CN111979162B

CN111979162B - 重组卡介苗菌株、其制备方法和用途

Info

Publication number: CN111979162B
Application number: CN201910427951.XA
Authority: CN
Inventors: 范小勇; 吴康; 罗道良
Original assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Current assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2024-02-13
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN111979162A

Abstract

本发明提供了重组卡介苗菌株，其包含编码融合蛋白的核苷酸序列，其中所述融合蛋白包含N端部分和C端部分，所述N端部分和所述C端部分是直接连接的或通过一个或多个氨基酸的接头连接，其中所述N端部分包含以SEQ ID No.1所示的氨基酸序列和所述C端部分包含以SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。本发明还提供了包含重组卡介苗菌株的疫苗。此外，本发明还提供重组卡介苗菌株或组合物作为结核病疫苗的用途。本发明的卡介苗菌株毒性低且产生更高的抗原特异性免疫反应。

Description

重组卡介苗菌株、其制备方法和用途

技术领域

一般而言，本发明涉及疫苗领域，更具体涉及重组卡介苗菌株、其制备方法和用途。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)的主要病原菌是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)。全世界有约23％的人口为Mtb潜伏感染者(latent TB infection，LTBI)，即约17亿人口[1]。LTBI人口中有约5-10％的人有可能进一步进展为活动性TB。2017年，全世界有约1000万新发TB病例[2]。2017年的TB致死病例数约为160万[2]。TB的预防是通过对新生儿免疫注射减毒牛结核分枝杆菌卡介苗BCG(M.bovis Bacille Calmette-Guérin，BCG)。BCG的使用最早可以追溯到1921年。BCG仍是目前仅有的TB疫苗。BCG可以显著降低幼儿患严重类型结核病(比如结核性脑膜炎，粟粒性TB)的风险，但是对于肺结核(pulmonary TB，PTB)或TB传播的保护却很差[3]。另外，免疫低下病人免疫BCG后，亦可能引起局部或扩散性疾病[4,5]。因为以上所描述的BCG的不足，需开发新TB活菌疫苗，以便取代现有的BCG(活菌疫苗)；和/或开发基于病毒载体的新疫苗或蛋白/佐剂新疫苗，以便进一步增强BCG或新TB活菌疫苗的免疫保护效力[6]。

对于取代BCG的分枝杆菌相关候选疫苗，已经有多个候选疫苗已被开发。这些候选疫苗目前处于临床前期或者临床试验的不同阶段(见综述[7])。基于彼此不相互排斥的开发策略，这些候选疫苗可以被分为三类。第一类是基因敲除内源基因的候选疫苗，比如BCGΔzmp1[8],MtbΔphoPΔfadD26(MTBVAC)[9],MtbΔRD1ΔpanCD[10]。第二类是重组来自近亲种属基因的候选疫苗，比如BCG::ESX-1^Mmar，其是将生物安全二级的海分枝杆菌(M.marinum)的ESX-1系统重组入BCG[11]。第三类是重组来自远亲种属基因的候选疫苗，比如BCG::hly，其是将来自单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)的LLO(listeriolysin)重组入BCG[12]。这三种开发策略可以相互组合并用于开发新TB候选疫苗，比如BCGΔureC::hly(VPM1002)[13]和M.smegmatisΔesx-3::esx-3(Mtb)[14]。

本领域仍然需要毒性低且产生更高的抗原特异性免疫反应的卡介苗菌株。

发明内容

来自结核分枝杆菌PPE17蛋白的N端结构域PPE17_1-177(即PPE17氨基酸1-177位)能够介导其C端蛋白部分定位在分枝杆菌(包括BCG)的菌膜并且伸向菌膜外侧[15]。ActA蛋白定位在单核细胞增生性李斯特菌的表面，进而介导该菌在细胞内的运动以及细胞-细胞之间的传播[16]。ActA亦介导单核细胞增生性李斯特菌在细胞内的吞噬逃逸[17]。出乎意料地，发明人将包含ActA的融合蛋白导入BCG后，与ActA在单核细胞增生性李斯特菌中的作用相反，包含ActA的融合蛋白促进了BCG和溶酶体的融合。另外，ActA蛋白亦具有佐剂活性[18,19]。因为ActA和吞噬、佐剂活性相关，所以，发明人借助PPE17_1-177将ActA定位在BCG的菌膜，重组菌株毒性低且可在小鼠诱导产生更高的抗原特异性免疫反应，可作为一个候选TB活菌疫苗。对应的重组BCG菌株被命名为rBCG-PA，其中P代表PPE17_1-177，A代表ActA_27-612(即ActA氨基酸27-612位)。重组BCG菌株rBCG-PA已保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号：CCTCC NO：M 2017667)。ActA的全长包含639个氨基酸。启动PA编码DNA转录mRNA的启动子为双突变furA(Rv1909c)启动子[20,21]。重组菌株rBCG-PA所表达的PA的具体蛋白序列见图1。重组菌株rBCG-PA可能是一个候选新TB活菌疫苗。

本发明的有益效果还包括：

(1)借助于PPE17_1-177，rBCG-PA能够膜定位且极化表达ActA_27-612。

(2)相比于BCG和过表达PPE17_1-177的重组菌株rBCG-P，重组菌株rBCG-PA在巨噬细胞内发生更高的吞噬体/溶酶体融合，进而导致rBCG-PA在巨噬细胞内菌落数更低。

(3)相比于BCG，rBCG-PA毒性更低。

(4)相比于BCG和rBCG-P，rBCG-PA诱导小鼠产生更强的免疫记忆。

(5)相比于BCG和rBCG-P，rBCG-PA诱导小鼠产生更强的针对结核分枝杆菌(Mtb)的免疫保护。

在一方面，本发明提供了重组卡介苗菌株，其包含用于表达融合蛋白的核苷酸序列，其中所述融合蛋白包含N端部分和C端部分，所述N端部分和所述C端部分是直接连接的或通过一个或多个氨基酸的接头连接，

其中所述N端部分包含以SEQ ID No.1所示的氨基酸序列、与以SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列、或以SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，条件是所述N端部分保留以SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的介导C端部分定位在卡介苗菌株的菌膜并且伸向菌膜外侧的能力；且

其中所述C端部分包含以SEQ ID No.3所示的氨基酸序列、与以SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列、或以SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，条件是所述C端部分保留以SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的介导吞噬和/或加强免疫的能力。

在一个实施方案中，所述N端部分源自结核分枝杆菌，和/或所述C端部分源自单核细胞增生性李斯特菌。

在一个实施方案中，所述接头包含2、3、4、5、6或7个以上的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述核苷酸序列导入卡介苗菌株中，从而整合在所述卡介苗菌株的基因组中或者作为独立于卡介苗菌株基因组的载体存在，条件是所述核苷酸序列得以表达。

在一个实施方案中，所述载体包含与表达融合蛋白的核苷酸序列可操作连接的启动子。

在一个实施方案中，所述启动子是为在卡介苗中有功能的启动子，优选优选为furA、突变furA(Rv1909c)、hsp60或hspX启动子。

在一个实施方案中，所述核苷酸序列包含编码以SEQ ID No.5所示的氨基酸序列的核苷酸序列，优选以SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述卡介苗菌株菌株还进行了下列一种或多种修饰：

1)zmp1基因缺失；ureC基因缺失；nuoG基因缺失；hip1基因缺失；SapM基因缺失；BCG_0381(iniA)(对应结核分枝杆菌H37Rv的座位标签，即locus tag，为Rv0342)基因缺失；BCG_0546c(cmaA2)(对应H37Rv座位标签Rv0503c)基因缺失；BCG_0992(对应H37Rv座位标签Rv0938)基因缺失；BCG_0993(对应H37Rv座位标签Rv0939)基因缺失；BCG_1472c(lprG)(对应H37Rv座位标签Rv1411c)基因缺失；BCG_1790(对应H37Rv座位标签Rv1751)基因缺失；BCG_1964(fadD31)(对应H37Rv座位标签Rv1925)基因缺失；BCG_2057c(pks12)(对应H37Rv座位标签Rv2048c)基因缺失；BCG_2384c(对应H37Rv座位标签Rv2370c)基因缺失；BCG_2580(对应H37Rv座位标签Rv2557)基因缺失；BCG_2588(对应H37Rv座位标签Rv2566的5’端)基因缺失；BCG_2589(对应H37Rv座位标签Rv2566的3’端)基因缺失；BCG_3231c(对应H37Rv座位标签Rv3205c)基因缺失；BCG_3297(对应H37Rv座位标签Rv3268)基因缺失；BCG_3445(echA18)(对应H37Rv座位标签Rv3373)基因缺失；BCG_3808c(对应H37Rv座位标签Rv3749c)基因缺失；

2)导入有海分枝杆菌的ESX-1系统；导入大肠杆菌LTAK63突变基因，即对应蛋白的63位氨基酸由丝氨酸替换为赖氨酸；导入有来自单核细胞增生性李斯特菌的LLO(listeriolysin)基因；导入人Cat S基因；

3)导入免疫优势Ag85A基因，即过表达该内源基因；导入免疫优势Ag85B基因，即过表达该内源基因；导入hspX基因，即过表达该内源基因；过表达免疫优势结核分枝杆菌esat-6基因的突变体，即对应ESAT-6 28位的亮氨酸替换为丙氨酸/29位的亮氨酸替换为丝氨酸；或者导入类似的具有免疫优势特性的抗原基因；

4)导入二腺苷酸环化酶(diadenylate cyclase)disA基因，即过表达该内源基因。

在一个实施方案中，其中所述卡介苗菌株还进行下列一种或多种修饰：在卡介苗或者重组卡介苗中缺失CpsA，其在结核分枝杆菌H37Rv的座位标签为Rv3484，该基因在结核分枝杆菌缺失后促进胞内结核分枝杆菌与溶酶体的融合，同时减弱结核分枝杆菌的毒性；或者在重组卡介苗中缺失和CpsA具有相似功能的基因，即缺失该基因后可促进胞内分枝杆菌和溶酶体的融合，和/或减弱该分枝杆菌的毒性。

在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含根据本文所述的重组卡介苗菌株。在一个实施方案中，所述组合物是疫苗，优选是卡介苗。

在另一个方面，本发明提供了本文所述的重组卡介苗菌株或本文所述的组合物作为结核病疫苗的用途。优选地，结核病是肺结核。优选地，疫苗是活菌疫苗，更优选是活菌减毒疫苗或卡介苗。

附图说明

图1：rBCG-PA所表达融合蛋白PA的蛋白序列。

图2：PPE17_1-177能够介导ActA_27-612极化定位在BCG的菌膜且伸向外侧。(A)蛋白示意图。蛋白对应的质粒(pMFA42骨架，不能够重组于BCG基因组[20-22])被用于电转化BCG。对应的转化BCG菌株分别被命名为BCG-E，BCG-PE和BCG-PAE。Arp2/3复合物＝肌动蛋白相关蛋白复合物(actin-related protein complex)。VASP＝vasodilator-stimulatedphosphoprotein。ActA的功能结构域展示于图A底侧(重画自[17])。(B)BCG菌株所表达蛋白的分布特征。(C)BCG菌株所表达蛋白的菌膜定位分析。BCG菌株和蛋白酶K(protease K，pro.K)在37℃共孵育。若蛋白定位于菌膜且伸向外侧，则该蛋白易被pro.K降解；反之，则不易被降解。＊非特异杂交条带。符号(-)表示未与Pro.K共孵育，符号(+)表示与Pro.K共孵育。(D)BCG菌株和pro.K共孵育后的流式分析。

图3：重组菌株rBCG-P和rBCG-PA的构建。(A)蛋白示意图。蛋白对应的质粒(pMV306骨架，可位点特异性稳定重组于BCG基因组[12])被用于电转化BCG。对应的转化BCG菌株分别被命名为rBCG-P和rBCG-PA。引物对PPE-F/PPE-R即可以扩增BCG内源PPE17_1-177编码DNA，亦可以扩增外源PPE17_1-177编码DNA；引物对PPE-F/306-R仅能扩增外源PPE17_1-177编码DNA。(B)重组菌株rBCG-P的菌液/反转录-PCR鉴定。蛋白片段PPE17_1-177对应DNA/RNA片段长度为531bp。(左)菌液PCR表示以菌液为模板进行PCR；符号(+)表示以质粒pMV306-P为模板进行PCR(阳性对照)，符号(-)表示未加模板进行的PCR(阴性对照)。(右)反转录PCR表示以rBCG-P的反转录产物为模板进行PCR，RNA为模板的PCR表示以rBCG-P的RNA为模板进行PCR，菌液PCR表示以菌液为模板进行PCR。(C)重组菌株rBCG-PA的菌液/反转录-PCR和Western杂交鉴定。蛋白片段ActA_27-612对应的DNA/RNA片段的长度为1758bp。蛋白PA的预测分子量为83.3kD。图3(C)所用引物为ActA-F/ActA-R。ActA特异抗体购自LifeSpan BioSciences，USA，货号LS-C137677-100。＊非特异Western杂交条带；☆因为PA的预测分子量为83.3kD，所以其可能为PA Western杂交条带；☆☆可能的较大分子量的PA翻译蛋白。(左)菌液PCR表示以菌液为模板进行PCR，反转录PCR表示以rBCG-PA的反转录产物为模板进行PCR，符号(+)表示质粒pMV306-PA为模板进行PCR(阳性对照)，符号(-)表示未加模板进行的PCR。(右)Lm表示单核增生性李斯特菌菌体蛋白，BCG表示BCG菌菌体蛋白，rBCG-PA表示rBCG-PA菌体蛋白。图3(B)和3(C)所用引物见表3。

图4：BCG菌株在体外7H9培养液的生长分析(A)、在小鼠巨噬细胞系RAW264.7的菌落数分析(B)、在人巨噬细胞系THP-1的菌落数分析(C)和小鼠引流淋巴结的菌落数分析(D)。MOI＝1。小鼠通过皮下免疫BCG菌株(1×10⁶CFUs/鼠)。免疫后不同时间点，引流淋巴结中BCG相关菌株CFUs测定。(A)的样本数为3，(B)-(D)的样本数为4。数据为平均值±SD(standard deviation)。**p<0.01,***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

图5：细胞(RAW264.7)内BCG菌株和吞噬通路标签蛋白LC3(A)或溶酶体(B)的共定位分析。左面板，胞内BCG相关菌株和吞噬通路标签蛋白LC3(A)或溶酶体标签Dextran(B)共定位的显微照片；右面板，左面板共定位照片的数字化展示。数据为平均值±SEM(standarderror of mean)(数据来自3次独立观察，每次50个感染细胞)。**p<0.01,***p<0.001

(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

图6：毒性分析。(A&B)被感染细胞的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色分析。死细胞为PI阳性；活细胞为PI阴性。(C&D)被感染细胞释放乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)的定量分析。死细胞大量释放LDH。(E)尾静脉感染免疫缺陷小鼠(SCID)的生存曲线。尾静脉注射剂量为2×10⁷CFUs/小鼠。(A)-(D)的样本量为4，(E)的样本量为11。(A)-(D)的数据为平均值±SD。尾静脉注射剂量为2×10⁷CFUs/鼠。***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

图7：细胞被感染后第10天的显微照片。箭头所指细胞为代表性死细胞。24孔板中每孔接种1×10⁵RAW264.7细胞。RAW264.7细胞感染后依然生长，因此其第十天的细胞密度很高。因为RAW264.7细胞感染后依然生长，因此我们认为BCG和rBCG-PA对RAW264.7细胞活力的影响可能很难被捕捉到(图6(A)和6(C))。24孔板中每孔接种2×10⁵THP-1细胞。接种THP-1时，同时用PMA处理。经过PMA处理，THP-1细胞分化成巨噬细胞样细胞。PMA处理的THP-1细胞几乎不分裂生长，因此其第十天的细胞密度依然较低。因为PMA处理过的THP-1细胞几乎不分裂生长，因此我们认为BCG和rBCG-PA对THP-1细胞活力的差异影响便于被捕捉到(图6(B)和6(D))。

图8：被免疫小鼠脾细胞PPD特异性T细胞胞内细胞因子分泌的流式分析。(A&B)皮下免疫后两个月的流式分析。(C&D)皮下免疫后八个月的流式分析。免疫菌量为1×10⁶CFUs/鼠。样本量为4。数据为平均值±SD。**p<0.01,***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

图9：被免疫小鼠肺脏和/或脾脏Mtb H37Rv的菌落数分析。小鼠被免疫后两个月，感染Mtb H37Rv小鼠的菌落数分析。数据为平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

具体实施方式

提供以下内容以便于本领域技术人员了解本发明。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

本领域普通技术人员应理解，在本发明中，术语“载体”包括DNA分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核酸序列，包括但不限于：λ-噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。

本发明的融合蛋白包含以SEQ ID No.5所示的序列或以SEQ ID No.5所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸的序列，只要融合蛋白保留SEQ ID No.5的氨基酸序列的功能，即N端部分介导C端部分定位在卡介苗菌株的菌膜并且伸向菌膜外侧的能力，C端部分介导吞噬和/或加强免疫的能力。“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。

氨基酸添加指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:5的C端或N端添加氨基酸，只要融合蛋白保留上述功能。

氨基酸取代指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:5的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要融合蛋白保留上述功能。

氨基酸插入指在氨基酸序列例如SEQ ID NO:5的序列的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要融合蛋白保留上述功能。

氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如SEQ ID NO:5的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要融合蛋白保留上述功能。

在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1：氨基酸保守取代。

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Vol；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lvs
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

实施例

材料和方法

1.实验动物

6-8周龄的雌性免疫缺陷小鼠(severe combined immuno-deficient，SCID)和BALB/c小鼠购自上海斯莱克。SCID小鼠用于实施例6的毒性分析，即其被尾静脉注射BCG相关菌株后的存活实验(图6(E))；BALB/c小鼠用于实施例4(即小鼠被腹部皮下免疫BCG相关菌株后，小鼠引流淋巴结菌落数分析。图4(D))、实施例7(即被免疫小鼠脾T细胞抗原PPD特异性细胞因子表达实验。图8)、实施例8(即被免疫小鼠抗Mtb H37Rv能力实验。图9)。

2.细菌菌株及其培养条件

分子克隆用的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)Top10培养于液体或者固体LB培养基。牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG Pasteur(简称BCG)(American TypeCulture Collection，ATCC；保藏编号：35734^TM)及其衍生菌株培养于添加10％oleic acid-albumin-dextrose-catalase enrichment(OADC)(BD BBL^TM，USA；货号：212351)、0.5％甘油、0.05％吐温-80的液体Middlebrook 7H9培养基(BD Difco^TM，USA；货号：271310)(简称液体7H9培养基)；或者培养于添加10％OADC、0.5％甘油的固体7H11培养基(BD BBL^TM，USA；货号：212203)(简称固体7H11培养基)。单核增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)分离株来自上海交通大学农业与生物学院王恒安课题组，该菌培养于脑心浸液肉汤培养基(海博生物，China；货号：HB8297-1)。细菌培养温度为37℃。固体培养为培养箱静置培养。Top10液体培养时摇床转速为250转/分钟；BCG相关菌株液体培养时摇床转速为55转/分钟。细菌长期-80℃冻存于含有10％甘油的对应培养液中。

3.细胞培养

RAW264.7细胞和THP-1细胞来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号分别为SCSP-5036和SCSP-567。RAW264.7培养于含有10％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)(Biological Industries，USA；货号：04-001-1ACS)的DMEM培养液(Hyclone，China；货号：SH30243.01B)中。THP-1细胞培养于含有10％FBS的RPMI1640培养液(Hyclone，China；货号：SH30809.01B)中。两个细胞系的培养条件都为37℃，5％CO₂。在感染THP-1细胞之前，需用20ng/mL佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)(Sigma-Aldrich，

USA；货号：P1585-1MG)处理THP-1细胞3天，以便其分化成贴壁的巨噬细胞样细胞。小鼠脾细胞培养于含有10％FBS、1×Penicillin-Streptomycin(ThermoFisherSCIENTIFIC，USA；货号：15070063)的RPMI1640培养液中。

4.质粒构建

表达EGFP(E)的质粒，即pMFA42-E，的构建过程：质粒pMFA42由专利发明人之一范小勇及其他人构建于2011年[22]。EGFP扩增所用模板为pEGFP-N2质粒(北京索莱宝科技有限公司；货号：P6440-20ul)。用高保真DNA聚合酶GXL DNA Polymerase(简称DNA聚合酶)(TaKaRa，Japan；货号：R050A)扩增完整EGFP编码区(包含终止密码子)，并通过常规分子克隆手段将EGFP编码区通过NdeI(上游，5’端)和BamHI(下游，3’端)内切酶位点连接入pMFA42。

表达PPE17_1-177-EGFP(PE)的质粒，即pMFA42-PE的构建过程：蛋白片段PPE17_1-177对应的DNA扩增模板为Mtb H37Rv(American Type Culture Collection，ATCC；编号：25618^TM)基因组DNA。首先将蛋白片段PPE17_1-177对应DNA编码区通过NdeI(上游，5’端)和BamHI(下游，3’端)内切酶位点连接入pMFA42；再将EGFP编码区(不包含终止密码子)通过BamHI(上游，5’端)和ClaI(下游，3’端)内切酶位点连接入(为了避免移码突变，在ClaI内切酶位点的5’端引入了TT两个碱基。)；最后，将通过全基因合成所得的HL5连接肽蛋白对应的DNA序列通过BamHI内切酶位点连接入。因为EGFP编码区不包含终止密码子，所以PAE的翻译终止需借助载体pMFA42自带的终止密码子，导致蛋白PAE的C端多了5个氨基酸。

表达PPE17_1-177-ActA_27-612-EGFP(PAE)的质粒，即pMFA42-PAE的构建过程：首先将蛋白片段PPE17_1-177对应编码区通过NdeI(上游，5’端)和BamHI(下游，3’端)内切酶位点连接入pMFA42；再将蛋白片段ActA_27-612对应DNA编码区通过BamHI(上游，5’端)和EcoRI(下游，3’端)内切酶位点连接入；最后，将EGFP编码区(不包含终止密码子)通过EcoRI(上游，5’端)和ClaI(下游，3’端)内切酶位点连接入。为了避免移码突变，在ClaI内切酶位点的5’端引入了TT两个碱基。蛋白片段ActA_27-612对应DNA编码区扩增自一个单核增生性李斯特菌分离株的基因组DNA。因为EGFP编码区不包含终止密码子，所以PAE的翻译终止需借助载体pMFA42自带的终止密码子，导致蛋白PAE的C端多了5个氨基酸。

表达PPE17_1-177(P)的质粒，即pMV306-P的构建过程：pMV306质粒惠赠自美国JohnHopkins University的Ying Zhang教授。将蛋白片段PPE17_1-177对应的DNA片段通过NdeI(上游，5’端)和BamHI(下游，3’端)内切酶位点连接入pMFA42，得到pMFA42-P。用内切酶XbaI和ClaI酶切pMFA42-P得到两个片段。两个片段其中一个大片段主要为载体骨架；另一个小片段主要包含了双突变furA(Rv1909c)启动子[20,21]、PPE17_1-177对应的DNA编码区。将该小片段通过XbaI(上游，5’端)和ClaI(下游，3’端)内切酶位点连接入pMV306。此时所得质粒为pMV306-P。因为蛋白片段PPE17_1-177对应的DNA片段不包含终止密码子，所以pMV306-P所表达蛋白的翻译终止需借助载体pMV306的终止密码子，导致所表达蛋白的C端多了13个氨基酸。

表达PPE17_1-177-ActA_27-612(PA)的质粒，即pMV306-PA的构建过程：将蛋白片段ActA_27-612对应的DNA片段通过BamHI(上游，5’端)和EcoRI(下游，3’端。通过PCR已经在蛋白片段ActA_27-612对应的DNA片段3’端引入终止密码子TAG)插入pMFA42-P，得到pMFA42-PA。用内切酶XbaI和ClaI酶切pMFA42-PA得到两个片段。两个片段其中一个大片段主要为载体骨架；另一个小片段主要包含了双突变furA(Rv1909c)启动子[20,21]、PPE17_1-177-ActA_27-612对应的DNA编码区。将该小片段通过XbaI(上游，5’端)和ClaI(下游，3’端)内切酶位点连接入pMV306。此时所得质粒为pMV306-PA。

5.菌株转化

用质粒电转化BCG。电转化所用仪器为Gene Pluser II(Bio-Rad，USA)；电转化条件为2.5kV、25μF、1000Ω。将电转化后的BCG涂布于含有50mg/L卡那霉素的固体7H11培养基，并培养于37℃。约3周后，挑取阳性克隆并培养于含有50mg/L卡那霉素的液体7H9培养基。待菌生长至对数期后，即波长为600nm的光密度(opitical density，OD)约为0.8(OD₆₀₀≈0.8)时，其被用于后续鉴定和分析。转化pMFA42-E的BCG菌株被命名为BCG-E；转化pMFA42-PE的BCG菌株被命名为BCG-PE；转化pMFA42-PAE的BCG菌株被命名为BCG-PAE；转化pMV306-P的菌株被命名为rBCG-P；转化pMV306-PA的菌株被命名为rBCG-PA。

6.荧光显微镜观察

对BCG相关菌株(即BCG-E、BCG-PE和BCG-PAE)进行荧光显微镜观察所用的显微镜为All-In-One digital inverted microscope(AMG，USA)，放大倍数为100倍。将2μL OD₆₀₀≈0.8的新鲜菌液滴于载玻片，之后覆盖方形盖玻片，再根据显微镜说明书所述操作进行显微观察和拍照。

7.蛋白酶K(protease K，pro.K)接触性分析

Pro.K接触性分析用以判断所过表达蛋白是否分布于菌膜外侧。若pro.K能够酶切消化菌体所过表达蛋白，说明该蛋白表达于菌膜外侧；反之，若pro.K不能够酶切消化菌体所过表达蛋白，则说明该蛋白表达于菌膜内侧。收集3mL OD₆₀₀≈0.8的新鲜菌液(5000g，10分钟)，并用TBS缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.2、150mM NaCl、3mM KCl)洗涤一次。之后将菌体重悬于500μL TBS缓冲液并等分至两份，每份250μL。其中一份加入终浓度为100ng/mL的pro.K；另一份不加pro.K，作为阴性对照。之后将样本在37℃水浴30分钟。孵育结束后，样本中加入不含EDTA的终浓度为1×的蛋白酶抑制剂(碧云天，China；货号：P1005)。之后，样本用500μL TBS缓冲液洗涤两次，并重悬于150μL TBS缓冲液。此时样本可以超声破碎以便获得菌体蛋白用于常规Western杂交；或者直接用于流式分析(BD LSRFortessa^TM flowcytometer，BD Biosciencces，USA)。对于菌体蛋白的获得，菌液通过超声波细胞粉碎机(宁波新芝，China；型号：JY92-IIDN)冰浴破碎(15％功率超声1s，间隙1s)至菌液透明，之后加入50μL 4×的蛋白上样缓冲液(200mM Tris-HCl pH6.8、8％十二烷基硫酸钠、0.4％溴酚蓝、40％甘油、4％β-巯基乙醇)。将此时的样本在沸水浴中煮5分钟，之后再冰浴5分钟(该沸水浴/冰浴步骤共重复两次)。之后高速离心(12000g，1分钟)以便去除可能的不可溶细胞碎片。去除细胞碎片的样本可以用于Western杂交。单核增生性李斯特菌也可以类似获得菌体蛋白。EGFP特异抗体购自Santa Cruz,USA，货号sc-81045。

8.菌体RNA抽提和反转录PCR

约2mL OD₆₀₀≈0.8的新鲜菌液重悬于1.2mL RNAiso Plus(TaKaRa，Japan；货号：9108)，并加入预先加有约500μL的氧化锆珠子(BioSpec，USA；货号：11079101)的2mL塑料丝口管中。将样本在MINI-BEADBEATER^TM(BioSpec，USA)震荡以便裂解菌样(最低速度20s，之后冰浴5分钟；重复该步骤3次)。然后按照RNAiso Plus的说明书进行后续的RNA抽提。用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(TIANGEN，China；货号：KR118-02)并按照其说明书进行RNA反转录，反转录所用引物为试剂盒所提供的随机引物(Random primers)。

9.细胞感染

在24孔板接种RAW264.7细胞(1×10⁵细胞/孔)或者THP-1细胞(2×10⁵细胞/孔，需同时用PMA处理3天后再感染)。第二天用OD₆₀₀≈0.8的新鲜菌液以特定感染复数(multiplicity of infection，MOI)，即细菌数：巨噬细胞数的数值，感染细胞。感染后2h，用预热的PBS润洗细胞3遍，以便去除胞外菌。之后加入500μL新鲜细胞培养液继续培养至特定时间。

10.胞内BCG相关菌株的菌落数(colony-forming units，CFUs)测定

细胞感染后不同时间，用0.5％Triton X-100(溶解在水中)裂解细胞。细胞裂解液用PBST(含0.05％吐温-80的PBS)梯度稀释，并涂布于固体7H11培养基。37℃培养3周后，计数CFUs。

对于小鼠淋巴结中BCG相关菌株CFUs的测定，需预先无菌分离淋巴结至PBST中，并用镊子挤压破碎为悬浮细胞。之后离心(500g，5分钟)收集细胞并采用如上所述步骤进行CFUs测定。

11.感染细胞的死亡分析及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放分析

感染的贴壁细胞用胰酶细胞消化液(Beyotime，China；货号：C0201)处理为悬浮状态，并用PBS洗涤两遍。将10⁵细胞重悬于200μL PBS，并加入终浓度2.5μg/mL的碘化丙啶(propidiu iodide，PI)，之后避光室温孵育15分钟。之后样本立即进行流式分析(BDLSRFortessa^TM flow cytometer，BD Biosciencces，USA)。流式数据用FlowJo软件进行分析(Tree Star，USA)。

LDH释放分析采用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(Dojindo Laboratories，Japan)并按照其说明书进行分析。

12.SCID小鼠尾静脉注射及其存活率监测

小鼠尾静脉注射剂量为2×10⁷CFUs/小鼠(细菌重悬于100μL PBS)。共两组小鼠，其中一组小鼠注射BCG，另一组小鼠注射rBCG-PA。每组小鼠数量为11只。注射当天记为第0天。注射后每天观测小鼠的存活情况并记录死亡日期。待所有小鼠都死亡后，根据小鼠死亡记录绘制存活曲线。存活率为所存活小鼠的数量占该组小鼠总数量(11只)的百分比。

13.胞内BCG相关菌株的染色

以24孔板为例。被感染细胞用500μL 4％多聚甲醛(溶解于PBS溶液中)室温固定20分钟，之后用500μL PBS润洗2遍。被感染细胞用500μL 0.1％Triton X-100(溶解于PBS溶液中)破膜5分钟，之后用500μL PBS润洗3遍。

1:1000稀释Gold Nucleic Acid Gel Stain(ThermoFisher SCIENTIFIC，USA；货号：S11494)于染色溶液中(0.85M苯酚、60％甘油、14％异丙醇)。

将稀释的Gold Nucleic Acid Gel Stain加入已经固定/破膜的被感染细胞中(200μL/孔)，并65℃水浴5分钟。之后置于室温放置5分钟。最后，被感染细胞用酸洗液(0.5％盐酸、70％异丙醇)(500μL/孔)润洗3分钟，并用500μL PBS润洗3遍。此时，细胞可以用于后续的免疫荧光染色，或者直接进行显微镜观察。

14.胞内BCG相关菌株和溶酶体的共定位分析

RAW264.7细胞接种至24孔板后8h(此时细胞已贴壁牢固)，向细胞孔加入0.5mg/mLfixable Texas Red-Dextran(10,000MW)(Thermal Fisher SCIENTIFIC，USA；货号：D1863)并37℃，5％CO₂培养过夜。第二天细胞用预热PBS润洗3遍，再加入500μL细胞培养液再培养2h。之后，用BCG相关菌株感染细胞。感染之后特定时间进行胞内菌染色。之后用抗荧光猝灭PVP封片剂(Beyotime，China；货号：P0123)封片，并用All-In-One digitalinverted microscope(AMG，USA)在100倍放大倍数下进行显微观察。

15.免疫荧光

因为本研究所用的细胞为贴壁的巨噬细胞，因此对于需要进行免疫荧光实验的细胞，其在种入24孔板之前，需预先在24孔板的细胞孔预先放入配套的圆形盖玻片(无锡耐思，China；货号：801007)，以便让巨噬细胞贴壁生长在圆形盖玻片上，便于后续的荧光显微观察。

对于已经进行胞内BCG相关菌株染色步骤的细胞，用500μL封闭液(含5％脱脂牛奶的PBS)在4℃封闭过夜。之后室温孵育用封闭液1:500稀释的LC3特异抗体(MEDICAL&BIOLOGICAL LABORATORIES，Japan；货号：PM036。200μL/孔)90分钟。LC3抗体孵育之后，用PBS润洗3遍。之后室温孵育用封闭液1:500稀释的iFluor^TM 594goat anti-rabbit IgG(AATBioquest，USA；货号：16628。200μL/孔)90分钟。之后用PBS润洗3遍。最后，免疫染色的细胞/盖玻片用抗荧光猝灭PVP封片剂(Beyotime，China；货号：P0123)封片，并用All-In-One digital inverted microscope(AMG，USA)在100倍放大倍数下进行显微观察。

16.小鼠免疫和感染

腹部皮下免疫每只小鼠1×10⁶BCG、rBCG-P或rBCG-PA(重悬于100μL PBS)一次。皮下免疫PBS作为阴性对照。两个月后，无菌分离小鼠脾细胞用于胞内细胞因子流式染色；或者用于Mtb H37Rv感染。小鼠Mtb H37Rv的感染参照吸入暴露系统(Glas-Col，USA)并参照其使用说明书进行。

17.胞内细胞因子流式染色

对经免疫的小鼠无菌分离脾脏、镊子挤压破碎脾脏、裂解红细胞(红细胞裂解液，Beyotime，China；货号：C3702)而得到脾细胞。以1×10⁶细胞/100μL细胞培养液/孔的数量将细胞加至U底96孔细胞培养板中，并加终浓度为10μg/mL purified protein derivative(PPD)(Statens Serum Institut，Denmark；货号：2391)。阴性对照孔不加PPD。于细胞培养箱培养12-14h。之后加入高尔基体阻断剂(BD GolgiStop^TM，BD Biosciences；货号：554724)0.1μL/孔，并继续培养5h。之后600g，4℃离心5分钟，弃上清，并使用染色缓冲液(含2％FBS的PBS)洗涤一遍，200μL/孔，弃上清。之后加入配制好的表面抗体混合液(0.5μL抗体/孔，用染色缓冲液稀释。抗体列表见表2)，50μL/孔，4℃避光孵育30分钟。加入150μL染色缓冲液终止表面抗体染色，600g，4℃离心5分钟，弃上清。加入100μL商品化的固定穿膜液(BDCytofix/Cytoperm，BD Biosciences；货号：554722；1×)，室温孵育15分钟，800g，4℃离心5分钟，弃上清。使用100μL商品化的缓冲液洗涤(BD Perm/Wash，BD Biosciences；货号：554723；用水稀释至1×)一遍后，800g，4℃离心5分钟；加入配制好的胞内抗体混合液(0.5μL抗体/孔，用1×的BD Perm/Wash稀释。抗体列表见表2)，50μL/孔，4℃避光孵育30分钟。加入150μL缓冲液(1×BD Perm/Wash)终止表面抗体染色，800g，4℃离心5分钟，弃上清，并使用200-300μL染色缓冲液重悬并流式上机。流式数据用FlowJo软件进行分析(Tree Star，USA)。

表2，胞内流式染色所用抗体。

18.小鼠脏器H37Rv菌落数测定

无菌分离对经免疫且用Mtb H37Rv感染的小鼠的肺脏和脾脏，并转至装有约20颗0.2mm直径钢珠/1mL PBST的2mL塑料丝口管。之后在多样本组织研磨机Tissuelyser-24(上海静信，China)匀浆脏器。匀浆液用PBST梯度稀释并涂布于固体7H11平板。为了抑制杂菌生长，固体7H11平板含有以下四种抗生素：40U/mL多黏霉素B、4μg/mL两性霉素、50μg/mL羧苄青霉素、2μg/mL甲氧苄氨嘧啶。37℃培养3周后，计数CFUs。

实施例1：PPE17_1-177能够介导ActA_27-612在BCG的极化分布，并介导ActA_27-612定位在菌膜且伸向外侧

质粒构建：如图2(A)所示，我们构建了三个质粒：pMFA42-E表达EGFP(E)，所得BCG菌株被命名为BCG-E；pMFA42-PE表达PPE17_1-177-EGFP(PE)，所得BCG菌株被命名为BCG-PE；pMFA42-PAE表达PPE17_1-177-ActA_27-612-EGFP(PAE)，所得BCG菌株被命名为BCG-PAE。在激发状态下，E可以发射绿色荧光，因此可以方便荧光显微镜观察和流式分析；另外，亦可以用E的特异抗体进行Western杂交分析。

荧光显微镜观察：如图2(B)所示，通过荧光显微镜观察，E在BCG呈均匀分布的特征；PE在BCG呈极化分布，即PE虽然在BCG全菌都有分布，但在BCG一极分布量明显增高；PAE和PE在BCG的分布特征相同，亦呈极化分布。

蛋白酶K接触分析：当菌体和pro.K共孵育后，针对菌体蛋白的Western杂交表明，E没有减少，说明E分布在BCG-E的菌膜内侧；而PE和PAE的量都明显减少，说明PE和PAE分布在BCG-PAE菌膜表面且伸向外侧(图2(C))。图2(D)的流式分析结果表明，当和pro.K共孵育后，BCG-E的荧光强度没有减弱，说明E分布在BCG-E的菌膜内侧；而BCG-PAE的荧光强度明显减弱；说明PAE分布在BCG-PAE菌膜表面且伸向外侧。这些结果说明PPE17_1-177能够成功的介导ActA_27-612极化定位在BCG的菌膜表面且伸向外侧。

图2，PPE17_1-177能够介导ActA_27-612极化定位在BCG的菌膜且伸向外侧。(A)蛋白示意图。蛋白对应的质粒(pMFA42骨架，不能够重组于BCG基因组[20-22])被用于电转化BCG。对应的转化BCG菌株分别被命名为BCG-E，BCG-PE和BCG-PAE。Arp2/3复合物＝肌动蛋白相关蛋白复合物(actin-related protein complex)。VASP＝vasodilator-stimulatedphosphoprotein。ActA的功能结构域展示于图A底侧(重画自[17])。(B)BCG菌株所表达蛋白的分布特征。(C)BCG菌株所表达蛋白的菌膜定位分析。BCG菌株和蛋白酶K(protease K，pro.K)在37℃共孵育。若蛋白定位于菌膜且伸向外侧，则该蛋白易被pro.K降解；反之，则不易被降解。＊非特异杂交条带。符号(-)表示未与Pro.K共孵育，符号(+)表示与Pro.K共孵育。(D)BCG菌株和pro.K共孵育后的流式分析。

实施例2：表达PPE17_1-177-ActA_27-612的重组菌株的构建

如图3(A)所示，我们进一步构建了两个质粒：pMV306-P表达PPE17_1-177(P)，所得BCG菌株被命名为rBCG-P；pMV306-PA表达PPE17_1-177-ActA_27-612(PA)，所得BCG菌株被命名为rBCG-PA。对于rBCG-P的鉴定，我们采用了两对引物，分别是PPE-F/PPE-R和PPE-F/306-R(表3)。因为PPE-F和PPE-R结合在蛋白片段PPE17_1-177对应DNA片段之上，所以PPE-F/PPE-R不能够特异的检测PPE17_1-177对应的外源DNA片段(图3(A))。引物306-R特异结合在随机肽对应的DNA片段之上，因此PPE-F/306-R能够特异的检测PPE17_1-177对应的外源DNA片段，进而可用于鉴定rBCG-P(图3(A))。如图3(B)左面版所示，引物对PPE-F/PPE-R可以检测出BCG PPE17_1-177对应的内源DNA片段；如图3(B)右面板所示，用引物对PPE-F/306-R则可特异的检测出rBCG-P所过表达的蛋白片段PPE17_1-177对应的外源DNA片段(菌液PCR)和外源RNA(反转录PCR)。图3(C)左面板表明，rBCG-PA转录ActA_27-612对应的DNA和RNA；图3(C)右面板表明rBCG-PA表达蛋白PA。综上所述，我们成功的构建了rBCG-P和rBCG-PA。

图3，重组菌株rBCG-P和rBCG-PA的构建。(A)蛋白示意图。蛋白对应的质粒(pMV306骨架，可位点特异性稳定重组于BCG基因组[12])被用于电转化BCG。对应的转化BCG菌株分别被命名为rBCG-P和rBCG-PA。引物对PPE-F/PPE-R即可以扩增BCG内源PPE17_1-177编码DNA，亦可以扩增外源PPE17_1-177编码DNA；引物对PPE-F/306-R仅能扩增外源PPE17_1-177编码DNA。(B)重组菌株rBCG-P的菌液/反转录-PCR鉴定。蛋白片段PPE17_1-177对应DNA/RNA片段长度为531bp。(左)菌液PCR表示以菌液为模板进行PCR；符号(+)表示以质粒pMV306-P为模板进行PCR(阳性对照)，符号(-)表示未加模板进行的PCR(阴性对照)。(右)反转录PCR表示以rBCG-P的反转录产物为模板进行PCR，RNA为模板的PCR表示以rBCG-P的RNA为模板进行PCR，菌液PCR表示以菌液为模板进行PCR。(C)重组菌株rBCG-PA的菌液/反转录-PCR和Western杂交鉴定。蛋白片段ActA_27-612对应的DNA/RNA片段的长度为1758bp。蛋白PA的预测分子量为83.3kD。图3(C)所用引物为ActA-F/ActA-R。ActA特异抗体购自LifeSpan BioSciences，USA，货号LS-C137677-100。＊非特异Western杂交条带；☆因为PA的预测分子量为83.3kD，所以其可能为PA Western杂交条带；☆☆可能的较大分子量的PA翻译蛋白。(左)菌液PCR表示以菌液为模板进行PCR，反转录PCR表示以rBCG-PA的反转录产物为模板进行PCR，符号(+)表示质粒pMV306-PA为模板进行PCR(阳性对照)，符号(-)表示未加模板进行的PCR。(右)Lm表示单核增生性李斯特菌菌体蛋白，BCG表示BCG菌菌体蛋白，rBCG-PA表示rBCG-PA菌体蛋白。图3(B)和3(C)所用引物见表3。

表3，菌液/反转录-PCR鉴定所用引物。

实施例3：重组菌株rBCG-PA在巨噬细胞内以及在免疫小鼠引流淋巴结菌落数较低

我们进而测定不同BCG菌株BCG、rBCG-P和rBCG-PA在液体7H9培养基中的生长速率。在生长的不同时间，即第0、2、4、6、8、11、13和15天，从培养瓶中吸取100μL菌液加入平底96孔板中。之后用Eon^TM Microplate Spectrophotometer(BioTek，USA)测定OD₆₀₀数值。如图4(A)所示，rBCG-PA和BCG在液体7H9培养基中的生长速率相同；rBCG-P在前两天的生长速率和rBCG-PA、BCG的生长速率相同，之后的生长速率明显减慢。

与此同时，我们比较了BCG、rBCG-P和rBCG-PA在小鼠巨噬细胞系RAW264.7、人巨噬细胞系THP-1中的菌落数。相比于BCG和rBCG-P，rBCG-PA在小鼠巨噬细胞系RAW264.7(图4(B))的菌落数更低。进一步，相比于BCG，rBCG-PA在人巨噬细胞系THP-1的菌落数亦更低(图4(C))。

最后，我们也测试了BCG和rBCG-PA在小鼠引流淋巴结的CFUs。小鼠被腹部皮下免疫1×10⁶的细菌。相比于BCG，rBCG-PA在被免疫小鼠的引流淋巴结的CFUs亦较低，特别是在免疫后第二周(图4(D))。

这些结果说明rBCG-PA在巨噬细胞内和免疫小鼠引流淋巴结菌落数更低。

图4，BCG菌株在体外7H9培养液的生长分析(A)、在小鼠巨噬细胞系RAW264.7的菌落数分析(B)、在人巨噬细胞系THP-1的菌落数分析(C)和小鼠引流淋巴结的菌落数分析(D)。MOI＝1。小鼠通过皮下免疫BCG菌株(1×10⁶CFUs/鼠)。免疫后不同时间点，引流淋巴结中BCG相关菌株CFUs测定。图4(A)的样本数为3，图4(B)-4(D)的样本数为4。数据为平均值±SD(standard deviation)。**p<0.01,***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

实施例5：重组菌株rBCG-PA在胞内更易发生吞噬体/溶酶体融合

鉴于rBCG-PA在巨噬细胞中菌落数较低(图4)，我们进一步鉴定其在巨噬细胞内是否更易发生吞噬体/溶酶体融合。所检测指标包括胞内BCG相关菌株与吞噬通路标签蛋白LC3[23]的共定位，以及与溶酶体的共定位。如图5(A)所示，相比于胞内BCG和rBCG-P，更多的胞内rBCG-PA与LC3共定位。进一步，相比于胞内BCG和rBCG-PA，更多的胞内rBCG-PA和溶酶体共定位(图5(B))。这些结果说明rBCG-PA在胞内更易发生吞噬体/溶酶体融合，进而导致该菌在胞内菌落数较低。

图5，细胞(RAW264.7)内BCG菌株和吞噬通路标签蛋白LC3(A)或溶酶体(B)的共定位分析。左面板，胞内BCG相关菌株和吞噬通路标签蛋白LC3(A)或溶酶体标签Dextran(B)共定位的显微照片；右面板，左面板共定位照片的数字化展示。数据为平均值±SEM(standarderror of mean)(数据来自3次独立观察，每次50个感染细胞)。**p<0.01,***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

实施例6：重组菌株rBCG-PA的毒性较低

如图6(A)所示，BCG和rBCG-PA感染的RAW264.7细胞的死亡比例基本相同；而BCG感染的THP-1细胞的死亡率在感染后第10天明显高于rBCG-PA感染的THP-1细胞(图6(B)，图7)。与图6(A)和6(B)的结果一致，BCG和rBCG-PA感染的RAW264.7细胞释放的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的量基本相同(图6(C))；而BCG感染的THP-1细胞释放LDH的量在感染后第10天显著高于rBCG-PA感染THP-1细胞释放LDH的量(图6(D))。进一步，相比于感染BCG的SCID小鼠，感染rBCG-PA的SCID小鼠生存时间更长(图6(E))。这些结果说明rBCG-PA的毒性较低。

图6，毒性分析。(A&B)被感染细胞的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色分析。死细胞为PI阳性；活细胞为PI阴性。(C&D)被感染细胞释放乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)的定量分析。死细胞大量释放LDH。(E)尾静脉感染免疫缺陷小鼠(SCID)的生存曲线。图6(A)–6(D)的样本量为4，图6(E)的样本量为11。图6(A)–6(D)的数据为平均值±SD。尾静脉注射剂量为2×10⁷CFUs/鼠。***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

图7，细胞被感染后第10天的显微照片。箭头所指细胞为代表性死细胞。24孔板中每孔接种1×10⁵RAW264.7细胞。RAW264.7细胞感染后依然生长，因此其第十天的细胞密度很高。因为RAW264.7细胞感染后依然生长，因此我们认为BCG和rBCG-PA对RAW264.7细胞活力的影响可能很难被捕捉到(图6(A)和6(C))。24孔板中每孔接种2×10⁵THP-1细胞。接种THP-1时，同时用PMA处理。经过PMA处理，THP-1细胞分化成巨噬细胞样细胞。PMA处理的THP-1细胞几乎不分裂生长，因此其第十天的细胞密度依然较低。因为PMA处理过的THP-1细胞几乎不分裂生长，因此我们认为BCG和rBCG-PA对THP-1细胞活力的差异影响便于被捕捉到(图6(B)和6(D))。

实施例7：重组菌株rBCG-PA诱导小鼠产生更强的免疫记忆

鉴于rBCG-PA在吞噬细胞内发生更高比例的吞噬体/溶酶体融合(图5)、在吞噬细胞和引流淋巴结更低的菌落数(图4)、在吞噬细胞和SCID小鼠的低毒性(图6)，这些结果暗示我们rBCG-PA(及其抗原)可能在小鼠体内更易被抗原处理和呈递，进而产生更强的T细胞免疫。如图8(A)和8(B)所示，相比于BCG和rBCG-P免疫小鼠，rBCG-PA免疫小鼠脾脏的CD4+和CD8+T细胞表达最高比例的PPD特异性ifng，il2和tnf。小鼠被免疫八个月后，相比于BCG免疫小鼠，rBCG-PA免疫小鼠脾脏的CD4+T细胞表达最高比例的PPD特异性ifng，il2，il17a和tnf(图8(C))；rBCG-PA免疫小鼠脾脏的CD8+T细胞表达最高比例的PPD特异性ifng(图8(D))。这些结果表明rBCG-PA能够诱导小鼠产生更强的免疫记忆。

图8，被免疫小鼠脾细胞PPD特异性T细胞胞内细胞因子分泌的流式分析。(A&B)皮下免疫后两个月的流式分析。(C&D)皮下免疫后八个月的流式分析。免疫菌量为1×10⁶CFUs/鼠。样本量为4。数据为平均值±SD。**p<0.01,***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

实施例8：重组菌株rBCG-PA诱导小鼠产生更强的针对Mtb的免疫保护

如图9所示，相比于BCG和rBCG-P免疫小鼠，rBCG-PA免疫小鼠在肺脏和脾脏中的Mtb H37Rv落数更低。该结果说明rBCG-PA能够诱导小鼠产生更强的针对Mtb的免疫保护。

图9，被免疫小鼠肺脏和/或脾脏Mtb H37Rv的菌落数分析。小鼠被免疫后两个月，感染Mtb H37Rv小鼠的菌落数分析。数据为平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(Bonferroni矫正的双向方差分析)。

序列表

PPE17_1-177(P)蛋白序列(SEQ ID NO.1)。对应图1-图3。

MDFTIFPPEFNSLNIQGSARPFLVAANAWKNLSNELSYAASRFESEINGLITSWRGPSSTIMAAAVAPFRAWIVTTASLAELVADHISVVAGAYEAAHAAHVPLPVIETNRLTRLALATTNIFGIHTPAIFALDALYAQYWSQDGEAMNLYATMAAAAARLTPFSPPAPIANPGALA

PPE17_1-177蛋白序列对应的DNA序列(SEQ ID NO.2)。对应图1-图3。

ATGGATTTCACAATTTTTCCGCCGGAGTTCAACTCCCTCAACATCCAAGGTAGCGCTCGTCCGTTTCTAGTAGCCGCGAACGCCTGGAAGAATCTGTCCAACGAGCTGAGCTACGCGGCCAGTCGGTTCGAGAGTGAGATCAACGGGCTGATCACATCGTGGCGGGGGCCATCGTCGACGATCATGGCAGCTGCGGTCGCCCCATTTCGGGCCTGGATTGTCACGACCGCTTCCCTGGCTGAACTCGTCGCCGACCACATCAGCGTCGTGGCAGGCGCCTATGAAGCGGCGCACGCAGCACACGTGCCGCTGCCGGTGATCGAGACCAACCGACTGACGCGCCTCGCTCTCGCCACGACCAACATTTTCGGGATTCACACCCCCGCGATCTTTGCCCTCGATGCACTGTATGCCCAGTACTGGTCCCAAGATGGCGAGGCGATGAACCTCTACGCCACAATGGCGGCGGCCGCCGCACGGCTGACACCGTTCTCGCCCCCGGCGCCGATCGCCAACCCGGGCGCGCTGGCC

ActA_27-612(A)蛋白序列(SEQ ID No.3)。对应图1-图3。

IFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPPIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHT

ActA_27-612蛋白序列对应的DNA序列(SEQ ID No.4)。对应图1-图3。

ATATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCCAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAGCCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTGAGGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAAAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGCAAAAGCAGAGAAAGGTCCGAATAACAATAATAACAACGGTGAGCAAACAGGAAATGTGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGTCGACCGACCAACTCTGCAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGTCTGTCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGAAAAGCCATAGCGTCGTCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCAGATAAACCAACAAAAGCAAATAAGAGAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGTGGATGCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGACGAGTCTACACCACAACCTTTAAAAGCAAATCAAAAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCGATGCTTCTCGGTTTTAATGCTCCTACTCCATCGGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCGCCGCCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATTATGCGGGAAACAGCACCTTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGCGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAGTGCTATTAATCGCCATAGCGAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGTTGAACGGGAGAGGCGGTAGACCAACATCTGAAGAATTTAGTTCGCTGAATAGTGGTGATTTTACAGATGACGAAAACAGCGAGACAACAGAAGAAGAAATTGATCGCCTAGCTGATTTAAGAGATAGAGGAACAGGAAAACACTCAAGAAATGCGGGTTTTTTACCATTAAATCCATTTATTAGTAGCCCTGTTCCTTCATTAACTCCAAAGGTACCGAAAATAAGCGCGCCGGCTCTGATAAGTGACATAACTAAAAAAGCGCCATTTAAGAATCCATCACAGCCATTAAATGTGTTTAATAAAAAAACTACAACGAAAACAGTGACTAAAAAACCAACCCCTGTAAAGACCGCACCAAAGCTAGCAGAACTTCCTGCCACAAAACCACAAGAAACCGTACTTAGGGAAAATAAAACACCCTTTATAGAAAAACAAGCAGAAACAAACAAGCAGTCAATTAATATGCCGAGCCTACCAGTAATCCAAAAAGAAGCTACAGAGAGCGATAAAGAGGAAATGAAACCACAAACCGAGGAAAAAATGGTAGAGGAAAGCGAATCAGCTAATAACGCAAACGGAAAAAATCGTTCTGCTGGCATTGAAGAAGGAAAACTAATTGCTAAAAGTGCAGAAGACGAAAAAGCGAAGGAAGAACCAGGGAACCATACG

PPE17_1-177-ActA_27-612(PA)蛋白序列(SEQ ID No.5)。对应图1和图3。

MDFTIFPPEFNSLNIQGSARPFLVAANAWKNLSNELSYAASRFESEINGLITSWRGPSSTIMAAAVAPFRAWIVTTASLAELVADHISVVAGAYEAAHAAHVPLPVIETNRLTRLALATTNIFGIHTPAIFALDALYAQYWSQDGEAMNLYATMAAAAARLTPFSPPAPIANPGALAGSIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPPIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHT

PPE17_1-177-ActA_27-612(PA)蛋白序列对应的DNA序列(SEQ ID No.6)。对应图1和图3。

ATGGATTTCACAATTTTTCCGCCGGAGTTCAACTCCCTCAACATCCAAGGTAGCGCTCGTCCGTTTCTAGTAGCCGCGAACGCCTGGAAGAATCTGTCCAACGAGCTGAGCTACGCGGCCAGTCGGTTCGAGAGTGAGATCAACGGGCTGATCACATCGTGGCGGGGGCCATCGTCGACGATCATGGCAGCTGCGGTCGCCCCATTTCGGGCCTGGATTGTCACGACCGCTTCCCTGGCTGAACTCGTCGCCGACCACATCAGCGTCGTGGCAGGCGCCTATGAAGCGGCGCACGCAGCACACGTGCCGCTGCCGGTGATCGAGACCAACCGACTGACGCGCCTCGCTCTCGCCACGACCAACATTTTCGGGATTCACACCCCCGCGATCTTTGCCCTCGATGCACTGTATGCCCAGTACTGGTCCCAAGATGGCGAGGCGATGAACCTCTACGCCACAATGGCGGCGGCCGCCGCACGGCTGACACCGTTCTCGCCCCCGGCGCCGATCGCCAACCCGGGCGCGCTGGCCGGATCCATATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCCAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAGCCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTGAGGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAAAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGCAAAAGCAGAGAAAGGTCCGAATAACAATAATAACAACGGTGAGCAAACAGGAAATGTGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGTCGACCGACCAACTCTGCAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGTCTGTCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGAAAAGCCATAGCGTCGTCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCAGATAAACCAACAAAAGCAAATAAGAGAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGTGGATGCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGACGAGTCTACACCACAACCTTTAAAAGCAAATCAAAAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCGATGCTTCTCGGTTTTAATGCTCCTACTCCATCGGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCGCCGCCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATTATGCGGGAAACAGCACCTTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGCGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAGTGCTATTAATCGCCATAGCGAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGTTGAACGGGAGAGGCGGTAGACCAACATCTGAAGAATTTAGTTCGCTGAATAGTGGTGATTTTACAGATGACGAAAACAGCGAGACAACAGAAGAAGAAATTGATCGCCTAGCTGATTTAAGAGATAGAGGAACAGGAAAACACTCAAGAAATGCGGGTTTTTTACCATTAAATCCATTTATTAGTAGCCCTGTTCCTTCATTAACTCCAAAGGTACCGAAAATAAGCGCGCCGGCTCTGATAAGTGACATAACTAAAAAAGCGCCATTTAAGAATCCATCACAGCCATTAAATGTGTTTAATAAAAAAACTACAACGAAAACAGTGACTAAAAAACCAACCCCTGTAAAGACCGCACCAAAGCTAGCAGAACTTCCTGCCACAAAACCACAAGAAACCGTACTTAGGGAAAATAAAACACCCTTTATAGAAAAACAAGCAGAAACAAACAAGCAGTCAATTAATATGCCGAGCCTACCAGTAATCCAAAAAGAAGCTACAGAGAGCGATAAAGAGGAAATGAAACCACAAACCGAGGAAAAAATGGTAGAGGAAAGCGAATCAGCTAATAACGCAAACGGAAAAAATCGTTCTGCTGGCATTGAAGAAGGAAAACTAATTGCTAAAAGTGCAGAAGACGAAAAAGCGAAGGAAGAACCAGGGAACCATACGTAG

EGFP(E)蛋白序列(SEQ ID No.7)。对应图2。

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELY

EGFP(E)蛋白序列对应的DNA(SEQ ID No.8)。对应图2。

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

HL5连接肽蛋白序列(SEQ ID No.9)。对应图2。

LAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA

HL5连接肽蛋白对应的DNA序列(SEQ ID No.10)。对应图2。

TTAGCAGAAGCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCA

PPE17_1-177-EGFP(PE)蛋白序列(SEQ ID No.11)。对应图2。

MDFTIFPPEFNSLNIQGSARPFLVAANAWKNLSNELSYAASRFESEINGLITSWRGPSSTIMAAAVAPFRAWIVTTASLAELVADHISVVAGAYEAAHAAHVPLPVIETNRLTRLALATTNIFGIHTPAIFALDALYAQYWSQDGEAMNLYATMAAAAARLTPFSPPAPIANPGALAGSLAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKLSMST

PPE17_1-177-EGFP(PE)蛋白序列对应的DNA序列(SEQ ID No.12)。对应图2。

ATGGATTTCACAATTTTTCCGCCGGAGTTCAACTCCCTCAACATCCAAGGTAGCGCTCGTCCGTTTCTAGTAGCCGCGAACGCCTGGAAGAATCTGTCCAACGAGCTGAGCTACGCGGCCAGTCGGTTCGAGAGTGAGATCAACGGGCTGATCACATCGTGGCGGGGGCCATCGTCGACGATCATGGCAGCTGCGGTCGCCCCATTTCGGGCCTGGATTGTCACGACCGCTTCCCTGGCTGAACTCGTCGCCGACCACATCAGCGTCGTGGCAGGCGCCTATGAAGCGGCGCACGCAGCACACGTGCCGCTGCCGGTGATCGAGACCAACCGACTGACGCGCCTCGCTCTCGCCACGACCAACATTTTCGGGATTCACACCCCCGCGATCTTTGCCCTCGATGCACTGTATGCCCAGTACTGGTCCCAAGATGGCGAGGCGATGAACCTCTACGCCACAATGGCGGCGGCCGCCGCACGGCTGACACCGTTCTCGCCCCCGGCGCCGATCGCCAACCCGGGCGCGCTGGCCGGATCCTTAGCAGAAGCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTTATCGATGTCGACGTAG

PPE17_1-177-ActA_27-612-EGFP(PAE)蛋白序列(SEQ ID No.13)。对应图2。

MDFTIFPPEFNSLNIQGSARPFLVAANAWKNLSNELSYAASRFESEINGLITSWRGPSSTIMAAAVAPFRAWIVTTASLAELVADHISVVAGAYEAAHAAHVPLPVIETNRLTRLALATTNIFGIHTPAIFALDALYAQYWSQDGEAMNLYATMAAAAARLTPFSPPAPIANPGALAGSIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPPIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHTEFEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKLSMST

PPE17_1-177-ActA_27-612-EGFP(PAE)蛋白序列对应的DNA(SEQ ID No.14)。对应图2。

ATGGATTTCACAATTTTTCCGCCGGAGTTCAACTCCCTCAACATCCAAGGTAGCGCTCGTCCGTTTCTAGTAGCCGCGAACGCCTGGAAGAATCTGTCCAACGAGCTGAGCTACGCGGCCAGTCGGTTCGAGAGTGAGATCAACGGGCTGATCACATCGTGGCGGGGGCCATCGTCGACGATCATGGCAGCTGCGGTCGCCCCATTTCGGGCCTGGATTGTCACGACCGCTTCCCTGGCTGAACTCGTCGCCGACCACATCAGCGTCGTGGCAGGCGCCTATGAAGCGGCGCACGCAGCACACGTGCCGCTGCCGGTGATCGAGACCAACCGACTGACGCGCCTCGCTCTCGCCACGACCAACATTTTCGGGATTCACACCCCCGCGATCTTTGCCCTCGATGCACTGTATGCCCAGTACTGGTCCCAAGATGGCGAGGCGATGAACCTCTACGCCACAATGGCGGCGGCCGCCGCACGGCTGACACCGTTCTCGCCCCCGGCGCCGATCGCCAACCCGGGCGCGCTGGCCGGATCCATATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCCAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAGCCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTGAGGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAAAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGCAAAAGCAGAGAAAGGTCCGAATAACAATAATAACAACGGTGAGCAAACAGGAAATGTGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGTCGACCGACCAACTCTGCAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGTCTGTCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGAAAAGCCATAGCGTCGTCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCAGATAAACCAACAAAAGCAAATAAGAGAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGTGGATGCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGACGAGTCTACACCACAACCTTTAAAAGCAAATCAAAAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCGATGCTTCTCGGTTTTAATGCTCCTACTCCATCGGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCGCCGCCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATTATGCGGGAAACAGCACCTTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGCGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAGTGCTATTAATCGCCATAGCGAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGTTGAACGGGAGAGGCGGTAGACCAACATCTGAAGAATTTAGTTCGCTGAATAGTGGTGATTTTACAGATGACGAAAACAGCGAGACAACAGAAGAAGAAATTGATCGCCTAGCTGATTTAAGAGATAGAGGAACAGGAAAACACTCAAGAAATGCGGGTTTTTTACCATTAAATCCATTTATTAGTAGCCCTGTTCCTTCATTAACTCCAAAGGTACCGAAAATAAGCGCGCCGGCTCTGATAAGTGACATAACTAAAAAAGCGCCATTTAAGAATCCATCACAGCCATTAAATGTGTTTAATAAAAAAACTACAACGAAAACAGTGACTAAAAAACCAACCCCTGTAAAGACCGCACCAAAGCTAGCAGAACTTCCTGCCACAAAACCACAAGAAACCGTACTTAGGGAAAATAAAACACCCTTTATAGAAAAACAAGCAGAAACAAACAAGCAGTCAATTAATATGCCGAGCCTACCAGTAATCCAAAAAGAAGCTACAGAGAGCGATAAAGAGGAAATGAAACCACAAACCGAGGAAAAAATGGTAGAGGAAAGCGAATCAGCTAATAACGCAAACGGAAAAAATCGTTCTGCTGGCATTGAAGAAGGAAAACTAATTGCTAAAAGTGCAGAAGACGAAAAAGCGAAGGAAGAACCAGGGAACCATACGGAATTCGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTTATCGATGTCGACGTAG

随机肽(5个氨基酸)序列(SEQ ID No.15)。对应图2。

LSMST

随机肽(5个氨基酸)序列对应的DNA序列(SEQ ID No.16)。对应图2。

TTATCGATGTCGACG

双突变furA(Rv1909c)启动子DNA序列(SEQ ID No.17)。

GGCGGGCACCGGGACACACCACTACCGGTTTACCCTCTACCACCTTCCTGCCGTGCCTCCACTCGCGGGACTGGCTGGGACACAAGCGGCGCGGGTGATCGCGCAGGCCGCCACCATGCAGGCCCGGCTCATCGGAACATACGAAGGCTGATCCACCCGCCATCCCACGATCCAGCGGCCCCGGGGCGATCGGGTCCTAGCAGACGCCTGTCACGCTAGCCAAAGTCTTGACTGATTCCTCTCCTGGGAGTCATATTGTCTAGTATGTCCTCTATACCGGAC

随机肽(13个氨基酸)序列(SEQ ID No.18)。对应图3。

GSSCRIRSLSMST

随机肽(13个氨基酸)序列对应的DNA序列(SEQ ID No.19)。对应图3。

GGATCCAGCTGCAGAATTCGAAGCTTATCGATGTCGACG

参考文献

1.Houben RM,Dodd PJ:The Global Burden of Latent TuberculosisInfection:A Re-estimation Using Mathematical Modelling.PLoS Med 2016,13:e1002152.

2.WHO.Global tuberculosis report 2018.2018.http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/274453/9789241565646-eng.pdf？ua＝1.

3.Colditz GA,Brewer TF,Berkey CS,Wilson ME,Burdick E,Fineberg HV etal.:Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis.Meta-analysisof the published literature.JAMA 1994,271:698-702.

4.Norouzi S,Aghamohammadi A,Mamishi S,Rosenzweig SD,Rezaei N:BacillusCalmette-Guerin(BCG)complications associated with primary immunodeficiencydiseases.J Infect 2012,64:543-554.

5.Hesseling AC,Cotton MF,Fordham von RC,Graham SM,Gie RP,Hussey GD:Consensus statement on the revised World Health Organization recommendationsfor BCG vaccination in HIV-infected infants.Int J Tuberc Lung Dis 2008,12:1376-1379.

6.Hatherill M,Tait D,McShane H:Clinical Testing of TuberculosisVaccine Candidates.Microbiol Spectr 2016,4.

7.Gengenbacher M,Nieuwenhuizen NE,Kaufmann S:BCG-old workhorse,newskills.Curr Opin Immunol 2017,47:8-16.

8.Sander P,Clark S,Petrera A,Vilaplana C,Meuli M,Selchow P et al.:Deletion of zmp1 improves Mycobacterium bovis BCG-mediated protection in aguinea pig model of tuberculosis.Vaccine 2015,33:1353-1359.

9.Arbues A,Aguilo JI,Gonzalo-Asensio J,Marinova D,Uranga S,Puentes Eet al.:Construction,characterization and preclinical evaluation of MTBVAC,thefirst live-attenuated M.tuberculosis-based vaccine to enter clinicaltrials.Vaccine 2013,31:4867-4873.

10.Sambandamurthy VK,Derrick SC,Hsu T,Chen B,Larsen MH,Jalapathy KVet al.:Mycobacterium tuberculosis DeltaRD1 DeltapanCD:a safe and limitedreplicating mutant strain that protects immunocompetent and immunocompromisedmice against experimental tuberculosis.Vaccine 2006,24:6309-6320.

11.Groschel MI,Sayes F,Shin SJ,Frigui W,Pawlik A,Orgeur M et al.:Recombinant BCG Expressing ESX-1 of Mycobacterium marinum Combines LowVirulence with Cytosolic Immune Signaling and Improved TB Protection.Cell Rep2017,18:2752-2765.

12.Hess J,Miko D,Catic A,Lehmensiek V,Russell DG,Kaufmann SH:Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin strains secreting listeriolysinof Listeria monocytogenes.Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:5299-5304.

13.Grode L,Seiler P,Baumann S,Hess J,Brinkmann V,Nasser EA et al.:Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacteriumbovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.J ClinInvest 2005,115:2472-2479.

14.Sweeney KA,Dao DN,Goldberg MF,Hsu T,Venkataswamy MM,Henao-Tamayo Met al.:A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidalimmunity against Mycobacterium tuberculosis.Nat Med 2011,17:1261-1268.

15.Dona V,Ventura M,Sali M,Cascioferro A,Provvedi R,Palu G et al.:ThePPE domain of PPE17 is responsible for its surface localization and can beused to express heterologous proteins on the mycobacterial surface.PLoS One2013,8:e57517.

16.Pillich H,Puri M,Chakraborty T:ActA of Listeria monocytogenes andIts Manifold Activities as an Important Listerial Virulence Factor.Curr TopMicrobiol Immunol 2017,399:113-132.

17.Yoshikawa Y,Ogawa M,Hain T,Yoshida M,Fukumatsu M,Kim M et al.:Listeria monocytogenes ActA-mediated escape from autophagic recognition.NatCell Biol 2009,11:1233-1240.

18.Wood LM,Pan ZK,Shahabi V,Paterson Y:Listeria-derived ActA is aneffective adjuvant for primary and metastatic tumor immunotherapy.CancerImmunol Immunother 2010,59:1049-1058.

19.Sewell DA,Douven D,Pan ZK,Rodriguez A,Paterson Y:Regression ofHPV-positive tumors treated with a new Listeria monocytogenes vaccine.ArchOtolaryngol Head Neck Surg 2004,130:92-97.

20.Fan XY,Ma H,Guo J,Li ZM,Cheng ZH,Guo SQ et al.:A noveldifferential expression system for gene modulation in Mycobacteria.Plasmid2009,61:39-46.

21.Ma H,Wu K,Liu F,Yang H,Kang H,Chen NN et al.:Dose of incorporatedimmunodominant antigen in recombinant BCG impacts modestly on Th1immuneresponse and protective efficiency against Mycobacterium tuberculosis inmice.J Immunol Res 2014,2014:196124.

22.王鑫,范小勇,马辉,曲勍,朱越雄：分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析.中华中华微生物学和免疫学杂志2011,6:537-543.

23.Koster S,Upadhyay S,Chandra P,Papavinasasundaram K,Yang G,Hassan Aet al.:Mycobacterium tuberculosis is protected from NADPH oxidase and LC3-associated phagocytosis by the LCP protein CpsA.Proc Natl Acad Sci U S A2017,114:E8711-E8720.

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 重组卡介苗菌株、其制备方法和用途

<130> C19P4050

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 177

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌

<400> 1

Met Asp Phe Thr Ile Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Leu Asn Ile Gln

1 5 10 15

Gly Ser Ala Arg Pro Phe Leu Val Ala Ala Asn Ala Trp Lys Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Glu Leu Ser Tyr Ala Ala Ser Arg Phe Glu Ser Glu Ile Asn

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Ser Trp Arg Gly Pro Ser Ser Thr Ile Met Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Pro Phe Arg Ala Trp Ile Val Thr Thr Ala Ser Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Val Ala Asp His Ile Ser Val Val Ala Gly Ala Tyr Glu Ala

85 90 95

Ala His Ala Ala His Val Pro Leu Pro Val Ile Glu Thr Asn Arg Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Ala Thr Thr Asn Ile Phe Gly Ile His Thr Pro

115 120 125

Ala Ile Phe Ala Leu Asp Ala Leu Tyr Ala Gln Tyr Trp Ser Gln Asp

130 135 140

Gly Glu Ala Met Asn Leu Tyr Ala Thr Met Ala Ala Ala Ala Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Ile Ala Asn Pro Gly Ala Leu

165 170 175

Ala

<210> 2

<211> 531

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌

<400> 2

atggatttca caatttttcc gccggagttc aactccctca acatccaagg tagcgctcgt 60

ccgtttctag tagccgcgaa cgcctggaag aatctgtcca acgagctgag ctacgcggcc 120

agtcggttcg agagtgagat caacgggctg atcacatcgt ggcgggggcc atcgtcgacg 180

atcatggcag ctgcggtcgc cccatttcgg gcctggattg tcacgaccgc ttccctggct 240

gaactcgtcg ccgaccacat cagcgtcgtg gcaggcgcct atgaagcggc gcacgcagca 300

cacgtgccgc tgccggtgat cgagaccaac cgactgacgc gcctcgctct cgccacgacc 360

aacattttcg ggattcacac ccccgcgatc tttgccctcg atgcactgta tgcccagtac 420

tggtcccaag atggcgaggc gatgaacctc tacgccacaa tggcggcggc cgccgcacgg 480

ctgacaccgt tctcgccccc ggcgccgatc gccaacccgg gcgcgctggc c 531

<210> 3

<211> 586

<212> PRT

<213> 单核细胞增生性李斯特菌

<400> 3

Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu

1 5 10 15

Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly

20 25 30

Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu

35 40 45

Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile

50 55 60

Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn

65 70 75 80

Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly

85 90 95

Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser

100 105 110

Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser

115 120 125

Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys

130 135 140

Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu

145 150 155 160

Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln

165 170 175

Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys

180 185 190

Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro

195 200 205

Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln

210 215 220

Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro

225 230 235 240

Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro

245 250 255

Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe

260 265 270

Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro

275 280 285

Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro

290 295 300

Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile

305 310 315 320

Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp

325 330 335

Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser

340 345 350

Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly

355 360 365

Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr

370 375 380

Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala

385 390 395 400

Asp Leu Arg Asp Arg Gly Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe

405 410 415

Leu Pro Leu Asn Pro Phe Ile Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Thr Pro

420 425 430

Lys Val Pro Lys Ile Ser Ala Pro Ala Leu Ile Ser Asp Ile Thr Lys

435 440 445

Lys Ala Pro Phe Lys Asn Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys

450 455 460

Lys Thr Thr Thr Lys Thr Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro Val Lys Thr

465 470 475 480

Ala Pro Lys Leu Ala Glu Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val

485 490 495

Leu Arg Glu Asn Lys Thr Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn

500 505 510

Lys Gln Ser Ile Asn Met Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala

515 520 525

Thr Glu Ser Asp Lys Glu Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Glu Lys Met

530 535 540

Val Glu Glu Ser Glu Ser Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser

545 550 555 560

Ala Gly Ile Glu Glu Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu

565 570 575

Lys Ala Lys Glu Glu Pro Gly Asn His Thr

580 585

<210> 4

<211> 1758

<212> DNA

<213> 单核细胞增生性李斯特菌

<400> 4

atatttgcag cgacagatag cgaagattcc agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 60

aaaacagaag agcagccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 120

gtaagttcac gtgatattga ggaactagaa aaatcgaata aagtgaaaaa tacgaacaaa 180

gcagacctaa tagcaatgtt gaaagcaaaa gcagagaaag gtccgaataa caataataac 240

aacggtgagc aaacaggaaa tgtggctata aatgaagagg cttcaggagt cgaccgacca 300

actctgcaag tggagcgtcg tcatccaggt ctgtcatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 360

aaaagaagaa aagccatagc gtcgtcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccagat 420

aaaccaacaa aagcaaataa gagaaaagtg gcgaaagagt cagttgtgga tgcttctgaa 480

agtgacttag attctagcat gcagtcagca gacgagtcta caccacaacc tttaaaagca 540

aatcaaaaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 600

cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 660

ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 720

ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccgat gcttctcggt 780

tttaatgctc ctactccatc ggaaccgagc tcattcgaat ttccgccgcc acctacggat 840

gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 900

acatcggaac cgagctcatt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatt 960

atgcgggaaa cagcaccttc gctagattct agttttacaa gcggggattt agctagtttg 1020

agaagtgcta ttaatcgcca tagcgaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1080

gaagagttga acgggagagg cggtagacca acatctgaag aatttagttc gctgaatagt 1140

ggtgatttta cagatgacga aaacagcgag acaacagaag aagaaattga tcgcctagct 1200

gatttaagag atagaggaac aggaaaacac tcaagaaatg cgggtttttt accattaaat 1260

ccatttatta gtagccctgt tccttcatta actccaaagg taccgaaaat aagcgcgccg 1320

gctctgataa gtgacataac taaaaaagcg ccatttaaga atccatcaca gccattaaat 1380

gtgtttaata aaaaaactac aacgaaaaca gtgactaaaa aaccaacccc tgtaaagacc 1440

gcaccaaagc tagcagaact tcctgccaca aaaccacaag aaaccgtact tagggaaaat 1500

aaaacaccct ttatagaaaa acaagcagaa acaaacaagc agtcaattaa tatgccgagc 1560

ctaccagtaa tccaaaaaga agctacagag agcgataaag aggaaatgaa accacaaacc 1620

gaggaaaaaa tggtagagga aagcgaatca gctaataacg caaacggaaa aaatcgttct 1680

gctggcattg aagaaggaaa actaattgct aaaagtgcag aagacgaaaa agcgaaggaa 1740

gaaccaggga accatacg 1758

<210> 5

<211> 765

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PPE171-177-ActA27-612（PA）蛋白序列

<400> 5

Met Asp Phe Thr Ile Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Leu Asn Ile Gln

1 5 10 15

Gly Ser Ala Arg Pro Phe Leu Val Ala Ala Asn Ala Trp Lys Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Glu Leu Ser Tyr Ala Ala Ser Arg Phe Glu Ser Glu Ile Asn

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Ser Trp Arg Gly Pro Ser Ser Thr Ile Met Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Pro Phe Arg Ala Trp Ile Val Thr Thr Ala Ser Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Val Ala Asp His Ile Ser Val Val Ala Gly Ala Tyr Glu Ala

85 90 95

Ala His Ala Ala His Val Pro Leu Pro Val Ile Glu Thr Asn Arg Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Ala Thr Thr Asn Ile Phe Gly Ile His Thr Pro

115 120 125

Ala Ile Phe Ala Leu Asp Ala Leu Tyr Ala Gln Tyr Trp Ser Gln Asp

130 135 140

Gly Glu Ala Met Asn Leu Tyr Ala Thr Met Ala Ala Ala Ala Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Ile Ala Asn Pro Gly Ala Leu

165 170 175

Ala Gly Ser Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn

180 185 190

Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val

195 200 205

Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp

210 215 220

Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala

225 230 235 240

Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn

245 250 255

Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu

260 265 270

Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala

290 295 300

Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys

305 310 315 320

Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp

325 330 335

Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser

340 345 350

Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val

355 360 365

Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp

370 375 380

Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu

385 390 395 400

Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser

405 410 415

Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro

420 425 430

Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro

435 440 445

Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu

450 455 460

Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr

465 470 475 480

Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu

485 490 495

Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr

500 505 510

Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser Glu

515 520 525

Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly

530 535 540

Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly

545 550 555 560

Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp

565 570 575

Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly Thr Gly Lys His Ser Arg Asn

580 585 590

Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe Ile Ser Ser Pro Val Pro Ser

595 600 605

Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser Ala Pro Ala Leu Ile Ser Asp

610 615 620

Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val

625 630 635 640

Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro

645 650 655

Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln

660 665 670

Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala

675 680 685

Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln

690 695 700

Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu

705 710 715 720

Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys

725 730 735

Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala

740 745 750

Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro Gly Asn His Thr

755 760 765

<210> 6

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPE171-177-ActA27-612（PA）蛋白序列编码序列

<400> 6

atggatttca caatttttcc gccggagttc aactccctca acatccaagg tagcgctcgt 60

ccgtttctag tagccgcgaa cgcctggaag aatctgtcca acgagctgag ctacgcggcc 120

agtcggttcg agagtgagat caacgggctg atcacatcgt ggcgggggcc atcgtcgacg 180

atcatggcag ctgcggtcgc cccatttcgg gcctggattg tcacgaccgc ttccctggct 240

gaactcgtcg ccgaccacat cagcgtcgtg gcaggcgcct atgaagcggc gcacgcagca 300

cacgtgccgc tgccggtgat cgagaccaac cgactgacgc gcctcgctct cgccacgacc 360

aacattttcg ggattcacac ccccgcgatc tttgccctcg atgcactgta tgcccagtac 420

tggtcccaag atggcgaggc gatgaacctc tacgccacaa tggcggcggc cgccgcacgg 480

ctgacaccgt tctcgccccc ggcgccgatc gccaacccgg gcgcgctggc cggatccata 540

tttgcagcga cagatagcga agattccagt ctaaacacag atgaatggga agaagaaaaa 600

acagaagagc agccaagcga ggtaaatacg ggaccaagat acgaaactgc acgtgaagta 660

agttcacgtg atattgagga actagaaaaa tcgaataaag tgaaaaatac gaacaaagca 720

gacctaatag caatgttgaa agcaaaagca gagaaaggtc cgaataacaa taataacaac 780

ggtgagcaaa caggaaatgt ggctataaat gaagaggctt caggagtcga ccgaccaact 840

ctgcaagtgg agcgtcgtca tccaggtctg tcatcggata gcgcagcgga aattaaaaaa 900

agaagaaaag ccatagcgtc gtcggatagt gagcttgaaa gccttactta tccagataaa 960

ccaacaaaag caaataagag aaaagtggcg aaagagtcag ttgtggatgc ttctgaaagt 1020

gacttagatt ctagcatgca gtcagcagac gagtctacac cacaaccttt aaaagcaaat 1080

caaaaaccat ttttccctaa agtatttaaa aaaataaaag atgcggggaa atgggtacgt 1140

gataaaatcg acgaaaatcc tgaagtaaag aaagcgattg ttgataaaag tgcagggtta 1200

attgaccaat tattaaccaa aaagaaaagt gaagaggtaa atgcttcgga cttcccgcca 1260

ccacctacgg atgaagagtt aagacttgct ttgccagaga caccgatgct tctcggtttt 1320

aatgctccta ctccatcgga accgagctca ttcgaatttc cgccgccacc tacggatgaa 1380

gagttaagac ttgctttgcc agagacgcca atgcttcttg gttttaatgc tcctgctaca 1440

tcggaaccga gctcattcga atttccaccg cctccaacag aagatgaact agaaattatg 1500

cgggaaacag caccttcgct agattctagt tttacaagcg gggatttagc tagtttgaga 1560

agtgctatta atcgccatag cgaaaatttc tctgatttcc caccaatccc aacagaagaa 1620

gagttgaacg ggagaggcgg tagaccaaca tctgaagaat ttagttcgct gaatagtggt 1680

gattttacag atgacgaaaa cagcgagaca acagaagaag aaattgatcg cctagctgat 1740

ttaagagata gaggaacagg aaaacactca agaaatgcgg gttttttacc attaaatcca 1800

tttattagta gccctgttcc ttcattaact ccaaaggtac cgaaaataag cgcgccggct 1860

ctgataagtg acataactaa aaaagcgcca tttaagaatc catcacagcc attaaatgtg 1920

tttaataaaa aaactacaac gaaaacagtg actaaaaaac caacccctgt aaagaccgca 1980

ccaaagctag cagaacttcc tgccacaaaa ccacaagaaa ccgtacttag ggaaaataaa 2040

acacccttta tagaaaaaca agcagaaaca aacaagcagt caattaatat gccgagccta 2100

ccagtaatcc aaaaagaagc tacagagagc gataaagagg aaatgaaacc acaaaccgag 2160

gaaaaaatgg tagaggaaag cgaatcagct aataacgcaa acggaaaaaa tcgttctgct 2220

ggcattgaag aaggaaaact aattgctaaa agtgcagaag acgaaaaagc gaaggaagaa 2280

ccagggaacc atacgtag 2298

<210> 7

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP（E）蛋白序列

<400> 7

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr

225 230 235

<210> 8

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP（E）蛋白序列编码序列

<400> 8

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HL5连接肽蛋白序列

<400> 9

Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

20 25

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HL5连接肽蛋白编码序列

<400> 10

ttagcagaag cagcagcaaa agaagcagca gcaaaagaag cagcagcaaa agaagcagca 60

gcaaaagcag cagca 75

<210> 11

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PPE171-177-EGFP（PE）蛋白序列

<400> 11

Met Asp Phe Thr Ile Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Leu Asn Ile Gln

1 5 10 15

Gly Ser Ala Arg Pro Phe Leu Val Ala Ala Asn Ala Trp Lys Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Glu Leu Ser Tyr Ala Ala Ser Arg Phe Glu Ser Glu Ile Asn

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Ser Trp Arg Gly Pro Ser Ser Thr Ile Met Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Pro Phe Arg Ala Trp Ile Val Thr Thr Ala Ser Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Val Ala Asp His Ile Ser Val Val Ala Gly Ala Tyr Glu Ala

85 90 95

Ala His Ala Ala His Val Pro Leu Pro Val Ile Glu Thr Asn Arg Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Ala Thr Thr Asn Ile Phe Gly Ile His Thr Pro

115 120 125

Ala Ile Phe Ala Leu Asp Ala Leu Tyr Ala Gln Tyr Trp Ser Gln Asp

130 135 140

Gly Glu Ala Met Asn Leu Tyr Ala Thr Met Ala Ala Ala Ala Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Ile Ala Asn Pro Gly Ala Leu

165 170 175

Ala Gly Ser Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

180 185 190

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Gly Ser Met Val

195 200 205

Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu

210 215 220

Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly

225 230 235 240

Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr

245 250 255

Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr

260 265 270

Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His

275 280 285

Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr

290 295 300

Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys

305 310 315 320

Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp

325 330 335

Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr

340 345 350

Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile

355 360 365

Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln

370 375 380

Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val

385 390 395 400

Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys

405 410 415

Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr

420 425 430

Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Ser Met

435 440 445

Ser Thr

450

<210> 12

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPE171-177-EGFP（PE）蛋白序列编码序列

<400> 12

atggatttca caatttttcc gccggagttc aactccctca acatccaagg tagcgctcgt 60

ccgtttctag tagccgcgaa cgcctggaag aatctgtcca acgagctgag ctacgcggcc 120

agtcggttcg agagtgagat caacgggctg atcacatcgt ggcgggggcc atcgtcgacg 180

atcatggcag ctgcggtcgc cccatttcgg gcctggattg tcacgaccgc ttccctggct 240

gaactcgtcg ccgaccacat cagcgtcgtg gcaggcgcct atgaagcggc gcacgcagca 300

cacgtgccgc tgccggtgat cgagaccaac cgactgacgc gcctcgctct cgccacgacc 360

aacattttcg ggattcacac ccccgcgatc tttgccctcg atgcactgta tgcccagtac 420

tggtcccaag atggcgaggc gatgaacctc tacgccacaa tggcggcggc cgccgcacgg 480

ctgacaccgt tctcgccccc ggcgccgatc gccaacccgg gcgcgctggc cggatcctta 540

gcagaagcag cagcaaaaga agcagcagca aaagaagcag cagcaaaaga agcagcagca 600

aaagcagcag caggatccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 660

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 720

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 780

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 840

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 900

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 960

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 1020

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1080

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 1140

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 1200

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 1260

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 1320

gacgagctgt acaagttatc gatgtcgacg tag 1353

<210> 13

<211> 1012

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PPE171-177-ActA27-612-EGFP（PAE）蛋白序列

<400> 13

Met Asp Phe Thr Ile Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Leu Asn Ile Gln

1 5 10 15

Gly Ser Ala Arg Pro Phe Leu Val Ala Ala Asn Ala Trp Lys Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Glu Leu Ser Tyr Ala Ala Ser Arg Phe Glu Ser Glu Ile Asn

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Ser Trp Arg Gly Pro Ser Ser Thr Ile Met Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Pro Phe Arg Ala Trp Ile Val Thr Thr Ala Ser Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Val Ala Asp His Ile Ser Val Val Ala Gly Ala Tyr Glu Ala

85 90 95

Ala His Ala Ala His Val Pro Leu Pro Val Ile Glu Thr Asn Arg Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Ala Thr Thr Asn Ile Phe Gly Ile His Thr Pro

115 120 125

Ala Ile Phe Ala Leu Asp Ala Leu Tyr Ala Gln Tyr Trp Ser Gln Asp

130 135 140

Gly Glu Ala Met Asn Leu Tyr Ala Thr Met Ala Ala Ala Ala Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Ile Ala Asn Pro Gly Ala Leu

165 170 175

Ala Gly Ser Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn

180 185 190

Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val

195 200 205

Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp

210 215 220

Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala

225 230 235 240

Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn

245 250 255

Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu

260 265 270

Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala

290 295 300

Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys

305 310 315 320

Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp

325 330 335

Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser

340 345 350

Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val

355 360 365

Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp

370 375 380

Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu

385 390 395 400

Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser

405 410 415

Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro

420 425 430

Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro

435 440 445

Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu

450 455 460

Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr

465 470 475 480

Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu

485 490 495

Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr

500 505 510

Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser Glu

515 520 525

Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly

530 535 540

Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly

545 550 555 560

Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp

565 570 575

Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly Thr Gly Lys His Ser Arg Asn

580 585 590

Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe Ile Ser Ser Pro Val Pro Ser

595 600 605

Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser Ala Pro Ala Leu Ile Ser Asp

610 615 620

Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val

625 630 635 640

Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro

645 650 655

Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln

660 665 670

Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala

675 680 685

Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln

690 695 700

Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu

705 710 715 720

Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys

725 730 735

Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala

740 745 750

Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro Gly Asn His Thr Glu Phe Glu

755 760 765

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

770 775 780

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

785 790 795 800

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

805 810 815

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

820 825 830

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

835 840 845

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

850 855 860

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

865 870 875 880

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

885 890 895

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

900 905 910

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

915 920 925

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

930 935 940

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

945 950 955 960

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

965 970 975

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

980 985 990

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu

995 1000 1005

Ser Met Ser Thr

1010

<210> 14

<211> 3039

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPE171-177-ActA27-612-EGFP（PAE）蛋白序列编码序列

<400> 14

atggatttca caatttttcc gccggagttc aactccctca acatccaagg tagcgctcgt 60

ccgtttctag tagccgcgaa cgcctggaag aatctgtcca acgagctgag ctacgcggcc 120

agtcggttcg agagtgagat caacgggctg atcacatcgt ggcgggggcc atcgtcgacg 180

atcatggcag ctgcggtcgc cccatttcgg gcctggattg tcacgaccgc ttccctggct 240

gaactcgtcg ccgaccacat cagcgtcgtg gcaggcgcct atgaagcggc gcacgcagca 300

cacgtgccgc tgccggtgat cgagaccaac cgactgacgc gcctcgctct cgccacgacc 360

aacattttcg ggattcacac ccccgcgatc tttgccctcg atgcactgta tgcccagtac 420

tggtcccaag atggcgaggc gatgaacctc tacgccacaa tggcggcggc cgccgcacgg 480

ctgacaccgt tctcgccccc ggcgccgatc gccaacccgg gcgcgctggc cggatccata 540

tttgcagcga cagatagcga agattccagt ctaaacacag atgaatggga agaagaaaaa 600

acagaagagc agccaagcga ggtaaatacg ggaccaagat acgaaactgc acgtgaagta 660

agttcacgtg atattgagga actagaaaaa tcgaataaag tgaaaaatac gaacaaagca 720

gacctaatag caatgttgaa agcaaaagca gagaaaggtc cgaataacaa taataacaac 780

ggtgagcaaa caggaaatgt ggctataaat gaagaggctt caggagtcga ccgaccaact 840

ctgcaagtgg agcgtcgtca tccaggtctg tcatcggata gcgcagcgga aattaaaaaa 900

agaagaaaag ccatagcgtc gtcggatagt gagcttgaaa gccttactta tccagataaa 960

ccaacaaaag caaataagag aaaagtggcg aaagagtcag ttgtggatgc ttctgaaagt 1020

gacttagatt ctagcatgca gtcagcagac gagtctacac cacaaccttt aaaagcaaat 1080

caaaaaccat ttttccctaa agtatttaaa aaaataaaag atgcggggaa atgggtacgt 1140

gataaaatcg acgaaaatcc tgaagtaaag aaagcgattg ttgataaaag tgcagggtta 1200

attgaccaat tattaaccaa aaagaaaagt gaagaggtaa atgcttcgga cttcccgcca 1260

ccacctacgg atgaagagtt aagacttgct ttgccagaga caccgatgct tctcggtttt 1320

aatgctccta ctccatcgga accgagctca ttcgaatttc cgccgccacc tacggatgaa 1380

gagttaagac ttgctttgcc agagacgcca atgcttcttg gttttaatgc tcctgctaca 1440

tcggaaccga gctcattcga atttccaccg cctccaacag aagatgaact agaaattatg 1500

cgggaaacag caccttcgct agattctagt tttacaagcg gggatttagc tagtttgaga 1560

agtgctatta atcgccatag cgaaaatttc tctgatttcc caccaatccc aacagaagaa 1620

gagttgaacg ggagaggcgg tagaccaaca tctgaagaat ttagttcgct gaatagtggt 1680

gattttacag atgacgaaaa cagcgagaca acagaagaag aaattgatcg cctagctgat 1740

ttaagagata gaggaacagg aaaacactca agaaatgcgg gttttttacc attaaatcca 1800

tttattagta gccctgttcc ttcattaact ccaaaggtac cgaaaataag cgcgccggct 1860

ctgataagtg acataactaa aaaagcgcca tttaagaatc catcacagcc attaaatgtg 1920

tttaataaaa aaactacaac gaaaacagtg actaaaaaac caacccctgt aaagaccgca 1980

ccaaagctag cagaacttcc tgccacaaaa ccacaagaaa ccgtacttag ggaaaataaa 2040

acacccttta tagaaaaaca agcagaaaca aacaagcagt caattaatat gccgagccta 2100

ccagtaatcc aaaaagaagc tacagagagc gataaagagg aaatgaaacc acaaaccgag 2160

gaaaaaatgg tagaggaaag cgaatcagct aataacgcaa acggaaaaaa tcgttctgct 2220

ggcattgaag aaggaaaact aattgctaaa agtgcagaag acgaaaaagc gaaggaagaa 2280

ccagggaacc atacggaatt cgaaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 2340

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 2400

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 2460

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 2520

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 2580

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 2640

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 2700

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 2760

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 2820

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 2880

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 2940

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 3000

ggcatggacg agctgtacaa gttatcgatg tcgacgtag 3039

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 随机肽序列

<400> 15

Leu Ser Met Ser Thr

1 5

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 随机肽序列编码序列

<400> 16

ttatcgatgt cgacg 15

<210> 17

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双突变furA（Rv1909c）启动子DNA序列

<400> 17

ggcgggcacc gggacacacc actaccggtt taccctctac caccttcctg ccgtgcctcc 60

actcgcggga ctggctggga cacaagcggc gcgggtgatc gcgcaggccg ccaccatgca 120

ggcccggctc atcggaacat acgaaggctg atccacccgc catcccacga tccagcggcc 180

ccggggcgat cgggtcctag cagacgcctg tcacgctagc caaagtcttg actgattcct 240

ctcctgggag tcatattgtc tagtatgtcc tctataccgg ac 282

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 随机肽序列

<400> 18

Gly Ser Ser Cys Arg Ile Arg Ser Leu Ser Met Ser Thr

1 5 10

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 随机肽编码序列

<400> 19

ggatccagct gcagaattcg aagcttatcg atgtcgacg 39

Claims

1.衍生自牛结核分枝杆菌的重组卡介苗菌株，其包含用于表达融合蛋白的核苷酸序列，其中所述融合蛋白包含N端部分和C端部分，所述N端部分和所述C端部分是直接连接的或通过一个或多个氨基酸的接头连接, 其中所述N端部分为以SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；且其中所述C端部分为以SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组卡介苗菌株，其中所述接头是GS接头。

3.根据权利要求1所述的重组卡介苗菌株，其中所述N端部分源自结核分枝杆菌，并且所述C端部分源自单核细胞增生性李斯特菌。

4.根据权利要求1所述的重组卡介苗菌株，其中所述接头包含2、3、4、5、6或7个以上的氨基酸残基。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组卡介苗菌株，其中所述核苷酸序列导入卡介苗菌株中，从而整合在所述卡介苗菌株的基因组中或者作为独立于卡介苗菌株基因组的载体存在，条件是所述核苷酸序列在菌体内得以表达。

6.根据权利要求5所述的重组卡介苗菌株，其中所述载体包含与编码所述融合蛋白的核苷酸序列可操作连接的启动子。

7.根据权利要求6所述的重组卡介苗菌株，其中所述启动子是在卡介苗中有功能的启动子。

8.根据权利要求7所述的重组卡介苗菌株，其中所述启动子是furA、突变furA（Rv1909c）、hsp60或hspX启动子。

9.根据权利要求1-4和6-8中任一项所述的重组卡介苗菌株，其中所述核苷酸序列包含编码以SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

10.根据权利要求5所述的重组卡介苗菌株，其中所述核苷酸序列包含编码以SEQ IDNo. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

11.根据权利要求9所述的重组卡介苗菌株，其中所述核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列。

12.根据权利要求10所述的重组卡介苗菌株，其中所述核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列。

13.以保藏编号CCTCC NO：M 2017667保藏于中国典型培养物保藏中心的重组卡介苗菌株。

14.组合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的重组卡介苗菌株和佐剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其为疫苗。

16.根据权利要求15所述的组合物，其为卡介苗。

17.制备权利要求1-12中任一项所述的重组卡介苗菌株的方法，其包括将编码所述融合蛋白的核苷酸序列导入卡介苗菌株中，其中所述核苷酸序列整合到卡介苗菌株的基因组中或者独立于卡介苗菌株的基因组存在。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述核苷酸序列存在于用于表达所述融合蛋白的载体中。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述载体是质粒。

20.根据权利要求1-13中任一项所述的重组卡介苗菌株或根据权利要求14-16中任一项所述的组合物在用于制备结核病疫苗中的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述结核病是肺结核。

22.根据权利要求20所述的用途，其中所述疫苗是活菌疫苗。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述活菌疫苗是活菌减毒疫苗。

24.根据权利要求22所述的用途，其中所述活菌疫苗是卡介苗。