EP3558388A1 - Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen - Google Patents

Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen

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EP3558388A1
EP3558388A1 EP17837949.1A EP17837949A EP3558388A1 EP 3558388 A1 EP3558388 A1 EP 3558388A1 EP 17837949 A EP17837949 A EP 17837949A EP 3558388 A1 EP3558388 A1 EP 3558388A1
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EP
European Patent Office
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antibody
seq
represented
sequence
chain variable
Prior art date
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Pending
Application number
EP17837949.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Georg Lerchen
Anne-Sophie Rebstock
Beatrix Stelte-Ludwig
Dennis KIRCHHOFF
Lisa Dietz
Christoph Mahlert
Simone Greven
Stephan MÄRSCH
Sandra Berndt
Anette Sommer
Stefanie Hammer
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Bayer AG
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer AG
Bayer Pharma AG
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Filing date
Publication date
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    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • ADCs Binder-drug conjugates (ADCs) with enzymatically cleavable groups
  • the invention relates to novel binder-drug conjugates (ADCs) having improved properties, active metabolites of these ADCs and their methods of preparation. Furthermore, the present invention relates to the use of these conjugates for the treatment and / or prevention of diseases and the use of these conjugates for the preparation of medicaments for the treatment and / or prevention of diseases, in particular hyperproliferative and / or angiogenic diseases such as
  • cancers for example, cancers.
  • Such treatments can be used alone or in combination with other medicines or other therapeutic agents.
  • the binder is preferably an antibody according to the invention.
  • Cancers are the result of uncontrolled cell growth of various tissues. In many cases, the new cells invade existing tissues (invasive growth) or they metastasize to distant organs. Cancers occur in various organs and often have tissue-specific disease courses.
  • cancer as a generic term describes a large group of defined diseases of various organs, tissues and cell types. Tumors of early stages may be surgically and surgically treated
  • ADCs antibody drug conjugates
  • cytotoxic agent itself or another cytotoxically active metabolite formed therefrom is released within the tumor cell, where it can exert its effect directly and selectively
  • the damage to normal tissue could be kept to a significantly narrower limit compared to conventional cancer chemotherapy [see, eg, JM Lambert, Curr.
  • WO2012 / 171020 describes ADCs in which several toxophore molecules are linked to an antibody via a polymeric linker.
  • the substances SB 743921, SB 715992 (isospinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 and ARRY-520 are mentioned in WO2012 / 171020 as potential toxophores.
  • Kinesin spindle protein (KSP, also known as Eg5, HsEg5, KNSL1, or KIF1 1) is a kinesin-like motor protein that is essential for the function of the bipolar mitotic spindle. Inhibition of KSP leads to mitotic arrest and apoptosis for a prolonged period of time (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8 (1), 39-59). After finding the first cell-derived CSF inhibitor, monastrol, KSP inhibitors have become established as a class of new chemotherapeutic agents (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) and are the subject of a number of patent applications (eg
  • CSF inhibitors must be present in a sufficiently high concentration during this phase.
  • WO2014 / 151030 discloses ADCs with certain KSP inhibitors.
  • the patent applications WO2015 / 096982 and WO2016 / 096610 already disclose ADCs with KSP inhibitors, which also contain enzymatically cleavable linkers, but which do not have an optimal activity profile.
  • Legumain is a tumor-associated asparaginyl endopeptidase (S. Ishii, Methods
  • lysosomal enzymes are, for example, cathepsin or glycosidases such as, for example, ⁇ -glucuronidases, which have also been used for the release of the active ingredients by enzymatic cleavage of prodrugs.
  • Enzymatically cleavable in vivo Groups are especially 2-8-oligopeptide groups or glycosides.
  • Peptide cleavage sites are disclosed in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, and Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346 and Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. These include, for example, valine-alanine, valine-lysine, valine-citrulline, alanine-lysine and phenylalanine-lysine (possibly with additional amide group).
  • the present invention therefore relates to binder-drug conjugates (ADCs) having a specific toxophore-linker composition which, in combination with antibodies, have a particularly interesting profile of action in terms of potency and effective width.
  • Binder conjugates have been provided with peptide linkers that can be released by lysosomal tumor-associated enzymes, such as legumain or cathepsin.
  • the tumor selectivity is thus not only determined by the choice of antibody, but additionally by the enzymatic cleavage of the peptide derivative, e.g. determined by tumor-associated enzymes such as Legumain.
  • ADCs binder-drug conjugates
  • the kinesin spindle protein inhibitors used according to the invention have an amino group which is essential for the action. By modifying this amino group with peptide derivatives, the effect on the kinesin spindle protein is blocked and thus also the unfolding of a cytotoxic effect is inhibited.
  • These peptide derivatives may also be components of the linker to the antibody. However, if this peptide residue or the peptide linker can be cleaved off from the active substance by tumor-associated enzymes such as, for example, legume or cathepsin, the effect can be selectively restored in the tumor tissue.
  • the particular property profile of the metabolites formed in the tumor is ensured by a further modification of the kinesin spindle protein inhibitor at a position other than the amino group in the molecule, which, however, does not affect the high potency at the target.
  • Embodiments a high load of the antibody (called DAR, drug-to-antibody ratio), which surprisingly do not adversely affect the physicochemical and pharmacokinetic behavior of the ADCs.
  • DAR drug-to-antibody ratio
  • Xs is C
  • Xs is N
  • X 3 is C
  • X 3 stands for C.
  • R 1 is hydrogen or methyl
  • n is a number from 1 to 50
  • AK is a binder or a derivative thereof, preferably one
  • Antibody or an antigen-binding fragment is,
  • X 3 is N
  • R 1 is hydrogen or methyl
  • M is the group
  • AK for a binder or a derivative thereof, preferably for one
  • Antibody or an antigen-binding fragment is,
  • ## is for binding to an S atom of a cysteine side chain of the binder, ### stands for binding to an N atom of a lysine side chain of the binder, and their salts, solvates and salts of these solvates.
  • R 2 is methyl or iso-propyl
  • n is a number from 1 to 50
  • AK for a binder or a derivative thereof, preferably for one
  • Antibody or an antigen-binding fragment is,
  • # stands for binding to an N atom of a lysine side chain of the binder, and their salts, solvates and salts of these solvates.
  • n is a number from 1 to 50
  • AK for a binder or a derivative thereof, preferably for one
  • Antibody or an antigen-binding fragment is,
  • # stands for binding to an N atom of a lysine side chain of the binder, and their salts, solvates and salts of these solvates.
  • R 1 is methyl
  • R 2 is methyl
  • n is a number from 1 to 20, AK for a binder or a derivative thereof, preferably for a
  • Antibody or an antigen-binding fragment is,
  • # stands for the binding to an N atom of a lysine side chain of the binder, and their salts, solvates and salts of these solvates.
  • R 1 is methyl
  • R 2 is methyl
  • AK for an anti-CD123 antibody, an anti-CXCR5 antibody, an anti-
  • B7H3 antibody an anti-TWEAKR antibody, an anti-Her2
  • Antibody or an anti-EGFR antibody or an antigen-binding antibody fragment of these are examples of these,
  • ### is for binding to an N-atom of a lysine side chain of the antibody (AK) or the antigen-binding antibody fragment thereof, as well as their salts, solvates and salts of these solvates.
  • R 2 is methyl
  • n is a number from 1 to 20 and
  • AK for an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of
  • TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 and TPP-6013 for an anti-CXCR5 antibody selected from the group consisting of TPP-9574 and TPP-9580, for an anti-B7H3 antibody TPP-8382, for an anti-CXCR5 antibody.
  • TWEAKR antibody selected from the group consisting of TPP-7006 and TPP-7007, for an anti-Her2 antibody TPP-1015, or for an anti-EGFR antibody TPP-981 or for an antigen-binding antibody fragment thereof,
  • ### is for binding to an N-atom of a lysine side chain of the antibody (AK) or the antigen-binding antibody fragment thereof, as well as their salts, solvates and salts of these solvates.
  • binder-drug conjugates of the above formulas are in the AK for a binder that specifically binds to an extracellular cancer targeting molecule.
  • the binder after binding to its extracellular target molecule on the target cell, the binder is internalized by binding from the target cell.
  • the binder is an antibody or an antigen-binding fragment.
  • the extracellular cancer targeting molecule is selected from the group consisting of the cancer targeting molecules EGFR, CD123, HER2, B7H3, TWEAKR and CXCR5, particularly preferred are CD123, CXCR5, and B7H3.
  • the binder AK is an anti-CD123 antibody, an anti-CXCR5 antibody, an anti-B7H3 antibody, an anti-TWEAKR antibody, an anti-Her2 antibody or an anti-EGFR antibody, or an antigen
  • binder-active substance conjugates of said formulas in the AK for an antibody selected from the group consisting of TPP-8382 (anti B7H3), TPP-6013 (anti-CD123).
  • TPP-8987 (anti-CD123), TPP-8988 (anti-CD123), TPP 9476 (anti-CD123), TPP-9574 (anti-CXCR5) and TPP 9580 (anti-CXCR5), or one for an antigen binding fragment of these stands.
  • Preferred herein are the antibodies TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 and TPP-9476 for each anti-CD123).
  • the exact structure (sequence) of these antibodies is shown in the table: Protein sequences of the antibodies follow the text following this table and the sequence listing.
  • AK is an antibody selected from the group consisting of TPP-8382 (anti-B7H3), TPP-6013 (anti-CD123), TPP-8987 (anti CD123), TPP-8988 (anti-CD123), TPP 9476 (anti-CD123), TPP-9574 (anti-CXCR5) and TPP 9580 (anti-CXCR5).
  • the antibodies (AK) TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 and TPP-9476 are preferred here.
  • Annotated sequences of preferred antibodies for binder-drug conjugates Shown are the protein sequences of the heavy and light chains of the IgGs, as well as the VH and VL regions of these antibodies.
  • VH and VL regions in IgGs are annotated (VH and VL regions in IgGs, and the CDR regions (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3)).
  • FIG. 2 Sequence listing of sequences of the preferred antibodies for binding
  • the invention provides conjugates of a binder or derivative thereof with one or more drug molecules, wherein the drug molecule is a kinesin spindle protein inhibitor (KSP inhibitor).
  • KSP inhibitor kinesin spindle protein inhibitor
  • KSP inhibitors which can be used according to the invention and also linkers which can be used according to the invention and which can be used without restriction in combination are described below.
  • the binders which are in each case described as being preferred or particularly preferred can be used in combination with the CPAs inhibitors respectively shown as being preferred or particularly preferred, if appropriate in combination with the linkers respectively shown as being preferred or particularly preferred.
  • KSP-inhibitor conjugates wherein AK (AKi, AK2) for binders or a derivative thereof (preferably for a
  • n is a number from 1 to 50, preferably 1 to 20, preferably 1 to 8, particularly preferably 4 to 8.
  • AKi is preferably an antibody linked to the KSP inhibitor via a cysteine residue; AK2; preferably represents an antibody which is bound via a lysine residue to the KSP inhibitor.
  • the binders or antibodies used here are preferably the binders or antibodies described as being preferred in the description.
  • binder-drug conjugates ⁇
  • such binder-drug conjugates of said formulas in the AK for a binder that binds specifically to an extracellular cancer target molecule is.
  • the binding agent becomes binding to its extracellular target molecule on the target cell through binding from the target cell
  • the extracellular cancer targeting molecule is selected from the group consisting of the cancer targeting molecules EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR and CXCR5, in particular CD123, CXCR5, and B7H3.
  • the binder AK is an anti-CD123 antibody, an anti-CXCR5 antibody, an anti-B7H3 antibody, an anti-TWEAKR antibody, an anti-Her2 antibody or an anti-EGFR antibody
  • Preferred herein are the antibodies TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 and TPP-9476 for each anti-CD123).
  • the exact structure (sequence) of these antibodies is shown in the table: Protein sequences of the antibodies, the text following this table and the sequence listing.
  • KSP inhibitor - linker intermediates and preparation of the Koniuqate is shown in the table: Protein sequences of the antibodies, the text following this table and the sequence listing.
  • low molecular weight KSP inhibitor thereof is provided with a linker.
  • the intermediate thus obtained is then reacted with the binder (preferably antibody).
  • reaction For an intermediate coupling to a lysine residue and subsequent coupling with the antibody, the reaction can be illustrated as follows:
  • X 1 , X 2 , X 3 , R 1 , R 2 , R 3 and AK 2 have the meanings given in formula (I) and R 4 here is methyl and n is 0 or 1.
  • X 1 , X 2 , X 3 , R 1 , R 2 , R 3 and AK 1 are as defined in formula (I) and R 4 is methyl and n is 1.
  • succinimide-linked ADCs after conjugation can be converted into the open-chain succinic acid amides, which are an advantageous
  • This reaction can be carried out at pH 7.5 to 9, preferably at pH 8, at a temperature of 25 0 C to 37 ° C, for example by stirring.
  • the preferred stirring time is 8 to 30 hours.
  • binding is broadly understood to mean a molecule that binds to a target molecule that binds to a particular drug conjugate
  • binder is to be understood in its broadest interpretation and includes, for example, lectins, proteins that can bind certain sugar chains, or phospholipid-binding proteins.
  • binders include, for example, high molecular weight proteins (binding proteins), polypeptides or peptides (binding peptides), non-peptidic (eg, aptamers (US5,270,163) review articles by Keefe AD., Et al., Nat., Rev. Drug Discov., 2010; 9 : 537-550), or vitamins) and all other cell-binding molecules or substances.
  • Binding proteins are, for example, antibodies and antibody fragments or antibody mimetics such as Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, Nanobodies (review article by Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13: 245-255; Nuttall SD et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8: 608-617).
  • Binding peptides are, for example, ligands of a ligand-receptor pair, such as VEGF of the ligand-receptor pair VEGF / KDR, such as transferrin of the ligand receptor pair transferrin / transferrin receptor or cytokine / cytokine receptor, such as TNFalpha of the ligand receptor pair TNFalpha / TNFalpha receptor.
  • the binder can be a binding protein.
  • Preferred embodiments of the binders are an antibody, an antigen-binding antibody fragment, a multispecific antibody or an antibody mimetic.
  • covalent coupling (conjugation) of organic molecules to binders and in particular antibodies are known from the literature.
  • the conjugation of the toxophore to the antibody is preferably via one or more sulfur atoms of cysteine residues of the antibody and / or via one or more NH groups of lysine residues of the antibody.
  • a "target molecule” is broadly understood to be a molecule that is present in the target cell population, and may be a protein (e.g., a receptor of a
  • Growth factor or a non-peptidic molecule (e.g., a sugar or phospholipid). It is preferably a receptor or an antigen.
  • extracellular target molecule describes a cell-bound one
  • Target molecule which is located on the outside of a cell or the part of a target molecule, which is located on the outside of a cell, i. a binder can bind to an extracellular target molecule on an intact cell.
  • An extracellular targeting molecule may be anchored in the cell membrane or be part of the cell membrane. The person skilled in the art knows methods to identify extracellular target molecules. For proteins, this can be achieved by determining the transmembrane domain (s) and the
  • Orientation of the protein in the membrane happen. This information is usually stored in protein databases (e.g., SwissProt).
  • protein databases e.g., SwissProt
  • cancer target molecule describes a target molecule that is more abundant on one or more types of cancer cells compared to non-cancerous cells of the same tissue type, Preferably, the cancer target molecule is on one or more cancer cell types compared to non-cancer cells of the same tissue type selectively present, selectively expressing at least two-fold accumulation on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type (a "selective cancer target molecule”).
  • selective cancer target molecule allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates of the invention.
  • the binder can be linked via a linkage with the linker.
  • the linkage of the binder can be effected by means of a heteroatom of the binder.
  • Heterocycles of the invention that can be used for linking are sulfur (in one embodiment via a sulfhydryl group of the binder), oxygen
  • the linkage of the binder with the toxophore has only a small influence on the binding activity of the binder to the target molecule.
  • the linkage has no effect on the binding activity of the binder to the target molecule.
  • antibody is understood in its broadest sense according to the present invention and includes immunoglobulin molecules, for example, intact or modified monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or multispecific
  • An immunoglobulin molecule preferably comprises a molecule having four polypeptide chains, two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains), which are typically linked by disulfide bridges.
  • Each heavy chain comprises a heavy chain variable domain (abbreviated VH) and heavy chain constant domain.
  • the heavy chain constant domain may comprise three domains CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a variable domain (abbreviated VL) and a constant domain.
  • the constant domain of the light chain comprises a domain (abbreviated to CL).
  • VH and VL domains can be further subdivided into regions of hypervariability, also called complementarity determining regions (abbreviated to CDR) and regions of lower sequence variability (FR).
  • CDR complementarity determining regions
  • FR regions of lower sequence variability
  • Each VH and VL region typically consists of three CDRs and up to four FRs. For example, from the amino terminus to
  • An antibody can be obtained from any suitable species, e.g.
  • the antibody is of human or murine origin.
  • An antibody can e.g. be humane, humanized or chimeric.
  • the term "monoclonal" antibody refers to antibodies obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., individual antibodies of the
  • Monoclonal antibodies recognize with high specificity a single antigenic binding site.
  • the term monoclonal antibody does not refer to a particular manufacturing process.
  • the term "intact” antibody refers to antibodies comprising both an antigen-binding domain and the light and heavy chain constant domain
  • the constant domain may be a naturally occurring domain, or a variant thereof in which multiple amino acid positions are altered and may also be aglycosylated.
  • modified intact antibody refers to intact antibodies that have been fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino terminus or carboxy-terminus via a covalent bond (e.g., a peptide linkage)
  • amino acid modification or “mutation” herein is meant an amino acid substitution, insertion, and / or deletion in a polypeptide sequence.
  • the preferred amino acid modification is here a substitution.
  • amino acid substitution or “substitution” herein is meant an exchange of an amino acid at a given position in a protein sequence with another amino acid.
  • substitution Y50W describes a variant of a parent polypeptide in which the tyrosine at position 50 is replaced by a tryptophan.
  • Polypeptide describes a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to a reference polypeptide, typically a native or "parent" polypeptide
  • human antibody refers to antibodies that can be obtained from a human or that are synthetic human antibodies
  • a "synthetic” human antibody is an antibody that is available in part or in full as a whole from synthetic sequences in silico that are based on the art Human analysis
  • Antibody sequences are based.
  • a human antibody can e.g. by a
  • Nucleic acid isolated from a library of antibody sequences of human origin is in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18: 853-856.
  • Such "human” and “synthetic” antibodies also include aglycosylated variants prepared either by deglycosylation by PNGaseF or by mutation of N297 (kabat numbering) of the heavy chain to any other amino acid.
  • the term "humanized” or “chimeric” antibody describes antibodies consisting of a non-human and a human sequence portion. In these
  • Antibodies a part of the sequences of the human immunoglobulin (recipient) is replaced by sequence portions of a non-human immunoglobulin (donor).
  • the donor is a murine immunoglobulin in many cases.
  • Amino acids of the CDR of the recipient replaced by amino acids of the donor.
  • the humanized antibody contains amino acids that were not contained in either the recipient or the donor and that were inserted during optimization of the antibody.
  • the variable domains of the donor immunoglobulin are fused to the constant regions of a human antibody.
  • Such "humanized” and “chimeric” antibodies also include aglycosylated variants prepared by either deglycosylation by PNGaseF or by mutation of N297 (kabat numbering) of the heavy chain to any other amino acid.
  • complementarity determining region refers to those amino acids of a variable antibody domain necessary for binding to the antigen.
  • Each variable region typically has three CDR regions, referred to as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • Each CDR region may comprise amino acids as defined by Kabat and / or amino acids of a hypervariable loop defined by Chotia.
  • the Kabat definition includes, for example, the region of approximately amino acid position 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) of the variable light chain / domain (VL) and 31-35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) and 95 - 102 (CDR3) of variable heavy chain / domain (VH) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
  • the definition according to Chotia includes the region of approximately amino acid position 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) and 91-96 (CDR3) of the variable light chain (VL) and 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) and 96-101 (CDR3) variable heavy chain (VH) Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)).
  • a CDR may comprise amino acids from a CDR region as defined by Kabat and Chotia.
  • antibodies can be divided into different classes. There are five major classes of intact antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, with several of them in more Subclasses can be broken down. (Isotypes), eg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the heavy chain constant domain corresponding to the different classes are referred to as [alpha / a], [delta / ⁇ ], [epsilon / ⁇ ], [gamma / ⁇ ] and [my / ⁇ ]. Both the three-dimensional structure and the subunit structure of antibodies are known.
  • Antibodies / immunoglobulins e.g., the variable domains of an IgG which still comprise the antigen binding domains of the antibody / immunoglobulin.
  • the "antigen binding domain" of an antibody typically comprises one or more
  • Hypervariable regions of an antibody e.g. the CDR, CDR2 and / or CDR3 region.
  • the "framework" or “framework” region of an antibody may also play a role in binding the antibody to the antigen.
  • the framework region provides the framework for the CDRs.
  • the antigen binding domain comprises at least amino acids 4 to 103 of the variable light chain and amino acids 5 to 109 of the variable heavy chain, more preferably amino acids 3 to 107 of the variable light chain and 4 to 11 of the variable heavy chain are particularly preferred the complete variable light and heavy chains, so amino acid 1 - 109 of the VL and 1 to 1 13 of the VH (numbering according to WO97 / 08320).
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” of the invention include but are not limited to Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments, diabodies, single domain antibodies (DAbs), linear antibodies, single chain antibodies (single-chain Fv , abbreviated scFv); and multi-specific, e.g. bi- and tri-specific antibodies formed from antibody fragments C.
  • DAbs single domain antibodies
  • single chain antibodies single chain antibodies
  • scFv single chain antibodies
  • Multispecific antibodies are those with identical binding sites. Multispecific antibodies may be specific for
  • An F (ab ') 2 or Fab molecule can be designed to reduce or completely eliminate the number of intermolecular disulfide interactions that occur between the Chi and CL domains.
  • Epitopic determinants refers to protein determinants that can specifically bind to an immunoglobulin or T cell receptor Epitopic determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or sugar side chains, or combinations thereof, and typically have specific 3-dimensional structural properties such as also specific charge characteristics.
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” may be fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino-terminus or carboxy-terminus via a covalent bond (e.g., a peptide linkage). Furthermore, antibodies and antigen-binding fragments can be modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008 Aug; 26 (8): 925-32) ).
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Köhler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
  • Humanized humanized monoclonal antibodies can be used for the
  • Amino acid sequences of a variety of antibodies which were created from a large number of healthy volunteers.
  • Antibodies can also be made by known recombinant DNA technology.
  • the nucleic acid sequence of an antibody can be obtained by routine sequencing, or is available from publicly available databases.
  • An "isolated" antibody or binder has been purified from other components of the cell Contaminating components of a cell that may interfere with a diagnostic or therapeutic use are, for example, enzymes, hormones, or other peptidic or non-peptidic components of a cell an antibody or binder which is greater than 95% by weight of the antibody or Binder was purified (determined by eg Lowry method, UV-Vis spectroscopy or by SDS capillary gel electrophoresis).
  • an antibody which has been purified to the extent that at least 15 amino acids of the amino terminus or an internal amino acid sequence can be determined, or purified to homogeneity, wherein the homogeneity is determined by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions (the detection can by means Coomassie blue staining or preferably determined by silver staining).
  • an antibody is usually produced by one or more purification steps.
  • the term “specific binding” or “specific binding” refers to one
  • Antibody or binder that binds to a predetermined antigen / target molecule typically describes an antibody or binding with an affinity of at least 10 "7 M (as Kd value, so preferably those with smaller Kd values than 10" ⁇ M) a, wherein the antibody or binder has at least two-fold higher affinity for the predetermined antigen / target molecule than for a nonspecific antigen / target molecule (eg, bovine serum albumin, or casein) that is not the predetermined antigen / target molecule or a closely related antigen / target molecule.
  • Specific binding of an antibody or binder does not preclude the antibody or binder from binding to multiple antigens / target molecules (eg, orthologs from different species).
  • the antibodies preferably have an affinity of at least 10 -7 M (as Kd value, so preferably those with smaller Kd values than 10 ⁇ 7 M), preferably at least 10 "8 M, more preferably in the range of 10" 9 M up to 10 " M.
  • Kd values can be determined by eg
  • the antibody-drug conjugates of the invention also have affinities in these areas.
  • affinity is not significantly affected by the conjugation of the drugs (as a rule, the affinity becomes less than one)
  • the antibodies used according to the invention are furthermore preferably characterized by a high selectivity.
  • a high selectivity is present when the
  • Antibody according to the invention has an affinity to the target protein which is at least a factor of 2, preferably a factor of 5 or particularly preferred factor 10 than of an independent other antigen, for example human serum albumin (the affinity can be determined, for example, by surface plasmon resonance spectroscopy).
  • the antibodies used according to the invention are preferably cross-reactive. In order to facilitate and better interpret preclinical studies, eg toxicological or efficacy studies (eg in xenograft mice), it is advantageous if the antibody used according to the invention binds not only the human target protein but also in the species used for the studies the species target protein binds.
  • the antibody used according to the invention is, in addition to the human target protein, cross-reactive to the target protein of at least one other species.
  • species of the family rodents, dogs and non-human primates are preferably used.
  • Preferred rodent species are mouse and rat.
  • Preferred non-human primates are rhesus monkeys, chimpanzees and long-tailed macaques.
  • the antibody used according to the invention is cross-reactive to the target protein of at least one other species selected from the group of species consisting of mouse, rat and
  • Macaca fascicularis Long-tailed Macaque (Macaca fascicularis). Particularly preferred
  • Antibodies used according to the invention which, in addition to the human target protein, are at least cross-reactive with the mouse target protein. Preference is given to cross-reactive antibodies whose affinity for the target protein of the further non-human species does not differ by more than a factor of 50, in particular not more than a factor of ten, from the affinity for the human target protein.
  • the target molecule against which the binder e.g. an antibody or antigen-binding fragment thereof, a cancer target molecule.
  • cancer target molecule describes a target molecule that is more abundant on one or more types of cancer cells as compared to non-cancerous cells of the same tissue type, Preferably, the cancer target molecule is on one or more cancer cell types compared to non-cancer cells of the same tissue type selectively present, selectively expressing at least two-fold accumulation on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type (a "selective cancer target molecule").
  • cancer target molecules allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates of the invention.
  • Antibodies directed specifically against an antigen may be made by those of ordinary skill in the art by methods known to those skilled in the art (such as recombinant expression) or purchased commercially (such as from Merck KGaA, Germany). Examples of known commercially available antibodies in cancer therapy are Erbitux® (Cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (Bevacizumab, Roche) and Herceptin® (Trastuzumab, Genentech).
  • the antibody is produced recombinantly in CHO cells. All of these antibodies can also be made as aglycosylated variants of these antibodies, either by deglycosylation by PNGase F or by mutation of N297 (Kabat numbering) of the heavy chain to any amino acid.
  • the target molecule is a selective cancer target molecule.
  • the target molecule is a protein.
  • the target molecule is an extracellular target molecule.
  • the extracellular target molecule is a protein.
  • Cancer target molecules are known to the person skilled in the art. Examples of this are listed below.
  • cancer target molecules are:
  • EGFR EGF receptor, NCBI reference sequence NP_005219.2, NCBI genes ID: 1956
  • Mesothelin StewissProt reference Q13421-3
  • Amino acids 37-286 encode "megakaryocyte-potentiating factor”.
  • Mesothelin is anchored in the cell membrane by a GPI anchor and is localized extracellularly.
  • CD52 NCBI reference sequence NP_001794.2
  • Her2 (ERBB2; NCBI Reference Sequence NP_004439.2; NCBI Gene ID: 2064)
  • CD20 NCBI reference sequence NP_068769.2
  • CD30 the lymphocyte activation antigen CD30
  • lymphocyte adhesion molecule CD22 (SwissProt ID P20273; NCBI gene ID: 933)
  • the B lymphocyte antigen CD19 (SwissProt ID P15391, NCBI Gene ID: 930)
  • the prostate-specific membrane antigen PSMA (Swiss Prot ID: Q04609; NCBI genes ID: 2346)
  • Ephrin receptor EPHB2 (SwissProt: P29323)
  • T cell protein VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3)
  • TWEAKR (FN14, TNFRSF12A, NCBI reference sequence: NP_057723.1, NCBI genes ID: 51330)
  • the lymphocyte antigen CD37 (Swiss Prot: P1 1049, NCBI genes ID: 951)
  • the FGF receptor 2; FGFR2 (NCBI gene ID: 2263; Official symbol: FGFR2).
  • the FGFR2 receptor occurs in different splice variants (alpha, beta, IIIb, IIIc). All splice variants can act as a target molecule.
  • CDH15 cadherin 15, NCBI genes ID: 1013
  • Ephrin A4 (67) Ephrin A4 (EFNA4, NCBI Gene ID: 1945)
  • FGF receptor 3 (FGFR3, NCBI gene ID: 2261)
  • folate receptor 1 (FOLR1, NCBI gene ID: 2348)
  • the cancer target molecule is selected from the group consisting of the cancer target molecules EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR and CXCR5, in particular CD123, CXCR5, and B7H3.
  • the binder binds to an extracellular cancer targeting molecule selected from the group consisting of the cancer targeting molecules EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR and CXCR5, especially CD123, CXCR5, and B7H3.
  • the binder specifically binds to an extracellular cancer target molecule selected from the group consisting of the cancer target molecules EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR and CXCR5, in particular CD123, CXCR5, and B7H3 ,
  • an extracellular cancer target molecule selected from the group consisting of the cancer target molecules EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR and CXCR5, in particular CD123, CXCR5, and B7H3 .
  • the binder after binding to the extracellular target molecule on the target cell, the binder is internalized by binding from the target cell. This causes the binder-drug conjugate, which may be an immunoconjugate or an ADC, to be taken up by the target cell. Subsequently, the binder is preferably processed intracellularly, preferably lysosomally. In one embodiment, the binder is a binding protein. In a preferred
  • the binder is an antibody, an antigen-binding antibody fragment, a multispecific antibody or an antibody mimetic.
  • Preferred antibody mimetics are Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, or Nanobodies.
  • Preferred multispecific antibodies are bispecific and trispecific antibodies.
  • the binder is an antibody or an antigen-binding antibody fragment, more preferably an isolated antibody or an isolated antigen-binding antibody fragment.
  • Preferred antigen-binding antibody fragments are Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv
  • the binder is an antibody.
  • monoclonal antibodies or antigen-binding antibody fragments thereof are particularly preferred.
  • human, humanized or chimeric antibodies or antigen-binding antibody fragments thereof are particularly preferred.
  • Antibodies or antigen-binding antibody fragments that bind cancer targeting molecules can be prepared by one of ordinary skill in the art by known methods, such as e.g. chemical synthesis or recombinant expression.
  • Cancer target binders can be purchased commercially or can be prepared by one of ordinary skill in the art by known methods, such as e.g. chemical synthesis or
  • Suitable expression vectors for bacterial expression of desired proteins are prepared by insertion of a DNA sequence encoding the desired protein in functional reading frame along with appropriate translation initiation and expression
  • the vector comprises one or more phenotypically selectable markers and one
  • Suitable prokaryotic hosts for transformation include, but are not limited to, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium and various species from the genus Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus.
  • bacterial vectors may be based on bacteriophages, plasmids, or phagemids. These vectors may contain selectable markers and a bacterial origin of replication derived from commercially available plasmids. Many commercially available plasmids typically contain elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017). In bacterial systems, a number of advantageous expression vectors can be selected based on the intended use of the protein to be expressed.
  • the selected promoter is de-repressed / re-induced by appropriate means (eg, temperature change or chemical induction) and the cells are cultured for an additional period.
  • appropriate means eg, temperature change or chemical induction
  • the cells are usually harvested by centrifugation, digested, if necessary, physically or by chemical means, and the resulting crude extra is retained for further purification.
  • Another embodiment of the present invention is a
  • An expression vector comprising a nucleic acid encoding a novel antibody of the present invention.
  • Antibodies of the present invention or antigen binding fragments thereof naturally include purified products, products derived from chemical syntheses, and products produced by recombinant technologies in prokaryotic hosts, such as E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, and various species from the Genus Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus, preferably E. coli.
  • prokaryotic hosts such as E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, and various species from the Genus Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus, preferably E. coli.
  • Preferred regulatory sequences for expression in mammalian cell hosts include viral elements that result in high expression in mammalian cells, such as promoters and / or expression enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) (such as the CMV promoter / enhancer), simian virus 40 (SV40) (such as the SV40 promoter / enhancer), the adenovirus (eg the adenovirus major late promoter (AdMLP)) and the polyoma.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 simian virus 40
  • AdMLP adenovirus major late promoter
  • Expression of the antibodies may be constitutive or regulated (eg, induced by addition or removal of small molecule inducers such as tetracycline in combination with the Tet system).
  • the recombinant expression vectors may also include an origin of replication and selectable markers (see, eg, US
  • Suitable selectable markers include genes that are resistant to substances such as G418, puromycin, hygromycin,
  • the dihydrofolate reductase (DHFR) gene mediates resistance to methotrexate
  • the neo gene mediates resistance to G4108
  • the bsd gene from Aspergillus terreus mediates resistance to blasticidin
  • puromycin N-acetyltransferase mediates resistance to puromycin, which mediates Sh ble gene product Resistance to zeocin
  • resistance to hygromycin is mediated by the E. coli hygromycin resistance gene (hyg or hph).
  • Selectable markers such as DHFR or glutamine synthetase are also useful for amplification techniques associated with MTX and MSX.
  • Transfection of an expression vector into a host cell can be performed with the aid of
  • Standard techniques including but not limited to electroporation, nucleofection, calcium-phosphate precipitation, lipofection, polycation-based transfection such as polyethylenylimine (PEI) -based transfection, and DEAE-dextran transfection.
  • PEI polyethylenylimine
  • Suitable mammalian host cells for the expression of antibodies, antigen-binding fragments thereof, or variants thereof include Chinese hamster ovary (CHO cells) such as CHO-K1, CHO-S, CHO-K1 SV [including DHFR-CHO cells described in Urlaub and Chasin , (1980) Proc. Natl. Acad. Be. USA 77: 4216-4220 and Urlaub et al., Cell. 1983 Jun; 33 (2): 405-12, used with a DHFR selectable marker as described in RJ Kaufman and PA Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621, as well as other knockout cells as outlined in Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr; 109 (4): 1007-15), NS0 myeloma cells, COS cells, HEK293 cells, HKB1 1 cells, BHK21 cells, CAP cells, EB66 cells, and SP2 cells.
  • CHO cells such as CHO-K1, CHO-
  • Variants of these may also be transient or semi-stable in expression systems HEK293E, HEK293-6E, HEK293- freestyle, HKB1 1, Expi293F, 293EBNALT75, CHO freestyle, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1 SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 or CAP-T cells (for example, as Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15; 30 (2): E9).
  • the expression vector is constructed in such a way that the protein to be expressed enters the cell culture medium in which the host cells grow, are secreted.
  • the antibodies, the antigen-binding fragments of them, or the variants of these can be isolated from the cell culture medium by means of
  • the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the variants of these can be recovered and purified from recombinant cell cultures by well-known methods, including, for example, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, protein A chromatography, protein G
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Antibodies of the present invention or antigen-binding fragments thereof, or the variants thereof include, of course, purified products, products from chemical synthetic methods, and products made by recombinant techniques in prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • Eukaryotic hosts include, for example, yeast cells, higher plant cells, insect cells and mammalian cells. Depending on the host cell selected for recombinant expression, the expressed protein may be glycosylated or unglycosylated.
  • the antibody is purified (1) to greater than 95% by weight as measured, for example, by the Lowry method, by UV-Vis spectroscopy or by SDS capillary gel electrophoresis (for example, with a Caliper LabChip GXII, GX 90 or Biorad Bioanalyzer device), and in more preferred Embodiments more than 99% by weight, (2) to a degree suitable for determining at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence, or (3) to homogeneity by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions with the aid of Coomassie blue or preferably silver staining.
  • an isolated antibody using at least one
  • Anti-CD123 Antibodies According to the invention anti-CD123 antibodies can be used.
  • anti-CD123 antibody or "an antibody specifically binding to CD123” refers to an antibody comprising the cancer target molecule CD123 (IL3RA; NCBI genes ID: 3563; NCBI reference sequence: NP_002174.1; Prot: P26951; SEQ ID NO: 1 1 1) binds, preferably with an affinity sufficient for diagnostic and / or therapeutic application.
  • the antibody binds CD123 with a dissociation constant (K D ) of ⁇ 1 ⁇ , ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 ⁇ , ⁇ 0.01 ⁇ , or ⁇ 0.001 nM.
  • K D dissociation constant
  • anti-CD123 antibody 12F1 An antibody that internalizes particularly well after cell surface antigen binding is anti-CD123 antibody 12F1, which has been described by Kuo et al. (Kuo et al., 2009, Bioconjug Chem. 20 (10): 1975-82).
  • the antibody 12F1 binds with a higher affinity to CD123 than the antibody 7G3 and internalizes significantly faster than 7G3 after cell surface antigen binding.
  • Bispecific scFv immunofusion proteins based on 12F1 are disclosed in WO 2013/173820.
  • Antibody TPP-6013 is a chimeric variant of 12F1.
  • the invention relates to conjugates with antibodies or antigen-binding antibody fragments thereof or variants thereof derived from mouse
  • Antibodies were generated based on CDR grafting into a human framework and subsequent optimization and are preferred examples within the scope of this invention.
  • anti-CD123 antibodies TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 and TPP-6013.
  • anti-CXCR5 antibody anti-CD123 antibodies TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 and TPP-6013.
  • anti-CXCR5 antibodies can be used.
  • anti-CXCR5 antibody or “an antibody that specifically binds to CXCR5" refers to an antibody that binds to the cancer target molecule CXCR5 (NCBI reference sequence: NP_001707.1; SEQ ID NO: 12) a sufficient for diagnostic and / or therapeutic use affinity.
  • the antibody binds CXCR5 with a
  • K D Dissociation constant of ⁇ 1 ⁇ , ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 ⁇ , ⁇ 0.01 ⁇ , or ⁇ 0.001 nM.
  • K D Dissociation constant
  • hybridoma cells for the rat antibody RF8B2 (ACC2153) were purchased from DSMZ and the sequence of the antibody identified by standard methods. This sequence represents the starting point of the humanized antibodies obtained by CDR grafting Humanized variants of this antibody were generated based on CDR grafting in germline sequences.
  • antibodies and antigen-binding fragments can be used within the scope of this invention.
  • Particularly preferred within the scope of this invention are the anti-CXCR5 antibodies TPP-9574 and TPP-9580.
  • anti-B7H3 antibodies can be used.
  • the term "anti-B7H3 antibody” or “an antibody that specifically binds to B7H3” refers to an antibody that binds the cancer target molecule B7H3 (NCBI reference sequence: NP_001019907.1 SEQ ID NO: 13), preferably with a sufficient affinity for diagnostic and / or therapeutic use.
  • the antibody binds B7H3 with a
  • K D Dissociation constant of ⁇ 1 ⁇ , ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 nM, ⁇ 0.01 nM, or ⁇ 0.001 nM.
  • a preferred embodiment of the anti-B7H3 antibodies was obtained by screening an antibody phage display library for recombinant B7H3 from mouse (mouse CD276, Gene ID: 102657) and human B7H3 (human CD276, Gene ID: 80381) expressing cells.
  • the recovered antibodies were converted into the human IgG1 format.
  • the anti-B7H3 antibody TPP-8382 is a preferred example.
  • anti-B7H3 antibodies TPP-8382 are particularly preferred within the scope of this invention.
  • anti-TWEAKR antibodies are particularly preferred.
  • anti-TWEAKR antibodies can be used.
  • anti-TWEAKR antibody or "an antibody that specifically binds to TWEAKR” refers to an antibody that binds the cancer target molecule TWEAKR (NCBI reference sequence: NP_057723.1; SEQ ID NO: 14) a sufficient for diagnostic and / or therapeutic use affinity.
  • the antibody binds TWEAKR with a
  • K D Dissociation constant
  • ITEM-4 is an anti-TWEAKR antibody described by Nakayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. Comm., 306: 819-825). humanized
  • Anti-HER2 antibodies According to the invention, anti-HER2 antibodies can be used.
  • anti-HER2 antibody or "an antibody that specifically binds to HER2” refers to an antibody that binds the cancer target molecule HER2 (NCBI reference sequence: NP_004439.2; SEQ ID NO: 11), preferably with a sufficient affinity for diagnostic and / or therapeutic use.
  • the antibody binds HER2 with a Dissociation constant (K D ) of ⁇ 1 ⁇ , ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 nM, ⁇ 0.01 nM, or ⁇ 0.001 nM.
  • K D Dissociation constant
  • Trastuzumab (Genentech). Trastuzumab is a humanized antibody used for, among other things, the treatment of breast cancer. In a particularly preferred embodiment, the anti-Her2 antibody is TPP-1015 (analogous to trastuzumab).
  • antibodies that bind to HER2 are, besides trastuzumab (INN 7637, CAS NR: RN: 180288-69-1) and pertuzumab (Cas NR: 380610-27-5), also antibodies as disclosed in WO 2009 / 123894-A2, WO 200/8140603-A2, or in WO 201 1/044368-A2.
  • An example of an anti-HER2 conjugate is trastuzumab emtansine (INN No. 9295). These antibodies and antigen-binding fragments can be used within the scope of this invention.
  • anti-HER2 antibody TPP-1015 analogous to trastuzumab.
  • anti-EGFR antibodies can be used.
  • anti-EGFR antibody or "an antibody that specifically binds to EGFR” refers to an antibody that binds the cancer target molecule EGFR (NCBI reference sequence: NP_005219.2; SEQ ID NO: 16) a sufficient for diagnostic and / or therapeutic use affinity.
  • the antibody binds EGFR with a
  • K D Dissociation constant of ⁇ 1 ⁇ , ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 nM, ⁇ 0.01 nM, or ⁇ 0.001 nM.
  • the anti-EGFR antibodies are selected from the group consisting of TPP-981, cetuximab, panitumumab, nimotuzumab. In a particularly preferred embodiment, the anti-EGFR antibody is TPP-981.
  • EGFR antibodies are: Zalutumumab / 2F8 / HuMax-EGFR, Genmab A / S (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN No. 8605)
  • Matuzumab / anti-EGFR MAb Merck KGaA / anti-EGFR MAb, Takeda / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 and EMD-55900 / MAb 425 / monoclonal antibody 425, Merck KGaA / Takeda (WO 92/15683 , INN number 8103 (Matuzumab)) ⁇ RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO-
  • Anti-EGFR-Mab, Xencor (WO 2005/056606) DXL-1218 / anti-EGFR monoclonal antibody (cancer), InNexus, InNexus company
  • C4.4a antibodies and antigen-binding fragments are described in WO 2012/143499 A2.
  • the sequences of the antibodies are given in Table 1 of WO 2012/143499 A2, each line representing the respective CDR amino acid sequences of the variable light chain or variable heavy chain of the antibody listed in column 1.
  • anti-CD20 antibody :
  • anti-CD52 antibody An example of an antibody that binds the cancer target molecule CD20 is rituximab (Genentech).
  • Rituximab (CAS number: 174722-31-7) is a chimeric antibody used to treat non-Hodgkin's lymphoma. These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • anti-CD52 antibody Anti-CD52 antibody:
  • An example of an antibody that binds the cancer target molecule CD52 is
  • Alemtuzumab (Genzyme). Alemtuzumab (CAS number: 216503-57-0) is a
  • anti-mesothelin antibodies are e.g. WO2009 / 068204. All antibodies and antigen-binding fragments disclosed in WO2009 / 068204 can be used within the scope of the invention disclosed herein. Particularly preferred is the antibody MF-T disclosed in WO2009 / 068204.
  • Examples of antibodies that bind the cancer target molecule CD30 and used to treat cancer e.g. Hodgkin's lymphoma can be used are Brentuximab,
  • anti-CD30 conjugate is brentuximab vedotin (INN No. 9144). These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • antibodies that bind the cancer target molecule CD22 and used to treat cancer e.g. Lymphoma can be used are inotuzumab or epratuzumab.
  • anti-CD22 conjugates are inotuzumab ozagamycin (INN No. 8574), or anti-CD22-MMAE and anti-CD22-MC-MMAE (CAS RN: 139504-50-0 and 474645-27-7, respectively). These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • antibodies that bind the cancer target molecule CD33 and used to treat cancer e.g. Leukemia can be used gemtuzumab or lintuzumab (INN 7580).
  • An example of an anti-CD33 conjugate is gemtuzumab ozagamycin.
  • anti-NMB antibody antigen-binding fragments can be used within the scope of this invention.
  • glembatumumab Treatment of cancer such as melanoma or breast cancer can be used is glembatumumab (INN 9199).
  • An example of an anti-NMB conjugate is glembatumumab Vedotin (CAS RN: 474645-27-7).
  • CAS RN: 474645-27-7 an antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • lorvotuzumab Treatment of cancer e.g. Multiple myeloma, small cell lung carcinoma, MCC or ovarian cancer can be used is lorvotuzumab.
  • An example of an anti-CD56 conjugate is Lorvotuzumab Mertansine (CAS RN: 139504-50-0).
  • Lorvotuzumab Mertansine CAS RN: 139504-50-0.
  • Non-Hodgkin's lymphoma or renal cell carcinoma examples of antibodies that bind the cancer target molecule CD70 and used to treat cancer e.g. Non-Hodgkin's lymphoma or renal cell carcinoma can be used are disclosed in WO 2007/038637-A2 or WO 2008/070593-A2.
  • An example of an anti-CD70 conjugate is SGN-75 (CD70 MMAF). These antibodies and antigen-binding fragments can be used within the scope of this invention.
  • milatuzumab Treatment of cancer e.g. Multiple myeloma can be used is milatuzumab.
  • An example of an anti-CD74 conjugate is milatuzumab-doxorubicin (CAS RN: 23214-92-8). These antibodies and antigen-binding fragments can be used in the context of this
  • anti-CD19 antibody anti-CD19 antibody
  • Non-Hodgkin's lymphoma Treatment of cancer e.g. Non-Hodgkin's lymphoma can be used is disclosed in WO 2008/031056-A2. Further antibodies and examples of an anti-CD19 conjugate (SAR3419) are disclosed in WO 2008/047242-A2. These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention. anti-mucin antibody
  • Examples of antibodies which bind the cancer target molecule mucin-1 and can be used for the treatment of cancer are clivatuzumab or the antibodies disclosed in WO 2003/106495-A2, WO 2008/028686-A2.
  • Examples of anti-mucin conjugates are disclosed in WO 2005/009369-A2. These antibodies and Antigen binding fragments thereof can be used in the invention.
  • anti-CD138 antibody anti-CD138 antibody
  • antibodies that bind the cancer target CD138 and conjugates thereof used to treat cancer e.g. Multiple myeloma can be used, WO 2009/080829-A1, WO 2009/080830-A1 are disclosed. These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • anti-Inteqrin-alphav antibody anti-Inteqrin-alphav antibody
  • Examples of antibodies that bind the cancer target integrin alphaV and used to treat cancer e.g. Melanoma, sarcoma or carcinoma are intetumumab (Cas RN: 725735-28-4), abciximab (Cas RN: 143653-53-6), etaracizumab (Cas RN: 892553-42-3) or the in US Pat. No. 7,465,449, EP 719859-A1, WO 2002/012501-A1 or WO2006 / 062779-A2.
  • Examples of antibodies that bind the cancer target molecule TDGF1 and can be used to treat cancer are the antibodies disclosed in WO 02/077033-A1, US 7,318,924, WO 2003/083041-A2 and WO 2002/088170-A2.
  • Examples of anti-TDGF1 conjugates are disclosed in WO 2002/088170-A2. These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • Examples of antibodies that bind the cancer target molecule PSMA and used to treat cancer e.g. Prostate cancer can be used are the antibodies disclosed in WO 97/35616 A1, WO 99/47554 A1, WO 01/009192 A1 and WO2003 / 034903.
  • anti-PSMA conjugates examples include WO 2009/026274-A1 and WO 2007/002222. These antibodies and antigen-binding fragments can be used within the scope of this invention.
  • anti-EphA2 antibodies examples include WO 2009/026274-A1 and WO 2007/002222. These antibodies and antigen-binding fragments can be used within the scope of this invention.
  • Examples of antibodies that bind the cancer target molecule EPHA2, can be used to make a conjugate, and to treat cancer are in WO
  • Examples of antibodies that bind the cancer target molecule SLC44A4 for the preparation of a conjugate and for the treatment of cancer, e.g. Pancreatic or prostate carcinoma can be used are disclosed in WO2009 / 033094-A2 and US2009 / 0175796-A1. These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • an antibody that binds the cancer target HLA-DOB is the antibody Lym-1 (Cas-RN: 301344-99-0) used to treat cancer, e.g. Non-Hodgkin's lymphoma can be used.
  • Examples of anti-HLA-DOB conjugates are e.g. in WO 2005/08171 1 -A2. These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • anti-FGFR2 antibody examples include antibodies that bind the cancer target molecule VTCN1 for the preparation of a conjugate and for the treatment of cancer, e.g. Ovarian, pancreatic, lung, or breast cancers. These antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used within the scope of this invention.
  • anti-FGFR2 antibody examples include antibodies that bind the cancer target molecule VTCN1 for the preparation of a conjugate and for the treatment of cancer, e.g. Ovarian, pancreatic, lung, or breast cancers.
  • anti-FGFR2 antibodies and antigen-binding fragments are in
  • WO2013076186 described.
  • the sequences of the antibodies are given in Table 9 and Table 10 of WO2013076186.
  • Preferred are antibodies, antigen-binding fragments and variants of the antibodies derived from the antibodies designated M048-D01 and M047-D08.
  • the binding agent conjugates are referred to the following preferred antibodies as shown in the following table: TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 and TPP-9580.
  • TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 and TPP-9580 are antibodies comprising one or more of in CDR sequences (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) of the heavy chain (VH) variable region or the light chain variable region (VL) indicated above in the table.
  • the antibodies comprise the indicated heavy chain variable region (VH) and / or the light chain variable region (VL).
  • the antibodies comprise the indicated heavy chain region (IgG heavy chain) and / or the indicated light chain region (IgG light chain).
  • TPP-981 is an anti-EGFR antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain variable CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 2, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 3 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 6, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 7 and the variable CDR3 Sequence of light chain (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 8.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 sequence H-CDR1 sequence
  • H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain
  • H-CDR3 heavy chain variable sequence H-CDR3 heavy chain variable sequence
  • VL
  • TPP-1015 is an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain variable CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 12, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 13 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 16, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 17 and the variable CDR3 Light chain sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 18.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 sequence H-CDR1 sequence
  • H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain
  • H-CDR3 heavy chain variable sequence H-CDR3
  • VL light chain variable region
  • TPP-6013 is an anti-CD123 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain variable CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 22, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 23 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 24, and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 26, the variable CDR2 sequence of the light chain A chain (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 27 and the light chain variable CDR3 sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 28.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 sequence H-CDR1 sequence
  • H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 23
  • TPP-7006 is an anti-TWEAKR antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain variable CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 32, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 33 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 34, and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 36, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 37 and the variable CDR3 Light chain sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 38.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • TPP-7007 is an anti-TWEAKR antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain CDR1 variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 42, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 43 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 44, and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 46, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 47 and the variable CDR3 Light chain sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 48.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 variable sequence H-CDR1 variable sequence
  • H-CDR2 variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain
  • H-CDR3 heavy chain variable sequence H-CDR3
  • SEQ ID NO: 48
  • TPP-8382 is an anti-B7H3 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the variable heavy chain CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 52, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 53 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 54 and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 56, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 57 and the variable CDR3 sequence.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • TPP-8987 is an anti-CD123 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the variable CDR1 heavy chain sequence (H- CDR1) as represented by SEQ ID NO: 62, the heavy chain CDR2 variable sequence (H-CDR2) as shown by SEQ ID NO: 63 and the variable CDR3 sequence of heavy chain (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 64, and a light chain variable region (VL) comprising the variable CDR1 light chain (L-CDR1) sequence as represented by SEQ ID NO: 66 , the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 67 and the light chain variable CDR3 sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 68.
  • VH heavy chain variable region
  • H- CDR1 heavy chain sequence H- CDR1 heavy chain sequence
  • H-CDR2 variable sequence H-CDR2 variable sequence
  • VL light chain variable region
  • TPP-8988 is an anti-CD123 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain variable CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 72, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 73 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 74 and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 76, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 77 and the variable CDR3 Sequence of the light chain (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 78.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 sequence H-CDR1 sequence
  • H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain H-CDR2 sequence of the heavy chain A chain
  • H-CDR3 heavy chain variable sequence H-C
  • TPP-9476 is an anti-CD123 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the variable CDR1 heavy chain sequence (H- CDR1), as represented by SEQ ID NO: 82, the heavy chain CDR2 variable sequence (H-CDR2) as shown h SEQ ID NO: 83 and the heavy chain CDR3 variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 84, and a light chain variable region (VL) comprising the variable CDR1 light chain sequence ( L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 86, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 87 and the light chain variable CDR3 sequence (L-CDR3). as represented by SEQ ID NO: 88.
  • VH heavy chain variable region
  • H- CDR1 heavy chain sequence H- CDR1 heavy chain sequence
  • H-CDR2 variable sequence H-CDR2 variable sequence
  • H-CDR3 variable sequence H-CDR3 variable sequence
  • TPP-9574 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain variable CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 92, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 93 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 94 and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 96, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 97 and the variable CDR3 sequence.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • TPP-9580 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the variable heavy chain CDR1 sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 102, the variable CDR2 sequence of the heavy chain A chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 103 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 104 and a light chain variable region (VL) the light chain variable CDR1 sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 106, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 107 and the variable CDR3 sequence.
  • TPP-981 is an anti-EGFR antibody, preferably comprising a heavy chain (VH) variable region as represented by SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 5.
  • VH heavy chain
  • VL light chain variable region
  • TPP-1015 is an anti-HER2 antibody, preferably comprising a heavy chain variable region (VH) as represented by SEQ ID NO: 11 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 15.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • TPP-6013 is an anti-CD123 antibody, preferably comprising a heavy chain variable region (VH) as represented by SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 25.
  • TPP-7006 is an anti-TWEAKR antibody preferably comprising a heavy chain variable region (VH) as represented by SEQ ID NO: 31 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 35.
  • TPP-7007 is an anti-TWEAKR antibody preferably comprising a heavy chain variable region (VH) region as represented by SEQ ID NO: 41 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 45.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • TPP-8382 is an anti-B7H3 antibody preferably comprising a heavy chain (VH) variable region as represented by SEQ ID NO: 51 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 55.
  • TPP-8987 is an anti-CD123 antibody preferably comprising a heavy chain variable region (VH) region as represented by SEQ ID NO: 61 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 65.
  • TPP-8988 is an anti-CD123 antibody preferably comprising a heavy chain variable region (VH) as represented by SEQ ID NO: 71 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 75.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • TPP-9476 is an anti-CD123 antibody preferably comprising a heavy chain variable region (VH) region as represented by SEQ ID NO: 81 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 85.
  • TPP-9574 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain variable region (VH) as represented by SEQ ID NO: 91 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 95.
  • TPP-9580 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain variable region (VH) region as represented by SEQ ID NO: 101 and a light chain variable region (VL) as represented by SEQ ID NO: 105.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • TPP-981 is an anti-EGFR antibody preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 10.
  • TPP-1015 is an anti-HER2 antibody comprising preferably a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 19 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 20.
  • TPP-6013 is an anti-CD123 antibody preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 29 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 30.
  • TPP-7006 is an anti-TWEAKR antibody preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 39 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 40.
  • TPP-7007 is an anti-TWEAKR antibody preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 49 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 50.
  • TPP-8382 is an anti-B7H3 antibody, preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 59 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 60.
  • TPP-8987 is an anti-CD123 antibody, preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 69 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 70.
  • TPP-8988 is preferably an anti-CD123 antibody a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 79 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 80.
  • TPP-9476 is an anti-CD123 antibody, preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 89 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 90.
  • TPP-9574 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 99 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 100.
  • TPP-9580 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain region as represented by SEQ ID NO: 109 and a light chain region as represented by SEQ ID NO: 10.
  • the present invention also includes all suitable isotopic variants of the compounds of the invention. Under an isotopic variant of a
  • Compound according to the invention is understood here to mean a compound in which at least one atom within the compound according to the invention is exchanged for another atom of the same atomic number, but with a different atomic mass than the atomic mass usually or predominantly occurring in nature.
  • isotopes incorporated in a compound of the invention are hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, chlorine, bromine and iodine, such as 2 H (deuterium), 3 H (tritium), 13 C, 14 C, 15 N, 17 O,
  • Variants of a compound of the invention such as those in which one or more radioactive isotopes are incorporated, may be useful
  • Lead compound such as an extension of the half-life in the body or a reduction of the required effective dose; such modifications of
  • compounds of the invention may also constitute a preferred embodiment of the present invention.
  • Isotopic variants of the compounds according to the invention can be prepared by the methods known to the person skilled in the art, for example by the methods described below and the instructions reproduced in the exemplary embodiments, by corresponding isotopic modifications of the respective reagents and / or
  • Salts used in the context of the present invention are physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention. Also included are salts which are themselves unsuitable for pharmaceutical applications but can be used, for example, for the isolation or purification of the compounds of the invention.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds of the invention include acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, e.g.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention also include salts of customary bases, such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and Ammonium salts derived from ammonia or organic amines having 1 to 16 carbon atoms, such as by way of example and preferably ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, A / methylpiperidine, A / Methylmorpholine, arginine, lysine and 1,2-ethylenediamine.
  • customary bases such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and
  • Solvates in the context of the invention are those forms of the compounds according to the invention which form a complex in the solid or liquid state by coordination with solvent molecules. Hydrates are a special form of solvates that coordinate with water. As solvates, hydrates are preferred in the context of the present invention.
  • the hyperproliferative diseases for the treatment of which the compounds according to the invention can be used include, in particular, the group of cancer and tumor diseases.
  • these include, but are not limited to, breast carcinomas and breast tumors (breast carcinomas including ductal and lobular forms, also in situ), respiratory tumors (small cell and non-small cell carcinoma, bronchial carcinomas), brain tumors (eg brain stem and hypothalamus, astrocytoma, ependymoma, glioblastoma, gliomas, medulloblastoma, meningiomas and neuro-ectodermal and pineal tumors), tumors of the digestive organs (esophageal, gastric, gallbladder, small intestine, colon, rectum, and Anal carcinoma), liver tumors (including hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma and mixed hepatocellular cholangiocarcinoma), tumors of the head and neck (lary
  • Osteosarcomas malignant fibrous histiocytomas, chondrosarcomas, fibrosarcomas,
  • Rhabdomyosarcomas tumors of the eyes (including intraocular melanoma and retinoblastoma), tumors of the endocrine and exocrine glands (e.g., thyroid and parathyroid glands, pancreatic and salivary gland carcinomas,
  • Adenocarcinomas tumors of the urinary tract (bladder, penis, kidney, renal pelvis and Ureteral tumors) and tumors of the reproductive organs (endometrial, cervical, ovarian, vaginal, vulvar and uterine carcinomas of the woman and prostate and
  • Testicular carcinomas of the man also include proliferative disorders of the blood, lymphatic system and spinal cord, in solid form and as circulating cells, such as leukemias, lymphomas and myeloproliferative disorders, e.g. acute myeloid, acute lymphoblastic, chronic lymphocytic, chronic myelogenous and hairy cell leukemia, as well as AI DS-correlated lymphomas, Hodgkin's lymphomas, non-Hodgkin's lymphomas, cutaneous T-cell lymphomas, Burkitt's lymphomas and lymphomas in the central nervous system.
  • leukemias e.g. acute myeloid, acute lymphoblastic, chronic lymphocytic, chronic myelogenous and hairy cell leukemia
  • AI DS-correlated lymphomas e.g. acute myeloid, acute lymphoblastic, chronic lymphocytic, chronic myelogenous and hairy cell leukemia
  • NHL cutaneous T-cell lymphomas
  • the CD123-directed binder or antibody-drug conjugates (ADCs) described herein may preferably be used to treat CD123-expressing disorders, such as CD123-expressing cancers.
  • CD123-expressing cancers such as CD123-expressing cancers.
  • cancer cells show measurable levels of CD123 as measured by protein (eg, by immunoassay) or RNA level.
  • Some of these cancerous tissues show an elevated level of CD123 compared to non-cancerous tissue of the same type, preferably measured on the same patient.
  • the level of CD123 is measured before initiating cancer treatment with an antibody-drug conjugate (ADC) of the invention (patient stratification).
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the CD123 directed binder drug conjugates may preferably be used to treat CD123-expressing disorders, such as CD123-expressing cancers, such as tumors of the hematopoietic and lymphoid tissues, or hematopoietic and lymphatic malignant tumors.
  • CD123-expressing cancers such as tumors of the hematopoietic and lymphoid tissues, or hematopoietic and lymphatic malignant tumors.
  • cancers associated with CD123 expression include myeloid diseases such as acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic syndrome (MDS).
  • AML acute myeloid leukemia
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • B-cell acute lymphoblastic leukemia B-ALL
  • hairy cell leukemia BPDCN
  • BPDCN blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm
  • Hodgkin's lymphoma Immature T-ALL
  • Burkitt's lymphoma follicular lymphoma
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • MCL mantle cell lymphoma
  • ADC inventive antibody-drug conjugate
  • treatment or "treating” is used within the scope of this invention.
  • Another object of the present invention is thus the use of the compounds of the invention for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • Another object of the present invention is the use of the compounds of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • Another object of the present invention is the use of
  • Another object of the present invention is a method for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases, using an effective amount of at least one of the compounds of the invention.
  • the compounds of the invention may be used alone or as needed in combination with one or more other pharmacologically active substances, as long as this combination is not too undesirable and unacceptable
  • Another object of the present invention are therefore pharmaceutical compositions containing at least one of the compounds of the invention and one or more further active ingredients, in particular for the treatment and / or
  • the compounds of the present invention may be treated with known anti-hyperproliferative, cytostatic, cytotoxic or immunotherapeutic agents Combining substances for the treatment of cancer.
  • suitable combination active ingredients are:
  • Methylaminolevulinate methylprednisolone, methyltestosterone, metirosine, mifamurtide, miltefosine, miriplatin, mitobronitol, mitoguazone, mitolactol, mitomycin, mitotan,
  • Nimorazole nimotuzumab, nimustine, nintedanib, nitracrin, nivolumab, obinutuzumab, octreotide, ofatumumab, olaparib, olaratumab, omacetaxin mepesuccinate, omeprazole, ondansetron, orgotein, orilotimod, osimertinib, oxaliplatin, oxycodone, oxymetholone, ozogamicin, p53 gene therapy, paclitaxel, Palbociclib, palifermin, palladium-103 seed, palonosetron, pamidronate, panitumumab, panobinostat, pantoprazole, pazopanib, pegaspargase, pembrolizumab, peg-interferon-alfa-2b, pembrolizumab, pemetrexed, pentostatin
  • Temsirolimus Teniposide, Testosterone, Tetrofosmin, Thalidomide, Thiotepa, Thymalfasin, Thyrotropin alfa, Tioguanine, Tocilizumab, Topotecan, Toremifene, Tositumomab,
  • the compounds of the present invention can be combined, for example, with binders (eg, antibodies) that can exemplarily bind to the following targets: OX-40, CD137 / 4-1 BB, DR3, ID01 / ID02, LAG-3, CD40.
  • binders eg, antibodies
  • OX-40 CD137 / 4-1 BB
  • DR3, ID01 / ID02 LAG-3
  • CD40 CD40
  • a non-cell-permeable toxoid metabolite of a binder-drug conjugate (ADC) should have no deleterious effect on the cells of the adaptive immune system
  • the combination of a binder-drug conjugate (ADC) of the invention with a cancer immunotherapy for use in the treatment of Cancer or tumors is another object of this invention.
  • cytotoxic binder drug conjugates The intrinsic mechanism of action of cytotoxic binder drug conjugates involves the direct initiation of cell death of the tumor cells and thus the release of tumor antigens that can stimulate an immune response.
  • KSP inhibitor toxophore class induces markers of so-called immunogenic cell death (ICD) in vitro.
  • ICD immunogenic cell death
  • the combination of the binder-drug conjugates (ADCs) of the present invention with one or more therapeutic approaches to cancer immunotherapy or with one or more drugs, preferably antibodies, directed against a molecular target from cancer immunotherapy is a preferred method Treatment of cancer or tumors there.
  • therapeutic approaches to cancer immunotherapy include immunomodulatory monoclonal
  • Antibodies include CTLA-4, PD-1 / PDL-1, OX-40, CD137, DR3, ID01, ID02, TD02, LAG-3, TIM-3 CD40.JCOS / ICOSLJIGIT; GITR / GITRL, VISTA, CD70, CD27,
  • HVEM / BTLA CEACAM1, CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3, TLR's.
  • Combination of a binder-drug conjugate (ADC) according to the invention with a cancer immunotherapy could therefore on the one hand make tumors with weakly immunogenic properties more immunogenic and increase the efficacy of a cancer immunotherapy and also develop a long-lasting therapeutic effect.
  • ADC binder-drug conjugate
  • the compounds according to the invention can also be used in combination with radiotherapy and / or surgical intervention.
  • the combination of compounds of the present invention with other cytostatic, cytotoxic or immunotherapeutically active agents may have the following aims:
  • the compounds according to the invention can also be used in combination with radiotherapy and / or surgical intervention.
  • compositions containing at least one compound of the invention usually together with one or more inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients, and their use for the purposes mentioned above.
  • the compounds according to the invention can act systemically and / or locally. For this purpose, they can be applied in a suitable manner, such as, for example, parenterally, possibly by inhalation or as an implant or stent.
  • the compounds according to the invention can be administered in suitable administration forms.
  • Parenteral administration can be done bypassing a resorption step (eg intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinally or intralumbarly) or with involvement of resorption (eg intramuscular, subcutaneous, intracutaneous, percutaneous or intraperitoneal).
  • a resorption step eg intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinally or intralumbarly
  • involvement of resorption eg intramuscular, subcutaneous, intracutaneous, percutaneous or intraperitoneal.
  • parenteral administration are suitable as application forms, inter alia, injection and infusion preparations in the form of solutions, suspensions,
  • Emulsions or lyophilisates Preference is given to parenteral administration, in particular intravenous administration. In general, it has proven to be advantageous to administer amounts of about 0.1 to 20 mg / kg, preferably about 0.3 to 7 mg / kg of body weight to achieve effective results when administered parenterally.
  • Xi, X 2 , X 3 , n and AK 2 have the meanings given in the formula (I).
  • Xi, X 2 , X 3 , n and AKi have the meanings given in the formula (I).
  • Xi, X2, X3, n and AK1 have the meanings given in the formula (I).
  • H 2 10% Pd-C, methanol 1.5 h, RT;
  • ABCB1 ATP-binding cassette subfamily B member 1 (synonym for P-gp and MDR1)
  • LLC-PK1 cells Lewis lung carcinoma pork kidney cell line
  • Non small cell lung cancer Non-small cell
  • P-gp P-glycoprotein a transporter protein
  • Method 1 Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Column: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 ⁇ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 l of water + 0.25 mL of 99% formic acid, eluent B: 1 L of acetonitrile + 0.25 mL of 99% formic acid; Gradient: 0.0 min 90% A -> ⁇ 1 .2 min 5% A - 2.0 min 5% A Furnace: 50 ° C; Flow: 0.40 mL / min; UV detection: 208-400 nm.
  • Method 2 (LC-MS):
  • Device Type MS Waters Synapt G2S
  • Device type UPLC Waters Acquity l-CLASS
  • Column Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1 .7 m
  • Eluent A 1 l of water + 0.01%
  • Method 3 Instrument MS: Waters (Micromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1 100 series; Column: Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-micron; Eluent A: 1 l of water + 0.01 mol of ammonium carbonate, eluent B: 1 l of acetonitrile; Gradient: 0.0 min 98% A -> ⁇ 0.2min 98% A - 3.0 min 5% A ⁇ 4.5 min 5% A; Oven: 40 ° C; Flow: 1 .75 mL / min; UV detection: 210 nm Method 4 (LC-MS):
  • Device Type MS Waters Synapt G2S
  • Device type UPLC Waters Acquity l-CLASS
  • Eluent A 1 liter of water + 0.01% of formic acid
  • Eluent B 1 L acetonitrile + 0.01% formic acid
  • Oven 50 ° C
  • Flow 1.20 mL / min
  • UV detection 210 nm
  • Device Type MS Waters Synapt G2S
  • Device type UPLC Waters Acquity l-CLASS
  • Eluent A 1 liter of water + 0.01% of formic acid
  • Eluent B 1 L acetonitrile + 0.01% formic acid
  • Oven 50 ° C
  • Flow 1 .20 ml / min
  • UV detection 210 nm.
  • Method 9 (LC-MS-Prep Cleaning Method) Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (column Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 ⁇ , eluent A: water + 0.05% ammonia, eluent B: acetonitrile (ULC) with gradient, flow: 40 ml / min, UV detection: DAD, 210-400 nm). respectively.
  • Instrument MS Waters
  • Instrument HPLC Waters (column Phenomenex Luna 5 ⁇ C18 (2) 100A, AXIA Tech 50 x 21 .2 mm, eluent A: water + 0.05% formic acid, eluent B: acetonitrile (ULC) with gradient; : 40 ml / min; UV detection: DAD: 210-400 nm).
  • Device type MS Thermo Scientific FT-MS; Device type UHPLC +: Thermo Scientific UltiMate 3000; Column: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1 .8 ⁇ ; Eluent A: 1 liter of water + 0.01% of formic acid; Eluent B: 1 L acetonitrile + 0.01% formic acid; Gradient: 0.0 min 10% B -> 2.5 min 95% B 3.5 min 95% B; Oven: 50 ° C; Flow: 0.90 ml / min; UV detection: 210 nm / Optimum Integration Path 210-300 nm.
  • Device type MS ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL
  • Device type HPLC Agilent 1200SL
  • Column Agilent, POROSHELL 120, 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 ⁇
  • Eluent A 1 L of water + 0.1% trifluoroacetic acid
  • Eluent B 1 L acetonitrile + 0.1% trifluoroacetic acid
  • Oven 40 ° C
  • Flow 0.75 ml / min
  • UV detection 210 nm
  • Reaction mixture was partitioned between water and ethyl acetate and the aqueous phase extracted with ethyl acetate. The combined organic phases were dried over magnesium sulfate and the solvent evaporated in vacuo. The reaction was repeated with 90.0 g of methyl 4-bromo-1H-pyrrole-2-carboxylate.
  • the organic phase was extracted with water and then washed with sat. NaCl solution washed.
  • the organic phase was dried over magnesium sulfate and the solvent evaporated in vacuo.
  • the residue was purified by means of silica gel (mobile phase: cyclohexane / ethyl acetate 100: 3).
  • intermediate C52 was reductively alkylated with benzyl- (2S) -2 - ⁇ [(benzyloxy) carbonyl] amino ⁇ -4-oxobutanoate in analogy to intermediate C2. Subsequently, the secondary amino group was acylated with 2-chloro-2-oxoethyl acetate and finally with 2M
  • the title compound was prepared by coupling dibenzyl-D-glutamate, previously liberated from its p-toluenesulfonic acid salt by partition between ethyl acetate and 5% sodium bicarbonate solution, with intermediate C61 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine, followed by cleavage Teoc protecting group prepared by zinc chloride in trifluoroethanol.
  • the dipeptide derivative di-tert-butyl-beta-alanyl-D-glutamate was prepared by classical methods of peptide chemistry by coupling commercially available N- [(benzyloxy) carbonyl] -beta-alanine and di-tert-butyl D-glutamate hydrochloride ( 1: 1) in the presence of HATU and subsequent hydrogenolytic cleavage of the Z-protecting group.
  • the reaction mixture was treated with zinc chloride (426 mg, 3.13 mmol) and stirred at 50 ° C for 40 min.
  • the mixture was admixed with ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid (914 mg, 3.13 mmol), diluted with 20 ml of water, treated with TFA (200 ⁇ ) and stirred briefly.
  • the batch was filtered and prep.
  • RP-HPLC columnumn: Chromatorex C18-5, 125x40, flow: 100 mL / min, MeCN / water, 0.1% TFA gradient). After lyophilization, the title compound was obtained.
  • This intermediate was prepared starting from N - [(benzyloxy) carbonyl] -L-valine and tert-butyl-L-alaninate hydrochloride using classical methods of peptide chemistry.
  • the title compound was prepared by classical methods of peptide chemistry beginning with the coupling of 4-pyridineacetic acid with commercially available tert-butyl-L-alanyl-L-alaninate in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine, followed by deprotection with trifluoroacetic acid, coupling with tert Butyl L-asparaginate and subsequent deprotection of the carboxy group with trifluoroacetic acid.
  • the title compound was prepared starting from commercially available 4-tert-butyl-L-asparaginate according to classical methods of peptide chemistry by coupling with N- [(benzyloxy) carbonyl] -L-alanyl-N-methyl-L-alanine (intermediate L1 16) in the presence by HATU, and finally by cleavage of the tert-butyl ester protecting group with TFA.
  • the title compound was prepared from commercially available tert-butyl-L-alaninate hydrochloride salt according to classical methods of peptide chemistry by coupling with N - [(benzyloxy) carbonyl] -L-alanyl-N-methyl-L-alanine (Intermediate L1 16) in the presence by HATU, and finally by cleavage of the tert-butyl ester protecting group with TFA.
  • the title compound was prepared from commercially available tert-butyl-L-leucine hydrochloride salt according to classical methods of peptide chemistry by coupling with N - [(benzyloxy) carbonyl] -L-alanyl-N-methyl-L-alanine (intermediate L1 16) in the presence by HATU, and finally by cleavage of the tert-butyl ester protecting group with TFA.
  • the title compound was prepared starting from commercially available 4-benzyl-1-tert-butyl-L-aspartate hydrochloride (1: 1) by conventional methods of peptide chemistry, first by coupling with 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl-N - [(benzyloxy) carbonyl] -L-alaninate, then cleavage of the tert-butyl ester protecting group with TFA, then the following coupling with 4-tert-butyl-L-asparaginate in the presence of HATU and finally by renewed
  • the title compound was prepared by coupling 1-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecane-15-acid with bromoacetic anhydride in the presence of N, N-diisopropylethylamine.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D first by coupling with intermediate L1 17 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine.
  • all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on charcoal in DCM-methanol 1: 1 under hydrogen normal pressure at RT for 1 h, and then the deprotected intermediate was converted by reaction with 1 - ⁇ 2- [(2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl) oxy] -2-oxoethyl ⁇ -1H-pyrrole-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine to the title compound.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D first by coupling with intermediate L1 17 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine.
  • all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on activated charcoal in DCM-methanol 1: 1 under hydrogen normal pressure at RT for 1 h and then the deprotected intermediate by reaction with 1, 1 '- [(1, 5-dioxopentane-1, 5-diyl) bis (oxy)] dipyrrolidine-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine to the title compound.
  • the title compound was prepared starting from compound C1 17, first by coupling with N- (tert-butoxycarbonyl) -L-alanyl-L-alanine in the presence of HATU and N, N-diisopropylethylamine. Subsequently, the intermediate was taken up in trifluoroethanol and by stirring at 50 ° C in the presence of zinc chloride, the tert-butoxycarbonyl protected amine was released.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D first by coupling with intermediate L1 17 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine.
  • all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on charcoal in DCM-methanol 1: 1 under hydrogen normal pressure at RT for 1 h and then the deprotected intermediate was converted by reaction with 1- ⁇ 6- [(2 5-dioxopyrrolidin-1-yl) oxy] -6-oxohexyl ⁇ -1H-pyrrole-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine to the title compound.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D initially by coupling with intermediate L1 18 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine.
  • all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on activated charcoal in DCM-methanol 1: 1 under hydrogen normal pressure at RT for 1 h and then the deprotected intermediate by reaction with 1, 1 '- [(1, 5-dioxopentane-1, 5-diyl) bis (oxy)] dipyrrolidine-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine to the title compound.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D first by coupling with intermediate L95 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine.
  • all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on activated charcoal in DCM-methanol 1: 1 under hydrogen normal pressure at RT for 1 h and then the deprotected intermediate by reaction with 1, 1 '- [(1, 5-dioxopentane-1, 5-diyl) bis (oxy)] dipyrrolidine-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine to the title compound.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D first by coupling with intermediate L95 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine.
  • all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on activated carbon in DCM-methanol 1: 1 under hydrogen normal pressure at RT for 1 h and then the deprotected intermediate was converted by reaction with 1- ⁇ 2 - [(2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl) oxy] -2-oxoethyl ⁇ -1 H -pyrrole-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine to the title compound.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D initially by coupling with intermediate L121 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine.
  • all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on charcoal in ethanol under hydrogen normal pressure at RT for 1 h, and the deprotected intermediate was then removed by reaction with 1,1 '- [(1,5-dioxopentane-1 , 5-diyl) bis (oxy)] dipyrrolidine-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine in the title compound.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D first by coupling with intermediate L122 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine. In the next step, all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on charcoal in methanol under hydrogen normal pressure at RT for 1 h and then the deprotected intermediate was converted by reaction with 3 equiv. 1, 1 '- [(1,5-dioxopentane-1, 5-diyl) bis (oxy)] dipyrrolidine-2,5-dione in the presence of 3 equiv. N, N-diisopropylethylamine converted into the title compound.
  • the title compound was prepared from compound C1 10D first by coupling with intermediate L1 17 in the presence of HATU and ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine. In the next step, all protecting groups were removed by hydrogenation over 10% palladium on charcoal in DCM-methanol 1: 1 under hydrogen normal pressure at RT for 1 h and then the deprotected intermediate by reaction with bromoacetic anhydride in the presence of 3 equiv. ⁇ , ⁇ -Diisopropylethylamin converted into the title compound.
  • the protein sequence (amino acid sequence) of the antibodies used was converted to a DNA sequence encoding the corresponding protein according to methods known to those skilled in the art and inserted into a transient mammalian cell culture suitable expression vector (as described by Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems, Micheal Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007).
  • TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574, and TPP-9580 were in transient mammalian cell cultures as described by Tom et al., Chapter 12 in Methods Express:
  • the antibodies for example, TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574, and TPP-9580, were obtained from the cell culture supernatants.
  • the cell supernatants were clarified by centrifugation of cells. Subsequently, the cell supernatant was purified by affinity chromatography on a MabSelect Sure (GE Healthcare) chromatography column.
  • the column was equillibrated in DPBS pH 7.4 (Sigma / Aldrich), the cell supernatant was applied and the column was washed with about 10 column volumes of DPBS pH 7.4 + 500 mM sodium chloride.
  • the antibodies were eluted in 50 mM sodium acetate pH 3.5 + 500 mM sodium chloride and then further purified by gel filtration chromatography on a Superdex 200 column (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4.
  • TPP-9476 Anti-CD123 AK
  • TPP-8382 Anti-B7H3 AK
  • TPP-1015 Anti-Her2 AK
  • TPP-9574 Anti-CXCR5 AK
  • TPP-9580 Anti-CXCR5 AK
  • the coupling reactions were usually carried out under argon.
  • Embodiments determined in each case protein concentration. Furthermore, the loading of the antibody (drug / mAb ratio) to that under B-6.
  • the ADCs shown in the examples may vary depending on the linker
  • # 1 represents the sulfur bridge to the antibody and # 2 the site of attachment to the modified KSP inhibitor
  • Such ADCs in which the linker is linked to the antibodies via hydrolyzed open-chain succinic acid amides, may optionally also be specifically used as described herein As an example, small scale and large scale couplings are produced:
  • the eluate was diluted with PBS buffer pH 8 to a concentration of 1 -5 mg / mL and then passed over a equillibrator with PBS buffer pH8 PD 10 column (Sephadex ® G-25, GE Healthcare) and eluted with PBS buffer pH 8 eluted.
  • the eluate was stirred overnight at RT under argon. Subsequently, the solution was through
  • AKi may have the meaning here
  • TPP-6013 (anti-CD123 AK) (partially reduced) - S 1 TPP-8987 (anti-CD123 AK) (partially reduced) - S 1 TPP-8988 (anti-CD123 AK) (partially reduced) - S ⁇ 1 TPP-9476 (Anti-CD123 AK) (partially reduced) - S ⁇ 1
  • TPP-7006 (anti-TWEAKR AK) (partially reduced) - S ⁇ 1
  • TPP-7007 anti-TWEAKR AK (partially reduced) - S ⁇ 1
  • Alkylene radical means, and
  • S represents the sulfur atom of a cysteine residue of the partially reduced antibody.
  • the coupling reactions were usually carried out under argon.
  • AK2 has the meaning of Examples a: TPP-981 cetuximab (Anti EGFR AK) - NH 2
  • TPP-9476 Anti-CD123 AK
  • TPP-1015 Anti-Her2 AK
  • TPP-7007 (Anti-TWEAKR AK) - NH ⁇ 2
  • TPP-9574 (Anti-CXCR5 AK) - NH ⁇ 2
  • ⁇ 2 means the linkage with the carbonyl group
  • NH is the side chain amino group of a lysine residue of the antibody.
  • the reaction mixture was concentrated for example by ultrafiltration and then desalted and purified by chromatography, for example by means of a Sephadex® G-25.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the solution was sterile filtered and frozen.
  • the conjugate can be lyophilized.
  • the determination of the toxophore loading of cysteine-linked conjugates was determined by reversed-phase chromatography of the reduced and denatured ADCs. Guanidinium hydrochloride (GuHCl) (28.6 mg) and a solution of DL-dithiothreitol (DTT) (500 mM, 3 ⁇ ) were added to the ADC solution (1 mg / mL, 50 ⁇ ). The mixture was incubated for one hour at 55 ° C and analyzed by HPLC.
  • GuHCl Guanidinium hydrochloride
  • DTT DL-dithiothreitol
  • HPLC analysis was performed on an Agilent 1260 HPLC system with detection at 220 nm.
  • a Polymer Laboratories PLRP-S Polymerized Reversed Phase column (catalog number PL1912-3802) (2.1 x 150 mm, 8 ⁇ m particle size, 1000 ⁇ ) was used at a flow rate of 1 mL / min with the following gradient: 0 min, 25% B ; 3 min, 25 % B; 28 min, 50% B.
  • Eluent A consisted of 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) in water, eluent B from 0.05% trifluoroacetic acid in acetonitrile.
  • the detected peaks were assigned by retention time comparison with the light chain (L0) and the heavy chain (HO) of the unconjugated antibody. Peaks detected only in the conjugated sample were assigned to the light chain with a toxophore (L1) and the heavy chains with one, two and three toxophores (H1, H2, H3).
  • the average loading of the antibody with toxophors was determined from the integration-determined peak areas as twice the sum of the HC loading and the LC load, wherein the LC load from the sum of the Calculated toxophore number of weighted integration results of all LC peaks divided by the sum of the singly weighted integration results of all LC peaks, and where the HC loading is the sum of the number of toxophore weighted integration results of all HC peaks divided by the sum of the single weighted ones Calculated integration results of all HC peaks. In isolated cases it was possible that the toxophore loading was not exactly possible due to co-elution of some peaks.
  • Guanidinium hydrochloride 28.6 mg
  • DTT DL-dithiothreitol
  • DAR drug-to-antibody ratio
  • TIC Total Ion Chromatogram
  • the molecular weight of the different light and heavy chain conjugate species was calculated on the basis of Max Dec deconvolution.
  • the average loading of the antibody with toxophore was determined from integration-determined peak areas as twice the sum of the HC loading and the LC loading.
  • the LC load was calculated from the sum of the number of toxophore weighted integration results of all LC peaks divided by the sum of the weighted integration results of all LC peaks and the HC load weighted by the sum of the number of toxophores
  • the molecular weight area ratio of closed and open cysteine adduct (molecular weight delta 18 Dalton) of all singly conjugated light and heavy chain variants was determined to determine the proportion of open cysteine adduct. The mean over all variants gave the proportion of opened cysteine adduct.
  • the binding ability of the binder to the target molecule was checked after coupling.
  • various methods are known, for example, the affinity of the conjugate using ELISA technology or
  • the ADCs exemplified below may release the preferred metabolite M1, which has preferred phramacological properties.
  • the coupling reactions were carried out under argon. All larger batches for in vivo experiments were sterile filtered at the end of the preparation.
  • the eluate was diluted with PBS buffer pH 8 to a volume of 7.5 mL and stirred overnight at RT under argon. This solution was then passed over a equillibriert with PBS buffer pH7.2 PD 10 column (Sephadex ® G-25, GE Healthcare) and eluted with PBS buffer pH7.2. It was then concentrated by ultracentrifugation, rediluted with PBS buffer (pH 7.2) and reconcentrated and filtered sterile.

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) mit verbesserten Eigenschaften, aktive Metabolite dieser ADCs sowie deren Verfahren zur Herstellung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Konjugate zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser Konjugate zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen.

Description

Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) mit enzymatisch spaltbaren Gruppen
Einleitung und Stand der Technik Die Erfindung betrifft neuartige Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) mit verbesserten Eigenschaften, aktive Metabolite dieser ADCs sowie deren Verfahren zur Herstellung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Konjugate zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser Konjugate zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie
beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen
Maßnahmen erfolgen. Der Binder ist erfindungsgemäß vorzugsweise ein Antikörper.
Krebserkrankungen sind die Folge unkontrollierten Zellwachstums verschiedenster Gewebe. In vielen Fällen dringen die neuen Zellen in bestehende Gewebe ein (invasives Wachstum), oder sie metastasieren in entfernte Organe. Krebserkrankungen treten in verschiedensten Organen auf und haben oft gewebespezifische Krankheitsverläufe.
Daher beschreibt die Bezeichnung Krebserkrankung als Oberbegriff eine große Gruppe definierter Erkrankungen verschiedener Organe, Gewebe und Zelltypen. Tumore früher Stadien lassen sich gegebenenfalls durch chirurgische und
radiotherapeutische Maßnahmen entfernen. Metastasierte Tumore können im Regelfall durch Chemotherapeutika nur palliativ therapiert werden. Ziel hierbei ist, die optimale Kombination aus einer Verbesserung der Lebensqualität und der Verlängerung der Lebenszeit zu erreichen. Konjugate von Binderproteinen mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen sind bekannt, insbesondere in Form sogenannter„antibody drug conjugates" (ADCs), in welchen ein internalisierender, gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichteter Antikörper auf kovalente Weise über eine Verknüpfungseinheit ("linker") mit einem cytotoxisch wirkenden Agens verbunden ist. Nach Einschleusung des ADCs in die Tumorzelle und anschließender Spaltung des Konjugats wird dann innerhalb der Tumorzelle entweder das cytotoxische Agens selbst oder ein anderer daraus gebildeter cytotoxisch wirksamer Metabolit freigesetzt, und kann dort seine Wirkung direkt und selektiv entfalten. Auf diesem Wege könnte die Schädigung von normalem Gewebe im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie der Krebserkrankung in signifikant engeren Grenzen gehalten werden [siehe z.B. J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu und P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1 137-1 146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5- 13 (2010)]. So beschreibt WO2012/171020 ADCs, bei denen mehrere Toxophormoleküle über einen polymeren Linker an einen Antikörper geknüpft ist. Als mögliche Toxophore werden in WO2012/171020 unter anderem die Substanzen SB 743921 , SB 715992 (Ispinesib), MK-0371 , AZD8477, AZ3146 und ARRY-520 erwähnt. Die zuletzt genannten Substanzen sind sogenannte Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren. Kinesin Spindel Protein (KSP, auch bekannt als Eg5, HsEg5, KNSL1 oder KIF1 1 ) ist ein Kinesin-ähnliches Motorprotein, welches für die Funktion der bipolaren mitotischen Spindel essentiell ist. Die Inhibierung von KSP führt zum mitotischen Stillstand und über einen längeren Zeitraum zur Apoptose (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8(1 ), 39-59). Nach dem Auffinden des ersten zellgängigen KSP-lnhibitors, Monastrol, haben sich KSP- Inhibitoren als eine Klasse neuer Chemotherapeutika etabliert (Mayer et al., Science 286: 971 -974, 1999) und sind Gegenstand einer Reihe von Patentanmeldungen (z.B.
WO2006/044825; WO2006/002236; WO2005/051922; WO2006/060737; WO03/060064; WO03/040979; und WO03/049527). Da KSP jedoch nur in einem kurzen Zeitraum der Mitosephase aktiv ist, müssen KSP-lnhibitoren in ausreichend hoher Konzentration während dieser Phase vorliegen. WO2014/151030 offenbart ADCs mit bestimmten KSP- lnhibitoren. Die Patentanmeldungen WO2015/096982 und WO2016/096610 offenbaren bereits ADCs mit KSP-lnhibitoren, die auch enzymatisch spaltbare Linker enthalten, die aber kein optimales Wirkungsprofil aufweisen. Legumain ist eine Tumor-assoziierte Asparaginyl-Endopeptidase (S. Ishii, Methods
Enzymol. 1994, 244, 604; J. M. Chen et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) und wurde zur Prozessierung von Prodrugs von kleinen cytotoxischen Molekülen wie zum Beispiel unter anderem von Doxorubicin und Etoposid Derivaten genutzt (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L. Stern et al. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri et al.
ChemMedChem 201 1 , 6, 54).
Andere lysosomale Enzyme sind beispielsweise Cathepsin oder Glycosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen, die auch zur Freisetzung der aktiven Wirkstoffe durch enzymatische Spaltung von Prodrugs genutzt wurden. Enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere 2-8-Oligopeptidgruppen oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341 -3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Valin-Alanin, Valin-Lysin, Valin-Citrullin, Alanin-Lysin und Phenylalanin-Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgruppe).
Zusammenfassung der Erfindung
Im Stand der Technik sind verschiedene Antikörper-Wirkstoff-Konjugate mit enzymatisch spaltbaren Linkern beschrieben, die aber kein optimales Wirkprofil, z. B. bezüglich ihrer breiten Wirksamkeit auf verschiedenen Zellen zeigen. Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung wirksamere Verbindungen bereitzustellen, die nach
Verabreichung in relativ geringer Konzentration eine lang-anhaltende apoptotische Wirkung zeigen und damit für die Krebstherapie nützlich sind. Hierbei spielt zum einen das Profil der aus den ADCs intrazellulär freigesetzten Metaboliten eine entscheidende Rolle. Häufig sind die aus ADCs gebildeten Metabolite Substrate von Efflux-Pumpen und/oder weisen eine hohe Permeabilität durch Zellmembranen auf. Beide Phänomene können zu einer kurzen Verweildauer und so zu einer suboptimalen apoptotischen Wirkung in der Tumorzelle beitragen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) mit einer spezifischen Toxophor-Linker-Zusammensetzung, die in Verbindung mit Antikörpern ein besonders interessantes Wirkprofil in Bezug auf Wirkstärke und Wirkbreite aufweisen. Um die Tumorselektivität von ADCs und ihrer Metabolite weiter zu verbessern, wurden Binder-Konjugate mit Peptidlinkern versehen, die durch lysosomale Tumor- assoziierte Enzyme, wie beispielsweise Legumain oder Cathepsin, freigesetzt werden können. Die Tumorselektivität wird somit nicht nur durch die Wahl des Antikörpers, sondern zusätzlich durch die enzymatische Spaltung des Peptidderivates, z.B. durch Tumor-assoziierte Enzyme wie beispielsweise Legumain bestimmt. Die aus den erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugaten (ADCs) in den Tumorzellen
freigesetzten Metabolite zeichnen sich weiterhin durch ein besonders interessantes
Eigenschaftsprofil aus. Sie zeigen einen geringen Efflux aus der Tumorzelle und führen zu hohen Expositionen des Wirkstoffes in Tumoren. Somit wird eine hohe Wirkung in der Tumorzelle erzielt, wohingegen bedingt durch die schlechte Permeabilität nur eine geringe systemische cytotoxische Wirkung vorliegt, was eine geringere off-Target Toxizität mit sich bringt.
Die erfindungsgemäß verwendeten Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren besitzen eine für die Wirkung essentielle Aminogruppe. Durch Modifizierung dieser Aminogruppe mit Peptidderivaten wird die Wirkung gegenüber dem Kinesin-Spindelprotein blockiert und damit auch die Entfaltung einer cytotoxischen Wirkung inhibiert. Diese Peptidderivate können auch Bestandteile des Linkers zum Antikörper sein. Kann dieser Peptidrest bzw. der Peptidlinker jedoch durch Tumor-assoziierte Enzyme wie beispielweise Legumain oder Cathepsin vom Wirkstoff abgespalten werden, so lässt sich die Wirkung gezielt im Tumorgewebe wieder herstellen. Das besondere Eigenschaftsprofil der im Tumor gebildeten Metabolite wird durch eine weitere Modifizierung des Kinesin-Spindelprotein Inhibitors an einer anderen Position als der Aminogruppe im Molekül gewährleistet, die jedoch die hohe Potenz am Target nicht beeinträchtigt.
Weiterhin ermöglicht die Struktur der erfindungsgemäßen ADCs für bestimmte
Ausführungsformen eine hohe Beladung des Antikörpers (genannt DAR, drug-to-antibody ratio), die sich dabei überraschenderweise nicht negativ auf das physikochemische und pharmakokinetische Verhalten der ADCs auswirken.
urde nun überraschend gefunden, dass Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I)
er
x2 für N und
Xs für C steht;
oder
x2 für C und
Xs für N steht;
oder
X2 für C und X3 für N steht;
oder
X3 für C steht;
oder
X3 für C steht.
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)OH oder iso-Propyl
R3 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)2-8 -C(=0)-###, #-C(=0)- (CH2)3-C(=0)-###, #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)5-W, #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)-## oder
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2-CH2-0)i-8-(CH2)2-N H-C(=0)-CH2-## steht, für die Gruppe
n für eine Zahl von 1 bis 50 steht, AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
## für die Bindung an ein S-Atom einer Cystein-Seitenkette des Binders steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate, überlegene Eigenschaften gegenüber den bekannten Konjugaten aufweisen.
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der
X2 für C,
X3 für N steht;
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht, R2 für Methyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)OH oder iso-Propyl steht, R3 für Methyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht, M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-###, #-C(=0)- (CH2)3-C(=0)-###, #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)5-W, #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)-## oder
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2-CH2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-## steht,
W für die Gruppe
steht, für eine Zahl von 1 bis 50 steht, AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
## für die Bindung an ein S-Atom einer Cystein-Seitenkette des Binders steht, ### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Besonders bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Ganz besonders bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der R1 für Methyl steht, R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Insbesondere bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der
R1 für Methyl steht, R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht, AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Ausgewählt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der
R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK für einen anti-CD123 Antikörper, einen anti-CXCR5 Antikörper, einen anti-
B7H3 Antikörper, einen anti-TWEAKR Antikörper, einen anti-Her2
Antikörper oder einen anti-EGFR Antikörper oder für ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Antikörpers (AK) oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Insbesondere ausgewählt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK für einen anti-CD123 Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 und TPP-6013, für einen anti-CXCR5 Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP- 9574 und TPP- 9580, für einen anti-B7H3 Antikörper TPP-8382, für einen anti- TWEAKR Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-7006 und TPP-7007, für einen anti-Her2 Antikörper TPP-1015, oder für einen anti-EGFR Antikörper TPP- 981 oder für ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Antikörpers (AK) oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der oben genannten Formeln in der AK für einen Binder, der spezifisch an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet, steht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle internalisiert. Vorzugsweise ist der Binder ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment. In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das extrazelluläre Krebs-Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen EGFR, CD123, HER2, B7H3, TWEAKR und CXCR5, insbesondere bevorzugt sind CD123, CXCR5, und B7H3. In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist der Binder AK ein anti-CD123 Antikörper, ein anti-CXCR5 Antikörper, ein anti-B7H3 Antikörper, ein anti-TWEAKR Antikörper, ein anti-Her2 Antikörper oder ein anti-EGFR Antikörper, oder ein Antigen- bindendes Antikörperfragment von diesen, Insbesondere bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der genannten Formeln in der AK (AK1 , AK2) für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-8382 (anti B7H3), TPP-6013 (anti-CD123), TPP-8987 (anti-CD123), TPP-8988 (anti- CD123), TPP 9476 (anti-CD123), TPP-9574 (anti-CXCR5) und TPP 9580 (anti-CXCR5), oder ein für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen steht. Hierbei bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 und TPP-9476 Qeweils anti-CD123). Die genaue Struktur (Sequenz) dieser Antikörper ist der Tabelle: Proteinsequenzen der Antikörper dem dieser Tabelle folgenden Text und dem Sequenzlisting zu entnehmen.
Insbesondere bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der AK für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-8382 (anti-B7H3), TPP-6013 (anti-CD123), TPP-8987 (anti-CD123), TPP-8988 (anti-CD123), TPP 9476 (anti-CD123), TPP-9574 (anti-CXCR5) und TPP 9580 (anti-CXCR5) steht. Hierbei bevorzugt sind die Antikörper (AK) TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 und TPP-9476 (jeweils anti-CD123).
Beschreibung der Figuren
Annotierte Sequenzen von bevorzugten Antikörpern für Binder-Wirkstoff- Konjugate. Gezeigt sind die Proteinsequenzen der schweren und leichten Ketten der IgGs, sowie die VH und VL Regionen dieser Antikörper.
Unterhalb der Sequenzen werden wichtige Regionen annotiert (VH und VL Regionen in IgGs, und die CDR Regionen (H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L- CDR1 , L-CDR2, L-CDR3)).
Fig. 2: Sequenzlisting von Sequenzen der bevorzugten Antikörper für Binder-
Wirkstoff- Konjugate und von Sequenzen der Zielproteine.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Konjugate eines Binders oder Derivats hiervon mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen bereit, wobei das Wirkstoffmolekül ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-lnhibitor) ist.
Im Folgenden werden erfindungsgemäß verwendbare Binder, erfindungsgemäß verwendbare KSP-lnhibitoren hiervon sowie erfindungsgemäß verwendbare Linker beschrieben, die ohne Einschränkung in Kombination verwendet werden können.
Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Binder in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten KSP-lnhibitoren, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Linkern verwendet werden.
Besonders bevorzugte KSP-lnhibitor-Koniuqate (Binder-Wirkstoff-Koniuqate)
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden KSP-lnhibitor-Konjugate, wobei AK (AKi, AK2) für Binder bzw. ein Derivat hiervon (vorzugsweise für einen
Antikörper), und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 8, besonders bevorzugt 4 bis 8 steht. AKi steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen Cysteinrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist; AK2; steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen Lysinrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist. Als Binder oder Antikörper werden hierbei vorzugswiese die in der Beschreibung als bevorzugt beschriebenen Binder bzw. Antikörper verwendet.
Besonders bevorzugt sind dabei die folgenden Binder-Wirkstoff-Konjugate: 

18
19
20
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der genannten Formeln in der AK (AK1 , AK2) für einen Binder, der spezifisch an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet, steht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle
internalisiert.
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das extrazelluläre Krebs-Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR und CXCR5, insbesondere CD123, CXCR5, und B7H3.
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist der Binder AK (AKi, AK2) ein anti- CD123 Antikörper, ein anti-CXCR5 Antikörper, ein anti-B7H3 Antikörper, ein anti- TWEAKR Antikörper, ein anti-Her2 Antikörper oder ein anti-EGFR Antikörper, oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen, Insbesondere bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der genannten Formeln in der AK (AK1 , AK2) für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-8382 (anti B7H3), TPP-6013 (anti-CD123), TPP-8987 (anti-CD123), TPP-8988 (anti- CD123), TPP-9476 (anti-CD123), TPP-9574 (anti-CXCR5) und TPP-9580 (anti-CXCR5), oder ein für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen steht. Hierbei bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 und TPP-9476 Qeweils anti-CD123). Die genaue Struktur (Sequenz) dieser Antikörper ist der Tabelle: Proteinsequenzen der Antikörper, dem dieser Tabelle folgenden Text und dem Sequenzlisting zu entnehmen. KSP-lnhibitor - Linker-Intermediate und Herstellung der Koniuqate
Die erfindungsgemäßen Konjugate werden hergestellt, in dem zunächst der
niedermolekulare KSP-lnhibitor hiervon mit einem Linker versehen wird. Das so erhaltene Intermediat wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antikörper) umgesetzt.
Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Intermediat und die anschließende Kupplung mit dem Antikörper kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:

In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, R1, R2, R3 und AK2 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen und R4 steht hier für Methyl und n ist 0 oder 1.
Die Synthese des Bausteins A wurde in WO2015/096982 beschrieben. Die Peptidderivate B und C wurden nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Die
Intermediate C und D wurden mittels HATU in DMF in Gegenwart von N, N-
Diisopropylethylamin bei RT gekuppelt. Anschließend wurden hydrogenolytisch über 10% Palladium auf Aktivkohle sowohl die Benzyloxycarbonylschutzgruppe als auch die
Benzylester abgespalten. Das vollständig entschützte Intermediat wurde dann mit 1 ,1 '- [(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in DMF in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin bei RT zum ADC-Precursor Molekül E umgesetzt. Dieser Aktivester wurde dann wie in Kapitel B-5 beschrieben mit den entsprechenden Antikörpern gekuppelt.
Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Intermediat und die anschließende Kupplung mit dem Antikörper kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:
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In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, R1, R2, R3 und AK1 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen und R4 steht hier für Methyl und n ist 1.
In analoger Verfahrensweise können auch solche Verbindungen hergestellt werden, bei denen n für 0 steht. Die Synthese des Bausteins A wurde in WO2015/096982 beschrieben. Die Peptidderivate B und C wurden nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Die
Intermediate C und D wurden mittels HATU in DMF in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin bei RT gekuppelt. Anschließend wurden hydrogenolytisch über 10% Palladium auf Aktivkohle sowohl die Benzyloxycarbonylschutzgruppe als auch die
Benzylester abgespalten. Das vollständig entschützte Intermediat wurde dann mit 1 -{6- [(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-6-oxohexyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin bei RT zum ADC-Precursor Molekül E umgesetzt. Dieses Maleinimid-Derivat wurde dann wie in Kapitel B-4 beschrieben mit den entsprechenden Antikörpern gekuppelt.
In Abhängigkeit vom Linker können Succinimid-verknüpfte ADCs nach der Konjugation die offenkettigen Bernsteinsäureamide überführt werden, die ein vorteilhaftes
Stabilitätsprofil aufweisen.
Diese Umsetzung (Ringöffnung) kann bei pH 7.5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8, bei einer Temperatur von 25 0 C bis 37 °C erfolgen, z.B. durch Rühren. Die bevorzugte Rührzeit beträgt 8 bis 30 Stunden.
Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Intermediat und die anschließende Kupplung mit dem Antikörper mit anschließender Ringöffnung des Succinimidrings kann die
Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:
In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, R1 , R2, R3 und AK1 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen und R4 steht hier für Methyl und n ist 0 oder 1. Die Synthese des Bausteins A wurde in WO2015/096982 beschrieben. Die Peptidderivate B und C wurden nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Die
Intermediate C und D wurden mittels HATU in DMF in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin bei RT gekuppelt. Anschließend wurden hyrogenolytisch über 10% Palladium auf Aktivkohle sowohl die Benzyloxycarbonylschutzgruppe als auch die
Benzylester abgespalten. Das vollständig entschützte Intermediat wurde dann mit 1 -{2- [(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin bei RT zum ADC-Precursor Molekül E umgesetzt. Dieses
Maleinimid-Derivat wurde dann wie in Kapitel B-4 unter Small Scale Kupplung oder unter Medium Scale Kupplung beschrieben mit den entsprechenden Antikörpern gekuppelt.
Binder
Der Begriff„Binder" wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches an ein Zielmolekül, das auf einer bestimmten, mit dem Binder-Wirkstoffkonjugat zu
adressierenden Zielzellen-Population vorhanden ist, bindet. Der Begriff Binder ist in seiner breitesten Auslegung zu verstehen und umfasst z.B. auch Lektine, Proteine die bestimmte Zuckerketten binden können, oder Phospholipid-bindende Proteine. Solche Binder umfassen beispielsweise hochmolekulare Proteine (Bindeproteine), Polypeptide oder Peptide (Bindepeptide), nicht-peptidische (z.B. Aptamere (US5,270, 163) Übersichtsartikel von Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550), oder Vitamine) und alle anderen zellbindenden Moleküle oder Substanzen. Bindeproteine sind z.B. Antikörper und Antikörperfragmente oder Antikörpermimetika wie z.B. Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, Nanobodies (Übersichtsartikel von Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617). Bindepeptide sind z.B. Liganden eines Liganden-Rezeptorspaares, wie z.B. VEGF des Liganden-Rezeptorpaares VEGF/KDR, wie Transferrin des Liganden- Rezeptorpaares Transferrin/Transferrin-Rezeptor oder Cytokine/Cytokin-Rezeptor, wie TNFalpha des Liganden-Rezeptorpaares TNFalpha/TNFalpha Rezeptor. Der Binder kann ein Bindeprotein sein. Bevorzugte Ausführungsformen der Binder sind ein Antikörper, ein antigen-bindendes Antikörperfragment, ein multispezifischer Antikörper oder ein Antikörpermimetikum. Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder und insbesondere Antikörper bekannt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der Toxophore an den Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das Toxophor an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.
Ein„Zielmolekül" wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches in der Zielzellenpopulation vorhanden ist, und kann ein Protein (z.B. ein Rezeptor eines
Wachstumsfaktors) oder ein nicht-peptidisches Molekül sein (z.B. ein Zucker oder Phospholipid). Bevorzugt ist es ein Rezeptor oder ein Antigen.
Der Begriff„extrazelluläres" Zielmolekül beschreibt ein an die Zelle gebundenes
Zielmolekül, welches sich auf der Außenseite einer Zelle befindet oder den Teil eines Zielmoleküls, welcher sich auf der Außenseite einer Zelle befindet, d.h. ein Binder kann an einer intakten Zelle an sein extrazelluläres Zielmolekül binden. Ein extrazelluläres Zielmolekül kann in der Zellmembran verankert sein oder Bestandteil der Zellmembran sein. Der Fachmann kennt Verfahren, um extrazelluläre Zielmoleküle zu identifizieren. Für Proteine kann dies über eine Bestimmung der Transmembrandomäne(n) und die
Orientierung des Proteins in der Membran geschehen. Diese Angaben sind in der Regel in Proteindatenbanken (z.B. SwissProt) hinterlegt.
Der Begriff„Krebs-Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein„selektives Krebs-Zielmolekül"). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Der Binder kann über eine Bindung mit dem Linker verknüpft werden. Die Verknüpfung des Binders kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Binders, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind Schwefel (in einer Ausführungsform via einer Sulfhydrylgruppe des Binders), Sauerstoff
(erfindungsgemäß mittels einer Carboxyl oder Hydroxylgruppe des Binders) und Stickstoff (in einer Ausführungsform via einer primären oder sekundären Amingruppe oder Amidgruppe des Binders). Diese Heteroatome können im natürlichen Binder vorhanden sein oder durch chemische oder molekularbiologische Methoden eingeführt werden. Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Binders mit dem Toxophor nur einen geringen Einfluss auf die Bindeaktivität des Binders zum Zielmolekül. In einer bevorzugten
Ausführungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluss auf die Bindeaktivität des Binders zum Zielmolekül.
Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische
Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche typischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CH1 , CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarity determining region", abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region", abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Aminoterminus zum
Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeigneten Spezies erhalten werden z.B.
Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Ausführungsform ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein.
Der Begriff„monoklonaler" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der
Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auftreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige antigene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfahren. Der Begriff„intakter" Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen- bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden, und kann auch aglykosyliert sein.
Der Begriff „modifizierter intakter" Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper
dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32).
Mit„Aminosäuremodifikation" oder„Mutation" ist hier eine Aminosäuresubstitution, - Insertion, und/oder eine -deletion in einer Polypeptidsequenz gemeint. Die bevorzugte Aminosäuremodifikation ist hier eine Substitution. Mit„Aminosäuresubstitution" oder „Substitution" ist hier ein Austausch einer Aminosäure an einer gegebenen Position in einer Proteinsequenz durch eine andere Aminosäure gemeint. Zum Beispiel beschreibt die Substitution Y50W eine Variante eines parentalen Polypeptids, in welcher das Tyrosin an Position 50 durch ein Tryptophan ausgetauscht ist. Eine„Variante" von einem
Polypeptid beschreibt ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz hat, die substanziell identisch zu einem Referenzpolypeptid ist, typischerweise einem nativen oder „parentalen" Polypeptid. Die Polypeptidvariante kann eine oder mehrere
Aminosäureaustauche, -deletionen, und/oder -Insertionen an bestimmten Positionen in der nativen Aminosäuresequenz aufweisen. Der Begriff„humaner" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein„synthetischer" humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als Ganzes von synthetischen Sequenzen in silico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner
Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine
Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden. Solche„humanen" und„synthetischen" Antikörper beinhalten auch agiykosylierte Varianten, die entweder durch Deglykosylierung durch PNGaseF oder durch Mutation von N297 (kabat Nummerierung) der schweren Kette zu einer beliebigen anderen Aminosäure hergestellt wurden. Der Begriff„humanisierter" oder„chimärer" Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen
Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nicht-humanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden
Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt.
Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In manchen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipient noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefügt wurden. Bei Chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusioniert. Solche„humanisierten" und„Chimären" Antikörper beinhalten auch aglykosylierte Varianten, die entweder durch Deglykosylierung durch PNGaseF oder durch Mutation von N297 (kabat Nummerierung) der schweren Kette zu einer beliebigen anderen Aminosäure hergestellt wurden.
Der Begriff Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Aminosäuren einer variablen Antikörperdomäne, die für die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR1 , CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Kabat und/oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Kabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDR1 ), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette / Domäne (VL) und 31 - 35 (CDR1 ), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 102 (CDR3) der variablen schweren Kette / Domäne (VH) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDR1 ), 50 - 52 (CDR2) und 91 -96 (CDR3) der variablen leichetn Kette (VL) und 26 - 32 (CDR1 ), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Kette (VH) Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Kabat und Chotia umfassen.
Abhängig von der Aminosäure-Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 und lgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [alpha/a], [delta/δ], [epsilon/ε], [gamma/γ] und [my/μ] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstruktur von Antikörpern sind bekannt.
Der Begriff„funktionales Fragment" oder„antigen-bindendes Antikörperfragment" eines Antikorpers/Immunoglobulins ist definiert als ein Fragment eines
Antikorpers/Immunoglobulins (z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen- Bindedomänen des Antikorpers/Immunoglobulins noch umfasst. Die„Antigen- Bindedomäne" eines Antikörpers umfasst typischerweise eine oder mehrere
Hypervariable Regionen eines Antikörpers, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework" oder die„Gerüst" Region eines Antikörpers zur Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen-Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 1 1 1 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 1 - 109 der VL und 1 bis 1 13 der VH (Nummerierung nach WO97/08320). „Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente" der Erfindung umfassen nicht abschließend Fab, Fab', F(ab')2 und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), lineare Antikörper, Einzelketten Antikörper (single-chain Fv, abgekürzt scFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S.
Duebel, editors (2001 ) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Andere Antikörper als„multi-spezifische" oder„multi-funktionale" sind solche mit identischen Bindestellen. Multispezifische Antikörper können spezifisch für
unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO
92/05793; Tutt, et al., 1991 , J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601 ,8 19; oder Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab')2 oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chi und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder komplett verhindert werden kann. „Epitope" bezeichnen Proteindeterminanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptoren eingehen können. Epitopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3-dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf.
„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente" können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen- bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).
Polyklonale Antikörper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den
Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397). Der Durchschnittsfachmann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lonberg und D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1 ):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den
Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wurden. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenzierung erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich. Ein„isolierter" Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, welche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicht-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV-Vis Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Außerdem ein Antikörper, der soweit aufgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterminus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Anfärbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden).
Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt. Der Begriff„spezifische Bindung" oder„bindet spezifisch" bezieht sich auf einen
Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekul bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10"7 M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10"^ M), wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekul als zu einem nichtspezifischen Antigen/Zielmolekul hat (z.B. Rinder Serumalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekul oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekul ist. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders schließt nicht aus, dass der Antikörpers oder Binder an mehrere Antigene/Zielmoleküle bindet (z.B. Orthologe aus verschiedenen Spezies). Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens 10~7 M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10~7 M), vorzugsweise von mindestens 10"8 M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10"9 M bis 10" M auf. Die Kd-Werte können durch z.B.
Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeinflusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine
Größenordnung verringert, also z.B. maximal von 10"8 M auf 10"^ M).
Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der
erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweist als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden). Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft- Mäusen), zu erleichtern und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies-Zielprotein bindet. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Spezien der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Schimpansen und Langschwanzmakaken.
In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und
Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind
erfindungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Maus-Zielprotein sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antikörper, deren Affinität zum Zielprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet.
Gegen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper
Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein Krebs-Zielmolekül. Der Begriff„Krebs- Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein„selektives Krebs-Zielmolekül"). Die
Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Antikörper, welche spezifisch gegen ein Antigen, wie z.B. ein Krebszell-Antigen, gerichtet sind, können vom Durchschnittsfachmann mittels ihm bekannter Verfahren hergestellt werden (wie z.B. rekombinante Expression) oder kommerziell erworben werden (wie z.B. von Merck KGaA, Deustchland). Beispiele bekannter kommerziell erhältlicher Antikörper in der Krebstherapie sind Erbitux® (Cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (Bevacizumab, Roche) und Herceptin® (Trastuzumab, Genentech). Trastuzumab ist ein rekombinanter humanisierter monokloaler Antikörper vom IgGl kappa Typ, welcher mit hoher Affinität in einem Zell-basierten Assay (Kd = 5 nM) die extrazelluläre Domäne des humanen epidermalen Wachstumsrezeptors bindet. Der Antikörper wird rekombinant in CHO-Zellen hergestellt. Alle diese Antikörper können auch als aglykosylierte Varianten dieser Antikörper hergestellt werden, entweder durch Deglycosylierung durch PNGase F oder durch Mutation von N297 (Kabat Nummerierung) der schweren Kette zu einer beliebigen Aminosäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein selektives Krebs- Zielmolekül.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein Protein.
In einer Ausführungsform ist das Zielmolekül ein extrazelluläres Zielmolekül. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das extrazelluläre Zielmolekül ein Protein.
Krebs-Zielmoleküle sind dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind im Folgenden aufgeführt.
Beispiele für Krebs-Zielmoleküle sind:
(1 ) EGFR (EGF-Rezeptor, NCBI-Referenzsequenz NP_005219.2, NCBI-Gene ID: 1956) (2) Mesothelin (SwissProt-Referenz Q13421-3), wobei Mesothelin von den Aminosäuren 296-598 kodiert wird. Aminosäuren 37-286 kodieren für "megakaryocyte-potentiating factor". Mesothelin ist durch einen GPI-Anker in der Zellmembran verankert und ist extrazellulär lokalisiert.
(3) Carboanhydrase IX (CA9, SwissProt-Referenz Q16790), NCBI-Gene ID: 768) (4) C4.4a (NCBI -Referenzsequenz NP_055215.2; Synonym LYPD3, NCBI-Gene ID: 27076)
(5) CD52 (NCBI-Referenzsequenz NP_001794.2)
(6) Her2 (ERBB2; NCBI-Referenzsequenz NP_004439.2; NCBI-Gene ID: 2064)
(7) CD20 (NCBI-Referenzsequenz NP_068769.2) (8) das Lymphozyten Aktivierungsantigen CD30 (SwissProt ID P28908)
(9) das Lymphozyten Adhesionsmolekül CD22 (SwissProt ID P20273; NCBI-Gene ID: 933)
(10) das Myloidzellen Oberflächenantigen CD33 (SwissProt ID P20138; NCBI-Gene ID: 945)
(1 1 ) das Transmembran Glykoprotein NMB (GPNMB, SwissProt ID Q14956, NCBI-Gene ID: 10457)
(12) das Adhesionsmolekül CD56 (SwissProt ID P13591 )
(13) das Oberflächenmolekül CD70 (SwissProt ID P32970, NCBI-Gene ID: 970)
(14) das Oberflächenmolekül CD74 (SwissProt ID P04233, NCBI-Gene ID: 972)
(15) das B-Lymphozyten Antigen CD19 (SwissProt ID P15391 , NCBI-Gene ID: 930)
(16) das Oberflächenprotein Mucin-1 (MUC1 , SwissProt ID P15941 , NCBI-Gene ID: 4582)
(17) das Oberflächenprotein CD138 (SwissProt ID P18827)
(18) das Integrin alphaV (NCBI -Referenzsequenz: NP_002201.1 , NCBI-Gene ID: 3685) (19) das teratocarcinoma-derived growth factor 1 Protein TDGF1 (NCBI - Referenzsequenz: NP_003203.1 , NCBI-Gene ID: 6997)
(20) das Prostata spezifische Membranantigen PSMA (Swiss Prot ID: Q04609; NCBI- Gene ID: 2346)
(21 ) die Tyrosin-Proteinkinase EPHA2 (Swiss Prot ID: P29317, NCBI-Gene ID: 1969) (22) das Oberflächenprotein SLC44A4 (NCBI -Referenzsequenz: NP_001 171515.1 , NCBI-Gene ID: 80736)
(23) das Oberflächenprotein BMPR1 B (SwissProt: 000238)
(24) das Transportprotein SLC7A5 (SwissProt: Q01650)
(25) das epitheliale Prostataantigen STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8, Gene ID: 26872) (26) das Ovarkarzinomantigen MUC16 (SwissProt: Q8WXI7, Gene ID: 94025)
(27) das Transportprotein SLC34A2 (SwissProt: 095436, Gene ID: 10568)
(28) das Oberflächenprotein SEMA5b (SwissProt: Q9P283)
(29) das Oberflächenprotein LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)
(30) der Endothelin Rezeptor Typ B EDNRB (SwissProt: P24530, NCBI-Gene ID: 1910)
(31 ) das Ringfingerprotein RNF43 (SwissProt: Q68DV7)
(32) das Prostatakarzinom-assoziierte Protein STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)
(33) der Kationenkanal TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)
(34) der Komplementrezeptor CD21 (SwissProt: P20023)
(35) das B-Zell Antigen Rezeptorkomplex-assoziierte Protein CD79b (SwissProt: P40259, NCBI-Gene ID: 974)
(36) das Zelladhäsionsantigen CEACAM6 (SwissProt: P40199)
(37) die Dipeptidase DPEP1 (SwissProt: P16444)
(38) der Interleukinrezeptor IL20Ralpha (SwissProt: Q9UHF4, NCBI-Gene ID: 3559)
(39) das Proteoglykan BCAN (SwissProt: Q96GW7)
(40) der Ephrin Rezeptor EPHB2 (SwissProt: P29323)
(41 ) das Prostatastammzellen-assoziierte Protein PSCA (NCBI -Referenzsequenz:
NP_005663.2 )
(42) das Oberflächenprotein LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)
(43) das Rezeptorprotein TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)
(44) das B-Zell Antigen Rezeptorkomplex-assoziierte Protein CD79a (SwissProt: P1 1912)
(45) das Rezeptorprotein CXCR5 (CD185; SwissProt: P32302; NCBI-Gene ID 643, NCBI -Referenzsequenz: NP_001707.1 ) (46) der lonenkanal P2X5 (SwissProt: Q93086)
(47) das Lymphozytenantigen CD180 (SwissProt: Q99467)
(48) das Rezeptorprotein FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)
(49) das Rezeptorprotein FCRL5 (SwissProt: Q96RD9) (50) das MHC Klasse II Molekül la Antigen HLA-DOB (NCBI -Referenzsequenz:
NP_0021 1 1.1 )
(51 ) das T-Zell Protein VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3)
(52) TWEAKR (FN14, TNFRSF12A, NCBI -Referenzsequenz: NP_057723.1 , NCBI-Gene ID: 51330) (53) das Lymphozytenantigen CD37 (Swiss Prot: P1 1049, NCBI-Gene ID: 951 )
(54) Der FGF Rezeptor 2; FGFR2 (NCBI-Gene ID: 2263; Official Symbol: FGFR2). Der FGFR2 Rezeptor kommt in verschiedenen Spleißvarianten vor (alpha, beta, lllb, lllc). Alle Spleißevarianten können als Zielmolekül fungieren.
(55) das transmembrane Glycoprotein B7H3 (CD276; NCBI-Gene ID: 80381 NCBI - Referenzsequenz: NP_001019907.1 , Swiss Prot: Q5ZPR3-1 )
(56) der B Zell Rezeptor BAFFR (CD268; NCBI-Gene ID: 1 15650)
(57) das Rezeptorprotein ROR 1 (NCBI-Gene ID: 4919)
(58) der Oberflächenrezeptor CD123 (IL3RA; NCBI-Gene ID: 3563; NCBI - Referenzsequenz: NP_002174.1 ; Swiss-Prot: P26951 ) (59) das Rezeptorprotein Syncytin ( NCBI-Gene ID 30816)
(60) die Aspartat beta Hydroxylase (ASPH; NCBI-Gene ID 444)
(61 ) das Zelloberflächen Glycoprotein CD44 (NCBI-Gene ID: 960)
(62) CDH15 (Cadherin 15, NCBI-Gene ID: 1013)
(63) das Zelloberflächen Glycoprotein CEACAM5 (NCBI-Gene ID: 1048) (64) das Zelladhäsionsmolekül L1 -Iike (CHL1 , NCBI-Gene ID: 10752)
(65) die Rezeptortyrosin-Kinase c-Met (NCBI-Gene ID: 4233)
(66) der Notch Ligand DLL3 (NCBI-Gene ID: 10683)
(67) das Ephrin A4 (EFNA4, NCBI-Gene ID: 1945)
(68) die Ectonucleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 3 (ENPP3, NCBI-Gene ID: 5169)
(69) der Koagulationsfaktor III (F3, NCBI-Gene ID: 2152)
(70) der FGF Rezeptor 3 (FGFR3, NCBI-Gene ID: 2261 )
(71 ) die Folatehydrolase FOLH1 (NCBI-Gene ID: 2346)
(72) der Folaterezeptor 1 (FOLR1 ; NCBI-Gene ID: 2348)
(73) die Guanylatzyklase 2C (GUCY2C, NCBI-Gene ID: 2984)
(74) die KIT proto-Oncogen Receptortyrosinkinase (NCBI-Gene ID: 3815)
(75) das lysosomal-assoziierte Membranprotein 1 (LAMP1 , NCBI-Gene ID: 3916)
(76) der Lymphocytenantigen 6 Complex, locus E (LY6E, NCBI-Gene ID: 4061 )
(77) das Protein NOTCH3 (NCBI-Gene ID: 4854)
(78) die Proteintyrosinkinase 7 (PTK7, NCBI-Gene ID: 5754)
(79) das Nectin Zelladhäsionsmolekül 4 (PVRL4, NECTIN4, NCBI-Gene ID: 81607)
(80) das Transmembranprotein Syndecan 1 (SDC1 , NCBI-Gene ID: 6382)
(81 ) das SLAM Familienmitglied 7 (SLAMF7, NCBI-Gene ID: 57823)
(82) das Transportprotein SLC39A6 (NCBI-Gene ID: 25800)
(83) das SLIT und NTRK artige Familienmitglied 6 (SLITRK6, NCBI-Gene ID: 84189)
(84) der Zelloberflächenrezeptor TACSTD2 (NCBI-Gene ID: 4070) (85) das Rezeptorprotein TNFRSF8 (NCBI-Gene ID: 943)
(86) das Rezeptorprotein TNFSF13B (NCBI-Gene ID: 10673)
(87) das Glykoprotein TPBG (NCBI-Gene ID: 7162)
(88) der Zelloberflächenrezeptor TROP2 (TACSTD2, NCBI-Gene ID: 4070) (89) der Galanin-like G Protein-gekoppelte Rezeptor KISS1 R (GPR54, NCBI-Gene ID: 84634)
(90) das Transportprotein SLAMF6 (NCBI-Gene ID: 1 14836)
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das Krebs-Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR und CXCR5, insbesondere CD123, CXCR5, und B7H3.
In einem weiteren besonders bevorzugten Gegenstand der Erfindung bindet der Binder an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR und CXCR5, insbesondere CD123, CXCR5, und B7H3.
In einem weiteren besonders bevorzugten Gegenstand der Erfindung bindet der Binder spezifisch an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR und CXCR5, insbesondere CD123, CXCR5, und B7H3. In einer bevorzugten
Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle internalisiert. Dies bewirkt, dass das Binder-Wirkstoffkonjugat, welches ein Immunokonjugat oder ein ADC sein kann, von der Zielzelle aufgenommen wird. Anschließend wird der Binder vorzugsweise intrazellulär, bevorzugt lysosomal, prozessiert. In einer Ausführungsform ist der Binder ein Bindeprotein. In einer bevorzugten
Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper, ein antigen-bindendes Antikörperfragment, ein multispezifischer Antikörper oder ein Antikörpermimetikum. Bevorzugte Antikörpermimetika sind Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, oder Nanobodies. Bevorzugte multispezifischer Antikörper sind bispezifische und trispezifische Antikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper oder ein antigen- bindendes Antikörperfragment, weiter bevorzugt ist ein isolierter Antikörper oder ein isoliertes antigen-bindendes Antikörperfragment.
Bevorzugte antigen-bindende Antikörperfragmente sind Fab, Fab', F(ab')2 und Fv
Fragmente, Diabodies, DAbs, lineare Antikörper und scFv. Besonders bevorzugt sind Fab, Diabodies und scFv. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon. Weiter besonders bevorzugt sind humane, humanisierte oder chimäre Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon.
Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder
rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten sind in WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22„Antibodies"). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK-Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seite 30-32 von WO2007070538 und im Detail in Queen, et al.,.Pros. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033, 1989 oder in WO 90/0786 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vo1. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1 -3); Current Protocols in Molecular Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (19881 , Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfahren zur Herstellung eines lgG1 -Antikörpers sind z.B. in WO
2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschrieben. Verfahren, mit denen die
Internalisierung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur
Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)-Antikörpern verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden.
Bakterielle Expression
Dem Fachmann ist bekannt, auf welche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe bakterieller Expression hergestellt werden können. Geeignete Expressionsvektoren zur bakteriellen Expression gewünschter Proteine werden durch Insertion einer DNA Sequenz, welche das gewünschte Protein kodiert, im funktionellen Leserahmen zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und
Translationsterminationssignalen und mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor umfasst ein oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen
Replikationsursprung, um die Erhaltung des Vektors und, falls erwünscht, die
Amplifikation desselben innerhalb des Wirtes zu ermöglichen. Geeignete prokaryotische Wirte zur Transformation umfassen, sind aber nicht limitiert auf, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies aus dem Genus Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus. Bakterielle Vektoren können zum Beispiel basieren auf Bakteriophagen, Plasmiden, oder Phagemiden. Diese Vektoren können selektierbare Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, welche aus kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind. Viele kommerziell erhältlichen Plasmide enthalten typischerweise Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). In bakteriellen Systemen können eine Anzahl von vorteilhaften Expressionsvektoren auf Basis der beabsichtigten Verwendung des zu exprimierenden Proteins ausgewählt werden.
Nach Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Wachstum des Wirtsstammes zu einer angemessenen Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturveränderung oder chemische Induktion) de-reprimiert / induziert, und die Zellen werden für eine zusätzliche Periode kultiviert. Die Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, falls nötig auf physikalische Weise oder mit chemischen Mitteln aufgeschlossen, und der resultierende Roh extra kt wird zur weiteren Reinigung zurückgehalten.
Daher ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein
Expressionsvektor, welcher eine Nukleinsäure umfasst, welche einen neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung kodiert.
Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindende Fragmente von diesen beinhalten natürlich gereinigte Produkte, Produkte, die aus chemischen Synthesen stammen, und Produkte, die durch rekombinante Technologien in prokaryotischen Wirten, wie zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies aus dem Genus Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus, bevorzugt E. coli, produziert werden. Säuqerzellexpression
Dem Fachmann ist bekannt, auf welche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe von Säugerzellexpression hergestellt werden können.
Bevorzugte regulatorische Sequenzen zur Expression in Säugerzellwirten umfassen virale Elemente, die zu einer hohen Expression in Säugerzellen führen, wie Promotoren und/oder Expressionsverstärker, welche vom Cytomegalovirus (CMV) (wie dem CMV Promotor/Enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (wie dem SV40 Promotor/Enhancer), vom Adenovirus, (z.B. der Adenovirus major late promoter (AdMLP)) und vom Polyoma abgeleitet sind. Die Expression der Antikörper kann konstitutiv oder reguliert erfolgen (z.B. induziert durch Zugabe oder Entfernen von Kleinmolekül Induktoren wie Tetracyclin in Kombination mit dem Tet-System). Zur weiteren Beschreibung viraler regulatorischer Elemente und Sequenzen von diesen sei verwiesen auf z.B. U.S. 5, 168,062 von Stinski, U.S. 4,510,245 von Bell et al. und U.S. 4,968,615 von Schaffner et al.. Die rekombinanten Expressionsvektoren können ebenfalls einen Replikationsursprung und selektierbare Marker beinhalten (siehe z.B. U.S.
4,399,216, 4,634,665 und U.S. 5,179,017). Geeignete selektierbare Marker umfassen Gene, die Resistenz gegenüber Substanzen wie G418, Puromycin, Hygromycin,
Blasticidin, Zeocin/Bleomycin, oder Methotrexate verleihen, oder selektierbare Marker, welche zur Auxotrophie einer Wirtszelle führen, wie Glutamine Synthetase (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb; 10(2): 169-75), wenn der Vektor in die Zelle
eingebracht wurde.
Zum Beispiel vermittelt das Dihydrofolate-Reductase (DHFR) Gen Resistenz gegenüber Methotrexate, das neo Gen vermittelt Resistenz gegenüber G418, das bsd Gen aus Aspergillus terreus vermittelt Resistenz gegenüber Blasticidin, Puromycin N-acetyl- transferase vermittelt Resistenz gegenüber Puromycin, das Sh ble Genprodukt vermittelt Resistenz gegenüber Zeocin, und Resistenz gegenüber Hygromycin wird vermittelt durch das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hyg or hph). Selektierbare Marker wie DHFR oder Glutamine-Synthetase sind auch hilfreich für Amplifikationstechniken in Verbindung mit MTX und MSX.
Die Transfektion eines Expressionsvektors in eine Wirtszelle kann mit Hilfe von
Standardtechniken ausgeführt werden, unter anderem mit Elektroporation, Nucleofection, Calcium-Phosphate-Präzipitation, Lipofection, Polykation-basierter Transfektion wie Polyethlylenimine (PEI)-basierter Transfektion und DEAE-Dextran Transfection.
Geeignete Säugerwirtszellen für die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder Varianten von diesen umfassen Chinese Hamster Ovary (CHO Zellen) wie CHO-K1 , CHO-S, CHO-K1 SV [inbegriffen DHFR-CHO Zellen, beschrieben in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 und Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12, verwendet mit einem DHFR selektierbaren Marker, wie beschrieben in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 , sowie andere Knockout-Zellen, wie ausgeführt in Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr; 109(4): 1007-15), NS0 myeloma Zellen, COS Zellen, HEK293 Zellen, HKB1 1 Zellen, BHK21 Zellen, CAP Zellen, EB66 Zellen, und SP2 Zellen.
Die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder
Varianten von diesen kann auch transient oder semi-stabil in Expressionssystemen erfolgen, wie HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293- Freestyle, HKB1 1 , Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-K1 , CHO- K1 SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 oder CAP-T Zellen (beispielsweise wie Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9) In einigen Ausführungsformen ist der Expressionsvektor in jener Weise konstruiert, dass das zu exprimierende Protein in das Zellkulturmedium, in welchem die Wirtszellen wachsen, sekretiert wird. Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus dem Zellkulturmedium mit Hilfe dem
Fachmann bekannten Proteinreinigungsmethoden gewonnen werden. Reinigung
Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus rekombinanten Zellkulturen mit Hilfe gut bekannter Methoden gewonnen und gereinigt werden, umfassend beispielsweise Ammoniumsulfat- oder Ethanol- Präzipitation, Säureextraktion, Protein A Chromatographie, Protein G
Chromatographie, Anion- oder Kationenaustauschchromatographie, Phospho-Cellulose Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC),
Affinitätschromatographie, Hydroxylapatite Chromatographie and Lectin
Chromatographie. High Performance Flüssigchromatographie ("HPLC") kann ebenfalls zur Reinigung angewendet werden. Siehe, beispielsweise, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001 ), e.g., Chapters 1 , 4, 6, 8, 9, 10.
Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen umfassen natürlich gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, welche mit Hilfe rekombinanter Techniken in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen hergestellt werden. Eukaryotische Wirte umfassen beispielsweise Hefezellen, höhere Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen. Abhängig von der für die rekombinanten Expression gewählten Wirtszelle kann das exprimierte Protein glykosyliert oder nicht-glykosyliert vorliegen.
In einer bevorzugen Ausführungsform wird der Antikörper gereinigt (1 ) zu mehr als 95 Gew.-% gemessen beispielsweise mit der Lowry-Methode, mit UV-Vis Spektroskopie oder mit der SDS-Kapillargelelektrophorese (zum Beispiel mit einem Caliper LabChip GXII, GX 90 oder Biorad Bioanalyzer Gerät), und in mehr bevorzugten Ausführungsformen mehr als 99 Gew.-%, (2) zu einem Grade geeignet zur Bestimmung von mindestens 15 Resten der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz, oder (3) zur Homogenität bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht- reduzierenden Bedingungen mit Hilfe von Coomassie-Blau oder bevorzugt Silber- Färbung.
Gewöhnlich wird ein isolierter Antikörper mit Hilfe wenigstens eines
Proteinreinigungsschrittes gewonnen.
anti-CD123 Antikörper Erfindungsgemäß können anti-CD123 Antikörper verwendet werden.
Der Begriff„anti-CD123 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an CD123 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CD123 (IL3RA; NCBI-Gene ID: 3563; NCBI -Referenzsequenz: NP_002174.1 ; Swiss-Prot: P26951 ; SEQ ID NO:1 1 1 ) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CD123 mit einer Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 ηΜ, < 0.01 ηΜ, oder < 0.001 nM.
Die Generierung und Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers 7G3, welcher die N- terminale Domäne von IL-3Ra, CD123, bindet, werden von Sun et al. beschrieben (Sun et al., 1996, Blood 87(1 ):83-92). US Patent Nummer 6, 177,078 (Lopez) bezieht sich auf den anti-CD123-Antikörper 7G3. Eine chimäre Variante dieses Antikörpers (CSL360) ist in WO 2009/070844 sowie eine humanisierte Version (CSL362) in WO 2012/021934
beschrieben. Die Sequenz des 7G3 Antikörpers ist in EP2426148 offenbart worden. Diese Sequenz stellt den Ausgangspunkt der humanisierten Antikörper dar, die durch CDR- Umsetzung („CDR grafting") erhalten wurden
Einen Antikörper, der besonders gut nach Zelloberflächenantigenbindung internalisiert, ist der anti-CD123 Antikörper 12F1 , der von Kuo et al. offenbart wurde (Kuo et a., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975-82). Der Antikörper 12F1 bindet mit einer höheren Affinität an CD123 als der Antikörper 7G3 und internalisiert nach Zelloberflächenantigenbindung deutlich schneller als 7G3. Bispezifische scFv Immunofusionsproteine basierend auf 12F1 werden in WO 2013/173820 offenbart. Antikörper TPP-6013 ist eine chimäre Variante des 12F1 .
Die Erfindung betrifft insbesondere Konjugate mit Antikörpern oder antigenbindende Antikörperfragmente davon oder Varianten davon, die auf den aus der Maus
stammenden Antikörper 7G3 (Sun et al., 1996, Blood 87(1 ):83-92) und 12F1 (Kuo et a., 2009, Bioconjug Chem. 20(10): 1975-82) zurückgehen, oder Konjugate mit Antikörpern oder antigenbindende Antikörperfragmente davon oder Varianten davon, die auf den aus der Maus stammenden Antikörper 12F1 (Kuo et a., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975- 82) zurückgehen. Humanisierte Varianten des murinen 7G3 Antikörpers sowie des murinen 12F1
Antikörpers wurden basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") in ein humanes Framework und anschließender Optimierung generiert und sind bevorzugte Beispiele im Rahmen dieser Erfindung.
Besonders bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-CD123 Antikörper TPP- 9476, TPP-8988, TPP-8987 und TPP-6013. anti-CXCR5 Antikörper
Erfindungsgemäß können anti-CXCR5 Antikörper verwendet werden.
Der Begriff„anti-CXCR5 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an CXCR5 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CXCR5 (NCBI - Referenzsequenz: NP_001707.1 ; SEQ ID NO: 1 12) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CXCR5 mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 ηΜ, < 0.01 ηΜ, oder < 0.001 nM. Beispiele für Antikörper und antigen-bindene Fragmente die an CXCR5 binden, sind dem Fachmann bekannt und z.B in EP2195023 beschrieben
Die Hybridomzellen für den Rattenantikörpers RF8B2 (ACC2153) wurden von DSMZ bezogen und die Sequenz des Antikörpers nach Standardmethoden identifiziert. Diese Sequenz stellt den Ausgangspunkt der humanisierten Antikörper dar, die durch CDR- Umsetzung („CDR grafting") erhalten wurden Humanisierte Varianten dieses Antikörpers wurden basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") in germline Sequenzen generiert.
Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Besonders bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti- CXCR5 Antikörper TPP- 9574 und TPP-9580.
anti-B7H3 Antikörper
Erfindungsgemäß können anti-B7H3 Antikörper verwendet werden. Der Begriff„anti-B7H3 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an B7H3 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül B7H3 (NCBI - Referenzsequenz: NP_001019907.1 SEQ ID NO: 1 13) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In
bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper B7H3 mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
Beispiele für Antikörper und antigen-bindende Fragmente die an B7H3 binden, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B in WO201 109400, EP1773884 und WO2014061277 beschrieben. EP2121008 beschreibt den anti-B7H3 Antikörper 8H9 sowie seine CDR Sequenzen.
Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der ant-B7H3 Antikörper wurden durch Screening einer Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek auf rekombinant B7H3 aus der Maus (Maus CD276; Gene ID: 102657) und humanes B7H3 (human CD276; Gene ID: 80381 ) exprimierenden Zellen erhalten. Die gewonnenen Antikörper wurden in das humane lgG1 Format überführt. Der anti-B7H3 Antikörper TPP-8382 ist ein bevorzugtes Beispiel.
Besonders bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-B7H3 Antikörper TPP- 8382. anti-TWEAKR-Antikörper
Erfindungsgemäß können anti-TWEAKR Antikörper verwendet werden.
Der Begriff„anti-TWEAKR Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an TWEAKR bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül TWEAKR (NCBI - Referenzsequenz: NP_057723.1 ; SEQ ID NO: 1 14) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper TWEAKR mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM. Beispiele für Antikörper, die an TWEAKR binden, sind zum Beispiel in
WO2009/020933(A2), WO2009/140177 (A2), WO 2014/198817 (A1 ) and WO
2015/189143 (A1 ) offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
ITEM-4 ist ein anti-TWEAKR-Antikörper, der von Nakayama et al. beschrieben wurde (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Humanisierte
Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") werden von Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4):1052-62) sowie in WO
2009/020933 beschrieben. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Besonders bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-TWEAKR Antikörper TPP-7006 und TPP-7007. Diese sind humanisierte Varianten des Antikörpers ITEM-4. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt verwendet werden. anti-HER2-Antikörper: Erfindungsgemäß können anti-HER2 Antikörper verwendet werden.
Der Begriff„anti- HER2Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an HER2 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül HER2 (NCBI - Referenzsequenz: NP_004439.2; SEQ ID NO: 1 15) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper HER2 mit einer Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle Her2 bindet, ist
Trastuzumab (Genentech). Trastuzumab ist ein humanisierter Antikörper, der zur unter anderem Behandlung von Brustkrebs eingesetzt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der anti-Her2 Antikörper TPP-1015 (analog Trastuzumab).
Weitere Beispiele für Antikörper, die an HER2 binden, sind neben Trastuzumab (INN 7637, CAS NR: RN: 180288-69-1 ) und Pertuzumab (Cas NR: 380610-27-5), auch Antikörper, wie offenbart in WO 2009/123894-A2, WO 200/8140603-A2, oder in WO 201 1/044368-A2. Beispiel für ein anti-HER2 Konjugat ist Trastuzumab-Emtansine (INN- Nr. 9295). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
Besonders bevorzugt ist im Rahmen dieser Erfindung der anti-HER2Antikörper TPP-1015 (analog Trastuzumab).
anti-EGFR-Antikörper
Erfindungsgemäß können anti- EGFR Antikörper verwendet werden.
Der Begriff„anti-EGFR Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an EGFR bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül EGFR (NCBI - Referenzsequenz: NP_005219.2; SEQ ID NO: 1 16) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper EGFR mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die anti-EGFR Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-981 , Cetuximab, Panitumumab, Nimotuzumab. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der anti-EGFR Antikörper TPP-981 .
Weitere Ausführungsformen für EGFR-Antikörper sind: • Zalutumumab / 2F8 / HuMax-EGFR, Firma Genmab A/S (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN-Nummer 8605)
• Necitumumab / 1 1 F8, ImClone / IMC-1 1 F8, Firma ImClone Systems Inc [Eli Lilly & Co] (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1 , US 2007/0264253-A1 , US 7,598,350, WO 2005/090407-A1 ), INN- Nummer 9083)
• Matuzumab / anti-EGFR MAb, Merck KGaA / anti-EGFR MAb, Takeda / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 und EMD-55900 / MAb 425 / monoclonal antibody 425, Firma Merck KGaA / Takeda ( WO 92/15683, INN-Nummer 8103 (Matuzumab)) · RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO-
5083945 / R04858696 / RO5083945, Firma Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO 2010/1 12413-A1 , WO 2010/1 15554)
• GT-MAB 5.2-GEX / CetuGEX, Firma Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (EP 01900750-A1 , EP 0191 1766-A1 , EP 02073842-A2, US 2010/0028947-A1 ) · ISU-101 , Firma Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd) / Scancell (WO 2008/004834-
A1 )
• ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / anti-EGFR monoclonal antibody 806, Firma Ludwig Institute for Cancer Research / Abbott / Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771 , WO 2005/081854 und WO 2009/023265) · SYM-004 (consists of two chimeric lgG1 antibodies (992 and 1024)), Firma
Symphogen A/S (WO 2010/022736-A2)
• MR1-1 /MR1-1 KDEL, Firma IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) (Duke University), (Patent: WO2001/062931 -A2)
• Antikörper gegen die Deletionsmutante, EGFRvlll, Firma Amgen/Abgenix (WO 2005/010151 , US 7,628,986)
• SC-100, Firma Scancell Ltd (WO 01/088138-A1 ) • MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA, Firma Bristol-Myers Squibb (US) / Merck KGaA (DE) / Takeda (JP), (WO
91/05871 , WO 92/15683)
• anti-EGFR-Mab, Firma Xencor (WO 2005/056606) · DXL-1218 / anti-EGFR monoclonal antibody (cancer), InNexus, Firma InNexus
Biotechnology Inc, Pharmaprojects PH048638 anti-Carboanhydrase IX Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmoleküle Carboanhydrase IX binden, sind in WO 2007/070538-A2 (z.B. Ansprüche 1 - 16) beschrieben. anti-C4.4a Antikörper:
Beispiele für C4.4a Antikörper und antigen-bindende Fragmente sind in WO 2012/143499 A2 beschrieben. Die Sequenzen der Antikörper sind in Tabelle 1 der WO 2012/143499 A2 angegeben, wobei jede Zeile die jeweiligen CDR Aminosäuresequenzen der variablen leichten Kette bzw. der variablen Schweren Kette des in Spalte 1 aufgeführten Antikörpers wiedergibt. anti-CD20-Antikörper:
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle CD20 bindet, ist Rituximab (Genentech). Rituximab (CAS-Nummer: 174722-31-7) ist ein chimärer Antikörper, der zur Behandlung von Non-Hodgkin-Lymphom verwendet wird. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD52-Antikörper:
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle CD52 bindet, ist
Alemtuzumab (Genzyme). Alemtuzumab (CAS-Nummer: 216503-57-0) ist ein
humanisierter Antikörper, der zur Behandlung von chronischer lymphatischer Leukämie eingesetzt wird. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-Mesot hei in- Antikörper:
Beispiele für anti-Mesothelin -Antikörper sind z.B. WO2009/068204 beschrieben. Alle WO2009/068204 offenbarten Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen der hierin offenbarten Erfindung verwendet werden können. Besonders bevorzugt ist der in WO2009/068204 offenbarte Antikörper MF-T.
anti-CD30-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD30 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Hodgkin-Lymphoma verwendet werden können, sind Brentuximab,
Iratumumab und Antikörper, wie in WO 2008/0921 17, WO 2008/036688 oder WO 2006/089232 offenbart. Beispiele für ein anti- CD30 Konjugat ist Brentuximab Vedotin (INN-Nr. 9144). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD22-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD22 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Lymphoma verwendet werden können, sind Inotuzumab oder Epratuzumab. Beispiele für anti- CD22 Konjugate sind Inotuzumab Ozagamycin (INN-Nr. 8574), oder anti-CD22-MMAE und anti-CD22-MC-MMAE (CAS RN: 139504-50-0 bzw. 474645-27-7). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD33-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD33 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Leukämie verwendet werden können, sind Gemtuzumab oder Lintuzumab (INN 7580). Ein Beispiel für ein anti-CD33 Konjugat ist Gemtuzumab-Ozagamycin. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-NMB-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül NMB bindet und zur
Behandlung von Krebs z.B. Melanom oder Brustkrebs verwendet werden kann, ist Glembatumumab (INN 9199). Ein Beispiel für ein anti-NMB Konjugat ist Glembatumumab Vedotin (CAS RN: 474645-27-7). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD56-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD56 bindet und zur
Behandlung von Krebs z.B. Multiples Myelom, Kleinzelliges Lungenkarzinom, MCC oder Ovarialkarzinom verwendet werden kann, ist Lorvotuzumab. Ein Beispiel für ein anti-CD56 Konjugat ist Lorvotuzumab Mertansine (CAS RN: 139504-50-0). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD70-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD70 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodgkin-Lymphom oder Nierenzellkrebs verwendet werden können, sind in WO 2007/038637-A2 oder WO 2008/070593-A2 offenbart. Ein Beispiel für ein anti- CD70 Konjugat ist SGN-75 (CD70 MMAF). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD74-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD74 bindet und zur
Behandlung von Krebs z.B. Multiplem Myelom verwendet werden kann, ist Milatuzumab. Ein Beispiel für ein anti-CD74 Konjugat ist Milatuzumab-Doxorubicin (CAS RN: 23214-92- 8). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser
Erfindung verwendet werden. anti-CD19-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD19 bindet und zur
Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodgkin-Lymphom verwendet werden kann, ist in WO 2008/031056-A2 offenbart. Weitere Antikörper und Beispiele für ein anti-CD19 Konjugat (SAR3419) sind in WO 2008/047242-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-Mucin-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül Mucin-1 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodkin-Lymphom verwendet werden können, sind Clivatuzumab oder die in WO 2003/106495-A2, WO 2008/028686-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti-Mucin Konjugate sind in WO 2005/009369-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD138-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD138 binden und Konjugate davon, die zur Behandlung von Krebs z.B. Multiples Myelom verwendet werden können, sind WO 2009/080829-A1 , WO 2009/080830-A1 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-Inteqrin-alphaV-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül Integrin alphaV binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Melanoma, Sarcoma oder Carcinoma verwendet werden können, sind Intetumumab (Cas RN: 725735-28-4), Abciximab (Cas-RN: 143653-53-6), Etaracizumab (Cas-RN: 892553-42-3) oder die in US 7,465,449, EP 719859-A1 , WO 2002/012501-A1 oder WO2006/062779-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti- Integrin AlphaV Konjugate sind lntetumumab-DM4 und weitere in WO 2007/024536-A2 offenbarte ADCs. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-TDGF1 -Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül TDGF1 binden und zur Behandlung von Krebs verwendet werden können, sind die in WO 02/077033-A1 , US 7,318,924, WO 2003/083041 -A2 und WO 2002/088170-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti- TDGF1 Konjugate sind in WO 2002/088170-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-PSMA-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül PSMA binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Prostatakarzinom verwendet werden können, sind die in WO 97/35616-A1 , WO 99/47554-A1 , WO 01/009192-A1 und WO2003/034903 offenbarten Antikörper.
Beispiele für anti-PSMA Konjugate sind in WO 2009/026274-A1 und WO 2007/002222 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-EPHA2-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül EPHA2 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs verwendet werden können, sind in WO
2004/091375-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-SLC44A4-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül SLC44A4 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs, z.B. Pankreas- oder Prostatakarzinom verwendet werden können, sind in WO2009/033094-A2 und US2009/0175796-A1 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-HLA-DOB-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül HLA-DOB bindet, ist der Antikörper Lym-1 (Cas-RN: 301344-99-0), der zur Behandlung von Krebs, z.B. Non- Hodgkin-Lymphom verwendet werden kann. Beispiele für anti-HLA-DOB Konjugate sind z.B. in WO 2005/08171 1 -A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-VTCN1 -Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül VTCN1 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs, z.B. Ovarialkarzinom, Pankreas-, Lungen-, oder Brustkrebs verwendet werden können, sind in WO 2006/074418-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-FGFR2-Antikörper
Beispiele für anti-FGFR2 Antikörper und antigen-bindende Fragmente sind in
WO2013076186 beschrieben. Die Sequenzen der Antikörper sind in Tabelle 9 und Tabelle 10 der WO2013076186 angegeben. Bevorzugt sind Antikörper, Antigen-bindende Fragmente und Varianten der Antikörper, die sich von den als M048-D01 und M047-D08 bezeichneten Antikörpern ableiten. Bevorzugte Antikörper und Antigen-bindende Antikörperfragmente für erfindungsgemäße Binder-Wirkstoff-Konjugate
In dieser Anmeldung wird bei den Binder-Wirkstoff-Konjugaten auf die folgenden bevorzugten Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TPP-981 , TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 und TPP-9580.
Tabelle: Proteinse uenzen der Antikör er:
TPP-981 , TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 und TPP-9580 sind Antikörper umfassend eine oder mehrere der in obiger Tabelle angegebenen CDR-Sequenzen (H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L- CDR2, L-CDR3) der variable Region der schwere Kette (VH) oder der variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene variable Region der schwere Kette (VH) und/oder die variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene Region der schweren Kette (IgG Schwere Kette) und/oder die angegebene Region der leichten Kette (IgG Leichte Kette).
TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 8.
TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 18.
TPP-6013 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28.
TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38.
TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 47 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 48.
TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58. TPP-8987 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 68.
TPP-8988 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 78. TPP-9476 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 84, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 86, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 88.
TPP-9574 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 92, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 93 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 94, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 96, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 97 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 98. TPP-9580 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 102, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 103 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 104, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 106, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 107 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 108.
TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 5.
TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15.
TPP-6013 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 25. TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 35.
TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 45.
TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55. TPP-8987 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65.
TPP-8988 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 71 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 75.
TPP-9476 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 85. TPP-9574 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 91 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 95.
TPP-9580 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 101 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 105.
TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10. TPP-1015 ist ein anti- HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20.
TPP-6013 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30.
TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 40. TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 50.
TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60.
TPP-8987 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 70. TPP-8988 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 79 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80.
TPP-9476 ist ein anti-CD123 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 89 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 90.
TPP-9574 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 99 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 100.
TPP-9580 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 109 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 10.
Isotope, Salze, Solvate, isotopische Varianten
Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer
erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie 2H (Deuterium), 3H (Tritium), 13C, 14C, 15N, 170,
180 j 32Pi 33P i 33Si 34S i 35S i 129| u nd 1311 Bestimmte ISOtOpiSChe
Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein
beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff-Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit 3H- oder 14C-lsotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der
Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der
erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder
Ausgangsverbindungen eingesetzt werden. Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methan- sulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalin- disulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C- Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyl- diisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, A/-Methylpiperidin, A/-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiamin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Therapeutische Verwendung
Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brusttumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegstumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Hirntumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt- hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypopharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhlenkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi- Sarkom, maligne Melanome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome,
Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome,
Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und
Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retino- blastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und para- thyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome,
Adenokarzinome), Tumore des Harntrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovarial-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und
Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute mye- loide, akute lymphoblastische, chronisch-lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell-Leukämie, sowie AI DS-korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non- Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem. Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer
Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den
Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die hier beschriebenen gegen CD123 gerichteten Binder- bzw. Antikörper-Wirkstoff- Konjugate (ADCs) können bevorzugt verwendet werden, um CD123 exprimierende Störungen, wie CD123 exprimierende Krebserkrankungen, zu behandeln. Typischerweise zeigen derartige Krebszellen messbare Mengen von CD123 gemessen auf Protein- (z.B. mittels Immunoassay) oder RNA-Ebene. Einige dieser Krebsgewebe zeigen einen erhöhten Spiegel an CD123 verglichen mit nicht-kanzerogenem Gewebe des gleichen Typs, bevorzugt gemessen am gleichen Patienten. Optional wird der Gehalt an CD123 gemessen, bevor die Krebsbehandlung mit einem erfindungsgemäßen Antikörper- Wirkstoff-Konjugat (ADCs) begonnen wird (Patienten-Stratifizierung). Die CD123 gerichteten Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) können bevorzugt verwendet werden, um CD123 exprimierende Störungen, wie CD123 exprimierende Krebserkrankungen zu behandeln, wie Tumore des hämatopoetischen und lymphatischen Gewebes oder hämatopoetische und lymphatische bösartige Tumore. Beispiele für Krebserkrankungen, die mit einer CD123-Expression verbunden sind, beinhalten myeloische Krankheiten, wie akute myeloische Leukämie (AML) und myelodysplastisches Syndrom (MDS). Weitere Krebsarten beinhalten B-Zell akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL), Haarzellleukämie, Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm (BPDCN), Hodgkin- Lymphom, immature T-Zell akute lymphoblastische Leukämie (Immature T-ALL), Burkitt- Lymphom, follikuläres Lymphom, chronische lymphatische Leukämie (CLL), Mantelzelllymphom (MCL). Methoden der beschriebenen Erfindung umfassen die Behandlung von Patienten mit einem CD123 exprimierenden Krebs, wobei die Methode die Gabe eines erfinderischen Antikörper-Wirkstoff-Konjugates (ADCs)umfasst. Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung metastasierter oder zirkulierender Formen hiervon.
Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung
konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen
Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder
Prävention der zuvor genannten Erkrankungen. Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti- hyperproliferativen, zytostatischen, zytotoxischen oder immuntherapeutischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
131 1-chTNT, Abarelix, Abirateron, Aclarubicin, Adalimumab, Ado-Trastuzumab Emtansin, Afatinib, Aflibercept, Aldesleukin, Alemtuzumab, Alendronsäure, Alitretinoin, Altretamin, Amifostine, Aminoglutethimid, Hexyl-5-Aminolevulinat, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Ancestim, Anethole dithiolethione, Anetumab ravtansine, Angiotensin II, Antithrombin III, Aprepitant, Arcitumomab, Arglabin, Arsentrioxid, Asparaginase, Atezolizumab, Avelumab Axitinib, Azacitidin, Belotecan, Bendamustin, Besilesomab, Belinostat, Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, Blinatumomab, Bortezomib, Buserelin, Bosutinib, Brentuximab vedotin, Busulfan, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calcitonin,
Calciumfolinat, Calciumlevofolinat, Capecitabin, Capromab, Carbamazepine, Carboplatin, Carboquon, Carfilzomib, Carmofur, Carmustin, Catumaxomab, Celecoxib, Celmoleukin, Ceritinib, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Chlormethin, Cidofovir, Cinacalcet, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Clofarabin, Cobimetinib, Copanlisib, Crisantaspase, Crizotinib, Cyclophosphamid, Cyproteron, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin,
Daratumumab, Dabrafenib, Darolutamide, Dasatinib, Daunorubicin, Decitabin, Degarelix, Denileukin-Diftitox, Denosumab, Depreotid, Deslorelin, Dexrazoxane,
Dibrospidiumchlorid, Dianhydrogalactitol, Diclofenac, Docetaxel, Dolasetron, Doxifluridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Estron, Dronabinol, Durvalumab Edrecolomab,
Elliptiniumacetat, Endostatin, Enocitabin, Enzalutamid, Epacadostat, Epirubicin,
Epitiostanol, Epoetin-alfa, Epoetin-beta, Epoetin-zeta, Eptaplatin, Eribulin, Erlotinib, Esomeprazol, Estramustin, Etoposid, Ethinylestradiol, Everolimus, Exemestan, Fadrozol, Fentanyl, Fluoxymesteron, Floxuridin, Fludarabin, Fluoruracil, Flutamid, Folinsäure, Formestan, Fosaprepitant, Fotemustin, Fulvestrant, Gadobutrol, Gadoteridol,
Gadotersäure-Megluminsalz, Gadoversetamid, Gadoxetsäure Dinatriumsalz (Gd-EOB- DTPA Dinatriumsalz), Galliumnitrat, Ganirelix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glucarpidase, Glutoxim, Goserelin, Granisetron, Granulocyten Kolonie stimulierender Factor (G-CSF), Granulocyten Macrophagen Kolonie stimulierender Factor (GM-CSF), Histamindihydrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, Ι-125-Seeds, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Ibrutinib, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Imiquimod, Improsulfan, Indisetron, Incadronic acid, Ingenolmebutat, Interferon-alfa, Interferon-beta, Interferon- gamma, lobitridol, lobenguane (1231), lomeprol, Ipilimumab, Irinotecan, Itraconazole, Ixabepilon, Ixazomib, Lanreotid, Lansoprazole, Lansoprazol, Lapatinib, Lasocholine, Lenalidomid, Lenvatinib, Lenograstim, Lentinan, Letrozol, Leuprorelin, Levamisol, Levonorgestrel, Levothyroxin-Natrium, Lipegfilgrastim, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidamin, Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melarsoprol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopurin, Mesna, Methadon, Methotrexat, Methoxsalen,
Methylaminolevulinat, Methylprednisolon, Methyltestosteron, Metirosin, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin, Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan,
Mitoxantron, Mogamulizumab, Molgramostim, Mopidamol, Morphinhydrochlorid,
Morphinsulfat, Nabilon, Nabiximols, Nafarelin, Naloxon + Pentazocin, Naltrexon,
Nartograstim, Necitumumab, Nedaplatin, Nelarabin, Neridronsäure,
Netupitant/palonosetron, Nivolumab, Nivolumabpentetreotid, Nilotinib, Nilutamid,
Nimorazol, Nimotuzumab, Nimustin, Nintedanib, Nitracrin, Nivolumab, Obinutuzumab, Octreotid, Ofatumumab, Olaparib, Olaratumab, Omacetaxin-Mepesuccinat, Omeprazol, Ondansetron, Orgotein, Orilotimod, Osimertinib, Oxaliplatin, Oxycodon, Oxymetholon, Ozogamicin, p53-Gentherapie, Paclitaxel, Palbociclib, Palifermin, Palladium-103-Seed, Palonosetron, Pamidronsäure, Panitumumab, Panobinostat, Pantoprazol, Pazopanib, Pegaspargase, Pembrolizumab, Peg-interferon-alfa-2b, Pembrolizumab, Pemetrexed, Pentostatin, Peplomycin, Perflubutane, Perfosfamid, Pertuzumab, Picibanil, Pilocarpin, Pirarubicin, Pixantron, Plerixafor, Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polyvinylpyrrolidone + Natriumhyaluronat, Polysaccharid-K, Pomalidomid, Ponatinib, Porfimer-Natrium, Pralatrexat, Prednimustin, Prednison, Procarbazin, Procodazole, Propranolol, Quinagolid, Rabeprazol, Racotumomab, Radium-223-chlorid, Radotinib, Raloxifen, Raltitrexed, Ramosetron, Ramucirumab, Ranimustin, Rasburicase, Razoxan, Refametinib, Regorafenib, Risedronsäure, Rhenium-186 Etidronat, Rituximab,
Rogaratinib, Rolapitant, Romidepsin, Romurtid, Roniciclib, Samarium (153Sm) lexidronam, Satumomab, Secretin, Siltuximab, Sipuleucel-T, Sizofiran, Sobuzoxan, Natriumglycididazol, Sonidegib, Sorafenib, Stanozolol, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Talimogen Laherparepvec, Tamibaroten, Tamoxifen, Tapentadol, Tasonermin,
Teceleukin, Technetium (99mTc) Nofetumomab Merpentan, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]- octreotid, Tegafur, Tegafur + Gimeracil + Oteracil, Temoporfin, Temozolomid,
Temsirolimus, Teniposid, Testosteron, Tetrofosmin, Thalidomid, Thiotepa, Thymalfasin, Thyrotropin alfa, Tioguanin, Tocilizumab, Topotecan, Toremifen, Tositumomab,
Trabectedin, Trametinib, Tramadol, Trastuzumab, Treosulfan, Tretinoin, Trifluridine + Tipiracil, Trametinib, Trilostan, Triptorelin, Trofosfamid, Thrombopoietin, Ubenimex, Valrubicin, Vandetanib, Vapreotid, Valatinib, Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Vismodegib, Vorinostat, Yttrium-90-Glasmikrokugeln, Zinostatin, Zinostatin-Stimalamer, Zoledronsäure, Zorubicin. Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit Bindern (z.B. Antikörpern) kombiniert werden, die beispielhaft an die folgenden Targets binden können: OX-40, CD137/4-1 BB, DR3, ID01/ID02, LAG-3, CD40. Da ein nicht Zell-permeabler Toxophormetabolit eines Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) keine schädigende Wirkung auf die Zellen des adaptiven Immunsystems haben sollte, ist die Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit einer Krebsimmuntherapie zur Verwendung in der Behandlung von Krebs oder Tumoren ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung. Der intrinsische Wirkmechanismus von zytotoxischen Binder-Wirkstoffkonjugaten beinhaltet die direkte Auslösung von Zelltod der Tumorzellen und somit die Freisetzung von Tumorantigenen, die eine Immunantwort stimulieren können. Zudem gibt es Hinweise, dass die KSP-lnhibitor-Toxophorklasse Marker des sogenannten immunogenen Zelltod [immunogenic cell death (ICD)] in vitro induziert. Somit stellt die Kombination der Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs- Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen, bevorzugt Antikörpern, gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie eine bevorzugte Methode zur Behandlung von Krebs oder Tumoren da. i) Beispiele therapeutischer Ansätze zur Krebs-Immuntherapie umfassen Immun-modulatorische monoklonale
Antikörper und niedermolekulare Substanzen gerichtet gegen Targets aus der Krebs Immuntherapie, Vakzine, CAR T Zellen, bi-spezifische T Zell-rekrutierende Antikörper, onkolytische Viren, zellbasierte Vakzinierungsansätze. ii) Beispiele ausgewählter Targets aus der Krebs Immuntherapie geeignet für Immun-modulatorische monoklonale
Antikörper umfassen CTLA-4, PD-1/PDL-1 , OX-40, CD137, DR3, ID01 , ID02,TD02, LAG-3, TIM-3 CD40.JCOS / ICOSLJIGIT; GITR/GITRL, VISTA, CD70, CD27,
HVEM/BTLA, CEACAM1 , CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3, TLR's. Die
Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit eine Krebsimmuntherapie könnte daher zum einen Tumoren mit schwach immunogenen Eigenschaften immunogener machen und die Wirksamkeit eine Krebsimmuntherapie verstärken und außerdem eine langanhaltende therapeutische Wirkung entfalten.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden. Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch, zytotoxisch oder immuntherapeutisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden:
• eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im
Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;
• die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;
• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im
Vergleich zur Einzelgabe;
• die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;
• das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie;
• eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen
Standardtherapie. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen,
Emulsionen oder Lyophilisaten. Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation. Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.1 bis 20 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.3 bis 7 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg,
individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt. Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsanqaben von flüssiq/flüssiq-Lösunqen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
Syntheseweqe:
Exemplarisch für die Ausführungsbeispiele sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege zu den Ausführungsbeispielen dargestellt. Schema 1 : Synthese von Lysin-verknüpften ADCs mit Legumain-spaltbarem Linker
In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, n und AK2 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen. a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; b) H2, 10% Pd-C, Methanol 1.5 h, RT; c) 1 , 1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, N,N-Diisopropylethylamin, DMF, Rühren über Nacht bei RT; d) AK2 in PBS, unter Argon 3-5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO zugeben, 60 min Rühren bei RT unter Argon, erneut 3-5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO nachsetzen, 60 min Rühren bei RT unter Argon, dann Reinigung über mit PBS Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und Einstellen der angestrebten Konzentration mit PBS Puffer (pH 7.2)]. Ggf. schließt sich bei Batches noch eine Sterilfiltration an.
Schema 2: S nthese von Cystein-verknüpften ADCs
In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, n und AKi die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen. a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; b): Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA c): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; d) H2, 10% Pd-C, Methanol 1.5 h, RT; e) 1 -{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-6-oxohexyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion, N,N- Diisopropylethyl amin, DMF, Rühren bei RT; f) AK1 in PBS lösen, unter Argon 3-4 Äquivalente TCEP in PBS-Puffer zusetzen und ca. 30 min Rühren bei RT rühren, dann 5- 10 Equivalente von Verbindung E gelöst in DMSO zusetzten, ca. 90 min bei RT Rühren, dann Reinigung über mit PBS Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G- 25, GE Healthcare) und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und Einstellen der angestrebten Konzentration mit PBS Puffer (pH 7.2)]. Ggf. schließt sich bei in vivo Batches noch eine Sterilfiltration an.
Schema 3: Synthese von Cystein-verknüpften ADCs über ring-geöffnete Succinimide
In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, n und AK1 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen. a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; b): Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA c): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; d) H2, 10% Pd-C, Methanol 1.5 h, RT; e) 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion, N,N- Diisopropylethyl amin, DMF, Rühren bei RT; f) AK1 in PBS lösen, unter Argon 3-4 Äquivalente TCEP in PBS-Puffer zusetzen und ca. 30 min Rühren bei RT rühren, dann 5- 10 Equivalente von Verbindung E gelöst in DMSO zusetzten, ca. 90 min bei RT Rühren, dann Umpuffern auf pH 8 über mit PBS Puffer (pH 8) equillibrierten PD 10-Säulen
(Sephadex® G-25, GE Healthcare), dann über Nacht bei RT Rühren; dann ggf. Reinigung über mit PBS Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE
Healthcare) und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und
Einstellen der angestrebten Konzentration mit PBS Puffer (pH 7.2)]. Ggf. schließt sich bei in vivo Batches noch eine Sterilfiltration an.
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für P- gp und MDR1 )
abs. Absolut
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
aq. wässrig, wässrige Lösung
ATP Adenosintriphosphat
BCRP Brustkrebs-Resistenz-Protein, ein Efflux-Transporter
BEP 2-Brom-1 -ethylpyridinium-Tetrafluoroborat
Boc te/t-Butoxycarbonyl
br. breit (bei NMR)
Bsp. Beispiel
BxPC3 humane Tumorzelllinie
C Konzentration
ca. circa, ungefähr
Cl chemische Ionisation (bei MS)
DAR drug-to-antibody ratio
D Dublett (bei NMR)
D Tag(e)
DC Dünnschichtchromatographie
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DCM Dichlormethan
Dd Dublett von Dublett (bei NMR)
DMAP 4-/V,/V-Dimethylaminopyridin
DME 1 ,2-Dimethoxyethan
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (standardisiertes
Nährmedium für die Zellkultur)
DMF Λ/JV-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
D/P Dye(Fluoreszenzfarbstoff)/Protein Verhältnis DPBS, D-PBS, Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
PBS PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537
Zusammensetzung:
0,2 g KCl
0,2 g KH2PO4 (anhyd)
8,0 g NaCI
1 , 15 g Na2HP04 (anhyd)
ad 1 I mit H20 auffüllen
Dt Dublett von Triplett (bei NMR)
DTT DL-Dithiothreitol
d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)
EDC /V'-(3-Dimethylaminopropyl)-A/-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid EGFR Epidermal growth factor receptor = Epidermaler
Wachstumsfaktor Rezeptor
El Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)
ELISA Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay
eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (Name des Massenspektrometer mit Tof =
Time Of Flight und q = Quadrupol)
FCS fötales Kälberserum
Fmoc (9/- -Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl
ges. Gesättigt
GTP Guanosin-5'-triphosphat
H Stunde(n)
HATU 0- (7-Azabenzotriazol-1-yl)-/V,/V,/V',A/'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1 -ethansulfonsäure
HOAc Essigsäure
HOAt 1 -Hydroxy-7-azabenzotriazol
HOBt 1- Hydroxy-1 H-benzotriazol-Hydrat
HOSu A/-Hydroxysuccinimid
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
IC50 halbmaximale Inhibitionskonzentration i.m. intramuskulär, Applikation in den Muskel
i.v. intravenös, Applikation in die Vene
konz. konzentriert
KPL-4 humane Tumorzelllinie
KU-19-19 humane Tumorzelllinie
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie
LLC-PK1-Zellen Lewis lung Carcinoma pork kidney cell line
L-MDR Human MDR1 transfizierte LLC-PK1 Zellen
LoVo humane Tumorzelllinie
M Multiple« (bei NMR)
Me Methyl
MDR1 Multidrug resistence protein 1
MeCN Acetonitril
Min Minute(n)
MOLM-13 humane Tumorzelllinie
MS Massenspektrometrie
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid
MV-4-1 1 humane Tumorzelllinie
NB4 humane Tumorzelllinie
NCI-H292 humane Tumorzelllinie
NMM A/-Methylmorpholin
NMP A/-Methyl-2-pyrrolidinon
NMR Kernresonanzspektrometrie
NMRI Mausstamm, Herkunft aus dem Naval Medical Research
Institute (NMRI)
Nude Mäuse Nacktmäuse(Versuchstiere)
NSCLC Non small cell lung Cancer (Nicht-kleinzelliges
Bronchialkarzinom)
PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
Pd/C Palladium auf Aktivkohle
P-gp P-Glycoprotein, ein Transporterprotein
PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung
quant. quantitativ (bei Ausbeute)
Quart Quartett (bei NMR) Quint Quintett (bei NMR)
Rec-1 humane Tumorzelllinie
Rf Retentionsindex (bei DC)
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
S Singulett (bei NMR)
s.c. subcutan, Applikation unter die Haut
SCI D Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten
Immundefekt (severe combined immunodeficiency)
SK-HEP-1 humane Tumorzelllinie
t Triplett (bei NMR)
TBAF Tetra-n-butylammoniumfluorid
TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphin
TEMPO (2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin-1 -yl)oxyl
Teoc Trimethylsilylethoxycarbonyl
tert. Tertiär
TFA Trifluoressigsäure
TH F Tetrahydrofuran
T3P® 2,4, 6-Tripropyl-1 , 3,5,2, 4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid
U251 humane Tumorzelllinie
UV Ultraviolett-Spektrometrie
v/v Volumen zu Volumen-Verhältnis (einer Lösung)
Z Benzyloxycarbonyl
HPLC- und LC-MS-Methoden:
Methode 1 (LC-MS): Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A ->■ 1 .2 min 5% A - 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm. Methode 2 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1 .7 m; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 %
Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B— 1.5 min 2% B -> 8.5 min 95% B -> 10.0 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.50 mL/min; UV- Detektion: 220 nm
Methode 3 (LC-MS): Instrument MS: Waters (Micromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1 100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 mol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 I Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A ->■ 0.2min 98% A - 3.0 min 5% A^ 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1 .75 mL/min; UV-Detektion: 210 nm Methode 4 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B ->■ 0.3 min 10% B -> 1 .7 min 95% B -> 2.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 5 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A ->■ 6.0 min 5% A - 7.5 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 mL/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.
Methode 6 (LC-MS):
Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A -> 0.5 min 97% A 3.2 min 5% A 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 mL/min; UV- Detektion: 210 nm. Methode 7 (LC-MS):
Instrument: Agilent MS Quad 6150;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 ml_ 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 ml_ 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A ->■ 0.3 min 90% A -> 1 .7 min 5% A 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1 ,20 mL/min; UV- Detektion: 205 - 305 nm.
Methode 8 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B ->■ 2.0 min 2% B -> 13.0 min 90% B -> 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1 .20 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 9: (LC-MS-Prep Reinigungsmethode) Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 μηη, Eluent A: Wasser + 0.05% Ammoniak, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw.
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21 .2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm).
Methode 10: (LC-MS-Analytik-Methode)
Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Säule: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 mm x 2.1 mm, 1 .8 μηη; Eluent A: Wasser + 0.025% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.025% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 1.0 min 5%A - 1.4 min 5%A - 1 .41 min 98%A - 1.5 min 98%A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 nm.
Methode 1 1 (HPLC):
Gerät: HP1 100 Serie Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4,6mm, Best-
Nr.1 .51450.0001 , Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4,6mm, Best.-Nr. 1 .51470.0001
Gradient: Flow 5ml_/ Min
Injection Volume 5μΙ
Solvent A: HCL04 (70%ig) in Wasser (4m U I)
Solvent B: Acetonitril
Start 20% B
0.50 Min 20% B
3.00 Min 90% B
3.50 Min 90% B
3.51 Min 20% B
4.00 Min 20% B
Säulentemperatur: 40°C
Wellenlänge: 210nm
Methode 12 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1 .8 μηι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 2.5 min 95% B 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 ml/min; UV-Detektion: 210 nm/ Optimum Integration Path 210-300 nm.
Methode 13: (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C18 1.7 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 mol
Ammoniumformiat, Eluent B: 1 I Acetonitril; Gradient: 0.0 min 95% A— > 0.1 min 95% A— > 2.0 min 15% A 2.5 min 15% A^ 2.51 min 10% A 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/min; UV-Detektion: 210 nm. Methode 14: (LC-MS) (MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10min)
Gerätetyp MS: ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL; Gerätetyp HPLC: Agilent 1200SL; Säule: Agilent, POROSHELL 120, 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 μπι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.1 % Trifluoressigsäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.1 % Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 2% B 0.3 min 2% B 5.0 min 95% B ^ 10.0 min 95% B; Ofen: 40°C; Fluss: 0.75 ml/min; UV-Detektion: 210 nm
Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.
Ausqanqsverbindunqen und Intermediate:
Intermediat C52 (1 R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5-difluor henyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropan-1 -amin
10.00 g (49.01 mmol) Methyl-4-brom-1 H-pyrrol-2-carboxylat wurden in 100.0 mL DMF vorgelegt und mit 20.76 g (63.72 mmol) Cäsiumcarbonat und 9.22 g (53.91 mmol) Benzylbromid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei RT. Die
Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt und die wässrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Ansatz wurde mit 90.0 g Methyl-4-brom-1 H-pyrrol-2-carboxylat wiederholt.
Die Reinigung der vereinigten beiden Ansätze erfolgte mittles präp. RP-HPLC (Säule: Daiso 300x100; 10μ, Fluss: 250 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 125.15 g (87 % d. Th.) der Verbindung Methyl-1 -benzyl-4-brom-1 H-pyrrol-2-carboxylat.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H]+.
Unter Argon wurden 4.80 g (16.32 mmol) Methyl-1 -benzyl-4-brom-1 H-pyrrol-2-carboxylat in DMF vorgelegt und mit 3.61 g (22.85 mmol) (2,5-Difluorphenyl)boronsäure und 19.20 ml_ ges. Natriumcarbonat-Lösung und 1 .33 g (1.63 mmol) [1 , 1 '-Bis-(diphenylphosphino)- ferrocen]-dichlorpalladium(ll):Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 85 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Ethylacetat gewaschen. Die organische Phase wurde mit Wasser extahiert und dann mit ges. NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 100:3) gereinigt. Die
Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.60 g (67 % d. Th.) der Verbindung Methyl-1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-carboxylat.
LC-MS (Methode 7): Rt = 1.59 min; MS (ESIpos): m/z = 328 [M+H]+.
3.60 g (1 1 .00 mmol) Methyl-1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-carboxylat wurden in 90.0 mL THF vorgelegt und bei 0 °C mit 1 .04 g (27.50 mmol) Lithiumaluminiumhydrid (2.4 M in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Es wurde bei 0 °C ges. Kaliumnatriumtartrat-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung mit Ethylacetat versetzt. Die organische Phase wurde dreimal mit gesättigter
Kaliumnatriumtartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCI-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 30.0 mL Dichlormethan gelöst. Es wurden 3.38 g (32.99 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und 48 h bei RT gerührt. Es wurden nochmals 2.20 g (21.47 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der
Rückstand 2.80 g (1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-carbaldehyd) wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 7): Rt = 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]+. 28.21 g (94.88 mmol) 1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-carbaldehyd wurden zusammen mit 23.00 g (189.77 mmol) (R)-2-Methylpropan-2-sulfinamid in 403.0 mL absol. THF vorgelegt und mit 67.42 g (237.21 mmol) Titan(IV)isopropylat versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 500.0 ml_ ges. NaCI-Lösung und 1000.0 mL Ethylacetat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Es wurde über Kieselgur filtriert und das Filtrat zweimal mit ges. NaCI-Lösung gewaschen. Die org. Phase wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 1500+340 g SNAP, Fluss 200 mL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 :10). LC-MS (Methode 7): Rt = 1.63 min; MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+.
25.00 g (62.42 mmol) (R)-N-{(E/Z)-[1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2- yl]methylen}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurden in absol. THF unter Argon vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 12.00 g (187.27 mmol) tert.-Butyllithium (1 .7 M Lösung in Pentan) bei -78 °C zugegeben und 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Dann wurden bei -78 °C 71.4 mL Methanol und 214.3 mL ges. Ammoniumchlorid-Lösung nacheinander zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen und 1 h bei RT gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (R)-N-{(1 R)-1 -[1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurde ohne weitere
Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 6): Rt = 2.97 min; MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]+.
28.00 g (61.05 mmol) (R)-N-{(1 R)-1 -[1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurden in 186.7 mL 1 ,4-Dioxan vorgelegt und dann mit 45.8 mL HCl in 1 ,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Kinetix 100x30; Fluss: 60 mL/min, MeCN/Wasser). Das Acetonitril wurde im Vakuum verdampft und der wässrige Rückstand wurde mit Dichlormethan versetzt. Die organische Phase wurde mit
Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.2 g (75 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 6): Rt = 2.10 min; MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH2]+, 709 [2M+H]+.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1 H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1 H), 6.94 (m, 1 H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1 H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1 H). Intermediat C58
(2S)-4-[{(1 R)-1-[1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl) amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butansäure
4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 8.99 g (24.5 mmol) von Intermediat L57 gelöst in 175 mL DCM hinzugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit 300 mL DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde anschließend mittels präparativer RP- HPLC (Säule: Chromatorex C18) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im
Hochvakuum getrocknet. So wurden 4.6 g (61 % d. Th.) Methyl-(2S)-4-({(1 R)-1 -[1-benzyl- 4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .97 min; MS (ESIpos): m/z = 614 (M+H)+. 2.06 g (3.36 mmol) von diesem Intermediat wurden in 76 mL DCM vorgelegt und mit 0.81 mL (7.17 mmol) 2-Chlor-2-oxoethylacetat in Gegenwart von 2.1 ml Triethylamin acyliert. Nach 20 h Rühren bei RT wurden weitere 0.36 mL 2-Chlor-2-oxoethylacetat und 0.94 ml Triethylamin zugegeben und der Ansatz weitere 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 500 mL Ethylacetat verdünnt und nacheinander zweimal mit 300 mL 5%-iger Zitronensäure, zweimal mit 300 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und einmal mit 100 mL gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt, dann über
Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 2.17 g (79% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
2.17 g (2.64 mmol) dieses Intermediats wurden in 54 mL THF und 27 mL Wasser gelöst und mit 26 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt und dann mit 1.4 mL TFA auf einen pH-Wert zwischen 3 und 4 eingestellt. Der Ansatz wurde im Vakuum aufkonzentriert. Nachdem THF weitgehend abdestilliert war wurde die wäßrige Lösung zweimal mit DCM extrahiert und anschließend im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Säule:
Chromatorex C18) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand und aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. So wurden 1 .1 g (63% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 656 (M-H)-.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.58 (m, 1 H), 0.74-0.92 (m, 1 1 H), 1.40 (m, 1 H), 3.3 (m, 2H), 3.7 (m, 1 H), 3.8-4.0 (m, 2H), 4.15 (q, 2H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 5.61 (s, 1 H), 6.94 (m, 2H), 7.13-7.38 (m, 7H), 7.48 (s, 1 H), 7.60 (m, 1 H), 12.35 (s, 1 H).
Intermediat C61
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]- beta-alanin
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 60 mg (0.091 mmol) Intermediat C58 mit ß-Alaninmethylester und anschließender Esterspaltung mit 2m Lithiumhydroxidlösung hergestellt. Es wurden 67mg (61 % d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.29 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+.
Intermediat C102
(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}
(glycoloyl)amino]-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}butansäure
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4- oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat acyliert und schließlich mit 2M
Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)\ Intermediat C110(D)
Dibenzyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamat
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Dibenzyl-D-glutamat, das zuvor durch Verteilung zwischen Ethylacetat und 5%-iger Natriumhydrogencarbonatlösung aus seinem p-Toluolsulfonsäure-Salz freigesetzt wurde mit Intermediat C61 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Teoc- Schutzgruppe mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+. Intermediat C111
Di-tert-butyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamat
Zunächst wurde das Dipeptidderivat Di-tert-butyl-beta-alanyl-D-glutamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von kommerziell erhältlichen N- [(Benzyloxy)carbonyl]-beta-alanin und Di-tert-butyl D-glutamat Hydrochlorid (1 :1 ) in Gegenwart von HATU und anschließender hydrogenolytischer Abspaltung der Z- Schutzgruppe hergestellt. Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C102 in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch 1-stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff- Normaldruck hergestellt. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.06 min; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+.
Intermediat C117
Trifluoressigsäure -dibenzyl-N-{(2S)-2-(L-asparaginylamino)-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D- glutamat Salz
Intermediat C1 10D und 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat (251 mg, 764 μηηοΙ) wurden in 21 ml DMF gelöst und mit N, N-Diisopropylethylamin (363 μΙ, 2.01 mmol), versetzt. Die Reaktion wurde bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Chromatorex C18-10) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand lyophilisiert. Das erhaltene Intermediat (578 mg, 52 μηηοΙ) wurde in 20.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (426 mg, 3.13 mmol) versetzt und 40 min bei 50°C nachgerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (914 mg, 3.13 mmol) versetzt, mit 20 ml Wasser verdünnt, mit TFA (200 μΙ) versetzt und kurz nachgerührt. Der Ansatz wurde filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Chromatorex C18-5, 125x40; Fluss: 100 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA Gradient) gereinigt. Nach Lyophilisation wurden der Titelverbindung erhalten.
Intermediat L57 Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat
500.0 mg (2.72 mmol) L-Asparaginsäuremethylester Hydrochlorid und 706.3 mg (2.72 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,5-dioxopyrrolidin-1 -carboxylat wurden in 5.0 mL 1 ,4-Dioxan vorgelegt und mit 826.8 mg (8.17 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im
Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 583.9 mg (74 % d. Th.) der Verbindung (3S)-4- Methoxy-4-oxo-3-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino) butansäure.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.89 min; MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H)-.
592.9 mg (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butansäure wurden in 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan vorgelegt und auf -15 °C abgekühlt und mit 205.8 mg (2.04 mmol) 4-Methylmorpholin und 277.9 mg (2.04 mmol) Isobutylchlorformiat versetzt. Der Niederschlag wird nach 15 min abgesaugt und zweimal mit je 10.0 mL 1 ,2- Dimethoxyethan gewaschen. Das Filtrat wird auf -10 °C abgekühlt und mit 1 15.5 mg (3.05 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 10 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase je einmal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 515.9 mg (91 % d. Th.) der Verbindung Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-homoserinat. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)+.
554.9 mg (2.00 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-homoserinat wurden in 30.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 1.27 g (3.0 mmol) Dess-Martin periodinan und 474.7 mg (6.00 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte über Nacht bei RT. Nach 4 h wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je dreimal mit 10%iger Na2S2C>3-Lösung, 10%iger Citronensäure-Lösung und ges.
Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Man erhielt 565.7 mg (97 % d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1 H), 2.88 (dd, 1 H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1 H), 7.54 (d, 1 H), 9.60 (t, 1 H).
Intermediat L95
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin
Dieses Intermediat wurde ausgehend von N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valin und tert-Butyl- L-alaninathydrochlorid mit klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .34 min; MS (ESIpos): m/z = 323.16 (M+H)+. Intermediat L103
N-(pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-L-alanyl-L-asparagine trifluoroacetate
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie beginnend mit der Kupplung von 4-Pyridinessigsäure mit kommerziell erhältlichem tert-Butyl-L-alanyl-L- alaninat in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin, dann folgender Entschützung mit Trifluoressigsaure, Kupplung mit tert-Butyl-L-asparaginat und anschließender Entschützung der Carboxygruppe mit Trifluoressigsaure hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.15 min; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+.
Intermediat L116
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanin
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem N-
[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung mit tert-Butyl-N-methyl-L-alaninathydrochlorid Salz in Gegenwart von HATU, und schließlich durch Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA hergestellt. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.68 min; MS (ESIpos): m/z = 309 [M+H]+
Intermediat L117
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-L-asparagin -trifluoressigsäure Salz
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem 4 tert-Butyl-L- asparaginat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanin (Intermediat L1 16) in Gegenwart von HATU, und schließlich durch Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.57 min; MS (ESIneg): m/z = 421 [M-H]-
Intermediat L1 18
N-[(Benzyloxy)carbon l]-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-L-alanin
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem tert-Butyl-L- alaninathydrochlorid Salz nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanin (Intermediat L1 16) in Gegenwart von HATU, und schließlich durch Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .25 min; MS (ESIneg): m/z = 378 [M-H]-
Intermediat L121
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-L-leucin
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem tert-Butyl-L- leucinathydrochlorid Salz nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanin (Intermediat L1 16) in Gegenwart von HATU, und schließlich durch Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 0.83 min; MS (ESIneg): m/z = 420 [M-H]-
Intermediat L122
(5S,8S,1 1 S)-1 1-(2-Amino-2-oxoethyl)-8-[2-(benzyloxy)-2-oxoethyl]-5-methyl-3,6,9-trioxo- 1 -phenyl-2-oxa-4,7, 10-triazadodecan-12-säure
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem 4-Benzyl-1-tert-butyl- L-aspartathydrochlorid (1 :1 ) nach klassischen Methoden der Peptidchemie zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-alaninat, dann Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA, dann folgende Kupplung mit 4 tert-Butyl-L-asparaginat in Gegenwart von HATU und schließlich durch erneute
Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.76 min; MS (ESIpos): m/z = 543 [M+H]+ Intermediat L138
1 -Brom-2-oxo-6,9, 12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-säure
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 1 -Amino-3,6,9, 12-tetraoxapentadecan-15- säure mit Bromessigsäureanhydrid in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin hergestellt.
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.05 min; MS (ESIpos): m/z = 386 und 388 (M+H)+.
Intermediat Q1
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl- [{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)amino]-1-oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L1 17 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 -{2- [(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .66 min; MS (ESIneg): m/z = 1 1 19 [M-H]-.
Intermediat Q2
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N1-{(2S)- 4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)amino]-1-oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L1 17 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 , 1 '- [(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 1 195 [M+H]+.
Intermediat Q3
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-alanyl-L-alanyl-N1-{(2S)-4-[{(1 R)-1 - [1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(3- {[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3-oxopropyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 17 zunächst durch Kupplung mit N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin hergestellt. Anschließend wurde das Intermediat in Trifluorethanol aufgenommen und durch Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid wurde das tert- Butoxycarbonyl geschützte Amin freigesetzt. Im nächsten Schritt wurden alle Benzyl- Schutzgruppen durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5- diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.90 min; MS (ESIneg): m/z = 1 181 [M-H]-.
Intermediat Q4 N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N1-{(2S)- 4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)amino]-1-oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L1 17 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1-{6- [(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-6-oxohexyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 3.2 min; MS (ESIpos): m/z = 1 177 [M+H]+.
Intermediat Q5
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N-{(2S)-4- [{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-alaninamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L1 18 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 , 1 '- [(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 1 152 [M+H]+.
Intermediat Q6
N-{(2S)-4-[{(1 R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}
(glycoloyl)amino]-2-[(N-{5-[(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-valyl-L- alanyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L95 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 , 1 '-[(1 ,5- Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 1095 [M+H]+.
Intermediat Q7
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-2-({N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1-yl)acetyl]-L-valyl-L- alanyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L95 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1-{2-[(2,5- Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+.
Intermediat Q8
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N1-{(2S)- 4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)amino]-1-oxobutan-2-yl}-L-leucinamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L121 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 , 1 '-[(1 ,5- Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.02 min; MS (ESIpos): m/z = 1 194 [M+H]+.
Intermediat Q9
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-alanyl-N-methyl-L-alpha-aspartyl- N1-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl) amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3-oxopropyl) amino]-1 - oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L122 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 3 Equiv. 1 , 1 '-[(1 ,5- Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 1225 [M+H]+.
Intermediat Q10
N-(Bromacetyl)-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N1-{(2S)-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3- dicarboxypropyl]amino}-3-oxopropyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C1 10D zunächst durch Kupplung mit Intermediat L1 17 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch 1-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit Bromessigsäureanhydrid in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 1 104 und 1 106 [M+H]+.
Intermediat Q11
N-(18-Brom-17-oxo-4,7, 10,13-tetraoxa-16-azaoctadecan-1 -oyl)-L-alanyl-N-methyl-L- alanyl-N1-{(2S)-4-[{(1 R)-1-[1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-1 -[(3-{[(1 R)-1 ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte zunächst durch Kupplung von Intermediat C1 1 1 mit Intermediat L1 17 in DMF in Gegenwart von 1.5 Equiv. HATU und 3 Equiv. N,N- Diisopropylethylamin. Anschließend wurde die Z-Schutzgruppe durch 2-stündige
Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff- Normaldruck bei RT entfernt. Das entschützte Intermediat wurde dann mit Intermediat L138 in DMF in Gegenwart von 1 .5 Equiv. HATU und 3 Equiv. N,N-Diisopropylethylamin umgesetzt. Im letzten Schritt wurde durch Abspaltung der tert.-Butylestergruppen durch 2 h Rühren bei 50°C mit 8 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 8): Rt = 4.06 min; MS (ESI-pos): m/z = 1353 [M+H]+.
B: Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Koniuqaten (ADO
B-1. Allgemeines Verfahren zur Generierunq von Antikörpern
Die Proteinsequenz (Aminosäuresequenz) der verwendeten Antikörper, zum Beispiel TPP-981 , TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 und TPP-9580, wurde in eine für das entsprechende Protein kodierende DNA Sequenz nach dem Fachmann bekannten Verfahren überführt und in einen für die transiente Säugerzellkultur geeigneten Expressionsvektor inseriert (wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben).
B-2. Allgemeines Verfahren zur Expression von Antikörpern in Säuqerzellen
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-981 , TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP- 8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 und TPP-9580, wurden in transienten Säugerzellkulturen produziert, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express:
Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben.
B-3. Allgemeines Verfahren zur Aufreiniqunq von Antikörpern aus Zellüberständen.
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-981 , TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP- 8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 und TPP-9580, wurden aus den Zellkulturüberständen gewonnen. Die Zellüberstände wurden durch Zentrifugation von Zellen geklärt. Anschließend wurde der Zellüberstand durch Affinitätschromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wurde die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich) equillibriert, der Zellüberstand aufgetragen und die Säule mit ca 10 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper wurden in 50 mM Natriumacetat pH 3.5 + 500 mM Natriumchlorid eluiert und anschließend durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt.
Kommerziell erhältliche Antikörper wurden mit Standard- Chromatographiemethoden aus den Handelsprodukten aufgereinigt (Protein A Chromatopgraphie, präparative
Gelfiltrationschomatographie (SEC - size exclusion Chromatographie)). B-4. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Cvstein-Seitenketten
In die Kupplungsreaktionen wurde folgender Antikörper eingesetzt: Beispiele a: TPP-981 Cetuximab (Anti EGFR AK)
Beispiele c: TPP-6013 (Anti-CD123 AK)
TPP-8987 (Anti-CD123 AK)
TPP-8988 (Anti-CD123 AK)
TPP-9476 (Anti-CD123 AK) Beispiele h: TPP-8382 (Anti-B7H3 AK)
Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK)
Beispiele k: TPP-7006 (Anti-TWEAKR AK)
TPP-7007 (Anti-TWEAKR AK)
Beispiele x: TPP-9574 (Anti-CXCR5 AK) TPP-9580 (Anti-CXCR5 AK)
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 10mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 1 h bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter
Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid-Vorläufer-Verbindung oder Halogenid-Vorläufer-Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde bei Maleinimid-Precursern 60-240 min bei RT und bei Halogenid-Precursern zwischen 8 und 24 h bei RT gerührt und
anschließend über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 mL PBS-Puffer erhalten.
Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den
Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-6.
beschriebenen Methoden ermittelt.
Die in den Beispielen dargestellten ADCs können in Abhängigkeit vom Linker
gegebenenfalls auch mehr oder weniger stark ausgeprägt in Form der hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegen.
Insbesondere die KSP-l-ADCs, die über die Linker-Substruktur
mit Thiolgruppen der Antikörper verknüpft sind, können auch ggf. durch Umpuffern im Anschluss an die Kupplung und ca. 20-24-stündiges Rühren bei pH 8 gemäß Schema 28 gezielt in die über offenkettige Bersteinsäureamide verknüpften ADCs hergestellt werden.
#1 stellt die Schwefelbrücke zum Antikörper dar und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-lnhibitor
Solche ADCs, bei denen der Linker über hydrolysierte offenkettige Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegt, können gegebenenfalls auch gezielt nach den hier exemplarisch aufgeführten Small Scale- und Large Scale- Kupplungen hergestellt werden:
Zu einer Lösung von 2-5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im
Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 7 Äquivalenten Tris(2- carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 20 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorläufer-Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20 Äquivalente eingesetzt werden. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde 60-240 min bei RT gerührt. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf eine Konzentration von 1 -5 mg/mL verdünnt und dann über eine mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde die Lösung durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Medium scale Kupplung:
20-200 mg des betreffenden Antikörpers in PBS-Puffer (c~5-15 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 2-7 Equivalenten, bevorzugt 3 Equivalenten TCEP in PBS- Puffer (c-0.2-0.8 mg/ml bevorzugt 0.5 mg/ml) versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 2-20, bevorzugt 5-10 Equivalente einer Maleinimid- Vorläuferverbindung gelöst in DMSO zugegeben. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20 Äquivalente eingesetzt werden. Nach weiteren 1 .5h-2h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt. Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf eine Konzentration von 2-7 mg/mL verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Dann erfolgte ggf. wieder ein Umpuffern auf pH 7.2. Die ADC- Lösung wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH7.2) und dann ggf. erneut bis auf eine Konzentration von etwa 10 mg/mL
aufkonzentriert. In den dargestellten Strukturformeln kann dabei AKi die Bedeutung haben
Beispiele a: TPP-981 Cetuximab (partiell reduziert)- S§1
Beispiele c: TPP-6013 (Anti-CD123 AK) (partiell reduziert)- S§1 TPP-8987 (Anti-CD123 AK) (partiell reduziert)- S§1 TPP-8988 (Anti-CD123 AK) (partiell reduziert)- S§1 TPP-9476 (Anti-CD123 AK) (partiell reduziert)- S§1
Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK) (partiell reduziert)- S§1
Beispiele h: TPP-8382 (Anti-B7H3 AK) (partiell reduziert)- S§1
Beispiele k: TPP-7006 (Anti-TWEAKR AK) (partiell reduziert)- S§1 TPP-7007 (Anti-TWEAKR AK) (partiell reduziert)- S§1
Beispiele x: TPP-9574 (Anti-CXCR5 AK) (partiell reduziert)- S§1 TPP-9580 (Anti-CXCR5 AK) (partiell reduziert)- S§1 wobei
§1 die Verknüpfung mit der Succinimid-Gruppe oder mit ggf. daraus entstandenen isomeren hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsaureamiden bzw. des
Alkylenrestes bedeutet, und
S für das Schwefelatom eines Cystein-Restes des partiell reduzierten Antikörpers steht.
B-5. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Lysin-Seitenketten
In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: Beispiele a: TPP-981 Cetuximab (Anti EGFR AK) Beispiele c: TPP-6013 (Anti-CD123 AK) TPP-8987 (Anti-CD123 AK) TPP-8988 (Anti-CD123 AK) TPP-9476 (Anti-CD123 AK) Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK) Beispiele k: TPP-7006 (Anti-TWEAKR AK) TPP-7007 (Anti-TWEAKR AK) Beispiele x: TPP-9574 (Anti-CXCR5 AK) TPP-9580 (Anti-CXCR5 AK)
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg/mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 8 Äquivalente der zu kuppelnden Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer-Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Nach
Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs inPBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels
Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die
Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-6. beschriebenen Methoden ermittelt.
In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK2 die Bedeutung Beispiele a: TPP-981 Cetuximab (Anti EGFR AK) - NH§2
Beispiele c: TPP-6013 (Anti-CD123 AK) - NH§2
TPP-8987 (Anti-CD123 AK) - NH§2
TPP-8988 (Anti-CD123 AK) - NH§2
TPP-9476 (Anti-CD123 AK) - NH§2 Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK) - NH§2
Beispiele k: TPP-7006 (Anti-TWEAKR AK) - NH§2
TPP-7007 (Anti-TWEAKR AK) - NH§2 Beispiele x: TPP-9574 (Anti-CXCR5 AK) - NH§2
TPP-9580 (Anti-CXCR5 AK) - NH§2
wobei
§2 die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und
NH für die Seitenketten-Aminogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht. Weitere Aufreiniqunq und Charakterisierung der erfindunqsqemäßen Koniuqate
Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugat lyophilisiert werden.
B-6. Bestimmung des Antikörpers, der Toxophorbeladung und des Anteils geöffneter Cystein-Addukte Zur Protein-Identifizierung wurde neben der Molekulargewichtsbestimmung nach
Deglykosilierung und/oder Denaturierung ein tryptischer Verdau durchgeführt, der nach Denaturierung, Reduktion und Derivatisierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptischen Peptide bestätigt.
Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen
Konjugate in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung (in den Tabellen bezeichnet als DAR, drug-to-antibody ratio), wie folgt bestimmt:
Die Bestimmung der Toxophor Beladung von Lysin-verknüpften ADCs erfolgte nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen
Konjugatspezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosyliert, die Probe angesäuert und nach HPLC-T rennung/Entsalzung
massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das
Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt
Deconvolution berechnet. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/Antibody Ratio) berechnet. Hierzu wurde die Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies.
Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein-verknüpften Konjugaten wurde über Reversed-Phase-Chromatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC-Lösung (1 mg/mL, 50μί) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μί) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.
Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μηι particle size, 1000 Ä) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 25 %B; 3 min, 25 %B; 28 min, 50 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden der leichten Kette mit einem Toxophor (L1 ) und den schweren Ketten mit einem, zwei und drei Toxophoren (H1 , H2, H3) zugeordnet.
Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren (genannt DAR, drug-to- antibody ratio) wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC- Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnete, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnete. In vereinzelten Fällen konnte es vorkommen, dass die Toxophorbeladung aufgrund von Ko-Elutionen einiger Peaks nicht exakt möglich war.
In den Fällen, in denen keine ausreichende HPLC-Trennung von leichter und schwerer Kette möglich war, erfolgte die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein verknüpften Konjugaten mittels massenspektrometrischer Bestimmung der
Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette.
Dazu wurde zur ADC-Lösung (1 mg/mL, 50μί) Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μί) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und massenspektrometrisch nach online Entsaltzung mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert.
Zur DAR-Bestimmung (drug-to-antibody ratio) wurden alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC- Beladung und der LC-Beladung bestimmt. Hierbei berechnete sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks und die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten
Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks.
Bei den geöffneten Konstukten wurde zur Bestimmung des Anteils des geöffneten Cystein-Addukts das Molekulargewichtsflächenverhältnis vom geschlossenen und offenen Cystein-Addukt (Molekulargewichtsdelta 18Dalton) aller einfach konjugierten leichten und schweren Kettenvarianten bestimmt. Der Mittelwert über alle Varianten ergab den Anteil des geöffneten Cystein-Addukts.
B-7. Überprüfung der Antiqen-Bindunq des ADCs
Die Bindefähigkeit des Binders an das Zielmolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder
Oberflächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen,
beispielsweise für Antikörper-Konjugate mittels Proteinbestimmung, (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21 :778-784 und Polson et al., Blood 2007; 1 102:616-623).
Ausführunqsbeispiele Metabolite
Beispiel M1
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Intermediat C1 10D wurden durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.78 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+.
Die nachfolgend beispielhaft dargestellten ADCs können den bevorzugten Metaboliten M1 freisetzen, der bevorzugte phramakologische Eigenschaften hat.
Ausführunqsbeispiele ADCs
Die in den Strukturformen der Ausführungsbeispiele dargestellten ADCs, die über Maleinimid-Reste an Cysteinseitenketten der Antikörper gekuppelt wurden, liegen in Abhängigkeit vom Linker und von dem Kupplungsprotokoll zum überwiegenden Teil in den jeweils dargestellten ring-geöffneten bzw. ring-geschlossenen Formen vor. Zu einem kleinen Anteil kann jedoch die jeweils andere Form in der Präparation enthalten sein. Die Kupplungsreaktionen wurden unter Argon durchgeführt. Alle größeren Batches für in vivo Versuche wurden am Ende der Herstellung steril filtriert.
Beispiele 1
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.26 mg (0.00023 mmol) von Intermediat Q1 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Exemplarische Vorschrift B:
30 mg des entsprechenden Antikörpers in 3 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.172 mg TCEP in 0.3 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 1.57 mg (0.0014 mmol) von Intermediat Q1 gelöst in 300 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 5 mL verdünnt und anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH 8 auf ein Volumen von 7.5 mL verdünnt und über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer pH7.2 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH7.2 eluiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert und steril filtriert.
Folgende ADCs wurden in Analogie zu diesen Vorschriften hergestellt und wie in der Tabelle angegeben charakterisiert:
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
1 a-981 EGFR 981 A 1.85 2.5
1 C-6013 CD123 6013 A 2.0 2.4
1 C-9476 CD123 9476 A 1.96 3.1
1 e-1015 HER2 1015 A 1.75 3.3
1 h-8382 B7H3 8382 B 1 1 .01 3.5
1 k-7006 TWEAKR 7006 A 1.8 2.9
1 k-7007 TWEAKR 7007 B 7.84 3.3
1x-9574 CXCR5 9574 A 1.26 2.9 Beispiele 2
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml_ PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.2 mg) von Intermediat Q2 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Exemplarische Vorschrift B:
Zu 30 mg des betreffenden Antikörpers in 3 ml_ PBS Puffer (pH7.2) (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 4 Eq (1 mg) von Intermediat Q2 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS (pH7.2) und erneut
aufkonzentriert und steril filtriert. Exemplarische Vorschrift C:
Zu 50 mg des betreffenden Antikörpers in 5 ml_ PBS Puffer (pH7.2) (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 2.5 Eq (1 mg) von Intermediat Q2 gelöst in 250μί DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 7.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS (pH7.2) und erneut
aufkonzentriert und steril filtriert.
Exemplarische Vorschrift D:
Zu 1000 mg des betreffenden Antikörpers in 150 ml_ PBS Puffer (pH7.2) (c = 6.7 mg/mL) wurden unter Argon 4.5 Eq (36 mg) von Intermediat Q2 gelöst in 7.5ml_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz über cross-flow Filtration gereinigt, aufkonzentriert und steril filtriert.
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
2a-981 EGFR 981 A 2.23 4.5
2c-6013 CD123 6013 A 2.32 4.9
2c-8987 CD123 8987 B 8.86 5.8
2C-8988 CD123 8988 B 9.81 3.6
2C-9476B CD123 9476 B 10.27 4.2
2C-9476C CD123 9476 C 9.22 3.4
2C-9476D CD123 9476 D 15.83 6.3
2e-1015 HER2 1015 A 2.05 5.4
2k-7006 TWEAKR 7006 A 2.09 5.9
2k-7007 TWEAKR 7007 B 9.32 3.4
2x-9574 CXCR5 9574 B 9.5 4.8
2X-9580 CXCR5 9580 B 10.12 4.8
Beispiele 3
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml_ PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.2 mg) von Intermediat Q3 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Exemplarische Vorschrift B:
Zu 30 mg des betreffenden Antikörpers in 3 ml_ PBS Puffer (pH7.2) (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 4 Eq (1 mg) von Intermediat Q3 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS (pH7.2) und erneut
aufkonzentriert und steril filtriert.
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
3a-981 EGFR 981 A 1.99 5.0
3C-9476 CD123 9476 A 2.09 5.8 Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
3e-1015 HER2 1015 A 2.06 6.3
3k-7007 TWEAKR 7007 A 2.1 1 5.3
3x-9574 CXCR5 9574 A 2.02 4.5
Beispiele 4
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.275 mg (0.00023 mmol) von Intermediat Q4 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer (pH 7.2) eluiert.
Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
4c-9476 CD123 9476 A 2.06 3.5
4k-7007 TWEAKR 7007 A 1.87 4.0
4x-9574 CXCR5 9574 A 1.93 3.6
Beispiele 5
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.2 mg) von Intermediat Q5 gelöst in 50μί DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
5C-9476 CD123 9476 A 2.37 5.3
5e-1015 HER2 1015 A 2.33 5.5
5k-7007 TWEAKR 7007 A 2.18 5.6
5X-9574 CXCR5 9574 A 1.88 6.8 Beispiele 6
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml_ PBS (c = 12.5 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.18 mg) von Intermediat Q6 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
6a-981 EGFR 981 A 2.39 4.9
6C-9476 CD123 9476 A 1.8 5.3
6e-1015 HER2 1015 A 2.23 6.2
6k-7007 TWEAKR 7007 A 2.57 5.6 Beispiele 7
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.4 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.24 mg (0.00023 mmol) von Intermediat Q7 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt und anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
7a-981 EGFR 981 A 2.03 3.4
7c-9476 CD123 9476 A 1.53 4.0
7e-1015 HER2 1015 A 1.88 3.8
7k-7007 TWEAKR 7007 A 1.99 3.6 Beispiele 8
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.2 mg) von Intermediat Q8 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
8a-981 EGFR 981 A 2.32 6.5
8C-9476 CD123 9476 A 2.37 6.9
8e-1015 HER2 1015 A 1.46 6.6
8k-7007 TWEAKR 7007 A 2.43 6.7 Beispiele 9
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.2 mg) von Intermediat Q9 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
9a-981 EGFR 981 A 2.34 4.4
9C-9476 CD123 9476 A 2.65 4.2
9e-1015 HER2 1015 A 2.22 4.8
9k-7007 TWEAKR 7007 A 2.14 3.8 Beispiele 10
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.295 mg (0.00023 mmol) von Intermediat Q10 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 20h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 ml_ verdünnt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer (pH 7.2) eluiert.
Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2).
Exemplarische Vorschrift C zum Erzielen einer höheren DAR:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.057 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.59 mg (0.00053 mmol) von Intermediat Q10 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 20h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer (pH 7.2) eluiert.
Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
10a-981 EGFR 981 A 1.9 3.2
10C-9476 CD123 9476 A 1.83 2.7
10C-9476 CD123 9476 C 1.97 4.8
hD
10e-1015 HER2 1015 A 1.83 3.4
10k-7007 TWEAKR 7007 A 1.9 4.7
I Ox-9574 CXCR5 9574 A 1.41 3.8
I Ox-9574 CXCR5 9574 C 0.97 6.3
hD
Beispiele 11
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.32 mg (0.00023 mmol) von Intermediat Q1 1 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 20h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer (pH 7.2) eluiert.
Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2).
Zum Verqleichszwecken wurde folgende ADCs hergestellt:
Referenzbeispiel R1 :
Solche ADCs wurden in WO2015/096982 und in WO2016/096610 mit verschiedenen Antikörpern wie beispielsweise auch Cetuximab und Trastuzumab offenbart. Zu
Vergleichszwecken wurde der dort offenbarte Precursor Intermediat F194 weiterhin auch mit TPP-6013 (Anti-CD123 AK) umgesetzt. Folgende ADCs wurden zu
Vergleichszwecken herangezogen: Beispiel Target Antikörper C [mg/mL] DAR
TPP-
R1 a EGFR 981 1 .67 1.9
R1 c CD123 6013 0.42 2.9
R1 e HER2 1015 1 .39 2.4
Rix CXCR5 9574 1 .28 2.2
Referenzbeispiel R2:
Solche ADCs wurden in WO2016/096610 mit einem aglycosilierten anti-TWEAKR
Antiköper offenbart. Zu Vergleichszwecken wurde der dort offenbarte Precursor
Intermediat F291 weiterhin auch mit TPP-9574 (Anti-CXCR5 AK), TPP-981 (anti-EGFR) und TPP-1015 (anti-HER2 AK) umgesetzt. Folgende ADCs wurden zu Vergleichszwecken herangezogen:
Für die Referenzbeispiele R1 wurde in WO2015/096982 der daraus gebildete Metabolit Beispiel 98 beschrieben. Für die Referenzbeispiele R2 wurde in WO2016/096610 der identische Metabolit Beispiel M9 beschrieben, der hier als Referenzbeispiel R3M aufgeführt wird.
Referenzbeispiel R3M: N-(3-Aminopropyl)-N-{(1 R)-1 -[1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydrox acetamid
Die Herstellung wurde in WO2015/096982 als Beispiel 98 beschrieben.
Die biologischen Daten zu diesen Referenzverbindungen, die in den besagten
Anmeldungen offenbart bzw. mit den neuen Referenzverbindungen erhoben wurden sind in Kapitel C beschrieben.
C: Bewertung der biologischen Wirksamkeit
Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden: a. C-1a Bestimmung der cytotoxischen Wirkung der ADCs Die Analyse der cytototoxischen Wirkung der ADCs erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:
NCI-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinomzellen, ATCC-CRL-1848,
Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-positiv; EGFR-positiv.
BxPC3: humane Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, ATCC-CRL-1687, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR- positiv
LoVo: humane kolorektale Krebszellen, ATCC No. CCL-229, Kultivierung für MTT-Assay: Standardmedium: Kaighn's + L-Glutamin (Invitrogen 21 127) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064). Kultivierung für CTG-Assay: RPMI 1640 (Biochrom;
#FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442). TWEAKR-positiv.
KPL4: humane Brustkrebszelllinie, Bayer Pharma AG (identity checked and confirmed on 19.7.2012 at DSMZ), Standardmedium: RPMI 1640 (Fa. Gibco; #21875- 059, stab. L- Glutamin) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); HER2-positiv.
SK-HEP-1 : humane Leberkrebszelllinie, ATCC No. HTB-52, Standardmedium: MEM mit Earle's Salzen + Glutamax I (Invitrogen 41090) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); EGFR-positiv, TWEAKR-positiv
MOLM-13: humane akute monozytäre Leukämiezellen (AML-M5a), DSMZ, No. ACC 554, Standardmedium: RPMI 1640 (Fa. Gibco; #21875- 059, stab. L-Glutamin) + 20% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); CD123-positiv.
MV-4-1 1 : humane biphenotypische B myelomonozytische Leukämiezellen gewonnen aus peripheren Blut, ATCC-CRL-9591 , Standardmedium: IMDM (ATCC: 30-2005), + 10% heat inactivated FCS (Gibco, No. 10500-064); CD123-positiv. NB4: humane akute promyelozytische Leukämiezellen gewonnen aus Knochenmark , DSMZ , No. ACC 207, Standardmedium: RPMI 1640 + GlutaMAX I (Invitrogen 61870) + 10% heat inactivated FCS (Gibco, No. 10500-064) + 2.5 g of Glukose (20% Glucose Lösung, Gibco, No.19002) + 10 mM Hepes (Invitrogen 15630) + 1 mM Sodium Pyruvat (Invitrogen 1 1360); CD123-negativ
Rec-1 : humane Mantelzell Lymphomzellen (B Zell non-Hodgkin's Lymphoma) ATCC CRL- 3004, Standardmedium: RPMI 1640 + GlutaMAX I (Invitrogen 61870) + 10% heat inactivated FCS (Gibco, No. 10500-064) + 10 mM) CXCR5-positiv
U251 : humane Glioblastomzellen, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, Stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #S0415);B7H3-positiv
HBL-1 : humane B Zell Lymphom-Zellen (Diffuse large B-cell lymphoma) ATT CRL- RRID (Resource Identification Initiative): CVCL_4213, erstmals beschrieben in Abe et al. Cancer 61 :483-490(1988), erhalten von Prof. Lenz, Universität Münster; Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #S0415), Kultivierung analog zu Rec-1 Zellen; CXCR5 positiv
Die Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) oder des Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) für die jeweiligen Zelllinien angegeben.
CTG-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach StandardMethode, mit den unter C-1
angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Trypsin (0.05%) und EDTA (0.02%) in PBS (Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Costar #3610) ausgesät (in 75μΙ/ίοοΙι, folgende Zellzahlen je Loch: NCI- H292: 2500 Zellen/ Loch, BxPC3 2500 Zellen / Loch, LoVo 3000 Zellen / Loch) und im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Die Suspensionszellen wurden gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Costar #3610) ausgesät (in 75μΙ/ϋ3θϊι, folgende Zellzahlen je Loch: Rec-1 : 3000 Zellen / Loch, HBL-1 : 6000
Zellen/Loch). Nach 24h wurden die Antikörper-Wirkstoffkonjugate in 25μΙ Kulturmedium (vierfach konzentriert) auf die Zellen gegeben, so dass finale Konzentrationen der Antikörper-Wirkstoffkonjugate von 3 x 10"7 M bis 3 x 10"11 M auf den Zellen erreicht wurden (Triplikate). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5%
Kohlendioxid inkubiert. In einer parallelen Platte wurde die Zellvitalität zu Beginn der Wirkstoff behandlung (Tag 0) mit dem Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega #G7573 und #G7571 ) bestimmt. Dazu wurden pro Zellansatz 10ΟμΙ des Substrats hinzugefügt, die Platten anschließend mit Alufolie abgedeckt, für 2 Minuten mit dem Plattenschüttler bei 180 rpm geschüttelt, für 8 Minuten auf der Laborbank stehen gelassen und dann mit einem Luminometer (Victor X2, Perkin Elmer) gemessen. Das Substrat detektiert den ATP-Gehalt in den lebenden Zellen, wobei ein Lumineszenz- Signal erzeugt wird, dessen Höhe direkt proportional zur Vitalität der Zellen ist. Nach 72h Inkubation mit den Antikörper-Wirkstoffkonjugaten wurde nun auch in diesen Zellen die Vitalität mit dem Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay wie oben beschrieben bestimmt. Aus den gemessenen Daten wurde die I C50 der Wachstumshemmung im Vergleich zum Tag 0 unter Verwendung des DRC (Dose Response Curve) Analysis Spreadsheets anhand einer 4-Parameter Anpassung berechnet. Das DRC Analysis
Spreadsheet ist ein von Bayer Pharma AG und Bayer Business Services auf der Plattform IDBS E-WorkBook Suite entwickeltes Biobook Spreadsheet (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK).
MTT-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C-1
angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NCI H292: 2500 Zellen/well; SK-HEP-1 : 1000 Zellen/well; KPL-4: 1200 Zellen/well; in 100μί Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Dann wurden die Antikörper-Wirkstoff-Konjugate in 10μΙ Kulturmedium in Konzentrationen von 10"5M bis 10"13M zu den Zellen (Triplikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Die Suspensionszellen wurden gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (#3610) (MOLM-13: 2000 Zellen/well; NB4: 7000 Zellen/well; MV-4-1 1 : 5000 Zellen/well in einem Gesamtvolumen von 100 μΙ). Nach 6-stündiger Inkubation im Inkubator bei 37°C und 5% Kohlendioxid wurde das Medium gewechselt und die
Antikörper Wirkstoff Konjugate oder Metabolite in 10μΙ Kulturmedium in Konzentrationen von 10"5M bis 10"13M zu den Zellen (Triplikate) in 90μΙ zupipettiert. Die Inkubation des Ansatzes im Inkubator erfolgte bei 37°C und 5% Kohlendioxid. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproliferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-101 OK). Hierzu wurde das MTT Reagens für 4h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570nm (Infinite M1000 pro, Fa.
Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde die I C50 der Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die Proliferation ohne
Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert.
In den folgenden Tabellen 1 a und 1 b sind die ICso-Werte repräsentativer
Ausführungsbeispiele aus diesen Assays aufgeführt:
Tabelle 1 a
NCI-H292 L0V0 SKHep-1 BxPC3 KPL-4
MOLM 13 MV-4-11
ICso [M ] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
Beispiel ICso [M] ICso [M]
MTT CTG MTT CTG [MTT] MTT MTT
/CTG
1 a-981 2.65E-1 1 6.70E-08
l c-6013 3.15E-10 2.29E-08
1 C-9476 2.28E-09 3.19E-09
1 e-1015 1 .51 E-09
1 k-7006 1.12E-10 5.37E-1 1 3.62E-1 1 1 .04E-10
1 k-7007 6.56E-1 1 6.70E-1 1 8.42E-1 1 9.61 E-1 1
2a-981 5.50E-12 1.79E-10
2C-6013 1 .78E-1 1 4.77E-10
2C-8987 4.59E-10 1 .26E-10
2C-8988 8.91 E-1 1 4.39E-09
2c-
9.15E-10 5.08E-10
9476B NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4
MOLM 13 MV-4-11
ICso [M ] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
Beispiel ICso [M] ICso [M]
MTT CTG MTT CTG [MTT] MTT MTT
/CTG
2c-
1.3E-08 2.01 E-09
9476C
2c-
1.10E-09 6.80E-11
9476D e-1015 1.43E-10 k-7006 5.86E-11 1.50E-11 2.04E-11 9.92E-11 k-7007 8.82E-11 1.50E-11 7.54E-11
3a-981 7.73E-13 1.11 E-10
C-9476 2.00E-10 1.05E-11 e-1015 3.64E-11 k-7007 5.49E-11 1.50E-11 9.80E-11
4a-981 8.40E-10 1.57E-10
c-9476 8.40E-10 1.57E-10
k-7007 7.74E-10 1.50E-11 1.18E-10
C-9476 1.08E-09 4.40E-11 e-1015 4.50E-10 k-7007 1.12E-10 1.50E-11 3,03E-10
X-9574
6a-981 1.68E-12 5.00E-07
C-9476 4.46E-10 1.24E-10 e-1015 5.54E-10k-7007 6.94E-11 4.93E-11 1.89E-10
7a-981 2.34E-10
C-9476 1.09E-09 6.41 E-10 e-1015 4.51E-10 NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4
MOLM 13 MV-4-11
ICso [M ] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
Beispiel ICso [M] ICso [M]
MTT CTG MTT CTG [MTT] MTT MTT
/CTG
7k-7007 1.03E-10 1.43E-09 4.39E-10
8a-981 9,87E-12 3,96E-08
8C-9476 3,36E-10 3.46E-11
8e-1015 4.30E-10
8k-7007 1.84E-10 3.66E-11 4.17E-10
9a-981 1.00E-11 4.29E-08
9C-9476 5.00E-07 1.44E-07
9e-1015 1.39E-10
9k-7007 1.45E-10 3.17E-11 2.69E-10
10a-981 1.00E-12 5.00E-07
IOc-9476 1.41E-09 8.42E-10
10C-9476
1.79E-10 5.45E-11
hD
10e- 3.78E-11 1015
10k-7007 9.60E-11 1.50E-11 1.29E-10
11a-981 1.98E-12 2.59E-08
11C-9475 9.61 E-08 6.90E-08
11e- 2.37E-10 1015
11k-7007 1.74E-10 1.62E-10 Tabellelb
In der folgenden Tabelle 1c sind die ICso-Werte der Referenzbeispiele aus diesen Assays aufgeführt. Tabelle 1c
MOLM 13 Rec-1 ICso NCI-H292 SKHep-1 KPL-4
Beispiel ICso [M] [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT CTG MTT MTT [MTT]
R1a 6.14E-11 1.85E-10
R1c 1.24E-07
R1e 1.55E-08
Rix 3.00E-07
R2a 2.10E-10 6.02E-08
R2e 4.39E-08
R2x 3.00E-07 Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele mit den angegebenen Drug/mAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Exprimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der Antikörper-Wirkstoffkonjugate war selektiv versus der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt. Bei den gegen CD123 gerichteten ADCs wurde die Targetspezifität zusätzlich durch Testung an einer CD123 negativen Zelle gezeigt. Die erfindungsgemäßen ADCs zeigen im Allgemeinen eine deutlich verbesserte zytotoxische Potenz gegenüber den korrespondierenden Referenzbeispielen.
C-1 b Bestimmung der Inhibition des Kinesinspindelproteins KSP/ Eq5 durch ausgewählte Beispiele
Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP /Eg5 (Fa. tebu-bio/
Cytoskeleton Inc, No. 027EG01 -XL) wurde in einer Konzentration von 10nM mit 5C^g/ml Taxol (Fa. Sigma No. T7191-5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc) für 5 min bei RT in 15mM PIPES, pH 6,8 (5mM MgCI2 und 10mM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Corning) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1.0 x10-6M bis 1.0x 10-13M und ATP (finale Konzentration 500μΜ; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit-Grün detektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50min Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgt. Als Positivkontrolle wurden Monastrol (Fa. Sigma, M8515-1 mg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience A10486) verwendet. Die Einzeldaten der Dosis-Wirkungskurve stellen achtfach
Bestimmungen dar. Bei den ICso-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe. In der folgenden Tabelle 2 sind die ICso-Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus dem beschriebenen Assay und den korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT- Assay) zusammengefasst: Tabelle 2
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele. C-1 c Enzymatische Assavs
a: Cathepsin B-Assay
Für jede zu untersuchende Cathepsin B-spaltbare Prodrug wurde ein Ansatz in einem Mikroreaktionsgefäße (0.5ml, Fa. Eppendorf) angesetzt. Das hier verwendete Enzym wurde aus humanem Lebergewebe gewonnen. Es wurden 2μg Cathepsin B (Sigma C8571 25 μg) vorgelegt und mit 50mM Na-Phosphat Puffer, pH6.0, 2mM DTT auf ein Gesamtvolumen von 20C^Laufgefüllt. Dann wurden 50 μΙ_ der zu untersuchenden Substratlösung zupipettiert. Die Inkubation des Ansatzes erfolgte im Thermoblock (Fa. Thermo Fisher Scientific) bei 40°C unter ständigem Schütteln bei 300rpm. Die
enzymatische Reaktion wurde kinetisch kontrolliert. Hierzu wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten eine 10μΙ_ Probe entnommen. Die entnommene Probe wurde sofort mit 20μΙ_ eiskaltem Methanol versetzt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und dann bei - 20°C eingefroren. Die gewählten Zeitpunkte zur Probenentnahme waren nach 10min, 2h, 4h und 24h. Die Proben wurden mittels RP-HPLC-Analyse untersucht (reverse phase HPLC, Fa. Agilent Technologies 1200er Series). Die Bestimmung des freigesetzten Toxophors ermöglichte die Bestimmung der Halbwertszeit 12 der enzymatischen
Reaktion. b: Legumain Assay
Der Legumain Assay wurde mit rekombinatem humanem Enzym durchgeführt. Die rhLegumain Enzymlösung (Catalog # 2199-CY, R&D Systems) wurde in 50mM Na-Acetat Puffer/ 100mM NaCI, pH4.0 auf die gewünschte Konzentration verdünnt und 2h bei 37°C vorinkubiert. rhLegumain wurde dann in 50mM MES Puffer, 250mM NaCI, pH 5.0 auf eine finale Konzentration von l ng/μΙ. eingestellt. Für jede zu untersuchende Legumain- spaltbare Prodrug wurde ein Ansatz in einem Mikroreaktionsgefäße (0.5ml, Fa.
Eppendorf) angesetzt. Hierzu wurde die Substratlösung mit 50mM MES Puffer, 250mM NaCI, pH 5.0 auf die gewünschte Konzentration (2-fach konzentriert) eingestellt. Für die kinetische Messung der enzymatischen Reaktion wurden zunächst 250μΙ_ der
Legumainlösung vorgelegt und durch Zugabe von 250μΙ_ der Substratlösung (finale Konzentration einfach konzentriert; 3μΜ) wurde die Enzymreaktion gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden je 50μΙ_ Proben entnommen Diese Probe wurde sofort mit 100μΙ_ eiskaltem Methanol versetzt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und dann bei -20°C eingefroren. Die gewählten Zeitpunkte zur Probenentnahme waren nach 0,5h, 1 h, 3h und 24h. Die Proben wurden dann anschließend mittels RP-HPLC-Analyse und durch LC-MS Analytik untersucht. Die Bestimmung des freigesetzten Toxophors ermöglichte die Bestimmung der Halbwertszeit h/2 der enzymatischen Reaktion.
Als repräsentative Beispiele, um die Legumain-vermittelte Spaltung zu zeigen, wurden als Substrate im Legumain-Assay die Modellverbindungen A und B hergestellt.
Referenzbeispiel Modellverbindunq A
N-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-L-alanyl-N1-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -(methylamino)-1-oxobutan-2-yl]-L- aspartamid
Zunächst wurde Trifluoressigsäure-(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methylbutanamid wie in WO 2015096982 A1 beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem
Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L103 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 902 [M+H]+.
Referenzbeispiel Modellverbindunq B
N-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N1-[(2S)-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -(methylamino)-1- oxobutan-2-yl]-L-aspartami
Zunächst wurde Trifluoressigsäure (2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methylbutanamid wie in WO 2015096982 A1 beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem
Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L1 18 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 916 [M+H]+.
Modellverbindung A wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen von Legumain mit einer Halbwertszeit von 0.4 h zur Zielverbindung gespalten.
Modellverbindung B wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen von Legumain mit einer Halbwertszeit von 0.5 h zur Zielverbindung gespalten.
C-2 Internalisierunqsassav
Internalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper-Drug- Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen Antikörpern und einem Isotyp-Kontrollantikörper verfolgt. Hierzu wurde zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgte mit zweifach bis 10-fach molarem Überschuss von CypHer 5E mono NHS ester (Batch 357392, GE Healthcare) bei pH 8,3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischung gelchromatographisch aufgereinigt (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768; Elutionspuffer:
DULBECCO'S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH-Wert zu adjustieren. Die Ankonzentrierung der Proteinlösung erfolgte mittels VIVASPIN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec). Die Bestimmung der dye load des Antikörpers erfolgte mittels spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung (D/P = Ad e Sprotein :(A280-0, 1 6Adye)Sdye). Die dye load der hier untersuchten Antikörpern sowie der Isotyp-Kontrolle lagen in vergleichbarer Größenordnung. In Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die
Kupplung zu keiner Affinitätsänderung der Antikörper führte.
Die markierten Antikörper wurden im Internalisierungs-Assays eingesetzt. Vor dem Behandlungsstart wurden Zellen (2x104/well) in 100μΙ_ Medium in einer 96-MTP ausgesät (fat, black, clear bottom No 4308776, Fa. Applied Biosystems). Nach 18h Inkubation bei 37°C/5%C02 wurde das Medium gewechselt und markierte Antikörper in variierender Konzentration hinzugefügt (10, 5, 2.5, 1 , O.^g/mL). Das gleiche Behandlungsschema erfolgte mit der markierten Isotyp-Kontrolle (negative Kontrolle). Die gewählten
Inkubationszeiten waren 0h, 0,25h, 0,5h, 1 h, 1 ,5h 2h, 3h, 6h and 24h. Die Fluoreszenz- Messung wurde mit Hilfe des InCellAnalyzer 1000 (Fa. GE Healthcare) durchgeführt. Es erfolgte eine kinetische Evaluierung über die Messung der Parameter granule counts/cell und totale granule intensity/cell.
Antikörper wurden nach Bindung an den Rezeptor auf ihre Internalisierungsfähigkeit hin untersucht. Hierzu wurden Zellen mit verschiedenen Expressionsleveln des Rezeptors gewählt. Es konnte Target-vermittelte spezifische Internalisierung mit den Antikörpern beobachtet werden, wohingegen die Isotyp-Kontrolle keine Internalisierung zeigte.
C-2b Internalisierunqsassav mit Suspensionszellen
Die Kupplung des Fluoreszenzfarbstoffs erfolgte wie unter C2 beschrieben. Das zu untersuchende Antigen wird von hämatopoetischen Suspensionszellen exprimiert, deshalb wurde die Internalisierung in einem FACS basierten Internalisierungsassay untersucht.
Es wurden Zellen mit verschiedenen Target Expressionslevel untersucht- Die Zellen (5x104/well) wurden in eine 96-MTP (Greiner bio-one, CELLSTAR, 650 180, U-bottom). in 100 μΙ Gesamtvolumen ausgesät Nach Zugabe des targetspezifischen Antikörpers in einer Endkonzentration von 10μg/ml, wurden die Ansätze bei 37°C unterschiedlich lang inkubiert (1 h, 2h, 6h, Dreifachbestimmung). Die Isotyp-Kontrolle wurde unter identischen Bedingungen behandelt. .Ein paraller Ansatz wurde konstant bei 4°C behandelt. und inkubiert (negative Kontrolle). Die FACS Analyse wurde mit Hilfe des Guava flow
Cytometers (Millipore) durchgeführt.. Die kinetische Evaluierung erfolgte über Messung der Fluoreszenzintensität, und die Auswertung wurde mit Hilfe der guavaSoft 2.6 Software (Millipore) durchgeführt. Für die hier beschriebenen Targets und targetspezifischen Antikörper konnte eine signifikante und spezifische Internalisierung in verschiedenen Zellen detektiert werden, Die Isotyp-Kontrollen zeigten keine Internalisierung.
C-2c Co-Lokalisation Untersuchungen der anti-CD123 Antikörper Die Generation des aktiven Metaboliten des Antikörper-Wirkstoff Konjugates erfolgt aufgrund des Linkers durch lysosomale Degradation. Dementsprechend ist das intrazelluläre trafficking nach erfolgter Internalisierung von essentieller Bedeutung. Die Untersuchungen zur Co-Lokalisation des Antikörpers mit Markern spezifisch für das lysosomale Organeil (z.B.. Oberflächenmoleküle oder kleine GTPasen), ermöglichen die Selektion von Antikörpern mit gewünschtem Profil. Hierzu wurden target positive Zellen (5x104/well) in 100 μΙ Gesamtvolumen in einer 96-MTP (Greiner bio-one, CELLSTAR, 650 180, U-bottom) ausgesät. Nach Zugabe des CypHer5E-markierten anti-target Antikörpers (finale Konzentation 20 Mg/ml), wurden die Ansätze (Dublikate pro Zeitpunkt) bei 37°C für 30 min, 2h und 6h im Inkubator (5% CO2) inkubiert. 30 min vor Beendigung der gewählten Inkubationszeit wurde den zu untersuchenden Ansätzen der Lysosom spezifische Marker hinzugfügt. Die Lysosome wurden mit CytoPainter LysoGreen indicator reagent (finale Konzentration 1 :2000; abcam, ab176826) gefärbt.. Nach der Inkubation wurden 200 μΙ eiskalter FACS Puffer (DULBECCO'S PBS, Sigma-Aldrich, No. D8537 + 3 % FBS heat inactivated FBS, Gibco, No. 10500-064) hinzugefügt und die Zellsuspension bei 400 x g, 4°C für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 300μΙ eiskaltem FACS-Puffer resuspendiert und erneut zentrifugiert (4 min, 400 x g bei 4°C). Nach erfolgter
Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 30 μΙ eiskalten FACS Puffer aufgenommen. Die Proben wurden dann einer sofortigen FACS/image Analyse (FlowSight amnis, Millipore) unterzogen. Die Co-Lokalisation wurde mittels einer spezifischen Software ausgewertet (Co-Localisation Software IDEAS Application v6.1 ). In Tablle 3 sind die Ergebnisse aus diesem Assay beispielhaft für die anti-CD 123 Antikörper zusammengefasst. Tabelle 3
Die humanisierten Antikörper TPP-9476 und TPP-8987 zeigen ein deutlich verbessertes Profil im Vergleich zu dem parentalen murinen Antikörper.
C-3 In vitro Tests zur Bestimmung der Zell-Permeabilität
Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in w'/roTestung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2-Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R.
Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch- Filterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol-Massen- spektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Pa (B-A) zu Papp (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0.5 war.
Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [Pa (B-A)] und das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A-B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2 -Zellen, so dass die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilt. Dies intrazelluläre Verbleiben des Metaboliten erhöht die Wahrscheinlichkeit für eine
Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin-Spindelprotein, KSP / Eg5), was zu einer verbesserten zytotoxischen Wirkung führt. In der folgenden Tabelle 4 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle 4
Der Metabolit M1 , der aus den erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugaten gebildet werden kann, zeigt sowohl einen deutlich reduzierten Transport aus der Zelle als auch eine reduzierte Efflux-Ratio gegenüber dem Referenzmetaboliten R3M, der aus den Binder-Wirkstoff-Konjugaten der Referenzbeispiele 2 gebildet werden kann.
C-4 In vitro Tests zur Bestimmung der Substrateiqenschaften für P-Glvcoprotein (P-qp)
Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen. Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCB1 ) wurden mittels eines Flux- Assays unter Verwendung von LLC-PK1 -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDR1- Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et al., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PK1- oder L-MDR1 -Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermectin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol- Massenspektrometer API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux-Verhältnis Papp (B-A) zu Papp (A-B) >2 war.
Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateigenschaften können die Efflux- Verhältnisse in L-MDR1- und LLC-PK1 -Zellen oder das Efflux-Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat.
C-5 Pharmakokinetik
Nach i.v. Applikation von 5 mg/kg von Beispiel 2c-9476 (DAR 6.3) und Beispiel 2c-9476 (DAR 3.4) in männliche Wistar Ratten wurden die Plasmakonzentrationen der ADCs mittels ELISA gemessen und die pharmakokinetischen Parameter wie Clearance (CL), Fläche unter der Kurve (AUC) und Halbwertszeit (ti/2) berechnet.
In Tabelle 5 sind die pharmakokinetischen Parameter des Beispiels 2c-9476 mit DAR 6.3 und DAR 3.4 zusammengefasst. Tabelle 5
In dieser orientierenden Ratten PK Studie nach i.v. Applikation wurde für beide Beispiele ein typisches IgG Profil beobachtet. Es konnten keine nennenswerten Unterschiede zwischen Beispiel 2c-9476 mit DAR 6.3 und DAR 3.4 festgestellt werden.
Analytik zur Quantifizierung der verwendeten ADCs
Der Antikörperteil der ADCs wurde mittels Liganden-Bindungs-Assay (ELISA) als Gesamt- IgG-Konzentration in Plasmaproben und Tumorlysaten bestimmt. Dabei wurde das Sandwich-ELISA-Format verwendet. Dieser ELISA war qualifiziert und validiert für die Bestimmung in Plasma- und Tumorproben. Die ELISA-Platten wurden mit anti-human- IgG-Fc-Antikörpern der Ziege beschichtet. Nach Inkubation mit der Probe wurden die Platten gewaschen und mit einem Detektor-Konjugat aus anti-human-lgG(H+L)-Antikörper des Affen und Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde das HRP-Substrat OPD hinzugegeben und die Farbentwicklung über die
Absorption bei 490 nm verfolgt. Standardproben mit bekannter IgG-Konzentration wurden mittels 4-Parameter-Gleichung gefittet. Innerhalb der unteren (LLOQ) und oberen (ULOQ) Quantifizierungsgrenzen wurden die unbekannten Konzentrationen über Interpolation ermittelt.
C5a: Identifizierung der ADC-Metabolite nach Internalisierunq in vitro
Methodenbeschreibung:
Internalisierungsuntersuchungen mit Immunkonjugaten werden durchgeführt, um intrazellulär entstandene Metaboliten zu analysieren. Hierzu werden humane
Lungentumorzellen NCI H292 (3x105/well) in 6-well Platten ausgesät und über Nacht inkubiert (37 °C, 5% C02). Es erfolgt eine Behandlung mit 10 g/mL (66 nM) des zu untersuchenden ADCs. Die Internalisierung wurde bei 37 °C und 5% CO2 durchgeführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 24, 48, 72h) werden Zellproben zur weiteren Analyse genommen. Zunächst werden die Überstände (ca. 5 mL) geerntet und nach erfolgter Zentrifugation (2 min, RT, 1000 rpm Heraeus Variofuge 3.0R) bei -80 °C gelagert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit Accutase abgelöst und die Zellzahl bestimmt. Nach erneutem Waschen wird eine definierte Zellzahl (2x105) mit 100 ml_ Lysis Puffer (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1 ) versetzt und unter ständigem Schütteln
(Thermomixer, 15min, 4°C, 650 rpm) in Protein LoBind tubes (eppendorf Cat.No. 0030 108.1 16) inkubiert. Nach der Inkubation wird das Lysat zentrifugiert (10min, 4°C, 12000g, eppendorf 5415R) und der Überstand geerntet. Der gewonnene Überstand wird bei -80 °C gelagert. Alle Proben werden anschließend wie folgt analysiert.
Zur Aufarbeitung von 50 μί Kulturüberstand/Zelllysat werden diese mit 150 μί
Fällungsreagenz (Methanol) versetzt und für 10 Sekunden geschüttelt. Das
Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 g/L). Nach dem 10minütigen Zentrifugieren bei 1881 g wird der Überstand in ein Autosampler-Vial überführt, mit 300 μΙ_ eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt und 10 min bei 1881 g zentrifugiert.
Die Messung der Zelllysat- und Überstandsproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.
Zur Kalibrierung wird Leerlysat bzw. Leerüberstand mit entsprechenden Konzentrationen (0.1 - 1000 g/L) versetzt. Die Nachweisgrenze (LLOQ) liegt bei ca. 0.2 μg/L.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4 und 40 μg/L.
C5b: Identifizierung der ADC-Metabolite in vivo
Nach i.v. Applikation von 3-30 mg/kg verschiedener ADCs können die Plasma- und Tumorkonzentrationen des ADCs sowie potentiell auftretender Metaboliten gemessen und die pharmakokinetischen Parameter wie Clearance (CL), Fläche unter der Kurve (AUC) und Halbwertszeit (ti/2) berechnet werden. Analytik zur Quantifizierung der potentiell auftretenden Metabolite
Die Messung der Verbindungen in Plasma, Tumor, Leber und Niere erfolgt nach Fällung der Proteine mit in der Regel Methanol durch eine Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
Zur Aufarbeitung von 50 μί Plasma werden diese mit 150 μί Fällungsreagenz (in der Regel Methanol) versetzt und für 10 sec geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 μg/ L). Nach dem 10minütigen Zentrifugieren bei 1881 g wird der Überstand in ein
Autosampler-Vial überführt, mit 300 μΙ_ eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt. Bei der Aufarbeitung von Tumor- oder Organmaterial wird das jeweilige Material mit der 3- 20 fachen Menge an Extraktionspuffer versetzt. Der Extraktionspuffer enthält 50 ml_ Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL), zwei Pellets Complete- Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, St. Louis, MO) in einer finaler Konzentration von 1 mM. Je nach Gewebetyp (hart: Tumor; weich: Leber, Niere) wird das Lyse und
Homogeniserungsprogramm des Prescellys 24 Lysis and Homogenization Gerätes (Bertin Technologies) ausgewählt (www.prescellys.com). Die homogenisierten Proben werden über Nacht bei 4°C stehen gelassen. 50 μί des Homogenats werden in ein Autosampler- Vial überführt und mit 150 μί Methanol inklusive ISTD aufgefüllt und 10 sec geschüttelt und darauf 5 min stehen gelassen. Nach Zugabe von 300 μί Ammoniumacetat Puffer (pH6.8) und kurzem Schütteln wird die Probe 10min bei 1881 g zentrifugiert.
Zur Kalibrierung wird für Plasmaproben Plasma und für Gewebeproben entsprechende Leermatrix mit Konzentrationen von 0.6 - 1000 μg/L versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) liegt je nach Probentyp bzw. Gewebetyp zwischen 1 und 20 μg/L. Die Messung der Plasma und Matrixproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API4500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4, 40 und 400 μg/L.
Tabelle 6 zeigt Metabolitkonzentrationen im MOLM-13 Xenograft Maus Modell gemessen in -Tumor, -Leber, -Niere und Plasma 24 h nach Applikation von 5 mg/kg des ADCs aus Beispiel 2c-9476 (n=3). Gemessener Metabolit war: Metabolit M1. n.c. = not calculated; LOQ: limit of quantification Tabelle 6:
Die Applikation des erfindungsgemäßen ADC Beispiels 2c-9476 mit einem Legumain- spaltbaren Linkerführte zu einer deutlich selektiven Anreicherung des aktiven Wirkstoffes am Zielgewebe (Tumor) im Vergleich zu anderen gesunden Organen/Geweben.
C-6 Wirksamkeitstest in vivo
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate wurde in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO 2005/08171 1 ; Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358- 64). Beispielsweise wurde hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmolekül des Binders exprimiert, inokuliert. Anschließend wurde den inokulierten Tieren entweder ein erfindungsgemäßes Konjugat, ein Isotyp-Antikörper-Kontrollkonjugate oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgte einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wurde die
Tumorgröße im Vergleich von Konjugat-behandelten Tieren und der Kontrollgruppe bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße.
C-6a. Wachstumshemmunq / Regression von experimentellen Tumoren in der Maus
Humane Tumorzellen, die das Antigen für das Antikörper-Wirkstoffkonjuqat exprimieren, werden subkutan in die Flanke von immunsupprimierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nude- oder SCID-Mäuse. 1-10 Millionen Zellen werden aus der Zellkultur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Medium / Matrigel resuspendiert. Die Zellsuspension wird unter die Haut der Maus gespritzt. Innerhalb von einigen Tagen wächst ein Tumor heran. Die Behandlung beginnt nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 40 mm2. Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 50-100 mm2 begonnen werden.
Die Behandlung mit APDCs und ADCs erfolgt über die intravenöse (i.v.) Route in die Schwanzvene der Maus. Das ADC wird mit einem Volumen von 5 ml_ / kg appliziert.
Das Behandlungsschema richtet sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers. Mit den erfindungsgemäßen Konjugaten wird als Standard einmal pro Woche für 2 oder 3 Wochen behandelt. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer
Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei
Behandlungstagen anschließen.
Standardmäßig werden 8 Tiere pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wird eine Gruppe als Kontrollgruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt.
Im Verlauf des Experiments wird die Tumorfläche regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorfläche wird mittels Länge x Breite bestimmt. Der Vergleich der mittleren Tumorfläche der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C area angegeben.
Werden alle Gruppen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, können die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C weight angegeben.
C-6b. Wirksamkeit der erfindungsgemaßen ADCs in verschiedenen
Tumormodellen
Die Tumorzellen (z.B. NCI-H292, REC-1 , MOLM-13 und MV-4-1 1 ) werden subkutan in die Flanke von weiblichen NMRI-nude Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer Tumorgröße von -40 mm2 wird intravenös mit dem Antikörper-Wirkstoffkonjugat behandelt. Im Anschluss an die Behandlung wird das Tumorwachstum ggf. weiterverfolgt. Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen ADCs führt zu einer deutlichen und zum Teil lang anhaltenden Wachstumshemmung der Tumore im Vergleich zur Kontrollgruppe und dem konjugierten Isotyp-Kontroll-Antikörper. Die Tabelle 7 gibt die T/C Werte an, ermittelt über die Tumorfläche am jeweiligen Tag des Versuchsendes gerechnet nach
Behandlungsstart.
Tabelle 7:
Beispiel Antigen Tumor Modell Dosis Dosisschema T/C area
2k-7007 TWEAKR NCI-H292 5 mg/kg Q7dx3 0.09 (Tag 25)
(humanes
Lungenkarzinom)
2x-9574 CXCR5 REC-1 (humanes 10 mg/kg Q7dx3 0.20 (Tag 24)
Mantle cell- Lymphom)
2C-9476D CD123 MOLM-13 5 mg/kg Q7dx2 0.15 (Tag 17)
(humane akute
myeloische
Leukemie)
2C-9476D CD123 MV-4-1 1 5 mg/kg Q7dx2 0.16 (Tag 18)
(humane akute
myeloische
Leukemie)

Claims

Patentansprüche
1. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I)
in der
X3 für C steht;
oder
X3 für N steht; oder
X3 für N steht;
oder
X3 für C steht;
oder
X3 für C steht.
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)OH oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)2-8 -C(=0)-###, #-C(=0)- (CH2)3-C(=0)-###, #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)5-W„ #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)-## oder #-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2-CH2-0)i-8-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-## steht,
W für die Gruppe
n für eine Zahl von 1 bis 50 steht, für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht, für die Bindung an der Verbindung steht, für die Bindung an ein S-Atom einer Cystein-Seitenkette des Binders steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
2. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß Anspruch 1 , in der
X2 für C,
X3 für N steht;
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)OH oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht, M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=0)-CH2-W,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-###,
#-C(=0)- (CH2)3-C(=0)-###,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)5-W,
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)-## oder
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2-CH2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-## steht,
W für die Gruppe
n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht, ## für die Bindung an ein S-Atom einer Cystein-Seitenkette des
Binders steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
3. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 und 2, in der
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
4. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, in der R1 für Methyl steht, R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
5. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, in der R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht,
AK für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht, ### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
6. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, in der R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK für einen anti-CD 123 Antikörper, einen anti-CXCR5 Antikörper, einen anti-B7H3 Antikörper, einen anti-TWEAKR Antikörper, einen anti-Her2 Antikörper oder einen anti-EGFR Antikörper oder für ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des
Antikörpers (AK) oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
7. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, in der R1 für Methyl steht, R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK für einen anti-CD123 Antikörper ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 und TPP-6013, für einen anti-CXCR5 Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP- 9574 und TPP- 9580, für einen anti-B7H3 Antikörper TPP-8382, für einen anti-TWEAKR Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-7006 und TPP- 7007, für einen anti-Her2 Antikörper TPP-1015, oder für einen anti-EGFR Antikörper TPP- 981 oder für ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen steht,
# für die Bindung an der Verbindung steht,
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin-Seitenkette des
Antikörpers (AK) oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
8. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, der Strukturen 170
171
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174
in denen
AK1 für einen Antikörper steht, der über ein S-Atom einer Cystein-
Seitenkette gebunden ist,
AK2 für einen Antikörper steht, der über eine N-Atom einer Lysin-
Seitenkette gebunden ist und
n 1 bis 50 ist, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
9. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß Anspruch 8, in denen
n 1 bis 20 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
10. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß den Ansprüchen 8 und 9, in denen
n 1 bis 8 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
1 1. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß den Ansprüchen 8 bis 10, in denen
n 4 bis 8 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate. Binder-Wirkstoff-Konjugate, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 1 1 , wobei
AK (AK1 , AK2) für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-8382 (anti B7H3), TPP-6013 (anti-CD123), TPP-8987 (anti-CD123), TPP- 8988 (anti-CD123), TPP 9476 (anti-CD123), TPP-9580 (anti-CXCR5) und TPP 9574 (anti-CXCR5), oder ein Antigen-bindendes Fragment von diesen steht.
Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, wobei
AK (AK1. AK2) für einen anti-CD123 Antikörper TPP-6013, für einen anti-CD123 Antikörper TPP-8987, für einen anti-CD123 Antikörper TPP-8988 oder für einen anti-CD123 Antikörper TPP-9476, oder ein Antigenbindendes Fragment von diesen steht.
14. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1
bis 13, wobei AK (AK1 , AK2)
(i) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58, (ii) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28,
(iii) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 68,
(iv) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 78,
(v) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 84, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 86, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 88,
(vi) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 92, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 93 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 94, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 96, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 97 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 98, oder
(vii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 102, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 103 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 104, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 106, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 107 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 108, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
15. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1
bis 14, wobei AK (AK1 , AK2) (i) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55,
(ii) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 25,
(iii) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65,
(iv) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 71 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 75,
(v) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 85,
(vi) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 91 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 95, oder
(vii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 101 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 105, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
16. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1
bis 15, wobei AK (AK1 , AK2)
(i) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60, (ii) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30,
(iii) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 70,
(iv) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 79 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80,
(v) für einen anti-CD123 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 89 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 90,
(vi) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 99 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 100, oder
(vii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 109 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 10, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
17. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der
Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment an ein extrazelluläres Zielmolekül bindet.
Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet.
Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle internalisiert.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens ein Binder-Wirkstoff- Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in
Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
21. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
22. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von
hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen
23. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren.
24. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren in Kombination mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs-Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie.
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