JP2003523771A - 改善された細胞傷害性および収率を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ、それに基づく免疫毒素、ならびにその使用方法 - Google Patents

改善された細胞傷害性および収率を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ、それに基づく免疫毒素、ならびにその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩとして公知の上皮増殖因子レセプターの変異形態に対する抗体を提供する。この変異体は、神経膠芽細胞腫細胞の表面上、ならびに乳癌、卵巣癌および非小細胞癌の細胞上にのみ見出されるかまたはそれらの細胞上で主に見出される。本発明により提供される抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する高い親和性を有し、そしてＭＲ１と名付けられたｓｃＦｖを含む先行技術の抗体よりも高い細胞傷害性および収率を有する免疫毒素を形成する。特に、本発明は、特に優れた細胞傷害性を有する抗体を提供するためにＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＣＤＲ３においてＭＲ１に変異を生じさせた、ＭＲ１−１と名付けられた抗体を提供する。本発明は、ＶＨまたはＶＬあるいはその両方のＣＤＲ１およびＣＤＲ２において変異したＭＲ１が、親のＭＲ１抗体の結合よりもＥＧＦＲｖＩＩＩに対してより良好な結合を有する、さらなる抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連する出願に対する相互参照） 本願は、２０００年２月２５日出願の米国仮特許出願第６０／１８５，０３９
号の利益を主張し、この内容は、参考として援用される。
【０００２】 （連邦政府による援助の研究および開発のもとでなされた発明に対する権利に
関する記載） 適用され得ない。
【０００３】 （発明の背景） 上皮増殖因子レセプターの変異形態（「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」と命名される）は
、およそ５０〜６０％の神経膠芽細胞腫において、高発現される、そしてまた乳
癌および卵巣癌のおよそ７０〜８０％、および約１６％の肺の非小細胞癌におい
て存在が示される（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３１
４０〜３１４８（１９９５）；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
．５５：５５３６〜５５３９（１９９５））。この変異体は、細胞外ドメインの
アミノ末端近傍のエキソン２〜７のインフレーム欠損からなり、この欠損は、Ｅ
ＧＦＲ ｍＲＮＡを８０１塩基欠損したものの発現を生じる。この変異タンパク
質は、スプライシングされた接合部において新たなグリシンコドンを含む（Ｍｏ
ｓｃａｔｅｌｌｏら、前出）。この変異レセプターは、細胞表面に発現され、そ
して欠損した接合部において新たな腫瘍特異的細胞表面エピトープ（配列）を生
じる。このレセプターは、インビボで神経膠芽細胞腫の腫瘍形成能を増大する構
成的なチロシンキナーゼ活性を有する（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、 Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７７２７〜７７３１（１９９４））
。腫瘍特異的細胞外配列に起因して、この変異レセプターは、癌治療（特に免疫
毒素の使用を介するもの）のための興味ある潜在的な標的である。
【０００４】 免疫毒素は、標的化部分（例えば、抗体または抗体の一部）をタンパク質毒素
（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素）に融合することによって作られる
。多くの腫瘍上に過剰発現されるＬｅｗｉｓ Ｙ関連抗原に対して特異的な抗体
を用いて作製した免疫毒素が、腫瘍の退化を示したことが第Ｉ相臨床試験によっ
て示されたように、免疫毒素は、ヒトにおける固形腫瘍に対する活性を有するこ
とが示されてる（Ｐａｉら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２：３５０〜３５３（１９９６）
）。しかし、Ｐａｉらの研究におけるような免疫毒素（これは、マウスモノクロ
ーナル抗体全体を用いて作製された）は、ある不都合を有する。これらは、相対
的に大きく、これらの腫瘍浸透は限定される。さらに、抗体と毒素の間の結合の
異質性が頻繁にあり、大量の接合体を生産することは難しい。同様に、当該分野
で公知のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する種々の抗体（例えば、米国特許第５，２１２
，２９０号、ＷＯ９６／１６９８８、およびＲｅｉｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５５：４３７５〜４３８２（１９９５）に例示される）は、免疫毒素を構築
することについて制限がある。クローン化されたＦｖが標的化に用いられる全体
の組換え免疫毒素を作ることによって、これらの問題を克服するための試みは、
ほとんどの抗体の可変ドメインがＦｖとしてほとんど機能しないので阻まれ、こ
れは、弱いＶＨ−ＶＬ相互作用に起因する不安定性または結合親和性の弱さのい
ずれかが原因である。
【０００５】 ＭＲ１は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する単鎖抗体可変ドメイン（ｓｃ
Ｆｖ）である。ＭＲ１ ｓｃＦＶは、抗体ファージディスプレイライブラリーか
ら単離された（Ｌｏｒｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９３：１４８１５〜１４８２０（１９９６））。ＭＲ１を含むｓｃＦｖラ
イブラリーは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ペプチドに、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍
異種移植片からアフィニティークロマトグラフィーによって精製したＥＧＦＲｖ
ＩＩＩの細胞外ドメインを加えて免疫したマウスの脾臓のｍＲＮＡから調製した
（Ｌｏｒｉｍｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：８５９〜８６４（
１９９５））。ＭＲ１は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性癌細胞を特異的に標的にする治
療因子を生成する予想物として生成された。ＭＲ１の配列は、登録番号Ｕ７６３
８２でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【０００６】 免疫毒素ＭＲ１（Ｆｖ）−ＰＥ３８は、ＭＲ１のｓｃＦｖをＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ体外毒素Ａの短縮型（ＰＥ３８）（このドメインＩａの全ておよびドメイ
ンＩｂのアミノ酸３６５〜３８０が欠損している）に融合することによって構築
された（Ｌｏｒｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：１４８１５〜１４８２０（１９９６））。いくつかの他の組換え体ＰＥ３
８免疫毒素は、現在臨床試験中である（Ｋｒｅｉｔｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ９４
（１０）：３３４０〜４８（１９９９）；Ｐａｉ−Ｓｃｈｅｒｆら、Ｃｌｉｎ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（印刷中）（１９９９）；Ｐａｉら、Ｃｌｉｎ．Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ２３４：８３〜９６（１９９８
））。一般に、ｓｃＦｖ遺伝子は、短いリンカーによってＰＥ３８遺伝子に連結
され、Ｔ７が土台の発現ベクターにクローニングされる。組換え免疫毒素は、Ｅ
．ｃｏｌｉにおいて発現され、封入体中に蓄積する。封入体を徹底的に洗浄した
後、これらをグアニジン塩酸に溶解し、タンパク質を再生し、そしてイオン交換
クロマトグラフィーおよびゲルろ過によって精製する。生じた分子は、活性であ
り、そしてｓｃＦｖによって細胞特異的抗原を指向する。細胞死は、毒素の活性
に帰因する。
【０００７】 治療因子として有用であるために、免疫毒素は、抗原に対する高親和性を有し
、抗原を発現する細胞に対して高い細胞傷害性を生じるべきである。免疫毒素が
高収率で生産され得る場合、処理を容易にしかつ関連するコストを軽減すること
はまた有利である。ＭＲ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８は、最も高親和性であり、Ｅ
ＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞に対して利用可能な最も細胞傷害性のある免疫毒
素であるが、理想には遠い。これは、８ｎＭのＫｄを有し、収率が３％より低い
。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩにより大きな親和性で結合し、そしてＰＥ３８
または他の毒素に結合する場合に、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞に対してよ
り高い細胞傷害性を有する免疫毒素を形成する抗体を開発することは有利となる
。さらに、より高い収率で免疫毒素を形成する抗体を見出すことは有用である。
【０００８】 モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体からさらなるｓｃＦｖを開発すること
によってのこれらの問題の解決のためのいくつかの試みは、失敗した。ＭＲ１は
、当該分野において、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ免疫毒素を標的化するための利用可能
な唯一のｓｃＦｖを保持する。
【０００９】 （発明の要旨） １つの局面において、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩとして公知の上皮増殖因子
レセプターの変異形態への改善された結合を有する抗体を提供する。特に本発明
は、変異した抗体可変重鎖（ＶＨ）領域または変異した軽鎖（ＶＬ）領域または
その両方を有するポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、７ｎＭ、６ｎ
Ｍ、５ｎＭ、４ｎＭ、３．５ｎＭ、３ｎＭ、またはより低いＥＧＦＲｖＩＩＩに
対するＫｄを有する。この変異したＶＨまたはＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ
）における少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換によって、親抗体ＭＲ１Ｖ Ｈ またはＶＬとそれぞれ異なる配列を有する。このアミノ酸は、ＡＧＹまたはＲ
ＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコド
ンによってコードされ、ここでＲは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴであ
り、そしてＷは、ＡまたはＴである。いくつかの実施形態においてこの置換は、
ＣＤＲ３ ＶＨまたはＣＤＲ３ ＶＬにおいて生じ得る。他の実施形態において
、置換は、ＣＤＲ１ ＶＨまたはＣＤＲ２ ＶＨまたはこの両方、あるいはＣＤ
Ｒ１ＶＬまたはＣＤＲ２ＶＬまたはこの両方、あるいは、ＣＤＲ１、２、および
３のＶＨならびにＶＬにおける任意の組み合わせにおいて生じ得る。例えば、１
つの実施形態において、置換は、ＣＤＲ３ ＶＬ、ＣＤＲ２ ＶＬおよびＣＤＲ
１ ＶＨにおいて生じ得る。
【００１０】 好ましい実施形態において、ポリペプチドは、Ｓ９８およびＴ９９からなる群
から選択される少なくとも１つのアミノ酸のＣＤＲ３ ＶＨにおける置換を有す
る。他の好ましい実施形態において、置換は、Ｐ９８−Ｙ９９、Ｐ９８−Ｎ９９
、Ｐ９８−Ｗ９９、Ｐ９８−Ｉ９９、Ｐ９８−Ｆ９９、およびＰ９８−Ｖ９９か
ら選択される。ポリペプチドは、ＣＤＲ３ ＶＬにおいてさらに置換を有し得、
ここでＷは、位置９２のおいてＦに置換される。特に好ましい実施形態において
、ポリペプチドは、重鎖においてＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙの置換を有し、軽鎖におい
て置換Ｆ９２Ｗを含む（この置換は、「ＭＲ１−１」と命名される抗体を規定す
る）。
【００１１】 上に記載されるポリペプチドは、抗体の単鎖可変領域（「ｓｃＦｖ」）、ジス
ルフィド安定化Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または抗原を認識し結合する能力
を保持する抗体の他のフラグメントであり得る。これらはまた、バクテリオファ
ージの表面タンパク質を含み得る。
【００１２】 好ましい実施形態において、上に記載されるポリペプチドは、ＥＧＦｖＩＩＩ
に対してＭＲ１のＫｄよりも低い少なくとも１ｎＭのＫｄを有する。このポリペ
プチドは、７、６、５、４、３．５、３またはより低いＫｄを有し得る。
【００１３】 上に記載されるポリペプチドはまた、エフェクター分子、治療部分、または検
出可能な標識に結合、付着、または連結され得る。治療部分は、毒素または毒素
の細胞傷害性部分（「毒素成分」）であり得、ポリペプチドと組み合わさって免
疫毒素を形成する。毒素成分は、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性フラグメ
ント、サポリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシン、またはこ
れらの細胞傷害性フラグメント、およびブリオジン１（ｂｒｙｏｄｉｎ １）で
あり得る。好ましい実施形態において、毒素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒
素（「ＰＥ」）またはＰＥの細胞傷害性フラグメントである。特に好ましい実施
形態において、ＰＥは、ＰＥ３８である。ポリペプチドおよび毒素部分の組み合
わせによって形成される免疫毒素は、７ｎｇ／ｍｌ以下、６ｎｇ／ｍｌ以下、５
ｎｇ／ｍｌ以下、４ｎｇ／ｍｌ以下、または約３．５ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０ を有し得る。免疫毒素は、組換え発現がされる場合、少なくとも３％の収率を有
し得、これは、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはより高くあ
り得る。
【００１４】 本発明はさらに、変異した抗体の可変重鎖（ＶＨ）領域または変異した軽鎖（
ＶＬ）領域またはその両方を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供す
る。このポリペプチドは、７ｎＭまたはより低いＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＫｄ
を有する。この変異したＶＨまたはＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）における
少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換によって、親抗体ＭＲ１ＶＨまたはＶ Ｌ とそれぞれ異なる配列を有する。このアミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから
選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによって
コードされ、ここでＲは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴであり、そして
Ｗは、ＡまたはＴである。いくつかの実施形態においてこの置換は、ＣＤＲ３
ＶＨまたはＣＤＲ３ ＶＬにおいて生じ得る。他の実施形態において、置換は、
ＣＤＲ１ ＶＨまたはＣＤＲ２ ＶＨまたはこの両方、あるいはＣＤＲ１ ＶＬ またはＣＤＲ２ ＶＬまたはこの両方、あるいは、ＣＤＲ１、２、および３のＶ Ｈ ならびにＶＬの任意の組み合わせにおいて生じ得る。例えば、１つの実施形態
において、置換は、ＣＤＲ３ ＶＬ、ＣＤＲ２ＶＬおよびＣＤＲ１ ＶＨにおい
て生じ得る。
【００１５】 好ましい実施形態において、この核酸分子は、ＭＲ１と比較して、ＣＤＲ３
ＶＨに、Ｓ９８およびＴ９９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ
酸の置換を有するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、
置換は、Ｐ９８−Ｙ９９、Ｐ９８−Ｎ９９、Ｐ９８−Ｗ９９、Ｐ９８−Ｉ９９、
Ｐ９８−Ｆ９９、およびＰ９８−Ｖ９９から選択される。この核酸分子はまた、
ＭＲ１と比較して、ＣＤＲ３ＶＬにおいて位置９２においてＦの代りに置換され
たＷを有する置換を含むポリペプチドをコードし得る。
【００１６】 この核酸分子は、抗体の単鎖可変領域（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または抗原に対する認識能および結合能を保持す
る抗体のほかのフラグメントであり得る。これらはまた、バクテリオファージの
表面タンパク質を含む。上に記載される核酸分子は、作動可能にプロモーターに
結合し得る。
【００１７】 別の実施形態のセットにおいて、本発明は、抗原を保有する細胞を殺す方法を
提供し、この方法は、細胞に毒素部分および標的化部分を有する免疫毒素を接触
させる工程を含む。この標的化部分は、変異した抗体可変重鎖（ＶＨ）領域また
は変異した軽鎖（ＶＬ）領域またはその両方を有するポリペプチドを含み、この
ポリペプチドは、７ｎＭ以下のＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＫｄを有する。この変
異したＶＨまたはＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）における少なくとも１つの
アミノ酸のアミノ酸置換によって、親抗体ＭＲ１ＶＨまたはＶＬとそれぞれ異な
る配列を有する。このアミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホット
スポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここ
でＲは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴであり、そしてＷは、ＡまたはＴ
である。いくつかの実施形態においてこの置換は、ＣＤＲ３ ＶＨまたはＣＤＲ
３ ＶＬにおいて生じ得る。別の実施形態において、置換は、ＣＤＲ１ ＶＨま
たはＣＤＲ２ ＶＨまたはこの両方、あるいはＣＤＲ１ ＶＬまたはＣＤＲ２
ＶＬまたはこの両方、あるいは、ＣＤＲ１、２、および３のＶＨならびにＶＬの
任意の組み合わせにおいて生じる。
【００１８】 好ましい実施形態において、この方法は、ＣＤＲ３ＶＨにおいてのＳ９８およ
びＴ９９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するポリ
ペプチドを含む標的化部分を含む。他の好ましい実施形態において、この標的化
部分は、Ｐ９８−Ｙ９９、Ｐ９８−Ｎ９９、Ｐ９８−Ｗ９９、Ｐ９８−Ｉ９９、
Ｐ９８−Ｆ９９、およびＰ９８−Ｖ９９から選択置換を含むポリペプチドを含む
。特に好ましい実施形態においては、標的化分子は、ＭＲ１−１である。
【００１９】 標的化部分は、抗体の単鎖可変領域（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆ
ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または抗原に対する認識能および結合能を保持する
抗体のほかのフラグメントであり得る。
【００２０】 抗原を保有する細胞は、悪性細胞（例えば、神経膠腫細胞、乳癌細胞、肺癌細
胞、または卵巣癌細胞）であり得る。
【００２１】 （詳細な説明） （Ｉ．序文） 本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和性がＭＲ１より高いｓｃＦｖ抗体お
よび他の抗体を提供し、さらにＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対する細胞傷害性が
、標的化部位の分子としてＭＲ１を用いた同じ免疫毒素より高い細胞傷害性を有
する免疫毒素を提供する。この抗体は、ＭＲ１から生成されるが、相補性決定領
域（ＣＤＲ）のホットスポット領域において変異している。驚くことに、ＭＲ１
の変異形体を標的化部分として含む免疫毒素は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するより
高い親和性を有するのみならず、標的化部位の分子としてＭＲ１を用いた同様の
免疫毒素より顕著な高収率で生成され得る。
【００２２】 ＣＤＲにおけるランダム化された抗体ライブラリーの構築における限定的な因
子は、ＣＤＲを構成する多数の残基である。Ｘ線構造は、ほとんどの抗体に対し
て利用可能ではないため、通常は、変異がより高親和性変異体を生成すると見ら
れるわずかなＣＤＲ残基を同定する試みはない。したがって、高親和性変異体の
単離を確かにするため、極度に大規模にランダム化されたライブラリーを構築す
る必要がある。
【００２３】 例示的な研究において、ＭＲ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３に変異を作
製した。ＭＲ１のＶＨＣＤＲは、１１のアミノ酸残基を有する。ＶＨ領域の最後
の２残基（Ｄ１０１およびＹ１０２）は、２つの理由から抗原結合に関与しない
ものと考えられたため、変異誘発研究から除外された。第１に、これら２つの残
基は、通常はＶＬ鎖に接して位置し、その結果として、これらは、露出されない
。第２に、Ｊセグメントによってこれら２つの残基は、提供され、そしてＶＨＣ
ＤＲ２の３’接合部領域に従う。その結果として、これらは、残りのＶＨＣＤＲ
３よりも相対的に保存されている。
【００２４】 ＣＤＲ３ ＶＨのそれぞれの位置における他の９つのアミノ酸は、他の天然の
アミノ酸のそれぞれと置換された。この研究は、ホットスポット（抗体親和性変
異の間に過剰変異を受けることが公知の領域（モチーフＲＧＹＷおよびＡＧＹ（
ここでＲは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴ、およびＷはＡまたはＴであ
る）によってもっとも特徴付けられる））として公知の領域における変異のみが
、親の抗体ＭＲ１よりも高い細胞傷害性を有する抗体を生じることを示した。こ
の変異はまた、これらの変異したｓｃＦｖが免疫毒素中に組み込まれた場合、親
のＭＲ１ｓｃＦｖとともに生成される、同様の免疫毒素と比較されて免疫毒素の
収率を増大することが見出された。さらに例示的な研究において、変異は、軽鎖
の可変領域のＭＲ１ ＣＤＲ３において生成された。これらの研究において、変
異はホットスポット中のアミノ酸に対してのみ生成された。再び、変異は、親の
抗体ＭＲ１よりも高い細胞傷害性および収率を有する抗体を生じた。
【００２５】 これらの結果に基づいて、変異がより高い親和性改変体を生じる残基を同定す
るために、ＣＤＲにおけるあらゆる残基を無作為化する必要はない。ＶＨおよび
ＶＬ ＣＤＲ１ならびにＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ２のホットスポットにおける変
異が、同様にＥＧＦＲｖＩＩＩについての親和性を改良する抗体を生じ、免疫毒
素中に取り込まれた場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞についての細胞傷害性を改
良し、そしてＭＲ１ベースの免疫毒素と比較してｓｃＦｖｓのような免疫毒素を
組み込む収率を改良することが予期される。この改良された特徴がアミノ酸の置
換に起因するので、同じ陽性効果はまた、ＭＲ１のこれらの変異型（ＶＨおよび
ＶＬ ＣＤＲ３において変異したＭＲＩを含む）がジスルフィド安定化Ｆｖｓ（
ｄｓＦｖｓ）またはＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ中に組み込まれる場
合に、見出される。
【００２６】 上昇する細胞傷害性活性は、上昇する親和性（上記表４および表５）と関連が
ある必要はない。この関連の欠失についての明確な説明は存在しない。結合親和
性に加えて（これは代表的に２２℃で測定される）、「ホットスポット」変異に
よって影響され得る毒性プロセスにおける多くの局面が存在する。このような局
面としては、３７℃での安定性、内部移行の速度、タンパク分解プロセスおよび
転座が要求される区画への移行が挙げられる。１つ以上のこれらの局面が影響さ
れることは可能である。しかし、ＥＧＦＲｖＩＩＩについてのより高い親和性を
有する抗体は、種々の目的、とりわけ、サンプルにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現
細胞の存在または非存在を決定するための診断用途およびインビトロアッセイに
有用である。例えば、インビトロ使用について、ＥＧＦＲｖＩＩＩについてのよ
り高い親和性を有するｓｃＦｖのような抗体は、放射性核種または任意の多くの
他の検出可能な標識と結合体化され得、そして、患者がこのような細胞の存在に
よって特徴付けられる癌を有するか否か決定するために、またはこの癌がこのよ
うな癌を有することが分かっている患者から根絶されていないかを決定するため
に、この患者由来の生検サンプルにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞の存
在を検出するために使用される。同様に、インビボ使用において、ｓｃＦｖ、ｄ
ｓＦｖまたは本発明の他の抗体は、放射性核種または他の検出可能な標識と結合
体化され得、そして患者におけるＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞の存在を検出
するために使用され、それによって再び、この患者がこのような細胞の存在によ
って特徴付けられる癌を有するか否か、またはこの癌がこのような癌を有するこ
とが分かっている患者から根絶されていないか否かを診断する。
【００２７】 最後に、ＣＤＲ変異の間に観察された１つの著しい違いは、活性な単量体タン
パク質の最終収率であった。組換え毒性は、封入体中に不溶性凝集タンパク質（
免疫毒素）として蓄積する。活性な単量体は、６Ｍ グアニジンＨＣｌ中の封入
体を溶解することによって産生され、酸化還元系における制御された再生、なら
びにマルチマーおよび凝集体からのモノマーの分離が続いた。この研究は、ＣＤ
Ｒ中の１つまたは２つのアミノ酸における変異が、以下に定義および説明される
ように免疫毒素の収率（表６）を大きく増加し得ることを示した。ＭＲ１（Ｆｖ
）−ＰＥ３８の収率はたった２％だが、しかし重鎖ＣＤＲ３ Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９
Ｓ変異と共に１７％まで劇的に増加する。おそらく、これらの変異は、折り畳み
経路に対して深在性の効果を有する。一般に、重鎖の最初の変異誘発における全
ての単離された重鎖変異体は、親のＭＲ１よりもよりよい収率を有する。従って
、ＣＤＲ３の重鎖は、正確な折り畳みのために非常に重要であり、そしてファー
ジ発現系は、より効率的に折り畳むタンパク質についていくつかの方法で選択さ
れ得る。従って、よりよく折り畳むＦｖｓを含むファージは、多数で存在してい
るようであり、そして抗原に対するパニングの間に優先的に濃縮される。
【００２８】 これらの結果に基づいて、ファージディスプレイを使用して、親のＭＲ１ ｓ
ｃＦｖと比較して上昇した産生収率を同様に示す、ＶＨおよびＶＬ鎖のＣＤＲ１
もしくはＣＤＲ２ において変異したＦｖｓを、選択し得ることが予期され得る
。
【００２９】 インビボ試験を行って、ヒト腫瘍の動物モデルに対するＭＲ１−１によって標
的化された例示的な免疫毒素の影響を決定した。腫瘍を樹立するために、胸腺欠
損ラットおよび胸腺欠損マウスが、頭蓋内、くも膜下腔内、または皮下に、ＥＧ
ＦＲｖＩＩＩを発現するようにトランスフェクトされるヒト神経膠芽細胞腫の細
胞様と共に注射された（このトランスフェクトされたＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株は
、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲｖＩＩＩと命名され、そしてＮｉｓｈｉｋａｗａら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１（１６）：７７２７〜
７７３１（１９９４）によって記載される）。一旦腫瘍が樹立されると、このラ
ットまたはマウスは、免疫毒素の種々の投薬量をボーラス注射または連続注入で
処理した。以下の実施例、および図３〜６に記載されるように、腫瘍の位置およ
び免疫毒素の投与の方法に関係なく、１μｇまたは２μｇの投薬量の免疫毒素を
与えられた動物は、生理食塩水コントロールを与えられた動物よりも、腫瘍増殖
の著しい低下およびより長い生存時間を示した。
【００３０】 （ＩＩ．定義） 単位、接頭語、および記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）承認形式で表される。数字の範囲は、範囲を規定す
る数を含む。他に示されない限り、核酸は左から右へ５’方向から３’方向に書
かれる；アミノ酸配列は左から右へアミノからカルボキシ方向に書かれる。本明
細書中で提供される見出しは、本発明の種々の局面または実施形態の限定ではな
く、全体として明細書に対する参照によって有され得る。従って、すぐ下に定義
される用語は、その全体において明細書に対する参照によって十分に定義される
。
【００３１】 公知の配列から変異された残基は、通常配列中の指定された位置（変異された
残基の配列中の位置）に見出される残基、およびもとの残基と置換された残基を
１文字コードで列挙することによって慣習によって表される。従って、ＭＲ１
ＣＤＲ３ ＶＨに関して、用語「Ｓ９８Ｐ」とは、ＭＲ１の正常ＣＤＲ３重鎖の
通常９８位に見出されるセリンが、プロリンに変異したことを示す。数のあとに
続かない「Ｓ９８」のような残基の参照の命名は、残基がペプチドの正常配列の
位置において通常見出されること、またはその特定の残基が現在その位置にある
ことのいずれかをいう（すなわち、命名された残基は、その位置に通常存在する
残基と置換されていること。どの用途が本明細書で意図されているかは文脈から
明らかである。特定の番号づけをされたＭＲ１−１のアミノ酸残基についての本
明細書中の参照は、Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ
Ｓ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（
１９８７）最新版；ｓｃＦｖの配列が整列されそしてＫａｂａｔシステムに従っ
て番号づけされた場合、この参考文献は、本明細書中で以後「Ｋａｂａｔ」とし
て参照され、これらの内容は本明細書中に参考として援用される）に従って番号
づけされた残基をいう。
【００３２】 「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、アミノ末端近くのエキソン２〜７のインフレーム欠
損における、ＭＲ１ ｓｃＦｖによって認識され、そして８０１塩基対によって
特徴付けられる上皮増殖因子レセプターの変異形態を意味する。このレセプター
の形態は当該分野で公知であり、背景で引用されたＷｉｃｋｓｔｒａｎｄら、Ｍ
ｏｓｃａｔｅｌｌｏら、およびＬｏｒｉｍｅｒらの参考文献によって例示される
。技術の変化に起因して、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、この分野におけるいくつかの初
期作業において、本来、ＩＩ型変異と呼ばれ、米国特許第５，２１２，２９０号
に例示される。
【００３３】 本明細書中で使用される場合、「抗体」とは特定の抗原と免疫学的に反応性の
免疫グロブリン分子をいい、そして適切なポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体の両方を含む。この用語はまた、遺伝子操作された形態（例えば、キメ
ラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合抗体（例えば、二重特異的抗
体））を含む。この用語は特に本明細書中で、組換え単鎖Ｆｖフラグメント（ｓ
ｃＦｖ）、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ
．０８／０７７，２５２を参照のこと（これは本明細書中で参考として援用され
る））またはｐＦｖフラグメント（米国仮特許出願第６０／０４２，３５０号お
よび同６０／０４８，８４８号を参照のこと）をいう。用語「抗体」はまた、抗
原結合能力を有するフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ
、ＦｖおよびｒＩｇＧ。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
、Ｒｏｃｋｆｏｌｄ、ＩＬもまた参照のこと））を有する抗体の抗原結合形態を
含む。例えば、Ｋｕｂｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅ
ｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）もまた参照のこと。用語の
どの特定の意味が意図されるかは、文脈中で明らかである。
【００３４】 特定の抗原との抗体免疫学反応は、組換え方法（例えば、ファージまたは類似
のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９）；およびＶａｕｇｈａｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９〜３１４（１９９６）を参照のこと）
）によって、または抗原またはこの抗原をコードするＤＮＡで動物を免疫化する
ことによって産生され得る。
【００３５】 代表的に、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。それぞれの重鎖および
軽鎖は、定常領域および可変領域（この領域はまた、「ドメイン」として公知で
ある）を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、３つの過剰可変領域によって阻害
される４つの「枠組み」領域を含み、これはまた、「相補性決定領域」または「
ＣＤＲ」と呼ばれる。この枠組み領域およびＣＤＲの範囲が、規定されている（
Ｋａｂａｔ、前出を参照のこと）。異なる軽鎖および重鎖の枠組み領域の配列は
、比較的種の間で保存される。抗体のこの枠組み領域（これは構成軽鎖および重
鎖の組合わされた枠組み領域である）は、３次元空間におけるＣＤＲの位置決め
および整列に役立つ。
【００３６】 このＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担っている。それぞれの鎖の
ＣＤＲは、代表的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から
開始して連続して番号づけされ、そしてまた、代表的に特定のＣＤＲが位置する
鎖によって同定される。従って、ＶＨ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重
鎖の可変領域に位置し、一方ＶＬ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の
可変領域由来のＣＤＲ１である。
【００３７】 「ＶＨ」または「ＶＨ」について言及すると、これは免疫グロブリンの重鎖の
可変領域をいい、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの重鎖を含む。「ＶＬ 」または「ＶＬ」について言及すると、これは抗体の免疫グロブリンの軽鎖の可
変領域をいい、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの軽鎖を含む。
【００３８】 句「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、伝統的な２つの鎖の抗体の重鎖の可変
領域および軽鎖の可変領域が結合して１つの鎖を形成する抗体をいう。代表的に
、リンカーペプチドは、２つの鎖の間に挿入され、正確な折り畳みおよび活性結
合部位の生成を可能にする。
【００３９】 用語「リンカーペプチド」は、抗体結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメ
ント）（これは重鎖の可変領域が軽鎖の可変領域に間接的に結合することを補助
する）中のペプチドについていう。
【００４０】 用語「親の抗体」は一般に、親の抗体として同じエピトープに結合する抗体ま
たはそれらのフラグメントを得るために変異または改変される目的の抗体につい
ていう。本明細書中で使用される場合、用語「親の抗体」は、他に指示されるか
、または文脈で要求されない限り、「ＭＲ１」（ジーンバンク受託番号Ｕ７６３
８２）と命名されたｓｃＦｖについていう。
【００４１】 用語「ホットスポット」は、特に高度な天然の変異の部位である可変領域の枠
組み領域のＣＤＲのヌクレオチド配列の部分を意味する。ＣＤＲがそれ自体で過
剰可変領域と見なされるにもかかわらず、変異はＣＤＲを通じて一様に分配され
ないと確認された。特定の部位（すなわちホットスポット）は、集中した変異を
受けたこれらの位置として同定された。このホットスポットは、多くの構造的特
徴および配列によって特徴付けられる。これらの「ホットスポットモチーフ」を
使用して、ホットスポットを同定し得る。特によく特徴付けられる２つの コンセンサス配列モチーフは、４ヌクレオチド配列ＲＧＹＷおよびセリン配列Ａ
ＧＹ（ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、およびＷはＡま
たはＴである）である。
【００４２】 「標的化部分」または「標的化分子」は、目的の細胞に対する免疫結合体を標
的化する能力を有する免疫結合体の部分である。代表的に、この標的化部分は、
目的の細胞に対する特異的な抗原を認識する抗体（ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ
またはＦ（ａｂ’）２）である。
【００４３】 「毒性部分」は、免疫毒素中に取り込まれた場合、目的の細胞に免疫毒素細胞
傷害性を与える、細胞毒素または細胞毒素の部分である。
【００４４】 「免疫毒素」は、標的化分子（例えば、ｓｃＦｖ）ならびに毒性部分（例えば
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 外毒素（「ＰＥ」）またはそれらの細胞傷害性フラ
グメントを含む分子である。
【００４５】 本明細書中で議論される免疫毒素は、代表的にＥ．ｃｏｌｉ中の封入体として
発現され、その後この封入体を精製した後、６ＭグアニジンＨＣｌ中に可溶化し
、そしてタンパク質は再折り畳みされる。本明細書中で使用される場合、用語「
収率」は、この手順を通して収集された、適切に折り畳まれたモノマー免疫毒素
の量をいう。これは、ＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィー後のタンパク質
（ｍｇ）／再折り畳みされた封入体タンパク質（ｍｇ）として決定される割合と
して表現される。
【００４６】 「治療的部分」は、治療剤として作用することを意図する免疫結合体の部分で
ある。
【００４７】 用語「治療剤」には、抗新生物、抗炎症、サイトカイン、抗感染、酵素アクチ
ベーターまたは酵素インヒビター、アロステリック修飾因子、抗体、または患者
において所望される治療的な効果を誘導するために投与される他の因子として現
在公知であるか、または後に作用するように開発された任意の数の化合物が挙げ
られる。この治療剤はまた、毒素または放射線同位体であり、ここで意図される
この治療的な効果は、例えば、癌細胞の死滅である。
【００４８】 「検出可能な標識」は、免疫結合体について、その存在を検出可能にする特徴
を有する免疫結合体の部分を意味する。例えば、この免疫結合体は、免疫結合体
が存在する細胞が免疫組織化学アッセイにおいて検出されることを可能にする放
射活性同位体で標識され得る。
【００４９】 用語「エフェクター部分」および「エフェクター分子」は、標的化部分によっ
て標的化された細胞に対する効果を有するか、または免疫結合体の存在を同定す
ることを意図される免疫結合体の部分を意味する。従って、このエフェクター部
分は、例えば、治療的部分、毒素、放射標識または蛍光標識であり得る。
【００５０】 用語「免疫結合体」は、直接的に（例えば、共有結合を介して）または間接的
に（例えば、リンカーペプチドを介して）エフェクター分子に結合する標的化分
子（例えば、ｓｃＦｖ）を含むキメラ分子を意味する。免疫結合体のサブセット
において、このエフェクター分子は毒素であり、そして次いでキメラ分子はより
特異的に「免疫毒素」と呼ばれる。
【００５１】 用語「有効量（ｅｆｆｅｎｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「有効な量（ａ
ｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｏ）」または「治療学的に有効な量」は、
所望の結果（例えば、細胞タンパク質の合成を少なくとも５０％阻害するか、ま
たは細胞を死滅する）を生じるのに十分な治療剤の用量をいう。
【００５２】 用語「毒素」は、アブリン、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）
、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、またはそれらの改変された毒素を
いう。例えば、ＰＥおよびＤＴは、代表的に肝臓毒性を通して死をもたらす、高
毒性化合物である。しかしＰＥおよびＤＴは、毒素のネイティブの標的成分（例
えば、ＰＥのドメインＩａまたはＤＴのＢ鎖）を除去することおよび例えば抗体
のような異なる標的化部分で置換することによって、免疫毒素として使用のため
の形態に改変され得る。
【００５３】 用語「ＩＣ５０」は、タンパク質の合成を５０％まで阻害することが要求され
る毒素または免疫毒素の濃度（ｎｇ／ｍｌとして示される）をいう。
【００５４】 用語「接触」は、直接的な物理的な関連における配置をいう。
【００５５】 「発現プラスミド」は、プロモーターに作動可能に連結される、目的の分子を
コードするヌクレオチド配列を含む。
【００５６】 本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タン
パク質」は互換的に使用され、そしてアミノ酸残基のポリマーの参照を含む。こ
の用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工
的な化学的アナログ、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーであるアミノ酸
ポリマーに適用する。この用語はまた、タンパク質が機能的なままであるように
保存的アミノ酸置換を含むポリマーに適用する。
【００５７】 用語「残基」もしくは「アミノ酸残基」もしくは「アミノ酸」は、タンパク質
、ポリペプチド、またはペプチド（集合的に「ペプチド」）中に取り込まれるア
ミノ酸をいう。このアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、および他に限定され
なければ、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能し得る天然のアミノ酸の
公知のアナログを含み得る。
【００５８】 本明細書中で参照されるアミノ酸およびアナログは、表１において以下のよう
に簡略化した名称を用いて記載される：
【００５９】
【表１】 「保存的置換」とは、タンパク質について記載する場合、タンパク質の活性を
実質的に変化しないタンパク質のアミノ酸組成物における変化をいう。従って、
特定のアミノ酸配列の「保存的に改変された改変体」は、重要なアミノ酸の置換
でさえ、実質的に活性を変化しないような、タンパク質活性について重要でない
これらのアミノ酸のアミノ酸置換、または同様の特徴（例えば、酸性、塩基性、
陽性に荷電するかもしくは陰性に荷電した、または極性もしくは非極性など）を
有する他のアミノ酸を有するアミノ酸の置換をいう。機能的に類似のアミノ酸を
提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。表２における以下の６つの
群は、代表的に互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：
【００６０】
【表２】 また、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）を参照のこと。しかし、フ
ェニルアラニンおよびトリプトファンが一般に互いに保存的置換とみなされてい
るが、ｓｃＦｖ ＭＲ１のＶＬ ＣＤＲ３のホットスポットにおけるトリプトフ
ァンのフェニルアラニンへの置換は、親のｓｃＦｖよりもより活性的である免疫
毒素を生成したことに注意すべきである。従って、これらのアミノ酸がＣＤＲの
外側の抗体の部分について保存的置換であると考えられるが、本発明の文脈にお
いて、これらの２つのアミノ酸はホットスポット中では互いに保存的置換ではな
い。これらの結果に基づいて、ホットスポット中でのアミノ酸置換は、それらが
生じる分子の結合親和性、標的化部分としての分子と共に生成された免疫毒素の
収率、またはその両方に影響するか否かを決定するために、例えば本明細書中で
示されるアッセイによって試験されない限り、保存的置換とみなされ得ない。
【００６１】 ペプチドの状況下における用語「実質的に類似した」は、ペプチドが、１０〜
２０アミノ酸の比較ウインドウ上の参照配列に対して、少なくとも９０％、好ま
しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。配列同一
性の割合は、比較ウインドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することに
よって決定され、ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、
２つの配列の最適な整列のための参照配列（これは、付加または欠失を含まない
）と比較される場合に、付加または欠失（すなわち、間隙（ｇａｐ））を含み得
る。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在して
多数の一致した位置を生じる、その位置の数を決定することによって、比較のウ
インドウ中の位置の総数により一致した位置の数を除算することによって、そし
て結果を１００で乗算して配列同一性の割合を生じることによって、計算される
。
【００６２】 成句「ジスルフィド結合」または「システイン−システインジスルフィド結合
」は、システインの硫黄原子が酸化されてジスルフィド結合を形成する、２つの
システイン間の共有結合性の相互作用をいう。ジスルフィド結合の平均の結合エ
ネルギーは、水素結合の１〜２ｋｃａｌ／ｍｏｌと比較して、約６０ｋｃａｌ／
ｍｏｌである。本発明の状況下において、ジスルフィド結合を形成するシステイ
ンは、単鎖抗体の枠組み領域内に存在し、そして、抗体の立体配座を安定化する
ために役立つ。
【００６３】 用語「結合体化する（こと）」、「結合する（こと）（ｊｏｉｎｉｎｇ）」、
「結合する（こと）（ｂｏｎｄｉｎｇ）」または「連結する（こと）」は、２つ
のポリペプチドを１つの連続するポリペプチド分子にすることである。本発明の
状況下において、この用語は、エフェクター分子（ＥＭ）に対する抗体部分の結
合をいう。この結合は、化学的手段または組換え手段のいずれかであり得る。化
学的手段は、２つの分子間に共有結合が形成されて１つの分子を形成するような
抗体部分とエフェクター分子との間の反応をいう。
【００６４】 本明細書中で使用される場合、「組換え（体）」は、それらのネイティブな状
態で、タンパク質の発現が可能なＤＮＡの内因性コピーを有さない細胞を使用し
て産生されたタンパク質をいう。これらの細胞は、適切な単離された核酸配列の
導入によって遺伝子的に変更されているので、組換えタンパク質を産生する。こ
の用語はまた、異種核酸の導入、またはその細胞に対してネイティブではない形
態へのネイティブな核酸の変更によって改変された細胞、核酸、またはベクター
、あるいは、細胞がそのように改変された細胞に由来する細胞、核酸、またはベ
クターをいう。従って、例えば、細胞のネイティブな（非組換え）形態中に見出
されない遺伝子を発現する組換え細胞は、ネイティブな形態中に見出されない遺
伝子の変異体を発現するか、または他に異常に発現されるか、過小発現されるか
、または全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。
【００６５】 本明細書中で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」は、一本鎖または
二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをい
い、そして他に制限されない限り、天然に存在するヌクレオチドに対して類似し
た様式で、核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含
する。他に示されない限り、特定の核酸配列は、その相補的な配列ならびに保存
的な改変体（すなわち、コドンのゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）位置に存在する核酸お
よびタンパク質に翻訳される場合に保存的なアミノ酸置換を生じる改変体）を含
む。
【００６６】 本明細書中で使用される場合、特定の核酸に関して、「コード（する）」は、
特定のタンパク質への翻訳のための情報を含む核酸をいう。この情報は、コドン
の使用によって特定される。代表的には、アミノ酸配列は、「ユニバーサル」遺
伝子コードを使用して、核酸によってコードされる。しかし、ユニバーサルコー
ドの改変体（いくつかの植物、動物、および真菌のミトコンドリア、細菌Ｍｙｃ
ｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８２：２３０６−２３０９（１９８５））または繊毛性Ｍａｃｒ
ｏｎｕｃｌｅｕｓに存在するような）は、核酸がこれらの生物体の翻訳機構を使
用する際に発現される場合に、使用され得る。
【００６７】 成句「インフレームで融合する（こと）」は、ポリペプチドをコードする２つ
以上の核酸を結合し、その結果、結合された核酸配列が、本来のポリペプチド鎖
を含む単鎖タンパク質に翻訳されることをいう。
【００６８】 本明細書中で使用される場合、「発現された」は、核酸のタンパク質への翻訳
をいう。タンパク質は、発現されそして細胞内に残ったままであり、細胞表面の
成分となり得るかまたは細胞外マトリックスまたは培地に分泌され得る。
【００６９】 「宿主細胞」は、発現ベクターの複製または発現を補助し得る細胞を意味する
。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原生生物細胞または酵母、昆虫、両生類、
または哺乳動物細胞のような真核生物細胞であり得る。
【００７０】 成句「ファージディスプレイライブラリー」は、各々が、表面タンパク質にイ
ンフレームで組換え的に融合された外来のｃＤＮＡを含むバクテリオファージの
集団をいう。細菌宿主（代表的にはＥ．ｃｏｌｉ）中での複製後、目的の外来ｃ
ＤＮＡを含むファージは、ファージ表面上の外来タンパク質の発現によって選択
される。
【００７１】 ２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況下で、用語「同一」またはパー
セント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してか、または
視覚的検査によって測定されるように、最大の一致のために比較および整列され
る場合に、同一の２つ以上の配列またはサブ配列、または特定の割合の同一であ
るアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する同一の２つ以上の配列またはサブ配
列をいう。
【００７２】 ２つの核酸またはポリペプチドの状況下で、成句「実質的に同一」は、以下の
配列比較アルゴリズムの１つを使用してか、または視覚的検査によって測定され
るように、最大の一致のために比較および整列される場合に、少なくとも６０％
、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ
酸残基同一性を有する２つ以上の配列またはサブ配列をいう。好ましくは、実質
的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基である配列の領域にわたって、より
好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そして、最も好
ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最
も好ましい実施形態において、配列は、コード領域の全体の長さにわたって実質
的に同一である。
【００７３】 配列比較のために、代表的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列
として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配
列は、コンピューターに入力され、必要な場合にサブ配列座標が指定され、そし
て、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較
アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比
較した試験配列のパーセント配列同一性を計算する。このような整列についての
多数のアルゴリズムが当該分野で公知である。
【００７４】 ２つの核酸またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、
第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第
２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるとい
うことである。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的な置
換のみによって異なる場合、代表的に、第２のポリペプチドに実質的に同一であ
る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子が、以
下に記載されるように、ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズす
るということである。
【００７５】 用語「インビボ」は、細胞が得られる生物体の体の内側をいう。「エキソビボ
」および「インビトロ」は、細胞が得られる生物体の体の外側を意味する。
【００７６】 成句「悪性細胞」または「悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）」は、侵襲性で
ありそして／または転移を起こし得る腫瘍または腫瘍細胞（すなわち、癌細胞）
をいう。
【００７７】 本明細書中で使用される場合、「哺乳動物細胞」は、ヒト、ラット、マウス、
モルモット、チンパンジー、またはマカクザルを含む哺乳動物に由来する細胞を
いう。この細胞は、インビボまたはインビトロで培養され得る。
【００７８】 用語「選択的に反応性」は、抗原に関して、その抗原を欠く細胞または組織で
はなく、その抗原を保有する細胞または組織との、全体または部分的な、抗体の
優先的な結合をいう。もちろん、ある程度の非特異的相互作用が、分子と非標的
細胞または組織との間で起こり得ることが認識されている。それにも関わらず、
選択的反応性は、抗原の特異的認識を介して媒介されるとして、区別され得る。
選択的反応性抗体は、抗原に結合するが、これらは、低い親和性で結合し得る。
他方、特異的な結合は、結合された抗体と抗原を欠く細胞との間よりも、抗体と
抗原を保有する細胞との間で、はるかに強力な結合を生じ得る。特異的結合は、
ＥＧＦＲｖＩＩＩを欠く細胞または組織と比較して、ＥＧＦＲｖＩＩＩを保有す
る細胞または組織に対する結合された抗体の量（単位時間あたり）において、代
表的に、２倍より大きい、好ましくは、５倍より大きい、より好ましくは１０倍
より大きい、そして最も好ましくは、１００倍より大きい増加を生じる。このよ
うな条件下でのタンパク質への特異的な結合は、特定のタンパク質のその特異性
について選択される抗体を必要とする。種々の免疫アッセイ型式が、特定のタン
パク質と特異的に免疫応答性である抗体を選択するために適切である。例えば、
固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質に特異的に免疫応答性であるモノク
ローナル抗体を選択するために慣用的に使用される（特定の免疫反応性を決定す
るために使用され得る免疫アッセイ型式および条件の説明については、Ｈａｒｌ
ｏｗ＆Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。
【００７９】 用語「免疫学的反応条件」は、特定のエピトープに対して産生された抗体が、
実質的に全ての他のエピトープへの結合よりも、検出可能により大きい程度に、
および／または実質的にその結合を排除する程度に、そのエピトープに結合する
ことを可能にする条件をいう。免疫学的反応条件は、抗体結合反応の型式に依存
し、そして、代表的に、免疫アッセイプロトコールまたはインビボで遭遇する条
件において、利用される条件である（免疫アッセイ型式および条件の説明につい
ては、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、前出、を参照のこと）。好ましくは、本発明の
方法において使用される免疫学的に反応性条件は、代表的に、生きている哺乳動
物または哺乳動物細胞の内側である条件（例えば、温度、浸透圧、ｐＨ）をいう
「生理学的条件」である。いくつかの器官は、厳しい条件に供されていることが
理解されるが、生物体内および細胞内環境は、通常、約ｐＨ７（すなわち、ｐＨ
６．０〜ｐＨ８．０、より好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５）に存在し、所定の
溶媒として水をふくみ、そして、０℃を超えて５０℃未満の温度で存在する。浸
透圧は、細胞の生存度および増殖を支持する範囲内である。
【００８０】 （ＩＩＩ．ＭＲ１の親和性よりもＥＧＦＲｖＩＩＩについてより高い親和性を
有する抗体の作製） 抗体は、それらのＣＤＲにおける残基を介して、抗原に結合する。結果として
、ＣＤＲの変異誘発は、抗体のＦａｂフラグメントおよびＦｖフラグメントの親
和性を改善するために広範に使用される。ＣＤＲ変異誘発に対する多数の異なる
アプローチが存在する。これら（例えば、コドンベースの変異誘発（Ｙｅｌｔｏ
ｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５））、ＣＤ
Ｒ ｗａｌｋｉｎｇ（Ｂａｒｂａｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ．１４
：２３０−２３４（１９９６）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：
３９２−４０３（１９９５））、誤りがちな複製（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２６０：３５９−３６８（１９９６））および合成ＣＤＲ構築物（ｄｅ
Ｋｒｕｉｆら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５（１９９５）））
のうちの多くは、作製するのが技術的に困難で、処理することが難しい、大きい
ライブラリーの構築を必要とする。比較的より小さい大きさのライブラリーから
の高親和性結合剤の単離すべく、抗体親和性成熟における傾向が存在する（Ｐｉ
ｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１７６９−２１７７６（１９９８
）；Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６０３７
−６０４２（１９９８）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｔｅｃｈ
ｎｏｌ．１７：５６８−５７２（１９９９））。これらのアプローチの全てが、
ＣＤＲにおける変異を有し、そして、より優れた結合剤の選択のための抗体の発
現ライブラリーの構築を包含する。
【００８１】 ファージディスプレイ技術は、大きいペプチドまたはタンパク質ライブラリー
をスクリーニングするための有用なツールとなっている（Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎ
ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）；ＭｃＣａ
ｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｂ
ａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７
８−７９８２（１９９１））。単鎖Ｆｖは、ファージミドベクター中で、Ｍ１３
遺伝子３タンパク質との融合物としてファージ粒子上に発現され得る。この融合
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され、そして、ヘルパーファージの存在下
で、培養培地から回収され得るＭ１３ファージの先端部に提示される。ｓｃＦｖ
融合タンパク質を提示するファージ（これは、特定の抗原に結合する）は、抗原
を発現する細胞上または抗原が結合される表面上のファージライブラリーのパニ
ング（例えば、磁気ビーズ）によって選択される。結合しないファージは、洗い
落とされ、結合したファージは、溶出され、そして、Ｅ．ｃｏｌｉを再感染する
ことによって増幅される。数回のパニングは、特定の結合剤の濃縮を生じる。パ
ニング条件をよりストリンジェントにすることによって、より優れた結合剤が、
乏しい結合剤からより効果的に分離され得る。
【００８２】 ファージディスプレイ技術を利用して、ＭＲ１よりも高い親和性で、ＥＧＦＲ
ｖＩＩＩに結合する抗体を開発し得る。当該分野で周知のように、インタクトな
抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む；各鎖は、３つのＣＤＲ（それぞれ
、１、２、および３と命名される）を有する。各ＣＤＲは、抗原結合に寄与する
ことが知られているが、それらは、不等に結合する（一般的に、Ｋｕｂｙ，Ｊ．
，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（第３版、１９９８年）を参照のこと）。いずれかのＣＤＲのアミノ酸は、親和
性を増加する変異を見出するように変異され得るが、平均的に、各鎖のＣＤＲ３
は、その鎖のＣＤＲ１またはＣＤＲ２よりも、抗原結合により大きく寄与する（
一般的に、Ｋｕｂｙ、前出、１１７頁を参照のこと）。従って、ＣＤＲ３ ＶＨ およびＶＬ鎖は、特に有利であり得る。さらに、ＭＲ１のＣＤＲ３ ＶＨは、マ
ウスＣＤＲ３について比較的長く、これは、他のｓｃＦｖに対するＭＲ１ ｓｃ
Ｆｖの相対的安定性に部分的に寄与し得る。
【００８３】 導入において議論される理由のため、抗原結合に寄与しそうにないが、ＶＨ
ＣＤＲ３の最後の２アミノ酸を交換した後、ＶＨ ＣＤＲ３における残りの９残
基を他の１９の天然のアミノ酸の各々と置換した。アミノ酸９８位および９９位
における、それぞれ、セリンおよびトレオニンのみの変異は、得られた免疫毒素
の改善した細胞傷害性を生じた（ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、
表５、６、および７、下方、における１文字コードによって示される。ＶＨを開
示する配列は、２つの残基（Ｄ１０１ および Ｙ１０２）を示さない。これらの 残基は、抗原結合に寄与しないようであると考えられている。）ＶＨ ＣＤＲ３
における好ましい置換は、Ｐ９８−Ｙ９９（これは、３．５ｎｇ／ｍｌのＰＥ３
８免疫毒素中でＩＣ５０を与える）、Ｐ９８−Ｎ９９、Ｐ９８−Ｗ９９、および
Ｐ９８−Ｉ９９（これらの全ては、４．５ｎｇのＩＣ５０を有した）、Ｐ９８−
Ｆ９９（６ｎｇのＩＣ５０を有した）、およびＰ９８−Ｖ９９（６．５ｎｇのＩ
Ｃ５０を有した）であった。４つのクローン（Ｐ９８−Ｓ９９、Ｗ９８−Ｖ９９
、Ｓ９８−Ｗ９９、およびＰ９８−Ｔ９９）は、親クローンと等しいＩＣ５０を
有した。（変換によって、「Ｐ９８−Ｙ９９」のような用語は、ＭＲ１ ＶＨ
ＣＤＲ３の場合、指定されたポリペプチドの９８位にアミノ酸プロリンが現れ、
そして、チロシンが、９９位に現れることを示すが、残りの分子が、正常なポリ
ペプチド（この場合、親抗体ＭＲ１）のアミノ酸であることを示す。） ＶＬ ＣＤＲ３の変異に関して、たった１つの変異（Ｆ９２Ｗ）は、親よりも
より活性な免疫毒素を与える。そのＩＣ５０は、１．３ｎｇ／ｍｌであった。こ
の場合、「親」分子は、ＶＨ ＣＤＲ３中に置換Ｐ９８−Ｙ９９を有するＭＲ１
であり、これは、ＶＬ ＣＤＲ３中の付加された置換なしで、３．５ｎｇ／ｍｌ
のＩＣ５０を有した。この変異ＭＲ１（これは、ＶＨおよびＶＬ鎖（ＶＨ Ｓ９
８Ｐ−Ｔ９９Ｙ−ＶＬＦ９２Ｗ）の両方のＣＤＲ３中の変異を併用する）は、免
疫毒素の標的化部分として使用される場合、試験された最高の細胞傷害性形態で
あり、ここで、「ＭＲ１−１」と呼ばれる。
【００８４】 これらの結果は、種々のＣＤＲにおける変異が、相加作用を有し得、そして、
得られた免疫毒素の細胞傷害性を増加し得ることを示す。これらの結果を考慮し
て、ＭＲ１のＶＨおよびＶＬ鎖のＣＤＲ１および２のホットスポットにおけるア
ミノ酸の変異は、同様に、ＥＧＦＲｖＩＩＩについてのさらに改善した親和性を
有する抗体を生じ、そして、ＭＲ１と比較される場合に、さらに改善した細胞傷
害性を有する免疫毒素を生じる。
【００８５】 クローンを分析する最もよい時期は、プロセスの初期である。濃縮がピークに
達した後のパニングは、クローンを失う危険のために、有害である。低い親和性
を有するが高い発現を有するＦｖが、優先的に濃縮されるが、良好な結合剤が失
われ得る。これを支持する証拠は、軽鎖のＣＤＲ３ライブラリーをパニングする
間に観察された：低い親和性（Ｋｄ ２２ｎＭ）を有する変異体Ｆ９２Ｓが、３
回目の後で、調査された１０クローンのうち７クローンで見出されたが、最高の
結合剤（Ｆ９２Ｗ）は、１度のみ提示された。対照的に、２回目は、Ｆ９２Ｓは
、１７クローン中の２つのみで見出されたが、Ｆ９２Ｗは、１７クローン中の６
つで提示された。
【００８６】 （ＩＶ．抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体） 本発明は、先行技術の抗体よりも高い親和性でＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、そ
して、ＥＧＦＲｖＩＩＩと選択的に反応する抗体を提供する。特に、本発明は、
ＭＲ１（この抗原に対して標的化された最も以前に公知のｓｃＦｖ）よりもＥＧ
ＦＲｖＩＩＩに関して低いＫｄを有する抗体を提供する。さらに、これらの抗体
は、ＭＲ１で作製された同一の免疫毒素よりも、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞につ
いて高い細胞傷害性を有する免疫毒素を形成する。本発明はさらに、ＭＲ１より
も、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する高い親和性および高い細胞傷害性を有する抗体を
産生する方法を提供する。以下に開示された免疫結合体は、本発明の抗体を使用
して、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的にする。これらの抗体は、哺乳動物細胞の表面に
提示されるＥＧＦＲｖＩＩＩのこれらの決定基に対して、免疫学的条件下で選択
的に反応性であり、そして、細胞外環境由来の抗体にアクセス可能である。
【００８７】 本発明の好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ｓｃＦｖの
ような組換え抗体またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体である。Ｆｖ抗体は、代表
的に、約２５ｋＤａであり、そして、重鎖および軽鎖の両方の上の３つのＣＤＲ
との完全な抗原結合部位を含む。ＶＨおよびＶＬ鎖が、連続して発現されない場
合、Ｆｖ抗体の鎖は、代表的に、非共有結合相互作用によって共に維持される。
しかし、これらの鎖は、希釈の際に解離する傾向があり、グルタルアルデヒド、
分子内ジスルフィド、またはペプチドリンカーを介して鎖を架橋するために、こ
のような方法が開発された。ジスルフィドによって安定化されたＦｖが、例えば
、米国特許第５，７４７，６５４号において教示される。
【００８８】 特に好ましい実施形態において、抗体は、単鎖抗体Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
ｓｃＦｖ抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、２鎖の抗体中に見出されるものと同様な
抗原結合部位を作製するために、折り畳まれる単鎖抗体を含む。一旦折り畳まれ
ると、非共有結合相互作用は、単鎖抗体を安定化する。より好ましい実施形態に
おいて、ｓｃＦｖは、組換え的に産生される。当業者は、本発明の抗体の保存的
な改変体が、作製され得ることを理解する。ｓｃＦｖフラグメントにおいて使用
されるこのような保存的な改変体は、ＶＨとＶＬ領域との間の正確な折り畳みお
よび安定化のために必要な重要なアミノ酸残基を保持する。
【００８９】 本発明のいくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ抗体は、軽鎖を介して、エフ
ェクター分子（ＥＭ）に直接結合される。しかし、ｓｃＦｖ抗体は、そのアミノ
末端またはカルボキシル末端に結合され得る。
【００９０】 いくつかの抗体実施形態のＶＨおよびＶＬ領域は、共に直接結合され得るが、
当業者は、領域が１つ以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって、 分離され得ることを理解する。ペプチドリンカーおよびそれらの用途は、当該分
野で周知である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：５８７９（１９８８）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４２：４２３６（１９８８）；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２９：１３６２（１９９０）；米国特許第４，９４６，７７８号、米国
特許第５，１３２，４０５号およびＳｔｅｍｍｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １４：２５６−２６５（１９９３）（全てが本明細書中に参考文献として
援用される）を参照のこと）。一般に、ペプチドリンカーは、領域を結合するこ
と、またはＶＨとＶＬとの間のいくらかの最小の距離もしくは他の空間的関係を
保持すること、以外に特定の生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカ
ーの成分アミノ酸は、折り畳み、正味電荷、または疎水性のような分子のいくつ
かの性質に影響するように選択され得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、必要に
応じて、長さが、たった５０アミノ酸、一般に、たった４０アミノ酸、好ましく
は、たった３０アミノ酸、およびより好ましくはたった２０アミノ酸のペプチド
リンカーを含む。いくつかの実施形態において、このペプチドリンカーは、配列
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのコンカテマーであり、好ましくは、
２、３、４、５、または６つのこのような配列である。しかし、リンカー内のい
くつかのアミノ酸置換が作製され得ることが理解されるべきである。例えば、バ
リンは、グリシンと置換され得る。
【００９１】 （Ａ．ｓｃＦｖの産生） 上記のように、好ましい実施形態において、抗体（例えば、免疫毒素の標的化
部分）は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖ抗体を作製する方法は、記載されている。
Ｈｕｓｅら、前出；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９
８９）；およびＶａｕｇｈａｎら、前出を参照のこと。簡単にいうと、Ｂ細胞由
来のｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製される。このｃＤＮＡは、周知
の技術（例えば、ＰＣＲ）により、免疫ブロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域
に特異的なプライマーを用いて増幅される。ＰＣＲ産物は、例えば、アガロース
ゲル電気泳動により精製され、そしてこの核酸配列が連結される。リンカーペプ
チドが所望される場合、このペプチドをコードする核酸配列が、重鎖核酸配列と
軽鎖核酸配列との間に挿入される。この配列は、当該分野で公知の技術により（
例えば、平滑末端連結、ＰＣＲ産物の末端における制限部位の挿入、または重複
伸長によるスプライシングにより）連結され得る（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｍｏ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９（１９９７））。増幅後、ｓｃＦｖをコードする
核酸は、当該分野で周知の技術により、再度ベクターに挿入される。好ましくは
、このベクターは、原核生物において複製し得、そして真核生物および原核生物
の両方において発現され得る。好ましい実施形態において、ｓｃＦｖ遺伝子は、
短いリンカーによりＰＥ３８遺伝子と連結され、そしてＴ７ベースの発現ベクタ
ー中にクローン化される。特定の好ましい実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＢＬ２１（λＤＥ３）において、Ｔ７プロモーターの制御下で発現さ
れる。
【００９２】 先の節で注釈したように、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するｓｃＦｖは、
パニングにより見出される。パニングは、様々な方法のいずれかにより実施され
得る。本発明に関する好ましい方法において、パニングは、その表面にＥＧＦＲ
ｖＩＩＩを発現する細胞を用いて、都合良く実施され得る。細胞を用いてパニン
グを実施するためのプロトコルは、以下の実施例に記載される。パニングはまた
、固体表面をＥＧＦＲｖＩＩＩでコーティングし、そして適切な条件下で適切な
時間その表面上でファージをインキュベートすることにより、固体表面上で実施
され得る。好都合には、この表面は、磁気ビーズであり得る。結合しないファー
ジは固体表面から洗い流され、そして結合したファージは溶出される。
【００９３】 最も高い親和性を有する抗体を見つけることは、選択プロセスの有効性により
決定され、そしてスクリーニングされ得るクローンの数およびスクリーニングが
なされるストリンジェンシーに依存する。代表的に、より高いストリンジェンシ
ーは、より選択的なパニングに対応する。しかし、条件がストリンジェントすぎ
る場合、ファージは結合しない。１ラウンドのパニングの後、ＥＧＦＲｖＩＩＩ
でコーティングされたプレートまたはその表面にＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細
胞に結合するファージは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて拡張され、そして別のラウンド
のパニングに供される。このようにして、数倍の濃縮が、３ラウンドのパニング
において起こる。従って、各ラウンドにおける濃縮が低い場合でさえも、複数の
ラウンドのパニングは、稀なファージおよび最も高い親和性を有するｓｃＦｖを
コードする遺伝物質かまたはファージにおいてより発現される遺伝物質の単離を
導く。
【００９４】 選択されるパニングの方法に関わらず、ファージディスプレイにより提供され
る遺伝型と表現型との間の物理的な関係は、クローンの大ライブラリーであって
も、抗原への結合についてｃＤＮＡライブラリーのそれぞれのメンバーを試験す
ることを可能にする。
【００９５】 （Ｂ．抗体の結合親和性） 本発明の抗体は、親の抗体ＭＲ１よりも少なくとも１ｎＭ低いＫｄでＥＧＦＲ
ｖＩＩＩのエピトープに結合する。代表的に標的抗原に対しての結合親和性は、
標準的な抗体−抗原アッセイ（例えば、競合アッセイ、飽和アッセイ、またはイ
ムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ））により測定または決定され
る。
【００９６】 このようなアッセイは、抗体の解離定数を決定するために使用され得る。用語
「解離定数」は、抗原に対する抗体の親和性の基準をいう。抗体と抗原との間の
結合の特異性は、抗体の解離定数（Ｋｄ＝１／Ｋ、ここでＫは親和定数）が、マ
イクロモル域で好ましくは１００ｎＭ未満、そして最も好ましくは０．１ｎＭ未
満の場合に存在する。代表的に抗体分子は、低域のＫｄを有する。Ｋｄ＝［Ａｂ
−Ａｇ］／［Ａｂ］［Ａｇ］（ここで、［Ａｂ］は、抗体の平衡点での濃度であ
り、［Ａｇ］は、抗原の平衡点での濃度であり、そして［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体
−抗原複合体の平衡点での濃度である）。代表的に、抗原と抗体との間の結合相
互作用は、可逆的な非共有結合性の会合（例えば、静電引力、ファンデルワール
ス力、および水素結合）を含む。結合特異性を規定するこの方法は、ＥＧＦＲｖ
ＩＩＩに特異的な単一の重鎖および／または軽鎖、ＣＤＲ、融合タンパク質、ま
たは重鎖および／または軽鎖のフラグメントに適用する。
【００９７】 （Ｃ．イムノアッセイ） 抗体は、多くの十分に認識された免疫学的結合アッセイのいずれかを用いて検
出および／または定量され得る（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同
第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，
１６８号を参照のこと）。一般的なイムノアッセイの総説については、ＭＥＴＨ
ＯＤ ＩＮ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ、第３７巻、Ａｓａｉ編、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＢＡＳＩＣ ＡＮ
Ｄ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ７ＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ、Ｓｔ
ｉｔｅｄ ＆ Ｔｅｒｒ編（１９９１）もまた参照のこと。代表的に、免疫学的
結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、抗体に特異的に結合し、そしてしば
しば抗体を固定化するリガンド（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）を用いる。本発明の
イムノアッセイにおいて用いられる抗体は、上記でより詳細に議論されている。
【００９８】 イムノアッセイはまた、リガンドと抗体により形成される結合複合体に特異的
に結合し、標識する標識因子をしばしば用いる。この標識因子は、それ自身が抗
体／分析物複合体を含む部分（すなわち、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）の１つであ
り得る。あるいは、この標識因子は、第３の部分（例えば、抗体／ＥＧＦＲｖＩ
ＩＩタンパク質複合体に特異的に結合する別の抗体）であり得る。
【００９９】 １つの局面において、競合アッセイは、標識因子が標識を保有する第２の抗Ｅ
ＧＦＲｖＩＩＩ抗体であるように企図される。次いで２つの抗体は、固定化され
たＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合について競合する。答えられるべき質問が、第１の
抗体の親和性とＭＲ１の親和性とを比較することであるような実施形態において
、第２の抗体は、ＭＲ１であり得る。あるいは、非競合的なフォーマットにおい
て、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は標識を欠くが、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が由来し（
例えば、マウス）、そして抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に結合する種の抗体に特異的
な二次抗体が標識される。
【０１００】 免疫グロブリン定常領域に特異的に結合する他のタンパク質（例えば、プロテ
インＡまたはプロテインＧ）はまた、標識因子として用いられ得る。これらのタ
ンパク質は、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ細菌の細胞壁の通常の構成要素であ
る。それらは、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域との強い非免疫学的な反
応性を示す（一般的には、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１
４０１−１４０６（１９７３）；およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５））。
【０１０１】 このアッセイを通して、インキュベーションおよび／または洗浄工程は、各因
子の連結後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒から数時間、
好ましくは約５分から約２４時間で変化し得る。しかし、インキュベーション時
間は、アッセイ形式、抗体、溶液の量、濃度などに依存する。通常、アッセイは
、環境温度にて実施されるが、４℃から４０℃の温度範囲にわたり実施され得る
。
【０１０２】 本発明のイムノアッセイの詳細は、用いられる特定の形式と共に変化し得るが
、一般的に、抗体を含むサンプル中の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を検出する方法は
、免疫学的に反応性の条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩ−抗体複合体と特異的に反応す
る抗体と、サンプルを接触させる工程を包含する。
【０１０３】 （Ｖ．免疫結合体の生成） 本発明において生成される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、エフェクター分子（Ｅ
Ｍ）とＥＭカルボキシル末端、ＥＭアミノ末端を通じて、ＥＭの内部アミノ酸残
基（例えば、システイン）を通じて、またはそれらの任意の組合せを通じて連結
され得る。同様に、ＥＭは、抗体の重領域、軽領域、Ｆｃ領域（定常領域）また
は骨組み領域に直接的に連結され得る。連結は、抗体のアミノ末端またはカルボ
キシル末端を通じて、または内部アミノ酸残基を通じて生じ得る。ＰＥまたはそ
の細胞傷害性フラグメントがＥＭとして用いられる場合、カルボキシル末端での
、またはその付近での連結は、この分子をサイトゾルへと向かわせるシグナル配
列として機能する配列を維持するかまたは添加する（連結がＣ末端に存在する場
合）様式でなされるべきである。ＲＥＤＬＫ（ネイティブＰＥの配列、１文字表
記）、ＫＤＥＬ、ＲＤＥＬおよびＫＤＥＬの繰り返しのような適切なシグナルア
ミノ酸配列は、当該分野で公知である。例えば、ＷＯ ９１／１８０９９を参照
のこと。さらに、複数のＥＭ分子（例えば、２〜１０個のいずれか１つ）が、抗
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に連結され得、そして／または複数の抗体（例えば、２〜
５個のいずれか１つ）が、ＥＭに連結され得る。特定の好ましい実施形態におい
て、ＫＤＥＬは、Ｃ末端配列である。抗体とのエフェクター分子の連結により形
成される分子は、免疫結合体として公知である。
【０１０４】 治療因子は、特定の標的分子かまたは標的分子を保有する細胞に対して指向す
る特定の生物学的活性を有する因子である。当業者は、治療因子として、種々の
薬物（例えば、ビンブラスチン、ダウノマイシンなど）、細胞毒（例えば、ネイ
ティブまたは改変されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはＤｉｐｈｔｈｅｒ
ｉａ毒素）、それ自身が薬理学的組成物、放射活性因子（例えば、１２５Ｉ、３ ２ Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、および３５Ｓ）および他の標識、標的部分およびリガンド
を含むカプセル化因子（例えば、リポソーム）が挙げられ得ることを認識してい
る。
【０１０５】 特定の治療因子の選択は、特定の標的分子または細胞に依存し、そして生物学
的効果が、惹起されることが所望される。従って、例えば、治療因子は、特定の
標的細胞の死を引き起こすために用いられる細胞毒であり得る。逆に、非致死的
な生物学的応答が引き起こされることのみが所望される場合、治療因子は、非致
死的な薬理学的因子または非致死的な薬理学的因子を含むリポソームと結合体化
され得る。
【０１０６】 本明細書で提供される治療因子および抗体を用いて、当業者は、機能的に等価
な核酸分子（例えば、配列において異なるが、同じＥＭまたは抗体配列をコード
する核酸）を含む種々のクローンを容易に構築し得る。従って、本発明は、抗体
および複合体ならびにそれらの融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【０１０７】 （Ａ．組換え方法） 本発明の核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の適切な
方法によるか、またはＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０
−９９（１９７９）のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１（１９７９）のホスホジエステル方法；Ｂｅ
ａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１
）のジエチルホスホラミダイト方法；例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａ
ｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９
８４）に記載されるような自動合成機を用いた、Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒ
ｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２（
１９８１）により記載される固相ホスホラミダイトトリエステル方法；および米
国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法のような方法による直接的な化
学合成により調製され得る。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する
。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーショによるか、またはテンプレー
トとして一本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼによる重合により二本鎖ＤＮＡに変
換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は、約１００塩基の配列に制限される
が、それより長い配列は、短い配列の連結により獲得され得ることを認識してい
る。
【０１０８】 好ましい実施形態において、本発明の核酸配列は、クローニング技術により調
製される。適切なクローニングおよび配列決定技術、ならびに多くのクローニン
グ実験を通して当業者を指示するのに十分な説明の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡ
Ｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９８９）、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編、ＧＵＩＤＥ
ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（１９８７）また
はＡｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ（１９８７）に見出される。生物
学的試薬および実験装置の製造者からの製品情報もまた、有用な情報を提供する
。このような製造者として、ＳＩＧＭＡ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ（
Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａ
ｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒ
ｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅ
ｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ、（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、Ｍ
Ｄ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋ
ａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当
業者に公知の多くの販売元が挙げられる。
【０１０９】 ネイティブのエフェクター分子（ＥＭ）または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコー
ドする核酸は、本発明のＥＭ、抗体、または免疫結合体を形成するよう改変され
得る。部位特異的変異誘発による改変は、当該分野で周知である。ＥＭまたは抗
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードする核酸は、インビトロ方法により増幅され得る
。増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、および自己維持的配列複製系（３ＳＲ）
が挙げられる。広範な種々のクローニング方法、宿主細胞、およびインビトロ増
幅方法論は、当業者に周知である。
【０１１０】 好ましい実施形態において、免疫結合体が、ＥＭをコードするｃＤＮＡを含む
ベクターに抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ抗体をコードするｃＤＮＡを挿入する
ことにより調製される。この挿入は、ｓｃＦｖおよびＥＭがインフレームで読ま
れるようになされ、それは、機能的なＦｖ領域および機能的なＥＭ領域を含む１
つの連続するポリペプチド中に存在する。特定の好ましい実施形態において、Ｄ
ｉｐｈｔｈｅｒｉａ毒素フラグメントをコードするｃＤＮＡが、ｓｃＦｖと連結
され、その結果、この毒素が、ｓｃＦｖのアミノ末端に配置される。最も好まし
い実施形態において、ＰＥまたはその細胞傷害性フラグメントをコードするｃＤ
ＮＡがｓｃＦｖと連結され、その結果、この毒素が、ｓｃＦｖのカルボキシル末
端に配置される。最も好ましい実施形態において、この細胞傷害性フラグメント
は、ＰＥ３８である。
【０１１１】 一旦、本発明のＥＭ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、または免疫結合体をコードす
る核酸が単離およびクローン化されると、組換え操作された細胞（例えば、細菌
細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞）において所望のタ
ンパク質を発現させ得る。当業者は、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、およ
び種々の高等真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細
胞株、およびミエローマ細胞株）を含む、タンパク質の発現のための利用可能な
多くの発現系において知識を有すると考えられる。原核生物または真核生物にお
けるタンパク質の発現について公知の種々の方法を詳細に記載する試みはなされ
ない。簡単にいうと、代表的に、本発明の単離されたタンパク質をコードする天
然または合成の核酸の発現は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーター（構成性か
誘導性のいずれか）に作動可能に連結し、次いで発現カセット中への組込みによ
り、達成される。このカセットは、原核生物または真核生物のいずれにおいても
、複製および組込みのために適切であり得る。代表的な発現カセットは、転写お
よび翻訳終結因子、開始配列、およびこのタンパク質をコードするＤＮＡの発現
の調節に有用なプロモーターを含む。好都合には、このカセットは、１つ以上の
抗生物質耐性遺伝子もまた含むプラスミド中に配置され得る。クローン化された
遺伝子の高レベルの発現を獲得するために、最低限、直接的な転写のための強力
なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳終結
因子を含む発現カセットを構築するのが望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉについては、こ
れはＴ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、またはλプ
ロモーターのようなプロモーター、リボソーム結合部位、および好ましくは転写
終結因子を含む。真核生物細胞については、コントロール配列が、プロモーター
および好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、お
よびポリアデニル化配列由来のエンハンサーを含み得、そしてスプライスドナー
配列およびスプライスアクセプター配列を含み得る。本発明のカセットは、周知
の方法（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについては、塩化カルシウム形質転換またはエレ
クトロポレーション、および哺乳動物細胞については、リン酸カルシウム処理、
エレクトロポレーション、またはリポフェクション）により、選択された宿主細
胞に移され得る。このカセットにより形質転換された細胞は、カセット中に含ま
れる耐性遺伝子（ａｍｐ遺伝子、ｋａｎ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、
およびｈｙｇ遺伝子）により与えられる抗生物質に対する耐性により選択され得
る。カナマイシン耐性およびアンピシリン耐性は、ファージを用いる研究に好ま
しい実施形態である。
【０１１２】 当業者は、本発明のポリペプチド（すなわち、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、ＰＥ
、またはそれらの組合せから形成される免疫結合体）をコードする核酸に対して
、その生物学的活性を消失することなく改変がなされ得ることを認識している。
いくつかの改変が、クローニング、発現、または標的分子の融合タンパク質への
組込みを容易にするためになされ得る。このような改変は当業者に周知であり、
そして例えば、開始部位を提供するためのアミノ末端へのメチオニン付加、また
は好都合に配置された制限部位または終結コドンもしくは精製配列を作製するた
めにいずれかの末端に配置される付加的なアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）が挙
げられる。
【０１１３】 組換え方法に加えて、本発明の免疫結合体、ＥＭ、および抗体はまた、標準的
なペプチド合成を用いてその全体または一部が構築され得る。約５０アミノ酸長
未満の本発明のポリペプチドの固相合成は、不溶性支持体にこの配列のＣ末端ア
ミノ酸を付着し、次いでこの配列の残りのアミノ酸を連続的に添加することによ
り達成され得る。固相合成のための技術は、Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ、ＴＨＥ ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＡＮＡＬＹＳＩＳ、ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、
ＢＩＯＬＯＧＹ、第２巻；ＳＰＥＣＩＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＥＰＴＩ
ＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、ＰＡＲＴ Ａ、３−２８４頁；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９６３）、
およびＳｔｅｗａｒｔら、ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴ
ＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ
１１（１９８４）により記載されている。より長いタンパク質は、短いフラグメ
ントのアミノ末端とカルボキシル末端の縮合により合成され得る。カルボキシル
末端の活性化により（例えば、カップリング試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカ
ルボジイミドの使用により）ペプチド結合を形成する方法は当業者に公知である
。
【０１１４】 （Ｂ．精製） 一旦発現されると、本発明の組換え免疫結合体、抗体、および／またはエフェ
クター分子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、イオン交換カラ
ムおよびゲル濾過カラムならびにバッチクロマトグラフィーなどを含む、当該分
野の標準的な手順に従い精製され得る（一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、ＰＲＯ
ＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．
Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的
に純粋な組成物が好ましく、薬学的使用のためには９８〜９９％またはそれ以上
の均質性が最も好ましい。一旦部分的にかまたは所望の均質性まで精製されると
、治療的に用いられる場合、このポリペプチドは、内毒素を実質的に含まない。
【０１１５】 Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌由来の単鎖抗体を含む、単鎖抗体の発現および／ま
たは適切な活性形態に再フォールディングさせるための方法は、記載され周知で
あり、そして本発明の抗体に適用可能である。Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０（１９９２）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５（１９９１）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１
：５４４（１９８９）を参照のこと（これら全ては、本明細書中で参考として援
用される）。
【０１１６】 しばしば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他のバクテリア由来の機能的な異種タンパク質
は、封入体から単離され、強力な変性剤を使用する可溶化およびそれに続く再折
り畳み（リフォールディング）を必要とする。可溶化工程の間、当該分野で公知
のように、ジスルフィド結合を還元するために、還元剤が存在しなければならな
い。還元剤を含む模範的な緩衝液は：０．１Ｍ トリス ｐＨ８、６Ｍ グアニ
ジン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＤＴＥ（ジチオエリトリトール）。還元型
および酸化型の低分子量チオール試薬の存在下で、ジスルフィド結合の再酸化が
起こり得る（本明細書中において援用されるＳａｘｅｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ９：５０１５−５０２１（１９７０）において記載され、そして特に
、Ｂｕｃｈｎｅｒら（前出）によって記載される）。
【０１１７】 代表的に、再生は、変性されたタンパク質および還元されたタンパク質の、再
折り畳み緩衝液中への希釈（例えば、１００倍）によって達成される。模範的な
緩衝液は、０．１Ｍ トリス ｐＨ８．０、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、８ｍＭ 酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、および２ｍＭ ＥＤＴＡである。
【０１１８】 ２本鎖抗体精製プロトコルへの改変として、重鎖領域および軽鎖領域は、再折
り畳み溶液中で別々に可溶化および還元され、次いで結合される。これらの２つ
のタンパク質が、他方のタンパク質に対してあるタンパク質が５倍モル過剰を超
えないモル比で、混合される場合、好ましい収量が得られる。酸化還元シャッフ
リングが完了した後、過剰量の酸化型グルタチオンまたは他の低分子量酸化化合
物を再折り畳み溶液へ加えることが所望される。
【０１１９】 （ＶＩ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素および他の毒素） 毒素は、本発明の抗体と共に使用され、免疫毒素を生成する。模範的な毒素と
して、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボ
ツリヌス毒素Ａ〜Ｆが挙げられる。これらの毒素は、商業的供給源（例えば、Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より
容易に入手可能である。ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。リシンは、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍ
ｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のレクチンＲＣＡ６０である。この用語はまた、その
毒性改変体もいう。例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および同第４，６
８９，４０１号を参照のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素（ＲＣ
Ａ）は、それぞれ分子量約６５ｋＤおよび１２０ｋＤに基づいて設計された２つ
の型ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０において生じる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＆
Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２６６
：５４３（１９７２））。Ａ鎖は、タンパク質合成を不活性化し、かつ細胞を殺
す原因である。Ｂ鎖は、リシンを細胞表面ガラクトース残基へ結合し、Ａ鎖の細
胞質ゾルへの結合輸送を容易にする（Ｏｌｓｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２４９：
６２７−６３１（１９７４）および米国特許第３，０６０，１６５号）。
【０１２０】 アブリンは、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の毒性レクチンを含ん
でいる。この毒性の素因（アブリンａ、ｂ、ｃ、およびｄ）は、約６３ｋＤ〜６
７ｋＤの分子量を有し、かつ２つのジスルフィド結合ポリペプチド鎖ＡおよびＢ
からなる。このＡ鎖は、タンパク質合成を阻害し；このＢ鎖（アブリン−ｂ）は
、Ｄ−ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．５２：１０９５（１９８８）；およびＯｌｓｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０：３３０〜３３５（１９７８）を参照のこと）。
【０１２１】 本発明の好ましい実施形態において、毒素はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ
（ＰＥ）である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって分泌
されるネイティブなＰＥは、非常に活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）
であり、これは、真核生物細胞におけるタンパク質合成を阻害する。このネイテ
ィブなＰＥの配列は、本発明の明細書中で参考として援用される米国特許第５，
６０２，０９５号において提供される。作用の方法は、ＡＤＰ−リボシル化によ
る延長因子２（ＥＦ−２）の不活性化である。この外毒素は、毒性を引き起こす
ために一斉に作用する３つの構造ドメインを含んでいる。ドメインＩａ（アミノ
酸１〜２５２）は、細胞結合を媒介する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６
４）は、細胞質ゾルへの移動の原因であり、そしてドメインＩＩＩ（アミノ酸４
００〜６１３）は、延長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ドメインＩｂ（
アミノ酸３６５〜３９９）の機能は、このドメインの大部分（アミノ酸３６５〜
３８０）が毒性の消失を伴わずに欠失され得るにも関わらず、定義されていない
ままである。
【０１２２】 本明細書中で使用される用語「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素」は、ネイティ
ブな配列、そのネイティブな配列の細胞障害性ラグメント、ならびに保存的に改
変されたネイティブＰＥの改変体およびその毒性フラグメントをいう。好ましい
実施形態において、ＰＥ分子は、毒素の非特異的な結合を減少または排除するた
めに、ドメインＩａを欠失するように改変されてきている。ＰＥの細胞傷害性フ
ラグメントは、標的細胞において、引き続きタンパク質加水分解または他のプロ
セッシングを伴うかまたは伴わない細胞傷害性のフラグメント（例えば、タンパ
ク質またはタンパク質前駆体）を含んでいる。ＰＥの細胞傷害性フラグメントは
、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５を含む。ＰＥ４０は、当該分野において
以前に記載されているようなＰＥの短縮型誘導体である。Ｐａｉら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３５８−６２（１９９１）；
およびＫｏｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５（
１９８８）を参照のこと。ＰＥ３５は、ネイティブＰＥの位置２８０でメチオニ
ン、それに続くネイティブＰＥのアミノ酸２８１〜３６４および３８１〜６１３
からなる、ＰＥの３５ｋＤのカルボキシル末端フラグメントである。ＰＥ３８は
、ＰＥのアミノ酸２５３〜３６４および３８１〜６１３からなる、短縮型ＰＥ前
駆タンパク質である。ＰＥ３８は、細胞内におけるプロセッシング時に、ＰＥ３
８の毒性型へ活性化される（本明細書中において参考として援用される米国特許
第５，６０８，０３９号を参照のこと）。
【０１２３】 特定の好ましい実施形態において、ＰＥ３８は、本発明の免疫毒素の毒性部分
である。しかしながら、細胞傷害性フラグメントＰＥ３５およびＰＥ４０もまた
使用され得る；これらのフラグメントは、各々が本明細書中において参考として
援用される米国特許第５，６０２，０９５号および同第４，８９２，８２７号に
開示されている。ＭＲｌベースの免疫毒素を使用して行う研究に基づいて、ＫＤ
ＥＬは、Ｃ末端配列の好ましい改変である（Ｌｏｒｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９３：１４８１５〜１４８２０（１９９６）の
１４８１８を参照のこと）。
【０１２４】 （Ａ．保存的に改変されたＰＥの改変体） 保存的に改変されたＰＥの改変体またはそれらの細胞傷害性フラグメントは、
目的のＰＥ（例えば、ＰＥ３８）と、アミノ酸レベルで、少なくとも８０％の配
列類似性、好ましくは少なくとも８５％の配列類似性、さらに好ましくは少なく
とも９０％の配列類似性、そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性
を有する。
【０１２５】 用語「保存的に改変される改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に
適用される。特定の核酸配列について、保存的に改変される改変体は、同一のア
ミノ酸配列または本質的に同一のアミノ酸配列、あるいは核酸がアミノ酸配列を
コードしない場合、本質的に同一の核酸配列をコードする核酸配列をいう。遺伝
暗号の縮重により、多くの機能的に同一な核酸が、任意の所定のポリペプチドを
コードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、全て、ア
ミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって指定されるあ
らゆる位置で、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく
記載される対応するコドンのいずかに変化され得る。核酸のこのような改変は、
「サイレント改変」であり、これは、保存的に改変される改変体の一種である。
ポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列はまた、核酸の起こり
得る全てのサイレント改変を記載する。当業者は、核酸中の各々のコドン（ＡＵ
Ｇ（通常メチオニンに対する唯一のコドンである）、およびＵＧＧ（トリプトフ
ァンに対する唯一のコドンである）を除く）が、機能的に同一な分子を生成する
ように改変され得ることを理解するであろう。従って、ポリペプチドをコードす
る核酸の各々のサイレント改変は、各々の記載される配列において暗黙である。
【０１２６】 アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一アミノ酸または
低い百分率のアミノ酸を変化、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプ
チド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、この変化が、
化学的に類似するアミノ酸を用いるアミノ酸置換をもたらす「保存的に改変され
る改変体」であることを理解するであろう。
【０１２７】 （Ｂ．ＰＥの細胞傷害性に対するアッセイ） 本発明において使用されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素は、当業者に周知の
アッセイによって、細胞傷害性の所望されるレベルについてアッセイされ得る。
例えば、細胞傷害性はしばしば、代理の測定として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外
毒素によるタンパク質合成の阻害を用いて測定される。例えば、Ｌｏｒｉｍｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４８１５〜１４
８２０（１９９６）の１４８１８を参照のこと。好都合なことに、これは、ＥＧ
ＦＲｖＩＩＩを正常に発現しないが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｃＤＮＡでトランスフ
ェクトされている細胞による、放射標識されたアミノ酸の取り込みを測定するこ
とによって行われ得る（Ｐｒｉｏｒら、Ｃｅｌｌ ６４：１０１７−１０２３（
１９９１）中で教示される）。以下の実施例において、トリチル化されたロイシ
ンの取り込みが、ＮＲ６Ｍ細胞（マウスＥＧＦＲの発現の欠如について選択され
て、およびヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ ｃＤＮＡでトランスフェクトされるＳｗｉｓ
ｓ ３Ｔ３細胞）において測定された。従って、ＰＥの細胞傷害性フラグメント
およびこのようなフラグメントの保存的に改変される改変体は、細胞傷害性につ
いて容易にアッセイされ得る。
【０１２８】 多数のＰＥ分子候補は、同時に、当該分野で周知の方法によって細胞傷害性に
ついてアッセイされ得る。例えば、候補分子のサブグループが細胞傷害性につい
てアッセイされ得る。候補分子の陽性に反応するサブグループは、継続的に細か
く分けられ、所望される細胞傷害性フラグメントが同定されるまで再度アッセイ
され得る。このような方法は、多くの細胞傷害性フラグメントまたはＰＥの保存
的改変体の迅速なスクリーニングを可能にする。
【０１２９】 （Ｃ．他の治療部分） 本発明の抗体はまた、表面上でＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞に対する多数
の異なる診断的または治療的化合物を標的化するために使用され得る。従って、
本発明の抗体（例えば、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ）は、直接的にかまたは
リンカーを介して、ＥＧＦＲｖＩＩＩを保持する細胞に直接的に送達される薬物
へ付着され得る。治療薬として、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしく
は誘導体のような化合物、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、糖質、または組
換えウイルスが挙げられる。治療的核酸部分および診断的核酸部分としては、ア
ンチセンス核酸、１重鎖ＤＮＡまたは２重鎖ＤＮＡとの共有結合的架橋のために
誘導されるオリゴヌクレオチド、および３重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げら
れる。
【０１３０】 あるいは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に結合される分子は、好ましくは直接的に
循環系への暴露から遮断するカプセル化系（例えば、治療的組成物（例えば、薬
物、核酸、（例えば、アンチセンス核酸）、または他の治療的部分）を含むリポ
ソームまたはミセル）であり得る。抗体に結合するリポソームを調製する方法は
、当業者に周知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏ
ｎｎｏｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１〜３６５（１９８５）を参照
のこと。
【０１３１】 （Ｄ．検出可能な標識） 本発明の抗体は、必要に応じて検出可能な標識に共有結合または非共有結合さ
れ得る。このような使用に適する検出可能な標識として、分光学的手段、光化学
的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、または化学的手段によっ
て検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明の有用な標識として、磁気ビー
ズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチ
オシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射
標識（例えば、３Ｈ、ｌ２５Ｉ、３５Ｓ、ｌ４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例え
ば、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラ
ーゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他の酵素）、および比色定
量の標識（コロイド金、色ガラス、またはプラスチック（例えば、ポリスチレン
、ポリプロピレン、ラテックス、など）のビーズ）が挙げられる。
【０１３２】 このような標識を検出する方法は、当業者に周知である。従って、例えば、放
射標識は、写真フィルムまたはシンチレーション計数管を使用することによって
検出され得、蛍光マーカーは、光の放射を検出するための光検出器を使用して検
出され得る。酵素標識は、代表的に酵素に基質を提供し、そしてその基質上の酵
素の作用によって生産される反応産物を検出することによって検出され、また、
比色定量の標識は、呈色された標識を単に視覚化することによって検出される。
【０１３３】 （Ｅ．抗体への結合体化） 本発明の非組換え実施形態において、エフェクター分子（例えば、治療的部分
、診断的部分、または検出部分）は、当業者に公知の多数の方法を使用して、本
発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に結合される。共有結合的付着および非共有結合
的付着手段の両方が、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を用いて使用され得る。
【０１３４】 エフェクター分子を抗体に付着させる手順は、ＥＭの化学的構造に従って変わ
る。ポリペプチドは代表的に、種々の官能基を含む；例えば、エフェクター分子
の結合をもたらすための、抗体上の適切な官能基との反応に有用なカルボン酸（
ＣＯＯＨ）、遊離アミン基（−ＮＨ２）またはスルフヒドリル基（−ＳＨ）。
【０１３５】 あるいは、抗体が誘導されて、さらなる反応官能基を暴露するか、またはこれ
を付着する。この誘導は、多くのリンカー分子（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌｉｎｏｉｓより入手可
能なリンカー分子）の付着を含み得る。
【０１３６】 本明細書中で使用される「リンカー」は、抗体をエフェクター分子に接合する
ために使用される分子である。このリンカーは、抗体およびエフェクター分子の
両方に対して共有結合を形成し得る。適切なリンカーは、当業者に周知であり、
そして以下のものを含むが、これらに限定されない；直鎖または分岐鎖炭素リン
カー、ヘテロ環式炭素リンカー、またはペプチドリンカー。抗体およびエフェク
ター分子がポリペプチドである場合、その側鎖の基を介して（例えば、システイ
ンへのジスルフィド結合を介して）、構成アミノ酸に接合され得る。しかしなが
ら、好ましい実施形態において、リンカーは、末端アミノ酸のα炭素アミノ基お
よびカルボキシル基に結合される。
【０１３７】 いくつかの状況において、免疫結合体が標的部位へ到達した場合、エフェクタ
ー分子が抗体から離れることが所望される。それゆえ、これらの状況において、
免疫結合体は、標的部位の近傍で開裂する結合を含む。エフェクター分子を抗体
から放出するためのリンカーの開裂は、酵素的活性、または免疫結合体が標的細
胞内かまたは標的部位の近傍のいずれかで従う条件によって促進され得る。標的
部位が腫瘍である場合、腫瘍部位で示される条件下（腫瘍関連酵素に暴露される
場合か、または酸性ｐＨ）で開裂するリンカーが使用され得る。
【０１３８】 多種多様な放射性診断化合物、放射性治療化合物、薬物、毒素、および他の薬
剤の抗体への付着に関して、報告されている多数の方法を考慮して、当業者は所
定の薬剤を抗体または他のポリペプチドへ付着させるための適切な方法を決定し
得る。
【０１３９】 （ＶＩＩ．薬学的組成物および投与） 本発明の抗体および／または免疫結合体組成物（すなわち、ＭＲ１のＫｄより
少なくとも１ｎＭ小さいＥＧＦＲｖＩＩＩのエピトープについてのＫｄを伴って
、抗体に結合されたＰＥ）は、脳内への投与のために有用である。脳腫瘍治療の
ための免疫毒素の使用は、最近、Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．，およびＹｏｕｌｅ，
Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３４：９７
−１１４（１９９８）によって概説された。小さいポリペプチドは、血液脳関門
を通る。血液脳関門を通らない大きなポリペプチドに関して、タンパク質を脳へ
投与する方法が周知である。例えば、タンパク質、ポリペプチド、他の化合物、
および細胞は、脳室内（ＩＣＶ）注入によってかまたはカニューレによって、哺
乳動物の脳へ送達され得る。（例えば、ＭｏｔｔａおよびＭａｒｔｉｎｉ、Ｐｒ
ｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１６８：６２〜６４（１９８１）；
Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｂｉｏｅｈｅｍ．Ｐｈａｒａｍａｃｏｌ．３１：２８０７
〜２８１０（１９８２）；Ｒｚｅｐｃｚｙｎｓｋｉら、Ｍｅｔａｂ．Ｂｒａｉｎ
Ｄｉｓ．３：２１１〜２１６（１９８８）；Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚら、Ｂｒａｉ
ｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．２１：９０５〜９１２（１９８８）；Ｓｒａｍｋａら、
Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．５８：７９〜８３（
１９９２）；Ｐｅｎｇら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６３２：５７〜６７（１９９３
）；Ｃｈｅｍら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２５：７２〜８１（１９９４）；Ｎ
ｉｋｋｈａｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６３：５７〜７２（１９９４）；
Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５７：２９６〜３１７（
１９９５）；およびＢｒｅｃｋｎｅｌｌおよびＦａｗｃｅｔｔ、Ｅｘｐ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．１３８：３３８〜３４４（１９９６）を参照のこと）。
【０１４０】 したがって、例えば、神経膠芽細胞腫は、カニューレまたは注射器による腫瘍
周辺組織への、またはより一般的にはＩＣＶによる中枢神経系区画への、局在化
された送達によって処置され得る。さらに、免疫結合体は、全身（例えば、患者
の神経膠芽細胞腫が上皮細胞を損傷しているところ）に投与され、十分に血液脳
関門の突破を可能にし得る。
【０１４１】 本発明の抗体または免疫結合体はまた、乳癌、卵巣癌、および肺癌を治療する
ために、局部的または全身的に投与され得る。例えば、これらの悪性疾患は、外
科的に切除され得ない腫瘍への直接的投与によって処置され得る。これらの癌腫
は、免疫結合体の非経口投与によって処置され、例えば、放射線または外科手術
によって処置されるか、または実際に容易に検出される、十分な大きさの腫瘍を
未だ形成していない任意の転移細胞の場所を捜し、そしてそれらを殺し得る。
【０１４２】 投与のための化合物は一般的に、薬学的に受容可能なキャリア（好ましくは、
水性キャリア）中に溶解される、抗体および／または免疫結合体の溶液を含む。
多種多様な水性キャリアが使用され得る（例えば、生理食塩水など）。このよう
な溶液は滅菌され、そして一般的には所望されない物質を含まない。これらの組
成物は、従来の、周知の滅菌技術によって、滅菌され得る。これらの組成物は、
生理学的条件を近づけることが必要とされる場合、薬学的に受容可能な補助物質
（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム
、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を
含み得る。これらの処方物中の融合タンパク質の濃度は、広く変化し得、そして
選択される特定の投与形態および患者の必要性に従って、主に、流体の体積、粘
性、体重などに基づいて選択される。
【０１４３】 従って、代表的な薬学的に受容可能な本発明の免疫毒素組成物は、脳への投与
を目的として、１日当り約１．２〜１２００μｇである。乳癌、卵巣癌、または
肺癌を治療するための静脈内投与を目的とする代表的な組成物は、患者１人当り
、１日当り約０．１〜１０ｍｇである。特に、薬物が、隔離された部位および循
環系またはリンパ系以外へ（例えば、体腔へ、または器官の管腔へ）投与される
場合、患者１人当り、１日当り０．１〜約１００ｍｇまでの投薬量が使用される
。投与可能な組成物を調整する現実的な方法は、当業者に公知であるか、または
明らかであり、そしてこれは、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴ
ＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）のような出
版物中により詳細に記載される。
【０１４４】 本発明の組成物は、治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、
組成物は、疾患（例えば、神経膠芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、または肺癌）を患っ
ている患者へ、疾患またはその合併症を少なくとも遅らせるかまたは部分的に阻
止するのに十分な量で、投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有
効量」として定義される。この使用に有効な量は、疾患の重症度および患者の健
康の全般的な状態に依存する。この化合物の有効量は、症状の主観的な軽減また
は臨床医もしくは資格を有する他の観察者によって気付かれるような客観的に確
認され得る改善のいずれかを提供する量である。
【０１４５】 化合物の単一または複数の投与は、患者によって必要とされかつ許容されるよ
うな投薬量および頻度に依存して、投与される。いくつかの場合において、この
組成物は、患者を処置するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供するべきで
ある。好ましくはこの投薬は１回投与されるが、治療成果が達成されるまでまた
は副作用が治療の中止の理由となるまで、周期的に適用され得る。一般的に、こ
の投薬量は、患者へ許容不可能な毒性を引き起こすことなく、症状または疾患の
徴候を処置または改善するのに十分である。
【０１４６】 本発明の免疫結合体組成物の徐放性非蛍光処方物は、インプラント、油状注射
物、または特別な系（システム）として作製され得る。タンパク質送達系の広範
な概説のついては、本明細書において参考として援用されているＢａｎｇａ，Ａ
．Ｊ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮ
Ｓ：ＦＲＯＭＵＬＡＴＩＯＮ，ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，ＡＮＤ ＤＥＬＩＶＥＲ
Ｙ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，（１９９５）を参照のこと。特定
の系（システム）としては、マイクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナ
ノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルは、
中心のコア（核）として治療用タンパク質を含む。マイクロスフェアにおいて、
治療剤は、この粒子全体にわたって分散している。約１μｍ未満の粒子、マイク
ロスフェア、およびマイクロカプセルは、一般にそれぞれナノ粒子、ナノスフェ
アおよびナノカプセルと呼ばれる。キャピラリーは、約５μｍの直径を有し、そ
のためナノ粒子のみが静脈内に投与される。微粒子は代表的にほぼ１００μｍの
直径であり、そして皮下にまたは筋肉内に投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ
，Ｊ．，ＣＯＬＬＯＩＤＡＬ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，
Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ，編．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ，第２１９〜３４２（１９９４）；およびＴｉｃｅ＆Ｔａｂｉｂ
ｉ，ＴＲＥＡＴＩＳＥ ＯＮ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥ
ＲＹ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ第３１５〜３３９（１９９２）（両方とも本明細書において
参考として援用される）を参照のこと。
【０１４７】 ポリマーを、本発明の免疫結合体組成物のイオン制御放出に用いることができ
る。徐放性の薬物送達における使用のための種々の分解性および非分解性のポリ
マーマトリックスは、当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，Ａｃｃｏｕ
ｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７〜５４２（１９９３））。例えば、ブ
ロックコポリマー、ポロキサマー４０７は、低温では粘性だが流動性の流体とし
て存在し、ただし、体温では半固体状ゲルを形成する。これは、組換えインター
ロイキン−２およびウレアーゼの処方および徐放性の送達のための有効なビヒク
ルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：
４２５−４３４（１９９２）；およびＰｅｃら．，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．
Ｔｅｃｈ．４４（２）５８−６５（１９９０））。あるいは、ヒドロキシアパタ
イトが、タンパク質の徐放性放出のためのマイクロキャリアとして用いられてき
た（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５−２２４（１
９９４））。なお別の局面において、リポソームが徐放性放出のために、および
流体カプセル化薬物の薬物標的化のために用いられる（Ｂｅｔａｇｅｒｉら．，
ＬＩＰＯＳＯＭＥＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｔｅｃｈｎｏ
ｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ
（１９９３））。治療用タンパク質の徐放性送達のための多くのさらなるシステ
ムは公知である。例えば、米国特許第５，０５５，３０３号、同第５，１８８，
８３７号、同第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８
３７，０２８号、同第４，９５７，７３５号および同第５，０１９，３６９号、
同第５，０５５，３０３号；同第５，５１４，６７０号；同第５，４１３，７９
７号；同第５，２６８，１６４号；同第５，００４，６９７号；同第４，９０２
，５０５号；同第５，５０６，２０６号；同第５，２７１，９６１号；５，２５
４，３４２号および同第５，５３４，４９６号（各々、本明細書において参考と
して援用される）を参照のこと。
【０１４８】 本発明の免疫毒素の種々の用途のなかでも、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（免疫結合体の
毒素作用によって排除され得る）を発現する特定のヒト細胞によって生じる疾患
状態が挙げられる。本発明の免疫毒素のための１つの好ましい適用は、ＥＧＦＲ
ｖＩＩＩを発現する悪性の細胞の処置である。例示的な悪性細胞としては、グリ
ア芽細胞腫、乳房癌腫、卵巣癌腫、および肺癌の細胞が挙げられる。
【０１４９】 （ＶＩＩＩ．診断キットおよびインビトロ使用） 別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＥＧＦＲｖＩＩ
Ｉの検出のためのキットを提供する。「生物学的サンプル」とは、本明細書にお
いて用いる場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含む生物学的組織または流体のサンプルで
ある。このようなサンプルとしては、生検由来の組織、喀痰、羊水、血液、血球
（例えば、白血球）が挙げられるがこれらに限定されない。流体サンプルは、あ
る程度は目的のものであるが、本明細書においては該して好ましくない。なぜな
ら、検出可能な濃度のＥＧＦＲｖＩＩＩが、このようなサンプル中で容易に見出
されるからである。生物学的サンプルはまた、組織の切片（例えば、組織学的目
的でとった凍結切片）を含む。生物学的サンプルは代表的に多細胞の真核生物、
好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、また
はウサギ）、より好ましくは霊長類（例えば、マカク、チンパンジー）から得ら
れる。最も好ましくは、生物学的サンプルはヒト由来である。
【０１５０】 キットは、代表的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対してＭＲ１ ｓｃＦＶが有する親
和性よりも高い親和性を有する、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦＶを含む
。
【０１５１】 さらに、このキットは代表的に、本発明の抗体の使用の方法（例えば、サンプ
ル中のＥＧＦＲｖＩＩＩ含有細胞の検出のため）を開示する説明書を含む。この
キットはまた、特定の適用（そのためにこのキットが設計される）を容易にする
ためのさらなる構成要素を含み得る。従って、例えば、このキットは、標識を検
出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフ
ィルターセット、適切な二次標識（例えば、ヒツジ抗−マウス−ＨＲＰ）など）
をさらに含み得る。このキットは、さらに特定の方法の実施のために慣用的に用
いられる緩衝液および他の試薬を含み得る。このようなキットおよび適切な内容
物は、当業者に周知である。
【０１５２】 本発明の１つの実施形態において、診断キットは、イムノアッセイを含む。上
記のように、本発明のイムノアッセイの詳細は、使用される特定の様式によって
変化し得るが、生物学的サンプル中でＥＧＦＲｖＩＩＩを検出するための方法は
、一般に、生物学的サンプルを抗体と接触させる工程を含む。この抗体は、ＥＧ
ＦＲｖＩＩＩに対してＭＲ１ ｓｃＦＶよりも高い親和性で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ
に（免疫学的反応条件下で）特異的に反応する。この抗体は、免疫学的に反応性
の条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩに結合させられ、そして結合した抗体の存在は直接
または間接的に検出される。
【０１５３】 本明細書に教示される方法によって開発された抗体、および、特に、ｓｃＦｖ
（ＭＲ１−１と名付けられた）の親和性が増大していることに起因して、本明細
書において提供される抗体は、診断薬として、そしてインビトロアッセイにおい
て、生物学的サンプル中のＥＧＦＲｖＩＩＩの存在を検出ために、特に有用であ
る。例えば、本明細書において教示される方法によって作成されるＭＲ１−１お
よび他の抗体は、免疫組織学的アッセイにおける免疫結合体の標的部分として用
いられて、どのサンプルがＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞を含むかを決定し得
る。このサンプルが通常はＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しないはずの患者の組織から
得られたものである場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩの検出は、この患者がＥＧＦＲｖＩ
ＩＩ発現細胞の存在によって特徴付けられる癌を有することか、またはこのよう
な癌の処置が癌を全滅させるのにまだ成功していないことのいずれかを示す。当
業者はまた、適切な標識に結合された本発明の抗ＥＧＦｒｖＩＩＩ抗体が、ＥＧ
ＦＲｖＩＩＩ発現細胞の存在を検出するためにインビボで同様に用いられ得、こ
れにより、この患者がＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞の存在によって特徴付けられる
癌を有することか、またはこのような癌の処置が癌を全滅させるのにまだ成功し
ていないことのいずれかを示すことを理解する。
【０１５４】 （実施例） （実施例１） （ＭＲ１の結合よりも強い結合を有する抗体を開発する戦略） ＥＧＦＲｖＩＩＩに対してＭＲ１の結合よりも強力な結合である抗体を開発す
るため、ＭＲ１ｓｃＦｖを用いてファージディスプレイライブラリーを作成した
。無作為の変異を重鎖の相補性決定領域３’（ＶＨＣＤＲ３）に導入した。この
領域は、抗原結合の重要な役割を有する（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５（１９９６））。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現す
る細胞でのパニングでいくつかの変異を生成した。この変異は、免疫毒素を構築
するために用いる場合、親和性、細胞傷害性、および収率が改善されている。こ
れらの改変体の分析により、これらの全てがＶＨＣＤＲ３の領域（過剰変異（超
変異）のためのホットスポット（突然変異多発領域）とみなされている）に局在
した変異体を有することが現された（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉ
ｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：２４８〜２５４（１９９５）；Ｊｏｌｌｙ，Ｃ．Ｊ．
,Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１５９〜１６８（１９９６）；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．６２：１０７〜１１６（
１９９８））。ホットスポットは、コンセンサス配列Ｇ／Ａ−Ｇ／Ｔ／Ｃ−Ａ／
ＴまたはＡ−Ｇ−Ｃ／Ｔによって規定される。後者は、抗体の可変性ドメイン遺
伝子で見出されたセリンコドンを含む（Ｇｏｙｅｎｅｃｈｅａら．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３９７９〜１３９８４（１９９
６））。ホットスポットは、抗体の成熟の間に高頻度で変異する領域である。Ｖ Ｈ ＣＤＲ３ライブラリーをパニング（パニング）しても、ホットスポットの外側
の変異を含むどんなクローンも生成しない。この結果は、ホットスポットを無作
為化することで、親和性の改善された変異体を生成する可能性が高くなるようで
あるという最近の知見を確認するものである（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５６８〜５７２（１９９９））。ＶＨＣＤ
Ｒ３をパニングして得られた最高のバインダー（結合因子）（ｂｉｎｄｅｒ）を
用いて軽鎖ＣＤＲ３におけるホットスポットを無作為化するファージディスプレ
イライブラリーを作成した。このライブラリーをパニングして、なおより所望さ
れ得る特徴を有するいくつかのより変異したクローンを生成した。
【０１５５】 （実施例２） （ＶＨ変異ライブラリーの構築）ＭＲ１のＶＨＣＤＲ３は、１１のアミノ酸か
らなる。序（導入部）において注記したように、これらのアミノ酸のうち２つは
、抗原結合には関与しないようであると考えられた。ＶＨにおける他の９つのア
ミノ酸は、他の天然のアミノ酸の全てを、以下の通りその位置で通常存在するア
ミノ酸残基で置換することによって変異したものである。ＤＮＡオリゴマーを設
計して３つのライブラリーを生成した（各々は９つのヌクレオチド（３つの保存
的アミノ酸）を無作為化する）。ＭＲ１ファージミドをテンプレートとして用い
て、３つの別々の２工程ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＣＤＲ重鎖に
おける３つのアミノ酸無作為化を導入した。以下のオリゴを用いた： ＣＤＲ３Ｈｂ（５’−ＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＳＮＮＳＮＮＳＮＮＡＧＡＧＧＴＡ
ＣＴＡＧＡＡＴＡＧＣＣＴＣＴＴＧＴＧＣＡ−３’）、 ＣＤＲ３Ｈｄ（５’―ＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＴＡＳＮＮＳＮＮＳ
ＮＮＡＧＡＡＴＡＧＣＣＴＣＴＴＧＴＧＣＡ−３’）、 ＣＤＲ３Ｈｆ（５’ＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＴＡＡＧＡＧＧＴＡＣ
ＴＳＮＮＳＮＮＳＮＮＴＣＴＴＧＴＧＣＡ−３’）、 Ｓ１（５’―ＣＡＡＣＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣ−３’）、 ＡＭＢＮ（５’−ＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＴＡＴＧＣＧＧ
ＧＣＡＣ−３’） １回目のＰＣＲでは、５０ｐｇのファージミドｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ−ＭＲ１
を、２０ｐｍｏｌ ＤＮＡオリゴマーＳ１とともに２０ｐｍｏｌのＤＮＡオリゴ
マーＣＤＲ３Ｈｂ、ＣＤＲ３ＨｄまたはＣＤＲ３Ｈｆを用いて、３つの別々の反
応中でテンプレートとして用いた。このテンプレートおよびオリゴを２ Ｒｅａ
ｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と５０μｌ容積
に混合して、次いで以下のプロフィールを用いてサイクルした：９５℃５分間で
１サイクル、続いて、９４℃１分間、５５℃１分間、そして７２℃１分間の３０
サイクル。これらの反応によって変異体を含む４０７ｂｐの産物を生成した。次
いで、第一の工程で生成した産物を、テンプレートとしてＭＲ１ファージミドを
用いてプライマーＡＭＢＮとの３つの別々の反応中で、プライマーとして用いた
。これらの反応において、第一の反応由来の１μｌの産物を、テンプレートとし
て、２０ｐｍｏｌのＤＮＡオリゴマーＡＭＢＮと、５０ｐｇのファージミドｐＣ
ＡＮＴＡＢ ５Ｅ−ＭＲ１とともに用いた。このプライマーおよびテンプレート
を５０μｌ容積中で２ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓと混合して、上記のプロフィールを
用いてサイクルした。各反応によって８７６ｂｐのライブラリーを生成した。Ｐ
ＣＲ産物を制限酵素Ｓｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いて消化し、そして精製し
た。１５０ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２５０ｎｇのファージディスプレイベクター
ＤＮＡ ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａによって供給されたとおり事
前消化済み）と連結した。連結混合液を脱塩し、各連結物の４０ｎｇを用いてＥ
．ｃｏｌｉ ＴＧ１を形質転換した。各形質転換によって約１．５×１０６クロ
ーンを生じた。次いで、このファージライブラリーを形質転換した最近からレス
キューした。各形質転換からの細胞を２％グルコース含有１０ｍｌ ２×ＹＴ（
水１Ｌ中に、１６ｇバクト（ｂａｃｔｏ）−トリプトファン、１０ｇバクト−酵
母抽出物（ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、５ｇ ＮａＣｌ）中で
２５０ＲＰＭで振盪しながら３７℃で増殖した。１時間後、アンピシリン（最終
濃度１００μｇ／ｍｌ）および１×１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＭ１
３ＫＯ７ヘルパーファージを添加した。培養物を１時間増殖し、ペレット化し、
次いで、１０ｍｌ ２×ＹＴ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）中に再懸濁し、そして２５０ＲＰＭで振盪しながら３
７℃で１６時間増殖した。細菌をＳｏｒｖａｌ ＳＳ３４ローター中で８０００
ＲＰＭで２０分間、遠心分離によってペレット化した。ファージ含有上清を０．
４５ミクロンのシリンジフィルターユニットを用いて濾過した。次いで、このフ
ァージを２ｍｌ ＰＥＧ、ＮａＣｌ（２０％ ＰＥＧ８０００含有２．５Ｍ Ｎ
ａＣｌｗ／ｖ）を添加することによって、沈殿させ、次いで氷上で３０分間イン
キュベートした。沈殿したファージを、Ｓｏｒｖａｌ ＳＳ３４ローター中で１
０ＫＲＰＭで２０分間、遠心分離によってペレット化し、次いで、１ｍｌ ＮＴ
Ｅ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中に再懸濁した。レスキューしたファージライブラリーをタイター（力価測
定）して、４℃で保管した。
【０１５６】 （ＶＨＣＤＲ３ライブラリーのパニング）１０％ウシ胎仔血清＋７５０μｇ／
ｍｌ Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ中で増殖したＮＲ６Ｍ細胞を、０．０２％
ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ｅ−８００８）を用いて収集した。２×１０７細胞をペ
レット化し、そして１０ｍｌの冷ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ、０．０２％
ＮａＮ３を含有するＤＰＢＳ）中に再懸濁し、そして４℃で１時間ゆっくり回転
させた。細胞をペレット化し、そして５ｍｌの冷ブロッキング緩衝液に再懸濁し
た。重鎖ＣＤＲ３ライブラリーの各々由来の１×１０９ファージを、細胞懸濁液
に添加して、この混合物を４℃で２時間回転させた。この細胞を１０ｍｌの冷ブ
ロッキング緩衝液で２回洗浄し、そして５ｍｌの冷ブロッキング緩衝液中に再懸
濁した。ＭＲ１ｄｓＦｖＰＥ３８を、競合インヒビターとして添加し（最終濃度
２μＭ）、そして懸濁液を４℃で２時間ゆっくり回転させた。この細胞を１０ｍ
ｌの冷ブロッキング緩衝液で３回洗浄した。１．５ｍｌの氷冷５０ｍＭ ＨＣｌ
中に洗浄した細胞を再懸濁することによって、結合したファージを溶出し、そし
て氷上で１０分間インキュベートした。ＮＲ６Ｍ細胞をペレット化し、そして溶
出したファージを、２００μｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含有する新しい
チューブ（試験管）に移した。溶出したファージを力価測定し、捕獲されたファ
ージの数を決定した。次いで、次回のパニングにおける使用のために、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＴＧ１を再感染させることによって、０．５ｍｌの溶出したファージを増
幅した。
【０１５７】 （ＶＬ変異体ライブラリーの構築）重鎖ＣＤＲ３変異体（Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ
）を、２工程ＰＣＲにおけるテンプレートとして用い、これが、軽鎖ＣＤＲ３に
配置されたホットスポットにおいて無作為化を誘導した。最初の反応中で、重鎖
変異体（Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ）を含有する５０ｐｇのファージミドを、２０ｐｍ
ｏｌのＤＮＡオリゴマーＶＬＭＵＴ（５’−ＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＧＣ
ＡＡＮＮＳＮＮＳＡＡＣＧＴＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡ−３’）およびＡＭＢＮと５
０μｌの容積中で混合した。、重鎖ＣＤＲ３ライブラリーを生成するために用い
たのと同じプロフィールを用いて、この混合物をサイクルした。この反応物は、
軽鎖ＣＤＲ３中に「ホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）」の無作為化を含有す
る１５０塩基対の産物を生成した。精製後、第一のＰＣＲにおいて生成した１μ
ｌの反応産物を２０ｐｍｏｌ ＤＮＡオリゴマーＳ１とともに、第二のＰＣＲ中
で、５０ｐｇのファージミドＤＮＡ（テンプレートとして重鎖変異体（Ｓ９８Ｐ
−Ｔ９９Ｙ）を含有する）とともに用いた。このテンプレートおよびプライマー
を２ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓと５０μｌ容積中に混合し、そして上記のプロフィー
ルを用いてサイクルした。この反応により、８７６塩基対のライブラリーを生成
し、これはＶＨＣＤＲ３変異体（Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ）およびＣＤＲ３Ｌ中のホ
ットスポットの無作為化を含む。このＰＣＲ産物を、制限酵素Ｓｆｉ Ｉおよび
Ｎｏｔ Ｉで消化し、精製して、重鎖ＣＤＲ３ライブラリーと同様に、ｐＣＡＮ
ＴＡＢ５Ｅと連結した。連結物を脱塩し、そして反応物の１０分の１（４０ｎｇ
）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１を形質転換した。３×１０５クローンを含有
するファージライブラリーを、重鎖ＣＤＲ３構築物において記載のようにレスキ
ューした。その４分の１を増幅して、１回目のパニングに用いた。
【０１５８】 （ＶＬＣＤＲ３ライブラリーのパニング）ＮＲ６Ｍ細胞を、ＶＨＣＤＲ３パニ
ング手順と同様に回収した。全ての工程および洗浄を、上記以外は、冷ブロッキ
ング緩衝液中で行った。５×１０６細胞を、１ｍｌのブロッキング緩衝液中に再
懸濁して、１時間回転した。この細胞をペレット化し、再懸濁して、レスキュー
したファージライブラリーを加え、そして懸濁液を４℃で２時間ゆっくり回転し
た。この細胞を３回洗浄し、次いで２ｐＭ ＭＲ１重鎖変異体（Ｓ９８Ｐ−Ｔ９
９Ｙ）ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を含有するブロッキング緩衝液中に再懸濁し、そして
４℃で２時間ゆっくり回転した。この細胞を３回洗浄して、結合したファージを
溶出させ、重鎖ＣＤＲ３ライブラリーと同様に中和した。
【０１５９】 （ファージのレスキュー）各回のパニング後に捕獲されたファージを次回のパ
ニングにおける使用のために増幅した。レスキューのために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ
Ｇ１を１０ｍｌ ２×ＹＴ（２％グルコース含有）中で増殖し、３７℃、２５０
ＲＰＭでインキュベートした。ＯＤ６００が０．３に達した場合、０．５ｍｌの
捕獲されたファージを培養物に加えて、インキュベーションを続けた。１時間後
、アンピシリン（最終、１００μｇ／ｍｌ）および１×１０１０ｐｆｕのＭ１３
ＫＯ７ヘルパーファージを加えて、１時間インキュベーションを続けた。次いで
、培養物を遠心分離して、ペレット化した細菌を１０ｍｌの新鮮２×ＹＴ培地（
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含
有）中に再懸濁して、３７℃で１６時間２５０ＲＰＭでインキュベートした。こ
の細菌を、８Ｋ ＲＰＭで、２０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター中の
遠心分離によってペレット化した。上清を含有するファージを０．４５ミクロン
シリンジフィルターユニットを用いて、ろ過した。次いで、このファージを２ｍ
ｌ ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ ＰＥＧ８０００含有２．５Ｍ ＮａＣｌｗ／ｖ
）を添加することによって、沈殿させ、氷上で３０分間インキュベートした。沈
殿したファージを、Ｓｏｒｖａｌ ＳＳ３４ローター中で１０ＫＲＰＭで２０分
間、遠心分離によってペレット化し、次いで、１ｍｌ ＮＴＥ（１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した
。レスキューしたファージライブラリーをタイター（力価測定）して、４℃で保
管した。
【０１６０】 （陽性クローンの検出）３回目のパニング後、重鎖ＣＤＲ３ライブラリー由来
の４８のクローンを、ＥＬＩＳＡを用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド（ＬＥＥ
ＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＳＧＧＫ−ビオチン）への結合について分析した。最強の
シグナルを生じる２２のクローンをＤＮＡ配列決定に供して、さらに分析した。
４回のパニング後、４８のクローンをＥＬＩＳＡによって分析して、最強のＥＬ
ＩＳＡシグナルを有する１０のクローンのＤＮＡ配列を決定した。軽鎖ライブラ
リーについて、２回目のパニング後、４８のクローンをＥＬＩＳＡによって分析
して、最強のシグナルを有する１７個を配列決定した。第三回目の後、２０のク
ローンを分析して、最強のＥＬＩＳＡシグナルを有する１０のクローンをＤＮＡ
配列決定に供した。個々のクローンからのファージをレスキューするため、単一
のコロニーを、最終のパニングタイタープレートから拾い上げ、そして１５０μ
ｌ ２×ＹＴ（９６ウェル培養皿中に２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含有）中に接種した。この皿を３７℃で１５０ＲＰＭで培養した。
３時間後、２０μｌの培養物を第二の皿のウェル（１００μｌ ２×ＹＴ（２％
グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋１×１０８Ｍ１３ＫＯ７ヘル
パーファージを含有））中に移して、２時間インキュベートした。この培養物を
ペレット化し、そして新鮮２×ＹＴプラスアンピシリンおよびカナマイシン中に
再懸濁し、次いで１６時間増殖した。この細胞をペレット化し、そして５０〜１
００μｌのファージ含有上清をＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。ファージＥＬ
ＩＳＡを、検出のための基質として１００μｌ３，３’，５，５’−テトラメチ
ルベンジジン（ＢＭ ｂｌｕｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
用いた以外は、記載のように（Ｌｏｒｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４８１５−１４８２０（１９９６））行った。ブ
ルー／グリーン（青／緑）色を発色させた後、１００μｌ ２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を
加えて、発色を停止させた。吸収を４５０ｎＭで測定した。
【０１６１】 （ＤＮＡ配列決定） ＤＮＡ配列決定を、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉ
ｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用して行った。サ
ンプルを、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３１０
自動配列決定機上で泳動しそして分析した。
【０１６２】 （ＳｃＦｖ免疫毒素のプラスミド構築、発現および精製） 選択されたファー
ジミドクローン由来のＳｖＦｖを、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導
入したプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。次いで、産物を消化し、そしてＴ
７ベースの発現ベクターにクローン化した。ここで、ｓｃＦｖは、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ体外毒素Ａの短縮化バージョンに融合される。このプラスミドを、発
現宿主ＢＬ２１（λＤＥ３）に形質転換した。ＭＲ１変異免疫毒素を、以前に記
載のように発現および調製した（Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．２０５：２６３−２７０（１９９２））。
【０１６３】 （表面プラズモン共鳴） 結合速度を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００ Ｂｉｏｓ
ｅｎｓｏｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用
して測定した。ストレプトアビジンを、ＢＩＡｃｏｒｅによって提供されるアミ
ンカップリング試薬を使用して、ＣＭＳ研究グレードのセンサチップに結合させ
た。ビオチン化ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドを、このペプチドの１０μｌの１０ｎ
Ｍ溶液をチップ上に注入することによってチップ全体にわたってストレプトアビ
ジンに結合させた。免疫毒素を、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）中２５
μｇ／ｍｌに希釈した。５０μｌのこの希釈免疫毒素を１０μｌ／分でチップ表
面上に注入し、次いで、その結合された物質を５分以上の間解離させることによ
って、開始速度および終結速度を測定した。残存するその結合された物質を、５
μｌの１００ｍＭリン酸を注入することによってＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドから
除去した。結合速度を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ Ｓｏｆｔｗａｒ
ｅを使用して分析した。
【０１６４】 （細胞培養および細胞傷害性アッセイ） ＮＲ６Ｍ細胞を、７５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充した、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中で培養した。細胞傷害
性アッセイは、以前に記載のように、［３Ｈ］−ロイシンの取り込みの阻害を測
定した（Ｐｒｉｏｒら、Ｃｅｌｌ ６４：１０１７−１０２３，１９９１）。
【０１６５】 （細菌および細胞株） Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１；Ｋ１２Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）
、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄΔ５／Ｆ’［ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ ｑ 、ｌａｃＺΔＭ１５］。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（λＤＥ３）；Ｆ−ｏｍｐＴ
［ｌｏｎ］ｈｓｄＳＢ（ｒＢ −ｍＢ −；ＤＥ３（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
を保有するλプロファージ）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株）。ＮＲ６は、検出可
能なＥＧＦＲを有さないＳｗｉｓｓ ３Ｔ３マウス線維芽細胞改変体細胞株であ
る。ＮＲ６Ｍは、β−アクチンプロモーターの制御下の変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩ
レセプターのｃＤＮＡでトランスフェクトしたＮＲ６細胞株である。ＮＲ６およ
びＮＲ６Ｍの供給源は、以前に記載されている（Ｌｏｒｉｍｅｒら、Ｃｌｉｎ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：８５９−８６４（１９９５））。
【０１６６】 （実施例３） （ＶＨＣＤＲ３ライブラリーの構築） ＭＲ１（Ｆｖ）の親和性および対応す
る免疫毒素ＭＲ１（ＦＶ）−ＰＥ３８の活性を増加させるために、本発明者らは
、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ３を変異誘発した。なぜなら、抗体のこれらの
部分が、抗原と有意に接触するからである（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））。ＶＨＣＤＲ３の１１種の
アミノ酸の最初の９種のアミノ酸を、表５に示す（最後の２種、Ｄ１０１および
Ｙ１０２は、これらが、抗原結合に寄与しないであろうと考えられたので排除す
る）。９アミノ酸残基をランダム化した完全なライブラリーは、５×１０１１よ
り多い個々のクローンを必要とするので、本発明者らは、代わりに、実施例１に
記載のような残基９５〜９７、９８〜１００および１０１Ａ〜１０１Ｃをカバー
する３つの異なるライブラリーを調製した。ライブラリーＨ−ＣＤＲ３ ９５−
９７は、１．６×１０６個のクローンを含み、ライブラリーＨ−ＣＤＲ３ ９８
−１００は、４×１０５個のクローンを含み、そしてライブラリーＨ−ＣＤＲ３
１００Ａ−１００Ｃは、１×１０６個のクローンを含んだ。ライブラリーが適
切に作製されたことを確かめるために、各ライブラリー由来の５つのクローンを
配列決定した。予想されたように、各クローンは、変異の標的にされた領域にお
いて異なるアミノ酸の組み合わせを有した。３アミノ酸を無作為化する完全な多
様性ライブラリーは、８×１０３個の独立したクローンのみを必要とするので、
ライブラリーのサイズは、全ての可能性のあるＤＮＡ配列が十分に示されている
ことを保証する。
【０１６７】 （ＶＨＣＤＲ３ライブラリーのパニングおよび選択されたクローンの分析） 改善されたＭＲ１変異体の最終的に意図される用途は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性
癌細胞に対して毒素を標的化することであったので、本発明者らは、ＥＧＦＲｖ
ＩＩＩ陽性ＮＲ６Ｍ細胞をパニングに使用した。パニングを、ライブラリー中の
野生型ＭＲ１ Ｆｖの選択に対する競合因子として作用することが予測される、
免疫毒素ＭＲ１（Ｆｖ）ＰＥ３８の存在下で行った。各ライブラリー由来のファ
ージをレスキューし、そして各ライブラリー由来の等量のファージ（１×１０９ ）をプールして、初回のパニングで使用した。溶出したファージを力価測定し、
そして次回のパニングのためにレスキューした。その引き続くパニングは、パニ
ングを行った後まで、そのレスキューしたファージの力価を測定することなく行
った。これは、時間の節約のため、および不安定な結合因子が２４時間以内に（
そのレスキューされたファージを力価測定するために必要とされる）失われ得る
可能性を減少するために行った。代表的には、このレスキューは、１×１０１２ ｃｆｕ／ｍｌを得た。表３は、４回のパニングの各々の間で捕捉されたファージ
の数を要約する。富化は、３回目でピークに達し、そして４回目で減少すること
が明らかになった。
【０１６８】 本発明者らは、最初に、４回のパニング後に選択されたファージを試験した。
４８個のクローンを、ファージＥＬＩＳＡでの結合について分析し、そして最も
強いシグナルを有する、これらのクローンのうち１０個のクローンのＤＮＡ配列
を決定した。表６に示されるように、回収された変異体は、９８位および９９位
における変異体のみであった。ＤＮＡ配列分析は、これらのクローンが、以下の
５つのグループに属することを示した：親Ｓ９８−Ｔ９９；および変異体Ｐ９８
−Ｎ９９；Ｐ９８−Ｙ９９；Ｐ９８−Ｆ９９；およびＰ９８−Ｗ９９。本発明者
らはまた、３回目後に選択したファージを試験し、良好な結合因子が３回目と４
回目との間で損失されたか否かを確認した。本発明者らは、４８個の個々のクロ
ーンを、ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドへの結合についてＥＬＩＳＡによって分析し
、最も高いシグナルを与えたこれらのうちの２２個を、ＤＮＡ配列決定に供した
。再度、回収された変異体は、９８位および９９位における変異体のみであった
（表６）。種々のアミノ酸を、これらの位置で回収した。最も多いのは、Ｓ９８
−Ｔ９９（野生型）であり、次いで、Ｐ９８−Ｓ９９；Ｐ９８−Ｙ９９；Ｐ９８
−Ｎ９９；およびＡ９８−Ｄ９９であった。４回目のパニングは、野生型（Ｓ９
８−Ｔ９９）を超える、クローンＰ９８−Ｎ９９およびＰ９８−Ｙ９９の富化、
いくつかのクローンの損失を生じ、また、Ｐ９８−Ｆ９９を含む新しいクローン
を生成した。
【０１６９】 （ＶＨＣＤＲ３変異体の細胞傷害性および親和性） ＭＲ１ ＶＨＣＤＲ３ラ
イブラリーをパニングすることによって得られた１２個の変異体の各々を使用し
て、免疫毒素を作製した。各免疫毒素を、ファージディスプレイベクターからＦ
ｖをＰＣＲ増幅し、そしてこれらを免疫毒素発現ベクター内にサブクローニング
することによって構築した。全ての免疫毒素（ＶＨＣＤＲ３中のＡ９８−Ｄ９９
変異を含む変異体を除く）は、９０〜９５％よりも高い均一性で高度に精製され
得た。これらの精製した免疫毒素を使用して、ＮＲ６Ｍ細胞に対するそれらの細
胞傷害性を決定した。結合親和性を、チップ上に固定したペプチド（またはチッ
プに結合したＥＧＦＲの細胞外ドメインの変異体形態）のいずれかを使用するＢ
ｉｏｃｏｒｅ方法によって測定した。１セットの実験の結果を、表６に示す；８
．０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を有する親クローン（Ｓ９８−Ｔ９９）と比較して、
より細胞傷害性の６つのクローンが存在した。これらは、３．５ｎｇ／ｍｌのＩ
Ｃ５０を有するＰ９８−Ｙ９９、次いで、４．５ｎｇのＩＣ５０を有するＰ９８
−Ｎ９９、Ｐ９８−Ｗ９９、Ｐ９８−Ｉ９９、６ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を有する
Ｐ９８−Ｆ９９、および６．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を有するＰ９８−Ｖ９９で
あった。４つのクローン、Ｐ９８−Ｓ９９、Ｗ９８−Ｆ９９、Ｓ９８−Ｗ９９お
よびＰ９８−Ｔ９９は、親クローンと同一のＩＣ５０を有した。
【０１７０】 （ＶＬＣＤＲ３ライブラリーの構築） ＶＨＣＤＲ３ライブラリーのパニング
後に回収した全ての変異体は、９８位および９９位に局在した。これら２つの残
基のＤＮＡ配列は、抗体のインビボでの親和性成熟中に変異を受ける領域である
、ホットスポットを構成する。ＶＨライブラリー由来の最も高い細胞傷害活性を
有する変異体を使用し、そしてＶＬＣＤＲ中のホットスポットのみを標的化する
変異誘発に供した。ＶＬＣＤＲ３の配列を、表３に示す。このライブラリーは、
残基９１および９２をコードするホットスポット中にランダム化を導入した。Ｖ Ｌ ＣＤＲ３ファージライブラリーを、実施例１に記載のように構築し、そしてこ
れは、３×１０５個のクローンを含んだ。わずか４００個のクローンのライブラ
リーが、変異について選択されたこの２つの位置での全ての可能なアミノ酸の組
み合わせを達成するために必要とされるので、全ての可能なＤＮＡ配列がこのラ
イブラリー中に豊富にあると想定され得る。
【０１７１】 （ＶＬＣＤＲ３ライブラリーのパニングおよび選択されたクローンの分析）
３回のパニングを行い、各工程で捕捉したファージを、表３に示す。このライブ
ラリーについて、本発明者らは、３回目よりも２回目のパニングでより多くの富
化を得た。２回目のパニング後、４８個の個々のクローンをレスキューし、ペプ
チドへの結合を、ＥＬＩＳＡによって測定し、そして最も高いシグナルを与えた
１７個のクローンのＤＮＡ配列を決定した。表７に示されるように、５つの異な
る変異体を得た。全ての変異体は、９１位に野生型セリン残基を保持し、そして
残基９２で変異を有した。最も多いものは、Ｆ９２Ｗ（１７個中６個）、次いで
、Ｆ９２Ｒ（１７個中３個）、Ｆ９２Ｓ（１７個中２個）、Ｆ９２Ｌ（１７個中
１個）およびＦ９２Ｍ（１７個中１個）である。分析した１７個のうち、４個は
、親型であることが見出された。
【０１７２】 ３回目のパニング後に単離されたクローンの特性をまた、分析した（表７）。
２０個のクローンを、ランダムに選択し、ファージをレスキューし、そしてペプ
チドへの結合についてＥＬＩＳＡでチェックした。最も高いシグナルを与えた１
０個のクローンを、ＤＮＡ配列分析のために選択した。ＤＮＡ配列決定は、３つ
の異なるクローンが存在し、これら全てが３回目に提示されたことを示した。１
個の親クローンに加えて、これらのクローンは、Ｆ９２Ｓ（１０個中７個）、Ｆ
９２Ｗ（１０個中１個）およびＦ９２Ｒ（１０個中１個）であった。新しい変異
体は見いだされず、そして本発明者らは、変異体Ｆ９２ＬおよびＦ９２Ｍを見出
さなかった。
【０１７３】 （ＶＬＣＤＲ３変異体の細胞傷害性および結合特性） 得られた異なるＦｖを
使用して免疫毒素を作製し、そしてそれらの細胞傷害活性および結合親和性を、
精製した組換えタンパク質を使用して測定した。１個の変異体Ｆ９２Ｗのみが、
親よりも活性な免疫毒素を与えた。そのＩＣ５０は、１．３ｎｇ／ｍｌであり、
対して、その親については、３．５ｎｇ／ｍｌであった（表７）。他の変異体は
、より低い活性を有した。表７のデータはまた、Ｆ９２Ｗが、親クローンＦ９２
（Ｋｄ ６ｎＭ）よりも高い親和性（Ｋｄ ３ｎＭ）を有することを示した。他
の１つの変異体Ｆ９２Ｌは、わずかに増加した親和性（Ｋｄ ４ｎＭ）を有した
が、細胞傷害性の増加は有さなかった。図２は、ＶＨＣＤＲ３ライブラリーから
得られたＦｖより作製された最も活性な免疫毒素（ＶＨＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ）お
よびＶＬＣＤＲ３ライブラリーから得られた最も活性なクローン（ＶＨＳ９８Ｐ
−Ｔ９９Ｙ−ＶＬＦ９２Ｗ）（ここでは、ＭＲ１−１と呼ぶ）との親クローンの
結合特性を比較する、ＢＩＡＣｏｒｅセンサグラムを示す。この図は、２つの変
異体が、親Ｆｖよりも遅い解離速度を有することを示す。ＶＨ変異およびＶＬ変
異の両方を有する免疫毒素（ＭＲ１−１−（Ｆｖ）−ＰＥ３８）の分析は、これ
が、ｋｏｆｆにおける減少およびｋｏｎにおけるわずかな増加を有し、これが、
３ｎＭのＫｄを生じることを示した。
【０１７４】 表４は、ＭＲ１（Ｆｖ）−ＰＥ３８の細胞傷害活性を、以下の２つの改善され
た改変体：ＭＲ１（Ｆｖ）（ＶＨＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ）−ＰＥ３８およびＭＲ１
−１（Ｆｖ）−ＰＥ３８と比較した２つの実験を示す。両方の実験において、Ｍ
Ｒ１（Ｆｖ）−ＰＥ３８は、最も活性が低く、そしてＭＲ１−１（Ｆｖ）−ＰＥ
３８は、最も活性が高かった。
【０１７５】 （実施例４） （免疫毒素の収率） 異なる変異免疫毒素の収率における顕著な増加が、精製
プロセス中に観察された、リフォールディング後、タンパク質を透析し、そして
クロマトグラフィーによって精製する（Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．２０５：２６３−２７０（１９９２））。タンパク質を、最初に、Ｑ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換樹脂上でバッチ精製し、粗大なタンパク質凝集
体、核酸および他の混入物を除去する。次に、溶出されたタンパク質を、Ｍｏｎ
ｏＱカラムにロードし、そしてタンパク質を、０〜０．３ＭのＮａＣｌの連続勾
配で溶出する。この工程は、より小さい凝集体を除去する。適切にフォールディ
ングされたモノマーの免疫毒素は、２８０ｍＭの特徴的なＮａＣｌ濃度でＭｏｎ
ｏＱから溶出する。収集したＭｏｎｏＱ画分の精製を、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ
サイズ排除カラムから溶出した単一のモノマーのピークを観察することによって
、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確かめる。各変異免疫毒素ＭＲ１（Ｆｖ）−
ＰＥ３８の収率を、ピークのＭｏｎｏＱ画分から収集したタンパク質の量および
サイズ排除クロマトグラム（ＴＳＫ ３０００）上の単一のピークの存在に基づ
いて計算する。表６および７は、１００ｍｇの封入体タンパク質を精製に供した
場合の収率を示す。免疫毒素の収率は、ＣＤＲ中の変異によって大きく影響され
、そして親ＭＲ１（Ｆｖ）−ＰＥ３８での２％からこれらの多くの変異体での１
０〜１７．５％程度に大きく増加されることを示す。
【０１７６】 （実施例５） ＥＧＦＲｖＩＩＩ頭蓋内腫瘍を、ブレグマの前方１ｍｍかつ側方４ｍｍに配置
したカテーテルを通した１０５個のＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（Ｕ８
７ＭＧ細胞をＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトすることによって作製したヒ
ト神経膠芽細胞腫（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ （ＵＳＡ）９１：７７２７−７７３０（１９９４）を参照のこと）の注射
によって、無胸腺症ラットにおいて惹起した。腫瘍を、ＭＲ１−１−ＰＥ３８免
疫毒素または生理食塩水コントロールをこのカテーテルを通して腫瘍に直接的に
注入することによって処置した。免疫毒素を、Ａｌｚｅｔ（登録商標）２Ｍ１浸
透圧ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を使用し
て、７日間の期間にわたって、０．２％ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）を含
む２００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中２μｇまたは６μｇの
いずれかの用量で投与し、コントロール動物には、２００μｌのＰＢＳ−ＨＳＡ
溶液を投与した。処置を、腫瘍播種後３日目に開始した。図３に示されるように
、生理食塩水コントロールを受けた全ての動物は、２０日で死んだ。６μｇ用量
を受けた動物のうちの１０％は、１６０日目でなお生存していた。２μｇ用量で
処置した動物のうちの３０％以上は、１６０日目でなお生存していた。２μｇ用
量と６μｇ用量との間の生存度における差異は、頭蓋内設定下で、６μｇ用量の
免疫毒素の濃度は、２μｇ用量では減少されたかまたは存在しなかった、脳組織
に対するいくらかの非特異的な毒性を生じるのに十分に高かったかのかもしれな
いが、両方の用量で、この免疫毒素が、生存を延長したことを示唆する。
【０１７７】 （実施例６） ＥＧＦＲｖＩＩＩ頭蓋内腫瘍を、ブレグマの前方１ｍｍかつ側方４ｍｍに配置
したカテーテルを通した１０５個のＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の注射
によって、無胸腺症ラットにおいて惹起した。腫瘍を、ＭＲ１−１−ＰＥ３８免
疫毒素または生理食塩水コントロールをこのカテーテルを通して腫瘍に直接的に
注入することによって処置した。免疫毒素（０．２μｇ、０．６μｇおよび２．
０μｇ）を、先の実施例に記載のように、Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプ
を使用して、７日間の期間にわたって、ＨＳＡを含む２００μｌのＰＢＳ中で送
達した。処置を、腫瘍播種後３日目で開始した。
【０１７８】 図４に示されるように、０．２μｇまたは０．６μｇ用量の免疫毒素を受けた
動物のうちの十数パーセントのみが、２５日目を過ぎて生存したが、生理食塩水
コントロールを受けた動物のうちの約２２％が、生存した。対照的に、２μｇ用
量を受けた動物のうち、約５５％が生存し、これは、生理食塩水コントロールを
受けた動物の２倍を超える生存パーセンテージである。これらの結果は、０．２
μｇおよび０．６μｇ用量が、生存に影響を及ぼすには低すぎるが、２．０μｇ
用量の免疫毒素は、生存を有意に延長することを示唆する。
【０１７９】 （実施例７） ＥＧＦＲｖＩＩＩ新生物性髄膜炎を、留置髄腔内カテーテルを通した４０μｌ
のＰＢＳ−ＨＳＡ溶液中の５×１０６ Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の
注射によって、無胸腺症ラットにおいて惹起した。全ての腫瘍保有動物の処置を
、腫瘍播種後３日目に開始した。ＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を、腫瘍惹起後
３日目、５日目および７日目に４０μｌのＰＢＳ−ＨＳＡ中で与えた。コントロ
ール動物には、同じ日に４０μｌのＰＢＳ−ＨＳＡを投与した。
【０１８０】 図５に示されるように、生理食塩水コントロールを受けた全ての動物は、１０
日目までに死んだ。対照的に、免疫毒素を受けた全ての動物は、少なくとも１４
日目までそれらの生存を延長し、１μｇ用量を受けた動物のうちの３０％および
２μｇ用量を受けた動物のうちの５０％が、６０日目を超えて生存した。
【０１８１】 （実施例８） 腫瘍を、処置の開始前７日目（本研究について、処置の開始を、「０」日目と
定める）に５０μｌのＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍細胞ホモジネートの
注射によって、無胸腺症マウスにおいて惹起した。腫瘍を、０日目、２日目およ
び４日目での、１μｇ、２μｇまたは３μｇの用量でのＭＲ１−１−ＰＥ３８免
疫毒素あるいは生理食塩水コントロール（先の実施例において記載したＰＢＳ−
ＨＳＡ溶液）の３回の２０μｌ腫瘍内ボーラス注射で処置した。腫瘍は、０日目
での処置開始時で６００ｍｍ３の平均体積を有した。
【０１８２】 図６に示されるように、任意の免疫毒素用量で処置した動物の腫瘍サイズは、
１回目の処置後の２日目に測定したのとほぼ同じサイズを維持し、この処置は、
この腫瘍の増殖を効果的に阻止した。対照的に、生理食塩水コントロールでのみ
処置した動物は、腫瘍負荷における迅速な増加を示し、腫瘍体積は、７日目まで
に７５００ｍｍ３程度に大きく増加した。
【０１８３】 本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特
許が、本明細書中で参考として援用されるように詳細かつ個々に示されているの
と同じ程度で、本明細書中に参考として援用される。
【０１８４】 （表３）
【０１８５】
【表３】 （表４）
【０１８６】
【表４】 ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する増大した親和性を有する２つの変異体との、ＭＲ１
（Ｆｖ）−ＰＥ３８の細胞傷害性活性の比較。ＩＣ５０を、異なる量の免疫毒素
を使用したアッセイから計算する。これらの値は、平均値±Ｓ．Ｄ．である。Ｐ
値は、実験１においてＭＲ１（Ｆｖ）−ＰＥ３８をＭＲ１−１（Ｆｖ）−ＰＥ３
８と、およびＭＲ１（Ｆｖ）（ＶＨＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ）−ＰＥ３８をＭＲ１−
１（Ｆｖ）−ＰＥ３８と比較した場合に、そして実験２においてＭＲ１（Ｆｖ）
−ＰＥ３８をＭＲ１（Ｆｖ）（ＶＨＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ）−ＰＥ３８と、および
ＭＲ１（Ｆｖ）（ＶＨＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ）−ＰＥ３８をＭＲ１−１（Ｆｖ）−
ＰＥ３８と比較した場合に、０．０１未満である。
【０１８７】 （表５）
【０１８８】
【表５】 （表６）
【０１８９】
【表６】 （表７）
【０１９０】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、変異体ライブラリーのＰＣＲ構築についてのストラテジーを示す。Ａ
．ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ−ＭＲ１を増幅のためのテンプレートとして用いて、上流
プライマー（Ｓ１）および縮重（ＮＮＳ）を標的領域に含む下流プライマーＣＤ
Ｒ３Ｈ ｂ、ｄ、またはｆを使用する。Ｂ．ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ−ＭＲ１を増幅
のためのテンプレートとして用いて、上流プライマーおよび下流プライマーＡＭ
ＢＮとして、工程Ａにおける反応産物を使用する。Ｃ．反応Ｂ由来の産物を切断
し、そしてｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅにクローニングする。
【図２】 図２は、ＭＲ１、ＭＲ１−１およびＶＨ ＣＤＲ３のＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ変異
を有するＭＲ１のＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図３】 図３は、ＭＲ１−１標的化免疫毒素を用いて処理されたＥＧＦＲｖＩＩＩでト
ランスフェクトされたヒトの神経膠芽腫細胞の頭蓋内腫瘍を有する無胸腺マウス
の生存である。Ｙ軸は、所定の時点においての動物の生存率を示す。Ｘ軸は、生
存時間を日数で示す。凡例：ＭＲ１−１は、ＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を示
す。塗りつぶされたひし形、２４時間注入によって７日にわたって、６μｇのＭ
Ｒ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を投与された動物。白ぬき三角：２μｇのＭＲ１−
１−ＰＥ３８免疫毒素を同様のスケジュールで投与された動物。白ぬき丸：生理
食塩水コントロールを同様のスケジュールで投与された動物。
【図４】 図４は、ＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトし、そしてＭＲ１−１標的化免
疫毒素または生理食塩水コントロールを用いて処理されたヒトの神経膠芽腫細胞
の頭蓋内腫瘍を有する無胸腺マウスの生存である。Ｙ軸は、所定の時点において
の動物の生存率を示す。Ｘ軸は、生存時間を日数で示す。凡例：ＭＲ１−１は、
ＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を示す。白ぬきひし形、２４時間注入によって７
日にわたって、０．２μｇのＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素（０．２％ＨＡを含
むＰＢＳ ２００μｌ中）を投与された動物。白ぬき三角：０．６μｇのＭＲ１
−１−ＰＥ３８免疫毒素を同様の様式で投与された動物。白ぬき丸：２．０μｇ
のＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を同様の様式で投与された動物。「Ｘ」、生理
食塩水コントロールを同様の様式で投与された動物。
【図５】 図５は、ＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトし、そしてＭＲ１−１標的化免
疫毒素または生理食塩水コントロールを用いて処理されたヒトの神経膠芽腫細胞
の頭蓋内注入により新生物性髄膜炎を有する無胸腺マウスの生存。Ｙ軸は、所定
の時点においての動物の生存率を示す。Ｘ軸は、生存時間を日数で示す。凡例：
ＭＲ１−１は、ＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を示す。三角：腫瘍開始後３日目
、５日目、および７日目に０．２％ＨＡを含む４０μｌのＰＢＳ中の２μｇのＭ
Ｒ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を総用量６μｇで投与された動物。ひし形：腫瘍開
始後３日目、５日目、および７日目に０．２％ＨＡを含む４０μｌのＰＢＳ中の
１μｇのＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素を総用量３μｇの免疫毒素で投与された
動物。丸：コントロールとして、腫瘍開始後３日目、５日目、および７日目に０
．２％ＨＡを含む４０μｌのＰＢＳを投与された動物。
【図６】 図６は、ＥＧＦＲｖＩＩＩでトランスフェクトし、そしてＭＲ１−１標的化免
疫毒素または生理食塩水コントロールを用いて処理されたヒトの神経膠芽細胞を
右側面に注入された無胸腺マウスにおける時間経過上の腫瘍の体積。Ｙ軸は、腫
瘍体積（ｍｍ３）を示す。Ｘ軸は、処置の開始からの時間（日数）を示す（「０
」日目より７日前に腫瘍細胞を動物に注入した）。凡例：ＭＲ１−１は、ＭＲ１
−１−ＰＥ３８免疫毒素を示す。四角：０日目、２日目、および４日目に、１μ
ｇのＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素（２０μｌ）をボーラス注射により、総用量
３μｇで投与された動物。上向き三角：０日目、２日目、および４日目に、２μ
ｇのＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素（２０μｌ 生理食塩水）をボーラス注射に
より、総用量６μｇ投与された動物。下向きの三角：０日目、２日目、および４
日目に、３μｇのＭＲ１−１−ＰＥ３８免疫毒素（２０μｌ 生理食塩水）をボ
ーラス注射により、総用量９μｇの免疫毒素で投与された動物。ひし形：コント
ロールとして、０日目、２日目、および４日目に、２０μｌの生理食塩水をボー
ラス注射により、投与された動物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 デューク ユニバーシティ アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27710， ダラム， デイビソン ビルデ ィング ルーム 454， デューク ユニ バーシティ メディカル センター， オ フィス オブ サイエンス アンド テク ノロジー (72)発明者 パスタン， アイラ アメリカ合衆国 メリーランド 20854， ポトマック， ビオール マウンテン ロード 11710 (72)発明者 ビアーズ， リチャード アメリカ合衆国 ディストリクト オブ コロンビア 20008， ワシントン ディ ーシー， 28ティーエイチ ストリート エヌダブリュー 2827 (72)発明者 チョウダリー， パーサ エス． アメリカ合衆国 メリーランド 29852， ロックビル， ロックビル パイク 1001 (72)発明者 ビッグナー， ダレル アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27302， ミーベイン， コーベット リ ッジ ロード 5133 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA38 BA61 CA04 CA07 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA08 HA09 4C084 AA02 AA03 AA22 BA02 BA34 NA14 ZB261 4C087 AA01 AA02 BC40 BC64 CA10 MA02 NA14 ZB26 4C088 AB12 MA02 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 BA41 CA40 DA75 DA83 EA28 FA72 FA74

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 変異した抗体重鎖可変領域（ＶＨ）または変異した軽鎖可変
    領域（ＶＬ）を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドがＥＧＦＲｖＩＩＩ
    抗原に対する７ｎＭ以下のＫｄを有し、該変異ＶＨまたは該変異ＶＬがそれぞれ
    、相補性決定領域（ＣＤＲ）における少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換
    によって親抗体ＭＲ１のＶＨまたはＶＬとは異なる配列を有し、該アミノ酸がＡ
    ＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチ
    ドを含むコドンによってコードされ、ここでＲがＡまたはＧであり、ＹがＣまた
    はＴであり、そしてＷがＡまたはＴである、ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 前記置換が、重鎖可変領域のＣＤＲ３において生じる、請求
    項１に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 前記置換が、軽鎖可変領域のＣＤＲ３において生じる、請求
    項１に記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 前記置換が、軽鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２におい
    て生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 前記置換が、重鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２におい
    て生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 前記ＶＨ鎖および前記ＶＬ鎖の両方が、ＣＤＲにおける少な
    くとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換によって変異した、請求項１に記載のポリ
    ペプチド。
  7. 【請求項７】 前記変異ＶＨが、Ｓ９８およびＴ９９からなる群より選択さ
    れる少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換によって、抗体ＭＲ１とは異なる
    配列を有する、請求項２に記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 前記置換が、Ｐ９８−Ｙ９９、Ｐ９８−Ｎ９９、Ｐ９８−Ｗ
    ９９、Ｐ９８−Ｉ９９、Ｐ９８−Ｆ９９およびＰ９８−Ｖ９９からなる群より選
    択される、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖである、請求項１に記載のポ
    リペプチド。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖである、請求項７に記載の
    ポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 前記ポリペプチドが、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ
    ’）２である、請求項１に記載のポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記重鎖における置換が、Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙであり、か
    つ前記軽鎖における置換が、Ｆ９２Ｗである（ＭＲ１−１）、請求項１に記載の
    ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 エフェクター分子、治療的成分、または検出可能な標識を
    さらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 前記治療的成分が、毒性成分である、請求項１３に記載の
    ポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 前記毒性成分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素または
    その細胞傷害性フラグメントである、請求項１４に記載のポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 前記毒性成分が、ＰＥ３８である細胞傷害性フラグメント
    である、請求項１４に記載のポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが、７ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有す
    る、請求項１５に記載のポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 前記ポリペプチドが、５ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有す
    る、請求項１５に記載のポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 前記ポリペプチドが、約３．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を有
    する、請求項１５に記載のポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１５に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプ
    チドが少なくとも１つのアミノ酸置換をＶＨ中に有し、ここで、該置換が、Ｐ９
    ８−Ｓ９９、Ｗ９８−Ｖ９９、Ｓ９８−Ｗ９９およびＰ９８−Ｔ９９からなる群
    より選択される、ポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドが、少なくとも３％の収率を有する、請
    求項１５に記載のポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 前記ポリペプチドが、約７％の収率を有する、請求項１５
    に記載のポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 請求項１４に記載のポリペプチドであって、ここで前記毒
    性成分が、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性フラグメント、サポリンまたは
    その細胞傷害性フラグメント、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細
    胞傷害性フラグメント、リシンまたはその細胞傷害性フラグメント、およびブリ
    オジン１またはその細胞傷害性フラグメントからなる群より選択される、ポリペ
    プチド。
  24. 【請求項２４】 前記重鎖における置換がＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙであり、かつ
    前記軽鎖における置換がＦ９２Ｗである（ＭＲ１−１）、請求項１５に記載のポ
    リペプチド。
  25. 【請求項２５】 バクテリオファージの表面タンパク質をさらに含む、請求
    項１に記載のポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 変異した抗体重鎖可変領域または変異した軽鎖可変領域を
    含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポ
    リペプチドがＥＧＦＲｖＩＩＩに対する６以下のＫｄを有し、該ポリペプチドが
    相補性決定領域（ＣＤＲ）における少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換に
    よってＭＲ１とは異なる配列を有し、該アミノ酸がＡＧＹまたはＲＧＹＷから選
    択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコ
    ードされ、ここで、ＲがＡまたはＧであり、ＹがＣまたはＴであり、そしてＷが
    ＡまたはＴである、核酸分子。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の核酸分子であって、ここで、前記ポリ
    ペプチドが、変異した重鎖可変領域または変異した軽鎖可変領域のＣＤＲ１また
    はＣＤＲ２における少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換によってＭＲ１
    ｓｃＦｖとは異なる配列を有する、核酸分子。
  28. 【請求項２８】 請求項２６に記載の核酸分子であって、ここで、前記ポリ
    ペプチドが、ＶＨ鎖ＣＤＲ３領域のＳ９８およびＴ９９から選択される少なくと
    も１つのアミノ酸のアミノ酸置換またはＶＬのＣＤＲ３領域のＦ９２の置換によ
    ってＭＲ１ ｓｃＦｖとは異なる配列を有する、核酸分子。
  29. 【請求項２９】 前記ＶＨ鎖中の置換が、Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙ、Ｓ９８Ｐ−
    Ｔ９９Ｗ、Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９ＩおよびＳ９８Ｐ−Ｔ９９Ｖから選択される、請求
    項２８に記載の核酸分子。
  30. 【請求項３０】 前記重鎖における置換が、Ｓ９８Ｐ−Ｔ９９Ｙであり、か
    つ前記軽鎖における置換がＦ９２Ｗである（ＭＲ１−１）、請求項２８に記載の
    核酸分子。
  31. 【請求項３１】 プロモーターに作動可能に連結された、請求項２６に記載
    の核酸分子。
  32. 【請求項３２】 プロモーターに作動可能に連結された、請求項２７に記載
    の核酸分子。
  33. 【請求項３３】 プロモーターに作動可能に連結された、請求項２８に記載
    の核酸分子。
  34. 【請求項３４】 プロモーターに作動可能に連結された、請求項２９に記載
    の核酸分子。
  35. 【請求項３５】 プロモーターに作動可能に連結された、請求項３０に記載
    の核酸分子。
  36. 【請求項３６】 抗原を保有する細胞を殺傷する方法であって、該細胞を毒
    性成分および標的化成分を含む免疫毒素に接触させる工程を包含し、該標的化成
    分が変異した抗体重鎖可変領域または変異した軽鎖可変領域を含むポリペプチド
    を含み、該ポリペプチドがＥＧＦＲｖＩＩＩに対する７以下のＫｄを有し、該ポ
    リペプチドが相補性決定領域（ＣＤＲ）における少なくとも１つのアミノ酸のア
    ミノ酸置換によってＭＲ１の配列とは異なる配列を有し、該アミノ酸がＡＧＹま
    たはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含
    むコドンによってコードされ、ここでＲがＡまたはＧであり、ＹがＣまたはＴで
    あり、そしてＷがＡまたはＴである、方法。
  37. 【請求項３７】 請求項３６に記載の方法であって、ここで、少なくとも１
    つのアミノ酸が、変異した抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２において
    置換され、あるいは変異した抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２におい
    て置換される、方法。
  38. 【請求項３８】 請求項３６に記載の方法であって、ここで、ＣＤＲ３が変
    異した重鎖可変領域が、Ｐ９８−Ｙ９９、Ｐ９８−Ｎ９９、Ｐ９８−Ｗ９９、Ｐ
    ９８−Ｉ９９、Ｐ９８−Ｆ９９およびＰ９８−Ｖ９９からなる群より選択される
    アミノ酸置換を含む、方法。
  39. 【請求項３９】 ＣＤＲ３が変異した軽鎖可変領域が、９２位でフェニルア
    ラニンと置換したトリプトファンを含む、請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記標的化成分がＭＲ１−１である、請求項３６に記載の
    方法。
  41. 【請求項４１】 前記細胞が、悪性細胞である、請求項３６に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記悪性細胞が、神経膠腫細胞である、請求項３６に記載
    の方法。
  43. 【請求項４３】 前記悪性細胞が、乳癌細胞である、請求項３６に記載の方
    法。
  44. 【請求項４４】 前記悪性細胞が、肺癌細胞である、請求項３６に記載の方
    法。
  45. 【請求項４５】 前記悪性細胞が、卵巣癌細胞である、請求項３６に記載の
    方法。
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YU (1) YU63302A (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2013046960A1 (ja) * 2011-09-29 2015-03-26 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ペプチド抗体のスクリーニングに使用する核酸構築物およびそれを用いたスクリーニング方法
WO2017142294A1 (ko) * 2016-02-15 2017-08-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도
JP2017158554A (ja) * 2007-09-04 2017-09-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
JP2018501783A (ja) * 2014-11-25 2018-01-25 ファームアブシン インコーポレイテッドＰｈａｒｍａｂｃｉｎｅ Ｉｎｃ． 新規ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体及びこれを含む組成物
JP2020503254A (ja) * 2016-10-28 2020-01-30 テクニスチェ ユニベルシタト ドレスデン 治療活性ペイロードの標的化送達のための送達システム
US10669340B2 (en) 2016-02-15 2020-06-02 Samsung Life Public Welfare Foundation Antibody against EGFRvIII and use thereof

Families Citing this family (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7589180B2 (en) 2001-05-11 2009-09-15 Abbott Laboratories Inc. Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US20030224397A1 (en) * 2002-02-11 2003-12-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
SE0300823D0 (sv) * 2003-03-23 2003-03-23 Gyros Ab Preloaded Microscale Devices
EP1639092B1 (en) 2003-06-27 2016-01-06 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
SI2471813T1 (sl) 2004-07-15 2015-03-31 Xencor, Inc. Optimirane Fc variante
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
AU2005304624B2 (en) 2004-11-12 2010-10-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP2500356A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2495257A3 (en) 2005-08-19 2012-10-17 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
CA2647671A1 (en) * 2006-03-31 2007-11-01 Massachusetts Institute Of Technology Treatment of tumors expressing mutant egf receptors
WO2008045437A2 (en) * 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
CN104013956B (zh) 2007-01-25 2018-12-18 达娜-法勃肿瘤研究所公司 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
US11535673B2 (en) 2007-04-05 2022-12-27 President and Fellows of Harvard CoHege Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
CA2696360C (en) 2007-08-14 2018-11-20 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibody targeting the egfr receptor and uses thereof
EP4269443A3 (en) 2007-12-26 2023-12-27 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
EP2297209A4 (en) 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
JP5723769B2 (ja) 2008-06-03 2015-05-27 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
ES2884117T3 (es) 2008-06-25 2021-12-10 Novartis Ag Optimización de la solubilidad de inmunoaglutinantes
EP2321422A4 (en) 2008-07-08 2013-06-19 Abbvie Inc PROSTAGLANDINE E2 VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF
PE20110707A1 (es) 2008-10-14 2011-10-11 Genentech Inc Variantes de inmunoglobulinas
RU2015132478A (ru) 2009-03-05 2015-12-10 Эббви Инк. Связывающие il-17 белки
CA2889453C (en) 2009-03-20 2018-11-06 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
SG178602A1 (en) 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
WO2011047262A2 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011097527A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Xencor, Inc. Immunoprotection of therapeutic moieties using enhanced fc regions
RU2012145183A (ru) 2010-03-29 2014-05-10 Займворкс, Инк. Антитела с повышенной или пониженной эффекторной функцией
AR081246A1 (es) 2010-05-14 2012-07-18 Abbott Lab Proteinas de union a il-1
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20130110169A (ko) 2010-09-22 2013-10-08 암젠 인크 담체 면역글로뷸린 및 이것의 용도
CA2815277A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Immunogen, Inc. Novel egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof
US9249217B2 (en) 2010-12-03 2016-02-02 Secretary, DHHS Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules
BR112013015944A2 (pt) 2010-12-21 2018-06-19 Abbvie Inc imunoglobulinas de domínio duplo variável il-1 alpha e beta biespecífico e seus usos.
WO2012143499A2 (de) 2011-04-21 2012-10-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
WO2019071023A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Yale University COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING POLYPEPTIDES CONTAINING SELENOCYSTEINE
WO2013009868A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Yale University Compositions and methods for making selenocysteine containing polypeptides
WO2013022855A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
JP6310394B2 (ja) 2011-10-10 2018-04-11 ゼンコア インコーポレイテッド 抗体を精製する方法
MX2014004977A (es) 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.
SG11201402365RA (en) 2011-11-16 2014-06-27 Amgen Inc Methods of treating epidermal growth factor deletion mutant viii related disorders
RU2014121820A (ru) * 2011-11-21 2015-12-27 Иммьюноджен, Инк. Способ лечения опухолей, устойчивых к анти-egfr терапиям, с помощью конъюгата антитела egfr с цитотоксическим средством
US9120870B2 (en) 2011-12-30 2015-09-01 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-13 and IL-17
AU2013270684B2 (en) 2012-06-08 2018-04-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
US9670276B2 (en) 2012-07-12 2017-06-06 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
JP6826367B2 (ja) 2012-08-31 2021-02-03 ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド アジド基を含む修飾アミノ酸
US12024568B2 (en) 2012-09-13 2024-07-02 Cornell University Treatment of brain cancers using central nervous system mediated gene transfer of monoclonal antibodies
AU2013328580B2 (en) 2012-10-12 2016-01-21 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2914626A2 (en) 2012-11-01 2015-09-09 Abbvie Inc. Stable dual variable domain immunoglobulin protein formulations
BR112015009961B1 (pt) 2012-11-01 2020-10-20 Abbvie Inc. proteína de ligação capaz de se ligar a dll4 e vegf, bem como composição que a compreende como composição que a compreende
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
KR102313997B1 (ko) * 2013-02-20 2021-10-20 노파르티스 아게 인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
AU2014230735B2 (en) 2013-03-13 2018-03-15 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
ES2699599T3 (es) 2013-03-15 2019-02-11 Abbvie Biotherapeutics Inc Variantes de Fc
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2970486B1 (en) 2013-03-15 2018-05-16 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3019522B1 (en) 2013-07-10 2017-12-13 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
CN105555804B (zh) * 2013-08-07 2020-12-25 阿菲姆德股份有限公司 对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点
WO2015035044A2 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Abbvie Biotherapeutics Inc. Fc VARIANTS WITH IMPROVED ANTIBODY-DEPENDENT CELL-MEDIATED CYTOTOXICITY
US9840493B2 (en) 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
WO2015096982A1 (de) 2013-12-23 2015-07-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
US9822186B2 (en) 2014-03-28 2017-11-21 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
US10308697B2 (en) 2014-04-30 2019-06-04 President And Fellows Of Harvard College Fusion proteins for treating cancer and related methods
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
AU2015292811B2 (en) 2014-07-21 2019-12-19 Novartis Ag Treatment of cancer using a CLL-1 chimeric antigen receptor
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
EA201791139A1 (ru) 2014-11-26 2018-04-30 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CN108025084B (zh) 2015-06-22 2024-08-09 拜耳医药股份有限公司 具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（adc）和抗体前药缀合物（apdc）
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
CN105384826A (zh) * 2015-11-19 2016-03-09 广州熙帝生物科技有限公司 表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞及其应用
EP3387013B1 (en) 2015-12-07 2022-06-08 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
NZ744821A (en) * 2016-01-21 2023-06-30 Pfizer Chimeric antigen receptors targeting epidermal growth factor receptor variant iii
US11319383B2 (en) 2016-03-14 2022-05-03 Universitetet | Oslo Engineered immunoglobulins with altered FcRn binding
MX2018011627A (es) 2016-03-24 2019-01-10 Bayer Pharma AG Profarmacos de farmacos citotoxicos que tienen grupos enzimaticamente escindibles.
RU2767357C2 (ru) 2016-06-14 2022-03-17 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
WO2017218698A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies with engineered ch2 domains, compositions thereof and methods of using the same
EP3471776B1 (en) 2016-06-15 2022-05-04 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
CA3030683C (en) 2016-07-12 2023-11-21 Kite Pharma, Inc. Antigen binding molecules and methods of use thereof
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CN109862919A (zh) 2016-10-11 2019-06-07 免疫医疗有限公司 抗体-药物缀合物联合免疫介导的治疗剂
RU2019114175A (ru) 2016-10-14 2020-11-16 Ксенкор, Инк. Биспецифические гетеродимерные слитые белки, содержащие fc-слитые белки il-15/il-15ra и фрагменты антитела к pd-1
EP3558388A1 (de) 2016-12-21 2019-10-30 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
WO2018114798A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
WO2019114804A1 (zh) * 2017-12-13 2019-06-20 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
MX2020010910A (es) 2018-04-18 2021-02-09 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas dirigidas a pd-1 que contienen proteinas de fusion il-15 / il-15ra fc y dominios de union al antigeno pd-1 y usos de los mismos.
JP2021520829A (ja) 2018-04-18 2021-08-26 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＴＩＭ−３抗原結合ドメインを含む、ＴＩＭ−３標的化ヘテロ二量体融合タンパク質
EP3796942A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 ADC Therapeutics SA Molecular adjuvant
SG11202011830SA (en) 2018-06-13 2020-12-30 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2020028909A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Brown University Oral formulations with increased uptake
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CN113329769A (zh) 2018-10-11 2021-08-31 斯克里普斯研究学院 具有反应性精氨酸的抗体化合物及相关的抗体药物缀合物
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
US20220242871A1 (en) 2019-06-10 2022-08-04 Sutro Biopharma, Inc. 5H-PYRROLO[3,2-d]PYRIMIDINE-2,4-DIAMINO COMPOUNDS AND ANTIBODY CONJUGATES THEREOF
CN114746420A (zh) 2019-06-17 2022-07-12 苏特罗生物制药公司 用于癌症治疗和诊断的作为Toll样受体（TLR）7/8激动剂的1-(4-(氨基甲基)苄基)-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-4-胺衍生物及相关化合物以及其抗体药物偶联物
WO2021178597A1 (en) 2020-03-03 2021-09-10 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
CN115803344A (zh) 2020-04-26 2023-03-14 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 经修饰的免疫球蛋白
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
MX2023001962A (es) 2020-08-19 2023-04-26 Xencor Inc Composiciones anti-cd28.
WO2022103983A2 (en) 2020-11-11 2022-05-19 Sutro Biopharma, Inc. Fluorenylmethyloxycarbonyl and fluorenylmethylaminocarbonyl compounds, protein conjugates thereof, and methods for their use
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
WO2022266075A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Caribou Biosciences, Inc. Methods and materials for treating cancer using car constructs with an intracellular domain comprising a stap domain and a kinase domain or a stap domain and a phosphatase domain
JP2024527977A (ja) 2021-07-27 2024-07-26 ノヴァブ， インコーポレイテッド 免疫エフェクター機能を有する操作されたｖｌｒｂ抗体
WO2023164487A1 (en) 2022-02-22 2023-08-31 Brown University Compositions and methods to achieve systemic uptake of particles following oral or mucosal administration
WO2024006272A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Sutro Biopharma, Inc. β-GLUCURONIDE LINKER-PAYLOADS, PROTEIN CONJUGATES THEREOF, AND METHODS THEREOF
WO2024015229A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Sutro Biopharma, Inc. Protease/enzyme cleavable linker-payloads and protein conjugates
CN116284435A (zh) * 2022-09-19 2023-06-23 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 EGFRvIII嵌合抗原受体及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6428788B1 (en) * 1995-03-15 2002-08-06 Penn State University Compositions and methods for specifically targeting tumors
EP0861091B1 (en) * 1995-10-13 2003-08-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Immunotoxin containing a disulfide-stabilized antibody fragment

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6010050037, Ｐｒｏｃ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， （１９９８）， ｖｏｌ．３９， ｐ．６５， ＃４４２ *
JPN6010050038, Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， （１９９８）， ｖｏｌ．１７， ｐ．５６８−５７２ *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017158554A (ja) * 2007-09-04 2017-09-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
JPWO2013046960A1 (ja) * 2011-09-29 2015-03-26 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ペプチド抗体のスクリーニングに使用する核酸構築物およびそれを用いたスクリーニング方法
JP2018501783A (ja) * 2014-11-25 2018-01-25 ファームアブシン インコーポレイテッドＰｈａｒｍａｂｃｉｎｅ Ｉｎｃ． 新規ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体及びこれを含む組成物
US10597457B2 (en) 2014-11-25 2020-03-24 Pharmabcine Inc. EGFRvIII antibody and composition comprising same
WO2017142294A1 (ko) * 2016-02-15 2017-08-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도
US10669340B2 (en) 2016-02-15 2020-06-02 Samsung Life Public Welfare Foundation Antibody against EGFRvIII and use thereof
JP2020503254A (ja) * 2016-10-28 2020-01-30 テクニスチェ ユニベルシタト ドレスデン 治療活性ペイロードの標的化送達のための送達システム
JP7090343B2 (ja) 2016-10-28 2022-06-24 テクニスチェ ユニベルシタト ドレスデン 治療活性ペイロードの標的化送達のための送達システム

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