CN101605815B - 拮抗性抗刻缺蛋白3抗体及其在预防和治疗刻缺蛋白3相关疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能特异性结合刻缺蛋白3并抑制其活化的拮抗性抗体。本发明包括抗体对包含第一Lin12域和第二二聚化域的构象性表位的结合。本发明还包括这些抗体用于治疗或预防刻缺蛋白3相关疾病或病症的用途。

Description

拮抗性抗刻缺蛋白3抗体及其在预防和治疗刻缺蛋白3相关疾病中的用途

相关申请

本申请要求2006年12月18日提交的美国临时专利申请No.60/875,597和2007年1月6日提交的美国临时专利申请No.60/879,218的权益，本文通过提及而完整收录它们的公开内容。

发明领域

本发明涉及拮抗性抗刻缺蛋白(Notch)3抗体及其在改善、治疗、或预防刻缺蛋白3相关疾病或病症中的用途。

发明背景

刻缺蛋白基因首次记载于1917年发现果蝇黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的一个系具有有缺刻的翅片的时候(Morgan，Am Nat 51：513(1917))。在几乎70年后才克隆了该基因，并确定其是在果蝇中许多不同细胞类型和组织的发育中发挥关键作用的细胞表面受体(Wharton等，Cell 43：567(1985))。不久便发现刻缺蛋白信号传导途径是由细胞-细胞接触介导的信号传导机制，并且其在进化方面从果蝇到人都是保守的。已经发现刻缺蛋白受体牵涉许多细胞过程，诸如发育和组织稳态期间各种细胞类型的分化、细胞命运决定、干细胞维持、细胞运动性、增殖、和凋亡(综述参见Artavanis-Tsakonas等，Science 268：225(1995))。

哺乳动物拥有4种刻缺蛋白受体蛋白(称为刻缺蛋白1至刻缺蛋白4)和5种相应的配体(称为德耳塔(Delta)-1(DLL-1)、德耳塔-3(DLL-3)、德耳塔-4(DLL-4)、锯齿蛋白(Jagged)-1和锯齿蛋白-2)。哺乳动物刻缺蛋白受体基因编码约300kD的蛋白质，其在向细胞表面运输过程中被切割，并且以异二聚体形式存在。刻缺蛋白受体的胞外部分具有34个表皮生长因子(EGF)样重复和3个富含半胱氨酸的刻缺蛋白/LIN12重复。两个切割后的亚基的结合是由就位于切割位点N端和C端的序列介导的，而且这两个亚基构成刻缺蛋白异二聚化(HD)域(Wharton等，Cell 43：567(1985)；Kidd等，Mol Cell Biol 6：3431(1986)；Kopczynski等，Genes Dev 2：1723(1988)；Yochem等，Nature 335：547(1988))。

目前，还不清楚不同受体如何调节刻缺蛋白信号传导或5种配体在其信号传导或调节方面有何不同。信号传导和/或调节方面的差异可能是由其在不同组织中的表达样式或由不同环境信号控制的。已经有记录，刻缺蛋白配体蛋白(包括锯齿蛋白/锯齿状蛋白(Serrate)和德耳塔/德耳塔样蛋白)特异性结合EGF重复区，而且诱导受体介导的刻缺蛋白信号传导(综述Bray，Nature RevMol Cell Biol.7：678(2006)及Kadesch，Exp Cell Res.260：1(2000))。在EGF重复中，第10个至第12个重复是配体对刻缺蛋白受体结合所需的，而其它EGF重复可能增强受体-配体相互作用(Xu等，J Biol Chem.280：30158(2005)；Shimizu等，Biochem Biophys Res Comm.276：385(2000))。虽然LIN12重复和二聚化域不直接牵涉配体结合，但是它们在维持异二聚体蛋白质复合物、阻止不依赖配体的蛋白酶切割和受体活化中发挥重要作用(Sanche-Irizarry等，Mol Cell Biol.24：9265(2004)；Vardar等，Biochem.42：7061(2003))。

突变型刻缺蛋白受体在发育中的非洲蟾蜍(Xenopus)胚胎中的表达深刻地干扰正常发育(Coffman等，Cell 73：659(1993))。发现刻缺蛋白1敲除在小鼠中是胎胚致死的(Swiatek等，Genes&Dev 8：707(1994))。在人中，已经有数种遗传性疾病(包括癌症)与不同刻缺蛋白受体突变联系起来(Artavanis-Tsakonas等，Science 284：770(1999))。例如，由易位引起的刻缺蛋白1受体的异常激活可导致T细胞成淋巴细胞性白血病(Ellisen等，Cell 66：649(1991))。刻缺蛋白1受体的HD域中的某些突变在没有配体结合的情况中增强信号传导(Malecki等，Mol Cell Biol 26：4642(2006))，这进一步暗示其在刻缺蛋白受体活化中的作用。由配体结合诱导的信号通过牵涉对受体的两次蛋白水解切割接着是胞内域(Notch-IC)的核易位的过程而传播至细胞核。虽然认为LIN12重复和HD域在没有配体的情况中阻止信号传导，但是仍不清楚配体结合如何促进蛋白水解切割事件。

已经将刻缺蛋白受体与广泛范围的疾病(包括癌症、神经学病症和免疫性疾病)联系起来，如与正常的或非恶性的细胞相比各种人疾病组织和细胞系中刻缺蛋白受体的过表达的报道所证明的(Joutel等，Cell&Dev Biol 9：619(1998)；Nam等，Curr Opin Chem Biol 6：501(2002))。刻缺蛋白3受体在多种实体瘤中过表达，包括非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌(Haruki等，Cancer Res65：3555(2005)；Park等，Cancer Res 66：6312(2006)；Lu等，Clin Cancer Res10：3291(2004))，这提示实体瘤中刻缺蛋白3受体表达的意义。此外，刻缺蛋白3受体表达在浆细胞新生物(包括多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、和髓外浆细胞瘤(Hedvat等，Br J Haematol 122：728(2003))；胰腺癌(Buchler等，AnnSurg 242：791(2005))；及T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)(Bellavia等，Proc Natl Acad Sci USA 99：3788(2002)；Screpanti等，Trends Mol Med 9：30(2003))中上调。刻缺蛋白3受体还在成神经细胞瘤细胞系的子集中表达，并充当在同源异型框基因Phox2B中具有组成性或肿瘤特异性突变的这类肿瘤的标志物(van Limpt等，Cancer Lett 228：59(2005))。其它已经与刻缺蛋白3受体表达联系起来的适应症和疾病包括神经学病症(Joutel等，Nature 383：707(1996))、糖尿病(Anastasi等，J Immunol 171：4504(2003)、类风湿性关节炎(Yabe等，J Orthop Sci 10：589(2005))、血管相关疾病(Sweeney等，FASEB J18：1421(2004))和Alagille综合征(Flynn等，J Pathol 204：55(2004))。

虽然已经在多种癌症中观察到刻缺蛋白3受体过表达(包括基因扩增)，但是激活性突变尚无报道。似乎可能的是，肿瘤中刻缺蛋白3受体的水平升高可由基质细胞或肿瘤细胞中的不同配体激活，并导致刻缺蛋白3信号传导增强。特别地，在发育和肿瘤发生两者过程中已经将刻缺蛋白配体定位于血管内皮(Mailhos等，Differentiation 69：135(2001)；Taichman等，Dev Dyn225：166(2002))，这提示内皮细胞可以为肿瘤中刻缺蛋白3受体活化提供配体。已经在不同类型的癌症中证明了刻缺蛋白配体和受体介导的类似肿瘤-间质对话(Houde等，Blood 104：3697(2004)；Jundt等，Blood 103：3511(2004)；Zeng等，Cancer Cell 8：13(2005))。由胞内刻缺蛋白3(刻缺蛋白3-IC)的过表达引起的刻缺蛋白3信号传导增加可导致T-ALL和乳腺癌动物模型中的肿瘤发生(Vacca等，The EMBO J 25：1000(2006)；Hu等，Am J Pathol 168：973(2006))。

已经将刻缺蛋白信号传导及其在细胞自我更新中的作用与癌症干细胞联系起来，所述癌症干细胞是肿瘤中的少数群体，并可启动肿瘤形成(Reya等，Nature 414：105(2001))。来自许多组织的正常干细胞(包括肠和神经元干细胞)在自我更新和命运决定方面依赖于刻缺蛋白信号传导(Fre等，Nature435：964(2005)；van Es等，Nature 435：959(2005)；Androutsellis-Theotokis等，Nature 442：823(2006))。类似的机制可存在于癌症干细胞中，而且显示了γ-分泌酶抑制剂对刻缺蛋白信号传导的抑制消减癌症干细胞，并且阻断胚胎性脑肿瘤(embryonal brain tumor)中的移植物移入(engraftment)(Fan等，CancerRes 66：7445(2006))。

γ-分泌酶抑制剂对刻缺蛋白信号传导的抑制在体外和在异种移植物模型中在表达刻缺蛋白的转化细胞中具有惊人的抗新生物效果(Weijzen等，NatMedicine 8：879(2002)；Bocchetta等，Oncogene 22：81(2003)；Weng等，Science306：269(2004))。新近，已经显示了γ-分泌酶抑制剂有效地杀死Apc(min+)小鼠中的结肠腺瘤(van Es等，Nature 435：959(2005))，虽然治疗窗是很窄的，这是由于其对正常干细胞的效应和对多个刻缺蛋白途径的抑制。与刻缺蛋白1不同，小鼠中的刻缺蛋白3基因敲除不是胎胚致死的，而且几乎没有缺损(Domenga等，Genes&Dev 18：2730(2004))，这提示刻缺蛋白3提供比刻缺蛋白1潜在地更好的治疗靶物。

Tournier-Lasserve等(美国申请2003/0186290)教导了刻缺蛋白3受体和CADASIL的联系。该申请披露了刻缺蛋白3基因中的多种突变及其与疾病CADASIL的可能联系。该申请提示诊断用抗体用以检测此类突变的用途。该申请还提示用于治疗CADASIL的治疗用抗体，即激动性抗体，但没有披露特定的抗体，也没有披露如何制备此类抗体。

鉴于大量人疾病与刻缺蛋白3信号传导途径有关，鉴定预防和治疗这些疾病的新方法是重要的。本发明提供了对这种未被满足的医学需要有用的新的抗刻缺蛋白3抗体。

发明概述

本发明提供了特异性结合人刻缺蛋白3受体的构象性表位的新抗体及其片段，所述表位包含LIN12域和异二聚化域。本发明的另一方面包括与本发明抗体结合该相同表位的表位结合位点和抗体。本发明的抗体经由刻缺蛋白3受体来抑制配体诱导的信号传导。

本发明包括抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列及其相应的核酸序列。本发明的另一个实施方案包括这些抗体的CDR序列。另一个实施方案包括这些抗体的人源化形式。

本发明的另一个实施方案包括包含本发明抗体序列的细胞系和载体。

本发明还包括本发明的拮抗性抗体所识别的构象性表位。本发明还包括结合这种构象性表位的抗体。实施方案包括包含与SEQ ID NO.9具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的LIN12域和与SEQ ID NO.18具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的二聚化域2的刻缺蛋白3构象性表位。更具体地，刻缺蛋白3构象性表位包含L1LIN12域的氨基酸残基1395-1396、1402-1404和1420-1422及D2二聚化域的氨基酸残基1576-1578和1626-1628。本发明包括结合这种构象性表位的抗体。

本发明的另一个实施方案是这些抗体之任一种用于制备药物或组合物的用途，所述药物或组合物用于治疗与刻缺蛋白3受体活化有关的疾病和病症。

本发明的另一个实施方案是这些抗体之任一种在治疗与刻缺蛋白3活化有关的病症中的用途，包括通过例如抑制刻缺蛋白3信号传导来抑制所述活化，或通过阻断配体结合来中和受体。刻缺蛋白3相关病症可包括但不限于T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、牵涉异常血管化的肝病(liver disease involving aberrantvascularization)、糖尿病(diabetes)、卵巢癌(ovarian cancer)、牵涉血管细胞命运的疾病(diseases involving vascular cell fate)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、胰腺癌(pancreatic cancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer)、浆细胞新生物(plasma cell neoplasms)(诸如多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、浆细胞性白血病(plasma cell leukemia)、和髓外浆细胞瘤(extramedullary plasmacytoma))、及成神经细胞瘤(neuroblastoma)。

附图简述

图1描绘了刻缺蛋白3的氨基酸序列。EGF重复区从氨基酸残基43延伸至1383；LIN12域从氨基酸残基1384延伸至1503；而二聚化域从氨基酸残基1504延伸至1640。

图2A-2H描绘了人刻缺蛋白1、刻缺蛋白2、刻缺蛋白3和刻缺蛋白4之间的氨基酸序列比较。

图3描绘了刻缺蛋白1、刻缺蛋白2、刻缺蛋白3和刻缺蛋白4的百分比同一性。

图4A和4B描绘了抗刻缺蛋白3单克隆抗体MAb 256A-4的重链和轻链可变区序列(SEQ ID NO：2)，其中CDR区标有下划线。

图5A和5B描绘了抗刻缺蛋白3单克隆抗体MAb 256A-8的重链和轻链可变区序列(SEQ ID NO：4)，其中CDR区标有下划线。

图6描绘了实施例5的萤光素酶报道测定法，其显示了抗刻缺蛋白3单抗对刻缺蛋白3配体锯齿蛋白1的抑制效应。

图7描绘了萤光素酶报道测定法，其显示了抗刻缺蛋白3单抗对刻缺蛋白3配体锯齿蛋白2的抑制效应。

图8描绘了萤光素酶报道测定法，其显示了抗刻缺蛋白3单抗对刻缺蛋白3配体DLL4的抑制效应。

图9描绘了萤光素酶报道测定法，其显示了抗刻缺蛋白3单抗对卵巢癌细胞中的天然刻缺蛋白3的抑制效应。(9A)人卵巢癌细胞系OV/CAR3和(9B)人卵巢癌细胞系A2780。

图10描绘了实施例6的凋亡测定法，其显示了抗刻缺蛋白3单抗抑制由锯齿蛋白1诱导的细胞存活效应。

图11描绘了抗刻缺蛋白3单抗对实施例7的细胞迁移(11A)和侵入(11B)的抑制效应。

图12描绘了以融合蛋白(其中人IgG/Fc连接至C末端)表达的刻缺蛋白1-刻缺蛋白3域交换蛋白的示意图。

图13描绘了使用抗人Fc对照抗体作为检测抗体的ELISA，其显示了图12的蛋白质在条件化培养基中表达。图13B描绘了使用256A-4作为检测抗体的ELISA。图13C描绘了使用256A-8作为检测抗体的ELISA。图13D描绘了使用阳性对照抗体256A-13作为检测抗体的ELISA。

图14描绘了工程化刻缺蛋白3前导肽编码序列与天然刻缺蛋白3前导肽编码序列(NCBI GenBank登录号NM_000435)的比较，其显示了工程化刻缺蛋白前导肽序列的核苷酸(14A)和翻译氨基酸序列(14B)变化。

图15描绘了通过PCR-SOE方法生成域交换构建体。箭头条表示PCR引物。空心条表示刻缺蛋白3序列。实心条表示刻缺蛋白1序列。

图16描绘了单抗256A-4和256A-8的刻缺蛋白3LIN12域表位作图中所使用的氨基酸序列。

图17描绘了单抗256A-4和256A-8的刻缺蛋白3二聚化域表位作图中所使用的氨基酸序列。

图18描绘了单抗256A-4和256A-8的表位结合位点的示意图。

发明详述

本发明不限于本文中所述具体的方法、方案、细胞系、载体或试剂，因为它们可以有所变化。另外，本文中所使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，并非意图限制本发明的范围。在用于本说明书和所附权利要求书时，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数称谓，除非另有明确说明，例如提及“宿主细胞”包括多个或多种此类宿主细胞。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩略词具有与本发明领域中本领域普通技术人员通常理解相同的含意。虽然与那些本文中所述的方法和材料类似的或等同的任何方法和材料可用于实施本发明，但是本文中只描述了例示性的方法、装置和材料。

本文中通过提及以法律容许的程度收录本文中所提及的所有专利和出版物，出于记载和披露其中所报道的可与本发明一起使用的蛋白质、酶、载体、宿主细胞、和方法的目的。然而，凭借在先发明，本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格早于所述公开。

定义

贯穿本申请所使用的术语应当用对本领域普通技术人员通常的和典型的意义来解释。然而，申请人希望下列术语被给予如下文所限定的特定定义。

关于抗体链多肽序列的短语“基本上相同的”可解释为展现出与参照多肽序列至少70％、或80％、或90％、或95％序列同一性的抗体链。关于核酸序列的该术语可解释为展现出与参照核酸序列至少约85％、或90％、或95％、或97％序列同一性的核苷酸序列。

术语“同一性”或“同源性”应当解释为指比对序列并在必要时引入缺口以获取整个序列的最大百分比同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与同其比较的相应序列中的残基相同的氨基酸残基的百分比。N端或C端延伸或插入均不应当解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域中公知的。可使用序列分析软件来测量序列同一性。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、和多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定靶物的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏靶物特异性的抗体样分子两者。本发明的抗体可以是任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成。每个重链具有在一端的可变域(V_H)，接着是若干恒定域。每个轻链具有在一端的可变域(V_L)和在其另一段的恒定域。

在用于本文时，“抗刻缺蛋白3抗体”指能以如下方式特异性结合人刻缺蛋白3的抗体，所述结合方式使其抑制或实质性降低刻缺蛋白3对其配体的结合或抑制刻缺蛋白3信号传导。

术语“可变的”在抗体可变域的语境中指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定靶物的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)(也称为高变区)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的靶物结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987))。在用于本文时，除非另有说明，免疫球蛋白氨基酸残基的编号方式依照Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。

术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是靶物结合或可变区。抗体片段的例子包括F(ab)、F(ab’)、F(ab’)₂和Fv片段。短语抗体的“功能性片段或类似物”指具有与全长抗体同样的定性的生物学活性的化合物。例如，抗刻缺蛋白3抗体的功能性片段或类似物指能以如下方式结合刻缺蛋白3受体的抗刻缺蛋白3抗体的功能性片段或类似物，所述结合方式使其阻止或实质性降低该受体结合其配体或启动信号传导的能力。在用于本文时，关于抗体的“功能性片段”指Fv、F(ab)和F(ab’)₂片段。“Fv”片段由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体(V_H-V_L二聚体)组成。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了一个靶物结合位点。六个CDR共同赋予抗体以靶物结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对靶物特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合靶物的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成结合靶物的期望结构。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。

F(ab)片段包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。F(ab’)片段与F(ab)片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)片段通过切割F(ab’)₂胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键生成。抗体片段的别的化学偶联是本领域普通技术人员所知的。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。本文中的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与自特定物种衍生的或属于特定抗体类或亚类的抗体中相应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种衍生的或属于另一抗体类或亚类的抗体中相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))。单克隆抗体是高度特异的，针对单一靶位点。另外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对靶物上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，与本发明一起使用的单克隆抗体可使用公知技术从噬菌体抗体文库分离。依照本发明使用的亲本单克隆抗体可通过最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组方法来制备。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含自非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或抗体的其它靶物结合子序列)。一般而言，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白模板序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是选定的人免疫球蛋白模板的。

术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括后代。还应理解，所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。包括具有相同功能或生物学性质的变体后代，如在最初转化的细胞中所筛选的。一般而言，本发明中所使用的“宿主细胞”指原核或真核宿主。

用DNA“转化”细胞生物体、细胞、或细胞系指将DNA导入靶细胞中以使得DNA是可复制的，其或是作为染色体外元件或是通过染色体整合来实现。用DNA“转染”细胞或生物体指细胞或生物体摄取DNA，例如表达载体，无论实际上是否表达任何编码序列。术语“经转染的宿主细胞”和“经转化的”指其中导入了DNA的细胞。该细胞称为“宿主细胞”，并且其可以是原核的或真核的。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)的各种菌株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物的，诸如中国仓鼠卵巢或人起源的。所导入的DNA序列可以是来自与宿主细胞相同的物种或与宿主细胞不同的物种，或者其可以是包含一些外来的和一些同源的DNA的杂合DNA序列。

术语“载体”指包含与合适的控制序列可操作连接的DNA序列的DNA构建体，所述合适的控制序列能够实现DNA序列在合适的宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子、任选的控制所述转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化入合适的宿主中，载体便可独立于宿主基因组地复制和发挥功能，或者在一些例子中可以自身整合入基因组中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意图包括如下的其它形式的载体，其发挥本领域中已知的等同功能，并且其是本领域中已知的，或变为本领域中已知的。

为了处置的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，非人灵长类，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。

单词“标记物”在用于本文时指可与分子或蛋白质(例如抗体)直接或间接偶联的可检测的化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化底物化合物或组合物的可检测的化学变化。

在用于本文时，“固相”指本发明的抗体可粘着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮(silicone)形成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它是纯化柱(例如亲和层析柱)。

在用于本文时，术语“刻缺蛋白3介导的病症”指以刻缺蛋白3受体的过表达和/或超敏感性为特征的疾患或疾病。明确地，其会被解释为包括与癌症有关的疾患，所述癌症诸如非小细胞肺癌、卵巢癌和T细胞急性成淋巴细胞性白血病。该术语的范围之内还涵盖其它癌症，包括胰腺癌、前列腺癌、浆细胞新生物(例如多发性骨髓瘤、浆细胞白血病和髓外浆细胞瘤)、成神经细胞瘤和髓外浆细胞瘤。其它类型的疾病包括淋巴瘤、Alagille综合征、牵涉异常血管形成的肝病、神经病学疾病(neurologic diseases)、糖尿病、牵涉血管细胞命运的疾病、和类风湿性关节炎。

用于生成抗体的刻缺蛋白3受体免疫原

可使用可溶性靶物或其片段作为免疫原来生成抗体。抗体针对感兴趣的靶物。优选的是，靶物是生物学重要多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物施用抗体可导致所述哺乳动物中的治疗益处。可使用完整的细胞作为免疫原来制备抗体。免疫原可重组生成或使用合成方法来制备。免疫原还可自天然来源分离。

对于跨膜分子(诸如受体)，这些跨膜分子的片段(例如受体的胞外结构域)可作为免疫原使用。或者，表达跨膜分子的细胞可作为免疫原使用。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是已经通过重组技术进行转化以过表达该跨膜分子的细胞。对制备抗体有用的其它形式的免疫原对本领域技术人员是显而易见的。

或者，可依照本领域技术人员公知的方法，将编码人刻缺蛋白3受体的基因或cDNA克隆入质粒或其它表达载体中，并在许多表达系统之任一种中表达。克隆和表达刻缺蛋白3受体的方法和人刻缺蛋白3受体的核酸序列是已知的(参见例如美国专利No.5,821,332和5,759,546)。由于遗传密码的简并性，可使用许多编码刻缺蛋白3受体蛋白或多肽的核苷酸序列。基于可能的密码子选择，可通过选择组合来改变核苷酸序列。依照标准三联体遗传密码，应用于编码天然存在的刻缺蛋白3受体的核苷酸序列，进行这些组合，并且可考虑所有的此类变异。可在动物免疫中使用这些多肽之任一种来生成结合人刻缺蛋白3受体的抗体。

由于刻缺蛋白3氨基酸序列的高度保守，还可使用来自其它物种的重组刻缺蛋白3蛋白作为免疫原来生成抗体。人的和小鼠的刻缺蛋白3之间的比较显示两个物种之间超过90％的氨基酸序列同一性。

在有益时，免疫原刻缺蛋白3受体可以作为融合蛋白来表达，所述融合蛋白具有附着至融合区段的刻缺蛋白3受体。融合区段通常帮助蛋白质纯化，例如，通过容许融合蛋白通过亲和层析而被分离和纯化来实现，而且还可用于提高免疫原性。可通过培养用融合核酸序列转化的重组细胞来生成融合蛋白，所述融合核酸序列编码包含附着至蛋白质的羧基端和/或氨基端末端的融合区段的蛋白质。融合区段可包括但不限于免疫球蛋白Fc区、谷胱甘肽-S-转移酶、β-半乳糖苷酶、能够结合二价金属离子的多组氨酸区段和麦芽糖结合蛋白。

使用实施例1中所述重组刻缺蛋白3受体蛋白来免疫小鼠以产生生成本发明单克隆抗体的杂交瘤。例示性多肽包含完整的或部分的SEQ ID NO.1或其变体。

抗体生成

本发明的抗体可通过任何本领域中已知的合适方法来生成。本发明的抗体可包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员已知的(Harlow等，Antibodies：a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第2版(1988)，由此本文通过提及而将其完整收录)。

例如，可将实施例1中所述免疫原施用于多种宿主动物(包括但不限于家兔、小鼠、大鼠等)以诱导包含抗原特异性多克隆抗体的血清的生成。免疫原的施用可能需要免疫剂和(若想要的话)佐剂的一次或多次注射。多种佐剂可用于提高免疫应答，这取决于宿主物种，并且包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔

血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人佐剂诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。可采用的佐剂的别的例子包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成的海藻糖二棒分枝菌酸酯(dicorynomycolate))。免疫方案是本领域中公知的，而且可通过在选定的动物宿主中引发免疫应答的任何方法来进行。佐剂在本领域中也是公知的。

典型地，通过多次皮下或腹膜内注射，或通过肌肉内或经由IV将免疫原(有或没有佐剂)注射入哺乳动物中。免疫原可包括刻缺蛋白3多肽、其融合蛋白、或变体。根据多肽的性质(即百分比疏水性、百分比亲水性、稳定性、净电荷、等电点等)，偶联免疫原至已知在所免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白质可能是有用的。此类偶联包括化学偶联(其通过将活性化学官能团衍生化至待偶联的免疫原和免疫原性蛋白质两者使得形成共价键)，或经由基于融合蛋白的方法，或熟练技术人员已知的其它方法。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔

血蓝蛋白、卵清蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂和各式各样的T辅助细胞肽。多种佐剂可用于提高上文所述免疫学应答。

本发明的抗体包括单克隆抗体。单克隆抗体是识别单一抗原性位点的抗体。它们一致的特异性使单克隆抗体比多克隆抗体有用得多，多克隆抗体通常包含识别多种不同抗原性位点的抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤技术(诸如那些记载于Kohler等，Nature 256：495(1975)；美国专利No.4,376,110；Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第2版(1988)和Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas，Elsevier(1981)的)、重组DNA方法、或技术人员已知的其它方法来制备。可用于生成单克隆抗体的方法的其它例子包括但不限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Proc Natl AcadSci USA 80：2026(1983))和EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R.Liss(1985))。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类(包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD)及其任何亚类的抗体。生成本发明的单抗的杂交瘤可以在体外或在体内培养。

在杂交瘤模型中，对宿主(诸如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系统的小鼠、仓鼠、家兔、骆驼、或任何其它合适的宿主动物)进行免疫以引发如下淋巴细胞，所述淋巴细胞生成或能够生成会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。或者，淋巴细胞可以在体外进行免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103(1986))。

一般而言，在制备生成抗体的杂交瘤中，若想要人起源的细胞则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者若想要非人哺乳动物来源则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，Academic Press，pp.59-103(1986))。永生化细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛或人起源的骨髓瘤细胞。典型地，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定的高水平的生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的永生化细胞系。在这些骨髓瘤细胞系中有鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diege，Calif.)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection(ATCC)，Manassas，VA，USA)获得的SP2/0或X63-Ag8-653细胞所衍生的。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J Immunol 133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc，pp.51-63(1987))。还可使用小鼠骨髓瘤细胞系NSO(欧洲细胞培养物保藏中心，EuropeanCollection of Cell Cultures，Salisbury，Wilshire，UK)。

对培养杂交瘤细胞的培养基测定针对刻缺蛋白3的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术是本领域中已知的，并且在技术人员的技术之内。单克隆抗体对刻缺蛋白3的结合亲和力可通过例如Scatchard分析来测定(Munson等，AnalBiochem 107：220(1980))。

在鉴定到生成具有期望的特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103(1986))。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(D-MEM)或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水、或血清适当分开或分离。

本领域中存在多种用于生成单克隆抗体的方法，如此，本发明不限于其在杂交瘤中的唯一生成。例如，单克隆抗体可通过重组DNA方法(诸如那些记载于美国专利No.4,816,567的)来制备。在此语境中，术语“单克隆抗体”指自单一的真核、噬菌体、或原核克隆衍生的抗体。编码本发明的单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用如下寡核苷酸探针实现，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链，或来自人抗体、人源化抗体、或其它来源抗体的此类链的基因)(Innis等，于PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，Academic(1990)；Sanger等，Proc Natl Acad Sci 74：5463(1977))。杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、NS0细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或者通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可用此类非免疫球蛋白多肽替代本发明的抗体的恒定域，或者可用它替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变域以产生嵌合二价抗体。

抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域中公知的。例如，一种方法牵涉免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任一点截短重链以防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或删除以防止交联。

识别特定表位的抗体片段可通过已知技术来生成。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，J Biochem BiophysMethods 24：107(1992)；Brennan等，Science 229：81(1985))。例如，可通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(为了生成Fab片段)或胃蛋白酶(为了生成F(ab’)₂片段)对免疫球蛋白分子的蛋白水解切割来生成本发明的Fab和F(ab’)₂片段。F(ab’)₂片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。然而，这些片段现在可直接由重组宿主细胞生成。例如，可从抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收F(ab’)₂-SH片段并化学偶联以形成F(ab’)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163(1992)。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员会是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(Fv)(PCT专利申请WO 93/16185)。

对于一些应用(包括抗体在人类中的体内应用和体外检测测定法)，使用嵌合的、人源化的、或人的抗体可能是优选的。嵌合抗体指其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如具有自鼠单克隆抗体衍生的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生成嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等，J Immunol Methods 125：191(1989)；美国专利No.5,807,715；4,816,567；及4,816,397，本文通过提及而将它们完整收录。

人源化抗体设计成具有比动物衍生的单克隆抗体更大的与人免疫球蛋白的同源性。人源化是用于生成嵌合抗体的技术，其中基本上少于整个人可变域已经由来自非人物种的相应序列替换。人源化抗体是非人物种中生成的、结合期望抗原的抗体分子，其具有一种或多种来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架(FR)区。通常，人框架区中的框架残基会用来自CDR供体抗体的相应残基替代以改变(优选改善)抗原结合。通过本领域中公知的方法来鉴定这些框架替代，例如，通过CDR和框架残基的相互作用的建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基和通过序列比较以鉴定在特定位置的不寻常框架残基。参见例如美国专利No.5,585,089；Riechmann等，Nature 332：323(1988)，本文通过提及而将它们完整收录。使用本领域中已知的多种技术来使抗体人源化，包括例如CDR家接(EP 239,400；PCT公开文本WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；及5,585,089)、镶饰(veneering)或重修表面(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28：489(1991)；Studnicka等，Protein Engineering7：805(1994)；Roguska等，Proc Natl Acad Sci USA 91：969(1994))、和链改组(美国专利No.5,565,332)。

一般而言，人源化抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature321：522(1986)；Riechmann等，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534(1988))，即用非人CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。

更重要的是，人源化的抗体保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来生成人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析某些残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白序列能力的残基，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而使期望的抗体特征最大化，诸如对靶抗原的亲和力提高，虽然正是CDR残基直接且最实质的影响抗原结合。

用于构建人源化抗体的人可变域(包括轻链和重链二者)的选择对于降低抗原性是重要的。依照所谓的“最适”(best-fit)方法的例示性方法，用非人抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后接受与非人亲本抗体最接近的人序列作为人源化抗体的人FR(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。

完全人抗体对于人类患者的治疗性处理是特别想要的。可通过本领域中已知的多种方法来制备人抗体，包括使用自人免疫球蛋白序列衍生的抗体文库的上文所述噬菌体展示方法。还可参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；及PCT公开文本WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，及WO 91/10741；本文通过提及而将每篇完整收录。Cole等和Boerder等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Riss(1985)；及Boerner等，J Immunol 147：86(1991))。

还可使用如下转基因小鼠来生成人抗体，所述转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因。例如，可随机地或通过同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物导入小鼠胚胎干细胞中。或者，在人重链和轻链基因之外还可将人可变区、恒定区、和多变区导入小鼠胚胎干细胞中。与通过同源重组导入人免疫球蛋白基因座分开地或同时地，可使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因变为非功能性的。具体地，JH区的纯合删除防止内源抗体生成。扩增经修饰的胚胎干细胞，并显微注射入胚泡中以生成嵌合小鼠。然后饲养嵌合小鼠以生成表达人抗体的纯合后代。参见例如Jakobovits等，Proc Natl Acad Sci USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature362：255(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol 7：33(1993)；Duchosal等，Nature 355：258(1992))。用选定的抗原(例如完整的或部分的本发明的多肽)以正常方式免疫转基因小鼠。可使用常规的杂交瘤技术从经免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换和体细胞突变。如此，使用此类技术，生成治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体是有可能的。关于用于生成人抗体的这种技术的综述，参见Lonberg等，Int Rev Immunol 13：65-93(1995)。关于用于生成人抗体和人单克隆抗体的这种技术和用于生成此类抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开文本WO 98/24893；WO 92/01047；WO96/34096；WO 96/33735；欧洲专利No.0,598,877；美国专利No.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；及5,939,598，本文通过提及而将它们完整收录。另外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)、Genpharm(San Jose，Calif.)和Medarex，Inc.(Princeton，N.J.)等公司可受雇来提供针对选定抗原的人抗体，这使用与上文所述技术类似的技术实现。

还可通过免疫用人外周血白细胞、脾细胞或骨髓移植的小鼠来制备人单抗(例如XTL的Trioma技术)。识别选定表位的完全人抗体可使用称为“导向选择”的技术来生成。在这种方法中，使用选定的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来引导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等，Bio/technology 12：899(1988))。

此外，可继而利用针对本发明多肽的抗体来生成“模仿”本发明多肽的抗独特型抗体，这使用本领域技术人员公知的技术实现(参见例如Greenspan等，FASEB J 7：437(1989)；Nissinoff，J Immunol 147：2429(1991))。例如，可使用结合多肽并竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明的多肽对配体的结合的抗体来生成如下抗独特型，所述抗独特型“模仿”多肽多聚化和/或结合结构域，因而结合并中和多肽和/或其配体。可在治疗方案中使用此类中和性抗独特型或此类抗独特型的Fab片段来中和多肽配体。例如，可使用此类抗独特型抗体来结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，由此阻断其生物学活性。

本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是具有对至少两种不同抗原的结合特异性的单克隆的(优选人的或人源化的)抗体。在本发明中，结合特异性之一可以针对刻缺蛋白3，另一可以针对任何其它抗原，优选针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生的蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生的蛋白质、或细菌表面蛋白等。

用于制备双特异性抗体的方法是公知的。传统上，双特异性抗体的重组生成是基于两对免疫球蛋白重链/轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Milstein等，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来实现。类似的规程披露于WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J 10：3655(1991)。

可将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，融合是与免疫球蛋白重链恒定域，其包含至少部分的铰链、CH2和CH3区。它可具有在至少一种融合物中存在的包含轻链结合必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和(若想要的话)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转化入合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的进一步的详情，参见例如Suresh等，Meth In Enzym 121：210(1986)。

本发明还涵盖异源偶联抗体(heteroconjugate antibody)。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。例如，已经提议用此类抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)。本文涵盖的是，可使用合成蛋白质化学(包括那些牵涉交联剂的)中的已知方法在体外制备抗体。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫酯键来构建免疫毒素。用于此目的的合适的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和-4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和那些披露于例如美国专利No.4,676,980的。

另外，可以生成针对刻缺蛋白3的单域抗体。这种技术的例子已经记载于WO94/25591(其关于自骆驼科(Camelidae)重链Ig衍生的抗体)，以及US2003/0130496(其记载从噬菌体文库分离单域完全人抗体)。

还可创建单肽链结合分子，其中重链和轻链Fv区是相连的。单链抗体(“scFv”)及其构建方法记载于美国专利No.4,946,778。或者，可通过类似的手段构建和表达Fab。所有的完全人抗体和部分人抗体比完全鼠单抗具有更小的免疫原性，而片段和单链抗体也具有更小的免疫原性。

可从使用McCafferty等，Nature 348：552(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature 352：624(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc Acids Res 21：2265(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。

还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))。

另一种替代方法是使用电融合而不是化学融合来形成杂交瘤。这种技术是完善建立的。还可使用例如埃巴病毒(Epstein Barr Virus)或转化基因代替融合来转化B细胞以使其永生。参见例如“Continuously Proliferating Human CellLines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity，”Zurawaki等，于Monoclonal Antibodies，Kennett等编，Plenum Press，pp.19-33.(1980))。可通过用由真核或原核系统表达的刻缺蛋白3蛋白、融合蛋白、或其片段免疫啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)来产生抗刻缺蛋白3单抗。其它动物也可用于免疫，例如非人灵长类、表达免疫球蛋白的转基因小鼠和移植有人B淋巴细胞的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠。可通过常规规程，通过融合来自经免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞(例如Sp2/0和NSO)来生成杂交瘤，如较早所述的(

等，Nature 256：495(1975))。另外，可通过筛选噬菌体展示系统中来自人B淋巴细胞的重组单链Fv或Fab文库来生成抗刻缺蛋白3抗体。单抗对刻缺蛋白3的特异性可通过ELISA、Western免疫印迹、或其它免疫化学技术来测试。抗体对补体活化的抑制活性可通过溶血测定法来评估，其使用用于经典补体途径的经过敏化的鸡或绵羊RBC进行。通过有限稀释来克隆阳性孔中的杂交瘤。对抗体进行纯化以通过上文所述测定法来表征对人刻缺蛋白3的特异性。

抗刻缺蛋白3抗体的鉴定

本发明提供了抑制和中和刻缺蛋白3的作用的拮抗性单克隆抗体。具体地，本发明的抗体结合刻缺蛋白3，并抑制刻缺蛋白3的活化。本发明的抗体包括本文中所公开的称为256A-4和256A-8的抗体。本发明还包括与这些抗体之一结合相同表位的抗体。

通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、Western免疫印迹、或其它免疫化学技术测试候选抗刻缺蛋白3抗体。在实施例中描述了为了表征各种抗体而实施的测定法。

本发明的抗体包括但不限于多克隆的、单克隆的、单价的、双特异性的、异源偶联的、多特异性的、人的、人源化的或嵌合的抗体、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库所生成的片段、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)、和任何上文抗体的表位结合片段。

抗体可以是本发明的人抗原结合抗体片段，并且包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)₂、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH域的单域抗体。抗原结合抗体片段(包括单链抗体)可包含单独的或与下列各项的整个或部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3域。本发明中还包括包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3域的任意组合的抗原结合片段。本发明的抗体可以来自任何动物起源，包括鸟类和哺乳类。优选地，抗体来自人、非人灵长类、啮齿类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、家兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、或鸡。

在用于本文时，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括自人免疫球蛋白文库或自针对一种或多种人免疫球蛋白进行转基因而且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如下文和例如美国专利No.5,939,598(Kucherlapati等)中所述的。

本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或者更大的多特异性的。多特异性抗体可以是对刻缺蛋白3的不同表位特异性的或者可以是对刻缺蛋白3以及异源表位(诸如异源多肽或固体支持材料)两者特异性的。参见例如PCT公开文本WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO92/05793；Tutt等，J Immunol 147：60(1991)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等，J Immunol 148：1547(1992)。

本发明的抗体可以根据它们识别或特异性结合的刻缺蛋白3表位或部分来描述或说明。表位或多肽部分可如本文所述的那样说明，例如按N端和C端位置，按连续氨基酸残基的大小，或列于表格和图形中。

本发明的抗体还可根据其交叉反应性来描述或说明。本发明中还包括结合刻缺蛋白3多肽的抗体，所述刻缺蛋白3多肽与刻缺蛋白3具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性(如使用本领域中已知的和本文中所述的方法所计算的)。抗刻缺蛋白3抗体还可以小于约10^-7M、小于约10^-6M、或小于约10^-5M的K_D结合其它蛋白质，诸如来自在抗刻缺蛋白3抗体所针对的物种之外的物种的抗刻缺蛋白3抗体。

在具体的实施方案中，本发明的抗体与人刻缺蛋白3的猴同系物(homologue)及其相应表位起交叉反应。在一个具体的实施方案中，上文所述交叉反应性是关于任何单一的特定的抗原性的或免疫原性的多肽，或本文所公开的特定的抗原性的和/或免疫原性的多肽的组合。

本发明中还包括结合由如下多核苷酸编码的多肽的抗体，所述多核苷酸在严格杂交条件下与编码刻缺蛋白3的多核苷酸杂交。本发明的抗体还可根据其对本发明多肽的结合亲和力来描述或说明。优选的结合亲和力包括那些具有10^-8至10^-15M、10^-8至10^-12M、10^-8至10^-10M、或10^-10至10^-12M的平衡解离常数或K_D的。本发明还提供了竞争性抑制抗体对本发明表位的结合的抗体，正如用于测定竞争性结合的本领域中已知的任何方法(例如本文中所描述的免疫测定法)所测定的。在优选的实施方案中，抗体竞争性抑制对表位的结合达至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。

载体和宿主细胞

在另一方面，本发明提供了编码本文中所公开的抗体的分离的核酸序列、包含编码本发明的抗体的核苷酸序列的载体构建体、包含此类载体的宿主细胞、和用于生产抗体的重组技术。

为了重组生产抗体，将编码其的核酸分离，并插入可复制的载体中，用于进一步克隆(DNA的扩增)或表达。编码抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用如下寡核苷酸探针实现，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因)。可在表达本发明抗体的细胞系的制备中使用用于克隆和转化的标准技术。

载体

许多载体是可获得的。载体构件一般包括但不限于以下一项或多项：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、及转录终止序列。包含编码本发明抗体的核苷酸序列的重组表达载体可使用公知技术来制备。表达载体包括与合适的转录或翻译调节核苷酸序列(诸如那些自哺乳动物的、微生物的、病毒的、或昆虫的基因衍生的)可操作连接的核苷酸序列。调节序列的例子包括转录启动子、操纵基因、增强子、mRNA核糖体结合位点、和/或其它控制转录和翻译起始和终止的合适序列。若调节序列在功能上与合适多肽的核苷酸序列相联系，则核苷酸序列是“可操作连接的”。如此，若启动子核苷酸序列控制合适的核苷酸序列的转录，则启动子核苷酸序列与例如抗体重链序列是可操作连接的。

另外，可将编码合适的信号肽的序列掺入表达载体中，所述信号肽在天然情况中不与抗体重链和/或轻链序列相关。例如，信号肽(分泌前导)的核苷酸序列可与多肽序列以符合读码框方式融合以使得抗体被分泌至周质空间或被分泌入培养基中。在预期的宿主细胞中有功能的信号肽增强合适抗体的胞外分泌。在自细胞分泌后信号肽可从多肽中切割掉。此类分泌信号的例子是公知的，并且包括例如那些记载于美国专利No.5,698,435；5,698,417；及6,204,023中的。

载体可以是质粒载体、单链或双链噬菌体载体、或单链或双链RNA或DNA病毒载体。可通过用于将DNA和RNA导入细胞中的公知技术来将此类载体作为多核苷酸导入细胞中。在噬菌体和病毒载体的情况中，也可通过用于感染和转导的公知技术将载体作为包装好的或封装好的病毒导入细胞中。病毒载体可以是有复制能力的或有复制缺陷的。在后者情况中，病毒增殖一般仅会在补足的宿主细胞中发生。也可采用无细胞翻译系统来生产蛋白质，这使用自存在的DNA构建体衍生的RNA实现。此类载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公开文本WO 86/05807和WO 89/01036；及美国专利No.5,122,464)，并且可将抗体的可变域克隆入此类载体中以表达整个重链或轻链。

宿主细胞

本发明的抗体可自任何合适的宿主细胞表达。在本发明中有用的宿主细胞的例子包括原核细胞、酵母细胞、或高等真核细胞，并且包括但不限于微生物诸如用包含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia))；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用包含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或含有包含自哺乳动物细胞基因组衍生的(例如金属硫蛋白启动子)或自哺乳动物病毒衍生的(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。

在本发明中作为宿主细胞有用的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31，446)，虽然其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而非限制性的。

在原核宿主细胞中使用的表达载体一般包含一种或多种表型选择标志基因。表型选择标志基因是例如编码赋予抗生素抗性或提供自养需要的蛋白质的基因。对原核宿主细胞有用的表达载体的例子包括那些自如下商品化质粒衍生的表达载体，诸如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin.，USA)、及pET(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和pRSET(Invitrogen，Carlsbad，CA)系列载体(Studier，J Mol Biol 219：37(1991)；Schoepfer，Gene 124：83(1993))。重组原核宿主细胞表达载体通常使用的启动子序列包括T7(Rosenberg等，Gene56：125(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等，Nature275：615(1978)；Goeddel等，Nature 281：544(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，Nucl Acids Res 8：4057(1980))和tac启动子(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory(1990))。

在本发明中有用的酵母或丝状真菌包括那些来自糖酵母属、毕赤氏酵母属、放线菌属(Actinomycetes)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及丝状真菌诸如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)的。酵母载体通常会包含来自2μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、多腺苷酸化的序列、转录终止的序列、和选择标志基因。适用于酵母载体的启动子序列包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，JBiol Chem 255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Holland等，Biochem 17：4900(1978))(诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、及葡糖激酶)的启动子等。适于酵母表达中使用的其它载体和启动子进一步记载于Fleer等，Gene 107：285(1991)。适用于酵母及酵母转化方案的其它启动子和载体是本领域中公知的。酵母转化方案是公知的。一种此类方案记载于Hinnen等，Proc Natl Acad Sci 75：1929(1978)。Hinnen方案在选择性培养基中选择Trp⁺转化体。

也可采用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统来表达重组抗体。原则上，任何高等真核细胞培养物都是可用的，无论来自脊椎动物培养物还是来自无脊椎动物培养物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞(Luckow等，Bio/Technology 6：47(1988)；Miller等，Genetics Engineering，Setlow等编，Vol.8，pp.277-9，Plenam Publishing(1986)；Mseda等，Nature 315：592(1985))。例如，可使用杆状病毒系统来生产异源蛋白质。在昆虫系统中，可使用苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)作为载体来表达外来基因。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可单独地将抗体编码序列克隆入病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并放置在AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。其它已经鉴定出的宿主包括伊蚊(Aedes)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和家蚕(Bombyx mori)。多种供转染用的病毒株是公众可获得的，例如AcNPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且依照本发明，此类病毒可作为本文中的病毒使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。此外，棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、及烟草的植物细胞培养物也作为宿主使用。

培养(组织培养)中的脊椎动物细胞和脊椎动物细胞的增殖已经变为常规的规程。参见Tissue Culture，Kruse等编，Academic Press(1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是猴肾；人胚肾系；幼年仓鼠肾细胞；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞；人宫颈癌瘤细胞(HELA)；犬肾细胞；人肺细胞；人肝细胞；小鼠乳房肿瘤；和NS0细胞。

宿主细胞用上文所述供抗体生产用的载体转化，并在为了诱导启动子、转录和翻译控制序列、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因而适当修改的常规营养培养基中培养。通常使用的启动子序列和增强子序列衍生自多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)。可使用自SV40病毒基因组衍生的DNA序列来提供用于在哺乳动物宿主细胞中表达结构基因序列的其它遗传元件，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接、和多腺苷酸化位点。病毒早期和晚期启动子是特别有用的，因为两者都易于自病毒基因组获得，作为还可包含病毒复制起点的片段。哺乳动物宿主细胞中使用的例示性表达载体是商品化的。

可在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化的培养基(诸如Ham氏F10(Sigma，St Louis，MO)、极限必需培养基(MEM，Sigma，StLouis，MO)、RPMI-1640(Sigma，St Louis，MO)、及Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM，Sigma，St Louis，MO)适于培养宿主细胞。另外，Ham等，MethEnzymol 58：44(1979)；Barnes等，Anal Biochem 102：255(1980)；及美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,560,655；5,122,469；5,712,163；或6,048,728中所述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可以在必要时补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐类(诸如X氯化物，其中X是钠、钙、镁；和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围中的终浓度存在的无机化合物)、及葡萄糖或等同能源。还可以包括本领域技术人员是已知的适当浓度的任何其它必需的补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的，而且对于普通技术人员是显而易见的。

编码抗体的多核苷酸

本发明进一步提供了包含编码本发明的抗体及其片段的核苷酸序列的多核苷酸或核酸，例如DNA。例示性多核苷酸包括那些编码包含一种或多种本文所述氨基酸序列的抗体链的。本发明还涵盖在严格的或严格性较低的杂交条件下与编码本发明抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

可通过本领域中已知的任何方法来获得多核苷酸并测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，若抗体的核苷酸序列是已知的，则可自化学合成的寡核苷酸装配编码抗体的多核苷酸(例如如记载于Kutmeier等，Bio/Techniques17：242(1994)中的)，简言之，这牵涉包含抗体编码序列的各部分的交叠寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和连接、和然后的通过PCR进行的连接得到的寡核苷酸的扩增。

或者，可从来自合适来源的核酸生成编码抗体的多核苷酸。若不可获得包含编码特定抗体的核酸的克隆，但抗体分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可化学合成或获自合适的来源(例如自如下组织或细胞生成的抗体cDNA文库或cDNA文库，或自如下组织或细胞分离的核酸，优选多A+RNA，所述组织或细胞是表达抗体的任何组织或细胞，诸如针对表达本发明的抗体而进行选择的杂交瘤细胞)，其通过使用可与序列的3’端和5’端杂交的合成引物进行的PCR扩增或通过使用用于鉴定例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆的、对特定基因序列特异的寡核苷酸探针进行的克隆实现。然后可使用本领域中公知的任何方法将通过PCR生成的扩增核酸克隆入可复制的克隆载体中。

一旦测定抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，抗体的核苷酸序列便可使用本领域中用于操作核苷酸序列的公知方法(例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如记载于Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1990)；Ausubel等编，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1998)中的技术，本文通过提及而将两者完整收录))来操作以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如以创建氨基酸替代、删除和/或插入。

在一个具体的实施方案中，可通过公知方法来检查重链和/或轻链可变域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列，例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较以确定序列高变性的区域来实现。使用常规重组DNA技术，可将一个或多个CDR插入框架区内，例如插入人框架区中以使非人抗体人源化，如上文所述的。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，并且优选人框架区(参见例如Chothia等，J Mol Biol 278：457(1998)，其关于人框架区的列表)。优选的是，通过组合框架区和CDR而生成的多核苷酸编码特异性结合本发明多肽的抗体。优选的是，如上文所述，可在框架区内产生一处或多处氨基酸替代，并且优选的是，氨基酸替代改善抗体对其抗原的结合。另外，此类方法可用于产生一个或多个参与链内二硫键的可变区半胱氨酸残基的氨基酸替代或删除以生成缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。对多核苷酸的其它改变是本发明所涵盖的，并且在本领域技术内。

另外，可使用为生成“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，Proc NatlAcad Sci 81：851(1984)；Neuberger等，Nature 312：604(1984)；Takeda等，Nature314：452(1985))，其通过将来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起来实现。如上文所述，嵌合抗体是其中不同部分自不同动物物种衍生的分子，诸如那些具有自鼠单抗衍生的可变区和人免疫球蛋白恒定区的，例如人源化抗体。

或者，为生成单链抗体而描述的技术(美国专利No.4,946,778；Bird，Science 242：423(1988)；Huston等，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879(1988)；及Ward等，Nature 334：544(1989))可适应生成单链抗体。如下形成单链抗体，即经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段，导致单链多肽。还可使用用于在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等，Science 242：1038(1988))。

生产抗刻缺蛋白3抗体的方法

本发明的抗体可通过本领域中用于合成抗体的任何已知方法，特别是通过化学合成或优选通过重组表达技术来生产。

本发明的抗体、或其片段、衍生物或类似物(例如本发明的抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达要求构建包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码抗体分子的多核苷酸，便可通过重组DNA技术来生成供抗体生产用的载体。构建包含抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。

通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养经转染的细胞以生成本发明的抗体。在本发明的一个方面中，可在宿主细胞中共表达编码重链和轻链两者的载体以表达整个免疫球蛋白分子，如下文所详述的。

可使用多种宿主-表达载体系统来表达上文所述本发明的抗体分子。此类宿主-表达系统表示可藉此生成、随后纯化感兴趣的编码序列的媒介，而且还表示可在用合适的核苷酸编码序列转化或转染后原位表达本发明的抗体分子的细胞。细菌细胞(诸如大肠杆菌)和真核细胞常用于表达重组抗体分子，尤其用于表达完整的重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞(诸如CHO)(连同载体，诸如来自人巨细胞病毒的主要的中间早期基因启动子元件)是有效的抗体表达系统(Foecking等，Gene 45：101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990))。

另外，可选择如下宿主细胞株，其调控插入序列的表达或以想要的特异性(specific)方式修饰和加工基因产物。对蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性的和特异性的(specific)的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保对所表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用如下真核宿主细胞，其拥有用于正确加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机器(cellular machinery)。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤细胞。

为了重组蛋白的长期高产率生产，优选稳定的表达。例如，可工程化改造稳定表达抗体分子的细胞系。宿主细胞可用由合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标志转化，而非使用包含病毒复制起点的表达载体。导入外来DNA之后，可容许工程化细胞在滋养培养基中生长1至2天，然后转换成选择性培养基。重组质粒中的选择标志赋予对选择的抗性，而且容许细胞稳定地将质粒整合入其染色体中，并生长以形成转化灶，继而其可被克隆和扩增成细胞系。这种方法可有利地用于工程化改造表达抗体分子的细胞系。此类工程化细胞系在筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的化合物中可能是特别有用的。

可使用许多选择系统，包括但不限于可分别在tk、hgprt或aprt细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等，Proc Natl Acad Sci USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 22：817(1980))基因。还有，可使用抗代谢物抗性作为选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等，Proc Natl Acad Sci USA 77：357(1980)；O’Hare等，Proc Natl Acad Sci USA78：1527(1981))；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等，Proc Natl Acad SciUSA 78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu等，Biotherapy3：87(1991))；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30：147(1984))。可常规地应用重组DNA技术领域中普遍知道的方法来选择想要的重组克隆，而且此类方法记载于例如Ausubel等编，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons(1993)；Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press(1990)；及第12章和第13章，Dracopoli等编，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons(1994)；Colberre-Garapin等，J Mol Biol 150：1(1981)，本文通过提及将它们完整收录。

抗体分子的表达水平可通过载体扩增来提高(关于综述，参见Bebbington等，“The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells，”DNA Cloning，Vol.3.Academic Press(1987))。若表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的，则宿主细胞培养中存在的抑制剂的水平升高会提高标志基因的拷贝数。由于所扩增的区域与抗体基因相连，抗体的生产也会提高(Crouse等，Mol Cell Biol 3：257(1983))。

可用两种本发明的表达载体(第一种载体编码重链衍生的多肽而第二种载体编码轻链衍生的多肽)共转染宿主细胞。两种载体可包含相同的选择标志，其使重链和轻链多肽能够相等的表达。或者，可使用编码和能够表达重链和轻链多肽两者的单一载体。在此类情形中，轻链应当放置在重链之前以避免过量的有毒的游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，ProcNatl Acad Sci USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。

一旦本发明的抗体分子已经由动物生成、化学合成或重组表达，其便可通过本领域中用于纯化免疫球蛋白分子的任何已知方法(例如通过层析(例如离子交换层析、亲和层析特别是通过蛋白A之后对特定抗原的亲和层析、和大小排阻层析)、离心、差别溶解度)或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术来纯化。另外，本发明的抗体或其片段可与本文所述的或本领域中其它方面所知的异源多肽序列融合以便于纯化。

本发明涵盖与多肽重组融合的或化学偶联的(包括共价的和非共价的偶联两者)抗体。可使用融合的或偶联的本发明的抗体以易于纯化。参见例如PCT公开文本WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，Immunol Lett 39：91(1994)；美国专利No.5,474,981；Gillies等，Proc Natl Acad Sci USA 89：1428(1992)；Fell等，J Immunol 146：2446(1991)，通过提及而将它们完整收录。

此外，本发明的抗体或其片段可与标志序列(诸如肽)融合以便于纯化。在优选的实施方案中，标志氨基酸序列是六组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)中所提供的标签等，其中许多是商品化的。例如，如Gentz等，Proc Natl Acad Sci USA 86：821(1989)中所记载的，六组氨酸为融合蛋白提供便利的纯化。对纯化有用的其它肽标签包括但不限于“HA”标签(其对应于自流感血凝素蛋白衍生的表位(Wilson等，Cell 37：767(1984))和“flag”标签。

抗体纯化

在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌入培养基中。若抗体在细胞内生成，则作为第一步，通过例如离心或超滤来除去颗粒碎片(或是宿主细胞或是溶胞碎片)。Carter等，Bio/Technology10：163(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简言之，在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA、及苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下在约30分钟里融化细胞浆。细胞碎片可以通过离心来除去。若抗体被分泌入培养基中，则一般首先使用商品化的蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)来浓缩来自此类表达系统的上清液。任何上述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。

自细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、及亲和层析来纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。作为亲和配体的蛋白A的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1(1983))。蛋白G推荐用于所有的小鼠同种型和人IgG3(Guss等，EMBO J.5：1567(1986))。亲和配体所附着的基质最经常是琼脂糖，但其它基质是可用的。机械稳定的基质(诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)容许获得比琼脂糖所能实现的更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker；Phillipsburg，N.J.)对于纯化是有用的。其它用于蛋白质纯化的技术(诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如多天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、及硫酸铵沉淀)也是可用的，这取决于待回收的抗体。

任何初步的纯化步骤后，包含感兴趣抗体和污染物的混合物可以进行低pH疏水相互作用层析，其中使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)实施。

药物配制剂

可通过将具有期望纯度的多肽与任选的在本领域中通常采用的“药学可接受的”载体、赋形剂或稳定剂(均称为“赋形剂”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张调节剂(isotonifier)、非离子型去污剂、抗氧化剂和其它各式各样的添加剂)混合来制备多肽或抗体的治疗用配制剂，以冻干配制剂或水溶液的形式供贮存。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，编(1980)。此类添加剂在所采用的剂量和浓度对接受者必须是无毒的。

缓冲剂帮助将pH维持在接近生理学条件的范围内。它们优选以约2mM至约50mM的浓度存在。适于与本发明一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可提及磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐诸如Tris。

可添加防腐剂来延迟微生物生长，并可以0.2％-1％(w/v)范围的量添加。适于与本发明一起使用的防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄基铵、苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、氯化己烷双铵、和对羟基苯甲酸烃基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、和3-戊醇。

可添加等张调节剂(有时称为“稳定剂”)以确保本发明的液体组合物的等张力，并且等张调节剂包括多羟基糖醇，优选三羟基的或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。

稳定剂指广泛种类的赋形剂，其在功能方面可从填充剂(bulking agent)变化至使治疗剂溶解或有助于防止变性或对容器壁的粘着的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上文列举的)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌肉肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇诸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质诸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，诸如棉子糖；和多糖，诸如右旋糖苷。稳定剂可以0.1至10,000份重量每份活性蛋白质重量的范围存在。

可添加非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及以保护治疗用蛋白质免于搅动诱导的聚集，其还容许配制剂在暴露于剪切表面应力时不引起蛋白质变性。合适的非离子型表面活性剂包括Polysorbate(20，80等)、Polyoxamer(184，188等)、Pluronic.RTM.多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖单醚(TWEEN-

TWEEN-

等)。非离子型表面活性剂可以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。

别的各式各样的赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。本文中的配制剂还可含有超过一种对于所治疗的特定适应症必需的活性化合物，优选那些具有互补活性且彼此不会不利影响的。例如，进一步提供免疫抑制剂可能是想要的。此类分子适合以对意图的目的有效的量组合存在。活性成分还可以封装于通过例如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，胶体药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osal，编(1980)中。

有待用于体内施用的配制剂应当是无菌的。这易于通过例如流经无菌滤膜的过滤来实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和-L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸使分子能够释放超过100天，但是某些水凝胶在较短的时间段释放蛋白质。在所封装的抗体在体内维持长时间时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿而变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性变化。根据所涉及的机制，可设计合理策略来稳定化。例如，若发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，则可通过修饰硫氢基、自酸性溶液冻干、控制湿度、使用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来稳定化。

治疗用多肽、抗体或其片段有效治疗特定病症或疾患的量会取决于病症或疾患的性质，并可通过标准临床技术来确定。若有可能的话，希望首先在体外，接着在有效的动物模型系统中测定本发明药物组合物和剂量-响应曲线，之后在人体内测试。

在一个优选的实施方案中，治疗用多肽、抗体或其片段的水溶液通过皮下注射来施用。每剂可在每千克体重约0.5μg至约50μg，或更优选地，每千克体重约3μg至约30μg的范围内。

皮下施用的剂量给药日程表可自一月一次变化至一日一次，这取决于许多临床因素，包括疾病的类型、疾病的严重程度和受试者对治疗剂的敏感性。抗刻缺蛋白3抗体的治疗用途

本发明涵盖的是，本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，例如出于获得临床前数据的目的，给非人哺乳动物施用抗体。有待治疗的例示性非人哺乳动物包括在其中进行临床前研究的非人灵长类、犬、猫、啮齿类和其它哺乳类。此类哺乳动物可以是为有待用抗体治疗的疾病建立的动物模型，或者可用于研究感兴趣抗体的毒性。在每个这些实施方案中，可对哺乳动物进行剂量放大研究。

单独地或与细胞毒性因子联合地施用的抗体(具有或没有与其偶联的治疗性模块)可作为治疗剂使用。本发明涉及基于抗体的疗法，其牵涉给动物、哺乳动物、或人施用本发明的抗体以治疗刻缺蛋白3介导的疾病、病症或疾患。动物或受试者可以是需要特定治疗的哺乳动物，诸如已经诊断为患有特定病症(例如涉及刻缺蛋白3的病症)的哺乳动物。针对刻缺蛋白3的抗体对哺乳动物(包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、犬、非人灵长类等)以及人中的癌症和其它刻缺蛋白3相关疾病是有效的，包括神经学病症、糖尿病、类风湿性关节炎、血管相关疾病和Alagille综合征。例如，通过施用治疗可接受剂量的本发明的抗刻缺蛋白3抗体、抗体、或本发明抗体的混合物，或与不同来源的其它抗体的组合，可在所治疗的哺乳动物(特别是人)中改善或预防疾病症状。

本发明的治疗用化合物包括但不限于本发明的抗体(包括如本文中所描述的其片段、类似物和衍生物)和下文所描述的编码本发明抗体(包括如本文中所描述的其片段、类似物和衍生物及抗独特型抗体)的核酸。本发明的抗体可用于治疗、抑制、或预防与刻缺蛋白3的异常表达和/或活性有关的疾病、病症或疾患，包括但不限于任何一种或多种本文中所描述的疾病、病症或疾患。与刻缺蛋白3的异常表达和/或活性有关的疾病、病症或疾患的治疗和/或预防包括但不限于减轻至少一种与那些疾病、病症或疾患有关的症状。可在本领域中已知的或本文中所描述的药学可接受组合物中提供本发明的抗体。

可在多种疾病中在治疗上使用本发明的抗刻缺蛋白3抗体。本发明提供了一种用于预防或治疗哺乳动物中刻缺蛋白3介导的疾病的方法。该方法包括给哺乳动物施用疾病预防或治疗量的抗刻缺蛋白3抗体。抗刻缺蛋白3抗体结合刻缺蛋白3，并拮抗其功能。已经将刻缺蛋白3信号传导与多种疾病诸如多种癌症(Haruki等，Cancer Res 65：3555(2005)；Park等，Cancer Res 66：6312(2006)；Lu等，Clin Cancer Res 10：3291(2004)；Hedvat等，Br J Haematol122：728(2003)；Buchler等，Ann Surg 242：791(2005)；Bellavia等，Proc NatlAcad Sci USA 99：3788(2002)；Screpanti等，Trends Mol Med 9：30(2003)；vanLimpt等，Cancer Lett 228：59(2005))、神经学病症(Joutel等，Nature 383：707(1996))、糖尿病(Anastasi等，J Immunol 171：4504(2003))、类风湿性关节炎(Yabe等，J Orthop Sci 10：589(2005))、血管相关疾病(Sweeney等，FASEB J18：1421(2004))和Alagille综合征(Flynn等，J Pathol 204：55(2004))联系起来。抗刻缺蛋白3抗体还可有效预防上文提及的疾病。

会有效治疗、抑制、和预防与刻缺蛋白3的异常表达和/或活性有关的疾病或病症的抗体量可通过标准临床技术来确定。剂量会取决于有待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、是出于预防目的还是治疗目的施用抗体、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断。抗体可以以与疾病相符的治疗方案施用，例如一天至数天里的单剂或几剂用以改善疾病状态或延长的时间里的周期性剂量用以抑制疾病进展和预防疾病复发。另外，可任选地采用体外测定法来帮助鉴定最佳的剂量范围。配制剂中有待采用的精确剂量也会取决于施用路径和疾病或病症的严重性，并且应当依照从业人员的判断和每位患者的情况来决定。有效剂量可从自体外或动物模型测试系统衍生的剂量-响应曲线外推。

对于抗体，给患者施用的剂量通常是0.1mg/kg至150mg/kg患者体重。优选的是，给患者施用的剂量介于0.1mg/kg和20mg/kg患者体重之间，更优选1mg/kg至10mg/kg患者体重。一般而言，由于对外来多肽的免疫应答，人抗体比来自其它物种的抗体具有更长的在人体内的半衰期。如此，人抗体剂量较低和施用频率较少通常是有可能的。此外，可通过修饰诸如例如脂化(lipidation)来增强抗体的摄取和组织穿透(例如进入脑中)，从而降低本发明抗体的施用剂量和频率。对于数天或更长时间里的重复施用，根据状况，持续治疗直至出现期望的对疾病症状的遏制。然而，其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进程易于通过常规技术和测定法监测。

可以以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用抗体组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。有待施用的抗体的“治疗有效量”会由此类考虑因素决定，并且是预防、改善、或治疗疾病或病症所必需的最低限度量。不是必需而是任选将抗体与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与之前所用相同剂量和施用路径使用，或是之前所采用剂量的大约1-99％。

本发明的抗体可单独地或与其它类型的癌症治疗联合地施用，所述其它类型的癌症治疗包括常规化疗剂(帕利他塞(paclitaxel)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和多柔比星(doxorbicin))、抗EGFR药剂(吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和西妥昔单抗(cetuximab))、抗血管发生剂(贝伐单抗(bevacizumab)和舒尼替尼(sunitinib))、以及免疫调节剂(诸如干扰素-α和沙利度胺(thalidomide))。

在一个优选的方面，抗体是基本上纯化的(例如基本上没有限制其效果或产生不想要的副作用的物质)。

多种投递系统是已知的，并且可用于施用本发明的抗体，包括注射，例如封装在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如Wu等，J Biol Chem 262：4429(1987))、构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。

抗刻缺蛋白3抗体可以任何可接受方式给哺乳动物施用。导入方法包括但不限于胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、硬膜外、吸入和口服路径，以及(若免疫抑制治疗想要的话)损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、真皮内、静脉内、动脉内或腹膜内施用。抗体或组合物可通过任何常规路径来施用，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(lining)(例如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是系统的或局部的。另外，可能想要的是，通过任何合适的路径(包括脑室内和鞘内注射)将本发明的治疗用抗体或组合物导入中枢神经系统中；可由例如附接至贮器(诸如Ommaya贮器)的脑室内导管来促进脑室内注射。另外，抗体适合通过脉冲输注施用，特别是递减剂量的抗体。优选的是，剂量给药通过注射给予，最优选通过静脉内或皮下注射给予，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。

还可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器和含雾化剂(aerosolizing agent)的配制剂实现。抗体还可以以干粉组合物形式施用入患者的肺中(参见例如美国专利No.6,514,496)。

在一个具体的实施方案中，可能想要的是，向需要治疗的区域局部施用本发明的治疗用抗体或组合物；这可通过例如而非限于局部输注、表面应用来实现，其通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物进行，所述植入物是多孔的、非多孔的或凝胶状的材料，包括膜(诸如硅橡胶膜(sialasticmembrane))或纤维。优选的是，在施用本发明的抗体时，必须小心的是，使用蛋白质不吸附的材料(materials to which the protein does not absorb)。

在另一个实施方案中，抗体可在媒介中投递，特别是在脂质体中(参见Langer，Science 249：1527(1990)；Treat等，于Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein等编，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，pp.317-27；通常参见如上)。

在又一个实施方案中，抗体可在受控释放系统中投递。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，Science 249：1527(1990)；Sefton，CRC Crit RefBiomed Eng 14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，NEngl J Med 321：574(1989))。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer等编，CRC Press(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen等编，Wiley(1984)；Ranger等，J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23：61(1983)；还可参见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann Neurol25：351(1989)；Howard等，J Neurosurg 71：105(1989))。在又一个实施方案中，受控释放系统可放置在治疗靶的附近。

本发明还提供了药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的抗体和生理学可接受载体。在一个具体的实施方案中，术语“生理学可接受的”指获得联邦或州政府管理机构批准的或美国药典或其它公认的药典中列举的，在动物中，更具体地在人中使用的。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或媒介。此类生理学载体可以是无菌的液体，诸如水和油，包括那些石油、动物、植物、或合成起源的，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖和甘油溶液也可作为液体载体使用，特别是对于可注射的溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。组合物(若想要的话)还可包含极少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放配制剂等形式。组合物可配制为栓剂，其具有传统的粘合剂和载体诸如甘油三(酸)酯。口服配制剂可包括标准载体诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适载体的例子记载于E.W. Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”。此类组合物会包含有效量的抗体(优选以纯化形式)，以及合适量的载体，以便提供用于向患者适当施用的形式。配制剂应当适合施用模式。

在一个实施方案中，依照常规规程将组合物配制为适应向人类静脉内施用的药物组合物。通常，供静脉内施用用的组合物是无菌的等张的水缓冲液中的溶液。在必需时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂(诸如利多卡因(lignocaine)，用以减轻注射位置的疼痛)。一般而言，在单位剂量形式中分开地或混合在一起地提供各成分，所述单位剂量形式例如在指明活性剂数量的密封容器(诸如安瓿或小袋(sachette))中的干燥的冻干粉或无水浓缩物。在组合物要通过输注来施用时，其可用含有无菌的药用级水或盐水的输液瓶来分配。在组合物通过注射来施用时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可在施用前被混合各成分。

本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含装有本发明药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。与此类容器任选地结合的可以是以由管理药物或生物学产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映该制造、使用或销售管理机构人体施用的批准。

另外，本发明的抗体可以与多种效应器分子(诸如异源多肽、药物、放射性核苷酸或毒素)偶联。参见例如PCT公开文本WO 92/08495；WO91/14438；WO 89/12624；美国专利No.5,314,995；及EP 396,387。抗体或其片段可以与治疗性模块诸如细胞毒素(例如抑制细胞剂或杀细胞剂)、治疗剂、或放射性金属离子(例如α-发射体诸如例如213Bi)偶联。细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害的药剂。例子包括帕利他塞(paclitaxol)、松胞菌素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质(激)素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌罗霉素(puromycin)及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)氨烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)和洛莫司汀(lomustine，CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链唑霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺式-二氯二氨铂(II)(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(daunorubicin)(以前为道诺霉素(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin))、抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)(以前为放射菌素(actinomycin))、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、和安曲霉素(anthramycin，AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。

用于将此类治疗性模块偶联至抗体的技术是公知的，参见例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld等编，pp.243-56 Alan R.Liss(1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，于Controlled DrugDelivery，第2版，Robinson等编，pp.623-53，Marcel Dekker(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review，”于Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等编，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy，”于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection and Therapy，Baldwin等编，pp.303-16，Academic Press(1985)；及Thorpe等，Immunol Rev 62：119(1982)。或者，抗体可以偶联第二抗体以形成抗体异源偶联物。参见例如美国专利No.4,676,980。

本发明的偶联物可用于修饰给定的生物学应答，治疗剂或药物模块不应解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物模块可以是具有期望生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如毒素，诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator)、凋亡剂例如TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际公开文本No.WO 97/33899)、AIM II(参见国际公开文本No.WO97/34911)、Fas配体(Takahashi等，Int Immunol，6：1567(1994))、VEGI(参见国际公开文本No.WO 99/23105)；血栓形成剂(thrombotic agent)；抗血管生成剂(anti-angiogenic agent)，例如血管他丁(angiostatin)或内皮他丁(endostatin)；或生物学应答改性剂(biological response modifier)，诸如例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。

制品

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制品。所述制品包括容器和标签。合适的容器包括例如药瓶、管形瓶、注射器和试管。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器装有有效预防或治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的活性剂是抗体。容器上的或与容器有关的标签指明该组合物用于治疗所选择的疾患。制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。其可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和印有使用说明的包装插页

基于抗体的基因疗法

在本发明的另一个方面，经由基因疗法，施用包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸来治疗、抑制或预防与刻缺蛋白3的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。基因疗法指通过给受试者施用所表达的或可表达的核酸而进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸生成其编码的介导治疗效果的蛋白质。依照本发明，可使用可获得的用于基因疗法的任何方法。下文描述了例示性的方法。

关于基因疗法的方法的一般性综述，参见Goldspiel等，Clinical Pharmacy12：488(1993)；Wu等，Biotherapy 3：87(1991)；Tolstoshev，Ann Rev PharmacolToxicol 32：573(1993)；Mulligan，Science 260：926(1993)；Morgan等，Ann RevBiochem 62：191(1993)；May，TIBTECH 11：155(1993)。

在一个方面，化合物包含编码抗体的核酸序列，所述核酸序列是在合适的宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的一部分。具体地，此类核酸序列具有与抗体编码区可操作连接的启动子，所述启动子是诱导型的或组成型的，并且任选是组织特异性的。

在另一个具体的实施方案中，使用如下核酸分子，其中抗体编码序列和任何其它想要的序列侧翼有促进基因组中想要的位点处的同源重组的区域，如此提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller等，Proc Natl Acad Sci USA86：8932(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435(1989))。在具体的实施方案中，所表达的抗体分子是单链抗体；或者，核酸序列包含编码抗体的重链和轻链两者或其片段的序列。

核酸进入患者中的投递可以是直接的(在这种情况中使患者直接暴露于核酸或携带核酸的载体)，或间接的(在这种情况中首先在体外用核酸转化细胞，然后移植入患者中)。这两种方法分别称为体内或回体(ex vivo)基因疗法。

在一个具体的实施方案中，将核酸序列直接在体内施用，在那里其被表达以生成编码产物。这可通过本领域中已知的许多方法之任一种来实现，例如通过将它们构建为合适的核酸表达载体的一部分，并施用该核酸表达载体使得它们变为细胞内的，其如下实现，即例如通过使用缺陷的或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体进行的感染(参见美国专利No.4,980,286)，或通过裸DNA的直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，封装在脂质体、微粒或微胶囊中，或通过与已知进入细胞核的肽联合地施用所述核酸序列，通过与经历受体介导的胞吞的配体联合地施用所述核酸序列(参见例如Wu等，J Biol Chem262：4429(1987))(其可用于靶向特异性表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中配体包含破坏内体的促融性病毒肽，这让核酸避免溶酶体降解。在又一个实施方案中，可在体内靶向核酸以进行细胞特异性摄取和表达，这通过靶向特异性受体实现(参见例如PCT公开文本WO 92/06180；WO 92/22635；WO92/20316；WO93/14188，WO93/20221)。或者，可将核酸导入细胞内，并掺入宿主细胞DNA内进行表达，这通过同源重组实现(Koller等，Proc Natl Acad Sci USA 86：8932(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435(1989))。

在一个具体的实施方案中，使用包含编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等，Meth Enzymol 217：581(1993))。这些逆转录病毒包含对于正确包装病毒基因组和整合入宿主细胞DNA中必需的构件。将编码要在基因疗法中使用的抗体的核酸序列克隆入一种或多种载体中，所述载体促进基因进入患者中的投递。更多关于逆转录病毒载体的详情可在Boesen等，Biotherapy 6：291(1994)中找到，该文献记载了使用逆转录病毒载体来投递mdrl基因至造血干细胞，以便使干细胞对化学疗法更具抗性。其它说明逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的参考文献是：Clowes等，J Clin Invest 93：644(1994)；Kiem等，Blood 83：1467(1994)；Salmons等，Human Gene Therapy 4：129(1993)；及Grossman等，Curr Opin Gen and Dev3：110(1993)。

本发明中也可使用腺病毒。腺病毒在本发明中是尤其具有吸引力的媒介物，用于将抗体投递至呼吸道上皮。腺病毒在天然情况中感染呼吸道上皮。基于腺病毒的投递系统的其它靶物是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky等，Curr Opin Gen Dev3：499(1993)呈现了基于腺病毒的基因疗法的综述。Bout等，Human GeneTherapy 5：3(1994)证明了腺病毒载体将基因转移至猕猴的呼吸道上皮的应用。腺病毒在基因疗法中的应用的其它例子可在Rosenfeld等，Science 252：431(1991)；Rosenfeld等，Cell 68：143(1992)；Mastrangeli等，J Clin Invest 91：225(1993)；PCT公开文本WO94/12649；Wang等，Gene Therapy 2：775(1995)中找到。还提出了腺病毒伴随病毒(AAV)在基因疗法中的应用(Walsh等，Proc SocExp Biol Med 204：289(1993)；美国专利No.5,436,146；6,632,670；及6,642,051)。

基因疗法的另一种方法牵涉通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法将基因转移至组织培养中的细胞。通常，转移的方法包括选择标志向细胞的转移。然后将细胞放置在选择之下以分离那些已经摄取并正在表达所转移的基因的细胞。然后将那些细胞投递至患者。

在这个实施方案中，将核酸导入细胞中，之后在体内施用所得的重组细胞。此类导入可通过本领域中已知的任何方法来实施，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌体载体进行的感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。许多用于将外来基因导入细胞中的技术是本领域已知的(参见例如Loeffler等，Meth Enzymol 217：599(1993)；Cohen等，Meth Enzymol 217：618(1993)；Cline，Pharmac Ther 29：69(1985))，并可依照本发明使用，只要受体细胞必需的发育和生理学功能没有遭到破坏。所述技术应当提供核酸向细胞的稳定转移，使得所述核酸可由所述细胞表达，并且优选地，可由其细胞后代遗传和表达。

所得的重组细胞可通过本领域中已知的多种方法投递至患者。重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选静脉内施用。所使用的细胞量取决于想要的效果、患者状态等，并可由本领域技术人员确定。

出于基因疗法的目的可在其中导入核酸的细胞包括任何想要的、可获得的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如如自骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的。

在一个实施方案中，用于基因疗法的细胞是患者自体的。将编码本发明抗体的核酸序列导入细胞中，使得它们可由所述细胞或其后代表达，然后为了治疗效果在体内施用重组细胞。在一个具体的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。依照本发明的这个实施方案，可潜在地使用可在体外分离和维持的任何干细胞和/或祖细胞(参见例如PCT公开文本WO 94/08598；Stemple等，Cell 71：973(1992)；Rheinwald，Meth Cell Bio 21 A：229(1980)；Pittelkow等，Mayo Clinic Proc 61：771(1986))。

实施例

实施例1：免疫原刻缺蛋白3胞外域-Fc融合蛋白的生成

使用重组刻缺蛋白3-Fc融合蛋白作为免疫原，生成特异性结合人刻缺蛋白3 LIN12/二聚化域(此后称为“LD”)的抗刻缺蛋白3单克隆抗体，所述免疫原包含在羧基端末端融合有γ1Fc区的刻缺蛋白3LD。具体地，该免疫原包含刻缺蛋白3LD氨基酸残基1378至1640(参见图1)和人γ1Fc融合蛋白(刻缺蛋白3LD/Fc)。生成包含刻缺蛋白3中氨基酸残基43至1377的EGF重复区的对照抗体(称为255A-79)。

使用基于因特网的搜索软件和服务(基序搜索，http://motif.genome.jp/)来分析刻缺蛋白3蛋白质序列。使用标准商品化cDNA合成试剂盒，使用人肝和胰RNA(Ambion，Inc.Austin，TX)作为模板来合成cDNA的第一条链。在存在甜菜碱(1-2M)和DMSO(5％)的情况中PCR扩增编码刻缺蛋白3LD和EGF重复区的cDNA。将PCR合成的刻缺蛋白3-LD DNA片段(约0.8kb)和刻缺蛋白3-EGF重复DNA片段(约4kb)克隆入表达载体中，所述表达载体包含商品化载体pSec或商品化载体pCD3.1(各带有不同的抗生素标志)中的His-γ1Fc。这种克隆导致两种表达质粒，一种表达刻缺蛋白3-LD/Fc融合蛋白，而另一种表达刻缺蛋白3-EGF/Fc融合蛋白。

为了促进质粒构建并增强各种刻缺蛋白3重组蛋白的表达，生成与前导肽序列对应的、包含刻缺蛋白3核酸编码序列的前135个碱基对的寡核苷酸。这些寡核苷酸包含摆动编码位置中的一些变化以降低GC含量。所有的核苷酸序列变化是沉默的，即没有氨基酸序列变化(图14A)。将寡核苷酸一起退火后，通过PCR-SOE将工程化前导肽编码序列连接至编码序列的剩余部分(Ho等，Gene 77：51(1989)；Horton等，BioTechniques 8：528(1990))(参见图15)。在刻缺蛋白3-LD/Fc和刻缺蛋白3表达构建体中使用这种前导肽编码序列。因此，两种Fc融合蛋白都包含连接至N端的信号肽和融合至C端的人γ1Fc序列。图14和SEQ ID NO：6中显示了刻缺蛋白3-LD(包括前导肽)的氨基酸序列。

分别通过刻缺蛋白3表达质粒向293T(ATCC号CRL-11268，Manassas，VA)和CHO细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的瞬时转染来检验刻缺蛋白3-EGF/Fc和刻缺蛋白3-LD/Fc融合蛋白的表达。转染前，将细胞培养于含有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、和1x必需氨基酸溶液的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)生长培养基中，接着在6孔平板中每孔接种约3-5×10⁵个细胞，并培养约24小时。使用Lipofectamine 2000转染系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)遵照制造商的方案，将3μg每种刻缺蛋白3融合蛋白表达质粒转染入每孔中的细胞中。转染后，将细胞培养于新鲜的生长培养基中，并培养在CO₂培养箱中达约40-48小时，之后进行刻缺蛋白3融合蛋白表达分析。或者，转染后，将细胞培养在生长培养基中达3-4小时，然后转换成含有2％FCS的DMEM培养基，并培养约60-66小时，之后吸取条件化培养基以进行分泌性蛋白质分析。

为刻缺蛋白3-LD/Fc(His-Fcγ/pSec载体)和刻缺蛋白3-EGF/Fc(His-Fcγ/pSec载体)两者生成稳定细胞系。将每种质粒转染入CHO细胞中。转染后，将细胞培养于DMEM生长培养基中过夜，然后转换成含有800μg/ml潮霉素的生长培养基，并培养至少两周，直至通过抗生素消除不携带刻缺蛋白3表达质粒的细胞。对来自稳定细胞系的条件化培养基进行Western印迹分析。

对稳定或瞬时转染的细胞测定刻缺蛋白3-LD/Fc或刻缺蛋白3-EGF/Fc融合蛋白的表达和分泌。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将自培养皿收获的转染细胞清洗一次，并重悬于去离子水中，与等体积的2x蛋白质样品加载缓冲液(BioRad，Hercules，CA)混合，然后在约100℃加热10分钟。使用条件化培养基来分析分泌性蛋白质，所述条件化培养基与等体积的2x蛋白质样品加载缓冲液混合并在100℃加热10分钟。使用4-15％梯度SDS-PAGE来将样品分开。将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜(BioRad，Hercules，CA)，所述PVDF膜在PBST(含有0.05％TWEEN-

的PBS)中的5％脱脂奶粉中封闭至少1小时，之后进行蛋白质的转移。

通过与封闭缓冲液中的γFc特异性的、偶联有HRP的抗体(Sigma，St Louis，MO)一起在室温温育1小时来检测刻缺蛋白3-EGF/Fc和刻缺蛋白3-LD/Fc融合蛋白。在PBST中将膜清洗3次，并用化学发光底物显影。

对于刻缺蛋白3结构域/Fc融合蛋白纯化，将上文所述CHO稳定细胞系培养于含有2％FCS的DMEM中长达5天。收集1L条件化培养基，并为亲和结合进行蛋白A珠填充柱层析。用PBS清洗该柱，并在50mM柠檬酸盐缓冲液(pH2.8)中洗脱所结合的蛋白质，并通过添加1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)将pH调至中性。通过使用4-15％梯度SDS-PAGE的蛋白质凝胶分析来评估蛋白质的纯度。使用考马斯蓝试剂遵照制造商的方案(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。经由该规程，纯化了毫克量的刻缺蛋白3-LD/Fc和刻缺蛋白3-EGF/Fc蛋白，用于免疫和ELISA结合测定法。

实施例2：抗刻缺蛋白3单抗的生成

给8-12周龄雄性A/J小鼠(Harlan，Houston，TX)皮下注射200μl PBS中的完全弗氏佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)中的25μg刻缺蛋白3-EGF/Fc或刻缺蛋白3-LD/Fc。注射后2周和处死前3天，再次给小鼠腹膜内注射PBS中的25μg相同抗原。对于每种融合物，自免疫小鼠的脾制备单细胞悬液，并用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合；在含有50％聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak，Rochester，NY)和5％二甲亚砜(Sigma，St.Louis，MO)的培养基中融合5×10⁸个Sp2/0和5×10⁸个脾细胞。然后将细胞在Iscove培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中调节至每200μl悬液1.5×10⁵个脾细胞的浓度，所述Iscove培养基补充有10％胎牛血清、100个单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、和16μM胸苷。将200μl细胞悬液添加至约60块96孔平板的每个孔。约10天后，取出培养物上清液，用于使用ELISA来筛选其抗体结合活性。

使用100μl含有1x酚红和3-4滴/L pHix(Pierce，Rockford，IL)的(PBS)中的刻缺蛋白3-EGF/Fc或刻缺蛋白3-LD/Fc(0.1μg/ml)并在室温温育过夜来包被96孔平底Immulon II微量测试板(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)。在通过轻拍平板来除去包被溶液后，将200μl封闭缓冲液添加至每孔达1小时以封闭非特异性结合，所述封闭缓冲液在含有0.1％硫柳汞的PBST中含有2％BSA。然后用PBST清洗孔。自每个融合孔收集50μl培养物上清液，并与50μl封闭缓冲液混合，然后添加至微量滴定板的各个孔。温育1小时后，用PBST清洗孔。然后通过偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的、Fc特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)的反应来检测所结合的鼠抗体。将含有0.1％3，3，5，5-四甲基联苯胺和0.0003％过氧化氢的HRP底物溶液添加至孔中达30分钟，用于显色。通过添加50ml/孔2M H₂SO₄来终止反应。用ELISA读板仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取450nm处的OD。

在185个所分离并分析的杂交瘤中，来自用刻缺蛋白3-LD/Fc免疫的小鼠的2种杂交瘤克隆生成刻缺蛋白3拮抗性抗体，其进行进一步表征。使用来自生成单抗256A-4和256A-8的两种杂交瘤克隆的上清液的ELISA显示了对纯化的刻缺蛋白3LD/Fc融合蛋白的强烈结合活性，而对人Notch1-LD/Fc(在羧基末端与Fc区融合的LIN/二聚化域)或对照人Fc蛋白(数据未显示)没有结合(表1)，所述刻缺蛋白3LD/Fc融合蛋白就是用于生成所述单抗的免疫原。使用功能测定法的后续研究也表明，相对于刻缺蛋白1和刻缺蛋白2，单抗256A-4和256A-8特异性拮抗刻缺蛋白3(数据未显示)。

通过挑取单集落来进一步分离来自此初次ELISA筛选的阳性杂交瘤克隆，并进行上文所述再次ELISA测定法来证实对所选免疫原的特异性结合。在更大规模的培养物中扩大经证实的杂交瘤克隆。使用蛋白质A亲和柱，自这些大规模培养物的培养液纯化单克隆抗体(单抗)。然后使用基于细胞的结合测定法、显微术、Western印迹、和FACS分析来表征抗刻缺蛋白3单抗。

实施例3：抗刻缺蛋白3单抗的基于细胞的结合测定法

用于表征抗刻缺蛋白3单抗的基于细胞的结合测定法需要将全长人刻缺蛋白3可读框克隆入载体中(在这种情况中为pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen，Carlsbad，CA))。通过使用人肝肿瘤RNA(Ambion，Inc.，Austin，TX)作为模板的RT-PCR来合成刻缺蛋白3编码区。最终的质粒构建体即刻缺蛋白3/Hygro表达图1所示全长刻缺蛋白3蛋白。使用Lipofectamine 2000试剂盒遵照实施例1所述相同的规程，通过将刻缺蛋白3/Hygro质粒构建体转染入293T细胞(ATCC No.CRL-11268)中来生成表达刻缺蛋白3的稳定细胞系。转染后，将细胞在DMEM生长培养基中培养过夜，然后在含有200μg/ml潮霉素的生长培养基中再次接种，并培养12-14天。挑取良好分离的单集落，并在分开的孔中培养，直至扩增得到足够的克隆细胞。通过Western印迹分析，和通过使用多克隆抗刻缺蛋白3抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)的荧光电子显微术来鉴定对潮霉素选择有抗性而且表达高水平刻缺蛋白3蛋白的稳定293T克隆。

还通过PCR并亚克隆入pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中来构建仅包含刻缺蛋白LIN12/二聚化(LD)域和跨膜(TM)域的部分刻缺蛋白3表达质粒。这种质粒构建体还包含其C端的V5标签，并称为刻缺蛋白3-LDTM/V5。依照实施例1所述规程生成表达这种质粒即刻缺蛋白3-LDTM/V5的稳定细胞系。

还通过Western印迹证实天然表达刻缺蛋白3的人Sup-T1细胞系(ATCCNo.CRL-1942)。在含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1x必需氨基酸溶液的RPMI1640培养基中培养Sup-T1细胞。

使用FMAT^TM(荧光宏-共焦高通量筛选，fluorescence macro-confocalhigh-throughput screening)8100 HTS系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)遵照制造商提供的方案评估基于细胞的抗体结合。在96孔平板中接种天然表达刻缺蛋白3的或经刻缺蛋白3表达构建体稳定转染的细胞系。或者，在96孔平板中接种瞬时转染的293T或CHO细胞。以每孔30,000-50,000个细胞的密度接种细胞。在20-24小时后，将抗刻缺蛋白3单抗和1xPBS反应缓冲液添加至孔中，并在37℃温育1小时。在除去一抗后，在孔中添加偶联有Cy-5的抗小鼠IgG抗体。

还通过荧光激活细胞分选仪(FACS)，使用发明人内部生成的293T/刻缺蛋白3稳定细胞系和两种癌系即人Sup-T1和A2780细胞系(UK ECACC No.Cat.No.93112519)(两者都天然表达刻缺蛋白3(数据未显示))来评估基于细胞的抗体结合。首先将细胞与1x PBS中的抗刻缺蛋白3单抗一起温育。清洗3次后，将细胞与经荧光分子偶联的二抗一起温育。将细胞重悬，在含0.1％低聚甲醛的1x PBS中固定，并通过FACS(BD Sciences，Palo Alto，CA)来分析。结果指明两种单抗都结合培养细胞中自重组质粒构建体或作为天然蛋白质表达的刻缺蛋白3受体(表2)。然而，Western印迹显示在刻缺蛋白3受体或刻缺蛋白3-LD/Fc融合蛋白在SDS-PAGE中变性并转移至尼龙印迹膜时，抗刻缺蛋白3单抗不再结合，提示是构象性表位。还用上文所述免疫荧光对含有刻缺蛋白3/Hygro质粒的瞬时转染293T细胞染色，并通过荧光显微术来观察。

基于细胞的FMAT和FACS分析证实两种单抗256A-4和256A-8确实结合培养细胞中自重组质粒构建体或作为天然蛋白质表达的刻缺蛋白3受体(表2和表3)。

G3是阴性对照人IgG1单抗。根据显著高于G3和其它阴性杂交瘤克隆(p＞0.01)的FMAT信号读出来确定阳性结合信号。G3 FMAT结合读出的阴性信号视为背景。还用上文所述免疫荧光对含有刻缺蛋白3/Hygro质粒的瞬时转染293T细胞染色，并通过荧光显微术来观察。

实施例4：抗刻缺蛋白3单抗结合活性的Western印迹分析

进行Western印迹以评估抗刻缺蛋白3单抗对变性条件下刻缺蛋白3的结合活性以及刻缺蛋白3和其它刻缺蛋白相关蛋白在人细胞系中的表达水平。将纯化的刻缺蛋白3-LD/Fc融合蛋白与蛋白质加载缓冲液组合。还自实施例1中所述瞬时或稳定转染的细胞制备蛋白质样品，自培养皿收获所述细胞，用PBS清洗1次，在总细胞蛋白质提取缓冲液(Pierce，Rockford，IL)中重悬，并在添加等体积的2x蛋白质样品加载缓冲液后在100℃加热10分钟。通过在4-15％梯度的SDS-PAGE中电泳来将所有样品分开。将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜，并将抗刻缺蛋白3单抗应用于Western印迹膜，作为检测用一抗。将偶联有HRP的二抗用于检测，并使用上文所述化学发光底物来产生信号。针对人Fc、V5标签、刻缺蛋白3和刻缺蛋白1的阳性对照抗体购自Invitrogen、R&D Systems、Santa Cruz Biotechnologies、和Orbigen。

Western印迹分析显示单抗256A-4和256A-8不结合变性条件下的刻缺蛋白3-LD/Fc，这与在其中刻缺蛋白3 LIN12/异二聚化域维持天然分子构象的ELISA和FACS分析中观察到的结果形成鲜明对比。因此，得出结论，单抗256A-4和256A-8结合刻缺蛋白3-LD中必须以其天然构象维持的多个表位。此结论得到来自下文实施例8中所讨论的表位作图的结果证实。

实施例5：通过萤光素酶报道测定法评估抗刻缺蛋白3单抗的功能性

A.质粒构建体

上文实施例3中所述全长刻缺蛋白3表达构建体通过测序证实，并且与图1中所示公开序列相同。人锯齿蛋白1质粒获自OriGene(Rockville，MD)，并通过测序证实与NM_000214(NCBI/GenBank登录号)相同。因为OriGene锯齿蛋白1质粒没有抗生素选择标志，所以将含有锯齿蛋白1编码序列的Not I片段转移入pcDNA3.1/潮霉素中。通过自人T细胞白血病细胞系HH(ATCCNo.CRL-2105)合成cDNA第一条链来生成3.7Kb的人锯齿蛋白2 cDNA亚克隆，并进行PCR扩增。随后对锯齿蛋白2 cDNA亚克隆。通过瞬时转染和实施例4中所述Western印迹来证实刻缺蛋白3、锯齿蛋白1和锯齿蛋白2的表达。

为了生成刻缺蛋白信号传导的萤光素酶报道质粒，合成含有CBF1结合基序的串联重复的2种互补寡核苷酸引物，其具有如下序列：5’GCTCGAGCTCGTGGGAAAATACCGTGGGAAAATGAACCGTGGGAAA ATCTCGTGG(SEQ ID NO 7)5’GCTCGAGATTTTCCCACGAGATTTTCCCACGGTTC(SEQ ID NO 8)

将这两种寡聚引物在65℃在100mM NaCl中退火，其中每种寡聚物处于4mM浓度。在彼此退火后，通过PCR延伸引物。将PCR产物克隆入商品化载体中。通过测序来证实插入物，其包含CBF1结合基序的4个串联重复和2个侧翼Xho I位点。使用Xho I切出插入物，并连接在萤火虫萤光素酶报道物编码序列下游。萤光素酶报道测定法和测序分析之后，选择具有CBF1结合基序的8个重复的质粒克隆，并称为CBF1-Luc。

B.稳定细胞系生成

使用人胚胎肾细胞系(HEK293)，为功能测定法生成两种稳定细胞系。一种细胞系含有整合入核基因组中的CBF1-Luc报道质粒和刻缺蛋白3表达质粒。使用LipoFectamine 2000依照制造商的方案，通过将刻缺蛋白3/潮霉素和CBF1-Luc质粒共转染入293T细胞中来生成此细胞系。针对200μg/ml在DMEM生长培养基中的潮霉素选择稳定转染细胞克隆，并通过萤光素酶报道测定法和Western印迹筛选。选择具有相对高水平的刻缺蛋白3表达(基于Western印迹)和萤光素酶活性的细胞系以在功能测定法中使用，并称为NC85。

第二种稳定细胞系包含刻缺蛋白配体表达构建体，诸如锯齿蛋白1或锯齿蛋白2，或作为阴性对照的pcDNA3.1。通过如上文所述那样的向293T细胞中的转染和针对潮霉素的选择来生成表达人锯齿蛋白1或包含pcDNA3.1的稳定细胞系。将锯齿蛋白2进行亚克隆，转染入293T细胞系中，并预期整合入基因组中的特定基因座中。如上文那样选择潮霉素抗性细胞。

C.共培养条件下的萤光素酶报道测定法

将NC85细胞分别与另一种稳定表达人锯齿蛋白1(锯齿蛋白1/293T)、锯齿蛋白2/293F、或pcDNA3.1/293T的293T细胞系混合并共培养24至48小时。共培养结束时，通过吸取来除去培养基，在1x被动溶解缓冲液(E1501，Promega，Madison，WI)中溶解细胞，并使用萤光素酶测定系统遵照制造商的方案(E1501，Promega，Madison，WI)在TD-20/20光度计(Turner DesignsInstrument，Sunnyvale，CA)中测定萤光素酶活性。如图6和图7中所示，在NC85细胞与锯齿蛋白1/293T或与锯齿蛋白2/293F共培养时，萤光素酶活性比与pcDNA3.1/293T细胞共培养时的萤光素酶活性提高了2-4倍。为了评估抗刻缺蛋白3单抗的抑制效应，在开始接种和混合共培养的细胞时将抗体添加至细胞培养物。(256-A、256A-8和EGF重复域对照255A-79)。

D.通过在经刻缺蛋白配体包被的平板上培养细胞进行的萤光素酶报道测定法

用大鼠锯齿蛋白1/Fc、人DLL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)或人Fc(Jackson ImmunoResearch，West G rove，PA)、牛血清清蛋白(Sigma，St Louis，MO)包被来自Becton Dickinson Labware(#18779，Palo Alto，CA)的常规96孔组织培养板。将100μl的每种蛋白质(3μg/ml在PBS中的)在孔中分配，并在室温或4℃维持至少8小时，直至在使用前除去包被溶液。以每孔3-5×10⁴个细胞接种NC85细胞或癌细胞，并容许生长28-48小时。如上文C部分中所述的那样进行萤光素酶报道测定法和抗体抑制测定法。萤光素酶报道测定法表明两种单抗256A-4和256A-8对LIN12/二聚化域的结合几乎完全阻断由锯齿蛋白1和锯齿蛋白2诱导的萤光素酶报道活性(图6和7)。比较而言，特异性结合刻缺蛋白3-EGF域的单抗(255A-79)(作为对照)仅抑制由锯齿蛋白1诱导的萤光素酶报道活性(约60％抑制，图6)，但不抑制由锯齿蛋白2诱导的萤光素酶报道活性(图7)。图8中显示了单抗256A-4和256A-8阻断由DLL-4诱导的萤光素酶报道活性的能力。

别的功能测定法表明单抗256A-4和256A-8抑制由配体诱导的对刻缺蛋白靶基因的上调。在经锯齿蛋白-1包被的平板上培养表达重组刻缺蛋白3的293T细胞。在存在单抗256A-4和256A-8的情况中，HES5和HEY2(两种刻缺蛋白靶基因)的上调受到抑制，如通过定量RT-PCR所测量的(数据未显示)。

为了证实抗刻缺蛋白3单抗是否能结合人癌细胞中所表达的天然刻缺蛋白3并阻断受体信号传导，使用两种卵巢癌细胞系OV/CAR3和A2780来进行报道测定法。256A-4和256A-8两者都显著阻断OV/CAR3细胞中由锯齿蛋白1诱导的、由天然刻缺蛋白3介导的刻缺蛋白信号传导(图9a)。类似地，两种单抗都抑制了约50％的由平板上所包被的Dll4诱导的萤光素酶活性(图9b)。后者的结果与刻缺蛋白1和刻缺蛋白3两者都在A2780细胞中表达的实情一致。这些结果提示抗刻缺蛋白3单抗能抑制癌细胞中由天然刻缺蛋白3介导的信号传导。

实施例6：凋亡测定法

膜联蛋白V是细胞表面上的早期凋亡标志物，并且凋亡细胞群体可通过带荧光团标记物的抗膜联蛋白V抗体来标记和通过FACS分析来定量。如上文所述在经Fc或锯齿蛋白1/Fc包被的96孔平板中以每孔5-6×10⁴个细胞接种NC85细胞，并在无血清的DMEM培养基中维持24小时。凋亡细胞通过带FITC标记物的抗膜联蛋白V抗体(BD Biosciences，Palo Alto，CA)来染色，并通过FACS来分析。与那些在经Fc包被的平板上培养的细胞相比，在经锯齿蛋白1/Fc包被的表面上培养的细胞具有显著更低的凋亡细胞群体(图10)。为了研究抗体的功能效应，在研究开始时在细胞培养物中添加抗刻缺蛋白3单抗。如图10中所示，抗刻缺蛋白3单抗256A-4和256A-8阻断约50-65％的由锯齿蛋白1诱导的细胞存活效应。

实施例7：细胞迁移测定法、侵入测定法、和形态学测定法

经常使用体外细胞迁移和侵入测定法来评估癌细胞的转移潜力。进行这些测定法来测定抗刻缺蛋白3单抗对致瘤性293T/刻缺蛋白3稳定细胞系(NC85)施加的抑制效应。使用Costar 48孔插入平板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)来进行侵入测定法。插入物将孔分成上室和下室，它们由插入物底部的多孔膜(孔径＝8μm)分开。将刻缺蛋白配体、锯齿蛋白1/Fc、DLL-4或人Fc固定化在膜表面上，如上文部分中所述的。以每孔100,000个细胞接种NC85细胞，并在上室中的无血清DMEM中和下室中的10％FCS/DMEM中维持。10-24小时后，除去保持在插入膜上表面的细胞，并且通过0.05％在PBS中的结晶紫对穿过膜、粘附在插入膜下面的细胞染色。通过30％乙酸自细胞提取该染料，并且记录590nm处的吸收读数。在Costar测定平板中接种NC85细胞之前24小时，将抗刻缺蛋白3单抗添加至细胞培养物，并且所有的单抗都是在Costar测定平板中接种NC85细胞之前24小时添加至细胞培养物的。添加新鲜的单抗以在迁移测定平板中维持相同的浓度。在图11A中显示了实验结果。

使用Becton Dickinson 48孔Matrigel平板(BD Labware，Palo Alto，CA)来进行侵入测定法。通过插入孔(insert well)将细胞培养孔分成上室和下室，它们由插入孔底部的多孔膜(孔径＝8μm)分开。制造商在膜上表面上包被了优化密度的Matrigel，而在膜下表面上包被了纤连蛋白。将NC85、锯齿蛋白1/293T、和pcDNA3.1/293T细胞成对混合，诸如图11B中所示的。在48孔Matrigel平板中的每个孔中接种总共6-10×10⁴个细胞，并在生长培养基中培养24小时。除去保持在上室中在插入膜上面的细胞，并且通过0.05％在PBS中的结晶紫对穿过膜、粘附在插入膜下面的细胞染色。提取染料，并且吸收测量如在先前部分中所述的。在开始混合细胞培养物时添加单抗。在图11B中显示了结果。

细胞迁移测定法结果显示在经锯齿蛋白1包被的膜上培养NC85细胞时，刻缺蛋白3信号传导的激活显著增加细胞迁移，而单抗256A-4和256A-8明显抑制该迁移(图11A)。侵入实验显示类似的趋势(图11B)。

另外，检验了单抗256A-4和256A-8对由锯齿蛋白-1诱导的细胞“球体”形成的效应。在经锯齿蛋白-1包被的平板上培养过表达刻缺蛋白3的293T细胞时，细胞形成松散附着的“细胞球”或“球体”。然而，在存在单抗256A-4和256A-8的情况中，这些细胞球体的形成受到抑制(数据未显示)。

实施例8：抗刻缺蛋白3单抗的结合表位的作图

A.域交换策略和基本原理

首先，拮抗性刻缺蛋白3单抗结合刻缺蛋白3LIN12/二聚化域(LD)，但不结合同源的人刻缺蛋白1 LIN12/二聚化域(参见图12和13)。其次，如在实施例4中所讨论的，在Western印迹中抗刻缺蛋白3单抗不结合变性的刻缺蛋白3蛋白，指明该单抗结合构象性表位。再次，刻缺蛋白3和刻缺蛋白1在LIN12/二聚化域中共享约55％氨基酸序列同源性，因此得出结论，在该区域内在刻缺蛋白3和刻缺蛋白1之间的域交换不会破坏蛋白质构象。

B.生成域交换融合蛋白构建体

序列分析指明刻缺蛋白3具有3个LIN12重复，而其二聚化域分成2个区段。因此，生成5种域交换蛋白质构建体，其中3个LIN12重复和2个二聚化区段之每个被刻缺蛋白1的相应域所替换。使用PCR-SOE(Ho等，Gene 77：51(1989)；Horton等，BioTechniques 8：528(1990))来生成域交换构建体，如图12中所示的。使用反应中添加有1M甜菜碱和5％DMSO的PCR来进行PCR和PCR-SOE反应。PCR热循环对于PCR和PCR-SOE几乎是相同的，只是每个PCR循环的退火步骤在PCR-SOE中延长1分钟。将最终的PCR-SOE产物进行亚克隆，并通过测序来证实。用Nhe I和Xho I切割具有正确插入物序列的质粒克隆以切出插入物，对其进行凝胶纯化，并进行亚克隆。在图12中显示了5种刻缺蛋白3/刻缺蛋白1域交换构建体。为了便于表位作图，使用人IgGκ链信号肽作为域交换构建体中的前导肽。在图16和17中显示了氨基酸序列。

使用在上文部分中所述PCR和方法来对刻缺蛋白1-LD cDNA进行PCR扩增。自PA-1细胞总RNA(ATCC No.CRL-1572)合成cDNA模板第一条链。对人IgGκ链前导肽编码序列进行PCR扩增，作为前导肽使用以通过PCR-SOE来连接至刻缺蛋白1-LD的5’端，并在His-γ1Fc/pSec中进行亚克隆。

基于ELISA分析结果，进一步将目标域LI、D1和D2分成亚域。使用亚域表达构建体的ELISA结合分析显示仅L1和D2是刻缺蛋白3单抗结合所需的。不需要D1域。因此，将L1和D2域分成氨基酸突变簇以进一步分析特异性结合位点。生成图16和图17中所示含有L1和D2亚域交换或氨基酸突变簇的构建体。

C.刻缺蛋白3/刻缺蛋白1域交换融合蛋白的表达

使用LipoFectamine 2000在CHO细胞中瞬时转染刻缺蛋白3/刻缺蛋白1-LD域交换质粒。在6孔平板中以每孔0.8～1×10⁶个细胞在含有10％FCS的DMEM生长培养基中接种CHO细胞，在CO₂培养箱中维持过夜，之后进行转染。转染后将细胞在生长培养基中恢复约3小时，然后转换成含有2％FCS的DMEM，并培养3天。收获条件化培养基，并以3500rpm离心10分钟。收集含有自CHO分泌的刻缺蛋白3-LD域交换蛋白的上清液，并准备好用于Western印迹和ELISA结合分析。ELISA显示所有的域交换融合蛋白都在条件化培养基中表达和分泌(表4)，这通过Western印迹分析获得进一步证实(数据未显示)。

ELISA读数使用抗人Fc抗体作为检测抗体，显示所有的蛋白质都在条件化培养基中表达。使用人IgG/Fc作为对照。每个孔中包被的人IgG/Fc的起点是100ng。

表4：ELISA读数

表4的ELISA结合测定法中所使用的蛋白质缩写包括：N1-LD，刻缺蛋白1-LD/Fc；N3-LD，刻缺蛋白3-LD/Fc；L1-交换物，第一LIN12域交换物；L2-交换物，第二LIN12域交换物；L3-交换物，第三LIN12域交换物；D1-交换物，第一二聚化域交换物；D2-交换物，第二二聚化域交换物；hIgG-Fc，人IgG Fc。

D.使用ELISA进行的表位结合分析

用抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch)通过添加100μl在含有1x酚红和3-4滴/L pHix(Pierce，Rockford，IL)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的抗体(0.1μg/ml)并在室温温育过夜来包被96孔平底Immulon II微量测试平板(DynatechLaboratories，Chantilly，VA)。在通过轻拍平板来除去包被溶液后，将200μl封闭缓冲液添加至每孔达1小时以封闭非特异性结合，所述封闭缓冲液含有2％在PBST中的BSA和0.1％硫柳汞。然后用PBST清洗孔。自每种刻缺蛋白3/刻缺蛋白1域交换构建体转染收集50μl上文的条件化培养基，与50μl封闭缓冲液混合，并添加至微量滴定板的各个孔。温育1小时后，通过所包被的抗Fc抗体捕获刻缺蛋白3/刻缺蛋白1-LD域交换蛋白，并用PBST清洗孔。在如上文的封闭缓冲液中连续稀释抗刻缺蛋白3单抗和同种型匹配的对照单抗，并在每个孔中添加50μl稀释的单抗以评估对所结合的刻缺蛋白3/刻缺蛋白1域交换蛋白的结合。使用偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的、Fc特异性的山羊抗小鼠IgG来检测。将含有0.1％3，3，5，5-四甲基联苯胺和0.0003％过氧化氢的HRP底物溶液添加至孔中达30分钟，用于显色。通过添加50ml/孔2M H₂SO₄来终止反应。用ELISA读板仪读取450nm处的OD。通过上文的ELISA分析类似地检验亚域交换构建体和突变簇。

使用单抗256A-4和256A-8进行的针对域交换蛋白的ELISA结合实验显示第一LIN12域(L1)和第二二聚化域(D2)的交换物完全消除所有3种单抗的结合，而第一二聚化域(D1)的交换物消除单抗256A-4和256A-8的结合(图13B和C)。第三LIN12域(L3)的交换物显著减弱结合。然而，两种单抗都仍能够结合融合蛋白。第二LIN12域的交换物对单抗的结合没有干扰(图13B和C)。阳性对照抗体(先前作图得出结合第一LIN12域)结合除L1外的所有域交换融合蛋白(图13D)。比较而言，在ELISA测定法中同种型对照阴性抗体G3不结合任何域交换融合蛋白(数据未显示)。从上文的实验得出结论，第一LIN12域和第二二聚化域是单抗256A-4和256A-8结合所需要的。

为了进一步对第一LIN12域(L1)中抗刻缺蛋白3单抗所结合的表位作图，将L1域进一步分成3个亚域，即L1-sub1、L1-sub2和L1-sub3，并用刻缺蛋白1中相应的序列交换(图16)。ELISA结合测定法显示L1-sub1交换物对结合活性没有抑制效应，而L1-sub2和L1-sub3交换物消除结合(图16)。在L1-sub2和L1-sub3区域中，刻缺蛋白3和刻缺蛋白1之间有不同的5个氨基酸残基簇。因此，在这5个氨基酸簇内生成交换融合蛋白构建体(图16)。ELISA分析表明L1-簇4交换物对所有3种单抗的结合都没有抑制。剩余的4种交换簇部分地或完全地消除抗刻缺蛋白单抗的结合。如此，那4种氨基酸残基簇代表单抗所结合的4个不同表位。L1-簇3(氨基酸：DRE)和L1-簇5(氨基酸：SVG)是需要的。L1-簇1(氨基酸：AKR)和簇2(氨基酸：DQR)也在抗刻缺蛋白3单抗的结合中发挥作用，它们的突变显著减弱单抗的结合。

为了对刻缺蛋白3的第二二聚化(D2)域中抗刻缺蛋白3单抗所结合的表位作图，将D2域进一步分成5个亚域，即D2-sub1、D2-sub2、D2-sub3、D2-sub4和D2-sub5。用刻缺蛋白1中的相应序列交换那些亚域中的序列(图17)。ELISA结合测定法显示单抗256A-4和256A-8强烈结合D1-sub2和D2-sub3交换物，但不结合D2-sub1和D2-sub4交换物。两种单抗都显示对D2-sub5的微弱结合(图17)。因此，数据提示D2-sub1和D2-sub4是抗刻缺蛋白3单抗结合所需的，而D2-sub5对结合活性有帮助。

两种单抗256A-4和256A-8都是结合包含L1和D2的构象性表位的拮抗性抗体，而仅结合L1的另一种抗体256A-13是激动性抗体(参见共同悬而未决的、2007年10月18日提交的美国申请No.11/874,682)。此外，激动性256A-13与拮抗性256A-4竞争L1内的表位，而且表位作图研究提示它们结合L1上交叠的表位。主要的差异在于拮抗性抗体还结合D2，而激动性抗体不然。为了检验如下假设，即对L1和D2的同时结合负责拮抗性活性，分析与256A-4结合D2中相似表位的抗体256A-2。单抗256A-2既不是拮抗性的也不是激动性的(数据未显示)。研究显示256A-2不与256A-13竞争，而且能同时结合刻缺蛋白3。此外，256A-2和256A-13能单独地部分与256A-4竞争，然而，这两种抗体的组合完全阻断256A-4对刻缺蛋白3的结合(数据未显示)。研究还显示两种抗体对L1和D2中的表位的分开结合没有导致对配体依赖性刻缺蛋白3活化的抑制，提示拮抗性抗体形成桥，其有可能锁住并稳定L1和D2相互作用，并阻止由配体诱导的构象变化(参见图18)。

实施例9：抗刻缺蛋白3单抗的测序

因为抗体结合性质依赖于重链和轻链两者的可变区，所以对256A-4和256A-8的可变序列分亚型，并测序。使用Isostrip小鼠单克隆抗体试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)来确定抗体IgG亚型。结果显示两种单抗即256A-4和256A-8都具有IgG₁重链和κ轻链。

经由RT-PCR和cDNA克隆来解码重链和轻链可变区序列。使用RNeasy迷你试剂盒遵照制造商的方案(QIAGEN，Valencia，CA)自杂交瘤克隆256A-4和256A-8分离总RNA。使用RNA模板和Superscriptase III试剂盒来合成cDNA第一条链。使用覆盖小鼠κ链编码区5’端的简并正向引物和与可变区3’端接合处的恒定区匹配的反向引物，或使用覆盖小鼠重链编码区5’端的简并正向引物和小鼠重链中的恒定区反向引物，自cDNA第一条链对轻链和重链cDNA的可变区进行PCR扩增。将PCR产物克隆入商品化载体中，并由Lone Star实验室(Houston，TX)测序。利用计算机软件程序DNAStar(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来分析核苷酸序列。根据来自多个自同一杂交瘤克隆衍生的PCR克隆的序列确定每种抗刻缺蛋白3单抗序列。

单抗256A-4在其重链和轻链可变区中分别包含123个和116个氨基酸残基(图4A和4B)。单抗256A-8由重链可变区中的122个氨基酸残基和轻链可变区中的123个氨基酸残基组成(图5A和5B)。

实施例10：刻缺蛋白3拮抗性抗体对金属蛋白酶对刻缺蛋白3的切割的影响

刻缺蛋白受体活化牵涉由配体诱导的金属蛋白酶在近膜位点(S2)处的切割，生成胞外亚基。此切割是S3切割的必要前提，以便释放活化的刻缺蛋白胞内区。发现256A-4和256A-8两者都需要刻缺蛋白3L1和D2域的至少一部分的存在来实现它们的结合。这两个域在线性序列中并非极为接近地定位，而是在两条分开的多肽上，这提示这些抗体可稳定无活性的、自身抑制的刻缺蛋白构型。为了检验拮抗性抗体是否能抑制序贯刻缺蛋白活化事件(包括两次蛋白水解切割)，将稳定表达重组刻缺蛋白3受体的293T细胞(NC85细胞)用固定化重组锯齿蛋白-1处理或者与表达锯齿蛋白-1的293T细胞共培养。通过ELISA测定法，使用结合至固体表面的、识别刻缺蛋白3切割产物的抗体来检测培养液中通过蛋白水解切割而生成的可溶性胞外亚基。预期刻缺蛋白3拮抗性单抗减少条件化培养基中可溶性刻缺蛋白3胞外亚基的生成，而非功能性刻缺蛋白3结合抗体则不然。

为了直接检测S2切割片段，进行7.5％SDS PAGE电泳和用刻缺蛋白3C端抗体进行的Western印迹。S2片段比非切割的刻缺蛋白3小亚基(跨膜亚基)小57个氨基酸残基，并且迁移比非切割的刻缺蛋白3小亚基(跨膜亚基)略微快些。

为了检验刻缺蛋白3拮抗性单抗是否抑制由配体诱导的金属蛋白酶对刻缺蛋白3在S2处的切割，用γ-分泌酶抑制剂化合物E(1μM)处理表达重组刻缺蛋白3的293T细胞达4小时，这稳定在位点S2处切割的产物，容许其积累。在存在单抗256A-4和256A-8的情况中，由锯齿蛋白-1诱导的金属蛋白酶对刻缺蛋白3在S2处的切割受到抑制(数据未显示)。

实施例11：使用异种移植物小鼠中的人癌症模型的功效研究

A.人癌细胞和致瘤细胞

具有刻缺蛋白3表达的人癌细胞系诸如HCC2429、HCC95可获自学术机构或ATCC。通过如在先前部分中所述的那样用相关基因转染293T并用潮霉素进行选择来生成293T/pcDNA3.1和293T/刻缺蛋白3(NC85)。在含10％胎牛血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、维生素溶液、和青霉素-链霉素(Flow Laboratories，Rockville，MD)的RPMI 1640或DMEM培养基中培养所有细胞。在5％CO₂和95％空气的混合物中在37℃在培养箱中温育细胞系。在自冷冻原种恢复后，将培养物维持不长于3周。使用对数生长中的单细胞悬液(具有大于等于90％生存力的细胞)，用于在用PBS清洗后进行肿瘤细胞注射。

B.动物

小鼠获自例如位于Frederick癌症研究和开发中心(Frederick CancerResearch and Development Center，Frederick，MD)的国立癌症研究所的动物繁殖区(Animal Production Area of the National Cancer Institute)。该动物是为特定目的饲养的，并且在研究开端时是首次用于实验的。为在该研究中使用而选择的小鼠选择为在年龄和体重方面尽可能的一致。它们是6-8周龄的，并且在启动称重时它们的体重范围为约18-25克。此研究中所使用的动物的出生日期记录保留在研究原始数据中，并且在报道中明确说明在分组时的体重范围。通过有编号的耳签来鉴别每只动物。动物是根据处理组分组收容在聚苯乙烯一次性鞋盒笼中的(4只小鼠/笼)，所述聚苯乙烯一次性鞋盒笼包含纤维素垫，满足或超过NIH准则。在研究过程期间，监测动物房中的环境条件，并维持在18-26℃的温度范围之内，并且每天记录相对湿度。整个研究期间维持12小时光照/黑暗照明循环。动物食用受过照射的食物。已知食物中不存在会干扰此研究结果的水平的污染物。热压灭菌处理过的水经由水瓶对每只动物是可得的。已知水中不存在会干扰此研究结果的水平的污染物。在分配至该研究之前，使所有的研究动物适应其指定的住处达至少7天，之后进行第一天的剂量给药。

C.肿瘤模型和功效研究

使用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉小鼠，并以右侧卧姿放置。将50μl含有10％Matrigel的Hank氏液中的癌细胞诸如非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系、HCC2429(Haruki等，Cancer Res.65：3555(2005))、HCC95(来自Dr.John.Mina)和H2122(ATCC No.CRL5985)注射入肺的左叶中。注射肿瘤细胞后，将小鼠翻转成左侧卧姿，并观察45-60分钟，直至它们完全恢复。肿瘤细胞注射的记录保存在原始研究数据中。

研究期间所有的动物都在其笼内每天观察至少一次，并且在研究原始数据中记录临床发现。如果认为必要，可从研究中除去显示明显有害效应的动物。处理过程中每周一次地测量体重。自每只小鼠收获癌组织(若可获得的话)，并贮存，用于潜在的、未来的生物学表征。

实施例12：刻缺蛋白3相关疾病的测定法

为了鉴定其它刻缺蛋白3相关疾病，可以对来自患者样品的刻缺蛋白3基因测序，使用患者细胞来进行FISH(萤光原位杂交)和CGH(比较基因组杂交)分析以寻找易位和基因扩增，或使用患者组织或肿瘤切片来进行免疫组织化学以检查刻缺蛋白3受体的过表达。另外，可以分离和培养来自怀疑患有刻缺蛋白3相关疾病的患者的细胞，并研究本发明的拮抗性抗体对细胞迁移、侵入、存活和增殖的影响。细胞迁移和侵入测定法的方案记载于实施例7中，而凋亡测定法的方案记载于实施例6中。对于细胞增殖测定法，将自患者样品培养的细胞接种于经过刻缺蛋白配体包被的和未经刻缺蛋白配体包被的96孔平板中。在培养开始时添加拮抗性抗体。使用台盼蓝染色，在特定时间点对细胞数目计数。可使用Park等(Cancer Res，66：12(2006))所公开的方案来进行刻缺蛋白3 FISH和CGH分析。

仅使用常规实验，本领域技术人员就会认识到或能够确定本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。所附权利要求书意图涵盖此类等同物。

Claims (18)

1.一种特异性结合刻缺蛋白3的单克隆抗体，其中该抗体抑制刻缺蛋白3信号传导，其中(1)该抗体包含重链可变区(″VH″)和轻链可变区(″VL″)，VH包含SEQ ID NO：32所示CDR-H1、SEQ ID NO：33所示CDR-H2、和SEQ IDNO：34所示CDR-H3，VL包含SEQ ID NO：35所示CDR-L1、SEQ ID NO：36所示CDR-L2、和SEQ ID NO：37所示CDR-L3；或(2)该抗体包含VH和VL，VH包含SEQ ID NO：38所示CDR-H1、SEQ ID NO：39所示CDR-H2、和SEQ ID NO：40所示CDR-H3，VL包含SEQ ID NO：41所示CDR-L1、SEQID NO：42所示CDR-L2、和SEQ ID NO：43所示CDR-L3。

2.权利要求1的抗体，其中该抗体结合SEQ ID NO：9所示LIN12域和SEQ IDNO：18所示二聚化域中的氨基酸残基。

3.权利要求1的抗体，其中该抗体包含VH和VL，VH包含SEQ ID NO：32所示CDR-H1、SEQ ID NO：33所示CDR-H2、和SEQ ID NO：34所示CDR-H3，VL包含SEQ ID NO：35所示CDR-L1、SEQ ID NO：36所示CDR-L2、和SEQID NO：37所示CDR-L3。

4.权利要求3的抗体，其中所述VH由SEQ ID NO：2组成，且所述VL由SEQID NO：3组成。

5.权利要求4的抗体，其中该抗体是人源化抗体。

6.权利要求1的抗体，其中该抗体包含VH和VL，VH包含SEQ ID NO：38所示CDR-H1、SEQ ID NO：39所示CDR-H2、和SEQ ID NO：40所示CDR-H3，VL包含SEQ ID NO：41所示CDR-L1、SEQ ID NO：42所示CDR-L2、和SEQID NO：43所示CDR-L3。

7.权利要求6的抗体，其中所述VH由SEQ ID NO：4组成，且所述VL由SEQID NO：5组成。

8.权利要求7的抗体，其中该抗体是人源化抗体。

9.权利要求1的抗体，其中该抗体是抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab’)₂，Fd，单链Fv(scFv)，单链抗体和二硫化物连接的Fv(sdFv)。

10.权利要求9的抗体，其中所述片段是单链Fv。

11.权利要求1的抗体，进一步包含轻链恒定区和／或重链恒定区。

12.权利要求1的抗体，其中该抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。

13.权利要求1的抗体，进一步包含标记物。

14.一种核酸，其编码权利要求1-12任一项的抗体。

15.一种载体，其包含权利要求14的核酸。

16.一种细胞，其包含权利要求15的载体。

17.权利要求1的抗体在制备用于检测刻缺蛋白3蛋白质的试剂中的用途。

18.一种用于生产抗体的方法，其包括在适于抗体生成的条件下培养权利要求16的细胞，并分离所生成的抗体。

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