WO2022078424A1 - 抗trop-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途 - Google Patents

抗trop-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2022078424A1
WO2022078424A1 PCT/CN2021/123731 CN2021123731W WO2022078424A1 WO 2022078424 A1 WO2022078424 A1 WO 2022078424A1 CN 2021123731 W CN2021123731 W CN 2021123731W WO 2022078424 A1 WO2022078424 A1 WO 2022078424A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
antibody
trop
variable region
mutant
Prior art date
Application number
PCT/CN2021/123731
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
毛东杰
罗燕
谢岳峻
Original Assignee
上海翰森生物医药科技有限公司
江苏豪森药业集团有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 上海翰森生物医药科技有限公司, 江苏豪森药业集团有限公司 filed Critical 上海翰森生物医药科技有限公司
Priority to AU2021362977A priority Critical patent/AU2021362977A1/en
Priority to KR1020237015300A priority patent/KR20230086712A/ko
Priority to CN202180051116.6A priority patent/CN116234573A/zh
Priority to JP2023521378A priority patent/JP2023545742A/ja
Priority to CA3194725A priority patent/CA3194725A1/en
Priority to EP21879467.5A priority patent/EP4230656A1/en
Priority to US18/030,928 priority patent/US20230374149A1/en
Publication of WO2022078424A1 publication Critical patent/WO2022078424A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present disclosure relates to an anti-TROP-2 antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a mutant thereof; a chimeric antibody, a humanized antibody, or a mutant thereof comprising the CDR region of the anti-TROP-2 antibody; and a human anti-TROP-2 antibody 2.
  • TROP-2 has a role in tumor cells Signal transfer function.
  • TROP-2 antigen is overexpressed in various epithelial-derived cancers such as gastric cancer, lung cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer and esophageal cancer.
  • TROP-2 antigen is rarely expressed or not expressed in normal adult tissues, and is limited to cells in the epithelial region with a small amount of expression, and the expression level is also lower than that in cancer cells, indicating that TROP-2 is involved in tumor formation.
  • the overexpression of TROP-2 in tumor tissue is closely related to the poor prognosis of the subjects and the metastasis of cancer cells, and also affects the overall survival rate of the subjects. Therefore, TROP-2 has become a compelling target in tumor molecular targeted therapy.
  • U.S. Patent No. 6,653,104 discloses an antibody (RS7) that was tested in an in vivo model using a radiolabeled antibody and showed antitumor activity in a nude mouse xenograft model, but no report of a naked antibody alone antitumor effect.
  • US Patent No. 7420040 also reports that isolated monoclonal antibodies produced by hybridoma cell lines AR47A6.4.2 or AR52A301.5 obtained by immunizing mice with human ovarian cancer tissue bind to TROP-2 antigen and are xenogeneic in nude mice Shows antitumor activity in a transplant model.
  • the present disclosure provides an anti-TROP-2 antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a mutant thereof, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • the heavy chain variable region comprises at least one HCDR selected from the following sequences:
  • HCDR1 set forth in SEQ ID NO:4, HCDR2 set forth in SEQ ID NO:28, and HCDR3 set forth in SEQ ID NO:6; or
  • HCDR1 set forth in SEQ ID NO:4, HCDR2 set forth in SEQ ID NO:29, and HCDR3 set forth in SEQ ID NO:6; or
  • HCDR1 set forth in SEQ ID NO:4, HCDR2 set forth in SEQ ID NO:41, and HCDR3 set forth in SEQ ID NO:6; or
  • HCDR1 shown in SEQ ID NO:4, HCDR2 shown in SEQ ID NO:42, and HCDR3 shown in SEQ ID NO:6.
  • LCDR1 shown in SEQ ID NO:7 LCDR2 shown in SEQ ID NO:8, and LCDR3 shown in SEQ ID NO:9.
  • the anti-TROP-2 antibody its antigen-binding fragment or its mutant, wherein:
  • the heavy chain variable region comprises: HCDR1 shown in SEQ ID NO: 4, HCDR2 shown in SEQ ID NO: 26 and HCDR3 shown in SEQ ID NO: 6; and
  • the heavy chain variable region comprises: HCDR1 shown in SEQ ID NO: 4, HCDR2 shown in SEQ ID NO: 28 and HCDR3 shown in SEQ ID NO: 6; and
  • the light chain variable region comprises: LCDR1 shown in SEQ ID NO:7, LCDR2 shown in SEQ ID NO:8 and LCDR3 shown in SEQ ID NO:9.
  • the anti-TROP-2 antibody its antigen-binding fragment or its mutant, wherein:
  • the anti-TROP-2 antibody its antigen-binding fragment or its mutant, wherein:
  • the anti-TROP-2 antibody its antigen-binding fragment or its mutant, wherein:
  • the heavy chain variable region comprises: HCDR1 shown in SEQ ID NO: 4, HCDR2 shown in SEQ ID NO: 40 and HCDR3 shown in SEQ ID NO: 6; and
  • the anti-TROP-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof further comprises a mutant heavy chain constant region derived from human IgG1, IgG2 or IgG4.
  • the anti-TROP-2 antibody, antigen-binding fragment thereof, or mutant thereof further comprises an IgG1 heavy chain constant region introduced with 239D and 241L mutations.
  • the anti-TROP-2 antibody, its antigen-binding fragment or its mutant comprises a heavyweight selected from the following Chain variable regions: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO: 34, or a heavy chain variable region having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity thereto.
  • the anti-TROP-2 antibody, its antigen-binding fragment or its mutant has the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 19, or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% thereof, 95% or 99% identical heavy chain variable region, and light chain variable region shown in SEQ ID NO: 11, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% therewith or 99% identical light chain variable regions; or,
  • the anti-TROP-2 antibody, its antigen-binding fragment or its mutant has the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 20, or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% thereof, 95% or 99% identical heavy chain variable region, and light chain variable region shown in SEQ ID NO: 11, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% therewith or 99% identical light chain variable regions; or,
  • the anti-TROP-2 antibody, its antigen-binding fragment or its mutant has the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 31, or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% thereof, 95% or 99% identical heavy chain variable region, and light chain variable region shown in SEQ ID NO: 11, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% therewith or 99% identical light chain variable regions; or,
  • the anti-TROP-2 antibody, its antigen-binding fragment or its mutant has the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 32, or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% thereof, 95% or 99% identical heavy chain variable region, and light chain variable region shown in SEQ ID NO: 11, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% therewith or 99% identical light chain variable regions; or,
  • the anti-TROP-2 antibody, its antigen-binding fragment or its mutant has the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 33, or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% thereof, 95% or 99% identical heavy chain variable region, and light chain variable region shown in SEQ ID NO: 11, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% therewith or 99% identical light chain variable regions; or,
  • the anti-TROP-2 antibody, its antigen-binding fragment or its mutant has the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 34, or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% thereof, 95% or 99% identical heavy chain variable region, and light chain variable region shown in SEQ ID NO: 11, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% therewith or 99% identical light chain variable regions.
  • the anti-TROP-2 antibody its antigen-binding fragment or its mutant, wherein:
  • the anti-TROP-2 antibody or mutant thereof comprises the heavy chain set forth in SEQ ID NO: 21, or a heavy chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity thereto, and SEQ ID The light chain represented by NO: 15, or a light chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity therewith; or,
  • the anti-TROP-2 antibody or mutant thereof comprises the heavy chain shown in SEQ ID NO: 22, or a heavy chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity thereto, and SEQ ID The light chain represented by NO: 15, or a light chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity therewith; or,
  • the anti-TROP-2 antibody or mutant thereof comprises the heavy chain set forth in SEQ ID NO: 23, or a heavy chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity thereto, and SEQ ID The light chain represented by NO: 15, or a light chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity therewith; or,
  • the anti-TROP-2 antibody or mutant thereof comprises the heavy chain set forth in SEQ ID NO: 24, or a heavy chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity thereto, and SEQ ID The light chain represented by NO: 15, or a light chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity therewith; or,
  • the anti-TROP-2 antibody or mutant thereof comprises the heavy chain set forth in SEQ ID NO: 37, or a heavy chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity thereto, and SEQ ID The light chain represented by NO: 15, or a light chain having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identity therewith;
  • the present disclosure also relates to a host cell that transforms the above-mentioned expression vector.
  • IgG can be divided into different subclasses according to the difference in the amino acid composition of the hinge region and the number and position of disulfide bonds in the heavy chain.
  • IgG can be divided into IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • Light chains are classified into kappa chains or lambda chains by the difference in the constant region.
  • Each of the five classes of Ig can have a kappa chain or a lambda chain.
  • the antibody light chain variable region may further comprise a light chain constant region comprising human or murine ⁇ , ⁇ chains or variants thereof.
  • the antibody heavy chain variable region may further comprise a heavy chain constant region comprising human or murine IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 or variants thereof.
  • recombinant human antibody includes human antibodies prepared, expressed, created or isolated by recombinant methods, involving techniques and methods well known in the art, such as:
  • antigen-binding fragment refers to antigen-binding fragments and antibody analogs of antibodies, which generally include at least a portion of the antigen-binding or variable regions (e.g., one or more CDRs) of the parental antibody.
  • Antibody fragments retain at least some of the binding specificity of the parent antibody. Typically, antibody fragments retain at least 10% of the parent binding activity when the activity is expressed on a molar basis. Preferably, the antibody fragment retains at least 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% or 100% or more of the binding affinity of the parent antibody for the target.
  • antigen-binding fragments include, but are not limited to: Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragments, linear antibodies, single chain antibodies, Nanobodies, domain antibodies, and multispecific antibodies. Engineered antibody variants are reviewed in Holliger and Hudson, 2005, Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136.
  • the "Fc" region contains two heavy chain fragments comprising the CH1 and CH2 domains of the antibody.
  • the two heavy chain fragments are held together by two or more disulfide bonds and by hydrophobic interactions of the CH3 domains.
  • an "effective amount” includes an amount sufficient to ameliorate or prevent a medical condition or symptoms thereof.
  • An effective amount also means an amount sufficient to allow or facilitate diagnosis.
  • the effective amount for a particular subject or veterinary subject may vary depending on factors such as the condition being treated, the general health of the subject, the method, route and dosage of administration, and the severity of the side effect.
  • An effective amount can be the maximum dose or dosing regimen that avoids significant side effects or toxic effects.
  • the designed heavy chain and light chain variable region sequences are respectively connected with the IgG1 heavy chain constant region and light chain constant region sequences, and the connected human IgG1 heavy chain constant region sequences are as follows:
  • the designed heavy and light chain variable region sequences were ligated to the IgG1 heavy and light chain constant region sequences, respectively: the resulting exemplary heavy and light chain sequences were as follows (wherein HU6DL.R54, HU6DL.Y54, HU6DL .Q54, HU6DL.L54, HU6DL.T54, HU6DL.I54, HU6DL.F54, HU6DL.E54 and HU6DL.A54 heavy chains were derived from combining the sequences SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 are concatenated to sequence SEQ ID NO: 12, respectively):
  • the cDNA fragments were synthesized according to the amino acid sequences of the light and heavy chains of the above humanized antibodies, and the protein expression service was provided by Beijing Yiqiao Shenzhou Technology Co., Ltd., HEK293 cells were transiently transfected to express the HU6DL protein mutant, and size exclusion chromatography was used.
  • the purity of the detection antibody, its concentration and purity are shown in Table 6 below.
  • the ELISA sandwich method namely "antigen-antibody-HRP-labeled secondary antibody", was used to evaluate the difference in the affinity level of different anti-TROP-2 mutants for TROP-2 antigen.
  • TROP-2 his-tagged protein
  • DPBS pH 7.4 DPBS pH 7.4
  • PBST PBS pH7.4
  • BSA dissolved in PBST
  • Blocked at 37°C for 1 h washed 3 times with PBST
  • added to 100 ⁇ L/well the candidate antibody diluted by 10 times, 8 concentration gradients (initial concentration: 10 nM-1 ⁇ 10 -6 nM), 0.5% BSA as a negative control, Blocked at 37°C for 1 h, washed 3 times with PBST; added 1:10000 diluted goat anti-human IgG, Fc
  • each HU6DL mutation was calculated using the GraphPad PRISM 8.0 log (agonist) vs. response-viable slope (four-parameter) formula
  • the EC50 of the body's affinity for the antigen is shown in Table 7 below:
  • Example 7 Affinity experiment of HU6DL mutants on tumor cells
  • Gastric cancer cell NCI-N87 (purchased from the Chinese Academy of Sciences Cell Bank, TCHu130);
  • Non-small cell lung cancer cell HCC827 (purchased from the Chinese Academy of Sciences Cell Bank, TCHu153);
  • Bladder cancer cell SW780 (purchased from Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, TCHu219);
  • Bladder cancer cell RT4 (purchased from the Chinese Academy of Sciences Cell Bank, TCHu226);
  • Tumor cells in good growth state were treated with Accutase (Sigma, cat: A6964) digestion solution, single cell suspension was prepared with 2% FBS (DBPS, pH7.4 dilution) solution, and the cell density was adjusted to 1 ⁇ 10 6 cells/mL. Divide 100 ⁇ L/well into a 96-well V-shaped bottom plate, centrifuge at 300g ⁇ 5min at 4°C, discard the supernatant, add 10-fold, 10 concentration gradients (1000nM-1 ⁇ 10 -6 nM) diluted to 100 ⁇ L/well.
  • Candidate antibody solution incubated at 4°C for 1h;
  • each candidate antibody pair was calculated using the GraphPad PRISM 8.0 log (agonist) vs. response-viable slope (four-parameter) formula
  • the EC50 of tumor cell affinity is shown in Table 8 below:
  • Antibody endocytosis activity of HU6DL mutants on TROP-2 antigen-expressing tumor cell lines was evaluated by flow cytometry.
  • antibody endocytosis percentage (%) (MIF of treatment group-MFI of blank control group)/(MFI of 0min group-MFI of blank control group)*100%.
  • the endocytosis rate of HU6DL mutants detected by the above method is shown in Table 9 below:
  • sample liquid exchange and concentration If the sample protein concentration is lower than 5 mg/ml, or the salt concentration of the sample buffer is high, sample liquid exchange and concentration treatment are required to ensure that the protein concentration is around 5 mg/ml.
  • the salt concentration should be less than 50mM.
  • Non-reduced CE sample treatment add samples to the EP tube, the amount of protein in each sample is 50 ⁇ g, add 1 ⁇ l of 10kD internal standard (Protein Simple, 046-144), and add 2.5 ⁇ l of 250mM IAM (Sigma, I1149-5G), 1 ⁇ sample buffer (Protein Simple, 046-567) was added to a final volume of 50 ⁇ l.
  • the non-reducing purity is the corrected peak area percentage of the main peak
  • CA is always the sum of the corrected peak areas of the main peak and impurities.
  • Competing antibodies hRS7 and HU6DL were diluted to 100 ⁇ g/ml with PBST containing 0.5% BSA and added to the microtiter plate at 50 ⁇ l/well.
  • TROP-2His protein (Acro biosystems, cat# TR2-H5223) was diluted with PBST containing 0.5% BSA at the concentration corresponding to 2xEC80 or 2xEC90 affinity of TROP-2His protein to the coating antibody, and added to the microtiter plate at 50 ⁇ l/well middle. Incubate the microtiter plate at room temperature for 1 hour.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

涉及抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途。进一步地，涉及一种人源化的抗TROP-2抗体的突变体，以及包含抗TROP-2抗体突变体的药物组合物及其在制备用于治疗TROP-2介导的疾病或病症的药物中的用途和用于肿瘤检测和诊断中的用途。

Description

抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途
本申请要求2020年10月14日提交的专利申请(申请号202011099107.8)的优先权。
技术领域
本公开涉及一种抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体；包含所述抗TROP-2抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体或其突变体；以及包含人抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体的药物组合物；以及其作为抗癌药物的用途和检测或诊断肿瘤的用途。
背景技术
随着对肿瘤基因组学、蛋白组学及信号传导途径研究的不断深入，人们对肿瘤细胞的癌基因和抑癌基因的相互作用以及它们对肿瘤微环境的影响已经越来越清楚，这也使得针对肿瘤的特异性分子靶点设计抗肿瘤治疗新方案成为可能。
肿瘤的分子靶向治疗是一种有异于传统手术、放疗、化疗的新的治疗模式，优越性在于药物通常仅与相应的靶位结合，通过直接影响其靶位分子的功能，或所携带的物理或化学效应分子来达到杀伤或抑制目标细胞的作用。由于靶位明确，药物通常具有很高的选择性，既可有效杀伤或抑制靶细胞，又对正常组织细胞不产生或仅产生较小的毒副作用。因此，研制分子靶向药物成为肿瘤临床研究的热点。
滋养层细胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen 2，TROP-2)也被称为肿瘤相关的钙信号转导子2(TACSTD2)，是由TACSTD2基因编码的细胞跨膜糖蛋白。TROP-2由约323个氨基酸构成，其中信号肽包含26个氨基酸，胞外区包含248个氨基酸，跨膜区包含23个氨基酸，胞质区包含26个氨基酸。TROP-2细胞外结构域中存在4个非均质N结合糖基化位点，添加糖链后，表观分子量增加11至13KD。TACSTD基因家族中，细胞外结构域具有特征性的甲状腺球蛋白(TY)序列，通常认为其与癌细胞的增殖、浸润和转移有关。
截至目前，尚未鉴定出TROP-2的生理学上的配体，分子功能尚未阐明。但由于细胞内丝氨酸303位的残基通过蛋白激酶C(PKC，属于Ca 2+依赖性蛋白激酶)而被磷酸化，以及细胞内结构域具有PIP2结合序列，表明TROP-2具有肿瘤细胞中的信号传递功能。
大量临床研究和文献报道表明TROP-2抗原在胃癌、肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌和食道癌等多种上皮源癌中存在过度表达。TROP-2抗原在成年人正常组织中很少表达或不表达，仅限于上皮区域的细胞有少量表达，表达水平也比癌细胞中低，表明TROP-2与肿瘤形成有关。TROP-2在肿瘤组织中 的过表达与受试者的预后不良和癌细胞的转移密切相关，同时影响受试者的总生存率。因此，TROP-2已成为肿瘤分子靶向治疗中引人注目的靶标。
目前，虽然已经报道了多种TROP-2抗体的抗肿瘤效果的研究：
美国专利第5840854号报告了与细胞毒素缀合的抗TROP-2单克隆抗体(BR110)对人癌细胞株H3619、H2987、MCF-7、H3396及H2981的细胞毒性。
美国专利第6653104号中公开了一种抗体(RS7)，使用经放射性物质标记的抗体在体内模型中进行了试验，在裸小鼠异种移植模型中显示出抗肿瘤活性，但没有报告仅裸抗体时的抗肿瘤效果。
美国专利第7420040号还报道，由通过用人卵巢癌组织免疫小鼠而得的杂交瘤细胞株AR47A6.4.2或AR52A301.5产生的分离单克隆抗体与TROP-2抗原结合，并且在裸小鼠异种移植模型中显示抗肿瘤活性。
CN102827282A公开了一种人源抗TROP-2基因工程抗体IgG及其应用，体外试验结果表明该抗TROP-2抗体IgG对胰腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用。
CN104114580A公开了一种与TROP-2抗原特异性反应且在体内具有抗肿瘤活性的抗体(特别是人源化抗体)；以及产生该抗体的杂交瘤、该抗体与药剂的复合物、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒。
但是，要找到具有高度亲和性、高度特异性及强效细胞毒性或肿瘤杀伤/抑制/退行活性的单克隆抗体存在挑战。因此，开发良好的疗效、安全性高且适用于人类受试者的TROP-2抗体及其它免疫治疗剂仍然存在迫切需求。
发明内容
本公开提供了一种抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其包含重链可变区和轻链可变区。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
重链可变区包含至少1个选自以下序列所示的HCDR：
SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：6；
和
所述的轻链可变区包含至少1个选自以下序列所示的LCDR：
SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；
其中，SEQ ID NO：43为RIDPXDSETHYNQKFKD所示，所述X选自R、Y、Q、L、T、I、F、E或A的氨基酸残基。
本公开的一个优选的实施方案，所述的重链可变区HCDR2选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、或，SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，所述的抗体重链可变区包含：
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：26所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：27所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：28所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：29所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：30所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：39所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：40所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：41所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；或
SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：42所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述的轻链可变区包含：
SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：26所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：27所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：28所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：29所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：30所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：39所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：40所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：41所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述的重链可变区包含：SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：42所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3；以及
所述的轻链可变区包含：SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述的抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突变体的恒定区。
本公开的进一步优选的实施方案，所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体进一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的突变体重链恒定区。
本公开的进一步优选的实施方案，所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体进一步包含源自氨基酸突变后具有增强的ADCC毒性的IgG1的重链恒定区。
本公开的进一步优选的实施方案，所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体进一步包含引入239D和241L突变的IgG1重链恒定区。
本公开的进一步优选的实施方案，所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体进一步包含选自SEQ ID NO：12的重链恒定区。
本公开的进一步优选的实施方案，所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体进一步包含源自人κ链、λ链或其突变体的轻链恒定区。
本公开的进一步优选的实施方案，所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体进一步包含选自SEQ ID NO：13的轻链恒定区。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含选自以下的重链可变区：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的重链可变区。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含轻链可变区SEQ ID NO：11，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的轻链可变区。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体或其突变体包含选自如下的重链：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、 SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的全长重链。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体或其突变体包含轻链SEQ ID NO：15，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的全长轻链。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：16所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：17所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：18所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：19所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：20所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：31所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：32所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：33所示 的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体具有SEQ ID NO：34所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区。
本公开的一个优选的实施方案，所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：21所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：22所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：23所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：24所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：25所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：35所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：36所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：37所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；
所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：38所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链。
本公开还涉及一种多核苷酸，其编码上述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体。
本公开还涉及一种表达载体，其含有上述多核苷酸。
本公开还涉及一种宿主细胞，其转化上述的表达载体。
本公开还涉及一种优选的实施方案，所述的宿主细胞选自细菌、酵母菌或哺乳动物细胞；
本公开还进一步优选的实施方案，所述的宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、CHO细胞或HEK293细胞。
本公开还涉及一种生产以上所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体的方法，包括步骤：培养上述的宿主细胞，优选HEK293细胞；从培养物中分离抗体，优选从细胞培养液中分离抗体；以及对所述抗体进行纯化，优选以层析方法纯化抗体。
本公开还涉及一种药物组合物，其含有：上述的抗TROP-2抗体、抗原结合片段或其突变体，以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
本公开还涉及一种检测或诊断试剂盒，其含有：上述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体。
本公开还涉及一种上述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防TROP-2介导的疾病或病症。
本公开还涉及一种述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体在制备试剂中的用途，其中所述试剂用于检测、诊断、预后TROP-2介导的疾病或病症。
本公开还涉及一种优选的实施方案，上述的用途，其中：所述TROP-2介导的疾病或病症为癌症；优选地，所述TROP-2介导的疾病或病症为表达TROP-2的癌症；优选地，所述的癌症选自：乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
本公开还涉及一种优选的实施方案，上述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其用于治疗或预防TROP-2介导的疾病；所述疾病选自：乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
本公开还涉及一种优选的实施方案，上述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其用于检测、诊断、预后TROP-2介导的疾病；所述疾病选自：乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
本公开还涉及一种治疗或预防TROP-2介导的疾病的方法，包括步骤：向有此需要的受试者提供治疗有效量或预防有效量的上述任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体；或者向有此需要的受试者提供治疗有效量或预防有 效量的根据本公开的药物组合物；其中所述TROP-2介导的疾病选自乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本公开所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条重链和两条轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本公开中，所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本公开中，所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG 3、IgG 4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则和Kabat或ABM定义规则。
术语“TROP-2”包括天然表达的TROP-2的任何变体或同种型。本公开的抗体可与得自非人物种的TROP-2交叉反应。作为另一种选择，该抗体也可以是人TROP-2特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。TROP-2或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。优选地，抗TROP-2抗体靶向具有正常糖基 化模式的人源TROP-2。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如：
1.从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；
2.从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；
3.从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及
4.通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。
此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人TROP-2的单克隆抗体。制备时用TROP-2抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个示例性实施方案中，所述的鼠源TROP-2抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本公开的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括人源化抗体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将非人物种的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量非人蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应的缺点。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将第一物种抗体的可变区与第二物种抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻第一物种抗体所诱发的免疫应答反应。作为一个示例，建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后增强ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1重链恒定区。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少 部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、己共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
术语“单链抗体”是由抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过一段连接肽连接而成的单链重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。
术语“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
术语“与TROP-2结合”，指能与TROP-2(或其表位)相互作用。
术语“抗原结合位点”指本公开抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸形成、或由不相邻的氨基酸通过蛋白质的三级折叠而形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变 性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用人TROP-2作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10 -7M或甚至更小的平衡解离常数(K D)与预定的抗原(或表位)结合；并且抗体与预定抗原(或表位)结合的亲和力是其与预定抗原(或紧密相关的抗原)之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
术语“交叉反应”是指本公开的抗体与来自不同物种的TROP-2结合的能力。例如，结合人TROP-2的本公开的抗体也可以结合另一物种的TROP-2。交叉反应性是通过在结合测定(例如SPR和ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达TROP-2的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。优选地，相较于在无抑制或无阻断情况下配体结合时活性的正常水平或类型，对配体的抑制或阻断，降低或改变了活性的水平或类型。抑制和阻断也旨在包括：与抗TROP-2抗体接触时，与未与抗TROP-2抗体接触的配体相比，任何可测量的配体结合亲和力的降低。
术语“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括任何可测量的细胞生长的降低。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的剌激(即，被动或适应性的)。针对诱导CDC或ADCC的术语“诱导”是指剌激特定的直接细胞杀伤机制。
术语“ADCC”，即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体靶向的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，增强或降低降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰在抗体的重链恒定区进行突变。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。作为一个示例，可以用人TROP-2或其片段免疫小鼠，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。同样可以用常规方法制备抗原结合片段。用基因工程方法，在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区获得本公开的抗体或抗原结合片段。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站得到，或者从免疫球蛋白杂志， 2001ISBN012441351上获得。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。相应抗体的cDNA序列可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在FC区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
本公开的抗体指单克隆抗体。本公开所述的单克隆抗体(mAb)，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(如CDR-grafting)、或其它现有技术进行重组得到。
“施用administration”、“给予dosing”和“处理treatment”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“施用”、“给予”和“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指向受试者提供内用或外用治疗剂(如包含本公开的任一种抗体或其片段)，其中所述受试者具有一种或多种疾病症状，而所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，无论是通过诱导这类症状退化，还是通过抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度，在受治疗受试者(或受试者群体)中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个受试者的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学有效数目的受试者中应当显著减轻目标疾病症状。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症或其症状的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定受试者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变 化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。
“内源性”指根据背景在生物、细胞或人体内产生的物质。
“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸残基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，表述“转化体”和“转化细胞”包括原代细胞和由其衍生的培养物，而不考虑传代数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与原代细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗体或其抗原结合片段，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
在上下文中，如果没有明确指明，则单数形式“一个a”、“一one”或“所述the”还包括其对应的复数形式。
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：抗原准备
编码带His标签的人TROP-2(TROP-2-His)蛋白由SinoBiologics公司合成(10428-H08H)。
TROP-2-His序列：
Figure PCTCN2021123731-appb-000001
Figure PCTCN2021123731-appb-000002
实施例2：鼠杂交瘤及抗体序列的获得
用人抗原TROP-2-His进行动物免疫，共5只Balb/c和5只A/J小鼠，雌性，10周龄，使用Sigma完全弗氏佐剂(CFA)和Sigma不完全弗氏佐剂(IFA)，免疫原和免疫佐剂以1：1的比例充分混合乳化，制成稳定“油包水”液体；注射剂量25μg/200μL/小鼠。
表1.免疫方案
第1天 第一次免疫，完全弗氏佐剂。
第21天 第二次免疫，不完全弗氏佐剂。
第35天 第三次免疫，不完全弗氏佐剂。
第42天 采血和血清效价检测(3免血)
第49天 第四次免疫，不完全弗氏佐剂。
第56天 采血和血清效价检测(4免血)
对免疫小鼠血清使用如实施例3所述的间接ELISA法评估血清效价及结合细胞表面抗原的能力，对照效价检测情况(大于10万倍稀释度)决定启动细胞融合。选择血清效价、亲和力和FACS结合强的免疫小鼠进行一次终免疫后处死小鼠，取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合后铺板获得杂交瘤。通过间接ELISA筛选到目标杂交瘤，并通过有限稀释法建株为单克隆细胞株。得到的阳性抗体株进一步使用间接ELISA进行筛选，从而选定结合重组蛋白的杂交瘤。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA并反转录(PrimeScript TM Reverse Transcriptase，Takara #2680A)。将反转录得到的cDNA采用小鼠Ig-引物组(Novagen，TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序，最终得到鼠源抗体的序列。
鼠单抗M1的重链和轻链可变区序列如下：
M1 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000003
M1 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000004
表2.鼠单抗M1的重链和轻链可变区CDR序列
名称 序列 编号
HCDR1 NYWMN SEQ ID NO：4
HCDR2 RIDPNDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：5
HCDR3 SGFGSTYWFFDV SEQ ID NO：6
LCDR1 KASQDVSTAVA SEQ ID NO：7
LCDR2 SASYRYT SEQ ID NO：8
LCDR3 QQHYSTPLT SEQ ID NO：9
实施例3：抗体的体外结合活性检测方法
体外间接ELISA结合实验：
用pH7.4的PBS将TROP-2His蛋白(Sino Biological Inc.，cat# 10428-H08H)稀释至1μg/mL浓度，以100μL/孔的体积加入96孔高亲和力酶标板中，于4℃冰箱孵育过夜(16-20小时)。用PBST(pH7.4PBS含0.05％Tween-20)洗板4次后，加入用PBST稀释的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭液150μL/孔，室温孵育1小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板4次。
用含3％BSA的PBST稀释待测抗体，10μM起始，5倍梯度，9个剂量，以100μL/孔加到酶标板中，放于室温孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入100μL/孔用含3％BSA的PBST稀释的HRP标记羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室温孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入100μL/孔TMB显色底物(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，于室温避光孵育1分钟，加入100μL/孔终止溶液(Cell Signaling Technology，cat#7002S)终止反应，用酶标仪(BioTek，型号Synergy H1)在450nm处读取吸收值，分析数据。做浓度信号值曲线分析结果，如下表3所示：
表3.鼠抗体对人TROP-2抗原的亲和力(EC 50值)
鼠抗体 与人TROP-2 His抗原结合EC 50(nM)
M1 0.56
实施例4：小鼠抗体人源化实验
如本领域许多文献公示的方法进行鼠源抗人TROP-2单克隆抗体的人源化。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列，本公开将鼠源抗体M1进行人源化。
在所获得的鼠源抗体VH/VL CDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与人源抗体种系数据库比较，获得同源性高的人种系模板。
将鼠源抗体M1的CDR区移植到选择好的相应人源化模板上。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，经表达测试和回复突变数量对 比，选择出设计了人源化重链可变区HCVR和轻链可变区LCVR序列组合而成的抗体，序列如下：
HU6 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000005
HU6 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000006
将设计的重链和轻链可变区序列分别与IgG1重链恒定区和轻链恒定区序列连接，连接的人IgG1重链恒定区序列如下：
IgG1 C1
Figure PCTCN2021123731-appb-000007
将设计的重链和轻链可变区序列分别与IgG1重链和轻链恒定区序列连接，连接的人kappa链恒定区序列如下：
Ig kappa C
Figure PCTCN2021123731-appb-000008
连接后，得到的示例性重链和轻链序列如下：
HU6DL HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000009
Figure PCTCN2021123731-appb-000010
HU6DL LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000011
实施例5：HU6DL变体设计实验
人源化抗体HU6DL在HCDR2中具有N 54D 55S 56基序，易发生糖基化作用。通过计算机辅助技术对N54进行定点突变，在不影响其与抗原结合和自身热稳定性的情况下降低潜在的糖基化风险，得到抗体HU6DL的突变体HU6DL.R54、HU6DL.Y54、HU6DL.Q54、HU6DL.L54、HU6DL.T54、HU6DL.I54、HU6DL.F54、HU6DL.E54以及HU6DL.A54，其对应重链和轻链可变区如下：
HU6DL.R54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000012
HU6DL.R54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000013
HU6DL.Y54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000014
HU6DL.Y54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000015
HU6DL.Q54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000016
HU6DL.Q54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000017
Figure PCTCN2021123731-appb-000018
HU6DL.L54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000019
HU6DL.L54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000020
HU6DL.T54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000021
HU6DL.T54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000022
HU6DL.I54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000023
HU6DL.I54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000024
HU6DL.F54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000025
HU6DL.F54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000026
HU6DL.E54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000027
Figure PCTCN2021123731-appb-000028
HU6DL.E54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000029
HU6DL.A54 HCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000030
HU6DL.A54 LCVR
Figure PCTCN2021123731-appb-000031
将设计的重链和轻链可变区序列分别与IgG1重链恒定区和轻链恒定区序列连接：得到的示例性重链和轻链序列如下(其中，HU6DL.R54、HU6DL.Y54、HU6DL.Q54、HU6DL.L54、HU6DL.T54、HU6DL.I54、HU6DL.F54、HU6DL.E54和HU6DL.A54重链来自于将序列SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34分别连接于序列SEQ ID NO：12)：
HU6DL.R54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000032
HU6DL.R54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000033
HU6DL.Y54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000034
HU6DL.Y54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000035
HU6DL.Q54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000036
HU6DL.Q54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000037
HU6DL.L54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000038
Figure PCTCN2021123731-appb-000039
HU6DL.L54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000040
HU6DL.T54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000041
HU6DL.T54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000042
HU6DL.I54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000043
HU6DL.I54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000044
HU6DL.F54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000045
HU6DL.F54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000046
HU6DL.E54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000047
HU6DL.E54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000048
HU6DL.A54 HC
Figure PCTCN2021123731-appb-000049
HU6DL.A54 LC
Figure PCTCN2021123731-appb-000050
表4.HU6DL突变体的重链可变区HCDR2序列
名称 序列 编号
HU6DL.R54 RIDPRDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：26
HU6DL.Y54 RIDPYDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：27
HU6DL.Q54 RIDPQDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：28
HU6DL.L54 RIDPLDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：29
HU6DL.T54 RIDPTDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：30
HU6DL.I54 RIDPIDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：39
HU6DL.F54 RIDPFDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：40
HU6DL.E54 RIDPEDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：41
HU6DL.A54 RIDPADSETHYNQKFKD SEQ ID NO：42
表5.HU6DL突变体序列编号
Figure PCTCN2021123731-appb-000051
Figure PCTCN2021123731-appb-000052
根据以上各人源化抗体轻链和重链的氨基酸序列合成cDNA片段，由北京义翘神州科技有限公司提供蛋白表达服务，利用HEK293细胞瞬时转染表达HU6DL蛋白突变体，利用分子排阻色谱技术检测抗体的纯度，其浓度和纯度如下表6所示。
表6.HU6DL突变体的浓度和纯度
名称 浓度(mg/mL) 纯度(％)
HU6DL.R54 1.99 95.8
HU6DL.Y54 1.34 96.4
HU6DL.Q54 1.73 93.1
HU6DL.L54 1.36 94.9
HU6DL.T54 2.73 96.1
HU6DL.I54 2.00 95.5
HU6DL.F54 1.68 93.5
HU6DL.E54 1.56 95.6
HU6DL.A54 1.00 95.1
实施例6：HU6DL突变体对TROP-2抗原的亲和实验
1.实验目的：
利用ELISA夹心法，即“抗原-抗体-HRP标记二抗”评价不同抗TROP-2突变体对TROP-2抗原的亲和水平的差别。
2.实验步骤：
利用pH7.4的DPBS将TROP-2，his标签蛋白(SinoBiologics，Cat：10428-H08H)稀释为1μg/mL，于100μL/孔加入高亲和力96孔板内(Corning，Cat：3590)，4℃ 孵育过夜，次日，甩净TROP-2抗原溶液，于200μL/孔加入含有0.05％Tween 20 PBS pH7.4(PBST)溶液，洗涤3次，于200μL/孔2％BSA(溶解于PBST)，37℃封闭1h，PBST洗涤3次，于100μL/孔加入，按10倍，8个浓度梯度(起始浓度为10nM-1×10 -6nM)稀释的候选抗体，0.5％BSA作为阴性对照，37℃封闭1h，PBST洗涤3次；于100μL/孔，加入按1：10000稀释的羊抗人IgG，Fc-HRP(abcam，cat：ab97225)二抗溶液，37℃封闭1h，PBST洗涤3次；
于100μL/孔加入TMB(CST，Cat：7004P6)底物，室温反应3min至抗体最高浓度孔溶液的颜色变为深蓝色，于50μL/孔加入终止液(CST，Cat：7002P6)，终止反应，于450nm波长读取吸光度值(OD)。
3.数据处理：
以候选抗体的浓度对数值作为X轴坐标，OD450吸光度值为纵坐标，利用GraphPad PRISM 8.0log(激动剂)vs.响应-变量斜率(response-viable slope)(四参数)公式计算每个HU6DL突变体对抗原亲和的EC 50。HU6DL突变体对人TROP-2抗原的亲和力(EC 50)如下表7所示：
表7.HU6DL突变体对人TROP-2抗原的亲和力(EC 50)
名称 TOP OD 450 亲和力EC 50(nM)
HU6DL.R54 2.05 0.052
HU6DL.Y54 1.93 0.051
HU6DL.Q54 1.91 0.086
HU6DL.L54 1.96 0.048
HU6DL.T54 1.90 0.052
HU6DL.I54 1.96 0.063
HU6DL.F54 1.93 0.067
HU6DL.E54 1.96 0.064
HU6DL.A54 2.07 0.062
4.实验结论：
以上数据显示，本公开HU6DL各突变体对人TROP-2抗原具有良好的亲和力。
实施例7：HU6DL突变体对肿瘤细胞的亲和实验
1.实验目的：
利用流式细胞术评价HU6DL突变体对表达TROP-2抗原的肿瘤细胞系的亲和水平差异。
2.实验试剂：
胃癌细胞NCI-N87(购自中科院细胞库，TCHu130)；
非小细胞肺癌细胞HCC827(购自中科院细胞库，TCHu153)；
膀胱癌细胞SW780(购自中科院细胞库，TCHu219)；
膀胱癌细胞RT4(购自中科院细胞库，TCHu226)；
3.实验步骤：
利用Accutase(Sigma，cat：A6964)消化液处理生长状态良好的肿瘤细胞，以2％FBS(DBPS，pH7.4稀释)溶液制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×10 6细胞/mL。于100μL/孔均分至96孔V型底板，300g×5min，4℃离心，弃上清，于100μL/孔加入以10倍，10个浓度梯度(1000nM-1×10 -6nM)稀释的候选抗体溶液，4℃孵育1h；
300g×5min，4℃离心，洗涤2次，于100μL/孔加入以5μL/10 6细胞比例稀释好的小鼠抗人IgG Fc，PE标记二抗(Biolegend，cat：409304)溶液，4℃孵育1h；300g×5min，4℃离心，洗涤2次，加入70μL 2％FBS溶液重悬细胞，于ZE5流式细胞仪(Bio-Rad，ZE5)检测PE通道的平均荧光强度(MFI)。
4.数据处理：
以突变体抗体的浓度对数值作为X轴坐标，MFI为纵坐标，利用GraphPad PRISM 8.0log(激动剂)vs.响应-变量斜率(response-viable slope)(四参数)公式计算每个候选抗体对肿瘤细胞亲和的EC 50，如下表8所示：
表8.HU6DL突变体对NCI-N87、HCC827、SW780和RT4肿瘤细胞的亲和力(EC 50)
Figure PCTCN2021123731-appb-000053
5.实验结论：
以上数据显示，本公开HU6DL各突变体对NCI-N87、HCC827、SW780和RT4肿瘤细胞均具有良好的亲和力。
实施例8：HU6DL突变体介导的TROP2内吞实验
1.实验目的：
利用流式细胞术评价HU6DL突变体在TROP-2抗原表达的肿瘤细胞系上的抗体内吞活性。
2.实验步骤：
利用Accutase(Sigma，cat：A6964)消化液处理生长状态良好的胃癌细胞NCI-N87(购自中科院细胞库，TCHu130)，以2％FBS(DBPS，pH7.4稀释)溶液制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×10 7个细胞/mL。于100μL/孔均分至96孔V型底板，加入终浓度为20μg/mL的候选抗体溶液，混匀，4℃孵育1h；
300g×5min，4℃离心，于100μL/孔加入以5μL/10 6细胞比例稀释好的小鼠抗人IgG Fc，PE标记二抗(Biolegend，cat：409304)溶液，4℃孵育1h；
300g×5min，4℃离心，洗涤2次，1mL预温的完全培养基重悬细胞沉淀，分为四等份，分别设为0min组、空白组、30min组、120min组；取出0min及空白对照置于冰上，其余放置于37℃培养箱，分别内吞30min、120min，在相应时间点取出对应的组，置于冰上预冷5min，所有处理组离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，用FACS buffer洗涤一次，弃上清；除0min组外所有处理组加入250μL strip buffer，室温孵育8min，离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS buffer洗涤两次，去上清，每组样品加入80μL2％FBS重悬细胞，于ZE5流式细胞仪(Bio-Rad，ZE5)检测待测样品荧光信号。
3.数据处理：
按照此公式计算每个候选抗体的内吞效率：抗体内吞百分率(％)＝(处理组MIF-空白对照组MFI)/(0min组MFI-空白对照组MFI)*100％。采用上述方法检测HU6DL突变体的内吞率如下表9所示：
表9.HU6DL突变体在NCI-N87细胞上的内吞效率
Figure PCTCN2021123731-appb-000054
4.实验结论：
以上数据显示，本公开HU6DL突变体介导的TROP-2蛋白在胃癌细胞NCI-N87中的具有良好的内吞作用。
实施例9：HU6DL突变体杂质成分的检测
1.实验目的：利用毛细管电泳仪基于Maurice-nrCE-SDS法检测，并比较突变后的抗体中杂质峰的含量及变化水平。
2.实验步骤
2.1.样品制备：
(1)样品换液和浓缩：若样品蛋白浓度低于5mg/ml，或者样品缓冲液的盐浓度较高，需进行样品换液以及浓缩处理，保证蛋白浓度在5mg/ml左右，样品中的盐浓度应小于50mM。
(2)非还原CE样品处理：向EP管中加入样品，每个样品的蛋白取用量为50μg，加入1μl的10kD内标(Protein Simple，046-144)，加入2.5μl的250mM  IAM(Sigma，I1149-5G)，加入1×样本缓冲液(Protein Simple，046-567)至终体积为50μl。
(3)振荡混匀后，70℃加热孵育10min，之后取出，于冰上孵育5min，冷却后于12000rpm离心5min。离心后取35μl上清转移至仪器匹配的96孔中，之后于1000rpm离心5min，将96孔样品板的放入Maurice(Protein Simple)中，准备上样分析。
2.2.上机检测
打开仪器以及软件，按照仪器操作步骤，进行仪器自检，安装毛细管卡盒，准备相应的试剂放入仪器的相应位置。根据仪器操作步骤，设置相应的参数，进行非还原CE分析。样品序列设置，根据样品名称编辑相应的序列，每个序列的样品数量不超过48个。序列编辑完成后，点击start开始序列检测。
利用如下公式计算样品主峰和杂质峰的含量。
Figure PCTCN2021123731-appb-000055
注：
公式中非还原纯度为主峰修正峰面积百分比；
CA 主峰为主峰的修正峰面积；
CA 总为主峰和杂质的修正峰面积之和。
3.实验结果：
表10.杂质成分的检测
样品 主峰含量(％) 杂质锋含量(％)
HU6DL.T54 93.62 N/A
HU6DL 84.78 4.72
以上数据显示，样品HU6DL.T54的主峰含量达到93.62％，未检出杂质。实验结果表明：针对HU6DL的HCDR2中N 54D 55S 56基序易发生糖基化作用，通过对N54进行定点突变，能够有效降低糖基化杂质，并获得较好的纯度。
实施例10：人源化抗体与抗原的竞争性结合
1.实验目的：研究不同抗体与抗原的结合方式和结合位点，采用竞争性结合实验。
2.实验步骤
用pH7.4的PBS将包被抗体hRS7和HU6DL突变体稀释至1μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔高亲和力酶标板中，于4℃冰箱孵育过夜(16-20小时)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05％Tween-20)洗板4次后，加入用PBST稀释的2％牛血清白蛋白(BSA)封闭液200μl/孔，室温孵育1小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板4次。
用含0.5％BSA的PBST稀释竞争抗体hRS7和HU6DL至100μg/ml，以50μl/孔加到酶标板中。分别以TROP-2His蛋白对包被抗体亲和力2xEC80或者2xEC90对应的浓度，用含0.5％BSA的PBST稀释TROP-2His蛋白(Acro biosystems，cat# TR2-H5223)，以50μl/孔加到酶标板中。将酶标板放于室温孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含0.5％BSA的PBST以1：5000稀释的anti-His HRP标记二抗(Sino Biological，cat# 105327-MM02T-H)，室温孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入100μl/孔TMB显色底物(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，于室温避光孵育1分钟，加入50μl/孔终止缓冲液(Cell Signaling Technology，cat#7002S)终止反应。
3.数据处理
用酶标仪(Thermo，型号Varioskan LUX)在450nm处读取吸收值，分析数据，如下表11所示。
表11.人源化抗体与hRS7的抗原竞争结合
人源化抗体 抑制率
hRS7 94.67％
HU6DL.T54 23.30％
4.实验结果
本发明的突变改造人源化抗体对hRS7抗体与TROP2蛋白的结合抑制率很低，提示本发明的突变改造人源化抗体与hRS7抗体不竞争结合相同的表位。

Claims (19)

  1. 一种抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：43所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，
    轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；
    优选地，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：30所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：26所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：27所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：28所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：29所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：39所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：40所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：41所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3；或，
    重链可变区包含SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：42所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的LCDR1、SEQ ID NO：8所示的LCDR2和SEQ ID NO：9所示的LCDR3。
  2. 根据权利要求1所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述的抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
  3. 根据权利要求1或2所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
    所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段或其突变体进一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突变体的恒定区；
    优选包含源自人IgG1、IgG2或IgG4突变体的重链恒定区；
    更优选包含引入239D和241L突变的IgG1重链恒定区；
    进一步优选包含选自SEQ ID NO：12的重链恒定区。
  4. 根据权利要求3所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体进一步包含源自人κ链、λ链或其突变体的轻链恒定区；优选包含选自SEQ ID NO：13的轻链恒定区。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含选自以下的重链可变区：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的重链可变区。
  6. 根据权利要求1-2和5中任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含轻链可变区SEQ ID NO：11，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的轻链可变区。
  7. 根据权利要求5或6所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体或其突变体包含选自如下的重链：SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的重链。
  8. 根据权利要求5或6所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中所述抗TROP-2抗体或其突变体包含轻链SEQ ID NO：15，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的轻链。
  9. 根据权利要求1-8中任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：20所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：16所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：17所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：18所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：19所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：31所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：32所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：33所示的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区；或，
    所述抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体包含SEQ ID NO：34所示 的重链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区、或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，其中：
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：25所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：21所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：22所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：23所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：24所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：35所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：36所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；或，
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：37所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链；
    所述抗TROP-2抗体或其突变体包含SEQ ID NO：38所示的重链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链，和SEQ ID NO：15所示的轻链、或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链。
  11. 一种多核苷酸，其编码权利要求1-10中任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体。
  12. 一种表达载体，其含有权利要求11所述的多核苷酸。
  13. 一种宿主细胞，其转化有权利要求12所述的表达载体，其中所述的宿主细胞选自细菌、酵母菌或哺乳动物细胞；优选大肠杆菌、毕赤酵母、CHO细胞或HEK293细胞。
  14. 一种生产权利要求1-10中任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体的方法，包括步骤：
    培养权利要求13所述的宿主细胞，优选HEK293细胞；
    从培养物中分离抗体，优选从细胞培养液中分离抗体；以及
    对所述抗体进行纯化，优选地，以层析方法纯化抗体。
  15. 一种药物组合物，其含有权利要求1-10中任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体，以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
  16. 一种检测或诊断试剂，其含有权利要求1-10任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体。
  17. 权利要求1-10任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体或者权利要求15所述的药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗或预防TROP-2介导的疾病或病症。
  18. 权利要求1-10任一项所述的抗TROP-2抗体、其抗原结合片段或其突变体或者权利要求16所述的检测或诊断试剂在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于检测、诊断、预后TROP-2介导的疾病或病症。
  19. 根据权利要求17或18所述的用途，其中：所述TROP-2介导的疾病或病症为癌症；
    优选地，所述TROP-2介导的疾病或病症为表达TROP-2的癌症；
    所述的癌症选自乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤或黑色素瘤。
PCT/CN2021/123731 2020-10-14 2021-10-14 抗trop-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途 WO2022078424A1 (zh)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2021362977A AU2021362977A1 (en) 2020-10-14 2021-10-14 Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof
KR1020237015300A KR20230086712A (ko) 2020-10-14 2021-10-14 항-trop-2 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 이의 돌연변이체, 및 이의 의학적 용도
CN202180051116.6A CN116234573A (zh) 2020-10-14 2021-10-14 抗trop-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途
JP2023521378A JP2023545742A (ja) 2020-10-14 2021-10-14 抗ｔｒｏｐ－２抗体、その抗原結合断片又はその変異体、及びそれらの医学的使用
CA3194725A CA3194725A1 (en) 2020-10-14 2021-10-14 Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof
EP21879467.5A EP4230656A1 (en) 2020-10-14 2021-10-14 Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof
US18/030,928 US20230374149A1 (en) 2020-10-14 2021-10-14 Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011099107.8 2020-10-14
CN202011099107 2020-10-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022078424A1 true WO2022078424A1 (zh) 2022-04-21

Family

ID=81207674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2021/123731 WO2022078424A1 (zh) 2020-10-14 2021-10-14 抗trop-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230374149A1 (zh)
EP (1) EP4230656A1 (zh)
JP (1) JP2023545742A (zh)
KR (1) KR20230086712A (zh)
CN (1) CN116234573A (zh)
AU (1) AU2021362977A1 (zh)
CA (1) CA3194725A1 (zh)
TW (1) TW202221038A (zh)
WO (1) WO2022078424A1 (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5840854A (en) 1995-10-19 1998-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibody BR110 and uses thereof
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
US7420040B2 (en) 2006-02-24 2008-09-02 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
CN102827282A (zh) 2012-09-04 2012-12-19 林红 人源抗Trop-2基因工程抗体IgG及其应用
CN104053672A (zh) * 2011-11-11 2014-09-17 瑞纳神经科学公司 Trop-2特异性抗体及其用途
CN104114580A (zh) 2011-11-22 2014-10-22 株式会社立富泰克 在体内具有抗肿瘤活性的抗人trop-2抗体
WO2015126548A1 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells
US20160313339A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
CN107406508A (zh) * 2014-12-04 2017-11-28 阿布鲁佐治疗诊断有限公司 人源化的抗trop‑2单克隆抗体及其应用
CN110317822A (zh) * 2019-07-19 2019-10-11 英威福赛生物技术有限公司 Trop2嵌合抗原受体、其t细胞及其制备方法和用途
CN111018992A (zh) * 2017-08-11 2020-04-17 百奥泰生物制药股份有限公司 Trop2阳性疾病治疗的化合物及方法
CN112243443A (zh) * 2019-05-10 2021-01-19 江苏豪森药业集团有限公司 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5840854A (en) 1995-10-19 1998-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibody BR110 and uses thereof
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
US7420040B2 (en) 2006-02-24 2008-09-02 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
CN104053672A (zh) * 2011-11-11 2014-09-17 瑞纳神经科学公司 Trop-2特异性抗体及其用途
CN104114580A (zh) 2011-11-22 2014-10-22 株式会社立富泰克 在体内具有抗肿瘤活性的抗人trop-2抗体
CN102827282A (zh) 2012-09-04 2012-12-19 林红 人源抗Trop-2基因工程抗体IgG及其应用
WO2015126548A1 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells
CN107406508A (zh) * 2014-12-04 2017-11-28 阿布鲁佐治疗诊断有限公司 人源化的抗trop‑2单克隆抗体及其应用
US20160313339A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
CN111018992A (zh) * 2017-08-11 2020-04-17 百奥泰生物制药股份有限公司 Trop2阳性疾病治疗的化合物及方法
CN112243443A (zh) * 2019-05-10 2021-01-19 江苏豪森药业集团有限公司 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN110317822A (zh) * 2019-07-19 2019-10-11 英威福赛生物技术有限公司 Trop2嵌合抗原受体、其t细胞及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The Immunoglobulin FactsBook", 2001
HOLLIGERHUDSON, NAT. BIOTECHNOL., vol. 23, 2005, pages 1126 - 1136
J. BIOL. CHEM, vol. 243, 1968, pages 3558
RHODA RAJI, FEDERICA GUZZO, LUISA CARRARA, JOYCE VARUGHESE, EMILIANO COCCO, STEFANIA BELLONE, MARTA BETTI, PAOLA TODESCHINI, SARA : "Uterine and ovarian carcinosarcomas overexpressing Trop-2 are sensitive to hRS7, a humanized anti-Trop-2 antibody", JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH, APSIT, vol. 30, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 106, XP055052404, ISSN: 17569966, DOI: 10.1186/1756-9966-30-106 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4230656A1 (en) 2023-08-23
TW202221038A (zh) 2022-06-01
CA3194725A1 (en) 2022-04-21
AU2021362977A1 (en) 2023-05-04
CN116234573A (zh) 2023-06-06
KR20230086712A (ko) 2023-06-15
JP2023545742A (ja) 2023-10-31
US20230374149A1 (en) 2023-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102662387B1 (ko) B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
WO2018161872A1 (zh) 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2018219327A1 (zh) 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
AU2019218319A1 (en) Anti-B7-H4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
CN112243443B (zh) 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US20210363266A1 (en) Anti-4-1bb antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
US20210238294A1 (en) Human il-4r binding antibody, antigen binding fragment thereof, and medical use thereof
CN113227148B (zh) 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2021213245A1 (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
JP2020532279A (ja) 抗ｇｉｔｒ抗体、その抗原結合性断片、およびその医薬用途
US20220251228A1 (en) Anti-bcma antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
EP4070816A1 (en) Anti-gdf15 antibody
WO2022078490A1 (zh) 抗erbb3抗体或其抗原结合片段及其医药用途
WO2022078424A1 (zh) 抗trop-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途
TWI836070B (zh) 抗trop-2抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
US20170183401A1 (en) Hypoglycemic agent containing anti-ang2 antibody
WO2021209066A1 (zh) 特异性抗原结合分子，其制备方法及医药用途
RU2819660C2 (ru) Антитело к BCMA, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
TWI840399B (zh) 結合人il-4r的抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
WO2022144025A1 (zh) 一种抗erbb3受体的抗体或其抗原结合片段及其医药用途
CN115998900A (zh) 抗trop-2抗体药物偶联物及其医药用途
CN116568707A (zh) 一种抗体药物偶联物及其医药用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21879467

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3194725

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023521378

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20237015300

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

Ref document number: 2021362977

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20211014

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021879467

Country of ref document: EP

Effective date: 20230515