KR20170063505A - 항-종양 반응 유발 목적 리스테리아계 면역원성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역 관문 억제자 또는 T 세포 자극제 또는 이들의 조합, 및 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 종양-연관 항원에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 살아 있는 약독화 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 종양 또는 암에 대한 치료, 보호, 및 면역 반응 유도 방법에 관한 것으로, 동일한 것을 투여하는 단계를 포함한다.

Description

항-종양 반응 유발 목적 리스테리아계 면역원성 조성물{LISTERIA-BASED IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR ELICITING ANTI-TUMOR RESPONSES}

정부기관 이익

본 발명은 부분적으로 공동 연구 개발 계약(CRADA) # 02648에 의해 지원되었다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 소정의 권리를 가질 수도 있다.

기술분야

본 발명은 면역 관문 억제자 또는 T 세포 자극제, 및 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 종양-연관 항원에 융합된 PEST 아미노산 서열의 융합 단백질을 포함하는 살아 있는 약독화 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 종양에 대한 치료, 보호, 및 면역 반응 유도 방법에 관한 것으로, 동일한 것을 투여하는 단계를 포함한다.

리스테리아 모노사이토젠 ( Listeria monocytogenes ) (Lm)은 리스테리아증(listeriolysis)을 야기하는 그람 양성 조건 세포내 병원체이다. 일단 세포 숙주에 침입하면, Lm은 세포질에 들어갈 수 있도록, 혈관 세포막을 용해시키기 위해 기공 형성 단백질 리스테리오리신 O (리스테리오리신 O, LLO)의 생산을 통해 파고리소좀에서 탈출할 수 있으며, 여기서 그것은 복제하고 액틴 중합화 단백질 (ActA)의 이동성에 기초하여 인접 세포들에 퍼진다. 세포질 내에서, Lm-분비 단백질은 프로테아좀에 의해 분해되고 소포체 내 MHC 클래스 I 분자와 연관되는 펩타이드로 가공된다. 이 독특한 특성은 종양 항원에 MHC 클래스 I 분자가 제공되어서 종양특이성 세포독성 T 림프구 (CTL)를 활성화시킨다는 점에서 그것을 매우 매력적인 암 백신 벡터로 만든다.

종양 매개된 면역 억제의 여러가지 기전 중 하나는 종양에 의한 T 세포 동시 억제 분자의 발현이다. 이러한 분자들은 리간드와의 결합 시 말초 부분 및 종양 마이크로 환경에서 효과기 림프구를 억제할 수 있다.

D-1은 골수 세포와 활성화된 림프구의 표면에서 발현된다. PD-L1는 광범위한 비조혈 세포 이외에 활성화된 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 대식세포 상에서 발현된다. PD-L1는 다수의 인간 종양에서 상향조절되며, PD-L1의 발현은 다양한 유형의 암에서의 생존율과 반비례하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 다양한 종양 세포 상에서의 PD-L2의 발현이 입증되었다.

종양 박멸은 PD-L1/PD-1 상호작용을 차단함으로써 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 최근, 백신을 이용한 PD-1 표적화와 저용량 시클로포스파미드의 조합은 치료받은 마우스의 생존율을 증가시키고, 종양 부하를 낮추며, 항원 특이적 면역 반응을 상당한 수준으로 향상시키는 것으로 입증되었다. 흥미롭게도, 리스테리아에 의한 감염은 면역 세포 상에서의 PD-L1의 상향조절을 야기한다.

현재, 종양 성장 및 암을 제거할 수 있는 효과적인 조합적 종양 표적 방법들을 제공할 필요성이 있다. 본 발명은 리스테리아에 기반한 백신과 PD-1/PD-L 상호작용 차단의 조합을 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다. 하기 상세한 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 이러한 조합은 면역 요법의 전체적인 항-종양 효능을 개선할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 면역 관문 억제자, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것인데, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열, 절단된 ActA 단백질, 또는 절단된 리스테리오리신 O 단백질을 포함한다.

관련된 측면에서, 본 발명은 T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것인데, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열, 절단된 ActA 단백질, 또는 절단된 리스테리오리신 O 단백질을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것인데, 여기서 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 상기 융합 폴리펩타이드는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열, 절단된 ActA 단백질, 또는 절단된 리스테리오리신 O 단백질을 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주 및 CD-80/86CTLA4 신호전달 경로 억제자, 또는 프로그램된 세포 사멸 수용체-1(PD-1) 신호전달 경로 억제자를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것인데, 여기서 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 상기 융합 폴리펩타이드는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열, 절단된 ActA 단백질, 또는 절단된 리스테리오리신 O 단백질을 포함한다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음과 같은 상세한 설명 실시예들과 도면들로부터 명백해질 것이다. 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예들을 나타내면서 단지 예시적으로만 주어지는 것으로, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 숙련자에게 명백해질 것이기 때문인 것으로 이해되어야 한다.

다음의 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시물의 소정의 측면들을 더욱 입증하기 위해 포함되며, 본 발명은 여기에 제시된 구체적인 실시예들의 상세한 설명과 조합하여 이러한 도면들 중 하나 이상을 참조하여 더욱 잘 이해될 수 있다. 본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개공보의 사본은 요청시와 필요 수수료의 납부시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a-1h. LmddA - LLO -E7은 Treg 빈도 감소와 함께 확립된 TC-1 종양의 퇴행을 유도한다. C57BL6 마우스를 1×10⁵ TC-1 종양 세포들로 각각 피하 접종하였으며, 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.1LD50 LmddA-LLO-E7(1×10⁸ CFU), Lm-E7 (1×10⁶ CFU), 또는 LmddA-LLO(1×10⁸ CFU)로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 전자 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양을 측정하였다. 길이×폭×폭/2라는 식에 의해 종양 부피를 산출하였다. 종양 직경이 약 2.0cm에 도달하였거나 24일째 되었을 때 유동 세포 분석을 위해 마우스를 희생하였다. (도 1a) 10일째부터 24일째까지의 평균 종양 부피. (도 1b) 24일째의 종양 부피. (도 1c) 생존율. (도 1d) CD4+ T 세포들 중 CD4+FoxP3+ T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 1e) 비장에서의 CD4+ T 세포들 중 CD4+FoxP3+ T 세포들의 퍼센트. (도 1f) 비장에서의 CD8+ T 세포들에 대한 CD4+FoxP3+ T 세포들의 비. (도 1g) 종양에서의 CD4+ T 세포들 중 CD4+FoxP3+ T 세포들의 퍼센트. (도 1h) 종양에서의 CD8+ T 세포들에 대한 CD4+FoxP3+T 세포들의 비. 데이터는 평균±SEM으로서 제시되어 있다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (만-휘트니 시험). 데이터는, 3개의 독립적 실험(도 1a 및 도 1b)으로부터 얻은 것이며, 3개의 독립적 실험(도 1c-1h)을 나타낸다.
도 2a-2d. LmddA - LLO -E7은 확립된 TC-1 종양의 퇴행을 유도한다. C57BL6 마우스를 1×10⁵ TC-1 종양 세포들로 각각 피하 접종하였으며, 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.1LD50 LmddA-LLO-E7(1×10⁸ CFU), Lm-E7 (1×10⁶ CFU), 또는 LmddA-LLO(1×10⁸ CFU)로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 전자 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양을 측정하였다. 길이×폭×폭/2라는 식에 의해 종양 부피를 산출하였다. (도 2a) PBS. (도 2b) LmddA. (도 2c) Lm-E7. (도 2d) LmddA-LLO-E7. 데이터는 3개의 독립적 실험으로부터 얻은 것이다.
도 3a-3e. LmddA - LLO -E7과 Lm-E7은 유사한 E7특정 CD8+T 세포 반응을 유도한다. C57BL6 마우스를 1×10⁵ TC-1 종양 세포들로 각각 피하 접종하였으며, 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.1 LD₅₀ LmddA-LLO-E7(1×10⁸ CFU), LmddA-LLO (1×10⁸ CFU), LmddA (1×10⁸ CFU), Lm-E7 (1×10⁶ CFU), 또는 0.5 LD₅₀ 야생형 Lm10403S(1×10⁴ CFU)로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 24일째에 마우스를 희생하고, 비장으로부터 림프구를 분리하고, 유동 세포 분석에 의해 종양을 분석하였다. 도 3a. 비장과 종양의 CD8+T 세포들 중 H-2D^bE7 사합체+CD8+ T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 3b 및 도 3c) 비장(도 13b)과 종양(도 3c)의 CD8+T 세포들 중 H-2D^b E7 사합체+CD8+ T 세포들의 퍼센트. (도 3d 및 도 3e) 마우스 비장(도 3d)당 및 백만 종양 세포(도 3e)당 H-2D^b E7 사합체+CD8+ T 세포 개수. n = 3-10. 데이터는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 4a-4e. L. 모노사이토젠은 Treg 빈도의 감소를 유도하는 데 충분하다. C57BL6 마우스를 1×10⁵ TC-1 종양 세포들로 각각 피하 접종하였으며, 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.1 LD₅₀ LmddA(1×10⁸ CFU) 또는 0.5 LD₅₀ 야생형 Lm10403S(1×10⁴ CFU)로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 24일째에 마우스를 희생하고, 비장으로부터 림프구를 분리하고, 유동 세포 분석에 의해 종양을 분석하였다. (도 4a) CD4⁺ 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 4b) 비장의 CD4+ T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 퍼센트. (도 4c) 비장의 CD8+ T 세포들에 대한 CD4+FoxP3+T 세포들의 비. (도 4d) 종양의 CD4+ T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 퍼센트. (도 4e) 종양의 CD8+ T 세포들에 대한 CD4+FoxP3+T 세포들의 비. 데이터는 평균±SEM으로서 제시되어 있다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (만-휘트니 시험). 데이터는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 5. L. 모노사이토젠은 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 팽창을 우선적으로 유도함으로써 Treg 빈도를 감소시킨다. C57BL6 마우스를 1×10⁵ TC-1 종양 세포들로 각각 피하 접종하였으며, 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.1 LD₅₀ LmddA-LLO-E7(1×10⁸ CFU), LmddA-LLO (1×10⁸ CFU), LmddA (1×10⁸ CFU), Lm-E7 (1×10⁶ CFU), 또는 0.5LD50 야생형 Lm10403S(1×10⁴ CFU)로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 24일째에 마우스를 희생하고, 종양으로부터 분리된 림프구를 유동 세포 분석에 의해 분석하였다. 데이터는 평균±SEM으로서 제시된다. n= 3-10. *P < 0.05, **P < 0.01 (만-휘트니 시험). 데이터는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 6a-6d. CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포의 L. 모노사이토젠 유도 팽창은 LLO에 의존하며 LLO에 의해 매개된다. PBS(100μl)의 1×10⁴ CFU 10403S, Δhly, Δhly::pfo, 또는 hly::Tn917 - lac (pAM401-hly)를 C57BL6 마우스에 복강내 주입하였다. 주입후 7일째에 마우스를 희생하고, 비장으로부터 분리된 림프구를 유동 세포 분석에 의해 분석하였다. (도 6a) 비장의 T 세포 개수. (도 6b) CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 6c) CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 퍼센트. (도 6d) CD8+T 세포들에 대한 CD4+FoxP3+T 세포들의 비. *P < 0.05 (만-휘트니 시험). 데이터는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 7a-7g. LmddA의 절단된 LLO의 에피솜 발현은, CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+T 세포들의 더욱 높은 레벨로의 팽창을 유도한다. PBS(100μl)의 1×10⁸ CFU LmddA 또는 LmddA-LLO를 C57BL6 마우스에 복강내 주입하였다. 주입후 7일째에 마우스를 희생하고, 비장으로부터 분리된 림프구를 유동 세포 분석에 의해 분석하였다. (도 7a) 비장의 T 세포 개수. (도 7b) CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 7c) CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 퍼센트. (도 7d) CD8+T 세포들에 대한 CD4+FoxP3+T 세포들의 비. (도 7e) Ki-67+T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 7f) Ki-67+T 세포들의 퍼센트. (도 7g) Ki-67+T 세포들의 형광 강도. (도 7h) LmddA 및 LmddA-LLO, 및 대조군-무 벡터 (PBS) 존재 시 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+ T 세포의 Ki-67 발현 레벨. 데이터는 평균±SEM으로서 제시되어 있다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (만-휘트니 시험). 데이터는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 8a-8g. Lm-E7과 LmddA-LLO의 조합은 확립된 TC-1 종양의 퇴행을 유도한다. C57BL/6 마우스를 1×10⁵ TC-1 종양 세포들로 각각 피하 접종하였으며, 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.05 LD₅₀ Lm-E7(5×10⁵ CFU), 0.05 LD₅₀ LmddA-LLO (5×10⁷ CFU), 0.05 LD₅₀ Lm-E7 + 0.05LD50 LmddA-LLO로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 전자 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양을 측정하고, 길이×폭×폭/2라는 식에 의해 종양 부피를 산출하였다. 마우스가 생존하는지를 관찰하였으며 또는 24일째에 마우스를 희생하고, 비장으로부터 분리된 림프구를 유동 세포 분석에 의해 분석하였다. (도 8a) 10일째부터 24일째까지의 평균 종양 부피. (도 8b) 24일째의 종양 부피. (도 8c) 생존율. (도 8d) 비장의 T 세포 개수. (도 8e) CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 8f) CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 퍼센트. (도 8g) CD8+T 세포들에 대한 CD4+FoxP3+T 세포들의 비. 데이터는 평균±SEM으로서 제시되어 있다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (만-휘트니 시험). 데이터는 2개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 9a-9g. Treg의 입양 전달(adoptive transfer)은, 확립된 TC-1 종양에 대하여 LmddA-LLO-E7의 항-종양 효능과 타협한다. 1×10⁵ TC-1 종양 세포들을 C57BL6 마우스(11주 지난 것)에 각각 피하 주입하고, 종양 접종후 9일째에 CD4+CD25+ Treg(각각 1×10⁶개의 세포)를 정맥 내 주입하였다. 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.1 LD₅₀ LmddA-LLO-E7(1×10⁸ CFU)로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 전자 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양을 측정하고, 길이×폭×폭/2라는 식에 의해 종양 부피를 산출하였다. 24일째에 마우스를 희생하고, 비장으로부터 분리된 림프구를 유동 세포 분석에 의해 분석하였다. (도 9a) 10일째부터 24일째까지의 평균 종양 부피. (도 9b) 24일째의 종양 부피. (도 9c) CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 유동 세포 분석 프로파일. (도 9d) 비장의 CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 퍼센트. (도 9e) 종양의 CD4+T 세포들 중 CD4+FoxP3+T 세포들의 퍼센트. (도 9f) 비장의 T 세포 개수. (도 9g) 백만 개의 종양 세포당 T 세포 개수. 데이터는 평균±SEM으로서 제시되어 있다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (만-휘트니 시험). 데이터는 2개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 10. LmddA는 Lm-E7 항-종양 활성을 증강시키지 않는다. C57BL/6 마우스를 1×10⁵ TC-1 종양 세포들로 각각 피하 접종하였으며, 종양 접종후 10일째와 17일째에 PBS(100μl)의 0.05 LD₅₀ Lm-E7(5×10⁵ CFU), 0.05 LD₅₀ LmddA (5×10⁷ CFU), 또는 0.05 LD₅₀ Lm-E7 + 0.05 LD₅₀ LmddA로 복강내 면역력을 갖게 하였다. 전자 캘리퍼를 사용하여 종양을 측정하였으며, 길이×폭×폭/2이라는 식에 의해 종양 부피를 산출하였다. 24일째에 종양 부피가 도시되어 있다. 데이터는 평균±SEM으로서 제시되어 있다.
도 11a-11b. Lm-LLO 및 Lm-LLO-E7 감염은 마우스 DC 표면 상에서의 PD-L1 발현을 상향조절한다. (도 11a) 골수 유래 마우스 DC 상에서의 PD-L1 발현은 다양한 농도의 Lm-LLO 또는 Lm-LLO-E7로의 처리 후, 미처리된 대조군 대비 배 증가함. (도 11b) 세 개의 독립적인 실험 중 하나로부터의 대표적인 히스토그램.
도 12. Lm- LLO -E7에 항-PD-1 Ab를 첨가하면 치료 효과가 향상된다. a. 처리 일정. b. 34일마다 측정된, 매 처리에 따른 개별적 마우스의 종양 부피. c. Kaplan-Meier 플롯은 전체적인 생존율을 나타냄. 세 개의 독립적인 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다.
도 13. Lm- LLO -E7에 항-PD-1 Ab를 첨가하면 항원 특이적 면역 반응을 향상시키고 종양에 침투된 CD8 T 세포의 수준을 증가시킨다. 종양 이식 후 21일째에 마우스를 희생한 것을 제외하고 C57BL/6 마우스(n = 그룹 당 5)를 도 2a에서와 같이 처리하였다. a. E7 펩타이드의 존재 또는 부재 시의 IFN-γ 형성을 비장으로부터 얻은 단일 세포 현탁액 내에서 분석하였다. 값은 E7로 재자극된 배양물로부터의 점의 개수로부터, 관련 없는 항원으로 재자극된 배양물로부터의 점의 개수를 뺀 것 ± SD를 나타낸다. b. 침투된 CD45+CD8+ T 세포의 절대 개수를 전체 종양 세포 10e6 개당 값으로 표준화하였으며, 이를 평균 값 ± SD으로 나타내었다. *P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001. 두 개의 독립적인 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다.
도 14a-14b. Lm- LLO 처리는 비장 및 종양 침투 MDSC의 레벨을 감소시킨다. (도 14a) 처리된 C57BL/6 마우스 및 대조군 C57BL/6 마우스(n = 5)에서의 비장 CD11b+Gr-1+MDSC의 백분율. (도 14b) 전체 종양 세포 10e6개당 값으로 표준화된, 침투된 CD45+CD11b+Gr-1+MDSC의 절대 개수를 평균 값 ± SD으로 나타냄. *P < 0.05. 두 개의 독립적인 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다.
도 15a-15b. Lm- LLO 처리는 비장 및 종양 침투 Treg 세포의 레벨을 감소시킨다. (도 15a) 실험군 및 대조군에서의, CD4+ 비장세포 세포군 내의 CD4+FoxP3+Treg 세포의 백분율. (도 15b) 전체 종양 세포 10e6개당 값으로 표준화된, 침투된 CD45+CD4+FoxP3+Treg 세포의 절대 개수를 평균 값 ± SD으로 나타냄. *P < 0.05. 두 개의 독립적인 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다.
도 16a-16b. Lm- LLO 감염은 단핵 백혈구에서 유래된 인간 DC 표면 상에서 PD-L1 발현을 상향조절한다. (도 16a) 인간 DC 상에서의 PD-L1 발현은 다양한 농도의 Lm-LLO로의 처리 후, 미처리된 대조군 대비 배 증가함. (도 16b) 다양한 농도의 Lm-LLO로 처리된 인간 DC 상에서의 PD-L1 발현의 대표적인 히스토그램. 세 개의 독립적인 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다.
예시의 단순성 및 명확성을 위해, 도면들에 도시된 요소들이 반드시 일정한 비율로 도시되지 않았음을 이해할 것이다. 예를 들어, 상기 요소들의 일부의 치수들은 명확성을 위해 다른 요소들에 비해 과장될 수도 있다. 또한, 적절하다고 인정되는 경우, 참조 부호들은 대응하거나 유사한 요소들을 나타내기 위해 도면들에 반복될 수도 있다.

본 발명은 일 실시예에서, 면역 관문 억제자 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자 또는 길항제 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물로, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, T 세포 자극제, 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, T 세포 자극제의 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여와 동시일 수도 있다. 다른 실시예에서, T 세포 자극제의 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여 전일 수도 있다. 다른 실시예에서, T 세포 자극제의 투여는 재조합 리스테리 아 균주의 투여 후일 수도 있다.

또 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자와 T 세포 자극제의 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여와 동시일 수도 있다. 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자와 T 세포 자극제의 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여 전일 수도 있다. 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자와 T 세포 자극제의 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여 후일 수도 있다.

다른 실시예에서, 프로그램된 세포 사멸 수용체-1(PD-1) 신호전달 경로 억제자, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시예에서, 프로그램된 세포 사멸 수용체-1(PD-1) 신호전달 경로 억제자, CD-80/86 및 CTLA4 신호전달 경로 억제자, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시예에서, 대상물에서 증강된 항-종양 T 세포 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 프로그램된 세포 사멸 수용체-1(PD-1) 신호전달 경로 억제자, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스 테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시예에서, 대상물에서 증강된 항-종양 T 세포 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 관문 억제자 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시예에서, 대상물에서 증강된 항-종양 T 세포 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시예에서, 대상물에서 증강된 항-종양 T 세포 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 관문 억제자의 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여와 동시일 수도 있다. 다른 실시예에서, 관문 억제자의 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여 전일 수도 있다. 다른 실시예에서, 투여는 재조합 리스테리아 균주의 투여 후일 수도 있다.

일 실시예에서, 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에서 제공되는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 프로그램된 세포 사멸 수용체-1(PD-1) 신호전달 경로 억제자, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 관문 억제자 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물에서 종양 성장 및 암을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 프로그램된 세포 사멸 수용체-1(PD-1) 신호전달 경로 억제자, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 상기 이종 항원은 종양-연관 항원이다. 또 다른 실시예에서, 종양-연관 항원은 자연 발생 종양-연관 항원이다. 또 다른 실시예에서, 종양-연관 항원은 합성 종양-연관 항원이다.

일 실시예에서는, 대상물의 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에서 제공되는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 대상물의 비장 및 종양에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역 관문 억제자 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물의 비장 및 종양에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물의 비장 및 종양에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 대상물의 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시킴으로써, 상기 대상물의 더욱 깊은 항-종양 반응이 가능해진다.

일 실시예에서, 본원에서 제공된 상기 재조합 리스테리아 균주는 항생제 내성 유전자가 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공된 상기 재조합 리스테리아 균주는 항생제 내성 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드를 포함한다.

일 실시예에서, 본원에서 제공된 상기 재조합 리스테리아는 파고리소좀(phagolysosome)을 탈출할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포이다. 또 다른 실시예에서, 상기 조절 T 세포는 CD4+FoxP3+ T 세포이다.

일 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암에 대한 치료, 보호, 및 면역 반응 유도 방법을 제공하며, 본원에서 제공된 면역원성 조성물을 대상물에게 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 면역 관문 억제자 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물 균주를 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하며, 이에 따라 상기 조성물의 투여는 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써 인간 대상물에서 종양 또는 암을 치료한다. 또 다른 실시예에서, 상기 이종 항원은 종양 연관 항원을 포함하며, 이에 따라 재조합 리스테리아 균주가 종양 연관 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써 인간 대상물에서 종양 또는 암을 치료한다. 또 다른 실시예에서, 상기 면역 반응은 T세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD4+FoxP3- T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD4+FoxP3- 및 CD8+ T 세포 반응이다.

일 실시예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물 균주를 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하며, 이에 따라 상기 조성물의 투여는 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써 인간 대상물에서 종양 또는 암을 치료한다. 또 다른 실시예에서, 상기 이종 항원은 종양 연관 항원을 포함하며, 이에 따라 재조합 리스테리아 균주가 종양 연관 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써 인간 대상물에서 종양 또는 암을 치료한다. 또 다른 실시예에서, 상기 면역 반응은 T세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD4+FoxP3- T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD4+FoxP3- 및 CD8+ T 세포 반응이다.

일 실시예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물 균주를 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하며, 이에 따라 상기 조성물의 투여는 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써 인간 대상물에서 종양 또는 암을 치료한다. 또 다른 실시예에서, 상기 이종 항원은 종양 연관 항원을 포함하며, 이에 따라 재조합 리스테리아 균주가 종양 연관 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써 인간 대상물에서 종양 또는 암을 치료한다. 또 다른 실시예에서, 상기 면역 반응은 T세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD4+FoxP3- T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 T세포 반응은 CD4+FoxP3- 및 CD8+ T 세포 반응이다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암에 대해 대상물을 보호하는 방법을 제공하며, 본원에서 제공된 상기 면역원성 조성물을 대상물에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 대상물 내의 종양의 퇴행을 유도하는 방법을 제공하며, 본원에서 제공된 상기 면역원성 조성물을 대상물에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암의 발생 또는 재발을 감소시키는 방법을 제공하며, 본원에서 제공된 상기 면역원성 조성물을 대상물에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 대상물 내의 종양의 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 본원에서 제공된 상기 면역원성 조성물을 대상물에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 대상물 내의 암의 퇴행을 유도하는 방법을 제공하며, 본원에서 제공된 상기 면역원성 조성물을 대상물에게 투여하는 단계를 포함한다.일 실시예에서, 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 판독 프레임를 포함하는 핵산 분자는 리스테리아 내로 통합된다. 또 다른 실시예에서, 핵산은 상기 재조합 리스테리아 균주 내의 플라스미드 내에 있다. 또 다른 실시예에서, 핵산 분자는 상기 재조합 리스테리아 균주 내의 세균 인공염색체 내에 있다.

일 실시예에서 상기 리스테리아 게놈은 일 실시예에서 독성 인자인, 내인성 actA 유전자의 결실을 포함한다. 일 실시예에서, 이러한 결실은 더욱 약독화되고 그래서 인간 사용을 위해 더 안전한 리스테리아 균주를 제공한다. 일 실시예에 따르면, 이종 항원 또는 항원 폴리펩타이드는 리스테리아 염색체에 LLO가 있는 틀에 통합된다. 또 다른 실시예에서, 상기 통합된 핵산 분자는 actA 유전자자리 내로 통합된다. 또 다른 실시예에서, ActA를 암호화하는 염색체 핵산은 항원을 암호화하는 핵산 분자로 대체된다.

숙련자는 용어 “항원 폴리펩타이드”가, 가공되어 대상물의 세포에 존재하는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자들에 제공되어, 숙주 내에 존재할 때 또는 다른 실시예에서는 숙주에 의해 검출될 때 면역 반응의 시작을 야기하는, 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 재조합 펩타이드를 의미하는 것임을 이해할 것이다.

일 실시예에서, 항원은 외래, 즉 숙주에 대해 이종일 수 있으며, 이는 본원에서 “이종 항원”으로 지칭된다. 다른 실시예에서, 이종 항원은 본원에서 제공되는, 상기 항원을 재조합적으로 발현하는 리스테리아 균주에 대해 이종이다. 또 다른 실시예에서, 이종 항원은 숙주 및 본원에서 제공되는, 상기 항원을 재조합적으로 발현하는 리스테리아 균주에 대해 이종이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 숙주에 존재하지만 면역학적 내성 때문에 숙주의 면역 반응을 유발하지 않는 항원인 자가 항원이다. 숙련자는 자가 항원 및 이종 항원은 종양 항원, 종양 관련 항원 또는 혈관형성 항원을 포괄할 수 있음을 이해할 것이다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하며, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 ActA 단백질, 절단된 리스테리오리신 O (LLO) 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열,을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 절단된 LLO 단백질은 N-말단 LLO 또는 그의 단편이다. 또 다른 실시예에서, 상기 절단된 ActA 단백질은 N-말단 ActA 단백질 또는 그의 단편이다.

일 실시예에서, 본원에서 제공된 핵산 분자는 대사 효소를 암호화하는 제2 개방 구조 틀을 더 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 대사 효소는 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 결여되어 있는 내인성 유전자를 보완한다. 또 다른 실시예에서, 제2 개방 구조 틀에 의해 암호화된 대사 효소는 알라닌 라세미화효소 (dal)이다. 또 다른 실시예에서, 제2 개방 구조 틀에 의해 암호화된 대사 효소는 D-아미노산 전이효소 (dat)이다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공된 리스테리아 균주는 내인성 dal/dat 유전자에서 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 리스테리아는 dal/dat 유전자가 결여되어 있다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 핵산 분자는 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 제1 개방 판독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 제2 개방 판독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 실시예에서, 각 개방 판독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된다.

“대사 효소”는, 또 다른 실시예에서, 숙주 박테리아에 의해 요구되는 영양소의 합성에 관련된 효소를 의미한다. 또 다른 실시예에서, 용어는 숙주 박테리아에 의해 요구되는 영양소의 합성에 요구되는 효소를 의미한다. 또 다른 실시예에서, 용어는 숙주 박테리아에 의해 사용되는 영양소의 합성에 관련된 효소를 의미한다. 또 다른 실시예에서, 용어는 숙주 박테리아의 지속되는 성장을 위해 요구되는 영양소의 합성에 관련된 효소를 의미한다. 또 다른 실시예에서, 효소는 영양소의 합성을 위해 요구된다. 각각의 가능성은, 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 약독화된다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 약독화 영양요구성 균주이다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 그 전체가 참조로 본원에 통합된 미국특허 제8,114,414호에 기재된 Lm-LLO-E7 균주이다.

일 실시예에서, 약독화 균주는 Lm dal(-)dat(-) (Lmdd)이다. 또 다른 실시예에서, 약독화 균주는 Lm dal(-)dat(-)ΔactA (LmddA)이다. LmddA는, 독성 유전자 actA 의 결실로 인해 약독화되고 원하는 이종 항원을 위한 플라스미드 또는 dal 유전자의 보완에 의한 생체 내 및 시험관 내 절단 LLO 발현을 보유하는 리스테리아 벡터에 기반한다.

또 다른 실시예에서, 약독화 균주는 LmΔactA이다. 또 다른 실시예에서, 약독화 균주는 LmΔPrfA이다. 또 다른 실시예에서, 약독화 균주는 LmΔPlcB이다 . 또 다른 실시예에서, 약독화 균주는 LmΔplcA이다. 또 다른 실시예에서, 균주는 상기 균주들 중 어느 하나의 이중 돌연변이체 또는 삼중 돌연변이체이다. 또 다른 실시예에서, 이 균주는 리스테리아 기반 백신의 고유한 속성인 강력한 보강제(adjuvant) 효과를 발휘한다. 또 다른 실시예에서, 이 균주는 EGD 리스테리아 골격으로부터 구축된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명에 사용된 균주는 비용혈 LLO를 발현하는 리스테리아 균주이다.

일 실시예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 리스테리아 백신 균주이다. 또 다른 실시예에서, 또한 본원에 개시된 리스테리아 균주를 이용하는 본원에 개시된 요법은 리스테리아 기반 면역요법이다.

또 다른 실시예에서, 영양요구성 돌연변이체인 리스테리아 균주이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 비타민 합성 유전자를 암호화하는 유전자가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 판토텐산 합성 효소를 암호화하는 유전자가 결핍되어 있다.

일 실시예에서, D-알라닌이 결핍된 리스테리아 의 AA 균주의 생성은, 예를 들면, 당해 기술 분야의 숙련자에게 주지된 다수의 방법으로 달성될 수도 있는데, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 프레임 이동 돌연변이의 생성을 초래하는 돌연변이, 단백질의 조기 종결을 초래하는 돌연변이, 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 조절 서열(들)의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 돌연변이는 재조합 DNA 기술을 이용하거나 돌연변이 화학 물질이나 방사선에 이어서 돌연변이체의 선택을 이용하여 기존의 돌연변이 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 결실 돌연변이체가 바람직한데, 영양요구성 표현형의 낮은 복귀 가능성을 동반하기 때문이다. 또 다른 실시예에서, 본 명세서에서 제시된 프로토콜에 따라 생성되는 D-알라닌의 돌연변이체는 간단한 실험실 배양 분석에서 D-알라닌의 부재 시에 성장할 수 있는 능력에 대해 시험될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 이 화합물의 부재 시에 성장할 수 없는 돌연변이체들은 추가 연구를 위해 선택된다.

또 다른 실시예에서, 상기 D-알라닌 관련 유전자에 더하여, 본원에서 제공된 바와 같은, 대사 효소의 합성에 관여하는 다른 유전자들이 리스테리아의 돌연변이 유발을 위한 표적으로 사용될 수도 있다.

또 다른 실시예에서, 대사 효소는 재조합 박테리아 균주의 염색체의 나머지 부분이 결여된 내인성 대사 유전자를 보완한다. 일 실시예에서, 내인성 대사 유전자는 염색체에서 돌연변이된다. 또 다른 실시예에서, 내인성 대사 유전자는 염색체에서 결실된다. 또 다른 실시예에서, 상기 대사 효소는 아미노산 대사 효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 대사 효소는 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 세포벽 합성에 사용되는 아미노산의 형성을 촉매한다. 또 다른 실시예에서, 상기 대사 효소는 알라닌 라세미화효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 대사 효소는 D-아미노산 전이효소이다. 각각의 가능성은, 본원에서 제공된 바와 같은 방법 및 조성물의 개별적인 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, 상기 영양 요구성 리스테리아 균주는 상기 영양 요구성 리스테리아 균주의 영양 요구성을 보완하는 대사 효소를 포함하는 에피솜 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 구성체는 에피솜 방식으로 리스테리아 균주에 포함되어 있다. 또 다른 실시예에서, 외부 항원은 재조합 리스테리아 균주에 의해 보호된 벡터로부터 발현된다. 또 다른 실시예에서, 상기 에피솜 발현 벡터는 항생제 내성 마커가 결여되어 있다. 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 및 조성물의 항원은 절단된 리스테리오리신 O 단백질(LLO), 절단된 ActA 단백질 또는 PEST 아미노산 서열에 융합된다. 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 및 조성물의 항원은 절단된 LLO에 융합된다. 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 및 조성물의 항원은 절단된 ActA 단백질에 융합된다. 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 및 조성물의 항원은 PEST 아미노산 서열에 융합된다.

또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 AA 대사 효소가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 리스 테리아 균주는 D-글루탐산 합성효소 유전자가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 dat 유전자가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 dal 유전자가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 dga 유전자가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 디아미노피멜산(diaminopimelic acid)의 합성에 관여하는 유전자가 결핍되어 있다. CysK. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 비타민 B12 독립적 메티오닌 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 trpA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 trpB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 trpE이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 asnB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 gltD이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 gltB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 leuA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 argG이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 thrC이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 상술한 유전자들 중 하나 이상이 결핍되어 있다.

또 다른 실시예에서의 리스테리아 균주는 합성효소 유전자가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 AA 합성 유전자이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 folP이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 디하이드로우리딘 합성효소 과 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispD이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispF이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포스포에놀피루베이트 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 hisF이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 hisH이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 fliI이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 리보솜 큰 소단위 슈도우리딘 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispD이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 2작용 GMP 합성효소/글루타민 아미도전이효소 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cobS이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cobB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cbiD이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 유로포르피린-III C-메틸전이효소/ 유로포르피리노겐-III 합성효소 이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cobQ이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 uppS이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 truB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 dxs이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 mvaS이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 dapA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispG이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 folC이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 시트르산염 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 argJ이다. 또 다른 실시예에서 상기 유전자는 3-데옥시-7-포스포헵투론산 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 인돌-3-글리세롤-인산 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 안트라닐산염 합성효소/글루타민 아미도전이효소 성분이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 menB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 메나퀴논-특이적 이소코리스민산염 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 I 또는 II이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포스포리보실아미노이미다졸-숙시노카르복사이미드 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 carB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 carA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 thyA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 mgsA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 hepB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 rluB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ilvB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ilvN이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 alsS이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 fabF이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 fabH이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 슈도우리딘 합성효소이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 pyrG이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 truA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 pabB이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 atp 합성효소 유전자이다 (예, atpC, atpD-2, aptG, atpA-2 등).

또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 phoP이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroC이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroD이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 plcB이다 .

또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 펩타이드 수송체가 결핍되어 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ABC 수송체/ ATP-결합/투과효소 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 올리고 펩타이드 ABC 수송체/올리고펩타이드-결합 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 올리고펩타이드 ABC 수송체/ 투과효소 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 아연 ABC 수송체/ 아연-결합 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 설탕 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 인산염 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ZIP 아연 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 EmrB/QacA 과의 약물 내성 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 황산염 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 양성자의존성 올리고펩타이드 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 마그네슘 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포름산염/아질산염 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 스퍼미딘/퓨트레신 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 Na/Pi-공동수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 설탕 인산염 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 글루타민 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 주 촉진자(Major Facilitator) 과 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 글리신 베타인/L-프롤린 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 몰리브덴 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 테코익산 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 코발트 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 암모늄 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 아미노산 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 세포 분열 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 망간 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 철 화합물 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 말토오스/말토덱스트린 ABC 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 Bcr/CflA 과 약물 내성 수송체이다. 또 다른 실시예에서, 상기 유전자는 상기한 단백질(들) 중 하나의 서브유닛이다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 것은 재조합 리스테리아에 도달하기 위해서 리스테리아를 형질전환시키는 데 사용되는 핵산 분자이다. 또 다른 실시예에서의 본원에서 제공되는 핵산은 독성 유전자가 결여된 리스테리아를 형질전환시키는 데 사용된다. 또 다른 실시예에서, 핵산 분자는 리스테리아 게놈 내에 통합되고 비-작용성 독성 유전자를 운반한다. 또 다른 실시예에서, 독성 유전자는 재조합 리스테리아 게놈에서 변이된다. 또 다른 실시예에서, 상기 핵산 분자는 리스테리아 게놈에 존재하는 내인성 유전자를 비활성화시키는 데에 사용된다. 또 다른 실시예에서, 독성 유전자는 actA 유전자, inlA 유전자, 및 inlB 유전자, inlC 유전자, inlJ 유전자, plbC 유전자, bsh 유전자, 또는 prfA 유전자이다. 독성 유전자는 재조합 리스테리아 내의 독성과 연관될 수 있다고 공지된 임의의 유전자일 수 있다는 것이 숙련자에 의해 이해되어야 한다.

또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 inlA 돌연변이체, inlB 돌연변이체, inlC 돌연변이체, inlJ 돌연변이체, prfA 돌연변이체, ActA 돌연변이체, dal/dat 돌연변이체, prfA 돌연변이체, plcB 결실 돌연변이체, 또는 plcA 및 plcB 둘 다 결핍된 이중 돌연변이체이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아는 이 유전자들의 개별적 또는 조합 형태의 결실 또는 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 리스테리아는 유전자들 중 각각 하나가 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 리스테리아는 actA, prfA, 및 dal/dat 유전자를 비롯하여, 본원에서 제공되는 임의의 유전자 중 적어도 하나 및 최대 10까지 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, prfA 돌연변이체는 D133V prfA 돌연변이체이다.

일 실시예에서, 살아 있는 약독화 리스테리아는 재조합 리스테리아이다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 게놈 internalin C(inlC) 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 게놈 actA 유전자 및 게놈 internalin C 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일 실시예에서, 인접하는 세포로의 리스테리아의 전위(translocation)는 actA 유전자 및/또는 inlC 유전자의 결실에 의해 억제되는데, 이는 상기 과정에 연관되어서, 백신 골격으로서 증가된 면역원성 및 유용성을 가지고 예기치 않게 높은 수준의 약독화 결과를 야기하게 된다. 각각의 가능성은, 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등은 리스테리아 균주의 염색체가 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등은 리스테리아 균주의 염색체 및 임의의 에피솜 유전적 요소가 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등은 독성 균주의 게놈이 결여되어 있다. 일 실시예에서, 독성 유전자는 염색체에서 돌연변이된다. 또 다른 실시예에서, 독성 유전자는 염색체로부터 결실된다. 각각의 가능성은, 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 약독화된다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 actA 독성 유전자가 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 prfA 독성 유전자가 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 inlB 유전자가 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 상기 actA와 inlB 유전자가 모두 결여되어 있다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 inlB 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 및 inlB 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아 균주는 다음과 같은 유전자들 중 임의의 하나의 유전자 또는 조합의 불활성화 돌연변이를 포함한다: actA , dal , dat, inlB , inlC , prfA , plcA , plcB.

용어 "돌연변이" 및 그 문법적 상당물은, 서열(핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 돌연변이 또는 변형 중 어느 유형을 포함하며, 및 결실 돌연변이, 절단(truncation), 불활성화, 파괴(disruption), 교환 또는 전좌를 포함한다는 것이 숙련자에 의해 이해될 것이다. 이러한 종류의 돌연변이는 본 기술분야에 쉽게 공지되어 있다.

일 실시예에서, 대사효소를 암호화하는 플라스미드 또는 본원에서 제공된 보완 유전자를 포함하는 영양요구성 박테리아를 위해 선별하기 위해, 형질전환된 영양 요구성 박테리아는, 아미노산 대사 유전자 또는 보완 유전자의 발현을 위해 선별하게 될 배지에서 성장된다. 또 다른 실시예에서, D-글루탐산 합성을 위한 영양 요구성 세균은 D-글루탐산 합성을 위한 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되고, 영양 요구성 세균은 D-글루탐산의 부재에서 성장할 것이며, 플라스미드로 형질전환되지 않았거나, 또는 D-글루탐산 합성을 위한 단백질을 암호화하는 플라스미드를 발현하지 않는 영양 요구성 세균은 성장하지 않을 것이다. 또 다른 실시예에서, 형질전환되고 플라스미드가 D-알라닌 합성을 위한 아미노산 대사효소를 암호화하는 단리된 핵산을 포함한다면 본 발명의 플라스미드를 발현할 때, D-알라닌 합성을 위한 영양 요구성 세균은 D-알라닌 부재에서 성장할 것이다. 필요한 성장 인자, 보충제, 아미노산, 비타민, 항생제 기타 등등을 포함하거나 결여된 적절한 배지를 제조하는 이러한 방법은, 본 기술분야에서 주지되어 있고, (Becton-Dickinson, 뉴저지 프랭클린 레이크스)에서 시판되고 있다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 플라스미드를 포함하는 영양 요구성 세균이 적절한 배지에 선택되었다면, 세균은 선택적 압력의 존재에서 전파된다. 이러한 전파는 영양요구성 인자 없는 배지에서 세균을 성장시키는 것을 포함한다. 영양 요구성 세균 내의 아미노산 대사효소를 발현하는 플라스미드의 존재는 이 플라스미드가 세균과 함께 복제할 것이며, 이에 따라 지속적으로 플라스미드를 숨기는 세균을 위해 선별하는 것을 보장한다. 숙련자라면, 본 발명과 본원에서의 방법들이 장착되는 경우, 플라스미드를 포함하는 영양 요구성 세균이 성장하고 있는 배지의 부피를 조정함으로써 리스테리아 백신 벡터의 생산 규모를 용이하게 크게 할 수 있을 것이다.

숙련자라면 또 다른 실시예에서, 다른 영양 요구성 균주들과 보완 시스템이 본 발명에 사용하기 위해 채택된다는 것을 이해할 것이다.

일 실시예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원은, 또 다른 실시예에서, 서로에게 직접 융합된다. 또 다른 실시예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원을 암호화하는 유전자는 서로에게 직접 융합된다. 또 다른 실시예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원은 링커 펩타이드를 통해 작동가능하게 부착된다. 또 다른 실시예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원은 이종 펩타이드를 통해 부착된다. 또 다른 실시예에서, N-말단 LLO 단백질 단편은 이종 항원에 대한 N-말단이다. 또 다른 실시예에서, N-말단 LLO 단백질 단편은 융합 단백질의 N-말단최대부분이다. 또 다른 실시예에서, 절단된 LLO는 C-말단에서 절단되어서 N-말단 LLO에 도달한다. 본원에서 제공되는 바와 같이, LLO를 발현하는 재조합 리스테리아 균주는 절단된 LLO를 발현하지 않는 재조합 리스테리아 균주 (실시예 5) 보다 높은 수준으로 비장 내 CD4+Foxp3-T 세포 및 CD8+T 세포 수를 예기치않게 증가시킴에 따라, CD4+Foxp3-T 세포 및 CD8+T 세포의 팽창이 LLO (실시예 6)에 의해 직접 매개된다는 것을 설명한다. 본원에서 추가로 제공되는 바와 같이, 절단된 LLO를 에피솜 발현하는 재조합 리스테리아는 Tregs의 수를 감소시키지 않고, CD4+Foxp3-T 세포 및 CD8+T의 팽창을 유도함으로써, CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포 대 CD4+FoxP3+ T 세포 (조절 T 세포 또는 Tregs)의 비를 예기치않게 증가시킴에 따라, 비례하게 Tregs의 빈도를 감소시킨다.

일 실시예에서, 절단된 ActA 단백질 및 이종 항원은, 또 다른 실시예에서, 서로에게 직접 융합된다. 또 다른 실시예에서, 절단된 ActA 단백질 및 이종 항원을 암호화하는 유전자들은 서로에게 직접 융합된다. 또 다른 실시예에서, 절단된 ActA 단백질 및 이종 항원은 링커 펩타이드를 통해 작동가능하게 부착된다. 또 다른 실시예에서, 절단된 ActA 단백질 및 이종 항원은 이종 펩타이드를 통해 부착된다. 또 다른 실시예에서, 절단된 ActA 단백질은 이종 항원에 대한 N-말단이다. 또 다른 실시예에서, 절단된 ActA 단백질은 융합 단백질의 가장 N-말단 부분이다. 또 다른 실시예에서, 절단된 ActA 단백질은 C-말단에서 절단되어서 N-말단 ActA에 도달한다.

일 실시예에서, PEST 아미노산 서열 및 이종 항원은, 다른 실시예에서, 서로에게 직접 융합된다. 또 다른 실시예에서, PEST 아미노산 서열 및 이종 항원을 암호화하는 유전자들은 서로에게 직접 융합된다. 또 다른 실시예에서, PEST 아미노산 서열 및 이종 항원은 링커 펩타이드를 통해 작동가능하게 부착된다. 또 다른 실시예에서, PEST 아미노산 서열 및 이종 항원은 이종 펩타이드를 통해 부착된다. 또 다른 실시예에서, PEST 아미노산 서열은 이종 항원에 대한 N-말단이다.

일 실시예에서, 본 발명의 리스테리아에 포함된 핵산 분자는 재조합 폴리펩타이드를 암호화한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공된 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공된 재조합 핵산은 본원에서 제공된 재조합 리스테리아 균주 내 플라스미드 내에 있다. 또 다른 실시예에서, 플라스미드는 상기 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 통합하지 않는 에피솜 플라스미드이다. 또 다른 실시예에서, 플라스미드는 상기 리스테리아 균주의 염색체에 통합하는 통합 플라스미드(integrative plasmid)이다. 또 다른 실시예에서, 플라스미드는 멀티카피 플라스미드이다.

일 실시예에서, 상기 방법은 추가 요법과 재조합 리스테리아를 공동 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 추가 요법은 수술, 화학 요법, 면역 요법 또는 이들의 조합이다. 또 다른 실시예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아의 투여에 선행한다. 또 다른 실시예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아의 투여에 뒤따른다. 또 다른 실시예에서, 추가 요법은 항체 요법이다. 또 다른 실시예에서 상기 항체 요법은 항-PD1, 항-CTLA4이다. 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 T-효과기 세포 대 조절 T 세포 비율을 증가시키고 더 강력한 항-종양 면역 반응을 생성하기 위해 투여량을 늘리면서 투여된다. 항-종양 면역 반응은 IFN-γ, TNF-α를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 사이토카인, 및 세포 면역 반응을 강화하는 것으로 당해 기술 분야에서 공지된 기타 사이토카인을 종양을 갖는 상기 대상물에 제공함으로써 더욱 강화될 수 있다는 사실이 숙련자에 의해 이해될 것이며, 이들 중 일부는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 번호 제6,991,785호에서 찾을 수 있다.

일 실시예에서, 이종 항원은 종양-연관 항원이다. 일 실시예에서, 본원에서 제공된 조성물 및 방법의 재조합 리스테리아 균주는 종양 세포에 의해 발현되는 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 발현한다.

또 다른 실시예에서, 종양-연관 항원은 인간 유두종 바이러스(HPV)이다. 또 다른 실시예에서, 종양-연관 항원은 HPV-E7이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 HPV-E6이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 Her-2이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 NY-ESO-1이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 텔로머라제이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 SCCE이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 WT-1이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 HIV-1 Gag이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 단백질분해효소 3이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 티로시나제 관련 단백질 2이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 E7, E6, Her-2, NY-ESO-1, 텔로머라제, SCCE, WT-1, HIV-1 Gag, 단백질분해효소 3, 티로시나제 관련 단백질 2에서 선택된다. 또 다른 실시예에서, 항원은 종양-연관 항원이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 감염성 질환 항원이다.

또 다른 실시예에서, 종양-연관 항원은 혈관형성 항원이다. 또 다른 실시예에서, 혈관형성 항원은 활성화된 혈관주위세포(pericyte)와 종양 혈관형성 혈관 내 혈관주위세포 모두에 발현되며, 이는 또 다른 실시예에서, 생체 내에서 신생혈관화에 연관된다. 또 다른 실시예에서, 혈관형성 항원은 HMW-MAA이다. 또 다른 실시예에서, 혈관형성 항원은 본 기술분야에 공지된 것이고 본원에서 참고로 인용된 WO2010/102140에 제공된다.

일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인터페론-감마의 강한 자극을 유도하며, 이는 일 실시예에서, 항-혈관형성 특성을 갖는다. 일 실시예에서, 본 발명의 리스테리 아는 인터페론-감마, 일 실시예에서는 항-혈관형성 특성을 갖는 인터페론감마의 강한 선천적 자극을 유도한다(Dominiecki 외, Cancer Immunol Immunother. 2005 May; 54(5):47788. Epub 2004 Oct 6, 본원 전체에서 참조로 포함됨; Beatty and Paterson, J Immunol. 2001 Feb 15; 166(4): 227682, 본원 전체에서 참조로 포함됨). 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 인터페론-감마 생산 세포의 수준을 증가시킨다. 일 실시예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD4⁺T 세포에 의해 매개된다 (Beatty 및 Paterson, 2001). 또 다른 실시예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD8⁺ T 세포에 의해 매개된다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 예방접종의 결과로서 IFN-γ 분비는 NK 세포, NKT 세포, Th1 CD4⁺ T 세포, TC1 CD8⁺ T 세포, 또는 이들의 조합에 의해 매개된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 단백질 또는 인자들의 생산을 유도한다. 일 실시예에서, 항-혈관형성 단백질은 IFN-γ이다. 또 다른 실시예에서, 항-혈관형성 단백질은 색소 상피세포 유래 인자(PEDF); 안지오스타틴; 엔도스타틴; fms-유사 티로신 키나제(sFlt)-1; 또는 수용성 엔도글린(endoglin) (sEng)이다. 일 실시예에서, 본 발명의 리스테리아는 항-혈관형성 인자의 방출에 관여하며, 따라서, 일 실시예에서, 대상물에 항원을 도입하기 위한 벡터 역할에 더하여 치료제 역할을 갖는다. 각각의 리스테리아 균주 및 이들의 유형은 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

다른 실시예에서, 상기 항원은 진균 병원체, 세균, 기생충, 연충(helminth) 또는 바이러스로부터 유래한다. 다른 실시예에서, 항원은 파상풍 톡소이드, 인플루엔자 바이러스 유래 헤마그글루티닌 분자, 디프테리아 톡소이드, HIV gp120, HIV gag 단백질, IgA 프로테아제, 인슐린 펩타이드 B, 스폰고스포라 수브테라네아 항원, 비브리오스(vibriose) 항원, 살모넬라 항원, 폐렴 구균 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 헤모필루스 인플루엔자 외막 단백질, 헬리코박터 파이로리 우레아제, 나이세리 아 뇌수막염 필린, N. 임질 필린, 흑색종 관련 항원 (TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나제, MART-1, HSP-70, 베타-HCG), HPV-16, -18, -31 , -33, -35 또는 -45 형 인간 유두종 바이러스 유래 인간 유두종 바이러스 항원 E1 및 E2, 종양 항원 CEA, ras 단백질, 돌연변이 또는, p53 단백질, 돌연변이 또는, Muc1, 메소텔린(mesothelin), EGFRVIII로부터 선택된다.

다른 실시예에서, 상기 항원은 다음 질환들 중 하나와 연관된다: 콜레라, 디프테리아, 헤모필루스, A 형 간염, B 형 간염, 인플루엔자, 홍역, 수막염, 유행성 이하선염, 백일해(pertussis), 천연두, 폐렴 구균성 폐렴, 소아마비, 광견병, 풍진, 파상풍, 결핵, 장티푸스, 수두대상물 포진, 백일기침(whooping cough), 황열병, 애디슨 병 유래 면역원 및 항원, 알레르기, 아나필락시스, 브루톤 증후군, 고체 및 혈액 매개 종양을 비롯한 암, 습진, 하시모토 갑상선염, 다발성 근염, 피부 근염, 1 형 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군, 신장, 심장, 췌장, 폐, 뼈, 간 이식 등의 이식 거부, 그레이브스 병(Graves' disease), 다선(polyendocrine) 자가면역 질환, 간염, 현미경적 다발성 동맥염, 결절성 다발 동맥염, 천포창, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 소아 지방 변증, 항체매개 신염, 사구체 신염, 류마티스 질환, 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 혈청음성 척추 관절병증, 비염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 전신성 경화증, 경화성 담관염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 포진, 건선, 백반증, 다발성 경화증, 뇌척수염 피부염, 길렝-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 중증 근무력증, 램버트-이튼 증후군(Lambert-Eaton syndrome), 공막(sclera), 상공막(episclera), 포도막염, 만성 피부 점막 칸디다증, 두드러기, 유아기의 일시적인 저감마글로불린혈증, 골수종, X-연결 하이퍼 IgM 증후군, 비스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 운동 실조의 모세혈관 확장, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 아밀로이드증, 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 말라리아 환상포자소체(malarial circumsporozite) 단백질, 미생물 항원, 바이러스 항원, 자가항원 및 리스테리아증(lesteriosis).

다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 이종 항원은 종양-연관 항원이며, 일 실시예에서는 하기 종양 항원 중 하나이다: MAGE(흑색종연관 항원 E) 단백질, 예를 들어, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, 티로시나아제; 돌연변이 ras 단백질; 돌연변이 p53 단백질; p97 흑색종 항원, ras 펩티드 또는 진행암과 연관된 p53 펩티드; 자궁경부암과 연관된 HPV 16/18 항원, 유방 암종과 연관된 KLH 항원, 대장암과 연관된 CEA(암배 항원), gp100, 흑색종과 연관된 MART1 항원, 또는. 다른 실시예에서, 본원에서 제공된 바와 같은 조성물 및 방법에 대한 항원은 흑색종연관 항원이며, 일 실시예에서는 TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나아제, HSP-70, 베타-HCG, 또는 이들의 조합이다.

다른 실시예에서, 항원은 전체가 참조로 본원에 통합된 미국 특허 제9,084,747호에 기재된 키메라 Her2 항원이다.

또 다른 실시예에서, 항원은 HPV-E7이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 HPV-E6이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 Her-2/neu이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 NY-ESO-1이다. 다른 실시예에서, 항원은 텔로머라아제(TERT)이다.　 또 다른 실시예에서, 항원은 SCCE이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 CEA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 LMP-1이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 p53이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 탄산 탈수효소 IX (CAIX)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 PSMA이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 전립선 줄기세포 항원(PSCA)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원은 HMW-MAA이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 WT-1이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 HIV-1 Gag이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 단백질분해효소 3이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 티로시나제 관련 단백질 2이다. 또 다른 실시예에서, 항원은 HPV-E7, HPV-E6, Her-2, NY-ESO-1, 텔로머라제(TERT), SCCE, HMW-MAA, EGFR-III, 서바이빈(survivin), 바큘로바이러스 세포사멸 억제자 반복배열 함유 5 (BIRC5), WT-1, HIV-1 Gag, CEA, LMP-1, p53, PSMA, PSCA, 단백질분해효소 3, 티로시나제 관련 단백질 2, Muc1, 또는 이들의 조합에서 선택된다.

일 실시예에서, 본 발명의 리스테리아에 의해 발현되는 융합 폴리펩타이드는, 일 실시예에서는 [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] 물질 P, [Arg6, D-Trp7,9, NmePhe8]물질 P(6-11)인 뉴로펩타이드 성장 인자 길항제를 포함할 수도 있다. 이들 및 관련된 실시예들은 숙련자에 의해 이해된다.

또 다른 실시예에서, 이종 항원은 감염성 질환 항원이다. 일 실시예에서, 항원은 자가 항원 또는 자기-항원이다.

또 다른 실시예에서, 이종 항원은 진균류 병원체, 박테리아, 기생충, 장내 기생충 또는 바이러스로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 항원은 파상풍 톡소이드, 인플루엔자 바이러스 유래 헤마그글루티닌 분자, 디프테리아 톡소이드, HIV gp120, HIV gag 단백질, IgA 프로테아제, 인슐린 펩타이드 B, 스폰고스포라 수브테라네아 항원, 비브리오스(vibriose) 항원, 살모넬라 항원, 폐렴 구균 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 헤모필루스 인플루엔자 외막 단백질, 헬리코박터 파이로리 우레아제, 나이세리아 뇌수막염 필린, N. 임질 필린, HPV-16, -18, -31 , -33, -35 또는 -45 형 인간 유두종 바이러스 유래 인간 유두종 바이러스 항원 E1 및 E2, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.

또 다른 실시예에서, 상기 이종 항원은 다음 질환들 중 하나와 연관된다: 콜레라, 디프테리아, 헤모필루스, A 형 간염, B 형 간염, 인플루엔자, 홍역, 수막염, 유행성 이하선염, 백일해(pertussis), 천연두, 폐렴 구균성 폐렴, 소아마비, 광견병, 풍진, 파상풍, 결핵, 장티푸스, 수두대상물 포진, 백일기침3(whooping cough3) 황열병, 애디슨 병 유래 면역원 및 항원, 알레르기, 아나필락시스, 브루톤 증후군, 고체 및 혈액 매개 종양을 비롯한 암, 습진, 하시모토 갑상선염, 다발성 근염, 피부 근염, 1 형 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군, 신장, 심장, 췌장, 폐, 뼈, 간 이식 등의 이식 거부, 그레이브스 병(Graves' disease), 다선(polyendocrine) 자가면역 질환, 간염, 현미경적 다발성 동맥염, 결절성 다발 동맥염, 천포창, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 소아 지방 변증, 항체매개 신염, 사구체 신염, 류마티스 질환, 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 혈청음성 척추 관절병증, 비염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 전신성 경화증, 경화성 담관염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 포진, 건선, 백반증, 다발성 경화증, 뇌척수염 피부염, 길렝-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 중증 근무력증, 램버트-이튼 증후군(Lambert-Eaton syndrome), 공막(sclera), 상공막(episclera), 포도막염, 만성 피부 점막 칸디다증, 두드러기, 유아기의 일시적인 저감마글로불린혈증, 골수종, X-연결 하이퍼 IgM 증후군, 비스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 운동 실조의 모세혈관 확장, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 아밀로이드증, 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 말라리아 환상포자소체(malarial circumsporozite) 단백질, 미생물 항원, 바이러스 항원, 자가항원 및 리스테리아증(lesteriosis). 각각의 항원은, 본원에서 제공된 바와 같은 방법 및 조성물의 개별적인 실시예를 나타낸다.

본원에서 제공된 방법 및 조성물에 의해 유도된 면역 반응은, 또 다른 실시예에서, T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 면역 반응은 T 세포 반응을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 상기 반응은 CD8⁺ T 세포 반응을 포함한다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아는 혈관형성 항원 또는 혈관형성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 실시예에서, 암 치료에 대한 항-혈관형성 접근법들은 매우 유망하고, 일 실시예에서, 이러한 항-혈관형성 치료의 한 가지 유형은 혈관주위세포를 표적화한다. 다른 실시예에서, 혈관내피 세포 및 혈관주위세포에 대한 분자 표적은 항-종양 치료의 중요한 표적이다. 다른 실시예에서, 혈소판에서 유래한 성장 인자 수용체(PDGF-B/PDGFR-β) 신호전달은 새롭게 형성된 혈관에 혈관주위세포를 모으는 데 있어 중요하다. 따라서, 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 혈관형성 폴리펩타이드는 혈관주위세포 신호전달에 관련된 분자를 억제하는데, 일 실시예에서 이러한 분자는 PDGFR-β이다.

일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 혈관형성 인자, 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는데, 일 실시예에 의하면 상기 면역원성 단편은 숙주 면역 시스템에 의해 인지되는 에피토프를 하나 이상 포함한다. 일 실시예에서, 혈관형성 인자는 새로운 혈관 형성에 관련된 분자이다. 일 실시예에서, 상기 혈관형성 인자는 VEGFR2이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 혈관형성 인자는 안지오제닌; 안지오포이에틴-1; Del-1; 섬유아 세포 성장 인자들: 산성(aFGF) 및 염기성(bFGF); 폴리스타틴; 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF); 헤파토사이트 성장 인자(HGF)/산란 인자(SF); 인터류킨-8(IL-8); 렙틴; 미드카인; 태반 성장 인자; 혈소판에서 유래한 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF); 혈소판에서 유래한 성장 인자-BB(PDGF-BB); 플레이오트로핀(PTN); 프로그래뉼린; 프롤리페린; 서바이빈; 형질전환 성장 인자-알파(TGF-alpha); 형질전환 성장 인자베타(TGFbeta); 종양 괴사 인자알파(TNFalpha); 혈관내피 성장 인자(VEGF)/혈관 투과 인자(VPF)이다. 다른 실시예에서, 혈관형성 인자는 혈관형성 단백질이다. 일 실시예에서, 성장 인자는 혈관형성 단백질이다. 일 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 혈관형성 단백질은 섬유아 세포 성장 인자(FGF); VEGF; VEGFR 및 뉴로필린1(NRP-1); 안지오포이에틴 1(Ang1) 및 Tie2; 혈소판유래 성장 인자(PDGF; BB-호모다이머) 및 PDGFR; 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 엔도글린 및 TGF-β 수용체; 단핵 백혈구 화학주성 단백질-1(MCP-1); 인테그린 αVβ3, αVβ5 및 α5β1; VE-카데린 및 CD31; 에프린; 플라스미노겐활성화인자; 플라스미노겐활성화인자 억제자-1; 일산화질소 합성 효소(NOS) 및 COX-2; AC133; 또는 Id1/Id3이다. 일 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법들에 사용하기 위한 혈관형성 단백질은 안지오포이에틴인데, 이는 일 실시예에서, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 3, 안지오포이에틴 4, 또는 안지오포이에틴 6이다. 일 실시예에서, 엔도글린은 CD105; EDG; HHT1; ORW; 또는 ORW1로서 또한 공지된다. 일 실시예에서, 엔도글린은 TGF베타 공수용체이다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 면역원성 조성물은 자가면역 질환의 예방, 억제, 저해, 또는 치료에 유용하다. 일 실시예에서, 상기 자가면역 질환은 본 기술분야에 알려져 있는 어떠한 자가면역 질환에도 해당되며, 이에는 류마티스 관절염(RA), 인슐린 의존성 진성 당뇨병(1형 당뇨병), 다발성 경화증(MS), 크론병, 전신 홍반성 낭창(SLE), 공피증, 쇼그렌 증후군, 심상성천포창, 유천포창, 애디슨 병, 강직성 척추염, 무형성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 소아 지방 변증, 피부 근염, 굿페스쳐 증후군, 그레이브스 병, 길렝-바레 증후군, 하시모토 병, 특발성 백혈구 감소증, 특발성 혈소판감소 자색반증, 남성불임, 혼합결합조직병, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 파코제닉 포도막염, 원발성 담즙성 간경변, 일차성 점액 수종, 라이터 증후군, 강직인간증후군, 갑상선중독증, 궤양성 대장염, 및 베게너 육아종증이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 다른 실시예에서, 본 발명은 또한 다발성 경화증과 같은 신경계의 염증성 질환, 염증성 장 질환, 천식, 또는 편도선과 같은 점막 염증성 질환, 피부염, 건선, 또는 접촉성 과민증과 같은 염증성 피부 질환, 및 류마티스 관절염과 같은 자가면역 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 길항제 항체(agonist antibody) 또는 그의 유도체에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 조성물 및 그의 사용 방법은 종양을 침투하고, 종양 세포를 파괴하며, 질환을 근절할 수 있는 효과기 T 세포를 생성한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 사용 방법은 T 효과기 세포에 의한 종양 침투를 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD45+CD8+ T 세포를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+Fox3P T 세포를 포함한다.

일 실시예에서, 자연적으로 발생하는 종양 침투 림프구(TIL)는 대장암, 난소암 및 흑색종과 같은 몇몇 종양에서의 더 나은 예후와 관련된다. 대장암의 경우, 미세전이의 징후가 없는 종양은 면역 세포 침투의 증가와 Th1 발현 프로파일을 보이는데, 이는 환자의 생존율 개선과 관련이 있다. 또한, T 세포에 의한 종양 침투는 전(煎)임상 및 인간을 대상으로 한 실험 모두에서의, 면역치료 접근법의 성공과 관련된다. 일 실시예에서, 종양 부위로의 림프구 침투는 일반적으로 IFN-γ, TNF-α 및 IL-1과 같은 전 염증성 사이토카인에 의한, 종양 맥관 구조의 내피 세포 중의 부착 분자의 상향조절에 의존적이다. 세포간 부착 분자 1(ICAM-1), 혈관내피 세포 부착 분자 1(V-CAM-1), 혈관 접착 단백질 1(VAP-1) 및 E-셀렉틴을 포함하는 몇몇 부착 분자는 종양으로 림프구가 침투하는 과정에 관련된다. 그러나, 이들 세포 부착 분자는 종양 맥관 구조 내에서 일반적으로 하향조절된다. 따라서, 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 암 백신은 TIL을 증가시키고, 부착 분자(일 실시예에서, ICAM-1, V-CAM-1, VAP-1, E-셀렉틴, 또는 이들의 조합)를 상향조절하며, 전 염증성 사이토카인(일 실시예에서, IFN-γ, TNF-α, IL-1, 또는 이들의 조합)을 상향조절하거나, 또는 이들의 조합을 야기한다.

또 다른 실시예에서, HPV 항원은 HPV 16이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-18이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-16 및 HPV-18로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-31이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-35이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-39이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-45이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-51이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-52이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 HPV-58이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 고위험 HPV 형이다. 또 다른 실시예에서, HPV는 점막 HPV 형이다. 각각의 가능성은, 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, HPV E6는 HPV-16 유래이다. 또 다른 실시예에서, HPV E7는 HPV-16 유래이다. 또 다른 실시예에서, HPV E6는 HPV-18 유래이다. 또 다른 실시예에서, HPV E7는 HPV-18 유래이다. 또 다른 실시예에서, HPV E6 항원은 HPV 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 개선시키기 위한 본 발명의 조성물 또는 방법에서 E7 항원 대신 또는 이에 추가하여 사용된다. 또 다른 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7은 HPV-18 E6 및 E7 대신 또는 이와 조합하여 사용된다. 이러한 실시예에서, 재조합 리스테리아는 염색체로부터 HPV-16 E6 및 E7을 발현하고 플라스미드로부터 HPV-18 E6 및 E7를 발현할 수도 있거나 또는 그 역으로 발현할 수도 있다. 또 다른 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 본원에서 제공된 재조합 리스테리아에 존재하는 플라스미드로부터 발현된다. 또 다른 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 본원에서 제공된 재조합 리스테리아의 염색체로부터 발현된다. 또 다른 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 각각의 HPV 균주로부터의 각각의 E6 및 E7 항원이 플라스미드 또는 염색체로부터 발현되는 경우를 비롯하여, 상기 실시예들과 임의의 조합으로 발현된다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 질병은 암 또는 종양이다. 일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 암은 유방암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 자궁 경부암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 Her2 함유 암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 흑색종이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 췌장암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 난소암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 위암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 췌장의 암종 병변이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 폐 선암이다. 또 다른 실시예에서, 그것은 아교 모세포종의 홍반이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 대장 선암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 폐 편평상피 선암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 위 선암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 난소 표면 상피 종양 (예, 그것의 양성, 증식성 또는 악성 변종)이다. 또 다른 실시예에서의 암이 구강 편평 세포 암종이다. 또 다른 실시예에서 상기 암은 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 자궁내막 암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 방광 암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 두경부 암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 전립선 암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 인두 암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 폐암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 항문암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 대장암이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 식도암이다. 다른 실시예에서, 암은 중피종이다. 각각의 가능성은, 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, 절단된 LLO는 PEST 아미노산 (AA) 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 PEST 아미노산 서열은 KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (서열번호 1)이다. 또 다른 실시예에서, 리스테 리아 유래의 다른 LM PEST AA 서열들에 대한 항원의 융합 또한 항원의 면역원성을 향상시킬 것이다.

본 발명의 방법 및 조성물의 N-말단 LLO 단백질 단편은, 또 다른 실시예에서, 서열번호 2를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 단편은 LLO 신호 펩타이드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 단편은 서열번호 3을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 단편은 대략 서열번호 3으로 이루어진다. 또 다른 실시예에서, 상기 단편은 필수적으로 서열번호 3으로 이루어진다. 또 다른 실시예에서, 상기 단편은 서열번호 3에 대응한다. 또 다른 실시예에서, 상기 단편은 서열번호 3에 동종이다. 또 다른 실시예에서, 상기 단편은 서열번호 3의 단편에 동종이다. 실시예들 중 일부에 사용되는 ΔLLO는 416 AA 길이였는데 (신호 서열 제외), 시스테인 484을 함유하는 활성 도메인에 포함되는 아미노기 말단으로부터 88 잔기가 절단되었다. 활성 도메인이 없는, 특히, 시스테인 484이 없는, 어떤 ΔLLO라도 본 발명의 방법 및 조성물에 적합하다는 것이 본 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 또 다른 실시예에서, PEST AA 서열, 서열 번호 1을 포함한, 임의의 ΔLLO에 대한 이종 항원의 융합은, 항원의 세포 매개 및 항-종양 면역을 향상시킨다. 각각의 가능성은, 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

본 발명의 백신을 구축하기 위해 사용되는 LLO 단백질은, 또 다른 실시예에서, 서열:

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE (GenBank 수탁번호 P13128; 서열번호: 4; 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 X15127에 제시된다)을 가진다. 이 서열에 상응하는 프로단백질의 처음 25 AA는 신호 서열이고 박테리아에 의해 분비되는 경우 LLO로부터 절단(cleave)된다. 따라서, 본 실시예에서, 전장 활성 LLO 단백질은 504 잔기 길이이다. 또 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 본 발명의 백신에 포함되는 LLO 단편의 소스로서 사용된다.

본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 LLO 단백질의 N-말단 단편은 서열:

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD (서열번호 2)을 가진다.

또 다른 실시예에서, LLO 단편은 본원에서 사용된 LLO 단백질의 약 AA 20-442에 상응한다.

또 다른 실시예에서, LLO 단편은 서열:

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD (서열번호 3)을 가진다.

다른 실시예에서, “절단된 LLO” 또는 “ΔLLO”는 추정 PEST 아미노산 서열을 포함하는 LLO의 단편을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상기 용어는 추정 PEST 도메인을 포함하는 LLO 단편을 가리킨다. 다른 실시예에서, “절단된 LLO” 및 “N-말단 LLO”는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

다른 실시예에서, 용어는 아미노 말단에서 활성 도메인을 함유하지 않고 시스테인 484를 포함하지 않는 LLO 단편을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상기 용어는 용혈성이 아닌 LLO 단편을 가리킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 상기 활성화 도메인의 결실 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성이 부여된다. 또 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 시스테인 484의 결실 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성이 부여된다. 또 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 다른 위치에서 결실 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성이 부여된다. 또 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 전체가 참조로 본원에 통합된 미국 특허 제8,771,702호에 기재된 콜레스테롤 결합 도메인(CBD)의 결실 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성이 부여된다.

또 다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 약 처음 441 AA로 구성된다. 또 다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO의 약 처음 420 AA로 구성된다. 또 다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 비용혈 형태이다.

또 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-25로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-50으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-75로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-100으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-125로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-150으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-175로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-200으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-225로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-250으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-275로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-300으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-325로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-350으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-375로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-400으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-425로 이루어진다.

또 다른 실시예에서, LLO 단편은 상기 AA 범위 중 하나에 해당하는 상동성 LLO 단백질의 잔기들을 포함하고 있다. 잔기 수는 필요하지 않으며, 또 다른 실시예에서, 위에 열거된 잔기 수와 정확히 일치한다; 예를 들면 상동성 LLO 단백질이 본원에서 이용되는 LLO 단백질에 대해 상대적인, 삽입 또는 결실을 가지는 경우, 그 잔기 수는 적절히 조절될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 LLO 단편이다.

또 다른 실시예에서, 상동성 LLO는 70% 초과의 LLO 서열에 대한(예, 서열번호 2-4 중 하나에 대한) 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성 LLO는 72% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 75% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 78% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 80% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 82% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 83% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 85% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 87% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 88% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 90% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 92% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 93% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 95% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 96% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 97% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 98% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 99% 초과의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상동성은 100%의 서열번호 2-4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다.

또 다른 실시예에서, 용어 "상동성"은, 본원에서 제공된 임의의 핵산 서열을 참조하는 경우 대응하는 고유의 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 비율을 유사하게 나타낸다.

상동성은, 일 실시예에서, 본 분야에서 널리 기재된 방법에 의해 서열 정렬을 위한 컴퓨터 알고리즘으로 결정된다. 예를 들어, 핵산 서열 상동성의 컴퓨터 알고리즘 분석은 예를 들어, BLAST, DOMAIN, BEAUTY (BLAST 증가 정렬 유틸리티), GENPEPT 및 TREMBL 패키지와 같은 입수가능한 많은 소프트웨어 패키지의 사용을 포함할 수 있다.

다른 실시예에서, “상동성”은 68% 초과의 본원에서 제공되는 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 확인하는 것을 의미한다.　 다른 실시예에서, “상동성”은 70% 초과의 본원에서 제공되는 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 확인하는 것을 의미한다.　 다른 실시예에서, “상동성”은 72% 초과의 본원에서 제공되는 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 확인하는 것을 의미한다.　 다른 실시예에서, 동일성은 75% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 78% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 80% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 82% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 83% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 85% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 87% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 88% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 90% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 92% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 93% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 95% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 96% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 97% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 98% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 99% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 100%이다.

다른 실시예에서, 상동성은 본 분야에서 널리 기재된 방법인 후보 서열 혼성화를 통해 결정된다(예를 들어, “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds.(1985); Sambrook 외, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel 외, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). 예를 들어, 잡종형성 방법들은, 적절한 조건 내지 엄격한 조건 하에서 천연 카스파제 펩타이드를 암호화하는 DNA의 보체에 대하여 실시될 수 있다. 혼성화 조건은, 예를 들어, 하기를 포함하는 용액 내에서 42℃에서 밤새 인큐베이션하는 것이다: 10% 내지 20% 포름아미드, 5 X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란황산, 및 20 μg/ml 변성된 시어드 연어 정자 DNA.

본원에서 제공된 바와 같은 방법 및 조성물의 또 다른 실시예에서, “핵산” 또는 “뉴클레오티드”는 적어도 두 염기당인산염 조합의 스트링을 의미한다. 용어는, 일 실시예에서, DNA 및 RNA를 포함한다. “뉴클레오티드”는, 일 실시예에서, 핵산 고분자의 단량체 유닛을 의미한다. RNA는, 일 실시예에서, tRNA (전이 RNA), snRNA (작은 핵 RNA), rRNA (리보솜 RNA), mRNA (메신저 RNA), 항-센스 RNA, 작은 억제 RNA (siRNA), 마이크로 RNA (miRNA) 및 리보솜의 형태일 수 있다. siRNA 및 miRNA의 사용은 기재되어 있다(Caudy AA 외, Genes & Devel 16:2491-96 및 여기에 인용된 참조 문헌). DNA는 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 선형 DNA, 또는 염색체 DNA 또는 이러한 그룹의 유도체의 형태일 수 있다. 게다가, 이들 형태의 DNA 및 RNA는 단일, 이중, 삼중 또는 사중 가닥일 수 있다. 용어는 또한, 다른 실시예에서, 인공 핵산은 다른 유형의 골격을 포함하나 상이한 염기를 함유할 수 있다. 일 실시예에서, 인공 핵산은 PNA(펩티드 핵산)이다. PNA는 펩티드 골격 및 뉴클레오티드 염기를 함유하며, 일 실시예에서, DNA 및 RNA 분자 둘 다에 결합할 수 있다. 다른 실시예에서, 뉴클레오티드는 개질된 옥세탄이다. 다른 실시예에서, 뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 개질된다. 다른 실시예에서, 인공 핵산은 본 분야에서 공지된 자생 핵산의 인산염 골격의 임의의 다른 변이체를 함유한다. 포스포로티오에이트 핵산 및 PNA의 사용이 본 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Neilsen PE의 문헌(Curr Opin Struct Biol 9: 353-57); 및 Raz NK 외의 문헌(Biochem Biophys Res Commun. 297: 1075-84)에 기재되어 있다. 핵산의 생산 및 사용은 본 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds. 및 Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in in eukaryotic cells (2003) Purchio 및 G. C. Fareed에 기재되어 있다. 각 핵산 유도체는 본 발명의 개별 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, 용어 "펩타이드"는 본연의 펩타이드 (분해 산물, 합성적으로 합성된 펩타이드 또는 재조합 펩타이드) 및/또는 펩타이드모방제 (통상적으로 합성적으로 합성된 펩타이드), 예컨대 펩타이드 유사체이고, 예를 들어, 펩타이드를 체내에 있는 동안 더 안정적으로 만들거나 세포 내로 더 침투할 수 있게 하는 개질을 가질 수 있는, 펩토이드 및 세미펩토이드를 지칭한다. 이러한 개질은 CH2-NH, CH2-S, CH2S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH을 포함하지만 이에 제한되지 않는 N 말단 개질, C 말단 개질, 펩타이드 결합 개질, 주쇄 개질 및 잔기 개질을 포함한다. 펩타이드모방제 화합물을 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 여기에 완전히 설명된 것처럼 참조로 통합된, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)에 상세히 기재되어 있다. 이와 관련한 더 상세한 내용은 이하에서 제공된다.

펩타이드 내의 펩타이드 결합 (-CO-NH-)은 예를 들어 N-메틸화 결합 (-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), 케토메틸렌 결합 (-CO-CH2-), *-아자 결합 (-NH-N(R)-CO-)(여기서 R은 임의의 알킬, 예를 들어 메틸), 카바 결합 (-CH2-NH-), 히드록시에틸렌 결합 (-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합 (-CS-NH-), 올레핀 이중 결합 (-CH=CH-), 레트로 아미드 결합 (-NH-CO-), 펩타이드 유도체 (-N(R)-CH2-CO-)(여기서 R은 탄소 원자 상에 자연적으로 존재하는 "정상" 측쇄)로 치환될 수도 있다.

이러한 개질은 펩타이드 사슬을 따르는 임의의 결합에서도 발생할 수 있으며 동시에 여러 (23) 경우에서도 발생할 수 있다. 천연 방향족 아미노산, Trp, Tyr 및 Phe는 TIC, 나프틸렌라인 (Nol), Phe의 고리 메틸화 유도체, Phe의 할로겐화 유도체 또는 o-메틸-Tyr과 같은 합성 비천연 산에 대해 치환될 수도 있다.

상기 이외에, 본원에서 제공되는 펩타이드는 또한 하나 이상의 개질된 아미노산 또는 하나 이상의 비아미노산 단량체 (예, 지방산, 복합 탄수화물 등)를 포함할 수도 있다.

일 실시예에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 용어 "핵산"과 상호교환 가능하며, 원핵 서열, 진핵 mRNA, 진핵 mRNA 유래 cDNA, 진핵 생물 (예, 포유류) DNA의 게놈 DNA 서열, 심지어 합성 DNA 서열도 의미할 수도 있다. 이 용어는 또한 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체를 포함하는 서열을 의미한다.

본원에서 열거된 임의의 아미노산 서열에 대한 단백질 및/또는 펩티드 상동성은, 일 실시예에서, 면역블롯 분석법을 포함하는 본 분야에서 널리 기재된 방법에 의해 또는 구축된 방법을 통해, 입수가능한 임의의 많은 소프트웨어 패키지를 사용하여 아미노산 서열의 컴퓨터 알고리즘 분석을 통해 결정된다. 이들 패키지의 일부는 FASTA, BLAST, MPsrch 또는 Scanps 패키지를 포함할 수 있으며, Smith 및 Waterman 알고리즘, 및/또는 예를 들어, 분석을 위해 국제/지역 또는 BLOCKS 정렬의 이용을 사용할 수 있다. 동종성을 결정하는 각 방법은 본 발명의 개별적인 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 리스테리아 균주는 HPV-E7 항원에 융합된 절단된 LLO의 융합 단백질을 암호화한다. 다른 실시예에서, tLLO-E7 융합 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호 13을 포함한다:

cttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA (서열번호 13), 여기서 대문자 서열은 E7을 암호화하며, 소문자 서열은 tLLO를 암호화하고, 밑줄친 "ctcgag"서열은 플라스미드 내의 절단된 LLO에 종양 항원을 연결하는 데 사용되는 XhoI 제한 자리를 나타낸다.

다른 실시예에서, E7 항원에 융합된 tLLO을 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함한다:

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADE

IDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNA

ISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNN

AVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAIS

EGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGR

QVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIID

GNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKIN

IDHSGGYVAQFNISWDEVNYDLEHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEI

DGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (서열번호 14).

일 실시예에서, 서열번호 14를 포함하는 E7 항원에 융합된 tLLO을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 리스테리아를 ADXS-HPV라고 지칭한다. 다른 일 실시예에서, “ADXS-HPV”과 “ADXS11-001”는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

다른 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 구성체 또는 핵산 분자는, 상동성 재조합을 이용하여 리스테리아 염색체에 통합된다. 상동성 재조합을 위한 기술은 본 분야에서 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Baloglu S, Boyle SM, 외 (Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein. Vet Microbiol 2005, 109(1-2): 11-7); 및 Jiang LL, Song HH, 외, (Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing green fluorescent protein. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2005, 37(1): 19-24)에 기재되어 있다. 다른 실시예에서, 상동성 재조합은 미국 특허 번호 제6,855,320호에 기재된 바와 같이 실행된다. 이 경우, E7을 발현하는 재조합체 Lm 균주는, Lm-AZ/E7이라 칭하는 재조합체를 형성하게끔 유전자 산물의 분비를 확실히 하도록 hly 신호 서열의 포함 및 hly 촉진자의 제어 하에 E7 유전자의 염색체 통합에 의해 제조되었다. 다른 실시예에서, 온도 민감성 플라스미드가 재조합체를 선별하기 위해 사용된다.

또 다른 실시예에서, 구성체 또는 핵산 분자는 트랜스포손 삽입을 이용하여 리스테리아 염색체에 통합된다. 트랜스포존 삽입을 위한 기술은 본 분야에서 널리 공지되어 있으며, 그 중에서, DP-L967의 구성물에서 Sun 외의 문헌에서 기재되어 있다(Infection and Immunity 1990, 58: 37703778). 트랜스포존 돌연변이 생성은, 다른 실시예에서, 안정한 게놈 삽입 돌연변이가 형성될 수 있는 이점을 갖지만 외부 유전자가 삽입된 게놈에서의 위치가 공지되지 않은 단점을 갖는다.

다른 실시예에서, 구성물 또는 핵산 분자는 파아지 통합 부위를 사용하여 리스테리아 염색체 내로 통합된다(Lauer P, Chow MY 외, Construction, characterization, and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002; 184(15):4177-86). 이 방법의 특정 실시예에서, 박테리오파아지(예를 들어, U153 또는 PSA 리스테리오파아지)의 인테그라아제 유전자 및 부착 부위는 이종 유전자를 상응하는 부착 부위 내로 삽입하기 위해 사용되며, 이는 게놈 내에서의 임의의 적절한 부위일 수 있다(예를 들어, arg tRNA 유전자의 comK 또는 3’ 말단). 다른 실시예에서, 내인성 프로파아지는 구성물 또는 이종 유전자의 통합 전에 사용되는 부착 부위로부터 치유된다. 다른 실시예에서, 이 방법은 단일-카피 통합물을 야기한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은, 임상 응용분야를 위한 파지계 염색체 통합 시스템을 더 포함하며, 이러한 응용분야에서 d-알라닌 라세미화효소를 포함한 필수 효소를 위한 영양 요구성 숙주 균주, 예를 들어, Lmdal(-)dat(-)를 사용할 수 있지만, 이러한 라세미화효소의 예로 한정되지는 않는다. 또 다른 실시예에서는, “파지 치료 단계”를 피하도록, PSA에 기초하는 파지 통합 시스템을 사용한다. 다른 실시예에서, 통합된 유전자를 유지하기 위해 항생제에 의한 지속적인 선별을 필요로 한다. 그러므로, 다른 실시예에서, 현재 발명은 항생제로의 선별을 필요로 하지 않는 파아지 기반 염색체 통합 시스템의 구축을 가능하게 한다. 대신, 영양 요구성 숙주 균주가 상보화될 수 있다.

본원에 제공된 방법 및 조성물의 일 실시예에서, 용어 "재조합 자리" 또는 "자리-특이적 재조합 자리"는 재조합 자리에 인접한 핵산 분절의 교환 또는 절단을 매개하는 재조합효소 (일부 경우에 관련 단백질과 함께)에 의해 인식되는 핵산 분자 내의 염기 서열을 지칭한다. 재조합효소 및 관련 단백질은 총칭하여 "재조합 단백질"이라 칭하며, 예를 들어, Landy, A., (Current Opinion in Genetics & Development) 3:699-707; 1993)를 참조한다.

“파아지 발현 벡터” 또는 “파지미드”는 실험관내 또는 생체내, 본질적으로 또는 유도성으로, 원핵, 효모, 진균류, 식물, 곤충 또는 포유류 세포를 포함하는 임의의 세포에서 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 및 조성물의 핵산 서열을 발현하는 목적을 위한 임의의 파아지-기반 재조합 발현 시스템을 의미한다. 파아지 발현 벡터는 전형적으로 박테리아 세포내에서 재생되고 적절한 조건 하에서 파아지 입자를 생산할 수 있다. 용어는 선형 또는 순환 발현 시스템을 포함하며 에피솜을 유지하거나 숙주 세포 게놈 내로 통합하는 파아지-기반 발현 벡터 둘 다를 포함한다.

일 실시예에서, 본원에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 전사 및 번역 조절 핵산이 전사가 개시되는 방식으로 임의의 코딩 서열에 상대적으로 위치한다는 것을 의미한다. 일반적으로, 이는 프로모터 및 전사 개시 또는 개시 서열이 코딩 영역의 5'에 위치한다는 것을 의미한다.

일 실시예에서, “개방 판독 프레임” 또는 “ORF”는 단백질을 잠재적으로 암호화할 수 있는 염기의 서열을 함유하는 생물의 게놈의 부분이다. 다른 실시예에서, ORF의 시작 및 종료 말단은 mRNA의 말단과 동일하지 않으나, 이들은 mRNA 내에 일반적으로 함유된다. 일 실시예에서, ORF는 유전자의 시작-코드 서열(개시 코돈) 및 종료-코돈(종결 코돈) 사이에 위치한다. 그러므로, 일 실시예에서, 내인성 폴리펩티드를 갖는 개방 판독 프레임으로서 게놈 내에 작동가능하게 통합된 핵산 분자는 내인성 폴리펩티드로서 동일한 개방 판독 프레임에서 게놈 내로 통합되는 핵산 분자이다.

일 실시예에서, 본 발명은 링커 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 일 실시예에서, "링커 서열"은 두 개의 이종 폴리펩타이드, 그의 단편들, 또는 그의 도메인들을 연결하는 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로, 본원에서 사용된 링커는 상기 폴리펩타이드들을 공유 결합시켜 융합 폴리펩타이드를 형성하는 아미노산 서열이다. 전형적으로, 링커는 디스플레이 단백질 및 개방 구조 틀에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 생성하기 위해 디스플레이 벡터로부터 리포터 유전자를 제거한 후 나머지 재조합 신호로부터 번역된 아미노산을 포함한다. 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 상기 링커는 글리신 및 기타 소(small) 중성 아미노산과 같은 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 본원에서 사용된 “내인성”은 참조 생물체 내에서 발생 또는 유래하였거나 참조 생물체 내의 원인으로부터 발생된 것을 말한다. 다른 실시예에서, 내인성은 고유의 성질을 의미한다.

숙련자는 용어 “PEST 아미노산 서열”, “PEST 서열 함유 폴리펩타이드”, “PEST 서열 함유 단백질”, 또는 “PEST 서열 함유 펩타이드”가 상호교환적으로 사용되고, 모두 동일한 의미와 특성을 지니고 있으며, 절단된 LLO 단백질(일 실시예에서 N-말단 LLO), 절단된 ActA 단백질(일 실시예에서 N-말단 ctA), 또는 그의 단편을 포괄할 수 있음을 이해할 것이다. PEST 아미노산 서열은 본 기술분야에 알려져 있고, 전체가 참조로 본원에 통합된 미국 특허 일련 번호 제 7,635,479 및 미국 특허 공보 일련 번호 제 2014/0186387에 기술되어 있다.

다른 실시예에서, 원핵생물의 PEST 아미노산 서열은 Rechsteiner 및 Roberts에 의해 L. 모노사이토젠에 대해 기술된 것(TBS 21:267-271,1996)과 같은 방법에 따라 일상적으로 식별될 수 있다. 대안적으로, 다른 원핵생물의 PEST 아미노산 서열은 이 방법에 기초하여 식별될 수 있다. 다른 원핵생물은 여기서 PEST 아미노산 서열이 다른 리스테리아 종을 포함할 것으로 예상될 것이지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, L. 모노사이토젠 단백질 ActA는 네 가지 이러한 서열을 함유한다. 이들은 KTEEQPSEVNTGPR (서열번호 5), KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK (서열번호 6), KNEEVNASDFPPPPTDEELR (서열번호 7), 또는 RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR (서열번호 8)이다. 또한 스트렙토코커스 종 유래 스트렙토리신 O는 PEST 서열을 함유한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 스트렙토리신 O는 아미노산 35-51에서 PEST 서열 KQNTASTETTTTNEQPK (서열번호 9)를 포함하며 스트렙토코커스 이퀴시밀리스 스트렙토리신 O는 아미노산 38-54에서 PEST 유사 서열 KQNTANTETTTTNEQPK (서열 번호 10)을 포함한다. 또한, PEST 서열은 항원 단백질 내에 내장될 수 있다고 여겨진다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, PEST 서열 융합에 관한 경우 "융합"이란, 항원 단백질이 항원과 항원의 한쪽 말단에 연결되거나 또는 항원 내에 내장된 PEST 아미노산 서열을 둘 다 함유한다는 것을 의미한다.

또 다른 실시예에서, 구성체 또는 핵산 분자는 이종 항원에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산 서열을 가진 에피솜 또는 플라스미드 벡터에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 플라스미드는 항생제 선택의 부재 시에 재조합 리스테리아 백신 균주에 안정적으로 유지된다. 다른 실시예에서, 플라스미드는 재조합 리스테리아에 항생제 내성을 부여하지 않는다. 또 다른 실시예에서, 단편은 기능성 단편이다. 또 다른 실시예에서, 단편은 면역원성 단편이다.

"안정적으로 유지된다"는 것은, 또 다른 실시예에서, 검출가능한 손실 없이 10 세대 동안 선택(예, 항생제 선택)의 부재에서 핵산 분자 또는 플라스미드의 유지를 가리킨다. 다른 실시예에서, 기간은 15세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 20세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 25세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 30세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 40세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 50세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 60세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 80세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 100세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 150세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 200세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 300세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 500세대이다. 또 다른 실시예에서, 상기 기간은 세대들보다 길다. 다른 실시예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 실험관내(예를 들어, 배양에서) 안정적으로 유지된다. 다른 실시예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 생체내에서 안정적으로 유지된다. 다른 실시예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 실험관내 및 생체내 둘 다에서 안정적으로 유지된다.

다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는 내인성 ActA 서열을 갖는 개방 판독 프레임으로서 리스테리아 게놈 내에 작동가능하게 통합된 핵산 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는 ActA 또는 절단된 ActA에 융합된 항원을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 에피솜 발현 벡터를 포함한다. 일 실시예에서, 항원의 발현 및 분비는 actA 프로모터 및 ActA 신호 서열의 조절하에 있으며, ActA의 1233 아미노산(절단된 ActA 또는 tActA)에 대한 융합으로서 발현된다. 다른 실시예에서, 절단된 ActA는, 이의 전체가 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 일련 번호 제7,655,238호에 기재된 바와 같이 야생형 ActA 단백질의 처음 390개 아미노산으로 구성된다. 다른 실시예에서, 말단이 절단된 ActA는 ActA-N100 또는 이의 개질된 버전(ActA-N100*으로서 언급됨)이며, 여기에서 미국 특허 공개 일련 번호 제2014/0186387호에 기재된 바와 같이 PEST 모티프가 삭제되고 비보존성 QDNKR 치환을 함유한다.

또 다른 실시예에서, "기능성 단편"은 면역원성 단편이며 대상물에게 단독으로 또는 본원에서 제공된 백신으로 투여할 때 면역 반응을 유발한다. 또 다른 실시예에서, 기능성 단편은 숙련자에 의해 이해될 것이고 본원에서 더 제공되는 바와 같이, 생물학적 활성을 가지고 있다.

다른 실시예에서, 대상물에게 투여되는 면역원성 조성물 내에 존재하는 면역 관문 억제자(예를 들어, PD-1 신호전달 경로 억제자)의 용량은 2주마다 5-10 mg/kg, 3주마다 5-10 mg/kg, 또는 3주마다 1-2 mg/kg이다. 다른 실시예에서, 용량은 매주 1-10mg/kg의 범위이다.　 다른 실시예에서, 용량은 2주마다 1-10mg/kg의 범위이다.　 다른 실시예에서, 용량은 3주마다 1-10mg/kg의 범위이다.　 다른 실시예에서, 용량은 4주마다 1-10mg/kg의 범위이다.　

다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 면역원성 조성물에 의해 포함된 재조합 리스테리아 균주의 용량은 1 x 10⁷ - 3.31 x 10¹⁰ CFU의 용량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1 x 10⁸ - 3.31 x 10¹⁰ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1 x 10⁹ - 3.31 x 10¹⁰ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 7-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 10-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 20-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 30-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 50-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 70-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 100-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 150-500 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-300 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-200 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-150 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-100 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-70 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-50 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-30 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5-20 x 10⁸ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1-30 x 10⁹ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1-20 x 10⁹CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 2-30 x 10⁹ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1-10 x 10⁹ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 2-10 x 10⁹ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 3-10 x 10⁹ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 2-7 x 10⁹ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 2-5 x 10⁹ CFU이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 3-5 x 10⁹ CFU이다.

또 다른 실시예에서, 투여량은 1 x 10⁷ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1 x 10⁸ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1.5 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 2 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 3 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 4 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 6 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 7 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 8 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 10 x 10⁹ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 1.5 x 10¹⁰ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 2 x 10¹⁰ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 2.5 x 10¹⁰ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 3 x 10¹⁰ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 3.3 x 10¹⁰ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 4 x 10¹⁰ 유기물이다. 또 다른 실시예에서, 투여량은 5 x 10¹⁰ 유기물이다.

용어 "추가투여(Boosting)"란 추가 백신 또는 면역원성 조성물 또는 재조합 리스테리아 균주 투여량 또는 면역 관문 억제자를 단독 또는 조합하여 대상물에게 투여하는 것을 포괄할 수도 있다고 숙련자에게 이해될 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은, 2개 추가투여 (또는 총 3개 접종)가 투여된다. 또 다른 실시예에서, 3개 추가투여가 투여된다. 또 다른 실시예에서, 4개 추가투여가 투여된다. 또 다른 실시예에서, 5개 추가투여가 투여된다. 또 다른 실시예에서, 6개 추가투여가 투여된다. 또 다른 실시예에서, 6개가 넘는 추가투여가 투여된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 본원에서 제공된 재조합 리스테리아 균주 또는 면역 관문 억제자로 대상물을 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시예에서, 추가투여 접종에 사용되는 재조합 리스테리아 균주는 초기 "시동투여" 접종에 사용된 균주와 동일하다. 또 다른 실시예에서, 추가투여 균주는 시동투여 균주와 다르다. 또 다른 실시예에서, 추가투여 접종에 사용된 재조합 면역 관문 억제자(immune checkpoint inhibitor)는 초기 "시동투여 " 접종에 사용된 억제자와 동일하다. 또 다른 실시예에서, 추가투여 억제자는 시동투여 억제자와 다르다. 또 다른 실시예에서, 동일한 투여량이 시동투여와 추가투여 접종에 사용된다. 또 다른 실시예에서, 더 큰 투여량이 추가투여에 사용된다. 또 다른 실시예에서, 더 작은 투여량이 추가투여에 사용된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 추가투여 예방접종을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에서, 추가투여 예방접종은 단일 시동 예방접종을 뒤따른다. 또 다른 실시예에서, 단일 추가투여 예방접종은 시동 예방접종 후 투여된다. 또 다른 실시예에서, 두 개의 추가투여 예방접종은 시동 예방접종 후 투여된다. 또 다른 실시예에서, 세 개의 추가투여 예방접종은 시동 예방접종 후 투여된다. 일 실시예에서, 시동투여 및 추가투여 백신 사이의 기간은 숙련자에 의해 실험적으로 결정된다. 다른 실시예에서, 시동투여 및 추가투여 백신 사이의 기간은 1주이고, 다른 실시예에서, 2주이고, 다른 실시예에서, 3주이고, 다른 실시예에서, 4주이고, 다른 실시예에서, 5주이고, 다른 실시예에서, 6 내지 8주이고, 또 다른 실시예에서 추가투여 백신은 시동투여 백신 후 8 내지 10주에 투여된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 PD-1 신호 경로 억제자 및 본원에서 제공된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물로 대상물을 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 본원에서 제공된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 T 세포 자극제 및 본원에서 제공된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물로 대상물을 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시예에서, 추가 투여량은 상기 면역원성 조성물의 대안적 형태이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 추가투여 면역원성 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에서, 추가투여량은 상기 면역원성 조성물의 단일 시동투여량을 뒤따른다. 또 다른 실시예에서, 단일 추가투여량은 시동투여량 후 투여된다. 또 다른 실시예에서, 두 개의 추가투여량은 시동투여량 후 투여된다. 또 다른 실시예에서, 세 개의 추가투여량은 시동 투여량 후 투여된다. 일 실시예에서, 본원에서 제공된 재조합 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물의 시동투여량과 추가투여량 사이의 기간은 실험적으로 숙련된 기술자에 의해 결정된다. 또 다른 실시예에서, 상기 투여량은 실험적으로 숙련된 기술자에 의해 결정된다. 또 다른 실시예에서, 시동 투여량과 추가투여량 사이의 기간은 1 주이고, 또 다른 실시예에서 2 주이고, 또 다른 실시예에서 3 주이고, 또 다른 실시예에서 4 주이고, 또 다른 실시예에서 5 주이고, 또 다른 실시예에서 6-8 주이고, 또 다른 실시예에서 추가투여량은 면역원성 조성물의 시동 투여량 투여 후 8-10 주에 투여된다.

이종 "시동 추가투여" 전략은 면역 반응 강화 및 다수의 병원체에 대한 보호에 효과가 있었다. Schneider 등, Immunol. Rev. 170:29-38 (1999); Robinson, H. L., Nat. Rev. Immunol. 2:239-50 (2002); Gonzalo, R. M. 등, Vaccine 20:1226-31 (2002); Tanghe, A., Infect. Immun. 69:3041-7 (2001). 상기 시동 및 추가투여 주사에 다양한 형태의 항원을 제공하는 것은 항원에 대한 면역 반응을 극대화하는 것처럼 보인다. 프라이밍 후 아주번트 내 단백질 또는 항원을 암호화하는 DNA의 바이러스 벡터 수송으로 부스팅되는 DNA 백신접종은 항원 특이 항체 및 CD4+ T-세포 반응 또는 CD8+ T-세포 반응 각각을 개선시키는 가장 효과적인 방법임을 나타낸다. Shiver J. W. 등, Nature 415: 331-5 (2002); Gilbert, S. C. 등, Vaccine 20:1039-45 (2002); Billaut-Mulot, O. 등, Vaccine 19:95-102 (2000); Sin, J. I. 등, DNA Cell Biol. 18:771-9 (1999). 원숭이 예방접종 연구의 최근 데이터는, HIV gag 항원을 암호화하는 DNA에, CRL1005 폴록사머 (12kDa, 5% POE)를 첨가하는 것은 HIV gag를 발현하는 아데노바이러스 벡터(Ad5-gag)로 추가투여하는 것이 뒤따르는 HIV gag DNA 시동투여로 원숭이가 예방접종되는 경우 T-세포 반응을 향상시킨다고 제시하고 있다. Ad5-gag 추가투여가 뒤따르는 DNA/폴록사머 시동투여에 대한 세포 면역 반응은 Ad5-gag 추가투여가 뒤따르는 DNA(폴록사머 없음) 시동투여 또는 Ad5-gag 만에 대해서만 유도된 반응보다 컸다. Shiver, J. W. 등 Nature 415:331-5 (2002). 미국 특허 출원 공개 번호 US 2002/0165172 A1은 항원의 면역원성 부분을 암호화하는 벡터 구성체 및 항원의 면역원성 부분을 포함하는 단백질을 공동 투여해서 면역 반응이 생성되는 것을 설명한다. 이 문서는 B 형 간염 항원들과 HIV 항원에 제한된다. 또한, 미국 특허 번호 제6,500,432호는 관심있는 폴리뉴클레오티드와 폴리펩타이드의 공동 투여에 의해 핵산 예방접종의 면역 반응을 강화하는 방법에 관한 것이다. 상기 특허에 따르면, 공동 투여는 동일한 면역 반응 동안, 바람직하게는 서로의 0-10 또는 3-7일 이내에서 폴리뉴클레오티드와 폴리펩타이드의 투여를 의미한다. 특허에 의해 고려되는 항원은, 그 중에서도, 간염(모든 형태), HSV, HIV, CMV, EBV, RSV, VZV, HPV, 소아마비, 인플루엔자, 기생충(예를 들어, 말라리아원층 종으로부터), 및 병원성 박테리아(M. 튜버큘로시스, M. 레프래, 클라미디아, 쉬겔라, B. 부르그도르페리, 독소원성 E. coli, S. 티포사, H. 파일로리, V. 콜레라, B. 페르투시스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않음)를 포함한다. 상기 참고 문헌들 모두는 본원에 그 전체가 참조로 인용된다.

본 발명의 방법 및 조성물의 "융합 폴리펩타이드"라는 용어는 소정의 실시예들에서는 "재조합 폴리펩타이드"와 상호교환 가능하게 사용될 수 있음을 숙련자는 이해할 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법의 융합 폴리펩타이드는 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현된다. 또 다른 실시예에서, 상기 발현은 재조합 리스테리아 균주에 의해 운반되는 뉴클레오티드 분자에 의해 매개된다.

본 발명의 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는, 또 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아 모노사이토젠 균주이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 실링게리 균주이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 그라이 균주이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 이바노비 균주이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 무라이 균주이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 웰쉬메리 균주이다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 리스테리아 종의 재조합 균주이다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 리스테리아 균주는 동물 숙주를 통해 계대되었다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 백신 벡터로서 균주의 효능을 극대화한다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 리 스테리아 균주의 면역원성을 안정화시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 안정화시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 면역원성을 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정안 서브균주를 제거한다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정안 서브균주의 유병률을 감소시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 리스테리아 균주는 항원 함유 재조합 펩타이드를 암호화하는 유전자의 유전자 삽입을 포함하고 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 리스테리아 균주는 항원 함유 재조합 펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 운반한다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 본원에서 기재된 바와 같이 수행된다. 또 다른 실시예에서, 상기 계대는 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수행된다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 면역 관문 억제자, 본원에서 제공되는 T 세포 자극제, 및 재조합 약독화된 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 각 성분은 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 다른 성분 전, 동시에 또는 후에 투여된다.

또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 면역 관문 억제자 및 재조합 약독화된 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 재조합 약독화된 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 또 다른 실시예에서, 일 실시예에서, 면역 관문 단백질 억제자는 프로그램된 사멸 1(PD-1) 신호전달 경로 억제자다. 다른 실시예에서, PD-1 신호전달 경로 억제자는 PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자이다. 다른 실시예에서, PD-L1은 CD274 또는 B7-H1로서 또한 공지된다. 다른 실시예에서, PD-L2는 CD273 또는 B7-DC로 또한 공지된다. 다른 실시예에서, PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2와 상호작용하는 분자이다. 다른 실시예에서, PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2와 상호작용하는 분자이다. 용어 “상호작용” 또는 이의 문법적 동의어는 다른 분자와 결합하거나 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 분자는 PD-1에 결합한다. 다른 실시예에서, PD-1 신호전달 경로 억제자는 항-PD-1 항체이다. 다른 실시예에서, PD-L2와 상호작용하는 분자는 항-PD-L1 항체 또는 PD-L1과 결합하는 소분자이다. 다른 실시예에서, 항-PD-L1 항체는 MEDI4736이다. 다른 실시예에서, PD-L2와 상호작용하는 분자는 항-PD-L2 항체 또는 PD-L2와 결합하는 소분자이다.

일 실시예에서, PD-1과 상호작용하는 분자는 절단된 PD-L1 단백질이다. 다른 실시예에서, 절단된 PD-L1 단백질은 PD-L1 단백질의 세포질 도메인을 포함한다. 다른 실시예에서, PD-1과 상호작용하는 분자는 말단이 절단된 PD-L2 단백질이다. 다른 실시예에서, 절단된 PD-L2 단백질은 PD-L2 단백질의 세포질 도메인을 포함한다. 다른 실시예에서, PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자는 PD-L1 및 PD-L2와 상호작용하는 분자이다. 다른 실시예에서, PD-L1 또는 PD-L2는 절단된 PD-1 단백질, PD-1 모방체 또는 PD-L1 또는 PD-L2와 결합하는 소분자이다. 다른 실시예에서, 절단된 PD-1 단백질은 PD-1 단백질의 세포질 도메인을 포함한다.

다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 CD80/86 신호전달 경로 억제자다. 다른 실시예에서, CD80은 B7.1로서 또한 공지된다. 다른 실시예에서, CD86은 B7.2로서 또한 공지된다. 다른 실시예에서, CD80 신호전달 경로 억제자는 CD80과 상호작용하는 소분자이다. 다른 실시예에서, CD80 억제자는 항 CD80 항체이다. 다른 실시예에서, CD86 신호전달 경로 억제자는 CD86과 상호작용하는 소분자이다. 다른 실시예에서, CD86 억제자는 항CD86 억제자다.

다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 CTLA-4 신호전달 경로 억제자다. 다른 실시예에서, CTLA-4는 또한 CD152로서 공지된다. 다른 실시예에서, CTLA-4 신호전달 경로 억제자는 CTLA-4과 상호작용하는 소분자이다. 다른 실시예에서, CTLA-4 억제자는 항-CTLA-4 항체이다. 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 CD40 신호전달 경로 제해제이다. 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 본 분야에서 공지된 임의의 다른 항원표시 세포:T 세포 신호전달 경로 억제자다.

공지된 임의의 면역 관문 단백질이 본 기술분야에서 공지된 임의의 면역 관문 억제자일 수도 있음이 숙련자에게 자명할 것이다. 면역 관문 단백질은 다음으로부터 선택될 수도 있지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다: 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), T 세포 막 단백질 3 (TIM3), 아데노신 A2a 수용체 (A2aR) 및 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3), 킬러 면역글로불린 수용체 (KIR) 또는 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4). 다른 실시예에서, 상기 관문 억제자 단백질은 B7/CD28 수용체 상과(superfamily)에 속하는 것이다.일 실시예에서, T 세포 자극제는 항원 제공 세포(APC)/T 세포 길항제이다. 다른 실시예에서, T 세포 자극제는 CD134 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, CD-137 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, 또는 유도가능한 T 세포 공동자극제(ICOS) 또는 이의 리간드 또는 이의 단편이다.

또 다른 실시예에서, T 세포 자극제, 및 재조합 약독화된 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에서 제공된다. 일 실시예에서, T 세포 자극제는 항원 제공 세포(APC)/T 세포 길항제이다. 다른 실시예에서, T 세포 자극제는 CD134 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, CD137 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, 또는 유도가능한 T 세포 공동자극제(ICOS) 또는 이의 리간드 또는 이의 단편이다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 보강제(adjuvant)를 더 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 보강제는, 또 다른 실시예에서, 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 GM-CSF 단백질을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 분자이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 사포닌 QS21이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 사포닌 QS21을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 모노포스포릴 리피드 A이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 모노포스포릴 리피드 A를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 SBAS2이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 SBAS2을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 뉴클레오티드 분자이다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 퀼 글리코시드이거나 이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 세균 미토겐이거나 이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 세균 독소이거나 이를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 보강제는 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 보강제이거나 이를 포함한다.

일 실시예에서, 본원에서 제공된 방법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여와 동시, 이전 또는 이후에, 면역 관문 단백질 억제자를 공동 투여하는 단계를 더 포함한다.

일 실시예에서, 면역 관문 단백질 억제자는 프로그램된 사멸 1(PD-1) 신호전달 경로 억제자다. 다른 실시예에서, PD-1 신호전달 경로 억제자는 PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자이다. 다른 실시예에서, PD-L1은 CD274 또는 B7-H1로서 또한 공지된다. 다른 실시예에서, PD-L2는 CD273 또는 B7-DC로 또한 공지된다. 다른 실시예에서, PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2와 상호작용하는 분자이다. 다른 실시예에서, PD-1 리간드 1(PD-L1) 또는 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2와 상호작용하는 분자이다. 용어 “상호작용” 또는 이의 문법적 동의어는 다른 분자와 결합하거나 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 분자는 PD-1에 결합한다. 다른 실시예에서, PD-1 신호전달 경로 억제자는 항-PD-1 항체이다. 다른 실시예에서, PD-L2와 상호작용하는 분자는 항-PD-L1 항체, 또는 PD-L1과 결합하는 소분자이다. 다른 실시예에서, 항-PD-L1 항체는 MEDI4736이다. 다른 실시예에서, PD-L2와 상호작용하는 분자는 항-PD-L2 항체, 또는 PD-L2와 결합하는 소분자이다.

일 실시예에서, PD-1과 상호작용하는 분자는 절단된 PD-L1 단백질이다. 다른 실시예에서, 말단이 절단된 PD-L1 단백질은 PD-L1 단백질의 세포질 도메인을 포함한다. 다른 실시예에서, PD-1과 상호작용하는 분자는 말단이 절단된 PD-L2 단백질이다. 다른 실시예에서, 말단이 절단된 PD-L2 단백질은 PD-L2 단백질의 세포질 도메인을 포함한다. 다른 실시예에서, PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자는 PD-L1 및 PD-L2와 상호작용하는 분자이다. 다른 실시예에서, PD-L1 또는 PD-L2는 절단된 PD-1 단백질, PD-1 모방체 또는 PD-L1 또는 PD-L2와 결합하는 소분자이다. 다른 실시예에서, 말단이 절단된 PD-1 단백질은 PD-1 단백질의 세포질 도메인을 포함한다.

다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 CD80/86 신호전달 경로 억제자다. 다른 실시예에서, CD80은 B7.1로서 또한 공지된다. 다른 실시예에서, CD86은 B7.2로서 또한 공지된다. 다른 실시예에서, CD80 신호전달 경로 억제자는 CD80과 상호작용하는 소분자이다. 다른 실시예에서, CD80 억제자는 항-CD80 항체이다. 다른 실시예에서, CD86 신호전달 경로 억제자는 CD86과 상호작용하는 소분자이다. 다른 실시예에서, CD86 억제자는 항-CD86 억제자다.

다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 CTLA-4 신호전달 경로 억제자다. 다른 실시예에서, CTLA-4는 또한 CD152로서 공지된다. 다른 실시예에서, CTLA-4 신호전달 경로 억제자는 CTLA-4과 상호작용하는 소분자이다. 다른 실시예에서, CTLA-4 억제자는 항-CTLA-4 항체이다. 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 CD40 신호전달 경로 제해제이다. 다른 실시예에서, 면역 관문 억제자는 본 분야에서 공지된 임의의 다른 항원표시 세포:T 세포 신호전달 경로 억제자다.

본 분야에서 공지된 임의의 면역 관문 단밸질이 면역 관문 억제자에 의해 표적화될 수 있음이 숙련자에게 자명할 것이다. 면역 관문 단백질은 다음으로부터 선택될 수도 있지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다: 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), T 세포 막 단백질 3 (TIM3), 아데노신 A2a 수용체 (A2aR) 및 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3), 킬러 면역글로불린 수용체 (KIR) 또는 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4). 또 다른 실시예에서, 상기 관문 억제자 단백질은 B7/CD28 수용체 상과(superfamily)에 속하는 것이다.

일 실시예에서, T 세포 자극제는 항원 제공 세포(APC)/T 세포 길항제이다. 다른 실시예에서, T 세포 자극제는 CD134 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, CD-137 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, 또는 유도가능한 T 세포 공동자극제(ICOS) 또는 이의 리간드 또는 이의 단편이다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 방법은 상기 대상물에서 항-종양 면역 반응을 증강시키는 사이토카인과 함께 본원에서 제공되는 면역원성 조성물을 공동투여하는 단계를 추가 포함한다. 면역 반응을 강화하는 사이토카인은 주지되어 있으며 I 형 인터페론 (IFN-α / IFN-β), TNF-α, IL-1, IL-4, IL-12, INF-γ, 및 면역 반응을 강화하는 것으로 알려진 임의의 다른 사이토카인을 포함하는 것으로 숙련자에 의해 이해될 것이다. 또 다른 실시예에서, 사이토카인은 염증성 사이토카인이다. 또 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은, 본 기술분야에 알려져 있거나 본원에서 제공되는 바와 같은 사이토카인을 포함한다. 다른 실시예에서, 사이토카인의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여 전일 수도 있다. 다른 실시예에서, 사이토카인의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여와 동시일 수도 있다. 다른 실시예에서, 사이토카인의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여 후일 수도 있다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 방법은 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO) 경로 억제자와 함께 본원에서 제공되는 면역원성 조성물을 공동투여하는 단계를 추가 포함한다. IDO 경로 억제자는 IDO와 결합하거나 상호작용하는 소분자, 또는 항-IDO 항체를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 IDO 경로 억제자는 1-메틸트립토판(1MT), 1- 메틸트립토판(1MT), 네크로스타틴-1, 피리독살 이소니코티노일 히드라존, 엡셀렌, 5-메틸인돌-3-카르복스알데히드, CAY10581, 항-IDO 항체 또는 소분자 IDO 억제자를 포함하는 본 분야에서 공지된 임의의 IDO 경로 억제자나 이에 제한되지 않는다. 다른 실시예에서, IDO 경로 억제자의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여 전일 수도 있다. 다른 실시예에서, IDO 경로 억제자의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여와 동시일 수도 있다. 다른 실시예에서, IDO 경로 억제자의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여 후일 수도 있다.

다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 또한 화학치료 또는 방사선치료 양생법과 함께, 전에 또는 후에 사용된다. 또 다른 실시예에서, IDO 억제는 화학치료제의 효능을 증강시킨다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 방법은 상기 개체에서 항-종양 면역 반응을 증강시키는 종양 키나아제 억제자와 함께 본원에서 제공되는 면역원성 조성물을 공동-투여하는 단계를 추가 포함한다. 종양 키나아제 억제자(TKI)는 특이 세포 신호전달 경로를 간섭하여 선택된 악성종양에 대한 표적-특이 치료를 가능하게 한다 TKI는 널리 공지되었으며 하기 표 1에 제시된 것들 및 항-종양 면역 반응을 증강시키는 공지된 임의의 다른 TKI를 포함하는 것이 숙련자에게 자명할 것이다. 다른 실시예에서, TKI의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여 전일 수도 있다. 다른 실시예에서, TKI의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여와 동시일 수도 있다. 다른 실시예에서, TKI의 투여는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여 후일 수도 있다.

명칭	표적	클래스
아파티닙	EGFR/ErbB2	소분자
악시티닙	VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3/PDGFRB/c-KIT	소분자
베바시주맙	VEGF	모노클로날 항체
Bosutinib	BcrAbl/SRC	소분자
세툭시맙	ErbB1	모노클로날 항체
크리조티닙	ALK/Met	소분자
다사티닙	다중 표적	소분자
엘로티닙	ErbB1	소분자
포스타마티닙	Syk	소분자
제피티닙	EGFR	소분자
이브루티닙	BTK	소분자
이마티닙	Bcr-Abl	소분자
라파티닙	ErbB1/ErbB2	소분자
렌바티닙	VEGFR2/VEGFR2	소분자
무브리티닙	/A	소분자
닐로티닙	Bcr-Abl	소분자
파니투무맙	EGFR	모노클로날 항체
파조파닙	VEGFR2/PDGFR/c-kit	소분자
페갑타닙	VEGF	RNA압토머
라니비누맙	VEGF	모노클로날 항체
룩소리티닙	JAK	소분자
소라페닙	다중 표적	소분자
SU6656	다중 표적	소분자
수니티닙	다중 표적	소분자
토파시티닙	JAK	소분자
트라스투주맙	Erb2	모노클로날 항체
반데타닙	RET/VEGFR/EGFR	소분자
베무라페닙	BRAF	소분자

일 실시예에서, 임의의 상기 화합물들 또는 본원에서 제공되는 것들이 화학치료, 방사선 또는 수술 요법과 함께 사용될 수도 있다.

“면역원성 조성물”이 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아, 및 보강제, 면역 관문 단백질 억제자, T 세포 자극제, TKI, 또는 사이토카인, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다는 점을 충분히 인식할 것이다. 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은 본원에서 제공되는 재조합 리스테리아를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은, 본 기술분야에 알려져 있거나 본원에서 제공되는 바와 같은 보강제를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은, 본 기술분야에 알려져 있거나 본원에서 제공되는 바와 같은 면역 관문 억제자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은, 본 기술분야에 알려져 있거나 본원에서 제공되는 바와 같은 면역 관문 억제자 및 T 세포 자극제를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은, 본 기술분야에 알려져 있거나 본원에서 제공되는 바와 같은 T 세포 자극제를 포함한다. 또한, 이러한 조성물들은, 본원에서 추가로 제공되는 바와 같이, 면역 반응을 향상시키거나 T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 비를 증가시키거나 항-종양성 면역 반응을 이끌어낸다는 점을 이해하도록 한다.

본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여 후에, 본원에서 제공되는 방법들은, 말초 림프 장기에서의 T 효과기 세포들의 팽창을 유도하여 종양 부위에서의 T 효과기 세포들의 존재를 향상시킨다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 방법들은, 말초 림프 장기에서의 T 효과기 세포들의 팽창을 유도하여 그 말초 부분에서의 T 효과기 세포들의 존재를 향상시킨다. 이러한 T 효과기 세포들의 팽창에 따라, 본원에서 입증된 바와 같이, Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 말초 부분과 종양 부위에서의 T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 비가 증가한다(예 참조). 숙련자라면, 말초 림프 장기가, 비장, 페이어스 패치, 림프절, 아데노이드 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 일 실시예에서, T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 증가된 비는, Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 말초 부분에서 발생한다. 또 다른 실시예에서, T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 증가된 비는, 말초 부분, 림프 장기, 및 종양 부위에서 이러한 부위들에서의 Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 발생한다. 또 다른 실시예에서, T 효과기 세포의 증가된 비는 Treg의 빈도를 감소시키지만, 이러한 부위들에서의 Treg의 총 개수는 감소시키지 않는다. 다른 실시예에서, 증강된 항-종양 T 세포 반응을 유발하는 본 발명의 방법은 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)의 빈도 감소를 포함하는 면역 반응을 포함한다. 다른 실시예에서, 증강된 항-종양 T 세포 반응을 유발하는 본 발명의 방법은 비장 및 종양 마이크로 환경에서 골수 유래 억제 세포(myeloid derived suppressor cell; MDSC)의 빈도 감소를 포함하는 면역 반응을 포함한다.

일 실시예에서, 절단된 LLO 및 이종 항원의 융합 단백질을 발현하는 약독화된 재조합 리스테리아 균주들을 동일한 항원을 발현하는 재조합 리스테리아와 조합함으로써, 완전한 종양 퇴행을 야기한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 재조합체 핵산은, 리스테리아 균주의 암호화된 펩타이드의 발현을 구동하는 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 링크된다. 유전자의 기본구성 발현을 구동하는 데 유용한 프로모터/조절 서열은, 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 리스테리아의 P_hlyA, P_ActA, 및 p60 프로모터, Streptococcus bac 프로모터, Streptomyces griseus sgiA 프로모터, 및 B. thuringiensis phaZ 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산의 유도가능 및 조직 특정성 발현은, 유도가능 또는 조직 특이성 프로모터/조절 서열의 제어 하에 펩타이드를 암호화하는 핵산을 배치함으로써 달성된다. 이 목적에 유용한 조직 특이성 또는 유도가능 프로모터/조절 서열의 예는, MMTV LTR 유도가능 프로모터 및 SV40 만기 증강제/프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 실시예에서는, 금속, 글루코코르티코이드 등의 유도제에 반응하여 유도되는 프로모터를 이용한다. 따라서, 본 발명은, 임의의 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 링크된 원하는 단백질의 발현을 구동할 수 있으며 알려져 있는 또는 알려져 있지 않은 임의의 프로모터/조절 서열을 이용하는 것을 포함한다는 점을 이해할 것이다. 숙련자는 용어 “이종”이 참조 종과는 상이한 종으로부터 유래된 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 일 실시예에서 이종 폴리펩타이드를 발현하는 리스테리아 균주는 리스테리아 균주에 내인성이 아닌 폴리펩타이드를 발현하거나, 다른 실시예에서는 상기 리스테리아 균주에 의해 일반적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현하거나, 또 다른 실시예에서는 상기 리스테리아 균주 외의 다른 출처로부터의 폴리펩타이드를 발현할 것이다. 다른 실시예에서, “이종”은 동일한 종 내의 상이한 생물체로부터 유래된 것을 기술하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 이종 항원은 리스테리아의 재조합 균주에 의해 발현되고, 가공되어 포유류 세포가 재조합 균주에 의해 감염될 때 세포독성 T 세포에게 제공된다. 또 다른 실시예에서, 리스테리아 종에 의해 발현된 상기 이종 항원은 그것이 포유류에서 자연적으로 발현되는 비개질된 항원 또는 단백질을 인식하는 T 세포 반응을 초래하는 한, 감염원이나 종양 세포 중의 단백질이나 대응하는 비개질된 항원과 정확히 일치할 필요는 없다. 용어 “이종 항원”은 본원에서 “항원 폴리펩타이드”, “이종 단백질”, “이종 단백질 항원”, “단백질 항원”, 및 “항원” 등으로 지칭될 수 있다.

숙련자는 용어 “에피솜 발현 벡터”가 선형 또는 순환형일 수 있으며, 일반적으로 이중 가닥 형태이고, 또한 박테리아의 게놈 또는 세포의 게놈에 통합되는 것과는 대조적으로 세포 또는 숙주 박테리아의 세포질에 존재한다는 점에서 염색체외적인 핵산 벡터를 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 일 실시예에서, 에피솜 발현 벡터는 관심있는 유전자를 포함한다. 다른 실시예에서, 에피솜 벡터는 박테리아 세포질에서 다중 복사체로서 지속되는데, 이로 인해 관심있는 유전자의 증폭이 초래되고, 또 다른 실시예에서는 필요한 경우 바이러스성 작용전달 인자가 공급된다. 또 다른 실시예에서, 상기 에피솜 발현 벡터는 플라스미드로 지칭될 수 있다. 또 다른 실시예에서, “통합 플라스미드”는 숙주 게놈으로 해당 서열 자체 또는 운반되는 관심있는 유전자를 삽입하는 것을 목표하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 삽입된, 관심있는 유전자는 세포 DNA로의 통합에 의해 종종 발생하는 규제적인 제약을 받지 않거나 이에 방해받지 않는다. 또 다른 실시예에서, 삽입된 이종 유전자의 존재는 세포 고유의 중요 영역의 재배치 또는 방해로 이어지지 않는다. 또 다른 실시예에 따르면, 안정한 형질 감염 과정에서, 에피솜 벡터의 사용은 염색체 통합 플라스미드의 사용 시보다 종종 높은 형질 감염 효율을 초래한다(Belt, P.B.G.M., 등 (1991) Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of mutant human cell line (HPRT2) using Epstein-Barr virus-derived cDNA experssion vector. Nucleic Acids Res. 19, 4861-4866; Mazda, O., 등 (1997) Extremely efficient gene transfection into lympho-hemotopoietic cell lines by EpsteinBarr virusbased vectors. J. Immunol. Methods 204, 143-151). 일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 조성물 및 방법의 에피솜 발현 벡터는 DNA 분자를 세포에 수송하기 위해 사용되는 다양한 방법 중 어떤 것에 의해서라도 생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내에서 세포에 수송될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 단독으로 또는 대상물의 세포로의 수송을 향상하는 약제학적 조성물의 형태로서 수송될 수 있다.

일 실시예에서, 용어 "융합된"은 공유 결합에 의한, 작동 가능한 연결을 의미한다. 일 실시예에서, 상기 용어는 (핵산 서열 또는 그의 개방 구조 틀의) 재조합 융합을 포괄한다. 다른 실시예에서, 상기 용어는 화학적 접합을 포괄한다.

일 실시예에서, “형질전환”은 플라스미드 또는 다른 이종 DNA 분자를 채택하기 위해 박테리아 세포를 조작하는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, “형질전환”은 플라스미드의 유전자 또는 다른 이종 DNA 분자를 발현하기 위해 박테리아 세포를 조작하는 것을 의미한다. 각각의 가능성은, 본원에서 제공된 바와 같은 방법 및 조성물의 개별적인 실시예를 나타낸다.

다른 실시예에서, 접합은 유전 물질 및/또는 플라스미드를 박테리아 내로 도입하기 위해 사용된다. 접합을 위한 방법은 본 분야에 널리 공지되었으며, 예를 들어, Nikodinovic J 외, (A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation. Plasmid.2006 Nov;56(3):223-7) 및 Auchtung JM 등 (Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 30;102 (35):12554-9)에서 기재된다. 각각의 방법은 본원에서 제공된 바와 같은 방법 및 조성물의 개별적인 실시예를 나타낸다.

일 실시예에서, 본원에서 사용된 용어 "약독화(attenuation)"는 박테리아가 동물에서 질병을 일으키는 능력의 감소를 의미한다. 다시 말하면, 약독화된 리스테리아 균주의 병리적 특징은, 야생형 리스테리아에 비해 감소되었지만, 약독화된 리스테리아는 배양액에서 성장 및 유지될 수 있다. 약독화된 리스테리아에 의한 Balb/c 마우스의 정맥 접종을 일례로 사용하여, 접종된 동물들의 50%( LD₅₀)가 생존하는 치사용량이 바람직하게 적어도 약 10배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 100배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 1,000배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 10,000배 만큼, 가장 바람직하게 적어도 약 100,000배만큼 야생형 리스테리아의 LD₅₀을 초과하여 증가한다. 따라서, 리스테리아의 약독화된 균주는, 투여되는 동물을 사멸하지 않는 것, 또는 투여되는 세균의 개수가 동일한 동물을 사멸하는 데 요구되는 야생형 비약독화 세균의 개수보다 매우 많을 때에만 동물을 사멸하는 것이다. 약독화된 세균은, 또한, 그 세균의 성장에 요구되는 영양분이 내부에 존재하지 않기 때문에, 일반적인 환경에서 복제될 수 없는 것을 의미하도록 해석되어야 한다. 따라서, 세균은, 필요 영양소가 제공되는 피제어 환경에서의 복제로 한정된다. 따라서, 본 발명의 약독화된 균주는, 그 균주가 제어되지 않은 복제가 가능하지 않는 식으로 환경적으로 안전하다.

본 발명의 백신과 조성물을 함유하는 약제학적 조성물은, 또 다른 실시예에서, 비경구식으로, 암 주위로, 점막식으로, 경피식으로, 근육내로, 정맥내로, 경피내로, 피하식으로, 복막내로, 심실내로, 두개내로, 질내로, 또는 종양내로 등의 통상의 기술자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 대상물에 투여된다.

본원에서 제공되는 조성물과 방법의 또 다른 실시예에서, 백신 또는 조성물은, 경구 투여되고, 따라서, 경구 투여에 적절한 형태로, 즉, 고체 또는 액체 조제물로 제형화된다. 적절한 고체 경구 제형은, 태블릿, 캡슐, 알약, 과립, 펠릿 등을 포함한다. 적절한 액체 경구 제형은, 용액, 현탁액, 분산제, 유탁액, 오일 등을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 활성 성분은 캡슐로 제형화된다. 본 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은, 활성 화합물과 비활성 담체 또는 희석액에 더하여, 단단한 겔화 캡슐을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 백신 또는 조성물은, 액체 조제물의 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주입에 의해 투여된다. 적절한 액체 제형은, 용액, 현탁액, 분산제, 유탁액, 오일 등을 포함한다. 일 실시예에서, 제약 조성물은, 정맥내 투여되며, 따라서, 정맥내 투여에 적절한 형태로 조제된다. 또 다른 실시예에서, 약제학적 조성물은, 동맥내 투여되고, 따라서 동맥내 투여에 적절한 형태로 제형화된다. 또 다른 실시예에서, 약제학적 조성물은, 근육내 투여되고, 따라서 근육내 투여에 적절한 형태로 제형화된다.

일 실시예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 조성물 및 방법의 백신은 숙주 척추 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간에게 단독 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와의 조합으로서 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 백신은 리스테리아 균주 그 자체 또는 개질을 통해 상기 리스테리아 종에 의해 발현되도록 된 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여된다. 또 다른 실시예에서, 투여될 면역원성 조성물 또는 백신의 양은 본 발명을 접한 숙련자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 멸균 증류수, 식염수, 인산 완충 용액, 또는 중탄산 완충 용액이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 실시예에서, 선택된 약제학적으로 허용 가능한 담체의 종류 및 사용될 담체의 양은 투여 방법, 리스테리아 균주의 종류, 및 백신 접종자의 연령과 질병 상태를 포함하는 몇몇 인자에 따라 다르다. 또 다른 실시예에서, 상기 백신은 경구적, 비경구적, 비강 내, 근육 내, 혈관 내, 직장 내, 복강 내, 또는 잘 알려진 다양한 투여 경로 중 어떤 하나의 경로로든지 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 투여 경로는 치료될 감염원 또는 종양의 유형에 따라 선택될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 투여를 포함하는, 대상물에서 하나 이상의 종양을 치료, 억제, 또는 저해하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 방법들을 편리하게 실시하기 위한, 본원에서 제공되는 하나 이상의 리스테리아 균주, 도포용 도구, 및 키트 구성요소를 사용하여 본원에서 제공되는 방법들을 실시하는 법을 기술하는 교육 자료를 포함하는 키트를 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 “약”은 5%가 더해지거나 빼지고, 또는 다른 실시예에서 10%가 더해지거나 빼지고, 또는 다른 실시예에서 15%가 더해지거나 빼지고, 또는 다른 실시예에서 20%가 더해지거나 빼지는 정량적 용어를 의미한다.

일 실시예에서의 “대상물”이라는 용어는, 질환 또는 그 후유증에 대한 요법을 필요로 하거나 질환 또는 그 후유증에 민감한 인간을 포함한 포유류를 가리킨다. 대상물은, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 쥐, 마우스, 및 인간을 포함할 수 있다. 용어 "대상물"은 모든 면에서 정상적인 개인을 배제하지 않는다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 좀더 충분히 설명하기 위해 나타낸 것이다. 그러나, 이들은 절대로 본 발명의 넓은 범주를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

실시예

재료 및 방법 (예 1 내지 예 7)

마우스

Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR)로부터 (개별적인 설명이 없는 한) 6 내지 8주된 암컷 C57BL/6 마우스를 구매하였다. 마우스를 Bethesda에 있는 Animal Facility of National Cancer Institute에 수용하였다. 실험용 마우스 사용을 위한 프로토콜은, Animal Care and Use Committee at National Institutes of Health에 의해 승인받았다.

세포주

저 레벨의 E6와 E7을 발현하는 TC-1 세포들을, HPV-16 E6 및 E7 및 활성화된 ras 종양 유전자에 의한 형질전환에 의해, 일차 C57BL/6 마우스 폐 상피 세포들로부터 도출하였다. 37℃에서 5% CO₂와 함께 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L글루타민, 1 mM 소듐 피르빈산염, 100 μM 비필수 아미노산, 및 0.4 mg/ml G418이 보충된 RPMI 1640에서 세포들을 성장시켰다.

L. 모노사이토젠 균주

LmddA-LLO-E7 및 그 대조군 LmddA-LLO 및 LmddA들을 Advaxis Inc (Princeton, NJ)에서 생성하였다. 염색체 내에 통합된 스트렙토마이신 저항성 유전자와 함께 Lm 야생형 균주 10403S에 기초하는 dal dat 균주로부터 dal dat △ actA 균주(LmddA)을 구축하였다. dal, dat, 및 actA가 돌연변이됨에 따라, LmddA가 크게 약독화된다. 플라스미드에서의 클로람페니콜 저항성 유전자, 및 prfA 삭제 후 pTV3 플라스미드를 이용한 LmddAd의 형질전환에 의해 LmddA-LLO-E7 균주를 구축하였다. 전술한 바와 같이 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해 LmddA-LLO-E7 균주의 배양 상청액에서 LLO-E7 융합 단백질의 발현 및 분비를 확인하였다. LmddA-LLO 대조 균주의 구축은 LmddA-LLO-E7 균주의 구축과 유사하였지만, prfA와 E7 모두가 pTV3 플라스미드에서 삭제되었다. Δhly, Δhly::pfo, 및 hly ::Tn917 - lac (pAM401-hly)를 포함한, Lm 야생형 균주 10403S 및 일부 돌연변이 균주는, Dr. D. Portnoy(University of California, Berkeley, CA)이 친절하게도 제공해 주었다. 균주 hly ::Tn917 - lac는, LLO 용혈 활동성을 방해하도록 Tn917 - lac 융합 유전자가 hly 유전자(LLO를 암호화하는 유전자)에 삽입되는 야생형 Lm의 비용혈 돌연변이다. 이러한 돌연변이는, LLO (pAM401-hly)를 발현하는 플라스미드로 핵산감염되는 경우, LLO를 가지므로 용혈 활동성을 다시 얻게 된다. E7 유전자의 전체 길이가 Lm 염색체에 통합된 Lm-E7 균주는, 친절하게도, Dr. Y. Paterson(University of Pennsylvania, Philadelphia, PA)에 의해 제공되었다. 뇌 심장 수액 배지 더하기 스트렙토마이신(100 μg/ml)에서 D_알라닌(100 μg/ml)이 있는 상태에서 또는 없는 상태에서 박테리아를 배양하였다.

시약

형광 결합 및 항 마우스 항체 CD4-PerCP-Cy5.5 (GK1.5) 및 CD8-Brillient Violet 421 (53-6.7)은, Biolegend (San Diego, CA)에서 제조된 것이다. FoxP3-FITC (FJK-16s)는 eBioscience (San Diego, CA)에서 제조된 것이다. E7 펩타이드(RAHYNIVTF) 서열번호 11이 탑재된 H-2D^b 사합체는, 친절하게도, the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Tetramer Core Facility and the National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program에 의해 제공되었다. CountBright™ 절대 카운팅 비드는 Life Technologies (Grand Island, NY)에서 제조된 것이다.

종양 접종 및 마우스 예방접종

TC1 세포들(10⁵ 세포/마우스)을, 0일째 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 10일째, 종양 직경이 5 내지 6mm로 되었을 때, LmddA-LLO-E7 백신 또는 적절한 대조군을 0.1LD50의 투여량으로 마우스에 복강내 주입하였다. 17일째 예방접종을 추가로 행하였다. 전자 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양을 측정하고, 길이×폭×폭/2이라는 식에 의해 종양 크기를 산출하였다. 종양 직경이 2.0cm에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.

유동 세포 분석

종양으로부터 수확된 마우스 비장세포 또는 세포들을 CD4-PerCP-Cy5.5, CD8-Brillient Violet 421, 및 H-2D^b E7 사합체-APC로 30분 동안 염색하였다. 세포들을, 고정하고, 투과성을 갖게 하고, FoxP3-FITC로 밤새 염색하였다. 유동 세포 분석에 의해 세포들을 분석하였다. Treg가 CD4+FoxP3+로서 식별되는 림프구 게이트를 고정하였다. 절대 세포 개수를 카운팅하도록 CountBright™ 절대 카운팅 비드를 첨가하였다.

CD4+CD25+ Treg의 입양 전달

Dynal^® CD4+CD25+ Treg Kit (Life Technologies, Grand Island, NY)에 의해 마우스 비장으로부터 CD4+CD25+ T 세포들을 분리하였다. 종양 세포 접종후 9일째에 세포들을 TC-1 종양이 있는 마우스에 정맥내 주입하였다. Treg 전달 후 1일째, 일주일 간격으로 두 번씩 LmddA-LLO-E7 (0.1 LD50)를 마우스에 복강 주입하여 마우스가 면역력을 갖게 하였다. 종양 성장을 감시하였다.

통계

비모수 만-휘트니 시험을 이용하여 데이터를 분석하였다. P < 0.05에서 유의성을 결정하였다.

예 1: LmddA-LLO-E7은 , 확립된 TC-1 종양의 퇴행 및 후속하는 Treg 빈도 감소를 유도한다 .

융합 단백질인 LLO-E7 및 PrFA가 리스테리아 XFL-7의 prfA 음성 균주에서 에피솜 발현되는 Lm계 백신인 Lm-LLO-E7이 확립된 TC-1 종양의 완벽한 퇴행을 유도하였다는 점은 이미 보고되어 있다. 여기서, dal, dat, 및 actA 돌연변이형 Lm 균주의 플라스미드에 의해 융합 단백질 LLO-E7을 생성하는 크게 약독화된 다른 Lm계 백신인 LmddA-LLO-E7의 항-종양 활동성을 조사하였다. LmddA-LLO-E7은, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 PrfA가 플라스미드로부터 제거되었으므로, Lm-LLO-E7와 비교하여 많이 약독화된다. Lm-LLO-E7과 유사하게, LmddA-LLO-E7이 확립된 TC-1 종양의 성장을 상당히 억제하였음을 관찰하였다((도 1a 및 도 1b, 도 2). 종양은, LmddA-LLO-E7에 의한 두 번의 예방접종 후 TC-1 종양이 있는 마우스에서 약 40% 퇴행되었다(도 1b 및 도 2). 3개월 때 재발해서 죽은 하나의 마우스를 제외하고, 종양 퇴행이 나타난 나머지들(총 동물들 중 33%)은 재발 없이 6개월 이상 생존하였다((도 1c). Lm-E7은, TC-1 종양 성장의 감소를 나타내었지만, 완벽한 종양 퇴행을 유도하지 못했다(도 1a 및 도 1b 및 도 2). (E7이 없는) LmddA-LLO는, TC-1 종양 성장을 크게 억제하지 못했으며(도 1a 및 도 1b 및 도 2), 선천적 면역 반응이 TC-1 종양 세포를 근절하는 데 충분하지 못함을 나타낸다. LmddA-LLO-E7과 Lm-E7은, 비장의 유사한 H-2D^b E7 사합체+CD8+ T 세포 반응을 유도하였으며(도 3a 상측 패널, 도 3b, 및 도 3d), 이는 이전 결과와 부합하였다. 이어서, CD4+FoxP3+Treg를 분석하였다. 예상 밖으로, LmddA-LLO-E7, Lm-E7, LmddA-LLO 모두가, PBS 대조군에 비해 비장의 Treg 빈도를 상당히 감소시켰고 종양에서 더욱 급격히 감소시켰으나, LmddA-LLO-E7과 LmddA-LLO는 Lm-E7보다 그 빈도를 더 감소시켰음을 관찰하였다(도 1d-1h).

예 2: Lm은 Treg 빈도의 감소를 유도하는 데 충분하다.

초기에, Treg 빈도 감소가 절단된 LLO에 의해 매개되었다고 의심되었다. 그러나, Lm-E7도, 절단된 LLO의 발현 없이, Treg 빈도를 감소시킬 수 있었다(도 1d-1h). 이러한 관찰은, Lm이 Treg 빈도를 감소시킬 수도 있음을 제시한다. 실제로, LmddA-LLO-E7을 위한 벡터 대조군인 LmddA와 Lm-E7을 위한 벡터 대조군과 야생형 Lm 균주인 10403S 모두가, 비장의 Treg 빈도를 상당히 감소시켰고 종양에서는 Treg 빈도를 더욱 감소시켰다(도 4).

예 3: Lm은 , CD4+ FoxP3 - T 세포 및 CD8+ T 세포 팽창을 우선적으로 유도함으로써 Treg 빈도를 감소시킨다.

상대적 Treg 빈도(총 T 세포들의 비율)는, Treg의 개수뿐만 아니라 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포의 개수에 의해서도 결정된다. Lm이 Treg 빈도를 얼마나 감소시키는지를 조사하도록, LmddA-LLO-E7, LmddA-LLO, LmddA, Lm-E7, 또는 Lm (10403S)으로 치료되는 TC-1 종양이 있는 마우스의 CD4+FoxP3+ Treg, CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포 개수를 정량화하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, 놀랍게도, LmddA가 종양의 CD4+FoxP3+T 세포들의 개수를 현저하게 변경하지 않음을 발견하였다. 이것은, 실제로, CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들을 증가시켰고, 이에 따라 Treg 빈도를 비례하여 감소시켰다. LmddA-LLO와 LmddA-LLO-E7의 절단된 LLO의 에피솜 발현은 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들을 더 증가시켰고, 이에 따라 CD4+FoxP3+ T 세포 빈도를 더 감소시켰다. 야생형 Lm 10403S 및 Lm-E7도, CD4+FoxP3+ T 세포 개수를 상당히 변경하지 않으면서 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 증가를 유도하였다. Lm-LLO-E7은, 종양의 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 밀도를 상당히 증가시켰다. 이러한 결과들은, Lm이 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포 팽창을 우선적으로 유도하여 CD4+FoxP3+T 세포 빈도를 감소시킴을 입증한다.

예 4: CD4 + FoxP3 - T 세포들과 CD8+ T 세포들의 Lm 유도 팽창은 LLO에 의존하며, LLO에 의해 매개된다.

hly 유전자에 의해 암호화된 LLO는, Lm이 숙주 세포 포식소체 공포로부터 세포질 내로 탈출할 수 있게 하는 포어 형성 세포용해소이다. LmddA-LLO-E7, Lm-E7, 및 이들의 모든 대조군은 LLO를 생성하므로, 상동성 재조합이 후속하는 셔틀 벡터를 사용하여 hly 유전자가 삭제되는 10403S로부터 유도된 LLO결핍 Lm 돌연변이를 사용하여, LLO가 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 팽창을 유도하는 역할을 담당하는지를 조사하였다. Δhly Lm은 단일 투여후 7일째 마우스의 비장에서 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들을 증가시킬 수 없음을 발견하였으며, 이는 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 유도가 LLO에 의존함을 의미한다(도 6a). 이는, LLO의 직접적 영향 또는 파고리소좀을 탈출하기 위한 요건일 수 있다. 이러한 문제를 다루도록, LLO가 PFO로 교체된 LM을 연구하였다. 클로스트리듐 페르프린젠스에 의해 제조되는 퍼플린고라이신 O(PFO)는, LLO를 갖는 아미노산에 있어서 43% 동일하며, 또한, 공포 막을 용해할 수 있다. hly 프로모터의 제어 하에 PFO를 암호화하는 pfo 유전자를 Δhly 균주의 염색체에 재결합하여 hly::pfo 균주를 형성하였다. Δhly::pfo는, 포식작용으로부터 세포질 내로 탈출할 수 있었지만, 마우스 비장의 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들을 증가시킬 수 없었다(도 6a). 대조적으로, hly ::Tn917 - lac (pAM401-hly)인, 플라스미드 pAM401-hly를 발현하는 LLO에 의해 형질전환된 (LLO 용혈 활동성을 방해하도록 Tn917 - lac 융합 유전자가 hly 유전자 내에 삽입되는) 야생형 Lm의 비용혈 Tn917-lac 돌연변이는, CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 팽창을 유도하였다(도 6a). 이러한 결과들은, CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 팽창이 LLO에 의해 직접 매개됨을 제시한다. Lm은 CD4+FoxP3+ T 세포 팽창을 크게 유도하지 않았으므로, CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 증가로부터 Lm 유도 Treg의 빈도 감소가 발생하였다(도 6a-6d).

예 5: LmddA의 절단된 LLO의 에피솜 발현은, CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 더욱 높은 레벨로의 팽창을 유도한다.

다음으로, LmddA와 LmddA-LLO를 비교하였으며, 여기서, 후자는, 종양이 없는 건강한 마우스의 T 세포 증식의 유도에 있어서, 절단된 LLO를 플라스미드에 의해 에피솜식으로 생성한다. LmddA는 단일 투여후 7일째 마우스의 비장의 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+ T 세포 개수를 약간 증가시킬 수 있지만, LmddA-LLO가 이러한 증가를 더욱 높은 레벨로 추가로 유도하였음을 알게 되었다(도 7a). 대조적으로, CD4+FoxP3+ T 세포 개수는, LmddA 또는 LmddA-LLO 감염 후에 크게 변하지 않았다(도 17a). 이에 따라, PBS 대조군에 비해 LmddA-LLO 투여 후에 Treg가 상당히 비례하여 감소하였다(도 7b-7d). 이러한 세포들에서의 세포 증식 마커 Ki-67의 존재를 검사하였다. LmddA는, Ki-67+CD4+FoxP3- T 세포들과 Ki-67+CD8+ T 세포들의 빈도 및 절대 개수를 증가시켰지만, LmddA-LLO는 그 개수를 더욱 증가시켰다(도 7e-7g). CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+ T 세포의 Ki-67 발현 레벨도 이에 따라 증가되었다(도 7h). 대조적으로, Ki-67+CD4+FoxP3+ T 세포들의 빈도와 절대 개수 및 CD4+FoxP3+ T 세포들의 Ki-67 발현은, 크게 변경되지 않았으며, LmddA와 LmddA-LLO가 해당 증식을 유도하지 않았음을 나타낸다.

예 6: Lm-E7과 LmddA-LLO의 조합은 확립된 TC-1 종양의 퇴행을 유도한다.

Lm-E7 백신만으로는, CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들의 많은 팽창을 유도하지 않았다(도 5). 이것은, TC-1 종양 퇴행의 유도 실패의 원인일 수 있다. LmddA-LLO는 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+ T 세포 팽창을 유도하였으므로(도 5 및 도 7a), LmddA-LLO가 존재하는 경우 Lm-E7의 항-종양 효과가 개선될 수 있음을 고려할 수 있다. 실제로, Lm-E7과 LmddA-LLO의 조합은 확립된 TC-1 종양의 거의 완벽한 퇴행을 유도하였다(도 8a-8c). 대조적으로, LmddA 첨가는, Lm-E7 유도 항-종양 활동성(데이터는 도시하지 않음)을 증강시키지 못했으며, Lm-E7 백신의 항-종양 효능을 개선하는 데 있어서 절단된 비용혈 LLO의 중요성을 나타낸다. 예상되는 바와 같이, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+ T 세포 개수는, Lm-E7 또는 PBS로 처리된 마우스에 비해 마우스 그룹의 조합의 비장에서 상당히 증가되었다(도 8d). 다시, CD4+FoxP3+개수는 비교적 불변이었기 때문에, Lm-E7과 LmddA-LLO의 조합에 의해 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+ T 세포 개수를 더욱 높은 레벨로 증가시킴으로써, CD4+FoxP3+ T 세포가 비례하여 더욱 감소되었다(도 8e-8g).

게다가, LmddA-LLO와 Lm-E7의 공동 투여 동안 작용하는 비용혈성 절단된 LLO의 역할을 결정하도록 LmddA를 또한 Lm-E7과 함께 대조군으로서 공동 투여하였다. LmddA 균주를 첨가한 경우 Lm-E7 유도 항-종양 활동성을 증강하지 못했음을 관찰하였으며, 이는 LmddA에 의해 생성되는 내인성 LLO가 Lm-E7 유도 항-종양 활동성을 보조하지 못할 수 있음을 나타낸다(도 10).

예 7: Treg의 입양 전달은, 확립된 TC-1 종양에 대한 LmddA-LLO-E7의 항-종양 효능과 타협한다.

LmddA-LLO-E7은 Treg 개수를 크게 변경하지 않았지만, Treg 빈도를 감소시켰다(도 1d-1h). CD4+FoxP3-T 세포 또는 CD8+T 세포에 대한 Treg의 비는, Treg 억제 능력을 결정하는 데 널리 허용되는 파라미터이다. Treg 비율이 LmddA-LLO-E7의 항-종양 효능에 임의의 영향을 끼치는지 여부를 결정하기 위해, 천연 C57BL/6 마우스로부터 CD4+CD25+Treg를 분리하여 TC-1 종양이 있는 마우스에 정맥내 주입하였으며, 후속하여 LmddA-LLO-E7 예방접종을 실시하였다. LmddA-LLO-E7은, Treg의 입양 전달 없이 마우스의 TC-1 종양 성장을 상당히 억제하였다(도 9a 및 도 9b). 그러나, Treg가 있는 마우스에서, LmddA-LLO-E7은 TC-1 종양 성장을 상당히 억제할 수 없었다(도 9a 및 도 9b). Treg를 수용하는 마우스는, 비장에서 Treg 개수의 약간의 증가를 나타내고 종양에서는 감소를 나타내었다. 반면, Treg를 수용하는 마우스는, LmddA-LLO-E7 대조군에 비해 LmddA-LLO-E7에 의한 예방접종 후 적은 CD4+FoxP3- T 세포들과 CD8+ T 세포들을 가졌으며, Treg의 입양 전달이 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+T 세포 팽창을 억제함을 나타낸다(도 9, f 및 g). 이에 따라, Treg 수용 마우스에서 Treg 빈도가 증가하였다(도 9c-9e).

종양 항원 특이성 CTL은, 종양 세포들을 죽이는 데 지배적 역할을 하며, 세포내 박테리아인 Lm은 CTL을 활성화하도록 MHC 클래스 I 분자에 연관된 항원을 전달할 수 있다는 점이 잘 알려져 있다. 그러나, 두 개의 Lm계 백신인 Lm-LLO-E7과 Lm-E7이 왜 비장에 유사한 레벨의 HPV E7-특이성 CTL을 유도하였으며 그럼에도 불구하고 명백한 항-종양 활성을 나타내었으며, 전자(Lm-LLO-E7)가 훨씬 강력한 항-종양 효과를 유도하였는가(도 1a-1c, 도 2, 도 3). 종양 세포의 고갈이 Lm-LLO-E7 유도 종양 퇴행을 끝냈으므로, CD8+T 세포들이 종양 세포들을 죽이는 데 참여한다는 점에는 의심의 여지가 없다. 또한, E7 발현이 없는 LmddA-LLO가 TC-1 종양 성장을 크게 억제할 수 없었으므로, 소정 레벨의 종양-항원 특이성 CTL이 종양 세포를 사멸하는 데 필요하다는 점은 명백하다(도 1a-1c 및 도 2). Lm-E7이 Treg 증가를 유도하여 숙주 면역 반응을 억제하고, 이에 따라 항-종양 면역성과 타협하는 것이 제안되어 왔다. 그러나, 사실상 Lm-E7과 LmddA-LLO-E7 모두가 PBS 대조군에 비해 TC-1 종양 모델의 Treg 빈도를 감소시켰음을 알게 되었다(도 1d-1h). 게다가, Lm-E7이나 LmddA-LLO-E7 어느 것도 예방접종 후 TC-1 종양의 Treg 총 개수를 상당히 증가시키지 않았음을 알게 되었다(도 5).

사실상, LmddA-LLO-E7과 Lm-E7 간의 주요한 차이점은, 전자가 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 개수의 현저한 증가를 유도할 수 있는 한편 후자가 훨씬 적은 증가를 유도하였음을 알게 되었다(도 5). 이는, 왜 LmddA-LLO-E7이 Lm-E7보다 Treg 퍼센트를 더욱 크게 감소시켰는지를 설명해준다(도 1d-1h). Lm 벡터가 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 개수를 증가시키는 데 충분하였음을 관찰하였다. 그러나, 절단된 LLO의 에피솜 발현에 의해, Lm은, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 개수를 더욱 높은 레벨로 급격히 증가시켰고, 이에 따라 Treg 빈도를 더욱 감소시켰다(도 7). 따라서, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 개수의 증가를 유도하는 데 있어서 LLO가 핵심 역할을 한다고 할 수 있다. 실제로, LLO는, L. 모토사이토젠이 포식소체로부터 탈출하는 데 필요할 뿐만 아니라 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 팽창을 직접적으로 야기하는 데 필요하며, 이는, LLO-minus (Δhly) L. 모노사이토젠 균주나 Lm이 세포질에 들어갈 수 있게 하는 PFO를 발현하는 Δhly::pfo 균주 어느 것도 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 증식을 유도하지 못했기 때문이지만, LLO-발현 플라스미드에 의한 비용혈 LLO 돌연변이 Lm 균주의 형질전환은 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 팽창을 복원하였다(도 6). LLO-유도 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 팽창은 용혈 활동성에 관련되지 않으며, 이는 LmddA의 비용혈 절단된 LLO의 에피솜 발현이 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 팽창을 크게 증강시켰기 때문이다(도 7). LLO에 의한 CD4+ T 세포와 CD8+T 세포 반응 모두의 팽창은 항원-비특이성 보강 효과로 보이지만, LLO는 이러한 두 개의 세포 유형의 면역 지배적 에피토프도 함유할 수 있다. 실제로, 초기 연구에서는, LLO가 두 개의 CD4+T 세포 에피토프(각각, 잔기 189-201 및 잔기 215-226) 및 하나의 CD8+T 세포 에피토프(잔기 91-99)를 갖는다는 것을 식별하였다.

LmddA-LLO-E7은, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포의 상당한 증가를 유도한다는 사실 때문에 뛰어난 항-종양 효과를 갖는다. 대조적으로, Lm-E7가 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 개수의 현저한 증가를 유도할 수 없음은 종양 박멸의 비효율의 이유가 되며, 이는 Lm-E7만에 비해 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 개수를 급격히 증가시킨 Lm-E7과 LmddA-LLO의 조합이 확립된 TC-1 종양의 거의 완벽한 퇴행을 유도하였기 때문이다(도 8). 본원 데이터는, Treg 빈도의 LmddA-LLO-E7 유도 감소가 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 개수의 증가의 결과임을 나타낸다. CD4+FoxP3- T 세포 또는 CD8+T 세포에 대한 Treg의 비는, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포의 기능을 억제하는 데 중요하다. 실제로, 종양이 있는 마우스로의 Treg의 입양 전달에 의해 생체 내 Treg 비를 증가시키고 이어서 LmddA-LLO-E7 예방접종에 의해, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포의 팽창을 억제하였고, 결국, 백신의 항-종양 효능과 타협하였다(도 9).

게다가, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포의 팽창을 우선적으로 유도함으로써, 절단된 비용혈성 LLO에 의해, LmddA-LLO-E7 백신의 항-종양 효능을 개선하는 데 기여한다. Lm-E7과 LmddA-LLO-E7이 E7-특이성 CD8+T 세포들의 유사한 팽창을 유도하였음을 관찰하였지만, 이는 종양의 경우에 해당되지 않는다. 절단된 LLO(LmddA-LLO-E7)의 에피솜 발현에 의해, 더욱 많은 E7-특이성 CD8+T 세포들이 종양에서 유도되는 경향이 있었다(도 3e). LmddA-LLO-E7이 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포에 대해서는 케모카인 수용체 CCR5 및 CXCR3의 발현을 상향조절하였으나 CCR5와 CXCR3이 Th1과 CD8+T 세포 교류에 결정적임을 나타내는 CD4+FoxP3+ T 세포에 대해서는 상향조절하지 않았음을 알게 되었다. 이러한 결과들은, LLO가 CCR5와 CXCR3의 상향조절을 통해 종양 마이크로미터 환경으로의 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 항원-특이성 세포 이동을 유도함을 제시한다. 또한, Lm으로부터의 항원의 효율적인 분비에 절단된 LLO가 필요하고, Lm 벡터로부터 분비되지 않는 항원에서는 덜 효과적인 항-종양 면역성 유도가 발생한다고 알려져 있다. 따라서, Lm-E7 벡터의 강력한 항-종양 활동성이 없는 것은, CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포의 효과적 팽창의 부재뿐만 아니라 비효과적 항원-특이성 T 세포 반응의 프라이밍과 감염된 항원을 제시하는 세포 면에서 Lm으로부터의 항원의 비효율적 분비 때문일 수도 있다.

전체적으로, LmddA-LLO-E7 백신의 비용혈성 절단된 LLO의 에피솜 발현은 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포 팽창을 우선적으로 유도하고, 이는 백신의 항-종양 활동성을 향상시킨다는 점이 입증되었다. 결론적으로, 그 결과는, 소정의 레벨의 항원특이성 CTL 및 소정의 레벨의 비종양 항원-특이성 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+T 세포, 및 감소된 Treg 비율 등의 많은 인자들 모두가, 효과적인 항-종양 면역 반응을 개시할 필요가 있으며, 이는 본원에서 제공되는 리스테리아 구성체로 달성될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이 연구에서는, LLO가 CD4+FoxP3- T 세포와 CD8+ T 세포 팽창을 우선적으로 유도하고, 이에 따라 Treg 빈도를 전체적으로 감소시키고 종양 세포를 죽이기 위한 면역 반응을 선호한다는 점에서 유망한 백신 보강제임을 나타낸다.

재료 및 방법 (예 8 내지 예 12)

동물, 세포주, 백신, 및 기타 시약

6-8 주령의 암컷 C57BL6 마우스를 NCI Frederick으로부터 구매하였고 이를 무 병원체 조건 하에서 보관하였다. 마우스를 NCI 동물 보호 및 사용 위원회(NCI Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 프로토콜 하에서 관리하였다. 인간 유두종 바이러스 균주 16(HPV16) 초기 단백질 6과 7(E6 and E7) 및 활성화된 ras 종양 유전자의, 원발성 C57BL/6 마우스 폐 상피 세포로의 동시 형질 감염에 의해 유래된 TC-1 세포를 ATCC(Manassas, VA)로부터 얻었다. 세포는 10% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신(각 100 U/ml) 및 L글루타민(2 mM)으로 보충된 RPMI 1640, 37℃, 및 5% CO₂에서 성장시켰다. 인간 유두종 바이러스-16(HPV-16) E7이 있는 리스테리아 백신 벡터 또는 인간 유두종 바이러스-16(HPV-16) E7이 없는 리스테리아 백신 벡터(Lm-LLO 및 Lm-LLO-E7)는 Advaxis Inc.로부터 제공되었다. Lm-LLO과 Lm-LLO-E7 모두 마우스당 5 × 10⁶ CFU의 투여량으로 복강 내 주입하였다. 상기 항-PD-1 단일 클론 항체는 CureTech(Israel)로부터 수득하였으며, 이를 마우스당 50μg의 투여량으로 정맥 내 주입하였다. 유동 세포 분석에 사용되는 적절한 아이소타입 대조군과 형광 표지된 항체 모두는 BD Biosciences(San Jose, CA) 또는 eBiosciences(San Diego, CA)로부터 구매하였다.

마우스 및 인간의 수지상 세포 분리, 정제, 및 PD-L1 발현의 분석

마우스 수지상 세포(DC)를 상기 기술된 바와 같이 골수로부터 분리하고 정제하였다. 인간 DC를 얻기 위해, 단핵 백혈구를 건강한 성인 혈액 기증자(국립보건연구원, 혈액은행)로부터 분리하였다. 간단히 말해, 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences)를 사용한 구배 원심 분리를 통하여 분리하였고, 이를 세척 후 2시간동안 37℃에서 조직 배양판에 부착되도록 허용하였다. 비부착성 세포를 세척을 통하여 제거하였으며, 부착성 단핵 백혈구를 37℃, 5% CO₂ 및 RPMI 1640, 2 mM L-글루타민, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 ug/ml), 10 mM HEPES, 10% 태아 소 혈청, 10 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루베이트산 나트륨, 및 5 × 10⁵ M2-머캅토에탄올로 이루어진 완벽한 RPMI 1640 중에서 판 위에서 배양하였다. 세포를 GM-CSF(1000 U/ml) 및 IL-4(500 U/ml)의 존재 하에 4일간 배양하여 미숙한 DC가 되게 하였다. GM-CSF 및 IL-4를 3일째에 새로운 배지와 함께 다시 첨가하였다. 배양물 중의 DC 생존력을 트리판 블루 배제 프로토콜에 의해 평가하였다. 트리판 블루음성 세포는 살아있는 것으로 간주되었다. 4-5일간 단핵 백혈구에서 DC를 배양한 후, DC를 수집하였고, 이를 6웰 플레이트에 옮겼다(1 × 10⁶ 개 세포/ml). Lm-LLO 또는 Lm-LLO-E7를 다양한 농도로서 DC 배양물(0, 10⁷, 10⁸, 및 10⁹ CFU/ml)에 한 시간동안 첨가한 후, 리스테리아를 죽이기 위하여 겐타마이신(50 ug/ml)을 첨가하였고, 48시간 배양하였다.

마우스 DC와 인간 DC 모두를 형광 표지된 적절한 항-PD-L1 항체(PE 항-마우스 PD-L1 및 FITC 항-인간 PD-L1)로 염색하였다. 아이소타입이 일치된 mAb를 음성 대조군으로서 사용하였다. 염색된 세포들을 FACS Calibur 세포계산기 및 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.

종양 이식과 처리

종양 성장과 생존을 분석하기 위한 치료 실험을 전술한 바와 같이 실행하였다. 간단히 말해, 0일째에 TC-1 세포를 마우스당 50,000개의 비율로 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 8일째(종양 크기: 직경 약 3-4mm)에 Lm-LLO 또는 Lm-LLO-E7을 단독으로 또는 항-PD-1 Ab(정맥 내 주입)와 함께 적절한 그룹으로부터의 마우스(그룹 당 5마리)에 복강 내 주입하였다. 종양 이식 후 15일째에 마우스를 백신 및 항-PD-1 Ab으로 다시 한 번 처리하였다. 다른 마우스 그룹은 처리하지 않은 채로 두었다. 디지털 캘리퍼를 이용하여 종양을 3-4일마다 측정하였다. 종양 부피를 V = (W2×L)/2라는 식을 이용하여 산출하였는데, 여기서 V는 부피, L은 길이(긴 직경)이며, W는 너비(짧은 직경)이다. 이들 실험에서 마우스는 빈사 상태이거나, 종양이 궤양화 되었거나 종양 부피가 1.5 cm 3에 도달하였을 때 희생되었다. 면역학적 실험에서는 마우스를 2차 처리로부터 6일 후인 21일째에 희생한 것을 제외하고는 동일한 그룹의 마우스를 유사한 방식으로 처리하였다. 비장 및 종양을 분리하여 이들로부터 항원특이적 면역 반응, CD8 T 세포, Treg, 및 골수로부터 유래된 억제 세포(MDSC)를 분석하였다.

말초 및 종양에서의 MDSC, Treg, 및 항원-특이적 세포 면역 반응의 분석. 상기 제조업자(BD Biosciences, San Jose, CA)의 제안대로 ELISPOT을 사용하여, 처리된 마우스 및 대조군 마우스로부터 E7로 재자극된(10μg/ml) 비장세포 배양물 중의 IFNγ 형성을 검출하였다. 점 분석을 위해 CTL Immunospot Analyzer(Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH)를 사용하였다. E7로 재자극된 배양물로부터, 관련 없는 펩타이드(hgp 10025-33 - KVPRNQDWL (서열번호 12)-Celtek Bioscience, Nashville, TN)로 재자극된 비장세포의 점의 개수를 제하였다. 제조사(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)의 제안대로 GentleMACS Dissociator 및 고체 종양 균질화 프로토콜을 사용하여 종양 샘플을 가공하였다. CD45+ 조혈 세포군 중에서, 종양에 침투하는 CD8+, CD4+Foxp3+ (Treg), 및 CD11b+ Gr1+ (MDSC) 세포의 개수를 앞에서 설명한대로 유동 세포 분석법을 사용하여 분석하였다. 종양을 보유한, 처리된 마우스 및 대조군 마우스의 비장에서의 Treg 세포와 MDSC의 레벨 역시 동일한 유동 세포 분석을 이용하여 평가하였다.

통계학적 분석

모든 통계학적 파라미터(DC 상에서의 PD-L1 발현, 종양 부피, ELISPOT과 말초 및 종양에 침투하는 세포 분석의 평균 값과 SD) 및 (말초 및 종양에 침투하는 세포의 분석에 대한) 그룹간 통계학적 유의성을 GraphPad Prism Software(San Diego, CA)를 이용하여 산출하였다. 그룹간 통계학적 유의성을 일원분산분석 및 투키 다중 비교 사후 테스트(P<0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주)를 통해 판단하였다.

결과

예 8: 쥐 DC의, Lm- LLO 및 Lm- LLO -E7로의 감염은 표면 PD-L1 발현을 상향조절한다.

마우스 비장세포가 Lm에 감염되면 대다수의 세포에서 PD-L1 발현이 상당한 수준으로 상향조절되며,

CD11c+ DC에서 PD-L1 발현 수준이 가장 높다는 것이 앞서 입증되었다.

PD-1/PD-L1 상호작용의 억제적 역할 및 시동투여 면역 반응에서의 DC의 중요성을 감안하여 DC에서의 PD-L1 발현에 대한 Lm-LLO와 Lm-LLO-E7의 영향을 먼저 분석하기로 결정하였다. 혼합 세포군 내에서의 세포간 상호작용이 결과의 정확도에 영향을 미치는 것을 피하기 위해, 다양한 Lm-LLO 및 Lm-LLO-E7 농도가 정제된 CD11c+ DC의 표면에서의 PD-L1 발현에 미치는 영향을 시험하였다. 도 11에서 보여지듯, Lm-LLO와 Lm-LLO-E7는 모두 10⁸ 및 10⁹ CFU/ml 투여량에서 PD-L1 발현을 용량 의존적인 방식으로 상당한 수준으로 상향조절한다.

중요한 것은, 모든 시험된 투여량에서 DC에서의 Lm-LLO로 유도된 PD-L1 상향조절과 Lm-LLO-E7로 유도된 PD-L1 상향조절 간에는 어떤 차이점도 발견되지 않았다(도 11)는 점에서 나타나듯 이러한 영향은 항원으로부터 독립적이라는 것이다.

예 9: 항-PD-1은 Lm- LLO -E7 백신의 치료 효능을 향상시킴

Lm-LLO와 Lm-LLO-E7의, DC에서의 PD-L1 발현 상향조절에 대한 영향을 확인하고, PD-1/PD-L1 상호작용의 억제적 영향을 감안하여 PD-1/PD-L1 차단과 리스테리아계 백신을 조합함으로써 면역 요법의 항-종양 효능을 개선할 수 있다는 가설을 세울 수 있다. 이 가설을 시험하기 위해, 항-PD-1 Ab와 Lm-LLO-E7의 조합이 E7를 발현하는 폐 상피 세포에 기초하는 TC-1 종양 모델의 마우스의 종양 성장과 생존에 미치는 영향을 평가하였다. 백신의 단독적인 영향을 최소화하기 위해 저용량의 Lm-LLO-E7, 지연된 처리 일정 및 많은 수의 종양 세포를 고의적으로 사용하였다. 종양 이식된 마우스에 Lm-LLO-E7 또는 Lm-LLO를 단독으로 또는 항-PD-1 Ab와 함께 주입한 후 0일째, 8일째 및 15일째에 마우스에 50,000개의 TC1 세포를 피하 이식하였다(도 12a). 다른 마우스 그룹은 처리하지 않은 채로 두었다.

Lm-LLO-E7 백신만으로는 종양 성장이 경미한 수준으로 억제되는데 반하여, Lm-LLO-E7/항-PD-1을 조합하면 처리된 마우스의 20%에서 종양 성장이 상당한 수준으로 늦추어졌고(도 12b), 생존이 연장되었으며, 종양이 완벽히 퇴행되었다(도 12c). 이러한 실험은 항-PD-1 Ab와 Lm-LLO-E7 백신을 조합하는 것이 이러한 실험에서 사용된 엄격한 조건 하에서조차 종양 성장을 억제하고 생존율을 개선하는, 실현 가능한 방법이라는 점을 보여준다.

예 10: 항-PD -1 Ab와 Lm-LLO-E7 의 조합은 항원특이적 면역 반응과 종양으로의 CD8 T 세포 침투를 상당한 수준으로 향상시킨다.

Lm-LLO-E7/항-PD-1 Ab 조합의 면역학적 효능을 평가하고 면역 기전을 정의하기 위해, 다음으로 종양에 침투된 CD8 T 세포 및 종양을 보유하는 처리된 마우스의 비장 내에서의, 항원에 특이적인 IFNγ을 형성하는 세포의 수준을 파악하기 위해 평가하였다. 2차 처리로부터 6일 후 마우스를 희생시키고 비장과 종양을 수확한 것을 제외하고, 상기 기술된 방식으로 치료 실험을 위해 마우스에 TC-1 세포를 이식하고 처리하였다. E7에 특이적인, IFNγ를 형성하는 세포를 표준 ELISPOT 분석법으로 분석하였다. 예상되는 바와 같이, 대조군 대비, Lm-LLO-E7 처리만으로도 IFNγ를 형성하는 E7특이적 세포가 상당 수준 유도되었다(P < 0.001). 특히, 항-PD-1 Ab를 이용한 PD-1/PD-L1 차단을 Lm-LLO-E7에 더하였을 때는, Lm-LLO-E7만이 이용되었을 때에 비해 항원 특이적 면역 반응이 더욱 상당한 수준으로 증가하였다(P < 0.01) (도 13a). Lm-LLO-E7/항-PD-1 Ab의 조합이 치료 효과를 발휘하는 기전을 좀더 밝히기 위해, 종양에 침투된 CD8 T 세포에 대한 처리 효과를 시험하였다. 앞서 기술된 바와 같이 처리된 마우스에서 종양에 침투된 CD8 T 세포를 종양 이식 21일 후에 시험하였다. Lm-LLO-E7 및 Lm-LLO-E7/항-PD-1 Ab는 대조군에 비해 종양에 침투된 CD8 T 세포를 상당한 수준으로 증가시켰다(Lm-LLO-E7 단독 사용 시 P < 0.05, Lm-LLO-E7/항-PD-1 Ab 사용 시 P <0.001) (도 13b). 말초 면역 반응과 유사하게도, Lm-LLO-E7 처리에 항-PD-1 Ab을 추가하는 것은 Lm-LLO-E7가 단독으로 이용되었을 때보다 CD8 T 세포 종양 침투를 상당한 수준으로 증가시켰다(P < 0.05) (도 13b).

예 11: 항원 또는 항-PD -1 Ab의 유무에 관계 없이 , Lm-LLO 처리는 비장 및 종양에 침투된 MDSC 및 Treg 세포 모두를 상당한 수준으로 감소시켰다.

MDSC와 Treg 세포는 대단한 면역 반응 억제적 활성을 갖는 두 개의 세포 부분 집합이다. 따라서, Lm-LLO-E7/항-PD-1 Ab 조합의 처리의 영향을 이해하기 위해 이들 부분 집합들을 말초 및 종양 마이크로 환경 내에서 분석하였다. 2차 예방접종으로부터 6일 후에 수확된 비장과 종양을 평가하여 MDSC와 Treg 세포의 백분율(비장) 및 실(實) 개수(종양)를 알아내었다. 종양이 없는 동물의 비장에서의 MDSC의 비율은 약 2.5%인 반면에, 종양이 존재하는 경우 이러한 비율은 상당한 수준으로 증가한다(~15%) (도 14a). 놀랍게도, E7 항원의 존재 또는 항-PD-1 처리의 유무와 관계 없이, Lm-LLO로의 처리는 대조군 동물에 비해 비장에서의 MDSC 레벨을 상당한 수준으로 감소시킨다(P < 0.05) (도 14a). 유사하게도, 종양에 침투된 MDSC의 개수 역시 Lm-LLO, Lm-LLO-E7, 및 Lm-LLO-E7/항-PD-1 Ab로의 처리 후 상당한 수준으로 감소하였다(도 14b). 중요한 것은, 비장(도 15a) 및 종양(도 15b) 내의 Treg 세포 역시 Lm-LLO 단독으로 또는 E7나 항-PD-1 Ab와 함께 처리된 그룹 내에서 다소, 그러나 유의미한 수준으로 감소하였다는 것이다.

이러한 데이터는 Lm-LLO가 처리된 마우스의 비장과 종양 모두에서의 MDSC와 Treg의 감소에 전적으로 책임이 있으며, 항원 또는 항-PD-1 항체를 첨가하는 것은 이러한 세포들의 레벨에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.

예 12: 인간 DC의, Lm-LLO 로의 감염 또한 표면 PD-L1 발현의 상향조절을 야기함

Lm-LLO-E7/항-PD-1 Ab 조합이 항-종양 효과를 발휘하는 면역 기전과 치료 효능을 입증한 후, 결과가 임상에도 전환될 수 있는지를 이해하기 위해 Lm-LLO이 인간 DC에서의 PD-L1 발현 수준에도 영향을 미치는지를 시험하였다. 단핵 백혈구로부터 유래한 인간 DC를 “방법” 부분에서 기술된 바와 같이 건강한 자원자의 PBMC로부터 분리하였다. 인간 DC를 다양한 농도의 Lm-LLO 및 Lm-LLO-E7로 감염시켰다. 쥐 DC와 유사하게도 Lm-LLO 감염과 Lm-LLO-E7 감염 모두 표면 PD-L1의 상향조절을 상당한 수준으로 야기한다는 것이 발견되었다(도 16a 및 도 16b, 데이터는 도시하지 않음). 쥐 DC의 경우, 인간 DC에서의 PD-L1 상향조절은 투여량에 의존적이었다. 이러한 결과는 리스테리아계 백신과 항-PD-1 Ab의 조합이 강력하고 임상적으로 전환 가능한 면역치료 접근법이 될 수 있음을 시사한다.

결론적으로, 상기 결과는 Lm-LLO계 백신과 항-PD-1 Ab의 조합이, 처리된 동물에게서 항원특이적 면역 반응 및 종양에 침투하는 CD8 T 세포를 증가시키고, 억제자 세포(Treg 세포 및 MDSC)를 감소시키며, 따라서, 상당한 수준의 종양 성장 억제 및 종양의 완벽한 퇴행/장기 생존을 야기한다는 것을 입증한다. 따라서, Lm-LLO계 백신과 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 조합하는 것은 항-종양 면역 요법 효능의 전반적인 향상을 야기할 수 있는, 실행 가능하고 전환 가능한 접근법이라는 것이 밝혀졌다.

예 13: 재발성/전이성 경부 또는 인간 유두종 바이러스( HPV ) 양성 두경부암 환자에서 의, ADXS11-001 또는 MEDI4736 면역 치료 단독 또는 조합의 I/II 상 연구

배경

암 성장 및 전이에 중요한 핵심 HPV 유전자를 표적화하는 접근법은 자궁 경부암 또는 두경부암으로 진단받은 개인의 생존율을 개선할 수 있다.

ADXS11-001은 항원 제공이 가능한 세포 내에서 HPV-E7 종양 항원을 절단된 LLO-E7 융합 단백질로서 분비하도록 생물 공학 처리된, 살아있는, 약독화된 리스테리아 모노사이토젠(Lm)-리스테리오리신 O(LLO) 면역 요법이다. 이것은 종양 마이크로 환경에서 종양 방어를 감소시키며 HPV-특이적 T 세포 생성을 초래한다. 항-프로그램된 사멸-1 리간드(PD-L1) 항체인 MEDI4736는 PD-L1가 PD-1과 CD8로 결합하는 것을 차단하며, PD-L1에 의존적인 면역 억제 효과의 억제를 완화한다. ADXS11-001과 항-PD-L1의 조합이 상당한 수준으로 종양 성장을 지연시키고 동물의 생존을 연장시킨다는 것을 보여준 전임상 연구에서, PD-L1 결합을 억제하는 것은 ADXS11-001의 뚜렷한 면역학적 효능/활성을 증가시켰다.

방법

이것은 개방표지, 다기관 공동, 2부분, 무작위 I/II 상 연구이다(NCT02291055). 재발성/전이성 환경에서 1회 이상의 사전 백금 기반 치료를 진행한, 편평상/비편평상 경부암종 또는 HPV에 관련된 두경부 편평 세포암을 앓는 환자(≥18세)는 자격을 갖는다. I 상의 주 목적은 ADXS11-001과 MEDI4736의 조합의 내약성과 안전성을 평가하고 해당 조합에 대해 권장되는 II 상 투여량(RP2D)을 선택하는 것이다. II 상의 주 목적은 ADXS11-001와 MEDI4736의 단독 또는 조합으로서의 안전성, 무진행생존(PFS), 및 종양 반응을 평가하는 것이다. I 상과 II 상 모두의 탐색적 목적은 PFS와 종양 반응을 보이는 면역학적 반응 바이오마커들 간의 연관성을 평가할 것이다. I 상에서는 최대 18명의 환자들이 고정 용량의 ADXS11-001(1×10⁹ 집락형성단위[CFU])를 투여받는 한편, MEDI4736의 투여량은 표준 3+3 설계에 따라 단계적으로 확대(3 mg/kg에서 시작)된다. II 상에서는 환자들(n=48)이 무작위로(1:1:2) ADXS11-001(1×10⁹CFU), MEDI4736(10 mg/kg), 또는 RP2D로 둘 모두를 투여받는다. 이때, 각 치료군은 질병에 따라 계층화된다. I 상과 II 상 모두에서, ADXS11-001는 4주마다 투여되며 MEDI4736는 2주마다 투여된다. 환자들은 최대 1년간, 또는 질병의 진행이나 허용 불가능한 독성으로 인해 치료를 중단할 때까지, 치료를 받는다. 유효성 파라미터는 고형 종양 그룹의 반응 평가 기준(RECIST) 및 면역에 관련된 RECIST 평가 기준에 의해 평가되며, 안전성은 이상 반응에 대한 일반적인 용어 기준(CTCAE)을 사용하여 판단된다.

첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 기술된 바람직한 실시예들을 가지고, 본 발명이 정확한 실시예들에 한정되지 않으며, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 본 기술분야의 숙련자에 의해 여러가지 변경 및 수정이 행해질 수도 있다는 것을 이해해야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Advaxis, Inc. 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Thr Glu Glu Glu Ile Asp 20 25 30 Arg <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 9 Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Streptococcus equisimilis <400> 10 Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E7 peptide <400> 11 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISPOT irrelevant peptide <400> 12 Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 13 <211> 1620 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tLLO-E7 fusion <400> 13 atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60 caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120 ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180 atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240 gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa 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ctacttttaa tcgagaaaca 1140 ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200 aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260 atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320 gatctcgagc atggagatac acctacattg catgaatata tgttagattt gcaaccagag 1380 acaactgatc tctactgtta tgagcaatta aatgacagct cagaggagga ggatgaaata 1440 gatggtccag ctggacaagc agaaccggac agagcccatt acaatattgt aaccttttgt 1500 tgcaagtgtg actctacgct tcggttgtgc gtacaaagca cacacgtaga cattcgtact 1560 ttggaagacc tgttaatggg cacactagga attgtgtgcc ccatctgttc tcagaaacca 1620 <210> 14 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tLLO-E7 fusion <400> 14 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Leu Glu His Gly Asp Thr Pro 435 440 445 Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu 450 455 460 Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile 465 470 475 480 Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile 485 490 495 Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln 500 505 510 Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr 515 520 525 Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 530 535 540

Claims (62)

1. 면역 관문 억제자, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물로, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
2. T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물로, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
3. 면역 관문 억제자, T 세포 자극제, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물로, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 구조 틀을 포함하고, 여기서 상기 융합 폴리펩타이드는 절단된 리스테리오리신 O 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 이종 항원이나 그의 단편에 융합된 PEST 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 리스테리아 게놈 내로 통합되는, 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 리스테리아 균주 내의 세균 인공염색체 내에 있는, 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 재조합 리스테리아 균주 내의 플라스미드 내에 있는, 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 플라스미드는 항생제 선별의 부재시 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 안정적으로 유지되는, 조성물.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 플라스미드는 상기 재조합 리스테리아 균주에 항생제 내성을 부여하지 않는, 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 항원은 종양-연관 항원인, 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 종양-연관 항원은 인간 유두종 바이러스(HPV)인, 조성물.
11. 제9항에 있어서, 상기 종양-연관 항원은 혈관형성 항원인, 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 약독화된, 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 약독화된 리스테리아는 내인성 유전자에서의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아는 상기 내인성 actA 독성 유전자에서의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아는 상기 내인성 prfA 독성 유전자에서의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 prfA 돌연변이는 D133V 돌연변이인, 조성물.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아는 상기 내인성 D-알라닌 라세미화효소(dal) 및 D-아미노산 전이효소(dat) 유전자에서의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
18. 제13항 내지 제15항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이는 유전자의 불활성화, 절단, 결실, 교환 또는 파괴를 포함하는, 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 제2 개방 구조 틀을 더 포함하는, 조성물.
20. 제19항에 있어서, 상기 제2 개방 구조 틀은 대사 효소를 암호화하는, 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 제2 개방 구조 틀에 의해 암호화되는 상기 대사 효소는 알라닌 라세미화효소 또는 D-아미노산 전이효소인, 조성물.
22. 제1항 및 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 관문 억제자는 PD-1 신호전달 경로 억제자, CD-80/86 및 CTLA4 신호전달 경로 억제자, T 세포 막 단백질 3 (TIM3) 신호전달 경로 억제자, 아데노신 A2a 수용체 (A2aR) 신호전달 경로 억제자, 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3) 신호전달 경로 억제자, 또는 킬러 면역글로불린 수용체 (KIR) 신호전달 경로 억제자인, 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 PD-1 신호전달 경로 억제자는 PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자인, 조성물.
24. 제23항에 있어서, 상기 PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 PD-1 리간드 2(PD-L2)와의 PD-1 수용체 상호작용을 차단하는 분자는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2와 상호작용하는 분자인, 조성물.
25. 제24항에 있어서, 상기 PD-1과 상호작용하는 분자는 항-PD-1 항체인, 조성물.
26. 제24항에 있어서, 상기 PD-1과 상호작용하는 분자는 절단된 PD-L1 단백질 또는 절단된 PD-L2 단백질인, 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 절단된 PD-L1 단백질은 PD-L1 단백질의 세포질 도메인을 포함하는, 조성물.
28. 제26항에 있어서, 상기 절단된 PD-L2 단백질은 PD-L2 단백질의 세포질 도메인을 포함하는, 조성물.
29. 제24항에 있어서, 상기 PD-L1과 상호작용하는 분자는 항-PD-L1 항체, 절단된 PD-1 단백질, PD-1 모방체, 또는 PD-L1과 결합하는 소분자인, 조성물.
30. 제24항에 있어서, 상기 PD-L2와 상호작용하는 분자는 항-PD-L2 항체, 절단된 PD-1 단백질, PD-1 모방체, 또는 PD-L2과 결합하는 소분자인, 조성물.
31. 제24항에 있어서, 상기 PD-1L 및 PD-2L와 상호작용하는 분자는 절단된 PD-1 단백질인, 조성물.
32. 제31항에 있어서, 상기 절단된 PD-1 단백질은 PD-1 단백질의 세포질 도메인을 포함하는, 조성물.
33. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 자극제는 항원 제공 세포(APC)/T 세포 길항제인, 조성물.
34. 제33항에 있어서, 상기 길항제는 CD134 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, CD-137 또는 이의 리간드 또는 이의 단편, 또는 유도가능한 T 세포 공동자극제(ICOS) 또는 이의 리간드 또는 이의 단편인, 조성물.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 보강제를 더 포함하는, 조성물.
36. 제35항에 있어서, 상기 보강제는 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A, 또는 비메틸화 CpG-함유 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
37. 대상물에서 증강된 항-종양 T 세포 면역 반응을 유발하는 방법으로, 상기 방법은 제1항 및 제4항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
38. 대상물에서 증강된 항-종양 T 세포 면역 반응을 유발하는 방법으로, 상기 방법은 제2항 및 제4항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
39. 대상물에서 증강된 항-종양 T 세포 면역 반응을 유발하는 방법으로, 상기 방법은 제3항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 인터페론-감마 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
41. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 T 효과기 세포에 의한 종양 침투 증가를 포함하는, 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 T 효과기 세포는 CD45+CD8+ T 세포 또는 CD4+Fox3P- T 세포인, 방법.
43. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)의 빈도 감소를 포함하는, 방법.
44. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 비장 및 종양 마이크로 환경에서 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 빈도 감소를 포함하는, 방법.
45. 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법으로, 상기 방법은 제1항 및 제4항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
46. 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법으로, 상기 방법은 제2항 및 제4항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
47. 대상물에서 종양 매개 면역억제를 저해하는 방법으로, 상기 방법은 제3항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
48. 대상물의 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시키는 방법으로, 상기 방법은 제1항 및 제4항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 대상물의 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시키는 방법으로, 상기 방법은 제2항 및 제4항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
50. 대상물의 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시키는 방법으로, 상기 방법은 제3항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
51. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-종양 면역 반응을 증강시키는 사이토카인을 상기 면역원성 조성물의 투여와 함께, 이전, 또는 이후에 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 사이토카인은 I 형 인터페론 (IFN-α / IFN-β), TNF-α, IL-1, IL-4, IL-12, INF-γ인, 방법.
53. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-종양 면역 반응을 증강시키는 종양 키나아제 억제자(TKI)를 상기 면역원성 조성물의 투여와 함께, 이전, 또는 이후에 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 TKI는 표 1에서 선택되는, 방법.
55. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO) 경로 억제자를 상기 면역원성 조성물의 투여와 함께, 이전, 또는 이후에 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
56. 제55항에 있어서, 상기 IDO 경로 억제자는 IDO와 결합하거나 상호작용하는 소분자, 또는 항-IDO 항체인, 방법.
57. 제37항, 제39항 내지 제41항, 제43항 내지 제45항, 제47항, 제48항, 및 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물에 의해 포함된 관문 억제자는 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 이전, 동시에, 또는 이후에 상기 대상물에게 투여되는, 방법.
58. 제38항, 제40항 내지 제44항, 제46항, 제47항, 및 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물에 의해 포함된 T 세포 자극제는 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 이전, 동시에, 또는 이후에 상기 대상물에게 투여되는, 방법.
59. 제39항 내지 제44항, 제47항, 및 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물에 의해 포함된 T 세포 자극제 및 관문 억제자는 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 이전, 동시에, 또는 이후에 상기 대상물에게 투여되는, 방법.
60. 제37항 내지 제50항, 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물, 상기 재조합 리스테리아, 상기 T 세포 자극제 또는 상기 관문 억제자의 추가 투여량을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
61. 제37항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 대상물에서 종양 또는 암을 치료하는 단계를 더 포함하는, 방법.
62. 제37항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 대상물에서 종양 성장 또는 암을 예방하는 단계를 더 포함하는, 방법.

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