TWI836070B - 抗trop-2抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本申請涉及抗TROP-2抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本申請涉及包含所述抗TROP-2抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本申請涉及一種人源化的抗TROP-2抗體，及其在製備用於治療TROP-2介導的疾病或病症的藥物中的用途和用於腫瘤檢測和診斷中的用途。
Description
本申請涉及一種特異性地對人TROP-2受體具有免疫反應性的抗TROP-2抗體、及其抗原結合片段、包含該抗TROP-2抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗TROP-2抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物用途和檢測或診斷腫瘤的用途。
隨著對腫瘤基因組學、蛋白組學及信號傳導途徑研究的不斷深入，人們對腫瘤細胞的癌基因和抑癌基因的相互作用以及它們對腫瘤微環境的影響已經越來越清楚，這也使得針對腫瘤的特異性分子靶點設計抗腫瘤治療新方案成為可能。
腫瘤的分子靶向治療是一種有異於傳統手術、放療、化療的新的治療模式，優越性在於藥物通常僅與相應的靶位結合，藉由直接影響其靶位分子的功能，或所攜帶的物理或化學效應分子來達到殺傷或抑制目標細胞的作用。由於靶位明確，藥物通常具有很高的選擇性，既可有效殺傷或抑制靶細胞，又對正常組織細胞不產生或僅產生較小的毒副作用。因此，研製分子靶向藥物成為腫瘤臨床研究的熱點。
人滋養層細胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2，TROP-2)是由TACSTD2基因編碼的細胞表面糖蛋白。TROP-2由323個胺基酸構成，其中信號肽26個胺基酸，胞外區248個胺基酸，跨膜區23個胺基酸，胞質區26個胺基酸。TROP-2細胞外結構域中存在4個非均質N結合糖基化位點，添加糖鏈後，表觀分子量增加11至13KD。TACSTD基因家族中，細胞外結構域具有特徵性的甲狀腺球蛋白(TY)序列，通常認為其與癌細胞的增殖、浸潤、轉移有關。
截至目前，尚未鑒定出TROP-2的生理學上的配體，分子功能尚未闡明，但由於細胞內絲胺酸303號殘基藉由屬於Ca2+依賴性蛋白激酶的蛋白激酶C(PKC)而磷酸化以及細胞內結構域具有PIP2結合序列，表明其具有腫瘤細胞中的信號傳遞功能。
大量臨床研究和文獻報導表明TROP-2在胃癌、肺癌、大腸、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、食道癌等多種上皮源癌腫中過度表現。與此相對，TROP-2在成年人正常組織中很少表現或不表現，僅限於上皮區域的細胞有少量表現，表現水平也比癌腫中低，表明TROP-2與腫瘤形成有關。TROP-2在腫瘤組織中的過表現與患者的預後不良和癌細胞的轉移密切相關，同時影響患者的總生存率。因此，TROP-2已成為腫瘤分子靶向治療中引人注目的靶標。
已經報告了幾種抗hTROP-2抗體的抗腫瘤效果的研究。
美國專利第5840854號報告了與細胞毒素結合的抗hTROP-2單株抗體(BR110)對人癌細胞株H3619、H2987、MCF-7、H3396及H2981的細胞毒性。
美國專利第6653104號中公開了一種抗體(RS7)，使用經放射性物
質標記的抗體在體內模型中進行了試驗，在裸小鼠異種移植模型中顯示出抗腫瘤活性，但沒有報告僅裸抗體時的抗腫瘤效果。
美國專利第7420040號還報道：由藉由用人卵巢癌組織免疫小鼠而得的融合瘤細胞株AR47A6.4.2或AR52A301.5產生的分離單株抗體與hTROP-2結合，並且在裸小鼠異種移植模型中顯示抗腫瘤活性。
CN102827282A公開了一種人源抗TROP-2基因工程抗體IgG及其應用，體外試驗結果表明該抗TROP-2抗體IgG對胰腺癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用。
CN104114580A公開了一種與hTROP-2特異性反應且在體內具有抗腫瘤活性的抗體(特別是人源化抗體)；以及產生該抗體的融合瘤、該抗體與藥劑的複合物、腫瘤的診斷用或治療用醫藥組成物、腫瘤的檢測方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒。
本發明提供了新的、具有增強的殺傷腫瘤細胞作用的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區，其中該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；以及該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所述的LCDR：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合
片段的重鏈可變區包含：
SEQ ID NO：3所示的HCDR1、
SEQ ID NO：4所示的HCDR2和
SEQ ID NO：5所示的HCDR3。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含：
SEQ ID NO：6所示的LCDR1、
SEQ ID NO：7所示的LCDR2和
SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含：
SEQ ID NO：3所示的HCDR1、
SEQ ID NO：4所示的HCDR2和
SEQ ID NO：5所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO：6所示的LCDR1、
SEQ ID NO：7所示的LCDR2和
SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段選自：鼠源抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結
合片段進一步包含源自經胺基酸突變後而具有增強的ADCC毒性的IgG1重鏈恆定區，在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含引入E239D和M241L突變的IgG1重鏈恆定區，在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含選自SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49的重鏈恆定區，在具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈或其變體的恆定區，在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含選自SEQ ID NO：50的恆定區。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其重鏈可變區是選自以下序列所示的重鏈可變區：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的重鏈可變區序列。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其輕鏈可變區是選自以下序列所示的輕鏈可變區：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的輕鏈可變區序列。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的重鏈選自含有如下序列的重鏈：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47，或
與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長重鏈序列。
在一些實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的輕鏈選自含有如下序列的輕鏈：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長輕鏈序列。
在一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：9所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：10所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：11所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：12所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：13所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：14所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：15所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：16所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：17所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：18所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：19所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：20所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：21所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：22所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：23所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：24所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈可變區為SEQ ID NO：25所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈可變區為SEQ ID NO：26所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：27所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：28所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：29所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：30所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：31所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：32所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：33所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：34所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：35所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：36所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：37所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：38所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：39所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：40所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：41所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：42所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：43所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：44所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：45所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：38所示。
在另一個具體的實施方案中，根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中：
該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：47所示；
該抗TROP-2抗體的輕鏈為SEQ ID NO：28所示。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種多核苷酸，其編碼本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種表現載體，其含有本申請的多核苷酸。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種宿主細胞，其導入或含有本申請的表現載體。
在一個具體的實施方案中，該宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌。
在另一個具體的實施方案中，該宿主細胞為酵母菌，較佳為畢赤酵母。
在另一個具體的實施方案中，該宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為CHO細胞或HEK293細胞。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種生產抗TROP-2抗體的方法，包括步驟：培養根據本申請的宿主細胞、從培養物中分離抗體、以及對該抗體進行純化。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種醫藥組成物，其含有根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種檢測或診斷試劑盒，其含有根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
根據本申請的一些實施方案，提供了根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防TROP-2介導的疾病或病症。
根據本申請的一些實施方案，提供了根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段在製備試劑中的用途，其中該試劑用於檢測或診斷TROP-2
介導的疾病或病症。
在一些實施方案中，該疾病或病症為癌症。
在一些實施方案中，該疾病或病症為表現TROP-2的癌症。
在具體的實施方案中，該疾病或病症選自：乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種治療或預防TROP-2介導的疾病的方法，包括步驟：向受試者提供治療有效量或預防有效量的根據本申請的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
根據本申請的一些實施方案，提供了一種治療或預防TROP-2介導的疾病的方法，包括步驟：向受試者提供治療有效量或預防有效量的根據本申請的醫藥組成物。
在一些實施方案中，該受試者是疑似患有、已經患有、易感於TROP-2介導的疾病，其選自乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
第1圖是抗體的ELISA體外結合實驗，顯示11個人源化抗TROP-2抗體與人TROP-2抗原的結合活性。
發明詳述
一、術語
為了更容易理解本申請，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本申請所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本申請所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本申請所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本申請中，本申請所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本申請中，本申請所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區
包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本申請所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則和Kabat或ABM定義規則(http://bioinf.org.uk/abs/)。
術語“抗原呈遞細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞。
術語“抗原呈遞”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語“TROP-2”包括由細胞天然表現的TROP-2的任何變體或同種型。本申請的抗體可與得自非人物種的TROP-2交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人TROP-2特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。TROP-2或其任何變體或同種型可從天然表現它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。較佳地，抗TROP-2抗體靶向具有正常糖基化模式的人源TROP-2。
術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表現、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：
1.從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融
合瘤中分離的抗體；
2.從經轉化以表現抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；
3.從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及
4.藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表現、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語“鼠源抗體”在本申請中為根據本領域知識和技能製備的對人TROP-2的單株抗體。製備時用TROP-2抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本申請一個較佳的實施方案中，該鼠源TROP-2抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本申請的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應的缺點。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下
降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再要據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後增強ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1重鏈恆定區。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區含有包含抗體的CH1和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩
個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由藉由兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本申請的術語“與TROP-2結合”，指能與人TROP-2相互作用。
本申請的術語“抗原結合位點”指本申請抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本申請所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人TROP-2作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
術語“交叉反應”是指本申請的抗體與來自不同物種的TROP-2結合的能力。例如，結合人TROP-2的本申請的抗體也可以結合另一物種的TROP-2。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表現TROP-2的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振
(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗TROP-2抗體接觸時，與未與抗TROP-2抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本申請中所述的“ADCC”，即抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，是指表現Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，增強或降低降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人TROP-2或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到，或者從免疫
球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本申請工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表現與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本申請的抗體指單株抗體。本申請所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(如CDR-grafting)、或其它現有技術進行重組得到。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本申請的任一
種抗體，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本申請的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Studentt檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由......組成”或其變形表示包括所有該元件或元件組，並且視需要包括與該元件類似或不同性質的其它元件，該其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。
本申請所述的應用於某個對象的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑
和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或其抗原結合片段，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促
進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
以下結合實施例用於進一步描述本申請，但這些實施例並非限制著本申請的範圍。本申請實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1：抗原準備
編碼帶His標簽的人TROP-2(TROP-2-His)蛋白由SinoBiologics公司合成(10428-H08H)。
TROP-2-His序列：
實施例2：鼠融合瘤及抗體序列的獲得
用人抗原TROP-2-His進行動物免疫，共5隻Balb/c和5隻A/J小鼠，雌性，10周齡，使用Sigma完全弗氏佐劑(CFA)和Sigma不完全弗氏佐劑(IFA)，免疫原和免疫佐劑以1：1的比例充分混合乳化，製成穩定“油包水”液體；注射劑量25μg/200μL/小鼠。
表1.免疫方案
對免疫小鼠血清使用如實施例3所述的間接ELISA法評估血清效價及結合細胞表面抗原的能力，對照效價檢測情況(大於10萬倍稀釋度)決定啟動細胞融合。選擇血清效價、親和力和FACS結合強的免疫小鼠進行一次終免疫後處死小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合後鋪板獲得融合瘤，藉由間接ELISA篩選到目標融合瘤，並藉由有限稀釋法建株為單株細胞株。得到的陽性抗體株進一步使用間接ELISA進行篩選，從而選定結合重組蛋白的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA並反轉錄(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara#2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用小鼠Ig-引物組(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序，最終得到鼠源抗體的序列。
鼠單抗M1的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
M1 HCVR
M1 LCVR
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFAGSGYGTDFTFTISSVQTEDLTVYHCQQHYSTPLTFGPGTRLELK SEQ ID NO：2
表2.鼠單抗M1的重鏈和輕鏈可變區CDR序列
實施例3：抗體的體外結合活性檢測方法
(1)體外間接ELISA結合實驗：
用pH7.4的PBS將TROP-2 His蛋白(Sino Biological Inc.，cat# 10428-H08H)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。
用含3%BSA的PBST稀釋待測抗體，10μM起始，5倍梯度，9個
劑量，以100μl/孔加到酶標板中，放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3%BSA的PBST稀釋的HRP標記羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔終止溶液(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析數據。做濃度信號值曲線分析結果，如下表3所示：
表3.鼠抗體對人TROP-2抗原的親和力(EC50值)
(2)體外細胞結合實驗：
收集培養好的TROP-2高表現細胞(過表現TROP-2的CHO或293細胞和表現TROP-2的腫瘤細胞，如HCC-827、MDA-MB-468等)，調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。1200g，5min離心，去上清，添加100ul已梯度稀釋的抗體溶液或小鼠免疫血清，4℃度孵育60min；1200g，5min離心，去上清，PBS洗細胞2次後，添加螢光標記二抗(PE-GAM或PE-GAH)100ul每孔，4℃度孵育60min。1200g，5min離心去上清。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞計數儀檢測信號，並作濃度曲線分析結果。
實施例4：小鼠抗體人源化實驗
鼠源抗人TROP-2單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體
的同源性選擇人種抗體序列，本申請將鼠源抗體M1進行人源化。
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。
將鼠源抗體M1的CDR區移植到選擇好的相應人源化模板上。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，經表現測試和回復突變數量對比，選擇出設計了人源化重鏈可變區HCVR和輕鏈可變區LCVR序列組合而成的抗體，序列如下：
HU1 HCVR
HU1 LCVR
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTRIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：10
HU2 HCVR
HU2 LCVR
ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：12
HU3 HCVR
HU3 LCVR
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：14
HU4 HCVR
HU4 LCVR
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：16
HU5 HCVR
HU5 LCVR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLFIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：18
HU6 HCVR
HU6 LCVR
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLFIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：20
HU7 HCVR
HU7 LCVR
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：22
HU8 HCVR
HU8 LCVR
HU9 HCVR
HU9 LCVR
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：26
將設計的重鏈和輕鏈可變區序列分別與IgG1重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列連接，連接的人IgG1重鏈恆定區序列如下：
IgG1 C1
IgG1 C2
將設計的重鏈和輕鏈可變區序列分別與IgG1重鏈和輕鏈恆定區序列連接，連接的人kappa鏈恆定區序列如下：
Ig kappa C
連接後，得到的示例性重鏈和輕鏈序列如下(其中，HU1-HU9重
鏈來自於將序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25分別連接於序列SEQ ID NO：49；HU6DL和HU10重鏈來自於將序列SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：9分別連接於序列SEQ ID NO：48)：
HU1 HC
HU1 LC
HU2 HC
HU2 LC
HU3 HC
HU3 LC
HU4 HC
HU4 LC
HU5 HC
HU5 LC
HU6 HC
HU6 LC
HU7 HC
HU7 LC
HU8 HC
HU8 LC
HU9 HC
HU9 LC
HU6DL HC
HU6DL LC
HU10 HC
HU10 LC
根據以上各人源化抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表現載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表現載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。收取細胞培養液，離心過濾後上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.70.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，得到本申請的人源化抗體蛋白，其濃度和純度如下表5所示。
表5.各人源化抗體的濃度和純度
實施例5：體外結合親和力和動力學實驗：
使用實施例3(1)中所述的體外間接ELISA結合實驗測定的各人源化抗體對人TROP-2抗原的親和力(EC50)如下表6所示：
表6.各人源化抗體對人TROP-2抗原的親和力(EC50)
為檢測各人源化抗體與腫瘤細胞上的靶標蛋白TROP-2的結合能力，使用實施例3(2)中所述的體外細胞結合實驗測定的各人源化抗體對HCC827腫瘤細胞(非小細胞肺癌)的親和力(EC50)如下表7所示：
使用實施例3(2)所述的體外細胞結合實驗測定的各人源化抗體對MAB-MB-468腫瘤細胞的親和力(EC50)(乳腺癌，浸潤型導管癌)如下表8所示：
實施例6：人源化抗體介導的腫瘤細胞殺傷作用
人源化抗體可以從多個方面發揮對腫瘤細胞的殺傷作用，其中之一是介導免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。為檢測本發明人源化抗體介導的免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，採用人外周血單個核細胞(PBMC)與HCC827腫瘤細胞(非小細胞肺癌)共培養的系統進行評估。收集HCC827細胞，離心計數後用完全培養基調整細胞密度為0.44×106個/mL，鋪於白色96孔板中間60個孔，每孔90μL，細胞數為40000。收集商業化的人PBMC細胞，離心計數後用完全培養基調整細胞密度為2.2×106個/mL，鋪於已有HCC827細胞的白色96孔板中間60個孔，
每孔90μL，細胞數為200000。其餘邊孔加入200μL PBS，細胞板放入37℃，5%CO2培養箱培養過夜。實驗第二天，用PBS在96孔V型底板中配製人源化抗體溶液，濃度為1000nM起始，3倍稀釋，9個濃度，配製完成後加入到白色96孔板中，每孔20μL，兩複孔，將細胞板放入37℃，5%CO2培養箱中繼續培養72小時。實驗第五天，檢測讀數：取出細胞培養板，平衡至室溫後，每孔加入50μL CTG溶液(Promega G7573)，振盪混勻後放於暗處靜置10分鐘後，使用酶標儀的發光程序進行檢測。實驗結果如下表9所示：
表9.人源化抗體介導的對腫瘤細胞的殺傷作用
採用同樣方法測定HU6抗體對HCC827腫瘤細胞的殺傷作用，結果顯示最高劑量殺傷效果為52.3%。
實施例7：人源化抗體介導的TROP2內吞
為研究人源化抗體介導的TROP-2蛋白在腫瘤細胞中的內吞，將SW780細胞使用胰酶消化，收集細胞並用預冷的PBS重新懸浮，調整細胞濃度為1×106個/mL。取EP管，加入1mL細胞懸液，1500rpm離心5分鐘後去上清，加入1mL已經配製好的待測抗體重新懸浮細胞，抗體的終濃度均為20μg/ml，4度搖床孵育1h，離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，PBS洗滌兩次，去上清。每管加入100μL
螢光二抗工作液重新懸浮細胞，4℃搖床孵育30min，離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，PBS洗滌兩次，去上清。每管加入1.0mL預熱的SW780細胞完全培養基重新懸浮細胞並混勻後，分裝為4管，每管200μL，分別為0min組，blank組，30min組和2h組，取出0min及blank置於冰上，其餘放置於37℃培養箱，分別內吞30min、2h，在不同相應時間點取出1管，置於冰上預冷5min，所有處理組離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，用PBS洗滌一次，去上清。除0min組外所有處理組的管中加入250μL strip buffer，室溫孵育8min，離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，PBS洗滌兩次，去上清。所有處理組加入100μL免疫染色固定液，4℃放置30min以上，上機用流式細胞儀DxFlex進行檢測。從0min組的管中，取200μl，直接加免疫染色固定液。從blank組取200μl，直接加strip buffer和加免疫染色固定液。上機用流式細胞儀DxFlex進行檢測。數據統計和分析：30min平均內吞百分比(%)=(30min組MIF-blank組MFI)/(0min組MFI-blank組MFI)*100%，2h平均內吞百分比(%)=(2h組MIF-blank組MFI)/(0min組MFI-blank組MFI)100%。採用上述方法檢測人源化抗體的內吞百分比如下表10所示：
表10.人源化抗體介導的TROP-2蛋白內吞
實施例8：人源化抗體與抗原的競爭性結合
研究不同抗體與抗原的結合方式和結合位點，通常採用競爭性結合實驗。用pH7.4的PBS將hRS7抗體蛋白稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的2%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。
用含2%BSA的PBST稀釋待測抗體至100μg/ml，以50μl/孔加到酶標板中。用含2%BSA的PBST稀釋TROP-2His蛋白(Sino Biological Inc.，cat# 10428-H08H)，以50μl/孔加到酶標板中。將酶標板放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含2%BSA的PBST稀釋的anti-HisHRP標記二抗(Abcam，cat#ab197049)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔Stop Solution(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析數據，如下表所示。本發明的人源化抗體對hRS7抗體與TROP2蛋白的結合抑制率很低，提示本發明的人源化抗體與hRS7抗體不競爭結合相同的表位。
表11.人源化抗體與hRS7的抗原競爭結合
<110> 上海翰森生物醫藥科技有限公司
江蘇豪森藥業集團有限公司
<120> 抗TROP-2抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
<130> 702040CPCT
<150> 2019103895872
<151> 2019-05-10
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(121)
<223> 鼠單抗M1的重鏈可變區
<400> 1
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> 鼠單抗M1的輕鏈可變區
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(5)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(17)
<223> 鼠單抗M1的HCDR2
<400> 4
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(12)
<223> 鼠單抗M1的HCDR3
<400> 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(11)
<223> 鼠單抗M1的LCDR1
<400> 6
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 鼠單抗M1的LCDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> HU1 LCVR
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<212> PRT
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<221> 鏈
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 鏈
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<223> HU7 LCVR
<400> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 鏈
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<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(214)
<223> HU8 LC
<400> 42
<210> 43
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(43)
<223> HU9 HC
<400> 43
<210> 44
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(214)
<223> HU9 LC
<400> 44
<210> 45
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(451)
<223> HU6DL HC
<400> 45
<210> 46
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(331)
<223> 帶His標簽的人TROP-2
<400> 46
<210> 47
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(451)
<223> HU10 HC
<400> 47
<210> 48
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(330)
<223> IgG1 C1
<400> 48
<210> 49
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(330)
<223> IgG1 C2
<400> 49
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> Ig kappa C
<400> 50
Claims (24)
- 一種抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段具有SEQ ID NO：19所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體為人源化抗體。
- 如申請專利範圍第2項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自胺基酸突變後具有增強的ADCC毒性的IgG1的重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含引入E239D和M241L突變的IgG1重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含選自SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49的重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段， 其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含選自SEQ ID NO：50的輕鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第9項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗TROP-2抗體的重鏈為SEQ ID NO：45，輕鏈為SEQ ID NO：38。
- 一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
- 一種表現載體，其含有如申請專利範圍第11項所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其轉化如申請專利範圍第12項所述的表現載體。
- 如申請專利範圍第13項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞選自細菌、酵母菌或哺乳動物細胞。
- 如申請專利範圍第14項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞選自大腸桿菌、畢赤酵母或CHO細胞或HEK293細胞。
- 一種生產抗TROP-2抗體的方法，包括步驟：培養申請專利範圍第13至15中任一項所述的宿主細胞；從培養物中分離抗體；以及對該抗體進行純化。
- 一種醫藥組成物，其含有：如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合 片段、以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種檢測或診斷試劑盒，其含有：如申請專利範圍第1至10項任一項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
- 一種申請專利範圍第1至10項任一項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段在製備藥物中的用途，其中，該藥物用於治療或預防TROP-2介導的疾病或病症。
- 一種申請專利範圍第1至10項任一項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段在製備試劑中的用途，其中，該試劑用於檢測、診斷、預後TROP-2介導的疾病或病症。
- 如申請專利範圍第19或20項所述的用途，其中，該TROP-2介導的疾病或病症為癌症。
- 如申請專利範圍第21項所述的用途，其中，該癌症選自：乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
- 如申請專利範圍第1至10項任一項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防TROP-2介導的疾病；該疾病選自：乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
- 如申請專利範圍第1至10項任一項所述的抗TROP-2抗體或其 抗原結合片段，其用於檢測、診斷、預後TROP-2介導的疾病；該疾病選自：乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
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