CN105246916A - 针对notch 3的抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及靶向Notch?3或突变体Notch?3受体的至少一个构象表位的抗体或其片段、及其组合物和使用方法。

Description

针对NOTCH3的抗体

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请号61/781,421的优先权,所述 文献的内容通过引用的方式完整并入本文作为参考。 发明领域

[0003] 本发明总体上涉及与Notch3相互作用的抗体或其片段。特别地,它涉及识别 Notch3或突变体Notch3的至少一个构象表位的抗体或其片段,所述构象表位包含来自 NRR结构域的LNR区域和HD的连续和不连续氨基酸残基。

背景技术

[0004] Notch信号传导是进化上保守的途径,该途径调节多样性生物学功能集合,包 括胚胎发育和成年组织中的干细胞维持、细胞分化和增殖(Kopan等人,(2009)Cell 137:216-233,Guruharsha等人,(2012)NatRevGenet. 13:654-66 和Andersson等 人,(2001)Development138:3593-3612)。在哺乳动物中,已经描述了四种Notch受体 (Notch1-4),它们具有保守结构域构造。胞外结构域(E⑶)由一系列EGF样重复序列接续 负向调节区(NRR)组成,所述负向调节区含有3个LNR重复序列和一个异二聚化结构域。 当一个细胞上的Notch受体与毗邻细胞上的配体相互作用时,规范的Notch信号传导活化。 在哺乳动物中,存在五种跨膜配体、三种δ样配体(DLLUDLL4和DLL3)和两种Jagged配 体(Jaggedl、Jagged2)。配体结合导致Notch被ADAM蛋白酶在NRR结构域内部的S2位点 切割。这种初始切割产生由γ-分泌酶复合体在S3位点后续切割Notch受体的底物。在 γ-分泌酶切割之后,Notch的胞内结构域(I⑶)转位至胞核,在那里它与CSL转录因子(哺 乳动物中的CBF-1/RBP-Jk)和辅助活化物操纵因子(mastermind) (MAML1)相互作用以活化 靶基因转录。HES/HEY转录因子家族是充分表征的Notch靶基因,然而多种转录靶是细胞类 型特异的。

[0005] 迄今,癌症中Notch受体的证据主要集中在Notch1信号传导的改变方面,而很少 关注其他Notch受体。因此,需要研究和鉴定改变其他Notch受体信号传导如Notch3信 号传导的方法和组合物。

[0006] 发明简述

[0007] 本公开涉及Notch3或突变体Notch3中的多种不同构象表位。本公开还涉及识 别Notch3或突变体Notch3的至少一个构象表位的抗体或其片段,所述构象表位包含来 自NRR结构域的LNR区域和HD的连续和不连续氨基酸残基。

[0008] 因此,在一个方面,本公开涉及一种分离的多肽,所述多肽包含Notch3受体的构 象表位,其中该构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区 域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选自 LNR-A、LNR-B、LNR-C和这些LNR之间的相应接头;其中HD结构域选自N端HD和C端HD, 并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。

[0009] 在另一个方面,本公开涉及一种分离的多肽,所述多肽包含Notch3受体的构象 表位,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异 二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是LNR-B, 并且HD结构域是HDα3螺旋,并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD 接头。

[0010] 在另一个方面,本公开涉及一种分离的多肽,所述多肽包含Notch3受体的构象 表位,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区域、异 二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是LNR-C, 并且HD结构域是HDα2螺旋,并且接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接 头。

[0011] 在另一个方面,本公开涉及一种识别Notch 3受体的构象表位的分离抗体或其片 段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区域、异二 聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选自LNR-A、 LNR-B、LNR-C ;其中HD结构域选自N端HD和C端HD;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖 的信号转导。

[0012] 在一个实施方案中,抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区 域。在一个实施方案中,本公开提供一种突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD结构域 具有至少一个氨基酸残基突变。在一个实施方案中,Notch3突变体包含选自S1580L和 G1487D或其组合的突变。

[0013] 在另一个方面,本公开涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离抗体 或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区 域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HDα 3螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。

[0014] 在一个实施方案中,构象表位还包含在NRR区域的LNR-A/B接头中的氨基酸残基。 在一个实施方案中,构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。在一个实 施方案中,构象表位还包含在NRR区域的LNR-HD接头中的氨基酸残基。在一个实施方案中, 构象表位还包含在HDβ4-α3环中的氨基酸残基。在一个实施方案中,构象表位还包含在 LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头和HDβ4-α3环中的氨基酸残基。在一个实施方 案中,抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。在一个实施方案中, Notch3受体是一种突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸 残基突变。在一个实施方案中,Notch3突变体包含选自S1580L、D1587N、R1589Q、Y1624H、 A1608T、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和G1487D、A1476T(LNR-C)或其组 合的突变。在一个实施方案中,构象表位包含氨基酸残基:(LNR-A/B接头的)1427-1429、 (LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、 (LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、1594-1599、1602 和(HDα3 螺旋的)1606或其子集。在一个实施方案中,抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch 3 残基结合:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、 Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598 和 Hisl599。在一个实施方案中,Notch3受体是一种突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD 结构域具有至少一个氨基酸残基突变。在一个实施方案中,抗体或其片段的VL与至少一个 以下 Notch 3 残基结合:Glnl427、Cysl428、Glul429、Pr〇1444、Serl445、Serl447、Serl448、 Prol449、Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602 和 Serl606。在 一个实施方案中,抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。

[0015] 在另一个方面,本公开涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离抗体 或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区 域、异二聚化(HD)结构域和接头内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是LNR-C, 并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。

[0016] 在一个实施方案中,构象表位还包含在NRR区域的LNR-B中的氨基酸残基。在一个 实施方案中,构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。在一个实施方案 中,构象表位还包含在HDα3-β 5环中的氨基酸残基。在一个实施方案中,构象表位还包 含在LNR-B、LNR-B/C接头和HDα3-β 5环中的氨基酸残基。在一个实施方案中,抗体或其 片段稳定处于自我抑制状态的Notch 3受体LNR区域。在一个实施方案中,突变体Notch 3 受体包含选自 S1580L、R1510H、D1587N、R1589Q、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、 R1526C(HD)和A1476T(LNR-C)或其组合的突变。在一个实施方案中,构象表位包含氨基酸 残基:(LNR-B 的)1440、(LNR-B/C 接头的)1463、1465-1468、(LNR-C 的)1469-1472、1474、 1486-1487、(HDα2 螺旋的)1534 以及(α3-β 5 环的)1618、1619 和 1621 或其子集。在一 个实施方案中,抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch 3残基结合:Argl463、Thrl466、 八8111468、?1〇1469、¥311470、了711471、了711474、61111486和6171487。在一个实施方案中,抗 体或其片段的VL与至少一个以下Notch 3残基结合:Serl440、Argl465、Thrl466、Asnl468、 卩『〇1469、¥311470、81111472、4找1434、61111618、4找1619和48?1621。在一个实施方案中,抗 体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。在一个实施方案中, 抗体或其片段抑制Notch 3信号传导,如通过选自Notch 3配体驱动的报道基因测定法、 FACS测定法、Notch 3靶基因mRNA定量、TALL-1细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch 3胞内结构域(ICD)的γ分泌酶切割形式评估。

[0017] 在另一个方面,本公开涉及一种对Notch3受体具有lx10^^10¾ \ kAi\ 10^^101¾ ^101¾1的解离常数(kd)的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段抑 制Notch3信号传导,如通过选自Notch3配体驱动的报道基因测定法、FACS测定法、Notch 3靶基因mRNA定量、TALL-1细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch3胞内结构域(I⑶) 的γ分泌酶切割形式评估。

[0018] 在一个实施方案中,抗体或其片段结合至与表2中所述抗体相同的构象表位。在 一个实施方案中,抗体或其片段与表2中所述的抗体交叉竞争。

[0019] 在另一个方面,本公开涉及一种针对Notch 3受体的分离抗体或其片段,所述抗 体包含选自 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:69、SEQ ID N0:89、 SEQ ID N0:109、SEQ ID N0:129、SEQ ID N0:149、SEQ ID N0:169、SEQ ID N0:189、SEQ ID NO:209 和 SEQ ID NO:229 的 VH 和选自 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 59、SEQ ID N0:79、SEQ ID N0:99、SEQ ID N0:119、SEQ ID N0:139、SEQ ID N0:159、SEQ ID N0:179、 SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 219 和 SEQ ID NO: 239 的 VL 或者与其具有 97-99% 同一性的氨 基酸序列。

[0020] 在另一个方面,本公开涉及一种包含可变重链序列和可变轻链序列的单链抗体或 其片段,所述可变重链序列和可变轻链序列选自具有SEQIDN0:9的可变重链和具有SEQ IDN0:19的可变轻链序列;具有SEQIDN0:29的可变重链序列和具有SEQIDN0:39的可 变轻链序列;具有SEQIDN0:49的可变重链序列和具有SEQIDN0:59的可变轻链序列; 具有SEQIDN0:69的可变重链序列和具有SEQIDN0:79的可变轻链序列;具有SEQID N0:89的可变重链序列和具有SEQIDN0:99的可变轻链序列;具有SEQIDNO: 109的可变 重链序列和具有SEQIDNO: 119的可变轻链序列;具有SEQIDNO: 129的可变重链序列和 具有SEQIDN0:139的可变轻链序列;具有SEQIDN0:149的可变重链序列和具有SEQID NO: 159的可变轻链序列;具有SEQIDNO: 169的可变重链序列和具有SEQIDNO: 179的可 变轻链序列;具有SEQIDNO: 189的可变重链序列和具有SEQIDNO: 199的可变轻链序列; 具有SEQIDN0:209的可变重链序列和具有SEQIDN0:219的可变轻链序列以及具有SEQ IDN0:229的可变重链序列和具有SEQIDN0:239的可变轻链序列。

[0021] 在另一个方面,本公开涉及一种包含可变重链序列和可变轻链序列的分离抗体或 其片段,所述可变重链序列和可变轻链序列选自具有SEQIDN0:9的可变重链和具有SEQ IDN0:19的可变轻链序列;具有SEQIDN0:29的可变重链序列和具有SEQIDN0:39的可 变轻链序列;具有SEQIDN0:49的可变重链序列和具有SEQIDN0:59的可变轻链序列; 具有SEQIDN0:69的可变重链序列和具有SEQIDN0:79的可变轻链序列;具有SEQID N0:89的可变重链序列和具有SEQIDN0:99的可变轻链序列;具有SEQIDNO: 109的可变 重链序列和具有SEQIDNO: 119的可变轻链序列;具有SEQIDNO: 129的可变重链序列和 具有SEQIDN0:139的可变轻链序列;具有SEQIDN0:149的可变重链序列和具有SEQID NO: 159的可变轻链序列;具有SEQIDNO: 169的可变重链序列和具有SEQIDNO: 179的可 变轻链序列;具有SEQIDNO: 189的可变重链序列和具有SEQIDNO: 199的可变轻链序列; 具有SEQIDN0:209的可变重链序列和具有SEQIDN0:219的可变轻链序列以及具有SEQ IDN0:229的可变重链序列和具有SEQIDN0:239的可变轻链序列。

[0022] 在另一个方面,本公开涉及一种针对Notch3受体的分离抗体或其片段,包含 选自SEQIDN0:5、SEQIDN0:25、SEQIDN0:45、SEQIDN0:65、SEQIDN0:85、SEQID NO:105、SEQIDNO:125、SEQIDNO:145、SEQIDNO:165、SEQIDNO:185、SEQIDNO:205 和SEQIDNO:225 的重链CDR3。

[0023] 在另一个方面,本公开涉及一种包含重链可变区和轻链可变区⑶R1XDR2和⑶R3 的分离抗体或其片段,所述重链可变区和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3选自重链可变区 SEQIDN0:3 的CDR1;SEQIDN0:4 的CDR2;SEQIDN0:5 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDN0:13 的CDR1;SEQIDNO: 14 的CDR2 ;和SEQIDNO: 15 的CDR3 ;重链可变区SEQIDN0:23 的 CDR1;SEQIDN0:24 的CDR2;SEQIDN0:25 的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:33 的CDR1; SEQIDN0:34 的CDR2 ;和SEQIDN0:35 的CDR3 ;重链可变区SEQIDN0:43 的CDR1;SEQ IDNO:44 的CDR2;SEQIDNO:45 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDNO:53 的CDR1 ;SEQIDNO:54 的CDR2 ;和SEQIDN0:55 的CDR3 ;重链可变区SEQIDN0:63 的CDR1;SEQIDN0:64 的 CDR2;SEQIDN0:65的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:73的CDR1;SEQIDN0:74的CDR2;和 SEQIDN0:75 的CDR3 ;重链可变区SEQIDN0:83 的CDR1;SEQIDN0:84 的CDR2;SEQID N0:85的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:93的CDR1;SEQIDN0:94的CDR2;和SEQIDN0:95 的CDR3 ;重链可变区SEQIDNO: 103 的CDR1;SEQIDNO: 104 的CDR2;SEQIDNO: 105 的CDR3;轻链可变区SEQIDNO: 113 的CDR1;SEQIDNO: 114 的CDR2;和SEQIDNO: 115 的 CDR3;重链可变区SEQIDNO:123的CDRl;SEQIDNO:124的CDR2;SEQIDNO:125的CDR3; 轻链可变区SEQIDNO: 133 的CDR1;SEQIDNO: 134 的CDR2 ;和SEQIDNO: 135 的CDR3 ; 重链可变区SEQIDNO: 143 的CDR1;SEQIDNO: 144 的CDR2;SEQIDNO: 145 的CDR3 ;轻链 可变区SEQIDNO: 153 的CDR1;SEQIDNO: 154 的CDR2 ;和SEQIDNO: 155 的CDR3 ;重链 可变区SEQIDNO: 163 的CDR1;SEQIDNO: 164 的CDR2;SEQIDNO: 165 的CDR3 ;轻链可 变区SEQIDNO: 173 的CDR1;SEQIDNO: 174 的CDR2 ;和SEQIDNO: 175 的CDR3 ;重链可 变区SEQIDNO: 183 的CDR1;SEQIDNO: 184 的CDR2;SEQIDNO: 185 的CDR3 ;轻链可变 区SEQIDNO: 193 的CDR1;SEQIDNO: 194 的CDR2 ;和SEQIDNO: 195 的CDR3 ;重链可变 区SEQIDN0:203 的CDR1;SEQIDN0:204 的CDR2;SEQIDN0:205 的CDR3;轻链可变区 SEQIDN0:213 的CDR1;SEQIDN0:214 的CDR2 ;和SEQIDN0:215 的CDR3 ;重链可变区 SEQIDN0:223 的CDR1;SEQIDN0:224 的CDR2;SEQIDN0:225 的CDR3 ;轻链可变区SEQ IDN0:233 的CDR1;SEQIDN0:234 的CDR2 ;和SEQIDN0:235 的CDR3。

[0024] 在另一个方面,本公开涉及一种包含抗体或其片段和可药用载体的药物组合物。

[0025] 在另一个方面,本公开涉及一种抗体或其片段,其用于治疗由Notch3信号转导 途径介导的癌,所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰 腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋 巴细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、鳞 状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透 明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。

[0026] 在一个实施方案中,所述抗体或其片段用于治疗由Notch3信号转导途径介导的 癌症,其中癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。

[0027] 在另一个方面,本公开涉及一种抗体或其片段,其用作治疗由Notch3信号转导 途径介导的癌的药物,所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃 癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、 慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉 瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组 织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。在一个实施方案中,所述抗 体或其片段用作治疗由Notch3信号转导途径介导的癌症的药物,其中癌症是T细胞急性 淋巴母细胞性白血病(TALL)。

[0028] 附图简述

[0029] 图1:Notch3的结构域结构;

[0030] 图2:Notch3NRR的结构域结构以及每个区域的氨基酸位置;

[0031] 图3A-C与人、食蟹猴和小鼠重组蛋白结合的Notch3抗体的ELISA数据;

[0032] 图4与人、食蟹猴和小鼠重组蛋白结合的Notch3抗体的Biacore数据;

[0033] 图5A-C多种Notch3抗体的FACS数据;

[0034] 图6A-FHCC1143Notch扩增的细胞中Notch3抗体的FACS数据;

[0035] 图7A-D:Notch3报道基因测定法中Notch配体(Jaggedl和δ1)存在下Notch 抗体的抑制%和IC5。值;

[0036]图 8:Notch3 靶基因mRNA定量;

[0037] 图9A-B:Notch3NRR(顶部)突变和PEST(底部)突变;

[0038] 图10A-B:显示Notch3NRR突变的特征的图;

[0039] 图11A-B:显示在Notch3抗体存在下的TALL-1mRNA和增殖抑制的图;

[0040] 图12A-B:显示仅在TALL-1细胞中存在新表位I⑶3抗体的蛋白质印迹照片;

[0041] 图13A-B:显示在TALL-1细胞和MDA-MB468细胞中用Notch3抗体处理时Notch 3信号传导减少的蛋白质印迹照片;

[0042]图 14A-C:显示在Ishikawaheraklio02_ER细胞、TE-11 细胞和A549 细胞中用 Notch3抗体处理时Notch3信号传导减少的蛋白质印迹照片;

[0043] 图15:显示在Notch3扩增的细胞系HCC1143中用Notch3抗体处理时Notch3 信号传导减少的蛋白质印迹照片;

[0044] 图16A-B:TALL_1异种移植中体内研究的蛋白质印迹照片和IHC照片;

[0045] 图17A-C:MDA-MB468异种移植中体内研究的蛋白质印迹照片;

[0046] 图18:体内H)HLUX1823模型异种移植中的蛋白质印迹照片;

[0047] 图19A-B:显示TALL-1体内功效的小鼠照片;

[0048] 图20:显示鉴定Notch3NRR结构域中4种不同表位(称为NRR-A,NRR-B,NRR-C 和NRR-D)的Notch3 抗体的表位分拣(epitopebinning);

[0049] 图21:Notch3NRRX射线晶体结构的表面图和带状图;标记出1)蛋白质的N端 和C端;2)三个LNR重复序列和配位Ca2+离子;3)L1419,自抑制性塞;4)S1和S2位点;5) HD结构域内部的二级结构;和6)Notch3中与Notch1和Notch2相比构象显著不同的两 个区域(LNR-B/C接头外加LNR-C的前半部分,和HD结构域中的β4-α3环);

[0050] 图22:人Notch1、2和3的序列比对。在划虚线框中所示是与Notch1或Notch 2相比结构显著不同的Notch3区域;

[0051] 图23:以3测定的Notch3/20350Fab复合物的X射线晶体结构,与Notch3 NRR结合的20350Fab的总体结构(左小图)和在Notch3NRR上与所标出表位残基的详 细相互作用(右小图);

[0052] 图24:以2.1A测定的Notch3/20358Fab复合物的X射线晶体结构,与Notch3 NRR结合的20358Fab的总体结构(左小图)和在Notch3NRR上与所标出表位残基的详 细相互作用(右小图)

[0053] 图25:Notch3NRR上20350和20358表位的比较。在Notch3NRR上叠加的 Notch3/20350Fab复合物和Notch3/20358Fab复合物的X射线晶体结构显示这两种抗体 与Notch3NRR上的不同表位结合;

[0054] 图26:构象表位20350、20358和A4中的氨基酸残基;

[0055] 图27:Notch3NRR+Ca2+的HDx-MS表位作图显示非结合状态下的Notch3NRR的 平均氘摄取量;

[0056] 图28:显示采用与Notch3NRR结合的20350、20358抗体时绝对保护量的Notch 3NRR+Ca2+差分图;

[0057] 图29:结构显示当20350和20358与Notch3NRR结合时受到保护(黑色)的区 域的结构;

[0058] 图30 :包埋的X射线氨基酸残基与HDx-MS中检测到的受保护区域的比较;

[0059] 图31 :无Ca2+情况下20037和20358对Notch3NRR的差异图和绘图在Notch3 NRR结构上的受保护区域(黑色);

[0060] 图32 :抗体20337、20350、20358和A4的绘图在Notch3NRR表面上的构象表位;

[0061]图 33:Notch3NRR上未被抗体 20337、20350、20358 和A4 覆盖的表面;

[0062] 图34:Notch3NRR表面上未被抗体20337、20350、20358和A4覆盖的潜在构象表 位。

[0063] 发明详述

[0064] 定义

[0065] 为了可以更轻易地理解本发明,首先定义某些术语。额外的定义在详细描述中自 始至终给出。

[0066] 如本文所用,短语"信号转导"或"信号传导活性"指通常由蛋白质-蛋白质相互 作用如生长因子与受体结合引发的生物化学因果关系,所述生物化学因果关系导致信号从 细胞的一个部分传输至细胞的另一个部分。对于Notch3,配体结合导致Notch3被ADAM 蛋白酶在NRR结构域内部的S2位点切割。这种初始切割产生由γ-分泌酶复合体在S3位 点后续切割Notch受体的底物。在γ-分泌酶切割之后,Notch的胞内结构域(I⑶)转位 至胞核,在那里它与CSL转录因子(哺乳动物中的CBF-1/RBP-Jk)和辅助活化物操纵因子 (MAML1)相互作用以活化靶基因转录。

[0067] 如本文所用,术语"Notch3"或"Notch3受体"指哺乳动物人Notch3蛋白。 图1中描述了Notch3的结构域结构,该图显示配体结合结构域(LBD)、包含LinNotch 重复序列(LNR)和N-端、C端异二聚化结构域(分别是HD-N和HD-C的负向调节区 (NRR))以及ankarin结构域(ANK)和PEST结构域。图2显示Notch3NRR的总体结构 和相应氨基酸残基:LNR-A具有氨基酸残基E1383-G1422 ;LNR-A-B接头具有氨基酸残基 Aspl423-Leu-1431 ;LNR-B具有氨基酸残基Glnl432-Alal460 ;LNR-BC接头具有氨基酸残 基Glyl461-Asnl468 ;LNR-C具有氨基酸残基Prol469-Serl502 ;LNR-HD接头具有氨基酸残 基Glul503-Argl510 ;HD-N具有氨基酸残基Glyl511-Argl571 ;并且HD-C具有氨基酸残基 1572-Serl640〇

[0068]人Notch3 如下文SEQIDNO: 1 代表。

[0069]MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPP GWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSC PPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQS⑶LTYDCA CLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSC VCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAIC TCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFT CICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYEC RCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRC PSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPP GSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPP GVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHG GYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGY GGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFT GPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYC VCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCS CPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQ DPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVG VPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAA PEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDN FDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFL QRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAAD YLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDV ASGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEEPGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVA PAMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGE TALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLA VEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDH FANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAAQSGSKKSRRPPGKAG LGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGL GRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAG AHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATTTGALPAQPLPLSVPSSLAQ AQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDN0:1)

[0070] 食蟹猴Notch3如下文SEQIDNO: 2代表。

[0071]MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAVPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGff VGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHSARCSVGPDGRFLCSCPP GYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQS⑶LTYDCACL PGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVC VNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTC PPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCI CMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGICKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRC AEGFEGMLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPS GTTGVNCEVNIDDCASNPCSFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGS LPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGV QGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGY TGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLLGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGG FHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCPQSFTGP QCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVC PEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGENCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCP PGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDP GGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVP CQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFSGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPE VSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFD CHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQR LSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYL GALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDVAA GHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEELGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVAPA MALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETA LHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVE GMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHFA NREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGTHGLGPLLCPPGAFLPGLKVTQSGSKKSRRPPGKAGLG PQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGR QPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAGAH SSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATATGALPAQPLPLSVPSSLAQAQ TQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDNO:2)

[0072] 如本文所用,术语"Notch配体"指结合并活化Notch3受体的多肽。Notch3配体 的例子包括但不限于δ样配体(例如DLL1、DLL3和DLL4)和Jagged配体(例如,Jaggedl 和Jagged2)。

[0073] 在Notch3的上下文中使用的术语"稳定作用"或"稳定"指直接维持(锁定、系 留、束缚、偏好地结合、有利于)Notch3受体自我抑制型构象或状态的抗体或其片段。在实 施例中描述的测定法可以用来测量稳定化Notch3受体的信号转导,例如使用本文中公开 的ICD3抗体的体外筛选法。

[0074] 如本文所用,术语"配体依赖的信号传导"指借助配体(例如,δ或Jagged配体) 活化Notch3。配体结合产生了导致Notch3信号转导的Notch3蛋白酶剪切事件。相对 未处理的(对照)细胞,抗体或其片段可以抑制暴露于该抗体或其片段的细胞的Notch3 信号传导,如使用实施例中描述的测定法测量。表达Notch3的细胞可以是天然存在的细 胞系或可以通过向宿主细胞引入编码Notch3蛋白的核酸重组地产生。

[0075] 如本文所用,术语"配体非依赖的信号传导"指细胞Notch3活性(例如,在NRR 结构域内部S2处被切割并且随后在不存在配体结合要求的情况下在S3位点处被切割的 Notch3)。例如,配体非依赖性Notch3活化可以是Notch3过量表达/Notch3中扩增或 活化性突变的结果。相对未突变的(对照)细胞,抗体或其片段可以抑制暴露于该抗体或 其片段的细胞的Notch3信号传导,如使用实施例中描述的测定法测量。过量表达Notch 3的细胞可以是天然存在的细胞系(例如HCC1143,TALL-1)或可以通过向宿主细胞引入编 码Notch3蛋白的核酸重组地产生。在另一个例子中,细胞可以具有配体依赖的和配体非 依赖的Notch3信号传导这两者。

[0076] 如本文所用,术语"阻断"指阻止或阻碍相互作用或过程,例如阻止配体依赖的或 配体非依赖的信号传导。

[0077] 如本文所用的术语"识别"指发现其构象表位并与之相互作用(例如,结合)的抗 体或其片段。

[0078] 如本文所用的术语"抗体"指(例如,通过结合、空间位阻、稳定空间分布)与Notch 3表位相互作用并抑制信号转导的完整抗体。天然存在的"抗体"是包含由二硫键相互连接 的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为 VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变 区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定域包含一个结构域CL。VH和VL区可以进 一步再划分为超变区,名为互补决定区(CDR),其间插有更保守的区域,名为构架区(FR)。 每个VH和VL包含三个⑶R和4个FR,从氨基端到羧基端以如下顺序排列:FR1、⑶R1、FR2、 ⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒 定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如,效应细胞) 和经典补系统的第一组分(Clq))结合。术语"抗体"例如包括,单克隆抗体,人抗体,人源化 抗体,胳化抗体,嵌合抗体,单链Fvs(scFv),二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片 段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如,针对本公开抗体的抗Id抗体)和前述任一者的表 位结合片段。抗体可以属于任何同种型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例 如,IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。

[0079] 轻链和重链均分成具有结构同源性和功能同源性的区域。术语"恒定"和"可变" 以功能方式使用。在这个方面,可以理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变域决定抗原识 别和特异性。相反,轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要的生物学特性如 分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合作用等。按常规,恒定区结构域的编号随着它们 变得距抗体的抗原结合位点或氨基端更远而增加。N端是可变区和在C端是恒定区;CH3和 CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。

[0080] 如本文所用,短语"抗体片段"指抗体的一个或多个部分,所述部分(例如,通过 结合、空间位阻、稳定空间分布)保留与Notch3表位特异性相互作用的能力并抑制信 号转导。抗体的结合片段的例子包括但不限于Fab片段,一种由VL结构域、VH结构域、 CL结构域和CH1结构域组成的单价片段;F(ab)2片段,一种包含由二硫键在铰链区连接 的两个Fab片段的双价片段;由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段;由抗体单臂的 VL结构域和VH结构域组成的Fv片段;由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989) Nature341:544_546);和分离的互补决定区(CDR)。

[0081] 另外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码,但是使用重组方法,可 以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头连接,在所述单条蛋 白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv);见例如Bird等人(1988) Science242:423-426 ;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. 85:5879-5883)。术语 "抗体片段"也意在涵盖这类单链抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术,获得这些抗 体片段,并且按照与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。

[0082]也可以将抗体片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、胞内抗体、 双抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见,例如Hoilinger和Hudson, (2005) NatureBiotechnology23:1126-1136)。可以将抗体片段移植至基于多肽的支架如纤 连蛋白III型(Fn3)中(参见美国专利号6, 703, 199,其描述纤连蛋白多肽单体抗体 (monobodies)) 〇

[0083] 可以将抗体片段并入单链分子中,其中所述单链分子包含一对串联Fv区 段(VH-CH1-VH-CH1),它们与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等 人,1995ProteinEng. 8 (10) : 1057-1062 ;和美国专利号 5, 641,870)。

[0084] 如本文所用的短语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"指具有基本上相同的氨 基酸序列或从相同遗传源衍生的多肽,包括抗体、抗体片段、双特异性抗体等。这个术语还 包括具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合 特异性和亲和力。

[0085] 如本文所用,短语"人抗体"包括具有构架区和⑶R区均从人源序列衍生的可变 区的抗体。另外,如果该抗体含有恒定区,则恒定区也衍生自这类人序列,例如人种系序 列、或者突变形式的人种系序列或含有从人构架序列分析导出的共有构架序列的抗体,例 如如Knappik等人,(2000)JMolBiol296:57-86)中所述。免疫球蛋白可变域(例如, CDR)的结构和位置可以使用熟知的编号方案(例如,Kabat编号方案、Chothia编号方案 或Kabat和Chothia的组合)定义(见,例如SequencesofProteinsofImmunological Interest,美国卫生和公众服务部(1991),(编著),Kabat等人;Lazikani等人,(1997) J.Mol.Bio. 273:927-948;Kabat等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunological Interest,第 5 版,NIHPublicationno. 91-3242 美国卫生和公众服务部;Chothia等 人,(1987)J.Mol.Biol. 196:901-917;Chothia等人,(1989)Nature342:877-883 ;和 Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol. 273:927-948。

[0086] 本文中公开的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外的 随机或定点诱变或通过体内的体细胞突变而引入的突变、或保守替换,以促进稳定性或生 产)。

[0087] 如本文中所用的短语"人单克隆抗体"指展示单一结合特异性的抗体,所述抗体是 具有构架区和CDR区衍生自人序列的可变区的抗体。在一个实施方案中,人单克隆抗体由 杂交瘤产生,所述杂交瘤包括从非人转基因动物(例如,转基因小鼠)获得的B细胞,所述 非人转基因动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。

[0088] 如本文所用,短语"重组人抗体"包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的全部 人抗体,如从就人免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如,小鼠)或从中制 备的杂交瘤抗体分离的抗体,从经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如,从转染瘤)分离的 抗体、从重组人抗体组合文库分离的抗体和通过涉及将全部或一部分人免疫球蛋白基因序 列剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具 有构架区和CDR区从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区。然而,在某些实施方案中,此类 重组人抗体可以经历体外诱变(或,使用相对于人Ig序列为转基因的动物时,经历体内体 细胞诱变)并且因此重组抗体的VH和^区的氨基酸序列是尽管衍生自人种系VH和八序列 并且与之相关,但可能在体内人抗体种系库内部不天然存在的序列。

[0089] 两个实体之间的"特异性结合"意指具有以下平衡常数(KA) 的结合作 用:至少K^M1、至少δχΙΟΜ1、至少KfM1、至少δχΙΟΜ1、至少104M1、至少δχΙΟΜ1、至少 105Μ\至少5χ105Μ\至少106Μ\至少5χ106Μ\至少107Μ\至少5χ107Μ\至少10SM\至少 5xlOsM\至少 109M\至少 5xl09M\至少 101QM\至少 5xl01QM\至少 10nM\至少 5xlOnM\ 至少1012M\至少5xl012M\至少1013M\至少5xl013M\至少1014M\至少5xl014M\至少 1015M1 或至少 5x1015M^

[0090] 短语"与抗体(例如,结合Notch3的抗体)特异性(或选择性)结合"指确定不 均一蛋白质群体和其他生物制品中存在关联抗原(例如,人Notch3)的结合反应。除上 文所示的平衡常数(KA)之外,本文中公开的结合Notch3的抗体一般还具有小于5x10 2M、 小于10 2M、小于5x10 3M、小于10 3M、小于5x10 4M、小于10 4M、小于5x10 5M、小于10 5M、小 于5x10 6M、小于10 6M、小于5x10 7M、小于10 7M、小于5x10SM、小于10SM、小于5x10 9M、小于 10 9M、小于 5x10 1QM、小于 10 1QM、小于 5x10nM、小于 10nM、小于 5x10 12M、小于 10 12M、小于 5x10 13M、小于10 13M、小于5x10 14M、小于10 14M、小于5x10 15M,或小于10 15M或更低的解离速 率常数(KD) 〇^。"/〇,并且以这样的亲和力与如〖(*3结合,所述亲和力至少两倍大于其与 非特异性抗原(例如,HSA)结合的亲和力。

[0091] 在一个实施方案中,抗体或其片段具有小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小 于 1500pM、小于ΙΟΟΟρΜ、小于 750pM、小于 500pM、小于 250pM、小于 200pM、小于 150pM、小 于100pM、小于75pM、小于10pM、小于ΙρΜ的解离常数(Kd),如使用本文所述或本领域技术 人员已知的方法(例如,BIAcore测定法、ELISA、FACS、SET)(BiacoreInternationalAB, Uppsala,瑞典)评估。如本文所用,术语"Kass。。"或"Ka"指特定抗体-抗原相互作用的结 合速率,而如本文所用,术语"Kdls"或"Kd"指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文 所用,术语"KD"指解离常数,它从K$Ka的比率(即Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。 可以使用本领域充分建立的方法确定抗体的KD值。一种用于确定抗体的KD的方法是使用 表面等离子体共振法或使用生物传感器系统如:Biaetife®系统。

[0092] 本文所用的术语"亲和力"(affinity)指,抗体与抗原在单个抗原部位上相互作用 的强度。在每个抗原位点内部、抗体"臂"的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相 互作用;相互作用越多,亲和力越强。

[0093] 如本文所用的术语"亲合力"指抗体-抗原复合物的总体稳定性或强度的信息型 量值。它受控于三个主要因素:抗体表位亲和力;抗原和抗体二者的价态;和相互作用部分 的结构排列。最终,这些因素定义了抗体的特异性,即,特定抗体与精确抗原表位结合的可 能性。

[0094] 如本文所用,术语"价态"指多肽中潜在靶结合位点的数目。每个靶结合位点特异 性结合一种靶分子或靶分子上的特定位点(即,表位)。当多肽包含多于一个靶结合位点 时,每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如,可以与不同分子(例如,不 同抗原)或相同分子上的不同表位结合)。

[0095] 如本文所用的短语"拮抗抗体"指与Notch3结合并抑制Notch3信号传导的抗 体,如通过本文所述的测定法(例如,ICD3测定法)所测定。因此,如根据本文所述的测定 法所测定,"抑制"一种或多种Notch3功能特征(例如,生物化学活性、免疫化学活性、细 胞活性、生理学活性或其他生物学活性等)的抗体将理解为相对于抗体不存在时(例如, 或当具有不相关特异性的对照抗体存在时)观察到的特定活性,涉及所述特定活性的统计 显著下降。抑制Notch3活性的抗体实现这种统计显著下降达测量参数的至少10%、至少 50 %、80 %或90 %,并且在某些实施方案中,本文中公开的抗体可以抑制大于95 %、98 %或 99 %的Notch3功能活性。

[0096] 短语"分离的抗体"指一种抗体,它基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体 (例如,与Notch3特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合除Notch3之外的抗原 的抗体)。然而,特异性结合Notch3的分离抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。另外, 分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。

[0097] 术语"表位"包括能够与免疫球蛋白特异性结合或与分子相互作用的任何蛋白质 决定簇。表位决定簇总体上由分子的化学活跃的表面基团如氨基酸或糖类或糖侧链组成并 且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是"线性"或"构象型"的。 [0098] 术语"线性表位"指蛋白质和相互作用性分子(如抗体或其片段)之间的全部相 互作用点沿该蛋白质的一级氨基酸序列(连续)线性存在的表位。一旦确定抗原上的所需 表位,可以产生针对这个表位的抗体,例如使用本文描述的技术产生。备选地,在发现过程 期间,抗体或其片段的产生和表征可以阐明关于所需表位的信息。从这种信息中,则可能针 对与相同表位的结合作用竞争性筛选抗体。一项实现这点的方案将实施交叉竞争研究以便 找到彼此竞争性结合的抗体,例如竞争与抗原结合的抗体。国际专利申请号W0 2003/4873 中描述了基于抗体交叉竞争作用"分拣(binning) "抗体的高通量方法。

[0099] 术语"构象表位"指其中不连续氨基酸残基在立体形状中聚拢的表位。在构象表 位中,相互作用点跨越彼此由至少一个氨基酸残基分隔的氨基酸残基出现(不连续),即, 接触点出现在不同和分离的NRR区域如LNR区域、HD以及接头区域上。仅出于示意性目的, 构象表位还可以包含在不同和分离的NRR区域上的连续触点,例如与LNR区域中的至少两 个氨基酸、HD区域中的至少两个氨基酸和接头区域(例如,LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、 LNR-HD接头)中的至少一个氨基酸残基连续接触。在一个实施方案中,构象表位是本文实 施例中描述的那种。在一个实施方案中,构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C) 和HD(例如,α3螺旋)内部的氨基酸残基之间的不连续相互作用点。在一个实施方案中, 构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)和HD内部的氨基酸残基之间的不连续相 互作用点和在LNR区域(例如,α3螺旋)和HD(例如,LNR-HD接头)之间的至少一个接 头。在一个实施方案中,构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)和HD(例如,α3 螺旋)内部的氨基酸残基之间的不连续相互作用点和在HD(例如,β4-α3环)内部的至少 一个接头。在一个实施方案中,构象表位包含在LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)和HD(例 如,α2螺旋)内部的氨基酸残基之间的不连续相互作用点和在HD(例如,α3-β5环)内 部的至少一个接头。在一个实施方案中,构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义:SEQ IDN0:1 的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、 1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一个实施方案中, 构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义:SEQIDN0:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接 头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2 螺旋的)1534 以 及(HDα3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一个实施方案中,构象表位由以下 Notch3 氨基酸残基定义:1489-1498 (LNR-C)、1500-1506 (LNR-HD接头)、1538-1568 (HD)和 1571-1591 (HD)。本领域技术人员理解,被创建分子形状的残基或侧链占据的空间有助于确 定表位是什么。

[0100] 通常,对特定靶抗原特异的抗体将偏好地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物 中靶抗原上的表位。

[0101] 可以使用本领域熟知的任何种类的表位作图技术,鉴定给定多肽中包括表位的区 域。见,例如MethodsinMolecularBiology,第 66 卷,(GlennE.Morris编著,1996) HumanaPress,Totowa,NewJersey中的EpitopeMappingProtocols。例如,可以通过 以下方式确定线性表位:在固相支持物上同时合成大量肽,这些肽与蛋白质分子的各部 分相对应,并且在肽仍与支持物连接的情况下,使所述肽与抗体反应。这类技术是本领 域已知的并且在例如美国专利号4, 708, 871 ;Geysen等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci. USA8:3998-4002;Geysen等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:78-182;Geysen等 人,(1986)Mol.Immunol. 23:709-715中描述。类似地,通过确定氨基酸的空间构象轻易地 鉴定构象表位,如通过例如氢/氘交换、X射线结晶学和二维核磁共振法。参见,例如上文 EpitopeMappingProtocols。也可以使用标准抗原性绘图和亲水性绘图鉴定蛋白质的抗 原区,如使用例如从OxfordMolecularGroup可获得的Omiga1.0版软件程序计算出来的 那些。这种计算机程序使用Hopp/Woods法,Hopp等人,(1981)Proc.Natl.Acad.SciUSA 78:3824-3828 ;以确定抗原性谱,并使用Kyte-Doolittle技术,Kyte等人,(1982)J.Mol. Biol. 157:105-132 ;用于亲水性绘图。

[0102] 如本文所用的术语"互补位"指决定与表位结合的结合区的总体结构。这种结构 影响结合区是否可能并且以何种方式与表位结合。术语"互补位"可以指抗体或其片段中 负责抗体或其片段与抗原决定簇结合的抗原位点。互补位还指抗体的独特位和与表位结合 的互补决定区(⑶R)。

[0103] 在一个实施方案中,构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义:SEQIDNO: 1的 (LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/ C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、 1594-1599U602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一个实施方案中,互补位是包 含CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中,互补位包含表2中所列的序列。在一个实施 方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Cysl442、Prol444、 Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、 Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598 和Hisl599。在一个实施方案中, 互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Glnl427、Cysl428、Glul429、 Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、 Leul592、Aspl598、Prol602 和Serl606〇

[0104] 在一个实施方案中,构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义:SEQIDNO: 1 的(LNR-B的)1440、 (LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、 (LNR-C的)1469-1472、1474、 1486-1487、(HDα2 螺旋的)1534 以及(α3-β5 环的)1618、1619 和 1621 或其子集。在 一个实施方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Argl463、 Thrl466、Asnl468、Pr〇1469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486 和Glyl487。在一个实施 方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Serl440、Argl465、 Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。

[0105] 本领域技术人员理解,任何抗体或其变体的互补位可以按本申请所述的方式确 定。

[0106] 术语"交叉竞争"和"交叉竞争的"在本文中互换地用来意指抗体或其片段在标准 竞争性结合测定法中干扰其他抗体或片段与Notch3结合的能力。在一个实施方案中,术 语"交叉竞争"指干扰其他抗体或其片段与Notch3的至少一个构象表位结合的抗体或其 片段。

[0107] 可以使用标准竞争结合测定法确定抗体或其他结合物能够干扰另一种抗体或其 片段与Notch3结合的能力和程度和是否因此可以称它为根据本发明的交叉竞争。一种合 适的测定法涉及使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore3000仪器(Biacore,Uppsala, 瑞典),所述技术可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。测量交叉竞争的另 一种测定法使用基于ELISA的方法。

[0108] 术语"多肽"和"蛋白质"在此互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语适 用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚 合物,以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有指出,特定的 多肽序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体。

[0109] 短语"保守性修饰的变体"适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定的核酸序列,保 守性修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或在核酸不编码氨基 酸序列的情况下,指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性,许多功能上相同的核酸 编码任何给出的蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和G⑶均编码氨基酸丙氨酸。因而, 在其中丙氨酸由某个密码子指定的每个位置,可以将该密码子变成任一个所述的相应密码 子,而不改变编码的多肽。这类核酸变异是"沉默性变异",它们是一个种类的保守性修饰 变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每种可能沉默变异。技术人员会 认识到,可以修饰核酸中的每个密码子(例外是AUG,它通常是甲硫氨酸的唯一密码子,和 TGG,它通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此,编码多肽的核酸的 每种沉默性变异隐含于每个描述的序列中。

[0110] 对于多肽序列,"保守性修饰的变体"包括对多肽序列的各个置换、缺失或添加,它 们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是 本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本文中公开的多态性变体、物种间同源物和 等位基因是额外的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、 甘氨酸(G) ;2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)、 赖氨酸(K) ;5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V) ;6)苯丙氨酸(F)、酪氨 酸(Y)、色氨酸(W) ;7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例 如,Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中,术语"保守序列修饰"用于指不显著 影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。

[0111] 如本文所用的术语"优化的"指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物 (通常是真核细胞,例如毕赤酵母属(Pichia)细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠 卵巢细胞(CH0)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列经工程 化以完全或尽可能保留由起始核苷酸序列最初编码的氨基酸序列,也称作"亲本"序列。

[0112] 评价抗体针对多个物种的Notch3的结合能力的标准测定法是本领域已知的,例 如包括ELISA、蛋白质印迹法和RIA。在实施例中详述合适的测定法。也可以通过本领域已 知的标准测定法,如通过Biacore分析或FACS相对亲和力(Scatchard),评估抗体的结合动 力学(例如,结合亲和力)。在实施例中更详细地描述评价抗体对Notch3的功能特征之影 响的测定法(例如,受体结合测定法、调节Notch3信号传导途径)。

[0113] 在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下,短语"同一的百分数"或"同一性 百分数"指相同的两个或更多个序列或子序列。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大 对应性而进行比较和比对时,如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所 测量,两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即,在指定区域范围内或当 未指定时在整个序列范围内60%同一性,任选地65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或99%同一性),则这两个序列是"基本上同一的"。任选地,同一性存在于具有至少约50 个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域内,或更优选地存在于具有100个至500个或1000 或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)长度的区域内。

[0114] 对于序列比较,一般地一个序列充当检验序列与之比较的参考序列。当使用序列 比较算法时,将检验序列和参考序列输入计算机,根据需要指定次级序列坐标,并指定序列 算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。基于程序参数,序列比较算 法随后相对于参考序列计算检验序列的序列同一性百分数。

[0115] 如本文所用,"比较窗口 "包括针对具有任一连续位置数的节段的参考,所述的 连续位置数选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150,其中一个序列可 以与具有相同连续位置数的参考序列在最佳比对这两个序列后进行比较。用于比对序列 以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以按如下方式进行,例如通 过Smith和Waterman, (1970)Adv.Appl.Math. 2:482c的局部同源性算法、通过Needleman 和Wunsch(1970)J.Mol.Biol. 48:443 的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman, (1988) Proc.Nat' 1.Acad.Sci.USA85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行 (WisconsinGenetics软件包,GeneticsComputerGroup, 575ScienceDr. ,Madison,WI 中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视审查(参见例如,Brent等 人,(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology)〇

[0116] 适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST算法和 BLAST2. 0 算法,它们分别在Altschul等人,(1977)Nuc.AcidsRes. 25:3389-3402 ;和 Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol. 215:403-410(1990)中描述。用于进行BLAST分析的 软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。这种算法涉及首先通过查询序列中长度 W的短字鉴定高评分序列对(HSP),其中所述短字与数据库序列中具有相同长度的字比对 时匹配或满足某些正值阈评分T。将T称作相邻字评分阈值(Altschul等人,上文)。这些 初始相邻字命中充当种子,所述种子用于启动检索以找到含有这些种子的更长HSP。所述 字命中在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸,只要可以提高累积比对评分即可。对于核 苷酸序列,使用参数M( -对匹配残基的报酬评分;总是>0)和N(错配残基的惩罚评分;总 是〈〇)计算累积评分。对于氨基酸序列,使用评分矩阵来计算累积评分。字命中在每个方 向上的延伸在以下情况时停止:累积比对评分从其最大实现值跌落达量X;累积评分因积 累一个或更多负评分残基比对结果而达到或低于零;或抵达两个序列中任一序列的末端。 BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使 用字长度(W) 11、期望(E) 10、Μ= 5、N= -4和两条链的比较作为默认参数。对于氨基酸 序列,BLASTP程序使用字长度3和期望(Ε) 10,以及BL0SUM62评分矩阵(见Henikoff和 Henikoff, (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:10915)、比对结果(B) 50、期望(E) 10、Μ= 5、Ν= -4和两条链的比较作为默认参数。

[0117]BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(见,例如Karlin和 Altschul, (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性 的一种度量是最小总和概率(P(N)),其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会 因偶然发生的概率指示。例如,如果最小总和概率在测试核酸与参考核酸的比较中小于约 〇. 2、更优选小于约0. 01并且最优选小于约0. 001,则将认为核酸相似于参考核酸。

[0118] 还可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12,空位罚分4,利用已经并入 ALIGN程序(2. 0 版)的E.Meyers和W.Miller算法,(1988)Comput.Appl.Biosci. 4:11-17) 确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外,可以使用已经集成至GCG软件包的GAP 程序中的Needlema和Wunsch(1970)J.Mol.Biol. 48:444-453)算法(在www.gcg.com可获 得),使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重 1、2、3、4、5或6,确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。

[0119] 除上文所示的序列同一性的百分数之外,两个核酸序列或多肽基本上同一的另一 个指标是由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽所产生的抗体发生免疫交叉 反应,如下文描述。因此,在两种肽仅因保守性置换而不同的情况下,一个多肽一般与第二 多肽基本上相同。两个核酸序列基本上同一的另一个指标是这两个分子或它们的互补物在 严格条件下彼此杂交,如下文描述。两个核酸序列基本上同一的又一个指标是相同的引物 可以用来扩增该序列。

[0120] 短语"核酸"在本文中可与术语"多核苷酸"互换使用并且指脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸及其单链形式或双链形式的聚合物。本术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰型 主链残基或键的核酸,所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的,具有与参考核酸相 似的结合特性,并且以类似参考核苷酸的方式代谢。这类类似物的例子包括但不限于硫代 磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。

[0121] 除非另外说明,特定核酸序列也隐含地包括其保守方式修饰的变体(例如简并密 码子置换)和互补序列,以及明确指出的序列。具体而言,如下文详述,可以通过产生其中 一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换 的序列,实现简并密码子置换(Batzer等人,(1991)NucleicAcidRes. 19:5081 ;0htsuka 等人,(1985)J.Biol.Chem. 260:2605-2608;和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)〇

[0122] 短语"有效连接"指两个或更多个多核苷酸(例如,DNA)区段之间的功能性关系。 一般地,它指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如,如果启动子或增强子序列在 适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录,则该启动子或增强子序列 与编码序列有效连接。通常,与已转录的序列有效连接的启动子转录调节序列物理地与已 转录的序列连续,即,它们是顺式作用的。然而,一些转录调节序列(如增强子)不需要物 理上与转录它们增强的编码序列连续或与之紧邻。

[0123] 术语"受试者"包括人和非人动物。非人动物包括全部脊椎动物,例如哺乳动物和 非哺乳动物,如非人灵长类、绵羊、犬、奶牛、鸡、两栖类和爬行类。除非指出,否则术语"患 者"或"受试者"在本文中可互换使用。

[0124] 本公开的多个方面在以下部分和子部分进一步详细描述。

[0125]Notch3 受体

[0126]Notch信号传导是进化上保守的途径,该途径调节多样性生物学功能集合,包 括胚胎发育和成年组织中的干细胞维持、细胞分化和增殖(Kopan等人,(2009)Cell137:216-233,Guruharsha等人,(2012)NatRevGenet. 13:654-66 和Andersson等 人,(2001)Development138:3593-3612)。在哺乳动物中,已经描述了四种Notch受体 (Notch1-4),它们具有保守结构域构造。胞外结构域(E⑶)由一系列EGF样重复序列接续 负向调节区(NRR)组成,所述负向调节区含有3个LNR重复序列和一个异二聚化结构域,如 图1中所显示。

[0127] 在实体瘤中,Notch信号传导在肿瘤起始和进展中的作用并未充分理解 (Ranganathan等人,(2011)NatRevCancer11:338-51)。Notch受体涉及上皮细胞转化 的早期证据来自小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)插入性诱变研究。例如,Notch4 (起初称作Int3) 由MMTV活化导致乳腺瘤发生(Gallahan等人,(1987)JVirol61:218-220,Gallahan等 人,(1997)0ncogene14:1883-1890)。2011年,在雌激素受体(ER)阴性乳腺癌中鉴定到 Notch1 或Notch2 重排(Robinson等人,(2011)NatMed17:1646-51)。这些Notch受体 重排导致膜束缚形式的缺少完整NRR结构域的受体或ICD样蛋白的产生。

[0128]Notch3NRR具有与Notchl(Gordan等人,(2009)Blood113:4381-4390;Gordon 等人,(2009) 4:e6613;Wu等人,(2010)Nature464:1052-1057)和Notch2(Gordon等 人,(2007)NatStructMolBiol14:295-300)相似的总体折叠。它包含三个Linl2/Notch 重复序列(LNR)(即LNR-A、LNR-B和LNR-C);和由弗林蛋白酶切割作用在S1位点(在R1571 和E1572之间)处分裂成N端部分(HD-N)和C端部分(HD-C)的异二聚化(HD)结构域(参 见图2)。

[0129]NRR结构域调节Notch受体的活化,这涉及三个蛋白酶解步骤。在Notch前体的成 熟期间,弗林蛋白酶样转化酶在NRR内部的S1位点处切割,以引发活化。ADAM蛋白酶在也 处于NRR内部的S2位点处切割,以产生γ分泌酶在S3位点处进行膜内蛋白酶解的底物。 在S3切割之后,Notch的胞内部分随后进入胞核以活化转录。S2切割是这种活化系列反应 的关键步骤并且受NRR结构域负向调节。这种所谓自我抑制的机制可以在下文由NRR结构 解释。

[0130] 虽然不受提供理论约束,一种可能的作用机理模型是Notch3NRR-般以自我抑 制型构象存在,其中各自配位一个Ca2+离子的三个LNR缠绕在HD周围以保护S2位点免遭 ADAM蛋白酶接近。LNR和HD之间相互作用以及这些区域内部那些相互作用的稳定性对维 持NRR的自我抑制型构象至关重要。Notch3NRR中的突变改变自我抑制型构象,因而暴露 HD结构域,从而蛋白酶可切割S2位点以及随后切割S3位点,因而活化下游Notch3信号 转导。因此,去稳定NRR的突变,如(本文中公开的)相关癌症中存在的那些突变,能增强 Notch3的活化。另一方面,能稳定LNR-HD相互作用的试剂如抗体或其片段能潜在地抑制 Notch3信号传导。抗体或其片段如20350和20358结合Notch3的自我抑制型构象并稳 定化(直接维持、束缚、锁定)自我抑制型构象,因而阻止S2位点暴露于蛋白酶切割作用, 并阻止后续的下游Notch3信号传导。

[0131] 在一些实施方案中,抗体或其片段与构象表位结合,从而它限制LNR区域(LNR-A、 LNR-B、LNR-C以及各LNR结构域之间的相应接头)相对HD的活动性,稳定处于自我抑制型 构象的Notch3NRR。未能形成活性(非抑制型、开放)构象导致不能活化信号转导。在一 些实施方案中,抗体或其片段与构象表位结合,从而它阻止NRR内部的HD变得暴露,因而使 其不可在S2位点和/或S3位点被蛋白酶切割。未能切割S2位点导致不能活化信号转导。

[0132]Notch3 突变体

[0133] 在一个方面,本公开涉及Notch3受体中的突变。在受体的两个常见区域, 在>50 %T-ALL患者中鉴定到Notch1的活化性突变(Weng等人,(2004)Science 306:269-71)。发现一类突变聚类于NRR的HD结构域的疏水核心中。也已经在LNR结构域 中鉴定到罕有突变(Gordon等人,(2009)Blood113:4381-4390)JRR突变可能通过部分或 完全地解折叠HD结构域,改变保护S2位点的口袋并破坏与LNR的相互作用而发挥作用。这 种假设得到以下生物化学数据支持:具有白血病相关突变的HD结构域较不稳定(Malecki 等人,(2006)Μ〇1·CellBiol. 26:4642-4651)。

[0134] 还在蛋白质C末端的PEST(脯氨酸-谷氨酸盐-丝氨酸-苏氨酸丰富)结构域中 鉴定到突变。ICD水平受到严密调节并且PEST结构域的磷酸化和后续遍在蛋白化指引ICD 被E3连接酶如Fbw7降解。突变是导致PEST结构域缺失并导致稳定性增加及蛋白质半寿 期更长的ICD的无义突变或移码突变。

[0135] 迄今,癌症中Notch受体的证据主要集中在Notch1信号传导的改变方面。但是, 已经在几项研究(包括TCGA分析浆液性卵巢癌)中显示Notch3在11-25%的患者样品中 扩增(Nakayama等人,(2007)IntJCancer120:2613-17;Etemadmoghadam等人,(2009) ClinCanRes15:1417-27;Bell等人,(2011)Nature474:609-615)。虽然已经报道在伴 皮质下梗死和脑白质病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)综合征中报道了Notch 3中的突变,但是这些突变一般在性质上是错义的,并且不清楚Notch3功能改变和疾病病 变的联系(参见Ayata,(2010),Stroke41:S129-S134)。全面分析各种癌类型中的基因突 变已经由TCGA和其他机构进行。使用的标准技术是外显子-捕获法。作为这些研究的部分, 已经在约1%的头颈部鳞状癌、卵巢癌和肺腺癌中报道Notch3突变。但是,缺少对Notch 3外显子25和外显子33的足够外显子覆盖率造成技术人员难以寻找Notch3基因中的突 变。进一步,Notch3基因中的高GC含量已经已经阻碍技术人员了解突变。此外,已经提 出鳞状细胞肺癌中鉴定的突变是功能丧失突变(参见Egloff和Grandis(2012)ClinCan Res18:5188-519)。相反并且与此前研究矛盾,本文公开内容显示了活化Notch3信号转 导("活化性突变")和参与癌症发病机理的多种突变。

[0136] 为了鉴定Notch3突变,表征了 947种人癌细胞系并且通过使用溶液相杂交分子 捕获技术大规模平行测序,获得>1600个基因的突变信息,如实施例5中所述。此外,用 RNAseq对原发肿瘤样品测序(Wang等人(2009)NatureReviewsGenetics10:57-63)。如 表1中所示,在多个细胞系和肿瘤样品中鉴定到NRR结构域和PEST结构域中的突变。

[0137] 干扰Notch3功能的活化性突变参与癌症发病机制。由于功能丧失、获得功能或 功能改变的变化Notch3的存在直接增加癌症风险,所以这类突变的检测本身适用于诊断 方法和预后方法。随后可以通过与突变体Notch3结合的抗体或其片段处理来鉴定这类活 化性突变。

[0138] 表1:Notch3活化性突变

[0139]

Figure CN105246916AD00261

[0140] 从以下不同细胞系选择来自NRR结构域的两个突变用于表征:(i)TALL_l细胞, 它是具有S1580L突变的T细胞急性淋巴母细胞系;和(ii)具有G1487D突变的乳腺肿瘤 (X-1004)。实施例显示向Notch3受体中引入S1580L突变或G1487D突变导致来自受体的 基础信号传导相对于野生型对照增加大约10倍。在这个系统中,野生型受体和突变体受体 以大致等同的水平表达,如通过FACS测定法所确定。该数据显示这些突变在表达这些突变 和其他相似突变的细胞系和肿瘤中活化Notch3信号传导。这种Notch3信号传导活化被 Notch3抗体或其片段抑制。

[0141] 为了检测Notch3突变体,制备生物样品并分析受试样品的序列与野生型Notch 3序列之间的差异,其中认为所述受试样品含有突变体Notch3。可以通过本文所述的任何 技术鉴定突变体Notch3。可以将突变体Notch3测序以鉴定特定突变(增加Notch3信 号转导的活化性突变)。突变,尤其导致蛋白质功能改变的那些突变,随后用于本发明的诊 断方法和预后方法。

[0142] 为了进一步分析,将Notch3突变体的癌突变定位到Notch3NRRX射线晶体结 构上。结构性分析显示这些突变的某些可能破坏结构域内和结构域间的相互作用、去稳定 化Notch3NRR的自我抑制性构象并造成Notch3活化和信号转导。

[0143] 这些突变与20350表位和20358表位的比较(下文描述)显示它们大部分不在所 述表位内部,表明20350和20358抗体片段可以结合处于自我抑制型构象的野生型和突变 体Notch3NRR并抑制Notch3信号转导。

[0144] 在一些实施方案中,可以将突变体引入野生型Notch3(SEQIDNO: 1)中,以 研究对抗体结合的影响。使用已知技术如丙氨酸扫描法诱变可以帮助定义功能相关 的表位。也可以使用利用精氨酸/谷氨酸扫描方法的诱变(参见,例如Nanevicz等 人,(1995),J.Biol.Chem. 270 (37) :21619-21625 和Zupnick等人,(2006),了.81〇1· Chem. 281 (29) :20464-20473)。通常,用精氨酸和谷氨酸(一般分别地)置换野生型多肽中 的氨基酸,因为这些氨基酸带电荷并且体积大并且因此具有在引入突变的抗原区域内破坏 抗原结合蛋白和抗原之间结合作用的可能性。野生型抗原中存在的精氨酸以谷氨酸替换。 可以获得多种的这类独立突变体并且分析收集的结合结果以确定哪些残基影响结合作用。 可以产生一系列突变体Notch3,每种突变体Notch3具有单一突变。可以测量每种突变 体Notch3与各种Notch3抗体或其片段的结合作用并且与结合野生型Notch3(SEQID NO: 1)的所选抗体或其片段的能力比较。

[0145] 抗体或其片段和如本文所用的突变体或变体Notch 3之间结合作用的改变(例如 减少或增加)意指存在抗原结合蛋白的结合亲和力变化(例如,如通过已知方法(如下文 在实施例中描述的Biacore检验或基于珠的测定法)所测量)、EC 5。变化和/或总结合能 力变化(例如减少)(例如,如通过抗原结合蛋白浓度对抗原浓度作图中的B_下降佐证)。 结合作用的显著改变表示突变的残基参与抗体或其片段的结合。

[0146] 在一些实施方案中,结合作用的显著减少意指抗体或其片段和突变体Notch3抗 原之间的结合亲和力、EC5。和/或能力相对于抗体或其片段和野生型Notch3 (例如,SEQ IDNO: 1)之间的结合作用减少大于10%、大于20%、大于40%、大于50%、大于55%、大于 60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%或大于95%。

[0147] 在一些实施方案中,抗体或其片段对与野生型Notch蛋白(例如,SEQIDNO: 1)相 比具有一个或多个(例如,1、2、3、4、5,6、7、8、9、10或更多个)突变的突变体1*^(*3的结 合作用显著减少或增加。

[0148] 尽管变体形式相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型序列提及,但是将可以理解在 Notch 3的等位变体或剪接变体中,氨基酸可能不同。还构思了对这类Notch 3等位形式显 示明显改变的结合作用(例如,更低或更高结合作用)的抗体或其片段。技术人员将理解, 表1中描述的任一个突变体可以与表1中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种任何其他突 变体组合,在以产生可以用来鉴定、诊断或监测受试者的"表达模式"或"表达特征标识"。

[0149] 在一些实施方案中,表达特征标识包含一个或多个组1突变,例如S1580L、 R1510H、D1587N、R1580Q和Y1624H的组合。在一些实施方案中,表达特征标识包含一个或 多个组2突变,例如G1487D、A1476T、A1609T、L1518M和A1537T的组合。在一些实施方案 中,表达特征标识包含一个或多个组3突变,例如N1597K、L1547V和R1526C的组合。

[0150] 在一些实施方案中,表达特征标识包含一个或多个组1突变,例如S1580L、 R1510H、D1587N、R1580Q和Y1624H的组合;和一个或多个组 2 突变,例如G1487D、A1476T、 A1609T、L1518M和A1537T的组合。在一些实施方案中,表达特征标识包含一个或多个组1 突变,例如S1580L、R1510H、D1587N、R1580Q和Y1624H的组合;和一个或多个组3突变,例 如N1597K、L1547V和R1526C的组合。在一些实施方案中,表达特征标识包含一个或多个组 2突变,例如例如G1487D、A1476T、A1609T、L1518M和A1537T的组合;和一个或多个组3突 变,例如N1597K、L1547V和R1526C的组合。

[0151] Notch 3结构和构象表位

[0152] 在一个方面,本公开涉及鉴定Notch 3的多种不同构象表位。首次,已经显示了与 多种抗体或其片段复合的Notch 3的NRR结构域(残基1379-1640)的三维结构。Notch 3 NRR/20350 Fab复合物和Notch 3 NRR/20358 Fab已经分别以3. 2埃(A)分辨率和2,L4分 辨率测定并且在图23和图24中显示。本公开还首次显示在NRR内部存在多个构象表位并 且抗体片段与彼此隔离的独特构象表位结合,如图25中所示。抗体或其片段与自我抑制状 态的Notch 3结合并且稳定处于这种自我抑制状态的Notch 3。

[0153] 本公开在此显示在NRR中存在与不同类别的Notch3抗体或其片段结合的多个不 同构象表位。在一个实施方案中,第一类抗体(例如,20350)与NRR结构域中的第一构象表 位结合;第二类抗体(例如,20358)与NRR结构域中的第二构象表位结合;并且第三类抗体 与NRR结构域中的第三构象表位结合。在一个实施方案中,NRR的第一、第二和第三构象表 位不重叠;并且第一、第二和第三类抗体与NRR的不同区域结合。在一个实施方案中,NRR 的第一和第二构象表位不重叠;并且第一和第二类抗体与NRR的不同区域结合。在一个实 施方案中,NRR的第一和第三构象表位不重叠;并且第一和第三类抗体与NRR的不同区域结 合。在一个实施方案中,NRR的第二和构象表位不重叠,并且第二和第三类抗体与NRR的不 同区域结合。

[0154] 在一个实施方案中,NRR的第一、第二和第三构象表位彼此重叠至少1、2、3、4、5、 6、 7、8、9或10个氨基酸残基;并且第一、第二和第三类抗体与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10个重叠性氨基酸残基结合。在一个实施方案中,NRR的第一和第二构象表位彼此重叠至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基;并且第一和第二类抗体与至少1、2、3、4、5、6、 7、 8、9或10个重叠性氨基酸残基结合。在一个实施方案中,NRR的第一和第三构象表位彼 此重叠至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基;并且第一和第三类抗体与至少1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10个重叠性氨基酸残基结合。在一个实施方案中,NRR的第二和第三构 象表位彼此重叠至少1、2、3、4、或5、6、7、8、9或10个氨基酸残基;并且第二和第三类抗体 与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重叠性氨基酸残基结合。

[0155] 为了分析NRR内部的不同构象表位,X射线结晶学和氢-氘交换实验如实验部分中 详述那样实施。可以通过以下方式制备Notch3的晶体:在合适宿主细胞中表达编码Notch 3或其变体的核苷酸序列,并且随后在革El向Notch3的相关Fab存在下结晶纯化的蛋白质。

[0156]Notch3多肽也可以作为融合蛋白产生,例如以辅助提取和纯化。融合蛋白配偶体 的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、组氨酸(HIS)、六组氨酸(6HIS)、GAL4(DNA结合和 /或转录活化结构域)和半乳糖苷酶。也可以便利的是在融合蛋白配偶体和目的蛋白 质序列之间包括蛋白酶剪切位点以允许移除融合蛋白序列。

[0157] 在表达后,可以将蛋白质纯化和/或浓缩,例如通过固定的金属亲和层析、离子交 换层析和/或凝胶过滤。

[0158] 可以使用本文所述的技术结晶蛋白质。常见地,在结晶过程中,含有蛋白质溶液 的液滴与结晶缓冲液混合并且允许其在密封容器中平衡。可以通过已知技术如"悬滴"法 或"坐滴"法实现平衡。在这些方法中,液滴悬在大得多的结晶缓冲液储器上方或坐落于 其旁边,并且通过蒸气扩散达到平衡。备选地,可以通过其他方法实现平衡,例如在油下、 穿过半透膜或通过自由界面扩散实现(参见例如,Chayen等人,(2008)NatureMethods 5, 147 - 153)。

[0159] -旦已经获得晶体,可以由已知X射线衍射技术解析结构。许多技术使用化学修 饰的晶体,如通过重原子衍生化修饰的那些,以逼近各相。在实践中,将晶体浸泡在含有可 以扩散穿过晶体并与蛋白质表面结合的重金属原子盐或有机金属化合物(例如,氯化铅、 硫代苹果酸金、硫柳汞或乙酸双氧铀)的溶液中。随后可以通过X射线衍射分析浸透的晶 体,测定结合的重金属原子的位置。当晶体原子(散射中心)衍射X射线单色射束所获 得的图形可以由数学方程解析以产生数学坐标。衍射数据用来计算晶体的重复单元的电 子密度图。获得相信息的另一种方法是使用称作分子置换的技术。在这种方法中,将旋 转算法和转换算法应用至衍生于相关结构的检索模型,产生目的蛋白的近似取向(参见 Rossmann, (1990)ActaCrystalsA46,73-82)。电子密度图用来确立各个原子在晶体的晶 胞内部的位置(Blundel等人,(1976)ProteinCrystallography,AcademicPress)。

[0160] 本公开首次描述了Notch3和Notch3抗体Fab的多个三维结构,并且显示在NRR 内部存在多个构象表位。Notch3的胞外NRR结构域在图2中显示。近似结构域界限如 下:LNR-A具有氨基酸残基E1383-G1422 ;LNR-A-B接头具有氨基酸残基Aspl423-Leul431 ; LNR-B具有氨基酸残基Glnl432-Alal460 ;LNR-B-C接头具有氨基酸残基Glyl461-Asnl468 ; LNR-C具有氨基酸残基Prol469-Serl502 ;LNR-HD接头具有氨基酸残基Glul503-Argl510 ; HD-N具有氨基酸残基Glyl511-Argl571 ;并且HD-C具有氨基酸残基1572-Serl640。人 Notch3具有登录号(NP_000426)(人),并且下文如SEQIDNO: 1代表。

[0161]Notch3和抗体或其片段的三维结构允许鉴定潜在Notch3受体调节物的祀结合 位点。优选的祀结合位点是参与活化Notch3的那些。在一个实施方案中,祀结合位点位 于Notch3的LNR结构域和HD结构域内部。因此,与LNR或HD结合并且优选地与LNR结 构域和HD结构域这两者均结合的抗体或其片段可以通过以下方式调节Notch3活化:阻 止所述结构域彼此解离并且阻止暴露HD结构域,从而阻止S2位点以及随后S3切割位点暴 露。因此,与这些结构域内部的氨基酸残基结合的抗体或其片段造成Notch3维持阻止活 化和下游信号转导的自我抑制型构象。

[0162] 在一个实施方案中,构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义:SEQIDNO: 1的 (LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/ C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、 1594-1599U602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。在一个实施方案中,互补位是包 含CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中,互补位包含表1中所列的序列。在一个实施 方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Cysl442、Prol444、 Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、 Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598 和Hisl599。在一个实施方案中, 互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Glnl427、Cysl428、Glul429、 Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、 Leul592、Aspl598、Prol602 和Serl606〇

[0163] 在一些实施方案中,抗体或其片段与具有下述构象表位的人Notch3蛋白结合, 所述构象表位包含氨基酸残基:SEQIDN0:1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B 的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD 接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、1594-1599、1602、和(HDα3 螺旋 的)1606或者其子集。在一些实施方案中,抗体或其片段与以下氨基酸残基内部的氨基酸 或重叠性氨基酸残基结合:SEQIDNO: 1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、 1444-1445、1447-1450、1453、1458、 (LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、 (LNR-HD接头 的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、1594-1599、1602、和(HDα3 螺旋的)1606 或者其子集。在一些实施方案中,抗体或其片段与以下氨基酸残基(和/或由其组成的 氨基酸序列)内部的氨基酸结合:SEQIDNO: 1的(LNR-A/B接头的)1427-1429、(LNR-B 的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、1594-1599、1602、和(HDα3 螺旋 的)1606或者其子集。

[0164] 在一个实施方案中,构象表位由以下Notch3氨基酸残基定义:SEQIDNO: 1 的(LNR-B的)1440、 (LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、 (LNR-C的)1469-1472、1474、 1486-1487、(HDα2 螺旋的)1534 以及(α3-β5 环的)1618、1619 和 1621 或其子集。在 一个实施方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Argl463、 Thrl466、Asnl468、Pr〇1469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486 和Glyl487。在一个实施 方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残基:Serl440、Argl465、 Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。

[0165] 在一些实施方案中,抗体或其片段与具有下述构象表位的人Notch3蛋白结合, 所述构象表位包含以下氨基酸残基:SEQIDNO: 1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头 的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2 螺旋的)1534 以及 (α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一些实施方案中,抗体或其片段与以下氨基 酸残基内部的氨基酸或重叠性氨基酸残基结合:SEQIDΝ0:1的(LNR-B的)1440、(LNR-B/ C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2 螺旋的)1534 以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一些实施方案中,抗体或其片段与以 下氨基酸残基(和/或由其组成的氨基酸序列)内部的氨基酸结合:SEQIDNO: 1的(LNR-B 的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HD α2螺旋的)1534以及(α3-β5环的)1618、1619和1621或其子集。在一些实施方案中, 抗体或其片段与构象表位结合,从而它限制LNR区域(LNR-A、LNR-B、LNR-C)的活动性,使其 稳定处于自我抑制型构象。未能形成活性(非抑制型、开放)构象导致不能活化信号转导。 在一些实施方案中,抗体或其片段与构象表位结合,从而它阻止NRR内部的HD变得暴露,因 而使其不可在S2位点和/或S3位点被蛋白酶切割。未能切割HD导致不能活化信号转导。

[0166] 所述的结构还允许鉴定抗体或其片段(例如,20350和20358)与Notch3的相 互作用界面的特定核心Notch3氨基酸残基。对于20350,这些核心氨基酸残基定义为在 20350VH链的5A范围内的残基。这些核心残基如下:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、 Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、 Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598 和Hisl599。对于VL链,核心残基如下:Glnl427、 Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Leul507、 Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602 和Serl606。

[0167] 对于20358,这些残基定义为在20358VH链的5A范围内的残基。这些核心残基如 下:厶找1463、11^1466、厶8111468、?仰1469、¥311470、了711471、了711474、61111486 和6171487。对于VL链,核心残基如下:Serl440、Argl465、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、 glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。

[0168] 实验部分显示,如通过将Notch3NRR/20350复合物和Notch3NRR/20358复合 物的晶体结构在Notch3NRR上叠加所确定,20350和20358的构象表位不重叠,如图25中 所示。20350和20358与不重叠的不同分立构象表位结合。甚至最接近的区域(与20350 形成的E1464-R54氢键和与20358形成的R1463-D100盐桥)完全分离。这表示两种抗体 可以同时结合Notch3NRR并且不交叉竞争。这个观察结果与下述分拣实验符合,所述分 拣实验显示这些抗体处于不同的分拣区(bin)中并且彼此不竞争结合Notch3。

[0169] 使用本文中公开的教导,技术人员能预测可以不过度干扰抗原结合蛋白与Notch 3结合的能力情况下变动抗原结合蛋白的哪些残基和区域。

[0170] 将相互作用界面氨基酸定义为至少一个原子相距Notch3配偶体蛋白小于或等 于i產的全部氨基酸残基。选择Si作为允许原子处于范德瓦尔斯半径加可能的水介导的 氢键范围内的截止距离。

[0171] 在一些实施方案中,结合至20350、覆盖20350或阻止20350与前述任一残基相互 作用的任何抗原结合蛋白可以用来结合至或抑制Notch3。在一些实施方案中,抗体或其 片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、 Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、 Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598和Hisl599。在一些实施方案中,抗体及其片段与以 下至少一个Notch3 残基结合或相互作用:Glnl427、Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、 Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、 Prol602和Serl606。在一些实施方案中,抗体或其片段与以下至少一个Notch3残基结合 或相互作用:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、 Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598、 Hisl599、Glnl427、Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、 Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602 和Serl606。在一些实 施方案中,抗体或其片段与以下Notch3残基的组合结合或相互作用:Cysl442、Prol444、 Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、 Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598、Hisl599、Glnl427、Cysl428、 Glul429、Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Leul507、Leul508、 Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602和Serl606。在一些实施方案中,抗体或其片段与 以下全部Notch3 残基结合或相互作用:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、Serl448、 Prol449、Tyrl453、Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、Prol595、 Glul596、Asnl597、Aspl598、Hisl599、Glnl427、Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、 Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、 Prol602 和Serl606〇

[0172] 在一些实施方案中,结合至20358、覆盖20358或阻止20358与前述任一残基相互 作用的任何抗原结合蛋白可以用来结合至或抑制Notch3。在一些实施方案中,抗体或其 片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用:Argl463、Thrl466、Asnl468、Prol469、 Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486和Glyl487。在一些实施方案中,抗体或其片段与以 下至少一个Notch3 残基结合或相互作用:Serl440、Argl465、Thrl466、Asnl468、Prol469、 Vall470、Glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。在一些实施方案中,抗体或其 片段与以下至少一个Notch3残基结合或相互作用:Argl463、Thrl466、Asnl468、Prol469、 Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486、Glyl487、Serl440、Argl465、Thrl466、Asnl468、 Prol469、Vall470、glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。在一些实施方案中, 抗体或其片段与以下Notch3残基的组合结合或相互作用:Argl463、Thrl466、Asnl468、 Prol469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486、Glyl487、Serl440、Argl465、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。在一些实 施方案中,抗体或其片段与以下全部Notch3残基结合或相互作用:Argl463、Thrl466、 Asnl468、Prol469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486、Glyl487、Serl440、Argl465、 Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。

[0173] 在一个实施方案中,本文中公开的抗体结合至与20350相同的构象表位。在一个 实施方案中,本文中公开的抗体结合至与20358相同的构象表位。在一些实施方案中,由表 1中列出的任何抗体结合的构象表位是特别有用的。在某些实施方案中,Notch3构象表位 可以用来分离与Notch3结合的抗体或其片段。在某些实施方案中,Notch3构象表位可 以用来产生与Notch3结合的抗体或其片段。在某些实施方案中,Notch3构象表位可以 用作免疫原以产生与Notch3构象表位结合的抗体或其片段。在某些实施方案中,Notch3 构象表位可以施用至动物,并且随后可以从动物获得与Notch3结合的抗体。

[0174] 除了对20337、20350和20358鉴定的构象表位之外,使用本文所公开的和如实施 例中公开的方法,也可以找到Notch3NRR上的其他构象表位。特别地,桥接LNR和HD的 构象表位;和其中S2塞(L1419)是表位组成部分的构象表位。

[0175] 除了对20337、20350和20358鉴定的构象表位之外,使用本文所公开的和如实施 例中公开的方法,也可以找到Notch3NRR上的其他构象表位。特别地,桥接LNR和HD的 构象表位;和其中S2塞(L1419)是表位组成部分的构象表位。

[0176]可获得Notch3NRR以及Notch3NRR/20350 和Notch3NRR/20358 的复合物的 3D结构为更详细地探索其他Notch3抗体提供了构架。Notch3的3D结构允许绘制单克 隆抗体的表位并推断它们的作用模式,原因是某些单克隆抗体抑制细胞生长,某些单克隆 抗体刺激细胞生长,和其他单克隆抗体对细胞生长无影响。Notch3的构象表位包含来自 NRR的LNR区域和HD的不连续氨基酸残基。Notch3 3D结构的可获得性将促进确定这些 抑制剂的精确作用机理和设计干扰Notch3功能的新方案。

[0177] 除抗体的总体结构方面之外,可以通过结构性方法研究互补位和表位之间更特异 的相互作用。在一个实施方案中,CDR的结构对互补位有贡献,其中抗体能够借助所述互补 位与表位结合。可以按许多方式确定这种互补位的形状。可以使用传统的结构研究方法, 如NMR或X射线结晶学。这些方法可以研究互补位单独或它与表位结合时的形状。

[0178] 在一个实施方案中,互补位是包含CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中,互 补位包含表1中所列的序列。在一个实施方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的 至少一个氨基酸残基:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、 Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、 Aspl598和Hisl599。在一个实施方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个 氨基酸残基:Glnl427、Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、 Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602 和Serl606。

[0179] 在一个实施方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸 残基:Argl463、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486 和 Glyl487。在一个实施方案中,互补位包含与以下Notch3残基结合的至少一个氨基酸残 基:Serl440、Argl465、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Glul472、Argl434、Glul618、 Argl619 和Aspl621。

[0180] 备选地,分子模型可以用计算机方式生成。可以借助商业软件包,如来自 Accelrys(圣迭戈,加利福尼亚州)的Insightll建模软件包,通过同源性建模生成结 构。简而言之,可以使用待研究抗体的序列查找结构已知的蛋白质的数据库物,如Protein DataBank。在鉴定结构已知的同源蛋白后,使用这些同源蛋白作为建模的模板。可以比 对每个可能的模板,因此在模板之间产生基于结构的序列比对结果。结构未知的抗体的序 列随后可以与这些模板比对以产生结构未知的抗体的分子模型。本领域技术人员理解, 存在以计算机方式产生这类结构物的许多备选方法,可以使用其中任一种方法。例如, 利用QUANTA(PolygenCorp·,Waltham,Mass.)和CHARM(Brooks等人,(1983),J.Comp. Chem. 4:187)(所述文献通过引用的方式完地并入),可以使用与授予Hardman等人的美国 专利号5958708中描述的方法相似的方法。

[0181] 不仅互补位的形状在确定某个可能的互补位是否及怎样与表位结合中重要,表位 和互补位之间的相互作用本身还是设计变体抗体时的巨大信息来源。本领域技术人员理 解,存在其中可以研究这种相互作用的多种方式。一种模式是使用(可能如上文所述)所 生成的结构模型,并且随后使用一种具有对接模块的程序如Insightll(Accelrys,圣迭戈, 加利福尼亚州),所述对接模块尤其能够对互补位和其表位之间的构象空间和取向空间执 行MonteCarlo搜索。结果是能够评估表位与互补位在哪里以及怎样相互作用。在一个实 施方案中,仅表位的片段或变体用来辅助确定相关的相互作用。在一个实施方案中,整个表 位用于互补位和表位之间相互作用的建模。

[0182] 通过使用这些建模的结构,能够预测哪些残基在表位和互补位之间的相互作用中 最重要。因此,在一个实施方案中,能够轻易选择改变哪些残基以便改变抗体的结合特征。 例如,可以从对接模型显而易见,互补位中的某些残基的侧链可以在空间上阻碍表位的结 合,因此将这些残基改变成具有更小侧链的残基可能是有益的。可以借助许多方式确定这 一点。例如,可以简单地评判这两个模型并且基于官能团和接近度评估相互作用。备选地, 可以进行表位和互补位的反复配对,如上文所述,旨在获得更有利的能量相互作用。还可以 对抗体的多种变体确定这些相互作用,以确定其中抗体可能与表位结合的其它方式。还可 以组合多种模型以确定应当怎样改变抗体结构以获得具有所需特定特征的抗体。

[0183] 可以通过多种技术检验以上确定的模型。例如,可以用上文讨论的程序测定相互 作用能量以决定进一步检验哪些变体。另外,库仑相互作用和范德瓦尔斯相互作用用来确 定表位和变体互补位的相互作用能量。另外,位点定向诱变用来观察抗体结构中预测的变 化是否实际上产生所需的结合特征变化。备选地,可以对表位作出变化以验证模型是正确 的或以确定可能在互补位和表位之间出现的总体结合主线(bindingtheme)。

[0184] 本领域技术人员理解,尽管这些模型提供了为产生本发明实施方案的抗体及其变 体所必需的指导,但仍可能需要进行计算机模型的例行检验,这可能通过体外研究进行。此 外,本领域技术人员显而易见的是,任何修饰还可能对抗体的活性产生额外的副作用。例 如,尽管据预测导致更大结合作用的任何改变可以诱导更大的结合作用,它还可以造成可 能减少或改变抗体活性的其他结构性变化。确定情况是否为这样是本领域常规行为并且可 以按许多方式实现。例如,可以通过ELISA试验检验活性。备选地,可以通过使用表面等离 子体共振装置受试样品。

[0185]Notch3 抗体

[0186] 本公开提供了识别Notch3的至少一个构象表位的抗体。本公开基于以下研究结 果:一类针对Notch3的抗体与表2中公开的Notch3特定构象表位结合。

[0187] 表2:Notch3抗体的例子

[0188]

Figure CN105246916AD00341

[0189] L0190J

Figure CN105246916AD00351

[0191]

[0192]

[0193]

[0194] L0195J

Figure CN105246916AD00411

L0197J

Figure CN105246916AD00431

[0199]

[0200]

Figure CN105246916AD00461

Figure CN105246916AD00471

[0203]

[0204]

[0205]

[0206]

[0207]

Figure CN105246916AD00531

[0209]

[0210]

[0211]

[0212]

[0213]

[0214]

Figure CN105246916AD00601

[0215] 本公开提供特异性结合Notch 3蛋白(例如,人和/或食蟹猴Notch 3)的抗体或 其片段,所述抗体包含具有SEQID N0:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189 和 209 的氨 基酸序列的VH结构域。本公开提供特异性结合Notch 3蛋白(例如,人和/或食蟹猴Notch 3)的抗体或其片段,所述抗体包含具有SEQID N0:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199 和219的氨基酸序列的VL结构域。本公开还提供与Notch 3 (例如,人和/或食蟹猴Notch 3)特异性结合的抗体或其片段,所述抗体尤其包含具有表1中所列的任一个CDR的氨基酸 序列的CDR。特别地,本公开提供与Notch 3蛋白(例如,人和/或食蟹猴Notch 3)特异性 结合的抗体,所述抗体包含1、2、3、4、5个或更多个⑶R(或备选地,由其组成),所述⑶R具 有在表2中列出的任一个CDR的氨基酸序列。

[0216] 其他抗体或其片段包括这些抗体,其中所述氨基酸或编码所述氨基酸的核酸已经 被突变,但仍与表2中描述的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 和99 %同一性。在一些实施方案中,其包括突变的氨基酸序列,其中在与表2所述序列所示 的可变区相比时,可变区中已突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸,但保留基本相同的治疗 活性。

[0217] 由于这些抗体或其片段的每一种均可以与Notch3结合,可以"混合并匹配"VH、 VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)以产生 其他Notch3的抗体。可以使用本领域已知的结合测定法(例如,ELISA和实施例部分中 描述的其他测定法)测试这类"混合和匹配的"结合Notch3的抗体。在混合和匹配这些 链时,应当将来自特定VH/VL配对的VH序列替换为结构相似的VH序列。同样,来自特定全 长重链/全长轻链配对的全长重链序列应当替换为结构上相似的全长重链序列。同样,来 自特定VH/VL配对的VL序列应当替换为结构上相似的VL序列。同样地,应当将来自特定 全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列替换为结构相似的全长轻链序列。

[0218] 因此,在一个方面,本公开提供一种分离的单克隆抗体或其片段,它们具有:包含 选自SEQID勵:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189和209的氨基酸序列的重链可变 区;和包含选自SEQID勵:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199和219的氨基酸序列的 轻链可变区;其中抗体与Notch3 (例如,人和/或食蟹猴)特异性结合。

[0219] 在另一个方面,本公开提供Notch3抗体,所述Notch3抗体包含如表2中所述的 重链和轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3或其组合。所述抗体的重链可变区⑶R1的氨基酸序列在 SEQID勵:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203中显示。所述抗体的重链可变区 CDR2 的氨基酸序列在SEQID勵:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204 中显示。所 述抗体的重链可变区CDR3的氨基酸序列在SEQIDN0:5、25、45、65、85、105、125、145、165、 185和205中显示。所述抗体的轻链可变区CDR1的氨基酸序列在SEQIDN0:13、33、53、 73、93、113、133、153、173、193和213中显示。所述抗体的轻链可变区CDR2的氨基酸序列在 SEQIDN0:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214中显示。所述抗体的轻链可变区 CDR3的氨基酸序列在SEQIDN0:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195和215中显示。使 用Kabat系统描述CDR区(Kabat等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunological Interest,第5版,美国卫生和公众服务部,NIH出版编号91-3242 ;Chothia等人,(1987) J.Mol.Biol. 196:901-917;Chothia等人,(1989)Nature342:877-883 ;和Al-Lazikani等 人,(1997)J.Mol.Biol. 273, 927-948)。

[0220] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:3的 CDR1;SEQIDN0:4 的CDR2;SEQIDN0:5 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDNO: 13 的CDR1;SEQ IDNO: 14 的CDR2 ;和SEQIDNO: 15 的CDR3。

[0221] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 9的VH和SEQID N0:19 的VL。

[0222] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO: 23的 CDR1;SEQIDN0:24 的CDR2;SEQIDN0:25 的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:33 的CDR1; SEQIDN0:34 的CDR2 ;和SEQIDN0:35 的CDR3。

[0223] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 29的VH和SEQ IDNO:39 的VL。

[0224] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:43的 CDR1;SEQIDN0:44 的CDR2;SEQIDN0:45 的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:53 的CDR1; SEQIDN0:54 的CDR2 ;和SEQIDN0:55 的CDR3。

[0225] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 49的VH和SEQ IDNO:59 的VL。

[0226] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:63的 CDR1;SEQIDN0:64 的CDR2;SEQIDN0:65 的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:73 的CDR1; SEQIDN0:74 的CDR2 ;和SEQIDN0:75 的CDR3。

[0227] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 69的VH和SEQ IDNO:79 的VL。

[0228] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:83的 CDR1;SEQIDN0:84 的CDR2;SEQIDN0:85 的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:93 的CDR1; SEQIDN0:94 的CDR2 ;和SEQIDN0:95 的CDR3。

[0229] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 89的VH和SEQ IDNO:99 的VL。

[0230] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO: 103 的CDR1;SEQIDNO: 104 的CDR2;SEQIDNO: 105 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDNO: 113 的 CDR1;SEQIDNO: 114 的CDR2 ;和SEQIDNO: 115 的CDR3。

[0231] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 109的VH和SEQ IDNO: 119 的VL。

[0232] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO: 123 的CDR1;SEQIDNO: 124 的CDR2;SEQIDNO: 125 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDNO: 133 的 CDR1;SEQIDNO: 134 的CDR2 ;和SEQIDNO: 135 的CDR3。

[0233] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 129的VH和SEQ IDNO: 139 的VL。

[0234] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO: 143 的CDR1;SEQIDNO: 144 的CDR2;SEQIDNO: 145 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDNO: 153 的 CDR1;SEQIDNO: 154 的CDR2 ;和SEQIDNO: 155 的CDR3。

[0235] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 149的VH和SEQ IDNO: 159 的VL。

[0236] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO: 163 的CDR1;SEQIDNO: 164 的CDR2;SEQIDNO: 165 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDNO: 173 的 CDR1;SEQIDNO: 174 的CDR2 ;和SEQIDNO: 175 的CDR3。

[0237] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 169的VH和SEQ IDNO: 179 的VL。

[0238] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO: 183 的CDR1;SEQIDNO: 184 的CDR2;SEQIDNO: 185 的CDR3 ;轻链可变区SEQIDNO: 193 的 CDR1;SEQIDNO: 194 的CDR2 ;和SEQIDNO: 195 的CDR3。

[0239] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 189的VH和SEQ IDNO: 199 的VL。

[0240] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:203 的CDR1;SEQIDN0:204 的CDR2;SEQIDN0:205 的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:213 的 CDR1;SEQIDN0:214 的CDR2 ;和SEQIDN0:215 的CDR3。

[0241] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含SEQIDNO: 209的VH和SEQ IDNO:219 的VL。

[0242] 在一个具体实施方案中,与Notch3结合的抗体包含重链可变区SEQIDNO:223 的CDR1;SEQIDN0:224 的CDR2;SEQIDN0:225 的CDR3;轻链可变区SEQIDN0:233 的 CDR1;SEQIDN0:234 的CDR2 ;和SEQIDN0:235 的CDR3。

[0243] 在一个具体实施方案中,与Notch 3结合的抗体包含SEQ ID NO: 229的VH和SEQ ID NO:239 的 VL。

[0244] 在一个实施方案中,Notch 3抗体是诘抗抗体。在某些实施方案中,与Notch3结 合的抗体是表2中描述的抗体。

[0245] 在一个实施方案中,本发明涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或 其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区 域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选自 LNR-A、LNR-B、LNR-C;其中HD结构域选自N端HD和C端HD ;其中抗体或其片段阻断配体依 赖的信号转导;并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。

[0246] 在一个实施方案中,本发明涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或 其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区 域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选自 LNR-A、LNR-B、LNR-C;其中HD结构域选自N端HD和C端HD ;其中抗体或其片段阻断配体依 赖的信号转导;并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域,并 且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。

[0247] 在一个实施方案中,本发明涉及一种识别Notch3受体的构象表位的分离抗体或 其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR)区 域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选自 LNR-A、LNR-B、LNR-C;其中HD结构域选自N端HD和C端HD ;其中抗体或其片段阻断配体 依赖的信号转导;并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域; 并且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。

[0248] 在一个实施方案中,本发明涉及一种识别Notch 3受体的构象表位的分离抗体或 其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区 域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选 自LNR-A、LNR-B、LNR-C ;其中HD结构域选自N端HD和C端HD ;其中抗体或其片段阻断配 体依赖的信号转导;并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch 3受体LNR区 域;并且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变;其中突变选自S1580L和 G1487D〇

[0249] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。

[0250] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在NRR区域的LNR-A/B接头中的氨基酸残基。

[0251] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在NRR区域的LNR-A/B接头中的氨基酸残基和在NRR区域的LNR - HD接 头中的氨基酸残基。

[0252] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中构象表位还包含在NRR区域的LNR - HD接 头中的氨基酸残基。

[0253] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中构象表位还包含在NRR区域的LNR - HD接 头中的氨基酸残基和在HD β 4-α 3环中的氨基酸残基。

[0254] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中构象表位还包含在HD β 4-α 3环中的氨基 酸残基。

[0255] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中构象表位还包含在LNR-A/B接头、LNR-B/C 接头、LNR-HD接头和HD β 4- α 3环中的氨基酸残基。

[0256] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中构象表位还包含在LNR-A/B接头、LNR-B/C 接头、LNR-HD接头和HD β 4-α 3环中的氨基酸残基;并且其中抗体或其片段稳定处于自我 抑制状态的Notch 3受体LNR区域。

[0257] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域 是LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的 Notch 3受体LNR区域。

[0258] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域 是LNR-B,并且HD结构域是HD α 3螺旋;并且其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的 Notch3受体LNR区域,并且其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。

[0259] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HDα3螺旋,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基 突变。

[0260] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HDα3螺旋,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个选自以下的 氨基酸残基突变:S1580L、D1587N、Υ1624Η、L1518M、Α1537Τ、Ν1597Κ、L1547V、R1526C(HD) 和G1487D、(LNR-C)、P2034fs、P2067fs( "fs"指移码)、p2177fs、Q2075*( 指终止密码 子)、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、G2038S、G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、P2178S或其组合。

[0261] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分 离抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列 (LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR 区域是LNR-B,并且HD结构域是HDα3螺旋;并且其中构象表位包含氨基酸残基:(LNR-A/ Β接头的)1427-1429、(LNR-B的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/C接 头的)1461-1462、1464、(LNR-HD接头的)1507-1508、1510、(HDβ4-α3 环的)1592、 1594-1599、1602和(HDα3螺旋的)1606或者其子集。

[0262] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HDα3螺旋;并且其中抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch 3 残基结合:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、 Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598 和 Hisl599〇

[0263] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-B,并且HD结构域是HDα3螺旋;并且其中抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch 3 残基结合:Glnl427、Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、 Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602 和 Serl606。

[0264] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα 2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。

[0265] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B中的氨基酸残基。

[0266] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B中的氨基酸残基并且还包含在NRR区域的LNR-B/C 接头中的氨基酸残基。

[0267] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα 2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基。

[0268] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在NRR区域的LNR-B/C接头中的氨基酸残基并且还包含在HDα3-β5 环中的氨基酸残基。

[0269] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在HDa3-β5环中的氨基酸残基。

[0270] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDa2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中构象表位还包含在LNR-B、LNR-B/C接头和HDa3-β5环中的氨基酸残基。

[0271] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDa2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中抗体或其片段稳定处于自我抑制状态的Notch3受体LNR区域。

[0272] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中Notch3受体是突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残 基突变。

[0273] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中Notch3受体是突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个选自以下 的氨基酸残基突变:S1580L、D1587N、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD) 和G1487D、 (LNR-C)、P2034fs、P2067fs、p2177fs、Q2075*、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、 G2038S、G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、 P2178S或其组合。

[0274] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域 是LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转 导,其中Notch3受体是突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨 基酸残基突变,其中构象表位包含氨基酸残基:(LNR-B的)1440、(LNR-B/C接头的)1463、 1465-1468、(LNR-C的)1469-1472、1474、1486-1487、(HDα2 螺旋的)1534 以及(α3-β5 环的)1618、1619和1621或其子集。

[0275] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导, 其中Notch3受体是突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸 残基突变,其中抗体或其片段的VH与至少一个以下Notch3残基结合:Argl463、Thrl466、 Asnl468、Prol469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486 和Glyl487〇

[0276] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch3受体NRR结构域的LinNotch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导, 其中Notch3受体是突变体Notch3受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸 残基突变,其中抗体或其片段的VL与至少一个以下Notch3残基结合:Serl440、Argl465、 Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和Aspl621。

[0277] 在一个实施方案中,本发明涉及一种特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离 抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR) 区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是 LNR-C,并且HD结构域是HDα 2螺旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导,其 中Notch 3受体是突变体Notch 3受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残 基突变。

[0278] 如本文所用,如果抗体的可变区或全长链从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获 得,则人抗体包含特定种系序列的"产物"或"衍生自"特定种系序列的重链或轻链可变区或 全长重链或轻链。这类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用 这种目的抗原筛选噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。可以通过以下方式鉴定作为人 种系免疫球蛋白序列的"产物"或"衍生自"人种系免疫球蛋白序列的人抗体:将人抗体的 氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列比较并且选择在序列方面与该人抗体的序 列最接近(即最大同一性%)的人种系免疫球蛋白序列。作为特定人种系免疫球蛋白序列 的"产物"或"衍生自"特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以含有与该种系序列相比, 例如因天然存在的体细胞突变或特意引入位点定向突变所致的氨基酸差异。然而,在VH或 VL构架区中,选择的人抗体一般在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序 列至少90%同一并且含有与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如,鼠种系序列) 相比时,确定所述人抗体为人类的氨基酸残基。在某些情况下,人抗体可以在氨基酸序列上 与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、或至少95%、或 甚至至少96 %、97 %、98 %或99 %同一。一般地,重组人抗体将在VH或VL构架区内显示与 人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列存在不多于10个氨基酸的不同。在某些情况下, 人抗体可以显示与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列存在不多于5个、或甚至不多 于4、3、2或1个氨基酸的不同。

[0279] 本文中公开的抗体可以是单链抗体、双抗体(diabody)、结构域抗体、纳米体和单 一抗体(unibody)的衍生物。"单链抗体"(scFv)由单条多肽链组成,所述单条多肽链包 含与VH结构域连接的VL结构域,其中VL结构域和VH结构域配对以形成单价分子。单链 抗体可以根据本领域已知的方法制备(见,例如Bird等人,(1988)Science242:423-426 和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。"disbud" 由两条链组 成,每条链包含与短肽接头连接的相同多肽链上的轻链可变区连接的重链可变区,其中相 同链上的这两个区域不彼此配对,但是与另一条链上的互补结构域配对以形成双特异性分 子。制备双抗体的方法是本领域已知的(见,例如Holliger等人,(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.USA90:6444-6448 以及Poljak等人,(1994)Structure2:1121-1123)。结构域抗体 (dAb)是抗体的有功能的小结合单位,对应于抗体重链或轻链的可变区。结构域抗体在细 菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好表达。结构域抗体及其产生方法的其他细节是本领域 已知的(见,例如美国专利号 6, 291,158 ;6, 582, 915 ;6, 593, 081 ;6, 172, 197 ;6, 696, 245 ; 欧洲专利 0368684&0616640;TO05/035572、TO04/101790、TO04/081026、TO04/058821、 W0 04/003019和W0 03/002609。纳米体源自抗体的重链。纳米体一般包含单个可变域和 两个恒定域(CH2和CH3)并保留原始抗体的抗原结合能力。纳米体可以通过本领域已知的 方法制备(见,例如美国专利号6, 765, 087 ;美国专利号6, 838, 254、W0 06/079372)。单一 抗体(unibody)由IgG4抗体的一条轻链和一条重链组成。可以通过移除IgG4抗体的铰链 区制备单一抗体。可以在W0 2007/059782中找到单一抗体及制备它们的方法的其他细节。

[0280] 同源抗体

[0281] 在又一个实施方案中,本公开提供了包含与表2中所述序列同源的氨基酸序列的 抗体或其片段,且所述抗体与Notch3蛋白(例如,人和/或食蟹猴Notch3)结合并且保 留表2中描述的那些抗体的所需功能特征。

[0282] 例如,本公开提供一种包含重链可变区和轻链可变区的分离单克隆抗体(或其功 能性片段),其中所述重链可变区包含与选自SEQIDN0:9、29、49、69、89、109、129、149、 169、189、209和229的氨基酸序列至少80%、至少90%或至少95%同一的氨基酸序列;轻 链可变区包含与选自SEQIDN0s:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199和219的氨基酸 序列至少80%、至少90%或至少95%同一的氨基酸序列;该抗体与Notch3 (例如,人和/ 或食蟹猴Notch3)结合并抑制Notch3的信号传导活性,这可以例如通过如实施例中所述 的ICD3测定法测量。本发明范围内还包括为哺乳动物细胞中的表达而优化的可变重链和 轻链亲本核苷酸序列;和全长重链和轻链序列。其他抗体包括已经被突变,仍与上文所述序 列具有至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %同一性的氨基酸或核酸。在一些实施方案 中,它包括突变氨基酸序列,其中与上文所述序列的可变区相比时,已经在可变区中通过氨 基酸缺失、插入或置换而突变不多于1、2、3、4或5个氨基酸。

[0283] 在其他实施方案中,VH和/或VL氨基酸序列可以与表2中所述序列50%、60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一。在其他实施方案中,¥!1和/或¥1^氨 基酸序列可以是相同的,例外是不多于1、2、3、4或5个氨基酸位置中的氨基酸置换。可以 通过以下方式获得具有与表2中所述的那些抗体的VH区和VL区具备高(S卩,80%或更大) 同一性的VH区和VL区的抗体:诱变(例如,位点定向诱变或PCR介导诱变),随后使用本 文所述的功能测定法对编码的已改变的抗体检验保留的功能。

[0284] 在其他实施方案中,重链核苷酸序列和/或轻链核苷酸序列的可变区可以与上文 所述序列 60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一。

[0285] 如本文所用,考虑到需要为最佳比对这两个序列而导入的空位的数目和每个空位 的长度,两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置数的函数(即,%同一 性等于相同位置数/位置总数X100)。可以使用如下文非限制性实施例中所述的数学算 法,完成序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定。

[0286] 额外地或备选地,可以进一步使用本公开的核酸序列和蛋白质序列作为"查询序 列"以针对公共数据库执行进行检索,以例如鉴定相关序列。例如,可以使用Altschul等 人,(1990)J.Mol.Biol. 215:403-10 的BLAST程序执行此类检索。

[0287] 具有保守修饰的抗体

[0288] 其他抗体或其片段包括已经被突变,然而在⑶R区内具有与表2中所述⑶R区的 序列至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %同一性的氨基酸。在一些实施方案中,它包括 这样的突变氨基酸序列,其中与表2所述序列中描述的CDR相比时,CDR区中不多于1、2、3、 4或5个氨基酸已经被突变,同时仍维持它们对原始抗体的表位的特异性。

[0289] 其他抗体或其片段包括已经被突变,然而在构架区内具有与表2中所述构架区的 序列至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %同一性的氨基酸。在一些实施方案中,它包括 这样的突变氨基酸序列,其中与表2所述序列中描述的构架区相比时,构架区中不多于1、 2、3、4、5、6或7个氨基酸已经被突变,同时仍维持它们对原始抗体的表位的特异性。本发明 还提供了编码与Notch3蛋白(例如,人和/或食蟹猴Notch3)特异性结合的抗体的VH、 VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。

[0290] 在某些实施方案中,抗体具有包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区和包含 ⑶R1XDR2和⑶R3序列的轻链可变区,其中这些⑶R序列的一个或多个序列具有基于本文 所述的抗体或其保守修饰物的指定氨基酸序列,并且其中所述抗体保留结合Notch3的本 公开抗体的所需功能特性。

[0291] 因此,本公开提供一种分离的Notch3单克隆抗体或其片段,由包含⑶R1XDR2和 ⑶R3序列的重链可变区和包含⑶R1XDR2和⑶R3序列的轻链可变区组成,其中:重链可变 区CDR1 的氨基酸序列选自SEQIDN0 :3、23、43、63、83、103、123、143、163、183 和 203 及其保 守修饰物;重链可变区CDR2的氨基酸序列选自SEQIDN0:4、24、44、64、84、104、124、144、 164、184和204及其保守修饰物;重链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQIDN0:5、25、45、 65、85、105、125、145、165、185和205及其保守修饰物;轻链可变区CDR1的氨基酸序列选自 SEQIDN0:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193 和 213 及其保守修饰物;轻链可变区 CDR2 的氨基酸序列选自SEQID勵:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214及其保 守修饰物;轻链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQIDN0:15、35、55、75、95、115、135、155、 175、195和215及其保守修饰物;抗体或其片段与Notch3特异性结合并通过抑制Notch 3信号传导途径,抑制Notch3活性,这可以通过实施例中描述的Notch3测定法(例如, I⑶3测定法)测量。

[0292] 与相同构象表位结合的抗体

[0293] 本公开提供同与表2中描述的结合Notch3的抗体相同的构象表位相互作用(例 如,通过结合、空间位阻、稳定空间分布)的抗体。额外的抗体可以因此基于它们在Notch3 结合测定法中与其他抗体交叉竞争(例如,以统计显著方式竞争性抑制结合作用)的能力 被鉴定。试验抗体抑制本公开抗体与Notch3蛋白(例如,人和/或食蟹猴Notch3)结合 的能力表明,该试验抗体能与这种抗体竞争结合Notch3 ;根据非限制性理论,这种抗体可 以结合至与它竞争的抗体在Notch3蛋白上的相同或相关(例如,结构上相似或空间上靠 近的)构象表位。在某个实施方案中,与Notch3上相同构象表位结合的抗体是人单克隆 抗体。可以本文所述制备并分离这类人单克隆抗体。

[0294] 在一个实施方案中,抗体或其片段与包含Notch3的LNR区域和HD中不连续氨基 酸残基的构象表位结合以约束Notch3处于自我抑制型构象,所述自我抑制型构象阻止HD 内部的S2位点暴露于蛋白酶及阻止蛋白酶随后切割S3位点。在这些位点处缺少切割阻止 了下游Notch3信号转导。

[0295] 虽然不受提供理论的约束,一种可能的作用机理模型是Notch 3 NRR -般以自我 抑制型构象存在,其中各自配位一个Ca2+离子的三个LNR缠绕在HD周围以保护S2位点免 遭ADAM蛋白酶接近(例如,来自LNR-A/B接头的保守L1419直接塞入S2位点中并且在空间 阻碍蛋白酶接近它)。LNR和HD之间相互作用以及这些区域内部那些相互作用的稳定性对 维持NRR的自我抑制型构象至关重要。Notch 3 NRR中的突变打开自我抑制型构象,因而暴 露HD结构域,从而蛋白酶可切割S2位点以及随后切割S3位点,因而活化下游Notch 3信号 转导。因此,去稳定NRR的突变,如(本文中公开的)相关癌症中存在的那些突变,能增强 Notch 3的活化。另一方面,能稳定LNR-HD相互作用的试剂如抗体能潜在地抑制Notch 3 信号传导。抗体或其片段如20350和20358结合Notch 3的自我抑制型构象并稳定化(直 接维持、束缚、锁定)自我抑制型构象,因而阻止HD暴露于蛋白酶切割作用,并阻止后续的 下游Notch 3信号传导。

[0296] 抗体或其片段抑制Notch3的配体活化;配体非依赖的Notch3活化;和在不阻 止配体结合情况下抑制配体依赖的和非依赖的Notch3活化。认为这是有利的,因为不同 的肿瘤类型受每种机制驱动,所以治疗性抗体会比靶向单一(即配体依赖的或配体非依赖 的)Notch3活化机制的抗体在广泛类型的肿瘤中具有临床用途。

[0297] 因此,这些抗体可以用来治疗现有治疗性抗体在临床上无效的疾病。

[0298] 工程化和修饰的抗体

[0299] 可以使用具有本文所示的作为原料以工程化修饰抗体的一个或多个VH和/或VL 序列的抗体制备抗体,所述修饰的抗体可以与起始抗体比较具有改变的特性。可以通过修 饰在一个或两个可变区(即VH和/或VL)内部,例如一种或多种CDR区内部和/或一个或 多个构架区内部的一个或多个残基,将抗体工程化。额外地或备选地,可以通过修饰恒定区 内部的残基,例如以改变抗体的效应子功能),将抗体工程化。

[0300] 可以进行的一种可变区工程化是⑶R移植。抗体优势地通过位于六个重链和轻 链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于这个原因,各抗体之间CDR 内部的氨基酸序列比CDR外部更多样。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用, 所以可以通过构建表达载体表达模拟天然存在的特定抗体的特性的重组抗体,其中所述表 达载体包含来自该天然存在的特定抗体的CDR序列,所述CDR序列被移植到来自具有不同 特性的不同抗体的构架序列上(参见,例如Riechmann等人,(1998)Nature332:323-327; Jones等人,(1986)Nature321:522-525;Queen等人,(1989)Proc.Natl.Acad·,U. S.A. 86:10029-10033 ;授予Winter的美国专利号5, 225, 539,和授予Queen等人的美国专 利号 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。

[0301] 因此,另一个实施方案涉及一种包含重链可变区和轻链可变区的分离的Notch3 抗体或其片段,所述重链可变区分别包含了具有选自SEQIDN0:3、23、43、63、83、103、123、 143、163、183和 203 的氨基酸序列的CDR1序列;具有选自SEQIDN0:4、24、44、64、84、104、 124、144、164、184和 204 的氨基酸序列的CDR2序列;具有选自SEQIDN0:4、10、22、28、 40、46、58、64、76、82、94、100、112、118、130、136、148、154、166、172、184、190、202、208、220、 226、238、244、256、262、274、280、292、298、310、316、328、334、346、352、364 和 370 的氨基酸 序列的CDR3序列,所述轻链可变区分别包含了具有选自SEQIDN0:13、33、53、73、93、113、 133、153、173、193和213的氨基酸序列的CDR1序列;具有选自SEQIDN0:14、34、54、74、 94、114、134、154、174、194 和 214 的氨基酸序列的CDR2 序列;具有选自SEQIDNO: 15、35、 55、75、95、115、135、155、175、195和215的氨基酸序列的0«3序列。

[0302] 因而,这类抗体含有抗体的VH和VL⑶R序列,但可以含有与这些抗体不同的构 架序列。这类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公布的参考文 献中获得。例如,人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在"Vase"人种系序列 数据库(在互联网上以下网址可获得:www.mrc_cpe.cam·ac.uk/vbase)中以及在Kabat 等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 5 版,美国卫生 和公众服务部,NIH出版编号 91-3242;Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol. 196:901-917 ; Chothia等人,(1989)Nature342:877-883;andAl-Lazikani等人,(1997)J.Mol. Biol. 273:927-948;Tomlinson等人,(1992)J.fol.Biol. 227:776-798;和Cox等 人,(1994)Eur.JImmunol. 24:827-836中找到;所述各篇文献的内容明确地通过引用的方 式并入本文作为参考。

[0303] 用于抗体中的构架序列的例子是这些序列,所述序列在结构上与本公开的所选择 抗体使用的构架序列(例如,本公开的单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列)相似。 可以将VHCDR1、2和3序列和VLCDR1、2和3序列移植到下述构架区上,所述构架区的序 列与衍生该构架序列的种系免疫球蛋白基因中存在的序列相同,或可以将所述CDR序列移 植到与种系序列相比含有一种或多种突变的构架区上。例如,已经发现在某些情况下,使构 架区内部的残基突变有益于维持或增强抗体的抗原结合能力(见,例如授予Queen等人的 美国专利号 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。

[0304] 另一个类型的可变区修饰是突变VH和/或VL⑶R1区、⑶R2区和/或⑶R3区内 部的氨基酸残基,以便因而改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力),称作"亲 和力成熟"。可以进行位点定向诱变或PCR介导的诱变以引入突变,并且可以在如本文所述 和实施例中提供的体外或在体内测定法中评价对抗体结合作用或其他目的功能特性的影 响。可以引入(如上文讨论的)保守修饰。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失。另外,一 般改变⑶R区内部不多于1个、2个、3个、4个、5个残基。

[0305] 因此,在一个实施方案中,本公开提供一种分离的Notch3抗体或其片段,所述抗 体或其片段由重链可变区组成,所述重链可变区具有:由选自具有SEQIDN0:3、23、43、63、 83、103、123、143、163、183 和 203 的氨基酸序列组成或由与SEQIDN0:3、23、43、63、83、 103、123、143、163、183和203相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨 基酸序列组成的VHCDR1 区域;具有选自SEQIDN0:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184 和 204 的氨基酸序列或与SEQIDN0:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184 和 204 相比含 1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VHCDR2区域;具有选自 SEQIDN0:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185和 205 的氨基酸序列或与SEQIDN0:5、 25、45、65、85、105、125、145、165、185和205相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺 失或添加的氨基酸序列的VHCDR3区域;具有选自SEQIDN0:13、33、53、73、93、113、133、 153、173、193 和 213 的氨基酸序列或与SEQIDN0:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193 和213相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VLCDR1区 域;具有选自SEQID勵:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214的氨基酸序列或与 SEQIDN0:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194和214相比含1个、2个、3个、4个、5个 氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的VL⑶R2区域;和具有选自SEQIDN0:15、35、55、 75、95、115、135、155、175、195和215的氨基酸序列或与SEQIDN0:15、35、55、75、95、115、 135、155、175、195和215相比含1个、2个、3个、4个、5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸 序列的VL⑶R3区域。

[0306] 移植抗体片段至备选的构架或支架中

[0307] 可以使用广泛类型的抗体/免疫球蛋白构架或支架,只要所产生的多肽包括至少 一个与Notch3特异性结合的结合区。这类构架或支架包括5个主要独特型的人免疫球蛋 白或其片段,并且包括其他动物物种的免疫球蛋白,优选地具有人源化方面。新的构架、支 架和片段继续由本领域技术人员发现并开发。

[0308] 在一个方面,本公开涉及使用可以将CDR移植到其上的非免疫球蛋白支 架产生基于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知的或将来的非免疫球蛋白构架 和支架,只要它们包含对靶Notch3蛋白(例如,人和/或食蟹猴Notch3)特异 的结合区。已知的非免疫球蛋白构架或支架包括但不限于纤连蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,ΜΑ)、锚蛋白(MolecularPartnersAG,Zurich,瑞士)、结 构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA和Ablynxnv,Zwijnaarde,比利时)、脂笼蛋白 (PierisProteolabAG,Freising,德国)、小模块免疫药物(TrubionPharmaceuticals Inc. ,Seattle,WA)nmaxybodies(Avidia,Inc. ,MountainView,CA)、蛋白A(AffibodyAG, 瑞典)和affilin(Y_晶体蛋白或遍在蛋白)(ScilProteinsGmbH,Halle,德国)。

[0309] 纤连蛋白支架基于纤连蛋白III型结构域(例如,纤连蛋白III型的第十模块 pFnS结构域))。纤连蛋白III型结构域具有7条或8条β链,这些β链分布在两个β 折叠之间,所述β折叠本身相互叠加以形成蛋白质的核心,并且还含有使β链彼此连接并 且暴露于溶剂的环(类似于CDR)。在β折叠夹心的每条边缘存在至少三个这样的环,其中 所述边缘是与β链的方向垂直的蛋白质边界(参见US6 818 418)。这些基于纤连蛋白的 支架不是免疫球蛋白,不过总体折叠与包含骆驼和羊驼IgG中完整抗原识别单元的最小功 能性抗体片段(即重链可变区)密切相关。由于这种结构,非免疫球蛋白抗体模拟在性质 和亲和力方面与抗体相似的抗原结合特性。这些支架可以用于与体内抗体亲和力成熟过程 类似的体外环随机化和改组策略。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架,其中可以使用 标准克隆技术,将该分子的环区域更换为CDR。

[0310] 锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复序列模块作为支架以携带可变区的 蛋白质,所述的可变区可以用于与不同靶结合。锚蛋白重复序列模块是一种由两个反平行 螺旋和一个β转角组成的33氨基酸多肽。大多通过使用核糖体展示法优化可变区的 结合。

[0311] 高亲和性多聚体(avimer)衍生自含有Α-结构域的天然蛋白质如Notch3。这些 结构域由自然界用于蛋白质-蛋白质相互作用并且在人类中超过250种蛋白质在结构上基 于A-结构域。高亲和性多聚体由借助氨基酸接头连接的多个不同"A-结构域"单体(2-10 个)组成。使用例如在美国专利申请公开号20040175756 ;20050053973 ;20050048512 ;和 20060008844中描述的方法学,可以产生可以与靶抗原结合的高亲和性多聚体。

[0312] 亲和体(affibody)亲和配体是包含一个三螺旋束的简单小蛋白,所述三螺 旋束基于蛋白A的IgG结合结构域之一的支架。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)的表面蛋白。这种支架结构域由58个氨基酸组成,其中13个氨 基酸经随机化以产生具有大量配体变体的亲和体文库(参见例如,US5 831 012)。亲和体 分子模拟抗体,与150kDa的抗体分子量相比,它们具有6kDa的分子量。尽管其尺寸小,亲 和体分子的结合位点类似于抗体。

[0313] 抗笼蛋白(Anticalin)是由PierisProteoLabAG公司开发的产品。它们衍生自 脂笼蛋白,一组广泛分布的小而稳健的通常参与生理学运输或储存化学敏感性或不溶性化 合物的蛋白质。几种天然脂笼蛋白存在于人组织或体液中。该蛋白质的构造类似于免疫球 蛋白,在刚性构架顶部上具有高变环。但是,与抗体或其重组片段相反,脂笼蛋白由仅略微 大于单个免疫球蛋白结构域的具有160个至180个氨基酸残基的单条多肽链组成。构成结 合袋的一组四个环显示突出的结构塑性并且耐受多种侧链。结合位点因此可以在专有过程 中再成型,旨在以高亲和力和高特异性识别规定的不同形状的靶分子。一种脂笼蛋白家族 蛋白,大菜粉蝶(Pierisbrassicae)的后胆色素结合蛋白(BBP),已经用来通过诱变这四 个环集合,开发抗笼蛋白(Anticalin)。描述抗笼蛋白的专利申请的一个例子在PCT公开号 TO199916873 中。

[0314]affi1in分子是小的非免疫球蛋白,其中就针对蛋白质和小分子的特异性亲和力 设计所述蛋白质。新的affilin分子可以非常迅速地选自两个文库,每个文库基于人衍 生的不同支架蛋白。affilin分子不对免疫球蛋白显示任何结构同源性。目前,使用两种 affilin支架,其中之一是γ晶体蛋白(人眼晶状体结构性蛋白)并且另一种是"遍在蛋 白"超家族蛋白。两种人类支架均非常小,显示高温稳定性并且几乎均抵抗pH变化和变性 剂。这种高稳定性主要归因于蛋白质的扩展β折叠结构。γ晶体蛋白衍生的蛋白质的例 子在W0 200104144中描述并且"遍在蛋白样"蛋白质的例子在W0 2004106368中描述。

[0315] 蛋白质表位模拟物(ΡΕΜ)是模拟蛋白质β-发夹二级结构(参与蛋白质-蛋白质 相互作用的主要二级结构)的中等大小、环状肽样分子(MWl_2kDa)。

[0316] 在一些实施方案中,通过改变Fc区,将Fab转化成沉默性IgGl样式。例如,表2 中的抗体可以转化成IgG样式。

[0317] 人抗体或人源化抗体

[0318] 本公开提供与Notch3蛋白(例如,人和/或食蟹猴/小鼠/小鼠Notch3)特异 性结合的全人抗体。与嵌合或人源化抗体相比,施用至人类受试者时,结合Notch3的人抗 体具有进一步降低的抗原性。

[0319] 可以使用本领域已知的方法生成结合Notch3的人抗体。例如,人工程化技术用 来将非人抗体转化成工程化的人抗体。美国专利公开号20050008625描述了在抗体中将非 人抗体可变区更换为人可变区,同时维持相同结合特性或相对于非人抗体提供更好结合特 征的体内方法。该方法依赖于表位指导的全人抗体替换非人类参考抗体的可变区。所得到 的人抗体通常在结构上与参比非人抗体不相关,但是结合至相同抗原上与参考抗体相同的 表位。简而言之,通过在响应于试验抗体与抗原结合的报道分子系统存在下,在细胞中针对 与有限量抗原结合在"竞争者"和参考抗体("试验抗体")的多样性杂交体文库之间建立 竞争,能够进行表位指导的系列互补性替换方案。竞争者可以是参考抗体或其衍生物如单 链Fv片段。竞争者也可以是抗原的天然或人工配体,所述配体结合至与参考抗体相同的表 位。对竞争者的唯一要求是它结合至与参考抗体相同的表位并且它与参考抗体竞争结合抗 原。试验抗体具有共同来自非人参考抗体的一个抗原结合性V区和从多样性来源如人抗体 文库随机选择的另一个V区域。来自参考抗体的共同V区充当引导,将试验抗体在抗原上 的相同表位上并以相同取向安置,从而选择偏向于针对参考抗体的最高抗原结合精确度。

[0320] 许多类型的报道分子系统可以用来检测试验抗体和抗原之间的所需相互作用。例 如,互补性报道分子片段可以与抗原和试验抗体分别连接,从而通过片段互补作用的报道 分子活化仅在试验抗体与抗原结合时才出现。当试验抗体-和抗原-报道分子片段融合 物随竞争者一起共表达时,报道分子活化变得依赖于试验抗体与竞争者的竞争能力,这种 能力与试验抗体对抗原的亲和力成比例。可以使用的其他报道分子系统包括如美国专利 申请系列号10/208, 730 (公开号20030198971)中公开的自我抑制型报道分子再活化系统 (RAIR)的再活化物,或在美国专利申请系列号10/076, 845 (公开号20030157579)中公开的 竞争性活化系统。

[0321] 采用表位指导的系列互补性替换系统时,作出选择以鉴定表达单一试验抗体连同 竞争者、抗原和报道分子组分的细胞。在这些细胞中,每种试验抗体与竞争者一对一竞争与 有限量抗原的结合。报道分子的活性与试验抗体结合的抗原量成比例,该量转而与试验抗 体对抗原的亲和力和试验抗体的稳定性成比例。作为试验抗体表达时,最初基于试验抗体 相对于参考抗体的活性选择试验抗体。第一轮选择的结果是一组"杂合抗体",其中每一者 包含来自参考抗体的相同非人类V区和来自文库的人类V区,并且每一者结合抗原上与参 考抗体相同的表位。在第一轮中选择的一种或多种杂合抗体将对该抗原具有与参考抗体可 比或较之更高的亲和力。

[0322] 在第二V区替换步骤中,使用第一步骤中选择的人V区作为指导以用关联人V区 的多样性文库选择剩余非人类参考抗体V区的人替换物。也可以使用第一轮中选择的杂合 抗体作为第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果是一组在结构上与参考抗体不同、但是 与参考抗体竞争结合相同抗原的全人抗体。一些所选择的人抗体结合至相同抗原上与参考 抗体相同的表位。在这些选择的人抗体当中,一种或多种人抗体以可比于或高于参考抗体 的亲和力与相同表位结合。

[0323] 使用上文描述的结合Notch3的小鼠或嵌合抗体之一作为参考抗体,这种方 法可以轻易地用来产生以相同结合特异性和相同或更好的结合亲和力与人Notch3结 合的人抗体。此外,这类结合Notch3的人抗体也可以从定制生产人抗体的公司例如 KaloBios,Inc.(MountainView,CA)商业地获得。

[0324] 驼类抗体

[0325] 从胳5它和单峰盤(dromedary)(双峰盤(Camelusbactrianus)和单峰盤(Calelus dromaderius))家族成员,包括新世界成员如羊盤属物种(羊盤(Lamapaccos)、大羊马它 (Lamaglama)和小羊盤(Lamavicugna))获得的抗体蛋白已经就大小、结构复杂性和针对 人类受试者的抗原性进行了表征。如自然界中所找到的来自这个哺乳动物家族的某些IgG 抗体缺少轻链,并且因此在结构上区别于来自其他动物的抗体的具有两条重链和两条轻链 的常见四链四级结构。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公布的W0 94/04678)。

[0326] 可以通过基因工程获得驼类抗体的一个区域(该区域是小的单可变域,确定为 VHH)以产生对靶具有高亲和力的小蛋白质,从而产生称作"驼类纳米体"的低分子量抗体 衍生的蛋白。参见1998年6月2日授予的美国专利号5,759,808 ;还参见Stijlemans等 人,(2004)JBiolChem279:1256-1261;Dumoulin等人,(2003)Nature424:783-788 ; Pleschberger等人,(2003)BioconjugateChem14:440-448 ;Cortez_Retamozo等 人,(2002)IntJCancer89:456-62;和Lauwereys等人,(1998)EMB0J17:3512-3520。驼 类抗体和抗体片段的工程化文库是例如从Ablynx,Ghent,Belgium可商业获得的(例如,US 20060115470 ;Domantis(US20070065440、US20090148434)。与其他非人源抗体一样,驼类 抗体的氨基酸序列可以重组地改变以获得更逼真模仿人序列的序列,即,纳米体可以"人源 化"。因此可以进一步降低驼类抗体对人类的天然低的抗原性。

[0327] 驼类纳米体的分子量是人IgG分子的分子量的约十分之一,并且这种蛋白质具有 仅若干纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是盤类纳米体能够与较大抗体蛋白在功能上不 可识别的抗原位点结合,即,驼类纳米体可用作试剂以检测使用经典免疫技术时否则隐匿 的抗原,并且可以用作可能的治疗药。因此小尺寸的又一个结果是驼类纳米体可以因为与 靶蛋白的槽或狭缝中的特定位点结合而发挥抑制作用,并且因此可以提供比经典抗体更逼 真模仿经典低分子量药物功能的能力。

[0328] 低分子量和紧凑大小进一步导致驼类纳米体具有极端热稳定性、对极端pH和蛋 白酶解消化稳定和抗原性低。另一个结果是驼类纳米体轻易地从循环系统移入组织,并且 甚至跨越血-脑屏障并且可以治疗累及神经组织的病症。纳米体还可以促进跨血脑屏障运 输药物。参见2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征连同对人类 的低抗原性表明了巨大的治疗潜力。另外,这些分子可以在原核细胞如大肠杆菌中充分表 达和用噬菌体表达为融合蛋白并具有功能。

[0329] 因此,本公开的一个特征是一种对Notch3具有高亲和力的§它类抗体或纳米体。 在本文的某些实施方案中,驼类抗体或纳米体天然地在驼类动物中产生,即,在使用本文对 其他抗体所述的技术用Notch3或其肽片段免疫之后由驼类产生。备选地,如本文实施例 中所述,使用以Notch3作为靶的淘选法,从展示适当诱变的驼类纳米体蛋白的噬菌体文 库,将结合Notch3的驼类纳米体工程化(即,例如通过选择过程产生)。还可以通过基因 工程,定制工程化的纳米体以在接受受试者中具有45分钟至2周的半寿期。在一个具体实 施方案中,通过将人抗体重链或轻链的CDR序列移植入纳米体或单结构域抗体构架序列, 获得驼类抗体或纳米体,如PCT/EP93/02214中所述。

[0330] 在一个实施方案中,驼类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合: Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Cysl458、Glyl461、 Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、Aspl598 和Hisl599。 在一个实施方案中,3它类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合:Glnl427、 Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、Leul507、 Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602 和Serl606。

[0331] 在一个实施方案中,驼类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合: Argl463、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、Glnl486 和Glyl487。 在一个实施方案中,3它类抗体或纳米体与至少一个以下Notch3残基结合:Serl440、 Argl465、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Glul472、Argl434、Glul618、Argl619 和 Aspl621〇

[0332] 双特异性分子和多价抗体

[0333] 在另一个方面,本发明的特征在于包含本公开的Notch3抗体或其片段的双互补 位性、双特异性或多特异性分子。本公开的抗体或其片段可以进行衍生化或连接至另一种 功能分子,例如另一种肽或蛋白质(例如针对受体的另一种抗体或配体)以产生与至少两 个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。所述抗体可以实际上被衍生化或连接至多 于一种其他功能分子以产生与多于两个不同结合位点和/或靶分子结合的双互补位性或 多特异性分子;获得这类双互补位性或多特异性分子。为了产生本公开的双特异性分子,本 公开的抗体可以功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)至一 种或多种其他结合分子,如另一种抗体、抗体片段、肽或结合性模拟物,从而产生双特异性 分子。

[0334] 可以通过一种抗体内部结合两种或更多种抗原提供其他临床益处(Coloma等 人,(1997);Merchant等人,(1998);Alt等人,(1999);Zuo等人,(2000);Lu等人,(2004); Lu等人,(2005);Marvin等人,(2005);Marvin等人,(2006);Shen等人,(2007);Wu等 人,(2007);Dimasi等人,(2009);Michaelson等人,(2009))。(Morrison等人,(1997) NatureBiotech.l5:l59_l63;Alt等人(1"9)FEBSLetters454:9〇_94;Zuo等人,(2〇00) ProteinEngineering13:361-367;Lu等人,(2004)JBC279:2856-2865;Lu等人,(2005) JBC280:19665-19672;Marvin等人,(2005)ActaPharmacologicaSinica26:649-658; Marvin等人,(2006)CurrOpinDrugDiscDevelop9:184-193 ;Shen等人,(2007)JTmmun Methods218:65-74;Wu等人,(2007)NatBiotechnol.il:1290-1297;Dimasi等人,(2009) JMolBiol. 393:672-692;andMichaelson等人,(2009)mAbs1:128-141。

[0335] 可以通过使用本领域已知的方法缀合结合特异性的组分,制备本公开的双特异性 分子。例如,双特异性分子的每种结合特异性可以单独地产生并且随后彼此缀合。当结 合特异性是蛋白质或肽时,多种偶联剂或交联剂可以用于共价缀合。交联剂的实例包括 蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5, 5' -二硫代双(2-硝 基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫 代)丙酸酯(STOP)和磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺 基-SMCC)(参见,例如Karpovsky等人,(1984)J.Exp.Med. 160:1686;Liu等人,(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括在Paulus(1985)BehringIns.Mitt. No. 78:118-132;Brennan等人,(1985)Science229:81-83)和Glennie等人,(1987) J.Immunol. 139:2367-2375)中描述的那些方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC,二者均从 PierceChemicalCo. (Rockford,IL)可获得。

[0336] 当结合特异性是抗体时,它们可以通过两条重链的C端铰链区的硫氢基键合而缀 合。在一个特别的实施方案中,在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个硫氢基残基,例如1个 硫氣基残基。

[0337] 备选地,可以在相同的载体中编码并且在相同的宿主细胞中表达及装配两种结合 特异性。这种方法在下列情况特别有用,其中双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、Fab xF(ab')2或配体xFab融合蛋白。双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合 决定簇的单链分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含 至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法例如在美国专利号5, 260, 203 ;美国专 利号5, 455, 030 ;美国专利号4, 881,175 ;美国专利号5, 132, 405 ;美国专利号5, 091,513 ; 美国专利号5, 476, 786 ;美国专利号5, 013, 653 ;美国专利号5, 258, 498 ;和美国专利号 5,482,858 中描述。

[0338] 可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物 测定法(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定法证实双特异性分子与其特异性靶的结合。通 过使用针对特定的目的蛋白质-抗体复合物特异的标记试剂(例如抗体),这些测定法的每 一种通常检测目的复合物的存在。

[0339] 在另一个方面,本公开提供了包含与Notch3结合的抗体的至少两个相同或不同 片段的多价化合物。抗体片段可以经蛋白质融合或共价键或非共价键连接在一起。可以例 如通过将抗体与结合至本公开抗体的恒定区(例如Fc区或铰链区)结合的抗体交联,获得 四价化合物。三聚化结构域例如在Borean专利EP1012280B1中描述。五聚化模块例如在 PCT/EP97/05897 中描述。

[0340] 在一个实施方案中,双互补位性/双特异性分子与Notch3的LNR和HD内部的氨 基酸残基结合。

[0341] 在另一个实施方案中,本公开涉及双功能抗体,其中单个单克隆抗体已经如此修 饰,从而抗原结合位点与多于一种抗原结合,如结合Notch3和另一种抗原(例如,Notch 1,EGFR)的双功能抗体。因此,双功能抗体可以与Notch3和Notch1或EGFR结合。双功 能抗体的双结合特异性还可以翻译成双活性或对活性的抑制。(参见例如,JennyBostrom 等人,(2009)Science:323 ;1610-1614)。

[0342] 半寿期延长的抗体

[0343] 本公开提供与Notch3蛋白特异性结合的抗体,所述抗体具有延长的体内半寿 期。

[0344] 许多因素可影响蛋白质的体内半寿期。例如,肾过滤、肝脏中代谢、遭蛋白水解酶 (蛋白酶)降解和免疫原性反应(例如,抗体的蛋白质中和作用和被巨嗤细胞和树状细胞摄 取)。多种策略可以用来延长本公开抗体的半寿期。例如,通过化学连接至聚乙二醇(PEG)、 reCODEPEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和糖屏障;通 过与结合血清蛋白如白蛋白、IgG、FcRn结合并转移的蛋白质遗传融合;通过偶联(遗传或 化学方式)至与血清蛋白结合的其他结合部分如纳米体、Fab、DARPin、高亲和性多聚体、亲 和体和抗笼蛋白(Anticalin);通过与rPEG、白蛋白、白蛋白结构域、白蛋白结合蛋白和Fc 遗传融合;或通过掺入纳米载体、缓释制剂或医疗装置。

[0345] 为了延长抗体的体内血清循环,惰性聚合物分子如高分子量PEG可以在采用或不 采用多功能接头的情况下,借助PEG与抗体N末端或C末端的位点特异性缀合或借助赖氨 酸残基上存在的ε-氨基,连接至抗体或其片段。为了使抗体聚乙二醇化,一般使该抗体或 其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的活性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团变得与该 抗体或其片段连接的条件下反应。PEG化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水 溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应实施。如本文所用,术语"聚乙二醇"意图包括已经用 来衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG,如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙 二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中,待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。使用导致 生物活性丧失最少的直链或分枝聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测缀 合程度以确保PEG分子与抗体正确缀合。未反应的PEG可以通过大小排阻层析或通过离子 交换层析与抗体-PEG缀合物分离。可以使用本领域技术人员熟知的方法,例如通过本文所 述的免疫测定法对PEG衍生化的抗体测试结合活性以及体内功效。使蛋白质聚乙二醇化的 方法是本领域已知的并且可以应用于本公开的抗体。见例如,Nishimura等人的EP0 154 316 和Ishikawa等人的EP0 401 384

[0346] 其他改良的聚乙二醇化技术包括重构化学正交定向工程化技术(ReCODEPEG),该 技术借助包括tRNA合成酶和tRNA的重构系统将化学指定的侧链掺入生物合成的蛋白质。 这项技术使得能够在大肠杆菌(E.coli)、酵母和哺乳动物细胞中将多于30个新氨基酸掺 入生物合成的蛋白质中。tRNA在存在任何琥珀密码子的位置掺入非天然氨基酸,使琥珀密 码子从终止密码子转变成发出信号掺入化学指定的氨基酸的一个密码子。

[0347] 重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可以用于血清半寿期延长。这项技术涉及300-600 个氨基酸的非结构化蛋白质尾与现有药用蛋白质遗传融合。因为这种非结构化蛋白质链的 表观分子量比其实际分子量大了约15倍,所以这种蛋白质的血清半寿期大大增加。与需要 化学缀合和再纯化的传统聚乙二醇化相反,生产工艺大为简化并且产物是均质的。

[0348] 聚唾液酸化是使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长治疗性肽和蛋白质的有效 寿命并改善其稳定性的另一项技术。PSA是唾液酸(一种糖)的聚合物。当用于蛋白质和 治疗肽药物递送时,聚唾液酸对缀合提供保护性微环境。这增加治疗性蛋白在循环中的有 效寿命并防止它被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体中。它由某些细菌采纳,这些 细菌经数百万年演化用PSA覆盖它们的细胞壁。这些天然聚唾液酸化的细菌则能够通过分 子拟态挫败身体的防御系统。PSA,自然界的终极隐形术,可以容易地从这类细菌以巨大量 和以预定的物理特征产生。细菌PSA完全无免疫原性,甚至与蛋白质连接时也是如此,因为 它在化学上与人体中的PSA同一。

[0349] 另一项技术包括使用与抗体连接的羟乙基淀粉("HES")衍生物。HES是源自蜡 质玉米淀粉的改性天然聚合物并且可以由身体的酶代谢。通常施用HES溶液以替代不足的 血液容积并改善血液的流变学特性。通过增加分子的稳定性,以及通过降低肾清除率,抗体 的HES化使得能够延长循环半寿期,导致增加的生物活性。通过变动不同参数,如HES的分 子量,可以定制广泛类型的HES抗体缀合物。

[0350] 也可以向IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地Fc或铰合部Fc结构域片 段)中引入一个或多个氨基酸修饰(即,置换、插入或缺失),产生具有增加的体内半寿期 的抗体。参见,例如国际公开号W098/23289;国际公开号W097/34631 ;和美国专利号6 277 375。

[0351] 进一步,抗体可以与白蛋白缀合以使抗体或抗体片段在体内更稳定或具有较长的 体内半寿期。这些技术是本领域熟知的,参见,例如国际公开号WO93/15199、W0 93/15200 和TO01/77137;和欧洲专利号EP413,622。

[0352] Notch3抗体或其片段也可以与一个或多个人血清白蛋白(HSA)多肽或其部分融 合。HSA(-种在其成熟形式下具有585个氨基酸的蛋白质)负责显著比例的血清渗透压 并且还作为内源和外源配体的载体发挥作用。白蛋白作为载体分子的作用及其惰性本质是 作为体内多肽的载体和转运蛋白使用的有利特性。已经在W0 93/15199、W0 93/15200和 EP413 622中提出使用白蛋白作为白蛋白融合蛋白的组分,其作为多种蛋白质的载体。还已 经提出使用HSA的N末端片段用于与多肽融合(EP399 666)。因此,通过将抗体或其片段 遗传地或化学地融合或缀合至白蛋白,可以稳定或延长货架期,和/或在溶液中、在体外和 /或在体内保留分子活性持续延长的时间段。

[0353] 可以通过遗传操作实现白蛋白与另一种蛋白质的融合,从而编码HSA或其片段的 DNA与编码这种蛋白质的DNA连接。合适宿主随后用融合的核苷酸序列转化或转染,所述融 合的核苷酸序列如此布置在合适的质粒上以表达融合多肽。表达可以在体外从例如原核或 真核细胞或在体内例如从转基因生物实现。涉及HSA融合的额外方法可以在例如通过引用 方式并入本文作为参考的W0 2001077137和W0 200306007中找到。在一个具体实施方案 中,在哺乳动物细胞系(例如,CH0细胞系)中进行融合蛋白的表达。还构思了抗体在低pH 或高pH与受体的改变的差异性结合,这处于本公开的范围内。例如,可以通过修饰抗体以 在抗体的CDR中包括额外氨基酸如组氨酸,如此调整抗体的亲和力,从而它在低pH(例如, 溶酶体内部的低pH)保持与其受体结合(参见例如,TomoyukiIgawa等人,(2010)Nature Biotechnology;28, 1203-1207)〇

[0354] 抗体缀合物

[0355] 本公开提供与Notch3蛋白特异性结合的抗体或其片段,所述抗体或其片段重组 融合于或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至异源蛋白或多肽(或其片段、优选地与至 少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、 至少90个或至少100个氨基酸的多肽缀合)以产生融合蛋白。特别地,本公开提供融合 蛋白,所述融合蛋白包含本文所述的抗体片段(例如,Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2 片段、VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)和异源蛋白、多肽或肽。蛋白质、多肽或肽 与抗体或抗体片段融合或缀合的方法是本领域已知的。参见,例如美国专利号5, 336, 603、 5, 622, 929、5, 359, 046、5, 349, 053、5, 447, 851 和 5, 112, 946 ;欧洲专利号EP307, 434 和EP 367, 166 ;国际公开号TO96/04388 和TO91/06570;Ashkenazi等人,(1991)?1〇(:.恥七1· Acad.Sci.USA88:10535-10539;Zheng等人,(1995)J.Immunol. 154:5590-5600 和Vil等 人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11337-11341。

[0356] 可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为"DNA改 组")技术,产生其他融合蛋白。可利用DNA改组来改变抗体或其片段的活性(例如,具 有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段)。通常参见,美国专利号5, 605, 793、 5,811,238、5,830,721、5,834,252 和 5,837,458;Patten等人,(1997),Curr.0pinion Biotechnol. 8:724-33 ;Harayama, (1998),TrendsBiotechnol. 16(2):76-82;Hansson 等人,(1999),J.Mol.Biol. 287:265-76 ;和Lorenzo和Blasco, (1998),Biotechniques 24 (2) : 308-313 (这些专利和出版物的每篇因而通过引用方式完整地并入)。可以通过在重 组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变,改变抗体或其片段或编码 的抗体或其片段。编码与Notch3蛋白特异性结合的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种 或多种异源分子的一种或多种组分、基序、节段、部分、结构域、片段等重组。

[0357] 另外,抗体或其片段可以与标记序列(如肽)融合以促进纯化。在优选的 实施方案中,标记氨基酸序列是六组氨酸肽,如PQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA, 91311)中提供的标签,许多其他标记氨基酸序列是可商业获得的。 如Gentz等,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824 中所述,例如六组氨酸为纯化 融合蛋白提供了便利。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素"HA"标签,其对应于衍 生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell37:767)和"flag"标签。

[0358] 在其他实施方案中,本发明公开了与诊断剂或检测剂缀合的抗体或其片段。这类 抗体可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的功效),用于监测或预测疾病或病 症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测物质偶联实现这类诊断和检 测,所述可检测物质包括但不限于多种酶,如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半 乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;辅基,如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物 素;荧光物质,如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、 丹磺酰氯或藻红蛋白;发光物质,如但不限于鲁米诺;生物发光物质,如但不限于、萤光素 酶、萤光素和水母发光蛋白;放射性物质,如但不限于碘( 1311、1251、1231和1211)、碳(14c)、硫 (35s)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和mIn)、锝(99Tc)、铊(2Q1Ti)、镓(6SGa、67Ga)、钯(1Q3Pd)、 钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(lsF)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、14〇La、175Yb、166H〇、9〇Y、47SC、1S6Re、lssRe、 ^Pr^Rh'Ru'te^Co^Zn^Sr^P^Gd^Yb^Cr^MnJSe^Sn和117Tin^ 种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。

[0359] 本公开还涵盖与治疗性部分缀合的抗体或其片段的用途。抗体或其片段可以与治 疗性部分如细胞毒素(例如,细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如, α_发射体)缀合。术语"细胞毒素"或"细胞毒剂"包括有害于细胞的任何物质。

[0360] 另外,抗体或其片段可以与调节给定生物学反应的治疗性部分或药物部分缀合。 治疗性部分或药物部分不得解释为限于经典的化学治疗药。例如,药物部分可以是拥有所 需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋 白Α、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素、蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干 扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原活化物、凋亡物质、抗血管 生成物质或生物学反应调节物,例如淋巴因子。在一个实施方案中,抗Notch3抗体或其片 段与治疗性部分如细胞毒素、药物(例如,免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。这类缀合物在 本文中称作"免疫缀合物"。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作"免疫毒素"。细胞 毒素或细胞毒药物包括有害于(例如,杀死)细胞的任何物质。例子包括紫杉酚、松胞菌素 B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙 碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-脱氢睾酮、糖 皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂 还包括,例如抗代谢物(例如,甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、 达卡巴嗪)、消融剂(例如,氮芥、嗥替哌(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU) 和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂 (II) (DDP)、顺铂、蒽环类(例如,佐柔比星(以前称作柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例 如,更生霉素(以前称作放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂 剂(例如,长春新碱和长春碱)。(参见例如,SeattleGeneticsUS20090304721)。

[0361] 可以与抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦 生和澳瑞司他汀和其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的例子是可商业获得的(Mylotarg™; Wyeth-Ayerst)〇

[0362] 使用本领域可获得的接头技术,能将细胞毒素与抗体缀合。已经用来将细胞毒素 与抗体缀合的接头类型的例子包括但不限于含腙、硫醚、酯、二硫键和肽的接头。可以选择 例如对于溶酶体区室内部低pH的切割作用敏感或对于蛋白酶(如肿瘤组织中优先表达的 蛋白酶如组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶B、C、D))的切割作用敏感的接头。

[0363] 关于各种细胞毒素、接头和用于治疗药与抗体缀合的方法的讨论,还参见Saito 等人,(2003)Adv.DrugDeliv.Rev. 55:199-215;Trail等人,(2003)CancerImmunol. Immunother. 52:328-337 ;Payne,(2003)CancerCell3:207-212 ;Allen,(2002)Nat. Rev.Cancer2:750-763;Pastan和Kreitman, (2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091;Senter和Springer, (2001)Adv.DrugDeliv.Rev. 53:247-264。

[0364] 本公开的抗体也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物,也称作放射 免疫缀合物。可以与抗体缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的例子包括但不限 于碘131、铟m、钇9°和镥177。本领域中建立了用于制备放射性免疫缀合物的方法。放射免疫 缀合物的例子是可商业获得的,包括Zevalin™(DECPharmaceuticals)和Bexxar™(Corixa Pharmaceuticals),并且相似的方法可以用来利用本公开的抗体制备放射免疫缀合 物。在某些实施方案中,大环螯合剂是1,4, 7, 10-四氮杂环十二烷-N,Ν',N",N"' -四 乙酸(DOTA),其可通过接头分子附着到抗体上。这类接头分子是本领域共知的并且在 Denardo等人(1998)ClinCancerRes. 4(10) :2483-90 ;Peterson等人,(1999)Bioconjug. Chem. 10(4) :553-7 ;和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol. 26(8) :943-50 中描述,所述 文献每篇通过引用的方式完整并入。

[0365] 用于将治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的,参见,例如Arnon等 人,"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy',,弓丨自 MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(编著),第 243_56 页(Alan R.Liss,Inc. 1985) ;Hellstrom等人/'AntibodiesForDrugDelivery",引自Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等人(编著),第623-53页(MarcelDekker,Inc. 1987); Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview',, 弓I自MonoclonalAntibodies84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等 人(编著),第 475-506 页(1985) ;"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfThe TherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",弓| 自Monoclonal AntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(编著),第 3〇3_l6 页 (AcademicPress1985)和Thorpe等人,(1982)Immunol.Rev. 62:119-58〇

[0366] 抗体也可以连接至固相支持物,所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯 化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或 聚丙烯。

[0367] 另一个方面,本公开涉及与其他治疗药如另一抗体、小分子抑制剂和医护标准治 疗药如EGFR和铂剂化疗联合使用的Notch3抗体或其片段。

[0368] 产生抗体的方法

[0369] (i)编码抗体的核酸

[0370] 本公开提供基本上纯化的核酸分子,所述核酸分子编码包含上述Notch3抗体链 的区段或结构域的多肽。一些核酸包含编码Notch3抗体重链可变区的核苷酸序列,和/ 或编码轻链可变区的核苷酸序列。在一个具体实施方案中,核酸分子是表2中鉴定的那些。 一些其他核酸分子包含与表2中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本上同一(例如,至 少65%、80%、95%或99%同一)的核苷酸序列。从适宜的表达载体表达时,由这些多核苷 酸编码的多肽能够显示Notch3抗原结合能力。

[0371] 本公开中还提供多核苷酸,所述多核苷酸编码来自上文所述Notch3抗体的重链 或轻链的至少一个⑶R区和通常全部三个⑶R区。一些其他多核苷酸编码上文所述的Notch 3抗体的重链和/或轻链的所有或基本上所有可变区序列。因为密码子简并性,所以多种核 酸序列将编码多种免疫球蛋白氨基酸序列的每个序列。

[0372] 核酸分子可以编码抗体的可变区和恒定区这两者。一些核酸序列包含编码成熟重 链可变区序列的核苷酸,所述成熟重链可变区序列与表2中所述的Notch3抗体的成熟重 链可变区序列基本上同一(例如,至少80%、90%或99%同一)。一些其他核酸序列包含编 码成熟轻链可变区序列的核苷酸,所述成熟轻链可变区序列与表2中所述的Notch3抗体 的成熟轻链可变区序列基本上同一(例如,至少80%、90%或99%同一)。

[0373] 可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码Notch3抗体或其结合片段的现 有序列(例如,如下文实施例中所述的序列)产生这些多核苷酸序列。可以通过本领域已 知的方法完成核酸的直接化学合成,如Narang等人,(1979)Meth.Enzymol. 68:90的磷酸 三酯法;Brown等人,(1979)Meth.Enzymol. 68:109 的磷酸二酯法;Beaucage等人,(1981) Tetra.Lett.,22:1859的二乙基磷酰亚胺法;和美国专利号4, 458, 066的固相支持法。例 如可以如PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification,H. A.Erlich(编著),FreemanPress,NY,NY, 1992;PCRProtocols:AGuidetoMethods andApplications,Innis等人(编著),AcademicPress,SanDiego,CA, 1990;Mattila 等人,(1991)NucleicAcidsRes. 19:967 ;和Eckert等人,(1991)PCRMethodsand Applications1:17中所述,通过PCR向多核苷酸序列引入突变。

[0374] 本公开中还提供了用于产生上述结合Notch3的抗体的表达载体和宿主细胞。多 种表达载体可以用来表达编码Notch3抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载 体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包含质 粒、游离型载体,一般具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒,和人类人工染色体(参见,例如 Harrington等人,(1997)NatGenet15:345)。例如,可用于哺乳动物(例如人)细胞中表 达结合Notch3的多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHisA、B和C、pcDNA3. 1/His、 pEBVHisA、B和C(Invitrogen,圣迭戈,CA)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质 的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的 载体,基于SV40、乳头瘤病毒、HBPEB病毒、痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)的载 体。参见,Brent等人,(1995)上文;Smith,Annu.Rev.Microbiol. 49:807 ;和Rosenfeld等 人,(1992)Cell68:143。

[0375] 表达载体的选择依赖于待在其中表达该载体的宿主细胞。一般地,表达载体含有 与编码Notch3抗体链或片段的多核苷酸有效连接的启动子和其他调节序列(例如,增强 子)。在一些实施方案中,用诱导型启动子来防止插入序列在诱导条件之外的条件下表达。 诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可在非诱导条 件下扩大转化的生物培养物,而不偏离用于编码序列的群体,其表达产物能更好地被宿主 细胞耐受。除启动子之外,也可要求或需要其他调节元件用于高效表达Notch3抗体链或 片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其他序列。此外,可以 通过纳入适用于所用细胞系统的增强子增强表达的效率(参见,例如Scharf等人,(1994) ResultsProbl.CellDiffer. 20:125;和Bittner等人,(1987)Meth.Enzymol. ,153:516)。 例如,SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。

[0376] 表达载体还可以提供分泌信号序列位置以形成具有多肽的融合蛋白,其中所述多 肽由插入的Notch3抗体序列编码。更经常地,插入的Notch3抗体序列在纳入载体之前 与信号序列连接。待用来接受编码Notch3抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的序列 的载体有时还编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白,由 此导致完整抗体或其片段的产生。通常,此类恒定区是人的恒定区。

[0377]用于携带并表达Notch 3抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆 菌是一种可用于克隆并表达本公开多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物 宿主包括杆菌(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),和其他肠杆菌属 (Enterobacteriaceae)如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)和多种假单胞 菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中,还可以产生一般含有与宿主细胞相容的表 达控制序列(例如,复制起点)的表达载体。此外,存在任何数目的多种熟知启动子,如乳 糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启 动子系统。启动子通常,可选地与操纵子序列一起,控制表达,并具有核糖体结合位点序列 等,用于起始并完成转录和翻译。其他微生物,如酵母,也可以用来表达结合Notch 3的本 公开多肽。也可组合使用昆虫细胞和杆状病毒载体。

[0378] 在一些实施方案中,哺乳动物宿主细胞用来表达并产生结合Notch3的本公开多 肽。例如,它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如,如实施例中所述 的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如,下文例举 的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些细胞包括任何正常的非永生的或正常或非正常的永生的动 物细胞或人细胞。例如,已经开发出能够分泌完整免疫球蛋白的多种合适宿主细胞系,包 括CH0细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳 动物组织细胞培养物表达多肽的用途通常例如在Winnacker,FROMGENESTOCLONES,VCH PublisherS,N.Y.,N.Y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表 达控制序列,如复制起点、启动子和增强子(参见,例如Queen等人,(1986)Immunol. Rev. 89:49-68),和必需的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷化位点 和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启 动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异的、阶段特异的和/或可调节或可控制 的。有用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松 诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRPpolIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型 CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强 子组合。

[0379] 用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变动。例 如,氯化钙转染常用于原核细胞,而磷酸钙处理法或电穿孔法可以用于其他细胞宿主。(通 常见Sambrook等人,上文)。其他方法例如包括电穿孔法、磷酸钙处理法、脂质体介导转 化法、注射法和微量注射法、抛射体法、病毒体法、免疫脂质体法、聚阳离子:核酸缀合物法、 裸DNA法、人工病毒粒法、疱疹病毒结构蛋白VP22融合法(Elliot和0'Hare, (1997)Cell 88:223)、试剂增强的DNA摄取法和离体转导法。对于重组蛋白质的长期高产率产生,通常 期望稳定表达。例如,可以使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达 载体,制备稳定表达Notch3抗体链或结合片段的细胞系。在引入该载体之后,可以允许细 胞在丰富培养基中生长1-2日,之后将它们转换至选择性培养基。选择标记的目的是赋予 选择抗性,并且它的存在允许成功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。抗性、稳 定转染的细胞可以使用适于该细胞类型的组织培养技术增殖。

[0380] (ii)单克隆抗体的产生

[0381] 可以通过多种技术产生单克隆抗体(mAb),所述技术包括常规单克隆抗体方法学, 例如Kohler和Milstein, (1975)Nature256:495的标准体细胞杂交技术。可以使用产生 单克隆抗体的许多技术,例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。

[0382] 制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是一个充分建立的方法。 用于分离免疫的脾细胞以便融合的免疫操作方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例 如,鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。

[0383] 可以基于上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列,制备本公开的嵌合抗体或人源化 抗体。可以从目的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA并且使用标准分子生物 学技术,经工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如,为产生嵌合抗体,可以使 用本领域已知的方法,将鼠可变区与人恒定区连接(见例如授予Cabilly等人的美国专利 号4, 816, 567)。为了产生人源化抗体,可以使用本领域已知的方法,将鼠⑶R区插入人类 构架中。参见例如,授予Winter的美国专利号5225539,和授予Queen等人的美国专利号 5530101 ;5585089 ;5693762 和 6180370。

[0384] 在某个实施方案中,抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而非小 鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠,产生这类针对Notch3的人单克隆抗体。这些转基 因小鼠和转染色体小鼠包括本文中分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠,并且在本文中统 称为"人Ig小鼠"。

[0385] HuMAb小鼠® (Medarex,Inc.)含有人免疫球蛋白基因微基因座,所述微基因 座编码未重排的人重链免疫球蛋白序列(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列,以及使 内源μ和Κ链基因座失活的靶向的突变(参见例如,Lonberg等人,(1994)Nature 368(6474) :856-859)。因此,这种小鼠显示减少的小鼠IgM或κ表达,并且响应于免 疫,引入的人重链和轻链转基因经历类转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGK单克 隆(Lonberg等人,(1994),见上文;综述于Lonberg, (1994)HandbookofExperimental Pharmacology113:49-101 中;Lonberg和Huszar, (1995)Intern.Rev.Immunol. 13:65-93 以及Harding和Lonberg, (1995)Ann.N.Y.Acad.Sci. 764:536-546)。HuMAb小鼠的制 备和使用和这类小鼠携带的基因组修饰进一步在Taylor等人,(1992)NucleicAcids Research20:6287-6295;Chen等人,(1993)InternationalImmunology5:647-656; Tuaillon等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3720-3724;Choi等人,(1993)Nature Genetics4:117-123;Chen等人,(1993)ΕΜΒ0J.12:821-830;Tuaillon等人,(1994) J.Immunol. 152:2912-2920;Taylor等人,(1994)InternationalImmunology579-591 ; 和Fishwild等人,(1996)NatureBiotechnology14:845-851 中描述,所述全部文献的 内容因而特别通过引用的方式完整并入。还参见全部授予Lonberg和Kay的美国专利 号 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 789, 650 ;5, 877, 397 ;5, 661,016 ; 5, 814, 318 ;5, 874, 299 ;和 5, 770, 429 ;授予Surani等人的美国专利号 5, 545, 807 ;全部授 予Lonberg和Kay的PCT公开号TO92103918、TO93/12227、TO94/25585、TO97113852、 TO98/24884 和W0 99/45962 ;和授予Korman等人的PCT公开号W0 01/14424。

[0386] 在另一个实施方案中,可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的 小鼠如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠,产生人抗体。本文中称作"KM小鼠"的 这类小鼠在授予Ishida等人的PCT公开W0 02/43478中详述。

[0387] 另外,表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统是本领域可获得的并且可 以用来产生结合Notch3的本公开抗体。例如,可以使用称作Xenomouse(Abgenix,Inc.) 的备选转基因系统。这类小鼠在例如授予Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598 ; 6, 075, 181 ;6, 114, 598 ;6, 150, 584 和 6, 162, 963 中描述。

[0388] 另外,表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统是本领域可获得的并且可 以用来产生结合Notch3的本公开抗体。例如,可以使用称作"TC小鼠"的携带人重链转染 色体和人轻链转染色体的小鼠;这类小鼠在Tomizuka等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci. USA97:722-727中描述。另外,携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经在本领域中描述 (Kuroiwa等人,(2002)NatureBiotechnology20:889-894)并且可以用来产生结合Notch 3的本公开抗体。

[0389] 也可以使用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示法,制备人单克隆抗体。 本领域建立了或以下实施例中描述了分离人抗体的这类噬菌体展示法。参见例如:授 予Ladner等人的美国专利号5, 223,409 ;5, 403, 484 ;和5, 571,698 ;授予Dower等人的 美国专利号5, 427, 908和5, 580, 717 ;授予McCafferty等人的美国专利号5, 969, 108 和 6, 172, 197 ;和授予Griffiths等人的美国专利号 5, 885, 793 ;6, 521,404 ;6, 544, 731 ; 6, 555, 313 ;6, 582, 915 和 6, 593, 081。

[0390] 也可以使用SCID小鼠制备人单克隆抗体,其中已经向所述SCID小鼠重构人免疫 细胞,从而一旦免疫则可以产生人抗体应答。这类小鼠在例如授予Wilson等人的美国专利 号 5, 476, 996 和 5, 698, 767 中描述。

[0391] (iii)构架或Fc工程化

[0392] 工程化抗体包括其中已经对VH和/或VL内部的构架残基修饰例如以改善抗体特 性的那些抗体。一般地,进行这种构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如,一种方案是将一 个或多个构架残基"回复突变"成相应的种系序列。更具体地,已经历过体细胞突变的抗体 可以含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。可以通过将抗体构架序列与衍生该抗 体的种系序列比较而鉴定这类残基。为了使构架区序列恢复其种系构型,可以例如通过位 点定向诱变,将体细胞突变"回复突变"成种系序列。此类"回复突变的"抗体也意在由本 公开涵盖。

[0393] 另一个类型的构架修饰涉及使构架区内部、或甚至一个或多个CDR区内部的一个 或多个残基突变,以移除T细胞表位,从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为"去免 疫化",并进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号20030153043中。

[0394] 除在构架区或⑶R区内进行的修饰外,抗体还可以或备选地可以被改造以包括Fc 区内的修饰,通常用来改变抗体的一种或多种功能性质,如血清半衰期、补体固定、Fc受体 结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。另外,抗体可以经化学修饰(例如一种或多种化学部分 可以与抗体连接)或经修饰以改变其糖基化作用,这再次旨在改变抗体的一个或多个功能 特征。下文中进一步详细描述了这些实施方案中的每一个。Fc区中残基的编号是Kabat的 EU索引。

[0395] 在一个实施方案中,修饰CH1的铰链区,使得改变例如增加或减少铰链区中半胱 氨酸残基的数目。Bodmer等的美国专利号5, 677, 425中进一步描述了该方法。改变CH1的 铰链区中半胱氨酸残基的数目,例如用来便于轻链和重链的装配、或提高或降低抗体的稳 定性。

[0396] 在另一实施方案中,突变抗体的Fc铰链区,以降低抗体的生物半衰期。更特别地, 可以向Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变,使得抗体相对于 天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在Ward等人的美 国专利号6, 165, 745中更详细地描述了这种方法。

[0397] 还在其他实施方案中,通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基来改 变Fc区,以改变抗体的效应子功能。例如,可用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸,使 得抗体对效应子配体具有改变的亲和力,但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的 效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在Winter等人的美国专利号 5, 624, 821和5, 648, 260中进一步详细描述。

[0398] 在另一实施方案中,可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基 酸,使得抗体具有改变的Clq结合/或降低的或消除的补体依赖的细胞毒性(CDC)。这种方 法在美国专利号6, 194, 551 (Idusogie等人)中进一步详细描述。

[0399] 在另一实施方案中,改变一个或多个氨基酸残基,由此改变抗体固定补体的能力。 这种方法在Bodmer等人的PCT公开W0 94/29351中进一步描述。

[0400] 还在另一实施方案中,修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC) 的能力,和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法 在Presta的PCT公开W0 00/42072中进一步描述。另外,已经绘制了人IgGl上FcyRl、 FcyRII、FcyRIII和FcRn的结合位点,并且已经描述了具有改进的结合作用的变体(见 Shields等人,(2001)J.Biol.Chen. 276:6591-6604) 〇

[0401] 还在另一实施方案中,修饰抗体的糖基化。例如,可以产生非糖基化的抗体(即, 抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以便例如增加抗体对"抗原"的亲和力。这类糖修饰也 可以通过例如改变抗体序列内部的一个或多个糖基化位点来完成。例如,可以产生一个或 多个氨基酸置换,所述氨基酸置换导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点,从而消除 在这个位点处的糖基化。这种非糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在例如Co等人的 美国专利号5, 714, 350和6, 350, 861中更详细地描述了这种方法。

[0402] 额外地或备选地,可以产生一种抗体,所述抗体具有改变的糖基化类型,如岩藻 糖残基数量减少的过低岩藻糖化的抗体或二分GlcNac结构增加的抗体。这类改变的糖 基化模式已经展示增加抗体的ADCC能力。这类糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基 化机制的宿主细胞中表达这种抗体而完成。本领域中已经描述了具有改变的糖基化机制 的细胞并且它们可以用作表达重组抗体的宿主细胞,从而产生具有改变的糖基化的抗体。 例如,Hang等人的EP1,176, 195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上遭破 坏的细胞系,从而在这种细胞系中表达的抗体显示过低岩藻糖化。Presta的PCT公开TO 03/035835描述了一种变异CH0细胞系(Lecl3细胞),所述细胞系具有降低的将岩藻糖 连接至Asn(297)连接的糖的能力,这也导致在这种宿主细胞中表达的抗体过低岩藻糖化 (也见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem. 277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开TO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺 基转移酶ΠΙ(GnTIII))的细胞系,从而在这种工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加 的二分GlcNac结构物,这导致抗体的增加的ADCC活性(还参见Umana等人,(1999)Nat. Biotech.17:176-180)。

[0403] 在另一实施方案中,修饰抗体以增加其生物半衰期。可使用多种方法。例如,可 以引入以下一种或多种突变:T252L、T254S、T256F,如Ward的美国专利号6, 277, 375中所 述。备选地,为了增加生物学半寿期,可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体 (salvagereceptor)结合表位,所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两 个环,如Presta等人的美国专利号5, 869, 046和6, 121,022中所述。

[0404] (iv)工程化改变的抗体的方法

[0405] 如上文讨论,通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或与其连接的 恒定区,具有本文所示的VH和VL序列或全长重链和轻链序列的结合Notch3的抗体可以 用来产生结合Notch3的新抗体。因此,在本公开的另一个方面,Notch3抗体的结构特征 用来产生结构上相关的结合Notch3的抗体,所述抗体保留本公开抗体的至少一种功能特 性如与人Notch3结合,并且还抑制Notch3的一个或多个功能特征。例如,本公开的抗体 或其突变物的一个或多个⑶R区可以重组地与已知的构架区和/或其他⑶R组合,以产生 额外的重组工程化的结合Notch3的本公开抗体,如上文讨论。其他类型的修饰包括在先 前部分中描述的那些。用于工程化方法的初始材料是本文中提供的一个或多个VH序列和/ 或VL序列或其一个或多个CDR区。为产生工程化抗体,不需要实际地制备(即表达为蛋白 质)具有本文中提供的一个或多个VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。 相反,使用序列中所含的信息作为初始材料以产生衍生自原始序列的"第二代"序列并且随 后制备"第二代"序列并且表达为蛋白质。

[0406] 因此,在另一个实施方案中,本公开提供一种用于制备Notch3抗体的方法,所述 Notch3抗体由重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列组成,所述重链可变区抗体序 列具有选自SEQIDN0:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183和203 的CDR1序列、选自SEQ IDN0:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184和204的CDR2序列和/或选自SEQIDN0:5、 25、45、65、85、105、125、145、165、185和205的CDR3序列;所述轻链可变区抗体序列包含 选自SEQIDN0:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193 和 213 的CDR1 序列、选自SEQID NO: 14、34、54、74、94、114、134、154、174、194 和 214 的CDR2 序列和 / 或选自SEQIDNO: 15、 35、55、75、95、115、135、155、175、195和215的CDR3序列;改变重链可变区抗体序列和/或 轻链可变区抗体序列内部的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列;并且将 改变的抗体序列表达为蛋白质。也可以通过筛选抗体文库制备改变的抗体序列,所述抗体 文库具有如US20050255552中所述的固定的CDR3序列或最小必需结合决定簇并在CDR1 和CDR2序列上具有多样性。可以根据适于从抗体文库筛选抗体的任何筛选技术(如噬菌 体展示技术)进行筛选。

[0407] 标准分子生物学技术可以用来制备并表达改变的抗体序列。由改变的抗体序列编 码的抗体是这样一种抗体,所述抗体保留本文所述的结合Notch3的抗体的一个、一些或 全部功能特征,所述功能特征包括但不限于与人和/或食蟹猴Notch3特异性结合;抗体与 Notch3结合并且在本文所述的报道分子测定法中通过抑制Notch3信号传导活性,中和 Notch3生物活性。

[0408] 可以使用本领域可获得的和/或本文所述的标准测定法,如实施例中所述的那些 (例如,ELISA),评估改变的抗体的功能特性。

[0409] 在工程化本公开抗体的方法的某些实施方案中,沿着全部或部分的Notch3抗体 编码序列可以随机地或选择性地引入突变,并且可以对所得到的修饰的结合Notch3的抗 体筛选如本文所述的结合活性和/或其他功能特征。已经在本领域描述了突变方法。例如, PCT公开W0 02/092780简短描述了用于使用饱和诱变法、合成连接装配法或其组合产生并 筛选抗体突变物的方法。备选地,Lazar等人的PCT公开WO03/074679描述了使用计算筛 选方法优化抗体物理化学特性的方法。

[0410] 抗体的表征

[0411] 抗体可以用多种功能测定法表征。例如,它们可以由如本文所述的基因报道分子 测定法中抑制Notch3信号传导而中和生物活性的能力、其对Notch3蛋白(例如,人和/ 或食蟹猴Notch3)的亲和力、表位分拣(binning)、其蛋白酶解抗性和其阻断Notch3下游 信号传导的能力表征。多种方法可以用来测量Notch3介导的信号传导。例如,可以通过 测量I⑶3监测Notch3信号传导途径。

[0412] 可以通过直接标记目的抗体,检测抗体与Notch3结合的能力,或抗体可以是未 标记的并且使用本领域已知的多种夹心测定模式,间接地检测结合作用。

[0413] 在一些实施方案中,Notch3抗体阻断参考Notch3抗体与Notch3多肽或蛋白质 结合或与参考Notch3抗体竞争结合。这些抗体可以是上文描述的全人Notch3抗体。它 们也可以是与参考抗体相同的表位结合的其他小鼠Notch3抗体、嵌合Notch3抗体或人 源化Notch3抗体。阻断参考抗体结合作用或与之竞争的能力表示测试下的Notch3抗体 结合至与参考抗体定义的表位相同或相似的表位,或结合至与参考Notch3抗体所结合的 表位充分靠近的表位。这类抗体特别地可能共有对参考抗体鉴定的有利特性。可以通过例 如竞争结合测定法确定阻断参考抗体或与参考抗体竞争的能力。采用竞争结合测定法,研 究受检抗体抑制参考抗体与共同抗原(如Notch3多肽或蛋白)特异性结合的能力。如果 过量的试验抗体基本上抑制参考抗体的结合作用,则试验抗体与参考抗体竞争特异性结合 至抗原。基本上抑制意指试验抗体减少参考抗体的特异性结合通常至少10%、25%、50%、 75%或 90%。

[0414] 存在许多已知的竞争结合测定法,所述竞争结合测定法可以用来评估Notch3 抗体与参考Notch3抗体竞争结合Notch3蛋白。例如,这些包括固相直接或间接放射 免疫测定法(RIA),固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹心竞争测定法(参见Stahli 等人,(1983)MethodsinEnzymology9:242 - 253);固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(参见Kirkland等人,(1986)J.Immunol. 137:3614-3619);固相直接标记的测定法、固 相直接标记的夹心测定法(参见Harlow和Lane,上文);使用1-125标记物的固相直接标 记物RIA(参见Morel等人,(1988)Molec.Immunol. 25:7-15);固相直接生物素-抗生物素 蛋白EIA(Cheung等人,(1990)Virology176:546-552);和直接标记的RIA(Moldenhauer 等人,(1990)Scand.J.Immunol. 32:77-82)。一般而言,这种测定法涉及使用与固体表面结 合的纯化抗原或携带未标记的试验Notch3抗体和标记的参考抗体中的任一种抗体的细 胞。通过在试验抗体存在的情况下确定与固体表面或细胞结合的标记物的量测量竞争性抑 制。通常,试验抗体过量存在。通过竞争测定法(竞争性抗体)鉴定的抗体包括结合与参 考抗体相同的表位的抗体和与相邻表位结合的抗体,所述相邻表位充分临近于参考抗体结 合的表位以便空间位阻作用发生。

[0415] 为了确定选择的Notch3单克隆抗体是否与独特表位结合,可以使用市售试剂 (例如,来自Pierce,Rockford,IL的试剂)将每种抗体生物素酰化。可以使用Notch3多 肽包被的ELISA平板进行竞争研究,所述竞争研究使用未标记的单克隆抗体和生物素酰化 的单克隆抗体。可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素酰化的mAb结合作用。为 了确定纯化的Notch3抗体的同种型,可以进行同种型ELISA。例如,可以在4°C用lyg/ml抗人IgG包被过夜微量滴定板的孔。用1 %BSA封闭后,平板与1μg/ml或浓度更低的 单克隆Notch3抗体或纯化的同种型对照在环境温度反应1-2小时。各孔随后可以与碱性 磷酸酶缀合的人IgGl或人IgM特异性探针反应。随后将平板显色并如此分析,从而可以确 定纯化抗体的同种型。

[0416] 为了展示单克隆Notch3抗体与表达Notch3多肽的活细胞的结合,可以使用流 式细胞术。简而言之,表达Notch3的细胞系(在标准生长条件下培育)可以在含有0. 1% BSA和10%胎牛血清的PBS中与多种浓度的Notch3抗体混合,并且在4°C温育1小时。在 洗涤后,细胞在与第一抗体染色相同的条件下与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。使用光 特性和侧向散射特性对单个细胞设门,能通过FACScan仪分析样品。除流式细胞术测定法 之外或取而代之,可以使用利用荧光显微术的备选测定法。细胞可以完全如上文所述那样 染色并且由荧光显微术检查。这种方法允许可视化各个细胞,但是可能具有削弱的灵敏度, 这取决于抗原的密度。

[0417] 可以通过蛋白质印迹法进一步测试Notch3抗体与Notch3多肽或抗原性片段的 反应性。简而言之,可以制备纯化的Notch3多肽或融合蛋白或来自表达Notch3的细胞的 细胞提取物并使其经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后,将分离的抗原转 移至硝酸纤维素膜,用10%胎牛血清封闭,并且用待测试的单克隆抗体探测。可以使用抗人 IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合作用并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.,St.Louis,M0) 显色。

[0418] 许多读数可以在基于细胞的测定法如本文所述的那些(例如,I⑶3测定法)中用 来评估Notch3抗体的功效和特异性。还在以下实施例部分中描述功能测定法的例子。

[0419] 抗体或其片段的能力阻断其致肿瘤性表型如本文中显示至少部分依赖于Notch3 细胞信号传导的人肿瘤细胞系的肿瘤异种移植物体内生长,并且可以在免疫受损的小鼠中 单独或与所讨论细胞系的适宜细胞毒药物组合情况下评估。

[0420] 预防性用途和治疗性用途

[0421] 本公开提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗与Notch3信号 传导途径相关的疾病或病症的方法。在一个具体实施方案中,本公开提供一种通过向有需 求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防癌症(例如,乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多 发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、T细 胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、骨肉瘤、鳞状 细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明 细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤)的方法。在一些实施方案中,本公开 提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防与Notch3信号传导途 径相关的癌症的方法。

[0422] 在一个具体实施方案中,本公开提供治疗与Notch3信号传导途径相关的癌症的 方法,所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌和T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。

[0423] Notch3抗体也可以用来治疗或预防与异常或缺陷性Notch3信号传导相关的其 他病症,包括但不限于呼吸道疾病、骨质疏松症、骨关节炎、多囊性肾病、糖尿病、精神分裂 症、血管疾病、心脏病、非致癌的增殖性疾病、纤维化和神经变性病如阿尔茨海默病。

[0424] 用于与Notch3抗体联合治疗的合适药物包括本领域已知的能够调节Notch信号 传导途径的医护标准药物。用于Notch3的医护标准药物的合适例子包括但不限于EGFR 抑制剂或基于铂剂的化疗。可能适于Notch3抗体联合治疗的其他药物包括但不限于调节 受体酪氨酸激酶、G-蛋白偶联受体、生长/存活信号转导途径、核激素受体、凋亡途径、细胞 周期和血管生成的那些药物。

[0425] 诊断用途

[0426] 在一个方面,本公开涵盖了在生物样品(例如,血液、血清、细胞、组织)背景下或 从罹患癌症或面临形成癌症风险的个体确定Notch3蛋白和/或核酸表达以及Notch3蛋 白功能的诊断测定法。

[0427] 本公开提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体确定与Notch3信 号传导途径相关的疾病或病症的方法。在一个具体实施方案中,本公开提供一种通过向有 需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防癌症(例如,乳腺癌、结直肠癌、肺癌、 多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、T 细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤、骨肉瘤、鳞 状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透 明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤)的方法。在一些实施方案中,本公 开提供通过向有需求的受试者施用有效量的本公开抗体治疗或预防与Notch3信号传导 途径相关的癌症的方法。

[0428] 在一个具体实施方案中,本公开提供确定与Notch3信号传导途径相关的癌症的 方法,所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌和T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。

[0429] 可以通过任何种类的方式检测Notch3突变,例如:DNA测序、基于PCR的方法(包 括RT-PCR)、微阵列分析、DNA印迹、RNA印迹和试纸条(dipstick)分析。

[0430] 聚合酶链反应(PCR)可以用来从提取自肿瘤组织的基因组DNA或RNA扩增并鉴定 Notch4突变。PCR是本领域熟知的并且在Saiki等人,Science1988, 239:487和美国专 利号4 683 195和美国专利号4, 683, 203中详述。

[0431] 可以通过任何适宜的方法检测基因表达,所述方法包括例如检测从基因转录 的mRNA的量或从转录自基因的mRNA逆转录所产生的cDNA的量或基因编码的多肽或蛋 白质的量。这些方法可以基于样品对样品进行或经修改用于高通量分析。例如,使用 AfTymetrix™\微阵列芯片。

[0432] 在一个方面,通过与探针的杂交检测并定量基因表达,其中所述探针与这种生 物标记的适宜探针特异性杂交。使用本领域已知的方法,这些探针还可以与用于高通量 筛选分析法中的固相支持物连接。W0 97/10365和美国专利号5, 405, 783、5, 412, 087和 5, 445, 934例如公开了可以含有本文中公开的一个或多个序列的高密度寡核苷酸芯片的构 建。使用美国专利号5, 405, 783、5, 412, 087和5, 445, 934中公开的方法,在衍生化玻璃表 面上合成本发明的探针。光保护的核苷磷酰亚胺与玻璃表面偶联,借助光刻掩膜通过光解 作用选择性去保护并与保护的第二核苷磷酰亚胺反应。重复偶联/去保护过程直至所需的 探针完成。

[0433] 备选地,可以使用已知技术确定的基因拷贝数、转录或翻译中的任一者。例如,可 以使用扩增方法如PCR。MacPherson等人,PCR:APracticalApproach,(IRLPressat OxfordUniversityPress(1991))教授了PCR的一般流程。然而,经验地确定用于每种应 用反应的PCR条件。许多参数影响反应的成功。在它们当中有复性温度和时间、延伸时间、 Mg2+和/或ATP浓度、pH,和引物、模板及脱氧核糖核苷酸的相对浓度。在扩增后,可以通过 琼脂糖凝胶电泳随后用溴化乙锭染色和紫外光照可视化,检测所产生的DNA片段。

[0434] 在一个实施方案中,通过检测与样品核酸连接的一个或多个标记物,来检出杂交 的核酸。可以通过本领域技术人员熟知的多种方法中的任意方法掺入标记物。然而,在一 个方面,将标记物在制备样品核酸中的扩增步骤期间同时掺入。因此,例如采用标记引物或 标记核苷酸的聚合酶链反应(PCR)将提供标记的扩增产物。在一个独立的实施方案中,如 上文所述的使用标记核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩增将标记物掺 入转录的核酸。

[0435] 备选地,可以将标记物直接添加至原始核酸样品(例如,mRNA、多聚A、mRNA、cDNA 等)或在扩增完成后直接添加至扩增产物。将标记物与核酸连接的方法是本领域技术人员 熟知的并且包括例如切口翻译或通过激酶处理核酸(例如用标记的RNA)进行末端标记并 随后连接核酸接头,其中所述核酸接头将样品核酸与标记物(例如,荧光团)连接。

[0436] 适用于本公开中的可检测标记物包括通过光谱手段、光化学手段、生物化学手段、 免疫化学手段、电学手段、光学手段或化学手段可检测的任何组合物。在本发明中有用的 标记物包括用于以标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素、磁珠(例如,Dynabeads™)、荧 光染料(例如,荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射标记物(例如, 3h、125i、 35S、14C、或32P、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他在ELISA中常使用的酶)、和 比色标记物如胶体金或有色玻璃珠或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。教授 这类标记物用途的专利包括美国专利号3, 817, 837 ;3, 850, 752 ;3, 939, 350 ;3, 996, 345 ; 4, 277, 437 ;4, 275, 149 ;和 4, 366, 241。

[0437] 对标记物的检测是本领域技术人员熟知的。因此,例如可以使用照相胶片或闪烁 计数器检测放射标记物;可以使用检测发射光的光检测器检测荧光标记物。酶标记物一般 通过向酶提供底物并检测因该酶作用于此底物所产生的反应产物检测,并且比色测定标记 物通过简单地观察有色标记物检测。

[0438] 可以在杂交之前或之后添加可检测标记物至靶(样品)核酸,如W0 97/10365中 描述。这些可检测标记物在杂交之前直接与靶(样品)核酸结合或掺入其中。与之相反, "间接标记物"在杂交后与杂交双链体结合。通常,间接标记物与已经在杂交之前与靶核酸 结合的结合部分结合。例如,靶核酸可以在杂交之前生物素酰化。在杂交后,抗生物素蛋白 缀合的荧光团将结合携带生物素的杂交双链体,提供容易检测到的标记物。关于标记核酸 及检测已标记杂交核酸的方法的详细综述,参见LaboratoryTechniquesinBiochemistry andMolecularBiology,第24卷:HybridizationwithNucleicAcidProbes,P.Tijssen 编著.Elsevier,N.Y. (1993)。

[0439] 在翻译成蛋白质时,Notch3突变可以由特异性抗体检出。也可以通过检查Notch 3突变体的蛋白质表达或蛋白质产物,确定Notch3突变的表达水平。确定蛋白质水平涉及 测量在下述抗体之间出现的任何免疫特异性结合作用的量并且将这个量与对照样品中至 少一种生物标记的免疫特异性结合作用的量比较,其中所述抗体选择性识别从患者获得的 样品中生物标记的多肽并且与之结合。与对照表达相比时,Notch3的蛋白质表达量可以 增加或减少。

[0440] 诊断测定法,如竞争性测定法,依赖于标记的类似物("示踪剂")与受试样品分析 物竞争共同结合配偶体上有限数目的结合位点的能力。结合配偶体通常在竞争之前或之后 不溶并且随后与结合配偶体结合的示踪剂和分析物与未结合的示踪剂和分析物分离。这种 分离通过滗析(其中结合配偶体预先不溶解)或通过离心(其中结合配偶体在竞争性反应 后沉淀)完成。受试样品分析物的量与结合型示踪剂的量(如通过标记物质的量所测量) 成反比。制备已知量的分析物的剂量-反应曲线并将它们与检验结果比较以定量地确定受 试样品中存在的分析物的量。当使用酶作为可检测标记时,这些测定法称作ELISA系统。在 这种形式的测定法中,抗体和Notch3抗体之间的竞争性结合产生结合的本发明Notch3 蛋白、优选地Notch3表位,其是血清样品中的抗体的量度、最特别地血清样品中的中和抗 体的量度。

[0441] 该测定法的明显优点是测量直接由中和抗体(即,干扰Notch3蛋白、尤其Notch3表位结合的那些抗体)组成。这种测定法,尤其在ELISA测试形式下,在临床环境和在例 行血液筛查时具有可观的应用。

[0442] 测试生物标记物

[0443] 本公开的另一个方面提供用于确定个体中Notch3核酸表达或Notch3蛋白活 性,因而对该个体选择适宜治疗药或预防药的方法(在本文中称作"药物基因组学")。药 物基因组学允许基于个体的基因型(例如,接受检查以确定该个体响应于特定药物的能力 的个体的基因型),选择药物(例如,小分子药物或生物制品如抗体或其片段)用于该个体 的治疗性或预防性治疗。

[0444] 本公开的又一个方面涉及在临床试验中监测药物(例如,小分子药物或生物制品 如抗体或其片段)对Notch3蛋白表达或活性的影响。

[0445] 一旦已经就Notch3突变分析患者并预测其对Notch3抑制剂敏感(例如,小分 子抑制剂或生物制品如Notch3抗体或其片段),则可以通过贯穿整个疗程连续或间歇给 药实现向患者施用任何Notch3抑制剂。可以基于Notch3突变体的存在和表达水平经验 地调整合适的剂型和施用药物的方法。

[0446] 可以在Notch3抑制剂施用后分析Notch3突变,以确定患者是否仍对Notch3 治疗敏感。此外,可以在单次施用Notch3抑制剂后的多个时间点分析Notch3突变。例 如,施用Notch3抑制剂的初始浓剂(bolus),可以在首次治疗后1小时、2小时、3小时、4 小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几个月分析Notch3突变。

[0447] 该患者可以进行多次Notch3抑制剂施用并且随后在不同时间点分析Notch3突 变。例如,疗程可能需要施用初始剂量的Notch3抑制剂,稍后指定的时间段施用第二剂 量,并且在第二次给药后若干小时再施用第三剂量。可以在施用每个剂量的Notch3抑制 剂后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几 个月分析Notch3突变。

[0448] 可以制备用于评估任何Notch3抑制剂(例如,抗体或其片段)的活性的试剂盒。 例如,下述试剂盒可以用于评估Notch3突变体的存在,所述试剂盒包含用于PCR或用于微 阵列杂交Notch3突变的核酸引物。备选地,表2中列出了随抗体或其片段一起供应用于 Notch3突变的试剂盒。

[0449] 使用Notch3突变以筛选Notch3抑制剂是可能的。这种方法包括从表2提供含 有Notch3突变的细胞,使细胞与候选Notch3抑制剂(例如,小分子或生物制品如抗体或 其片段)接触,并且将处理的细胞的IC5。与已知的Notch3抑制剂比较。

[0450] 药物组合物

[0451] 为了制备包括Notch3抗体或其片段的药物组合物或无菌组合物,将Notch3抗 体或其片段与可药用载体或赋形剂混合。该组合物可以额外地含有一种或多种适于治疗或 阻止癌症(乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、 急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤 文肉瘤、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、 食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、和黑素 瘤)的其他治疗药。

[0452] 可以通过与生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合以例如冻干散剂、膏剂、水溶液 剂、洗剂或混悬剂的形式制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见,例如Hardman等人,(2001) GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y. ;Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Lippin cott,Williams,andWilkins,NewYork,N.Y.;Avis等人(编著)(1993)Pharmaceutical DosageForms:ParenteralMedications,MarcelDekker,NY;Lieberman等人(编著) (1990)PharmaceuticalDosageForms:Tablets,MarcelDekker,NY;Lieberman等人(编 著)(1990)PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystems,MarcelDekker,NY;ffeiner 和Kotkoskie(2000)ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc. ,NewYork,N. Y.)〇

[0453] 治疗剂施用方案的选择取决于若干因素,包括该实体的血清或组织周转率、症状 水平、该实体的免疫原性、及靶细胞在生物基质中的可达性。在某些实施方案中,施用方案 使递送给患者的治疗剂的量最大化且符合可接受的副作用水平。因此,递送的生物剂的量 部分取决于具体实体和所治疗病症的严重性。选择适宜剂量的抗体、细胞因子和小分子 的指南是可获得的(参见,例如Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,BiosScientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK;Kresina(编著)(1991)MonoclonalAntibodies,Cytokines andArthritis,MarcelDekker,NewYork,N.Y. ;Bach(编著)(1993)Monoclonal AntibodiesandPeptideTherapyinAutoimmuneDiseases,MarcelDekker,New York,N.Y.;Baert等人,(2003)NewEngl.J.Med. 348:601-608;Milgrom等人,(1999) NewEngl.J.Med. 341:1966-1973;Slamon等人,(2001)NewEngl.J.Med. 344:783-792; Beniaminovitz等人,(2000)NewEngl.J.Med. 342:613-619;Ghosh等人,(2003)NewEngl. J.Med. 348:24-32;Lipsky等人,(2000)NewEngl.J.Med. 343:1594-1602)。

[0454] 由临床医生,例如使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的参数或因素 确定适宜的剂量。通常,剂量始于或多或少小于最佳剂量的量并此后将它以小增量增加,直 至相对于任何不利副作用,实现所需的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎 症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。

[0455] 可改变本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平,以获得活性成份的下述 量,所述量就具体患者、组合物和施用方式而言可以有效达到所希望的治疗应答,并同时对 患者无毒性。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素,包括所用的本公开具体 组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的化合物的排泄速率、治疗 的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的 年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域已知的因素。

[0456] 可以通过连续输注或通过以例如,1日、1周或每周1-7次的时间间隔,提供包 含抗体或其片段的组合物。可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻、直肠、肌肉内、脑内或 通过吸入来提供剂量。具体剂量方案是涉及避免显著不良副作用的最大剂量或剂量频 率。每周总剂量可以是至少0. 05μg/kg体重、至少0. 2μg/kg、至少0. 5μg/kg、至少 1μg/kg、至少 10μg/kg、至少 100μg/kg、至少 0· 2mg/kg、至少 1.Omg/kg、至少 2.Omg/kg、 至少 10mg/kg、至少 25mg/kg或至少 50mg/kg(参见,例如Yang等人,(2003)NewEngl. J.Med. 349:427-434;Herold等人,(2002)NewEngl.J.Med. 346:1692-1698;Liu等 人,(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych. 67:451-456;Portielji等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother. 52:133-144)。基于摩尔/kg体重,抗体或其片段的目的剂量与抗体 或多肽大致相同。抗体或其片段的目的血浆浓度是大约基于摩尔/kg体重。剂量可以是 至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至 少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少 85μg、至少90μg、至少95μg,或至少100μg。向受试者施用的次数可以是至少1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11或12次或更多次。

[0457] 对于本公开的抗体或其片段,施用至患者的剂量可以是0· 0001mg/kg至100mg/kg 患者体重。剂量可在 〇· 〇〇〇lmg/kg至 20mg/kg、0. 0001mg/kg至 10mg/kg、0. 0001mg/kg至 5mg/kg、0. 0001 至 2mg/kg、0. 0001 至lmg/kg、0. 0001mg/kg至 0·75mg/kg、0. 0001mg/kg至 0· 5mg/kg、0.OOOlmg/kg至 0· 25mg/kg、0. 0001 至 0· 15mg/kg、0. 0001 至 0· 10mg/kg、0. 001 至 0· 5mg/kg、0. 01 至 0· 25mg/kg、或 0· 01 至 0·lOmg/kg患者体重之间。

[0458] 可以使用以千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计的待施用的剂量,计算抗体或 其片段的剂量。抗体或其片段的剂量可以150μg/kg或更小、125μg/kg或更小、100μg/kg 或更小、95μg/kg或更小、90μg/kg或更小、85μg/kg或更小、80μg/kg或更小、75μg/kg 或更小、70μg/kg或更小、65μg/kg或更小、60μg/kg或更小、55μg/kg或更小、50μg/kg 或更小、45μg/kg或更小、40μg/kg或更小、35μg/kg或更小、30μg/kg或更小、25μg/kg 或更小、20μg/kg或更小、15μg/kg或更小、10μg/kg或更小、5μg/kg或更小、2. 5μg/kg 或更小、2μg/kg或更小、1. 5μg/kg或更小、1μg/kg或更小、0. 5μg/kg或更小或0. 5μg/ kg或更小的患者体重。

[0459] 抗体或其片段的单位剂量可以是0·lmg至20mg、0.lmg至15mg、0.lmg至12mg、 0.lmg至 10mg、0.lmg至 8mg、0.lmg至 7mg、0.lmg至 5mg、0. 1 至 2. 5mg、0. 25mg至 20mg、0. 25 至 15mg、0. 25 至 12mg、0. 25 至 10mg、0. 25 至 8mg、0. 25mg至 7mg、0. 25mg至 5mg、0. 5mg至 2. 5mg、lmg至 20mg、lmg至 15mg、lmg至 12mg、lmg至 10mg、lmg至 8mg、lmg至 7mg、lmg至 5mg 或lmg至 2. 5mg〇

[0460] 抗体或其片段的剂量可以在受试者中实现至少0. 1 μg/ml、至少0. 5 μg/ml、至少 1 μg/ml、至少 2 μg/ml、至少 5 μg/ml、至少 6 μg/ml、至少 10 μg/ml、至少 15 μg/ml、至少 20 μg/ml、至少 25 μg/ml、至少 50 μg/ml、至少 100 μg/ml、至少 125 μg/ml、至少 150 μg/ ml、至少 175μg/ml、至少 200μg/ml、至少 225μg/ml、至少 250μg/ml、至少 275μg/ml、至 少 300μg/ml、至少 325μg/ml、至少 350μg/ml、至少 375μg/ml、或至少 400μg/ml的血 清滴度。备选地,抗体或其片段的剂量可以在受试者中实现至少〇. 1μg/ml、至少0. 5μg/ ml、至少 1μg/ml、atleast、2μg/ml、至少 5μg/ml、至少 6μg/ml、至少 10μg/ml、至少 15μg/ml、至少 20μg/ml、至少 25μg/ml、至少 50μg/ml、至少 100μg/ml、至少 125μg/ ml、至少 150μg/ml、至少 175μg/ml、至少 200μg/ml、至少 225μg/ml、至少 250μg/ml、至 少 275μg/ml、至少 300μg/ml、至少 325μg/ml、至少 350μg/ml、至少 375μg/ml、或至少 400μg/ml的血清滴度。

[0461] 可以重复给予抗体或其片段的剂量并且各次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5 天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3个月或至少6个月D

[0462] 特定患者的有效量可以根据多种因素变动,如正在治疗的病状、患者的总体 健康、施用方法、途径和剂量和副作用的严重程度(参见,例如Maynard等人,(1996)A HandbookofSOPsforGoodClinicalPractice,InterpharmPress,BocaRaton,Fla.; Dent, (2001)GoodLaboratoryandGoodClinicalPractice,UrchPubl.,London,UK)〇

[0463] 施用途径可以是通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑室椎管内、 病灶内或通过缓释系统或植入物借助例如局部或皮肤施加、注射或输注(参见例如, Sidman等人,(1983)Biopolymers22:547-556;Langer等人,(1981)J.Biomed.Mater. Res. 15:167-277 ;Langer(1982)Chem.Tech. 12:98-105;Epstein等人,(1985)Proc. Natl.Acad.Sci.USA82 :3688-3692;Hwang等人,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034 ;美国专利号6, 350, 466和6, 316, 024)。根据需要,组合物也可以包括增溶 剂和局部麻醉药,如利多卡因,以便减轻注射部位处的疼痛。此外,也可以利用肺部施用法, 例如通过使用吸入器或雾化器和具有雾化剂的制剂。参见,例如美国专利号6, 019, 968、 5, 985, 320、5, 985, 309、5, 934, 272、5, 874, 064、5, 855, 913、5, 290, 540 和 4, 880, 078 ;和PCT 公开号TO92/19244、TO97/32572、TO97/44013、TO98/31346 和TO99/66903,每份专利 通过引用方式完整并入完整本文。

[0464] 也可用本领域已知的多种方法中的一种或多种,经由一种或多种施用途径,施用 本公开的组合物。熟练技术人员将理解,施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而 变。用于抗体或其片段的所选择施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其 他肠胃外施用途径,例如通过注射或输注。胃肠外施用可以代表除了肠和局部施用以外的 施用模式,通常通过注射进行,并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、 心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸 骨内注射和输注。备选地,组合物可经非胃肠外途径,例如局部、表皮或黏膜施用途径施用, 例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。在一个实施方案中,通过输注法施用抗体或 其片段。在另一个实施方案中,皮下施用多特异性表位结合蛋白。

[0465] 如果抗体或其片段在控释或缓释系统中施用,则栗可以用来实现控释或缓释 (参见Langer,上文;Sefton,(1987)CRCCrit.RefBiomed.Eng. 14:20;Buchwald等 人,(1980),Surgery88:507;Saudek等人,(1989)N.Engl.J.Med. 321:574)。聚合物材料 可以用来实现治疗药的控释或缓释(参见例如,MedicalApplicationsofControlled Release,Langer和Wise(编著),CRCPres·,BocaRaton,Fla. (1974);Controlled DrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(编 著),Wiley,NewYork(1984);Ranger和Peppas, (1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol· Chem. 23:61 ;还参见Levy等人,(1985)Science228:190;During等人,(1989)Ann. Neurol. 25:351;Howard等人,(1989)J.Neurosurg. 71:105);美国专利号 5, 679, 377 ; 美国专利号5,916,597 ;美国专利号5,912,015 ;美国专利号5,989,463 ;美国专利号 5, 128, 326 ;PCT公开号W0 99/15154 ;和PCT公开号W0 99/20253。在持续释放制剂中使用 的聚合物的例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚 (丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯 吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA) 和聚原酸酯。在一个实施方案中,在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤的 杂质、储存时稳定、无菌和可生物降解。可以将控释或持续释放系统靠近预防靶或治疗靶布 置,因此仅需要全身性剂量的一部分(见,例如Goodson,引自MedicalApplicationsof ControlledRelease,上文,第 2 卷,第 115-138 页(1984))〇

[0466] 控释系统在Langer, (1990)Science249:1527-1533的综述中讨论。本领域技 术人员已知的任何技术可以用来产生包含一种或多种本公开抗体或其片段的持续释放制 剂。参见,例如美国专利号4,526,938沖(:1'公开10 91/05548,?(:1'公开10 96/20698,·!^ 等人,(1996),Radiotherapy&0ncology39:179-189;Song等人,(1995)PDAJournalof PharmaceuticalScience&Technology50:372-397;Cleek等人,(1997)Pro.Int'l.Symp. Control.Rel.Bioact.Mater. 24:853-854 和Lam等人,(1997)Proc.Int,1.Symp.Control Rel.Bioact.Mater. 24:759-760,所述的每篇文献通过引用方式完整并入本文作为参考。

[0467] 如果局部施用抗体或其片段,则可以将它们按油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、 凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气溶胶剂、溶液剂、乳剂的形式或本领域技术人员熟知的其他 形式配制。参见,例如Remington'sPharmaceuticalSciencesandIntroductionto PharmaceuticalDosageForms,第 19 版,MackPub.Co.,Easton,Pa. (1995)。对不可喷雾 的局部剂型,通常使用黏性至半固体或固体形式,该形式包含与局部施用相容的载体或一 种或多种赋形剂,并在某些情况下具有大于水的动态黏度。合适的制剂包括但不限于溶液 剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、油膏剂、散剂、搽剂、药膏剂等,如果需要,与对它们进行消毒或与 影响多种特性(例如,渗透压)的助剂(例如,防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。 其他合适的局部用剂型包括可喷雾气溶胶制品,其中与固体或液体惰性载体组合的有效成 分在一些情况下包装在含有加压的挥发性物质(例如,气态推进剂,如氟利昂)的混合物中 或挤瓶中。根据需要,也可以将润湿剂或吸湿剂添加至药物组合物和剂型。这类额外成分 的例子是本领域熟知的。

[0468] 如果鼻内施用包含抗体或其片段的组合物,则可以将它以气溶胶剂、喷雾剂、雾化 剂形式或以滴剂形式配制。具体而言,根据本公开使用的预防药或治疗药可以在使用合适 推进剂(例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)的情 况下,以从加压的包装或雾化器中提供的气溶胶喷雾剂形式便利地递送。在加压气雾剂的 情况下,可通过提供阀门,确定剂量单位,以提供经计量的量。可以配制用于吸入器或吹入 器中的胶囊剂和套筒剂(cartridge)(包含例如明胶),其含有所述化合物及合适散剂基底 (powderbase)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

[0469] 用第二治疗药例如细胞因子、类固醇、化疗药、抗生素或辐射共施用或治疗的方法 是本领域已知的(参见,例如Hardman等人,(编著)(2001)GoodmanandGilman'sThe PharmacologicalBasisofTherapeutics,第 10 增补版,McGraw-Hill,NewYork,N. Y.;Poole和Peterson(编著)(2001)PharmacotherapeuticsforAdvancedPractice:A PracticalApproach,Lippincott,ffilliams&ffilkins,Phila. ,Pa.;Chabner和Longo(编 著)(2001)CancerChemotherapyandBiotherapy,Lippincott,ffilliams&ffilkins,Phila .,Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减少至少10 %、至少20 %、至少约30 %、至少40 %或至少 50%〇

[0470] 可以与抗体或其片段组合施用的额外治疗药(例如,预防药或治疗药)可以按照 与本公开的抗体或其片段间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时,按间隔约1小时、 间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时 至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小 时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间 隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时 至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔 60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时、间隔或96小时至120 小时施用。可在同一次患者就诊中施用2种或更多种疗法。

[0471] 抗体或其片段和其他疗法可以循环施用。循环治疗涉及施用第一疗法(例如,第 一预防药或治疗药)一段时间,随后施用第二疗法(例如,第二预防药或治疗药)一段时 间,任选地,接着施用第三疗法(例如,预防药或治疗药)一段时间等,并重复这种依次施用 (即,该循环),以减少对所述疗法中的一种疗法的耐药性形成,以避免或减少所述疗法中 的一种疗法的副作用和/或以改善所述所述疗法中的一种疗法的功效。

[0472] 在某些实施方案中,可以配制抗体或其片段以确保恰当的体内分布。例如, 血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保治疗性化合物跨过BBB(如果希 望的话),可将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法,参见例如美国专利 号4, 522, 811 ;5, 374, 548 ;和5, 399, 331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运 至特定细胞或器官中的部分,因而增强靶向的药物递送(参见,例如Ranade,(1989) J. Clin.Pharmacol. 29:685)。示例性祀向部分包括叶酸或生物素(见,例如Low等人 的美国专利号 5, 416, 016);甘露糖昔(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res. Commun. 153:1038);抗体(Bloeman等人,(1995)FEBSLett. 357:140 ;0wais等人,(1995) Antimicrob.AgentsChemother. 39:180);表面活性蛋白质A受体(Briscoe等人,(1995) Am.J.Physiol. 1233:134 ;pl20(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem. 269:9090);还参见 K. Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett. 346:123 ;J.J.Killion;I.J.Fidler(1994) Immunomethods4:273。

[0473] 本公开提供向有需求的受试者施用单独或与其他治疗药组合的包含抗体或其片 段的药物组合物的方案。本公开的联合疗法的治疗药(例如,预防药或治疗药)可以同时 或依次向受试者施用。本公开的联合疗法的治疗药(例如,预防药或治疗药)也可以循环 施用。循环治疗涉及施用第一治疗药(例如,第一预防药或治疗药)一段时间,随后施用第 二治疗药(例如,第二预防药或治疗药)一段时间并重复这种依次施用,即,该循环,以减少 对一种治疗药(例如药物)的耐药性形成,以避免或减少一种治疗药(例如药物)的副作 用和/或以改善治疗药的功效。

[0474] 联合疗法的治疗药(例如,预防药或治疗药)可以同时施用至受试者。术语"同 时"不限于在完全相同的时间施用治疗药(例如,预防药或治疗药),而是意指将包含抗体 或其片段的药物组合以这样的序列并在这样的时间间隔内施用至受试者,从而抗体可以与 其他治疗药一起发挥作用,以提供与如果另外施加它们相比增加的益处。例如,可在同一时 间或在不同时点以任意顺序顺次对个体施用各疗法;然而,如果不在同一时间施用,则应在 足够接近的时间内施用,以提供希望的治疗效果或预防效果。可以以任意合适的形式和通 过任意合适的途径对受试者分开施用各疗法。在多个实施方案中,将治疗药(例如,预防药 或治疗药)相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约 2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相 隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小 时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至 约12小时、相隔24小时、48小时、72小时或1周施用至受试者。在其他实施方案中,将两 种或更多种治疗药(例如,预防药或治疗药)在患者的同一访视中施用。

[0475] 组合疗法的预防剂或治疗剂可在同一药物组合物中施用给个体。备选地,联合疗 法的预防药或治疗药可以在分立的药物组合物中同时施用至受试者。可通过相同或不同的 施用途径对个体施用这些预防剂或治疗剂。

[0476] 已经充分描述了本公开,通过以下实施例和权利要求进一步说明本发明,所述实 施例和权利要求是说明性的并且不意图是进一步限制性的。

[0477] I⑶3测定法及其用途

[0478] 在一个方面,本公开涉及一种用于检测Notch3信号转导的测定法。Notch信号 传导由一系列的蛋白酶剪切活化。γ分泌酶复合物介导Notch受体的最终切割,最终释放 Notch胞内结构域(ICD),后者转位到胞核以活化Notch祀基因转录。生成新表位抗体(检 测抗体)以检测仅在人Notch3的氨基酸Glyl661和Vall662之间切割时γ分泌酶切割 形式的Notch3ICD(ICD3)。

[0479] 该测定法包括使用检测γ分泌酶切割的Notch3结构域(I⑶3)中的新表位 VMVARRK(SEQIDN0:243)的检测抗体。可以通过在野生型Notch3或突变体Notch3的位 置Glyl661-Vall662 切割产生ICD3。

[0480] 通过本文公开的测定法检测I⑶3显示Notch3信号活化和转导。阻止Notch3 信号活化和转导的抗体或其片段阻止ICD3的产生,并且因而通过检测抗体检出其中所含 的新表位。在一个实施方案中,抗体或其片段束缚Notch3处于自我抑制型构象,因而妨碍 S2和S3切割位点暴露于蛋白酶,因而阻止包含检测抗体识别的新表位的ICD3形成。

[0481] 在一个方面,本公开涵盖了在生物样品(例如,血液、血清、细胞、组织)背景下或 从罹患癌症或面临形成癌症风险的个体确定Notch3蛋白和/或核酸表达以及Notch3蛋 白功能的诊断测定法。

[0482] I⑶3测定法可以用来检测活化型Notch3信号传导的存在。Notch3信号传导的 活化可以因Notch3突变或Notch3高表达/基因扩增而实现。可以制备生物样品并分析 ICD3蛋白的存在或不存在。如果Notch3ICD存在,则NRR结构域可能含有突变,所述突变 导致NRR的自我抑制型构象改变,因而使HD结构域暴露于蛋白酶切割和ICD3的产生,这可 以通过本公开的检测抗体检测到。这些试验的结果和解读性信息可以返回到卫生保健提供 者以通报给受检个体。这类诊断可以由诊断实验室进行,或备选地,可以制造诊断试剂盒并 出售给卫生保健提供者或出售给私人个体以自我诊断。

[0483] 本公开的另一个方面提供用于确定个体中Notch3核酸表达或Notch3蛋白活 性,因而对该个体选择适宜治疗药或预防药的方法(在本文中称作"药物基因组学")。药 物基因组学允许基于个体的基因型(例如,接受检查以确定该个体响应于特定药物的能力 的个体的基因型),选择药物(例如,小分子药物或生物制品如抗体或其片段)用于该个体 的治疗性或预防性治疗。

[0484] 本公开的又一个方面涉及在临床试验中监测药物(例如,小分子药物或生物制品 如抗体或其片段)对Notch3蛋白表达或活性的影响。 实施例

[0485] 实施例1 :食蟹猴Notch3的克隆

[0486] 由于食蟹猴Notch3的序列在公共数据库中不可获得,所以将它如下克隆:

[0487] 食蟹猴总RNA

[0488] 全部总RNA均购自Zyagen(http://zyagen.com/index,php),San Diego,CA92121)。从食蟹猴的多种组织(脑、肾、肝、肺、骨骼肌、胰、脾、皮肤、胃、睾丸、胸 腺、甲状腺、骨髓)提取总RNAaZyagen未专门说明来源参考信息和个体猴的参考信息。使用 允许快速分离包括微RNA在内的总RNA的异硫氰酸胍-酚:氯仿提取法,从组织/细胞常 规提取总RNA。将RNA用无RNA酶的DNA酶处理以除去残余DNA,精确定量,并贮存在-80°C。 通过变性琼脂糖凝胶电泳验证每份RNA样品的完整性,如通过完整核糖体RNA所示。通过分 光光度计(A260/A280 :1. 9-2. 1)评估RNA的纯度。对于RNA印迹法、核糖核酸酶保护测定 法、SI核酸酶测定法、RT-PCR/Q-PCR分析、cDNA末端快速扩增(RACE),RNA是理想的;且对 于文库构建,纯化mRNA。将总RNA以lmg/ml的浓度在无RNA酶的水、ImM柠檬酸钠或0.ImM Η)ΤΑ中提供并且在干冰上运输。在接收后,全部总RNA样品均贮存在-80°C。

[0489] RNA逆转录成cDNA和PCR扩增

[0490] 全部总RNA均利用ThermoScriptRT-PCR系统(Invitrogen,Cat. 11146-016) 和寡聚dT逆转录。通常,2μg总RNA用于每份cDNA汇集物并且以20μ1洗脱。1μ1引 物(50μΜ寡聚(dT20),2yg(组织)。将总RNA和2μ1 10mMdNTP混合物合并,并用 DEPC-处理的水调节体积至12μ1。在65°C温育5分钟后,制备以下组分的主混合物:4μ1 5xcDNA合成缓冲液、1μ1 0· 1ΜDTT、1μ1RNaseOUT™ (40U/μ1)、1μ1DEPC处理的水和 1μ1ThermoScript™RT(15单位/μ1),并且将8μ1总体积在冰上添加至此前的每个反应 管。总RNA样品的逆转录阶段在55 °C于90分钟内完成。随后通过在85 °C温育整个反应物 五分钟,终止这种反应。最后,添加1μ1RNA酶Η并将样品在37°C温育20分钟。将cDNA 反应贮存在-20°C作为全部聚合酶链反应的基础材料。

[0491] 使用2μ1cDNA进行PCR扩增。在UTR区和在编码序列中设计引物。将PCR产物 直接进行凝胶提取并由直接测序分析。

[0492] 钓取食蟹猴Notch3基因的PCR引物

[0493] 将非人灵长类例如大猩猩、猩猩、恒河猴的靶序列与人序列比对以设计引物和特 异性检验。也可能需要靶序列的小鼠和大鼠序列。用于比对的靶序列可以是提取自数据库 如NCBI、eEnsembl或UniProt〇

[0494]

Figure CN105246916AD01011

[0495] LL^yo」Γυκ /ρμ坎光;

Figure CN105246916AD01021

[0497]使用ΚΑΡΑ™SYBR®FAST主混合物(2X),通过Corbett®Rotor-Gene6000 (现 在的QIAGEN®Rotor-GeneQ)RT-PCR实现cDNA的PCR。ΚΑΡΑ™SYBR®FASTqpcR 通 用主混合物(2X),一种即用型混合物,其含有抗体介导的热启动剂、SYBR®Green I荧光 染料、MgCl2、dNTP和用于qPCR中扩增和检测DNA的稳定剂(KAPABIOSYSTEMS)。对于PCR, 在每个0. lmlPCR管中制备体积20 μ 1的反应混合物,所述反应混合物由10 μ 1SYBR®: 绿、0· 4 μ 1正向引物(10 μΜ)、0· 4 μ 1反向引物(10 μΜ)、2 μ 1模板和7. 2 μ 1无RNA酶Η20 组成,并且管用盖封闭。PCR循环之前是95°C保温5分钟并且将循环步骤重复45次。变性 由加热反应体系至温度95°C持续10秒组成。在这个步骤后,温度降至60°C持续30秒,允 许引物复性至单链DNA模板上。通过升高温度至72°C持续30秒获得延伸并且重复循环步 骤。全部PCR产物随后加载于lxTBE琼脂糖凝胶1 %上,按PCR片段大小分离并进行凝胶 提取和用溴化乙锭(3x103mg/ml)染色。

[0498] 随后进行靶DNA片段的凝胶提取。在这种情况下,基于QIAquick®凝胶提取试 剂盒方案的程序用来纯化DNA片段,所述程序与MACHEREY-,NAGEL®的NudeoSpin® 8/96ExtractII组合。为了提取PCRDNA片段,将QIACiEN⑩的400μ1QG溶解缓冲液添 加至96孔板中的每条凝胶条带。为了熔化凝胶条带,将深孔平板置于热水浴(50至60°C) 中约15分钟。在抽吸该溶液到NudeoSpin® 8/96ExtractII滤板上之前,将溶液小心地 祸旋混合。如果DNA条带小于400bp,则使用额外的100μ1异丙醇。将溶液过滤两次。在 这个步骤后,将柱用650μ1洗涤缓冲液ΝΤ3洗涤两次并且随后通过置于真空下20分钟进 行干燥,之后用无RNA酶水洗脱DNA片段。为此,将NudeoSpin® 8/96ExtractII滤板 下的收集储器更换为"U型底"洗脱平板并将100μ1无RNA酶水在不触碰膜的情况下直接 添加到膜的中央。通过使用真空过滤实现DNA的提取并且洗脱物最终可以用于测序。

[0499] 测序和数据分析

[0500] 为了将纯化的DNA片段测序,将8μ1纯化的PCR样品与4μ1无RNA酶的Η20和 1μ1正向引物或1μ1反向引物(10μΜ)混合。用Sanger法联合AppliedBiosystems® ABI3730x1DNA分析仪完成PCR片段的测序。将DNA序列读数输入至程序,修订并且 随后相对于参比序列装配,在这种情况下,参比序列是人基因的序列。相应基因的序列从 Ensembl或Swiss-Prot基因组数据库浏览器直接拷贝入VectorNTI®中。参考序列的使 用允许鉴定全长序列。

[0501] 食蟹猴Notch3序列。在以下位置处鉴定到三个天然SNP:213S/N;719E/D;和 2053V/A。

[0502] MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAVPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGW VGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHSARCSVGPDGRFLCSCPP GYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQSS⑶LTYDCAC LPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCV CVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICT CPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTC ICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGICKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECR CAEGFEGMLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCP SGTTGVNCEVNIDDCASNPCSFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPG SLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPG VQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGG YTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLLGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYG GFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCPQSFTG PQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCV CPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGENCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSC PPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQD PGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGV PCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFSGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAP EVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNF DCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQ RLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADY LGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDVA AGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEELGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVAP AMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGET ALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAV EGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHF ANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGTHGLGPLLCPPGAFLPGLKVVTQSGSKKSRRPPGKAG LGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGL GRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAG AHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATATGALPAQPLPLSVPSSLAQ AQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQIDNO:268)

[0503] 实施例2 :筛选Notch3抗体和评价蛋白质/细胞结合作用

[0504] 为了选择识别人Notch3的抗体,在采用菌体展示文库的淘选中使用代表 Notch3受体关键区域(参见图1中的胞外结构域结构示意图)的几种重组蛋白。淘选中 使用Notch3的NRR、EGF32-NRR和配体结合(LBD)区。此外,在如下文描述的完整细胞淘 选或差异性完整细胞淘选中使用表达外源或内源Notch3的细胞系。使用市售噬菌体展示 文库MorphosysHuCAL|%ATimJM».文库作为抗体变体蛋白的来源,通过选择具有高亲 和结合亲和力的克隆,产生针对人Notch3蛋白的抗体。图3-6中显示Notch3抗体对重 组蛋白(人、小鼠、食蟹猴)以及对表达Notch3的细胞的结合特性。

[0505] 细胞系

[0506] U20S、MDA-MB-468、HCC1143 购自ATCC并在补充有 10%FBS和 1%青霉素-链霉 素的生长培养基中常规维持。细胞系TALL-1购自DSMZ并在补充有10%FBS和1%青霉 素-链霉素的生长培养基中常规维持。HLRPathDetect细胞购自Stratagene,并根据制造 商的说明书维持。

[0507] 产生用于Notch3-NRR结构域和Notch3-NRR-EGF结构域的表达载体

[0508] 将人Notch3NRR结构域(氨基酸1378-1640)的编码序列进行基因合成并亚克 隆至表达载体pRS5a的衍生物中以包括小鼠IgK信号肽和C末端六组氨酸纯化标签。类 似地,将人、食蟹猴和小鼠EGF32-NRR双结构域(分别是氨基酸1246-1640、1246-1640、 1247-1641)进行基因合成并克隆至表达载体pRS5a中以包括小鼠IgK信号肽和C末 端六组氨酸纯化标签。pRS5a含有CMV启动子并通过瞬时转染HEK293Freestyle细胞 (Invitrogen)用于表达所述蛋白质。

[0509] 重组Notch3蛋白的表达/纯化

[0510] 使用1: 3DNA:PEI转染试剂的比例,将表达Notch蛋白的载体瞬时转染入 HEK293Freestyle细胞。转染后7天,将细胞上清液施加至镍-NTA柱(Qiagen)以纯化加组 氨酸标签的蛋白质。将蛋白质用咪唑洗脱,随后在PBS中的SuperdeX200(GE)上通过大 小排阻法进一步纯化以除去任何聚集的蛋白质。通过SDS-PAGE和HPLC-大小排阻分析蛋 白质以评估纯度和聚集状态。

[0511] Notch3_LBD蛋白

[0512] 重组人 Notch3_Fc 嵌合体(登录号 Q9UM47,aa40-467)购自R&D Systems (#1559-NT-050)。重组小鼠 Notch3-Fc 嵌合体(登录号 Q61982,aa40-468)购自 R&DSystems(#1308-NT-050)〇

[0513] 产生过量表达Notch3的细胞系

[0514] 为了产生过量表达Notch3和Notch3_GFP的细胞系,cDNA购自Origene(目录号 RG224711)。使用NEON电穿孔仪(Invitrogen)遵循来自制造商的说明,将U20S细胞电穿 孔。电穿孔参数是:1230V脉冲电压,10ms脉冲宽度,4个脉冲。使用100μLNEON移液器 尖头(Invitrogen,目录号MPK10096),将一百万个U20S细胞与 2ygNotch3-GFPcDNA混 合。电穿孔后24小时,将细胞置于选择(200μg/mL的G418)下2周。将Notch3GFP阳性 细胞用FACS分选成两个群体一高GFP阳性细胞和中等GFP阳性细胞。选择来自每个亚群 体的克隆系并且通过FACS进一步检验Notch3细胞表面表达。

[0515] HuCALPLATINUM®淘选

[0516] 为选择识别人Notch3的抗体,使用多次淘选策略。使用市售噬菌体展示文库 MorphosysHuCALP_LA:TINUM·文库作为抗体变体蛋白的来源,通过选择具有高亲和结 合亲和力的克隆,产生针对人Notch3蛋白的治疗性抗体。该噬菌粒文库基于HuCAL®, 概念(Knappik等人,(2000)JMolBiol296:57-86)并利用在噬菌体表面上展示Fab的 CysDisplay⑧技术(Lohning,W0 01/05950)。为了分离抗Notch3抗体,使用固相、溶液、 完整细胞和差异性完整细胞淘选法,执行标准淘选策略。

[0517] 固相淘选

[0518] 在抗原选择过程之前,进行包被检验ELISA以确定抗原的最佳包被浓度。将96孔 Maxisorp™平板的适宜数目(取决于子文库汇集物的数目)的孔在4°C用300μ1Notch3 抗原包被过夜(ο/n)。对于每次淘选,用PBS/0. 05%Tween20/5%乳粉/5%BSA封闭约4x 1013个HuCALPLATINUM®1噬菌体-抗体。在封闭操作后,将预封闭的噬菌体混合物添加 至抗原包被和封闭的每个孔并且在室温(RT)在微量滴定板摇床上温育2小时。此后,通过 几个洗涤步骤洗去非特异性结合的噬菌体,并且对于洗脱特异性结合的噬菌体,使用10mM Tris/HClpH8中的DTT。将DTT洗脱物转移至14ml大肠杆菌TG1中,并且此后将大肠杆 菌TG1和DTT洗脱物的混合物在水浴中在37°C温育45分钟以便噬菌体感染。将细菌沉淀 物重悬于2xYT培养基中,铺种于LB/Cam琼脂平板上并在30°C温育过夜。将菌落从平板刮 下并用于噬菌体拯救、多克隆扩增选择的克隆和噬菌体产生。采用纯化的噬菌体,启动下一 轮淘选。

[0519] 根据第一轮的方案进行第二和第三轮固相淘选,例外是抗原的量减少和洗涤条件 更严格。

[0520] 采用链霉亲和素偶联的磁珠的溶液淘选方案

[0521] 溶液淘选的前提是抗原的生物素酰化和证实生物素酰化抗原保留活性。在溶液淘 选期间,将展示Fab的噬菌体和生物素酰化抗原在促进噬菌体接近抗原的溶液中温育。

[0522] 对于噬菌体汇集物,使用链霉亲和素珠(Dynabeads®M-280链霉亲和素; Invitrogen)并且对于每次淘选,将HuCALPLATINUM®噬菌体-抗体用Chemiblocker 封闭,随后,将ΙΟΟηΜ生物素酰化的Notch3抗原添加至噬菌体粒子并且在室温在摇床上温 育1-2小时。使用2mg封闭的链霉亲和素珠,捕获噬菌体-抗原复合物并用磁分离器收集与 链霉亲和素珠结合的噬菌体粒子。使用PBS/0. 05%Tween20和PBS,通过几个洗涤步骤洗 去非特异性结合的噬菌体。为了从链霉亲和素珠洗脱特异性结合的噬菌体,使用DTT。随后 将DTT洗脱物转移至大肠杆菌TG1中,并且将TG1和DTT洗脱物的混合物在水浴中在37°C 温育45分钟以便噬菌体感染。将细菌沉淀物重悬于2xYT培养基中,铺种于LB/Cam琼脂 平板上并在30°C温育过夜。将菌落从平板刮下并用于噬菌体拯救、多克隆扩增选择的克隆 和菌体产生。米用纯化的菌体,启动下一轮淘选。

[0523] 根据第一轮的方案进行第二和第三轮溶液淘选,例外是抗原的量减少和洗涤条件 更严格。

[0524] 针对Notch3的完整细胞淘选

[0525] 对于每次淘选,在PBS/5 %FCS中封闭约4x1013个HuCALPLATINXIM®噬菌 体-抗体。平行地,将每份噬菌体汇集物0. 5-1.OxlO7个表达Notch3抗原的靶细胞和(如 果用的话)〇. 5-1.OxlO7个不表达Notch3的吸附细胞在冰上重悬于lmlPBS/5%FCS中以 便封闭。将封闭的靶细胞离心、重悬于预封闭的噬菌体粒子中并在4°C在摇床上温育2小 时。在PBS的/5%FCS中洗涤噬菌体-细胞复合物3次。通过用0. 1M甘氨酸-HC1/0. 5M NaCl,pH2. 2酸性洗脱10分钟,从靶细胞洗脱特异性结合的噬菌体。在离心后,通过添加 2M未缓冲的Tris,中和上清液(洗脱物)。最终上清液用于噬菌体感染大肠杆菌TG1培养 物。将细菌沉淀物重悬于2xYT培养基中,铺种于LB/Cam琼脂平板上并在30°C温育过夜。 将菌落从平板刮下并用于噬菌体拯救和噬菌体扩增。扩增的噬菌体用于后续的淘选轮次。

[0526] 根据第一轮的方案进行第二和第三轮完整细胞淘选。

[0527] 针对Notch3的差异性完整细胞淘选

[0528] 在差异性完整细胞淘选中,在细胞和纯化的蛋白质上交替进行选择。如对固相淘 选所述那样在纯化的抗原上进行选择轮次。对于细胞上的选择轮次,请参考完整细胞淘选 的程序。与完整细胞淘选相反,在DWCP中可以省略后吸附。

[0529] 成熟淘选

[0530] 为了增加所选择的抗体片段的亲和力和生物活性,使用三核苷酸定向诱变 (Virnekas等人,(1994)NucleicAcidsResearch22:5600-5607),通过盒诱变法平行地优 化L-CDR3和H-CDR2区,而构架区保持恒定。在用于亲和力成熟的克隆之前,将亲本Fab片 段从相应的表达载体亚克隆到展示载体中。

[0531] 为了选择亲和力改善的结合物,使用Notch3抗原(hN3_EGF4-ll_Fc、hN3_ EGF4-ll_Fc_biot、hN3_EGF32_NRR_His和hN3_NRR_His_biot),对衍生自成熟文库的噬菌 体进行三轮固相淘选、溶液淘选或差异性完整细胞淘选。通过降低每个淘选轮次中的抗原 浓度,增加严格性(Low等人,(1996)JMolBiol260:359-368)。除减少抗原之外,进行解 离速率选择(Hawkins等人,(1992)JMolBiol226:889-896)。这与22°C的延时洗涤步骤 组合。

[0532] 亚克隆和微量表达选择的Fab片段

[0533] 为了促进可溶性Fab的快速表达,将选择的HuCALPLATINUM®1噬菌体的 编码Fab的插入物从pMORPH®30展示载体亚克隆入pMORPH®xll表达载体 pMO:RPlAll_FH 中。

[0534] 通过EcoRI/Xbal/Bmtl三重消化进行亚克隆。在转化大肠杆菌TG1-F单 个克隆后,如先前所描述进行含有I-IuCAL'Fab片段的周质提取物的表达和制备 (Rauchenberger 等人,(2003) J Biol Chem. 278:38194-38205)。

[0535] 制备含有细菌裂解物的Fab用于ELISA筛选

[0536] 将5 μ1每种过夜培养物转移至每孔预填充有40 μ1 2xYT培养基(34 μg/ml氯霉 素(Cam) ;0.1 %葡萄糖)的无菌384孔微量滴定板。将平板在37°C温育直至培养物略微 浑浊。向这些表达平板,每孔添加1(^121¥1'培养基(34以 8/11110&111和511111?16)。将 平板用透气性胶带密封并在22°C温育过夜。向表达平板的每个孔添加15 μ1 BEL缓冲剂 (2. 5mg/ml溶菌酶,4mM EDTA,10U/ μ1 Benzonase)并将平板在22°C温育1小时。对于后续 ELISA筛选,通过向每个孔添加15 μ1 12. 5%MPBST并以400转/分钟和在22°C振摇平板 至少30分钟,封闭含有Fab的大肠杆菌裂解物。将表达平板立即使用或贮存在-20°C。

[0537] 制备含有Fab的细菌裂解物用于FACS筛选

[0538] 将5 μ1每种过夜培养物转移至每孔预填充有100 μ1 2xYT培养基(34 μg/ml Cam ;0. 1 %葡萄糖)的无菌96孔微量滴定板。将平板在22°C温育直至培养物略微浑浊。向 这些表达平板,每孔添加2(^121丫1'培养基(34以 8/11110&111;311111?16)。将平板用透气性 胶带密封并在22°C温育过夜。向表达平板的每个孔,添加15 μ1 BEL缓冲剂(2. 5mg/ml溶 菌酶,4mM EDTA,10U/ μ1 Benzonase)并将平板在22°C温育1小时。对于后续FACS筛选, 通过向每个孔添加15 μ1 16% FBS并以400转/分钟和在22°C振摇平板至少30分钟,封 闭含有Fab的大肠杆菌裂解物。在温育后,离心BEL-裂解物以使细菌细胞碎片沉淀下来。 含有Fab的上清液立即用于筛选目的或存储在-20°C。

[0539] ELISA筛选直接包被的抗原

[0540]将 Maxisorp™384 孔平板用 PBS 中浓度分别为 2. 5 μ g/ml、5 μ g/ml 或 1. 25 μ g/ ml 的 Notch3 抗原 hN3_NRR_His、hN3_EGF32_NRR_His 和 hN3_EGF4-ll_Fc 包被。用 PBS 中 的5%脱脂乳粉封闭平板后,添加含有Fab的大肠杆菌裂解物。使用AttoPhos荧光底物 (Roche,#11681982001),通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)4.异性山羊抗人IgG(Jackson Tmmuno Research#109-055_097 ; 1:5000 稀释)检测 Fab 的结合。记录在 535nm 的焚光发 射,在430nm激发。

[0541] ELISA筛选生物素酰化的抗原

[0542]将 NeutrAvidin™-包被的平板用 2. 5-5 μ g/ml hN3_NRR_His、5-10 μ g/ml hN3_ EGF32_NRR_His生物素酰化的Notch3抗原或用稀释于PBS中的1. 25 μ g/ml hN3_EGF4-ll_ Fc抗原包被。用PBS中的3%牛血清白蛋白封闭后,添加含有Fab的大肠杆菌裂解物。 使用AttoPhos荧光底物(Roche,#11681982001),通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)#. 异性山羊抗人 IgG (Jackson Tmmuno Research#109-055_097 ; 1:5000 稀释)检测捕获的 HuCAL®-Fal)片段。记录在535nm的荧光发射,在430nm激发。

[0543] FACS筛选

[0544] 在FACS筛选时,从淘选输出结果鉴定与细胞表面表达的抗原结合的单个Fab 克隆。使用含有Fab的粗制大肠杆菌裂解物测试Fab。所用的细胞系是U20S细胞 (ATCC#HTB-96 ;未修饰的细胞=U20S_par或经遗传修饰以高度表达人Notch3的细胞= U20S_N3)和携带Notch3基因扩增的乳腺癌细胞系HCC1143(ATCC#CRL-2321)。

[0545] 将100μ1细胞悬液转移入一块新的96孔板(产生lx105个细胞/孔)。将含有 靶细胞悬液的平板离心并且弃去上清液。重悬剩余的细胞沉淀物并且将50μ1含有Fab的 FACSBEL提取物添加至相应的孔。将平板在冰上温育1小时。在温育后,将细胞离心并用 200μ1FACS缓冲液(PBS,3%FCS)洗涤3次。在每个洗涤步骤后,将细胞离心并小心地重 悬。

[0546] 添加PE缀合的山羊-抗人IgG第二检测抗体(Jackson,目录号109-116-098)并 且将样品在冰上温育并随后根据Fab温育洗涤。

[0547] 最后,将细胞沉淀物重悬于每孔150μ1 FACS缓冲液中并在BDFACS阵列中分析 样品。

[0548] 亲和力成熟后筛选

[0549]对于基于(Haenel等人,(2005)AnalBiochem. 339:182-184)描述的原理,通过溶 液平衡滴定法对成熟的结合物排级别,将恒定量的稀释的BEL提取物以不同浓度的抗原过 夜平衡。

[0550] 随后,将混合物转移至事先用抗原包被的MSD平板,并且温育和洗涤后,添加合适 的MSD-磺基标签标记的检测抗体。

[0551] 随后,使用Sector成像仪 6000(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MD,美国) 通过ECL检测,对未结合的Fab的浓度定量。

[0552] 采用相应拟合模型,使用XLfit(IDBS)软件处理结果,以评估亲和力并且因此鉴 定通过成熟过程改进最大的克隆。

[0553] 大肠杆菌中表达和纯化加His标签的HllCAL®Fab片段(mg规模)

[0554] 在摇瓶培养物中使用500ml补充有0. 1 %葡萄糖和34μg/ml氯霉素的2xYT培养 基,实施大肠杆菌TG1F-细胞中表达pMCMPIi翁xll_lab_FH:编码的Fab片段。将培养 物在30°C振摇直至0D6。。达到值0. 5。通过以终浓度0. 75mM添加IPTG(异丙基-β-D-硫 代半乳糖吡喃糖苷)并且在30°C进一步培养20小时,诱导Fab表达。将细胞收获并使用溶 菌酶破坏。借助IMAC(Bi〇-Rad,德国)分离加His6标签的Fab片段并使用咪唑洗脱。使 用]^10 柱(GEHealthcare,德国),将缓冲液交换成lxDulbeccc/sPBS(pH7.2)。无菌 过滤样品(〇. 2μπι)。通过UV-分光光度法确定蛋白质浓度。在变性、还原型15%SDS-PAGE 中分析样品的纯度。在天然状态下通过大小排阻层析(HP-SEC)用校正标准品确定Fab制 备物的均匀性。

[0555] 转化成IgG

[0556] 为了表达全长IgG,将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从Fab表达载体亚 克隆入用于igGlf的适宜pMorph4®_hIgGlf载体中。

[0557] 以IgG筛选规模瞬时表达人IgG

[0558] 在96孔表达系统中使用真核HEK293cl8细胞(ATCC#CRL-10852)以产生条件化的 细胞培养上清液,所述细胞培养上清液含有后续用于特异性和/或功能性筛选分析法的全 长IgG〇

[0559] 将HuCAL®Fab片段从pMORPH®表达载体或展示载体亚克隆至 pMORPH®4Ig表达载体中。所产生的连接物用于转化大肠杆菌XLlBlue,接着将样品 涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的LB平板上。

[0560] 通过使用与Bi〇R_wt_8000装置组合的适宜DNA制备试剂盒,制备单菌落的 DNA制备物。通过UV-分光光度法确定各个DNA浓度。

[0561] 在前一日,将真核HEK293cl8细胞在96孔平底平板中接种密度约4xl04个细胞 /50以1/孔日并用等量的18表达载体0嫩转染。在37°(:和6%〇) 2温育40-50小时后,将 培养上清液转移至96孔U型底平板并通过离心澄清。通过抗-Fd捕获ELISA测试所产生 的Ig上清液,参考已知的标准物计算Ig浓度,并贮存在-20°C以稍后用于特异性和/或功 能性筛选测试法。

[0562] 采用纯化Ig在直接包被抗原上的ELISA

[0563]Maxisorp™384 孔平板用PBS中的Notch3 抗原hN3_NRR_His(2. 5μg/ml),N3_ EGF32_NRR_His(对于人、食蟹猴和小鼠,5μg/ml)和N3_EGF4-ll_Fc(人L25μg/ml;食蟹 猴和小鼠:5yg/ml)包被。用PBS中的5%脱脂乳粉封闭平板后,添加来自探索性规模表达 的IgG(对于ELISAEC5。测定,在1:3稀释步骤中从50μg/ml(333. 3nM)起向下进行12点 滴定)。使用AttoPhos荧光底物(Roche,#11681982001),通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)2 特异性山羊抗人IgG(JacksonTmmunoResearch#109-055_097 ; 1:5000 稀释)检测IgG的 结合。记录在535nm的焚光发射,在430nm激发。

[0564] 采用探索性规模IgG的FACS筛选

[0565] 在FACS筛选时,从探索性规模表达鉴定与细胞表面表达的抗原结合的IgG。 所用的细胞系是U20S细胞(ATCC#HTB-96 ;未修饰的细胞=U20S_par或经遗传修饰 以高度表达人Notch3的细胞=U20S_N3)和携带Notch3基因扩增的乳腺癌细胞系 HCC1143(ATCC#CRL-2321)。

[0566] 将100μ1细胞悬液转移入一块新的96孔板(产生lx105个细胞/孔)。将含有 靶细胞悬液的平板离心并且弃去上清液。重悬剩余的细胞沉淀物并且将50μ1IgG稀释物 添加至相应的孔。在1:5稀释步骤中从20μg/ml起向下进行FACSEC5。确定。将平板在冰 上温育1小时。在温育后,将细胞离心并用200μ1FACS缓冲液(PBS,3%FCS)洗涤3次。 在每个洗涤步骤后,将细胞离心并小心地重悬。添加PE缀合的山羊-抗人IgG第二检测抗 体(Jackson,目录号109-116-098)并且将样品在冰上温育并随后根据Fab温育洗涤。最 后,将细胞沉淀物重悬于每孔150μ1FACS缓冲液中并在BDFACS阵列中分析样品。

[0567] 用于产生表达Notch3抗体的稳定细胞系的表达载体

[0568] 为了更大规模表达Notch3抗体,将轻链编码序列和重链编码序列从噬菌体载体 克隆到含有小鼠IgK信号肽的单个双CMV启动子质粒中,以产生稳定的细胞系。通过ELISA 对细胞筛选Notch3抗体的高水平表达。

[0569]BiacoreKd测定

[0570]使用Biacore3000 仪(Biacore,GEHealthcare)如下文所述那样,借助SPR通过 测定动力学参数进行亲和力测定。

[0571] 直接包被的抗原上的Biacore测定。如下分析与固定化抗原的结合作用。将抗原 遵循制造商的操作方案固定在芯片表面上。使用六种不同的Fab浓度(2倍连续稀释物), 进行动力学测量。在每个循环后再生传感芯片。空白注射运行缓冲液,用作双重参比。使 用BIA评价软件4. 1. 1 (Biacore,GEHealthcare)拟合全部传感图,以确定Uk。^速率 常数,该常数用来计算KD。

[0572] 备选地,对于定性结合实验,使用IgG样品作为样品。为了IgG样品的相对比较, 使用与Fab片段相同的模型拟合结合曲线。

[0573] 使用标准EDC-NHS胺偶联化学,将稀释于10mMpH4. 5乙酸盐缓冲液中至10μg/mL 的大约 100RUhN3_NRR_His(或 400RUhN3_EGF32_NRR_His)固定在CM5 芯片(Biacore,GE Healthcare)上。仅活化和去活化参比流动小室1。运行缓冲液是0.005% (v/V)Tween20 的PBS(GIBC0)pH7. 2,流速25μ1/分钟。使用范围从15. 6至500nM的Fab浓度,注射时间 120秒和适宜的解离时间例如240秒。通过注射1次甘氨酸/HC1pH2. 5 (20秒)和注射1 次甘氨酸/HC1pH2 (20秒)进行结合的分析物的再生。用设定至"全局(global) "的尺_ 和设定至0的RI参数进行拟合。

[0574] 借助抗体捕获设置的BiacoreKD测定。如下分析单体抗原对捕获抗体的结合。 在CM5芯片(Biacore,GEHealthcare)上,使用EDC/NHS化学,共价固定适宜的捕获抗体 (Biacore,GEHealthcare)。通过捕获抗体和后续注射六种不同的抗原浓度(2倍连续稀释 物),进行动力学测量。在每个循环后再生传感芯片。空白注射运行缓冲液,用作双重参比。 使用BIA评价软件4. 1. 1 (Biacore,GEHealthcare)拟合全部传感图,以确定U1^。"速 率常数,该常数用来计算KD。

[0575]运行缓冲液是 0· 05% (v/v)Tween20 的PBS(GIBC0)pH7. 2。使用抗人Fc抗体 (Biacore,GEHealthcare)捕获100RUIgG。使用例如范围从15.6至500nM的抗原浓度 (hN3_NRR_His或hN3_EGF32_NRR_His),流速30μ1/分钟,注射时间180秒和适宜的解离时 间例如360秒。通过按30秒注射2次3ΜMgCl2,进行抗体/抗原复合物的再生。用设定至 "全局"的1?_和设定至〇的RI参数进行拟合。

[0576] 借助抗原捕获的BiacoreKD测定。如下分析Fab对捕获抗原的结合。在CM5芯 片(Biacore,GEHealthcare)上,使用EDC/NHS化学,共价固定适宜的抗-抗原标签捕获 抗体。通过捕获抗原和后续注射六种不同的Fab浓度(2n连续稀释物),进行动力学测 量。在每个循环后再生传感芯片。空白注射运行缓冲液用于双重参比。使用BIA评价软件 4. 1. 1 (Biacore,GEHealthcare)拟合全部传感图,以确定MPk。》速率常数,该常数用来 计算KD。

[0577]运行缓冲液是 0· 05% (v/v)Tween20 的PBS(GIBC0)pH7. 2。使用抗人Fc抗体 (Biacore,GEHealthcare)捕获大约75RU抗原(例如hN3_EGF4-ll_Fc,5〇nM)。使用例如 范围从15. 6至500nM的抗体Fab片段浓度,流速30μ1/分钟,注射时间180秒和适宜的解 离时间(例如直至1800秒)。通过按35秒注射2次3ΜMgCl2,进行抗体/抗原复合物的 再生。用设定至"全局"的R_和设定至0的RI参数进行拟合。

[0578]使用Sector成像仪6000 (MSD),用于KD测定的溶液平衡滴定(SET)法

[0579]溶液中的亲和力测定基本上如文献(Friquet等人,(1985)JImmunolMethods 77:305-319)中所述进行。为了改善SET法的灵敏度和准确度,将它从经典ELISA转移为基 于ECL的技术(Haenel等人,(2005)AnalBiochem339:182-184)。

[0580] 根据制造商的说明书,将lmg/ml山羊抗人$813)2片段特异性抗体(Dianova或 Bethyl)用MSD横基-TAGTMNHS-酯(MesoScale0丨8(3〇¥6^,6&;[1:116^1311找,]\0),美国)标 记。对于小鼠抗体的KD测定,标记相应的抗小鼠IgG并用作检测试剂。

[0581] 实验在聚丙烯微量滴定板中实施并且使用含有0. 5 %BSA和0. 02%Tween-20的 PBSpH7. 4作为测试缓冲液。将未标记的抗原以2倍系列稀释,始于高于预计KD至少10 倍的浓度。无抗原的孔用来测值;仅含测试缓冲液的孔用来确定背景。在添加适宜 量的结合物(抗体浓度类似于或低于预计KD,60μ1终体积)后,将混合物在室温温育过夜。

[0582] 用抗原包被MSD平板(每孔30 μ1)。用含有0. 02%Tween-20的PBS洗涤平板 后,将平衡的样品转移至这些平板(每孔30 μ1)并温育20分钟。在洗涤后,将每孔30 μ1 MSD-磺基标签标记的检测抗体(抗人(Fab) 2,最终稀释度一般1:2000)添加至MSD平板并 在室温在Eppendorf摇床(700转/分钟)上温育30分钟。

[0583] 在洗涤MSD平板并添加30μ1/孔含表面活性剂的MSD读数缓冲液T后,使用 Sector成像仪 6000(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MD,美国)检测电化学发光信 号。

[0584] 采用定制的拟合模型,用XLfit(IDBS)软件评价数据。对于Fab分子的KD测定, 使用根据(Abraham等人,(1996)JMolRecognit. 9, 456-461)改良的以下拟合模型(根据 (Haenel等人·(2005)AnalBiochem339:182-184):

[0585]

Figure CN105246916AD01111

[0586] [Fab],:应用的总Fab浓度

[0587] X:应用的可溶性抗原总浓度(结合位点)

[0588]Bmax:无抗原时Fab的最大信号

[0589] KD:亲和力。

[0590]对于IgG分子的KD测定,使用以下拟合模型(根据(Piehler等人,(1997) JImmunolMethods201:189-206)改良):

[0591]

Figure CN105246916AD01112

[0592] [IgG]:应用的总IgG浓度

[0593] X:应用的可溶性抗原总浓度(结合位点)

[0594]Bmax:无抗原时IgG的最大信号

[0595] KD:亲和力。

[0596] 实验设置:

[0597] HuCAL®_Fab(或IgG)的KD测定基本上如下进行:将抗原hN3_EGF4_ll_Fc 以PBS中的0. 2μg/mL在4°C在标准MSD平板上包被过夜(或1μg/mL的hN3_NRR_His,这 取决于样品的特异性)。随后,将MSD平板在室温用含有3%BSA的PBS封闭1小时。单体 抗原(hN3_NRR_His)必须用于IgG样品的滴定;对于Fab片段的KD测定,hN3_NRR_His和 hN3_EGF4-ll_Fc均可以使用。

[0598] 淘选策略和筛选的总结

[0599] 使用重组Notch3抗原以及表达Notch3的细胞系,单独或组合执行11种初始淘选 束略。对淘选输出结果师选抗原结合作用和功能活性。3771种原始命中结果显不与Notch3 重组抗原结合,774种在表达Notch3的细胞上阳性并产生295个独特克隆。用55种IgG进 行完整抗体表征,选择12个候选物用于亲和力成熟(包括与Notch3NRR-结构域结合的 5个克隆和与Notch3LBD-结构域结合的7个克隆)。在亲和力成熟后的SET-筛选产生 315个改进的独特克隆(9个家族)。对111μ-规模表达的IgG筛选抗原结合作用和功能 性。进一步表征31/111种IgG(来自8个不同HCDR3家族)并且产生属于4个不同HCDR3 家族的9个优先克隆。

[0600] 实施例3 :在配体驱动的报道基因测定法中表征Notch3抗体

[0601] 当一个细胞上的Notch受体与毗邻细胞上的配体相互作用时,活化规范的Notch 信号传导。在哺乳动物中,存在五种跨膜配体,为三种S样配体(DLL1、DLL4和DLL3)和两 种Jagged配体(Jagl、Jag2)。为了确定抗Notch3抗体抑制Notch3配体诱导的信号传导 的能力,开发了使用双重稳定报道分子细胞系HLR-huNotch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4-UA-萤 光素酶的报道基因测定法(RGA)。使用这种测定法,研究对Jagl或DLL1活化的Notch3信 号传导的抑制。对人Notch1和Notch2受体开发了相似的测定法。在这个系列的Notch 受体特异性RGA测定法中测试Notch3抗体允许特异性评估抗体对Notch3的抑制。

[0602] 为了确定抗Notch3抗体抑制Notch3配体诱导的信号传导的能力,开发了使用双 重稳定报道分子细胞系HLR-huNotch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4-UA-萤光素酶的报道基因测 定法(RGA)。

[0603] 产生表达人Notch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4_UA-萤光素酶的细胞系

[0604] 向逆转录病毒载体pLNCX2(Clontech,目录号631503)中克隆人Notchl、Notch2和 Notch3以及食蟹猴Notch3胞外部分和跨膜部分,后接Gal4DNA结合结构域、VP16及核定 位序列(NLS)。这些嵌合Notch受体的产生和相应报道基因测定法允许研究Notch3抗体对 Notch受体特异性信号传导的影响。

[0605]Notchl-Gal4-VP16、Notch2-Gal4-VP16 和Notch3-Gal4-VP16 的表达载体

[0606] 将Gal4_VP16的编码序列进行基因合成并克隆至载体pLNXC2(Clontech)的 Sall-Clal位点中以制备pLNXC2-Gal4-VP16。将食蟹猴Notch3 (氨基酸1-1669)、人 Notchl(氨基酸1-1762)和人Notch2 (1-1704)的胞外(ECD)结构域和跨膜结构域基因 合成并克隆至pLNXC2-Gal4-VP16的HindIll-SalI位点中,以产生相应Notch蛋白与 Gal4-VP16的融合物。

[0607] 用于Notch-Gal4_VP16表达载体的构建体

[0608]人Notch3-Gal4_VP16

[0609] MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPP GffVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSC PPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQS⑶LTYDCA CLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSC VCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAIC TCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFT CICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYEC RCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRC PSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPP GSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPP GVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHG GYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGY GGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFT GPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYC VCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCS CPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQ DPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVG VPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAA PEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDN FDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFL QRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAAD YLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRL KKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALL TGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSKLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFP GISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDML⑶⑶SPGPG(SEQ ID N0:272)

[0610] 食蟹猴Notch3-Gal4_VP16

[0611] MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAVPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGff VGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHSARCSVGPDGRFLCSCPP GYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQS⑶LTYDCACL PGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSCVC VNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTC PPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCI CMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGICKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRC AEGFEGMLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPS GTTGVNCEVNIDDCASNPCSFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGS LPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGV QGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGY TGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLLGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGG FHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCPQSFTGP QCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVC PEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGENCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCSCP PGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQDP GGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVP CQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFSGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPE VSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFD CHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQR LSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYL GALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRLKK LKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTG LFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSQLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGI STAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDML⑶⑶SPGPG(SEQ ID N0:273)

[0612] 人Notchl-Gal4_VP16

[0613] MPPLLAPLLCLALLPALAARGPRCSQPGETCLNGGKCEAANGTEACVCGGAFVGPRCQDPNPCLSTPCK NAGTCHWDRRGVADYACSCALGFSGPLCLTPLDNACLTNPCRNGGTCDLLTLTEYKCRCPPGWSGKSCQQADPCAS NPCANGGQCLPFEASYICHCPPSFHGPTCRQDVNECGQKPGLCRHGGTCHNEVGSYRCVCRATHTGPNCERPYVPCS PSPCQNGGTCRPIODVTHECACLPGFTGQNCEENIDDCPGNNCKNGGACVDGVNTYNCRCPPEWTGQYCTEDVDECQ LMPNACQNGGTCHNTHGGYNCVCVNGWTGEDCSENIDDCASAACFHGATCHDRVASFYCECPHGRTGLLCHLNDACI SNPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPSGYTGPACSQDVDECSLGANPCEHAGKCINTLGSFECQCLQGYTGPRCEIDVN ECVSNPCQNDATCLDQIGEFQCICMPGYEGVHCEVNTDECASSPCLHNGRCLDKINEFQCECPTGFTGHLCQYDVDE CASTPCKNGAKCLDGPNTYTCVCTEGYTGTHCEVDIDECDPDPCHYGSCKDGVATFTCLCRPGYTGHHCETNINECS SQPCRHGGTCQDRDNAYLCFCLKGTTGPNCEINLDDCASSPCDSGTCLDKIDGYECACEPGYTGSMCNINIDECAGN PCHNGGTCEDGINGFTCRCPEGYHDPTCLSEVNECNSNPCVHGACRDSLNGYKCDCDPGWSGTNCDINNNECESNPC VNGGTCKDMTSGYVCTCREGFSGPNCQTNINECASNPCLNQGTCIDDVAGYKCNCLLPYTGATCEVVLAPCAPSPCR NGGECRQSEDYESFSCVCPTGWQGQTCEVDINECVLSPCRHGASCQNTHGGYRCHCQAGYSGRNCETDIDDCRPNPC HNGGSCTDGINTAFCDCLPGFRGTFCEEDINECASDPCRNGANCTDCVDSYTCTCPAGFSGIHCENNTPDCTESSCF NGGTCVDGINSFTCLCPPGFTGSYCQHDVNECDSQPCLHGGTCQDGCGSYRCTCPQGYTGPNCQNLVHWCDSSPCKN GGKCWQTHTQYRCECPSGWTGLYCDVPSVSCEVAAQRQGVDVARLCQHGGLCVDAGNTHHCRCQAGYTGSYCEDLVD ECSPSPCQNGATCTDYLGGYSCKCVAGYHGVNCSEEIDECLSHPCQNGGTCLDLPNTYKCSCPRGTQGVHCEINVDD CNPPVDPVSRSPKCFNNGTCVDQVGGYSCTCPPGFVGERCE⑶VNECLSNPCDARGTQNCVQRVNDFHCECRAGHTG RRCESVINGCKGKPCKNGGTCAVASNTARGFICKCPAGFEGATCENDARTCGSLRCLNGGTCISGPRSPTCLCLGPF TGPECQFPASSPCLGGNPCYNQGTCEPTSESPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQ EDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLY DQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVWVLMPPEQLRNSSFHFLRELSRVLHTNWFKR DAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRELDPMDVRGSIVYLEIDNRQ CVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSETVEPPPPAQLHFMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKR RRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFP REDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSQL KLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSL⑶ELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDML⑶⑶SPGPG(SEQ ID NO :274)

[0614]人 Notch2-Gal4_VP16

[0615] MPALRPALLWALLALWLCCAAPAHALQCRDGYEPCVNEGMCVTYHNGTGYCKCPEGFLGEYCQHRDPCE KNRCQNGGTCVAQAMLGKATCRCASGFTGEDCQYSTSHPCFVSRPCLNGGTCHMLSRDTYECTCQVGFTGKECQWTD ACLSHPCANGSTCTTVANQFSCKCLTGFTGQKCETDVNECDIPGHCQHGGTCLNLPGSYQCQCPQGFTGQYCDSLYV PCAPSPCVNGGTCRQTCDFTFECNCLPGFEGSTCERNIDDCPNHRCQNGGVCVDGVNTYNCRCPPQWTGQFCTEDVD ECLLQPNACQNGGTCANRNGGYGCVCVNGWS⑶DCSENIDDCAFASCTPGSTCIDRVASFSCMCPEGKAGLLCHLDD ACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVDECAMANSNPCEHAGKCVNTDGAFHCECLKGYAGPRCE MDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTCLCMPGFKGVHCELEINECQSNPCVNNGQCVDKVNRFQCLCPPGFTGPVCQI DIDDCSSTPCLNGAKCIDHPNGYECQCATGFTGVLCEENIDNCDPDPCHHGQCQDGIDSYTCICNPGYMGAICSDQI DECYSSPCLNDGRCIDLVNGYQCNCQPGTSGVNCEINFDDCASNPCIHGICMDGINRYSCVCSPGFTGQRCNIDIDE CASNPCRKGATCINGVNGFRCICPEGPHHPSCYSQVNECLSNPCIHGNCTGGLSGYKCLCDAGWVGINCEVDKNECL SNPCQNGGTCDNLVNGYRCTCKKGFKGYNCQVNIDECASNPCLNQGTCFDDISGYTCHCVLPYTGKNCQTVLAPCSP NPCENAAVCKESPNFESYTCLCAPGWQGQRCTIDIDECISKPCMNHGLCHNTQGSYMCECPPGFSGMDCEEDIDDCL ANPCQNGGSCMDGVNTFSCLCLPGFIODKCQTDMNECLSEPCKNGGTCSDYVNSYTCKCQAGFDGVHCENNINECTL· SSCFNGGTCVDGINSFSCLCPVGFTGSFCLHEINECSSHPCLNEGTCVDGLGTYRCSCPLGYTGKNCQTLVNLCSRS PCKNKGTCVQKKAESQCLCPSGWAGAYCDVPNVSCDIAASRRGVLVEHLCQHSGVCINAGNTHYCQCPLGYTGSYCE EQLDECASNPCQHGATCSDFIGGYRCECVPGYQGVNCEYEVDECQNQPCQNGGTCIDLVNHFKCSCPPGTRGLLCEE NIDDCARGPHCLNGGQCMDRIGGYSCRCLPGFAGERCE⑶INECLSNPCSSEGSLDCIQLTNDYLCVCRSAFTGRHC ETFVDVCPQMPCLNGGTCAVASNMPDGFICRCPPGFSGARCQSSCGQVKCRKGEQCVHTASGPRCFCPSPRDCESGC ASSPCQHGGSCHPQRQPPYYSCQCAPPFSGSRCELYTAPPSTPPATCLSQYCADKARDGVCDEACNSHACQWDG⑶C SLTMENPWANCSSPLPCWDYINNQCDELCNTVECLFDNFECQGNSKTCKYDKYCADHFKDNHCDQGCNSEECGWDGL DCAADQPENLAEGTLVIVVLMPPEQLLQDARSFLRALGTLLHTNLRIKRDSQGELMVYPYYGEKSAAMKKQRMTRRS LPGEQEQEVAGSKVFLEIDNRQCVQDSDHCFKNTDAAAALLASHAIQGTLSYPLVSVVSESLTPERTQLLYLLAVAV VIILFIILLGV頂AKRKRVDKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVE SRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEE SSNKGQRQLTVSQLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFPGISTAPPTDVSL⑶ELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDML⑶G DSPGPG(SEQ ID NO :275)

[0616] 产生逆转录病毒以表达Notch3-Gal4_VP16

[0617]用适宜的逆转录病毒载体(pLNCX2_hNotchl_Gal4-VP16、pLNCX2_hNotch2_ Gal4-VP16、pLNCX2_hNotch3_Gal4-VP16、pLNCX2_cNotch3_Gal4-VP16)转染 293-GP2 包装 细胞系(Clontech,目录号631458),产生逆转录病毒。使用Promega的Fugene6作为基于 脂质的转染试剂。根据制造商的说明书实施转染。在转染后48小时收集病毒并立即用来 转导HLR细胞(HLR-PathDetect,Stratagene)。转导的细胞接受选择至少两周,之后在共 培养测定法中测试它们。选择每个细胞系的克隆性群体。

[0618] Notch3-Gal4-NLS-VP16_UA-萤光素酶配体诱导的报道基因测定法

[0619] 通过与稳定表达细胞表面表达的rrjaggedl (SN3T9)或rrDeltal (DLL1-19)的 L 细胞(HICKSC 等人(2000)Nature Cell Bio 2:515-520 ;Lindsell C 等人(1995)Cell 80:909-917)共培养,活化 HLR-Notch3-Gal4-NLS-VP16/Gal4-UA-TATA-萤光素酶(HLR-N3) 细胞。与表达配体的细胞共培养导致活化Notch3信号传导和蛋白酶剪切Notch3嵌合受 体以释放Gal4-NLS-VP16。这种Gal4-NLS-VP16转位到核酸酶,在那里它与Gal4-萤光素酶 报道分子结合,导致萤光素酶产生。在90%汇合度时,使用胰蛋白酶40了4使11?-吧细胞 脱离贴壁并且在测试介质(DMEM,高葡萄糖,L-Glu,Invitrogen,目录号21063-029 ;补充有 10 %FBS,1 %P/S)中稀释至浓度2x105个细胞/ml。将每孔50μ1HLR-N3细胞(=1x10 4 个细胞)接种在白色平底96孔板(Costar,目录号3917)中并在37°C和5%C02温育过夜。

[0620] 次日,将.HuCAL®抗体(IgG)在PBS中以所需的浓度稀释。将每孔10μ1抗体 稀释物添加至接种的细胞并在37°C和5%C02温育2小时。接下来,使用胰蛋白酶-EDTA, 使表达Jaggedl和Deltal配体的小鼠L细胞脱离贴壁并在测试介质中稀释至浓度8x105 个细胞/ml。将每孔50μ1小鼠L细胞(=4x104个细胞/孔)添加至培养的HLR-N3细 胞(50μ1HLR细胞+10μ1抗体+50μ1小鼠细胞=110μ1终体积)并在37°C和5%C02 温育过夜。对于配体非依赖的设定,作为对照,代之以添加50μ1小鼠亲本L细胞。

[0621] 在温育过夜后,使50μ1新鲜制备的Bright-Glo试剂适应室温(Promega,目录号 E2610)并添加至每个孔。在5分钟温育时间后,在光度计(Geni〇SPr〇,TeCan)中读取发光。 在充分滴定相应的抗体后使用Prism计算IC5。值。相对IgG对照来显示抑制%。如果添加 抗体后检测到增加的信号传导,则使用负数。

[0622] 总结和讨论

[0623]除huNotch3RGA之外,还如上文所述进行cynoNotch3RGA以及huNotchlRGA(仅 DLL1配体设定)和huNotch2RGA(Jaggedl和DLL1)。直至最大浓度10yg/ml,所述的 Notch3抗体无一在huNotchlRGA或huNotch2RGA中显示任何活性。鉴定到抑制Jaggedl 诱导和Deltal诱导的Notch3信号传导的Notch3抗体。抑制百分数和IC5。根据用于活化 的抗体和配体变动。从针对LBD结构域(12229、20364、20802)的淘选中鉴定的抗体在抑制 来自这种配体驱动的RGA测定法的信号传导方面最有效,如图7A-D中所示。

[0624] 实施例4 :Notch3抗体对Notch革E1基因mRNA水平的影响

[0625] 为了鉴定一系列乳腺癌细胞系中的Notch靶基因,评价了γ分泌酶抑制剂 (651)处理对基因1111?熟表达的影响。八€€71116廿丨1人1]1334阵列用来描述0150或1(^]\1 DAPT(Calbiochem 565770)处理 HCC70、MDA-MB468 或 HCC1143 细胞 72 小时的概况。每个 时间点进行三个重复。使用R/Bioconductor构架并且Limma包装用来确定DMS0处理和 DAPT处理之间差异性表达的基因。使用调整的0. 05p-值作为阈值以确定差异性表达的基 因集合。最终,每个细胞系选出两个靶基因并且总结于下表中。当抑制Notch信号传导时, Hesl、MMP7和VSNL1 mRNA水平降低,而抑制Notch信号传导时,DKK1 mRNA水平增加。

[0626]

Figure CN105246916AD01171

[0627] 为了定量以上基因的mRNA水平,将细胞系HCC70、MDA-MB-468或HCC1143以细胞 密度lxlO5个细胞/mL按100μL铺种在96孔板(Costar,目录号3610)中。平板在37°C 温育过夜,之后用适宜浓度的抗体处理。将处理的平板返回培养箱持续额外72小时,之后 使用Qiagen'sRNeasy试剂盒(目录号74181)裂解以提取RNA。使用Taqman逆转录试剂 (AppliedBiosystems,目录号N808-0234),合成cDNA。通过实时PCR(Taqman快速高级主 混合物,AppliedBiosystems,目录号4444557)测定mRNA表达。实时PCR在ViiA7实时 PCR系统或7900HT快速实时PCR系统(AppliedBiosystems)中运行。为了定量每个靶基 因的水平,使用2-ΔACt法。ΔACt的计算涉及将目的样品的Ct值与对照如未处理的样 品或DMS0 处理样品比较(Schmittgen和Livak2008NatureProtocols3:1101-1108)。

[0628] 总结和讨论

[0629] 如图8中所示,鉴定到能抑制一系列乳腺癌细胞系中内源Notch 3信号传导的 Notch3抗体。用Notch3抗体处理乳腺癌细胞系导致HES1或MMP7 mRNA的表达减少和DKK1 mRNA的表达增加。

[0630] 实施例5 :鉴定和表征Notch3NRR结构域和PEST结构域中的突变

[0631] 迄今,癌症中Notch受体的证据主要集中在Notch1信号传导的改变方面。尽管 Notch3在卵巢癌中扩增,但是不存在其扩增导致依赖于Notch3信号传导的直接证据。此 外,不存在Notch3中活化性突变的证据。对一系列细胞系中的Notch3测序以鉴定该基因 中的突变以进一步表征。

[0632] 癌细胞系百科全书(CCLE)用来表征947种人癌细胞系(BarretinaJ.等人(2012) Nature483:603-7)。通过使用溶液相杂交分子捕获技术大规模平行测序,获得>1600个基 因的突变信息。使用SureSelect革E富集系统(AligentTechnologies),如所述那样构建用 于外显子组捕获测序的多个文库。Notch3是测序的基因之一并且分析数据以鉴定该蛋白 质的NRR(外显子25、26、氨基酸1378-1640)结构域和PEST(外显子33氨基酸1972-2322) 结构域中的任何突变。当细致检验来自947种癌细胞系的序列数据后,确定在外显子25和 33中的序列覆盖率不足以鉴定突变。下表显示Notch3中的外显子平均覆盖率。列出的数 字是表3中每碱基对的读数平均数值。

[0633] 表3:Notch3外显子读数。

Figure CN105246916AD01191

[0635] 为了确定这些细胞系或原发肿瘤的任何一者是否在这些区域中含有突变,使 用三种方法,包括Sanger测序法(Genewiz)、RainDance(Tewhey等人(2009)Nature Biotechnology27:1025-1031)和RNAseq(Wang等人(2009)NatureReviewsGenetics 10:57-63)。如图9中所示,在多个细胞系和肿瘤样品中鉴定到NRR结构域和PEST结构域 中的突变。在图9a中,上半小图显示具有NRR突变的细胞系,而下半小图具有PEST突变。 图9b中指示在原发肿瘤中鉴定的NRR突变。

[0636] 分离原发肿瘤和产生原发肿瘤异种移植库

[0637] 按以下方式生成从原发性人肿瘤异种移植物获得的数据:在手术切除期间在补充 有1 %青霉素/链霉素的RPMI中从患者收集肿瘤标本,缺血时间小于1小时。将不含坏 死组织的15-30_3小块在异氟烷麻醉下皮下移植至6至8周龄雌性裸鼠的肩胛间脂肪垫 中。将小鼠在无特定病原体动物笼舍中维持饲养并根据批准的方案和法规操作。在移植 后2至8个月异种移植物出现在移植部位。一旦肿瘤达到700-800_ 3,随后将它们从小鼠 移植到小鼠直至实现合理一致的生长速率。在小鼠中连续传代期间,在补充有50%FBS和 10%DMS0的RPMI中产生冷冻贮存物并且检验它们以确保异种移植模型的成功建立。将来 自患者和每一代异种移植物的30-50mg小块急冻用于基因表达谱分析、拷贝数分析以及突 变分析。还收集每个成功移植的异种移植模型的150mg小块并进行组织学分析。在第四 代后,建立的肿瘤异种移植模型进一步用于体内研究。对于基因表达谱分析,使用亲和树 脂(QIAGENRNeasy微量试剂盒;QIAGENAG)分离总RNA。用RNA6000NanoLabChip系统在 Bioanalyzer2100 上(AgilentTechnologies)评估RNA完整性和纯度。

[0638] 实施例6 :在报道基因测定法中表征Notch3NRR突变

[0639] 产生具有Notch3NRR突变的Notch3表达载体

[0640] 选择两个突变用于表征。TALL-1细胞是一个具有S1580L突变的T细胞急性淋巴母 细胞系。TALL-1细胞购自DSMZ(#ACC521)。还鉴定到具有G1487D突变的乳腺肿瘤(Χ-1004)。 用于RNAseq分析以检测X-1004样品中突变的RNA来自一只第5代小鼠。将这些突变引入 载体pLNCX2_Notch3-GAL4-NLS-VP16〇

[0641] 构建体

[0642] Notch3_S1580L_Gal4-VP16

[0643] MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPP GWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSC PPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQS⑶LTYDCA CLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSC VCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAIC TCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFT CICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYEC RCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRC PSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPP GSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPP GVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHG GYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGY GGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFT GPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYC VCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCS CPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQ DPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVG VPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAA PEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDN FDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFL QRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGLVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAAD YLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRL KKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALL TGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSKLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFP GISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDML⑶⑶SPGPG(SEQ ID N0:276)

[0644] Notch3_G1487D_Gal4-VP16

[0645] MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPP GffVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSC PPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQS⑶LTYDCA CLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSC VCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAIC TCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFT CICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYEC RCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRC PSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPP GSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPP GVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHG GYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGY GGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFT GPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYC VCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCS CPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQ DPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVG VPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAA PEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDN FDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQDCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFL QRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAAD YLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKRVDKLLSSIEQACDICRL KKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALL TGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSKLKLLSSIEQACPKKKRKVDEFP GISTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDML⑶⑶SPGPG(SEQ ID N0:277)

[0646] 通过用适宜的逆转录病毒载体转染293-GP2包装细胞系(Clontech,目录号 631458),产生逆转录病毒。使用?1'〇111683的?耶61166作为基于脂质的转染试剂。根 据制造商的说明书实施转染。在转染后48小时收集病毒并立即用来转导HLR细胞 (HLR-PathDetect,Stratage)。用 Notch3wt-Gal4_VP16、Notch3_p. S1850L-Gal4_VP16 或 Notch3_p. G1487D-Gal4-VP16逆转录病毒粒子转导HLR细胞(Stratagene)。在试验之前, 用G418选择细胞2周。

[0647] 评估Notch 3野生型受体和Notch 3 NRR突变体受体的基础活性的Notch3报道 基因测定法

[0648]Notch3报道基因测定法:在无酚红DMEM、10%FBS(Hyclone,目录号SH30071)、 1 %青霉素-链霉素(Gibco目录号15140-122)、L-谷氨酰胺(Gibco,目录号25030-081)、 100μg/ml潮霉素(Gibco,目录号 10687-010)和 400μg/mlG418(Gibco,目录号 10131-027)中维持HLR-Notch3wt-Gal4-VP16、HLR-Notch3_p.S1580L-Gal4-VP16 和 HLR-Notch3_p.G1487D-Gal4-VP16 细胞。在无酚红DMEM、10 %FBS(Hyclone,目录号 SH30071)、1 %青霉素-链霉素(Gibco目录号15140-122)、L-谷氨酰胺(Gibco,目录号 25030-081)和100μg/ml潮霉素(Gibco,目录号10687-010)中维持HLR亲本系。将完全培 养基中生长的接近汇合的细胞用?85(6让(:〇,目录号20012-027)洗涤,用1'巧?扭(6让(3〇,目 录号12605010)进行胰蛋白酶消化并稀释成4x104个细胞/mL;将100μL的细胞悬液以密 度4000个细胞/孔铺种在96孔透明底白色平板(Costar,目录号3610)中。全部平板随后均 在37°C温育过夜,之后用DAPT(10μM,CalBiochem)处理。将平板返回培养箱持续24小时, 之后使用Bright-Glo(Promega)测定萤光素酶活性。Envision平板读数仪(PerkinElmer) 用来确定发光量。

[0649] 评估野生型和突变体Notch3受体的细胞表面水平的FACS测定法

[0650] 为了展示细胞系中突变体Notch3受体的表达,使用流式细胞术。将(标准条件下 生长的)表达突变体Notch3和野生型Notch3的细胞系在含有0. 1 %BSA和0. 01 %叠氮钠 的PBS中与含有APC荧光素标记物(R&D目录号FAB1559A)的抗Notch3结合及检测抗体混 合,并且在4°C温育1小时。在洗涤后,利用光特性和侧向散射特性对单个细胞设门,通过 BDFACSCanto仪分析细胞。

[0651] 细胞表面上的Notch3受体水平通过市售抗Notch3APC(R&D#FAB1559A)标记抗体 与表达突变体和内源Notch3的细胞结合来确定并且通过FACS评估。将细胞进行胰蛋白酶 消化(InvitrogenTrypLE目录号 12605-010)并且在FACS缓冲液(PBS/3 %FBS/0. 01 % NaN3)中稀释至2x106个细胞/mL。将2. 5x105个细胞/孔添加至96孔平板(Corning目录 号3610)的每个孔并且在4°C以1500转/分钟离心5分钟,之后取出上清液。将抗Notch3 APC抗体或用APC标记的绵羊IgG同种型对照(R&D目录号IC016A)以100μLFACS缓冲液 中的终浓度〇. 1μg添加至细胞沉淀物并且在4°C温育1小时。将细胞用100μLFACS缓 冲液洗涤并沉淀2次。最后,细胞重悬于200μLFACS缓冲液中并且用BDFACSCanto(BD Biosciences)测量荧光值。通过测量平均通道荧光来评估细胞表面结合的抗Notch3APC 抗体的量。

[0652] 总结和讨论

[0653] 向Notch3受体中引入S1580L突变或G1487D突变导致来自受体的基础信号传导 相对于野生型对照增加大约10倍。在这个系统中,野生型受体和突变体受体以大致等同的 水平表达,如通过FACS测定法所确定。该数据表明这些突变在表达这些突变和其他相似突 变的细胞系和肿瘤中活化Notch3信号传导(参见在实施例7、9、10、11、15中的进一步讨 论)。

[0654] 实施例7 :Notch3抗体对TALL-1细胞中Notch3信号传导和体外增殖的影响

[0655]TALL-1细胞系在Notch3的NRR结构域中S1580L处具有突变。向Notch3表达构 建体引入这个突变导致活化Notch3信号传导。为了进一步表征抑制这个细胞株系中Notch 3信号传导的影响,检测Notch靶基因的mRNA水平并且在Notch3抗体存在下监测该细胞 的体外增殖。

[0656]TALL-1体外增殖测定法

[0657] 将lx104个TALL-1细胞/孔接种在96孔组织培养板(Corning,目录号3610)的 100以1培养基(补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的1«^1-1640)中。同一天,在 IXPBS中制备抗体稀释物,由此每孔添加5μ1 20X抗体稀释物。将细胞与抗体在37°C/5% C02温育。在 37°C/5%C02温育 0 天和 9 天后,添加 100μ1CellTiter-Glo试剂(Promega) 并将平板在平板摇床上温育10分钟。使用PerkinElmerEnvision平板读数仪测定发光 量。IgG对照处理的细胞的CellTiter-Glo发光值用来归一化数据并且计算因Notch3抗体 处理所致的增殖抑制百分数。

[0658]TALL-1mRNA定量测定法

[0659]Deltexl是TALL细胞系中充分表征的Notch信号传导靶基因(Weng等 人,2006,GenesDev. 20:2096-2109)。将lx104个TALL-1 细胞 / 孔接种在 96 孔组织培养 板(Corning,目录号3610)的100μ1培养基(补充有10 %胎牛血清和1 %青霉素/链霉 素的RPMI-1640)中。同一天,在IXPBS中制备抗体和化合物稀释物,由此每孔添加5μ1 20Χ抗体或化合物稀释物。DAPT(Calbiochem,目录号565770)和DMSO(ATCC,目录号4-Χ-5) 是用于这个测定法的化合物。将细胞与抗体或化合物在37°C/5%C02温育72小时。使 用QiagenRNeasy96 试剂盒分离RNA。使用TaqMan逆转录试剂(LifeTechnologies) 和MJResearchPTC-225 热循环仪,制备cDNA。使用TaqMan通用PCRMasterMix(Life Technologies)以及针对Deltexl(DTXl)(Hs00269995_ml,LifeTechnologies)和持家基 因PP1A(Hs99999904_ml,LifeTechnologies)的基因表达探针,进行TaqMan基因表达测定 法。在AppliedBiosystemsABIPrism7900HT快速实时PCR系统上进行TaqMan基因表 达测定法。为了定量Deltex1的水平,使用2 -ΔΔCt法。计算ΔΔCt涉及将目的样品 的Ct值与对照如未处理的样品或DMS0处理样品比较(Schmittgen和Livak(2008)Nature Protocols3:1101-1108)。

[0660] 总结和讨论

[0661] 如图11A-B中所示,从针对NRR结构域或EGF32-NRR结构域(20350、20358、20337) 的淘选中鉴定的Notch3抗体强力抑制TALL-1细胞中的DeltexlmRNA表达。相反,针对 LBD结构域的抗体(20364)不明显抑制DeltexlmRNA。此外,20350、20358、20337以剂量依 赖的方式显著抑制TALL-1增殖。在一组其他TALL细胞系(DND41、P12-Ichikawa、SUPT1、 SUPT11和RPMI-8402)中测试Notch3抗体时,未检测到对增殖的影响。

[0662] 实施例8 :产生检测γ分泌酶切割形式的Notch3胞内结构域的新表位抗体。

[0663]Notch信号传导由一系列的蛋白酶剪切活化。γ分泌酶复合物介导Notch受体的 最终切割,最终释放Notch胞内结构域(I⑶),后者转位到胞核以活化Notch靶基因转录。 生成新表位抗体以检测仅在(人Notch3)氨基酸Glyl661和Vall662之间切割时γ分泌 酶切割形式的Notch3ICD(ICD3)。

[0664] 产生I⑶3兔多克隆抗体

[0665] 显示了用于免疫的肽和负选择(耗尽肽)。

[0666]免疫肽:H2N-VMVARRK(dPEG4)C-酰胺(SEQIDN0:278)

[0667]耗尽肽:Ac-VILVLGVMVARRK(dPEG4)C-酰胺(SEQIDN0:279)。使用标准程序在 Covance生成兔多克隆抗体。简而言之,使用一个77天方案,用500μg免疫肽和弗氏佐剂 进行初次强化免疫。第21日、第42日和第63日用500yg免疫肽进行额外的强化免疫。 为了耗尽识别Notch3的VMVARRK(SEQIDN0:243)序列、但不识别γ分泌酶切割后的新表 位的非特异性抗体,将耗尽肽用于负选择。使用耗尽肽通过"负向"亲和层析耗尽纯化的样 品。利用末端半胱氨酸,将肽与柱偶联以恰当定向所述肽。从样品移除交叉反应性抗体并 由ELISA证实。在TALL-1细胞中通过蛋白质印迹法检验来自兔的血清以确定是否检测到 特异性条带。

[0668] 兔多克隆ICD3抗体转化成兔单克隆抗体

[0669] 为了将兔多克隆抗体转化成兔单克隆抗体,对选择的兔进行免疫肽的终末IV强 化免疫。4天后,实施脾切除术并且在Epitomics通过标准程序生成兔杂交瘤。简而言之, 全部淋巴细胞均从1个兔脾分离。进行40x96孔平板的融合ELISA筛选和标准ELISA筛 选。将全部ELISA阳性杂交瘤扩充至24孔平板并且用免疫肽和耗尽肽再次进行ELISA。在 TALL-1细胞中通过蛋白质印迹法分析来自139个阳性杂交瘤的上清液。基于蛋白质印迹筛 选ELISA阳性杂交瘤,选出3个杂交瘤(73、128、95)用于亚克隆。为了亚克隆杂交瘤,进行 所选择的亲本杂交瘤(0.5个细胞/孔)的有限稀释并且将这些亚克隆铺种于4x96孔平 板中。使用免疫肽和耗尽肽,通过ELISA再次筛选亚克隆。将克隆扩充至24孔平板并且在 TALL-1细胞中通过蛋白质印迹法筛选来自ELISA阳性亚克隆的上清液。显示了来自3个亚 克隆的示例性蛋白质印迹数据。

[0670] 使用I⑶3抗体体外筛选Notch3信号传导抑制作用

[0671] 使用靶向Notch3I⑶的抗体来评估途径活性。细胞系TALL-1购自DSMZ并在补 充有10%FBS和1 %青霉素-链霉素的生长培养基中常规维持。实验设置:将5百万个 TALL-1细胞铺种在25cm2组织培养瓶(Corning,目录号430639)的10mL培养基中。细胞用 0.5%01^0或1(^]\104?1'(0311^〇(*6111,目录号 565770)处理72小时。将了41^-1细胞离心 并且随后在PBS中洗涤。在添加N-乙基马来酰亚胺(ThermoScientific,目录号23030) 和蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Pierce,目录号78444)的60μLIX细胞裂解缓冲液(CST,目录 号9803)中裂解细胞。使用BCA方法进行蛋白质定量并且在SpectramaxΜ5微量平板读数 仪中读数。在4-12%Bis_Tris凝胶(Invitrogen,目录号NP0006-1)中每孔加载30yL蛋 白质样品。

[0672]SDS-PAGE:样品在标准条件下在IXNuPageMOPSSDS运行缓冲液(Invitrogen,目 录号NP0001)中以180V运行大约90分钟。在转移至硝酸纤维素膜(iBlot,Invitrogen) 之前,凝胶浸泡在含20%甲醇的2x转移缓冲液(Invitrogen,目录号NP0006-1)中。在4% 乳-TBST中封闭膜1小时;来自杂交瘤上清液的上清液在2%乳-TBST中1:4稀释并且在 4°C温育伴以温和振摇。添加在2%乳-TBST中的第二抗体45分钟,之后用TBST进行一系 列膜洗涤。使用ECLPlus蛋白质印迹检测系统(GEhealthcare,目录号RPN2232)将膜显 色。

[0673] 用I⑶3抗体筛选一组T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞系

[0674]细胞系TALL-1 (MCC521)、RPMI8402 (#ACC290)、DM)41 (MCC525)、 SUPT11 (#ACC605)和P12-Ichikawa(#ACC34)购自DSMZ并在补充有 10 %FBS和 1 % 青 霉素-链霉素的生长培养基中常规维持。细胞系HPB-ALL和Jurkat细胞从Andreas Strasser(WalterandElizaHallInstituteofMedicalResearch,澳大利亚)商业获 得。将5百万个TALL-1细胞铺种在25cm2组织培养瓶(Corning,目录号430639)的lOmL培 养基中。将细胞离心并且随后在PBS中洗涤。如上文所述裂解细胞并进行蛋白质印迹。来 自杂交瘤亚克隆73-8的纯化抗体按1:5000稀释用于其他研究。这种抗体此后称作"I⑶3 Ab"并且表2中详述其序列。使用来自CellSignaling(#2421)抗体以1:1000稀释评估 I⑶1蛋白水平。

[0675] 总结和讨论

[0676] 如图12A-B中所示,高水平I⑶3蛋白仅在TALL-1细胞中检出,但是未在一系列其 他T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞系中检出。可以于已知在Notchl中具有活化突变 的几个TALL细胞系中检出高ICD1水平,所述TALL细胞系包括HPBALL、RPMI-8402、DND41、 P12Ichikawa和Jurkat(Weng等人(2004)Science306:269-71)。ICD3 抗体不与ICD1 交 叉反应,如具有Notchl突变的其他这些TALL细胞系中缺少信号所佐证。

[0677] 实施例9 :体外评估抗体处理时的Notch3信号传导抑制作用

[0678] 在一系列CCLE细胞系中评价Notch3突变状态导致鉴定到具有NRR突变的TALL-1 和具有PEST结构域突变的MDA-MB468。MDA-MB468细胞具有在氨基酸2034处导致引入过 早终止密码子的移码突变。因此,ICD3具有改变的分子量,所述改变的分子量可以在蛋白 质印迹物上作为迀移更快的条带检出。

[0679] WT和MDAMB468 PEST结构域的部分的序列:

[0680]WTNotch3 序列(NP_000426)氨基酸 2034-末端

[0681] PSGPRSPPGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAAQSGSKKSRRPPGKAGLGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADS SVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDW ARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAGAHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSP ESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATTTGALPAQPLPLSVPSSLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQ ID NO :280)

[0682]MDA-MB468序列氨基酸2034末端

[0683] PSGPRSPPRSPRPGASALSSRGLPPWPQSGTVGVQEEQEAPREGGAGAAGAPGAGQEADAGLPGPPG. (SEQ ID NO:281)

[0684] 起初,这两个细胞系模型用来表征Notch3抑制性抗体对Notch3信号传导的影 响。采用I⑶3抗体的蛋白质印迹法用来监测传导抑制作用。实验设置:一百万个MDA-MB468 细胞铺种在60mm培养皿(Corning,目录号430196)的3mL培养基中或将5百万个TALL-1 细胞铺种在25cm2组织培养瓶(Corning,目录号430639)的10mL培养基中。将平板在37°C 温育过夜,之后用10μg/ml终浓度的Notch3抑制剂抗体20337、20350、20358和20802以 及IgG对照处理。将抗体直接添加至平板并将它们在37°C,5%C02进一步温育72小时。 此外,将一些细胞用0. 5%DMS0或10μΜDAPT(Calbiochem,目录号565770)处理72小时。 通过以下方式收获细胞:吸出培养基并在lmLPBS(Gibco,目录号20012-027)中漂洗,从平 板刮下细胞并在桌面式离心机上离心下来。将悬浮细胞离心并且随后在PBS中洗涤。用纯 化的ICD3抗体如先前所描述进行蛋白质印迹法。

[0685] 此外,对三个其他细胞系表征Notch3抗体处理时的ICD3水平和信号传导抑制作 用:-(i)Ishikawaheraklio02_ER在N1597R处具有NRR突变,(ii)A549 在 2034 处具有PEST 移码突变,而(iii)TE-ll在2260处具有PEST移码突变。

[0686] 总结和讨论

[0687] 如图13A-B中所示,除前述的配体驱动的RGA和Notch靶基因mRNA定量外,也可 以通过测量I⑶3水平监测Notch 3信号传导。I⑶3水平是Notch3信号传导活性的膜近端 读数。用Notch3抗体20337、20350、20358处理TALL-1细胞导致ICD3水平降低。在IgG 对照样品和DMS0样品中I⑶3的水平是等价的。该数据与这些抗体处理时Deltexl mRNA 和TALL-1增殖的抑制作用一致。相反,未检测到12229处理时对ICD3水平的影响。如图 13B中所示,在MDA-MB468细胞中,氨基酸2034处的移码突变产生过早终止密码子和更小 的I⑶3。这种I⑶3可以在蛋白质印迹物上作为迀移更快的条带检出。用Notch 3 NRR抗 体20337、20350、20358处理时,检出ICD3水平降低。相反,相对对照IgG,用20802(LBD抗 体)处理不改变 ICD3 水平。如图 14A-C 中所示,Ishikawaheraklio02_ER、TE-11 和 A549 细胞中Notch3抗体处理时,检测到对ICD3水平的变化的影响。但是在测试的全部细胞系 中,20350处理一致地导致显著减少降低的I⑶3水平。

[0688] 实施例10:在Notch3扩增的细胞系中体外评估抗体处理时的Notch3信号传导 抑制作用

[0689]将HCC1143 细胞描述为具有Notch3 扩增(Yamaguchi等人(2008)Cancer Res. 68:1881-1888)。使用ICD3抗体在这个细胞系中检查活化的Notch3信号传导的水平。 采用ICD3抗体的蛋白质印迹法用来监测传导抑制作用。

[0690] 实验设置:将一百万个HCC1143细胞铺种在60mm培养皿(Corning,目录号 430196)中的3mL培养基中,所述3mL培养基在25cm2组织培养瓶(Corning,目录号430639) 中。将平板在37°C温育过夜,之后用10μg/ml终浓度的Notch3抑制剂抗体20337、20350、 20358和20802以及IgG对照处理。将抗体直接添加至平板并将它们在37°C,5%C02进一 步温育72小时。如先前所描述收获细胞和进行蛋白质印迹。

[0691] 总结和讨论

[0692] 如图15中所示,HCC1143细胞具有Notch3扩增并且显示高水平的I⑶3。全部 Notch3抗体处理均导致降低的I⑶3水平。在10μg/ml,20350处理导致最大的I⑶3水平 降低。

[0693] 实施例11:体内ro评估

[0694] 在Notch3中携带遗传畸变的三种异种移植模型中研究调节作用:NRR突变体 TALL-1人白血病模型、PEST突变体MDA-MB-468人乳腺模型、和Notch3扩增的HLUX1823患 者衍生的肺模型。

[0695]TALL-1人白血病异种移植模型中的体内

[0696] 将携带TALL-1异种移植物的雌性SCID-beige小鼠用单剂量Notch3抗体处理。 将小鼠用ΙΟχΙΟ6个细胞接种,所述细胞在Hank平衡盐溶液的悬液中皮下注射。一旦肿瘤 达到300至500mm3(η= 3个/组),则将小鼠随机分配以接受单次静脉内20mg/kg剂量的 3207 (IgG对照)、20350、20358或20802。处理后,在选择的时间点收获肿瘤并且通过蛋白 质印迹法和IHC评价I⑶3,如下文描述。

[0697]MDA-MB-468人乳腺癌异种移植模型中的体内

[0698] 将携带MDA-MB-468异种移植物的雌性SCID-beige小鼠用单剂量Notch3抗体处 理。3x3x3mm3肿瘤小块从携待MDA-MB-468肿瘤的小鼠(供体)传代并在左侧和右侧皮 下植入SCID-beige受体小鼠。一旦肿瘤达到300至500mm3(η= 3个/组),则将小鼠随机 分配至未处理的对照组或接受单次静脉内20mg/kg剂量的20350。在额外的研究中,相对 于PBS或3207非靶向性IgG对照,评估单次静脉内20mg/kg剂量的20350、20358、20337和 20802的影响。多种处理之后,收获肿瘤并且通过蛋白质印迹法评价I⑶3,如下文描述。

[0699]HLUX1823患者衍生的肺癌异种移植模型中的体内

[0700] 还在Notch3扩增的患者衍生的原发性肺癌肿瘤异种移植模型HLUX-1823中评价 抗Notch3抗体的活性。在这些研究中,对nu/nu小鼠皮下植入DMEM中含有3x3x3mm3肿 瘤小块的50%无苯酸基质胶(matrigel)(BDBiosciences)并且在植入后30日时达到大约 250mm3。一旦肿瘤达到300至500mm3(η= 3个/组),则将小鼠随机分配以接受PBS或单 次20mg/kg静脉内剂量的3207非靶向性IgG对照抗体、或20358或12229 (衍生20364和 20802的亲本抗体)。多种处理之后,收获肿瘤并且通过蛋白质印迹法评价I⑶3,如下文描 述。

[0701] 肿瘤细胞裂解物的制备和ICD3蛋白质印迹

[0702] 使用组织裂解仪II(Qiagen)在30Hz,将肿瘤样品在具有无EDTA完全蛋白酶抑制 剂混合物微型片剂(Roche,目录号04693159001)的200-400μLT-PER组织蛋白质提取 试剂(Pierce,目录号78510)中裂解1分钟。每个管中放置一粒5mm不锈钢珠(Qiagen, 目录号69965)以帮助裂解组织。取出钢珠后,随后将样品在桌面式离心机上在4°C以最 高速度离心15分钟。将上清液收集并且贮存在-80°C用于稍后时间的研究,或使用BCA 方法(Pierce,目录号232550)评估蛋白质浓度,并且如先前所描述进行I⑶3的蛋白质 印迹法。根据需要,还用全长Notch3抗体进行蛋白质印迹以检测Notch3总水平(Cell Signaling#2889,1:1000 稀释度)。

[0703] 通过IHC检测ICD3水平

[0704] 在10%福尔马林中固定异种移植肿瘤并包埋在石蜡中。将5μπι切片置于带电荷 聚赖氨酸包被的载玻片上。在自动化系统Discovery ULTRA (Ventana Medical System)上 优化免疫组织化学方案。

[0705] 切片在60°C烘烤8分钟,随后脱石蜡。在细胞条件化1 (CC1,基于TRIS的具有略 碱性pH的缓冲液)中在高温持续76分钟实现抗原修复。使用特定的抗体封闭剂(目录 号760-4204)实施抗体非特异性结合作用的封闭。将第一抗体Notch3ICD(20yg/ml)在 37°C温育60分钟,接着在第二抗体中温育32分钟。使用特定的DiscoveryAmplification HQ试剂盒#760-052(VentanaMedicalSystems),按照制造商的说明,实施扩增步骤。用 二氨基联苯胺(DAB)实现检测并用苏木精复染。全部这些步骤均在VentanaDiscovery ULTRA(VentanaMedicalSystems)上进行。

[0706] 总结和讨论

[0707] 图16-18显示在几种异种移植模型中的体内Η)研究。如本申请中较早所述那样, 用Notch3抗体体外处理TALL-1细胞导致抑制信号传导,如通过DeltexlmRNA水平和I⑶3 蛋白水平所评估。生长TALL-1细胞作为异种移植物并且将小鼠用Notch3抗体处理。通过 用蛋白质印迹法或IHC评估I⑶3水平,监测TALL-1肿瘤中Notch3信号传导的变化。用 抗体20350或20358处理导致I⑶3水平降低,如图16A-B中所示。IHC对I⑶3染色由肿 瘤切片中的黑色/深灰色细胞指示,如图16B中所示。在最后施用Notch3抗体之后,评估 肿瘤中的ICD3水平72小时,并且肿瘤内部仍然存在一些显示强烈ICD3表达的细胞。在 MDA-MB468模型中,如通过蛋白质印迹所评估,相对于未处理的对照小鼠,施用抗体后24小 时和72小时,用20350处理的动物产生明显的I⑶3减少(图17A)。发现在72小时时间 点,相对于PBS和3207 (IgG)对照,所有靶向Notch3NRR的20350、20358和20337引起 I⑶3水平降低。与之相反,用靶向NRR外部的Notch3区域的20802处理后,I⑶3水平显 得与对照水平相似(图17B)。在HLUX1823Notch3-基因扩增的模型中,如通过蛋白质印迹 所评估,相对于对照小鼠,用20358或12229处理的动物在施用抗体后72小时产生明显的 I⑶3减少(图18)。综上,这些数据显示Notch3NRR抗体可以在存在Notch3基因扩增或 NRR结构域或PEST结构域中的突变的情况下抑制Notch3信号传导,而在这个区域外部产 生的Notch3抗体仅可以在基因扩增存在下抑制Notch3信号传导并且在突变存在下具有 更有限的活性。

[0708] 实施例12 :TALL_1异种移植中的体内功效

[0709] 产生具有萤光素酶组成型表达的TALL-1细胞系

[0710] 用pMMP-LucNeo逆转录病毒转导TALL-1细胞系(参见US7399851)并且在lmg/mL 遗传霉素(G418)下接受几周选择。与不存在萤光素酶的TALL-1细胞相比,TALL-l_Luc细 胞表达高水平的萤光素酶。对野生型和萤光素酶细胞用Notch3抗体抑制剂进行增殖实验, 显示相同的结果;表明感染不干扰TALL-1对Notch3抑制的敏感性。

[0711] 在TALL-1细胞系异种移植模型中评估Notch3抗体的体内活性

[0712] 将小鼠用ΙΟχΙΟ6个TALL_l_Luc细胞接种,所述细胞在Hank平衡盐溶液的悬液中 皮下注射,并且使用Xenogen体内成像系统(CaliperLifeSciences)监测肿瘤的存在。在 第7日可检出肿瘤的存在。在第11日,将携瘤动物随机分配以接受PBS或20mg/kg的3207 阴性对照IgG抗体或Notch3抗体20337、20350、20358或20802作为单一药物每周2次静 脉内给药。使用Xenogen体内成像系统监测肿瘤尺寸。

[0713] 总结和讨论

[0714] 如图19中所示,20358和20350显示出这项研究中评价的抗体的最大抗肿瘤活性。 图19A显示在研究时程范围内各种处理之后获得的发光信号的图示,并且图19B显示对照 组在第29日(因肿瘤尺寸而可能成像的最后时间点)和抗Notch3抗体处理组在第43日 的发光信号。

[0715] 实施例13 :用Biacore对NRRNotch3抗体的表位分拣

[0716] 通过Biacore进行表位分拣以将Notch3抗体(IgG或Fab片段)划分成相同的 表位或显著重叠的表位的组,即能够抑制彼此结合作用的抗体。

[0717] 用Biacore实验设置表位分拣

[0718] 对于Biacore中的表位分拣,使用具有低密度固定化或捕获抗原的传感芯片(与 动力学实验是可比较的)。与KD测定相同的样品前提适用(即单体含量)。涉及芯片制备 (抗原固定/捕获)的实验条件以及再生条件与Biacore中的KD测定相同。为了实现表位 的饱和,每种抗体仅使用一种(高)浓度(例如250nM持续90秒)。

[0719] 抗体样品按全因素分析设计配对注射,例如对于两份抗体样品A和B,要求以下配 对注射:A-A、A-B、B~A、B-B。

[0720] 传感芯片必须通过第一注射用抗体饱和,从而第二抗体仅能够在不同表位的情况 下结合。已结合抗体的完全再生必须在每个双重注射后进行。

[0721]为了评价对照,即双重注射相同抗体(A-A、B_B),在每一注射结束时评价它们的结 合水平:第二注射预计不产生额外的结合作用。为了一致性,比较双重注射不同的抗体样品 对,例如如果注射A-B导致额外的B结合作用(不同表位),则注射B-A预计也导致额外的 A结合作用。产生这类不一致性的可能原因例如是部分重叠的表位,或KD的巨大差异。

[0722] 总结和讨论:

[0723] 编纂了总结全部配对抗体注射评价结果的图20,显示它们的相互抑制状态,从所 述相互抑制状态可以得出表位基团或分拣区(bins)的结论。基于这些研究,确定从自噬菌 体展示筛选鉴定的NRR抗体具有不同的构象表位。如图20中所示,当首先添加20345,接着 添加20350或20351时,未检测到额外结合作用。实验中获得与首先添加何种抗体无关的 相似信息。因此,20345、20350和20351具有重叠表位,所述重叠表位在表中以深灰色阴影 指出。这个表位定义为NRR_B。当首先添加20337时,可以随着添加以下任何抗体检测到 与Biacore的额外结合作用:20345、20350、20351、20358和A4。如果逆转添加两种抗体的 顺序,则得出相同的结论。因此,20337具有与所测试的任何其他抗体不同的表位并且称为 表位NRR_A。当首先添加20358时,用20337、20345、20350和20351检测到额外结合。如果 逆转添加两种抗体的顺序,则得出相同的结论。因此,20358具有与这些其他测试抗体不同 的表位并且称为表位NRR_C。与之相反,当首先添加20358并且接着添加A4时,存在最小 的额外结合作用(参见汇总表中具有浅灰色阴影的细胞)。在额外的Biacore研究中进一 步证实了这个结果。在这些实验中,将A4或20358固定至适宜的传感芯片上,使Notch3 NRR(SEQID:282)流过该表面,并且评价未固定至传感器表面的其他抗体与Notch3NRR结 合的能力。在这些分析条件下,发现20358可以与结合至固定化A4的Notch3结合并且A4 还可以与结合至传感器表面上的固定化20358的Notch3结合。该数据与所进行的其他研 究完全一致并且与以下结论完全一致:A4和20358与Notch3NRR内部的不同表位结合。 另外,当首先添加A4时,在接着添加以下抗体:20337、20345、20350、20351时检测到额外 的结合作用。如果逆转添加两种抗体的顺序,则得出相同的结论。因此,A4具有与20337、 20345、20350、20351不同的表位并且称为表位NRR_D。

[0724] 实施例14 :采用20350和NRR以及20358和NRR的共晶体结构研究

[0725] 测定了与20350或20358的Fab片段结合的人Notch3负向调节区(NRR,SEQID NO: 282)的两种晶体结构。如下文详述,将Notch3NRR表达、纯化并与20350或20358Fab 混合以形成复合物。蛋白质结晶学用来产生分别与20350或20358Fab结合的Notch3NRR 的原子解析数据,以定义它们的表位(为距抗体残基在距离范围内的Notch3NRR残 基)。

[0726] 蛋白质产生

[0727] 下文显示经产生用于结晶学的Notch3NRR、20350Fab和20358Fab的序列。 Notch3NRR的构建体包含人Notch3(UniProt识别码Q9UM47,SEQIDN0:1)的残基 1378 至1640 (加下划线),连同来自重组表达载体的N末端和C末端残基(以小写字母显示,SEQ IDN0:282)。来自小鼠IgGK轻链的N末端信号序列用于分泌型表达并在表达期间切除, 留下Notch3NRR的完整N末端。对于20350和20358Fab,显示重链和轻链的序列(SEQ IDN0: - 6283、284、285 和 286)。

[0728] 用于晶体结构测定的蛋白质

[0729] 构建体:

[0730]人Notch3NRR(Q9UM47)

[0731]MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPP GffVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRFLCSC PPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCRQS⑶LTYDCA CLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNTLGGHSC VCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAIC TCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFT CICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYEC RCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRC PSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPP GSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICYDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPP GVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHG GYTGPSCDQDINDCDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGY GGFHCEQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFT GPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYC VCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSCIDLVARYLCS CPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADINECRSGACHAAHTRDCLQ DPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGPRCERVARSCRELQCPVG VPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGSCRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAA PEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGffDGGDCSLSVGDPffRQCEALQCffRLFNNSRCDPACSSPACLYDN FDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGffDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFL QRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAAD YLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLffFPEGFSLHKDV ASGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEEPGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVA PAMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGE TALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLA VEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDH FANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAAQSGSKKSRRPPGKAG LGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGL GRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPAAG AHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATTTGALPAQPLPLSVPSSLAQ AQTQLGPQPEVTPKRQVLA(SEQ ID N0:1)

[0732] Notch3 NRR

[0733] metdt11lwvl1lwvpgstgAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWR QCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASE VPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIG SVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSgshhhhhh(SEQ ID NO :282)

[0734] 20350 Fab重链

[0735] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISffVRQAPGQGLEWMGWIKPRWGAAHYAQKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSFWFGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH (SEQ ID NO :283)

[0736] 20350 Fab轻链

[0737] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASKLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLQYPMTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :284)

[0738] 20358 Fab重链

[0739]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRTYAMHWVRQAPGQGLEWMGGIVPYHGITDYAQKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYSTYAFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTH(SEQIDNO:285)

[0740] 20358Fab轻链

[0741]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIASYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYKTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:286)

[0742]Notch3NRR的产生

[0743]Notch3NRR在HEK293SGnTI-细胞(ATCC)中表达为分泌型蛋白。lmgNotch3 NRR构建体DNA稀释于50mlOptiMEMI培养基(LifeTechnologies)中,并且与50ml相 同培养基中的2. 5mgPEI(Polysciences)温育30分钟。随后将混合物加入1LHEK293S GnTI-细胞,所述细胞以悬浮方式在FreeStyle™293表达培养基(LifeTechnoligies)中以 一百万个细胞/ml在37°C、8%C02生长用于转染。在72小时后,通过离心收获含有Notch 3NRR的培养基。将3mlNi-NTASuperflow树脂(Qiagen)加入培养基中并在4°C连续搅 拌过夜。次日,将树脂装填至重力柱中并用50mMΗ印espH7.4,500mMNaCl,20mM咪唑洗 涤。将靶蛋白用相同缓冲液外加300mM咪唑洗脱并在4°C在20mMH印espH7. 4,150mM NaCl,lOmMCaCl2中透析过夜。随后将蛋白质浓缩至lmg/ml并在50mMTrispH8. 0,lOmM CaCl2(缓冲液A)中稀释3倍。将稀释的蛋白质加载于HiTrapQHP柱(GEHealthcare) 上,所述柱在缓冲液A外加4%50mMTrispH8. 0,1MCaCljPlOmMCaCl2(缓冲液B)中 平衡。通过缓冲液A加2%-100%缓冲液B的梯度洗脱Q柱。收集含有Notch3NRR的主 峰并在4°C用30单位/mg靶蛋白的弗林蛋白酶(NEB)处理过夜。随后浓缩弗林蛋白酶处理 的蛋白质并且加载于20mMΗ印espH7,4,150mMNaCl中平衡的Superdex75 10/300GL(GE Healthcare)上。将峰级分通过SDS-PAGE和LCMS分析,并且合并以与Fab复合。

[0744] 20350Fab和 20358Fab的产生

[0745] 以一百万个细胞/ml生长的1LHEK293F细胞(LifeTechnologies)用lmg含有 全长IgG20350 (或20358)的DNA构建体转染三天。根据制造商的方案,通过ProS印-vA 高容量色谱介质树脂(Millipore)从培养基纯化全长IgG。纯化的IgG随后由固定化的木 瓜蛋白酶(Pierce)消化以产生Fab片段。具体而言,按20mg/ml在20mM磷酸钠pH7. 0和 10mMEDTA中的IgG与固定化木瓜蛋白酶以重量比80:1混合。将混合物在37°C在15ml管 中转动过夜。次日,通过重力流柱移除固定化木瓜蛋白酶;收集含有Fab区段和Fc区段的 流通液并加载于HiTrapMabSelectSURE柱(GEHealthcare)上以移除Fc区段。浓缩来 自这个步骤的仅含有Fab片段的流通液并加载于20mMΗ印espH7.4,150mMNaCl中平衡 的HiLoad16/60Superdex75(GEHealthcare)上。将峰级分通过SDS-PAGE和LCMS分析, 随后合并以与Notch3NRR形成复合物。

[0746] 结晶和结构测定

[0747] 以相同方式制备Notch3NRR/20350复合物或Notch3NRR/20358复合物。纯化 的Notch3NRR与Fab以2:1摩尔比混合(通过LCUV测量浓度)。将Notch3NRR/Fab 复合物在冰上温育30分钟,并加载于20mMΗ印espH7. 5、150mMNaCl中平衡的HiLoad16/60Superdex75(GEHealthcare)上。通过SDS-PAGE和LCMS分析峰级分。对于Notch3 NRR/20350复合物,将含有Notch3NRR/Fab复合物的级分浓缩至约25mg/ml,或对于Notch 3NRR/20358复合物,浓缩至18mg/ml。立即离心Notch3NRR/Fab复合物并筛选结晶。

[0748] 通过坐滴蒸气扩散技术生长晶体。具体而言,对于NRR/20350复合物,将0. 1 μ1 复合物与含有〇. 1ΜNaAcpH5. 6、17. 5%PEG3000的0. 1 μ1储器溶液混合;并且将液滴在 20 °C针对45 μ1储器溶液平衡。

[0749]对于NRR/20358 复合物,使用 0· 1ΜΗ印espH7. 5,10%PEG8000、10% 乙二醇;并 且将液滴在20°C针对45 μ1储器溶液平衡。

[0750] 在收集数据之前,对于Notch3NRR/20350复合物,将Notch3NRR/Fab晶体转移 至含有额外22. 5 %甘油的储器溶液;或对于Notch3NRR/20358复合物,转移至含有额外 20%乙二醇的储器溶液,之后在液氮中快速冷却。

[0751] 在高级光子源(阿尔贡国家实验室,美国)以光束线17-ID采集衍射数据。处理 数据并使用HKL2000(HKLResearch)作图。Notch3NRR/20350复合物的数据在空间群C2 中处理至3JA,晶胞大小如下:a= 91.92A,b. = 104,351,c= 92J5Α,:α= 90°,β=113.17°,γ= 90。。Notch3NRR/20358复合物的数据在空间群P2JA中处理 至2.1 赢:,晶胞大小如下= 88,34A,b=:!23.86A,c= 150.57Α,α=90°,β = 90°,γ= 90°。采用与20350或20358Fab具有最高序列同一性的NotchlNRR结构 (PDBID:3ET0)和自有Fab结构物作为检索模型,使用Phaser(MCC〇y等人,(2007)J.Appl. Cryst. 40:658-674),通过分子置换法解析Notch3NRR/Fab复合物的结构。最终模型 以COOT(Emsley和Cowtan(2004)ActaCryst. 60:2126-2132)建立并且用Buster(Global Phasing,LTD)修正。对于Notch3NRR/20350复合物,RWOTk值和Rf」t分别是23. 0%和 26. 9%;并且键长和键角的rmsd值分别是0.008A和1. 17。。对于Notch3NRR/20358复 合物,^直和1^_值分别是19.2%和22.6%;并且键长和键角的^8(1值分别是〇.〇1〇人 和 1. 13°。

[0752] 含有在20350或20358Fab中任何原子的5A范围内原子的Notch3NRR残基通 过PyMOL(Schrodinger,LL)鉴定并且在表4和5中列出。由AREA頂0L从CCP4程序包计 算Notch3NRR和Fab之间的埋藏表面积(Winn等人,(2011)Acta.Cryst.D67:235-242)。

[0753]Notch3NRR的结构

[0754]在Notch3NRR/20350 复合物和Notch3NRR/20358 复合物之间Notch3NRR的 结构非常相似。叠加来自两种复合物的Notch3NRR的均方根距离(RMSD)是0.42A,显示 几乎相同的NRR结构。因此,使用Notch3NRR/20358复合物作为进一步分析结构的代表。

[0755]Notch3NRR具有与Notchl(Gordan等人,(2009)Blood113:4381-4390;Gordon 等人,(2009) 4:e6613;Wu等人,(2010)Nature464:1052-1057)和Notch2(Gordon等 人,(2007)NatStructMolBiol14:295-300)相似的总体折叠。它包含三个Linl2/Notch 重复序列(LNR)(即LNR-A、LNR-B和LNR-C);和由弗林蛋白酶切割作用在S1位点(在R1571 和E1572之间)处分裂成N端部分(HD-N)和C端部分(HD-C)的异二聚化(HD)结构域。

[0756]NRR结构域调节Notch受体的活化,这涉及三个蛋白酶解步骤。在Notch前体的成 熟期间,弗林蛋白酶样转化酶在NRR内部的S1位点处切割,以引发活化。ADAM蛋白酶在也 处于NRR内部的S2位点处切割,以产生γ分泌酶在S3位点处进行膜内蛋白酶解的底物。 在S3切割之后,Notch的胞内部分进入胞核以活化转录。S2切割是这种活化系列反应的关 键步骤并且受NRR结构域负向调节。这种所谓自我抑制的机制可以由NRR结构解释。

[0757] 图21显示Notch3NRR的总体X射线结构。标记出了 1)蛋白质的N端和C端; 2)三个LNR重复序列和配位Ca2+离子;3)L1419,自抑制性塞;4)S1和S2位点;5)HD结构 域内部的二级结构;和6)Notch3中与Notch1和Notch2相比构象显著不同的两个区域 (LNR-B/C接头以及LNR-C的前半部分,和HD结构域中的β4-α3环)。

[0758] 如Notch3NRR结构中那样,各自配位一个Ca2+离子的三个LNR缠绕在HD周围以 保护S2位点免遭ADAM蛋白酶接近。值得注意地,来自LNR-A/B接头的保守L1419直接塞 入S2位点中并且在空间上堵塞它,使之免遭蛋白酶接近。LNR和HD之间相互作用以及这 些结构域内部那些相互作用的稳定性对维持NRR的自我抑制型构象至关重要。因此,去稳 定NRR的突变,如相关癌症中发现的那些突变,能增强Notch3的活化。另一方面,能稳定 LNR-HD相互作用的试剂如抗体能潜在地抑制Notch3信号传导。

[0759] 图22显示Notchl、Notch2和Notch3NRR的序列比对结果。标出了 1)结构域名 称和界限;2)二级结构;3)相对于Notchl和Notch2具有独特结构区域的Notch3 ;和4)S1 和S2 位点。Notch3NRR与NotchlNRR(PDBID:3I08)和Notch2NRR(PDBID:2004)的结构 叠加产生和1.4SA的RMSD值,表明总体折叠相似。然而,Notch3NRR的一些部分 具有显著不同的构象(RMSD值> ),主要地在两个区域中如此,即LNR-B/C接头和LNR-C 的前半部分(R1463 -A1476)和HD结构域中的β4-α3环(C1591-D1598)。有趣地,这两个 独特区域的大部分被20350和20358抗体捕获。在下一个部分描述详细的相互作用。

[0760] 20350 和 20358 的Notch3 表位

[0761] 20350 表位

[0762]Notch3NRR/20350Fab复合物的晶体结构用来鉴定20350的Notch3表位。 Notch3NRR上与20350Fab的相互作用表面由几个不连续(即非连续)序列形成:即残 基 1427-1429、1442、1444、1445、1447-1450、1453、1458、1461、1462、1464、1507、1508、1510、 1592、1594 - 1599、1602和1606,如表4中详述。这些残基形成由20350Fab识别的三维表 面,如图23中所示。有趣地,与Notchl和Notch2相比,HD结构域中的β4-α3环具有独 特结构,并且这个区段的大部分处于20350表位内部。另外,这个环在Notch3NRR/20358 复合物中大多是非结构化的(因灵活性所致无电子密度),但是在这个20350复合物中因与 Fab直接结合而稳定化和结构化。

[0763] 表4 :人Notch3NRR和20350之间的相互作用。Notch3残基基于UniProtID Q9UM47(SEQIDNO: 1)编号,并且划分成结构域。Fab重链残基和轻链残基分别基于其线性 氨基酸序列SEQIDN0:283和SEQIDN0:284编号。显示的Notch3残基在20350Fab中 原子5A范围内具有至少一个原子,以解释潜在的水介导的相互作用。

[0764]

Figure CN105246916AD01341

[0765]

[0766」

Figure CN105246916AD01361

[0767] 20350Fab跨越Notch3NRR的LNR(主要在LNR-B周围)和HD结构域(主要在 β4-α3环周围)结合。20350Fab和LNR之间的埋藏表面积是554,9Jl2,并且20350Fab 和HD结构域之间的埋藏表面积是535.2A2。该Fab的这种排布提示20350能将LNR和HD 结构域夹在一起,稳定Notch3NRR的自我抑制构象并抑制Notch3活化。

[0768] 20358 表位

[0769] Notch3NRR/20358Fab复合物的晶体结构用来鉴定20358的Notch3表位。Notch 3NRR上与20358Fab的相互作用表面由几个不连续(即非连续)序列形成:即残基1440、 1463、1465-1472、1474、1486、1487、1534、1618、1619 和 1621,如表 5 中详述。这些残基形成 由20350Fab识别的三维表面,如图24中所示。有趣地,与Notchl和Notch2相比,前半部 分LNR-C中的LNR-B/C接头具有独特结构,并且这个区段的大部分处于20358表位内部。

[0770] 表5 :人Notch3NRR和20358之间的相互作用。Notch3残基基于UniProtID Q9UM47(SEQIDNO: 1)编号,并且划分成结构域。Fab重链残基和轻链残基分别基于其线性 氨基酸序列SEQIDN0:4285和SEQIDN0:5286编号。显示的Notch3残基在20358Fab 中原子5A范围内具有至少一个原子,以解释潜在的水介导的相互作用。

[0771]

Figure CN105246916AD01362

[0772]

[0773]

Figure CN105246916AD01381

[0774] 20358 Fab 跨越 Notch 3 NRR 的 LNR(主要在 LNR-B/C 接头和 LNR-C 周围)和HD 结构域(主要在α 3- β 5环周围)结合。20358 Fab和LNR之间的埋藏表面积是729.6A2, 并且20358Fab和HD结构域之间的埋藏表面积是1S2.2 该hb的这种排布提示20358 能将LNR和HD结构域夹在一起,稳定Notch3NRR的自我抑制构象并抑制Notch3活化。

[0775] 20350和20358表位不重叠

[0776] 为了确定20350和20358的表位是否重叠,将Notch3NRR/20350复合物和Notch 3NRR/20358复合物的晶体结构在Notch3NRR上叠加,如图25中所示。这张图清晰地表 明20350和20358与Notch3NRR内部不重叠的不同分立构象表位结合。实际上,它们在 甚至最接近的区域(与20350形成的E1464-R54氢键和与20358形成的R1463-D100盐桥) 中充分分离。这表明两种抗体可以同时结合Notch3NRR,这与下述分拣实验符合,所述分 拣实验显示这些抗体处于不同的bin中并且彼此不竞争结合Notch3 (参见图20)。

[0777]比较 20350、20358、256A-13,256A-4 和 256A-8 之间的表位

[0778]将 20350 和 20358 的表位与 256A-13(此后称作 "A13")(US2008/0118520A1)的 表位比较;并且与256A-4 (此后称作"A4")和256A-8 (此后称作"A8")(US7 935 791B2) 的表位比较。对于A13,其表位包含LNR-A结构域中的D1402、R1403和E1404,它们完全位 于20350和20358的表位外部。

[0779] 对于A4和A8,由于已经将它们定位到Notch3上的相同表位(US7,935,791B2), 仅A4表位将用于比较。

[0780] 如图26中所示,20350的表位完全位于A4的表位外部;并且20358的表位具有三 个可能(但高度可能不)重叠的残基(Glul618、Argl619和Aspl621),原因如下:1)通过X 射线结晶学测定20358的表位至单原子分辨率,并且因此通过诱变确定单个残基(同时,另 一方面A4的表位)至三到八个氨基酸残基延伸的有限分辨率。没有实施进一步定义A4实 际表位或确定它是否为线性或构象表位的精细表位作图。这意味着只要在这种3-8个氨基 酸延伸内部存在一个与A4接触的残基,则将该延伸的其余部分定义为表位,即便对它没有 精细地进行表位作图。因此,关于这三个氨基酸是否实际上构成A4表位,仍存在高度的不 确定性。2)在实施例13中详述的表位分拣和结合实验显示,20358和A4彼此不竞争结合 Notch3NRR并且二者可以同时与Notch3NRR结合。仅当这两个抗体没有重叠表位时才 可以实现这种情况。因此,认为20358和A4的表位不重叠。

[0781] 绘制在Notch3NRR结构上的癌突变

[0782] 为了在机理上额外深入了解Notch3的NRR,将癌突变绘图到Notch3NRR结构上。 结构性分析表明,这些突变中的一些突变破坏结构域内或结构域间相互作用、去稳定Notch 3NRR的自我抑制性构象并造成Notch3活化和信号转导。

[0783] 同时,这些突变与20350表位和20358表位的比较显示它们大部分不在所述表位 内部,表明20350和20358可以结合至处于自我抑制型构象的野生型和突变体Notch3NRR 以抑制Notch3信号转导。

[0784] 表7 :显示基于结构的Notch3突变解释

[0785]

Figure CN105246916AD01391

[0786] 组 1 (S1580L、R1510H、D1587N、Y1624H、R1589Q)

[0787] 这个组中的突变在HD结构域内部失去氢键并且因此造成去稳定化。

[0788] 来自这个组的代表是S1580L。它在细胞测定法(图13a)中活化Notch3信号传 导并且是TALL-1的驱动力。在结构中,(HD-N中的)S1580的侧链氧与(HD-C中的)主链 氮的P1521形成氢键。S1580L突变能丧失这个氢键并去稳定化HD结构域。考虑到S1580 接近于S2位点(约1〇A),这种去稳定化可以使得ADAM蛋白酶更可接近S2位点并且因 此增强Notch3的活化。

[0789] 类似地,HD-N中的R1510H突变能丧失与HD-C中D1603形成氢键,D1587N、R1589Q 突变能丧失最初在这两个残基之间存在的盐桥,并且HD-N中的Y1624H突变能丧失与HD-C 中的S1527和D1530形成氢键。全部这些突变均能去稳定HD结构域并且潜在地活化Notch 3信号传导。

[0790] 组 2 (G1487D、A1476T、A1608T、L1518M、A1537T)

[0791] 这个组中的突变能影响结构域内部的结构完整性或造成与周围残基的冲突,因此 去稳定化Notch3NRR。

[0792] 来自这个组的代表是G1487D。它在细胞测定法中活化Notch3信号传导。G1487 毗邻于LNR-C的C1475-C1488二硫键,该二硫键对这个结构域内部的结构完整性和Ca2+配 位至关重要。G1487D突变可以干扰这个二硫键的正确定位并去稳定化LNR-C结构域。

[0793] L1518位于毗邻S2位点的疏水性口袋内,该疏水性口袋由R1627、Y1558、和11578 的侧链形成。L1518M突变能与这个疏水性口袋冲突并且因此去稳定化S2位点。

[0794] HD-N中的A1537仅与LNR-C中的E1492相距X3A。A1537T突变能与E1492冲突 并去稳定化LNR-HD相互作用。

[0795] 组 3(N1597K、L1547V、R1526C)

[0796] 这个组中的突变处于Notch3NRR的表面上。N1597K在细胞测定法中活化Notch 3信号传导(图14a),表明这些表面突变可能通过非NRR去稳定化的机制(例如干扰蛋白 质-蛋白质相互作用事件)发挥作用。

[0797] 癌突变与表位

[0798] 癌突变与20350表位

[0799] 这些癌突变位于20350表位的主要部分内部或外部,表明20350仍能与野生型和 突变体Notch3NRR结合。

[0800] 该表位内部的两个癌突变是R1510H和N1597K。例如,R1510H可能削弱20350与 Notch3NRR的结合,因为这种突变能丧失与轻链的几种相互作用,包括与D50形成盐桥和 与N31形成氢键。

[0801] 癌突变与20358表位

[0802] 除G1487D之外的全部癌突变均位于20358表位范围外部,表明20358仍能与野生 型和突变体Notch3NRR结合。

[0803] G1487D可能削弱20358与Notch3NRR的结合,因为这个突变可以与 Y1471(Notch3)和H55(20358重链)之间的氢键抵触并破坏它。

[0804] 实施例 15 :人Notch3NRR/20350、人Notch3NRR/20358 和人Notch3 NRR/20337复合物的HDx-MS表位作图

[0805] 氖交换质谱法(HDx-MS)测量蛋白质的酰胺主链上的氖摄取量;这些量值对酰胺 的溶剂可及性和主链酰胺的氢键网络的变化敏感。HDx-MS经常用来比较处于两个不同状态 (如结合apo和结合配体)的蛋白质并且与胃蛋白酶快速消化法联用。在这类实验中,可以 定位显示两个不同状态之间差异性氘摄取量的区域,其一般具有10至15个氨基酸。复合 物中受到保护的区域直接参与配体结合或以变构方式受配体的结合影响。

[0806] 在这些实验中,在三种 IgG 抗体:20350(SEQIDN0:287)、20358(SEQIDN0:288) 和20337(SEQIDN0:289)不存在和存在的情况下,用钙测量Notch3NRR蛋白(SEQID N0:282)的氖摄取量。Notch3NRR中当抗体结合时显示氖摄取量下降的区域可能参与表 位;然而,归因于测量的性质,还可能检测远离直接结合位点的变化(变构效应)。为了阐 明来自变构效应的直接结合事件,还实施正交测量(例如前述实施例中显示的X射线结晶 学)。

[0807] HDx-MS实验中所用的蛋白质:

[0808] Notch3NRR

[0809] metdt11lwvl1lwvpgstgAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWR QCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASE VPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIG SVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSgshhhhhh(SEQID NO:282)

[0810] 20350 IgG

[0811] MGLGARGRRRRRRLMALPPPPPPMRALPLLLLLAGLGAAAPPCLDGSPCANGGRCTHQQPSLEAACLCL PGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCLRGFQGPDCSQPDPCVSRPCVHGAPCSVGPDGRFACA CPPGYQGQSCQSDIDECRSGTTCRHGGTCLNTPGSFRCQCPLGYTGLLCENPVVPCAPSPCRNGGTCRQSSDVTYDC ACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNLLGGHS CVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVSGRAI CTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQF TCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSMCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYE CRCAEGFEGTLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGIRCESQVDECRSQPCRYGGKCLDLVDKYLCR CPPGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFHCLCP PGSLPPLCLPANHPCAHKPCSHGVCHDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLAPDACESQPCQAGGTCTSDGIGFRCTCA PGFQGHQCEVLSPCTPSLCEHGGHCESDPDRLTVCSCPPGWQGPRCQQDVDECAGASPCGPHGTCTNLPGNFRCICH RGYTGPFCDQDIDDCDPNPCLHGGSCQDGVGSFSCSCLDGFAGPRCARDVDECLSSPCGPGTCTDHVASFTCACPPG YGGFHCEIDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVSSFSCLCRPGYTGTHCQYEADPCFSRPCLHGGICNPTHPGFECTCREGF TGSQCQNPVDWCSQAPCQNGGRCVQTGAYCICPPGWSGRLCDIQSLPCTEAAAQMGVRLEQLCQEGGKCIDKGRSHY CVCPEGRTGSHCEHEVDPCTAQPCQHGGTCRGYMGGYVCECPAGYAGDSCEDNIDECASQPCQNGGSCIDLVARYLC SCPPGTLGVLCEINEDDCDLGPSLDSGVQCLHNGTCVDLVGGFRCNCPPGYTGLHCEADINECRPGACHAAHTRDCL QDPGGHFRCVCHPGFTGPRCQIALSPCESQPCQHGGQCRHSLGRGGGLTFTCHCVPPFWGLRCERVARSCRELQCPV GIPCQQTARGPRCACPPGLSGPSCRVSRASPSGATNASCASAPCLHGGSCLPVQSVPFFRCVCAPGWGGPRCETPSA APEVPEEPRCPRAACQAKRGDQNCDRECNTPGCGWDGGDCSLNVDDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYD NFDCYSGGRDRTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADF LQRLSAILRTSLRFRLDARGQAMVFPYHRPSPGSESRVRRELGPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSAENDHCFPDAQSAA DYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEAPEQSVPLLPLLVAGAVFLLIIFILGVMVARRKREHSTLWFPEGFALHKD IAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVVTDLNDSECPEAKRLKVEEPGMGAEEPEDCRQWTQHHLVAADIRV APATALTPPQGDADADGVDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPAEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTG ETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARL AVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLD HLANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPSGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAVQSGTKKSRRPPGKT GLGPQGTRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFSGPPASPGGFPLEGPYATTATAVSLAQLGASRAGPL GRQPPGGCVLSFGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGAPVSPQERPPPYLAAPGHGEEYPAAG TRSSPTKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSDSTPSPATATNATASGALPAQPHPISVPSLPQSQT QLGPQPEVTPKRQVMA(SEQIDNO:287)

[0812] 20358IgG

[0813] MGLGARGRRRRRRLMALPPPPPPMRALPLLLLLAGLGAAAPPCLDGSPCANGGRCTHQQPSLEAACLCL PGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCLRGFQGPDCSQPDPCVSRPCVHGAPCSVGPDGRFACA CPPGYQGQSCQSDIDECRSGTTCRHGGTCLNTPGSFRCQCPLGYTGLLCENPVVPCAPSPCRNGGTCRQSSDVTYDC ACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNLLGGHS CVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVSGRAI CTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQF TCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSMCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYE CRCAEGFEGTLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGIRCESQVDECRSQPCRYGGKCLDLVDKYLCR CPPGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFHCLCP PGSLPPLCLPANHPCAHKPCSHGVCHDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLAPDACESQPCQAGGTCTSDGIGFRCTCA PGFQGHQCEVLSPCTPSLCEHGGHCESDPDRLTVCSCPPGWQGPRCQQDVDECAGASPCGPHGTCTNLPGNFRCICH RGYTGPFCDQDIDDCDPNPCLHGGSCQDGVGSFSCSCLDGFAGPRCARDVDECLSSPCGPGTCTDHVASFTCACPPG YGGFHCEIDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVSSFSCLCRPGYTGTHCQYEADPCFSRPCLHGGICNPTHPGFECTCREGF TGSQCQNPVDWCSQAPCQNGGRCVQTGAYCICPPGWSGRLCDIQSLPCTEAAAQMGVRLEQLCQEGGKCIDKGRSHY CVCPEGRTGSHCEHEVDPCTAQPCQHGGTCRGYMGGYVCECPAGYAGDSCEDNIDECASQPCQNGGSCIDLVARYLC SCPPGTLGVLCEINEDDCDLGPSLDSGVQCLHNGTCVDLVGGFRCNCPPGYTGLHCEADINECRPGACHAAHTRDCL QDPGGHFRCVCHPGFTGPRCQIALSPCESQPCQHGGQCRHSLGRGGGLTFTCHCVPPFWGLRCERVARSCRELQCPV GIPCQQTARGPRCACPPGLSGPSCRVSRASPSGATNASCASAPCLHGGSCLPVQSVPFFRCVCAPGWGGPRCETPSA APEVPEEPRCPRAACQAKRGDQNCDRECNTPGCGWDGGDCSLNVDDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYD NFDCYSGGRDRTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADF LQRLSAILRTSLRFRLDARGQAMVFPYHRPSPGSESRVRRELGPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSAENDHCFPDAQSAA DYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEAPEQSVPLLPLLVAGAVFLLIIFILGVMVARRKREHSTLWFPEGFALHKD IAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVVTDLNDSECPEAKRLKVEEPGMGAEEPEDCRQWTQHHLVAADIRV APATALTPPQGDADADGVDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPAEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTG ETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARL AVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLD HLANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPSGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAVQSGTKKSRRPPGKT GLGPQGTRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFSGPPASPGGFPLEGPYATTATAVSLAQLGASRAGPL GRQPPGGCVLSFGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGAPVSPQERPPPYLAAPGHGEEYPAAG TRSSPTKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSDSTPSPATATNATASGALPAQPHPISVPSLPQSQT QLGPQPEVTPKRQVMA(SEQIDNO:288)

[0814] 20337IgG

[0815] MGLGARGRRRRRRLMALPPPPPPMRALPLLLLLAGLGAAAPPCLDGSPCANGGRCTHQQPSLEAACLCL PGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCLRGFQGPDCSQPDPCVSRPCVHGAPCSVGPDGRFACA CPPGYQGQSCQSDIDECRSGTTCRHGGTCLNTPGSFRCQCPLGYTGLLCENPVVPCAPSPCRNGGTCRQSSDVTYDC ACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNACHNGGTCFNLLGGHS CVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCHLDDACVSNPCHEDAICDTNPVSGRAI CTCPPGFTGGACDQDVDECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGPRCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQF TCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPSGFSGSMCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYE CRCAEGFEGTLCERNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSCACAPGYTGIRCESQVDECRSQPCRYGGKCLDLVDKYLCR CPPGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGINRYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFHCLCP PGSLPPLCLPANHPCAHKPCSHGVCHDAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLAPDACESQPCQAGGTCTSDGIGFRCTCA PGFQGHQCEVLSPCTPSLCEHGGHCESDPDRLTVCSCPPGWQGPRCQQDVDECAGASPCGPHGTCTNLPGNFRCICH RGYTGPFCDQDIDDCDPNPCLHGGSCQDGVGSFSCSCLDGFAGPRCARDVDECLSSPCGPGTCTDHVASFTCACPPG YGGFHCEIDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVSSFSCLCRPGYTGTHCQYEADPCFSRPCLHGGICNPTHPGFECTCREGF TGSQCQNPVDWCSQAPCQNGGRCVQTGAYCICPPGWSGRLCDIQSLPCTEAAAQMGVRLEQLCQEGGKCIDKGRSHY CVCPEGRTGSHCEHEVDPCTAQPCQHGGTCRGYMGGYVCECPAGYAGDSCEDNIDECASQPCQNGGSCIDLVARYLC SCPPGTLGVLCEINEDDCDLGPSLDSGVQCLHNGTCVDLVGGFRCNCPPGYTGLHCEADINECRPGACHAAHTRDCL QDPGGHFRCVCHPGFTGPRCQIALSPCESQPCQHGGQCRHSLGRGGGLTFTCHCVPPFWGLRCERVARSCRELQCPV GIPCQQTARGPRCACPPGLSGPSCRVSRASPSGATNASCASAPCLHGGSCLPVQSVPFFRCVCAPGWGGPRCETPSA APEVPEEPRCPRAACQAKRGDQNCDRECNTPGCGWDGGDCSLNVDDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYD NFDCYSGGRDRTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADF LQRLSAILRTSLRFRLDARGQAMVFPYHRPSPGSESRVRRELGPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSAENDHCFPDAQSAA DYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEAPEQSVPLLPLLVAGAVFLLIIFILGVMVARRKREHSTLWFPEGFALHKD IAAGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVVTDLNDSECPEAKRLKVEEPGMGAEEPEDCRQWTQHHLVAADIRV APATALTPPQGDADADGVDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPAEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTG ETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARL AVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLD HLANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPSGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAVQSGTKKSRRPPGKT GLGPQGTRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFSGPPASPGGFPLEGPYATTATAVSLAQLGASRAGPL GRQPPGGCVLSFGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGAPVSPQERPPPYLAAPGHGEEYPAAG TRSSPTKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSDSTPSPATATNATASGALPAQPHPISVPSLPQSQT QLGPQPEVTPKRQVMA(SEQIDNO:289)

[0816] HDx-MS实验部分

[0817] HDx-MS实验在WatersSynaptG2HDX平台上进行,所述平台包括LEAP机器人系 统、nanoACQUITYUPLC系统和SynaptG2质谱仪。两个实验方法用来进行HDx-MS测量。在第 一方法中,全部实验均在溶液中实施,并且在第二方法中,将抗体固定在珠上以改善Notch 3NRR抗原的肽覆盖率。

[0818] 在第一方法中,通过LeapShe11软件操作的LEAP机器人,使试验自动化,所述软件 执行氖交换反应启动、反应时间控制、猝灭反应、注射样品到UPLC系统上和消化时间控制。 Leap机器人配备了温度受控制的两个叠式储存器(stack),所述叠式储存器维持在37 °C用 于HDx反应并且维持在2°C用于储存蛋白质和猝灭溶液。使用250pmolNotch3NNR抗原, 实施三个重复对照实验。将抗原在37°C以终浓度90. 0%D交换为氘化Tris缓冲液(15mM TrisHC1,10mM氯化钙,D20中的10mM氯化钠,pH= 7. 6)40分钟。通过用(6M脲和1MTCEP pH= 2. 5) 1:1稀释交换溶液,在2 °C猝灭氘交换5分钟。在猝灭后,将样品注射到Waters UPLC系统上,在那里,使用维持在12°C的固定化胃蛋白酶柱消化所述样品。在消化后,肽 留在WatersUPLCHSST3 2.lx5mm前置柱上。随后将肽从前置柱洗脱并在WatersUPLC CSHC18 1.Ox100mm柱上使用8分钟2%至35%乙腈梯度分离。接着,对抗原-mAb复合物 实施三次重复实验。在这些实验中,将250pmolNotch3NRR抗原与375pmol抗体在室温 于TRIS缓冲液(水中15mMTrisHCl,10mM氯化钙、10mM氯化钠,pH= 7. 6)中预先温育15 分钟。全部其他实验参数与对照实验相同。

[0819] 为了改善Notch3NRR在LNR-B结构域中的肽覆盖率,使用第二HDx-MS方法,所 述方法并入mAb与珠的固定以最小化LC-MS实验中的抗体信号。在这种方法中,如下实施 三次重复对照实验。将400pmolNotch3NRR抗原稀释于预温37°C、99%氘化TRIS缓冲液 (ρΗ7· 6)中并在37°C于热混合器(700rpm)中温育40分钟D= 96. 1% )。通过用冷猝灭 缓冲液(6M脲和1MTCEPpH= 2. 5)在冰上1:1稀释,猝灭氘交换5分钟。在猝灭后,将管 转移到LEAP系统上并且将猝灭样品通过LEAP系统注射到UPLC系统上以便分析。UPLC系 统并入在线胃蛋白酶消化(维持在12°C)。将8分钟2%至35%乙腈梯度和WatersUPLC CSHC18 1.Ox100mm柱用于分离。接着,使用抗体实施三次重复实验。使用标准技术,将 20350和20358抗体固定在蛋白G琼脂糖珠(Thermo目录号22851)上。简而言之,将抗体 离心以移除储存缓冲液。随后,将200μ1TRIS缓冲液(pH7. 6)和400pmolNotch3NRR 添加至固定化Ab并且在25°C温育15分钟。在温育后,将复合物离心并用200μ1TRIS缓 冲液洗涤并且再次离心。对于氘交换,将200μL氘化的TRIS添加至抗原-抗体复合物以 在37°C温育40分钟D= 96. 1 % )。随后移除氘缓冲液,并立即添加125μL冰冷的猝 灭缓冲液。在猝灭后,将柱离心并且将流过液转移至预冷的HPLC小瓶中并使用相同的在线 胃蛋白酶消化/LC-MS设置进行分析。

[0820] 20350 和 20358 的HDx-MS结果

[0821] HDx-MS结果总结于图27和图28中。图27显示在20350和20358不存在(对照) 和存在下Notch3NRR肽的平均氘摄取量。在图27中有用的是检查以下两种差异:对照和 mAb之间的差异和各mAb之间的差异。图28显示20350和20358抗体的apo状态和结合状 态之间的差异。小于0.f5Da的差异视为不显著(例如,相对于未结合的Notch3NRR对照 无变化)。对差异的检验允许确定当IgG结合时受保护的Notch3NRR区域。

[0822] 从图27和图28中,在LNR-A区域中存在总体不显著的保护量。这种观察结果表 明20350抗体和20358抗体均不与Notch3NRR的这个区域显著相互作用。在LNR-B结构 域中,保护作用增加,尤其在肽1432-1463中如此。这种肽跨越绝大部分的LNR-B和部分 LNR-B/C接头并且仅在固定化抗体实验中检测到。在LNR-B/C接头和LNR-C区域中,一些肽 (1457-1471,1457-1472和1457-1489)在20358中受到保护,但是这些肽在20350中未受到 保护。还检测到不因任一种抗体与Notch3NRR结合而受到保护的较短区域1478-1489。 借助这种信息,可以推断受到20358差异性保护的区域是跨越1457-1477的区域。最后,在 LNR-C中的一个其他区域(1490-1500)受到两种抗体保护。除了跨越1532-1545的区域外, 在HD-N结构域中,未观察到所研究的任一抗体的保护作用。在HD-C结构域中,当20350或 20358与Notch3NRR结合时,区域1580-1583、1592-1616和1617-1628均受到保护免于氘 交换。

[0823] 图29显示在使用实施例14中所示的Notch3NNR晶体结构的HDx-MS实验中受 保护区域的图。将受保护区域绘图到结构上允许阐明这样的保护区域(可能参与变构效 应),所述保护区域距蛋白质表面上的那些区域(潜在地参与形成表位)更深埋入结构中。 例如,在图27和图28中,对应于α3螺旋的中心断面的区域1609-1616基本上受到两种抗 体保护,尽管它不直接与20350或20358相互作用。这种保护作用在性质上是变构的并且 可以归因于LNR结构域的稳定作用,其中这些LNR结构域在抗体结合时包围α3螺旋。包 围α3螺旋的LNR结构域的稳定作用随后能限制氖接近α3螺旋的中心。α3螺旋保护作 用也能归因于抗体结合时3螺旋氢键网络的稳定作用增加。

[0824] 研究表面上的保护作用时,立即地观察到区域1457-1477位于表面上。这个区域, 跨越整个LNR-B/C接头和LNR-C的Ν末端,仅在20358与Notch3NRR结合并且不与20350 结合时受到保护。这个区域中的差异性保护可以用来区分20350抗体和20358抗体并且与 X射线结晶学研究(实施例14) 一致。从表5可见,区域1457-1477含有11个包埋于20358 复合物中的残基。与之相反,表4表示这个区域仅含有4个包埋于20350复合物中的残基。 从图29可以解释两种抗体基本上还与LNR-B结构域相互作用。从X射线结晶学(实施例 14)可见,仅20350基本上与这个区域相互作用(Notch3NRR上9个对1个包埋残基)。 HDx-MS实验中分辨率有限和对变构效应的敏感性可能造成这种误导性解释。如前文提到, 在LNR-B结构域中,受到最大保护的肽跨越31个氨基酸,范围从1432-1463。这种肽含有在 两种晶体结构中包埋的残基(20350中11个包埋残基对20358中2个包埋残基)。因为两 种复合物均具有来自1432-1457的相似保护作用,所以附近LNR-C结构域中20358的结合 作用似乎还在这个区域诱导某种变构保护作用。最后,含有LNR-A的C末端和A/B接头的 更小肽(例如1420-1430)还显示受两种抗体的某种(和等同)保护。X射线结晶学(实施 例14)表明这个区域仅包埋在20350复合物中。HDx-MS数据表明这个区域还在20358结合 时被变构保护并且不能与20358直接结合事件区分。

[0825] 最后,图30提供通过HDx-MS确定的受保护区域的总结并且将它们与来自X射线 结晶学研究的包埋残基比较(实施例14)。总之,HDx-MS实验检测到含有借助X射线结晶 学确定的几乎全部包埋残基的受保护区域。如前文提到,还检测到一些额外的保护区域,这 些保护区域在性质上可能是变构的,如α3螺旋的中心。

[0826] IgG抗体20337的HDx-MS实验和结果

[0827] 使用未结合的Notch3NRR和Notch3,在前述两种IgG抗体和一种额外IgG抗 体20337(SEQIDN0:289)存在下使用自动化HDx-MS系统,还进行了钙不存在下采用Notch 3NRR的初步实验。在这些实验中,将200pmolNotch3NRR(对照)或200pmolNotch3 NRR+300pmolIgG抗体在37°C交换为D-PBS(最终%D= 88. 3% )持续40分钟。通过用 (6M脲和1MTCEPpH= 2· 5) 1:1稀释交换溶液,在2°C猝灭氘交换过程5分钟。在猝灭后, 将样品注射到WatersUPLC系统上,在那里,使用维持在12°C的固定化胃蛋白酶柱消化所 述样品。在消化后,肽留在WatersUPLCHSST3 2.lx5mm前置柱上。随后将肽从前置柱 洗脱并在WatersUPLCCSHC18 1.Ox100mm柱上使用8分钟2%至35%乙腈梯度分离。

[0828] 图31的左侧显示在不存在Ca2+的情况下与20358或20337复合的Notch3NRR 的HDX-MS差异图。研究该图允许观察到在这两种抗体之间受到差异性保护的区域。例如, 区域1419-1432和1456-1488在20358存在下相对于20337受到更多保护。与之相反,相 对于 20358,在 20337 与Notch3NRR结合之后,区域 1489-1498、1500-1506、1538-1568、 1571-1582和1583-1591受到更多保护。20337和20358的受保护区域在图31右侧上的两张 图中以黑色突出显示。观察到差异性HDx-MS表明了相对于20358 (数据显示)和20350 (数 据未显示)抗体,20337抗体差异地与Notch3NRR抗原相互作用。总之,HDx-MS数据与表 位分拣数据(实施例13)和X射线结晶学(实施例14) 一致,表明20337、20358和20350 在Notch3NRR上具有不同的相互作用(和表位)。

[0829] 可以重复相同实验以获得与Ca2+存在下的Notch3NRR- 20337复合物相对应的 HDx-MS数据,预期获得在Ca2+不存在下所见到的相似数据是可能的,S卩,将见到受全部三种 抗体差异性保护的Notch3NRR区域。

[0830] 实施例16 :鉴定Notch3NRR的额外构象表位

[0831] 能过用本文公开的抗体(例如,20337、20350、20358和A4)预阻断Notch3NRR,找 到Notch3NRR的额外构象表位。基于本文公开的Notch3NRR结构,抗体20337、20350、 20358和A4的表位可以绘图到Notch3NRR的表面上。如图32中所示,四种抗体的表位 覆盖约67%的Notch3NRR表面,留下约33%的表面未覆盖,横跨LNR结构域和HD结构域 (图 32)。

[0832] 如通过本文公开的四种抗体所例举,结合桥接LNR和HD的构象表位的抗体是抗体 抑制Notch3信号传导的潜在机制。这些抗体通过将LNR和HD夹在一起并稳定Notch3 NRR的自我抑制状态发挥作用。在Notch3NRR的表面上鉴到至少两个额外的潜在表位,所 述表位未被20337、20350、20358和A4覆盖。如图34中所示,第一潜在表位包含LNR-C和 HD结构域并且第二潜在表位包含LNR-A/B接头、LNR-A结构域和HD结构域。关于这两种潜 在表位(直接桥接LNR和HD)的有利几何形状,可能的是能找到针对它们的额外Notch3抑 制性抗体。

[0833] 为了筛选靶向这两个潜在表位以及其他构象表位的抗体,可以使用以下实验策 略。通常而言,先前鉴定的Notch3抗体(例如,20337、20350或20358)可以与重组NRR蛋 白预温育,之后用市售噬菌体展示文库(如MorphosysHuCALPLATINUM®.文库)淘 选。此外,这些Notch3抗体(20337、20350、20358)可以在淘选之前预结合至表达Notch3 的细胞。与单独或组合的Notch3抗体预温育将阻断这些抗体的表位并且富集与不同和独 特表位结合的克隆/抗体。如所述那样,使用综合淘选策略,所述综合淘选策略使用借助重 组NRR蛋白和完整细胞的固相淘选或溶液相淘选和差异性完整细胞淘选。随后选择克隆/ 抗体,所述克隆/抗体显示与作为重组蛋白的Notch3以及与表达Notch3的细胞选择性结 合,如图3-6中所述。此外,在基于细胞的功能测定法(配体驱动的报道基因测定法,Notch 靶基因mRNA定量、I⑶3蛋白水平、TALL-1增殖)中筛选从以上方案鉴定的抗体对Notch3 信号传导的抑制,如图7、8、11、13、14、15中所述。为了确定新鉴定的Notch3抗体是否与 20337、20350、20358相同的表位结合或结合至不同的非重叠表位,可以使用三种一般方案: 采用Biacore的表位分拣(图20);采用NRR蛋白的共晶体结构物(图21、23、24、25);和抗 体/Notch3NRR复合物的HDx-MS表位作图(图27-31)。最终,这些新抗体与NRR蛋白质 的共晶体结构将允许鉴定出抗体的表位并且确定所述表位是否与20337、20358和20350的 不同。

[0834] 等同物

[0835] 认为前面的书面说明书足以使本领域技术人员实施本公开成为可能。前面的描述 和实施详述了本公开的某些优选实施方案并描述了发明人构思的最佳模式。然而,将理解 无论前述内容可能在文本上如何详细出现,本公开可以按许多方式实施并且本公开应当根 据所附权利要求书及其任何等同物解释。

[0836] 通过引用方式并入作为参考

[0837] 本文援引的全部参考文献,包括专利、专利申请、论文、教材等及其中引用的参考 文献,因而通过引用的方式完整并入本文作为参考至它们尚未达到的程度。

Claims (46)

1. 分离的多肽,其包含Notch 3受体的构象表位,其中构象表位包含在Notch 3受体 NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连 续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C ;其中HD结构域选自N端 HD和C端HD,并且其中接头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
2. 分离的多肽,其包含Notch 3受体的构象表位,其中构象表位包含在Notch 3受体 NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连 续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是LNR-B,并且HD结构域是HD a 3螺旋,并且其中接 头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
3. 分离的多肽,其包含Notch 3受体的构象表位,其中构象表位包含在Notch 3受体 NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部的连 续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是LNR-C,并且HD结构域是HD a 2螺旋;并且其中接 头区域选自LNR-A/B接头、LNR-B/C接头、LNR-HD接头。
4. 识别Notch 3受体的构象表位的分离抗体或其片段,其中构象表位包含在Notch 3 受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头区域内部 的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域选自LNR-A、LNR-B、LNR-C ;其中HD结构域选自 N端HD和C端HD ;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
5. 根据权利要求4所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段稳定处于自我抑制状 态的Notch 3受体LNR区域。
6. 根据权利要求4所述的分离抗体或其片段,其中Notch 3受体是突变体Notch 3受 体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
7. 根据权利要求6所述的分离抗体或其片段,其中Notch 3突变体包含选自S1580L和 G1487D的突变。
8. 特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离抗体或其片段,其中构象表位包含在 Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头 区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是LNR-B,并且HD结构域是HD a 3螺 旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
9. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在NRR区域的 LNR-A/B接头中的氨基酸残基。
10. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在NRR区域的 LNR-B/C接头中的氨基酸残基。
11. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在NRR区域的 LNR-HD接头中的氨基酸残基。
12. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在HD P 4-a 3环中 的氨基酸残基。
13. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在LNR-A/B接头、 LNR-B/C接头、LNR-HD接头和HD 4- a 3环中的氨基酸残基。
14. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段稳定处于自我抑制 状态的Notch 3受体LNR区域。
15. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中Notch 3受体是突变体Notch 3受 体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
16. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中Notch 3突变体包含选自以下的 突变:S1580L、D1587N、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和 G1487D、 (LNR-C)、P2034fs、P2067fs、p2177fs、Q2075*、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、G2038S、 G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、P2178S 或其组合。
17. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段、其中构象表位包含氨基酸残基: (LNR-A/B 接头的)1427-1429、(LNR-B 的)1442、1444-1445、1447-1450、1453、1458、(LNR-B/ C 接头的)1461-1462、1464、(LNR-HD 接头的)1507-1508、1510、(HD P 4- a 3 环的)1592、 1594-1599、1602 和(HD a 3 螺旋的)1606 或其子集。
18. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段的VH与至少一个以 下 Notch 3 残基结合:Cysl442、Prol444、Alal445、Serl447、Serl448、Prol449、Tyrl453、 Cysl458、Glyl461、Glyl462、Glyl464、Leul592、Serl594、Prol595、Glul596、Asnl597、 Aspl598 和 Hisl599。
19. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段的VL与至少一个以 下 Notch 3 残基结合:Glnl427、Cysl428、Glul429、Prol444、Serl445、Serl447、Serl448、 Prol449、Tyrl453、Leul507、Leul508、Argl510、Leul592、Aspl598、Prol602 和 Serl606。
20. 根据权利要求8所述的分离抗体或其片段,其中抗体选自单克隆抗体、多克隆抗 体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。
21. 特异性结合Notch 3受体的构象表位的分离抗体或其片段,其中构象表位包含在 Notch 3受体NRR结构域的Lin Notch重复序列(LNR)区域、异二聚化(HD)结构域和接头 区域内部的连续和不连续氨基酸序列;其中LNR区域是LNR-C,并且HD结构域是HD a 2螺 旋;并且其中抗体或其片段阻断配体依赖的信号转导。
22. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在NRR区域的 LNR-B中的氨基酸残基。
23. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在NRR区域的 LNR-B/C接头中的氨基酸残基。
24. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在HD a 3- 0 5环 中的氨基酸残基。
25. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中构象表位还包含在LNR-B、LNR-B/ C接头和HD a 3- P 5环中的氨基酸残基。
26. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段稳定处于自我抑制 状态的Notch 3受体LNR区域。
27. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中Notch 3受体是突变体Notch 3 受体,其中LNR区域或HD结构域具有至少一个氨基酸残基突变。
28. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中突变体Notch 3受体包含选自 以下的突变:S1580L、D1587N、Y1624H、L1518M、A1537T、N1597K、L1547V、R1526C(HD)和 G1487D、(LNR-C)、P2034fs、P2067fs、p2177fs、Q2075*、W2172*、G2112D、L2212M、F2121L、 G2038S、G2059R、R2022H、Y2127H、Y2211C、V2202I、S2096L、P2089L、P2209L、R1981C、R2145Q、 P2178S、或其组合。
29. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中构象表位包含氨基酸残基: (LNR-B 的)1440、 (LNR-B/C 接头的)1463、1465-1468、 (LNR-C 的)1469-1472、1474、 1486-1487、(HD a 2 螺旋的)1534 以及(a 3-(65 环的)1618、1619 和 1621、或其子集。
30. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段的VH与至少一个以 下 Notch 3 残基结合:Argl463、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Tyrl471、Tyrl474、 Glnl486 和 Glyl487。
31. 根据权利要求21所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段的VL与至少一个以 下 Notch 3 残基结合:Serl440、Argl465、Thrl466、Asnl468、Prol469、Vall470、Glul472、 Argl434、Glul618、Argl619 和 Aspl621。
32. 根据权利要求4-31所述的分离抗体或其片段,其中抗体选自单克隆抗体、多克隆 抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成的抗体。
33. 根据权利要求4-31所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段抑制Notch 3信 号传导,这通过选自Notch 3配体驱动的报道基因测定法、FACS测定法、Notch 3靶基因 mRNA定量、TALL-I细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch 3胞内结构域(I⑶)的Y分 泌酶切割形式评估。 34•对 Notch 3 受体具有至少 Ix 10 7M \ IO8M \ IO9M \ IO10M \ IO11M \ IO12M \ IO13M 1 的 解离常数(Kd)的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段抑制Notch 3信号传导,这通过选 自Notch 3配体驱动的报道基因测定法、FACS测定法、Notch 3靶基因mRNA定量、TALL-I 细胞体外增殖的测定法和通过检测Notch 3胞内结构域(ICD)的y分泌酶切割形式评估。
35. 根据权利要求34所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段结合至与表2中所 述抗体相同的构象表位。
36. 根据权利要求34所述的分离抗体或其片段,其中抗体或其片段与表2中所述的抗 体交叉竞争。
37. 针对Notch 3受体的分离抗体或其片段,所述抗体包含选自SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 209 和 SEQ ID NO: 229 的 VH 和 选自 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO:219 和SEQ ID N0:239的VL、或者与其具有97-99%同一性的氨基酸序列。
38. 包含可变重链序列和可变轻链序列的分离抗体或其片段,其中所述可变重链序列 和可变轻链序列选自具有SEQ ID N0:9的可变重链和具有SEQ ID NO: 19的可变轻链序 列;具有SEQ ID N0:29的可变重链序列和具有SEQ ID N0:39的可变轻链序列;具有SEQ ID N0:49的可变重链序列和具有SEQ ID N0:59的可变轻链序列;具有SEQ ID N0:69的可 变重链序列和具有SEQ ID N0:79的可变轻链序列;具有SEQ ID N0:89的可变重链序列和 具有SEQ ID N0:99的可变轻链序列;具有SEQ ID NO: 109的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 119的可变轻链序列;具有SEQ ID NO: 129的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 139的可 变轻链序列;具有SEQ ID NO: 149的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 159的可变轻链序列; 具有SEQ ID NO: 169的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 179的可变轻链序列;具有SEQ ID NO: 189的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 199的可变轻链序列;具有SEQ ID NO:209的可 变重链序列和具有SEQ ID NO: 219的可变轻链序列以及具有SEQ ID NO: 229的可变重链序 列和具有SEQ ID N0:239的可变轻链序列。
39. 包含可变重链序列和可变轻链序列的单链抗体或其片段,其中所述可变重链序列 和可变轻链序列选自具有SEQ ID N0:9的可变重链和具有SEQ ID NO: 19的可变轻链序 列;具有SEQ ID N0:29的可变重链序列和具有SEQ ID N0:39的可变轻链序列;具有SEQ ID N0:49的可变重链序列和具有SEQ ID N0:59的可变轻链序列;具有SEQ ID N0:69的可 变重链序列和具有SEQ ID N0:79的可变轻链序列;具有SEQ ID N0:89的可变重链序列和 具有SEQ ID N0:99的可变轻链序列;具有SEQ ID NO: 109的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 119的可变轻链序列;具有SEQ ID NO: 129的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 139的可 变轻链序列;具有SEQ ID NO: 149的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 159的可变轻链序列; 具有SEQ ID NO: 169的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 179的可变轻链序列;具有SEQ ID NO: 189的可变重链序列和具有SEQ ID NO: 199的可变轻链序列;具有SEQ ID NO:209的可 变重链序列和具有SEQ ID NO: 219的可变轻链序列以及具有SEQ ID NO: 229的可变重链序 列和具有SEQ ID N0:239的可变轻链序列。
40. 针对Notch 3受体的分离抗体或其片段,包含选自SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:25、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:145、 SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:205 和 SEQ ID NO:225 的重链 CDR3。
41. 包含重链可变区和轻链可变区⑶RUOTR2和⑶R3的分离抗体或其片段,所述重链 可变区和轻链可变区CDRUCDR2和CDR3选自重链可变区SEQ ID N0:3的CDR1;SEQ ID N0:4 的 CDR2 ;SEQ ID N0:5 的 CDR3 ;轻链可变区 SEQ ID NO: 13 的 CDRl ;SEQ ID NO: 14 的 CDR2 ; 和 SEQ ID NO: 15 的 CDR3 ;重链可变区 SEQ ID N0:23 的 CDRl ;SEQ ID N0:24 的 CDR2 ;SEQ ID N0:25 的 CDR3;轻链可变区 SEQ ID N0:33 的 CDR1;SEQ ID N0:34 的 CDR2;和 SEQ ID 勵:35的0«3;重链可变区5£〇10勵:43的0)1?1;5£〇10勵:44的0)1?2 ;5£〇10勵:45的 CDR3;轻链可变区 SEQ ID NO :53 的 CDRl ; SEQ ID NO :54 的 CDR2;和 SEQ ID NO :55 的 CDR3; 重链可变区 SEQ ID NO:63 的 CDRl ;SEQ ID NO:64 的 CDR2 ;SEQ ID NO:65 的 CDR3 ;轻链可 变区 SEQ ID N0:73 的 CDRl ;SEQ ID N0:74 的 CDR2 ;和 SEQ ID N0:75 的 CDR3 ;重链可变区 SEQ ID NO:83 的 CDRl ;SEQ ID NO:84 的 CDR2 ;SEQ ID NO:85 的 CDR3 ;轻链可变区 SEQ ID N0:93 的 CDRl ;SEQ ID N0:94 的 CDR2 ;和 SEQ ID N0:95 的CDR3 ;重链可变区 SEQ ID N0:103 的 CDRl ;SEQ ID NO: 104 的 CDR2 ;SEQ ID NO: 105 的 CDR3 ;轻链可变区 SEQ ID NO: 113 的 CDRl ;SEQ ID NO: 114 的 CDR2 ;和 SEQ ID NO: 115 的 CDR3 ;重链可变区 SEQ ID NO: 123 的 CDRl ;SEQ ID NO: 124 的 CDR2 ;SEQ ID NO: 125 的 CDR3 ;轻链可变区 SEQ ID NO: 133 的 CDRl ; SEQ ID NO: 134 的 CDR2 ;和 SEQ ID NO: 135 的 CDR3 ;重链可变区 SEQ ID NO: 143 的 CDRl ; SEQ ID NO: 144 的 CDR2 ;SEQ ID NO: 145 的 CDR3 ;轻链可变区 SEQ ID NO: 153 的 CDRl ;SEQ ID NO: 154 的 CDR2;和 SEQ ID NO: 155 的 CDR3;重链可变区 SEQ ID NO: 163 的 CDRl ;SEQ ID 从):164的001?2;5£〇10勵:165的001?3;轻链可变区5£〇10勵:173的001?1 ;5£〇10从):174 的 CDR2;和 SEQ ID NO: 175 的 CDR3;重链可变区 SEQ ID NO: 183 的 CDRl ;SEQ ID NO: 184 的 0)1?2;5£〇10勵:185的0)1?3;轻链可变区5£〇10勵:193的0)1?1 ;5£〇10勵:194的0)1?2; 和 SEQ ID NO: 195 的 CDR3 ;重链可变区 SEQ ID N0:203 的 CDRl ;SEQ ID N0:204 的 CDR2 ; SEQ ID N0:205 的 CDR3 ;轻链可变区 SEQ ID N0:213 的 CDRl ;SEQ ID N0:214 的 CDR2 ;和 SEQ ID NO:215 的 CDR3 ;重链可变区 SEQ ID NO:223 的 CDRl ;SEQ ID NO:224 的 CDR2 ;SEQ ID NO: 225 的 CDR3;轻链可变区 SEQ ID NO: 233 的 CDRl ;SEQ ID NO: 234 的 CDR2;和 SEQ ID N0:235 的 CDR3。
42. 药物组合物,包含选自权利要求4-41的抗体或其片段和可药用载体。
43. 根据权利要求4-41所述的抗体或其片段,用于治疗由Notch 3信号转导途径介导 的癌,所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、前列 腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血 病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外 周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、 恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。
44. 根据权利要求43所述的抗体或片段,用于治疗由Notch 3信号转导途径介导的癌 症,其中癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
45. 根据权利要求4-41所述的抗体或其片段,用作治疗由Notch 3信号转导途径介导 的癌的药物,所述癌选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺 癌、前列腺癌、急性髓样白血病、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴 细胞白血病、尤文肉瘤、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、鳞状 细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明 细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌和黑素瘤。
46. 根据权利要求45所述的抗体或片段,用作治疗由Notch 3信号转导途径介导的癌 症的药物,其中癌症是T细胞急性淋巴母细胞性白血病(TALL)。
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