CN107108735A

CN107108735A - 新型egfrviii抗体和包含所述抗体的组合物

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Publication number: CN107108735A
Application number: CN201480084380.XA
Authority: CN
Inventors: 尹载烽; 柳珍相; 柳珍山; 李元燮; 金圣祐; 沈相烈; 卞相順; 李英爱; 李赫峻; 金度玧; 崔真熺
Original assignee: Pharmabcine Inc
Current assignee: Pharmabcine Inc
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: EP3239177A1; US20170327585A1; EP3239177A4; AU2014412643A1; AU2014412643B2; ES2871598T3; PT3239177T; US10597457B2; CA2968510A1; JP2018501783A; WO2016084993A1; JP6616833B2; CN107108735B; CA2968510C; DK3239177T3; EP3239177B1

Abstract

本发明涉及特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗体，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，宿主细胞，所述抗体的制备方法，以及用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。

Description

新型EGFRVIII抗体和包含所述抗体的组合物

技术领域

本发明涉及特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗体，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，制备所述抗体的方法，以及用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。

背景技术

EGFR(表皮生长因子受体；ErbB-1；人HER1)是在细胞表面表达的ErbB家族的受体酪氨酸激酶(RTK)，由范德堡大学的Stanley Cohen所发现。该受体的过度表达或过度活性突变表现为癌变(Zhang H.等，2007)。EGFR家族的受体(EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)以及Her 4(ErbB-4))在诸如EGF、TGF-α等的配体(在Her2的情况下无已知配体)中反应，形成同源二聚体或异源二聚体，并将激活信号传导到细胞。

由于二聚体的形成，如附图中所示的经自磷酸化通过MAPK、Akt或JNK的信号(Downward J.等，1984)被传导以激活细胞周期或细胞增殖(Oda K.等，2005)。EGFR的各结构域和磷酸化位点与图1中所示相同。

用于抑制肿瘤相关EGFR激活的各治疗剂已经问世，目前显示强抗癌效应。正在开发新型EGFR拮抗剂，以弥补诸如治疗剂相应的副作用、耐受性等的缺陷。目前开发中的EGFR拮抗剂的详细情况与图2中所示相同。

EGFR过度表达及突变以多种不同形式出现于肺癌、肛门癌以及多形性成胶质细胞瘤(GBM)。EGFRvIII突变常见于脑肿瘤，并反映手术治疗、放射治疗及化学治疗后的预后不良(Kuan CT等，2003)。重组形式的EGFR突变体具有特异性外显子的缺失或复制。重组形式的EGFR和EGFR突变体与图3中所示相同。

EGFRvIII是SEQ ID NO:1的EGFR变体，其是最常出现的，缺乏外显子2-7氨基酸，在50％或更多的终末病脑肿瘤患者中表达。EGFRvIII缺乏EGFRwt的氨基酸序列中的267个氨基酸，结合外显子1和8，产生作为新氨基酸的甘氨酸，诱导细胞内结构域磷酸化，显示持续活性，由此促进致癌作用(Downward J等，1984)。当然，EGFR的其他形式也可被靶向，但目前EGFRvIII被认为是作为抗癌靶的最合适的EGFR变体，许多研究和开发正在进行中。

具体地，在脑肿瘤中，细胞信号主要通过EGFRvIII的PI3K和AKT由主要信号传导途径传导。通过作为次要途径的Stat-3、AP-1或MAPK激活，其促进癌细胞增殖，抵抗程序性细胞死亡，血管发生，增加癌细胞穿透，形成癌干细胞，等等(Gan HK等，2013)。最近的研究已经报道了EGFRvIII在致癌作用中通过mTORC2激活NF-κB而起到重要作用(Stanley Cohen等，2012；Tanaka等，2011)。EGFRvIII激活相应的信号传导途径与图4中所示相同。

此外，由于EGFRvIII诱导c-Met磷酸化后的激活(Huang PH.等，2007)，当与c-Met抑制剂连同EGFR或EGFRvIII抑制剂一起应用和施用于患者时，可在降低高水平EGFRvIII患者化学治疗抗药性的同时改进功效。

在脑肿瘤中，EGFRvIII通常与EGFR野生型(WT)同时表达(Ekstrand等，1991)，由于EGFRvIII自身在EGFR基因扩增的肿瘤中表达(Biernat等，2004，Frederick等，2000)，认为单个的癌症细胞会同时进行相互作用的EGFRwt扩增和EGFRvIII表达。

EGFRvIII在脑肿瘤中以相对高频率表达，但是在其他癌中需要进一步的研究。最新的一项研究使用了被转化表达EGFRvIII的脑肿瘤细胞系，该究表明，使用EGFRvIII和EGFRwt的网络的确会具有被共同激活的可能性(Shia Q.等，PNAS,2012)。EGFRvIII和EGFRwt之间这样的相互作用需要再使用EGFRvIII加以证实，EGFRvIII通过异种移植模型、GBM球体细胞系或其他细胞系天然表达。

已有报道EGFR磷酸化EGFRvIII，导致STAT3/5激活途径，显著影响脑肿瘤进展(FanQW等，2013)。EGFRvIII二聚体形成显著影响信号转导的激活。由于EGFRwt表达增加，EGFRvIII磷酸化和激活提高。由此，认为形成EGFRwt二聚化的二聚化臂和激酶激活促进EGFRvIII激活。从在同位移植模型中当EGFRwt或HB-EGF的表达被抑制则EGFRvIII诱导的癌变被抑制的结果(Li L.等，2014)可以说明，围绕EGFRwt的激活途径在肿瘤发生中通过EGFRvIII激活起到重要作用。

目前，正开发的靶向EGFRvIII的治疗(脑)肿瘤的治疗剂可分为五类。第一类是一种通过使用传统EGFR治疗剂阻断EGFRwt和EGFRvIII的内部信号转导的方法。第二类是一种通过使用诸如ABT-806(mAb806,Abbott)的同时靶向EGFR和EGFRvIII的抗体抑制外部信号转导和受体之间相互作用的方法。第三类是开发抗体药物缀合物(ADC)形式的抗EGFRvIII抗体，如Amgen目前正在开发的AMG-595。第四类是嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T)形式可用作细胞免疫治疗剂。第五类是一种将EGFRvIII特异性14个氨基酸序列与匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)连接并将其作为EGFRvIII抗癌疫苗施用的方法。目前没有仅靶向EGFRvIII而不靶向EGFR的商业化抗癌药，如图6所示，有一种EGFRvIII疫苗CDX-110，目前由临床开发领先的Celldex Therapeutics开发。

在这些技术背景下，本发明的发明人制备了一种新型特异性结合EGFRvIII的抗体。具体地，他们证实了一种仅结合EGFRvIII而不结合EGFRwt的新型抗体，其可通过生成特异性结合EGFRvIII而不与EGFRwt交叉反应的抗体来制备，由此实现了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供新型的特异性结合EGFRvIII的抗体，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，其制备方法，以及用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。

本发明涉及结合包含SEQ ID NO:1氨基酸序列的表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗体，所述抗体不与野生型表皮生长因子受体(EGFR)交叉反应，其中，所述抗体特异性结合SEQ ID NO:1氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸区域。

本发明涉及一种编码所述抗体的核酸。

本发明涉及一种包含所述核酸的载体。

本发明涉及一种包含所述载体的宿主细胞。

本发明涉及一种制备所述抗体的方法，所述方法包括通过培养宿主细胞表达所述抗体。

本发明涉及一种用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。

本发明涉及一种通过将药理学有效量的所述抗体施用于有相应需要的个体治疗癌症或肿瘤的方法。

附图说明

图1显示EGFR的各结构域和磷酸化位点。

图2显示靶向EGFR受体的已知拮抗剂的开发进展。

图3是显示与EGFR重组形式的EGFR突变体的结构的示意图。

图4是显示EGFRvIII激活相应的信号转导流的示意图。

图5显示获自www.clinicaltrials.gov.的临床开发中的EGFRvIII靶向治疗剂候选系列。

图6a显示CHOK1-EGFRvIII单细胞系的受体表达的蛋白质印迹结果。

图6b显示U87MG-EGFRvIII单细胞系的受体表达的蛋白质印迹结果。

图7显示包含用于筛选EGFRvIII抗体的EGFRvIII特异性序列的肽的小珠淘选噬菌体ELISA结果。

图8显示证实了通过小珠淘选筛选(bead panning)的单噬菌体-抗体的抗原特异性结合能力的蛋白质印迹结果。

图9a显示证实在非还原性缓冲液中通过SDS-PAGE处理获得的IgG的结果。

图9b显示证实在还原性缓冲液中通过SDS-PAGE处理获得的IgG的结果。

图10显示使用ELISA人IgG克隆的抗EGFRvIII肽结合。

图11显示使用流式细胞术的人IgG克隆的EGFRvIII细胞系的结合特异性。

图12显示证实在抗EGFRvIII流式细胞术中人IgG浓度降低影响的结合能力的结果。

图13显示通过ELISA证实人IgG轻链变化相应的结合能力的结果。

图14显示通过流式细胞术证实人IgG轻链变化相应的结合能力的结果。

图15a显示通过使用U87MG 13的流式细胞术证实抗EGFRvIII人IgG的内化结果。

图15b显示通过使用CHOK1 22-2的流式细胞术证实抗EGFRvIII人IgG的内化结果。

具体实施方式

一方面，本发明涉及结合包含SEQ ID NO:1氨基酸序列的表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗体，所述抗体不与野生型表皮生长因子受体(EGFR)交叉反应，其中，所述抗体特异性结合SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸区域。各组成具体描述如下。

抗原EGFRvIII

如上所述，EGFRvIII是EGFR的缺失突变体，具有SEQ ID NO:1序列，其中，EGFR细胞外结构域的267个氨基酸缺失，同时接头处具有甘氨酸单个氨基酸取代。

本发明的发明人通过使用包含EGFRvIII肽特异性序列13mer的肽作为抗原制备抗体，以制备特异性结合EGFRvIII而不与EGFR野生型交叉反应的抗体。具体地，根据本发明所述的抗体可特异性结合SEQ ID NO:2LEEKKGNYVVTDHCSGGKN(N是生物素)序列，该序列中包含EGFRvIII肽特异性序列13mer、4mer的连接体和生物素。同时，具有TTACCDRII序列的肽，例如SEQ ID NO:3NEINPGNGHTNYNEKFKS(N是生物素)用作阻断非特异性结合的负抗原。由此，制备特异性结合EGFRvIII而不与EGFR野生型交叉反应的抗体。

抗体

本申请所用的术语“抗体”是指与特异性抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，表示用作特异性识别抗原的受体作用的蛋白分子，该术语可包括多克隆抗体、单克隆抗体、全抗体和抗体片段。此外，该术语还可包括嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、二价或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体。

全抗体是具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，各轻链通过二硫键与重链连接。全抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，IgG是亚类，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体片段是指具有结合抗原功能的片段，包括Fab、Fab'、F(ab')₂和F_v等。

在具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区(CH1域)的结构中，Fab具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同在于其具有铰链区，该铰链区在重链CH1结构域的C末端区至少包含一个半胱氨酸残基。当Fab'铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键时生成F(ab')₂抗体。

可变片段(Fv)是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链Fv(dsFv)通过二硫键连接到重链可变区和轻链可变区，单链Fv(scFv)通常经共价键通过肽连接体连接到重链可变区和轻链可变区。此类抗体片段可以通过使用蛋白水解酶获得(例如，可以通过使用木瓜蛋白酶限制和裂解全抗体获得Fab，可以通过使用胃蛋白酶裂解全抗体获得F(ab')₂片段)，并且可以通过基因重组技术制备(例如，设定编码抗体重链或其可变区的DNA和编码轻链或其可变区的DNA作为模板，使用引物通过PCR扩增它们，组合和扩增编码肽连接体的DNA和引物对，所述引物对被设置成连接重链及其可变区和轻链或其可变区各自末端)。

免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链均包含恒定区和可变区(该区域也称为“结构域”)。轻链和重链可变区包含被称为“互补决定区”(下文称为“CDR”)的三个可变区和四个框架区。该CDR主要负责结合到抗原的表位上。从N-末端开始按链的CDR通常被顺序称为CDR1、CDR2和CDR3，通过特异性CDR位于其中的链来鉴定。

本申请使用的术语“单克隆抗体”是指从基本相同的抗体组获得的具有单一分子组成的抗体分子，可对特异性表位表现出单一结合特异性和亲和力。

本申请使用的术语“人抗体”是指源于人免疫球蛋白的分子，其中构成抗体的所有氨基酸序列包括互补决定区和框架区均由人免疫球蛋白氨基酸序列组成。人抗体通常用于治疗人疾病，其优点在于：i)通过与人免疫系统更稳定地相互作用而更有效地破坏靶细胞，例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；ii)人免疫系统不会将该抗体识别为外来抗体；以及iii)即使以较小量较低频率施用较小量药物，人循环系统中的半衰期也与天然存在的抗体的半衰期相似。

鉴于如上所述，根据本发明所述的抗体是特异性结合EGFRvIII的单克隆抗体，其不仅对于EGFRvIII表现强亲和力和特异性，而且表现低免疫原性，这是因为其源自于人，由此适于治疗诸如癌症或肿瘤的疾病。

本申请使用的术语“特异性结合EGFRvIII的抗体”是指结合EGFRvIII而抑制EGFRvIII生物活性的抗体，该术语可与“抗EGFRvIII抗体”交换使用。此时，EGFRvIII的K_D可为例如10^-8或更少，优选10^-9或更少，更优选10^-10或更少。

本申请使用的术语“不与EGFR交叉反应”可指结合EGFR野生型的抗体和结合EGFRvIII的抗体不显示对于各抗原的交叉反应性。此时，不与EGFR交叉反应的抗体具有针对对EGFR野生型的抗体的K_D的，例如，10^-5或更多、优选10^-4或更多、更优选10^-3或更多。实际上，不与EGFR交叉反应的抗体可指这样一种抗体，即这种抗体不能以标准结合测定的非限制形式检测结合EGFR野生型的抗体。

在一种非限制性实施方式中，根据本发明所述的抗体可为，例如，实施例1中具体描述的，不与EGFR交叉反应的单克隆人抗体PA430、PD27、PD52以及PD10，结构上特定化并分离以特异性结合SEQ ID NO:1的EGFRvIII氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸区域。各抗体的重链CDR和轻链CDR在下列表1和表2中列出。

[表1]

[表2]

根据本发明所述的抗体可通过例如混合V_H和V_L序列来生成，所述V_H和V_L序列与表1和表2中所述的V_H CDR1、V_H CDR2及V_H CDR 3序列和V_L CDR1、V_L CDR2及V_L CDR 3序列在结构上相似，被设置为V_H/V_L配对的CDR1、CDR2以及CDR 3，可包括例如包含下列重链CDR的重链可变区：

包含选自SEQ ID NO:4-7的至少一种氨基酸序列的重链CDR1；

包含选自SEQ ID NO:8-11的至少一种氨基酸序列的重链CDR2；以及

包含选自SEQ ID NO:12-15的至少一种氨基酸序列的重链CDR3。

此外，根据本发明所述的抗体可包括轻链可变区，所述轻链可变区包含下列轻链CDR：

包含选自SEQ ID NO:16-19的至少一种氨基酸序列的轻链CDR1；

包含选自SEQ ID NO:20-23的至少一种氨基酸序列的轻链CDR2；以及

包含选自SEQ ID NO:24-27的至少一种氨基酸序列的轻链CDR3。

在一种实施方式中,根据本发明所述的抗体可特别包含下列表3中所述的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，或与它们具有同源性的序列：

[表3]

根据本发明所述的抗体可包含例如重链可变区，所述重链可变区包含与选自SEQID NO:28-31的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。该抗体可包括，即，SEQID NO:28-31的序列作为重链可变区，包含与选自SEQ ID NO:28-31的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性、优选至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同源性以及更优选100％同源性的序列的重链可变区。

此外，根据本发明所述的抗体可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自SEQID NO:32-35的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。该抗体可包括，即，SEQID NO:32-35的序列作为轻链可变区，包含与选自SEQ ID NO:32-35的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性、优选至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同源性以及更优选100％同源性的序列的轻链可变区。

具体地，根据本发明所述的抗体可包含选自下列序列的重链可变区和轻链可变区，表3中所述的V_H序列和V_L序列可通过混合V_H和V_L序列来生成，它们在结构上相似，可非限制性设置为V_H/V_L配对：

包含SEQ ID NO:28序列的重链可变区和选自SEQ ID NO:32-35的序列的轻链可变区；

包含SEQ ID NO:29序列的重链可变区和选自SEQ ID NO:32-35的序列的轻链可变区；

包含SEQ ID NO:30序列的重链可变区和选自SEQ ID NO:32-35的序列的轻链可变区；

包含SEQ ID NO:31序列的重链可变区和选自SEQ ID NO:32-35的序列的轻链可变区。

具体地，根据本发明所述的抗体可包含下列重链可变区和轻链可变区：

包含SEQ ID NO:28序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32序列的轻链可变区；

包含SEQ ID NO:29序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:33序列的轻链可变区；

包含SEQ ID NO:30序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:34序列的轻链可变区；

包含SEQ ID NO:31序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:35序列的轻链可变区。

另一方面，本发明涉及编码抗体的核酸。本申请所用的术语“核酸”可以在细胞内、细胞裂解物或者以部分纯的形式或基本纯的形式提供。当通过标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及其他本领域公知的技术从其他细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞的核酸或蛋白质)纯化时，核酸成为“分离的”或“基本纯的”。本发明的核酸可为例如DNA或RNA，可包含或不包含内含子序列。

在一非限制性实施方式中，根据本发明所述的编码V_H序列和V_L序列的核酸在表4中描述，可包含与选自SEQ ID NO:36-39的编码重链可变区的序列具有至少95％同源性的至少一种重链可变区编码序列，和/或可包含与选自SEQ ID NO:40-43的至少一种轻链可变区编码序列具有至少95％同源性的至少一种轻链可变区编码序列。该抗体与选自SEQ ID NO:36-39和/或SEQ ID NO:40-43的至少一种核酸序列具有至少95％同源性、优选至少98％同源性、更优选100％同源性。

[表4]

本发明可包括一种缀合物，其中，毒素、药物等与抗体连接。毒素或药物可包括任何靶化合物。这样的毒素的实例可为duocamycin,刺孢霉素，美登新(mytansine)或阿里他汀(auristatin)，所述化合物可为已知的抗癌或抗肿瘤化合物，例如，紫杉醇(taxol)，依托泊苷(etoposide)，tenofoside，长春新碱，阿霉素等，烷化剂(例如，顺铂，蒽环类抗生素(例如阿霉素等)。缀合物可使用本领域可获得的技术使用交联剂来制备。

此外，除了抗体外，本发明还可包括双特异性结合分子，该双特异性结合分子包含两个或更多不同的结合位点，其中，肽、蛋白质或抗体与不同于抗体的其他抗原结合位点结合。双特异性结合分子可通过使用本领域已知的方法连接结合特异性部分来制备。此外，当连接抗体时，可在重链的C末端区通过巯基来连接。根据具体情况，所述抗体可在同一载体被编码，并且在同一待组合的宿主细胞中被表达。

抗体的制备方法

另一方面，本发明涉及一种包含核酸的载体。为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物技术(例如，使用表达靶抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)来获得编码轻链和重链的部分或全长的DNA，并且可将其插入到表达载体中，以此将DNA与转录和翻译调控序列操作性连接。

本申请所用的术语“操作性连接”可指将抗体基因与载体连接以致载体中的转录和翻译调控序列起到调控抗体基因转录和翻译的预期功能。对于表达载体和表达调控序列的选择要使得其与用于表达的宿主细胞匹配。将抗体的轻链基因和抗体的重链基因插入各自的载体，或将两种基因均插入同一表达载体。通过标准方法(例如，在抗体基因片段和载体上连接互补限制性酶位点，或者如果不存在非限制性酶位点钝末端连接)将抗体插入表达载体。根据具体情况，重组表达载体可编码有利于从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，以致将信号肽与抗体链基因的氨基末端结合以适合框架。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(例如，源自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。此外，重组表达载体具有调控宿主细胞中抗体链基因表达的“调控序列”。“调控序列”可包括启动子、增强子以及其他调控抗体链基因转录或翻译的表达调控元件(例如，多腺苷酸化信号)。本领域技术人员可认识到，根据诸如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质表达水平等因素，可通过选择不同调控序列来改变表达载体的设计。

本发明还可包括宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸或载体。所述核酸或载体是转染过的。可以使用通常用于将外源DNA导入待“转染”的原核或真核宿主细胞的多种技术，例如，电泳、磷酸钙沉淀方法、DEAE-葡聚糖转染或脂质转染。根据本发明所述的抗体可在真核细胞中表达，考虑到应用于哺乳动物细胞的可能性，优选哺乳动物宿主细胞。用于抗体表达的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括，例如，与DHFR可选择标记物一起使用的dhfr-CHO细胞)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞或SP2细胞等。

另一方面，本发明涉及一种制备抗体的方法，所述方法包括培养宿主细胞以表达所述抗体。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，可通过培养宿主细胞持续一段足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，持续一段足以允许抗体分泌至培养宿主细胞的培养基中的时间。此外，抗体的制备可包括使用包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的EGFRvIII淘选。

根据具体情况，可从宿主细胞中分离表达抗体，并将其纯化至同质。抗体的分离或纯化可通过用于常规蛋白质的分离和纯化方法来进行，例如层析。层析可包括，例如，亲和层析(包括蛋白质A柱、蛋白质G柱)，离子交换层析，或疏水层析。除层析以外，还可通过联合过滤、超滤、盐析、透析等进一步分离和纯化抗体。

药物组合物

另一方面，本发明涉及一种用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。

本申请所用的术语“癌症或肿瘤”并非特别限制，只要是可通过本发明的抗体治疗的癌症或肿瘤类型。例如，可以是由EGFRvIII过度表达导致的乳腺癌、肺癌或肛门癌，和脑肿瘤，例如原发性脑肿瘤(即，在脑中发生的)和继发性或转移性脑肿瘤。

根据具体情况，根据本发明所述的抗体可与其他抗癌药物联合施用(即，在接受癌症治疗之前、过程中或之后)。其可联合本领域技术人员已知的任何一种或多种化学治疗药物施用，例如，烷化剂，例如卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺铂、碳铂、oxyplatin、proccarbazine以及环磷酰胺；抗代谢物，例如，氟尿嘧啶、氟尿苷(phloxuridine)、氟达拉滨、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤以及羟基脲；天然产物，例如植物生物碱，或抗生素，例如博来霉素、阿霉素、柔红霉素、去甲氧基柔红霉素、依托泊苷、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春新碱，以及诸如的紫杉醇(paclitaxel)或相关化合物；用于治疗脑肿瘤的治疗剂，例如包含替莫唑胺或卡氮芥的薄片(wafer)；以及其他药物，例如依立替康，格列卫(gleevec)等。此外，可包括其他生物剂，例如，单克隆抗体，例如用于HER2抗原的Herceptin^TM，用于VEGF的Avastin^TM；针对EGF受体的抗体，例如以及其他EGF受体拮抗剂。

药物组合物可配制成包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指不刺激活生物体且不抑制所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。用于待配制成液体溶液的组合物的药学上可接受的载体适于灭菌和活体，可通过混合盐水溶液、无菌水、林格氏液(Ringer’s solution)、缓冲的盐水溶液、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或这些组分中的一种或多种来使用。如有必要，可添加其他常用添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和制菌剂。此外，可另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂以及润滑剂而配制成注射制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，例如水性溶液，悬浮液、乳剂等。

药物组合物可以是各种口服或胃肠外制剂形式。在制剂的情况下，可使用常规使用的稀释剂或赋形剂制备，例如填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等，可通过将一种或多种诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等的赋形剂与一种或多种化合物混合来制备。此外，除了简单的赋形剂，也可使用诸如硬脂酸镁、滑石等的润滑剂。口服施用的液体制剂实例包括悬浮液、溶液、乳剂以及糖浆等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡以外，还可包括各种赋形剂，例如，润湿剂，甜味剂，香料，防腐剂等。

肠胃外给药的制剂可包括灭菌水溶液剂、非水溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂以及栓剂。非水溶剂和悬浮液溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油、诸如油酸乙酯的可注射酯。witepsol、聚乙二醇、吐温、可可脂、月桂脂、甘油明胶等可用作栓剂基质。

药物组合物可具有选自如下的任一种制剂：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液剂、乳剂、糖浆、灭菌水溶液剂、非水溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。此外，可以一次或多次施用。此时，以液体制剂、粉剂、气雾剂、胶囊、阴道片剂、胶囊或栓剂的形式施用组合物。施用途径可包括但不限于腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内、直肠内等。然而，当口服施用时，由于肽在胃中消化，必须配制成保护其防止在胃中降解或对活性成分包衣。此外，可通过任何能够转移至靶细胞的装置施用活性物质。

可以以药学有效量施用组合物，“治疗有效量”可指足以以适用于医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平通过如下因素来确定，包括个体的类型和严重程度、年龄、性别、癌症类型、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、释放速率、治疗持续时间、同时使用的药物和医学领域中公知的其他因素。通常可以以0.1至5mg/kg的高剂量给药组合物，例如1、2、3或4mg/kg，10mg/kg，或15或20mg/kg。作为固定的单位量，例如，可以以50、100、200、500或1000mg提供。为了导致癌症或肿瘤退化，更优选去除肿瘤，可以1至8次(例如1、2、3、4、5、6、7或8次)，或10、20或更多次给药。基于抗体的半衰期，可每周两次，每周一次、每两周一次、每个月一次，或以一周、两周、四周、八周、三至六个月或更长时间的其他间隔来给药。

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅例示本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。

实施例1：EGFRvIII细胞系的建立

通过使用DNA合成(Invitrogen，SEQ ID NO:1)获得含有HindIII和XbaI限制性酶位点的EGFRvIII基因，并通过使用HindIII和XbaI限制性酶裂解该基因。将所裂解的模板DNA克隆至使用HindIII和XbaI限制性酶裂解的表达载体pcDNA3.1中，以组合pcDNA3.1-EGFRvIII。将PcDNA3.1-EGFRvIII转化至DH5α大肠杆菌中以筛选氨苄霉素抗性菌株。确认是否通过使用HindIII和XbaI限制性酶裂解而插入EGFRvIII基因。

就CHOK1、U87MG以及A431而言，通过使用Lipofectamine 2000转染被制备以产生EGFRvIII细胞系的pcDNA3.1-EGFRvIII载体，在10％FBS,DMEM中培养细胞48小时。将所培养的细胞在添加G418的10％FBS(1000μg/ml、400μg/ml、400μg/ml 1:10稀释度)的DMEM或RPMI中培养之后，在6孔板中筛选和增殖待克隆的细胞。当溶解各增殖12天的细胞之后，进行蛋白质印迹，并进行电泳，使用抗EGFR抗体和抗人IgG HRP处理，与ECL底物反应(图6a和6b)。

实施例2：生物淘选

将用作抗原的EGFRvIII肽合成为含有用作连接体的特异性序列13mer和4mer以及生物素(SEQ ID NO:2)。还将生物素-TTACCDRII肽(SEQ ID NO:3)合成为负抗原以阻断非特异性结合。使用M-280链霉亲和素(Invitrogen,USA)珠以每5μl连接7.8ng肽制备各肽。

在25℃使人抗体噬菌体文库与事先连接至小珠的TTACCDRII肽反应30分钟以诱导非特异性噬菌体抗体结合。其后，使用磁棒收集结合至小珠的TTACCDRII肽，然后分开仅收取上清液。将上清液再添加至结合小珠的EGFRvIII肽，在25℃反应2小时以发生抗体噬菌体的结合。使用磁棒收集结合至小珠的EGFRvIII肽，移除噬菌体上清液。使用PBST(含有0.1％Tween 20的PBS)重复洗涤吸引至磁棒上的小珠EGFRvIII肽5次，最后，使用PBS洗涤一次。使100ul 100mM的三乙胺溶液反应10分钟，以使得结合至抗原的噬菌体洗脱，通过50ul 1MTris pH 7.5中和洗脱的噬菌体。

将中和的噬菌体洗脱液添加至10ml对数中期XL1-Blue大肠杆菌细胞系，在37℃反应30分钟以诱导感染。将所感染的XL1-Blue大肠杆菌细胞系铺于含有1％葡萄糖的2×YT/C板上，在30℃培养16小时。以相同方式进行第一轮淘选和第二轮和第三轮淘选。

实施例3：特异性结合EGFRvIII的噬菌体抗体的筛选

从所完成的淘选中随机选择大肠杆菌克隆，在96孔板37℃和300rpm下在对数中期通过添加500μl 2×YT/C培养基中培养，之后添加M13辅助噬菌体，之后在37℃诱导噬菌体感染30分钟。在30℃和30rpm条件下培养所感染的大肠杆菌克隆15小时，以制备待洗脱的噬菌体抗体。在6000rpm下离心所培养的大肠杆菌克隆细胞10分钟以去除细胞，仅获得上清液。

以1μg/ml将EGFRvIII肽、TTACCDRII肽以及BSA涂覆在Maxisorb 96孔ELISA板(Nunc，Denmark)上，在室温下使用3％脱脂乳/PBS封闭1小时，然后使用所获得的上清液接种，在室温下反应1小时。使用0.05％PBST洗涤ELISA板3次，然后经1小时将抗M13-HRP(辣根过氧化物酶)抗体(GE)稀释至1:300 0.05％PBST。在处理10分钟并TMB底物(BD,USA)显色后，通过2N H₂SO₄处理终止反应。在450nm-650nm使用Sunrise ELISA读板机(TECAN，Switzerland)测量显色ELISA(图7)。

实施例4：蛋白质印迹

使用CHOK1-EGFRvIII细胞裂解物通过蛋白质印迹观察噬菌体-抗体的EGFRvIII结合能力。

使用PBS洗涤实施例1中制备的CHOK1 22-2(作为CHOK1-EGFRvIII细胞系)和作为其母细胞表达CHOK1和EGFR的A431，通过使用洗脱缓冲液(1％SDS，1mM Na₃VO₃，10mM Tris(pH 7.4)，1mM PMSF，10μM亮抑酶肽(Leupeptin)，1.5μM胃蛋白酶(pepstein)，以及10μg/ml抑肽酶)溶解。通过6％SDS-PAGE分离15μg各细胞裂解物之后，将蛋白质转移至PVDF膜。在使用3％脱脂乳TBST封闭1小时之后，处理5×10¹⁰pfu PA430噬菌体和PD54噬菌体1小时，之后经1小时将抗M13-HRP(辣根过氧化物酶)抗体(GE)稀释至1:24000TBST，在通过使用ECL(GEHealthcare，USA)底物显色之后，使用Odyssey Fc成像系统(Licor，USA)确认印迹。

结果示于图8，根据图8，可以理解PA430噬菌体和PD54噬菌体仅在表达EGFRvIII的细胞系中结合。

实施例5：IgG表达和纯化

通过使用包含噬菌体-抗体重链可变区以获取片段的sfiI限制性酶双切，并且通过在包含重链区以获取与片段连接的pIgGHD-6A6Hvy中使用sfiI限制性酶双切，实现向IgG形式的转化。

通过使用包含噬菌体-抗体轻链可变区的BstX I限制性酶双切获取片段。以与包含轻链区的载体pIgGLD-6A6Lgt相同的方式将片段与片段连接(对于上述方法，请参考韩国专利申请公开文本No.2008-0109417)。

通过每100mm细胞培养皿8×10⁶个细胞，接种HEK293T细胞，并且在37℃CO₂ 5％培养基中培养细胞24小时以致细胞的附着和密度达到80～90％培养细胞来测定IgG的表达。以80％至90％来培养细胞。

将所制备的IgG的10μg重链表达载体和10μg轻链表达载体，即总共20μg载体与PEI以1:3(DNA:PEI)μg比例混合，反应15分钟以形成复合物。将DNAPEI复合物添加至培养的细胞中，在反应10小时之后，使用DMEM洗涤一次。然后，通过添加10ml其中添加了10％青霉素链霉素(GIBCO，USA)至Freestyle 293(GIBCO，USA)的培养基，放置48小时，以获取其中表达IgG的上清液。

将所获得的上清液注射至使用20mM Tris-HCl,50mM NaCl及5mM EDTApH 7.0平衡的蛋白A柱(GE healthcare,USA)，使用50mM Tris-HCl(pH 7.0),5mM EDTA,500mM NaCl,0.2％聚山梨醇酯20洗涤，然后使用50mM NaCl,0.1M甘氨酸-HCl(pH 3.5)溶液洗脱。之后，进行使用1M Tris中和的亲和层析。在MWCO 10,000spectra/por透析膜(spectrum,USA)中回收洗脱的蛋白质，通过PBS透析置换溶液。

结果示于图9a和9b。根据图9a和9b，使用非还原性或还原性LDS样品缓冲液通过SDS-PAGE处理各抗体，当将其上样至Nupage 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen,USA)上时，获得包含50kD重链和25kDa轻链对应于150kDa的IgG。

实施例6：特异性结合EGFR vIII的IgG的筛选

进行ELISA以鉴定转化为IgG的克隆的抗原特异性结合能力。在37℃将EGFRvIII肽、TTACCDRII肽以及BSA铺于1μg/ml 96孔板2小时。此后，在使用3％脱脂乳/0.05％PBST封闭未覆盖的部分之后，将1μg/ml IgG添加至板上，于37℃反应1小时。以1:3000稀释抗人IgGHRP(pierce,USA)，反应1小时。接下来，处理TMB底物(BD，USA)10分钟用于显色，通过使用2NH₂SO₄处理来终止反应。对于显色ELISA，在450nm-650nm使用Sunrise ELISA读板机(TECAN，Switzerland)检测吸光度。

结果示于图10，根据图10，PA430、PD27、PD52以及PD10仅对于EGFRvIII肽显示特异性结合能力，而无非特异性结合。

基于这些结果，进行荧光染色流式细胞术，以证实上述四种抗体是否保持EGFRvIII表达细胞系的结合能力。以EGFRvIII表达细胞系，CHOK122-2及其母细胞，CHOK1以及表达EGFR野生型的A431为试验对象。以1×10⁶个细胞数获取各细胞，以在添加有2％FBS的PBS中1μg/ml的各抗体稀释，并添加至细胞，在4℃反应1小时。1:200稀释抗人IgG PE(Bethyl，USA)，在4℃反应45分钟，用于荧光染色。使用FACS Caliber(BD,USA)仪器以每样品1×10⁴个细胞检测各样品。

结果示于图11，根据图11，PA431、PD27以及PD10能够结合EGFRvIII表达细胞系CHOK122-2，但不结合EGFRvIII非表达细胞系CHOK1和A431。此外，显示在表达EGFR野生型的A431中未观察到结合。

为了根据抗体浓度的降低来证实三种对于EGFRvIII表达细胞系显示结合能力的抗体的结合特性，进行如下实验。从1000ng/ml连续数量级双倍稀释抗体浓度，制备至达31ng/ml。以如上所述相同数量级进行荧光染色流式细胞术。

结果示于图12，根据图12，观察到，PA430显示高结合能力，即便是在与PD27和PD10相同浓度下处理IgG时也是如此。

实施例7：轻链亲和力增强的变化

改变轻链以增强PA430的抗原特异性亲和力。当考察PA430、PD52以及PD27的轻链可变区的CDR时，已经证实它们在PA430的轻链可变区序列中是相似的，具有高抗原特异性亲和力(见表1-3)。利用该事实，除了原始的PA430轻链，将PD52、PD27以及PD10的轻链载体与PA430的重链载体混合，进行转染以产生IgG，这与实施例5中相同。

当以实施例6的ELISA相同方式进行所产生的和鉴定的430H10L、430H52L以及430H27L的实验时，证实其保持了抗原特异性结合能力(图13)。

对于PA430和430H52L、430H27L和PD10IgG以相同方式进行实施例6的荧光染色流式细胞术。当对于基于U87MG细胞和A431 16-3细胞系(基于A431细胞作为EGFRvIII表达细胞系产生的)作为EGFRvIII表达细胞系产生的U87MG 13细胞系进行实验时，证实430H52L和430H27L保持结合能力，即便在EGFRvIII特异性细胞系中也是如此。此外，观察到430H52L的结合信号显著，即便在与具有环轻链的PA430相同浓度处理时也是如此(图14)。

实施例8：使用荧光染色流式细胞术分析抗体内化

通过使用具有EGFRvIII特异性结合能力的430H52L抗体，进行荧光染色流式细胞术，以证实是否通过抗体-EGFRvIII结合进行了内化。

针对U87MG 13细胞和CHOK1 22-2细胞，使用胰蛋白酶EDTA处理2×10⁶个细胞，然后在4℃冷却30分钟，以抑制细胞活性。在4℃于DMEM培养基中使用1μg/ml 430H52L处理细胞30分钟以诱导抗体抗原结合。使用仅DMEM处理的二级抗体处理样品。接下来，在1300rpm离心3分钟后，使用PBS洗涤细胞以去除残留抗体，添加DMEM培养基，在4℃与样品反应，在CO₂ 5％下37℃温育样品15分钟，37℃温育样品30分钟，以及37℃温育样品60分钟。在离心后，在4℃使用PBS洗涤细胞，然后0.1M甘氨酸和0.5M NaCl pH 2.2重复处理三次每次10分钟，以人工去除结合细胞表面EGFRvIII的抗体。离心之后，使用PBS洗涤细胞，在4℃使用4％多聚甲醛(USB，USA)固定10分钟。通过0.1％triton-100(sigma Aldrich,USA)PBS溶液使各样品渗透，或使用2％FBS PBS溶液处理，以致不发生渗透。离心之后，使用PBS洗涤细胞，2％FBS PBS处理和封闭，以1:400处理抗人IgG PE(bethyl,USA)，用于染色。使用FACS Caliber(BD,USA)仪器以每一样品1×10⁴个细胞来检测各样品。

结果分别示于图15a和15b。根据15a和15b，当使用430H52L抗体处理EGFRvIII表达细胞系U87MG 13或CHOK1 22-2细胞和通过使用细胞透化通过各温度和时间的反应进行荧光染色时，观察到与4℃相比在37℃信号随着时间增加而增加。当在不进行细胞透化的对照组中进行非透化荧光染色时，没有信号随着温度和时间增加而增加。这通过37℃条件下430H52L IgG结合EGFRvIII以致内化随着时间增加而增加的荧光信号来证实。

根据本发明所述的特异性结合EGFRvIII的抗体是仅结合EGFRvIII而不结合野生型EGFR(EGFRwt)的新型抗体，在表达EGFRvIII的细胞中显示显著的结合能力。已经证实发生内化，由此其可用作靶向EGFRvIII的有效拮抗剂。由此，根据本发明所述的特异性结合EGFRvIII的抗体可有效用于治疗EGFRvIII表达诱导的疾病。

基于上述内容，本发明范围内的多种变化和修饰对于本发明所属领域普通技术人员来说是显而易见的。

序列表

<110> 药物抗体公司

<120> 新型EGFRVIII抗体和包含所述抗体的组合物

<130> PDK03479A

<140> PCT/KR2014/011381

<141> 2014-11-25

<160> 43

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFRvIII的序列

<400> 1

Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys

1 5 10 15

Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val

20 25 30

Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly

35 40 45

Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn

50 55 60

Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile

65 70 75 80

Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu

85 90 95

Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly

100 105 110

Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln

130 135 140

Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg

145 150 155 160

Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys

165 170 175

Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr

180 185 190

Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys

195 200 205

Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys

210 215 220

Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg

225 230 235 240

Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg

245 250 255

Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu

260 265 270

Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys

275 280 285

Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys

290 295 300

Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala

305 310 315 320

Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly

325 330 335

Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile

340 345 350

Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val

355 360 365

Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg

370 375 380

Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro

385 390 395 400

Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu

405 410 415

Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe

420 425 430

Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys

435 440 445

Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala

450 455 460

Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn

465 470 475 480

Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln

485 490 495

Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg

500 505 510

Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val

515 520 525

Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His

530 535 540

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val

545 550 555 560

Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys

565 570 575

Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu

580 585 590

Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser

595 600 605

Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr

610 615 620

Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu

625 630 635 640

Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met

645 650 655

Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu

660 665 670

Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu

675 680 685

Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser

690 695 700

Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val

705 710 715 720

Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro

725 730 735

Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn

740 745 750

Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro

755 760 765

Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly

770 775 780

Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu

785 790 795 800

Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn

805 810 815

Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro

820 825 830

His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu

835 840 845

Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala

850 855 860

His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp

865 870 875 880

Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe

885 890 895

Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln

900 905 910

Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

915

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗原的序列

<400> 2

Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Cys Ser Gly

1 5 10 15

Gly Lys Asn

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 负抗原的序列

<400> 3

Asn Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

1 5 10 15

Lys Ser

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 4

Tyr His Ala Met His

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 5

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 6

Glu His Ala Met His

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 7

Glu His Ala Met His

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 8

Ala Met Ser His Asp Gly Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 9

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ala Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 10

Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 11

Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 12

Glu Gly Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 13

Ala Ser Arg Gly Leu Gly Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 14

Pro Gly Glu Asp Thr Gly Gly Gly Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 15

Pro Gly Glu Asp Thr Gly Gly Gly Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 16

Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 17

Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 18

Ser Gly Asp Val Leu Ala Asp His Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 19

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 20

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 21

Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 22

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 23

Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 24

Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser Val Val

1 5 10

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 25

Gln Ser Val Asp Asn Ser Asp Thr Ser Val Val

1 5 10

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 26

Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser Val Val

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 27

Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Thr Phe Tyr Val

1 5 10

<210> 28

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 28

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Ala Met Ser His Asp Gly Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ala Glu Gly Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 29

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Ser Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ala Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ala Ser Arg Gly Leu Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Pro Gly Glu Asp Thr Gly Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Pro Gly Glu Asp Thr Gly Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 32

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Thr Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Lys Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Arg Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 33

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 33

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 34

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 34

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Asp His Tyr Ser

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 35

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 35

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 36

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 36

cagatgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactt 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt taccatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg gctggcagct atgtcacatg atggaaccga aaccagctac 180

gcagactccg tgaagggccg aatcaccatc tccagagaca attccaagag tgcgttgtat 240

ctacaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac cgcagagggg 300

cttcggagca atggaggggc ttttgagact tggggccgcg ggacaatgat caccgtctcc 360

tca 363

<210> 37

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 37

cagatgcagc tggtgcagtc tggagggggc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag gctctggatt cagctttgat gattatgcca tgcactgggt ccgtcaggct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtgc cataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc cacagcctcc 300

agaggacttg gtgatgcttt tgatatctgg ggccagggga caatggtcac cgtctcctca 360

<210> 38

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 38

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gaacatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctgcagtg ggtctcagga atcaattgga atagtggtaa aacaggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac tagacccggg 300

gaggacaccg ggggtggctt tgatatctgg ggccaaggga caatgatcac cgtctcctca 360

<210> 39

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hv

<400> 39

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gaacatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctgcagtg ggtctcagga atcaattgga atagtggtaa aacaggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac tagacccggg 300

gaggacaccg ggggtggctt tgatatctgg ggccaaggga caatgatcac cgtctcctca 360

<210> 40

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 40

tcctatgagc tgacacagcc accctcagtg tcggtggccc cagggcagac ggccaggatc 60

acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120

caggcccctg ttttggtgat atataaagac agcgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttcactggtt ccagctcagg gacaaaagtc acgctgacca taagtggagt ccgggcagaa 240

gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacagcagtg atacttctgt ggttttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327

<210> 41

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 41

tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60

acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120

caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240

gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctgt ggttttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327

<210> 42

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 42

tcctatgagc tgactcagcc actctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60

acctgctctg gagatgtatt ggcagatcat tattcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120

caggcccctg tgttggtgat gtataaagac agtgagaggc cctctgggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccagctcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240

gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacagcagtg atacttctgt ggttttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327

<210> 43

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lv

<400> 43

aattttatgc tgactcagcc cgcctccgtg tctgggtccc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaagcagcag cgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccca actcatcatt tatgatgtca ctaagcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctccggctc caagtctggc aactcggcct ccctgaccat ctctggactc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcataca gcagcagcac tttttacgtc 300

ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta ggt 333

Claims

1.一种结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗体，所述表皮生长因子受体变体III包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述抗体不与表皮生长因子受体(EGFR)交叉反应，其中，所述抗体特异性结合SEQ ID NO:1氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸区域。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合包含SEQ ID NO:2氨基酸序列的氨基酸区域。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含下列重链CDR：

包含选自SEQ ID NO:4-7的至少一种氨基酸序列的重链CDR1；

包含选自SEQ ID NO:8-11的至少一种氨基酸序列的重链CDR2；以及

包含选自SEQ ID NO:12-15的至少一种氨基酸序列的重链CDR3。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含下列轻链CDR：

包含选自SEQ ID NO:16-19的至少一种氨基酸序列的轻链CDR1；

包含选自SEQ ID NO:20-23的至少一种氨基酸序列的轻链CDR2；以及

包含选自SEQ ID NO:24-27的至少一种氨基酸序列的轻链CDR3。

5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:28-31的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。

6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:32-35的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。

7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含选自下列序列的重链可变区和轻链可变区：

包含SEQ ID NO:30序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:34序列的轻链可变区；以及

8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人抗体类型。

9.一种核酸，其编码权利要求1至8任一项所述的抗体。

10.根据权利要求9所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:36-39的至少一种重链可变区编码序列。

11.根据权利要求9所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:40-43的至少一种轻链可变区编码序列。

12.一种载体，其包含根据权利要求9所述的核酸。

13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求9所述的核酸或根据权利要求12所述的载体。

14.一种制备权利要求1所述抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求13所述的宿主细胞以表达抗体。

15.一种用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的根据权利要求1至8任一项所述的抗体。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述癌症或肿瘤是肺癌、肛门癌或脑肿瘤。