CN101563366A - 抗notch3激动性抗体及其在治疗notch3相关疾病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合Notch 3且激活信号传导的激动性抗体。本发明包括结合包含第一个Lin12结构域的表位的抗体。本发明还包括这些抗体用于治疗或预防Notch 3相关疾病或病症的用途。

Description

抗NOTCH3激动性抗体及其在治疗NOTCH3相关疾病中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年10月19日提交的美国临时申请No.60/852,861和2007年1月6日提交的美国临时申请No.60/879,218的权益，并以提述方式并入它们的全部公开内容。
发明领域
本发明涉及抗Notch 3激动性抗体及其在改善、治疗、或预防Notch 3相关疾病或病症中的用途。
发明背景
Notch基因是在1917年首次记载的，当时发现一个果蝇即黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)品系具有缺刻翅片(Morgan，Am Nat 51：513(1917))。该基因几乎70年后才被克隆出来，并被确定为一种细胞表面受体，其在果蝇许多不同细胞类型和组织的发育中发挥关键作用(Wharton等，Cell 43：567(1985))。不久就发现Notch信号传导途径是一种由细胞-细胞接触介导的信号传导机制，且从果蝇到人类在进化上是保守的。已经发现Notch受体参与许多细胞过程，诸如发育和组织稳态过程中各种细胞类型的凋亡、分化、细胞命运决定、干细胞维持、细胞运动性、和增殖(参见综述Artavanis-Tsakonas等，Science 268：225(1995))。
哺乳动物拥有四种Notch受体蛋白(称为Notch 1至Notch 4)和五种相应配体(称为德耳塔(δ)样-1(DLL-1)、德耳塔样-3(DLL-3)、德耳塔样-4(DLL-4)、Jagged-1和Jagged-2)。哺乳动物Notch受体基因编码约300kD的蛋白质，它们在转运至细胞表面的过程中遭到切割且以异二聚体形式存在。Notch受体的胞外部分具有34个表皮生长因子(EGF)样重复和3个富含半胱氨酸Notch/LIN12重复。两个切割后的亚基之间的结合是由紧挨着位于切割位点N端和C端的序列介导的，而且这两个亚基构成Notch异二聚化(HD)结构域(Wharton等，Cell 43：567(1985)；Kidd等，Mol Cell Biol 6：3431(1986)；Kopczynski等，Genes Dev 2：1723(1988)；Yochem等，Nature 335：547(1988))。
目前，仍然不清楚Notch信号传导如何受到不同受体的调节或者五种配体在它们的信号传导或调节中有何不同。信号传导和/或调节中的差异可能是由它们在不同组织中的表达样式或由不同环境诱因控制的。已有记载，Notch配体蛋白(包括Jagged/Serrate和德耳塔/德耳塔样)特异性结合EGF重复区并诱导受体介导的Notch信号传导(综述见Bray，Nature Rev Mol Cell Biol.7：678(2006)及Kadesch，Exp Cell Res.260：1(2000))。在各个EGF重复中，第10个至第12个重复是配体结合Notch受体所要求的，而其它EGF重复可增强受体-配体相互作用(Xu等，J Biol Chem.280：30158(2005)；Shimizu等，BiochemBiophys Res Comm.276：385(2000))。虽然LIN12重复和二聚化结构域不直接参与配体结合，但是它们在维持异二聚体蛋白质复合物、防止不依赖配体的蛋白酶切割、和受体活化中发挥重要作用(Sanche-Irizarry等，Mol Cell Biol.24：9265(2004)；Vardar等，Biochem.42：7061(2003))。
来自许多组织的正常干细胞(包括肠和神经元干细胞)依赖Notch信号传导来进行自我更新和命运决定(Fre等，Nature，435：964(2005)；van Es等，Nature，435：959(2005)；Androutsellis-Theotokis等，Nature，442：823(2006))。因此，Notch 3激动性抗体可在变性性疾病中具有应用。伴有皮层下梗死和脑白质病的脑常染色体显性动脉病(CADASIL，cerebral autosomal dominantarteriopathy with subcortical infarcts和leukoencephalopathy)引起一类中风和痴呆，其关键特征包括复发性皮层下缺血事件和血管性痴呆。已经发现CADASIL与一种定位于19号染色体的突变基因有关(Joutel等，Nature383：707(1996))。Joutel等鉴定了CADASIL患者中引起Notch 3基因严重破坏的突变，指明了Notch 3可能是CADASIL患者中的缺陷蛋白质。不幸的是，这种高度地使丧失能力的且常常致死的疾病仍然大量地未被诊断或误诊为多发性硬化和阿耳茨海默氏病。当前的研究越来越显示，它是一种比人们最初所认为的普遍得多的疾患。
Notch 3相关疾病的另一个例子是家族性偏瘫性偏头痛(FHM)，即显性常染色体形式的有先兆(aura)的偏头痛，与Notch 3基因位于19号染色体的同一区。应当注意，超过30％的患有CADASIL的患者还患有有先兆的偏头痛。然而，后者只在约5％的人群中观察到，此观察结果导致人们发现此疾患的机制中涉及Notch 3基因。类似地，人们已经将家族性阵发性共济失调与位于染色体19同一区的一种基因联系起来，而且已经有迹象表明Notch 3与此疾患相关。已经与Notch 3联系起来的其它疾患和疾病包括Alagille综合征(Flynn等，JPathol 204：55(2004))。
正在进行的研究致力于鉴定其它与Notch 3表达和/或信号传导缺陷有关的疾病和疾患。鉴于大量的人类疾病与Notch 3信号传导途径有关，发现预防和治疗这些疾病的新途径有重要意义。本发明提供了新的抗Notch 3激动性抗体，它可望解决医学上的这种亟待满足的需求。
发明概述
本发明提供了新的激动性抗体及其片段，其特异性结合人Notch 3受体在LIN12结构域中的表位。本发明的另一个方面包括表位结合位点和与本发明的抗体结合此相同表位的抗体。本发明的抗体能经由Notch 3受体不依赖配体结合地激活Notch 3介导的信号传导。
本发明包括抗体可变重链和轻链的氨基酸序列及其相应核酸序列。本发明的另一个实施方案包括这些抗体的CDR序列。
本发明的另一个实施方案包括包含本发明抗体序列的细胞系和载体。
本发明还包括受本发明的激动性抗体识别的表位。本发明还包括结合此表位的抗体。本发明的实施方案包括Notch 3表位，其包含与SEQ ID NO：10具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的Lin12结构域。更特别地，所述Notch 3表位包含SEQ ID NO：11。本发明包括结合此表位的激动性抗体。
本发明的另一个实施方案是这些抗体用于制备药物或组合物的用途，所述药物或组合物用于治疗与例如受体失活有关的Notch 3相关疾病和病症。
本发明的另一个实施方案是这些抗体在治疗与例如受体失活有关的Notch 3相关疾病或病症中的用途，所述治疗包括激活所述缺陷，例如通过不依赖配体结合地激活Notch 3信号传导来激活所述缺陷。Notch 3相关病症可以包括但不限于CADASIL、家族性偏瘫性偏头痛(FHM)、家族性阵发性共济失调(familial paroxytic ataxia)、Alagille综合征和其它变性性疾病。
附图简述
图1描绘了Notch 3的氨基酸序列。EGF重复区自氨基酸残基43延伸至1383；LIN12结构域自氨基酸残基1384延伸至1503；而二聚化结构域自氨基酸残基1504延伸至1640。
图2(A-H)描绘了人Notch 1、Notch 2、Notch 3、和Notch 4之间的氨基酸序列比较。
图3描绘了Notch 1、Notch 2、Notch 3、和Notch 4的百分比同一性。
图4A和4B描绘了抗Notch 3单克隆抗体MAb 256A-13(SEQ ID NO：2)的重链和轻链可变区序列，其中CDR区以下划线标示。
图5描绘了实施例5的萤光素酶报道物测定法，其显示了抗Notch 3单抗对Notch 3受体的激活效应。
图6描绘了Notch 3激动性抗体对Notch 3的金属蛋白酶切割的影响。
图7描绘了用于256A-13的结合位点的表位定位的Notch 3-Fc融合蛋白构建物。
图8描绘了工程化Notch 3前导肽编码序列与天然Notch 3前导肽编码序列(NCBI GenBank编号NM 000435)的比较，显示了工程化Notch前导肽序列的核苷酸(8A)和翻译后的氨基酸序列(8B)的变化。图8C描绘了LIN12结构域，而8D描绘了LIN12的亚结构域表位。
图9描绘了通过PCR-SOE法进行的结构域交换(swap)构建物的生成。箭头条代表PCR引物。空心条代表Notch 3序列。实心条代表Notch 1序列。
图10描绘了单抗256A-13的Notch 3LIN12结构域表位定位中所使用的氨基酸序列。
图11描绘了用于进行256A-13的线性表位定位的丙氨酸扫描肽。
发明详述
本发明不限于本文中所描述的具体方法学、规程、细胞系、载体、或试剂，因为它们可以变化。此外，本文中所使用的术语仅仅出于描述具体实施方案的目的，并非意图限制本发明的范围。在用于本文和所附权利要求书时，单数形式“一个”、“一种”、“所述”和“该”包括复数指称，除非从上下文清楚地表示其它意思，例如提及“一个/种宿主细胞”包括多个/种此类宿主细胞。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语及任何首字母缩写具有与本发明技术领域的普通技术人员普遍理解相同的含义。虽然与本文所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料都可用于本发明的实施，但是本文中描述了例示性的方法、装置、和材料。
本文中提到的所有专利和出版物均以提述方式并入本申请(以法律允许为限)用于描述和公开其中所报告的、可以与本发明一起使用的蛋白质、酶、载体、宿主细胞和方法学的目的。然而，这里不应解释为承认本发明没有资格依据“在先发明”的原则早于此类公开内容。
定义
贯穿本申请使用的术语对于本领域普通技术人员解释为普通的和典型的含义。然而，申请人期望给予以下术语以如下文所定义的特定定义。
关于抗体链多肽序列的短语“基本上相同”可以解释为与参比多肽序列展示至少70％、或80％、或90％、或95％序列同一性的抗体链。对核酸序列而言的该术语可以解释为与参比核酸序列展示至少约85％、或90％、或95％、或97％序列同一性的序列。
术语“同一性”或“同源性”应当解释为意指对比序列并在必要时引入缺口以为整个序列获取最大百分比同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中其与所比较的相应序列的残基相同的氨基酸残基的百分比。N端或C端延伸和插入都不应解释为降低同一性或同源性。用于对比的方法和计算机程序是本领域众所周知的。序列同一性可以使用序列分析软件来测量。
术语“抗体”以最广义使用，具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定靶物的结合特异性，但是免疫球蛋白既包括抗体也包括其它缺乏靶物特异性的抗体样分子。本发明的抗体可以是任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，在另一端具有一个恒定域。
在用于本文时，“抗Notch3抗体”意指特异性结合人Notch 3从而不依赖配体地激活Notch 3信号传导的抗体。
术语“可变的”在抗体可变域的语境中指可变域的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDRs；即CDR1、CDR2、和CDR3)、也称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR区非常接近地保持在一起，并与另一条链的CDR一起贡献于抗体的靶物结合位点的形成(Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1987))。在用于本文时，免疫球蛋白氨基酸残基的编号依照Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行，除非另有说明。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，一般是靶物结合区或可变区。抗体片段的例子包括F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2和Fv片段。短语抗体的“功能性片段或类似物”指与全长抗体具有性质上共同的生物学活性的化合物。例如，抗Notch3抗体的功能性片段或类似物指能结合Notch3受体的，从而阻止或实质性降低受体的结合其配体或启动信号传导之能力的功能性片段或类似物。在用于本文时，就抗体的“功能性片段”而言，指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。“Fv”是由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体(VH-VL二聚体)组成的片段。正是在这种构型下，每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个靶物结合位点。六个CDR一起赋予抗体以靶物结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对靶异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合靶物的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成结合靶物所需的结构。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。
F(ab)片段包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。F(ab′)片段与F(ab)片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab′)抗体片段是通过在F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处切割二硫键而生成的。本领域普通技术人员还知道抗体片段的其它化学偶联。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；及Morrison，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：6851(1984))。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一靶位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对靶物上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们可以是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，与本发明一起使用的单克隆抗体可使用众所周知的技术从噬菌体抗体库分离。将依照本发明使用的亲本单克隆抗体可通过最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组法来制备。
非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式指包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab’)2或抗体的其它靶物结合亚序列)。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白模板序列的FR。人源化抗体还可包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的恒定区。
术语“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”包括后代(progeny)。还应理解，由于有意为之的或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上不是完全相同的。具有与最初转化细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的变异后代包括在内。本发明中所使用的“宿主细胞”一般是原核的或真核的宿主。
用DNA“转化”细胞生物体、细胞、或细胞系指将DNA导入靶细胞，使得该DNA可复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体整合。用DNA“转染”细胞或生物体指细胞或生物体对DNA(例如表达载体)的摄取，无论任何编码序列事实上是否表达。术语“经转化的”和“经转染的宿主细胞”指如下细胞，即该细胞中导入了DNA。所述细胞称为“宿主细胞”，而且它可以是原核的或真核的。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种菌株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物的，诸如中国仓鼠卵巢细胞或人类起源的细胞。所导入的DNA序列可以与宿主细胞来自相同的物种，或者与宿主细胞来自不同的物种，或者它可以是杂合DNA序列，包含一些外来DNA和一些同源DNA。
术语“载体”指包含与合适控制序列可操作连接的DNA序列的DNA构建物，所述控制序列能够在合适宿主中实现所述DNA的表达。此类控制序列包括启动子(以实现转录)、任选的操纵基因序列(以控制此类转录)、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或仅仅是潜在的基因组插入序列(genomic insert)。一旦被转化入合适宿主中，载体可以不依赖宿主基因组地复制和发挥功能，或者在有些情况中，自身整合入基因组中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包括发挥等效功能的其它形式载体，它们是本领域已知的或成为本领域已知的。
为了治疗的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，非人灵长类，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。
术语“标记物”在用于本文时指可以与分子或蛋白质(例如抗体)直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物可以自身是可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化底物化合物或组合物的可检测化学改变。
在用于本文时，“固相”意指本发明的抗体可附着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。
在用于本文时，术语“Notch3介导的病症”指以Notch3受体有缺陷或表达不足为特征的疾患或疾病。具体而言，它可解释为包括与变性性疾病有关的疾患，诸如CADASIL、FHM、家族性阵发性共济失调、Alagille综合征、和其它变性性疾病。
用于生成抗体的NOTCH 3受体免疫原
可以使用可溶性靶物或其片段作为免疫原来生成抗体。抗体针对感兴趣的靶物。优选地，靶物是生物学上重要的多肽，而且给患有疾病或病症的哺乳动物施用抗体可以在该哺乳动物中导致治疗效益。可以使用全细胞作为免疫原来生成抗体。免疫原可以重组生成或使用合成方法生成。免疫原还可以自天然来源分离。
对于跨膜分子，诸如受体，可以使用它们的片段(例如受体的胞外结构域)作为免疫原。或者，可以使用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。此类细胞可以衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组技术转化而过表达跨膜分子的细胞。可用于制备抗体的其它形式免疫原对于本领域技术人员是显而易见的。
或者，可以依照本领域技术人员公知的方法，将编码人Notch 3受体的基因或cDNA克隆入质粒或其它表达载体中，并在多种表达系统中的任一种中表达。克隆和表达Notch3的方法和人Notch 3受体的核酸序列是已知的(参见例如美国专利No.5,821,332和5,759,546)。由于遗传密码的简并性，可以使用多种编码Notch3受体蛋白或多肽的核苷酸序列。可以通过选择基于可能的密码子选项的组合来改变核苷酸序列。依照应用于编码天然存在Notch 3受体的核苷酸序列的标准三联遗传密码来进行这些组合，而且可以考虑所有此类变异。可以使用这些多肽中的任一种来免疫动物以生成结合人Notch3受体的抗体。
由于Notch 3氨基酸序列的高度保守性，也可以使用来自其它物种的重组Notch 3蛋白作为免疫原来生成抗体。人和小鼠Notch 3间的比较显示了90％以上的氨基酸序列在这两个物种间是相同的。
如果有好处，可以将免疫原Notch 3受体表达成融合蛋白，其具有附接于融合区段的Notch 3受体。融合区段常常帮助蛋白质纯化，例如有助于通过亲和层析来分离和纯化融合蛋白，但是也可用于提高免疫原性。可以培养用融合核酸序列转化的重组细胞来生成融合蛋白。所述融合核酸序列编码蛋白质，该蛋白质其包含附接于其羧基和/或氨基末端的融合区段。融合区段可以包括但不限于免疫球蛋白Fc区、谷胱甘肽-S-转移酶、β-半乳糖苷酶、能够结合二价金属离子的多组氨酸区段、和麦芽糖结合蛋白。
使用如实施例1所述的重组Notch 3受体蛋白免疫小鼠制备了生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤。例示性的多肽包含SEQ ID NO：1的全部或部分，或其变体。
抗体生成
本发明的抗体可通过本领域已知的任何合适方法来生成。本发明的抗体可包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是技术人员所知道的(Harlow等，Antibodies：a Laboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory Press，第2版(1988)，以提述方式完整收入本文)。
例如，可以将如实施例1所述的免疫原施用于各种宿主动物，包括但不限于家兔、小鼠、大鼠等，以引发包含对抗原特异性的多克隆抗体的血清的生成。免疫原的施用可需要一次或多次注射免疫剂和(视需要时)佐剂。根据宿主物种的不同，可使用各种佐剂来提高免疫学应答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔`血蓝蛋白、二硝基酚、和可能有用的人用佐剂诸如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。可采用的佐剂的其它例子包括MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A，合成的海藻糖二白喉菌酸酯(trehalosedicorynomycolate)。免疫规程是本领域众所周知的，可以通过任何能在所选择的动物宿主中引发免疫应答的方法来实施。佐剂也是本领域众所周知的。
通常，通过多次皮下或腹膜内注射、或肌肉内地或经由IV将免疫原(有或无佐剂)注射入哺乳动物中。免疫原可包括Notch 3多肽、其融合蛋白或变体。根据多肽的性质(即百分比疏水性、百分比亲水性、稳定性、净电荷、等电点等)，将免疫原与已知在所免疫的哺乳动物中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。此类偶联包括化学偶联，即用活性化学官能基衍生化待偶联的免疫原和免疫原性蛋白质二者，以形成共价键，或者借助基于融合蛋白的方法学，或者技术人员知道的其它方法。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔
Figure A20078004714100141
血蓝蛋白、卵清蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、和混在的T辅助肽。如上所述，可使用各种佐剂来提高免疫学应答。
本发明的抗体包括单克隆抗体。单克隆抗体是识别单一抗原性位点的抗体。它们一致的特异性使得单克隆抗体比通过包含识别多种不同抗原性位点的抗体的多克隆抗体有用得多。单克隆抗体可以使用杂交瘤技术(诸如Kohler等，Nature 256：495(1975)；美国专利No.4,376,110；Harlow等，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory Press，第2版(1988)及Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier(1981))、重组DNA方法、或技术人员知道的其它方法来制备。可用于生成单克隆抗体的方法的其它例子包括但不限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Proc Natl Acad Sci USA 80：2026(1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，pp.77-96，Alan R.Liss(1985))。此类抗体可以属于任何免疫球蛋白类(包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD)及其任何亚类。生成本发明单抗的杂交瘤可以在体外或在体内培养。
在杂交瘤模型中，对于宿主(诸如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系统的小鼠、仓鼠、家兔、骆驼、或任何其它适宜的宿主动物)进行免疫以引发生成或能够产生抗体的淋巴细胞，它们产生的抗体会特异性结合免疫所使用的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103(1986))。
一般而言，在制备生成抗体的杂交瘤时，如果期望人源细胞的话，那么使用外周血淋巴细胞(″PBL″)；或者，如果期望非人哺乳动物来源的话，使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103(1986))。永生化细胞系通常是已转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛或人类来源的骨髓瘤细胞。典型的是，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选包含一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤乌嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)的话，那么用于杂交瘤的培养基典型地会包含次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的永生化细胞系是这样的细胞系：高效融合、支持所选择的抗体生成细胞稳定地且高水平地生成抗体、且对某种培养基如HAT培养基等敏感。在这些骨髓瘤细胞系中包括小鼠骨髓瘤系，诸如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的小鼠骨髓瘤系(可获自Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego，Calif.美国申请No.)和SP2/0或X63-Ag8-653细胞(American TypeCulture Collection，Rockville，Md.USA)。也有关于人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生成人单克隆抗体的记载(Kozbor，J Immunol 133：3001(1984)；Brodeur，et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc，pp.51-63(1987))。也可使用小鼠骨髓瘤细胞系NSO(European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wilshire，UK)。
对杂交瘤细胞在其中培养的培养液测定针对Notch 3的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或体外结合测定法(诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))来测定杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术是本领域已知的，而且在技术人员的技术范围内。单克隆抗体对Notch 3的结合亲和力可通过例如Scatchard分析来测定(Munson等，AnalBiochem 107：220(1980))。
在鉴定出生成具有期望特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释规程将该克隆亚克隆并通过标准方法来培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103(1986))。适合于此目的的培养基包括例如Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(D-MEM)或RPMI-1640培养基。另外，可以在动物中作为腹水瘤在体内培养杂交瘤细胞。
通过常规免疫球蛋白纯化规程将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水、或血清分开或分离，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。
本领域存在多种方法可用于生成单克隆抗体，因此，本发明不限于仅在杂交瘤中生成单克隆抗体。例如，可通过重组DNA方法来生成单克隆抗体诸如美国专利No.4,816,567中记载的那些。在此语境中，术语“单克隆抗体”指自单一真核克隆、噬菌体克隆、或原核克隆衍生的抗体。编码本发明单克隆抗体的DNA易于使用常规规程来分离和测序(例如通过使用能够与鼠源抗体重链和轻链的编码基因或人源、人源化、或其它来源的重链和轻链的编码基因特异性结合的寡核苷酸探针)(Innis等，于PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic(1990)，Sanger等，Proc Natl Acad Sci74：5463(1977))。杂交瘤细胞可作为此类DNA的来源。一旦分离DNA，可将DNA置入表达载体中，然后将该表达载体转染入宿主细胞(如原本不产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌、NS0细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如用人源重链和轻链恒定域的编码序列置换同源的鼠源序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc Natl Acad Sci USA 81：6851(1984))或将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接在一起。可以用这样的非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定域，或者用其替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变域来创建嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经过修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任何点处截断重链，以防止重链交联。或者，将相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或删除以防止交联。
可通过已知技术来生成识别特定表位的抗体片段。传统上，这些片段是通过对完整抗体的蛋白水解消化得到的(参见例如Morimoto等，J BiochemBiophys Methods 24：107(1992)；Brennan等，Science 229：81(1985))。例如，可使用酶诸如木瓜蛋白酶(用于生成Fab片段)或胃蛋白酶(用于生成F(ab’)2片段)蛋白水解切割免疫球蛋白分子来生成本发明的Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接生成。例如，可以自抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以自大肠杆菌直接回收F(ab’)2-SH片段，并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163(1992))。依照另一种方法，可以自重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(Fv)(PCT专利申请WO 93/16185)。
对于有些用途，包括抗体在人类中的体内使用和体外检测测定法，使用嵌合的、人源化的、或人的抗体可能是优选的。嵌合抗体是如下的分子，其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种，诸如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生成嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等，J Immunol Methods 125：191(1989)；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816397，以提述方式完整并入本申请。
人源化抗体设计成具有比衍生自动物的单克隆抗体更大的对人免疫球蛋白的同源性。人源化是一种用于生成嵌合抗体的技术，所生成的嵌合抗体中实质上小于全长的人可变域已经被来自非人物种的相应序列所替代。人源化抗体是在非人物种中生成的、结合期望抗原的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架(FR)区。通常，人框架区中的框架残基会被替换为来自CDR供体抗体的相应残基，以改变(优选改善)抗原结合。这些框架替代通过本领域众所周知的方法来加以鉴定，例如通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，及通过序列比较以鉴定位于位置上的不常见框架残基。参见例如美国专利No.5,585,089；Riechmann等，Nature 332：323(1988)，以提述方式完整并入本申请。可使用本领域已知的多种方法将抗体人源化，包括例如CDR嫁接(EP 239,400；PCT申请公布WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶嵌(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28：489(1991)；Studnicka等，ProteinEngineering 7：805(1994)；Roguska等，Proc Natl Acad Sci USA 91：969(1994))、和链改组(chain shuffling)(美国专利No.5,565,332)。
一般而言，人源化抗体中导入了一个或多个自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”(import)残基，这些残基通常取自“输入”可变域。人源化基本上可遵循Winter及其同事的方法(Jones等，Nature321：522(1986)；Riechmann等，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534(1988))，用非人CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来实施。因而，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中实质上小于全长的人可变域已经被来自非人物种的相应序列所替代。在实践中，人源化抗体通常是如下的人抗体，其中有些CDR残基，可能还有一些FR残基，被来自啮齿类抗体的类似位点所替代。
此外，重要的是人源化抗体保留了针对抗原的较高亲和力和其它有利的生物学特性。为了实现此目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像，可以分析某些残基在候选免疫球蛋白序列的功能行使中的可能扮演的角色，即分析影响候选免疫球蛋白序列的能力的残基，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体序列和输入序列中选出FR残基并进行组合，使得期望的抗体特征(诸如对靶抗原的亲和力提高)最大化，尽管直接且最实质地影响抗原结合的是CDR残基。
用于构建人源化抗体的人可变域(轻链可变域和重链可变域)的选择对于降低抗原性是重要的。依照所谓的“最佳适配”(best-fit)方法，用非人抗体的可变域序列对整个已知人可变域序列的文库进行筛选。然后接受与非人亲本抗体的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人FR(Sims等，J Immunol151：2296(1993)；Chothia等，J Mol Biol 196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285(1992)；Presta等，J Immunol 151：2623(1993))。
对于人类患者的治疗性处理而言，完全人的抗体是尤其理想的。可通过本领域已知的多种方法来生成人抗体，包括上文所述的使用自人免疫球蛋白序列衍生的抗体库的噬菌体展示方法。还可参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；及PCT申请公布WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；将它们分别以提述方式完整并入本申请。也可用Cole等和Boerder等的技术制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Riss(1985)；及Boerner等，J Immunol 147：86(1991))。
也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来生成人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机地或通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞中。或者，可以在人重链和轻链基因之外，还将人可变区、恒定区、和多变区导入小鼠胚胎干细胞中。可以在将通过同源重组导入人免疫球蛋白基因座的同时或者另行使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能化。具体而言，JH区的纯合删除可阻止内源抗体的生成。将经过修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射入胚泡中以生成嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以生成表达人抗体的纯合后代。参见例如Jakobovitis等，Proc Natl Acad Sci USA 90：2551(1993)；Jakobovitis等，Nature 362：255(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol 7：33(1993)；Duchosal等，Nature355：258(1992))。选用抗原(例如本发明多肽的整个或部分)以正常方式免疫转基因小鼠。可使用常规杂交瘤技术自经过免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中进行重排，随后经历类别转换和体细胞突变。如此，使用这样的技术，有可能生成治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于生成人抗体的这种技术的综述参见Lonberg等，Int Rev Immunol 13：65-93(1995)。关于用于生成人抗体和人单克隆抗体的该技术和用于生成这样的抗体的方案的详细讨论参见例如PCT申请公布WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO96/33735；欧洲专利No.0 598 877；美国专利No.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，以提述方式完整并入本申请。另外，可联系诸如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)、Genpharm(San Jose，Calif.)和Medarex，Inc.(Princeton，N.J.)等公司使用与上文所述类似的技术来提供针对所选择的抗原的人抗体。
还有，可通过对移植有人外周血白细胞、脾细胞或骨髓的小鼠进行免疫来生成人单抗(例如XTL的Trioma技术)。可使用称为“导向选择”(guidedselection)的技术来生成识别选定表位的完全人源抗体。这种方法使用所选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来指导识别相同表位的完全人源抗体的选择(Jespers等，Bio/technology 12：899(1988))。
进一步地，可使用本领域技术人员众所周知的技术利用针对本发明多肽的抗体来生成“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体(参见例如Greenspan等，FASEB J 7：437(1989)；Nissinoff，J Immunol 147：2429(1991))。例如，可使用结合并竞争性抑制多肽的多聚化和/或本发明多肽与配体的结合的抗体来生成的抗独特型抗体，这样的抗体“模拟”多肽的多聚化和/或结合结构域，因而能结合并中和多肽和/或其配体。这样的中和性抗独特型抗体或其Fab片段可以在治疗方案中用于中和多肽配体。例如，这样的抗独特型抗体可用于结合本发明多肽和/或结合其配体/受体，由此阻断其生物学活性。
本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体。在本发明中，一种结合特异性可以是针对Notch 3的，另一种可以是针对任何其它抗原的，优选细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生的蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生的蛋白质、或细菌表面蛋白等。
用于生成双特异性抗体的方法是众所周知的。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两对免疫球蛋白重链/轻链的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein等，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来实现。类似的规程披露于WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J10：3655(1991)。
可以将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。可以在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入不同的(separate)表达载体中，并共转化入合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Meth In Enzym 121：210(1986)。
本发明还涵盖异源偶联抗体。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。这样的抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)。可以在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利No.4,676,980中所公开的。
另外，可生成针对Notch 3的单结构域抗体。这种技术的例子记载于WO9425591(关于自Camelidae重链Ig衍生的抗体)以及US20030130496(记载了自噬菌体文库分离单结构域、完全人源的抗体)。
还可以创建这样的单一肽链结合分子，其中重链和轻链Fv区相连接。单链抗体(“scFv”)及其构建方法记载于美国专利No.4,946,778。或者，可以通过类似的方式构建和表达Fab。所有完全或部分人的抗体免疫原性小于完全鼠源的单抗，而片段和单链抗体免疫原性也较低。
可以自使用McCafferty等，Nature 348：552(1990)中记载的技术生成的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clarkson等，Nature 352：624(1991)和Marks等，J Mol Biol 222：581(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续的出版物记载了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779(1992))，以及组合感染和体内重组(Waterhouse等，Nuc Acids Res 21：2265(1993))作为构建非常大的噬菌体文库的策略，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
还可以例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc Natl Acad Sci USA 81：6851(1984))来修饰DNA。
另一种备选方法是使用电融合(electrical fusion)而非化学融合来形成杂交瘤。这种技术已完全确立。除了融合，也可以使用例如埃巴二氏病毒或转化基因转化B细胞以使得其永生。参见例如“Continuously ProliferatingHuman Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity”，Zurawaki等，于Monoclonal Antibodies，Kennett等编，Plenum Press，pp.19-33(1980))。可通过用由真核或原核系统表达的Notch 3蛋白、融合蛋白、或其片段免疫啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、和豚鼠)来生成抗Notch 3单抗。可以使用其它动物来进行免疫，例如非人灵长类动物、表达免疫球蛋白的转基因小鼠、和移植有人B淋巴细胞的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠。可以通过常规规程通过将来自经免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞(例如Sp2/0和NSO)融合来生成杂交瘤，如前人所述(
Figure A20078004714100211
等，Nature 256：495(1975))。另外，可以通过在噬菌体展示系统中筛选来自人B淋巴细胞的重组单链Fv或Fab文库来生成抗Notch 3抗体。针对Notch3的单抗的特异性可通过ELISA、Western免疫印迹、或其它免疫化学技术来测试。抗体对补体激活的抑制活性可通过溶血测定法来评估，其中使用用于经典补体途径的敏化的鸡或绵羊RBC。通过有限稀释克隆阳性孔中的杂交瘤。纯化抗体以便通过上文所述测定法确定对人Notch 3的特异性。
抗NOTCH 3抗体的鉴定
本发明提供了不依赖配体地激活Notch 3介导的信号传导的激动性单克隆抗体。具体而言，本发明的抗体结合并激活Notch 3。本发明的抗体包括称为256A-13的抗体。本发明还包括与256A-13结合相同表位的抗体。
通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、Western免疫印迹、或其它免疫化学技术测试了候选抗Notch 3抗体。实施例中描述了为了表征各种抗体而实施的测定法。
本发明的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异源偶联、多特异性、人源、人源化或嵌合抗体、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab′)片段、通过Fab表达文库生成的片段、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)、和任何上述的表位结合片段。
[0087]抗体可以是本发明的人源抗原性结合抗体片段，包括但不限于Fab、Fab′和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含一个VL域或一个VH域的单结构域抗体。抗原结合性抗体片段(包括单链抗体)可包含单独的可变区，或包含可变区与整个或部分铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域的组合。本发明还包括包含可变区与铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域的任意组合的抗原结合片段。本发明的抗体可以来自任何动物起源，包括鸟类和哺乳类。优选的是，抗体来自人类、非人灵长类、啮齿类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、家兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、或鸡。
在用于本文时，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体或从转基因动物(该动物转入了一种或多种人免疫球蛋白基因且不表达内源免疫球蛋白)分离的抗体，如下文所述，例如Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598。
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更多特异性的。多特异性抗体可以是对于Notch 3的多个不同表位有特异性的，或者可以是既对Notch 3有特异性，又对异源表位(如异源多肽或固体支持材料)有特异性的。参见例如PCT申请公布WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等，J Immunol 147：60(1991)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等，J Immunol 148：1547(1992)。
本发明的抗体可以用它们所识别或特异性结合的Notch 3中的表位或部分来加以描述或规定。表位或多肽部分可以如本文所述来规定，例如通过N端和C端位置、通过以连续氨基酸残基计的大小、或在表和图中列出。
本发明的抗体也可以用它们的交叉反应性来加以描述或规定。结合与Notch 3具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(如使用本领域已知的方法和本文描述的方法计算的)的Notch 3多肽的抗体也包括在本发明中。抗Notch 3抗体也可以以小于约10-7M、小于约10-6M、或小于约10-5M的KD结合其它蛋白质，诸如来自该抗Notch 3抗体所针对的物种之外的物种的抗Notch 3抗体。
在特定的实施方案中，本发明的抗体与Notch 3的猴同源物及其相应表位起交叉反应。在一个特定的实施方案中，上文所述交叉反应性是关于本文所公开的任何单一特定抗原性或免疫原性多肽、或特定抗原性和/或免疫原性多肽的组合。
本发明进一步包括这样的抗体，它们结合由在严格杂交条件下与编码Notch 3的多核苷酸发生杂交的多核苷酸所编码的多肽。本发明的抗体也可以用它们对本发明多肽的结合亲和力来加以描述或规定。优选的结合亲和力包括具有10-8-10-15M、10-8-10-12M、10-8-10-10M、或10-10-10-12M的平衡解离常数或KD的结合亲和力。本发明还提供了竞争性抑制抗体与本发明表位结合的抗体，所述竞争性结合可由任何本领域已知的关于测定竞争性结合的方法所测定，例如本文所述的免疫测定法。在优选的实施方案中，抗体将对表位的结合竞争性抑制了至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％。
载体和宿主细胞
在另一个方面，本发明提供了编码本文所公开的抗体变体的分离的核酸序列、包含编码本发明抗体的核苷酸序列的载体构建物、包含这样的载体的宿主细胞、和用于生成抗体的重组技术。
为了重组生成抗体变体，分离编码抗体变体的核酸并将其插入复制型载体，用于进一步的克隆(DNA扩增)或用于表达。编码抗体变体的DNA易于使用常规规程来分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体变体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可使用用于克隆和转化的标准技术来制备表达本发明抗体的细胞系。
载体
有许多载体可供使用。载体的组成部分一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。可使用众所周知的技术来制备包含编码本发明抗体的核苷酸序列的重组表达载体。表达载体包含与合适的转录或翻译调节核苷酸序列(诸如衍生自哺乳动物、微生物、病毒、或昆虫基因的转录或翻译调节核苷酸序列)可操作连接的核苷酸序列。调节序列的例子包括转录启动子、操纵基因、增强子、mRNA核糖体结合位点、和/或其它控制转录和翻译起始和终止的适宜序列。当调节序列与适宜多肽的核苷酸序列在功能上相关时，核苷酸序列是“可操作连接的”。如此，例如，启动子核苷酸序列与抗体重链序列是可操作连接的，若启动子核苷酸序列控制适宜核苷酸序列的转录。
另外，表达载体中可以纳入编码适宜的信号肽的序列，其中所述信号肽不与抗体重链和/或轻链序列天然相关。例如，可以以符合读码框的方式将信号肽(分泌前导序列)的核苷酸序列与多肽序列融合，使得抗体被分泌到周质空间或培养基中。在目标宿主细胞中有功能的信号肽增强适宜抗体的胞外分泌。信号肽可以在抗体自细胞分泌出来时被切除。这样的分泌信号的例子是众所周知的，包括例如美国专利No.5,698,435；5,698,417和6,204,023中记载的那些。
载体可以是质粒载体、单链或双链噬菌体载体、或单链或双链RNA或DNA病毒载体。可以通过众所周知的用于将DNA和RNA导入细胞中的技术将这样的载体以多核苷酸形式导入细胞中。在噬菌体和病毒载体的情况下，也可以通过众所周知的感染和转导技术将载体以包装的或封装的病毒形式导入细胞中。病毒载体可以是能复制的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒繁殖一般只会在互补的宿主细胞中发生。也可以使用本发明DNA构建物衍生的RNA利用无细胞翻译系统来生成蛋白质。这样的载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT申请公布WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利No.5,122,464)，而且可以将抗体可变域克隆到这样的载体中以表达完整的重链或轻链。
宿主细胞
可以从任何合适的宿主细胞表达本发明的抗体。在本发明中有用的宿主细胞的例子包括原核、酵母、或高等真核细胞，包括但不限于微生物，诸如经包含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体的转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转化过的酵母(例如糖酵母属酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母属酵母(Pichia))；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染过的或用包含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化过的植物细胞系统；或携带含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。
可用作本发明宿主细胞的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，诸如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌或枯草杆菌(B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的而非限制性的。
在原核宿主细胞中使用的表达载体一般包含一种或多种表型选择标志基因。表型选择标志基因是例如编码赋予抗生素抗性或供应自养需求的蛋白质的基因。对于原核宿主细胞有用的表达载体的例子包括那些自商品化质粒衍生的表达载体，诸如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin.，USA)、和pET(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和pRSET(Invitrogen，Carlsbad，CA)系列载体(Studier，J Mol Biol 219：37(1991)；Schoepfer，Gene 124：83(1993))。常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7(Rosenberg等，Gene56：125(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等，Nature275：615(1978)；Goeddel等，Nature 281：544(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，Nucl Acids Res 8：4057(1980))、和tac启动子(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory(1990))。
在本发明中有用的酵母或丝状真菌包括那些来自酵母属(Saccharomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、放线菌属(Actinomycetes)、克鲁维氏酵母属(Lluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、木霉属(Trichoderma)、脉孢霉属(Neurospora)、和丝状真菌诸如脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)。酵母载体常常会包含来自2μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、聚腺苷酸化序列、用于转录终止的序列、和选择标志基因。适合于酵母载体的启动子序列包括金属硫蛋白的启动子、3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等，J Biol Chem 255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Holland等，Biochem 17：4900(1978))如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子，等等。用于酵母表达的其它合适载体和启动子进一步记载于Fleer等，Gene 107：285(1991)。用于酵母和酵母转化方案的其它合适启动子和载体是本领域众所周知的。酵母转化方案是众所周知的。一种这样的方案记载于Hinnen等，Proc Natl Acad Sci 75：1929(1978)。Hinnen方案在选择性培养基中选择Trp+转化子。
也可以采用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统来表达重组抗体。原则上，任何高等真核细胞培养物都可使用，无论是来自脊椎动物的培养物或是来自无脊椎动物的培养物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞(Luckow等，Bio/Technology 6：47(1988)；Miller等，Genetics Engineering，Setlow等编，Vol.8，pp.277-9，Plenam Publishing(1986)；Mseda等，Nature315：592(1985))。例如，可使用杆状病毒系统来生成异源蛋白。在昆虫系统中，可使用苜蓿尺蠖(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外来基因。该病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列分别地克隆入病毒的非必需区(例如多角体基因)中，置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制之下。已经鉴定的其它宿主包括伊蚊属(Aedes)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、和家蚕(Bombyxmori)。多种用于转染的病毒株是公众可获得的，例如AcNPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，而且这样的病毒可用作依照本发明的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。此外，也可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
脊椎动物细胞、和脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已经成为常规规程。参见Tissue Culture，Kruse等编，Academic Press(1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子有猴肾；人胚肾；幼仓鼠肾细胞；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(Sertoli)细胞；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞；人肺细胞；人肝细胞；小鼠乳房肿瘤；和NS0细胞。
用上文所述的用于抗体生成的载体转化宿主细胞，并在视需要进行改良以便诱导启动子、转录和翻译控制序列、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养。常用的启动子序列和增强子序列衍生自多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)、和人巨细胞病毒(CMV)。为了在哺乳动物宿主细胞中表达结构基因序列，可使用衍生自SV40病毒基因组的DNA序列来提供其它遗传元件，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接、和聚腺苷酸化位点。病毒早期和晚期启动子是特别有用的，因为它们都易于以片段的形式从病毒基因组获得，所述片段还可以包含病毒复制起点。用于在哺乳动物宿主细胞中使用的例示性表达载体是可商购的。
可以在多种培养基中培养用于生成本发明的抗体变体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma，St Louis，MO)、基本必需培养基(MEM，Sigma，St Louis，MO)、RPMI-1640(Sigma，St Louis，MO)、和Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM，Sigma，St Louis，MO)适合于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，MethEnzymol 58：44(1979)；Barnes等，Anal Biochem 102：255(1980)；及美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,560,655；5,122,469；5,712,163；或6,048,728。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(诸如X-氯化物，其中X是钠、钙、镁；和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件如温度、pH等是表达所选用的宿主细胞原先使用的条件，这些条件对于普通技术人员而言是显而易见的。
编码抗体的多核苷酸
本发明进一步提供了包含编码本发明抗体及其片段的核苷酸序列的多核苷酸或核酸，例如DNA。例示性的多核苷酸包括编码包含一种或多种本文所述氨基酸序列的抗体链的多核苷酸。本发明还涵盖在严格或较低严格性杂交条件下与编码本发明抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。
可通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸并测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么可以用化学合成的寡核苷酸来装配编码抗体的多核苷酸(例如，如Kutmeier等，Bio/Techniques 17：242(1994)中所述)，简言之，该过程包括合成包含抗体编码序列的部分的多个重叠的寡核苷酸，将这些寡核苷酸进行退火和连接，然后通过PCR扩增连接所得的寡核苷酸。
或者，可以用来自合适来源的核酸来生成编码抗体的多核苷酸。如果无法得到包含编码特定抗体的核酸的克隆，但是抗体分子的序列是已知的，那么可以化学合成编码免疫球蛋白的核酸，或者可以从合适的来源[例如抗体cDNA文库，或者从任何表达抗体的组织或细胞(如选用来表达本发明抗体的杂交瘤细胞)分离的核酸，优选polyA+RNA]通过PCR扩增或克隆获得编码免疫球蛋白的核酸，其中PCR扩增使用能与序列3′和5′端杂交的合成引物，而克隆使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针以(例如)从编码抗体的cDNA文库中鉴定出cDNA克隆。然后可以使用本领域任何公知方法将通过PCR扩增的核酸克隆入复制型克隆载体中。
一旦确定了抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，则可使用本领域众所周知的用于操作核苷酸序列的方法操作抗体的核苷酸序列，这些方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1990)；Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1998)中记载的技术，以提述方式完整并入本申请)，以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如用于创建氨基酸替代、删除、和/或插入。
在一个特定的实施方案中，可通过众所周知的方法检查重链和/或轻链可变域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列，例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较以确定具有序列高变性的区域。使用常规重组DNA技术，可以在框架区内插入一个或多个CDR，例如将一个或多个CDR插入人框架区中以使非人抗体人源化，如上文所述。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人框架区(参见例如Chothia等，J Mol Biol 278：457(1998)中人框架区的列表)。优选地，框架区与CDR组合而生成的多核苷酸编码特异性结合本发明多肽的抗体。优选地，如上文所述，可以在框架区中进行一处或多处氨基酸替代，而且优选地，氨基酸替代改善抗体对其抗原的结合。另外，可以用这样的方法针对一个或多个可变区半胱氨酸残基(特别是参与形成链内二硫键的半胱氨酸残基)进行氨基酸替代或删除，以生成缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。本发明涵盖对多核苷酸的其它改变，而且这些改变在本领域技术范围之内。
另外，可使用为生成“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，Proc NatlAcad Sci 81：851(1984)；Neuberger等，Nature 312：604(1984)；Takeda等，Nature314：452(1985))，即将来自具有适宜抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适宜生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起。如上所述，嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如具有自鼠单抗衍生的可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体，例如人源化抗体。
或者，文献记载的用于生成单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778；Bird，Science 242：423(1988)；Huston等，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879(1988)；和Ward等，Nature 334：544(1989))可改造适用于生成单链抗体。通过用氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段，产生单链多肽而形成单链抗体。也可使用用于在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等，Science242：1038(1988))。
生成抗NOTCH 3抗体的方法
可通过任何本领域已知的用于抗体合成的方法来生成本发明的抗体，特别是通过化学合成或优选通过重组表达技术来生成本发明的抗体。
本发明的抗体或其片段、衍生物、或类似物(例如本发明抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达要求构建包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。一旦得到了编码抗体分子的多核苷酸，可通过重组DNA技术来生成用于抗体生成的载体。构建包含抗体编码序列和适宜的转录和翻译控制序列的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养经过转染的细胞以生成本发明的抗体。在本发明的一个方面，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链的载体以表达完整免疫球蛋白分子，如下文详述的。
可利用多种宿主-表达载体系统来表达本发明的抗体分子，如上文所述。这样的宿主-表达系统不但代表了可用于生成随后纯化感兴趣编码序列的媒介，而且代表了在用适宜核苷酸编码序列转化或转染后可原位表达本发明抗体的细胞。常常使用细菌细胞(诸如大肠杆菌)和真核细胞来表达重组抗体分子，尤其是用于表达完整重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞(诸如CHO)和载体(诸如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件)的组合是有效的抗体表达系统(Foecking等，Gene 45：101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990))。
另外，可选择这样的宿主细胞株，其以期望的特定方式调控所插入序列的表达或修饰和加工基因产物。这样的蛋白质产物修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同宿主细胞具有特征性的和特定的蛋白质和基因产物翻译后加工和修饰机制。可选择适宜的细胞系或宿主细胞来确保所表达外来蛋白的正确修饰和加工。为此，可使用拥有初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化、和磷酸化所需的细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3、或骨髓瘤细胞。
为了长期、高产量地生成重组蛋白，稳定的表达是优选的。例如，可工程化产生(engineer)稳定表达抗体分子的细胞系。可以不使用包含病毒复制起点的表达载体，而使用受适宜表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标志来转化宿主细胞。在导入外来DNA后，可以让工程化细胞在富营养培养基(enriched media)中生长1-2天，然后转换成选择培养基。重组质粒中的选择标志赋予对选择的抗性，并容许细胞将质粒稳定整合入它们的染色体中并生长以形成转化灶(foci)，转化灶继而可克隆和扩增形成细胞系。这种方法可有利地用于工程化改造表达抗体分子的细胞系。这样的工程化细胞系在直接地或间接地与抗体分子相互作用的化合物的筛选和评估中可以是特别有用的。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-乌嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等，ProcNatl Acad Sci USA 48：202(1992))、和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell22：817(1980))基因分别可用于tk、hgprt或aprt-细胞。还有，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhff，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等，ProcNatl Acad Sci USA 77：357(1980)；O′Hare等，Proc Natl Acad Sci USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等，Proc Natl Acad Sci USA78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu等，Biotherapy 3：87(1991))；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30：147(1984))。可常规应用重组DNA技术领域公知的方法来选择期望的重组克隆，这样的方法记载于例如Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press(1990)；及Dracopoli等编，Current Protocols in Human Genetics，第12和13章，John Wiley & Sons(1994)；Colberre-Garapin等，J Mol Biol 150：1(1981)，以提述方式将上述文献完整并入本申请。
可通过载体扩增来提高抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington等，″The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells，″DNA Cloning，Vol.3.Academic Press(1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物能被扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的升高会提高标志物基因的拷贝数。由于所扩增的区域与抗体基因相关，因此抗体的生成也会升高(Crouse等，Mol Cell Biol 3：257(1983))。
可以用两种本发明的表达载体共转染宿主细胞，其中第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可包含相同的选择标志，这可使得重链和轻链多肽的表达相等。或者，可使用编码且能够表达重链和轻链多肽二者的单一载体。在这种情况中，应当将轻链置于重链之前以避免有毒的游离重链过量(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc Natl Acad Sci USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦由动物生成了、化学合成了、或重组表达了本发明的抗体分子，可通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化它，例如通过层析(例如离子交换层析、亲和层析、特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和层析、和大小排阻层析)、离心、溶解度差异、或通过任何其它用于蛋白质纯化的标准技术。另外，可以将本发明的抗体或其片段与本文所述的或本领域知道的异源多肽序列融合以便于纯化。
[00124]本发明涵盖与多肽重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)的抗体。可使用本发明的融合或偶联抗体来简化纯化。参见例如PCT申请公布WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，Immunol Lett 39：91(1994)；美国专利No.5,474,981；Gillies等，Proc Natl Acad Sci USA 89：1428(1992)；Fell等，J Immunol 146：2446(1991)，以提述方式将它们完整并入本申请。
此外，可以将本发明的抗体或其片段与标志物序列(诸如肽)融合以便于纯化。在优选的实施方案中，标志物氨基酸序列是六聚组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA)中提供的标签等，其中许多是商品化的。如例如Gentz等，Proc Natl Acad Sci USA 86：821(1989)所述，六聚组氨酸有助于方便的融合蛋白纯化。对纯化有用的其它肽标签包括但不限于“HA”标签，其对应于自流感血凝素蛋白衍生的表位(Wilson等，Cell 37：767(1984))和“Flag”标签。
抗体纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体变体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体变体，那么作为第一步，可以通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等，Bio/Technology 10：163(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)存在下用约30分钟使细胞糊融化。细胞碎片可以通过离心除去。若抗体变体被分泌到培养基中，则通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元对来自这样的表达系统的上清液加以浓缩。在上述任何步骤中，可以引入蛋白酶抑制剂如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以引入抗生素来防止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来加以纯化，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体变体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等，JImmunol Meth 62：1(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人IgG3(Guss等，EMBO J 5：1567(1986))。亲和配体所附接的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。机械稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可有助于获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体变体包含CH3结构域，则Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体变体的不同，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤后，可以将包含感兴趣抗体变体和污染物的化合物进行低pH疏水相互作用层析，其中使用pH为约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M的盐)实施。
药物配制剂
[00129]可通过将具有期望纯度的多肽与任选的本领域典型采用的“药学可接受的”载体、赋形剂或稳定剂(都称为“赋形剂”)混合，以冻干配制剂或水溶液的形式，制备包含多肽或抗体的治疗性配制剂供贮存，所述赋形剂即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张剂、非离子去污剂、抗氧化剂、和其它各种添加剂。参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol编，(1980)。这样的添加剂在所采用的剂量和浓度对接受者必须是无毒的。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理学条件的范围内。它们优选以约2mM-约50mM的浓度范围存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖醛酸盐缓冲剂(葡糖醛酸-葡糖醛酸钠混合物、葡糖醛酸-氢氧化钠混合物、葡糖醛酸-葡糖醛酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)、和醋酸盐缓冲剂(例如醋酸-醋酸钠混合物、醋酸-氢氧化钠混合物等)。另外，还有磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、和三甲胺盐诸如Tris。
可添加防腐剂以延迟微生物生长，防腐剂可以以范围为0.2％-1％(w/v)的量添加。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄基铵、苄烷铵(benzalkonium)卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、氯己双胺、和多羟基苯甲酸烃基酯诸如多羟基苯甲酸甲酯或丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、和3-戊醇。
可添加等张剂(有时称为“稳定剂”)以确保本发明液体组合物的等张性，等张剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
稳定剂指一大类赋形剂，其功能范围从填充剂到使治疗剂溶解或有助于防止变性粘附容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上文所列)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、乌氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖(stachyose)、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇(cyclitols)诸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸(thioctic acid)、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质，诸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖，二糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖，和三糖，诸如棉子糖；和多肽，诸如右旋糖苷。稳定剂可以以0.1-10,000份重量每份活性蛋白质重量的范围存在。
[00134]可以添加非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助使治疗剂溶解以及保护治疗性蛋白质免于搅动诱导的聚集(agitation-induced aggregation)，这也使得配制剂能够暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质变性。合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、Polyoxamers(184、188等)、PluronicRTM多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖单醚(TWEEN-
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TWEEN-
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等)。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml-约1.0mg/ml、优选约0.07mg/ml-约0.2mg/ml的范围存在。
其它的杂类赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)、和助溶剂。本文中的配制剂还可应所治疗的特定适应症所需含有多于一种的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的活性化合物。例如，可能希望进一步提供免疫抑制剂。这样的分子合适地以对预定目的有效的量呈组合存在。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、存在于胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或存在于粗滴乳状液中。这样的技术披露于Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osal编，(1980)。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体变体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
[00137]治疗性多肽、抗体、或其片段会在特定病症或疾患的治疗中有效的量取决于病症或疾患的性质，而且可以通过标准临床技术来确定。若可能，理想的是在人类中进行测试之前，首先在体外，然后在有用的动物模型中，测定剂量-应答曲线和本发明的药物组合物。
在一个优选的实施方案中，通过皮下注射施用治疗性多肽、抗体或其片段的水溶液。每剂的范围为约0.5μg-约50μg每千克体重，或更优选约3μg-约30μg每千克体重。
用于皮下施用的剂量给药方案可以随许多临床因素(包括疾病的类型、疾病的严重程度和受试者对治疗剂的敏感性)而变化(从每月一次到每天一次)。
抗NOTCH 3抗体的治疗用途
本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，例如为了获得临床前数据的目的而将抗体施用于非人哺乳动物。待治疗的例示性非人哺乳动物包括非人灵长类、犬、猫、啮齿类和其它对其实施临床前研究的哺乳动物。这样的哺乳动物可以是针对要用抗体治疗的疾病的已建立的动物模型，或可用于研究感兴趣抗体的毒性。在这些实施方案的每一个中，可以对哺乳动物实施剂量升级研究(dose escalation studies)。
可使用单独的或与因子组合的抗体作为治疗剂。本发明涉及基于抗体的疗法，其包含将本发明的抗体施用于动物、哺乳动物、或人类以治疗Notch 3介导的疾病、病症、或疾患。动物或受试者可以是需要特定治疗的哺乳动物，诸如已经诊断有特定病症(例如与Notch 3有关的病症)的哺乳动物。针对Notch 3的抗体对于哺乳动物(包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、犬、非人灵长类等，以及人类)中的变性性疾病和其它Notch 3相关疾病(包括CADASIL、FHM、Alagille综合征、神经学和变性性病症)是有用的。例如，通过施用治疗可接受剂量的抗Notch 3抗体或本发明抗体或本发明抗体的合剂，或与不同来源的其它抗体组合使用，所治疗哺乳动物(特别是人类)中的疾病症状可得到改善或预防。
[00142]本发明的治疗性化合物包括但不限于本发明的抗体(包括如本文所述的其片段、类似物和衍生物)和编码本发明抗体的核酸(如下文所述)包括如本文所述的其片段、类似物和衍生物以及抗独特型抗体)。本发明的抗体可用于治疗、抑制、或预防与Notch 3的异常表达和/或活性有关的疾病、病症、或疾患，包括但不限于任何一种或多种本文所述的疾病、病症、或疾患。与Notch 3的异常表达和/或活性有关的疾病、病症、或疾患的治疗和/或预防包括但不限于减轻至少一种与那些疾病、病症、或疾患有关的症状。本发明的抗体可以在本领域已知的或如本文所述的药学可接受组合物中提供。
本发明的抗Notch 3抗体可以治疗性地应用于多种疾病。本发明提供一种在哺乳动物中预防或治疗Notch 3介导的疾病的方法。该方法包括给哺乳动物施用疾病预防或治疗量的抗Notch 3抗体。抗Notch 3抗体结合Notch 3并激动化(agonize)其功能。人们已经将Notch 3信号传导与多种疾病如CADASAL、FHM、家族性阵发性共济失调、Alagille综合征和其它变性性疾病和神经学病症联系起来(Joutel等，Nature 383：707(1996)；Flynn等，J Pathol 204：55(2004))。预计抗Notch 3抗体对预防上述疾病也会是有效的。
在与Notch 3的异常表达和/或活性有关的疾病或病症的治疗、抑制和预防中有效的抗体量可通过标准临床技术来加以确定。剂量将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是为了预防目的还是治疗目的而施用的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的裁量。可以按照与病情相符的治疗方案来施用抗体，例如经一至数天时间施用单个剂量或几个剂量以改善疾病状态，或者在较长一段时间里定期施用多个剂量，以抑制疾病进展和预防疾病复发。另外，可任选采用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。配药中采用的确切剂量还会取决于施用路径和疾病或病症的严重程度，而且应当依照从业人员的判断和每名患者的实际情况来决定。可以根据从体外或动物模型测试系统得到的剂量-应答曲线来外推有效剂量。
对于抗体，给患者施用的剂量典型地是0.1mg/kg至150mg/kg患者体重。优选的是，给患者施用的剂量介于0.1mg/kg和20mg/kg患者体重之间，更优选1mg/kg至10mg/kg患者体重。一般而言，由于对外来多肽的免疫应答，人抗体在人体中的半衰期长于来自其它物种的抗体。因此，人抗体常常可能使用较低的剂量和较低的施用频率。此外，可通过修饰(诸如例如脂化(lipidation))而增强抗体的摄取和组织穿透(例如进入脑)，以降低本发明抗体的施用剂量和频率。对于数天或更长时间里的重复施用而言，根据状况，持续实施治疗直至出现期望的疾病症状遏制。然而，其它剂量方案也是有用的。这样的治疗进程很容易通过常规技术和测定法来加以监测。
[00146]抗体变体组合物将以符合良好医学实践的方式来配制、定剂量(dose)和施用。在此语境中的考虑因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的原因、药剂的投递部位、施用的方法、施用的进度安排、和医学从业人员知道的其它因素。待施用的抗体变体的“治疗有效量”会受这样的考虑因素的控制，而且是预防、改善、或治疗疾病或病症的最小量。抗体变体不必但可任选与一种或多种当前用于预防或治疗相关病症的药剂一起配制。这样的其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、和上文所讨论的其它因素。这些一般使用与以前所使用的相同的剂量和施用路径，或者是以前所采用的剂量的约1-99％。
本发明的抗体可以单独施用或与其它类型的治疗联用。
在一个优选的方面，抗体是基本上纯化的(即基本上不含限制其效果或产生不想要的副作用的物质)。
已知有多种投递系统，它们可用来施用本发明的抗体，包括注射例如封装在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如Wu等，J Biol Chem 262：4429(1987))、作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸的构建等。
[00150]可以以任何可接受的方式给哺乳动物施用抗Notch 3抗体。导入方法包括但不限于胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、硬膜外、吸入和口服路径、及(如果有利于免疫遏制治疗的话)病变内施用。胃肠外输注包括肌肉内、皮内、静脉内、动脉内、或腹膜内施用。可通过任何方便的路径来施用抗体或组合物，例如通过输注或推注、通过穿过上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收，而且可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可能希望通过任何合适路径将本发明的治疗性抗体或组合物导入中枢神经系统中，包括室内和鞘内注射；室内导管(例如连接于储药库(reservoir)诸如Ommaya储药库的导管)可有助于室内注射。另外，通过脉冲输注(特别是用递减剂量的抗体)合适地施用抗体。优选的是，通过注射(最优选静脉内或皮下注射，取决于施用是短期的还是长期的)来给予剂量给药。
也可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器及含有雾化剂的配制剂。也可以以干粉组合物的形式将抗体施用入患者的肺中(参见例如美国专利No.6,514,496)。
在一个特定的实施方案中，可能希望将本发明的治疗性抗体或组合物局部地施用于需要治疗的部位；这可以通过例如但不限于局部输注、表面涂施、通过注射、借助导管、借助栓剂、或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝胶状的材料，包括膜，诸如硅橡胶(sialastic)膜，或纤维。优选的是，在施用本发明的抗体时，必须注意使用蛋白质不吸附(absorb)的材料。
在另一个实施方案中，可以将抗体置于媒介中，特别是脂质体中加以投递(参见Langer，Science 249：1527(1990)；Treat等，于Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein等编，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，pp.317-27；参见一般同上)。
在又一个实施方案中，可以将抗体置于受控释放系统中加以投递。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，Science 249：1527(1990)；Sefton，CRC Crit Ref Biomed Eng 14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N Engl J Med 321：574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer等编，CRCPress(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen等编，Wiley(1984)；Ranger等，J Macromol Sci RevMacromol Chem 23：61(1983)；还可参见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann Neurol 25：351(1989)；Howard等，J Neurosurg 71：105(1989))。在又一个实施方案中，可以将受控释放系统置于治疗靶附近。
本发明还提供了药物组合物。这样的药物组合物包含治疗有效量的抗体和生理学可接受载体。在一个特定的实施方案中，术语“生理学可接受的”指得到联邦或州政府管理机构的批准或列于美国药典或其它一般认可的药典中用于动物，更特别的是人类。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或媒介。这样的生理学载体可以是无菌液体，诸如水，和油，包括源自石油、动物、植物、或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是对于可注射溶液。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、丙二醇(propylene，glycol)、水、乙醇等。如果需要，组合物还可含有极小量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放配制剂等形式。组合物可以用常规粘合剂和载体(诸如甘油三酸酯)配制成栓剂。口服配制剂可包括标准载体，诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适载体的例子记载于E.W.Martin的《Remington′sPharmaceutical Sciences》。这样的组合物将含有有效量的抗体(优选纯化的形式)以及合适量的载体，从而提供适合施用于患者的形式。配制剂应当与施用模式相适应。
[156]在一个实施方案中，依照常规规程将组合物配制为适合于对人体静脉内施用的药物组合物。典型地，用于静脉内施用的组合物是无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利诺卡因(lignocaine)以减轻注射部位的疼痛。一般而言，各成分或是分开地提供，或是一起混合成单位剂型来提供，例如作为标明了活性剂的量的密封容器(诸如安瓿或药囊(sachette))中的冻干干粉或无水浓缩物)。若要通过输注来施用组合物，可以用装有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。若通过注射来施用组合物，可提供装有无菌注射用水或盐水的安瓿，以便在施用前混合各个成分。本发明还提供了药包或试剂盒，其包括一个或多个容器，容器中装有本发明药物组合物的一种或多种成分。任选地，这样的容器可伴有管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府部门所规定的形式的告知书(notice)，该告知书反映了政府部门对用于人体施用的制造、使用或销售的批准。
制品
在本发明的另一个实施方案中提供了制品，其包含对于上文所述病症的治疗有用的材料。制品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器和试管。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器装有对预防或治疗疾患有效的组合物，且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的活性剂是抗体。位于容器上的或与容器相伴随的标签说明所述组合物系用于治疗所选择的疾患。制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受的缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液、和右旋糖溶液。它还可进一步包括其它从商业和用户立场上看可取的材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明书的包装插页。
基于抗体的基因治疗
在本发明的另一个方面，通过基因治疗的方式，施用包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸，用以治疗、抑制或预防与Notch3的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。基因治疗指通过对受试者施用被表达的或能表达的(expressed or expressible)核酸来实施的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸生成它们所编码的蛋白质，该蛋白质介导治疗效应。任何可用的基因治疗方法均可依照本发明加以使用。下文描述了例示性的方法。
关于基因治疗方法的一般性综述参见Goldspiel等，Clinical Pharmacy12：488(1993)；Wu等，Biotherapy 3：87(1991)；Tolstoshev，Ann Rev PharmacolToxicol 32：573(1993)；Mulligan，Science 260：926(1993)；Morgan等，Ann RevBiochem 62：191(1993)；May，TIBTECH 11：155(1993)。
[00160]在一个方面，化合物包含编码抗体的核酸序列，所述核酸序列表达载体的一部分，所述表达载体在合适宿主中表达抗体或它们的片段或嵌合蛋白或重链或轻链。具体而言，这样的核酸序列具有与抗体编码区可操作连接的启动子，所述启动子是诱导型的或组成型的，而且任选是组织特异性的。
在另一个具体的实施方案中，使用这样的核酸分子，其中抗体编码序列和任何其它期望序列的侧翼存在着促进在基因组中期望位点处发生同源重组的区域，如此为抗体编码核酸的染色体内表达提供条件(Koller等，Proc NatlAcad Sci USA 86：8932(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435(1989))。在特定的实施方案中，所表达的抗体分子是单链抗体；或者，核酸序列包括编码抗体重链和轻链二者或其片段的序列。
将核酸投递入患者中可以是直接的，在这种情况中，使患者直接暴露于核酸或携带核酸的载体；或者是间接的，在这种情况中，首先在体外用核酸转化细胞，然后将细胞移植入患者中。这两种方法分别称为体内或回体(exvivo)基因治疗。
在一个特定的实施方案中，在体内直接施用核酸序列，核酸序列在体内表达以生成所编码的产物。这可以通过本领域已知的多种方法中的任一种方法来实现，例如通过将它们构建为适宜的核酸表达载体的一部分并施用它，使得它们成为细胞内的，例如通过使用缺陷型或减毒型逆转录病毒或其它病毒载体进行感染(参见美国专利No.4,980,286)、或通过裸DNA的直接注射、或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)、或用脂质细胞表面受体或转染剂包被、封装在脂质体、微粒或微胶囊中、或将它们与已知的能进入核的肽连接后加以施用，将它们与受到受体介导胞吞作用的配体连接后加以施用(参见例如Wu等J Biol Chem 262：4429(1987))(这可以用来靶向特异性表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，可以形成这样的核酸-配体复合物，其中配体包含促溶(fusogenic)病毒肽以破坏内体，使得核酸能够避免溶酶体降解。在又一个实施方案中，可以使核酸靶向的特定受体来实现体内靶向细胞特异性摄取和表达(参见例如PCT申请公布WO 92/06180；WO 92/22635；WO92/20316；WO93/14188，WO 93/20221)。或者，可以将核酸导入胞内并通过同源重组掺入宿主细胞DNA中以进行表达(Koller等，ProcNatl Acad Sci USA 86：8932(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435(1989))。
[00164]在一个特定的实施方案中，使用包含编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等，Meth Enzymol217：581(1993))。这些逆转录病毒包含病毒基因组的正确包装和整合入宿主细胞DNA中所必需的构件。将编码基因疗法中使用的抗体的核酸序列克隆入一种或多种载体中，所述载体帮助将所述基因投递入患者中。关于逆转录病毒载体的更多详情可见于Boesen等，Biotherapy 6：291(1994)，其描述了使用逆转录病毒载体将mdrl基因投递至造血干细胞以使得干细胞对化疗更有抗性。阐述逆转录病毒载体在基因疗法中使用的其它参考文献有：Clowes等，JClin Invest 93：644(1994)；Kiem等，Blood 83：1467(1994)；Salmons等，HumanGene Therapy 4：129(1993)；和Grossman等，Curr Opin Gen和Dev 3：110(1993)。
也可以在本发明中使用腺病毒。腺病毒是本发明中用于投递抗体至呼吸上皮的一种特别有吸引力的媒介。腺病毒天然地感染呼吸上皮。基于腺病毒的投递系统的其它靶标有肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒的优点在于能够感染不处于分裂中的细胞。Kozarsky等，Curr Opin Gen Dev 3：499(1993)对基于腺病毒的基因疗法进行了综述。Bout等，Human Gene Therapy5：3(1994)演示了应用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸上皮的用途。腺病毒在基因疗法中的用途的其它例子可见于Rosenfeld等，Science 252：431(1991)；Rosenfeld等，Cell 68：143(1992)；Mastrangeli等，J Clin Invest 91：225(1993)；PCT申请公布WO94/12649；Wang等，Gene Therapy 2：775(1995)。腺伴随病毒(AAV)也已被建议用于基因治疗(Walsh等，Proc Soc Exp Biol Med204：289(1993)；美国专利No.5,436,146；6,632,670；和6,642,051)。
基因疗法的另一种方法涉及将基因转移至组织培养中的细胞，这通过诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染、或病毒感染来实现。通常，转移方法包括将选择标志转移至细胞。然后将细胞置于选择之下以分离那些已摄取并正在表达所转移基因的细胞。然后将那些细胞投递至患者。
在这个实施方案中，将核酸导入细胞中，之后将所得重组细胞施用到体内。这样的导入可通过本领域已知的任何方法来进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、使用包含核酸序列的病毒或噬菌体载体进行的感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域知道将外来基因导入细胞中的许多技术(参见例如Loeffler等，MethEnzymol 217：599(1993)；Cohen等，Meth Enzymol 217：618(1993)；Cline，Pharmac Ther 29：69(1985))，而且可依照本发明使用这些技术，只要受体细胞的必需的发育和生理功能不受其破坏即可。所述技术应当有助于核酸稳定转移进入细胞，使得核酸可被细胞所表达，且优选能被该细胞的后代细胞遗传和表达。
可通过本领域已知的各种方法将所得重组细胞投递至患者。优选静脉内施用重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)。细胞的预计用量取决于期望的效果、患者的状态等，而且可以由本领域技术人员来确定。
为了基因疗法可在其中导入核酸的细胞涵盖任何期望的、可得的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞、血细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞(特别是造血干细胞或祖细胞)，例如自骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的。
在一个实施方案中，用于基因疗法的细胞对于患者是自体的。将编码本发明抗体的核酸序列导入细胞中，使得它们可由细胞或其后代表达，然后体内施用这些重组细胞以获得治疗效应。在一个特定的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。任何可以在体外分离和维持的干细胞和/或祖细胞均可能依照本发明的这个实施方案来使用(参见例如PCT申请公布WO 94/08598；Stemple等，Cell 71：973(1992)；Rheinwald，Meth Cell Bio 21A：229(1980)；Pittelkow等，Mayo Clinic Proc 61：771(1986))。
实施例
实施例1：免疫原的生成：NOTCH 3胞外结构域-FC融合蛋白
使用重组Notch 3-Fc融合蛋白(其包含羧基末端与γ1Fc区融合的Notch 3LD)作为免疫原，生成了特异性结合人Notch 3之LIN12/二聚化结构域(下文称为″LD″)的抗Notch 3单克隆抗体。具体而言，所述免疫原包含Notch 3 LD的氨基酸残基1378-1640(见图1)和人γ1 Fc融合蛋白(Notch 3 LD/Fc)。使用Notch 3 EGF重复区氨基酸残基43-1377作为免疫原生成了对照抗体。
使用基于因特网的研究软件和服务(Motif Search，http://motif.genome.jp/)分析了Notch 3蛋白序列。使用标准商品化cDNA合成试剂盒，使用人肝脏和胰腺RNA(Ambion，Inc.Austin，TX)作为模板来合成cDNA第一条链。在甜菜碱(1-2M)和DMSO(5％)存在下PCR扩增编码Notch 3LD和EGF重复区的cDNA。将PCR合成的Notch 3-LD DNA片段(～0.8kb)和Notch 3-EGF重复DNA片段(～4kb)克隆入表达载体中，所述表达载体在商品化载体pSec中或在商品化载体pCD3.1中包含His-γ1Fc，每种商品化载体都携带一种不同的抗生素标志物。此克隆过程产生两种表达质粒，一种表达Notch 3-LD/Fc融合蛋白，另一种表达Notch 3-EGF/Fc融合蛋白。
为便于质粒构建和增强各种Notch 3重组蛋白的表达，生成了包含Notch3核酸编码序列的前135个碱基对的、与前导肽序列对应的寡核苷酸。这些寡核苷酸在摇摆(wobble)编码位置上包含有一些变化以降低GC含量。所有核苷酸序列变化都是沉默的，即没有氨基酸序列变化(图8A和8B)。将这些寡核苷酸退火到一起后，通过PCR-SOE(Ho等，Gene 77：51(1989)；Horton等，BioTechniques 8：528(1990))将工程化前导肽编码序列与其余的编码序列相连接(见图9)。Notch 3-LD/Fc表达构建物和Notch 3表达构建物中使用了此前导肽编码序列。因此，这两种Fc融合蛋白都包含与N端连接的信号肽和与C端融合的人γ1Fc序列。Notch 3-LD(包括前导肽)的氨基酸序列显示于图8B和SEQ ID NO：6。
[00174]通过将Notch 3表达质粒分别瞬时转染入293T(ATCC编号CRL-11268，Manassas，VA)和CHO细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)验证了Notch3-EGF/Fc和Notch 3-LD/Fc融合蛋白的表达。在转染前，将细胞在含有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和1x必需氨基酸溶液的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)生长培养基中培养，接着在6孔板中接种约3-5 x 105个细胞/孔，并培养大约24小时。使用Lipofectamine 2000转染系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)遵循制造商的方案将每种Notch 3融合蛋白表达质粒3微克转染入每个孔中的细胞中。转染后，用新鲜的生长培养基将细胞在CO2温箱中培养大约40-48小时，之后进行Notch 3融合蛋白表达分析。或者，转染后，将细胞在生长培养基中培养3-4小时，然后转换成含有2％FCS的DMEM培养基，并培养大约60-66小时，之后采取条件培养基用于分泌型蛋白质分析。
生成了Notch 3-LD/Fc(His-Fcγ/pSec载体)和Notch 3-EGF/Fc(His-Fcγ/pSec载体)的稳定细胞系。将每种质粒转染入CHO细胞中。转染后，将细胞在DMEM生长培养基中培养过夜，然后转换成含有800μg/ml潮霉素的生长培养基并培养至少两周，直至不携带Notch 3表达质粒的细胞被抗生素淘汰。用来自稳定细胞系的条件培养基进行Western印迹分析。
对稳定转染的和瞬时转染的细胞测定了Notch 3-LD/Fc或Notch3-EGF/Fc融合蛋白的表达和分泌。将自培养皿收集的转染细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一次，并在去离子水中重悬，与等体积的2x蛋白质样品加载缓冲液(BioRad，Hercules，CA)混合，然后在大约100℃加热10分钟。如下分析分泌型蛋白质：将条件培养基与等体积的2x蛋白质样品加载缓冲液混合，并在100℃加热10分钟。使用4-15％梯度SDS-PAGE将样品分开。将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜(BioRad，Hercules，CA)，其中该膜在蛋白质转移前在含有5％脱脂奶粉的PBST(含有0.05％TWEEN-的PBS)中封闭了至少1小时。
如下检测Notch 3-EGF/Fc和Notch 3-LD/Fc融合蛋白：与偶联有HRP的γFc特异性抗体(Sigma，St Louis，MO)在封闭缓冲液中于室温温育1小时。将膜在PBST中清洗3次，并用化学发光底物显色。
为了Notch 3结构域/Fc融合蛋白纯化，将如上所述CHO稳定细胞系在含有2％FCS的DMEM中培养最多至5天。收集1升条件培养基，并加载至装填有蛋白A珠子的柱子上以进行亲和结合。用PBS清洗该柱，在50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.8)中洗脱所结合的蛋白质，并通过添加1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)将pH调至中性。使用4-15％梯度SDS-PAGE进行蛋白质凝胶分析评估了蛋白质纯度。使用考马斯蓝试剂遵循制造商(Pierce，Rockford，IL)的方案测定了蛋白质浓度。通过此规程，纯化了毫克量的Notch 3-LD/Fc和Notch 3-EGF/Fc蛋白，供免疫接种和ELISA结合测定用。
实施例2：抗NOTCH 3单抗的生成
对8-12周龄雄性A/J小鼠(Harlan，Houston，TX)皮下注射25μg Notch3-EGF/Fc或Notch 3-LD/Fc(与弗氏完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)混合，溶于200μl PBS中)。在注射后2周、处死前3天，再次给小鼠腹膜内注射25μg相同抗原(溶于PBS中)。对于每种融合物，自经免疫小鼠的脾制备单细胞悬浮液，并用该悬液与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合；在含有50％聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak，Rochester，NY)和5％二甲亚砜(Sigma，St.Louis，MO)的培养基中融合5x108个Sp2/0和5x108个脾细胞。然后在补充有10％胎牛血清，100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1μM次黄嘌呤、0.4μM氨基喋呤和16μM胸苷的Iscove培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中将细胞调整至每200μl悬浮液含有1.5x105个脾细胞的浓度。将200μl细胞悬浮液添加至大约60个96孔板的每个孔中。大约10天后，取出培养物上清液，用ELISA筛选它们的抗体结合活性。
[00180]使用100μl Notch 3-EGF/Fc或Notch 3-LD/Fc(0.1μg/ml)(在含有1x酚红和3-4滴/升pHix(Pierce，Rockford，IL)的PBS中)包被96孔平底Immulon II微量测试板(Dynatech，Laboratories，Chantilly，VA)，并于室温温育过夜。轻击板以除去包被溶液，然后向每个孔添加200μl封闭缓冲液(含有2％BSA、0.1％硫柳汞的PBST)，经1小时以封闭非特异性结合。然后用PBST清洗各孔。自每个融合孔收集50μl培养上清液，并与50μl封闭缓冲液混合，然后添加至微量滴定板的各个孔中。温育1小时后，用PBST清洗各孔。然后通过与偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的Fc特异性山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)的反应来检测所结合的小鼠抗体。向各孔添加HRP底物溶液(含有0.1％3，3，5，5-四甲基联苯胺和0.0003％过氧化氢)，并显色30分钟。通过每孔添加50ml 2M H2SO4来终止反应。用ELISA读板仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取450nm的OD。
在185个分离和分析的杂交瘤中，一个来自用Notch 3-LD/Fc免疫的小鼠的杂交瘤克隆产生了Notch 3激动性抗体256A-13，对此抗体进行了进一步定性。使用来自该生成单抗256A-13的杂交瘤克隆的上清液实施了ELISA。结果显示出对纯化的Notch3 LD/FC融合蛋白(该单抗就是用此融合蛋白生成的)的强结合活性，且不结合人Notch1-LD/Fc(LIN/二聚化结构域在羧基末端与Fc区融合而成)或对照人Fc蛋白(数据未显示)(表1)。
表1：256A-13的ELISA OD读数(使用杂交瘤上清液)
Figure A20078004714100471
对从该第一ELISA筛选获得的阳性杂交瘤克隆通过挑取单克隆进行进一步分离，并如上所述进行第二ELISA测定以检验对所选择的免疫原的特异性结合。在更大规模的培养物中扩增经过检验的杂交瘤克隆。使用蛋白A亲和柱从这些大规模培养物的培养基中纯化单克隆抗体(单抗)。然后使用基于细胞的结合测定法、显微镜检术、Western印迹、和FACS分析来表征抗Notch3激动剂单抗。
实施例3：抗NOTCH 3单抗的基于细胞的结合测定
用于表征抗Notch 3单抗的基于细胞的结合测定要求将全长人Notch 3可读框克隆入载体中，在这里所述载体是pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用人肝肿瘤RNA(Ambion，Inc.，Austin，TX)作为模板通过RT-PCR合成Notch 3编码区。最终的质粒构建物Notch 3/Hygro表达全长Notch 3蛋白，如图1所示。使用Lipofectamine 2000试剂盒，遵循与实施例1所述相同的规程，将Notch 3/Hygro质粒构建物转染到293T细胞(ATCC No.CRL-11268)中而生成了表达Notch 3的稳定细胞系。转染后，将细胞在DMEM生长培养基中培养过夜，然后再接种到含有200μg/ml潮霉素的生长培养基中并培养12-14天。挑取完全分离的单集落，并在分开的孔中培养，直至扩增得到足够的克隆细胞。通过Western印迹分析和使用多克隆抗Notch 3抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)的荧光电子显微镜检术鉴定了对潮霉素选择有抗性且表达高水平Notch 3蛋白的稳定293T克隆。
还通过PCR构建了只包含Notch LIN12/二聚化(LD)结构域和跨膜(TM)结构域的部分(partial)Notch 3表达质粒，并亚克隆入pcDNA3.1中。
[00186]还通过Western印迹验证了天然表达Notch3的人Sup-T1细胞系(ATCC No.CRL-1942)。在含有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺和1X必需氨基酸溶液的培养基中培养Sup-T1细胞。
使用FMATTM(荧光宏观共聚焦高通量筛选)8100 HTS系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)遵循制造商提供的方案评估基于细胞的抗体结合。在96孔板中接种天然表达Notch 3或经Notch 3表达构建物稳定转染的细胞系。或者，在96孔板中接种瞬时转染的293T或CHO细胞。细胞接种密度为30,000-50,000个细胞每孔。20-24小时后，向各孔添加抗Notch3单抗和1x PBS反应缓冲液，并于37℃温育1小时。除去一抗后，在各孔中添加偶联有Cy-5的抗小鼠IgG抗体。
还使用内部自制的293T/Notch 3稳定细胞系以及两种癌细胞系即人Sup-T1和A2780细胞系(UK ECACC No.Cat.No.93112519)(二者都天然表达Notch 3)通过荧光激活细胞分选仪(FACS)评估了基于细胞的抗体结合(数据未显示)。首先将细胞与1x PBS中的抗Notch 3单抗一起温育。清洗3次后，将细胞与偶联有荧光分子的二抗一起温育。将细胞重悬，在含有0.1％低聚甲醛的1x PBS中固定，并通过FACS(BD Sciences，Palo Alto，CA)分析。结果表明了256A-13可结合培养细胞中自重组质粒构建物表达的Notch 3受体或作为天然蛋白的Notch 3受体(表2)。对经瞬时转染的包含Notch 3/Hygro质粒的293T细胞也如上所述用免疫荧光染色并通过荧光显微镜检术加以观察。
表2：256A-13在基于细胞的FACS分析中的结合活性(以平均荧光强度表示)
  对照IgG1   256A-13
  Notch 3/Hyg   24.16   32.2
  Sup-T1   24.51   55.44
基于细胞的FMAT和FACS分析证实了单抗256A-13确实结合培养细胞中自重组质粒构建物表达的Notch 3受体或作为天然蛋白的Notch 3受体(表2和表3)。
表3：抗Notch 3单抗在基于细胞的FMAT中的结合活性的汇总表
  抗体   对照IgG1   256A-13
  Notch 3(全长)   无结合   弱结合
  Notch 3-LDTM   无结合   强结合
基于显著高于IgG1对照和其它阴性杂交瘤克隆的FMAT信号读出(p＞0.01)确定阳性结合信号。IgG1对照结合读出视为背景。用Notch 3/Hygro质粒瞬时转染的293T细胞也如上所述用免疫荧光染色并通过荧光显微镜检术观察。
通过Biacore系统(Biacore Inc.，Piscataway，NJ)分析了单抗256A-13的结合活性。将抗体经由胺偶联直接在芯片上固定化(固定化水平：200RU)，并以5种不同浓度(范围为37.5-120nM，结合时间为5-8分钟，解离时间为1-2小时)注射Notch 3-LD/Fc蛋白(抗原)。运行缓冲液和样品缓冲液为含有5mMCa2+的PBS。芯片表面用10mM甘氨酸pH2再生。抗体以一式二份进行定性。表4公开了计算得到的统计学均值、标准误差和动力学解离常数(KD)。抗体具有KD为280pM的高亲和力和较慢的关闭速率(off-rate)。标准误差和卡方都很低，拟合也很好(动力学曲线未显示)。
表4：通过Biacore进行的单抗256A-13结合亲和力的表征
样品 KD[pM] ka[M-1s-1] SE(ka) kd[s-1] SE(kd) ·χ2
  256A-13   280   4.20e4   0.98   1.18e-5   1.02e-7   0.392
KD：256A-13和Notch 3-LD/Fc解离常数。
Ka：256A-13与Notch 3-LD/Fc结合的速率(或称“开启速率”(On-rate))。
Kd：256A-13与Notch 3-LD/Fc解离的速率(或称“关闭速率”(Off-rate))。
SE：标准误差。
实施例4：256A-13结合活性的WESTERN印迹分析
实施了Western印迹来评估在变性条件下256A-13对Notch 3受体的结合活性，以及Notch 3和其它Notch相关蛋白在人细胞系中的表达水平。将纯化的Notch 3-LD/Fc融合蛋白与蛋白质加载缓冲液混合。还从实施例1所述瞬时或稳定转染的细胞制备蛋白质样品，即自培养皿收获细胞，用PBS清洗一次，在总细胞蛋白提取缓冲液(Pierce，Rockford，IL)中重悬，并在添加等体积的2x蛋白质样品加载缓冲液后于100℃温育10分钟。通过在4-15％梯度SDS-PAGE中电泳将所有样品分开。将蛋白质自凝胶转移至PVDF膜，并将256A-13作为第一检测抗体施加于Western印迹膜。如上所述使用偶联有HRP的第二抗体来进行检测，并使用化学发光底物生成信号。针对人Fc、V5标签、Notch 3和Notch1的阳性对照抗体购自Invitrogen、R&D Systems、Santa CruzBiotechnologies、和Orbigen。
Western印迹分析显示，单抗256A-13不但如ELISA和FACS分析中观察到的那样在天然分子构象下结合Notch 3-LD/Fc，还在变性条件下结合Notch3-LD/Fc。
实施例5：通过萤光素酶报道物测定法评估256A-13的功能性
A.质粒构建物
通过测序验证了上文实施例3所述全长Notch 3表达构建物，其与图1所示的公布序列相同。如实施例4所述通过瞬时转染和Western印迹检验了Notch 3表达。
为了生成用于进行Notch信号传导的萤光素酶报道物质粒，合成了两种包含CBF1结合基序串联重复的互补寡核苷酸引物，其具有如下序列：
5’GCTCGAGCTCGTGGGAAAATACCGTGGGAAAATGAACCGTGGGAAA ATCTCGTGG(SEQ ID NO：12)
5’GCTCGAGATTTTCCCACGAGATTTTCCCACGGTTC(SEQ ID NO：13)
将这两种寡聚物引物在100mM NaCl中于65℃退火，每种寡聚物的浓度各为4mM。彼此退火后，通过PCR延伸引物。将PCR产物克隆入商品化载体中。通过测序检验插入序列，其包含CBF1结合基序的四个串联重复和两个侧翼Xho I位点。使用Xho I切出插入序列，并连接在萤火虫萤光素酶报道物编码序列的下游。在萤光素酶报道物测定法和测序分析后，选择具有CBF1结合基序的八个重复的质粒克隆，命名为CBF1-Luc。
B.稳定细胞系的生成
使用人胚肾细胞系(HEK293)生成了两种稳定细胞系，供功能测定使用。一种细胞系包含已整合到核基因组中的CBF1-Luc报道物质粒和Notch 3表达质粒。此细胞系是使用LipoFectamine 2000依照制造商的方案将Notch 3/潮霉素和CBF1-Luc质粒共转染入293T细胞中而生成的。在DMEM生长培养基中针对200μg/ml潮霉素选择稳定转染的细胞克隆，并通过萤光素酶报道测定和Western印迹进行筛选。选择一个具有相对高水平Notch3受体表达(根据Western印迹)和萤光素酶活性的细胞系供功能测定使用，并命名为NC85。
C.仅使用过表达Notch 3的细胞进行的萤光素酶报道物测定
将NC85细胞在单抗256-A13存在下培养24-48小时。然后吸去培养基，在1x Passive溶胞缓冲液(E1501，Promega，Madison，WI)中裂解细胞，并使用萤光素酶测定系统遵循制造商的方案(E1501，Promega，Madison，WI)在TD-20/20照度计(Turner Designs Instrument，Sunnyvale，CA)中测定萤光素酶活性。如图5所示，对于在单抗256-A13存在下培养的NC85细胞，萤光素酶活性与对照抗体G3相比升高了几乎4倍。萤光素酶报道物测定证明了单抗256-A13在没有配体结合的情况下诱导了萤光素酶活性的显著升高，而拮抗性抗Notch 3抗体单抗256A-4和256A-8不然(图5)。
实施例8：256A-13的结合表位的定位
A.使用Notch3单一结构域和Fc融合蛋白构建物进行的表位定位策略和原理
Notch3 LIN12/异二聚化结构域(也称为Notch3 LIN12-二聚化结构域(Notch3-LD))由三个LIN12结构域组成，即第一LIN12(L1)、第二LIN12(L2)和第三LIN12(L3)(见图10)。生成了五种Notch3单一结构域/Fc融合蛋白表达构建物(图7)，并实施了Western印迹来评估哪个结构域足以进行单抗256A-13结合。瞬时转染后，通过SDS-PAGE分析了含有被分泌的Notch3单一结构域/Fc融合蛋白的的上清液。结果显示了单抗256A-13只结合Notch3-L1，而不结合任何其它结构域。ELISA实验也显示了单抗256A-13对Notch3-L1具有很强的结合，对Notch3-L3的结合弱，而不结合其它结构域(表5)。
表5：使用针对Notch3-结构域/Fc融合蛋白构建物的单抗256A-13的Western印迹结果和ELISA读数的总结
A.通过亚结构域交换进行的结合表位鉴定
首先，激动性Notch3单抗256A-13可结合Notch3 LIN12/二聚化结构域(LD)，但不结合与之同源的人Notch1 LIN12/二聚化结构域(表5)。其次，抗Notch3单抗在Western印迹中可结合变性的Notch3蛋白，如实施例4和8所讨论的，说明256A-13可结合单一表位或彼此独立的离散表位。第三，Notch3和Notch 1在LIN12/二聚化结构域中共享大约55％的氨基酸序列同源性，因此得出结论此区域中Notch3和Notch 1之间的亚结构域交换不会破坏蛋白质构象。使用标准PCR方法PCR扩增了Notch1-LD cDNA。cDNA模板第一条链是自PA-1细胞总RNA(ATCC No.CRL-1572)合成的。PCR扩增了人IgGκ链前导肽编码序列，用其作为前导肽通过PCR-SOE连接至Notch1-LD的5’端并亚克隆入His-γ1Fc/pSec中。
表6：单抗256A-13和对照IgG1结合Notch3-LD/Fc或Notch1-LD/Fc的ELISAOD读数
Figure A20078004714100521
B.亚结构域交换融合蛋白构建物的生成
基于上文A部分呈示的ELISA分析结果，将第一LIN12结构域或L1的靶结构域进一步分成3个亚结构域，并个别地与Notch1-L1的相应亚结构域交换。使用PCR-SOE(Ho等，Gene 77：51(1989)；Horton等，BioTechniques 8：528(1990))生成了亚结构域交换构建物，如图9和10所示。PCR和PCR-SOE反应是使用PCR实施的，其中向反应中添加了1M甜菜碱和5％DMSO。将最终的PCR-SOE产物亚克隆，并通过测序检验。用Nhe I和Xho I切割具有正确插入序列的质粒克隆以切出插入序列，将其凝胶纯化和亚克隆。图7显示了五种Notch3/Notch1亚结构域交换构建物。为了便于表位定位，使用人IgG κ链信号肽作为结构域交换构建物中的前导肽。图10显示了亚结构域构建物的氨基酸序列。
C.Notch3/Notch1亚结构域交换融合蛋白的表达
使用LipoFectamine 2000将Notch3/Notch1-LD结构域交换质粒瞬时转染入CHO细胞中。在6孔板中在含有10％FCS的DMEM生长培养基中以0.8-1x106个细胞每孔接种CHO细胞，在CO2温箱中维持过夜后转染。在生长培养基中转染约3小时后回收细胞，然后转换成含有2％FCS的DMEM，并培养3天。收获条件培养基，并以3500rpm离心10分钟。收集自CHO分泌的含有Notch3-LD结构域交换蛋白的上清液，并为Western印迹和ELISA结合分析做好准备。ELISA显示了所有结构域交换融合蛋白均在条件培养基中被表达并分泌(表4)，这得到了Western印迹分析的进一步证实(数据未显示)。
ELISA读数使用抗人Fc抗体作为检测抗体，显示了所有蛋白质均在条件化培养基中得到了表达。人IgG/Fc用作对照。各个孔中包被的人IgG/Fc的起始点是100ng。
D.使用ELISA进行的表位结合分析
用抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch)包被96孔平底Immulon II微量测试板(Dynatech，Laboratories，Chantilly，VA)，方法是添加100μl抗体(0.1μg/ml)(在含有1x酚红和3-4滴/升pHix(Pierce，Rockford，IL)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)，并于室温温育过夜。通过轻击板以除去包被溶液后，向每个孔添加200μl封闭缓冲液(在含有2％BSA和0.1％硫柳汞的PBST中)，温育1小时以封闭非特异性结合。然后用PBST清洗各孔。自每个Notch3/Notch1结构域交换构建物转染收集50μl上述条件培养基，与50μl封闭缓冲液混合，并添加至微量滴定板的各个孔中。温育1小时后，Notch3/Notch1-LD结构域交换蛋白被所包被的抗Fc抗体捕获，并用PBST清洗各孔。将抗Notch3单抗和同种型匹配的对照单抗在上述封闭缓冲液中连续稀释，并向每个孔中添加50μl稀释的单抗来评估对所结合的Notch3/Notch1结构域交换蛋白的结合。使用偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的Fc特异性山羊抗小鼠IgG来进行检测。向各孔添加HRP底物溶液(含有0.1％3，3，5，5-四甲基联苯胺和0.0003％过氧化氢)，显色30分钟。通过每孔添加50ml 2M H2SO4来终止反应。用ELISA读板仪读取450nm的OD。通过上述ELISA分析类似地检验了亚结构域交换构建物和突变簇(clusters of mutations)。
使用针对亚结构域交换蛋白的单抗256A-13进行的ELISA结合实验显示，Notch3-L1结构域中第一亚结构域(L1)的交换不影响结合，表明256A-13不结合此区。另一方面，Notch3-L1中第二和第三亚结构域的交换显著降低了结合。因此可见，这两个亚结构域包含单抗256A-13的结合表位(图10)。相反，同种型匹配的阴性对照抗体G3在ELISA测定中不结合任何结构域交换融合蛋白(图10)。自上述实验得出结论，即第一LIN12结构域是单抗256A-13结合所要求的，具体是在第二和第三亚结构域区内。
为了进一步对单抗256A-13所结合的具体表位定位，将Notch3-L1结构域的第二和第三亚结构域进一步分成五个氨基酸簇，并与Notch1中的相应氨基酸残基交换(图10)。ELISA结合测定法显示了DRE(Notch3序列)变成SQL(Notch1序列)的交换完全消除了ELISA结合活性，表明只有此表位是Notch3-L1结构域内单抗256A-13结合所要求的。
使用双丙氨酸肽扫描进行了单抗256A-13结合所要求的氨基酸残基的精确分析。这些丙氨酸肽覆盖了通过氨基酸交换分析定位得出的DRE表位。将这些肽合成为交联到尼龙支持膜上的点。通过点印迹评估了抗体印迹结合。单抗G3用作对照IgG1。图11显示了这些肽序列。
实施例9：抗NOTCH3单抗的测序
因为抗体结合特性完全依赖于重链和轻链二者的可变区，所以确定了256A-13的可变序列的亚型并加以测序。抗体IgG亚型是使用Isostrip小鼠单克隆抗体试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)确定的。结果显示了256A-13具有IgG1重链和κ轻链。
通过RT-PCR和cDNA克隆将重链和轻链的可变区序列解码(decode)。使用RNeasy微型试剂盒遵循制造商的方案(Qiagen Sciences，Valencia，CA)自杂交瘤克隆256A-13分离总RNA。使用RNA模板和Superscriptase III试剂盒合成cDNA第一链。使用覆盖小鼠κ链编码区的5’端的简并正向引物和在与可变区3’端的连接处(juncture to the 3’end of the variable region)与恒定区匹配的反向引物，或者使用覆盖小鼠重链编码区的5’端的简并正向引物和小鼠重链中的恒定区反向引物，从该cDNA第一链PCR扩增轻链和重链cDNA的可变区。将PCR产物克隆入商品化载体中，并由Lone Star Lab(Houston，TX)测序。利用计算机软件程序DNAStar(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)分析核苷酸序列。根据源自同一杂交瘤克隆的多个PCR克隆的序列确定了每种抗Notch3单抗序列。
单抗256A-13的可变重链区包含121个氨基酸残基，而轻链可变区包含102个氨基酸残基(图4A和4B)。
实施例10：NOTCH3激动性抗体对NOTCH3的金属蛋白酶切割的影响
Notch受体活化参与配体诱导的、近膜位点(S2)处的金属蛋白酶切割，生成胞外亚基。此切割是进行S3切割以释放活化的Notch胞内区的必要先决条件。为了测试激动性抗体是否能诱导不依赖配体的顺序Notch活化事件，包括两次蛋白水解切割，用G3或256-A13处理稳定表达重组Notch3受体的293T细胞(NC85细胞)。使用结合至固相表面的识别Notch3切割产物的抗体进行ELISA测定来检测培养基中由于蛋白水解切割而生成的可溶性胞外亚基。如图6所示，Notch3激动性单抗显著提高了条件培养基中可溶性Notch3胞外亚基的生成，而对照抗体G3不然。
实施例12：NOTCH3相关疾病的测定法
为了鉴定其它Notch3相关疾病，可以对来自患者样品的Notch3基因测序，或者使用患者组织实施免疫组织化学来检查Notch3受体表达的不足。另外，可以分离和培养来自怀疑具有Notch3相关疾病的患者的细胞，并研究本发明的激动性抗体对Notch3信号传导的影响。
本领域技术人员会认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述本发明具体实施方案的许多等效实施方案。所附权利要求意图涵盖这样的等效实施方案。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(Genentech，Inc.)
<120>抗NOTCH 3激动性抗体及其在治疗NOTCH 3相关疾病中的用途
<130>P4024R1WO
<150>US 60/852,861
<151>2006-10-19
<150>US 60/879,218
<151>2007-01-06
<160>37
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>2321
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>1
Met Gly Pro Gly Ala Arg Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Met Ser
1               5                   10                  15
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Leu
            20                  25                  30
Leu Ala Gly Pro Gly Ala Ala Ala Pro Pro Cys Leu Asp Gly Ser Pro
        35                  40                  45
Cys Ala Asn Gly Gly Arg Cys Thr Gln Leu Pro Ser Arg Glu Ala Ala
    50                  55                  60
Cys Leu Cys Pro Pro Gly Trp Val Gly Glu Arg Cys Gln Leu Glu Asp
65                  70                  75                  80
Pro Cys His Ser Gly Pro Cys Ala Gly Arg Gly Val Cys Gln Ser Ser
                85                  90                  95
Val Val Ala Gly Thr Ala Arg Phe Ser Cys Arg Cys Pro Arg Gly Phe
            100                 105                 110
Arg Gly Pro Asp Cys Ser Leu Pro Asp Pro Cys Leu Ser Ser Pro Cys
        115                 120                 125
Ala His Gly Ala Arg Cys Ser Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Cys
    130                 135                 140
Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Gln Gly Arg Ser Cys Arg Ser Asp Val Asp
145                 150                 155                 160
Glu Cys Arg Val Gly Glu Pro Cys Arg His Gly Gly Thr Cys Leu Asn
                165                 170                 175
Thr Pro Gly Ser Phe Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Gly Pro
            180                 185                 190
Leu Cys Glu Asn Pro Ala Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Arg Asn
        195                 200                 205
Gly Gly Thr Cys Arg Gln Ser Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Cys Ala Cys
    210                 215                 220
Leu Pro Gly Phe Glu Gly Gln Asn Cys Glu Val Asn Val Asp Asp Cys
225                 230                 235                 240
Pro Gly His Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Val Asn
                245                 250                 255
Thr Tyr Asn Cys Gln Cys Pro Pro Glu Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr
            260                 265                 270
Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Gln Pro Asn Ala Cys His Asn Gly
        275                 280                 285
Gly Thr Cys Phe Asn Thr Leu Gly Gly His Ser Cys Val Cys Val Asn
    290                 295                 300
Gly Trp Thr Gly Glu Ser Cys Ser Gln Asn Ile Asp Asp Cys Ala Thr
305                 310                 315                 320
Ala Val Cys Phe His Gly Ala Thr Cys His Asp Arg Val Ala Ser Phe
                325                 330                 335
Tyr Cys Ala Cys Pro Met Gly Lys Thr Gly Leu Leu Cys His Leu Asp
            340                 345                 350
Asp Ala Cys Val Ser Asn Pro Cys His Glu Asp Ala Ile Cys Asp Thr
        355                 360                 365
Asn Pro Val Asn Gly Arg Ala Ile Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Thr
    370                 375                 380
Gly Gly Ala Cys Asp Gln Asp Val Asp Glu Cys Ser Ile Gly Ala Asn
385                 390                 395                 400
Pro Cys Glu His Leu Gly Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Ser Phe Leu
                405                 410                 415
Cys Gln Cys Gly Arg Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Thr Asp Val
            420                 425                 430
Asn Glu Cys Leu Ser Gly Pro Cys Arg Asn Gln Ala Thr Cys Leu Asp
        435                 440                 445
Arg Ile Gly Gln Phe Thr Cys Ile Cys Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr
    450                 455                 460
Tyr Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys Gln Ser Ser Pro Cys Val Asn
465                 470                 475                 480
Gly Gly Val Cys Lys Asp Arg Val Asn Gly Phe Ser Cys Thr Cys Pro
                485                 490                 495
Ser Gly Phe Ser Gly Ser Thr Cys Gln Leu Asp Val Asp Glu Cys Ala
            500                 505                 510
Ser Thr Pro Cys Arg Asn Gly Ala Lys Cys Val Asp Gln Pro Asp Gly
        515                 520                 525
Tyr Glu Cys Arg Cys Ala Glu Gly Phe Glu Gly Thr Leu Cys Asp Arg
    530                 535                 540
Asn Val Asp Asp Cys Ser Pro Asp Pro Cys His His Gly Arg Cys Val
545                 550                 555                 560
Asp Gly Ile Ala Ser Phe Ser Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Thr Gly
               565                 570                 575
Thr Arg Cys Glu Ser Gln Val Asp Glu Cys Arg Ser Gln Pro Cys Arg
        580                 585                 590
His Gly Gly Lys Cys Leu Asp Leu Val Asp Lys Tyr Leu Cys Arg Cys
    595                 600                 605
Pro Ser Gly Thr Thr Gly Val Asn Cys Glu Val Asn Ile Asp Asp Cys
610                 615                 620
Ala Ser Asn Pro Cys Thr Phe Gly Val Cys Arg Asp Gly Ile Asn Arg
625                 630                 635                 640
Tyr Asp Cys Val Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Pro Leu Cys Asn Val
                645                 650                 655
Glu Ile Asn Glu Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gly Glu Gly Gly Ser Cys
            660                 665                 670
Val Asp Gly Glu Asn Gly Phe Arg Cys Leu Cys Pro Pro Gly Ser Leu
        675                 680                 685
Pro Pro Leu Cys Leu Pro Pro Ser His Pro Cys Ala His Glu Pro Cys
    690                 695                 700
Ser His Gly Ile Cys Tyr Asp Ala Pro Gly Gly Phe Arg Cys Val Cys
705                 710                 715                 720
Glu Pro Gly Trp Ser Gly Pro Arg Cys Ser Gln Ser Leu Ala Arg Asp
                725                 730                 735
Ala Cys Glu Ser Gln Pro Cys Arg Ala Gly Gly Thr Cys Ser Ser Asp
            740                 745                 750
Gly Met Gly Phe His Cys Thr Cys Pro Pro Gly Val Gln Gly Arg Gln
        755                 760                 765
Cys Glu Leu Leu Ser Pro Cys Thr Pro Asn Pro Cys Glu His Gly Gly
     770                 775                 780
Arg Cys Glu Ser Ala Pro Gly Gln Leu Pro Val Cys Ser Cys Pro Gln
785                 790                 795                 800
Gly Trp Gln Gly Pro Arg Cys Gln Gln Asp Val Asp Glu Cys Ala Gly
                805                 810                 815
Pro Ala Pro Cys Gly Pro His Gly Ile Cys Thr Asn Leu Ala Gly Ser
            820                 825                 830
Phe Ser Cys Thr Cys His Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ser Cys Asp Gln
        835                 840                 845
Asp Ile Asn Asp Cys Asp Pro Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys
    850                 855                 860
Gln Asp Gly Val Gly Ser Phe Ser Cys Ser Cys Leu Pro Gly Phe Ala
865                 870                 875                 880
Gly Pro Arg Cys Ala Arg Asp Val Asp Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys
                885                 890                 895
Gly Pro Gly Thr Cys Thr Asp His Val Ala Ser Phe Thr Cys Thr Cys
            900                 905                 910
Pro Pro Gly Tyr Gly Gly Phe His Cys Glu Gln Asp Leu Pro Asp Cys
        915                 920                 925
Ser Pro Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Val Asn
    930                 935                 940
Ser Phe Ser Cys Leu Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Ala His Cys Gln
945                 950                 955                 960
His Glu Ala Asp Pro Cys Leu Ser Arg Pro Cys Leu His Gly Gly Val
                965                 970                 975
Cys Ser Ala Ala His Pro Gly Phe Arg Cys Thr Cys Leu Glu Ser Phe
            980                 985                 990
Thr Gly Pro Gln Cys Gln Thr Leu Val Asp Trp Cys Ser Arg Gln Pro
        995                 1000                1005
Cys Gln Asn Gly Gly Arg Cys Val Gln Thr Gly Ala Tyr Cys Leu
    1010                1015                1020
Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Arg Leu Cys Asp Ile Arg Ser Leu
    1025                1030                1035
Pro Cys Arg Glu Ala Ala Ala Gln Ile Gly Val Arg Leu Glu Gln
    1040                1045                1050
Leu Cys Gln Ala Gly Gly Gln Cys Val Asp Glu Asp Ser Ser His
        1055                1060                1065
Tyr Cys Val Cys Pro Glu Gly Arg Thr Gly Ser His Cys Glu Gln
        1070                1075                1080
Glu Val Asp Pro Cys Leu Ala Gln Pro Cys Gln His Gly Gly Thr
        1085                1090                1095
Cys Arg Gly Tyr Met Gly Gly Tyr Met Cys Glu Cys Leu Pro Gly
        1100                1105                1110
Tyr Asn Gly Asp Asn Cys Glu Asp Asp Val Asp Glu Cys Ala Ser
        1115                1120                1125
Gln Pro Cys Gln His Gly Gly Ser Cys Ile Asp Leu Val Ala Arg
        1130                1135                1140
Tyr Leu Cys Ser Cys Pro Pro Gly Thr Leu Gly Val Leu Cys Glu
        1145                1150                1155
Ile Asn Glu Asp Asp Cys Gly Pro Gly Pro Pro Leu Asp Ser Gly
        1160                1165                1170
Pro Arg Cys Leu His Asn Gly Thr Cys Val Asp Leu Val Gly Gly
        1175                1180                1185
Phe Arg Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Leu Arg Cys Glu
        1190                1195                1200
Ala Asp Ile Asn Glu Cys Arg Ser Gly Ala Cys His Ala Ala His
        1205                1210                1215
Thr Arg Asp Cys Leu Gln Asp Pro Gly Gly Gly Phe Arg Cys Leu
        1220                1225                1230
Cys His Ala Gly Phe Ser Gly Pro Arg Cys Gln Thr Val Leu Ser
        1235                1240                1245
Pro Cys Glu Ser Gln Pro Cys Gln His Gly Gly Gln Cys Arg Pro
        1250                1255                1260
Ser Pro Gly Pro Gly Gly Gly Leu Thr Phe Thr Cys His Cys Ala
        1265                1270                1275
Gln Pro Phe Trp Gly Pro Arg Cys Glu Arg Val Ala Arg Ser Cys
        1280                1285                1290
Arg Glu Leu Gln Cys Pro Val Gly Val Pro Cys Gln Gln Thr Pro
        1295                1300                1305
Arg Gly Pro Arg Cys Ala Cys Pro Pro Gly Leu Ser Gly Pro Ser
        1310        1315                1320
Cys Arg Ser Phe Pro Gly Ser Pro Pro Gly Ala Ser Asn Ala Ser
    1325                1330                1335
Cys Ala Ala Ala Pro Cys Leu His Gly Gly Ser Cys Arg Pro Ala
    1340                1345                1350
Pro Leu Ala Pro Phe Phe Arg Cys Ala Cys Ala Gln Gly Trp Thr
    1355                1360                1365
Gly Pro Arg Cys Glu Ala Pro Ala Ala Ala Pro Glu Val Ser Glu
    1370                1375                1380
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp
    1385                1390                1395
Gln Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp
    1400                1405                1410
Gly Gly Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly Asp Pro Trp Arg Gln Cys
    1415                1420                1425
Glu Ala Leu Gln Cys Trp Arg Leu Phe Asn Asn Ser Arg Cys Asp
    1430                1435                1440
Pro Ala Cys Ser Ser Pro Ala Cys Leu Tyr Asp Asn Phe Asp Cys
    1445                1450                1455
His Ala Gly Gly Arg Glu Arg Thr Cys Asn Pro Val Tyr Glu Lys
    1460                1465                1470
Tyr Cys Ala Asp His Phe Ala Asp Gly Arg Cys Asp Gln Gly Cys
    1475                1480                1485
Asn Thr Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Ser Glu
    1490                1495                1500
Val Pro Ala Leu Leu Ala Arg Gly Val Leu Val Leu Thr Val Leu
    1505                1510                1515
Leu Pro Pro Glu Glu Leu Leu Arg Ser Ser Ala Asp Phe Leu Gln
    1520                1525                1530
Arg Leu Ser Ala Ile Leu Arg Thr Ser Leu Arg Phe Arg Leu Asp
    1535                1540                1545
Ala His Gly Gln Ala Met Val Phe Pro Tyr His Ar  Pro Ser Pro
    1550                1555                1560
Gly Ser Glu Pro Arg Ala Arg Arg Glu Leu Ala Pro Glu Val Ile
    1565                1570                1575
Gly Ser Val Val Met Leu Glu Ile Asp Asn Arg Leu Cys Leu Gln
    1580            1585                    1590
Ser Pro Glu Asn Asp His Cys Phe Pro Asp Ala Gln Ser Ala Ala
    1595                1600                1605
Asp Tyr Leu Gly Ala Leu Ser Ala Val Glu Arg Leu Asp Phe Pro
    1610                1615                1620
Tyr Pro Leu Arg Asp Val Arg Gly Glu Pro Leu Glu Pro Pro Glu
    1625                1630                1635
Pro Ser Val Pro Leu Leu Pro Leu Leu Val Ala Gly Ala Val Leu
    1640                1645                1650
Leu Leu Val Ile Leu Val Leu Gly Val Met Val Ala Arg Arg Lys
    1655                1660                1665
Arg Glu His Ser Thr Leu Trp Phe Pro Glu Gly Phe Ser Leu His
    1670                1675                1680
Lys Asp Val Ala Ser Gly His Lys Gly Arg Arg Glu Pro Val Gly
    1685                1690                1695
Gln Asp Ala Leu Gly Met Lys Asn Met Ala Lys Gly Glu Ser Leu
    1700                1705                1710
Met Gly Glu Val Ala Thr Asp Trp Met Asp Thr Glu Cys Pro Glu
    1715                1720                1725
Ala Lys Arg Leu Lys Val Glu Glu Pro Gly Met Gly Ala Glu Glu
    1730                1735                1740
Ala Val Asp Cys Arg Gln Trp Thr Gln His His Leu Val Ala Ala
    1745                1750                1755
Asp Ile Arg Val Ala Pro Ala Met Ala Leu Thr Pro Pro Gln Gly
    1760                1765                1770
Asp Ala Asp Ala Asp Gly Met Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp
    1775                1780                1785
Gly Phe Thr Pro Leu Met Leu Ala Ser Phe Cys Gly Gly Ala Leu
    1790                1795                1800
Glu Pro Met Pro Thr Glu Glu Asp Glu Ala Asp Asp Thr Ser Ala
    1805                1810                1815
Ser Ile Ile Ser Asp Leu Ile Cys Gln Gly Ala Gln Leu Gly Ala
    1820                1825                1830
Arg Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg
    1835                1840                1845
Tyr Ala Arg Ala Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala
    1850                1855                1860
Asp Thr Asn Ala Gln Asp His Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Thr
    1865                1870                1875
Ala Val Thr Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg
    1880                1885                1890
Asn Arg Ser Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met Ala Asp Gly Ser Thr
    1895                1900                1905
Ala Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Val Glu
    1910                1915                1920
Glu Leu Ile Ala Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Glu Leu
    1925                1930                1935
Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Glu
    1940                1945                1950
Ala Thr Leu Ala Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln
    1955                1960                1965
Asp Ser Lys Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly
    1970                1975                1980
Ser Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg
    1985                1990                1995
Glu Ile Thr Asp His Leu Asp Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Gln
    2000                2005                2010
Glu Arg Leu His Gln Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp Gln Pro Ser
    2015                2020                2025
Gly Pro Arg Ser Pro Pro Gly Pro His Gly Leu Gly Pro Leu Leu
    2030                2035                2040
Cys Pro Pro Gly Ala Phe Leu Pro Gly Leu Lys Ala Ala Gln Ser
    2045                2050                2055
Gly Ser Lys Lys Ser Arg Arg Pro Pro Gly Lys Ala Gly Leu Gly
    2060                2065                2070
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Arg Gly Lys Lys Leu Thr Leu Ala Cys
    2075                2080                2085
Pro Gly Pro Leu Ala Asp Ser Ser Val Thr Leu Ser Pro Val Asp
    2090                2095                2100
Ser Leu Asp Ser Pro Arg Pro Phe Gly Gly Pro Pro Ala Ser Pro
    2105                2110                2115
Gly Gly Phe Pro Leu Glu Gly Pro Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr
    2120                2125                2130
Ala Val Ser Leu Ala Gln Leu Gly Gly Pro Gly Arg Ala Gly Leu
    2135                2140                2145
Gly Arg xln Pro Pro Gly Gly Cys Val Leu Ser Leu Gly Leu Leu
    2150                2155                2160
Asn Pro Val Ala Val Pro Leu Asp Trp Ala Arg Leu Pro Pro Pro
    2165                2170                2175
Ala Pro Pro Gly Pro Ser Phe Leu Leu Pro Leu Ala Pro Gly Pro
    2180                2185                2190
Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Pro Val Ser Pro Gln Glu Arg Pro
    2195                2200                2205
Pro Pro Tyr Leu Ala Val Pro Gly His Gly Glu Glu Tyr Pro Val
    2210                2215                2220
Ala Gly Ala His Ser Ser Pro Pro Lys Ala Arg Phe Leu Arg Val
    2225                2230                2235
Pro Ser Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro Glu
    2240                2245                2250
His Trp Ala Ser Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ser Asp Trp Ser Glu
    2255                2260                2265
Ser Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Met Ala Thr Thr
    2270                2275                2280
Thr Gly Ala Leu Pro Ala Gln Pro Leu Pro Leu Ser Val Pro Ser
    2285                2290                2295
Ser Leu Ala Gln Ala Gln Thr Gln Leu Gly Pro Gln Pro Glu Val
    2300                2305                2310
Thr Pro Lys Arg Gln Val Leu Ala
    2315                2320
<210>2
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>MAB 256A-13的重链可变区
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Leu Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala
        115                 120
<210>3
<211>102
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>MAB 256A-13的轻链可变区
<400>3
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Ser Asn
1               5                   10                  15
Tyr Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
            20                  25                  30
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala Arg
        35                  40                  45
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro
    50                  55                  60
Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys Gln His Ser Trp Glu
65                  70                  75                  80
Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Ala
                85                  90                  95
Asp Ala Ala Pro Thr Val
            100
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Mab 256A-13的CDR-H1
<400>4
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr His Trp Met Asn Trp
1              5                  10
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Mab 256A-13的CDR-H2
<400>5
Ile Asn Pro Ser Asn Asp Phe Thr Asp Cys Asn
1               5                   10
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Mab 256A-13的CDR-H3
<400>6
Thr Ala Arg Ala Trp Phe Ala Tyr
1               5
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>MAB 256A-13的CDR-L1
<400>7
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ser Tyr Met His
1               5                   10                  15
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>MAB 256A-13的CDR-L2
<400>8
Tyr Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly
1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Mab 256A-13的CDR-L3
<400>9
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr
1               5
<210>10
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Notch 3 LIN 12结构域
<400>10
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
        35
<210>11
<211>29
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Notch 3 LIN 12亚结构域
<400>11
Ala Lys Arg Gly Asp Gln Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
            20                  25
<210>12
<211>55
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>12
Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr
        35                  40                  45
Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly
    50                  55
<210>13
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>13
gctcgagatt ttcccacgag attttcccac ggttc    35
<210>14
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>14
Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln
1                5                  10                  15
Arg Cys Asp Arg Glu CysAsn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
        35
<210>15
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>15
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Glu Asp Ala Gly Asn Lys
1               5                   10                  15
Val Cys Ser Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
        35
<210>16
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>16
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Arg Cys Asp Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn
        35
<210>17
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>17
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Glu Asp Ala Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
        35
<210>18
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>18
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asn Lys
1               5                   10                  15
Val Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
        35
<210>19
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>19
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Arg Cys Ser Leu Gln Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
        35
<210>20
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>20
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Asn His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly
        35
<210>21
<211>39
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>NOTCH 3/NOTCH 1之LIN 12结构域交换(图10)
<400>21
Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln
1               5                    10                  15
Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn
        35
<210>22
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>22
Ala Ala Cys Gln Ala Ala Ala Gly Asp Gln Arg Cys
1               5                   10
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>23
Ala Cys Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gln Arg Cys Asp
1               5                   10
<210>24
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>24
Cys Gln Ala Lys Arg Ala Ala Gln Arg Cys Asp Arg
1               5                   10
<210>25
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>25
Gln Ala Lys Arg Gly Ala Ala Arg Cys Asp Arg Glu
1               5                   10
<210>26
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>26
Ala Lys Arg Gly Asp Ala Ala Cys Asp Arg Glu Cys
1               5                   10
<210>27
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>27
Lys Arg Gly Asp Gln Ala Ala Asp Arg Glu Cys Asn
1               5                   10
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>28
Arg Gly Asp Gln Arg Ala Ala Arg Glu Cys Asn Ser
1               5                   10
<210>29
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>29
Gly Asp Gln Arg Cys Ala Ala Glu Cys Asn Ser Pro
1               5                   10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>30
Asp Gln Arg Cys Asp Ala Ala Cys Asn Ser Pro Gly
1               5                   10
<210>31
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>31
Gln Arg Cys Asp Arg Ala Ala Asn Ser Pro Gly Cys
1               5                   10
<210>32
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>32
Arg Cys Asp Arg Glu Ala Ala Ser Pro Gly Cys Gly
1               5                   10
<210>33
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>33
Cys Asp Arg Glu Cys Ala Ala Pro Gly Cys Gly Trp
1               5                   10
<210>34
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>34
Asp Arg Glu Cys Asn Ala Ala Gly Cys Gly Trp Asp
1               5                   10
<210>35
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>35
Arg Glu Cys Asn Ser Ala Ala Cys Gly Trp Asp Gly
1               5                   10
<210>36
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>36
Glu Cys Asn Ser Pro Ala Ala Gly Trp Asp Gly Gly
1               5                   10
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>丙氨酸扫描肽(图11)
<400>37
Cys Asn Ser Pro Gly Ala Ala Trp Asp Gly Gly Asp
1               5                   10

Claims (37)

1.一种可变重(″VH″)链序列，其包含与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的VH链区，其进一步包含恒定区。
3.权利要求2的VH链区，其包含恒定区的CH1、CH2和CH3结构域。
4.权利要求2的VH链区，其中所述恒定区来自IgG抗体。
5.权利要求4的VH链区，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
6.一种可变轻(″VL″)链序列，其包含与SEQ ID NO：3所列氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
7.权利要求6的VL链区，其进一步包含恒定区。
8.一种VH链序列，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
9.一种VL链序列，其包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
10.一种核酸，其编码权利要求1或权利要求6的可变重链序列和/或可变轻链序列。
11.一种核酸，其编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中的一个或多个。
12.一种载体，其包含权利要求10或权利要求11的一种或多种核酸。
13.一种细胞，其包含权利要求12的载体。
14.一种抗体或抗体片段，其包含权利要求1的VH链区，其中所述抗体特异性结合Notch 3。
15.一种抗体或抗体片段，其包含权利要求6的VL链区，其中所述抗体特异性结合Notch 3。
16.权利要求13的抗体，其进一步包含权利要求6的VL链区。
17.权利要求15的抗体，其中所述VL链区包含SEQ ID NO：3且所述VH链区包含SEQ ID NO：2。
18.一种抗体或抗体片段，其包含权利要求6的VL链区，其中所述抗体特异性结合Notch 3。
19.权利要求17的抗体，其进一步包含权利要求1的VH。
20.一种抗体，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
21.权利要求20的抗体，其进一步包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9。
22.权利要求14-21任一项的抗体，其中所述抗体是单链Fv。
23.权利要求14-22任一项的抗体，其进一步包含标记物。
24.一种用于产生抗体的方法，包括在适于抗体产生的条件下培养权利要求13的细胞，并分离所产生的抗体。
25.权利要求14-22任一项或权利要求24的抗体在制备药物中的用途。
26.权利要求14-22任一项或权利要求24的抗体用于治疗Notch 3相关疾病或病症的用途。
27.依照权利要求26的用途，其中所述疾病是神经变性性疾病。
28.依照权利要求26的用途，其中所述疾病是CADASIL、家族性偏瘫性偏头痛(FHM)、家族性阵发性共济失调或Alagille综合征。
29.依照权利要求23的抗体用于检测Notch 3相关疾病的用途。
30.一种Notch 3结合表位，其包含SEQ ID NO：10。
31.一种Notch 3结合表位，其包含SEQ ID NO：11。
32.一种抗体，其结合权利要求30或权利要求31的表位。
33.权利要求32的抗体，其中所述抗体是激动剂。
34.权利要求33的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
35.权利要求33的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
36.一种组合物，其包含权利要求14-22或32-35任一项的抗体。
37.权利要求36的组合物用于治疗Notch 3相关疾病或病症的用途。
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