KR101761341B1

KR101761341B1 - 신규 EGFRvlll 항체 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101761341B1
Application number: KR1020140165417A
Authority: KR
Inventors: 윤재봉; 유진상; 유진산; 이원섭; 김성우; 심상렬; 변상순; 이영애; 이혁준; 김도윤; 최진희
Original assignee: 주식회사 파멥신
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2017-07-26
Also published as: KR20160062535A

Abstract

본 발명은 EGFRvIII (epidermal growth factor receptor variant III)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 숙주세포, 상기 항체의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 EGFRvlll 항체 및 이를 포함하는 조성물 {Novel Antibody Binding to EGFRvlll and Composition Comprising the Same}

EGFR (Epidermal growth factor receptor; ErbB-1; HER1 in humans)은 Vanderbilt 대학의 Stanley Cohen에 의해 발견된 세포표면에 발현하는 ErbB계열의 타이로신 카이네이즈 수용체(RTK)로써 이 수용체의 과 발현 또는 활성화 변이는 암화작용을 한다(Zhang H. et al, 2007). EGFR 계열의 수용체들(EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) and Her 4 (ErbB-4))은 EGF, TGF-a등의 리간드에 반응하여(Her2의 경우는 알려진 리간드가 없음) 동형(homo) 또는 이형(hetero)의 이합체를 만들어 활성화 신호를 세포 내로 전달한다.

이합체 형성으로 인해 그림과 같은 자가인산화(Downward J. et al., 1984)를 통해 MAPK, Akt 또는 JNK를 경유하는 신호를 전달하여, 세포주기나, 세포증식을 활성화한다(Oda K. et al., 2005). EGFR의 각 도메인과 인산화 부위는 도 1에 도시된 바와 같다.

이러한, 종양 관련 EGFR의 활성화를 억제하기 위한 다양한 치료요법들이 등장하여 현재 강력한 항암효과를 보이고 있으며, 치료요법에 따른 부작용, 내성 등 단점을 보완하기 위해 새로운 형태의 EGFR 길항제들이 개발되고 있다. 현재 개발 진행 중인 EGFR 길항제에 대한 구체적 내용은 도 2에 기재된 바와 같다.

EGFR 의 과량발현 및 돌연변이는 폐암, 항문암, 뇌종양(GBM, glioblastoma multiforme)등에서 다양한 형태로 나타나는데, EGFRvIII 돌연변이의 경우 뇌종양에서 종종 발견되어, 수술, 방사능요법, 화합요법을 통한 치료 후 좋지 않은 예후를 반영한다(Kuan CT et al., 2003). 재조합 형태의 EGFR 돌연변이체들은 특정 엑손(exon)의 삭제(deletion)나 중복(duplication)을 가지고 있다. EGFR과 재조합 형태의 EGFR 돌연변이체들은 도 3에 나타낸 바와 같다.

EGFRvIII는 2번부터 7번까지의 엑손 내의 아미노산이 결핍되어있는 가장 자주 나타나는 서열번호 1의 EGFR 변이체이며, 말기 뇌종양 환자로부터 50% 이상이 발현된다. EGFRvIII는 EGFRwt의 아미노산 서열 중 267 아미노산을 결핍하고 있으며, 1번과 8번 엑손이 결합되며 새로운 아미노산인 글라이신이 생성되고, 세포 내 도메인의 인산화를 유도하여 지속적인 활성을 나타내어 암화 과정에 기여하게 된다(Downward J et al., 1984). 물론, 다른 형태의 EGFR도 타겟팅이 가능하지만, 현재로서는 EGFRvIII가 항암 표적으로서 가장 적당한 EGFR 변이체로 여겨지며, 다수의 연구 개발이 진행 중에 있다.

특히, 뇌종양에서 EGFRvIII의 주로 PI3K와 AKT를 경유하는 주요 신호전달 경로에 의하여 세포신호를 전달하며, 비주류 경로로 Stat-3, AP-1 또는 MAPK의 활성화를 통하여, 암세포의 증식, 세포사멸에 대한 저항성, 신생혈관형성, 암세포의 침투 증가, 암줄기세포 형성 등에 기여한다(Gan HK, et al., 2013). 최근 연구에서는 EGFRvIII가 mTORC2를 경유하여 NF-κB 를 활성화하여 암화 작용에 중요한 역할을 담당한다는 보고가 있다(Bonavia et al., 2012; Tanaka et al., 2011). EGFRvIII의 활성화에 따른 신호 전달 경로는 도 4에 나타낸 바와 같다.

또한, EGFRvIII에 의해서 c-Met 인산화에 이은 활성화가 유도되므로(Huang PH. et al., 2007), EGFR 또는 EGFRvIII 저해제와 함께 c-Met 저해제를 병합하여 환자에 적용 투여할 경우 EGFRvIII를 고발현하는 환자의 화학요법에 대한 저항성을 경감시키면서 효능을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.

EGFRvIII는 뇌종양에서 보통 EGFR wild-type (WT)과 동시에 발현하며(Ekstrand et al., 1991), EGFRvIII 자체는 EGFR 유전자가 증폭된 종양에서 발현되기 때문에 (Biernat et al., 2004, Frederick et al., 2000), 개개의 암세포들은 EGFRwt 증폭과 EGFRvIII의 발현을 동시에 수행하여 상호작용을 할 것으로 생각되어졌다.

EGFRvIII은 뇌종양에서 비교적 높은 빈도로 발현되지만, 다른 암종에서는 추가 연구가 필요하다. EGFRvIII를 발현하도록 형질전환된 뇌종양 세포주를 이용한 최근 연구에서는 EGFRvIII과 EGFR wt을 사용하는 네트워크가 확실히 상호간 활성화될 가능성이 있음이 밝혀졌다(Shia Q. et al., PNAS, 2012). 이와 같은 EGFRvIII, EGFRwt 간의 상호작용은 이종이식(xenografts) 모델, GBM 스페로이드(spheroid lines)나 여타의 다른 세포주를 통해서 자연적으로 발현되는 EGFRvIII를 이용하여 재차 확인할 필요가 있다.

EGFR이 EGFRvIII를 인산화하여 STAT3/5 활성화 경로를 주도하여, 뇌종양의 진행에 큰 영향을 준다는 보고도 있으며(Fan QW et al., 2013), EGFRvIII 이합체 형성이 신호전달의 활성화에 큰 영향을 주는데, EGFRwt의 발현이 증가할수록 EGFRvIII의 인산화와 활성화를 증대시키므로, EGFRwt의 이합체형성을 이루는 팔(dimerization arm)과 카이네이즈 활성이 EGFRvIII의 활성화에 기여한다고 생각되며, 정위이식(orthotopic) 모델에서 EGFRwt또는 HB-EGF의 발현을 억제하였을 때, EGFRvIII에 의해 유도된 암화를 억제한다는 결과(Li L. et al., 2014)로 부터, EGFRwt을 둘러싸고 있는 활성화 경로가 EGFRvIII 의 활성화를 경유한 종양형성에 매우 중요한 역할을 수행한다고 할 수 있다.

현재, EGFRvIII를 타겟하여 개발되고 있는 (뇌)종양 치료제는 다섯 가지 범주로 나눌 수 있다. 첫번째는 기존의 EGFR 치료제를 이용하여, EGFRwt 및 EGFRvIII의 내부 신호전달을 막는 방법, 두번째는 ABT-806(mAb806, 애봇)와 같이 EGFR과 EGFRvIII를 동시에 타겟팅하는 항체를 이용하여 외부 신호전달과 수용체들간의 상호작용을 억제하는 방법, 세번째는, 암젠(Amgen)에서 개발중인 AMG-595에서 보듯이, anti-EGFRvIII 항체를 ADC(antibody drug conjugate) 형태로 개발 중인 것이 있고, 네번째는 CAR-T(Chimeric antigen receptor-T cell) 형태로 세포 면역 치료제로 사용할 수 있다. 다섯번째는 EGFRvIII 특이적인 14개의 아미노산서열을 KLH(Keyhole limpet hemocyanin)에 접합하여, EGFRvIII 항암 백신으로 투여하는 방법이다. EGFR이 아닌, EGFRvIII만을 타겟팅하는 항암 치료제는 현재 상품화 된 예가 없으며, 도 6에 나타낸 바와 같이 임상개발에 있어 가장 선두에 있는 것이 셀덱스(Celldex Therapeutics)에서 개발중인 EGFRvIII 백신 CDX-110이다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 제조하였다. 특히, EGFRwt에 교차반응(cross reactive)을 하지 않고, EGFRvIII에 특이적으로 결합하도록 제작하여, EGFRwt에는 결합하지 않고 EGFRvIII에만 결합하는 신규 항체를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 신규 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 숙주세포, 이의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 야생형 EGFR에 교차반응(cross reactive)하지 않고, 서열번호 1로 표시되는 EGFRvIII (epidermal growth factor receptor variant III)의 아미노산 서열 중 1-13번째 아미노산 영역에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명은 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체는 야생형 EGFR (EGFRwt)에는 결합하지 않고 EGFRvIII에만 결합하는 신규 항체로, EGFRvIII를 발현하는 세포에서 우수한 결합능을 나타내며, 내재화(internalization)가 일어남이 확인되었으므로, EGFRvIII를 타겟으로 하는 유효한 길항제로 작용할 수 있다. 이를 바탕으로, 본 발명에 따른 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체는 EGFRvIII의 발현에 의해 유도되는 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 EGFR의 각 도메인과 인산화 부위를 나타낸 것이다.
도 2는 EGFR 수용체를 타겟팅하는 공지의 길항체의 개발 진행 상황을 나타낸 것이다.
도 3은 EGFR과 재조합 형태의 EGFR 돌연변이체들의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 4는 EGFRvIII의 활성화에 따른 신호 전달 흐름을 나타내는 모식도이다.
도 5는 에서 입수된, 임상 개발중인 EGFRvIII 타겟팅 치료제 후보 리스트를 나타낸 것이다.
도 6a는 CHOK1-EGFRvIII 단일 세포주의 수용체 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 U87MG-EGFRvIII 단일 세포주의 수용체 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 EGFRvIII 항체를 선별하기 위해 사용된 EGFRvIII 특이서열을 포함하는 peptide에 대한 비드 패닝 모노파지 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 bead panning에 의해 선별된 단일 파지-항체의 항원 특이적 결합능을 확인하는 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 SDS-PAGE를 통해 non-reducing 버퍼에 처리하여 획득한 IgG를 확인하는 결과이다.
도 9b는 SDS-PAGE를 통해 reducing 버퍼에 처리하여 획득한 IgG를 확인하는 결과이다.
도 10은 ELISA를 이용하여 인간 IgG 클론의 항 EGFRvIII-peptide 결합을 확인한 것이다.
도 11은 유세포 분석법을 이용하여 인간 IgG 클론의 EGFRvIII 세포주에 대한 결합 특이성을 나타낸 것이다.
도 12는 항-EGFRvIII 유세포 분석법에서 인간 IgG의 농도 저하가 미치는 결합능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 인간 IgG의 경쇄사슬 변화에 따른 결합능을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 IgG의 경쇄사슬 변화에 따른 결합능을 유세포 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 항 EGFRvIII 인간 IgG의 내재화를 U87 MG 13을 이용하여 유세포 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15b는 항 EGFRvIII 인간 IgG의 내재화를 CHOK1 22-2를 이용하여 유세포 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 관점에서, EGFR 야생형에 교차반응하지 않고, 서열번호 1로 표시되는 EGFRvIII (epidermal growth factor receptor variant III)의 아미노산 서열 중 1-13번째 아미노산 영역에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 각 구성에 대한 구체적 설명은 다음과 같다.

항원 EGFRvIII

위에서 논의한 바와 같이, EGFRvⅢ는 EGFR의 세포외 도메인에서 267 아미노산이 접합부에서 글리신의 단일 아미노산 치환과 함께 결실되어 있는 EGFR의 결실 돌연변이체로, 서열번호 1로 표시되는 서열을 가진다.

본 출원의 발명자들은 EGFR 야생형에 교차반응하지 않으면서 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하고자, EGFRvIII 펩타이드 특이서열 13mer를 포함하는 펩타이드를 항원으로 사용하여 항체를 제작하였다. 본 발명에 따른 항체는 구체적으로, EGFRvIII 펩타이드 특이서열 13mer, 4mer의 링커 및 비오틴이 포함된 서열번호 2 LEEKKGNYVVTDHCSGGKN (N은 비오틴)로 표시되는 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 동시에, 비특이적 결합을 차단하기 위한 negative 항원으로 TTACCDRII, 예를 들어 서열번호 3 NEINPGNGHTNYNEKFKS (N은 비오틴)으로 표시되는 서열을 가지는 펩타이드를 이용하였다. 이를 통해, EGFR 야생형에 교차반응하지 않으면서도, EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하였다.

항체

본 명세서에서 사용되는 "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로블린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 및 단클론 항체와 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가 (bivalent) 또는 양특이성 분자 (예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함할 수 있다.

전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형 (subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다.

상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

상기 Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술 (예를 들어, 항체의 중쇄 또는 이의 가변영역을 코딩하는 DNA 및 경쇄 또는 이의 가변영역을 코딩하는 DNA를 주형으로 하고, 프라이머쌍을 이용하여 PCR법에 의해 증폭시키고, 펩티드 링커를 코딩하는 DNA와 양 말단이 각각 중쇄 또는 이의 가변영역 및 경쇄 또는 이의 가변영역과 연결되도록 하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭)을 통하여 제작할 수 있다.

면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역 (complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 명세서에서 사용하는 "단클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하고, 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 "인간항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, i) 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cellmediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다는 점, ii) 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는다는 점, 및 iii) 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 점에서 장점이다.

이를 고려하여, 본 발명에 따른 항체는 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 단클론항체로 EGFRvIII에 대한 우수한 친화도 및 특이도를 나타낼 수 있을 뿐 아니라, 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로, 암 또는 종양과 같은 질병의 치료에 있어 적합하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 항체"는 EGFRvⅢ에 결합하여 EGFRvⅢ의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 의미하며, 항-EGFRvⅢ 항체와 혼용하여 사용할 수 있다. 이 때, 상기 EGFRvⅢ에 대한 K_D는예를 들어, 10^-8이하, 바람직하게 10^-9 이하, 더욱 바람직하게 10^-10 이하일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "EGFR에 교차반응하지 않음"은 EGFR 야생형에 결합하는 항체 및 EGFRvⅢ에 결합하는 항체가 각 항원에 대하여 교차반응성을 나타내지 않음을 의미할 수 있다. 이 때, 상기 EGFR에 교차반응하지 않는 항체는 예를 들어 EGFR 야생형에 대한 항체의 K_D가 예를 들어, 10^-5이상, 바람직하게 10^-4 이상, 더욱 바람직하게 10^-3 이상일 수 있으며, 실질적으로 상기 EGFR에 교차반응하지 않는 항체는 제한되지 않는 형태의 표준 결합 분석에서 EGFR 야생형에 결합하는 항체를 검출할 수 없는 항체를 의미할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이, EGFR에 교차반응하지 않고, 서열번호 1로 표시되는 EGFRvIII의 아미노산 서열 중 1-13번째 아미노산 영역에 특이적으로 결합하도록 구조적으로 특성화되어 분리된 단클론 인간항체 PA430, PD27, PD52 및 PD10일 수 있다. 각 항체의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR에 대한 아미노산 서열은 다음 표 1 및 2에 기재된 바와 같다.

[표 1]

[표 2]

본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 표 1 및 2에 기술된 V_H CDR1, 2 및 3 서열과 V_L CDR1, 2 및 3 서열은 구조적으로 유사한 V_H 및 V_L 서열이 혼합되어 V_H/V_L 쌍의 CDR1, 2 및 3로 배치되어 형성될 수 있으며, 예를 들어 다음의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:

서열번호 4-7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 8-11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 12-15으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

또한, 본 발명에 따른 항체는 다음의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:

서열번호 16-19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 20-23로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및

서열번호 24-27로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 구체적으로, 다음 표 3에 기재된 바와 같은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 또는 이와 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다:

[표 3]

본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 예를 들어 다음의 서열번호 28-31로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체는 서열번호 28-31로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 100%의 상동성 즉, 서열번호 29-32의 서열을 중쇄 가변 영역으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 32-35로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체는 서열번호 32-35로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 100%의 상동성 즉, 서열번호 33-36을 중쇄 가변 영역으로 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 항체는 다음의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 표 3에 기술된 V_H 서열과 V_L 서열은 구조적으로 유사한 V_H 및 V_L 서열이 혼합되어, V_H/V_L 쌍으로 제한없이 배치되어 형성될 수 있다:

서열번호 28의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32-35으로 이루어진 군에서 선택된 서열의 경쇄 가변 영역;

서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32-35으로 이루어진 군에서 선택된 서열의 경쇄 가변 영역;

서열번호 30의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32-35으로 이루어진 군에서 선택된 서열의 경쇄 가변 영역;

서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32-35으로 이루어진 군에서 선택된 서열의 경쇄 가변 영역.

특히, 본 발명에 따른 항체는 다음의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:

서열번호 28의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32의 경쇄 가변 영역;

서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 33의 경쇄 가변 영역;

서열번호 30의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역; 및

서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "핵산"은 세포, 세포 용해물 (lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 당업계에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 되는" 것이다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 핵산은 표 4에 기술된 V_H 서열과 V_L 서열을 코딩하는 것으로, 서열번호 36-39로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함 및/또는 서열번호 40-43으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체는 서열번호 36-39 및/또는 서열번호 40-43으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성, 바람직하게 98% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 100%의 상동성을 가질 수 있다.

[표 4]

본 발명은 상기 항체에 독소, 약물 등이 접합된 접합체를 포함할 수 있다. 상기 독소 또는 약물은 목적하는 바에 따른 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 상기 독소의 예시로는 듀오카마이신, 칼리케아마이신, 마이탄신 또는 아우리스타틴일 수 있으며, 상기 화합물은 공지의 항암 또는 항종양 화합물 예를 들어, 탁솔, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 독소루비신 등, 알킬화제 (예를 들어 시스플라틴, 안트라시클린 (예를 들어 독소루비신) 등일 수 있다. 상기 접합체는 당업계에서 이용가능한 링커 이용 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항체 이외에도, 상기 항체와 다른 항원 결합 부위에 결합하는 펩티드, 단백질 또는 항체가 결합되어, 2개 이상의 상이한 결합 부위를 포함하는 이특이성 (bispecific) 결합 분자를 포함할 수 있다. 상기 이특이성 결합 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결합 특이적 부분을 연결함으로써 제조할 수 있다. 또한, 항체가 연결되는 경우 중쇄의 C 말단 영역에서 sulf-hydryl link를 통하여 연결될 수 있다. 경우에 따라서, 동일한 벡터에서 코딩되고 동일한 숙주세포에서 발현되어 조합되도록 할 수 있다.

항체의 제조방법

본 발명은 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 항체 또는 그의 항체 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어 PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA가 전사 및 번역 제어 서열에 작동되도록 결합되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "작동되도록 결합"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 숙주세포와 상용성 있도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 항체의 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되거나, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체는 표준 방법 (예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트 (blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 경우에 따라서, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 프레임에 맞게 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 결합되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 면역글로불린 외 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 지닌다. "조절서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 당업자는 형질전환시킬 숙주세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 포함할 수 있다. 상기 핵산 또는 상기 벡터는 트랜스펙션된다. "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 lipofection 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 포유류 세포에의 적용 가능성을 고려하여, 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 숙주세포에서 발현될 수 있다. 상기 항체의 발현에 적합한 포유류 숙주세포는 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 (예를 들어 DHFR 선발 가능한 마커와 함께 사용되는 dhfr- CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 또는 SP2 세포 등을 예시할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우 항체는 숙주세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 또한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIII을 사용하여 바이오패닝 (biopanning)하는 단계를 포함하여 항체를 제조할 수도 있다.

경우에 따라서, 발현된 항체는 숙주세포로부터 분리하여 균일하도록 정제할 수 있다. 상기 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다

의약 조성물

본 발명은 다른 관점에서, 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "암 또는 종양"은 본 발명의 항체에 의하여 치료될 수 있는 암 또는 종양의 종류라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 EGFRvIII의 과발현에 의한 유방암, 폐암 또는 항문암일 수 있고, 뇌종양 예를 들어, 원발성 뇌종양 (즉, 뇌에서 발생) 및 속발성 또는 전이성 뇌종양일 수 있다.

경우에 따라서, 본 발명에 따른 항체는 기타 항암제와 병용 (즉, 항암 치료전, 치료 동안 또는 치료후) 하여 투여될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 하나 이상의 화학요법 약물, 예를 들어 알킬화제, 예를들어 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥시플라틴, 프로카르바진, 및 시클로포스파미드; 항대사물질, 예를 들어 플루오로우라실, 플록스우리딘, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트 및 히드록시우레아; 천연 생성물, 예를들어 식물 알칼로이드 또는 항생제, 예를 들어 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 에토포시드, 미토마이신, 미톡산트론, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 탁솔 (파클리탁셀) 또는 관련 화합물, 예를 들어 탁소테레 (Taxotereㄾ); 뇌종양 치료에 치료제, 예를 들어 테모졸로미드 또는 카르무스틴 함유 글리아델 (Gliadelㄾ) 웨이퍼; 및 기타 약물, 예를 들어 이리노테칸 및 글리벡 등과 병용하여 투여될 수 있다. 이외에도, 기타 생물학적 약제, 예를들어 모노클로날 항체, 예를들어 HER2 항원에 대한 허셉틴 (Herceptin™), VEGF에 대한 아바스틴 (Avastin™), EGF 수용체에 대한 항체, 예를들어 어비툭스 (Erbituxㄾ), 기타 EGF 수용체 길항 약물을 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 제제화될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이 때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 조성물은 치료적 유효량으로 투여될 수 있으며, "치료적 유효량"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미할 수 있다. 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 보통 0.1 내지 5 mg/kg, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4 mg/kg이나, 10 mg/kg 또는 15 또는 20 mg/kg의 높은 용량으로 투여될 수 있다. 고정된 단위 용량으로, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg으로 제공될 수 있다. 암 또는 종양의 퇴행을 야기시키거나, 더욱 바람직하게는 종양을 제거하기 위해 1 내지 8회의 투여 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)로 투여되나, 10, 20 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 항체의 반감기를 기초로, 1주일에 2회, 매주, 격주, 매월 또는 기타 간격으로 1주, 2주, 4주, 8주, 3-6개월 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: EGFRvIII 세포주의 확립

HindIII와 XbaI 제한효소자리를 포함하는 EGFRvIII의 유전자를 DNA합성(Invitrogen, 서열번호 1)을 이용하여 획득하고 HindIII와 XbaI 제한효소를 이용하여 절단하였다. 절단된 주형 DNA는 HindIII와 XbaI 제한효소에 절단된 발현 벡터 pcDNA3.1에 클로닝 하여 pcDNA3.1-EGFRvIII를 조합하였다. pcDNA3.1-EGFRvIII는 DH5α 대장균 세포에 트랜스포메이션(transformation)하여 앰피실린(ampicillin) 저항성이 있는 균주를 선별하였다. HindIII와 XbaI 제한효소에 의해 절단되어 EGFRvIII유전자의 삽입여부를 확인하였다.

EGFRvIII 세포주를 제작하기 위하여 제조된 pcDNA3.1-EGFRvIII벡터를 CHOK1, U87MG, A431에 대하여 Lipofectamine 2000을 이용하여 트랜스펙션 시키고, 세포는 10% FBS, DMEM에서 48시간 배양하였다. 배양된 세포는 1:10 dilution하여 10%FBS 1000㎍/ml, 400㎍/ml, 400㎍/ml의 G418이 첨가된 DMEM 또는 RPMI에서 배양된 후, 콜로니화되는 세포를 선택하여 6-well에서 증식하였다. 12일 동안 증식된 각 세포들을 용해시켜 전기영동 후 웨스턴블랏을 수행할 때, 항-EGFR 항체와 항-인간 IgG HRP로 처리하고 ECL기질로 반응하였다 (도 6a 및 도 6b).

실시예 2: 바이오패닝

항원으로 사용되는 EGFRvIII peptide는 특이서열 13mer와 linker로 사용되는 4mer 및 biotin이 포함되도록 합성 (서열번호 2)하였다. 비특이적 결합을 차단하기 위한 negative 항원으로 biotin-TTACCDRII peptide도 합성 (서열번호 3)하였다. 각 peptide는 M-280 streptavidin (Invitrogen. USA) bead를 이용하여 5ul당 7.8ng의 peptide가 접합되도록 제조하였다.

인간 항체 파지 라이브러리는 bead에 접합 시킨 TTACCDRII peptide에 미리 25˚C 30분간 반응 하여 비특이적 파지 항체가 결합되도록 유도하였다. 그 후 magnetic bar를 이용하여 bead에 결합된 TTACCDRII peptide를 잡고, 상등액만 따로 취하였다. 상등액은 다시 bead에 접합시킨 EGFRvIII peptide에 첨가하여 25˚C 2시간 반응하여 항체파지의 결합이 일어나도록 반응하였다. Magnetic bar를 이용하여 bead에 결합된 EGFRvIII peptide를 잡고, 파지 상등액은 제거하였다. Magnetic bar에 당겨진 Bead EGFRvIII peptide는 PBST (0.1% Tween 20을 포함하는 PBS)로 5회 반복 세척하고 마지막으로 PBS를 이용하여 1회 세척하였다. 100ul의 100mM 트리에틸아민 용액을 10분간 반응 시켜 항원에 결합된 파지가 용출될수 있도록 하고, 용출된 파지는 50ul의 1M 트리스 pH7.5에 의해 중화시켰다.

중화된 파지 용출액은 10ml의 미드 로그(mid-log)기 XL1-Blue 대장균 세포주에 첨가되어 37˚C에서 30분간 반응 하여 감염되도록 유도하였다. 감염된 XL1-Blue 대장균 세포주는 1% glucose가 함유된 2xYT/C 플레이트에 스프레딩 하여 30˚C 16시간 배양하였다. 1차 패닝과 2차, 3차 패닝은 동일한 방법으로 진행 하였다.

실시예 3: EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 파지항체의 선별

완료된 패닝으로부터 무작위로 E.coli 클론을 선별하여 500ul 2xYT/C 의 배지를 첨가하여 96well 플레이트에서 37˚C 300rpm에서 미드 로그(mid-log)기로 배양 시킨 후, M13 헬퍼파지(helperphage)를 첨가한 다음 37˚C 30분간 파지의 감염을 유도하였다. 감염된 E.coli 클론은 30˚C 30rpm의 조건으로 15시간 배양되어 파지-항체가 용출되도록 준비하였다. 배양된 E.coli클론의 세포들은 6000rpm 10분간 원심분리하여 세포는 제거하고 상등액만 획득하였다.

EGFRvIII peptide, TTACCDRII peptide, BSA를 1㎍/ml로 Maxisorb 96well ELISA 플레이트 (Nunc, Denmark)에 코팅하고, 실온에서 1시간 동안 3% 탈지우유/PBS로 먼저 차단시킨 다음, 획득된 상등액을 접종하여 1시간 실온에서 반응 시켰다. 상기 ELISA 플레이트는 PBST 0.05%로 3회 세척 후, 항-M13-HRP(Horse Radish Peroxidase) 항체 (GE)를 1:300 PBST 0.05%에 희석하여 1시간, TMB 기질 (BD, USA)을 10분 처리 하여 발색시킨 후 2N H₂SO₄를 처리하여 반응을 중지시켰다. 발색된 ELISA는 Sunrise ELISA reader (TECAN, Switzerland)기를 이용하여 450nm-650nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 7).

실시예 4: 웨스턴 블랏

파지-항체에 의해 EGFRvIII 결합능을 CHOK1-EGFRvIII 세포 용해물을 이용한 웨스턴블랏으로 관찰하였다.

실시예 1에서 제조된 CHOK1-EGFRvIII 세포주인 CHOK1 22-2와 이에 대한 모세포인 CHOK1 및 EGFR wildtype을 발현하는 A431을 PBS로 세척하고 1% SDS, 1mM Na3VO3, 10mM Tris (pH7.4), 1mM PMSF, 10uM Leupeptin, 1.5uM pepstein, 10㎍/ml aprotinin의 용출버퍼를 이용하여 용해시켰다. 6% SDS-PAGE로 각 세포의 용해물을 15㎍씩 분리한 후, PVDF membrane으로 단백질을 전이시켰다. 3% 탈지우유 TBST로 1시간 block한 다음, 5x1010 pfu의 PA430 파지, PD54 파지를 처리하여 1시간, 그 다음으로 항-M13-HRP(Horse Radish Peroxidase) 항체 (GE)를 1:24000 TBST에 희석하여 1시간, ECL (GE healthcare, USA)기질을 이용하여 발색 시킨 후 Odyssey Fc 이미징 시스템 (Licor, USA)으로 블랏을 확인하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었으며, 도 8을 참조하면 PA430 파지와 PD54 파지는 EGFRvIII를 발현하는 세포주에서만 결합함을 알 수 있었다.

실시예 5: IgG 발현 및 정제

IgG 형태로의 전환은 파지-항체의 가변 중쇄 사슬을 포함하는 sfiI 제한효소로 이중 절단하여 단편을 취득하고, 중쇄 영역을 포함하는 벡터인 pIgGHD-6A6Hvy에 sfiI 제한효소를 이중절단 하여 단편과 라이게이션하였다. 파지-항체의 가변 경쇄 사슬을 포함하는 BstX I 제한효소로 이중 절단하여 단편을 취득하고, 경쇄 영역을 포함하는 벡터인 pIgGLD-6A6Lgt에 마찬가지로 단편과 라이게이션하였다 (위 방법은 특허출원공개 제 2008-0109417호 참조).

IgG의 발현은 HEK293T세포를 100mm 세포배양 디쉬당 8 x 106세포를 접종하여 37˚C CO2 5% 배양기에서 24시간 방치하도록 하여 세포의 부착 및 밀도가 80~90%가 되도록 배양하였다. 제작된 IgG 의 중쇄 발현벡터 10㎍과 경쇄 발현벡터 10㎍, 총 20㎍의 벡터는 1:3(DNA:PEI)㎍의 비율로 PEI와 혼합하여 15분간 반응하여 복합체를 형성 되도록 하였다. 배양된 세포에 DNA PEI복합체를 첨가하여 10시간 동안 반응한 후, DMEM으로 1회 세척 후 Freestyle 293 (GIBCO, USA)에 10% penicillin streptomycin (GIBCO, USA)이 첨가된 배지 10ml을 첨가하여 48시간 방치하고 IgG가 발현된 상등액을 취하도록 하였다.

획득된 상등액은 20mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 5mM EDTA pH7.0으로 평형화시킨 protein A 컬럼(GE healthcare, USA)에 주입하고, 50mM Tris-HCl(pH7.0)과 5mM EDTA, 500mM NaCl, 0.2% Polysorbate 20의 용액으로 세척한 후, 50mM NaCl, 0.1M glycine-HCl (pH 3.5) 용액으로 용출하고 1M Tris로 중화 하는 친화력 크로마토그래피를 실시 하였다. 용출된 단백질은 MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane(spectrum, USA)에 팩킹하여, PBS 투석하여 용액을 교체하였다.

그 결과를 도 9a 및 9b에 도시하였다. 도 9a 및 9b를 참조하면, SDS-PAGE를 통해 각 항체를 Non-reducing 또는 Reducing LDS sample buffer (Invitrogen, USA)에 처리하여 Nupage 4~12% Bis-Tris Gel (Invitrogen, USA)에 Loading하였을시 50kDA의 중쇄 사슬 및 25kDa의 경쇄 사슬을 포함하고 150kDa에 준하는 IgG를 획득하였다.

실시예 6: EGFR vIII에 특이적으로 결합하는 IgG의 선별

IgG로 전환된 클론들의 항원 특이적 결합력을 확인하기 위해 ELISA를 수행하였다. EGFRvIII peptide와 TTACCDRII peptide, BSA를 각각 1㎍/ml 96well 플레이트에 37˚C에서 2시간 반응시켜 코팅하였다. 이후 3% 탈지우유/PBST 0.05%로 코팅되지 않은 부분을 차단시킨 후, 1㎍/ml의 IgG를 플레이트에 첨가하여 37˚C에서 1시간 반응하였고 항 인간 IgG HRP (pierce, USA)를 1:3000 희석하여 1시간 반응하였다. 다음으로 TMB 기질 (BD, USA)을 10분 처리 하여 발색시킨 후 2N H2SO4를 처리하여 반응을 중지시켰다. 발색된 ELISA는 Sunrise ELISA reader (TECAN, Switzerland)기를 이용하여 450nm-650nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 10에 나타내었으며, 도 10을 참조하면 PA430, PD27, PD52, PD10은 비특이적 결합없이, EGFRvIII peptide에서만 특이적인 결합능이 있음을 보였다.

이러한 결과를 바탕으로 상기의 항체 4종을 대상으로 EGFRvIII 발현 세포주에서 결합력을 유지하는지 확인하고자 형광 염색 유세포 분석법을 실시하였다. EGFRvIII 발현 세포주인 CHOK1 22-2와 이에 대한 모세포인 CHOK1 그리고 EGFR wildtype을 발현하는 A431을 그 대상으로 하였다. 각 세포는 1 x 106의 세포수로 획득하고, 2% FBS가 첨가된 PBS에 각 항체를 1㎍/ml로 희석하여 세포에 첨가하여 4˚C 1시간 반응하고, 항 인간 IgG PE (Bethyl, USA)를 1:200 희석하여 4˚C 45분간 반응 시켜 형광 염색하였다. 각 샘플은 FACS Caliber (BD, USA)기기를 이용하여 샘플당 1 x 10⁴개의 세포를 측정하였다.

그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11을 참조하면, PA431, PD27, PD10은 EGFRvIII 발현세포주인 CHOK1 22-2에 결합능을 보였고 EGFRvIII 비발현 세포주인 CHOK1과 A431에서는 결합능이 없는 것으로 보였다. 또한, EGFR wild type을 발현하는 세포인 A431에서도 결합이 이루어지지 않음을 보였다.

EGFRvIII 발현 세포주에 결합능을 보이는 항체 3종이 항체 농도의 저하에 따라 미치는 결합특성을 확인하기 위해 아래와 같이 실시하였다. 항체의 농도는 1000ng/ml을 시작으로 2배씩 차순 희석하여 31ng/ml까지 준비하였다. 형광 염색 유세포 분석법은 상기에 열거된 순으로 동일하게 실시하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었으며, 도 12를 참조하면 PA430은 PD27과 PD10에 비하여 같은 농도의 IgG를 처리함에도 높은 결합능을 보임이 관찰되었다.

실시예 7: 친화도 증진을 위한 경쇄사슬의 변경

PA430의 항원 특이적 친화도 증진을 위하여 경쇄사슬의 변경해 주었다. PA430과 PD52, PD27의 가변 경쇄사슬의 CDR을 살펴보면 항원 특이적 친화도가 높았던 PA430의 가변 경쇄사슬의 서열과 유사함을 확인할 수 있다 (표 1-3 참조). 이러한 점을 이용하여 PA430의 원래 경쇄사슬 외에 PD52, PD27, PD10의 경쇄사슬 벡터를 PA430의 중쇄사슬 벡터와 혼합하여 트랜스팩션하여 IgG를 생산하였고, 이는 실시예 5와 동일하다.

생산 및 동정된 430H10L, 430H52L, 430H27L을 실시예 6의 ELISA와 동일하게 실시하였을 때, 항원특이적 결합능이 유지되었음을 확인하였다 (도 13).

PA430과 430H52L, 430H27L, PD10 IgG를 대상으로 실시예 6의 형광 염색 유세포 분석법을 동일하게 실시하고 U87MG세포를 기반으로 EGFRvIII 발현세포주로 제작된 U87 MG 13 세포주, A431세포를 기반으로 EGFRvIII 발현세포주로 제작된 A431 16-3 세포주를 추가하여 실시하였을 때 430H52L, 430H27L은 EGFRvIII 특이 세포주에서도 결합능이 유지됨을 확인하였다. 또한, 430H52L은 원형 경쇄사슬을 가진 PA430에 비해 같은 농도를 처리함에도 결합 시그널이 우수함이 관찰되었다 (도 14).

실시예 8: 형광 염색 유세포 분석법을 이용한 항체 내재화 분석

EGFRvIII 특이적 결합능을 보이는 430H52L 항체를 이용하여, 항체-EGFRvIII 결합에 의한 내재화가 이루어지는지 확인하고자 형광 염색 유세포 분석법을 실시하였다.

U87 MG 13세포와 CHOK1 22-2세포를 대상으로 2 X 10⁶세포를 Trypsin EDTA 처리하여 취득한 후, 세포의 활성을 저해시키기 위해 4˚C에서 30분간 cooling 하였다. DMEM 배지에 430H52L 1㎍㎍을 희석하여 세포에 처리하여 4˚C 에서 30분간 항체 항원 결합을 유도하였다. 2차 항체만 처리될 샘플은 DMEM만을 처리하였다. 다음으로 1300rpm 3분간 원심분리 후 잔여 항체가 제거되도록 세포를 PBS로 세척하고 DMEM 배지를 첨가하여 4˚C 반응하는 샘플, 37˚C 15분, 37˚C 30분, 37˚C 60분 CO₂ 5% 인큐베이팅 샘플로 반응시켰다. 원심 분리하여 4˚C PBS로 세척한 후 0.1M Glycine, 0.5M NaCl pH 2.2를 10분간 3회 반복 처리하여 세포 표면의 EGFRvIII에 결합되어 있는 항체를 인위 제거시켰다. 원심 분리하여 PBS 세척 후 4% paraformaldehyde (USB, USA)로 10분 4˚C 고정화 작업을 하였다. 각 샘플은 0.1% triton-100(sigma Aldrich, USA) PBS 용액을 4˚C 10분 반응하여 투과 할 수 있게 만들거나, 2%FBS PBS용액을 처리하여 투과가 일어나지 않게 하였다. 원심 분리하여 PBS 세척후 2%FBS PBS를 처리하여 블로킹 하였고 항 인간 IgG PE (bethyl, USA)를 1:400 처리하여 염색하였다. 각 샘플은 FACS Caliber (BD, USA)기기를 이용하여 샘플당 1x10⁴개의 세포를 측정하였다.

그 결과를 도 15a 및 15b에 각각 나타내었다. 도 15a 및 15b를 참조하면, EGFRvIII 발현 세포주인 U87 MG 13이나 CHOK1 22-2세포에 430H52L 항체를 처리하고 온도 및 시간별 반응을 거쳐 세포투과 (permeablization)를 이용해 형광염색을 하였을 때, 4˚C에 비하여 37˚C에서의 시간이 증가됨에 따라 시그널이 증가되는 것으로 관찰되었다. 대조군의 의미로 세포 투과를 거치지 않고 (Non-permeablized) 형광염색을 하였을시, 온도 및 시간의 증가에 따른 시그널의 증가는 없었다. 이는 430H52L IgG가 EGFRvIII에 결합되어 37˚C의 조건에서 시간의 증가에 따라 내재화가 증가하였음을 형광 시그널로 증명한 것이다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

<110> Pharmabcine Inc. <120> Novel Antibody Binding to EGFRvlll and Composition Comprising the Same <130> P14-B318 <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 919 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of EGFRvIII <400> 1 Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys 1 5 10 15 Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val 20 25 30 Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly 35 40 45 Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn 50 55 60 Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile 65 70 75 80 Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu 85 90 95 Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly 100 105 110 Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala 115 120 125 Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln 130 135 140 Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg 145 150 155 160 Ser Leu 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38 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv <400> 38 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gaacatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctgcagtg ggtctcagga atcaattgga atagtggtaa aacaggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac tagacccggg 300 gaggacaccg ggggtggctt tgatatctgg ggccaaggga caatgatcac cgtctcctca 360 360 <210> 39 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv <400> 39 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gaacatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctgcagtg ggtctcagga atcaattgga atagtggtaa aacaggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac tagacccggg 300 gaggacaccg ggggtggctt tgatatctgg ggccaaggga caatgatcac cgtctcctca 360 360 <210> 40 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv <400> 40 tcctatgagc tgacacagcc accctcagtg tcggtggccc cagggcagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac agcgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttcactggtt ccagctcagg gacaaaagtc acgctgacca taagtggagt ccgggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacagcagtg atacttctgt ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 41 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv <400> 41 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctgt ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 42 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv <400> 42 tcctatgagc tgactcagcc actctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtatt ggcagatcat tattcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgttggtgat gtataaagac agtgagaggc cctctgggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccagctcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacagcagtg atacttctgt ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 43 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv <400> 43 aattttatgc tgactcagcc cgcctccgtg tctgggtccc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaagcagcag cgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccca actcatcatt tatgatgtca ctaagcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctccggctc caagtctggc aactcggcct ccctgaccat ctctggactc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcataca gcagcagcac tttttacgtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta ggt 333

Claims

EGFR에 교차반응(cross reactive)하지 않고, 서열번호 1로 표시되는 EGFRvIII (epidermal growth factor receptor variant III)의 아미노산 서열 중 1-13번째 아미노산 영역에 특이적으로 결합하는 항체로,
다음의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
서열번호 28의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32-35으로 이루어진 군에서 선택된 서열의 경쇄 가변 영역;
서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 33의 경쇄 가변 영역;
서열번호 30의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역; 및
서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역.
제1항에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
삭제
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제1항에 있어서, 인간항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산.
제9항에 있어서, 서열번호 36-39로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제9항에 있어서, 서열번호 40-43로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제9항의 핵산을 포함하는 벡터.
제9항의 핵산을 포함하는 숙주세포.
제13항의 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 제조방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 폐암, 항문암 또는 뇌종양인 것을 특징으로 하는 조성물.