ES2871598T3 - Anticuerpo novedoso contra EGFRvIII y composición que comprende el mismo - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFRvIII) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sin reacción cruzada con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), en donde el anticuerpo se une específicamente a las regiones del 1er al 13er aminoácido de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y comprende: una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 28 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 32 o 33.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo novedoso contra EGFRvIlI y composición que comprende el mismo

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a un anticuerpo que específicamente se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFRvIII), un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, un vector que incluye el ácido nucleico, una célula huésped que incluye el vector, un método de preparación del anticuerpo, y una composición farmacéutica para tratar cáncer o tumores que incluye el anticuerpo como principio activo.

Descripción de la técnica relacionada

El EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico; ErbB-1; HER1 en seres humanos) es un receptor tirosina quinasa (RTK) de la familia ErbB expresado en la superficie de células encontrado por Stanley Cohen de la Universidad Vanderbilt. La sobreexpresión o mutaciones de sobreactividad del receptor actúa como cancerización (Zhang H. et al, 2007). Los receptores de la familia del EGFR (EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) y Her 4 (ErbB-4)) se hacen reaccionar en un ligando tal como EGF, TGF-a y similares (en el caso de Her2, no hay ligando conocido) para formar un homo o heterodímero y transmitir una señal de activación a células.

En virtud de la formación de dímeros, la señal que va a través de MAPK, Akt o JNK mediante autofosforilación (Downward J. et al., 1984) como se ilustra en la imagen se transmite para activar el ciclo celular o la proliferación celular (Oda K. et al., 2005). Cada dominio y sitio de fosforilación del EGFR es el mismo que se ilustra en la figura 1.

Han surgido varias terapias para inhibir la activación del EGFR relacionado con tumores y muestran un fuerte efecto anticáncer. Se están desarrollando nuevos tipos de antagonistas de EGFR para compensar deficiencias tales como efectos secundarios, tolerancias y similares según las terapias. Los detalles del antagonista de EGFR actualmente en desarrollo son los mismos que se describen en la figura 2.

La sobreexpresión y mutaciones del EGFR vienen en muchas formas diferentes en cáncer de pulmón, cáncer anal, y glioblastoma multiforme (GBM). Las mutaciones de EGFRvIII con frecuencia se encuentran en un tumor cerebral, y reflejan un mal pronóstico después de un tratamiento mediante cirugía, terapia de radiación, y quimioterapia (Kuan CT et al., 2003). Los mutantes de EGFR en la forma de una recombinación tienen deleciones o duplicaciones de exones específicos. El EGFR y los mutantes de EGFR en la forma de una recombinación son los mismos que se ilustran en la figura 3.

El EGFRvIII es una variante del EGFR de SEQ ID NO: 1, que aparece lo más frecuentemente y carece de aminoácidos en los exones 2-7, y se expresa en el 50% o más de pacientes de tumor cerebral terminalmente enfermos. EGFRvIII carece de 267 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de EGFRwt, une los exones 1 y 8 y produce glicina, que es un nuevo aminoácido, e induce fosforilación del dominio intracelular y muestra actividad continua, contribuyendo de esta manera a la carcinogénesis (Downward J. et al., 1984). Por supuesto, otras formas de EGFR también pueden ser objetivo, pero en el momento presente, EGFRvIII se considera como la variante de EGFR más adecuada como una diana anticáncer, y muchas investigaciones y desarrollos están en marcha.

En particular, en tumores cerebrales, las señales celulares se transmiten por la ruta de señalización principal a través de PI3K y AKT de EGFRvIII. Mediante la activación de Stat-3, AP-1 o MAPK como una ruta secundaria, contribuye a la proliferación de células cancerosas, resistencia a apoptosis, angiogénesis, aumento de la penetración de células cancerosas, formación de células madre cancerosas, y similares (Gan HK, et al., 2013). Estudios recientes han descrito que EGFRvIII desempeña una función importante en carcinogénesis activando NF-kB a través de mTORC2 (Bonavia et a., 2012; Tanaka et al., 2011). La ruta de señalización según la activación de EGFRvIII es la misma que se ilustra en la figura 4.

Además, puesto de EGFRvIII induce activación después de fosforilación de c-Met (Huang PH. et al., 2007), cuando se aplica y administra a un paciente en combinación con un inhibidor de c-Met junto con un inhibidor de EGFR o EGFRvIII, puede mejorar la eficacia al tiempo que reduce la resistencia a quimioterapia de un paciente con altos niveles de EGFRvIII.

EGFRvIII habitualmente se expresa en tumores cerebrales simultáneamente con EGFR de tipo salvaje (WT) (Ekstrand et al., 1991), y puesto que EGFRvIII mismo se expresa en tumores con el gen de EGFR amplificado (Bienart et al., 2004, Frederick et al., 2000), se ha pensado que las células cancerosas individuales realizarían simultáneamente amplificación de EGFRwt y expresión de EGFRvIII para interacción.

EGFRvIII se expresa a frecuencia relativamente alta en tumores cerebrales, pero se necesitan estudios adicionales en otros carcinomas. Un estudio reciente usando líneas celulares de tumores cerebrales transformadas para expresar EGFRvIII reveló que redes que usan EGFRvIII y EGFRwt podrían seguramente tener la posibilidad de ser coactivadas (Shia Q. et al., PNAS, 2012). Tal interacción entre EGFRvIII y EGFRwt necesita confirmarse de nuevo usando EGFRvIlI que se exprese de forma natural mediante modelos de xenoinjertos, líneas esferoides de GBM u otras líneas celulares.

Se ha descrito que EGFR fosforila EGFRvIII y lleva a una ruta de activación de STAT3/5, y afecta mucho la evolución de tumores cerebrales (Fan EW et al., 2013). La formación de dímeros de EGFRvIII afecta mucho la activación de la transducción de señales. Según aumenta la expresión de EGFRwt, la fosforilación y activación de EGFRvIII aumentan. Por tanto, se cree que el brazo de dimerización y actividad quinasa, que forman la dimerización de EGFRwt, contribuyen a la activación de EGFRvIII. Del resultado de que la cancerización inducida por EGFRvIII se inhibe cuando la expresión de EGFRwt o HB-EGF se inhibe en un modelo de trasplante ortotópico (Li L. et al., 2014), se puede decir que la ruta de activación que rodea EGFRwt desempeña una función muy importante en tumorigénesis a través de la activación de EGFRvIII.

Actualmente, los agentes terapéuticos para tratar tumores (cerebrales) que se están desarrollando mientras se dirigen a EGFRvIII se pueden dividir en cinco categorías. La primera es un método de bloquear la transducción de señales interna de EGFRwt y EGFRvIII usando los agentes terapéuticos de EGFR convencionales. La segunda es un método de inhibir la interacción entre transducción de señales externa y receptores usando anticuerpos que simultáneamente se dirigen a EGFR y EGFRvIII, tal como ABT-806 (mAb806, Abbott). La tercera es el desarrollo de un anticuerpo anti-EGFRvIII en forma de un conjugado fármaco anticuerpo (ADC), como AMG-95 que está desarrollando ahora Amgen. La cuarta es que la forma de receptor de antígeno quimérico-célula T (CAR-T) se puede usar como un agente inmunoterapéutico celular. La quinta es un método de unir secuencias de 14 aminoácidos específicas de EGFRvIII a hemocianina de lapa californiana (KLH) y administrarlo como una vacuna anticáncer de EGFRvIII. Actualmente no hay un fármaco anticáncer dirigido solo a EGFRvIII, ni EGFR. Como se ilustra en la figura 6, hay una vacuna de EGFRvIII CDX-110 que está desarrollando ahora Celldex Therapeutics que lidera en desarrollo clínico.

Se describen anticuerpos dirigidos contra EGFRvIII que no dan reacción cruzada con EGFR de tipo salvaje en los documentos WO02092771, WO2005010151, WO2013075048.

Con estos antecedentes técnicos, los inventores de la presente divulgación prepararon un anticuerpo novedoso que se une específicamente a EGFRvIII. En particular, confirmaron que se puede preparar un anticuerpo novedoso que se une solo a EGFRvIII, pero no a EGFRwt, produciendo que se una específicamente a EGFRvIII sin dar reacción cruzada con EGFRwt, y completaron la presente divulgación.

Compendio

La invención se presenta en el conjunto adjunto de reivindicaciones.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar un anticuerpo novedoso que se une específicamente a EGFRvIII, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, un vector que incluye el ácido nucleico, una célula huésped que incluye el vector, un método de preparación del mismo, y una composición farmacéutica para tratar cáncer o tumores que incluye el anticuerpo como principio activo.

La presente divulgación se refiere a un anticuerpo que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFRvIII) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sin reacción cruzada con el receptor del factor de crecimiento epidérmico de tipo salvaje (EGFR), en donde el anticuerpo se une específicamente a las regiones del 1er al 13er aminoácido de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y comprende:

una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 28 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.

La presente divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica el anticuerpo.

La presente divulgación se refiere a un vector que incluye el ácido nucleico.

La presente divulgación se refiere a una célula huésped que incluye el vector.

La presente divulgación se refiere a un método de preparación del anticuerpo que incluye expresar el anticuerpo cultivando la célula huésped.

La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica para tratar cáncer o tumores que incluye el anticuerpo como principio activo.

La presente divulgación se refiere a un método para tratar cáncer o tumores administrando el anticuerpo a un individuo en necesidad de ello en una cantidad farmacológicamente eficaz.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra cada dominio y sitio de fosforilación del EGFR.

La figura 2 ilustra el progreso del desarrollo de los antagonistas conocidos dirigidos a receptores EGFR.

La figura 3 es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de mutantes de EGFR en una forma recombinante con EGFR.

La figura 4 es un diagrama esquemático que ilustra el flujo de transducción de señales según la activación de EGFRvIII. La figura 5 ilustra una lista de candidatos de agentes terapéuticos dirigidos a EGFRvIII en desarrollo clínico obtenida de www.clinicaltrials.gov.

La figura 6a ilustra los resultados de inmunotransferencia que ilustran la expresión del receptor de una línea celular única CHOK1-EGFRvIII.

La figura 6b ilustra resultados de inmunotransferencia que ilustran la expresión del receptor de una línea celular única U87MG-EGFRvIII.

La figura 7 ilustra los resultados de ELISA monofago de adsorción en bolas para péptidos que contienen la secuencia específica de EGFRvIII usada para seleccionar anticuerpos contra EGFRvIII.

La figura 8 ilustra resultados de inmunotransferencia que confirman la capacidad unión específica de antígeno de un anticuerpo de fago único seleccionado por adsorción a bolas.

La figura 9a ilustra el resultado de confirmar la IgG obtenida por tratamiento en un tampón no reductor a través de SDS-PAGE.

La figura 9b ilustra el resultado de confirmar la IgG obtenida por tratamiento en un tampón reductor a través de SDS-PAGE.

La figura 10 ilustra la unión de anti-péptido de EGFRvIII de clones de IgG humana usando ELISA.

La figura 11 ilustra la especificidad de unión a la línea celular de EGFRvIII de un clon de IgG humana usando citometría de flujo.

La figura 12 ilustra los resultados de confirmar la capacidad de unión afectada por la reducción en la concentración de IgG humana en la citometría de flujo anti-EGFRvIII.

La figura 13 ilustra los resultados de confirmar la capacidad de unión según el cambio en una cadena ligera de IgG humana por ELISA.

La figura 14 ilustra los resultados de confirmar la capacidad de unión según el cambio en una cadena ligera de IgG humana por citometría de flujo.

La figura 15a ilustra los resultados de confirmar la internalización de IgG humana anti-EGFRvIII por citometría de flujo usando U87 MG 13.

La figura 15b ilustra los resultados de confirmar la internalización de IgG humana anti-EGFRvIII por citometría de flujo usando CHOK1 22-2.

Descripción detallada de la forma de realización

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFRvIII) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sin reacción cruzada con el receptor del factor de crecimiento epidérmico de tipo salvaje (EGFR), en donde el anticuerpo se une específicamente a regiones del 1er al 13er aminoácido de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Las descripciones detalladas de cada constitución son como sigue.

Antígeno EGFRvIII

Como se ha discutido anteriormente, EGFRvIII es un mutante de deleción de EGFR en el que 267 aminoácidos están delecionados en el dominio extracelular de EGFR junto con una única sustitución de aminoácido de glicina en una unión, y tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1.

Los inventores de la presente divulgación produjeron un anticuerpo usando un péptido que incluye una secuencia 13mera específica de péptido de EGFRvIII como antígeno con el fin de producir un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvIlI sin reacción cruzada con el EGFR de tipo salvaje. Específicamente, el anticuerpo según la presente divulgación puede específicamente unirse a la secuencia de SEQ ID NO: 2 LEEKKGNYVVTDHCSGGKN (N es biotina) en la que se incluye enlazador y biotina de secuencias 13meras, 4meras específicas de péptido de EGFRvIII. Al mismo tiempo, un péptido que tiene la secuencia de TTACCDRII, por ejemplo, SEQ ID NO: 3 NEINPGNGHTNYNEKFKS (N es biotina) se usó como un antígeno negativo para bloquear la unión no específica. Mediante esto, se produjo un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvIII sin reacción cruzada con el EGFR de tipo salvaje.

Anticuerpo

El término “anticuerpo” usado en la presente especificación se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es inmunológicamente reactiva con un antígeno específico, significa una molécula de proteína que sirve como un receptor que reconoce específicamente un antígeno, y puede incluir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales y anticuerpos enteros y fragmentos de anticuerpo. Además, también puede incluir anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y moléculas bivalentes o biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos.

El anticuerpo entero es una estructura que tiene dos cadenas ligeras de longitud total y dos cadenas pesadas de longitud total, y cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro. El anticuerpo entero incluye IgA, IgD, IgE, IgM e IgG, e IgG es un subtipo e incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El fragmento de anticuerpo significa un fragmento que tiene una función de unión a antígeno, e incluye Fab, Fab', F(ab')2, Fv, y similares.

El Fab tiene un sitio de unión a antígeno en una estructura que tiene una región variable de una cadena ligera y una cadena pesada, una región constante de una cadena ligera, y una primera región constante (dominio CH1) de una cadena pesada. Fab' se diferencia de Fab en que tiene una región bisagra que contiene al menos un residuo de cisteína en el extremo C del dominio CH1 de la cadena pesada. El anticuerpo F(ab')2 se genera cuando el residuo de cisteína de la región bisagra de Fab' forma un enlace disulfuro.

El fragmento variable (Fv) significa el fragmento de anticuerpo mínimo que tiene solo una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. El Fv bicatenario (dsFv) está unido por un enlace disulfuro a una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. El Fv monocatenario (scFv) en general está unido a una región variable de una cadena pesada y una región variable de una cadena ligera a través de un enlazador peptídico por un enlace no covalente. Tales fragmentos de anticuerpos se pueden obtener usando enzimas hidrolíticas de proteínas (por ejemplo, Fab se puede obtener limitando y cortando el anticuerpo entero con papaína y los fragmentos F(ab')2 se pueden obtener cortando con pepsina), y se puede producir mediante tecnología recombinante de genes (por ejemplo, poniendo ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo o su región variable y ADN que codifica la cadena ligera o su región variable como molde, amplificándolas por PCR usando un par de cebadores, y combinando y amplificando el ADN que codifica un enlazador peptídico y un par de cebadores configurados para unir cada uno de ambos terminales a la cadena pesada y su región variable y la cadena ligera o su región variable).

Las inmunoglobulinas tienen una cadena pesada y una cadena ligera, y cada cadena pesada y ligera incluye una región constante y una región variable (el sitio también es conocido como un dominio). Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada incluyen tres regiones variables y cuatro regiones marco que se llaman regiones determinantes de complementariedad (de aquí en adelante, denominadas “CDR”). La CDR sirve como la unión principalmente al epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena típicamente se llaman secuencialmente como CDR1, CDR2, CDR3 empezando desde el extremo N, y se identifican por la cadena en que una CDR específica está localizada.

El término “anticuerpo monoclonal” usado en la presente especificación significa una molécula de anticuerpo de una única composición molecular obtenida de un grupo de anticuerpos sustancialmente idénticos, y puede mostrar una única especificidad y afinidad de unión para un epítopo específico.

El término “anticuerpo humano” usado en la presente especificación se refiere a una molécula derivada de inmunoglobulina humana, en donde todas las secuencias de aminoácidos que constituyen el anticuerpo incluyendo una región determinante de complementariedad y una región marco están compuestas de la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humano habitualmente se usa para tratar enfermedades humanas, y tiene ventajas en que i) las células diana se pueden destruir más eficazmente al interaccionar con el sistema inmunitario humano más establemente, por ejemplo, por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), o citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADDC), ii) el sistema inmunitario humano no reconoce el anticuerpo como uno exógeno, y iii) incluso si se administra una cantidad de fármaco menor con menos frecuencia, la semivida en el sistema circulatorio humano es similar a un anticuerpo natural.

Considerando lo anterior, el anticuerpo según la presente divulgación es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EGFRvIII, que no solo muestra excelente afinidad y especificidad por EGFRvIII, sino que también muestra baja inmunogenicidad porque deriva de humano, y por tanto es adecuado para el tratamiento de enfermedades tal como cáncer o tumores.

El término “anticuerpo que se une específicamente a EGFRvIII” usado en la presente especificación significa un anticuerpo que se une a EGFRvIII e inhibe la actividad biológica de EGFRvIII, y se puede usar de forma intercambiable con un anticuerpo anti-EGFRvIII. En este momento, la Kd para el EGFRvIII puede ser, por ejemplo, 10-8 o menos, preferiblemente 10-9 o menos, más preferiblemente 10-10 o menos.

El término “sin reacción cruzada con EGFR” usado en la presente especificación puede significar que un anticuerpo que se une al EGFR de tipo salvaje y un anticuerpo que se une a EGFRvIII no muestran reactividad cruzada para cada antígeno. En este momento, el anticuerpo que no da reacción cruzada con el EGFR puede tener, por ejemplo, 10-5 o más, preferiblemente 10-4 o más, más preferiblemente 10-3 o más de Kd del anticuerpo contra el EGFR de tipo salvaje. Sustancialmente, el anticuerpo que no da reacción cruzada con el EGFR puede significar un anticuerpo que no puede detectar un anticuerpo que se une al EGFR de tipo salvaje de una forma ilimitada de un ensayo de unión estándar.

En una forma de realización ejemplar, el anticuerpo según la presente divulgación puede ser, por ejemplo, como se describe específicamente en el ejemplo 1, los anticuerpos monoclonales humanos PA430, PD27, PD52 y PD10 sin reacción cruzada con EGFR, y están estructuralmente especificados y separados para unirse específicamente a la región de la 1a a la 13a regiones de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos de EGFRvIII de SEQ ID NO: 1. Las secuencias de aminoácidos para las CDR de la cadena pesada y las CDR de la cadena ligera de cada anticuerpo se enumeran en las siguientes tablas 1 y 2.

[Tabla 1]

[Tabla 2]

El anticuerpo según la presente divulgación se puede formar, por ejemplo, mezclando secuencias Vh y Vl, que son estructuralmente similares a las secuencias CDR1, 2 y 3 de Vh y las secuencias CDR1,2 y 3 de Vl descritas en las tablas 1 y 2, y al ser colocadas como CDR1, 2 y 3 de emparejamiento Vh/Vl, y puede incluir, por ejemplo, una región variable de la cadena pesada que comprende las siguientes CDR de la cadena pesada:

una CDR1 de la cadena pesada que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4-7;

una CDR2 de la cadena pesada que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8-11; y

una CDR3 de la cadena pesada que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15.

Además, el anticuerpo según la presente divulgación puede incluir una región variable de la cadena ligera que comprende las siguientes CDR de la cadena ligera:

una CDR1 de la cadena ligera que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-19;

una CDR2 de la cadena ligera que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20-23; y

una CDR2 de la cadena ligera que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 24-27.

En una forma de realización, el anticuerpo según la presente divulgación puede incluir específicamente una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera como se describe en la tabla 3 a continuación, o una secuencia que tiene homología a la misma:

[Tabla 3]

El anticuerpo según la presente divulgación puede incluir, por ejemplo, una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia que tiene al menos el 80% de homología con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28-31. El anticuerpo puede incluir, es decir, las secuencias de SEQ ID NO: 28-31, como regiones variables de la cadena pesada, que comprende una secuencia que tiene al menos el 80% de homología, preferiblemente al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, y al menos el 99% de homología, y más preferiblemente el 100% de homología con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28-31.

Además, el anticuerpo según la presente divulgación puede comprender una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia que tiene al menos el 80% de homología con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32-35. El anticuerpo puede incluir, es decir, las secuencias de SEQ ID NO: 32-35, como regiones variables de la cadena ligera, que comprende una secuencia que tiene al menos el 80% de homología, preferiblemente al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, y al menos el 99% de homología, y más preferiblemente el 100% de homología con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32-35.

Para ser específicos, el anticuerpo según la presente divulgación puede incluir la siguiente región variable de cadena pesada y región variable de la cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en las siguientes, y la secuencia de Vh y la secuencia de Vl descritas en la tabla 3 se pueden formar mezclando las secuencias de Vh y Vl, que son estructuralmente similares y al ser colocadas como emparejamiento Vh/Vl sin limitación:

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 28 y una región variable de la cadena ligera de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32-35;

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 29 y una región variable de la cadena ligera de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32-35;

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 30 y una región variable de la cadena ligera de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32-35;

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31 y una región variable de la cadena ligera de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32-35.

En particular, el anticuerpo según la presente divulgación puede incluir la siguiente región variable de la cadena pesada y región variable de la cadena ligera:

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 28 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 32;

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 29 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 33.

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 30 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 34; y

Una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 35.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. El término “ácido nucleico” usado en la presente especificación puede estar presente en una célula, un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o en una forma sustancialmente pura. El ácido nucleico se vuelve “aislado” o “sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, ácido nucleico o proteínas de las otras células por tecnología estándar incluyendo tratamiento alcalino/SDS, separación en bandas por CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y las otras que son bien conocidas en la técnica pertinente. El ácido nucleico de la presente divulgación puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, y puede o no incluir una secuencia intrónica.

En una forma de realización ejemplar, el ácido nucleico según la presente divulgación que codifica la secuencia de Vh y la secuencia de Vl se describe en la tabla 4, y puede incluir al menos una secuencia que codifica una región variable de la cadena pesada que tiene al menos el 95% de homología con una secuencia que codifica una región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36-39 y/o puede incluir al menos una secuencia que codifica una región variable de la cadena ligera que tiene al menos el 95% de homología con una secuencia que codifica una región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 40-43. El anticuerpo tiene al menos el 95% de homología, preferiblemente el menos el 98% de homología, más preferiblemente el 100% de homología con al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36-39 y/o SEQ ID NO: 40-43.

[Tabla 4]

La presente divulgación puede incluir un conjugado en el que una toxina, un fármaco, o similar, se une al anticuerpo. La toxina o fármaco puede incluir cualquier compuesto diana. Los ejemplos de tales toxinas pueden ser duocamicina, calicheamicina, mitansina o auristatina, y los compuestos pueden ser un compuesto anticáncer o antitumoral conocido tal como taxol, etopósido, tenofósido, vincristina, doxorrubicina, etc., agentes alquilantes (tal como cisplatino, antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina) etc.). Los conjugados se pueden preparar usando enlazador usando tecnología disponible en la técnica pertinente.

Además, además del anticuerpo, la presente divulgación puede incluir una molécula de unión biespecífica que incluye dos o más sitios de unión diferentes en los que un péptido, una proteína o un anticuerpo está unido a los otros sitios de unión a antígeno que son diferentes del anticuerpo. La molécula de unión biespecífica se puede preparar uniendo una parte específica de unión usando los métodos conocidos en la técnica pertinente. Además, cuando el anticuerpo se une, se puede unir a través de un enlace sulfhidrilo en la región C-terminal de la cadena pesada. Según las circunstancias, puede estar codificado en el mismo vector y expresarse en la misma célula huésped para ser combinado.

Método de preparación del anticuerpo

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico. Para la expresión de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de los mismos, el ADN que codifica la longitud parcial o total de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas se puede obtener por tecnología de biología molecular estándar (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc usando hibridomas que expresan el anticuerpo diana), y se puede insertar en un vector de expresión de tal manera que el ADN está operativamente unido a secuencias de control de transcripción y traducción.

El término “operativamente unido” usado en la presente especificación puede significar que el gen del anticuerpo está ligado en un vector de modo que las secuencias de control de transcripción y traducción en el vector sirven la función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan de modo que sean compatibles con la célula huésped usada para la expresión. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se insertan en vectores separados, o ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. El anticuerpo se inserta en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de enzimas de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos romos si no está presente sitio de enzima de restricción). Según las circunstancias, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de la célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en un vector de modo que el péptido señal esté unido al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo para ajustar al marco de lectura. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (por ejemplo, un péptido señal derivado de una proteína diferente de una inmunoglobulina). Además, el vector de expresión recombinante tiene una “secuencia reguladora” que controla la expresión del gen de la cadena del anticuerpo en la célula huésped. Las “secuencias reguladoras” pueden incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de un gen de la cadena del anticuerpo. Los expertos en la materia pueden reconocer que el diseño de un vector de expresión se puede variar seleccionando secuencias reguladoras diferentes dependiendo de factores tales como la selección de una célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína, y similares.

La presente divulgación también puede incluir una célula huésped que comprende el ácido nucleico o el vector. El ácido nucleico o el vector se transfecta. Se pueden usar varios tipos de tecnologías comúnmente usadas para introducir ADN exógeno en células huéspedes procariotas o eucariotas que se van a “transfectar”, por ejemplo, se pueden usar electroforesis, método de precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano o lipofección. El anticuerpo según la presente divulgación se puede expresar en una célula eucariota, preferiblemente una célula huésped de mamífero, en consideración de la posibilidad de ser aplicado a una célula de mamífero. Las células huéspedes de mamífero adecuadas para la expresión de los anticuerpos incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo, por ejemplo, células CHO dhfr- usadas junto con marcadores seleccionables DHFR), células de mieloma NSO, células COS o células SP2, y similares.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de preparación del anticuerpo que comprende cultivar una célula huésped para expresar el anticuerpo. Cuando el vector de expresión recombinante que codifica el gen del anticuerpo se introduce en una célula huésped de mamífero, el anticuerpo se puede preparar cultivando la célula huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo se exprese en la célula huésped, o más preferiblemente, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo se secrete al medio de cultivo en el que se cultiva la célula huésped. Además, el anticuerpo se puede preparar mediante que comprende la bioselección usando EGFRvIII que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Según las circunstancias, el anticuerpo expresado se puede separar de la célula huésped y purificar para que sea homogéneo. La separación o purificación del anticuerpo se puede llevar a cabo por métodos de separación y purificación usados en las proteínas convencionales, por ejemplo, cromatografía. La cromatografía puede incluir, por ejemplo, cromatografía de afinidad incluyendo una columna de proteína A, una columna de proteína G, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía hidrofóbica. Además de la cromatografía, el anticuerpo se puede separar y purificar adicionalmente combinando filtración, ultrafiltración, precipitación con sal, diálisis, y similares.

Composición farmacéutica

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica para tratar un cáncer o un tumor que comprende el anticuerpo como un principio activo.

El término “cáncer o tumores” usado en la presente especificación no está particularmente limitado siempre que sea el tipo de cáncer o tumores que se puede tratar por el anticuerpo de la presente divulgación. Por ejemplo, puede ser cáncer de mama, cáncer de pulmón o cáncer anal causado por la sobreexpresión de EGFRvIII, y un tumor cerebral, por ejemplo, un tumor cerebral primario (es decir, se produce en el cerebro) y un tumor cerebral secundario o metastásico.

Según las circunstancias, el anticuerpo según la presente divulgación se puede administrar en combinación con otros fármacos anticáncer (es decir, antes, durante, o después de recibir tratamientos para el cáncer). Se puede administrar en combinación con cualquiera o más fármacos quimioterapéuticos que conocen los expertos en la materia, tal como agentes alquilantes tal como carmustina, clorambucilo, cisplatino, carboplatino, oxiplatino, procarbacina, y ciclofosfamida; antimetabolitos tal como fluorouracilo, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexato e hidroxiurea; productos naturales tal como alcaloides vegetales o antibióticos tal como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, etopósido, mitomicina, mitoxantrona, vinblastina, vincristina, y taxol (paclitaxel) o compuestos relacionados tal como Taxotere®; agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores cerebrales tal como obleas de Gliadel® que contienen temozolomida o carmustina; y otros fármacos tal como irinotecano, gleevec, y similares. Además, se pueden incluir otros agentes biológicos tal como anticuerpos monoclonales tal como Herceptin™ para antígeno HER2, Avastin™ para VEGF, anticuerpos contra el receptor de EGF, tal como Erbitux®, y otros antagonistas del receptor de EGF.

La composición farmacéutica se puede formular para que incluya un soporte farmacéuticamente aceptable. El término “soporte farmacéuticamente aceptable” se refiere a un soporte o diluyente que no estimula organismos vivos y no inhibe la actividad biológica y características del compuesto administrado. El soporte farmacéutico que es aceptable para la composición que se va a formular en una solución líquida es adecuado para esterilización y cuerpos vivos, y se puede usar mezclando una solución salina, agua estéril, una solución de Ringer, una solución salina tamponada, una solución de inyección de albúmina, una solución de dextrosa, una solución de maltodextrina, glicerol, etanol, y uno o más componentes de estos componentes. Si es necesario, se pueden añadir los otros aditivos comunes tal como un antioxidante, un tampón, y un agente bacteriostático. Además, diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y lubricantes se pueden añadir adicionalmente para ser formulados en formulaciones para inyección, píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos tal como soluciones, suspensiones, emulsiones acuosas y similares.

La composición farmacéutica puede ser de varias formulaciones orales o parenterales. En el caso de formulación, se puede preparar usando diluyentes o excipientes tal como rellenos, extensores, aglutinantes, agentes humectantes, agentes disgregantes, tensioactivos y similares que se usan habitualmente. La preparación sólida para la administración oral incluye comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, cápsulas y similares, y se puede preparar mezclando uno o más excipientes tal como almidón, carbonato de calcio, sacarosa o lactosa, gelatina, y similares con uno o más compuestos. Además, además de los excipientes sencillos, también se pueden usar lubricantes tal como estearato de magnesio, talco y similares.

Los ejemplos de la preparación líquida para la administración oral incluyen suspensiones, soluciones, emulsiones y jarabes. Además de agua y parafina líquida, que se usan comúnmente y son diluyentes sencillos, se pueden incluir varios excipientes tal como agentes humectantes, edulcorantes, ambientador, conservantes y similares.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas esterilizadas, soluciones no acuosas, suspensiones, emulsiones, formulaciones liofilizadas, y supositorios. Los ejemplos del solvente no acuoso y solvente de suspensión incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, y éster inyectable tal como oleato de etilo. Como base de supositorio, se pueden usar witepsol, macrogol, Tween, manteca de cacao, laurinum, glicerogelatina y similares.

La composición farmacéutica puede tener cualquiera de las formulaciones seleccionadas del grupo consistente en comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, cápsulas, suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes, soluciones acuosas esterilizadas, solventes no acuosos, suspensiones, emulsiones, formulaciones liofilizadas y supositorios. Además, se pueden administrar una vez o muchas veces. En este momento, la composición se puede administrar en la forma de una preparación líquida, un polvo, un aerosol, una cápsula, un comprimido intravaginal, una cápsula, o un supositorio. Las rutas de administración pueden incluir, pero no están limitadas a, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, endotelial, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar, intrarrectal, y similares. Sin embargo, tras la administración oral, el péptido se debe formular de modo que se proteja contra la degradación en el estómago o recubrimiento del agente activo ya que se digiere. Además, la sustancia activa se puede administrar mediante cualquier dispositivo capaz de migrar a la célula diana.

La composición se puede administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz, y una “cantidad terapéuticamente eficaz” se puede referir a una cantidad suficiente para tratar una enfermedad a una proporción riesgo/beneficio razonable aplicable al tratamiento médico. Los niveles de dosis eficaces se determinan por los elementos incluyendo el tipo y gravedad del individuo, edad, sexo, tipo de cáncer, actividad de fármaco, sensibilidad al fármaco, tiempo de administración, vía de administración y velocidad de liberación, duración del tratamiento, fármacos usados simultáneamente, y los otros elementos bien conocidos en el campo de la medicina. Se puede administrar en altas dosis de habitualmente 0,1 a 5 mg/kg, por ejemplo, 1, 2, 3, o 4 mg/kg, 10 mg/kg o 15 o 20 mg/kg. Como una capacidad unidad fijada, por ejemplo, se puede proporcionar con 50, 100, 200, 500 o 1000 mg. Con el fin de producir regresión del cáncer o tumor, más preferiblemente eliminar el tumor, se puede administrar de una vez a ocho veces (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8), o 10, 20 o más veces. Basado en la semivida del anticuerpo, se puede administrar dos veces a la semana, cada semana, cada dos semanas, cada mes o a los otros intervalos de una semana, dos semanas, cuatro semanas, ocho semanas, de tres a seis meses, o más largo.

De aquí en adelante, la presente divulgación se describirá en más detalle mediante los ejemplos. Es aparente para un experto en la materia pertinente que estos ejemplos meramente ilustran la presente divulgación, y el ámbito de la presente divulgación no está limitada a estos ejemplos.

Ejemplo 1: Establecimiento de línea celular de EGFRvIII

El gen de EGFRvIII que contiene sitios de enzimas de restricción HindIII y XbaI se obtuvo usando síntesis de ADN (Invitrogen, SEQ ID NO: 1) y se cortó usando enzimas de restricción HindIII y XbaI. El ADN molde cortado se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1 cortado con las enzimas de restricción HindIII y XbaI para combinar pcDNA3.1-EGFRvIII. pcDNA3.1-EGFRvIII se transformó en E. coli DH5a para seleccionar cepas resistentes a ampicilina. Si el gen EGFRvIII está insertado se confirmó cortando con las enzimas de restricción HindIII y XbaI.

El vector pcDNA3.1-EGFRvIII preparado para producir la línea celular de EGFRvIII se transfectó usando Lipofectamine 2000 con respecto a CHOK1, U87MG y A431, y las células se cultivaron en DMEM, SFB al 10% durante 48 horas. Después de que las células cultivadas se cultivaran en DMEM o RPMI al que G418 de SBF al 10% 1000 jg/ml, 400 |jg/ml, 400 jg/m l en una dilución 1:10, las células que se van a colonizar se seleccionaron e hicieron proliferar en una placa de 6 pocillos. Cuando se realizó inmunotransferencia después de cada célula proliferara durante 12 días se disolvió y se sometió a electroforesis, se trató con anticuerpo anti-EGFR y anti-IgG humana HRP y se hizo reaccionar con sustrato ECL (Figuras 6a y 6b).

Ejemplo 2: Bioselección por afinidad

El péptido de EGFRvIII usado como un antígeno se sintetizó para contener una secuencia específica 13mera y una 4mera y una biotina, usado como un enlazador (SEQ ID NO. 2). El péptido biotina-TTACCDRII también se sintetizó (SEQ ID NO: 3) como un antígeno negativo para bloquear la unión no específica. Cada péptido se preparó usando una bola de estreptavidina M-280 (Invitrogen, EE UU) para unir 7,8 ng de péptido por 5 jl.

La genoteca en fago de anticuerpos humanos se hizo reaccionar con el péptido TTACCDRII unido a la bola de antemano a 25°C durante 30 minutos para inducir unión de un anticuerpo de fago no específico. Después de ello, el péptido TTACCDRII unido a la bola se recogió usando una barra magnética y después solo líquido sobrenadante se tomó por separado. El líquido sobrenadante se añadió al péptido de EGFRvIII unido a la bola de nuevo y se hizo reaccionar a 25°C durante 2 horas para producir unión de un fago con anticuerpo. El péptido de EGFRvIII unido a la bola se recogió usando una barra magnética y el líquido sobrenadante se eliminó. El péptido EGFRvIII en la bola atraído sobre la barra magnética se lavó repetidamente 5 veces con PBST (PBS que contenía Tween 20 al 0,1%), y, por último, se lavó una vez con PBS. Se hicieron reaccionar 100 j l de solución de trietilamina 100 mM durante 10 minutos para dejar que el fago unido al antígeno eluyera, y el fago eluido se neutralizó por 50 j l de Tris 1 M pH 7,5.

El eluato de fago neutralizado se añadió a 10 ml de línea celular de E. coli XL1-Blue en fase logarítmica media y se hizo reaccionar a 37°C durante 30 minutos para inducir infección. La línea celular de E. coli XL1-Blue infectada se extendió en una placa 2xYT/C que contenía glucosa al 1% y se cultivó a 30°C durante 16 horas. La primera selección y la segunda y tercera selección se realizaron de la misma manera.

Ejemplo 3: Selección de anticuerpo en fago que específicamente se une a EGFRvIlI

Se seleccionaron aleatoriamente clones de E. coli de la selección por afinidad completada, y se cultivaron en una placa de 96 pocillos a 37°C y 300 rpm en una fase logarítmica media añadiendo 500 pl de medio YT/C 2x, seguido por la adición de fago auxiliar M13, y después, la infección del fago se indujo a 37°C durante 30 minutos. Los clones de E. coli infectados se cultivaron durante 15 horas en la condición de 30°C y 30 rpm para preparar el anticuerpo de fago para eluir. Las células de los clones de E. coli cultivados se centrifugaron a 6000 rpm durante 10 minutos para eliminar las células y se obtuvo solo sobrenadante.

El péptido de EGFRvIlI, el péptido TTACCDRII y BSA se recubrieron sobre una placa de ELISA de 96 pocillos Maxisorb (Nunc, Dinamarca) a 1pg/ml, se bloqueó con leche desnatada al 3%/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, y después se inoculó con el líquido sobrenadante obtenido y se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa de ELISA se lavó tres veces con el 0,05% de p Bs T, y después un anticuerpo anti-M13-HRP (peroxidasa de rábano) (GE) se diluyó a 1:300 PBST al 0,05% durante 1 hora. Después de tratar durante 10 minutos y sustrato de desarrollo de color TMB (BD, EE UU), la reacción se paró tratando con H2SO42 N. El ELISA con el color desarrollado se midió para absorbancia a 450 nm-650 nm usando un lector de ELISA Sunrise (TECAN, Suiza) (Fig. 7).

Ejemplo 4: Inmunotransferencia

La capacidad de unión de EGFRvIII por anticuerpo de fago se observó por inmunotransferencia usando lisado celular de CHOK1-EGFRvIII.

CHOK1 22-2, que es una línea celular CHOK1-EGFRvIII preparada en el ejemplo 1, y A431 que expresa CHOK1 y EGFR de tipo salvaje como una célula parental para la misma se lavaron con PBS y se disolvió usando un tampón de elución de SDS al 1%, Na3VO3 1 mM, Tris 10 mM (pH 7,4), PMSF 1 mM, leupeptina 10 pM, pepstatina 1,5 pM y aprotinina 10 pg/ml.

Después de separar 15 pg de cada lisado celular por SDS-PAGE al 6%, la proteína se transfirió a una membrana de PVDF. Después de 1 hora de bloqueo con leche desnatada al 3% TBST, 5 x 1010 ufp de fago PA430 y fago PD54 se trataron durante 1 hora, seguido por dilución de anticuerpo anti-M13-HRP (peroxidasa de rábano) (GE) a 1:24000 TBST durante 1 hora, y después desarrollo de color usando sustrato ECL (GE Healthcare, EE UU), y la membrana se confirmó con un sistema de imágenes Odysset Fc (Licor, EE UU).

Los resultados se ilustran en la figura 8, y con referencia a la figura 8, se puede entender que el fago PA430 y el fago PD54 se unen solo a la línea celular que expresa EGFRvIII.

Ejemplo 5: Expresión y purificación de IgG

La conversión a la forma IgG se logró por corte doble con una enzima de restricción sfiI que contiene una cadena pesada variable del anticuerpo del fago para obtener un fragmento, y por doble corte con una enzima de restricción sfiI en pIgGHD-6A6Hvy, que es un vector que comprende una región de la cadena pesada para obtener una ligación con un fragmento.

El fragmento se obtuvo por doble corte con una enzima de restricción BstX I que incluye una cadena ligera variable de un anticuerpo de fago. El fragmento se ligó con el fragmento de la misma manera que el vector PigGLD-6A6Lgt que incluye una región de la cadena ligera (respecto al método anterior, por favor, se hace referencia a la publicación de la patente coreana accesible al público No. 2008-0109417).

La expresión de IgG se determinó inoculando células HEK293T con 8 x 106 células por placa de cultivo de 100 mm y cultivando las células en un medio de cultivo a 37°C CO2 al 5% durante 24 horas de modo que la adherencia y densidad de las células se vuelve el 80~90% respecto a células de cultivo. Las células se cultivaron con del 80% al 90%.

10 pg del vector de expresión de la cadena pesada y 10 pg del vector de expresión de la cadena ligera de la IgG preparada, es decir, un total de 20 pg del vector se mezclaron con PEI a una proporción de 1:3 (ADN:PEI) pg y se hicieron reaccionar durante 15 minutos para formar un complejo. El complejo ADN PEI se añadió a las células cultivadas, y después de reacción durante 10 horas, se lavó con DMEM una vez. Después, añadiendo 10 ml de un medio de cultivo al que se añade penicilina estreptomicina (GIBCO, EE UU) al 10% a Freestyle 293 (GIBCO, EE UU), se dejó solo durante 48 horas para tomar el sobrenadante en el que se expresó IgG.

El sobrenadante obtenido se inyectó en una columna de proteína A (GE Healthcare, EE UU) equilibrada con Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM y EDTA 5 mM pH 7,0, y se lavó con Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), EDTA 5 mM, NaCl 500 mM, polisorbato 20 al 0,2% y después se eluyó con solución NaCl 50 mM, glicina-HCl 0,1 M (pH 3,5). A continuación, se realizó la cromatografía de afinidad neutralizada con Tris 1 M. Las proteínas eluídas se empaquetaron en una membrana de diálisis con MWCO 10.000 espectros/por (espectrum, EE UU), y las soluciones se intercambiaron por diálisis en PBS.

Los resultados se ilustran en las figuras 9a y 9b. Con referencia a las figuras 9a y 9b, cada anticuerpo se trató con un tampón de muestra LDS no reductor o reductor (Invitrogen, EE UU) a través de SDS-PAGE, y cuando se carga en un gel de Bis-Tris del 4-12% Nupage (Invitrogen, EE UU), se obtuvo IgG que incluía una cadena pesada de 50 kDa y una cadena ligera de 25 kDa y correspondiente a 150 kDa.

Ejemplo 6: Selección de IgG que se une específicamente a EGFR vIII

Se realizaron ELISA para identificar la capacidad de unión específica de antígeno de los clones convertidos a IgG. El péptido de EGFRvIII, el péptido TTACCDRII y BSA se recubrieron a 1|jg/ml sobre placas de 96 pocillos a 37°C durante 2 horas. Después de ello, después de bloquear la porción no recubierta con leche desnatada al 3%/PBST al 0,05%, se añadió IgG 1 jg/m l a la placa y se hizo reaccionar a 37°C durante 1 hora. Se diluyó anti-IgG humana HRP (pierce, EE UU) en 1:3000 y se hizo reaccionar durante 1 hora. A continuación, el sustrato TMB (BD, EE UU) se trató durante 10 minutos para desarrollo de color, y la reacción se paró tratando con H2SO42 N. Respecto al ELISA con el color desarrollado, la absorbancia se midió a 450 nm-650 nm usando un lector de ELISA Sunrise (TECAN, Suiza).

Los resultados se ilustran en la figura 10, y respecto a la figura 10, PA430, PD27, PD52 y PD10 mostraron capacidad de unión específica solo en péptido de EGFRvIII sin unión no específica.

Basado en estos resultados, se realizó citometría de flujo con colorante fluorescente para confirmar si la capacidad de unión de la línea celular con expresión de EGFRvIII se mantenía con respecto a los cuatro tipos de anticuerpos anteriormente mencionados. La línea celular de expresión de EGFRvIII, CHOK1 22-2 y su célula madre, CHOK1, y A431, que expresa EGFR de tipo salvaje eran los objetos. Cada célula se obtuvo a número de células de 1 x 106, se diluyó con 1 jg/m l de cada anticuerpo en PBS añadido con SBF al 2% y se añadió a las células, y se hizo reaccionar a 4°C durante 1 hora. El anti-IgG humana PE (Bethyl, EE UU) se diluyó 1:200 y se hizo reaccionar a 4°C durante 45 minutos para tinción de fluorescencia. Cada muestra se midió para 1 x 104 células por muestra usando un instrumento FACS Caliber (BD, EE UU).

Los resultados se ilustran en la figura 11. Con respecto a la figura 1, PA430, PD27 y PD10 fueron capaces de unirse a la línea celular de expresión de EGFRvIII CHOK1 22-2, pero no la las líneas celulares sin expresión de EGFRvIII CHOK1 y A431. Además, se mostró que la unión no se observaba en A431, una célula que expresa REGFR de tipo salvaje.

Con el fin de confirmar las características de unión de tres anticuerpos que muestran capacidad de unión a la línea celular de expresión de EGFRvIII según la disminución de la concentración del anticuerpo, se realizó el siguiente experimento. La concentración de anticuerpo se diluyó el doble la cantidad en un orden secuencial empezando de 1000 ng/ml, y se preparó hasta 31 ng/ml. Se realizó citometría de flujo de tinción de fluorescencia en el mismo orden que se ha descrito anteriormente.

Los resultados se ilustran en la figura 12. Con respecto a la figura 12, se ha observado que PA430 mostró alta capacidad de unión incluso en el tiempo de tratar IgG a la misma concentración en comparación con PD27 y PD10.

Ejemplo 7: Cambio en la cadena ligera para aumento de la afinidad

La cadena ligera se cambió para aumentar la afinidad específica de antígeno de PA430. Tras revisar las CDR de las cadenas ligeras variables de PA430, PD52 y PD27, se ha confirmado que son similares en secuencia de la cadena ligera variable de PA430, que tiene alta afinidad específica de antígeno (véase la tabla 1-3). Usando este hecho, además de la cadena ligera original de PA430, el vector de la cadena ligera de PD52, PD27 y PD10 se mezcló con el vector de la cadena pesada de PA430 y se transfectó para producir IgG, que la misma que en el ejemplo 5.

Cuando las 430H10L, 430H52L y 430H27L producidas e identificadas se ejecutaron de la misma manera que en el ELISA del ejemplo 6, se confirmó que la capacidad de unión específica de antígeno se mantenía (Fig. 13).

La citometría de flujo de tinción fluorescente del ejemplo 6 se realizó para las IgG PA430, 430H52L, 430H27L y PD10 de la misma manera. Cuando líneas celulares U87 m G 13 producidas como líneas celulares de expresión de EGFRvIII basadas en células U87MG y líneas A431 16-3 producidas como líneas celulares de expresión de EGFRvIII basadas en células A431 se ejecutaron adicionalmente, se ha confirmado que 430H52L y 430H27L mantienen la capacidad de unión incluso en la línea celular específica de EGFRvIII. Además, se ha observado que 430H52L es excelente en señal de unión incluso en el momento de tratar la misma concentración en comparación con PA430 con una cadena ligera circular (Fig. 14).

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFRvIlI) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sin reacción cruzada con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), en donde el anticuerpo se une específicamente a las regiones del 1er al 13er aminoácido de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y comprende: una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 28 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 32 o 33.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un tipo de anticuerpo humano.

3. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo según la reivindicación 1 o 2.

4. El ácido nucleico según la reivindicación 3, que comprende una secuencia que codifica una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 36.

5. El ácido nucleico según la reivindicación 3, que comprende una secuencia que codifica una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 40 o 41.

6. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3.

7. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3 o el vector según la reivindicación 6.

8. Un método de producir el anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 7 para expresar el anticuerpo.

9. Una composición farmacéutica para tratar un cáncer o un tumor que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1 o 2 como un principio activo.