CN107921146A - 纺锤体驱动蛋白(ksp)抑制剂与抗‑cd123的抗体的抗体药物缀合物(adc) - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的抗体药物缀合物(ADC)、所述ADC的活性代谢物、涉及制备所述ADC的方法、涉及所述ADC用于治疗和/或预防疾病的用途，以及涉及所述ADC用于产生用于治疗和/或预防疾病(特别是过度增殖性疾病和/或血管生成性疾病，例如癌症疾病)的药剂的用途。所述治疗可作为单一疗法起作用或与其他药物或其他治疗措施结合。

Description

纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂与抗-CD123的抗体的抗体药物 缀合物(ADC)
引言和背景技术
本发明涉及纺锤体驱动蛋白抑制剂的结合体药物缀合物(ADC)、涉及这些ADC的活性代谢物、涉及制备这些ADC的方法、涉及这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途，及涉及这些ADC用于制备用于治疗和/或预防疾病(特别是过度增殖性和/或血管生成性病症，例如癌症疾病)的药剂的用途。这样的治疗可以作为单一疗法进行，或者也与其他药物或其他治疗措施组合进行。
癌症是大多数不同组织不受控制的细胞生长的结果。在许多情况下，新细胞渗入现有组织(侵入性生长)，或者新细胞转移到远端器官。癌症发生在各种各样的器官中，并且经常具有组织特异性过程。因此，术语“癌症”作为上位概念描述了不同器官、组织和细胞类型的大量确定的疾病。
早期的一些肿瘤可以通过外科手术和放射疗法措施去除。一般来说，转移性肿瘤只能通过化学疗法来姑息治疗。这样做的目标是实现改善生活质量和延长寿命的最佳组合。
结合蛋白与一种或多种活性化合物分子的缀合物是已知的，特别是以抗体药物缀合物(ADC)的形式，其中针对肿瘤相关抗原的内化抗体通过接头共价连接至细胞毒性剂。在将ADC引入肿瘤细胞并随后解离缀合物之后，细胞毒性剂本身或由其形成的细胞毒性代谢物在肿瘤细胞内释放，并且可以直接地及选择性地在其中展现其作用。以这种方式，与常规化学疗法相反，对正常组织的损伤被限制在明显更窄的限度内[参见，例如，J.M.Lambert,Curr.Opin.Pharmacol.5,543-549(2005)；A.M.Wu and P.D.Senter,Nat.Biotechnol.23,1137-1146(2005)；P.D.Senter,Curr.Opin.Chem.Biol.13,235-244(2009)；L.Ducry andB.Stump,Bioconjugate Chem.21,5-13(2010)]。因此，WO2012/171020描述了其中多个毒性基团分子通过聚合的接头连接至抗体的ADC。作为可能的毒性基团，WO2012/171020尤其提及物质SB 743921、SB 715992(伊匹尼塞)、MK-0371、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。
最后提到的物质是纺锤体驱动蛋白抑制剂。纺锤体驱动蛋白(KSP，也称为Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)是一种驱动蛋白样动力蛋白，其对于双极有丝分裂纺锤体发挥功能是必不可少的。对KSP的抑制导致有丝分裂停止，并在相对较长时期内导致细胞凋亡(Taoet al.,Cancer Cell 2005Jul 8(1),39-59)。在发现第一种可穿透细胞的KSP抑制剂monastrol后，KSP抑制剂已经被确认为一类新型化学治疗剂(Mayer et al.,Science 286:971-974,1999)，并且它们已经是许多专利申请(例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；和WO03/049527)的主题。然而，由于KSP仅在有丝分裂期中的相对较短的时期内发挥其作用，所以KSP抑制剂在该阶段中必须以足够高的浓度存在。WO2014/151030公开了包括某些KSP抑制剂的ADC。
发明内容
在这一背景下，本发明的一个目的是提供在以相对低的浓度给药后可展现细胞凋亡作用并因此有益于癌症治疗的物质。
为实现该目的，本发明提供了抗-CD123的抗体与下式(I)的化合物的缀合物，其中一种或多种式(I)的化合物是通过接头L连接至所述抗体。所述抗体优选地为人、人源化或嵌合的单克隆抗体。本文优选由来源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化的抗-CD123的抗体。特别优选抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
式(I)：
其中
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表一个可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽构成的基团；R4’代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”(其中x代表0或1且v代表1-20的数目且R4”代表-H、-烷基(优选地C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中裂解后存在伯胺基团(对应于R4＝H)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-、其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表–L-#1、-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟代的)C1-10-烷基、(任选地氟代的)C2-10-烯基、(任选地氟代的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟代的)C1-10-烷基、(任选地氟代的)C2-10-烯基、(任选地氟代的)C2-10-炔基、(任选地氟代的)C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、CO2H、或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中取代基R1、R3或R4中的一个代表或(在R8的情况下)包含-L-#1，
L代表接头且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链的烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
本发明的缀合物可具有化学上不稳定的接头、酶学上不稳定的接头或稳定的接头。特别优选稳定的接头和可通过蛋白酶裂解的接头。
本发明还提供用于制备本发明的缀合物的方法，以及用于所述制备的前体和中间体。
本发明的缀合物的制备经常包括以下步骤：
制备任选地带有保护基团且具有能够偶联至抗体的反应性基团的接头前体；
将接头前体缀合至式(I)(其中在这些式中还不存在键合至接头的键)的KSP抑制剂的衍生物，其任选地带有保护基团，从而得到任选地带有保护基团的反应性KSP抑制剂/接头缀合物；
除去KSP抑制剂/接头缀合物中存在任何保护基团以及
将抗体缀合至KSP抑制剂/接头缀合物，从而得到本发明的抗体/KSP抑制剂缀合物。
反应性基团的连接还可发生在构建任选地被保护的KSP抑制剂/接头前体缀合物构造之后。
根据所述接头，琥珀酰亚胺-连接的ADC可在缀合后根据方案26转化成开链琥珀酰亚胺，其具有有利的稳定性特性。
如上所述，接头前体与低分子量KSP抑制剂的缀合可通过由接头取代式(I)中R1、R3或R4上的氢原子来进行。在缀合之前的合成步骤中，存在的任何官能团也可能以被保护的形式存在。在缀合步骤前，将这些保护基团通过已知的肽化学方法除去。所述缀合可通过各种路线以化学方式发生，如实施例中方案20至31中以示例性方式所示。特别地，可任选地修饰用于缀合至接头的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基团或离去基团以帮助取代。
特别地，本发明提供缀合至抗-CD123的抗体(例如7G3或12F1的嵌合的或人源化的变体)的新的低分子量KSP抑制剂。这些KSP抑制剂或它们的抗体缀合物具有以下通式(II)：
其中
R1代表H、-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中
Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、
-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或
-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；
W代表H或OH，
Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链的C1-6烷基，
或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
或
R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，
其中
R11代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或-OH；
Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-BINDER、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，R4”代表-H、-烷基(优选地C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中裂解后存在伯胺基(对应于R4＝H)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2-NH或-CNNH2-；
R3代表-L-BINDER、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-BINDER，或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代的烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
n代表0、1或2，
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7-元杂环(优选地氧杂环丁烷)，其中这些基团中的每一个皆可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中L代表接头且BINDER代表抗-CD123的抗体，其中所述结合体可任选地连接至多个活性化合物分子，
其中R1、R3和R4中的一个代表物代表-L-BINDER；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链的烃基，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
附图说明
图1：序列方案。
图2：带注释的抗体的序列。对于每个抗体或抗体片段，强调了CDR区域(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)和可变区域(VH、VL)。
具体实施方式
本发明提供抗-CD123的抗体与一种或多种活性化合物分子的缀合物，其中活性化合物分子是通过接头L连接至抗体的纺锤体驱动蛋白抑制剂(KSP抑制剂)。
本发明的缀合物可由以下通式表示
其中BINDER代表抗-CD123的抗体，L代表接头，KSP代表KSP抑制剂，且n代表1至50的数字，优选1.2至20，特别优选2至8。本文中，n为每个BINDER中KSP抑制剂/接头缀合物的数目平均值。优选地，KSP-L具有以上所示的式(I)。此外，所述接头优选地与抗体的不同氨基酸相连接。特别优选的是与至结合体的不同半胱氨酸残基的结合。抗-CD123的抗体优选地为人的、人源化的或嵌合的单克隆抗体。本文中优选的是由来源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化的抗-CD123的抗体。特别优选的是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
下面描述了本发明可使用的抗体、本发明可使用的KSP抑制剂和本发明可使用的接头，其可结合使用而没有任何限制。特别地，在每种情况下作为优选或特别优选地代表的结合体可与在每种情况下作为优选或特别优选地代表的KSP抑制剂、任选地与在每种情况下作为优选或特别优选地代表的接头结合使用。
KSP抑制剂和它们的结合体缀合物
定义
术语“取代的”意指涉及的原子或基团上的一个或多个氢被选自所提及基团的基团所替代，条件是在目前情况下不超过所涉及的原子的正常价。涉及的原子或基团上的一个或多个氢被所提及的基团选项替代，条件是在目前情况下不超过所涉及的原子的正常价。取代基和/或变量的组合是可接受的。
术语“任选地被取代的”意指取代基的数目可等于零或不等于零。除非另有说明，否则任选地被取代的基团可被所能容纳的多个任选的取代基取代，其是通过在任意可用的碳原子或氮原子或硫原子上用非氢取代基替代氢原子来进行。通常，任选的取代基(如果存在的话)的数目可为1、2、3、4或5，特别是1、2或3。
本文中使用的术语“一次或多于一次”，例如在本发明的通式的化合物的取代基的定义中，意指“1、2、3、4或5，优选1、2、3或4，特别优选1、2或3，非常特别优选1或2”。
如果本发明化合物中的基团被取代，则除非另有说明，否则所述基团可被单取代或多取代。在本发明的范围内，出现多于一次的所有基团的含义是彼此独立的。优选用一个、两个或三个相同或不同的取代基的取代。特别优选用一个取代基的取代。
烷基
烷基代表具有1至10个碳原子(C1-C10-烷基)，通常1至6个(C1-C6-烷基)，优选1至4个(C1-C4-烷基)并且特别优选1至3个碳原子(C1-C3-烷基)的直链或支链的饱和一价烃基。
以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、戊基-、己基-、异丙基-、异丁基-、仲丁基-、叔丁基-、异戊基-、2-甲基丁基-、1-甲基丁基-、1-乙基丙基-、1,2-二甲基丙基-、新戊基-、1,1-二甲基丙基-、4-甲基戊基-、3-甲基戊基-、2-甲基戊基-、1-甲基戊基-、2-乙基丁基-、1-乙基丁基-、3,3-二甲基丁基-、2,2-二甲基丁基-、1,1-二甲基丁基-、2,3-二甲基丁基-、1,3-二甲基丁基-以及1,2-二甲基丁基-。
特别优选甲基-、乙基-、丙基-、异丙基-和叔丁基基团。
杂烷基
杂烷基代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NRy-、-NRyC(＝O)-、-C(＝O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-、-CRx＝N-O-，并且其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
本文中，Ry在每种情况下代表-H、苯基-、C1-C10-烷基-、C2-C10-烯基-或C2-C10-炔基-，其本身均可被-NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
本文中，Rx代表-H、C1-C3-烷基-或苯基-。
烯基
烯基代表具有一个或两个双键和2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(C2-C10-烯基)、特别是2或3个碳原子(C2-C3-烯基)的直链或支链的一价烃链，应理解的是，如果烯基基团含有多于一个双键，则双键可彼此分离或彼此共轭。烯基基团为，例如，乙烯基(ethenyl)(或乙烯基(vinyl))、丙-2-烯-1-基(“烯丙基”)、丙-1-烯-1-基、丁-3-烯基、丁-2-烯基、丁-1-烯基、戊-4-烯基、戊-3-烯基、戊-2-烯基、戊-1-烯基、己-5-烯基、己-4-烯基、己-3-烯基、己-2-烯基、己-1-烯基、丙-1-烯-2-基(或“异丙烯基”)、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯基、1-甲基丁-2-烯基、3-甲基丁-1-烯基、2-甲基丁-1-烯基、1-甲基丁-1-烯基、1,1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-异丙基乙烯基、4-甲基戊-4-烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊-3-烯基、3-甲基戊-3-烯基、2-甲基戊-3-烯基、1-甲基戊-3-烯基、4-甲基戊-2-烯基、3-甲基戊-2-烯基、2-甲基戊-2-烯基、1-甲基戊-2-烯基、4-甲基戊-1-烯基、3-甲基戊-1-烯基、2-甲基戊-1-烯基、1-甲基戊-1-烯基、3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、3-乙基丁-2-烯基、2-乙基丁-2-烯基、1-乙基丁-2-烯基、3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-异丙基丙-2-烯基、1-异丙基丙-2-烯基、2-丙基丙-1-烯基、1-丙基丙-1-烯基、2-异丙基丙-1-烯基、1-异丙基丙-1-烯基、3,3-二甲基丙-1-烯基、1-(1,1-二甲基乙基)乙烯基、丁-1,3-二烯基、戊-1,4-二烯基或己-1,5-二烯基基团。所述基团特别是乙烯基或烯丙基。
炔基
炔基代表具有三键和2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(C2-C10-炔基)，尤其是2或3个碳原子(C2-C3-炔基)的直链或支链的一价烃链。C2-C6-炔基为例如乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-异丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-2-炔基或3,3-二甲基丁-1-炔基。炔基基团特别是乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。
环烷基
环烷基代表具有3-12个碳原子的饱和一价单环-或双环烃基(C3-C12-环烷基)。
本文中，单环烃基代表通常具有3至10个碳原子(C3-C10-环烷基)、优选3至8个碳原子(C3-C8-环烷基)且特别优选3至7个碳原子(C3-C7-环烷基)的一价烃基。
对于单环烃基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
特别优选的是环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
本文中，双环烃基代表通常具有3至12个碳原子的烃基(C3-C12-环烷基)，其应理解为一起共享两个直接相邻原子的两个饱和的环体系的稠合。对于双环烃基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：双环[2.2.0]己基、双环[3.3.0]辛基、双环[4.4.0]癸基、双环[5.4.0]十一烷基、双环[3.2.0]庚基、双环[4.2.0]辛基、双环[5.2.0]壬基、双环[6.2.0]癸基、双环[4.3.0]壬基、双环[5.3.0]癸基、双环[6.3.0]十一烷基和双环[5.4.0]十一烷基。
杂环烷基
杂环烷基代表具有一个、两个、三个或四个可相同或不同的杂原子的非芳族的单环体系或双环环体系。存在的杂原子可为氮原子、氧原子或硫原子。
根据本发明的单环环体系可具有3至8个、优选4至7个、特别优选5或6个环原子。
对于具有3个环原子的杂环烷基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
氮丙啶基。
对于具有4个环原子的杂环烷基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基。
对于具有5个环原子的杂环烷基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、二氧戊环基和四氢呋喃基。
对于具有6个环原子的杂环烷基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
哌啶基、哌嗪基、吗啉基、二噁烷基、四氢吡喃基和硫代吗啉基。
对于具有7个环原子的杂环烷基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、1,3-二氮杂环庚烷基、1,4-二氮杂环庚烷基。
对于8个环原子的杂环烷基，以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：
氧杂环辛烷基、氮杂环辛烷基(azocanyl)。
从单环杂环烷基中，优选的是具有至多两个选自O、N和S的杂原子的4-至7元饱和杂环基基团。
特别优选的是吗啉基、哌啶基、吡咯烷基和四氢呋喃基。
根据本发明具有一个、两个、三个或四个可以相同或不同的杂原子的双环体系可具有6至12个且优选6至10个环原子，其中一个、两个、三个或四个碳原子可被替换为相同或不同的选自O、N和S的杂原子。
以下基团是以举例的方式提及：氮杂双环[3.3.0]辛基、氮杂双环[4.3.0]壬基、二氮杂双环[4.3.0]壬基、噁嗪双环[4.3.0]壬基、噻唑双环[4.3.0]或氮杂双环[4.4.0]癸基，以及根据定义源自其他可能的组合的基团。
特别优选的是全氢环戊烷并[c]吡咯基、全氢呋喃并[3,2-c]吡啶基、全氢吡咯并[1,2-a]吡嗪基、全氢吡咯并[3,4-c]吡咯基和3,4-亚甲二氧基苯基。
芳基
芳基是由碳原子组成的一价单环或双环芳族环体系。实例为萘基和苯基；优选的是苯基或苯基基团。
C6-C10-芳烷基
在本发明上下文中，C6-10-芳烷基代表单环芳族芳基，例如苯基，其与C1-C4-烷基基团相连接。
示例性的C6-10-芳烷基基团为苄基。
杂芳基
杂芳基为具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14环体系(“5-至14-元杂芳基”基团)、特别是5、6、9或10个环原子的一价单环、双环或三环芳族环体系，其含有至少一个环杂原子和任选地一个、两个或三个其他环杂原子(所述环杂原子选自N、O和S)且其通过环碳原子连接或任选地(化合价允许的情况下)通过环氮原子连接。
杂芳基可为5元杂芳基，例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基或四唑基；或6元杂芳基，例如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基；或三环杂芳基，例如咔唑基、吖啶基或吩嗪基；或9元杂芳基，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基或嘌呤基；或10元杂芳基，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹喔啉基或蝶啶基。
一般而言，如果不另外提及，否则杂芳基包括其所有可能的异构体形式，例如相对于与分子的其余部分的连接点相关的互变异构体和位置异构体。因而，作为举例说明性的而非包括性的实例，术语吡啶基包括吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；或术语噻吩基包括噻吩-2-基和噻吩-3-基。
C5-C10-杂芳基
在本发明上下文中，C5-10-杂芳基代表具有一个、两个、三个或四个可相同或不同的杂原子的单环-或双环芳族环体系。可存在的杂原子为：N、O、S、S(＝O)和/或S(＝O)2。结合价(binding valency)可位于任意芳族碳原子或氮原子上。
根据本发明的单环杂芳基基团具有5或6个环原子。
优选的是具有一个或两个杂原子的杂芳基基团。本文中特别优选的是一个或两个氮原子。
具有5个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、恶二唑基、三唑基、四唑基和噻二唑基。
具有6个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基和三嗪基。
根据本发明的双环杂芳基基团具有9个或10个环原子。
具有9个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
苯酞基(phthalidyl)、硫代苯酞基(thiophthalidyl)、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基、二氢吲哚基。
具有10个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
异喹啉基、喹啉基、喹嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基、酞嗪基、1,7-和1,8-萘啶基、蝶啶基、苯并二氢吡喃基。
杂烷氧基
杂烷氧基代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链的烃链，其通过-O-连接至分子的其余部分，且其还可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NRy-、-NRyC(＝O)-、-C(＝O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-、-CRx＝N-O-，且其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
本文中，Ry在每种情况下代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其本身在每种情况下可被-NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
本文中，Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基。
在本发明的上下文中，卤素或卤原子代表氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)。
氟代烷基、氟代烯基和氟代炔基意指烷基、烯基和炔基可被氟单取代或多取代。
KSP抑制剂与抗体的缀合可通过多种路线以化学方式进行，如在实施例的方案20至31中以示例性方式所示。特别的是，可任选地修饰用于缀合至接头的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基团或离去基团以帮助取代(以使得在反应中，所述离去基团而非氢原子被接头取代)。然后可使以此方式获得的KSP抑制剂—接头分子(其中接头具有用于偶联至结合体的反应性基团)与结合体反应以得到本发明的结合体缀合物。在实验部分中，通过大量实施例以示例性方式说明了本方法。
其他特别优选的化合物具有下面的式(I)或(Ia)：
式(I)：
其中
R1代表H、-L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，并且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团。其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”(其中x代表0或1且v代表1至20的数字且R4”代表-H、-烷基(优选地C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-#1、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代的：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7-元杂环(优选氧杂环丁烷)，其中这些基团中的每一个皆可被-OH、CO2H或NH2取代；
其中取代基R1、R3和R4中的一个代表-L-#1，
L代表接头且#1代表与抗体连接的键，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中含任何侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
在式(I)的一个优选的实施方案中，取代基R1或R3中的一个代表-L-#1。在该实施方案中，特别优选的是，如果R4代表H或-SGlys-(CO)0-1-R4’，则其中SGlys和R4’具有与上述相同的含义。在式(I)的另一个优选的实施方案中，取代基R4代表-L-#1，其中接头为可在结合至R4的氮原子上被裂解的接头，以使得裂解后存在伯氨基基团(对应于R4＝H)。这类可裂解的基团详述如下。
如果R1不代表H，则R1结合的碳原子为可以L和/或D构型(优选以L构型存在)的立体中心。
如果R2不代表H，则R2结合的碳原子为可以L和/或D构型存在的立体中心。
式(Ia)：
其中
R1代表H、-L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基。
R2和R4彼此独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”(其中x代表0或1且v代表1至20的数字且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
或R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；或R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，且R4代表-L-#1darstellt，且其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，其中Y4彼此独立地代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表任选地被取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-#1，或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或任选地被取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
通过R1、R3或R4上氢原子的取代，可以本领域技术人员已知的方式将式(I)或(Ia)化合物(其中取代基R1、R3和R4皆不代表-L-#1)连接至接头。这样得到式(I)或(Ia)的缀合物，其中取代基R1、R3或R4中的一个代表-L-#1，L代表接头且#1代表与抗体连接的键。如果根据式(I)或(Ia)的KSP抑制剂与结合体缀合，则因而取代基R1、R3或R4中的一个代表-L-#1，其中L代表接头且#1代表与抗体连接的键。也就是说，在缀合物的情况下，取代基R1、R3或R4中的一个代表-L-#1，其中-L-#1代表与抗体连接的键。结合体优选地为人的、人源化或嵌合的单克隆抗体或其抗原结合片段。在式(I)或(Ia)的一个优选实施方案中，取代基R1或R3中的一个代表-L-#1。在该实施方案中，特别优选的是如果R4代表H或-SGlys-(CO)0-1-R4’，则其中SGlys和R4’具有与上述相同的含义。在式(I)的另一个优选的实施方案中，取代基R4代表-L-#1，其中接头为可在结合至R4的氮原子上裂解的接头，以使得裂解后存在伯氨基(对应于R4＝H)。这类可裂解基团详述如下。本文中优选的是源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合或人源化抗-CD123的抗体。特别优选的是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
此外，基团-L-#3可替代-L-#1存在于化合物中，其中L代表接头且#3代表用于结合至抗体的反应性基团。含-L-#3的化合物为与抗体反应的反应性化合物。#3优选地为在形成共价键的情况下与氨基或硫醇基反应、优选与蛋白质的半胱氨酸残基反应的基团。蛋白质的半胱氨酸残基可天然地存在于蛋白质中，其可通过生物化学方法引入或优选地可通过在先还原结合体的二硫化物产生。
对于A，优选的是CO(羰基)。
对于R1，优选的是-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2。
对于R2和R4，优选的是H，或者R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H或F。对于R4，还优选的是-L-#1，其中-L-#1为可裂解的接头，优选可被酶细胞内裂解的接头。
对于R3，优选的是-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选地为C1-3-烷基)。
对于R5，优选的是H或F。
对于R6和R7，优选的是彼此独立地为H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素。
对于R8，优选的是支链的C1-5-烷基，特别是式-C(CH3)2-(CH2)0-2-Ry基团，其中Ry代表-H、-OH、CO2H或NH2，或(任选地氟化的)C5-7-环烷基。特别优选的是式-C(CH3)3基团或环己基基团。
对于R9，优选的是H或F。
尤其优选的是式(I)或(Ia)化合物，其中
A代表CO(羰基)；
R1代表H、-L-#1、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2或-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；或R4代表-L-#1和R2代表H；
R3代表-L-#1或可被卤素(特别是F)或任选地氟化的C1-3-烷基单取代或多取代的苯基基团，或代表可任选地被以下基团取代的任选地氟化的C1-10-烷基基团：-OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、-NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4(其中n代表0、1或2)、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2，其中Y4代表H、苯基(任选地被卤素(特别是F)或任选地氟化的C1-3-烷基单取代或多取代)或烷基(其中烷基基团可被-OH、-COOH和/或-NHCO-C1-3-烷基取代且其中烷基优选地代表C1-3-烷基)；
其中特别优选地，R3可被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选地意指C1-3-烷基)取代；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H,(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基或环己基；且
R9代表H或F。
此外，优选的是(单独地或结合地)
R1代表-L-#1、COOH或H，
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H，或R4代表-L-#1和R2代表H；
A代表CO，
R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、可被1-3个卤原子、1-3个氨基基团或1-3个烷基基团(其可任选地被卤代)取代的苯基基团，或代表-L-#1，
R5代表-H，
R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和R7代表F；
R8代表C1-4-烷基(优选叔丁基)或环己基；和/或
R9代表H。
另外，根据本发明，优选的是
R1代表-L-#1、COOH或H，
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H，
A代表CO，
R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、可被1-3个卤原子、1-3个氨基基团或1-3个烷基基团(其可任选地被卤代)取代的苯基基团，或代表-L-#1，
R5代表H，
R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和R7代表F；
R8代表C1-4-烷基(优选叔丁基)；且
R9代表H。
其他特别优选的化合物具有下面的式(II)或(IIa)：
式(II)：
其中
R1代表H、-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R4代表H、-L-BINDER、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”(其中x代表0或1且v代表1至20的数字且R4”代表-H、-烷基(优选地C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-BINDER、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-BINDER，或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代的烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F,SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7-元杂环，其中这些基团中的每一个可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链的烃基，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
在式(II)的KSP抑制剂的结合体缀合物的情况下，R1、R3和R4中的至多一个代表物(或者上面给出的条件之一)可代表-L-BINDER，其中L代表接头，且BINDER代表抗体，其中抗体可任选地连接至多个活性化合物分子。
式(IIa)：
其中
R1代表-L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表-SGlys-(CO)0-1-R4’、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-,或R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0- 3Z和R4代表-L-#1，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”(其中x代表0或1且v代表1至20的数字且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3,
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-BINDER或任选地被取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-BINDER，或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代的烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表接头，BINDER代表结合体或其衍生物，其中结合体可任选地与多个活性化合物分子连接，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或任选地被取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
此外，根据本发明还优选的是下面的KSP抑制剂/抗体缀合物：
式(IIb)：
其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，A代表CO，B代表单键、-O-CH2-或-CH2-O-，R20代表NH2、F、CF3或CH3，且n代表0、1或2。
式(IIc)：
其中A、R1、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，其中A优选地代表CO和R3代表-CH2OH、-CH2OCH3、CH(CH3)OH或CH(CH3)OCH3。
式(IId)：
其中A、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，其中A优选地代表CO和R3代表-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x代表0或1和Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
式(IIe)：
其中A、R2、R3、R4、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，R1代表-L-BINDER。
式(IIi)：
其中A、R1、R2、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，R4代表-L-BINDER，优选可酶促裂解的结合体，以使得裂解后R4＝H。R1或R3特别优选地代表-MOD。
式(IIj)：
其中
R3代表-L-#1；
A代表CO；且
R6、R7、R8和R9具有与式(I)中相同的含义，
式(IIk)：
其中
R1代表-L-#1；
A代表CO和R3代表-CH2OH；
R3、R6、R7、R8和R9具有与式(I)中相同的含义。
此外，优选式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(III)、(IIj)和(IIk)的化合物(单独地或结合地)：
Z代表Cl或Br；
R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-COOH或-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0- 3Z‘且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘和Z‘代表-COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘和Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4基团之一代表异丙基且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4基团之一代表-CH3且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基；至少一个Y4代表物选自异丙基和-CH3；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH和Y4代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
Y4代表氨基苄基；
R2代表-(CH2)0-3Z和Z代表-SY3；
R4代表-CO-CHY4-NHY5，且Y5代表H；
R4代表-CO-CHY4-NHY5，且Y5代表-CO-CHY6-NH2；
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基。
此外，优选的是在式(I)或(II)中，R1、R2或R3代表-MOD。
特别优选地，R3代表-MOD，和R1或R4代表-L-#1或-L-BINDER，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链的烃基，且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中含任意侧链的烃链可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中G3代表-H或-COOH，其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
特别优选地，基团-MOD具有(优选末端)-COOH基团，例如在甜菜碱基团中。优选地，基团-MOD具有式-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
其他特别优选的化合物具有下面的式(III)：
其中
R1代表-L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”(其中x代表0或1且v代表1至20的数字且R4”代表-H、-烷基(优选地C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-BINDER或任选地被取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，或-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x代表0或1和Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，优选-L-BINDER，或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表接头，BINDER代表抗体，其中结合体可任选地与多个活性化合物分子连接，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或任选地被取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
此外，优选的是(单独的或结合的)在式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或(III)中：
Z代表Cl或Br；
R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘和Z‘代表-COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH，和Y4代表物之一代表异丙基且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH和Y4代表物之一代表-CH3且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基；至少一个Y4代表物选自异丙基和-CH3；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH和Y4代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
Y4代表氨基苄基；
R2代表-(CH2)0-3Z和Z代表-SY3；
R4代表-CO-CHY4-NHY5和Y5代表H；
R4代表-CO-CHY4-NHY5和Y5代表-CO-CHY6-NH2；和/或
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基。
此外优选的是式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)的化合物，
其中
R1代表H、-L-#1或-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3,
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选地-NHCONH2被取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H或-L-#1或-L-BINDER(其中-L-#1或-L-BINDER为可酶促地裂解的接头，从而导致R4转化为H)；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-#1或-L-BINDER、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F，-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基或(任选地氟化的)C4-10-环烷基；
其中取代基R1和R3中之一代表-L-#1或-L-BINDER，
L代表接头，#1代表与抗体连接的键，BINDER代表抗体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基，且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
还优选的是式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)的化合物，其中R1代表H、-L-#1或-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H，
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-#1或-L-BINDER、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，其可被以下基团取代：1-3个-OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基基团(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0- 3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H或卤素(特别是F、Cl、Br)；
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基；
其中取代基R1和R3中的一个代表-L-#1或-L-BINDER，
L代表接头且#1代表与抗体连接的键且BINDER代表抗体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，
及其盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐。
还优选的是可任选地与酸(例如三氟乙酸)一起存在的下述化合物。这些化合物可经由对应于位置R1,R3和R4的位置通过接头连接至抗体(其中氢原子被接头取代)：
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2yl]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)己酰基]氨基}乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸；
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丝氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}甘氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸；
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基]-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷-1-酸；
N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸；
N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氢呋喃-2-羧酰胺；
3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸；
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
根据本发明特别优选的是以下的式IV的化合物，其中R1、R2、R3、R4和R5具有上述含义(如例如式(I)或(II)中所述)：
特别优选的是式IV的化合物，其中R1和R5代表H或-L-#1；R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；R3代表CH2OH、CH(CH3)OH或-L-#1，其中取代基R1和R3中的一个代表-L-#1。此外，特别优选的是式IV的化合物，其中R1代表H或COOH；R2和R5代表H；R4代表-L-#1；且R3代表CH2OH或CH(CH3)OH，其中-L-#1可酶促地裂解的接头，其导致R4转化为H。
接头
文献公开了用于将有机分子共价偶联(缀合)至结合体(例如抗体)上的多种选择(参见例如K.Lang and J.W.Chin.Chem.Rev.2014,114,4764-4806,M.Rashidian etal.Bioconjugate Chem.2013,24,1277-1294)。根据本发明优选的是KSP抑制剂通过抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子(已作为游离硫醇存在的或通过二硫桥的还原产生的)和/或通过抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团缀合至抗体。但是，也可以通过酪氨酸残基、通过谷氨酰胺残基、通过非天然氨基酸的残基、通过游离羧基或通过抗体的糖残基将KSP抑制剂连接至抗体上。对于偶联，使用的是接头。接头可分类成可体内裂解的接头组和体内稳定的接头组(参见L.Ducry and B.Stump,Bioconjugate Chem.21,5-13(2010))。可体内裂解的接头具有可体内裂解的基团，其中又可区分为可体内化学裂解的基团和可体内酶促裂解的基团。“可体内化学裂解”和“可体内酶促裂解”是指该接头或基团在循环中稳定并仅在靶细胞处或靶细胞中通过其中不同的化学或酶环境(较低pH；升高的谷胱甘肽浓度；溶酶体酶如组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶或糖苷酶(glyosidase)如β-葡糖醛酸糖苷酶的存在)裂解，由此释放低分子量KSP抑制剂或其衍生物。可体内化学裂解的基团特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；可体内酶促裂解的基团、特别是可通过溶酶体酶裂解的那些特别是2-8-寡肽基团，尤其是三肽基团或二肽基团或糖苷。在Bioconjugate Chem.2002,13,855-869和Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 8(1998)3341-3346以及Bioconjugate Chem.1998,9,618-626中公开了肽裂解位点。这些包括，例如，缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(任选具有额外的酰胺基团)。
体内稳定的接头以高稳定性为特征(在血浆中24小时后少于5％代谢产物)并且没有上文提到的可体内化学裂解或酶促裂解的基团。
接头-L-优选地具有下面的基本结构(i)至(iv)之一：
(i)-(CO)m-SG1-L1-L2-
(ii)-(CO)m-L1-SG-L1-L2-
(iii)-(CO)m-L1-L2-
(iv)-(CO)m-L1-SG-L2
其中m为0或1；SG为可体内(化学或酶促)裂解的基团(特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；或可被蛋白酶裂解的2-8-寡肽基团)，SG1是寡肽基团或优选二肽基团，L1彼此独立地代表体内稳定的有机基团，且L2代表与结合体的偶联基团或单键。在本文中，优选地偶联至抗体的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上。或者，可以偶联到抗体的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸上。非天然氨基酸可含有例如醛或酮基(例如甲酸基甘氨酸)或叠氮或炔基(参见Lan&Chin,Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids andBioorthogonal Labeling of Proteins,Chem.Rev.2014,114,4764-4806)。
根据本发明特别优选的是基本接头结构(iii)。通过代谢，具有基本接头结构(iii)且将接头偶联至抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基的本发明的缀合物的给药产生下式的半胱氨酸或赖氨酸衍生物：
其中L1在每种情况下连接至低分子量KSP抑制剂，例如式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIca)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(III)或(IV)的化合物。
根据本发明还优选的是基本接头结构(ii)和(iv)，特别是当在R1位置上连接时，特别是当基团L1具有一种以下结构时：
(a)-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-Y7，其中Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，且Y7代表单键或-NH-(CH2)0-4-CHNH2-CO-，以使得在裂解后获得相应结构-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH或-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH。
(b)-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-CO-，其中x为0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，以使得在裂解后获得相应结构-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH。
根据本发明还优选的是基本接头结构(i)(当连接至位置R4时、特别是如果m＝0)。
如果将接头连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基，L2优选地衍生自与半胱氨酸巯基基团反应的基团。它们包括卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰、芳基化的化合物、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB硫醇和二硫化物-还原剂。这些基团通常以亲电子的方式与巯基键反应，从而形成硫化物(例如硫醚)或二硫桥。优选稳定的硫桥。L2优选地为
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR、CONR2(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
对于L2，特别优选的是：
其中#1表示与抗体的硫原子的连接点，#2表示与活性化合物的连接点，x代表1或2，并且R22代表COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。优选x＝1并且R22代表COOH。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选大于90％(在每种情况下均基于接头与抗体连接的键的总数计)，特别优选作为式A3或A4的两种结构之一。在本文中，式A3或A4的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至抗体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在
根据本发明，L1优选由下式表示
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或(其中如果G1代表–NHCO-或则R10不为-NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；以及
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2-(优选)，其中包括任何侧链的烃链可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-SO-(优选)，其中侧链(如果存在的话)可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2优选地代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10-元(例如5-至10-元)芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2-(优选)，其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中的其他间断基团优选地为
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
本文中，#1为与KSP抑制剂连接的键且#2为与抗体的偶联基团(例如L2)连接的键。
亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链通常包括具有所述的各个数目的碳原子的α,ω-二价烷基。以下基团是以举例的方式提及并且是优选的：亚甲基、乙烷-1,2-二基(1,2-亚乙基)、丙烷-1,3-二基(1,3-亚丙基)、丁烷-1,4-二基(1,4-亚丁基)、戊烷-1,5-二基(1,5-亚戊基)、己烷-1,6-二基(1,6-亚己基)、庚烷-1,7-二基(1,7-亚庚基)、辛烷-1,8-二基(1,8-亚辛基)、壬烷-1,9-二基(1,9-亚壬基)、癸烷-1,10-二基(1,10-亚癸基)。然而，烃链中的亚烷基还可为支链的，即上述直链亚烷基的一个或多个氢原子可任选地被C1-10-烷基取代，从而形成侧链。此外，烃链还可含有环状亚烷基(环烷二基)，例如1,4-环己烷二基或1,3-环戊烷二基。这些环状基团可以是未饱和的。特别地，在烃基中可以存在芳族基团(亚芳基)，例如亚苯基。而且，也在环状亚烷基和亚芳基中，一个或多个氢原子还可任选地被C1-10-烷基取代。以此方式，形成任选地支化的烃链。该烃链具有总共0至100个碳原子，优选1至50个，特别优选2至25个碳原子。
侧链(如果存在的话)可以相同或不同地被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸单取代或多取代。
烃链可被一个或多个以下基团相同或不同地间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2-(优选)。
G2中的其他间断基团优选地为
优选地，接头对应于下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与活性化合物分子连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，并且
L1和L2具有以上给出的含义。
特别优选地，L1具有式–NR11B-，其中
R11代表H或NH2；
B代表-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝0至5；且
X4代表-O-、-CONH-,-NHCO-或
根据本发明优选的接头L具有下式：
其中
#3代表与活性化合物分子连接的键，
#4代表与结合肽或蛋白质连接的键，
R11代表H或NH2；
B代表-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝1至5；且
X4代表-O-、-CONH-,-NHCO-或
在其中接头是通过R1处的氢原子的取代偶联或在R4处与可裂解的接头SG1组合偶联的式(I)或(II)的缀合物中，尤其优选上述接头，即R1代表–L-#1或R4代表-SG1-L-#1，其中#1代表与抗体连接的键。
此外根据本发明还优选的是以下接头：在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选地大于90％(在每种情况下均基于接头与抗体连接的键的总数计)，特别优选地作为式A5或A6的两个结构之一：
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，并且
R22代表COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
在本文中，式A5或A6的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至抗体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在
其他连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基的接头-L-具有下式：
其中
§代表与活性化合物分子连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，
m代表0、1、2或3；
n代表0、1或2；
p代表0至20；且
L3代表
其中
o代表0或1；
且
G3代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10元(优选5-至10元)芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2-(优选)，其中侧链(如果存在的话)可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在上式中，优选地
m代表1；
p代表0；
n代表0；
且L3代表
其中
o代表0或1；且
G3代表-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)u CH2CH2O)v(CH2)w-，其中
s、t、v和w中每一个均彼此独立地为0至20且u为0或1。
上述式§-(CO)m-L1-L2-§§中的优选基团L1如下所示，其中r在每种情况下彼此独立地代表0至20的数字，优选0至15，特别优选1至20，尤其优选2至10：
表C中给出了L1的其他实例，其中该基团在框中突出显示。
下表A和A'中给出了接头部分L1的实例。此外该表还说明了这些L1的实例优选地与哪个基团L2组合，还有优选的偶联点(R1或R3或R4)和m的优选值，这是L1前面是否存在羰基(参见§-(CO)m-L1-L2-§§)。这些接头优选地与半胱氨酸残基偶联。如果L2是琥珀酰亚胺或由其衍生，则该酰亚胺也可以完全或部分地为水解的开链琥珀酰胺的形式，如上所述。根据L1，这种向开链琥珀酰胺的水解可能或多或少是显著的或根本不存在。
表A
**特别优选的，在这些行中给出的接头L1连接到选自以下的接头L2上：
和/或
其中#1表示与结合体的硫原子的连接点，#2表示与基团L1的连接点，R22优选地代表-COOH。在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与结合体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选地大于90％(在每种情况下均基于接头与结合体连接的键的总数计)，特别优选作为式A7或A8的两种结构之一。此处，式A7或A8的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至结合体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在
表A‘
**:参见表A的注**。
***:当存在该结构L2时，可同时存在下式的结构L2：
具有相应接头的缀合物的实例具有以下结构，其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，并且L1具有以上给出的含义，L2和L3具有与L1相同的含义，AK 1代表通过半胱氨酸残基连接的抗-CD123的抗体并且n为1至10的数字。特别优选地，AK1为人的、人源化或嵌合的单克隆的抗-CD123的抗体。本文中特别优选的是由源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化的抗-CD123的抗体。特别优选的是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
如果接头连接到赖氨酸侧链或赖氨酸残基，其优选具有下式：
-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中
§代表与活性化合物分子连接的键且
§§代表与结合肽或蛋白质的键，
x代表0或1，
SG代表可裂解的基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，
且
L4代表单键或基团-(CO)y-G4-，其中y代表0或1，且G4代表具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子的直链或支链烃链且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10-元芳族的或非芳族的杂环、-SO-或-SO2-(优选地)，其中侧链(如果存在的话)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
下表B给出了连接至赖氨酸残基的接头的实例。所述表还给出了优选的偶联点(R1-R5)。第一栏还说明了使用相应接头的实例编号。
表B：赖氨酸接头
-§-(SG)x-L4-CO-§§
具有对应接头的缀合物的实例具有以下结构，其中X1代表CH，X2代表C，X3代表N，L4具有上面给出的定义，AK2代表通过赖氨酸残基连接的抗体，n为1至10的数字。特别优选地，AK2为人的、人源化或嵌合的单克隆的抗-CD123的抗体或其抗原结合片段。本文中特别优选的是由来源于小鼠衍生的抗体7G3或12F1的嵌合的或人源化抗-CD123的抗体。特别优选的是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
根据本发明还优选的是基本结构(i)、(ii)或(iv)，其中SG1或SG代表可通过蛋白酶裂解的基团，L1和L2具有上面给出的含义。特别优选的是以下基团：
-Val-Ala-CONH-(在本文中丙氨酸的C-末端酰胺处酰胺键的裂解)
-NH-Val-Lys-CONH-(赖氨酸的C-末端酰胺处酰胺键的裂解)
-NH-Val-Cit-CONH-(瓜氨酸的C-末端酰胺处酰胺键的裂解)
-NH-Phe-Lys-CONH(赖氨酸的C-末端酰胺处酰胺键的裂解)
-NH-Ala-Lys-CONH-(赖氨酸的C-末端酰胺处酰胺键的裂解)
-NH-Ala-Cit-CONH-(瓜氨酸的C-末端酰胺处酰胺键的裂解)
SG1或SG特别优选地为
其中X代表H或可任选地被-NHCONH2、-COOH、-OH、NH2、-NH-CNNH2或磺酸取代的C1-10-烷基。
下表C给出了接头部分-SG1-L1-或-L1-SG-L1-的实例，其中SG1和SG为可通过蛋白酶裂解的基团。表C还说明了这些-SG1-L1-和-L1-SG-L1-的实例优选地与哪个基团L2组合，以及优选的偶联点(R1-R5)和m的优选值，由此在L1前面是否存在羰基(参见§-(CO)m-L1-L2-§§)。将这些接头优选地偶联至半胱氨酸残基。L1基团以方框突出显示。然而，这些基团L1可被上面给出的式§-(CO)m-L1-L2-§§的基团L1之一替代。如果L2为琥珀酰胺或由其衍生，该酰胺也可以完全或部分地为水解的开链琥珀酰胺的形式，如上所述。
表C
具有基本结构(i)的缀合物的实例具有下述结构，其中X1代表CH，X2代表C，X3代表N，L4具有与L1相同的含义，AK1代表通过半胱氨酸残基连接的抗CD-123抗体，n为1至10的数字。本文中特别优选的是由来源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化抗-CD123的抗体。特别优选的是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
KSP抑制剂-接头-中间体以及缀合物的制备
本发明的缀合物是通过首先提供低分子量的KSP抑制剂与接头来制备。然后将以此方式获得的中间体与结合体(优选抗体)反应。
优选地，为了与半胱氨酸残基偶联，将以下化合物中的一种与含半胱氨酸的结合体(如抗体)反应，所述抗体任选地为此目的而被部分还原：
其中R代表-H或-COOH，
其中K代表任选地被C1-C6-烷氧基或-OH取代的直链或支链的C1-C6烷基，且
其中X1代表CH，X2代表C和X3代表N，SG1、L1、L2、L3和L4具有与上述相同的含义。
在每一个上述化合物中以及在下述化合物中，叔丁基可被环己基替代。
化合物可例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合体如抗体的反应，化合物优选地以相对于结合体过量2至12倍摩尔的量使用。
优选地，为了偶联至赖氨酸残基，使下述化合物之一与含赖氨酸的结合体(如抗体)反应：
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，并且L4与L1具有相同的含义，而L1具有与上述相同的含义。
对于与半胱氨酸残基的中间体偶联，所述反应可以如下所示：
其他中间体和其他抗体可以相应地反应。
对于与赖氨酸残基的中间体偶联，所述反应可以如下所示：
根据本发明，这样得到以下缀合物：
根据所述接头，在缀合后，琥珀酰亚胺连接的ADC可以转化为开链琥珀酰胺，其具有有利的稳定性特征。
该反应(开环)可以在pH 7.5至9(优选在pH 8)，在25℃至37℃的温度下进行，例如通过搅拌。优选的搅拌时间是8至30小时。
在上式中，X1代表CH、X2代表C且X3代表N，SG1和L1具有与上述相同的含义，L2、L3和L4具有与L1相同的含义；R和K具有与上述相同的含义。AK1是通过半胱氨酸残基偶联的抗-CD123的抗体，且AK2是通过赖氨酸残基偶联的抗-CD123的抗体。特别优选地，AK1和AK2为由来源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合或人源化抗-CD123的抗体。特别优选的是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
抗-CD123的抗体
文献还公开了将有机分子共价偶联(缀合)至抗体的多种选项。根据本发明优选的是通过抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或通过抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团将毒性基团缀合至抗体。然而，还可通过游离羧基或通过抗体的糖残基将毒性基团结合至抗体。
抗体可以通过键连接至接头。抗体的连接可以通过结合体的杂原子。根据本发明的可用于连接的结合体的杂原子是硫(在一个实施方案中通过抗体的巯基)、氧(根据本发明借助于抗体的羧基或羟基)和氮(在一个实施方案中通过抗体的伯胺或仲胺基团或酰胺基团)。这些杂原子可以存在于天然抗体中或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，所述抗体与所述毒性基团的连接对抗体相对于靶分子的结合活性仅具有很小的影响。在优选的实施方案中，连接对抗体相对于靶分子的结合活性没有影响。
根据本发明，术语“抗体”应理解为其最广泛的含义并包含免疫球蛋白分子，例如完整或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选地包括具有四条多肽链的分子，通常通过二硫键连接的两条重链(H链)和两条轻链(L链)。每条重链包含重链的可变域(缩写为VH)和重链的恒定域。例如，重链的恒定域可以包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含可变域(缩写为VL)和恒定域。轻链的恒定域包含结构域(缩写为CL)。VH和VL结构域可以进一步细分成具有超变性(hypervariability)的区域，也称为互补决定区(缩写为CDR)和具有低序列变异性的区域(框架区，缩写为FR)。通常，每个VH和VL区由三个CDR和最多四个FR组成。例如从氨基末端到羧基末端按以下顺序：FR、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可以从任何合适的物种获得，例如，兔、骆马(llama)、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，抗体是人源的或鼠源的。抗体可以例如是人的、人源化的或嵌合的。
术语“单克隆”抗体是指从基本上均一的抗体群获得的抗体，即所述群体的单个抗体除了天然发生的突变之外是相同的，突变可以是小数目。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不是指特定的制备过程。
术语“完整”抗体是指包含抗原结合结构域以及轻链和重链的恒定域的抗体。恒定域可以是天然存在的结构域或其具有许多修饰的氨基酸位置的变体。
术语“修饰的完整”抗体是指这样的完整抗体，其是通过其氨基末端或羧基末端借助于共价键(例如肽键)与不来源于抗体的另外的多肽或蛋白质融合。此外，抗体可以被修饰以便在确定的位置引入反应性半胱氨酸以促进与毒性基团的偶联(参见Junutula etal.，Nat Biotechnol.2008,26(8):925-32)。
术语“人”抗体是指这样的抗体，其可以从人获得的或者是合成的人抗体。“合成的”人抗体是基于对人抗体序列的分析通过计算机部分或完全地从合成序列获得的抗体。例如，人抗体可以由从人源的抗体序列文库分离的核酸编码。这样的抗体的实例可以发现于et al.,Nature Biotech.2000,18:853-856。
术语“人源化”或“嵌合”抗体描述了由序列的非人的部分和人的部分组成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白(受体)的部分序列被非人免疫球蛋白(供体)的序列部分取代。在很多情况中，供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体的CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，框架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。在一些情况下，人源化抗体含有在抗体优化期间引入的，既不存在于受体中也不存在于供体中的氨基酸。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变域与人抗体的恒定区融合。
如本文所用，术语互补决定区(CDR)是指与抗原结合所需的可变抗体结构域的那些氨基酸。通常，每个可变区具有称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。每个CDR区可以包含根据Kabat的定义的氨基酸和/或根据Chotia定义的超可变(hypervariable)环的氨基酸。根据Kabat的定义包含例如可变轻链的约氨基酸位置24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)的区域以及可变重链的31-35(CDR1)、50–65(CDR2)和95–102(CDR3)的区域(Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。根据Chotia的定义包含例如可变轻链的约氨基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)和91-96(CDR3)的区域以及可变重链的26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和96-101(CDR3)的区域(Chothia and Lesk；J MolBiol 196:901-907(1987))。在一些情况下，CDR可包含来自根据Kabat和Chotia定义的CDR区的氨基酸。
根据重链的恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为不同的类别。完整抗体主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的重链的恒定区称为[阿尔法/α]、[德耳塔/δ]、[伊普西隆/ε]、[伽马/γ]和[谬/μ]。抗体的三维结构和亚基结构都是已知的。
将抗体/免疫球蛋白的术语“功能片段”或“抗原结合抗体片段”定义为仍然包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合结构域的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变结构域)。抗体的“抗原结合结构域”通常包含抗体的一个或多个超可变区，例如CDR、CDR2和/或CDR3区。然而，在抗体与抗原的结合过程中，抗体的“框架”或“骨架”区也可起作用。框架区形成CDR的骨架。优选地，抗原结合结构域至少包含可变轻链的第4至103位的氨基酸和可变重链的第5至109位的氨基酸，更优选可变轻链的第3至107位的氨基酸和可变重链的第4至111位的氨基酸，特别优选完全的可变轻链和重链，即VL的第1-109位的氨基酸和VH的第1-113位的氨基酸(根据WO97/08320编号)。
本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”非排他性地包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，双抗体，单域抗体(Dab)，线性抗体，抗体的单个链(单链Fv，缩写为scFv)；以及多特异性抗体，例如双特异性抗体和三特异性抗体，例如从抗体片段形成的多特异性抗体C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in MolecularBiology),牛津大学出版社；R.Kontermann&S.Duebel,editor(2001)AntibodyEngineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag。除了“多特异性”或“多功能性”抗体以外的抗体是具有相同结合位点的那些抗体。多特异性抗体可以对抗原的不同表位具有特异性，或者可以对多于一种抗原的表位具有特异性(参见例如WO 93/17715；WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.,1991,J.Immunol.147:60 69；U.S.专利号4,474,893；4,7 14,68 1；4,925,648；5,573,920；5,601,8 19；或Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547 1553)。可以构建F(ab')2或Fab分子，使得Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量可以减少或完全防止。
“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链或其组合)组成，并且通常具有特定的三维结构特性和特定的电荷特性。
“功能片段”或“抗原结合抗体片段”可以经由其氨基末端或羧基末端通过共价键(例如肽键)与不来源于抗体的另一种多肽或蛋白质融合。此外，抗体和抗原结合片段可以通过在确定的位置引入反应性半胱氨酸来修饰，以促进与毒性基团的偶联(参见Junutulaet al.Nat Biotechnol.2008Aug；26(8):925-32)。
多克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(and Milstein,Nature,256,495-497,1975)。人单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(Olsson et al.,Meth Enzymol.92,3-16或Cabilly et al.US 4,816,567或Boss etal.US4,816,397)。
本领域普通技术人员知晓用于制备人抗体及其片段的多种方法，例如通过转基因小鼠(N Lonberg and D Huszar,Int Rev Immunol.1995；13(1):65-93)或噬菌体展示技术(Phage Display Technologien)(Clackson et al.,Nature.1991年8月15日；352(6336):624-8)。本发明的抗体可以从重组抗体文库获得，所述重组抗体文库例如由大量健康志愿者收集的多种抗体的氨基酸序列组成。抗体也可以通过已知的重组DNA技术产生。抗体的核酸序列可以通过常规测序获得，或者可以从公众可获得的数据库获得。
已经纯化了“分离的”抗体或结合体以移除细胞的其它成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的污染成分例如是细胞的酶、激素或其他肽或非肽成分。优选的抗体或结合体是与抗体或结合体相比纯化程度超过95重量％的抗体或结合体(例如通过Lowry法、UV-Vis光谱法或通过SDS毛细管凝胶电泳测定)。此外，纯化程度使得可以确定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的抗体或已经纯化至均一的抗体，均一性(homogeneity)是通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下测定(检测可通过考马斯亮蓝染色或优选通过银显色来测定)。然而，抗体通常是通过一个或多个纯化步骤来制备。
术语“特异性的结合(specific binding)”或“特异性地结合(bindsspecifically)”是指结合预定抗原/靶分子的抗体或结合体。抗体或结合体的特异性结合通常描述亲和力至少为10-7M的抗体或结合体(称为Kd值；即优选Kd值小于10-7M的那些抗体 或结合体)，其中抗体或结合体对预定抗原/靶分子的亲和力比对不是预定抗原/靶分子或紧密相关抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)高至少两倍。抗体优选地具有至少10-7M的亲和力(称为Kd值；换言之，优选Kd值小于10-7M的那些抗体)，优选至少10-8M，更优选10-9M至10-10M。例如，可以通过表面等离子体共振光谱法来确定Kd值。
本发明的抗体-药物缀合物同样表现出在这些范围内的亲和力。亲和力优选地基本上不受药物缀合的影响(通常，亲和力降低小于一个数量级，换言之，例如至多10-8M至10-7M)。
根据本发明使用的抗体还明显优选地具有高选择性。当本发明的抗体对靶蛋白表现出的亲和力比对于独立的其他抗原高至少2倍，优选5倍或更优选10倍，则存在高选择性，例如人血清白蛋白(亲和力可以例如通过表面等离子体共振光谱法来测定)。
此外，所使用的本发明的抗体优选地是交叉反应性的。为了能够促进且更好地解释临床前研究，例如毒理学或活性研究(例如在异种移植小鼠中)，如果根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白而且还结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，那么这是有利的。在一个实施方案中，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还与至少一种其他物种的靶蛋白交叉反应性。对于毒理学和活性研究，优选使用啮齿动物、狗和非人灵长类科的种。优选的啮齿动物的种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物是猕猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还与选自鼠、大鼠和长尾猕猴(成束猴(Macaca fascicularis))的至少一种其他物种的靶蛋白交叉反应。特别优选的是，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还至少与小鼠靶蛋白交叉反应。优选交叉反应性抗体，其对其他非人物种的靶蛋白的亲和力与对人的靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，更特别是不超过10倍。
针对癌症靶分子的抗体
结合剂(如抗体或其抗原结合片段)所针对的靶分子优选地是癌症靶分子。术语“癌症靶分子”描述了这样的靶分子，即与非癌细胞相比，其更大量地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上。优选地，与非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上，其中与非癌细胞相比，选择性地描述了在相同组织类型的癌细胞上至少两倍的富集(“选择性癌症靶分子”)。使用癌症靶分子允许使用根据本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。
本文中特别优选的是细胞外的癌症靶分子IL-3Rα，CD123(SEQ ID NO：41)。
功能性白介素3受体为包含特定α链(IL-3Rα，CD123)和“通用的(general)”IL-3受体β链(βC，CD131)的异源二聚体，所述IL-3受体β链被粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的受体和白介素5(IL-5)的受体所共有。
IL-3Rα，CD123，为具有计算分子量为约41kDa的1型跨膜蛋白质。CD123包含参与IL-3结合的细胞外结构域、跨膜结构域和约50个氨基酸的短细胞质末端(end)。细胞外结构域由两个区组成：与GM-CSF和IL-5受体α链的等价区具有序列相似性的约100个氨基酸的N-末端区；和跨膜区近端的区域，该区包含四个保守的半胱氨酸残基和细胞因子受体家族中常见的WSXWS基序。
IL-3结合域包含由两个Ig-样折叠的两个结构域构成的约200个氨基酸残基的细胞因子受体基序(CRM)。IL-3Rα，CD123，的细胞外结构域是高度糖基化的，N-糖基化是配体结合和受体信号转导所需要的。
IL-3Rα，CD123，在整个造血系统中广泛地表达，例如在造血前体细胞、肥大细胞、红系细胞、巨核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和CD5+B淋巴细胞上；CD123还在非造血细胞(例如树突细胞、莱迪希细胞、内皮细胞和间质细胞)上表达。
IL-3Rα，CD123，还通过参与特定疾病的细胞表达；这些疾病包含：骨髓增生异常综合征、白血球过多症(如急性髓性白血病(AML))、淋巴瘤、变态反应和自身免疫性病症如狼疮或硬皮病。
由于这些关系，抗-IL-3Rα，抗-CD123，的抗体可作为裸露的抗体或偶联的抗体(如ADC)用于治疗。
本发明涉及包含特异性结合至IL-3Rα，CD123(SEQ ID NO：41)的抗体的缀合物。
术语“抗-CD123的抗体”或“特异性结合至CD123的抗体”涉及结合具有足以用于诊断和/或治疗应用的亲和力的癌症靶分子CD123(IL-3Rα，SEQ ID NO：41)的抗体。在一个实施方案中，抗-CD123的抗体向与CD123无关的蛋白质的结合比抗体向CD123的结合少10％，例如通过表面等离子共振光谱法测定。在某些实施方案中，抗体结合CD123(IL-3Rα，SEQ IDNO：41)，其中解离常数(KD)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM。在某些实施方案中，抗-CD123的抗体结合至在不同种类之间保守的表位。
结合癌症靶分子的抗体可由本领域普通技术人员使用已知的方法(例如化学合成或重组表达)来制备。癌症靶分子的结合体可以商购获得或可以由本领域普通技术人员使用已知的方法(例如化学合成或重组表达)来制备。用于制备抗体或抗原结合抗体片段的其它方法记载于WO 2007/070538(参见第22页“抗体”)。本领域技术人员已知如何编译诸如噬菌体展示文库(例如Morphosys HuCAL Gold)的方法并将其用于发现抗体或抗原结合抗体片段(参见WO 2007/070538，第24页以及第70页上的AK实施例1、第72页上的AK实施例2)。用于制备使用来自B细胞的DNA文库的抗体的其他方法例如记载于第26页(WO 2007/070538)。人源化抗体的方法记载于WO2007070538的第30-32页并详细记载于Queen et al.,Pros.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033,1989或WO 90/0786中。此外，一般来说，用于重组表达蛋白质的方法并且特别是用于重组表达抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如Berger and Kimrnel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology,Vo1.152,Academic Press,Inc.)；Sambrook,et al.,(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,(第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold SpringHarbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabelet al.[Eds.],Current Protocols,Green Publishing Associates,Inc./John Wiley&Sons,Inc.)；Harlow et al.,(Monoclonal Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1988,Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams&Wilkins(1998))；以及Harlow et al.,(Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。本领域技术人员已知表达蛋白质/抗体所必需的相应载体、启动子和信号肽。常见的方法也记载于WO2007/070538的第41-45页。制备IgG1抗体的方法记载于例如WO2007/070538的第74页的实施例6ff中。允许测定与其抗原结合后的抗体内化的方法是本领域技术人员已知的，并且例如记载于WO 2007/070538的第80页。本领域技术人员能够使用记载于WO 2007/070538中的方法，其已经被用于以与制备具有不同靶分子特异性的抗体的类似方式制备碳酸酐酶IX(Mn)抗体。
抗-CD123的抗体
根据本发明，使用抗-CD123的抗体或其抗原结合片段，优选使用选自下面描述的那些或通过适当突变修饰的那些中的一种。此外，本领域技术人员熟知结合至CD123的抗体。
Sun等人(Sun e al.，1996，Blood 87(1)：83-92)描述了单克隆的抗体7G3的产生和性质，其结合至IL-3Rα，CD123的N-末端域。US专利第6,177,078号(Lopez)涉及抗-CD123的抗体7G3。该抗体的嵌合变体(CSL360)记载于WO 2009/070844中，人源化版本(CSL362)记载于WO 2012/021934中。7G3抗体的序列公开于EP2426148中。该序列代表通过CDR移植获得的人源化抗体TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971的起点。
细胞表面抗原结合后内化特别好的抗体为由Kuo等人(Kuo et al.，2009,Bioconjug Chem.20(10)：1975-82)公开的抗-CD123的抗体12F1。抗体12F1对CD123结合的亲和力高于抗体7G3，且在细胞表面抗原结合后比7G3显著更快地内化。基于12F1的双特异性scFv免疫融合蛋白公开于WO 2013/173820中。抗体TPP-6013为12F1的嵌合变体。
特别地，本发明涉及与由源于小鼠的抗体7G3(Sun等人,1996,Blood 87(1)：83-92)和12F1(Kuo et al.，2009,Bioconjug Chem.20(10)：1975-82)衍生的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体的缀合物，或与由源于小鼠的抗体12F1(Kuo et al.，2009，BioconjugChem.20(10)：1975-82)衍生的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体的缀合物。
抗-CD123的抗体的产生
基于公开的7G3的可变区(VH和VL)的序列(EP2426148)，通过人框架区的CDR移植获得以下抗体序列：TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
基于公开的12F1的可变区(VH和VL)的序列(WO 2013/173820)，通过将免疫球蛋白的可变区(VH和VL)与人抗体的恒定区融合获得以下抗体序列：TPP-6013。
抗-CD123的抗体的其他人源化变体可通过本技术领域中已知的人源化方法产生。
产生它们的方法的综述可见于Almagro and Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，进一步见于Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Queen et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；US专利第5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409号；Kashmiri et al.，Methods 36：25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了表面重修)；Dall'Acquaet al.，Methods 36：43-60(2005)(描述了FR改组)；和Osboum et al.，Methods 36：61-68(2005)和Klimka et al.，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了用于FR改组的指导性选择方法)。
抗-CD123的抗体的具体实施方案
在本申请中，涉及下面的优选的本发明的抗-CD123的抗体，如下表所示：“TPP-6013”、“TPP-5968”、“TPP-5969”和“TPP-5971”。
TPP-6013是12F1的嵌合变体，其中可变区VH和VL连接至kappa亚型的人IgG1的恒定区(CL、CH1、CH2、CH3)。
抗体TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971是作为人IgG1kappa亚型形式的7G3的人源化变体。
表：抗体的蛋白质序列：
TPP-5968是包含对应于SEQ ID NO：9的重链区和对应于SEQ ID NO：10的轻链区的抗体。
TPP-5969是包含对应于SEQ ID NO：19的重链区和对应于SEQ ID NO：20的轻链区的抗体。
TPP-5971是包含对应于SEQ ID NO：29的重链区和对应于SEQ ID NO：30的轻链区的抗体。
TPP-6013是包含对应于SEQ ID NO：39的重链区和对应于SEQ ID NO：40的轻链区的抗体。
TPP-5968是：包含对应于SEQ ID NO：1的重链可变区和对应于SEQ ID NO：5的轻链可变区的抗体。
TPP-5969是：包含对应于SEQ ID NO：11的重链可变区和对应于SEQ ID NO：15的轻链可变区的抗体。
TPP-5971是：包含对应于SEQ ID NO：21的重链可变区和对应于SEQ ID NO：25的轻链可变区的抗体。
TPP-6013是：包含对应于SEQ ID NO：31的重链可变区和对应于SEQ ID NO：35的轻链可变区的抗体。
根据本发明用于与接头和/或毒性基团偶联的抗-CD123的抗体的优选实施方案为下面这些：
1.结合至CD123且为抗体7G3或12F1的嵌合的或人源化的变体的抗体或抗原结合片段。
2.结合至CD123的抗体或抗原结合片段，包含：
包含如SEQ ID NO：2中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：3中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：4中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO：6中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：7中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：8中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO：12中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：13中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：14中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO：16中所示轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：17中所示轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：18中所示轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO：22中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：23中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：24中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO：26中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：27中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：28中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO：32中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：33中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：34中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
可变轻链包含如SEQ ID NO：36中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：37中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：38中所示的轻链的可变CDR3序列。
3.根据实施方案2所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
如SEQ ID NO：1中所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO：5中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：11中所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO：15中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：21中所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO：25中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：31中所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO：35中所示的轻链的可变序列。
4.根据前述任一实施方案所述的抗体，其为IgG抗体。
5.根据前述任一实施方案所述的抗体，包含：
如SEQ ID NO：9中所示的重链的序列，以及如SEQ ID NO：10中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：19中所示的重链的序列，以及如SEQ ID NO：20中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：29中所示的重链的序列，以及如SEQ ID NO：30中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：39中所示的重链的序列，以及如SEQ ID NO：40中所示的轻链的序列。
6.根据前述任一实施方案所述的抗体，包括：根据前述任一实施方案的抗原结合片段或根据前述任一实施方案的抗体的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab’片段或F(ab)2片段。
7.根据前述任一实施方案所述的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或其抗原结合片段。
8.根据前述任一实施方案所述的抗体或抗原结合片段，其为人的、人源化的或嵌合的抗体或抗原结合片段。
特别优选的是抗-CD123的抗体“TPP-6013”、“TPP-5968”、“TPP-5969”和“TPP-5971”。
同位素、盐、溶剂合物、同位素变体
本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体在此应理解为是指其中本发明化合物中的至少一个原子已被替换为具有相同原子序数但具有不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一个原子的化合物。可纳入本发明化合物的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的那些同位素，例如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。本发明化合物的特定同位素变体(尤其是其中已经掺入一种或多种放射性同位素的那些化合物的同位素变体)可能是有益的，例如用于检查作用机制或体内的活性成分分布；由于相对容易的可制备性和可检测性，特别是用3H或14C同位素标记的化合物适合于此目的。另外，掺入同位素(例如掺入氘)，可能由于化合物具有更高的代谢稳定性(例如体内半衰期延长或所需活性剂量降低)而导致特定的治疗益处；因此，本发明化合物的这些修饰在一些情况下也可构成本发明的优选实施方案。本发明化合物的同位素变体可以通过本领域技术人员已知的方法制备，例如通过下文进一步描述的方法和工作实施例中描述的操作、通过使用相应的同位素修饰各个试剂和/或起始化合物。
本发明上下文中优选的盐是本发明化合物的生理上可接受的盐。还包括本身不适用于药物应用，但可用于例如分离或纯化本发明化合物的盐。
本发明化合物的生理学上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。
本发明化合物的生理学上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如且优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及由氨或有机胺衍生的具有1至16个碳原子的铵盐，例如且优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺。
在本发明的上下文中命名为溶剂合物的是通过与溶剂分子配位而形成固体或液体状态的复合体的本发明化合物的那些形式。水合物是与水配位的溶剂合物的具体形式。在本发明上下文中优选的溶剂合物是水合物。
此外，本发明还包括本发明化合物的前药。本申请上下文中的术语“前药”是指本身可以是具有生物活性或无活性的，但在其体内停留时间内被转化(例如代谢或水解方式)成本发明化合物的化合物。
具体实施方案
以下实施方案是特别优选的：
实施方案A：
下式的ADC
其中KSP-L-代表下面的式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)、(Iik)的化合物或下面的式(IIf)的化合物，结合体为抗-CD123的抗体(特别优选由来源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化的抗-CD123的抗体，特别是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971)，且n代表1至10的数字：
式(IIf)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；
R3代表-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选地为C1-3-烷基)取代；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-代表接头且#1代表与抗体连接的键，
以及ADC的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐。
接头优选地为以下接头
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与KSP连接的键，且
§§代表与抗体连接的键，且
L2代表
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
且L1由下式代表
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次的直链或支链的烃链：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环或-SO-(优选地)，其中侧链(如果存在的话)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
本文中，#1为与KSP抑制剂连接的键且#2为与抗体连接的偶联基团(例如L2)的键。
实施方案B：
下式的ADC
其中KSP-L-代表下式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIi)、(IIj)、(Iik)的化合物或下式(IIg)的化合物，结合体为抗-CD123的抗体(特别优选的是由源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源抗-CD123的抗体，特别是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971)，且n代表1至10的数字：
式(IIg)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；
R3代表-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选地为C1-3-烷基)取代；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-代表接头且#1代表与抗体连接的键，
其中-L-由以下表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与KSP连接的键且
§§代表与抗体连接的键，且
L2代表
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
且L1由下式表示
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次的直链或支链的烃链：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环，或-SO-(优选地)，其中侧链(如果存在的话)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
#1与KSP抑制剂连接的键且#2为与抗体连接的偶联基团的键(例如L2),
以及ADC的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐。
实施方案C：
下式的ADC
其中KSP-L-代表下面的式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIi)、(IIj)、(Iik)的化合物或下面的式(IIh)的化合物，结合体为抗-CD123的抗体(特别优选的由源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化抗-CD123的抗体，特别是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971)，且n代表1至10的数字：
式(IIh)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；
R3代表C1-10-烷基-，其可任选地被-OH,O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选地为C1-3-烷基)取代，或-MOD；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至10个碳原子且可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次的直链或支链的烃基：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中-L-代表接头且#1代表与抗体连接的键,
其中-L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与KSP连接的键且
§§代表与抗体连接的键，且
L2代表
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
且L1由下式表示
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次的直链或支链的烃链：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环、-SO-或-SO2-(优选地)，其中含侧链的烃链(如果存在的话)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1与KSP抑制剂连接的键，#2为与抗体连接的偶联基团(例如L2)的键，
以及ADC的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐。
实施方案D：
本发明还提供下面通式的结合体/活性化合物缀合物：
其中BINDER代表抗-CD123的抗体(特别优选由源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化抗-CD123的抗体，特别是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971)，L代表接头，WS代表活性化合物，优选KSP抑制剂，例如，根据本发明的式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIh)、(IIi)之一的KSP抑制剂，m代表1至2的数字，优选1，且n代表1至50的数字，优选1.2至20且特别优选2至8，其中L具有一种以下的结构。本文中，m代表每个接头的活性化合物分子的数目且n为每个BINDER的活性化合物/接头缀合物数目平均值。因此缀合物分子中存在的所有WS的总和为m和n的乘积。
WS为在动物中(优选在人中)具有局部的或全身的治疗作用的活性化合物。这些活性化合物的分子量通常小于5kDa，优选小于1.5kDa。优选的活性化合物为长春花生物碱、奥利他汀类(auristatins)、tubulysins、多卡米星、激酶抑制剂、MEK抑制剂和KSP抑制剂。
本文中，L代表下式A3和A4之一
其中#1表示与抗体的硫原子的连接点，#2表示与活性化合物的连接点，x代表1或2，且R22代表COOH、COOR、COR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2、Br，优选COOH。
L1具有如上相同的含义。优选地，-L1-#2由下式代表：
#3-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
#3表示结合至氮原子的结合点，
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表NHCO或则R10不代表NH2)，
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个来自亚芳基基团和/或直链和/或支链的和/或环状亚烷基基团的碳原子且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次的直链或支链的烃链：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环、-SO-或-SO2-(优选地)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中其他间断基团优选地为
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体体的半胱氨酸残基连接的键，其达到优选超过80％、特别优选超过90％(在每种情况下基于接头与抗体的键的总数)，所述键作为式A3或A4的两种结构之一。
与式A3或A4的接头的缀合物可通过分别将抗体偶联至式A3‘和A4‘的适当的溴衍生物而获得：
这些式A3‘或A4‘的溴衍生物可通过使R22CH2CHBrCOOH或R22CHBrCH2COOH与结合体的胺基团反应而获得，如以示例的方式在下面的方案30至32中所述。
方案30：
[a)：2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量的TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT]
方案31：
[a)：2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量的TCEP、PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT.]
实施方案E：
本发明还提供下面通式的结合体/活性化合物缀合物：
其中BINDER代表抗-CD123的抗体(特别优选由源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化抗-CD123的抗体，特别是抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971)，L代表接头，WS代表活性化合物，优选KSP抑制剂，例如，根据本发明式(I)、(Ia)、(II)或(IIa)的KSP抑制剂，m代表1至2的数字，优选1，且n代表1至50的数字，优选1.2至20且特别优选2至8，其中L具有一种下面的结构式。本文中，m代表每个接头的活性化合物分子/的数目且n为每个BINDER的活性化合物/接头缀合物数目平均值。因此缀合物分子中存在的所有WS的总和为m和n的乘积。
本文中，L代表：
其中#1表示与抗体的硫原子的连接点，#2表示与活性化合物的连接点，R22代表COOH、COOR、COR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2、Br，优选COOH；连接至结合体的硫原子的连接由此可具有以下结构中的一种：
在每个抗体药物缀合物含有多于一个活性化合物分子WS的抗体药物缀合物的情况下，根据式A1和/或A2的两种结构皆可存在于抗体药物缀合物中。由于本发明的抗体药物缀合物可为不同抗体药物缀合物的混合物，因此该混合物还可既包含式A1或式A2的抗体药物缀合物又包含和式A1和A2的那些。
L5为选自-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-的基团，其中m、n、o、p和q彼此独立地具有以下值：m＝0-10；n＝0或1；o＝0-10；p＝0或1；且q＝0-10，其中m+n+o＝1-15，优选1-6。x代表5-或6-元芳族的或非芳族的杂环或同素环，优选-C6H4-或-C6H10-。RS代表酸基团，优选-COOH或SO3H。
L6为选自以下的基团：-CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、其中r为1、2或3。
L7为单键或选自具有1至100个(优选1至10个)来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次的直链或支链的烃链的基团：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均被以下基团取代：NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10-元、优选5-至10-元芳族的或非芳族的杂环、-SO-或-SO2-(优选地)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
L5优选地为基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m＝1-3，n＝0，o＝0-7，p＝0且q＝0或1。特别优选基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m＝1或2，n＝0，o＝0或1，p＝0和q＝0或1。
L6优选地为选自-CONH-和-NHCO-的基团。
L7优选地为单键或-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
其中
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝1至5；且
X4代表-O-、-CONH-、-NHCO-或
特别优选地，L7为单键或基团-[(CH2)x-NHCO-)]，其中x＝1至5。
特别优选地，-L5-L6-L7-代表-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q--NHCO--[(CH2)x-NHCO-)]，其中m＝1或2，n＝0，o＝0或1，p＝0，且q＝0或1，且x＝1-5。
然而，然后这两种结构还可以共同存在于本发明的缀合物中。
根据本发明，这些抗体药物缀合物可由下式的化合物制备
其中L具有下式A‘：
优选地，A‘向A的转化是通过在37℃以下的温度(优选10至25℃的温度下)在pH为7.5至8.5(优选8)的pH缓冲液中经至多40个小时(优选1至15个小时)内的搅拌进行。
实施方案I：
下式的抗体药物缀合物
其中
R2、R4和R5代表H；
R3代表-CH2OH；
R1代表-L1-L2-BINDER，其中
L1代表
其中#2代表与L2的连接点，#1代表与其他连接的连接点；
且L2代表下式A5和A6结构中的一个或两个：
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其达到优选超过80％、特别优选超过90％(在每种情况下基于接头与抗体的键的总数)的程度，特别优选作为式A5或A6的两种结构之一：
本文中，式A5或A6的结构通常一起存在，优选以60:40至40:60的比率，基于与抗体连接的键的数目计。然后其余键作为以下结构存在。
抗体优选地为由来源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化抗-CD123的抗体。特别优选抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
特定实施方案
提供了根据下式之一的下述特别优选的抗体缀合物，其中n为1至20的数字，AK1(以及AK1a、AK1b等)和AK2(以及AK2a、AK2b等)为抗体。AK1为通过半胱氨酸连接的抗体，AK2为通过赖氨酸连接的抗体。下式之一中的抗体(AK1或AK2)优选地为由来源于小鼠的抗体7G3或12F1衍生的嵌合的或人源化抗-CD123的抗体。特别优选抗体TPP-6013、TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971。
其他缀合物
其他缀合物可具有下式之一：
其中
AK1代表通过半胱氨酸连接的抗体且AK2代表通过赖氨酸连接的抗体，其抗体结合至CD123并代表抗体7G3或12F1的嵌合或人源化变体或为其抗体片段，
n代表1至20的数目；且
L1代表被以下基团相同或不同地间断一次或多于一次的具有1至30个碳原子的直链或支链的烃链：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、环戊基、哌啶基、苯基，其中直链或支链的烃链可被-COOH或-NH2取代，
以及它们的盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐及其差向异构体。
本文中，接头L1优选地代表以下基团
§-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)6-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-O-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(CH3)-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2OH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-NH§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)5-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
或
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§,
其中
§代表与活性化合物分子连接的键且
§§代表与抗体连接的键和
异C3H7代表异丙基基团。
这些缀合物还包括它们的盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体。
治疗用途
可采用本发明化合物治疗的过度增殖性疾病特别包括癌症和肿瘤疾病。在本发明的上下文中，这些癌症和肿瘤疾病被理解为特别指以下疾病，但不限于此：乳腺癌和乳腺肿瘤(包括导管和小叶形式的乳腺癌，也是原位的)、呼吸道的肿瘤(小细胞肺癌或非小细胞肺癌、支气管癌)、脑肿瘤(例如脑干的肿瘤和下丘脑的肿瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤以及神经外胚层和松果体瘤)、消化道器官的肿瘤(食道癌、胃癌、胆囊癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝肿瘤(尤其是肝细胞癌、胆管上皮癌和混合肝细胞胆管上皮癌)、头部和颈部的肿瘤(喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌、口腔黑素瘤)、皮肤肿瘤(基底细胞癌、棘细胞癌(spinalioma)、鳞状细胞癌、Kaposi氏肉瘤、恶性黑色素瘤、非黑色素皮肤癌、Merkel细胞皮肤癌、肥大细胞肿瘤)、间质肿瘤和结缔组织肿瘤(尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤)、眼睛的肿瘤(特别是眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、内分泌腺和外分泌腺的肿瘤(例如甲状腺和甲状旁腺的肿瘤、胰腺和唾液腺癌、腺癌)、泌尿道的肿瘤(膀胱、阴茎、肾脏、肾盂和输尿管的肿瘤)和生殖器官的肿瘤(子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、女性的外阴癌和子宫癌以及男性的前列腺癌和睾丸癌)。这些癌症和肿瘤疾病还包括血液、淋巴系统和脊髓的增殖性疾病，其以固体形式且为循环细胞，例如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，例如急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病，以及AIDS相关淋巴瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、非Hodgkin氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。
这些在人类中被充分特征的疾病也可以在其他哺乳动物中以相似的病因发生，在其他哺乳动物中同样可以用本发明的化合物进行治疗。
用本发明的化合物治疗上述癌症疾病包括治疗实体瘤和治疗实体瘤的转移或循环形式。
在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”以常规意义使用，意指照料、照顾、护理患者，目的是对抗、减轻、减弱或缓解疾病或健康异常，改善由该疾病所损害的生活状态，例如在癌症的情况下。
因此，本发明还提供了本发明化合物用于治疗和/或预防病症，特别是上述病症的用途。
本发明还提供了本发明化合物在制备用于治疗和/或预防病症，特别是上述病症中的用途。
本发明还提供了本发明化合物在治疗和/或预防病症，特别是上述病症的方法中的用途。
本发明还提供了使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防病症，特别是上述病症的方法。
本发明化合物可以单独使用，或者如果需要的话，与一种或多种其他药理学活性物质组合使用，条件是该组合不会导致不合乎需要的和不可接受的副作用。因此，本发明还提供了药物，其包含至少一种本发明化合物和一种或多种其他活性成分，特别用于治疗和/或预防上述病症。
例如，本发明化合物可以与已知的抗过度增殖物质、细胞抑制物质或细胞毒性物质组合用于治疗癌症疾病。合适的组合活性成分的实例包括：
131I-chTNT、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、阿法替尼、阿柏西普、阿地白介素、阿仑珠单抗、alisertib、阿利维A酸、alpharadin(氯化镭-223)、六甲蜜胺、氨鲁米特、AMP-514、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、arglabin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、AT9283、阿西替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比生群、博来霉素、BMS-936559、博舒替尼、硼替佐米、brentuximab vedotin、布舍瑞林、白消安、卡巴他赛、卡博替尼、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来昔布、西莫白介素、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、氯法拉滨、copanlisib、crisantaspase、克唑替尼、环磷酰胺、CYC116、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、阿法达贝泊汀、达拉菲尼、达鲁舍替、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素2、地诺单抗、地洛瑞林、二溴螺氯铵、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星+雌酮、依库丽单抗、依决洛单抗、依利醋铵、艾曲泼帕、内皮他丁、ENMD-2076、依诺他滨、表柔比星、环硫雄醇、阿法依泊汀、倍他依泊汀、依他铂、艾立布林、埃罗替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福美坦、福莫司汀、氟维司群、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗、glutoxim、戈舍瑞林、组胺二盐酸盐、组氨瑞林、羟基脲、I-125种子、伊班膦酸、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、INCB24360、英丙舒凡、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、易普利姆玛、伊立替康、伊沙匹隆、lambrolizumab、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、来格司亭、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、麦角乙脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索罗酚、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、美雄烷、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基乙酰丙酸甲酯、甲睾酮、米伐莫肽、米替福新、米铂、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、MLN-8054、Mps1抑制剂(公开于WO2013/087579中，特别是实施例01.01，WO2014/131739中，特别是实施例2中)、萘达铂、奈拉滨、奈莫柔比星、尼洛替尼、尼鲁米特、尼妥珠单抗、尼莫司汀、硝氨丙吖啶、nivolumab、NMS-P715、NMS-P937、奥法木单抗、奥美拉唑、奥普瑞白介素、奥沙利铂、p53基因疗法、紫杉醇、palbociclib、palifermin、钯-103种子、帕米膦酸、帕尼单抗、帕唑帕尼、培门冬酶、PEG-倍他依泊汀(甲氧基-PEG-倍他依泊汀)、聚乙二醇化非格司亭、Peg干扰素-α-2b、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛霉素、培磷酰胺、溶链菌、吡柔比星、普乐沙福、普卡霉素、聚氨葡糖、聚磷酸雌二醇、多糖-K、帕纳替尼、卟吩姆钠、普拉曲沙、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、喹高利特、R763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫司汀、雷佐生、refametinib、瑞格非尼、利塞膦酸、利妥昔单抗、罗米地新、罗米司亭、roninciclib、鲁索利替尼、沙格司亭、sipuleucel-T、西佐喃、索布佐生、甘氨双唑钠、SNS-314、索拉非尼、链脲菌素、舒尼替尼、他拉泊芬、他米巴罗汀、他莫昔芬、他索纳明、替西白介素、替加氟、替加氟+吉美嘧啶+奥特拉西、替莫泊芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度胺、塞替哌、胸腺法新、TKM-PLK1、硫鸟嘌呤、托珠单抗、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、托泽色替、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲奥舒凡、维甲酸、曲洛司坦、曲普瑞林、曲磷胺、色氨酸、乌苯美司、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、volasertib、伏立诺他、伏罗唑、XL228、钇-90玻璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星。
此外，本发明的化合物可例如与例如可结合至下列靶上的结合体组合：OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3、CD40。
另外，本发明化合物还可以与放射疗法和/或外科手术干预组合使用。
通常，以下目标可以通过本发明化合物与其他细胞抑制活性剂或细胞毒性活性剂的组合来实现：
与使用单独活性化合物的治疗相比，在减缓肿瘤生长、减小肿瘤尺寸或甚至完全消除肿瘤方面功效提高；
以比单一疗法情况下的剂量更低的剂量使用化学疗法药物的可能性；
与单独给药相比，副作用更少的更可耐受的疗法的可能性；
治疗更广谱的肿瘤病症的可能性；
获得更高的治疗反应率；
与当前的标准疗法相比，患者的存活时间更长。
此外，本发明化合物还可以与放射疗法和/或外科手术干预组合使用。
本发明还提供了药物，其包含至少一种通常与一种或多种惰性的、无毒的、药学上合适的赋形剂一起的本发明化合物，以及其用于上述目的的用途。
本发明化合物可以全身地和/或局部地起作用。为此目的，它们可以以合适的方式给药，例如肠胃外给药，可能吸入地或作为植入物或支架给药。
本发明化合物可以以适合于这些给药途径的给药形式给药。
肠胃外给药可以绕过吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰内)或者可以包括吸收(例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)。适于胃肠外给药的给药形式包括以溶液剂、悬液剂、乳剂或冻干剂形式的用于注射和输注的制品。优选肠胃外给药，尤其是静脉内给药。
通常，已发现在胃肠外给药的情况下，给药约0.001至1mg/kg体重，优选约0.01至0.5mg/kg体重的量有益于达到有效的结果。
然而，在某些情况下，有必要偏离所述的量，具体地根据体重、给药途径、个体对活性成分的反应、制品的性质以及进行给药的时间或间隔。因此，在一些情况下，小于上述最小量时可能就足够了，而在其他情况下，必须超过所提到的上限。在给药更大量的情况下，可以建议在一天中将它们分成几个单独剂量。
实施例
下面的实施例举例说明本发明。本发明不限于这些实施例。
除非另有说明，下面的试验和实施例中的百分比是重量百分比；份数是重量份数。液体/液体溶液的溶剂比例、稀释比例和浓度数据在每种情况下均是基于体积。
在实验的描述中，如果进行反应的温度未说明，则可假定是室温。
合成路线：
作为工作实施例的示例，下述方案示出了成为工作实施例的示例性合成路线：
方案20：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案21：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案22：中间体的合成
[a)：例如三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)例如乙酰氧基乙酰基氯，NEt3，DCM，RT；c)例如LiOH，THF/水，RT；d)例如H2，Pd-C，EtOH，RT；e)例如Teoc-OSu，NEt3，二噁烷，RT；f)例如Fmoc-Cl，二异丙基乙胺，二噁烷/水2:1，RT]
方案24：中间体的合成
[a)：例如苄基溴，Cs2CO3，DMF，RT；b)例如Pd(dppf)2Cl2，DMF，Na2CO3，85℃；c)例如LiAlH4，THF，0℃；MnO2，DCM，RT；d)例如Ti(iOPr)4，THF，RT；e)例如tBuLi，THF，-78℃；MeOH，NH4Cl；f)例如HCl/1,4-二噁烷]
方案25：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案26：经由水解的琥珀酰胺进行的半胱氨酸-连接的ADC的合成
该方法特别用于将其中L1＝CH2或其中L1＝CH-CH3或其中L1＝苯基的ADC以将这些ADC转化成开链连接形式。
方案27：ADC前体分子的合成
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰基氯，二异丙基乙胺，DCM，RT；c)LiOH，MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案28：ADC前体分子的合成
[a)：HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案29：ADC前体分子的合成
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰基氯，三乙胺，DCM，RT；c)LiOH，MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案30：ADC的合成
[a)：2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4个当量的TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT。]
方案31：ADC的合成
[a)：2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4个当量的TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT。]
方案32：中间体的合成
[a)例如二甲基锌，cyhexylMgCl，THF，-78℃；NH4Cl；b)例如HCl/1,4-二噁烷]
方案33：ADC前体分子的合成
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰基氯，三乙胺，DCM，RT；c)L-半胱氨酸，NaHCO3，DBU，异丙醇/水，RT；d)3-硫烷基丙酸，K2CO3，RT；e)接头，HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案34：赖氨酸-连接的ADC的合成
方案35：赖氨酸-连接的ADC的合成
A.实施例
缩写和简称：
ABCB1 ATP-结合盒亚家族B成员1(P-gp和MDR1的同义词)
abs. 无水的(absolute)
Ac 乙酰基
ACN 乙腈
aq. 水性的，水溶液
ATP 三磷酸腺苷
BCRP 乳腺癌抗药性蛋白质，外排转运蛋白(efflux transporter)
BEP 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐
Boc 叔丁氧基羰基
br. 宽峰(在NMR中)
Ex. 实施例
CI 化学电离(在MS中)
D 双峰(在NMR中)
D 天
TLC 薄层色谱法
DCI 直接化学电离(MS中)
DCM 二氯甲烷
Dd 双峰的双峰(在NMR中)
DMAP 4-N,N-二甲基氨基吡啶
DME 1,2-二甲氧基乙烷
DMEM 达尔贝科改良的伊格尔培养基(Dulbecco’Modified Eagle
Medium)(用于细胞培养的标准化的营养培养基)
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DPBS 达尔贝科的磷酸盐缓冲的盐溶液
D-PBS，PBS PBS＝DPBS＝D-PBS，pH 7.4，购自Sigma，No D8537
组成：
0.2g KCl
0.2g KH2PO4(无水的)
8.0g NaCl
1.15g Na2HPO4(无水的)
用H2O补充至1升
Dt 三峰的双峰(在NMR中)
DTT DL-二硫苏糖醇
EDC N'-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐
EGFR 表皮生长因子受体
EI 电子碰撞电离(在MS中)
ELISA 酶联免疫吸附测定
eq. 当量
ESI 电喷雾电离(在MS中)
ESI-MicroTof ESI-MicroTofq(质谱仪名称，其中Tof＝飞行时间且
q q＝四极)
FCS 胎牛血清
Fmoc (9H-芴-9-基甲氧基)羰基
sat. 饱和的
GTP 5'-三磷酸鸟苷
H 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HEPES 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸
HOAc 乙酸
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt 1-羟基-1H-苯并三唑水合物
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
HPLC 高压液相色谱法，高效液相色谱法
IC50 半最大抑制浓度
i.m. 肌肉内，给药到肌肉内
i.v. 静脉内，给药到静脉内
KG-1 人肿瘤细胞系
conc. 浓缩的
LC-MS 液相色谱-质谱联用
LLC-PK1细胞 Lewis肺癌猪肾细胞系
L-MDR 人MDR1转染LLC-PK1细胞
LoVo 人肿瘤细胞人肿瘤细胞系
L428 人肿瘤细胞系
m 多重峰(在NMR中)
MDR1 多药耐药蛋白1
MeCN 乙腈
Me 甲基
min 分钟
MOLM-13 人肿瘤细胞系
MS 质谱法
MTT 溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓
MV-4-11 人肿瘤细胞系
NCI-H292 人肿瘤细胞系
NMM N-甲基吗啉
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振谱法
NMRI 小鼠品系，源自Naval Medical Research Institute(NMRI)
裸小鼠 裸小鼠(受试动物)
NSCLC 非小细胞肺癌
PBS 磷酸盐缓冲的盐溶液
Pd/C 活性炭载钯
P-gp P-糖蛋白(P-gycoprotein)，转运蛋白
PNGaseF 用于裂解糖的酶
quant. 定量(收率)
quart 四重峰(在NMR中)
quint 五重峰(在NMR中)
Rf 保留指数(在TLC中)
RT 室温
Rt 保留时间(在HPLC中)
s 单峰(在NMR中)
s.c. 皮下，在皮肤下给药
SCID小鼠 具有重症联合免疫缺陷的受试小鼠
t 三重峰(在NMR中)
TBAF 四正丁基氟化铵
TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基
tert 叔
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
THP-1 人肿瘤细胞系
2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三次膦烷2,4,6-三氧化物(2,
4,6-tripropyl-1,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinane2,4,6-trioxide)
UV 紫外光谱法
v/v (溶液的)体积比体积的比例
Z 苄氧基羰基
HPLC和LC-MS方法：
方法1(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ50x 1mm；流动相A：1l水+0.25ml 99％浓度的甲酸；流动相B：1l乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→1.2min 5％A→2.0min 5％A；烤箱：50℃；流速：0.40ml/min；UV检测：208-400nm。
方法2(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，BEH300，2.1x 150mm，C18 1.7μm；流动相A：1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→1.5min 2％B→8.5min 95％B→10.0min 95％B；烤箱：50℃；流速：0.50ml/min；UV检测：220nm
方法3(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)QM；HPLC仪器：Agilent 1100系列；柱：AgilentZORBAX Extend-C18 3.0x 50mm 3.5微米；流动相A：1l水+0.01mol碳酸铵，流动相B：1l乙腈；梯度：0.0min 98％A→0.2min 98％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；烤箱：40℃；流速：1.75ml/min；UV检测：210nm
方法4(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1x 50mm，C18 1.8μm；流动相A：1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→0.3min 10％B→1.7min 95％B→2.5min 95％B；烤箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm
方法5(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ50x 1mm；流动相A：1l水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 95％A→6.0min 5％A→7.5min 5％A；烤箱：50℃；流速：0.35ml/min；紫外检测：210-400nm。
方法6(LC-MS)：
仪器：具有Waters UPLC Acquity的Micromass Quattro Premier；色谱柱：ThermoHypersil GOLD 1.9μ50x 1mm；流动相A：1l水+0.5ml 50％浓度的甲酸；流动相B：1l乙腈+0.5ml 50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 97％A→0.5min 97％A→3.2min 5％A→4.0min 5％A烘箱：50℃；流速：0.3ml/min；UV检测：210nm。
方法7(LC-MS)：
仪器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；柱：Waters Acquity UPLCHSS T31.8μ50x 2.1mm；流动相A：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→0.3min 90％A→1.7min 5％A→3.0min 5％A烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：205-305nm。
方法8(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1x 50mm，C181.8μm；流动相A：1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→2.0min 2％B→13.0min 90％B→15.0min 90％B；烤箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm
方法9：用于实施例181-191的LC-MS-预纯化方法(方法LIND-LC-MS-预)
MS仪器：Waters；HPLC仪器：Waters(柱Waters X-Bridge C18，19mm x 50mm，5μm，流动相A：水+0.05％氨，流动相B：具有梯度的乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD；210-400nm)。
或
MS仪器：Waters；HPLC仪器：Waters(柱Phenomenex Luna 5μC18(2)100A，AXIATech.50x 21.2mm，流动相A：水+0.05％甲酸，流动相B：具有梯度的乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD；210-400nm)。
方法10：用于实施例181-191的LC-MS分析方法
(LIND_SQD_SB_AQ)
MS仪器：Waters SQD；HPLC仪器：Waters UPLC；柱：Zorbax SB-Aq(Agilent)，50mmx 2.1mm，1.8μm；流动相A：水+0.025％甲酸，流动相B：乙腈(ULC)+0.025％甲酸；梯度：0.0min 98％A-0.9min 25％A-1.0min 5％A-1.4min 5％A-1.41min 98％A-1.5min98％A；烤箱：40℃；流速：0.600ml/min；UV检测：DAD；210nm。
方法11(HPLC)：
仪器：HP1100系列
柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e，50-4.6mm，目录号1.51450.0001，预柱Chromolith Guard Cartridge Kit，RP-18e，5-4.6mm，目录号1.51470.0001
梯度：流速5ml/min
进样体积5μl
溶剂A：HClO4(70％浓度)的水溶液(4ml/l)
溶剂B：乙腈
开始20％B
0.50min 20％B
3.00min 90％B
3.50min 90％B
3.51min 20％B
4.00min 20％B
柱温度：40℃
波长：210nm
方法12(LC-MS)：
MS仪器类型：Thermo Scientific FT-MS；UHPLC+仪器类型：Thermo ScientificUltiMate 3000；柱：Waters，HSST3，2.1x 75mm，C18 1.8μm；流动相A：1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→2.5min 95％B→3.5min 95％B；烤箱：50℃；流速：0.90ml/min；UV检测：210nm/最佳积分路径210-300nm
方法13：(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)Quattro Micro；仪器Waters UPLC Acquity；柱：Waters BEH C18 1.7μ50x 2.1mm；流动相A：1l水+0.01mol甲酸铵，流动相B：1l乙腈；梯度：0.0min 95％A→0.1min95％A→2.0min 15％A→2.5min 15％A→2.51min 10％A→3.0min10％A；烤箱：40℃；流速：0.5ml/min；UV检测：210nm。
方法14：(LC-MS)：
MS仪器类型：ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL；HPLC仪器类型：Agilent 1200SL；柱：Agilent，POROSHELL 120，3x 150mm，SB-C18 2.7μm；洗脱液A：1l水+0.1％三氟乙酸；流动相B：1l乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min 2％B→0.3min 2％B→5.0min95％B→10.0min 95％B；烤箱：40℃；流速：0.75ml/min；UV检测：210nm
其制备未在下文中明确描述的所有反应物或试剂都是从通常可获得的来源商购的。对于其制备同样未在下文中描述且不能商购或者从通常不可获得的来源获得的所有其他反应物或试剂，可参考其中记载了它们的制备的公开文献。
起始材料和中间体：
中间体C11
R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸酯(1:1)
首先将990.0mg(2.79mmol)的(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺加入15.0ml二氯甲烷中，加入828.8mg(3.91mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和129.9mg(3.21mmol)乙酸，并将混合物在RT下搅拌5min。加入698.1mg(3.21mmol)溶于15.0ml二氯甲烷中的(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体L58)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，并且将有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)两次。将有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:2)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到1.25g(理论值的73％)的化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.09min；MS(ESIpos)：m/z＝556(M+H)+。
向400.0mg(0.65mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯中加入151.4mg(1.5mmol)三乙胺和161.6mg(1.43mmol)氯乙酰氯。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，并且将有机相用水洗涤三次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到254.4mg(理论值的57％)的化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIneg):m/z＝676(M+HCOO-)-。
将117.4mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶于10.0ml异丙醇中，加入928.4μl 1M NaOH和50.2mg(0.37mmol)DL-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌4.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，并且将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化残余物。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到75.3mg(理论值的48％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝731(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.40(m,1H),0.75-0.91(m,11H),1.30(m,1H),1.99-2.23(m,2H),2.63-2.88(m,4H),3.18-3.61(m,5H),3.79-4.10(m,3H),4.89(d,1H),4.89(d,1H),5.16(d,1H),5.56(s,1H),6.82(m,1H),6.91(s,1H),6.97(m,1H),7.13-7.38(m,6H),7.49(s,1H),7.63(m,1H),8.26(s,3H).
中间体C12
R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸
以与中间体C11的合成类似的方式进行合成，使用(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(中间体L57)和中间体C52作为起始物质。
LC-MS(方法1):Rt＝1.18min；MS(ESIpos):m/z＝775(M+H)+。
中间体C52
(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
首先将10.00g(49.01mmol)4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯加入100.0ml DMF中，加入20.76g(63.72mmol)碳酸铯和9.22g(53.91mmol)苄基溴。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配，水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。用90.0g 4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯重复该反应。
将两个合并的反应物通过制备型RP-HPLC(柱：Daiso 300x 100；10μ，流速：250ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到125.15g(理论值的87％)化合物1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.18min；MS(ESIpos):m/z＝295[M+H]+。
在氩气下，首先将4.80g(16.32mmol)1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯加入DMF中，加入3.61g(22.85mmol)(2,5-二氟苯基)硼酸、19.20ml饱和碳酸钠水溶液和1.33g(1.63mmol)[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯化钯(II):二氯甲烷。将反应混合物在85℃下搅拌过夜。反应混合物通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。有机相用水萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝100:3)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到3.60g(理论值的67％)化合物1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯。
LC-MS(方法7):Rt＝1.59min；MS(ESIpos):m/z＝328[M+H]+。
首先将3.60g(11.00mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯加入90.0ml THF中，并在0℃下加入1.04g(27.50mmol)氢化铝锂(2.4M的THF溶液)。将反应混合物在0℃下搅拌30min。在0℃下，加入饱和酒石酸钾钠溶液，并向反应混合物中加入乙酸乙酯。有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次，用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于30.0ml二氯甲烷中。加入3.38g(32.99mmol)氧化锰(IV)，将混合物在RT下搅拌48h。再加入2.20g(21.47mmol)氧化锰(IV)，并将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物通过硅藻土过滤，并且将滤饼用二氯甲烷洗涤。减压蒸发溶剂，并将残余物2.80g(1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法7):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝298[M+H]+。
首先将28.21g(94.88mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛与23.00g(189.77mmol)(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入到403.0ml无水THF中，加入67.42g(237.21mmol)异丙氧钛(IV)，将混合物在RT下搅拌过夜。加入500.0ml饱和NaCl溶液和1000.0ml乙酸乙酯，并将混合物在RT下搅拌1h。通过硅藻土过滤混合物，滤液用饱和NaCl溶液洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，残余物用Biotage Isolera(硅胶，柱1500+340g SNAP，流速200ml/min，乙酸乙酯/环己烷1:10)纯化。
LC-MS(方法7):Rt＝1.63min；MS(ESIpos):m/z＝401[M+H]+。
首先将25.00g(62.42mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺在氩气下加入无水THF中并冷却至-78℃。然后在-78℃下加入12.00g(187.27mmol)叔丁基锂(1.7M的戊烷溶液)，并将混合物在此温度下搅拌3h。在-78℃下，然后依次加入71.4ml甲醇和214.3ml饱和氯化铵溶液，并将反应混合物升温至RT，并在RT下搅拌1h。混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法6):Rt＝2.97min；MS(ESIpos):m/z＝459[M+H]+。
首先将28.00g(61.05mmol)(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入186.7ml 1,4-二噁烷中，然后加入45.8ml HCl的1,4-二噁烷溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌2h，并且减压蒸发溶剂。通过制备性RP-HPLC(柱：Kinetix 100x 30；流速：60ml/min，MeCN/水)纯化残余物。减压蒸发乙腈并向含水残余物中加入二氯甲烷。有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥，得到16.2g(理论值的75％)的标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.10min；MS(ESIpos):m/z＝338[M-NH2]+,709[2M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.87(s,9H),1.53(s,2H),3.59(s,1H),5.24(d,2H),6.56(s,1H),6.94(m,1H),7.10(d,2H),7.20(m,1H),7.26(m,2H),7.34(m,2H),7.46(m,1H).
中间体C53
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，以与中间体C58类似的方式，将中间体C52用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄基酯来还原性烷基化。然后如对于中间体C58所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化，然后用2M氢氧化锂的甲醇溶液水解两个酯基。将以这种方式获得的中间体溶于乙醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9H-芴-9-基甲基酯在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下引入Fmoc保护基。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝734(M-H)-。
中间体C54
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酰基]-β-丙氨酸
首先，以与中间体C2类似的方式，将中间体C52用N-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酰基]-β-丙氨酸苄基酯还原性烷基化。然后如对于中间体C58所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。将以这种方式获得的中间体溶于甲醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化1h。然后用2M氢氧化锂的甲醇溶液水解酯基。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9H-芴-9-基甲基酯在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下引入Fmoc保护基。得到48mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝807(M+H)+。
中间体C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸
首先，以与中间体C2类似的方式，将中间体C52使用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯进行还原烷基化。然后将仲氨基基团用2-氯-2-氧代乙酸乙酯酰化，如在中间体C27中所述，然后在甲醇中将两个酯基团用2M氢氧化锂水解。将以此方式获得的中间体溶于乙醇，加入活性炭载钯(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化1小时。
将500mg(0.886mmol)的该完全脱保护的中间体溶于60ml的二噁烷中，并加入253mg(0.975mmol)的1-({[2-(三甲基硅基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和198μl的三乙胺。在RT下搅拌24小时后，将反应物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并、在减压下浓缩并在高真空下干燥得到312mg(理论值的50％)的标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.61min；MS(ESIpos)：m/z＝658(M+H)+。
或者，中间体C58通过以下路线制备：
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min后，加入溶于175ml DCM中的8.99g(24.5mmol)中间体L57，将反应物在RT下再搅拌45min。然后将反应物用300ml DCM稀释并用100ml碳酸氢钠溶液洗涤两次，用饱和NaCl溶液洗一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。然后将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Chromatorex C18)纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到4.6g(理论值的61％)(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614(M+H)+。
首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入76ml DCM中并在存在2.1ml三乙胺的情况下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。在RT下搅拌20h后，加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙酯和0.94ml三乙胺，将反应在RT下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并连续用300ml 5％浓度的柠檬酸萃取两次，用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，再用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
将2.17mg(2.64mmol)该中间体溶于54ml THF和27ml水中，加入26ml 2摩尔氢氧化锂溶液。将混合物在RT下搅拌30min，然后使用1.4ml TFA将pH调节至3和4之间。将混合物减压浓缩。一旦大部分THF被蒸馏出去，将水溶液用DCM萃取两次，然后减压浓缩至干燥。残余物通过制备型HPLC(柱：Chromatorex C18)纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.1g(理论值的63％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝656(M-H)-。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.58(m,1H),0.74-0.92(m,11H),1.40(m,1H),3.3(m,2H),3.7(m,1H),3.8-4.0(m,2H),4.15(q,2H),4.9和5.2(2d,2H),5.61(s,1H),6.94(m,2H),7.13-7.38(m,7H),7.48(s,1H),7.60(m,1H),12.35(s,1H).
中间体C59
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，如对于中间体C53所述的，将(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸苄基酯的仲氨基在存在三乙胺的情况下用(2S)-2-甲氧基丙酰氯(中间体C53的中间体)酰化。将获得的中间体溶于乙醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9H-芴-9-基甲基酯在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下引入Fmoc保护基。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝764(M-H)-。
中间体C60
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
该合成以与中间体C53类似的方式进行。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝750(M+H)+。
中间体C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-β-丙氨酸
通过将60mg(0.091mmol)中间体C58与β-丙氨酸甲酯偶联，然后用2M氢氧化锂溶液进行酯裂解来制备标题化合物。经2步，得到67mg(理论值的61％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.29min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C62
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸
以与中间体C61类似的方式，由中间体C58和D-丙氨酸甲酯制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C64
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
标题化合物是以与中间体C63类似的方式由中间体C58制备。
HPLC(方法11):Rt＝2.4min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝700(M+H)+。
中间体C65
(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
首先将215mg(0.59mmol)中间体L66加入到25ml二氯甲烷中，加入377mg(0.89mmol)Dess-Martin过碘烷和144μl(1.78mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌30min。然后用300ml二氯甲烷稀释反应物，有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液，10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤(在每种情况下)两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。得到305mg醛，其不经进一步纯化即进行反应。
将175mg(0.49mmol)中间体C52溶于50ml二氯甲烷中，加入147mg(0.69mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和32.5μl乙酸。在RT下搅拌5min后，加入214mg(0.593mmol)上述醛，并将反应在RT下搅拌过夜。此处，代替预期产物，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。由于该酰亚胺也可以转化成标题化合物，所以浓缩反应物并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并合适的含酰亚胺的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到195mg(58％)上述酰亚胺。
LC-MS(方法5):Rt＝3.32min；MS(ESIpos):m/z＝667(M+H)+。
将65mg(97.5μmol)该酰亚胺溶于15ml二氯甲烷中，加入367μl(3.4mmol)乙酰氧基乙酰氯和595μl N,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌30min之后，将反应物在不加热的情况下减压浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂并在高真空下干燥后得到28mg(理论值的37％)(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝767(M+H)+。
将28mg(37μmol)该中间体溶于3ml甲醇中，加入548μl 2M氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10min后，用三氟乙酸将反应物调节至pH 4，然后浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥，得到26mg(96％的理论值)的标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝743(M+H)+。
中间体C66
[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(甘氨酰氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
首先，根据肽化学的经典方法(HATU偶联和Boc移除)由N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯制备三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸苄基酯(1:1)。
将13mg(0.036mmol)该中间体和25mg(0.033mmol)中间体C58溶于3ml DMF中，加入19mg(0.05mmol)HATU和17μl N,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌10min后，浓缩混合物，并且将残余物通过制备型HPLC纯化。得到17.8mg(理论值的60％)中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝891(M+H)+。
将17mg(0.019mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，加入钯碳(10％)，将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化2h。滤除催化剂，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到9mg(理论值的62％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝757(M+H)+。
中间体C67
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
首先将605.3mg(1.71mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)加入10.0ml二氯甲烷中，加入506.7mg(2.39mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和117.9mg(1.96mmol)乙酸，将混合物在RT下搅拌5min。加入溶于10.0ml二氯甲烷中的580.0mg(1.96mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(中间体L70)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到514.7mg(理论值的46％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.10min；MS(ESIpos):m/z＝634(M+H)+。
中间体C69
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
首先将117.0mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C70)和21.6mg(0.20mmol)3-硫烷基丙酸加入到3.0ml甲醇中，加入89.5mg(0.65mmol)碳酸钾，将混合物在50℃下搅拌4h。用乙酸乙酯稀释反应混合物，有机相用水和饱和的NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。得到106.1mg(理论值的73％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.42min；MS(ESIneg):m/z＝700(M-H)-。
中间体C70
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
首先将908.1mg(1.63mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参见中间体C11的合成)和545.6mg(5.39mmol)三乙胺加入10.0ml二氯甲烷中，并将混合物冷却至0℃。在此温度下，加入590.5mg(5.23mmol)氯乙酰氯，并将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤(在每种情况下)三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到673.8mg(理论值的65％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIneg):m/z＝676(M+HCOO-)-。
中间体C71
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将536.6mg(4.43mmol)L-半胱氨酸与531.5mg(6.33mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.5ml水中。加入溶于25.0ml异丙醇中的400mg(0.63mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C70)和1.16g(7.59mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤有机相，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到449.5mg(理论值的86％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.20min；MS(ESIpos):m/z＝717(M+H)+。
中间体C72
(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
首先将90mg(0.212mmol)中间体L72加入到6ml二氯甲烷中，加入86μl(1.06mmol)吡啶和135mg(0.318mmol)Dess-Martin过碘烷。将混合物在RT下搅拌30min。然后用30ml二氯甲烷稀释反应物，有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液洗涤两次，用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。以该方式获得的醛不经进一步纯化即反应。
将63mg(0.177mmol)中间体C52溶于15ml二氯甲烷中，加入52.4mg(0.247mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和20.2μl乙酸。在RT下搅拌5min后，加入89.6mg(0.212mmol)上述醛，并将反应在RT下搅拌20min。将反应物减压浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物从乙腈/水中冻干。得到71mg(经过两步的理论值的53％)(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝761(M+H)+。
将70mg(92μmol)该中间体溶于15ml二氯甲烷中，将混合物冷却至10℃，加入54μl三乙胺和25.5μl(0.23mmol)乙酰氧基乙酰氯。在RT下搅拌1h后，加入相同量的酰基氯和三乙胺，在RT下再搅拌1h后再次加入。然后将反应在RT下再搅拌30min，然后减压浓缩，并且将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂并将残余物从乙腈/水中冷干，得到46.5mg(理论值的59％)酰化的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝861(M+H)+。
将46mg(53μmol)该中间体溶于5ml甲醇中，加入2.7ml 2M氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10min后，用乙酸将反应物调节至pH 3-4，然后用15ml水稀释。水相用乙酸乙酯萃取，有机相用硫酸镁干燥并浓缩。将残余物从乙腈/水中冻干，在高真空下干燥残余物之后，得到37mg(理论量的90％)的标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C73
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸
首先将619mg(0.86mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)加入到8.8ml二氯甲烷中，加入87mg(0.86mmol)三乙胺和224mg(0.86mmol)N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。1h后，加入45mg(0.17mmol)N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在RT下搅拌1h。将混合物减压浓缩，将残余物溶于二氯甲烷中，然后将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到602mg(71％，纯度87％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.58min；MS(ESIpos):m/z＝861(M+H)+。
中间体C74
三氟乙酸3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(11)
将75mg(0.114mmol)中间体C58溶于12.5ml DMF中，并在存在65mg(0.11mmol)HATU和79μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与78mg(0.171mmol)中间体L75偶联。通过制备型HPLC纯化后，将中间体溶于20ml乙醇中，并在RT、氢气标准压力下用10％活性炭上的钯氢化1h。然后过滤催化剂，减压移除溶剂，产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到63mg(经2步的理论值的64％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.16min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
中间体C75
(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min后，加入溶于175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(由(3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸通过经典方法制备)，并将混合物在RT下再搅拌45min。然后将混合物用DCM稀释并用100ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在高真空下浓缩并干燥残余物，得到4.6g(理论值的61％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614.32(M+H)+。
将200mg(0.33mmol)该中间体溶于10ml DCM中，然后加入105μl三乙胺和77μl(0.717mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在RT下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，然后浓缩。得到213mg(75％)的标题化合物，其为米色泡沫。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
中间体C76
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
标题化合物是由中间体C75根据肽化学的经典方法(用氯化锌移除Teoc保护基、在存在HATU的情况下用N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酰化并用氢氧化锂的THF/水溶液进行酯裂解)制备。
LC-MS(方法1):Rt＝1.23min；MS(ESIpos):m/z＝818(M+H)+。
中间体C77
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸
首先将4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(8.39mg，48.1μmol)加入1.0ml DMF中，加入7.37mg(48.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、15.5mg(48.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和8.60μl(48.1μmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物在RT下搅拌10min。首先将40.0mg(0.048mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)(中间体C71)加入1.0ml DMF中，加入25.4μl(141.9mmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物加入到反应中，并将反应混合物在RT下搅拌4h。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到35.0mg(理论值的83％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.76min；MS(ESIpos):m/z＝873[M+H]+
中间体C78
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸
首先将197mg(0.354mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参见中间体C11的合成)加入5.0ml二氯甲烷中，并将混合物加热至40℃。在此温度下，加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用5％KHSO4溶液萃取(在每种情况下)3次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂。残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到74.1mg(理论值的31％)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝670[M+H]+
首先将78.3mg(117μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯加入到4.0ml THF中，加入800μl甲醇、160μl水和230μl(230μmol)LiOH水溶液(1M)。将反应混合物在RT下搅拌3h，用乙酸猝灭并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到64.8mg(理论值的85％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIneg):m/z＝654[M-H]-
中间体C79
三氟乙酸3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
首先将57.4mg(81.8μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入到5.7ml DMF中，加入74.0mg(164μmol)三氟乙酸3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)(中间体L75)、43μl(250μmol)N,N-二异丙基乙胺和62.2mg(164μmol)HATU，将混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物在RT下搅拌1h，用乙酸淬灭并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，乙基胺残余物在高真空下干燥。得到52.4mg(理论值的63％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.64min；MS(ESIpos):m/z＝1022[M]+
在氩气下，首先将6.23mg(27.7μmol)乙酸钯(II)加入3.0ml二氯甲烷中，加入12μl(83μmol)三乙胺和89μl(550μmol)三乙基硅烷，并将混合物搅拌5min。然后加入在3.0ml二氯甲烷中的56.7mg(55.5μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯，将混合物在RT下搅拌过夜。将混合物浓缩至几乎干燥，加入乙腈/水，过滤混合物并通过制备RP-HPLC(柱：Reprosil125x 30；μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到37.4mg(理论值的67％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):):Rt＝2.15min；MS(ESIpos):m/z＝888[M+H]+
中间体C80
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将43.4mg(95.1μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(中间体L90)加入2.5mlDMF中，加入14.6mg(95.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、30.5mg(95.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和16.5μl(95.1μmol)N,N-二异丙基乙胺，并将混合物搅拌10min。将79.0mg(95.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)(中间体C71)溶于2.5ml DMF中，加入49.5μl(285.3μmol)N,N-二异丙基乙胺，并将混合物加入到反应中。将反应混合物在RT下搅拌2h，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到44.2mg(理论值的40％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.57min；MS(ESIpos):m/z＝1156[M+H]+
将60.2mg(52.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸悬浮于3.0ml乙醇中，加入6.0mg在活性炭上的钯(10％)，并将混合物在RT和标准压力下用氢气氢化1h。再一次，加入6.0mg活性炭上的钯(10％)，并将混合物在RT和标准压力下用氢气氢化1h。滤出催化剂，在减压下移除反应混合物中的溶剂，并在高真空下干燥。残余物通过制备RP-HPLC(柱：Reprosil 125x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到29.4mg(理论值的50％)的标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝3.77min；MS(ESIpos):m/z＝1021[M+H]+
中间体C81
(R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺
在氩气和-78℃下，将18.7ml(37.45mmol)环己基氯化镁的乙醚溶液(2M)加入3.12ml(6.24mmol)二甲基锌的甲苯溶液(2.0M)中，并将混合物在-78℃下搅拌30min。然后在-78℃下加入5.0g(12.48mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的THF溶液，并将反应混合物在此温度下搅拌1h，然后在RT下搅拌4h。然后在-78℃下，加入饱和氯化铵溶液，并使反应混合物升温至RT。混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物使用BiotageIsolera(硅胶，乙酸乙酯/环己烷25:75)纯化，得到1.59g(理论值的26％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝2.76min；MS(ESIneg):m/z＝483[M-H]-
在氩气下，首先将264.0mg(0.54mmol)该中间体加入0.5ml 1,4-二噁烷中，然后加入1.36ml HCl的1,4-二噁烷溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入二氯甲烷，反应混合物用1M氢氧化钠水溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。残余物使用Biotage Isolera(硅胶，甲醇/二氯甲烷98:2)纯化。减压蒸发溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中，用碳酸氢钠溶液洗涤并用硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到148mg(理论值的72％)的标题化合物。
LC-MS(方法13):Rt＝2.07min；MS(ESIpos):m/z＝364[M-NH2]+
中间体C82
(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
在氩气下，将392.2mg(1.85mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和91.29mg(1.52mmol)乙酸加入到503.0mg(1.32mmol)1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺(中间体C81)在1.4ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入574.6(2.38mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯的二氯甲烷溶液，将混合物在RT下搅拌过夜。加入143mg(0.66mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯后，将混合物再搅拌2h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液(在每种情况下)洗涤两次，用硫酸钠干燥并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到488g(理论值的63％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.89min；MS(ESIpos):m/z＝582(M+H)+。
中间体C83
(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将280.0mg(2.77mmol)三乙胺和397.8mg(3.52mmol)氯乙酰氯加入到487.9mg(0.84mmol)(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C82)以及分子筛在8.40ml二氯甲烷的溶液中，将反应混合物在RT下搅拌6h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。残余物未经纯化即进一步使用。得到470mg(理论值的85％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.88min；MS(ESIpos):m/z＝680(M+Na)+。
中间体C84
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-L-半胱氨酸
将322.1mg(2.66mmol)L-半胱氨酸与319.0mg(3.80mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.19ml水中。将250.0mg(0.38mmol)(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C83)溶于1.90ml异丙醇中，加入693.8g(4.56mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥，并减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到276mg(理论值的97％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.34min；MS(ESIpos):m/z＝744(M+H)+。
中间体C85
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸
将34.8mg(0.27mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到100mg(0.13mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-L-半胱氨酸(1:1)(中间体C84)和41.5mg(0.13mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在4.0ml DMF中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌3h。不进行后处理，通过制备型HPLC纯化混合物。得到88mg(理论值的70％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.71min；MS(ESIpos):m/z＝936(M+H)+。
中间体C86
11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
将161.65mg(1.17mmol)碳酸钾加入到220.0mg(0.33mmol)(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C83)和39.02mg(0.37mmol)3-硫烷基丙酸在7.45ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和饱和用NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸钠干燥，并减压蒸发溶剂。残余物未经后处理即进一步使用。得到201mg(理论值的83％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝726(M-H)-。
中间体C87
(13-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基](环己基)甲基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂3,6,13-三氮杂十六烷-16-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将54.18mg(0.28mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)、71.01mg(0.50mmol)N,N-二异丙基乙胺、104.46mg(0.27mmol)HATU和0.23ml(0.14mmol)1-羟基-7-氮杂苯并三唑0.5M的DMF溶液加入到100mg(0.14mmol)11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C86)在1.37ml DMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5h。不经进一步后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到41mg(理论的33％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIpos):m/z＝907(M+H)+。
中间体C88
3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯三氟乙酸(1:1)
立体异构体的混合物
将1.71g(8.05mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.40g(6.61mmol)乙酸加入到2.04mg(5.75mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中间体C52)在51ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌5min。然后加入1.32g(6.61mmol)3-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯在20ml二氯甲烷中的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)两次，用硫酸镁干燥并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到1.86g(理论值的50％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝538(M+H-CF3CO2H)+。
中间体C89
3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
将1.36g(13.42mmol)三乙胺和2.13g(18.87mmol)氯乙酰氯加入到2.89g(4.19mmol，80％纯度)的3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C88)以及分子筛在42ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到449mg(理论值的17％)的标题化合物的异构体1和442mg(理论值的17％)的标题化合物的异构体2。
异构体1LC-MS(方法1):Rt＝2.74min；MS(ESIpos):m/z＝614(M+H)+。
异构体2LC-MS(方法1):Rt＝2.78min；MS(ESIpos):m/z＝614(M+H)+。
中间体C90
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将357.3mg(0.58mmol)L-半胱氨酸与488.7mg(4.07mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.3ml水中。加入溶于23.0ml异丙醇中的357.0mg(0.58mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体1)(中间体C89，异构体1)和1.06g(6.98mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物未经纯化即进一步使用。得到255.0mg(理论值的62％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝699(M+H)+。
中间体C91
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体2)
将453.5mg(3.74mmol)L-半胱氨酸与449.2mg(5.35mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.1ml水中。加入溶于21.1ml异丙醇中的3287.4mg(0.54mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C89，异构体2)和0.98g(6.42mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物未经纯化即进一步使用。得到221.0mg(理论值的59％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.12min；MS(ESIpos):m/z＝699(M+H)+。
中间体C92
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将18.49mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到50mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.3ml DMF中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌45min。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到65mg(理论值的100％，71％纯度)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝892(M+H)+。
中间体C93
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体2)
将18.49mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到50mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C91)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.0ml DMF中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌90min。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到63mg(理论值的98％，纯度73％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝892(M+H)+。
中间体C94
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将18.5mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到50.0mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和18.0mg(0.07mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.3ml DMF中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌30min。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和NH4Cl溶液反复洗涤有机相和用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即使用。得到57mg(理论值的81％，纯度85％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝836(M+H)+。
中间体C95
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体1)
将302.5mg(2.19mmol)碳酸钾加入到384.0mg(0.62mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C89，异构体1)和73.0mg(0.69mmol)3-硫烷基丙酸在14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到358.0mg(理论值的84％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝684(M+H)+。
中间体C96
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体2)
将226.0mg(1.64mmol)碳酸钾加入到287.0mg(0.45mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C89，异构体2)和54.6mg(0.51mmol)3-硫烷基丙酸在14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到318.7mg(理论值的88％，纯度88％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝684(M+H)+。
中间体C97
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)在2.81ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入22.75mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸(中间体L1)在1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物在RT下搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷萃取。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物未经后处理即进一步使用。得到26mg(理论值的84％)的标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.39min；MS(ESIpos):m/z＝86
中间体C98
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)在2.81ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入37.30mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸在1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物在RT下搅拌过夜。加入水，并用二氯甲烷萃取混合物。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即使用。得到22mg(理论值的63％)的标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.54min；MS(ESIpos):m/z＝919(M+H)+。
中间体C99
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,19三氧代-12,15-二氧杂-5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)在2.81ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入35.05mg(0.07mmol)N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸(中间体L82)在1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物在RT下搅拌过夜。加入水，用二氯甲烷萃取混合物。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物经制备型HPLC纯化。得到25mg(理论值的60％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝4.52min；MS(ESIpos):m/z＝1007(M+H)+。
中间体C100
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将22.2mg(0.068mmol)(2R)-N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)三氟乙酸加入到45mg(0.068mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸(中间体C58)在5.8ml DMF中的溶液中。在RT下搅拌30min后，将39mg(0.10mmol)HATU和36mg(0.27mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到混合物中。将反应混合物在RT下搅拌1h。未经后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到7mg(理论值的12％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z 851(M+H)+。
中间体C101
三氟乙酸/(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸甲酯(1:1)
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min后，加入溶于175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(使用经典方法由(3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸制备)，并将混合物在RT下再搅拌45min。然后将混合物用DCM稀释，用100ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次并然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在高真空下浓缩并干燥残余物，得到4.6g(理论值的61％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614.32(M+H)+。
首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入到76ml DCM中并在存在2.1ml三乙胺的情况下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。在RT下搅拌20h后，加入另外0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙酯和0.94ml三乙胺，将混合物在RT下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并依次用300ml 5％柠檬酸萃取两次、用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
将321mg(0.342mmol)该中间体溶于7ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入279.5mg(2.05mmol)氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌2h。然后加入599mg(2.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸水溶液，然后将混合物减压浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到60mg(理论值的26％)的标题化合物，其仍含有一些脱乙酰的化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min和0.95min；MS(ESIpos):m/z＝528和570(M+H)+。
中间体C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，以与中间体C2类似的方式，使用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯对中间体C52进行还原性烷基化。随后，使用2-氯-2-氧代乙酸乙酯将仲氨基酰化，最后使用2M氢氧化锂的甲醇溶液将两个酯基团水解。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.31min；MS(ESIpos)：m/z＝646(M-H)-。
中间体C103
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
首先通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下使151mg(0.23mmol)中间体C102与128g(0.234mmol)中间体L98在DMF中偶联来制备标题化合物。随后，通过在10％在活性炭上的钯上，在RT、标准氢气压力下氢化30min来移除Z保护基，得到标题化合物。
产率：经过2个步骤的理论值的30％
LC-MS(方法1):Rt＝1.14min；MS(ESIpos):m/z＝929(M+H)+。
中间体C104
(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
向2.24g(6.31mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺以及分子筛在56.0ml二氯甲烷中的溶液中加入1.87g(8.84mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，将混合物在室温下搅拌15min。随后，加入2.20g(7.58mmol)(3R,4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参考WO2014/151030A1)，并将反应混合物在室温下搅拌3.5h。混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。得到1.39g(理论值的24％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.15min；MS(ESIpos):m/z＝600(M+H)+。
中间体C105
(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
向692.8mg(0.88mmol)(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯以及分子筛在8.7ml二氯甲烷中的溶液中加入295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯，将反应混合物在RT下搅拌2.5h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。再次，将295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯与分子筛一起加入溶于8.7ml二氯甲烷中的残余物，将反应混合物在RT下搅拌3h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。有机相用硫酸钠干燥、浓缩并不经纯化即进一步使用。得到691mg(理论值的74％，纯度64％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.78min；MS(ESIpos):m/z＝676(M+H)+。
中间体C106
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸
向691.0mg(0.65mmol)(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C105)和76.3mg(0.72mmol)3-硫烷基丙酸在15ml甲醇和几滴水中的混合物中加入316mg(2.29mmol)碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到502mg(理论值的67％，纯度65％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIneg):m/z＝744(M-H)-.
中间体C107
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸
将203.6mg(1.68mmol)L-半胱氨酸与201.7mg(2.40mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.95ml水中。向其中加入溶于9.5ml异丙醇中的170.0mg(0.24mmol)(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体105)和438.5mg(2.40mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤有机相，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到152mg(理论值的83％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.26min；MS(ESIpos):m/z＝762(M+H)+。
中间体C115
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
将11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫代-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(200mg，285μmol)(中间体C69)溶于10ml的三氟乙醇中。加入氯化锌(233mg，1.71mmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再加入两次氯化锌(233mg，1.71mmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(1.50g，5.13mmol)，随后加入水(0.1％TFA)，然后将混合物在减压下浓缩。残余物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到162mg(理论值的85％)的化合物3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.94min；MS(ESIneg)：m/z＝556[M-H]-
将3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸/三氟乙酸(1:1)(80.0mg，119μmol)溶于5.0ml的DMF中，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酸酯(69.4mg，纯度82％，119μmol)(中间体L88)和N,N-二异丙基乙胺(41μl，240μmol)。将反应混合物在RT下搅拌2小时30分钟，并加入水(0.1％TFA)。将混合物浓缩并通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这样得到82.2mg(理论值的75％)的标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.17min；MS(ESIpos)：m/z＝921[M+H]+
中间体C116
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
在氩气下，首先将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(56.7mg，61.6μmol)(中间体C115)和β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)(13.4mg，73.9μmol)加入3.0ml的DMF中，并加入HATU(28.1mg，73.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(32μl，180μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10分钟然后通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这样得到41.4mg(理论值的64％)的化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-(14-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,8,13-三氧代-3-氧杂-11-硫代-7,14-二氮杂十七烷-17-基)-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.28min；MS(ESIpos)：m/z＝1048[M+H]+
将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-(14-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,8,13-三氧代-3-氧杂-11-硫代-7,14-二氮杂十七烷-17-基)-L-丙氨酰胺(39.3mg，37.5μmol)溶于2.5ml的三氟乙醇。加入氯化锌(30.7mg，225μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再一次加入氯化锌(30.7mg，225μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(131mg，450μmol)，随后加入水(0.1％TFA)，然后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物溶于少量水中并冻干。这样得到30mg(理论值的81％)的标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.12min；MS(ESIpos)：m/z＝992[M+H]+
中间体L1
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝198(M+H)+。
中间体L2
三氟乙酸/rel-(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
标题化合物是通过用EDC/HOBT偶联并随后用TFA脱保护来由50mg(0.214mmol)可商购的顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷羧酸和60mg(0.235mmol)同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备。得到36mg(经2步的理论值的38％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L3
三氟乙酸/(1S,2R)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
标题化合物是通过用EDC/HOBT偶联并随后用TFA脱保护来由50mg(0.214mmol)可商购的(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和72mg(0.283mmol)同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备。得到13mg(经2步的理论值的16％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.2min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L4
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷羧酰胺(1:1)
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的1-(4-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.26min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝280(M+H)+。
中间体L5
三氟乙酸/N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-β-丙氨酰胺(1:1)
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮和N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.22min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.22min；MS(ESIpos):m/z＝260(M+H)+。
中间体L6
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
标题化合物是通过最初在存在EDC/HOBT的情况下偶联可商购的6-(2,5-二氧代-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸与部分保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯来制备，其通过肽化学的经典方法制备。随后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌，在氨基上进行脱保护，得到标题化合物，产率37％。
HPLC(方法11):Rt＝1.29min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.62min；MS(ESIpos):m/z＝566(M+H)+。
中间体L7
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式根据肽化学的经典方法由可商购的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过依次在存在HATU的情况下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用TFA再次脱保护。得到32mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.31min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.47min；MS(ESIpos):m/z＝516(M+H)+。
中间体L8
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式根据肽化学的经典方法由可商购的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮顺序来制备，即通过依次在存在HATU的情况下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用TFA再次脱保护。得到171mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.23min；
LC-MS(方法7):Rt＝0.3min；MS(ESIpos):m/z＝417(M+H)+。
中间体L9
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是以与中间体L7类似的方式，由可商购的乙酸(4-氨基苯基)甲酯制备。得到320mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.48min；MS(ESIpos):m/z＝493(M+H)+。
中间体L10
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-rel-N6-{[(1R,2S)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
标题化合物是通过以下方式由中间体L6制备，即通过用EDC/HOBT与顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷羧酸偶联，随后用TFA脱保护。得到12mg(经2步的理论值的52％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L11
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1S,2R)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
标题化合物是通过以下方式由中间体L6来制备，即通过用EDC/HOBT与(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸偶联，随后用TFA脱保护。得到11mg(经2步的理论值的39％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L12
三氟乙酸/1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
将381mg(2.46mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯加入到228mg(1.12mmol)溶于7ml二噁烷/水1:1中的[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯中。然后加入1.2ml饱和碳酸氢钠溶液，并且将反应在RT下搅拌。在总共5天的搅拌和进一步添加相同量的碳酸氢钠溶液2次之后，将反应通过用三氟乙酸酸化、在旋转蒸发器上浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物来进行后处理。合并适当的级分，减压移除溶剂，并且将残余物从乙腈/水1:1中冻干。
将残余物溶于3ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸。在RT下搅拌15min后，减压移除溶剂并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。得到70mg(经2步的理论值的67％)的标题化合物，其为树脂状残余物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.18min；MS(ESIpos):m/z＝185(M+H)+。
中间体L13
三氟乙酸/N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
标题化合物是通过在存在EDC/HOBT的情况下偶联(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸与N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)，随后以与中间体L6类似的方式温和地移除叔丁氧基羰基保护基来制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.42min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.43min；MS(ESIpos):m/z＝340(M+H)+。
中间体L14
三氟乙酸/1-[2-(4-氨基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
以与中间体L2类似的方式，经2步从哌嗪-1-基氨基甲酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝239(M+H)+。
中间体L15
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺(1:1)
将2.93g(10.58mmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶于100ml二噁烷/水1:1中，加入3.28g(21.15mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯和饱和碳酸氢钠溶液直到达到6-7的pH值。将溶液在RT下搅拌30min，然后减压蒸发1,4-二噁烷。然后加入200ml水，并将混合物用300ml乙酸乙酯萃取(在每种情况下)三次。合并有机萃取物，用硫酸镁干燥并过滤。浓缩得到棕色油状的3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸叔丁酯，然后将其在高真空下干燥。
HPLC(方法11):Rt＝1.5min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝375(M+NH4)+。
通过标准方法(用TFA脱保护，与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯偶联并用TFA再次脱保护)该中间体转化为标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝344(M+H)+。
中间体L16
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将535mg(1.73mmol)可商购的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮和930ml N,N-二异丙基乙胺加入到266mg(1.33mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸在24ml DMF中的溶液中。反应在超声波浴中处理24h，然后减压浓缩至干燥。剩余的残余物是通过制备型HPCL纯化，在浓缩适当的级分并在高真空下干燥残余物之后，得到337mg(理论值的50％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.4min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝468(M+H)+。
中间体L17
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联172mg(0.37mmol)中间体L16和125mg(0.37mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)，然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸DCM溶液中在RT下搅拌2h使氨基脱保护。从乙腈/水中的冻干，经2步得到194mg(理论值的49％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.1min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝652(M+H)+。
中间体L18
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是根据肽化学的经典方法，以与中间体L7类似的方式，通过以下方式由(4-氨基苯基)乙酸甲酯来制备，即通过在存在HATU的情况下连接N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用TFA再次脱保护。得到330mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.29min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.41min；MS(ESIpos):m/z＝465(M+H)+。
中间体L19
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是依次根据肽化学的经典方法，由1,4-苯二胺制备。在第一步中，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将942mg(8.72mmol)1,4-苯二胺用0.8g(2.9mmol)N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸来单酰化。在第二步中，以类似的方式，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将仲苯胺基氨基用(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸来酰化。用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，并用TFA再次脱保护，然后在另外3个合成步骤中得到标题化合物，通过该路线得到148mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.21min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
LC-MS(方法4):Rt＝0.2min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
中间体L20
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是以与中间体L8类似的方式，根据肽化学的经典方法，通过以下步骤由可商购的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过依次在存在HATU的情况下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，并用TFA再次脱保护。得到171mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.28min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.39min；MS(ESIpos):m/z＝445(M+H)+。
中间体L21
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺
标题化合物是根据肽化学的经典方法，通过以下方式由可商购的0.42g(2.56mmol)(4-氨基苯基)乙酸甲酯制备，即通过依次在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与N6-(叔丁氧基羰基)-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸偶联，用哌啶脱保护，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，随后在10％在活性炭上的钯上氢解移除苄氧基羰基保护基。得到360mg(经4步，理论值的32％)的标题化合物
HPLC(方法11):Rt＝1.5min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝493(M+H)+。
中间体L22
三氟乙酸/N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(2S)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是依次根据肽化学的经典方法由N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙氨酸制备。在第一步中，首先将2.5g(8.06mmol)该起始原料转化为铯盐，然后用碘甲烷的DMF溶液转化为甲酯。
在甲醇中经在10％在活性炭上的钯上氢解，然后将硝基转化为氨基。
然后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将以该方式生成的氨基用N5-氨基甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酸的DMF溶液来酰化。在下一步中，用哌啶的DMF溶液移除Fmoc基团。
然后在存在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基-1H-苯并三唑水合物和N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中用N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸进行偶联，最后用三氟乙酸移除叔丁氧基羰基。
HPLC(方法11):Rt＝1.6min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
中间体L23
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙氨酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式由可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即在存在EDCI/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联，然后用三氟乙酸脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min.
中间体L24
三氟乙酸/1-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷羧酰胺(1:1)
将114mg(0.67mmol)可商购的1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷羧酸溶于25ml DCM中，加入110mg(0.623mmol)可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)和395μl N,N-二异丙基乙胺，将混合物冷却至-10℃。然后加入217mg(0.793mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐，将混合物在RT下搅拌2h。然后将混合物用乙酸乙酯稀释并连续用10％浓度的柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液萃取，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到152mg受保护的中间体。
然后将它们溶于10ml DCM中并用1ml三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干，得到158mg(经2步的理论值的71％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min.
LC-MS(方法3):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝224(M+H)+。
中间体L25
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将31.4mg(0.17mmol)缬氨酰基-L-丙氨酸溶于3.0ml DMF中，加入115.0mg(0.17mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和33.7mg(0.33mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到74.1mg(理论值的58％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.61min；MS(ESIpos):m/z＝763[M+H]+。
中间体L26
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600.0mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸悬浮于25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中，加入在活性炭上的靶(10％)，并将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化5h。滤出催化剂，并且减压蒸发溶剂。所得化合物不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS(方法1):Rt＝0.42min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180mg(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF中，加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。然后加入254.6mg(0.73mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。反应溶液通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
首先将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸加入20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中，加入27.2mg在活性炭上的钯。在RT和标准压力下将混合物用氢气氢化5h。借助Celite(R)过滤混合物，并且将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。标题化合物(182mg，理论值的72％)未经进一步纯化即用于下一反应步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
中间体L27
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
首先将30mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(中间体L26)和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺加入1.5ml DMF中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应溶液在RT下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到55.6mg(理论值的90％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝920[M+H]+。
中间体L28
3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
首先将461.7mg(1.15mmol)3-乙基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯(该化合物是根据WO 2006/066896的文献方法制备)加入5.0ml无水二氯甲烷中，并将混合物冷却至-78℃。然后缓慢滴加326.2mg(2.29mmol)二异丁基氢化铝溶液(1M，在THF中)，并将混合物在-78℃下搅拌2h(通过薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)监测)。逐滴加入溶于60ml水中的1.3g(4.59mmol)酒石酸钾钠溶液，使反应混合物升温至RT。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并且将水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次，并且用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到629.0mg作为粗产物的标题化合物，将其不经进一步纯化即立即用于下一反应步骤中。
中间体L29
3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
非对映异构体的混合物
首先将807.1mg(2.34mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(根据WO 2006/100036的文献方法制备)加入8.0ml二氯甲烷中，加入236.4mg(2.34mmol)三乙胺。在0℃下，滴加267.6mg(2.34mmol)甲磺酰氯，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。再加入133.8mg(1.17mmol)甲磺酰氯和118.2mg(1.17mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用饱和的碳酸氢钠溶液、5％浓度的硫酸氢钾溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在Biotage Isolera(硅胶，柱50g SNAP，流速66ml/min，环己烷/乙酸乙酯)上纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到402.0mg(理论值的41％)化合物3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝424[M+H]+。
首先将400.0mg(0.94mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入5.0ml DMF中，加入98.2mg(1.51mmol)叠氮化钠。将反应混合物在40℃下搅拌10h。然后再加入30.7mg(0.47mmol)叠氮化钠，并将该混合物在40℃下再搅拌10h。加入乙酸乙酯，并且将有机相用水反复洗涤。用硫酸镁干燥有机相后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到309.5mg(理论值的89％)化合物3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝1.50min；MS(ESIpos):m/z＝371[M+H]+。
将250mg(0.68mmol)3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于10.0ml乙酸乙酯/乙醇(1:1)中，加入25.0mg在活性炭上的靶(10％)。在RT和标准压力下，将混合物用氢气氢化8h。通过Celite(R)过滤反应物，并将滤饼用乙酸乙酯充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到226.2mg(理论值的82％)化合物3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝345[M+H]+。
715.0mg(2.08mmol)3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于15.0ml THF中，并且加入2.28ml(2.28mmol)TBAF溶液(1M，在THF中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，残余物(1.54g)不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.41min；MS(ESIpos):m/z＝231[M+H]+。
首先将1.54g(4.88mmol)3-(氨基甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入1,4-二噁烷中，加入541.8mg(4.88mmol)氯化钙(无水)和488.6mg(4.88mmol)碳酸钙，并且剧烈搅拌混合物。然后加入592.8mg(5.86mmol)三乙胺和1.52g(5.86mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮，并且将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入644.9mg(10.7mmol)HOAc和乙酸乙酯。有机相用水洗涤两次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:1)上纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到346.9mg(理论值的19％)化合物3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝375[M+H]+。
首先将804.0mg(2.15mmol)3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入20.0ml氯仿和20.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入59.7mg(0.22mmol)氯化四正丁基铵，然后加入429.9mg(3.22mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和33.5mg(0.22mmol)TEMPO，并且将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。将有机相分离出来并减压移除溶剂。残余物通过硅胶(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)色谱纯化。得到517.0mg(理论值的46％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝373[M+H]+。
中间体L30
3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
立体异构体的混合物
首先将250.0mg(0.72mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(该化合物根据WO2006/100036的文献方法制备)加入12.5ml二氯甲烷/DMSO(4:1)中，并加入219.6mg(2.17mmol)三乙胺。在2℃下，每次一点地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶复合体，并将混合物在2℃下搅拌3h。再每次一点地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶复合体，并将混合物在RT下搅拌17h。将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将水相用二氯甲烷萃取三次，将合并的有机相用水洗涤一次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤(薄层色谱法：石油醚/乙酸乙酯7:3)。
中间体L31
{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙二酸二叔丁酯
将57.2g(488.27mmol)氨基甲酸叔丁酯、51.2ml(683.57mmol)37％浓度的甲醛水溶液和25.9g(244.13mmol)碳酸钠加入到600ml水中。加热混合物直至形成溶液，然后在RT下搅拌16h。用500ml二氯甲烷萃取所形成的悬液，分离出有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤并用硫酸钠干燥。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物在高真空下干燥，得到结晶固体。将残余物溶于1000ml无水THF中，并在RT下逐滴加入322ml(3.414mol)乙酸酐和138ml(1.707mol)吡啶的混合物。将反应混合物在RT下搅拌16h，然后在旋转蒸发器上浓缩(在室温下水浴)。将残余物溶于乙醚中，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次，并用饱和氯化钠溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥2天。将残余物溶于2000ml无水THF中，并在冰冷却下加入456ml(456.52mmol)1M叔丁醇钾的THF溶液。将混合物在0℃下搅拌20min，然后滴加溶于200ml无水THF中的100.8g(456.52mmol)丙二酸二叔丁酯。将混合物在RT下搅拌48h，然后加入水。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并溶于500ml乙酸乙酯中。混合物用500ml水和100ml饱和氯化钠溶液洗涤，并且将有机相用硫酸钠干燥。有机相在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。通过硅胶过滤(流动相：环己烷/乙酸乙酯，梯度＝30:1→5:1)纯化残余物。得到37.07g(理论值的22％)目标化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.87min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
中间体L32
[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将37.0g(107.11mmol)(乙酰氧基甲基)丙二酸二叔丁酯溶于1000ml无水THF中，在冰冷却下滴加535.5ml(1071.10mmol)2M硼氢化锂的THF溶液。逐滴加入19.3ml(1071.10mmol)水，并将混合物在RT下搅拌4.5h。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于1500ml乙酸乙酯中，加入100ml水，并将混合物在水冷(稍微放热的)下搅拌30min。分离出有机相，并且将水相用500ml乙酸乙酯萃取两次。有机相在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。得到20.7g(理论值的94％)目标化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝1.49min；MS(EIpos):m/z＝106[M-C5H8O2]+。
中间体L33
[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将20.00g(97.44mmol)(3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于1000ml无水二氯甲烷中，然后在RT下加入6.63g(97.44mmol)咪唑和16.16g(107.18mmol)叔丁基(氯)二甲基硅烷。将反应混合物在RT下搅拌16h，并用半浓缩的氯化钠溶液洗涤。水相用乙酸乙酯萃取，并且将合并的有机相用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到28.50g(理论值的92％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.02(s,6H),0.86(s,9H),1.37(s,9H),1.58-1.73(m,1H),2.91(q,2H),3.33-3.36[m,(2H,hidden)],3.53-3.58(m,2H),6.65-6.72(m,1H).
中间体L34
(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯
将12.65g(39.591mmol)[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于200ml二氯甲烷中，并在RT下逐滴加入19.31g(45.53mmol)溶于150ml二氯甲烷中的Dess-Martin过碘烷。将混合物在RT下搅拌2h，然后加入250ml半浓缩的碳酸氢钠溶液和250ml 10％浓度的硫代硫酸钠溶液，将混合物搅拌20min。分离出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用300ml水洗涤，用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到11.35g(理论值的90％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.02(s,6H),0.84(s,9H),1.36(s,9H),1.48-1.51(m,1H),3.08-3.32[m,(1H,hidden)],3.50-3.58(m,2H),3.81-3.91(m,1H),6.71(t,1H),9.60(d,1H).
中间体L35
(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物是根据文献(例如Jean Bastide et al.J.Med.Chem.2003,46(16),3536-3545)中已知的方法制备。
中间体L36
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将100mg(0.57mmol)N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸溶于4.0ml DMF中，加入0.08ml(0.57mmol)三乙胺。然后加入199.0mg(0.57mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和0.08ml(0.57mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌48h。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/含0.1％TFA的水)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到75.7mg(理论值的33％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.69min；MS(ESIpos):m/z＝409[M+H]+。
中间体L37
L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将75.7mg(0.19mmol)中间体L36悬浮于25ml水/乙醇/THF中，加入7.5mg在活性炭上的钯(10％)，将混合物在RT下用在标准压力下的氢气氢化4.5h。滤出催化剂，减压移除反应混合物中的溶剂并在高真空下干燥。将残余物不经进一步纯化即用于下一步。得到64.9mg(理论值的93％)的标题化合物。得到64.9mg(理论值的93％)的标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝275[M+H]+。
中间体L38
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将38.3mg(0.14mmol)中间体L37加入3.0ml DMF中，并加入96.4mg(0.14mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和39.0μl(0.28mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。然后加入16.0μl(0.28mmol)HOAc，将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到58.9mg(理论值的45％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.61min；MS(ESIpos):m/z＝849[M+H]+。
中间体L39
(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
首先将300mg(2.64mmol)2-氨基乙硫醇盐酸盐(1:1)加入3.0ml二氯甲烷中，加入668.0mg(6.60mmol)三乙胺和719.1mg(2.77mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮。将混合物在RT下搅拌2天(通过薄层色谱监测：二氯甲烷/甲醇＝100:1.5)。加入乙酸乙酯，并将反应混合物用水洗涤三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤两次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
中间体L40
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中用在活性炭上的靶(10％)，在RT和标准压力下用氢气氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180.0mg(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)加入三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于20ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中，加入27.2mg在活性炭上的钯，将混合物在标准压力和RT下用氢气氢化。混合物通过Celite(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶于1.5ml DMF中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到55.6mg(理论值的90％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝920[M+H]+。
中间体L41
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中用在活性炭上的钯(10％)在RT和标准压力下用氢气氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180.0(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化反应混合物。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中,加入27.2mg在活性炭上的钯，将混合物在标准压力和RT下用氢气氢化。将混合物经Celite(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和34.3mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶于1.5ml DMF中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到40.6mg(理论值的82％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝744[M+H]+。
中间体L42
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将50.0mg(0.18mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体L37)加入到DMF中，加入93.6mg(0.18mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和36.9mg(0.37mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入21.9mg(0.37mmol)HOAc，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到20.6mg(理论值的14％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.55min；MS(ESIpos):m/z＝673[M+H]+。
中间体L43
N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将11.3mg(0.04mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体L37)加入DMF中，并加入50.0mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-63-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧杂六十三烷-1-基}丙酰胺和8.3mg(0.08mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入4.9mg(0.08mmol)HOAc，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到15.8mg(理论值的20％)的标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1377[M+H]+。
中间体L44
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将73.3mg(0.39mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶于7.0ml DMF中，加入200.0mg(0.39mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和78.8mg(0.78mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到103.3mg(理论值的45％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝587[M+H]+。
中间体L45
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯
将2.00g(7.26mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶于90ml二氯甲烷中，然后加入1.76ml吡啶和4.62g(10.90mmol)1,1,1-三乙酰氧基-1λ5,2-苯碘酰基-3(1H)-酮(Dess-Martin过碘烷)。将反应物在RT下搅拌2h，然后用200ml二氯甲烷稀释，用10％浓度的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后连续用5％浓度的柠檬酸萃取两次，用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，用硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将100ml乙醚和环己烷(v/v＝1:1)加入到残余物中，并将混合物稍微浓缩，结果形成白色沉淀。抽吸过滤。将滤液在旋转蒸发器上浓缩，并在高真空下干燥，得到1.74g(理论值的88％)目标化合物，其为浅黄色油状物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝274[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]＝1.38(s,18H),2.64-2.81(m,2H),4.31-4.36(m,1H),7.23(d,1H),9.59(s,1H).
中间体L46
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酸叔丁酯(1:1)
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将200mg(0.79mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)与263mg(0.87mmol)(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸/三氟乙酸(1:1)偶联，然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌1h将氨基脱保护。从乙腈/水中冻干，经2步得到85mg(理论值的20％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.37min；MS(ESIpos):m/z＝326[M+H]+。
中间体L47
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
标题化合物是通过将中间体L8与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，随后用TFA脱保护来制备。
LC-MS(方法3):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝488(M+H)+。
中间体L48
三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
以与中间体L2类似的方式，由可商购的(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸制备标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝1.22min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L49
三氟乙酸/N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁基酯(1:1)
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在二氯甲烷中偶联可商购的溴乙酸酐，然后是部分受保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯(按照肽化学的经典方法制备)。然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌在氨基上进行脱保护，经2步得到标题化合物，产率为49％。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝593和595(M+H)+。
中间体L50
三氟乙酸/(1S,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1S,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用HATU偶联，并随后用TFA脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L51
三氟乙酸/(1R,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1R,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用HATU偶联，并随后用TFA脱保护。
LC-MS(方法3):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝250(M-H)-.
中间体L52
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(1:1)
将420mg(2.62mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯溶于50ml二氯甲烷中，加入817mg(3.15mmol)溴乙酸酐和913μl(5.24mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应在RT下搅拌1h，然后减压浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。
得到577mg受保护的中间体，然后将其溶入50ml二氯甲烷中，并加入10ml三氟乙酸。在RT下搅拌1h后，将反应减压浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干。得到705mg(理论值的65％)的标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝0.34min；MS(ESIpos):m/z＝181和183(M+H)+。
中间体L53
三氟乙酸/(1S,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1S,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用HATU偶联，并随后用TFA脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝250(M-H)-.
中间体L54
三氟乙酸/(1R,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用HATU偶联，随后用TFA脱保护。
LC-MS(方法3):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L55
三氟乙酸/N6-D-丙氨酰基-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在HATU的情况下将中间体L6与N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸偶联，随后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌90min在氨基上进行脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝1.35min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.67min；MS(ESIpos):m/z＝637(M+H)+。
中间体L56
三氟乙酸/叔丁基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸酯(1:1)
标题化合物通过以下步骤制备：首先在存在HATU的情况下将中间体L6与(1R,3S)-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸偶联，然后在温和条件下通过在25％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌15min来在氨基上进行脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝1.4min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.7min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L57
(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
首先将500.0mg(2.72mmol)L-天冬氨酸甲酯盐酸盐和706.3mg(2.72mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯加入5.0ml 1,4-二噁烷中，并加入826.8mg(8.17mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到583.9mg(理论值的74％)化合物(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIneg):m/z＝290(M-H)-.
首先将592.9mg(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸加入10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷中，将混合物冷却至-15℃，加入205.8mg(2.04mmol)4-甲基吗啉和277.9mg(2.04mmol)氯甲酸异丁酯。15min后通过抽滤滤出沉淀物，用10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷(在每种情况下)进行两次。将滤液冷却至-10℃，剧烈搅拌下加入溶于10ml水中的115.5mg(3.05mmol)硼氢化钠。分离各相，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到515.9mg(理论值的91％)化合物N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝278(M+H)+。
将554.9mg(2.00mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯加入30.0ml二氯甲烷中，并加入1.27g(3.0mmol)Dess-Martin过碘烷和474.7mg(6.00mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌过夜。4h后，反应用二氯甲烷稀释，并且将有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液、10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤(在每种情况下)三次。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。得到565.7mg(理论值的97％)的标题化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.91(m,2H),2.70-2.79(m,1H),2.88(dd,1H),3.63(s,3H),4.04(m,2H),4.55(m,1H),7.54(d,1H),9.60(t,1H).
中间体L58
(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将434.4mg(5.78mmol)3-氨基-1-丙醇和1.50g(5.78mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶于10.0ml二氯甲烷中，加入585.3mg(5.78mmol)三乙胺，并且将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂。残余物(3-羟基丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(996.4mg，理论值的79％)在高真空下干燥，不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
首先将807.0mg(3.68mmol)(3-羟基丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入102.2mg(0.37mmol)四正丁基氯化铵、736.9mg(5.52mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和57.5mg(0.37mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥，并且不经进一步纯化即用于下一合成步骤(890.3mg)。
中间体L59
三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
首先将300.0mg(0.91mmol)(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯加入二氯甲烷中，加入4.2g(36.54mmol)TFA并将混合物在RT下搅拌1h(通过TLC监测：二氯甲烷/甲醇10:1)。减压蒸发挥发性组分，并且将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏四次。将残余物在高真空下干燥，并且不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.19min；MS(ESIpos):m/z＝229(M+H)+。
中间体L60
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯
将200.0mg(0.95mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸溶于4.0ml二氯甲烷中，加入338.0mg(2.84mmol)亚硫酰氯。将反应混合物在RT下搅拌3h，然后加入1滴DMF。将混合物再搅拌1h。减压蒸发溶剂，并且将残余物与二氯甲烷共蒸馏三次。粗产物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
中间体L61
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
首先，肽衍生物L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯是根据肽化学的经典方法由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备(用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，氢解，在存在HATU的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联并再一次氢解)。标题化合物是通过将该部分保护的肽衍生物与可商购的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)已酸在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联来制备。然后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌2.5h，在保留酯保护基的情况下，在氨基上进行脱保护。后处理并通过制备型HPLC纯化，得到438mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.69min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝610(M+H)+。
中间体L62
三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸酯(1:1)
首先，N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯是根据肽化学的经典方法由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备。然后在存在195mg(0.51mmol)HATU和149μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将148mg(0.43mmol)该中间体与200mg(0.43mmol)中间体L16偶联。在浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物后，将受保护的中间体溶于20ml DCM中，通过加入2ml三氟乙酸并在RT下搅拌1h移除叔丁氧基羰基保护基。将残余物浓缩并从乙腈/水中冻干，得到254mg(经2步的理论值的63％)。
HPLC(方法11):Rt＝1.51min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.68min；MS(ESIpos):m/z＝696(M+H)+。
中间体L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
首先，肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸是根据肽化学的经典方法由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸制备(用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，用三氟乙酸移除Boc保护基，在存在HATU的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联，并在甲醇中在10％在活性炭上的钯上氢解)。标题化合物是通过将该部分保护的肽衍生物与可商购的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联来制备。后处理并通过制备型HPLC纯化，得到601mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝611(M+H)+。
中间体L64
(4S)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
标题化合物是根据肽化学的经典方法由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸制备(用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，用三氟乙酸移除Boc保护基，在甲醇中在10％在活性炭上的钯上氢解裂解苄基酯，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝385(M+H)+。
中间体L65
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-L-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
标题化合物是根据肽化学的经典方法由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸制备(用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，并用三氟乙酸移除Boc保护基)。得到373mg(经2步的理论值的79％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.72min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
中间体L66
(8S)-8-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-甲酯
首先将1000mg(2.84mmol)(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸加入10ml 1,2-二甲氧基乙烷中，加入344.4mg(3.4mmol)的4-甲基吗啉和504mg(3.69mmol)氯甲酸异丁酯。在RT下搅拌10min后，将反应物冷却至5℃，在剧烈搅拌下每次一点地加入溶于3ml水中的161mg(4.26mmol)硼氢化钠。1h后，再次加入等量的硼氢化钠，然后将反应物缓慢升温至RT。加入170ml水，然后将反应物用200ml乙酸乙酯萃取(在每种情况下)四次。分离各相，有机相用柠檬酸洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到760mg(理论值的78％)化合物[(2S)-4-羟基丁烷-1,2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
将760mg(2.16mmol)溶于13ml氯化氢/二噁烷中的该中间体在RT下搅拌20min。然后将反应浓缩至5ml，并且加入乙醚。滤出沉淀物并从乙腈/水1:1中冻干。
将以该方式获得的产物溶于132ml DMF中，加入345.5mg(2.35mmol)4-甲氧基-4-氧代丁酸，加入970mg(2.55mmol)HATU和1025μl N,N-二异丙基乙胺。将混合物在RT下搅拌5min。减压移除溶剂，并且将剩余的残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的级分合并，并且减压蒸发乙腈。剩余的水相用乙酸乙酯萃取两次，然后浓缩有机相并在高真空下干燥。
将以该方式获得的中间体溶于甲醇中，并在10％在活性炭上的钯上在RT和氢气标准压力下氢化1h。然后滤出催化剂，并且减压移除溶剂。
将247mg该脱保护的化合物溶于20ml DMF中，并加入352mg(1.36mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和592μl N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌1h，然后浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。经过这5个反应步骤得到218mg标题化合物，总产率为21％。
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝363(M+H)+。
中间体L67
三氟乙酸/2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基-β-丙氨酸酯(1:1)
标题化合物是通过以下方式由50mg(0.354mmol)可商购的1-(2-羟基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过在存在1.5个当量的EDCI和0.1个当量的4-N,N-二甲基氨基吡啶的情况下，与在10ml二氯甲烷中的134mg(0.71mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联，然后用三氟乙酸脱保护。
中间体L68
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)
以与中间体L1类似的方式，根据肽化学的经典方法由可商购的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝212(M+H)+。
中间体L69
三氟乙酸/1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸酯(1:1)
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的4-羟基哌啶-1-羧酸苄酯制备，即通过使用EDCI/DMAP与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸来酯化，随后用TFA移除Boc，然后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(叔丁氧基)羰基]-L-缬氨酸偶联，最后再次用TFA移除Boc。
LC-MS(方法1):Rt＝0.62min；MS(ESIpos):m/z＝492(M+H)+。
中间体L70
9H-芴-9-基甲基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯
首先将1000.0mg(3.36mmol)(3-羟基丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入93.5mg(0.34mmol)四正丁基氯化铵、673.6mg(5.04mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和52.5mg(0.34mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和的NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥并通过硅胶色谱法纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯3:1-1:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到589.4mg(理论值的58％)的标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.15min；MS(ESIpos):m/z＝296(M-H)+。
中间体L71
[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
首先将100.0mg(0.42mmol)4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酸加入2.0ml二氯甲烷中，加入64.2mg(0.51mmol)草酰二氯(oxalyl dichloride)。将反应混合物在RT下搅拌30min(通过TLC监测：二氯甲烷/甲醇)。然后再加入192.6mg(1.53mmol)草酰二氯和1滴DMF，并将混合物在RT下搅拌1h。减压蒸发溶剂，并且将残余物与二氯甲烷反复共蒸馏。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
中间体L72
(9S)-9-(羟甲基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄基酯
标题化合物是根据肽化学的经典方法，通过以下方式由可商购的[(2S)-3-羟基丙-1,2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯制备，即通过氢解移除Z保护基，随后在存在EDCI/HOBT的情况下与4-(苄氧基)-4-氧代丁酸偶联，然后用TFA移除Boc保护基，最后通过在存在三乙胺的情况下与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝425[M+H]+。
中间体L73
N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺
将395.5mg(1.87mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)N,N-二异丙基乙胺和854.3mg(2.25mmol)mmol)HATU加入到300mg(1.87mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯在20ml二甲基甲酰胺中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5min。浓缩混合物后，将残余物溶解在DCM中并用水洗涤。有机相用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。得到408mg(33％，纯度53％)的标题化合物，其不经进一步纯化即使用。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝354(M+H)+。
将1ml TFA加入到(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯(408mg，0.365mmol)在7ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌0.5h。将反应混合物减压浓缩并将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏两次。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到384mg(94％，纯度57％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.26min；MS(ESIpos):m/z＝254(M+H)+。
中间体L74
3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸
将107mg(0.335mmol)3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯和93mg(0.369mmol)2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯溶于5ml二甲基甲酰胺中，加入0.074ml(0.671mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到133mg(86％，纯度100％)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝459(M+H)+。
将0.5ml TFA加入到3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯(130mg，0.284mmol)在5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到102mg(90％，纯度100％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.52min；MS(ESIpos):m/z＝402(M+H)+。
中间体L75
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
标题化合物是根据肽化学的经典方法，由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸制备(用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，并用三氟乙酸移除Boc保护基)。得到405mg(经2步的理论值的58％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
中间体L76
(2S)-2-溴-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸
首先，由(3S)-4-(苄氧基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸根据肽化学的经典方法制备适当受保护的天冬氨酸衍生物(用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇来酯化，并氢解移除Z保护基和苄基酯)。
将以该方式得到的470mg(1.8mmol)(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸悬浮于10ml水中，加入1.8ml 1摩尔浓度的盐酸和0.5ml浓硫酸，然后加入863mg(7.25mmol)溴化钾。然后在10℃下，经30min逐滴加入150mg(2.175mmol)亚硝酸钠在1ml水中的溶液，并将混合物在10-15℃下搅拌2h。然后用50ml乙酸乙酯萃取混合物。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并用硫酸镁干燥。蒸发溶剂并通过制备型HPLC纯化产物，得到260mg(理论值的48％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIneg):m/z＝295和297(M-H)-.
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.95(t,2H),2.94和3.2(2dd,2H),4.18(t,2H),4.57(t,1H)。
中间体L77
三氟乙酸/N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-溴乙酰胺(1:1)
首先将418mg(2.05mmol)[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯与638mg(2.46mmol)溴乙酸酐反应，然后用三氟乙酸移除Boc保护基。得到551mg(理论值的63％)的标题化合物。
LC-MS(方法):Rt＝0.32min；MS(ESIpos):m/z＝227和225(M+H)+。
中间体L78
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸
标题化合物是通过以下方式由可商购的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸制备，即通过在存在EDCI/HOBt和N,N-二异丙基乙胺的情况下与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联，随后用三氟乙酸脱保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.32min；MS(ESIpos):m/z＝227(M+H)+。
中间体L79
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸
将64.8mg(0.357mmol)β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)和100mg(0.324mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}1H-吡咯-2,5-二酮溶于4ml二甲基甲酰胺中，加入65.6mg(0.649mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到84.5mg(77％，纯度100％)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
将1.62ml TFA加入到N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯(82.8mg，0.244mmol)在8ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩，将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到62.7mg(87％，纯度95％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝283(M+H)+。
中间体L80
3-[(15-氨基-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基)氨基]-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
标题化合物是根据肽化学的经典方法由可商购的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)制备(从盐中释放，并用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇来酯化，氢解移除Z保护基，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与可商购的3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸偶联，再次氢解移除Z保护基)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.70min；MS(ESIpos):m/z＝552(M+H)+。
中间体L81
三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄基酯(1:1)
在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，将250mg(1.11mmol)2,2'-磺酰基二乙胺与92.3mg(0.37mmol)1-{[(苄氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮在DMF中偶联。随后通过HPLC纯化，得到70mg(理论值的47％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.64min；MS(ESIpos):m/z＝257.11(M+H)+。
中间体L82
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
将88.6mg(0.357mmol)N-Boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺和100mg(0.324mmol)6-马来酰亚胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯溶于4.0ml二甲基甲酰胺中，加入0.071ml(0.650mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：75ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到127mg(理论值的81％){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝442(M+H)+。
将2.0ml TFA加入123mg(225μmol){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯在7.5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到111mg(理论值的100％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.31min；MS(ESIpos):m/z＝342(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.04(m,2H),2.98(m,2H),3.19(m,2H),3.39(m,4H),3,56(m,6H),7.01(s,2H),7.72(bs,3H),7.80(m,1H)。
中间体L83
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
将200mg(0.805mmol){2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯、150mg(0.966mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和560μl(3.2mmol)N,N-二异丙基乙胺溶于10ml二甲基甲酰胺中，加入459mg(1.21mmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌30min。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于二氯甲烷。有机相用5％柠檬酸溶液洗涤两次，用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。使用Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，二氯甲烷:甲醇98:2)纯化残余物。得到276mg(理论值的89％){2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.67min；MS(ESIpos):m/z＝386(M+H)+。
将4ml TFA加入到{2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(275mg，714μmol)在15ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌30min。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。得到281mg(理论值的99％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝286(M+H)+。
中间体L84
三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯和202mg(0.654mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶于4.0ml二甲基甲酰胺中，加入0.130ml(1.2mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.085ml(1.5mmol)乙酸，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到275mg(理论值的73％)[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝530(M+H)+。
将780μl(10mmol)TFA加入到[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯(268mg，505μmol)在5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到266mg(理论值的97％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.46min；MS(ESIpos):m/z＝430(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.03(m,2H),2.99(m,2H),3.18(m,2H),3.38(m,4H),3,52(m,8H),3,58(m,6H),7.01(s,2H),7.73(bs,3H),7.80(m,1H)。
中间体L85
三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁基酯、111mg(0.713mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和410μl(2.4mmol)N,N-二异丙基乙胺溶解于6ml二甲基甲酰胺中，并加入339mg(0.892mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌1h并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到130mg(理论值的43％)[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.71min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
向[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯(126mg，267μmol)在4.0ml二氯甲烷中的溶液中加入410μl(5.3mmol)TFA。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到124mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法13):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝374(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝2.99(m,2H),3.22(m,2H),3.41(m,2H),3,53(m,8H),3,58(m,6H),4.02(s,2H),7.09(s,2H),7.73(bs,3H),8.21(m,1H)。
中间体L86
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将100mg(0.531mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和134mg(0.531mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于3ml二甲基甲酰胺中，并加入0.150ml(1.1mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌8h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到71.5mg(理论值的41％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.42min；MS(ESIpos):m/z＝326(M+H)+。
中间体L87
3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸
将250mg(1.07mmol)3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯、151mg(0.974mmol)2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸、224mg(1.46mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和224mg(1.17mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于5.0ml二甲基甲酰胺中。将反应混合物在室温下搅拌1h。加入乙酸乙酯，将混合物用浓度为5％的柠檬酸溶液萃取两次，并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到267mg(理论值的64％)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝371(M+H)+。
向3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯(263mg，710μmol)在10ml二氯甲烷中的溶液中加入1.1ml(14mmol)TFA。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到240mg(理论值的94％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.57min；MS(ESIpos):m/z＝315(M+H)+。
中间体L88
2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯
将150mg(0.797mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和246mg(0.797mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.220ml(1.6mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到302mg(理论值的97％)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.02min；MS(ESIpos):m/z＝382(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.82(dd,6H),1.17(m,2H),1.27(d,3H),1.48(m,4H),1.94(m,1H),2.13(m,2H),3.38(t,2H),4.17(m,2H),7.00(s,2H),7.75(d,1H),8.19(d,1H)。
将130mg(0.531mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解于6.5ml二氯甲烷中，并加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。再加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。加入二氯甲烷，并将混合物用水洗涤三次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到172mg(理论值的87％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.28min；MS(ESIpos):m/z＝479(M+H)+。
中间体L89
1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-L-谷氨酸酯盐酸盐(1:1)
首先将1.00g(2.96mmol)(4S)-5-(苄氧基)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸加入到13.0ml THF中，并加入510μl(3.6mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙醇和109mg(889μmol)4-二甲基氨基吡啶。将反应混合物冷却至0℃，并加入682mg(3.56mmol)N-乙基-N'-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶解于乙酸乙酯中。将有机相用0.1N的HCl溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，环己烷:乙酸乙酯80:20)纯化。得到649mg(理论值的50％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝4.6min；MS(ESIpos):m/z＝438(M+H)+。
将649mg(1.48mmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸酯溶解于7.0ml二噁烷中，并在冰浴冷却下加入14ml(59mmol)4N的HCl(溶于二噁烷中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥并通过Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，二氯甲烷:甲醇90:10)纯化。得到320mg(理论值的57％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min；MS(ESIpos):m/z＝338(M+H)+。
中间体L90
1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
首先将118mg(566μmol)N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸加入到5.0ml DMF中，加入200mg(622μmol)1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯、130mg(849μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和130mg(679μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并将混合物在室温下搅拌1h。加入乙酸乙酯，并将混合物用浓度为5％的柠檬酸溶液萃取两次并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到274mg(理论值的95％)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法12):Rt＝1.69min；MS(ESIpos):m/z＝513(M+H)+。
将820μl(11mmol)TFA加入到274mg(535μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯在5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。得到262mg(理论值的100％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.12min；MS(ESIpos):m/z＝457(M+H)+。
中间体L91
三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基1-{[3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(1:1)
标题化合物是通过肽化学的经典方法由市售的3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸制备(使用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，氢解除去Z保护基团，与市售的N-(叔丁氧基羰基)-3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸偶联，并除去Fmoc保护基团)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝552(M+H)+。
中间体L95
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
该中间体是通过肽化学的经典方法由N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)制备。
LC-MS(方法12):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝323.16(M+H)+。
中间体L96
N-乙酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
该中间体是通过肽化学的经典方法制备：由偶联2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸与N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸开始，随后在乙醇中经10％钯/活性碳氢解移除Z保护基团，最后使所得到的二肽与1-乙酰氧基吡咯烷-2,5-二酮反应。
LC-MS(方法1):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝317(M+H)+。
中间体L97
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸
首先将1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸叔丁酯(100mg，201μmol)加入到1.0ml DMF中，并加入(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(46.8mg，301μmol)、1-羟基-1H-苯并三唑水合物(76.9mg，502μmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(77.0mg，402μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯。将有机相用浓度为5％的柠檬酸溶液洗涤两次，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，然后用饱和氯化钠溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到19.1mg(理论值的13％)化合物1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝635[M+H]+。
向1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(19.1mg，30.1μmol)在1.0ml DCM中的溶液中加入TFA(62μl，600μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到10.8mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.55min；MS(ESIneg):m/z＝577[M-H]-。
中间体L98
2,2-二甲基丙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(2-氨基乙基)-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酸酯(1:1)
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，偶联(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸与(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯。随后，通过溶于DCM中的三氟乙酸，分离Boc保护基团和叔丁基酯。然后，首先通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF/水中与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应而再保护氨基，然后通过在存在EDCI/DMAP的情况下，在DCM中与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇反应而再保护羧基。在最后一步中，通过在标准压力下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)的氢解而对末端氨基去保护。通过过滤除去催化剂，浓缩，通过制备型HPLC纯化并将残余物从乙腈/水中冻干后，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝434(M+H)+。
中间体L99
三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基-L-赖氨酸酯(1:1)
首先，根据肽化学的经典方法由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备2-(三甲基甲硅烷基)乙基N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸酯。然后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与通过标准方法制备的三肽结构构件(buildingblock)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酸偶联。然后通过在甲醇中氢解来除去Z保护基团，并在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将获得的中间体与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联。在最后一步中，通过在室温下在浓度为10％的三氟乙酸的DCM溶液中搅拌1h而在温和条件下对侧链氨基去保护。浓缩并从乙腈/水中冻干后，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.64min；MS(ESIpos):m/z＝625(M+H)+。
中间体L100
3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4- 噁二唑-3-基]丙酸
将461mg(6.60mmol)羟胺盐酸盐和1341.86mg(13.26mmol)三乙胺加入于40ml乙醇中的3-氰基丙酸甲酯的溶液(500mg，4.42mmol)中。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将混合物浓缩并将残余物溶解于乙酸乙酯中，然后用水和盐水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。将残余物不经进一步纯化地使用。得到400mg(理论值的62％)标题化合物。
将6.91g(36.50mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸和8.22g(39.82mmol)1,3-二环己基碳二亚胺加入于120.0ml二噁烷中的(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯的溶液(4.85g,33.19mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌3h。将混合物浓缩并将残余物溶解于水中并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱纯化。得到6.0g(理论值的57％)标题化合物。
将于100ml的DMF中的(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯的溶液(6.0g，18.91mmol)在120℃下搅拌5h。加入水，将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到4g(理论值的71％)标题化合物。
将2.96g(25.96mmol)三氟乙酸加入于30ml二氯甲烷中的3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸的溶液(2.0g，7.01mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌1h。加入水并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物不经进一步纯化地使用。得到1.50g(理论值的72％)标题化合物。
将1.30g(5.52mmol)1-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基]-1-吡咯-2,5-二酮和1.52g(15.04mmol)三乙胺加入于25ml的DMF中的3-[5-(2-氨基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸的溶液(1.5g，5.01mmol)中。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入水并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到774mg(理论值的47％)标题化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝2.67(t,2H),2.91(t,2H),3.03(t,2H),3.46(q,2H),4.28(s,2H),7.01(s,2H),8.37(t,1H),12.28(bs,1H)。
中间体L123
[1-氟-4-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯
在氩气下，将3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氟丁酸乙酯(150mg，602μmol)(Synth.Com.,1985,15(5),377)首先加入12.0ml的DCM中。将反应混合物冷却至-78℃，加入溶于甲苯中的二异丁基氢化铝1M(1.2ml，1.0M，1.2mmol)并将混合物搅拌2小时。将混合物用甲醇小心地猝灭，再搅拌10min并用乙酸乙酯稀释。将有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到86.1mg(理论值的67％)标题化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ[ppm]:1.37(s,9H),2.58(m,2H),4.18(m,1H),4.31(dd,2H),7.05(d,1H),9.60(s,1H)。
中间体L124
N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯
将4.0g(13.8mmol)Boc-Asp-OtBu和1.8g(15.2mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解于100ml乙酸乙酯中，并在0℃下加入3.1g(15.2mmol)1,3-二环己基碳二亚胺。将反应混合物在0℃下搅拌2小时然后在RT下搅拌过夜。随后将反应混合物过滤并在减压下浓缩。得到4.1g(理论值的77％)化合物4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-N-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸1-叔丁酯。
将3-氨基-N-[(苄氧基)羰基]-D-丙氨酸(2.53g，10.6mmol)溶解于30ml的DMF中，并加入N,N-二异丙基乙胺(2.74g，21.2mmol)和4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-N-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸1-叔丁酯(4.10g，10.6mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜并在减压下浓缩。得到4.9g(理论值的90％)化合物(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-({(3S)-4-叔丁氧基-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙酸。
将(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-({(3S)-4-叔丁氧基-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙酸(4.90g，9.62mmol)溶解于100ml乙腈中，并在RT下加入吡啶(1.6ml，19mmol)、2-(三甲基硅烷基)乙醇(1.7ml，12mmol)和二环己基碳二亚胺(2.38g，11.5mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时然后在RT下搅拌过夜。随后将反应混合物过滤并在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到3.9g(理论值的66％)化合物N-{(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯。
将N-{(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯(3.80g，6.23mmol)溶解于120ml甲醇中，并加入380mg于碳上的钯(10％)。将反应混合物在RT下在标准压力下用氢气来氢化2小时，然后过滤。将溶剂在减压下去除。得到2.9g(理论值的84％)标题化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.04(s,9H),0.97(m,2H),1.38(s,9H),1.39(s,9H),1.89(bs,2H),2.43(m,1H),3.18(m,3H),3.38(m,1H),4.11(m,3H),6.93(d,1H),7.91(bt,1H)。
中间体L125
三氟乙酸/叔丁基-N-(2-氨基乙基)-N2-(溴乙酰基)-D-α-谷氨酸酯(1:1)
通过肽化学的经典方法由(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯出发来制备该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝0.49min；MS(ESIpos):m/z＝366und 368(M+H)+。
中间体F104
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
将10mg(0.014mmol)中间体C53溶解于3.3ml的DMF中，并加入8.5mg(0.027mmol)中间体L1、7.8mg(0.02mmol)HATU和12μl的N,N-二异丙基乙胺。将反应物在RT下搅拌15min，然后浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，冻干后得到5.6mg(理论值的38％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝915(M+H)+。
将5.6mg(0.006mmol)该中间体溶于2ml的DMF中，并加入69mg(0.61mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应在超声波浴中处理2h。然后加入35μl乙酸并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到2.4mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(EIpos):m/z＝693[M+H]+。
HPLC(方法11):Rt＝1.91min；
或者，也由中间体C58制备标题化合物。首先在存在13mg(0.034mmol)HATU和10μlN,N-二异丙基乙胺的情况下，使15mg(0.023mmol)中间体C58与11mg(0.036mmol)中间体L1反应。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到12.3mg(理论值的63％)保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.3min；MS(EIpos):m/z＝837[M+H]+。
在第二步中，将该中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到8.1mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝693(M+H)+。
中间体F119
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)
将29mg(0.044mmol)中间体C58溶于3.4ml DMF中，并加入36mg(0.087mmol)中间体L52、25mg(0.065mmol)HATU和19μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到26.4mg(理论值的73％)所述中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝820和822(M+H)+。
将该中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.5mg(0.048mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。加入13.9mg(0.048mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到14.4mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝676和678(M+H)+。
中间体F127
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
将12mg(0.015mmol)中间体C59溶解于2.4ml DMF中，并加入14.6mg(0.046mmol)中间体L1、6mg(0.031mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5.9mg(0.039mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和8μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到11mg(理论值的70％)该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝942(M+H)+。
将11mg(0.011mmol)该中间体溶于2ml DMF中，并加入123mg(1.1mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理2h。然后加入63μl乙酸并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到2mg(理论值的22％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝721[M+H]+。
HPLC(方法11):Rt＝1.95min。
中间体F153
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-羟基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
所述合成是以与中间体F104类似的方式由中间体C60进行。
LC-MS(方法1):Rt＝1.1min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H)+。
中间体F155
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：在存在8.7mg(0.023mmol)HATU和17μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将14mg(0.019mmol)中间体C61与15mg(0.021mmol)中间体L61偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到13mg(经两个步骤，理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝1076(M+H)+。
中间体F173
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.018mmol)中间体C64制备：通过在存在7.7mg(0.02mmol)HATU和16μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与12mg(0.02mmol)中间体L63偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到12mg(经两个步骤，理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(EIpos):m/z＝1048[M+H]+。
中间体F178
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}环戊烷甲酰胺(1:1)
标题化合物是以与中间体F177类似的方式制备，但使用中间体L52代替中间体L1。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝787和789[M+H]+。
中间体F180
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：在存在7mg(0.018mmol)HATU和6μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将9.6mg(0.012mmol)中间体C64与5mg(0.013mmol)中间体L64偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到3.1mg(经两个步骤，理论值的28％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(EIpos):m/z＝822[M+H]+。
中间体F192
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-L-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将60mg(0.091mmol)中间体C58溶于8ml DMF中，并在存在42mg(0.11mmol)HATU和64μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与45mg(0.100mmol)中间体L65偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于10ml乙醇中，并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化45min。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到24.5mg(经两个步骤，理论值的31％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-L-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.17min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
然后通过以下方式制备标题化合物：通过在存在5.4mg(0.014mmol)HATU和8μl N,N-二异丙基乙胺的情况下将10mg(0.012mmol)该中间体与2mg(0.013mmol)市售的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸中间体偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到3.5mg(经两个步骤，理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F193
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
标题化合物的合成是以与中间体F192类似的方式由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F194
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
标题化合物是由实施例M9通过以下步骤制备：首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化1小时来除去Z保护基团，然后通过与1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮反应将去保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.19min；MS(ESIpos):m/z＝851[M+H]+。
中间体F207
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
标题化合物是以与中间体F155类似的方式而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
中间体F216
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将30.2mg(0.06mmol)N,N'-双[(苄氧基)羰基]-L-胱氨酸加入到2.0ml水和2.0ml异丙醇中，并加入56.7mg(0.20mmol)TCEP。将反应混合物在室温下搅拌30min。然后加入溶解于2.0ml异丙醇中的50.0mg(0.08mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体C70)以及122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后再加入122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取并用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到43.1mg(理论值的64％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝851(M+H)+。
首先将16.5mg(0.05mmol)4-甲基苯磺酸/β-丙氨酸苄酯(1:1)与14.0mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺一起加入到1.5ml乙腈中。将反应混合物在室温下搅拌3min，然后加入溶解于1.5ml乙腈中的30.8mg(0.04mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸、23.4mg(0.18mmol)N,N-二异丙基乙胺和29.9mg(0.05mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。所得化合物为S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.59min；MS(ESIpos):m/z＝1012(M+H)+。
将43.8mg(43.3μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄酯溶解于8.0ml乙醇中，加入4.4mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在室温、标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物如刚才所述再处理两次。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.5mg(理论值的37％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝788(M+H)+。
首先将14.5mg(16.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)与9.1mg(17.7μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.0ml DMF中，并加入4.9mg(48.2μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.4mg(0.06mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.9mg(理论值的50％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.28min；MS(ESIpos):m/z＝1186(M+H)+。
将14.1mg(11.9μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在70℃下搅拌4h。加入20.8mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到6.2mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝1042(M+H)+。
中间体F239
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸加入到1.5ml DMF中，并加入7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5mg(0.05mmol)TBTU和6.2mg(0.05mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于1.5mlDMF中的40.0mg(0.05mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和18.7mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝854(M+H)+。
将10.9mg(12.8μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入10.4mg(76.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到7.5mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝710(M+H)+。
中间体F240
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)
首先将27.5mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L1)一起加入到1.8ml乙腈中。然后加入32.4mg(0.31mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入32.4mg(0.05mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.9mg(理论值的35％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝881(M+H)+。
将11.9mg(0.01mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入5.5mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.75min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F241
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式由中间体C66制备：通过与市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联并随后用氯化锌去封闭。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(EIpos):m/z＝733和735[M+H]+。
中间体F242
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)
标题化合物的合成是以与中间体F104类似的方式进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H)+。
中间体F243
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]丁酰胺(1:1)
标题化合物的合成是以与中间体F242类似的方式进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F245
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：在存在15mg(0.04mmol)HATU和9μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.0135mmol)中间体C65与8mg(0.027mmol)中间体L1在8ml DMF中偶联，随后在三氟乙醇用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述)。通过制备型HPLC纯化得到8.8mg(经两个步骤，理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝778(M+H)+。
中间体F247
三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
将14mg(0.018mmol)中间体C66溶解于14ml DCM中，加入10.1mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)并以一次少量的方式加入总共250μl吡啶，pH保持在5和6之间。然后用乙酸将pH调节至4，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，冻干并干燥，得到4mg(理论值的21％)保护的中间体，然后将其用氯化锌在氨基官能团处去保护。HPLC纯化并冻干得到3mg(理论值的72％)标题化合物，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F248
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：在存在HATU的情况下，将10mg(0.015mmol)中间体C58与5mg(0.017mmol)中间体L12偶联，随后用氯化锌去保护。得到6.5mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝680(M+H)+。
中间体F254
三氟乙酸/(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
标题化合物是以与中间体247类似的方式通过以下方法制备：通过将15mg(0.02mmol)中间体C66与21mg(0.099mmol)(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸偶联(其是如(J.Org.Chem.200,65,517-522)中所述由(2S)-2-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐(1:1)合成)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F255
R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基})高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先将13.1mg(0.04mmol)(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入到1.0ml DMF中，并加入5.4mg(0.04mmol)HOBt、11.4mg(0.04mmol)TBTU和4.6mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于12.9mg(0.1mmol)N,N-二异丙基乙胺和1ml DMF中的30.0mg(0.04mmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C11)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到32mg(73％)化合物4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝1084(M+H)+。
将41.4mg(0.038mmol)4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸溶解于10ml乙醇中，加入4.2mg Pd/C，并将混合物在标准压力下氢化。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压和不加热的情况下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到21.1mg(56％)化合物R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.11min；MS(ESIpos):m/z＝860(M+H)+。
首先将20.4mg(20.94μmol)R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与11.8mg(23.04μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.0ml DMF中，并加入4.2mg(41.88μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.1mg(0.05mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(36％)化合物R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.66min；MS(ESIpos):m/z＝1259(M+H)+。
将9.4mg(7.47μmol)R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入6.1mg(44.81μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.9mg(75％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1114(M+H)+。
中间体F256
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-N'-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]琥珀酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.014mmol)中间体C65和9.6mg(0.027mmol)三氟乙酸/N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到8mg(经两个步骤，理论值的64％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝822(M+H)+。
中间体F257
R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将50.0mg(0.06mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和29mg(0.07mmol)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(中间体L74)溶解于3.0ml DMF中，并加入27.3mg(0.07mmol)HATU和23.3mg(0.18mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg(26％)化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1101(M+H)+。
将17mg(0.02mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.05mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入13.5mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.6mg(46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝957(M+H)+。
中间体F258
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[3-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}氨基)-3-氧代丙基]丁酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：使用HATU将中间体C58与三氟乙酸/[2-(β-丙氨酰基氨基)乙基]氨基甲酸苄酯(1:1)偶联，随后氢解，然后与1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联，最后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F259
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将75mg(0.114mmol)中间体C58溶于12.5ml DMF中，并在存在65mg(0.11mmol)HATU和79μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与78mg(0.171mmol)中间体L75偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于20ml乙醇中，并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到63mg(经两个步骤，理论值的64％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.16min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
然后如上所述，在存在HATU的情况下，将40mg(0.047mmol)该中间体与N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸偶联，然后再一次氢解去保护。
然后通过以下方法制备标题化合物：在存在4μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.012mmol)该中间体与7.7mg(0.032mmol)市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型HPLC纯化(如对于中间体F119所述的)，得到1.3mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝777和779(M+H)+。
中间体F260
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
标题化合物是以与中间体F155类似的方式而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
中间体F261
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙基)丁酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：在存在HATU的情况下，将20mg(0.03mmol)中间体C58与25.8mg(0.061mmol)中间体L77偶联，随后用氯化锌去保护。得到11.9mg(经两个步骤，理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝722和720(M+H)+。
中间体F262
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先将30mg(36μmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)与16.9mg(40μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[2-(2-{3-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]丙酰胺一起加入到1.5ml DMF中，并加入10.9mg(108μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入7.58mg(0.13mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到33.4mg(理论值的80％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1027(M+H)+。
将32.8mg(32μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解于3.0ml三氟乙醇中，并加入26.1mg(192μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2h。加入56.0mg(0,192mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到22.9mg(理论值的71％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝883(M+H)+。
中间体F263
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和9.8mg(0.04mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸(中间体L78)溶解于1.0ml DMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.2mg(13％)化合物N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝925(M+H)+。
将11.3mg(0.011mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.0mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入10.7mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4mg(40％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H)+。
中间体F264
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和12.2mg(0.04mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸(中间体L79)溶解于1.0ml DMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到8.9mg(24％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝981(M+H)+。
将15.3mg(0.015mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.045mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入13.5mg(0.045mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.1mg(62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝837(M+H)+。
中间体F265
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺(1:1)
首先将30.0mg(42.7μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)和25.3mg(55.6μmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)(中间体L82)加入到1.9ml乙腈中，并加入60μl(340μmol)N,N-二异丙基乙胺和33μl(56μmol)2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物(2,4,6-tripropyl-1,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinane 2,4,6-trioxide)(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到26.7mg(理论值的60％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂-7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.40min；MS(ESIpos):m/z＝1025(M+H)+。
将25.3mg(24.7μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂-7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入20.2mg(148μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入43.3mg(148μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到23.4mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝881(M+H)+。
中间体F266
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12-二氮杂十八烷-18-酰胺(1:1)
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与22.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L83)一起加入到1.9ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到20.5mg(理论值的49％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝969(M+H)+。
将19.1mg(19.7μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入16.1mg(118μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入34.6mg(118μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.9mg(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝825(M+H)+。
中间体F267
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将13.4mg(33.3μmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(中间体L74)加入到1.0ml DMF中，并加入9.3μl(54.4μmol)N,N-二异丙基乙胺和12.6mg(33.3μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.7μl(27.7μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的25.0mg(27.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(参见中间体F216的合成)。将反应混合物在室温下搅拌90分钟。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的19％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸。
LC-MS(方法5):Rt＝4.44min；MS(ESIpos):m/z＝1172(M+H)+。
将6.70mg(5.71μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入4.67mg(34.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入10mg(34.3μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4mg(理论值的67％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝1028(M+H)+。
中间体F268
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-28-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,23-二氧代-10,13,16,19-四氧杂-3-硫杂-7,22-二氮杂二十八烷-1-酰胺(1:1)
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与30.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)(中间体L84)一起加入到2.0ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到27.9mg(理论值的59％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝1114(M+H)+。
将25.6mg(23.0μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸酯溶解于2.5ml三氟乙醇中，并加入18.8mg(138μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入40.3mg(138μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到22.2mg(理论值的88％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝969(M+H)+。
中间体F269
4-{[(8R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
首先将17.0mg(0.0195mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)与4.99mg(0.0253mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)一起加入到1.0ml乙腈中。然后加入27μl(0.16mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入15μl(0.025mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(理论值的46％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.47min；MS(ESIpos):m/z＝1052(M+H)+。
将8.3mg(7.89μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌6h。加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.10mg(理论值的14％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝852(M+H)+。
中间体F270
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入到1.0ml DMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N,N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的8.54mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L1)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.7mg(理论值的77％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法5):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝835(M+H)+。
将13.2mg(15.8μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.9mg(94.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.9mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝691(M+H)+。
中间体F271
4-{[(20R,26R)-25-(3-氨基丙基)-26-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-27,27-二甲基-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-20-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将19.4mg(22.2μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)加入到2.0ml DMF中，并加入21.7mg(44.4μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L74)、12μl(67μmol)N,N-二异丙基乙胺和16.9mg(44.4μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.1mg(理论值的66％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法4):Rt＝1.79min；MS(ESIpos):m/z＝1250(M+Na)+。
将18.1mg(14.7μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.0mg(88.4μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入25.8mg(88.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到12.3mg(理论值的73％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1028(M+H)+。
中间体F272
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]琥珀酰胺(1:1)
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入到1.0ml DMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N,N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的13.4mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L85)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.8mg(理论值的68％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(ESIpos):m/z＝1011(M+H)+。
将15.1mg(14.9μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.2mg(89.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入26.2mg(89.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.3mg(理论值的70％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝867(M+H)+。
中间体F273
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18-二氮杂二十四烷-24-酰胺(1:1)
在氩气下，首先将20.0mg(28.5μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入到1.0ml DMF中，并加入10.0μl(57.0μmol)N,N-二异丙基乙胺和13.0mg(34.2μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于5.0μl(28.5μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的16.7mg(34.2μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L85)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.6mg(理论值的62％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝1057(M+H)+。
将17.1mg(16.2μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入13.2mg(97.0μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入28.4mg(97.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.80mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝913(M+H)+。
中间体F274
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先将13.9mg(0.0167mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)与7.07mg(0.0217mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体L86)一起加入到2.0ml乙腈中。然后加入23μl(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入13μl(0.022mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到3.70mg(理论值的19％)化合物N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1024(M+H)+。
将10.6mg(10.3μmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入8.46mg(62.1μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入18.1mg(62.1μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的54％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.69min；MS(ESIpos):m/z＝880(M+H)+。
中间体F275
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
首先将39.0mg(55.6μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入到4.0ml DMF中，加入41.6mg(111μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-L-谷氨酸酯盐酸盐(1:1)(中间体L89)、29μl(170μmol)N,N-二异丙基乙胺和42.3mg(111μmol)HATU，并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在室温下搅拌1小时，用乙酸淬灭并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到53.1mg(理论值的93％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-L-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.71min；MS(ESIpos):m/z＝1021[M+H]+
在氩气下，首先将7.60mg(33.9μmol)乙酸钯(II)加入到3.0ml二氯甲烷中，并加入14μl(100μmol)三乙胺和110μl(680μmol)三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5min，并加入溶解于3.0ml二氯甲烷中的69.2mg(67.7μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-L-谷氨酸酯。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到38.4mg(理论值的61％)化合物(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝931(M+H)+。
首先将10.0mg(10.7μmol)(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸(中间体C69)加入到1.0ml DMF中，加入6.73mg(21.5μmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺/2,2,2-三氟乙烷-1,1-二醇(1:1)(中间体L1)、5.6μl(32μmol)N,N-二异丙基乙胺和8.17mg(21.5μmol)HATU，并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在室温下搅拌3小时，用乙酸淬灭，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的58％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1110[M+H]+
将6.90mg(6.21μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入10.1mg(74.4μmol)二氯化锌，将反应混合物在50℃下搅拌过夜并在室温下搅拌72h。加入54.5mg(186μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.4mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝866(M+H)+。
中间体F276
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将9.08mg(28.9μmol)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸(中间体L87)加入到1.0ml DMF中，并加入8.33μl(48.2μmol)N,N-二异丙基乙胺和11.0mg(28.9μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.67μl(24.1μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的20.0mg(27.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.70mg(理论值的19％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.47min；MS(ESIpos):m/z＝1013(M+H)+。
将13.9mg(13.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.6mg(41.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入5.6mg(41.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌30分钟。加入24.1mg(82.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.8mg(理论值的80％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.58min；MS(ESIpos):m/z＝869(M+H)+。
中间体F277
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸酯(1:1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1008(M+H)+。
将5.80mg(5.75μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入20.2mg(69.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.70mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.90min；MS(ESIpos):m/z＝764(M+H)+。
中间体F278
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将10.0mg(9.98μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸酯(1:1)(中间体C80)和2.77mg(11.0μmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入3.3μl(30μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.50mg(理论值的54％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.51min；MS(ESIpos):m/z＝1024(M+H)+。
将5.50mg(5.36μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入28.2mg(96.5μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.70mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H)+。
中间体F279
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({(2R)-2-羧基-2-[(3-羧基丙酰基)氨基]乙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
将12.2mg(14μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(83.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(83.8μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.60mg(理论值的42％)化合物4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
将10.0mg(12.7μmol)4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)和7.41mg(12.7μmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯(中间体L88)溶解于1.5ml二甲基甲酰胺中，并加入4.4μl(25μmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2h。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.20mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.11min；MS(ESIpos):m/z＝1036(M+H)+。
中间体F280
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯甲酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方式由中间体C64制备：通过与市售的1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝755(M+H)+。
中间体F281
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，通过肽化学的经典方法制备修饰的氨基酸结构单元N-(溴乙酰基)-β-丙氨酸和2-(三甲基甲硅烷基)乙基-3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸酯。然后在存在HATU和吗啉的情况下将这些偶联。然后使用浓度为10％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到中间体2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸酯。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝791和793(M+H)+。
中间体F282
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)
首先，通过肽化学的经典方法由甘氨酸叔丁酯和溴代乙酸酐制备中间体三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N2-(溴乙酰基)甘氨酰胺(1:1)。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F283
N-[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬酰胺/三氟乙酸(1:1)
首先，由(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐制备修饰的氨基酸结构单元(2S)-2-[(溴乙酰基)氨基]-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐，并由市售的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)制备氨基酸结构单元2-(三甲基甲硅烷基)乙基-3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸酯。在存在HATU和吗啉的情况下将这两种结构单元偶联，然后使用浓度为5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团，并由此得到中间体三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬氨酸酯(1:1)。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝835和837(M+H)+。
中间体F284
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将中间体L80与市售的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用浓度为16％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法12):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝984.45(M+H)+。
中间体F285
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-[(18-溴-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，将中间体L80用市售的溴代乙酸酐酰化，然后使用浓度为20％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝967和969(M+H)+。
中间体F286
1-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酰基)氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将中间体L91与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用浓度为12.5％的TFA的DCM溶液除去Boc保护基团。在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下将所得中间体与中间体C58偶联，然后通过用氯化锌去保护而转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝984(M+H)+。
中间体F288
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-({N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酰基}氨基)-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，偶联35mg(39μmol)中间体C74与N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酸(其已经预先由O-叔丁基-L-丝氨酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸制备)。用氯化锌去保护并通过HPLC纯化，得到14mg(理论值的38％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.43min；MS(ESIpos):m/z＝824.34(M+H)+。
中间体F289
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N6-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸/三氟醋酸盐(1:1)
首先，通过肽化学的经典方法由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N6-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸酯(1:1)。
然后，在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将12.5mg(25μmol)该中间体与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌去保护并通过HPLC纯化，得到14mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝779(M+H)+。
中间体F290
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，通过肽化学的经典方法由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸酯(1:1)。
然后，在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将12mg(25μmol)该中间体与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌去保护并通过HPLC纯化，得到7mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝762和764(M+H)+。
中间体F291
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
标题化合物是通过以下方法由实施例M9制备：首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去Z保护基团，然后通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联而将去保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝777(M+H)+。
中间体F293
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯甲酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将35mg(39μmol)中间体C74溶解于4ml DMF中，并在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，与13.5mg(43μmol)市售的1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶联。用氯化锌去保护并通过HPLC纯化，得到12mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝799(M+H)+。
中间体F294
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
在室温、氢标准压力下，将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中间体C76经10mg活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后，将催化剂滤出，并在减压下除去溶剂。得到32mg(理论值的92％)去保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于DMF中，并加入13mg(0.039mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮和7μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将残余物通过HPLC纯化。得到9mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝895(M+H)+。
中间体F295
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
在室温、氢标准压力下，将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中间体C76经10mg活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后，将催化剂滤出，并在减压下除去溶剂。得到32mg(理论值的92％)去保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于4ml DMF中，并加入10mg(0.039mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮和7μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌2h后，将反应物浓缩，并将残余物通过HPLC纯化。得到10mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝821(M+H)+。
中间体F296
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)磺酰基]乙基}丁酰胺(1:1)
标题化合物是通过以下方法由中间体L81制备：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与中间体C58偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下，在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化30min而除去Z保护基团。然后，通过以下方法将去保护的中间体转化成标题化合物：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，最后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝785(M+H)+。
中间体F297
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体1)
在氩气下，将15mg(0.11mmol)氯化锌加入到36mg(0.03mmol，纯度68％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C92)在0.74ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后加入32mg(0.11mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到6.4mg(理论值的25％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝792(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F298
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体2)
在氩气下，将19mg(0.14mmol)氯化锌加入到45mg(0.04mmol，71％纯的)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C91)在0.94ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入42mg(0.14mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到5.7mg(理论值的18％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝791(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F299
S-(2-{(3-氨基丙基)[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}-2-氧代乙基)-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
向88.0mg(0.09mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C84)在1.88ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入76.8mg(0.57mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入164.6mg(0.57mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到31mg(理论值的35％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.82min；MS(ESIpos):m/z＝792(M+H)+。
中间体F300
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺
在氩气下，向7mg(0.08mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸酯(中间体C100)在0.2ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入11mg(0.08mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入14mg(0.05mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到1.6mg(理论值的27％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F302
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸三氟乙酸酯(1:1)(异构体1)
在氩气下，向56.9mg(58.2mmol，纯度85％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸(中间体C94)在1.4ml 2,2,2-三氟乙醇中的混合物中加入31.7mg(0.23mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入68.0mg(0.23mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到7mg(理论值的13％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝736(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F304
N-(2-{[3-({2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]氨基}乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)三氟乙酸(异构体2)
将13.2mg(0.10mmol)氯化锌加入于0.64ml的2,2,2-三氟乙醇中的22.3mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体98)的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.36mg(0.10mmol)，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到5mg(理论值的24％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt 3.05min；MS(ESIpos):m/z＝819(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F305
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-N-(吡咯烷-3-基甲基)-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺/三氟乙酸(1:1)(异构体2)
向24.80mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,19-三氧代-12,15-二氮杂-5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C99)在0.65ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入13.42mg(0.10mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.78mg(0.10mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝3.11min；MS(ESIpos):m/z＝907(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F306
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
标题化合物是通过以下方法制备：在存在16.7mg(0.044mmol)HATU和15μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将24mg(0.029mmol)中间体C61与30mg(0.035mmol)中间体L99偶联，随后如对于中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型HPLC纯化，得到19mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝1091(M+H)+。
中间体F307
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{(5R,14R)-13-[(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸酯(1:1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1008(M+H)+。
将2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯(31.9mg，31.6μmol)和L-半胱氨酸(7.66mg，63.2μmol)溶解于3.0ml DMF中，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到28.1mg(理论值的76％)化合物S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法12):Rt＝2.52min；MS(ESIpos):m/z＝1049[M+H]+
将S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(13.5mg，11.6μmol)溶解于1.0ml DMF中，加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯(6.76mg，11.6μmol)(中间体L88)和N,N-二异丙基乙胺(4.0μl，23μmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.1mg(理论值的68％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法14):Rt＝7.38min；MS(ESIpos):m/z＝1412[M+H]+
将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸(9.40mg，6.65μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(5.44mg，39.9μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(5.44mg，39.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(23.4mg，79.8μmol)加入反应混合物中(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝1168(M+H)+。
中间体F308
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(12R,19R)-19-氨基-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-12,19-二羧基-5,10,15-三氧代-7,17-二硫杂-4,11,14-三氮杂十九烷-1-基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
将N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.7mg，14.5μmol)和N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(3.84mg，14.5μmol)溶解于1.5ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌过夜。
然后加入N,N-二异丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.40mg(理论值的48％)化合物S-{(5R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝949[M+H]+
将S-{(5R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(7.50mg，7.05μmol)溶解于1.0ml DMF中，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯(4.11mg，纯度82％，7.05μmol)(中间体L88)和N,N-二异丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.30mg(46％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂-7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法14):Rt＝6.47min；MS(ESIpos):m/z＝1312[M+H]+
将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂-7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺(4.00mg，3.05μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(2.49mg，18.3μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h，然后向其中加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(5.34mg，18.3μmol)，将混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.50mg(理论值的64％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.00min；MS(ESIpos):m/z＝1168[M+H]+
中间体F309
4-{[(11R,17R)-16-(3-氨基丙基)-17-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-18,18-二甲基-6,6-二氧化(dioxido)-2,10,15-三氧代-6λ6,13-二硫杂-3,9,16-三氮杂十九烷-11-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(50.0mg，57.3μmol)(中间体C77)和三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄酯(1:1)(27.5mg，68.7μmol)(中间体L81)加入到4.0mlDMF中，并加入HATU(26.1mg，68.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(30μl，170μmol)。将反应混合物在室温下搅拌10min，然后通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到53.9mg(81％)化合物4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}26,26-二甲基-7,7-二氧化-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ6,14-二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.54min；MS(ESIpos):m/z＝1141[M+H]+
在氩气下，首先将乙酸钯(II)(5.12mg，22.8μmol)加入到3.0ml DCM中，加入三乙胺(9.5μl，68μmol)和三乙基硅烷(73μl，460μmol)，并将混合物搅拌5min。然后加入在2.0mlDCM中的4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}26,26-二甲基-7,7-二氧化-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ6,14-二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(52.1mg，45.6μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入2.0ml水。在减压下蒸发溶剂。向残余物中加入乙腈，将混合物过滤并将产物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到43.4mg(85％)化合物三氟乙酸/4-{[(16R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丙酸叔丁酯(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝1007[M+H]+
首先将三氟乙酸/4-{[(16R)-23-氨基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(1:1)(20.0mg，17.8μmol)和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(3.32mg，21.4μmol)加入到2.0ml DMF中，并加入HATU(8.14mg，21.4μmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.3μl,54μmol)。
将反应混合物在室温下搅拌10min。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg(85％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝1144[M+H]+
将4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(15.9mg，13.9μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(73.2mg，250μmol)加入反应混合物(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.45min；MS(ESIpos):m/z＝944[M+H]+
中间体F310
三氟乙酸/N-[(8R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酰胺(1:1)
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(100mg，120μmol)(中间体C70)和1-[(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(44.1mg，132μmol)加入到3.0ml DMF中，并加入4-甲基吗啉(40μl，360μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用乙酸(420μmol)淬灭并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到69.4mg(理论值的62％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIneg):m/z＝933[M-H]-。
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸(27.0mg，28.9μmol)加入到2.0ml DMF中，并加入N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(11.4mg，57.7μmol)(中间体L1)、N,N-二异丙基乙胺(15μl，87μmol)和HATU(22.0mg，57.7μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.7mg(理论值的43％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸酯。
LC-MS(方法12):Rt＝2.54min；MS(ESIpos):m/z＝1114[M+H]+
将2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸酯(13.7mg，12.3μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(10.1mg，73.8μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.30mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝970[M+H]+
中间体F311
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(10.8mg，18.7μmol)(中间体L97)加入到1.0ml DMF中，加入N,N-二异丙基乙胺(5.4μl，31.2μmol)和HATU(7.10mg，18.7μmol)，并将混合物搅拌10min。然后加入溶解于1.0ml DMF和N,N-二异丙基乙胺(2.7μl，15.6μmol)中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.9mg，15.6μmol)(中间体C71)。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到3.5mg(18％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIneg):m/z＝1276[M-H]-
将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸(3.50mg，2.74μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(6.25mg，16.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(47μl，16μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.0mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1133(M+H)+。
中间体F312
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(L-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
标题化合物是通过以下方法由中间体C103制备：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去Z保护基团。然后通过以下方式将去保护的中间体转化成标题化合物：通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，最后用氯化锌去保护并通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝992(M+H)+。
中间体F313
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，将16.9mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和50.0mg(0.13mmol)HATU加入55.0mg(0.14mmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸在2.60ml DMF中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后，加入40.0mg(0.05mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C107)的溶液，并将混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的13％，纯度82％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝1145(M+H)+。
将4.3mg(0.03mmol)氯化锌加入10.9mg(7.8mmol，纯度82％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸在0.85ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入9.1mg(0.03mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到2.3mg(理论值的26％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt 0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F314
三氟乙酸/3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺
在氩气下，向50.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体106)在3.14ml DMF中的溶液中加入16.89mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入27.29mg(0.09mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺-三氟乙酸(1:1)(中间体L1)的溶液，并将混合物在室温下搅拌15分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到41mg(理论值的68％，纯度66％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.55min；MS(ESIneg):m/z＝959(M-H+Na)-。
向41.1mg(0.03mmol，纯度66％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯在2.54ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入24.7mg(0.18mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入53.0mg(0.18mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt 0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F315
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸
在氩气下，向50.0mg(0.07mmol)3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(中间体L100)在3.5ml DMF中的溶液中加入18.02mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺和31.82mg(0.09mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入50.0mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺乙酸盐(1:1)(中间体C107)的溶液，并将混合物在室温下搅拌2h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物不经纯化即进一步使用。得到49mg(理论值的21％，纯度31％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIpos):m/z＝1022(M+H)+。
向49.0mg(0.015mmol，纯度31％)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸在0.5ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入8.0mg(0.06mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入17.2mg(0.06mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到3mg(理论值的21％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝877(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F316
三氟乙酸/N-{2-[(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)氨基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
在氩气下，向50.0mg(0.04mmol，纯度65％)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体106)在3.0ml DMF中的溶液中加入16.89mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入37.2mg(0.09mmol，纯度70％)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺乙酸盐(1:1)(中间体L73)的溶液，并将混合物在室温下搅拌7分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物不经纯化即进一步使用。得到57mg(理论值的77％，纯度59％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.60min；MS(ESIpos):m/z＝981(M+H)+。
向56.0mg(0.03mmol，纯度59％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯在2.8ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入36.0mg(0.27mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入78.3mg(0.27mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到16mg(理论值的44％，纯度85％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝837(M+H-AcOH)+。
中间体F317
1-[(S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基)氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，将30.2mg(0.06mmol)N,N'-二[(苄氧基)羰基]-L-胱氨酸首先加入2.0ml水和2.0ml异丙醇中，并加入56.7mg(0.20mmol)TCEP。将反应混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于2.0ml异丙醇中的50.0mg(0.08mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C70)、和122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后加入另外的122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取并用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到43.1mg(理论值的64％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝851(M+H)+。
在氩气下，将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸(50.0mg，59μmol)溶解于1.0ml的DMF中，并加入N,N-二异丙基乙胺(20.5μl，117μmol)和HATU(26.8mg，70μmol)。将反应混合物搅拌10min。然后加入1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(22.6mg，70μmol)。将反应混合物搅拌1小时然后直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到59.3mg(理论值的87.5％)化合物1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法12):Rt＝2.97min；MS(ESIpos):m/z＝1154[M+H]+。
在氩气下，将乙酸钯(II)(6.74mg，30.0μmol)首先加入3.0ml二氯甲烷中，并加入三乙胺(13μl，90μmol)和三乙基硅烷(96μl，600μmol)。将反应混合物搅拌5min，然后加入于1.0ml二氯甲烷中的1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(69.3mg，60.0μmol)。将反应混合物在RT下搅拌2小时，然后加入三乙基硅烷(48μl，300μmol)。将反应混合物在RT下搅拌2小时，并加入2.0ml水(0.1％TFA)。将溶剂在减压下不经加热地蒸发。将残余物在乙腈中吸收，通过注射器式过滤器过滤并通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到65.9mg(理论值的97％)化合物三氟乙酸/1-{[S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.22min；MS(ESIpos):m/z＝1020[M+H]+。
在氩气下，将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(4.26mg，10.6μmol)首先加入1.0ml的DMF中，并加入N,N-二异丙基乙胺(3.2μl，18μmol)和HATU(4.02mg，10.6μmol)。将反应混合物搅拌10min，然后加入溶解于1.0ml的DMF中的三氟乙酸/1-{[S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(1:1)(10.0mg，8.82μmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.5μl，8.8μmol)。将反应混合物在RT下搅拌1小时并直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到10.9mg(理论值的93％)化合物1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝1404[M+H]+。
将1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(8.20mg，5.84μmol)溶解于2.0三氟乙醇中，并加入氯化锌(4.77mg，35.0μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1小时。
加入氯化锌(4.77mg，35.0μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(10.2mg，35.0μmol)，将反应混合物搅拌10min然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到4.1mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.90min；MS(ESIpos):m/z＝1204[M+H]+。
中间体F318
三氟乙酸/3-{[2-([3-氨基-4-氟丁基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)
将(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(124mg，350μmol)(中间体C52)首先加入5.0ml二氯甲烷中，并加入三乙酰氧基硼氢化钠(104mg，491μmol)和乙酸(23μl，400μmol)。将反应混合物在RT下搅拌5min，然后加入溶解于3.0ml二氯甲烷中的[1-氟-4-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯(82.7mg，403μmol)(中间体L123)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯。将混合物用饱和碳酸氢钠溶液然后用饱和氯化钠溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥然后浓缩。将残余物通过柱色谱在Biotage/Isolera(SNAP 25g)上使用流动相环己烷/乙酸乙酯95:5来纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到146mg(理论值的77％)化合物[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-氟丁烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法13):Rt＝2.57min；MS(ESIneg):m/z＝588[M+CHOOH-H]-。
将[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-氟丁烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg，184μmol)溶解于6.0ml的DCM中，并在0℃下加入三乙胺(85μl，610μmol)和氯乙酰氯(47μl，590μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发。将残余物在乙腈/水中吸收并通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到80mg(理论值的70％)化合物叔丁基-{4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-1-氟丁烷-2-yl}氨基甲酸酯。
LC-MS(方法12):Rt＝2.67min；MS(ESIneg):m/z＝664[M-H+COOH]-。
将{4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-1-氟丁烷-2-基}氨基甲酸叔丁酯(79.2mg，128μmol)和3-硫烷基丙酸(12μl，140μmol)及一滴水首先加入3.0ml甲醇中。加入碳酸钾(61.8mg，447μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙酸乙酯并将混合物用水反复洗涤。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥然后浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到68.6mg(理论值的78％)化合物9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(氟甲基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十五烷-15-酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.46min；MS(ESIneg):m/z＝688[M-H]-。
将9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(氟甲基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十五烷-15-酸(15.0mg，21.7μmol)和三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(8.12mg，26.1μmol)(中间体L1)首先加入1.6ml的DMF中。加入HATU(9.92mg，26.1μmol)和N,N-二异丙基乙胺(11μl，65μmol)并将反应混合物在RT下搅拌5min。加入水(0.1％TFA)并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到18.6mg(理论值的98％)化合物[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氟-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十七烷-16-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法12):Rt＝2.36min；MS(ESIpos):m/z＝869[M+H]+。
将[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氟-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十七烷-16-基]氨基甲酸叔丁酯(17.0mg，19.6μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中。加入氯化锌(16.0mg，117μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(16.0mg，117μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(68.6mg，234μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)并将混合物随后在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到10.7mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法14):Rt＝5.51min；MS(ESIpos):m/z＝769[M+H]+。
中间体F319
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-天冬氨酸
在氩气下，将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(9.80mg，9.88μmol)(中间体C116)和L-天冬氨酸二-叔丁酯盐酸盐(1:1)(3.34mg，11.9μmol)首先加入1.0ml的DMF中，并加入HATU(4.51mg，11.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min并直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到10.5mg(理论值的87％)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-天冬氨酸二-叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝1219[M+H]+。
将N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-天冬氨酸二-叔丁酯(9.70mg，7.95μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入氯化锌(6.50mg，47.7μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(6.50mg，47.7μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(27.9mg，55.4μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)并将混合物随后在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到4.10mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝1107[M+H]+。
中间体F320
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
在氩气下，将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(20.0mg，21.7μmol)(中间体C115)和L-谷氨酸二-叔丁酯盐酸盐(1:1)(7.71mg，26.1μmol)首先加入2.0ml的DMF中，并加入HATU(9.91mg，26.1μmol)和N,N-二异丙基乙胺(11μl，65μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min然后直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到16.4mg(理论值的65％)化合物(2S)-2-{[(13S,16S)-7-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-异丙基-13-甲基-6,12,15,18-四氧代-4-硫杂-7,11,14,17-四氮杂二十三烷-1-酰基]氨基}戊烷二酸二-叔丁基酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.40min；MS(ESIpos):m/z＝1162[M+H]+。
将(2S)-2-{[(13S,16S)-7-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-异丙基-13-甲基-6,12,15,18-四氧代-4-硫杂-7,11,14,17-四氮杂二十三烷-1-酰基]氨基}戊烷二酸二-叔丁基酯(14.7mg，12.6μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入氯化锌(10.3mg，75.9μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(10.3mg，75.9μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(44.4mg，152μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)并将混合物随后在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到6.0mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.10min；MS(ESIneg):m/z＝1048[M-H]-。
中间体F321
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-D-谷氨酸
在氩气下，将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(9.80mg，9.88μmol)(中间体C116)和D-谷氨酸二-叔丁酯盐酸盐(1:1)(3.51mg，11.9μmol)首先加入1.0ml的DMF中，并加入HATU(4.51mg，11.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min并直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到11.7mg(理论值的96％)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-D-谷氨酸二-叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1233[M+H]+。
将N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-D-谷氨酸二-叔丁酯(11.5mg，9.32μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入(7.62mg，55.9μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(7.62mg，55.9μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(32.6mg，112μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)并将混合物随后在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到6.5mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝1121[M+H]+。
中间体F322
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸
在氩气下，将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(9.80mg，9.88μmol)(中间体C116)和L-谷氨酸二-叔丁酯盐酸盐(1:1)(3.51mg，11.9μmol)首先加入1.0ml的DMF中，并加入HATU(4.51mg，11.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min并直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到11.3mg(理论值的93％)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二-叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1233[M+H]+。
将N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二-叔丁酯(11.0mg，8.92μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入氯化锌(7.29mg，53.5μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(7.29mg，53.5μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(31.2mg，107μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)并将混合物随后在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到5.10mg(理论值的51％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝1121[M+H]+。
中间体F323
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({[(3-{[(1R)-2-(L-β-天冬胺酰基氨基)-1-羧基乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(10.0mg，7.05μmol)(中间体C115)和N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯(4.02mg，8.46μmol)(中间体L124)首先加入2.0ml的DMF中，并加入HATU(3.22mg，8.46μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.7μl，21μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min并直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到4.3mg(理论值的32％)化合物(6S,11R,25S,28S)-19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-28-异丙基-2,2,25-三甲基-4,8,13,18,24,27,30-七氧代-3-氧杂-16-硫杂-5,9,12,19,23,26,29-七氮杂三十五烷-6,11-二甲酸6-叔丁基11-[2-(三甲基硅烷基)乙基]酯。
LC-MS(方法5):Rt＝5.32min；MS(ESIpos):m/z＝1379[M+H]+。
将(6S,11R,25S,28S)-19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-28-异丙基-2,2,25-三甲基-4,8,13,18,24,27,30-七氧代-3-氧杂-16-硫杂-5,9,12,19,23,26,29-七氮杂三十五烷-6,11-二羧酸6-叔丁基11-[2-(三甲基硅烷基)乙基]酯(4.10mg，73％纯的，2.17μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中。加入氯化锌(1.77mg，13.0μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再重复五次地，加入氯化锌(1.77mg，13.0μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸()22.0mg，78μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)并将混合物随后在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到2.1mg(理论值的69％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝1122[M+H]+
中间体F324
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[吡咯烷-3-基甲基]氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体1)
在氩气下，将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(99.6mg，247μmol)(中间体L74)首先加入1.4ml的DMF中，并加入HATU(90.4mg，238μmol)和N,N-二异丙基乙胺(41μl，240μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，并加入溶解于1.4ml的DMF中的S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(70.0mg，95.2μmol)(中间体C90)。将反应混合物在RT下搅拌过夜并直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在少量水中吸收并冻干。得到19.0mg(理论值的18.4％)化合物S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.29min；MS(ESIpos):m/z＝1082[M+H]+。
将S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸(17.0mg，15.7μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中。加入氯化锌(8.56mg，62.8μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(8.56mg，62.8μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌2小时。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(36.7mg，126μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)并将混合物随后在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到3.90mg(理论值的22％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝983[M+H]+。
中间体F325
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
将30mg(0.046mmol)中间体C58于29mg(0.055mmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-D-α-谷氨酸苄酯(1:1)在1.5当量HATU和3当量N,N-二异丙基乙胺的存在下偶联。通过制备型HPLC纯化得到39.5mg(理论值的82％)受保护的中间体。首先，通过氢解去除该中间体的苄基酯基团。随后的与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮在DMF中在3当量N,N-二异丙基乙胺存在下偶联并在三氟乙醇中用氯化锌去除Teoc保护基团(如对中间体F119所述)在2个进一步的步骤中得到标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝822(M+H)+。
中间体F326
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-(溴乙酰基)-D-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
将43mg(0.066mmol)中间体C58与57mg(0.077mmol)中间体L125在1.5当量HATU和4当量4-甲基吗啉的存在下偶联。通过制备型HPLC纯化得到27mg(理论值的34％)受保护的中间体。然后使用氯化锌在三氟乙醇中将其转化为标题化合物，如对中间体F119所述。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝805and 807(M+H)+。
B:制备抗体药物缀合物(ADC)
B-1.产生抗-CD123抗体的一般方法
通过CDR移植获得抗-CD123抗体。7G3抗体的序列(EP2426148)代表人源化抗体(例如TPP-5969和TPP-5971)的起点。基于12F1的双特异性的scFv免疫融合蛋白公开于WO2013/173820中。基于可变区(VH和VL)12F1的序列的公开(WO 2013/173820)，通过将供体免疫球蛋白(VH和VL)的可变结构域与人抗体的恒定区融合来获得以下抗体序列。产生12F1的嵌合变体。
人源化
通过将CDR转移至人抗体骨架中将7G3抗体的小鼠抗体序列人源化。对于根据Kabat的CDR的定义，参见Andre C.R.Martin,Antibody Engineering中的“Proteinsequence and structure analysis of antibody variable domains”(Springer LabManuals),编辑:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg。将小鼠框架序列(无CDR)与人种系序列对比后，选择相似的经常出现的人框架序列。在这种情况下，它是重链IGHV1-46-01与J序列IGHJ4-03和轻链IGKV4-1-01与J部分IGKJ2。种系序列来源于VBASE2数据库(Retter I,Althaus HH,Münch R,Müller W:VBASE2,an integrative Vgene database.Nucleic Acids Res.2005年1月,1；33(数据库期号):D671-4)。使用IMGT系统(Lefranc,M.-P.,Giudicelli,V.,Ginestoux,C.,Jabado-Michaloud,J.,Folch,G.,Bellahcene,F.,Wu,Y.,Gemrot,E.,Brochet,X.,Lane,J.,Regnier,L.,Ehrenmann,F.,Lefranc,G.和Duroux,P.the international ImMunoGeneTics informationNucl.Acids Res,37,D1006-D1012(2009)；doi:10.1093/nar/gkn838)命名序列。本文所述的抗体变体TPP-5968、TPP-5969和TPP-5971携带不同于人种系序列的多个点突变，这可能影响它们的性质。
B-2.用于在哺乳动物细胞中表达抗-CD123抗体的一般方法
抗体(例如TPP-6013和TPP-5969)是在哺乳动物细胞的瞬时培养物中产生，如Tomet al.,Chapter 12in Methods Express:Expression Systems edited by MichealR.Dyson and Yves Durocher，Scion Publishing Ltd,2007中所述。
B-3.用于从细胞上清液中纯化抗体的一般方法
抗体(例如TPP-6013和TPP-5969)是从细胞培养上清液中获得。通过对细胞进行离心而使细胞上清液澄清。通过对细胞进行离心而使细胞上清液澄清。然后通过在MabSelectSure(GE Healthcare)色谱柱上进行亲和色谱法而纯化细胞上清液。为此，将所述柱在DPBSpH 7.4(Sigma/Aldrich)中平衡，施加细胞上清液，并将所述柱用约10倍柱体积的DPBS pH7.4+500mM氯化钠洗涤。将抗体在50mM乙酸钠pH3.5+500mM氯化钠中洗脱，然后通过在Superdex 200柱(GE Healthcare)上在DPBS pH 7.4中进行凝胶过滤色谱法而进一步纯化。
此外，经BIAcore分析通过抗体与可溶性IL3Ralpha(获得自R&D Systems)的结合亲和力来表征抗体。为测定抗-CD123抗体的细胞结合特征，在CD123阳性癌细胞系(MOLM-13，THP-1)上通过流式细胞术测量结合力。
B-4.用于与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
在偶联反应中使用以下抗体：
抗-CD123AK1A(TPP-5969)
抗-CD123AK1B(TPP-5971)
抗-CD123AK1C(TPP-6013)
抗-CD123AK1D(TPP-5968)
偶联反应通常是在氩气下进行。
将溶解在PBS缓冲液中的2至5个当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)加入到浓度范围为1mg/ml至20mg/ml(优选约5mg/ml至15mg/ml)的适当抗体在PBS缓冲液中的溶液中，并将混合物在室温下搅拌1h。为此目的，可以以工作实施例中所述的浓度使用所使用的各个抗体的溶液，或者也可以任选地用PBS缓冲液稀释至所述起始浓度的约一半，以达到优选的浓度范围。随后，根据预期负载量，以在DMSO中的溶液的形式加入2至12个当量(优选约5-10个当量)的待偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物。在本文中，DMSO的量应不超过总体积的10％。在马来酰亚胺前体的情况下，将反应物在室温下搅拌60-240min，在卤化物前体的情况下，将反应物在室温下搅拌8至24h，然后将反应物施加到PBS平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)上并用PBS缓冲液洗脱。一般而言，除非另有说明，否则将5mg在PBS缓冲液中的所研究的抗体用于还原和随后的偶联。因此，在每种情况下，在PD10柱上的纯化提供各个ADC在3.5ml PBS缓冲液中的溶液。然后将样品通过超速离心浓缩，并任选用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好地除去低分子量组分，用PBS缓冲液再稀释后重复超滤浓缩。对于生物学试验，如果需要，最终ADC样品的浓度任选地通过再稀释调节至0.5-15mg/ml的范围。测定ADC溶液的各个蛋白质浓度，如工作实施例中所述。此外，使用B-7中所述的方法确定抗体负载量(药物/mAb比率)。
取决于接头，实施例中所示的ADC也可或多或少地以与抗体连接的水解的开链琥珀酰胺的形式存在。
特别地，通过以下接头结构与抗体的巯基连接的KSP-I-ADC也可以任选地通过以下方式以靶向方式制备：用经由开链琥珀酰胺连接的ADC根据方案26在偶联和搅拌后在pH8下重新缓冲约20-24h。
#1代表与抗体的硫桥，#2代表与修饰的KSP抑制剂的连接点
其中接头是通过水解的开链琥珀酰胺与抗体连接的此类ADC也可以任选地通过如下示例性方法以靶向方式制备：
小规模偶联：
将2至5当量溶解于PBS缓冲液中的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)加入于PBS缓冲液中的浓度范围为1mg/ml至20mg/ml(优选约5mg/ml至15mg/ml范围)的2-5mg所述抗体的溶液中，并将混合物在RT下搅拌30min至1h。为此，所用的相应抗体的溶液可以工作实施例中给定的浓度使用，或其还可任选地用PBS缓冲液稀释至约指定起始浓度的一半以达到优选的浓度范围。随后，取决于预期的载量(charging)，作为在DMSO中的溶液加入2至12当量(优选约5-10当量)的待偶联的马来酰亚胺前体化合物。在此，DMSO的量不应超过总体积的10％。将混合物在RT下搅拌60-240min，然后用pH已被提前调节为8的PBS缓冲液稀释至体积为3-7ml，并在氩气下在RT下搅拌过夜。将该溶液通过用pH为7.2的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)并用用pH为7.2的PBS缓冲液洗脱。随后将洗脱液通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)后稀释。
中规模偶联：
在氩气下，将0.344mg TCEP在100μl PBS缓冲液中的溶液加入到60mg的所研究的抗体在5ml PBS缓冲液中的溶液(c～12mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于600μl DMSO中的0.003mmol马来酰亚胺前体化合物。在室温下再搅拌1.5h-2h后，将反应物用1075μl预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD-10柱(G-25，GEHealthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗出液用PBS缓冲液pH 8稀释至总体积为14ml。将该溶液在室温和氩气下搅拌过夜。如果需要，然后将溶液重新缓冲至pH 7.2。将ADC溶液通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，然后任选地再次浓缩至浓度为约10mg/ml。
在工作实施例中，与抗体桥接的其他可能水解敏感的硫化环戊烷基琥珀酰亚胺(thianylsuccinimide)桥包含以下接头亚结构，其中#2代表与抗体键合的硫醚键，#2代表与修饰的KSP抑制剂的连接点：
这些接头亚结构代表与抗体连接的连接单元，并且(除了接头组合物之外)对肿瘤细胞中形成的代谢物的结构和特征具有显著影响。
在所示结构式中，AK1A、AK1B、AK1C和AK1D具有下列含义：
AK1A＝抗-CD123AK1A(TPP-5969)(部分还原)-S§1
AK1B＝抗-CD123AK1B(TPP-5971)(部分还原)-S§
AK1C＝抗-CD123AK1C(TPP-6013)(部分还原)-S§
AK1D＝抗-CD123AK1D(TPP-5968)(部分还原)-S§
其中
§1代表与琥珀酰亚胺基团或与任何异构的水解的开链琥珀酰胺或由其产生的亚烷基基团连接的键
并且
S代表部分还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-5.偶联至赖氨酸侧链的一般方法
以下抗体用于偶联反应：
抗-CD123AK1A(TPP-5969)
抗-CD123AK1B(TPP-5971)
抗-CD123AK1C(TPP-6013)
抗-CD123AK1D(TPP-5968)
偶联反应通常是在氩气下进行。
根据预期负载量，将2至8个当量待偶联的前体化合物以在DMSO中的溶液的形式加入到所研究的抗体在PBS缓冲液中的溶液中(所述溶液的浓度范围为1mg/ml至20mg/ml，优选为约10mg/ml)。在室温下搅拌30min至6h后，再次加入相同量的在DMSO中的前体化合物。在本文中，DMSO的量应不超过总体积的10％。在室温下再搅拌30min至6h后，将反应物施加到用PBS平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液洗脱。一般而言，除非另有说明，否则将5mg在PBS缓冲液中的所研究的抗体用于还原和随后的偶联。因此，在PD10柱上的纯化在每种情况下均提供各个ADC在3.5ml PBS缓冲液中的溶液。然后将样品通过超速离心浓缩，并任选地用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好地除去低分子量组分，用PBS缓冲液再稀释后重复超滤浓缩。对于生物学试验，如果需要，任选地通过再稀释将最终ADC样品的浓度调节至0.5-15mg/ml的范围。
测定ADC溶液的各个蛋白质浓度，如工作实施例中所述。此外，使用B-7中所述的方法确定抗体负载量(药物/mAb比率)。
在所示结构式中，AK2A、AK2B、AK2C和AK2D具有以下含义：
AK2A＝抗-CD123AK1A(TPP-5969)-NH§2
AK2B＝抗-CD123AK1B(TPP-5971)-NH§2
AK2C＝抗-CD123AK1C(TPP-6013)-NH§2
AK2D＝抗-CD123AK1D(TPP-5968)-NH§2
其中
§2代表与羰基连接的键
并且
NH代表抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-6a.用于制备闭链琥珀酰亚胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将10μmol上述马来酰亚胺前体化合物溶于3-5ml DMF中，并加入2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌2h至24h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。
B-6aa.用于制备异构的开链琥珀酰胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将68μmol上述马来酰亚胺前体化合物溶于15ml DMF中，并加入36mg(136μmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌约20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于15ml THF/水1:1中。加入131μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1h。然后用1M的盐酸中和反应物，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到理论值的约50％的区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
在最后一步中，将0.023mmol该区域异构的水解产物溶解于3ml2,2,2-三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到水解的开链硫烷基琥珀酰胺，其为区域异构体混合物形式。
本发明的缀合物的进一步纯化和表征
反应后，在一些情况下，将反应混合物(例如通过超滤)浓缩，然后脱盐并通过色谱法(例如使用G-25柱)纯化。(例如用磷酸盐缓冲盐水(PBS))进行洗脱。然后将所述溶液无菌过滤并冷冻。或者，可以将缀合物冻干。
B-7.确定抗体、毒性基团负载量和开链半胱氨酸加合物的比例
除了去糖基化和/或变性之后的分子量测定之外，对于蛋白质鉴定，也进行胰蛋白酶消化，其在变性、还原和衍生化后通过所发现的胰蛋白酶肽确认蛋白质的身份。
如下所述确定在工作实施例中所述的缀合物的所获得的PBS缓冲溶液的毒性基团负载量：
赖氨酸连接的ADC的毒性基团负载量的确定是通过用质谱确定单个缀合物种类的分子量而进行。在本文中，首先将抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，将样品酸化，并在HPLC分离/脱盐后，通过质谱法使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)进行分析。将在TIC(总离子色谱图)中的信号上的所有光谱加和，并且基于MaxEnt去卷积来计算不同缀合物种类的分子量。然后在对不同种类进行信号积分后计算DAR(＝药物/抗体比率)。
半胱氨酸连接的缀合物的毒性基团负载量是通过对还原和变性的ADC进行反相色谱法而确定。向ADC溶液(1mg/ml，50μl)中加入盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)。将混合物在55℃下孵育1小时并通过HPLC进行分析。
HPLC分析是在Agilent 1260HPLC系统上进行，在220nm处进行检测。使用PolymerLaboratories PLRP-S聚合物反相柱(目录号PL1912-3802)(2.1×150mm，粒度为8μm，)，流速为1ml/min，梯度如下：0min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。流动相A是由0.05％的三氟乙酸(TFA)的水溶液组成，流动相B是由0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液组成。
通过与非缀合抗体的轻链(L0)和重链(H0)的保留时间进行比较来指定检测到的峰。仅在缀合样品中检测到的峰指定为具有一个毒性基团的轻链(L1)和具有一个、两个和三个毒性基团的重链(H1、H2、H3)。
通过以HC负载量和LC负载量的二重和的方式积分而确定的峰面积来计算带有毒性基团的抗体的平均负载量，其中LC负载量是由所有LC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有LC峰的单独加权的积分结果之和来计算，并且其中HC负载量是由所有HC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有HC峰的单独加权的积分结果之和来计算。在个别情况下，由于某些峰的共洗脱，可能无法准确地确定毒性基团负载量。
在通过HPLC不能充分分离轻链和重链的情况下，半胱氨酸连接的缀合物的毒性基团负载量的确定是通过用质谱法确定轻链和重链上各个缀合物种类的分子量而进行。
向ADC溶液(1mg/ml，50μl)中加入盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)。将混合物在55℃下孵育1小时，并在在线脱盐后通过质谱法使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)进行分析。
对于DAR确定，将在TIC(总离子色谱图)中的信号上的所有光谱加和，并且基于MaxEnt去卷积来计算轻链和重链上不同缀合物种类的分子量。通过以HC负载量和LC负载量的二重和的方式积分而确定的峰面积计算带有毒性基团的抗体的平均负载量，其中LC负载量是由所有LC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有LC峰的单独加权的积分结果之和来计算，并且其中HC负载量是由所有HC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有HC峰的单独加权的积分结果之和来计算。
为了确定开链半胱氨酸加合物的比例，确定了所有单一缀合的轻链和重链变体的闭链与开链半胱氨酸加合物(分子量δ18道尔顿)的分子量面积比。所有变体的均值产生开链半胱氨酸加合物的比例。
B-8.检查ADC的抗原结合
偶联发生后，检查结合体与靶分子结合的能力。本领域技术人员熟悉可用于此目的的多种方法；例如，可以使用ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)来检查缀合物的亲和力。缀合物浓度可由本领域技术人员使用常规方法测量，例如对于抗体缀合物，通过蛋白质测量(还参见Doronina et al.；Nature Biotechnol.2003；21:778-784和Polson et al.,Blood 2007；1102:616-623)。
代谢物实施方案
实施例M1
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将1.8mg(2μmol)中间体F104溶于1ml DMF中，并加入2.7mg(22μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。剩下0.6mg(理论值的26％)标题化合物，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
实施例M2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将406mg(1.53mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于10ml DMF中，加入157.5mg(1.606mmol)马来酸酐，并将反应物在室温下搅拌1小时。向130μl该溶液中加入7.5mg(0.01mmol)中间体C66，并将反应物在室温下搅拌5min。然后将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10mg(89％)保护的中间体；既不能通过HPLC也不能通过LC-MS分离区域异构体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(EIpos):m/z＝1120[M+H]+。
在最后一步中，将10mg该中间体溶解于2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌30min。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到8.3mg(理论值的99％)标题化合物，其为比例为87:13的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.3min和2.43min；MS(ESIpos):m/z＝832(M+H)+。
1H-NMR主要区域异构体:(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.7(m,1H),8.5(m,2H),8.1(m,1H),7.6(m,1H),7.5(s,1H)7.4-7.15(m,6H),6.9-7.0(m,1H),6.85(s,1H),5.61(s,1H),4.9和5.2(2d,2H),4.26和4.06(2d,2H),3.5-3.8(m,5H),3.0-3.4(m,5H),2.75-3.0(m,3H),2.58和2.57(dd,1H),0.77和1,5(2m,2H),0.81(s,9H)。
或者，区域异构的标题化合物是如下制备：
为此，首先在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将55mg(0.068mmol)中间体F104和36mg(0.136mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于15ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌20h。然后将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于15ml THF/水1:1中。加入131μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1h。然后将反应物用1M的盐酸中和，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到37mg(理论值的50％)区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法5):Rt＝3.33min和3.36min；MS(ESIpos):m/z＝976(M+H)+。
在最后一步中，将25mg(0.023mmol)该中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到18.5mg(理论值的85％)标题化合物，其为比例为21:79的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.37min和3.44min；MS(ESIpos):m/z＝832(M+H)+。
实施例M3
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将11mg(0.013mmol)中间体F193和8mg(0.016mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于3ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌20h。然后将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。
合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于2ml THF/水1:1中。加入19μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1h。然后再加入19μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌过夜。然后将混合物用1M的盐酸中和，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到4.1mg(理论值的38％)区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min(breit)；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
在最后一步中，将4.1mg(0.004mmol)该中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入3mg(0.022mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌1h。然后加入6mg(0.022mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到5mg(定量)标题化合物，其为比例为20:80的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min(breit)；MS(ESIpos):m/z＝876(M+H)+。
LC-MS(方法5):Rt＝2.36min and 2.39min；MS(ESIpos):m/z＝876(M+H)+。
实施例M4
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙氧基]乙基}-2,5--二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将3mg(4μmol)中间体F248溶于2ml DMF中，并加入0.9mg(8μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌18h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，在将残余物从乙腈/水中冻干后，得到1.1mg(理论值的32％)标题化合物，其为白色固体形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(EIpos):m/z＝801[M+H]+。
实施例M5
(3R,7S)-7-氨基-17-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰基-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
和
(3R,7S)-7-氨基-18-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰基-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
将8mg(0.010mmol)中间体F248的保护的中间体和5.1mg(0.02mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于3ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌18h，然后在超声波浴中处理2h。然后浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于2ml THF/水1:1中。加入15μl2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌15min。然后将反应物用1M的盐酸调节至pH～3，用20ml氯化钠溶液稀释并用20ml乙酸乙酯萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到8.4mg(经两个步骤，理论值的78％)区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min和3.43min；MS(ESIpos):m/z＝1107(M+H)+。
在最后一步中，将8mg(0.007mmol)该中间体溶解于5ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入9.8mg(0.072mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌1.5h。然后加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到4mg(理论值的59％)标题化合物，其为比例为31:67的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min和0.81min；MS(ESIpos):m/z＝819(M+H)+。
实施例M6
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:2)和
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:2)
将18mg(0.021mmol)中间体F213和11.2mg(0.04mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(21.2mg)溶解于3ml THF/水1:1中。加入0.04ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌3小时。加入0.02ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1小时。然后使用7.2mg(0.12mmol)乙酸将反应物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13mg(经两个步骤，57％)区域异构的保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
在最后一步中，将13mg(0.01mmol)该中间体溶解于2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.2mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌7h。然后加入13.3mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到10.3mg(81.4％)标题化合物，其为区域异构体混合物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝875(M+H)+。
实施例M7
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将6mg(8μmol)中间体F119溶于3ml DMF中，并加入1.8mg(15μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌6h，然后使其在室温下静置3天。然后将反应物在减压下浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝717(M+H)+。
实施例M8
(3R)-6-{(11S,15R)-11-氨基-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-乙醇酰基-16,16-二甲基-2,5,10-三氧代-3,6,9,14-四氮杂十七烷-1-基}-5-氧代硫代吗啉-3-甲酸/三氟乙酸(1:1)
将4mg(0.004mmol)实施例135的化合物溶解于4ml THF/水中，并加入48μl 2M的氢氧化锂水溶液。将反应物在室温下搅拌1h，然后浓缩并通过制备型HPLC纯化。将适当的级分合并，浓缩并从乙腈/水中冻干，得到2.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
实施例M9
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
首先将150.0mg(0.42mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)溶解于2.0ml二氯甲烷中，加入29.2mg(0.49mmol)HOAc和125.6mg(0.59mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在室温下搅拌5min。加入98.9mg(0.49mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，将有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇100:1)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到188.6mg(74％)化合物2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮。
LC-MS(方法1):Rt＝1.00min；MS(ESIpos):m/z＝541[M+H]+。
首先将171.2mg(0.32mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮加入到5.0ml二氯甲烷中，并加入73.6mg(0.73mmol)三乙胺。在0℃下，加入94.9mg(0.70mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物使用Biotage Isolera纯化(硅胶，柱10g SNAP，流速12ml/min，乙酸乙酯/环己烷1:3)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到159.0mg(77％)化合物2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙基乙酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(ESIpos):m/z＝642[M+H]+。
首先将147.2mg(0.23mmol)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙基乙酸酯加入到4.0ml乙醇中，并加入356.2mg(4.59mmol)甲胺(40％，在水中)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物与甲苯一起共蒸馏三次。将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝10:1)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到67.4mg(63％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝470[M+H]+。
实施例M10
(2R,28R)-28-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-25-(羧基甲基)-4,20,24-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-26-硫杂-3,19,23-三氮杂二十九烷-1,29-二酸/三氟乙酸(1:2)和
(1R,28R,34R)-1-氨基-33-(3-氨基丙基)-34-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35,35-二甲基-6,10,26,32-四氧代-14,17,20,23-四氧杂-3,30-二硫杂-7,11,27,33-四氮杂三十六烷-1,4,28-三甲酸/三氟乙酸(1:2)
将20mg(0.018mmol)R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体F209)和9.78mg(0.036mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(47.7mg)溶解于3ml THF/水1:1中。加入0.08ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1小时。然后使用9.26mg(0.15mmol)乙酸将反应物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.3mg(经两个步骤，29％)区域异构的保护的中间体。
LC-MS(方法6):Rt＝12.26min和12.30min；MS(ESIpos):m/z＝1254(M+H)+。
在最后一步中，将15.3mg(0.01mmol)该中间体溶解于2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.1mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到11.9mg(79.5％)标题化合物，其为区域异构体混合物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝1110(M+H)+。
实施例M11
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:2)
将15.0mg(0.018mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入7.4mg(0.054mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入15.8mg(0,054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.1mg(77％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝573(M+H)+。
实施例M12
4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
将12.2mg(0.014mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(0.084mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(0.084mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.6mg(42％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
实施例M13
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1，差向异构体1(2R)或(2S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1:1)用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌18h后，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，将混合物在室温下再搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.74min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
将145mg该中间体通过超临界流体色谱法经由手性柱分离成单个非对映异构体(SFC；柱DAICEL，AD-H 5u 250x20mm；流速80ml/min；方法AD-25％ETOH-80ml；压力100bar；波长210nM)，得到63mg(43％)差向异构体1和58mg(40％)差向异构体2。
差向异构体1的特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.94min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.57(d,1H),4.24(m,1H),4.05(t,2H),3.67(t,1H),3.65(s,3H),3.62(s,3H),3.05(dd,1H),2.70-2.88(m,2H),2.59(dd,1H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
差向异构体2的特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.95min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.58(d,1H),4.16-4.23(m,1H),4.05(t,2H),3.67(dd,1H),3.65(s,3H),3.64(s,3H),3.04(dd,1H),2.88(dd,1H),2.77(dd,1H),2.61(dd,1H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将32.5mg(0.079mmol)差向异构体1与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml 2M的氢氧化锂溶液一起在11ml甲醇中在室温下搅拌20min，使两个甲酯基团均裂解。通过HPLC纯化得到12mg(理论值的31％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.74min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，将10mg(0.009mmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到2.6mg(理论值的30％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1，差向异构体2(2R或2S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
以与实施例M13所述类似的方式，使实施例M13中所述的中间体差向异构体2进行反应：
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将32.5mg(0.079mmol)差向异构体2与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml 2M的氢氧化锂溶液一起在11ml甲醇中在室温下搅拌20min，使得两个甲酯基团均裂解。通过HPLC纯化，得到11mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.74min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，将10mg(0.009mmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到4.4mg(理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M15
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2，差向异构体1(3R或3S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
将742.8mg(3.3mmol)市售的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于32ml DMF中，并加入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌20h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5):Rt＝3.13min；MS(ESIpos):m/z＝424(M+H)+。
将510mg该中间体通过超临界流体色谱法经由手性柱分离成单个非对映异构体(SFC；柱DAICEL，AD-H 5u 250x20mm；流速80ml/min；方法AD-10％ETOH-80ml；压力100bar；波长210nM)，得到100mg(20％)差向异构体1和141mg(28％)差向异构体2。
差向异构体1的特征如下：
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIneg):m/z＝422(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.60(d,1H),4.18-4.26(m,1H),4.01-4.08(m,4H),3.63(s,3H),3.59(dd,1H),3.04(dd,1H),2.92(dd,1H),2.80(dd,1H),2.63(dd,1H),1.17(t,3H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
差向异构体2的特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.95min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.56(d,1H),4.21-4.29(m,1H),4.01-4.1(m,4H),3.64(s,3H),3.58(dd,1H),3.08(dd,1H),2.85(dd,1H),2.78(dd,1H),2.60(dd,1H),1.17(t,3H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将33.6mg(0.079mmol)差向异构体1与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到51mg(理论值的63％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体与0.5ml 2M的氢氧化锂溶液一起在12ml THF/水1:1中在室温下搅拌30min，使两个甲酯基团均裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到11mg(理论值的24％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.68min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，将11mg(0.01mmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到3.7mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M16
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2，差向异构体2(3R或3S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
以与实施例M15所述类似的方式，使实施例M15中所述的中间体差向异构体2进行反应：
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将33.6mg(0.079mmol)差向异构体2与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到51mg(理论值的63％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体与0.5ml 2M的氢氧化锂溶液一起在12ml THF/水1:1中在室温下搅拌30min，使两个甲酯基团均裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到13.4mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.66min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，将13.4mg(0.012mmol)该中间体如上所述在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到7.5mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M17
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酸盐酸盐(1:1)
将150mg(0.2mmol)中间体C53溶解于15ml DMF中，并加入2.29g(20.39mmol)DABCO。将反应物在超声波浴中处理30min。然后通过加入1.17ml乙酸，将反应物调节至pH3-4，并将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，并将适当的级分在室温、减压下浓缩。将残余物溶于乙腈/水1:1中，加入5ml 4N的盐酸，然后将混合物冻干。得到81mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.69min；MS(EIpos):m/z＝514[M+H]+。
实施例M18
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
首先，使用肽化学的经典方法制备三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-L-谷氨酸苄酯(1:1)。然后在存在HATU的情况下，将该中间体与中间体C58偶联。随后，首先通过氢解裂解除去苄氧基羰基保护基团和苄基酯，然后使用氯化锌除去2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基团。
LC-MS(方法6):Rt＝1.91min；MS(EIpos):m/z＝685[M+H]+。
实施例M19
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，使用肽化学中已知的经典保护基团操作制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸酯(1:1)。然后在存在HATU的情况下，将该中间体与中间体C61偶联。随后，首先使用氯化锌裂解2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基团和2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯。最后，通过氢解裂解苄氧基羰基保护基团并通过制备型HPLC纯化来获得标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.65min；
实施例M20
(1R,4R,27R,33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧杂-3,29-二硫杂-7,10,26,32-四氮杂三十五烷-1,4,27-三甲酸/三氟乙酸(1:2)
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1:1)用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌18h后，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将混合物在室温下再搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.74min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
在存在3.66mg(8.93μmol)HATU和1.6μl(15μmol)4-甲基吗啉的情况下，将3.66mg(8.93μmol)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸与13.0mg(7.44μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C80)偶联，HPLC纯化后，得到3.9mg(理论值的37％)完全保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11R)-8,11-双(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,13-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将3.90mg(2.76μmol)该中间体与35μl 2M的氢氧化锂溶液一起在1.0ml THF/水3:1中在室温下搅拌15min，使两个甲酯基团均裂解。通过HPLC纯化得到3.60mg(理论值的94％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.83min；MS(ESIpos):m/z＝1385[M+H]+。
最后，如上所述，将3.6mg(2.6μmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到1.92mg(理论值的55％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝1094[M-H]-。
实施例M21
(2R,24S,27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧基甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-25-硫杂-3,19,22-三氮杂二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1:2)
将742.8mg(3.3mmol)市售的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于32ml DMF中，并加入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌20h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5):Rt＝3.13min；MS(ESIpos):m/z＝424(M+H)+。
在存在3.92mg(10.3μmol)HATU和1.9μl(17μmol)4-甲基吗啉的情况下，将4.36mg(10.3μmol)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸与15.0mg(8.59μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C80)偶联，HPLC纯化后，得到3.6mg(理论值的26％)完全保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11S)-11-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-8-(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十二烷-12-基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将6.20mg(2.82μmol)该中间体与35μl 2M的氢氧化锂溶液一起在1.0ml THF/水1:1中在室温下搅拌15min，使得两个酯基团均裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到3.60mg(理论值的92％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.71min；MS(ESIpos):m/z＝1385[M+H]+。
最后，如上所述，将3.60mg(1.69μmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到0.88mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝1094[M-H]-。
实施例M22
(2R,27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧基甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-25-硫杂-3,19,22-三氮杂二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1:2)和
(1R,27R,33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧杂-3,29-二硫杂-7,10,26,32-四氮杂三十五烷-1,4,27-三甲酸/三氟乙酸(1:2)
将16.5mg(0.015mmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体F257)和8.18mg(0.031mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(28.9mg)溶解于3ml THF/水1:1中。加入0.046ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将混合物在室温下搅拌3小时。然后使用5.2μl(0.092mmol)乙酸将混合物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到12.1mg(经两个步骤，58％)区域异构的保护的中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.82min；MS(ESIpos):m/z＝1240(M+H)+。
在最后一步中，将12.1mg(0.009mmol)该中间体溶解于2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入7.3mg(0.054mmol)氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌2h。然后加入15.7mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将溶剂通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到6.4mg(59％)标题化合物，其为区域异构体混合物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝1096(M+H)+。
实施例M23
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-谷氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1:1)与中间体C61偶联。然后将保护的中间体溶于三氟乙醇中，并通过在存在氯化锌的情况下在50℃下搅拌过夜而完全去保护。在加入EDTA后，通过用制备型HPLC纯化而进行后处理。
LC-MS(方法12):Rt＝1.45min；MS(ESIpos):m/z＝714[M+H]+。
实施例M24
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-D-谷氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将D-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1:1)与中间体C61偶联。然后将保护的中间体溶于三氟乙醇中，并通过在存在氯化锌的情况下在50℃下搅拌而完全去保护。加入EDTA后，通过用制备型HPLC纯化而进行后处理。
LC-MS(方法12):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝714[M+H]+。
实施例M25
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-谷氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1:1)与中间体C61偶联。在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化45分钟而除去Z保护基团。然后将部分保护的中间体溶于三氟乙醇中，并通过在存在氯化锌的情况下在50℃下搅拌7小时而完全去保护。加入EDTA后，通过用制备型HPLC纯化而进行后处理。
LC-MS(方法12):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝643[M+H]+。
实施例M26
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1，差向异构体的混合物
该实施例描述了实施例13和实施例14的化合物的差向异构体混合物。所述合成是以与实施例13类似的方式进行，其中省去了通过超临界流体色谱法分离两种差向异构体，并制备了标题化合物，其为差向异构体混合物形式。
LC-MS(方法5):Rt＝2.43min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2，差向异构体的混合物
该实施例描述了实施例15和实施例16的化合物的差向异构体混合物。所述合成是以与实施例15类似的方式进行，其中省去通过超临界流体色谱分离两种差向异构体，并制备了标题化合物，其为差向异构体混合物形式。
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
工作实施例ADC
取决于接头和偶联方法，工作实施例的结构式中所示的ADC(其通过马来酰亚胺基团与抗体的半胱氨酸侧链偶联)主要以在每种情况下所示的开环或闭环形式存在。然而，制品可以包含小部分相应的其他形式。
实施例194m1
此处，将于500μl的PBS(c＝10mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)用于与中间体F194偶联。首先，加入溶解于100μl的DMSO中的5当量中间体F194，在RT下搅拌1h后再加入相同量的中间体F194并将反应在RT下搅拌另外的1小时。随后将反应在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.28mg/ml
药物/mAb比例：3.3
实施例194m2
此处，将于500μl的PBS(c＝10mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)用于与中间体F194偶联。首先，加入溶解于100μl的DMSO中的5当量中间体F194，在RT下搅拌1h后，再加入相同量的中间体F194并将反应在RT下搅拌另外的1小时。随后将反应在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.18mg/ml
药物/mAb比例：3.2
实施例194m3
此处，将于500μl的PBS(c＝10mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)用于与中间体F194偶联。首先，加入溶解于100μl的DMSO中的5当量中间体F194，在RT下搅拌1h后，再加入相同量的中间体F194并将反应在RT下搅拌另外的小时。随后将反应在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：0.42mg/ml
药物/mAb比例：2.9
实施例208m1
在氩气下，将于10μl的PBS缓冲液中的0.006mg的TCEP的溶液加入于93μl的PBS(c＝10.2mg/ml)中的1mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于10μl的DMSO中的0.043mg(0.053μmol)中间体F104。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的2387μl的PBS缓冲液稀释。
将该溶液施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液用PH为8的PBS缓冲液稀释至总体积为15ml。将该溶液在氩气下在RT下搅拌过夜然后使用PD-10柱重新缓冲至pH为7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：0.54mg/ml
药物/mAb比例：2.5
实施例208m1(TV)
在氩气下，将于0.83ml的PBS缓冲液中的1.4mg的TCEP的溶液加入于21.7ml的PBS(c＝11.5mg/ml)中的250mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于2500μl的DMSO中的10.76mg(0.0133mmol)中间体F104。在RT下搅拌另外的90min后，将反应使用PD-10柱重新缓冲至pH为8。然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将反应用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2，并将洗脱液用PBS稀释至总体积为125ml。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液重新稀释(pH 7.2)并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：9.79mg/ml
药物/mAb比例：2.9
实施例208m2
在氩气下，将于0.05ml的PBS缓冲液中的0.287mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.215mg(0.000267mmol)中间体F104。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液用PH为8的PBS缓冲液稀释至总体积为15ml。将该溶液在氩气下在RT下搅拌过夜然后使用PD-10柱重新缓冲至pH为7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.76mg/ml
药物/mAb比例：2.8
实施例208m3
在氩气下，将于0.05ml的PBS缓冲液中的0.29mg的TCEP的溶液中加入于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.215mg(0.000267mmol)中间体F104。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液用PH为8的PBS缓冲液稀释至总体积为15ml。将该溶液在氩气下在RT下搅拌过夜然后使用PD-10柱重新缓冲至pH为7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.99mg/ml
药物/mAb比例：2.9
实施例208m3(TV)
在氩气下，将于0.83ml的PBS缓冲液中的1.4mg的TCEP的溶液加入于21.7ml的PBS(c＝11.5mg/ml)中的250mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于2500μl的DMSO中的10.76mg(0.0133mmol)中间体F104。在RT下搅拌另外的90min后，使用PD-10柱将反应重新缓冲至pH为8。
然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将反应用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2并将洗脱液用PBS稀释至总体积为125ml。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液重新稀释(pH 7.2)并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：11.06mg/ml
药物/mAb比例：3.4
对于该ADC制备，86.1％的比率被确定为开环的琥珀酰胺形式。
实施例208m4
在氩气下，将于0.05ml的PBS缓冲液中的0.29mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1D(TPP-5968)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.215mg(0.000267mmol)中间体F104。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液用PH为8的PBS缓冲液稀释至总体积为15ml。将该溶液在氩气下在RT下搅拌过夜然后使用PD-10柱重新缓冲至pH为7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.41mg/ml
药物/mAb比例：3.8
实施例240m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于366μl的PBS(c＝13.66mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应用pH已被提前调节为8的1984μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.199mg(0.00023mmol)中间体F240。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.84mg/ml
药物/mAb比例：2.7
实施例240m2
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于337μl的PBS(c＝14.85mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中。将反应用pH已被提前调节为8的2013μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.199mg(0.00023mmol)中间体F240。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.74mg/ml
药物/mAb比例：2.7
实施例240m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于371μl的PBS(c＝13.49mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应用pH已被提前调节为8的1979μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.199mg(0.00023mmol)中间体F240。在RT下搅拌另外的90min后，将该反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.58mg/ml
药物/mAb比例：2.3
对于该ADC制备，92.9％的比率被确定为开环的琥珀酰胺形式。
实施例257m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于366μl的PBS(c＝13.66mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应用pH已被提前调节为8的1984μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.290mg(0.00023mmol)中间体F257。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.78mg/ml
药物/mAb比例：3.2
实施例257m1(TV)
在氩气下，将于0.83ml的PBS缓冲液中的1.4mg的TCEP的溶液加入于21.7ml的PBS(c＝11.5mg/ml)中的250mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应在RT下搅拌30min然后加入溶解于2500μl的DMSO中的8.92mg(0.0083mmol)中间体F257。在RT下搅拌另外的90min后，使用PD-10柱将反应重新缓冲至pH为8。然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将反应用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2并将洗脱液用PBS稀释至总体积为125ml。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液重新稀释(pH 7.2)并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：11.27mg/ml
药物/mAb比例：3.6
实施例257m2
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于337μl的PBS(c＝14.85mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中。将反应用pH已被提前调节为8的2013μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.290mg(0.00023mmol)中间体F257。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比例：3.1
实施例257m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于371μl的PBS(c＝13.49mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应用pH已被提前调节为8的1979μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.290mg(0.00023mmol)中间体F257。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.59mg/ml
药物/mAb比例：2.4
实施例257m3(TV)
在氩气下，将于0.83ml的PBS缓冲液中的1.4mg的TCEP的溶液加入于21.7ml的PBS(c＝11.5mg/ml)中的250mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应在RT下搅拌30min然后加入溶解于2500μl的DMSO中的8.93mg(0.0083mmol)中间体F257。在RT下搅拌另外的90min后，使用PD-10柱将反应重新缓冲至pH为8。然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将反应用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2并将洗脱液用PBS稀释至总体积为125ml。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液重新稀释(pH 7.2)并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：13.36mg/ml
药物/mAb比例：3.3
对于该ADC制备，78.7％的比率被确定为开环的琥珀酰胺形式。
实施例259m1
此处，将于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)用于与中间体F259偶联。抗体的还原时间为30min，加入0.245mg(0.267μmol)F259后，将反应在RT下搅拌20h然后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.70mg/ml
药物/mAb比例：1.7
实施例259m2
此处，将于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)用于与中间体F259偶联。抗体的还原时间为30min，加入0.245mg(0.267μmol)F259后，将反应在RT下搅拌20h然后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.72mg/ml
药物/mAb比例：1.8
实施例259m3
此处，将于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)用于与中间体F259偶联。抗体的还原时间为30min，加入0.245mg(0.267μmol)F259后，将反应在RT下搅拌20h然后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.57mg/ml
药物/mAb比例：2.0
实施例260m1
实施例260m1(TV)
在氩气下，将于0.83ml的PBS缓冲液中的1.4mg的TCEP的溶液加入于21.7ml的PBS(c＝11.5mg/ml)中的250mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于2500μl的DMSO中的15.1mg(0.0133mmol)中间体F260。在RT下搅拌另外的90min后，使用PD-10柱将反应重新缓冲至pH为8。然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将反应用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2并将洗脱液用PBS稀释至总体积为125ml。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液重新稀释(pH 7.2)并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：9.47mg/ml
药物/mAb比例：3.0
实施例260m2
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.302mg(0.00027mmol)中间体F260。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.62mg/ml
药物/mAb比例：3.5
实施例260m3(TV)
在氩气下，将于0.83ml的PBS缓冲液中的1.4mg的TCEP的溶液加入于21.7ml的PBS(c＝11.5mg/ml)中的250mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于2500μl的DMSO中的15.1mg(0.0133mmol)中间体F260。在RT下搅拌另外的90min后，使用PD-10柱将反应重新缓冲至pH为8。然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将反应用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2并将洗脱液用PBS稀释至总体积为125ml。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液重新稀释(pH 7.2)并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：12.08mg/ml
药物/mAb比例：2.8
对于该ADC制备，84.5％的比率被确定为开环的琥珀酰胺形式。
实施例270m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于366μl的PBS(c＝13.66mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应用pH已被提前调节为8的1984μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.188mg(0.00023mmol)中间体F270。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.71mg/ml
药物/mAb比例：2.7
实施例270m2
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于337μl的PBS(c＝14.85mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中。将反应用pH已被提前调节为8的2013μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.188mg(0.00023mmol)中间体F270。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.65mg/ml
药物/mAb比例：2.9
实施例270m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于371μl的PBS(c＝13.49mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应用pH已被提前调节为8的1979μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.188mg(0.00023mmol)中间体F270。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.51mg/ml
药物/mAb比例：2.4
对于该ADC制备，94.4％的比率被确定为开环的琥珀酰胺形式。
实施例271m1
在氩气下，将于0.30ml的PBS缓冲液中的0.172mg的TCEP的溶液加入于3.0ml的PBS(c＝10.0mg/ml)中的30mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于300μl的DMSO中的1.14mg(0.001mmol)中间体F271。在RT下搅拌另外的90min后，使用PD-10柱将混合物重新缓冲至pH为8。然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将混合物用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2并将洗脱液用PBS稀释至总体积为14ml。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液重新稀释(pH 7.2)并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：11.82mg/ml
药物/mAb比例：3.1
实施例271m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.267mg(0.00023mmol)中间体F271。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.33mg/ml
药物/mAb比例：4.2
实施例274m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于366μl的PBS(c＝13.66mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应用pH已被提前调节为8的1984μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.232mg(0.00023mmol)中间体F274。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.92mg/ml
药物/mAb比例：3.2
实施例274m2
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于337μl的PBS(c＝14.85mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中。将反应用pH已被提前调节为8的2013μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.232mg(0.00023mmol)中间体F274。在RT下搅拌另外的90min后，将反应施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.84mg/ml
药物/mAb比例：3.2
实施例274m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于371μl的PBS(c＝13.49mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应用pH已被提前调节为8的1979μl的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl的DMSO中的0.232mg(0.00023mmol)中间体F274。在RT下再搅拌90min后，将反应物加到已用PBS缓冲液pH8平衡的PD 10柱(G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC也可以闭环形式存在。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.69mg/ml
药物/mAb比例：3.0
对于该ADC制备，89.5％的比率被确定为开环的琥珀酰胺形式。
实施例276m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.229mg(0.00023mmol)中间体F276。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于用PH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.26mg/ml
药物/mAb比例：3.8
实施例276m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.229mg(0.00023mmol)中间体F276。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于用PH为8的PBS缓冲液平衡并用PH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.39mg/ml
药物/mAb比例：4.0
实施例281m3
此处，将于500μl的PBS中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)用于在pH 7.2(c＝10mg/ml)下与中间体F281偶联。在0.029mg的TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。然后，在加入0.25mg(0.27μmol)F281后，将混合物在50μl的DMSO中在RT下搅拌20h随后在Sephadex上纯化。最后，将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.42mg/ml
药物/mAb比例：3.8
实施例284m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.256mg(0.00023mmol)中间体F284。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.78mg/ml
药物/mAb比例：2.7
实施例284m2
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.256mg(0.000233mmol)中间体F284。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.83mg/ml
药物/mAb比例：3.3
实施例284m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于510μl的PBS(c＝9.8mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.26mg(0.23μmol)中间体F284。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用PH为8的PBS缓冲液补足至2.5ml并通过用pH为8的PBS缓冲液平衡、用PH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)然后在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比例：2.2
实施例296m1
在氩气下，将于0.25ml的PBS缓冲液中的0.14mg的TCEP的溶液加入于2.5ml的PBS(c＝10mg/ml)中的25mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将反应在RT下搅拌30min然后加入溶解于250μl的DMSO中的1.05mg(0.0012mmol)中间体F296。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用2ml pH被调节至8的PBS缓冲液稀释，并将反应在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将反应用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2。然后将混合物通过超速离心来浓缩、用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：7.66mg/ml
药物/mAb比例：2.8
实施例296m2
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于500μl的PBS(c＝10mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.21mg(0.23μmol)中间体F296。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用PH为8的PBS缓冲液补足至2.5ml并通过用PH为8的PBS缓冲液平衡、用PH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.7mg/ml
药物/mAb比例：2.8
实施例296m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于500μl的PBS(c＝10mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.21mg(0.23μmol)中间体F296。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用PH为8的PBS缓冲液补足至2.5ml并通过用PH为8的PBS缓冲液平衡、用PH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.51mg/ml
药物/mAb比例：2.1
实施例297m1
此处，将于427μl的PBS中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)在pH 7.2(c＝13.66mg/ml)下用于与中间体F297偶联。在0.029mg的TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。加入于50μl的DMSO中的0.23mg(0.26μmol)F297后，然后将反应在RT下搅拌2h随后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.81mg/ml
药物/mAb比例：2.5
实施例297m2
此处，将于427μl的PBS中的5mg抗-CD123AK1B(TPP-5971)在pH 7.2(c＝14.85mg/ml)下用于与中间体F297偶联。在0.029mg的TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。加入于50μl的DMSO中的0.23mg(0.26μmol)F297后，然后将反应在RT下搅拌2h随后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.64mg/ml
药物/mAb比例：2.4
实施例297m3
此处，将于427μl的PBS中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)在pH 7.2(c＝13.49mg/ml)下用于与中间体F297偶联。在0.029mg的TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。加入于50μl的DMSO中的0.23mg(0.26μmol)F297后，然后将反应在RT下搅拌2h随后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.81mg/ml
药物/mAb比例：2.1
实施例309m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.247mg(0.00023mmol)中间体F309。在RT下搅拌另外的90min后，将反应用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：0.77mg/ml
药物/mAb比例：4.1
实施例309m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.247mg(0.00023mmol)中间体F309。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.15mg/ml
药物/mAb比例：4.2
实施例310m1
在氩气下，将于0.30ml的PBS缓冲液中的0.172mg的TCEP的溶液加入于3.0ml的PBS(c＝10.0mg/ml)中的30mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于300μl的DMSO中的1.08mg(0.001mmol)中间体F310。在RT下搅拌另外的90min后，使用PD-10柱将混合物重新缓冲至pH为8。然后将合并的洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱将混合物用PBS缓冲液重新缓冲至pH为7.2并将洗脱液用PBS稀释至总体积为14ml。然后将混合物通过超速离心来浓缩、用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：13.04mg/ml
药物/mAb比例：3.0
实施例310m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.253mg(0.00023mmol)中间体F310。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.84mg/ml
药物/mAb比例：4.4
实施例314m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.209mg(0.00023mmol)中间体F314。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.42mg/ml
药物/mAb比例：4.0
实施例314m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.209mg(0.00023mmol)中间体F314。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.29mg/ml
药物/mAb比例：4.3
实施例317m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.308mg(0.00023mmol)中间体F317。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.59mg/ml
药物/mAb比例：2.5
实施例317m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将反应在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.308mg(0.00023mmol)中间体F317。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.61mg/ml
药物/mAb比例：2.7
实施例318m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.206mg(0.00023mmol)中间体F318。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.39mg/ml
药物/mAb比例：5.2
实施例318m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.206mg(0.00023mmol)中间体F318。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用pH已被提前调节为8的1950μl的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上，将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.46mg/ml
药物/mAb比例：4.0
实施例319m1
在氩气下，将于0.25ml的PBS缓冲液中的0.143mg的TCEP的溶液加入于2.5ml的PBS(c＝10.0mg/ml)中的25mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于250μl的DMSO中的0.923mg(0.00083mmol)中间体F319。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用2ml的PBS缓冲液稀释。
然后将混合物在PD-10柱上纯化并将洗脱液用PBS稀释至总体积为14ml。随后，将混合物通过超速离心来浓缩，用PBS缓冲液重新稀释并再次浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：12.79mg/ml
药物/mAb比例：3.9
实施例320m1
此处，将于374μl的PBS中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969在pH7.2(c＝13.36mg/ml)下用于与中间体F320偶联。在0.029mg的TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。加入于100μl的DMSO中的0.245mg(0.23μmol)F320后，然后将混合物在RT下搅拌90min随后在Sephadex上纯化。然后将混合物通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.84mg/ml
药物/mAb比例：1.8
实施例321m1
此处，将于374μl的PBS中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)在pH7.2(c＝13.36mg/ml)下用于与中间体F321偶联。在0.029mg的TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。加入于100μl的DMSO中的0.262mg(0.23μmol)F321后，然后将混合物在RT下搅拌90min随后在Sephadex上纯化。然后将混合物通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.93mg/ml
药物/mAb比例：1.9
实施例322m1
此处，将于374μl的PBS中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)在pH7.2(c＝13.36mg/ml)下用于与中间体F322偶联。在0.029mg的TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。加入于100μl的DMSO中的0.262mg(0.23μmol)F322后，然后将混合物在RT下搅拌90min随后在Sephadex上纯化。然后将混合物通过超速离心来浓缩并用PBS重新稀释。
蛋白质浓度：1.88mg/ml
药物/mAb比例：1.8
实施例323m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.328mg(0.00023mmol)中间体F323。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用1950μl的PBS缓冲液稀释然后在PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上纯化。然后将混合物通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：2.03mg/ml
药物/mAb比例：2.9
实施例323m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.328mg(0.00023mmol)中间体F323。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用1950μl的PBS缓冲液稀释然后在PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上纯化。然后将混合物通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：2.06mg/ml
药物/mAb比例：4.2
实施例324m1
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1A(TPP-5969)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.256mg(0.00023mmol)中间体F324。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用1950μl的pH已被提前调节为8的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.48mg/ml
药物/mAb比例：3.1
实施例324m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于450μl的PBS(c＝11.11mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.256mg(0.00023mmol)中间体F324。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用1950μl的pH已被提前调节为8的PBS缓冲液稀释，然后施加于已经用pH为8的PBS缓冲液平衡并用pH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜然后通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。在这些条件下，一些ADC可能也以闭环的形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.42mg/ml
药物/mAb比例：4.4
实施例325m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于0.400ml的PBS(c＝12.5mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.22mg(0.00023mmol)中间体F325。在RT下搅拌另外的90min后，将混合物用PH为8的PBS缓冲液补足至2.5ml并施加于用pH为的PBS缓冲液平衡、用PH为8的PBS缓冲液洗脱的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.87mg/ml
药物/mAb比例：4.1
实施例326m3
在氩气下，将于50μl的PBS缓冲液中的0.029mg的TCEP的溶液加入于0.400ml的PBS(c＝12.5mg/ml)中的5mg抗-CD123AK1C(TPP-6013)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl的DMSO中的0.22mg(0.00023mmol)中间体F326。然后将混合物在氩气下在RT下搅拌过夜，然后用PBS缓冲液(pH 7.2)补足至2.5，并施加于用pH为7.2的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上。然后将混合物通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)重新稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.33mg/ml
药物/mAb比例：6.0
C:生物效力的评估
可以在下述检测中显示本发明的化合物的生物活性：
C-1a针对CD123的ADC的细胞毒性作用的测定
用多种细胞系进行抗-CD123的ADC的细胞毒性作用的分析：
NCI-H292：人粘液表皮样肺癌细胞，ATCC-CRL-1848，标准培养基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，稳定化的(stab.)谷氨酰胺)+10％FCS(Biochrom；#S0415)。
MOLM-13：人急性单核细胞白血病细胞(AML-M5a)，DSMZ，编号ACC 554，标准培养基：RPMI 1640(Gibco；#21875-059，稳定化的L-谷氨酰胺)+20％高温灭活的FCS(Gibco，编号10500-064)；CD123-阳性。
THP-1：人单核细胞白血病细胞，ATCC，编号TIB-202，标准培养基：RPMI 1640(Gibco；#21875--059，稳定化的L-谷氨酰胺)+10％高温灭活的FCS(Gibco，编号10500-064)+2.5g葡萄糖(20％葡萄糖溶液，Gibco，编号19002)；CD123-阳性。
KG-1：获得自骨髓的人急性骨髓白血病细胞，DSMZ，编号ACC 14，标准培养基：RPMI1640(Gibco；#21875-059，稳定化的L-谷氨酰胺)+10％高温灭活的FCS(Gibco，编号10500-064)+2.5g葡萄糖(20％葡萄糖溶液，Gibco，编号19002)；CD123-阳性。
细胞通过如American Tissue Culture Collection(ATCC)或Leibniz-InstitutDSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)对所述细胞系所示的标准方法进行培养。
MTT检测
根据标准方法使用C-1中所列的生长培养基培养细胞。通过用于PBS中的Accutase的溶液(Biochrom AG#L2143)将细胞分离、造粒、再悬浮在培养基中、计数并接种到白底96孔培养板(Costar#3610)中(在100μl的总体积中，NCI H292：2500个细胞/孔；MOLM-13：2000个细胞/孔；THP-1：8000个细胞/孔；KG-1：5000个细胞/孔)进行试验。然后将细胞在培养器中在37℃和5％二氧化碳下培养。48小时后更换培养基。然后将10μl培养基中浓度为10-5M至10-13M的抗体药物缀合物或代谢物吸移至细胞中(一式三份)，然后将测定物在37℃下和5％二氧化碳的培养箱中孵育。96h后，使用MTT测定(ATCC，Manassas，Virginia，USA，目录号30-1010K)检测细胞增殖。为此，将MTT试剂与细胞孵育4h，接着通过加入洗涤剂裂解细胞过夜。在570nm处检测到形成的染色(Infinite M1000pro，Tecan)。测量的数据用于使用DRC(剂量响应曲线)来计算生长抑制的IC50。没有用测试物质处理但其他以相同方式处理的细胞的增殖定义为100％数值。
下表1列出了该检测中不同抗-CD123抗体的代表性工作实施例的IC50值：
表1：
所报道的活性数据涉及本实验部分中描述的工作实施例，使用所示出的药物/mAB比率。对于不同的药物/mAB比率，这些值可能会有偏差。IC50值是几个独立实验的平均值或单个值。CD123抗体药物缀合物的作用对于包含相应接头和毒性基团的相应亚型对照是选择性的。
C-1b通过选择的实施例测定纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5的抑制
将人纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5(tebu-bio/Cytoskeleton Inc，编号027EG01-XL)的动力结构域(motor domain)以10nM的浓度与以50nM/ml紫杉醇(Sigma编号T7191-5MG)稳定的微管(牛或猪，tebu-bio/Cytoskeleton Inc)在15mM PIPES(pH 6.8)(5mM MgCl2和10mMDTT，Sigma)中在RT下孵育5min。将新制备的混合物等分成384MTP(Greiner bio-one REF781096)。然后加入浓度为1.0x10-6M至1.0x 10-13M待检测的抑制剂和ATP(终浓度500μM，Sigma)。在RT下孵育2h。通过使用孔雀绿(Biomol)检测形成的无机磷酸盐来检测ATPase活性。在加入试剂后，在检测620nm波长处的吸收之前，将测定物在RT下孵育50min。使用的阳性对照是monastrol(Sigma，M8515-1mg)和ispinesib(AdooQ Bioscience A10486)。剂量-活性曲线的个别数据是8倍的测定值。IC50值是两个独立实验的平均值。100％对照是未用抑制剂处理的样品。
下表2列出了所述测定的代表性工作实施例的IC50值和相应的细胞毒性数据(MTT测定)：
表2
所报道的活性数据涉及本实验部分所述的工作实施例。
C-2a内化测定
内化是使得能够通过抗体药物缀合物(ADC)在表达抗原的癌细胞中特异而有效地提供细胞毒性有效载荷的关键过程。该过程是经由对特异性CD123抗体的荧光标记和用pH敏感的荧光体标记的同种型对照抗体来监测。首先，将荧光染料与抗体的赖氨酸缀合。缀合是使用二倍摩尔过量的pH 8.3的CypHer 5E单NHS酯(批次357392，GE Healthcare)进行。偶联后，将反应混合物通过凝胶色谱法(Zeba Spin Desalting Columns，40K，ThermoScientific，编号87768；洗脱缓冲液：DULBECCO'S PBS，Sigma-Aldrich，编号D8537)进行纯化，以移除过量的染料并调整pH。使用VIVASPIN 500柱(Sartorius stedim biotecVS0131)浓缩蛋白质溶液。通过分光光度分析(NanoDrop)以及随后的使用以下方程D的计算来测定抗体的染料载量：P＝A染料ε蛋白质:(A280-0.16A染料)ε染料。在此检查的CD123抗体和同种型对照的染料载量是相当的量级。在细胞结合检测中，证实该缀合不会造成抗体亲和力的变化。由造血的悬浮细胞表达待检测的抗原，因此在基于FACS的内化检测中检测经标记的CD123抗体的内化。为此，选择并试验具有不同的受体表达水平的细胞系。将细胞(5x104/孔)以100μl的总体积中接种在96-MTP(Greiner bio-one，CELLSTAR，650180，U-底)中。加入最终浓度为10μg/ml的待检测的抗-CD123抗体后，将细胞批次在37℃下培养不同的时间(1h、2h、6h，一式三份)。将相同的处理方案应用于经标记的同种型对照(阴性对照)。平行地，在4℃下处理相同的试验批次(阴性对照)。然后使用Guava流式细胞仪(Millipore)进行FACS分析。通过使用guavaSoft 2.6软件(Millipore)测量荧光强度来进行动力学评估。在多种癌细胞系(MOLM-13、THP-1、KG-1)中观察到抗-CD123抗体的靶标介导的特异性内化，而同种型对照和4℃批次未显示出内化。
C-2b测定溶酶体中内化的CD123抗体的共定位
由于所选择的接头，抗体药物缀合物的毒性活性化合物释放在溶酶体中。因此抗体至该细胞器的运输非常重要。通过将抗体与溶酶体特异性的标记蛋白(例如表面蛋白或小GTPasen)共定位，可以鉴定具有合适特征的抗体。为此，首先将100μl培养基中的CD123-阳性细胞(5x104/孔)接种在96-MTP(Greiner bio-one，CELLSTAR，650180，U-底)中。加入CypHer5E-标记的抗-CD123抗体(最终浓度20μg/ml)后，将该批次一式两份在37℃下培养6h。在各情况中，在培养时间结束前30min将溶酶体特异性的活性染料加入样品中。将溶酶体用CytoPainter LysoGreen指示剂(最终浓度1:2000；abcam，ab176826)染色。培养后，将200μl冰冷的FACS缓冲液(DULBECCO′S PBS，Sigma-Aldrich，编号D8537+3％FBS高温灭活的FBS，Gibco，编号10500-064)移吸至该批次中并将细胞悬浮液在400x g和4℃下离心5min。然后将沉淀重悬于300μl冰冷的FACS缓冲液中并再次离心(4min，400x g在4℃下)。离心后，将上清液去除并将沉淀在30μl冰冷的FACS缓冲液中吸收。对以此方式制备的样品立即进行FACS/图像分析(FlowSight amnis,Millipore)。使用特定的共定位软件IDEASApplication v6.1评估共定位。表3总结了所检测的抗-CD123抗体在该检测中的数据。
表3
实施例 共定位[％]
TPP-6013 43.5
TPP-5969 26.0
7G3 10.0
同种型对照 0.2
C-3用于确定细胞渗透性的体外测试
可以通过使用Caco-2细胞的流量测定(flux assay)中的体外测试来研究物质的细胞渗透性[M.D.Troutman and D.R.Thakker,Pharm.Res.20(8),1210-1224(2003)]。为此，将细胞在24孔滤板上培养15-16天。为了测定渗透，将相应的测试物质在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基底(B)上施用于细胞，并孵育2h。0h后和2h后，从顺式和反式隔室中取样。通过HPLC(Agilent 1200，德国)使用反相柱分离样品。HPLC系统是通过TurboIon Spray Interface连接至Triple Quadropol质谱仪API 4000(AB SCIEX DeutschlandGmbH，Darmstadt，德国)。基于Papp值评估渗透性，所述Papp值是使用Schwab et al.公布的公式[D.Schwab et al.,J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]计算。当Papp(B-A)与Papp(A-B)的比率(流出率)>2或<0.5时，物质被分类为主动运输。
对于细胞内释放的毒性基团至关重要的是从B到A的渗透性[Papp(B-A)]和Papp(B-A)与Papp(A-B)的比率(流出比)：该渗透性越低，通过Caco-2细胞单分子层的物质的主动和被动运输过程越慢。如果流出比又不表示任何主动运输，则该物质在细胞内释放后可在细胞中保留更长时间。因此，也有更多的时间可用于与生化靶标(在这种情况下：纺锤体驱动蛋白，KSP/Eg5)的相互作用。
下表4列出了该测定的代表性工作实施例的渗透性数据：
表4
C-4确定针对P-糖蛋白(P-gp)的底物性质的体外测试
许多肿瘤细胞表达针对药物的转运蛋白，并且这经常伴随着对细胞抑制剂的抗性的发展。不是这种转运蛋白的底物的物质，例如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP，因此可以表现出改善的活性特征。
用于P-gp(ABCB1)的物质的底物性质是通过使用过量表达P-gp(L-MDR1细胞)的LLC-PK1细胞的流量测定来确定[A.H.Schinkel et al.,J.Clin.Invest.96,1698-1705(1995)]。为此，将LLC-PK1细胞或L-MDR1细胞在96孔滤板上培养3-4天。为了确定渗透，单独地或在存在抑制剂(例如伊维菌素(ivermectin)或维拉帕米(verapamil))的情况下，将相应的测试物质在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基底(B)上施用于细胞，并孵育2h。0h后和2h后，从顺式和反式隔室中取样。通过HPLC使用反相柱分离样品。HPLC系统通过Turbo IonSpray Interface连接至Triple Quadropol质谱仪API3000(Applied BiosystemsApplera，Darmstadt，德国)。基于Papp值评估渗透性，所述Papp值是使用Schwab et al.公布的公式[D.Schwab et al.,J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]计算。当Papp(B-A)与Papp(A-B)的流出率>2时，物质被分类为P-gp底物。
作为评价P-gp底物性质的进一步标准，可以比较L-MDR1和LLC-PK1细胞中的流出率或在存在或不存在抑制剂的情况下的流出率。如果这些值相差超过2倍，则所研究的物质是P-gp底物。
C-5药代动力学
C5a：体外内化后ADC代谢物的鉴定
方法描述：
用免疫缀合物进行内化研究以分析在细胞内形成的代谢物。为此，将人肺肿瘤细胞NCI H292(3x 105/孔)接种在6孔板中并孵育过夜(37℃、5％CO2)。用10μg/ml(66nM)待检测的ADC处理细胞。内化是在37℃和5％CO2下进行。在不同的时间点(0、4、24、48、72h)，取样细胞样品作进一步分析。首先，收集上清液(约5ml)，并在离心(2min，RT，1000rpm HeraeusVariofuge 3.0R)之后储存在-80℃下。用PBS洗涤细胞，用Accutase脱附，确定细胞数。在又一次洗涤后，用100ml裂解缓冲液(哺乳动物细胞裂解试剂盒(Sigma MCL1))处理确定数目的细胞(2x 105)并在连续摇动下(Thermomixer，15min，4℃，650rpm)在Protein LoBind管(Eppendorf目录号0030108.116)中孵育。孵育后，将裂解物离心(10min，4℃，12000g，Eppendorf 5415R)，收集上清液。将获得的上清液保存在-80℃下。然后如下分析所有样品。
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后，通过与三重四极质谱仪(MS)联用的高压液相色谱(HPLC)测量培养物上清液或细胞裂解物中的化合物。
为了后处理50μl培养物上清液/细胞裂解液，加入150μl沉淀试剂(通常为乙腈)，将混合物摇动10秒钟。所述沉淀试剂含有适当浓度(通常在20-100ng/ml的范围内)的内标(ISTD)。在16000g下离心3min后，将上清液转移到自动采样器小瓶中，用500μl适于流动相的缓冲液配制并再次摇动。
然后使用HPLC偶联的三重四极质谱仪API6500(来自AB SCIEX DeutschlandGmbH)测量两个基质样品。
为了校准，将0.5-2000μg/l的浓度加入到血浆样品中。检出限(LOQ)约为2μg/l。线性范围为2至1000μg/l。
为了校准肿瘤样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未经处理的肿瘤的上清液中。检出限为4μg/l。线性范围为4至200μg/l。
测试有效性的质量控制含有5和50μg/l。
C5b：体内ADC代谢物的鉴定
在静脉内给药3-30mg/kg不同ADC后，可以测量ADC和产生的任何代谢物的血浆和肿瘤浓度，并且可以计算药代动力学参数如清除率(CL)、曲线下面积(AUC)和半衰期(t1/2)。
产生的任何代谢物的定量分析
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质之后，通过高压液相色谱(HPLC)与三重四极质谱仪(MS)联用测量血浆和肿瘤中的化合物。
对于50μl血浆的后处理，加入250μl沉淀试剂(通常为乙腈)，并将混合物振荡10秒。沉淀试剂含有合适浓度(通常为20-100ng/ml)的内标物(ISTD)。在以16000g离心3分钟后，将上清液转移到自动采样瓶中，用500μl适用于流动相的缓冲液配制并再次振荡。
在肿瘤的后处理过程中，后者用3倍量的提取缓冲液处理。提取缓冲液含有50ml组织蛋白提取试剂(Pierce，Rockford，IL)、两种丸粒的完全蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)和终浓度为1mM的苯甲基磺酰氟(Sigma，St.Louis，MO)。样品在Tissuelyser II(Qiagen)中以最大冲程数均质化两次，每次20min。将50μl匀浆转移到自动采样器小瓶中，并用150μl含有ISTD的甲醇配制。在16000g下离心3min后，用180μl适于流动相的缓冲液配制10μl上清液并再次摇动。然后准备用于测量的肿瘤样品。
然后使用HPLC-偶联的三重四极质谱仪API6500(来自AB SCIEX DeutschlandGmbH)测量两个基质样品。
为了校准，将0.5-2000μg/l的浓度加入到血浆样品中。检出限(LOQ)为约2μg/l。线性范围从2延伸至1000μg/l。
为了校准肿瘤样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未处理的肿瘤的上清液中。检出限为5μg/l。线性范围为5至200μg/l。
测试有效性的质量控制含有5和50μg/l，在血浆中另外含有500μg/l。
定量所用抗体的分析
使用配体结合测定(ELISA)测定ADC的抗体部分，作为血浆样品和肿瘤裂解物中的总IgG浓度。此处使用夹心ELISA形式。该ELISA已经被确认并验证以用于血浆和肿瘤样品中的测定。ELISA板用抗人山羊IgG Fc抗体包被。与样品一起孵育后，将平板洗涤并与猿抗人IgG(H+L)抗体和辣根过氧化物酶(HRP)的检测缀合物一起孵育。在又一次的洗涤步骤之后，将HRP底物加入到OPD中，并通过在490nm处的吸收监测显色。具有已知IgG浓度的标准样品使用4-参数方程进行拟合。在更低的(LLOQ)和更高的(ULOQ)定量限内，通过内插确定未知浓度。
C-6体内效力试验
本发明的缀合物的效力使用例如异种移植模型在体内测试。本领域技术人员熟悉可用于测试本发明的化合物的效力的现有技术方法(参见例如WO2005/081711；Polson等人，Cancer Res.2009Mar 15；69(6):2358-64)。
为此，例如，将表达结合体的靶分子的肿瘤细胞系植入到啮齿动物(例如小鼠)中。然后将本发明的缀合物、同型抗体对照缀合物或对照抗体或等渗盐水给药至植入动物。给药进行一次或多次。在几天的培养时间后，通过比较缀合物处理的动物和对照组(对照缀合物)来测定肿瘤尺寸。缀合物处理的动物表现出较小的肿瘤尺寸。
C-6a.小鼠中的实验肿瘤的生长抑制/消退
将表达抗体药物缀合物的抗原的人肿瘤细胞经皮下接种到免疫抑制小鼠如NMRi裸鼠或SCID小鼠的侧腹中。从细胞培养物中分离1-1千万个细胞，离心并再悬浮在培养基或培养基/基质胶中。在小鼠的皮肤下注射该细胞悬浮液。
肿瘤生长数天。一旦肿瘤建立(在肿瘤尺寸为约40mm2时)，即开始治疗。如果要检验对更大肿瘤的作用，则还可以仅在肿瘤尺寸为50-100mm2时开始治疗。
通过腹膜内(i.p.)途径进行用ADC对小鼠的治疗。ADC以5ml/kg的体积给药。
治疗方案取决于抗体缀合物的药代动力学。作为标准，每隔三天进行四次连续治疗。为了快速评估，也可以使用单次治疗方案。然而，也可以继续该治疗，或可在稍后阶段接着进行三个治疗日的第二循环。
作为标准，每治疗组使用8个动物。除接受活性物质的组外，一个仅用缓冲液处理然后进行相同方案的组作为对照组。
在实验过程中，使用卡尺在两个维度(长度/宽度)上定期测量肿瘤面积。测定肿瘤面积为长度x宽度。将治疗组与对照组的平均肿瘤面积比规定为T/C面积。
如果在治疗结束后所有实验组同时终止，则可将肿瘤摘除并称重。将治疗组与对照组的平均肿瘤重量比规定为T/C重量。
C-6b.人肿瘤异种移植模型中的效力
将所讨论的肿瘤细胞经皮下接种到雌性NMRI裸小鼠(Janvier)的侧腹中。在肿瘤尺寸～40mm2时，用抗体药物缀合物进行静脉内治疗。在治疗后，任选地进一步监测肿瘤生长。
与对照组和同种型药物缀合物相比，抗CD123抗体药物缀合物的治疗产生显著的且长效的肿瘤生长抑制。表5示出了培养后计算的，同种型组的最后测量值的天数的肿瘤面积确定的T/C值。
表5：
抗-CD123抗体的工作实施例
除非本文中详细说明，否则所有实施例使用本领域技术人员已知的标准方法进行。以下实施例的分子生物学的常规方法可如标准实验教材——例如Sambrook等人，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989——中所述进行。
通过表面等离子体共振测定抗体的结合亲和力
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare Biacore,Inc.)进行用于定量的结合分析的表面等离子体共振实验。此处借助胺偶联至传感器芯片表面的抗人Fc抗体(“HumanAntibody Capture Kit”，BR-1008-39，GE Healthcare Biacore,Inc.)固定待检测的抗体。根据生产商的说明书使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和pH为8.5的乙醇胺HCl进行胺偶联(“Amine Coupling Kit”BR-1000-50，GEHealthcare Biacore,Inc.)。为了分析，与流动缓冲液HBS-EP+(10mM HEPES pH 7.4，150mMNaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20)使用系列S传感器芯片CM5(GE HealthcareBiacore,Inc.)。在25℃下进行所有实验步骤。将待检测的抗-CD123抗体固定后，以1.56至200nM的浓度范围进行IL3Ra(Analyt,R&D Systems)的细胞外结构域的注射，各抗原注射后，用pH为2.0的甘氨酸HCl再生传感器表面。将各情况下的抗体如上固定后，在相同条件下注射另外的分析物。对于所有测量，使用仅含有固定化的胺偶联的抗人Fc抗体的上游流动细胞作为对照细胞。两倍参照(double referencing)(减去参照流动细胞信号和缓冲液注射)后，通过基于1:1Langmuir结合模型的全部配置借助Biacore T200评估软件(GEHealthcare Biacore,Inc.)进行获得的传感图的评估。
表6a：用于亲和力测定的重组抗原(IL3R3alpha/CD123)
名称 说明 来源 目录编号(R&D)
TPP-5521 IL3Ra aa20-305 小鼠 203-IL
表6b：使用IL3Ra蛋白用Biacore测定的抗-CD123抗体的单价KD值(TPP-5521作为分析物)
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
TPP-6013 3.0E+05 1.9E-04 0.6E-09
抗-CD123抗体与多种表达抗原的癌细胞系的结合
使用不同的人血液学细胞系(MOLM-13、THP-1、KG-1)通过流式细胞术检测抗-CD123抗体的结合。为此，将细胞(5x105个细胞/孔)在FACS缓冲液(不含Ca/Mg的PBS，3％FCS，Biochrom)中用10μg/ml一级抗体溶液(起始浓度)在冰上避光培养30-45min。绘制剂量活性曲线(1:5稀释)。培养后，使用移液管加入200μl冰冷的FACS缓冲液，将细胞悬浮液在4℃、400g下离心4min。将细胞沉淀用300μl冰冷的FACS缓冲液洗涤然后将获得的沉淀重悬于100μl的FACS缓冲液中并用二级抗体(单克隆抗-κ轻链-FITC抗体，Sigma，编号SAB4700605)以1:10稀释在冰上再培养30min。然后将细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤并调节细胞浓度至0.5x106个细胞/ml，然后使用Guava流式细胞仪(Millipore)进行流式细胞术。将碘化丙啶(最终浓度1μg/ml)用于活染色。通过滴定曲线测定待检测的抗体的EC50值(表7)。
表7：FACS分析：抗-CD123抗体与不同癌细胞系的结合
序列表
<110> Bayer Pharma Aktiengesellschaft
<120> 纺锤体驱动蛋白（KSP）抑制剂与抗-CD123的抗体的抗体药物缀合物（ADC）
<130> BHC 15 1 034
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Tyr Tyr Met Lys
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 10
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Tyr Tyr Met Lys
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 20
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Tyr Tyr Met Lys
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 30
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 31
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Ser Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Phe Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly
20 25 30
Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Met Pro Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 39
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 40
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Phe Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly
20 25 30
Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Met Pro Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 41
<211> 359
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr Asp Ile Glu
20 25 30
Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn Asn Ser Tyr
35 40 45
Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn Tyr Thr Val
50 55 60
Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe Pro Glu Asn
65 70 75 80
Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys Trp Ile His
85 90 95
Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro Gly Ala Pro
100 105 110
Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn Arg Arg Gln
115 120 125
Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly Thr Arg Ile
130 135 140
Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly Ile Pro Cys
165 170 175
Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu Thr Pro Pro
180 185 190
Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met His Trp Lys
195 200 205
Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu Gln Ile Gln
210 215 220
Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp Arg Thr Ser
225 230 235 240
Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile Arg Ala Arg
245 250 255
Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro Gln Arg Phe
260 265 270
Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp Arg Thr Ser
275 280 285
Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys Val Phe Val
290 295 300
Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro Arg Ile Pro
305 310 315 320
His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp Lys Leu Val
325 330 335
Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu Val Thr Glu
340 345 350
Val Gln Val Val Gln Lys Thr
355

Claims (28)

1.一种抗体与具有下式的一种或多种药物分子的缀合物，以及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
BINDER表示为抗体7G3或12F1的嵌合或人源化变体的抗-CD123的抗体或表示其抗原结合片段，
L表示接头，
n表示1至50的数字，优选1.2至20，特别优选2至8，以及
KSP表示具有以下式(I)化合物：
式(I)：
其中
R1表示-H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，
其中
Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-C(＝O)-NY1Y2或–C(＝O)-OY3，
Y1和Y2彼此独立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
Y3表示-H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、
-NH-C(＝O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或
-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，
W表示H或OH，
Y4表示任选地被–NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6烷基，或表示任选地被–NH2取代的芳基或苄基；
R2表示-H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中
Z表示-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2
或-C(＝O)-OY3，
Y1和Y2彼此独立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
Y3表示-H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
Y4表示任选地被–NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，
或表示任选地被–NH2取代的芳基或苄基，以及
Y5表示-H或–C(＝O)-CHY6-NH2，
Y6表示直链或支链C1-6-烷基；
R4表示-H、–L-#1、-SGlys-(C＝O)0-1-R4’、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中
SGlys表示可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，
其中R4’表示可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2或–OH、-H或基团-Ox-(CH2CH2O)v-R4”单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团，
其中x表示0或1，
其中v表示1至20的数字，
其中R4”表示–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、
-CH2-CH2-COOH、或-CH2-CH2-NH2；
其中Z表示-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3表示-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4表示任选地被–NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或表示任选地被–NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5表示-H或–C(＝O)-CHY6-NH2，以及
其中Y6表示直链或支链C1-6-烷基；
或
R2和R4一起(形成吡咯烷环)表示–CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，
其中
R11表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、C(＝O)-O-(C1-4-烷基)或-OH；
A表示-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2-NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3表示–L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选–L-#1，或在每种情况下可被1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤素取代的烷基基团(每种均具有1-3个卤素原子)、1-3个-O-烷基基团、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-C(＝O)-烷基基团、1-3个-O-C(＝O)-NH-烷基基团、1-3个-NH-C(＝O)-烷基基团、1-3个-NH-C(＝O)-NH-烷基基团、1-3个-S(＝O)n-烷基基团、1-3个–S(＝O)2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团，
其中
n表示0、1或2，
Z表示-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
Y1和Y2彼此独立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
Y3表示-H、-(CH2)0-3-CH(NH-C(＝O)-CH3)Z‘、
-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘表示-H、-SO3H、-NH2或–COOH，
R5表示-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，
其中
Z表示-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2
或-C(＝O)-OY3，
Y1和Y2彼此独立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
Y3表示-H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7彼此独立地表示-H、氰基、C1-10-烷基、氟-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟-C2-10-炔基、羟基、-NO2、-NH2、-COOH或卤素，
R8表示可相同或不同地被-OH、-COOH或-NH2单取代或二取代的C1-10-烷基、氟-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烷基、C2-10-炔基、氟-C2-10-炔基、C4-10-环烷基、氟-C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，以及
其中
HZ2表示具有最多达2个选自N、O和S的杂原子的4至7元杂环，
R9表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中
取代基R1、R3和R4中的1个表示–L-#1，
L表示接头以及#1表示与抗体的键，
–MOD表示–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，
其中
R10表示-H或C1-C3-烷基；
G1表示–NH-C(＝O)-或-C(＝O)-NH-(其中，如果G1表示–NH-C(＝O)-，则R10不表示-NH2)；
n表示0或1；
o表示0或1；以及
G2表示具有1至10个碳原子的直链或支链烃链且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-,-S-,-S(＝O)-,S(＝O)2,-NRy-,-NRyC(＝O)-,C(＝O)-NRy-,-NRyNRy-,-S(＝O)2-NRyNRy-,-C(＝O)-NRyNRy-，
其中
Ry表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其中每一个均可相同或不同地被-NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺胺、砜、亚砜或磺酸单取代或二取代，
和/或其可相同或不同地被-C(＝O)-、-CRx＝N-O-间断一次或多于一次，
其中
Rx表示-H、C1-C3-烷基或苯基，以及
其中
在烃基团上包含被任选取代的C1-C10-烷基基团作为侧链的烃链可被–NH-C(＝O)NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺胺、砜、亚砜或磺酸取代，
G3表示-H或-COOH，以及
其中基团–MOD优选地具有至少1个基团-COOH。
2.权利要求1的缀合物，其中A表示–C(＝O)-。
3.权利要求1或2的缀合物，其中R1表示-H、–L-#1、-COOH、-C(＝O)-NHNH2、-(CH2)1-3NH2、-C(＝O)-NZ“(CH2)1-3NH2或–C(＝O)-NZ“CH2COOH，其中Z“表示-H或-NH2。
4.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R2和R4表示-H或R2和R4一起(形成吡咯烷环)表示-CHR11-CH2-或-CH2-CHR11-；其中R11表示-H、-COOH、-F、甲基、-CH2F、-O-甲基、-CH2OH、-C(＝O)-O-(C1-4-烷基)或-OH。
5.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R3表示–L-#1或表示可被卤素、C1-3-烷基或氟-C1-3-烷基单取代或多取代的苯基基团，或表示可任选地被–OY4、-SY4、-O-C(＝O)-Y4、-O-C(＝O)-NH-Y4、-NH-C(＝O)-Y4、-NH-C(＝O)-NH-Y4、-S(O)n-Y4、-S(＝O)2-NH-Y4、-NH-Y4或-N(Y4)2取代的C1-10-烷基基团或氟-C1-10-烷基基团，
其中
n表示0、1或2，
Y4表示-H，任选地被卤素、C1-3-烷基或氟-C1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或表示可被-OH、-COOH和/或-NH-C(＝O)-C1-3-烷基取代的烷基。
6.权利要求5的缀合物，其中所述缀合物具有以下式(IIj)：
其中
R3表示–L-#1；
A表示–C(＝O)-；以及
R6、R7、R8和R9具有与在权利要求1的式(I)中相同的含义。
7.权利要求1至5中一项或多项的缀合物，其中所述取代基R1表示–L-#1。
8.权利要求7的缀合物，其中所述缀合物具有式(IIk)：
其中
R1表示–L-#1；
A表示–C(＝O)-和
R3表示–CH2OH-；
R6、R7、R8和R9具有与在权利要求1的式(I)中相同的含义。
9.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R5表示-H或-F。
10.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R6和R7彼此独立地表示-H、C1-3-烷基、氟-C1-3-烷基、C2-4-烯基、氟-C2-4-烯基、C2-4-炔基、氟-C2-4-炔基、羟基或卤素。
11.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R8表示支链的C1-5-烷基基团或环己基。
12.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R9表示-H或氟。
13.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中所述接头–L-具有以下基础结构(i)至(iv)中的一个：
(i)(CO)m–SG1-L1-L2-
(ii)-(CO)m–L1-SG-L1-L2-
(iii)-(CO)m–L1-L2-
(iv)–(CO)m–L1-SG-L2
其中m表示0或1，SG和SG1表示体内可裂解基团，L1彼此独立地表示体内不可裂解的有机基团，以及L2表示与结合体的偶联基团。
14.权利要求13的缀合物，其中体内可裂解基团SG是2-8寡肽基团，优选二肽基团或二硫化物、腙、乙缩醛或缩醛胺，SG1是2-8寡肽基团，优选二肽基团。
15.前述权利要求中一项或多项的缀合物，
其中所述接头L连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基并具有下式：
§-(C(＝O)-)m-L1-L2-§§
其中
m表示0或1；
§表示与活性化合物分子的键以及
§§表示与抗体的键，以及
-L2-表示
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
L1表示–(NR10)n-(G1)o-G2-，
其中
R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1表示–NH-C(＝O)-；
n表示0或1；
o表示0或1；以及
G2表示具有来自芳基基团的1至100个(优选1至25个)碳原子的直链或支链烃链，和/或直链和/或支链烷基基团，和/或环烷基基团并且其被以下基团相同或不同地间断一次或多于一次：-O-、-S-、-S(＝O)-、S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-N-CH3-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NHNH-和具有1至4个选自N、O和S、-S(＝O)-或–S(＝O)2-的相同或不同杂原子和/或杂基团的5至10元芳族或非芳族杂环，
其中所述直链或支链烃链可任选地被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺胺、砜、亚砜或磺酸取代，
或表示以下基团中的一个：
其中Rx表示-H、C1-C3-烷基或苯基。
16.权利要求15的缀合物，其中L2是由下式的一个或两个表示：
其中
#1表示与结合体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
R22表示-COOH以及
与结合体的硫原子的键中大于80％(基于接头与结合体的键的总数)是以这两种结构中的一种存在。
17.权利要求15和16中一项或多项的缀合物，其中L1具有下式：
其中
r表示0至8的数字。
18.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中所述接头–L-连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基并具有下式：
其中
§表示与活性化合物分子的键以及
§§表示与抗体的键，
m表示0、1、2或3，
n表示0、1或2，
p表示0至20，以及
L3表示
其中
o表示0或1，以及
G3表示具有来自芳基基团的1至100个(优选1至25个)碳原子的直链或支链烃链，和/或直链和/或直链烷基基团，和/或环烷基基团并且其可被以下基团相同或不同地间断一次或多于一次：-O-、-S-、-S(＝O)-、S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-N-CH3-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NHNH-和具有1至4个选自N、O和S、-S(＝O)-或–S(＝O)2-的相同或不同的杂原子和/或杂基团的5至10元芳族或非芳族杂环，
其中直链或支链烃链可任选地被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2-、-NH-CN-NH2、磺胺、砜、亚砜或磺酸取代。
19.前述权利要求中一项或多项的缀合物，及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体，其中所述缀合物具有下式中的一个：
其中
AK1表示经半胱氨酸连接的抗-CD123的抗体以及AK2表示经赖氨酸连接的抗-CD123的抗体，该抗体是抗体7G3或12F1的嵌合或人源化变体，
n表示1至20的数字以及
L1表示具有1至30个碳原子的直链或支链烃链，其可相同或不同地被-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、环戊基、哌啶基、苯基间断一次或多于一次，
其中所述直链或支链烃链可被–COOH或-NH2取代。
20.权利要求19的缀合物，及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体，其中所述接头L1表示基团
§-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)6-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-O-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(CH3)-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2OH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-NH§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)5-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
或
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§，
其中
§表示与活性化合物分子的键以及
§§表示与抗体的键以及
异C3H7表示异丙基基团。
21.权利要求1至18中一项或多项的缀合物，其中所述缀合物具有下式中的一个：
其中
AK1表示经半胱氨酸连接的抗-CD123的抗体以及AK2表示经赖氨酸连接的抗-CD123的抗体，该抗体是抗体7G3或12F1的嵌合或人源化变体以及
n表示1至20的数字。
22.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中所述抗-CD123的抗体或其抗原结合片段包含：
可变重链，其包含如SEQ ID NO:2所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:3所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:4所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:6所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:7所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:8所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:12所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:13所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:14所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:16所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:17所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:18所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:22所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:23所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:24所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:26所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:27所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:28所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:32所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:33所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:34所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:36所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:37所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:38所示的轻链的可变CDR3序列。
23.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中所述抗-CD123的抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:1所示的重链的可变序列、和如SEQ ID NO:5所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:11所示的重链的可变序列、和如SEQ ID NO:15所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:21所示的重链的可变序列、和如SEQ ID NO:25所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:31所示的重链的可变序列、和如SEQ ID NO:35所示的轻链的可变序列。
24.前述权利要求中一项的缀合物，其中所述抗-CD123的抗体是IgG抗体。
25.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中所述抗-CD123的抗体包含：
如SEQ ID NO:9所示的重链的序列、和如SEQ ID NO:10所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:19所示的重链的序列、和如SEQ ID NO:20所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:29所示的重链的序列、和如SEQ ID NO:30所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:39所示的重链的序列、和如SEQ ID NO:40所示的轻链的序列。
26.药物组合物，其包含权利要求1至25中一项或多项的缀合物结合惰性无毒的药学上合适的助剂。
27.权利要求1至25中一项或多项的缀合物，用于治疗和/或预防疾病的方法中。
28.权利要求1至25中一项或多项的缀合物，用于治疗过度增殖性病症和/或血管生成性病症的方法中。
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