相关蛋白可为在本文中其他地方所列的癌症相关蛋白中的任一者。举例来说，癌症相关蛋白可由一个以下基因编码：CEACAM5、GAGE1、hTERT、KLHL7、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、NUF2、NYESO1、PAGE4、PRAME、PSA、PSMA、RNF43、SART3、SSX2、STEAP1和SURVIVIN。
Figure BDA0002571091800000211
每个异变免疫原性肽可以是癌症相关蛋白的包含异变突变的片段(即，来自癌症相关蛋白的连续氨基酸序列)。每个异变免疫原性肽可以具有足以诱导免疫应答的任何长度。例如，本文公开的异变免疫原性肽可以是5-100、15-50或21-27个氨基酸的长度，或者15-100、15-95、15-90、15-85、15-80、15-75、15-70、15-65、15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、20-100、20-95、20-90、20-85、20-80、20-75、20-70、20-65、20-60、20-55、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、11-21、15-21、21-31、31-41、41-51、51-61、61-71、71-81、81-91、91-101、101-121、121-141、141-161、161-181、181-201、8-27、10-30、10-40、15-30、15-40、15-25、1-10、10-20、20-30、30-40、1-100、5-75、5-50、5-40、5-30、5-20、5-15、5-10、1-75、1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-10、8-11或11-16个氨基酸的长度。例如，异变免疫原性肽可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的长度。例如，异变免疫原性肽可以是8-100、8-50、8-30、8-25、8-22、8-20、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、7-11或8-10个氨基酸的长度。在一个实例中，异变免疫原性肽的长度可以是9个氨基酸。
在一些情况下，异变免疫原性肽可以是亲水的，或者评分可以直至或低于可以预示在单核细胞增生性李斯特菌或其他目的细菌中的分泌性的某个亲水性阈值。例如，异变免疫原性肽可以通过Kyte和Doolittle亲水性指数21氨基酸窗来评分，并且高于截断值(约1.6)的所有评分都可被排除，因为它们不太可能被单核细胞增生性李斯特菌分泌。
异变免疫原性肽可以包含单个异变突变，或可以包含两个或多个异变突变(例如，两个异变突变)。示例性的异变突变体肽由下表中的异变肽序列组成，基本上由下表中的异变肽序列组成，或包含下表中的异变肽序列，这个表还提供了相应的野生型(天然)肽。野生型肽中的在相应的异变肽中进行了修饰的残基以粗体加下划线显示。
Figure BDA0002571091800000221
Figure BDA0002571091800000231
本文还公开了编码此类异变肽的核酸。核酸可以是任何形式。核酸可以包含DNA或RNA或者由DNA或RNA组成，并且可以是单链或双链。核酸可以是质粒的形式，例如游离质粒、多拷贝游离质粒或整合质粒。或者，核酸可以是病毒载体、噬菌体载体的形式或在细菌人工染色体中。此类核酸可以具有一个开放阅读框或可以具有两个或更多个开放阅读框。在一个实例中，所述核酸可包含两个或更多个由在各开放阅读框之间的Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的开放阅读框。举例来说，核酸可包含两个至四个由在各开放阅读框之间的Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的开放阅读框。各开放阅读框可编码不同肽。在一些核酸中，编码融合多肽的羧基末端的密码子继之以两个终止密码子以确保蛋白质合成的终止。
可对核酸进行密码子优化。如果核酸中的至少一个密码子被那个氨基酸的相比于原始序列中的密码子，由特定生物体更频繁使用的密码子置换(例如，密码子被优化以在人或单核细胞增多性李斯特菌中表达)，那么所述核酸是经密码子优化的。SEQ ID NO:223-977中提供了本文公开的编码异变肽的核酸的实例。
III.重组融合多肽
本文公开了重组融合多肽，其包含与本文他处公开的包含异变突变的一个或多个的肿瘤相关抗原肽融合的含PEST的肽(即，与癌症相关蛋白的一个或多个免疫原性片段融合，其中各片段包含异变突变)。
本文也公开了包含本文他处公开的包含异变突变的一个或多个的肿瘤相关抗原肽的重组融合多肽(即，与癌症相关蛋白的一个或多个免疫原性片段融合，其中各片段包含异变突变)，并且其中所述融合多肽不包含含PEST肽。
本文也提供从N末端至C末端包含细菌分泌序列、泛素(Ub)蛋白和一个或多个本文他处公开的包含异变突变的肿瘤相关抗原肽(即与癌症相关蛋白的一个或多个免疫原性片段融合，其中各片段包含异变突变)，即串联，诸如Ub-肽1-肽2。或者，可使用单独融合多肽的组合，其中各抗原性肽与它的自身分泌序列和Ub蛋白(例如Ub1-肽1；Ub2-肽2)融合。
也公开编码所述重组融合多肽的核酸(被称为小基因构建体)。所述小基因核酸构建体可进一步包含两个或更多个由在各开放阅读框之间的Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的开放阅读框。举例来说，小基因核酸构建体可进一步包含两个至四个由在各开放阅读框之间的Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的开放阅读框。各开放阅读框可编码不同多肽。在一些核酸构建体中，编码融合多肽的羧基末端的密码子继之以两个终止密码子以确保蛋白质合成的终止。
细菌信号序列可为李斯特菌属信号序列，诸如Hly或ActA信号序列，或任何其他已知信号序列。在其他情况下，信号序列可为LLO信号序列。示例性的LLO信号序列以SEQ IDNO:97示出。信号序列可为细菌性的，可为宿主细菌(例如单核细胞增多性李斯特菌，诸如secA1信号肽)所天然具有，或对于宿主细菌来说可为外来的。信号肽的特定实例包括来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Usp45信号肽、来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的保护性抗原信号肽、来自单核细胞增多性李斯特菌的secA2信号肽诸如p60信号肽、以及Tat信号肽诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Tat信号肽(例如PhoD)。在特定实例中，分泌信号序列来自李斯特菌属蛋白质，诸如ActA300分泌信号或ActA100分泌信号。示例性的ActA信号序列以SEQ ID NO:98示出。
泛素可为例如全长蛋白质。示例性的泛素序列以SEQ ID NO:188示出。由本文提供的核酸构建体表达的泛素可在进入宿主细胞胞质液后通过水解酶的作用来在羧基末端从由核酸构建体表达的重组融合多肽的其余部分裂解。这使融合多肽的氨基末端释放，从而在宿主细胞胞质液中产生肽。
融合多肽内的抗原性肽的选择、变化形式和排列在本文中其他地方详细讨论，并且包含异变突变的肿瘤相关抗原肽在本文中其他地方更详细讨论。
重组融合多肽可包含一个或多个标签。举例来说，重组融合多肽可在一个或多个抗原性肽的N末端和/或C末端包含一个或多个肽标签。标签可直接融合于抗原性肽或通过接头(其实例在本文中其他地方公开)来连接于抗原性肽。标签的实例包括以下：FLAG标签；2xFLAG标签；3xFLAG标签；His标签、6xHis标签；和SIINFEKL标签。一示例性SIINFEKL标签以SEQ ID NO:16示出(由以SEQ ID NO:1-15示出的核酸中的任一者编码)。一示例性3xFLAG标签以SEQ ID NO:32示出(由以SEQ ID NO:17-31示出的核酸中的任一者编码)。一示例性变体3xFLAG标签以SEQ ID NO:99示出。可一起使用两个或更多个标签，诸如2xFLAG标签和SIINFEKL标签、3xFLAG标签和SIINFEKL标签、或6xHis标签和SIINFEKL标签。如果使用两个或更多个标签，那么它们可在重组融合多肽内任何地方以及以任何顺序定位。举例来说，两个标签可在重组融合多肽的C末端，两个标签可在重组融合多肽的N末端，两个标签可位于重组融合多肽内内部，一个标签可在重组融合多肽的C末端，并且一个标签在N末端，一个标签可在C末端，并且一个标签在重组融合多肽内内部，或一个标签可在N末端，并且一个标签在重组融合多肽内内部。其他标签包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)和聚(NANP)。特定重组融合多肽包含C末端SIINFEKL标签。所述标签可允许容易检测重组融合蛋白，确认重组融合蛋白的分泌，或通过追踪对这些“标签”序列肽的免疫应答来追踪分泌融合多肽的免疫原性。所述免疫应答可使用许多试剂来监测，所述试剂包括例如对这些标签具有特异性的单克隆抗体和DNA或RNA探针。
本文公开的重组融合多肽可由重组李斯特菌属菌株表达，或可从用于蛋白质表达和分离的其他载体和细胞系统表达和分离。表达所述抗原性肽的重组李斯特菌属菌株可例如用于包含所述重组李斯特菌属的免疫原性组合物中以及包含重组李斯特菌属菌株和佐剂的疫苗中。一个或多个抗原性肽以与非溶血性截短形式的LLO、ActA或PEST样序列的融合多肽形式在采用李斯特菌属菌株的宿主细胞系统和除李斯特菌属以外的宿主细胞系统中的表达可导致抗原性肽的免疫原性增强。
本文也公开了编码所述重组融合多肽的核酸。核酸可呈任何形式。核酸可包括DNA或RNA或由DNA或RNA组成，并且可为单链或双链。核酸可呈质粒形式，诸如游离型质粒、多拷贝游离型质粒、或整合型质粒。或者，核酸可呈病毒载体、噬菌体载体形式，或呈细菌人工染色体形式。所述核酸可具有一个开放阅读框或可具有两个或更多个开放阅读框(例如编码重组融合多肽的开放阅读框和编码代谢酶的第二开放阅读框)。在一个实例中，所述核酸可包含两个或更多个由在各开放阅读框之间的Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的开放阅读框。举例来说，核酸可包含两个至四个由在各开放阅读框之间的Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的开放阅读框。各开放阅读框可编码不同多肽。在一些核酸中，编码融合多肽的羧基末端的密码子继之以两个终止密码子以确保蛋白质合成的终止。
A.抗原性肽
本文公开的重组融合多肽包含本文他处公开的一种或多种包含异变突变的肿瘤相关抗原性肽(即，癌症相关蛋白的免疫原性片段，其中各片段包含异变突变)。融合多肽可包括单个抗原性肽，或可包括两个或更多个抗原性肽。各抗原性肽可以具有足以诱导免疫应答的任何长度，并且各抗原性肽可以具有相同的长度，或者抗原性肽可以具有不同的长度。异变抗原性肽的合适长度的实例在本文其他地方公开。
各抗原性肽也可为亲水性的，或可评分直至或低于可预示在单核细胞增多性李斯特菌或另一目标细菌中的可分泌性的某一亲水性阈值。举例来说，抗原性肽可通过Kyte和Doolittle亲水性指数21氨基酸窗来评分，并且高于截断值(约1.6)的所有评分都可被排除，因为它们不可能可由单核细胞增多性李斯特菌分泌。同样地，抗原性肽或融合多肽的组合可为亲水性的，或可评分直至或低于可预示在单核细胞增多性李斯特菌或另一目标细菌中的可分泌性的某一亲水性阈值。
抗原性肽可以任何方式连接在一起。举例来说，抗原性肽可在无间插序列的情况下直接彼此融合。或者，抗原性肽可通过一个或多个接头诸如肽接头来间接彼此连接。在一些情况下，一些对邻近抗原性肽可直接彼此融合，并且其他对抗原性肽可通过一个或多个接头来间接彼此连接。相同接头可在各对邻近抗原性肽之间使用，或任何数目的不同接头可在不同对邻近抗原性肽之间使用。此外，一个接头可在一对邻近抗原性肽之间使用，或多个接头可在一对邻近抗原性肽之间使用。
任何适合序列都可用于肽接头。作为一实例，接头序列在长度方面可为例如1至约50个氨基酸。一些接头可为亲水性的。接头可满足不同目的。举例来说，接头可用于使细菌分泌增加，有助于抗原加工，使融合多肽的柔性增加，使融合多肽的刚性增加，或任何其他目的。作为一特定实例，可使用柔性接头、刚性接头和免疫蛋白酶体加工接头中的一者或多者或全部。以下提供所述接头的实例。在一些情况下，不同氨基酸接头序列分布在抗原性肽之间，或编码相同氨基酸接头序列的不同核酸分布在抗原性肽之间(例如SEQ ID NO:84-94)以使重复序列最少。这也可用于使二级结构简化，由此允许编码融合多肽的核酸(例如质粒)在Lm重组载体菌株群体内高效转录、翻译、分泌、维持或稳定。其他适合肽接头序列可例如基于一个或多个以下因素来选择：(1)它们能够采用柔性延伸构象；(2)它们不能采用可与抗原性肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可能与功能性表位反应的疏水性或带电荷残基。举例来说，肽接头序列可含有Gly、Asn和Ser残基。其他接近中性氨基酸诸如Thr和Ala也可用于接头序列中。可适用地用作接头的氨基酸序列包括Maratea等(1985)Gene 40:39-46；Murphy等(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83:8258-8262；US 4,935,233；和US 4,751,180中公开的那些，所述文献和专利各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。接头的特定实例包括下表中的那些(其各自可单独用作接头，用于包含序列的重复的接头中，用于进一步包含表中的一个或多个其他序列的接头中)，但也可设想其他接头(参见例如Reddy Chichili等(2013)Protein Science 22:153–167，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。除非指定，否则“n”代表所列接头中未确定的重复数目。
肽接头 实例 SEQ ID NO: 假定目的
(GAS)<sub>n</sub> GASGAS 33 柔性
(GSA)<sub>n</sub> GSAGSA 34 柔性
(G)<sub>n</sub>；n＝4-8 GGGG 35 柔性
(GGGGS)<sub>n</sub>；n＝1-3 GGGGS 36 柔性
VGKGGSGG VGKGGSGG 37 柔性
(PAPAP)<sub>n</sub> PAPAP 38 刚性
(EAAAK)<sub>n</sub>；n＝1-3 EAAAK 39 刚性
(AYL)<sub>n</sub> AYLAYL 40 抗原加工
(LRA)<sub>n</sub> LRALRA 41 抗原加工
(RLRA)<sub>n</sub> RLRA 42 抗原加工
AAY AAY N/A 免疫蛋白酶体加工
ADLVVG ADLVVG 209 免疫蛋白酶体加工
ADLIEATAEEVL ADLIEATAEEVL 210 免疫蛋白酶体加工
GDGSIVSLAKTA GDGSIVSLAKTA 211 免疫蛋白酶体加工
RDGSVADLAKVA RDGSVADLAKVA 212 免疫蛋白酶体加工
ADGSVKTLSKVL ADGSVKTLSKVL 213 免疫蛋白酶体加工
GDGSIVDGSKEL GDGSIVDGSKEL 214 免疫蛋白酶体加工
GDGSIKTAVKSL GDGSIKTAVKSL 215 免疫蛋白酶体加工
ADLSVATLAKSL ADLSVATLAKSL 216 免疫蛋白酶体加工
ADLAVKTLAKVL ADLAVKTLAKVL 217 免疫蛋白酶体加工
VGKGGSGG接头(SEQ ID NO:37)可用于例如提供柔性，并且使融合蛋白达成电荷平衡。EAAAK接头(SEQ ID NO:39)是可用于促进表达和分泌的刚性/不灵活接头，例如如果融合蛋白否则将自身折叠。GGGGS接头(SEQ ID NO:36)是可例如用于将增加的柔性添加至融合蛋白中以有助于促进表达和分泌的柔性接头。正如本文设计并公开的异变9聚体，“i20”接头(例如SEQ ID NO:209-217)是例如被设计来有助于促进融合蛋白被免疫蛋白酶体裂解，并且使获得所需精确最小结合片段的频率增加的免疫蛋白酶体接头。GGGGS接头和EAAAK接头(分别是SEQ ID NO:36和39)的组合可例如用于使柔性和刚性交替以有助于使构建体平衡以达成表达和分泌改进，并且有助于通过提供更独特密码子进行选择来促进DNA合成。
融合多肽可包含任何数目的异变抗原性肽。在一些情况下，融合多肽包含任何数目的异变抗原性肽，以致融合多肽能够从重组李斯特菌属菌株产生和分泌。举例来说，融合多肽可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个异变抗原性肽，或2-50、2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、或45-50个异变抗原性多肽。在另一实例中，融合多肽可包括单一异变抗原性肽。在另一实例中，融合多肽可包括在约1-100、1-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40,40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、5-15、5-20、5-25、15-20、15-25、15-30、15-35、20-25、20-35、20-45、30-45、30-55,40-55、40-65、50-65、50-75、60-75、60-85、70-85、70-95、80-95、80-105、95-105、50-100、1-100、5-100、5-75、5-50、5-40、5-30、5-20、5-15、5-10、1-100、1-75、1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、或1-10个异变抗原性肽的范围内的异变抗原性肽数。在另一实例中，融合多肽可包括多达约100、10、20、30、40或50个异变抗原性肽。在另一实例中，融合多肽可包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个异变抗原性肽。
此外，融合多肽可包含任何数目的来自同一癌症相关蛋白的异变抗原性肽(即任何数目的来自同一癌症相关蛋白的非连续片段)。或者，融合多肽可包含任何数目的来自两个或更多个不同癌症相关蛋白，诸如来自2、3、4、5、6、7、8、9或10个癌症相关蛋白的异变抗原性肽。举例来说，融合多肽可包含来自至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个癌症相关蛋白，或2-5、5-10、10-15或15-20个癌症相关蛋白的异变突变。举例来说，两个或更多个癌症相关蛋白可以是约2-30，约2-25，约2-20，约2-15或约2-10个癌症相关蛋白。举例来说，融合多肽可包含至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个来自同一癌症相关蛋白的异变抗原性肽，或2-50,2-45,2-40,2-35,2-30,2-25,2-20,2-15,2-10,2-5,5-10,10-15,15-20,20-25,25-30,30-35,35-40,40-45或45-50个来自同一癌症相关蛋白的异变抗原性多肽。同样，融合多肽可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个来自同一癌症相关蛋白的异变抗原性肽，或2-50、2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、或45-50个来自两个或更多个不同癌症相关蛋白的异变抗原性多肽。此外，融合多肽可包含任何数目的来自同一癌症相关蛋白的非连续异变抗原性肽(即任何数目的来自同一癌症相关蛋白的非连续片段)。举例来说，融合多肽可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个来自同一癌症相关蛋白的非连续异变抗原性肽，或2-50、2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、或45-50个来自同一癌症相关蛋白的非连续异变抗原性多肽。在一些情况下，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的异变抗原性肽是来自同一癌症相关蛋白的非连续异变抗原性肽，或至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的来自单一癌症相关蛋白的异变抗原性肽是来自那个癌症相关蛋白的非连续异变抗原性肽。
各异变抗原性肽可包含不同(即独特)异变突变。或者，融合多肽中的两个或更多个异变抗原性肽可包含相同异变突变。举例来说，同一异变抗原性多肽的两个或更多个拷贝可被包括在融合多肽中(即融合多肽包含同一异变抗原性肽的两个或更多个拷贝)。在一些融合多肽中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的异变抗原性肽包含不存在于任何其他异变抗原性肽中的不同(即独特)异变突变。
在一些情况下，至少两个异变抗原性肽可包含同一癌症相关蛋白的重叠片段。举例来说，两个或更多个异变抗原性肽可在癌症相关蛋白的同一氨基酸残基处包含不同异变突变。
一些异变抗原性肽可包含至少两个不同异变突变、至少三个不同异变突变、或至少四个不同异变突变。
异变突变的任何组合都可被包括在融合多肽中。举例来说，可包括结合一个或多个不同HLA类型的异变抗原性肽。举例来说，可鉴定结合一个或多个或全部以下HLA类型的异变抗原性肽：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
融合多肽中的各异变抗原性肽可包含来自同一癌症相关蛋白的异变突变，或融合多肽中的异变抗原性肽的组合可包含来自两个或更多个癌症相关蛋白的异变突变。举例来说，融合多肽可包含来自至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个癌症相关蛋白或2-5、5-10、10-15、或15-20个癌症相关蛋白的异变突变。举例来说，两个或更多个癌症相关蛋白可为约2-30、约2-25、约2-20、约2-15、或约2-10个癌症相关蛋白。在一个实例中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的异变抗原性肽包含来自同一癌症相关蛋白的异变突变。在另一实例中，异变抗原性肽都不包含来自同一癌症相关蛋白的异变突变。
异变抗原性肽的示例性序列在本文中其他地方公开。作为一实例，异变抗原性肽可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与任何本文公开的抗原性肽序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列。
作为一个实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、MAGEA6、MAGEA4、GAGE1、NYESO1、STEAP1和RNF43。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如非小细胞肺癌(NSCLC)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表3中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、或全部11个异变抗原性肽，或包括包含例如表3中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、或全部11个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、MAGEA4、STEAP1、RNF43、SSX2、SART3、PAGE4、PSMA和PSA。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如前列腺癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表5中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表5中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、STEAP1、MAGEA3、PRAME、hTERT和SURVIVIN。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如胰腺癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表7中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个或全部12个异变抗原性肽，或包括包含例如表7中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个或全部12个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、GAGE1、NYESO1、RNF43、NUF2、KLHL7、MAGEA3和PRAME。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如膀胱癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表9中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表9中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个或全部13个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、STEAP1、RNF43、MAGEA3、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表11中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或全部11个异变抗原性肽，或包括包含例如表11中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或全部11个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、PRAME、hTERT、STEAP1、RNF43、NUF2、KLHL7和SART3。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如子宫癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表13中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表13中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个或全部14个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、STEAP1、RNF43、SART3、NUF2、KLHL7、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如卵巢癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表15中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表15中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、MAGEA6、STEAP1、RNF43、SART3、NUF2、KLHL7和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如低级神经胶质瘤相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表17中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表17中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、MAGEA6、MAGEA4、GAGE1、NYESO1、STEAP1、RNF43,和MAGEA3。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如结肠直肠癌(例如，MSS结肠直肠癌)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表19中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表19中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，重组融合多肽可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码的异变肽：CEACAM5、MAGEA4、STEAP1、NYESO1、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如头颈癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表21中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表21中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
B.含PEST肽
本文公开的重组融合蛋白包含含PEST肽。含PEST肽可在融合多肽的氨基末端(N末端)(即在抗原性肽的N末端)，可在融合多肽的羧基末端(C末端)(即在抗原性肽的C末端)，或可包埋在抗原性肽内。在一些重组李斯特菌属菌株和方法中，含PEST肽不是融合多肽的一部分，并且与融合多肽分开。抗原性肽与PEST样序列诸如LLO肽的融合可使抗原性肽的免疫原性增强，并且可使细胞介导且抗肿瘤的免疫应答增加(即，使细胞介导且抗肿瘤的免疫性增加)。参见例如Singh等(2005)J Immunol 175(6):3663-3673，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
含PEST肽是包含PEST序列或PEST样序列的肽。真核蛋白中的PEST序列已在很久之前得以鉴定。举例来说，含有富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)(PEST)的氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列通常但不始终由含有若干带正电荷氨基酸的聚簇侧接，具有快速细胞内半衰期(Rogers等(1986)Science 234:364-369，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。此外，已报道这些序列使蛋白质靶向泛素-蛋白体路径以达成降解(Rechsteiner和Rogers(1996)Trends Biochem.Sci.21:267-271，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。这个路径也由真核细胞用于产生结合I类MHC的免疫原性肽，并且已假设PEST序列在产生免疫原性肽的真核蛋白之中是丰富的(Realini等(1994)FEBSLett.348:109-113，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。原核蛋白通常不含有PEST序列，因为它们不具有这个酶促路径。然而，已报道在LLO的氨基末端的富含氨基酸脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的PEST样序列，并且已报道所述PEST样序列为单核细胞增多性李斯特菌病原性所必需(Decatur和Portnoy(2000)Science 290:992-995，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。这个PEST样序列在LLO中的存在使蛋白质靶向由宿主细胞的蛋白水解机构达成的破坏，以致一旦LLO已发挥它的功能以及促进单核细胞增多性李斯特菌逃脱吞噬体泡或吞噬溶酶体泡，它即在它可损害细胞之前被破坏。
对PEST和PEST样序列的鉴定在本领域中是熟知的，并且例如描述于Rogers等(1986)Science 234(4774):364-378中以及Rechsteiner和Rogers(1996)TrendsBiochem.Sci.21:267-271中，所述文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。PEST或PEST样序列可使用PEST-find程序来鉴定。举例来说，PEST样序列可为富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的区域。任选地，PEST样序列可由一个或多个含有若干带正电荷氨基酸的聚簇侧接。举例来说，可将PEST样序列定义为长度是至少12个氨基酸，具有高局部浓度的脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和/或苏氨酸(T)残基的亲水性链段。在一些情况下，PEST样序列不含有带正电荷氨基酸，即精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)。一些PEST样序列可含有一个或多个内部磷酸化位点，并且在这些位点处的磷酸化先于蛋白质降解。
在一个实例中，PEST样序列符合Rogers等人公开的算法。在另一实例中，PEST样序列符合Rechsteiner和Rogers公开的算法。PEST样序列也可通过初始扫描指定蛋白质序列内的带正电荷氨基酸R、H和K来鉴定。在带正电荷侧接物之间的所有氨基酸都加以计数，并且只有含有等于或高于窗口尺寸参数的氨基酸数目的那些基序被进一步考虑。任选地，PEST样序列必须含有至少一个P、至少一个D或E、以及至少一个S或T。
PEST基序的品质可借助于基于局部关键氨基酸富集以及基序疏水性的评分参数加以改进。D、E、P、S和T的富集用质量百分比(w/w)表示，并且关于一当量的D或E、一当量的P、以及一当量的S或T加以修正。疏水性的计算也可在原则上遵循Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157:105的方法，所述文献出于所有目的以引用的方式整体并入本文。对于简化计算，使用产生从对于精氨酸是0至对于异亮氨酸是90的数值的以下线性变换将原先在对于精氨酸是-4.5至对于异亮氨酸是+4.5的范围内的Kyte-Doolittle亲水性指数换算成正整数：亲水性指数＝10*Kyte-Doolittle亲水性指数+45。
潜在PEST基序的疏水性也可计算为各氨基酸种类的摩尔百分比和疏水性指数的乘积的总和。所需PEST评分以局部富集项和疏水性项的组合形式获得，如由以下等式所表示：PEST评分＝0.55*DEPST-0.5*疏水性指数。
因此，含PEST肽可指使用以上算法，具有至少+5的评分的肽。或者，它可指具有至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少32、至少35、至少38、至少40或至少45的评分的肽。
本领域中已知的任何其他可用方法或算法都也可用于鉴定PEST样序列。参见例如CaSPredictor(Garay-Malpartida等(2005)Bioinformatics 21增刊1:i169-76，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。可使用的另一方法是以下方法：通过对氨基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln指定数值1来计算具有适当长度的各链段(例如30-35个氨基酸的链段)的PEST指数。各PEST残基的系数值(CV)是1，并且各其他AA(非PEST)的CV是0。
PEST样氨基酸序列的实例是以SEQ ID NO:43-51示出的那些。PEST样序列的一个实例是KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:43)。PEST样序列的另一实例是KENSISSMAPPASPPASPK(SEQ ID NO:44)。然而，可使用任何PEST或PEST样氨基酸序列。PEST序列肽是已知的，并且例如描述于US 7,635,479；US 7,665,238；和US 2014/0186387中，所述专利各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
PEST样序列可来自李斯特菌属属物种，诸如来自单核细胞增多性李斯特菌。举例来说，单核细胞增多性李斯特菌ActA蛋白含有至少四个所述序列(SEQ ID NO:45-48)，其中任一者都适于在本文公开的组合物和方法中使用。其他类似PEST样序列包括SEQ ID NO:52-54。来自链球菌属某种(Streptococcus sp.)的链球菌溶素O(Streptolysin O)蛋白也含有PEST序列。举例来说，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)链球菌溶素O在氨基酸35-51处包含PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:49)，并且类马链球菌(Streptococcus equisimilis)链球菌溶素O在氨基酸38-54处包含PEST样序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:50)。PEST样序列的另一实例来自由lso基因编码的西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)细胞溶素(cytolysin)：RSEVTISPAETPESPPATP(例如SEQ IDNO:51)。
或者，PEST样序列可源于其他原核生物体。将被预期在其中存在PEST样氨基酸序列的其他原核生物体包括例如其他李斯特菌属物种。
(1)李斯特菌溶素O(LLO)
可用于本文公开的组合物和方法中的含PEST肽的一个实例是李斯特菌溶素O(LLO)肽。LLO蛋白的一实例是被指定GenBank登录号P13128的蛋白质(SEQ ID NO:55；核酸序列以GenBank登录号X15127示出)。SEQ ID NO:55是包括信号序列的原蛋白(proprotein)。原蛋白的前25个氨基酸是信号序列，并且在LLO由细菌分泌时从LLO裂解，由此产生具有504个氨基酸的无信号序列全长活性LLO蛋白。本文公开的LLO肽可包含信号序列，或可包括不包括信号序列的肽。可使用的示例性LLO蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：以SEQ ID NO:55示出的序列或SEQ ID NO:55的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、以及亚型的片段。可使用编码LLO蛋白的片段或LLO蛋白的同源物、变体、亚型、类似物、同源物的片段、变体的片段、或类似物的片段的任何序列。同源性LLO蛋白可与参照LLO蛋白具有例如大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
LLO蛋白的另一实例以SEQ ID NO:56示出。可使用的LLO蛋白可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：以SEQ ID NO:56示出的序列或SEQ ID NO:56的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、以及亚型的片段。
LLO蛋白的另一实例是来自单核细胞增多性李斯特菌10403S菌株的LLO蛋白，如以GenBank登录号：ZP_01942330或EBA21833所示出，或如由如以GenBank登录号：NZ_AARZ01000015或AARZ01000015.1示出的核酸序列所编码。LLO蛋白的另一实例是来自单核细胞增多性李斯特菌4b F2365菌株(参见例如GenBank登录号：YP_012823)、EGD-e菌株(参见例如GenBank登录号：NP_463733)或单核细胞增多性李斯特菌的任何其他菌株的LLO蛋白。LLO蛋白的另一实例是来自黄杆菌目(Flavobacteriales)细菌HTCC2170的LLO蛋白(参见例如GenBank登录号：ZP_01106747或EAR01433，或由GenBank登录号：NZ_AAOC01000003编码)。可使用的LLO蛋白可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：任何以上LLO蛋白或以上LLO蛋白的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、以及亚型的片段。
也可使用与LLO或其同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、以及亚型的片段同源的蛋白质。一个所述实例是可例如见于蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)中的蜂房杆菌溶素(alveolysin)(参见例如GenBank登录号：P23564或AAA22224，或由GenBank登录号：M62709编码)。其他所述同源性蛋白质是已知的。
LLO肽可为全长LLO蛋白或截短LLO蛋白或LLO片段。同样，LLO肽可为保留天然LLO蛋白的一种或多种功能性，或缺乏天然LLO蛋白的一种或多种功能性的LLO肽。举例来说，保留的LLO功能性可为允许细菌(例如李斯特菌属)逃脱吞噬体或吞噬溶酶体，或增强它与其融合的肽的免疫原性。保留的功能性也可为溶血性功能或抗原性功能。或者，LLO肽可为非溶血性LLO。LLO的其他功能是已知的，用于评估LLO功能性的方法和测定也是已知的。
LLO片段可为PEST样序列或可包含PEST样序列。LLO片段可包含内部缺失、从C末端截短和从N末端截短中的一者或多者。在一些情况下，LLO片段可包含超过一个内部缺失。其他LLO肽可为具有一个或多个突变的全长LLO蛋白。
一些LLO蛋白或片段相对于野生型LLO具有降低的溶血活性，或是非溶血性片段。举例来说，可通过在羧基末端使活化结构域缺失或突变，通过使半胱氨酸484缺失或突变，或通过在另一位置处进行缺失或突变来致使LLO蛋白是非溶血性的。
如出于所有目的以引用的方式整体并入本文的US 8,771,702中所详述，通过使胆固醇结合结构域(CBD)缺失或突变来致使其他LLO蛋白是非溶血性的。突变可包括例如取代或缺失。可使整个CBD突变，可使CBD的各部分突变，或可使CBD内的特定残基突变。举例来说，LLO蛋白可包含SEQ ID NO:55的残基C484、W491和W492中的一者或多者(例如C484、W491、W492、C484和W491、C484和W492、W491和W492、或全部三个残基)或在与SEQ ID NO:55最优比对时的相应残基(例如相应半胱氨酸或色氨酸残基)的突变。作为一实例，可产生突变LLO蛋白，其中LLO的残基C484、W491和W492被相对于野生型LLO将使溶血活性实质上降低的丙氨酸残基取代。具有C484A、W491A和W492A突变的突变LLO蛋白被称为“mutLLO”。
作为另一实例，可产生具有包含胆固醇结合结构域的内部缺失的突变LLO蛋白。SEQ ID NO:55的胆固醇结合结构域的序列以SEQ ID NO:74示出。举例来说，内部缺失可为1-11氨基酸缺失、11-50氨基酸缺失、或更长缺失。同样，突变区域可为1-11个氨基酸、11-50个氨基酸，或更长(例如1-50、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、12-50、11-15、11-20、11-25、11-30、11-35、11-40、11-50、11-60、11-70、11-80、11-90、11-100、11-150、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-50、15-60、15-70、15-80、15-90、15-100、15-150、20-25、20-30、20-35、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-150、30-35、30-40、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、或30-150个氨基酸)。举例来说，由SEQ ID NO:55的残基470-500、470-510、或480-500组成的突变区域将导致缺失序列包含CBD(SEQ ID NO:55的残基483-493)。然而，突变区域也可为CBD的片段，或可与CBD的一部分重叠。举例来说，突变区域可由SEQ ID NO:55的残基470-490、480-488、485-490、486-488、490-500、或486-510组成。举例来说，CBD的片段(残基484-492)可被相对于野生型LLO将使溶血活性实质上降低的异源性序列置换。举例来说，CBD(ECTGLAWEWWR；SEQ ID NO:74)可被来自抗原NY-ESO-1的CTL表位(ESLLMWITQCR；SEQ ID NO:75)置换，所述CTL表位含有来自NY-ESO-1的HLA-A2限制表位157-165。所得LLO被称为“ctLLO”。
在一些突变LLO蛋白中，突变区域可被异源性序列置换。举例来说，突变区域可被相等数目的异源性氨基酸、较小数目的异源性氨基酸、或较大数目的氨基酸(例如1-50、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、12-50、11-15、11-20、11-25、11-30、11-35、11-40、11-50、11-60、11-70、11-80、11-90、11-100、11-150、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-50、15-60、15-70、15-80、15-90、15-100、15-150、20-25、20-30、20-35、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-150、30-35、30-40、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、或30-150个氨基酸)置换。其他突变LLO蛋白具有一个或多个点突变(例如1个残基、2个残基、3个残基或更多个残基的点突变)。突变残基可为连续的或不连续的。
在一个实例实施方案中，LLO肽可具有信号序列中的缺失以及CBD中的突变或取代。
一些LLO肽是N末端LLO片段(即具有C末端缺失的LLO蛋白)。一些LLO肽的长度是至少494、489、492、493、500、505、510、515、520或525个氨基酸，或者长度是492-528个氨基酸。举例来说，LLO片段可由LLO蛋白的大约前440或441个氨基酸(例如SEQ ID NO:55或56的前441个氨基酸，或另一LLO蛋白在与SEQ ID NO:55或56最优比对时的相应片段)组成。其他N末端LLO片段可由LLO蛋白的前420个氨基酸(例如SEQ ID NO:55或56的前420个氨基酸，或另一LLO蛋白在与SEQ ID NO:55或56最优比对时的相应片段)组成。其他N末端片段可由LLO蛋白的大约氨基酸20-442(例如SEQ ID NO:55或56的氨基酸20-442，或另一LLO蛋白在与SEQ ID NO:55或56最优比对时的相应片段)组成。其他N末端LLO片段包含任何ΔLLO而不具有包含半胱氨酸484的活化结构域，并且特别是不具有半胱氨酸484。举例来说，N末端LLO片段可对应于LLO蛋白的前425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、50或25个氨基酸(例如SEQ ID NO:55或56的前425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、50或25个氨基酸，或另一LLO蛋白在与SEQ ID NO:55或56最优比对时的相应片段)。优选地，片段包含一个或多个PEST样序列。LLO片段和截短LLO蛋白可含有同源性LLO蛋白的对应于任一以上特定氨基酸范围的残基。残基数目无需与以上列举的残基数目精确对应(例如如果同源性LLO蛋白相对于本文公开的特定LLO蛋白具有插入或缺失)。N末端LLO片段的实例包括SEQ ID NO:57、58和59。可使用的LLO蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:57、58或59的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、以及亚型的片段。在一些组合物和方法中，使用以SEQ ID NO:59示出的N末端LLO片段。编码以SEQ ID NO:59示出的N末端LLO片段的核酸的一实例是SEQ ID NO:60。
(2)ActA
可用于本文公开的组合物和方法中的含PEST肽的另一实例是ActA肽。ActA是表面相关蛋白，并且在受感染宿主细胞中充当骨架来促进宿主肌动蛋白聚合物的聚合、装配和活化以推动单核细胞增多性李斯特菌穿过细胞质。在进入哺乳动物细胞胞质液中之后不久，单核细胞增多性李斯特菌诱导宿主肌动蛋白微丝的聚合，并且使用由肌动蛋白聚合产生的力进行移动，首先在细胞内移动，接着从细胞至细胞进行移动。ActA负责介导肌动蛋白核化和基于肌动蛋白的运动。ActA蛋白提供宿主细胞骨架组分的多个结合位点，由此充当骨架以装配细胞肌动蛋白聚合机构。ActA的N末端结合单体肌动蛋白，并且通过刺激固有肌动蛋白核化活性来充当组成型活性核化促进因子。actA基因与hly基因均是由转录活化子PrfA调控的10kb基因簇的成员，并且在哺乳动物胞质液中actA被上调至约226倍。可使用编码ActA蛋白或ActA蛋白的同源物、变体、亚型、类似物、同源物的片段、变体的片段、或类似物的片段的任何序列。同源性ActA蛋白可与参照ActA蛋白具有例如大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
ActA蛋白的一个实例包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：以SEQ ID NO:61示出的序列。ActA蛋白的另一实例包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：以SEQ IDNO:62示出的序列。对应于这些序列中的任一者的原蛋白的前29个氨基酸是信号序列，并且在ActA蛋白由细菌分泌时从ActA蛋白裂解。ActA肽可包含信号序列(例如SEQ ID NO:61或62的氨基酸1-29)，或可包括不包括信号序列的肽。ActA蛋白的其他实例包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:61或62的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、亚型的片段、或类似物的片段。
ActA蛋白的另一实例是来自单核细胞增多性李斯特菌10403S菌株(GenBank登录号：DQ054585)、NICPBP 54002菌株(GenBank登录号：EU394959)、S3菌株(GenBank登录号：EU394960)、NCTC 5348菌株(GenBank登录号：EU394961)、NICPBP 54006菌株(GenBank登录号：EU394962)、M7菌株(GenBank登录号：EU394963)、S19菌株(GenBank登录号：EU394964)、或单核细胞增多性李斯特菌的任何其他菌株的ActA蛋白。可使用的LLO蛋白可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：任何以上LLO蛋白或以上LLO蛋白的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、以及亚型的片段。
ActA肽可为全长ActA蛋白或截短ActA蛋白或ActA片段(例如其中C末端部分被移除的N末端ActA片段)。优选地，截短ActA蛋白包含至少一个PEST序列(例如超过一个PEST序列)。此外，截短ActA蛋白可任选包含ActA信号肽。截短ActA蛋白中含有的PEST样序列的实例包括SEQ ID NO:45-48。一些所述截短ActA蛋白包含至少两个以SEQ ID NO:45-48示出的PEST样序列或其同源物、至少三个以SEQ ID NO:45-48示出的PEST样序列或其同源物、或全部四个以SEQ ID NO:45-48示出的PEST样序列或其同源物。截短ActA蛋白的实例包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的那些：全长ActA蛋白序列(例如SEQ ID NO:62)的大约残基30-122、大约残基30-229、大约残基30-332、大约残基30-200、或大约残基30-399。截短ActA蛋白的其他实例包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的那些：全长ActA蛋白序列(例如SEQ ID NO:62)的大约前50、100、150、200、233、250、300、390、400或418个残基。截短ActA蛋白的其他实例包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的那些：全长ActA蛋白序列(例如SEQ ID NO:62)的大约残基200-300或残基300-400。举例来说，截短ActA由如US 7,655,238中所述的野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，所述专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。作为另一实例，截短ActA可为ActA-N100或其经修饰形式(被称为ActA-N100*)，其中PEST基序已被缺失，并且含有非保守性QDNKR(SEQ ID NO:73)取代，如出于所有目的以引用的方式整体并入本文的US 2014/0186387中所述。或者，截短ActA蛋白可含有同源性ActA蛋白的对应于一个以上氨基酸范围或任何本文公开的ActA肽的氨基酸范围的残基。残基数目无需与本文列举的残基数目精确对应(例如如果同源性ActA蛋白相对于本文利用的ActA蛋白具有插入或缺失，那么残基数目可相应地加以调整)。
截短ActA蛋白的实例包括例如包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的蛋白质：以SEQ ID NO:63、64、65或66示出的序列或SEQ ID NO:63、64、65或66的同源物、变体、亚型、类似物、变体的片段、亚型的片段、或类似物的片段。SEQ ID NO:63被称为ActA/PEST1，并且由以SEQ ID NO:62示出的全长ActA序列的氨基酸30-122组成。SEQ ID NO:64被称为ActA/PEST2或LA229，并且由以SEQ ID NO:62示出的全长ActA序列的氨基酸30-229组成。SEQ ID NO:65被称为ActA/PEST3，并且由以SEQ ID NO:62示出的全长ActA序列的氨基酸30-332组成。SEQ ID NO:66被称为ActA/PEST4，并且由以SEQ ID NO:62示出的全长ActA序列的氨基酸30-399组成。作为一特定实例，可使用由以SEQ ID NO:64示出的序列组成的截短ActA蛋白。
截短ActA蛋白的实例包括例如包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的蛋白质：以SEQ ID NO:67、69、70或72示出的序列或SEQ ID NO:67、69、70或72的同源物、变体、亚型、类似物、变体的片段、亚型的片段、或类似物的片段。作为一特定实例，可使用由以SEQID NO:67示出的序列组成的截短ActA蛋白(由以SEQ ID NO:68示出的核酸编码)。作为另一特定实例，可使用由以SEQ ID NO:70示出的序列组成的截短ActA蛋白(由以SEQ ID NO:71示出的核酸编码)。SEQ ID NO:71是编码单核细胞增多性李斯特菌10403S菌株中ActA的前1170个核苷酸。在一些情况下，ActA片段可融合于异源性信号肽。举例来说，SEQ ID NO:72示出融合于Hly信号肽的ActA片段。
C.产生编码重组融合多肽的免疫疗法构建体
本文也提供用于产生编码本文公开的重组融合多肽的免疫疗法构建体或包含本文公开的重组融合多肽的组合物的方法。举例来说，所述方法可包括选择和设计抗原性肽来包含在免疫疗法构建体中(以及例如测试各抗原性肽的亲水性，并且如果抗原性肽的评分高于所选亲水性指数阈值，那么对它进行修饰或将它取消选择)，设计一种或多种包含所选抗原性肽中的每一者的融合多肽，以及产生编码融合多肽的核酸构建体。
可关于疏水性或亲水性来筛选抗原性肽。举例来说，如果抗原性肽是亲水性的或如果抗原性肽的评分直至或低于可预示在特定目标细菌(例如单核细胞增多性李斯特菌)中的可分泌性的某一亲水性阈值，那么可选择它们。举例来说，抗原性肽可通过具有21氨基酸窗的Kyte和Doolittle亲水性指数来评分，并且将高于截断值(约1.6)的所有评分都排除，因为它们不可能可由单核细胞增多性李斯特菌分泌。参见例如Kyte-Doolittle(1982)JMol Biol 157(1):105–132；其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。或者，可改变抗原性肽关于所选截断值进行的评分(例如改变抗原性肽的长度)。可使用的其他滑动窗大小包括例如9、11、13、15、17、19、21、23、25、27个或更多个氨基酸。举例来说，滑动窗大小可为9-11个氨基酸、11-13个氨基酸、13-15个氨基酸、15-17个氨基酸、17-19个氨基酸、19-21个氨基酸、21-23个氨基酸、23-25个氨基酸、或25-27个氨基酸。可使用的其他截断值包括例如以下范围1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2.0、2.0-2.2、2.2-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、或4.0-4.5，或截断值可为1.4、1.5、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.3、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5。截断值可例如视用于递送融合多肽的细菌的属或种而变化。
其他适合亲水性图或其他适当尺度包括例如Rose等(1993)Annu Rev BiomolStruct22:381–415；Biswas等(2003)Journal of Chromatography A 1000:637–655；Eisenberg(1984)Ann Rev Biochem 53:595–623；Abraham和Leo(1987)Proteins:Structure,Function and Genetics 2:130-152；Sweet和Eisenberg(1983)Mol Biol 171:479-488；Bull和Breese(1974)Arch Biochem Biophys 161:665-670；Guy(1985)Biophys J47:61-70；Miyazawa等(1985)Macromolecules 18:534-552；Roseman(1988)J Mol Biol200:513-522；Wolfenden等(1981)Biochemistry 20:849-855；Wilson(1981)Biochem J199:31-41；Cowan和Whittaker(1990)Peptide Research 3:75-80；Aboderin(1971)Int JBiochem 2:537-544；Eisenberg等(1984)J Mol Biol 179:125-142；Hopp和Woods(1981)Proc Natl Acad Sci USA 78:3824-3828；Manavalan和Ponnuswamy(1978)Nature 275:673-674；Black和Mould(1991)Anal Biochem 193:72-82；Fauchere和Pliska(1983)Eur JMed Chem 18:369-375；Janin(1979)Nature 277:491-492；Rao和Argos(1986)BiochimBiophys Acta 869:197-214；Tanford(1962)Am Chem Soc84:4240-4274；Welling等(1985)FEBS Lett 188:215-218；Parker等(1986)Biochemistry25:5425-5431；以及Cowan和Whittaker(1990)Peptide Research 3:75-80中报道的那些，所述文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
任选地，可对抗原性肽关于它们结合受试者人白细胞抗原(HLA)类型的能力加以评分(例如通过使用可在www.iedb.org处获得的免疫表位数据库(Immune EpitopeDatabase，IED)，其包括netMHCpan、ANN、SMMPMBEC、SMM、CombLib_Sidney2008、PickPocket和netMHCcons)，并且根据各抗原性肽的最佳MHC结合评分加以分级。其他资源包括TEpredict(tepredict.sourceforge.net/help.html)或其他可用MHC结合测量尺度。对于不同表达载体诸如沙门氏菌属(Salmonella)，截断值可为不同的。
任选地，可对抗原性肽关于免疫遏制性表位(例如T-reg表位、IL-10诱导性T辅助细胞表位等)加以筛选以将抗原性肽取消选择或以避免免疫遏制性影响。
任选地，关于表位的免疫原性的预测算法可用于筛选抗原性肽。然而，这些算法在预测哪个肽将产生T细胞应答方面是不大于20％准确的。或者，不使用筛选/预测算法。或者，抗原性肽可关于免疫原性加以筛选。举例来说，这可包括使一种或多种T细胞与抗原性肽接触，以及分析免疫原性T细胞应答，其中免疫原性T细胞应答将所述肽鉴定为免疫原性肽。这也可包括在使一种或多种T细胞与肽接触后使用免疫原性测定来测量CD25、CD44或CD69中的至少一者的分泌，或测量选自包含IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-2的组的细胞因子的分泌，其中分泌增加将所述肽鉴定为包含一个或多个T细胞表位。
所选抗原性肽可被排列成一个或多个用于潜在融合多肽的候选顺序。如果相比于可装入单一质粒中的抗原性肽，有更多可用的抗原性肽，那么不同抗原性肽可根据需要/需求被指定优先等级和/或拆分至不同融合多肽中(例如以包括在不同重组李斯特菌属菌株中)。优先等级可通过诸如相对大小、转录优先级和/或所翻译多肽的总体疏水性的因素来确定。抗原性肽可被排列以致它们在任何数目的抗原性肽对之间无如在本文中其他地方更详细公开的接头或接头的任何组合的情况下直接连结在一起。待包括的线性抗原性肽的数目可基于以下考虑事项加以确定：所需构建体的数目相对于突变负荷、多个表位从单一质粒的翻译和分泌的效率、为包含质粒的各细菌或Lm所需的MOI。
抗原性肽的组合或整个融合多肽(即包含抗原性肽和含PEST肽以及任何标签)也可关于疏水性加以评分。举例来说，融合抗原性肽的整体或整个融合多肽可通过具有滑动21氨基酸窗的Kyte和Doolittle亲水性指数来关于亲水性加以评分。如果任何区域的评分高于截断值(例如约1.6)，那么可将抗原性肽在融合多肽内重新排序或改组直至得到抗原性肽的可接受顺序(即其中没有区域的评分高于截断值的顺序)。或者，任何有问题的抗原性肽都可被移除或重新设计以具有不同大小。或者或另外，一个或多个如在本文中其他地方公开的在抗原性肽之间的接头可被添加或修饰以改变疏水性。如同用于个别抗原性肽的亲水性测试一样，可使用其他窗口大小，或可使用其他截断值(例如视用于递送融合多肽的细菌的属或种而定)。此外，可使用其他适合亲水性图或其他适当尺度。
任选地，抗原性肽的组合或整个融合多肽可关于免疫遏制性表位(例如T-reg表位、IL-10诱导性T辅助细胞表位等)加以进一步筛选以将抗原性肽取消选择或以避免免疫遏制性影响。
可接着设计和优化编码候选抗原性肽组合或融合多肽的核酸。举例来说，序列可针对增加的翻译水平、表达持续时间、分泌水平、转录水平及其任何组合加以优化。举例来说，相对于对照非优化序列，可增加至2倍至1000倍、2倍至500倍、2倍至100倍、2倍至50倍、2倍至20倍、2倍至10倍、或3倍至5倍。
举例来说，融合多肽或编码融合多肽的核酸可针对可能在寡核苷酸序列中形成的二级结构的水平降低加以优化，或替代地，优化以防止可对序列进行修饰的任何酶的附着。在细菌细胞中的表达可例如受阻于转录沉默、低mRNA半衰期、二级结构形成、寡核苷酸结合分子诸如阻遏物和抑制剂的附着位点、以及稀少tRNA汇集物的可用性。细菌表达中的许多问题的来源见于原始序列内。对RNA的优化可包括修饰顺式作用性元件，改适它的GC含量，关于细菌细胞的非限制性tRNA汇集物改进密码子偏倚，以及避免内部同源性区域。因此，对序列进行优化可必然伴有例如调整GC含量极高(>80％)或极低(<30％)的区域。对序列进行优化也可必然伴有例如避免一个或多个以下顺式作用性序列基序：内部TATA框、Х位点和核糖体进入位点；富含AT或富含GC的序列链段；重复序列和RNA二级结构；(隐蔽)剪接供体位点和接受体位点；分支点；或其组合。对表达进行优化也可必然伴有将序列元件添加至基因的侧接区域和/或质粒中的其他地方中。
对序列进行优化也可必然伴有例如使密码子使用适应于宿主基因(例如单核细胞增多性李斯特菌基因)的密码子偏倚。举例来说，以下密码子可用于单核细胞增多性李斯特菌。
A＝GCA G＝GGT L＝TTA Q＝CAA V＝GTT
C＝TGT H＝CAT M＝ATG R＝CGT W＝TGG
D＝GAT I＝ATT N＝AAC S＝TCT Y＝TAT
E＝GAA K＝AAA P＝CCA T＝ACA 终止＝TAA
F＝TTC
可产生编码融合多肽的核酸，并且将其引入递送载体诸如细菌菌株或李斯特菌属菌株中。其他递送载体可适于DNA免疫疗法或肽免疫疗法，诸如痘苗病毒或病毒样粒子。一旦产生编码融合多肽的质粒并将其引入细菌菌株或李斯特菌属菌株中，即可培养并表征细菌或李斯特菌属菌株以确认包含抗原性肽的融合多肽的表达和分泌。
IV.重组细菌或李斯特菌属菌株
本文也提供包含本文公开的异变肽或重组融合多肽或如在本文中其他地方公开的编码所述异变肽或重组融合多肽的核酸的重组细菌菌株，诸如李斯特菌属菌株。优选地，细菌菌株是李斯特菌属菌株，诸如单核细胞增多性李斯特菌(Lm)菌株。然而，也可使用其它细菌菌株，例如沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)或分枝杆菌属(Mycobacterium)菌株。Lm作为疫苗载体具有许多固有优势。所述细菌在体外在无特殊要求下极其高效生长，并且它缺乏作为诸如沙门氏菌的革兰氏阴性细菌中的主要毒性因子的LPS。遗传减毒Lm载体也提供额外安全性，因为它们在严重不利作用的情况下可易于用抗生素消除，并且不同于一些病毒载体，不发生遗传物质向宿主基因组中的整合。
重组李斯特菌属菌株可为任何李斯特菌属菌株。适合李斯特菌属菌株的实例包括西尔李斯特菌、格雷李斯特菌(Listeria grayi)、伊凡诺夫李斯特菌(Listeriaivanovii)、默里李斯特菌(Listeria murrayi)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、单核细胞增多性李斯特菌(Lm)或本领域中已知的任何其他李斯特菌属物种。优选地，重组李斯特菌属菌株是物种单核细胞增多性李斯特菌的菌株。单核细胞增多性李斯特菌菌株的实例包括以下：单核细胞增多性李斯特菌10403S野生型(参见例如Bishop和Hinrichs(1987)J Immunol 139:2005-2009；Lauer等(2002)J Bact 184:4177-4186)；噬菌体经消除的单核细胞增多性李斯特菌DP-L4056(参见例如Lauer等(2002)J Bact 184:4177-4186)；噬菌体经消除并且具有hly基因缺失的单核细胞增多性李斯特菌DP-L4027(参见例如Lauer等(2002)J Bact184:4177-4186；Jones和Portnoy(1994)Infect Immunity 65:5608-5613)；噬菌体经消除并且具有actA基因缺失的单核细胞增多性李斯特菌DP-L4029(参见例如Lauer等(2002)J Bact184:4177-4186；Skoble等(2000)J Cell Biol 150:527-538)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4042(ΔPEST)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl AcadSci.USA 101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4097(LLO-S44A)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4364(ΔlplA；硫辛酸蛋白连接酶)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4405(ΔinlA)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad SciUSA 101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4406(ΔinlB)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌CS-LOOOl(ΔactA；ΔinlB)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc NatlAcad Sci USA 101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌CS-L0002(ΔactA；ΔlplA)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌CS-L0003(LLO L461T；ΔlplA)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4038(ΔactA；LLO L461T)(参见例如Brockstedt等(2004)ProcNatl Acad Sci USA 101:13832-13837以及支持信息)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4384(LLO S44A；LLO L461T)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:13832-13837以及支持信息)；具有lplA1缺失(编码硫辛酸蛋白连接酶LplA1)的单核细胞增多性李斯特菌菌株(参见例如O’Riordan等(2003)Science 302:462-464)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4017(具有LLO L461T的10403S)(参见例如US 7,691,393)；单核细胞增多性李斯特菌EGD(参见例如GenBank登录号AL591824)。在另一实施方案中，李斯特菌属菌株是单核细胞增多性李斯特菌EGD-e(参见GenBank登录号NC_003210；ATCC登录号BAA-679)；单核细胞增多性李斯特菌DP-L4029(actA缺失，任选与uvrAB缺失组合(DP-L4029uvrAB))(参见例如US 7,691,393)；单核细胞增多性李斯特菌actA/inlB双重突变体(参见例如ATCC登录号PTA-5562)；单核细胞增多性李斯特菌lplA突变体或hly突变体(参见例如US 2004/0013690)；单核细胞增多性李斯特菌dal/dat双重突变体(参见例如US2005/0048081)。其他单核细胞增多性李斯特菌菌株包括经修饰(例如通过质粒和/或通过基因组整合)以含有编码以下基因中的一者或以下基因的任何组合的核酸的那些：hly(LLO；李斯特菌溶素)；iap(p60)；inlA；inlB；inlC；dal(丙氨酸外消旋酶)；dat(D-氨基酸氨基转移酶)；plcA；plcB；actA；或介导单壁囊泡的生长、分布、分解；双壁囊泡的分解；与宿主细胞的结合；或由宿主细胞达成的摄取的任何核酸。以上参考文献中的每一者都出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
重组细菌或李斯特菌属可具有野生型毒力，可具有减弱毒力，或可为无毒力的。举例来说，重组李斯特菌属可具有足够毒力以逃脱吞噬体或吞噬溶酶体以及进入胞质液。所述李斯特菌属菌株也可为活体减毒李斯特菌属菌株，其包含至少一个如在本文中其他地方公开的减毒突变、缺失或失活。优选地，重组李斯特菌属是减毒营养缺陷型菌株。营养缺陷型菌株是不能合成为它的生长所需的特定有机化合物的菌株。所述菌株的实例描述于出于所有目的以引用的方式整体并入本文的US 8,114,414中。
优选地，重组李斯特菌属菌株缺乏抗生素抗性基因。举例来说，所述重组李斯特菌属菌株可包含不编码抗生素抗性基因的质粒。然而，一些本文提供的重组李斯特菌属菌株包含含有编码抗生素抗性基因的核酸的质粒。抗生素抗性基因可用于通常在分子生物学和疫苗制备中采用的常规选择和克隆过程中。示例性抗生素抗性基因包括赋予对氨苄青霉素(ampicillin)、青霉素(penicillin)、甲氧西林(methicillin)、链霉素(streptomycin)、红霉素(erythromycin)、卡那霉素(kanamycin)、四环素(tetracycline)、氯霉素(chloramphenicol，CAT)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和庆大霉素(gentamicin)的抗性的基因产物。
A.包含异变肽或重组融合多肽或编码异变肽或重组融合多肽的核酸的细菌或李斯特菌属菌株
本文公开的重组细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)包含本文公开的异变肽或重组融合多肽或如在本文中其他地方公开的编码所述异变肽或重组融合多肽的核酸。
在包含编码异变肽或重组融合蛋白的核酸的细菌或李斯特菌属菌株中，可对所述核酸进行密码子优化。各氨基酸的由单核细胞增多性李斯特菌利用的最优密码子显示于US2007/0207170中，所述专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。如果核酸中的至少一个密码子被那个氨基酸的相比于原始序列中的密码子，由单核细胞增多性李斯特菌更频繁使用的密码子置换，那么所述核酸是经密码子优化的。
核酸可在细菌或李斯特菌属菌株内存在于游离型质粒中，和/或核酸可被基因组整合在细菌或李斯特菌属菌株中。一些重组细菌或李斯特菌属菌株包含两种编码两种如本文公开的异变肽或重组融合多肽的单独核酸；一种核酸在游离型质粒中，并且一种核酸被基因组整合在细菌或李斯特菌属菌株中。
游离型质粒可为在体外(在细胞培养中)、在体内(在宿主中)、或在体外与在体内均得以稳定维持的质粒。如果在游离型质粒中，那么编码异变肽或重组融合多肽的开放阅读框可被可操作地连接于质粒中的启动子/调控序列。如果被基因组整合在细菌或李斯特菌属菌株中，那么编码异变肽或重组融合多肽的开放阅读框可被可操作地连接于外源性启动子/调控序列或内源性启动子/调控序列。适用于驱动基因的组成性表达的启动子/调控序列的实例是熟知的，并且包括例如李斯特菌属的hly、hlyA、actA、prfA和p60启动子、链球菌bac启动子、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)sgiA启动子、以及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)phaZ启动子。在一些情况下，插入的目标基因不是间断的或受到调控约束，此经常由于整合至基因组DNA中而发生，并且在一些情况下，存在插入的异源性基因不导致细胞的自身重要区域的重排或间断。
所述重组细菌或李斯特菌属菌株可通过用包含编码异变肽或重组融合多肽的核酸的质粒或载体转化在本文中其他地方所述的细菌或李斯特菌属菌株或减毒细菌或李斯特菌属菌株来制备。质粒可为不整合至宿主染色体中的游离型质粒。或者，质粒可为整合至细菌或李斯特菌属菌株的染色体中的整合型质粒。本文所用的质粒也可为多拷贝质粒。用于转化细菌的方法是熟知的，并且包括基于氯化钙感受态细胞的方法、电穿孔方法、噬菌体介导的转导、化学转化技术和物理转化技术。参见例如de Boer等(1989)Cell 56:641-649；Miller等(1995)FASEB J.9:190-199；Sambrook等(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel等(1997)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York；Gerhardt等编,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society forMicrobiology,Washington,D.C.；以及Miller,1992,A Short Course in BacterialGenetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
具有基因组整合的异源性核酸的细菌或李斯特菌属菌株可例如通过使用位点特异性整合载体来制备，借此使用同源性重组来产生包含整合基因的细菌或李斯特菌属。整合载体可为能够感染细菌或李斯特菌属菌株的任何位点特异性整合载体。这种整合载体可包含例如PSA attPP’位点、编码PSA整合酶的基因、U153 attPP’位点、编码U153整合酶的基因、A118 attPP’位点、编码A118整合酶的基因、或任何其他已知attPP’位点或任何其他噬菌体整合酶。
包含整合基因的所述细菌或李斯特菌属菌株也可使用用于使异源性核酸整合至细菌或李斯特菌属染色体中的任何其他已知方法来产生。用于同源性重组的技术是熟知的，并且例如描述于Baloglu等(2005)Vet Microbiol 109(1-2):11-17)；Jiang等(2005)Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)37(1):19-24)以及US 6,855,320中，所述文献和专利各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
向细菌或李斯特菌属染色体中的整合也可使用转座子插入来实现。用于转座子插入的技术是熟知的，并且例如由Sun等(1990)Infection and Immunity 58:3770-3778关于DP-L967的构建加以描述，所述文献出于所有目的以引用的方式整体并入本文。转座子诱变可实现稳定基因组插入，但在基因组中的其中已插入异源性核酸的位置是未知的。
向细菌或李斯特菌属染色体中的整合也可使用噬菌体整合位点来实现(参见例如Lauer等(2002)J Bacteriol 184(15):4177-4186，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。举例来说，整合酶基因和噬菌体(例如U153或PSA李斯特菌属噬菌体)的附着位点可用于将异源性基因插入可为基因组中任何适当位点的相应附着位点(例如comK或arg tRNA基因的3’末端)中。内源性原噬菌体可在异源性核酸的整合之前从所用附着位点消除。所述方法可例如产生单拷贝整合体。为避免“噬菌体消除步骤”，可使用基于PSA噬菌体的噬菌体整合系统(参见例如Lauer等(2002)J Bacteriol 184:4177-4186，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。维持整合基因可例如需要通过抗生素来进行连续选择。或者，可建立不需要用抗生素进行选择的基于噬菌体的染色体整合系统。作为替代，可对营养缺陷型宿主菌株进行补充。举例来说，可使用用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中使用就包括例如D-丙氨酸外消旋酶的必需酶来说是营养缺陷型的宿主菌株(例如Lm dal(-)dat(-))。
接合也可用于将遗传物质和/或质粒引入细菌中。用于接合的方法是熟知的，并且例如描述于Nikodinovic等(2006)Plasmid 56(3):223-227以及Auchtung等(2005)ProcNatl Acad Sci USA 102(35):12554-12559中，所述文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在一特定实例中，重组细菌或李斯特菌属菌株可包含被基因组整合至细菌或李斯特菌属基因组中的编码异变肽或重组融合多肽的核酸，其呈具有内源性actA序列(编码ActA蛋白)或内源性hly序列(编码LLO蛋白)的开放阅读框形式。举例来说，异变肽或融合多肽的表达和分泌可受控于内源性actA启动子和ActA信号序列，或可受控于内源性hly启动子和LLO信号序列。作为另一实例，编码异变肽或重组融合多肽的核酸可置换编码ActA蛋白的actA序列或编码LLO蛋白的hly序列。
对重组细菌或李斯特菌属菌株的选择可通过任何手段来实现。举例来说，可使用抗生素选择。抗生素抗性基因可用于通常在分子生物学和疫苗制备中采用的常规选择和克隆过程中。示例性抗生素抗性基因包括赋予对氨苄青霉素、青霉素、甲氧西林、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素和庆大霉素的抗性的基因产物。或者，可使用营养缺陷型菌株，并且替代抗生素抗性基因或除抗生素抗性基因之外，外源性代谢基因(也)可用于选择。作为一实例，为选择包含编码本文提供的代谢酶或补充基因的质粒的营养缺陷型细菌，可使经转化营养缺陷型细菌在将关于编码代谢酶的基因(例如氨基酸代谢基因)或补充基因的表达进行选择的培养基中生长。或者，温度敏感性质粒可用于选择重组体，或任何其他已知手段用于选择重组体。
B.细菌或李斯特菌属菌株的减毒
本文公开的重组体细菌菌株(例如重组李斯特菌属菌株)可为减毒的。术语“减毒”涵盖使细菌在宿主动物中导致疾病的能力减弱。举例来说，相较于野生型李斯特菌属，减毒李斯特菌属菌株的病原性特征可被减小，但减毒李斯特菌属能够在培养中生长和维持。作为用减毒李斯特菌属对BALB/c小鼠进行静脉内接种的一实例进行使用，50％的接种动物存活所处的致死剂量(LD50)优选增加至高于野生型李斯特菌属的LD50至少约10倍，更优选是至少约100倍，更优选是至少约1,000倍，甚至更优选是至少约10,000倍，并且最优选是至少约100,000倍。因此，减毒李斯特菌属菌株是不杀灭它所施用的动物的菌株，或是仅当施用的细菌的数目极其大于将为杀灭相同动物所需的野生型非减毒细菌的数目时杀灭所述动物的菌株。减毒细菌也应被解释为意指不能在一般环境中复制的细菌，因为为它的生长所需的营养物不存在于其中。因此，细菌限于在其中提供所需营养物的受控环境中复制。减毒菌株具有环境安全性，因为它们不能达成不受控制的复制。
(1)使细菌和李斯特菌属菌株减毒的方法
减毒可通过任何已知手段来实现。举例来说，所述减毒菌株可缺乏一个或多个内源性毒力基因或一个或多个内源性代谢基因。所述基因的实例在本文中公开，并且减毒可通过使本文公开的基因中的任一者或本文公开的基因的任何组合失活来实现。失活可例如通过缺失或通过突变(例如失活性突变)来实现。术语“突变”包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的突变或修饰，并且可涵盖缺失、截短、插入、取代、破坏或易位。举例来说，突变可包括移码突变、导致蛋白质过早终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。诱变可使用重组DNA技术，或使用利用诱变化学物质或辐射以及对突变体的后续选择进行的传统诱变技术来实现。由于伴有低可能性的逆转，所以缺失突变体可为优选的。术语“代谢基因”是指编码涉及于由宿主细菌利用或为宿主细菌所需的营养物的合成中或为所述营养物的合成所需的酶的基因。举例来说，酶可涉及于为宿主细菌的持续生长所需的营养物的合成中或为所述营养物的合成所需。术语“毒力”基因包括其在生物体的基因组中的存在或活性促进所述生物体的病原性(例如使得所述生物体能够实现在宿主中定殖于小生境(包括附着于细胞)、免疫逃避(逃避宿主的免疫应答)、免疫遏制(抑制宿主的免疫应答)、进入和退出细胞、或从宿主获得营养)的基因。
这种减毒菌株的一特定实例是单核细胞增多性李斯特菌(Lm)dal(-)dat(-)(Lmdd)。这种减毒菌株的另一实例是Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。参见例如US 2011/0142791，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。LmddA基于由于内源性毒力基因actA的缺失而得以减毒的李斯特菌属菌株。所述菌株可保持用于通过对dal基因进行补充来达成在体内和在体外的抗原表达的质粒。或者，LmddA可为在内源性dal、dat和actA基因中具有突变的dal/dat/actA李斯特菌属。所述突变可为例如缺失或其他失活性突变。
减毒菌株的另一特定实例是Lm prfA(-)或在prfA基因中具有部分缺失或失活性突变的菌株。PrfA蛋白控制包含为Lm定殖于它的脊椎动物宿主所需的必需毒力基因的调控元的表达；因此，prfA突变强烈损害PrfA使PrfA依赖性毒力基因的表达活化的能力。
减毒菌株的另一特定实例是Lm inlB(-)actA(-)，其中对细菌的天然毒力至关重要的两个基因—内化蛋白B(internalin B)和act A—被缺失。
减毒细菌或李斯特菌属菌株的其他实例包括缺乏一个或多个内源性毒力基因的细菌或李斯特菌属菌株。所述基因的实例包括李斯特菌属中的actA、prfA、plcB、plcA、inlA、inlB、inlC、inlJ和bsh。减毒李斯特菌属菌株也可为任何以上提及的菌株的双重突变体或三重突变体。减毒李斯特菌属菌株可包含本文提供的基因中的每一者的突变或缺失，或包含本文提供的任何基因中的例如多达十者的突变或缺失(例如包括actA、prfA和dal/dat基因)。举例来说，减毒李斯特菌属菌株可包含内源性内化蛋白C(inlC)基因的突变或缺失和/或内源性actA基因的突变或缺失。或者，减毒李斯特菌属菌株可包含内源性内化蛋白B(inlB)基因的突变或缺失和/或内源性actA基因的突变或缺失。或者，减毒李斯特菌属菌株可包含内源性inlB、inlC和actA基因的突变或缺失。李斯特菌属向邻近细胞的易位通过使过程中涉及的内源性actA基因和/或内源性inlC基因或内源性inlB基因缺失来抑制，由此产生高水平的减毒作用，伴有增加的免疫原性和作为菌株骨架的效用。减毒李斯特菌属菌株也可为包含plcA与plcB两者的突变或缺失的双重突变体。在一些情况下，可由EGD李斯特菌属骨架构建菌株。
细菌或李斯特菌属菌株也可为在代谢基因中具有突变的营养缺陷型菌株。作为一个实例，菌株可缺乏一个或多个内源性氨基酸代谢基因。举例来说，缺乏D-丙氨酸的营养缺陷型李斯特菌属菌株的产生例如可以许多熟知方式实现，所述方式包括缺失突变、插入突变、移码突变、导致蛋白质过早终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。由于伴有低可能性的营养缺陷型表型逆转，所以缺失突变体可为优选的。作为一实例，可在简单实验室培养测定中测试根据本文呈现的方案产生的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸下生长的能力。可选择在不存在这个化合物下不能生长的那些突变体。
内源性氨基酸代谢基因的实例包括维生素合成基因、编码泛酸合成酶的基因、D-谷氨酸合成酶基因、D-丙氨酸氨基转移酶(dat)基因、D-丙氨酸外消旋酶(dal)基因、dga、涉及于二氨基庚二酸(DAP)的合成中的基因、涉及于半胱氨酸合成酶A(cysK)的合成中的基因、维生素B12非依赖性甲硫氨酸合成酶、trpA、trpB、trpE、asnB、gltD、gltB、leuA、argG和thrC。李斯特菌属菌株可缺乏两个或更多个所述基因(例如dat和dal)。D-谷氨酸合成部分地由涉及于D-glu+pyr向α-酮戊二酸+D-ala的转化以及逆反应中的dal基因控制。
作为另一实例，减毒李斯特菌属菌株可缺乏内源性合成酶基因，诸如氨基酸合成基因。所述基因的实例包括folP、编码二氢尿苷合成酶家族蛋白的基因、ispD、ispF、编码磷酸烯醇丙酮酸合成酶的基因、hisF、hisH、fliI、编码核糖体大亚单位假尿苷合成酶的基因、ispD、编码双功能性GMP合成酶/谷氨酰胺酰胺基转移酶蛋白的基因、cobS、cobB、cbiD、编码尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合成酶的基因、cobQ、uppS、truB、dxs、mvaS、dapA、ispG、folC、编码柠檬酸合成酶的基因、argJ、编码3-脱氧-7-磷酸阿拉伯庚糖酮酸合成酶的基因、编码吲哚-3-甘油-磷酸合成酶的基因、编码邻氨基苯甲酸合成酶/谷氨酰胺酰胺基转移酶组分的基因、menB、编码甲基萘醌特异性异分支酸合成酶的基因、编码磷酸核糖基甲酰基甘氨脒合成酶I或II的基因、编码磷酸核糖基氨基咪唑-丁二酸甲酰胺合成酶的基因、carB、carA、thyA、mgsA、aroB、hepB、rluB、ilvB、ilvN、alsS、fabF、fabH、编码假尿苷合成酶的基因、pyrG、truA、pabB、和atp合成酶基因(例如atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。
减毒李斯特菌属菌株可缺乏内源性phoP、aroA、aroC、aroD或plcB。作为另一实例，减毒李斯特菌属菌株可缺乏内源性肽转运体。实例包括编码ABC转运体/ATP结合/渗透酶蛋白、寡肽ABC转运体/寡肽结合蛋白、寡肽ABC转运体/渗透酶蛋白、锌ABC转运体/锌结合蛋白、糖ABC转运体、磷酸转运体、ZIP锌转运体、EmrB/QacA家族的药物抗性转运体、硫酸转运体、质子依赖性寡肽转运体、镁转运体、甲酸/亚硝酸转运体、亚精胺/腐胺ABC转运体、Na/Pi协同转运体、糖磷酸转运体、谷氨酰胺ABC转运体、主要协助转运蛋白家族转运体、甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运体、钼ABC转运体、磷壁酸ABC转运体、钴ABC转运体、铵转运体、氨基酸ABC转运体、细胞分裂ABC转运体、锰ABC转运体、铁化合物ABC转运体、麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运体、Bcr/CflA家族的药物抗性转运体、以及一种以上蛋白质的亚单位的基因。
其他减毒细菌和李斯特菌属菌株可缺乏使用于细菌生长过程、复制过程、细胞壁合成、蛋白质合成、脂肪酸的代谢、或任何其他生长或复制过程的氨基酸代谢的内源性代谢酶。同样，减毒菌株可缺乏可催化形成用于细胞壁合成中的氨基酸，可催化合成用于细胞壁合成中的氨基酸，或可涉及于用于细胞壁合成中的氨基酸的合成中的内源性代谢酶。或者，氨基酸可用于细胞壁生物发生中。或者，代谢酶是作为细胞壁组分的D-谷氨酸的合成酶。
其他减毒李斯特菌属菌株可缺乏由D-谷氨酸合成基因、dga、alr(丙氨酸外消旋酶)基因编码的代谢酶或涉及于丙氨酸合成中的任何其他酶。李斯特菌属菌株可缺乏的代谢酶的其他实例包括由以下编码的酶：serC(磷酸丝氨酸氨基转移酶)、asd(天冬氨酸β半醛脱氢酶；涉及于细胞壁成分二氨基庚二酸的合成中)、编码gsaB-谷氨酸-1-半醛氨基转移酶的基因(催化从(S)-4-氨基-5-氧代戊酸形成5-氨基乙酰丙酸)、hemL(催化从(S)-4-氨基-5-氧代戊酸形成5-氨基乙酰丙酸)、aspB(催化从L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸形成草酰乙酸和L-谷氨酸的天冬氨酸氨基转移酶)、argF-1(涉及于精氨酸生物合成中)、aroE(涉及于氨基酸生物合成中)、aroB(涉及于3-脱氢奎尼酸生物合成中)、aroD(涉及于氨基酸生物合成中)、aroC(涉及于氨基酸生物合成中)、hisB(涉及于组氨酸生物合成中)、hisD(涉及于组氨酸生物合成中)、hisG(涉及于组氨酸生物合成中)、metX(涉及于甲硫氨酸生物合成中)、proB(涉及于脯氨酸生物合成中)、argR(涉及于精氨酸生物合成中)、argJ(涉及于精氨酸生物合成中)、thil(涉及于硫胺生物合成中)、LMOf2365_1652(涉及于色氨酸生物合成中)、aroA(涉及于色氨酸生物合成中)、ilvD(涉及于缬氨酸和异亮氨酸生物合成中)、ilvC(涉及于缬氨酸和异亮氨酸生物合成中)、leuA(涉及于亮氨酸生物合成中)、dapF(涉及于赖氨酸生物合成中)和thrB(涉及于苏氨酸生物合成中)(全都属于GenBank登录号NC_002973)。
减毒李斯特菌属菌株可通过使其他代谢酶诸如tRNA合成酶突变来产生。举例来说，代谢酶可由编码色氨酰基tRNA合成酶的trpS基因编码。举例来说，宿主菌株细菌可为Δ(trpS aroA)，并且两种标记均可含于整合载体中。
可被突变以产生减毒李斯特菌属菌株的代谢酶的其他实例包括由以下编码的酶：murE(涉及于二氨基庚二酸的合成中；GenBank登录号：NC_003485)、LMOf2365_2494(涉及于磷壁酸生物合成中)、WecE(脂多糖生物合成蛋白rffA；GenBank登录号：AE014075.1)、或amiA(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶)。代谢酶的其他实例包括天冬氨酸氨基转移酶、组氨醇-磷酸氨基转移酶(GenBank登录号NP_466347)、或细胞壁磷壁酸糖基化蛋白GtcA。
可被突变以产生减毒李斯特菌属菌株的代谢酶的其他实例包括肽聚糖组分或前体的合成酶。组分可为例如UDP-N-乙酰基胞壁酰基五肽、UDP-N-乙酰基葡糖胺、MurNAc-(五肽)-焦磷酰基-十一萜醇、GlcNAc-p-(1,4)-MurNAc-(五肽)-焦磷酰基十一萜醇、或任何其他肽聚糖组分或前体。
可被突变以产生减毒李斯特菌属菌株的代谢酶的其他实例包括由murG、murD、murA-1或murA-2(全都以GenBank登录号NC_002973示出)编码的代谢酶。或者，代谢酶可为肽聚糖组分或前体的任何其他合成酶。代谢酶也可为转糖基酶、转肽酶、羧基肽酶、任何其他类别的代谢酶、或任何其他代谢酶。举例来说，代谢酶可为任何其他李斯特菌属代谢酶或任何其他单核细胞增多性李斯特菌代谢酶。
其他细菌菌株可如上对于李斯特菌属所述通过使其他细菌菌株中的相应直系同源基因突变来减毒。
(2)对减毒细菌和李斯特菌属菌株进行补充的方法
本文公开的减毒细菌或李斯特菌属菌株可进一步包含含有补充基因或编码对减毒突变进行补充(例如对营养缺陷型李斯特菌属菌株的营养缺陷进行补充)的代谢酶的核酸。举例来说，具有编码如本文公开的融合多肽的第一开放阅读框的核酸可进一步包含含有补充基因或编码补充代谢酶的第二开放阅读框。或者，第一核酸可编码融合多肽，并且单独第二核酸可包含补充基因或编码补充代谢酶。
补充基因可在染色体外，或可整合至细菌或李斯特菌属基因组中。举例来说，营养缺陷型李斯特菌属菌株可包含含有编码代谢酶的核酸的游离型质粒。所述质粒将以游离或染色体外方式含于李斯特菌属中。或者，营养缺陷型李斯特菌属菌株可包含含有编码代谢酶的核酸的整合型质粒(即整合载体)。所述整合型质粒可用于整合至李斯特菌属染色体中。优选地，游离型质粒或整合型质粒缺乏抗生素抗性标记。
替代抗生素抗性基因或除抗生素抗性基因之外，代谢基因(也)可用于选择。作为一实例，为选择包含编码本文提供的代谢酶或补充基因的质粒的营养缺陷型细菌，可使经转化营养缺陷型细菌在将关于编码代谢酶的基因(例如氨基酸代谢基因)或补充基因的表达进行选择的培养基中生长。举例来说，D-谷氨酸合成营养缺陷型细菌可用包含用于D-谷氨酸合成的基因的质粒转化，并且营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸下生长，而尚未用质粒转化或不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白质的质粒的营养缺陷型细菌将不生长。类似地，当被转化并且表达包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的核酸的质粒时，D-丙氨酸合成营养缺陷型细菌将在不存在D-丙氨酸下生长。用于制备包含或缺乏必需生长因子、补充物、氨基酸、维生素、抗生素等的适当培养基的所述方法是熟知的，并且可商购获得。
一旦已在适当培养基中选择包含编码本文提供的代谢酶或补充基因的质粒的营养缺陷型细菌，即可在选择压力存在下使细菌繁殖。所述繁殖可包括使细菌在无营养缺陷因子的培养基中生长。表达代谢酶或补充基因的质粒在营养缺陷型细菌中的存在确保质粒将与细菌一起复制，从而连续选择具有质粒的细菌。细菌或李斯特菌属菌株的产生可易于通过调整包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长的培养基的体积来按比例扩大。
在一个特定实例中，减毒菌株是具有dal和dat的缺失或在dal和dat中具有失活性突变的菌株(例如单核细胞增多性李斯特菌(Lm)dal(-)dat(-)(Lmdd)或Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA))，并且补充基因编码丙氨酸外消旋酶(例如由dal基因编码)或D-氨基酸氨基转移酶(例如由dat基因编码)。一示例性丙氨酸外消旋酶蛋白可具有以SEQ ID NO:76示出的序列(由SEQ ID NO:78编码；GenBank登录号：AF038438)，或可为SEQ ID NO:76的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、或亚型的片段。丙氨酸外消旋酶蛋白也可为任何其他李斯特菌属丙氨酸外消旋酶蛋白。或者，丙氨酸外消旋酶蛋白可为任何其他革兰氏阳性丙氨酸外消旋酶蛋白或任何其他丙氨酸外消旋酶蛋白。一示例性D-氨基酸氨基转移酶蛋白可具有以SEQ ID NO:77示出的序列(由SEQ ID NO:79编码；GenBank登录号：AF038439)，或可为SEQ ID NO:77的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、或亚型的片段。D-氨基酸氨基转移酶蛋白也可为任何其他李斯特菌属D-氨基酸氨基转移酶蛋白。或者，D-氨基酸氨基转移酶蛋白可为任何其他革兰氏阳性D-氨基酸氨基转移酶蛋白或任何其他D-氨基酸氨基转移酶蛋白。
在另一特定实例中，减毒菌株是具有prfA的缺失或在prfA中具有失活性突变的菌株(例如Lm prfA(-))，并且补充基因编码PrfA蛋白。举例来说，补充基因可编码使部分PrfA功能恢复的突变PrfA(D133V)蛋白。野生型PrfA蛋白的一实例以SEQ ID NO:80示出(由以SEQ ID NO:81示出的核酸编码)，并且D133V突变PrfA蛋白的一实例以SEQ ID NO:82示出(由以SEQ ID NO:83示出的核酸编码)。补充PrfA蛋白可为SEQ ID NO:80或82的同源物、变体、亚型、类似物、片段、同源物的片段、变体的片段、类似物的片段、或亚型的片段。PrfA蛋白也可为任何其他李斯特菌属PrfA蛋白。或者，PrfA蛋白可为任何其他革兰氏阳性PrfA蛋白或任何其他PrfA蛋白。
在另一实例中，细菌菌株或李斯特菌属菌株可包含actA基因的缺失或actA基因中的失活性突变，并且补充基因可包括actA基因以对突变进行补充以及恢复李斯特菌属菌株的功能。
其他营养缺陷菌株和补充系统也可被采用来与本文提供的方法和组合物一起使用。
C.细菌或李斯特菌属菌株的制备和储存
重组细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)任选已通过动物宿主来传代。所述传代可使李斯特菌属菌株作为疫苗载体的功效最大化，可使李斯特菌属菌株的免疫原性稳定，可使李斯特菌属菌株的毒力稳定，可使李斯特菌属菌株的免疫原性增加，可使李斯特菌属菌株的毒力增加，可移除李斯特菌属菌株的不稳定子菌株，或可降低李斯特菌属菌株的不稳定子菌株的盛行。用于通过动物宿主来使重组李斯特菌属菌株传代的方法在本领域中是熟知的，并且例如描述于出于所有目的以引用的方式整体并入本文的US 2006/0233835中。
重组细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)可储存在冷冻细胞库中或储存在冻干细胞库中。这种细胞库可为例如主细胞库、工作细胞库或良好制造规范(GMP)细胞库。“良好制造规范”的实例包括由美国联邦法规的21CFR 210-211规定的那些。然而，“良好制造规范”也可由关于生产临床等级物质或关于人类食用的其他标准规定，诸如除美国以外的国家的标准。所述细胞库可意图用于生产临床等级物质或可符合关于人类使用的监管规范。
重组细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)也可来自一批疫苗剂，来自冷冻储备物，或来自冻干储备物。
所述细胞库、冷冻储备物或各批疫苗剂可例如在解冻后展现大于90％的活力。解冻例如可在低温保存储存或冷冻储存24小时之后。或者，储存可持续例如2天、3天、4天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、5个月、6个月、9个月或1年。
细胞库、冷冻储备物或一批疫苗配料可例如通过包括以下的方法来低温保存：使细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)的培养物在营养培养基中生长，将所述培养物冷冻在包含甘油的溶液中，以及将李斯特菌属菌株储存在低于-20℃下。温度可为例如约-70℃或在约-70至约-80℃之间。或者，细胞库、冷冻储备物或一批疫苗配料可通过包括以下的方法来低温保存：使李斯特菌属菌株的培养物在成分确定培养基中生长，将所述培养物冷冻在包含甘油的溶液中，以及将李斯特菌属菌株储存在低于-20℃下。温度可为例如约-70℃或在约-70至约-80℃之间。任何成分确定微生物学培养基都可用于这个方法中。
培养物(例如用于产生一批李斯特菌属疫苗剂的李斯特菌属疫苗菌株的培养物)可例如从细胞库，从冷冻储备物，从起始培养物，或从菌落加以接种。培养物可例如在对数生长期中期时，在大约对数生长期中期时，或在另一生长期时加以接种。
替代甘油或除甘油之外，用于冷冻的溶液(也)任选含有另一粘性(colligative)添加剂或具有抗冷冻性质的添加剂。所述添加剂的实例包括例如甘露糖醇、DMSO、蔗糖、或任何其他粘性添加剂或具有抗冷冻性质的添加剂。
用于使细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)的培养物生长的营养培养基可为任何适合营养培养基。适合培养基的实例包括例如LB；TB；改良无动物产品极品肉汤；或成分确定培养基。
生长步骤可通过使细菌生长的任何已知手段来进行。举例来说，生长步骤可用振荡烧瓶(诸如挡板振荡烧瓶)、批式发酵罐、搅拌槽或烧瓶、气升发酵罐、补料批式反应器、连续细胞反应器、固定化细胞反应器、或使细菌生长的任何其他手段来进行。
任选地，在培养物的生长(例如在批式发酵罐中)期间维持恒定pH。举例来说，pH可维持在约6.0下，在约6.5下，在约7.0下，在约7.5或约8.0下。同样，pH可为例如约6.5至约7.5、约6.0至约8.0、约6.0至约7.0、约6.0至约7.0、或约6.5至约7.5。
任选地，可在培养物的生长期间维持恒定温度。举例来说，温度可维持在约37℃下或在37℃下。或者，温度可维持在25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃或39℃下。
任选地，可在培养物的生长期间维持恒定溶氧浓度。举例来说，溶氧浓度可维持在20％饱和、15％饱和、16％饱和、18％饱和、22％饱和、25％饱和、30％饱和、35％饱和、40％饱和、45％饱和、50％饱和、55％饱和、60％饱和、65％饱和、70％饱和、75％饱和、80％饱和、85％饱和、90％饱和、95％饱和、100％饱和、或接近100％饱和下。
用于冻干和低温保存重组细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)的方法是已知的。举例来说，李斯特菌属培养物可被快速冷冻在液氮中，随后储存在最终冷冻温度下。或者，培养物可以更渐进方式冷冻(例如通过在最终储存温度下在小瓶中放置培养物)。培养物也可通过用于使细菌培养物冷冻的任何其他已知方法来冷冻。
培养物的储存温度可例如在-20与-80℃之间。举例来说，温度可显著低于-20℃或不比-70℃更暖。或者，温度可为约-70℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-80℃、-30至-70℃、-40至-70℃、-50至-70℃、-60至-70℃、-30至-80℃、-40至-80℃、-50至-80℃、-60至-80℃、或-70至-80℃。或者，温度可比70℃更冷或比-80℃更冷。
V.免疫原性组合物、药物组合物和疫苗
本文也提供包含如本文公开的异变肽、如本文公开的重组融合多肽、如本文公开的编码异变肽或重组融合多肽的核酸、或如本文公开的重组细菌或李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。包含李斯特菌属菌株的免疫原性组合物可由于它包含李斯特菌属菌株而固有地具有免疫原性，和/或组合物也可进一步包含佐剂。其他免疫原性组合物包含DNA免疫疗法或肽免疫疗法组合物。
术语“免疫原性组合物”是指含有抗原的任何组合物，所述抗原在暴露于所述组合物后的受试者中引发针对所述抗原的免疫应答。由免疫原性组合物引发的免疫应答可针对特定抗原或针对抗原上的特定表位。
免疫原性组合物可包含单一如本文公开的异变肽或重组融合多肽、如本文公开的编码异变肽或重组融合多肽的核酸、或如本文公开的重组细菌或李斯特菌属菌株，或它可包含多个不同如本文公开的异变肽或重组融合多肽、如本文公开的编码异变肽或重组融合多肽的核酸、或如本文公开的重组细菌或李斯特菌属菌株。举例来说，如果第一重组融合多肽包含第二重组融合多肽不包含的一种抗原性肽，那么所述第一重组融合多肽不同于所述第二重组融合多肽。这两种重组融合多肽可包括某些相同抗原性肽，并且仍然被视为不同。所述不同异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸或重组细菌或李斯特菌属菌株可并行向受试者或依序向受试者施用。当包含本文公开的重组李斯特菌属菌株(或异变肽、重组融合多肽或核酸)的药物物质呈不同剂型(例如一种药剂是片剂或胶囊，并且另一药剂是无菌液体)和/或根据不同给药方案施用(例如来自混合物的一种组合物至少每日施用，而另一组合物以诸如每周一次、每两周一次、或每三周一次的较小频率施用)时，依序施用可为特别适用的。多种异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸或重组细菌或李斯特菌属菌株可各自包含一组不同抗原性肽。或者，两种或更多种异变肽、重组融合多肽、编码异变肽、重组融合多肽的核酸或重组细菌或李斯特菌属菌株可包含一组相同抗原性肽(例如一组处于不同顺序的相同抗原性肽)。
多个异变肽或片段或重组融合多肽可以结合多种不同的HLA类型。举例来说，它们可以与以下HLA类型中的一种或多种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
作为一个实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、MAGEA6、MAGEA4、GAGE1、NYESO1、STEAP1和RNF43。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如非小细胞肺癌(NSCLC)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部异变抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表3中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、或全部11个异变抗原性肽，或包括包含例如表3中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、或全部11个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、MAGEA4、STEAP1、RNF43、SSX2、SART3、PAGE4、PSMA和PSA。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如前列腺癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表5中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表5中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、STEAP1、MAGEA3、PRAME、hTERT和SURVIVIN。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如胰腺癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表7中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个或全部12个异变抗原性肽，或包括包含例如表7中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个或全部12个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、GAGE1、NYESO1、RNF43、NUF2、KLHL7、MAGEA3和PRAME。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如膀胱癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表9中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表9中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个或全部13个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、STEAP1、RNF43、MAGEA3、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表11中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或全部11个异变抗原性肽，或包括包含例如表11中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或全部11个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、PRAME、hTERT、STEAP1、RNF43、NUF2、KLHL7和SART3。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如子宫癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表13中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表13中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个或全部14个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、STEAP1、RNF43、SART3、NUF2、KLHL7、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如卵巢癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表15中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表15中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、MAGEA6、STEAP1、RNF43、SART3、NUF2、KLHL7和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如低级神经胶质瘤相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表17中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表17中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、MAGEA6、MAGEA4、GAGE1、NYESO1、STEAP1、RNF43和MAGEA3。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如结肠直肠癌(例如，MSS结肠直肠癌)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表19中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表19中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，免疫原性组合物可包含由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码的异变肽(以诸如肽、核酸或细菌载体形式)：CEACAM5、MAGEA4、STEAP1、NYESO1、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如头颈癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表21中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表21中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
免疫原性组合物可另外包含佐剂(例如两种或更多种佐剂)、细胞因子、趋化因子或其组合。任选地，免疫原性组合物可另外包含对于受试者可为自体的或可为同种异体的抗原呈递细胞(APC)。
术语佐剂包括使对抗原的免疫应答增强的化合物或混合物。举例来说，佐剂可为免疫应答的非特异性刺激物，或允许在受试者中产生储库(depot)的物质，所述储库在与本文公开的免疫原性组合物组合时提供甚至更加增强和/或延长的免疫应答。佐剂可例如有利于主要是Th1介导的免疫应答、Th1型免疫应答、或Th1介导的免疫应答。同样，佐剂可有利于细胞介导的免疫应答而超过有利于抗体介导的应答。或者，佐剂可有利于抗体介导的应答。一些佐剂可通过缓慢释放抗原来使免疫应答增强，而其他佐剂可通过任何以下机理来介导它们的作用：使细胞浸润、炎症以及向注射部位的迁移增加，特别是对于抗原呈递细胞(APC)；通过使共刺激性信号或主要组织相容性复合物(MHC)表达上调来促进APC的活化状态；使抗原呈递增强；或诱导细胞因子释放以达成间接作用。
佐剂的实例包括皂素(saponin)QS21、CpG的寡核苷酸、含未甲基化CpG的寡核苷酸、MPL、TLR激动剂、TLR4激动剂、TLR9激动剂、
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咪喹莫特(imiquimod)、细胞因子或编码细胞因子的核酸、趋化因子或编码趋化因子的核酸、IL-12或编码IL-12的核酸、IL-6或编码IL-6的核酸、以及脂多糖。适合佐剂的另一实例是Montanide ISA 51。Montanide ISA 51含有天然可代谢油和精制乳化剂。适合佐剂的其他实例包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或编码粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子的核酸以及钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或编码钥孔虫戚血蓝蛋白的核酸。GM-CSF可为例如在酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))载体中产生的人蛋白质。GM-CSF促进造血祖细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞和T细胞的克隆扩增和分化。
适合佐剂的另一实例是去毒李斯特菌属溶素O(dtLLO)蛋白。去毒可以通过对三个选定的氨基酸引入点突变来实现，这些氨基酸对于LLO与胆固醇的结合以及对最终的膜孔形成很重要。所述三个被靶向的氨基酸存在于LLO的胆固醇结合域(ECTGLAWEWWR；SEQ IDNO:74)中，并可通过由PCR在DNA序列中引入的点突变来对其序列进行修饰(EATGLAWEAAR；SEQ ID NO:96)。适用作佐剂的dtLLO的一个实例由SEQ ID NO:95编码。LLO的去毒、非溶血形式(dtLLO)是肿瘤免疫治疗中的有效佐剂，可通过充当PAMP来激活先天免疫应答和细胞免疫应答。由与SEQ ID NO:95至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列编码的dtLLO也适用作佐剂。
佐剂的其他实例包括生长因子或编码生长因子的核酸、细胞群体、弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)、磷酸铝、氢氧化铝、BCG(卡介苗)、明矾、白介素或编码白介素的核酸、皂树糖苷、单磷酰基脂质A、脂质体、细菌有丝分裂原、细菌毒素、或任何其他类型的已知佐剂(参见例如Fundamental Immunology,第5版(2003年8月):WilliamE.Paul(编)；Lippincott Williams&Wilkins Publishers；第43章:Vaccines,GJV Nossal，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。
免疫原性组合物可进一步包含一种或多种免疫调节分子。实例包括干扰素γ、细胞因子、趋化因子和T细胞刺激剂。
免疫原性组合物可呈疫苗或药物组合物形式。术语“疫苗”和“药物组合物”可互换，并且是指用于向受试者进行体内施用的处于药学上可接受的载体中的免疫原性组合物。疫苗可为例如肽疫苗(例如包含如本文公开的异变肽或重组融合多肽)、DNA疫苗(例如包含如本文公开的编码异变肽或重组融合多肽的核酸)、或含于细胞(例如如本文公开的重组李斯特菌属)内并由所述细胞递送的疫苗。疫苗可防止受试者感染或显现疾病或病状，和/或疫苗对于患有疾病或病状的受试者可为治疗性的。用于制备肽疫苗的方法是熟知的，并且例如描述于EP 1408048、US 2007/0154953以及Ogasawara等(1992)Proc.Natl AcadSci USA 89:8995-8999中，所述专利和文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。任选地，肽进化技术可用于产生具有更高免疫原性的抗原。用于肽进化的技术是熟知的，并且例如描述于出于所有目的以引用的方式整体并入本文的US 6,773,900中。
“药学上可接受的载体”是指用于含有免疫原性组合物的媒介物，其可被引入受试者中而不具有重大不利作用以及对所述免疫原性组合物不具有有害作用。也就是说，“药学上可接受”是指任何制剂是安全的，并且提供对用于本文公开的方法中的有效量的至少一种免疫原性组合物的适于所需施用途径的递送。药学上可接受的载体或媒介物或赋形剂是熟知的。对适合药学上可接受的载体以及涉及于它们的选择中的因素的描述见于多种可易于获得的来源中，所述来源诸如像出于所有目的以引用的方式整体并入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,1990。所述载体可适于任何施用途径(例如胃肠外、经肠(例如口服)或表面施加)。所述药物组合物可加以缓冲处理，例如其中根据免疫原性组合物的稳定性和施用途径，将pH维持在于pH 4.0至pH 9.0的范围内的特定所需值下。
适合药学上可接受的载体包括例如无菌水、盐溶液诸如盐水、葡萄糖、缓冲溶液诸如磷酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液、醇、阿拉伯胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、白石蜡、甘油、海藻酸盐、透明质酸、胶原、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。药物组合物或疫苗也可包括不有害地与免疫原性组合物反应的助剂，包括例如稀释剂、稳定剂(例如糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、粘度增强添加剂、润滑剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、维生素、着色剂、调味剂、芳香物质等。
对于液体制剂，举例来说，药学上可接受的载体可为水性或非水性溶液、混悬液、乳液或油。非水性溶剂包括例如丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括例如水、醇性溶液/水性溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。油的实例包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、葵花油和鱼肝油。固体载体/稀释剂包括例如胶状物、淀粉(例如玉米淀粉、预胶凝淀粉)、糖(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖或右旋糖)、纤维素物质(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯酸甲酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。
任选地，可配制持续或定向释放药物组合物或疫苗。这可例如通过使用脂质体或组合物来实现，其中活性化合物用可差异性降解的包衣保护(例如通过微囊封、多层包覆等)。可配制所述组合物以达成立刻或缓慢释放。也有可能将组合物冷冻干燥，并且使用所得冻干物(例如用于制备注射用产品)。
本文公开的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗也可包含一种或多种有效预防或治疗癌症的额外化合物。举例来说，额外化合物可包括适用于化学疗法中的化合物，诸如安吖啶(amsacrine)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、克立他酶(crisantaspase)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)、吉西他滨(gemcitabine)、格立得植入物(gliadelimplant)、羟基脲(hydroxycarbamide)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、脂质体多柔比星(liposomaldoxorubicin)、脂质体柔红霉素(liposomaldaunorubicin)、洛莫司汀(lomustine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美斯纳(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(紫杉醇(Taxol))、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他汀(pentostatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、赛特铂(satraplatin)、链脲霉素(streptozocin)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、噻替派(thiotepa)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、拓扑替康(topotecan)、曲奥舒凡(treosulfan)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)或其组合。额外化合物也可包括其他生物制剂，包括针对HER2抗原的
Figure BDA0002571091800000701
(曲妥珠单抗(trastuzumab))、针对VEGF的
Figure BDA0002571091800000702
(贝伐单抗(bevacizumab))、或针对EGF受体的抗体诸如
Figure BDA0002571091800000703
(西妥昔单抗(cetuximab))和
Figure BDA0002571091800000704
(帕尼单抗(panitumumab))。额外化合物也可包括例如额外免疫疗法。
额外化合物也可包括免疫检查点抑制拮抗剂，诸如PD-1信号传导路径抑制剂、CD-80/86和CTLA-4信号传导路径抑制剂、T细胞膜蛋白3(TIM3)信号传导路径抑制剂、腺苷A2a受体(A2aR)信号传导路径抑制剂、淋巴细胞活化基因3(LAG3)信号传导路径抑制剂、杀伤免疫球蛋白受体(KIR)信号传导路径抑制剂、CD40信号传导路径抑制剂、或任何其他抗原呈递细胞/T细胞信号传导路径抑制剂。免疫检查点抑制拮抗剂的实例包括抗PD-L1/PD-L2抗体或其片段、抗PD-1抗体或其片段、抗CTLA-4抗体或其片段、或抗B7-H4抗体或其片段。额外化合物也可包括T细胞刺激物，诸如结合T细胞受体共刺激性分子、抗原呈递细胞受体结合共刺激性分子、或TNF受体超家族的成员的抗体或其功能性片段。T细胞受体共刺激性分子可包括例如CD28或ICOS。抗原呈递细胞受体结合共刺激性分子可包括例如CD80受体、CD86受体或CD46受体。TNF受体超家族成员可包括例如糖皮质素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25。参见例如WO2016100929、WO2016011362和WO2016011357，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
VI.治疗方法
本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽的核酸、编码重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗可用于各种方法中。举例来说，它们可用于在受试者中诱导或增强抗癌相关蛋白或抗肿瘤相关抗原免疫应答的方法、在受试者中诱导或增强抗肿瘤或抗癌免疫应答的方法、治疗受试者的肿瘤或癌症的方法、预防受试者的肿瘤或癌症的方法、或保护受试者对抗肿瘤或癌症的方法中。它们也可用于使受试者的脾和肿瘤中T效应细胞与调控性T细胞(Treg)的比率增加的方法中，其中T效应细胞靶向肿瘤相关抗原。它们也可用于使受试者中肿瘤相关抗原T细胞增加，使患有肿瘤或癌症的受试者的存活时间增加，使受试者的癌症的发作延迟，或使受试者中肿瘤或转移瘤尺寸降低的方法中。
一种在受试者中诱导或增强抗肿瘤相关抗原免疫应答的方法可包括例如向所述受试者施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗(例如包含异变肽或含有所述异变肽的重组融合多肽或编码所述异变肽或重组融合多肽的核酸)。抗肿瘤相关抗原免疫应答可由此在受试者中被诱导或增强。举例来说，在重组李斯特菌属菌株的情况下，李斯特菌属菌株可表达融合多肽，由此在受试者中引发免疫应答。免疫应答可包括例如T细胞应答，诸如CD4+FoxP3-T细胞应答、CD8+T细胞应答、或CD4+FoxP3-和CD8+T细胞应答。所述方法也可使受试者的脾和肿瘤微环境中T效应细胞与调控性T细胞(Treg)的比率增加，从而允许在受试者中达成更深远抗肿瘤应答。
一种在受试者中诱导或增强抗肿瘤或抗癌免疫应答的方法可包括例如向所述受试者施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。抗肿瘤或抗癌免疫应答可由此在受试者中被诱导。举例来说，在重组李斯特菌属菌株的情况下，李斯特菌属菌株可表达融合多肽，由此在受试者中引发抗肿瘤或抗癌应答。
一种治疗受试者的肿瘤或癌症(例如其中所述肿瘤或癌症表达本文中其他地方公开的特定肿瘤相关抗原或癌症相关蛋白)的方法可包括例如向所述受试者施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。受试者可接着发动针对表达肿瘤相关抗原的肿瘤或癌症的免疫应答，由此治疗受试者的肿瘤或癌症。
一种预防受试者的肿瘤或癌症或保护受试者以防显现肿瘤或癌症(例如其中所述肿瘤或癌症与本文其他地方公开的特定肿瘤相关抗原或癌症相关蛋白的表达相关)的方法可包括例如向所述受试者施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。受试者可接着发动针对肿瘤相关抗原的免疫应答，由此预防肿瘤或癌症或保护受试者以防显现肿瘤或癌症。
在一些以上方法中，施用两种或更多种异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。多种异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗可以任何顺序或组合依序施用，或可以任何组合同时施用。作为一实例，如果施用四种不同李斯特菌属菌株，那么它们可依序施用，它们可同时施用，或它们可以任何组合施用(例如同时施用第一菌株和第二菌株，并且随后同时施用第三菌株和第四菌株)。任选地，在依序施用的情况下，组合物可在同一免疫应答期间，优选在彼此的0-10或3-7天内施用。多种异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗可各自包含一组不同抗原性肽。或者，两者或更多者可包含一组相同抗原性肽(例如一组处于不同顺序的相同抗原性肽)。
多个异变肽或片段或重组融合多肽可以结合多种不同的HLA类型。举例来说，它们可以与以下HLA类型中的一种或多种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
作为一个实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、MAGEA6、MAGEA4、GAGE1、NYESO1、STEAP1和RNF43。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如非小细胞肺癌(NSCLC)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部异变抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表3中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、或全部11个异变抗原性肽，或包括包含例如表3中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、或全部11个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、MAGEA4、STEAP1、RNF43、SSX2、SART3、PAGE4、PSMA和PSA。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如前列腺癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表5中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表5中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、STEAP1、MAGEA3、PRAME、hTERT和SURVIVIN。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如胰腺癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表7中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个或全部12个异变抗原性肽，或包括包含例如表7中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个或全部12个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、GAGE1、NYESO1、RNF43、NUF2、KLHL7、MAGEA3和PRAME。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如膀胱癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表9中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表9中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个或全部13个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、STEAP1、RNF43、MAGEA3、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表11中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或全部11个异变抗原性肽，或包括包含例如表11中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或全部11个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、PRAME、hTERT、STEAP1、RNF43、NUF2、KLHL7和SART3。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如子宫癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表13中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表13中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个或全部14个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、STEAP1、RNF43、SART3、NUF2、KLHL7、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如卵巢癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表15中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个异变抗原性肽，或包括包含例如表15中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、或全部14个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、MAGEA6、STEAP1、RNF43、SART3、NUF2、KLHL7和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如低级神经胶质瘤相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表17中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表17中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、MAGEA6、MAGEA4、GAGE1、NYESO1、STEAP1、RNF43和MAGEA3。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如结肠直肠癌(例如，MSS结肠直肠癌)相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表19中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表19中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
作为另一实例，多个异变肽(以诸如肽、重组融合多肽、核酸或细菌载体形式)可由1个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或所有以下基因编码：CEACAM5、MAGEA4、STEAP1、NYESO1、PRAME和hTERT。异变抗原性肽可以结合例如HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02中的一个或多个或全部。所述癌症相关蛋白与例如头颈癌相关。异变抗原性肽可以是以任何顺序。异变抗原性肽可以直接融合在一起或通过接头连接在一起，其实例在本文其他地方公开。在一特定实例中，一个或多个或全部抗原性肽可为9聚体(例如由接头连接在一起的9聚体)。所述异变抗原性肽的实例提供于实施例2中。异变抗原性肽可包括例如表21中的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个异变抗原性肽，或包括包含例如表21中1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或全部10个序列的肽。
癌症是哺乳动物中的一种通常特征在于细胞生长和增殖不受调控的生理状况。癌症可为造血性恶性肿瘤或实体肿瘤(即由过度细胞生长或增殖所致的细胞团块，包括癌前病变)。转移性癌症是指已从它首先开始所处的地点扩散至体内另一地点的癌症。由转移性癌细胞形成的肿瘤被称为转移性肿瘤或转移，其是也用于指代癌细胞向身体的其他部分扩散所采用的过程的术语。一般来说，转移性癌症与原始或原发性癌症具有相同名称和相同类型的癌细胞。实体肿瘤的实例包括黑素瘤、癌瘤、母细胞瘤和肉瘤。血液恶性肿瘤包括例如白血病或淋巴性恶性肿瘤，诸如淋巴瘤。癌症的示例性种类包括脑癌、乳腺癌、胃肠癌、泌尿道癌、妇科癌、头颈癌、血液癌、皮肤癌和胸癌。脑恶性肿瘤包括例如胶质母细胞瘤、高级脑桥神经胶质瘤、低级神经胶质瘤、神经管母细胞瘤、神经母细胞瘤和毛细胞性星形细胞瘤。胃肠癌包括例如结肠直肠癌、胆囊癌、肝细胞癌、胰腺癌、PNET、胃癌和食道癌。泌尿道癌包括例如肾上腺皮质癌、膀胱癌、肾嫌色细胞癌、肾(透明细胞)癌、肾(乳头状)癌、横纹肌样癌和前列腺癌。妇科癌包括例如子宫癌肉瘤、子宫子宫内膜癌、浆液性卵巢癌和子宫颈癌。头颈癌包括例如甲状腺癌、鼻咽癌、头颈癌和腺样囊性癌。血液癌包括例如多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、套膜细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、非淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和急性骨髓性白血病(AML)。皮肤癌包括例如皮肤黑素瘤和鳞状细胞癌。胸癌包括例如鳞状肺癌、小细胞肺癌和肺腺癌。
所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌或癌瘤(例如口腔鳞状细胞癌)、骨髓瘤、口腔癌、青少年鼻咽血管纤维瘤、神经内分泌肿瘤、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质肿瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、乳腺癌、三重阴性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌或癌瘤、唾液腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、纤维肉瘤、胆囊癌、骨肉瘤、间皮瘤以及头颈癌。癌症也可为脑癌或另一类型的CNS或颅内肿瘤。举例来说，受试者可患有星形细胞肿瘤(例如星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、毛细胞性星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤)、寡树突神经胶质肿瘤(例如寡树突神经胶质细胞瘤、间变性寡树突神经胶质细胞瘤)、室管膜细胞肿瘤(例如室管膜瘤、间变性室管膜瘤、粘液乳头状室管膜瘤、亚室管膜瘤)、混合胶质细胞瘤(例如混合寡突星形细胞瘤、间变性寡突星形细胞瘤)、不确定来源的神经上皮肿瘤(例如极性海绵胶质母细胞瘤、星形母细胞瘤、脑神经胶质瘤病(gliomatosiscerebri))、脉络丛肿瘤(例如脉络丛乳头状瘤、脉络丛癌瘤)、神经元或混合神经元-神经胶质肿瘤(例如神经节细胞瘤、小脑发育不良神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、间变性神经节神经胶质瘤、促结缔组织增生性婴儿神经节瘤、中枢性神经细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、嗅神经母细胞瘤)、松果体实质肿瘤(例如松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、混合松果体细胞瘤/松果体母细胞瘤)、或具有混合神经母细胞性要素或胶质母细胞性要素的肿瘤(例如髓质上皮瘤、神经管母细胞瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、室管膜母细胞瘤)。癌症的其他实例包括低级神经胶质瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌和DNA错配修复缺陷性癌症或肿瘤。如果癌具有雌激素的受体，那么它被称为呈雌激素受体阳性。癌症的另一实例是微卫星稳定(MSS)结肠直肠癌。
在特定实例中，癌症为非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、低级神经胶质瘤、结肠直肠癌或头颈癌。
术语“治疗(treat/treating)”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施两者，其中目标在于预防或减轻所靶向的肿瘤或癌症。治疗可包括以下中的一者或多者：直接影响或治愈与肿瘤或癌症相关的症状、遏制所述症状、抑制所述症状、预防所述症状、减轻所述症状的严重性、延迟所述症状的发作、减缓所述症状的进展、使所述症状的进展稳定、诱导所述症状的缓解、预防或延迟所述症状的转移、减轻/改善所述症状、或其组合。举例来说，治疗可包括使预期存活时间增加或使肿瘤或转移瘤尺寸降低。作用(例如遏制症状、抑制症状、预防症状、减轻症状的严重性、延迟症状的发作、减缓症状的进展、使症状的进展稳定、诱导症状的缓解、预防或延迟症状的转移、减轻/改善症状等)可相对于未接受治疗或接受安慰剂治疗的对照受试者而言。术语“治疗”也可指使患有肿瘤或癌症的受试者的存活百分比概率增加，或使对所述受试者预期的存活时间增加(例如相对于未接受治疗或接受安慰剂治疗的对照受试者)。在一个实例中，“治疗”是指延迟进展、加快缓解、诱导缓解、加强缓解、加速康复、使替代性治疗剂的功效增加、使对替代性治疗剂的抗性降低、或其组合(例如相对于未接受治疗或接受安慰剂治疗的对照受试者)。术语“预防”或“阻碍”可例如指代延迟症状的发作、预防肿瘤或癌症的复发、使复发发作的次数或频率降低、使症状性发作之间的潜伏期增加、预防肿瘤或癌症的转移、或其组合。术语“遏制”或“抑制”可例如指代减轻症状的严重性、减轻急性发作的严重性、使症状的次数降低、使疾病相关症状的发生减少、使症状的潜伏期降低、改善症状、使继发性症状减少、使继发性感染减少、延长患者存活期、或其组合。
术语“受试者”是指需要针对肿瘤或癌症的疗法或易于显现肿瘤或癌症的哺乳动物(例如人)。术语受试者也指接受防治性治疗或治疗性治疗的哺乳动物(例如人)。受试者可包括狗、猫、猪、母牛、绵羊、山羊、马、大鼠、小鼠、非人哺乳动物和人。术语“受试者”未必排除在所有方面都是健康的，并且不具有或不显示癌症或肿瘤的征象的个体。
如果受试者具有至少一个已知风险因素(例如遗传、生物化学、家族史和情境显露)，相比于不具有所述风险因素的个体，所述风险因素将具有那个风险因素的个体置于显现肿瘤或癌症的统计显著更大风险下，那么个体处于显现所述肿瘤或癌症的增加风险下。
“症状”或“征象”是指疾病的如由医师所观察的客观迹象，或疾病的如由受试者所察觉的主观迹象，诸如步态改变。症状或征象可为疾病的任何表现形式。症状可为原发性的或继发性的。术语“原发性”是指症状是特定疾病或病症(例如肿瘤或癌症)的直接结果，而术语“继发性”是指症状由主要原因产生或因主要原因而发生。本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗可治疗原发性或继发性症状或继发性并发症。
以有效方案施用异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，这意味着剂量、施用途径和施用频率使肿瘤或癌症的至少一种征象或症状的发作延迟、减轻所述至少一种征象或症状的严重性、抑制所述至少一种征象或症状的进一步恶化、和/或改善所述至少一种征象或症状。或者，以有效方案施用异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，这意味着剂量、施用途径和施用频率诱导对异变肽或重组融合多肽(或由核酸编码)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗中的异源性抗原的免疫应答，或在重组细菌或李斯特菌属菌株的情况下，诱导对细菌或李斯特菌属菌株自身的免疫应答。如果受试者已罹患肿瘤或癌症，那么方案可被称为治疗有效方案。如果受试者相对于一般群体处于显现肿瘤或癌症的升高风险下，但尚未经历症状，那么方案可被称为防治有效方案。在一些情况下，可相对于历史对照或在同一患者中的过往经历，观察个别患者中的治疗或防治功效。在其他情况下，可在临床前或临床试验中，相对于未治疗患者的对照群体，在治疗患者的群体中显示治疗或防治功效。举例来说，如果个别治疗患者实现的结果比未通过本文所述的方法来治疗的类似患者的对照群体中的平均结果更有利，或如果在对照临床试验(例如II期、II/III期或III期试验)中，相对于对照患者，在治疗患者中在p<0.05或0.01或甚至0.001水平下显示更有利结果，那么方案可被视为具有治疗或防治有效性。
肽的示例性剂量为例如每日10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、10-20、20-40、30-60、40-60、40-80、50-100、50-150、60-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-600、500-800、600-800、800-1000、1000-1500或1500-1200μg肽。肽的示例性剂量为例如每日10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、10-20、20-40、30-60、40-60、40-80、50-100、50-150、60-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-600、500-800、600-800、800-1000、1000-1500或1500-1200mg肽。
重组李斯特菌属菌株的示例性剂量是例如1x 106-1x 107CFU、1x 107-1x 108CFU、1x 108-3.31x 1010CFU、1x 109-3.31x 1010CFU、5-500x 108CFU、7-500x 108CFU、10-500x108CFU、20-500x 108CFU、30-500x 108CFU、50-500x 108CFU、70-500x 108CFU、100-500x108CFU、150-500x 108CFU、5-300x 108CFU、5-200x108CFU、5-15x 108CFU、5-100x 108CFU、5-70x 108CFU、5-50x 108CFU、5-30x108CFU、5-20x 108CFU、1-30x 109CFU、1-20x 109CFU、2-30x 109CFU、1-10x 109CFU、2-10x 109CFU、3-10x 109CFU、2-7x 109CFU、2-5x 109CFU、和3-5x 109CFU。重组李斯特菌属菌株的其他示例性剂量是例如1x 107个生物体、1.5x 107个生物体、2x 108个生物体、3x 107个生物体、4x 107个生物体、5x 107个生物体、6x 107个生物体、7x 107个生物体、8x 107个生物体、10x 107个生物体、1.5x 108个生物体、2x 108个生物体、2.5x 108个生物体、3x 108个生物体、3.3x 108个生物体、4x 108个生物体、5x 108个生物体、1x 109个生物体、1.5x 109个生物体、2x 109个生物体、3x 109个生物体、4x 109个生物体、5x 109个生物体、6x 109个生物体、7x 109个生物体、8x 109个生物体、10x 109个生物体、1.5x 1010个生物体、2x 1010个生物体、2.5x 1010个生物体、3x 1010个生物体、3.3x 1010个生物体、4x 1010个生物体、和5x 1010个生物体。剂量可取决于患者的状况和对先前治疗的响应(如果有的话)，治疗是防治性的还是治疗性的，以及其他因素。
施用可通过任何适合手段来进行。举例来说，施用可为以下方式：胃肠外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、脑室内、腹膜内、经表面、鼻内、肌肉内、眼内、直肠内、经结膜、经皮、真皮内、经阴道、经直肠、肿瘤内、癌旁、经粘膜、血管内、室内、吸入(气雾剂)、鼻吸(喷雾剂)、舌下、气雾剂、栓剂、或其组合。对于鼻内施用或通过吸入来施加，在适当载体存在下混合以及气雾化或雾化异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗的溶液或混悬液是适合的。这种气雾剂可包含本文所述的任何异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株。免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。施用也可以栓剂(例如直肠栓剂或尿道栓剂)形式，以用于皮下植入的丸粒形式(例如提供历经一段时期的控制释放)，或以胶囊形式进行。施用也可通过向肿瘤部位中或向肿瘤中注射来进行。施用方案可易于基于诸如以下的因素加以确定：所治疗肿瘤或癌症的确切性质和类型、肿瘤或癌症的严重性、受试者的年龄和总体身体状况、受试者的体重、个别受试者的响应等。
施用频率可取决于异变肽或重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗在受试者中的半衰期、受试者的状况和施用途径以及其他因素。响应于受试者的状况的变化或所治疗肿瘤或癌症的进展，频率可为例如每日、每周、每月、每季度或在不定期间隔下。治疗过程可取决于受试者的状况和其他因素。举例来说，治疗过程可为数周、数月、或数年(例如多达2年)。举例来说，重复施用(给药)可紧接在第一治疗过程之后或在间隔数天、数周或数月之后进行以实现肿瘤消退或肿瘤生长遏制。评估可通过任何已知技术来制定，包括诊断方法，诸如成像技术、分析血清肿瘤标志物、活检、或肿瘤相关症状的存在、不存在或改善。作为一特定实例，异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗可每3周加以施用，持续多达2年。在一个实例中，以递增剂量施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗以使T效应细胞与调控性T细胞比率增加，以及产生更强力抗肿瘤免疫应答。抗肿瘤免疫应答可通过对受试者提供细胞因子来进一步强化，所述细胞因子包括例如IFN-γ、TNF-α和已知会增强细胞免疫应答的其他细胞因子。参见例如US 6,991,785，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
一些方法可进一步包括用额外异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，或多次施用异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗来使受试者“加强免疫”。“加强免疫”是指向受试者施用额外剂量。举例来说，在一些方法中，施用2次加强物(或总计3次接种)，施用3次加强物，施用4次加强物，施用5次加强物，或施用6次或更多次加强物。施用的剂量次数可例如取决于肿瘤或癌症对治疗的响应。
任选地，用于加强接种中的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗与用于初始“初免”接种中的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗相同。或者，加强异变肽、重组融合多肽、核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗不同于初免异变肽、重组融合多肽、核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。任选地，在初免接种和加强接种中使用相同剂量。或者，较大剂量用于加强中，或较小剂量用于加强中。初免接种与加强接种之间的时期可以实验方式确定。举例来说，初免接种与加强接种之间的时期可为1周、2周、3周、4周、5周、6-8周、或8-10周。
异源性初免加强策略已有效用于增强针对众多病原体的免疫应答和保护作用。参见例如Schneider等(1999)Immunol.Rev.170:29-38；Robinson(2002)Nat.Rev.Immunol.2:239-250；Gonzalo等(2002)Vaccine 20:1226-1231；以及Tanghe(2001)Infect.Immun.69:3041-3047，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。在初免注射和加强注射中提供呈不同形式的抗原可使对抗原的免疫应答最大化。DNA疫苗初免继之以用处于佐剂中的蛋白质来加强或通过病毒载体递送编码抗原的DNA来加强是一种改进抗原特异性抗体和CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答的有效方式。参见例如Shiver等(2002)Nature 415:331-335；Gilbert等(2002)Vaccine20:1039-1045；Billaut-Mulot等(2000)Vaccine 19:95-102；以及Sin等(1999)DNA Cell Biol.18:771-779，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。作为一个实例，当受试者以DNA初免继之以用表达抗原的腺病毒载体加强来接种疫苗时，将CRL1005泊洛沙姆(poloxamer)(12kDa，5％POE)添加至编码所述抗原的DNA中可增强T细胞应答。参见例如Shiver等(2002)Nature 415:331-335，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。作为另一实例，可施用编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含所述抗原的所述免疫原性部分的蛋白质。参见例如US 2002/0165172，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。类似地，核酸疫苗接种的免疫应答可通过同时施用(例如在同一免疫应答期间，优选在彼此的0-10或3-7天内)目标多核苷酸和多肽来增强。参见例如US 6,500,432，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
本文公开的治疗方法也可包括施用一种或多种有效预防或治疗癌症的额外化合物。举例来说，额外化合物可包括适用于化学疗法中的化合物，诸如安吖啶、博莱霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克立他酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、格立得植入物、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、甲酰四氢叶酸、脂质体多柔比星、脂质体柔红霉素、洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、美斯纳、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、培美曲塞、喷司他汀、丙卡巴肼、雷替曲塞、赛特铂、链脲霉素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替派、硫鸟嘌呤、拓扑替康、曲奥舒凡、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或其组合。或者，额外化合物也可包括其他生物制剂，包括针对HER2抗原的
Figure BDA0002571091800000841
(曲妥珠单抗)、针对VEGF的
Figure BDA0002571091800000843
(贝伐单抗)、或针对EGF受体的抗体诸如
Figure BDA0002571091800000842
(西妥昔单抗)和
Figure BDA0002571091800000844
(帕尼单抗)。或者，额外化合物可包括其他免疫疗法。或者，额外化合物可为吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)路径抑制剂，诸如1-甲基色氨酸(1MT)、1-甲基色氨酸(1MT)、坏死抑素-1(Necrostatin-1)、吡哆醛异烟酰基腙、依布硒(Ebselen)、5-甲基吲哚-3-甲醛、CAY10581、抗IDO抗体或小分子IDO抑制剂。IDO抑制可增强化学治疗剂的功效。本文公开的治疗方法也可与放射、干细胞治疗、手术或任何其他治疗组合。
所述额外化合物或治疗可在施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗之前，在施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗之后，或与施用本文公开的异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗同时。
靶向免疫调节疗法主要集中在使共刺激性受体活化上，例如通过使用靶向肿瘤坏死因子受体超家族的成员的激动剂抗体，所述成员包括4-1BB、OX40和GITR(糖皮质素诱导的TNF受体相关蛋白)。对GITR的调节已在抗肿瘤环境与疫苗环境两者中均显示潜力。激动剂抗体的另一靶标是T细胞活化的共刺激性信号分子。靶向共刺激性信号分子可导致T细胞的活化增强以及促进更强力免疫应答。共刺激也可帮助防止来自检查点抑制的抑制性影响以及使抗原特异性T细胞增殖增加。
基于李斯特菌属的免疫疗法通过诱导浸润和破坏肿瘤的肿瘤抗原特异性T细胞的全新(de novo)产生，以及通过使肿瘤微环境中免疫遏制性调控性T细胞(Treg)和骨髓源性遏制细胞(MDSC)的数目和活性降低来起作用。针对T细胞共抑制性或共刺激性受体(例如检查点抑制物CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG3和共刺激物CD137、OX40、GITR和CD40)的抗体(或其功能性片段)可与基于李斯特菌属的免疫疗法具有协同作用。
因此，一些方法可包括进一步施用包含免疫检查点抑制拮抗剂的组合物，所述拮抗剂诸如PD-1信号传导路径抑制剂、CD-80/86和CTLA-4信号传导路径抑制剂、T细胞膜蛋白3(TIM3)信号传导路径抑制剂、腺苷A2a受体(A2aR)信号传导路径抑制剂、淋巴细胞活化基因3(LAG3)信号传导路径抑制剂、杀伤免疫球蛋白受体(KIR)信号传导路径抑制剂、CD40信号传导路径抑制剂、或任何其他抗原呈递细胞/T细胞信号传导路径抑制剂。免疫检查点抑制拮抗剂的实例包括抗PD-L1/PD-L2抗体或其片段、抗PD-1抗体或其片段、抗CTLA-4抗体或其片段、或抗B7-H4抗体或其片段。举例来说，抗PD-1抗体可每2周在5-10mg/kg下，每3周在5-10mg/kg下，每3周在1-2mg/kg下，每周在1-10mg/kg下，每2周在1-10mg/kg下，每3周在1-10mg/kg下，或每4周在1-10mg/kg下向受试者施用。
同样，一些方法可进一步包括施用T细胞刺激物，诸如结合T细胞受体共刺激性分子、抗原呈递细胞受体结合共刺激性分子、或TNF受体超家族的成员的抗体或其功能性片段。T细胞受体共刺激性分子可包括例如CD28或ICOS。抗原呈递细胞受体结合共刺激性分子可包括例如CD80受体、CD86受体或CD46受体。TNF受体超家族成员可包括例如糖皮质素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25。
举例来说，一些方法可进一步包括施用有效量的包含结合T细胞受体共刺激性分子的抗体或其功能性片段、或结合抗原呈递细胞受体结合共刺激性分子的抗体或其功能性片段的组合物。抗体可为例如抗TNF受体抗体或其抗原结合片段(例如TNF受体超家族成员糖皮质素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25)、抗OX40抗体或其抗原结合片段、或抗GITR抗体或其抗原结合片段。或者，可施用其他激动性分子(例如GITRL、GITRL的活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITRL的活性片段的融合蛋白、抗原呈递细胞(APC)/T细胞激动剂、CD134或其配体或片段、CD137或其配体或片段、或诱导性T细胞共刺激性(ICOS)蛋白或其配体或片段、或激动性小分子)。
在一特定实例中，一些方法可进一步包括施用抗CTLA-4抗体或其功能性片段和/或抗CD137抗体或其功能性片段。举例来说，抗CTLA-4抗体或其功能性片段或抗CD137抗体或其功能性片段可在第一剂异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗之后约72小时，或在第一剂异变肽、重组融合多肽、编码异变肽或重组融合多肽的核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗之后约48小时施用。抗CTLA-4抗体或其功能性片段或抗CD137抗体或其功能性片段可在例如约0.05mg/kg和约5mg/kg的剂量下施用。重组李斯特菌属菌株或包含重组李斯特菌属菌株的免疫原性组合物可在例如约1x 109CFU的剂量下施用。一些所述方法可进一步包括施用有效量的抗PD-1抗体或其功能性片段。
用于评估癌症免疫疗法的功效的方法是熟知的，并且例如描述于Dzojic等(2006)Prostate 66(8):831-838；Naruishi等(2006)Cancer Gene Ther.13(7):658-663，Sehgal等(2006)Cancer Cell Int.6:21)，以及Heinrich等(2007)Cancer Immunol Immunother56(5):725-730中，所述文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。作为一个实例，对于前列腺癌，前列腺癌模型可用以测试本文公开的方法和组合物，所述模型诸如TRAMP-C2小鼠模型、178-2BMA细胞模型、PAIII腺癌细胞模型、PC-3M模型、或任何其他前列腺癌模型。
或者或另外，可在人受试者中测试免疫疗法，并且可使用已知方法监测功效。所述方法可包括例如直接测量CD4+和CD8+T细胞应答，或测量疾病进展(例如通过测定肿瘤转移的数目或尺寸，或监测疾病症状诸如咳嗽、胸痛、重量减轻等)。用于评估癌症免疫疗法在人受试者中的功效的方法是熟知的，并且例如描述于Uenaka等(2007)Cancer Immun.7:9以及Thomas-Kaskel等(2006)Int J Cancer119(10):2428-2434中，所述文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
VII.试剂盒
本文也提供包括用于进行本文公开的方法的试剂的试剂盒或包括本文公开的组合物、工具或仪器的试剂盒。
举例来说，所述试剂盒可包括本文公开的异变肽、重组融合多肽、本文公开的编码异变肽或重组融合多肽的核酸、本文公开的重组细菌或李斯特菌属菌株、本文公开的免疫原性组合物、本文公开的药物组合物、或本文公开的疫苗。所述试剂盒可另外包括描述使用肽或重组融合多肽、编码肽或重组融合多肽的核酸、重组李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗来进行本文公开的方法的说明材料。所述试剂盒可任选进一步包括施加器。尽管以下描述模型试剂盒，但其他适用试剂盒的内含物将鉴于本公开而显而易知。
以上或以下引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登录号等都出于所有目的以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像明确地和个别地指示将各个别条目都如此以引用的方式并入本文一样。如果在不同时间有序列的不同版本与登录号相关联，那么意指的是在本申请的有效申请日期时与所述登录号相关联的版本。有效申请日期意指实际申请日期或涉及所述登录号的优先权申请的申请日期(如果可适用)的早先日期。同样，如果在不同时间有出版物、网站等的不同版本被公布，那么除非另外指示，否则意指的是在申请的有效申请日期时最新近公布的版本。除非另外明确指示，否则本发明的任何特征、步骤、要素、实施方案或方面都可与任何其他特征、步骤、要素、实施方案或方面组合使用。尽管本发明已出于明晰和理解的目的通过说明和举例的方式相当详细地加以描述，但将显而易知的是某些变化和修改可在随附权利要求的范围内加以实施。
实施方案的清单
本文公开的主题包括但不限于以下实施方案。
1.一种分离的肽，其包含癌症相关蛋白的免疫原性片段，其中所述片段包含异变突变。
2.根据实施方案1所述的分离的肽，其中所述异变突变是在锚定位置上突变至优选氨基酸。
3.根据实施方案1或2所述的分离的肽，其中所述片段的长度为约7至约11个氨基酸，长度为约8至约10个氨基酸，或长度为约9个氨基酸。
4.根据任何前述实施方案所述的分离的肽，其中所述癌症相关蛋白为癌症睾丸抗原或癌胚抗原。
5.根据任何前述实施方案所述的分离的肽，其中所述癌症相关蛋白由以下人类基因中的一个编码：CEACAM5、GAGE1、TERT、KLHL7、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、NUF2、NYESO1、PAGE4、PRAME、PSA、PSMA、RNF43、SART3、SSX2、STEAP1、和SURVIVIN。
6.根据实施方案5所述的分离的肽，其中：(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个；(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：110和112中的任一个；(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：114；(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：116；(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段包含SEQID NO：118、120、122和124中的任一个；(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：126；(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：128；(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：130和132中的任一个；(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：134和136中的任一个；(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：138；(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：140；(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：142；(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：144；(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：146；(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：148；(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：150；(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：152和154中的任一个；或者(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：156和158中的任一个。
7.根据实施方案6所述的分离的肽，其中：(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段由SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个组成；(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：110和112中的任一个组成；(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段由SEQ ID NO：114组成；(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段由SEQ ID NO：116组成；(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：118、120、122和124中的任一个组成；(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段由SEQ ID NO：126组成；(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段由SEQ ID NO：128组成；(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：130和132中的任一个组成；(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：134和136中的任一个组成；(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段由SEQ IDNO：138组成；(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段由SEQ ID NO：140组成；(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：142组成；(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：144组成；(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段由SEQ ID NO：146组成；(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：148组成；(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：150组成；(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：152和154中的任一个组成；或者(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段由SEQ ID NO：156和158中的任一个组成。
8.根据实施方案7所述的分离的肽，其中：(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个组成；(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：110和112中的任一个组成；(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：114组成；(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：116组成；(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NOS：118、120、122和124中的任一个组成；(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：126组成；(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：128组成；(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：130和132中的任一个组成；(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：134和136中的任一个组成；(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：138组成；(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：140组成；(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：142组成；(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：144组成；(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述分离的肽由SEQID NO：146组成；(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：148组成；(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：150组成；(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：152和154中的任一个组成；或者(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：156和158中的任一个组成。
9.根据任何前述实施方案所述的分离的肽，其中所述片段与以下HLA类型中的一种或多种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
10.一种核酸，其编码根据任何前述实施方案所述的分离的肽。
11.根据实施方案10所述的核酸，其中所述核酸经密码子优化以在人中表达。
12.根据实施方案10所述的核酸，其中所述核酸经密码子优化以在单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)中表达。
13.根据实施方案10-12中任一项所述的核酸，其中所述核酸包括DNA。
14.根据实施方案10-12中任一项所述的核酸，其中所述核酸包括RNA。
15.根据实施方案10-14中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：223-977及其编码相同氨基酸序列的简并变体中的任一个序列。
16.根据实施方案15所述的核酸，其中所述核酸由选自SEQ ID NO：223-977及其编码相同氨基酸序列的简并变体中的任一个序列组成。
17.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)根据实施方案1-9中任一项所述的一种或多种分离的肽或根据实施方案10-16中任一项所述的一种或多种核酸；和
(b)佐剂。
18.根据实施方案17所述的药物组合物，其中所述佐剂包括去毒李斯特菌溶素O(dtLLO)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰基脂质A、未甲基化的含CpG的寡核苷酸或Montanide ISA 51。
19.根据实施方案17或18所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含与以下HLA类型中的每一种结合的肽或编码与以下HLA类型中的每一种结合的肽的核酸：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
20.根据实施方案17-19中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：(a)表3所示的肽中的两个或多个或编码表3所示的肽中的两个或多个的核酸；(b)表5所示的肽中的两个或多个或编码表5所示的肽中的两个或多个的核酸；(c)表7所示的肽中的两个或多个或编码表7所示的肽中的两个或多个的核酸；(d)表9所示的肽中的两个或多个或编码表9所示的肽中的两个或多个的核酸；(e)表11所示的肽中的两个或多个或编码表11所示的肽中的两个或多个的核酸；(f)表13所示的肽中的两个或多个或编码表13所示的肽中的两个或多个的核酸；(g)表15所示的肽中的两个或多个或编码表15所示的肽中的两个或多个的核酸；(h)表17所示的肽中的两个或多个或编码表17所示的肽中的两个或多个的核酸；(i)表19所示的肽中的两个或多个或编码表19所示的肽中的两个或多个的核酸；或者(j)表21所示的肽中的两个或多个或编码表21所示的肽中的两个或多个的核酸。
21.根据实施方案20所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：(a)表3所示的所有肽或编码表3所示的所有肽的核酸；(b)表5所示的所有肽或编码表5所示的所有肽的核酸；(c)表7所示的所有肽或编码表7所示的所有肽的核酸；(d)表9所示的所有肽或编码表9所示的所有肽的核酸；(e)表11所示的所有肽或编码表11所示的所有肽的核酸；(f)表13所示的所有肽或编码表13所示的所有肽的核酸；(g)表15所示的所有肽或编码表15所示的所有肽的核酸；(h)表17所示的所有肽或编码表17所示的所有肽的核酸；(i)表19所示的所有肽或编码表19所示的所有肽的核酸；(j)表21所示的所有肽或编码表21所示的所有肽的核酸。
22.一种重组细菌菌株，其包含核酸，所述核酸编码根据实施方案1-9所述的任一种分离的肽。
23.一种重组细菌菌株，其包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据实施方案1-9所述的分离肽中的两种或更多种。
24.根据实施方案23所述的重组细菌菌株，其中所述两种或更多种肽包含：(a)表3所示肽中的两个或多个或编码表3所示肽中的两个或多个的核酸；(b)表5所示肽中的两个或多个或编码表5所示肽中的两个或多个的核酸；(c)表7所示肽中的两个或多个或编码表7所示肽中的两个或多个的核酸；(d)表9所示肽中的两个或多个或编码表9所示肽中的两个或多个的核酸；(e)表11所示肽中的两个或多个或编码表11所示肽中的两个或多个的核酸；(f)表13所示肽中的两个或多个或编码表13所示肽中的两个或多个的核酸；(g)表15所示肽中的两个或多个或编码表15所示肽中的两个或多个的核酸；(h)表17所示肽中的两个或多个或编码表17所示肽中的两个或多个的核酸；(i)表19所示肽中的两个或多个或编码表19所示肽中的两个或多个的核酸；或者(j)表21所示肽中的两个或多个或编码表21所示肽中的两个或多个的核酸。
25.根据实施方案24所述的重组细菌菌株，其中所述两种或更多种肽包含：(a)表3所示的所有肽或编码表3所示的所有肽的核酸；(b)表5所示的所有肽或编码表5所示的所有肽的核酸；(c)表7所示的所有肽或编码表7所示的所有肽的核酸；(d)表9所示的所有肽或编码表9所示的所有肽的核酸；(e)表11所示的所有肽或编码表11所示的所有肽的核酸；(f)表13所示的所有肽或编码表13所示的所有肽的核酸；(g)表15所示的所有肽或编码表15所示的所有肽的核酸；(h)表17所示的所有肽或编码表17所示的所有肽的核酸；(i)表19所示的所有肽或编码表19所示的所有肽的核酸；或者(j)表21所示的所有肽或编码表21所示的所有肽的核酸。
26.根据实施方案23-25中任一项所述的重组细菌菌株，其中两种或更多种肽的组合与以下HLA类型中的每一种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
27.根据实施方案22-26中任一项所述的重组细菌菌株，其中所述细菌菌株为沙门氏菌属、李斯特菌属、耶尔森氏菌属、志贺氏菌属或分枝杆菌属菌株。
28.根据实施方案27所述的重组细菌菌株，其中所述细菌菌株为李斯特菌属菌株，任选地其中所述李斯特菌属菌株为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株。
29.一种重组李斯特菌属菌株，其包括核酸，所述核酸包括编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包括与癌症相关蛋白的免疫原性片段融合的含PEST的肽，其中所述片段包括异变突变。
30.根据实施方案29所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述异变突变是在锚定位置上突变为优选氨基酸。
31.根据实施方案29或30所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述片段的长度为约7至约11个氨基酸，长度为约8至约10个氨基酸，或长度为约9个氨基酸。
32.根据实施方案29-31中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述癌症相关蛋白为癌症睾丸抗原或癌胚抗原。
33.根据实施方案29-32中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述癌症相关蛋白由以下人类基因中的一个编码：CEACAM5、GAGE1、TERT、KLHL7、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、NUF2、NYESO1、PAGE4、PRAME、PSA、PSMA、RNF43、SART3、SSX2、STEAP1和SURVIVIN。
34.根据实施方案33所述的重组李斯特菌属菌株，其中：
(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个；(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段包含SEQ IDNO：110和112中的任一个；(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段包含SEQ IDNO：114；(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：116；(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：118、120、122和124中的任一个；(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：126；(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：128；(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：130和132中的任一个；(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：134和136中的任一个；(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：138；(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：140；(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：142；(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：144；(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：146；(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：148；(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段包含SEQID NO：150；(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：152和154中的任一个；或者(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：156和158中的任一个。
35.根据实施方案34所述的重组李斯特菌属菌株，其中：
(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段由SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个组成；(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段由SEQ IDNO：110和112中的任一个组成；(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段由SEQ IDNO：114组成；(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段由SEQ ID NO：116组成；(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：118、120、122和124中的任一个组成；(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段由SEQ ID NO：126组成；(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段由SEQ ID NO：128组成；(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：130和132中的任一个组成；(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：134和136中的任一个组成；(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段由SEQ ID NO：138组成；(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段由SEQ ID NO：140组成；(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：142组成；(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：144组成；(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段由SEQ ID NO：146组成；(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：148组成；(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：150组成；(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：152和154中的任一个组成；或者(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段由SEQ ID NO：156和158中的任一个组成。
36.根据实施方案29-35所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述片段与以下HLA类型中的一种或多种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
37.根据实施方案29-36中任一项所述的重组李斯特菌属真菌，其中所述含PEST的肽包含细菌分泌信号序列，并且所述融合多肽还包含与所述片段融合的泛素蛋白，其中所述含PEST的肽、所述泛素和所述羧基末端抗原性肽从融合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列。
38.根据实施方案29-37中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含与癌症相关蛋白的两种或多种免疫原性片段融合的所述含PEST的肽，其中所述两种或多种片段中的每种包含异变突变。
39.根据实施方案38所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段彼此直接融合而没有插入序列。
40.根据实施方案38所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段通过肽接头彼此连接。
41.根据实施方案40所述的重组李斯特菌属菌株，其中将SEQ ID NO：209-217所示的一种或多种接头用于连接所述两种或多种免疫原性片段。
42.根据实施方案38-41所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽中两种或更多种免疫原性片段的组合与以下HLA类型中的每种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
43.根据实施方案38-42中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段包含：(a)表3所示肽中的两个或多个；(b)表5所示肽中的两个或多个；(c)表7所示肽中的两个或多个；(d)表9所示肽中的两个或多个；(e)表11所示肽中的两个或多个；(f)表13所示肽中的两个或多个；(g)表15所示肽中的两个或多个；(h)表17所示肽中的两个或多个；(i)表19所示肽中的两个或多个；或者(j)表21所示肽中的两个或多个。
44.根据实施方案43所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段包含：(a)表3所示的所有肽；(b)表5所示的所有肽；(c)表7所示的所有肽；(d)表9所示的所有肽；(e)表11所示的所有肽；(f)表13所示的所有肽；(g)表15所示的所有肽；(h)表17所示的所有肽；(i)表19所示的所有肽；或者(j)表21所示的所有肽。
45.根据实施方案29-44中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST的肽在所述融合多肽的N-末端上。
46.根据实施方案45所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST的肽为LLO的N末端片段。
47.根据实施方案46所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述LLO的N-末端片段具有SEQ ID NO：59所示的序列。
48.根据实施方案29-47中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸在游离型(episomal)质粒中。
49.根据实施方案29-48中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸不赋予所述重组李斯特菌属菌株以抗生素抗性。
50.根据实施方案29-49中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株为减毒营养缺陷型李斯特菌属菌株。
51.根据实施方案50所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述减毒营养缺陷型李斯特菌属菌株包括一种或多种内源基因上的突变，所述突变使所述一种或多种内源基因失活。
52.根据实施方案51所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述一种或多种内源基因包括actA、dal和dat。
53.根据实施方案29-52中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸包含编码代谢酶的第二开放阅读框。
54.根据实施方案53所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述代谢酶为丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶。
55.根据实施方案29-54中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中从hly启动子表达所述融合多肽。
56.根据实施方案29-55中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株。
57.根据实施方案29-56中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株为减毒单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株，其包括actA、dal和dat的缺失或失活突变，其中所述核酸在游离型质粒中且包含编码丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶的第二开放阅读框，并且其中所述含PEST的肽为LLO的N末端片段。
58.一种免疫原性组合物，其包含：(a)根据实施方案22-28中任一项所述的重组细菌菌株或根据实施方案29-57中任一项所述的重组李斯特菌属菌株；和(b)佐剂。
59.根据实施方案58所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括去毒李斯特菌溶素O(dtLLO)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰基脂质A或未甲基化的含CpG的寡核苷酸。
60.一种在受试者中诱导或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1-9中任一项所述的分离的肽，根据实施方案10-16中任一项所述的核酸，根据实施方案17-21中任一项所述的药物组合物，根据实施方案22-28中任一项所述的重组细菌菌株，根据实施方案29-57中任一项所述的重组李斯特菌属菌株或根据实施方案58-59中任一项所述的免疫原性组合物。
61.一种在受试者中预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1-9中任一项所述的分离的肽，根据实施方案10-16中任一项所述的核酸，根据实施方案17-21中任一项所述的药物组合物，根据实施方案22-28中任一项所述的重组细菌菌株，根据实施方案29-57中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，或根据实施方案58-59中任一项所述的免疫原性组合物。
62.根据实施方案60或61所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、低级神经胶质瘤、结肠直肠癌或头颈癌。
序列简述
使用标准核苷酸碱基字母缩写和氨基酸三字母代码显示随附序列表中所列的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列遵循在序列的5'末端开始，并且前进(即在各行中从左至右)直至3'末端的标准惯例。仅显示各核苷酸序列的一个链，但互补链应理解为通过对所显示链的任何提及来包括。当提供编码氨基酸序列的核苷酸序列时，应了解也提供其编码同一氨基酸序列的密码子简并变体。氨基酸序列遵循在序列的氨基末端开始，并且前进(即在各行中从左至右)直至羧基末端的标准惯例。
Figure BDA0002571091800000981
Figure BDA0002571091800000991
Figure BDA0002571091800001001
Figure BDA0002571091800001011
Figure BDA0002571091800001021
实施例
实施例1.用于异变肽设计的计算机方法
设计来自肿瘤相关蛋白的异变肽(即序列优化的肽)来使由I类MHC等位基因达成的呈递增加。异变肽通过改变由肿瘤相关抗原基因表达的肽来获得，因为这些基因代表在肿瘤组织中表达、但在正常健康组织中具有极小表达的基因。特定来说，从癌症相关蛋白诸如癌症睾丸抗原或癌胚抗原设计(即从肿瘤相关抗原设计)异变肽。癌症睾丸抗原(CTA)是一大家族的在不同组织学来源的人肿瘤中表达、但除男性生殖细胞之外不在正常组织中表达的肿瘤相关抗原。在癌症中，这些发育抗原可被重新表达，并且可充当免疫活化的位置。癌胚抗原(OFA)是通常仅在胎儿发育期间存在、但见于患有某些种类的癌症的成人中的蛋白质。CTA和OFA的表达的肿瘤限制样式使得它们成为肿瘤特异性免疫疗法的理想靶标。多个OFA/CTA的组合能使患者覆盖范围最大化。大多数OFA/CTA蛋白在肿瘤发生方面起关键作用，因此靶向它们可显著损害癌增殖。将多个OFA/CTA肽组合会在一个治疗中呈现多个在患有靶标疾病的潜在所有患者中表达的高亲合力靶标。
针对在北美洲四个最普遍HLA来从在某一癌症类型中具有多达100％表达的基因设计异变物。所选HLA类型包括A0201、A0301、A2402和B0702，其在北美洲在白种人中分别具有47.8％、20.6％、20.6％和28.7％的频率，并且在北美洲在非裔美国人中具有16.8％、23.8％、8.9％和16.0％的频率。这使每名患者至少1个肽-MHC组合的机率增加。已显示异变序列足以引发T细胞应答、克服中枢耐受性并且引发对野生型肽的成功交叉反应性免疫应答。异变表位的组合会使某一癌症类型内的总患者覆盖范围接近100％的水平。因此，我们不需要在治疗之前对患者测序，因为我们假定他们将表达我们已针对其设计异变肽以涵盖最普遍HLA(HLA-A0201、HLA-A0301、HLA-A2402和HLA-B0702)的肿瘤相关抗原。
进行文献综述来考察适应症-特异性肿瘤相关抗原的基因组图景以产生肿瘤相关抗原(TAA)的候选清单。选择了具有来自文献的免疫原性信息的针对HLA-A0201的异变肽。还选择了针对HLA-A2402的异变肽。
进行第二文献综述以确定候选清单TAA是否含有产生CD8+T淋巴细胞应答的已知免疫原性肽。这个方法主要集中在由来自TAA的9个氨基酸(9聚体)组成的I类MHC表位上。这个步骤鉴定结合至四个HLA类型(HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02)中的一者的呈9聚体形式的潜在肿瘤相关抗原肽(TAAP)。
对TAAP进行序列优化以使与I类MHC分子的结合增强(也称为异变肽)。为对与各HLA的结合进行优化，由免疫表位数据库和分析资源(例如：iedb.org/MHCalleleid/143)评估肽MHC结合基序和氨基酸结合图。将在锚定位置处的优选氨基酸插入TAAP序列中(例如NUF2–野生型：YMMPVNSEV(SEQ ID NO:131)；以及NUF2–异变：YLMPVNSEV(SEQ ID NO:130))。
序列优化的TAAP和野生型TAAP序列的结合亲和力接着使用以下算法中的一种来评估：NetMHC4.0服务器；NetMHCpan4.0服务器；和mhcflurry v0.2.0。
如果对特定HLA的预测结合亲和力等于或强于野生型TAAP序列，那么将序列优化的TAAP加以考虑。
所选序列优化的TAAP接着使用ProImmune的REVEAL测定就与特定HLA的体外结合加以筛选。结合亲和力>＝REVEAL测定的阳性对照肽的45％的TAAP被视为结合剂。
最后，在TCGA RNAseqV2数据集中测量在特定适应症中TAAP的RNA表达水平。计算归一化的RNA表达读数大于0的TCGA样品的百分比。在大多数样品中具有TCGA表达的TAAP被优先考虑。
每个异变抗原肽可包含单个异变突变或可包含两个或更多个异变突变(例如，两个异变突变)。下表提供了示例性的异变突变体肽以及相应的野生型(天然)肽。野生型肽中的在相应的异变肽中修饰的残基以加粗并加下划线表示。
表1.异变抗原性肽和相应的天然肽
Figure BDA0002571091800001041
Figure BDA0002571091800001051
实施例2.异变肽的设计和结合亲和力
选择了几种癌症类型，以针对其开发异变免疫原性肽(序列优化的肿瘤相关抗原肽)。这些包括非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌(例如ER+乳腺癌)、子宫癌、卵巢癌、低级神经胶质瘤、结肠直肠癌(例如MSS结肠直肠癌)和头颈癌症。表2提供了肿瘤相关基因的概述，从中可衍生出针对每种癌症的多肽。最后一列表示前一列中在至少90％的癌症基因组图谱(TCGA)患者中针对该适应症所表达的肿瘤相关抗原(例如CTA/OFA)基因的数量。例如，3个TAA基因在超过90％的NSCLC患者中表达了。其余的TAA基因在<90％的TCGANSCLC患者中表达。
表2.异变肽所来源的肿瘤相关基因的概述
Figure BDA0002571091800001061
非小细胞肺癌(NSCLC)异变肽
选择跨越7个基因的总计11个具有异变突变的肽用于NSCLC异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表3中。各肽中的异变突变描述于表1中。
表3.示例性NSCLC异变9聚体
Figure BDA0002571091800001062
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表4中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表4中也提供各基因在患有NSCLC的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表4中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的NSCLC患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*03:01的NSCLC患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的NSCLC患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的NSCLC患者表达至少一个TAA基因。
表4.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001071
Figure BDA0002571091800001081
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
&-SEQ ID NO:118
构建体被设计来编码包含tLLO融合于一个或多个异变肽的融合多肽，伴有C末端异变肽在泛素肽之后(即，异变肽和“小基因”)。融合多肽的tLLO、异变肽和泛素/异变肽组分由选自本文其他地方公开的那些接头的各种接头连结。一示例性融合多肽插入序列(即在tLLO的下游的肽序列)是NSCLC HC+MG(SEQ ID NO:218)。一示例性的编码NSCLC HC+MG的核酸示于SEQ ID NO:220中。
构建体也被设计来编码包含tLLO融合于一个或多个异变肽而无泛素肽的融合多肽(即异变肽，不具有“小基因”)。融合多肽的tLLO和异变肽组分由选自本文其他地方公开的那些接头的各种接头连结。一示例性融合多肽插入序列(即在tLLO的下游的肽序列)是仅NSCLC HC(SEQ ID NO:219)。示例性的仅编码NSCLC HC的核酸示于SEQ ID NO:221和222中。
以下提供各构建体中各个组分的氨基酸位置的细目。
表4B.NSCLC HC+MG插入物的组分的位置.
Figure BDA0002571091800001082
表4C.仅NSCLC HC插入物的组分的位置.
Figure BDA0002571091800001091
前列腺癌异变肽
选择跨越9个基因的总计10个具有异变突变的肽用于前列腺癌异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表5中。各肽中的异变突变描述于表1中。
表5.示例性前列腺癌异变9聚体
Figure BDA0002571091800001092
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表6中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表6中也提供各基因在患有前列腺癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表6中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的前列腺癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*03:01的前列腺癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的前列腺癌患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的前列腺癌患者表达至少一个TAA基因。
表6.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001101
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
胰腺癌异变肽
选择跨越6个基因的总计12个具有异变突变的肽用于胰腺癌异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表7中。各自中的异变突变描述于表1中。
表7.示例性胰腺癌异变9聚体
Figure BDA0002571091800001111
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表8中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表8中也提供各基因在患有胰腺癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表8中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的胰腺癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*03:01的胰腺癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的胰腺癌患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的胰腺癌患者表达至少一个TAA基因。
表8.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001121
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
膀胱癌异变肽
选择跨越8个基因的总计14个具有异变突变的肽用于膀胱癌异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表9中。各自中的异变突变描述于表1中。
表9.示例性膀胱癌异变9聚体
Figure BDA0002571091800001131
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表10中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表10中也提供各基因在患有膀胱癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表10中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的膀胱癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*03:01的膀胱癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的膀胱癌患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的膀胱癌患者表达至少一个TAA基因。
表10.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001141
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
乳腺癌异变肽
选择跨越6个基因的总计11个具有异变突变的肽用于乳腺癌异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表11中。各自中的异变突变描述于表1中。
表11.示例性乳腺癌异变9聚体
Figure BDA0002571091800001151
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表12中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表12中也提供各基因在患有乳腺癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表12中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的乳腺癌患者表达至少一个TAA基因，95％的具有HLA类型A*03:01的乳腺癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的乳腺癌患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的乳腺癌患者表达至少一个TAA基因。
表12.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001161
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
子宫癌异变肽
选择跨越8个基因的总计14个具有异变突变的肽用于子宫癌异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表13中。各自中的异变突变描述于表1中。
表13.示例性子宫癌异变9聚体
Figure BDA0002571091800001171
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表14中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表14中也提供各基因在患有子宫癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表14中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的子宫癌患者表达至少一个TAA基因，83％的具有HLA类型A*03:01的子宫癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的子宫癌患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的子宫癌患者表达至少一个TAA基因。
表14.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001181
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
1–SEQ ID NO:100
2–SEQ ID NO:102
卵巢癌异变肽
选择跨越8个基因的总计14个具有异变突变的肽用于卵巢癌异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表15中。各自中的异变突变描述于表1中。
表15.示例性卵巢癌异变9聚体
Figure BDA0002571091800001191
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表16中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表16中也提供各基因在患有卵巢癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表16中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的卵巢癌患者表达至少一个TAA基因，83％的具有HLA类型A*03:01的卵巢癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的卵巢癌患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的卵巢癌患者表达至少一个TAA基因。
表16.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001201
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
1–SEQ ID NO:100
2–SEQ ID NO:102
低级神经胶质瘤(LGG)异变肽
选择跨越8个基因的总计10个具有异变突变的肽用于LGG异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表17中。各自中的异变突变描述于表1中。
表17.示例性LGG异变9聚体
Figure BDA0002571091800001211
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表18中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表18中也提供各基因在患有低级神经胶质瘤(LGG)的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表18中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的LGG患者表达至少一个TAA基因，43％的具有HLA类型A*03:01的LGG患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的LGG患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的LGG患者表达至少一个TAA基因。
表18.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001221
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
结肠直肠癌(CRC)异变肽
选择跨越8个基因的总计10个具有异变突变的肽用于CRC异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表19中。各自中的异变突变描述于表122中。
表19.示例性CRC异变9聚体
Figure BDA0002571091800001222
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表20中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表20中也提供各基因在患有结肠直肠癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表20中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的结肠直肠癌患者表达至少一个TAA基因，98％的具有HLA类型A*03:01的结肠直肠癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的结肠直肠癌患者表达至少一个TAA基因，并且98％的具有HLA类型B*07:02的结肠直肠癌患者表达至少一个TAA基因。
表20.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001231
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
头颈癌异变肽
选择跨越6个基因的总计10个具有异变突变的肽用于头颈癌异变肽。对于各异变突变，如实施例1中以及在本文中其他地方所述设计长度是9个氨基酸的肽。肽显示于表21中。各自中的异变突变描述于表1中。
表21.示例性头颈癌异变9聚体
Figure BDA0002571091800001241
异变9聚体肽的计算机预测的结合亲和力和体外结合亲和力提供于表22中。计算机预测的结合亲和力基于NetMHC4.0算法，其以50％抑制浓度(IC50)值(nM)预测肽与I类MHC分子的结合；较低数值反映较强的预测的结合亲和力。体外结合亲和力通过结合测定来测定，所述结合测定通过将结合与高亲和力T细胞表位的结合进行比较来测定各候选肽结合所指示I类MHC等位基因以及使MHC-肽复合物稳定的能力。简要来说，在体外测定中，使各肽与它的特定HLA分子一起孵育。相对于同一HLA分子的作为阳性对照的已知免疫原性肽，比较结合强度，其中阳性对照结合评分设置成100％。序列优化的结合评分相对于对照肽加以归一化。也就是说，相对于是具有极其强的结合性质的已知T细胞表位的阳性对照肽，对各肽给予评分。异变测试肽的评分定量地报告为由阳性对照肽产生的信号的百分比。具有大于或等于阳性对照的45％的评分的肽被视为结合剂。表22中也提供各基因在患有头颈癌的患者中的表达百分比(癌症基因组图谱(TCGA)数据库)、所测试的HLA等位基因、以及对应于各异变肽的野生型肽是否已知具有免疫原性。对于包括表22中的各异变肽的构建体，100％的具有HLA类型A*02:01的头颈癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*03:01的头颈癌患者表达至少一个TAA基因，100％的具有HLA类型A*24:02的头颈癌患者表达至少一个TAA基因，并且100％的具有HLA类型B*07:02的头颈癌患者表达至少一个TAA基因。
表22.异变9聚体对HLA的结合亲和力.
Figure BDA0002571091800001251
#-NetMHC4.0
^-相对于阳性对照肽结合的％
实施例3.概念验证：Lm异变WT1小基因融合蛋白构建体的功效.
肽小基因表达系统用于评估靶向威尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)蛋白的独特异变小基因。这个表达系统被设计来促进各组在羧基末端含有不同肽部分的重组蛋白的克隆。这通过简单PCR反应利用编码一个信号序列(SS)-泛素(Ub)-抗原性肽构建体的序列作为模板来实现。通过使用延伸至Ub序列的羧基末端区域中的引物以及在所述引物的3’末端引入所需肽序列的密码子，可在单一PCR反应中产生新的SS-Ub-肽序列。对于所有构建体，编码细菌启动子和信号序列(例如LLO或ActA1-100分泌信号)的前几个核苷酸的5’引物都可为相同的。使用这个策略产生的构建体示意性地表示在图1A和图1B中。
小基因系统的一个优势是将有可能使用单一李斯特菌属载体构建体来用多个肽对细胞进行装载。多个肽可使用上述单一肽表达系统的修改引入重组减毒李斯特菌属(例如Lmdda)中。编码来自依序SS-Ub-肽序列的多个不同肽的嵌合蛋白可在一个插入物中加以编码。参见例如图1B。Shine-Dalgarno核糖体结合位点可引入在各SS-Ub-肽编码序列之前以使得各个肽构建体能够单独翻译。图1B显示被设计来从一个重组李斯特菌属菌株表达三个单独肽抗原的构建体的示意性图示。
为评估由ADXS Lmdda李斯特菌属构建体达成的tLLO-WT1-异变融合蛋白的表达，在pAdv134质粒中产生靶向威尔姆斯肿瘤1蛋白的独特异变小基因，并且将其转化至Lmdda中。pAdv134 tLLO质粒编码以SEQ ID NO:59示出的N末端LLO片段。tLLO-WT1异变融合蛋白从N末端至C末端包含：以SEQ ID NO:59示出的N末端LLO片段，随后是以SEQ ID NO:99示出的FLAG标签，随后是以SEQ ID NO:188示出的泛素序列，随后是下表23中所列的异变WT1 9聚体。
表23.异变WT1肽.
Figure BDA0002571091800001261
组合WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸构建体(1号构建体)以SEQ ID NO:189示出(tLLO＝1-441；FLAG＝442-462；泛素＝463-537；异变苯丙氨酸肽＝538-546)。产生一个额外构建体(Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸小基因构建体)，其靶向3个WT1肽(P1-P2-P3；分别是SEQ ID NO:190(RSDELVRHHNMHQRNMTKL)、191(PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG)和192(SGQAYMFPNAPYLPSCLES))。各‘P’肽包含19-22个氨基酸，在长度方面足以提供额外CD4 T辅助细胞表位。三个肽由接头分隔。P3肽含有使SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:193)转变成SGQAYMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:192)的异变突变。除异变P3肽之外，Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸小基因构建体也在C末端含有泛素-YMFPNAPYL(SEQ ID NO:169)部分。组合WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸小基因构建体以SEQ ID NO:194示出(tLLO＝1-441；野生型WT1肽v14—WT1-427长型＝442-460；野生型WT1肽v15—WT1-331长型＝466-487；异变WT1肽v1B—WT1-122A1-长型＝493-511；FLAG＝512-532；泛素＝533-607；异变酪氨酸肽＝608-616)。通过蛋白质印迹来测定各单独Lmdda构建体的独特异变WT1小基因产物的tLLO-融合蛋白表达。
针对独特异变WT1小基因产物的tLLO-融合蛋白表达，通过蛋白质印迹来测定1号构建体(Lmdda-WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸小基因构建体)和Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸小基因构建体。来自各板的含有Lm WT1小基因构建体的单一菌落用于接种以在37℃下在干燥振荡孵育器中在6mL脑心浸液(BHI)肉汤中进行过夜培养。次日，将1:10稀释的原始过夜培养物再混悬于9mL新鲜BHI中，并且在37℃下在干燥振荡孵育器中生长直至达到OD600＝0.6。通过在13000RPM下离心2分钟来使细胞沉淀。收集样品上清液，并且在SDS-PAGE上跑。将样品通过用25μL 4X LDS样品缓冲液(目录号161-0747)稀释75μL样品来制备，在98℃下煮沸10分钟，放置在冰上，接着在4℃下在最大速度下离心10分钟。在4-15％预浇制蛋白质凝胶(BioRad目录号4561086)上跑13μL样品。使用Trans-BlotTurbo转移设备(目录号170-4155)和PVDF中型转移包装(Bio-Rad#170-4157)来转移蛋白质凝胶。使印迹与作为一级抗体的抗FLAG单克隆抗体(Sigma F1804)或抗-LLO(Abcamab200538)和作为二级抗体的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合(sc2005)一起孵育。接着将印迹在iBind Flex(Invitrogen目录号1772866)上孵育，洗涤，接着通过Super Signal West Dura延长持续时间底物(ThermoFisher#34076)来显色；在Amersham Imager 600(GE)上显现图像。
确认了独特tLLO-WT1-异变小基因融合蛋白的表达和分泌。来自1号构建体和Lmdda-WT1-P1-P2-P3-YMFPNAPYL(SEQ ID NO:169)异变酪氨酸+小基因构建体的培养上清液的抗Flag标签抗体蛋白质印迹分别显示于图2A和图2B中。我们能够检测到对应于各单独tLLO-WT1-异变小基因融合蛋白的正确大小和身份的蛋白质条带。这些数据证明靶向WT1蛋白内的多个肽片段的异变肽能够使用pAdv134质粒和Lmdda李斯特菌属菌株来产生。
对于表23中的2-9号构建体，各单独Lmdda构建体通过菌落PCR来测定以根据含有异变WT1小基因的各独特tLLO-融合蛋白检测质粒DNA。
表24.材料.
材料 供应商 目录号/序列
DreamTaq DNA聚合酶 ThermoFisher EP0702
正向引物(Adv16f)* ThermoFisher 5’-catcgatcactctgga-3’(SEQ ID NO:195)
反向引物(Adv295r)* ThermoFisher 5’-ctaactccaatgttacttg-3’(SEQ ID NO:196)
10mM dNTP NEB N0447S
TrackIt 1kB Plus DNA梯形物 ThermoFisher 10488085
程序
使用的一般性菌落PCR程序如下。获得具有大型菌落的板(通常，在37℃下生长24小时的板适用于这个程序)。如下产生用于PCR的主混合物。
Figure BDA0002571091800001281
将20μL主混合物等分至各PCR管中。使用吸移器尖端(10-20μL体积最适用)，从一个菌落舀起充足体积。将吸移器尖端向PCR管中轻叩数次，并且涡旋以移去细菌。使用以下PCR程序在热循环仪中跑PCR反应。
Figure BDA0002571091800001291
将PCR管从热循环仪移除，添加4μL 6X上样染料。在1％琼脂糖凝胶上与10μL1kb+DNA梯形物并排跑10μL各PCR反应物。引物将额外163个碱基对添加至产物中。正向引物结合在tLLO的3’末端的上游的70个碱基对(包括XhoI位点)。反向引物结合在终止位点的下游的93个碱基对(包括XmaI位点)。
显示Lmdda菌株含有来自表23的2-9号pAdv134 WT1-异变质粒的代表性菌落PCR结果显示于图3中。我们能够检测到对应于各单独tLLO-WT1-异变小基因质粒的正确大小和身份的DNA条带。这些数据证明靶向WT1蛋白内的多个肽片段的异变肽能够使用pAdv134质粒和Lmdda李斯特菌属菌株来产生，这指示所述构建体可作为治疗性组合物用于靶向WT1以产生或增强针对WT1和WT1表达性癌症和肿瘤的免疫应答。
为评估在使用两种不同WT1构建体的情况下WT1特异性T细胞应答在AAD小鼠中的产生，进行ELISpot以测定所需疫苗诱导的Ag特异性应答。AAD小鼠(B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J；The Jackson Laboratory–库存编号：004191)是表达物种间杂合I类MHC基因AAD的转基因小鼠，所述AAD含有人HLA-A2.1基因的α-1结构域和α-2结构域以及小鼠H-2Dd基因的α-3跨膜结构域和细胞质结构域，处于人HLA-A2.1启动子的指导下。这个转基因品系使得能够对针对HLA-A2呈递抗原的人T细胞免疫应答建模，并且可用于测试用于感染性疾病或癌症疗法的疫苗。免疫方案提供于表25中。所用小鼠是8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠。
表25.免疫方案.
Figure BDA0002571091800001301
疫苗制备.简要来说，将各甘油储备物在所需营养物板上划线，并且使其生长过夜。单一菌落用于在抗生素选择下在脑心浸液(BHI)肉汤的过夜培养物中生长。过夜培养物在1:10(vol/vol)稀释度下用于接种新鲜BHI肉汤。在37℃下在轨道式振荡器中孵育细菌1–3小时直至对数中期，OD是约0.6-0.7。用处于PBS中的1x109 CFU Lm通过腹膜内(i.p.)接种来感染小鼠。
ELISPOT.在第18天，根据IACUC方案通过CO2窒息来将小鼠处死，收集脾，并且将脾细胞单细胞混悬液涂铺在96孔板上并用野生型肽或异变肽(表26)刺激。用其他对野生型肽和异变肽(表27)进行类似实验。ELISPOT测定用于对针对野生型肽或异变肽起应答的抗原特异性CD8 T细胞进行计数。完整ELISPOT方案根据CTL immunospot(www.immunospot.com/resources/protocols/ELISPOT-protocol.htm)。
表26.野生型和异变WT1肽.
Figure BDA0002571091800001311
表27.野生型和异变WT1肽.
野生型 异变
SLGEQQYSV(SEQ ID NO:198) YLGEQQYSV(SEQ ID NO:161)
ALLPAVPSL(SEQ ID NO:199) YLLPAVPSL(SEQ ID NO:162)
DLNALLPAV(SEQ ID NO:200) YLNALLPAV(SEQ ID NO:163)
ALLLRTPYS(SEQ ID NO:201) ALLLRTPYV(SEQ ID NO:164)
NLGATLKGV(SEQ ID NO:202) YLGATLKGV(SEQ ID NO:165)
KRYFKLSHL(SEQ ID NO:203) KLYFKLSHL(SEQ ID NO:166)
CMTWNQMNL(SEQ ID NO:204) YMTWNQMNL(SEQ ID NO:167)
GVFRGIQDV(SEQ ID NO:205) GLRRGIQDV(SEQ ID NO:168)
以下提供一通用ELISPOT方案。
第0天(无菌条件).通过根据特定方案稀释捕集抗体来制备捕集溶液。许多细胞因子受益于在将80μL捕集溶液添加至各孔中之前用70％乙醇使PVDF膜预湿30秒，以及用150μL PBS洗涤三次。在含湿气腔室中在4℃下将板孵育过夜。
第1天(无菌条件).通过添加1％新鲜L-谷氨酰胺来制备CTL-TestTM培养基。在CTL-TestTM培养基中在2X最终浓度下制备抗原/有丝分裂原溶液。将来自第0天的具有涂布抗体的板倾析，并且用150μL PBS洗涤一次。涂铺抗原/有丝分裂原溶液，100μL/孔。在解冻PBMC或用密度梯度分离白细胞之后，在CTL-TestTM培养基中将PBMC调整至所需浓度，例如对应于300,000个细胞/孔的300万/mL(然而，细胞数目可根据预期斑点计数调整，因为100,000-800,000个细胞/孔将提供线性结果)。在处理PBMC时以及直至涂铺，使细胞在37℃下保持在5-9％CO2含湿气孵育器中。使用大口尖端以100μL/孔涂铺PBMC。一旦完成，即温和轻叩板的侧面，并且立刻放置至5-9％CO237℃含湿气孵育器中。视你的细胞因子而定，孵育24-72小时。不要将各板叠加。通过小心打开和关闭孵育器门来避免使板振荡。在孵育期间不要触碰板。
第2天.制备当天使用的洗涤溶液：PBS、蒸馏水和吐温(Tween)-PBS。通过根据特定方案稀释检测抗体来制备检测溶液。用PBS将板洗涤两次，接着用0.05％吐温-PBS洗涤两次，每次200μL/孔。添加80μL/孔检测溶液。在室温下孵育2小时。根据特定方案通过稀释三级抗体来制备三级溶液。用200μL/孔的0.05％吐温-PBS将板洗涤三次。添加80μL/孔的Strep-AP溶液。在室温下孵育30分钟。根据你的特定方案制备显色溶液。用0.05％吐温-PBS将板洗涤两次，接着用蒸馏水洗涤两次，每次200μL/孔。添加80μL/孔的显色溶液。在室温下孵育10-20分钟。通过用自来水温和冲洗膜来终止反应，倾析，并且重复三次。移除板的保护性暗渠，并且用自来水冲洗板的背部。使板在运行的通风橱中正面向下风干2小时，或在工作台台面上在纸巾上风干24小时。对板进行扫描和计数。
HLA-A2转基因B6小鼠如所述加以疫苗接种，并且将脾细胞用特定WT1肽(RMFPNAPYL(SEQ ID NO:197)、FMFPNAPYL(SEQ ID NO 160))离体刺激并通过IFNg ELISpot测定来分析。异变疫苗接种(WT1-F小基因：FMFPNAPYL；SEQ ID NO:160)在经免疫HLA2转基因小鼠中诱导Ag特异性T细胞应答。参见图4和图6B。此外，异变疫苗接种引发与天然WT1肿瘤抗原(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:197)交叉反应的T细胞应答。参见图4和图6A。数据证明用WT1-F异变小基因疫苗接种疫苗可引发与WT1天然肿瘤抗原(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:197)具有交叉反应性的T细胞。总之，数据证明异变小基因疫苗可引发与天然肿瘤抗原交叉反应的T细胞。
HLA-A2转基因B6小鼠如所述加以疫苗接种，并且收集脾细胞。通过IFNg ELISpot测定来测定T细胞应答于疫苗特异性YMFPNAPYL肽(SEQ ID NO:169)或天然WT1肽(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:197)来产生IFNg的能力。异变疫苗接种(WT1-AH1-Tyr小基因：YMFPNAPYL；SEQ ID NO:169)在经免疫HLA2转基因小鼠中诱导Ag特异性T细胞应答。参见图5和图7B。此外，异变疫苗接种引发与天然WT1肿瘤抗原(RMFPAPYL；SEQ ID NO:197)交叉反应的T细胞应答。参见图5和图7A。
实施例4.概念验证：异变Lm-AH1构建体在CT26挑战(challenge)研究中的治疗功效.
这个研究考查Lm AH1-HC异变小基因疫苗是否可控制或遏制CT26肿瘤生长。
治疗方案
如表28中所述开始异变AH1-HC疫苗接种，继之以用推荐的疫苗在一周间隔下进行两次加强。
表28.治疗方案.
Figure BDA0002571091800001331
实验细节
疫苗给药细节.AH1-HC是指小鼠用异变AH1-HC疫苗加以初免和加强。
肿瘤细胞系扩增.在具有10％FBS的RPMI中培养CT26细胞系。
肿瘤接种.在第0天(14JUN17)，将CT26细胞用0.25％胰蛋白酶(1X)进行胰蛋白酶处理，并且于PBS中在适当浓度(3x105个细胞/小鼠)下用培养基洗涤两次。将CT26细胞皮下植入在各小鼠的右侧腹中。
治疗.疫苗制备如下：(a)在37℃水浴中解冻来自-80℃的1个小瓶；(b)在14,000rpm下旋转2分钟并丢弃上清液；(c)用1mL PBS洗涤2次并丢弃PBS；和(d)再混悬以达到5x108 CFU/mL的最终浓度。在肿瘤植入之后3-4天开始疫苗给药。
表29.构建体序列.
Figure BDA0002571091800001341
结果和结论
Lm-AH1 HC构建体能够在鼠CT26结肠直肠癌模型中显著控制肿瘤生长。参见图8。
序列表
<110> 阿德瓦希斯公司
<120> 来自癌症相关蛋白的免疫原性异变肽及其使用方法
<130> 62384-522598
<150> US 62/583,292
<151> 2017-11-08
<150> US 62/592,884
<151> 2017-11-30
<160> 977
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
gcacgtagta taatcaactt tgaaaaactg taataa 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
gcacgttcta ttatcaactt cgaaaaacta taataa 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
gcccgcagta ttatcaattt cgaaaaatta taataa 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
gcgcgctcta taattaactt cgaaaaactt taataa 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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gctcgctcta tcatcaattt cgaaaaactt taataa 36
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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gcacgttcca tcattaactt tgaaaaacta taataa 36
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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gctcgctcta ttatcaattt tgaaaaatta taataa 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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gctcgtagta ttattaattt cgaaaaatta taataa 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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gctcgttcga ttatcaactt cgaaaaactg taataa 36
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<220>
<223> 合成的
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gcaagaagca tcatcaactt cgaaaaactg taataa 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
gcgcgttcta ttattaattt tgaaaaatta taataa 36
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<211> 10
<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 16
Ala Arg Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
gattataaag atcatgacgg agactataaa gaccatgaca ttgattacaa agacgacgat 60
gacaaa 66
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 18
gactataaag accacgatgg cgattataaa gaccatgata ttgactacaa agatgatgat 60
gataag 66
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<211> 66
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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gacaaa 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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gactacaaag atcacgatgg tgactacaaa gatcacgaca ttgattataa agacgatgat 60
gacaaa 66
<210> 21
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<223> 合成的
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gataaa 66
<210> 22
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<220>
<223> 合成的
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gattacaaag atcacgatgg cgattacaaa gatcatgaca ttgactacaa agacgatgat 60
gataaa 66
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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gattacaagg atcatgatgg tgattacaaa gatcacgata tcgactacaa agatgatgac 60
gataaa 66
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<220>
<223> 合成的
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gactacaaag atcatgatgg tgattacaaa gatcatgaca ttgattataa agatgatgat 60
gacaaa 66
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gataaa 66
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gacaaa 66
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gactataaag accacgatgg tgattataaa gatcacgaca tcgactacaa agacgatgat 60
gataaa 66
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<223> 合成的
<400> 28
gactacaaag atcacgacgg cgattataaa gatcacgata ttgactataa agatgacgat 60
gataaa 66
<210> 29
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gattataaag accatgatgg agattacaaa gatcatgata ttgactataa agacgacgac 60
gataaa 66
<210> 30
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
gattataaag atcacgatgg tgactacaaa gatcacgata tcgattataa agacgatgac 60
gataaa 66
<210> 31
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
gactacaaag atcacgatgg tgattataaa gaccatgata ttgattacaa agatgatgat 60
gacaaa 66
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Gly Ala Ser Gly Ala Ser
1 5
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<220>
<223> 合成的
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Gly Ser Ala Gly Ser Ala
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<220>
<223> 合成的
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Gly Gly Gly Gly
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<223> 合成的
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Gly Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> 合成的
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Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly
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<213> 人工序列
<220>
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Pro Ala Pro Ala Pro
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Glu Ala Ala Ala Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Ala Tyr Leu Ala Tyr Leu
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Leu Arg Ala Leu Arg Ala
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Arg Leu Arg Ala
1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
20 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Arg Ser Glu Val Thr Ile Ser Pro Ala Glu Thr Pro Glu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Ala Thr Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
<210> 54
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
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<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 56
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
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Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 57
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
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Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 58
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
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Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
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Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
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Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
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Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
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Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
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Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
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Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
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Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
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Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
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Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
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Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
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Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
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405 410 415
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<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 60
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120
ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180
atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240
gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300
gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360
atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420
caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480
atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540
gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600
agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660
tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720
gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780
aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840
gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900
caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960
gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020
tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080
ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140
ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200
aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260
atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320
gat 1323
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<223> 合成的
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1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
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65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
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Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu
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Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
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165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
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225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
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340 345 350
Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
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370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser
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Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe Ile Ser Ser Pro Val Pro
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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370 375 380
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
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275 280 285
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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165 170 175
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Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys
195 200 205
Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro
225 230 235 240
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Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser
325 330 335
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Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr
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<223> 合成的
<400> 67
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
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Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
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Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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<220>
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aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300
aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360
gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
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aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600
aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
<400> 70
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<220>
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<400> 71
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aaaacagaag agcagccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattga ggaactagaa aaatcgaata aagtgaaaaa tacgaacaaa 240
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aaaagaagaa aagccatagc gtcgtcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccagat 480
aaaccaacaa aagcaaataa gagaaaagtg gcgaaagagt cagttgtgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gacgagtcta caccacaacc tttaaaagca 600
aatcaaaaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccgat gcttctcggt 840
tttaatgctc ctactccatc ggaaccgagc tcattcgaat ttccgccgcc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcatt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatt 1020
atgcgggaaa cagcaccttc gctagattct agttttacaa gcggggattt agctagtttg 1080
agaagtgcta ttaatcgcca tagcgaaaat ttctctgatt tcccactaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 72
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Ser Arg Ala Thr Asp Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln
35 40 45
Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val
50 55 60
Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn
65 70 75 80
Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys
85 90 95
Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala
100 105 110
Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu
115 120 125
Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys
130 135 140
Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu
165 170 175
Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser
180 185 190
Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe
195 200 205
Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg
210 215 220
Asp Lys
225
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Gln Asp Asn Lys Arg
1 5
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Glu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Arg
1 5 10
<210> 76
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Met Val Thr Gly Trp His Arg Pro Thr Trp Ile Glu Ile Asp Arg Ala
1 5 10 15
Ala Ile Arg Glu Asn Ile Lys Asn Glu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Ser
20 25 30
Val Asp Leu Trp Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Ile
35 40 45
Ile Glu Val Ala Arg Thr Ala Lys Glu Ala Gly Ala Lys Gly Phe Cys
50 55 60
Val Ala Ile Leu Asp Glu Ala Leu Ala Leu Arg Glu Ala Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ile Leu Val Leu Gly Ala Thr Arg Lys Glu Asp Ala Asn
85 90 95
Leu Ala Ala Lys Asn His Ile Ser Leu Thr Val Phe Arg Glu Asp Trp
100 105 110
Leu Glu Asn Leu Thr Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ile His Leu Lys Val
115 120 125
Asp Ser Gly Met Gly Arg Leu Gly Ile Arg Thr Thr Glu Glu Ala Arg
130 135 140
Arg Ile Glu Ala Thr Ser Thr Asn Asp His Gln Leu Gln Leu Glu Gly
145 150 155 160
Ile Tyr Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Gln Leu Glu Thr Ser Tyr Phe
165 170 175
Glu Gln Gln Leu Ala Lys Phe Gln Thr Ile Leu Thr Ser Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Pro Thr Tyr Val His Thr Ala Asn Ser Ala Ala Ser Leu Leu Gln
195 200 205
Pro Gln Ile Gly Phe Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ile Ser Met Tyr Gly
210 215 220
Leu Thr Pro Ser Thr Glu Ile Lys Thr Ser Leu Pro Phe Glu Leu Lys
225 230 235 240
Pro Ala Leu Ala Leu Tyr Thr Glu Met Val His Val Lys Glu Leu Ala
245 250 255
Pro Gly Asp Ser Val Ser Tyr Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Thr Glu Arg
260 265 270
Glu Trp Val Ala Thr Leu Pro Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Leu Ile Arg
275 280 285
His Tyr Ser Gly Phe His Val Leu Val Asp Gly Glu Pro Ala Pro Ile
290 295 300
Ile Gly Arg Val Cys Met Asp Gln Thr Ile Ile Lys Leu Pro Arg Glu
305 310 315 320
Phe Gln Thr Gly Ser Lys Val Thr Ile Ile Gly Lys Asp His Gly Asn
325 330 335
Thr Val Thr Ala Asp Asp Ala Ala Gln Tyr Leu Asp Thr Ile Asn Tyr
340 345 350
Glu Val Thr Cys Leu Leu Asn Glu Arg Ile Pro Arg Lys Tyr Ile His
355 360 365
<210> 77
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Met Lys Val Leu Val Asn Asn His Leu Val Glu Arg Glu Asp Ala Thr
1 5 10 15
Val Asp Ile Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr Glu
20 25 30
Val Val Arg Leu Tyr Asn Gly Lys Phe Phe Thr Tyr Asn Glu His Ile
35 40 45
Asp Arg Leu Tyr Ala Ser Ala Ala Lys Ile Asp Leu Val Ile Pro Tyr
50 55 60
Ser Lys Glu Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Val Ala Glu Asn
65 70 75 80
Asn Ile Asn Thr Gly Asn Val Tyr Leu Gln Val Thr Arg Gly Val Gln
85 90 95
Asn Pro Arg Asn His Val Ile Pro Asp Asp Phe Pro Leu Glu Gly Val
100 105 110
Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Val Pro Arg Asn Glu Arg Gln Phe Val
115 120 125
Glu Gly Gly Thr Ala Ile Thr Glu Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys
130 135 140
Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Asn Ile Leu Ala Lys Asn Lys
145 150 155 160
Ala His Gln Gln Asn Ala Leu Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Glu Gln
165 170 175
Val Thr Glu Cys Ser Ala Ser Asn Val Ser Ile Ile Lys Asp Gly Val
180 185 190
Leu Trp Thr His Ala Ala Asp Asn Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg
195 200 205
Gln Val Ile Ile Asp Val Ala Lys Lys Asn Gly Ile Pro Val Lys Glu
210 215 220
Ala Asp Phe Thr Leu Thr Asp Leu Arg Glu Ala Asp Glu Val Phe Ile
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Ile Glu Ile Thr Pro Ile Thr His Ile Asp Gly Val
245 250 255
Gln Val Ala Asp Gly Lys Arg Gly Pro Ile Thr Ala Gln Leu His Gln
260 265 270
Tyr Phe Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Cys Gly Glu Leu Glu Phe Ala
275 280 285
Lys
<210> 78
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
atggtgacag gctggcatcg tccaacatgg attgaaatag accgcgcagc aattcgcgaa 60
aatataaaaa atgaacaaaa taaactcccg gaaagtgtcg acttatgggc agtagtcaaa 120
gctaatgcat atggtcacgg aattatcgaa gttgctagga cggcgaaaga agctggagca 180
aaaggtttct gcgtagccat tttagatgag gcactggctc ttagagaagc tggatttcaa 240
gatgacttta ttcttgtgct tggtgcaacc agaaaagaag atgctaatct ggcagccaaa 300
aaccacattt cacttactgt ttttagagaa gattggctag agaatctaac gctagaagca 360
acacttcgaa ttcatttaaa agtagatagc ggtatggggc gtctcggtat tcgtacgact 420
gaagaagcac ggcgaattga agcaaccagt actaatgatc accaattaca actggaaggt 480
atttacacgc attttgcaac agccgaccag ctagaaacta gttattttga acaacaatta 540
gctaagttcc aaacgatttt aacgagttta aaaaaacgac caacttatgt tcatacagcc 600
aattcagctg cttcattgtt acagccacaa atcgggtttg atgcgattcg ctttggtatt 660
tcgatgtatg gattaactcc ctccacagaa atcaaaacta gcttgccgtt tgagcttaaa 720
cctgcacttg cactctatac cgagatggtt catgtgaaag aacttgcacc aggcgatagc 780
gttagctacg gagcaactta tacagcaaca gagcgagaat gggttgcgac attaccaatt 840
ggctatgcgg atggattgat tcgtcattac agtggtttcc atgttttagt agacggtgaa 900
ccagctccaa tcattggtcg agtttgtatg gatcaaacca tcataaaact accacgtgaa 960
tttcaaactg gttcaaaagt aacgataatt ggcaaagatc atggtaacac ggtaacagca 1020
gatgatgccg ctcaatattt agatacaatt aattatgagg taacttgttt gttaaatgag 1080
cgcataccta gaaaatacat ccattag 1107
<210> 79
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
atgaaagtat tagtaaataa ccatttagtt gaaagagaag atgccacagt tgacattgaa 60
gaccgcggat atcagtttgg tgatggtgta tatgaagtag ttcgtctata taatggaaaa 120
ttctttactt ataatgaaca cattgatcgc ttatatgcta gtgcagcaaa aattgactta 180
gttattcctt attccaaaga agagctacgt gaattacttg aaaaattagt tgccgaaaat 240
aatatcaata cagggaatgt ctatttacaa gtgactcgtg gtgttcaaaa cccacgtaat 300
catgtaatcc ctgatgattt ccctctagaa ggcgttttaa cagcagcagc tcgtgaagta 360
cctagaaacg agcgtcaatt cgttgaaggt ggaacggcga ttacagaaga agatgtgcgc 420
tggttacgct gtgatattaa gagcttaaac cttttaggaa atattctagc aaaaaataaa 480
gcacatcaac aaaatgcttt ggaagctatt ttacatcgcg gggaacaagt aacagaatgt 540
tctgcttcaa acgtttctat tattaaagat ggtgtattat ggacgcatgc ggcagataac 600
ttaatcttaa atggtatcac tcgtcaagtt atcattgatg ttgcgaaaaa gaatggcatt 660
cctgttaaag aagcggattt cactttaaca gaccttcgtg aagcggatga agtgttcatt 720
tcaagtacaa ctattgaaat tacacctatt acgcatattg acggagttca agtagctgac 780
ggaaaacgtg gaccaattac agcgcaactt catcaatatt ttgtagaaga aatcactcgt 840
gcatgtggcg aattagagtt tgcaaaataa 870
<210> 80
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp
20 25 30
Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu
35 40 45
Thr Ser Ile Ser Glu Asn Gly Thr Ile Met Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys
50 55 60
Gly Ala Phe Val Ile Met Ser Gly Phe Ile Asp Thr Glu Thr Ser Val
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Asn Leu Glu Val Ile Ser Glu Gln Ala Thr Ala Tyr Val
85 90 95
Ile Lys Ile Asn Glu Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Asn Leu Thr His
100 105 110
Phe Phe Tyr Val Phe Gln Thr Leu Gln Lys Gln Val Ser Tyr Ser Leu
115 120 125
Ala Lys Phe Asn Asp Phe Ser Ile Asn Gly Lys Leu Gly Ser Ile Cys
130 135 140
Gly Gln Leu Leu Ile Leu Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Pro Asp
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ile Thr Leu Asp Asn Leu Thr Met Gln Glu Leu Gly Tyr
165 170 175
Ser Ser Gly Ile Ala His Ser Ser Ala Val Ser Arg Ile Ile Ser Lys
180 185 190
Leu Lys Gln Glu Lys Val Ile Val Tyr Lys Asn Ser Cys Phe Tyr Val
195 200 205
Gln Asn Leu Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Ala Pro Lys Leu Asp Glu Trp
210 215 220
Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Ala Thr Trp Gly Lys Leu Asn
225 230 235
<210> 81
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
atgaacgctc aagcagaaga attcaaaaaa tatttagaaa ctaacgggat aaaaccaaaa 60
caatttcata aaaaagaact tatttttaac caatgggatc cacaagaata ttgtattttt 120
ctatatgatg gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180
caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240
ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300
gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360
caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgatt tttcgattaa cgggaagctt 420
ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480
ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540
gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600
tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat cttgattatc tcaaaagata tgcccctaaa 660
ttagatgaat ggttttattt agcatgtcct gctacttggg gaaaattaaa ttaa 714
<210> 82
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp
20 25 30
Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu
35 40 45
Thr Ser Ile Ser Glu Asn Gly Thr Ile Met Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys
50 55 60
Gly Ala Phe Val Ile Met Ser Gly Phe Ile Asp Thr Glu Thr Ser Val
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Asn Leu Glu Val Ile Ser Glu Gln Ala Thr Ala Tyr Val
85 90 95
Ile Lys Ile Asn Glu Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Asn Leu Thr His
100 105 110
Phe Phe Tyr Val Phe Gln Thr Leu Gln Lys Gln Val Ser Tyr Ser Leu
115 120 125
Ala Lys Phe Asn Val Phe Ser Ile Asn Gly Lys Leu Gly Ser Ile Cys
130 135 140
Gly Gln Leu Leu Ile Leu Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Pro Asp
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ile Thr Leu Asp Asn Leu Thr Met Gln Glu Leu Gly Tyr
165 170 175
Ser Ser Gly Ile Ala His Ser Ser Ala Val Ser Arg Ile Ile Ser Lys
180 185 190
Leu Lys Gln Glu Lys Val Ile Val Tyr Lys Asn Ser Cys Phe Tyr Val
195 200 205
Gln Asn Arg Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Ala Pro Lys Leu Asp Glu Trp
210 215 220
Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Ala Thr Trp Gly Lys Leu Asn
225 230 235
<210> 83
<211> 713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
atgaacgctc aagcagaaga attcaaaaaa tatttagaaa ctaacgggat aaaaccaaaa 60
caatttcata aaaaagaact tatttttaac caatgggatc cacaagaata ttgtattttt 120
ctatatgatg gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180
caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240
ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300
gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360
caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgttt tttcgattaa cgggaagctt 420
ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480
ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540
gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600
tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat ctgattatct caaaagatat gcccctaaat 660
tagatgaatg gttttattta gcatgtcctg ctacttgggg aaaattaaat taa 713
<210> 84
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
ggtggtggag ga 12
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
ggtggaggtg ga 12
<210> 86
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
ggtggaggag gt 12
<210> 87
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
ggaggtggtg ga 12
<210> 88
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
ggaggaggtg gt 12
<210> 89
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
ggaggtggag gt 12
<210> 90
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
ggaggaggag gt 12
<210> 91
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
ggaggaggtg ga 12
<210> 92
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
ggaggtggag ga 12
<210> 93
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
ggtggaggag ga 12
<210> 94
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
ggaggaggag ga 12
<210> 95
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Ala Thr Gly Leu Ala Trp Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Glu Ala Thr Gly Leu Ala Trp Glu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 97
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys
20 25
<210> 98
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala
20 25
<210> 99
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Lys
20
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
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Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile
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Lys Tyr Lys Lys Phe Pro Trp Trp Leu
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Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu
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Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu
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Ser Trp Phe Lys Asn Trp Pro Phe Phe
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Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu
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Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
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Tyr Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
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Tyr Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
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Tyr Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
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<223> 合成的
<400> 164
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Tyr Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val
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<223> 合成的
<400> 166
Lys Leu Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
Tyr Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 168
Gly Leu Arg Arg Gly Ile Gln Asp Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 169
Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 170
<211> 702
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 170
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
100 105 110
Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
195 200 205
Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
210 215 220
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro
500 505 510
Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln
515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540
Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn
545 550 555 560
Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser
565 570 575
Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly
580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly
595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
610 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
625 630 635 640
Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe
645 650 655
Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile
660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr
675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
690 695 700
<210> 171
<211> 139
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171
Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg
1 5 10 15
Tyr Val Gln Pro Pro Glu Met Ile Gly Pro Met Arg Pro Glu Gln Phe
20 25 30
Ser Asp Glu Val Glu Pro Ala Thr Pro Glu Glu Gly Glu Pro Ala Thr
35 40 45
Gln Arg Gln Asp Pro Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Asp Glu Gly Ala
50 55 60
Ser Ala Gly Gln Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asp Ser Gln Glu Gln Gly
65 70 75 80
His Pro Gln Thr Gly Cys Glu Cys Glu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Glu
85 90 95
Met Asp Pro Pro Asn Pro Glu Glu Val Lys Thr Pro Glu Glu Glu Met
100 105 110
Arg Ser His Tyr Val Ala Gln Thr Gly Ile Leu Trp Leu Leu Met Asn
115 120 125
Asn Cys Phe Leu Asn Leu Ser Pro Arg Lys Pro
130 135
<210> 172
<211> 1132
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 172
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
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1010 1015 1020
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
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Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
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1070 1075 1080
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
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Thr Ile Leu Asp
1130
<210> 173
<211> 586
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173
Met Ala Ala Ser Gly Val Glu Lys Ser Ser Lys Lys Lys Thr Glu Lys
1 5 10 15
Lys Leu Ala Ala Arg Glu Glu Ala Lys Leu Leu Ala Gly Phe Met Gly
20 25 30
Val Met Asn Asn Met Arg Lys Gln Lys Thr Leu Cys Asp Val Ile Leu
35 40 45
Met Val Gln Glu Arg Lys Ile Pro Ala His Arg Val Val Leu Ala Ala
50 55 60
Ala Ser His Phe Phe Asn Leu Met Phe Thr Thr Asn Met Leu Glu Ser
65 70 75 80
Lys Ser Phe Glu Val Glu Leu Lys Asp Ala Glu Pro Asp Ile Ile Glu
85 90 95
Gln Leu Val Glu Phe Ala Tyr Thr Ala Arg Ile Ser Val Asn Ser Asn
100 105 110
Asn Val Gln Ser Leu Leu Asp Ala Ala Asn Gln Tyr Gln Ile Glu Pro
115 120 125
Val Lys Lys Met Cys Val Asp Phe Leu Lys Glu Gln Val Asp Ala Ser
130 135 140
Asn Cys Leu Gly Ile Ser Val Leu Ala Glu Cys Leu Asp Cys Pro Glu
145 150 155 160
Leu Lys Ala Thr Ala Asp Asp Phe Ile His Gln His Phe Thr Glu Val
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Phe Met Val Asp Ile Leu Ala Lys Val Arg Phe Pro Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Asn Phe Leu Ser Lys Thr Val Gln Ala Glu Pro Leu Ile Gln Asp Asn
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Lys Lys His Asp Tyr Arg Ile Ala Leu Phe Gly Gly Ser Gln Pro Gln
290 295 300
Ser Cys Arg Tyr Phe Asn Pro Lys Asp Tyr Ser Trp Thr Asp Ile Arg
305 310 315 320
Cys Pro Phe Glu Lys Arg Arg Asp Ala Ala Cys Val Phe Trp Asp Asn
325 330 335
Val Val Tyr Ile Leu Gly Gly Ser Gln Leu Phe Pro Ile Lys Arg Met
340 345 350
Asp Cys Tyr Asn Val Val Lys Asp Ser Trp Tyr Ser Lys Leu Gly Pro
355 360 365
Pro Thr Pro Arg Asp Ser Leu Ala Ala Cys Ala Ala Glu Gly Lys Ile
370 375 380
Tyr Thr Ser Gly Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Ala Leu Tyr Leu Phe
385 390 395 400
Glu Cys Tyr Asp Thr Arg Thr Glu Ser Trp His Thr Lys Pro Ser Met
405 410 415
Leu Thr Gln Arg Cys Ser His Gly Met Val Glu Ala Asn Gly Leu Ile
420 425 430
Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Gly Asn Asn Val Ser Gly Arg Val Leu
435 440 445
Asn Ser Cys Glu Val Tyr Asp Pro Ala Thr Glu Thr Trp Thr Glu Leu
450 455 460
Cys Pro Met Ile Glu Ala Arg Lys Asn His Gly Leu Val Phe Val Lys
465 470 475 480
Asp Lys Ile Phe Ala Val Gly Gly Gln Asn Gly Leu Gly Gly Leu Asp
485 490 495
Asn Val Glu Tyr Tyr Asp Ile Lys Leu Asn Glu Trp Lys Met Val Ser
500 505 510
Pro Met Pro Trp Lys Gly Val Thr Val Lys Cys Ala Ala Val Gly Ser
515 520 525
Ile Val Tyr Val Leu Ala Gly Phe Gln Gly Val Gly Arg Leu Gly His
530 535 540
Ile Leu Glu Tyr Asn Thr Glu Thr Asp Lys Trp Val Ala Asn Ser Lys
545 550 555 560
Val Arg Ala Phe Pro Val Thr Ser Cys Leu Ile Cys Val Val Asp Thr
565 570 575
Cys Gly Ala Asn Glu Glu Thr Leu Glu Thr
580 585
<210> 174
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 174
Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu
1 5 10 15
Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala
20 25 30
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35 40 45
Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln
130 135 140
Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly
225 230 235 240
Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu
245 250 255
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260 265 270
Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His
275 280 285
His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu
290 295 300
His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu
305 310
<210> 175
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175
Met Ser Ser Glu Gln Lys Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Val
1 5 10 15
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20 25 30
Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Pro
35 40 45
Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Ala Gly Pro Pro Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Thr Ser Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asn
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Lys
145 150 155 160
Met Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr
165 170 175
Tyr Thr Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly
180 185 190
Asn Asn Gln Ile Phe Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly
195 200 205
Thr Ile Ala Met Glu Gly Asp Ser Ala Ser Glu Glu Glu Ile Trp Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Val Met Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr
245 250 255
Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe
260 265 270
Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu
275 280 285
Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ala Tyr Pro Ser
290 295 300
Leu Arg Glu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val
305 310 315
<210> 176
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 176
Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu
1 5 10 15
Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val
35 40 45
Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser
50 55 60
Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp
65 70 75 80
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys
100 105 110
Val Ala Lys Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln
130 135 140
Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Asp Ser Leu Gln Leu
145 150 155 160
Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr
165 170 175
Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp
180 185 190
Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr Gly Phe Leu Ile Ile Ile Leu Ala Ile
195 200 205
Ile Ala Lys Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu
210 215 220
Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Phe Gly
225 230 235 240
Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln Tyr Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu
245 250 255
Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu
260 265 270
Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His
275 280 285
His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu Leu
290 295 300
His Glu Trp Ala Leu Arg Glu Gly Glu Glu
305 310
<210> 177
<211> 464
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile
1 5 10 15
His Ile Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr
20 25 30
Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile
35 40 45
Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe
50 55 60
Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu
65 70 75 80
Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu
85 90 95
Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro
100 105 110
Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile
115 120 125
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130 135 140
Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln
145 150 155 160
Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu
165 170 175
Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln
180 185 190
Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly
195 200 205
Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn
210 215 220
Glu Leu Lys Leu Ser Val Val Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu
225 230 235 240
Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu
245 250 255
Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val
260 265 270
Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser
275 280 285
Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser
290 295 300
Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu
305 310 315 320
Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr
325 330 335
Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu
340 345 350
Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln
355 360 365
Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg
370 375 380
Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys
385 390 395 400
Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys
405 410 415
Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys
420 425 430
Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile
435 440 445
Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr
450 455 460
<210> 178
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 178
Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp
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Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly
20 25 30
Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala
35 40 45
Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro
50 55 60
His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala
65 70 75 80
Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe
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Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp
100 105 110
Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val
115 120 125
Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln
130 135 140
Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met
145 150 155 160
Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser
165 170 175
Gly Gln Arg Arg
180
<210> 179
<211> 102
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179
Met Ser Ala Arg Val Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Gly Asp Gly Gln
1 5 10 15
Glu Ala Pro Asp Val Val Ala Phe Val Ala Pro Gly Glu Ser Gln Gln
20 25 30
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50 55 60
Glu Met Asp Leu Glu Lys Thr Arg Ser Glu Arg Gly Asp Gly Ser Asp
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Gly Asp Gly Gln Pro
100
<210> 180
<211> 509
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 180
Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln
20 25 30
Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg
50 55 60
His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys
65 70 75 80
Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr
85 90 95
Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val
100 105 110
Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser
115 120 125
His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr
130 135 140
Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu
165 170 175
Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe
180 185 190
Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu
195 200 205
Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys
210 215 220
Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu
245 250 255
Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala
260 265 270
Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe
275 280 285
Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val
305 310 315 320
Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu
325 330 335
Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser
340 345 350
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
355 360 365
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
370 375 380
Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn
405 410 415
Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
420 425 430
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr
435 440 445
Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His
450 455 460
Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val
465 470 475 480
Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr
485 490 495
Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
500 505
<210> 181
<211> 261
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 181
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 182
<211> 750
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 182
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 183
<211> 783
<212> PRT
<213> 智人
<400> 183
Met Ser Gly Gly His Gln Leu Gln Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp Leu
1 5 10 15
Leu Met Ala Thr Leu Gln Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu Val Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gln Lys Ala Ile Ile
35 40 45
Arg Val Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn Leu Thr
50 55 60
Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu Ile Thr Pro Ala Glu Gly
65 70 75 80
Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu Cys Asn Ala Ser Asp Asp
85 90 95
Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser Ile Val Lys Leu Glu Ser Pro
100 105 110
Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Met
115 120 125
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130 135 140
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Leu Gln Gln Pro Leu Gly Leu Thr Trp Pro
145 150 155 160
Val Val Leu Ile Trp Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu Phe Val
165 170 175
Tyr Lys Asn Gln Lys Ala His Val Arg Ile Glu Leu Lys Glu Pro Pro
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Ala Trp Pro Asp Tyr Asp Val Trp Ile Leu Met Thr Val Val Gly Thr
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Gln Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gln Ala Ser Cys Arg Gln Ala Arg
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Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro Val Cys
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Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gln Glu Leu Arg Val Ile
275 280 285
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290 295 300
Gln His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Met Phe Asn Ile Thr Glu Gly Asp
305 310 315 320
Ser Phe Ser Gln Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Tyr Gln Glu Pro Gly
325 330 335
Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gln His Pro Gly His Ala His Tyr His
340 345 350
Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val Ala Arg
355 360 365
Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe Leu Pro Ser Gln Glu Pro Gly Met Gly
370 375 380
Pro Arg His His Arg Phe Pro Arg Ala Ala His Pro Arg Ala Pro Gly
385 390 395 400
Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Ala Gln His Pro Tyr Ala Gln Gly Trp
405 410 415
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420 425 430
Val Pro Leu Arg Arg Ala Arg Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser Gly Glu
435 440 445
Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro Ala Ser
450 455 460
Asp Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser Val Val
465 470 475 480
Asn Cys Thr Asp Ile Ser Leu Gln Gly Val His Gly Ser Ser Ser Thr
485 490 495
Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr Cys Ser
500 505 510
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515 520 525
Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Thr Gly Glu Thr Gln Val
530 535 540
Ser Ser His Val His Tyr His Arg His Arg His His His Tyr Lys Lys
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565 570 575
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Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu Gln Ala Val
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<213> 智人
<400> 184
Met Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ala Ser Glu Pro Glu Ala Glu Ser
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Lys Ala Gly Pro Lys Ala Asp Gly Glu Glu Asp Glu Val Lys Ala Ala
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35 40 45
Lys Thr Met Gly Pro Ala Trp Asp Gln Gln Glu Glu Gly Val Ser Glu
50 55 60
Ser Asp Gly Asp Glu Tyr Ala Met Ala Ser Ser Ala Glu Ser Ser Pro
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Glu Trp Glu Tyr Asp Glu Glu Glu Glu Lys Asn Gln Leu
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Glu Ile Glu Arg Leu Glu Glu Gln Leu Ser Ile Asn Val Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asn Cys His Val Asp Leu Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu Gly Glu Leu
115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Leu Ala Leu Trp Glu Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala Ile Val Glu
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Ala Ala Arg Leu Glu Lys Val His Ser Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala
245 250 255
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290 295 300
Ala Glu Ala Pro Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile Asp Phe Glu
305 310 315 320
Met Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala
325 330 335
Leu Val Glu Asn Cys Leu Val Pro Asp Leu Trp Ile Arg Tyr Ser Gln
340 345 350
Tyr Leu Asp Arg Gln Leu Lys Val Lys Asp Leu Val Leu Ser Val His
355 360 365
Asn Arg Ala Ile Arg Asn Cys Pro Trp Thr Val Ala Leu Trp Ser Arg
370 375 380
Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val Asp His Gln Val Ile Ser
385 390 395 400
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405 410 415
Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val
420 425 430
Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ala
435 440 445
Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Glu Val Glu Glu Arg Phe
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Asp Ser Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala Asn Met Trp Leu
500 505 510
Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Ala His Gly Asp Thr Gln His Cys Arg
515 520 525
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530 535 540
Val Cys Glu Val Leu Leu Thr Met Glu Arg Thr Glu Gly Ser Leu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Ile Ala Val Gln Lys Thr Glu Thr Arg Leu Ala Arg Val
565 570 575
Asn Glu Gln Arg Met Lys Ala Ala Glu Lys Glu Ala Ala Leu Val Gln
580 585 590
Gln Glu Glu Glu Lys Ala Glu Gln Arg Lys Arg Ala Arg Ala Glu Lys
595 600 605
Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Arg Gly Pro Glu Lys Arg Gly
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Ala Asp Glu Asp Asp Glu Lys Glu Trp Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gln
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Pro Ser Lys Arg Arg Arg Val Glu Asn Ser Ile Pro Ala Ala Gly Glu
645 650 655
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Val Asp Val Glu Pro Pro Ser Lys Gln Lys Glu Lys Ala Ala Ser Leu
675 680 685
Lys Arg Asp Met Pro Lys Val Leu His Asp Ser Ser Lys Asp Ser Ile
690 695 700
Thr Val Phe Val Ser Asn Leu Pro Tyr Ser Met Gln Glu Pro Asp Thr
705 710 715 720
Lys Leu Arg Pro Leu Phe Glu Ala Cys Gly Glu Val Val Gln Ile Arg
725 730 735
Pro Ile Phe Ser Asn Arg Gly Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Tyr Val Glu
740 745 750
Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu Gln Ala Leu Glu Met Asp Arg Lys
755 760 765
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Lys Val Ala Ile Ser Asn Pro Pro Gln
865 870 875 880
Arg Lys Val Pro Glu Lys Pro Glu Thr Arg Lys Ala Pro Gly Gly Pro
885 890 895
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Leu Ser Leu Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Ala Pro
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Gln Ala Glu Asn Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Pro Ala
930 935 940
Ala Thr Glu Ala Pro Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala Lys Leu Phe
945 950 955 960
Leu Arg Lys
<210> 185
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人
<400> 185
Met Asn Gly Asp Asp Ala Phe Ala Arg Arg Pro Thr Val Gly Ala Gln
1 5 10 15
Ile Pro Glu Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile Ala Lys Tyr Phe
20 25 30
Ser Lys Glu Glu Trp Glu Lys Met Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr
35 40 45
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50 55 60
Ala Thr Leu Pro Pro Phe Met Cys Asn Lys Arg Ala Glu Asp Phe Gln
65 70 75 80
Gly Asn Asp Leu Asp Asn Asp Pro Asn Arg Gly Asn Gln Val Glu Arg
85 90 95
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100 105 110
Pro Lys Lys Pro Ala Glu Glu Gly Asn Asp Ser Glu Glu Val Pro Glu
115 120 125
Ala Ser Gly Pro Gln Asn Asp Gly Lys Glu Leu Cys Pro Pro Gly Lys
130 135 140
Pro Thr Thr Ser Glu Lys Ile His Glu Arg Ser Gly Pro Lys Arg Gly
145 150 155 160
Glu His Ala Trp Thr His Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val Ile
165 170 175
Tyr Glu Glu Ile Ser Asp Pro Glu Glu Asp Asp Glu
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<210> 186
<211> 339
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met
1 5 10 15
Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln
35 40 45
Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His
85 90 95
Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu
100 105 110
Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu
115 120 125
Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly
130 135 140
Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr
145 150 155 160
Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala
165 170 175
Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu
180 185 190
Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp
195 200 205
Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile
210 215 220
Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser
225 230 235 240
Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys
245 250 255
Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe
260 265 270
Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro
275 280 285
Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe
290 295 300
Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile
305 310 315 320
Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys
325 330 335
Ser Gln Leu
<210> 187
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人
<400> 187
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130 135 140
<210> 188
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 188
Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 189
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 189
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
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65 70 75 80
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Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
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305 310 315 320
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355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
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385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly
435 440 445
Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys Gln Ile
450 455 460
Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro
465 470 475 480
Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly
485 490 495
Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu
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Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu
515 520 525
His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro
530 535 540
Tyr Leu
545
<210> 190
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 190
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met
1 5 10 15
Thr Lys Leu
<210> 191
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 191
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys His Thr Gly
20
<210> 192
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 192
Ser Gly Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 193
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 193
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 194
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 194
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg
435 440 445
His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
465 470 475 480
His Ser Arg Lys His Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala
485 490 495
Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Asp
500 505 510
Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys
515 520 525
Asp Asp Asp Lys Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile
530 535 540
Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys
545 550 555 560
Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe
565 570 575
Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile
580 585 590
Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Tyr
595 600 605
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
610 615
<210> 195
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 195
catcgatcac tctgga 16
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 196
ctaactccaa tgttacttg 19
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 197
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 198
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 199
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 200
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
1 5
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 201
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser
1 5
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 202
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 203
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
1 5
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 204
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 205
Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
1 5
<210> 206
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 206
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Lys Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala
35 40 45
Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile
50 55 60
Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
85 90 95
Met Pro Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu
100 105
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 207
Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe
1 5
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 208
Met Pro Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu
1 5
<210> 209
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 209
Ala Asp Leu Val Val Gly
1 5
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 210
Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala Glu Glu Val Leu
1 5 10
<210> 211
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 211
Gly Asp Gly Ser Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala
1 5 10
<210> 212
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 212
Arg Asp Gly Ser Val Ala Asp Leu Ala Lys Val Ala
1 5 10
<210> 213
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 213
Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu
1 5 10
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 214
Gly Asp Gly Ser Ile Val Asp Gly Ser Lys Glu Leu
1 5 10
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 215
Gly Asp Gly Ser Ile Lys Thr Ala Val Lys Ser Leu
1 5 10
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 216
Ala Asp Leu Ser Val Ala Thr Leu Ala Lys Ser Leu
1 5 10
<210> 217
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 217
Ala Asp Leu Ala Val Lys Thr Leu Ala Lys Val Leu
1 5 10
<210> 218
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 218
Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala
1 5 10 15
Glu Glu Val Leu His Val Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Asp Gly
20 25 30
Ser Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Tyr Leu Phe Pro Val Ile Phe
35 40 45
Ser Lys Arg Asp Gly Ser Val Ala Asp Leu Ala Lys Val Ala Ile Pro
50 55 60
Gln Val His Thr Gln Val Leu Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser
65 70 75 80
Lys Val Leu Met Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Gly Asp Gly Ser
85 90 95
Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val
100 105 110
Met Gly Asp Gly Ser Ile Val Asp Gly Ser Lys Glu Leu Ile Tyr Pro
115 120 125
Asn Ala Ser Leu Leu Phe Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala Glu Glu
130 135 140
Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Asp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Lys Thr Ala Val Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Val
165 170 175
Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Lys Tyr Lys Lys
180 185 190
Phe Pro Trp Trp Leu Ala Asp Leu Ser Val Ala Thr Leu Ala Lys Ser
195 200 205
Leu Asn Pro Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Ala Asp Leu Ala Val Lys
210 215 220
Thr Leu Ala Lys Val Leu Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Asp Tyr
225 230 235 240
Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp
245 250 255
Asp Asp Lys Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Ser
260 265 270
Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Ala Asp Leu Val Val Gly Gln Ile Phe
275 280 285
Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
290 295 300
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
305 310 315 320
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
325 330 335
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
340 345 350
Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ile Leu Ile Gly Val Leu Val Gly
355 360 365
Val
<210> 219
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 219
Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala
1 5 10 15
Glu Glu Val Leu His Val Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Asp Gly
20 25 30
Ser Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Tyr Leu Phe Pro Val Ile Phe
35 40 45
Ser Lys Arg Asp Gly Ser Val Ala Asp Leu Ala Lys Val Ala Ile Pro
50 55 60
Gln Val His Thr Gln Val Leu Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser
65 70 75 80
Lys Val Leu Met Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Gly Asp Gly Ser
85 90 95
Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val
100 105 110
Met Gly Asp Gly Ser Ile Val Asp Gly Ser Lys Glu Leu Ile Tyr Pro
115 120 125
Asn Ala Ser Leu Leu Phe Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala Glu Glu
130 135 140
Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Asp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Lys Thr Ala Val Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Val
165 170 175
Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Lys Tyr Lys Lys
180 185 190
Phe Pro Trp Trp Leu Ala Asp Leu Ser Val Ala Thr Leu Ala Lys Ser
195 200 205
Leu Asn Pro Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Ala Asp Leu Ala Val Lys
210 215 220
Thr Leu Ala Lys Val Leu Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Asp Tyr
225 230 235 240
Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp
245 250 255
Asp Asp Lys Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Ser
260 265 270
Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Ala Asp Leu Val Val Gly Ile Leu Ile
275 280 285
Gly Val Leu Val Gly Val
290
<210> 220
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 220
gttggtaaag gtggatctgg aggagcagac cttatcgaag caacagcaga agaagtatta 60
catgtttttg gttatagttg gtacaaagga gatggtagta ttgtaagttt agctaaaaca 120
gcttatttat ttcccgttat ttttagtaaa cgtgacggta gtgttgcaga tttagcaaaa 180
gtagcaattc cacaagttca tacacaagtt ttagctgacg gaagtgttaa aacattatct 240
aaagtattaa tgccaagttt aagagaagca gcattaggag acggaagtat tgtaagttta 300
gctaagacag cttggccacg tcctcgtcgt tatgttatgg gtgacggtag tatcgtagac 360
ggttctaaag aattaattta tccaaatgct agtttattat ttgcagattt aattgaagct 420
acagctgagg aagttttacg tttacttgaa ttttacttag cagttggtga tggaagtatt 480
aagacagctg taaaaagttt attattatta ggtacaattc acgcagttgc tgacggttct 540
gtaaaaacat taagtaaagt tttaaaatac aaaaaatttc catggtggtt agctgattta 600
tctgttgcaa cattagcaaa aagtttaaat ccacaaccag tatggttatg tcttgctgat 660
ttagctgtta aaacacttgc aaaagtttta gttggaaaag gtggtagtgg tggtgactat 720
aaggatcatg atggtgacta caaagatcac gatattgatt acaaagacga tgataaagca 780
gatggtagtg ttaaaactct ttctaaagtt ttaagtatta ttaatttcga aaaattagca 840
gatttagttg ttggacaaat ttttgttaag acattaactg gtaaaacaat tacattagag 900
gtagaaccat ctgatacaat cgaaaatgta aaagcaaaaa tccaagataa agaaggtatc 960
ccaccagacc agcagcgtct tatcttcgct ggtaaacaat tagaagatgg tcgtacatta 1020
tctgattata acattcaaaa agaaagtaca ttacatttag ttcttcgttt acgtggaggt 1080
attttaattg gagttttagt aggtgtataa taa 1113
<210> 221
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 221
gtgggtaaag gcggtagcgg tggtgctgat ttaattgaag ctacagctga agaagtatta 60
catgtttttg gatatagttg gtataaaggt gatggatcta ttgtaagttt agcaaaaaca 120
gcttatttat ttccagttat ttttagtaaa cgtgatggaa gtgtagcaga tttagctaaa 180
gtagcaattc cacaagtaca tacacaagta ttagctgatg gtagtgttaa aacattaagt 240
aaagttttaa tgccaagttt acgtgaagca gctttaggag atggttctat tgtttcttta 300
gctaaaacag catggccacg tccacgtcgt tatgttatgg gtgatggtag tattgtagat 360
ggaagtaaag aattaattta tccaaatgct tctttattat ttgcagattt aattgaagca 420
acagcagaag aagtattacg tttattagaa ttttatttag cagtaggtga tggaagtatt 480
aaaacagcag ttaaaagtct tcttcttctt ggtacaattc atgcagtggc ggatggaagt 540
gtaaaaacac tttctaaagt tcttaaatat aaaaaatttc catggtggtt agcagattta 600
agtgttgcaa cacttgctaa atctttaaat ccacaaccag tatggctttg tcttgcagat 660
cttgctgtta aaacattagc taaagtatta gtaggaaaag gtggaagtgg aggagattat 720
aaagatcatg atggtgatta taaagatcat gatattgatt ataaagatga tgataaagca 780
gatggtagtg taaaaacatt atctaaagta ttaagtatta ttaattttga aaaattagca 840
gatttagtag ttggaattct tattggtgtg cttgttggtg tttgataa 888
<210> 222
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 222
gttggaaagg gaggtagtgg tggtgctgat ttaattgaag ctacagcaga ggaagtttta 60
cacgtttttg gttatagttg gtataaagga gacggaagta tcgtatcttt agcaaaaaca 120
gcttatttat ttccagttat tttttctaaa agagatggta gtgtagctga tttagcaaaa 180
gttgctatcc cacaagtaca tacacaagtt ttagctgacg gttctgttaa aactctttct 240
aaagtattaa tgccaagttt acgtgaggct gcacttggtg atggttctat cgtttctctt 300
gcaaaaactg cttggccacg tccacgtcgt tatgttatgg gagacggtag tatcgttgac 360
ggatctaaag aattaattta tccaaacgca agtttattat ttgcagatct tattgaagca 420
actgctgaag aagttttacg tcttttagaa ttttatcttg cagttggaga tggaagtatc 480
aaaacagctg ttaaaagtct tttactttta ggtacaattc atgcagtagc tgatggaagt 540
gtaaaaacat taagtaaagt tttaaaatat aaaaaatttc catggtggtt agctgattta 600
agtgtagcaa ctttagcaaa atctttaaat ccacagccag tatggttatg ccttgcagat 660
ttagctgtaa aaacacttgc taaagtttta gttggaaaag gaggttctgg tggtgactac 720
aaagaccatg acggagatta caaagatcat gatattgatt ataaagatga tgataaagct 780
gacggtagtg taaagacact tagtaaagtt cttagtatta ttaattttga aaaattagct 840
gacttagttg ttggtatttt aattggtgtt ttagttggag tttaataa 888
<210> 223
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 223
cacgtatttg gttatagttg gtataaa 27
<210> 224
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 224
cacgtatttg gttatagttg gtataaa 27
<210> 225
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 225
catgtttttg gttatagttg gtataaa 27
<210> 226
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 226
catgtattcg gttatagctg gtacaaa 27
<210> 227
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 227
cacgttttcg gttatagctg gtacaaa 27
<210> 228
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 228
catgtgtttg gttatagctg gtataaa 27
<210> 229
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 229
cacgtgttcg ggtatagttg gtataag 27
<210> 230
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 230
catgtttttg gatattcttg gtataaa 27
<210> 231
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 231
catgtatttg gttatagttg gtataaa 27
<210> 232
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 232
catgtttttg gttatagttg gtataaa 27
<210> 233
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 233
catgtttttg gatatagttg gtataaa 27
<210> 234
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 234
catgtttttg gttattcttg gtataaa 27
<210> 235
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 235
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<210> 236
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tcttggttta aaaattggcc atttttc 27
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atgccaagtc ttagagaggc agcttta 27
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attccacaag ttcatacaca agtactt 27
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 977
aatatgacac atgtacttta tccatta 27

Claims (62)

1.一种分离的肽，其包含癌症相关蛋白的免疫原性片段，其中所述片段包含异变突变。
2.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述异变突变是在锚定位置上突变为优选氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的分离的肽，其中所述片段的长度为约7至约11个氨基酸，长度为约8至约10个氨基酸，或长度为约9个氨基酸。
4.根据任何前述权利要求所述的分离的肽，其中所述癌症相关蛋白为癌症睾丸抗原或癌胚抗原。
5.根据任何前述权利要求所述的分离的肽，其中所述癌症相关蛋白由以下人类基因中的一个编码：CEACAM5、GAGE1、TERT、KLHL7、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、NUF2、NYESO1、PAGE4、PRAME、PSA、PSMA、RNF43、SART3、SSX2、STEAP1、和SURVIVIN。
6.根据权利要求5所述的分离的肽，其中：
(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个；
(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：110和112中的任一个；
(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：114；
(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：116；
(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：118、120、122和124中的任一个；
(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：126；
(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：128；
(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：130和132中的任一个；
(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：134和136中的任一个；
(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：138；
(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：140；
(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：142；
(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：144；
(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：146；
(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：148；
(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：150；
(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：152和154中的任一个；或者
(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：156和158中的任一个。
7.根据权利要求6所述的分离的肽，其中：
(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段由SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个组成；
(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：110和112中的任一个组成；
(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段由SEQ ID NO：114组成；
(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段由SEQ ID NO：116组成；
(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：118、120、122和124中的任一个组成；
(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段由SEQ ID NO：126组成；
(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段由SEQ ID NO：128组成；
(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：130和132中的任一个组成；
(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：134和136中的任一个组成；
(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段由SEQ ID NO：138组成；
(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段由SEQ ID NO：140组成；
(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：142组成；
(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：144组成；
(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段由SEQ ID NO：146组成；
(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：148组成；
(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：150组成；
(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：152和154中的任一个组成；或者
(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段由SEQ ID NO：156和158中的任一个组成。
8.根据权利要求7所述的分离的肽，其中：
(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个组成；
(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：110和112中的任一个组成；
(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：114组成；
(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：116组成；
(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NOS：118、120、122和124中的任一个组成；
(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：126组成；
(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：128组成；
(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：130和132中的任一个组成；
(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：134和136中的任一个组成；
(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：138组成；
(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：140组成；
(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：142组成；
(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：144组成；
(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：146组成；
(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：148组成；
(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：150组成；
(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：152和154中的任一个组成；或者
(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述分离的肽由SEQ ID NO：156和158中的任一个组成。
9.根据任何前述权利要求所述的分离的肽，其中所述片段与以下HLA类型中的一种或多种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
10.一种核酸，其编码根据任何前述权利要求所述的分离的肽。
11.根据权利要求10所述的核酸，其中所述核酸经密码子优化以在人中表达。
12.根据权利要求10所述的核酸，其中所述核酸经密码子优化以在单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)中表达。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的核酸，其中所述核酸包括DNA。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的核酸，其中所述核酸包括RNA。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：223-977及其编码相同氨基酸序列的简并变体中的任一个序列。
16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述核酸由选自SEQ ID NO：223-977及其编码相同氨基酸序列的简并变体中的任一个序列组成。
17.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)根据权利要求1-9中任一项所述的一种或多种分离的肽或根据权利要求10-16中任一项所述的一种或多种核酸；和
(b)佐剂。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述佐剂包括去毒李斯特菌溶素O(dtLLO)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰基脂质A、未甲基化的含CpG的寡核苷酸或Montanide ISA 51。
19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含与以下HLA类型中的每一种结合的肽或编码与以下HLA类型中的每一种结合的肽的核酸：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：
(a)表3所示的肽中的两个或多个或编码表3所示的肽中的两个或多个的核酸；
(b)表5所示的肽中的两个或多个或编码表5所示的肽中的两个或多个的核酸；
(c)表7所示的肽中的两个或多个或编码表7所示的肽中的两个或多个的核酸；
(d)表9所示的肽中的两个或多个或编码表9所示的肽中的两个或多个的核酸；
(e)表11所示的肽中的两个或多个或编码表11所示的肽中的两个或多个的核酸；
(f)表13所示的肽中的两个或多个或编码表13所示的肽中的两个或多个的核酸；
(g)表15所示的肽中的两个或多个或编码表15所示的肽中的两个或多个的核酸；
(h)表17所示的肽中的两个或多个或编码表17所示的肽中的两个或多个的核酸；
(i)表19所示的肽中的两个或多个或编码表19所示的肽中的两个或多个的核酸；或者
(j)表21所示的肽中的两个或多个或编码表21所示的肽中的两个或多个的核酸。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：
(a)表3所示的所有肽或编码表3所示的所有肽的核酸；
(b)表5所示的所有肽或编码表5所示的所有肽的核酸；
(c)表7所示的所有肽或编码表7所示的所有肽的核酸；
(d)表9所示的所有肽或编码表9所示的所有肽的核酸；
(e)表11所示的所有肽或编码表11所示的所有肽的核酸；
(f)表13所示的所有肽或编码表13所示的所有肽的核酸；
(g)表15所示的所有肽或编码表15所示的所有肽的核酸；
(h)表17所示的所有肽或编码表17所示的所有肽的核酸；
(i)表19所示的所有肽或编码表19所示的所有肽的核酸；
(j)表21所示的所有肽或编码表21所示的所有肽的核酸。
22.一种重组细菌菌株，其包含核酸，所述核酸编码根据权利要求1-9所述的任一种分离的肽。
23.一种重组细菌菌株，其包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据权利要求1-9所述的分离肽中的两种或更多种。
24.根据权利要求23所述的重组细菌菌株，其中所述两种或更多种肽包含：
(a)表3所示肽中的两个或多个或编码表3所示肽中的两个或多个的核酸；
(b)表5所示肽中的两个或多个或编码表5所示肽中的两个或多个的核酸；
(c)表7所示肽中的两个或多个或编码表7所示肽中的两个或多个的核酸；
(d)表9所示肽中的两个或多个或编码表9所示肽中的两个或多个的核酸；
(e)表11所示肽中的两个或多个或编码表11所示肽中的两个或多个的核酸；
(f)表13所示肽中的两个或多个或编码表13所示肽中的两个或多个的核酸；
(g)表15所示肽中的两个或多个或编码表15所示肽中的两个或多个的核酸；
(h)表17所示肽中的两个或多个或编码表17所示肽中的两个或多个的核酸；
(i)表19所示肽中的两个或多个或编码表19所示肽中的两个或多个的核酸；或者
(j)表21所示肽中的两个或多个或编码表21所示肽中的两个或多个的核酸。
25.根据权利要求24所述的重组细菌菌株，其中所述两种或更多种肽包含：
(a)表3所示的所有肽或编码表3所示的所有肽的核酸；
(b)表5所示的所有肽或编码表5所示的所有肽的核酸；
(c)表7所示的所有肽或编码表7所示的所有肽的核酸；
(d)表9所示的所有肽或编码表9所示的所有肽的核酸；
(e)表11所示的所有肽或编码表11所示的所有肽的核酸；
(f)表13所示的所有肽或编码表13所示的所有肽的核酸；
(g)表15所示的所有肽或编码表15所示的所有肽的核酸；
(h)表17所示的所有肽或编码表17所示的所有肽的核酸；
(i)表19所示的所有肽或编码表19所示的所有肽的核酸；或者
(j)表21所示的所有肽或编码表21所示的所有肽的核酸。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的重组细菌菌株，其中两种或更多种肽的组合与以下HLA类型中的每一种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的重组细菌菌株，其中所述细菌菌株为沙门氏菌属、李斯特菌属、耶尔森氏菌属、志贺氏菌属或分枝杆菌属菌株。
28.根据权利要求27所述的重组细菌菌株，其中所述细菌菌株为李斯特菌属菌株，任选地其中所述李斯特菌属菌株为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株。
29.一种重组李斯特菌属菌株，其包含核酸，所述核酸包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含与癌症相关蛋白的免疫原性片段融合的含PEST的肽，其中所述片段包含异变突变。
30.根据权利要求29所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述异变突变是在锚定位置上突变为优选氨基酸。
31.根据权利要求29或30所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述片段的长度为约7至约11个氨基酸，长度为约8至约10个氨基酸，或长度为约9个氨基酸。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述癌症相关蛋白为癌症睾丸抗原或癌胚抗原。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述癌症相关蛋白由以下人类基因中的一个编码：CEACAM5、GAGE1、TERT、KLHL7、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、NUF2、NYESO1、PAGE4、PRAME、PSA、PSMA、RNF43、SART3、SSX2、STEAP1和SURVIVIN。
34.根据权利要求33所述的重组李斯特菌属菌株，其中：
(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个；
(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：110和112中的任一个；
(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：114；
(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：116；
(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：118、120、122和124中的任一个；
(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：126；
(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：128；
(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：130和132中的任一个；
(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：134和136中的任一个；
(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：138；
(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：140；
(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：142；
(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：144；
(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：146；
(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：148；
(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：150；
(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：152和154中的任一个；或者
(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段包含SEQ ID NO：156和158中的任一个。
35.根据权利要求34所述的重组李斯特菌属菌株，其中：
(a)所述癌症相关蛋白由CEACAM5编码，并且所述片段由SEQ ID NO：100、102、104、106和108中的任一个组成；
(b)所述癌症相关蛋白由GAGE1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：110和112中的任一个组成；
(c)所述癌症相关蛋白由TERT编码，并且所述片段由SEQ ID NO：114组成；
(d)所述癌症相关蛋白由KLHL7编码，并且所述片段由SEQ ID NO：116组成；
(e)所述癌症相关蛋白由MAGEA3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：118、120、122和124中的任一个组成；
(f)所述癌症相关蛋白由MAGEA4编码，并且所述片段由SEQ ID NO：126组成；
(g)所述癌症相关蛋白由MAGEA6编码，并且所述片段由SEQ ID NO：128组成；
(h)所述癌症相关蛋白由NUF2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：130和132中的任一个组成；
(i)所述癌症相关蛋白由NYESO1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：134和136中的任一个组成；
(j)所述癌症相关蛋白由PAGE4编码，并且所述片段由SEQ ID NO：138组成；
(k)所述癌症相关蛋白由PRAME编码，并且所述片段由SEQ ID NO：140组成；
(l)所述癌症相关蛋白由PSA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：142组成；
(m)所述癌症相关蛋白由PSMA编码，并且所述片段由SEQ ID NO：144组成；
(n)所述癌症相关蛋白由RNF43编码，并且所述片段由SEQ ID NO：146组成；
(o)所述癌症相关蛋白由SART3编码，并且所述片段由SEQ ID NO：148组成；
(p)所述癌症相关蛋白由SSX2编码，并且所述片段由SEQ ID NO：150组成；
(q)所述癌症相关蛋白由STEAP1编码，并且所述片段由SEQ ID NO：152和154中的任一个组成；或者
(r)所述癌症相关蛋白由SURVIVIN编码，并且所述片段由SEQ ID NO：156和158中的任一个组成。
36.根据权利要求29-35所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述片段与以下HLA类型中的一种或多种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
37.根据权利要求29-36中任一项所述的重组李斯特菌属真菌，其中所述含PEST的肽包含细菌分泌信号序列，并且所述融合多肽还包含与所述片段融合的泛素蛋白，其中所述含PEST的肽、所述泛素和所述羧基末端抗原性肽从融合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列。
38.根据权利要求29-37中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含与癌症相关蛋白的两种或多种免疫原性片段融合的所述含PEST的肽，其中所述两种或多种片段中的每种包含异变突变。
39.根据权利要求38所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段彼此直接融合而没有插入序列。
40.根据权利要求38所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段通过肽接头彼此连接。
41.根据权利要求40所述的重组李斯特菌属菌株，其中将SEQ ID NO：209-217所示的一种或多种接头用于连接所述两种或多种免疫原性片段。
42.根据权利要求38-41所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽中两种或更多种免疫原性片段的组合与以下HLA类型中的每种结合：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02和HLA-B*07:02。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段包含：
(a)表3所示肽中的两个或多个；
(b)表5所示肽中的两个或多个；
(c)表7所示肽中的两个或多个；
(d)表9所示肽中的两个或多个；
(e)表11所示肽中的两个或多个；
(f)表13所示肽中的两个或多个；
(g)表15所示肽中的两个或多个；
(h)表17所示肽中的两个或多个；
(i)表19所示肽中的两个或多个；或者
(j)表21所示肽中的两个或多个。
44.根据权利要求43所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两种或更多种免疫原性片段包含：
(a)表3所示的所有肽；
(b)表5所示的所有肽；
(c)表7所示的所有肽；
(d)表9所示的所有肽；
(e)表11所示的所有肽；
(f)表13所示的所有肽；
(g)表15所示的所有肽；
(h)表17所示的所有肽；
(i)表19所示的所有肽；或者
(j)表21所示的所有肽。
45.根据权利要求29-44中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST的肽在所述融合多肽的N-末端上。
46.根据权利要求45所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST的肽为LLO的N末端片段。
47.根据权利要求46所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述LLO的N-末端片段具有SEQID NO：59所示的序列。
48.根据权利要求29-47中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸在游离型(episomal)质粒中。
49.根据权利要求29-48中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸不赋予所述重组李斯特菌属菌株以抗生素抗性。
50.根据权利要求29-49中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株为减毒营养缺陷型李斯特菌属菌株。
51.根据权利要求50所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述减毒营养缺陷型李斯特菌属菌株包括一种或多种内源基因上的突变，所述突变使所述一种或多种内源基因失活。
52.根据权利要求51所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述一种或多种内源基因包括actA、dal和dat。
53.根据权利要求29-52中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸包含编码代谢酶的第二开放阅读框。
54.根据权利要求53所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述代谢酶为丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶。
55.根据权利要求29-54中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中从hly启动子表达所述融合多肽。
56.根据权利要求29-55中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株。
57.根据权利要求29-56中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株为减毒单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株，其包括actA、dal和dat的缺失或失活突变，其中所述核酸在游离型质粒中且包含编码丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶的第二开放阅读框，并且其中所述含PEST的肽为LLO的N末端片段。
58.一种免疫原性组合物，其包含：
(a)根据权利要求22-28中任一项所述的重组细菌菌株或根据权利要求29-57中任一项所述的重组李斯特菌属菌株；和
(b)佐剂。
59.根据权利要求58所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括去毒李斯特菌溶素O(dtLLO)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰基脂质A或未甲基化的含CpG的寡核苷酸。
60.一种在受试者中诱导或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-9中任一项所述的分离的肽，根据权利要求10-16中任一项所述的核酸，根据权利要求17-21中任一项所述的药物组合物，根据权利要求22-28中任一项所述的重组细菌菌株，根据权利要求29-57中任一项所述的重组李斯特菌属菌株或根据权利要求58-59中任一项所述的免疫原性组合物。
61.一种在受试者中预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-9中任一项所述的分离的肽，根据权利要求10-16中任一项所述的核酸，根据权利要求17-21中任一项所述的药物组合物，根据权利要求22-28中任一项所述的重组细菌菌株，根据权利要求29-57中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，或根据权利要求58-59中任一项所述的免疫原性组合物。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、低级神经胶质瘤、结肠直肠癌或头颈癌。
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