ES2931955T3 - Anticuerpo anti-Notch3 - Google Patents

Abstract

Se describen anticuerpos monoclonales que se unen e inhiben la activación de Notch3 humano. Los anticuerpos se pueden usar para tratar enfermedades y trastornos de proliferación celular, incluidas ciertas formas de cáncer, asociadas con la activación y/o sobreexpresión de Notch3. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-Notch3

Campo de la invención

El campo de la invención es anticuerpos que se unen a Notch3 humano.

Antecedentes

La señalización de la vía de Notch está implicada en numerosos procesos celulares, entre los que se incluyen la determinación del destino celular, la diferenciación, la proliferación, la apoptosis, la migración y la angiogénesis. En mamíferos, hay cuatro proteínas Notch (en ocasiones denominadas "receptores Notch"), denominadas Notch1-Notch4. Las cuatro proteínas Notch tienen una estructura de dominio similar, que incluye un dominio extracelular, un dominio regulador negativo (NRR), un dominio transmembrana de un solo pase y un dominio intracelular. El dominio extracelular contiene una serie de repeticiones similares a EGF que están implicadas en la unión al ligando. Durante la maduración, el polipéptido Notch se escinde por una proteasa similar a furina. Esta escisión divide la proteína Notch en dos subunidades que se mantienen unidas por el NRR. En ausencia de unión al ligando, el dominio NRR funciona para mantener la proteína Notch en una conformación resistente a las proteasas. El dominio intracelular es un factor de transcripción denominado dominio intracelular Notch (NICD), que se libera tras la escisión proteolítica por la gamma secretasa, en respuesta a la unión de la proteína Notch por un ligando. En mamíferos, los ligandos de Notch son del tipo Delta (por ejemplo, DLL1 y DLL4) y Jagged (también denominados Jag, por ejemplo, Jag1 y Jag2). Cuando se libera el NICD, viaja al núcleo, donde activa la transcripción de los genes sensibles a Notch, HES1, HES5, NRARP, Deltex1 y c-MYC. Para revisiones de la biología relacionada con Notch, véase, por ejemplo, Bray, 2006, NATURE REVIEWS 7:678-689; Kopan et al., 2009, CELL 137:216-233.

Aunque las proteínas Notch desempeñan un papel crucial en el desarrollo normal, la desregulación de las proteínas Notch está asociada con varios tipos de cáncer, entre los que se incluyen la leucemia/linfoma linfático agudo de linfocitos T (T-ALL), cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario y cáncer de pulmón. Véase, por ejemplo, Miele et al., 2006, CURRENT CAN^c E^r DRUG TAR^g E^t S 6:313-323. Por consiguiente, una estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer es la inhibición de la señalización de la vía de Notch. La inhibición de la señalización de la vía de Notch se ha logrado utilizando anticuerpos monoclonales (Wu et al., 2010, NATURE 464:1052-1057; Aste-Amezaga et al., 2010, PLOS ONE 5:1-13 e9094). Asimismo, la desregulación de Notch puede estar asociada con el desarrollo de hipertensión arterial pulmonar (HAP). Por consiguiente, una estrategia terapéutica para tratar la HAP puede implicar la inhibición de la señalización de la vía de Notch. (Li et al., 2009, Nature Medicine, 15:1289-1299; Jalali et al., 2012, PLOS ONE 7:e46808; Yu et al., 2013, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 48:647-654; Chida et al., 2014, Mol Gen. & Gen. Med., 2:229-239). El documento WO 2014/159239 divulga anticuerpos antagonistas humanos dirigidos contra Notch3. El documento WO 2014/100435 divulga anticuerpos antagonistas murinos y humanizados dirigidos contra Notch3.

Los anticuerpos naturales son proteínas multiméricas que contienen cuatro cadenas polipeptídicas (FIG. 1). Dos de las cadenas polipeptídicas se denominan cadenas pesadas de inmunoglobulina (cadenas H), y dos de las cadenas polipeptídicas se denominan cadenas ligeras de inmunoglobulina (cadenas L). Las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina están conectadas por un enlace disulfuro entre cadenas. Las cadenas pesadas de la inmunoglobulina están conectadas por medio de enlaces disulfuro entre cadenas. Una cadena ligera consta de una región variable (VL en la FIG. 1) y una región constante (C^l en la FIG. 1). La cadena pesada consta de una región variable (V^h en la FIG.

1) y al menos tres regiones constantes (CH1, CH2 y CH3 en la FIG. 1). Las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo.

Cada región variable contiene tres regiones hipervariables conocidas como regiones determinantes de la complementariedad (CDR) flanqueadas por cuatro regiones relativamente conservadas conocidas como regiones marco (FR). Las tres CDR, conocidas como CDR1, CDR2 y CDR3, contribuyen a la especificidad de unión del anticuerpo. Los anticuerpos naturales se han utilizado como material de partida para anticuerpos modificados, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados.

Existe la necesidad de anticuerpos mejorados que neutralicen la actividad biológica de Notch3 humano y que puedan usarse como agentes terapéuticos para tratar a pacientes humanos.

Sumario de la invención

La invención se basa, en el descubrimiento de anticuerpos como se definen en las reivindicaciones que se unen específicamente a Notch3 humano.

Los anticuerpos previenen o inhiben la activación de Notch3 humano, lo que hacen inhibiendo la unión de Notch3 a los ligandos de Notch, es decir, Jag1, Jag2, DLL1 y DLL4. Los anticuerpos son para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral, como se define en las reivindicaciones. Cuando se administra a un paciente humano con cáncer, los anticuerpos inhiben o reducen la proliferación tumoral en el sujeto.

Estos y otros aspectos y ventajas de la invención se ilustran mediante las siguientes figuras, la descripción detallada y las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La invención puede entenderse más completamente en referencia a los siguientes dibujos.

La FIG. 1 es una representación esquemática de un anticuerpo típico de origen natural.

La FIG.2 proporciona la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular (ECD; aminoácidos 40 a 1643) de Notch3 humano (SEQ ID NO: 19).

La FIG. 3 proporciona la secuencia de aminoácidos correspondiente a las repeticiones similares a EGF 1-11 (aminoácidos 40 a 467 del dominio extracelular mostrado en la FIG. 2) de Notch3 humano (SEQ ID NO: 20).

La FIG. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable completa de la cadena pesada (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo 28042. Las secuencias correspondientes a la CDR1 (SEQ ID NO: 3), la CDR2 (SEQ ID NO: 4), y la CDR3 (SEQ ID NO: 5) se identifican en recuadros. Las secuencias sin recuadro representan secuencias marco (FR).

La FIG. 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable completa de la cadena ligera (kappa) (SEQ ID NO: 10) del anticuerpo 28042. Las secuencias correspondientes a la CDR1 (SEQ ID NO: 7), la CDR2 (SEQ ID NO: 8), y la CDR3 (SEQ ID NO: 9) se identifican en recuadros. Las secuencias sin recuadro representan secuencias marco (FR).

La FIG. 6 muestra la unión del anticuerpo 28042 a las proteínas de fusión Fc de los dominios extracelulares de Notch1, Notch2 y Notch3, según se observa mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). La unión se midió en tres diluciones diferentes. Los resultados demuestran que la afinidad de unión del anticuerpo 28042 a Notch3 es alta, mientras que no hay una unión apreciable del anticuerpo 28042 con Notch1 o Notch2.

LaFIG. 7 muestra la unión del anticuerpo 28042 a Notch1 humano, Notch2 humano, Notch3 humano y Notch3 murino de la superficie celular, observada mediante FACS. Los resultados demuestran que el anticuerpo 28042 se une a Notch3 humano y murino, mientras que no hay una unión apreciable del anticuerpo 28042 a Notch1 o Notch2.

La FIG. 8 es una transferencia de Western que muestra el nivel de inhibición de la activación de Notch3 inducida por Jag1 por el anticuerpo 28042 en comparación con otros anticuerpos, según la evaluación del grado de escisión del dominio intracelular de mNotch3 expresado en células Flpln™.

La FIG. 9 es una transferencia de Western que muestra el nivel de inhibición de la activación del receptor Notch3 humano inducida por DLL4, según la evaluación de la escisión del dominio intracelular de Notch3 en células NCI-H838 emplacadas sobre el ligando en presencia del anticuerpo 28042 y otros anticuerpos.

Las FIG. 10A-B muestran la inhibición de la activación del receptor Notch3 inducida por el ligando, según la prueba de escisión del dominio intracelular de Notch3. La FIG. 10A es una transferencia de Western que muestra el nivel de inhibición de Jag1, Jag2, y DLL4 inducida por la activación de Notch3 mediante el anticuerpo 28042, tal como se evaluó por el grado de escisión del dominio intracelular de Notch3 murino expresado en células Flpln™. La FIG.

10B es una transferencia de Western que muestra el nivel de inhibición de Jag1, Jag2 y DLL4 inducida por la activación Notch3 mediante el anticuerpo 28042, tal como se evaluó por el grado de escisión del dominio intracelular de Notch3 humano expresado en células Flpln™.

La FIG. 11 es una curva de dosis-respuesta basada en un ensayo indicador de Notch3 humano que muestra que el anticuerpo 28042 inhibe la activación funcional de Notch3, medida por la expresión del gen indicador dependiente de Notch3 en presencia del ligando Jag2 unido a Fc (Jag2-Fc). La gráfica muestra la inhibición de la actividad indicadora estimulada por Jag2-Fc (% de inhibición) por el anticuerpo 28042 en células transducidas de forma estable en función de la cantidad del anticuerpo 28042.

Las FIGS. 12A-B muestran la inhibición del crecimiento tumoral por el anticuerpo 28042 en un modelo tumoral de ratón mediado por Notch3. La FIG. 12A muestra el volumen del tumor a lo largo del tiempo (en días) para los ratones tratados con hIgG o el anticuerpo 28042. El anticuerpo 28042 mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con la IgG de control. La FIG. 12B muestra los resultados de la transferencia de Western realizada en el lisado de los tumores cosechados utilizando un anticuerpo específico para el extremo C de Notch3 con el fin de detectar el grado de escisión del dominio intracelular de Notch. La p-tubulina se utilizó como control de carga.

La FIG. 13 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera para el anticuerpo 28042 y las variantes 28042.1-28042.10. Las CDR se identifican mediante letras en negrita y recuadros.

La FIG. 14 muestra las CDR de la cadena ligera para el anticuerpo 28042 y las variantes 28042.1-28042.10.

Descripción detallada

Los anticuerpos divulgados en el presente documento se basan en los sitios de unión a antígeno de ciertos anticuerpos monoclonales que se han seleccionado basándose en la unión y la neutralización de la actividad de Notch3 humano. Los anticuerpos de la invención contienen secuencias de CDR de región variable de inmunoglobulina que definen un sitio de unión para Notch3 humano, como se define en las reivindicaciones.

Debido a la actividad neutralizante de estos anticuerpos, pueden utilizarse para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de determinadas células cancerosas y tumores y para tratar la hipertensión arterial pulmonar (HAP) u otras afecciones en las que esté implicada la vía de Notch3. Cuando se utilizan como agentes terapéuticos, los anticuerpos pueden estar optimizados, por ejemplo, con la afinidad madurada, para mejorar las propiedades bioquímicas y/o biofísicas, y/o para reducir o eliminar la inmunogenia cuando se administra a un paciente humano. A continuación se comentan con más detalle diversas características y aspectos de la invención.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, el término "anticuerpo" significa un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal intacto) o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, lo que incluye un anticuerpo intacto o un fragmento de unión a antígeno que se ha modificado, diseñado o conjugado químicamente. Algunos ejemplos de anticuerpos modificados o diseñados son anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Algunos ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), minicuerpos y diacuerpos. Un anticuerpo conjugado a un resto de toxina es un ejemplo de un anticuerpo conjugado químicamente.

I. Anticuerpos que se unen a Notch3 humano

Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos comprenden: (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR^h1-CDR^h2-Cd R^h3 y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR^l1-CDR^l2-CDR^l3, en donde la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, juntas, definen un solo sitio de unión para la unión a Notch3 humano.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR^h1-CDR^h2-CDR^h3 y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR^l1-CDR^l2-CDR^l3, en donde la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, juntas, definen un solo sitio de unión para la unión a hNotch3. La CDR^h1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la CDR^h2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y la CDR^h3 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. La CDR^l1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; la CDR^l2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y la CDR^l3 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR^h1-CDR^h2-CDR^h3 y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR^l1-CDR^l2-CDR^l3, en donde la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, juntas, definen un solo sitio de unión para la unión a hNotch3. La CDR^h1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la CDR^h2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y la CDR^h3 es la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 5. La CDR^l1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 21; la CDR^l2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22; y la CDR^l3 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

El anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEq ID NO: 6, y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 38 y la SEQ ID NO: 39.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en donde la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 incluye una mutación en una o más de las posiciones 31,50, 62, 65, 106 y 107. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 incluye una o más mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en N31S, G50A, V62F, T65S, F106I y E107K.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 incluye una mutación en una o más de las posiciones 31,50, 62, 65, 106 y 107. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 incluye una o más mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en N31S, G50A, V62F, T65S, F106I y E107K.

Un anticuerpo aislado divulgado en el presente documento que se une a hNotch3 puede comprender una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a toda la región variable o a la secuencia de la región marco de SEQ ID NO: 6. Un anticuerpo aislado divulgado en el presente documento que se une a hNotch3 puede comprender una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a toda la región variable o a la secuencia de la región marco de SEQ ID NO: 10. Un anticuerpo aislado divulgado en el presente documento que se une a hNotch3 puede comprender una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la región variable completa o a la secuencia de la región marco de SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 37, 38 o 39.

La identidad de secuencia puede determinarse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles al público, tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) que emplea el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Karlin et al., (1990) PROC. N^a T^l . ACAD. SCI. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EvOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402, están diseñados para la búsqueda de similitudes de secuencia. Para un análisis de las cuestiones básicas al realizar búsquedas en bases de datos de secuencias, véase Altschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. Los parámetros de búsqueda para el histograma, las descripciones, los alineamientos, la expectativa (es decir, el umbral de significación estadística para notificar coincidencias frente a las secuencias de la base de datos), los valores de corte, la matriz y el filtro son los parámetros de ajuste por defecto. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., (1992) PROC. Na Tl . ACAD. SCI. USA 89:10915-10919, Pueden ajustarse cuatro parámetros de blastn como se indica a continuación: Q = 10 (penalización por creación de huecos); R = 10 (penalización por extensión de hueco); wink = 1 (genera aciertos de palabras en cada posición wink-ésima a lo largo de la consulta); y gapw = 16 (establece la amplitud de la ventana dentro de la que se generan alineamientos con huecos). La configuración equivalente de los parámetros de Blastp puede ser Q = 9; R = 2; wink = 1; y gapw = 32. Las búsquedas también pueden realizarse utilizando el parámetro de la opción avanzada de BLAST del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (por ejemplo: -G, Coste de abrir un hueco [Número entero]: por defecto = 5 para nucleótidos/11 para proteínas; -E, Coste de extender un hueco [Número entero]: por defecto = 2 para nucleótidos/1 para proteínas; -q, Penalización por desajuste de nucleótidos [Número entero]: por defecto = -3; -r, recompensa por coincidencia de nucleótidos [Número entero]: por defecto = 1; -e, valor de expectativa [Real]: por defecto = 10; -W, tamaño de palabra [Número entero]: por defecto = 11 para nucleótidos/ 28 para megablast/ 3 para proteínas; -y, Dropoff (X) para extensiones de blast en bits: por defecto = 20 para blastn/7 para otros; -X, valor de dropoff de X para alineamiento con huecos (en bits): por defecto = 15 para todos los programas, no procede para blastn; y -Z, valor de dropoff de X final para alineamiento con huecos (en bits): 50 para blastn, 25 para otros). También puede utilizarse ClustalW para alineamientos de proteínas por pares (los parámetros por defecto pueden incluir, por ejemplo, la matriz Blosum62, una penalización por apertura de hueco = 10 y una penalización por extensión de hueco = 0,1). Una comparación mediante Bestfit entre secuencias, disponible en la versión 10.0 del paquete GCG, utiliza los parámetros para ADN GAP = 50 (penalización por extensión de hueco) y LEN = 3 (penalización por extensión de hueco) y los parámetros equivalentes en las comparaciones de proteínas son GAP = 8 y LEN = 2.

En cada una de las realizaciones anteriores, se contempla en el presente documento que las secuencias de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y/o las secuencias de la región variable de la cadena ligera que juntas se unen a hNotch3 pueden contener alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 10 sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos) en las regiones marco de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a hNotch3 con una K^d de 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM o inferior. A menos que se especifique otra cosa, Los valores de K^d se determinan mediante métodos de resonancia de plasmón superficial o mediante interferometría de biocapas en las condiciones descritas en el ejemplo 2.

Los anticuerpos monoclonales pueden unirse al mismo epítopo de hNotch3 al que se une el anticuerpo 28042. Los anticuerpos monoclonales pueden competir por la unión a hNotch3 con el anticuerpo 28042. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden competir por la unión al dominio extracelular (ECD) de Notch3 con el anticuerpo 28042. En otro ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden competir por la unión a las repeticiones similares a ^eG^f 1-11 de Notch3 humano con el anticuerpo 28042 (la secuencia de aminoácidos correspondiente a las repeticiones similares a EGF 1-11 de Notch3 humano se muestra en la FIG. 3).

Los ensayos de competición para determinar si un anticuerpos e une al mismo epítopo que, o que compita por la unión con, el anticuerpo 28042 se conocen en la técnica. Algunos ensayos de competición ilustrativos incluyen inmunoensayos (por ejemplo, ensayos ELISA, ensayos RIA), análisis BIAcore, interferometría de biocapas y citometría de flujo.

Normalmente, un ensayo de competición implica usar un antígeno (por ejemplo, una proteína Notch3 humana o un fragmento de la misma) unido a una superficie sólida o expresado en una superficie celular, un anticuerpo de unión a Notch3 de ensayo y un anticuerpo de referencia (por ejemplo, el anticuerpo 28042). El anticuerpo de referencia está marcado y el anticuerpo de ensayo está sin marcar. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de anticuerpo de referencia marcado unido a la superficie sólida o a las células en presencia del anticuerpo de ensayo. Normalmente, el anticuerpo de ensayo está presente en exceso (por ejemplo, 1 x, 5x, 10x, 20x o 100x). Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competición (es decir, los anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo, o a epítopos similares (por ejemplo, solapantes), que el anticuerpo de referencia, y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficiente próximo al epítopo al que se une el anticuerpo de referencia como para que se produzca impedimento estérico.

En un ensayo de competición ilustrativo, un anticuerpo de unión a Notch3 de referencia (por ejemplo, el anticuerpo 28042) se biotinila utilizando reactivos disponibles comercialmente. El anticuerpo de referencia biotinilado se mezcla con diluciones seriadas del anticuerpo de ensayo o del anticuerpo de ensayo sin marcar (control de autocompetencia), lo que da resultado una mezcla de diversas relaciones molares (por ejemplo, 1x, 5x, 10x, 20x o 100x) del anticuerpo de ensayo (o el anticuerpo de referencia no marcado) al anticuerpo de referencia marcado. La mezcla de anticuerpos se añade a una placa de ELISA recubierta de polipéptido Notch3 humano (por ejemplo, dominio extracelular de Notch3 humano). A continuación, se lava la placa y se añade HRP (peroxidasa de rábano picante)-estreptavidina como reactivo de detección. La cantidad de anticuerpo de referencia marcado unida al antígeno diana se detecta después de la adición de un sustrato cromogénico (por ejemplo, TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) o ABTS (2,2"-azino-di-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato)), que se conocen bien en la técnica. Las lecturas de la densidad óptica (unidades de DO) se miden utilizando un espectrómetro SpectraMax M2 (Molecular Devices). Las unidades de D^o correspondientes a un cero por ciento de inhibición se determinan a partir de los pocillos sin ningún anticuerpo competidor. Las unidades de DO correspondientes a un 100 % de inhibición, es decir, el fondo del ensayo, se determinan a partir de los pocillos sin anticuerpo de referencia marcado o anticuerpo de ensayo. El porcentaje de inhibición del anticuerpo de referencia marcado dirigido contra Notch3 por el anticuerpo de ensayo (o el anticuerpo de referencia no marcado) a cada concentración se calcula del siguiente modo: % de inhibición = (1-(unidades de DO - 100 % de inhibición)/(0 % de inhibición - 100 % de inhibición))* 100. Los expertos en la materia apreciarán que el ensayo de competición puede realizarse utilizando diversos sistemas de detección bien conocidos en la técnica.

Puede realizarse un ensayo de competición en ambas direcciones a fin de garantizar que la presencia del marcador no interfiere o inhibe de otro modo la unión. Por ejemplo, en la primera dirección, el anticuerpo de referencia se marca y el anticuerpo de ensayo no está marcado y en la segunda dirección, el anticuerpo de ensayo está marcado y el anticuerpo de referencia está sin marcar.

Un anticuerpo de ensayo compite con el anticuerpo de referencia para la unión específica al antígeno si un exceso de un anticuerpo (por ejemplo, 1 x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe la unión del otro anticuerpo, por ejemplo, en al menos un 50 %, 75 %, 90 %, 95 % o 99 %, medida en un ensayo de unión competitivo.

Puede determinarse que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo, reducen o eliminan la unión del otro. Puede determinarse que dos anticuerpos se unen a epítopos solapados si solo un subconjunto de las mutaciones que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo, reducen o eliminan la unión del otro.

II. Producción de anticuerpos

Los métodos para producir anticuerpos de la invención son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican regiones variables de cadena ligera y/o regiones variables de cadena pesada pueden sintetizarse químicamente utilizando la información de secuencia proporcionada en el presente documento. Pueden ligarse moléculas de ADN sintéticas a otras secuencias de nucleótidos adecuadas, lo que incluye, por ejemplo, secuencias codificantes de la región constante y secuencias de control de la expresión, para producir construcciones de expresión génica convencionales que codifican el anticuerpo deseado. La producción de construcciones génicas definidas se encuentra dentro de las capacidades habituales de la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos deseados pueden incorporarse (ligarse) en vectores de expresión, que pueden introducirse en células hospedadoras mediante técnicas de transfección o transformación convencionales. Algunas células hospedadoras ilustrativas son células de E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y células de mieloma que no producen de otro modo proteína de IgG. Las células hospedadoras transformadas pueden cultivarse en condiciones que permiten que las células hospedadoras expresen los genes que codifican las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada de inmunoglobulina.

Las condiciones de expresión y purificación específicas variarán dependiendo del sistema de expresión empleado. Por ejemplo, si un gen se va a expresar en E. coli, se clona en primer lugar en un vector de expresión posicionando el gen modificado cadena abajo de un promotor bacteriano adecuado, por ejemplo, Trp o Tac y una secuencia de señal procariota. La proteína secretada expresada se acumula en cuerpos refractarios o de inclusión y pueden recolectarse tras la ruptura de las células mediante una prensa francesa o ultrasonidos. Los cuerpos refractarios se solubilizan a continuación y se vuelven a plegar las proteínas y se escinden mediante métodos conocidos en la técnica.

Si el gen modificado se va a expresar en células hospedadoras eucariotas, por ejemplo, células CHO, se inserta en primer lugar en un vector de expresión que contiene un promotor eucariota adecuado, una señal de secreción, una secuencia de poli A y un codón de parada, y, opcionalmente, puede contener potenciadoras y diversos intrones. Este vector de expresión contiene opcionalmente secuencias que codifican la totalidad o parte de una región constante, que permiten la expresión de la totalidad o parte de una cadena pesada o ligera. La construcción génica puede introducirse en células hospedadoras eucariotas utilizando técnicas convencionales. La célula hospedadora expresa fragmentos de V^l o V^h, heterodímeros de V^l-V^h, polipéptidos monocatenarios de V^h-V^l o V^l-V^h, cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas completas o porciones de las mismas, cada una de las cuales puede estar unidas a un resto que tiene otra función (por ejemplo, citotoxicidad). Puede transfectarse una célula hospedadora con un solo vector que expresa un polipéptido que expresa la totalidad o una parte de, una cadena pesada (por ejemplo, una región variable de cadena pesada) o una cadena ligera (por ejemplo, una región variable de cadena ligera). Como alternativa, puede transfectarse una célula hospedadora con un solo vector que codifica (a) un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada y un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera o (b) una cadena pesada de inmunoglobulina completa y una cadena ligera de inmunoglobulina completa. Puede cotransfectarse una célula hospedadora con más de un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión que codifica un polipéptido que comprende la totalidad o parte de, una cadena pesada o una región variable de cadena pesada y otro vector de expresión que codifica un polipéptido que comprende la totalidad o parte de, una cadena ligera o una región variable de cadena ligera).

Puede producirse un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina cultivando una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica dicha región variable, en condiciones que permiten la expresión del polipéptido. Después de la expresión, el polipéptido puede recolectarse y purificarse o aislarse utilizando técnicas conocidas en la especialidad, por ejemplo, marcadores de afinidad, tales como glutatión-S-transferasa (GST) y marcadores de histidina.

Puede producirse un anticuerpo monoclonal que se une a Notch3 humano, o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo, cultivando una célula hospedadora transfectada con: (a) un vector de expresión que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina completa o parcial, y un vector de expresión independiente que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina completa o parcial; o (b) un solo vector de expresión que codifica ambas cadenas (por ejemplo, las cadenas pesadas y ligeras completas o parciales), en condiciones que permiten la expresión de ambas cadenas. El anticuerpo intacto (o el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo) puede recolectarse y purificarse o aislarse utilizando técnicas conocidas en la especialidad, por ejemplo, Proteína A, Proteína G, marcadores de afinidad, tales como glutatión-S-transferasa (GST) y marcadores de histidina. Se encuentra dentro de las capacidades de la técnica expresar la cadena pesada y la cadena ligera a partir de un único vector de expresión o a partir de dos vectores de expresión independientes.

III. Modificaciones de anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales humanos pueden aislarse o seleccionarse a partir de fagotecas de presentación, incluidas bibliotecas inmunes, no inmunes y sintéticas. Las fagotecas de presentación se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, Hoet et al., NATURE BIOTECH. 23:344-348, 2005; Soderlind et al., NATURE BIOTECH. 18:852-856, 2000; Rothe et al., J. MOL. BIOL. 376:1182-1200, 2008; Knappik et al., J. MOL. BIOL. 296:57-86, 2000; y Krebs et al., J. IMMUNOL. METH. 254:67-84, 2001. Cuando se usan como agente terapéutico, los anticuerpos humanos aislados mediante presentación en fagos pueden optimizarse (por ejemplo, madurarse su afinidad) para mejorar las características bioquímicas, incluida la afinidad y/o la especificidad, mejorar las propiedades biofísicas, incluida la agregación, la estabilidad, la precipitación y/o las interacciones no específicas y/o para reducir la inmunogenia. Los procedimientos de maduración de la afinidad se encuentran dentro de las capacidades habituales de la técnica. Por ejemplo, puede introducirse diversidad en una cadena pesada de inmunoglobulina y/o una cadena ligera de inmunoglobulina mediante entremezclado de ADN, entremezclado de cadenas, entremezclado de CDR, mutagénesis aleatoria y/o mutagénesis de sitio específico.

En algunas realizaciones, los anticuerpos humanos aislados contienen una o más mutaciones somáticas. En estos casos, los anticuerpos pueden modificarse a una secuencia de línea germinal para optimizar el anticuerpo (es decir, un proceso denominado reversión a la línea germinal).

En general, un anticuerpo optimizado tiene al menos la misma o sustancialmente la misma afinidad por el antígeno que el anticuerpo no optimizado (o precursor) del que procedía. Preferentemente, un anticuerpo optimizado tiene mayor afinidad por el antígeno cuando se compara con el anticuerpo precursor.

Los fragmentos de anticuerpos humanos (por ejemplo, los precursores y las variantes optimizadas) pueden diseñarse para que contengan ciertas regiones constantes (es decir, Fc) con una función efectora específica (por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)). Se conocen en la técnica regiones constantes humanas.

Si el anticuerpo se va a utilizar como agente terapéutico, puede conjugarse con un agente efector, tal como una toxina de molécula pequeña o un radionúclido utilizando químicas de conjugación in vitro convencionales. En caso de que el agente efector sea un polipéptido, el anticuerpo puede conjugarse químicamente al efector o unirse al efector como una proteína de fusión. La construcción de proteínas de fusión se encuentra dentro de las capacidades habituales de la técnica.

El anticuerpo puede conjugarse a un resto efector, tal como una toxina de molécula pequeña o un radionúclido, utilizando químicas de conjugación in vitro convencionales. En caso de que el resto sea un polipéptido, el anticuerpo puede conjugarse químicamente al efector o unirse al efector como una proteína de fusión. La construcción de proteínas de fusión se encuentra dentro de las capacidades habituales de la técnica.

IV. Uso de los anticuerpos

Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden utilizarse para tratar diversas formas de cáncer, por ejemplo, leucemia, cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de endometrio y cáncer de ovario. Las células cancerosas se exponen a una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo a fin de inhibir o reducir la proliferación de las células cancerosas. En algunas realizaciones, los anticuerpos inhiben la proliferación de células cancerosas en al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % en relación con un anticuerpo de control que no se une a Notch3 humano con la misma avidez que el anticuerpo 28042. Cualquier referencia a un método de tratamiento realizado en el cuerpo humano o animal debe interpretarse como el anticuerpo de la invención y composiciones que comprenden el mismo para su uso en dichos tratamientos.

En algunas realizaciones, el anticuerpo 28042 o una variante del mismo es para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral en un mamífero (por ejemplo, un paciente humano). En algunas realizaciones, el uso en la inhibición del crecimiento tumoral en un mamífero comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo. El anticuerpo 28042 o una variante del mismo puede utilizarse para inhibir la proliferación de una célula tumoral. El anticuerpo 28042 o una variante del mismo puede utilizarse para tratar o prevenir la hipertensión arterial pulmonar (HAP).

Los anticuerpos divulgados pueden inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral mediante la inhibición de la unión de Notch3 humano a un ligando, por ejemplo, Jag1, Jag2, DLL1 y DLL4. Los anticuerpos divulgados pueden utilizarse en un método para inhibir el crecimiento tumoral en un paciente humano. El método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo.

Los cánceres asociados con la sobreexpresión y/o la activación de Notch3 incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello de útero, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro (por ejemplo, glioblastoma, astrocitoma, neuroblastoma), melanomas, cánceres gastrointestinales (por ejemplo, colorrectal, pancreático y gástrico), cáncer de cabeza y cuello, sarcomas (por ejemplo, rabdomiosarcoma, osteosarcoma) y cánceres de células hepáticas, (por ejemplo, mieloma múltiple, leucemia, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T precursores (T-ALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B precursores (B-ALL) y leucemia linfoblástica crónica de linfocitos B (B-CLL)).

Como se usa en el presente documento, "tratar", "tratando" y "tratamiento" significan el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano. Esto incluye: (a) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la patología.

En general, una cantidad terapéuticamente eficaz del componente activo se encuentra en el intervalo de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por ejemplo, de 1 mg/kg a 100 mg/kg, de 1 mg/kg a 10 mg/kg. La cantidad administrada puede depender de variables como el tipo y el alcance de la enfermedad o la indicación que se vaya a tratar, el estado de salud general del paciente, la potencia in vivo del anticuerpo, la formulación farmacéutica y la vía de administración. La dosis inicial puede aumentarse más allá del nivel superior a fin de lograr rápidamente el nivel sanguíneo o tisular deseado. Como alternativa, la dosis inicial puede ser menor que la óptima y la dosis diaria puede aumentarse progresivamente durante el transcurso del tratamiento. La dosis en humanos puede optimizarse, por ejemplo, en un estudio de fase I convencional de aumento gradual de la dosis diseñado para pasar de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. La frecuencia de la administración puede variar, dependiendo de factores como la vía de administración, la cantidad de dosis, la semivida en suero del anticuerpo y la enfermedad que se esté tratando. Las frecuencias de administración ilustrativas son una vez al día, una vez a la semana y una vez cada dos semanas. Una vía de administración preferida es la parenteral, por ejemplo, infusión intravenosa. La formulación de fármacos a base de anticuerpos monoclonales se encuentra dentro de las capacidades habituales de la técnica. En algunas realizaciones, se liofiliza un anticuerpo monoclonal y después se reconstituye en solución salina tamponada, en el momento de la administración.

Para uso terapéutico, se combina preferentemente un anticuerpo con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" significa tampones, portadores y excipientes adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin provocar excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, acorde con una relación beneficio-riesgo razonable. Los uno o más portadores deben ser "aceptables", en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de las formulaciones y no perjudiciales para el receptor. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen tampones, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para principios activos farmacéuticos es conocido en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos divulgados en el presente documento pueden presentarse en una forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método adecuado. Una composición farmacéutica debe formularse para que sea compatible con su vía de administración prevista. Algunos ejemplos de vías de administración son administración intravenosa (i.v.), intradérmica, por inhalación, transdérmica, tópica, transmucosa y rectal. Una vía de administración preferida para anticuerpos monoclonales es la infusión i.v. Las formulaciones útiles pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, véase Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. (Mack Publishing Company, 1990). Algunos componentes de formulación adecuados para administración parenteral incluyen un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes, tales como EDTA; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para ajustar la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa.

Para administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El portador debe ser estable en las condiciones de fabricación y conservación y debe preservarse contra los microorganismos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

Las formulaciones farmacéuticas son preferentemente estériles. La esterilización puede lograrse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración esterilizante. Cuando la composición está liofilizada, la filtración esterilizante puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance o el contenido de la invención de modo alguno.

Ejemplo 1: Anticuerpos anti-Notch3

Este ejemplo describe la producción de anticuerpos monoclonales anti-hNotch3.

A. Aislamiento de anticuerpos anti-Notch3 mediante presentación en fagos

Se aíslan anticuerpos anti-hNotch3 a partir de una fagoteca de presentación construida a partir de genes de región variable de cadena pesada y cadena ligera humana. Más específicamente, los anticuerpos anti-hNotch3 se aíslan utilizando una biblioteca de fagémidos de anticuerpos construida a partir de genes de región variable y constante de cadena ligera de donante de linfocitos B, emparejados con una única región marco de cadena pesada humana que consiste en los genes de la CDR3 de región variable de cadena pesada del donante humano de linfocitos B y diversas secuencias sintéticas de CDR1 y CDR2 de región variable de cadena pesada (Dyax Corporation, Burlington, MA).

Se aisló un anticuerpo anti-hNotch3 (el anticuerpo 28042) a partir de una fagoteca de presentación de anticuerpos humanos después de tres rondas de presentación en fagos utilizando cantidades decrecientes de un concatémero recombinante biotinilado de las repeticiones similares a EGF 1-11 de Notch 3 humano y murino alternas (FIG. 3) como antígeno. En la primera ronda se utilizaron 200 pmol del antígeno, seguido de 50 y 5 pmol en las rondas dos y tres, respectivamente. Al inicio de cada ronda de selección, la fagoteca se agotó con Fc de IgG1 humana biotinilada. Cada ronda de selección fue seguida de infección de E. coli TG1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), rescate con fago auxiliar M13K07 (Life Technologies, Grand Island, NY), y amplificación en fagos para enriquecer la entrada para cada ronda posterior. Las colonias resultantes de la tercera ronda de selección se seleccionaron mediante ELISA para comprobar la unión a Notch3 recombinante tanto humano como de ratón. Se secuenciaron todos los clones positivos. Los clones con secuencias únicas se expresaron como Fab, se purificaron con proteína A y se analizó su función. Los anticuerpos funcionales se convirtieron en anticuerpos IgG1 de longitud completa y se comprobó adicionalmente su función.

Además, se cambiaron individualmente los restos de cadena ligera no humana del anticuerpo 28042 a secuencias de la línea germinal humana para crear variantes de cadena ligera adicionales. Por ejemplo, el anticuerpo 28042.1 contiene la mutación N31S en la CDR de cadena ligera; el anticuerpo 28042.2 contiene la mutación G50A en la CDR de cadena ligera; el anticuerpo 28042.3 contiene la mutación F106I en la región marco de cadena ligera; el anticuerpo 28042.4 contiene la mutación E107K en la región marco de cadena ligera; el anticuerpo 28042.5 contiene las mutaciones N31S y G50A en la CDR y la región marco de cadena ligera; el anticuerpo 28042.6 contiene las mutaciones F106I y del E107K en la región marco de cadena ligera; el anticuerpo 28042.7 contiene las mutaciones N31S, G50A, F106I y E107K en la CDR y las regiones marco de cadena ligera; el anticuerpo 28042.8 contiene la mutación V62F en la región marco de cadena ligera; el anticuerpo 28042.9 contiene la mutación T65S en la región marco de cadena ligera; y el anticuerpo 28042.10 contiene las mutaciones N31S, G50A, V62F y T65S en la CDR y la región marco de cadena ligera. Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede contener 1 o más de las mutaciones de la región marco y/o CDR de cadena ligera anteriormente mencionadas.

B. Secuencias de anticuerpos anti-Notch3

Las cadenas pesadas humanas se subclonan en pEE6.4 (Lonza, Basilea, Suiza) mediante los sitios de HindIII y EcoRI usando clonación por PCR In-Fusion™ (Clontech, Mountain View, CA). Se subclonaron las cadenas ligera kappa humanas en pEE14.4 (Lonza) mediante los sitios de HindIII y EcoRI utilizando la clonación por PCR In-Fusion™.

El anticuerpo se expresa o bien mediante transfección transitoria de células 293T con vectores de expresión independientes para la cadena pesada y ligera o mediante transfección estable de células CHOK1SV (Lonza) con un solo vector que expresa las cadenas pesadas y ligeras. Los anticuerpos se purifican para su análisis posterior. Puede construirse un solo vector de expresión combinando vectores basados en pEE6.4 y pEE14.4. En primer lugar, pEE6.4, que contiene ADNc de cadena pesada humana de longitud completa, se digiere con NotI y SaII para crear un fragmento que contiene el promotor hCMV-MIE ADNc de cadena pesada humana de longitud completa poli A de SV40. Este fragmento se inserta en el vector pEE14.4 que ya contiene ADNc de cadena ligera humana de longitud completa mediante los sitios de NotI/SaII, creando de este modo un vector de expresión que expresa simultáneamente las cadenas pesadas y ligeras. El vector de cadena pesada y ligera combinado se linealiza y transfecta en células CHOK1SV. Los clones estables se seleccionan en presencia de metionina sulfoximina. La unión de los anticuerpos humanos a Notch3 humano puede medirse como se describe a continuación.

Las secuencias de ácido nucleico codificantes y las secuencias de proteína que definen las regiones variables de los anticuerpos 28042 humanos se resumen a continuación (las secuencias del péptido de señal aminoterminal no se muestran). En las secuencias de aminoácidos, las secuencias de las CDR (utilizando el sistema de Kabat) se muestran en negrita y subrayado.

Secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 11)

gaagttcaattgttagagtctggtggcggtcttgttcagcctggtggttctttacgtctttct tgcgctgcttccggattcaetttctctgattacatgatgtcttgggttcgccaagctcctggt aaaggtttggagtgggtttcttggatccgttcttctggtggcactactctttatgctgactcc gttaaaggtcgcttcactatctctagagacaactctaagaatactctctacttgcagatgaac agcttaagggctgaggacacagccacatattactgtgcgagagtcggtggtgggaccacgggt tatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcaagcgcctcaacaaaagga ccaagtgtgttcccactcgcccctagcagcaagagtacatccgggggcactgcagcactcggc tgcctcgtcaaggattattttccagagccagtaaccgtgagctggaacagtggagcactcact tctggtgtccatacttttcctgctgtcctgcaaagctctggcctgtactcactcagctccgtc gtgaccgtgccatcttcatctctgggcactcagacetacatctgtaatgtaaaccacaagcct agcaatactaaggtcgataagcgggtggaacccaagagctgcgacaagactcacacttgtccc ccatgccctgcccctgaacttctgggcggtcccagcgtctttttgttcccaccaaagcctaaa gatactctgatgataagtagaacacccgaggtgacatgtgttgttgtagacgtttcccacgag gacccagaggttaagttcaactggtacgttgatggagtcgaagtacataatgctaagaccaag cctagagaggagcagtataatagtacataccgtgtagtcagtgttctcacagtgctgcaccaa gactggctcaacggcaaagaatacaaatgcaaagtgtccaacaaagcactcccagcccctatc gagaagactattagtaaggcaaaggggcagcctcgtgaaccacaggtgtacactctgccaccc agtagagaggaaatgacaaagaaccaagtctcattgacctgcctggtgaaaggcttctacece agcgacatcgccgttgagtgggagagtaacggtcagcctgagaacaattacaagacaaccccc

ccagtgctggatagtgacgggtctttctttctgtacagtaagctgactgtggacaagtcccgc tggcagcagggtaacgtcttcagctgttccgtgatgcacgaggcattgcacaaccactacacc cagaagtcactgagcctgagcccagggaag ^ 353 nucleótidos)

Secuencia de proteína que define la cadena pesada del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 1)

Evqllesqqglvqpggslrlscaasgftfsdymmswvrqapgkglewvswirssggttlyads vkgrftisrdnskntlylqmnslraedtatyycarvgggttgyafdiwgqqtmvtvssastkq psvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssv vtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpk dtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhq dwlngkeykckvsnkalpapiektis kakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfyp sdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvf scsvmhealhnhyt ^qkslslspgk (451 aminoácidos)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 17)

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc 50 tttacgtctt tcttgcgctg cttccggatt cactttetet gattacatga 100 tgtcttgggt tcgccaagct cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg 150 atccgttctt ctggtggcac tactctttat gctgactccg ttaaaggtcg 200 cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac ttgcagatga 250 acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gagagtcggt 300 ggtgggacca cgggttatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt 350 caccgtctca age 363

Secuencia de proteína que define la región variable de cadena pesada del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 6)

evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs dymmswvrqa pgkglewvsw 50 irssggttly adsvkgrfti srdnskntly lqmnslraed tatyycarvc[ 100 ggttgyafdi wgqgtmvtvs s 121

Secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena kappa del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 12)

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga 50 cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa 100 attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt 150 gcatccagtc tgcaaagtgg ggtcccatca agggtcagtg gcactggatc 200 tgggacagat ttcactctta ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg 250

caacttacta ctgtcaacag agttacagtc cctcattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatttcga acgaactgtg gctgcaccat ctgtgttcat 350 ctttccacca agtgatgagc aactgaagtc tggtactgct tcagtcgtgt 400 gtctgctgaa caatttctac cctcgagaag ccaaagtcca atggaaggta 450 gacaacgcac tgcagtccgg caatagccaa gaatcagtta ccgaacagga 500 ttcaaaggac agtacatatt ccctgagcag cactctgacc ctgtcaaagg 550 ccgattacga gaaacacaag gtctatgctt gcgaagtgac acatcaggga 600 ctgtccagcc cagtgacaaa atcttttaac cgtggggagt gt 642

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 2)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsqvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfqp 100 gtkvdfertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 18)

gacatccaga tgacctagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga 50 cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa 100 attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt 150 gcatccagtc tgcaaagtgg ggtcccatca agggtcagtg gcactggatc 200 tgggacagat ttcactctta ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg 250 caacttacta ctgtcaacag agttacagtc cctcattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatttcga a 321

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 10)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsqvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfqp 100 gtkvdfe 107

La secuencia de aminoácidos que define la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de los anticuerpos producidos en el ejemplo 1 se muestra en la FIG. 4. Las secuencias del péptido de señal aminoterminal (para la expresión/secreción adecuada) no se muestran. La CDR1, la CDR2 y la CDR3 (usando el sistema de Kabat) se identifican mediante recuadros.

Las secuencias de aminoácidos que definen las regiones variables de cadena ligera para los anticuerpos en el ejemplo 1 se alinean en la FIG. 5. Las secuencias del péptido de señal aminoterminal (para la expresión/secreción adecuada) no se muestran. La CDR1, la CDR2 y la CDR3 se identifican mediante recuadros.

La tabla 1 es un diagrama de concordancia que muestra la SEQ ID NO de cada secuencia analizada en este ejemplo.

Tabla 1

continuación

Las secuencias de CDR (definición de Kabat) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 28042 se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

Las secuencias de CDR (definición de Kabat) de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 28042 se muestran en la tabla 3.

Tabla 3

Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 16)

gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag 50 tacatccggg ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc 100 cagagccagt aaccgtgagc tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc 150 catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct ggcctgtact cactcagctc 200 cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc tacatctgta 250 atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 300 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact 350 tctgggcggt cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc 400 tgatgataag tagaacaccc gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc 450 cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg tacgttgatg gagtcgaagt 500 acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat agtacatacc 550 gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 600 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa 650 gactattagt aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc 700 tgccacccag tagagaggaa atgacaaaga accaagtctc attgacctgc 750 ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgttgagt gggagagtaa 800 cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg ctggatagtg 850 acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 900 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa 950 ccactacacc cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag 990

Secuencia de proteína que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 13) astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 50 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep 100 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs 150 hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk 200 eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree mtknqvsltc 250 lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 300 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk 330

Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena ligera kappa humana del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 15)

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtgttcatc tttccaccaa gtgatgagca 50 actgaagtct ggtactgctt cagtcgtgtg tctgctgaac aatttctacc 100 ctcgagaagc caaagtccaa tggaaggtag acaacgcact gcagtccggc 150 aatagccaag aatcagttac cgaacaggat tcaaaggaca gtacatattc 200 cctgagcagc actctgaccc tgtcaaaggc cgattacgag aaacacaagg 250

tctatgcttg cgaagtgaca catcagggac tgtccagccc agtgacaaaa 300 tcttttaacc gtggggagtg t 321

Secuencia de proteína que define la región constante de cadena ligera kappa humana del anticuerpo 28042 (SEQ ID NO: 14)

rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg 50 nsqesvteqd skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk 100 sfnrgec 107

La tabla 4 es un diagrama de concordancia que muestra la SEQ ID NO de cada secuencia analizada en este ejemplo.

Tabla 4

Las siguientes secuencias se refieren a variantes del anticuerpo 28042, donde se han modificado determinados restos de la región marco mediante reversión a la línea germinal. Las secuencias de las CDR están subrayadas.

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,1 (SEQ ID NO: 23)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyg 50 asslqsqvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfqp 100 gtkvdfe 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,2 (SEQ ID NO: 24) diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfe 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,3 (SEQ ID NO: 25)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyg 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdle 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,4 (SEQ ID NO: 26)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyg 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfK 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,5 (SEQ ID NO: 27)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfe 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,6 (SEQ ID NO: 28)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdlK 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,7 (SEQ ID NO: 29)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdlK 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,8 (SEQ ID NO: 37)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsgvps rFsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfe 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,9 (SEQ ID NO: 38)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsgvps rvsgSgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfe 107

Secuencia de proteína que define la región variable de la cadena kappa del anticuerpo 28042,10 (SEQ ID NO: 39)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsgvps rFsgSgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfe 107 Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,1 (SEQ ID NO: 30)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,2 (SEQ ID NO: 31)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,3 (SEQ ID NO: 32)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdlertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

10

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,4 (SEQ ID NO: 33)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyg 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfKrtv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,5 (SEQ ID NO: 34)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdfertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,6 (SEQ ID NO: 35)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsgvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfgp 100 gtkvdlKrtv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,7 (SEQ ID NO: 36)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsqvps rvsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfqp 100 gtkvdlKrtv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 ls spvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,8 (SEQ ID NO: 40)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyg 50 asslqsqvps rFsgtgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfqp 100 gtkvdfertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 ls spvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,9 (SEQ ID NO: 41)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis nylnwyqqkp gkapklliyc[ 50 asslqsqvps rvsgSgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfqp 100 gtkvdfertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

Secuencia de proteína que define la cadena kappa del anticuerpo 28042,10 (SEQ ID NO: 42)

diqmtqspss lsasvgdrvt itcrasqsis Sylnwyqqkp gkapklliyA 50 asslqsqvps rFsgSgsgtd ftltisslqp edfatyycqq syspsftfqp 100 gtkvdfertv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv 150 dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg 200 lsspvtksfn rgec 214

La tabla 5 proporciona las secuencias de longitud completa de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo 28042 y de las variantes de anticuerpo 28042.1-28042.10.

Tabla 5

La tabla 6 proporciona combinaciones de secuencias de proteína de región variable de cadena pesada, secuencias de región constante de cadena pesada, secuencias de región variable de cadena ligera y secuencias de región constante de cadena ligera del anticuerpo 28042 y de las variantes de anticuerpo 28042.1-28042.10.

Tabla 6

La tabla 7 divulga las secuencias de CDR del anticuerpo 28042 y las variantes 28042.1-28042.10.

Tabla 7

Ejemplo 2: Afinidades de unión

La afinidad de unión y la cinética de unión del anticuerpo 28042 a la proteína de fusión de Fc del dominio extracelular de Notch3 humano recombinante (que contiene los dominios similares a EGF 1-11) (rhNotch3-Fc (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)) puede medirse mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento Biacore® T100 (Ge Healthcare, Piscataway, NJ).

La IgG de cabra anti-humano se inmoviliza sobre chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina, según un protocolo estándar. Los análisis se realizan a 25 0C y 37 0C usando PBS que contiene tensioactivo P20 al 0,05 % como tampón de ejecución. El anticuerpo se captura en celdas de flujo individuales a un caudal de 10 pl/minuto. El tiempo de inyección se varía para cada anticuerpo, obteniéndose una Rmáx entre 30 y 60 unidades de resonancia (UR). Se inyectan 250 pg/ml de Fc de IgG humana para bloquear la unión no específica de Fc (de la proteína de fusión de Notch3) al anticuerpo de captura. Se inyecta secuencialmente tampón o rhNotch3-Fc diluido en tampón de ejecución sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (el anticuerpo a ensayar) durante 240 segundos a 60 pl/minutos. La fase de disociación se controla hasta 1500 segundos. A continuación, se regenera la superficie con dos inyecciones de 60 segundos de glicina-HCl 10 mM, pH 2,25, a un caudal de 30 pl/minuto. El intervalo de concentración de rhNotch3-Fc analizado es de 100 nM a 3,125 nM (dilución de factor 2).

Los parámetros cinéticos pueden determinarse utilizando la función de cinética del software BIAevaluation (GE Healthcare) con resta de doble referencia. Se determinan los parámetros cinéticos del anticuerpo, ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y K^d (constante de equilibrio de disociación).

Los valores cinéticos del anticuerpo monoclonal 28042 en rhNotch3-Fc a 25 0C y 37 0C se resumen en la tabla 8.

Tabla 8

Los datos en la tabla 8 demuestran que el anticuerpo 28042 se une a rhNotch3-Fc con una K^d de aproximadamente 1-10 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM o 200 pM o menos.

La unión a Notch3 humano en la superficie celular por el anticuerpo 28042 puede medirse a 4 0C, usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células CHO N3 (células Flp-In-CHO (Invitrogen) transfectadas de forma estable con Notch3 humano), las células HCC2429 y las células RL-952 que expresan Notch3 humano se lavan una vez con PBS que contiene cloruro de calcio y cloruro de magnesio (Invitrogen) y se recolectan utilizando tampón de disociación celular (Invitrogen). Las células se lavan una segunda vez con PBS y se resuspenden en tampón de FACS (PBS con BSA al 0,5 % (Sigma-Aldrich)) para una concentración celular final de 250.000 células por pocillo en una placa de fondo en v de 96 pocillos. Los anticuerpos purificados se diluyen en tampón de FACS en un rango de concentración de 100 nM a 0 nM. A continuación se incuban las células a 4 0C con 100 pl de anticuerpo durante una hora, se lavan con tampón de FACS dos veces y se resuspenden en 100 pl de anticuerpo conjugado con PE de cabra anti-ratón (Jackson Immuno Research). Las células se incuban a 4 0C durante 30 minutos en la oscuridad, se lavan una vez con tampón de FACS y posteriormente se analizan utilizando un instrumento Cytomics FC 500 de Beckman Coulter. La media geométrica de la intensidad fluorescente se calcula a continuación para cada concentración de anticuerpo. A continuación se introducen estos valores en el software Prism (GraphPad, La Jolla, CA) y se utilizan para generar una curva de unión representando la media geométrica frente a la concentración del anticuerpo. A partir de la curva de unión, se utiliza la siguiente ecuación para calcular la K^d y el intervalo de la K^d de la unión del anticuerpo 28042 a Notch3 humano en la superficie celular de las tres líneas celulares.

Ecuación: Unión de un sitio (hipérbola)

Y=Bmáx*X/(KD X)

* describe la unión de un ligando a un receptor que sigue la ley de acción de masas. La Bmáx es la unión máxima y la K^d es la concentración necesaria de ligando para alcanzar la unión semimáxima.

Los resultados del anticuerpo 28042 se resumen en la tabla 9.

Tabla 9

Los datos en la tabla 9 demuestran que el anticuerpo 28042 se une a rhNotch3-Fc con una K^d de aproximadamente 1-10 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM o 200 pM o menos.

Los valores de K^d para la unión de los anticuerpos 28042, 28042.1-28042.7 a cynoNotch3 se analizó siguiendo un protocolo similar como al descrito anteriormente para la unión del anticuerpo 28042 a hNotch3 y los resultados se muestran en la tabla 10.

Tabla 10

Ejemplo 3: Especificidad de unión

En este ejemplo, se describe la especificidad de unión del anticuerpo 28042 a las proteínas Notchl humana, Notch2 humana, Notch3 humana o Notch3 murina.

La especificidad de la unión del anticuerpo 28042 a las proteínas de fusión de Notch-Fc puede determinarse utilizando resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento Biacore® T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se inmovilizan IgG de conejo anti-ratón (GE Healthcare) sobre chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina, según un protocolo estándar. Los análisis se realizan a 25 °C y 37 °C usando PBS que contiene tensioactivo P20 al 0,05 % como tampón de ejecución. El anticuerpo se captura en celdas de flujo individuales a un caudal de 10 pl/minuto. El tiempo de inyección se varía para cada anticuerpo, obteniéndose una Rmáx entre 30 y 60 UR. Se inyectan 250 pg/ml de Fc de IgG humana para bloquear la unión no específica de Fc (de la proteína de fusión de Notch3) al anticuerpo de captura. El tampón o rhNotch1-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN; N.2 de cat. 3647-TK-050), rhNotch2-Fc (R&D N.2 de cat. 3735-NT-050), y rhNotch3-Fc (R&D N.2 de cat. 1559-NT-050), diluidos en el tampón de funcionamiento se inyectan secuencialmente sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a probar) durante 240 segundos a 60 pl/minuto. La fase de disociación se controla hasta 1500 segundos. A continuación, se regenera la superficie con dos inyecciones de 60 segundos de glicina-HCl 10 mM, pH 2,25, a un caudal de 30 pl/minuto. El rango de concentración de rhNotch3-Fc, rhNotch2-Fc y rhNotch1-Fc probado es de 100 nM a 3,125 nM (dilución de factor 2).

Como se muestra en la FIG. 6, la especificidad de la unión del anticuerpo 28042 a los dominios extracelulares de las proteínas de fusión Notch1-Fc, Notch2-Fc y Notch3-Fc se midió en tres diluciones diferentes mediante resonancia de plasmón superficial. Como se muestra en la FIG. 6, la afinidad de unión del anticuerpo 28042 a Notch3 es alta, mientras que no hay una unión apreciable del anticuerpo 28042 con Notch1 o Notch2.

Para determinar la especificidad de la unión a las proteínas Notch de la superficie celular, las líneas celulares estables que expresan receptores Notch se producen mediante la transfección de células Flpln™ CHO o Flpln™ 293 (Life Technologies, Grand Island, NY) con ADNc de Notch1, Notch2 o Notch3 humano de longitud completa o Notch3 murino de longitud completa clonados en el vector pcDNA5FRT utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según el protocolo del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células CHO se dividen en un medio F12 que contiene FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y 600-700 pg/ml de higromicina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para seleccionar las células transfectadas. Las células 293 se dividen en medio DMEM que contiene FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y 200 pg/ml de higromicina B. La expresión de receptores Notch puede confirmarse mediante análisis FACS utilizando anticuerpo conjugado a PE anti-Notch1 humano (BioLegend, San Diego, CA), anticuerpo conjugado a anti-Notch2 (eBioscience, San Diego, CA) o anticuerpo conjugado a PE anti-Notch3 humano (BioLegend, San Diego, CA).

Para determinar la especificidad de la unión a las proteínas Notch de la superficie celular, el anticuerpo 28042 se prueba para la unión a Notch1 humano, Notch2 humano, Notch3 humano y Notch3 murino expresado en la superficie de células CHO por análisis FACS. Los ADNc del receptor Notch de longitud completa clonados en pcDNA5FRT se transfectaron en células CHO Flpln™ y se seleccionaron con 600 pg/ml de higromicina (Sigma), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La expresión en la superficie celular de receptores Notch se confirma mediante análisis FACS usando anticuerpo conjugado a PE anti-Notch1, anticuerpo conjugado a PE anti-Notch2 PE o anticuerpo de control conjugado a PE anti-Notch3 (Biolegend). Las células FlpIn™ CHO que expresan receptores Notch se incuban con 5 pg/ml de anticuerpo 28042 o anticuerpo de control de IgG humana (Jackson ImmunoResearch) durante 1 hora sobre hielo, seguido de lavado con PBS/BSA al 0,5 % e incubación con anticuerpo secundario conjugado con PE anti­ humano (Biolegend) durante 30 minutos sobre hielo. El FACS se realiza en un analizador celular BD FACSCanto II (BD Biosciences) y se analiza con el software FlowJo.

Como se muestra en la FIG. 7, los datos de unión de FACS demuestran que el anticuerpo 28042 se une específicamente a Notch3 humano y Notch3 murino, sin reactividad cruzada con Notch1 humano o Notch2 humano.

Para determinar la especificidad de la unión a las proteínas Notch de la superficie celular, se evalúa la unión del anticuerpo 28042 a Notch1 humano, Notch2 humano, Notch3 humano y Notch3 murino expresados en la superficie de células CHO utilizando electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery). Como control negativo, se utiliza una línea CH2 que carece de proteína Notch humana. Las células se cultivan en condiciones estándar (37 °C, F12 FBS al 10 %). Para los estudios de unión, las células se lavan en PBS que contiene calcio y magnesio, y se retiran de la placa mediante un tratamiento con tampón de disociación celular (Life Technologies) durante diez minutos a 37 °C.

Las células se siembran a una densidad de 30.000 células por pocillo, en medio de hibridoma, en placas de unión de 96 pocillos estándar (Meso Scale Discovery, N.° de Cat. L15XA-6). Las células se incuban durante una hora a 37 °C. Se añaden anticuerpos o IgG de control a 5 pg/ml, en 50 pl de medio de hibridoma, y se incuba durante una hora a 37 °C. Las placas se lavan dos veces con PBS que contiene BSA al 3 %. La unión de los anticuerpos a la superficie celular se detecta utilizando 2 pg/ml de anticuerpo secundario MSD anti-IgG de ratón (Meso Scale Discovery, N.° de cat. R32AC-1) durante una hora a 4 °C. Las placas se lavan dos veces con PBS que contiene BSA al 3 % y se añaden 150 pl de tampón de lectura (Meso Scale Discovery N.° de cat. R92TC-1). Las placas se analizan en un instrumento Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery).

Ejemplo 4: Inhibición de la unión de ligando de Notch3

Se puede evaluar la capacidad del anticuerpo 28042 para inhibir la unión de la unión de rhNotch3 a Jag1, Jag2, DLL1 y DLL4 humanas. Las mediciones de unión se realizan mediante interferometría de biocapas (BLI), utilizando un instrumento ForteBio Octet® QK (ForteBio, Menlo Park, CA). Los ligandos analizados son rhJag1-Fc (R&D N.° de cat.

1277-JG-050), rhJag2-Fc (R&D N.2 de cat. 1726-JG-050), rhDLL1-Fc (R&D N.2 de cat. 5026-DL-050), y rhDLL4 marcado con His (R&D N.° de cat. 1506-D4-050).

Para determinar el grado de inhibición de la unión del ligando de Notch3 por el anticuerpo 28042, los sensores de Octet se cargan con Notch3 humano recombinante y se deja que se una el anticuerpo. Los sensores se sumergen en 500 pg/ml de IgG humana para bloquear la unión no específica. Los ligandos se preparan a una concentración de 400 nM en PBS que contiene BSA al 3 % y se deja que se unan. La velocidad de asociación y disociación para la unión del ligando se detecta utilizando el instrumento y el software de Octet QK.

Ejemplo 5: Inhibición de la escisión del ICD de Notch3 inducida por ligando

La activación de receptores de Notch por ligandos da como resultado una escisión del dominio intracelular de Notch (NICD), que puede detectarse mediante transferencia de Western. En este ejemplo, se analiza la capacidad del anticuerpo 28042 para inhibir la escisión inducida por ligando del ICD de Notch3.

Para crear ligandos de Notch solubles, se utiliza la PCR para amplificar las secuencias correspondientes al ADNc de los dominios extracelulares de Jag1 humana o Jag2 humana y fusionarlas en fase a la secuencia codificante de Fc de IgG murina. Posteriormente, se subclonó esta construcción en el vector de expresión pEE14.4 (Lonza), se transfecta en células CHOK1SV y se seleccionan para producir líneas celulares estables que secretan proteínas de fusión hJag1-hFc, hJag1-mFc, hJag2-hFc o hJag2-mFc. Las proteínas de fusión se purifican de los sobrenadantes celulares.

En un experimento, las células que expresan mNotch3 se incuban con el ligando de Notch3 Jag1 y se mide la escisión inducida por el ligando del ICD de mNotch3 mediante transferencia de Western. Se añade además el anticuerpo 28042 para evaluar su capacidad para inhibir la escisión inducida por el ligando del ICD de mNotch3. Las placas ELISA Immunosorp de 96 pocillos (Nalgene Nunc, Rochester, NY) se recubren con 5 pg/ml de anti-fc de ratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) durante la noche a 4 °C. Después de lavar los pocillos con PBS/BSA al 0,5 %, se añaden 5 pg/ml de proteína de fusión hJag1-mFc soluble y se dejan ligar a temperatura ambiente durante dos horas. La proteína no unida se elimina mediante lavado con PBS/BSA al 0,5 %. Las células FlpIn™ 293 modificadas para expresar mNotch3 (producidas como se ha descrito en el ejemplo 3) se siembran sobre ligando capturado o mFc en presencia de 10 pg/ml de IgG humana de control, el anticuerpo 28042, el anticuerpo dirigido contra Notch3 ABX o un anticuerpo específico para Notch3 humano (04F11). Las células se lisan 24 horas después en tampón RIPSA (Boston BioProducts, Ashland, MA) que contiene inhibidores de proteasas. Los lisados se analizaron mediante SDS PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La inducción de la escisión de NICD puede detectarse sondando con un anticuerpo dirigido contra el extremo C de Notch3 (Cell Signaling, Danvers, MA) que detecta tanto la proteína de longitud completa como el ICD escindido.

Como se muestra en la FIG. 8, la siembra de células FlpIn™ 293 productoras de mNotch3 sobre ligando Jag1-mFc induce la escisión del ICD y la activación del receptor. La adición del anticuerpo 28042 reduce la escisión inducida por ligando y la activación de mNotch3, mientras que la adición de una IgG de control humana o un anticuerpo de control dirigido contra Notch3 humano no tiene efecto en la escisión del ICD de mNotch3.

En otro experimento, las células que expresan Notch3 se incuban con el ligando de Notch3 DLL4 y se mide la escisión inducida por el ligando del ICD de Notch3 mediante transferencia de Western. Se añade además el anticuerpo 28042 para evaluar su capacidad para inhibir la escisión inducida por el ligando del ICD de Notch3. se recubrieron placas de ELISA Immunosorp de 96 pocillos con 5 pg/ml de anticuerpo marcado con His (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante una noche a 4 °C, tras lo cual se añadieron 5 pg/ml de fusión de DLL4-His (R&D Systems, Minneapolis, MN), y se deja que se una durante dos horas a temperatura ambiente. La proteína no unida se elimina mediante lavado con PBS/BSA al 0,5 %. Las células NCI-H838 se siembran sobre ligando capturado en presencia de 10 pg/ml de IgG de control humana, el anticuerpo 28042, el anticuerpo dirigido contra Notch3 ABX o un anticuerpo específico para Notch3 humano (04F11). Las células se lisan 24 horas después en tampón RIPA (Boston BioProducts, Ashland, MA) que contiene inhibidores de proteasas. Los lisados se analizaron mediante SDS PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La inducción de la escisión de NICD puede detectarse sondando con un anticuerpo dirigido contra el extremo C de Notch3 (Cell Signaling, Danvers, MA) que detecta tanto la proteína de longitud completa como el ICD escindido.

Las células NCI-H838 muestran bajos niveles de activación constitutiva de Notch3 humano, según se evidencia por la presencia de ICD de N3 escindido, incluso en ausencia de ligando exógeno, como se muestra en la transferencia de Western en la FIG. 9. Como se muestra en la FIG. 9, el anticuerpo 28042 bloquea la escisión y activación adicional del receptor Notch3 en respuesta a la estimulación con DLL4 y reduce la concentración de ICD de Notch3 escindido a concentraciones por debajo de la de referencia, mientras que un anticuerpo de control de IgG no tuvo efecto en la escisión y la activación de Notch3.

En otro experimento, las células que expresan Notch3 murino o humano se incuban con los ligandos de Notch3 Jag1, Jag2 y DLL4 y la escisión inducida por ligando del ICD de Notch3 se mide mediante transferencia de Western. Se añade además el anticuerpo 28042 para evaluar su capacidad para inhibir la escisión inducida por el ligando del ICD de Notch3. Se recubren placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) durante una noche con 5 pg/ml de anticuerpo anti­ marcador de His (R&D Systems) o anticuerpo anti-mFc (Jackson ImmunoResearch). Después del lavado, se añaden 5 pg/ml de DLL4 recombinante (^r &D Systems, Minneapolis, MN), hJag1-mFc, o hJag2-mFc en PBS/BSA al 0,5 % y se dejan ligar durante dos horas a temperatura ambiente. Los pocillos de control sin ligando se recubren con anticuerpo anti-mFc durante una noche y se incuban con 5 pg/ml de mFc (Jackson ImmunoResearch). Las células CHO FlpIn™ que expresan de forma estable Notch3 humano o Notch3 murino se preincuban con 10 pg/ml del anticuerpo 28042 o del anticuerpo de control hIgG durante 30 minutos antes de colocar 30.000 células por pocillo en placas recubiertas de ligando y de incubar a 37 °C durante una noche. Las células se lisan 24 horas después en tampón RIPA (Boston BioProducts, Ashland, MA) que contiene inhibidores de proteasas. Los lisados se analizaron mediante SDS PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La inducción de la escisión de NICD puede detectarse sondando con un anticuerpo dirigido contra el extremo C de Notch3 (Cell Signaling, Danvers, MA) que detecta tanto la proteína de longitud completa como el ICD escindido. Como control de carga, se utiliza un anticuerpo dirigido contra GAPDH (Cell Signaling). Las bandas se detectan utilizando un sistema de formación de imágenes Odyssey CLx y el software Image Studio (LI­ COR).

Como se muestra en la FIG. 10, en células de ratón (FIG. 10A) y humanas (FIG. 10B) que expresan Notch3, el anticuerpo 28042 bloquea la escisión y activación de Notch3 inducida por los ligandos Jag1, Jag2 o DLL4.

Colectivamente, estos resultados demuestran la capacidad del anticuerpo 28042 para inhibir la activación inducida por ligando de Notch3.

Ejemplo 6: Inhibición de la transcripción dependiente de Notch3

En este ejemplo, se evalúa la capacidad del anticuerpo 28042 para inhibir la transcripción de genes diana de Notch3. Se generan células indicadoras que expresan luciferasa en respuesta a la activación de Notch3 y la luminiscencia resultante se mide en presencia o ausencia del anticuerpo 28042.

Las líneas celulares indicadoras dependientes de Notch3 se producen mediante la introducción lentivírica de un gen indicador de luciferasa dependiente de RBP-J ^k (SABiosciences, Frederick, MD) en células 293-FlpIn que expresan Notch3, células de cáncer de endometrio RL95-2, células de cáncer de mama HCC1143 y células de cáncer de mama MDA-MB-468. Para activar la señalización y la transcripción dependiente de Notch3, las células se siembran sobre pocillos recubiertos con ligando preparados como se describe en el ejemplo 5. Las células se preincuban con una serie de diluciones de factor 3 de anticuerpos dirigidos contra Notch3 a concentraciones en el intervalo de 0-300 pg/ml, durante una hora a 37 0C, antes de sembrar 100 pl de la suspensión en placas de 96 pocillos recubiertas con ligando o hFc. Las células se incuban en pocillos recubiertos con ligando o recubiertos con Fc murino durante cuatro o veinticuatro horas a 37 0C, en CO2 al 5 %. A continuación, se añaden 100 pl de Bright Glo™ de Promega (Promega, Madison, WI) a cada pocillo. Se deja que se desarrolle la reacción durante cinco minutos en la oscuridad y después, se transfiere el volumen de 200 pl íntegros a placas para su análisis en un luminómetro. Los anticuerpos policlonales dirigidos contra Notch1 (AF1057, R&D Systems), Notch2 (AF1190, R&D Systems) o Notch3 (AF1559, R&D Systems) se utilizan como controles para confirmar que la actividad indicadora estimulada por el ligando en cada línea celular depende específicamente del receptor Notch introducido.

Los datos de un ensayo indicador de luciferasa de Notch3 para el anticuerpo 28042 se muestra en la FIG. 11. En este ensayo, las células de una línea celular indicadora de MDA-MB-468 que expresa Notch3 humano endógeno y una construcción indicadora de luciferasa RBP-J ^k se siembran sobre hJag2-mFc en presencia de anticuerpos inhibidores de Notch3. Como se muestra en el presente documento, el anticuerpo 28042 inhibe con fuerza la señal luminiscente que resulta de la transcripción dependiente de Notch3. Los resultados demuestran que el anticuerpo 28042 inhibe la transcripción dependiente de Notch3 estimulada por el ligando Jag2.

Ejemplo 7: Inhibición del crecimiento tumoral

En este ejemplo, se evalúa la capacidad del anticuerpo 28042 para inhibir el crecimiento tumoral in vivo en un modelo de tumor impulsado por Notch3 modificado por ingeniería genética que sobreexpresa y depende de mNotch3 para el mantenimiento tumoral. Se inoculan ratones NCR de aproximadamente once semanas de edad (Taconic, Germantown, NY) por vía subcutánea en el costado derecho con 2 x 105 células en HBSS Matrigel 1:1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)/Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Las mediciones tumorales se realizaron dos veces a la semana, utilizando calibres vernier. El volumen tumoral se calcula utilizando la fórmula: V=0,5 x ancho x ancho x largo. Cuando los tumores se aproximan a un volumen de 150-200 mm3, los ratones se asignan aleatoriamente a tres grupos de diez animales cada uno. Al día siguiente, se trata a los ratones con 20 mg/kg de hIgG (control) o 20 mg/kg del anticuerpo 28042 o el anticuerpo ABX mediante inyección intraperitoneal. Los ratones reciben dosis dos veces a la semana durante todo el estudio. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se miden los volúmenes tumorales nuevamente para evaluar la inhibición del crecimiento tumoral. Todos los análisis estadísticos se realizan utilizando GrapHPad PRISM® versión 4.00. Los volúmenes tumorales finales se analizan utilizando un análisis unifactorial de la varianza y una prueba de comparación múltiple de Tukey.

Como se muestra en la FIG. 12A, el grupo de tratamiento (es decir, animales que reciben el anticuerpo 28042) muestra una inhibición significativa del crecimiento tumoral, en comparación con los controles tratados con hIgG. Todos los tratamientos se toleran bien, sin una pérdida significativa de peso corporal.

Como se muestra en la FIG. 12B, los lisados de células tumorales recolectadas tratadas con el anticuerpo 28042 mostró una reducción significativa en la escisión del ICD de Notch3 humano frente a los tratados con el anticuerpo de control, lo que demuestra que el anticuerpo 28042 reduce la activación de Notch3 en células tumorales.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humano que comprende

(i) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y

(ii) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 21, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde

(i) la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y una CDR^l3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9;

(ii) la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y una CDR^l3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9;

(iii) la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, y una CDR^l3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; o

(iv) la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina comprende una CDRl1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 o 2, que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende

(i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23;

(iii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;

(v) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;

(vi) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27;

(vii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;

(viii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29;

(ix) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37;

(x) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; o

(xi) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.

4. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende

(i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30;

(iii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31;

(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(v) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33;

(vi) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34;

(vii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35;

(viii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;

(ix) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;

(x) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; o

(xi) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

5. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica

(i) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de la reivindicación 1 o la reivindicación 3; o

(ii) una cadena pesada y una cadena ligera de inmunoglobulina de la reivindicación 4.

6. Un vector de expresión que comprende

(i) el ácido nucleico de la reivindicación 5(i); o

(ii) el ácido nucleico de la reivindicación 5(ii).

7. Una célula hospedadora que comprende

(i) el vector de expresión de la reivindicación 6(i); o

(ii) el vector de expresión de la reivindicación 6(ii).

8. Un método para producir un anticuerpo que se une a Notch3 humano o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo, comprendiendo el método:

(a) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7(i) o la reivindicación 7(ii) en condiciones en las que la célula hospedadora expresa un polipéptido que comprende la cadena pesada de inmunoglobulina y la cadena ligera de inmunoglobulina, produciendo de este modo el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo; y (b) purificar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo tiene una K^d de 15 nM o menor, medida mediante resonancia de plasmón superficial o interferometría de biocapas.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral en un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo al mamífero.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento del cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo al mamífero, opcionalmente en donde el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en leucemia, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello de útero, cáncer de cerebro, cáncer de piel, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello y leucemia.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde el mamífero es un ser humano.