JP7346501B2 - ペプチドミニ遺伝子発現系を含むリステリアベースの組成物およびその使用方法 - Google Patents

ペプチドミニ遺伝子発現系を含むリステリアベースの組成物およびその使用方法 Download PDF

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Description

ミニ遺伝子発現構築体を含むリステリア送達ベクターを含む組成物と、抗原発現腫瘍ま
たはガンに対する免疫応答を誘発するためおよびこれを処置するためにこの組成物を使用
する方法、ならびに腫瘍またはガンを持つ被験者に対してこの組成物をワクチン接種する
ことと、が開示される。
リステリア・モノサイトゲネスは、主として抗原提示細胞に感染し、またこれらの細胞
の細胞質内に死ぬまで適合する細胞内病原体である。マクロファージなどの宿主細胞は、
Ｌ．モノサイトゲネスを活発に貪食し、その大半の細菌がファゴリソソーム内で分解され
る。一部の細菌は、溶血素、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の活動を通してファゴソーム
膜に穿孔することによって宿主サイトゾルの中へとエスケープする。一旦サイトゾル内に
入ると、Ｌ．モノサイトゲネスは宿主アクチンを重合して、細胞間を直接通り抜けて、宿
主の免疫系をさらに逃れることができ、結果としてＬ．モノサイトゲネスに対する抗体応
答がごくわずかになる。
リステリアからの組み換え型タンパク質発現は、全長のタンパク質をコードするＤＮＡ
配列または対象となる抗原性配列（複数可）を含有する大きいポリペプチドの導入に関与
するが、異種供給源からの複数のペプチド決定基の発現が望ましい事例ではこれは可能で
はなかった。この事例では、ペプチドは、様々な長さのアミノ酸リンカーによって分離さ
れた対象となるペプチドを含有する単一のポリペプチド構築体として発現されており、ま
たこれらはＭＨＣクラスＩ結合ペプチド決定基の産生のためのプロテアソーム活性を必要
とされている。これは抗原提示の損失をもたらす場合がある。
よって、免疫応答を増強するためにプロテアソーム活性を避けることおよび抗原提示を
強化することに対する必要性がある。本開示は、ＭＨＣクラスＩ分子による提示のために
最小限のペプチド決定基をコードする核酸配列の「ミニ遺伝子」発現系を含むリステリア
ベースの組成物を提供することによってこの必要性に対処する。これらのミニ遺伝子は、
ユビキチン部分（Ｕｂ－ペプチド）にすぐ続くペプチドを用いて発現させることができ、
そうすることによって、この系は抗原を抗原プロセシング経路に入れる必要性を避け、こ
れによって組み換え型リステリアによって感染した細胞のサイトゾルの中へとペプチド抗
原を直接発現することができるようにする。さらに、また本明細書で詳細な説明に記述さ
れるように、本開示のミニ遺伝子系は、単一のリステリア送達ベクターを使用して複数の
ペプチドを細胞の中へと装填することができるようにする利点を提供する。
一態様では、本開示はミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株を提供し、
前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記
キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドは、アミノ末端からカ
ルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される。
別の態様では、本開示は腫瘍またはガンを有する被験者の中に抗腫瘍または抗ガン応答
を引き出す方法を提供し、前記方法は前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え
型リステリアを投与する工程を含み、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドは、アミノ末端からカ
ルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、それによって前記被験者での抗腫瘍応答が強
化される。
一態様では、本開示は被験者の中の腫瘍またはガンを処置する方法を提供し、前記方法
は前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み
、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前
記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカ
ルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、それによって前記被験者での抗腫瘍応答が強
化される。
特許または出願の書類は、色付きで描かれた少なくとも一つの図面を含有する。本特許
または本特許出願のカラー図面（複数可）付きの出版物の複製物は、要求に応じ、かつ必
要な料金の支払いに応じて米国特許商標局から提供される。本開示に関する主題は、本明
細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明
の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図
面とともに読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良
好に理解され得る。
図１Ａ～図１Ｂは、Ｅ７を発現および分泌するために異なる発現系を使用するＬｍ－Ｅ７およびＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７を示す。Ｌｍ－Ｅ７は、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって生成された（図１Ａ）。ｈｌｙプロモーターは、ＨＰＶ－１６ Ｅ７が後に続くＬＬＯのｈｌｙシグナル配列および最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を駆動する（図１Ｂ）。Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７を、ｐｒｆＡ－株ＸＦＬ－７をプラスミドｐＧＧ－５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ－５５は、ＬＬＯ－Ｅ７の融合非溶血性の融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ－５５は、ｐｒｆＡ遺伝子も含有し、インビボでＸＦＬ－７によってプラスミドの保持を選択する。 図２は、Ｌｍ－Ｅ７およびＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７のＥ７分泌を示す。Ｌｍ－Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ－Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ－７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を、ルリア－ベルターニ培地中、３７℃で一晩増殖させた。６００ｎｍの吸光度においてＯＤによって決定された同等数の細菌をペレット化し、そして各々の上清１８ｍＬをＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって解析した。ブロットを抗Ｅ７ ｍＡｂでプローブし、それに続いてＨＲＰ共役抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブし、次いでをＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。 図３は、ＬＬＯ－Ｅ７融合の腫瘍免疫療法的な有効性を示す。腫瘍接種の７、１４、２１、２８、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示される。無処置マウス：白丸、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７：黒丸、Ｌｍ－Ｅ７：正方形、Ｌｍ－Ｇａｇ：白ひし形、そしてＬｍ－ＬＬＯ－ＮＰ：黒三角。 図４は、ＴＣ－１細胞に曝露されたとき増殖するＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７－免疫化マウスからの脾細胞を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、Ｌｍ－Ｅ７、または対照ｒＬｍ株を用いて免疫を与え、かつブーストした。脾細胞を、ブーストの６日後に採取し、そして示される比で照射したＴＣ－１細胞と共に培養皿に蒔いた。細胞を３Ｈチミジンでパルスラベルし、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）－（非ＴＣ－１対照）と定義された。 図５Ａは、（Ａ）Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７がＥ７を分泌することを実証するウエスタンブロットを示す。レーン１：Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、レーン２：Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７．００１、レーン３：Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７－２．５．３、レーン４：Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７－２．５．４。 図５Ｂは、Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７（長方形）、Ｌｍ－Ｅ７（楕円）、およびＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７（×）を投与したマウス、ならびに無処置マウス（非ワクチン接種、黒三角形）内の腫瘍サイズを示す。 図６Ａは、４つのＬＭワクチンを作り出すために使用されるプラスミドインサートの概略表示を示す。Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７インサートは、使用されるすべてのリステリア遺伝子を含有する。これは、ｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子の最初の１．３ｋｂ（タンパク質ＬＬＯをコードする）、およびＨＰＶ－１６ Ｅ７遺伝子を含有する。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、残りの切断ＬＬＯ遺伝子は除外する。Ｌｍ－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７はＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および切断ＬＬＯの残りを含有する。Ｌｍ－Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。 上のパネル：リステリア構築体は、腫瘍退行を誘発するＰＥＳＴ領域を含有する。下のパネル：２つの別個の実験での腫瘍チャレンジ後２８日目における平均腫瘍サイズ。 図６Ｃは、脾臓内にＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体を示す。３つの実験からのデータの平均およびＳＥが図示される。 図７Ａは、ＴＣ－１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ－Ｅ７、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、もしくはＬｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７を投与した、またはワクチンを投与しなかった（無処置）マウスでの、脾臓内でのＥ７特異的なＩＦＮ－ガンマ－分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸透する数を示す。 図７Ｂは、（Ａ）に記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的なＣＤ８＋細胞の誘導および浸透を示す。 図８Ａ～図８Ｂは、腫瘍の中のＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体を示す。（図８Ａ）１つの実験からの代表的データ。（図８Ｂ）３つのすべての実験からのデータの平均およびＳＥ。 図９Ａは、大腸菌－リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５の概略的なマップを示す。ＣＡＴ（－）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ、Ｏｒｉ Ｌｍ：リステリアの複製起点、Ｏｒｉ Ｅｃ：大腸菌のｐ１５複製の起点、ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ、ＬＬＯ：Ｃ末端切断リステリオリシンＯ、そのプロモーターを含む、Ｅ７：ＨＰＶ Ｅ７。選択された制限部位も図示される。 図９Ｂは、大腸菌－リステリアシャトルプラスミドｐＴＶ３（下記）の概略的なマップを示す。ＣＡＴ（－）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ、Ｏｒｉ Ｌｍ：リステリアの複製起点、Ｏｒｉ Ｅｃ：大腸菌のｐ１５複製の起点、ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ、ＬＬＯ：Ｃ末端切断リステリオリシンＯ、そのプロモーターを含む、Ｅ７：ＨＰＶ Ｅ７、ｐ６０－ｄａｌ、ｐ６０プロモーターおよびリステリアｄａｌ遺伝子の発現カセット。選択された制限部位も図示される。 図１０はＤＮＡ配列（配列番号：７４）を示し、これは、リステリア株ＥＧＤのゲノム上のｉｎｌＣ領域の上流および下流を提示する。ＤＮＡ－ｕｐ（赤色）、ｉｎｌＣ遺伝子（青色）、およびＤＮＡ－ｄｏｗｎ（黒色）。 図１１はＤＮＡの配列（配列番号：７５）を示し、これは、温度感受性プラスミド、ｐＫＳＶ７中でクローニングされ、ｉｎｌ Ｃ欠失突然変異体を作り出す。これらの領域のクローニングのために使用される制限酵素部位は、大文字および下線付きで示される。ＧＡＡＴＴＣ－ＥｃｏＲＩ、ＧＧＡＴＣＣ－ＢａｍＨＩ、およびＣＴＧＣＡｇ－ＰｓｔＩである。ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩインサートは、ベクター、ｐＫＳＶ７内でクローニングされる。 図１２は、Ｌｍ－ｄｄおよびＬｍ－ｄｄＤ ａｃｔＡ株の概略的な表示を示す。株、Ｌｍ－ｄｄおよびＬｍ－ｄｄΔａｃｔＡのｅ染色体のＤＮＡをテンプレートとして使用して、オリゴの１／２およびオリゴの３／４を使用するＰＣＲ産物のサイズを示すゲルが得られた。 図１３はＤＮＡ配列（配列番号：５７）を示し、これは、リステリア染色体内のｉｎｌＣ領域ａｃｔＡ遺伝子の上流および下流を提示する。斜字体の領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内に存在する残りのａｃｔＡ配列要素を含有する。下線付きの配列ｇｔｃｇａｃは、ａｃｔＡのＮ－Ｔ領域とＣ－Ｔ領域との間の結合である、ＸｈｏＩの制限部位を表す。 図１４は、ＬＭワクチン株（Ａ）の投与に応答する腫瘍退行を図示する。丸は無処置マウスを表し、逆三角形はＬｍｄｄ－ＴＶ３を投与されたマウスを表し、十文字はＬｍ－ＬＬＯＥ７を投与されたマウスを表す。 図１５Ａは、ｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップを示し、これは、構造性のリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ－ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を持つ。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ ４０－１７０）、ＥＣ２（ａａ ３５９－５１８）およびＩＣＩ（ａａ ６７９－８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１－４ ４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。図１５Ｂでは、抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ－ＬＬＯ－１３８）およびＬｍｄｄＡ－ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１－１６４）内でｔＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。～１０４ ＫＤの差を示す帯はｔＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８ ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。 図１６Ａでは、ＮＴ－２細胞を刺激細胞として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨｅｒ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答が試験された。Ｌｍ－対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６－Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。図１６Ｂでは、脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ－γが、ＮＴ－２細胞によって処置されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。図１６Ｃは、インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ－γ分泌である。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ－γ分泌が検出された。各々のデータ点は、３倍のデータ＋／－標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。 図１７は、各々の組み換え型リステリア－ＣｈＨｅｒ２ワクチン、または対照リステリアワクチンを６回注射したＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスからの結果を表す。生後６週で免疫化を開始し、２１週目まで３週ごとに継続した。腫瘍の外観を毎週観察して、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。 図１８は、ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ－２細胞を用いて皮下接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化したことを示す。第２の免疫化の７日後、脾臓を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のためにこれらを抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によって染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。 図１９Ａ～図１９Ｂは、ＦＶＢ／Ｎマウスが１×１０６ＮＴ－２細胞を用いて皮下接種され、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化されたことを示す。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。図１９Ａは、代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットである。図１９Ｂは、異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度である。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示される。 図２０Ａ～図２０Ｃは、組み換え型リステリアタンパク質ミニ遺伝子構築体の概略的なマップを表す。図２０Ａは、オボアルブミン派生ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを産生する構築体を表す。図２０Ｂは、ＰＣＲクローニングによってＳＩＩＮＦＥＫＬの代わりにＧＢＭ派生ペプチドが導入された同等の組み換え型タンパク質を表す。図２０Ｃは、リステリアの株から４つの別個のペプチド抗原を発現するように設計された構築体を表す。
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していない
ことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相
対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応
するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具
体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施さ
れてもよいことが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしな
いために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
一実施形態では、抗腫瘍または抗ガン応答を誘発するための組成物および方法が本明細
書に開示される。
一態様では、本開示は、キメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含むミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株を提供し、前記構築体は、前
記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドは、アミノ末端からカ
ルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される。
一実施形態では、リステリアは、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によ
ってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む。
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、各々のオープンリーディングフレームの
間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ～４つのオ
ープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、各々のオープンリーディ
ングフレームは異なるペプチドを含む。
別の態様では、本開示は腫瘍またはガンを有する被験者の中に抗腫瘍または抗ガン応答
を誘発する方法を提供し、前記方法は前記被験者にキメラタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを含むミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与
する工程を含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカ
ルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を
強化する。
一態様では、本開示は被験者の中の腫瘍またはガンを処置する方法を提供し、前記方法
は前記被験者にキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むミニ
遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記キメラタンパ
ク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカ
ルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を
強化する。
一実施形態では、「核酸分子」、「核酸構築体」、および「ミニ遺伝子核酸構築体」と
いう用語は、本明細書では交換可能に使用される。
「核酸」という用語およびその文法的な同等物は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、
真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮ
Ａ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含む場合があるがこれに限定されない分子を指す場
合があることを当業者は理解するであろう。この用語は既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基
類似体のいずれかを含む配列も指す。
別の実施形態では、本明細書に開示された方法を使用して生成された融合ペプチドは、
ＨＩＳタグまたはＳＩＩＮＦＥＣＫＬタグにさらにリンクしている。これらのタグが発現
される場合があり、そして提示される抗原性エピトープは、これらの「タグ」配列ペプチ
ドに対する免疫応答を追いかけることによって、臨床医が分泌されたペプチド免疫原性を
追いかけることができるようにする。かかる免疫応答は、これらのタグに対して特異的な
モノクローナル抗体およびＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含むがこれに限定されない数多
くの試薬を使用して監視することができる。タグに対する配列は、融合ペプチド配列をコ
ードする核酸配列の中へと組み込まれる場合があることが当業者によって理解されるであ
ろう。別の実施形態では、プラスミドまたはファージベクターなどの本明細書に開示され
たベクターは、本明細書に開示された融合ペプチドまたはキメラタンパク質をコードする
核酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「ガン」および「腫瘍」という用語は、すべて同一の意味
と質を有する場合があることを当業者は理解するであろう。
別の実施形態では、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法が本
明細書に開示される。別の実施形態では、腫瘍抗原は異種抗原である。別の実施形態では
、腫瘍抗原は自己抗原である。別の実施形態では、感染性疾患抗原に対する免疫応答を誘
発するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、感染性疾患
抗原は異種抗原である。別の実施形態では、本開示の組成物および方法は腫瘍またはガン
に対してワクチン接種するために使用される。
また別の実施形態では、本開示の組成物および方法は、処置に続くエスケープ変異の発
生を防止する。別の実施形態では、腫瘍またはガンを患う被験者に無進行生存率を提供す
るための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、被験者にガンま
たは腫瘍に対して免疫付与するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実
施形態では、被験者にガンまたは腫瘍に対して免疫付与するための組成物および方法が本
明細書に開示される。別の実施形態では、このガンは転移である。
組み換え型リステリア株
一実施形態では、キメラタンパク質をコードする核酸構築体を含む組み換え型弱毒化リ
ステリア株が本明細書に開示される。別の実施形態では、核酸構築体は組み換え型核酸構
築体である。別の実施形態では、細菌分泌シグナル配列（ＳＳ）、ユビキチン（Ｕｂ）タ
ンパク質、およびペプチド配列をコードするオープンリーディングフレームを含む組み換
え型核酸構築体を含む組み換え型弱毒化リステリア株が本明細書に開示される。別の実施
形態では、核酸構築体は、細菌分泌シグナル配列、ユビキチンタンパク質、およびペプチ
ド配列を含むキメラタンパク質をコードする。一実施形態では、キメラタンパク質は以下
の様式（ＳＳ－Ｕｂ－ペプチド）で配列される。
一実施形態では、核酸構築体は、ペプチド部分のカルボキシ末端に対応するコドンを含
み、タンパク質合成の終了を確認するために２つの終止コドンが続く。
一実施形態では、本明細書に開示される組み換え型ポリペプチドをコードする核酸は、
シグナルペプチドまたは配列も含む。一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築体
によってコードされる細菌分泌シグナル配列は、リステリア分泌シグナル配列である。別
の実施形態では、本開示の方法および組成物の融合タンパク質はリステリオリシンＯ（Ｌ
ＬＯ）からのＬＬＯシグナル配列を含む。一実施形態では、異種抗原は、リステリアシグ
ナル配列（例えば、溶血素（ｈｌｙ）シグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列）などの
シグナル配列の使用を通して発現される場合がある。代替的には、例えば、融合タンパク
質を作り出すことなく外来遺伝子をＬ．モノサイトゲネスプロモーターから下流で発現す
ることができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌性（リステリア性または
非リステリア性）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対してネイティ
ブである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して外来である。別の実施
形態では、シグナルペプチドは、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドなどのリステリア・モノサ
イトゲネスからのシグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ラ
クトコッカス・ラクティスからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはバチルス・アント
ラシスからの保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは
、ｐ６０シグナルペプチドなどの、リステリア・モノサイトゲネスからのｓｅｃＡ２シグ
ナルペプチドである。さらに、組み換え型核酸分子は、任意選択的にｐ６０またはその断
片をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、シグナルペプチ
ドは、バシラスサチリスＴａｔシグナルペプチドなどのＴａｔシグナルペプチド（例えば
、ＰｈｏＤ）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、組み換え型ポリペプチドを
コードする同一の翻訳リーディングフレームである。
本明細書のすべての目的に対して、「組み換え型ポリペプチド」、「融合タンパク質」
、「組み換え型タンパク質」、および「キメラタンパク質」という用語は、本明細書では
交換可能に使用される。
別の実施形態では、分泌シグナル配列はリステリアタンパク質由来である。別の実施形
態では、分泌シグナルは、ＡｃｔＡ３００分泌シグナルである。別の実施形態では、分泌
シグナルは、ＡｃｔＡ１００分泌シグナルである。
一実施形態では、核酸構築体はユビキチンタンパク質をコードするオープンリーディン
グフレームを含む。一実施形態では、ユビキチンは全長のタンパク質である。本明細書に
開示された発現された構築体内のユビキチン（本明細書に開示された核酸構築体から発現
される）は、カルボキシ末端において、宿主細胞サイトゾルへ入る際に加水分解酵素の活
性を通して核酸構築体から発現される組み換え型キメラタンパク質の残りから分割される
ことを当業者は理解するであろう。これはペプチド部分のアミノ末端を遊離させ、ペプチ
ド（長さは特異的ペプチドに依存する）を宿主細胞サイトゾルの中に産生する。
一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築体によってコードされるペプチドは、
長さが８～１０アミノ酸（ＡＡ）である。別の実施形態では、ペプチドは１０～２０ＡＡ
長である。別の実施形態では、ペプチドは２１～３０ＡＡ長である。別の実施形態では、
ペプチドは３１～５０ＡＡ長である。別の実施形態では、ペプチドは５１～１００ＡＡ長
である。
一実施形態では、ペプチドは抗原性ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドは腫
瘍抗原に由来する。別の実施形態では、ペプチドは感染性疾患抗原に由来する。別の実施
形態では、ペプチドは自己抗原に由来する。別の実施形態では、ペプチドは血管形成抗原
に由来する。
一実施形態では、本明細書に開示されたペプチドが由来する抗原は、真菌病原体、細菌
、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、本明細書のペプチド
が由来する抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、
ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテ
アーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ
抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘ
リコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ－関連抗
原（ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ｇｐ－１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ
－１、ＨＳＰ－７０、β－ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ－１６、－１８、－３１、－３３、－
３５、または－４５からのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ
、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５
３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、またはｐＳＡから選択される
。
他の実施形態では、ペプチドは以下の疾患のうちの１つと関連付けられる抗原から由来
する。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹
、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破
傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンお
よび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫
瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不
全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病
、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原
発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ
性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレ
ン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、
白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イ
ートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん
、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・
アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血
小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ア
ミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タ
ンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
別の実施形態では、本明細書に開示されたペプチドが由来する抗原は腫瘍関連抗原であ
り、これは、一実施形態では、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、
ＭＡＧＥ １、ＭＡＧＥ ２、ＭＡＧＥ ３、ＭＡＧＥ ４、チロシナーゼ；突然変異ｒ
ａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノー
マ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１
６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（
ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立
腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原といった腫瘍抗原のうちの１つである。別の実施形態
では、本明細書に開示された組成物および方法のための抗原はメラノーマ－関連抗原であ
り、これは、一実施形態では、ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ｇｐ－１００
、チロシナーゼ、ＨＳＰ－７０、β－ＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。当該技
術分野で既知の他の腫瘍関連抗原は本発明でも企図される。
一実施形態では、ペプチドは、米国特許出願シリアル番号第１２／９４５，３８６号（
その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されているキメラ型Ｈｅｒ２抗原
に由来する。
別の実施形態では、ペプチドは、ＨＰＶ－Ｅ７（ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８株のいず
れかから）、ＨＰＶ－Ｅ６（ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８株のいずれかから）、Ｈｅｒ－
２／ｎｅｕ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ、ＳＣＣＥ、ＣＥＡ、ＬＭＰ－
１、ｐ５３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）
、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＷＴ－１、ＨＩＶ－１ Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関
連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺に特異的な抗原）、ＥＧＦＲ－ＩＩＩ、サバイビン、ア
ポトーシスのバキュロウイルス阻害剤繰返し含有５（ＢＩＲＣ５）、ＬＭＰ－１、ｐ５３
、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺に特異的な抗原）、またはこれらの組
み合せから選択される抗原に由来する。
一実施形態では、本開示のリステリアによって発現されるポリペプチドは神経ペプチド
成長因子拮抗薬でもよく、一実施形態では、これは［Ｄ－Ａｒｇ１、Ｄ－Ｐｈｅ５、Ｄ－
Ｔｒｐ７，９、Ｌｅｕ１１］サブスタンスＰ、［Ａｒｇ６、Ｄ－Ｔｒｐ７，９、ＮｍｅＰ
ｈｅ８］サブスタンスＰ（６－１１）である。これらの実施形態および関連する実施形態
は当業者に理解される。
別の実施形態では、異種抗原は感染性疾患抗原である。一実施形態では、抗原は自己抗
原（ａｕｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ）または自己抗原（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）である。
一実施形態では、ペプチドはＭＨＣクラスＩ分子上に負荷される能力を有する。別の実
施形態では、ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷される能力を有する。別の実施形
態では、ペプチドはＭＨＣクラスＩペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはＭＨ
ＣクラスＩＩペプチドである。別の実施形態では、宿主細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ分
子と結合した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でＴ細胞受容体によってペプチドを識別することが
できる。別の実施形態では、宿主細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ分子と結合した場合、Ｃ
Ｄ４＋Ｔ細胞上でＴ細胞受容体によってペプチドを識別することができる。別の実施形態
では、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に宿主細胞の表面上で結合したとき、
ペプチドの結合に対して特異的なエフェクターＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の表面上に存
在する抗体または小分子によってペプチドを識別することができる。
一実施形態では、本明細書に開示された発現系は、本明細書に開示されたキメラタンパ
ク質をコードする核酸構築体の使用を含む。別の実施形態では、この発現系は、カルボキ
シ末端において独特のペプチド部分を含有する組み換え型タンパク質のパネルを促進する
ように設計される。一実施形態では、これはテンプレートとして細菌分泌シグナル配列－
ユビキチン－ペプチド（ＳＳ－Ｕｂ－ペプチド）構築体上でコードする配列を利用するＰ
ＣＲ反応によって達成される。一実施形態では、Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域の中へと
延在するプライマーを使用し、また所望のペプチド配列に対してプライマーの３’端にお
いてコドンを導入して、単一のＰＣＲ反応で新しいＳＳ－Ｕｂ－ペプチド配列を生成する
ことができる（本明細書の実施例を参照のこと）。細菌プロモーターおよび細菌分泌シグ
ナル配列の最初のいくつかのヌクレオチドをコードする５’プライマーは、すべての構築
体に対して同一であってもよい。この構築体の概略表示が本明細書の図１に提供される。
一実施形態では、組み換え型リステリアは、第２の核酸分子または代謝酵素をコードす
るオープンリーディングフレームを含む構築体を含み、代謝酵素はリステリアの内因性遺
伝子で突然変異、欠失、または不活性化を相補する。別の実施形態では、代謝酵素は、組
み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では
、第２の核酸分子は、リステリアの内因性遺伝子内の突然変異を相補する第２の代謝酵素
をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、第２の核酸分子
は、組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する第２の代
謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。
完全長のタンパク質またはポリペプチドについて、「断片」という用語は、完全長のタ
ンパク質またはポリペプチドよりも短いかまたは少ないアミノ酸を含むタンパク質または
ポリペプチドを意味する。
一実施形態では、断片は１０～２０の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態で
は、断片は５つの核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１００～２
００の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１００～５００の核酸
またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は５０～２００の核酸またはアミノ
酸を有し、また別の実施形態では、断片は１０～２５０の核酸またはアミノ酸を有する。
別の実施形態では、核構築体または核酸分子は少なくとも１つのエピソーム性またはプ
ラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、プラ
スミドベクターは組み換え型リステリア株内で安定して維持される。別の実施形態では、
プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。一実施形態では、本
明細書に開示された組み換え型リステリア株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。別の
実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は抗生物質耐性遺伝子をコ
ードする核酸を含むプラスミドを含む。
一実施形態では、組み換え型リステリアは本明細書に開示される核酸構築体を担持する
エピソーム性ベクターを含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは染色体外であ
り、その中でリステリアのゲノムに組み込まれない。別の実施形態では、組み換え型リス
テリアは本明細書に開示される核酸構築体を担持するプラスミドベクターを含む。別の実
施形態では、プラスミドベクターは、リステリア染色体に組み込むための組み込み配列を
含有する。別の実施形態では、「ゲノム」および「染色体」という用語は本明細書で交換
可能に使用される。
別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法で使用するためのＬＬＯタ
ンパク質が本明細書で開示される。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片は、本明細
書に開示される組成物および方法で利用される。別の実施形態では、断片は機能的断片で
ある。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。
本開示のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では
、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭ
ＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨ
ＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮ
ＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰ
ＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮ
ＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩ
ＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬ
ＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦ
ＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩ
ＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶ
ＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮ
ＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶ
ＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫ
ＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ （ＧｅｎＢａｎｋ受入番号 Ｐ１３１２８；配列番号：１；核酸
配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１５１２７で示される）。別の実施形態では、ＬＬＯタ
ンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ０５４５８９．１で示される配列を有し、これ
は、リステリア１０４０３Ｓからのｈｌｙ遺伝子を指す。この配列に対応するプロタンパ
ク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯ
から分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４
残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本発明のワクチンに組み込まれる
ＬＬＯ断片の供給源として使用される。
別の実施形態では、本開示の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端
断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶ
ＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨ
ＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮ
ＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰ
ＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮ
ＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩ
ＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬ
ＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦ
ＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩ
ＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶ
ＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮ
ＹＤ （配列番号：２）。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書で利用されるＡＡ２０～４４２のＬＬＯタン
パク質にほぼ対応する。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶ
ＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨ
ＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮ
ＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰ
ＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮ
ＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩ
ＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬ
ＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦ
ＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩ
ＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶ
ＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ 配列番号：３。
一実施形態では、ＬＬＯシグナルペプチドまたはシグナル配列は以下のアミノ酸を含む
：ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫ（配列番号：４）。
本明細書で使用される場合、「切断ＬＬＯ」、「ｔＬＬＯ」、または「ΔＬＬＯ」はＰ
ＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳ
Ｔ配列を含むＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、上で定義したように「ΔＬＬＯ」は
４１６ＡＡ ＬＬＯ断片を指す。
別の実施形態では、切断ＬＬＯ、ｔＬＬＯ、またはΔＬＬＯという用語はアミノ末端に
おいて活性化ドメインを含有せず、システイン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の
実施形態では、これらの用語は溶血性でないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬ
Ｏ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形
態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされ
る。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、別の場所における欠失または突然変異によって非
溶血性にされる。別の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，
７７１，７０２号に詳細に述べられるように、ＬＬＯは、コレステロール結合ドメイン（
ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１ ＡＡから構
成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０ ＡＡから構成
される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～２５から構成される。別の実施形態で
は、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は
およそ残基１～７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１
００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１２５から構成さ
れる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１５０から構成される。別の実施
形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬ
Ｏ断片はおよそ残基１～２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ
残基１～２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～２５０
から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～２７５から構成される
。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～３００から構成される。別の実施形態
では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断
片はおよそ残基１～３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基
１～３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～４００から
構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～４２５から構成される。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタ
ンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必
ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用され
るＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節すること
ができる。他のＬＬＯ断片が当該技術分野で既知である。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１ ＡＡから構
成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０ ＡＡから構成
される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～２５から構成される。別の実施形態で
は、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は
およそ残基１～７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１
００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１２５から構成さ
れる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１５０から構成される。別の実施
形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬ
Ｏ断片はおよそ残基１～２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ
残基１～２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～２５０
から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～２７５から構成される
。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～３００から構成される。別の実施形態
では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断
片はおよそ残基１～３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基
１～３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～４００から
構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１～４２５から構成される。
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタ
ンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必
ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用され
るＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節すること
ができる。他のＬＬＯ断片が当該技術分野で既知である。
別の実施形態では、相同ＬＬＯは、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号：１～３のうちの１
つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＬＬＯは、配
列番号：１～３から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施
形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が７５％より高いこと
を指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が７
８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに
対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～
３４のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同
は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実
施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が８５％より高いこ
とを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が
８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つ
に対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１
～３のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同
は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実
施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が９３％より高いこ
とを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が
９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つ
に対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１
～３のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同
は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実
施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が９９％より高いこ
とを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１～３のうちの１つに対する同一性が
１００％であることを指す。
一実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号：５で示される配列によってコード
される
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ
ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫ
ＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡ
ＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥ
ＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳ
ＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩ
ＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥ
ＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬ
ＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲ
ＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰＴＳＥＥ
ＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲＬＡＤＬＲＤＲＧＴＧＫＨＳＲＮＡ
ＧＦＬＰＬＮＰＦＡＳＳＰＶＰＳＬＳＰＫＶＳＫＩＳＤＲＡＬＩＳＤＩＴＫＫＴＰＦＫＮ
ＰＳＱＰＬＮＶＦＮＫＫＴＴＴＫＴＶＴＫＫＰＴＰＶＫＴＡＰＫＬＡＥＬＰＡＴＫＰＱＥ
ＴＶＬＲＥＮＫＴＰＦＩＥＫＱＡＥＴＮＫＱＳＩＮＭＰＳＬＰＶＩＱＫＥＡＴＥＳＤＫＥ
ＥＭＫＰＱＴＥＥＫＭＶＥＥＳＥＳＡＮＮＡＮＧＫＮＲＳＡＧＩＥＥＧＫＬＩＡＫＳＡＥ
ＤＥＫＡＫＥＥＰＧＮＨＴＴＬＩＬＡＭＬＡＩＧＶＦＳＬＧＡＦＩＫＩＩＱＬＲＫＮＮ（
配列番号：５）。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：５から成る。この
配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によっ
て分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から分割される。一実施形態では、ＡｃｔＡポリ
ペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列番号：５のＡＡ１～２９を含む。
別の実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列
番号：５のＡＡ１～２９を含まない。
別の実施形態では、本明細書に開示される切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする組み換
え型ヌクレオチドは、配列番号：６に示される配列を含む
Ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａ
ｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇ
ｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａ
ａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａ
ｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａ
ａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａ
ｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇ
ｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａ
ｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａ
ｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇ
ａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃ
ａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔ
ａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔ
ｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔ
ｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａ
ａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａ
ａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａ
ｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇ
ｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇ
ｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａ
ｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔ
ｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔ
ｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔ
ｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔ
ａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａ
ｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃ
ｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇ
ａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔ
ｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇ
ｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：６）。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは
配列番号：６に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、
ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：７に示される配列を含む
Ｍ Ｇ Ｌ Ｎ Ｒ Ｆ Ｍ Ｒ Ａ Ｍ Ｍ Ｖ Ｖ Ｆ Ｉ
Ｔ Ａ Ｎ Ｃ Ｉ Ｔ Ｉ Ｎ Ｐ Ｄ Ｉ Ｉ Ｆ Ａ
Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ Ｅ
Ｗ Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ Ｖ
Ｎ Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ Ｓ Ｓ
Ｒ Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ Ｋ
Ｎ Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ Ａ
Ｋ Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｇ Ｅ
Ｑ Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ Ｇ
Ｖ Ｄ Ｒ Ｐ Ｔ Ｌ Ｑ Ｖ Ｅ Ｒ Ｒ Ｈ Ｐ
Ｇ Ｌ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ａ Ａ Ｅ Ｉ Ｋ Ｋ Ｒ Ｒ
Ｋ Ａ Ｉ Ａ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｓ Ｌ
Ｔ Ｙ Ｐ Ｄ Ｋ Ｐ Ｔ Ｋ Ａ Ｎ Ｋ Ｒ Ｋ
Ｖ Ａ Ｋ Ｅ Ｓ Ｖ Ｖ Ｄ Ａ Ｓ Ｅ Ｓ Ｄ Ｌ
Ｄ Ｓ Ｓ Ｍ Ｑ Ｓ Ａ Ｄ Ｅ Ｓ Ｔ Ｐ Ｑ
Ｐ Ｌ Ｋ Ａ Ｎ Ｑ Ｋ Ｐ Ｆ Ｆ Ｐ Ｋ Ｖ
Ｆ Ｋ Ｋ Ｉ Ｋ Ｄ Ａ Ｇ Ｋ Ｗ Ｖ Ｒ Ｄ Ｋ
Ｉ Ｄ Ｅ Ｎ Ｐ Ｅ Ｖ Ｋ Ｋ Ａ Ｉ Ｖ Ｄ
Ｋ Ｓ Ａ Ｇ Ｌ Ｉ Ｄ Ｑ Ｌ Ｌ Ｔ Ｋ Ｋ
Ｋ Ｓ Ｅ Ｅ Ｖ Ｎ Ａ Ｓ Ｄ Ｆ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ
Ｔ Ｄ Ｅ Ｅ Ｌ Ｒ Ｌ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ｔ Ｐ
Ｍ Ｌ Ｌ Ｇ Ｆ Ｎ Ａ Ｐ Ｔ Ｐ Ｓ Ｅ Ｐ
Ｓ Ｓ Ｆ Ｅ Ｆ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｄ Ｅ Ｅ Ｌ
Ｒ Ｌ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ｔ Ｐ Ｍ Ｌ Ｌ Ｇ Ｆ
Ｎ Ａ Ｐ Ａ Ｔ Ｓ Ｅ Ｐ Ｓ Ｓ Ｆ Ｅ Ｆ
Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｅ Ｄ Ｅ Ｌ Ｅ Ｉ Ｍ Ｒ Ｅ
Ｔ Ａ Ｐ Ｓ Ｌ Ｄ Ｓ Ｓ Ｆ Ｔ Ｓ Ｇ Ｄ
Ｌ Ａ Ｓ Ｌ Ｒ Ｓ Ａ Ｉ Ｎ Ｒ Ｈ Ｓ Ｅ
Ｎ Ｆ Ｓ Ｄ Ｆ Ｐ Ｐ Ｉ Ｐ Ｔ Ｅ Ｅ Ｅ Ｌ
Ｎ Ｇ Ｒ Ｇ Ｇ Ｒ Ｐ Ｔ Ｓ Ｅ Ｅ Ｆ Ｓ
Ｓ Ｌ Ｎ Ｓ Ｇ Ｄ Ｆ Ｔ Ｄ Ｄ Ｅ Ｎ Ｓ
Ｅ Ｔ Ｔ Ｅ Ｅ Ｅ Ｉ Ｄ Ｒ Ｌ Ａ Ｄ Ｌ Ｒ
Ｄ Ｒ Ｇ Ｔ Ｇ Ｋ Ｈ Ｓ Ｒ Ｎ Ａ Ｇ Ｆ
Ｌ Ｐ Ｌ Ｎ Ｐ Ｆ Ｉ Ｓ Ｓ Ｐ Ｖ Ｐ Ｓ
Ｌ Ｔ Ｐ Ｋ Ｖ Ｐ Ｋ Ｉ Ｓ Ａ Ｐ Ａ Ｌ Ｉ
Ｓ Ｄ Ｉ Ｔ Ｋ Ｋ Ａ Ｐ Ｆ Ｋ Ｎ Ｐ Ｓ
Ｑ Ｐ Ｌ Ｎ Ｖ Ｆ Ｎ Ｋ Ｋ Ｔ Ｔ Ｔ Ｋ
Ｔ Ｖ Ｔ Ｋ Ｋ Ｐ Ｔ Ｐ Ｖ Ｋ Ｔ Ａ Ｐ Ｋ
Ｌ Ａ Ｅ Ｌ Ｐ Ａ Ｔ Ｋ Ｐ Ｑ Ｅ Ｔ Ｖ
Ｌ Ｒ Ｅ Ｎ Ｋ Ｔ Ｐ Ｆ Ｉ Ｅ Ｋ Ｑ Ａ
Ｅ Ｔ Ｎ Ｋ Ｑ Ｓ Ｉ Ｎ Ｍ Ｐ Ｓ Ｌ Ｐ Ｖ
Ｉ Ｑ Ｋ Ｅ Ａ Ｔ Ｅ Ｓ Ｄ Ｋ Ｅ Ｅ Ｍ
Ｋ Ｐ Ｑ Ｔ Ｅ Ｅ Ｋ Ｍ Ｖ Ｅ Ｅ Ｓ Ｅ
Ｓ Ａ Ｎ Ｎ Ａ Ｎ Ｇ Ｋ Ｎ Ｒ Ｓ Ａ Ｇ Ｉ
Ｅ Ｅ Ｇ Ｋ Ｌ Ｉ Ａ Ｋ Ｓ Ａ Ｅ Ｄ Ｅ
Ｋ Ａ Ｋ Ｅ Ｅ Ｐ Ｇ Ｎ Ｈ Ｔ Ｔ Ｌ Ｉ
Ｌ Ａ Ｍ Ｌ Ａ Ｉ Ｇ Ｖ Ｆ Ｓ Ｌ Ｇ Ａ Ｆ
Ｉ Ｋ Ｉ Ｉ Ｑ Ｌ Ｒ Ｋ Ｎ Ｎ （配列番号：７）
。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌
によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から分割される。
一実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、配列番号：
７のＡＡ１～２９を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、
シグナル配列、配列番号：７のＡＡ１～２９を含まない。一実施形態では、切断ＡｃｔＡ
タンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡ
タンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：８に示される配列を含む
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥ
ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫ
ＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰ
ＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤ
ＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡ
ＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧ
ＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧ
ＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡ
ＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬ
ＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号：８）。別
の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８に示される配列を含む。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：９に示される配列を含む Ｍ
ＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤ
ＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶ
ＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧ（配列番号：９）。
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片であ
る。
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１０に示される配列を含む
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥ
ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫ
ＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰ
ＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤ
ＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡ
ＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧ
ＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧ
ＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡ
ＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬ
ＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ （配列番号：１０）
。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１１に示される配列を含む
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ
ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥ
ＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫ
ＥＫＡＥＫＧ（配列番号：１１）。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１２に示される配列を含む
Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ Ｅ
Ｗ Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ Ｖ Ｎ
Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ Ｓ Ｓ
Ｒ Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ Ｋ
Ｎ Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ Ａ Ｋ
Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｇ Ｅ
Ｑ Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ Ｇ （
配列番号：１２）。別の実施形態では、配列番号：１２に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔ
Ａ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全
長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１２は、
最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では
、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。別の実
施形態では、配列番号：１２は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸１２２までを
含む。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１３に示される配列を含む
Ｍ Ｒ Ａ Ｍ Ｍ Ｖ Ｖ Ｆ Ｉ Ｔ Ａ Ｎ Ｃ Ｉ Ｔ Ｉ Ｎ Ｐ Ｄ Ｉ
Ｉ Ｆ Ａ Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ
Ｅ Ｗ Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ
Ｖ Ｎ Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ
Ｓ Ｓ Ｒ Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ
Ｋ Ｎ Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ
Ａ Ｋ Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ
Ｇ Ｅ Ｑ Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ
Ｇ Ｖ Ｄ Ｒ Ｐ Ｔ Ｌ Ｑ Ｖ （配列番号：１３）。別の実施形態では、配
列番号：１２に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態
では、切断ＡｃｔＡは、最初の１個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１３０までを含
む。別の実施形態では、配列番号：１３は、最初の１個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミ
ノ酸１３０までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の１個から配列番号：
７のアミノ酸１３０までを含む。別の実施形態では、配列番号：１３は、最初の３０個か
ら配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１４に示される配列を含む
Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ Ｅ
Ｗ Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ Ｖ Ｎ
Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ Ｓ Ｓ
Ｒ Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ Ｋ
Ｎ Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ Ａ Ｋ
Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｇ Ｅ
Ｑ Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ Ｇ
Ｖ Ｄ Ｒ Ｐ Ｔ Ｌ Ｑ Ｖ （配列番号：１４）。別の実施形態では、配列番号：
１４に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態では、切
断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２２までを含む。別
の実施形態では、配列番号：１４は、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸
１２２までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から配列番号：７
のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１４は、最初の３０個から
配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５に示される配列を含む
Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ Ｅ
Ｗ Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ Ｖ Ｎ
Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ Ｓ Ｓ
Ｒ Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ Ｋ
Ｎ Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ Ａ Ｋ
Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｇ Ｅ
Ｑ Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ Ｇ
Ｖ Ｄ Ｒ Ｐ Ｔ Ｌ Ｑ Ｖ Ｅ Ｒ Ｒ Ｈ Ｐ Ｇ
Ｌ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ａ Ａ Ｅ Ｉ Ｋ Ｋ Ｒ Ｒ
Ｋ Ａ Ｉ Ａ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｓ Ｌ
Ｔ Ｙ Ｐ Ｄ Ｋ Ｐ Ｔ Ｋ Ａ Ｎ Ｋ Ｒ Ｋ Ｖ
Ａ Ｋ Ｅ Ｓ Ｖ Ｖ Ｄ Ａ Ｓ Ｅ Ｓ Ｄ Ｌ
Ｄ Ｓ Ｓ Ｍ Ｑ Ｓ Ａ Ｄ Ｅ Ｓ Ｔ Ｐ Ｑ
Ｐ Ｌ Ｋ Ａ Ｎ Ｑ Ｋ Ｐ Ｆ Ｆ Ｐ Ｋ Ｖ Ｆ
Ｋ Ｋ Ｉ Ｋ Ｄ Ａ Ｇ Ｋ Ｗ Ｖ Ｒ Ｄ Ｋ
（配列番号：１５）。別の実施形態では、配列番号：１５に示される切断ＡｃｔＡはＡｃ
ｔＡ／ＰＥＳＴ２と呼ばれる。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、完全長のＡｃｔＡ配
列のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では、配列番号：１５は
、完全長のＡｃｔＡ配列のおよそアミノ酸３０からおよそアミノ酸２２９までを含む。別
の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、配列番号：７のおよそアミノ酸３０からおよそアミノ
酸２２９までを含む。別の実施形態では、配列番号：１５は、配列番号：７のアミノ酸３
０からアミノ酸２２９までを含む。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１６に示される配列を含む
Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ Ｅ
Ｗ Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ Ｖ Ｎ
Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ Ｓ Ｓ
Ｒ Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ Ｋ
Ｎ Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ Ａ Ｋ
Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｇ Ｅ
Ｑ Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ Ｇ
Ｖ Ｄ Ｒ Ｐ Ｔ Ｌ Ｑ Ｖ Ｅ Ｒ Ｒ Ｈ Ｐ Ｇ
Ｌ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ａ Ａ Ｅ Ｉ Ｋ Ｋ Ｒ Ｒ
Ｋ Ａ Ｉ Ａ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｓ Ｌ
Ｔ Ｙ Ｐ Ｄ Ｋ Ｐ Ｔ Ｋ Ａ Ｎ Ｋ Ｒ Ｋ Ｖ
Ａ Ｋ Ｅ Ｓ Ｖ Ｖ Ｄ Ａ Ｓ Ｅ Ｓ Ｄ Ｌ
Ｄ Ｓ Ｓ Ｍ Ｑ Ｓ Ａ Ｄ Ｅ Ｓ Ｔ Ｐ Ｑ
Ｐ Ｌ Ｋ Ａ Ｎ Ｑ Ｋ Ｐ Ｆ Ｆ Ｐ Ｋ Ｖ Ｆ
Ｋ Ｋ Ｉ Ｋ Ｄ Ａ Ｇ Ｋ Ｗ Ｖ Ｒ Ｄ Ｋ
Ｉ Ｄ Ｅ Ｎ Ｐ Ｅ Ｖ Ｋ Ｋ Ａ Ｉ Ｖ Ｄ
Ｋ Ｓ Ａ Ｇ Ｌ Ｉ Ｄ Ｑ Ｌ Ｌ Ｔ Ｋ Ｋ Ｋ
Ｓ Ｅ Ｅ Ｖ Ｎ Ａ Ｓ Ｄ Ｆ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ
Ｔ Ｄ Ｅ Ｅ Ｌ Ｒ Ｌ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ｔ Ｐ
Ｍ Ｌ Ｌ Ｇ Ｆ Ｎ Ａ Ｐ Ｔ Ｐ Ｓ Ｅ Ｐ Ｓ
Ｓ Ｆ Ｅ Ｆ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｄ Ｅ Ｅ Ｌ
Ｒ Ｌ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ｔ Ｐ Ｍ Ｌ Ｌ Ｇ Ｆ
Ｎ Ａ Ｐ Ａ Ｔ Ｓ Ｅ Ｐ Ｓ Ｓ （配列番号：１６）。別
の実施形態では、配列番号：１６に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ば
れる。別の実施形態では、この切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列
のアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１６は、最初の３０個から
完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは
、およそ最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では
、配列番号：１６は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３３２までを含む。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７に示される配列を含む
Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ Ｅ
Ｗ Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ Ｖ Ｎ
Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ Ｓ Ｓ
Ｒ Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ Ｋ
Ｎ Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ Ａ Ｋ
Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｇ Ｅ
Ｑ Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ Ｇ
Ｖ Ｄ Ｒ Ｐ Ｔ Ｌ Ｑ Ｖ Ｅ Ｒ Ｒ Ｈ Ｐ Ｇ
Ｌ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ａ Ａ Ｅ Ｉ Ｋ Ｋ Ｒ Ｒ
Ｋ Ａ Ｉ Ａ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｓ Ｌ
Ｔ Ｙ Ｐ Ｄ Ｋ Ｐ Ｔ Ｋ Ａ Ｎ Ｋ Ｒ Ｋ Ｖ
Ａ Ｋ Ｅ Ｓ Ｖ Ｖ Ｄ Ａ Ｓ Ｅ Ｓ Ｄ Ｌ
Ｄ Ｓ Ｓ Ｍ Ｑ Ｓ Ａ Ｄ Ｅ Ｓ Ｔ Ｐ Ｑ
Ｐ Ｌ Ｋ Ａ Ｎ Ｑ Ｋ Ｐ Ｆ Ｆ Ｐ Ｋ Ｖ Ｆ
Ｋ Ｋ Ｉ Ｋ Ｄ Ａ Ｇ Ｋ Ｗ Ｖ Ｒ Ｄ Ｋ
Ｉ Ｄ Ｅ Ｎ Ｐ Ｅ Ｖ Ｋ Ｋ Ａ Ｉ Ｖ Ｄ
Ｋ Ｓ Ａ Ｇ Ｌ Ｉ Ｄ Ｑ Ｌ Ｌ Ｔ Ｋ Ｋ Ｋ
Ｓ Ｅ Ｅ Ｖ Ｎ Ａ Ｓ Ｄ Ｆ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ
Ｔ Ｄ Ｅ Ｅ Ｌ Ｒ Ｌ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ｔ Ｐ
Ｍ Ｌ Ｌ Ｇ Ｆ Ｎ Ａ Ｐ Ｔ Ｐ Ｓ Ｅ Ｐ Ｓ
Ｓ Ｆ Ｅ Ｆ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｄ Ｅ Ｅ Ｌ
Ｒ Ｌ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ｔ Ｐ Ｍ Ｌ Ｌ Ｇ Ｆ
Ｎ Ａ Ｐ Ａ Ｔ Ｓ Ｅ Ｐ Ｓ Ｓ Ｆ Ｅ Ｆ Ｐ
Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｅ Ｄ Ｅ Ｌ Ｅ Ｉ Ｍ Ｒ Ｅ
Ｔ Ａ Ｐ Ｓ Ｌ Ｄ Ｓ Ｓ Ｆ Ｔ Ｓ Ｇ Ｄ
Ｌ Ａ Ｓ Ｌ Ｒ Ｓ Ａ Ｉ Ｎ Ｒ Ｈ Ｓ Ｅ Ｎ
Ｆ Ｓ Ｄ Ｆ Ｐ Ｌ Ｉ Ｐ Ｔ Ｅ Ｅ Ｅ Ｌ
Ｎ Ｇ Ｒ Ｇ Ｇ Ｒ Ｐ Ｔ Ｓ Ｅ （配列番号：１７）。
別の実施形態では、配列番号：１７に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼
ばれる。別の実施形態では、この切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配
列のアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では、配列番号：２５は、最初の３０個か
ら完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡ
は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では、配
列番号：１７は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３９９までを含む。
別の実施形態では、本明細書に開示された切断ＡｃｔＡ配列はＮ末端においてｈｌｙシ
グナルペプチドにさらに融合される。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは配列番号：１８
を含むｈｌｙシグナルペプチドに融合される
Ｍ Ｋ Ｋ Ｉ Ｍ Ｌ Ｖ Ｆ Ｉ Ｔ Ｌ Ｉ Ｌ
Ｖ Ｓ Ｌ Ｐ Ｉ Ａ Ｑ Ｑ Ｔ Ｅ Ａ Ｓ Ｒ Ａ
Ｔ Ｄ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ｓ Ｌ Ｎ Ｔ Ｄ Ｅ Ｗ
Ｅ Ｅ Ｅ Ｋ Ｔ Ｅ Ｅ Ｑ Ｐ Ｓ Ｅ Ｖ Ｎ
Ｔ Ｇ Ｐ Ｒ Ｙ Ｅ Ｔ Ａ Ｒ Ｅ Ｖ Ｓ Ｓ Ｒ
Ｄ Ｉ Ｅ Ｅ Ｌ Ｅ Ｋ Ｓ Ｎ Ｋ Ｖ Ｋ Ｎ
Ｔ Ｎ Ｋ Ａ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ Ｍ Ｌ Ｋ Ａ Ｋ
Ａ Ｅ Ｋ Ｇ Ｐ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｇ Ｅ Ｑ
Ｔ Ｇ Ｎ Ｖ Ａ Ｉ Ｎ Ｅ Ｅ Ａ Ｓ Ｇ Ｖ
Ｄ Ｒ Ｐ Ｔ Ｌ Ｑ Ｖ Ｅ Ｒ Ｒ Ｈ Ｐ Ｇ
Ｌ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ａ Ａ Ｅ Ｉ Ｋ Ｋ Ｒ Ｒ Ｋ
Ａ Ｉ Ａ Ｓ Ｓ Ｄ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｓ Ｌ Ｔ Ｙ
Ｐ Ｄ Ｋ Ｐ Ｔ Ｋ Ａ Ｎ Ｋ Ｒ Ｋ Ｖ Ａ Ｋ
Ｅ Ｓ Ｖ Ｖ Ｄ Ａ Ｓ Ｅ Ｓ Ｄ Ｌ Ｄ Ｓ
Ｓ Ｍ Ｑ Ｓ Ａ Ｄ Ｅ Ｓ Ｔ Ｐ Ｑ Ｐ Ｌ
Ｋ Ａ Ｎ Ｑ Ｋ Ｐ Ｆ Ｆ Ｐ Ｋ Ｖ Ｆ Ｋ Ｋ
Ｉ Ｋ Ｄ Ａ Ｇ Ｋ Ｗ Ｖ Ｒ Ｄ Ｋ． 別の実施形
態では、配列番号：１８に示される切断ＡｃｔＡは「ＬＡ２２９」と呼ばれる。
別の実施形態では、ｈｌｙシグナルペプチドに融合された切断ＡｃｔＡは、配列番号：
１９を含む配列によってコードされるＡｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔ
ｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａ
ａｃｔｇａａｇｃａｔｃｔａｇａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｃａｇｔｃ
ｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａ
ｇｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａ
ｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔｇａｇｇａａｃｔａｇａａａａａｔ
ｃｇａａｔａａａｇｔｇａａａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃ
ａａｔｇｔｔｇａａａｇｃａａａａｇｃａｇａｇａａａｇｇｔｃｃｇａａｔａａｃａａｔ
ａａｔａａｃａａｃｇｇｔｇａｇｃａａａｃａｇｇａａａｔｇｔｇｇｃｔａｔａａａｔｇ
ａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｔｃｇａｃｃｇａｃｃａａｃｔｃｔｇｃａａｇｔｇｇａ
ｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａ
ａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａａａｇｃｃａｔａｇｃｇｔｃｇｔｃｇｇａｔａｇｔｇ
ａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃａｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｃ
ａａａｔａａｇａｇａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｔｇｇａｔｇｃｔ
ｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｃｇ
ａｇｔｃｔａｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｔｃａａａａａｃｃａｔｔ
ｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａ
ｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａ （配列番号：１９）。別の実施形態では、配列番号：
１９は、ＸｂａＩに対して特有の制限酵素部位を作製するために使用されるリンカー領域
（太字、斜字体のテキストを参照のこと）をコードする配列を含み、これによりシグナル
配列の後に異なるポリペプチド、異種抗原等をクローンすることができる。よって、リン
カー領域がシグナルペプチド分割する前にシグナルペプチダーゼが配列上で作用すること
が当業者によって理解されるであろう。
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする組み換え型ヌクレオチドは、
配列番号：２０に示される配列を含む
ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａ
ｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇ
ｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａ
ａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａ
ｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａ
ａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａ
ｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇ
ｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａ
ｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａ
ｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇ
ａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃ
ａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔ
ａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔ
ｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔ
ｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａ
ａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａ
ａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａ
ｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇ
ｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇ
ｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａ
ｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔ
ｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔ
ｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔ
ｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔ
ａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａ
ｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃ
ｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇ
ａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔ
ｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇ
ｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：２０）。
別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：１８に示される配列を有する
。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードす
る他の配列を含む。
別の実施形態では、「切断ＡｃｔＡ」、「Ｎ末端ＡｃｔＡ」、または「ΔＡｃｔＡ」と
いう用語は、本明細書で交換可能に使用され、ＰＥＳＴドメインを含むＡｃｔＡの断片を
指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＡｃｔＡ断片を指す。別の
実施形態では、この用語はＡｃｔＡタンパク質の免疫原性断片を指す。別の実施形態では
、この用語は、本明細書に開示される配列番号：８～１８によってコードされる切断Ａｃ
ｔＡ断片を指す。
一実施形態では、本発明の方法および組成物のＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は配列番
号：８～１８から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡシ
グナルペプチドを含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８～１８から選択
される配列からほぼ構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８～１８
から選択される配列から本質的に構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番
号：８～１８から選択される配列に対応する。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番
号：８～１８から選択される配列と相同である。
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ ＡＡ配列であ
る。ＰＥＳＴ ＡＡ配列は、当該技術分野で既知の他のＰＥＳＴ配列であってもよい。
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡタンパク質のおよそ最初の１００ ＡＡか
ら構成される。
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～２５から構成される。別の実施形態
では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～２９から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ
断片はおよそ残基１～５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残
基１～７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～１００か
ら構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～１２５から構成される
。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～１５０から構成される。別の実施形
態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～１７５から構成される。別の実施形態では、Ａｃ
ｔＡ断片はおよそ残基１～２００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はお
よそ残基１～２２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～
２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～２７５から構
成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～３００から構成される。別
の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～３２５から構成される。別の実施形態で
は、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～３３８から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ
断片はおよそ残基１～３５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ
残基１～３７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～４０
０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～４５０から構成さ
れる。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～５００から構成される。別の実
施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～５５０から構成される。別の実施形態では、
ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～６００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片
はおよそ残基１～６３９から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基
３０～１００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～１２
５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～１５０から構成
される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～１７５から構成される。別
の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～２００から構成される。別の実施形態
では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～２２５から構成される。別の実施形態では、Ａｃ
ｔＡ断片はおよそ残基３０～２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は
およそ残基３０～２７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基
３０～３００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～３２
５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～３３８から構成
される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～３５０から構成される。別
の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～３７５から構成される。別の実施形態
では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～４００から構成される。別の実施形態では、Ａｃ
ｔＡ断片はおよそ残基３０～４５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は
およそ残基３０～５００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基
３０～５５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１～６００
から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０～６０４から構成さ
れる。
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同Ａｃｔ
Ａタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号
と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が本明細書で利
用されるＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節
することができる。他のＡｃｔＡ断片が当該技術分野で既知である。
別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ配列（例えば、配列番号：５、７～１８
のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同Ａ
ｃｔＡは、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを
指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性
が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のう
ちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列
番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施
形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が８２％より高
いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対す
る同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～
１８のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同
は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。
別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が８８
％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１
つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：
５、７～１８のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態で
は、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が９３％より高いこと
を指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一
性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８の
うちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配
列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実
施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対する同一性が９８％より
高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７～１８のうちの１つに対
する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７
～１８のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、本明細書に開示された任意の核
酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中
のヌクレオチドのパーセンテージを指す。
当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対
してコンピューターアルゴリズムによって決定されてもよい。例えば、核酸配列相同性の
コンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用
を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬ
ＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッ
ケージなどである。
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同
一性が６８％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示さ
れた配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態で
は、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７２％より
大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、
同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形
態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別
の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大
きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０
％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一
性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態で
は、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実
施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい
。別の実施形態では、同一性は１００％である。
別の実施形態では、本開示のＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片
は、正確に本明細書に示される配列通りに示される必要はないが、本明細書のどこかに示
されるＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質の機能的な特徴を保持する他の改変、修飾、また
は変更を行うことができる。別の実施形態では、本開示はＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタ
ンパク質、またはその断片の類似体を利用する。別の実施形態では、保存ＡＡ配列の差異
によって、または配列に影響しない修飾によって、または両方によって、類似体は自然発
生したタンパク質またはペプチドとは異なる。
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介し決定され
、その方法は当業者によりよく記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ
Ｓ． Ｊ．， Ｅｄｓ．（１９８５）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００
１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．； ａｎｄ Ａ
ｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙを参照）
。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードす
るＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。
例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０～２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１
５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬ
の変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを
避ける能力を有する。
一実施形態では、異種抗原またはその抗原性部分をコードする核酸配列は、リステリア
染色体内にフレーム内で統合される。別の実施形態では、異種抗原をコードする統合核酸
配列は、ＡｃｔＡを持つフレーム内のＡｃｔＡ遺伝子座にて統合される。別の実施形態で
は、ＡｃｔＡをコードする染色体の核酸は、抗原をコードする配列を含む核酸分子によっ
て置き換えられる。別の実施形態では、抗原は本明細書に開示されており、かつ当該技術
分野で既知の任意の抗原である。
一実施形態では、本明細書に開示される第２の核酸分子または構築体は代謝酵素をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え
型リステリア株の染色体内で突然変異した内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、
代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性遺伝子を相補する。別
の実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニ
ン・ラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態では、オープンリーディングフレー
ムによってコードされる代謝酵素はＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）であ
る。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリア株は内因性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝
子内の突然変異を含む。別の実施形態では、リステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いて
いる。
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節性配
列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本開示の方法および組成物のオープンリ
ーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形
態では、本明細書に開示されるオープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調
節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本明細書に開示されるオープンリ
ーディングフレームの各々の発現は単一のプロモーター／調節性配列から駆動される。
一実施形態では、ｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列は、本明細書に開示さ
れるキメラタンパク質の発現を駆動するように動作可能にリンクする。別の実施形態では
、ａｃｔＡプロモーターおよびａｃｔＡシグナル配列は本明細書に記述されるキメラタン
パク質の発現を駆動するように動作可能にリンクする。
「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別
の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求され
る酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成
に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要
求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合
成のために要求される。
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ ｄａｌ（－）ｄａｔ（－）（Ｌｍｄｄ）である。
別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ ｄａｌ（－）ｄａｔ（－）ΔａｃｔＡ（Ｌｍｄｄ
Ａ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病毒性遺伝子
ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロで、ｄａｌ遺伝子
の相補によってプラスミドの発現を保持する。
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍ
ΔａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔｐｒｆＡである。別の実施形態
では、弱毒化株はＬｍΔｐｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔｐｌｃＡ
である。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体であ
る。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強
いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボ
ーンから作られる。別の実施形態では、本開示で使用される株はゲノムの溶血性ＬＬＯを
発現するリステリア株である。
別の実施形態では、リステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では
、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態
では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
一実施形態では、リステリア株はアミノ酸（ＡＡ）代謝酵素が欠損している。一実施形
態では、Ｄ－アラニンを欠損したリステリアの栄養要求性株の生成は、例えば、欠失突然
変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる
突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与え
る調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実
施形態では、組み換え型ＤＮＡ技法を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射、
およびそれに続く突然変異体の選択を使用する従来の突然変異生成技術を使用して突然変
異生成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰をともなう
可能性が低いため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプ
ロトコルに従って生成されるＤ－アラニンの変異体は、単純な実験室の培養アッセイでＤ
－アラニンの非存在下で成長する能力を試験される場合がある。別の実施形態では、この
化合物の非存在下で成長することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
別の実施形態では、本明細書に開示されるとおり、リステリアの突然変異生成のための
標的として上述のＤ－アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他
の遺伝子が使用されてもよい。
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型細菌株の染色体の残りのものに欠けている
内在性代謝遺伝子を相補する。一実施形態では、内在性代謝遺伝子は、染色体内で突然変
異する。別の実施形態では、内在性代謝遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態で
は、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は組み換え型リス
テリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態で
は、代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はＤ－ア
ミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
一実施形態では、栄養要求性リステリア株は、栄養要求性リステリア株の栄養要求性を
相補する代謝酵素を含むエピソームの発現ベクターを含む。別の実施形態では、構成物は
エピソームの様式でリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原またはペ
プチドは組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、
エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。別の実施形態では、リ
ステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リス
テリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝
子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別
の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が欠損し
ている。ＣｙｓＫ。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２に依存しないメチオニン
シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺
伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では
、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態
では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施
形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の
実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
別の実施形態では、リステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態で
は、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。
別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。
別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦであ
る。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施
形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の
実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型
サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤ
である。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトラ
ンスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実
施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別
の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン－ＩＩＩＣ－メチルトランスフェラーゼ／ウ
ロポルフィリノゲン－ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱで
ある。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕ
Ｂである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖ
ａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子は
ｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝
子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実
施形態では、遺伝子は３－デオキシ－７－ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実
施形態では、遺伝子はインドール－３－グリセロール－リン酸シンターゼである。別の実
施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ
構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝
子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホ
スホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態で
は、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール－スクシノカルボキサミドシンターゼで
ある。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒ
Ａである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍ
ｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子
はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺
伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では
、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態
では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンター
ゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔ
ｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子
はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ－２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ－２
、等々）である。
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡで
ある。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏ
Ｄである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では
、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態で
は、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の
実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。
別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形
態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体であ
る。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は
ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫
酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体で
ある。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝
子は蟻酸塩／亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレ
シンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の
実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミン
ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はメジャーファシリテイターファミリー
輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ－プロリンＡＢＣ輸送
体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態で
は、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ
輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態で
は、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ
輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態
では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／
マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡ
ファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のう
ちの１つのサブユニットである。
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換する
ために使用される核酸分子が本明細書に開示されている。別の実施形態では、リステリア
を形質転換するために使用される本明細書に開示される核酸は病毒性遺伝子を欠いている
。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性
遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変
異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺
伝子を不活性化するために使用される。また別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ａｃｔ
Ａ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子
、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み
換え型リステリア内で、病毒性と関連付けられる当該技術分野で既知の任意の遺伝子とす
ることができることが当業者によって理解されるべきである。
また別の実施形態では、リステリア株は、ｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、
ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ａｃｔＡ突然変異体、
ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの
両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の
個別または組合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示さ
れたリステリアは、各々遺伝子のうちの１つを欠いている。別の実施形態では、本明細書
に開示されたリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本
明細書に開示されたいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１個かつ最高１０個を欠いてい
る。別の実施形態では、ｐｒｆＡ突然変異体はＤ１３３Ｖ ＰｒｆＡ突然変異体である。
一実施形態では、弱毒化生リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態
では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異
または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子
およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リ
ステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／ま
たはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによ
って、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予
想外に高いレベルの弱毒化が得られる。
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体で欠けてい
る。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子等は、リステリア株のゲノムを欠いて
いる。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、
病毒性遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で
不活性化される。
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は弱毒化されている。
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の
実施形態では、組み換え型リステリアは、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施
形態では、組み換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組
み換え型リステリアはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態
では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化
突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内
因性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示され
た組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施
形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌ
Ｂ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え
型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の
実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌ
ＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示
された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活
性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株
は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施
形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄ
ａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一
遺伝子または遺伝子の組み合わせの不活性化突然変異を含む。一実施形態では、「欠いて
いる」という用語は、ゲノム病毒性遺伝子に関連するとき、病毒性遺伝子が欠失した（部
分的もしくは全体的な欠失）、または別の方法で染色体から機能的に発現されていないこ
とを意味する。かかる用語は、染色体内の病毒性遺伝子の部分的な欠失または遺伝子全体
の欠失も包含する場合がある。
「突然変異」という用語およびその文法的な同等物は、配列（核酸またはアミノ酸配列
）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、これにはアミノ酸欠失突然変異、
置換、置き換え、切断、不活性化、妨害、または転座を含むことを当業者は理解するであ
ろう。突然変異のこれらのタイプは当該技術分野でよく知られている。
一実施形態では、本明細書に開示された代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプ
ラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ
酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態では
、Ｄ－グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ－グルタミン酸合成のための遺
伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ－グルタミン酸無
しで増殖することになり、一方でＤ－グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質
転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現して
いない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ－アラニン合成
のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ－アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素
をコードする孤立核酸を含む場合、本開示のプラスミドを形質転換し、かつ発現するとき
Ｄ－アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビ
タミン、抗生物質、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地
を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（Ｂｅｃ
ｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ）
。
別の実施形態では、本開示のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、こ
の細菌は適切な培地上で選択圧の存在下で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有
しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現する
プラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラ
スミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミ
ドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リス
テリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されることを
当業者は理解するであろう。
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、本明細書に開示さ
れたキメラタンパク質を発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株はキメラ
タンパク質をコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組
み換え型核酸は、本明細書に開示された組み換え型リステリア株のプラスミド中にある。
別の実施形態では、プラスミドは、組み換え型リステリア株の染色体の中へと統合されな
いエピソーム性プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはマルチコピープラス
ミドである。別の実施形態では、プラスミドはリステリア株の染色体の中へと組み込まれ
る組み込みプラスミドである。
一実施形態では、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、腫瘍関連１ペプチ
ドをコードする核酸分子を含む。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株
は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列ととも
に動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方
法および組成物の組み換え型リステリア株は、アミノ末端上でユビキチンタンパク質に融
合されるペプチド抗原を含むキメラタンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性
の発現ベクターを含む。一実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプ
ロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（切断Ａｃｔ
ＡまたはｔＡｃｔＡ）の１～２３３アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態で
は、ペプチド抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配
列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１～１００ア
ミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は
、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ
（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１～３００アミノ酸への融合として発現される。別
の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，
２３８号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０
のアミノ酸から成る。別の実施形態では、米国特許公開第２０１４／０１８６３８７号に
記述されるように、切断ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ－Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ－
Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフを欠失しており、非保存的な
ＱＤＮＫＲ置換を含有する。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株
は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＬＬＯ配列とともに
動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法
および組成物の組み換え型リステリア株は、アミノ末端上でユビキチンタンパク質に融合
されるペプチド抗原を含むキメラタンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の
発現ベクターを含む。一実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ＬＬＯプロモ
ーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり、またこれはＬＬＯ（切断ＬＬＯまたは
ｔＬＬＯ）の１～５０アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、ペプチド
抗原の発現および分泌は、ＬＬＯプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり
、またこれはＬＬＯ（切断ＬＬＯまたはｔＬＬＯ）の１～１００アミノ酸への融合として
発現される。別の実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ＬＬＯプロモーター
およびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり、またこれはＬＬＯ（切断ＬＬＯまたはｔＬＬ
Ｏ）の１～３００アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、切断ＬＬＯは
、野生型ＬＬＯの最初の４２０アミノ酸から成る。
一実施形態では、無処置の動物、または無関連のリステリアワクチンを注射したマウス
ではＣＴＬ活性は検出されなかった。一方で、別の実施形態では、本明細書に開示される
キメラタンパク質を発現する弱毒化栄養要求性株は、ＩＦＮ－γの分泌を刺激することが
でき、かつ抗腫瘍免疫応答を引き出すことができる。
別の実施形態では、リステリア株は、ペプチド抗原に対する耐性を破壊する能力を有す
る強くかつ抗原特異的な抗腫瘍応答を行使する。
一実施形態では、免疫化したマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、ｄａｌ／ｄ
ａｔ／ａｃｔＡ株は高度に弱毒化され、以前のリステリアワクチン世代より良好な安全性
プロファイルを有する。別の実施形態では、リステリア株は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞（Ｔ
ｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処理した腫瘍
内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、Ｌｍｄ
ｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを
示唆する。
一実施形態では、「ペプチド抗原」という用語は、以下の用語、すなわち「抗原」、「
抗原断片」、「抗原性ペプチド」、または「抗原ペプチド」と交換可能に使用される。「
ペプチド抗原」という用語が、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の状況で抗原提示
細胞（ＡＰＣ）に提示される場合、免疫応答を引き出す能力を有する異種抗原またはその
断片を包含することを当業者は理解するであろう。
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド
相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述さ
れる方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパ
ッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される
。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、また
はＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス－ウォーターマンアルゴ
リズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアライ
ンメントを採用してもよい。
別の実施形態では、本明細書に開示された構築体または核酸分子は相同的組み換えを使
用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。相同的組み換えのための技法は当該技術
分野で周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ Ｓ、Ｂｏ
ｙｌｅ ＳＭ、ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｔ
ｏ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｅｉｔｈｅｒ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｐａｒｔｉａｌ ｌ
ｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ ｏｒ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍ
ａｌ Ｌ７／Ｌ１２ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５， １０
９（１－２）：１１－７）；およびＪｉａｎｇ ＬＬ， Ｓｏｎｇ ＨＨ， ｅｔ ａｌ
．， （Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ Ｌｉｓｔｅｒｉ
ａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｓｉｎ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） ２００５， ３７（１）：１９－２４）。別の実施形態
では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。
この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺
伝子産物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含めることによって、Ｅ７遺伝子
の染色体組み込みによって作成され、Ｌｍ－ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別
の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア
染色体の中へと組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、
とりわけ以下のＳｕｎらの文献 ＤＰ－Ｌ９６７の構造における（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９０， ５８： ３７７０－３７７８）に記載されてい
る。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形
成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置
が未知であるという不利点を有する。
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステ
リアの染色体の中へと組み込まれる（Ｌａｕｅｒ Ｐ，Ｃｈｏｗ ＭＹ ｅｔ ａｌ，Ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ
ｔｗｏ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｈａｇｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２
００２；１８４（１５）：４１７７－８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種
遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃ
ｏｍＫまたはａｒｇ ｔＲＮＡ遺伝子の３‘端）の中へとインサートするために、バクテ
リオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺
伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体ま
たは異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方
法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。別の実施形態では、本開示は、臨床用
途のためのファージベースの染色体組み込み系をさらに含み、ここでｄ－アラニン・ラセ
マーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用する
ことができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（－）ｄａｔ（－）である。別の実施形態では、「ファ
ージキュアリング工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組み込み系を使用する。
別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な
選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本開示は、抗生物質を用いた選択を
必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要
求性宿主株を相補することができる。
本明細書で開示される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「
部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換また
は切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質と
ともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連するタン
パク質は「組み換え型タンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３
：６９９－７０７；１９９３）を参照のこと）。
「ベクター」という用語はプラスミドを包含しうることを当業者は理解するであろう。
別の実施形態では、この用語は、リステリア宿主へと形質転換され、かつリステリアの染
色体内に前記ベクターから成る遺伝子の発現を可能にするようにする様式で組み込まれる
能力を有する組込み型ベクターを指す。別の実施形態では、この用語は、リステリアの染
色体内に統合されないが、その代わりに前記リステリアの細胞質内に存在する非組込み型
ベクターを指す。別の実施形態では、該用語は組込み型ベクターを含むプラスミドを指す
。別の実施形態では、組込み型ベクターは部位特異的な組込み型ベクターである。
本開示および本明細書に開示される方法が装備されたとき、異なる転写プロモーター、
停止剤、キャリアベクター、または特異的な遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベ
クター内のもの）を本発明の方法および組成物内で順調に使用することができることを当
業者は容易に理解するであろう。本発明で意図されるように、これらの機能性は、例えば
、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のベクターで提供される。別の実施形態では、非必
須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）は除去される。別の実施形態では、本発
明で市販のプラスミドが使用される。かかるプラスミドは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ（米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア
州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）など
の様々な供給元から入手可能であり、または当該技術分野で周知の方法を使用して構築す
ることができる。
別の実施形態は、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ
Ｊｏｌｌａ）などのプラスミドであり、これは原核生物の複製起点および原核生物内での
発現を容易にするプロモーター／調節要素を有する原核生物発現ベクターである。別の実
施形態では、外来ヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを減少しかつその中に定置す
ることができるカセットのサイズを増加するために除去される。
かかる方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ ＆
Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記述されている。
抗生物質抵抗性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般的に採用される従来の
選択およびクローニングプロセスで使用される。本開示で企図される抗生物質抵抗性遺伝
子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマ
イシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイ
シン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンおよび当該技術分野で周知の他のものに抵抗を
与える遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。
本開示で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは、本明細書のどこかに記述され、
プロモーター／調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対する複製の起点、融合タ
ンパク質をコードする孤立核酸、および分離されたアミノ酸代謝遺伝子をコードする核酸
などの特徴を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコ
ードする孤立核酸は、かかる孤立核酸の発現を駆動するのに好適なプロモーターを有する
。細菌系で発現を駆動するために有用であるプロモーターは当該技術分野で周知であり、
またバクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター
、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡ
Ｔプロモーターを含む。原核生物プロモーターのさらなる例として、５ バクテリオファ
ージλの主要な右および左のプロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａ
ｃＺ、ｌａｄ、および［２］Ｅ． ｃｏｌｉ［３］のｇａｌプロモーター、αアミラーゼ
（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ， １９８５． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６２：
１７６－１８２）およびＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳ２８特異的プロモーター（Ｇｉｌｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ， １９８４ Ｇｅｎｅ ３２：１１－ ２０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓの
バクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ， １９８２， Ｉｎ： Ｔｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ， Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびストレプトミセスプロモー
ター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ， １９８６， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０
３：４６８－４７８）が挙げられる。本開示において企図される追加的な原核生物プロモ
ーターは、例えば、Ｇｌｉｃｋ（１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７
７－２８２）、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ，（１９８６，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，６８：５０５
－５１６）、およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，（１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１
８：４１５－４４２）で概説されている。本開示で企図されるプロモーター／調節要素の
さらなる実施例としては、リステリアのｐｒｆＡプロモーター、リステリアのｈｌｙプロ
モーター、リステリアのｐ６０プロモーター、およびリステリアのＡｃｔＡプロモーター
（遺伝子銀行受入番号ＮＣ＿００３２１０）またはその断片が挙げられるが、これらに限
定されない。
別の実施形態では、含む部分配列の方法および組成物のプラスミドは分割され、ならび
に適切な部分配列は適切な制限酵素を使用してクローニングされる。別の実施形態では、
次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、抗原をコ
ードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使
用して生産され、その技法は当該技術分野で周知である。
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書で開示されるような
方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞（原核生物細胞
、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む）内で構造的に
または誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファー
ジ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファ
ージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の
発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組込まれた両方の
ファージベースの発現ベクターを包含する。
別の実施形態では、本開示は臨床用途のためのファージベースの染色体組込系をさらに
含む。ｄ－アラニン・ラセマーゼ（しかしこれに限定されない）を含む必須酵素のための
栄養要求性宿主株は、例えばＬｍｄａｌ（－）ｄａｔ（－）を使用されることになる。別
の実施形態では、「ファージ治癒工程」を避けるためにＰＳＡベースのファージ組込系を
使用した（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：４
１７７－４１８６）。別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するために抗
生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本開示は、抗
生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にす
る。別の方法で、栄養要求性宿主株を相補することになる。
別の実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、組み換え型ＤＮＡ法を使用して合成
される。一実施形態では、これは、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を作り出す
ことと、特定のプロモーター／調節要素の制御下で本発明のプラスミドなどの発現カセッ
ト内にＤＮＡを定置することと、タンパク質を発現することと、に関与する。別の実施形
態では、本開示のキメラタンパク質（例えば、ＳＳ－Ｕｂ－ペプチド）をコードするＤＮ
Ａは、任意の好適な方法によって調製され、この方法としては、例えば、適切な配列のク
ローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法（１９７９， Ｍ
ｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８： ９０－９９）、Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル
法（１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ ６８：１０９－１５１）、Ｂｅａｕｃａｇｅ
らのジエチルホスホラミダイト法（１９８１，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１５ １
８５９－１８６２）、および米国特許第４，４５８，０６６号の固定支持法などの方法に
よる直接化学合成が挙げられる。
別の実施形態では、本開示のキメラタンパク質または組み換え型タンパク質をコードす
るＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用してクローニ
ングされる。別の実施形態では、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生産するために化学合成
が使用される。様々な実施形態では、一本鎖をテンプレートとして使用して、相補的な配
列を用いたハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いた重合に
よって、この一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖のＤＮＡへと変換する。ＤＮＡの化学
合成が約１００個の塩基の配列に限られ一方で、より短い配列の連結によってより長い配
列を得ることができることを当業者は認識するであろう。別の実施形態では、部分配列は
クローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。次いで
断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸配列は、大
腸菌、リステリアなどの他の細菌宿主、酵母、および様々なより高度な真核生物細胞（Ｃ
ＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞株、ならびに骨髄腫細胞株などの）を含む様々な宿主細
胞へと形質転換される。本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸配列は
、各々の宿主に対して適切な発現制御配列に動作可能にリンクされる。プロモーター／調
節配列は、本明細書のいずれかに詳細に記述される。別の実施形態では、本明細書に開示
されるキメラタンパク質をコードするプラスミドは、追加的なプロモーター調節要素、な
らびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルをさらに含む。真核生物細胞について
は、対照配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、等
々に由来するプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含む
。別の実施形態では、配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各
々が異なるペプチド抗原を含む、少なくとも１つのキメラタンパク質をコードすることが
できるようにする、少なくとも１つのリボソーム結合部位および少なくとも１つの転写終
止シグナルを含む。一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開
示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む、１つ～４つのキメラタンパク質をコー
ドすることができるようにする、１つ～４つのリボソーム結合リボソーム結合部位および
１つ～４つの転写終止シグナルを含む。一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミ
ドは、本明細書に開示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む、５～１０個のキメ
ラタンパク質をコードすることができるようにする、５～１０個のリボソーム結合リボソ
ーム結合部位および５～１０個の転写終止シグナルを含む。一実施形態では、本明細書に
開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む
、１１～２０個のキメラタンパク質をコードすることができるようにする、１１～２０個
のリボソーム結合リボソーム結合部位および１１～２０個の転写終止シグナルを含む。一
実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各々が
異なるペプチド抗原を含む、２１～３０個のキメラタンパク質をコードすることができる
ようにする、２１～３０個のリボソーム結合リボソーム結合部位および２１～３０個の転
写終止シグナルを含む。別の実施形態では、リボソーム結合部位はシャイン・ダルガノリ
ボソーム結合部位である。
一実施形態では、「動作可能にリンクした」という用語は、転写および翻訳調節性核酸
が、任意のコード配列に対して転写が開始されるような様式で位置することを意味する。
一般的にこれは、プロモーターおよび転写開始配列または始動配列がコ－ド化領域に５’
に位置されることを意味することになる。別の実施形態では「動作可能にリンクする」と
いう用語は並置を指し、そのように記述される構成成分はそれらの意図される様式で機能
することができるような関係にある。コード配列に「動作可能にリンクする」対照配列は
、コード配列の発現が対照配列に対応する条件の下で達成されるようなやり方で連結され
る。別の実施形態では、「動作可能にリンクした」という用語は、各々がタンパク質また
はペプチドをコードする転写ユニット内でのいくつかのオープンリーディングフレームの
結合を指し、これにより結果的に意図されるように機能するキメラタンパク質またはポリ
ペプチドの発現をもたらす。
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタ
ンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。
別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常
のｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コ
ドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、一実施例として
、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノム
の中へと組込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフ
レーム内でゲノムの中へと組込まれた核酸分子である。
一実施形態では、本開示はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。「リンカ
ー配列」は２つの異種ポリペプチド、またはその断片もしくはドメインを結合するアミノ
酸配列を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。一般的に、リンカーは融
合ポリペプチドを形成するためにポリペプチドを共有的にリンクするアミノ酸配列である
。リンカーは、典型的には、オープンリーディングフレームおよび表示タンパク質によっ
てコードされたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作り出すために、表示ベクターから
のレポーター遺伝子の除去後の残りの組み換え型信号から翻訳されたアミノ酸を含む。当
業者によって理解されるように、リンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸など
の追加的なアミノ酸を含むことができる。
一実施形態では、「内因性」という用語は、参照生命体内で発生もしくは創出された、
または参照生命体の中生じたものから発生してきた物品を記述する。例えば、内因性は天
然を指す。
本明細書に開示される組み換え型またはキメラタンパク質は、例えば、クローニングお
よび適切な配列の制限、または以下に考察する方法による直接的化学合成を含む任意の好
適な方法によって調製されてもよい。あるいは、部分配列をクローニングし、適切な部分
配列を適切な制限酵素を使用して分割してもよい。次いで断片を連結し、望ましいＤＮＡ
配列を生産してもよい。一実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産することができる。まず、
未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配
列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペ
プチドリンカーをコードする。第一の断片の５’端は第二の断片の３’端の相補なので、
２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第三のＰＣＲ反応での
重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカ
ルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位
のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる
。抗原はプラスミドへと連結される。
「安定して維持される」とは、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失を
伴わずに、核酸分子またはプラスミドを１０世代の間、維持することを指す。別の実施形
態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形
態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形
態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形
態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形
態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実
施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別
の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるもの
である。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養
液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビ
ボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロ
およびインビトロの両方で安定して維持される。
「機能的断片」は免疫原性断片であり、単独でまたは本明細書に開示された治療的な組
成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す。例えば、当業者は理解するであ
ろうように、また本明細書にさらに開示されるように、機能的断片は生物活性を有する。
本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、「免疫原性断片」という用語
と交換可能に使用される。
「免疫原性」もしくは「免疫原性の」という用語またはその文法的な均等物は、タンパ
ク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与されたとき、ヒトまたは非ヒト動
物内に免疫応答を引き出すタンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物体の先天的な
能力を指す場合があることを当業者は理解するであろう。したがって、「免疫原性の促進
」は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与された時に、動物に
おいて免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の固有の能力
を増大することを指す場合がある。免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗
原または生物体の能力の増大は、一実施形態では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原ま
たは生物体に対する抗体数の増加、抗原または生物体に対する抗体の多様性の増大、タン
パク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に特異的なＴ細胞数の増加、タンパク質、ペ
プチド、核酸、抗原または生物体に対する細胞毒性またはヘルパーＴ細胞の応答の増大、
およびこれに類するものによって測定されうる。
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の組み換え型リステリア株は組み換え型
リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型
リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステ
リア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバ
ノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株であ
る。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。
別の実施形態では、リステリア株は、別のリステリア種の組み換え型株である。
一実施形態では、本発明では、ＬＭ ｄｅｌｔａ－ａｃｔＡ ｍｕｔａｎｔ（Ｂｒｕｎ
ｄａｇｅ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、
９０：１１８９０－１１８９４）、Ｌ．モノサイトゲネスｄｅｌｔａ－ｐｌｃＡ（Ｃａｍ
ｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３：７５１－７５４）、
またはｄｅｌｔａ－ＡｃｔＡ、ｄｅｌｔａ ＩＮＬ－ｂ（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ ｅｔ
５ ａｌ、２００４、ＰＮＡＳ、１０１：１３８３２－１３８３７）などの弱毒化リステ
リア株が使用される。別の実施形態では、弱毒化リステリア株は、本明細書の開示を装備
するとき当業者であれば理解するとおり、１つ以上の弱毒化突然変異を導入することによ
って構築される。かかる株の例としては、芳香族アミノ酸に対する栄養要求性のリステリ
ア株（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ １０ ６１：２２４５－２２４８）およびリポタイコ酸の形成のための突
然変異体（Ａｂａｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３
：１－１４）、および病毒性遺伝子を欠くことによって弱毒化されるもの（本明細書に含
まれる実施例を参照）が挙げられるが、これに限定されない。
別の実施形態では、本開示の組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されて
いる。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別
の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代
はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原
性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形
態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリス
テリア株の不安定な亜系の有病率を減少する。別の実施形態では、継代は本明細書に記述
されるように実施される。別の実施形態では、当該技術分野で既知の他の方法によって継
代を実施する。
一実施形態では、リステリア株は本明細書に開示されるミニ遺伝子核酸構築体のゲノム
の挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は本明細書に開示されるミニ遺伝子
核酸構築体を含むプラスミドを担持する。
別の実施形態では、本開示の組み換え型核酸は、リステリア株内のコードしたペプチド
の発現を駆動するプロモーター／調節配列に動作可能にリンクしている。遺伝子の構造性
の発現を駆動するために有用なプロモーター／調節性配列が当該技術分野で周知であり、
これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモータ
ー、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマ
イセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａ
Ｚプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本開示のペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な
発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列
の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発
性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ ＬＴＲ誘発性プロモーター、
およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない
。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤
に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本開示は、既知または未知
のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能
力を有する、任意のプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。
「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポ
リペプチド、ペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるで
あろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態
では、天然ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現すること
になり、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されるポリペプチドを
発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の供給源からのポリペ
プチドを発現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異な
る生命体に由来するものを記述するために使用される。
「エピソーム性の発現ベクター」という用語が、直線状または円形状であってもよく、
また通常二本鎖の形態であり、その中に細菌のゲノムまたは細胞のゲノムに組み込まれる
のと反対に宿主細菌の細胞質または細胞内に存在する染色体外である核酸ベクターを包含
することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、エピソーム性の発現ベクターは
対象となる遺伝子を含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは細菌性細胞質内の
複数のコピーの中で持続し、結果的に対象となる遺伝子の増幅をもたらし、これは一実施
形態では本明細書に開示される核酸分子または構築体である。別の実施形態では、ウイル
ス性トランス作用因子は必要に応じて供給される。本明細書ではエピソーム性の発現ベク
ターはプラスミドと呼ばれる場合がある。「組み込みプラスミド」はその挿入または宿主
ゲノムの中に担持される対象となる遺伝子の挿入を標的化する配列を含む。別の実施形態
では、挿入された対象となる遺伝子は中断されない、または細胞ＤＮＡへの組み込みから
しばしば生じる調節性の制約を受けない。別の実施形態では、挿入された異種遺伝子の存
在は細胞自身の重要な領域の再配列または中断につながらない。別の実施形態では、安定
したトランスフェクション手順で、エピソーム性ベクターの使用は、染色体を組み込むプ
ラスミドの使用より高いトランスフェクション効率をしばしばもたらす（Ｂｅｌｔ，Ｐ．
Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ
ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕ
ｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖ
ｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４８６１－４８６６；Ｍａｚ
ｄａ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅ
ｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｌｙｍｐｈｏ－ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉ
ｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ
ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４，１４３－１５１）。
一実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物のエピソーム性の発現ベクター
は、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために採用される様々な方法のいずれかによってインビ
ボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される場合がある。ベクターも単独でま
たは被験者の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態で送達される場合がある。
「融合された」という用語が共有結合による動作可能な連鎖を包含する場合があること
は当業者によって理解されるであろう。一実施形態では、この用語は組み換え型融合（そ
の核酸配列またはオープンリーディングフレームの）を包含する。別の実施形態では、こ
の用語は化学的結合を包含する。
「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために
細菌細胞を改変すること包含する場合があることを理解するべきである。「形質転換」は
、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変するこ
とも指す場合がある。
細菌を形質転換する方法は当該技術分野で周知であり、塩化カルシウムコンピテント細
胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的
、および物理的な形質転換技術（ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｃｅｌｌ ５
６：６４１－６４９；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１
９０－１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１
９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅ
ｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｍｉｌｌｅｒ，１９
９２，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本開示のリステリアワ
クチン株はエレクトロポレーションにより形質転換される。
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために
結合が使用される。結合の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏ
ｖｉｃ Ｊ．ら（Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｎｐ－ｄｅｒｉｖｅｄ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｉｓ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｂｌｅ ｂｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６ Ｎｏｖ；５
６（３）：２２３－７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｍｏｂｉｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍ
ｅｎｔ ｂｙ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｇ
ｌｏｂａｌ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００５ Ａｕｇ ３０；１０２（３５）：１２５５４－９）に
記述されている。
「弱毒化」という用語が細菌の動物内に疾患を発生する能力の減少を包含する場合があ
ることが当業者によって理解されるであろう。つまり、弱毒化されたリステリア株の病原
性特徴は野生型リステリアと比較すると低下しているが、弱毒化されたリステリアは培養
物中で成長および維持する能力を有する。実施例として弱毒化されたリステリアを用いた
Ｂａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用すると、接種した動物の５０％が生存する致死量
（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ま
しく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加
するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、お
よび少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがってリステリアの
弱毒化された株は、投与された動物を殺さないものであるか、または投与された細菌の数
が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときの
み動物を殺すものである。弱毒化された細菌は、その成長のために必要な栄養素がその中
に存在しないために一般的な環境内では複製する能力を有しないものを意味するとも解釈
されるべきである。したがって、細菌は必要な栄養素がその中で提供される制御された環
境に複製が限定される。したがって、本開示の弱毒化された株は制御されていない複製の
能力がないという点で、環境的に安全である。
組成物
別の実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核
酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む医薬組成物が本明細書に開示され、ガンを含
む疾患を有する被験者に医薬組成物を投与することは、前記疾患または前記ガンを処置、
軽快する。別の実施形態では、本明細書は、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコ
ードするミニ遺伝子核酸構築体を含む医薬組成物を開示する。別の実施形態では、医薬組
成物はアジュバントとともに投与される。
一実施形態では、本開示の組成物は免疫原性組成物である。一実施形態では、本開示の
組成物はインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは
抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本開示のリステリアはインターフェロンガン
マの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する（Ｄｏ
ｍｉｎｉｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ
ｒ．２００５ Ｍａｙ；５４（５）：４７７－８８．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｏｃｔ ６、
その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅａｔｔｙ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏ
ｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｆｅｂ １５；１６６（４）：２２７６－８２、そ
の全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、リステリアの抗血管形
成特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏ
ｎ， ２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞
によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ
－γ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞
、またはこれらの組み合せによって媒介される。
別の実施形態では、本開示の組成物の投与は１つ以上の抗血管形成タンパク質または因
子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はＩＦＮ－γである。別の
実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタ
チン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）－１、または可溶性エン
ドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本開示のリステリアは、抗血管形成因子
の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターと
しての役割に加えて、治療的な役割を有する。一実施形態では、本開示の組成物の投与は
、宿主の中のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路を刺激する。
本明細書に開示された方法および組成物によって誘発される免疫応答は、別の実施形態
ではＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態
では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答
を含む。
別の実施形態では、本開示の方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ８
＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ８＋ Ｔ細胞媒
介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、Ｃ
Ｄ８＋ Ｔ細胞媒介性応答である。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物によって引き出される免疫
応答はＣＤ４＋ Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ
４＋ Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な
構成成分は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞媒介性応答である。別の実施形態では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞
媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随して起こる。別の実施形態では、Ｃ
Ｄ４＋ Ｔ細胞媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随しない。
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を抗原の準優占ＣＤ８＋
Ｔ細胞エピトープに対して被験者の中に誘発する方法を提供する。
一実施形態では、腫瘍内のＣＤ８＋／調節性Ｔ細胞の比を増加する方法が本明細書に開
示され、また別の実施形態では、この方法は本発明のキメラタンパク質、組み換え型リス
テリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
別の実施形態では、腫瘍内のＣＤ８＋／調節性Ｔ細胞の比を増加する方法が本明細書に
開示され、また別の実施形態では、この方法は本発明のキメラタンパク質、組み換え型リ
ステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物によって引き出された免疫
応答は少なくとも１つの抗原の準優占エピトープへの免疫応答を含む。別の実施形態では
、免疫応答は準優占エピトープへの免疫応答を含まない。別の実施形態では、免疫応答は
少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答から構成される。別の実施形態では、た
だ１つの測定可能な免疫応答の構成成分は少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応
答である。
別の実施形態では、本開示の組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させる。別
の実施形態では、組成物の投与はＴ細胞上の共刺激受容体を活性化する。別の実施形態で
は、組成物の投与は記憶Ｔ細胞および／またはエフェクターＴ細胞の増殖を誘発する。別
の実施形態では、組成物の投与はＴ細胞の増殖を増加させる。
被験者内に強化した抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すため、被験者内で腫瘍を薬物治療した
免疫抑制を阻害するため、もしくは被験者の脾臓および腫瘍のＴエフェクター細胞の調節
性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するため、またはこれらの任意の組み合せの目的
で、本開示の組成物を本開示の方法で使用してもよい。
別の実施形態では、本発明のリステリア株を含む組成物はアジュバントをさらに含む。
一実施形態では、本開示の組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本開
示の方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激
因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ－ＣＳ
Ｆタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ－ＣＳＦをコードするヌク
レオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ－ＣＳＦをコードするヌク
レオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の
実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバン
トは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリ
ルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態
では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化さ
れていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメ
チル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバ
ントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイト
カインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌ
クレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコー
ドするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドで
あるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンである
か、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこ
れを含む。他のアジュバントが当該技術分野で既知である。
一実施形態では、本開示はペプチド抗原を発現する組み換え型リステリア株を提供する
。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される組み換え型リステリアを含むワク
チンおよび免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示さ
れる組み換え型リステリアを含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示されるキメラタンパク質
をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む。
一部の実施形態では、追加的なポリペプチドまたは追加的なアジュバントポリペプチド
は、ＬＬＯと類似の様式で抗原提示および免疫性を増強する。
一実施形態では、本明細書に開示された医薬組成物は、追加的な療法と同時投与される
。別の実施形態では、追加的な療法は外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、また
はこれらの組み合せである。別の実施形態では、組み換え型リステリアを含む医薬組成物
の投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リステリアを含む医薬
組成物の投与の後に追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法である
。別の実施形態では、抗体療法は、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４である。別の実施形態では、
Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強力な抗腫瘍免疫応答を生
成するために、組み換え型リステリアを含む医薬組成物は漸増用量で投与される。細胞の
免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、および当該
技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提供する
ことによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によって理解
されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記載され
ており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアを含むワクチンを本明細書に開示する
。別の実施形態では、本発明のミニ遺伝子構築体を発現する組み換え型弱毒化リステリア
を含むワクチンを本明細書に開示する。
別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリアを含む医薬組成物を本明細書に開示
する。別の実施形態では、本発明のミニ遺伝子構築体を発現する組み換え型弱毒化リステ
リアを含む医薬組成物を本明細書に開示する。
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチド、またはこれをコードする核酸構
築体、または核酸構築体をコードする組み換え型リステリアを含む免疫原性組成物を本明
細書に開示する。
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含む医
薬組成物を本明細書に開示する。
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含むベ
クターを本明細書に開示する。
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子またはリステリアの組み換え型形態を本
明細書に開示する。
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態を含むワクチンを本明細書に
開示する。別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態を含む医薬組成物を
本明細書に開示する。
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態のカルチャーを本明細書に開
示する。
別の実施形態では、本開示の方法および組成物のリステリアはリステリア・モノサイト
ゲネスである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施
形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリ
アはリステリア・シーリゲリである。
抗原
「抗原」、「抗原性ポリペプチド」、「抗原断片」という用語は本明細書で交換可能に
使用され、また宿主の細胞の表面上でＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上に
負荷および提示され、かつ宿主の免疫細胞によって識別または検出することができるポリ
ペプチドまたはペプチド（組み換え型ペプチドを含む）を包含する場合があり、これによ
ってポリペプチド、ペプチドまたはこれを提示する細胞に対する免疫応答の搭載をもたら
すことを当業者は理解するであろう。同様に、免疫応答は、宿主の中の同一のポリペプチ
ドまたはペプチドを発現する腫瘍またはガン細胞などの病的な細胞を含む他の細胞にも延
長される場合がある。
「その抗原性部分」、「その断片」、「その免疫原性部分」という用語は、タンパク質
、ペプチド、またはポリペプチドに関して本明細書で交換可能に使用され、また本明細書
に記述されるように単独で、または融合タンパク質の状況でのいずれかで、宿主によって
検出されるものの中にまたは一部の実施形態の中に存在する場合、免疫応答の搭載をもた
らすドメインまたは区分を含むその組み換え型形態を含むタンパク質、ポリペプチド、ペ
プチドを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。
「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポ
リペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。し
たがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、天然
ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現することになり、ま
たは別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されるポリペプチドを発現するこ
とになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の供給源からのポリペプチドを発
現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異なる生命体に
由来するものを記述するために使用される。別の実施形態では、異種抗原はリステリアの
組み換え型株によって発現され、かつ哺乳類細胞の感染に際して組み換え型株によって細
胞毒性Ｔ細胞に加工および提示される。別の実施形態では、リステリア種によって発現さ
れる異種抗原は、結果として哺乳類内に自然に発現される修飾されていない抗原またはタ
ンパク質を識別するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染性薬剤の中で対応す
る修飾されていない抗原またはタンパク質に厳密に適合する必要はない。一実施形態では
、「抗原性ポリペプチド」および「タンパク質抗原」、「抗原」という用語は、本明細書
で交換可能に使用される。
一実施形態では、抗原は外来であってもよく、すなわち、宿主に対して異種であっても
よく、本明細書では「異種抗原」と称される。別の実施形態では、抗原は、自己抗原であ
り、これは宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出
さない。当業者にとっては当然のことながら、異種抗原ならびに自己抗原は、腫瘍抗原、
腫瘍関連抗原、または血管形成抗原を包含しうる。さらに、異種抗原は、感染性疾患抗原
を包含する場合がある。別の実施形態では、抗原は血管形成抗原である。
一実施形態では、本明細書に開示されるペプチドは、腫瘍関連抗原に由来する。一実施
形態では、腫瘍関連抗原は、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、Ｈｅｒ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－
１、高分子量メラノーマ－関連（ＨＭＷ－ＭＡＡ）抗原またはその断片、ヘプシン、サバ
イビン、ＰＳＧ４、ＶＥＧＦＲ－２断片、サバイビン、Ｂ－細胞受容体抗原、チロシナー
ゼ関連タンパク質２、またはＰＳＡ（前立腺－特異的抗原）またはこれらの組み合せから
選択される。別の実施形態では、抗原は、ＨＩＶ－１ Ｇａｇ、ＭＡＧＥ（メラノーマ－
関連抗原Ｅ）タンパク質（例えば、ＭＡＧＥ １、ＭＡＧＥ ２、ＭＡＧＥ ３、ＭＡＧ
Ｅ ４、チロシナーゼ）；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行
ガン関連ｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチド、またはｐ５３ペプチド；子宮頸ガン関
連ＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガン関連ＫＬＨ抗原、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００
、メラノーマ関連ＭＡＲＴ１抗原、インターロイキン－１３受容体α（ＩＲ１３－Ｒ α
）、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ＣＥＡ
、ＬＭＰ－１、ｐ５３、プロテイナーゼ３、滑膜肉腫、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、
サバイビン、ＧＰ１００、テスチシンペプチド、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ
）、またはウィルムス腫瘍（ＷＴ－１）抗原などの感染性疾患抗原である。本明細書に開
示されるまたは当該技術分野において開示される任意の抗原の断片は本発明にも包含され
ることが理解されるべきである。
一実施形態では、本明細書に開示される疾患は感染性疾患である。一実施形態では、感
染性疾患は、以下の病原体のいずれか１つによって発生するものであるが、これに限定さ
れない。リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結
核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウ
イルス、コレラ、ジフテリア－破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピ
ローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹
および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および
三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌
）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（
ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツ
ラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、
マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス
、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブル
グ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセ
ラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウ
ム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲン
のイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア
・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌
、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エ
ルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイル
ス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャ
サヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス
、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ
型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム
・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソ
プラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン
、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、コクシジ
オイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア
、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコ
モナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で既知の任意の他の感染性疾患
。
一実施形態では、病原性原虫および蠕虫感染としては：アメーバ症；マラリア；リーシ
ュマニア；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ニューモシスティス・カリニ；バベシ
ア症；ランブル鞭毛虫症；旋毛虫病；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍ
ａｔｏｄｅｓまたはｆｌｕｋｅｓ）；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅまたはｔａｐｅｗｏｒ
ｍ）感染が挙げられる。
一実施形態では、本明細書に開示されるＥ６またはＥ７抗原などのＨＰＶ抗原は、ＨＰ
Ｖ ６株、およびＨＰＶ １１株、ＨＰＶ １６株、ＨＰＶ－１８株、ＨＰＶ－３１株、
ＨＰＶ－３５株、ＨＰＶ－３９株、ＨＰＶ－４５株、ＨＰＶ－５１株ＨＰＶ－５２株、Ｈ
ＰＶ－５８株、またはＨＰＶ－５９株から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶ抗原は
高リスクＨＰＶ株から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶ株は粘膜ＨＰＶタイプであ
る。別の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、いぼおよび異形成を生じるタイプ６、タイプ１１
等などの非発ガン性ＨＰＶを含むすべてのＨＰＶ株から選択される可能性がある。
一実施形態では、ＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ７の
代わりにまたはこれと組み合せて利用される。かかる実施形態では、組み換え型リステリ
アはＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７を染色体から、ならびにＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ
７をプラスミドから発現してもよく、またはその反対であってもよい。別の実施形態では
、ＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ７抗原は、本
明細書に開示された組み換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現される。別の
実施形態では、ＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ
７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリアの染色体から発現される。別の実
施形態では、ＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ７
抗原は上記の実施形態の任意の組み合せで発現され、これには各々のＨＰＶ株由来の各々
のＥ６およびＥ７抗原がプラスミドまたは染色体のいずれかから発現されるものを含む。
一実施形態では、抗原は、米国特許出願シリアル番号第１２／９４５，３８６号（その
全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２抗原である。
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテ
リア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風
邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス
、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー
、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、
橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓
、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾
患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、
悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性
狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化
症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、
脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、
強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマ
グロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、
毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫
性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リン
パ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、
ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
別の実施形態では、本明細書に開示された症状は異形成である。別の実施形態では、疾
患は新生物である。別の実施形態では、疾患は肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）である。別の実
施形態では、疾患は膣上皮内腫瘍（ＶＩＮ）である。別の実施形態では、疾患は子宮頸部
上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）である。
別の実施形態では本明細書に開示される症状は前ガン状態、または処置されずに放置さ
れた場合に疾患（慢性もしくは急性）を発症するように進行する状態である。
別の実施形態では、本明細書に開示される腫瘍関連抗原は、活性化した周皮細胞と腫瘍
血管形成血管系内の周皮細胞との両方の上で発現される血管形成抗原であり、これインビ
ボでの新血管形成と関連付けられる。血管形成抗原は、当該技術分野で既知であり、例え
ば国際特許公開広報第ＷＯ２０１０／１０２１４０号（参照により本明細書に組み込まれ
る）を参照されたい。例えば、血管形成因子は、アンジオポイエチン－１（Ａｎｇ１）、
アンジオポイエチン３、アンジオポイエチン４、アンジオポイエチン６；Ｄｅｌ－１；線
維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）；ホリスタチン；顆粒球
コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）；イン
ターロイキン－８（ＩＬ－８）；レプチン；ミッドカイン；胎盤成長因子；血小板由来内
皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）；血小板由来成長因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）；プ
レイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；スルビビン；形質転
換成長因子－アルファ（ＴＧＦ－アルファ）；形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－ベー
タ）；腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－アルファ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／
血管透過性因子（ＶＰＦ）から選択されてもよい。別の実施形態では、血管形成因子は血
管形成タンパク質である。一実施形態では、成長因子は血管形成タンパク質である。一実
施形態では、本発明の組成物および方法で使用する血管形成タンパク質は、線維芽細胞成
長因子（ＦＧＦ）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲおよびニューロピリン１（ＮＲＰ－１）；Ｔｉ
ｅ２；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；ＢＢホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ；形質転換成
長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、エンドグリンおよびＴＧＦ－β受容体；単球走化性タン
パク質－１（ＭＣＰ－１）；インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１；ＶＥ－カ
ドヘリンおよびＣＤ３１；エフリン；プラスミノーゲン活性化因子；プラスミノーゲン活
性化因子阻害剤－１；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）およびＣＯＸ－２；ＡＣ１３３；
またはＩｄ１／Ｉｄ３、ＴＧＦベータ共受容体またはエンドグリン（これはＣＤ１０５；
ＥＤＧ；ＨＨＴ１；ＯＲＷ；またはＯＲＷ１としても既知である）である。
一実施形態では、ネオエピトープは以下の米国特許出願のうちのいずれか１つに開示さ
れるように生成されかつ得られる（米国特許出願シリアル番号第６２／１６６，５９１号
、同第６２／１７４，６９２号、同第６２／２１８，９３６号、同第６２／１８４，１２
５号、これらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、リステリアベースの免疫療法レジメンの投与に続く被験者の中の組織
上のリステリア株の持続性を防止する方法が本明細書に開示され、方法は、前記組み換え
型リステリアベースの免疫療法の投与に続いて、有効量の抗生物質のレジメンを投与する
工程を含み、これによって前記被験者の中の前記リステリア株の前記持続性を防止する。
別の実施形態では、リステリア株は、１つ以上のネオエピトープをコードする１つ以上
のペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含み、前記１つ
以上のペプチドは免疫原性タンパク質またはペプチドに融合される。別の実施形態では、
免疫原性タンパク質またはペプチドは、切断ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）、切断ＡｃｔＡ（ｔＡｃ
ｔＡ）、またはＰＥＳＴアミノ酸配列ペプチドを含む。
一実施形態では、組み換え型弱毒化リステリア株が本明細書に開示され、リステリア株
は１つ以上の個人用のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の
オープンリーディングフレームを含む核酸配列を含み、ネオエピトープ（複数可）は、疾
患または症状を有する被験者の疾患または症状を持つ組織または細胞の中に存在する免疫
原性エピトープを含む。別の実施形態では、１つ以上のネオエピトープは、疾患または症
状を有する被験者の疾患または症状を持つ組織または細胞の中に存在する。
別の実施形態では、リステリア株を前記疾患または症状を有する被験者に投与すると、
被験者の疾患または症状を標的とする免疫応答を生成する。
別の実施形態では、株は前記被験者の疾患または症状を標的とする前記被験者のための
個人用の免疫療法ベクターである。
別の実施形態では、ペプチドは少なくとも２つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を
含む。
別の実施形態では、ペプチドは同じアミノ酸配列の１つ以上のネオエピトープの繰り返
しを含む。
別の実施形態では、リステリア株は１つのネオエピトープを含む。別の実施形態では、
リステリア株は約１～１００の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は
、約１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、１０～２０、２０～３０、３０～４０
、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、５～
１５、５～２０、５～２５、１５～２０、１５～２５、１５～３０、１５～３５、２０～
２５、２０～３５、２０～４５、３０～４５、３０～５５、４０～５５、４０～６５、５
０～６５、５０～７５、６０～７５、６０～８５、７０～８５、７０～９５、８０～９５
、８０～１０５、または９５～１０５の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、リステ
リア株は約５０～１００の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は最高
約１００のネオエピトープを含む。
別の実施形態では、リステリア株は約１００を超えるネオエピトープを含む。別の実施
形態では、リステリア株は最高約１０のネオエピトープを含む。別の実施形態では、リス
テリア株は最高約２０のネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は最高
約５０のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は約２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、
２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３
５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８
、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、
６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７
５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８
、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００
のネオエピトープを含む。
本明細書に記述される一実施形態では、検出された突然変異の各々の側に隣接する約５
～３０の範囲のアミノ酸の組み込みが生成される。追加的にまたは代替的に、様々なサイ
ズのネオエピトープインサートが約８～２７の範囲のアミノ酸配列長さで挿入される。追
加的にまたは代替的に、様々なサイズのネオエピトープインサートが約５～５０の範囲の
アミノ酸配列長さで挿入される。
別の実施形態では、ネオエピトープ配列は腫瘍特異的、転移特異的、細菌感染特異的、
ウイルス感染特異的、およびこれらの任意の組み合せである。追加的にまたは代替的に、
ネオエピトープ配列は、炎症特異的、免疫調整分子エピトープ特異的、Ｔ－細胞特異的、
自己免疫疾患特異的、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）特異的、およびこれらの任意の組み合
わせである。
別の実施形態では、１つ以上のネオエピトープは線形ネオエピトープを含む。追加的に
または代替的に、１つ以上のネオエピトープは溶媒曝露エピトープを含む。
別の実施形態では、１つ以上のネオエピトープはＴ細胞エピトープを含む。
治療的な方法およびその使用の組成
別の実施形態では、本開示は上述のように、腫瘍またはガンを含む疾患または症状を処
置するために免疫原性組成物を提供する。例えば、本開示の方法で使用される免疫原性組
成物は、本明細書に記載するようにミニ遺伝子核酸構築体を発現するリステリア株を含む
。
一実施形態では、本明細書に開示された症状は異形成である。別の実施形態では、疾患
は新生物である。別の実施形態では、疾患は肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）である。別の実施
形態では、疾患は膣上皮内腫瘍（ＶＩＮ）である。別の実施形態では、疾患は子宮頸部上
皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）である。
別の実施形態では本明細書に開示される症状は前ガン状態、または処置されずに放置さ
れた場合に疾患、慢性、もしくは急性を発症するように進行する状態である。
一実施形態では、本明細書に開示されたガンは、乳ガン、中枢神経系（ＣＮＳ）ガン、
頭頸部ガン、骨肉腫（ＯＳＡ）、イヌの骨肉腫（ＯＳＡ）、大腸ガン、腎臓の細胞ガン、
膵管腺ガン、ユーイング肉腫（ＥＳ）、膵臓ガン、卵巣ガン、胃ガン、膵臓のガンの病巣
、肺腺ガン、結腸直腸腺ガン、肺の扁平上皮腺ガン、胃腺ガン、卵巣表面上皮性新生物（
例えば、その良性、増殖性、または悪性変種）、口腔扁平細胞ガン、非小細胞肺ガン、Ｃ
ＮＳガン腫、子宮内膜ガン、膀胱ガン、中皮腫、悪性中皮腫（ＭＭ、前立腺ガン、メラノ
ーマ、または当該技術分野で既知の任意の他のガンである。別の実施形態では、ガンはリ
ンパ腫、白血病、または骨髄腫である。別の実施形態では、リンパ腫はホジキンリンパ腫
である。別の実施形態では、リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である。別の実施形態では、
ガンは多発性メラノーマである。
また別の実施形態では、ガンは急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）である。別の実施形態で
は、ガンは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。また別の実施形態では、ガンは慢性リン
パ性白血病（ＣＬＬ）である。別の実施形態では、ガンは有毛細胞白血病（ＨＣＬ）であ
る。別の実施形態では、ガンはＴ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）である。別の実
施形態では、ガンは大顆粒リンパ球性白血病である。別の実施形態では、ガンは成人Ｔ細
胞白血病である。別の実施形態では、ガンは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。別の実
施形態では、ガンは慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。別の実施形態では、ガン
はリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは皮膚リンパ腫である。別の実施形態では、
ガンはホジキン病である。別の実施形態では、ガンは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）であ
る。別の実施形態では、ガンは低悪性度のＮＨＬである。別の実施形態では、ガンはびま
ん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは低悪性度のＮＨＬである
。別の実施形態では、ガンは前駆Ｔ細胞リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは末梢
Ｔ細胞リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは末梢マントル細胞リンパ腫である。別
の実施形態では、ガンは多発性骨髄腫である。別の実施形態では、ガンは濾胞性リンパ腫
である。別の実施形態では、ガンは免疫増殖性疾患である。また別の実施形態では、ガン
はＢ細胞慢性リンパ性白血病である。別の実施形態では、このガンはバーキットリンパ腫
である。別の実施形態では、ガンはＭＡＬＴリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは
菌状息肉症である。別の実施形態では、ガンは結節性硬化症である。別の実施形態では、
ガンは低悪性度のリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは上記のタイプのリンパ腫ま
たは白血病のうちの１つからの残りの疾患である。別の実施形態では、ガンは、当該技術
分野で既知の任意の他のタイプのリンパ腫または白血病である。別の実施形態では、ガン
はサバイビンを発現する任意の他の既知のタイプのリンパ腫である。別の実施形態では、
ガンは骨髄異形成症候群である。別の実施形態では、ガンは任意のサバイビンを発現する
血液ガンである。別の実施形態では、前記ガンまたは固形腫瘍は、再燃または転移性疾患
の結果である。別の実施形態では、ガンは不応性である。別の実施形態では、ガンは進行
性である。別の実施形態では、ガンは転移性である。
別の実施形態では、腫瘍は骨肉腫腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、または本明細書に開示
されるいずれかのガンに進行する可能性があり、かつ当該技術分野で既知の任意の他の腫
瘍である。
別の実施形態では、本開示の方法および組成物によって標的とされる腫瘍の細胞は、本
明細書に開示される組み換え型リステリア株によって発現されるペプチドと関連付けられ
た抗原を発現する。別の実施形態では、ペプチド抗原は血管形成性腫瘍抗原（例えば、Ｈ
ＭＷ－ＭＡＡ）と関連付けられる。本明細書に開示された免疫原性組成物の投与に続いて
、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖を誘発し
、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす。別の実施形態では、本
明細書に開示された方法は末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、
Ｔエフェクター細胞の末梢における存在の強化をもたらす。Ｔエフェクター細胞のかかる
増殖は、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、末梢内および腫瘍部位におけるＴエフェクター
細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす。末梢リンパ器官としては、脾臓、パイ
エル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるが、これに限定されないことを当業者は理
解するであろう。一実施形態では、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞
の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が末梢で生じる。別の実施形態では、末梢、リンパ器官
、および腫瘍部位で、これらの部位でのＴｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター
細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が生じる。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞
の比の増加はＴｒｅｇの頻度を減少するが、この部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しな
い。
別の実施形態では、被験者の中のガンを防止する方法が本明細書に開示され、方法はキ
メラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与す
る工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。別の実施形態では
、被験者の中の腫瘍の成長を防止する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク
質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成物を投与す
る工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。
一実施形態では、被験者の中のガンを処置する方法が本明細書に開示され、方法はキメ
ラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成
物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。一実施
形態では、被験者の中の腫瘍の成長を処置する方法が本明細書に開示され、方法はキメラ
タンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工
程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。
一実施形態では、ガンを持つ被験者の生存を延長する方法が本明細書に開示され、方法
はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含
む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。
一実施形態では、腫瘍の成長を有する被験者の生存を延長する方法が本明細書に開示され
、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリ
アを含む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを
含む。
一実施形態では、疾患を有する被験者の中の転移性疾患を阻害する、妨げる、または遅
延する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸
構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタン
パク質は前記疾患と関連付けられる関連ペプチドを含む。一実施形態では、本開示は被験
者の中に抗腫瘍または抗ガン免疫応答を誘発する方法を提供し、方法は被験者に本発明の
組成物を投与することを含む。
別の実施形態では、被験者内の腫瘍またはガンの退行を誘発する方法を本明細書に開示
し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与す
る工程を含む。
一実施形態では、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の頻度を減少する方法を本明細書に開示し、方
法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程
を含む。
一実施形態では、腫瘍内の骨髄系由来サプレッサー細胞の頻度を減少する方法を本明細
書に開示し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者
に投与する工程を含む。
別の実施形態では、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の頻度を減少する方法を
本明細書に開示し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリアワクチン株を含む
組成物を被験者に投与する工程を含む。
別の実施形態では、被験者内の転移性腫瘍またはガンを処置する方法を本明細書に開示
し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与す
る工程を含む。
一実施形態では、本開示の方法は被験者内の腫瘍またはガンに対する前記被験者内の耐
性を破壊し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者
に投与する工程を含む。
別の実施形態では、本開示は被験者内の腫瘍またはガンの成長を妨げる方法を提供し、
方法は被験者に本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を投与するこ
とを含み、これによって被験者内の腫瘍またはガンの成長を妨げる。
別の実施形態では、本開示は、ガンの発生率を減少する方法を提供し、方法は本発明の
組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は
、ガンを軽快する方法を提供し、方法は本発明の組み換え型リステリアを含む組成物を投
与する工程を含む。
一実施形態では、本明細書に記述されるリステリア株を含む本明細書に開示する任意の
組成物を、本発明の方法で使用してもよい。
一実施形態では、本発明の組成物を投与する方法が本明細書に開示される。別の実施形
態では、本発明の組み換え型リステリアを含むワクチンを投与する方法が本明細書に開示
される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドを投与する方法が本明細書
に開示される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドをコードする核酸構
築体を投与する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、異なる弱毒化細菌ベク
ターを用いて投与を遂行する。別の実施形態では、異なる弱毒化リステリア・モノサイト
ゲネスベクターを用いて投与を遂行する。別の実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、
ネイキッドＤＮＡワクチン）を用いて投与を遂行する。別の実施形態では、本開示の組み
換え型ポリペプチドの投与は、タンパク質を遺伝子組み換えによって生産し、次いで組み
換え型タンパク質を被験者に投与することによって遂行される。
一実施形態では、本開示は腫瘍の「エピトープ拡大」のための方法を提供する。別の実
施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する免疫付与は、本発明のワ
クチン内で搬送される抗原以外の抗原を持つ他の腫瘍の上へのエピトープ拡大を誘発する
。これは結果的に他の腫瘍上への抗腫瘍応答の延長をもたらす。
別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される被験者内で
それぞれ優占または準優占である。別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピ
トープは、治療される母集団内でそれぞれ優占または準優占である。
一実施形態では、エピトープ拡大によって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療する、
抑制する、または阻害する方法が本明細書に開示され、また別の実施形態では、前記ガン
は本発明の組成物内に含まれる抗原またはその断片の発現と関連付けられる。別の実施形
態では、方法は前記被験者に本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、
または組み換え型ベクターを含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では
、被験者は抗原を発現するガンまたは抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、こ
れによって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療、抑制、または阻害する。
一実施形態では、「優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」または「優占エピトープ」という
用語は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、またはタ
ンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％を超える抗原特異的なＣＤ８
＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、これに
よって引き出される３５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピ
トープを指す。別の実施形態では、この用語は、４０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ
細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４５％を超
える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態で
は、この用語は、５０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピト
ープを指す。別の実施形態では、この用語は、５５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細
胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６０％を超え
る抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では
、この用語は、６５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトー
プを指す。別の実施形態では、この用語は、７０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞
によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、７５％を超える
抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、
この用語は、８０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープ
を指す。別の実施形態では、この用語は、８５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に
よって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９０％を超える抗
原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、こ
の用語は、９５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを
指す。別の実施形態では、この用語は、９６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によ
って識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９７％を超える抗原
特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この
用語は、９８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指
す。
一実施形態では、「準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」または「準優占エピトープ」と
いう用語は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、また
はタンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％より少ない抗原特異的な
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、
２８％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別
の実施形態では、この用語は、２６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別
されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２４％より少ない抗原特異的
なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は
、２２％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別
の実施形態では、この用語は、２０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識
別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１８％を超える抗原特異的
なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は
、１６％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
別の実施形態では、この用語は、１４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識
別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１２％を超える抗原特異的
なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は
、１０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
別の実施形態では、この用語は、８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別
されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６％より少ない抗原特異的な
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、
５％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の
実施形態では、この用語は、４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別され
るエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、３％より少ない抗原特異的なＣＤ
８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２％
より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施
形態では、この用語は、１％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別される
エピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、０．５％より少ない抗原特異的なＣ
Ｄ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
一実施形態では、本開示の方法および組成物でのペプチドを含む抗原は被験者の非腫瘍
細胞上で検出可能なレベルで発現される。別の実施形態では、抗原は被験者の非腫瘍細胞
の少なくともある特定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、
０．３％、１％、２％、３％、または５％）の検出可能なレベルで発現される。一実施形
態では、「非腫瘍細胞」は腫瘍の本体の外側の細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍
細胞」は非悪性細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は形質転換されていない
細胞を指す。別の実施形態では、非腫瘍細胞は体細胞である。別の実施形態では、非腫瘍
細胞は生殖細胞である。
「検出可能なレベル」は、標準的なアッセイ使用するときに検出可能なレベルを指す。
一実施形態では、アッセイは免疫学的アッセイである。一実施形態では、アッセイは酵素
結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。別の実施形態では、アッセイはウエスタンブロッ
トである。別の実施形態では、アッセイはＦＡＣＳである。別の実施形態では、アッセイ
は遺伝子発現アッセイである。当該技術分野において利用可能である他のアッセイを本明
細書に開示される方法において使用することができることが当業者によって理解されるべ
きである。別の実施形態では、検出可能なレベルは特定のアッセイのバックグラウンドレ
ベルに対して決定される。これらの技法の各々を遂行するための方法は当業者には周知で
ある。
一実施形態では、組み換え型の抗原を発現するＬＭを用いたワクチン接種はエピトープ
拡大を誘発する。
一実施形態では、本開示は抗腫瘍応答の「エピトープ拡大」のための方法を提供する。
別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する免疫付与は、他の
腫瘍の上へのエピトープ拡大を誘発する。
別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される被験者内で
それぞれ優占または準優占である。別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピ
トープは、治療される母集団内でそれぞれ優占または準優占である。
一実施形態では、エピトープ拡大によって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療する、
抑制する、または阻害する方法が本明細書に開示され、また別の実施形態では、前記ガン
は本発明の組成物内に含まれる抗原またはその断片の発現と関連付けられる。別の実施形
態では、方法は前記被験者に本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、
または組み換え型ベクターを含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では
、被験者は抗原を発現するガンまたは抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、こ
れによって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療、抑制、または阻害する。
別の実施形態では、本開示はガンを有する宿主内に細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発するた
めの方法を提供し、この方法は宿主に本発明の組成物を投与することを含み、これによっ
てガンを有する宿主内の細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発する。
一実施形態では、組成物を被験者の細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組
成物をドナーの細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組成物をドナーの細胞に
インビボで投与し、次いで被験者に移入した。
本発明の方法の別の実施形態では、被験者は抗原を発現する腫瘍または標的抗原に対し
て免疫応答を搭載し、これによって抗腫瘍効果を媒介する。
一実施形態では、腫瘍退行を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、ま
たは数日、数週間、または数か月の間隔の後、本開示の組成物の繰返し投与（ブースター
投与量）を行ってもよい。別の実施形態では、腫瘍増殖の抑制を達成するために、第１の
処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、繰返し投
与を行ってもよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの解析、生検、または腫瘍に伴う症状の
存在、不在、または寛解などの診断方法を含む当該技術分野で既知の任意の技法によって
評価を決定してもよい。
一実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍微小環境内で、Ｔエフェクター細胞の制御性
Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、方法は本明細書に
開示された免疫原性組成物を投与することを含む。別の実施形態では、被験者内の脾臓お
よび腫瘍微小環境内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加
することは、被験者内のより著明な抗腫瘍応答を可能にする。別の実施形態では、制御性
Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞を含む。別の実
施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞である。別の実施形態で
は、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別
の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細
胞である。
一実施形態では、本開示は、腫瘍またはガンを治療する、腫瘍またはガンから保護する
、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには本明細書に
提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
一実施形態では、本開示はヒトの被験者内の腫瘍またはガンを防止または処置する方法
を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ
４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応
答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞応答およびＣＤ
８＋Ｔ細胞応答である。
別の実施形態では、本開示は腫瘍またはガンから被験者を保護する方法を提供し、これ
は本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態で
は、本開示は被験者内の腫瘍の退行を誘発する方法を提供し、これは本明細書に開示され
る免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は腫瘍また
はガンの発生または再発を減少させる方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原
性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内の腫瘍の
形成を抑制する方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投
与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内のガンの寛解を誘発する方法を
提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ型ペプチドをコードするオープンリーデ
ィングフレームを含むミニ遺伝子核酸構築体がリステリアゲノムに組み込まれる。別の実
施形態では、ミニ遺伝子構築体は組み換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中に
ある。別の実施形態では、ミニ遺伝子構築体は前記リステリア内の染色体外プラスミドの
中にある。別の実施形態では、構築体は前記リステリア内の染色体外プラスミドから発現
される。
別の実施形態では、処置する方法はリンパ節サイズを減少する。リンパ節サイズの減少
は部分的または１００％である場合がある。別の実施形態では、本開示の方法はリンパ節
サイズを９０％ほど減少する。別の実施形態では、本開示の方法はリンパ節サイズを８０
％ほど減少する。別の実施形態では、方法はリンパ節サイズを７０％ほど減少する。別の
実施形態では、方法はリンパ節サイズを６０％ほど減少する。別の実施形態では、方法は
リンパ節サイズを５０％ほど減少する。
別の実施形態では、処置する方法は疾患が進行する時間を増加する。一実施形態では、
疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも２カ月ほど増加す
る。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なく
とも４カ月ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被
験者と比較して少なくとも６カ月ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は
、処置されていない被験者と比較して少なくとも１年ほど増加する。一実施形態では、疾
患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも２年ほど増加する。
一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも
３年ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と
比較して少なくとも４年ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置さ
れていない被験者と比較して少なくとも５年ほど増加する。
一実施形態では、方法は組み換え型リステリアを追加的な療法とともに同時投与する工
程を含む。別の実施形態では、追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、放射線療
法、抗体ベースの免疫療法、またはこれらの組み合わせである。別の実施形態では、組み
換え型リステリアの投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リス
テリアの投与に続いて追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法であ
る。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強
力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、組み換え型リステリアは漸増用量で投与される。
細胞の免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およ
び当該技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提
供することによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によっ
て理解されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記
載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物
を前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化する抗体またはその機能的断片と同時投与する工
程をさらに含む。
別の実施形態では、ガンを患う被験者または腫瘍を有する被験者の生存を増加する方法
が本明細書に開示され、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリアワクチン株を
含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
別の実施形態では、ガンを患う被験者または腫瘍を有する被験者内の抗原特異的なＴ細
胞を増加する方法が本明細書に開示され、方法は本明細書に開示される組み換え型リステ
リアワクチンを含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
一実施形態では、本開示の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロト
コルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本開
示の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状
況のために、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するた
めに使用される。別の実施形態では、組成物は、外科手術による腫瘍成長の減量術、従来
の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続い
て、本開示の組成物を投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞
（ＣＴＬ）応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態で
は、組成物は、外科手術、従来の化学療法、または放射線治療と組み合わせてガン免疫療
法として使用される。別の実施形態では、本開示の組成物は、以前に定着した腫瘍の成長
に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
本発明によって投与範囲の様々な実施形態が企図される。一実施形態では、ワクチンベ
クターの場合は、投与量は０．４ＬＤ５０／回の範囲である。別の実施形態では、投与量
は約０．４～４．９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．５～０．５
９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．６～０．６９ＬＤ５０／回で
ある。別の実施形態では、投与量は約０．７～０．７９ＬＤ５０／回である。別の実施形
態では、投与量は約０．８ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は０．４ＬＤ
５０／回～０．８のＬＤ５０／回である。
別の実施形態では、投与量は細菌数１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は
細菌数１．５×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０７個／
回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０７個／回である。別の実施形態で
は、投与量は細菌数４×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１
０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０７個／回である。別の実
施形態では、投与量は細菌数１×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌
数１．５×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０８個／回で
ある。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０８個／回である。別の実施形態では、
投与量は細菌数４×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０８
個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０８個／回である。別の実施形
態では、投与量は細菌数１×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１
．５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０９個／回である
。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０９個／回である。別の実施形態では、投与
量は細菌数５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０９個／
回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態で
は、投与量は細菌数１×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．
５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１０個／回であ
る。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１０個／回である。別の実施形態では、
投与量は細菌数５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０
１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１０個／回である。別の
実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細
菌数１×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１１個
／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１１個／回である。別の実施形
態では、投与量は細菌数３×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数
５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１１個／回であ
る。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１１個／回である。
本発明によって様々な投与レジメンも企図される。一実施形態では、本開示に記述され
るような細菌を含む医薬組成物は１回投与される。別の実施形態では、組成物は２回以上
投与される。別の実施形態では、組成物は２回投与され、投与の間の間隔は１週間である
。別の実施形態では、組成物は２回投与され、投与の間の間隔は２週間である。別の実施
形態では、組成物は２回投与され、投与の間の間隔は３週間である。別の実施形態では、
組成物は３回投与され、投与の間の間隔は１週間である。別の実施形態では、組成物は３
回投与され、投与の間の間隔は２週間である。別の実施形態では、組成物は３回投与され
、投与の間の間隔は３週間である。別の実施形態では、上記のレジメンのうちのいずれか
には、さらなる投与が追加される。一部の実施形態では、さらなる投与は予防的である。
別の実施形態では、被験者がガンの再発を経験する場合、さらにブースター投与が行われ
る。別の実施形態では、被験者がガンの寛解を経験する場合、さらにブースター投与が行
われる。一部の実施形態では、ブースターレジメンは、組成物の月次の投与を含む。別の
実施形態では、ブースターレジメンは、組成物の２カ月に一度の投与を含む。また別の実
施形態では、ブースターレジメンは、組成物の２カ月以上の間隔での投与を含む。他の実
施形態では、ブースターレジメンは、追加的な投与を１回含む。他の実施形態では、ブー
スターレジメンは、追加的な投与を２回以上含む。また別の実施形態では、ブースターレ
ジメンは追加的な投与を２回含む。また別の実施形態では、ブースターレジメンは追加的
な投与を３回含む。別の実施形態では、追加する投与レジメンは、４回以上の追加的な投
与を含む。
別の実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示された弱毒化リステリア株を含む
免疫原性組成物を用いて被験者をブーストすることをさらに含む。別の実施形態では、本
開示の方法は本明細書に開示された弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物のブースタ
ー用量を投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示の方法は被験者にブースター免
疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースター用量は前記免疫
原性組成物の単一のプライミング用量の後に続く。別の実施形態では、プライミング用量
の後に単一のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に２
回のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に３回のブー
スター投与量を投与する。一実施形態では、本明細書に開示された弱毒化リステリアを含
む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に
決定される。
別の実施形態では、ブースター用量は、本明細書に開示されるリステリアを含む免疫原
性組成物の代替形態である。別の実施形態では、ブースター用量は、本明細書に開示され
る免疫原性組成物およびアジュバントを含む。異種「プライムブースト」戦略は免疫応答
および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９－３８（１９９９）；Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９－５０（２００２）
；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ ２０：１２２６－３１（２０
０２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１－７（２００
１）。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対す
る免疫応答を最大化するように思われる。ＤＮＡ株プライミングの後にアジュバント中の
タンパク質を用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター
送達が続くのが、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答の
それぞれの改善の最も効果的なやり方であるように思われる。Ｓｈｉｖｅｒ Ｊ．Ｗ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：３３１－５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ
．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ ２０：１０３９－４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ－
Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ １９：９５－１０２（２０００）；Ｓｉ
ｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：７７１－９（１９９９
）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ ｇａｇ ＤＮＡを
プライムでワクチン接種し、ＨＩＶ ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５
－ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤ
ａ、５％ ＰＯＥ）をＨＩＶ ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答
を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５－ｇａｇ
ブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プラ
イムの後に続くＡｄ５－ｇａｇブーストで、またはＡｄ５－ｇａｇのみで誘発される応答
より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４１５：３３１－５（
２００２）。米国特許出願 公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が
生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性
の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗
原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許 第６，５００，４３２号は対象とな
るポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答
を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０～１０日間または
３～７日間であるのが好ましい。意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべて
の形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフ
ルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ラ
イ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティ
フォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない）が挙げ
られる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物を被験者に単独で投与する。
別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、放射線療法、化学療法、または抗
－ＰＤ－１抗体、ＩＤＯ経路阻害剤等などのチェックポイント阻害剤、またはこれらの任
意の組み合せなどの、しかしこれに限定されない、別のガン療法と一緒に投与される。
一実施形態では、本開示の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロト
コルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本開
示の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状
況のために、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するた
めに使用される。別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、外科手術による
腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用さ
れる。かかる治療に続いて、本開示のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗
原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施
形態では、本開示のワクチンは、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を
死滅させるために使用される。
本明細書で使用される時、単数形（「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」
）は複数形の参照を含むが、その文脈によってそうでないことが明らかに示される場合は
その限りではない。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、こ
れらの混合物を含む複数の化合物を含む場合がある。
本出願全体を通して、本開示の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。
範囲の形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、本発明の範囲の一定不動
の制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述
はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数値を具体的に開示した
ものと考えるべきである。例えば、１～６などのような範囲の記述は、１～３、１～４、
１～５、２～４、２～６、３～６、等々などの具体的に開示された部分的範囲、ならびに
この範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えるべきで
ある。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
本明細書に数値的範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された
数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１に示す数と第２に示す数と「の間の
範囲」という句、および第１に示す数「から」第２に示す数「までの範囲」という句は、
本明細書で互換的に使用され、第１に示す数および第２に示す数ならびにそれらの間のす
べての分数および整数を含むことを意味する。
「方法」という用語は、化学技術、薬学技術、生物学技術、生化学技術、および医術の
実践者に既知であるか、または既知の様式、手段、技法、および手順からこれらの施術者
によって容易に開発される様式、手段、技法、および手順を含むがこれに限定されない、
所与の課題を遂行するための様式、手段、技法、および手順を包含することが当業者には
理解されるであろう。
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示され
る。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されうることが当業者
には理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手
順、および構成成分は詳細には記述されていない。
医薬的剤形および投与
別の実施形態では、非経口的に、ガン近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈
内に、皮内に、皮下に、経口で、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内
になどの当業者に既知の任意の方法によって、本開示のワクチン、免疫原性組成物、また
は組み換え型リステリアを含有する医薬組成物を被験者に投与する。
一実施形態では、被験者内の少なくとも１つのガンを治療、抑制、または阻害する方法
が本明細書に開示され、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含
む。
一実施形態では、特定のガンまたは腫瘍に感受性があることが知られている特異的な母
集団で、本明細書に開示された免疫原性組成物を投与することによってガンまたは腫瘍が
防止される場合がある。一実施形態では、こうした感受性は、一実施形態で、喫煙によっ
てある母集団が肺ガンになりやすくなる場合があるなど、環境的因子による場合があり、
一方で別の実施形態では、こうした感受性は遺伝的因子による場合があり、例えば、ＢＲ
ＣＡ１／２突然変異を持つ母集団は、一実施形態では乳ガンに、また別の実施形態では卵
巣ガンに対する影響を受けやすい場合がある。別の実施形態では、染色体８ｑ２４、染色
体１７ｑ１２、および染色体１７ｑ２４．３での１つ以上の突然変異は、当該技術で既知
のとおり、前立腺ガンに対する感受性を高めうる。ガン感受性に寄与するその他の遺伝的
因子および環境的因子は当該技術分野で既知である。
本明細書に開示される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は
経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液
状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、
ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液
、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発
明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本開
示の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセル
を含む。
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋
肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマル
ション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静
脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、
医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の
実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処
方される。
「免疫原性組成物」、「組成物」、および「医薬組成物」という用語は交換可能に使用
される場合がある。例えば、一実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に記述される
組み換え型リステリア、およびアジュバントを包含する場合がある。別の実施形態では、
免疫原性組成物は本明細書に開示された組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では
、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に開示されたアジュバントを含
む。本明細書にさらに開示されているとおり、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する
、またはＴエフェクター細胞に対する制御性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応
答を引き出すことも理解されるべきである。
「医薬組成物」という用語は、リステリア株を医薬的に許容される担体または希釈剤と
ともに含む治療的に有効な量の活性成分（複数可）を包含する。
「投与する」という用語は被験者に本発明の組成物との接触をもたらすことを包含する
ことを当業者は理解するであろう。一実施形態では、投与はインビトロで、すなわち、試
験管内で、またはインビボで、すなわち、生命体、例えば、ヒトの細胞または組織の中で
遂行することができる。一実施形態では、本開示は、本開示のリステリア株およびその組
成物を被験者に投与することを包含する。
一実施形態では、「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態
では、「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では、「治療する」と
は疾患の発生率を減少することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の症状
を軽快することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは患者のパフォーマンスのな
い生存率または全体的な生存率が増加することを指す。別の実施形態では、「治療する」
とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では、「治療する」とは寛解を誘
発することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を減速することを指
す。別の実施形態では、腫瘍またはガンに関する場合、「処置する」は腫瘍またはガンの
退行を誘発することを指す。「減少する」、「抑制する」、および「阻害する」という用
語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。
一実施形態では、「治療する」という用語は、療法的な治療および予防または防止手段
の両方を意味するが、目的は本明細書に記述されるように、標的化された病理学状態また
は障害を予防または少なくすることである。したがって、一実施形態では、治療すること
は、疾患、障害、もしくは病状、またはこれらの組合せに直接的に影響するもしくはそれ
を治癒すること、抑制すること、阻害すること、防止すること、その重症度を減少するこ
と、その発症を遅延すること、それに関連する症状を減少することを含む場合がある。し
たがって、一実施形態では、「治療する」ことは、とりわけ、進行を遅延すること、寛解
を早めること、寛解を誘発すること、寛解を増強すること、回復を加速すること、代替治
療に対する有効性を増加することもしくは耐性を減少すること、またはこれらの組合せを
意味する。一実施形態では、「防止する」または「妨げる」ことは、とりわけ、症状の発
症を遅延すること、疾患の再発を防止すること、再発の発症の数または頻度を減少するこ
と、症候性の症状の発現の間の潜伏を増加すること、またはこれらの組合せを意味する。
一実施形態では、「抑制する」または「阻害する」ことは、とりわけ、症状の重症度を減
少すること、急性症状の発現の重症度を減少すること、症状の数を減少すること、疾患に
関係した症状の発生率を減少すること、症状の潜伏を減少すること、症状を軽快すること
、二次性症状を減少すること、二次感染を減少すること、患者の生存を延長すること、ま
たはこれらの組合せを意味する。
一実施形態では、症状は一次性であるが、一方で別の実施形態では、症状は続発性であ
る。一実施形態では、「一次」は特定の疾患または障害の直接的な結果である症状を指す
が、一方で一実施形態では、「続発性」は主因に由来する、その結果としての症状を指す
。一実施形態では、本開示で使用するための化合物は、一次症状、または続発性症状、ま
たは二次合併症を治療する。別の実施形態では、「症状」は疾患または病的状態の何らか
の兆候である場合がある。
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５
％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または
別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、
プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
「被験者」という用語は、症状もしくはその後遺症に対するまたはその症状になりやす
いことに対する療法を必要とする、成人のヒト、またはヒトの子ども、ティーンエージャ
ー、もしくは青年を含むことができ、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウ
マ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類を包含してもよいことを当業者は理解
するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者
」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
治療の目的については、［哺乳類」という用語は哺乳類と分類されたあらゆる動物を指
し、ヒト、飼育動物および家畜物、ならびに動物園の動物、スポーツ用の動物、または愛
玩用動物（犬を含むイヌ科の動物、およびウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ等々など）を
含むがこれに限定されないことを当業者は理解するであろう。
腫瘍の治療に関して「治療的に有効な量」とは、以下の効果のうちの１つ以上を引き起
こす能力を有する量を指す。（１）増殖の減速および完全な増殖停止を含むある程度の腫
瘍増殖の阻害、（２）腫瘍細胞の数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）周辺器官へ
の腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（５）転移の阻
害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（６）腫瘍の退行もしくは拒絶をもた
らす場合があるが、必ずしもそうでなくてもよい、抗腫瘍免疫応答の強化、および／また
は（７）障害に関連した１つ以上の症状のある程度の軽減。腫瘍の治療の目的については
、本明細書に開示されるワクチンの「治療的に有効な量」は、経験的におよび習慣的な様
式で決定される場合がある。
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示され
る。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当
業者には理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法
、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。したがって、これらの実施例は本
発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
材料および実験方法（実施例１～２）
（実施例１） ＬＬＯ－抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ－１腫瘍をＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ－Ｈ
ａ－ｒａｓガン遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、米国メリーランド州Ｂａ
ｌｔｉｍｏｒｅ）によって提供されたＴＣ－１は、ＨＰＶ－１６ Ｅ６ および Ｅ７で
低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またｃ－Ｈａ－ｒａｓガン遺
伝子で形質転換される。ＴＣ－１を、ＲＰＭＩ １６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ
－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、
１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃ
Ｍ）の２－ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナ
ショナルコレクションタイプ培養液－１０９培地中、３７°で、１０％のＣＯ２を用いて
成長させた。Ｃ３は、ＨＰＶ １６の完全ゲノムで不死化し、ｐＥＪ－ｒａｓで形質転換
されたＣ５７ＢＬ／６マウスからのマウスの胎芽細胞である。ＥＬ－４／Ｅ７は、Ｅ７を
用いてレトロウイルスによって形質導入した胸腺腫ＥＬ－４である。
Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖
使用されたリステリア株は、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７（エピソームの発現系内のｈｌｙ－Ｅ
７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ－Ｅ７（リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーＥ７
遺伝子カセット）、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＮＰ（「ＤＰ－Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内の
ｈｌｙ－ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ－Ｇａｇ（「ＺＹ－１８」、染色体へと組込まれ
る単一コピーＨＩＶ－１Ｇａｇ遺伝子カセット）である。Ｅ７を、プライマー５’－ＧＧ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ－３’（配列番号：２１、ＸｈｏＩ部位は下
線付き）および５’－ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ－３
’（配列番号：２１、ＳｐｅＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによって増幅し、ｐＣ
Ｒ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）へと連結さ
せた。ｐＣＲ２．１をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによって消化してＥ７を切り離してｐＧＧ－５
５へと連結した。このｈｌｙ－Ｅ７融合遺伝子および多能性の転写因子ｐｒｆＡをマルチ
コピーシャトルプラスミド（Ｗｉｒｔｈ Ｒ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１
６５：８３１，１９８６）であるｐＡＭ４０１へとクローニングし、ｐＧＧ－５５を生成
した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物（以下に「ΔＬＬＯ」と称される溶血性の
Ｃ末端を欠いている）の最初の４４１ ＡＡの発現を駆動し、これはＸｈｏＩ部位によっ
てＥ７遺伝子に連結され、ｈｌｙ－Ｅ７融合遺伝子を生じ、これは転写されてＬＬＯ－Ｅ
７として分泌される。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ－７（ペンシルバニア大学の
Ｄｒ．Ｈａｏ Ｓｈｅｎによって提供された）のｐＧＧ－５５を用いた形質転換が、イン
ビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ～図１Ｂ）。ｈｌｙプロモーター
および遺伝子断片は、プライマー５’－ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴ
ＡＧＴＡＴＡＴＴＣ－３’（配列番号：２３、ＮｈｅＩ部位は下線付き）、および５’－
ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ－３’（配列番号：２４、
ＸｈｏＩ部位は下線付き）を用いて作成した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５’－ＧＡ
ＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡ
ＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ－３’（配列番号：２５、ＸｂａＩ部位は下線付き）、およ
び５’－ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ－３’（配列番号：
２６、ＳａｌＩ部位は下線付き）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｌｍ－Ｅ７は、ｈｌｙプロモ
ーターと、Ｅ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含有する発現カセットを、
ＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによって生成した。Ｅ７をプライマー５
’－ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ－３’（配列番号：２７、Ｂ
ａｍＨＩ部位は下線付き）および５’－ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ
－３’（配列番号：２８、ＸｂａＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲ増幅した。次いで
Ｅ７をｐＺＹ－２１シャトルベクターへと連結させた。ＬＭ株１０４０３Ｓを、結果とし
て得られるプラスミドｐＺＹ－２１－Ｅ７を用いて形質転換したが、このプラスミドはＬ
ＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現
カセットを含む。相同性ドメインは、相同的組み換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆ
Ｚドメインへの挿入を可能にする。クローンを、Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメイン
への組込みについてスクリーニングした。細菌をブレインハートインフュージョン培地中
で、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を用いて（Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７およびＬｍ
－ＬＬＯ－ＮＰ）、または用いないで（Ｌｍ－Ｅ７およびＺＹ－１８）、成長させた。細
菌は、アリコートで－８０℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証
した（図２）。
ウエスタンブロット法
リステリア株をルリア－ベルターニ培地内で３７℃にて増殖させ、６００ｎｍで測定さ
れた同一の光学濃度にて採取した。上清をＴＣＡ沈殿させ、０．１ＮのＮａＯＨを補充し
た１×サンプルバッファー中で再懸濁した。同一量の各々の細胞ペレットまたは各々のＴ
ＣＡ沈殿させた上清を、４～２０％のトリスグリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ
、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリ
デンに移し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、
次いでＨＲＰ－結合抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、英国Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ ＥＣＬ検出試薬で顕色し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露光させた。
腫瘍増殖の測定
１日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら２
つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロット
した。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを犠牲にした。各々の時点に対する腫瘍の
測定値は、生きているマウスに対してのみ示されている。
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組み換え型の効果
生後６～８週目のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）が２×１０５
ＴＣ－１細胞を左脇腹の皮下に投与された。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４～５ｍｍ
の触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスの群が、７日目および１４日目に、０
．１ＬＤ５０腹腔内で、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ－Ｅ７（１０６ＣＦ
Ｕ）、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ－Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）
で処置された。
５１Ｃｒリリースアッセイ
生後６～８週間のＣ５７ＢＬ／６マウスが、０．１ＬＤ５０Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、Ｌｍ
－Ｅ７、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＮＰ、またはＬｍ－Ｇａｇで腹腔内免疫化された。免疫化の１０
日後、脾臓を採取した。フィーダー細胞として照射されたＴＣ－１細胞（１００：１、脾
細胞：ＴＣ－１）を用いて、脾細胞を培養液内に定着させ、インビトロで５日間刺激し、
次いで以下の標的を使用して標準的５１Ｃｒリリースアッセイに使用した。ＥＬ－４、Ｅ
Ｌ－４／Ｅ７、またはＥＬ－４でパルスしたＥ７ Ｈ－２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴ
Ｆ）（配列番号：２９）。各３回実施したＥ：Ｔ細胞比は、８０：１、４０：１、２０：
１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間のインキュベーショ
ン後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各々のウェルから取り出した。Ｗａｌｌａ
ｃ １４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）を用いてサンプルをアッセイした。パーセント特異的溶解は、［（一分当たりの実験
計数（ｃｐｍ）－自然発生ｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ－自然発生ｃｐｍ）］×１００として
決定された。
ＴＣ－１特異的増殖
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０を用いて免疫化し、２０日後に１ＬＤ５０のＬ
ｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、Ｌｍ－Ｅ７、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＮＰ、またはＬｍ－Ｇａｇを用いて腹腔
内注射によってブーストした。ブースティングの６日後、免疫化マウスおよび無処置マウ
スから脾臓を採取した。脾細胞を５×１０５／ウェルで、平底９６－ウェルプレート内に
、２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、または３×１０３の照射ＴＣ－１細
胞／ウェルをＥ７ Ａｇ源として用いて、またはＴＣ－１細胞なし、もしくは１０μｇ／
ｍＬのＣｏｎ Ａありで、培養液内に定着させた。４５時間後に０．５μＣｉ［３Ｈ］チ
ミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（
米国コネチカット州Ｏｒａｎｇｅ）を使用して１８時間後に採取され、Ｗａｌｌａｃ １
４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的
ｃｐｍ－Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。
フローサイトメトリー解析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．１ ＬＤ５０ Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７またはＬｍ－Ｅ７を
用いて静脈内（ｉ．ｖ．）免疫化し、３０日後にブーストした。ＣＤ８（５３－６．７、
ＰＥ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ－１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７
Ｈ－２Ｄｂ四量体に対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登
録商標）フローサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、）を
使用して実施した。ブーストの５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩ
ＶＴＦ）（配列番号：２９）または対照（ＨＩＶ－Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ－２Ｄ
ｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）にて染色した。四量体は１／２００に希釈して使用され
、これらの四量体は、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ Ｒ．Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ、米
国ミネソタ州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）およびＮＩＡＩＤ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆ
ａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラム
によって提供された。Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞が解析され
た。
Ｂ１６Ｆ０－Ｏｖａ実験
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６Ｆ０－Ｏｖａ細胞を接種した。３
日目、１０日目、および１７日目に、０．１ＬＤ５０Ｌｍ－ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌ
ｍ－ＬＬＯ－ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群を免疫化し、８匹のマウ
スは処置しないままにした。
統計
腫瘍径の比較のために、各々の群に対する腫瘍サイズの平均およびＳＤが決定され、ス
チューデントのｔ－検定によって統計的有意性が決定された。ｐ≦０．０５が有意と見な
された。
結果
Ｌｍ－Ｅ７およびＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７がＴＣ－１増殖に影響を与える能力に関して比較
された。皮下腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に定着した。７日後、腫瘍は触診可
能なサイズ（４～５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０ｍ－Ｅ７
、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、または対照としてのＬｍ－ＧａｇおよびＬｍ－ＬＬＯ－ＮＰをマ
ウスにワクチン接種した。Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７は、定着したＴＣ－１腫瘍の７５％の完全
な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された（図３
）。対照的に、Ｌｍ－Ｅ７およびＬｍ－Ｇａｇを用いた免疫化は、腫瘍退行を誘発しなか
った。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Ｌｍ－Ｌ
ＬＯ－Ｅ７に対しては異なる免疫化プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験
では、単一の免疫化で、マウスの定着した５ｍｍのＴＣ－１腫瘍を治癒することができた
。
他の実験では、２つの他のＥ７を発現する腫瘍細胞株：Ｃ３およびＥＬ－４／Ｅ７で類
似の結果が得られた。Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するため
に、腫瘍を除去した動物にＴＣ－１またはＥＬ－４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目ま
たは４０日目に再負荷した。Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７を用いて免疫化した動物は実験終了まで
腫瘍がないままであった（ＴＣ－１の場合１２４日目、ＥＬ－４／Ｅ７に対しては５４日
目）。
したがってΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現は抗原の免疫原性を強化す
る。
（実施例２） ＬＭ－ＬＬＯ－Ｅ７治療がＴＣ－１特異的脾細胞増殖を引き出す
Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７を有するＬｍ－Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、Ｅ７特
異的な増殖性の応答、抗原特異的な免疫能の測定が免疫化したマウスで測定された。脾細
胞においてＥ７の供給源として照射したＴＣ－１細胞に曝露したとき、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ
７で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。ＴＣ－１比は２０：１、４０：１、８０
：１、および１６０：１である（図４）。反対に、Ｌｍ－Ｅ７およびｒＬｍ対照免疫化マ
ウスからの脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖しか示さなかった。
（実施例３）ＡｃｔＡ－Ｅ７およびＰＥＳＴ－Ｅ７融合が抗腫瘍免疫性を与える
材料および実験方法
Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７の構築
Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７は、ａｃｔＡタンパク質の切断版に融合されるＥ７タンパク質を
発現するプラスミドを含むＬＭの組み換え型株である。Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７は、ｐＤＰ
－２０２８を修飾することにより構成されるプラスミドベクターｐＤＤ－１をリステリア
に導入することにより生成された。ｐＤＤ－１は、ＡｃｔＡ－Ｅ７の発現および分泌を駆
動する３１０ｂｐのｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）のコピーを発
現する発現カセットと、４つのＰＥＳＴ配列を含む１１７０ｂｐのＡｃｔＡ遺伝子（切断
ＡｃｔＡポリペプチドは分子の最初の３９０のＡＡから成る）と、３００ｂｐのＨＰＶ
Ｅ７遺伝子と、１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病毒性遺伝子の発現を制御）と、形質転
換細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）とを含
む（Ｓｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈ
ｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．、１３０：９２－９７）。
ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片は、ｐＧＧ５５（実施例１）から、
プライマー５’－ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ－
３’（Ｘｂａ Ｉ部位は下線付き；配列番号：３０）およびプライマー５’－ＡＴＣＴＴ
ＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ
－’３（Ｎｏｔ Ｉ部位は下線付き。最初の１８ヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子と重複；
配列番号：３１）を使用してＰＣＲ増幅された。ＡｃｔＡ遺伝子は、Ｌｍ １０４０３Ｓ
野生型ゲノムからプライマー５’－ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ－３’（ＮｏｔＩ部位は下線付き；配列番
号：３２）およびプライマー５’－ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧ
ＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ－３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号：３
３）を使用してＰＣＲ増幅された。Ｅ７遺伝子は、ｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ－Ｅ７）から、
プライマー５’－ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡ
ＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ－３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号：３４）およびプライ
マー５’－ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴ
ＧＡＧＡＡＣＡ－３’（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号：３５）を使用してＰＣＲ増
幅された。ｐｒｆＡ遺伝子は、Ｌｍ １０４０３Ｓ野生型ゲノムから、プライマー５’－
ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴ
ＴＴ－３’（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号：３６）およびプライマー５’－ＧＧＧ
ＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ－３’（ＳａｌＩ部位は下線付き
；配列番号：３７）を使用してＰＣＲ増幅された。ｈｌｙプロモーター－ＡｃｔＡ遺伝子
融合（ｐＨｌｙ－ａｃｔＡ）は、精製したｐＨｌｙ ＤＮＡおよび精製したＡｃｔＡ Ｄ
ＮＡから、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３０）および下流ＡｃｔＡプライマー（
配列番号：３３）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。
ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７－ｐｒｆＡ）に融合されたＥ７遺伝子は、精製したＥ７ ＤＮＡ
および精製したｐｒｆＡ ＤＮＡから、上流Ｅ７プライマー（配列番号：３４）および下
流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：３７）を使用してＰＣＲ生成および増幅された
。
Ｅ７－ｐｒｆＡ融合生成物に融合されたｐＨｌｙ－ａｃｔＡ融合生成物は、精製した融
合ｐＨｌｙ－ａｃｔＡ ＤＮＡ生成物および精製した融合Ｅ７－ｐｒｆＡ ＤＮＡ生成物
から、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３０）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー
（配列番号：３７）を使用してＰＣＲ生成および増幅され、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）に連結された。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ
１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）は、ｐＣＲＩＩ－
ＡｃｔＡＥ７で形質転換された。溶解および分離の後、プラスミドは、ＢａｍＨＩ（期待
される断片サイズ７７０ｂｐおよび６４００ｂｐ（またはインサートがベクター：２５０
０ｂｐおよび４１００ｂｐに反転された時））およびＢｓｔＸＩ（期待される断片サイズ
２８００ｂｐおよび３９００ｂｐ）を使用した制限分析によってスクリーニングされ、ま
た上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３０）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配
列番号：３７）を使用したＰＣＲ分析を用いてスクリーニングされた。
ｐＨｌｙ－ＡｃｔＡ－Ｅ７－ｐｒｆＡ ＤＮＡインサートはＸｂａ ＩおよびＳａｌ
Ｉを用いた二重消化によってｐＣＲＩＩから切り離され、またこれもＸｂａ Ｉ および
Ｓａｌ Ｉを用いて消化されたｐＤＰ－２０２８へと連結された。ＴＯＰ１０’Ｆ構成
要素大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を発現系ｐＡｃ
ｔＡＥ７で形質転換した後、クロラムフェニコール耐性クローンが、上流ｐＨｌｙプライ
マー（配列番号：３０）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：３７）を使用
してＰＣＲ分析によってスクリーニングされた。。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンがブレ
インハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ（マイクログラム
）／ｍｌ（ミリリットル）、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．を使用）内で培養
され、ｐＡｃｔＡＥ７がミディプレップＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ
ａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して細菌細胞から分離された。ペニシリン処置したリス
テリア（株ＸＦＬ－７）のｐｒｆＡ陰性株は、Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓら（１９９４、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２０９－２２１８）が記述しているように発現系ｐＡｃｔＡ
Ｅ７を用いて形質転換され、クローンはプラスミドの保持のためにインビボで選択された
。クローンをクロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）入りのブレインハートインフュ
ージョン中で３７℃にて増殖させた。細菌をアリコートで－８０℃にて凍結した。
抗原発現のイムノブロット検証
Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７がＡｃｔＡ－Ｅ７を分泌する（約６４ｋＤ）ことを検証するため
に、リステリア株をルリア－ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃にて増殖させた。トリク
ロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎの水酸化ナト
リウムを用いて１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一の量の各々のＴＣＡ沈殿し
た上清を４％～２０％のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に負荷した。ゲルを二フッ化
ポリビニリデン膜に導入し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ
）でプローブし、次いで１：５０００西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａ
ｌｆｏｎｔ）でプローブした。ブロットはＡｍｅｒｓｈａｍ強化化学発光検出試薬を用い
て発色させ、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝露した（図５Ａ
）。
Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７、Ｌｍ－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７、およびＬｍ－Ｅ７ｅｐｉの構築（図
６Ａ）
Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７は、それがプロモーターおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列のみ
、特にＬＬＯの最初の５０個のＡＡを含有すること以外はＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７と同一であ
る。Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７を構築するために、ＳＯＥ（重複延長による遺伝子スプライシ
ング）ＰＣＲ技法を使用して、ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を全長のＥ７遺伝
子に融合した。Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ－ＰＥＳＴ遺伝子断片をＬＬＯの最初の４４１個
のＡＡを含有するプラスミドｐＧＧ－５５から増幅し、従来のＰＣＲ技法によって一緒に
スプライシングした。最終的なプラスミドｐＶＳ１６．５を作り出すために、ｈｌｙ－Ｐ
ＥＳＴ－Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子を、インビトロでの選択のためのクロラムフェニ
コール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１へとサブクローンし、得られたプラスミ
ドを使用してＸＦＬ－７を形質転換した。
Ｌｍ－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７は、それがＰＥＳＴ配列を欠いていること以外は、Ｌｍ－ＬＬ
Ｏ－Ｅ７と同一である組み換え型リステリア株である。これは、ＰＥＳＴ含有領域（ｂｐ
３３３－３８７）をｈｌｙ－Ｅ７融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを
使用してエピソーム発現系を構築した以外は、Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７について本質的に記
載されたように作成された。Ｌｍ－Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯなしでＥ７
を分泌する組み換え型株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドは、ｈｌｙ
プロモーターの遺伝子断片、およびＥ７遺伝子に融合したシグナル配列を含有する。この
構築体は、染色体の中へと組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを発現する本来のＬｍ－
Ｅ７とは異なる。Ｌｍ－Ｅ７ｅｐｉは、発現されたＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ－ＬＬ
Ｏ－Ｅ７、Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７、およびＬｍ－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７と完全に同系である。
結果
Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７対Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７によって誘発した抗腫瘍免疫性を比較する
ために、２×１０５ＴＣ－１腫瘍細胞をマウス内に皮下移植し、触知可能サイズ（おおよ
そ５ミリメートル［ｍｍ］）まで増殖させた。７日目および１４日目に、マウスをＬｍ－
ＡｃｔＡ－Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）（十字）、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７（１０８ＣＦＵ）（
四角）、またはＬｍ－Ｅ７（１０６ＣＦＵ）（丸）いずれかの１つのＬＤ５０でマウスを
腹腔内で免疫化した。２６日目までに、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７およびＬｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７
でのすべての動物は腫瘍がなく、そのままであったが、一方ですべての無処置の動物（三
角）およびＬｍ－Ｅ７で免疫化した動物は大きい腫瘍を成長させた（図５Ｂ）。したがっ
て、ＡｃｔＡ－Ｅ７融合でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
加えて、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７、Ｌｍ－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７、およ
びＬｍ－Ｅ７ｅｐｉを、Ｅ７発現腫瘍の退行を生じさせるそれらの能力について比較した
。皮下 ＴＣ－１腫瘍は４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に定着した。腫瘍が４～
５ｍｍに達した後、マウスを８匹のマウスの５つの群に分けた。各々の群を４つの組み換
え型ＬＭワクチンのうちの１つで処置し、１つの群は未処置のまま放置した。Ｌｍ－ＬＬ
Ｏ－Ｅ７およびＬｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７は、それぞれ５／８および３／８の事例では定着し
た腫瘍の退行を誘発した。いずれの時点においても、Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７またはＬｍ－
ＬＬＯ－Ｅ７で処置したマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしな
がら、ＰＥＳＴ配列、Ｌｍ－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７、およびＬｍ－Ｅ７ｅｐｉを含まないＥ７
を発現したワクチンは、１つを除いて全てのマウスで腫瘍退行を生じなかった（図６Ｂ、
上のパネル）。これは２つの実験の代表であり、２８日目における平均腫瘍サイズの統計
的に有意な差がＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７またはＬｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７で処置した腫瘍とＬｍ－
Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７で処置した腫瘍との間で観察された（Ｐ＜０．
００１、スチューデントのｔ検定；図６Ｂ、下のパネル）。加えて、四量体陽性脾細胞の
パーセンテージの増大は、ＰＥＳＴ含有ワクチンをワクチン接種したマウスの脾臓におけ
る３つの実験にわたって再現性が見られた（図６Ｃ）。したがって、ＰＥＳＴ－Ｅ７融合
を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
（実施例４）ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列へのＥ７の融合はＥ７特異的な免
疫性を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８ ＋ 細胞を発生させる
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０５
ＴＣ－１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ）を含む５０
０ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮
下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内免疫し、脾
臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上
で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ １０培地を含有する試験管内で４℃にて一晩インキ
ュベートした。腫瘍を鉗子を用いて細かく切り刻み、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍＬ
の酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ
－１）とともに３７℃で１時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを
通して濾過し、四量体およびＩＦＮ－γ染色のために、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋０
．０５％のＮａＮ３で洗浄した。
脾細胞および腫瘍細胞を１０７細胞／ｍＬのブレフェルジンＡの存在下で、１マイクロ
モル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５
０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４ Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキ
ュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、浸透させ、浸透
キットＧｏｌｇｉ－ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ－Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して固定し、Ｉ
ＦＮ－γに対して染色した。５００，０００事象を２レーザーフローサイトメーター、Ｆ
ＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して獲得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ
）を使用して分析した。活性化（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ－γ分泌
細胞のパーセンテージを計算した。
四量体染色のために、Ｈ－２Ｄｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド
（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号：２７）を負荷し、室温で１時間染色し、抗アロフィコ
シアニン（ＡＰＣ）結合ＭＥＬ－１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ－結合ＣＤ８＋で４
℃にて３０分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を
比較して細胞を解析した。
結果
抗原特異的免疫性を強化するＬｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７の能力を解析するために、マウスに
ＴＣ－１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ－Ｅ７（１
×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫
化するか、あるいは未処置とした（無処置）。Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７およびＬｍ－ＡｃｔＡ
－Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ－Ｅ７または無処置マウスにおけるよりも、より高
いパーセンテージのＩＦＮ－γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）および四量体特異的なＣＤ
８＋細胞（図７Ｂ）を含有した。
別の実験では、腫瘍を持つマウスにＬｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、Ｌｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７、Ｌｍ
－ΔＰＥＳＴ－Ｅ７、またはＬｍ－Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球
のレベルを測定した。０．１ＬＤ５０の４つのワクチンを用いて、７日目および１４日目
にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用い
て、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセン
テージの増大が、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７およびＬｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ７を用いてワクチン接種
したマウスで見られた（図８Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図
８Ｂ）。
したがって、Ｌｍ－ＬＬＯ－Ｅ７、Ｌｍ－ＡｃｔＡ－Ｅ７、およびＬｍ－ＰＥＳＴ－Ｅ
７は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
材料および実験方法（実施例５～１０）
細菌株、形質転換、および選択
大腸菌株ＭＢ２１５９が、標準的なプロトコルを使用して、形質転換のために使用され
た。細菌細胞は、Ｈ２Ｏを用いた洗浄によって電気穿孔法のために準備された。
大腸菌株ＭＢ２１５９（Ｓｔｒｙｃｈ Ｕ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ Ｌｅｔｔ．２００１ Ｍａｒ １５；１９６（２）：９３－８）は、Ｄ－アラニン・
ラセマーゼを合成することができないａｌｒ（－）／ｄａｄＸ（－）欠損突然変異体であ
る。同様に、リステリア株Ｌｍ ｄａｌ（－）／ｄａｔ（－）（Ｌｍｄｄ）は、ｄａｌ遺
伝子およびｄａｔ遺伝子の部分的な欠失に起因してＤ－アラニン・ラセマーゼを合成する
ことができない。
プラスミド構築
公開されているｐｌｃＡ遺伝子の配列（Ｍｅｎｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ
．１９８９ ５７、３６９５－３７０１）を使用して、染色体ＤＮＡから遺伝子を増幅す
るためにＰＣＲが使用された。次いで、増幅された製品はＳａｌＩを生成したおよびＸｂ
ａＩを生成したＤＮＡ端部を使用してｐＡＭ４０１へと連結され、ｐＤＰ１４６２を生成
する。
ｐｒｆＡを単独で含有するプラスミドｐＤＰ１５００は、ｐＤＰ１４６２から、ｐｌｃ
Ａ遺伝子、塩基４２９～１３４９（Ｍｅｎｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．、同上）を除去するこ
とによって、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩを用いた制限、それらを鈍らせるためのＴ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼを使用したＤＮＡ端部の処置、および細胞内連結の後、構造化される。
ｐｌｃＡプロモーターおよびｐｌｃＡの３’端部の一部を含有するプラスミドｐＤＰ１
４９９は、ｐｌｃＡ内部断片、塩基４２８～８８２（Ｍｅｎｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９ ５７，３６９５－３７０１）を除去することによっ
て、ｐＤＰ１３３９から、ＰｓｔＩおよびＮｓｉＩを用いた制限、および細胞内連結の後
、構造化された。
ｐＤＰ１５２６（ｐＫＳＶ７：：ΔｐｌｃＡ）は、ＢＡＭＨＩおよびＸｂａＩ、４６８
ｂｐのｐｌｃＡの５’端部を含有するｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡからのＸｂａＩおよびＮ
ｓｉＩで生成した断片（塩基８８２～１３５１、Ｍｅｎｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．、同上）
、および５０１ｂｐのｐｌｃＡの３’端部を含有するｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡ ｐｒｆ
ＡからのＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで生成した断片（塩基７７～４２９、Ｍｅｎｇａｕｄ
ｅｔ ａｌ．、同上）で制限されたｐＫＳＶ７の単一の３部分からなる連結によって構
造化された。
ｐｒｆＡプロモーター、塩基１～４２９（Ｍｅｎｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．、同上）は、
ｐＤＰ１４６２のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ二重消化によって分離され、またこれに続い
て断片はＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで制限されたｐＫＳＶ７へと連結され、ｐＤＰ１４９
８を生成した。２つのランダムにＨｉｎｄＩＩＩで生成した長さがおよそ３ｋｂである１
０４０３Ｓ染色体ＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩで制限されたｐＫＳＶ７へと連結され、
ランダム組み込み対照プラスミドｐＤＰ１５１９およびｐＤＰ１５２１を生成した。
Ｌ．モノサイトゲネス突然変異体株の構築
Ｌ．モノサイトゲネス株ＤＰ－Ｌ１３８７は、構造化されたＳＬＣＣ ５７６４のＴｎ
９１７－ＬＴＶ３バンクから、減少したレシチナーゼ（ＰＣ－ＰＬＣ）を用いて突然変異
体として分離された（前述されているように（Ｃａｍｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０，１７２，３７３８－３７４４）。Ｔｎ９１７－ＬＴＶ３挿入
の部位はトランスポゾン染色体ＤＮＡ結合をシークエンシングすることによって決定され
る（前述されているように（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９
０ ５８，３７７０－３７７８）。Ｌ．モノサイトゲネスはプラスミドＤＮＡを用いて形
質転換される（前述されているように（Ｃａｍｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．、同上））。Ｌ．
モノサイトゲネス内のｐＡＭ４０１、ｐＫＳＶ７、およびこれらの誘導体の維持のための
選択的な圧力が、培地１ｍＬ当たり１０μｇのクロラムフェニコールの存在下でかけられ
た。加えて、ｐＫＳＶ７誘導体の維持は、３０℃（グラム陽性細菌内でのプラスミド複製
のために許容できる温度）における増殖を必要とした。
Ｌ．モノサイトゲネス染色体の中へのｐＫＳＶ７誘導体の組み込みは、プラスミド上の
Ｌ．モノサイトゲネスＤＮＡ配列とこれらの対応する染色体の対立遺伝子との間の相同的
組み換えによってによって生じた。組込突然変異体は、培地１ｍＬあたり１０μｇのクロ
ラムフェニコールを含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）培地中で４０℃（
ｐＫＳＶ７の複製を許容しない温度）にておよそ３０世代の間増殖することによって富化
された。これに続いて各々の組込み株を、培地１ｍＬあたり１０μｇのクロラムフェニコ
ールを含有するＢＨＩ寒天培養基上でコロニー精製し、４０℃にてインキュベートした。
各々の組込み株から分離された染色体ＤＮＡのサザンブロット解析は組込まれたプラスミ
ドの存在を確認した。
ＤＰ－Ｌ１５５２の構築は、上述のように、部分二倍体中間体を生成するためのｐＫＳ
Ｖ７誘導体ｐＤＰ１５２６の組込みによって達成された。組込まれたプラスミドの細胞内
の相同的組み換えを通した自然発生的な切り離しが低い頻度で生じる。プラスミドが染色
体から切り離された細菌を、ＢＨＩ培地中で３０℃におけるおよそ５０世代の間の増殖に
よって濃縮した。この工程の間の選択圧の特性は、未知であるが、組込まれている温度感
応性プラスミドを含有する株のわずかな増殖欠陥に起因しているかもしれない。切り離し
事象、すなわち３’の欠失の配列の間の相同的組み換えから結果として得られもののおよ
そ５０％は、結果として染色体上の野生型対立遺伝子に対するΔｐｌｃＡの対立遺伝子の
交換を生じる。
切り離されたプラスミドは細菌をＢＨＩ中で４０℃にておよそ３０世代増殖することに
よって回復される。染色体上にΔｐｌｃＡ対立遺伝子を保持するプラスミドから回復した
細菌は、ＢＨＩ寒天培養基／２．５％の卵黄／２．５％のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（
ＢＨＩ／卵黄寒天培養基）の５ｍＬの覆いを含有するＢＨＩ寒天培養基プレート上で増殖
した後、コロニーを包囲する濁ったゾーンを生成できないことによって識別される。濁り
ゾーンは、卵黄中のＰＩのＰＩ－ＰＬＣ加水分解の結果から生じ、不溶性のジアシルグリ
セロールの沈殿が得られる。Ｌ．モノサイトゲネス染色体上の正しいｐｌｃＡ欠失は、Ｐ
ＣＲおよび欠失にわたる配列決定を使用して欠失した対立遺伝子を増幅することによって
確認される。
したがって、ＰＩ－ＰＬＣ陰性突然変異体（ｐｌｃＡ欠失突然変異体）は、本開示によ
り弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチンを生成するために使用される場合がある。他の突
然変異体、すなわち、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、およびｐｌｃ
ＡとｐｌｃＢとの両方を欠いている二重変異体が同じ方法を使用して作成され、これらの
すべては、弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチンを生成するためにも本開示により使用さ
れてもよい。本開示が与えられると、当業者は上述のものに加えて他の弱毒化突然変異体
を作り出すことができることになる。
Ｌｍｄｄの構築
ｄａｌ遺伝子は、本来の８５０－ｂｐｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の５’端部からの４５０
－ｂｐ断片とｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の３’端部からの４５０－ｂｐ断片との間に、染色
体遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子を担持する温度感受性シャトルプラスミドｐＫＳ
Ｖ７（Ｓｍｉｔｈ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２ Ｊｕｌ－Ａｕｇ；
７４（７－８）：７０５－１１）との間の二重の対立遺伝子交換によって、当初不活性化
されていた。これに続いて、遺伝子の８２％をカバーするｄａｌ欠失突然変異体は、相同
性領域を望ましい欠失を包囲する無傷の遺伝子（遺伝子の上流および下流の配列を含む）
の５’および３’端部から搬送するｐＫＳＶ７を用いた類似の交換反応によって構造化さ
れた。ＰＣＲ解析は、この染色体の欠失の構造を確認するために使用される。
染色体のｄａｔ遺伝子は、類似の対立遺伝子交換反応によって不活性化される。ｐＫＳ
Ｖ７は、無傷のｄａｔ遺伝子の５’および３’の両方の端部からＰＣＲに由来する４５０
ｂｐの断片を搬送するように修正される（配列の上流および下流の遺伝子を含む）。これ
らの２つの断片は適切なＰＣＲによって連結される。この構築体の染色体の中への交換は
、結果としてＰＣＲ解析によって確認されたｄａｔ遺伝子の中心塩基の３０％の欠失をも
たらす。
細菌培養およびリステリアのインビボ継代
大腸菌は以下の標準的な方法で培養された。リステリアをＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ、米国
ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）＋５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの中で２５０ｒｐｍ
のシェーキングで３７℃にて増殖させ、対数増殖フェーズの間に採取した。Ｌｍ－ＬＬＯ
Ｅ７については、３７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが培地に追加された。増殖速度
論の決定のために、細菌を１０ｍＬのＬＢ＋抗生剤中で１６時間の間増殖させた。ＯＤ６
００ｎｍが測定され、培養液密度が株の間で標準化された。培養液はＬＢ＋の好適な抗生
物質および適用可能な場合はＤ－アラニン中へ１：５０に希釈された。
マウス中でのＬＭの継代
１×１０８ＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスの中に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。３日目
に脾臓を分離し、ＰＢＳ中で均質化した。脾臓懸濁液のアリコートをＬＢプレート上に適
用可能な抗生物質と共にプレーティングした。いくつかのコロニーが拡張し、混合して注
射ストックを定着した。
抗生物質抵抗性因子を有しないプラスミドｐＴＶ３の構築
ｐ６０－ｄａｌカセットの構築。抗生物質抵抗性遺伝子を有しないベクターの構築での
第１の工程は、切断ｐ６０プロモーターの融合のｄａｌ遺伝子への構築である。ＬＭアラ
ニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子（フォワードプライマー：５’－ＣＣＡ ＴＧＧ Ｔ
ＧＡ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ－３’；配列番号：３８）（リバースプライマー
：５’－ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＴＡ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＧ－
３’；配列番号：３９）および最小限のｐ６０プロモーター配列（フォワードプライマー
：５’－ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＡＡタグＴＴＧ ＧＴＡタグＴＣＣ－３’；配列番
号：４０）（リバースプライマー：５’－ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＴＧ Ｔ
ＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＣＴ ＣＴＣ－３’；配列番号：４１）は、
ＰＣＲ増幅によってＬＭ株１０４０３Ｓのゲノムから分離される。プライマーは、重なっ
た延長部の接合（ＳＯＥ）－ＰＣＲによるｐ６０およびｄａｌのこれに続く融合のために
、ｐ６０配列の上流ＰａｃＩ部位と、ｄａｌ配列の下流のＮｈｅＩ部位（制限部位を太字
で示す）と、ｐ６０プロモーターの下流の重なっているｄａｌ配列（最初の１８ｂｐ）と
を導入した。切断ｐ６０プロモーターの配列は以下のとおりである。 ＣＡＡＡＴＡＧ
ＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣ
ＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＴ
ＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＧＧ
ＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣ（配列番号：４２）（Ｋ
ｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７３：４６６８－７４、１９９１
）。ＳＯＥ－ＰＣＲを使用して、ｐ６０およびｄａｌ ＰＣＲ産物はクローニングベクタ
ーｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）へと
融合およびクローニングされる。
抗生物質抵抗性遺伝子のｐＧＧ５５からの除去。これに続くｐＧＧ５５からクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を除去するためおよびｐ６０－
ｄａｌカセットを導入するためのクローニング戦略は、グラム陽性複製領域（ｏｒｉＲｅ
ｐ； Ｂｒａｎｔｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １８：４７８３
－４７９０，１９９０）の除去も間欠的にもたらす。グラム陽性ｏｒｉＲｅｐを再導入す
るために、配列（ＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＴＡＧＴＡＧ、配列番号：４
３）の上流にＮａｒＩ／ＥｈｅＩ部位を追加する５’プライマー、および配列（ＧＣＴＡ
ＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ、配列番号：４４）の下流にＮｈｅＩ
部位を追加する３’プライマーを使用して、ｐＧＧ５５からｏｒｉＲｅｐをＰＣＲ増幅す
る。ＰＣＲ産物はクローニングベクターｐＣＲ２．１の中へとクローニングされ、配列が
検証された。
ｐ６０－ｄａｌ配列をｐＧＧ５５ベクターの中へと組込むために、ｐ６０－ｄａｌ発現
カセットはＰａｃＩ／ＮｈｅＩ二重消化によってｐＣＲ－ｐ６０ｄａｌから切り離された
。ｐＧＧ５５内のグラム陽性細菌に対する複製領域は、追加的な制限部位をＥｈｅＩおよ
びＮｈｅＩ対して導入するために、ｐＣＲ－ｏｒｉＲｅｐからＰＣＲによって増幅される
（プライマー１、５’－ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＡＣ Ｔ
ＡＡ ＣＴＣ ＡＡＣ ＧＣＴ ＡＧＴ ＡＧ－３’；配列番号：４５）；（プライマー
２、５’－ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＡ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＡ
ＣＡＡ ＡＣＡ ＣＧ－３’；配列番号：４６）。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１－ＴＯＰ
Ｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）へと連結され、配
列は検証された。複製領域はＥｈｅＩ／ＮｈｅＩ消化によって切り離され、ベクターｐＧ
Ｇ５５はＥｈｅＩおよびＮｈｅＩで二重消化され、両方のＣＡＴ遺伝子をプラスミドから
同時に除去する。２つのインサート、ｐ６０－ｄａｌおよびｏｒｉＲｅｐ、ならびにｐＧ
Ｇ５５断片は一緒に連結され、ｐＴＶ３を産する（図９）。ｐＴＶ３はｐｒｆＡ（病原性
調節因子Ａ）遺伝子も含有する。この遺伝子はｐＴＶ３の機能のためには必要ないが、追
加的な選択されたマーカーが必要かまたは望ましい状況では使用することができる。
リアルタイムＰＣＲのためのＤＮＡの準備
総リステリアＤＮＡはＭａｓｔｅｒｐｕｒｅ（登録商標）Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｋｉｔ
（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して準備された。
リステリアは２４時間の間３７℃にて培養されてから、２５ｍＬのルリア－ベルターニ培
地（ＬＢ）中で２５０ｒｐｍで振盪された。細菌細胞は遠心分離によってペレット化され
、５ｍｇ／ｍＬのリゾチームで補足されたＰＢＳ中で再懸濁されてから、３７℃にて２０
分の間インキュベートされ、その後ＤＮＡが分離された。
リアルタイムＰＣＲのための標準的な標的ＤＮＡを得るために、ＬＬＯ－Ｅ７遺伝子を
ｐＧＧ５５（５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣ－３
’（配列番号：４７）；５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧ ＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ－３’（配列番号：４８））からＰＣ
Ｒ増幅し、そしてベクターｐＥＴｂｌｕｅ１（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ）へとクローニングした。同様に、ｐｌｃＡアンプリコンはｐＣＲ２．
１へとクローニングされる。大腸菌はｐＥＴ－ＬＬＯＥ７およびｐＣＲ－ｐｌｃＡでそれ
ぞれ形質転換されてから、精製されたプラスミドＤＮＡはリアルタイムＰＣＲで使用する
ために準備された。
リアルタイムＰＣＲ
Ｔａｑｍａｎプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米
国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）は、プラスミド標的としてＥ７を用いてＡ
ＢＩ ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）を使用するように設計され、以下のプライマー、５’－ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣ
ＴＡＣＧＣＴＴＣＧ－３’（配列番号：４９）；５’－ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴ
ＣＴＴＣＣＡ－３’（配列番号：５０）；５’－ＦＡＭ－ＴＧＣＧＴＡ ＣＡＡＡＧＣＡ
ＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号：５１）、およ
びワンコピー遺伝子ｐｌｃＡ（ＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧ－３
’（配列番号：５２）、５’－ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣ－３’
（配列番号：５３）；５’－ＴＥＴ－ＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＴＧＴＣＴＣＣ
ＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＡ－ＴＡＭＲＡ－３’；配列番号：５４）をリステリア
ゲノム標的として使用する。
０．４μＭのプライマーおよび０．０５ｍＭのプローブを、製造業者による推奨に従っ
てＰｕＲＥ Ｔａｑ ＲＴＧ ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国ニュージャージー
州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）と混合した。各々の標的に対して精製したプラスミドＤＮＡ、
ｐＥＴ－ＬＬＯＥ７、およびｐＣＲ－ｐｌｃＡ（内部標準）を用いて標準曲線が準備され
、既知のサンプルにおいて遺伝子コピー番号を計算するために使用された。Ｅ７コピー／
ｐｌｃＡコピーの平均比は、標準曲線に基づいて計算され、Ｌｍｄｄ－ＴＶ３およびＬｍ
－ＬＬＯＥ７に対する結果をＬｍ－Ｅ７（ゲノムの中へと組込まれたＥ７遺伝子のシング
ルコピーを有するリステリア株）からの結果で割ることによって較正された。すべてのサ
ンプルを各々のｑＰＣＲアッセイ中で３回実行し、これは３回繰り返された。サンプル間
の変化を、ＫｙＰｌｏｔソフトウェアを使用するＴｗｏ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって解
析した。ｐ＜０．０５の場合、結果は統計的に有意であると見なされた。
増殖の測定
細菌を３７℃にて、２５０ｒｐｍのシェーキングで、ルリア－ベルターニ（ＬＢ）培地
＋／－１００マイクログラム（μｇ）／ｍＬのＤ－アラニンおよび／または３７μｇ／ｍ
Ｌのクロラムフェニコール中で増殖させた。開始種材料はＯＤ６００ｎｍの測定値に基づ
いて、すべての株に対して同じとなるように調節された。
溶血性溶解アッセイ
４×１０９ＣＦＵのリステリアが解凍され、遠心分離（１分間、１４０００ｒｐｍ）に
よってペレット化され、１Ｍのシステインを有する１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ５．５）中
で再懸濁された。細菌は、１：２で段階希釈され、分泌されたＬＬＯを活性化するために
３７℃にて４５分間インキュベートされた。線維素を取り除いたヒツジ全血（Ｃｅｄａｒ
ｌａｎｅ、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を５倍量のＰＢＳで２回洗浄
し、上清が透明のままになるまで６倍量のＰＢＳ－システインで３～４回洗浄し、洗浄工
程の間に３０００×ｇで８分間細胞をペレット化し、次いで１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度
になるようにＰＢＳ－システイン中で再懸濁した。１００μｌの１０％洗浄血液細胞を１
００μｌのリステリア懸濁液と混合し、さらに３７℃にて４５分間インキュベートした。
次いで溶解していない血液細胞を遠心分離（１０分間、１０００×ｇ）によってペレット
化した。１００μｌの上清を新しいプレートの中へと移し、ＯＤ５３０ｎｍが決定され、
サンプル希釈に対してプロットされた。
Ｌｍｄｄ－Ｔｖ３の治療的有効性
１０５ＴＣ－１（ＡＴＣＣ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）をＣ５７ＢＬ／６マ
ウス（ｎ＝８）の皮下に移植し、約７日間増殖させ、その後腫瘍は触知可能になった。Ｔ
Ｃ－１は、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７で不死化したＣ５７ＢＬ／６上皮細胞株であり、また
皮下移植すると腫瘍を形成する活性化したｒａｓを用いて形質転換されている。マウスは
、腫瘍細胞の移植後７日目および１４日目に０．１ＬＤ５０の適切なリステリア株で免疫
化されている。非免疫化対照群（無処置）も含まれた。腫瘍増殖は電子カリパスを用いて
測定された。
ＡｃｔＡ欠失突然変異体の発生
Ｌｍｄａｌ ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によっ
て弱毒化された。ａｃｔＡのＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンド内でのイン
フレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Ｌ
ｍｄａｌ ｄａｔΔａｃｔＡは、ＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によるＮ末端における
最初の１９アミノ酸およびＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。染色体スポットの中へ
の遺伝子の欠失が、ａｃｔＡ欠失領域の外部をアニーリングするプライマーを使用して検
証された。これらは、図１２に示すように、プライマー３（Ａｄｖ３０５－ｔｇｇｇａｔ
ｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ）（配列番号：５５）および４（Ａｄｖ３０４－ｃｔａｃｃ
ａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ）（配列番号：５６）である。ＰＣＲ解析をＬｍｄ
ｄおよびＬｍ－ｄｄΔＡｃｔＡから分離された染色体ＤＮＡ上で実施した。Ｌｍ－ｄｄ染
色体のＤＮＡ内のプライマー対１、２および３、４の２つの異なるセットで増幅した後の
ＤＮＡ断片のサイズは、３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂとなると予想された。しかしながら
、Ｌｍ－ｄｄΔａｃｔＡについては、プライマーの対１、２および３、４を使用するＰＣ
Ｒの予想されるサイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂである。したがって、図１２のＰ
ＣＲ解析はａｃｔＡの１．８ｋｂ領域は株、Ｌｍ－ｄｄΔａｃｔＡ内では除去されている
ことを確認する。ＤＮＡ配列決定を、株、Ｌｍ－ｄｄΔａｃｔＡ（図１３、配列番号：５
７）内の領域を含有するａｃｔＡの欠失を確認するためにＰＣＲ産物上でも実施した。
ｇｃｇｃｃａａａｔｃａｔｔｇｇｔｔｇａｔｔｇｇｔｇａｇｇａｔｇｔｃｔｇｔｇｔｇ
ｃｇｔｇｇｇｔｃｇｃｇａｇａｔｇｇｇｃｇａａｔａａｇａａｇｃａｔｔａａａｇａｔｃ
ｃｔｇａｃａａａｔａｔａａｔｃａａｇｃｇｇｃｔｃａｔａｔｇａａａｇａｔｔａｃｇａ
ａｔｃｇｃｔｔｃｃａｃｔｃａｃａｇａｇｇａａｇｇｃｇａｃｔｇｇｇｇｃｇｇａｇｔｔ
ｃａｔｔａｔａａｔａｇｔｇｇｔａｔｃｃｃｇａａｔａａａｇｃａｇｃｃｔａｔａａｔａ
ｃｔａｔｃａｃｔａａａｃｔｔｇｇａａａａｇａａａａａａｃａｇａａｃａｇｃｔｔｔａ
ｔｔｔｔｃｇｃｇｃｃｔｔａａａｇｔａｃｔａｔｔｔａａｃｇａａａａａａｔｃｃｃａｇ
ｔｔｔａｃｃｇａｔｇｃｇａａａａａａｇｃｇｃｔｔｃａａｃａａｇｃａｇｃｇａａａｇ
ａｔｔｔａｔａｔｇｇｔｇａａｇａｔｇｃｔｔｃｔａａａａａａｇｔｔｇｃｔｇａａｇｃ
ｔｔｇｇｇａａｇｃａｇｔｔｇｇｇｇｔｔａａｃｔｇａｔｔａａｃａａａｔｇｔｔａｇａ
ｇａａａａａｔｔａａｔｔｃｔｃｃａａｇｔｇａｔａｔｔｃｔｔａａａａｔａａｔｔｃａ
ｔｇａａｔａｔｔｔｔｔｔｃｔｔａｔａｔｔａｇｃｔａａｔｔａａｇａａｇａｔａａｃｔ
ａａｃｔｇｃｔａａｔｃｃａａｔｔｔｔｔａａｃｇｇａａｃａａａｔｔａｇｔｇａａａａ
ｔｇａａｇｇｃｃｇａａｔｔｔｔｃｃｔｔｇｔｔｃｔａａａａａｇｇｔｔｇｔａｔｔａｇ
ｃｇｔａｔｃａｃｇａｇｇａｇｇｇａｇｔａｔａａｇｔｇｇｇａｔｔａａａｃａｇａｔｔ
ｔａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃ
ａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃｇｔｃｇａｃｃｃａｔａｃｇａｃｇｔｔａａｔｔ
ｃｔｔｇｃａａｔｇｔｔａｇｃｔａｔｔｇｇｃｇｔｇｔｔｃｔｃｔｔｔａｇｇｇｇｃｇｔ
ｔｔａｔｃａａａａｔｔａｔｔｃａａｔｔａａｇａａａａａａｔａａｔｔａａａａａｃａ
ｃａｇａａｃｇａａａｇａａａａａｇｔｇａｇｇｔｇａａｔｇａｔａｔｇａａａｔｔｃａ
ａａａａｇｇｔｇｇｔｔｃｔａｇｇｔａｔｇｔｇｃｔｔｇａｔｃｇｃａａｇｔｇｔｔｃｔ
ａｇｔｃｔｔｔｃｃｇｇｔａａｃｇａｔａａａａｇｃａａａｔｇｃｃｔｇｔｔｇｔｇａｔ
ｇａａｔａｃｔｔａｃａａａｃａｃｃｃｇｃａｇｃｔｃｃｇｃａｔｇａｔａｔｔｇａｃａ
ｇｃａａａｔｔａｃｃａｃａｔａａａｃｔｔａｇｔｔｇｇｔｃｃｇｃｇｇａｔａａｃｃｃ
ｇａｃａａａｔａｃｔｇａｃｇｔａａａｔａｃｇｃａｃｔａｔｔｇｇｃｔｔｔｔｔａａａ
ｃａａｇｃｇｇａａａａａａｔａｃｔａｇｃｔａａａｇａｔｇｔａａａｔｃａｔａｔｇｃ
ｇａｇｃｔａａｔｔｔａａｔｇａａｔｇａａｃｔｔａａａａａａｔｔｃｇａｔａａａｃａ
ａａｔａｇｃｔｃａａｇｇａａｔａｔａｔｇａｔｇｃｇｇａｔｃａｔａａａａａｔｃｃａ
ｔａｔｔａｔｇａｔａｃｔａｇｔａｃａｔｔｔｔｔａｔｃｔｃａｔｔｔｔｔａｔａａｔｃ
ｃｔｇａｔａｇａｇａｔａａｔａｃｔｔａｔｔｔｇｃｃｇｇｇｔｔｔｔｇｃｔａａｔｇｃ
ｇａａａａｔａａｃａｇｇａｇｃａａａｇｔａｔｔｔｃａａｔｃａａｔｃｇｇｔｇａｃｔ
ｇａｔｔａｃｃｇａｇａａｇｇｇａａ （配列番号：５７）。
炎症性サイトカインの生産：
ＲＡＷ ２６４．７などのマクロファージは、ＬｍｐｒｆＡ－（ｐＧＧ５５）、Ｌｍｄ
ａｌ ｄａｔ、Ｌｍｄａｌ ｄａｔ ａｃｔＡ、Ｌｍｄａｌ ｄａｔ ａｃｔＡΔｉｎｌ
Ｃ、およびＬｍｄａｌ ｄａｔΔｉｎｌＣなどの異なるリステリアバックボーンに感染し
、様々なサイトカインのレベルを定量するために異なるＥＬＩＳＡベースのキットを使用
して上清を異なる時点で採取した。定量化されたサイトカインとしてはＩＦＮ－γ、ＴＮ
Ｆ－α、およびＩＬ－６が挙げられる。
インビボでのサイトカインの生産：
インビボでのサイトカイン生産および好中球の採用を測定するために、異なる１０８Ｃ
ＦＵのＬｍｐｒｆＡ－（ｐＧＧ５５）、Ｌｍｄａｌ ｄａｔ、Ｌｍｄａｌ ｄａｔ ａｃ
ｔＡ、Ｌｍｄａｌ ｄａｔ ａｃｔＡΔｉｎｌＣ、およびＬｍｄａｌ ｄａｔ Δｉｎｌ
Ｃ、リステリア対照、または等価な体積の生理食塩水をＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内に
注射した。１２時間後、マウスを屠殺し、２ｍＬのＰＢＳで腹膜腔を洗浄した。プレーテ
ィングした後増殖培地上で腹膜洗浄を細菌の負荷について調べ、ＭＩＰ－１α、ＫＣ、Ｍ
ＣＰ等々などの炎症誘発性のサイトカインの解析を行った。フローサイトメトリーを使用
して、Ｇｒ－１、ＣＤ１１ｂ、およびＦ４／８０などのマーカーを用いて染色した後に好
中球およびマクロファージの数を決定し、さらにＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用
してこれらの集団を定量化した。
トランスウェル遊走アッセイ：
ｉｎｌＣ欠失株を用いたマクロファージまたは樹状細胞に由来する骨髄の感染に続く好
中球の遊走の増加があるかどうかを決定するためにこのアッセイを行った。骨髄に由来す
るマクロファージまたは樹状細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６などのマウスから分離され、これら
はｉｎｌＣ欠失突然変異体または対照リステリアに感染した。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔ
ａｒトランスウェルプレートを使用して、感染した細胞を使用してトランスウェルアッセ
イを設定した。アッセイは、当初３、５、または８マイクロメートルポアトランスウェル
プレートを使用して標準化された。好中球の遊走を試験するためには、プレートの底部に
感染したＡＰＣをプレーティングし、チャンバー内のウェルの上部に好中球をプレーティ
ングした。異なる時点で、底部に遊走した好中球の数を決定するために細胞を計数した。
Ｌｍｄａｌ ｄａｔ ａｃｔＡΔｉｎｌＣ突然変異体の治療的有効性：
概念の証拠として、ｉｎｌＣ突然変異体の治療的な有効性を決定するために、ヒトの前
立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）を腫瘍抗原として使用した。バックボーンＬｍｄａｌ ｄａ
ｔ ａｃｔＡ ｉｎｌＣは、プラスミド、ｐＡｄｖ１４２を用いて形質転換され、これは
ヒトＰＳＡに対する発現カセットを含有し、結果としてＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２が得ら
れる。株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２は、融合タンパク質、ｔＬＬＯ－ＰＳＡの発現および
分泌のために特徴付けられる。さらに、株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２はマウスの中でイン
ビボで２回継代されたが、インビボで２回の継代の後に得られたコロニーを融合タンパク
質、ｔＬＬＯ－ＰＳＡの発現および分泌について調べた。ワクチンの通常在庫は第２のイ
ンビボ継代の後で得られたコロニーから準備され、これは治療的な効果および免疫原性の
評価のために使用された。
腫瘍微小環境への影響：
ＬｍｄｄＡ、ＬｍｄｄＡΔａｃｔＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＢ、
ＬｍｄｄＡΔｐｒｆＡ、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２、および他の対照
株が腫瘍微小環境内で免疫細胞の浸潤を生じる能力が決定された。この研究では、マウス
に１×１０６ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞を０日目に接種し、７日目、１４日目、および２１日
目に１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２、および他の対照株を
ワクチン接種した。２８日目に腫瘍を採取して、Ｇｒ－１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４
、ＣＤ８、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ６２Ｌなどの異なる細胞表面
マーカーを用いてさらに染色のために処理した。これらのマーカーを使用して、調べられ
る異なる細胞集団としては、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋
）、好中球（Ｇｒ－１＋ＣＤ１１ｂ＋）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）（Ｇｒ－１＋Ｃ
Ｄ１１ｂ＋）、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｆｏｘｐ３＋）およびエフェクタ
ーＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ３＋ ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）が挙げられる。さらにエフェクター
Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２などのエフェクターサイトカインを
生産するそれらの機能的な能力のために特徴付けられる。腫瘍内の調節性Ｔ細胞およびＭ
ＤＳＣは、Ｔ細胞増殖の抑制を生じるそれらの能力を試験された。
結果
（実施例５） アミノ酸代謝酵素を含有するプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子の代わり
に、大腸菌およびＬＭ内に、インビトロおよびインビボの両方で保持される
Ｄ－アラニン・ラセマーゼに基づく栄養要求性相補系が、抗生物質耐性遺伝子を使用せ
ずにＬＭ中へのプラスミド保持を媒介するために利用された。大腸菌株ＭＢ２１５９は、
Ｄ－アラニン・ラセマーゼを合成することができないａｌｒ（－）／ｄａｄＸ（－）欠損
突然変異体である。同様に、リステリア株Ｌｍ ｄａｌ（－）／ｄａｔ（－）（Ｌｍｄｄ
）は、ｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の部分的な欠失に起因してＤ－アラニン・ラセマ
ーゼを合成することができない。大腸菌－リステリアシャトルベクターｐＡＭ４０１に基
づくプラスミドｐＧＧ５５を、ｐＴＶ３を生成するためのリステリアｐ６０プロモーター
の制御下で、両方のＣＡＴ遺伝子を除去し、かつこれらをｐ６０－ｄａｌ発現カセットで
置き換えることによって修正した（図９）。いくつかのコロニーからＤＮＡを精製した。
（実施例６） 代謝酵素を含有するプラスミドは細菌の病毒性を増加しない
病毒性はＬＬＯ機能に関連しているので、Ｌｍｄｄ－ＴＶ３とＬｍ－ＬＬＯＥ７との間
の溶血性溶解活性が比較される。このアッセイは赤血球の溶解によってＬＬＯ機能を試験
したが、これは培養上清、精製したＬＬＯ、または細菌細胞を用いて実施することができ
る。Ｌｍｄｄ－ＴＶ３は、Ｌｍ－ＬＬＯＥ７より高い溶血性溶解活性を示した。
インビボでの病毒性はＬＤ５０値を決定することによっても測定され、これはより直接
的で、したがってより正確な病毒性の測定手段である。Ｌｍｄｄ－ＴＶ３のＬＤ５０（０
．７５×１０９）は、Ｌｍ－ＬＬＯＥ７のもの（１×１０９）に大変近く、これは代謝酵
素を含有するプラスミドが細菌の病毒性を増加しないことを示す。
（実施例７）代謝酵素を含有するプラスミドによる抗腫瘍免疫性の誘導
代謝酵素含有プラスミドのガンワクチンとしての有効性は腫瘍退行モデルで決定された
。ＴＣ－１細胞株モデルが使用され、これはＨＰＶワクチン発生のために良好に特徴付け
られ、かつこれはＬｍｄｄ－ＴＶ３またはＬｍ－ＬＬＯＥ７で免疫化した後の類似サイズ
の定着した腫瘍退行の制御された比較を可能にする。２つの別個の実験では、Ｌｍｄｄ－
ＴＶ３およびＬｍ－ＬＬＯＥ７を用いたマウスの免疫化は、結果として類似の腫瘍退行（
図１４）をもたらし、ワクチン接種した群の間には統計的に有意な差異はない（ｐ＜０．
０５）。すべての免疫化マウスは、６３日後でも生きていたが、非免疫化マウスはその腫
瘍の直径が２０ｍｍに達したときに犠牲にしなければならなかった。回復したマウスは実
験終了時まで腫瘍を有しないままであった。
したがって、代謝酵素含有プラスミドは治療的なガンワクチンとして有効である。治療
的なガンワクチンに対して要求される免疫応答は、予防的なガンワクチンに対して要求さ
れる免疫応答より強いので、これらの結果は予防的なガンワクチンに対する有用性も実証
する。
（実施例８）ｉｎｌＣ欠失突然変異体はケモカインおよびサイトカインの著しく高いレベ
ルを生成する。
ｉｎｌＣ欠失突然変異体は、著しく高いレベルのケモカイン（ＭＩＰ－１α、ＫＣ（Ｉ
Ｌ－８のマウスホモログ）、ＭＣＰなどの）を生成し、結果として感染部位に対する好中
球および白血球の浸潤が得られる。したがって、異なるリステリア株が腹腔内に投与され
たとき、ｉｎｌＣ突然変異体はこれらのサイトカインおよびケモカインの産生の増加を実
証し、これは、注射の１２時間後に得られた腹水中の好中球およびマクロファージを引き
付ける。さらに、ｉｎｌＣ欠失突然変異体は対照株と比較したときに著しく高いレベルの
炎症性サイトカインを生成した。
（実施例９）ｉｎｌＣ欠失突然変異体は好中球の遊走を誘発する
ｉｎｌＣ欠失突然変異体に感染したマクロファージは、他の対照株と比較したとき、異
なる時点で好中球の遊走の著しい増加を示す。この実験の結果は、感染の間にこの株の好
中球などの免疫細胞を引き付ける能力を強く支持する。
（実施例１０）ｉｎｌＣ欠失突然変異体は治療的な抗腫瘍応答に影響を与える
ＬｍｄｄＡ１４２とＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２との両方を使用した抗腫瘍研究の結果は
、相互に大変同等であり、また腫瘍の治療的な退行が観察された。さらに、それの先天的
な応答および炎症誘発性のサイトカインの分泌の増加を生成する能力のレベルが高いので
、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２の２回の投与量は株ＬｍｄｄＡ１４２の３回の投与と同等で
ある。
材料および方法（実施例１１～１６）
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ
）によって合成され、またＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚ Ｉｎｃ（米国ニュージャー
ジー州Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）によって行われた。フローサイトメトリー試
薬はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、米国カリフォ
ルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての
試薬は、示されない限りＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓｅ）から入手し
た。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ ＨＬＡ－Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ
州Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ）によって合成された。完全なＲＰＭＩ １６４０（Ｃ－ＲＰＭＩ
）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナ
トリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍ
Ｍ）を含有した。多クローン性の抗ＬＬＯ抗体が前述されており、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗
体はＳｉｇｍａから購入した。
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたは
Ｒｕｔｇｅｒｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいてＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコ
ルに従って実施した。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（
米国メーン州Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍性タン
パク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼
育された。ＮＴ－２腫瘍細胞株は高いレベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現
し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述したように増殖した。
ＤＨＦＲ－Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから得られ、ＡＴＣＣの推奨に従って
増殖した。ＥＭＴ６－Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、米国ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、また
完全なＣ－ＲＰＭＩ培地中で増殖した。生物発光の作業は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のＳｍ
ａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＡＩＦ）によるガイダン
スに従って実行された。
リステリア構築体および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ－ｐＧＥＭ７Ｚは、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎ
ｓｙｌｖａｎｉａのＭａｒｋ Ｇｒｅｅｎｅ博士によって供与され、これはｐＧＥＭ７Ｚ
プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）へとクローニング
された全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミド
は、ＰＣＲによってｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表１に
示されるオリゴを使用して、ｈＨｅｒ－２／ｎｅｕの３つの区分、すなわちＥＣ１、ＥＣ
２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとして使用された。
Ｈｅｒ－２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲ法およびテンプレートとして
の各々の別個のｈＨｅｒ－２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマ
ーを表２に示す。
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列。
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列。
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８か
ら切り離され、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４で、ＬＬＯの切断非溶血性断
片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロ
モーターの配列はＤＮＡシークエンシング解析によって確認された。このプラスミドは電
子コンピテントＡｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、
ＬｍｄｄＡへと電気穿孔され、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレ
インハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された
。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ－ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似の
リステリア株が比較の目的で使用された。これらは以前に記述した。すべての研究で、無
関連リステリア構築体（Ｌｍ対照）が、免疫系でリステリアの抗原と無関係な効果を説明
するために含まれる。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１－１６４と同一のリステリアプラットフ
ォームに基づくが、ＨＰＶ１６－Ｅ７またはＮＹ－ＥＳＯ－１などの異なる抗原を発現し
た。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はイ
ンビボで２回継代された。
細胞毒性アッセイ
３～５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群が、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ－
ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１－１６４、Ｌｍ－ｈＨｅｒ２ ＩＣＩ、またはＬｍ
対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置
のままとされた。ＮＴ－２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイト
マイシンＣ（血清を含まないＣ－ＲＰＭＩ媒体中２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて４５分
間処置した。５回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した
脾細胞を用いて１：５の比（刺激薬：レスポンダー）で５日間、３７℃および５％ＣＯ２
で共インキュベートした。標的として３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ－Ｇ８）細胞のラベルが
付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを
実施した。４時間のインキュベーションの後、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、
Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピ
ウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが（実験群での溶解－自然発生的溶解）／（
最大溶解－自然発生的溶解）として定義された。
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン－γ分泌
３～５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスの群が、１×１０
８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１－１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用い
て一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週
間後、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が分離され、５×１０６細胞／ウェルにて２４ウェ
ルプレートでマイトマイシンＣで処置したＮＴ－２細胞の存在下でＣ－ＲＰＭＩ培地中で
共培養された。ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１μＭのＨＬＡ
－Ａ２特異的なペプチドまたは１μｇ／ｍＬの組み換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タ
ンパク質（大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシ
ステムによって精製された）の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが２
４時間または７２時間後に得られ、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の存在について
、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ－γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）キットを使用して試験した。
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後６週間のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９～１４
／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ－ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１－１６４、また
はＬｍ対照を６回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に２回
観察し、これらは最高５２週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が１ｃ
ｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ内で－２
０℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質内の突然
変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡ分離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し
、配列決定した。
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞へのＡＤＸＳ３１－１６４の効果
マウスに１×１０６ＮＴ－２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）で移植した。７日目、１４日目、
および２１日目に、これらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１－１６４、ＬｍｄｄＡ対照
で免疫化、または無処置のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ解
析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について試験した。簡潔に
述べると、Ｃ－ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによ
って脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中に
ＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファー
を用いて消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後で、細胞を
激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し
、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全なＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて数回洗浄した。
ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％
ＦＢＳ／ＰＢＳ）中で再懸濁し、抗ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ４－ＦＩＴＣ
、ＣＤ２５－ＡＰＣ抗体を用いて染色し、続いて抗Ｆｏｘｐ３－ＰＥを用いて透過処理お
よび染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー解析を
実施し、ｃｅｌｌ ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに
対してスチューデントのｔ検定を使用し、これらを３回行った。これらの解析では、０．
０５未満（＊印をつけた）のｐ値は統計的に有意であると考えられる。Ｐｒｉｓｍソフト
ウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００
６）のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべ
てのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、群あたり８～
１４匹のマウスを使用し、すべての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、群あたり少なくとも
８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍
研究を除いて、すべての研究を少なくとも１回は繰り返した。
結果
（実施例１１） Ｈｅｒ－２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネ
ス株の発生：ＡＤＸＳ３１－１６４の構築。
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については前述した。簡潔に述
べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲ法によって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタ
ンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０～１７０およびａａ３５９～４３３）と１つの細
胞内断片（ａａ６７８～８０８）との直接融合によって生成された。キメラタンパク質は
、タンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２
遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（これは構築体Ｌｍ－ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２に使
用される）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果
としてプラスミドｐＡｄｖ１６４が得られる（図１５Ａ）。これらの２つのプラスミドバ
ックボーンの間には２つの大きい違いがある。１）組み換え型細菌のインビトロでの選択
のためにｐＡｄｖ１３８はクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用している
が、ｐＡｄｖ１６４はバシラスサチリスからのＤ－アラニン・ラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ
）を寄生し、これはｄａｌ－ｄａｔ遺伝子を欠いているＬｍｄｄＡ株内でインビトロでの
選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワ
クチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性に
ついての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、
これはインビボでのＬｍｄｄ株の相補に必要ないので、プラスミド（以下の配列および図
１５Ａを参照）中でｐＡｄｖ１６４はｐｒｆＡ遺伝子のコピーを有しない。ＬｍｄｄＡワ
クチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担
当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その
親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワ
クチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８
時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２の発
現および分泌は、インビトロで８時間増殖したＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ－
ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２のもの（図１５Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用
して～１０４ＫＤの帯域として抗ＬＬＯ抗体によって検出される。負の対照としてｔＬＬ
Ｏのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１５参照）：
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：７０）
（実施例１２） ＡＤＸＳ３１－１６４は、ＬＭ－ＬＬＯ－ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原
性である。
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１－１６４
の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ－ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２ワクチンの
ものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅ
ｒ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、Ｌ
ＬＯに対してＨｅｒ２に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化
されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラより低い溶解活
性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウス（図１６Ａ
）ではＣＴＬ活性は検出されなかった。ＡＤＸＳ３１－１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウ
スからの脾細胞によってＩＦＮ－γの分泌を刺激することもできる（図１６Ｂ）。これは
マイトマイシンＣで処理されたＮＴ－２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中
で検出され、これらは高いレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原（図１９Ｃ）を発現する。
ヒトＭＨＣクラスＩエピトープのＡＤＸＳ３１－１６４を用いた免疫化後の適切な処置
および提示は、ＨＬＡ－Ａ２マウスで試験された。免疫化したＨＬＡ－Ａ２トランスジェ
ニックからの脾細胞は、マッピングしたＨＬＡ－Ａ２で制限されたエピトープに対応する
ペプチドと７２時間の間共インキュベートされ、このペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の
細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号：７１もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号：７２
）、または細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号：７３）領域に位置する（図１６Ｃ）。
組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質は、正の対照、および無関連ペプチド、または負の対
照としてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１－１６４が
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒト
エピトープへと引き出すことができることを示す。
（実施例１３） ＡＤＸＳ３１－１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、Ｌ
Ｍ－ＬＬＯ－ＣｈＨＥＲ２より有効である。
ＡＤＸＳ３１－１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ－ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２とＨｅｒ２／ｎｅ
ｕトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後２０～２５週間で繁殖の遅
い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化され
たすべての動物は、２１～２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた
。対照的に、リステリア－Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著
しい遅延を生じた。４５週には、５０％を超えるＡＤＸＳ３１－１６４をワクチン接種し
たマウス（９匹のうち５匹）は、まだ腫瘍がなく、これはＬｍ－ＬＬＯ－ＣｈＨｅｒ２を
用いて免疫化したマウスの２５％と比較される。５２週には、ＡＤＸＳ３１－１６４を用
いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で
他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた（図１７）。
これらの結果は、ＡＤＸＳ３１－１６４はより弱毒化しているにもかかわらず、Ｈｅｒ２
／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではＬｍ－ＬＬＯ
－ＣｈＨｅｒ２より有効であることを示す。
（実施例１４） ＡＤＸＳ３１－１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子で
の突然変異。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチン
またはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインでエピトー
プを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当す
ると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープし
た腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化し
た腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍
サンプルのＨｅｒ－２／ｎｅｕ遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替
的なエスケープ機構を示唆するの（データ示さず）。
（実施例１５）ＡＤＸＳ３１－１６４は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の著しい減少を生じる。
脾臓および腫瘍内での調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１－１６４の効果を解明
するために、マウスにＮＴ－２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫化の後、脾細胞および腫
瘍内のリンパ球が分離され、Ｔｒｅｇのために染色した。これらは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋
／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、別個に解析したとき、ＦｏｘＰ３マー
カーまたはＣＤ２５マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無
関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ＡＤＸＳ３１－１６４を用いた
免疫化は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度については効果を有しないことを示した（図１８参照
）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在は少なか
らぬ影響を生じた（図１９Ａ）。処置されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋ Ｔ細胞の
平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％
に減少し、ＡＤＸＳ３１－１６４ついては３．４％と腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１
に減少した（図１９Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内の
Ｔｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、Ａ
ＤＸＳ３１－１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６
．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．
０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置さ
れたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較
は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチン
で処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をも
たらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ること
ができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１－１
６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍
内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
（実施例１６）ペプチド「ミニ遺伝子」発現系
材料および方法
この発現系は、カルボキシ末端において独特のペプチド部分を含有する組み換え型タン
パク質のパネルのクローニングを促進するように設計される。これは、テンプレートとし
てＳＳ－Ｕｂ－ペプチド構築体のうちの１つをコードする配列を利用する単純なＰＣＲ反
応によって達成される。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域の中へと延在するプライマーを使
用し、また所望のペプチド配列に対してプライマーの３’端においてコドンを導入するこ
とによって、単一のＰＣＲ反応で新しいＳＳ－Ｕｂ－ペプチド配列を生成することができ
る。細菌プロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の最初のいくつかのヌクレオチドをコ
ードする５’プライマーは、すべての構築体に対して同一である。この戦略を使用して生
成された構築体を図１に概略的に表す。この実施例では、２つの構築体が記述される。一
方は、マウスＭＨＣクラスＩ上に提示されるモデルペプチド抗原を含有し、第２の構築体
は、ヒト膠芽腫（ＧＢＭ）ＴＡＡに由来するものなどの治療的に関連のあるペプチドが置
換されることになる場所を示す。明確のため、図１で図表化した構築体をＡｃｔＡ１～１
００分泌シグナルを含有するものとして指定した。しかしながら、ＬＬＯベースの分泌シ
グナルは均等な効果を置換される可能性がある。
提案されている系の利点のうちの１つは、単一のリステリアベクター構築体を使用して
細胞にマルチプルペプチドを負荷することができることになる点である。マルチプルペプ
チドは、上述の単一のペプチド発現系の修正を使用して組み換え型弱毒化リステリア（例
えば、ＰｒｆＡ突然変異リステリアまたはｄａｌ／ｄａｔ／ＡｃｔＡ突然変異リステリア
）の中へと導入されることになる。連続的なＳＳ－Ｕｂ－ペプチド配列から独特のマルチ
プルペプチドをコードするキメラタンパク質が１つのインサートの中にコードした。シャ
イン・ダルガノリボソーム結合部位は、各々のＳＳ－Ｕｂ－ペプチドコード配列がペプチ
ド構築体の各々の分離翻訳が有効になる前に導入される。図１Ｃは、組み換え型リステリ
アの１つの株から４つの別個のペプチド抗原を発現するように設計された構築体の概略表
示を実証する。これは厳密に一般的な発現戦略の表示であるので、既知のマウスまたはヒ
ト腫瘍に関連する抗原または感染性疾患の抗原に由来する４つの独特のＭＨＣクラスＩ結
合ペプチドを含めた。
本開示のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、今では当業者には数多くの修正、置換、変更、および均等物が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨に含まれるかかるすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株であって、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される、組み換え型リステリア。
（項目２）
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、項目１に記載の組み換え型リステリア。
（項目３）
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間に、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ～４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、項目１～２のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目４）
前記ペプチドが１つ以上のネオエピトープを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目５）
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目６）
前記ミニ遺伝子構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、項目１～５のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目７）
前記プロモーターが、ＡｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、項目６に記載の組み換え型リステリア。
（項目８）
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、項目１～７のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目９）
前記細菌分泌シグナル配列が、配列番号：４を含むリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、項目１～８のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１０）
前記組み換え型リステリアが、Ｄ－アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異、または欠失を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１１）
リステリアが、代謝酵素をコードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記ｄａｌ／ｄａｔゲノム突然変異または欠失を相補する、項目１０に記載の組み換え型リステリア。
（項目１２）
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、項目１１に記載の組み換え型リステリア。
（項目１３）
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いときに、前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、項目１１に記載の組み換え型リステリア。
（項目１４）
前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素、またはＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目１１～１３のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１５）
前記ミニ遺伝子構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、項目１１～１４のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１６）
前記組み換え型リステリアが、ａｃｔＡ遺伝子内のゲノム突然変異、または欠失を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１７）
前記組み換え型リステリアが、ｉｎｌＢ遺伝子内に、ゲノム突然変異、または欠失を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１８）
前記組み換え型リステリアが、ｐｒｆＡ遺伝子内に、ゲノム突然変異、または欠失を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１９）
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、項目１～１８のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目２０）
項目１～１９のいずれか一項に記載の組み換え型リステリアと、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
（項目２１）
腫瘍またはガンを有する被験者の中に抗腫瘍または抗ガン応答を引き出す方法であって、前記方法が前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記構築体がキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質が、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を強化する、方法。
（項目２２）
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ～４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ペプチドが、１つ以上のネオエピトープを含む、項目２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、項目２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ミニ遺伝子構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記プロモーターが、ａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、項目２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記細菌分泌シグナル配列が、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、項目２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記組み換え型リステリアが、Ｄ－アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異を含む、項目２１～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記リステリアが代謝酵素をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異または欠失している内因性遺伝子を相補する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、項目３３に記載の方法。
（項目３３）
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いとき、前記プラスミドは前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、項目３３に記載の方法。
（項目３４）
前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記ミニ遺伝子構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、項目２１～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む、項目２１～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記組み換え型リステリアが、ｉｎｌＢ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む、項目２１～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記組み換え型リステリアが、ｐｒｆＡ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む、項目２１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、項目２１～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
独立したアジュバントを投与することをさらに含む、項目２１～３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ガンが、リンパ腫、白血病、乳ガン、大腸ガン、頭頸部扁平上皮ガン腫、腎臓の細胞ガン腫、膵管腺ガン、骨肉腫、胃ガン、非小細胞肺ガン、または骨ガンを含む、項目２１～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ガンが難治性ガンである、項目２１～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記リンパ腫が多発性骨髄腫である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
被験者の中の腫瘍またはガンを処置する方法であって、前記方法が前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記構築体がキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質が、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を強化する、方法。
（項目４７）
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ～４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記ペプチドが、１つ以上のネオエピトープを含む、項目４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、項目４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記ミニ遺伝子発現核酸構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、項目４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記プロモーターが、ａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、項目４６～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記細菌分泌シグナル配列が、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、項目４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記組み換え型リステリアが、Ｄ－アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異を含む、項目４６～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
リステリアが代謝酵素をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異または欠失している内因性遺伝子を相補する、項目４６～５５のいずれか一項に記載の方法。（項目５７）
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いとき、前記プラスミドは前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記ミニ遺伝子発現構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、項目４６～５９のいずれか一項に記載の方法。（項目６１）
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、項目４６～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記組み換え型リステリアが前記ｉｎｌＢ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、項目４６～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記組み換え型リステリアが前記ｐｒｆＡ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、項目４６～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、項目４６～６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
独立したアジュバントを投与することをさらに含む、項目４６～６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ガンが、リンパ腫、白血病、乳ガン、大腸ガン、頭頸部扁平上皮ガン腫、腎臓の細胞ガン腫、膵管腺ガン、骨肉腫、胃ガン、非小細胞肺ガン、または骨ガンを含む、項目４６～６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記ガンが難治性ガンである、項目４６～６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記リンパ腫が多発性骨髄腫である、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記投与が前記組み換え型弱毒化リステリアの少なくとも２つの投与を含む、項目２１～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記ガンの前記被験者内での再発または転移に続いて前記組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程をさらに含む、項目２１～７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
ブースター注射を投与することをさらに含む、項目２１～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、項目２１～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記処置が転移性疾患を遅延させる、項目４６～７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記処置がリンパ節サイズを減少する、項目４６～７５のいずれか一項に記載の方法。（項目７７）
前記処置が結果として無進行生存率をもたらす、項目４６～７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記処置が、結果的に疾患が進行する時間の増加をもたらす、項目４６～７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
被験者内の腫瘍またはガンの形成を抑制または遅延する方法であって、前記方法が項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
（項目８０）
自己抗原に対する耐性を破壊する方法であって、前記方法が項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
（項目８１）
被験者内のガンの退行を誘発する方法であって、前記方法が項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
（項目８２）
被験者の生存を延長する方法であって、前記方法が項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
（項目８３）
腫瘍またはガンを有する被験者内の抗腫瘍または抗ガン応答を引き出すための組み換え型リステリアの使用であって、前記使用が、前記腫瘍またはガンを有する前記被験者に前記リステリアを投与する前記工程を含み、前記組み換え型リステリアがミニ遺伝子核酸構築体を含み、前記核酸構築体がキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質が、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ～ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される、使用。
（項目８４）
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、項目８３に記載の使用。
（項目８５）
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ～４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、項目８３に記載の使用。
（項目８６）
前記ペプチドが、１つ以上のネオエピトープを含む、項目８３～８５のいずれか一項に記載の使用。
（項目８７）
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、項目８３～８６のいずれか一項に記載の使用。
（項目８８）
前記ミニ遺伝子構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、項目８３～８７のいずれか一項に記載の使用。
（項目８９）
前記プロモーターが、ａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、項目８８に記載の使用。
（項目９０）
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、項目８３～８９のいずれか一項に記載の使用。
（項目９１）
前記細菌分泌シグナル配列が、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、項目８３～９０のいずれか一項に記載の使用。
（項目９２）
前記組み換え型リステリアが、Ｄ－アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異を含む、項目８３～９１のいずれか一項に記載の使用。
（項目９３）
リステリアが代謝酵素をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の染色体内の欠失または突然変異している内因性遺伝子を相補する、項目８８に記載の使用。
（項目９４）
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、項目９３に記載の使用。
（項目９５）
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いとき、前記プラスミドは前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、項目９３のいずれか一項に記載の使用。
（項目９６）
前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目９３～９５のいずれか一項に記載の使用。
（項目９７）
前記ミニ遺伝子構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、項目８３～９６のいずれか一項に記載の使用。
（項目９８）
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、項目８３～９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記組み換え型リステリアが、前記内因性ｉｎｌＢ遺伝子でのゲノム突然変異を含む、項目８３～９８に記載の使用。
（項目１００）
前記組み換え型リステリアが、前記内因性ｐｒｆＡ遺伝子でのゲノム突然変異を含む、項目８３～９９に記載の使用。
（項目１０１）
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、項目８３～１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
独立したアジュバントを投与することをさらに含む、項目８３～１０１に記載の使用。（項目１０３）
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、項目１０２に記載の使用。
（項目１０４）
前記免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、項目８３～１０３のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０５）
被験者内の腫瘍またはガンを処置するための、項目８３～１０４のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０６）
前記ガンが、リンパ腫、白血病、乳ガン、大腸ガン、頭頸部扁平上皮ガン腫、腎臓の細胞ガン腫、膵管腺ガン、骨肉腫、胃ガン、非小細胞肺ガン、または骨ガンを含む、項目８３～１０５のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０７）
前記ガンが難治性ガンである、項目８３～１０６のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０８）
前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、項目１０６に記載の使用。
（項目１０９）
前記ガンの前記被験者内での再発または転移に続いて前記組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程をさらに含む、項目１０５～１０８のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１０）
ブースター注射を投与することをさらに含む、項目１０４～１０９のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１１）
前記処置が転移性疾患を遅延させる、項目１０４～１１０のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１２）
前記処置がリンパ節サイズを減少する、項目１０４～１１１のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１３）
前記処置が結果として無進行生存率をもたらす、項目１０４～１１２のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１４）
前記処置が、結果的に疾患が進行する時間の増加をもたらす、項目１０４～１１３のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１５）
被験者内の腫瘍またはガンの形成を抑制または遅延するための、項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。
（項目１１６）
自己抗原に対する耐性を破壊するための項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。
（項目１１７）
被験者内のガンの退行を誘発するための、項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。
（項目１１８）
被験者の生存を延長するための、項目１～１９の前記組み換え型リステリアまたは項目２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。

Claims (17)

  1. ミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株であって、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、（ａ）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質由来の細菌分泌シグナル配列と、
    （ｂ）ユビキチンタンパク質と、
    （ｃ）ＭＨＣクラスＩ分子による提示のための最小限のペプチド決定基であるペプチドとを含み、前記ミニ遺伝子核酸構築体が、前記組み換え型リステリア株中の染色体外プラスミド中にあり、
    前記キメラタンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、（ａ）～（ｃ）の細菌分泌シグナル配列、ユビキチンタンパク質、およびペプチドが配置され、
    前記組み換え型リステリア株が、Ｄ－アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子、Ｄ－アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子、およびａｃｔＡ遺伝子内にゲノム突然変異、または欠失を含み、かつ
    前記組み換え型リステリア株が、リステリア・モノサイトゲネスである、組み換え型リステリア株。
  2. 前記キメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって第２のオープンリーディングフレームに連結され、前記第２のオープンリーディングフレームが、（ａ）第２の細菌分泌シグナル配列と、（ｂ）第２のユビキチンタンパク質と、（ｃ）第２のペプチドとを含む第２のキメラタンパク質をコードし、前記第２のキメラタンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、（ａ）～（ｃ）の第２の細菌分泌シグナル配列、第２のユビキチンタンパク質、および第２のペプチドが配列されている、請求項１に記載の組み換え型リステリア株。
  3. 各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、請求項２に記載の組み換え型リステリア株。
  4. 前記ペプチドが１つ以上のネオエピトープを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア株。
  5. 前記ミニ遺伝子構築体が、前記ミニ遺伝子構築体の発現を駆動する５’細菌プロモーターをさらに含み、前記プロモーターが、ａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア株。
  6. 前記組み換え型リステリア株が、代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記ｄａｌ遺伝子および前記ｄａｔ遺伝子のゲノム突然変異または欠失を相補する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア株。
  7. 前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いときに、前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、請求項６に記載の組み換え型リステリア株。
  8. 前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素、またはＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項６または７に記載の組み換え型リステリア株。
  9. 前記組み換え型リステリア株が、ｐｒｆＡ遺伝子内に、ゲノム突然変異、または欠失を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア株。
  10. 前記組み換え型リステリア株が、リステリア・モノサイトゲネスであり、前記細菌分泌シグナル配列が配列番号：４を含み、前記組み換え型リステリア株が、代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素、またはＤ－アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１に記載の組み換え型リステリア株。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア菌株と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  12. 腫瘍または癌を有する被験者において抗腫瘍または抗癌応答を誘発するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア菌株を含む組成物。
  13. 前記組成物が、独立したアジュバントと一緒に投与されることを特徴とし、前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記抗腫瘍または抗癌応答がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 前記癌が、リンパ腫、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫、白血病、乳癌、大腸癌、頭頸部扁平上皮癌、腎細胞癌、膵管腺癌、骨肉腫、胃癌、非小細胞肺癌、骨癌、または難治性癌である、被験者における腫瘍または癌を治療するための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記組成物が、前記被験者における癌の再発または転移後に投与されるか、またはブースターショットが投与されることを特徴とする、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記組成物が、転移性疾患を遅延させ、リンパ節サイズを減少させ、無増悪生存をもたらし、疾患進行までの時間を増加させ、腫瘍または癌の形成を抑制または遅延させ、自己抗原に対する耐性を破壊し、癌の退行を誘発し、または生存期間を延長する、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の組成物。
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