CN105246916A - 针对notch 3的抗体 - Google Patents

针对notch 3的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN105246916A
CN105246916A CN201480027023.XA CN201480027023A CN105246916A CN 105246916 A CN105246916 A CN 105246916A CN 201480027023 A CN201480027023 A CN 201480027023A CN 105246916 A CN105246916 A CN 105246916A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seqidno
antibody
notch3
lnr
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480027023.XA
Other languages
English (en)
Inventor
J·德普拉泽斯-劳伯
C·弗埃尔
T·胡
D·詹金斯
K·佩特罗普洛斯
P·蒂尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN105246916A publication Critical patent/CN105246916A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Abstract

本公开涉及靶向Notch？3或突变体Notch？3受体的至少一个构象表位的抗体或其片段、及其组合物和使用方法。

Description

针对NOTCH 3的抗体
相关申请
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请号61/781,421的优先权，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文作为参考。
发明领域
本发明总体上涉及与Notch3相互作用的抗体或其片段。特别地，它涉及识别Notch3或突变体Notch3的至少一个构象表位的抗体或其片段，所述构象表位包含来自NRR结构域的LNR区域和HD的连续和不连续氨基酸残基。
背景技术
Notch信号传导是进化上保守的途径，该途径调节多样性生物学功能集合，包括胚胎发育和成年组织中的干细胞维持、细胞分化和增殖(Kopan等人,(2009)Cell137:216-233,Guruharsha等人,(2012)NatRevGenet.13:654-66和Andersson等人,(2001)Development138:3593-3612)。在哺乳动物中，已经描述了四种Notch受体(Notch1-4)，它们具有保守结构域构造。胞外结构域(ECD)由一系列EGF样重复序列接续负向调节区(NRR)组成，所述负向调节区含有3个LNR重复序列和一个异二聚化结构域。当一个细胞上的Notch受体与毗邻细胞上的配体相互作用时，规范的Notch信号传导活化。在哺乳动物中，存在五种跨膜配体、三种δ样配体(DLL1、DLL4和DLL3)和两种Jagged配体(Jagged1、Jagged2)。配体结合导致Notch被ADAM蛋白酶在NRR结构域内部的S2位点切割。这种初始切割产生由γ-分泌酶复合体在S3位点后续切割Notch受体的底物。在γ-分泌酶切割之后，Notch的胞内结构域(ICD)转位至胞核，在那里它与CSL转录因子(哺乳动物中的CBF-1/RBP-Jk)和辅助活化物操纵因子(mastermind)(MAML1)相互作用以活化靶基因转录。HES/HEY转录因子家族是充分表征的Notch靶基因，然而多种转录靶是细胞类型特异的。
迄今，癌症中Notch受体的证据主要集中在Notch1信号传导的改变方面，而很少关注其他Notch受体。因此，需要研究和鉴定改变其他Notch受体信号传导如Notch3信号传导的方法和组合物。
发明简述
本公开涉及Notch3或突变体Notch3中的多种不同构象表位。本公开还涉及识别Notch3或突变体Notch3的至少一个构象表位的抗体或其片段，所述构象表位包含来自NRR结构域的LNR区域和HD的连续和不连续氨基酸残基。
因此，在一个方面，本公开涉及一种分离的多肽，所述多肽包含Notch3受体的构象表位，其中该构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C和这些LNR之间的相应接头；其中HD结构域选自N端HD和C端HD，并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
在另一个方面，本公开涉及一种分离的多肽，所述多肽包含Notch3受体的构象表位，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋，并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
在另一个方面，本公开涉及一种分离的多肽，所述多肽包含Notch3受体的构象表位，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋，并且接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
在另一个方面，本公开涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C；其中HD结构域选自N端HD和C端HD；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
在一个实施方案中，抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。在一个实施方案中，本公开提供一种突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。在一个实施方案中，Notch3突变体包含选自S1580L和G1487D或其组合的突变。
在另一个方面，本公开涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
在一个实施方案中，构象表位还包含在NRR区域的LNR-A/B接头中的氨基酸残基。在一个实施方案中，构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。在一个实施方案中，构象表位还包含在NRR区域的LNR-HD接头中的氨基酸残基。在一个实施方案中，构象表位还包含在HDβ4-α3环中的氨基酸残基。在一个实施方案中，构象表位还包含在LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头和HDβ4-α3环中的氨基酸残基。在一个实施方案中，抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。在一个实施方案中，Notch3受体是一种突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。在一个实施方案中，Notch3突变体包含选自S1580L、D1587N、R1589Q、Y1624H、A1608T、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和G1487D、A1476T(LNR-C)或其组合的突变。在一个实施方案中，构象表位包含氨基酸残基：(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或其子集。在一个实施方案中，抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch3残基结合：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。在一个实施方案中，Notch3受体是一种突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。在一个实施方案中，抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch3残基结合：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。在一个实施方案中，抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。
在另一个方面，本公开涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
在一个实施方案中，构象表位还包含在NRR区域的LNR-B中的氨基酸残基。在一个实施方案中，构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。在一个实施方案中，构象表位还包含在HDα3-β5环中的氨基酸残基。在一个实施方案中，构象表位还包含在LNR-B、LNR-B/C接头和HDα3-β5环中的氨基酸残基。在一个实施方案中，抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。在一个实施方案中，突变体Notch3受体包含选自S1580L、R1510H、D1587N、R1589Q、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和A1476T(LNR-C)或其组合的突变。在一个实施方案中，构象表位包含氨基酸残基：(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一个实施方案中，抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch3残基结合：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。在一个实施方案中，抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch3残基结合：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。在一个实施方案中，抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。在一个实施方案中，抗体或其片段抑制Notch3信号传导，如通过选自Notch3配体驱动的报道基因测定法、FACS测定法、Notch3靶基因mRNA定量、TALL-1细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch3胞内结构域(ICD)的γ分泌酶切割形式评估。
在另一个方面，本公开涉及一种对Notch3受体具有1x107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、1013M-1的解离常数(KD)的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段抑制Notch3信号传导，如通过选自Notch3配体驱动的报道基因测定法、FACS测定法、Notch3靶基因mRNA定量、TALL-1细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch3胞内结构域(ICD)的γ分泌酶切割形式评估。
在一个实施方案中，抗体或其片段结合至与表2中所述抗体相同的构象表位。在一个实施方案中，抗体或其片段与表2中所述的抗体交叉竞争。
在另一个方面，本公开涉及一种针对Notch3受体的分离抗体或其片段，所述抗体包含选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:49、SEQIDNO:69、SEQIDNO:89、SEQIDNO:109、SEQIDNO:129、SEQIDNO:149、SEQIDNO:169、SEQIDNO:189、SEQIDNO:209和SEQIDNO:229的VH和选自SEQIDNO:19、SEQIDNO:39、SEQIDNO:59、SEQIDNO:79、SEQIDNO:99、SEQIDNO:119、SEQIDNO:139、SEQIDNO:159、SEQIDNO:179、SEQIDNO:199、SEQIDNO:219和SEQIDNO:239的VL或者与其具有97-99％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本公开涉及一种包含可变重链序列和可变轻链序列的单链抗体或其片段，所述可变重链序列和可变轻链序列选自具有SEQIDNO:9的可变重链和具有SEQIDNO:19的可变轻链序列；具有SEQIDNO:29的可变重链序列和具有SEQIDNO:39的可变轻链序列；具有SEQIDNO:49的可变重链序列和具有SEQIDNO:59的可变轻链序列；具有SEQIDNO:69的可变重链序列和具有SEQIDNO:79的可变轻链序列；具有SEQIDNO:89的可变重链序列和具有SEQIDNO:99的可变轻链序列；具有SEQIDNO:109的可变重链序列和具有SEQIDNO:119的可变轻链序列；具有SEQIDNO:129的可变重链序列和具有SEQIDNO:139的可变轻链序列；具有SEQIDNO:149的可变重链序列和具有SEQIDNO:159的可变轻链序列；具有SEQIDNO:169的可变重链序列和具有SEQIDNO:179的可变轻链序列；具有SEQIDNO:189的可变重链序列和具有SEQIDNO:199的可变轻链序列；具有SEQIDNO:209的可变重链序列和具有SEQIDNO:219的可变轻链序列以及具有SEQIDNO:229的可变重链序列和具有SEQIDNO:239的可变轻链序列。
在另一个方面，本公开涉及一种包含可变重链序列和可变轻链序列的分离抗体或其片段，所述可变重链序列和可变轻链序列选自具有SEQIDNO:9的可变重链和具有SEQIDNO:19的可变轻链序列；具有SEQIDNO:29的可变重链序列和具有SEQIDNO:39的可变轻链序列；具有SEQIDNO:49的可变重链序列和具有SEQIDNO:59的可变轻链序列；具有SEQIDNO:69的可变重链序列和具有SEQIDNO:79的可变轻链序列；具有SEQIDNO:89的可变重链序列和具有SEQIDNO:99的可变轻链序列；具有SEQIDNO:109的可变重链序列和具有SEQIDNO:119的可变轻链序列；具有SEQIDNO:129的可变重链序列和具有SEQIDNO:139的可变轻链序列；具有SEQIDNO:149的可变重链序列和具有SEQIDNO:159的可变轻链序列；具有SEQIDNO:169的可变重链序列和具有SEQIDNO:179的可变轻链序列；具有SEQIDNO:189的可变重链序列和具有SEQIDNO:199的可变轻链序列；具有SEQIDNO:209的可变重链序列和具有SEQIDNO:219的可变轻链序列以及具有SEQIDNO:229的可变重链序列和具有SEQIDNO:239的可变轻链序列。
在另一个方面，本公开涉及一种针对Notch3受体的分离抗体或其片段，包含选自SEQIDNO:5、SEQIDNO:25、SEQIDNO:45、SEQIDNO:65、SEQIDNO:85、SEQIDNO:105、SEQIDNO:125、SEQIDNO:145、SEQIDNO:165、SEQIDNO:185、SEQIDNO:205和SEQIDNO:225的重链CDR3。
在另一个方面，本公开涉及一种包含重链可变区和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的分离抗体或其片段，所述重链可变区和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3选自重链可变区SEQIDNO:3的CDR1；SEQIDNO:4的CDR2；SEQIDNO:5的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:13的CDR1；SEQIDNO:14的CDR2；和SEQIDNO:15的CDR3；重链可变区SEQIDNO:23的CDR1；SEQIDNO:24的CDR2；SEQIDNO:25的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:33的CDR1；SEQIDNO:34的CDR2；和SEQIDNO:35的CDR3；重链可变区SEQIDNO:43的CDR1；SEQIDNO:44的CDR2；SEQIDNO:45的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:53的CDR1；SEQIDNO:54的CDR2；和SEQIDNO:55的CDR3；重链可变区SEQIDNO:63的CDR1；SEQIDNO:64的CDR2；SEQIDNO:65的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:73的CDR1；SEQIDNO:74的CDR2；和SEQIDNO:75的CDR3；重链可变区SEQIDNO:83的CDR1；SEQIDNO:84的CDR2；SEQIDNO:85的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:93的CDR1；SEQIDNO:94的CDR2；和SEQIDNO:95的CDR3；重链可变区SEQIDNO:103的CDR1；SEQIDNO:104的CDR2；SEQIDNO:105的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:113的CDR1；SEQIDNO:114的CDR2；和SEQIDNO:115的CDR3；重链可变区SEQIDNO:123的CDR1；SEQIDNO:124的CDR2；SEQIDNO:125的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:133的CDR1；SEQIDNO:134的CDR2；和SEQIDNO:135的CDR3；重链可变区SEQIDNO:143的CDR1；SEQIDNO:144的CDR2；SEQIDNO:145的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:153的CDR1；SEQIDNO:154的CDR2；和SEQIDNO:155的CDR3；重链可变区SEQIDNO:163的CDR1；SEQIDNO:164的CDR2；SEQIDNO:165的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:173的CDR1；SEQIDNO:174的CDR2；和SEQIDNO:175的CDR3；重链可变区SEQIDNO:183的CDR1；SEQIDNO:184的CDR2；SEQIDNO:185的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:193的CDR1；SEQIDNO:194的CDR2；和SEQIDNO:195的CDR3；重链可变区SEQIDNO:203的CDR1；SEQIDNO:204的CDR2；SEQIDNO:205的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:213的CDR1；SEQIDNO:214的CDR2；和SEQIDNO:215的CDR3；重链可变区SEQIDNO:223的CDR1；SEQIDNO:224的CDR2；SEQIDNO:225的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:233的CDR1；SEQIDNO:234的CDR2；和SEQIDNO:235的CDR3。
在另一个方面，本公开涉及一种包含抗体或其片段和可药用载体的药物组合物。
在另一个方面，本公开涉及一种抗体或其片段，其用于治疗由Notch3信号转导途径介导的癌，所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。
在一个实施方案中，所述抗体或其片段用于治疗由Notch3信号转导途径介导的癌症，其中癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
在另一个方面，本公开涉及一种抗体或其片段，其用作治疗由Notch3信号转导途径介导的癌的药物，所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。在一个实施方案中，所述抗体或其片段用作治疗由Notch3信号转导途径介导的癌症的药物，其中癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
附图简述
图1：Notch3的结构域结构；
图2：Notch3NRR的结构域结构以及每个区域的氨基酸位置；
图3A-C与人、食蟹猴和小鼠重组蛋白结合的Notch3抗体的ELISA数据；
图4与人、食蟹猴和小鼠重组蛋白结合的Notch3抗体的Biacore数据；
图5A-C多种Notch3抗体的FACS数据；
图6A-FHCC1143Notch扩增的细胞中Notch3抗体的FACS数据；
图7A-D：Notch3报道基因测定法中Notch配体(Jagged1和δ1)存在下Notch抗体的抑制％和IC50值；
图8：Notch3靶基因mRNA定量；
图9A-B：Notch3NRR(顶部)突变和PEST(底部)突变；
图10A-B：显示Notch3NRR突变的特征的图；
图11A-B：显示在Notch3抗体存在下的TALL-1mRNA和增殖抑制的图；
图12A-B：显示仅在TALL-1细胞中存在新表位ICD3抗体的蛋白质印迹照片；
图13A-B：显示在TALL-1细胞和MDA-MB468细胞中用Notch3抗体处理时Notch3信号传导减少的蛋白质印迹照片；
图14A-C：显示在Ishikawaheraklio02_ER细胞、TE-11细胞和A549细胞中用Notch3抗体处理时Notch3信号传导减少的蛋白质印迹照片；
图15：显示在Notch3扩增的细胞系HCC1143中用Notch3抗体处理时Notch3信号传导减少的蛋白质印迹照片；
图16A-B：TALL-1异种移植中体内PD研究的蛋白质印迹照片和IHC照片；
图17A-C：MDA-MB468异种移植中体内PD研究的蛋白质印迹照片；
图18：体内PDHLUX1823模型异种移植中的蛋白质印迹照片；
图19A-B：显示TALL-1体内功效的小鼠照片；
图20：显示鉴定Notch3NRR结构域中4种不同表位(称为NRR-A，NRR-B，NRR-C和NRR-D)的Notch3抗体的表位分拣(epitopebinning)；
图21：Notch3NRRX射线晶体结构的表面图和带状图；标记出1)蛋白质的N端和C端；2)三个LNR重复序列和配位Ca2+离子；3)L1419，自抑制性塞；4)S1和S2位点；5)HD结构域内部的二级结构；和6)Notch3中与Notch1和Notch2相比构象显著不同的两个区域(LNR-B/C接头外加LNR-C的前半部分，和HD结构域中的β4-α3环)；
图22：人Notch1、2和3的序列比对。在划虚线框中所示是与Notch1或Notch2相比结构显著不同的Notch3区域；
图23：以测定的Notch3/20350Fab复合物的X射线晶体结构，与Notch3NRR结合的20350Fab的总体结构(左小图)和在Notch3NRR上与所标出表位残基的详细相互作用(右小图)；
图24：以测定的Notch3/20358Fab复合物的X射线晶体结构，与Notch3NRR结合的20358Fab的总体结构(左小图)和在Notch3NRR上与所标出表位残基的详细相互作用(右小图)
图25：Notch3NRR上20350和20358表位的比较。在Notch3NRR上叠加的Notch3/20350Fab复合物和Notch3/20358Fab复合物的X射线晶体结构显示这两种抗体与Notch3NRR上的不同表位结合；
图26：构象表位20350、20358和A4中的氨基酸残基；
图27：Notch3NRR+Ca2+的HDx-MS表位作图显示非结合状态下的Notch3NRR的平均氘摄取量；
图28：显示采用与Notch3NRR结合的20350、20358抗体时绝对保护量的Notch3NRR+Ca2+差分图；
图29：结构显示当20350和20358与Notch3NRR结合时受到保护(黑色)的区域的结构；
图30：包埋的X射线氨基酸残基与HDx-MS中检测到的受保护区域的比较；
图31：无Ca2+情况下20037和20358对Notch3NRR的差异图和绘图在Notch3NRR结构上的受保护区域(黑色)；
图32：抗体20337、20350、20358和A4的绘图在Notch3NRR表面上的构象表位；
图33：Notch3NRR上未被抗体20337、20350、20358和A4覆盖的表面；
图34：Notch3NRR表面上未被抗体20337、20350、20358和A4覆盖的潜在构象表位。
发明详述
定义
为了可以更轻易地理解本发明，首先定义某些术语。额外的定义在详细描述中自始至终给出。
如本文所用，短语“信号转导”或“信号传导活性”指通常由蛋白质-蛋白质相互作用如生长因子与受体结合引发的生物化学因果关系，所述生物化学因果关系导致信号从细胞的一个部分传输至细胞的另一个部分。对于Notch3，配体结合导致Notch3被ADAM蛋白酶在NRR结构域内部的S2位点切割。这种初始切割产生由γ-分泌酶复合体在S3位点后续切割Notch受体的底物。在γ-分泌酶切割之后，Notch的胞内结构域(ICD)转位至胞核，在那里它与CSL转录因子(哺乳动物中的CBF-1/RBP-Jk)和辅助活化物操纵因子(MAML1)相互作用以活化靶基因转录。
如本文所用，术语“Notch3”或“Notch3受体”指哺乳动物人Notch3蛋白。图1中描述了Notch3的结构域结构，该图显示配体结合结构域(LBD)、包含LinNotch重复序列(LNR)和N-端、C端异二聚化结构域(分别是HD-N和HD-C的负向调节区(NRR))以及ankarin结构域(ANK)和PEST结构域。图2显示Notch3NRR的总体结构和相应氨基酸残基：LNR-A具有氨基酸残基E1383-G1422；LNR-A-B接头具有氨基酸残基Asp1423-Leu-1431；LNR-B具有氨基酸残基Gln1432-Ala1460；LNR-BC接头具有氨基酸残基Gly1461-Asn1468；LNR-C具有氨基酸残基Pro1469-Ser1502；LNR-HD接头具有氨基酸残基Glu1503-Arg1510；HD-N具有氨基酸残基Gly1511-Arg1571；并且HD-C具有氨基酸残基1572-Ser1640。
人Notch3如下文SEQIDNO:1代表。
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDVASGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEEPGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVAPAMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHFANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAAQSGSKKSRRPPGKAGLGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAGAHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATTTGALPAQPLPLSVPSSLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDNO:1)
食蟹猴Notch3如下文SEQIDNO:2代表。
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAVPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHSARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGICKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGMLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCSFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLLGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCPQSFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGENCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFSGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDVAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEELGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVAPAMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHFANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGTHGLGPLLCPPGAFLPGLKVTQSGSKKSRRPPGKAGLGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAGAHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATATGALPAQPLPLSVPSSLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDNO:2)
如本文所用，术语“Notch配体”指结合并活化Notch3受体的多肽。Notch3配体的例子包括但不限于δ样配体(例如DLL1、DLL3和DLL4)和Jagged配体(例如，Jagged1和Jagged2)。
在Notch3的上下文中使用的术语“稳定作用”或“稳定”指直接维持(锁定、系留、束缚、偏好地结合、有利于)Notch3受体自我抑制型构象或状态的抗体或其片段。在实施例中描述的测定法可以用来测量稳定化Notch3受体的信号转导，例如使用本文中公开的ICD3抗体的体外筛选法。
如本文所用，术语“配体依赖的信号传导”指借助配体(例如，δ或Jagged配体)活化Notch3。配体结合产生了导致Notch3信号转导的Notch3蛋白酶剪切事件。相对未处理的(对照)细胞，抗体或其片段可以抑制暴露于该抗体或其片段的细胞的Notch3信号传导，如使用实施例中描述的测定法测量。表达Notch3的细胞可以是天然存在的细胞系或可以通过向宿主细胞引入编码Notch3蛋白的核酸重组地产生。
如本文所用，术语“配体非依赖的信号传导”指细胞Notch3活性(例如，在NRR结构域内部S2处被切割并且随后在不存在配体结合要求的情况下在S3位点处被切割的Notch3)。例如，配体非依赖性Notch3活化可以是Notch3过量表达/Notch3中扩增或活化性突变的结果。相对未突变的(对照)细胞，抗体或其片段可以抑制暴露于该抗体或其片段的细胞的Notch3信号传导，如使用实施例中描述的测定法测量。过量表达Notch3的细胞可以是天然存在的细胞系(例如HCC1143，TALL-1)或可以通过向宿主细胞引入编码Notch3蛋白的核酸重组地产生。在另一个例子中，细胞可以具有配体依赖的和配体非依赖的Notch3信号传导这两者。
如本文所用，术语“阻断”指阻止或阻碍相互作用或过程，例如阻止配体依赖的或配体非依赖的信号传导。
如本文所用的术语“识别”指发现其构象表位并与之相互作用(例如，结合)的抗体或其片段。
如本文所用的术语“抗体”指(例如，通过结合、空间位阻、稳定空间分布)与Notch3表位相互作用并抑制信号转导的完整抗体。天然存在的“抗体”是包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定域包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步再划分为超变区，名为互补决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，名为构架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和4个FR，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补系统的第一组分(C1q))结合。术语“抗体”例如包括，单克隆抗体，人抗体，人源化抗体，骆化抗体，嵌合抗体，单链Fvs(scFv)，二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，针对本公开抗体的抗Id抗体)和前述任一者的表位结合片段。抗体可以属于任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
轻链和重链均分成具有结构同源性和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”以功能方式使用。在这个方面，可以理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要的生物学特性如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合作用等。按常规，恒定区结构域的编号随着它们变得距抗体的抗原结合位点或氨基端更远而增加。N端是可变区和在C端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如本文所用，短语“抗体片段”指抗体的一个或多个部分，所述部分(例如，通过结合、空间位阻、稳定空间分布)保留与Notch3表位特异性相互作用的能力并抑制信号转导。抗体的结合片段的例子包括但不限于Fab片段，一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头连接，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见例如Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。术语“抗体片段”也意在涵盖这类单链抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗体片段，并且按照与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。
也可以将抗体片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、胞内抗体、双抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如Hollinger和Hudson,(2005)NatureBiotechnology23:1126-1136)。可以将抗体片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)中(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽单体抗体(monobodies))。
可以将抗体片段并入单链分子中，其中所述单链分子包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995ProteinEng.8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用的短语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有基本上相同的氨基酸序列或从相同遗传源衍生的多肽，包括抗体、抗体片段、双特异性抗体等。这个术语还包括具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，短语“人抗体”包括具有构架区和CDR区均从人源序列衍生的可变区的抗体。另外，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自这类人序列，例如人种系序列、或者突变形式的人种系序列或含有从人构架序列分析导出的共有构架序列的抗体，例如如Knappik等人,(2000)JMolBiol296:57-86)中所述。免疫球蛋白可变域(例如，CDR)的结构和位置可以使用熟知的编号方案(例如，Kabat编号方案、Chothia编号方案或Kabat和Chothia的组合)定义(见，例如SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，美国卫生和公众服务部(1991)，(编著)，Kabat等人；Lazikani等人,(1997)J.Mol.Bio.273:927-948；Kabat等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，NIHPublicationno.91-3242美国卫生和公众服务部；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:877-883；和Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948。
本文中公开的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或定点诱变或通过体内的体细胞突变而引入的突变、或保守替换，以促进稳定性或生产)。
如本文中所用的短语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性的抗体，所述抗体是具有构架区和CDR区衍生自人序列的可变区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从非人转基因动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞，所述非人转基因动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，短语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的全部人抗体，如从就人免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从中制备的杂交瘤抗体分离的抗体，从经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体、从重组人抗体组合文库分离的抗体和通过涉及将全部或一部分人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有构架区和CDR区从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可以经历体外诱变(或，使用相对于人Ig序列为转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管衍生自人种系VH和VL序列并且与之相关，但可能在体内人抗体种系库内部不天然存在的序列。
两个实体之间的“特异性结合”意指具有以下平衡常数(KA)(kon/koff)的结合作用：至少102M-1、至少5x102M-1、至少103M-1、至少5x103M-1、至少104M-1、至少5x104M-1、至少105M-1、至少5x105M-1、至少106M-1、至少5x106M-1、至少107M-1、至少5x107M-1、至少108M-1、至少5x108M-1、至少109M-1、至少5x109M-1、至少1010M-1、至少5x1010M-1、至少1011M-1、至少5x1011M-1、至少1012M-1、至少5x1012M-1、至少1013M-1、至少5x1013M-1、至少1014M-1、至少5x1014M-1、至少1015M-1或至少5x1015M-1。
短语“与抗体(例如，结合Notch3的抗体)特异性(或选择性)结合”指确定不均一蛋白质群体和其他生物制品中存在关联抗原(例如，人Notch3)的结合反应。除上文所示的平衡常数(KA)之外，本文中公开的结合Notch3的抗体一般还具有小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M、小于5x10-10M、小于10-10M、小于5x10-11M、小于10-11M、小于5x10-12M、小于10-12M、小于5x10-13M、小于10-13M、小于5x10-14M、小于10-14M、小于5x10-15M，或小于10-15M或更低的解离速率常数(KD)(koff/kon)，并且以这样的亲和力与Notch3结合，所述亲和力至少两倍大于其与非特异性抗原(例如，HSA)结合的亲和力。
在一个实施方案中，抗体或其片段具有小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM、小于10pM、小于1pM的解离常数(Kd)，如使用本文所述或本领域技术人员已知的方法(例如，BIAcore测定法、ELISA、FACS、SET)(BiacoreInternationalAB，Uppsala，瑞典)评估。如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语“Kdis”或“Kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”指解离常数，它从Kd对Ka的比率(即Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域充分建立的方法确定抗体的KD值。一种用于确定抗体的KD的方法是使用表面等离子体共振法或使用生物传感器系统如系统。
本文所用的术语“亲和力”(affinity)指，抗体与抗原在单个抗原部位上相互作用的强度。在每个抗原位点内部、抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
如本文所用的术语“亲合力”指抗体-抗原复合物的总体稳定性或强度的信息型量值。它受控于三个主要因素：抗体表位亲和力；抗原和抗体二者的价态；和相互作用部分的结构排列。最终，这些因素定义了抗体的特异性，即，特定抗体与精确抗原表位结合的可能性。
如本文所用，术语“价态”指多肽中潜在靶结合位点的数目。每个靶结合位点特异性结合一种靶分子或靶分子上的特定位点(即，表位)。当多肽包含多于一个靶结合位点时，每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以与不同分子(例如，不同抗原)或相同分子上的不同表位结合)。
如本文所用的短语“拮抗抗体”指与Notch3结合并抑制Notch3信号传导的抗体，如通过本文所述的测定法(例如，ICD3测定法)所测定。因此，如根据本文所述的测定法所测定，“抑制”一种或多种Notch3功能特征(例如，生物化学活性、免疫化学活性、细胞活性、生理学活性或其他生物学活性等)的抗体将理解为相对于抗体不存在时(例如，或当具有不相关特异性的对照抗体存在时)观察到的特定活性，涉及所述特定活性的统计显著下降。抑制Notch3活性的抗体实现这种统计显著下降达测量参数的至少10％、至少50％、80％或90％，并且在某些实施方案中，本文中公开的抗体可以抑制大于95％、98％或99％的Notch3功能活性。
短语“分离的抗体”指一种抗体，它基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，与Notch3特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合除Notch3之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合Notch3的分离抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。另外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白特异性结合或与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇总体上由分子的化学活跃的表面基团如氨基酸或糖类或糖侧链组成并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性”或“构象型”的。
术语“线性表位”指蛋白质和相互作用性分子(如抗体或其片段)之间的全部相互作用点沿该蛋白质的一级氨基酸序列(连续)线性存在的表位。一旦确定抗原上的所需表位，可以产生针对这个表位的抗体，例如使用本文描述的技术产生。备选地，在发现过程期间，抗体或其片段的产生和表征可以阐明关于所需表位的信息。从这种信息中，则可能针对与相同表位的结合作用竞争性筛选抗体。一项实现这点的方案将实施交叉竞争研究以便找到彼此竞争性结合的抗体，例如竞争与抗原结合的抗体。国际专利申请号WO2003/4873中描述了基于抗体交叉竞争作用“分拣(binning)”抗体的高通量方法。
术语“构象表位”指其中不连续氨基酸残基在立体形状中聚拢的表位。在构象表位中，相互作用点跨越彼此由至少一个氨基酸残基分隔的氨基酸残基出现(不连续)，即，接触点出现在不同和分离的NRR区域如LNR区域、HD以及接头区域上。仅出于示意性目的，构象表位还可以包含在不同和分离的NRR区域上的连续触点，例如与LNR区域中的至少两个氨基酸、HD区域中的至少两个氨基酸和接头区域(例如，LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头)中的至少一个氨基酸残基连续接触。在一个实施方案中，构象表位是本文实施例中描述的那种。在一个实施方案中，构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)和HD(例如，α3螺旋)内部的氨基酸残基之间的不连续相互作用点。在一个实施方案中，构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)和HD内部的氨基酸残基之间的不连续相互作用点和在LNR区域(例如，α3螺旋)和HD(例如，LNR-HD接头)之间的至少一个接头。在一个实施方案中，构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)和HD(例如，α3螺旋)内部的氨基酸残基之间的不连续相互作用点和在HD(例如，β4-α3环)内部的至少一个接头。在一个实施方案中，构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)和HD(例如，α2螺旋)内部的氨基酸残基之间的不连续相互作用点和在HD(例如，α3-β5环)内部的至少一个接头。在一个实施方案中，构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义：SEQIDNO:1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一个实施方案中，构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义：SEQIDNO:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(HDα3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一个实施方案中，构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义：1489-1498(LNR-C)、1500-1506(LNR-HD接头)、1538-1568(HD)和1571-1591(HD)。本领域技术人员理解，被创建分子形状的残基或侧链占据的空间有助于确定表位是什么。
通常，对特定靶抗原特异的抗体将偏好地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中靶抗原上的表位。
可以使用本领域熟知的任何种类的表位作图技术，鉴定给定多肽中包括表位的区域。见，例如MethodsinMolecularBiology,第66卷,(GlennE.Morris编著,1996)HumanaPress,Totowa,NewJersey中的EpitopeMappingProtocols。例如，可以通过以下方式确定线性表位：在固相支持物上同时合成大量肽，这些肽与蛋白质分子的各部分相对应，并且在肽仍与支持物连接的情况下，使所述肽与抗体反应。这类技术是本领域已知的并且在例如美国专利号4,708,871；Geysen等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8:3998-4002；Geysen等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:78-182；Geysen等人,(1986)Mol.Immunol.23:709-715中描述。类似地，通过确定氨基酸的空间构象轻易地鉴定构象表位，如通过例如氢/氘交换、X射线结晶学和二维核磁共振法。参见，例如上文EpitopeMappingProtocols。也可以使用标准抗原性绘图和亲水性绘图鉴定蛋白质的抗原区，如使用例如从OxfordMolecularGroup可获得的Omiga1.0版软件程序计算出来的那些。这种计算机程序使用Hopp/Woods法，Hopp等人,(1981)Proc.Natl.Acad.SciUSA78:3824-3828；以确定抗原性谱，并使用Kyte-Doolittle技术，Kyte等人,(1982)J.MoI.Biol.157:105-132；用于亲水性绘图。
如本文所用的术语“互补位”指决定与表位结合的结合区的总体结构。这种结构影响结合区是否可能并且以何种方式与表位结合。术语“互补位”可以指抗体或其片段中负责抗体或其片段与抗原决定簇结合的抗原位点。互补位还指抗体的独特位和与表位结合的互补决定区(CDR)。
在一个实施方案中，构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义：SEQIDNO:1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一个实施方案中，互补位是包含CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中，互补位包含表2中所列的序列。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
在一个实施方案中，构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义：SEQIDNO:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
本领域技术人员理解，任何抗体或其变体的互补位可以按本申请所述的方式确定。
术语“交叉竞争”和“交叉竞争的”在本文中互换地用来意指抗体或其片段在标准竞争性结合测定法中干扰其他抗体或片段与Notch3结合的能力。在一个实施方案中，术语“交叉竞争”指干扰其他抗体或其片段与Notch3的至少一个构象表位结合的抗体或其片段。
可以使用标准竞争结合测定法确定抗体或其他结合物能够干扰另一种抗体或其片段与Notch3结合的能力和程度和是否因此可以称它为根据本发明的交叉竞争。一种合适的测定法涉及使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore3000仪器(Biacore，Uppsala，瑞典)，所述技术可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。测量交叉竞争的另一种测定法使用基于ELISA的方法。
术语“多肽”和“蛋白质”在此互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体。
短语“保守性修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定的核酸序列，保守性修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码任何给出的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因而，在其中丙氨酸由某个密码子指定的每个位置，可以将该密码子变成任一个所述的相应密码子，而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默性变异”，它们是一个种类的保守性修饰变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每种可能沉默变异。技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(例外是AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默性变异隐含于每个描述的序列中。
对于多肽序列，“保守性修饰的变体”包括对多肽序列的各个置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本文中公开的多态性变体、物种间同源物和等位基因是额外的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用的术语“优化的”指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物(通常是真核细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列经工程化以完全或尽可能保留由起始核苷酸序列最初编码的氨基酸序列，也称作“亲本”序列。
评价抗体针对多个物种的Notch3的结合能力的标准测定法是本领域已知的，例如包括ELISA、蛋白质印迹法和RIA。在实施例中详述合适的测定法。也可以通过本领域已知的标准测定法，如通过Biacore分析或FACS相对亲和力(Scatchard)，评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)。在实施例中更详细地描述评价抗体对Notch3的功能特征之影响的测定法(例如，受体结合测定法、调节Notch3信号传导途径)。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，短语“同一的百分数”或“同一性百分数”指相同的两个或更多个序列或子序列。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量，两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域范围内或当未指定时在整个序列范围内60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则这两个序列是“基本上同一的”。任选地，同一性存在于具有至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域内，或更优选地存在于具有100个至500个或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)长度的区域内。
对于序列比较，一般地一个序列充当检验序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将检验序列和参考序列输入计算机，根据需要指定次级序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。基于程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列同一性百分数。
如本文所用，“比较窗口”包括针对具有任一连续位置数的节段的参考，所述的连续位置数选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中一个序列可以与具有相同连续位置数的参考序列在最佳比对这两个序列后进行比较。用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以按如下方式进行，例如通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics软件包，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视审查(参见例如，Brent等人,(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology)。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST算法和BLAST2.0算法，它们分别在Altschul等人,(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。这种算法涉及首先通过查询序列中长度W的短字鉴定高评分序列对(HSP)，其中所述短字与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某些正值阈评分T。将T称作相邻字评分阈值(Altschul等人，上文)。这些初始相邻字命中充当种子，所述种子用于启动检索以找到含有这些种子的更长HSP。所述字命中在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积比对评分即可。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的报酬评分；总是>0)和N(错配残基的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在以下情况时停止：累积比对评分从其最大实现值跌落达量X；累积评分因积累一个或更多负评分残基比对结果而达到或低于零；或抵达两个序列中任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长度(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认参数。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长度3和期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915)、比对结果(B)50、期望(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认参数。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(见，例如Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会因偶然发生的概率指示。例如，如果最小总和概率在测试核酸与参考核酸的比较中小于约0.2、更优选小于约0.01并且最优选小于约0.001，则将认为核酸相似于参考核酸。
还可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
除上文所示的序列同一性的百分数之外，两个核酸序列或多肽基本上同一的另一个指标是由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽所产生的抗体发生免疫交叉反应，如下文描述。因此，在两种肽仅因保守性置换而不同的情况下，一个多肽一般与第二多肽基本上相同。两个核酸序列基本上同一的另一个指标是这两个分子或它们的互补物在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两个核酸序列基本上同一的又一个指标是相同的引物可以用来扩增该序列。
短语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用并且指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链形式或双链形式的聚合物。本术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰型主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似参考核苷酸的方式代谢。这类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外说明，特定核酸序列也隐含地包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下文详述，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并密码子置换(Batzer等人,(1991)NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。
短语“有效连接”指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。一般地，它指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列与编码序列有效连接。通常，与已转录的序列有效连接的启动子转录调节序列物理地与已转录的序列连续，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要物理上与转录它们增强的编码序列连续或与之紧邻。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括全部脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、犬、奶牛、鸡、两栖类和爬行类。除非指出，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
本公开的多个方面在以下部分和子部分进一步详细描述。
Notch3受体
Notch信号传导是进化上保守的途径，该途径调节多样性生物学功能集合，包括胚胎发育和成年组织中的干细胞维持、细胞分化和增殖(Kopan等人,(2009)Cell137:216-233,Guruharsha等人,(2012)NatRevGenet.13:654-66和Andersson等人,(2001)Development138:3593-3612)。在哺乳动物中，已经描述了四种Notch受体(Notch1-4)，它们具有保守结构域构造。胞外结构域(ECD)由一系列EGF样重复序列接续负向调节区(NRR)组成，所述负向调节区含有3个LNR重复序列和一个异二聚化结构域，如图1中所显示。
在实体瘤中，Notch信号传导在肿瘤起始和进展中的作用并未充分理解(Ranganathan等人,(2011)NatRevCancer11:338-51)。Notch受体涉及上皮细胞转化的早期证据来自小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)插入性诱变研究。例如，Notch4(起初称作Int3)由MMTV活化导致乳腺瘤发生(Gallahan等人,(1987)JVirol61:218-220，Gallahan等人,(1997)Oncogene14:1883-1890)。2011年，在雌激素受体(ER)阴性乳腺癌中鉴定到Notch1或Notch2重排(Robinson等人,(2011)NatMed17:1646-51)。这些Notch受体重排导致膜束缚形式的缺少完整NRR结构域的受体或ICD样蛋白的产生。
Notch3NRR具有与Notch1(Gordan等人,(2009)Blood113:4381-4390；Gordon等人,(2009)4:e6613；Wu等人,(2010)Nature464:1052-1057)和Notch2(Gordon等人,(2007)NatStructMolBiol14:295-300)相似的总体折叠。它包含三个Lin12/Notch重复序列(LNR)(即LNR-A、LNR-B和LNR-C)；和由弗林蛋白酶切割作用在S1位点(在R1571和E1572之间)处分裂成N端部分(HD-N)和C端部分(HD-C)的异二聚化(HD)结构域(参见图2)。
NRR结构域调节Notch受体的活化，这涉及三个蛋白酶解步骤。在Notch前体的成熟期间，弗林蛋白酶样转化酶在NRR内部的S1位点处切割，以引发活化。ADAM蛋白酶在也处于NRR内部的S2位点处切割，以产生γ分泌酶在S3位点处进行膜内蛋白酶解的底物。在S3切割之后，Notch的胞内部分随后进入胞核以活化转录。S2切割是这种活化系列反应的关键步骤并且受NRR结构域负向调节。这种所谓自我抑制的机制可以在下文由NRR结构解释。
虽然不受提供理论约束，一种可能的作用机理模型是Notch3NRR一般以自我抑制型构象存在，其中各自配位一个Ca2+离子的三个LNR缠绕在HD周围以保护S2位点免遭ADAM蛋白酶接近。LNR和HD之间相互作用以及这些区域内部那些相互作用的稳定性对维持NRR的自我抑制型构象至关重要。Notch3NRR中的突变改变自我抑制型构象，因而暴露HD结构域，从而蛋白酶可切割S2位点以及随后切割S3位点，因而活化下游Notch3信号转导。因此，去稳定NRR的突变，如(本文中公开的)相关癌症中存在的那些突变，能增强Notch3的活化。另一方面，能稳定LNR-HD相互作用的试剂如抗体或其片段能潜在地抑制Notch3信号传导。抗体或其片段如20350和20358结合Notch3的自我抑制型构象并稳定化(直接维持、束缚、锁定)自我抑制型构象，因而阻止S2位点暴露于蛋白酶切割作用，并阻止后续的下游Notch3信号传导。
在一些实施方案中，抗体或其片段与构象表位结合，从而它限制LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C以及各LNR结构域之间的相应接头)相对HD的活动性，稳定处于自我抑制型构象的Notch3NRR。未能形成活性(非抑制型、开放)构象导致不能活化信号转导。在一些实施方案中，抗体或其片段与构象表位结合，从而它阻止NRR内部的HD变得暴露，因而使其不可在S2位点和/或S3位点被蛋白酶切割。未能切割S2位点导致不能活化信号转导。
Notch3突变体
在一个方面，本公开涉及Notch3受体中的突变。在受体的两个常见区域，在>50％T-ALL患者中鉴定到Notch1的活化性突变(Weng等人,(2004)Science306:269-71)。发现一类突变聚类于NRR的HD结构域的疏水核心中。也已经在LNR结构域中鉴定到罕有突变(Gordon等人,(2009)Blood113:4381-4390)。NRR突变可能通过部分或完全地解折叠HD结构域，改变保护S2位点的口袋并破坏与LNR的相互作用而发挥作用。这种假设得到以下生物化学数据支持：具有白血病相关突变的HD结构域较不稳定(Malecki等人,(2006)Mol.CellBiol.26:4642-4651)。
还在蛋白质C末端的PEST(脯氨酸-谷氨酸盐-丝氨酸-苏氨酸丰富)结构域中鉴定到突变。ICD水平受到严密调节并且PEST结构域的磷酸化和后续遍在蛋白化指引ICD被E3连接酶如Fbw7降解。突变是导致PEST结构域缺失并导致稳定性增加及蛋白质半寿期更长的ICD的无义突变或移码突变。
迄今，癌症中Notch受体的证据主要集中在Notch1信号传导的改变方面。但是，已经在几项研究(包括TCGA分析浆液性卵巢癌)中显示Notch3在11-25％的患者样品中扩增(Nakayama等人,(2007)IntJCancer120:2613-17；Etemadmoghadam等人,(2009)ClinCanRes15:1417-27；Bell等人,(2011)Nature474:609-615)。虽然已经报道在伴皮质下梗死和脑白质病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)综合征中报道了Notch3中的突变，但是这些突变一般在性质上是错义的，并且不清楚Notch3功能改变和疾病病变的联系(参见Ayata,(2010),Stroke41:S129-S134)。全面分析各种癌类型中的基因突变已经由TCGA和其他机构进行。使用的标准技术是外显子-捕获法。作为这些研究的部分，已经在约1％的头颈部鳞状癌、卵巢癌和肺腺癌中报道Notch3突变。但是，缺少对Notch3外显子25和外显子33的足够外显子覆盖率造成技术人员难以寻找Notch3基因中的突变。进一步，Notch3基因中的高GC含量已经已经阻碍技术人员了解突变。此外，已经提出鳞状细胞肺癌中鉴定的突变是功能丧失突变(参见Egloff和Grandis(2012)ClinCanRes18:5188-519)。相反并且与此前研究矛盾，本文公开内容显示了活化Notch3信号转导(“活化性突变”)和参与癌症发病机理的多种突变。
为了鉴定Notch3突变，表征了947种人癌细胞系并且通过使用溶液相杂交分子捕获技术大规模平行测序，获得>1600个基因的突变信息，如实施例5中所述。此外，用RNAseq对原发肿瘤样品测序(Wang等人(2009)NatureReviewsGenetics10:57-63)。如表1中所示，在多个细胞系和肿瘤样品中鉴定到NRR结构域和PEST结构域中的突变。
干扰Notch3功能的活化性突变参与癌症发病机制。由于功能丧失、获得功能或功能改变的变化Notch3的存在直接增加癌症风险，所以这类突变的检测本身适用于诊断方法和预后方法。随后可以通过与突变体Notch3结合的抗体或其片段处理来鉴定这类活化性突变。
表1：Notch3活化性突变
从以下不同细胞系选择来自NRR结构域的两个突变用于表征：(i)TALL-1细胞，它是具有S1580L突变的T细胞急性淋巴母细胞系；和(ii)具有G1487D突变的乳腺肿瘤(X-1004)。实施例显示向Notch3受体中引入S1580L突变或G1487D突变导致来自受体的基础信号传导相对于野生型对照增加大约10倍。在这个系统中，野生型受体和突变体受体以大致等同的水平表达，如通过FACS测定法所确定。该数据显示这些突变在表达这些突变和其他相似突变的细胞系和肿瘤中活化Notch3信号传导。这种Notch3信号传导活化被Notch3抗体或其片段抑制。
为了检测Notch3突变体，制备生物样品并分析受试样品的序列与野生型Notch3序列之间的差异，其中认为所述受试样品含有突变体Notch3。可以通过本文所述的任何技术鉴定突变体Notch3。可以将突变体Notch3测序以鉴定特定突变(增加Notch3信号转导的活化性突变)。突变，尤其导致蛋白质功能改变的那些突变，随后用于本发明的诊断方法和预后方法。
为了进一步分析，将Notch3突变体的癌突变定位到Notch3NRRX射线晶体结构上。结构性分析显示这些突变的某些可能破坏结构域内和结构域间的相互作用、去稳定化Notch3NRR的自我抑制性构象并造成Notch3活化和信号转导。
这些突变与20350表位和20358表位的比较(下文描述)显示它们大部分不在所述表位内部，表明20350和20358抗体片段可以结合处于自我抑制型构象的野生型和突变体Notch3NRR并抑制Notch3信号转导。
在一些实施方案中，可以将突变体引入野生型Notch3(SEQIDNO:1)中，以研究对抗体结合的影响。使用已知技术如丙氨酸扫描法诱变可以帮助定义功能相关的表位。也可以使用利用精氨酸/谷氨酸扫描方法的诱变(参见，例如Nanevicz等人,(1995),J.Biol.Chem.270(37):21619-21625和Zupnick等人,(2006),J.Biol.Chem.281(29):20464-20473)。通常，用精氨酸和谷氨酸(一般分别地)置换野生型多肽中的氨基酸，因为这些氨基酸带电荷并且体积大并且因此具有在引入突变的抗原区域内破坏抗原结合蛋白和抗原之间结合作用的可能性。野生型抗原中存在的精氨酸以谷氨酸替换。可以获得多种的这类独立突变体并且分析收集的结合结果以确定哪些残基影响结合作用。可以产生一系列突变体Notch3，每种突变体Notch3具有单一突变。可以测量每种突变体Notch3与各种Notch3抗体或其片段的结合作用并且与结合野生型Notch3(SEQIDNO:1)的所选抗体或其片段的能力比较。
抗体或其片段和如本文所用的突变体或变体Notch3之间结合作用的改变(例如减少或增加)意指存在抗原结合蛋白的结合亲和力变化(例如，如通过已知方法(如下文在实施例中描述的Biacore检验或基于珠的测定法)所测量)、EC50变化和/或总结合能力变化(例如减少)(例如，如通过抗原结合蛋白浓度对抗原浓度作图中的Bmax下降佐证)。结合作用的显著改变表示突变的残基参与抗体或其片段的结合。
在一些实施方案中，结合作用的显著减少意指抗体或其片段和突变体Notch3抗原之间的结合亲和力、EC50和/或能力相对于抗体或其片段和野生型Notch3(例如，SEQIDNO:1)之间的结合作用减少大于10％、大于20％、大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。
在一些实施方案中，抗体或其片段对与野生型Notch蛋白(例如，SEQIDNO:1)相比具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5，6、7、8、9、10或更多个)突变的突变体Notch3的结合作用显著减少或增加。
尽管变体形式相对于SEQIDNO:1中所示的野生型序列提及，但是将可以理解在Notch3的等位变体或剪接变体中，氨基酸可能不同。还构思了对这类Notch3等位形式显示明显改变的结合作用(例如，更低或更高结合作用)的抗体或其片段。技术人员将理解，表1中描述的任一个突变体可以与表1中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种任何其他突变体组合，在以产生可以用来鉴定、诊断或监测受试者的“表达模式”或“表达特征标识”。
在一些实施方案中，表达特征标识包含一个或多个组1突变，例如S1580L、R1510H、D1587N、R1580Q和Y1624H的组合。在一些实施方案中，表达特征标识包含一个或多个组2突变，例如G1487D、A1476T、A1609T、L1518M和A1537T的组合。在一些实施方案中，表达特征标识包含一个或多个组3突变，例如N1597K、L1547V和R1526C的组合。
在一些实施方案中，表达特征标识包含一个或多个组1突变，例如S1580L、R1510H、D1587N、R1580Q和Y1624H的组合；和一个或多个组2突变，例如G1487D、A1476T、A1609T、L1518M和A1537T的组合。在一些实施方案中，表达特征标识包含一个或多个组1突变，例如S1580L、R1510H、D1587N、R1580Q和Y1624H的组合；和一个或多个组3突变，例如N1597K、L1547V和R1526C的组合。在一些实施方案中，表达特征标识包含一个或多个组2突变，例如例如G1487D、A1476T、A1609T、L1518M和A1537T的组合；和一个或多个组3突变，例如N1597K、L1547V和R1526C的组合。
Notch3结构和构象表位
在一个方面，本公开涉及鉴定Notch3的多种不同构象表位。首次，已经显示了与多种抗体或其片段复合的Notch3的NRR结构域(残基1379-1640)的三维结构。Notch3NRR/20350Fab复合物和Notch3NRR/20358Fab已经分别以3.2埃分辨率和分辨率测定并且在图23和图24中显示。本公开还首次显示在NRR内部存在多个构象表位并且抗体片段与彼此隔离的独特构象表位结合，如图25中所示。抗体或其片段与自我抑制状态的Notch3结合并且稳定处于这种自我抑制状态的Notch3。
本公开在此显示在NRR中存在与不同类别的Notch3抗体或其片段结合的多个不同构象表位。在一个实施方案中，第一类抗体(例如，20350)与NRR结构域中的第一构象表位结合；第二类抗体(例如，20358)与NRR结构域中的第二构象表位结合；并且第三类抗体与NRR结构域中的第三构象表位结合。在一个实施方案中，NRR的第一、第二和第三构象表位不重叠；并且第一、第二和第三类抗体与NRR的不同区域结合。在一个实施方案中，NRR的第一和第二构象表位不重叠；并且第一和第二类抗体与NRR的不同区域结合。在一个实施方案中，NRR的第一和第三构象表位不重叠；并且第一和第三类抗体与NRR的不同区域结合。在一个实施方案中，NRR的第二和构象表位不重叠，并且第二和第三类抗体与NRR的不同区域结合。
在一个实施方案中，NRR的第一、第二和第三构象表位彼此重叠至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基；并且第一、第二和第三类抗体与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重叠性氨基酸残基结合。在一个实施方案中，NRR的第一和第二构象表位彼此重叠至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基；并且第一和第二类抗体与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重叠性氨基酸残基结合。在一个实施方案中，NRR的第一和第三构象表位彼此重叠至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基；并且第一和第三类抗体与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重叠性氨基酸残基结合。在一个实施方案中，NRR的第二和第三构象表位彼此重叠至少1、2、3、4、或5、6、7、8、9或10个氨基酸残基；并且第二和第三类抗体与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重叠性氨基酸残基结合。
为了分析NRR内部的不同构象表位，X射线结晶学和氢-氘交换实验如实验部分中详述那样实施。可以通过以下方式制备Notch3的晶体：在合适宿主细胞中表达编码Notch3或其变体的核苷酸序列，并且随后在靶向Notch3的相关Fab存在下结晶纯化的蛋白质。
Notch3多肽也可以作为融合蛋白产生，例如以辅助提取和纯化。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、组氨酸(HIS)、六组氨酸(6HIS)、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以便利的是在融合蛋白配偶体和目的蛋白质序列之间包括蛋白酶剪切位点以允许移除融合蛋白序列。
在表达后，可以将蛋白质纯化和/或浓缩，例如通过固定的金属亲和层析、离子交换层析和/或凝胶过滤。
可以使用本文所述的技术结晶蛋白质。常见地，在结晶过程中，含有蛋白质溶液的液滴与结晶缓冲液混合并且允许其在密封容器中平衡。可以通过已知技术如“悬滴”法或“坐滴”法实现平衡。在这些方法中，液滴悬在大得多的结晶缓冲液储器上方或坐落于其旁边，并且通过蒸气扩散达到平衡。备选地，可以通过其他方法实现平衡，例如在油下、穿过半透膜或通过自由界面扩散实现(参见例如，Chayen等人,(2008)NatureMethods5,147–153)。
一旦已经获得晶体，可以由已知X射线衍射技术解析结构。许多技术使用化学修饰的晶体，如通过重原子衍生化修饰的那些，以逼近各相。在实践中，将晶体浸泡在含有可以扩散穿过晶体并与蛋白质表面结合的重金属原子盐或有机金属化合物(例如，氯化铅、硫代苹果酸金、硫柳汞或乙酸双氧铀)的溶液中。随后可以通过X射线衍射分析浸透的晶体，测定结合的重金属原子的位置。当晶体原子(散射中心)衍射X射线单色射束所获得的图形可以由数学方程解析以产生数学坐标。衍射数据用来计算晶体的重复单元的电子密度图。获得相信息的另一种方法是使用称作分子置换的技术。在这种方法中，将旋转算法和转换算法应用至衍生于相关结构的检索模型，产生目的蛋白的近似取向(参见Rossmann,(1990)ActaCrystalsA46,73-82)。电子密度图用来确立各个原子在晶体的晶胞内部的位置(Blundel等人,(1976)ProteinCrystallography,AcademicPress)。
本公开首次描述了Notch3和Notch3抗体Fab的多个三维结构，并且显示在NRR内部存在多个构象表位。Notch3的胞外NRR结构域在图2中显示。近似结构域界限如下：LNR-A具有氨基酸残基E1383-G1422；LNR-A-B接头具有氨基酸残基Asp1423-Leu1431；LNR-B具有氨基酸残基Gln1432-Ala1460；LNR-B-C接头具有氨基酸残基Gly1461-Asn1468；LNR-C具有氨基酸残基Pro1469-Ser1502；LNR-HD接头具有氨基酸残基Glu1503-Arg1510；HD-N具有氨基酸残基Gly1511-Arg1571；并且HD-C具有氨基酸残基1572-Ser1640。人Notch3具有登录号(NP_000426)(人)，并且下文如SEQIDNO:1代表。
Notch3和抗体或其片段的三维结构允许鉴定潜在Notch3受体调节物的靶结合位点。优选的靶结合位点是参与活化Notch3的那些。在一个实施方案中，靶结合位点位于Notch3的LNR结构域和HD结构域内部。因此，与LNR或HD结合并且优选地与LNR结构域和HD结构域这两者均结合的抗体或其片段可以通过以下方式调节Notch3活化：阻止所述结构域彼此解离并且阻止暴露HD结构域，从而阻止S2位点以及随后S3切割位点暴露。因此，与这些结构域内部的氨基酸残基结合的抗体或其片段造成Notch3维持阻止活化和下游信号转导的自我抑制型构象。
在一个实施方案中，构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义：SEQIDNO:1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一个实施方案中，互补位是包含CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中，互补位包含表1中所列的序列。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
在一些实施方案中，抗体或其片段与具有下述构象表位的人Notch3蛋白结合，所述构象表位包含氨基酸残基：SEQIDNO:1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602、和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下氨基酸残基内部的氨基酸或重叠性氨基酸残基结合：SEQIDNO:1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602、和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下氨基酸残基(和/或由其组成的氨基酸序列)内部的氨基酸结合：SEQIDNO:1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602、和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。
在一个实施方案中，构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义：SEQIDNO:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
在一些实施方案中，抗体或其片段与具有下述构象表位的人Notch3蛋白结合，所述构象表位包含以下氨基酸残基：SEQIDNO:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下氨基酸残基内部的氨基酸或重叠性氨基酸残基结合：SEQIDNO:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下氨基酸残基(和/或由其组成的氨基酸序列)内部的氨基酸结合：SEQIDNO:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一些实施方案中，抗体或其片段与构象表位结合，从而它限制LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)的活动性，使其稳定处于自我抑制型构象。未能形成活性(非抑制型、开放)构象导致不能活化信号转导。在一些实施方案中，抗体或其片段与构象表位结合，从而它阻止NRR内部的HD变得暴露，因而使其不可在S2位点和/或S3位点被蛋白酶切割。未能切割HD导致不能活化信号转导。
所述的结构还允许鉴定抗体或其片段(例如，20350和20358)与Notch3的相互作用界面的特定核心Notch3氨基酸残基。对于20350，这些核心氨基酸残基定义为在20350VH链的范围内的残基。这些核心残基如下：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。对于VL链，核心残基如下：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
对于20358，这些残基定义为在20358VH链的范围内的残基。这些核心残基如下：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。对于VL链，核心残基如下：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
实验部分显示，如通过将Notch3NRR/20350复合物和Notch3NRR/20358复合物的晶体结构在Notch3NRR上叠加所确定，20350和20358的构象表位不重叠，如图25中所示。20350和20358与不重叠的不同分立构象表位结合。甚至最接近的区域(与20350形成的E1464-R54氢键和与20358形成的R1463-D100盐桥)完全分离。这表示两种抗体可以同时结合Notch3NRR并且不交叉竞争。这个观察结果与下述分拣实验符合，所述分拣实验显示这些抗体处于不同的分拣区(bin)中并且彼此不竞争结合Notch3。
使用本文中公开的教导，技术人员能预测可以不过度干扰抗原结合蛋白与Notch3结合的能力情况下变动抗原结合蛋白的哪些残基和区域。
将相互作用界面氨基酸定义为至少一个原子相距Notch3配偶体蛋白小于或等于的全部氨基酸残基。选择作为允许原子处于范德瓦尔斯半径加可能的水介导的氢键范围内的截止距离。
在一些实施方案中，结合至20350、覆盖20350或阻止20350与前述任一残基相互作用的任何抗原结合蛋白可以用来结合至或抑制Notch3。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。在一些实施方案中，抗体及其片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598、His1599、Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下Notch3残基的组合结合或相互作用：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598、His1599、Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下全部Notch3残基结合或相互作用：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598、His1599、Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
在一些实施方案中，结合至20358、覆盖20358或阻止20358与前述任一残基相互作用的任何抗原结合蛋白可以用来结合至或抑制Notch3。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486、Gly1487、Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下Notch3残基的组合结合或相互作用：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486、Gly1487、Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。在一些实施方案中，抗体或其片段与以下全部Notch3残基结合或相互作用：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486、Gly1487、Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
在一个实施方案中，本文中公开的抗体结合至与20350相同的构象表位。在一个实施方案中，本文中公开的抗体结合至与20358相同的构象表位。在一些实施方案中，由表1中列出的任何抗体结合的构象表位是特别有用的。在某些实施方案中，Notch3构象表位可以用来分离与Notch3结合的抗体或其片段。在某些实施方案中，Notch3构象表位可以用来产生与Notch3结合的抗体或其片段。在某些实施方案中，Notch3构象表位可以用作免疫原以产生与Notch3构象表位结合的抗体或其片段。在某些实施方案中，Notch3构象表位可以施用至动物，并且随后可以从动物获得与Notch3结合的抗体。
除了对20337、20350和20358鉴定的构象表位之外，使用本文所公开的和如实施例中公开的方法，也可以找到Notch3NRR上的其他构象表位。特别地，桥接LNR和HD的构象表位；和其中S2塞(L1419)是表位组成部分的构象表位。
除了对20337、20350和20358鉴定的构象表位之外，使用本文所公开的和如实施例中公开的方法，也可以找到Notch3NRR上的其他构象表位。特别地，桥接LNR和HD的构象表位；和其中S2塞(L1419)是表位组成部分的构象表位。
可获得Notch3NRR以及Notch3NRR/20350和Notch3NRR/20358的复合物的3D结构为更详细地探索其他Notch3抗体提供了构架。Notch3的3D结构允许绘制单克隆抗体的表位并推断它们的作用模式，原因是某些单克隆抗体抑制细胞生长，某些单克隆抗体刺激细胞生长，和其他单克隆抗体对细胞生长无影响。Notch3的构象表位包含来自NRR的LNR区域和HD的不连续氨基酸残基。Notch33D结构的可获得性将促进确定这些抑制剂的精确作用机理和设计干扰Notch3功能的新方案。
除抗体的总体结构方面之外，可以通过结构性方法研究互补位和表位之间更特异的相互作用。在一个实施方案中，CDR的结构对互补位有贡献，其中抗体能够借助所述互补位与表位结合。可以按许多方式确定这种互补位的形状。可以使用传统的结构研究方法，如NMR或X射线结晶学。这些方法可以研究互补位单独或它与表位结合时的形状。
在一个实施方案中，互补位是包含CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中，互补位包含表1中所列的序列。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。在一个实施方案中，互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
备选地，分子模型可以用计算机方式生成。可以借助商业软件包，如来自Accelrys(圣迭戈，加利福尼亚州)的InsightII建模软件包，通过同源性建模生成结构。简而言之，可以使用待研究抗体的序列查找结构已知的蛋白质的数据库物，如ProteinDataBank。在鉴定结构已知的同源蛋白后，使用这些同源蛋白作为建模的模板。可以比对每个可能的模板，因此在模板之间产生基于结构的序列比对结果。结构未知的抗体的序列随后可以与这些模板比对以产生结构未知的抗体的分子模型。本领域技术人员理解，存在以计算机方式产生这类结构物的许多备选方法，可以使用其中任一种方法。例如，利用QUANTA(PolygenCorp.,Waltham,Mass.)和CHARM(Brooks等人,(1983),J.Comp.Chem.4:187)(所述文献通过引用的方式完地并入)，可以使用与授予Hardman等人的美国专利号5958708中描述的方法相似的方法。
不仅互补位的形状在确定某个可能的互补位是否及怎样与表位结合中重要，表位和互补位之间的相互作用本身还是设计变体抗体时的巨大信息来源。本领域技术人员理解，存在其中可以研究这种相互作用的多种方式。一种模式是使用(可能如上文所述)所生成的结构模型，并且随后使用一种具有对接模块的程序如InsightII(Accelrys，圣迭戈，加利福尼亚州)，所述对接模块尤其能够对互补位和其表位之间的构象空间和取向空间执行MonteCarlo搜索。结果是能够评估表位与互补位在哪里以及怎样相互作用。在一个实施方案中，仅表位的片段或变体用来辅助确定相关的相互作用。在一个实施方案中，整个表位用于互补位和表位之间相互作用的建模。
通过使用这些建模的结构，能够预测哪些残基在表位和互补位之间的相互作用中最重要。因此，在一个实施方案中，能够轻易选择改变哪些残基以便改变抗体的结合特征。例如，可以从对接模型显而易见，互补位中的某些残基的侧链可以在空间上阻碍表位的结合，因此将这些残基改变成具有更小侧链的残基可能是有益的。可以借助许多方式确定这一点。例如，可以简单地评判这两个模型并且基于官能团和接近度评估相互作用。备选地，可以进行表位和互补位的反复配对，如上文所述，旨在获得更有利的能量相互作用。还可以对抗体的多种变体确定这些相互作用，以确定其中抗体可能与表位结合的其它方式。还可以组合多种模型以确定应当怎样改变抗体结构以获得具有所需特定特征的抗体。
可以通过多种技术检验以上确定的模型。例如，可以用上文讨论的程序测定相互作用能量以决定进一步检验哪些变体。另外，库仑相互作用和范德瓦尔斯相互作用用来确定表位和变体互补位的相互作用能量。另外，位点定向诱变用来观察抗体结构中预测的变化是否实际上产生所需的结合特征变化。备选地，可以对表位作出变化以验证模型是正确的或以确定可能在互补位和表位之间出现的总体结合主线(bindingtheme)。
本领域技术人员理解，尽管这些模型提供了为产生本发明实施方案的抗体及其变体所必需的指导，但仍可能需要进行计算机模型的例行检验，这可能通过体外研究进行。此外，本领域技术人员显而易见的是，任何修饰还可能对抗体的活性产生额外的副作用。例如，尽管据预测导致更大结合作用的任何改变可以诱导更大的结合作用，它还可以造成可能减少或改变抗体活性的其他结构性变化。确定情况是否为这样是本领域常规行为并且可以按许多方式实现。例如，可以通过ELISA试验检验活性。备选地，可以通过使用表面等离子体共振装置受试样品。
Notch3抗体
本公开提供了识别Notch3的至少一个构象表位的抗体。本公开基于以下研究结果：一类针对Notch3的抗体与表2中公开的Notch3特定构象表位结合。
表2：Notch3抗体的例子
本公开提供特异性结合Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)的抗体或其片段，所述抗体包含具有SEQIDNO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189和209的氨基酸序列的VH结构域。本公开提供特异性结合Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)的抗体或其片段，所述抗体包含具有SEQIDNO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199和219的氨基酸序列的VL结构域。本公开还提供与Notch3(例如，人和/或食蟹猴Notch3)特异性结合的抗体或其片段，所述抗体尤其包含具有表1中所列的任一个CDR的氨基酸序列的CDR。特别地，本公开提供与Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)特异性结合的抗体，所述抗体包含1、2、3、4、5个或更多个CDR(或备选地，由其组成)，所述CDR具有在表2中列出的任一个CDR的氨基酸序列。
其他抗体或其片段包括这些抗体，其中所述氨基酸或编码所述氨基酸的核酸已经被突变，但仍与表2中描述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些实施方案中，其包括突变的氨基酸序列，其中在与表2所述序列所示的可变区相比时，可变区中已突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸，但保留基本相同的治疗活性。
由于这些抗体或其片段的每一种均可以与Notch3结合，可以“混合并匹配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)以产生其他Notch3的抗体。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA和实施例部分中描述的其他测定法)测试这类“混合和匹配的”结合Notch3的抗体。在混合和匹配这些链时，应当将来自特定VH/VL配对的VH序列替换为结构相似的VH序列。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应当替换为结构上相似的全长重链序列。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列应当替换为结构上相似的VL序列。同样地，应当将来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列替换为结构相似的全长轻链序列。
因此，在一个方面，本公开提供一种分离的单克隆抗体或其片段，它们具有：包含选自SEQIDNO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189和209的氨基酸序列的重链可变区；和包含选自SEQIDNO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199和219的氨基酸序列的轻链可变区；其中抗体与Notch3(例如，人和/或食蟹猴)特异性结合。
在另一个方面，本公开提供Notch3抗体，所述Notch3抗体包含如表2中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合。所述抗体的重链可变区CDR1的氨基酸序列在SEQIDNO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203中显示。所述抗体的重链可变区CDR2的氨基酸序列在SEQIDNO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204中显示。所述抗体的重链可变区CDR3的氨基酸序列在SEQIDNO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185和205中显示。所述抗体的轻链可变区CDR1的氨基酸序列在SEQIDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193和213中显示。所述抗体的轻链可变区CDR2的氨基酸序列在SEQIDNO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214中显示。所述抗体的轻链可变区CDR3的氨基酸序列在SEQIDNO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195和215中显示。使用Kabat系统描述CDR区(Kabat等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，美国卫生和公众服务部，NIH出版编号91-3242；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:877-883；和Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273,927-948)。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:3的CDR1；SEQIDNO:4的CDR2；SEQIDNO:5的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:13的CDR1；SEQIDNO:14的CDR2；和SEQIDNO:15的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:9的VH和SEQIDNO:19的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:23的CDR1；SEQIDNO:24的CDR2；SEQIDNO:25的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:33的CDR1；SEQIDNO:34的CDR2；和SEQIDNO:35的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:29的VH和SEQIDNO:39的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:43的CDR1；SEQIDNO:44的CDR2；SEQIDNO:45的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:53的CDR1；SEQIDNO:54的CDR2；和SEQIDNO:55的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:49的VH和SEQIDNO:59的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:63的CDR1；SEQIDNO:64的CDR2；SEQIDNO:65的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:73的CDR1；SEQIDNO:74的CDR2；和SEQIDNO:75的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:69的VH和SEQIDNO:79的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:83的CDR1；SEQIDNO:84的CDR2；SEQIDNO:85的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:93的CDR1；SEQIDNO:94的CDR2；和SEQIDNO:95的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:89的VH和SEQIDNO:99的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:103的CDR1；SEQIDNO:104的CDR2；SEQIDNO:105的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:113的CDR1；SEQIDNO:114的CDR2；和SEQIDNO:115的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:109的VH和SEQIDNO:119的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:123的CDR1；SEQIDNO:124的CDR2；SEQIDNO:125的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:133的CDR1；SEQIDNO:134的CDR2；和SEQIDNO:135的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:129的VH和SEQIDNO:139的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:143的CDR1；SEQIDNO:144的CDR2；SEQIDNO:145的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:153的CDR1；SEQIDNO:154的CDR2；和SEQIDNO:155的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:149的VH和SEQIDNO:159的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:163的CDR1；SEQIDNO:164的CDR2；SEQIDNO:165的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:173的CDR1；SEQIDNO:174的CDR2；和SEQIDNO:175的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:169的VH和SEQIDNO:179的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:183的CDR1；SEQIDNO:184的CDR2；SEQIDNO:185的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:193的CDR1；SEQIDNO:194的CDR2；和SEQIDNO:195的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:189的VH和SEQIDNO:199的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:203的CDR1；SEQIDNO:204的CDR2；SEQIDNO:205的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:213的CDR1；SEQIDNO:214的CDR2；和SEQIDNO:215的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:209的VH和SEQIDNO:219的VL。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:223的CDR1；SEQIDNO:224的CDR2；SEQIDNO:225的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:233的CDR1；SEQIDNO:234的CDR2；和SEQIDNO:235的CDR3。
在一个具体实施方案中，与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO:229的VH和SEQIDNO:239的VL。
在一个实施方案中，Notch3抗体是拮抗抗体。在某些实施方案中，与Notch3结合的抗体是表2中描述的抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C；其中HD结构域选自N端HD和C端HD；其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导；并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。
在一个实施方案中，本发明涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C；其中HD结构域选自N端HD和C端HD；其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导；并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域，并且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
在一个实施方案中，本发明涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C；其中HD结构域选自N端HD和C端HD；其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导；并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域；并且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
在一个实施方案中，本发明涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C；其中HD结构域选自N端HD和C端HD；其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导；并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域；并且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变；其中突变选自S1580L和G1487D。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-A/B接头中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-A/B接头中的氨基酸残基和在NRR区域的LNR—HD接头中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中构象表位还包含在NRR区域的LNR—HD接头中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中构象表位还包含在NRR区域的LNR—HD接头中的氨基酸残基和在HDβ4-α3环中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中构象表位还包含在HDβ4-α3环中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中构象表位还包含在LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头和HDβ4-α3环中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中构象表位还包含在LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头和HDβ4-α3环中的氨基酸残基；并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域，并且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个选自以下的氨基酸残基突变：S1580L、D1587N、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和G1487D、(LNR-C)、P2034fs、P2067fs(“fs”指移码)、p2177fs、Q2075*(“*”指终止密码子)、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、G2038S、G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、P2178S或其组合。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中构象表位包含氨基酸残基：(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch3残基结合：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch3残基结合：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B中的氨基酸残基并且还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基并且还包含在HDα3-β5环中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在HDα3-β5环中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中构象表位还包含在LNR-B、LNR-B/C接头和HDα3-β5环中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个选自以下的氨基酸残基突变：S1580L、D1587N、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和G1487D、(LNR-C)、P2034fs、P2067fs、p2177fs、Q2075*、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、G2038S、G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、P2178S或其组合。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变，其中构象表位包含氨基酸残基：(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变，其中抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch3残基结合：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变，其中抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch3残基结合：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
在一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
如本文所用，如果抗体的可变区或全长链从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得，则人抗体包含特定种系序列的“产物”或”衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区或全长重链或轻链。这类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用这种目的抗原筛选噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。可以通过以下方式鉴定作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或”衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体：将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列比较并且选择在序列方面与该人抗体的序列最接近(即最大同一性％)的人种系免疫球蛋白序列。作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或”衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以含有与该种系序列相比，例如因天然存在的体细胞突变或特意引入位点定向突变所致的氨基酸差异。然而，在VH或VL构架区中，选择的人抗体一般在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％同一并且含有与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比时，确定所述人抗体为人类的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体可以在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％同一。一般地，重组人抗体将在VH或VL构架区内显示与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列存在不多于10个氨基酸的不同。在某些情况下，人抗体可以显示与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列存在不多于5个、或甚至不多于4、3、2或1个氨基酸的不同。
本文中公开的抗体可以是单链抗体、双抗体(diabody)、结构域抗体、纳米体和单一抗体(unibody)的衍生物。“单链抗体”(scFv)由单条多肽链组成，所述单条多肽链包含与VH结构域连接的VL结构域，其中VL结构域和VH结构域配对以形成单价分子。单链抗体可以根据本领域已知的方法制备(见，例如Bird等人,(1988)Science242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。“disbud”由两条链组成，每条链包含与短肽接头连接的相同多肽链上的轻链可变区连接的重链可变区，其中相同链上的这两个区域不彼此配对，但是与另一条链上的互补结构域配对以形成双特异性分子。制备双抗体的方法是本领域已知的(见，例如Holliger等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448以及Poljak等人,(1994)Structure2:1121-1123)。结构域抗体(dAb)是抗体的有功能的小结合单位，对应于抗体重链或轻链的可变区。结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好表达。结构域抗体及其产生方法的其他细节是本领域已知的(见，例如美国专利号6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；欧洲专利0368684&0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。纳米体源自抗体的重链。纳米体一般包含单个可变域和两个恒定域(CH2和CH3)并保留原始抗体的抗原结合能力。纳米体可以通过本领域已知的方法制备(见，例如美国专利号6,765,087；美国专利号6,838,254、WO06/079372)。单一抗体(unibody)由IgG4抗体的一条轻链和一条重链组成。可以通过移除IgG4抗体的铰链区制备单一抗体。可以在WO2007/059782中找到单一抗体及制备它们的方法的其他细节。
同源抗体
在又一个实施方案中，本公开提供了包含与表2中所述序列同源的氨基酸序列的抗体或其片段，且所述抗体与Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)结合并且保留表2中描述的那些抗体的所需功能特征。
例如，本公开提供一种包含重链可变区和轻链可变区的分离单克隆抗体(或其功能性片段)，其中所述重链可变区包含与选自SEQIDNO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209和229的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％同一的氨基酸序列；轻链可变区包含与选自SEQIDNOs:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199和219的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％同一的氨基酸序列；该抗体与Notch3(例如，人和/或食蟹猴Notch3)结合并抑制Notch3的信号传导活性，这可以例如通过如实施例中所述的ICD3测定法测量。本发明范围内还包括为哺乳动物细胞中的表达而优化的可变重链和轻链亲本核苷酸序列；和全长重链和轻链序列。其他抗体包括已经被突变，仍与上文所述序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸或核酸。在一些实施方案中，它包括突变氨基酸序列，其中与上文所述序列的可变区相比时，已经在可变区中通过氨基酸缺失、插入或置换而突变不多于1、2、3、4或5个氨基酸。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表2中所述序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以是相同的，例外是不多于1、2、3、4或5个氨基酸位置中的氨基酸置换。可以通过以下方式获得具有与表2中所述的那些抗体的VH区和VL区具备高(即，80％或更大)同一性的VH区和VL区的抗体：诱变(例如，位点定向诱变或PCR介导诱变)，随后使用本文所述的功能测定法对编码的已改变的抗体检验保留的功能。
在其他实施方案中，重链核苷酸序列和/或轻链核苷酸序列的可变区可以与上文所述序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
如本文所用，考虑到需要为最佳比对这两个序列而导入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置数的函数(即，％同一性等于相同位置数/位置总数x100)。可以使用如下文非限制性实施例中所述的数学算法，完成序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定。
额外地或备选地，可以进一步使用本公开的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行进行检索，以例如鉴定相关序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序执行此类检索。
具有保守修饰的抗体
其他抗体或其片段包括已经被突变，然而在CDR区内具有与表2中所述CDR区的序列至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸。在一些实施方案中，它包括这样的突变氨基酸序列，其中与表2所述序列中描述的CDR相比时，CDR区中不多于1、2、3、4或5个氨基酸已经被突变，同时仍维持它们对原始抗体的表位的特异性。
其他抗体或其片段包括已经被突变，然而在构架区内具有与表2中所述构架区的序列至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸。在一些实施方案中，它包括这样的突变氨基酸序列，其中与表2所述序列中描述的构架区相比时，构架区中不多于1、2、3、4、5、6或7个氨基酸已经被突变，同时仍维持它们对原始抗体的表位的特异性。本发明还提供了编码与Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)特异性结合的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。
在某些实施方案中，抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列的一个或多个序列具有基于本文所述的抗体或其保守修饰物的指定氨基酸序列，并且其中所述抗体保留结合Notch3的本公开抗体的所需功能特性。
因此，本公开提供一种分离的Notch3单克隆抗体或其片段，由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成，其中：重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQIDNO：3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203及其保守修饰物；重链可变区CDR2的氨基酸序列选自SEQIDNO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204及其保守修饰物；重链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQIDNO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185和205及其保守修饰物；轻链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQIDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193和213及其保守修饰物；轻链可变区CDR2的氨基酸序列选自SEQIDNO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214及其保守修饰物；轻链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQIDNO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195和215及其保守修饰物；抗体或其片段与Notch3特异性结合并通过抑制Notch3信号传导途径，抑制Notch3活性，这可以通过实施例中描述的Notch3测定法(例如，ICD3测定法)测量。
与相同构象表位结合的抗体
本公开提供同与表2中描述的结合Notch3的抗体相同的构象表位相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定空间分布)的抗体。额外的抗体可以因此基于它们在Notch3结合测定法中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性抑制结合作用)的能力被鉴定。试验抗体抑制本公开抗体与Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)结合的能力表明，该试验抗体能与这种抗体竞争结合Notch3；根据非限制性理论，这种抗体可以结合至与它竞争的抗体在Notch3蛋白上的相同或相关(例如，结构上相似或空间上靠近的)构象表位。在某个实施方案中，与Notch3上相同构象表位结合的抗体是人单克隆抗体。可以本文所述制备并分离这类人单克隆抗体。
在一个实施方案中，抗体或其片段与包含Notch3的LNR区域和HD中不连续氨基酸残基的构象表位结合以约束Notch3处于自我抑制型构象，所述自我抑制型构象阻止HD内部的S2位点暴露于蛋白酶及阻止蛋白酶随后切割S3位点。在这些位点处缺少切割阻止了下游Notch3信号转导。
虽然不受提供理论的约束，一种可能的作用机理模型是Notch3NRR一般以自我抑制型构象存在，其中各自配位一个Ca2+离子的三个LNR缠绕在HD周围以保护S2位点免遭ADAM蛋白酶接近(例如，来自LNR-A/B接头的保守L1419直接塞入S2位点中并且在空间阻碍蛋白酶接近它)。LNR和HD之间相互作用以及这些区域内部那些相互作用的稳定性对维持NRR的自我抑制型构象至关重要。Notch3NRR中的突变打开自我抑制型构象，因而暴露HD结构域，从而蛋白酶可切割S2位点以及随后切割S3位点，因而活化下游Notch3信号转导。因此，去稳定NRR的突变，如(本文中公开的)相关癌症中存在的那些突变，能增强Notch3的活化。另一方面，能稳定LNR-HD相互作用的试剂如抗体能潜在地抑制Notch3信号传导。抗体或其片段如20350和20358结合Notch3的自我抑制型构象并稳定化(直接维持、束缚、锁定)自我抑制型构象，因而阻止HD暴露于蛋白酶切割作用，并阻止后续的下游Notch3信号传导。
抗体或其片段抑制Notch3的配体活化；配体非依赖的Notch3活化；和在不阻止配体结合情况下抑制配体依赖的和非依赖的Notch3活化。认为这是有利的，因为不同的肿瘤类型受每种机制驱动，所以治疗性抗体会比靶向单一(即配体依赖的或配体非依赖的)Notch3活化机制的抗体在广泛类型的肿瘤中具有临床用途。
因此，这些抗体可以用来治疗现有治疗性抗体在临床上无效的疾病。
工程化和修饰的抗体
可以使用具有本文所示的作为原料以工程化修饰抗体的一个或多个VH和/或VL序列的抗体制备抗体，所述修饰的抗体可以与起始抗体比较具有改变的特性。可以通过修饰在一个或两个可变区(即VH和/或VL)内部，例如一种或多种CDR区内部和/或一个或多个构架区内部的一个或多个残基，将抗体工程化。额外地或备选地，可以通过修饰恒定区内部的残基，例如以改变抗体的效应子功能)，将抗体工程化。
可以进行的一种可变区工程化是CDR移植。抗体优势地通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于这个原因，各抗体之间CDR内部的氨基酸序列比CDR外部更多样。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体表达模拟天然存在的特定抗体的特性的重组抗体，其中所述表达载体包含来自该天然存在的特定抗体的CDR序列，所述CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见，例如Riechmann等人,(1998)Nature332:323-327；Jones等人,(1986)Nature321:522-525；Queen等人,(1989)Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033；授予Winter的美国专利号5,225,539，和授予Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，另一个实施方案涉及一种包含重链可变区和轻链可变区的分离的Notch3抗体或其片段，所述重链可变区分别包含了具有选自SEQIDNO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQIDNO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQIDNO:4、10、22、28、40、46、58、64、76、82、94、100、112、118、130、136、148、154、166、172、184、190、202、208、220、226、238、244、256、262、274、280、292、298、310、316、328、334、346、352、364和370的氨基酸序列的CDR3序列，所述轻链可变区分别包含了具有选自SEQIDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193和213的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQIDNO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQIDNO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195和215的氨基酸序列的CDR3序列。
因而，这类抗体含有抗体的VH和VLCDR序列，但可以含有与这些抗体不同的构架序列。这类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公布的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“Vase”人种系序列数据库(在互联网上以下网址可获得：www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)中以及在Kabat等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，美国卫生和公众服务部，NIH出版编号91-3242；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:877-883；andAl-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948；Tomlinson等人,(1992)J.fol.Biol.227:776-798；和Cox等人,(1994)Eur.JImmunol.24:827-836中找到；所述各篇文献的内容明确地通过引用的方式并入本文作为参考。
用于抗体中的构架序列的例子是这些序列，所述序列在结构上与本公开的所选择抗体使用的构架序列(例如，本公开的单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列)相似。可以将VHCDR1、2和3序列和VLCDR1、2和3序列移植到下述构架区上，所述构架区的序列与衍生该构架序列的种系免疫球蛋白基因中存在的序列相同，或可以将所述CDR序列移植到与种系序列相比含有一种或多种突变的构架区上。例如，已经发现在某些情况下，使构架区内部的残基突变有益于维持或增强抗体的抗原结合能力(见，例如授予Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一个类型的可变区修饰是突变VH和/或VLCDR1区、CDR2区和/或CDR3区内部的氨基酸残基，以便因而改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)，称作“亲和力成熟”。可以进行位点定向诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以在如本文所述和实施例中提供的体外或在体内测定法中评价对抗体结合作用或其他目的功能特性的影响。可以引入(如上文讨论的)保守修饰。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失。另外，一般改变CDR区内部不多于1个、2个、3个、4个、5个残基。
因此，在一个实施方案中，本公开提供一种分离的Notch3抗体或其片段，所述抗体或其片段由重链可变区组成，所述重链可变区具有：由选自具有SEQIDNO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203的氨基酸序列组成或由与SEQIDNO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列组成的VHCDR1区域；具有选自SEQIDNO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204的氨基酸序列或与SEQIDNO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VHCDR2区域；具有选自SEQIDNO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185和205的氨基酸序列或与SEQIDNO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185和205相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VHCDR3区域；具有选自SEQIDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193和213的氨基酸序列或与SEQIDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193和213相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VLCDR1区域；具有选自SEQIDNO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214的氨基酸序列或与SEQIDNO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VLCDR2区域；和具有选自SEQIDNO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195和215的氨基酸序列或与SEQIDNO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195和215相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VLCDR3区域。
移植抗体片段至备选的构架或支架中
可以使用广泛类型的抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要所产生的多肽包括至少一个与Notch3特异性结合的结合区。这类构架或支架包括5个主要独特型的人免疫球蛋白或其片段，并且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选地具有人源化方面。新的构架、支架和片段继续由本领域技术人员发现并开发。
在一个方面，本公开涉及使用可以将CDR移植到其上的非免疫球蛋白支架产生基于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知的或将来的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包含对靶Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)特异的结合区。已知的非免疫球蛋白构架或支架包括但不限于纤连蛋白(CompoundTherapeutics,Inc.,Waltham,MA)、锚蛋白(MolecularPartnersAG,Zurich，瑞士)、结构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA和Ablynxnv,Zwijnaarde，比利时)、脂笼蛋白(PierisProteolabAG,Freising，德国)、小模块免疫药物(TrubionPharmaceuticalsInc.,Seattle,WA)、maxybodies(Avidia,Inc.,MountainView,CA)、蛋白A(AffibodyAG，瑞典)和affilin(γ-晶体蛋白或遍在蛋白)(ScilProteinsGmbH,Halle，德国)。
纤连蛋白支架基于纤连蛋白III型结构域(例如，纤连蛋白III型的第十模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有7条或8条β链，这些β链分布在两个β折叠之间，所述β折叠本身相互叠加以形成蛋白质的核心，并且还含有使β链彼此连接并且暴露于溶剂的环(类似于CDR)。在β折叠夹心的每条边缘存在至少三个这样的环，其中所述边缘是与β链的方向垂直的蛋白质边界(参见US6818418)。这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，不过总体折叠与包含骆驼和羊驼IgG中完整抗原识别单元的最小功能性抗体片段(即重链可变区)密切相关。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟在性质和亲和力方面与抗体相似的抗原结合特性。这些支架可以用于与体内抗体亲和力成熟过程类似的体外环随机化和改组策略。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架，其中可以使用标准克隆技术，将该分子的环区域更换为CDR。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复序列模块作为支架以携带可变区的蛋白质，所述的可变区可以用于与不同靶结合。锚蛋白重复序列模块是一种由两个反平行α-螺旋和一个β转角组成的33氨基酸多肽。大多通过使用核糖体展示法优化可变区的结合。
高亲和性多聚体(avimer)衍生自含有A-结构域的天然蛋白质如Notch3。这些结构域由自然界用于蛋白质-蛋白质相互作用并且在人类中超过250种蛋白质在结构上基于A-结构域。高亲和性多聚体由借助氨基酸接头连接的多个不同“A-结构域”单体(2-10个)组成。使用例如在美国专利申请公开号20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中描述的方法学，可以产生可以与靶抗原结合的高亲和性多聚体。
亲和体(affibody)亲和配体是包含一个三螺旋束的简单小蛋白，所述三螺旋束基于蛋白A的IgG结合结构域之一的支架。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的表面蛋白。这种支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个氨基酸经随机化以产生具有大量配体变体的亲和体文库(参见例如，US5831012)。亲和体分子模拟抗体，与150kDa的抗体分子量相比，它们具有6kDa的分子量。尽管其尺寸小，亲和体分子的结合位点类似于抗体。
抗笼蛋白(Anticalin)是由PierisProteoLabAG公司开发的产品。它们衍生自脂笼蛋白，一组广泛分布的小而稳健的通常参与生理学运输或储存化学敏感性或不溶性化合物的蛋白质。几种天然脂笼蛋白存在于人组织或体液中。该蛋白质的构造类似于免疫球蛋白，在刚性构架顶部上具有高变环。但是，与抗体或其重组片段相反，脂笼蛋白由仅略微大于单个免疫球蛋白结构域的具有160个至180个氨基酸残基的单条多肽链组成。构成结合袋的一组四个环显示突出的结构塑性并且耐受多种侧链。结合位点因此可以在专有过程中再成型，旨在以高亲和力和高特异性识别规定的不同形状的靶分子。一种脂笼蛋白家族蛋白，大菜粉蝶(Pierisbrassicae)的后胆色素结合蛋白(BBP)，已经用来通过诱变这四个环集合，开发抗笼蛋白(Anticalin)。描述抗笼蛋白的专利申请的一个例子在PCT公开号WO199916873中。
affilin分子是小的非免疫球蛋白，其中就针对蛋白质和小分子的特异性亲和力设计所述蛋白质。新的affilin分子可以非常迅速地选自两个文库，每个文库基于人衍生的不同支架蛋白。affilin分子不对免疫球蛋白显示任何结构同源性。目前，使用两种affilin支架，其中之一是γ晶体蛋白(人眼晶状体结构性蛋白)并且另一种是“遍在蛋白”超家族蛋白。两种人类支架均非常小，显示高温稳定性并且几乎均抵抗pH变化和变性剂。这种高稳定性主要归因于蛋白质的扩展β折叠结构。γ晶体蛋白衍生的蛋白质的例子在WO200104144中描述并且“遍在蛋白样”蛋白质的例子在WO2004106368中描述。
蛋白质表位模拟物(PEM)是模拟蛋白质β-发夹二级结构(参与蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构)的中等大小、环状肽样分子(MW1-2kDa)。
在一些实施方案中，通过改变Fc区，将Fab转化成沉默性IgG1样式。例如，表2中的抗体可以转化成IgG样式。
人抗体或人源化抗体
本公开提供与Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴/小鼠/小鼠Notch3)特异性结合的全人抗体。与嵌合或人源化抗体相比，施用至人类受试者时，结合Notch3的人抗体具有进一步降低的抗原性。
可以使用本领域已知的方法生成结合Notch3的人抗体。例如，人工程化技术用来将非人抗体转化成工程化的人抗体。美国专利公开号20050008625描述了在抗体中将非人抗体可变区更换为人可变区，同时维持相同结合特性或相对于非人抗体提供更好结合特征的体内方法。该方法依赖于表位指导的全人抗体替换非人类参考抗体的可变区。所得到的人抗体通常在结构上与参比非人抗体不相关，但是结合至相同抗原上与参考抗体相同的表位。简而言之，通过在响应于试验抗体与抗原结合的报道分子系统存在下，在细胞中针对与有限量抗原结合在“竞争者”和参考抗体(“试验抗体”)的多样性杂交体文库之间建立竞争，能够进行表位指导的系列互补性替换方案。竞争者可以是参考抗体或其衍生物如单链Fv片段。竞争者也可以是抗原的天然或人工配体，所述配体结合至与参考抗体相同的表位。对竞争者的唯一要求是它结合至与参考抗体相同的表位并且它与参考抗体竞争结合抗原。试验抗体具有共同来自非人参考抗体的一个抗原结合性V区和从多样性来源如人抗体文库随机选择的另一个V区域。来自参考抗体的共同V区充当引导，将试验抗体在抗原上的相同表位上并以相同取向安置，从而选择偏向于针对参考抗体的最高抗原结合精确度。
许多类型的报道分子系统可以用来检测试验抗体和抗原之间的所需相互作用。例如，互补性报道分子片段可以与抗原和试验抗体分别连接，从而通过片段互补作用的报道分子活化仅在试验抗体与抗原结合时才出现。当试验抗体-和抗原-报道分子片段融合物随竞争者一起共表达时，报道分子活化变得依赖于试验抗体与竞争者的竞争能力，这种能力与试验抗体对抗原的亲和力成比例。可以使用的其他报道分子系统包括如美国专利申请系列号10/208,730(公开号20030198971)中公开的自我抑制型报道分子再活化系统(RAIR)的再活化物，或在美国专利申请系列号10/076,845(公开号20030157579)中公开的竞争性活化系统。
采用表位指导的系列互补性替换系统时，作出选择以鉴定表达单一试验抗体连同竞争者、抗原和报道分子组分的细胞。在这些细胞中，每种试验抗体与竞争者一对一竞争与有限量抗原的结合。报道分子的活性与试验抗体结合的抗原量成比例，该量转而与试验抗体对抗原的亲和力和试验抗体的稳定性成比例。作为试验抗体表达时，最初基于试验抗体相对于参考抗体的活性选择试验抗体。第一轮选择的结果是一组“杂合抗体”，其中每一者包含来自参考抗体的相同非人类V区和来自文库的人类V区，并且每一者结合抗原上与参考抗体相同的表位。在第一轮中选择的一种或多种杂合抗体将对该抗原具有与参考抗体可比或较之更高的亲和力。
在第二V区替换步骤中，使用第一步骤中选择的人V区作为指导以用关联人V区的多样性文库选择剩余非人类参考抗体V区的人替换物。也可以使用第一轮中选择的杂合抗体作为第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果是一组在结构上与参考抗体不同、但是与参考抗体竞争结合相同抗原的全人抗体。一些所选择的人抗体结合至相同抗原上与参考抗体相同的表位。在这些选择的人抗体当中，一种或多种人抗体以可比于或高于参考抗体的亲和力与相同表位结合。
使用上文描述的结合Notch3的小鼠或嵌合抗体之一作为参考抗体，这种方法可以轻易地用来产生以相同结合特异性和相同或更好的结合亲和力与人Notch3结合的人抗体。此外，这类结合Notch3的人抗体也可以从定制生产人抗体的公司例如KaloBios,Inc.(MountainView,CA)商业地获得。
驼类抗体
从骆驼和单峰驼(dromedary)(双峰驼(Camelusbactrianus)和单峰驼(Calelusdromaderius))家族成员，包括新世界成员如羊驼属物种(羊驼(Lamapaccos)、大羊驼(Lamaglama)和小羊驼(Lamavicugna))获得的抗体蛋白已经就大小、结构复杂性和针对人类受试者的抗原性进行了表征。如自然界中所找到的来自这个哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并且因此在结构上区别于来自其他动物的抗体的具有两条重链和两条轻链的常见四链四级结构。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公布的WO94/04678)。
可以通过基因工程获得驼类抗体的一个区域(该区域是小的单可变域，确定为VHH)以产生对靶具有高亲和力的小蛋白质，从而产生称作“驼类纳米体”的低分子量抗体衍生的蛋白。参见1998年6月2日授予的美国专利号5,759,808；还参见Stijlemans等人,(2004)JBiolChem279:1256-1261；Dumoulin等人,(2003)Nature424:783-788；Pleschberger等人,(2003)BioconjugateChem14:440-448；Cortez-Retamozo等人,(2002)IntJCancer89:456-62；和Lauwereys等人,(1998)EMBOJ17:3512-3520。驼类抗体和抗体片段的工程化文库是例如从Ablynx,Ghent,Belgium可商业获得的(例如，US20060115470；Domantis(US20070065440、US20090148434)。与其他非人源抗体一样，驼类抗体的氨基酸序列可以重组地改变以获得更逼真模仿人序列的序列，即，纳米体可以“人源化”。因此可以进一步降低驼类抗体对人类的天然低的抗原性。
驼类纳米体的分子量是人IgG分子的分子量的约十分之一，并且这种蛋白质具有仅若干纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是驼类纳米体能够与较大抗体蛋白在功能上不可识别的抗原位点结合，即，驼类纳米体可用作试剂以检测使用经典免疫技术时否则隐匿的抗原，并且可以用作可能的治疗药。因此小尺寸的又一个结果是驼类纳米体可以因为与靶蛋白的槽或狭缝中的特定位点结合而发挥抑制作用，并且因此可以提供比经典抗体更逼真模仿经典低分子量药物功能的能力。
低分子量和紧凑大小进一步导致驼类纳米体具有极端热稳定性、对极端pH和蛋白酶解消化稳定和抗原性低。另一个结果是驼类纳米体轻易地从循环系统移入组织，并且甚至跨越血-脑屏障并且可以治疗累及神经组织的病症。纳米体还可以促进跨血脑屏障运输药物。参见2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征连同对人类的低抗原性表明了巨大的治疗潜力。另外，这些分子可以在原核细胞如大肠杆菌中充分表达和用噬菌体表达为融合蛋白并具有功能。
因此，本公开的一个特征是一种对Notch3具有高亲和力的驼类抗体或纳米体。在本文的某些实施方案中，驼类抗体或纳米体天然地在驼类动物中产生，即，在使用本文对其他抗体所述的技术用Notch3或其肽片段免疫之后由驼类产生。备选地，如本文实施例中所述，使用以Notch3作为靶的淘选法，从展示适当诱变的驼类纳米体蛋白的噬菌体文库，将结合Notch3的驼类纳米体工程化(即，例如通过选择过程产生)。还可以通过基因工程，定制工程化的纳米体以在接受受试者中具有45分钟至2周的半寿期。在一个具体实施方案中，通过将人抗体重链或轻链的CDR序列移植入纳米体或单结构域抗体构架序列，获得驼类抗体或纳米体，如PCT/EP93/02214中所述。
在一个实施方案中，驼类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。在一个实施方案中，驼类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
在一个实施方案中，驼类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。在一个实施方案中，驼类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
双特异性分子和多价抗体
在另一个方面，本发明的特征在于包含本公开的Notch3抗体或其片段的双互补位性、双特异性或多特异性分子。本公开的抗体或其片段可以进行衍生化或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如针对受体的另一种抗体或配体)以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。所述抗体可以实际上被衍生化或连接至多于一种其他功能分子以产生与多于两个不同结合位点和/或靶分子结合的双互补位性或多特异性分子；获得这类双互补位性或多特异性分子。为了产生本公开的双特异性分子，本公开的抗体可以功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)至一种或多种其他结合分子，如另一种抗体、抗体片段、肽或结合性模拟物，从而产生双特异性分子。
可以通过一种抗体内部结合两种或更多种抗原提供其他临床益处(Coloma等人,(1997)；Merchant等人,(1998)；Alt等人,(1999)；Zuo等人,(2000)；Lu等人,(2004)；Lu等人,(2005)；Marvin等人,(2005)；Marvin等人,(2006)；Shen等人,(2007)；Wu等人,(2007)；Dimasi等人,(2009)；Michaelson等人,(2009))。(Morrison等人,(1997)NatureBiotech.15:159-163；Alt等人(1999)FEBSLetters454:90-94；Zuo等人,(2000)ProteinEngineering13:361-367；Lu等人,(2004)JBC279:2856-2865；Lu等人,(2005)JBC280:19665-19672；Marvin等人,(2005)ActaPharmacologicaSinica26:649-658；Marvin等人,(2006)CurrOpinDrugDiscDevelop9:184-193；Shen等人,(2007)JImmunMethods218:65-74；Wu等人,(2007)NatBiotechnol.11:1290-1297；Dimasi等人,(2009)JMolBiol.393:672-692；andMichaelson等人,(2009)mAbs1:128-141。
可以通过使用本领域已知的方法缀合结合特异性的组分，制备本公开的双特异性分子。例如，双特异性分子的每种结合特异性可以单独地产生并且随后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可以用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见，例如Karpovsky等人,(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括在Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78:118-132；Brennan等人,(1985)Science229:81-83)和Glennie等人,(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，二者均从PierceChemicalCo.(Rockford,IL)可获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C端铰链区的硫氢基键合而缀合。在一个特别的实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个硫氢基残基，例如1个硫氢基残基。
备选地，可以在相同的载体中编码并且在相同的宿主细胞中表达及装配两种结合特异性。这种方法在下列情况特别有用，其中双特异性分子是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab')2或配体xFab融合蛋白。双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法例如在美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定法证实双特异性分子与其特异性靶的结合。通过使用针对特定的目的蛋白质-抗体复合物特异的标记试剂(例如抗体)，这些测定法的每一种通常检测目的复合物的存在。
在另一个方面，本公开提供了包含与Notch3结合的抗体的至少两个相同或不同片段的多价化合物。抗体片段可以经蛋白质融合或共价键或非共价键连接在一起。可以例如通过将抗体与结合至本公开抗体的恒定区(例如Fc区或铰链区)结合的抗体交联，获得四价化合物。三聚化结构域例如在Borean专利EP1012280B1中描述。五聚化模块例如在PCT/EP97/05897中描述。
在一个实施方案中，双互补位性/双特异性分子与Notch3的LNR和HD内部的氨基酸残基结合。
在另一个实施方案中，本公开涉及双功能抗体，其中单个单克隆抗体已经如此修饰，从而抗原结合位点与多于一种抗原结合，如结合Notch3和另一种抗原(例如，Notch1，EGFR)的双功能抗体。因此，双功能抗体可以与Notch3和Notch1或EGFR结合。双功能抗体的双结合特异性还可以翻译成双活性或对活性的抑制。(参见例如，JennyBostrom等人,(2009)Science:323；1610-1614)。
半寿期延长的抗体
本公开提供与Notch3蛋白特异性结合的抗体，所述抗体具有延长的体内半寿期。
许多因素可影响蛋白质的体内半寿期。例如，肾过滤、肝脏中代谢、遭蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原性反应(例如，抗体的蛋白质中和作用和被巨噬细胞和树状细胞摄取)。多种策略可以用来延长本公开抗体的半寿期。例如，通过化学连接至聚乙二醇(PEG)、reCODEPEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和糖屏障；通过与结合血清蛋白如白蛋白、IgG、FcRn结合并转移的蛋白质遗传融合；通过偶联(遗传或化学方式)至与血清蛋白结合的其他结合部分如纳米体、Fab、DARPin、高亲和性多聚体、亲和体和抗笼蛋白(Anticalin)；通过与rPEG、白蛋白、白蛋白结构域、白蛋白结合蛋白和Fc遗传融合；或通过掺入纳米载体、缓释制剂或医疗装置。
为了延长抗体的体内血清循环，惰性聚合物分子如高分子量PEG可以在采用或不采用多功能接头的情况下，借助PEG与抗体N末端或C末端的位点特异性缀合或借助赖氨酸残基上存在的ε-氨基，连接至抗体或其片段。为了使抗体聚乙二醇化，一般使该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的活性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团变得与该抗体或其片段连接的条件下反应。PEG化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应实施。如本文所用，术语“聚乙二醇”意图包括已经用来衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。使用导致生物活性丧失最少的直链或分枝聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测缀合程度以确保PEG分子与抗体正确缀合。未反应的PEG可以通过大小排阻层析或通过离子交换层析与抗体-PEG缀合物分离。可以使用本领域技术人员熟知的方法，例如通过本文所述的免疫测定法对PEG衍生化的抗体测试结合活性以及体内功效。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本公开的抗体。见例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384
其他改良的聚乙二醇化技术包括重构化学正交定向工程化技术(ReCODEPEG)，该技术借助包括tRNA合成酶和tRNA的重构系统将化学指定的侧链掺入生物合成的蛋白质。这项技术使得能够在大肠杆菌(E.coli)、酵母和哺乳动物细胞中将多于30个新氨基酸掺入生物合成的蛋白质中。tRNA在存在任何琥珀密码子的位置掺入非天然氨基酸，使琥珀密码子从终止密码子转变成发出信号掺入化学指定的氨基酸的一个密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可以用于血清半寿期延长。这项技术涉及300-600个氨基酸的非结构化蛋白质尾与现有药用蛋白质遗传融合。因为这种非结构化蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大了约15倍，所以这种蛋白质的血清半寿期大大增加。与需要化学缀合和再纯化的传统聚乙二醇化相反，生产工艺大为简化并且产物是均质的。
聚唾液酸化是使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长治疗性肽和蛋白质的有效寿命并改善其稳定性的另一项技术。PSA是唾液酸(一种糖)的聚合物。当用于蛋白质和治疗肽药物递送时，聚唾液酸对缀合提供保护性微环境。这增加治疗性蛋白在循环中的有效寿命并防止它被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体中。它由某些细菌采纳，这些细菌经数百万年演化用PSA覆盖它们的细胞壁。这些天然聚唾液酸化的细菌则能够通过分子拟态挫败身体的防御系统。PSA，自然界的终极隐形术，可以容易地从这类细菌以巨大量和以预定的物理特征产生。细菌PSA完全无免疫原性，甚至与蛋白质连接时也是如此，因为它在化学上与人体中的PSA同一。
另一项技术包括使用与抗体连接的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是源自蜡质玉米淀粉的改性天然聚合物并且可以由身体的酶代谢。通常施用HES溶液以替代不足的血液容积并改善血液的流变学特性。通过增加分子的稳定性，以及通过降低肾清除率，抗体的HES化使得能够延长循环半寿期，导致增加的生物活性。通过变动不同参数，如HES的分子量，可以定制广泛类型的HES抗体缀合物。
也可以向IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地Fc或铰合部Fc结构域片段)中引入一个或多个氨基酸修饰(即，置换、插入或缺失)，产生具有增加的体内半寿期的抗体。参见，例如国际公开号WO98/23289；国际公开号WO97/34631；和美国专利号6277375。
进一步，抗体可以与白蛋白缀合以使抗体或抗体片段在体内更稳定或具有较长的体内半寿期。这些技术是本领域熟知的，参见，例如国际公开号WO93/15199、WO93/15200和WO01/77137；和欧洲专利号EP413,622。
Notch3抗体或其片段也可以与一个或多个人血清白蛋白(HSA)多肽或其部分融合。HSA(一种在其成熟形式下具有585个氨基酸的蛋白质)负责显著比例的血清渗透压并且还作为内源和外源配体的载体发挥作用。白蛋白作为载体分子的作用及其惰性本质是作为体内多肽的载体和转运蛋白使用的有利特性。已经在WO93/15199、WO93/15200和EP413622中提出使用白蛋白作为白蛋白融合蛋白的组分，其作为多种蛋白质的载体。还已经提出使用HSA的N末端片段用于与多肽融合(EP399666)。因此，通过将抗体或其片段遗传地或化学地融合或缀合至白蛋白，可以稳定或延长货架期，和/或在溶液中、在体外和/或在体内保留分子活性持续延长的时间段。
可以通过遗传操作实现白蛋白与另一种蛋白质的融合，从而编码HSA或其片段的DNA与编码这种蛋白质的DNA连接。合适宿主随后用融合的核苷酸序列转化或转染，所述融合的核苷酸序列如此布置在合适的质粒上以表达融合多肽。表达可以在体外从例如原核或真核细胞或在体内例如从转基因生物实现。涉及HSA融合的额外方法可以在例如通过引用方式并入本文作为参考的WO2001077137和WO200306007中找到。在一个具体实施方案中，在哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)中进行融合蛋白的表达。还构思了抗体在低pH或高pH与受体的改变的差异性结合，这处于本公开的范围内。例如，可以通过修饰抗体以在抗体的CDR中包括额外氨基酸如组氨酸，如此调整抗体的亲和力，从而它在低pH(例如，溶酶体内部的低pH)保持与其受体结合(参见例如，TomoyukiIgawa等人,(2010)NatureBiotechnology；28,1203-1207)。
抗体缀合物
本公开提供与Notch3蛋白特异性结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段重组融合于或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至异源蛋白或多肽(或其片段、优选地与至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽缀合)以产生融合蛋白。特别地，本公开提供融合蛋白，所述融合蛋白包含本文所述的抗体片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)和异源蛋白、多肽或肽。蛋白质、多肽或肽与抗体或抗体片段融合或缀合的方法是本领域已知的。参见，例如美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP307,434和EP367,166；国际公开号WO96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535-10539；Zheng等人,(1995)J.Immunol.154:5590-5600和Vil等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11337-11341。
可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)技术，产生其他融合蛋白。可利用DNA改组来改变抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,(1997),Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,(1998),TrendsBiotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,(1999),J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,(1998),Biotechniques24(2):308-313(这些专利和出版物的每篇因而通过引用方式完整地并入)。可以通过在重组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变，改变抗体或其片段或编码的抗体或其片段。编码与Notch3蛋白特异性结合的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、节段、部分、结构域、片段等重组。
另外，抗体或其片段可以与标记序列(如肽)融合以促进纯化。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的标签，许多其他标记氨基酸序列是可商业获得的。如Gentz等,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824中所述，例如六组氨酸为纯化融合蛋白提供了便利。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell37:767)和“flag”标签。
在其他实施方案中，本发明公开了与诊断剂或检测剂缀合的抗体或其片段。这类抗体可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的功效)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测物质偶联实现这类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于、萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本公开还涵盖与治疗性部分缀合的抗体或其片段的用途。抗体或其片段可以与治疗性部分如细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如，α-发射体)缀合。术语“细胞毒素”或“细胞毒剂”包括有害于细胞的任何物质。
另外，抗体或其片段可以与调节给定生物学反应的治疗性部分或药物部分缀合。治疗性部分或药物部分不得解释为限于经典的化学治疗药。例如，药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素、蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原活化物、凋亡物质、抗血管生成物质或生物学反应调节物，例如淋巴因子。在一个实施方案中，抗Notch3抗体或其片段与治疗性部分如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。这类缀合物在本文中称作“免疫缀合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒药物包括有害于(例如，杀死)细胞的任何物质。例子包括紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括，例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、消融剂(例如，氮芥、嗥替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂、蒽环类(例如，佐柔比星(以前称作柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称作放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。(参见例如，SeattleGeneticsUS20090304721)。
可以与抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生和澳瑞司他汀和其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的例子是可商业获得的(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。
使用本领域可获得的接头技术，能将细胞毒素与抗体缀合。已经用来将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的例子包括但不限于含腙、硫醚、酯、二硫键和肽的接头。可以选择例如对于溶酶体区室内部低pH的切割作用敏感或对于蛋白酶(如肿瘤组织中优先表达的蛋白酶如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))的切割作用敏感的接头。
关于各种细胞毒素、接头和用于治疗药与抗体缀合的方法的讨论，还参见Saito等人,(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215；Trail等人,(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Payne,(2003)CancerCell3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。
本公开的抗体也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物，也称作放射免疫缀合物。可以与抗体缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了用于制备放射性免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的例子是可商业获得的，包括ZevalinTM(DECPharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并且相似的方法可以用来利用本公开的抗体制备放射免疫缀合物。在某些实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子附着到抗体上。这类接头分子是本领域共知的并且在Denardo等人(1998)ClinCancerRes.4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中描述，所述文献每篇通过引用的方式完整并入。
用于将治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见，例如Arnon等人,“MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy”，引自MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(编著)，第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“AntibodiesForDrugDelivery”，引自ControlledDrugDelivery(第2版),Robinson等人(编著)，第623-53页(MarcelDekker,Inc.1987)；Thorpe,“AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview”，引自MonoclonalAntibodies84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(编著)，第475-506页(1985)；“Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy”，引自MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(编著)，第303-16页(AcademicPress1985)和Thorpe等人,(1982)Immunol.Rev.62:119-58。
抗体也可以连接至固相支持物，所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
另一个方面，本公开涉及与其他治疗药如另一抗体、小分子抑制剂和医护标准治疗药如EGFR和铂剂化疗联合使用的Notch3抗体或其片段。
产生抗体的方法
(i)编码抗体的核酸
本公开提供基本上纯化的核酸分子，所述核酸分子编码包含上述Notch3抗体链的区段或结构域的多肽。一些核酸包含编码Notch3抗体重链可变区的核苷酸序列，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，核酸分子是表2中鉴定的那些。一些其他核酸分子包含与表2中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本上同一(例如，至少65％、80％、95％或99％同一)的核苷酸序列。从适宜的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示Notch3抗原结合能力。
本公开中还提供多核苷酸，所述多核苷酸编码来自上文所述Notch3抗体的重链或轻链的至少一个CDR区和通常全部三个CDR区。一些其他多核苷酸编码上文所述的Notch3抗体的重链和/或轻链的所有或基本上所有可变区序列。因为密码子简并性，所以多种核酸序列将编码多种免疫球蛋白氨基酸序列的每个序列。
核酸分子可以编码抗体的可变区和恒定区这两者。一些核酸序列包含编码成熟重链可变区序列的核苷酸，所述成熟重链可变区序列与表2中所述的Notch3抗体的成熟重链可变区序列基本上同一(例如，至少80％、90％或99％同一)。一些其他核酸序列包含编码成熟轻链可变区序列的核苷酸，所述成熟轻链可变区序列与表2中所述的Notch3抗体的成熟轻链可变区序列基本上同一(例如，至少80％、90％或99％同一)。
可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码Notch3抗体或其结合片段的现有序列(例如，如下文实施例中所述的序列)产生这些多核苷酸序列。可以通过本领域已知的方法完成核酸的直接化学合成，如Narang等人,(1979)Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,(1979)Meth.Enzymol.68:109的磷酸二酯法；Beaucage等人,(1981)Tetra.Lett.,22:1859的二乙基磷酰亚胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持法。例如可以如PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification,H.A.Erlich(编著),FreemanPress,NY,NY,1992；PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis等人(编著),AcademicPress,SanDiego,CA,1990；Mattila等人,(1991)NucleicAcidsRes.19:967；和Eckert等人,(1991)PCRMethodsandApplications1:17中所述，通过PCR向多核苷酸序列引入突变。
本公开中还提供了用于产生上述结合Notch3的抗体的表达载体和宿主细胞。多种表达载体可以用来表达编码Notch3抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包含质粒、游离型载体，一般具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，和人类人工染色体(参见，例如Harrington等人,(1997)NatGenet15:345)。例如，可用于哺乳动物(例如人)细胞中表达结合Notch3的多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHisA、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHisA、B和C(Invitrogen，圣迭戈，CA)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBPEB病毒、痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)的载体。参见，Brent等人,(1995)上文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807；和Rosenfeld等人,(1992)Cell68:143。
表达载体的选择依赖于待在其中表达该载体的宿主细胞。一般地，表达载体含有与编码Notch3抗体链或片段的多核苷酸有效连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，用诱导型启动子来防止插入序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可在非诱导条件下扩大转化的生物培养物，而不偏离用于编码序列的群体，其表达产物能更好地被宿主细胞耐受。除启动子之外，也可要求或需要其他调节元件用于高效表达Notch3抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过纳入适用于所用细胞系统的增强子增强表达的效率(参见，例如Scharf等人,(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:125；和Bittner等人,(1987)Meth.Enzymol.,153:516)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置以形成具有多肽的融合蛋白，其中所述多肽由插入的Notch3抗体序列编码。更经常地，插入的Notch3抗体序列在纳入载体之前与信号序列连接。待用来接受编码Notch3抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的序列的载体有时还编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，由此导致完整抗体或其片段的产生。通常，此类恒定区是人的恒定区。
用于携带并表达Notch3抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本公开多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，和其他肠杆菌属(Enterobacteriaceae)如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以产生一般含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)的表达载体。此外，存在任何数目的多种熟知启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常，可选地与操纵子序列一起，控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始并完成转录和翻译。其他微生物，如酵母，也可以用来表达结合Notch3的本公开多肽。也可组合使用昆虫细胞和杆状病毒载体。
在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞用来表达并产生结合Notch3的本公开多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实施例中所述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文例举的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些细胞包括任何正常的非永生的或正常或非正常的永生的动物细胞或人细胞。例如，已经开发出能够分泌完整免疫球蛋白的多种合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途通常例如在Winnacker,FROMGENESTOCLONES,VCHPublishers,N.Y.,N.Y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见，例如Queen等人,(1986)Immunol.Rev.89:49-68)，和必需的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异的、阶段特异的和/或可调节或可控制的。有用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRPpolIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变动。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理法或电穿孔法可以用于其他细胞宿主。(通常见Sambrook等人,上文)。其他方法例如包括电穿孔法、磷酸钙处理法、脂质体介导转化法、注射法和微量注射法、抛射体法、病毒体法、免疫脂质体法、聚阳离子：核酸缀合物法、裸DNA法、人工病毒粒法、疱疹病毒结构蛋白VP22融合法(Elliot和O'Hare,(1997)Cell88:223)、试剂增强的DNA摄取法和离体转导法。对于重组蛋白质的长期高产率产生，通常期望稳定表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体，制备稳定表达Notch3抗体链或结合片段的细胞系。在引入该载体之后，可以允许细胞在丰富培养基中生长1-2日，之后将它们转换至选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许成功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。抗性、稳定转染的细胞可以使用适于该细胞类型的组织培养技术增殖。
(ii)单克隆抗体的产生
可以通过多种技术产生单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein,(1975)Nature256:495的标准体细胞杂交技术。可以使用产生单克隆抗体的许多技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。
制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是一个充分建立的方法。用于分离免疫的脾细胞以便融合的免疫操作方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
可以基于上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列，制备本公开的嵌合抗体或人源化抗体。可以从目的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA并且使用标准分子生物学技术，经工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法，将鼠可变区与人恒定区连接(见例如授予Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法，将鼠CDR区插入人类构架中。参见例如，授予Winter的美国专利号5225539，和授予Queen等人的美国专利号5530101；5585089；5693762和6180370。
在某个实施方案中，抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠，产生这类针对Notch3的人单克隆抗体。这些转基因小鼠和转染色体小鼠包括本文中分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex，Inc.)含有人免疫球蛋白基因微基因座，所述微基因座编码未重排的人重链免疫球蛋白序列(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向的突变(参见例如，Lonberg等人,(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，这种小鼠显示减少的小鼠IgM或κ表达，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg等人,(1994)，见上文；综述于Lonberg,(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101中；Lonberg和Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93以及Harding和Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMAb小鼠的制备和使用和这类小鼠携带的基因组修饰进一步在Taylor等人,(1992)NucleicAcidsResearch20:6287-6295；Chen等人,(1993)InternationalImmunology5:647-656；Tuaillon等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3720-3724；Choi等人,(1993)NatureGenetics4:117-123；Chen等人,(1993)EMBOJ.12:821-830；Tuaillon等人,(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor等人,(1994)InternationalImmunology579-591；和Fishwild等人,(1996)NatureBiotechnology14:845-851中描述，所述全部文献的内容因而特别通过引用的方式完整并入。还参见全部授予Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；授予Surani等人的美国专利号5,545,807；全部授予Lonberg和Kay的PCT公开号WO92103918、WO93/12227、WO94/25585、WO97113852、WO98/24884和WO99/45962；和授予Korman等人的PCT公开号WO01/14424。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生人抗体。本文中称作“KM小鼠”的这类小鼠在授予Ishida等人的PCT公开WO02/43478中详述。
另外，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统是本领域可获得的并且可以用来产生结合Notch3的本公开抗体。例如，可以使用称作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的备选转基因系统。这类小鼠在例如授予Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
另外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统是本领域可获得的并且可以用来产生结合Notch3的本公开抗体。例如，可以使用称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；这类小鼠在Tomizuka等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述。另外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经在本领域中描述(Kuroiwa等人,(2002)NatureBiotechnology20:889-894)并且可以用来产生结合Notch3的本公开抗体。
也可以使用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示法，制备人单克隆抗体。本领域建立了或以下实施例中描述了分离人抗体的这类噬菌体展示法。参见例如：授予Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；授予Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；授予McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和授予Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以使用SCID小鼠制备人单克隆抗体，其中已经向所述SCID小鼠重构人免疫细胞，从而一旦免疫则可以产生人抗体应答。这类小鼠在例如授予Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述。
(iii)构架或Fc工程化
工程化抗体包括其中已经对VH和/或VL内部的构架残基修饰例如以改善抗体特性的那些抗体。一般地，进行这种构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方案是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，已经历过体细胞突变的抗体可以含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。可以通过将抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列比较而鉴定这类残基。为了使构架区序列恢复其种系构型，可以例如通过位点定向诱变，将体细胞突变“回复突变”成种系序列。此类“回复突变的”抗体也意在由本公开涵盖。
另一个类型的构架修饰涉及使构架区内部、或甚至一个或多个CDR区内部的一个或多个残基突变，以移除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，并进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号20030153043中。
除在构架区或CDR区内进行的修饰外，抗体还可以或备选地可以被改造以包括Fc区内的修饰，通常用来改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。另外，抗体可以经化学修饰(例如一种或多种化学部分可以与抗体连接)或经修饰以改变其糖基化作用，这再次旨在改变抗体的一个或多个功能特征。下文中进一步详细描述了这些实施方案中的每一个。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得改变例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。Bodmer等的美国专利号5,677,425中进一步描述了该方法。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如用来便于轻链和重链的装配、或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物半衰期。更特别地，可以向Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相对于天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在Ward等人的美国专利号6,165,745中更详细地描述了这种方法。
还在其他实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一实施方案中，可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合/或降低的或消除的补体依赖的细胞毒性(CDC)。这种方法在美国专利号6,194,551(Idusogie等人)中进一步详细描述。
在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT公开WO94/29351中进一步描述。
还在另一实施方案中，修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力，和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法在Presta的PCT公开WO00/42072中进一步描述。另外，已经绘制了人IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改进的结合作用的变体(见Shields等人,(2001)J.Biol.Chen.276:6591-6604)。
还在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以产生非糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以便例如增加抗体对“抗原”的亲和力。这类糖修饰也可以通过例如改变抗体序列内部的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以产生一个或多个氨基酸置换，所述氨基酸置换导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除在这个位点处的糖基化。这种非糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中更详细地描述了这种方法。
额外地或备选地，可以产生一种抗体，所述抗体具有改变的糖基化类型，如岩藻糖残基数量减少的过低岩藻糖化的抗体或二分GlcNac结构增加的抗体。这类改变的糖基化模式已经展示增加抗体的ADCC能力。这类糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达这种抗体而完成。本领域中已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞并且它们可以用作表达重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上遭破坏的细胞系，从而在这种细胞系中表达的抗体显示过低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO03/035835描述了一种变异CHO细胞系(Lecl3细胞)，所述细胞系具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)连接的糖的能力，这也导致在这种宿主细胞中表达的抗体过低岩藻糖化(也见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而在这种工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的二分GlcNac结构物，这导致抗体的增加的ADCC活性(还参见Umana等人,(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可使用多种方法。例如，可以引入以下一种或多种突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。备选地，为了增加生物学半寿期，可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体(salvagereceptor)结合表位，所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
(iv)工程化改变的抗体的方法
如上文讨论，通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或与其连接的恒定区，具有本文所示的VH和VL序列或全长重链和轻链序列的结合Notch3的抗体可以用来产生结合Notch3的新抗体。因此，在本公开的另一个方面，Notch3抗体的结构特征用来产生结构上相关的结合Notch3的抗体，所述抗体保留本公开抗体的至少一种功能特性如与人Notch3结合，并且还抑制Notch3的一个或多个功能特征。例如，本公开的抗体或其突变物的一个或多个CDR区可以重组地与已知的构架区和/或其他CDR组合，以产生额外的重组工程化的结合Notch3的本公开抗体，如上文讨论。其他类型的修饰包括在先前部分中描述的那些。用于工程化方法的初始材料是本文中提供的一个或多个VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区。为产生工程化抗体，不需要实际地制备(即表达为蛋白质)具有本文中提供的一个或多个VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，使用序列中所含的信息作为初始材料以产生衍生自原始序列的“第二代”序列并且随后制备“第二代”序列并且表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本公开提供一种用于制备Notch3抗体的方法，所述Notch3抗体由重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列组成，所述重链可变区抗体序列具有选自SEQIDNO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203的CDR1序列、选自SEQIDNO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204的CDR2序列和/或选自SEQIDNO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185和205的CDR3序列；所述轻链可变区抗体序列包含选自SEQIDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193和213的CDR1序列、选自SEQIDNO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214的CDR2序列和/或选自SEQIDNO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195和215的CDR3序列；改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内部的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并且将改变的抗体序列表达为蛋白质。也可以通过筛选抗体文库制备改变的抗体序列，所述抗体文库具有如US20050255552中所述的固定的CDR3序列或最小必需结合决定簇并在CDR1和CDR2序列上具有多样性。可以根据适于从抗体文库筛选抗体的任何筛选技术(如噬菌体展示技术)进行筛选。
标准分子生物学技术可以用来制备并表达改变的抗体序列。由改变的抗体序列编码的抗体是这样一种抗体，所述抗体保留本文所述的结合Notch3的抗体的一个、一些或全部功能特征，所述功能特征包括但不限于与人和/或食蟹猴Notch3特异性结合；抗体与Notch3结合并且在本文所述的报道分子测定法中通过抑制Notch3信号传导活性，中和Notch3生物活性。
可以使用本领域可获得的和/或本文所述的标准测定法，如实施例中所述的那些(例如，ELISA)，评估改变的抗体的功能特性。
在工程化本公开抗体的方法的某些实施方案中，沿着全部或部分的Notch3抗体编码序列可以随机地或选择性地引入突变，并且可以对所得到的修饰的结合Notch3的抗体筛选如本文所述的结合活性和/或其他功能特征。已经在本领域描述了突变方法。例如，PCT公开WO02/092780简短描述了用于使用饱和诱变法、合成连接装配法或其组合产生并筛选抗体突变物的方法。备选地，Lazar等人的PCT公开WO03/074679描述了使用计算筛选方法优化抗体物理化学特性的方法。
抗体的表征
抗体可以用多种功能测定法表征。例如，它们可以由如本文所述的基因报道分子测定法中抑制Notch3信号传导而中和生物活性的能力、其对Notch3蛋白(例如，人和/或食蟹猴Notch3)的亲和力、表位分拣(binning)、其蛋白酶解抗性和其阻断Notch3下游信号传导的能力表征。多种方法可以用来测量Notch3介导的信号传导。例如，可以通过测量ICD3监测Notch3信号传导途径。
可以通过直接标记目的抗体，检测抗体与Notch3结合的能力，或抗体可以是未标记的并且使用本领域已知的多种夹心测定模式，间接地检测结合作用。
在一些实施方案中，Notch3抗体阻断参考Notch3抗体与Notch3多肽或蛋白质结合或与参考Notch3抗体竞争结合。这些抗体可以是上文描述的全人Notch3抗体。它们也可以是与参考抗体相同的表位结合的其他小鼠Notch3抗体、嵌合Notch3抗体或人源化Notch3抗体。阻断参考抗体结合作用或与之竞争的能力表示测试下的Notch3抗体结合至与参考抗体定义的表位相同或相似的表位，或结合至与参考Notch3抗体所结合的表位充分靠近的表位。这类抗体特别地可能共有对参考抗体鉴定的有利特性。可以通过例如竞争结合测定法确定阻断参考抗体或与参考抗体竞争的能力。采用竞争结合测定法，研究受检抗体抑制参考抗体与共同抗原(如Notch3多肽或蛋白)特异性结合的能力。如果过量的试验抗体基本上抑制参考抗体的结合作用，则试验抗体与参考抗体竞争特异性结合至抗原。基本上抑制意指试验抗体减少参考抗体的特异性结合通常至少10％、25％、50％、75％或90％。
存在许多已知的竞争结合测定法，所述竞争结合测定法可以用来评估Notch3抗体与参考Notch3抗体竞争结合Notch3蛋白。例如，这些包括固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹心竞争测定法(参见Stahli等人,(1983)MethodsinEnzymology9:242－253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人,(1986)J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记的测定法、固相直接标记的夹心测定法(参见Harlow和Lane,上文)；使用I-125标记物的固相直接标记物RIA(参见Morel等人,(1988)Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,(1990)Virology176:546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人,(1990)Scand.J.Immunol.32:77-82)。一般而言，这种测定法涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或携带未标记的试验Notch3抗体和标记的参考抗体中的任一种抗体的细胞。通过在试验抗体存在的情况下确定与固体表面或细胞结合的标记物的量测量竞争性抑制。通常，试验抗体过量存在。通过竞争测定法(竞争性抗体)鉴定的抗体包括结合与参考抗体相同的表位的抗体和与相邻表位结合的抗体，所述相邻表位充分临近于参考抗体结合的表位以便空间位阻作用发生。
为了确定选择的Notch3单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用市售试剂(例如，来自Pierce，Rockford，IL的试剂)将每种抗体生物素酰化。可以使用Notch3多肽包被的ELISA平板进行竞争研究，所述竞争研究使用未标记的单克隆抗体和生物素酰化的单克隆抗体。可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素酰化的mAb结合作用。为了确定纯化的Notch3抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。例如，可以在4℃用1μg/ml抗人IgG包被过夜微量滴定板的孔。用1％BSA封闭后，平板与1μg/ml或浓度更低的单克隆Notch3抗体或纯化的同种型对照在环境温度反应1-2小时。各孔随后可以与碱性磷酸酶缀合的人IgG1或人IgM特异性探针反应。随后将平板显色并如此分析，从而可以确定纯化抗体的同种型。
为了展示单克隆Notch3抗体与表达Notch3多肽的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简而言之，表达Notch3的细胞系(在标准生长条件下培育)可以在含有0.1％BSA和10％胎牛血清的PBS中与多种浓度的Notch3抗体混合，并且在4℃温育1小时。在洗涤后，细胞在与第一抗体染色相同的条件下与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。使用光特性和侧向散射特性对单个细胞设门，能通过FACScan仪分析样品。除流式细胞术测定法之外或取而代之，可以使用利用荧光显微术的备选测定法。细胞可以完全如上文所述那样染色并且由荧光显微术检查。这种方法允许可视化各个细胞，但是可能具有削弱的灵敏度，这取决于抗原的密度。
可以通过蛋白质印迹法进一步测试Notch3抗体与Notch3多肽或抗原性片段的反应性。简而言之，可以制备纯化的Notch3多肽或融合蛋白或来自表达Notch3的细胞的细胞提取物并使其经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用10％胎牛血清封闭，并且用待测试的单克隆抗体探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合作用并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.,St.Louis,MO)显色。
许多读数可以在基于细胞的测定法如本文所述的那些(例如，ICD3测定法)中用来评估Notch3抗体的功效和特异性。还在以下实施例部分中描述功能测定法的例子。
抗体或其片段的能力阻断其致肿瘤性表型如本文中显示至少部分依赖于Notch3细胞信号传导的人肿瘤细胞系的肿瘤异种移植物体内生长，并且可以在免疫受损的小鼠中单独或与所讨论细胞系的适宜细胞毒药物组合情况下评估。
预防性用途和治疗性用途
本公开提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗与Notch3信号传导途径相关的疾病或病症的方法。在一个具体实施方案中，本公开提供一种通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防癌症(例如，乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤)的方法。在一些实施方案中，本公开提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防与Notch3信号传导途径相关的癌症的方法。
在一个具体实施方案中，本公开提供治疗与Notch3信号传导途径相关的癌症的方法，所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌和T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
Notch3抗体也可以用来治疗或预防与异常或缺陷性Notch3信号传导相关的其他病症，包括但不限于呼吸道疾病、骨质疏松症、骨关节炎、多囊性肾病、糖尿病、精神分裂症、血管疾病、心脏病、非致癌的增殖性疾病、纤维化和神经变性病如阿尔茨海默病。
用于与Notch3抗体联合治疗的合适药物包括本领域已知的能够调节Notch信号传导途径的医护标准药物。用于Notch3的医护标准药物的合适例子包括但不限于EGFR抑制剂或基于铂剂的化疗。可能适于Notch3抗体联合治疗的其他药物包括但不限于调节受体酪氨酸激酶、G-蛋白偶联受体、生长/存活信号转导途径、核激素受体、凋亡途径、细胞周期和血管生成的那些药物。
诊断用途
在一个方面，本公开涵盖了在生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织)背景下或从罹患癌症或面临形成癌症风险的个体确定Notch3蛋白和/或核酸表达以及Notch3蛋白功能的诊断测定法。
本公开提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体确定与Notch3信号传导途径相关的疾病或病症的方法。在一个具体实施方案中，本公开提供一种通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防癌症(例如，乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤)的方法。在一些实施方案中，本公开提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防与Notch3信号传导途径相关的癌症的方法。
在一个具体实施方案中，本公开提供确定与Notch3信号传导途径相关的癌症的方法，所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌和T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
可以通过任何种类的方式检测Notch3突变，例如：DNA测序、基于PCR的方法(包括RT-PCR)、微阵列分析、DNA印迹、RNA印迹和试纸条(dipstick)分析。
聚合酶链反应(PCR)可以用来从提取自肿瘤组织的基因组DNA或RNA扩增并鉴定Notch4突变。PCR是本领域熟知的并且在Saiki等人,Science1988,239:487和美国专利号4683195和美国专利号4,683,203中详述。
可以通过任何适宜的方法检测基因表达，所述方法包括例如检测从基因转录的mRNA的量或从转录自基因的mRNA逆转录所产生的cDNA的量或基因编码的多肽或蛋白质的量。这些方法可以基于样品对样品进行或经修改用于高通量分析。例如，使用AffymetrixTM\微阵列芯片。
在一个方面，通过与探针的杂交检测并定量基因表达，其中所述探针与这种生物标记的适宜探针特异性杂交。使用本领域已知的方法，这些探针还可以与用于高通量筛选分析法中的固相支持物连接。WO97/10365和美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934例如公开了可以含有本文中公开的一个或多个序列的高密度寡核苷酸芯片的构建。使用美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934中公开的方法，在衍生化玻璃表面上合成本发明的探针。光保护的核苷磷酰亚胺与玻璃表面偶联，借助光刻掩膜通过光解作用选择性去保护并与保护的第二核苷磷酰亚胺反应。重复偶联/去保护过程直至所需的探针完成。
备选地，可以使用已知技术确定的基因拷贝数、转录或翻译中的任一者。例如，可以使用扩增方法如PCR。MacPherson等人,PCR：APracticalApproach,(IRLPressatOxfordUniversityPress(1991))教授了PCR的一般流程。然而，经验地确定用于每种应用反应的PCR条件。许多参数影响反应的成功。在它们当中有复性温度和时间、延伸时间、Mg2+和/或ATP浓度、pH，和引物、模板及脱氧核糖核苷酸的相对浓度。在扩增后，可以通过琼脂糖凝胶电泳随后用溴化乙锭染色和紫外光照可视化，检测所产生的DNA片段。
在一个实施方案中，通过检测与样品核酸连接的一个或多个标记物，来检出杂交的核酸。可以通过本领域技术人员熟知的多种方法中的任意方法掺入标记物。然而，在一个方面，将标记物在制备样品核酸中的扩增步骤期间同时掺入。因此，例如采用标记引物或标记核苷酸的聚合酶链反应(PCR)将提供标记的扩增产物。在一个独立的实施方案中，如上文所述的使用标记核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩增将标记物掺入转录的核酸。
备选地，可以将标记物直接添加至原始核酸样品(例如，mRNA、多聚A、mRNA、cDNA等)或在扩增完成后直接添加至扩增产物。将标记物与核酸连接的方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如切口翻译或通过激酶处理核酸(例如用标记的RNA)进行末端标记并随后连接核酸接头，其中所述核酸接头将样品核酸与标记物(例如，荧光团)连接。
适用于本公开中的可检测标记物包括通过光谱手段、光化学手段、生物化学手段、免疫化学手段、电学手段、光学手段或化学手段可检测的任何组合物。在本发明中有用的标记物包括用于以标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素、磁珠(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射标记物(例如，3H、125I、35S、14C、或32P、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他在ELISA中常使用的酶)、和比色标记物如胶体金或有色玻璃珠或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。教授这类标记物用途的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。
对标记物的检测是本领域技术人员熟知的。因此，例如可以使用照相胶片或闪烁计数器检测放射标记物；可以使用检测发射光的光检测器检测荧光标记物。酶标记物一般通过向酶提供底物并检测因该酶作用于此底物所产生的反应产物检测，并且比色测定标记物通过简单地观察有色标记物检测。
可以在杂交之前或之后添加可检测标记物至靶(样品)核酸，如WO97/10365中描述。这些可检测标记物在杂交之前直接与靶(样品)核酸结合或掺入其中。与之相反，“间接标记物”在杂交后与杂交双链体结合。通常，间接标记物与已经在杂交之前与靶核酸结合的结合部分结合。例如，靶核酸可以在杂交之前生物素酰化。在杂交后，抗生物素蛋白缀合的荧光团将结合携带生物素的杂交双链体，提供容易检测到的标记物。关于标记核酸及检测已标记杂交核酸的方法的详细综述，参见LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,第24卷:HybridizationwithNucleicAcidProbes,P.Tijssen编著.Elsevier,N.Y.(1993)。
在翻译成蛋白质时，Notch3突变可以由特异性抗体检出。也可以通过检查Notch3突变体的蛋白质表达或蛋白质产物，确定Notch3突变的表达水平。确定蛋白质水平涉及测量在下述抗体之间出现的任何免疫特异性结合作用的量并且将这个量与对照样品中至少一种生物标记的免疫特异性结合作用的量比较，其中所述抗体选择性识别从患者获得的样品中生物标记的多肽并且与之结合。与对照表达相比时，Notch3的蛋白质表达量可以增加或减少。
诊断测定法，如竞争性测定法，依赖于标记的类似物(“示踪剂”)与受试样品分析物竞争共同结合配偶体上有限数目的结合位点的能力。结合配偶体通常在竞争之前或之后不溶并且随后与结合配偶体结合的示踪剂和分析物与未结合的示踪剂和分析物分离。这种分离通过滗析(其中结合配偶体预先不溶解)或通过离心(其中结合配偶体在竞争性反应后沉淀)完成。受试样品分析物的量与结合型示踪剂的量(如通过标记物质的量所测量)成反比。制备已知量的分析物的剂量-反应曲线并将它们与检验结果比较以定量地确定受试样品中存在的分析物的量。当使用酶作为可检测标记时，这些测定法称作ELISA系统。在这种形式的测定法中，抗体和Notch3抗体之间的竞争性结合产生结合的本发明Notch3蛋白、优选地Notch3表位，其是血清样品中的抗体的量度、最特别地血清样品中的中和抗体的量度。
该测定法的明显优点是测量直接由中和抗体(即，干扰Notch3蛋白、尤其Notch3表位结合的那些抗体)组成。这种测定法，尤其在ELISA测试形式下，在临床环境和在例行血液筛查时具有可观的应用。
测试生物标记物
本公开的另一个方面提供用于确定个体中Notch3核酸表达或Notch3蛋白活性，因而对该个体选择适宜治疗药或预防药的方法(在本文中称作“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型(例如，接受检查以确定该个体响应于特定药物的能力的个体的基因型)，选择药物(例如，小分子药物或生物制品如抗体或其片段)用于该个体的治疗性或预防性治疗。
本公开的又一个方面涉及在临床试验中监测药物(例如，小分子药物或生物制品如抗体或其片段)对Notch3蛋白表达或活性的影响。
一旦已经就Notch3突变分析患者并预测其对Notch3抑制剂敏感(例如，小分子抑制剂或生物制品如Notch3抗体或其片段)，则可以通过贯穿整个疗程连续或间歇给药实现向患者施用任何Notch3抑制剂。可以基于Notch3突变体的存在和表达水平经验地调整合适的剂型和施用药物的方法。
可以在Notch3抑制剂施用后分析Notch3突变，以确定患者是否仍对Notch3治疗敏感。此外，可以在单次施用Notch3抑制剂后的多个时间点分析Notch3突变。例如，施用Notch3抑制剂的初始浓剂(bolus)，可以在首次治疗后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几个月分析Notch3突变。
该患者可以进行多次Notch3抑制剂施用并且随后在不同时间点分析Notch3突变。例如，疗程可能需要施用初始剂量的Notch3抑制剂，稍后指定的时间段施用第二剂量，并且在第二次给药后若干小时再施用第三剂量。可以在施用每个剂量的Notch3抑制剂后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几个月分析Notch3突变。
可以制备用于评估任何Notch3抑制剂(例如，抗体或其片段)的活性的试剂盒。例如，下述试剂盒可以用于评估Notch3突变体的存在，所述试剂盒包含用于PCR或用于微阵列杂交Notch3突变的核酸引物。备选地，表2中列出了随抗体或其片段一起供应用于Notch3突变的试剂盒。
使用Notch3突变以筛选Notch3抑制剂是可能的。这种方法包括从表2提供含有Notch3突变的细胞，使细胞与候选Notch3抑制剂(例如，小分子或生物制品如抗体或其片段)接触，并且将处理的细胞的IC50与已知的Notch3抑制剂比较。
药物组合物
为了制备包括Notch3抗体或其片段的药物组合物或无菌组合物，将Notch3抗体或其片段与可药用载体或赋形剂混合。该组合物可以额外地含有一种或多种适于治疗或阻止癌症(乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、和黑素瘤)的其他治疗药。
可以通过与生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合以例如冻干散剂、膏剂、水溶液剂、洗剂或混悬剂的形式制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如Hardman等人,(2001)GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Lippincott,Williams,andWilkins,NewYork,N.Y.；Avis等人(编著)(1993)PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedications,MarcelDekker,NY；Lieberman等人(编著)(1990)PharmaceuticalDosageForms:Tablets,MarcelDekker,NY；Lieberman等人(编著)(1990)PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystems,MarcelDekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.)。
治疗剂施用方案的选择取决于若干因素，包括该实体的血清或组织周转率、症状水平、该实体的免疫原性、及靶细胞在生物基质中的可达性。在某些实施方案中，施用方案使递送给患者的治疗剂的量最大化且符合可接受的副作用水平。因此，递送的生物剂的量部分取决于具体实体和所治疗病症的严重性。选择适宜剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见，例如Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,BiosScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编著)(1991)MonoclonalAntibodies,CytokinesandArthritis,MarcelDekker,NewYork,N.Y.；Bach(编著)(1993)MonoclonalAntibodiesandPeptideTherapyinAutoimmuneDiseases,MarcelDekker,NewYork,N.Y.；Baert等人,(2003)NewEngl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人,(1999)NewEngl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人,(2001)NewEngl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人,(2000)NewEngl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人,(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人,(2000)NewEngl.J.Med.343:1594-1602)。
由临床医生，例如使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的参数或因素确定适宜的剂量。通常，剂量始于或多或少小于最佳剂量的量并此后将它以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所需的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可改变本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得活性成份的下述量，所述量就具体患者、组合物和施用方式而言可以有效达到所希望的治疗应答，并同时对患者无毒性。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本公开具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域已知的因素。
可以通过连续输注或通过以例如，1日、1周或每周1-7次的时间间隔，提供包含抗体或其片段的组合物。可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻、直肠、肌肉内、脑内或通过吸入来提供剂量。具体剂量方案是涉及避免显著不良副作用的最大剂量或剂量频率。每周总剂量可以是至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少25mg/kg或至少50mg/kg(参见，例如Yang等人,(2003)NewEngl.J.Med.349:427-434；Herold等人,(2002)NewEngl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人,(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人,(2003)CancerImmunol.Immunother.52:133-144)。基于摩尔/kg体重，抗体或其片段的目的剂量与抗体或多肽大致相同。抗体或其片段的目的血浆浓度是大约基于摩尔/kg体重。剂量可以是至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg，或至少100μg。向受试者施用的次数可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次或更多次。
对于本公开的抗体或其片段，施用至患者的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg、或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。
可以使用以千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计的待施用的剂量，计算抗体或其片段的剂量。抗体或其片段的剂量可以150μg/kg或更小、125μg/kg或更小、100μg/kg或更小、95μg/kg或更小、90μg/kg或更小、85μg/kg或更小、80μg/kg或更小、75μg/kg或更小、70μg/kg或更小、65μg/kg或更小、60μg/kg或更小、55μg/kg或更小、50μg/kg或更小、45μg/kg或更小、40μg/kg或更小、35μg/kg或更小、30μg/kg或更小、25μg/kg或更小、20μg/kg或更小、15μg/kg或更小、10μg/kg或更小、5μg/kg或更小、2.5μg/kg或更小、2μg/kg或更小、1.5μg/kg或更小、1μg/kg或更小、0.5μg/kg或更小或0.5μg/kg或更小的患者体重。
抗体或其片段的单位剂量可以是0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg。
抗体或其片段的剂量可以在受试者中实现至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml、或至少400μg/ml的血清滴度。备选地，抗体或其片段的剂量可以在受试者中实现至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、atleast、2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml、或至少400μg/ml的血清滴度。
可以重复给予抗体或其片段的剂量并且各次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3个月或至少6个月。
特定患者的有效量可以根据多种因素变动，如正在治疗的病状、患者的总体健康、施用方法、途径和剂量和副作用的严重程度(参见，例如Maynard等人,(1996)AHandbookofSOPsforGoodClinicalPractice,InterpharmPress,BocaRaton,Fla.；Dent,(2001)GoodLaboratoryandGoodClinicalPractice,UrchPubl.,London,UK)。
施用途径可以是通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑室椎管内、病灶内或通过缓释系统或植入物借助例如局部或皮肤施加、注射或输注(参见例如，Sidman等人,(1983)Biopolymers22:547-556；Langer等人,(1981)J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer(1982)Chem.Tech.12:98-105；Epstein等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692；Hwang等人,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030-4034；美国专利号6,350,466和6,316,024)。根据需要，组合物也可以包括增溶剂和局部麻醉药，如利多卡因，以便减轻注射部位处的疼痛。此外，也可以利用肺部施用法，例如通过使用吸入器或雾化器和具有雾化剂的制剂。参见，例如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903，每份专利通过引用方式完整并入完整本文。
也可用本领域已知的多种方法中的一种或多种，经由一种或多种施用途径，施用本公开的组合物。熟练技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变。用于抗体或其片段的所选择施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。胃肠外施用可以代表除了肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。备选地，组合物可经非胃肠外途径，例如局部、表皮或黏膜施用途径施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。在一个实施方案中，通过输注法施用抗体或其片段。在另一个实施方案中，皮下施用多特异性表位结合蛋白。
如果抗体或其片段在控释或缓释系统中施用，则泵可以用来实现控释或缓释(参见Langer，上文；Sefton,(1987)CRCCrit.RefBiomed.Eng.14:20；Buchwald等人,(1980),Surgery88:507；Saudek等人,(1989)N.Engl.J.Med.321:574)。聚合物材料可以用来实现治疗药的控释或缓释(参见例如，MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(编著),CRCPres.,BocaRaton,Fla.(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(编著),Wiley,NewYork(1984)；Ranger和Peppas,(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人,(1985)Science228:190；During等人,(1989)Ann.Neurol.25:351；Howard等人,(1989)J.Neurosurg.71:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤的杂质、储存时稳定、无菌和可生物降解。可以将控释或持续释放系统靠近预防靶或治疗靶布置，因此仅需要全身性剂量的一部分(见，例如Goodson,引自MedicalApplicationsofControlledRelease,上文,第2卷,第115-138页(1984))。
控释系统在Langer,(1990)Science249:1527-1533的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术可以用来产生包含一种或多种本公开抗体或其片段的持续释放制剂。参见，例如美国专利号4,526,938，PCT公开WO91/05548，PCT公开WO96/20698，Ning等人,(1996),Radiotherapy&Oncology39:179-189；Song等人,(1995)PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372-397；Cleek等人,(1997)Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854和Lam等人,(1997)Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，所述的每篇文献通过引用方式完整并入本文作为参考。
如果局部施用抗体或其片段，则可以将它们按油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气溶胶剂、溶液剂、乳剂的形式或本领域技术人员熟知的其他形式配制。参见，例如Remington'sPharmaceuticalSciencesandIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第19版,MackPub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对不可喷雾的局部剂型，通常使用黏性至半固体或固体形式，该形式包含与局部施用相容的载体或一种或多种赋形剂，并在某些情况下具有大于水的动态黏度。合适的制剂包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、油膏剂、散剂、搽剂、药膏剂等，如果需要，与对它们进行消毒或与影响多种特性(例如，渗透压)的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其他合适的局部用剂型包括可喷雾气溶胶制品，其中与固体或液体惰性载体组合的有效成分在一些情况下包装在含有加压的挥发性物质(例如，气态推进剂，如氟利昂)的混合物中或挤瓶中。根据需要，也可以将润湿剂或吸湿剂添加至药物组合物和剂型。这类额外成分的例子是本领域熟知的。
如果鼻内施用包含抗体或其片段的组合物，则可以将它以气溶胶剂、喷雾剂、雾化剂形式或以滴剂形式配制。具体而言，根据本公开使用的预防药或治疗药可以在使用合适推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)的情况下，以从加压的包装或雾化器中提供的气溶胶喷雾剂形式便利地递送。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门，确定剂量单位，以提供经计量的量。可以配制用于吸入器或吹入器中的胶囊剂和套筒剂(cartridge)(包含例如明胶)，其含有所述化合物及合适散剂基底(powderbase)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
用第二治疗药例如细胞因子、类固醇、化疗药、抗生素或辐射共施用或治疗的方法是本领域已知的(参见，例如Hardman等人,(编著)(2001)GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第10增补版,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.；Poole和Peterson(编著)(2001)PharmacotherapeuticsforAdvancedPractice:APracticalApproach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编著)(2001)CancerChemotherapyandBiotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减少至少10％、至少20％、至少约30％、至少40％或至少50％。
可以与抗体或其片段组合施用的额外治疗药(例如，预防药或治疗药)可以按照与本公开的抗体或其片段间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时，按间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时、间隔或96小时至120小时施用。可在同一次患者就诊中施用2种或更多种疗法。
抗体或其片段和其他疗法可以循环施用。循环治疗涉及施用第一疗法(例如，第一预防药或治疗药)一段时间，随后施用第二疗法(例如，第二预防药或治疗药)一段时间，任选地，接着施用第三疗法(例如，预防药或治疗药)一段时间等，并重复这种依次施用(即，该循环)，以减少对所述疗法中的一种疗法的耐药性形成，以避免或减少所述疗法中的一种疗法的副作用和/或以改善所述所述疗法中的一种疗法的功效。
在某些实施方案中，可以配制抗体或其片段以确保恰当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保治疗性化合物跨过BBB(如果希望的话)，可将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分，因而增强靶向的药物递送(参见，例如Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等人,(1995)FEBSLett.357:140；Owais等人,(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180)；表面活性蛋白质A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134；p120(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4:273。
本公开提供向有需求的受试者施用单独或与其他治疗药组合的包含抗体或其片段的药物组合物的方案。本公开的联合疗法的治疗药(例如，预防药或治疗药)可以同时或依次向受试者施用。本公开的联合疗法的治疗药(例如，预防药或治疗药)也可以循环施用。循环治疗涉及施用第一治疗药(例如，第一预防药或治疗药)一段时间，随后施用第二治疗药(例如，第二预防药或治疗药)一段时间并重复这种依次施用，即，该循环，以减少对一种治疗药(例如药物)的耐药性形成，以避免或减少一种治疗药(例如药物)的副作用和/或以改善治疗药的功效。
联合疗法的治疗药(例如，预防药或治疗药)可以同时施用至受试者。术语“同时”不限于在完全相同的时间施用治疗药(例如，预防药或治疗药)，而是意指将包含抗体或其片段的药物组合以这样的序列并在这样的时间间隔内施用至受试者，从而抗体可以与其他治疗药一起发挥作用，以提供与如果另外施加它们相比增加的益处。例如，可在同一时间或在不同时点以任意顺序顺次对个体施用各疗法；然而，如果不在同一时间施用，则应在足够接近的时间内施用，以提供希望的治疗效果或预防效果。可以以任意合适的形式和通过任意合适的途径对受试者分开施用各疗法。在多个实施方案中，将治疗药(例如，预防药或治疗药)相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、48小时、72小时或1周施用至受试者。在其他实施方案中，将两种或更多种治疗药(例如，预防药或治疗药)在患者的同一访视中施用。
组合疗法的预防剂或治疗剂可在同一药物组合物中施用给个体。备选地，联合疗法的预防药或治疗药可以在分立的药物组合物中同时施用至受试者。可通过相同或不同的施用途径对个体施用这些预防剂或治疗剂。
已经充分描述了本公开，通过以下实施例和权利要求进一步说明本发明，所述实施例和权利要求是说明性的并且不意图是进一步限制性的。
ICD3测定法及其用途
在一个方面，本公开涉及一种用于检测Notch3信号转导的测定法。Notch信号传导由一系列的蛋白酶剪切活化。γ分泌酶复合物介导Notch受体的最终切割，最终释放Notch胞内结构域(ICD)，后者转位到胞核以活化Notch靶基因转录。生成新表位抗体(检测抗体)以检测仅在人Notch3的氨基酸Gly1661和Val1662之间切割时γ分泌酶切割形式的Notch3ICD(ICD3)。
该测定法包括使用检测γ分泌酶切割的Notch3结构域(ICD3)中的新表位VMVARRK(SEQIDNO:243)的检测抗体。可以通过在野生型Notch3或突变体Notch3的位置Gly1661-Val1662切割产生ICD3。
通过本文公开的测定法检测ICD3显示Notch3信号活化和转导。阻止Notch3信号活化和转导的抗体或其片段阻止ICD3的产生，并且因而通过检测抗体检出其中所含的新表位。在一个实施方案中，抗体或其片段束缚Notch3处于自我抑制型构象，因而妨碍S2和S3切割位点暴露于蛋白酶，因而阻止包含检测抗体识别的新表位的ICD3形成。
在一个方面，本公开涵盖了在生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织)背景下或从罹患癌症或面临形成癌症风险的个体确定Notch3蛋白和/或核酸表达以及Notch3蛋白功能的诊断测定法。
ICD3测定法可以用来检测活化型Notch3信号传导的存在。Notch3信号传导的活化可以因Notch3突变或Notch3高表达/基因扩增而实现。可以制备生物样品并分析ICD3蛋白的存在或不存在。如果Notch3ICD存在，则NRR结构域可能含有突变，所述突变导致NRR的自我抑制型构象改变，因而使HD结构域暴露于蛋白酶切割和ICD3的产生，这可以通过本公开的检测抗体检测到。这些试验的结果和解读性信息可以返回到卫生保健提供者以通报给受检个体。这类诊断可以由诊断实验室进行，或备选地，可以制造诊断试剂盒并出售给卫生保健提供者或出售给私人个体以自我诊断。
本公开的另一个方面提供用于确定个体中Notch3核酸表达或Notch3蛋白活性，因而对该个体选择适宜治疗药或预防药的方法(在本文中称作“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型(例如，接受检查以确定该个体响应于特定药物的能力的个体的基因型)，选择药物(例如，小分子药物或生物制品如抗体或其片段)用于该个体的治疗性或预防性治疗。
本公开的又一个方面涉及在临床试验中监测药物(例如，小分子药物或生物制品如抗体或其片段)对Notch3蛋白表达或活性的影响。
实施例
实施例1：食蟹猴Notch3的克隆
由于食蟹猴Notch3的序列在公共数据库中不可获得，所以将它如下克隆：
食蟹猴总RNA
全部总RNA均购自Zyagen(http://zyagen.com/index.php),SanDiego,CA92121)。从食蟹猴的多种组织(脑、肾、肝、肺、骨骼肌、胰、脾、皮肤、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、骨髓)提取总RNA。Zyagen未专门说明来源参考信息和个体猴的参考信息。使用允许快速分离包括微RNA在内的总RNA的异硫氰酸胍–酚:氯仿提取法，从组织/细胞常规提取总RNA。将RNA用无RNA酶的DNA酶处理以除去残余DNA，精确定量，并贮存在-80℃。通过变性琼脂糖凝胶电泳验证每份RNA样品的完整性，如通过完整核糖体RNA所示。通过分光光度计(A260/A280：1.9-2.1)评估RNA的纯度。对于RNA印迹法、核糖核酸酶保护测定法、SI核酸酶测定法、RT-PCR/Q-PCR分析、cDNA末端快速扩增(RACE)，RNA是理想的；且对于文库构建，纯化mRNA。将总RNA以1mg/ml的浓度在无RNA酶的水、1mM柠檬酸钠或0.1mMEDTA中提供并且在干冰上运输。在接收后，全部总RNA样品均贮存在-80℃。
RNA逆转录成cDNA和PCR扩增
全部总RNA均利用ThermoScriptRT-PCR系统(Invitrogen，Cat.11146-016)和寡聚dT逆转录。通常，2μg总RNA用于每份cDNA汇集物并且以20μl洗脱。1μl引物(50μM寡聚(dT20)，2μg(组织)。将总RNA和2μl10mMdNTP混合物合并，并用DEPC-处理的水调节体积至12μl。在65℃温育5分钟后，制备以下组分的主混合物：4μl5xcDNA合成缓冲液、1μl0.1MDTT、1μlRNaseOUTTM(40U/μl)、1μlDEPC处理的水和1μlThermoScriptTMRT(15单位/μl)，并且将8μl总体积在冰上添加至此前的每个反应管。总RNA样品的逆转录阶段在55℃于90分钟内完成。随后通过在85℃温育整个反应物五分钟，终止这种反应。最后，添加1μlRNA酶H并将样品在37℃温育20分钟。将cDNA反应贮存在-20℃作为全部聚合酶链反应的基础材料。
使用2μlcDNA进行PCR扩增。在UTR区和在编码序列中设计引物。将PCR产物直接进行凝胶提取并由直接测序分析。
钓取食蟹猴Notch3基因的PCR引物
将非人灵长类例如大猩猩、猩猩、恒河猴的靶序列与人序列比对以设计引物和特异性检验。也可能需要靶序列的小鼠和大鼠序列。用于比对的靶序列可以是提取自数据库如NCBI、eEnsembl或UniProt。
PCR和凝胶纯化
使用KAPATM FAST主混合物(2X)，通过Rotor-Gene6000(现在的Rotor-GeneQ)RT-PCR实现cDNA的PCR。KAPATM FASTqPCR通用主混合物(2X)，一种即用型混合物，其含有抗体介导的热启动剂、GreenI荧光染料、MgCl2、dNTP和用于qPCR中扩增和检测DNA的稳定剂(KAPABIOSYSTEMS)。对于PCR，在每个0.1mlPCR管中制备体积20μl的反应混合物，所述反应混合物由10μl绿、0.4μl正向引物(10μM)、0.4μl反向引物(10μM)、2μl模板和7.2μl无RNA酶H2O组成，并且管用盖封闭。PCR循环之前是95℃保温5分钟并且将循环步骤重复45次。变性由加热反应体系至温度95℃持续10秒组成。在这个步骤后，温度降至60℃持续30秒，允许引物复性至单链DNA模板上。通过升高温度至72℃持续30秒获得延伸并且重复循环步骤。全部PCR产物随后加载于1xTBE琼脂糖凝胶1％上，按PCR片段大小分离并进行凝胶提取和用溴化乙锭(3x10-3mg/ml)染色。
随后进行靶DNA片段的凝胶提取。在这种情况下，基于凝胶提取试剂盒方案的程序用来纯化DNA片段，所述程序与MACHEREY-的8/96ExtractII组合。为了提取PCRDNA片段，将的400μlQG溶解缓冲液添加至96孔板中的每条凝胶条带。为了熔化凝胶条带，将深孔平板置于热水浴(50至60℃)中约15分钟。在抽吸该溶液到8/96ExtractII滤板上之前，将溶液小心地涡旋混合。如果DNA条带小于400bp，则使用额外的100μl异丙醇。将溶液过滤两次。在这个步骤后，将柱用650μl洗涤缓冲液NT3洗涤两次并且随后通过置于真空下20分钟进行干燥，之后用无RNA酶水洗脱DNA片段。为此，将8/96ExtractII滤板下的收集储器更换为“U型底”洗脱平板并将100μl无RNA酶水在不触碰膜的情况下直接添加到膜的中央。通过使用真空过滤实现DNA的提取并且洗脱物最终可以用于测序。
测序和数据分析
为了将纯化的DNA片段测序，将8μl纯化的PCR样品与4μl无RNA酶的H2O和1μl正向引物或1μl反向引物(10μM)混合。用Sanger法联合AppliedABI3730xlDNA分析仪完成PCR片段的测序。将DNA序列读数输入至程序，修订并且随后相对于参比序列装配，在这种情况下，参比序列是人基因的序列。相应基因的序列从Ensembl或Swiss-Prot基因组数据库浏览器直接拷贝入Vector中。参考序列的使用允许鉴定全长序列。
食蟹猴Notch3序列。在以下位置处鉴定到三个天然SNP：213S/N；719E/D；和2053V/A。
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAVPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHSARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGICKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGMLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCSFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLLGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCPQSFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGENCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFSGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDVAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEELGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVAPAMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHFANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGTHGLGPLLCPPGAFLPGLKVVTQSGSKKSRRPPGKAGLGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAGAHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATATGALPAQPLPLSVPSSLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDNO:268)
实施例2：筛选Notch3抗体和评价蛋白质/细胞结合作用
为了选择识别人Notch3的抗体，在采用噬菌体展示文库的淘选中使用代表Notch3受体关键区域(参见图1中的胞外结构域结构示意图)的几种重组蛋白。淘选中使用Notch3的NRR、EGF32-NRR和配体结合(LBD)区。此外，在如下文描述的完整细胞淘选或差异性完整细胞淘选中使用表达外源或内源Notch3的细胞系。使用市售噬菌体展示文库MorphosysHuCAL文库作为抗体变体蛋白的来源，通过选择具有高亲和结合亲和力的克隆，产生针对人Notch3蛋白的抗体。图3-6中显示Notch3抗体对重组蛋白(人、小鼠、食蟹猴)以及对表达Notch3的细胞的结合特性。
细胞系
U2OS、MDA-MB-468、HCC1143购自ATCC并在补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的生长培养基中常规维持。细胞系TALL-1购自DSMZ并在补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的生长培养基中常规维持。HLRPathDetect细胞购自Stratagene，并根据制造商的说明书维持。
产生用于Notch3-NRR结构域和Notch3-NRR-EGF结构域的表达载体
将人Notch3NRR结构域(氨基酸1378-1640)的编码序列进行基因合成并亚克隆至表达载体pRS5a的衍生物中以包括小鼠IgK信号肽和C末端六组氨酸纯化标签。类似地，将人、食蟹猴和小鼠EGF32-NRR双结构域(分别是氨基酸1246-1640、1246-1640、1247-1641)进行基因合成并克隆至表达载体pRS5a中以包括小鼠IgK信号肽和C末端六组氨酸纯化标签。pRS5a含有CMV启动子并通过瞬时转染HEK293Freestyle细胞(Invitrogen)用于表达所述蛋白质。
重组Notch3蛋白的表达/纯化
使用1:3DNA:PEI转染试剂的比例，将表达Notch蛋白的载体瞬时转染入HEK293Freestyle细胞。转染后7天，将细胞上清液施加至镍-NTA柱(Qiagen)以纯化加组氨酸标签的蛋白质。将蛋白质用咪唑洗脱，随后在PBS中的Superdex200(GE)上通过大小排阻法进一步纯化以除去任何聚集的蛋白质。通过SDS-PAGE和HPLC-大小排阻分析蛋白质以评估纯度和聚集状态。
Notch3-LBD蛋白
重组人Notch3-Fc嵌合体(登录号Q9UM47，aa40-467)购自R&DSystems(#1559-NT-050)。重组小鼠Notch3-Fc嵌合体(登录号Q61982，aa40-468)购自R&DSystems(#1308-NT-050)。
产生过量表达Notch3的细胞系
为了产生过量表达Notch3和Notch3-GFP的细胞系，cDNA购自Origene(目录号RG224711)。使用NEON电穿孔仪(Invitrogen)遵循来自制造商的说明，将U2OS细胞电穿孔。电穿孔参数是：1230V脉冲电压，10ms脉冲宽度，4个脉冲。使用100μLNEON移液器尖头(Invitrogen，目录号MPK10096)，将一百万个U2OS细胞与2μgNotch3-GFPcDNA混合。电穿孔后24小时，将细胞置于选择(200μg/mL的G418)下2周。将Notch3GFP阳性细胞用FACS分选成两个群体－高GFP阳性细胞和中等GFP阳性细胞。选择来自每个亚群体的克隆系并且通过FACS进一步检验Notch3细胞表面表达。
HuCAL淘选
为选择识别人Notch3的抗体，使用多次淘选策略。使用市售噬菌体展示文库MorphosysHuCAL文库作为抗体变体蛋白的来源，通过选择具有高亲和结合亲和力的克隆，产生针对人Notch3蛋白的治疗性抗体。该噬菌粒文库基于概念(Knappik等人,(2000)JMolBiol296:57-86)并利用在噬菌体表面上展示Fab的技术(Lohning，WO01/05950)。为了分离抗Notch3抗体，使用固相、溶液、完整细胞和差异性完整细胞淘选法，执行标准淘选策略。
固相淘选
在抗原选择过程之前，进行包被检验ELISA以确定抗原的最佳包被浓度。将96孔MaxisorpTM平板的适宜数目(取决于子文库汇集物的数目)的孔在4℃用300μlNotch3抗原包被过夜(o/n)。对于每次淘选，用PBS/0.05％Tween20/5％乳粉/5％BSA封闭约4x1013个HuCAL噬菌体-抗体。在封闭操作后，将预封闭的噬菌体混合物添加至抗原包被和封闭的每个孔并且在室温(RT)在微量滴定板摇床上温育2小时。此后，通过几个洗涤步骤洗去非特异性结合的噬菌体，并且对于洗脱特异性结合的噬菌体，使用10mMTris/HClpH8中的DTT。将DTT洗脱物转移至14ml大肠杆菌TG1中，并且此后将大肠杆菌TG1和DTT洗脱物的混合物在水浴中在37℃温育45分钟以便噬菌体感染。将细菌沉淀物重悬于2xYT培养基中，铺种于LB/Cam琼脂平板上并在30℃温育过夜。将菌落从平板刮下并用于噬菌体拯救、多克隆扩增选择的克隆和噬菌体产生。采用纯化的噬菌体，启动下一轮淘选。
根据第一轮的方案进行第二和第三轮固相淘选，例外是抗原的量减少和洗涤条件更严格。
采用链霉亲和素偶联的磁珠的溶液淘选方案
溶液淘选的前提是抗原的生物素酰化和证实生物素酰化抗原保留活性。在溶液淘选期间，将展示Fab的噬菌体和生物素酰化抗原在促进噬菌体接近抗原的溶液中温育。
对于噬菌体汇集物，使用链霉亲和素珠(M-280链霉亲和素；Invitrogen)并且对于每次淘选，将HuCAL噬菌体-抗体用Chemiblocker封闭，随后，将100nM生物素酰化的Notch3抗原添加至噬菌体粒子并且在室温在摇床上温育1-2小时。使用2mg封闭的链霉亲和素珠，捕获噬菌体-抗原复合物并用磁分离器收集与链霉亲和素珠结合的噬菌体粒子。使用PBS/0.05％Tween20和PBS，通过几个洗涤步骤洗去非特异性结合的噬菌体。为了从链霉亲和素珠洗脱特异性结合的噬菌体，使用DTT。随后将DTT洗脱物转移至大肠杆菌TG1中，并且将TG1和DTT洗脱物的混合物在水浴中在37℃温育45分钟以便噬菌体感染。将细菌沉淀物重悬于2xYT培养基中，铺种于LB/Cam琼脂平板上并在30℃温育过夜。将菌落从平板刮下并用于噬菌体拯救、多克隆扩增选择的克隆和噬菌体产生。采用纯化的噬菌体，启动下一轮淘选。
根据第一轮的方案进行第二和第三轮溶液淘选，例外是抗原的量减少和洗涤条件更严格。
针对Notch3的完整细胞淘选
对于每次淘选，在PBS/5％FCS中封闭约4x1013个HuCAL噬菌体-抗体。平行地，将每份噬菌体汇集物0.5-1.0x107个表达Notch3抗原的靶细胞和(如果用的话)0.5-1.0x107个不表达Notch3的吸附细胞在冰上重悬于1mlPBS/5％FCS中以便封闭。将封闭的靶细胞离心、重悬于预封闭的噬菌体粒子中并在4℃在摇床上温育2小时。在PBS的/5％FCS中洗涤噬菌体-细胞复合物3次。通过用0.1M甘氨酸-HCl/0.5MNaCl，pH2.2酸性洗脱10分钟，从靶细胞洗脱特异性结合的噬菌体。在离心后，通过添加2M未缓冲的Tris，中和上清液(洗脱物)。最终上清液用于噬菌体感染大肠杆菌TG1培养物。将细菌沉淀物重悬于2xYT培养基中，铺种于LB/Cam琼脂平板上并在30℃温育过夜。将菌落从平板刮下并用于噬菌体拯救和噬菌体扩增。扩增的噬菌体用于后续的淘选轮次。
根据第一轮的方案进行第二和第三轮完整细胞淘选。
针对Notch3的差异性完整细胞淘选
在差异性完整细胞淘选中，在细胞和纯化的蛋白质上交替进行选择。如对固相淘选所述那样在纯化的抗原上进行选择轮次。对于细胞上的选择轮次，请参考完整细胞淘选的程序。与完整细胞淘选相反，在DWCP中可以省略后吸附。
成熟淘选
为了增加所选择的抗体片段的亲和力和生物活性，使用三核苷酸定向诱变(Virnekas等人,(1994)NucleicAcidsResearch22:5600-5607)，通过盒诱变法平行地优化L-CDR3和H-CDR2区，而构架区保持恒定。在用于亲和力成熟的克隆之前，将亲本Fab片段从相应的表达载体亚克隆到展示载体中。
为了选择亲和力改善的结合物，使用Notch3抗原(hN3_EGF4-11_Fc、hN3_EGF4-11_Fc_biot、hN3_EGF32_NRR_His和hN3_NRR_His_biot)，对衍生自成熟文库的噬菌体进行三轮固相淘选、溶液淘选或差异性完整细胞淘选。通过降低每个淘选轮次中的抗原浓度，增加严格性(Low等人,(1996)JMolBiol260:359-368)。除减少抗原之外，进行解离速率选择(Hawkins等人,(1992)JMolBiol226:889-896)。这与22℃的延时洗涤步骤组合。
亚克隆和微量表达选择的Fab片段
为了促进可溶性Fab的快速表达，将选择的HuCAL噬菌体的编码Fab的插入物从展示载体亚克隆入表达载体中。
通过EcoRI/XbaI/BmtI三重消化进行亚克隆。在转化大肠杆菌TG1-F-单个克隆后，如先前所描述进行含有片段的周质提取物的表达和制备(Rauchenberger等人,(2003)JBiolChem.278:38194-38205)。
制备含有细菌裂解物的Fab用于ELISA筛选
将5μl每种过夜培养物转移至每孔预填充有40μl2xYT培养基(34μg/ml氯霉素(Cam)；0.1％葡萄糖)的无菌384孔微量滴定板。将平板在37℃温育直至培养物略微浑浊。向这些表达平板，每孔添加10μl2xYT培养基(34μg/mlCam和5mMIPTG)。将平板用透气性胶带密封并在22℃温育过夜。向表达平板的每个孔添加15μlBEL缓冲剂(2.5mg/ml溶菌酶，4mMEDTA，10U/μlBenzonase)并将平板在22℃温育1小时。对于后续ELISA筛选，通过向每个孔添加15μl12.5％MPBST并以400转/分钟和在22℃振摇平板至少30分钟，封闭含有Fab的大肠杆菌裂解物。将表达平板立即使用或贮存在-20℃。
制备含有Fab的细菌裂解物用于FACS筛选
将5μl每种过夜培养物转移至每孔预填充有100μl2xYT培养基(34μg/mlCam；0.1％葡萄糖)的无菌96孔微量滴定板。将平板在22℃温育直至培养物略微浑浊。向这些表达平板，每孔添加20μl2xYT培养基(34μg/mlCam；3mMIPTG)。将平板用透气性胶带密封并在22℃温育过夜。向表达平板的每个孔，添加15μlBEL缓冲剂(2.5mg/ml溶菌酶，4mMEDTA，10U/μlBenzonase)并将平板在22℃温育1小时。对于后续FACS筛选，通过向每个孔添加15μl16％FBS并以400转/分钟和在22℃振摇平板至少30分钟，封闭含有Fab的大肠杆菌裂解物。在温育后，离心BEL-裂解物以使细菌细胞碎片沉淀下来。含有Fab的上清液立即用于筛选目的或存储在-20℃。
ELISA筛选直接包被的抗原
将MaxisorpTM384孔平板用PBS中浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml或1.25μg/ml的Notch3抗原hN3_NRR_His、hN3_EGF32_NRR_His和hN3_EGF4-11_Fc包被。用PBS中的5％脱脂乳粉封闭平板后，添加含有Fab的大肠杆菌裂解物。使用AttoPhos荧光底物(Roche，#11681982001)，通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)2特异性山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch#109-055-097；1:5000稀释)检测Fab的结合。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。
ELISA筛选生物素酰化的抗原
将NeutrAvidinTM-包被的平板用2.5-5μg/mlhN3_NRR_His、5-10μg/mlhN3_EGF32_NRR_His生物素酰化的Notch3抗原或用稀释于PBS中的1.25μg/mlhN3_EGF4-11_Fc抗原包被。用PBS中的3％牛血清白蛋白封闭后，添加含有Fab的大肠杆菌裂解物。使用AttoPhos荧光底物(Roche，#11681982001)，通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)2特异性山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch#109-055-097；1:5000稀释)检测捕获的片段。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。
FACS筛选
在FACS筛选时，从淘选输出结果鉴定与细胞表面表达的抗原结合的单个Fab克隆。使用含有Fab的粗制大肠杆菌裂解物测试Fab。所用的细胞系是U2OS细胞(ATCC#HTB-96；未修饰的细胞＝U2OS_par或经遗传修饰以高度表达人Notch3的细胞＝U2OS_N3)和携带Notch3基因扩增的乳腺癌细胞系HCC1143(ATCC#CRL-2321)。
将100μl细胞悬液转移入一块新的96孔板(产生1x105个细胞/孔)。将含有靶细胞悬液的平板离心并且弃去上清液。重悬剩余的细胞沉淀物并且将50μl含有Fab的FACSBEL提取物添加至相应的孔。将平板在冰上温育1小时。在温育后，将细胞离心并用200μlFACS缓冲液(PBS，3％FCS)洗涤3次。在每个洗涤步骤后，将细胞离心并小心地重悬。
添加PE缀合的山羊-抗人IgG第二检测抗体(Jackson，目录号109-116-098)并且将样品在冰上温育并随后根据Fab温育洗涤。
最后，将细胞沉淀物重悬于每孔150μlFACS缓冲液中并在BDFACS阵列中分析样品。
亲和力成熟后筛选
对于基于(Haenel等人,(2005)AnalBiochem.339:182-184)描述的原理，通过溶液平衡滴定法对成熟的结合物排级别，将恒定量的稀释的BEL提取物以不同浓度的抗原过夜平衡。
随后，将混合物转移至事先用抗原包被的MSD平板，并且温育和洗涤后，添加合适的MSD-磺基标签标记的检测抗体。
随后，使用Sector成像仪6000(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD，美国)通过ECL检测，对未结合的Fab的浓度定量。
采用相应拟合模型，使用XLfit(IDBS)软件处理结果，以评估亲和力并且因此鉴定通过成熟过程改进最大的克隆。
大肠杆菌中表达和纯化加His标签的Fab片段(mg规模)
在摇瓶培养物中使用500ml补充有0.1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的2xYT培养基，实施大肠杆菌TG1F-细胞中表达编码的Fab片段。将培养物在30℃振摇直至OD600达到值0.5。通过以终浓度0.75mM添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)并且在30℃进一步培养20小时，诱导Fab表达。将细胞收获并使用溶菌酶破坏。借助IMAC(Bio-Rad,德国)分离加His6标签的Fab片段并使用咪唑洗脱。使用PD10柱(GEHealthcare，德国)，将缓冲液交换成1xDulbecco′sPBS(pH7.2)。无菌过滤样品(0.2μm)。通过UV-分光光度法确定蛋白质浓度。在变性、还原型15％SDS-PAGE中分析样品的纯度。在天然状态下通过大小排阻层析(HP-SEC)用校正标准品确定Fab制备物的均匀性。
转化成IgG
为了表达全长IgG，将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从Fab表达载体亚克隆入用于IgG1f的适宜载体中。
以IgG筛选规模瞬时表达人IgG
在96孔表达系统中使用真核HEK293c18细胞(ATCC#CRL-10852)以产生条件化的细胞培养上清液，所述细胞培养上清液含有后续用于特异性和/或功能性筛选分析法的全长IgG。
将片段从表达载体或展示载体亚克隆至Ig表达载体中。所产生的连接物用于转化大肠杆菌XL1Blue，接着将样品涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的LB平板上。
通过使用与装置组合的适宜DNA制备试剂盒，制备单菌落的DNA制备物。通过UV-分光光度法确定各个DNA浓度。
在前一日，将真核HEK293c18细胞在96孔平底平板中接种密度约4x104个细胞/50μl/孔日并用等量的Ig表达载体DNA转染。在37℃和6％CO2温育40-50小时后，将培养上清液转移至96孔U型底平板并通过离心澄清。通过抗-Fd捕获ELISA测试所产生的Ig上清液，参考已知的标准物计算Ig浓度，并贮存在-20℃以稍后用于特异性和/或功能性筛选测试法。
采用纯化Ig在直接包被抗原上的ELISA
MaxisorpTM384孔平板用PBS中的Notch3抗原hN3_NRR_His(2.5μg/ml)，N3_EGF32_NRR_His(对于人、食蟹猴和小鼠，5μg/ml)和N3_EGF4-11_Fc(人1.25μg/ml；食蟹猴和小鼠：5μg/ml)包被。用PBS中的5％脱脂乳粉封闭平板后，添加来自探索性规模表达的IgG(对于ELISAEC50测定，在1:3稀释步骤中从50μg/ml(333.3nM)起向下进行12点滴定)。使用AttoPhos荧光底物(Roche，#11681982001)，通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)2特异性山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch#109-055-097；1:5000稀释)检测IgG的结合。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。
采用探索性规模IgG的FACS筛选
在FACS筛选时，从探索性规模表达鉴定与细胞表面表达的抗原结合的IgG。所用的细胞系是U2OS细胞(ATCC#HTB-96；未修饰的细胞＝U2OS_par或经遗传修饰以高度表达人Notch3的细胞＝U2OS_N3)和携带Notch3基因扩增的乳腺癌细胞系HCC1143(ATCC#CRL-2321)。
将100μl细胞悬液转移入一块新的96孔板(产生1x105个细胞/孔)。将含有靶细胞悬液的平板离心并且弃去上清液。重悬剩余的细胞沉淀物并且将50μlIgG稀释物添加至相应的孔。在1:5稀释步骤中从20μg/ml起向下进行FACSEC50确定。将平板在冰上温育1小时。在温育后，将细胞离心并用200μlFACS缓冲液(PBS，3％FCS)洗涤3次。在每个洗涤步骤后，将细胞离心并小心地重悬。添加PE缀合的山羊-抗人IgG第二检测抗体(Jackson，目录号109-116-098)并且将样品在冰上温育并随后根据Fab温育洗涤。最后，将细胞沉淀物重悬于每孔150μlFACS缓冲液中并在BDFACS阵列中分析样品。
用于产生表达Notch3抗体的稳定细胞系的表达载体
为了更大规模表达Notch3抗体，将轻链编码序列和重链编码序列从噬菌体载体克隆到含有小鼠IgK信号肽的单个双CMV启动子质粒中，以产生稳定的细胞系。通过ELISA对细胞筛选Notch3抗体的高水平表达。
BiacoreKd测定
使用Biacore3000仪(Biacore，GEHealthcare)如下文所述那样，借助SPR通过测定动力学参数进行亲和力测定。
直接包被的抗原上的Biacore测定。如下分析与固定化抗原的结合作用。将抗原遵循制造商的操作方案固定在芯片表面上。使用六种不同的Fab浓度(2倍连续稀释物)，进行动力学测量。在每个循环后再生传感芯片。空白注射运行缓冲液，用作双重参比。使用BIA评价软件4.1.1(Biacore，GEHealthcare)拟合全部传感图，以确定kon和koff速率常数，该常数用来计算KD。
备选地，对于定性结合实验，使用IgG样品作为样品。为了IgG样品的相对比较，使用与Fab片段相同的模型拟合结合曲线。
使用标准EDC-NHS胺偶联化学，将稀释于10mMpH4.5乙酸盐缓冲液中至10μg/mL的大约100RUhN3_NRR_His(或400RUhN3_EGF32_NRR_His)固定在CM5芯片(Biacore，GEHealthcare)上。仅活化和去活化参比流动小室1。运行缓冲液是0.005％(v/v)Tween20的PBS(GIBCO)pH7.2，流速25μl/分钟。使用范围从15.6至500nM的Fab浓度，注射时间120秒和适宜的解离时间例如240秒。通过注射1次甘氨酸/HClpH2.5(20秒)和注射1次甘氨酸/HClpH2(20秒)进行结合的分析物的再生。用设定至“全局(global)”的Rmax和设定至0的RI参数进行拟合。
借助抗体捕获设置的BiacoreKD测定。如下分析单体抗原对捕获抗体的结合。在CM5芯片(Biacore，GEHealthcare)上，使用EDC/NHS化学，共价固定适宜的捕获抗体(Biacore，GEHealthcare)。通过捕获抗体和后续注射六种不同的抗原浓度(2倍连续稀释物)，进行动力学测量。在每个循环后再生传感芯片。空白注射运行缓冲液，用作双重参比。使用BIA评价软件4.1.1(Biacore，GEHealthcare)拟合全部传感图，以确定kon和koff速率常数，该常数用来计算KD。
运行缓冲液是0.05％(v/v)Tween20的PBS(GIBCO)pH7.2。使用抗人Fc抗体(Biacore，GEHealthcare)捕获100RUIgG。使用例如范围从15.6至500nM的抗原浓度(hN3_NRR_His或hN3_EGF32_NRR_His)，流速30μl/分钟，注射时间180秒和适宜的解离时间例如360秒。通过按30秒注射2次3MMgCl2，进行抗体/抗原复合物的再生。用设定至“全局”的Rmax和设定至0的RI参数进行拟合。
借助抗原捕获的BiacoreKD测定。如下分析Fab对捕获抗原的结合。在CM5芯片(Biacore，GEHealthcare)上，使用EDC/NHS化学，共价固定适宜的抗-抗原标签捕获抗体。通过捕获抗原和后续注射六种不同的Fab浓度(2n连续稀释物)，进行动力学测量。在每个循环后再生传感芯片。空白注射运行缓冲液用于双重参比。使用BIA评价软件4.1.1(Biacore，GEHealthcare)拟合全部传感图，以确定kon和koff速率常数，该常数用来计算KD。
运行缓冲液是0.05％(v/v)Tween20的PBS(GIBCO)pH7.2。使用抗人Fc抗体(Biacore，GEHealthcare)捕获大约75RU抗原(例如hN3_EGF4-11_Fc，50nM)。使用例如范围从15.6至500nM的抗体Fab片段浓度，流速30μl/分钟，注射时间180秒和适宜的解离时间(例如直至1800秒)。通过按35秒注射2次3MMgCl2，进行抗体/抗原复合物的再生。用设定至“全局”的Rmax和设定至0的RI参数进行拟合。
使用Sector成像仪6000(MSD)，用于KD测定的溶液平衡滴定(SET)法
溶液中的亲和力测定基本上如文献(Friquet等人,(1985)JImmunolMethods77:305-319)中所述进行。为了改善SET法的灵敏度和准确度，将它从经典ELISA转移为基于ECL的技术(Haenel等人,(2005)AnalBiochem339:182-184)。
根据制造商的说明书，将1mg/ml山羊抗人(Fab)2片段特异性抗体(Dianova或Bethyl)用MSD磺基-TAGTMNHS-酯(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD，美国)标记。对于小鼠抗体的KD测定，标记相应的抗小鼠IgG并用作检测试剂。
实验在聚丙烯微量滴定板中实施并且使用含有0.5％BSA和0.02％Tween-20的PBSpH7.4作为测试缓冲液。将未标记的抗原以2倍系列稀释，始于高于预计KD至少10倍的浓度。无抗原的孔用来测定Bmax值；仅含测试缓冲液的孔用来确定背景。在添加适宜量的结合物(抗体浓度类似于或低于预计KD，60μl终体积)后，将混合物在室温温育过夜。
用抗原包被MSD平板(每孔30μl)。用含有0.02％Tween-20的PBS洗涤平板后，将平衡的样品转移至这些平板(每孔30μl)并温育20分钟。在洗涤后，将每孔30μlMSD-磺基标签标记的检测抗体(抗人(Fab)2，最终稀释度一般1:2000)添加至MSD平板并在室温在Eppendorf摇床(700转/分钟)上温育30分钟。
在洗涤MSD平板并添加30μl/孔含表面活性剂的MSD读数缓冲液T后，使用Sector成像仪6000(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD，美国)检测电化学发光信号。
采用定制的拟合模型，用XLfit(IDBS)软件评价数据。对于Fab分子的KD测定，使用根据(Abraham等人,(1996)JMolRecognit.9,456-461)改良的以下拟合模型(根据(Haenel等人,(2005)AnalBiochem339:182-184)：
y = B max - ( B max 2 &lsqb; F a b &rsqb; t ( &lsqb; F a b &rsqb; t + x + K D - ( &lsqb; F a b &rsqb; t + x + K D ) 2 - 4 x &lsqb; F a b &rsqb; t ) )
[Fab]t：应用的总Fab浓度
x：应用的可溶性抗原总浓度(结合位点)
Bmax：无抗原时Fab的最大信号
KD：亲和力。
对于IgG分子的KD测定，使用以下拟合模型(根据(Piehler等人,(1997)JImmunolMethods201:189-206)改良)：
y = 2 B max &lsqb; I g G &rsqb; ( &lsqb; I g G &rsqb; 2 - ( x + &lsqb; I g G &rsqb; + K D 2 - ( x + &lsqb; I g G &rsqb; + K D ) 2 4 - x &lsqb; I g G &rsqb; ) 2 2 &lsqb; I g G &rsqb; )
[IgG]：应用的总IgG浓度
x：应用的可溶性抗原总浓度(结合位点)
Bmax：无抗原时IgG的最大信号
KD：亲和力。
实验设置：
Fab(或IgG)的KD测定基本上如下进行：将抗原hN3_EGF4-11_Fc以PBS中的0.2μg/mL在4℃在标准MSD平板上包被过夜(或1μg/mL的hN3_NRR_His，这取决于样品的特异性)。随后，将MSD平板在室温用含有3％BSA的PBS封闭1小时。单体抗原(hN3_NRR_His)必须用于IgG样品的滴定；对于Fab片段的KD测定，hN3_NRR_His和hN3_EGF4-11_Fc均可以使用。
淘选策略和筛选的总结
使用重组Notch3抗原以及表达Notch3的细胞系，单独或组合执行11种初始淘选策略。对淘选输出结果筛选抗原结合作用和功能活性。3771种原始命中结果显示与Notch3重组抗原结合，774种在表达Notch3的细胞上阳性并产生295个独特克隆。用55种IgG进行完整抗体表征，选择12个候选物用于亲和力成熟(包括与Notch3NRR-结构域结合的5个克隆和与Notch3LBD-结构域结合的7个克隆)。在亲和力成熟后的SET-筛选产生315个改进的独特克隆(9个家族)。对111μ-规模表达的IgG筛选抗原结合作用和功能性。进一步表征31/111种IgG(来自8个不同HCDR3家族)并且产生属于4个不同HCDR3家族的9个优先克隆。
实施例3：在配体驱动的报道基因测定法中表征Notch3抗体
当一个细胞上的Notch受体与毗邻细胞上的配体相互作用时，活化规范的Notch信号传导。在哺乳动物中，存在五种跨膜配体，为三种δ样配体(DLL1、DLL4和DLL3)和两种Jagged配体(Jag1、Jag2)。为了确定抗Notch3抗体抑制Notch3配体诱导的信号传导的能力，开发了使用双重稳定报道分子细胞系HLR-huNotch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4-UA-萤光素酶的报道基因测定法(RGA)。使用这种测定法，研究对Jag1或DLL1活化的Notch3信号传导的抑制。对人Notch1和Notch2受体开发了相似的测定法。在这个系列的Notch受体特异性RGA测定法中测试Notch3抗体允许特异性评估抗体对Notch3的抑制。
为了确定抗Notch3抗体抑制Notch3配体诱导的信号传导的能力，开发了使用双重稳定报道分子细胞系HLR-huNotch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4-UA-萤光素酶的报道基因测定法(RGA)。
产生表达人Notch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4-UA-萤光素酶的细胞系
向逆转录病毒载体pLNCX2(Clontech，目录号631503)中克隆人Notch1、Notch2和Notch3以及食蟹猴Notch3胞外部分和跨膜部分，后接Gal4DNA结合结构域、VP16及核定位序列(NLS)。这些嵌合Notch受体的产生和相应报道基因测定法允许研究Notch3抗体对Notch受体特异性信号传导的影响。
Notch1-Gal4-VP16、Notch2-Gal4-VP16和Notch3-Gal4-VP16的表达载体
将Gal4-VP16的编码序列进行基因合成并克隆至载体pLNXC2(Clontech)的SalI-ClaI位点中以制备pLNXC2-Gal4-VP16。将食蟹猴Notch3(氨基酸1-1669)、人Notch1(氨基酸1-1762)和人Notch2(1-1704)的胞外(ECD)结构域和跨膜结构域基因合成并克隆至pLNXC2-Gal4-VP16的HindIII-SalI位点中，以产生相应Notch蛋白与Gal4-VP16的融合物。
用于Notch-Gal4-VP16表达载体的构建体
人Notch3-Gal4-VP16
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSKLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPG(SEQIDNO:272)
食蟹猴Notch3-Gal4-VP16
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAVPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHSARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGICKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGMLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCSFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLLGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCPQSFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGENCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFSGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSQLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPG(SEQIDNO:273)
人Notch1-Gal4-VP16
MPPLLAPLLCLALLPALAARGPRCSQPGETCLNGGKCEAANGTEACVCGGAFVGPRCQDPNPCLSTPCKNAGTCHVVDRRGVADYACSCALGFSGPLCLTPLDNACLTNPCRNGGTCDLLTLTEYKCRCPPGWSGKSCQQADPCASNPCANGGQCLPFEASYICHCPPSFHGPTCRQDVNECGQKPGLCRHGGTCHNEVGSYRCVCRATHTGPNCERPYVPCSPSPCQNGGTCRPTGDVTHECACLPGFTGQNCEENIDDCPGNNCKNGGACVDGVNTYNCRCPPEWTGQYCTEDVDECQLMPNACQNGGTCHNTHGGYNCVCVNGWTGEDCSENIDDCASAACFHGATCHDRVASFYCECPHGRTGLLCHLNDACISNPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPSGYTGPACSQDVDECSLGANPCEHAGKCINTLGSFECQCLQGYTGPRCEIDVNECVSNPCQNDATCLDQIGEFQCICMPGYEGVHCEVNTDECASSPCLHNGRCLDKINEFQCECPTGFTGHLCQYDVDECASTPCKNGAKCLDGPNTYTCVCTEGYTGTHCEVDIDECDPDPCHYGSCKDGVATFTCLCRPGYTGHHCETNINECSSQPCRHGGTCQDRDNAYLCFCLKGTTGPNCEINLDDCASSPCDSGTCLDKIDGYECACEPGYTGSMCNINIDECAGNPCHNGGTCEDGINGFTCRCPEGYHDPTCLSEVNECNSNPCVHGACRDSLNGYKCDCDPGWSGTNCDINNNECESNPCVNGGTCKDMTSGYVCTCREGFSGPNCQTNINECASNPCLNQGTCIDDVAGYKCNCLLPYTGATCEVVLAPCAPSPCRNGGECRQSEDYESFSCVCPTGWQGQTCEVDINECVLSPCRHGASCQNTHGGYRCHCQAGYSGRNCETDIDDCRPNPCHNGGSCTDGINTAFCDCLPGFRGTFCEEDINECASDPCRNGANCTDCVDSYTCTCPAGFSGIHCENNTPDCTESSCFNGGTCVDGINSFTCLCPPGFTGSYCQHDVNECDSQPCLHGGTCQDGCGSYRCTCPQGYTGPNCQNLVHWCDSSPCKNGGKCWQTHTQYRCECPSGWTGLYCDVPSVSCEVAAQRQGVDVARLCQHGGLCVDAGNTHHCRCQAGYTGSYCEDLVDECSPSPCQNGATCTDYLGGYSCKCVAGYHGVNCSEEIDECLSHPCQNGGTCLDLPNTYKCSCPRGTQGVHCEINVDDCNPPVDPVSRSPKCFNNGTCVDQVGGYSCTCPPGFVGERCEGDVNECLSNPCDARGTQNCVQRVNDFHCECRAGHTGRRCESVINGCKGKPCKNGGTCAVASNTARGFICKCPAGFEGATCENDARTCGSLRCLNGGTCISGPRSPTCLCLGPFTGPECQFPASSPCLGGNPCYNQGTCEPTSESPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVVVVLMPPEQLRNSSFHFLRELSRVLHTNVVFKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRELDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSETVEPPPPAQLHFMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSQLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPG(SEQIDNO:274)
人Notch2-Gal4-VP16
MPALRPALLWALLALWLCCAAPAHALQCRDGYEPCVNEGMCVTYHNGTGYCKCPEGFLGEYCQHRDPCEKNRCQNGGTCVAQAMLGKATCRCASGFTGEDCQYSTSHPCFVSRPCLNGGTCHMLSRDTYECTCQVGFTGKECQWTDACLSHPCANGSTCTTVANQFSCKCLTGFTGQKCETDVNECDIPGHCQHGGTCLNLPGSYQCQCPQGFTGQYCDSLYVPCAPSPCVNGGTCRQTGDFTFECNCLPGFEGSTCERNIDDCPNHRCQNGGVCVDGVNTYNCRCPPQWTGQFCTEDVDECLLQPNACQNGGTCANRNGGYGCVCVNGWSGDDCSENIDDCAFASCTPGSTCIDRVASFSCMCPEGKAGLLCHLDDACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVDECAMANSNPCEHAGKCVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTCLCMPGFKGVHCELEINECQSNPCVNNGQCVDKVNRFQCLCPPGFTGPVCQIDIDDCSSTPCLNGAKCIDHPNGYECQCATGFTGVLCEENIDNCDPDPCHHGQCQDGIDSYTCICNPGYMGAICSDQIDECYSSPCLNDGRCIDLVNGYQCNCQPGTSGVNCEINFDDCASNPCIHGICMDGINRYSCVCSPGFTGQRCNIDIDECASNPCRKGATCINGVNGFRCICPEGPHHPSCYSQVNECLSNPCIHGNCTGGLSGYKCLCDAGWVGINCEVDKNECLSNPCQNGGTCDNLVNGYRCTCKKGFKGYNCQVNIDECASNPCLNQGTCFDDISGYTCHCVLPYTGKNCQTVLAPCSPNPCENAAVCKESPNFESYTCLCAPGWQGQRCTIDIDECISKPCMNHGLCHNTQGSYMCECPPGFSGMDCEEDIDDCLANPCQNGGSCMDGVNTFSCLCLPGFTGDKCQTDMNECLSEPCKNGGTCSDYVNSYTCKCQAGFDGVHCENNINECTESSCFNGGTCVDGINSFSCLCPVGFTGSFCLHEINECSSHPCLNEGTCVDGLGTYRCSCPLGYTGKNCQTLVNLCSRSPCKNKGTCVQKKAESQCLCPSGWAGAYCDVPNVSCDIAASRRGVLVEHLCQHSGVCINAGNTHYCQCPLGYTGSYCEEQLDECASNPCQHGATCSDFIGGYRCECVPGYQGVNCEYEVDECQNQPCQNGGTCIDLVNHFKCSCPPGTRGLLCEENIDDCARGPHCLNGGQCMDRIGGYSCRCLPGFAGERCEGDINECLSNPCSSEGSLDCIQLTNDYLCVCRSAFTGRHCETFVDVCPQMPCLNGGTCAVASNMPDGFICRCPPGFSGARCQSSCGQVKCRKGEQCVHTASGPRCFCPSPRDCESGCASSPCQHGGSCHPQRQPPYYSCQCAPPFSGSRCELYTAPPSTPPATCLSQYCADKARDGVCDEACNSHACQWDGGDCSLTMENPWANCSSPLPCWDYINNQCDELCNTVECLFDNFECQGNSKTCKYDKYCADHFKDNHCDQGCNSEECGWDGLDCAADQPENLAEGTLVIVVLMPPEQLLQDARSFLRALGTLLHTNLRIKRDSQGELMVYPYYGEKSAAMKKQRMTRRSLPGEQEQEVAGSKVFLEIDNRQCVQDSDHCFKNTDAAAALLASHAIQGTLSYPLVSVVSESLTPERTQLLYLLAVAVVIILFIILLGVIMAKRKRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSQLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPG(SEQIDNO:275)
产生逆转录病毒以表达Notch3-Gal4-VP16
用适宜的逆转录病毒载体(pLNCX2_hNotch1_Gal4-VP16、pLNCX2_hNotch2_Gal4-VP16、pLNCX2_hNotch3_Gal4-VP16、pLNCX2_cNotch3_Gal4-VP16)转染293-GP2包装细胞系(Clontech，目录号631458)，产生逆转录病毒。使用Promega的Fugene6作为基于脂质的转染试剂。根据制造商的说明书实施转染。在转染后48小时收集病毒并立即用来转导HLR细胞(HLR-PathDetect，Stratagene)。转导的细胞接受选择至少两周，之后在共培养测定法中测试它们。选择每个细胞系的克隆性群体。
Notch3-Gal4-NLS-VP16-UA-萤光素酶配体诱导的报道基因测定法
通过与稳定表达细胞表面表达的rrJagged1(SN3T9)或rrDelta1(DLL1-19)的L细胞(HICKSC等人(2000)NatureCellBio2:515-520；LindsellC等人(1995)Cell80:909-917)共培养，活化HLR-Notch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4-UA-TATA-萤光素酶(HLR-N3)细胞。与表达配体的细胞共培养导致活化Notch3信号传导和蛋白酶剪切Notch3嵌合受体以释放Gal4-NLS-VP16。这种Gal4-NLS-VP16转位到核酸酶，在那里它与Gal4-萤光素酶报道分子结合，导致萤光素酶产生。在90％汇合度时，使用胰蛋白酶-EDTA使HLR-N3细胞脱离贴壁并且在测试介质(DMEM，高葡萄糖，L-Glu，Invitrogen，目录号21063-029；补充有10％FBS，1％P/S)中稀释至浓度2x105个细胞/ml。将每孔50μlHLR-N3细胞(＝1x104个细胞)接种在白色平底96孔板(Costar，目录号3917)中并在37℃和5％CO2温育过夜。
次日，将抗体(IgG)在PBS中以所需的浓度稀释。将每孔10μl抗体稀释物添加至接种的细胞并在37℃和5％CO2温育2小时。接下来，使用胰蛋白酶-EDTA，使表达Jagged1和Delta1配体的小鼠L细胞脱离贴壁并在测试介质中稀释至浓度8x105个细胞/ml。将每孔50μl小鼠L细胞(＝4x104个细胞/孔)添加至培养的HLR-N3细胞(50μlHLR细胞+10μl抗体+50μl小鼠细胞＝110μl终体积)并在37℃和5％CO2温育过夜。对于配体非依赖的设定，作为对照，代之以添加50μl小鼠亲本L细胞。
在温育过夜后，使50μl新鲜制备的Bright-Glo试剂适应室温(Promega，目录号E2610)并添加至每个孔。在5分钟温育时间后，在光度计(GeniosPro，Tecan)中读取发光。在充分滴定相应的抗体后使用Prism计算IC50值。相对IgG对照来显示抑制％。如果添加抗体后检测到增加的信号传导，则使用负数。
总结和讨论
除huNotch3RGA之外，还如上文所述进行cynoNotch3RGA以及huNotch1RGA(仅DLL1配体设定)和huNotch2RGA(Jagged1和DLL1)。直至最大浓度10μg/ml，所述的Notch3抗体无一在huNotch1RGA或huNotch2RGA中显示任何活性。鉴定到抑制Jagged1诱导和Delta1诱导的Notch3信号传导的Notch3抗体。抑制百分数和IC50根据用于活化的抗体和配体变动。从针对LBD结构域(12229、20364、20802)的淘选中鉴定的抗体在抑制来自这种配体驱动的RGA测定法的信号传导方面最有效，如图7A-D中所示。
实施例4：Notch3抗体对Notch靶基因mRNA水平的影响
为了鉴定一系列乳腺癌细胞系中的Notch靶基因，评价了γ分泌酶抑制剂(GSI)处理对基因mRNA表达的影响。Affymetrix人U133A阵列用来描述DMSO或10μMDAPT(Calbiochem565770)处理HCC70、MDA-MB468或HCC1143细胞72小时的概况。每个时间点进行三个重复。使用R/Bioconductor构架并且Limma包装用来确定DMSO处理和DAPT处理之间差异性表达的基因。使用调整的0.05p-值作为阈值以确定差异性表达的基因集合。最终，每个细胞系选出两个靶基因并且总结于下表中。当抑制Notch信号传导时，Hes1、MMP7和VSNL1mRNA水平降低，而抑制Notch信号传导时，DKK1mRNA水平增加。
为了定量以上基因的mRNA水平，将细胞系HCC70、MDA-MB-468或HCC1143以细胞密度1x105个细胞/mL按100μL铺种在96孔板(Costar，目录号3610)中。平板在37℃温育过夜，之后用适宜浓度的抗体处理。将处理的平板返回培养箱持续额外72小时，之后使用Qiagen’sRNeasy试剂盒(目录号74181)裂解以提取RNA。使用Taqman逆转录试剂(AppliedBiosystems，目录号N808-0234)，合成cDNA。通过实时PCR(Taqman快速高级主混合物，AppliedBiosystems，目录号4444557)测定mRNA表达。实时PCR在ViiA7实时PCR系统或7900HT快速实时PCR系统(AppliedBiosystems)中运行。为了定量每个靶基因的水平，使用2–ΔΔCt法。ΔΔCt的计算涉及将目的样品的Ct值与对照如未处理的样品或DMSO处理样品比较(Schmittgen和Livak2008NatureProtocols3:1101-1108)。
总结和讨论
如图8中所示，鉴定到能抑制一系列乳腺癌细胞系中内源Notch3信号传导的Notch3抗体。用Notch3抗体处理乳腺癌细胞系导致HES1或MMP7mRNA的表达减少和DKK1mRNA的表达增加。
实施例5：鉴定和表征Notch3NRR结构域和PEST结构域中的突变
迄今，癌症中Notch受体的证据主要集中在Notch1信号传导的改变方面。尽管Notch3在卵巢癌中扩增，但是不存在其扩增导致依赖于Notch3信号传导的直接证据。此外，不存在Notch3中活化性突变的证据。对一系列细胞系中的Notch3测序以鉴定该基因中的突变以进一步表征。
癌细胞系百科全书(CCLE)用来表征947种人癌细胞系(BarretinaJ.等人(2012)Nature483:603-7)。通过使用溶液相杂交分子捕获技术大规模平行测序，获得>1600个基因的突变信息。使用SureSelect靶富集系统(AligentTechnologies)，如所述那样构建用于外显子组捕获测序的多个文库。Notch3是测序的基因之一并且分析数据以鉴定该蛋白质的NRR(外显子25、26、氨基酸1378-1640)结构域和PEST(外显子33氨基酸1972-2322)结构域中的任何突变。当细致检验来自947种癌细胞系的序列数据后，确定在外显子25和33中的序列覆盖率不足以鉴定突变。下表显示Notch3中的外显子平均覆盖率。列出的数字是表3中每碱基对的读数平均数值。
表3：Notch3外显子读数。
Notch3的外显子 平均覆盖率
e01 0.03
e02 -
e03 -
e04 10.49
e05 595.39
e06 277.47
e07 79.71
e08 99.63
e09 210.51
e10 0.58
e11 42.39
e12 558.77
e13 0.77
e14 0.66
e15 1.71
e16 168.88
e17 1.65
e18 1.13
e19 111.12
e20 53.03
e21 414.89
e22 12.79
e23 6.72
e24 -
e25 0.44
e26 171.70
e27 52.77
e28 3.44
e29 36.78
e30 280.90
e31 404.35
e32 223.13
e33 1.27
为了确定这些细胞系或原发肿瘤的任何一者是否在这些区域中含有突变，使用三种方法，包括Sanger测序法(Genewiz)、RainDance(Tewhey等人(2009)NatureBiotechnology27:1025-1031)和RNAseq(Wang等人(2009)NatureReviewsGenetics10:57-63)。如图9中所示，在多个细胞系和肿瘤样品中鉴定到NRR结构域和PEST结构域中的突变。在图9a中，上半小图显示具有NRR突变的细胞系，而下半小图具有PEST突变。图9b中指示在原发肿瘤中鉴定的NRR突变。
分离原发肿瘤和产生原发肿瘤异种移植库
按以下方式生成从原发性人肿瘤异种移植物获得的数据：在手术切除期间在补充有1％青霉素/链霉素的RPMI中从患者收集肿瘤标本，缺血时间小于1小时。将不含坏死组织的15-30mm3小块在异氟烷麻醉下皮下移植至6至8周龄雌性裸鼠的肩胛间脂肪垫中。将小鼠在无特定病原体动物笼舍中维持饲养并根据批准的方案和法规操作。在移植后2至8个月异种移植物出现在移植部位。一旦肿瘤达到700-800mm3，随后将它们从小鼠移植到小鼠直至实现合理一致的生长速率。在小鼠中连续传代期间，在补充有50％FBS和10％DMSO的RPMI中产生冷冻贮存物并且检验它们以确保异种移植模型的成功建立。将来自患者和每一代异种移植物的30-50mg小块急冻用于基因表达谱分析、拷贝数分析以及突变分析。还收集每个成功移植的异种移植模型的150mg小块并进行组织学分析。在第四代后，建立的肿瘤异种移植模型进一步用于体内研究。对于基因表达谱分析，使用亲和树脂(QIAGENRNeasy微量试剂盒；QIAGENAG)分离总RNA。用RNA6000NanoLabChip系统在Bioanalyzer2100上(AgilentTechnologies)评估RNA完整性和纯度。
实施例6：在报道基因测定法中表征Notch3NRR突变
产生具有Notch3NRR突变的Notch3表达载体
选择两个突变用于表征。TALL-1细胞是一个具有S1580L突变的T细胞急性淋巴母细胞系。TALL-1细胞购自DSMZ(#ACC521)。还鉴定到具有G1487D突变的乳腺肿瘤(X-1004)。用于RNAseq分析以检测X-1004样品中突变的RNA来自一只第5代小鼠。将这些突变引入载体pLNCX2_Notch3-GAL4-NLS-VP16。
构建体
Notch3_S1580L_Gal4-VP16
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGLVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSKLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPG(SEQIDNO:276)
Notch3_G1487D_Gal4-VP16
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQDCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSKLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPG(SEQIDNO:277)
通过用适宜的逆转录病毒载体转染293-GP2包装细胞系(Clontech，目录号631458)，产生逆转录病毒。使用Promega的Fugene6作为基于脂质的转染试剂。根据制造商的说明书实施转染。在转染后48小时收集病毒并立即用来转导HLR细胞(HLR-PathDetect，Stratage)。用Notch3wt-Gal4-VP16、Notch3_p.S1850L-Gal4-VP16或Notch3_p.G1487D-Gal4-VP16逆转录病毒粒子转导HLR细胞(Stratagene)。在试验之前，用G418选择细胞2周。
评估Notch3野生型受体和Notch3NRR突变体受体的基础活性的Notch3报道基因测定法
Notch3报道基因测定法：在无酚红DMEM、10％FBS(Hyclone，目录号SH30071)、1％青霉素-链霉素(Gibco目录号15140-122)、L-谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-081)、100μg/ml潮霉素(Gibco，目录号10687-010)和400μg/mlG418(Gibco，目录号10131-027)中维持HLR-Notch3wt-Gal4-VP16、HLR-Notch3_p.S1580L-Gal4-VP16和HLR-Notch3_p.G1487D-Gal4-VP16细胞。在无酚红DMEM、10％FBS(Hyclone，目录号SH30071)、1％青霉素-链霉素(Gibco目录号15140-122)、L-谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-081)和100μg/ml潮霉素(Gibco，目录号10687-010)中维持HLR亲本系。将完全培养基中生长的接近汇合的细胞用PBS(Gibco，目录号20012-027)洗涤，用TryplE(Gibco，目录号12605010)进行胰蛋白酶消化并稀释成4x104个细胞/mL；将100μL的细胞悬液以密度4000个细胞/孔铺种在96孔透明底白色平板(Costar，目录号3610)中。全部平板随后均在37℃温育过夜，之后用DAPT(10μM，CalBiochem)处理。将平板返回培养箱持续24小时，之后使用Bright-Glo(Promega)测定萤光素酶活性。Envision平板读数仪(PerkinElmer)用来确定发光量。
评估野生型和突变体Notch3受体的细胞表面水平的FACS测定法
为了展示细胞系中突变体Notch3受体的表达，使用流式细胞术。将(标准条件下生长的)表达突变体Notch3和野生型Notch3的细胞系在含有0.1％BSA和0.01％叠氮钠的PBS中与含有APC荧光素标记物(R&D目录号FAB1559A)的抗Notch3结合及检测抗体混合，并且在4℃温育1小时。在洗涤后，利用光特性和侧向散射特性对单个细胞设门，通过BDFACSCanto仪分析细胞。
细胞表面上的Notch3受体水平通过市售抗Notch3APC(R&D#FAB1559A)标记抗体与表达突变体和内源Notch3的细胞结合来确定并且通过FACS评估。将细胞进行胰蛋白酶消化(InvitrogenTrypLE目录号12605-010)并且在FACS缓冲液(PBS/3％FBS/0.01％NaN3)中稀释至2x106个细胞/mL。将2.5x105个细胞/孔添加至96孔平板(Corning目录号3610)的每个孔并且在4℃以1500转/分钟离心5分钟，之后取出上清液。将抗Notch3APC抗体或用APC标记的绵羊IgG同种型对照(R&D目录号IC016A)以100μLFACS缓冲液中的终浓度0.1μg添加至细胞沉淀物并且在4℃温育1小时。将细胞用100μLFACS缓冲液洗涤并沉淀2次。最后，细胞重悬于200μLFACS缓冲液中并且用BDFACSCanto(BDBiosciences)测量荧光值。通过测量平均通道荧光来评估细胞表面结合的抗Notch3APC抗体的量。
总结和讨论
向Notch3受体中引入S1580L突变或G1487D突变导致来自受体的基础信号传导相对于野生型对照增加大约10倍。在这个系统中，野生型受体和突变体受体以大致等同的水平表达，如通过FACS测定法所确定。该数据表明这些突变在表达这些突变和其他相似突变的细胞系和肿瘤中活化Notch3信号传导(参见在实施例7、9、10、11、15中的进一步讨论)。
实施例7：Notch3抗体对TALL-1细胞中Notch3信号传导和体外增殖的影响
TALL-1细胞系在Notch3的NRR结构域中S1580L处具有突变。向Notch3表达构建体引入这个突变导致活化Notch3信号传导。为了进一步表征抑制这个细胞株系中Notch3信号传导的影响，检测Notch靶基因的mRNA水平并且在Notch3抗体存在下监测该细胞的体外增殖。
TALL-1体外增殖测定法
将1x104个TALL-1细胞/孔接种在96孔组织培养板(Corning，目录号3610)的100μl培养基(补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)中。同一天，在1XPBS中制备抗体稀释物，由此每孔添加5μl20X抗体稀释物。将细胞与抗体在37℃/5％CO2温育。在37℃/5％CO2温育0天和9天后，添加100μlCellTiter-Glo试剂(Promega)并将平板在平板摇床上温育10分钟。使用PerkinElmerEnvision平板读数仪测定发光量。IgG对照处理的细胞的CellTiter-Glo发光值用来归一化数据并且计算因Notch3抗体处理所致的增殖抑制百分数。
TALL-1mRNA定量测定法
Deltex1是TALL细胞系中充分表征的Notch信号传导靶基因(Weng等人,2006,GenesDev.20:2096-2109)。将1x104个TALL-1细胞/孔接种在96孔组织培养板(Corning，目录号3610)的100μl培养基(补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)中。同一天，在1XPBS中制备抗体和化合物稀释物，由此每孔添加5μl20X抗体或化合物稀释物。DAPT(Calbiochem，目录号565770)和DMSO(ATCC，目录号4-X-5)是用于这个测定法的化合物。将细胞与抗体或化合物在37℃/5％CO2温育72小时。使用QiagenRNeasy96试剂盒分离RNA。使用TaqMan逆转录试剂(LifeTechnologies)和MJResearchPTC-225热循环仪，制备cDNA。使用TaqMan通用PCRMasterMix(LifeTechnologies)以及针对Deltex1(DTX1)(Hs00269995_m1，LifeTechnologies)和持家基因PP1A(Hs99999904_m1，LifeTechnologies)的基因表达探针，进行TaqMan基因表达测定法。在AppliedBiosystemsABIPrism7900HT快速实时PCR系统上进行TaqMan基因表达测定法。为了定量Deltex1的水平，使用2–ΔΔCt法。计算ΔΔCt涉及将目的样品的Ct值与对照如未处理的样品或DMSO处理样品比较(Schmittgen和Livak(2008)NatureProtocols3:1101-1108)。
总结和讨论
如图11A-B中所示，从针对NRR结构域或EGF32-NRR结构域(20350、20358、20337)的淘选中鉴定的Notch3抗体强力抑制TALL-1细胞中的Deltex1mRNA表达。相反，针对LBD结构域的抗体(20364)不明显抑制Deltex1mRNA。此外，20350、20358、20337以剂量依赖的方式显著抑制TALL-1增殖。在一组其他TALL细胞系(DND41、P12-Ichikawa、SUPT1、SUPT11和RPMI-8402)中测试Notch3抗体时，未检测到对增殖的影响。
实施例8：产生检测γ分泌酶切割形式的Notch3胞内结构域的新表位抗体。
Notch信号传导由一系列的蛋白酶剪切活化。γ分泌酶复合物介导Notch受体的最终切割，最终释放Notch胞内结构域(ICD)，后者转位到胞核以活化Notch靶基因转录。生成新表位抗体以检测仅在(人Notch3)氨基酸Gly1661和Val1662之间切割时γ分泌酶切割形式的Notch3ICD(ICD3)。
产生ICD3兔多克隆抗体
显示了用于免疫的肽和负选择(耗尽肽)。
免疫肽：H2N-VMVARRK(dPEG4)C-酰胺(SEQIDNO:278)
耗尽肽：Ac-VILVLGVMVARRK(dPEG4)C-酰胺(SEQIDNO:279)。使用标准程序在Covance生成兔多克隆抗体。简而言之，使用一个77天方案，用500μg免疫肽和弗氏佐剂进行初次强化免疫。第21日、第42日和第63日用500μg免疫肽进行额外的强化免疫。为了耗尽识别Notch3的VMVARRK(SEQIDNO:243)序列、但不识别γ分泌酶切割后的新表位的非特异性抗体，将耗尽肽用于负选择。使用耗尽肽通过“负向”亲和层析耗尽纯化的样品。利用末端半胱氨酸，将肽与柱偶联以恰当定向所述肽。从样品移除交叉反应性抗体并由ELISA证实。在TALL-1细胞中通过蛋白质印迹法检验来自兔的血清以确定是否检测到特异性条带。
兔多克隆ICD3抗体转化成兔单克隆抗体
为了将兔多克隆抗体转化成兔单克隆抗体，对选择的兔进行免疫肽的终末IV强化免疫。4天后，实施脾切除术并且在Epitomics通过标准程序生成兔杂交瘤。简而言之，全部淋巴细胞均从1个兔脾分离。进行40x96孔平板的融合ELISA筛选和标准ELISA筛选。将全部ELISA阳性杂交瘤扩充至24孔平板并且用免疫肽和耗尽肽再次进行ELISA。在TALL-1细胞中通过蛋白质印迹法分析来自139个阳性杂交瘤的上清液。基于蛋白质印迹筛选ELISA阳性杂交瘤，选出3个杂交瘤(73、128、95)用于亚克隆。为了亚克隆杂交瘤，进行所选择的亲本杂交瘤(0.5个细胞/孔)的有限稀释并且将这些亚克隆铺种于4x96孔平板中。使用免疫肽和耗尽肽，通过ELISA再次筛选亚克隆。将克隆扩充至24孔平板并且在TALL-1细胞中通过蛋白质印迹法筛选来自ELISA阳性亚克隆的上清液。显示了来自3个亚克隆的示例性蛋白质印迹数据。
使用ICD3抗体体外筛选Notch3信号传导抑制作用
使用靶向Notch3ICD的抗体来评估途径活性。细胞系TALL-1购自DSMZ并在补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的生长培养基中常规维持。实验设置：将5百万个TALL-1细胞铺种在25cm2组织培养瓶(Corning，目录号430639)的10mL培养基中。细胞用0.5％DMSO或10μMDAPT(Calbiochem，目录号565770)处理72小时。将TALL-1细胞离心并且随后在PBS中洗涤。在添加N-乙基马来酰亚胺(ThermoScientific，目录号23030)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Pierce，目录号78444)的60μL1X细胞裂解缓冲液(CST，目录号9803)中裂解细胞。使用BCA方法进行蛋白质定量并且在SpectramaxM5微量平板读数仪中读数。在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号NP0006-1)中每孔加载30μL蛋白质样品。
SDS-PAGE：样品在标准条件下在1XNuPageMOPSSDS运行缓冲液(Invitrogen，目录号NP0001)中以180V运行大约90分钟。在转移至硝酸纤维素膜(iBlot，Invitrogen)之前，凝胶浸泡在含20％甲醇的2x转移缓冲液(Invitrogen，目录号NP0006-1)中。在4％乳-TBST中封闭膜1小时；来自杂交瘤上清液的上清液在2％乳-TBST中1:4稀释并且在4℃温育伴以温和振摇。添加在2％乳-TBST中的第二抗体45分钟，之后用TBST进行一系列膜洗涤。使用ECLPlus蛋白质印迹检测系统(GEhealthcare，目录号RPN2232)将膜显色。
用ICD3抗体筛选一组T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞系
细胞系TALL-1(#ACC521)、RPMI8402(#ACC290)、DND41(#ACC525)、SUPT11(#ACC605)和P12-Ichikawa(#ACC34)购自DSMZ并在补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的生长培养基中常规维持。细胞系HPB-ALL和Jurkat细胞从AndreasStrasser(WalterandElizaHallInstituteofMedicalResearch，澳大利亚)商业获得。将5百万个TALL-1细胞铺种在25cm2组织培养瓶(Corning，目录号430639)的10mL培养基中。将细胞离心并且随后在PBS中洗涤。如上文所述裂解细胞并进行蛋白质印迹。来自杂交瘤亚克隆73-8的纯化抗体按1:5000稀释用于其他研究。这种抗体此后称作“ICD3Ab”并且表2中详述其序列。使用来自CellSignaling(#2421)抗体以1:1000稀释评估ICD1蛋白水平。
总结和讨论
如图12A-B中所示，高水平ICD3蛋白仅在TALL-1细胞中检出，但是未在一系列其他T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞系中检出。可以于已知在Notch1中具有活化突变的几个TALL细胞系中检出高ICD1水平，所述TALL细胞系包括HPBALL、RPMI-8402、DND41、P12Ichikawa和Jurkat(Weng等人(2004)Science306:269-71)。ICD3抗体不与ICD1交叉反应，如具有Notch1突变的其他这些TALL细胞系中缺少信号所佐证。
实施例9：体外评估抗体处理时的Notch3信号传导抑制作用
在一系列CCLE细胞系中评价Notch3突变状态导致鉴定到具有NRR突变的TALL-1和具有PEST结构域突变的MDA-MB468。MDA-MB468细胞具有在氨基酸2034处导致引入过早终止密码子的移码突变。因此，ICD3具有改变的分子量，所述改变的分子量可以在蛋白质印迹物上作为迁移更快的条带检出。
WT和MDAMB468PEST结构域的部分的序列：
WTNotch3序列(NP_000426)氨基酸2034-末端
PSGPRSPPGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAAQSGSKKSRRPPGKAGLGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAGAHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATTTGALPAQPLPLSVPSSLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDNO:280)
MDA-MB468序列氨基酸2034末端
PSGPRSPPRSPRPGASALSSRGLPPWPQSGTVGVQEEQEAPREGGAGAAGAPGAGQEADAGLPGPPG.(SEQIDNO:281)
起初，这两个细胞系模型用来表征Notch3抑制性抗体对Notch3信号传导的影响。采用ICD3抗体的蛋白质印迹法用来监测传导抑制作用。实验设置：一百万个MDA-MB468细胞铺种在60mm培养皿(Corning，目录号430196)的3mL培养基中或将5百万个TALL-1细胞铺种在25cm2组织培养瓶(Corning，目录号430639)的10mL培养基中。将平板在37℃温育过夜，之后用10μg/ml终浓度的Notch3抑制剂抗体20337、20350、20358和20802以及IgG对照处理。将抗体直接添加至平板并将它们在37℃，5％CO2进一步温育72小时。此外，将一些细胞用0.5％DMSO或10μMDAPT(Calbiochem，目录号565770)处理72小时。通过以下方式收获细胞：吸出培养基并在1mLPBS(Gibco，目录号20012-027)中漂洗，从平板刮下细胞并在桌面式离心机上离心下来。将悬浮细胞离心并且随后在PBS中洗涤。用纯化的ICD3抗体如先前所描述进行蛋白质印迹法。
此外，对三个其他细胞系表征Notch3抗体处理时的ICD3水平和信号传导抑制作用：-(i)Ishikawaheraklio02_ER在N1597R处具有NRR突变，(ii)A549在2034处具有PEST移码突变，而(iii)TE-11在2260处具有PEST移码突变。
总结和讨论
如图13A-B中所示，除前述的配体驱动的RGA和Notch靶基因mRNA定量外，也可以通过测量ICD3水平监测Notch3信号传导。ICD3水平是Notch3信号传导活性的膜近端读数。用Notch3抗体20337、20350、20358处理TALL-1细胞导致ICD3水平降低。在IgG对照样品和DMSO样品中ICD3的水平是等价的。该数据与这些抗体处理时Deltex1mRNA和TALL-1增殖的抑制作用一致。相反，未检测到12229处理时对ICD3水平的影响。如图13B中所示，在MDA-MB468细胞中，氨基酸2034处的移码突变产生过早终止密码子和更小的ICD3。这种ICD3可以在蛋白质印迹物上作为迁移更快的条带检出。用Notch3NRR抗体20337、20350、20358处理时，检出ICD3水平降低。相反，相对对照IgG，用20802(LBD抗体)处理不改变ICD3水平。如图14A-C中所示，Ishikawaheraklio02_ER、TE-11和A549细胞中Notch3抗体处理时，检测到对ICD3水平的变化的影响。但是在测试的全部细胞系中，20350处理一致地导致显著减少降低的ICD3水平。
实施例10：在Notch3扩增的细胞系中体外评估抗体处理时的Notch3信号传导抑制作用
将HCC1143细胞描述为具有Notch3扩增(Yamaguchi等人(2008)CancerRes.68:1881-1888)。使用ICD3抗体在这个细胞系中检查活化的Notch3信号传导的水平。采用ICD3抗体的蛋白质印迹法用来监测传导抑制作用。
实验设置：将一百万个HCC1143细胞铺种在60mm培养皿(Corning，目录号430196)中的3mL培养基中，所述3mL培养基在25cm2组织培养瓶(Corning，目录号430639)中。将平板在37℃温育过夜，之后用10μg/ml终浓度的Notch3抑制剂抗体20337、20350、20358和20802以及IgG对照处理。将抗体直接添加至平板并将它们在37℃，5％CO2进一步温育72小时。如先前所描述收获细胞和进行蛋白质印迹。
总结和讨论
如图15中所示，HCC1143细胞具有Notch3扩增并且显示高水平的ICD3。全部Notch3抗体处理均导致降低的ICD3水平。在10μg/ml，20350处理导致最大的ICD3水平降低。
实施例11:体内PD评估
在Notch3中携带遗传畸变的三种异种移植模型中研究PD调节作用：NRR突变体TALL-1人白血病模型、PEST突变体MDA-MB-468人乳腺模型、和Notch3扩增的HLUX1823患者衍生的肺模型。
TALL-1人白血病异种移植模型中的体内PD
将携带TALL-1异种移植物的雌性SCID-beige小鼠用单剂量Notch3抗体处理。将小鼠用10x106个细胞接种，所述细胞在Hank平衡盐溶液的悬液中皮下注射。一旦肿瘤达到300至500mm3(n＝3个/组)，则将小鼠随机分配以接受单次静脉内20mg/kg剂量的3207(IgG对照)、20350、20358或20802。处理后，在选择的时间点收获肿瘤并且通过蛋白质印迹法和IHC评价ICD3，如下文描述。
MDA-MB-468人乳腺癌异种移植模型中的体内PD
将携带MDA-MB-468异种移植物的雌性SCID-beige小鼠用单剂量Notch3抗体处理。3x3x3mm3肿瘤小块从携待MDA-MB-468肿瘤的小鼠(供体)传代并在左侧和右侧皮下植入SCID-beige受体小鼠。一旦肿瘤达到300至500mm3(n＝3个/组)，则将小鼠随机分配至未处理的对照组或接受单次静脉内20mg/kg剂量的20350。在额外的研究中，相对于PBS或3207非靶向性IgG对照，评估单次静脉内20mg/kg剂量的20350、20358、20337和20802的影响。多种处理之后，收获肿瘤并且通过蛋白质印迹法评价ICD3，如下文描述。
HLUX1823患者衍生的肺癌异种移植模型中的体内PD
还在Notch3扩增的患者衍生的原发性肺癌肿瘤异种移植模型HLUX-1823中评价抗Notch3抗体的活性。在这些研究中，对nu/nu小鼠皮下植入DMEM中含有3x3x3mm3肿瘤小块的50％无苯酚基质胶(matrigel)(BDBiosciences)并且在植入后30日时达到大约250mm3。一旦肿瘤达到300至500mm3(n＝3个/组)，则将小鼠随机分配以接受PBS或单次20mg/kg静脉内剂量的3207非靶向性IgG对照抗体、或20358或12229(衍生20364和20802的亲本抗体)。多种处理之后，收获肿瘤并且通过蛋白质印迹法评价ICD3，如下文描述。
肿瘤细胞裂解物的制备和ICD3蛋白质印迹
使用组织裂解仪II(Qiagen)在30Hz，将肿瘤样品在具有无EDTA完全蛋白酶抑制剂混合物微型片剂(Roche，目录号04693159001)的200-400μLT-PER组织蛋白质提取试剂(Pierce，目录号78510)中裂解1分钟。每个管中放置一粒5mm不锈钢珠(Qiagen，目录号69965)以帮助裂解组织。取出钢珠后，随后将样品在桌面式离心机上在4℃以最高速度离心15分钟。将上清液收集并且贮存在-80℃用于稍后时间的研究，或使用BCA方法(Pierce，目录号232550)评估蛋白质浓度，并且如先前所描述进行ICD3的蛋白质印迹法。根据需要，还用全长Notch3抗体进行蛋白质印迹以检测Notch3总水平(CellSignaling#2889，1:1000稀释度)。
通过IHC检测ICD3水平
在10％福尔马林中固定异种移植肿瘤并包埋在石蜡中。将5μm切片置于带电荷聚赖氨酸包被的载玻片上。在自动化系统DiscoveryULTRA(VentanaMedicalSystem)上优化免疫组织化学方案。
切片在60℃烘烤8分钟，随后脱石蜡。在细胞条件化1(CC1，基于TRIS的具有略碱性pH的缓冲液)中在高温持续76分钟实现抗原修复。使用特定的抗体封闭剂(目录号760-4204)实施抗体非特异性结合作用的封闭。将第一抗体Notch3ICD(20μg/ml)在37℃温育60分钟，接着在第二抗体中温育32分钟。使用特定的DiscoveryAmplificationHQ试剂盒#760-052(VentanaMedicalSystems)，按照制造商的说明，实施扩增步骤。用二氨基联苯胺(DAB)实现检测并用苏木精复染。全部这些步骤均在VentanaDiscoveryULTRA(VentanaMedicalSystems)上进行。
总结和讨论
图16-18显示在几种异种移植模型中的体内PD研究。如本申请中较早所述那样，用Notch3抗体体外处理TALL-1细胞导致抑制信号传导，如通过Deltex1mRNA水平和ICD3蛋白水平所评估。生长TALL-1细胞作为异种移植物并且将小鼠用Notch3抗体处理。通过用蛋白质印迹法或IHC评估ICD3水平，监测TALL-1肿瘤中Notch3信号传导的变化。用抗体20350或20358处理导致ICD3水平降低，如图16A-B中所示。IHC对ICD3染色由肿瘤切片中的黑色/深灰色细胞指示，如图16B中所示。在最后施用Notch3抗体之后，评估肿瘤中的ICD3水平72小时，并且肿瘤内部仍然存在一些显示强烈ICD3表达的细胞。在MDA-MB468模型中，如通过蛋白质印迹所评估，相对于未处理的对照小鼠，施用抗体后24小时和72小时，用20350处理的动物产生明显的ICD3减少(图17A)。发现在72小时时间点，相对于PBS和3207(IgG)对照，所有靶向Notch3NRR的20350、20358和20337引起ICD3水平降低。与之相反，用靶向NRR外部的Notch3区域的20802处理后，ICD3水平显得与对照水平相似(图17B)。在HLUX1823Notch3-基因扩增的模型中，如通过蛋白质印迹所评估，相对于对照小鼠，用20358或12229处理的动物在施用抗体后72小时产生明显的ICD3减少(图18)。综上，这些数据显示Notch3NRR抗体可以在存在Notch3基因扩增或NRR结构域或PEST结构域中的突变的情况下抑制Notch3信号传导，而在这个区域外部产生的Notch3抗体仅可以在基因扩增存在下抑制Notch3信号传导并且在突变存在下具有更有限的活性。
实施例12：TALL-1异种移植中的体内功效
产生具有萤光素酶组成型表达的TALL-1细胞系
用pMMP-LucNeo逆转录病毒转导TALL-1细胞系(参见US7399851)并且在1mg/mL遗传霉素(G418)下接受几周选择。与不存在萤光素酶的TALL-1细胞相比，TALL-1_Luc细胞表达高水平的萤光素酶。对野生型和萤光素酶细胞用Notch3抗体抑制剂进行增殖实验，显示相同的结果；表明感染不干扰TALL-1对Notch3抑制的敏感性。
在TALL-1细胞系异种移植模型中评估Notch3抗体的体内活性
将小鼠用10x106个TALL-1_Luc细胞接种，所述细胞在Hank平衡盐溶液的悬液中皮下注射，并且使用Xenogen体内成像系统(CaliperLifeSciences)监测肿瘤的存在。在第7日可检出肿瘤的存在。在第11日，将携瘤动物随机分配以接受PBS或20mg/kg的3207阴性对照IgG抗体或Notch3抗体20337、20350、20358或20802作为单一药物每周2次静脉内给药。使用Xenogen体内成像系统监测肿瘤尺寸。
总结和讨论
如图19中所示，20358和20350显示出这项研究中评价的抗体的最大抗肿瘤活性。图19A显示在研究时程范围内各种处理之后获得的发光信号的图示，并且图19B显示对照组在第29日(因肿瘤尺寸而可能成像的最后时间点)和抗Notch3抗体处理组在第43日的发光信号。
实施例13：用Biacore对NRRNotch3抗体的表位分拣
通过Biacore进行表位分拣以将Notch3抗体(IgG或Fab片段)划分成相同的表位或显著重叠的表位的组，即能够抑制彼此结合作用的抗体。
用Biacore实验设置表位分拣
对于Biacore中的表位分拣，使用具有低密度固定化或捕获抗原的传感芯片(与动力学实验是可比较的)。与KD测定相同的样品前提适用(即单体含量)。涉及芯片制备(抗原固定/捕获)的实验条件以及再生条件与Biacore中的KD测定相同。为了实现表位的饱和，每种抗体仅使用一种(高)浓度(例如250nM持续90秒)。
抗体样品按全因素分析设计配对注射，例如对于两份抗体样品A和B，要求以下配对注射：A-A、A-B、B-A、B-B。
传感芯片必须通过第一注射用抗体饱和，从而第二抗体仅能够在不同表位的情况下结合。已结合抗体的完全再生必须在每个双重注射后进行。
为了评价对照，即双重注射相同抗体(A-A、B-B)，在每一注射结束时评价它们的结合水平：第二注射预计不产生额外的结合作用。为了一致性，比较双重注射不同的抗体样品对，例如如果注射A-B导致额外的B结合作用(不同表位)，则注射B-A预计也导致额外的A结合作用。产生这类不一致性的可能原因例如是部分重叠的表位，或KD的巨大差异。
总结和讨论：
编纂了总结全部配对抗体注射评价结果的图20，显示它们的相互抑制状态，从所述相互抑制状态可以得出表位基团或分拣区(bins)的结论。基于这些研究，确定从自噬菌体展示筛选鉴定的NRR抗体具有不同的构象表位。如图20中所示，当首先添加20345，接着添加20350或20351时，未检测到额外结合作用。实验中获得与首先添加何种抗体无关的相似信息。因此，20345、20350和20351具有重叠表位，所述重叠表位在表中以深灰色阴影指出。这个表位定义为NRR_B。当首先添加20337时，可以随着添加以下任何抗体检测到与Biacore的额外结合作用：20345、20350、20351、20358和A4。如果逆转添加两种抗体的顺序，则得出相同的结论。因此，20337具有与所测试的任何其他抗体不同的表位并且称为表位NRR_A。当首先添加20358时，用20337、20345、20350和20351检测到额外结合。如果逆转添加两种抗体的顺序，则得出相同的结论。因此，20358具有与这些其他测试抗体不同的表位并且称为表位NRR_C。与之相反，当首先添加20358并且接着添加A4时，存在最小的额外结合作用(参见汇总表中具有浅灰色阴影的细胞)。在额外的Biacore研究中进一步证实了这个结果。在这些实验中，将A4或20358固定至适宜的传感芯片上，使Notch3NRR(SEQID:282)流过该表面，并且评价未固定至传感器表面的其他抗体与Notch3NRR结合的能力。在这些分析条件下，发现20358可以与结合至固定化A4的Notch3结合并且A4还可以与结合至传感器表面上的固定化20358的Notch3结合。该数据与所进行的其他研究完全一致并且与以下结论完全一致：A4和20358与Notch3NRR内部的不同表位结合。另外，当首先添加A4时，在接着添加以下抗体：20337、20345、20350、20351时检测到额外的结合作用。如果逆转添加两种抗体的顺序，则得出相同的结论。因此，A4具有与20337、20345、20350、20351不同的表位并且称为表位NRR_D。
实施例14：采用20350和NRR以及20358和NRR的共晶体结构研究
测定了与20350或20358的Fab片段结合的人Notch3负向调节区(NRR，SEQIDNO:282)的两种晶体结构。如下文详述，将Notch3NRR表达、纯化并与20350或20358Fab混合以形成复合物。蛋白质结晶学用来产生分别与20350或20358Fab结合的Notch3NRR的原子解析数据，以定义它们的表位(为距抗体残基在距离范围内的Notch3NRR残基)。
蛋白质产生
下文显示经产生用于结晶学的Notch3NRR、20350Fab和20358Fab的序列。Notch3NRR的构建体包含人Notch3(UniProt识别码Q9UM47，SEQIDNO:1)的残基1378至1640(加下划线)，连同来自重组表达载体的N末端和C末端残基(以小写字母显示，SEQIDNO:282)。来自小鼠IgGκ轻链的N末端信号序列用于分泌型表达并在表达期间切除，留下Notch3NRR的完整N末端。对于20350和20358Fab，显示重链和轻链的序列(SEQIDNO:–6283、284、285和286)。
用于晶体结构测定的蛋白质
构建体：
人Notch3NRR(Q9UM47)
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQC EALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQ GCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRL DAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSA ADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDVASGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEEPGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVAPAMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHFANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAAQSGSKKSRRPPGKAGLGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAGAHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATTTGALPAQPLPLSVPSSLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDNO:1)
Notch3NRR
metdtlllwvlllwvpgstgAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSgshhhhhh(SEQIDNO:282)
20350Fab重链
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISWVRQAPGQGLEWMGWIKPRWGAAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSFWFGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH(SEQIDNO:283)
20350Fab轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASKLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLQYPMTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:284)
20358Fab重链
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRTYAMHWVRQAPGQGLEWMGGIVPYHGITDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYSTYAFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH(SEQIDNO:285)
20358Fab轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIASYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYKTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:286)
Notch3NRR的产生
Notch3NRR在HEK293SGnTI-细胞(ATCC)中表达为分泌型蛋白。1mgNotch3NRR构建体DNA稀释于50mlOptiMEMI培养基(LifeTechnologies)中，并且与50ml相同培养基中的2.5mgPEI(Polysciences)温育30分钟。随后将混合物加入1LHEK293SGnTI-细胞，所述细胞以悬浮方式在FreeStyleTM293表达培养基(LifeTechnoligies)中以一百万个细胞/ml在37℃、8％CO2生长用于转染。在72小时后，通过离心收获含有Notch3NRR的培养基。将3mlNi-NTASuperflow树脂(Qiagen)加入培养基中并在4℃连续搅拌过夜。次日，将树脂装填至重力柱中并用50mMHepespH7.4，500mMNaCl，20mM咪唑洗涤。将靶蛋白用相同缓冲液外加300mM咪唑洗脱并在4℃在20mMHepespH7.4，150mMNaCl，10mMCaCl2中透析过夜。随后将蛋白质浓缩至1mg/ml并在50mMTrispH8.0，10mMCaCl2(缓冲液A)中稀释3倍。将稀释的蛋白质加载于HiTrapQHP柱(GEHealthcare)上，所述柱在缓冲液A外加4％50mMTrispH8.0，1MCaCl2和10mMCaCl2(缓冲液B)中平衡。通过缓冲液A加2％-100％缓冲液B的梯度洗脱Q柱。收集含有Notch3NRR的主峰并在4℃用30单位/mg靶蛋白的弗林蛋白酶(NEB)处理过夜。随后浓缩弗林蛋白酶处理的蛋白质并且加载于20mMHepespH7,4，150mMNaCl中平衡的Superdex7510/300GL(GEHealthcare)上。将峰级分通过SDS-PAGE和LCMS分析，并且合并以与Fab复合。
20350Fab和20358Fab的产生
以一百万个细胞/ml生长的1LHEK293F细胞(LifeTechnologies)用1mg含有全长IgG20350(或20358)的DNA构建体转染三天。根据制造商的方案，通过ProSep–vA高容量色谱介质树脂(Millipore)从培养基纯化全长IgG。纯化的IgG随后由固定化的木瓜蛋白酶(Pierce)消化以产生Fab片段。具体而言，按20mg/ml在20mM磷酸钠pH7.0和10mMEDTA中的IgG与固定化木瓜蛋白酶以重量比80:1混合。将混合物在37℃在15ml管中转动过夜。次日，通过重力流柱移除固定化木瓜蛋白酶；收集含有Fab区段和Fc区段的流通液并加载于HiTrapMabSelectSURE柱(GEHealthcare)上以移除Fc区段。浓缩来自这个步骤的仅含有Fab片段的流通液并加载于20mMHepespH7.4，150mMNaCl中平衡的HiLoad16/60Superdex75(GEHealthcare)上。将峰级分通过SDS-PAGE和LCMS分析，随后合并以与Notch3NRR形成复合物。
结晶和结构测定
以相同方式制备Notch3NRR/20350复合物或Notch3NRR/20358复合物。纯化的Notch3NRR与Fab以2:1摩尔比混合(通过LCUV测量浓度)。将Notch3NRR/Fab复合物在冰上温育30分钟，并加载于20mMHepespH7.5、150mMNaCl中平衡的HiLoad16/60Superdex75(GEHealthcare)上。通过SDS-PAGE和LCMS分析峰级分。对于Notch3NRR/20350复合物，将含有Notch3NRR/Fab复合物的级分浓缩至约25mg/ml，或对于Notch3NRR/20358复合物，浓缩至18mg/ml。立即离心Notch3NRR/Fab复合物并筛选结晶。
通过坐滴蒸气扩散技术生长晶体。具体而言，对于NRR/20350复合物，将0.1μl复合物与含有0.1MNaAcpH5.6、17.5％PEG3000的0.1μl储器溶液混合；并且将液滴在20℃针对45μl储器溶液平衡。
对于NRR/20358复合物，使用0.1MHepespH7.5，10％PEG8000、10％乙二醇；并且将液滴在20℃针对45μl储器溶液平衡。
在收集数据之前，对于Notch3NRR/20350复合物，将Notch3NRR/Fab晶体转移至含有额外22.5％甘油的储器溶液；或对于Notch3NRR/20358复合物，转移至含有额外20％乙二醇的储器溶液，之后在液氮中快速冷却。
在高级光子源(阿尔贡国家实验室，美国)以光束线17-ID采集衍射数据。处理数据并使用HKL2000(HKLResearch)作图。Notch3NRR/20350复合物的数据在空间群C2中处理至晶胞大小如下： α＝90°，β＝113.17°，γ＝90°。Notch3NRR/20358复合物的数据在空间群P212121中处理至晶胞大小如下： α＝90°，β＝90°，γ＝90°。采用与20350或20358Fab具有最高序列同一性的Notch1NRR结构(PDBID：3ETO)和自有Fab结构物作为检索模型，使用Phaser(McCoy等人,(2007)J.Appl.Cryst.40:658-674)，通过分子置换法解析Notch3NRR/Fab复合物的结构。最终模型以COOT(Emsley和Cowtan(2004)ActaCryst.60:2126-2132)建立并且用Buster(GlobalPhasing,LTD)修正。对于Notch3NRR/20350复合物，Rwork值和Rfree值分别是23.0％和26.9％；并且键长和键角的rmsd值分别是和1.17°。对于Notch3NRR/20358复合物，Rwork值和Rfree值分别是19.2％和22.6％；并且键长和键角的rmsd值分别是和1.13°。
含有在20350或20358Fab中任何原子的范围内原子的Notch3NRR残基通过PyMOL(LL)鉴定并且在表4和5中列出。由AREAIMOL从CCP4程序包计算Notch3NRR和Fab之间的埋藏表面积(Winn等人,(2011)Acta.Cryst.D67:235-242)。
Notch3NRR的结构
在Notch3NRR/20350复合物和Notch3NRR/20358复合物之间Notch3NRR的结构非常相似。叠加来自两种复合物的Notch3NRR的均方根距离(RMSD)是显示几乎相同的NRR结构。因此，使用Notch3NRR/20358复合物作为进一步分析结构的代表。
Notch3NRR具有与Notch1(Gordan等人,(2009)Blood113:4381-4390；Gordon等人,(2009)4:e6613；Wu等人,(2010)Nature464:1052-1057)和Notch2(Gordon等人,(2007)NatStructMolBiol14:295-300)相似的总体折叠。它包含三个Lin12/Notch重复序列(LNR)(即LNR-A、LNR-B和LNR-C)；和由弗林蛋白酶切割作用在S1位点(在R1571和E1572之间)处分裂成N端部分(HD-N)和C端部分(HD-C)的异二聚化(HD)结构域。
NRR结构域调节Notch受体的活化，这涉及三个蛋白酶解步骤。在Notch前体的成熟期间，弗林蛋白酶样转化酶在NRR内部的S1位点处切割，以引发活化。ADAM蛋白酶在也处于NRR内部的S2位点处切割，以产生γ分泌酶在S3位点处进行膜内蛋白酶解的底物。在S3切割之后，Notch的胞内部分进入胞核以活化转录。S2切割是这种活化系列反应的关键步骤并且受NRR结构域负向调节。这种所谓自我抑制的机制可以由NRR结构解释。
图21显示Notch3NRR的总体X射线结构。标记出了1)蛋白质的N端和C端；2)三个LNR重复序列和配位Ca2+离子；3)L1419，自抑制性塞；4)S1和S2位点；5)HD结构域内部的二级结构；和6)Notch3中与Notch1和Notch2相比构象显著不同的两个区域(LNR-B/C接头以及LNR-C的前半部分，和HD结构域中的β4-α3环)。
如Notch3NRR结构中那样，各自配位一个Ca2+离子的三个LNR缠绕在HD周围以保护S2位点免遭ADAM蛋白酶接近。值得注意地，来自LNR-A/B接头的保守L1419直接塞入S2位点中并且在空间上堵塞它，使之免遭蛋白酶接近。LNR和HD之间相互作用以及这些结构域内部那些相互作用的稳定性对维持NRR的自我抑制型构象至关重要。因此，去稳定NRR的突变，如相关癌症中发现的那些突变，能增强Notch3的活化。另一方面，能稳定LNR-HD相互作用的试剂如抗体能潜在地抑制Notch3信号传导。
图22显示Notch1、Notch2和Notch3NRR的序列比对结果。标出了1)结构域名称和界限；2)二级结构；3)相对于Notch1和Notch2具有独特结构区域的Notch3；和4)S1和S2位点。Notch3NRR与Notch1NRR(PDBID：3I08)和Notch2NRR(PDBID：2OO4)的结构叠加产生和的RMSD值，表明总体折叠相似。然而，Notch3NRR的一些部分具有显著不同的构象(RMSD值>)，主要地在两个区域中如此，即LNR-B/C接头和LNR-C的前半部分(R1463–A1476)和HD结构域中的β4-α3环(C1591-D1598)。有趣地，这两个独特区域的大部分被20350和20358抗体捕获。在下一个部分描述详细的相互作用。
20350和20358的Notch3表位
20350表位
Notch3NRR/20350Fab复合物的晶体结构用来鉴定20350的Notch3表位。Notch3NRR上与20350Fab的相互作用表面由几个不连续(即非连续)序列形成：即残基1427-1429、1442、1444、1445、1447-1450、1453、1458、1461、1462、1464、1507、1508、1510、1592、1594–1599、1602和1606，如表4中详述。这些残基形成由20350Fab识别的三维表面，如图23中所示。有趣地，与Notch1和Notch2相比，HD结构域中的β4-α3环具有独特结构，并且这个区段的大部分处于20350表位内部。另外，这个环在Notch3NRR/20358复合物中大多是非结构化的(因灵活性所致无电子密度)，但是在这个20350复合物中因与Fab直接结合而稳定化和结构化。
表4：人Notch3NRR和20350之间的相互作用。Notch3残基基于UniProtIDQ9UM47(SEQIDNO:1)编号，并且划分成结构域。Fab重链残基和轻链残基分别基于其线性氨基酸序列SEQIDNO:283和SEQIDNO:284编号。显示的Notch3残基在20350Fab中原子范围内具有至少一个原子，以解释潜在的水介导的相互作用。
20350Fab跨越Notch3NRR的LNR(主要在LNR-B周围)和HD结构域(主要在β4-α3环周围)结合。20350Fab和LNR之间的埋藏表面积是并且20350Fab和HD结构域之间的埋藏表面积是该Fab的这种排布提示20350能将LNR和HD结构域夹在一起，稳定Notch3NRR的自我抑制构象并抑制Notch3活化。
20358表位
Notch3NRR/20358Fab复合物的晶体结构用来鉴定20358的Notch3表位。Notch3NRR上与20358Fab的相互作用表面由几个不连续(即非连续)序列形成：即残基1440、1463、1465-1472、1474、1486、1487、1534、1618、1619和1621，如表5中详述。这些残基形成由20350Fab识别的三维表面，如图24中所示。有趣地，与Notch1和Notch2相比，前半部分LNR-C中的LNR-B/C接头具有独特结构，并且这个区段的大部分处于20358表位内部。
表5：人Notch3NRR和20358之间的相互作用。Notch3残基基于UniProtIDQ9UM47(SEQIDNO:1)编号，并且划分成结构域。Fab重链残基和轻链残基分别基于其线性氨基酸序列SEQIDNO:4285和SEQIDNO:5286编号。显示的Notch3残基在20358Fab中原子范围内具有至少一个原子，以解释潜在的水介导的相互作用。
20358Fab跨越Notch3NRR的LNR(主要在LNR-B/C接头和LNR-C周围)和HD结构域(主要在α3-β5环周围)结合。20358Fab和LNR之间的埋藏表面积是并且20358Fab和HD结构域之间的埋藏表面积是该Fab的这种排布提示20358能将LNR和HD结构域夹在一起，稳定Notch3NRR的自我抑制构象并抑制Notch3活化。
20350和20358表位不重叠
为了确定20350和20358的表位是否重叠，将Notch3NRR/20350复合物和Notch3NRR/20358复合物的晶体结构在Notch3NRR上叠加，如图25中所示。这张图清晰地表明20350和20358与Notch3NRR内部不重叠的不同分立构象表位结合。实际上，它们在甚至最接近的区域(与20350形成的E1464-R54氢键和与20358形成的R1463-D100盐桥)中充分分离。这表明两种抗体可以同时结合Notch3NRR，这与下述分拣实验符合，所述分拣实验显示这些抗体处于不同的bin中并且彼此不竞争结合Notch3(参见图20)。
比较20350、20358、256A-13，256A-4和256A-8之间的表位
将20350和20358的表位与256A-13(此后称作“A13”)(US2008/0118520A1)的表位比较；并且与256A-4(此后称作“A4”)和256A-8(此后称作“A8”)(US7935791B2)的表位比较。对于A13，其表位包含LNR-A结构域中的D1402、R1403和E1404，它们完全位于20350和20358的表位外部。
对于A4和A8，由于已经将它们定位到Notch3上的相同表位(US7,935,791B2)，仅A4表位将用于比较。
如图26中所示，20350的表位完全位于A4的表位外部；并且20358的表位具有三个可能(但高度可能不)重叠的残基(Glu1618、Arg1619和Asp1621)，原因如下：1)通过X射线结晶学测定20358的表位至单原子分辨率，并且因此通过诱变确定单个残基(同时，另一方面A4的表位)至三到八个氨基酸残基延伸的有限分辨率。没有实施进一步定义A4实际表位或确定它是否为线性或构象表位的精细表位作图。这意味着只要在这种3-8个氨基酸延伸内部存在一个与A4接触的残基，则将该延伸的其余部分定义为表位，即便对它没有精细地进行表位作图。因此，关于这三个氨基酸是否实际上构成A4表位，仍存在高度的不确定性。2)在实施例13中详述的表位分拣和结合实验显示，20358和A4彼此不竞争结合Notch3NRR并且二者可以同时与Notch3NRR结合。仅当这两个抗体没有重叠表位时才可以实现这种情况。因此，认为20358和A4的表位不重叠。
绘制在Notch3NRR结构上的癌突变
为了在机理上额外深入了解Notch3的NRR，将癌突变绘图到Notch3NRR结构上。结构性分析表明，这些突变中的一些突变破坏结构域内或结构域间相互作用、去稳定Notch3NRR的自我抑制性构象并造成Notch3活化和信号转导。
同时，这些突变与20350表位和20358表位的比较显示它们大部分不在所述表位内部，表明20350和20358可以结合至处于自我抑制型构象的野生型和突变体Notch3NRR以抑制Notch3信号转导。
表7：显示基于结构的Notch3突变解释
组1(S1580L、R1510H、D1587N、Y1624H、R1589Q)
这个组中的突变在HD结构域内部失去氢键并且因此造成去稳定化。
来自这个组的代表是S1580L。它在细胞测定法(图13a)中活化Notch3信号传导并且是TALL-1的驱动力。在结构中，(HD-N中的)S1580的侧链氧与(HD-C中的)主链氮的P1521形成氢键。S1580L突变能丧失这个氢键并去稳定化HD结构域。考虑到S1580接近于S2位点(约)，这种去稳定化可以使得ADAM蛋白酶更可接近S2位点并且因此增强Notch3的活化。
类似地，HD-N中的R1510H突变能丧失与HD-C中D1603形成氢键，D1587N、R1589Q突变能丧失最初在这两个残基之间存在的盐桥，并且HD-N中的Y1624H突变能丧失与HD-C中的S1527和D1530形成氢键。全部这些突变均能去稳定HD结构域并且潜在地活化Notch3信号传导。
组2(G1487D、A1476T、A1608T、L1518M、A1537T)
这个组中的突变能影响结构域内部的结构完整性或造成与周围残基的冲突，因此去稳定化Notch3NRR。
来自这个组的代表是G1487D。它在细胞测定法中活化Notch3信号传导。G1487毗邻于LNR-C的C1475-C1488二硫键，该二硫键对这个结构域内部的结构完整性和Ca2+配位至关重要。G1487D突变可以干扰这个二硫键的正确定位并去稳定化LNR-C结构域。
L1518位于毗邻S2位点的疏水性口袋内，该疏水性口袋由R1627、Y1558、和I1578的侧链形成。L1518M突变能与这个疏水性口袋冲突并且因此去稳定化S2位点。
HD-N中的A1537仅与LNR-C中的E1492相距A1537T突变能与E1492冲突并去稳定化LNR-HD相互作用。
组3(N1597K、L1547V、R1526C)
这个组中的突变处于Notch3NRR的表面上。N1597K在细胞测定法中活化Notch3信号传导(图14a)，表明这些表面突变可能通过非NRR去稳定化的机制(例如干扰蛋白质-蛋白质相互作用事件)发挥作用。
癌突变与表位
癌突变与20350表位
这些癌突变位于20350表位的主要部分内部或外部，表明20350仍能与野生型和突变体Notch3NRR结合。
该表位内部的两个癌突变是R1510H和N1597K。例如，R1510H可能削弱20350与Notch3NRR的结合，因为这种突变能丧失与轻链的几种相互作用，包括与D50形成盐桥和与N31形成氢键。
癌突变与20358表位
除G1487D之外的全部癌突变均位于20358表位范围外部，表明20358仍能与野生型和突变体Notch3NRR结合。
G1487D可能削弱20358与Notch3NRR的结合，因为这个突变可以与Y1471(Notch3)和H55(20358重链)之间的氢键抵触并破坏它。
实施例15：人Notch3NRR/20350、人Notch3NRR/20358和人Notch3NRR/20337复合物的HDx-MS表位作图
氘交换质谱法(HDx-MS)测量蛋白质的酰胺主链上的氘摄取量；这些量值对酰胺的溶剂可及性和主链酰胺的氢键网络的变化敏感。HDx-MS经常用来比较处于两个不同状态(如结合apo和结合配体)的蛋白质并且与胃蛋白酶快速消化法联用。在这类实验中，可以定位显示两个不同状态之间差异性氘摄取量的区域，其一般具有10至15个氨基酸。复合物中受到保护的区域直接参与配体结合或以变构方式受配体的结合影响。
在这些实验中，在三种IgG抗体：20350(SEQIDNO:287)、20358(SEQIDNO:288)和20337(SEQIDNO:289)不存在和存在的情况下，用钙测量Notch3NRR蛋白(SEQIDNO:282)的氘摄取量。Notch3NRR中当抗体结合时显示氘摄取量下降的区域可能参与表位；然而，归因于测量的性质，还可能检测远离直接结合位点的变化(变构效应)。为了阐明来自变构效应的直接结合事件，还实施正交测量(例如前述实施例中显示的X射线结晶学)。
HDx-MS实验中所用的蛋白质：
Notch3NRR
metdtlllwvlllwvpgstgAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSgshhhhhh(SEQIDNO:282)
20350IgG
MGLGARGRRRRRRLMALPPPPPPMRALPLLLLLAGLGAAAPPCLDGSPCANGGRCTHQQPSLEAACLCLPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCLRGFQGPDCSQPDPCVSRPCVHGAPCSVGPDGRFACACPPGYQGQSCQSDIDECRSGTTCRHGGTCLNTPGSFRCQCPLGYTGLLCENPVVPCAPSPCRNGGTCRQSSDVTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNLLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVSGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSMCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGIRCESQVDECRSQPCRYGGKCLDLVDKYLCRCPPGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFHCLCPPGSLPPLCLPANHPCAHKPCSHGVCHDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLAPDACESQPCQAGGTCTSDGIGFRCTCAPGFQGHQCEVLSPCTPSLCEHGGHCESDPDRLTVCSCPPGWQGPRCQQDVDECAGASPCGPHGTCTNLPGNFRCICHRGYTGPFCDQDIDDCDPNPCLHGGSCQDGVGSFSCSCLDGFAGPRCARDVDECLSSPCGPGTCTDHVASFTCACPPGYGGFHCEIDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVSSFSCLCRPGYTGTHCQYEADPCFSRPCLHGGICNPTHPGFECTCREGFTGSQCQNPVDWCSQAPCQNGGRCVQTGAYCICPPGWSGRLCDIQSLPCTEAAAQMGVRLEQLCQEGGKCIDKGRSHYCVCPEGRTGSHCEHEVDPCTAQPCQHGGTCRGYMGGYVCECPAGYAGDSCEDNIDECASQPCQNGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCDLGPSLDSGVQCLHNGTCVDLVGGFRCNCPPGYTGLHCEADINECRPGACHAAHTRDCLQDPGGHFRCVCHPGFTGPRCQIALSPCESQPCQHGGQCRHSLGRGGGLTFTCHCVPPFWGLRCERVARSCRELQCPVGIPCQQTARGPRCACPPGLSGPSCRVSRASPSGATNASCASAPCLHGGSCLPVQSVPFFRCVCAPGWGGPRCETPSAAPEVPEEPRCPRAACQAKRGDQNCDRECNTPGCGWDGGDCSLNVDDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCYSGGRDRTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDARGQAMVFPYHRPSPGSESRVRRELGPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSAENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEAPEQSVPLLPLLVAGAVFLLIIFILGVMVARRKREHSTLWFPEGFALHKDIAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVVTDLNDSECPEAKRLKVEEPGMGAEEPEDCRQWTQHHLVAADIRVAPATALTPPQGDADADGVDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPAEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHLANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPSGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAVQSGTKKSRRPPGKTGLGPQGTRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFSGPPASPGGFPLEGPYATTATAVSLAQLGASRAGPLGRQPPGGCVLSFGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGAPVSPQERPPPYLAAPGHGEEYPAAGTRSSPTKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSDSTPSPATATNATASGALPAQPHPISVPSLPQSQTQLGPQPEVTPKRQVMA(SEQIDNO:287)
20358IgG
MGLGARGRRRRRRLMALPPPPPPMRALPLLLLLAGLGAAAPPCLDGSPCANGGRCTHQQPSLEAACLCLPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCLRGFQGPDCSQPDPCVSRPCVHGAPCSVGPDGRFACACPPGYQGQSCQSDIDECRSGTTCRHGGTCLNTPGSFRCQCPLGYTGLLCENPVVPCAPSPCRNGGTCRQSSDVTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNLLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVSGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSMCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGIRCESQVDECRSQPCRYGGKCLDLVDKYLCRCPPGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFHCLCPPGSLPPLCLPANHPCAHKPCSHGVCHDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLAPDACESQPCQAGGTCTSDGIGFRCTCAPGFQGHQCEVLSPCTPSLCEHGGHCESDPDRLTVCSCPPGWQGPRCQQDVDECAGASPCGPHGTCTNLPGNFRCICHRGYTGPFCDQDIDDCDPNPCLHGGSCQDGVGSFSCSCLDGFAGPRCARDVDECLSSPCGPGTCTDHVASFTCACPPGYGGFHCEIDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVSSFSCLCRPGYTGTHCQYEADPCFSRPCLHGGICNPTHPGFECTCREGFTGSQCQNPVDWCSQAPCQNGGRCVQTGAYCICPPGWSGRLCDIQSLPCTEAAAQMGVRLEQLCQEGGKCIDKGRSHYCVCPEGRTGSHCEHEVDPCTAQPCQHGGTCRGYMGGYVCECPAGYAGDSCEDNIDECASQPCQNGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCDLGPSLDSGVQCLHNGTCVDLVGGFRCNCPPGYTGLHCEADINECRPGACHAAHTRDCLQDPGGHFRCVCHPGFTGPRCQIALSPCESQPCQHGGQCRHSLGRGGGLTFTCHCVPPFWGLRCERVARSCRELQCPVGIPCQQTARGPRCACPPGLSGPSCRVSRASPSGATNASCASAPCLHGGSCLPVQSVPFFRCVCAPGWGGPRCETPSAAPEVPEEPRCPRAACQAKRGDQNCDRECNTPGCGWDGGDCSLNVDDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCYSGGRDRTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDARGQAMVFPYHRPSPGSESRVRRELGPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSAENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEAPEQSVPLLPLLVAGAVFLLIIFILGVMVARRKREHSTLWFPEGFALHKDIAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVVTDLNDSECPEAKRLKVEEPGMGAEEPEDCRQWTQHHLVAADIRVAPATALTPPQGDADADGVDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPAEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHLANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPSGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAVQSGTKKSRRPPGKTGLGPQGTRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFSGPPASPGGFPLEGPYATTATAVSLAQLGASRAGPLGRQPPGGCVLSFGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGAPVSPQERPPPYLAAPGHGEEYPAAGTRSSPTKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSDSTPSPATATNATASGALPAQPHPISVPSLPQSQTQLGPQPEVTPKRQVMA(SEQIDNO:288)
20337IgG
MGLGARGRRRRRRLMALPPPPPPMRALPLLLLLAGLGAAAPPCLDGSPCANGGRCTHQQPSLEAACLCLPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCLRGFQGPDCSQPDPCVSRPCVHGAPCSVGPDGRFACACPPGYQGQSCQSDIDECRSGTTCRHGGTCLNTPGSFRCQCPLGYTGLLCENPVVPCAPSPCRNGGTCRQSSDVTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNLLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVSGRAICTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSMCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGIRCESQVDECRSQPCRYGGKCLDLVDKYLCRCPPGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFHCLCPPGSLPPLCLPANHPCAHKPCSHGVCHDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLAPDACESQPCQAGGTCTSDGIGFRCTCAPGFQGHQCEVLSPCTPSLCEHGGHCESDPDRLTVCSCPPGWQGPRCQQDVDECAGASPCGPHGTCTNLPGNFRCICHRGYTGPFCDQDIDDCDPNPCLHGGSCQDGVGSFSCSCLDGFAGPRCARDVDECLSSPCGPGTCTDHVASFTCACPPGYGGFHCEIDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVSSFSCLCRPGYTGTHCQYEADPCFSRPCLHGGICNPTHPGFECTCREGFTGSQCQNPVDWCSQAPCQNGGRCVQTGAYCICPPGWSGRLCDIQSLPCTEAAAQMGVRLEQLCQEGGKCIDKGRSHYCVCPEGRTGSHCEHEVDPCTAQPCQHGGTCRGYMGGYVCECPAGYAGDSCEDNIDECASQPCQNGGSCIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCDLGPSLDSGVQCLHNGTCVDLVGGFRCNCPPGYTGLHCEADINECRPGACHAAHTRDCLQDPGGHFRCVCHPGFTGPRCQIALSPCESQPCQHGGQCRHSLGRGGGLTFTCHCVPPFWGLRCERVARSCRELQCPVGIPCQQTARGPRCACPPGLSGPSCRVSRASPSGATNASCASAPCLHGGSCLPVQSVPFFRCVCAPGWGGPRCETPSAAPEVPEEPRCPRAACQAKRGDQNCDRECNTPGCGWDGGDCSLNVDDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCYSGGRDRTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDARGQAMVFPYHRPSPGSESRVRRELGPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSAENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEAPEQSVPLLPLLVAGAVFLLIIFILGVMVARRKREHSTLWFPEGFALHKDIAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVVTDLNDSECPEAKRLKVEEPGMGAEEPEDCRQWTQHHLVAADIRVAPATALTPPQGDADADGVDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPAEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHLANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPSGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAVQSGTKKSRRPPGKTGLGPQGTRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFSGPPASPGGFPLEGPYATTATAVSLAQLGASRAGPLGRQPPGGCVLSFGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGAPVSPQERPPPYLAAPGHGEEYPAAGTRSSPTKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSDSTPSPATATNATASGALPAQPHPISVPSLPQSQTQLGPQPEVTPKRQVMA(SEQIDNO:289)
HDx-MS实验部分
HDx-MS实验在WatersSynaptG2HDX平台上进行，所述平台包括LEAP机器人系统、nanoACQUITYUPLC系统和SynaptG2质谱仪。两个实验方法用来进行HDx-MS测量。在第一方法中，全部实验均在溶液中实施，并且在第二方法中，将抗体固定在珠上以改善Notch3NRR抗原的肽覆盖率。
在第一方法中，通过LeapShell软件操作的LEAP机器人，使试验自动化，所述软件执行氘交换反应启动、反应时间控制、猝灭反应、注射样品到UPLC系统上和消化时间控制。Leap机器人配备了温度受控制的两个叠式储存器(stack)，所述叠式储存器维持在37℃用于HDx反应并且维持在2℃用于储存蛋白质和猝灭溶液。使用250pmolNotch3NNR抗原，实施三个重复对照实验。将抗原在37℃以终浓度90.0％D交换为氘化Tris缓冲液(15mMTrisHCl，10mM氯化钙，D2O中的10mM氯化钠，pH＝7.6)40分钟。通过用(6M脲和1MTCEPpH＝2.5)1:1稀释交换溶液，在2℃猝灭氘交换5分钟。在猝灭后，将样品注射到WatersUPLC系统上，在那里，使用维持在12℃的固定化胃蛋白酶柱消化所述样品。在消化后，肽留在WatersUPLCHSST32.1x5mm前置柱上。随后将肽从前置柱洗脱并在WatersUPLCCSHC181.0x100mm柱上使用8分钟2％至35％乙腈梯度分离。接着，对抗原-mAb复合物实施三次重复实验。在这些实验中，将250pmolNotch3NRR抗原与375pmol抗体在室温于TRIS缓冲液(水中15mMTrisHCl，10mM氯化钙、10mM氯化钠，pH＝7.6)中预先温育15分钟。全部其他实验参数与对照实验相同。
为了改善Notch3NRR在LNR-B结构域中的肽覆盖率，使用第二HDx-MS方法，所述方法并入mAb与珠的固定以最小化LC-MS实验中的抗体信号。在这种方法中，如下实施三次重复对照实验。将400pmolNotch3NRR抗原稀释于预温37℃、99％氘化TRIS缓冲液(pH7.6)中并在37℃于热混合器(700rpm)中温育40分钟(％D＝96.1％)。通过用冷猝灭缓冲液(6M脲和1MTCEPpH＝2.5)在冰上1:1稀释，猝灭氘交换5分钟。在猝灭后，将管转移到LEAP系统上并且将猝灭样品通过LEAP系统注射到UPLC系统上以便分析。UPLC系统并入在线胃蛋白酶消化(维持在12℃)。将8分钟2％至35％乙腈梯度和WatersUPLCCSHC181.0x100mm柱用于分离。接着，使用抗体实施三次重复实验。使用标准技术，将20350和20358抗体固定在蛋白G琼脂糖珠(Thermo目录号22851)上。简而言之，将抗体离心以移除储存缓冲液。随后，将200μlTRIS缓冲液(pH7.6)和400pmolNotch3NRR添加至固定化Ab并且在25℃温育15分钟。在温育后，将复合物离心并用200μlTRIS缓冲液洗涤并且再次离心。对于氘交换，将200μL氘化的TRIS添加至抗原-抗体复合物以在37℃温育40分钟(％D＝96.1％)。随后移除氘缓冲液，并立即添加125μL冰冷的猝灭缓冲液。在猝灭后，将柱离心并且将流过液转移至预冷的HPLC小瓶中并使用相同的在线胃蛋白酶消化/LC-MS设置进行分析。
20350和20358的HDx-MS结果
HDx-MS结果总结于图27和图28中。图27显示在20350和20358不存在(对照)和存在下Notch3NRR肽的平均氘摄取量。在图27中有用的是检查以下两种差异：对照和mAb之间的差异和各mAb之间的差异。图28显示20350和20358抗体的apo状态和结合状态之间的差异。小于0.5Da的差异视为不显著(例如，相对于未结合的Notch3NRR对照无变化)。对差异的检验允许确定当IgG结合时受保护的Notch3NRR区域。
从图27和图28中，在LNR-A区域中存在总体不显著的保护量。这种观察结果表明20350抗体和20358抗体均不与Notch3NRR的这个区域显著相互作用。在LNR-B结构域中，保护作用增加，尤其在肽1432-1463中如此。这种肽跨越绝大部分的LNR-B和部分LNR-B/C接头并且仅在固定化抗体实验中检测到。在LNR-B/C接头和LNR-C区域中，一些肽(1457-1471，1457-1472和1457-1489)在20358中受到保护，但是这些肽在20350中未受到保护。还检测到不因任一种抗体与Notch3NRR结合而受到保护的较短区域1478-1489。借助这种信息，可以推断受到20358差异性保护的区域是跨越1457-1477的区域。最后，在LNR-C中的一个其他区域(1490-1500)受到两种抗体保护。除了跨越1532-1545的区域外，在HD-N结构域中，未观察到所研究的任一抗体的保护作用。在HD-C结构域中，当20350或20358与Notch3NRR结合时，区域1580-1583、1592-1616和1617-1628均受到保护免于氘交换。
图29显示在使用实施例14中所示的Notch3NNR晶体结构的HDx-MS实验中受保护区域的图。将受保护区域绘图到结构上允许阐明这样的保护区域(可能参与变构效应)，所述保护区域距蛋白质表面上的那些区域(潜在地参与形成表位)更深埋入结构中。例如，在图27和图28中，对应于α3螺旋的中心断面的区域1609-1616基本上受到两种抗体保护，尽管它不直接与20350或20358相互作用。这种保护作用在性质上是变构的并且可以归因于LNR结构域的稳定作用，其中这些LNR结构域在抗体结合时包围α3螺旋。包围α3螺旋的LNR结构域的稳定作用随后能限制氘接近α3螺旋的中心。α3螺旋保护作用也能归因于抗体结合时3螺旋氢键网络的稳定作用增加。
研究表面上的保护作用时，立即地观察到区域1457-1477位于表面上。这个区域，跨越整个LNR-B/C接头和LNR-C的N末端，仅在20358与Notch3NRR结合并且不与20350结合时受到保护。这个区域中的差异性保护可以用来区分20350抗体和20358抗体并且与X射线结晶学研究(实施例14)一致。从表5可见，区域1457-1477含有11个包埋于20358复合物中的残基。与之相反，表4表示这个区域仅含有4个包埋于20350复合物中的残基。从图29可以解释两种抗体基本上还与LNR-B结构域相互作用。从X射线结晶学(实施例14)可见，仅20350基本上与这个区域相互作用(Notch3NRR上9个对1个包埋残基)。HDx-MS实验中分辨率有限和对变构效应的敏感性可能造成这种误导性解释。如前文提到，在LNR-B结构域中，受到最大保护的肽跨越31个氨基酸，范围从1432-1463。这种肽含有在两种晶体结构中包埋的残基(20350中11个包埋残基对20358中2个包埋残基)。因为两种复合物均具有来自1432-1457的相似保护作用，所以附近LNR-C结构域中20358的结合作用似乎还在这个区域诱导某种变构保护作用。最后，含有LNR-A的C末端和A/B接头的更小肽(例如1420-1430)还显示受两种抗体的某种(和等同)保护。X射线结晶学(实施例14)表明这个区域仅包埋在20350复合物中。HDx-MS数据表明这个区域还在20358结合时被变构保护并且不能与20358直接结合事件区分。
最后，图30提供通过HDx-MS确定的受保护区域的总结并且将它们与来自X射线结晶学研究的包埋残基比较(实施例14)。总之，HDx-MS实验检测到含有借助X射线结晶学确定的几乎全部包埋残基的受保护区域。如前文提到，还检测到一些额外的保护区域，这些保护区域在性质上可能是变构的，如α3螺旋的中心。
IgG抗体20337的HDx-MS实验和结果
使用未结合的Notch3NRR和Notch3，在前述两种IgG抗体和一种额外IgG抗体20337(SEQIDNO:289)存在下使用自动化HDx-MS系统，还进行了钙不存在下采用Notch3NRR的初步实验。在这些实验中，将200pmolNotch3NRR(对照)或200pmolNotch3NRR+300pmolIgG抗体在37℃交换为D-PBS(最终％D＝88.3％)持续40分钟。通过用(6M脲和1MTCEPpH＝2.5)1:1稀释交换溶液，在2℃猝灭氘交换过程5分钟。在猝灭后，将样品注射到WatersUPLC系统上，在那里，使用维持在12℃的固定化胃蛋白酶柱消化所述样品。在消化后，肽留在WatersUPLCHSST32.1x5mm前置柱上。随后将肽从前置柱洗脱并在WatersUPLCCSHC181.0x100mm柱上使用8分钟2％至35％乙腈梯度分离。
图31的左侧显示在不存在Ca2+的情况下与20358或20337复合的Notch3NRR的HDX-MS差异图。研究该图允许观察到在这两种抗体之间受到差异性保护的区域。例如，区域1419-1432和1456-1488在20358存在下相对于20337受到更多保护。与之相反，相对于20358，在20337与Notch3NRR结合之后，区域1489-1498、1500-1506、1538-1568、1571-1582和1583-1591受到更多保护。20337和20358的受保护区域在图31右侧上的两张图中以黑色突出显示。观察到差异性HDx-MS表明了相对于20358(数据显示)和20350(数据未显示)抗体，20337抗体差异地与Notch3NRR抗原相互作用。总之，HDx-MS数据与表位分拣数据(实施例13)和X射线结晶学(实施例14)一致，表明20337、20358和20350在Notch3NRR上具有不同的相互作用(和表位)。
可以重复相同实验以获得与Ca2+存在下的Notch3NRR–20337复合物相对应的HDx-MS数据，预期获得在Ca2+不存在下所见到的相似数据是可能的，即，将见到受全部三种抗体差异性保护的Notch3NRR区域。
实施例16：鉴定Notch3NRR的额外构象表位
能过用本文公开的抗体(例如，20337、20350、20358和A4)预阻断Notch3NRR，找到Notch3NRR的额外构象表位。基于本文公开的Notch3NRR结构，抗体20337、20350、20358和A4的表位可以绘图到Notch3NRR的表面上。如图32中所示，四种抗体的表位覆盖约67％的Notch3NRR表面，留下约33％的表面未覆盖，横跨LNR结构域和HD结构域(图32)。
如通过本文公开的四种抗体所例举，结合桥接LNR和HD的构象表位的抗体是抗体抑制Notch3信号传导的潜在机制。这些抗体通过将LNR和HD夹在一起并稳定Notch3NRR的自我抑制状态发挥作用。在Notch3NRR的表面上鉴到至少两个额外的潜在表位，所述表位未被20337、20350、20358和A4覆盖。如图34中所示，第一潜在表位包含LNR-C和HD结构域并且第二潜在表位包含LNR-A/B接头、LNR-A结构域和HD结构域。关于这两种潜在表位(直接桥接LNR和HD)的有利几何形状，可能的是能找到针对它们的额外Notch3抑制性抗体。
为了筛选靶向这两个潜在表位以及其他构象表位的抗体，可以使用以下实验策略。通常而言，先前鉴定的Notch3抗体(例如，20337、20350或20358)可以与重组NRR蛋白预温育，之后用市售噬菌体展示文库(如MorphosysHuCAL文库)淘选。此外，这些Notch3抗体(20337、20350、20358)可以在淘选之前预结合至表达Notch3的细胞。与单独或组合的Notch3抗体预温育将阻断这些抗体的表位并且富集与不同和独特表位结合的克隆/抗体。如所述那样，使用综合淘选策略，所述综合淘选策略使用借助重组NRR蛋白和完整细胞的固相淘选或溶液相淘选和差异性完整细胞淘选。随后选择克隆/抗体，所述克隆/抗体显示与作为重组蛋白的Notch3以及与表达Notch3的细胞选择性结合，如图3-6中所述。此外，在基于细胞的功能测定法(配体驱动的报道基因测定法，Notch靶基因mRNA定量、ICD3蛋白水平、TALL-1增殖)中筛选从以上方案鉴定的抗体对Notch3信号传导的抑制，如图7、8、11、13、14、15中所述。为了确定新鉴定的Notch3抗体是否与20337、20350、20358相同的表位结合或结合至不同的非重叠表位，可以使用三种一般方案：采用Biacore的表位分拣(图20)；采用NRR蛋白的共晶体结构物(图21、23、24、25)；和抗体/Notch3NRR复合物的HDx-MS表位作图(图27-31)。最终，这些新抗体与NRR蛋白质的共晶体结构将允许鉴定出抗体的表位并且确定所述表位是否与20337、20358和20350的不同。
等同物
认为前面的书面说明书足以使本领域技术人员实施本公开成为可能。前面的描述和实施详述了本公开的某些优选实施方案并描述了发明人构思的最佳模式。然而，将理解无论前述内容可能在文本上如何详细出现，本公开可以按许多方式实施并且本公开应当根据所附权利要求书及其任何等同物解释。
通过引用方式并入作为参考
本文援引的全部参考文献，包括专利、专利申请、论文、教材等及其中引用的参考文献，因而通过引用的方式完整并入本文作为参考至它们尚未达到的程度。

Claims (46)

1.分离的多肽，其包含Notch3受体的构象表位，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C；其中HD结构域选自N端HD和C端HD，并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
2.分离的多肽，其包含Notch3受体的构象表位，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋，并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
3.分离的多肽，其包含Notch3受体的构象表位，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
4.识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C；其中HD结构域选自N端HD和C端HD；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
5.根据权利要求4所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。
6.根据权利要求4所述的分离抗体或其片段，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
7.根据权利要求6所述的分离抗体或其片段，其中Notch3突变体包含选自S1580L和G1487D的突变。
8.特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-B，并且HD结构域是HDα3螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
9.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-A/B接头中的氨基酸残基。
10.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。
11.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-HD接头中的氨基酸残基。
12.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在HDβ4-α3环中的氨基酸残基。
13.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头和HDβ4-α3环中的氨基酸残基。
14.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。
15.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
16.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中Notch3突变体包含选自以下的突变：S1580L、D1587N、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和G1487D、(LNR-C)、P2034fs、P2067fs、p2177fs、Q2075*、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、G2038S、G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、P2178S或其组合。
17.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段、其中构象表位包含氨基酸残基：(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3环的)1592、1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或其子集。
18.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch3残基结合：Cys1442、Pro1444、Ala1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Cys1458、Gly1461、Gly1462、Gly1464、Leu1592、Ser1594、Pro1595、Glu1596、Asn1597、Asp1598和His1599。
19.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch3残基结合：Gln1427、Cys1428、Glu1429、Pro1444、Ser1445、Ser1447、Ser1448、Pro1449、Tyr1453、Leu1507、Leu1508、Arg1510、Leu1592、Asp1598、Pro1602和Ser1606。
20.根据权利要求8所述的分离抗体或其片段，其中抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。
21.特异性结合Notch3受体的构象表位的分离抗体或其片段，其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列；其中LNR区域是LNR-C，并且HD结构域是HDα2螺旋；并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
22.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B中的氨基酸残基。
23.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。
24.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在HDα3-β5环中的氨基酸残基。
25.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中构象表位还包含在LNR-B、LNR-B/C接头和HDα3-β5环中的氨基酸残基。
26.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。
27.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中Notch3受体是突变体Notch3受体，其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
28.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中突变体Notch3受体包含选自以下的突变：S1580L、D1587N、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和G1487D、(LNR-C)、P2034fs、P2067fs、p2177fs、Q2075*、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、G2038S、G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、P2178S、或其组合。
29.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中构象表位包含氨基酸残基：(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621、或其子集。
30.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch3残基结合：Arg1463、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Tyr1471、Tyr1474、Gln1486和Gly1487。
31.根据权利要求21所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch3残基结合：Ser1440、Arg1465、Thr1466、Asn1468、Pro1469、Val1470、Glu1472、Arg1434、Glu1618、Arg1619和Asp1621。
32.根据权利要求4-31所述的分离抗体或其片段，其中抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。
33.根据权利要求4-31所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段抑制Notch3信号传导，这通过选自Notch3配体驱动的报道基因测定法、FACS测定法、Notch3靶基因mRNA定量、TALL-1细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch3胞内结构域(ICD)的γ分泌酶切割形式评估。
34.对Notch3受体具有至少1x107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、1013M-1的解离常数(KD)的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段抑制Notch3信号传导，这通过选自Notch3配体驱动的报道基因测定法、FACS测定法、Notch3靶基因mRNA定量、TALL-1细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch3胞内结构域(ICD)的γ分泌酶切割形式评估。
35.根据权利要求34所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段结合至与表2中所述抗体相同的构象表位。
36.根据权利要求34所述的分离抗体或其片段，其中抗体或其片段与表2中所述的抗体交叉竞争。
37.针对Notch3受体的分离抗体或其片段，所述抗体包含选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:49、SEQIDNO:69、SEQIDNO:89、SEQIDNO:109、SEQIDNO:129、SEQIDNO:149、SEQIDNO:169、SEQIDNO:189、SEQIDNO:209和SEQIDNO:229的VH和选自SEQIDNO:19、SEQIDNO:39、SEQIDNO:59、SEQIDNO:79、SEQIDNO:99、SEQIDNO:119、SEQIDNO:139、SEQIDNO:159、SEQIDNO:179、SEQIDNO:199、SEQIDNO:219和SEQIDNO:239的VL、或者与其具有97-99％同一性的氨基酸序列。
38.包含可变重链序列和可变轻链序列的分离抗体或其片段，其中所述可变重链序列和可变轻链序列选自具有SEQIDNO:9的可变重链和具有SEQIDNO:19的可变轻链序列；具有SEQIDNO:29的可变重链序列和具有SEQIDNO:39的可变轻链序列；具有SEQIDNO:49的可变重链序列和具有SEQIDNO:59的可变轻链序列；具有SEQIDNO:69的可变重链序列和具有SEQIDNO:79的可变轻链序列；具有SEQIDNO:89的可变重链序列和具有SEQIDNO:99的可变轻链序列；具有SEQIDNO:109的可变重链序列和具有SEQIDNO:119的可变轻链序列；具有SEQIDNO:129的可变重链序列和具有SEQIDNO:139的可变轻链序列；具有SEQIDNO:149的可变重链序列和具有SEQIDNO:159的可变轻链序列；具有SEQIDNO:169的可变重链序列和具有SEQIDNO:179的可变轻链序列；具有SEQIDNO:189的可变重链序列和具有SEQIDNO:199的可变轻链序列；具有SEQIDNO:209的可变重链序列和具有SEQIDNO:219的可变轻链序列以及具有SEQIDNO:229的可变重链序列和具有SEQIDNO:239的可变轻链序列。
39.包含可变重链序列和可变轻链序列的单链抗体或其片段，其中所述可变重链序列和可变轻链序列选自具有SEQIDNO:9的可变重链和具有SEQIDNO:19的可变轻链序列；具有SEQIDNO:29的可变重链序列和具有SEQIDNO:39的可变轻链序列；具有SEQIDNO:49的可变重链序列和具有SEQIDNO:59的可变轻链序列；具有SEQIDNO:69的可变重链序列和具有SEQIDNO:79的可变轻链序列；具有SEQIDNO:89的可变重链序列和具有SEQIDNO:99的可变轻链序列；具有SEQIDNO:109的可变重链序列和具有SEQIDNO:119的可变轻链序列；具有SEQIDNO:129的可变重链序列和具有SEQIDNO:139的可变轻链序列；具有SEQIDNO:149的可变重链序列和具有SEQIDNO:159的可变轻链序列；具有SEQIDNO:169的可变重链序列和具有SEQIDNO:179的可变轻链序列；具有SEQIDNO:189的可变重链序列和具有SEQIDNO:199的可变轻链序列；具有SEQIDNO:209的可变重链序列和具有SEQIDNO:219的可变轻链序列以及具有SEQIDNO:229的可变重链序列和具有SEQIDNO:239的可变轻链序列。
40.针对Notch3受体的分离抗体或其片段，包含选自SEQIDNO:5、SEQIDNO:25、SEQIDNO:45、SEQIDNO:65、SEQIDNO:85、SEQIDNO:105、SEQIDNO:125、SEQIDNO:145、SEQIDNO:165、SEQIDNO:185、SEQIDNO:205和SEQIDNO:225的重链CDR3。
41.包含重链可变区和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的分离抗体或其片段，所述重链可变区和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3选自重链可变区SEQIDNO:3的CDR1；SEQIDNO:4的CDR2；SEQIDNO:5的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:13的CDR1；SEQIDNO:14的CDR2；和SEQIDNO:15的CDR3；重链可变区SEQIDNO:23的CDR1；SEQIDNO:24的CDR2；SEQIDNO:25的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:33的CDR1；SEQIDNO:34的CDR2；和SEQIDNO:35的CDR3；重链可变区SEQIDNO:43的CDR1；SEQIDNO:44的CDR2；SEQIDNO:45的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:53的CDR1；SEQIDNO:54的CDR2；和SEQIDNO:55的CDR3；重链可变区SEQIDNO:63的CDR1；SEQIDNO:64的CDR2；SEQIDNO:65的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:73的CDR1；SEQIDNO:74的CDR2；和SEQIDNO:75的CDR3；重链可变区SEQIDNO:83的CDR1；SEQIDNO:84的CDR2；SEQIDNO:85的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:93的CDR1；SEQIDNO:94的CDR2；和SEQIDNO:95的CDR3；重链可变区SEQIDNO:103的CDR1；SEQIDNO:104的CDR2；SEQIDNO:105的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:113的CDR1；SEQIDNO:114的CDR2；和SEQIDNO:115的CDR3；重链可变区SEQIDNO:123的CDR1；SEQIDNO:124的CDR2；SEQIDNO:125的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:133的CDR1；SEQIDNO:134的CDR2；和SEQIDNO:135的CDR3；重链可变区SEQIDNO:143的CDR1；SEQIDNO:144的CDR2；SEQIDNO:145的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:153的CDR1；SEQIDNO:154的CDR2；和SEQIDNO:155的CDR3；重链可变区SEQIDNO:163的CDR1；SEQIDNO:164的CDR2；SEQIDNO:165的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:173的CDR1；SEQIDNO:174的CDR2；和SEQIDNO:175的CDR3；重链可变区SEQIDNO:183的CDR1；SEQIDNO:184的CDR2；SEQIDNO:185的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:193的CDR1；SEQIDNO:194的CDR2；和SEQIDNO:195的CDR3；重链可变区SEQIDNO:203的CDR1；SEQIDNO:204的CDR2；SEQIDNO:205的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:213的CDR1；SEQIDNO:214的CDR2；和SEQIDNO:215的CDR3；重链可变区SEQIDNO:223的CDR1；SEQIDNO:224的CDR2；SEQIDNO:225的CDR3；轻链可变区SEQIDNO:233的CDR1；SEQIDNO:234的CDR2；和SEQIDNO:235的CDR3。
42.药物组合物，包含选自权利要求4-41的抗体或其片段和可药用载体。
43.根据权利要求4-41所述的抗体或其片段，用于治疗由Notch3信号转导途径介导的癌，所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。
44.根据权利要求43所述的抗体或片段，用于治疗由Notch3信号转导途径介导的癌症，其中癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
45.根据权利要求4-41所述的抗体或其片段，用作治疗由Notch3信号转导途径介导的癌的药物，所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。
46.根据权利要求45所述的抗体或片段，用作治疗由Notch3信号转导途径介导的癌症的药物，其中癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
CN201480027023.XA 2013-03-14 2014-03-10 针对notch 3的抗体 Pending CN105246916A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361781421P 2013-03-14 2013-03-14
US61/781,421 2013-03-14
PCT/US2014/022642 WO2014159239A2 (en) 2013-03-14 2014-03-10 Antibodies against notch 3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105246916A true CN105246916A (zh) 2016-01-13

Family

ID=50680110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480027023.XA Pending CN105246916A (zh) 2013-03-14 2014-03-10 针对notch 3的抗体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10538587B2 (zh)
EP (2) EP3611189A1 (zh)
JP (2) JP2016514130A (zh)
CN (1) CN105246916A (zh)
WO (1) WO2014159239A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753833A (zh) * 2018-05-28 2018-11-06 上海海洋大学 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017190025A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-notch3 antibody
AU2019252878B2 (en) * 2018-04-10 2024-02-22 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Chimeric Notch receptors
TW202237642A (zh) * 2021-01-08 2022-10-01 美商１０Ｘ基因組學有限公司 對冠狀病毒具有特異性的抗原結合多肽及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101563366A (zh) * 2006-10-19 2009-10-21 健泰科生物技术公司 抗notch3激动性抗体及其在治疗notch3相关疾病中的用途
CN101605815A (zh) * 2006-12-18 2009-12-16 健泰科生物技术公司 拮抗性抗刻缺蛋白3抗体及其在预防和治疗刻缺蛋白3相关疾病中的用途

Family Cites Families (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4683203A (en) 1984-04-14 1987-07-28 Redco N.V. Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
DE3853515T3 (de) 1987-05-21 2005-08-25 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0517895B1 (en) 1990-12-14 1996-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
ES2181673T3 (es) 1991-05-01 2003-03-01 Jackson H M Found Military Med Procedimiento de tratamiento de las enfermedades respiratorias infecciosas.
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
EP1024191B8 (en) 1991-12-02 2008-11-05 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
ATE452975T1 (de) 1992-08-21 2010-01-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte ketten
US5958708A (en) 1992-09-25 1999-09-28 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
CZ25697A3 (en) 1994-07-29 1997-09-17 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
EP0805678B1 (en) 1995-01-05 2003-10-29 THE BOARD OF REGENTS acting for and on behalf of THE UNIVERSITY OF MICHIGAN Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
JP2000506165A (ja) 1996-03-04 2000-05-23 ザ ペン ステイト リサーチ ファウンデーション 細胞インターナリゼーションを増強するための物質および方法
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP0954282B1 (en) 1997-01-16 2005-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
GB2339430A (en) 1997-05-21 2000-01-26 Biovation Ltd Method for the production of non-immunogenic proteins
PT1012280E (pt) 1997-06-11 2005-02-28 Borean Pharma As Modulo de trimerizacao
ATE386802T1 (de) 1997-06-12 2008-03-15 Novartis Int Pharm Ltd Künstliche antikörperpolypeptide
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
ES2198922T3 (es) 1998-06-24 2004-02-01 Advanced Inhalation Research, Inc. Particulas porosas grandes emitadas por un inhalador.
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
EP1144607B1 (en) 1999-07-20 2008-12-17 MorphoSys AG Methods for displaying (poly)peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds
CA2589418A1 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
CA2747325A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
JP2004532038A (ja) 2001-05-17 2004-10-21 ディヴァーサ コーポレイション 新規抗原結合分子の治療、診断、予防、酵素、産業ならびに農業各分野への応用とそのための新規抗原結合分子の作製とスクリーニングの方法
ATE477280T1 (de) 2001-06-28 2010-08-15 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
DE10131904A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Putzmeister Ag Vorrichtung zum Fördern von fließ- oder schüttfähigem Fördergut
ITMI20011483A1 (it) 2001-07-11 2003-01-11 Res & Innovation Soc Coop A R Uso di composti come antagonisti funzionali ai recettori centrali deicannabinoidi
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US7335478B2 (en) 2002-04-18 2008-02-26 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Reactivation-based molecular interaction sensors
US20030157579A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Kalobios, Inc. Molecular sensors activated by disinhibition
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
US7399851B2 (en) 2002-07-25 2008-07-15 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Composition and method for imaging cells
NZ563471A (en) 2002-11-08 2009-04-30 Ablynx Nv Camelidae antibodies against imminoglobulin E and use thereof for the treatment of allergic disorders
JP2006523090A (ja) 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
US20050008625A1 (en) 2003-02-13 2005-01-13 Kalobios, Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
US20090005257A1 (en) 2003-05-14 2009-01-01 Jespers Laurent S Process for Recovering Polypeptides that Unfold Reversibly from a Polypeptide Repertoire
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
EP2221317A3 (en) 2003-06-30 2011-07-27 Domantis Limited PEGylated single domain antibodies (dAb)
US7981843B2 (en) 2004-01-20 2011-07-19 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US7684505B2 (en) 2004-04-26 2010-03-23 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for encoding interleaving and mapping data to facilitate GBPS data rates in wireless systems
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
EP1928912A4 (en) 2005-09-07 2010-02-24 Medimmune Inc EPH ANTI-RECEPTOR ANTIBODIES CONJUGATED TO TOXINS
CA2631184A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2008051797A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Genentech, Inc. Anti-notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of notch3-related diseases
WO2008076960A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Genentech, Inc. Antagonist anti-notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of notch3-related diseases
US8088617B2 (en) * 2007-01-24 2012-01-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind the glutamate ligand binding region of Notch1
SG192467A1 (en) * 2008-07-08 2013-08-30 Oncomed Pharm Inc Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
ES2580229T3 (es) * 2009-09-30 2016-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos antagonistas anti-Notch3 para el tratamiento de una leucemia de linfocitos T positiva a un inhibidor de la gamma-secretasa que no responde a un anticuerpo antagonista anti-Notch1
KR20150082548A (ko) * 2012-11-07 2015-07-15 화이자 인코포레이티드 항-notch3 항체 및 항체-약물 접합체
PL2935330T3 (pl) * 2012-12-19 2019-11-29 Aveo Pharmaceuticals Inc Przeciwciała przeciw notch3

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101563366A (zh) * 2006-10-19 2009-10-21 健泰科生物技术公司 抗notch3激动性抗体及其在治疗notch3相关疾病中的用途
CN101605815A (zh) * 2006-12-18 2009-12-16 健泰科生物技术公司 拮抗性抗刻缺蛋白3抗体及其在预防和治疗刻缺蛋白3相关疾病中的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANG LI等: "Modulation of Notch Signaling by Antibodies Specific for the Extracellular Negative Regulatory Region of NOTCH3", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753833A (zh) * 2018-05-28 2018-11-06 上海海洋大学 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法
CN108753833B (zh) * 2018-05-28 2021-12-03 上海海洋大学 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10538587B2 (en) 2020-01-21
EP3611189A1 (en) 2020-02-19
US20180009889A1 (en) 2018-01-11
JP2016514130A (ja) 2016-05-19
WO2014159239A2 (en) 2014-10-02
WO2014159239A3 (en) 2015-02-19
JP2019011331A (ja) 2019-01-24
EP2970479B1 (en) 2019-04-24
EP2970479A2 (en) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Weber et al. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies
JP6771002B2 (ja) 上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）に対する抗体
US20210318322A1 (en) Anti-vista antibodies and fragments
CN108341873B (zh) 表皮生长因子受体3(her3)的抗体
CN102753578B (zh) 增加肌肉生长的组合物和方法
JP2021167359A (ja) 抗ｖｉｓｔａ抗体および断片
CN101939336B (zh) Axl抗体
CN109311985A (zh) 抗pd-l1抗体
CN110392694A (zh) 针对pd-1的抗体及其用途
CN108290946A (zh) 抗tigit抗体和使用方法
CN108383909A (zh) 抗sez6抗体及使用方法
CN109069623A (zh) 靶向CD32b的抗体及其使用方法
KR20140125351A (ko) 항-cd98 항체 및 이의 사용 방법
CN107531783A (zh) 靶向bmp6抗体的组合物和方法
CN104105709A (zh) 抗her3的结构域ii的表皮生长因子受体3(her3)抗体
CN104093742A (zh) 抗her3的结构域iii和结构域iv的表皮生长因子受体3(her3)抗体
WO2011140151A1 (en) Antibodies against epidermal growth factor receptor (egfr)
CN107922939B (zh) 中和全部种类埃博拉病毒的感染性的单克隆抗体
JP2019011331A (ja) Ｎｏｔｃｈ３に対する抗体
US20220298257A1 (en) Anti-cd22 antibodies and uses thereof
EP4108256A1 (en) Anti-ospa antibodies and methods of use
EA043336B1 (ru) Анти-vista антитела и фрагменты антител, содержащие их композиции и их применение для стимуляции иммунитета и лечения рака

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160113

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication