EP3313524A1 - Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-cd123-antikörpern - Google Patents

Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-cd123-antikörpern

Info

Publication number
EP3313524A1
EP3313524A1 EP16736011.4A EP16736011A EP3313524A1 EP 3313524 A1 EP3313524 A1 EP 3313524A1 EP 16736011 A EP16736011 A EP 16736011A EP 3313524 A1 EP3313524 A1 EP 3313524A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
alkyl
cooh
seq
antibody
represented
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP16736011.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Georg Lerchen
Anne-Sophie Rebstock
Yolanda Cancho-Grande
Sven WITTROCK
Beatrix Stelte-Ludwig
Christoph Mahlert
Simone Greven
Stephan MÄRSCH
Dennis KIRCHHOFF
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Pharma AG filed Critical Bayer Pharma AG
Publication of EP3313524A1 publication Critical patent/EP3313524A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/32—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/33—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • ADCs Antibody-drug conjugates
  • the invention relates to binder-drug conjugates (ADCs) of kinesin spindle protein inhibitors, to active metabolites of these ADCs, to methods of producing these ADCs, to the use of these ADCs for the treatment and / or prevention of diseases and to the use of these ADCs for the preparation of medicaments for the treatment and / or prevention of diseases, in particular hyperproliferative and / or angiogenic diseases such as, for example, cancer.
  • ADCs binder-drug conjugates
  • Such treatments may be monotherapy or in combination with other medicines or other therapeutic measures.
  • Cancers are the result of uncontrolled cell growth of various tissues. In many cases, the new cells invade existing tissues (invasive growth) or they metastasize to distant organs. Cancers occur in various organs and often have tissue-specific disease courses. Therefore, the term cancer as a generic term describes a large group of defined diseases of various organs, tissues and cell types.
  • early stage tumors may be removed by surgical and radiotherapeutic measures.
  • metastatic tumors can only be treated palliatively by chemotherapeutic agents.
  • the goal here is to achieve the optimal combination of an improvement in the quality of life and the extension of the lifetime.
  • ADCs antibody drug conjugates
  • cytotoxic agent itself or another cytotoxically active metabolite formed therefrom is released within the tumor cell, where it can exert its effect directly and selectively In this way the damage to normal tissue could be kept to a significantly narrower limit compared to conventional cancer chemotherapy [see eg JM Lambert, Curr, Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); AM Wu and PD S enter, emergency.
  • WO2012 / 171020 describes ADCs in which several toxophore molecules are linked to an antibody via a polymeric linker.
  • the substances SB 743921, SB 715992 (isospinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 and ARRY-520 are mentioned in WO2012 / 171020 as potential toxophores.
  • Kinesin spindle protein inhibitors Kinesin spindle protein (KSP, also known as Eg5, HsEg5, KNSL1, or KIF1 1) is a kinesin-like motor protein that is essential for the function of the bipolar mitotic spindle. Inhibition of KSP leads to mitotic arrest and prolonged apoptosis (Tao et al, Cancer Cell 2005, lul 8 (1), 39-59).
  • KSP inhibitors After finding the first cell-derived KSP inhibitor, monastrol, KSP inhibitors have become established as a class of new chemotherapeutic agents (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) and are the subject of a number of patent applications (eg, WO2006 / 044825 WO2006 / 002236, WO2005 / 051922, WO2006 / 060737, WO03 / 060064, WO03 / 040979, and WO03 / 049527).
  • KSP inhibitors must be present at a sufficiently high concentration during this phase.
  • WO2014 / 151030 discloses ADCs with certain KSP inhibitors.
  • the invention provides conjugates of an anti-CD123 antibody with compounds of the following formula (I), wherein one or more of the compounds of formula (I) is or are linked to the antibody via a linker L.
  • the antibody is preferably a human, humanized or chimeric monoclonal antibody.
  • Preferred here is an ehimeric or humanized ti-CD123 antibody derived from an antibody 7G3 or 12F1 derived from mice.
  • Particularly preferred are the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971.
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, - (CH 2 CH 2 0) o -3 - (CH2) o-3Z '(for example, - (CH2) o-3Z'), or -CH (CH 2 W ) Z 'and Y 3 represents H or ⁇ (CH 2 ) 0 .3Z', where Z 'is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CHCNH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i -3 represents COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , Ci-s alkyl or optionally substituted with ⁇ NH 2 substituted aryl or benzylene;
  • R 2 represents H, -MOD, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (( ⁇ . ⁇ ⁇ ), ⁇ .: /.
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY 'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - ( € ⁇ 2 ) ⁇ - ⁇ , ⁇ ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by - NHCONH 2 , C ⁇ -s alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzylene and Y * H or •• ⁇ CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 represents linear or branched C M alkyl;
  • R 4 H, -L ⁇ # 1, -SG lys - (CO) 0- i -R 4 % -CO-CHY ⁇ NHY 5 or - (CH 2 ) o. 3 Z represents,
  • SGjy S is a grappe cleavable by a lysosome enzyme, in particular a grappe consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a C 1-10 -alkyl, Cs-10-yl or ce-j-Araikyl-, Cs-io-heteroalkyl, Cno-Alk 10-Ce-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Ce-io- Aryloxy or Ce-io-aralkoxy, Cs-io-heteroaralkoxy, Cwo-alkyl-O-Ce-io-aryloxy, Cs-io-heterocycloalkoxy group which is mono- or polysubstituted with - NH 2 , -NH- Alkyl, -N (alkyl
  • Y 1 and Y 2 are independently H, H 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH2, Ci .. & alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched CM represents alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, where R 11 is H, H 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (in particular F or Cl) , CM alkyl, C i- darsteilt 4 haloalkyl, C 1-4 alkoxy, hydroxyl-substituted C alkyl, COO (C ⁇ alkyl), or OH;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO.MI or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L- # 1, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L- # 1 or a Cwo-alkyl, Ce-io Aryl or cycloalkyl, Cs-io-heteroalkyl, G-io-alkyl-O-Ce-io-aryl or C 5-10 -heterocycloalkyl group which react with 1-3 -OH groups, 1-3 halogen atoms, 1 -3 halogenated alkyl groups (each having 1 -3 halogen atoms), 1 -3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1-3 -O- COalkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alky
  • alkyl is preferably CMO-alkyl
  • R 5 is H, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 - 3
  • Z is where Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO- ⁇ 2 , or -CO-OY 3 , where Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2) o -:; Z ', and Y 3 represents H or -, wherein Z' represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 8 is (optionally fluorinated) Ci-i ⁇ -Alky !, (optionally fluorinated) C2-io-alkenyl, (optionally fluorinated) Ci-io-alkynyl, (optionally fluorinated) or- (CH 2) o-2- (HZ 2 ) wherein HZ 2 is a 4- to 7-membered heterocycle containing up to two heteroatoms selected from N, O and S, each of which is -OH, CO 2 OH or NH 2 may be substituted;
  • R i is LF, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ;
  • R 1 , R 3 or R 4 represents -L- # 1 or (in the case of R 8 ), L represents the linker and # 1 represents the bond to the binder or derivative thereof, wherein -MOD - (NR 10 ) n - (GI) o -G2-G3 wherein R 10 is H or C 1 -C 6 -alkyl;
  • Gl represents -NHCO- or -C ⁇ NH- (not wherein when Gl -NHCO-, R 10 is NH 2);
  • n 0 or 3;
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • the conjugates according to the invention may have chemically labile linkers, enzymatically labile linkers or stable linkers. Particularly preferred are stable linkers and
  • the invention further provides processes for the preparation of the conjugate according to the invention as well as precursors and intermediates for the preparation.
  • the preparation of the conjugates according to the invention regularly comprises the following steps:
  • the attachment of the reactive group can also take place after the formation of an optionally protected KSP inhibitor-linker precursor conjugate.
  • succinimide-linked ADCs after conjugation according to Scheme 26 can be converted into the open-chain succinic acid amides which have a favorable stability profile.
  • conjugation of the linker to a low molecular weight KSP inhibitor may be accomplished by substitution of a hydrogen atom on R 1 , R 3 or R 4 in formula (I) by the linker.
  • any functional groups present may also be present in protected form. Prior to the conjugation step, these protecting groups are removed by known peptide chemistry techniques.
  • the conjugation can be carried out chemically in various ways, as exemplified in Schemes 20 to 31 in the Examples.
  • it is possible to optionally modify the low molecular weight KSP inhibitor for conjugation to the linker eg, by introducing protecting groups or leaving groups for ease of substitution.
  • the invention provides novel low molecular weight KSP iso-inhibitors conjugated to an anti-CD 123 antibody, such as chimeric or humanized variants of 7G3 or 12F1.
  • KSP inhibitors or their antibody conjugates have the following general formula (II):
  • R is H, -L-BINDER, MOD or - (CH 2 ) o-; Z, wherein Z is -H, - HY J
  • Y 1 and Y z independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o. 3 Z '(eg
  • Y 3 represents H or ⁇ ⁇ (I i - ⁇ .,: / ⁇ ⁇ ,
  • w represents H or OH
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NH-C (H)) - NH 2 , Ci e -alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aiyl or benzyl;
  • R 2 represents H, -MOD, -Ci; - ⁇ ⁇ ⁇ - ⁇ ⁇ "or - (CH 2 ) o-3Z,
  • R and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 1 '- or
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY ! Y 2 represents or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, H 2 , or - (CH o -sZ ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o- 3 Z', where Z 'is H, SO : .H, NH 2 or COOH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally roite-NHCONH? substituted, Ci-6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 'is H or -C ⁇ -CHY 6 -NH 2 , wherein Y * represents linear or branched Ci-e alkyl;
  • R 4 represents H, -L-BINDER, -SG iys - (CO) 0- ] -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • SGfyg represents a group cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a Ci-io alkyl, Cs-jo-aryl or Ce-io aralkyl, Cs-io -Heteroalkyl, Ci-io-Alkyi-O-Ce-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heieroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Ce-io- Aryloxy or ceria-aralkoxy, C 5-10 heteroaralkoxy, C 1-10 -alkyl-O-ce-io-aryloxy, C 1-10 heterocycloalkoxy group which may be mono- or polysubstituted with - NH 2 , - NH-alkyl, -N (alkyl) 2
  • Y 1 and Y 2 are independently H, H 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , C 1-6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CflY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched CM represents alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR 1 -CH 2 -, where R 10 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl) , CM alkyl, C] - 4 Haloaiky3, CM alkoxy, hydroxyl-substituted CM alkyl, COO (CM alkyl) or OH;
  • A represents Ci (> ⁇ -S (-O) -, -S ( ⁇ !) ⁇ .. -S ( ⁇ ! I -N i! Or -C NH 2 -;
  • R 3 represents -L-BINDER, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a ci-alkyl radical, io-aryl or Ce-io-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryl or C5-10 heterocycloalkyl group having 1-3 -OH groups , 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1-3 -alkyl groups,
  • alkyl is preferably CMO-alkyl
  • n 0, 1 or 2
  • R 5 is H, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 J 3 -Z 3 , wherein Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY [ Y 2 , or -CO-OY 3 , wherein Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CTb sZ and Y 3 represents H or - (CH 2 J 3 Z ', wherein ⁇ ' represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 8 (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) coco-alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, (optionally fluorinated) C 1-10 -cycloalkyl or - (CH 2)
  • o- represents 2 - (HZ 2 ) wherein HZ 2 represents a 4- to 7-membered heterocycle having up to two halogen atoms selected from N, O and S (preferably oxetane), each of which is represented by -OH, CO2H or H 2 may be substituted;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein L is a linker and BINDER is an anti-CD 123 antibody, wherein the binder may optionally be bound to a plurality of drug molecules, wherein a member of R 1 , R J and R 4 represents -L-Binder;
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-8 -alkynyl, hydroxyl, NO 2, NH 2 , COOH or halogen (in particular F, Cl, Br), where -MOD is - (NR iO ) n - (GI) o -G2-G3, where R ! 0 is H or C 1 -C 3 -alkyl;
  • G represents -NHCO- or -CONH- (wherein when G represents -NHCO-, R ! 0 is not NH 2 );
  • n 0 or 1 isi
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • G 3 represents -H or -COOH, the group -MOD preferably having at least one group -COOH; and their salts, solvates, d salts of solvates and epimers.
  • FIG. 1 Sequence listing.
  • FIG. 2 Annotated sequence of the antibodies.
  • the CDR regions (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) and variable regions (VH, VL) are respectively highlighted relative to the antibodies or antibody fragments.
  • the invention provides conjugates of an anti-CD123 antibody with one or more drug molecules, wherein the drug molecule is a kinesin spindle protein inhibitor (KSP inhibitor) linked to the antibody via a linker L.
  • KSP inhibitor kinesin spindle protein inhibitor
  • KSP-L preferably has the above-mentioned formula (I).
  • the linker is linked to various amino acids of the antibody. Particularly preferred is a bond to different cysteine residues of the binder.
  • the anti-CD123 antibody is preferably a human, humanized or chimeric monoclonal antibody. Preferred here is a chimeric or humanized anti-CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 32F1. Particularly preferred are the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971.
  • antibodies which can be used according to the invention antibodies which can be used according to the invention, KSP inhibitors which can be used according to the invention and linkers which can be used according to the invention are described which can be used without restriction in combination.
  • the binders which are in each case described as being preferred or particularly preferred can be used in combination with the KSP inhibitors respectively shown as being preferred or particularly preferred, if appropriate in combination with the linkers respectively shown as being preferred or particularly preferred.
  • substituted means that one or more hydrogens on the designated atom or group are replaced by a selection from the group indicated, provided that the normal valence of the designated atom has not been exceeded under the present circumstances Combinations of substituents and / or variables are permitted.
  • optionally substituted means that the number of substituents may be the same or different from zero. Unless otherwise indicated, where appropriate substituted groups may be substituted by as many optional substituents as can be accommodated by replacing a hydrogen atom with a non-hydrogen substituent on any available carbon or nitrogen or sulfur atom. Normally, the number of optional substituents (if present) can be 1, 2, 3, 4 or 5, especially 1, 2, or 3.
  • the term "one or more times", for example, in the definition of the substituents of the compounds of the general formulas of the present invention, means "1, 2, 3, 4 or 5, preferably 1, 2, 3 or 4, more preferably 1, 2 or 3, most preferably 1 or 2 ".
  • radicals are substituted in the compounds according to the invention, the radicals can, unless stated otherwise, be monosubstituted or polysubstituted; in the scope of the present invention, the meanings of all radicals which occur repeatedly are independent of one another. Substitution by, one, two or three identical or different substituents is preferred. Substitution by a substituent is particularly preferred.
  • Alkyl is a linear or branched, saturated, monovalent hydrocarbon radical having 1 to 10 carbon atoms (Q-Cjo-alkyl), generally 1 to 6 (Q-Ce-alkyl), preferably 1 to 4 (C ( - Gralkyl), and particularly preferably 1 to 3 carbon atoms (C, -C 3 -alkyl).
  • Particularly preferred is a methyl, ethyl, propyl, isopropyl and tert-butyl radical.
  • Heteroalkyl represents a straight-chain and / or branched hydrocarbon chain having 1 to 10
  • Carbon atoms which are monosubstituted or polysubstituted, or one or more of the groups -O-, -S-,
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or suifonic acid may be substituted.
  • R x is -H, C ⁇ -C 3 alkyl or phenyl.
  • Alkenyi represents a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having one or two double bonds and 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C 2 -C 10 -alkenyl), in particular 2 or 3 carbon atoms (CVCj-Aikenyl ), it being understood that when the alkenyl group contains more than one double bond, the double bonds may be isolated from each other or conjugated with each other.
  • the alkenyl group is, for example, an ethenyl (or vinyl), prop-2-en-1-yl (or “allyl”), prop-1-eryl-1-yl, but 3-enyl, but-2-enyl, but-1-enyl, pent-4-enyl, pent-3-enyl, pent-2-enyl, pent-1-enyl, hexane 5-enyl, hex-4-enyl, hex-3-enyl, hex-2-enyl, hex-1-enyl, prop-1-en-2-yl (or "isopropenyl") )
  • the group is Vinyi or Allyl. alkynyl
  • Alkynyl represents a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having one triple bond and having 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C 2 -C 10 -alkynyl), in particular 2 or 3 carbon atoms (C 2 -C 3) alkynyl).
  • the C 1 -C 6 alkynyl group is, for example, an ethynyl, prop-1-ynyl, prop-2-ynyl (or propargyl), but-1-ynyl, but-2-ynyl , But-3-ynyl, pent-1-yl, pent-2-ynyl, pent-3-ynyl, pent-4-ynyl, hex-1-ynyl, hex-2-ynyl , Hex-3-ynyl, hex-4-ynyl, hex-5-ynyl, 1-methylprop-2-ynyl, 2-methylbiitol-3-ynyl, 1-methylbut-3-ynyl, 1 Methylbut-2-ynyl, 3-methylbut-1-ynyl, 1-ethylprop-2-ynyl,
  • alkmyl group is ethynyl, propyl-inyl or prop-2-ynyl.
  • Cycloalkyl is a saturated monovalent mono- or bicyclic hydrocarbon radical having 3-12 carbon atoms (C 3 -C 12 -cycloalkyl).
  • Cs-Cs cycloalkyl and more preferably 3 to 7 (C3-C 7 cycloalkyl) carbon atoms.
  • a monocyclic hydrocarbon radical mention may be made:
  • cyclopropyl cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and
  • a bicyclic Kohienwasserstoffrest stands for a Kohienwasserstoffrest with usually 3 to 12 carbon atoms (C: rCi 2-cycloalkyl), which in this case is a fusion of two saturated ring systems to understand that share two directly adjacent atoms.
  • C: rCi 2-cycloalkyl carbon atoms
  • a bicyclic hydrocarbon radical bicyclo [2.2.0] hexyl, bicyclo [3.3.0] oclyl, bicyclo [4.4.0] decyl, bicyclo [5.4.0] undecyl, bicyclo [3.2. 0jheptyl, bicyclo [4.2.0] octyl, bicyclo [5.2.0] nonyl, bicyclo [6.2.0] decyl,
  • Heterocycloalkyl represents a non-aromatic mono- or bicyciic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be the same or different. As heteroatoms nitrogen atoms, oxygen atoms or sulfur atoms can occur.
  • a monocyclic ring system according to the present invention may have 3 to 8, preferably 4 to 7, particularly preferably 5 or 6 ring atoms.
  • heterocycloalkyl having 4 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl having 4 ring atoms are:
  • heterocycloalkyl having 7 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl having 7 ring atoms are:
  • Azepanyl, oxepanyl, 1,3-diazepanyl, 1, 4-diazepanyl is azepanyl, oxepanyl, 1,3-diazepanyl, 1, 4-diazepanyl.
  • heterocycloalkyl having 8 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl having 8 ring atoms are:
  • Oxocanyl, azocanyl
  • saturated heterocyclyl radicals having up to two heteroatoms from the series O, N and S are preferred.
  • a bicyciic ring system having one, two, three or four heteroatoms, the same or can be different, according to the present invention can have 6 to 12, preferably 6 to 10 ring atoms, wherein one, two, three or four carbon atoms can be exchanged for identical or different heteroatoms from the series O, N and S.
  • Examples include: azabicyco [3.3.0] octyl, azabicyclo [4.3.0] nonyl,
  • Aryl is a monovalent, mono- or bicyclic, aromatic carbon ring system consisting of carbon atoms. Examples are naphthyl and phenyl; preferred is phenyl or a phenyl radical.
  • An exemplary Gs-j o -aralkyl group is benzyl.
  • Heieroaryl means! a monovalent monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic ring system having 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14 ring atoms (a 5- to 14-membered
  • the heteroaryl group may be a 5-membered heteroaryl group such as tbienyl, furyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl or tetrazolyl; or a 6-membered heteroaryl group such as, for example, pyridinyl, pyridazinyl, pyrirnidinyl, pyrazinyl or triazinyl: or a tricyclic Heteroaryl group such as carbazolyl, acridinyl, or phenazinyl; or a 9-membered heteroaryl group such as benzofuranyl, benzothienyl, benzoxazolyl, benzisoxazolyl, benzimidazoi, benzothiazolyl, benzotriazoly
  • heteroaryl radicals include all possible isomeric forms thereof, e.g. Tautomers and positional isomers with respect to
  • pyridinyl includes pyridin-2-yl, pyridin-3-yl and pyridin-4-yl; or the term thienyl includes thien-2-yl and thien-3-yl.
  • the bond valency may be on any aromatic carbon atom or on a nitrogen atom.
  • a monocyclic heteroaryl group according to the present invention has 5 or 6 ring atoms. Preference is given to those heteroaryl radicals having one or two heteroatoms. Particularly preferred are one or two nitrogen atoms.
  • heteroaryl radicals having 5 ring atoms include the rings:
  • Oxadiazolyl triazolyl, tetrazolyl and thiadiazolyl.
  • Heteroaryl radicals having 6 ring atoms include, for example, the rings:
  • a bicyclic heteroaryl group according to the present invention has 9 or 10 ring atoms.
  • heteroaryl radicals having 9 ring atoms include the rings:
  • Heteroaryl radicals with 10 ring atoms include, for example, the rings:
  • Heteroalkoxy represents a straight-chain and / or branched hydrocarbon chain having 1 to 10 carbon atoms, which is bonded via -O- to the remainder of the molecule and which furthermore comprises one or more of the groups -O-, -S-, NR>'-,
  • HC ( NH 2 ) -,
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • R x is -H, C ⁇ -C 3 alkyl or phenyl.
  • Halogen or halogen atom in the context of the invention is fluorine (-F), chlorine (-C1), bromine (-Br), or iodine (-1).
  • Fluoroalkyl, fluoro-Alkenyi and fluoro-alkynyl means that the alkyl, Aikenyl and Aikiny 1 may be substituted one or more times by fluorine.
  • the conjugation of the KSP inhibitor to the antibody can be accomplished chemically in a variety of ways, as exemplified in Schemes 20 to 31 in the Examples.
  • it is possible to optionally modify the low molecular weight KSP inhibitor for conjugation to the linker eg by introducing protecting groups or leaving groups for easier substitution (so that in the reaction this leaving group is substituted by the linker and not an H). Atom).
  • the resulting KSP inhibitor linker molecule (where the linker has a reactive group for coupling to the binder) can then be reacted with the binder to obtain a binding conjugate of the invention.
  • This procedure is illustrated exemplarily in the experimental part by means of a multiplicity of examples,
  • Other particularly preferred compounds have the following formula (I) or (Ia): Formula (I):
  • R 1 H i. '' -MOD or •• i Ci i ./.
  • Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO- ⁇ ' ⁇ 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y ! and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o- 3 - (CH 2 ) 0 -3Z '(for example - (CH 2 ) o-3Z'), or -CH (CH 2 W ) Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o-3Z 1 , wherein 7 is H, NH 2 , SO 3 H, COOK, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (COH-CHY 4 ) 1-3 COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally with HCONH 2 substituted, C1-6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 subscribed Aryi or benzyl;
  • R 2 represents H, -MOD, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO- ⁇ 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently represent H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 represents H or -, wherein Z' represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , Cw alkyl or optionally substituted by - : NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 'is H or -CO-CHY ° - H2, wherein Y 6 linear or branched C ie Alkyl; H, I, ⁇ I
  • j represents -R 4 ', -CO-CHY -NHY 5 or - (CH 2 V 3 Z represents
  • SG jvs is a grappe cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a CMO-alkyl, Cs-io-aryl or cocooro-aralkyl, Cs-io Heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, Heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Gwo-aryloxy or Ce-io-aralkoxy, C5-10 heteroaralkoxy, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryloxy , Cs-io-Hetoocycloalkoxy group containing one or more of - NH 2 , -NH-Aikyl, -N (alkyl) 2 ,
  • ⁇ 'and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 V 3 Z', and Y 3 H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by-NHCONHb, Ci-e alkyl or optionally substituted with M i substituted aiyl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched C « Alkyl;
  • R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CHj-CHR 1 '- or -CHR.
  • "-CH 2 - represent wherein R is H, NH2, SO3H, COOH, SH, halo (especially F or Cl), CM alkyl, Cw Haioalkyi, CwAlkoxy, Hydroxyi substituted CM alkyl, COO (C M alkyl), or! OH represents;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 H or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L- # l, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycoalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably a Ci-io-alkyl, Ce-io-aryl or Ce- 10-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Cj-io-alkyl-O-Ce io-aryl or Cs-io-Heterocycioaikyl group containing 1-3 -OH groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1 -3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1-3-S-alkyl groups, 1-3 -
  • R 5 is H, -MOD, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CFI 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) o Is -3Z, wherein Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY 'Y 2 , or -CO-OY 3 , wherein Y 1 and Y 2 are independently H, H>, or - (CH 2) o -: > Z l , and Y 3 is H or - (CH 2 3 Z ', where Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOH represents;
  • R 6 and R "independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, hydroxyl, NO 2, H 2 , COOH or halogen (in particular F, C3, Br),
  • R 8 is (optionally fluorinated) C jo-alkyl, (optionally fluorinated) C2-io-alkenyl, (optionally fluorinated) C2 ⁇ io-alkynyl, (optionally fluorinated) C cycloalkyl or - ( € ⁇ 7) ⁇ - ( ⁇ 2 ), wherein HZ 2 represents a 4 to 7-g lower ring heterocycle containing up to two heteroatoms selected from N, O and S (preferably oxetane), each of which may be substituted with -OH, CO 2 OH or NH 2; wherein one of the substituents R 1 , R J and R 4 represents -L- # 1,
  • L is the linker and # 1 is for binding to the antibody, R i is LF, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein -MOD - represents (NR 10 ) n - (GI) o -G2-G3, wherein R 10 represents H or G -C r alkyl;
  • G represents -NHCO-, -CONH-, or " ⁇ / N" ° (where if Gl is -NHCO- or if
  • ⁇ / represents, R is not NH 2 );
  • n 0 or 3;
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • the carbon atom to which R 1 binds is a stereocenter which may be in the L and / or D configuration, preferably in the L configuration.
  • the colilenated atom to which R 2 binds is a stereocenter which may be in the L and / or D configuration.
  • ⁇ 'and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z' (for example - (CH 2 yjZ '), or -CH (CH 2 W) Z and Y 3 represents Ii or - (CH 2 ) o- 3 Z l , wherein Z 'is H, H 2 , SO 3 H, COOK, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i. 3 COOH, wherein W 1 represents i or OH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , Ci-e alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl.
  • R 2 and R 4 are independently H, -SG lys - (CO) 0- iR 4 ', -CO-Cl I V-NHY ' or - (CH 2 ) o- 3 Z,
  • SGjyg represents a group cleavable by a lysosoinal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a Ci-io-alkyl, Cs-io-Aryi- or Ce-io aralkyl, Cs-io -Heteroalkyi, Ci-io-Alk lO-Ce-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryi, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Ce-io-aryloxy - or Ce-io-aralkoxy, C5-10-heteroaralkoxy, Ci-w-alkyl-O-Ce-jo-aryloxy, Cs-io-heterocycloalkoxy group, each one or more times with ⁇ NH, -NH Alkyl, - (alkyl) 2
  • R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR H - ⁇ represent CH 2, wherein R n is H, NH 2, SO 3 H, COOH, SH, halo (especially F or - or -CHR 11 w C alkyl) or OH Cl), CM alkyl, CM haloalkyl, C M alkoxy, substituted Hydroxyh C, .4 alkyl, COO ( or R 2 is H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) o- 3 Z and R 4 is -L- # 1 wherein Z is - H, halo, -OY 3 , -SY 3 , ⁇ 3 , -CO-Y ] Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o- 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H, H 2 or COOH;
  • Y 4 is independently linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , C 1-6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl, wherein Y 4 linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 , Ci-6 alkyl or optionally substituted aryl, or benzyl with 2 -NH and Y 5 is H or -CO-C FLY 6 -NH 2 wherein Y 6 represents linear or branched C1-6 alkyl;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO, N, or C NH 2 ;
  • R 3 represents an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryi, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L- # 1 or a Ci-io-alkyl, Cwo-aryl or Ce-io-aralkyl, Cs
  • heteroalkyi, Cno-alkyl-O-Ce-io-aryl or Cs-io-Heteroeycloalkyl group which with 1-3 -OH Groups, 1 -3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1 -3 Haiogenatome) ,, 1 -3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1-3 -O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-H-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-H-alkyl groups, 1-3 -S (0) n
  • alkyl is preferably Ci-10-alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or - (CH 2 V 3 Z, where Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 1 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o-3Z 1 , where Z' is H, SO 3 H, H represents 2 or COOH;
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkyn-L, hydroxyl or halogen,
  • R s (optionally fluorinated) C uo-Alky !, (optionally fluorinated) ci io-cyeloalkyl or optionally substituted oxetane;
  • R 9 is H, F, CH 3, C! :.
  • CH 2 represents F or CHF 2 ; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • one of the substituents R 1 , R J or R 4 represents -L- # 1, where L is the linker and # 1 is the binding to the antibody is. That is, in the case of the conjugates, one of the substituents R 1 , R 'or R 4 represents -L- # 1, wherein -L, - # i represents the bond to the antibody.
  • the binder is preferably a human, humanized or chimeric monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • R 4 is H or -SG [ys - (CO) o. ⁇ -R 4 * , where SG [ys and R 'have the same meaning as above.
  • Corresponding cleavable groups are described below.
  • Preferred here is a chimeric or humanized anti-CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12F1. Particularly preferred are the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971.
  • the group -L- # 3 may also be present in the compound, where L is the linker and # 3 is the reactive group for binding to antibodies.
  • Compounds with -L ⁇ # 3 are reactive compounds that react with the antibody.
  • # 3 is preferably a group that reacts with an amino or thiol group to form a covalent bond, preferably with the cysteine residue in a protein.
  • the cysteine residue in a protein may be present in the protein, introduced by biochemical methods, or preferably generated by prior reduction of disulfides of the binder.
  • CO carbonyl
  • R 1 preferred is -L- # 1, H, -COOH, -CONH H 2 , - (CH 2 ), - 3 NH 2 , -CONZ "(CH 2 ) j, 3 NH 2, and - CONZ" CH 2 COOH, where Z is H or H 2 .
  • R 2 and R 4 are preferably H or R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or -CHR is -CH 2 -, wherein R n is H or F. Also preferred as R 4 is -L- # 1 where -L- # 1 is a cleavable linker, preferably an intracellular enzymatically cleavable linker.
  • R 3 is preferably -L- # l or a Ci-io-alkyl, which may be OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-AlkyL NH- CO-Aikyl, NH-CO-NH-AlkyL S (O) n -alkyl, S ⁇ 2 -NH-alkyl, NH-alkyl, (alkyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably alkyl).
  • R 3 is preferably H or F.
  • R 6 and R ' are independently of each other preferably H, (optionally fluorinated) Cj-s-alkyl, (optionally fluorinated) C -AlkenyL (optionally fluorinated) C alkynyl, hydroxy or halogen.
  • R 8 is preferably a branched Ci-s-Aikyl group, in particular a group of the formula - C (CH 3 - (CH 2) o-2 -Ry, wherein R y is -H, OH, C0 2 H, or NH 2 , or a (optionally fluorinated) C 5-7 -cycloalkyl Particularly preferred is a group of the formula -C (CH 3) 3 or a cyclohexyl group.
  • R 9 is preferably H or F.
  • A is CO (caxbonyl);
  • R] is H, -L-# l, -COOH, -CONHNH2, - (CH 2) i- 3 NH 2, -CONZ "(CH 2) i-3 NH 2 and -CONZ" CH 2 COOH, where Z " H or NH 2 ;
  • R 2 and R 4 is H, or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR 1! -CH 2 represent, where R "is H or R 4 - # -L- is 1 and R 2 is H;
  • halogen in particular F
  • optionally fluorinated C 1-3 alkyl or represents an optionally fluorinated C 1-10
  • alkyl substituted ⁇ alkyl substituted
  • alkyl wherein the alkyl group may be substituted with -OH, -COOH, and / or -NHCO-O..3-alkyl, and wherein alkyl is preferably Ci-j alkyl
  • R 3 particularly preferably being substituted by -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-acyl, NH-CO-alkyl, NH-CO-NH-alkyl, S (0 ) n -alkyl, S0 2 -NH-alkyl, ⁇ -alkyl, N (alkyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C1-3 alkyl);
  • R J is H or F
  • R 6 and R independently of one another are H, (optionally fluorinated) C 1-3 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-4 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-4 -alkynyl, hydroxyl or halogen;
  • R ö is a branched C 1-5 alkyl group or cyclohexyl
  • R 9 is FI or F.
  • R represents -L- # 1, COOK or H
  • R and R 4 are H or R 2 and R 4 together (to form a PynOlidinringes) -CH 2 -CHR 1 or -CHR I! Represent -CH 2 -, wherein R 11 is H, or R 4 is -L- # 1 and R 2 is H:
  • A represents CO
  • R 3 is - (CH 2 ) OH, -CH (CH 3 ) OH, -CH 2 SCH 2 CH (CXXlH) NHCOCH 3 , -CH (CH 3 ) OCH 3 , a phenyl group containing 1-3 halogen atoms, 1 - 3 amino groups or 1-3 alkyl groups (which may optionally be halogenated, may be substituted, or -L- # l represents,
  • R ' represents -H
  • R 6 and R 'independently of one another represent H, C 1-3 -alkyl or halogen, in particular that R 6 and R 7 represent F;
  • R 8 is C 1-4 -alkyl (preferably tert-butyl) or cyclohexyl; and or
  • R 9 represents H
  • R represents -L- # 1, COOK or H
  • R 2 and R 4 are H or R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 1 '- or -CHR n -CH 2 -, where R lj is H,
  • A represents CO
  • R ' represents H
  • R 6 and R 'independently of one another represent H, C 1-3 -alkyl or halogen, in particular that R ° and R 7 represent F;
  • R 8 is C 1-4 -alkyl (preferably tert-butyl).
  • R 9 represents H.
  • R 1 represents H, -L-Binder, -MOD or - (CH 2 J 3 -Z 3 , wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-Y'Y 2 , or -CO- OY 3 represents,
  • Y s and Y 2 independently of one another are H, H 2 ,... ⁇ (I i (I ii ) ⁇ , -iOl; / ⁇ ⁇ /.! -. - (CH 2 ) o-: sZ I ), or CH (CH 2 W) Z ', and Y 3 represents Ii or - (CH 2 ) o- 3 Z', where H, NH 2 , SO 3 H, - COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH ( NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) ,. 3 represents COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHC ⁇ NH 2 , C1-6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 is H, -MOD, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, wherein Y 4 is linear or branched, optionally substituted by - NHCO H 2 , de alkyl or optionally with - H 2 represents substituted aryl or benzyl; and Y 5 II or where Y 6 is linear or branched C 1-3 alkyl,
  • Y 2 represents or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another, denote H, NH 2 , or - (CHb sZ ', and Y 3 H or
  • R 44 is a Ci-io-Alkyi-, Cs-io-aryl or Ce-io-aralkyl, C5-10 Heteroalkyl, Cuio-alkyl-O-Cfr-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Cj-10-alkoxy, Ce-io-aryloxy or Ce-io-aralkoxy, Cs-io-heteroaralkoxy, Cj.
  • Y 1 and Y 2 independently of one another represent H, NH 2 , or - (CH.) ⁇ "Z ', and Y 3 H or
  • Y 4 is linear or branched, optionally with NHCONH ? substituted, Cj-s alkyl or aryl or benzyl optionally substituted with -NH 2 and Y 5 represents H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 represents linear or branched CM alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 represents H, NH 2 , SO 3 H, COOK, SH, or OH;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R represents J- L-Binder, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyi, heterocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a Ci-10-alkyl-, Ce-io Aryl or Ce-io-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Cwo-alkyl-O-Ce-io-aryl or Cs-io heterocycloalkyl group, which with 1 -3 -OH groups, 1 - 3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-Aikyl groups, 1 -3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1 -3 -O-CO- Alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -
  • alkyl is preferably CM O - alkyl
  • R 5 is H, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 -3Z, where Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY !
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - ( ⁇ 2 ) ⁇ - ⁇ ', wherein Z' represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH; R "and R 'independently of one another H, cyano, (optionally fluorinated) G-jo-alkyl, (optionally fluorinated) CJ-IO-Alkenyi, (optionally fluorinated) Cj-io-alkynyl, Hydro xy, NO ?. , H2, COOH or halogen (in particular F, Ci, Br),
  • R (optionally fluorinated) Ci-i ⁇ -Alky !, (optionally fluorinated) C2-io-alkenyl, (optionally fluorinated) Ci-io-alkynyl, (optionally fluorinated) or- (CH 2) o-2- (HZ 2 ) wherein HZ 2 is a 4- to 7-membered heterocycle containing up to two heteroatoms selected from N, O and S, each of which is -OH, CO 2 OH or NH 2 may be substituted;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 darstelli; wherein -MOD - (NR 10 ) n - (GI) o -G2-G3, wherein
  • R 10 is H or C ( C 3 alkyl
  • G represents -NHCO- or -CONH- (wherein when G represents -NHCO-, R ! 0 is not NH 2 );
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R 1 , R 'and R 4 may represent (alternatively to one of the meanings given above) L-linkers, where L is a linker and BINDER is the antibody is, where the antibody may be bound to multiple drug molecules.
  • R 1 represents -L-BINDER, H, or - (CH 2 ) o- 3 Z, wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-Y'Y 2 , or -CO Represents -OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) 0 _. t is Z ', or -CH (CH 2 W) Z', and Y 3 is H or - (CH 2 ) 0 .. 3 Z ', where Z' is I, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO -CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-H-CHY 4 ) i.
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with - HCONH 2 , Cw alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R and R * are independent of each other
  • SG ⁇ VS represents a group which can be cleaved by lysosomal enzymes, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a Ci-jo-alkyl, Cs-io-aryl or Ce-io-aralkyl, Cs io-heteroalkyi, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryl, Cs -so-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io alkoxy, Ce io-aryloxy or Ce-jo-aralkoxy, Cs-io-heteroaralkoxy, cilo-alkyl-O-Ce-io-aiyloxy, Cs-io-heterocycloalkoxy group which is mono- or polysubstituted with - NH 2 , - NH-alkyl,
  • ⁇ 'and Y 2 independently of one another represent H, NH 2 , or - (CTb sZ', and Y * H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , Ci-e alkyl or optionally substituted with -NH2 substituted aryl or benzyi and Y 5 is H or -CO-CHY ° - H2, wherein Y 6 linear or branched C « Alkyl;
  • A represents CO, SO, SO, SO 2 NH, or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L-BINDER or an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-Binder or a Ci-io-Alkyi-, Ce-io-aryl or Ce-io -Aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, CMO-alkyl-O-Ce-io-aryl or Cs-io-heterocycloalkyl group halogenated with 1-3 -OH groups, 1 -3 halogen atoms, 3 -3 halogenated Alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms) ,, 1 -3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1 -3 -S-alkyl groups, 1-3 - O-CO-alkyl groups, 1 -3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl galenes, 1-3
  • alkyl is preferably CMO-alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or - (CH 2 J 3 Z 3 Z, wherein Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , -NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or Represents -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 -oZ), and Y 3 is H or - (CH 2 ) o- 3 Z ', where Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • L is a linker and BINDER is a binder or derivative thereof, it being possible for the binder to be bound to a plurality of active substance molecules,
  • R "and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C-O-alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkynyl, hydroxyl or halogen,
  • R 8 represents (optionally fluorinated) C 10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 3-10 cycloalkyl or optionally substituted oxetane; and RI i. F, CH:>, CF 3 , CH 2 F or CFIF 2 ; and their salts, solvaie, salts of solvates and epiners.
  • R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 6 , R ? , s and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa),
  • A is CO
  • B is a single bond, -O-CH 2 - or -CH 2 -O-
  • R 20 is NH 2, F, CF 3, or CH3, and n represents 0, 1, or 2.
  • R 1 , R 3 , R 6 , R ', R s , and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa), wherein A is preferably CO and R 3 is -CH 2 OH, -CH 2 represents OCH 3 , CH (CH 3 ) OH or CH (CH 3 ) OCH 3 .
  • A, R ', R 6, R', R “and R 9 have the same meaning as in formula ( ⁇ ) or (IIa), wherein A is preferably CO and R J is -CH 2 -S X - (CH 2) ( M is -CHY 5 -COOH, where x is 0 or 1, and Y 5 is H or HY 6 , where Y 6 is II or -COCH 3 .
  • R 1 represents -L-BINDER.
  • R 1 or R 3 particularly preferably represent -MOD.
  • A represents CO
  • A represents CO and R 3 represents C H. Ol I;
  • R J , R ", R 7 , R 8 , and R y have the same meaning as in formula (I).
  • Z represents Cl or Br
  • R 1 - (CH 2 ) O-. 3 represents Z, wherein Z is -COOK or -CO-NY'Y 2 , where Y is 2
  • Y 1 represents H, Y 2 and Z represents ⁇ -COOH
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z 'and Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH;
  • Y 2 is -CH 2 CH 2 Z' represents, 7 ⁇ (CO I-ICHY 4), 2 COOH and Y represents a 4 i-propyl and the other a ⁇ ⁇ ' ⁇ ⁇ ) ⁇ ⁇ ⁇ represents iCON ' ii;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by - HCO H 2 , Ci-e alkyl; at least one member of Y 4 is selected from propyl or -CH 3 .
  • Y 1 represents H, Y 2 - € Fi 2 CH 2 Z ', Z' represents -CONHCIT ⁇ COOH and Y 4 optionally with
  • Y 4 represents aminobenzyl
  • R 2 is - (CH 2 ) o-3Z and Z is -SY 3 ;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is H;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is -CO-CHY 6 - H 2 ; Y 4 is linear or branched, optionally substituted with - NHCO] NH 2 Ci-6 alkyl.
  • R ', R 2 or R' in formula (I) or (II) -MOD darsieilt it is preferred if R ', R 2 or R' in formula (I) or (II) -MOD darsieilt.
  • R 3 represents -MOD and R 1 or R 4 represents -L- # i and -L-BINDER, respectively, wherein -MOD represents - (R i0 ) n - (Gl) o -G2-G3, wherein
  • R 10 is H or dC, - alkyl
  • G is --NHCO- or -CONH- (wherein when G 1 represents -NHCO-, R 10 is not NH 2 );
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • the group -MOD has a (preferably terminal) -COOH group, for example in a betaine group.
  • the group -MOD the formula -CH2-X S - (CH2) C - CHY 5 -COOH, wherein x is 0 or 1, and Y 5 represents H or NHY 6, wherein Y6 is H or -COCH 3 represents.
  • R 1 is -L-BINDER, H, or - (CH 2 ) (wZ, wherein Z is -H, - HY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 represents
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or or - CH (CH 2 W) Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o- 3 Z', wherein H, NH 2 , SO 3 H, COOH, - NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY) i-3 COOH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCONH2 Substituted, Ci-e alkyl or optionally -NH2 substituted aryl or benzyl;
  • R and R 4 independently of one another H
  • R 2 and R 4 together (to form a Pyrrolidmringes) -CH 2 -CHR n - or -CHR n - CH 2 - represent wherein R n is H, NH 2, SO 3 H, COOH, SH, halo (especially F or Cl), CM is alkyl, CM is haloalkylene, CM is alkoxy, hydroxyl substituted CM is alkyl, COO (C M is alkyl) or OH;
  • SGjyg represents a group cleavable by lysosomal enzymes, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a Ci-jo-alkyl, Cs-io-aryl or Ce-so-aralkyl, C5-10- Heteroalkyl, Cno-alkyl-O-Ce-io-aryl, Cs-io-Heteroeyeloalkyl-, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaiyl-alkoxy, C1-10-alkoxy, Ce-io-aryloxy or Ce-io-aralkoxy, Cs-io-heteroaralkoxy, Cj.
  • lo-alkyl-O-Ce-io-aryloxy, Cs-i o-heterocycloalkoxy group which is mono- or polysubstituted by -NH 2, -H-alkyl, -N (alkyl) 2 , NH-CO-alkyl, N ( Alkyl) -COalkyl, -SO 3 H, -SO 2 NH 2 , -SO 2 -N (alkyl) 2 , -COOH, -CONH 2 , -CON (Alkyi) 2 , or -OH, -H or a group -O x ⁇ (CH 2 CH 2 O) v -R 4 ", (wherein x represents 0 or 1 and v represents a number from 1 to 20, and R 4 signifies --H, -alkyl (preferably C 12 -alkyl), -CH 2 represents -COOH, -CH 2 -CH 2 -COOH, or -CH 2 -CH
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , wherein Y 1 and Y 2 are independently H, H 2 , or - (CH 2 ) o -:> Z l , and Y 3 is H or - (CH 2 ) 0 ..3 Z ', where Z' is H, SO 3 represents H, NH 2 or COOK;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , Cw alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y J is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , where Y 6 linear or branched Cj- e is alkyl;
  • A represents CO, SO, SO 2, SO, N or C, NH 2 ;
  • R 3 represents -L-BINDER, an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, or -CH 2 -S x - (CH 2 ) o- -CHY 5 -COOH, where x is 0 or Is 1 and Y 5 is H or NHY 6 , where Y 6 is H or -COCH 3.
  • Y 2 , or -CO-OY 3 with Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or ((CH 2 ) e-3Z ', and Y 3 H, - ⁇ CH 2 ) a -: r CH ( NHCOCH 3 ) Z ', - (CH 2) o-3-CH (H 2 ) Z', or - (CH 2 V 3 Z ', where 7 is H, SO 3 H, NH 2 or COOK,
  • alkyl is preferably CM O - alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or - (CH 2 V 3 Z, where Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , -NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o-3Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH represents; where L is a linker and BINDER is the antibody, where the binder may possibly be bound to several active substance molecules,
  • R "and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C-O-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 -10-acyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, hydroxyl or halogen,
  • R 8 represents (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) Gs-10-cycloalkyl or optionally substituted oxetane; and R is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; and their salts, solvaie, salts of the derivatives and epimers.
  • Z represents Cl or Br
  • R 1 represents - (CH 2 ) O-3Z, wherein Z represents -CO- ⁇ ' ⁇ 2 , wherein Y 2 - (CH 2 CH 2 O) o- 3 - (CH 2 ) 0 - 3 Z 'and Y 1 H, NH 2 , or - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2) 0 .. Z ';
  • Y is 1 H, Y 2 is - (CH 2 CH 2 O) 3 -CH 2 CH 2 Z 1 and Z 'is -COOH;
  • Y ! H represents Y 2 -CH 2 CH 2 Z 'and Z' - (CONHCHY 4 ) 2 COOH;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z ', Z' - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and represents a representative of Y 4 isopropyl and the other ⁇ ! ! ) N i K " ⁇ ) N! I;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and represents one of Y 4 - CH 3 and the other represents - ⁇ CH 2 ) 3-NHCONH 2 ;
  • Y 4 is C 1-6 alkyl, linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2; at least one member of Y 4 is selected from z ' propyl or -CH 3 .
  • Y 1 is H
  • Y 2 is -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' is -CONHCHY COOH
  • Y 4 is aryl or Benz 1 optionally substituted with -NH 2;
  • Y 4 represents aminobenzyl
  • R 2 is - (CH 2 ) 0 - 3 Z and Z is -SY 3 ;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is H;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y is CO-CHY ⁇ NH? represents; and or
  • Y 4 represents linear or branched C1-6 alkyl optionally substituted with -NHCONH2.
  • R 1 is H, -L- # 1 or -L-BI is DER, -MOD or - (CH 2 ) o- 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, Represents -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 'and Y 2 independently of one another H, NH 2 , ⁇ (( ⁇ !! ⁇ (!! ⁇ ⁇ ) !,: H Ci i - // i M ⁇ ⁇ ( ' ⁇ ⁇ ) r. or -CH (CH 2 W) Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) réelle 3Z', wherein H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 Represents -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i -3 COOH, wherein represents WH or OH,
  • Y 4 represents linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , C [-6 alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 represents H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) O - 3 Z, wherein Z represents -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NYV, or -CO-OY 3 ,
  • Y ! and Y 2 are independently H, NH ?, or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y J is H or -
  • Y is independently linear or branched, optionally substituted with -NHCONEb, C1-6 alkyl or optionally with -NH2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 - H2, wherein Y 6 linear or branched Cw alkyl represents;
  • R 4 represents H or -L- # 1 and -L-BINDER, respectively (wherein -L- # 1 and -L-BINDER, respectively, is an enzymatically cleavable linker leading to the conversion of R 4 to H);
  • A represents CO, SO, SO2, SO2NH or CNNH2;
  • R 3 represents -L-1 or -L-BINDER, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably a C 1-10 -alkyl-, Ce -io-aryl or Ce-io-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Cj-io-alkyl-O-Ce-io-aryl or C5-10-heterocycloalkyl group which is substituted with 1-3 -OH Groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH groups, 1-3 -alkyl groups, 1-3 O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-
  • Y 1 and Y 2 independently represent Ii, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y * represents H or - (CH 2 ) o-3Z i , wherein Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) -10-alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-8 -alkynyl, hydroxy, NO 2 , NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br), R 8 (optionally fluorinated) C 12 -jo-alkyl (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, or (optionally fluorinated) C 1-4 -cycloalkyl; where one of the substituents R 'and R 3 represents -L- # 1 or -L-BINDER, respectively,
  • L stands for the linker and sets # 1 for binding to the antibody and BINDER for the antibody
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein -MOD - (NR 10 ) n - (GI) o -G2-G3, wherein
  • R 10 is H or Ci-C, -alkyl
  • G represents -NHCO- or -CONH- (wherein when G represents MR O-, R 10 is not H 2 );
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G 2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, -SO 2, -NR>'-, -NRYCO-, CONRy-, -NRyNR -, -S02NRyNR> '', -CON WRy- (wherein R y is H, phenyl, CJ -CJ Q-alkyl, C2-C ⁇ 0-alkenyl, or C 2 - ⁇ Q-alkynyl , each with
  • R ' is H, -L- # 1 and -L-BINDER, -MOD or - (CH 2 ) o... 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, Represents -CO-NY 'Y 2 , or -CO-OY 3 .
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by-NHCONH 2 , Ci-e alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 represents H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, H 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by-NHCONH 2 , Ci-e alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY ° -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched C represents alkyl;
  • R 4 represents H
  • A represents CO, SO, S0 2 , S0 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents L-L-BINDER, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably an O-JO-alkyl, Cc - ⁇ -aryl or coco-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-all yl-O-Ce-io-aryl or C5-10-heterocycloalkyl group, denoted by 1-3 OH groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1-3 -O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO- alkyl, grappeo, 3-NH3-NH-CO-H-al
  • R 5 is H, -MOD, NH, NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 3Z, wherein Z represents -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , wherein Y 1 and Y 2 are independently H, NH ;, or - (CH 2) o-: > Z l , and Y 3 is H or - (CH 2 3 Z ', where Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOK represents;
  • R 6 and R ? independently of one another represent H or halogen (in particular F, Ci, Br);
  • R 8 represents (optionally fluorinated) G-io-alkyl; wherein one of the substituents R 1 and R 3 represents -L- # 1 or -L-BINDER, respectively,
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; where --MOD is -CH 2 -SX- (CH 2 ) ⁇ M-CHY 5 -COOH, where x is 0 or 1, and Y 5 is H or NHY *, where Y 6 is H or -COCH 3, and their salts, Solvates and salts of solvates.
  • R 1 , R, R 3 , R 4 and R 5 have the abovementioned meanings (as indicated, for example, for formula (I) or (II)):
  • R 1 and R ⁇ is H or -L # l are represented;
  • R 2 and R 4 are H or R 1 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 - CHR 1 '- or -CHR H -CH 2 -, where R n is H; and
  • R 3 is CH 2 OH, CH (CH 3 ) OH or - L- / 1 wherein one of the substituents R 1 and R 'represents --L - # 1.
  • R 1 represents H or COOH
  • R 4 is -L- # 1
  • R 3 is CH 2 OH, or CH (CH 3 ) OH, where -L- # 1 is an enzymatically cleavable linker useful for the conversion of R 4 leads to H.
  • linkers fall into the group of in vivo cleavable linkers and into the group of in vivo stable linkers (see L. Ducry and B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2,010)).
  • the in vivo cleavable linkers have an in vivo cleavable group, again distinguishing between chemically in vivo cleavable and enzymatically cleavable groups.
  • “Chemically in vivo cleavable” or “enzymatically cleavable in vivo” means that the linkers or groups in the blood circulation are stable and only at or in the target line by the changed there chemical or enzymatic environment (lower pH; Giutathione concentration; presence of lysosomal Enzymes such as proteases, or glycosidases such as ⁇ -glucuronidases), so as to release the low molecular weight KSP inhibitor or a derivative thereof.
  • the chemically in vivo cleavable groups are in particular disulfide, hydrazone, acetal and aminal; the enzymatically in vivo cleavable groups, in particular those which are cleavable by lysosomal enzymes, are in particular 2-8-Oligopeptidgrappe, in particular a tripeder Dipeptidolitic docking or glycosides.
  • Peptide cleavage sites are disclosed in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, and Bioorganic & Medicinal Chemistry Ladders 8 (1998) 3341-3346 and Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. These include, for example, valine-alanine, valine-lysine, valine-citrulline, alanine-lysine and phenylalanine-lysine (optionally with additional amide group).
  • the in vivo stable linkers are characterized by high stability (less than 5% metabolites after 24 hours in plasma) and do not have the above-mentioned chemically or enzymatically in vivo cleavable groups.
  • the linker -L- preferably has one of the following basic structures (i) to (iv):
  • m is 0 or 1;
  • SG is a (chemically or enzymatically) in vivo cleavable group (especially disulfide, hydrazone, acetal, and aminal, or a protease cleavable 2-8 oligopeptide group),
  • SGI is an oligopeptide group or preferably a dipeptide group, LI independently for in vivo stand stable organic groups, and L2 stands for a coupling group to the binder or a single bond. The coupling is preferably carried out on a cysteine residue or a lysine residue of the antibody.
  • the coupling may be to a tyrosine residue, glutamine residue or an unnatural amino acid of the antibody.
  • the unnatural amino acids may include, for example, aldehyde or keto groups (such as formyl glycine) or azide or alkyne groups (see Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chern. Rev. 2014, 114, 4764-4806 ).
  • linker basic structure (iii) Particularly preferred according to the invention is the linker basic structure (iii).
  • the administration of a conjugate according to the invention having a linker basic structure (iii) and coupling of the linker to a cysteine or lysine residue of the antibody leads by metabolization to cysteine or lysine derivatives of the following formulas: COOH COOH
  • L 1 is in each case bound to the low molecular weight KSP inhibitor, eg a compound of the formula I (I), (Ta), (IT), (IIa) , (IIb), (TIca), (ITd), (ITe), (ITf), (III) or (IV).
  • linker basic structure (i) when bound to the position R4, in particular when m 0.
  • L2 is preferably derived from a group reactive with the sulfhydryl group of the cysteine.
  • groups include haloacetyls, maleimides, aziridines, acryloyls, arylating compounds, vinylsulfones, pyridyl disulfides, TNB-thiols and disulfide reducing agents.
  • These groups typically react electrophilically with the sulfhydryl bond to form a sulfide (e.g., thioether) or disulfide bridge. Preference is given to stable sulfide bridges.
  • L2 is preferable
  • # 'de notes the linking moieties with the sulfur atom of the Antiköpers, (i 2 denotes the point of attachment with the group L 1 , and 22 COOH, COOR, COR, CONHR, CONR 2 (with R each Cl-3-Alkyi), CONH2, preferably COOH represents.
  • L2 is:
  • Formula A4 where # ! denotes the linkage parts with the sulfur atom of the antibody, # 2 denotes the linking parts with the active ingredient, x represents 1 or 2, and R 1 is COOH, COOR, COR, CO R 2 , CONHR (with R in each case Cl 3 -alkyl), CONH 2 , preferably COOH.
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, particularly preferably more than 90% in each case based on the total number of linker bonds to the antibody), particularly preferably one of the two structures of formula A3 or A4.
  • the structures of the formula A3 or A4 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the antibody. The remaining bonds are then in the structure
  • LI is preferably represented by the formula
  • R 10 is H, H 2 or C 1 -C 6 alkyl
  • Gl is WO-, -CONH- or represents; (R 1 U is preferably not H2, if
  • n 0 or 3;
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups is one or more times by one or more of the groups -O-, -S ⁇ , -SO-, SO2, -NR ⁇ '-, - NRYCO-, -C (NH) NRy-, ⁇ ( ' ⁇ ) > , R. v . -. -NRYNRY-, -S ⁇ ! ⁇ ⁇ ⁇ ? > ⁇ . ⁇ ( ' ⁇ > ⁇ V R. N> - "wherein R y is H, phenyl, Ci-Ci0 alkyl, C2 ⁇ Ci 0-alke yl, or C2-C1 Q-Alkmyl represents (each with
  • NHCONH 2 , -COOK, -OH, -H 2 , NH-CNNH 2, sulfonamide, suifon, sulfoxide, or sulfonic acid), -CO-, -CR x N-O- (where Rx is H, Ci-C-) 3-alkyl or phenyl) and / or a 3 to 10-membered, aromatic or non-aromatic Heierozyklus with up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -S02- may be interrupted (preferably
  • hydrocarbon chain including the side chains if present, with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH.
  • NH ⁇ CNNH 2 , sulfonamide, suifon, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 5 to 1 O-membered, aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably
  • OH, -NH2, NH-CNNH2, sulfonamide, suifon, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • G2 is preferably a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which are mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S.sup.-, -SO -, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONPINH-, -CR ⁇ NO- (where Rx H, C j -C ⁇ -Alkyl or phenyl) and a 3 to 10-membered, for example 5 to I O-membered aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -S02- may be unierbrobst (preferably
  • hydrocarbon chain including the side chains, if present, may be substituted by -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH?., NH-CNNH 2, sulfonamide, suifon, sulfoxide, or sulfonic acid.
  • Other interrupting groups in G2 are preferred
  • Rx represents H, Ci-Cß-alkyl or phenyl.
  • # ' is the binding to the SP inhibitor and - the binding to the coupling group to the antibody (e.g., L2).
  • a straight-chain or branched hydrocarbon chain comprising arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups generally comprises an ⁇ , ⁇ -divalent alkyl radical having the respectively indicated number of carbon atoms. Examples which may be mentioned by way of example and are preferably: methylene, ethane-1,2-diyl (1,2-ethylene), propane-1,3-diyl (1,3-propylene), butane-1,4-diyl (1,4-diyl).
  • Buiylen pentane-l, 5-diyl (1,5-pentylene), hexane-1,6-diyl (1,6-hexylene), heptane-l, 7-diyl (1,7-hexylene), octane l, 8-diyl (1,8-octylene), nonane-l, 9-diyl (1,9-onylene), decane-i, 10-diyl (1, 10-decylene).
  • the aikylene groups in the hydrocarbon chain can also be branched, ie one or more H atoms of the abovementioned linear aikylene groups can optionally be substituted by C 1-10 -alkyl groups and thus form side chains.
  • the hydrocarbon chain may further contain cyclic alkylene groups (cycloalkanediyl), for example 1,4-cyclohexanediyl or 1,3-cyclopentanediyl. These cyclic groups may be unsaturated.
  • aromatic groups arylene groups
  • one or more H atoms may optionally be substituted by C 1-10 -alkyl groups. It is thus formed a hydrocarbon chain, which may be branched. This hydrocarbon chain has a total of 0 to 100 carbon atoms, preferably 1 to 50, particularly preferably 2 to 25 carbon atoms.
  • the Seiienketten if present, with -NHCONH 2 , -COOK, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or suifonic acid mono- or polysubstituted by identical or different substituents.
  • the hydrocarbon chain can be monosubstituted or polysubstituted by identical or different substituents by -O-, -S-, -SO-, -SO 2, -H-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -HNH-, - S02 H H, -CO HNH- and a 5 to lOgiiedriger, aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -S02- be interrupted (preferably
  • the linker corresponds to the following formula:
  • ⁇ represents the binding to the binder peptide or protein
  • LI has the formula -NR 1 ⁇ B-, wherein
  • R 11 represents H or H 2 ;
  • B represents - ⁇ (CH 2 ) x - (X 4 ) y ] w - (CH 2 ) 2 -
  • Linker L preferred according to the invention has the following formula:
  • # 3 represents the binding to the drug molecule
  • # 4 represents binding to the binder peptide or protein
  • R 1 1 represents H or ⁇ 2;
  • H represents.
  • the above-identified linkers are particularly preferably coupled in conjugates of the formula (I) or (II) in which the linker is coupled to R4 by substitution of an H atom on L or in conjunction with a cleavable linker SGI, ie R 1 -L- # 1 represents or R4 -SG1-L- # 1, "wherein ff l represents the binding to the antibody.
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, particularly preferably more than 90% (in each case based on the total number of linker bonds to the antibody), particularly preferably in one of the two structures of the formula A5 or A6 before:
  • R 22 is COOH, COOR, COR, CONR 2 , CONHR (each R is Cl-3-alkyl), CO is H 2 , preferably COOH.
  • the structures of the formula A5 or A6 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the antibody. The remaining bonds are then in the structure
  • linker -L- attached to a cysteine side chain or cysteine residue have the following formula:
  • ⁇ represents the binding to the drug molecule
  • ⁇ represents the bond to the binder peptide or protein
  • n 0, 3, 2, or 3;
  • n 0, 1 or 2;
  • p is 0 to 20;
  • o 0 or 3;
  • G3 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms
  • Arylene groups and / or straight-chain and / or cyclic alkylene groups which are mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, SO 2, -NH-, -CO-, -NHCO-, - COH, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 HNH-, -CONHNH- and a 3 to 1 O-membered (preferably 5 to 1 O-membered), aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -SO 2 - may be interrupted (preferably ), wherein the side chains, if present, may be subsituted with -NHCONH2, -COOH, -OH, -H2, NH-CNNH2, sulfonamide, suifon, suifoxide or suifonic acid.
  • n 1;
  • n 0;
  • o 0 or 1
  • s, t, v and w are each independently 0 to 20, and u is 0 or 1.
  • Preferred groups LI in the above formula ⁇ - (CO) m-Ll-L2-Sections are the following, wherein each r independently of one another is a number from 0 to 20, preferably from 0 to 15, particularly preferably from 1 to 20, in particular preferably from 2 to 10
  • linker Li indicated in these lines which is selected from:
  • Linkage site with the group I. / denotes, '- preferably COOH represents.
  • the bonds to a cysteine residue of the binder are preferably more than 80%, more preferably more than 90% (in each case based on the total number of bonds of the linker to the binder), particularly preferably in one of the two structures of the form A7 or A8 ago.
  • the structures of the formula A7 or A8 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the binder. The remaining bonds are then in the structure
  • conjugates with corresponding linkers have the following structures, wherein XI is CH, X2 C, and X3 is N, and LI has the abovementioned meaning, L2 and L3 have the same meaning as LI, AK1 stands for an anti ⁇ CD123 antibody, which is linked via a cysteine residue, and n is a number from 1 to 10. More preferably, AK1 is a human, humanized or chimeric anti-CD123 monoclonal antibody. Particularly preferred here is a chimeric or humanized anti-CD 323 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or I 2F1. Particularly preferred are the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971.
  • the linker When the linker is attached to a lysm side chain or a lysine residue, it preferably has the following formula:
  • ⁇ represents the binding to the drug molecule
  • ⁇ represents the binding to the Binderpeplid or -prolein
  • SG is a cleavable group, preferably a 2-8 oligopeptide, especially, preferably a dipeptide,
  • L4 a single bond or a group! ( ' (>.! .- ⁇ 14- where y is 0 or 1 and G4 is a straight or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight and / or branched and / or cyclic alkylene groups) single or multiple by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, SO2, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHM 1-.
  • -S02NHNH -, -CONHNH- and a 5- to 10-membered aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from, O and S, -SO- or -S02- may be interrupted (preferably
  • conjugates with corresponding linkers have the following structures, wherein XI is CH, X2 C, and X3 N, and L4 have the meanings given above, AK2 is an antibody which is bonded via a lysm residue, and n is a number of 1 to 10 is. More preferably, AK2 is a human, humanized or chimeric monoclonal anti-CD123 antibody or antigen-binding fragment thereof. Particularly preferred here is a chimeric or humanized anti-CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12F1. Particularly preferred are the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971.
  • SGI or SG is particularly preferred
  • X is H, a Ci-io-alkyl group, optionally with -NHCONH2, -COOK, -OH, NH 2 , NH-C NH2. or sulfonic acid may be substituted.
  • these Grappen LI can be exchanged by one of the LI groups specified for the above formula ⁇ - (CO) m -Ll-L2- ⁇ .
  • L2 is a succinic acid amide or derived therefrom, this amide can be partially or completely pre-purified in the form of the hydrolyzed open-chain succinamide, as described above.
  • conjugates having the basic structure (i) have the following structure, wherein XI is CH, X2C, and X3 is N, L4 has the same meaning as LI, AK1 is an anti-CD123 antibody bound via a cysteine residue , and n is a number from 1 to 10. Particular preference is given to a chimeric or humanized anti-CD 123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12F1.
  • the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971 are particularly preferred.
  • the conjugates according to the invention are prepared by initially providing the low molecular weight KSP inhibitor with a linker.
  • the intermediate thus obtained is then reacted with the binder (preferably Antiköiper).
  • the binder preferably Antiköiper
  • R represents -H or COOK
  • K is linear or branched, optionally substituted with Ci-Ce Aikoxy or -OH-substituted Cr Ct. Represents alkyl, and
  • XI CH, X2 C, and X3 is N, SGI, Li, L2, L3 and L4 have the same meaning as described above.
  • the tert-butyl-Grappe may be replaced by cyclohexyl.
  • the compound may be used, for example, in the form of its trifluoroacetic acid salt.
  • the antibody is preferably used in 2 to 12 fold molar excess over the binder.
  • lysine residue For the coupling to a lysine residue, one of the following compounds is preferably reacted with the lysine-containing binder such as an antibody:
  • succinimide-linked ADCs after conjugation can be converted into the open-chain benisylic acid amides, which have a favorable stability profile.
  • This reaction may be carried out at pH 7.5 to 9, preferably at pH 8, at a temperature of 25 ° C to 37 ° C, e.g. by stirring.
  • the preferred stirring time is 8 to 30 hours.
  • X 3 represents CH, X 2 C, and X 3 N; SG3 and LI have the same meaning as described above, and L2, L3 and L4 have the same meaning as LI; and R and K have the same meaning as described above.
  • a 1 is a cysteine residue-linked anti-CD123 antibody, and AK2 is a lysine-linked anti-CD 123 antibody.
  • AK1 and AK2 are chimeric or humanized anti- CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12F 3. Particularly preferred are the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971.
  • conjugation of organic molecules to antibodies via one or more sulfur atoms of C-stone residues of the antibody and / or via one or more NH groups of lysine residues of the antibody is preferred.
  • the antibody can be linked via a linkage with the linker.
  • the linkage of the antibody can be effected by means of a heteroatom of the binder.
  • Heteroatoms of the invention which can be used for linking are sulfur (in one embodiment via a sulfhydryl group of the antibody), oxygen (according to the invention by means of a carboxyl or hydroxyl group of the antibody) and nitrogen (in one embodiment via a primary or secondary amine or amide group of the antibody). These heteroatoms may be present in the natural antibody or introduced by chemical or molecular biological methods.
  • the linkage of the antibody with the toxophore has only a small influence on the binding activity of the antibody to the target molecule. In a preferred embodiment, the linkage has no influence on the binding activity of the antibody to the target molecule.
  • an immunoglobulin molecule preferably comprises a molecule having four polypeptide chains, two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains), which are typically linked by disulfide bridges.
  • Each heavy chain comprises a heavy chain variable domain (abbreviated VH) and heavy chain constant domain.
  • the heavy chain constant domain may include three domains CHI, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a variable domain (abbreviated VL) and a constant domain.
  • the constant domain of the light chain comprises a domain (abbreviated to CL).
  • VH and VL domains can be further subdivided into hypervariable regions, too Complementarity determining regions ("complementarity determining region”, abbreviated to CDR) and regions with lower sequence variability ("framework region”, abbreviated FR).
  • CDR Complementarity determining region
  • FR frame region
  • Each VH and VL region typically consists of three CDRs and up to four FRs.
  • FRl Complementarity determining region
  • FR2 Complementarity determining region
  • FR3 sequence variability
  • Em antibody can be obtained from any suitable species, eg, rabbit, llama, camel, mouse, or rat.
  • the antibody is of human or murine origin.
  • an antibody can be human, humanized or chimeric.
  • monoclonal antibody refers to antibodies obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, individual antibodies of the population are identical except for naturally occurring mutations which may occur in small numbers.Monoclonal antibodies recognize with high specificity a single antigenic binding site The term monoclonal antibody does not refer to a particular manufacturing process.
  • the term "intact" antibody refers to antibodies comprising both an antigen-binding domain and the light and heavy chain constant domain
  • the constant domain may be a naturally occurring domain, or a variant thereof in which multiple amino acid positions are altered were.
  • modified intact antibody refers to intact antibodies that have been fused to another polypeptide or protein other than an antibody via their amino acid nucleus or carboxy terminus via a covalent bond (eg, a peptide linkage) modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008, 26 (8): 925-32).
  • a covalent bond eg, a peptide linkage
  • human antibody refers to antibodies that can be obtained from a human or are synthetic human antibodies
  • a "synthetic” human antibody is an antibody that is available in part or in full as a whole from synthetic sequences in silico that are based on the Analysis of human antibody sequences.
  • a human antibody can e.g. be encoded by a nucleic acid isolated from a library of antibody sequences of human origin. An example of such antibodies is in Söderlind et al, Nature Biotech. 2000, 18: 853-856.
  • humanized or “chimeric” antibody describes antibodies consisting of a non-human and a human sequence portion. In these antibodies, part of the sequences of the human immunoglobulin (recipient) is replaced by sequence portions of a non-human human immunoglobulin (donor).
  • the donor is a murine immunoglobulin in many cases.
  • amino acids of the CDR of the recipient are replaced with amino acids of the donor. Sometimes amino acids of the framework are replaced by corresponding amino acids of the donor.
  • the humanized antibody contains amino acids that were neither in the recipient nor in the donor and that were inserted during optimization of the antibody.
  • the variable domains of the donor immunoglobulin are fused to the constant regions of a human antibody
  • complementarity determining region refers to those amino acids of a variable antibody domain necessary for binding to the antigen.
  • Each variable region typically has three CDR regions, referred to as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • Each CDR region may comprise amino acids as defined by Kabat and / or amino acids of a hypervariable loop defined by Chotia.
  • the Kabat definition includes, for example, the region of approximately amino acid position 24-34 (CDR!), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) of the variable light chain, and 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2 ) and 95-102 (CDR3) variable heavy chain (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
  • the definition according to Chotia includes the region of approximately amino acid position 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) and 91-96 (CDR3) of the variable ieichetn chain and 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) and 96-101 (CDR3) of the variable heavy chain Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)).
  • a CDR may comprise amino acids from a CDR region as defined by Kabat and Chotia.
  • antibodies can be divided into different classes. There are five major classes of intact antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, several of which can be broken down into other subclasses. (Isotypes), e.g. TgG1, IgG2, IgG3, TgG4, IgA1 and IgA2.
  • the heavy chain constant domain corresponding to the different classes are referred to as [alpha / a], [delta / ⁇ ], [epsilon / e], [gamma / ⁇ ] and [my / ⁇ ]. Both the three-dimensional structure and the subunit structure of antibodies are known.
  • the term "functional fragment” or "antigen binding antibody fragment” of an antibody / immunoglobulin is defined as a fragment of an antibody / immunoglobulin (eg, the variable domains of an IgG) which still comprises the antigen binding domains of the antibody immunoglobulin.
  • the "antigen-binding domain” of an antibody typically comprises one or more hypervariable regions of an antibody, eg CDR, CDR2 and / or CDR3 region.
  • the "framework” or “framework” region of an antibody may also play a role in binding the antibody to the antigen.
  • the framework region provides the framework for the CDRs.
  • the antigen-binding domain comprises at least amino acids 4 to 103 of the variable light chain and amino acids 5 to 109 of the variable heavy chain, more preferably the amino acids 3 to 107 of the variable light chain and 4 to 11 of the variable heavy chain; complete variable light and heavy chains, ie amino acid 3 - 309 of the VL and 1 to 113 of the VH (numbering according to WO97 / 08320).
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” of the invention do not comprehend Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments, diabodies, single domain antibodies (DAbs), linearae antibodies, single chain antibodies (single-ehain Fv , abbreviated scFv); and multi-specific, e.g. bi- and tri-specific antibodies formed from antibody fragments C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag).
  • Multi-specific antibodies are those with identical binding sites.
  • Multi-specific antibodies may be specific for different epitopes of an antigen or specific for epitopes of more than one antigen (see eg WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793, Tutt, et al. 1991, J. Immunol., 147: 60 69; US Fat Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; or Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553 ).
  • An F (ab '> 2 or Fab molecule can be designed to reduce or completely prevent the number of intermolecular disulfide interactions that occur between the Chi and CL domains.
  • Epiopic determinants refers to protein insert genes that can specifically bind to an immunoglobulin or T-cell receptor Epiopic determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or sugar side chains, or combinations thereof, and typically have specific 3-dimensional structural properties such as also specific charge characteristics.
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” may be fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino-terminus or carboxy-terminus via a covalent bond (eg, a peptide linkage). Furthermore, antibodies and antigen-binding fragments can be modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008 Aug; 26 (8): 925-32) ).
  • Polyclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art. Monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Köhler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
  • Humanized human monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Olsson et al., Meth Enzymol., 92, 3-16 and Cabilly et al., US 4,816,567 or Boss et al., US 4,816,397).
  • Antibodies of the invention can be obtained from recombinant antibody libraries, e.g. consists of the amino acid sequences of a variety of antibodies generated from a large number of healthy volunteers. Antibodies can also be made by known recombinant DNA technology. The nucleic acid sequence of an antibody can be obtained by routine sequencing, or is available from publicly available databases.
  • an “isolated” antibody or binder has been purified from other components of the cell Contaminating components of a cell that may interfere with a diagnostic or therapeutic use are, for example, enzymes, hormones, or other peptidic or non-peptidic components of a cell an antibody or binder that has been purified to more than 95% by weight of the antibody or binder (determined, for example, by Lowry method, UV-Vis spectroscopy, or by SDS capillary gel electrophoresis) and an antibody which has been purified to such an extent at least fifteen amino acids of amino acid or internal amino acid sequence can be determined or purified to homogeneity, homogeneity being determined by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions (detection may be determined by Coomassie Blue staining or preferably by silver staining).
  • An antibody is usually produced by one or more purification steps
  • specific binding refers to an antibody or binder that binds to a predetermined antigen / target molecule.
  • Specific binding of an antibody or binder typically describes an antibody or binding with an affinity of at least 10 -7 M (as Kd value, so preferably those with smaller Kd values as IQ '"-7 M), wherein the antibody or Binder has at least two-fold higher affinity for the predetermined antigen / target molecule than for a non-specific antigen / target molecule (eg, bovine senimalbumin, or casein) which is not the predetermined antigen / target molecule or a closely related antigen / target molecule an affinity of at least 10 " 'M (as Kd value, ie preferably those with smaller Kd values than 10 " ' M), preferably of at least 10 " M, more preferably in the range of 10 " 9 M to 10 " M
  • the Kd values can be determined by eg surface plasmon resonance spectroscopy.
  • the antibody-drug conjugates of the invention also have affinities in these areas.
  • the conjugation of the active substances preferably does not significantly affect the affinity (as a rule, the affinity is reduced by less than an order of magnitude, ie, for example, from a maximum of 10 ⁇ 8 M to 10 -7 M).
  • the antibodies used according to the invention are furthermore preferably characterized by a high selectivity.
  • a high selectivity is present when the antibody according to the invention has an affinity to the target protein which is better by at least a factor 2, preferably factor 5 or especially preferred factor 10, than to an independent other antigen, e.g. human serum albumin (the affinity can be determined, for example, by surface plasmon resonance spectroscopy).
  • the antibodies used according to the invention are preferably cross-reactive.
  • the antibody used according to the invention binds not only the human target protein but also binds the species Zieiprotein in the species used for the studies .
  • the antibody used according to the invention is, in addition to the human target protein, cross-reactive to the target protein of at least one other species.
  • rodent family pets dogs and non-human primates are used.
  • rodent species are mouse and rat.
  • Preferred non-human primates are rhesus monkeys, chimpanzees and long-tailed macaques.
  • the antibody used according to the invention is cross-reactive with the target protein of at least one other species selected from the group of species consisting of mouse, rat and long-tailed macaque (Macaca fascicularis).
  • the target protein of at least one other species selected from the group of species consisting of mouse, rat and long-tailed macaque (Macaca fascicularis).
  • antibodies used according to the invention which, in addition to the human target protein, are at least cross-reactive with the mouse goat protein.
  • Preference is given to cross-reactive antibodies whose affinity for the zieiprotein of the further non-human species does not differ by more than a factor of 50, in particular not more than a factor of ten, from the affinity for the human target protein.
  • the target molecule against which the binder e.g. an antibody or antigen-binding fragment thereof, a cancer target molecule.
  • cancer target molecule refers to a target molecule that is more abundant on one or more types of cancer cells than non-cancerous cells of the same tissue type
  • the cancer targeting molecule is selectively present on one or more cancer cell types compared to non-cancerous cells of the same tissue type , where selectively describes at least two-fold accumulation on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type! (a "selective cancer target molecule").
  • selective cancer target molecule allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates of the invention.
  • the functional Interleuldn 3 receptor is a heterodimer containing the specific alpha chain (IL-3Ra, CD123) and a "general" IL-3 receptor beta chain ( ⁇ C, CD131) that interact with the receptors for granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM -CSF) and interleukin 5 (IL-5).
  • IL-3Ra specific alpha chain
  • ⁇ C "general" IL-3 receptor beta chain
  • GM -CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IL-5 interleukin 5
  • CD 123 is a type 1 transmembrane protein with a calculated molecular weight of about 41 kDa.
  • CD123 comprises an extracellular domain involved in IL-3 binding, a transmembrane domain and a short zyloplasmalic end of about 50 amino acids.
  • the extracellular domain consists of two regions: an N-terminal region of about 100 amino acids that has sequence similarity with the equivalent regions of the GM-CSF and the IL-5 Rezeplor alpha chain, and a region proximal to the transmembrane domain, the four conserved cysteine residues and a common in the cytokine receptor family WSXWS motif.
  • the IL-3 binding domain comprises an approximately 200 amino acid residue cyanokine receptor (CRM) motif constructed from two Ig-like folded domains.
  • CCM cyanokine receptor
  • the extracellular domain of 3L-3Ra, CD123, is highly glycosylated, with N-linked glycosylation necessary for ligand binding and receptor signaling.
  • IL-3Ra CD123
  • hematopoietic progenitor cells such as hematopoietic progenitor cells, mast cells, erythroid cells, megakaryocytes, neutrophils, basophils and eosinophils, monocytes / macrophages, and CD5 + B lymphocytes
  • CD 123 is also expressed on non-hematopoietic cells such as dendritic cells, Leydig cells, endothelial cells and stromal cells.
  • IL-3Ra CD123
  • myelodysplastic syndrome a chronic myeloid leukemia (AML)
  • lymphoma a malignant neoplasm originating from a malignant neoplasm originating from a malignant neoplasm originating from a malignant neoplasm originating from a malignant neoplasm originating from a malignant neoplasm originating from a malignant IL-3Ra, CD123, is also expressed by cells involved in certain diseases; These diseases include: myelodysplastic syndrome, leukemia (such as acute myeloid leukemia (AML)), lymphoma, allergies and autoimmune diseases such as lupus or scleroderma.
  • AML acute myeloid leukemia
  • anti-IL-3Ra, anti-CD123, antibodies are useful in therapy as naked and coupled antibodies (such as ADCs).
  • the present invention relates to conjugates comprising antibodies which specifically bind to IL-3Ra, CD 123 (SEQ ID NO: 41).
  • anti-CD 123 antibody or “an antibody specifically binding to CD 123” refers to an antibody comprising the cancer target molecule CD123 (IL-3Ra, SEQ ID NO: 41) for diagnostic and / or diagnostic purposes.
  • the binding of an anti-CD 123 antibody to a CD 123 unrelated protein is less than 10% of the antibody's binding to CD123, such as can be determined by surface plasmon resonance spectroscopy.
  • the antibody binds CD123 (IL-3Ra, SEQ ID NO: 41) with a dissociation constant (KD) of ⁇ ⁇ , ⁇ 100 M, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 nM, ⁇ 0.01 nM, or ⁇ 0.001 nM.
  • KD dissociation constant
  • the anti-CD123 antibody binds to an epitope conserved between different species.
  • Antibodies that bind cancer targeting molecules can be prepared by those of ordinary skill in the art by known methods such as chemical synthesis or recombinant expression. Cancer target binders can be purchased commercially or can be prepared by one of ordinary skill in the art by known methods such as chemical synthesis or recombinant expression. Further methods for producing antibodies or antigen-binding antibody fragments are described in WO 2007/070538 (see page 22 "Antibodies"). The person skilled in the art knows methods such as so-called phage display libraries (eg Morphosys HuCAL Gold) and can be used to detect antibodies or antigen-binding antibody fragments (see WO 2007/070538, page 24 ff and AK example 1 on page 70, AK example 2 on page 72).
  • phage display libraries eg Morphosys HuCAL Gold
  • Verfaliren for the production of an IgGl antibody are be Kunststoffieben example in WO 2007/070538 in Example 6 on page 74 ff.
  • Procedures with which the intemalization of an antibody after binding to its antigen can be determined are known to the person skilled in the art and are described, for example, in WO 2007/070538 on page 80.
  • the person skilled in the art can use the methods described in WO 2007/070538, which were used for the production of carbonic anhydrase IX (Mn) antibodies, for the preparation of antibodies with a different target molecule specificity.
  • an anti-CD123 antibody or an antigen-binding fragment thereof is used, preferably one selected from those described below or modified by a suitable mutation.
  • those skilled in the art are aware of antibodies that bind to CD 123.
  • Antibody TPP-6013 is a chimeric variant of 12F1.
  • the invention relates to conjugates with antibodies or antigen-binding amino acid fragments thereof, or variants thereof, which are based on mouse-derived antibodies 7G3 (Sun et al., 1996, Blood 87 (1): 83-92) and 12F1 (Kuo et al. 20 (10): 1975-82), or conjugates with antibodies or antigen-binding antibody fragments thereof, or variants thereof, which are based on mouse-derived antibody 12F1 (Kuo et al., 2009, Bioeonjug Chem. 20 (10): 3975-82).
  • variable regions (VH and VL) of 7G3 were obtained by CDR grafting into human framework regions: TPP-5968, TPP-5969 and TPP 5,971th
  • variable regions (VH and VL) sequences of 12F1 Based on the publication of the variable regions (VH and VL) sequences of 12F1 (WO 2013/173820), the following antibody sequences were obtained by fusion of the variable domains of the donor immunoglobulin (VH and VL) with the constant regions of a human antibody: TPP 6013th
  • anti-CD 123 antibodies Particular embodiments of anti-CD 123 antibodies
  • TPP-6013 is a chimeric variant of 12F1 in which the VH and VL variable regions are linked to the constant regions (CL, CHI, CH2, CH3) of a human kappa subtype IgG1.
  • TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971 are humanized variants of 7G3 as a subtype of human IgG1 kappa.
  • TPP-5968 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 9 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 10.
  • TPP-5969 is an antibody uniquely a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 19 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 20,
  • TPP-5971 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 29 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 30,
  • TPP-6013 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 39 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 40,
  • TPP-5968 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 5.
  • TPP-5969 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 11 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 15.
  • TPP-5971 is an antibody comprising a heavy chain variable region according to SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 25.
  • TPP-601 3 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 33 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO : 35.
  • Preferred embodiments of the ariti CD123 antiloeter for coupling with linkers and / or toxophores according to the invention are the following:
  • An antibody or antigen binding fragment thereof which binds to CD123 and is a chimeric or humanized variant of the antibodies 7G3 or 12F1,
  • variable heavy chain comprising the heavy chain CDR1 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 2, the heavy chain CDR2 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 3 and the variable CDR3 heavy chain sequence; as shown by SEQ ID NO: 4, as well as
  • variable light chain comprising the light chain variable CDR1 sequence represented by SEQ ID NO: 6, the light chain variable CDR2 sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO : 8 or
  • variable heavy chain comprising the variable CDR1 heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 12, the variable Heavy chain CDR2 sequence as represented by SEQ ID NO: 13 and the CDR3 heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 14, as well as
  • variable light chain comprising the light chain variable CDR1 sequence represented by SEQ ID NO: 16, the light chain variable CDR2 sequence represented by SEQ ID NO: 17, and the light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO : 18 or
  • variable heavy chain comprising the heavy chain variable CDR1 sequence as represented by SEQ ID NO: 22, the heavy chain CDR2 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 23 and the heavy chain variable CDR3 sequence, as shown by SEQ ID NO: 24, as well as
  • variable light chain comprising the variable CDR1 light chain variable sequence represented by SEQ ID NO: 26, the light chain variable CDR2 sequence represented by SEQ ID NO: 27 and the light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO : 28 or
  • variable heavy chain comprising the heavy chain CDR1 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 32, the heavy chain CDR2 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 33 and the variable CDR3 heavy chain sequence, as represented by SEQ ID NO: 34, as well as
  • variable light chain comprising the light chain variable CDR1 sequence represented by SEQ ID NO: 36, the light chain variable CDR2 sequence represented by SEQ ID NO: 37, and the light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO : 38.
  • the antibody according to any one of the preceding embodiments which is an IgG antibody.
  • the antibody according to any one of the preceding embodiments comprising: the antigen-binding fragment according to one of the preceding embodiments or an antigen-binding fragment of an antibody according to one of the preceding embodiments which contains an scFv, Fab, Fab 'fragment or an F (ab) 2 Fragment is.
  • the antibody or antigen binding fragment according to any preceding embodiment which is a monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof.
  • the antibody or antigen binding fragment of any of the preceding embodiments which is a human, humanized or chimeric antibody or an antigen binding fragment.
  • Particularly preferred are the anti-CD 123 antibodies "TPP-6013", “TPP-5968", “TPP-5969” and "TPP-5971”.
  • the present invention also encompasses all suitable isotopic variants of the compounds according to the invention.
  • an isotopic variant of a compound according to the invention is meant a compound in which at least one atom within the compound according to the invention is reactive with another atom of the same atomic number but with a different atomic mass than the one of the atomic number is usually or primarily occurring in nature atomic mass exchanged
  • isotopes that can be incorporated into a compound of the invention are those of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, chlorine, bromine and iodine, such as 2 H (deuterium), 3 H (tritium), i3 C, 4 C, "N, 17 0, ig O, 32 P, 33 P, 33 S, 34 S, 35 S, 6 S, 18 F, 36 C 1, 82 Br, 12 1, 124 1, m l and i3, L
  • isotopes such as deuterium may result in certain therapeutic benefits as a result of greater metabolic stability of the compound, such as prolonging the body's half-life or reducing the required effective dose;
  • isotopic variants of the compounds according to the invention can be prepared by the methods known to the person skilled in the art, for example by the methods described below and the rules given in the exemplary embodiments, by using appropriate isotopic modifications of the respective reagents and / or starting compounds.
  • Salts which are preferred in the context of the present invention are physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention. Also included are salts which are themselves unsuitable for pharmaceutical applications but can be used, for example, for the isolation or purification of the compounds of the invention.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention are acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, for example salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, touluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, citric acid, Fumaric acid, maleic acid and benzoic acid.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention also include salts of customary bases, such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (eg sodium and potassium salts), alkaline earths (eg calcium and magnesium salts) and ammonium salts derived from ammonia or organic amines having 1 to 16 carbon atoms, such as, by way of example and by way of illustration, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, dietlianolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, N-methylpiperidine, A 1 -methylmorpholine, arginine, lysine and 1,2-ethylenediarnine.
  • customary bases such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (eg sodium and potassium salts), alkaline earths (eg
  • Solvates in the context of the invention are those forms of the compounds according to the invention which form a complex in the solid or liquid state by coordination with solvent molecules. Hydrates are a special form of solvates that coordinate with water. As solvates, hydrates are preferred in the context of the present invention.
  • the present invention also includes prodrugs of the compounds of the invention.
  • prodrugs refers to compounds which themselves may be biologically active or inactive, but are converted during their residence time in the body to compounds of the invention (for example metabolically or hydrolytically).
  • KSP-L- is a compound represented by the following formula (I), (Ta), (II), (IIa), (IIb), (ITe), (Ild), (He), (Iii), (IIj) (Ilk) or the following formula (ITf),
  • the binder is an anti-CD123 antibody (most preferably a chimeric or humanized anti-CD 123 antibody derived from a murine antibody 7G3 or 12.Fi, in particular the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971), and n is a number from 1 to 10:
  • A is CO (carbonyl);
  • R '-L- # 1 H, -COOH, -CONI-INH 2 , - (CH 2 ) i- 3 H 2 , -CONZ "(CH 2 ) i-3 H 2 and CONZ" CH 2 COOH where Z is H or H 2 ;
  • R 2 and R 4 are H, or R and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 1! - or -CHR n represents -CH 2 -, wherein R 11 represents H;
  • R 5 is H or F
  • R 6 and R ' are independently of each other the H, (optionally fluorinated) Cj.j-Alkyi, (optionally fluorinated) C 2 . 4 alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 ..4 "alkynyl, hydroxy or halogen;
  • R 8 is a branched Ci-s-alkyl group;
  • R is H or F, where one of the substituents R ! and R 3 represents -L- # 1, and
  • L represents the linker and # 3 represents the binding to the antibody, as well as salts, solvates and salts of the solvates of the ADC.
  • the linker is preferably a linker
  • n 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to KSP
  • ⁇ represents the binding to the antibody
  • # 'de denotes the site of attachment to the sulfur atom of the antibody
  • # denotes the site of attachment to the group L 1
  • LI represents the formula
  • R 10 is LiX or Cl is C 3 alkyl
  • G represents -NHCO- or ⁇ ___ /;
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G 2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 1 00 carbon atoms of arylene groups and or of straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO- , S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONH H-, and a 3 to 10-membered aromatic or non-aromatic heterocycle of up to 4 heteroatoms
  • - N N-CO- selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably ⁇ /), the side chains, if present, with -NHCONH 2 , -COOK, -OH, -NH 2 , HC NHi, sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • # 1 is the binding to the CSF inhibitor and # - the binding to the coupling group to the antibody (eg, L2).
  • KSP-L- is a compound of the following formula (I), (ia), (II), (IIa), (IIb), (lic), (Ild), (He), (III), (Iii) (Iii), (Ilk) or the following formula (Hg)
  • the binder is an anti-CD 123 antibody (more preferably a chimeric or humanized anti-CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12.Fi in particular the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971), and n is a number from 1 to 10:
  • A is CO (carbonyl);
  • R z and R 4 are H, or R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrole ring) -CH 2 -CHR "- or -CHR 1! -CH 2 -, wherein R n represents H;
  • R s is H or F
  • R 6 and R 7 are independently H, (optionally fluorinated) Cw Alkyi, (optionally fluorinated) C represent C2 _4 alkenyl, (optionally fluorinated) 2 -4-alkynyl, hydroxy or halogen;
  • R s is a branched C 1-5 alkyl oro group
  • R is H or F, wherein one of the substituents R 1 and R 3 represents -L- # 1, and
  • L represents the linker and # 1 represents the binding to the antibody
  • rn 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to KSP
  • ⁇ represents the binding to the antibody
  • R 10 is H, NH 2 or C 1 -C 3 alkyl; Gl -NHCO- or represents;
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups is one or more times by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NB-, - CO-, -N! ! ( ' ⁇ ! ⁇ . - (( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . - Me-, - ⁇ -, -SO2NHNH-, -COH H- and a 3 to lOgiiedriger, aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms
  • - N-CO- selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably ⁇ /), the side chains, if present, with - HCONH 2 , -COOK, -OH, -NH 2 , NH- C NH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted,
  • KSP-L- is a compound of the following formula (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IM), (He), (IIIf), (Hg); (Iii), (iii), (Ilk) or the following formula (31h),
  • the binder is an anti-CD123 antibody (more preferably a chimeric or humanized anti-CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12F1 in particular the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP-5971), and n is a number from 1 to 10:
  • A is CO (carbonyl); R -L- # l is;
  • R 2 and R 4 are H, or R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, wherein R u represents H;
  • R 3 is a Ci-io-alkyl, optionally with -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-alkyl, NH-CO-alkyl, NH-CO -NH-alkyl, SiO) "- alkyl, S0 2 ⁇ NH-alkyl, ⁇ -alkyl, N (alkyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C1-3 alkyl), or -MOD;
  • R 10 is H or Ci-C, - alkyl
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R y is H, phenyl, C 2 -C 4 -alkyl, C 2 -C 4 -Q -alkenyl, or C 2 -C 1 2-C 1-alkynyl, each with
  • R 5 is H or F
  • R 6 and R ? independently represent H, (optionally fluorinated) -3- Cj alkyl, (optionally fluorinated) C2 .4 alkenyl, (optionally fluorinated) C.- alkynyl, hydroxy or halogen;
  • R 8 is a branched Ci-s-alkyl group;
  • R is H or F, where -L is the linker and # 1 is the bond to the antibody,
  • n 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to KSP
  • ⁇ represents the binding to the antibody
  • linkage site is labeled with the sulfur atom of the antibody
  • # 2 denotes the linkage site with the group L 1
  • LI is represented by the formula
  • R l 0 H 5 NHj 0 de. r is C1-C3 alkyl; Gl ⁇ 1 represents K / O- or ⁇ ;
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • S02- may be interrupted (preferably ⁇ /), whereby hydrocarbon chain including the side chains, if present, with -NHCONH 2 , -COOK, -OH, -NH ?, NH-
  • CNNH2 sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • the binding to the KSP inhibitor and the binding to the coupling group to the antibody is (for example L2),
  • the invention also provides binder-drug conjugates of the following general formula:
  • BINDER for the anti-CD123 antibody (particularly preferably a chimeric or humanized anti-CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12F1, in particular the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP- 5971), L for the linker, WS for the active ingredient, preferably a KSP inhibitor, such as, for example, a KSP inhibitor according to the invention of one of the formulas (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), ( IIc), (lid), (Ile), (Iii), (Hg), (Uli) (Iii), m is a number from 1 to 2, preferably 1, and n is a number from 1 to 50, preferably 1.2 to 20 and more preferably 2 to 8, wherein L is one of the following Structures aut réelle.
  • m is the number of drug molecules per linker and n is an average of the number of drug-linker conjugates per BINDER.
  • WS is an active substance which shows therapeutic effect in animals, preferably humans, a local or systemic effect.
  • active ingredients generally have a molecular weight of less than 5 kDa, preferably less than 1.5 kDa.
  • Preferred active ingredients are vinca alkaloids, auristatins, tubulysins, duocarmycins, kinase inhibitors, MEK inhibitors and KSP inhibitors.
  • Formula A4 where # 'denotes the point of attachment to the sulfur atom of the binder, # 2 denotes the point of attachment to the active substance, x represents I or 2, and R i - COOH, COOR, COR (with R in each case Cl-3-alkyl), CONH2 , Br, preferably represents COOH ,.
  • LI has the same meaning as above.
  • -L- # 2 is represented by the following formula:
  • R represents H, NH 2 or Ci-CL-alkyl
  • R 10 is not NH 2
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G 2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms from aryiene clusters and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is monosubstituted or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO- , SO 2, - RY, - RYCO-, -C (NH) R V -, -CONRY-, -NRYNRY-, -S ⁇ ) 2 ⁇ R> ' ⁇ R. V -.
  • R y is H, phenyl, C 1 -C 1 -Q-alkyl, C 2 -C 1 -Q-alkenyl, or C 2 -C 10 -Q-alkynyl], each containing HCONH 2 , -COOH, -OH, - H2 may be substituted, NH-C NH2, sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid), -CO-, -CR x -N-0- (wherein Rx is H, C j -C ⁇ alkyl or phenyl) and / or a 3 to 10-membered, aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -SO 2 - may be interrupted (preferably
  • hydrocarbon chain including the side chains may be substituted with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2, sulfonamide, suifon, sulfoxide, or sulfonic acid.
  • Rx is H, Ci-C ⁇ alkyl or phenyl.
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, more preferably more than 90%, particularly preferably (based on the total number of linker bonds to the antibody) one of the two structures of the formula A3 or A4 ago.
  • conjugates with the linkers of formula A3 or A4 can be obtained by coupling the antibodies to the corresponding bromo derivatives of the following formulas A3 'or A4':
  • bromo derivatives of the formula A3 'or A4' can be obtained by reacting R2: CF12CHB COO I or 22CHB1CH2COOH with an amine group of the binder, as exemplified in the following Sciiemata 30 to 32.
  • the invention also provides binder-drug conjugates of the following general formula:
  • BINDER for the anti-CD123 antibody (particularly preferably a chimeric or humanized anti-CD123 antibody derived from a mouse-derived antibody 7G3 or 12F1, in particular the antibodies TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 and TPP- 5971), L for the linker, WS for the active ingredient, preferably a KSP inhibitor, such as a KSP inhibitor according to the invention of one of the formulas (I), (Ia), (II), or (IIa), m for a number from 1 to 2, preferably 1, and n is a number from 1 to 50, preferably 1.2 to 20 and more preferably 2 to 8, wherein I. has one of the following structures.
  • m is the number of drug molecules per linker and n is an average of the number of drug-linker conjugates per BINDER. The sum of all WS present in a conjugate molecule is thus the product of m and n.
  • linkage with the sulfur atom of the binder can thus have one of the following structures:
  • both structures according to formulas AI and / or A2 may be present in an antibody-drug conjugate. Since the antibody-active substance conjugates according to the invention can be a mixture of different antibody-active substance conjugates, it is also possible that in this mixture, antibody-active substance conjugates with both the formula AI or formula A2 and with the Formula AI and A2 are included.
  • X represents a 5- or 6-membered, aromatic or non-aromatic heterocycle or homocycle, preferably -C5H4- or -
  • RS represents an acid group, preferably -COOH or SO 3 H.
  • L? is a single bond or a group selected from a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 (preferably 1 to 10) carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of Groups -O-, -S-, -SO-, SO 2 , -NR '-, -
  • R> ( ⁇ (> -. -C (NH) NRY-, -CONRY-, -NRVNRV-, -S (>2N> ⁇ 'R> -. -CONRVNRy- (wherein R y is H, phenyl, C ; -Cl 0 alkyl, C ⁇ -C j Q alkenyl, or C ⁇ -C-Q Aikinyl, each with
  • S02- may be interrupted (preferably , where the
  • H -NHCO 2 - may be substituted COOH, -OH, -NH 2, NH-CNNH2, sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid.
  • Le is preferably a group selected from --- CONH and -NHCO-.
  • L? is preferably a terminal bond or - [(CH 2) x - (X 4 ) y ] w - (CH 2) z-,
  • X 4 is -O-, -CONH-, -NHCO- or represents.
  • -L5- L7- represents - (CH 2) m - (CHR s ) n - (OCH 2 CH 2 ) 0 - (X) p- (CH 2) q --- NHCO ---

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Binder- Wirkstoff-Konjugate (ADCs), wirksame Metabolite dieser ADCs, Verfahren zur Herstellung dieser ADCs, die Verwendung dieser ADCs zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser ADCs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.

Description

Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) von KSP-Inhibitoresi mit anti-CD 123- Antikörpern
Einleitung und Stand der Technik
Die Erfindung betrifft Binder- Wirkstoff-Konjugate (ADCs) von Kinesin Spindel Protein- Inhibitoren, wirksamer Metabolite dieser ADCs, Verfahren zur Hersteilung dieser ADCs, die Verwendung dieser ADCs zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser ADCs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.
Krebserkrankungen sind die Folge unkontrollierten Zellwachstums verschiedenster Gewebe. In vielen Fällen dringen die neuen Zellen in bestehende Gewebe ein (invasives Wachstum), oder sie metastasieren in entfernte Organe. Krebserkrankungen treten in verschiedensten Organen auf und haben oft gewebespezifische Krankheitsverläufe. Daher beschreibt die Bezeichnung Krebserkrankung als Oberbegriff eine große Gruppe definierter Erkrankungen verschiedener Organe, Gewebe und Zelltypen.
Tumore früher Stadien lassen sich gegebenenfalls durch chirurgische und radiotherapeutische Maßnahmen entfernen. Metastasierte Tumore können im Regelfall durch Chemotherapeutika nur palliativ therapiert werden. Ziel hierbei ist, die optimale Kombination aus einer Verbesserang der Lebensqualität und der Verlängerung der Lebenszeit zu erreichen.
Konjugale von Binderproteinen mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen sind bekannt, insbesondere in Form sogannter „antibody drug conjugates" (ADCs), in welchen ein internalisierender, gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichteter Antikörper auf kovalente Weise über eine Verknüpfungseinheit ("linker") mit einem c totoxisch wirkenden Agens verbunden ist. Nach Einschleusung des ADCs in die Tumorzelle und anschließender Spaltung des Konjugats wird dann innerhalb der Tumorzelle entweder das cytotoxische Agens selbst oder ein anderer daraus gebildeter cytotoxisch wirksamer Metabolit freigesetzt, und kann dort seine Wirkung direkt und selektiv entfalten. Auf diesem Wege könnte die Schädigung von normalem Gewebe im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie der Krebserkrankung in signifikant engere Grenzen gehalten werden [siehe z.B. J. M. Lambert, Curr, Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu und P. D. S enter, Not. Biotechnol. 23, 1 137- 3 146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Cnern. 21, 5-13 (2010)1, So beschreibt WO2012/171020 ADCs, bei denen mehrere Toxophormoleküle über einen polymeren Linker an einen Antikörper verknüpft ist. Als mögliche Toxophore werden in WO2012/171020 unter anderem die Substanzen SB 743921, SB 715992 (Ispinesib), MK-0371 , AZD8477, AZ3146 und ARRY-520 erwähnt.
Die zuletzt genannten Substanzen sind sogenannte Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren. Kinesin Spindel Protein (KSP, auch bekannt als Eg5, HsEg5, KNSL1 oder KIF1 1) ist ein Kinesin-ähnliches Motorprotein, welches für die Funktion der bipolaren mitotischen Spindel essentiell ist. Die Inhibierung von KSP fuhrt zum mitotischen Stillstand und über einen längeren Zeitraum zur Apoptose (Tao et al, Cancer Cell 2005 lul 8(1), 39-59). Nach dem Auffinden des ersten zellgängigen KSP -Inhibitors, Monastrol, haben sich KSP-Inhibitoren als eine Klasse neuer Chemotherapeutika etabliert (Mayer et al., Science 286: 971 -974, 1999) und sind Gegenstand einer Reihe von Patentanmeldungen (z.B. WO2006/044825; WO2006/002236; WO2005/051922; WO2006/060737; WO03/060064; WO03/040979; und WO03/049527). Da KSP jedoch nur in einem kurzen Zeitraum der Mitosephase seine Wirkung entfaltet, müssen KSP-Inhibitoren in ausreichend hoher Konzentration während dieser Phase vorliegen, WO2014/151030 offenbart ADCs mit bestimmten KSP-Inhibitoren.
Zusammenfassung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Substanzen bereitzusteilen, die nach Verabreichung in relativ geringer Konzentration eine apoptotische Wirkung zeigen und damit für die Krebstherapie nützlich sein können.
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung Konjugate eines anti-CD123-Antikörpers mit Verbindungen der folgenden Formel (I) bereit, wobei eine oder mehrere der Verbindungen der Formel (I) mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist bzw. sind. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper. Bevorzugt ist hierbei ein ehimärer oder humanisierter an ti-CD123- Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1. Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP- 5968, TPP-5969 und TPP-5971. Formel (I):
wobei
R1 H, Ι , ··· . -MOD oder i Cl i ),, ;/ darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- ΝΥ'Υ2, oder -CO-OV darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' (z.B. -(CH2)o-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder ~(CH2)0.3Z ' darstellt, wobei Z' H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CHCNH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-s Alkyl oder gegebenenfalls mit ~NH2 substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt;
R2 H, -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -( (Ή.· ),·. :/. darsieilt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY' Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(€Η2)Ο-Γ,Ζ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit--NHCONH2 substituiertes, C ι-s Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt und Y* H oder••■CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes CM Alkyl darstellt;
R4 H, -L~#l, -SGlys-(CO)0-i -R4% -CO-CHY^NHY5 oder -(CH2)o.3Z darstellt,
wobei SGjyS eine durch ein lysosomaies Enzym spaltbare Grappe darsteilt, insbesondere eine Grappe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine Ci- 10- Alkyl-, Cs-io-A-yl- oder Ce-jo- Araikyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Cno-Alk l-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl- alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io- Heteroaralkoxy-, Cwo-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO- Alkyl, N(Aikyl)-COAlkyl, -SO3H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, ~CON(Alk:yl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe ~Ox-(CH2CH20)yR4 darstellt, (wobei x 0 oder I und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise CU2- Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Arningruppe vorliegt (entsprechend R = H); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NYV, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)o-;Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, Ci..& Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes CM Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H, H2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, C i-4 Haloalkyl, C 1-4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C Alkyl, COO(C Λ Alkyl) oder OH darsteilt;
A CO, SO, S02, SO.M I oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l , -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine Cwo-Alkyl-, Ce-io- Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, G-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O- Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- H- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)a-Alkyl Gruppen, 1-3 -SO2- H- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2J0- iZ Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder - CO-OY' darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CHjjo-jZ' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH{NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)0-3Z ' darstellt, wobei 7 H, SO3H, NH oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet);
R5 H, NH2, N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder - (CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-:;Z' darstellen, und Y3 H oder - darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
darstellt, R" und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) G-jo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) CJ-IO- Alkenyi, (ggf. fluoriertes) Cj-io-Alkinyl, Hydro xy, NO?., H2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) Ci-i©-Alky!, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) oder-(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heierocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt, wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann;
R i L F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt;
wobei einer der Substituenten R1 , R3 oder R4 -L-#l darstellt bzw. (im Falle von R8) aufweist, L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Bi nder bzw. Derivat hiervon steht, wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R10 H oder Ci -C,-Aikyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CÖNH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 3 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -Ö-, -S-, -
SO-, SO2, · N R> ·.. - RyCO-, CONRy-, - yNRy-, -S02NRy R -, -CONR N y-, (wobei Ry H, Phenyl, C] -C] Q-Alkyl, C^-C iQ-Aikenvl, oder C2-C j Q-Alki yi darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, - H2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N~0- (wobei Rx H, Cj -C3-A!kyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate,Salze der Solvate und Epimere. Die erfindungsgemäßen Konjugale können chemisch labile Linker, enzymatisch labile Linker oder stabile Linker aufweisen. Besonders bevorzugt sind stabile Linker und durch eine Protease spaltbare Linker.
Die Erfindung stellt ferner bereit Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugal« sowie Vorstufen und Intennediate zur Herstellung.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugale umfasst regelmäßig die folgenden Schritte:
Herstellen einer ggf. Schutzgruppen tragenden Linkervorstufe mit einer reaktiven Gruppe, die an den Antikörper koppeln kann;
Konjugieren der Linkervorstufe an das ggf. Schutzgruppen tragende Derivat eines SP-Inhibitors der Formel (I) , wobei in diesen Formeln eine Bindung an einen Linker noch nicht vorliegt), wobei ein ggf. Schutzgruppen tragendes reaktives KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat erhalten wird;
Abspaltung der ggf. vorhandenen Schutzgruppen im KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat und
Konjugieren des Antikörpers an das KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat, wobei das erfindungsgemäße Antiköiper-KSP-Inhibitor-Konjugat erhalten wird.
Die Anknüpfung der reaktiven Gruppe kann auch nach Aufbau einer ggf. geschützt vorliegenden KSP-Inhibitor-Linkervorstufe Konjugats erfolgen.
In Abhängigkeit vom Linker können Succinimid-verknüfte ADCs nach der Konjugation nach Schema 26 in die offenkettige en Bernsteinsäureamide überführt werden, die ein vorteilhaftes Stabilitätsprofil aufweisen.
Wie oben erläutert, kann das Konjugieren der Linker Vor tufe an einen niedermolekularen KSP- Inhibitor durch Substitution eines Wasserstoffatoms an R1, R3 oder R4 in Formel (I) durch den Linker erfolgen. In den Syntheseschritten vor der Konjugation können ggf. vorhandene funktionelle Gruppen auch in geschützter Form vorliegen. Vor dem Konjugationsschritt werden diese Schutzgruppen nach bekannten Methoden der Peptidehemie entfernt. Die Konjugation kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-Inhibitor für die Konjugation an den Linker ggf. zu modifizieren, z.B. durch Einführen von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur einfacheren Subslituierung. Insbesondere stellt die Erfindung neue niedermolekulare KSP-Irthibitoren bereit, die an einen anti- CD 123-Antikärper wie chimäre oder humanisierte Varianten von 7G3 oder 12F1 konjugiert worden sind. Diese KSP-Inhibitoren bzw. ihre Antikörper-Konjugate weisen die folgende allgemeine Formel (II) auf:
wobe
R H, -L-BINDER, MOD oder -(CH2)o-;Z darstellt, wobei Z -H, - HYJ
OY3, -SY}, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wooei
Y1 und Yz unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o.3Z'(z.B.
(CH2)o-3Z '), oder -CH(CH2W)Z' darstellen,
Y3 H oder ·{( I i -}., :/.· darstellt,
Z' H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH( H2)COOH
oder ·{(;( ). N M -ί, Π V i :(. Onl ! darstellt;
w H oder OH darstellt,
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(H))-NH2 substituiertes, Ci-eAlkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aiyl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -Ci ;- Π ίΥ · -\Ή Υ" oder -(CH2)o-3Z darstellt,
oder
R und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR1 '- oder
-CHR'-CH2- darstellen,
wobei RS 1 -H, - H2, SO : I i. -COOH, -SH, Halogen (insbesondere F oder Cl),
C Alkyl, Haloalkyl, C5.4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes Cj-4 Alkyl, COO(Ci-4 Alkyl) oder -OH darstellt;
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH o-sZ' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO:.H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls roit-NHCONH? substituiertes, Ci-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y' H oder -CÖ-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y* lineares oder verzweigtes Ci-e Alkyl darstellt;
R4 H, -L-BINDER, -SGiys-(CO)0-] -R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei SGfyg eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine Ci-io- lkyl-, Cs-jo-Aryl- oder Ce-io- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyi-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heieroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io- Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO- Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyi)2, oder OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)v-R4" darstellt (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R4" -H, - Alkyl (vorzugsweise Ci..!2- Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH 0-3Z' daxstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CflY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes CM Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrroiidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHR1-CH2- darstellen, wobei R10 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, C]-4 Haloaiky3, CM Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyl, COO(CM Alkyl) oder OH darstellt;
A •Ci ( > ·· . -S(-O)-, -S( < !} ·.. -S( < !i -N i ! oder -C NH2- darstellt; R3 -L-BINDER, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Ar l-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci- io-Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs- io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkyl grappen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 3 -3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH- Alkyl Gruppen, 3 -3 -NH-CO- Aikyl Grappen, 3 -3 -NH-CO- H- Alkyl Grappen, 1-3 -S(0)„-Alkyl Grappen, 1-3 -SO2- H- Alkyl Grappen, 1 -3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CI-Ljo- 3Z Grappen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y' und Yz unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CI^o-sZ' darstellen, und Y' H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)ö-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei T H, SO3H, "NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet);
n für 0, 1 oder 2 steht,
R5 H, NH2, N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder - (CH2J0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY[Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CTb sZ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2J0-3Z' darstellt, wobei Ζ' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
darstellt,
R8 (ggf. fluoriertes) Cj-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) Co-io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Cycloalkyl oder -(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heieroaiomen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder H2 substituiert sein kann;
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für einen anti-CD 123- Antikörper steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann, wobei ein Vertreter von R1, RJ und R4 -L-Binder darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-jo-Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen, wobei -MOD -(NRi0)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R!0 H oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R!0 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 isi;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SC)2, -NRY-, -NR-vCO-, CONRY-, -NRYNRY-, -S02NRYNRY-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C\ -Ci Q-Alkyl, C2-C1 Q-Alkenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOK, -OH, - H2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, C -C ^-Alkyi oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit N HCON i b. -COOK, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, d Salze der Solvate und Epimere.
Beschreibung der Figuren Figur 1: Sequenzlisting.
Figur 2: Annotierte Sequenz der Antikörper. Es sind jeweils zu den Antikörpern oder Antikörperfragmenten die CDR-Bereiche (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) und variablen Bereiche (VH, VL) hervorgehoben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Konjugate eines anti-CD123-Antikörpers mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen bereit, wobei das Wirkstoffmolekül ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-Inhibitor) ist, das mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist. Das erfindungsgemäße Konjugal kann durch die allgemeine Formel
BINDER-+ L" KSP
n dargestellt werden, wobei BINDER für den anti-CD 123 -Antikörper, L für den Linker, KSP für den KSP -Inhibitor, und n für eine Zahl von I bis 50, vorzugsweise 1 ,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht. Hierbei ist n ein Mittelwert der Anzahl an KSP-Inhibitor-Linker-Konjugate pro BINDER. KSP-L weist vorzugsweise die oben aufgeführte Formel (I) auf. Weiterhin ist es bevorzugt, dass der Linker an verschiedene Aminosäuren des Antikörpers gebunden ist. Besonders bevorzugt ist eine Bindung an unterschiedliche Cysteinreste des Binders. Der anti-CD123- Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper. Bevorzugt ist hierbei ein chimärer oder humanisierter anti-CD123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 32F1 . Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971.
Im Folgenden werden erfindungsgemäß verwendbare Antikörper, erfindungsgemäß verwendbare KSP-Inhibitoren sowie erfindungsgemäß verwendbare Linker beschrieben, die ohne Einschränkung in Kombination verwendet werden können. Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Binder in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten KSP-Inhibitoren, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Linkern verwendet werden.
KSP-Inhibitoren und deren Binderkonjugate
Definitionen
Der Begriff„substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Wasserstoffe an dem bezeichneten Atom bzw. der bezeichneten Gruppe durch eine Auswahl aus der angegebenen Gruppe ersetzt ist/sind, mit der Maßgabe, dass die normale Wertigkeit des bezeichneten Atoms unter den vorliegenden Umständen nicht überschritten wird. Kombinationen von Substituenten und/oder Variablen sind zulässig.
Der Begriff'„gegebenenfalls substituiert." bedeutet, dass die Anzahl an Substituenten gleich oder verschieden von Null sein kann. Wenn nicht anders angegeben, können gegebenenfalls substituierte Gruppen durch so viele fakultative Substituenten substituiert sein, wie sich durch Ersetzen eines Wasserstoffatoms durch einen Nicht- Wasserstoff-Suhstituenten an einem beliebigen verfügbaren Kohlenstoff- oder Stickstoff- oder Schwefelatom unterbringen lassen. Normalerweise kann die Anzahl an fakultativen Substituenten (falls vorhanden) 1 , 2, 3, 4 oder 5, insbesondere von 1, 2, oder 3 sein.
So, wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "ein- oder mehrfach", zum Beispiel in der Definition der Substituenten der Verbindungen der allgemeinen Formeln der vorliegenden Erfindung, "1 , 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1, 2, 3 oder 4, besonders bevorzugt 1, 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt 1 oder 2".
Sind Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert, so können die Reste, wenn nicht anders angegeben, ein- oder mehrfach substituiert sein, im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind die Bedeutungen aller Reste, die mehrfach auftreten, unabhängig voneinander. Eine Substitution durch, einen, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Substituenten ist be vorzugt. Die Substitution durch einen Substituenten ist besonders bevorzugt.
Alkvi
Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten, monovalenten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Q-Cjo-Alkyl), in der Regel 1 bis 6 (Q-Ce-Alkyl), bevorzugt 1 bis 4 (C (- GrAlkyl), und besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (C,-C3-Aikyl).
Beispielhaft und bevorzugt seien genannt:
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, iso-Propyi-, iso-Butyl-, sec-Butyl, tert-Bulyl-, iso-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, 1-Methylbutyl-, 1-Ethylpropyl-, 1,2-Diniethyipropyl, neo-Pentyl-, 1 , 1 -Dirneihylpropyl-, 4-Methylpentyl-, 3-Methylpentyl-, 2-Methylpentyl-, 1 -Methylpentyl-, 2-Ethylbutyl-, 1-Ethylbutyl-, 3,3-Dimethylbutyl-, 2,2-Dimethylbutyl-, Ll-Dirnethylbutyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, 1,3-Dimethylbutyl- und 1,2-Dimethylbutyl-,
Besonders bevorzugt ist ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- und tert-Butylrest.
Heteroalkyl
Heteroalkyl steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10
Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach durch, ei ne oder mehrere der Gruppen -O-, -S-,
■Vi O. -S( O -S( < >} -. - N R-' -. -NRyC( J)-, ·( ·· i >)-N R> -. -NRYNRy-, - Si ( >} -\ R> \ R> - .
-C(=0)- R NRy-, -CR ' \'-< >- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit S\ i ( > !-N i i2. -C(=0)-OH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, Hierbei steht Ryjeweils für -H, Phenyl-, Cj-C] Q-A kyl-, C2-C j o-Alken i- oder ^-C j Q-Alkinyl-, die wiederum jeweils mit N Ü -O OS- N I b. -O ( ))-( )ί I. -OH, - N U . - H-C(= NH2)-,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Suifonsäure substituiert sein können.
Hierbei steht Rx für -H, C■ -C3-Alkyl~ oder Phenyl-.
Alkenyi
Alkenyi steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoffkette mit einer oder zwei Doppelbindungen und 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-C10- Alkenyi), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (CVCj-Aikenyl), wobei es sich versteht, dass, wenn die Alkenylgruppe mehr als eine Doppelbindung enthält, die Doppelbindungen isoliert voneinander oder miteinander konjugiert sein können. Bei der Alkenylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethenyl- (bzw. Vinyi-), Prop-2-en-l -yl- (bzw.„Allyl-"), Prop-l-eri-l-yl-, But-3-enyl-, But-2-enyi-, But- I -enyi-, Pent-4-enyJ-, Pent-3-enyl-, Pent-2-enyl-, Pent-l -enyl-, Hex-5-enyl-, Hex-4-enyl-, Hex-3-enyl-, Hex-2-enyl-, Hex-l-enyl-, Prop-l -en-2-yl- (bzw.„Isopropenyl-"),
2- Methylprop-2-enyl-, 1 -Metliylprop-2-enyi-, 2-Methylprop-l-enyl-, l-Methyiprop-l -enyl-,
3- Methylbut-3-enyl-, 2-Methylbut-3-enyl-, l-Methylbut-3-enyl-, 3-Methylbut-2-enyl-,
2- Methylbut-2-enyl-, l-Methylbut-2-enyl-, 3-Methylbut- l-enyl-, 2-Methylbut-l-enyl-,
1 -Methylbut- 1 -enyl-, 1 -, 3 -Dimethylprop-2-enyl-, 1 -Ethyiprop- 1 -enyl-, 3 -Propylvinyl-,
1-IsopropyIvinyl-, 4-Methylpent-4~enyl-, 3-Methylpent-4-enyl-, 2-Methylpent-4-enyl-,
1 -Metiiylpent-4-enyl-, 4-Metiiylpent-3-enyl-, 3-Metiiylpent-3-enyl-, 2-Methylpent-3-enyl-, 1 -Metiiylpent-3-enyl-, 4-Metiiylpent-2-enyl-, 3-Metiiylpent-2-enyl-, 2-Methylpent-2-enyl-, l-Metiiylpent-2-enyl-, 4-Metiiylpent-l-enyl-, 3-Metiiylpent-l-enyl-, 2-Methylpent-l-enyl-, i-Methylpeni-l-enyl-, 3-Ethylbut-3-enyl-, 2-Ethylbut-3-enyl-, l-Ethylbut-3-enyl-,
3- Ethylbut-2-enyl-, 2-Ethylbut-2-enyl-, I -Ethylbut-2-enyl-, 3-Ethylbut- 1 -enyl-, 2-Ethylbut-l -enyl-, 3 -Ethylbut-3 -enyl-, 2-Propylprop-2-eny3-, 1 -Propylprop-2-enyl-, 2-isopropylprop-2-eny3-,
3 -Tsopropylprop-2-enyl-, 2-Propylprop-l -enyl-, 3 -Propylprop-l -enyl-, 2-Isopropylprop-l -enyl-, 3 -Tsopropylprop-1 -enyl-, 3,3-Dimethylprop- 3 -enyl-, 3 -( 3 , 3 -Dimethyietiiy ethenyl-,
Buta-l ,3-dienyl-, Penta- i ,4-dienyi- oder Hexa-1 -5-dienylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Gruppe um Vinyi oder Allyl. Alkinyl
Alkinyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoffkette mit einer Dreifachbindung und mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-C10- Alkinyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C2-C3-Alkinyl). Bei der C^-Ce-Alkinylgruppe handelt es sieh zum Beispiel um eine Ethinyl-, Prop-l-inyl-, Prop-2-inyl- (bzw. Propargyl-), But-l -inyl-, But-2-inyl-, But-3-inyl-, Pent-l -inyl-, Pent-2-inyl-, Pent-3-inyl-, Pent-4-inyl-, Hex-l-inyl-, Hex-2-inyl-, Hex-3-inyl-, Hex-4-inyl-, Hex-5-inyl-, l -Methylprop-2-inyl-, 2-Methylbiit-3-inyl-, l-Methylbut-3-inyl-, l-Methylbut-2-inyl-, 3-Methylbut-l-inyl-, 1 -Ethylprop-2-inyl-,
3-Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-4-inyl-, 1 -Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-3-inyl-, l-Methylpent-3-inyl-, 4-Methylpent-2-inyl-, 1 -Methylpent-2-inyl-, 4-Methylpent-l-inyl-, 3-Methylpent-l -inyl-, 2-Ethylbut-3-inyl-, l -Ethylbut-3-inyl-, 1 -Ethylbut-2-inyl-,
1 -Propylprop-2-inyl-, 1 -Isopropylprop-2-inyl-, 2,2-Dimethylbut-3-inyl-, 1 , 1 -Dimethyibut-3 -inyl-, 1 , 1 -Dimethylbut-2-myl- oder 3,3-Dimethylbut-l - inylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Alkmylgruppe um Ethinyl, Prop- l-inyl oder Prop-2-inyl.
Cycloaikyl
Cycloaikyl steht für einen gesättigten einwertigen mono- oder bicyclischen Kohienwasserstoffrest mit 3-12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalkyl).
Hierbei steht ein monocyclischer Kohienwasserstoffrest für einen monovalenten
Kohienwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 10 (Cj-Cio-Cycloalkyl), bevorzugt 3 bis 8
(Cs-Cs-Cycloalkyl), und besonders bevorzugt 3 bis 7 (C3-C7-Cycloalkyl) Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und bevorzugt für einen monocy clischen Kohienwasserstoffrest seien genannt:
Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl- und Cycloocty]-.
Besonders bevorzugt ist ein Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cylopentyl-, Cyclohexyl- und
Cycloheptyl-.
Hierbei steht ein bicyclischer Kohienwasserstoffrest für einen Kohienwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 12 Kohlenstoffatomen (C:rCi 2-Cycloalkyl), wobei hierbei eine Fusion aus zwei gesättigten Ringsystemen zu verstehen ist, die sich gemeinsam zwei direkt benachbarte Atome teilen. Beispielhaft und bevorzugt für einen bicyclischen Kohienwasserstoffrest seien genannt: Bicyclo[2.2.0]hexyl-, Bicyclo[3.3.0]oclyl-, Bicyclo[4.4.0]decyl-, Bicyclo[5.4.0]undecyl-, Bicyclo[3.2.0jheptyl-, Bicyclo[4.2.0]octyl-, Bicyclo[5.2.0]nonyl-, Bicyclo[6.2.0]decyl-,
Bicyclo[4.3.0]nonyl-, Bicyclo[5.3.0]decyl-, Bicyclo[6.3.0]undecyl- und Bicycio[5.4.0]undecyk Heteocycjoalk l
Heterocycloalkyl steht für ein nicht aromatisches mono- oder bicyciisches Ringsysiem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können Stickstoffatome, Sauerstoffatome oder Schwefelatome vorkommen.
Ein monocyclisches Ringsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 7, besonders bevorzugt 5 oder 6 Ringatome aufweisen.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 3 Ringatomen seien genannt:
Aziridinyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 4 Ringatomen seien genannt:
Azetidinyl-, Oxetanyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 5 Ringatomen seien genannt:
Pyrrolidinyl-, imidazolidinyl- , Pyrazolidinyl-, Pyrrolinyl-, Dioxolanyl- und Tetrahydrofüranyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 6 Ringatomen seien genannt:
Piperidinyl-, Piperazinyl-, Morpholinyl-, Dioxanyl-, T'etrahydropyranyl- und Thiomorpholinyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 7 Ringatomen seien genannt:
Azepanyl-, Oxepanyl-, 1,3-Diazepanyl-, 1 ,4-Diazepanyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 8 Ringatomen seien genannt:
Oxocanyl-, Azocanyl-.
Unter monocvclischem Heterocycloalkyl sind 4 bis 7-gliedrige, gesättigte Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S bevorzugt.
Besonders bevorzugt sind Morpholinyl-, Piperidinyl-, Pyrrolidinyl- und Tetrahydrofüranyl-.
Ein bicyciisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können, können gemäß der vorliegenden Erfindung 6 bis 12, bevorzugt 6 bis 10 Ringatome aufweisen, wobei ein, zwei, drei oder vier Kohlenstoffatome gegen gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe O, N und S ausgetauscht sein können.
Beispielhaft seien genannt: Azabicyc3o[3.3.0]octyi-, Azabicyclo[4.3.0]nonyl-,
Diazabicyclo[4.3.0]nony]-, Oxazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Thiazabicyclo[4.3.0]nonyl- oder
Azabieyelo[4.4.0]decyl- sowie aus weiteren möglichen Kombinationen gemäß Definition abgeleitete Reste,
Besonders bevorzugt ist Perhydrocyclopentaicjpyrrolyl-, Per ydrofuro[3,2-c]pyridinyi-,
Perhydropyrroloi 1 ,2-ajpyrazinyl-, Perhydropyrrolo[3,4-e]pyrrolyl- und 3,4-Methylenedioxyphenyl.
Aryl
Aryl bedeutet ein monovalentes, mono- oder bicyclisches, aus Kohlenstoffatomen bestehendes aromatisches Ringsystem. Beispiele sind Naphthyl- und Phenyl-; bevorzugt ist Phenyl- beziehungsweise ein Phenylrest.
CVCin-Aralkyl
Ce-io-Aralkyl- sieht im Rahme der Erfindung für ein nionocycliscb.es aromatisches Aryl, bespielhafi Phenyl, an das eine Ci-Gi-Alkylgruppe gebunden ist.
Eine beispielhafte Gs-j o-Aralkyl-Gruppe ist Benzyl.
Hgieroarvl
Heieroaryl bedeute! ein einwertiges monocyclisches, bicyclisches oder tricyclisches aromatisches Ringsystem mit 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 Ringatomen (eine„5- bis 14- gliedrige
Heteroa.ryl"gruppe), insbesondere 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen, zu verstehen, das mindestens ein Ringheteroatom und gegebenenfalls ein, zwei oder drei weitere Ringheteroatome aus der Gruppe N, O und S enthält und das über ein Ringkohlenstoffatom oder gegebenenfalls (wenn es die Wertigkeit erlaubt) über ein Ringstickstoffatom gebunden ist.
Bei der Heteroarylgruppe kann es sich um eine 5-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Tbienyl, Furyl, Pyrrolyl, OxazolyL Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Triazolyl, Thiadiazolyl oder Tetrazolyl; oder eine 6-glie irige Heteroarylgrupoe wie zum Beispiel Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrirnidinyl, Pyrazinyl oder Triazinyl: oder eine tricyclische Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Carbazolyl, Acridiny] oder Phenazinyl; oder eine 9-gl iedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzoxazolyl, Benzisoxazolyl, Benzimidazoiyi, Benzothiazolyl, Benzotriazolyi, Indazoiyl, Indolyl, Isoindolyl, Indolizinyl oder Purinyi; oder eine 10-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Chinolinyl, Chinazolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, C noxalinyl oder Pteridinyl handeln.
Im Aligemeinen, und wenn nicht anders erwähnt, schließen die Heteroarylreste alle möglichen isomeren Formen davon ein, z. B. Tautomere und Positionsisomere in Bezug auf den
Anbindungspunkt zum Rest des Moleküls. Somit schließt, als erläuterndes, nicht einschließendes Beispiel, der Begriff Pyridinyl Pyridin-2-yl, Pyridin-3-yl und Pyridin-4-yl ein; oder der Begriff Thienyl schließt Thien-2-yl und Thien-3-yl ein.
C5-io-Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für ein monooder bicyclisches, aromatisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heieroatome, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können vorkommen: N, O, S, S(=0) und/ oder S(=0)2. Die Bindungsvalenz kann sich an einem beliebigen aromatischen Kohlenstoffetom oder an einem Stickstoffatom befinden.
Ein monocyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 5 oder 6 Ringatome. Bevorzugt sind solche Heteroarylreste mit ein oder zwei Heteroatomen. Besonders bevorzugt sind hierbei ein oder zwei Stickstoffatome.
Heteroarylreste mit 5 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Thienyl, T azolyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl,
Oxadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl und Thiadiazolyl.
Heteroarylreste mit 6 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl und Triazinyl.
Ein bicyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 9 oder 10 Ringatome.
Heteroarylreste mit 9 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Phthalidyl, Thiophthalidyl, Indolyl, Isoindolyl, Indazoiyl, Benzothiazolyl, Benzoftuyl,
Benzothienyl, Benzimidazoiyi, Benzoxazolyl, Azocinyl, Indolizinyl, Purinyi, Indoiinyl. Heteroarylreste mit 10 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Isochinolinyl, ChinolinyL Chinolizinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthaiazinyl, 1,7- und I,8-Naphthyridinyä, Pteridinyl, Chromanyl.
Heteroalkoxy
Heteroalkoxy steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die über -O- an den Rest des Moleküls gebunden ist und die weiterhin einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -NR>'-,
•\ R>C; O -C(0)-NRy-, -NRYNR -, - S< ( >) · ·\Κ> \Κ> · . -O < >}- N: Ry\ > -. ··(. - \■( )· unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -C(0)-OH, -OH, -NH2, - H-Ci=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Hierbei steht Ry jeweils für -H, Phenyl-, Cj-C] Q-Alkyl-, C^-C j o-Aikenyl- oder y-C ] Q-Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -C(-0)-OH, -OH, - N H . - H-C(= NH2)-,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei steht Rx für -H, C■ -C3-Alkyl- oder Phenyl-.
Halogen beziehungsweise Halogenatom steht im Rahmen der Erfindung für Fluor (-F), Chlor (-C1), Brom (-Br), oder lod (-1).
Fluor-Alkyl, Fluor-Alkenyi und Fiuor-Alkinyl bedeutet, dass das Alkyl, Aikenyl und Aikiny 1 ein oder mehrfach durch Fluor substituiert sein kann.
Die Konjugation des KSP-Inhibitors an den Antikörper kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-lnhibitor für die Konjugation an den Linker ggf. zu modifizieren, z.B. durch Einführen von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur einfacheren Substituierung (so dass in der Reaktion diese Abgangsgruppe durch den Linker substituiert wird, und nicht ein H-Atom). Das so erhaltene KSP-lnhibitor - Linker - Molekül (wobei der Linker eine reaktive Gruppe zur Ankopplung an den Binder aufweist) kann dann mit dem Binder umgesetzt werden, um ein erfindungsgemäßes Binderkonjugat zu erhalten. Diese Vorgehensweise ist im experimentellen Teil anhand einer Vielzahl von Beispielen exemplarisch veranschaulicht, Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (I) oder (la) auf: Formel (I):
wobei
R1 H, i .-'- -MOD oder ••i Ci i ./. darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- ΝΥ 'Υ2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y! und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, ~(CH2CH20)o-3~(CH2)0-3Z'(z.B. -(CH2)o-3Z ' ), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z l darstellt, wobei 7 H, NH2, SO3H, COOK, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO- H-CHY4) l-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit- HCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 subsiituiertes Aryi oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Cw Alkyl oder gegebenenfalls mit -:NH2 substituiertes Aryi oder Benzyl darstellt und Y ' H oder -CO-CHY°- H2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C i-e Alkyl darstellt; H, I ,···· I
, -SGjyS-(CO)o. j -R4', -CO-CHY -NHY5 oder -(CH2V3Z darstellt,
wobei SGjvs eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Grappe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine CMO- Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Gwo-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Hetoocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehriach mit - NH2, -NH-Aikyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyi, N(Alkyi)-COAikyl, -SO3H, -SO- N U . -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyi)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)Y-R4 ' ' darstellt (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-12-AJkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Υ ' und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2V3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2J0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONHb substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit M i substituiertes Aiyl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C« Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CHj-CHR1 '- oder -CHR. " -CH2- darstellen, wobei R! H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, Cw Haioalkyi, CwAlkoxy, Hydroxyi-substituiertes CM Alkyl, COO(CM Alkyl) oder OH darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2 H oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, CycJoalkyl-, Aryi-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Ci-io-Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce- 10-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Cj-io-Alkyl-O-Ce io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycioaikyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -
0- CO- Alkyl Gruppen, 3 -3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-Alkyi Gruppen, 1 -3 - H-CO- NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)r.-Aikyl Gruppen, 3 -3 -S02-NH-Aikyl Grappeo, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH((CH2CH20) \ .2oH)-Gruppen, 1 -3 -NH2 Gruppen oder
1- 3 -(CHJ SZ Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Ψ unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o.3-CH(NHCOCH3)Zt,-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH Jo-sZ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet);
R5 H, -MOD, NH2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CFI2F, -CH2F, SH oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY 'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H>, oder -(CH2)o-:>Zl darstellen, und Y3 H oder - (CH2 3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R'' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-!o-Alkinyl, Hydroxy, NO2, H2, COOH oder Halogen (insbesondere F, C3, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) C jo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2~ io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C Cycloalkyl oder --(€Ή7)^-(ΗΖ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gJiedriger Heierocyclus mit bis zu zwei Heieroatornen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann; wobei einer der Substituenten R1, RJ und R4-L-#l darstellt,
L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper stellt, R i L F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R10 H oder G -CrAlkyl darstellt;
Gl -NHCO- , -CONH- oder "\ /N "° darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- oder
N N CO ,n
\ / darstellt, R nicht NH2 ist);
n 0 oder 3 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch, eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, - R '-, -NR CO-, CONRy-, -NRYNRY-, -S02NR> N R> -. -CONRYNRy-, (wobei Ry H, Phenyl, C] -C] Q-A3kyl, C^-C iQ-Aikenvl, oder C2-C j Q-Alki yl darstellt, die jeweils mit HCONH2, -COOH, -OH, - H2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx-N~0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CN H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder _COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe - -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere. R1 oder R3 -L-
darstelit, wobei SGivs und R4'dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausruhrungsform der Formel (I) stellt der Substituenten R4-L-#l dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stickstoffatom, das an R4 bindet, spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben.
Wenn R1 nicht H darstellt, ist das Kohlenstoffatom, an das R1 bindet, ein Stereozentrum, welches in der L- und/oder D-Konfiguration vorliegen kann, vorzugsweise in der L— Konfiguration.
Wenn R2 nicht H darstellt, ist das Kolilensioffatom, an das R2 bindet, ein Stereozentrum, welches in der L- und/Oder D-Konfiguration vorliegen kann.
Formel (Ia):
(Ia) wobei
R1 H, I .-··· ! . oder -(CH2)e-:>Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- \Y Y ". oder -CO-OY3 darstellt. wobei Υ' und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' (z.B. -(CH2yjZ'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 Ii oder -(CH2)o-3Zl darstellt, wobei Z' H, H2, SO3H, COOK, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i.3COÖH darstellt; wobei W I i oder OH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt.
R2 und R4 unabhängig voneinander H, -SGlys-(CO)0-i-R4', -CO-Cl I V- N H Y ' oder -(CH2)o-3Z darstellen,
wobei SGjyg eine durch ein lysosoinales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4' eine Ci-io-Alkyl-, Cs-io-Aryi- oder Ce-io- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyi-, Ci-io-Alk l-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryi-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-, Ci-w-Alkyl-O-Ce-jo-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die jeweils ein oder mehrfach mit ■ NH , -NH-Alkyl, - (AIkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, - S02NH2, -S02-N< Alkyl)2, -COOK, -CO H2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe --Ox-(CH2CH20)v-R4" darstellt (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und 4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-i2-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder - CH2-CH2-NH2 darstellt);
,oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRH- oder -CHR11- CH2~ darstellen, wobei Rn H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, CM Haloalkyl, CM Alkoxy, Hydroxyh substituiertes C,.4 Alkyl, COO(Cw Alkyl) oder OH darstellt; oder R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt und R4 -L-#l darstellt, wobei Z - H, Halogen, -OY3, -SY3, ΝΗΎ3, -CO- Y]Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, H2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, C 1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt, wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CflY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl darstellt;
A CO, SO, S02, SO N i l oder C NH2 darstellt;
R3 eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryi- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gmppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine Ci-io-Alkyl-, Cwo-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-so- Heteroalkyi-, Cno-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-io-Heteroeycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Haiogenatome aufweisen),, 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO- H-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- H-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n-Alkyl Gruppen, 1-3 -SÖ2-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gnippen, 1-3 - N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NHb Gruppen oder 1 -3 -(CH2)o-3 Gruppen, wobei n itir 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - HY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Zl, oder -{Cl l - y. : darstellt, wobei 7 H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Ci-10-Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, NO2, Halogen, SH oder -(CH2V3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y1 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Zl darstellt, wobei Z' H, SO3H, H2 oder COOH darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-AlkinyL Hydroxy oder Halogen darstellen,
Rs (ggf. fluoriertes) C uo-Alky!, (ggf. fluoriertes) C-i- io-Cyeloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und
R9 H, F, CH3, C! :. CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Durch Substitution eines H- Atoms an R\ R3 oder R4 kann in einer dem Durchschnittsfachmann bekannten Weise eine Verbindung der Formel (I) oder (la), in der keiner der Substituenten R1, R3 und R4 -L-# l darstellt, mit einem Linker verbunden werden. Hierdurch werden Konjugate der Fonnel (I) oder (la) erhalten, wobei einer der Substituenten Rs, R3 oder R4 -L-#l darstellt, L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht. Wenn der KSP-lnhibitor nach Fonnel (I) oder (la) mit einem Antikörper konjugiert ist, stellt einer der Substituenten R1, RJ oder R4 also -L-#l dar, wobei L für den Linker steht und # 1 für die Bindung zum Antikörper steht. D.h. im Falle der Konjugate stellt einer der Substituenten R1, R' oder R4 -L-#l dar, wobei -L,-#i die Bindung an den Antikörper darstellt. Der Binder ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. In einer bevorzugten Ausfülirungsform der Fonnel (I) oder (la) stellt einer der Substituenten R1 oder R3 -L- itl dar. In dieser Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, wenn R4 H oder -SG[ys-(CO)o. } -R4* darstellt, wobei SG[ys und R 'dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) stellt der Substituenten R4-L-#l dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stiekstoffatom, das an R4 bindet spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben. Bevorzugt ist hierbei ein chimärer oder humanisierter anti-CD123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1. Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971.
Anstelle von -L-#l kann auch die Gruppe -L-#3 in der Verbindung vorhanden sein, wobei L für den Linker steht und #3 für die reaktive Gruppe zur Bindung an Antikörper steht. Verbindungen mit -L~#3 sind reaktive Verbindungen, die mit dem Antikörper reagieren. #3 ist vorzugsweise eine Gruppe, die mit einer Amino- oder Thiolgruppe unter Bildung einer kovalenten Bindung reagiert, vorzugsweise mit dem Cysteinrest in einem Protein. Der Cysteinrest in einem Protein kann natürlich im Protein vorliegen, durch biochemische Methoden eingebracht werden oder vorzugsweise durch vorherige Reduktion von Disulfiden des Binders generiert werden kann.
Als A ist CO (carbonyl) bevorzugt.
Als R1 ist bevorzugt -L-#l , H, -COOH, -CONH H2, -(CH2) ,-3NH2, -CONZ"(CH2)j.3 NH2 und - CONZ"CH2COOH, wobei Z" H oder H2.
Als R2 und R4 sind bevorzugt H oder R2 und R4 stellen gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRis-CH2- darstellen, wobei Rn H oder F darstellt. Als R4 ist zudem -L-#l bevorzugt wobei -L-#l spaltbarer Linker ist, vorzugsweise ein intrazellulär enzymatisch spaltbarer Linker.
Als R3 ist bevorzugt -L-#l oder eine Ci-io-Alkyl-, die ggf. mit OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO- Alkyl, O-CO-NH-AlkyL NH-CO-Aikyl, NH-CO-NH-AlkyL S(0)n-Alkyl, SÖ2-NH-Alkyl, NH- Alkyl, (Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise Alkyl bedeutet).
Als R3 ist bevorzugt H oder F.
Als R6 und R' sind unabhängig voneinander bevorzugt H, (ggf. fluoriertes) Cj-s-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C -AlkenyL (ggf. fluoriertes) C Alkinyl, Hydroxy oder Halogen. Als R8 ist bevorzugt eine verzweigte Ci-s-Aikyl-Gruppe, insbesondere eine Gruppe der Formel - C(CH3 -(CH2)o-2 -Ry, wobei Ry -H, OH, C02H, oder NH2, oder eine (ggf. fluoriertes) C5.7- Cycloalkyl Besonders bevorzugt ist eine Gruppe der Formel -C(CH3j3 oder eine Cyclohexylgruppe.
Als R9 ist bevorzugt H oder F.
Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I) oder (la), in der
A CO (caxbonyl) ist;
R] H, -L-#l , -COOH, -CONHNH2, -(CH2)i-3NH2, -CONZ"(CH2)i-3 NH2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder NH2;
R2 und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHR1 !-CH2- darstellen, wobei R" H darstellt; oder R4 - -L-# 1 ist und R2 H ist;
RJ -L-#l oder eine Phenylgruppe, die ein oder mehrfach mit Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes C1.3 Alkyl substituiert sein kann, oder eine ggf fluorierte Ci-10-Alkyigruppe darstellt, die ggf mit -OY4, -SY4, -O-CO-Y4, -O-CO-NH-Y4, NH-CO-Y4, -NH-CO-NH-Y4, S(0)rl- Y (wobei n 0, 3 oder 2 darstellt), -SO2- H-Y4, NH-Y4, oder (Y )2, substituiert sein kann, wobei Y4 FI, Phenyl (ggf. ein oder mehrfach mit Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes C [ .^ Alkyl substituiert), oder Alkyl (wobei die Alkylgruppe mit -OH, -COOH, und/oder -NHCO-O..3- Alkyl substituiert sein kann, und wobei Alkyl vorzugsweise Ci-j Alkyl bedeutet) darstellt;
wobei insbesondere bevorzugt R3mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Aikyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S02-NH-Alkyl, ΝΉ-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet);
RJ H oder F ist;
R6 und R; unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-Alkyi, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
Rö eine verzweigt.e Ci-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl ist; und
R9 FI oder F ist.
Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn R -L-#l , COOK oder H darstellt,
R und R4 H sind oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines PynOlidinringes) -CH2-CHR1 oder -CHRI!-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt, oder R4 -L-#l ist und R2 H ist:
A CO darstellt,
R3 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2SCH2CH(CXXlH)NHCOCH3, -CH(CH3)OCH3, eine Phenylgruppe, die mit 1-3 Halogenatomen, 1 -3 Aminogruppen oder 1-3 Alkylgruppen (die ggf. halogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,
R' -H darstellt,
R6 und R' unabhängig voneinander H, Ci-3-Alkyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R6 und R7 F darstellen;
R8 C]-4-Alkyl (vorzugsweise tert-butyl) oder Cyclohexyi darstellt; und' oder
R9 H darstellt
Zudem ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn
R -L-#l, COOK oder H darstellt,
R2 und R4 H oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR1 '- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei Rlj H darstellt,
A CO darstellt,
R3 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3, -CH(CH3)OCH3, eine Phenylgruppe, die mit 1 -3 Halogenatomen, 1-3 Aminogruppen oder 1 -3 Alkylgruppen (die ggf. halogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,
R' H darstellt,
R6 und R' unabhängig voneinander H, Ci-3-A!kyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R° und R7 F darstellen;
R8 C i-4-Alkyl (vorzugsweise tert-butyl) darstellt; und
R9 H darstellt.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (II) oder (IIa) auf: Formel (II):
wobei
R1 H, -L-Binder, -MOD oder -(CH2J0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- Y'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Ys und Y2 unabhängig voneinander H, H2, ·ί( I i ( I i i )}.; -iOl ;/·</.!*. -(CH2)o-:sZl), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 Ii oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei H, NH2, SO3H, - COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4),.3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCÖNH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit--NHCO H2 substituiertes, d-e Alkyl oder gegebenenfalls mit - H2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 II oder darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Cw Alkyl darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CHb sZ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R4 H, -L-Binder,
-SG!yg-iCOio-i-R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellen,
wobei SG}VS eine durch lysosornale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R44 eine Ci-io-Alkyi-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, Cuio-Alkyl-O-Cfr-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Cj-10-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, Cj. lo-Alkyl-O-Ce-io-Aryioxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, - H-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO;! ! . -SO -X U -. -S02-N(Alkyl)2, - COOK, -CONH2, -CON(ALkyl)2, oder OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe Ox- (CH2CH20)v-R4" darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R4" - H, -Aikyl (vorzugsweise Ci.12-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NYV, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH.)<«Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)o-;Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls rnit-NHCONH? substituiertes, Cj-s Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes CM Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H, NH2, SO3H, COOK, SH, oder OH darstellt;
A CO, SO, S02, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
RJ -L-Binder, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyi-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci-10-Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Cwo-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-io- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Aikyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n-Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)0- 3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2) -:rCH(NHCOCH3)Z',-(CH2)0-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2 3Z' darstellt, wobei 7 H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet);
R5 H, NH2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder - (CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (ΟΗ2)ο-·,Ζ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt; R" und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) G-jo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) CJ-IO- Alkenyi, (ggf. fluoriertes) Cj-io-Alkinyl, Hydro xy, NO?., H2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Ci, Br) darstellen,
R (ggf. fluoriertes) Ci-i©-Alky!, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) oder-(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heierocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt, wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann darstellt;
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstelli; wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R10 H oder C (-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R!0 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgrappe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, -NRY-, -NRyCO-, CONR-V-, -NRYNRY-, -S02NR>'NRy-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C] -C] Q-AlkyL C?_-C ] Q-Alkenyl, oder C2-C [ Q-Aikinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NI-I2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sutfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, C j -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH?, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate,Salze der Solvate und Epimere.
Im Falle von Binderkonjugaten der KSP-Inhibitoren der Formel (II) kann maximal ein Vertreter von R1, R'und R4 (alternativ zu einer der oben angegebenen Bedeutungen) -L-Binder darstellen, wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Antikörper ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann. Formel (IIa):
wobei
Rl -L-BINDER, H, oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- Y'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)0_.tZ', oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0..3Z' darstellt, wobei Z' Ii, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2- CH2~CH(NH2)COOH oder -(CO- H-CHY4)i.3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt; wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-- HCONH2 substituiertes, Cw Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R und R* unabhängig voneinander
-SGlys-(CO)o_j -R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2).MZ darstellen, darstellen, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) --CH2-CHR1 1- oder -CHRn-CH2- darstellen, oder R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt und R4 ~L-#1 darstellt, wobei RJ0 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), d.4 Alkyl, CV, Haloalkyl, CV, Alkoxy, Hydroxyl-substiiuiertes CM Alkyl, COO(Ci-4 Alkyl)oder OH darstellt;
wobei SG}VS eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine Ci-jo-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io- Heteroalkyi-, C i-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, Cs-so-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io- Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-jo-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, Ci- lo-Alkyl-O-Ce-io-Aiyloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, - NH-Alkyl, -N(Alkyi)2, H-CO-Alkyl, N(Alkyi)-COAlkyl, -SO3H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, - COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox~ (CH2CH20)v-R4" darstellt (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci.12-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO- Y'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Υ ' und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CTb sZ' darstellen, und Y* H oder -
(CH2J0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt und Y5 H oder -CO-CHY°- H2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C « Alkyl darstellt;
A CO, SO, SO?, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-BINDER oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyi- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci-io-Alkyi-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, CMO- Alkyl-O-Ce-io- Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 3 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1 -3 O- Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1 -3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 - O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gnippen, 1-3 -NH-CO- NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gnippen, 1-3 -SO2-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl)2 Gappen, 1 -3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NYY2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2 3 ' darstellen, und Y'
H, -(CH2V3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -{CH2)o-3Z ' darstellt, wobei 7 H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, NO2, Halogen, SH oder -(CH2J0-3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH^o-sZ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei L für einen Linker steht und BINDER für Binder bzw. Derivat hiervon steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,
R" und R ' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CM O- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Aikenyl, (ggf. fluoriertes) 62-10- Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C-s-io-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und R I i. F, CH:>, CF3, CH2F oder CFIF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvaie,Salze der Solvate und Epiniere.
Weiterhin sind erfindungsgemäß bevorzugt folgende SP-Inhibitoren-Antikörper-Konjugate: Formel (IIb):
wobei R1, R2, R4, R5, R6, R?, s und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, A CO darstellt, B eine Einfachbindung, -O-CH2- oder -CH2-O- darstellt, und R20 NH2, F, CF3, oder CH3, und n 0, 1, oder 2 darstellt.
Formel (IIc):
wobei A, R1, R3, R6, R', Rs, und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, wobei A vorzugsweise CO und R3 -CH2OH, -CH2OCH3, CH(CH3)OH oder CH(CH3)OCH3 darstellt. Formel (IM):
wobei A, R ', R6, R', R" und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (Π) oder (IIa) aufweisen, wobei A vorzugsweise CO und RJ -CH2-SX-(CH2)(M-CHY5 -COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder HY6 darstellt, wobei Y6 II oder -COCH3 darstellt.
Formel (He):
wobei A, R2, R3, R4, R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formet (Ii) oder (IIa) aufweisen, und R1 -L-BINDER darstellt.
Forme! (Iii):
wobei A, R1, R2, R3, R6, R ', R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, und -L- BINDER darstellt, vorzugsweise einen enzyrnatisch spaltbaren Binder, so dass nach Spaltung R^ =H. R1 oder R3 stellen besonders bevorzugt -MOD dar.
Formel (Ilj):
(nj)
wobei
R? -L-#l darstellt;
A CO darstellt; und
R°, R;, R8 und R die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) aufweisen Formel (Ilk):
(ITk) wobei
R! -L-#l darstellt;
A CO und R3 C H. Ol I darstellt;
RJ, R", R7, R8, und Ry die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) aufweisen.
Weiterhin sind bevorzugt in den Verbindungen der Formeln (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (He), (Iii), (Ilj) und (Ilk) (allein oder in Kombination), wenn:
Z Cl oder Br darstellt;
R1 -(CH2)Ö-.3Z darstellt, wobei Z -COOK oder -CO-NY'Y2 darstellt, wobei Y2
(CH2) 3Z' und Y1 H, NH2, oder
Y1 H darstellt, Y2 darstellt und Z< -COOH darstellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt und Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt;
Υ' II darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, 7 ■(CO I-ICHY4)2COOH stellt und eine Y4 i-propyl darstellt und der andere ein ί ί'Ι { · );· Ν Ι iCON' i i darstellt ;
Υ' H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und eine Y4 -CH3 darstellt und der andere ein -(CH2)3~NHCONH2 darstellt ;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit - HCO H2 substituiertes, Ci-e Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y4 ausgewählt wird aus -propyl oder -CH3.
Y1 H darstellt, Y2 -€Fi2CH2Z' darstellt, Z' -CONHCIT^COOH darstellt und Y4 gegebenenfalls mit
N ü; substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt;
Y4 Aminobenzyl darstellt;
R2 -(CH2)o-3Z darstellt und Z -SY3 darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5 H darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5-CO-CHY6- H2 darstellt; Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls substituiertes mit - NHCO]NH2 Ci-6 Alkyl darstellt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn R', R2 oder R' in Formel (I) oder (II) -MOD darsieilt.
Besonders bevorzugt stellt R3 -MOD und R1 oder R4 -L-#i bzw. -L-BINDER dar, wobei -MOD --( Ri0)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R 10 H oder d-C,- Alkyl darstellt;
Gl --NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn G l -NHCO- darstellt, R 10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, - R '-, -NRYCO-, CO R -, -N yNR)'-, -S02NRy" R>'-, -C< !\ R> \ R> -. (wobei Ry H, Phenyl, C [ -C { Q-Alkyl, C2-C [o-Alkenyl, oder C2-C] q-Aikinyl darstellt, die jeweils mit HCONH2, -COOK, -OH, -NH2, H-C NI-I2, Sulfonamid, Suif n, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR"=N-0- (wobei Rx H, C|-C-$ -Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit - NHCONH2, -COOK, -OH, ~NH2, H-C H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;
Besonders bevorzugt weist die Gruppe -MOD eine (vorzugsweise terminale) -COOH-Gruppe auf, z.B. in einer Betaingruppe. Vorzugsweise weist die Gruppe -MOD die Formel -CH2-SX-(CH2)C - CHY5-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (III) auf:
wobei
Rl -L -BINDER, H, oder -(CH2)(wZ darstellt, wobei Z -H, - HY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder oder - CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei H, NH2, SO3H, COOH, - NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY )i-3COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substitsiiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R und R4 unabhängig voneinander H,
, -SGlys-(CO)0„rR4', -CO-CHY4-NHY5 oder -;Ci i ί,, ;Z darstellen,
, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidmringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn- CH2- darstellen, wobei Rn H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, CM Haloalk l, CM Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyl, COO(CM Alkyl) oder OH darstellt;
wobei SGjyg eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine Ci-jo-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-so-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, Cno-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heteroeyeloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaiyl-alkoxy-, C1-10- Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, Cj. lo-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-i o-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, - H- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -SO2NH2, -S02-N(Alkyl)2, - COOH, -CONH2, -CON(Alkyi)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox~ (CH2CH20)v-R4" darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R4" - H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-12-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt);
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-:>Zl darstellen, und Y3 H oder - (CH2)0..3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Cw Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und YJ H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Cj-e Alkyl darstellt;
A CO, SO, SO2, SO N i l oder C NH2 darstellt;
R3 -L-BINDER, eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe, oder-CH2-Sx-(CH2)o- -CHY5-COOH darstellt, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3. darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci-10-Alkyl-, C-6-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroaikyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder C5- 10-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen),, 1-3 O- Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 - NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -SO2- NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1- 3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder ~(CH2)e-3Z ' darstellen, und Y3 H, -{CH2)a-:rCH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH( H2)Z', oder -(CH2V3Z' darstellt, wobei 7 H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, NO2, Halogen, SH oder -(CH2V3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,
R" und R ' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CM O- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Aikenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) Ci-io- Alkyl, (ggf. fluoriertes) Gs-io-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und R H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvaie,Salze der Soivate und Epimere.
Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn in Formel (I), (la), (II), (IIa), (IIb), (Tic), (TM), (Tie), (Iii), (ilj), (ITk) oder (III):
Z Cl oder Br darstellt;
R1 -(CH2)O-3Z darstellt, wobei Z -CO-ΝΥ'Υ2 darstellt, wobei Y2 -(CH2CH20)o-3-(CH2)0_3Z' und Y1 H, NH2, oder -(CH2CH20)o-3-(CH2)0 ..Z'darstellt;
Y1 H darsteiit, Y2 -(CH2CH20)3-CH2CH2Zl darstellt und Z' -COOH darsteiit;
Y! H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt und Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und ein Vertreter von Y4 i- propyl darstellt und der andere {< ! ! ) N i K "< )N! I; darstellt ;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und ein Vertreter vonY4 - CH3 darstellt und der andere --<CH2)3-NHCONH2 darstellt ;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, C 1-6 Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y4 ausgewählt wird aus z'-propyl or -CH3.
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -CONHCHY COOH darstellt und Y4 gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryt oder Benz l darstellt;
Y4 Aminobenzyl darstellt;
R2 -(CH2)0-3Z darstellt und Z -SY3 darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5 H darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y^CO-CHY^NH? darstellt; und/oder
Y4 lineares oder verzweigtes gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes C1-6 Alkyl darstellt.
Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel (I), (la), (II), (IIa) oder (III),
wobei
R1 H, -L-#l bzw. -L-BI DER, -MOD oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y' und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, ·(( ·! ! ·( ! ! ·< ) !,: H Ci i -//i M. ·ί ( 'ί ί )r.■/: ). oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)».3Z' darstellt, wobei H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituie-tes, C [-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)Ö-3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NYV, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y! und Y2 unabhängig voneinander H, NH?, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und YJ H oder -
(CH2)o-3Zl darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONEb substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6- H2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Cw Alkyl darstellt;
R4 H oder -L-#l bzw. -L-BINDER darstellt (wobei -L-#l bzw. -L- BINDER ein ertzymatisch spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R4 zu H führt);
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Ci-jo- lkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Cj-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)„-Alkyl Grappen, 1-3 -SO2-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH((CH2CH2O)1.20H)-Gl'uPPen' 1 -3 -NH Gruppen oder 1-3 -(CH2)0-:;Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2 3Z' darstellen, und Y3 H, -(Π ί ·)„ !· N i ICi iCl i Z -.-iCi i -}, :-CI i(M !;}Z". oder ( C i i ):! : darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Cuo-Alkyl bedeutet);
R5 H, -MOD, NH2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF:-„ -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-ΝΥ'Υ2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander Ii, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y* H oder - (CH2)o-3Zi darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) -10- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-jo-Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen, R8 (ggf. fluoriertes) Ci-jo-AlkyL (ggf. fluoriertes) C2-10-.Alken.yl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, oder (ggf. fluoriertes) C4-io-Cycloalkyl; wobei einer der Substituenten R' und R3-L-#l bzw. -L-BINDER darstellt,
L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper stellt,
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R10 H oder Ci-C,-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl M R O- darstellt, R10 nicht H2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2, eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit I bis 10 Kohlensioffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, - SO-, SO2, -NR>'~, -NRYCO-, CONRy-, -NRyNR -, -S02NRyNR>'», -CON WRy-, (wobei Ry H, Phenyl, CJ -CJ Q-Alkyl, C2-C{0-Alkenyl, oder C2- } Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, - H2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CR"=N-0- (wobei Rx H, Cj-C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel Formel (I), (Ia), (II), (IIa) oder (III), in denen
R' H, -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder -(CH2)o..3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY' Y2, oder -CO-OY3 darstellt. wobei Y1 und unabhängig voneinander H, NH2,•••CH -CU -O),: ; ·((. | {. ).·. '·(,··. Η. -(CH2)o-3Z '), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 Ii oder ~(CH2)o-3Z ' darstellt, wobei 7 H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i.3COOH darstellt; wobei W I i oder OH darstellt
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)ö..3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY°-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C« Alkyl darstellt;
R4 H darstellt,
A CO, SO, S02, S02NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine O-JO- Alkyl-, Cc-iö-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-All yl-O-Ce-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyi Grappeo, 3 -3 -NH-CO- H- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)„-Alkyl Gruppen, 1-3 -S02- H- Alkyl Gruppen, 1-3 - H-Alkyi Gruppen, 1-3 -N(A3kyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH((CH2CH2O)1.20H)-Gl'uPPen' 1 -3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH )o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)ö..3-CH(NH2)Z', oder - ί I I. >,5■ : darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Cuo-Alkyl bedeutet);
R5 H, -MOD, NH , N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2 3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH;, oder -(CH2)o-:>Zl darstellen, und Y3 H oder - (CH2 3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt;
R6 und R? unabhängig voneinander H oder Halogen (insbesondere F, Ci, Br) darstellen;
R8 (ggf. fluoriertes) G-io-Alkyl darstellt; wobei einer der Substit enten R1 und R3 -L-#l bzw. -L-BINDER darstellt,
L für den Linker sieht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper steht,
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei --MOD -CH2-SX-(CH2)<M-CHY5-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY* darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Weiterhin sind die folgenden Verbindungen bevorzugt, die ggf. gemeinsam mit einer Säure wie z.B. Tritluoressigsäure vorliegen können. Diese Verbindungen können über die Positionen entsprechend den Positionen R1, R' und R4 über einen Linker an den Antikörper gebunden werden (wobei ein Wasserstoffatom durch den Linker substituiert wird):
N-(3-Arninopropyl)-N-{(lR)-l-[l-bem^
dimethylpropyl} -2-hydroxyacetamid;
(2S)-2-amino-4-[ {(iR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluo 3henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)aminol-N-methylbutananiid(3 : 3 );
H-pyrrol-2yl]-2,2- dimethylpropyl } acetamid;
N-(3-Anlinopropyl)-N- {(lS) 1-be z ί-4-(2,5-d!f3uo he ί) H roί-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2-hydroxyacetamid;
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} -beta-alanyl)aniino]ethyl} -2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)- L-cy stein;
S-(l- {2-[( -{(2S)-2-Amrno-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-diίluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} -beta-alanyl)aniino]ethyl} -2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)- L-cy stein; S-[ l -(2- {[2-({(2S)-2-Amino-4 {(l R)-l -[l -be^
dimetliylpropyl}(glycoloyl)amino]buta^
3-yl]-L-cystein;
N-[I9-(3(R/S)- {[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)- 17-oxo- 4 ,7 ,10, 33 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1-o 1] -R/S- {2-[(3-aminopropyl) {(lR)- l -[ l -benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH-pyπΌl-2-yl]-2,2-diInethylpropyl}ammo]-2-oxoethyl}homocy stein;
S- {(3R/S)-i-[2-ai2S)-2-Arrino-4-[ {(iRH
dimethylpropyl} (glycoioyl)amino3butanoyl} amino)ethyl3-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl} -L-cystein; S-[(3R/S)-l-(2- {[6-({2-[(3-Ammopropyl) {(lR)-l-[^
2,2-dimetbylpropyi) amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)hexanoyi3ainino} ethyl)-2,5-dioxopyrrolidiii-3-yl3- L-cystein;
S- { l-[2-( {[(lR,3S)-3-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-l -[l -b^
2,2-dimethylpropyI} (glycoloy!)amino]butanoyl} amino)cyclopentyl3carbonyl} amino)ethyl]-2,5- dioxopyrrolidin-3-yl } -L-cystein;
S-(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l -[l-ber^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl ]amino}-2-oxoethyl)-L-cystein;
6-( - {(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluo!phenyl)- 3 H-pyrro3-2-yi]-2,2- dimethylpropyl} (giycoioyl)amino]butanoyl} -beta-alanyl)-N2- {N-[6-(3- { [(2R)-2-amino-2- carboxyethyljsuifanyl} -2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)liexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} -L- lysin;
N-[2-({(2S)-2-Amm0-4-[ {(lR)-l-[l -benzyi-4^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino3butanoyl}amino)ethyl]-L-glutamin;
6-(N-{(2S)-2-Amlno-4-[ {(l )-l-[l-benzyi-4-(2,5-dinuoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}{glycoloyl)amino]butanoyl} -beia-alanyl)-L-lysin;
N-(3-Armnopropyl)-N- {(lR)-l-[l-benzyl-4-^
dimethylpropyl} -3,3,3-trifluoφro anamid; -(3-Armnopropyl)- - {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH yrrol-2-yl3-2,2- dimethylpropyl}-4-fluorbeiizamid;
N-(3-AminoplΌpyl)-N- {(l R)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difΊuo henyl)-lH- yrrol-2-yl3-2,2- dimethylpropyl} acetamid;
N-(3-Aminopropyl)-N- {(lR)-l-[l-berlzyl-4-(2,5-difluo herlyl)-lH- ^τol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-4-(trifluoromethyl)benzamid; (2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-diflv Hphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]butansäure;
(2S)-2-amino-N-(2-airiinoethyl)-4-[ {(lR)-H
dimet ylpropyl}(glycoloyl)amino]butanamid;
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {( l R)-l-[l -benzy^
dimethylpropyl} (giycoioyl)amino]butanoyl} amino)etiiyl]amino} -2-oxoethyl)aniino]-3-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure;
4-[(2- {[2-( { (2S)-2-Amino-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yi]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} ainino)ethyl]ainino} -2-oxoethyI)amino]-2- { [(2R)-2- arnmo-2-carboxyethyl]sulfanyl } -4-oxobutansäure;
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(iR)-i-[l -be^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -beta-aianin; -{(2S)-2-Ammo-4-[{(lR)- l -[l -beDz ί-4-(2,5-difluo heDyl)-lH- yπ·ol-2-yl]-2,2- dimethy]piOpyl}(g]yco]oyl)amino]butanoyl}-L-serin; - {(2S)-2-Amino-4-[ {(iR)-i-[i -benzyi-4-(2,5-difίUOφhenyI)-lH-pyπΌl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -L-alanin;
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( i R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl}glycin;
dime thy lpropy 1 } -4-methy lbenzamid ;
dimethyipropy! } -4-(methytsu!fanyl)benzamid;
(2S)-N-(3-arrrinopropyl)-N-{(lR)-l-^^
dimethylpropyl} -2 -hydroxypropanamid;
-(3-aminopropyl)-N- {(lR)-l-[ ! -benzyl-4-(2,5-difliiorpheny
dimethylpropyl } -2 - (methy 1 sul any 1) ae etamid;
(2S)-N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [4-benzyl- 1 -(2,5-difluorphenyl)- 3 H-pyrazol-3-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2-hydroxypropanamid;
Methyl-4-[(3-aminopropyl) {(lR)- l -[].-benzyl-4-(2,5-ditluo heny])-lH-pyrlΌl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-4-oxobutanoat; 4- [(3-Aminopropyl) {(l R)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-4-oxobutarisäure;
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-Amino-2-carto^^
aminopropyl) {(1R)-1 -[ I -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl} suifanyl)methyi]-4,20-dioxo-7, 10, 13,16-tetraoxa-3,19- diazadocosan- 1 -säure;
N-Acetyl-S- {2-[(3-aminopropyl) {(lR)-l-[ l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amiiio]-2-oxoethyl}-L-cysteiii;
N-Acetyl-S-[2-([3-(L-alanylamino)propyl] {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2- ylj-2,2-dimeÜiylpropyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein;
(2S)~N-(3-aminopropyl)~]\M^
dimethylpropyl}te1xahydrofuran-2-carboxaraid;
3- ( {2-[(3-Aminopropyl) {(1 R)~ 1-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-p>iTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)propansäure;
5- {2-[(3-Aminopropyl){(lRH-[l-benzyl^
dimethylpropyl}amino]-2-oxoetbyl}horoocystein;
4- amino-N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}benzamid;
4-[(2- {[(2R)-2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {( lRH
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} araino)-2-carboxyethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-3- { [(2R)-2-amino-2-carboxyethyl Jsulfanyl} -4-oxobutansäure;
4-[(2- {[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(l R)- l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} ainino)-2-carboxyelliyl]amiiio}-2-oxoethyl)airiino]-2- {[(2R)-2-ammo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure.
Erfmdungsgemäß besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen der Formel IV, wobei R1, R , R3, R4 und R5 die oben genannten Bedeutungen (wie z.B. für Formel (I) oder (II) angegeben) haben:
Formel IV
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der Formeln IV, wobei R1 und R~ H oder -L-#l darstellen; R2 und R4 H oder R1 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2- CHR1 '- oder -CHRH-CH2- darstellen, wobei Rn H darstellt; und R3 CH2OH, CH(CH3)OH oder - L- / 1 darstellt, wobei einer der Substituenten R1, und R~' -L-# l darstellt. Zudem sind besonders bevorzugt die Verbindungen der Formein IV, wobei R1 H oder COOH darstellt; R2 und R" H darstellen; R4 -L-#l darstellt; und R3 CH2OH, oder CH(CH3)OH darstellt, wobei- -L-# l ein enzymatiscli spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R4 zu H führt darstellt.
Linker
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder wie z.B. Antikörper bekannt (siehe z.B. K. Lang and J. W. Chin. Omni. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian et al. Bioconjugate Omni. 2013, 24, 1277-1294). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der KSP-Inhibitoren an einen Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers, die entweder als freie Thiole bereits vorliegen oder durch Reduktion von Disuliidbrücken generiert werden, und/oder über eine oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, den KSP-Inhibitor an den Antikörper über Tyrosinreste, über Glutaminreste, über Reste unnatürlicher Aminosäuren, über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden. Zur Kopplung werden sogenannte Linker verwendet. Linker lassen sich in die Gruppe der in vivo spaltbaren Linker und in die Gruppe der in vivo stabilen Linker unterteilen (siehe L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5- 13 (2,010)). Die in vivo spaltbaren Linker weisen eine in vivo spaltbare Gruppe auf, wobei wiederum zwischen chemisch in vivo spaltbaren und enzymatiscli in vivo spaltbaren Gruppen unterschieden werden kann. „Chemisch in vivo spaltbar" bzw. „enzymatiscli in vivo spaltbar" bedeutet, dass die Linker bzw. Gruppen im Blutkreislauf stabil sind und erst an bzw. in der Zielzeile durch die dort veränderte chemische bzw. enzymatische Umgebung (niedrigerer pH-Wert; erhöhte Giutathion-Konzentration; Vorliegen lysosomaler Enzyme wie Proteasen, oder Glyosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen) sich spalten, um so den niedermolekularen KSP-Inhibitor oder ein Derivat davon freizusetzen. Die chemisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; die enzymatiseh in vivo spaltbaren Gruppen, insbesondere solche, die durch, lysosomale Enzyme spaltbar sind, sind insbesondere 2-8-Oligopeptidgrappe, insbesondere eine Tri- pder Dipeptidgruppe oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Medicinal Chemistry Leiters 8 (1998) 3341-3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Valin-Alanin, Valin-Lysin, Valin-Citrullin, Alanin-Lysin und Phenylalanin- Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgruppe).
Die in vivo stabilen Linker zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus (weniger als 5 % Metabolite nach 24 Stunden in Plasma) und weisen die oben genannten chemisch oder enzymatiseh in vivo spaltbaren Gruppen nicht auf.
Der Linker -L- weist vorzugsweise eine der folgenden Grundstrukturen (i) bis (iv) auf:
(i) ---(COV-SG1-L1 -L2-
(ii) (CO) . -L1-SG-L1-L2-
(iii) -(CO)m -Ll-L2-
(iv) -(CO)m -Ll -SG-L2 wobei m 0 oder 1 ist; SG eine (chemisch oder enzymatiseh) in vivo spaltbare Gruppe (insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit einer Protease spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist, SGI eine Oligopeptidgruppe oder vorzugsweise eine Dipeptidgruppe ist, LI unabhängig voneinander für in vivo stabile organische Gruppen stehen, und L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder oder eine Einfachbindung steht. Die Kopplung erfolgt hierbei vorzugsweise an einen Cysteinrest oder einen Lysinrest des Antikörpers. Alternativ kann die Kopplung an einen Tyrosinrest, Giutaminrest oder an eine unnatürliche Aminosäure des Antikörpers erfolgen. Die unnatürlichen Aminosäuren können beispielsweise Aldehyd- oder Ketogruppen (wie z.B. Formylglycin) oder Azid- oder Alkingruppen enthalten (siehe hierzu Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chern.Rev. 2014, 114, 4764-4806).
Erfindungsgemäß bevorzugt ist insbesondere die Linker-Grundstruktur (iii). Die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats mit einer Linker-Grundstruktur (iii) und Kopplung des Linkers an einen Cystein- oder Lysinrest des Antikörpers führt durch Metabolisierung zu Cystein- bzw. Lysinderivaten der folgenden Formeln: COOH COOH
■N H—(CH2)i L ^— 1_2~ " S— C H wobei LI jeweils an den niedermolekularen KSP-Inhibitor gebunden ist, z.B. einer Verbindung der Forme! (I), (Ta), (IT), (IIa), (IIb), (TIca), (ITd), (ITe), (ITf), (III) oder (IV).
Erfindungsgemäß bevorzugt sind auch die Linker-Grundstrukturen (ii) and (iv), insbesondere bei Anbindung an die Position R1, insbesondere wenn die Gruppe LI eine der folgenden Strukturen aufweist:
(a) -NH-(CH2)O.4-(CHCH3)<M-CHY5-CO-Y7 , wobei Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder - COCH3 darstellt, und Y7 eine Einfachbindung oder -NH -(CH2)o-4 -CHNH2-CO- darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur -- H-(CH2)O-4-(CHCH3).:M-CHY5-COOH bzw. -NH- (CH2)o-4-(CHCH3)o-4-CHY5-CO-NH -(CH2)M -CHNH2-COOH erhalten wird.
(b) --€H3-SX-(CH2)o-4-CHY5-CO- auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY* darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur -Cft-Sx- (CH2)Ö-4-CHY5-COOH erhalten wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch die Linker-Grundstruktur(i) bei Anbindung an die Position R4, insbesondere wenn m=0.
Wenn der Linker an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest gebunden ist, leitet sich L2 vorzugsweise von einer mit der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins reaktiven Gruppe ab. Hierzu zählen Haloacetyle, Maleimide, Aziridine, Acryloyle, Arylierende Verbindungen, Vinylsulfone, Pyridyldisulfide, TNB-thiole and Disulfid-reduzierende Mittel. Diese Gruppen reagieren in der Regel elektrophil mit der Sulfhydiyl-Bindung unter Bildung einer Sulfid (z.B. Thioether)- oder Disulfid-Brücke. Bevorzugt sind stabile Sulfidbrücken. L2 ist vorzugsweise
wobei
#' die Verknüpfungssteile mit dem Schwefeiatom des Antiköipers kennzeichnet, (i2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und 22 COOH, COOR, COR, CONHR, CONR2 (mit R jeweils Cl-3-Alkyi), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt.
Besonders bevorzugt als L2 ist:
Formel A
Formel A4 wobei #! die Verknüpfüngssteile mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfüngssteile mit dem Wirkstoff kennzeichnet, x 1 oder 2 darstellt, und R^ COOH, COOR, COR, CO R2, CONHR (mit R jeweils Cl -3-Alkyi), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt.
Bevorzugt ist es, wenn x=l und R 2 COOH darstellt.
In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfmdungsgemäßen Konjugale liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A3 oder A4 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
vor.
Erfindungsgemäß wird LI vorzugsweise durch die Formel
#l-(NR10)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt, wobei
R10 H, H2 oder Ci-C .-Alkyl darstellt;
N N— CO
Gl WO- , -CONH- oder darstellt; (R1 U ist vorzugsweie nicht H2, wenn
N— CO
Gl NHCO oder ).
n 0 oder 3 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyelischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S~, -SO-, SO2, -NR}'-, - NRYCO-, -C(NH)NRy-, ·( '< )>. R.v-. -NRYNRY-, -S< ! ΝΊΟ \ }·? > ··. ·( '< >\ R.VN > -„ (wobei Ry H, Phenyl, Ci-Ci0-AlkyL C2~Ci 0-Alke yl, oder C2-C1 Q-Alkmyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOK, -OH, - H2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci-C-3-Alkyl oder Phenyl darsieilt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heierozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
), wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -N H . NH~CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoftatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
G2 ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen - O-, -S~, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONPINH-, -CR^N-O- (wobei Rx H, C j -Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis 10-gliedriger, z.B. 5 bis I Ogliedriger aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unierbrochen sein kann (vorzugsweise
— H CO
\ / ), wobei Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH?., NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können. eitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
wobei Rx H, Ci-Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt.
Hierbei ist # ' die Bindung zum SP-lnhibitor und - die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).
Eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyciischen Aikylengruppen umfasst in der Regel einen α,ω-divalenten Alkyirest mit der jeweils angegebenen Zahl von Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-l ,2-diyl (1,2-Ethylen), Propan-1,3- diyl (1,3-Propylen), Butan- 1,4-diyl (1,4-Buiylen), Pentan-l,5-diyl (1,5-Pentylen), Hexan- 1,6-diyl (1,6-Hexylen), Heptan-l,7-diyl (1,7-Hexylen), Octan-l ,8-diyl (1,8-Octylen), Nonan-l,9-diyl (1,9- onylen), Decan-i,10-diyl (1 ,10-Decylen). Die Aikylengruppen in der Kohlenwasserstoffkette können jedoch auch verzweigt sein, d.h. ein oder mehrere H-Atome der oben genannten linearen Aikylengruppen können ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein und so Seitenketten bilden. Die Kohlenwasserstoffkette kann weiterinn cyclische Aikylengruppen (Cycloalkandiyl) enthalten, z.B. 1 ,4-Cyclo exandiyl oder 1 ,3-Cyclopentandiyl. Diese cyciischen Gruppen können ungesättigt sein. Insbesondere können in der Kohlenwasserstoffgruppe aromatische Gruppen (Arylengruppen) vorliegen, z.B. Phenylen. Auch in den cyciischen Aikylengruppen und den Arylengruppen können wiederum ein oder mehrere H-Atome ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein. Es wird so eine Kohlenwasserstofikette gebildet, die ggf. verzweigt ist. Diese Kohlenwasserstoffkette weist insgesamt 0 bis 100 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 25 Kohlenstoffatome auf. Die Seiienketten können, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Suifonsäure ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden substituiert sein.
Die Kohlenwasserstoffkette kann einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - SO-, S02, - H-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, - HNH-, -S02 H H-, -CO HNH- und einen 5 bis lOgiiedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein (vorzugsweise
— N N-CO—
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
Vorzugsweise enispricht der Linker der folgenden Formel:
§-(CO)m-Ll-L2-§§ wobei
m 0 oder 1 ist; § die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt, und
LI und L2 die oben genannten Bedeutungen aufweisen.
Besonders bevorzugt weist LI die Formel -NR1 ^ B- auf, wobei
R11 H oder H2 darstellt;
B -{(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)2- darstellt,
w = 0 bis 20 ist;
x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 0 bis 5 ist; und
NH darstellt.
Erfindungsgemäß bevorzugte Linker L weisen die folgende Formel auf:
wobei
#3 die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt,
#4 die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
R1 1 H oder ΝΉ2 darstellt;
B -[(CH2)x-iX4)y]w-(CH2)z- darstelit,
w = 0 bis 20 ist;
x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 1 bis 5 ist; und
H darstellt. Die oben gemannten Linker werden insbesondere bevorzugt in onjugaten der Formel (I) oder (II), in denen der Linker durch Substitution eines H- Atoms an l oder in Verbindung mit einem spaltbaren Linker SGI an R4 ankoppelt, d.h. Rl-L-#1 darstellt oder R4 -SG1-L-#1, "wobei ff l die Bindung an den Antikörper darstellt.
Weiterhin sind die folgenden Linker erfindungsgemäß bevorzugt: In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor:
Formel A5
Formel A6 wobei
(i 1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, # die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOH, COOR, COR, CONR2, CONHR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CO H2, vorzugsweise COOH darstellt. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
vor.
Andere Linker -L-, die an eine Cystein-Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden sind, weisen die folgende Formel auf:
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bi ndung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
m 0, 3 , 2, oder 3 ist;
n 0, 1 oder 2 ist;
p 0 bis 20 beträgt; und
L3
darstellt;
wobei
o 0 oder 3 ist;
und
G3 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus
Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder cyciischen Aikylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, - CO H-, -NMe-, -NHNH-, -S02 HNH-, -CONHNH- und einen 3 bis 1 Ogliedriger (vorzugsweise 5 bis 1 Ogliedriger), aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder --S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, - H2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Suifoxid oder Suifonsäure subsiituiert sein können.
Bevorzugt ist in der obigen Formel
m 1 ist;
p 0 ist;
n 0 ist;
und L3
wobei
o 0 oder 1 ist; und
G3 -(CH2CH20)3(CH2)t(C0 H)u CH2CH20)v(CH2)w- darstellt, wobei
s, t, v und w jeweils unabhängig voneinander 0 bis 20 betragen, und u 0 oder 1 beträgt.
Bevorzugte Gruppen LI in der obigen Formel §-(CO)m-Ll -L2-§§ sind die folgenden, wobei r jeweils unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, besonders bevorzugt von 1 bis 20, insbesondere bevorzugt von 2 bis 10 aulweist:
CH, H H 0 r
H 0
0 NH / NH ^
Weitere Beispiele für LI sind in Tabelle C angegeben, in denen diese Gruppe in einem Kasten hervorgehoben ist.
In den folgenden Tabellen A und A' sind Beispiele für einen Linkerteil LI angegeben. In der Tabelle ist weiterhin angegeben, mit welcher Gruppe L2 diese Beispiele für LI vorzugsweise kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungssteile (R1 oder R" oder R4) sowie der bevorzugte Wert für m, also ob vor LI eine Carbonylgruppe vorliegt oder nicht (vgl, §-(CO)m-LI - L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cysteinrest gekoppelt. Wenn L2 ein Bemsteinsäureimid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Inrid ganz oder teilweise auch in Form des hydrolysierten oöenkettigen Bernsteinsäureamids vorliegen, wie oben beschrieben. In Abhängigkeit von LI kann diese Hydrolyse zu offenkettigen Bernsteinsäureamiden mehr oder weniger stark oder gar nicht ausgeprägt sein.
Tabelle A
**Besonders bevorzugt werden die in diesen Zeilen angegebenen Linker Li mit verknüpft, der ausgewähit ist aus:
Fomiel A7
und/oder
Formel A8 vor, wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Sehwefelatom des Binders kennzeichnet, # die
Verknüpfungsstelle mit der Gruppe I./ kennzeichnet, '- vorzugsweise COOH darstellt. In einem erfindungsgemäßen Konjugal bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate egen die Bindungen an einen Cysteinrest des Binders vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formei A7 oder A8 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A7 oder A8 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Binder. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
vor.
und
**: Siehe Anmerksing ** zu Tabelle A.
***: Bei Vorhandensein dieser Struktur L2 kann zugleich eine Struktur L2 der folgenden Formel vorliegen:
Beispiele für Konjugate mit entsprechenden Linkem weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und LI die oben angegebenen Bedeutung aufweist, L2 und L3 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AK1 für einen anti~CD123~Antikörper steht, der über einen Cysteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Besonders bevorzugt ist AK1 ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler anti-CD123-Antikörper. Besonders bevorzugt ist hierbei ein chimärer oder humanisierter anti-CD 323-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder I 2F1. Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP- 6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971.
Wenn der Linker an eine Lysm-Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden ist, weist er vorzugsweise die folgende Formel aufweist:
-§-(SGVL4-CO-§§. wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffrnolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeplid oder -prolein darstellt,
x 0 oder 1 darstellt, SG eine spaltbare Gruppe, vorzugsweise ein 2-8 Oligopeptid, besonders, bevorzugt ein Dipeptid darstellt,
und
L4 eine Einfachbindung oder eine Gruppe ! ( '( >.!.-< 14- darstellt, wobei y 0 oder 1 darstellt, und G4 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigte und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHM 1-. -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 10- gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus , O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
N N CO
\ / ), wobei die Seitenketten, soiem vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, - H2, H-CN H2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid oder Suitonsäure substituiert sein können.
In der folgenden Tabelle B sind Beispiele für Linker an einen Lysmrest angegeben. In der Tabelle ist weiterhin die bevorzugte Ankopplungssielle (R!-R5) angegeben. In der ersten Spalte sind weiterhin die Beispielnummern angegeben, in denen entsprechende Linker Anwendung finden.
Tabelle B: Ly sin- Linker
Beispiele für Konjugate mit entsprechenden Linkern weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und L4 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, AK2 für einen Antikörper steht, der über einen Lysmrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Besonders bevorzugt ist AK2 ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler, anti- CD123-Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist hierbei ein chimärer oder humanisierter anii-CD123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1. Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP- 5968, TPP-5969 und TPP-5971.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt die Grandstruktur (i), (ii), oder (iv), wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Gruppe darstellt, und LI und L2 die oben aufgeführten Bedeutungen aufweisen. Besonders bevorzugt sind die folgenden Gruppen:
-Val-Ala-CONH- (hierdurch Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Alanin) -NH-Val-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-ieiTiiinalen Arnid von Lysin)
-NH- Val-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citrullin) -NH-Phe-Lys-CONH (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Aia-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Ala-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Arnid von Citrullin)
SGI bzw. SG ist besonders bevorzugt
3ZW.
wobei X H, eine Ci-io-Alkylgruppe ist, die gegebenenfalls mit -NHCONH2, -COOK, -OH, NH2, NH-C NH2. oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
In der folgenden Tabelle C sind Beispiele für einen Linkerteil -SG1-L1- bzw. -Ll-SG-Ll- angegeben, wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Gruppe ist. in der Tabelle C ist weiterhin angegeben, mit weicher Gruppe L2 diese Beispiele für -SGI -LI- bzw. -Ll-SG-Ll- vorzugsweise kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungsstelle (R'-R5) sowie der bevorzugte Wert für m, also ob vor L I eine Carbonylgruppe vorliegt oder nicht (vgl. §-(CO)m-Ll- L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cysteinrest gekoppelt. Die LI -Gruppe ist in einem Kasten hervorgehoben. Diese Grappen LI können jedoch durch eine der Gruppe LI , die für die obige Formel §-(CO)m-Ll-L2-§§ angegeben ist, ausgetauscht werden. Wenn L2 ein Bernsteinsäureamid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Amid ganz oder teilweise auch in Form des hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamids vorleigen, wie oben beschrieben.
Beispiele für Konjugale mit der Grundstruktur (i) weisen die folgende Struktur auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, L4 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AK1 für einen anti-CD123- Antikörper sieht, der über einen Cysteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Besonders bevorzugt ist hierbei ein chimärer oder humanisierter anti-CD 123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1 , Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971.
KSP-Inhibitor - Linker-Intermediate und Herstellung der Konjugale
Die erfindungsgemäßen Konjugale werden hergestellt, in dem zunächst der niedermolekulare KSP- Inhibitor mit einem Linker versehen wird. Da so erhaitene intermediat wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antiköiper) umgesetzt. Für die Kopplung an einen Cysteinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Cystein-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper, der dazu ggf. partiell reduziert wurde, umgesetzt:
TFÄ
TFA
wobei R -H oder COOK darstellt,
wobei K lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit Ci-Ce Aikoxy oder -OH substituiertes Cr Ct. Alkyl darstellt, und
wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, SGI, Li, L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben.
In jeder der obigen Verbindungen wie auch den folgenden Verbindungen kann die tert.-butyl- Grappe durch Cyciohexyl ersetzt sein.
Die V erbindung kann z.B in Form ihres Trifluoressigsäuresalzes verwendet werden. Zur Reaktion mit dem Binder wie z.B. dem Antikörper wird die Verbindung vorzugsweise in 2 bis 12 fächern molaren Überschuss gegenüber dem Binder verwendet.
Für die Kopplung an einen Lysinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Lysin-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper umgesetzt:
wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt,, und L4 die gleiche Bedeutung wie LI hat, und LI die gleiche Bedeutimg hat wie oben beschrieben.
Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Intermedia!; können die Reaktionen wie folgt veranschaulicht werden:
Die anderen Intennediaie und andere Antikörper können entsprechend umgesetzt werden.
Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Tntermediat kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:
Erfindungsgemäß werden so die folgenden Konjugale erhalten:
In Abhängigkeit vom Linker können Succinimid-verknüfte ADCs nach der Konjugation in die offenketiigen Benisleinsäureamide überführt werden, die ein vorteilhaftes Stabilitätsprofil aufweisen.
Diese Umsetzung {Ringöffnung) kann bei pH 7.5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8, bei einer Temperatur von 25 ° C bis 37 °C erfolgen, z.B. durch Rühren. Die bevorzugte Rührzeit beträgt 8 bis 30 Stunden.
In den obigen Formeln stellen X 3 CH, X2 C, und X3 N dar; haben SG3 und LI die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben, und L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung wie LI ; und R und K haben die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben. A 1 ist ein über einen Cysteinrest gekoppelter, anti-CD123-Antikörper, und AK2 ist ein über einen Lysinrest gekoppelter, anti- CD 123 -Antikörper. Besonders bevorzugt ist AKl und AK2 ein chimärer oder humanisierter anti- CD123- Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F 3 . Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971.
A n ti- CD123-Antikörper
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Antikörper bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der Toxophore an den Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von C stein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das Toxophor an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuekerreste des Antikörpers zu binden.
Der Antikörper kann über eine Bindung mit dem Linker verknüpft werden. Die Verknüpfung des Antikörpers kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Antikörper, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind Schwefel (in einer Ausführungsform via einer Sulfhydrylgruppe des Antikörper), Sauerstoff (erfindungsgemäß mittels einer Carboxyl oder Hydroxylgruppe des Antikörper) und Stickstoff (in einer Ausfuhrungsform via einer primären oder sekundären Amingruppe oder Amidgruppe des Antikörper). Diese Heteroatome können im natürlichen Antikörper vorhanden sein oder durch chemische oder molekularbiologische Methoden eingeführt werden. Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Antikörpers mit dem Toxophor nur einen geringen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörper zum Zielmolekül. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörpers zum Zielmolekül.
Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche typischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CHI, CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarit determining region", abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region", abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sieh typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Arninotenninus zum Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em Antikörper kann aus jeder dafür geeeigneten Spezies erhalten werden z.B. Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Ausführungsforni ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein.
Der Begriff „monoklonaler" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auttreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige antigene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfahren.
Der Begriff„intakter" Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen-bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden.
Der Begriff „modifizierter intakter" Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Arninotenninus oder Carboxytermmus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptid Verknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008, 26(8):925-32).
Der Begriff „humaner" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein „synthetischer" humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als ganzes von synthetischen Sequenzen in silico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al, Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden.
Der Begriff „humanisierter" oder„chimärer" Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nicht- humanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt. Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In manchen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipiert noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefügt wurden. Bei chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusionier
Der Begriff Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) wie er hier verwendet wird, bezieht sieh auf diejenigen Aminosäuren einer variablen Antikörperdomäne, die für die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Kabat und/oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Kabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDR! ), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette und 31 - 35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 102 (CDR3) der variablen schweren Kette (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDR1), 50 - 52 (CDR2) und 91 - 96 (CDR3) der variablen ieichetn Kette und 26 - 32 (CDR1), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Kette Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Kabat und Chotia umfassen.
Abhängig von der Aminosäure-Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: lgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. TgGl, IgG2, IgG3, TgG4, IgAl und IgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [alpha/a], [delta/δ], [epsiäon/e], [gamma/γ] und [my/μ] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstruktur von Antikörpern sind bekannt.
Der Begriff „funktionales Fragment" oder „antigen-bindendes Antiköiperfragment" eines Antikörpers/Immunoglobul ins ist definiert als ein Fragment eines Antikörpers/immunoglobulins (z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen-Bindedomänen des Anΐikö er ϊmmunoglobulins noch umfasst. Die „Antigen-Bindedomäne" eines Antikörpers umfasst typischerweise eine oder mehrere Hypervariable Regionen eines Antikörpers, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework" oder die„Gerüst" Region eines Antikörpers zur Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen- Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 1 11 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 3 - 309 der VL und 1 bis 113 der VH (Nummerierung nach WO97/08320).
„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente" der Erfindung umfassen nicht abschliessend Fab, Fab', F(ab')2 und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), linerae Antikörper, Einzelketten Antikörper (single-ehain Fv, abgekürzt scFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Andere Antikörper als„multi-spezifische" oder „multi-fünktionale" sind solche mit identischen Bindestellen. Multi spezifische Antikörper können spezifisch für unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60 69; U. S. Fat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; oder Kostelny et al, 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab'>2 oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chi und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder oder komplett verhindert werden kann.
„Epitope" bezeichnen Proteindetenninanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T-Zeil-Rezeptoren eingehen können. Epiiopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3- dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf.
„Funktionale Fragmente" oder „antigen-bindende Antikörperfragmente" können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüprung) fusioniert, werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen-bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtem (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32). Polyklonale Antikörper können durch für den Durchschnitts fachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnitts fachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397).
Der Durchschnittsfachniann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lemberg und D Huszar, Int Rev lmmunol. 1995; 13(l ):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wurden. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenzierung erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich.
Ein „isolierter" Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, weiche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicht-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV- Vis Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Ausserdem ein Antikörper, der soweit aufgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterrninus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Anfärbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden). Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt
Der Begriff„spezifische Bindung" oder„bindet spezifisch" bezieht sich auf einen Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekül bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10'7 M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd- Werten als IQ'"-7 M), wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekül als zu einem nicht-spezifischen Antigen/Zielmolekül hat (z.B. Rinder Senimalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekül oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekül ist. Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens 10" ' M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10" ' M), vorzugsweise von mindestens 10"^ M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10"9 M bis 10" ^ M auf. Die Kd- Werte können durch z.B. Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper- Wirkstof -Konjugate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeinflusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine Größenordnung verringert, also z.B. maximal von I 0~8 M auf 10" 7 M).
Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweisst als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden).
Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft-Mäusen), zu erleichtern und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies-Zieiprotein bindet. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Speiden der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Schimpansen und Langschwanzmakaken.
In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind erfindungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Maus-Zieiprotein sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antikörper, deren Affinität zum Zieiprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet. Gegen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper
Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein Krebs-Zielmolekül. Der Begriff„Krebs-Zielmolekül" bescirreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nichtKrebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs- Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreib! (ein „selektives Krebs-Zielmolekül"). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Besonders bevorzugt ist hierbei das extrazelluläre Krebs Zielmoiekül 3L-3Ra, CD 123 (SEQ ID NO: 41)
Der funktionale Interleuldn 3 Rezeptor ist ein Heterodimer, der die spezifische alpha Kette (IL- 3Ra, CD123) und eine „allgemeine" IL-3 Rezeptor beta Kette (ßC, CD131), die mit den Rezeptoren für Granolozyten Makrophagen Kolonie Stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Interleukin 5 (IL-5) geteilt wird, umfasst.
3L-3Ra, CD 123, ist ein Transmembranprotein des Typs 1 mit einem berechneten Molekulargewicht von ca. 41 kDa. CD123 umfasst eine extrazelluläre Domäne, die an der IL-3-Bindung beteiligt ist, eine Transmembrandomäne und ein kurzes zyloplasmalisehes Ende von ungefähr 50 Aminosäuren. Die extrazelluläre Domäne besteht aus zwei Regionen: einer N-ierminalen Region von ca. 100 Aminosäuren, die Sequenzähnlichkeit mit den äquivalenten Regionen des GM-CSF und der IL-5 Rezeplor-alpha-Kette aufweist, und einer proximal zur Transmembrandomäne gelegenen Region, die vier konservierte Cystein-Reste und ein in der Cytokin-Rezeptor-Familie übliches WSXWS Motiv umfasst.
Die IL-3 Bindedomäne umfasst ein ungefähr 200 Aminosäurereste großes Cyiokinrezeptormotiv (CRM), welches aus zwei Ig-artig gefalteten Domänen aufgebaut ist. Die extrazelluläre Domäne von 3L-3Ra, CD123, ist hoch glykosyliert, wobei die N-Glykosylierung notwendig für die Ligandenbindung und die Rezeptorsignalweitergabe ist. IL-3Ra, CD123, ist durchgehend und umfangreich im hämatopoetischen System exprimiert, wie z.B. auf hämatopoetischen Vorläuferzellen, Mastzeilen, erythroiden Zellen, Megakaryozyten, neutrophile, basophile und eosinophile Granulozyten, Monozyten / Makrophagen, und CD5+ B- Lymphozyten; CD 123 ist auch exprimiert auf nicht-hämatopoetischen Zellen wie dendridische Zellen, Leydig-Zellen, Endothelzellen und Stromazellen.
IL-3Ra, CD123, wird auch von Zellen exprimiert, die an bestimmten Krankheiten beteiligt sind; diese Krankheiten umfassen: Myelodysplastisches Syndrom, Leukämie (wie z.B. akute myeloische Leukämie (AML)) Lymphoma, Allergien und Autoimmunkrankheiten wie Lupus oder Scleroderma.
Aufgrund dieser Zusammenhänge sind anti-IL-3Ra, anti-CD123, Antikörper in der Therapie als nackte und gekoppelte Antikörper (wie z.B. ADCs) verwendbar.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Konjugale umfassend Antikörper, die spezifisch an IL- 3Ra, CD 123 (SEQ ID NO: 41) binden.
Der Begriff „anti-CD 123- Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an CD 123 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CD123 (IL-3Ra , SEQ ID NO: 41) mit für eine diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität bindet In einer Ausfuhrungsform ist die Bindung eines anti-CD 123 Antikörpers zu einem mit CD 123 nicht verwandten Protein weniger als 10% der Bindung des Antikörpers an CD123, wie z.B. mit Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden kann. in bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CD123 (IL-3Ra , SEQ ID NO: 41) mit einer Dissotiationskonstante (KD) von < Ι μΜ, < 100 M, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, or < 0.001 nM. In bestimmten Ausführungsformen bindet der anti-CD123 Antikörper an ein Epitop, das zwischen verschiedenen Spezies konserviert ist.
Antikörper, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen- bindenden Antikörperfragmenten sind in WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22 „Antibodies"). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK- Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seile 30-32 von WO2007070538 und im Detail in Queen, et al.,,Pros. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029- 10033,1989 oder in WO 90/0786 beschiieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanien Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Teclmiques, Methode in Enzymology, Vol. 152, Acadernic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (39881, Paul [Ed.]); Fundamental Tmmunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (üsing Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfaliren zur Herstellung eines IgGl- Antikörpers sind z.B. in WO 2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschiieben. Verfaliren, mit denen die Intemalisierung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)- Antikörpern verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden.
Anti-CD! 23-Antikörper
Erfindungsgemäß wird ein anti-CD123-Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon verwendet, vorzugsweise einer, der unter den nachfolgend beschriebenen ausgewählt bzw. durch geeignete Mutation verändert vorliegt. Darüber hinaus sind dem Fachmann Antikörper, die an CD 123 binden bekannt.
Die Generierung und Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers 7G3, welcher die N-terminale Domäne von IL-3Ra, CD123, bindet, werden von Sun et al. beschrieben (Sun et al., 1996, Blood 87(l):83-92). US Patent Nummer 6,177,078 (Lopez) bezieht sieh auf den anti-CD123-Antikörper 7G3. Eine cliimäre Variante dieses Antikörpers (CSL360) ist in WO 2009/070844 sowie eine humanisierte Version (CSL362) in WO 2012/021934 beschrieben. Die Sequenz des 7G3 Antikörpers ist in EP2426148 offenbart worden. Diese Sequenz stellt den Ausgangspunkt der humanisierten Antikörper TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971 dar, die durch CDR -Umsetzung („CDR grafting") erhalten wurden
Einen Antikörper, der besonders gut nach Zelloberflächenantigenbindung internatisiert, ist der anti- CD123 Antikörper 12F1, der von Kuo et al. offenbart, wurde (Kuo et a., 2009, Bioeonjug Chem. 20(10): 1975-82). Der Antikörper 12F1 bindet mit einer höheren Affinität an CD 123 als der Antikörper 7G3 und internalisiert nach Zelloberflächenantigenbindung deutlich schnei! er als 7G3. Bispezifische scFv Immunofusionsproteine basierend auf 12F1 werden in WO 2013/373820 offenbart. Antikörper TPP-6013 ist eine chimäre Variante des 12F1.
Die Erfindung betrifft insbesondere Konjugate mit Antikörpern oder antigenbindende Aniikö 3erfragmente davon oder Varianten davon, die auf den aus der Maus stammenden Antikörper 7G3 (Sun et al, 1996, Blood 87(l):83-92) und 12F1 (Kuo et a., 2009, Bioeonjug Chem. 20(10):1975-82) zurückgehen, oder Konjugate mit Antikörpern oder antigenbindende .Antikörperfragmente davon oder Varianten davon, die auf den aus der Maus stammenden Antikörper 12F1 (Kuo et a., 2009, Bioeonjug Chem. 20(10): 3975-82) zurückgehen.
Erzeugung der anti-CD 2 - Antikörper
Basierend auf der Veröffentlichung der Sequenzen der variablen Regionen (VH und VL) von 7G3 (EP2426148) wurden folgende Antikörper-Sequenzen durch CDR-Umsetzung („CDR grafting") in humane„framework regions" erhalten: TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971.
Basierend auf der Veröffentlichung der Sequenzen der variablen Regionen (VH und VL) von 12F1 (WO 2013/173820) wurden folgende Antikörper-Sequenzen durch Fusion der variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins (VH und VL) mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers erhalten: TPP-6013.
Weitere humanisierte Varianten der anti-CD123-Antikörper können durch fachbekannte Verfahren der Humanisierung erzeugt werden.
Methoden zur Erzeugung dieser sind übersichtsartig beschrieben in Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), und weiter beschrieben in Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5,821 ,337, 7,527,791, 6,982,321 , and 7,087,409; Kashmiri ei al, Methods 36:25-34 (2005) (beschrieben wird das "speeifieity determining regio« (SDR)" Grafting); Padlan, Mol. Tmmunol. 28:489-498 (1991) (beschrieben wird das "resurfacing"); Dali' Acqua et al, Methods 36:43-60 (2005) (beschrieben wird das "FR shuffling"); and Osboum et al., Methods 36:61 -68 (2005) and Klinika et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (beschrieben wird das "guided selection" Ansatz zum FR Shuffling).
Besondere Ausführimgsformen von anti-CD 123- Antikörpern
In dieser Anmeldung wird auf die folgenden bevorzugten anti-CD123 Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt:„TPP-6013",„TPP-5968",„TPP-5969" und „TPP-5971".
TPP-6013 ist eine chimäre Variante des 12F1, bei welchem die variablen Regionen VH und VL mit den konstanten Regionen (CL, CHI, CH2, CH3) eines humanen IgGl des kappa Subtyps verbunden sind.
Bei den Antikörpern TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971 handelt es sich um humanisierte Varianten des 7G3 als Subtyp humaner IgGl kappa.
Tabelle: Proteinsequenzen der Antikörper:
TPP-5968 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 10. TPP-5969 ist ein Antikörper unifassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 20,
TPP-5971 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 30,
TPP-6013 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 40,
TPP-5968 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 5.
TPP-5969 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 11 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 15. TPP-5971 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 25. TPP-601 3 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 33 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 35.
Bevorzugte Ausiiihrungsfomien des ariti-CD123-Antiliöroers zur Kopplung mit erfindungsgemäßen Linkem und / oder Toxophoren sind die folgenden:
1. Ein Antikörper oder ein antigenbindend.es Fragment davon, welcher an CD123 bindet und eine chimäre oder humanisierte Variante der Antikörper 7G3 oder 12F1 ist,
2. Ein Antikörper oder ein antigenbmdendes Fragment, welcher an CD123 bindet,
umfassend:
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8 oder
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 18 oder
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: 23 und die variable CDR3~Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 28 oder
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: 34, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ TD NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 38.
, Der Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon gemäß Ausführangsfortn 2 umfassend:
eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: i , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:5 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: 1 1 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15 oder
eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:21 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:25 oder
eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:31 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:35.
Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfülrrungsfonnen, der ein IgG Antikörper ist.
Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, umfassend:
eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30 oder
eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 39 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20 oder
eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30 oder
eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:40.
Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausitthrangsforaien, umfassend: Das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausfiihrungsformen oder ein antigenbindendes Fragment eines Antikörpers gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, das ein scFv-, Fab-, Fab ' -Fragment oder ein F(ab )2-Fragment ist.
Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, der ein monoklonaler Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon ist.
Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einem der vorhergehenden Ausfühnmgsformen, der ein humaner, humanisierter oder chimärer Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment ist. Besonders bevorzugt sind die anti-CD 123- Antikörper„TPP-6013",„TPP-5968",„TPP- 5969" und„TPP-5971 ".
Isotope, Salze, Solvate, isotopische Varianten
Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen, Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist, Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie 2H (Deuterium), 3H (Tritium), i3C, ,4C, "N, 170, igO, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 6S, 18F, 36C1, 82Br, 12 1, 1241, ml und i3,L Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff- Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit Ή- oder 14C- Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der erfmdungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsforrn der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfmdungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen unifassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansuifonsäure, Benzolsulfonsäure, Toiuolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalinietallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdaikaiisaize (z.B. Calcium- und Magnesiumsaize) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropyiamin, Monoethanolamin, Dietlianolamin, Trietha.nola.min, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylpiperidin, A^-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiarnin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
Besondere A usführu ngsform en
Die folgenden Ausführungsformen sind besonders bevorzugt:
AusfflhnmgsJmn Ai
Ein ADC der Formel
BINDER- ■L- wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (I), (Ta), (II), (IIa), (IIb), (ITe), (Ild), (He), (Iii), (Ilj), (Ilk) oder der folgenden Formel (ITf) ist, der Binder ein anti-CD123-Antiköiper (besonders bevorzugt ein chimärer oder humanisierter anti-CD 123 --Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12.Fi , insbesondere die Antikörper TPP-6013, TPP- 5968, TPP-5969 und TPP-5971), und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Formel (ITf):
(Ilf) wobei
A CO (carbonyl) ist;
R ' -L-#l, H, -COOH, -CONI-INH2, -(CH2)i-3 H2, -CONZ"(CH2)i-3 H2 und CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder H2;
R2 und R4 H ist, oder R und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRl!- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt;
R3 - L--// 1 oder eine Cl-10-Atkyl-, die ggf, mit -OH, O- Alkyl, SH, S- Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO- NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, H-CO-NH-Alkyl, S(0)n- Alkyl, S02- H-Alkyl, NH-A3kyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1..3 Alkyl bedeutet) ist:
R5 H oder F ist;
R6 und R' unabhängig voneioaDder H, (ggf. fluoriertes) Cj.j-Alkyi, (ggf. fluoriertes) C2.4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2..4"Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen; R8 eine verzweigte Ci-s-Alkyl-Gruppe ist; und
R H oder F ist, wobei einer der Substituenten R! und R3-L-#l darstellt, und
-L-den Linker und #3 die Bindung zum Antikörper darstellt, sowie Salze, Solvate und Salze der Solvate des ADCs. Der Linker ist vorzugsweise ein Linker
§-(CO)m-Ll-L2-§§
wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
darstellt, wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #" die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
# 1 -(NR10)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt wird. wobei
R10 i L \ Π oder Cl»C3»Alkyl darstellt;
— N N-co—
Gl -NHCO- oder \___/ darstellt;
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 1 00 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und'Oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONH H- und einen 3 bis lOgliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen
— N N-CO— ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, H-C NHi, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei ist #l die Bindung zum KSP-lnhibitor und #- die Bindung zur opplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).
Ausführungsfbrm B:
Ein ADC der Formel
BINDER- ■L— KSP
wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (I), (ia), (II), (IIa), (IIb), (lic), (Ild), (He), (III), (Iii), (Iii), (Ilk) oder der folgenden Formel (Hg) ist, der Binder ein anti-CD 123 -Antikörper ist (besonders bevorzugt ein chimärer oder humanisierter anti-CD123- Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12.Fi, insbesondere die Antikörper TPP-6013, TPP- 5968, TPP-5969 und TPP-5971), und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Formel (Hg):
(ng) wobei
A CO (carbonyl) ist;
R1 -L-# l , H, -COOK, ·( ·< >Ν ί Γ\ ί ί. . -(CH2)]-3NH2, -CONZ"(CH2) i-3 H2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder NH2;
Rz und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines PyrroHdinringes) -CH2-CHR"- oder -CHR1!-CH2- darstellen, wobei Rn H darstellt;
R3 -L-#l oder eine C,-10- Alkyi-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S- Alkyi, O-CO-Alkyl, O-CO- NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, H-CO-NH- Alkyi, S(0)n-Alkyl, S02»NH- Alkyi, NH-Aikyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyi vorzugsweise C1-3 Alkyi bedeutet) ist;
Rs H oder F ist;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, (ggf, fluoriertes) Cw- Alkyi, (ggf. fluoriertes) C2_4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
Rs eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Oruppe ist; und
R H oder F ist, wobei einer der Substituenten R1 und R3-L-#l darstellt, und
-L-den Linker und # 1 die Bindung zum Antikörper darstellt,
wobei -L- dargestellt wird durch §-(CO)m-Ll-L
wobei
rn 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
darstellt, wobei
#' die Verknüpfirngsstelie mit dem Scliwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, (i2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
«i-(NR10)n-(Gi)o-G2-#2
dargestellt wird,
wobei
R10 H, NH2 oder Cl-C3-Alkyl darstellt; Gl -NHCO- oder darstellt;
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/Oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cycliscnen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NB-, - CO-, -N ! !( '< !·. -( ( }Χ Π· . - Me-, -ΝΗΝΉ-, -S02NHNH-, -CO H H- und einen 3 bis lOgiiedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen
— N-CO— ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit - HCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
#' die Bindung zum KSP-Inhibitor und #■"· die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper ist (z.B. ! ..? !.
sowie Salze, Solvaie und Salze der Solvate des ADCs.
Ausffihninjrefomi C:
Ein ADC der Formel
BINDER- ■L-
wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Forrnei (II), (IIa), (IIb), (llc), (IM), (He), (Ilf), (Hg); (Iii), (Iii), (Ilk) oder der folgenden Formel (31h) ist, der Binder ein anti-CD123-Antikörper (besonders bevorzugt ein chimärer oder humanisierter anti-CD123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1, insbesondere die Antikörper TPP-6013, TPP- 5968, TPP-5969 und TPP-5971), und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Formel (Ilh):
wobei
A CO (carbonyl) ist; R -L-#l ist,;
R2 und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder ~CHRn-CH2- darstellen, wobei Ru H darstellt;
R3 eine Ci-io-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, SiO)„-Alkyl, S02~NH-Alkyl, ΝΉ-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet), oder -MOD ist;
wobei -MOD -(NRi0)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R 10 H oder Ci-C,- Alkyl darstellt;
Gl --NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl --NHCO- darstellt, R 10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, -NR '-, -NRYCO-, CONR -, -N NR)'-, -802ΝϊΐΥΝίϋ'-, -C< !\ R> \ R> -. (wobei Ry H, Phenyl, C -C Q-Alkyl, C2-C1 Q-Alkenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CR*=N-0- (wobei Rx H, C -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;
R5 H oder F ist;
R6 und R? unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Cj -3- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2.4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C.- -Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen; R8 eine verzweigte Ci-s-Alkyl-Gruppe ist; und
R H oder F ist, wobei -L-den Linker und #1 die Bindung zum Antikörper darstellt,
wobei -L- dargestellt wird durch
§-(CO)m-Ll-L2-§§
wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
darstellt, wobei die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
#1-(NR10)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt wird,
wobei
Rl 0 H5 NHj 0de.r Cl-C3-Alkyl darstellt; Gl \ 1 K/O- oder \ darstellt;
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder eye fischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Cj -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis iO-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -
N N CO
S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOK, -OH, -NH?, NH-
CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
- die Bindung zum KSP-Inhibitor und iß die Bindung zur Koppiungsgmppe zum Antikörper ist (z.B. L2),
sowie Salze, Solvate und Salze der Solvate des ADCs.
Ausfülirungsform D:
Die Erfindung stellt auch Binder- Wirkstoff-Konjugate der folgenden allgemeinen Formel bereit:
BINDER- WS
m
n wobei BINDER für den anti-CD123-Antikörper (besonders bevorzugt ein chimärer oder humanisierter anti-CD123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1 , insbesondere die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971), L für den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-Inhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP-Inhibitor einer der Formeln (I), (la), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (lid), (Ile), (Iii), (Hg), (Uli) (Iii) ist, m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1, und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei L eine der folgenden Strukturen autweist. Hierbei ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker und n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff-Linker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe aller WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.
WS ist ein Wirkstoff, der in Tieren, bevorzugt Menschen, eine lokale oder systemische Wirkung therapeutische Wirkung zeigt. Diese Wirkstoffe haben in der Regel ein Molekulargewicht von unter 5 kDa, bevorzugt unter 1.5 kDa. Bevorzugte Wirkstoffe sind Vinca-Alkaloide, Auristatine, Tubulysine, Duocarmycine, Kinase-Inhibitoren, MEK-lnhibitoren und KSP-inhibitoren.
Hierbei steht L für eine der folgenden Formeln A3 oder A4
Formel A3
Formel A4 wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit dem Wirkstoff kennzeichnet, x I oder 2 darstellt, und R i- COOH, COOR, COR (mit R jeweils Cl-3-Alkyi), CONH2, Br, vorzugsweise COOH darstellt,.
LI weist dieselbe Bedeutung wie oben auf. Vorzugsweise wird -Ll-#2 durch die folgende Formel dargestellt:
#3-( l0)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt, wobei #3 die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom kennzeichnet
R " H, NH2 oder Ci-CL-Alkyl darsteilt;
— N N-CO—
-NHCO-, -CONH- oder N / darstellt; (wobei wenn Gl NHCO oder
\ QQ
darstellt, R 10 nicht NH2 ist),
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit I bis 100 Kohlenstoffatomen aus Aryiengrappen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, - RY-, - RYCO-, -C(NH) RV-, -CONRY-, -NRYNRY-, -S< )2\ R>'\ R.V-. -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, Ci -C1 Q-Alkyl, C2-C 1 Q-Alkenyl, oder C2-Ci Q-Alkiny] darstellt, die jeweils mit HCONH2, -COOH, -OH, - H2, NH-C NH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx-N-0- (wobei Rx H, Cj -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozykius mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
/ \
— N N-CO—
\ / ), wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind Vorzugs
wobei Rx H, Ci-C^-Alkyl oder Phenyl darstellt.
In dem erfindungsgemäßen Konjugal bzw. in einem Gemisch der erfmdungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers egen vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 %, besonders bevorzugt (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper) in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor.
Die Konjugate mit den Linkern der Formel A3 bzw. A4 können durch Kupplung der Antikörper an die entsprechenden Bromderivate der folgenden Formeln A3' bzw. A4' erhalten werden:
Formel A4'
Diese Bromderivate der Formel A3' bzw. A4' können durch Reaktion von R2 :CFl2CHB COO I bzw. 22CHB1CH2COOH mit einer Amingruppe des Binders erhalten werden, wie in den folgenden Sciiemata 30 bis 32 beispielhaft veranschaulicht.
[a): 2-Brom- 1 -ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, T; b) Zinkchlorid, Triüuorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
[a): 2-Bron>l -ethylpyridimum-TetrafluoiOborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
Ausfuhrungsform E:
Die Erfindung stellt auch Binder- Wirkstoff-Konjugate der folgenden allgemeinen Formel bereit:
BINDER- L-IWS
m
n wobei BINDER für den anti-CD123-Antikörper (besonders bevorzugt ein chimärer oder humanisierter anti-CD123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1, insbesondere die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971), L für den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-lnhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP-lnhibitor einer der Formeln (I), (la), (II), oder (IIa), m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1 , und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei I. eine der folgenden Strukturen aufweist. Hierbei ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker und n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff-Linker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe aller WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.
Hierbei steht L für:
Formel A wobei #' die Verknüpfungssteile mit dem Schwefel atom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die
Verknüpfungssteile mit dem Wirkstoff kennzeichnet, und R^2 COOH, COOR, COR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, Br, vorzugsweise COOH darstellt. Die Verknüpfung mit dem Schwefelatom des Binders kann somit eine der folgenden Strukturen aufweisen:
Forme
Formel A2 Bei Antikörper— Wirkstof -KonjugateD, die mehr als ein Wirkstoffmolekül WS pro Wirkstoff- Antikörper -Konjugal enthalten, können beide Strukturen gemäß den Formeln A I und/oder A2 in einem Antikörper— Wirkstoff-Konjugat vorliegen. Da es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörper— Wirkstoff -Konjugaten um eine Mischung unterschiedlicher Antikörper— Wirkstoff- Konjugate handeln kann, ist es auch möglich, dass in dieser Mischung A ntikörper— Wirkstoff- Konjugate sowohl mit der Formel A I oder Formel A2 als auch mit der Formel AI und A2 enthalten sind. ist eine Gruppe ausgewählt aus -(CH2)m-(CHRs)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-, wobei m, n, o, p und q unabhängig voneinander die folgenden Werte aufweisen: m=0-10; n=0 oder 1 ; o=0-10; p=0 oder 1 ; und q=0-10, wobei m+n+o=l-15, vorzugsweise 1-6 ist. X stellt einen 5- oder 6-gliedrigen, aromatischen oder nicht-aromatischen Hetero- oder Homocyclus dar, vorzugsweise -C5H4- oder -
C5H1 Q- . RS stellt eine Säuregruppe, vorzugsweise -COOH oder SO3H dar. -NHCO-, -NHCOO-,
L? ist eine Einfachbindung oder eine Gruppe ausgewählt aus einer geradkettige oder verzweigten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 10) Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NR '-, -
\R > ( ·( >-. -C(NH)NRY-, -CONRY-, -NRVNRV-, -S( >2N > \'R > -. -CONRVNRy-, (wobei Ry H, Phenyl, C ; -Ci 0-Alkyl, C^-Cj Q-Alkenyl, oder C^-Ci Q-Aikinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, - H2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0~ (wobei Rx H, C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) und oder einen 3 bis 10-gliedriger, vorzugsweise 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -
S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise , wobei die
Kohlenwasserstoffketie einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCO H2, - COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können. L5 ist bevorzugt eine Gruppe -(CH2)m-(CHRs)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-, wobei m=l-3, n=0, o=0-7, p=0, und q=0 oder 1 darstellt. Besonders bevorzugt ist eine Gruppe -(CH2)m-(CHRS)n- (OCH2CH2)0-( )p-(CH2)q-, wobei m=l oder 2, n=0, O=0 oder 1, p=0, und q=0 oder 1 darstellt.
Le ist bevorzugt eine Gruppe ausgewählt aus ---CONH- und -NHCO-.
L? ist bevorzugt eine Einfaehbindung oder -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-,
wobei x = 0 bis 5 isi;
y = 0 oder 1 ist;
z = 1 bis 5 ist; und
X4 -O-, -CONH-, -NHCO- oder darstellt.
Besonders bevorzugt isi L? eine Einfachbindung oder eine Gruppe --{(Cftjx-NHCO-)], wobei x = 1 bis 5 ist.
Besonders bevorzugt stellt -L5- -L7- -(CH2)m-(CHRs)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q---NHCO---
[iCH2)x- HCO-)] dar, wobei m=l oder 2, n=0, o=0 oder 1, p=0, und q=0 oder 1 , und x=l -5 darstellt.
Es ist jedoch auch möglich, dass diese beiden Strukturen gemeinsam in dem erfindungsgemäßen Konjugat vorliegen.
Diese Antikörper- Wirkstoff-Kortjugate können erfindungsgemäß aus den Verbindungen der Formel
BINDER- WS
m wobei L die folgende Formel A' aufweist, hergestellt werden:
Formel A'
Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung von A' zu A durch Rühren in einem pH-Puffer mit einem pH- Wert von 7.5 bis 8.5, vorzugsweise 8, bei einer 'Temperatur unterhalb 37°C, vorzugsweise 10 bis 25 °C, über einen Zeitraum von bis zu 40 Stunden, vorzugsweise 1 bis 15 Stunden.
Ausführangsform Ϊ:
Ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugal der Forme]
wobei
R2, R4 und R5H darstellen;
R3 -CH20H darstellt;
Rl -L1-L2-BINDER darstellt, wobei
LI darstellt, wobei #2 die Verknüfung mit der L2 darstellt, und #1 die Verknüfung mit die andere Verknüpfung darstellt; und L2 eine oder beide der folgenden Strukturen der Formeln A5 und A6 darstellt:
Formel A5
Formel A6 wobei
#' die Verknüpfungssteile mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOK, COOR, COR, CONHR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOK darstellt.
In einem erfindungsgemäßen Konjugal; bzw. in einem Gemisch, der erfindungsgemäßen Konjugale liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor: Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
vor.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein chimärer oder humanisierter anti-CD 123-Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F1. Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971 ,
Spezielle Ausführungsformen
Es werden folgende besonders bevorzugte Antikörper-Konjugate gemäß einer der folgenden Formeln bereitgestellt, wobei n eine Zahl von 3 bis 20 ist und AK 1 (wie auch AK 1 a, AKlb, usw.) bzw. AK2 (wie auch AK2a, AK2b usw.) einen Antikörper darstellen. AK 1 stellt einen über Cystein verknüpften Antikörper, AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper dar. Der Antikörper (AK1 oder AK2) in einer der der folgenden Formeln ist vorzugsweise ein chimärer oder humanisierter anti-CD 123 -Antikörper abgeleitet von einem aus Mäusen stammenden Antikörper 7G3 oder 12F 1. Besonders bevorzugt sind die Antikörper TPP-6013, TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971.
wobei
A 1 einen über Cysten- verknüpften und AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper, welcher an CD 123 bindet und eine chimäre oder humanisierte Variante der Antiköiper 7G3 oder 12F1 ist, oder eine Antikörperfragment davon, darstellt,
n eine Zahl von 1 bis 20 darstellt; und
Li eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 30
Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, Cyclopentyl, Piperidinyl, Phenyl unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -COOH, oder -NHj substituiert sein kann,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere. Hierbei steht der Linker Li vorzugsweise für die Gruppe
§-NIL CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-§§;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-]SO-(CH2)2-C ))-0-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
ς-ΝΠ-ίί Π ).-NH-Ci (!)-Cii-i?:
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)s-§§;
§- H-(CH2)2- H-C( ))-CH(CH3)-§§;
§- H-(CH2)2-0-{CH2)2- H-C(-0)-CH2-§§;
§-NiLCH(COOH)-CH2-NH-C(-0)~CH2-§§;
§-NiLCH(COOH)-{CH2)2- H-C(=0)-CH2"§§;
§-NiLCH(COOH)-{CH2)4- H-C(=0)-CH2"§§;
\! !·( !!:(·<)(>(!)·( ·ίί··\ίί·(·{ <)) ·(·(!·!;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(C2H4COOH)-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-((CH2)2-0)3-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-S( ))2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-]SiH-C(=O)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)3-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2COOH)-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(C2H4COOH)- H-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(C(X)H)-CH2-NH-C( ))-(CH2)2-NH-C(=<))-CH2-§§;
§- H-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2OH)- H-C(=0)-CH2-§§;
§- H-CH[C(=0)-NH-(CH2)2-0)4-(CH2)2COOH]-CH2- H-C(=0)-CH2-§§;
§- H-CH(COOH)-CH2- H-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(C(X)H)^^
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH- C(=0)-(CH2)5-§§; §- H-(CH2)2-C(-O)-NH CH2)4-CH(COOH)- H ;(-O) H(CH; - H-C( ))-
CH(isoC3H7)-NH-C(-0)-CH2-§§;
§-NH-{CH7j2-C(-0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(-0)-CH(CH3)-NH-C(==0)- CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)3-NH-CK))-NH2]-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-CH))-(CH2)2 :H(COOH)-NH-CH))
CH(isoC3H7)-NH-C(K))-(CH2)5-§§;
§-NH-CH(CH3)-CK))-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C( ^)- CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
ij-\'!l-(CH. ).·-<. "i < ))·\ί :·!('! I .·).·.-('! Ι ΌΟί ί }·Νί Ι·ν ! (>}-Ciii!Cll }:·\Π·( ·( Οί· H2]- H-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-ΝΗ ν " C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-ΝΗ /!"" (·· {))·ΝΠ·((.Ί{·);·ΜΙ·(·ί (>}
§-ΝΗ C(K))-NH-(CH2)4-CH(C(X)H)-NH-C(K))-CH[(CH2)3-NH-C( ))- H2]- H-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-ΝΗ C(-0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(-0)-CH[(CH2)3-NH-C(=0)- NH2]-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
·?··ΝΠ '' C(-0)- H CH2)4-CH(COOH)- H-C{-0)-CH(CH3)-NH-C( ))- CH( isoC dl }·ΝίΙ·(. ί <>) · U }s - § § ;
§-NH-(CH2)3-C(=0)-NH-CH(isoC3H7)-C(=0)- H-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2
C(=0)-0 ' ^ ' C(=0)-CH2-§§; i-N!{-(CH.);-Ci Oi-Xfi-C!iiis Cdl )·{·( ί )}·\! ί·(Ί i({ Ί K ί ί »-<>
C(<))~CH2-§§; ί ·Μ ! ·(( !;). · XI ί· Γ( <>) · \
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0) - H-(CH2) -C(=0)- H-CH(CH3)-C(0)- H-CH[(CH2)3- H-C(0)- H2]
§ · :( !! ) ·( ! (»·ΧίΙ··(·:!·! ·Μ!·( ί Κ'ίί··^ ;
§-CH(CH;,)" H~C(-0)-CH(isoC3H7)-§§;
§-CH(CH3)- H-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH(CH3)- H-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-(CH2)2-C(K))-]SlH (CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(= ))-CH2-§§;
§-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-
{CH2)2-§§;
A
§ ' \==/ NH-C(-0)-CH(CH3)-NH-C(-0)-CH(isoC3H7)-NH-C(-0)-((CH2)2-
§-CH2- -S -(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2- -s -(CH2)5-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2- -s -CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
H Ii- ■s ■CH2CH(COOH)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-CH- ■s -(CH2)2-C(=0)- H-((CH2)2-0)2-(CH2)2-§§;
§-CH- ■s -(CH2)2-C(=0)- H-((CH2)2-0)2-(CH2)5-§§;
§-CH2- -S- -(<. i I ) -< 0)-\Η-((Ή·)-ΝΙί-Γ( m-ai-ii
§-CH2- -S- CH2)2-C(-0)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(-0)-CH2-§§
§-CH2- -S- -CH2CH(NH2)-C(==0)- H-(CH2)2-NH-C(==0)-(CH2)5-§§:
§-CH2- -S- -(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-{ }§;
§-CH2- ■s- -(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2- §§;
§-CH2- ■s- -(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)
§-CH2- ■s- -(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)
§-CH2- ■s- H2CH(COOH)~]\O ;(<)H^^^
§-CH2- -s- -CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- H-C(- 0)-CH2-§§;
§-CH2- -s- •{'Ii ·{ Ί l{{ K )l I )·Ν! Ι·( < >}-«( Ί !.·}-< > ( ! I. } -X! i-C{ =0)-(CH2)2-§§
§-CH2- ■s- iCll ;-ClliC<K)!!)MI-( i (>;..i:( j!;) .()) .((.1 1-Ci i)) \C\\ )■
§§;
§-€Η2-8 €Η2)2-€(=Ο)-ΝΗ-0Ή(€2Η4€ΟΟΗ)-0 ))- Η-(€Η2)2- Η-€(==Ο)-€Η2- §-CH2-S-CH2CHp^-C(=0)-(OT2)2-COOH]-C(=0)-NH-(CT2)2-NH-C( ))-CH2-
§§;
§-CH2-S H2CH| IH-C(=0)-((CH2)2-0)4-CH3]-C(=0)- H CH2)2- H-C(=0)-
H il-S-( H;( !!:(0(>i!)-\U (;i <))-CH<CH:)-N!i-C< ( >}·( Ί ii iso( M I ;· Nl 1 · C( OK W-ii:
§-CH2-S-CH2CH|TSlH-C(==0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-(CH2)2-S(==0)2-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
H'li-S-CH.-nijMi-CC ( >)-·<.'! i !···(.·()< !ü|.(i t > )- N ί I -( ( Π . ) -i > } - ( Π . > - "X = - C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[C(K))-NH-(CH2)2 ;OOH]-NH-C )) (CH2)2-0)4 C«))-CH2~§§;
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C( ^)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH- C(=0)-(CHa)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2CH(COOH)- H-C(=0)-((CH2)2-0)4-
(CH2)2- H-C ))-CH2-§§
§ :H2-S-CH2CH[C(<))^^
{(.ΊΚ-ΜΚ ! (>)·(·ίί· - § § ;
oder
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-
(CH2)2-NH-C(-0)-(CH2)2-§§,
wobei
§ die Bindung an das Wirkstofimolekül darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt und
isoCiH? einen isoPropyi-Rest darstellt.
Diese Konjugate umfassen auch ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Therapeutische Verwendung
Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumor erkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brusttumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegstumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Hiratumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningeome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt- hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypopharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Miindhöhlenkarzinonie, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliorne, Plattenepithelkarzinome, Kaposi-Sarkom, maligne Melanome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzeil-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome, Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome, Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retinoblastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und parathyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome, Adenokarzinome), Tumore des Haratrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovarial-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute myeloide, akute lyinphoblasiische, chronisch- lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell-Leukämie, sowie AIDS -korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell- Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.
Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung metastasierter oder zirkulierender Formen hiervon.
Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung.
Weiterei' Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfmdungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfmdungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfmdungsgemäßen Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der zuvor genannten Erkrankungen.
Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti- hyperproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
1311-chTNT, Aharelix, Abirateron, Aclarubicin, Afatinib, Aflibercept, Aldesleukin, Alemtuzumab, Alisertib, Alitretinoin, Alpharadin (Radium-223-chlorid), Altretamin, Aminoglutethimid, AMP- 514, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Arglabin, Arsentrioxid, Asparaginase, AT9283, Axitinib, Azacitidin, Basiliximab, Belotecan, Bendamustin, Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, BMS-936559, Bosutinib, Bortezomih, Brentuximab vedotin, Buserelin, Busulfan, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calciumfolinat, Calciumlevofoiinat, Capecitabin, Carboplatin, Carfilzomib (proteasome Inhibitor), Carmofur, Carmustin, Catumaxomab, Celecoxib, Celmoleukin, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Clilormethin, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Clofarabin, Copanlisib , Crisantaspase, Cnzotinib, Cyclophosphamid, CYC1 16, Cyproteron, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Darbepoetin-alfa, Dabrafenib, Danusertib, Dasatinib, Daunorubicin, Decitabin, Degarelix, Deniieukin-Diftitox, Denosiimab, Deslorelin, Dibrospidiumchlorid, Docetaxel, Doxifiuridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Estron, Eculizumab, Edrecolomab, Elliptimumacetat, Eltrombopag, Endostatin, ENMD-2076, Enocitabin, Epirubicin, Epitiostanol, Epoetin-aifa, Epoetin-beta, Eptaplatin, Eribulin, Erlotinib, Estradiol, Estramustin, Etoposid, Everolimus, Exemestan, Fadrozoi, Filgrastim, Fludarabin, Fiuoruracii, Flutamid, Fomiestan, Fotemustin, Fulvestrant Galliurnnitrat Ganirelix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glutoxim, Goserelin, Histamindilwdrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, I-125-Seeds, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Fbrutinib, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, lmiquimod, FNCB24360, Improsulfan, Interfe on-alfa, Interferon-beta, Interferon- gamma, Ipilimumab, Irinotecan, Ixabepilon, Lambrolizumab, Lanreotid, Lapatinib, Lenalidomid, Lenograstim, Lentinan, Letrozol, Leuproreliti, Leva isol, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidatnin, Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopurin, Methotrexat, Methoxsaien, Methyl aminolevulinat, Metliyltestosteron, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin, Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan, Mitoxantron, MLN-8054, Mpsl - Inhibitoren (offenbart in WO2013/087579, insbesondere Beispiel 01.01, WO2014/131739, insbesondere Beispiel 2), Nedaplatin, Nelarabin, Nemorubicin, Nilotinib, Nilutaniid, imotuzurnab, Nimustin, Nitracrin, Nivolumab, NMS-P715, NMS-P937, Ofatumurnab, Omeprazol, Öprelvekin, Oxaliplatin, p53-Gentlierapie, PaclitaxeL Palbociclib, Palifemiin, Palladium- 103-Seed, Pamidronsäure, Panitumumab, Pazopanib, Pegaspargase, PEG-epoetin-beta (Methoxy-PEG-epoetin-beta), Pegfilgrastim, Peg-interferon-alfa-2b, Pemetrexed, Pentazocin, Pentostatin, Peplomycin, Perfosfamid, Picibanil, Pirarubicin, Plerixafbr, Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polysaccharid-K, Ponatinib, Porfimer-Natrium, Pratatrexat, Prednimustin, Procarbazin, Quinagolid, , R763, Raloxifen, Raltitrexed, Ranimustin, Razoxan, Refametinib (, Regorafenib, Risedronsäure, Rituximab, Romidepsin, Romiplostim, Roninciclib, Ruxolitinib, Sargramostim, Sipuleucel-T, Sizofeati, Sobuzoxan, Natriumglycididazol, SNS-314, Sorafenib, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Tamibaroten, Tamoxifen, Tasonermin, Teceleukin, Tegafur, Tegafur + Gimeracil + Oteracil, Temoporfin, Temozolomid, Temsirolinuis, Teniposid, Testosteron, Tetrofosmin, Thalidomid, Thiotepa, Thymalfasin, TKM-PLK1, Tioguanin, Tocilizumab, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Tozasertib, Trabectedin, Trametinib, Trastuzumab, Trastuzumab emtansine, Treosiilfan, Tretinoin, Trilostan, Triptorelin, Trofosfamid, Tryptophan, Ubenirnex, Valrubicin, Vandetanib, Vapreotid, Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Volasertib, Vorinostat, Vorozol, XL228, Yttrium-90-Glasmikrokugeln, Zinostatin, Zinostatin-Stimalamer, Zoledronsäure, Zorubicin.
Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit Bindern kombiniert werden, die beispielhaft an die folgenden Targets binden können: OX-40, CD 137/4- 1BB, DR 3, ID01/TD02, LAG-3, CD40.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden: eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff; die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen; die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe; die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen; das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie; eine längere Überiebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent. Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsfbrmen verabreicht werden.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorotionssehrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. . intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsfbrmen u.a. injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder Lyophilisaten. Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichisteile. Lösungsmitteiverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
Wenn bei Versuchsbeschreibungen keine Angaben bzgl. einer Temperatur gemacht werden, bei der die Reaktion durchgefürht wird, ist von Raumtemperatur auszugehen. Synthesewege:
Exemplarisch für die Ausföhruügsbeispiele sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege zu den Ausführungsbeispielen dargestellt:
[a): beispielsweise Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) beispielsweise Acetoxyacetylchiorid, NEÖ, DCM, RT; e) beispielsweise LiOH, THF/Wasser, RT; d) beispielsweise H2, Pd-C, EtOH, RT; e) beispielsweise Teoc-OSu, NEt3, Dioxan, RT; f) beispielsweise Fmoc-Cl, Diisopropylethylamin, Dioxan/Wasser 2: 1 , RT
[a): beispielsweise Benzylbromid, CS2CO3, DMF, RT; b) beispielsweise Pdicippf Cb, DMF, a2CO3, 85 °C; c) beispielsweise LiAIE , THF, 0 °C; Mn02, DCM, RT; d) beispielsweise Ti(iOPr)4, THF, RT; e) beispielsweise tBuLi, THF, -78 °C; MeOH, NH4CI; f) beispielsweise HCl/1 ,4-Dioxan]
Schema 25: Synthese von Cvstem-verknüpften ADCs
Schema 26: Synthese von Cystein-verknüpften ADCs über hydrolysierte Bemsteinsäureamide
Dieses Vertaliren wurde insbesondere bei ADCs mit LI = CH2 oder mit LI = CH-CH3 oder mit Ll= PheDyl angewendet, um diese ADCs in die offenkettigen Verknüpfungsformen zu überfuhren. [a): Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchlorid, Diisopropylethylamin, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) Tri fluoressigsäure-- 1 -(2-aminoetliyi)- lH-pyrrol-2,5-dion (1: 1) HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanoi, 50°C, EDTA.]
[a): HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanoi, 50°C, EDTA.]
chema 29: Synthese von ADC-Precurser Molekülen
[a): Natriumtriacetoxyborhydiid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchlorid, Triethylaniin, DCM, RT; e) LiOH, MeOH, RT; d) Trifluoressigsäuie--l-(2-aminoeÜiyl)-lH-pyrrol-2,5-dion (1: 1) HATU, DMF, Drisopropylethylamin, RT; e) Zinkehlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]
Schema 30: Synthese von ADCs
[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BF.P), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
[a): 2-Brom-l-ethylpyridini m-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; e) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
Schema 32: Synthese von Intermediaten
[a) beispielsweise Diniethylzink, CyhexylMgCl, THF, -78 °C; NH4C1; b) beispielsweise HCl/3 , 4- Dioxan]
[a): Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyaceiylchlorid, Triethylaniin, DCM, RT; c) L-Csytein, NaHCOs, DBU, isopropanol/Wasser , RT; d) 3-Sulfanylpropansäure, 2C03,RT; e) Linker, HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Triiiuorethanol, 50°C, EDTA.]
Schema 34: Synthese von Lysin- ve knüpften ADCs
chema 35: Synthese von Lysin-verknüpften ADCs
A, Beispiele
Afokürzuugesi um i Akronyme:
ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für P-gp und MDRl)
ahs. Absolut
Ae Acetyl
ACN Acetonitril
aq. wässrig, wässrige Lösung
ATP Adenosintriphosphat
BCRP BrusÜCTebs-Resistenz-Protein, ein Efflux-Transporter
BEP 2-BiOm-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborai
Boc ier/.-Butoxycarbonyl
br. breit (bei NMR)
Bsp. Beispiel
ca. circa, ungefähr
CI ehemische Ionisation (bei MS)
D Dublett (bei NMR)
D Tag(e)
DC Dünnschichtchromatographie DC1 direkte chemische Ionisation (bei MS)
DCM Dichiormethan
Dd Dublett von Dubiett (bei NMR)
DMAP 4-jV,N-Dimethylaniinopyridin
DME i ,2-Dimethoxyethan
DMEM Dulbecco's Modified Eagie Medium (standardisiertes Nährmedium für die Zelikultur)
DMF A V-Dimethylformamid
DMSO Diinethylsulfoxid
DPBS, D-PBS, PBS Dulbecco's Phosphai-gepufferte Salz-Lösimg
PBS - DPBS - D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No DS537
Zusammensetzung:
0,2 g KCl
0,2 g Ki i -PO . (anhyd)
8,0 g NaCl
1,15 g Na2HP04 (anhyd)
ad 1 1 mit H O auffülle n
Dt Dubiett von Triplett (bei NMR)
DTT DL-Dithiothreitol
d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)
EDC N'-(3-Dimethylammopropyl)-N-ethylcarbodimiid-Hydroc orid
EGFR Epidermal growth factor receptor = Epidermaler Wachstumsfaktor
Reze tor
Ei Elektronenstoß-Ionisalion (bei MS)
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
eq. Äquivalente)
ESI Elektrospray-Tonisation (bei MS)
ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (Name des Massenspektrometer mit Tof - Time Of
Fiight und q = Quadiiipol)
FCS fötales Kälberserum
Fmoc (9//-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl
ges. Gesättigt
GTP Guanosin-5'-triphosphai
H Stunde(n) HATU 0-(7-Azabenzo1ria7 )l -yl)-N r,N',N' etra]TiethyluToniurii- hexafluorophosphat
HEPF.S 4-(2-Hydroxye1hyl)piperazin- 1 -ethansulfonsäure
HOAc Essigsäure
HOAt 1 -Hydroxy-7 -azabenzotriazoi
HOBt 1 -Hydroxy- i//-benzotriazol-Hydrai
HO Su Λ' -Hydroxy suc cinimid
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
IC50 halbmaximale Inhibitionskonzentration
i.m. intramuskulär, Applikation in den Muskel
i.V. intravenös, Applikation in die Vene
KG- 1 humane Tumorzell lini e
konz. Konzentriert
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie
LLC-PK1 -Zellen Lewis lung Carcinoma pork kidney cell line
L-MDR Human MDR 3 transfizierte LLC-PK1 Zellen
L0V0 Humane Tumorzelllinie
L428 Humane Tumorzelllinie
rn Multiplett (bei NMR)
MDR1 Multidrug resistence protein 1
MeCN Acetonitril
Me Methyl
min Minute(n)
MOLM-13 humane Tumorzelllinie
MS Massenspektrometrie
MTT 3-{4,5-Dimethyithiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2//-tetrazoliunibroniid 3
MV-4- 1 1 Humane Tumorzelllinie
NCI-H292 humane Tumorzelllinie
MM N-Methylmorpholin
MP N-Methyl-2-pyrrolidinon
NMR Kernresonanzspektrometrie
NMRI Mausstamm, Herkunft aus dem Naval Medicai Research Institute
(NMRI) ude Mäuse Nacktmäuse (Versuchstiere)
NSCLC Nor- small cell lung Cancer (Nicht-kleinzelliges Bronchi alkarzinom)
PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
Pd/C Palladium auf Aktivkohle
P-gp P-Giycoprotein, ein Transporterprotein
PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung
quant. quantitativ (bei Ausbeute)
quart Quartett (bei NMR)
qui n: Quintett (bei NMR)
Rf Retentionsindex (bei DC)
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
s Singulett (bei NMR)
s.c. subcutan, Applikation unter die Haut
SCTD Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten immundefekt
(severe combined immunodeficiency)
t Triplett (bei NMR)
TBAF Tetra-n-but lammoniumfluorid
TEMPO (2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin- 1 -yljoxyl
tert. Tertiär
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
THP-1 humane Tumorzelllinie
T3P® 2,4,6-Tripropyl-l ,3,5,2,4,6-trioxatriphosphman-2,4,6-trioxid
UV U'ltraviolett-Spektrometrie
v/v Volumen zu Volumen- Verhältnis (einer Lösung)
Z Benzyloxycarbonyl
HPLC- und LC-MS-Methoden:
Methode 1 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System: Säule: Waters Acquiiv UPLC HSS T3 1 ,8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure, Eiueni B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A — > 1.2 min 5% A—>■ 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 tun.
Methode 2 (LC-MS i:
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 μιη; Eluent A: 1 I Wasser + 0.03 % Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B --> LS min 2% B --> 8.5 min 95% B --> 10.0 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.50 mL/min; UV-Detektion: 220 nm
Methode 3 (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Micromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1 100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 3 Wasser + 0.01 rnol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 3 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A— > 0.2min 98%« A— *· 3.0 min 5% A-> 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1.75 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 4 (LC-MS i:
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity T-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C3 8 1.8 iim; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 0.3 min 10% B— > 1.7 min 95% B -» 2.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 5 (LC-MS i:
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 3 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A — > 6.0 min 5% A — > 7.5 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 mL/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.
Methode 6 (LC-MS):
Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A —* 0.5 min 97% A—► 3.2 min 5% A -» 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 mL/min; UV-Detektion: 21 nm. Methode 7 (LC-MS):
Instrumen Agilent MS Quad 6150;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waiers Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 2.1 mm: Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A — > 0.3 min 90% A—► 1.7 min 5% A ~> 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1,20 niL/ in; UV-Detekiion: 205 - 305 nm.
Methode 8 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapi G2S; Geräteryp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.03 % Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B -» 2.0 min 2% B ->■ 13.0 min 90% B -» 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/min; UV-Detektion: 21 0 nm
Methode 9: LC-MS-Prep Reinigungsmethode für die Beispiele 181-191 (Methode LI D-LC-MS- Prep)
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Waters -Bridge Cl 8, 19 mm x 50 mm, 5 μ.πϊ, Eluent A: Wasser + 0.05% Ammoniak, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw.
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21.2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 mV min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm).
Methode 30: LC-MS-Analytik-Methode für die Beispiele 3 81-191 (LIND__SQD__SB_ AQ)
Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Säule: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 mm x 2.3 mm, 1 .8 μτη; Eluent A: Wasser + 0.025% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.025%i Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 1 .0 min 5%A - 3 .4 min 5%A - 1.43 min 98%A - 1.5 min 98% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detektion: DAD; 230 nm.
Methode 11 (HPLC): HP 1 100 Serie
Merck Cliromolith SpeedROD RP-18e, 50-4,6mm, Best- Nr.1.51450.0001 , Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP- 38e, 5-4,6mm, Best-Nr. 1.51470.0001
Flow 5mL/ Min
Injection Volume 5μ1
Solvent A: HCL04 (70%ig) in Wasser (4mL/ 1)
Solvent B: Acetonitril
Start 20% B
0.50 Min 20% B
3.00 Min 90% B
3.50 Mm 90% B
3.51 Min 20% B
4.00 Mm 20% B
Säulentemperatur: 40°C
Methode 12 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UliiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 3 1 Acetonitril + 0.03 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B—>■ 2.5 min 95% B—> 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 ml/min; UV-Detektion: 230 nm/ Optimum Integration Path 210-300 nm
Methode 13: (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C18 1.7 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Arnmoniumformiat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 95% A 0.1 min 95% A -> 2.0 min 1 5% A -* 2.5 min 15% A-> 2.51 min 10%, A --> 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 14: (LC-MS):
Gerätetyp MS: ThermoFisherScientifie LTQ-Orbitrap-XL; Gerätetyp HPLC: Agilent 1200SL; Säule: Agilent, POROSHELL 120, 3 x 350 mm, SB - C18 2.7 μιτι; Eluent A: 1 3 Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 2%> B— > 0.3 min 2% B ->· 5.0 min 95% B -> 10.0 min 95% B; Ofen: 40°C; Fluss: 0.75 ml/min; UV- Detektion: 210 nm Füx alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, dere Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.
Ausgangsverbindungen und Intermediate: Intermediat Cll
R/S-(l l-{(lR)-l-[i-Benzyl-4-(2,5-di^^
dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13- l)-hoinocystein-trifluoressigsäure(l : 1 )
990.0 mg (2.79 mmol) (^)-1-[1-Βει^1-4-(2,5-άίί1υο 1ιεην1)-1 Η-ρνΓτο1-2-ν3]-2,2- dimethy]propan-l -amin wurden in 15.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 828.8 mg (3.91 mmol) atriumtriacetoxyborhydrid und 129.9 mg (3.21 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT grührt. Es wurden 698.1 mg (3.21 mmol) 2-( rimethylsilyi)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat (Intermediat L58) gelöst i 15.0 mL Dichlormethan zugegebe und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethyiaceiat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufrniitel: Dichlormethan/Methanol 100:2) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 .25 g (73 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimeftylsilyl)ethyl-[3-({(l R)-l - [ 1 >e!izyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-p rrol-2-yi]-2»2-dimeth.ylpropyl } arnmo)propyl]carbamat. LC-MS (Methode 1): R, - 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 556 (M+H)+.
400.0 mg (0.65 mmol) 2-(Trimetliylsilyl)ethyl- ^^^
pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat wurden mit 151.4 mg (1.5 mmol) Triethylamin und mit 161 ,6 mg (1.43 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase dreimal mit Wasser und einmal mit ges, NaQ-Lösung gewaschen. Es wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 3: 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 254.4 mg (57 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethyisi3yi)et3ryl- {3-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } (chloracetyl)amino]propyl } carbamat.
LC-MS (Methode l ): Rt = 1.49 min; MS (ESTneg): m/z = 676 (M+HC(X)-)\
3 17.4 mg (0.19 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl- {3 -[ {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoipheriyl)- lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]propyl} carbamat wurde in 10.0 rnL Isopropanol gelöst und mit 928.4 yL IM NaOH und 50.2 mg (0.37 mmol) DL-Homocystein versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 4.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase mit ges. Natriumhydrogencarhonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.3 mg (48 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.24 min; MS (ESIpos): m/z - 733 (M+H)+.
!H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.40 (m, IH), 0.75-0.91 (m, 1 1 H), 1.30 (m, IH), 1.99-2.23 (m, 2H), 2.63-2.88 (m, 4H), 3.18-3.61 (m, 5H), 3.79-4, 10 (m, 3H), 4.89 (d, 3 H), 4.89 (d, IH), 5.16 (d, 1H), 5.56 (s, IH), 6.82 (m, IH), 6.91 (s, 3 H), 6.97 (m, 3 H), 7.13-7.38 (m, 6H), 7.49 (s, I i i ). 7.63 ( , IH), 8.26 (s, 3H), Intermediat C12
R/S (8SH M(iRH-[l-Benzyl-4-(2 difluoroheny^
carboxy-2^-dimeth l-6, 12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yljhomocystein
Die Synthese erfolgte in Analogie zur Synthese von Intennediat C 11 mit
Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trirnet (Intennediat L57) und
Intermediat C52 als Edukten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.18 min; MS (ESIpos): m/z - 775 (M+H)+.
C52
(1R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyi)- lH-pyTrol-2-yi]-2y2-dimethyipropan- 1 -amin
10.00 g (49.01 mmol) Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wurden in 100.0 mL DMF vorgelegt und mit 20.76 g (63.72 mmol) Cäsiumcarbonat und 9.22 g (53.91 mmol) Benzyibromid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei RT. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt und die wässrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Ansatz wurde mit 90.0 g Methyl-4-brom- l H-pyTrol-2-carboxyiat wiederholt. Die Reinigung der vereinigten beiden Ansätze erfolgte mittles präp. RP-HPLC (Säule: Daiso 300x 100; ΙΟμ, Fluss: 250 mL/min, MeC /Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 125.15 g (87 % d. Th.) der Verbindung Methyl- 1 -benzyl-4-brom- 1 H-pyrrol-2-carboxylat
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.18 min; MS (ESIpos): m/z - 295 [M+H]+.
Unter Argon wurden 4.80 g (16.32 mmol) Methyl- l-benzyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat in DMF vorgelegt und mit 3.61 g (22.85 mmol) und 19.20 mL ges. atriumcarbonat-Lösung und 1 .33 g (1 .63 mmol) [l,l'-Bis-(diphenylphosphino)-ferrocen]- dichloipaUadium(Il):Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 85 °C gerührt Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Ethylaeetat gewaschen. Die organische Phase wurde mit Wasser extahiert und dann mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittei: Cyclohexan/Ethylacetat 100:3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.60 g (67 % d. Th.) der Verbindung Methyl- 1 -benzyl-4- (2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carboxylat.
LC-MS (Methode 7): R, - 1.59 min; MS (ESIpos): m/z - 328 [M+H]+.
3.60 g (11.00 mmol) Methyi-l -benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carboxylat wurden in 90.0 mL THF vorgelegt und bei 0 °C mit 1.04 g (27.50 mmol) Lithiumaluminiumhydi-id (2.4 M in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Es wurde bei 0 °C ges. aliumnatriumtartrat-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung mit Ethylaeetat versetzt. Die organische Phase wurde dreimal mit ges. Kaliumnatriumtartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 30.0 mL Dichlormethan gelöst. Es wurden 3.38 g (32.99 mmol) Manga.n(IV)oxid zugegeben und 48 h bei RT gerührt. Es wurden nochmals 2.20 g (21 .47 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand 2.80 g (i -Benzyl-4-(2,5- difluoiphenyl)-iH-pyrrol-2-carbaldehyd) wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 7): R, - 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+Hf. 28.21 g (94.88 mmol) 1-Ββηζγ1-4-(2,5-άίΑυοφ1ιοηγί)- 1 H-pyrrol-2-carbaldebyd wurden zusammen mit 23.00 g (189.77 ttmiol) (R)-2-Methylpropan-2-sulfmamid in 403.0 mL absol. THF vorgelegt und mit 67.42 g (237.21 mmol) Tita.n(IV)isopropylat versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 500.0 mL ges. NaCl-Lösung und 1000.0 mL Ethylacetat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Es wurde über Kieselgur filtriert und das Filtrat zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die org. Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 1500+340 g SNAP, Fluss 200 mL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 : 10).
LC-MS (Methode 7): Rt = 1.63 min; MS (ESIpos): m/z - 401 [M+Hf.
25.00 g (62.42 mmol) (R)- - {(E/Z)-[l-BenzyM 2,5-difluo hen !) H y!τol-2-yl]me len -2- methylpropan-2-sulfinamid wurden in absol. THF unter Argon vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 12.00 g (187.27 mmol) tert.-Butyllithium (1.7 M Lösung in Pentan) bei -78 °C zugegeben und 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Dann wurden bei -78 °C 73 .4 mL Methanol und 214.3 mL ges. Ammoniumchlorid- Lösung nacheinander zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen und 1 bei RT gerülirt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (R)-N- {(lR)-l-[i-Benzyl-4-(2,5- difiuoiphenyl)-iil-py Tol-2- /l]-2,2-dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 6): Rt - 2.97 min; MS (ESIpos): m/z - 459 [M+Fif,
28.00 g (61.05 mmol) (R)- - {(l )-l- i-Be zyl-4-(2,5-dlfluo llellyl)-lH-pyr ol-2-ylj-2,2- dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurden in 186.7 mL 1,4-Dioxan vorgelegt und dann mit 45.8 mL HCl in 1 ,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Kinetix 1 00x30; Fluss: 60 mL/min, MeCN/Wasser). Das Acetonitril wurde im Vakuum verdampft und der wässrige Rückstand wurde mit Dichlormethan versetzt. Die organische Phase wurde mit Nalxiumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.2 g (75 % d. Tb..) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 6): R.t - 2.10 min; MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH2]+, 709 [2Μ+ΗΓ ,
I i- N MR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H). Intermediat C53
(28)-4-[ {(1Κ) -[ 1-Β6ηζγ1-4-(2,5-άίΑυο 1ΐ6η /1) Η-ρνΓΓθ1-2-γ1]
dimet ylpropy 1 } (giycoioy l)amino]-2- { [(9H-f !uoren-9-ylmeihoxy)carbonyl]ammo}butansäure
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2- {[(benzyloxy)carbonyl]amino) -4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C58 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in intermediat C58 beschrieben acyiiert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergrappen durchgeführt. Das so erhaltene Intermediat wurde in Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2:1 aufgenommen und mit 9H-Fiuoren-9- ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von N, N-Diisopropyletliyiamin wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.37 min; MS (ESIpos): m/z - 734 (M-H) .
Intermediat C54
N-[(2S)-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimetiiylpropyl} (glyeoloyl)amino]-2~ {[(9H~Üuoren~9-ym^
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benz l-N-[(2S)-2- {[(benz loxy)carbonyl]amino}-4- oxobutanoylj-beta-alaninat in Analogie zu interaiediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C58 beschrieben acyliert. Das so erhaltene Intermediat wurde in Methanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff:" unter Normaldruck 1 h hydriert. Anschließend wurde mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der Estergruppe durchgeführt. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/W asser 2: 1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9- yimethylclilorocarbonat in Gegenwart von N, N-Diisopropylethylamin wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt. Es wurden 48 mg der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.38 min; MS (ESlpos): m/z - 807 (M+H)+.
ammoj-2-({[2-(trime1hylsilyl)etto
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2- {[(ben-yloxy)carboiiyi]amino}-4-oxobuianoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. Das so erhaliene Intermediat wurde in Ethanol gelöst mit Pailadium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert.
500 mg (0.886 mmol) von diesem vollständig entschützten Intermediat wurden in 60 ml Dioxan aufgenommen und mit 253 mg (0.975 mmol) l -({[2-(Trimethylsily])ethoxy]carbonyl}oxy) pyrrolidin-2,5-dion sowie 198 μΕ Triethylamin versetzt. Nach 24 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen im Vakuum und Trocknen im Hochvakuum wurden 312 mg (50% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.61 min; MS (ESIpos): m/z - 658 (M+H)+.
Alternativ wurde Intermediat C58 auf folgendem Weg hergestellt:
4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL. DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 8.99 g (24.5 mmol) von intermediat L57 gelöst in 175 mL DCM hinzugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit 300 mL DCM verdünnt und zweimal mit 100 ml, Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde anschließend mittels präparativer RP-HPLC (Säule: Chromatorex C18) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. So wurden 4.6 g (61 % d. Th.) \k-;h> 1- i ÜS )-4--( ! ·; i i- 1 ··[ i ·· ben_^l-4-(2,5-dMuo^henyl)-lH^yirol-2-yl3-2,2-d4methyipropyl} amino)-2-({
(trimethylsilyl)eihoxyjcarbonyl}ammo)butanoat erhallen.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.97 mm; MS (ESIpos): m/z - 614 · V· · I i ) .
2.06 g (3.36 mmol) von diesem Tntermediat wurden in 76 mL DCM vorgelegt und mit 0.81 mL (7.17 mmol) 2-Chlor-2-oxoethylacetat in Gegenwart von 2.1 ml Triethylamin acyliert. Nach 20 h Rühren bei RT wurden weitere 0.36 mL 2-Chlor-2-oxoethylacetat und 0.94 ml Triethylamin zugegeben und der Ansatz weitere 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 500 mL Ethylacetat verdünnt und nacheinander zweimal mit 300 mL 5%-iger Zitronensäure, zweimal mit 300 mL gesättigter NatriumhydrogencarbonaÜösimg und einmal mit 100 L gesättigter Natriunichloridlösung ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 2.17 g (79% d. Th.) des geschützten Interrnediats erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.48 min; MS (ESIpos): m/z - 714 (M+H)+.
2.17 g (2.64 mmol) dieses Interrnediats wurden in 54 mL THF und 27 mL Wasser gelöst und mit 26 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt und dann mit 1.4 mL TFA auf einen pH- Wert zwischen 3 und 4 eingestellt. Der Ansatz wurde im Vakuum aufkonzentriert. Nachdem THF weitgehend abdestilliert war wurde die wäßrige Lösung zweimal mit DCM extrahiert und anschließend im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Säule: Chromatorex C ! 8) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand und aus Acetonitril/W asser lyophilisiert. So wurden 1.1 g (63% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 656 (M-H)\
! i NM R (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.58 (m, 1 H), 0.74-0.92 (m, 1 IH), 1.40 (m, IH), 3.3 (m, 2H), 3.7 (m, 1H), 3.8-4.0 (rn, 2H), 4.15 (q, 2H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 5.61 (s, 1H), 6.94 (m, 2H), 7.13-7.38 (m, 7! i L 7.48 (s, IH), 7.60 (m, IH), 12.35 (s, 1H). Intermediat C59
(2S)-4-( {(1 )-1-[1 -Βεηζγ1-4-(2,5-άίί1υο 1ιεηνί)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } [(2S)-2- methoxypropanoy]]aniino)-2- {[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]a]Timo}butansäure
Zunächst wurde die sekundäre Aminogruppe von Benzyl-(2S)-4-( {(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5- diÜuo henyl)~l H- yrrol~2~yί]~2,2~dim
butanoat mit (2S)-2-Metboxypropanoylcblorid (Zwischenstufe aus Tntermediat C53) in Gegenwart von Triethylamin wie in Intermediat C53 beschrieben acyliert. Das erhaltene Intermediat wurde in Ethanol aufgenommen, mit Palladium auf Kohle (10 ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/W asser 2: 1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9-ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin wurde im letzten Schritt die Fmoe-Sehutzgruppe eingeführt.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 1.39 min; MS (ESTpos): m/z - 764 (M-H) .
Intermediat C60
(2S)~4-({(iR)~i -[143enzyl-4-(2,5-dif^
metboxypropanoy]]anrino)-2- {[(9H-rluoren-9-ylmetboxy)carbonyl]airiirio}butarisäure
Die Synthese erfolgte in Analogie zu Intennediat C53.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.41 min; MS (ESIpos): m/z - 750 (M+H)+.
Intermediat C61 (2S)-4-{ {(!R}- i -{l»Benzy^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-2 - ( { [2-(trimethylsilyl)eÜioxy]carbonyl}ainino)butanoyl]-beta- alanin
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 60 mg (0.091 mmol) Tntermediat C58 mit ß- Alaninmethylester und anschließender Esterspaltung mit 2m Lithiumhydroxidlösung hergestellt. Es wurden 67mg (61% d.Th.) der Titel erbindung über 2 Stufen erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.29 min; MS (ESIpos): m/z - 729 (M+H)+.
Int£EmediaLC62
N-[(2S)-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 -Β6ηζγ1-4-(2,5^ί11υο ίΐ6ΐιν1)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]-2-( {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl } amino)butanoyl]-D- alanin
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu intermediat C61 aus Intermediat C58 und Methyl-D- alaninat hergestellt.
LC-MS (Methode l ): Rt = 1.32 min; MS (ESTpos): m/z - 729 (M+H)4. Intermediat C64
Trifluoressigsäure --2-(lximethylsilyl)ethyl- {(2S)-l-[(2-aminoethyl)amino]-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l -oxobutan-2- yljcarbamat (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C58 in Analogie zu Intermediat C63 hergestellt.
HPLC (Methode 1 1): R, - 2.4 min;
LC-MS (Methode 1): R* - 1.01 min; MS (ESIpos): m/z - 700 (M+H)+.
(8S)-8- {2-[{(l R)- 1-[1 -Benzyi-4-(2,5-difluoiplienyl)- 1 H-pyirol-2-yl]-2,2-dimetliylpropyl} (glycoloyl)amino]ethyi}-2,2-dimethyl-6, 11 -dioxo-5 -oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan-l 4-säure
215 mg (0.59 mmol) von Intermediat L66 wurden in 25 mL Dichiormethan vorgelegt und mit 377 mg (0.89 mmol) Dess-Martin Periodinan und 144 μ]_ (1.78 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 300 ml Dichiormethan verdünnt und die organische Phase je zweimal mit 10%iger Na2S2C ~Lösung, 10%iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiunisulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Man erhielt 305 mg des Aldehyds, der ohne weitere Reinigung umgesetzt wurde.
175 mg (0.49 mmol) von Intermediat C52 wurden in 50 i Dichiormethan gelöst und mit 147mg (0.69 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie 32.5 μΐ, Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 214 mg (0.593 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Dabei ist anstelle erwarteten Prodiiktes 2-(Trimethylsilyl)ethyl- [(2S)-4--({(!R)- i 1~benzyl-4--(2 ^
(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)butan-2-yl]carbamat entstanden. Da auch dieses Imid sich weiter zur Titel Verbindung umsetzen lassen sollte, wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Imid-enthaltenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. So wurden 195 mg (58%) des oben benannten Imids erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 3.32 min; MS (ESipos): m/z - 667 (Μ+Η .
65 mg (97.5 μηιοΐ) dieses Imids wurden in 15 ml Dichiormethan aufgenommen und mit 367 μΕ (3.4 mmol) Acetoxyacetylchlorid sowie 595 μΕ NN-Diisopropylethylamin versetzt. Nach 30 min Rühren bei RT wurde der Ansatz ohne Erwärmung im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittel und Trocknung im Hochvakuum verblieben 28 mg (37% d. Th.) (8S)-l l-{(lRH 1-Benzyl-4-(2,5-d^
dioxopyrrolidin-l-yl)methyl]-2,2-dimetb.yl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l i -diaza-2-silatridecan- 13-yl- acetat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.44 min; MS (ESlpos): m/z = 767 (M+H)+.
28 mg (37 μπιοΐ) von diesem Intermedia* wurden in 3 ml, Methanol gelöst und mit 548 μΐ, einer 2M Lithiumhydroxidlösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Trifluoressigsäure auf pH 4 gebracht und dann eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparalive HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Abdampfen des Lösungsmittels und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 26 mg (96% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
LC-MS (Methode l): Rt = 1.33 min; MS (ESlpos): m/z - 743 (M+H)4,
liitermediai; C66
2-(Tnmethylsilyl)ethy^
dimethylpropy!} lycoloyl)amino]- 1 - { [2-(glycylamino)ethyl]amino} - 1 -oxobutan-2-yljcarbamat
Zuächst winde aus N-[(benzyloxy)carbonyl]glycin und tert-Butyl (2-aminoethyl)carbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie (HATU-Kupplung und Boc-Spaltung) Trifluoressigsäure - benzyl- {2-[(2-aminoe yl)amino]-2K)xoe yl}carbamat (1 : 1) hergestellt.
13 mg (0.036 mmol) von diesem Intermediat sowie 25 mg (0.033 mmol) von Intermedia! C58 wurden in 3 ml, DMF aufgenommen und mit 19 mg (0.05 mmol) HATU und 17 \x\ N,N- Diisopropylethylamin versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparaiive HPLC gereinigt. Es wurden 17.8 mg (60% d. Tb..) der Zwischenstufe erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt - 1.36 min; MS (ESIpos): m/z - 891 (M+H .
17 mg (0.019 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 10 ml Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt, und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 2 h hydriert. Der Katalysator wurde ab filtriert, die Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 9 mg (62% d. Tb.) der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.03 min; MS (ESIpos): m/z - 757 (M+H)+.
Intenned«jtjC67
dimethy Ipropyl amino)propyl] carbamat
605.3 mg (1.71 mmol) (].R)-l -[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan- 1 -amin (Intermediat C52) wurden in 10.0 mL Diclilormethan vorgelegt und mit 506.7 mg (2.39 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und. 1 17.9 mg (1.96 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT gerührt. Es wurden 580.0 mg (1.96 mmol) 9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3- oxopropyl)carbamat (Intermediat L70) gelöst in 10.0 mL Dichlormethan zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges. Natriumearbonat-Lösung und ges. NaCl- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesium sui tat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Etliylacetat 3: 3 ) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 514.7 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, - 1.10 min; MS (ESIpos): m/z = 634 (M+H)+.
Intermedi t C^g
11-{(1Κ) -[1-ΒεηζνΙ-4-(2,5-ά]Αυο η6^
6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7 l 1 -diaza-2-silaheptadeean- 17-säure
117.0 mg (0.19 mmol) (2-(Trimethylsilyl)ethyl- {3-[ {(lR) 1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pynOl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloracetyl)aminojpropyl}carbamat (Inierinediat C70) und 21.6 mg (0.20 mmol) 3-Sutfanylpropansäure wurden in 3.0 mL Methanol vorgelegt und mit 89.5 mg (0.65 mmol) Kaliumcarbonat versetzt und 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethyiacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt. Man erhielt 106.1 mg (73 % d. Th.) der Tite 1 Verbindung .
LC-MS (Methode 3 ): Rt - 1.42 min; MS (ESIneg): m z - 700 (M-H)\ Intermediat C70
(2-(Trimethylsilyl)ethyl- {3-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]propyl) carbamat
908.1 mg (1.63 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH- pyrrol-2-y ]-2,2-dimethylpropyl} amino)propyl]carbamat (siehe Synthese Intermediat Cl l) und 545.6 mg (5.39 mmol) Triethylamin wü den in 10.0 mL Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurden 590.5 mg (5.23 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacelat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit ges. Natriunihydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 673.8 mg (65 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.53 min; MS (ESIneg): m/z - 676 (M+HCOO")'. Intermediat C71
S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφheny
6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-siiatridecan-13-yl)-L-cystein-trifluoressigsäure (1 : 1)
536.6 mg (4.43 mmol) L-Cystein wurden in 2.5 mL Wasser zusammen mit 531.5 mg (6.33 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 400.0 mg (0.63 mmol) (2- (Trimethylsilyl)ethyl- {3 {(1RH
dimethylpropyl} (cMoracety!)amino]propyl} carbamat (Intermediat C70) gelöst in 25.0 mL iso- Propanol und 1.16 g (7.59 mmol) l ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischimg wurde 1.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü* 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 449.5 mg (86 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 1.20 min; MS (ESIpos): m/z - 717 (M+H) . Intermediat C72
( S)- - {[ {( l R)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- l H ylτol-2-yl]-2,2-dimeth lpropyl}(gl coloyl) aminojmethyl} -2,2-dimethyl-6, 1 l-dioxo-5-oxa-7,10-diaza-2-silatetradecan-14-säure
90 mg (0.212 mmol) von Intermedia!. 1,72 wurden in 6 L Dichlormethan vorgelegt und mit 86 uL (1.06 mmol) Pyridin sowie 135 mg (0.318 mmol) Dess-Martin Periodinan versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 30 ml Dichlormethan verdünnt und die organische Phase zweimal mit 10%iger iS^SzC -Lösung und einmal mit 5%iger Citronensäure-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Der so erhaltene Aldehyd wurde ohne weitere Reinigung umgesetzt.
63 mg (0.177 mmol) von Intermediat C52 wurden in 15 ml Dichlormethan gelöst und mit 52.4 mg (0.247 mmol) Natriumlriacetoxyborhydrid sowie 20.2 sL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 89.6 mg (0.212 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz 20 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Acetonitril/W asser lyophilisiert. So wurden 71 mg (53% d. Th. Über 2 Stufen) Benzyl-(9R)-9-[({(lR)-l -[l -benzy]-4-(2,5- difluoiphenyl)- l H-pyrrol-2-y]]-2,2-dimetlaylpropyl} aniino)methy]]-2,2-dimethyl-6,]. l -dioxo-5- oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan- 14-oat erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.21 min; MS (ESIpos): m/z - 761 (M+H)+.
70 mg (92 μηιοΐ) dieses Intermediats wurden in 15 ml Dichlormethan aufgenommen, auf 10°C abgekühlt und mit 54 μΕ Triethylamin sowie mit 25.5 \iL (0.23 mmol) Aeetoxyacetylchlorid versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurden nochmals gleiche Mengen an Säurechlorid und Triethylamin zugegeben und nach einer weiteren Stunde Rühren bei RT erneut. Der Ansatz wurde anschließend für weitere 30 min bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittel und Lyophilisation des Rückstandes aus Acetonitril/W asser verblieben 46,5 mg (59% d. Th,) des acy Vierten Intermediats.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.53 min; MS (ESIpos): m/z - 861 (M+H)+.
46 nig (53 μηιοΐ) von dieseni Intermediat wurden in 5 mL Metlianoi gelöst und mit 2,7 roL einer 2M Lithiumhydroxidlösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Essigsäure auf pH 3-4 gebracht und dann mit 15 ml Wasser verdünnt. Die wäßrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde aus Acetronitrii/Wasser lyophilisiert und nach Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 37 mg (90% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 1 .32 min; MS (ESTpos): m/z - 729 (M+H)+, Intermediat C73
S-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl - 6,12-dioxo-5- xa-7,l i -diaza-2-silairidecan-13-yl)-N-[3-(trimethykilyl)propanoyl]-L-cystein
619 mg (0.86 mmol) S-( i l- {(l R)-l -[ l -Benzyl-4-(2,5-diiluorphenyl)-lH-pyrroi-2-yll-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-eystein- trifiuoressigsäure (1: 1) (Intermediat C71) wurden in 8.8 ml Dichlormethan vorgelegt und mit 87 mg (0.86 mmol) Triethylamin und 224 mg (0.86 mmol) N-[2-(Trimethylsilyl)-ethoxycarbonyloxy]- pyrrolidin-2,5 -dion versetzt. Nach 1h wurden 45 mg (0.17 mmol) N-[2-(Trimethylsilyl)- ethoxycarbonyioxy]-pyrroiidin-2,5-dion zugegeben. Die Reaktionsmiscliung wurde 1 h bei RT gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und dann wurde die organische Phase zweimal mit Wasser und einer gesättigten Natriumhydrogenkarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 602 mg (71%, Reinheit 87%) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.58 min; MS (ESIpos): m/z - 861 (M+H . Intermediat C74
Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)e1hyl-3-amino-N-[(2S)-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH- rrol-2-yl]-2,2κhmet ylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} anhno)butanoyl]-D-aianinat ( 1 : 1 )
75mg (0.1 14 mmol) von Intermediat C58 wurden in 12.5 ml DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart von 65 mg (0.3 1 mmol) HATU und 79 μΕ Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 30%-igem Palladium auf Aktivkohle 3 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyopliilisation aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): R, - 1.16 min; MS (EIpos): m/z = 844 [M+Hf. Intermediat C75
Methy1-(2S)-4-[(acetoxyacetyl) {(lR)-H
dimethylpropyl} amino]-2~({[
4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g ( 1 1.85 mmol) Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi} amino)butanoat (hergestellt aus (3S)-3-Amino-4-me oxy-4-oxobutansäure nach klassischen Methoden) gelöst in 175 L DCM zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL gesättigter atriumhydiOgencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumcliloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen und Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum erhielt man 4.6 g (61% d. Th.) des Intermediats.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.97 min; MS (ESIpos): m/z = 614.32 ( \M I ) .
200 mg (0.33 mmol) dieses Intermediats wurden in 10 mL DCM gelöst und dann mit 105 .nL Triethylamin sowie mit 77 \iL (0.717 mmol) Acetoxyacetylchlorid versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen und zweimal mit gesättigter Natriumliydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Es wurden 2,13 mg (75%) der Titelverbindung als beiger Schaum erhalten. LC-MS (Methode 1): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z - 714 (M+H)+.
N-[(BeDzyloxy)carbonyl]-L-valyi-N- {(1 S)-3-[ {( 1R)-1 -[ 1 -b€aizyi-4-(2,5-difluorph€aiyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpiOpyl}(glycoloyl)amino]-l -carboxypropyl}-L-alaninamid
Die Tite verbmdung wurde ausgehend von Intermediat C75 nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt (Spaltung der Teoc-Schutzgruppe mit Zinkclilorid, Acylierung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-aianin in Gegenwart von HATÜ und Esterspaltung mit Lithiumhydroxid in THF/' Wasser).
LC-MS (Methode 1): R, - 1.23 min; MS (ESIpos): m/z - 818 (M+H)+. Intermediat C77
S-(l l~{(lR)~l -n -Benzyl~4-(2,5-difluorphen^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-si!atridecan- 13-y!)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutenoyl)-L-cystein
CH3
~CH ■,3
■3
O 4 ert-Butoxy-4-oxobutansäure (8,39 mg, 48.1 μηιοΐ) wurde in 1.0 niL DMF vorgelegt, mit 7.37 mg (48.1 μηιοΐ) i -Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat, 15.5 mg ((48.1 μηιοΐ) Benzotriazoi-I - yk xy)bisdimeÜiylaminoineihyiii!mfluoiOborat und 8.60 μ! (48.1 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt und 10 Minuten bei RT gerülirt. 40.0 mg (0.048 mmol) S-(l 1-{(1R)-
I -[ 1 -Benzyl~4-(2,5-dif luorphenyl)- lH~pyiTol-2-yl]~2,2-dimethylpropyl} ~2,2-dmiethyl~6, 12-dioxo- 5-oxa-7,3 l -diaza-2-siiatridecan-13-yl)-L-cystein -trifiuoressigsäure (1 : 1) (Intermediat C71) wurden in 1.0 ml, DMF vorgelegt, mit 25.4 μΐ (141.9 μηιοΐ) N,N-Diisopropyiethylamin versetzt, zum Ansatz gegeben und 4 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 toL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 35.0 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): R* - 2.76 min; MS (ESlpos): m/z - 873 [M+H]+
Intermediat C78
I I - {(1R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6,12-dioxo-5-oxa-7 l l-diaza-2-sUapentadecan-15-säure
197 mg (0.354 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(l R)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- l H- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} arrrino)propyl]carbamat (siehe Synthese Intermediat O l) wurden in 5.0 mL Dichlormethan vorgelegt und auf 40°C erhitzt. Bei dieser Temperatur wurden 240 μί (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ ( 1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerülirt. Dann wurden 240 μί (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4- oxobutanoat zugegeben und 1 hbei RT gerührt. Dann wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit 5 %iger KHSCVLösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel mirden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg (31 % d. Th.) Meüryl-I l-{(1R)-1-[1- benzyl-4-(2,5-diQuo^henyl)-lH^ rrol-2-yl]-2^-dimethylpropyi}-2^-&
7,1 1 -diaza-2-silapen tadecan- 15-oat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.49 min; MS (ESIpos): m/z - 670 [M+H]+
78.3 mg (1 17 μτηοΐ) Mdh l 1 -{(lR) 1-benz l-4-(2,5-d!fluo hen l) H■pyΓrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silapentadecan- 15 -oat wurden in 4.0 mL THF vorgelegt, mit 800 μΐ Methanol, 160 μί Wasser und 230 μΐ (230 μηιοί) wässriger LiOH- Lösung (IM) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 64.8 mg (85 % d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 12): Rt - 2.61 min; MS (ESIneg): m/z - 654 [M-H]"
Intermedia! C79
Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyl)etliyi-3-amino-N-(l 3 - {(1R)-1.-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12,1 7-trioxo-5-oxa- 34-thia-7, 11 -diaza-2- silaheptadecan- 37- l)-D-alaninat ( 1 : 1 )
57.4 mg (81.8 μηιοί) 1 l- {(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5-difluo hen l)-lH-p lrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dmieihyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden in 5.7 rnL DMF vorgelegt, mit 74.0 mg (164 μηιοΐ) Trifluoressigsäure 2- (1ximethylsilyl)ethyl-3- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -D-alaninat (1 : 1) (Intermediat L75), 43 μΐ (250 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 62.2 mg (1 64 μητοΐ) HATU versetzt und 1 h bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 I bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel "wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 52.4 mg (63 % d. TL) der Verbindung 2- (Trimethy lsily llethy l-N-( 11-{(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl 1-2,2- dimethylpropy!} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.64 min; MS (ESIpos): m/z - 1 22 [Mf
Unter Argon wurden 6.23 mg (27.7 μιηοΐ) Palladium(II)acetat: in 3.0 ml Dichloromethan vorgelegt, mit 12 μΕ (83 μτηοΐ) Triethylamin und 89 μΐ^ (550 μιηοΐ) Triethylsilan versetzt und 5 Minuten, gerührt. Dann wurden 56.7 mg (55.5 μτηοΐ) 2-(Trimethylsiiyi)ethyl-N-(l l-{(lR)-l-[l- beriz l-4-(2,5-difluoφhenyl)- lH^yrrot-2-y!]-2^-dimethylpropyt} -2,2-chmethyl-6, 12, 17-trioxo-5- oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-si!aheptadecan- 17-yl)-3- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -D-alaninat in 3.0 ■nL Dichloromethan zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde bis fast zur Trockene eingeengt, mit Acetonitril/Wasser versetzt, filtriert und mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; ίθμ, Fluss: 50 mL min, MeCNAVasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 37.4 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): ): Rt - 2.15 min; MS (ESIpos): m/z - 888 [M+Hf Intermediat C80
S-(i l-{(lR)-l- l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-l^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l 5-(glycylamino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadecan- 1 -oy l]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
Unter Argon, wurden 43.4 mg (95.1 μηιοί) l -({N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan- 15-säure (Intermediat L90) in 2.5 ml DMF vorgelegt, mit 14.6 mg (95.1 μηιοΐ) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat, 30.5 mg (95.1 μηιοί) (Benzotriazol-1 - yloxy)bisdimetiiylaminomethyliumfluoroborat und 16.5 μΐ (95, 1 μηιοί) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und 10 min geröhrt. 79.0 mg (95.1 μιτιοΐ) S-(i 1- {(1 ) -[1-ΒεΓ^-1-4-(2,5-άιΑαο 1ιεηνί)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimetliylpropyi}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l -diaza-2-silatridecan-13- yl)-L-eystein -trifluoressigsäure (1: 1) (intermediat C71) wurden in 2.5 ml DMF gelöst mit 49.5μ1 (2,85.3 μιηοΐ ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und zum Ansatz gegeben. Die Reactionmischung wurde 2 h bei RT gerührt und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 inL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 44.2 mg (40 % d. Th.) der Verbindung S-(l l~{(lR)~l -n -Benzyl~4-(2,5-difluorphen^
6, 32-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 1 3-yl)-N-[ 3 5-( {N- [(benzyloxy)earbonyi]glycyl} amino)-4,7, 10, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.57 min; MS (ESIpos): m/z = 1156 [Μ+Η]+
60.2 mg (52.1 moί) S-(i i- {(lR)-l-ί Be zyl-4-(2,5-d!fluo he yi)-lH-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethytpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-i 3-yl)-N -[ 15-( {N- [(benzyloxy)carbonyl]glycyl} amino)-4,7, 10, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-eystein wurden in 3.0 mL Ethanol suspendiert und mit 6.0 mg Palladium auf Aictivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Zweimal wurden 6.0 mg Palladium auf Aktivkohle ( 10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 29.4 mg (50 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt = 3.77 min; MS (ESIpos): m/z - 1021 [M+Hf
Intermediat C81
(R)- 1 -[ 1 -Benzy l-4-(2,5-difiuor - 1 -cyclohexy Imethanamin
Eine Lösung von 3.12 ml (6.24 mmol) Dimethylzink in Toluol (2.0 M) unter Argon bei -78 °C wurde mit 18.7 ml (37.45 mmol) Cyclohexylmagnesiumchlorid in Diethy lether (2M) versetzt und die Mischung wurde 30 Minuten bei -78 °C gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 5.0 g (12.48 mmol) (R)-N-{(E/Z)-[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]methylen}-2- me ylpropan-2-sulfinamid in THF bei -78 °C zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei dieser Temperatur gerührt und dann 4 h bei RT. Dann wurde bei -78 °C gesättigte Amrnoniumchlorid-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen. Es wurde mit Elhylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isoiera gereinigt (Kieseigel, Ethylacetat/Cyclohexan 25:75). Man erhielt 1.59 g (26% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.76 min; MS (ESIneg): m/z = 483 [M-H]"
264.0 mg (0.54 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 0.5 mL 1,4-Dioxan unter Argon vorgelegt und dann mit 1.36 mL HCl in 1 ,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan versetzt und mit einer was. I M Natriumhydroxid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isoiera gereinigt (Kieselgel, Methanol Dichlornethan 98:2). Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Dichlormetban gelöst und mit einer Natriumhyxirogenearbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 148 mg (72% d. Th.) der Tileiverbindung.
LC-MS (Methode 13): Rt - 2.07 min; MS (ESIpos): m/z - 364 [M~NH2]+ IntennedMtjCM
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3- { [(R)-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2- yl](cyelohexy])methyl]amino}propyl)carbamat
Eine Lösung von 503.0 mg (1.32 mmol) 1-[1~Βεηζ}'1-4-(2,5~ά111υο 1ιεην1)~1 Η^"π·ο1-2~ν1]-1- cyciohexylmethanamin (Intermediat C81 ) in 1.4 ml Diehlormethan unter Argon wurde mit 392.2 mg (1.85 mmol) Natriumtnacetoxyborhydrid und 91 .29 mg (1.52 mmol) Essigsaure versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 574.6 (2.38 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyi-(3-oxopropyl)carbamat in Diehlormethan hinzugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Zugabe von 143 mg (0.66 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat wurde die Mischung noch 2 h weiter gerührt. Das Reaktionsmgemisch wurde mit Diehlormethan verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 488 g (63 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.89 min; MS (ESIpos): m/z = 582 (M+H)+. Intermediat C83
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3- { [(R)-[ 1 -0βηζγ1-4-(2,5-<3ΐί1αο 1ιβηγί)- lH-p rrol-2- yl](cyclohexyl)methyI](chioracetyl)amino}propyi)carbamat
Zur eine Lösung von 487.9 mg (0.84 mmol) 2-(Trimethylsiiyl)e11iyl-(3-{[(R)-[l-benz l-4-(2,5- difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl](cyclohexyl)methyl]amino}piOpyl)carbamat (Intermediat C82) in 8.40 ml Dichiorrnetban mit Mol Sieb 4 Ä wurden 280.0 mg (2.77 mmol) Triethyiamin und 397.8 mg (3.52 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichiormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natiiumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Anmioniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 470 mg (85 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.88 min; MS (ESIpos): m/z - 680 (M+Na)+.
Intermediat C84
S- {1 l - ( )- l-Be zyl-4~(2,5~dίt]uo: he yl)-iH-pyτrol-2-yl](cyclohexyl)
6, 12-dioxo-5-oxa-7,l i-diaza-2-silatridecan-13-yi}-I>-cystein
322.1 mg (2.66 mmol) L-Cysiein wurden in 0.19 mL Wasser zusammen mit 319.0 mg (3.80 mmol) Natriumhydrogencarhonat suspendiert. Dazu wurden 250.0 mg (0.38 mmol) 2- (Trimethylsilyl)e l 3- {[(R)-[ l -berizyl-4-(2,5-difluorpheriyl)-lH-pyrrol-2- yl](cyelohexy])methyl](chloracety])amino} propy])carbamat (Intermediat C83) gelöst in 3 .90 mL z'.so-Propanol und 693.8 mg (4.56 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 Ii bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarboriat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 276 mg (97 % d. TL) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.34 min; MS (ESIpos): m/z = 744 (M+H)+.
Intermediat C85
S-{l ! -[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difl^^^
6,l 2Hlioxo-5-oxa-7,l l -diaza-2-s!ia1xid€can-l3-yi}-N-[6-(2,5^ioxo-2,5-dihydro- l.H-pyrrol- 1 - y 1 )hexanoy 3 ] -L- cy stei n
Zu einer Mischung von 100 mg (0.13 mmol) S- { 1 l-[(R)-[l-Beozyl-4-(2,5-difluorpheoyl)-lH- pyrrol-2-yl](cyclohexyl)methyl]-2^-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl) - L-cystein (1 : 1) (Intermediat C84) und 41.5 mg ( 0.13 mmol) l -{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]- 6-oxo'hexyl} -lH-pyrrol-2,5-dion in 4.0 ml DMF wurden 34.8 mg ( 0.27 mmol) N,N- diisopropylethylamin hinzugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 88 mg (70% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.71 min; MS (ESlpos): m/z - 936 (M+H)+.
Intermediat C86
3 1 -[(R)-[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorpheny])- lH-pyrrol-2-yl](cyclohexyl)rnethyl]-2,2-dirnethyl-6, 12- dioxo-5-oxa- 14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure
Eine Mischung von 220.0 mg (0.33 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-{[(R)-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyi)-lH-pyrrol-2-yl ^
(Tntermediat C83) und 39.02 mg (0.37 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 7.45 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 161.65 mg (1.17 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriummsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 201 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.72 min; MS (ESlneg): m/z - 726 (M-H)\
Intermediat C87
2-(Trimethylsilyl)ethyl- { 13-[(R)-[ 1 -benzyl~4-(2 difluorpheny1HH-pyiTOl~2- yl](cyclohexyl)methyl]- 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-2,7, 12-trioxo-l 0-thia-3,6, 13- triazahexadecan- 16-yl} carbamat
Zu einer Lösung von 300 mg (0.14 mmol) l l-[(R)-[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-l.H-pyiTol-2- yl](eyclohexyl)methyl]-2,2-dimethyl-6, 32-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-sila eptadecan- 17- säure (Intermediat C86) in 1.37 ml DMF wurden 54.1 8 mg (0.28 mmol) N-(2-Aminoethyl)-2- (2,5-dioxo-2,5-dihydro- l H-pyrrol-l -yl)acetamid (intermediat LI ), 71.01 mg (0.50 mmol) N,N- diisopropylethylamin, 104.46 mg (0.27 mmol) HATU und 0.23 ml (0.14 mmol) i -Hydoxy-7- Azabenzotriazole 0.5 M in DMF hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei RT gerührt. Die Mischung wurde ohne weitere Aufarbeitung mittels wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 41 mg (33 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.61 min; MS (ESlpos): m/z - 907 (M+H)+.
InterjnedMtjC iert-Butyl-3-[({(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- iH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino)methyl]pyrrolidin-l -carboxylat-trifluoressigsäure (1 : 1)
Mischung aus Stereoisomeren
Eine Lösung von 2.04 g (5.75 mmol) (1 )-1-[1-Βεηζγ1-4-(2,5-άιί^ο 1ιεην1)-1Η-ργπΌΐ-2-ν1]-2,2- dimet ylpropan- 1 -amin (Intermedia! C52) in 51 ml Dichlormethan wurde mit 1.71 g (8.05 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und 0.40 g (6.61 mmol) Essigsaure versetzt und die Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 1.32 g (6.61 mmol) tert- Butyl-3-formylpyrrolidin-l-earboxylat in 20 ml Dichlormethan hinzugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetai verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.86 g (50% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.99 min; MS (ESIpos): m/z - 538 (M+H-CF;;C02H)
Intermediat C89
?e^Butyi-3- {[ {(lR)-i-[i-benzyl-4-^
dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]methyl} Pyrrolidin- 1 -carboxyiat
Eine Lösung von 2.89 g (4.19 mmol, 80 Reinheit) von tert-Butyl-3-[({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH yrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropy
(Intermediat C88) in 42 ml Dichlormethan mit Molsieb 4 Ä wurde mit 1.36 g (13.42, mmol) Triethylamin und 2.13 g (18.87 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT 5 h geröhrt. Die Mischung wurde einrotiert und der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 449 mg (17 % d. Th.) von Isomere 1 und 442 mg (17 % d. Th) von Isomere 2 der Titel verbindung.
Isomer 1 LC-MS (Methode 1): Rt - 2.74 min; MS (ESIpos): m/z - 614 (M+H)"h.
Isomer 2 LC-MS (Methode 1): Rt - 2.78 min; MS (ESIpos): m/z - 614 (M+H) Intermediat C9Ö
S 2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^h^ {[l-(tert- butoxycarbonyl)p rrolidiEi-3-yl]metiiyl} ammo)-2-oxoethyl]-L-cystein (Isomer 1 )
357.3 mg (0.58 mmol) L-Cystein wurden in 2.3 mL Wasser zusammen mit 488.7 mg (4.07 mmol) Natriurnhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 357.0 mg (0.58 mmol tert-Butyl-3- {[{(lR)-I -
dimethylpiOpyl} (chloracetyl)amino]methyl} Pyrrolidin- 1 -carboxyiat (Isomer 1)
(Intermediat C89, Isomer 1) in 23.0 mL κο-Propanoi gelöst und 1.06 g (6.98 mmol) 1 ,8- Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h ei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetal versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Nafriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCi-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 255.0 mg (62 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.09 min; MS (ESTpos): m/z - 699 (M+H) Intermediat C91
butoxycai oi!yl)pyrroi!din-3-yl]methyl}amiDo)-2-oxoethyl]-L-cystem (Isomer 2)
453.5 mg (3.74 mmol) L-Cystein wurden in 2.1 mL Wasser zusammen mit 449.2 mg (5.35 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 3287.4 mg (0.54) mmol tert-Butyl-3-{[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]methyl } Pyrrolidin- 1 -carboxylat (Tntermediat C89, Isomer 2) in 21 .1 L «o-Propanol gelöst und 0.98 g (6.42 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)utidec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Ii bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 221.0 mg (59 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.12 min; MS (ESTpos): m/z - 699 (M+H)4. Intermediat C92
S 2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^henylH^ {[l-(tert- butoxycarbonyl)pynOlidin-3-yl]metl^
pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-cystein (isomer 1)
Eine Mischling von 50 mg ( 0,07 mmol) S-[2-({(lR)- l -[1 -Benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbotiyl)pyrrolidiri-3-yl]rnethyl}aniino)-2-oxoethyl]-L- cystein (Intermediat C90) und 22,06 mg (0.07 mmol) 1 - {6-[(2,5-Dioxop rrolidm- 1 -yl)oxy]-6- oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 3.3 ml DMF wurde mit 18.49 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei RT 45 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 65 mg (100 % d. Th, 71 % Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.31 min; MS (ESIpos): m/z - 892 (M+Hf.
S-[2-({(lR)- 1 -[ 1 -Benzyl■ ■<2,5■dlfluo enyl) H■ yrrol·2■ l]-2,2-dlmeύJy3propyl} {[l-(feHr butoxycarbonyl)pyrrolidm-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[6-(2,5-dioxo-2,5- pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-cystein (Isomer 2)
Eine Mischung von 50.0 mg ( 0.07 mmol) S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difmorphenyi)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(ie:ri-huioxycarbonyi)pyrrolidin-3-yl]methyi^
oxoethyl]-L-cystein (Tntermediat C91) und 22.06 mg (0.07 mmol) l- {6-[(2,5-Dioxopyrrolidiri-l - yl)oxy]-6-oxohexyl}- l H-pyrrol-2,5-dion in 3.0 ml DMF -wurde mit 18.49 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropyiethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei RT 90 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 63 mg (98 % d. Th, 73 % Reinheit)der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 3 .34 min; MS (ESIpos): m/z - 892 (M+H) . Intermediat C94
S-[2-({(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5^rä^^
butoxycarrxrayl)pyrrol ^
1 -yl)acetyl]-L-cystein (Isomer 1 )
Eine Mischung von 50.0 mg (0.07 mmol) S-[2-( {(1R)- 1 -[ 1 -Beozyl-4-(2,5-difluorpheoyl)- 1H- pyrrol-2-y ]-2,2-dimethy3propyl} {[(3R)-l-(tert-butoxycarbonyl)py!Tolidin-3-yi]methyl}amino)-2- oxoethyl]-L-cystein (Tntermediat C90) und 1 8.0 mg (0.07 mmol) l- {2-[(2,5-Dioxopyrrolidm-l- yl)oxy]-2-oxoethyl} - 1 H-pyrrol-2,5-dioD in 3.3 mi DMF wurde mit 1 8.5 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch, wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit ges. NHiCl-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 57 mg (81 % d. Th, 85 % Reinheit) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): R, - 0.96 min; MS (ESIpos): m/z - 836 (M+H)+. Intermediat C95
3- {[2-( {(3 R)- 1 -[ 1 -Benzy3-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [ 3 -(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 -yl]methyl} amino)-2-oxoethyl]sui fanyl } propansäure (Isomer 1)
Eine Mischung von 384.0 mg (0.62 mmol) tert-Butyl-3- {[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-diili!^henyi)- lH^yrrol-2-yl]-2,2 limethylpropyl}(chlora
(Intermediai C89, Isomer 1) und 73.0 mg (0.69 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 302.5 mg (2.19 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 358.0 mg (84 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 684 (M+H)+.
Intermedia* C96
3- { [2-( {( 1 R) 1 -Benzyl-4-(2 difmorphenylH
butoxycarrxmyljpyrrolidi^ (Isomer 2)
Eine Mischung von 287.0 mg (0.45 mmol) terl-Butyl-3- {[ {(lRH 1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH^yrrol-2-yl]-2,2 limethylpropyl}(chlora
(Intermediai C89, Isomer 2) und 54.6 mg (0.51 mmol) 3-Suifanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 226.0 mg (1.64 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th., 88 % Reinheit) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): R, - 1.36 min; MS (ESIpos): m/z - 684 (M+H)+.
Intermedia! C97 teTt-Butyl-3-[2-{(lR)-l -[ l -berczyl-4-(2,5-difl^^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-3,8,l 3-trioxo-5-thia-2,9,12-triazatetradee-l -yl]py!Tolidin- 1-carboxylat (Isomer 2)
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3- { [2-({(lR)-I -[I -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol~2~yi]~2,2~dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (lntermediat C96) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.1 1 mmol) N,N-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 22.75 mg (0.07 mmol) N-(2-Amiaoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-iH-pyrroi-l-yl)acetemid -ethan (1 : 1 ) Trifluoressigsättre (Intermedia! LI) in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N,N- diisopropyiethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ü.N bei RT gerührt. Die Mischung wurdemit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 26 mg (84 % d. Th.) der Titelverbindung.3 (Μ+ΗΓ.
LC-MS (Methode 5): R, = 4.39 min; MS (ESipos): m/z = 86
Intermediat C98 teri-Butyl-3 - [2- { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2 ,5 -difluorphenyl)■ 1 H-pyrrol-2-yi]-2,2-dimethylpropyi} - 18- (2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1.H-pyrrol-1 -yl)-3,8,13-lrioxo-5-thia-2,9,12-triazaoctadec- l -yl]pyiTolidin-l - carboxylat (Isomer 2)
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3- {[2-({(lR)-l-[l-BenzyI-4-(2,5-difluoiphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyirolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyljsulfanyl} propansäure (Intermediat C96) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.1 1 mmol) N,N-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 37.30 mg (0.07 mmol) N-(2-Aininoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l-yl)hexanamid -ethan (1 :1) Trifluoressigsäure in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) Ν,Ν-diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ÜN bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlonnethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 22 mg (63 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.54 min; MS (ESIpos): m/z - 919 (M+Fff ,
Intermediat C99 tert-Butyl-3 -[2- { ( i R) 1 -benzy!-4-^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro H^yiroJ-l ^
yljpyrrolidin- 1 -carboxylat (Isomer 2)
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3- {[2-({(lR)-i-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyl]sulfanyi}propansäure (Mermediat C96) in 2.81 ml DMF unier Argon wurden 14, 17 mg (0.1 1 mmol) N,N-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 35.05 mg (0.07 mmol) N- {2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]e^
yljhexanamid -ethan (1 : l)Trifluoressigsäure (Intermediat L82) in 1 .4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N,N~diisopropylethyla.min hinzugegeben und das Gemisch wurde üN bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlonnethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurdemitte ls präp. HPLC gereinigt Man erhielt 25 mg (60 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 4.52 min; MS (ESIpos): m/z - 1007 (M+H)+.
Intermediat C100
2-(Trime isilyi)ethyl-
2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]- l -[(2- {[(2R)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yijpropanoyljamino ethyljamino] - l-oxobutan-2-yl}carbamat
Zu einer Lösung von 45 mg (0.068 mmol) (2S)-4- [ {(lR)- l-[l -Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl) - 1 H-pyrro 1-2 - yl] -2,2» dimethylpropyl } ( giyco loyl)amino] - 2 - ( { [2 - (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butansäure (Intennediat C58) in 5.8 ml DMF wurden 22.2 mg (0.068 mmol) (2R)-N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydxo-lH-py]Tol-I - yljpropanainid (1: 1) Trifluoressigsäure zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei RT die Mischung wurde mit 39 mg (0.10 mmol) HATU und 36 mg (0.27 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT geriihrt. Das Gemisch wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (12 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R- 1.41 min; MS (ESIpos): m/z 851 (M+H)+.
Intermediat C101
Trifluoressigsäure -methyl-(2S)-4-[(acetoxyacetyl) {(lR)-l-[l-beozyl-4-(2,5-difluorpheoyl)-lH- pyiToi-2-yl]-2,2-dirnetliylpropyi}arnino]-2-anunobiUanoat (1 :1)
4.3 g (12.2 mmol) von intermedia! C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriaeetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (1 3 .85 mmol) Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat (hergestellt aus (3S)-3-Amino-4-methoxy-4-oxobutansä«re nach klassischen Methoden) gelöst in 175 mL DCM zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL gesättigter Natriunihydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen und Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum erhielt man 4.6 g (61% d. Th.) des Intermediats.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.97 min; MS (ESIpos): m/z - 614.32 (M+H)+.
2.06 g (3.36 mmol) von diesem Intermediat wurden in 76 mL DCM vorgelegt und mit 0,81 L (7.17 mmol) 2-Chlor-2-oxoelhylacetal in Gegenwart von 2.1 ml Triethylamin acyliert. Nach 20 h Rühren bei RT wurden weitere 0.36 mL 2-Chlor-2-oxoethylacetat und 0.94 ml Triethylamin zugegeben und der Ansatz weitere 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 500 mL Ethylacetat verdünnt und nacheinander zweimal mit 300 mL 5%-iger Zitronensäure, zweimal mit 300 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und einmal mit 100 mL gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschütteit, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 2.17 g (79% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.48 min; MS (ESIpos): m/z - 714 (M+H .
321 mg (0.342 mmol) von diesem intermediat wurde in 7 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst, Es wurden 279.5 mg (2.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 Ii bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 599 mg (2.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäi!re und 2 mL einer 0.1%igen Trifluoressigsäurelösung in Wasser hinzugegeben und der Ansatz anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mitteis präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril Wasser wurden 60 mg (26% d.Th.) der Titelverbindung erhalten, die noch einen Teil der de-aceiylierten Verbindung enthielt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min und 0.95 mm; MS (ESIpos): m/z - 528 und 570 (M+H)+.
Intermediat C102
(25)-4-[ {(1Κ)-].-[1-ΒεηζγΙ-4-(2,5-άϊί1υο 1ιεηγ1)-1Η γΓτο1-2-γ1]-2,2-άϊ]τιοί1ιγ1ρΓοργ1}
(giycoioyl)amino]-2-{[(benzyioxy)carbonyi]amino}butansättre
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)earbonyl]amino}-4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv aikyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aniinogiiippe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgerührt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H) .
Intermediat C103
2-(Trimethylsily1)ethyl-N-[2-({(2S)-2-amino-4-[ {(IR)- l-[l-benzyl-4-(2
pyTrol-2~yl]-2,2~dimethylpropyl}(glyeoloyl)am
ethoxyjcarbonyl } -L-glutaminat
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 151 mg (0.23 mmol) Intermediat C102 mit 128 mg (0.234 mmol) Intermediat L98 in DMF in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin hergestellt. Anschließend wurde die Z-Schutegruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.
Ausb,: 30% d. Th. über 2 Stufen
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.14 min; MS (ESI os): m/z - 929 (M+H)+. Intermediat C104
2-(lnmethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3-[( {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-di
dimethylpropyl } amino)methyl]-4-fiuo!py!Tolidin- 1 -carboxylat
Eine Lösung von 2.24 g (6.31 mmol) (l R)-l -[l -Benzy]-4-(2,5-difluorphetiyl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2- dimethylpropan-l -amin in 56.0 mi Dichiormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurde mit 1 .87 g (8.84 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid versetz, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 2.20 g (7.58 mmol) 2-(Trimemylsilyl)ethyl-(3R,4S)-3-fluor-4- fonrr lpyrrolidin- 1 -carboxylat (Ref: WO 2014/151030A1) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3.5 h bei Raumtemperatur geröhrt. Das Gemisch wurde mit Dichiormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurdemittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 1.39 g (24 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.15 min; MS (ESIpos): m/z - 600 (M+H)4'.
Intermediat C105
2-(TrimetbyisiJyi)e H3R,4R)-3-{[{0
dimethylpropyl} (chloracetyl)am
Zur eine Lösung von 692,8 mg (0.88 mmol) 2-(Trimethyisiiyl)ethyl-(3R,4R)-3-[({(lR)-] -[] - benzyl-4-(2,5-difluorpheny])- 1 H-pyTrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } amino)methyl]-4- ίΙυο γΓτοΗίίίη- 1 -carboxylat (Intermediat C104) in 8.7 ml Dichlormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 295.0 mg (2.91 mmol) Triethylarnin und 418.9 mg (3.71 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 2.5 h bei RT gerührt. Die Reakiionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde nochmal in 8.7 ml Dichlormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 295.0 mg (2.91 mmol) Triethylarnin und 418.9 mg (3.71 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchiorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 691 mg (74 % d. Th., 64% Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.78 min; MS (ESIpos): m/z - 676 (M+H)+. Intermediat C106
3- {[2-( {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-dif luorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyi } { [(3R,4R)-4- fluor- 1 - { [2-(trimethy lsilyl)ethoxy]carbonyl } pyrrolidin-3-yl]methy 1 } amino)-2 - oxoethyl]sulfanyl}propansäu
Eine Mischung von 691.0 mg (0.65 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3- {[ {(lR)-l-[l-benzyl- 4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dimethylpropyl} (chloracetyl)aminojmethyl} -4- fluorpyrrolidin-l-carboxylat (Intermediat C105) und 76.3 mg (0.72 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 15 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 31 6 mg (2.29 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1.5 h bei 50 "C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 502 mg (67 % d. Th., 65% Reinheit) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.48 min; MS (ESIneg): m/z - 744 (M~H)\ Intermediat C107
S-[2-({(lR)~l -[l -Benzyl~4-(2 diüuor^
fluor- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl } pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein
203.6 mg (1.68 mmol) L-Cystein wurden in 0.95 mL Wasser zusammen mit 201.7 mg (2.40 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 170.0 mg (0.24 mmol 2- (Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3- {[ {(1R)- 3 -[ 3 -benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimeth ί ro yi}(c oΓacetyl)amino]methyl}-4-fluo y!τoHdin-I -c rbo lat (Intennediat 105) gelöst in 9.5 mL wo-Propanol und 438.5 mg (2.40 mmol) und i,8-Diazabicyc3o(5.4.0)u:ndec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde melirmals mit ges. Naüiumhydrogencarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 152 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.26 min; MS (ESIpos): m/z - 762 (M+H)+. Intermediat C115
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihycho-lH-pyrroi-l^
difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dirnethylpropyl} {[(2- carboxyeth l)sulfanyl]acetyl}amirio)propyl]-L-alarimamid
l l~ {(lR)~l -[l -Benzyi~4-(2,5-difluorphenyl)-iH-py^^^
6, 12-dioxo-5 -oxa - 14-thia-7, 11 -diaza-2-siIaheptadecan- 17-sä re (200 mg, 285 μτηοΐ) (Intermediat
C69) wurde in 10 ml Triiluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (233 mg, 1.71 mmol) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch zweimal mit Zinkchlorid (233 mg, 1.71 mmol) versetzt und 3 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit F.thylendianiin-N,N, !, '-tetraessigsaeure (1.50 g, 5.13 mmol) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 L/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 162 mg (85 % d. Th.) der Verbindung 3-({2-[(3- Amino ro ί) {(lR)-ί -[l-benz ί-4-(2,5-difluoφhenyl) H- rroί■2- l]■2y2- dimethylpropyl } amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)propansäure -trifluoressigsäure (1 : 1).
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.94 min; MS (ESIneg): m/z = 556 [M-H]"
3-( {2-[(3-Aminopropyl) {(1R)- 1 -[ 1 -benz l-4 2,5-difluo enyi)-lH-pyrrol-2- l]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)propansäure -trifluoressigsäure (1 : 1) (80.0 mg, 1 19 μηιοΐ) wurde in 5.0 ml DMF gelöst und mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l -yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (69.4 mg, 82 % Reinheit, 1 19 μιτιοΐ) (intermediat L88) und N, -Diisopropylethyiamin (41 μΐ, 240 umol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2h30 bei RT geröhrt und mit Wasser (0.1%TFA) versetzt. Der Ansatz wurde autkonzentriert und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Rcprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser, 0,1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 82.2 mg (75 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.17 min; MS (ESIpos): m/z - 921 [M+Hf
Intermediat C116
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H-pyrrol-l-yl^^
difluo henyl)-l H- vrrol-2-yl]-2,2-dimeΐhyl ro yl} [({3-[(2-carboxyet yl)amino]-3- oxopropyl}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-( {(1R)- l-[l-benzyl-4-(2,5-dii]uo 3henyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(2- carboxyethyl)suifanyl]acetyi} amino)propyi]-L-alaninamid (56.7 mg, 61.6 μιτιοΐ) (Intermediat C115) und tert-Buiyl-beta-aianinathydrochiorid (1 : 1) (ϊ3.4 mg, 73.9 μτηο!) in 3.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (28.1 mg, 73.9 μηιοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (32 μΐ, 180 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp, RP- HPLC (Säule: Rcprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 41.4 mg (64 % d. Th.) der Verbindung N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro lH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-
4,8,13-trioxo-3-oxa- 11 -thia-7, 14-diazaheptadecan- 17-yl)-L-alaninamid.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.28 min; MS (ESIpos): m/z - 1048 ; Vi ! i |
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-m-pyiTol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-N-(14- {(lR)-l -[l-benz dii]uo 3henyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimeihylpropyl}-2,2-dimethyl-4,8,13-trioxo-3-oxa-l 1 -thia- 7,14-diazaheptadecan-17-yl)-L-alaninamid (39.3 mg, 37.5 μτηοΐ) wurde in 2.5 ml Trifiuorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (30.7 mg, 225 μ/moi) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (30.7 mg, 2,25 μπιοΓ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsaeure (131 mg, 450 μηιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 30 mg (81 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.12 min; MS (ESIpos): m/z - 992 [M+Hf
Intermediat L l
Trifluoressigsäure--N-(2-amino - dihydro 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid(l : 1 )
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlicher (2,5~Dioxo-2,5~dihydro~l H-pyrrol- 1 -yt)essigsäure und tert-Butyt-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.19 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.17 min; MS (ESIpos): m/z - 198 (M+H)+. Intermediat L2
Trifluoressigsäure--rel-( lR,2S)-2-arm^
yl)ethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.214 mmol) von kommerziel! erhältlicher eis- 2-[(tert-Butoxycarbonyi)aniino]-l-cyclopentancarbonsäure mit 60 mg (0.235 mmol) von ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure--l -(2-armnoethyl)-lH-pyrroi-2,5-dion(l:l) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 36 mg (38% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode i 1): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.17 min; MS (ESlpos): m/z - 252 (M+H)+. IntennedM Lä
Trifluoressigsäirre--(lS,2R)-2-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l- yl)ethyl]cyclopentancarboxamid( 1 : 1 )
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.214 mmol) von kommerziell erhältlicher (lS,2R)-2-[(teri-Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure mit 72 mg (0.283 mmol) von ebenso kommerziell erhältlichem Trifiuoressigsäure- 1 -(2-aminoethy 1)- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 13 mg (16% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.2 min;
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 0.2 min; MS (ESlpos): m/z - 252 (M+H)+. Intermedi t L4
Trifluoressigsäure--N-(2-armnoethyi)-4-(2,5-dioxo-2,5-dmydro-lH^yn-oi- l ^
yi)cyclohexancarboxamid( 1 : 1 )
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem l-[(4-{[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]carrx)nyl}eyclohexy3)methyi]-lH^ Trol-2,5- dion und tert-Butyl-(2-aminoethyi) carbamat hergestellt
HPLC (Methode 1 1): Rt = 0.26 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.25 min; MS (ESlpos): m/z - 280 (M+H)+. IntennedM LS
Trifliioressigsäiire-- -[4-(
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion und N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.22 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.22 min; MS (ESlpos): m/z - 260 (M+H)+.
Trifluoressigsäure--tert-bu1yl-N-[6-(2,5 lioxcH2,5-dihydro-lH^yrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl-L-lysinat(]. : 1)
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro- 1 H-pyrroi- 1 -yl)hexansäure mit dem nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellten partiell geschützten Pepiid tert-Butyl-L-valyl-L-alanyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysinat in Gegenwart von EDC HOBT hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch Rühren in 5 iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 37%iger Ausbeute die Titelverbindung erhalten wurde.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 1.29 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.62 min; MS (ESipos): m/z = 566 (M+H)+. Intermediat L7
Triihtioixssigsäiire--beta-alanyl-L-valyl-N5-carbamoyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihy
yl)phenyl]-L-ornithinamid(l : 1)
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycaxbonyl)-N5-carbamoyl-L-omthin in Gegenwart von HATU, Enisciiüizung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-valinat, Enisciiüizung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin- l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 32 mg der Titelverbindung erhalten.
HPEC (Methode 11): Rt - 0.31 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.47 min; MS (ESipos): m/z - 516 (M+H)+. Intgrmgdjat Lj
Trifluoressigsäure--L-alanyl- i-carbanioyl- ~[4-(2,5-dioxo- L-ornithinamid( 1 : 1)
Die Titelverhindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem 1 -(4- Aminaphenyi)- 1 H-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N"-carbamoyl-L -Ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-aianinat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 171 mg der Titel Ver indung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.23 min:
LC-MS (Methode 7): R, - 0.3 min; MS (ESIpos): m/z - 417 (M+Hf. IntennedM L
Triihioressigsäure~-beta~alanyl~L-valyl~N^
ornithinamid/
Die Titelverbindung in Analogie zu Interaiediat L7 ausgehend von kommerziell erhältlichem Methyl-(4-aminophenyl)acetat hergestellt. Es wurden 320 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): R, = 0.45 min;
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.48 min; MS (ESTpos): m/z - 493 (M+HY Intermediat L10
N 6-(2,S-Dioxo-2,S-dihyciro H-pyrroi-i-yl)hexanoyl] -vaIyI^
atrdnocyclopentyl]carbonyl}-L-lysin-trifluoressigsäure(l:2)
Die Titel Verbindung wurde ausgehend von Intermedia!; L6 durch Kupplung mit cis-2-[(tert- Butoxycarhonyi)aniino]-l-cyclopentancarbonsäure mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 12 mg (52% d.Th, über 2 Stufen) der Titelverbindung erha lten.
HPLC (Methode 11): Rt - 1.45 min;
LC-MS (Methode l): Rt = 0.73 min; MS (ESTpos): m/z - 677 (M+H)4, Intermediat Ll l -[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl- 6- {[(lS,2R)-2- aTmnocyclopmtyl]carbonyl}-L-iysiri-toifluoressigsäure(l:2)
Die Titel Verbindung wurde ausgehend von Intermedia! L6 durch Kupplung mit (lS,2R)-2-[(iert- Butoxycarbonyl)aniino]cyclopentancarbonsäure mit EDC/HOBT und anschließender Enischützung mit TFA hergestellt. Es wurden 11 mg (39% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. HPLC (Methode 1 1): Rt - 1.45 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)4'. Intermediat LI 2
Trifluoressigsäiire--l-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]-lH-pym i-2,5-
Zu 228 mg (1.12 mmol) tert-Butyi-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]carbamat gelöst in 7 mL Dioxan Wasser 1 : 1 gelöst wurden 381 mg (2.46 mmol) Methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1-carboxylat gegeben. Dann wurden 1.2 mL einer gesättigten Natriurnhydrogencarbonat Lösung zugesetzt und der Ansatz bei RT gerührt. Nach insgesamt 5-iägigern Rühren bei 2 weiteren Zugaben von gleichen Mengen der Natriurnhydrogencarbonat Lösung wurde der Ansatz durch Ansäuern mit Trifluoressigsäure, Einrotieren und Reinigung des Rückstandes durch präparative HPLC aufgearbeitet. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus AcetonitriVWasser 1 : 1 lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 3 mL Dichlormethan aufgenommen und mit 1 mL Trifiuoressigsäure versetzt. Nach 35 min Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Acetordtril/Wasser 1 : 3 lyophilisiert. So wurden 70 mg (67% d.Th. über 2, Stufen) der Titelverbindung als harziger Rückstand erhalten.
HPLC (Methode 3 1): Rt - 0.2 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.18 min; MS (ESlpos): m/z - 185 (M+H)+. Intermediat L13
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)essigsäure mit tert-Butyl-N&-(tert-butoxycarbony3)-L-3ysinathydroch3orid(3 : 1) in Gegenwart von EDC/HOBT und anschließender schonender Abspaltung der tert-Butoxycarbonyl Schutzgruppe in Analogie zu Intermediat L6 hergesteilt.
HPLC (Methode 3 1): Rt - 0.42 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.43 min; MS (ESlpos): m/z = 340 (M+H)+. Intermediat LI 4
Trifiuoressigsäure— 1 -[2-(4-arninopiperazin- 1 -yl)-2-oxoethyl]- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1)
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat L2 über 2 Stufen aus tert-Butyl-piperazin-1 - ylcarbamat und (2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)essigsäure hergestellt.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 0.2 min; LC-MS (Methode 3): R, - 0.25 min; MS (ESIpos): m z = 239 (M+H)+. Intermediat L15
Triüuoressigsäure--N-(2-a inoe^
y ] ) ethoxy ] ethoxy } eth oxy) propanamid( 1 : 1)
2.93 g (10.58 mmol) tert-Biityl-3-{2 2-(2-animoethoxy)ethoxy]ethoxy}propanoat wurden in 100 mL Dioxan/Wasser 1 : 1 gelöst und mit 3.28 g (21.15 mmol) Methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -carboxylat sowie einer gesättigten Natriu hydrogencarbonatlösung bis zum Erreichen eines pH- Wertes von 6-7 versetzt. Die Lösung wurde 30 min bei RT gerührt und anschließend wurde das 1 ,4-Dioxan im Vakuum abgedampft. Dann wurden 200 mL Wasser zugegeben und die Mischung dreimal mit jeweils 300 mL Ethylacetat ausgeschüttelt Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach Einengen wurde tert-Buty!-3-(2- {2- [2-(2,5-dioxo-2,5-dmydro-lH-pyrrol-l-yl)e1hoxy]ethoxy}eti!oxy)propanoat als braunes Öl erhalten, das anschließend im Hochvakuum getrocknet wurde.
HPLC (Methode i 1): Rt = 1.5 min;
LC-MS (Methode 3): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 375 (M+NH4)+.
Dieses Intermediat wurde nach Standard verfahren (Entschuldung mit TFA, Kupplung mit tert- Butyl-(2-aminoethyl)carbamai und erneute Entschützung mit TFA) in die Titel Verbindung überführt.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.25 min; MS (ESIpos): m/z - 344 (M+H . Intermediat L16
N- [6-(2, 5 -Dioxo-2 , 5 -dihy dro- 1 H-pym l- 1 -yl)hexan^
Zu einer Lösung von 266 mg (1.33 mmol) L-Valyl-NS-carbamoyl-L-oraithin in 24 mL DMF wurden 535 mg (1.73 mmol) von kommerziell erhältlichem 1- {6-[(2,5-Dioxopyrrolidm- l-yl)oxy]- 6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion sowie 930 mL NN-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Der Ansatz wurde 24 h im Ultraschallbad behandelt und anschließend irn Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde mittels präparativer HPCL gereinigt und nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum verblieben 337 mg (50% d.Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.4 min;
LC-MS (Methode 3): R, - 0.58 min; MS (ESIpos): m/z - 468 (M+H)+.
Intgnngdjat Ll?
Trifluoressigsäure--tert-bu!yl-N^
carbamoyl-L-ornithyl-L-lysinat(l : 1)
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 172 mg (0.37 mmol) Intermediat L16 und 125 mg (0.37 mmol) tert-Butyl- 6"(tert-butoxycarbonyl)-L.-lysinat hydrochlorid(l : 1 ) in Gegenwart von EDC/HOBT und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschüizung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 2h Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus AcetonitriV Wasser wurden 194 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 1.1 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.58 min; MS (ESlpos): m/z - 652 (M+H)+.
Intermedia! L18
Trifluoressigsäure— beta-alanyl-L-alanyl-N -carbamoyl-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)phenyl]-L- omithinamid( 1 : 1 )
CH..
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Methyl-(4-aminophenyl)acetat analog Intermediat L7 sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Anknüpfung von N2-(tert- ButoxycarbonylJ-N^-earbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidm-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestelit. Es wurden 330 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 0.29 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.41 min; MS (ESlpos): m/z = 465 (M+H)+. Intermediat L19
Triftuoressigsäure~L-alanyl-N5-carbainoyl-N-(4- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino}phenyl)-L-ornithinamid(l : 1 )
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 1,4 Phenylendiamin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Im ersten Schritt wurden 942 mg (8.72 mmol) 1 ,4 Phenylendiamin mit 0.8 g (2.9 mmol) 2-(te:rt-Eiutoxycarbo:ny3)-N5~carba.m.oyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropyäethylamin monoacyliert. Im zweiten Schritt wurde in analoger Weise die zweite anilinische Aniinogruppe mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropyäethylamin acyliert. Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat und erneute Entschützung mit TFA führten dann in 3 weiteren Syntheseschlitten zur Titelverbindung, von der auf diesem Weg 148 rng erhallen wurden.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.21 min; MS (ESIpos): m/z - 474 (M+H . LC-MS (Methode 4): R, = 0.2 min; MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H . Intermediat L20
Trifluoressigsäiire--L-vaiyl- J-carbanioyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrro
omithmamid(l : 1 )
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidciiemie analog zu Intermediat L8 ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L- Ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,S-Dioxopyrrolidm-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)- L-valinat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 171 rng der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.28 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.39 min; MS (ESIpos): m/z = 445 (M+H)+. Intgnngdjat_L2j_
L-Valyl-r^-(tert-butoxycarbonyl)-N-[4-(2-methoxy-2-oxoe1hyl)phenyl]-l^lysm^
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem 0.42 g (2.56 mmol) Methyl-(4-aminophenyl)acetat durch sequentielle Kupplung mit N6-(tert-Butoxycarbonyl)-N2-[(9H-fluoren-9-ymieli!Oxy)carbonyl]-L-lysi!i in Gegenwart von HATU, und N,N-Diisopropylethylamin, Entschützung mit Piperidin, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin und anschließende hydrogenolytische Abspaltung der Benzyloxycarbonylschutzgruppe über 10%-Palladium- Aktivkohle. Es wurden 360 mg (32% d.Th. über 4 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 1.5 nun;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)+. Int nedjat L22
Trifluoressigsäure--N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N- (4-[(2S)-2-amino-3- rnethoxy-3-oxopropyljphenyl} -Ni-carbamoyl-L-ornithinamid(l : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von N-(tert-Butoxycarbonyl)-4-nitro-L-phenylalanin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. 2.5 g (8.06 mmol) von diesem Edukt wurde im ersten Schritt zunächst in das Caesiurnsaiz und dann mit lodmetiian in DMF in den Methylester überfuhrt. Hydrogenolyti eh wurde dann in Methanol über 10% Palladium- Aktivkohle die Nitrograppe in eine Aminogruppe überführt.
Die so generierte Aminogruppe wurde dann mit N5-Carbamoyl-N2-[(9H-fluoren-9- ylmethoxy)carbonyl]-L-ornithin in DMF in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropyietiiylamin acyliert. Im nächsten Sehritt wurde die Fmoc-Gruppe mit Piperidin in DMF abgespalten.
Anschließend erfolgte in DMF die Kupplung mit N-[(9H-Fiuoren-9-ylmethox.y)carbonyl]-L-valin in Gegenwart von l-(3-Dirneihyiaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydroehlorid, 1-Hydroxy-lH- benzotriazol-Hydrat und NN-Diisopropylethylamin und schließlieh die Abspaltung der terl- Butoxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.6 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.77 min; MS (ESIpos): m/z - 673 (M+H)+. Iratermediat L;^
Trifluoressigsäure--N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihy^
Die Tiie iverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-- 1 -(2- arninoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l:l) durch Kupplung mit N-(tert-Butoxyearbonyi)-beta-alanin in Gegenwart von EDCI/HOBT und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.19 min.
Intermediat L24
Trifluoressigsäure-- l-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pynOl- l-yl)ethyl]
cyclopropancarboxamid( 1:1)
114 räig (0.67 mmol) von kommerziell erhältlicher 3 -[(tert-Butox earbonyl)amino]cyclopropa-n carbonsäure wurden in 25 mL DCM gelöst und mit 1 10 mg (0.623 mmol) von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-- 1 -(2-aminoethyl)- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1) sowie mit 395 μΐ Ν,Ν- Diisopropyiethylamin versetzt und auf - 10°C abgekühlt. Dann wurden 217 mg (0.793 mmol) 2- Brom- 1 -ethylpyridiniumtetrafluoroborat zugegeben und der Ansatz 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde mit Etiiylacetat verdünnt und nacheinander mit ! 0%-iger Zitronensäure, gesättigter Nafriumhydrogencarbonatlösung un gesättigter Natriumchloridlösubng ausgeschüttelt, dann über Magnesiums ulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 152 mg des geschützten Intermedia ts erhalten.
Diese wurden anschließend in 10 mL DCM aufgenommen und mit 1 mL Trifluoressigsäure entschützt, Nach Lyophilisation aus Acetonitrii/Wasser wurden 1 58 mg (71% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.19 min.
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.98 min; MS (ESIpos): m/z - 224 (M+H)+. Intermediat L25
N-[31-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyixol-l -yl)-29-oxo-4,7,10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan-1 - oyl]-L- valyl-L-alanin
31.4 mg (0.17 mmol) Valyl-L-alanin wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 1 15.0 mg (0.17 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTOl-l-yl)-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-27-oxo- 3,6,9,12,15, 18,23 ,24-octaoxaheptacos-l -yl}propanamid und mit 33.7 mg (0.33 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser), Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.61 min; MS (ESIpos): m/z - 763 [M+H]+.
Intermediat L26
L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin
600.0 mg (1 .58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarboi!yl)-L-lys!n wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol THF (1:1:0.5) suspendiert und mit Palladium auf Kohle ( 10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 5 h hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Lösemittel im Vakuum verdampft. Die erhaltene Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.42 min; MS (ESIpos): m/z - 247 i M i i j .
3 80 mg (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyi)-L-lysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethyiamin versetzt. Dann wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin- 3 -yl-N-[(benzyloxy)carbony]]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethyiamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/mrn, MeCN/Wasser, 0.1 % ITA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z - 480 [M+Hf. 272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20.0 mL Ethylacetat Ethanol/THF (1 : 1:1) vorgelegt und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 5 h. Es wurde mit Hilfe von CeIite'R) abfiitriert und der Filterkuchen mit Ethylacetat Ethanol/THF (1 : 1 : 1) nachgewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Titelverbindung (182 mg, 72 % d. Th.) wurde in der nächsten Reaktionsstufe ohne weitere Reinigung eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.53 min; MS (ESIpos): m/z - 346 j \M ! i .
Intermediat L27
N 31-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H-pyrrol -yl)-29-oxo-4;/,10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan-l-oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-l sin
30 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin (Intermediat L26)
und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l-yl)-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin- l-yl)oxyj-27-oxo-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacos-l -yl}propanamid wurden in 1 .5 mL DMF vorgelegt und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionslösung rührte bei RT über Nacht. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 30μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/W asser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.77 min; MS (ESIpos): m/z - 920 [M+H]+. Intermediat L28 tert-Butyl-3-formyl-4-( |[2-(trimethyisiiyi)ethoxy]carbonyl}ainino)pyrroUdin-l-carboxylat
461.7 mg (1.15 mmol) l-tert-Butyl-3-ethyl-4-( {[2-
(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)pyrrolidin-l ,3-dicarboxylat (Diese Verbindung wurde gemäß Literaturvorschrift WO 2006/066896 hergestellt) mirden in 5.0 mL absol. Diciiloraiethan vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurde langsam 326.2 mg (2.29 mmol) (1 M in THF) zugetropft und 2 h bei -78 °C geröhrt
(Dünnschichtchromatographische Kontrolle (Petroletlier/Ethylacetat = 3: 1 ). Es wurden 1.3 g (4.59 mmol) Kaliumnatriumtartrat gelöst in 60 mL Wasser zugetropft und die Reaktionsmischung auf RT kommen gelassen. Die Reaktionsniischung würde mit Ethylacetat versetzt und die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat extrahiert, Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 62,9.0 mg der Titelverbindung als Rohprodukt, welches ohne weitere Reinigung sofort in der nächsten Reaktionsstufe eingesetzt wurde.
Intermediat L29 tert-Butyl-3-fbrmyl-4-[({[2-(1rimelhy
Mischung aus Diastereomeren.
807.1 mg (2.34 mmol) tert-Buty]-3-({[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}rnethyl)-4- (hydroxymethyi)p rrolidin- 1 -carboxylat (Die Herstellung erfolgte gemäß der Literatun/orschrift WO 2006/100036) wurden in 8.0 niL Dichlormethan vorgelegt und 236.4 mg (2.34 mmol) Triethylamin zugegeben. Bei 0 °C wurden 267.6 mg (2.34 mmol) Methansuifonsäurechlorid zugetropft und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es erfolgte eine weitere Zugabe von 133.8 mg (1.17 mmol) Methansuifonsäurechlorid und 118.2 mg (1.17 mmol) Triethylamin, Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je einmal mit ges. NaüiumliydiOgencarbonat-Lösung, 5%iger Kaliumhydrogensulfat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Tsolera gereinigt (Kieselgel, Säule 50 g SN AP, Fluss 66 mL/ in, Cyelohexan/Ethylacetat). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 402.0 mg (41 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3-({[tert- buty l(dimethyl)silyl]oxy } methyi)-4 - { [(niethyisulfonyl)oxy]methyi } Pyrrolidin- 1 - carboxylat LC-MS (Methode 1): R, - 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 424 [M+H]+.
400.0 mg (0.94 mmol) tert-Butyl-3~({[te:rt-butyl(diniethyl)silyl]oxy} methyl)-4- {[(methylsislfonylioxyjmethyl) Pyrrolidin- 1 -carboxylat wurden in 5.0 mL DMF vorgelegt und mit 98.2 mg (1.51 mmol) Natriumazid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 h bei 40 °C gerührt. Dann wurden nochmals 30.7 mg (0.47 mmol) Natriumazid zugegeben und weitere 10 h bei 40 °C gerührt. Es wurde Ethylaceiat zugegeben und die organsiche Phase mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung der organischen Phase über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 309.5 mg (89 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3-(azidomethyl)-4-( {[tert- butyl(dime1hyl)silyl]oxy}metliyi)pyrrolidiD-l-carbox iat. Die Verbindung wurde ohne weitere
Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.50 min; MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H]+.
250 mg (0.68 mmol) tert-Butyl-3-(azidomethyl)-4-( {[tert- butyl(dirnethy l)sil l]ox } methyl)pyrrolidin- 1 -carboxylat wurden in 10.0 mL Emylacetat/Ethanol (1:1) gelöst und mit 25.0 rng Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 8 h. Die Reaktion wurde über Celite'R! filtiert und der Filterkuchen miensiv mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 226.2 mg (82 % d. Th.) der Verbindung tert~Butyl~3-(aminomethyl)-4~( { [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy} methyl)pyrrolidin- 1 -carboxylat. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 345 [M+H]+.
715.0 mg (2.08 mmol) tert-Butyl-3-(aminomethyl)-4-({[tert- butyi(dimethyi)sily3]oxy}niethyl)pyrrolidin-l -carboxylat wurden in 15.0 L THF gelöst und mit 2.28 mL (2.28 mmol) TBAF-Lösung (IM in THF) versetzt.. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand (1.54 g) ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.41 min; MS (ESIpos): m/z - 231 [M+Hf ,
1.54 g (4.88 mmol) tert-Butyi-3-(aminomethyl)-4-(hydroxymethyl)pyrrolidin-l-carbox /lai wurden in 1 ,4-Dioxan vorgelegt mit 541.8 mg (4.88 mmol) Caleiumchlorid (wasserfrei) und 488.6 mg (4.88 mmol) Calciumcarbonat versetzt und kräftig gerührt. Dann wurden 592.8 mg (5.86 mmol) Triethylamin und 1.52 g (5.86 mmol) 1. -({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5- dion zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 644.9 mg (10.7 mmol) HOAc und Ethylacetat zugegeben. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lsöemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormeth an/Methanol = 100: 1 ) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 346.9 mg (19 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3 -(hydroxymethyl)-4-[( { [2-(trimelhylsüyl)e1hoxy3carbonyl}arümo)methyl3pyrroiidm- 1 - carboxylat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z - 375 [M+H]+. 804.0 mg (2.15 mmol) tert-Butyl-3-(hydroxymethyl)-4-[({[2-
(trimethylsilyl)ethoxylcaA wurden in 20.0 mL
Chloroform und 20.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonai/0,05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 59.7 mg (0.2,2 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 429.9 mg (3.22 mmol) N-Chlorsuccimmid und 33.5 mg (0.22 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmisciiung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und im Vakuum vom Lösemittel befreit. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Lausfmittel: Cyclohexan Ethylacetat = 3: 1) gereinigt. Man erhielt 517.0 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt - 1.13 min; MS (ESI os): m/z - 373 [M+Hf.
Intermediat L30 teri-Buty 1-3 -( { [tert-butyl(dimethy Ijsüyljoxy } methyl)-4-formylpyrro lidin- 1 -carboxy lat
Mischung aus Stereoisomeren
250.0 mg (0.72 mmol) tert-Butyl-3-({[tert-but l(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4- (hydroxymethyl)pyrrolidm- l-carboxylat (Die Verbindung wurde gemäß der Literaturvorschrift WO2006/100036 hergestellt.) wurde in 12.5 mL Dichlormethan/DMSO (4: 1) vorgelegt und mit 219.6 mg (2.17 mmol) Triethylamin versetzt. Bei 2 °C wurde 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex portionsweise zugegeben und 3 h bei 2 °C gerührt. Es wurden nochmals 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex portionsweise zugegeben und 17 h bei RT gerührt. Die Reakiionsmischung wurde zwischen Dichlormethan und Wasser verteilt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen einmal mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (Dünnsehichtchromatographie: Petrolether/Ethylacetat 7:3).
Di-tert-butyl- { [(tert-butoxycarbonyl)amino]methyl } malonat
Zu 600 rnL. Wasser wurden 57.2 g (488.27 mmol) tert-Butylcarbamat, 51.2 niL (683.57 mmol) einer 37%-igen Losung von Formaldehyd in Wasser und 25.9 g (244.13 mmol) Natriumcarbonat addiert. Das Gemisch wurde erwärmt, bis eine Lösung entstand und dann bei RT für 16 h gerührt. Die entstandene Suspension wurde mit 500 mL Dichlormethan extrahiert, die organische Phase abgetrennt, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Es wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, wobei ein kristalliner Feststoff anfällt. Der Rückstand wurde in 1000 mL absoluten THF aufgenommen und bei RT ein Gemisch aus 322 mL (3.414 mol) Essigsäureanhydrid und 138 L (1.707 mol) Pyridin zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde bei RT für 16 h gerührt und anschließend am Rotationsverdampfer eingenegt, wobei das Wasserbad Raumtemperatur hatte. Der Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und drei mal mit einer gesättigten atriunihydrogencarbonat-Lösung sowie ein mal mit einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand 2 d im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 2000 L absolutem THF aufgenommen und unter Eiskühlung mit 456 L (456.52 mmol) einer 1 M Lösung von Kalium-tert-butanolat in THF versetzt. Es wurde 20 Min. bei 0°C gerührt und anschließend 100.8 g (456.52 mmol) Di-tert-butylmalonat gelöst in 200 mL absolutem THF zugetropft. Es wurde 48 h bei RT gerührt und anschließend Wasser addiert. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und in 500 mL Essigsäureethylester aufgenommen. Das Gemisch wurde mit 500 mL Wasser und 100 mL einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels Filtration über Kieselgel (Eluent: Cylohexan/Essigsäureethylester, Gradient = 30: 1 — *· 5: 1) gereinigt. Es wurden 37.07 g (22% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 6): R, = 2.87 min; MS (ESlpos): m/z - 346 [M+H]+.
Intermediat L32 tert-Buty 1- [ 3 -hydroxy-2 - (hydroxymethy l)propy 1 ] c arbamat
37.0 g (107.11 mmol) Di-tert-butyl-(acetoxymethyl)malonat wurden in 1000 mL absolutem THF gelöst und unter Eiskühlung mit 535.5 mL ( 1071.10 mmol) einer 2 M Lösung von Lithiumborhydrid in THF tropfenweise versetzt. Es wurden 19.3 mL (1071.10 mmol) Wasser zugetropft und 4.5 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 1 00 mL Essigsäureethylester aufgenommen und mit 100 mL Wasser versetzt und 30 Min. unter Wasserkühlung gerührt (leicht exotherm). Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase zwei mal mit 500 mL Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rücksiand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 20.7 g (94% d. Th.) der Zeilverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 6): Rt - 1.49 min; MS (EIpos): m/z - 106 [M-CsHsChf. Intermediat L33 tert-Butyl-[3-{[tert-butyl(dime
20,00 g (97.44 mmol) te:ri-Butyl-[3~hydroxy-2-(hydroxymetliyi)pi pyl]carbamat wurden in 1000 mL absolutem Dichlormethan gelöst und bei RT mit 6.63 g (97.44 mmol) Imidazoi sowie 16.16 g (107.18 mmol) tert-But l(chlor)dimethyisiian versetzt. Es wurde 16 h bei RT gerührt und das Reaktionsgemisch mit halbkonzentrierter Nafriumchlorid-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Essigsäureetliylester extrahiert und die vereinigten oranischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet, am Rotations Verdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 28.50 g (92% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] - 0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9! i L 1.37 (s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, verdeckt)], 3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1 H). . tert-Butyl-(3-{[tert-butyl(dimethyl)sily]]oxy}-2-formylpropyl)carbamat
12.65 g ( 39.591 mmol) tert-Butyl-[3- {[tert-bu1yl(dimelhyl)silyljoxy} -2- (hydroxymethyl)propyl]carbamat wurden in 200 mL Dichlormethan gelöst und bei RT mit und mit 19.3 1 g (45.53 mmol) Dess-Martin-Periodinan gelöst in 150 mL Dichlormethan tropfenweise versetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 250 mL einer Imlbkonzentrierten NatriumhydrogencarboDat-Lösvmg sowie mit 250 mL einer 10%-igen Natriumthiosulfat-Lösvmg versetzt, und für 20 Min. gerührt Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 300 mL Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 1 1.35 g ( 90% d. Th.) der Zielverbindung erhallen. l i-N M (400 MHz, DMSO-ck): δ [ppm] - 0.02 (s, 6H), 0.84(s, 9H), 1.36 (s, 9H), 1.48-1.51 (m, 3 H), 3.08-3.32 [m, (1H, verdeckt)], 3.50-3.58 (m, 2H), 3.81 -3.91 (m, 1H), 6.71 (t, 1H), 9.60 (d, ΠΙ),
Intermediat L3S tert-Butyl - (3 - oxopropyl) c arbamat
Die Titelverbindung wurde nach iiteraturbekannten Verfahren hergestellt (z.B. Jean Basiide Med. Chem. 2003, 46(16), 3536-3545).
Intermediat L36 -[(Benzyloxy)carbonyi]-L-vaiyi-N5-carbamoyi-L-omithin
100 mg (0.57 mmol) N5-Carbamoyl-L-ornithin wurden in 4.0 mL DMF aufgenommen und mit 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin versetzt. Dann wurden 199.0 mg (0.57 mmol) 2,5- Dioxopyrrolidin- 1 -yi-N-[(benzyloxy)carbonyl] -L-valin und 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin zugesetzt. Es wurde 48 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 rnL/min, eC /Wasser mit 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.7 mg (33 % d. ri.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.69 min; MS (ESIpos): m/z - 409 [M+Hf.
Intermediat L37
L - Valyl-N 5 - c arb anioy 1-L -Ornithin
75.7 mg (0.19 mmol) von Intermediat L36 wurden in 25 mL Wasser/Ethanol/THF suspendiert und mit 7.5 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 4,5 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt. Man erhielt 64.9 mg (93 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 6): R, - 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 275 [M+H]+.
Ilttgnnediat_L38
N-[31-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyixol-l -yl)-29-oxo-4,7,10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan-1 - oyl]-L- valyl-N5-carbamoyl-L- Ornithin
38,3 mg (0, 14 mmol) von Intermediat L37 wurden in 3.0 mL DMF vorgelegt und mit 96.4 mg (0.14 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-py!Tol-l-yi)-N-{27-[(2,5-dioxop3nroiidin-l -yl)oxy]-
27-0X0-3, 6,9, 12, 35, 18,21 , 24-octaoxaheptacos-i -yljpropanamid und mit 39.0 μΐ, (0.28 mmol) Trietlryiamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit 16.0 μΕ (0.2,8 mmol) HOAc versetzt und direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser), Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 58.9 mg (45 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.61 min; MS (ESlpos): m/z - 849 i M i i j .
Intermediat L39
2-(Trirnethyisilyl)ethy3~(2~sulfanyietlrv'l)carbaniat
300 mg (2.64 mmol) 2-AniinoethanthioIhydrochlorid (1 : 1) wurden in 3.0 ml, Dichlonnethan vorgelegt und mit 668.0 mg (6.60 nimol)Triethylamin mit 719.1 mg (2.77 mmol) l-({[2- (Trimeth.ylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyriOlidin-2,5-dion versetzt. Es wurde 2 Tage bei RT gerührt. (Dünnschichtchromatographische Kontrolle: Dichlormethan/Methanol = 100: 1.5) Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Einsatz der Verbindung ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe.
Intermedia* L40
N^31K2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTol-l-yl)-29-oxo-4,7,10,13,16,19,22^5-octaoxa-28- azahentriaeontan-l -oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin
600 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 : 1 :0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.99 min; MS (ESIpos): m/z - 247 [M+H]+.
180.0 mg (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysm wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0,73 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5- Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-va!inat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosi! 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Tli.) der Verbindung N- [(Benzyloxy)carbonyi]-L-valyi-N6-(tert-butoxycarbonyi)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.97 min; MS (ESTpos): m/z - 480 [M+Hf , 272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20 rnL Ethylacetat Ethanol/THF (1 : 1: 1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über Celite(R) filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Ethanol/THF (1: 1: 1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th.) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.53 min; MS (ESI os): m/z - 346 [M+Hf.
30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L -lysin und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihycho-lH-pyrrol-l -yl)-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-27-oxo-
3,6,9,12,15,18,21 ,24~octaoxaheptacos-l ~yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4-Meihylmorpholin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt, mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 1 0μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R - 0.77 min; MS (ESIpos): m/z - 920 [M+H]+. IntgrjnedMt_L41
N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7,l 0, 13-tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin
600 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyk xy)carbonyl]-N6-(ieri-buioxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 : 1 :0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.99 min; MS (ESIpos): m/z - 247 [M+H]+.
3 80.0 mg (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysir! wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5- Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L- valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die eaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) der Verbindung N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): R* = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]+.
272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20.0 mL Ethylacetat/Ethanol/THF (1 : 1: 1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über CelitelR) filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Ethanol/THF (1 : 1 : 1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th.) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.53 min; MS (ESIpos): m/z - 346 [M+Hf.
30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L4ysin und 34.3 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidm-l-yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12- letraoxapentadee- 1 -yl} ropanamid wurden in LS mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4- Meihylmorphoiin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 40.6 mg (82 % d. Th.) der Titel verbindung. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.73 min; MS (ESIpos): m/z - 744 [M+H]+.
Intermediat Ϊ..42
N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7,l 0, 13-teiraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oy 1] -L- valyl-N5 - carbamoy l-L-omithin
50.0 mg (0.18 mmol) L-Valyl-N5-carbainoyl-L-oraithin (Intermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 93.6 mg (0.18 mmol) 3-(2,5-Dioxo2,5-dihydro 1 H-pyrrol- 1 -yl)-N- { 15-[(2,5- dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadec-l-yl} propanamid und 36.9 mg (0.37 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT über Nacht, Es wurden 21.9 mg (0.37 mmol) HOAc hinzugefügt und die R eaktionsmischung direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/W asser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.6 mg (14 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.55 min; MS (ESIpos): m/z = 673 [M+H]+.
Intermediat L43
N-[67-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- l H-pyrrol-l-yl)-65-oxo- 4,7,10,I 3,16,19,22,25,28,3 I ,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61 cosaoxa^^
oyi] -L- valyl -N5 - earbamoy i-L-ornithin
11.3 mg (0.04 mmol) L-Valyl- 5-carbamoyl-L-ornithin (Intermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 50.0 mg (0.04 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-N- {63-[(2,5- dioxopyiToiidm-l-yl)oxy]-63-oxo-3A9,12 548,21,24,27,30 3 6,39,42,45,48,5 I ,54,57,60- icosaoxatrihexacont- 1 -yl}propanamid und 8.3 mg (0.08 mmol) Triethyiamin versetzt. Die Reaktionsmischung röhrte bei RT über Nacht. Es wurden 4.9 mg (0.08 mmol) HOAc hinzugefügt und die Reaktionsmischung direkt, über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (20 % d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 4): R, - 0.94 min; MS (ESIpos): m z - 1377 [M+H] ". N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7,l 0, 13-tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyl]-L-valyl-L-alanin
73.3 mg (0.39 mmol) L-Valyl-L-alanin wurden in 7.0 rnL DMF gelöst und mit 200.0 mg (0.39 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]- 15-oxo- 3,6,9,12-tetraoxapentadec-l-yl}propanamid und 78.8 mg (0.78 mmol) Trietliylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischimg wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 3.3 mg (45 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.58 min; MS (ESTpos): m/z - 587 [M+Hf ,
Intermediat L45 iert-Butyl-(2S)-2-[(tert-butoxycarbonyi)aminoj-4-oxobutanoat
2,00 g (7.26 mmol) tat-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-homos€ainat wurden in 90 ml Dichlonriethan gelöst und dann mit 1.76 ml Pyridin sowie mit 4.62 g (10.90 mmol) 1 ,1,1- Triacetoxy- 13ambda5,2-benziodoxol-3(lH)-on (Dess-Martin-Periodinan) versetzt. Der Ansatz wurde 2 h bei RT gerührt, anschließend mit 200 ml Dichlonnethan verdünnt und zweimal mit 10%- iger Natriumtiosulfat-Lösung und dann nacheinander zweimal mit 5%- iger Zitronensäure und zweimal mit gesättigter Natriumliydrogencarbonat-Lösung ausgesciiüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit 100 ml Dieihylether und Cyclohecan (v/v=i : i) versetzt, etwas eingeengt, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel. Dieser wurde abgesaugt. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet, wobei 1.74 g (88%:. d. Th.) der Zielverbindung als hellgelbes Öl erhalten wurden.
LC-MS (Methode 1 ): R, - 0.85 min; MS (ESIpos): m/z - 274 [M+H]+.
!H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H), 4.31 -4.36 (m, 1 H), 7.23 (d, 1H), 9.59 (s, 1H).
Intermediat L46
Trifluoressigsäure--tert-butyl-N-[2-(2,5~dioxo-2,5-diliydro-lH
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 200 mg (0.79 mmol) Trifluoressigsäure- -1 -(2-aminoethyt)-lH-pyrrol-2,5-dion(l : 1) mit 263 mg (0.87 mmol) (4S)-5-tert-Butoxy-4-[(tert- butoxycarbonyl)amino]-5-oxopentansäure-trifluoressigsäui-e(l : l) in Gegenwart von EDC/HOBT und N,N-Diisopropyletbylamin und anschließende Entschützung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 1h Rühren in 10%jger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus Acetonitril/ Wasser wurden 85 mg (20% d.Th.) der Titel Verbindung über 2 Stufen erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.37 min; MS (ESIpos): m/z = 326 [M+H]+. Intermediat L47
Trifluoressigsäure--beta-alanyl-L-alrayl-N5-carbamoyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihy(fr
yl)phenyl]-L-ornithinamid(l : 1)
Die Titelverbindung wurde durch Kuppiung von Intermediat L8 mit 2,5-Dioxopyrrolidin- (tert-butoxycarbonyI)-beta-alaninat und anschließender Entsehützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 1.36 min; MS (ESIpos): m/z - 488 (M+H)+.
Intermediat L48
Triihuoressigsäure-~(lR,2S)-2-amino^
yl)ethyl]cyclopentancarboxamid( 1 : 1 )
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (1R, 2S)-2-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure in Analogie zu Intermediat L2 hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 1.22 min; MS (ESIpos): m/z - 252 (M+H)+. Trifiuoressigsäure--tert-butyl-N-(bromace1yl)-L-valyl-L-alanyl-L-lys!nat( 1 : 1 )
Die Titelverhindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlichem
Bromessigsäureanhydrid mit dem nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellten partiell geschützten Peptid tert-Butyl-L-valyl-L-aianyi-l^-itert-buioxycarbony^-L-iysiDat in Gegenwart von NN-Diisopropylethylaniin in Dichlormethan hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 49%-iger Ausbeute über 2 Stufen die Titelverbindung erhalten wurde.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.09 min; MS (ESIpos): m z - 593 und 595 (M+H)
In ter media 1 1.50
Trifluoressigsäure--(lS,3R)-3-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^
yl)ethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgeltend von kommerziell erhältlicher (l S,3R)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure- -(2-arninoethyi)-lH-pyrrol-2,5-dion(l:I) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Diisopropylemylatnin und anschließender Enlschüizung mit TFA hergesteilt.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.2 mm;
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.88 min; MS (ESTpos): m/z - 252 (M+H)4, Intermcdiat L51
Trifluoressigsäi!re--(lR,3R)-3-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihyd^
yDethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3R)-3-[(tert- Butoxyearbonyl)ammo]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure--l-(2-aminoeihyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l:l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Düsopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 0.98 min; MS (ESIpos): m/z - 250 (M-H) .
Intermcdiat L52
Trifluoressigsäure --N-(2-aminoethyl)-2-bromacetamid (1: 1)
420 mg (2.62 mmol) tert-Butyl-(2-aminoethyl)earbamat wurden in 50 ml Dichiormethan aufgenommen und mit 817 mg (3.15 mmol) Bromessigsäureanhydrid sowie 913 μΐ (5.24 mmol) NN-Diisopropylethylamin versetzt. Der Ansatz wurde 1 Ii bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde duch präparative HPLC gereinigt.
Es wurden 577 mg der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend in SO ml Dichlormethan aufgenommen und mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt wurde. Nach 1 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Acentonitril/Wasser lyophilisert. So wurden 705 mg (65% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 3): R, - 0.34 min; MS (ESIpos): m/z = 181 und 183 (M+H)\ Intermediat L53
Trifluoressigsäure--(lS,3S)-3-amino-N-[2^
yl)ethyl]eyelopentancarboxamid(l : 1 )
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lS,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)aroiDo]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure- l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l : l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließender Enlschützung mit TFA hergestellt.
HPLC (Methode 11): R« - 0.19 min;
LC-MS (Methode 3): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 250 (M-H)\ Intermediat L54
Trifluoressigsäirre--(lR,3S)-3-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3S)-3-[(tert- Butoxyca.rbonyl)aniino]cyclopenta.ncarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsä re--l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dioii(l: l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Dnsopropylethylaniiii und anschließender Enischützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 0.89 min; MS (ESlpos): m/z - 252 (M+H)+.
In ter media 1 1.55
TrifluoressigsäOTe--lert >ulyl-]S^
yljhexanoyl ]-L-valyl-L-alanyl} -L-lysinat (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermediat L6 mit N-(tert- Butoxycarbonyl)~D-alanin in Gegenwart von HATU und anschließender Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 90 minütiges Rühren in 5%iger
Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. HPLC (Methode i 1): Rt - 1.35 min;
LC-MS (Methode 1): R* = 0.67 min; MS (ESIpos): m/z = 637 (M+H)+. Intermediat L56
Trifluoressigsäure ~tert-bu1yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)bexanoyl]-L-valyl-L- alanyl-N°- {[(lR,3S)-3-aminocyclopentyl]carbonyl}-L-lysinat (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermediat L6 mit (lR,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure in Gegenwart von HATÜ und anschließender Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 15 minütiges Rühren in 25 -iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 1.4 min;
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.7 min; MS (ESIpos): m/z - 677 (M+H)\ Intermediat L57
Methyl-(2S)-4-oxo-2-( { 2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat
500.0 mg (2.72 mmol) L-Asparaginsäuxemelhylester Hydrochlorid und 706.3 mg (2.72 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl-2,5 -dioxopyrrolidin- 1 -carboxylat wurden in 5.0 mL 1,4-Dioxan vorgelegt und mit 826.8 mg (8.17 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 583.9 mg (74 % d. Th.) der Verbindung (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-( {[2-(trimethykiiyl)ethoxy]carbonyl}amino) butansäure.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min; MS (ESIneg): m/z - 290 (M-HV.
592.9 mg (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-( f[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butansäure wurden in 10,0 niL 1,2-Dimethoxyethan vorgelegt und auf -15 °C abgekühlt und mit 205.8 mg (2.04 mmol) 4-Methylmorpholin und 277.9 mg (2.04 mmol) lsobutylchlorformiat versetzt. Der Niederschlag wird nach 15 min abgesaugt und zweimal mit je 10.0 mL 1,2-Dimethoxyethan gewaschen. Das Filtrat wird auf -10 °C abgekühlt und mit 115.5 mg (3.05 mmol) atriumborhydrid gelöst in 10 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase je einmal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, Man erhielt 53 5.9 mg ( 1 % d. Th.) der Verbindung Methyl-N- { [2-(trimethylsiiyl)ethoxy]carbonyl}-L-homoserinat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z - 278 (M+H)4'.
554.9 mg (2.00 mmol) Methyl-N- { [2-(trimethylsilyl)e1hoxy]carbonyl} -L-homoserinat wurden in 30.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 1.27 g (3.0 mmol) Dess-Martin periodinan und 474.7 mg (6.00 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte über Nacht bei RT. Nach 4 h wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je dreimal mit 10%iger
10%iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft, Man erhielt 565.7 mg (97 % d, Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 211), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, III).
2-(Trimethylsilyl)ethy!-(3-oxopropyl)carbamat CK
434.4 mg (5.78 mmol) 3-Amino-l -propanol und 1.50 g (5.78 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,5- dioxopyrrolidin- 1 -carbox lat wurden in 10.0 mL Dichiormetnan gelöst und mit 585.3 mg (5.78 mmol) Triethylamin versetzt und über Nacht bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischung mirde mit Dichiormetnan verdünnt und die organische Phase mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen und anschließend über Magnesiumsuifat getrocknet Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand 2-(Trimethylsiiyl)ethyl-(3-hydroxypropyl)carbamat (996.4 mg, 79 % d. Th.) wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
807.0 mg (3.68 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyi-(3-hydi xypropyl)carbaniat wurden in 15.0 mL Chloroform und 15.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat 0.05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1: 1) vorgelegt. Dann wurden 102.2 mg (0.37 mmol) Tetra-n-butyiarnmoniumchlorid, 736.9 mg (5.52 mmol) N-Chlorsuccinimid und 57.5 mg (0.37 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktiortsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (890.3 mg).
Ilttgnnedjat_L59
Trifluoressigsäure--l-{2-[2-(2-ammoemoxy)ethoxy]ethyl} -lH-pyrrol-2,5
300.0 mg (0,91 mmol) tm-Butyl-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethoxy]ethoxy}eihyl)carbamat wurden in Dichlonnethan vorgelegt und mit 4.2 g (36.54 mmol) TFA versetzt und 1 h bei RT gerührt (DC-Kontrolie: Dichlormethan/Metlianol 10: 1). Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand viermal mit Dichlonnethan kodestilliert. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.19 min; MS (ESIpos): m/z - 229 (M+H)+.
Intermediat L60
6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yijhexanoyichlorid
200.0 mg (0.95 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- l-yljhexansäure wurden in 4.0 mL Dichlonnethan gelöst und mit 338.0 mg (2.84 mmol) Tliionylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT gerührt und da n mit 1 Tropfen DMF vesetzi. Es wurde nochmal 1 h gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und es wurde dreimal mit Dichlonnethan kodestilliert. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
Intermediat 1,61
Trifluoressigsäure --2-(trimethylsüyl)e1hyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro
L-valyl-L-alanyl-L-lysinat (1 : 1)
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(BeErzyloxy)earhonyl]-N6-(tert-butoxyearhonyl)-L-lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-(Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Hydrogenolyse, Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und erneute Hydrogenolyse) das Tripeptidderivat 2-Trimethylsilyl)ethyl-L- valy3-L-alanyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinat hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch Kupplung dieses partiell gesciiützten Peptidderivats mit kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexansäure in Gegenwart von HATU und iV,/v-Diisopropylethylamin hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 2.5 stündiges Rühren in 5%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT unter Erhalt der Esterschutzgruppe. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparaiive HPLC wurden 438 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt - 1.69 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.78 min; MS (ESIpos): m/z - 610 (M+H)+.
Intermed^ L62
Trifluoressigsäure --2-(trimeihylsilyl)ethyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexa L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithyt-L-!ysinat (1 : 1)
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N6-(tert-butoxycarbonyi)-L- lysinat hergestellt. 148 mg (0.43 mmol) von diesem Intermediat wurden dann in Gegenwart von 195 mg (0.51 mmol) HATU und 149 iiL N.N-Diisopropylethyiamin mit 200 mg (0.43 mmol) von Intermediat L16 gekuppelt. Nach Einengen und Reinigung des Rückstandes mittels präparativer HPLC wurde das geschützte Tnterniediat in 20 niL DCM aufgenommen und durch Zugabe von 2 ■nL Trifluoressigsäure und 1 h Rühren bei RT die teil. Butox carbonyl-Schutzgrappe abgelöst. Nach Einengen und Lyophiiisation des Rückstandes aus Acetonitril/ Wasser wurden 254 mg (63% d, Th. über 2, Stufen) erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 1.51 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.68 min; MS (ESlpos): m/z = 696 (M+H)+.
IittgnnedMt_L63
(4S)-4- {[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-moxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol -yl)hexanoyl]amm
■ nethy lbutanoy 1] amino } propanoy 3 j amino } -5 -oxo -5 - [2. - (triniethylsilyl)ethoxyjpentansäure
Zunächst wurde ausgehend von (2S)-5-(Benzyloxy)-2-[(tert-buioxycarbonyl)amino]-5- oxopentansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure, Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyll-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und Hydrogenolyse in Methanol über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle) das Tripeptidderivat (4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-Aniino-3-me1hylbutanoyi]am!no}propanoyl]amino}-5- oxo-5-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]pentansäure hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch Kupplung dieses partiell geschützten Pepüdderivats mit kommerziell erhältlichem l - {6-[(2,5- Dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy3-6-oxohexyi}-lH-pyrrol-2,5-dion hergestellt. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparative HPLC wurden 601 mg der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.96 min; MS (ESlpos): m/z - 611 (M+H)+. (4S)-4-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihydr^
penlansäure
Die Titelverbindung wurde ausgehend von (2S)-5-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5- oxopentansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure, hydrogenolytische Spaltung des Benzylesters in Methanol über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle und Kupplung mit i-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-2-oxoethyl} - lH-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.84 min; MS (ESlpos): m/z - 385 (M+H)+.
Intermediat L65
Trifluoressigsäure --2-(trimelhylsilyl)ethy3-3- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -L-alaninat (1: 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3- {[(Benzyioxy)carbonyl]amino}-N-(teri- butoxycarbonyl)-L-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 373 mg (79 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, - 0.72 min; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+
Methyl-(8S)-8-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-6,l l-dioxo-5-oxa-7,10-diaza-2-silatetradecan-14-oat
1000 mg (2.84 mmol) (3S)-3- {[(Benzyloxy)carbonyl]amino} -4-[(tert-butoxycarbonyl)amino] butansäure wurden in 10.0 mL 1,2-Dimethoxyethan vorgelegt und mit 344.4 mg (3.4 mmol) 4- Methyimorpholin und 504 mg (3.69 mmol) Isohutylchlorformiat versetzt. Nach 10min Rühren bei RT wurde der Ansatz auf 5°C abgekühlt und portionsweise mit 161 mg (4.26 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 3 L Wasser unter starkem Rühren versetzt. Nach 3 h erfolgte nochmals eine Zugabe der gleichen Menge an Natriumborhydrid und der Ansatz wurde anschließend langsam auf RT erwärmt. Es wurden 170 ml Wasser zugegeben und der Ansatz dann viermal mit jeweils 200 ml Ethylacetat extrahiert. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase einmal mit Citronensäure und anschließend mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 760 mg (78 % d. Tb..) der Verbindung Benzyl-tert-butyl-[(2S)-4-hydroxybutan- 1 ,2-diyl]biscarbamat. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 339 (M+H)4".
760 mg (2.16 mmol) von diesem Intermediat wurden in 13 ml Chloiwasserstof£'Dioxan gelöst 20 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz auf 5 ml auikonzeniriert und mit Diethylether versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und aus Acetonitril W asser 1 : 1 lyophilisiert.
Das so erhaltene Produkt wurde in 132 ml DMF gelöst und mit 345.5 mg (2.35 mmol) 4-Methoxy- 4-oxobutansäure, 970 mg (2.55 mmol) HATU und 1025 μΐ NN-Diisopropylethylamin versetzt. Die Mischung wurde 5 min bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbliebene Rückstand mittels präparaiiver HPLC geremigi. Die enisprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril im Vakuum abgedampft. Die verbleibende wässrige Phase wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase anschließend einggengt und im Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Zwischenprodukt wurde in Methanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
247 mg von dieser entschützten Verbindung wurden in 20 ml DMF aufgenommen und mit 352 mg (1.36 mmol) l -{{[2-(Trimethylsilyl)ethoxyjcarbonyl}oxy)pyri lidin-2,5-dion sowie 592 h - iL N,N- Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde lh bei RT geröhrt, anschließend eingeengt und der Rückstand mittles präparativer HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt über diese 5 Reaktionsschritte in einer 23 %-igen Gesamtausbeute 218 mg der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.74 min; MS (ESIpos): m/z - 363 (M+H)+.
Intermediat L67
Trifluoressigsäure -■2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l-yl)ethyl-beta-alaninat (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.354 mmol) von kommerziell erhältlichem 1 - (2-Hydrox ethyl)-l H-pyrrol-2,5-dioD durch Kupplung mit 134 mg (0.71 mmol) N-(tert- Butoxycarbonyl)-beta-alanin in 10 ml Diclilormethan in Gegenwart von 1.5 Equivalenten EDCI und 0.1 Equivalent 4-N, N-Dimethylaminopyridin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
Ausbeute: 56 mg (48% d. Th. über 2 Stufen)
LC-MS (Methode 3): R, - 1.15 min; MS (ESIpos): m/z = 213 (M+H)+. Intermediat L68
Trif]uoressigsäure--N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-] H-pyrrol-i -yl)propanamid( I : I )
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Tntermediat Li nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydrolH-pyrroi- 1 -yi)propansäure und tert-Butyl-(2-aminoethyl) earbamat hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.17 min; MS (ESIpos): m/z - 212 (M+H)+. (1 : 1)
H„N .. / O
O
HN
OH
O
H„N . o
N H
H„C ' ex o
Die TitelverbinduDg wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem Benzyl-4-hydroxypiperidm- 1 -carboxylat durch Veresterung mit 2-(tert- Butoxycarrx)i!yl)-N5-carbamoyl-L-ormliiin mittels EDCI/DMAP, anschließende Boc-Spaltung mit TFA, dann folgende Kupplung mit N-[(tert.-Butoxy)carbonyl]-L-valin in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin und schließlich erneute Boc-Abspaltung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.62 min; MS (ESIpos): m/z = 492 (M+H)4'.
Intermediat L70
9H- Fluor en-9-ylmethyl-(3-oxopropyl)carbamat
1000.0 mg (3.36 mmol) 9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3-hydroxypropyl)carbamat wurden in 15.0 ml, Chloroform und 15.0 niL 0.05 Kaliumcarbonat/0.05 N Nafriumhydrogencarbonat-Lösung ( 1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 93.5 mg (0.34 mmol) Tetra-n-buryiammordumchiorid, 673.6 mg (5.04 mmol) N-C orsuccinimid und 52.5 mg (0.34 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlomiethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCi-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 3: 1 -1 : 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 589.4 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 6): R, - 2.15 min; MS (ESIpos): m/z - 296 (M-H)+. Intermedia* L71 tert-Butyl-[4-(chlorcarbonyl)phenyl]carbamat
100.0 mg (0,42 mmol) 4-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]benzoesäure wurden in 2.0 mL
Dichlomiethan vorgelegt und mit 64.2 mg (0.51 mmol) Oxalsäuredichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT 30 min (DC-Kontrolle: Dichlormethan/Methanol). Dann wurden nochmals 192.6 mg (1.53 mmol) Oxalsäuredichlorid und 1 Tropfen DMF zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand mehrmals mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
Berrzyi-(9S)-9-(hydroxymeihyl)-2,2-dimethyl-6, 11 -dioxo-5-oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan- 14-oat
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Benzyl-tert-butyl-[(2S)-3- hydroxypropan- 1 ,2-diyl]biscarbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch hydrogenolytische Abspaltung der Z- Schutzgruppe, anschließende Kupplung mit 4-(Benzyloxy)-4- oxobutansäure in Gegenwart von EDCI HOBT, dann Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit TFA und schließlich durch Umsetzung mit 1 -( f[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} oxy)pyrrolidin-2,5- dion in Gegenwart von Triethylamin hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R* - 0.94 min; MS (ESIpos): m z - 425 [M+Hf,
Intermediat Ϊ..73
N-(2-arrnnoemyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l-yl)hexanamide
Zu einer Lösung von 300 mg (1 ,87 mmol) tert-butyl (2-aminoethyl)carbamate in 20 ml Dimethylformamid wurden 395.5 mg (1 .87 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydi"o-lH-pyrrol-l- yl)hexansäure, 1.21 g ( 9.36 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 854.3 mg (2.25 mmol) HATU zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten bei Rt gerührt. Nach Einengen der Mischung wurde der Rückstand in DCM aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Brine gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert, und eingeengt. Man erhielt 408 mg (33%, Reinheit 53%) der Titelverbindung, die ohne weitere Reinigung eingesetzt wurden.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.75 min; MS (ESlpos): m/z - 354 (M+H)+.
Zu einer Lösung von /eri-butyi (2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi-I - yl)hexanoyl]amino} ethyl)carbamate (408 mg, 0.365 mmol) in 7 ml dichlormethan wurde 1 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 0.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde zweimal mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 384 mg (94%, Reinheit 57%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.26 min; MS (ESTpos): m/z - 254 (M+H)4. Intermedia! L74
3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l -y])acetyl]amino]etlaoxy]etlaoxy]ethoxy]ethoxy]piOpansäure
307 mg (0.335 mmol) ieri-butyl 3-[2-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate und 93 mg (0.369 mmol) (2,5-cuoxopyrrolidin-l-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-l -yl)acetate wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.074 ml, (0.673 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 133 mg (86%, Reinheit 100%) ierf-butyi 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l- y l)acety 1] amino] ethoxy] ethoxy] ethoxy] e thoxyjpropanoate.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.82 min; MS (ESlpos): m/z - 459 (M+H)+.
Zu einer Lösung von /eri-butyl 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-i - yl)acetyl]amino]etlioxy]etlioxy]etlioxy]etlioxy]piOpanoate (130 mg, 0.284 mmol) in 5 ml diehlormefhan wurde 0.5 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT geröhrt. Die Reakiionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 102 mg (90%, Reinheit 100%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.52 min; MS (ESlpos): m/z - 402 (M+H)+. Intenned«jtJ-j75
Trifluoressigsäure— 2-(trimethylsilyl)ethyl-3- {[(berizyloxy)carbonyl]amino} -D-alaninat (1 : 1 )
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3- { [(Benzyioxy)carbonyl]amino} -N-(tert- butoxycarbonyi)-D-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI DMAP und Abspaltung der Boc-Sehutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 405 mg (58 % d. Tri. über 2 Stufen) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.75 min; MS (ESlpos): m/z - 339 (M+H)+.
Intermediat L76
(2S)-2-Brom-4-oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxv]butansäuri
Zunächst wurde ein geeignet geschütztes Asparaginsäurederivat ausgehend von (3S)-4- (Benzyloxy)-3-{[(benzyloxy)carboDyl]amino} -4-oxobutansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-Trimethylsilylethanol mittels EDCT/DMAP und hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe und des Benzylesters) hergesteilt. 470 mg (1.8 mmol) der so erhaltenen (2S)-2-Amino-4-oxo-4-[2-(t!nmethyis!iyi)ethoxy]butansäure wurden in 10 ml Wasser suspendiert und mit 1.8 mL einer 1 molaren Salzsäure sowie 0.5 ml konzentrierter Schwefelsäure und anschließend mit 863 mg (7.25 mmol) Kaliumbromid versetzt. Dann wurden bei 10°C über einen Zeitraum von 30 min eine Lösung aus 150 mg (2.375 mmol) Natriumnitrit in 1 ml Wasser zugetropft und der Ansatz 2 Ii bei 10-15°C gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 50 mL Ethylacetat ausgeschüttelt Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch präparative HPLC mirden 260 mg (48% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 1.03 min; MS (ESIneg): m/z - 295 und 297 (M-H)\
'H-NMR (400 MHz, CDC13): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.95 (t, 2H), 2.94 und 3.2 (2dd, 2H), 4.18 (t, 2H), 4.57 (t, 1H).
Intermediat L77
Trifluoressigsäure --N-[2-(2-arninoethoxy)ethyl]-2-bromacetamid (1 : 1)
Zunächst wurden 418 mg (2.05 mmol) tert-Butyl-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]carbamat mit 638 mg (2.46 mmol) Bromessigsäureanhydrid umgesetzt und anschließend die Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure entfernt. Man erhielt 551 mg (63 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode ): Rt - 0.32 min; MS (ESlpos): m z = 227 und 225 (M+H)+. Intermediat L78
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-beta-alanin
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)essigsäure durch Kupplung mit teri-Butyl-beta-alaninathydrochlorid (1 : 1) in Gegenwart von EDCI/HOBt und NN-Diisopropyletiiylamin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.32 min; MS (ESlpos): m/z = 227 (M+H)+. Intermediat L79
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pynOl-l-yl)hexanoyl]-beta-alanin
64.8 mg (0.357 mmol) ieri-Butyl-beta-alaninathydrochlorid (1 :1) und 100 mg (0.324 mmol) l - {6- [(2,5~Dioxopyrrolidin-l~y3)oxyl-6-oxohexyi}-lH-pyrrol~2,5-dion wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und mit 65.6 mg (0.649 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mUmia, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 84.5 mg (77%, Reinheit 100%) ieri-Butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di ydro- lH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-bela- alaninat.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.78 min; MS (ESlpos): m/z - 339 (M+H)+.
Zu einer Lösung von /eri-Butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)hexanoyl]-beta- alaninat (82.8 mg, 0.244 mmol) in 8 ml dichlormethan wurde 1.62 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 62.7 mg (87%, Reinheit 95%) der Tite Iverbindung .
LC-MS (Methode 1): R, - 0.75 min; MS (ESlpos): m/z - 283 (M+H)+. 2-(Trimethylsilyl)ethyI-3-[(l 5-airiino-4,7,l 0, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oy !)amino]-N-(tert- butoxycarbonyl)-D-alaninat
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem 3- {[(Benzyloxy)carbonyl] amino}-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanin --N-cyclohexylcyclohexanamin (1 : 1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Freisetzung aus dem Salz und Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCT/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlicher 3-Oxo- 1 -phenyl-2,7, 10,13,16-pentaoxa-4-azanonadecan- 19-säure in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und erneute hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.70 min; MS (ESIpos): m/z = 552 (M+H)+. Intermediat L81
Triöuoressigsäure -benzyl- {2-[(2-aminoethyl)sulfonyl]ethyl } carbamat (1 : 1)
250 mg (1.3 1 mmol) 2,2'-Sulfonyldiethanamin wurden mit 92.3 mg (0.37 mmol) 1 - {[(Benzyloxy)carbonyl] oxy) pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von , N-Diisopropylethylamin in DMF gekuppelt. Nach anschließender HPLC Reinigung wurden 70 mg (47% d. Th.) der Titelverbindung erha lten. LC-MS (Methode 12): Rt - 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 257.1 1 (M+H)+.
Triflsioressigsäiire - {2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}- - vl)hexanamid (1 : 1 )
NH
88.6 mg (0.357 mmol) N-Boc-2,2'-(ethylenedioxy)diethylarnine und 1 00 mg (0.324 mmol) N- Succinimidyl 6-maleimidohexanoate wurden in 4.0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.071 L (0.650 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 75 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 127 mg (81 % d. Th) tert-Butyt- {2-[2-(2- {[6-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]amino}et?ioxy)et?ioxy]et?iyl}carbamat.
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.78 min; MS (ESTpos): m/z - 442 (M+H)4,
Zu einer Lösung von 123 mg (225 μπιοΐ) tert-Butyl- {2-[2-(2- {[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)hexanoyl]amino}ethoxy)ethoxy]ethyl} carbamat in 7.5 ml dichlormethan wurde 2.0 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 1 1 1 mg (100% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.31 min; MS (ESIpos): m z - 342 (M+H .
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.04 (m, 2H), 2.98 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.39 (m, 4H), 3,56 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.72 (bs, 3H), 7.80 (m, 1 H).
Intermediat L83
Trifluoressigsäure N- {2-[2-(2-aminoeihoxy)ethoxy]ethyl} -2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)acetamid (1 : 1)
200 mg (0.805 mmol) tert-Butyl-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl} carbamat, 150 mg (0.966 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)essigsä re und 560 μί (3.2 mmol) N,N~ Diisopropylethylamin wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 459 mg (1,21 mmol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichloromethan gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 5 iger Citronensäure-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, DischlorornethamMethanol 98:2). Man erhielt 276 mg (89 % d. Th) tert-Butyl- {2-[2-(2- { [(2,5 -dioxo-2,5 -dihydro- lH-pyrrol- 1■
yl)acetyl]aniino}ethoxy)ethoxy]ethyl}carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.67 min; MS (ESI os): m/z - 386 (M+H .
Zu einer Lösung von tert-Butyl- {2-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]ethyl} ca.rbamat (2,75 mg, 714 μιηοΐ) in 15 ml diclilormethan wurde 4 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 281 mg (99% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): , = 0.1 7 min; MS (ESTpos): m/z - 286 (M+H)+.
Intgrmedjat_L84
Trifluoress 2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -y l
200 mg (0.594 mmol) tert-Butyl-(14-amiao-3,6,9,12-tetraoxatetradec- l-yl)carbamat und 202 mg (0.654 mmol) l-{6-[(2,5-ESoxopyiTolidin-i -yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH^yrrol-2,5-dion wurden in 4.0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.130 mL (1.2 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmisehung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.085 ml (1.5 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 275 mg (73% d. Th) tert-Butyl-[2i -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -y 1)- ί 6-oxo-3,6,9, 12-tetraoxa- 15- azahenicos- 1 -yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.81 min; MS (ESI os): m/z - 530 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl-[21 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-py!Toi- 1 -yl)-l 6-oxo-3,6,9,12- tetraoxa-15-azahenicos- i -yl]carbamat (268 mg, 505 μηιοΐ) in 5.0 ml dichlormethan wurde 780 μΐ (10 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 266 mg (97% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.46 min; MS (ESIpos): m/z - 430 (M+H)+.
Ί-ί-NMR. (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.03 (m, 2H), 2.99 (m, 2H), 3.18 (m, 21 1 ). 3.38 i m. 41 I i. 3,52 (m, 8H), 3,58 (m, 6H), 7.01 (s, 21 1 i. 7.73 (bs, 31 1 i. 7.80 (m, 1H).
Trifluoressigsäure N-(14-amino-3, 6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : 1)
200 mg (0.594 mmol) tert-Butyl-(14-annrio-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)carbamat, I I I mg (0.713 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yi)essigsäure und 410 μί (2.4 mmol) N,N- Diisopropylethylamin wurden in 6 ml Dimethylformamid gelöst und mit 339 mg (0.892 mmol) HA TU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; ΙΟμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 130 mg (43% d. Th) tert-But l-[17-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l -yi)-16-oxo- 3,6,9,12-tetraoxa- 15-azaheptadec- 1 -yijcarbamat.
LC-MS (Methode 1): R* = 0.71 min; MS (ESIpos): m z = 474 (M+H)+.
Zu einer Lösung tert-Butyl-[ 17-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)-16-oxo-3,6,9,12-tetraoxa- 15 -azaheptadec-1 -yijcarbamat (126 mg, 267 μηιοί) in 4.0 ml Dichlormethan wurde 410 μΐ (5.3 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 124 mg (95% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 13): Rt - 0.74 min; MS (ESIpos): m/z - 374 (M+H)+.
I i- N MR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 2.99 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3,53 (m, 8H), 3,58 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 7.09 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 8.21 (m, 1H).
Intermediat L86
N -[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyiTol-l -yl)acetylj-L-valyl-L-alanin
100 mg (0.531 mmol) L-Valyl-L-alanin und 134 mg (0.531 mmol) 1 - {2-[(2,5-Dioxopyrrolidin- 1 - yl)oxyj-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.150 mL (1.1 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischimg wurde 8 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 71.5 mg (43 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, - 0.42 min; MS (ESIpos): m/z - 326 (M+H +.
IntgQnedjat_L87
3-[2-(2- {[(2,5-Dioxo-2,5-dihydiO-lH-pynOl- l-yl)acetyl]amino} ethoxy)ethoxy]propansäure
250 mg (1.07 mmol) tert-But l-3-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]propanoat, 151 mg (0.974 mmol) 2- (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)acetic acid, 224 mg (1.46 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol Hydrat und 224 mg (3 .37 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochiorid wurden in 5.0 ml Dimethylfonnamid gelöst. Die Reaktionsmischung wurde I Ii bei T gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylacetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung und mit ges. Naliiumhydrogencarbonat-Lösung extrarlierl. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen,, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säuie: Reprosil 250x40; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 267 mg (64% d: Th) tert-Bulyl-3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-diliydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoat
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.73 min; MS (ESIpos): m/z - 371 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl-3-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTo]-l - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoat (263 mg, 710 μηιοί) in 10 ml dichlormethan wurde 1.1 ml (14 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 240 mg (94% d: Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 0.57 min; MS (ESIpos): m/z - 315 (M+H)+.
Intermedia! L88
2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alaninat
150 mg (0.797 mmol) L-Valyl-L-alanin und 246 mg (0.797 mmol) l- {6-[(2,5-DioxopyiTolidin-l - yl)oxy]-6-oxoh.exyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 4.0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.220 mL (1.6 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 ruL/min, MeCNAV asser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 302 mg (97 % d. Th.) N-[6-(2,5 -Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanin.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.02 min; MS (ESIpos): m/z - 382 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 0.82 (dd, 6H), 1.17 (m, 2H), 1.27 (d, 3H), 1.48 (m, 4H), 1 .94 ( , 1 H), 2.33 (m, 2H), 3.38 (t, 2H), 4.17 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 7.75 (d, 1 H), 8.19 (d, 3 H).
130 mg (0.531 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5^ü ydr( iH-pyrrol-l-yl)liexanoyi]-L-valyl-L-aianin wurden in 6.5 ml Dichloromethan gelöst und mit 58.8 mg (0.511 mmol) l-Hydroxypyrrolidin-2,5- dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l -(3-Dimethyiaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid versetzt. 58.8 mg (0.511 mmol) l-Hydroxypyrrolidin-2,5-dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l -(3- Dimethylamiriopropyl)-3-etliylcarbodiimidhiydrochlorid wurden nocheinmal zugegeben. Der Ansatz wurde mit Dichloromethan versetzt une dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 172 mg (87 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 12): R - 1.28 mm; MS (ESIpos): m z - 479 · Vi - I i ) .
Intermediat L89 l-Benzyl-5-[2-(lTnnethylsilyl)ethy3]-L-glutainathydrochlorid (1 : 1) 1.00 g (2.96 mmol) (4S)-5-(Benzyioxy)-4-[(teri-butoxycarbonyl)amino]-5-oxopentansäure wurden in 13.0 ml THF vorgelegt und mit 510 μΐ (3.6 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethanol und 109 mg ( 889 μηιοΐ)
4-Dimethylaminopyridin versetzt. Die Reactionmischung wurde auf 0°C gekühlt und mit 682 mg (3.56 mmol) N-Ethyl-N!-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid hydroehlorid versetzt. Die Reactiormiischung wurde über Nacht bei RT geröhrt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 0. IN HCl-Lösung und ges. Natriumchlorid-Lösunggewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isoiera gereinigt (Kieseigel, Säule 25 g SNAP, Cyclohexan:Ethylacetat 80:20), Man erhielt 649 mg (50 % d. Th) der Verbindung l -Benzyl-5-[2-(trimethylsilyi)ethyl]-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-glutamat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 4.6 min; MS (ESlpos): m/z - 438 (Μ+Η .
649 mg (1.48 mmol) l-Benzyl-5-[2-(1ximetiiylsilyl)etliyi]-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-glutamat wurden in 7.0 ml Dioxan gelöst und unter Eisbadkühlung wurden 14 ml (59 mmol) 4N HCl in Dioxan dazugegeben. Die Reactionmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet und mittels Biotage isoiera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, Dischloromethan:Methanol 90: 10). Man erhielt 320 mg (57 % d. Th) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.79 min; MS (ESlpos): m/z - 338 (M+H)+.
Intermedia* L90
1 -( {N-[(Benzyloxy)carbony!]glycyl} amino)-3,6,9, 12-tetraoxapentadeean-l 5-säure H
118 mg (566 μιτιοΐ) N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycin wurden in 5.0 ml DMF vorgelegt, mit 200 mg (622 μηιοΐ) tert-Butyl-l-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat, 130 mg (849 μηιοΐ) 1- Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat und 130 mg (679 μηιοΐ) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid versetzt und 1 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylacetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung und mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung extrartiert. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen und. über Magnesiums ulfai getrocknet. Die Lösemittel mirden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 274 mg (95% d. Th) tert-Butyl-l -( {N- [(benzyloxy)carbonyl]giycyi } amino)-3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.69 min; MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H)\
Zu einer Lösung von 274 mg (535 μmol)tert-But}d- l -ί{ -[(henzyloxy)carho yl]glycyl}ami o)- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat in 5.0 ml dichlormethan wurde 820 μΐ (1 1 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 262 mg (100% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.12 mm; MS (ESIpos): m/z - 457 · Vi - I i ) . Intermediat L91
Trifluoressigsäure
3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher 3-Oxo- I -phenyl-2,7, 1 0, 13,16- pentaoxa-4-azanonadeean-19-säure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-Trimethylsiiyletha.nol mittels EDCI/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlichem N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-{[(9H-fluoren-9-yimethoxy) carbonyljamino) -D-alanin und Abspaltung der Fmoc -Schutzgruppe) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 552 (M+H)+.
N (Benzyloxy carbonyl]-L-valyl-L-alanin
Dieses Intermediat wurde ausgehend von IN - [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valin und tert-Butyä-L- alaninathydrochlorid (1 :1) mit klassischen Methoden der Peptidciiemie hergestellt,
LC-MS (Methode 12): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 323.16 (M+H)+.
Intermediat L96
N-Acetyl-L-valyl-N5-cai"bamovl-L-ornithinamid
Dieses Intermediat wurde nach klassischen Methoden der Peptidciiemie hergestellt beginnend mit der Kupplung von 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-I>-va3inat mit N5- Carbamoyl-L-ornithin, dann folgender hydrogenolytischer Abspaltlung der Z-Schutzgruppe über 10% Palladium/ Aktivkohle in Ethanol und schließlich durch Umsetzung des erhaltenen Dipeptids mit 1 -Acetoxypyrrolidin-2,5-dion.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.25 min; MS (ESIpos): m/z - 317 (M+H)+. InterjnedM L97
3 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-2-oxo-6,9, 12,15,3 8,21 ,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-
30-säure
Tert-Butyl-l -airimo-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxahepiacosan-27-oat (100 mg, 201 μιηοΐ) wurde in 3 .0 ml DMF vorgelegt und mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-i H-pyrroi-l-y3)essigsäuxe (46,8 mg, 301 μηιοί), 1 -Hydroxy-1 H-benzofriazol Hydrat (76.9 mg, 502 μπιοΐ) und 1 -(3-Dimetbylammopropyl)- 3-etbylearbodiimidbydrochlorid (77.0 mg, 402 μ/moi) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit Ethylacetat versetzt. Die organische Phase wurde zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung, mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und dann mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 19.1 mg (13% d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2-oxo- 6,9,12,15,18,21,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-oat.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.87 min; MS (ESlpos): m/z = 635 [M+H]+
Zu einer Lösung von tert-Buty]-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-2-oxo-
6,9,12, 35,18,21 ,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-oat (19.1 mg, 30.3 μπιοΐ) in 1.0 ml DCM wurde
TFA (62 μΐ, 600 μιηοΐ) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3h bei RT gerührt. Die
Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt.
Man erhielt 10.8 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.55 min; MS (ESIneg): m/z - 577 [M-H]\ Intermediat L98
2,2-Dimeihylpropansäirre--2-(trimeihylsilyl)ethyi-N
ethoxyjearhonyl} -L-glutaminat (1 : 1)
Zunächst wurde (4S)-5-tert-Butoxy-4-[(tert-butoxy arbonyl)airiino]-5-oxopentansäure in Gegenwart von HATU und N.N-Diisopropylethylamin mit Benzyl-(2-aminoethyl)carbamat gekuppelt. Anschließend wurden mittels Trifluoressigsäure in DCM die Boc-Schutzgruppe sowie der tert.-Butylester abgespalten. Dann wurde zunächst die Aminogruppe durch Umsetzung mit 1 - ({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi}oxy)pyrrolidin-2,5-dion in DMF/'Wasser in Gegenwart von N,N-Diisopropyiethylamin und anschließend die Carboxygruppe durch Umsetzung mit 2- (Trimethylsilyl)ethanol in DCM in Gegenwart von EDCI /DMAP erneut geschützt. Im letzten Schritt erfolgte die Entschützung der terminalen Aminogruppe mittels Hydrogenoiyse über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unier Normaldruck. Nach Abfiltrieren des Katalysators, Einengen, Reinigung durch präparalive HPLC und Gefrierirocknung des Rückstandes aus Aceioniiril/W asser wurde die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 434 (M+H)+.
Intermediat L99
Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydr< lH-pynOi-l -yl)acetyl]-L- valyl-L-alanyl-beta-alanyl-L-lysinat (1 : 1)
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butox earbonyl)-L-iysir! nach klassischen Methoden der Peptidchemie 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N6-(tert-butoxycarbonyi)-L- lysinat hergestellt. Dieses Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropyl- ethylamin mit dem nach Standardmethoden hergestellten Tripeptidbaustein N-[(Benzyloxy) carbonyl]-L-valyl-L-aianyi-beta-alanin gekuppelt. Die Z-Schutzgruppe wurde anschließend durch Hydrogenolyse in Methanol entfernt und das erhaltene Intermediat mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 - l)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylarnin gekuppelt. Im letzten Schritt erfolgte die Entschützung der Seitenkettenaminogruppe unter schonenden Bedingungen durch ih Rühren in 10%iger Trifiuoressigsäure in DCM bei RT. Nach Einengen und Gefriertrocknung aus Acetonitril/Wasser wurde die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.64 min; MS (ESIpos): m/z - 625 (M+H)+.
Intermediat LIPO
Zu einer Lösung von Methyi-3-cyanpropanoat Lösung (500 mg, 4.42 mmol) in 40 ml Ethanol wurden 461 mg (6.60 mmol) Hydroxylaminehydrochlorid und 1341.86 mg ( 13.26 mmol) Triethylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 50 °C 3h gerührt. Das Gemischt wurde eingeengt und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und anschließend mit Wasser und Brine gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 400 mg (62% d. Th) der Titelverbindung.
Zu einer Lösung von Methyl-(4E)-4- {[N-(tert-butoxycarboriyl)-beta-alanyl]amino}-4- (hydroxyimino)butanoat (4.85 g, 33.19 mmol) in 120.0 ml ml Dioxan wurde 6.91 g (36.50 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin und 8.22 g (39.82 mmol) 1,3-Dicycloxexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3h gerührt. Das Gemisch wurde eingeengt und der Rückstand wurde in Wasser gelöst und mit Ethylacetat extrahiert. Die organisch Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeent. Der Rückstand wurde mittels Flash- Chromatographie. Man erhielt 6.0 g (57% d.Th) der Titelverbindung.
Eine Lösung von Methyl-(4E)-4- {[N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alanyl]amino} -4- (hydroxyimino)butanoat ( 6.0g, 18.91 mmol) in 100 ml DMF wurde 5h bei 120 °C gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser versetzt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 4 g (71% d. Th.) der Titel Verbindung.
Zur eine Lösung von 3~(5- {2~[(tert-Butoxycarbonyl)aminolethyl}- 3 ,2,4-oxadiazol-3~ yl)propansäure ( 2.0 g, 7.01 mmol) in 30 ml Dichlorrnethan wurden 2.96 g (25.96 mmoi) Trifluoressigsäure zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch, wurde mit Wasser versetzt und extrahiert mit Dichlorrnethan. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne weitere reinigung eingesetzt. Man erhielt 1.50 g (72% d. Th.) der Titel Verbindung.
Zur eine Lösung von 3-[5-(2-Arninoethyl)-l»2,4-oxadiazol-3-yl]propansäure ( 1.5 g, 5.01 mmol) in 25 ml DMF wurden 1.30 g (5.52 mmol) l-[2-(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]-lH-pyrrol- 2,5-dion und 1.52 g (15,04 mmol) Triethylmin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde lh bei rt gerührt. Das Geniisch wurde mit Wasser versetzt und extrahiert mit Dichlorrnethan. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 774 m g (47% d. Th.) der Titel Verbindung.
Ή-NMR (300 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 2.67 (t, 2H), 2.91 (t, 2H), 3.03 (t, 2H), 3.46 (q, 2H), 4.28 (s, 2H), 7.01 (s, 2H), 8.37 (t, 1H), 32.28 (bs, Iii).
Intermediat L123
Tert-Buryl-[l-fiuor-4-oxobutan-2- l]carbamat
Unter Argon wurde Ethyl-3-[(teri-butoxycarbonyl)amino]-4-fluorbi!tanoat (150 mg, 602 μηιοΐ) (Synth. Com., 1985, 15(5), 377) in 12.0 ml DCM vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde auf - 78°C abgekühlt, mit Diisobutylaluminiumhydrid I M in Totuol (1.2 ml, 1.0 M, 1.2 mmol) versetzt und 2 Stunde nachgerührt. Der Ansatz wurde vorsichtig mit Methanol gequencht, 10min. nachgerührt und mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde dreimal mit ges. aliutimatriumtartrat-LösuDg extraliiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 86.1 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
I N M R (400 MHz, DMSO-dü) δ [ppm]: 1 .37 (s, 9H), 2.58 (m, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.31 (dd, 2H), 7.05 (d, 3 H), 9.60 (s, I M )
Intermediat LI 24
Tert-Butyl-N-{(2R)-2-amino-3-oxo-3-[2-(trimeti^^
L-asparaginat
4.0 g (13.8 mmol) Boc-Asp-OtBu und 1.8 g (15.2 mmol) N-hydroxysuccmimid wurden in 100 rnL Ethyl Acetate geiöst und bei 0°C mit 3.1 g (15.2 mmol) 1 , 3 -Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei 0°C geröhrt und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann filtriert und im Vakuum verdampft. Man erhielt 4.1 g (77 % d. Th.) der Verbindung 1 -tert-Butyl-4-(2,5-dioxopyrrolidii!- 1 -yl)-N-(tert-butoxyearbonyl)-L-aspartat. 3-Amino-N-[(berizyloxy)carbonyl]-D-aiania (2.53 g, 10.6 mmol) wurde in 30 rnL DMF gelöst und mit N,N-Diisopropy3ethylamin (2.74 g, 21.2 mmol) und 1 -tert-Buiyl-4-(2,5-dioxopyrrolidin- ί -yl)- N-(tert-butoxycarbonyl)-L-aspartat (4.10 g, 10.6 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und im Vakuum verdampft. Man erhielt 4.9 g (90 % d. Th.) der Verbindung (2R)-2- {[(Benzyloxy)carbonyl]amino} -3-({(3S)-4-tert-butoxy-3-[(tert- butoxycarbonyl)ammo]-4-oxobutanoyl}amino)propansäure.
(2R)-2Hl(Benzyloxy)carbonyljarnino} -3- oxobutanoyi} amino)propansäure (4.90 g, 9.62 mmol) wurde in 100 ml of Acetonitril gelöst und mit Pyridin (1.6 ml, 19 mmol), 2-(Trimethylsilyl)ethanol (1.7 ml, 12 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (2.38 g, 11.5 mmol) bei RT versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 0°C geröhrt und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.9 g (66 % d. Th.) der Verbindung tert-Bu1yl-N-{(2R)-2- {[(benzyloxy)carbonyl]ainino}-3-oxo-3-[2-(triinethylsilyl)ethox ]p
butoxycarbonyl)-L-asparaginat.
Tert-But l-N- {(2R)-2- - N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat (3.80 g, 6.23 mmol) wurde in 120 ml Methanol gelöst und mit 380 mg Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT mit Wasserstoff unier Normaldruck 2 Stunde hydriert und dann filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Man erhielt 2.9 g (84 % d. Th.) der Titel Verbindung
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d,,): δ [ppm] - 0.04 (s, 9H), 0.97 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.39 (s, 9H), 1.89 (bs, 2H), 2.43 (m, 1 H), 3.18 (m, 3H), 3.38 (m, 1H), 4.1 1 (m, 3H), 6.93 (d, 1.H), 7.91 (bt, 1 H)
Intermediat L125
Trifluoressigsäure --tert-butyl-N-(2-aminoethyl)-N -(biOmacetyl)-D-alpha-glutaminat (1 : 1)
Dieses intermediat wurde ausgehend von (2R)-2- {[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-5-tert-butoxy-5- oxopentansäure und tert-Rutyl (2-aminoethyl)carbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.49 min; MS (ESIpos): m z = 366 und 368 (M+H)+. Intermediat Fl 04
Trifluoressigsäure-(2S)-2-amino-4-[ {(iR)A-[l-henzyl -(2,5-öiüüQ^li -yi)A'tl-pyn^^ dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethyl)butanamid(l : i)
10 mg (0.014 mmol) von intermedia! C53 wurden in 3.3 mL DMF gelöst und mit 8.5 mg (0.027 mmol) von Intermediat LI sowie mit 7.8 mg (0.02 mmol) HATU und 12 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt. Der Ansatz wurde 15 min bei RT gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und nach Lyophilisation wurden 5.6 mg (38% d. Th.) der geschützten Zwischstufe erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.32 min; MS (ESIpos): m/z - 915 (M+H)+.
5.6 mg (0.006 mmol) dieses Intermediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 69 mg (0.61 mmol) l ,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Uliraschailbad behandelt. Anschließend wurden 35 μΐ Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 2.4 mg (48% d. Th.) der Titelverbindung erhal ten.
LC-MS (Methode 3 ): Rt - 0.84 min; MS (EIpos): m/z - 693 [M+H]+. HPLC (Methode 11): Rt - 1.91 min;
Alternativ wurde die Titelverbindung auch ausgehend von Intermediat C58 hergestellt. 15 mg (0.023 mmol) von Intermediat C58 wurden zunächst mit 1 1 mg (0.036 mmol) Intermediat LI in Gegenwart von 13 mg ( 0.034 mmol) HATU sowie 10 μί Ν,Ν-Diisopropylemylamin umgesetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 12.3 mg (63% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.3 min; MS (EIpos): m z - 837 [M+H]+.
Im zweiten Schritt wurde dieses Intermediat in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C geröhrt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) EthyIeridiamin- ,N,N',N'-tetraessigsäure sowie 2, mL einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisaiion des Rückstands aus Aceionitrii/W asser wurden 8.1 mg (68% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESlpos): m/z = 693 (M+H)+. Intermediat Fl 19
Trifluoressigsäiffe--(2S)-2-amino-4-[{(l^
dimethylpropyl} (g 1 : 1)
29 mg (0.044 mmol) von Intermediat C58 wurden in 3.4 L DMF aufgenommen und mit 36 mg (0.087 mmol) von Intermediat L52 sowie mit 25 mg (0.065 mmol) HA TU und 39 μΐ Ν,Ν- Düsopropylethylamin versetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparaiive HPLC gereinigt. Es wui'den 26.4 mg (73% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.34 min: MS (ESlpos): m/z - 820 und 822 (M+H)4.
Dieses Intermediat wurde in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.5 mg (0.048 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Dann wurden 13.9 mg (0.048 mmol) Ethylendiamm-N,N,N',N'-teiraessigsäure sowie 2 mL einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisaiion des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 14.4 mg (58% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.88 min; MS (ESlpos): m/z - 676 und 678 (M+H)4 Intermediat Fl 27
Trifluoressigsäure --(2S)-2-amino-4-( {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- i H-pyrrol-2-y] 1-2,2- dimeihyipropyl} [(2S)-2-meth^
yi)acetyl]amino } ethyl)butanamid (1 : 1 )
12 mg (0.035 mmol) von Intermediat C59 wurden in 2.4 mL DMF gelöst und mit 34.6 mg (0.046 mmol) von Intermediat LI sowie mit 6 mg (0.031 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodmnid-Hydrochlorid, 5.9 mg (0.039 mmol) 1-Hydroxy- lH-benzotriazol-Hydrat und 8 μΐ
NN-Diisopropyiethylamin versetzt. Nach 1 h Rüliren bei RT wu de eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. 11 mg (70% d. Th.) dieser Zwischenstufe wurden erhalten. LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 942 (M+H)+.
1 1 mg (0.01 1 mmol) dieses Intermediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 123 mg (1.1 mmol) l ,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurden 63 μί Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 2 mg (22% d. Th.) der Titelverbindung erhal ten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (EIpos): m/z = 721 [M+Hf.
HPLC (Methode 11): Rt - 1.95 min;
Intermediat Fl 53
Trifluoressigsäure --(2S)-2-amino-4-({(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difl^^henyl)- i H-pyrrol-2-yi]-2,2- diniethylpropyl} [(2S)-2-liy iroxypropanoy ]amino)-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-d
yl)acetyl]amino } ethyl)butanamid (1 : 1 )
Synthese erfolgte in Analogie zu Intermediat Fl 04 ausgehend von Intermediat C60.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.1 min; MS (ESIpos): m/z - 707 (M+H)\
]sP-( - {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)- 1 -[ l-benz l-4-(2,5-difluorplienyl)-lH-p rrol-2-yl3-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl^
pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} -L-lysin -trifluoressigsäure (1: 1)
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 14 mg (0.019 mmol) des intermediats C61 mit I S mg (0.021 mmol) von Intermediat L61 in Gegenwart von 8.7 rng (0.023 mmol) HATU sowie 17 μί Ν,Ν-Diisopropylethylarnin und anschließender Entschüizung mit Zinkchlorid in Trifluorethanoi wie in intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC mirden 1 3 mg (59% d. 'I i. über 2 Stufen) der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.86 min; MS (ESIpos): m z - 1076 (M+H)+. Intermediat F173
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-p^
[ {{ 1 R)- 1 -[ 1 -benz l-4-(2,5-difluorphenyl)- 1.H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)ammo] butanoyl} amino)ethyl]-L-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)
Die Titelverbindimg wurde ausgehend von 15 rng (0.018 mmol) Intemiediat C64 durch Kupplung mit 12 mg (0.02 mmol) von Intermediat L63 in Gegenwart von 7.7 mg ( 0.02 mmol) HATU sowie 16 μΐ N,N-Diisopropy!ethy!amin und anschließender Entschützung mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fi 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 12 mg (58% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (EIpos): m/z - 1048 [M+H]+.
IntennedJfcjtJ 78
Trifluoressigsäure--(lR,2S)-2-({(2S)-2-amino-4-[ {(lR)-i-[i-benzyl-4-(2^
pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]butanoyl } amiDo)-N- {2-[(bromacetyl)amii!o] ethyl} cyclopentancarboxamid (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde in Anlogie zu Intermediat Fl 77 hergestellt, wobei an Stelle von Intermediat Li das Intermediat L52 eingesetzt wurde.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min; MS (EIpos): m/z - 787 und 789 ί \·Μ 11 . Intermediat F180
N 2-({(2S)-2-Ammo-4-[{(lRH-[1 3enzyM^
dimethylpropyl} (giycoioyl)aminojbutanoyl} amino)ethyl]-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acet l]-L-glutamin -trifluoressigsäure (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 9.6 mg (0.012 mmol) Intermediat C64 mit 5 mg (0.013 mmoi) von Intermediat L64 in Gegenwart von 7 mg ( 0.018 mmol) HATU sowie 6 μί Ν,Ν- DiisopropylethylamiD und anschließender Entschützung mittels Zinkc lorid in Trifluorethanol wie in Iniermediat F I 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.1 mg (28% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.85 min; MS (EIpos): m/z = 822 [M+Hf .
Intermediat Fl 92
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( l R)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo hen l)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyi} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- i - yl)acetyl]amino} -L-
60mg (0.091 mmol) von Intermediat C58 wurden in 8 ml DMF aufgenommen und mit 45 mg (0.100 mmol) von Intermediat L65 in Gegenwart von 42 mg (0.11 mmol) HAU! und 64 μ.1. Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 10 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 45 min lang bei RT unter Wasserstoff -Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril Wasser 1: 1 wurden 24.5 mg (31% d.Th. über 2 Stufen) von 2- (Trimeüiylsilyl)ethyl-3-amino-N-[(2S)-4-[ { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzy l-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2- ylj-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amm^
butanoylj-L-alaninat erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.17 min; MS (EIpos): m/z = 844 [M+H]+.
Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 2 mg (0.013 mmol) von kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l■ yl)essigsäure Intermediat in Gegenwart von 5.4 mg ( 0.014 mmol) HATU sowie 8 μί Ν,Ν- Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.5 mg (33%o d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): R, - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 737 (M+H)+. Intermediat F193
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 3 H-pyrro]-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l .H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]ammo}- -alanin -trifluoressigsättre (1:1)
Die Synthese der Titelverhindung erfolgte in Analogie zu Intennediat F192 ausgehend von 3- {[(Benzyloxy)carboriyi]aniino} -N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanm - N-cyelohexylcyclohexanamine (1 : 1).
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z - 737 (M+H)+. Intermediat F194
N- {5-[(2,5-Dioxopyiroüdm-l-yl)ox
diüuor henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]propyl} -L-alaninamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und ,N--Diisopropyiethyiamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutegruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch. Umsetzung mit i,r-[(l,5-Dioxopentan-l,5- diyl)bis(oxy)] dipyrrolidin-2,5 -dion in die Titelverbindung überfuhrt.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.19 min; MS (ESIpos): m/z = 851 [M+H]+. Intermediat F2Ö7
N6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)- i -[ 3 -hen^
dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]butanoyl } -beta-alanyl)-N2- {N- [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- l H- pyrrol- 1 -yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl}-L-lysin -trifluoressigsäure (1: 1)
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat F155 hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 1020 (M+H)+. Intermediat F216
S- {?.,- [(3-Aminopropyl) {(1R)- 1 - [1 -benzyl-4-(2,5-diflu^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } amino] -2 - oxoethyl } -N- [ 19 - (2, ,5 -dioxo-2,5 -diliydro- lH-pyiTol- l -yl)-17-oxo- 4,7,10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oylj-L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1: 1)
Unter Argon wurden 30,2 mg (0.06 mmol) N,N'-Bis[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystin in 2,0 mL Wasser und 2.0 mL wo-Propanol vorgelegt und mit 56.7 mg (0.20 mmol) TCEP versetzt. Die Reaktionsmiscliung wurde 30 min bei RT gerührt. Es wurden dann 50.0 mg (0.08 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl- {3 {(1RH
dimethylpropyl}(chloracet l)amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 2.0 mL iso- Propanol und 122.2 mg (0.48 mmol) l ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmiscliung wurde 7 Ii bei 50 °C gerührt. Dann wurden nochmals 122.2 mg (0.48 mmol) l ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Etbylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lsg. extrahiert und mit ges. NaCl-Lsg. gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.1 mg (64 % d. Th.) der Verbindung S-(l 1 - {(lRH i-Benzyl-4-(2,5-difluorohenyl)-iH^
dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z - 851 (M+H)+.
16.5 mg (0.05 mmol) 4-Methylbenzolsulfonsäure-benzyl-beta-alaninat (1 : 1) wurden zusammen mit 14.0 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 1.5 mL Acetonitril vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde 3 min bei RT gerührt und dann wurden 30.8 mg (0.04 mmol) S-(l l- {(i R)-i-[l-Benzyl-4-(2,5-difi^^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,i 1 -diaza-2-siiatridecan- 13-yi)-N-[(benzyloxy)carbonyi]-L-cystein gelöst in 1.5 mL Acetonitril, 23.4 mg (0.18 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 29.9 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Efhylacetat) zugegeben. Die eaktionsmisc uDg wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; ίθμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Benzyl-S-(1 1- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5 -difluo he yl) H ylτol-2-yl]-2,2-dimeth lpropyl} -2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l l^iiaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyi]i-cystemyl-beta-alaninat wurde als Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.59 min; MS (ESIpos): m/z - 1012 (M+H)+.
43.8 mg (43.3 μηιοΐ) Benzyl-S-(1 l-{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethytpropyl} ~2,2~dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silairidecan- 13-yl)-N- [(benzyloxy)carbonylj-L-cysteinyl-beta-alaninat wurden in 8.0 mL Ethanol gelöst, mit 4.4 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt und bei RT und Normaldruck über Nacht hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen wurde mit einem Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde noch zweimal wie soeben beschrieben behandelt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 14.5 mg (37 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH- pyiTol-2-ylj-2,2-dmiethylpropy
L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1: 1).
LC-MS (Methode 1): R, - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 788 (M+H)+.
14.5 mg (16.1 μιηοΐ) S-(l l- {(lR)-l- l-Be z l-4-(2,5-dlfluo llellyl)-lH-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethyipropy!} -2,2-dimethyl~6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-L-cy steinyl-beta- alanin-trifluoressigsäure (1: 1) wurden zusammen mit 9.1 mg (17.7 μηαοΐ) 3-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-N- { 1 5-1(2,5 -dioxopyrrolidin- 1 -y])oxy]- 15 -oxo-3 ,6,9, 12-tetraoxapentadec- l-yl}propanamid in 1 .0 mL DMF vorgelegt und mit 4.9 mg (48.2 μτηοΐ) 4-Mefhylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 3.4 mg (0.06 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30: ί θμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.9 mg (50 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(iR)-l-[l-Benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}
alanm-trifluoressigsäure (1 : 1). LC-MS (Methode 1): Rt - 1.28 min; MS (ESIpos): m/z - 1 186 (M+H)+.
14.1 mg ( 1 1.9 μϊϊ-οί) S-(l l- {(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5-difluo hen l)-lH-p lrol-2-yl]-2,2- dmethylpropy!} -2,2-dimethyl-6,I2-^^
dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa-16-azanonadecan- 1 -oyi]-L- cysieinyl-beta-alanin-frifluoressigsäure (1 : 1) wurden in 1.5 mL Trifluorethanoi gelöst und mit 9.7 mg (71.3 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 mg (71.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid zugegeben und die Reakiionsmischung röhrte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 rng (71.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 70 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 20.8 mg (0.07 mmol) Ethylendiamin- jlS^N'jN'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 6.2 mg (44 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 0.82 min; MS (ESTpos): m/z - 1042 (M+H)+.
Intermediat F239
S-{2-[(3-Aminopn^l) {(lR)-l-[l-b^^
dimethylpropyl } amino] -2-oxoethyl} -N-[(2,5-dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - l)acetyl] -L-cystein - trifluoressigsäure (1 : 1)
Unter Argon wurden 7.5 mg (0.05 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 7.5 mg (0.05 mmol) HOBt, 15.5 mg (0.05 mmol) TBTU und 6.2 mg (0.05 mmol) N,N-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. Es wurden dann 40.0 mg (0.05 mmol) S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)- L-cystein-trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat C71 ) gelöst in 1.5 mL DMF und 18.7 mg (0.14 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1.2 mg (25 % d. Th,) der Verbindung S-( l 1- {(1 )-1
2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-
pyrrol- 1 -yl)acetyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.37 min; MS (ESIpos): m/z - 854 (M+H)+.
10.9 mg (12.8 μηιοί) S-(l l- {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethytpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[(2,5-dioxo- 2,5-dih.ydro- lH-pyrrol- 1 -yl)acetyt]-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 10.4 mg (76.6 urnol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmiscliung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 22.4 mg (0.08 mmol) Ethylendiamin-N,N,N!,N!-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 7.5 mg (65 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.92 min; MS (ESIpos): m/z - 710 (M+H)+.
Intermediat F240
Trifluoressigsäure--3-({2-[(3-aminopropy
yl]-2,2-dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl } sulfanyl)-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino}ethyl)propanamid ( 1 : 1)
27.5 mg (0.04 mmol) l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-diflu^^
dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-^^
(intermediat C69) wurden zusammen mit 15,9 mg (0.05 mmol) Trifluoressigsäure ~ -(2- aminoetlwl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l- /l)acetamid (1 : 1) (Intermediat Li) in 1.8 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 32.4 mg (0.31 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 32.4 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Ethylaeetat) zugetropft. Die Reaktionsmiscliung wurde über Nacht bei RT gerühr Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1.9 mg (35 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsiiyl)ethyl-[ 13-{(iR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1H- pyrroi-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}- 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrroi-l-yl)-2,7, 12-trioxo-l 0-thia- 3,6, 13 -triazahexadecan- 16-yl]carbamat
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.39 min; MS (ESIpos): m/z - 881 (M+H)4'.
11.9 mg (0.01 mol) 2-(Trime&yisiiyl)e l-[13- {(lR) ^
pyrrol-2-yl]-2,2 limethylpropyl} -l-(2,5-dio^
3,6, 13-triazahexadecan- 16-yl]carbamat wurden in 1.0 mL Trifluorethanot gelöst und mit 5.5 mg (0.04 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 1.8 mg (0.04 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/miri, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.4 mg (60 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.75 min; MS (ESIpos): m/z - 737 (M+H)+.
Intermcdiat F241
Trifluoressigsäure ~(2S)-2-amino-4-[ {(1 )- 1 -[ 1
dimethyipr (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde aus Intermediat C66 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem 1 - (2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion und anschließender Debiockienmg mit Zinkclorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.84 min; MS (EIpos): m/z = 733 und 735 [M+H]\ Intermediat F242
Trifluoressigsäure --(2S)-2-amino-4-[ {(1 R)- 1 -[ 1 >εηζγ1· -(2,5-άϊΑυοφηεηγ1)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-(3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}propyl)butanamid (1 : 1)
Die Synthese der Titelverbindimg erfolgte in Analogie zu intemiediat Fl 04. LC-MS (Methode l ): Rt = 0.84 min; MS (ESTpos): m/z - 707 (M+H)4, Intermediat F243
Trifluoressigsäure— (2S)-2-amino-4- [{(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-[2-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino} ethoxy)ethyl]butanamid (1 : 1)
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intemiediat F242. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)4'. Trifluoressigsäure --N-{(2S)-2-ammo-4^{(lR) 1-berizyl-4-(2,5-^
2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]bu1yl } -N'-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- IH-pyrroi-I - y 1) ac ety 1 ] am in o } ethyl) suc ci n amid (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.0135 mmol) von Intermediat C65 mit 8 mg (0.027 mmol) von Intermediat LI in 8 ml DMF in Gegenwart von 15 mg ( 0.04 mmol) HATU sowie 9 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschuldung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fi 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparaiive HPLC wurden 8.8 mg (58% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 778 (M+H)4'.
Intermediat F247
Trifluoressigsäure -niethyl-4-[(2- {[2-( {(2S)-2-amino-4-[ {^^
lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amm
oxoethyl)amino]-2-brom-4-oxobutanoat (1 : 1)
14 mg (0.03 8 mmol) von Intermediat C66 wurden in 14 ml, DCM gelöst und mit 10.1 mg (0.037 mmol) 2-Brom- 1 -etliylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP) sowie portionsweise mit insgesamt 250 μΐ Pyridin versetzt, wobei der pH-Wert zwischen 5 und 6 gehalten wurde. Dann wurde mit Essigsäure ein pH-Wert von 4 eingestellt, der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Lyophilisation und Trocknung wurden 4 mg (21% d.Th.) der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend mit Zinkchlorid an der Aminofunktion entschützt wurde. Nach HPLC-Reinigung und Lyophilisation wurden 3 mg ( 72% d.Th.) der Titelverbindung als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 805 und 807(M+H)+.
Intermediat F248
Trifluoressigsäuie --(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l -[l -i)enzyi-4-(2,5-d^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N- {2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l.H-pyrrol- 1 - yl)ethoxy]ethyl} tanamid ( 1 : 1)
Die Titel Verbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.035 mmol) Intermediat C58 mit 5 mg (0.017 mmol) Intennediat L12 in Gegenwart von HATU und anschließende Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 6.5 mg (52% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 680 (M+H)4'. Trifluoressigsäure -methyl-(3S)-4-[(2- |[2-({(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-diQuor phenyl)-lH-pym i-2-yI]-2,2-dimethylpropyl} (glycolo /l)ainino]bu amino}-2- oxoethyl)ami -3-brom-4-oxobutanoat (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat 247 durch Kupplung von 15 mg (0.02 mmol) Intemiediat C66 mit 21 mg (0.099 mmol) (2S)-2-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure, die wie in (J.Org.Chem. 200, 65, 517-522) beschrieben aus (2S)-2-Amino-4-methoxy-4- oxobutansäurehydrochlorid (1 : 1 ) synthetisiert wurde, hergestellt.
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.89 min; MS (ESTpos): m/z - 805 und 807(M+H)4,
Intermedi tJ SS
R/S-(N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 3 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 3 3-tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyll-L-alpha-glutamyl-S- {2-[(3-aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluo:rphenyl)-l H- pynOl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl})- honiocystein-trifluoressigsäure (1 : 1)
13.1 mg (0.04 mmol) (2S)-5-(Benz loxy)-2-{[(beDz loxy)carbonyl]amino}-5-oxopentai!säure wurden in 3 .0 mL DMF vorgelegt und mit 5.4 mg (0.04 mmol) HOBt, 1 1.4 mg (0.04 mmol) TBTU und 4.6 mg (0.04 mmol) N,N-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 30.0 mg (0.04 mmol) R/S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- p rrol-2-yl]-2^-dimethylpropyl}-2,2-dimethyi-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- ί 3-yl)- homocystein-trifluoressigsäure(l: l) (Intermedia! Cl l) gelöst in 12.9 mg (0.1 mmol) N,N- Diisopropylethylamin und 1 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/mm, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel Wiarden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 32 mg (73 %) der Verbindung 4-[2-[[( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorophenyl)pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl- propyl]-[3-(2-trimethylsilylethoxycarbon^
benz} oxy-2-(benzy1oxycarbonylaniino)-5-oxo-pentanoy3]aniino]biHansäure.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.53 min; MS (ESTpos): m/z - 1084 (M+H)+.
41.4 mg (0.038 mmol) 4-[2-[[( i R)-1 i -benzy3~4-(2,5 iirluorophenyl)pyiTo3-2- piOpyl]-[3-(2-trimethylsilylethoxycarbonylamino)propyl]amino]-2-oxo-ethyl]sulfanyl-2-[[(2S)-5- benzy3oxy-2-(benzyloxycarbonyla:inino)-5-oxo-pentanoyl]ainino]butan wurde in 10 mL
Ethanol, mit 4.2 mg Pd/C versetzt und mit Normaldruck hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filierkuchen mit Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum ohne Erwärmen verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 21 .1 mg (56 %) der Verbindung R/S-(L-alpha-Glutamyl-S-(l 1 - {(lR)-l.-[l-benzyl-4-(2,5- cüfiuo^henyl)-lH-pyrrol-2-ylj-2,2-dim l -diaza-2- silatridecan- 13-yl))-horiiocystem -trifluoressigsäure (1 : 1 ).
LC-MS (Methode 1): R, - 1.11 min; MS (ESIpos): m/z - 860 (M+H)+.
20.4 mg (20.94 μηιοΐ) R/S-(L-aipha-Glutamyl-S-(l 1- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-m- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl))- homocystein -Irifluoressigsäure (1 : 1) wurden zusammen mit 11.8 mg (23.04 μηιοΐ) 3-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrroHdin-l -yl)oxy]- 15-oxo-3,6,9, 12- tetraoxapentadec-l-yl}propanamid in 1.0 mL DMF vorgelegt und mit 4.2 mg (41.88 μιηοΐ) 4- Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT geröhrt und dann mit 3.1 mg (0.05 mmol) Essigsäure versetzt. Die eaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mlv'min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (36 %) der Verbindung R S-(N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo- 4,7, 10, 13-tetraoxa- 1 6-azanonadecan- 3 -oyl]-L-alpha-glutamyl-S-(l 1 - {(1R)- 1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- lH-pyrrol-2 -yI]-2,2 -dimethylpropyi} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2- silatridecan- 13 -yl))-homocystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.66 min; MS (ESIpos): m/z - 1259 (M+H)+.
9.4 mg (7.47 μιηοΐ) R/S-(N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydiO-iH-pyrrol-l-yl)-17-oxo-4,7,10,13- tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L-alpha-glutamyl-S-( 11- {(1R)-1-[1 -benzy l-4-(2,5- dii]uo 3henyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2- silatridecan-13-yl))-homocystein wurden in 1.5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.1 mg (44.81 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.1 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 30 min geröhrt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt, mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; Ι Ομ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.9 mg (75 %) der Titelverbindung
LC-MS (Methode 1): R, - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 1 1 14 (M+H)+. Trifluoressigsäure -->^{(2S)-2-ammo-4 {(lR) 1-benzyl-4-(2,5 U^^
2,2-dimethylpropyl} (glycoloyt)aminojbutyl } -N'-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - y 1) ac ety 1 ] am in o } ethoxy) ethy 1] suc ci n amid (1 : 1)
Die Tiielverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.014 mmol) von Intermedial C65 und 9.6 mg (0.027 mmol) Trifluoressigsäure --N-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)acet amid (1 : 1) in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Tntermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 8 mg (64% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 822 (M+H)+. Intermediat F257
R- {2-[(3-Aminopropyl) {(1R)- 1 -[ 1 -benzyM-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2^- dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl}-N-[18-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi- 1 -yl)- 17-oxo- 4,7, 10, 13-tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein- trifluoressigsäure (1 : 1)
50.0 mg (0.06 mmol) R-(l 1- {(1Κ)-1-[1-Ββηζγ1-4-(2,5-<3ΐΠαο 1ιβηγ1)-1Η-ργπ·οί-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dirnethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yi)-L-cy stein- trifluoressigsäure (1 : 1) (Inlermediat C71) und 29 mg (0.07 mmol) 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5- dioxopyrrol- 1 -yl)acelyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propansäure (Intermediat L74) wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 27.3 mg (0.07 mmol) HATU und 23.3 mg (0.18 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 17.4 mg (26 %) der Verbindung R-(l l-
dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[ 18-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-l-yl)- 17- oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 - oyi]-L-cystein.
LC-MS (Methode 6): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 1 101 (M+H)+.
17 mg (0.02 mmol) R-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[ 18-(2,5- dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yi)-l 7-oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.3 mg (0.05 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmisehung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.5 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min geröhrt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 325x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.6 mg (46 %) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 957 (M+H)+. Intermediat F258
Trifluoressigsäure --(2S)~2-amino-4-[ {(lR)-l~[l ~benzyl-4~^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-[3-({2-[(bromacetyl)amino]ethyl} ammo)-3- oxopropyljbutanamid (1 : 1 )
Die Titeiverbindung wurde durch Kupplung von Interniedial C58 mit Trifluoressigsäure -benzyl- [2-(beta-aianyiamino)ethyl]carbamai (1 : 1) mittels HATU, anschließender Hydrogenolyse, dann folgender Kupplung mit l-(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid hergesteilt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 747 und 749(M+H)+. Intgrmgdjat ^59 - {(2S)-2-Amino-4-[ {(iR)-l-[i -benzyi-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2
propyl) (glycoloyl)aminojbutanoyl) -3- f[N-(bromacetyl)glycyl]amino} -D-alanin -trifluoressigsäure
(1 : 1)
75mg (0.1 14 mmol) von Intermedia! C58 wurden in 12.5 ml DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart, von 65 mg (0.3 1 mmol) HATU und 79 μΕ Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Kataly sator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser 1: 1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) von 2-(Trimethylsilyl)eihyl-3- ammo-N (2S)-4 {(lR) -[l-benzyM-(2,5^fluoφhen l) H yrroi-2-yl]-2,2- dimethyipropyl} (giycoioyl)amino]-2-({[2-(1iimeÜiylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino) butanoyI]-D- alaninat erhalten,
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.16 min; MS (EIpos): m/z - 844 [M+Hf.
40 mg (0.047 mmol) von diesem Intermediat wurden dann wie oben beschrieben mit N- [(Benzyloxy)ca.rbonyl]glycin in Gegenwart von HATU gekuppelt und anschließend erneut hydrogenolytisch entschützt.
Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 7.7 mg (0.032 mmol) von kommerziell erhältlichem 1.-(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 4 μ.Ι Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Enischützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 1.3 mg der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.83 min; MS (ESlpos): m/z - 777 und 779 (M+H)+. IntennedMtJ360
N6-(N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)-1-[1 -benzyl-4 2,5-difluc^henyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoy
pyiTol-l-y3)acetyl]-L-valyl-L-alanyl}-L-iysin -trifluoressigsäure (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat F155 hergestellt. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 1020 ( \M I) . Intermedi t F ^l
Trifluoressigsäure ~-(2S)-2-amino-4 {(iR) T-benzyl-4-^
dimethylpropyl} (g tanamid (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 20 mg (0.03 mmol) intermediat C58 mit 25.8 mg (0.061 mmol) Intermediat L77 in Gegenwart von HATU und anschließende Entsehützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 11.9 mg (47% d.Th. über 2 Stufen) der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 722 und 720 (M+H)\ Intermediat F262
S- {2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5^
dimethylpropyi}aniino]-2-oxoetiiyl} -N- {3-[2-(2- {[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- l)propanoyl]amino} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
30 mg (36 μηιοί) S- {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)- l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH-pyTrol-2-yl]- 2,2-cumethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} -L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Intemiediat C71 ) wurden zusammen mit 16,9 mg (40 umol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- l H-pyrrol-l -y])-N-[2-(2- {3- [(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-3-oxopropoxy}ethoxy)ethyl]propanamid in 1.5 ml, DMF vorgelegt und mit 10,9 mg (108 μηιοΓ) 4-Memylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 7.58 mg (0.13 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 33,4 mg (80 % d. Th.) der Verbindung S- ( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyi)- 1 H-pyrrol-2-yt] -2,2-dimethylpropyt} -2 ,2-dimethy 1- 6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N- {3-[2-(2- {[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrroi- 1 -yl)propanoyl]amino} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1027 (M+H)+.
32.8 mg (32 μηιοΐ) S-(l 1 -{(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5-d!fiuo henyί)-lH-pyrrol-2-y3]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyi-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan- 33-yl)-N- {3-[2-(2- { [3- (2,5-dioxo-2,5-dihydiO-lH-pynOl- l -yl)propanoyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein wurden in 3.0 roL Trifluorethanol gelöst und mit 26.1 mg (192 μπιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 56.0 mg (0.192 mmol) Ethyiendiamin- ,N,N',N'-teiraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 2,50x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 22.9 mg (71 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 883 (M+H)+.
Intermediat F263
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]-beta-alanyl-S- {2-[(3-aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 - benzyl-4-(2,5-difmo^lienyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimetlrv1propyl} amffi - trifiuoressigsäur
30.0 mg (0.036 mmol) R-(l 1- {(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-p rro!-2-yl]-2,2- dimethyipropy!} -2^2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-ojra-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yi)-L-cy stein- trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat C71) und 9.8 mg (0.04 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 3 -yl)aeetyl]-beta-alanin (Intermediat L78) wurden in 3 .0 ml, DMF gelöst und mit 36.4 mg (0.04 mmol) HA TU und 14.0 mg (0.1 1 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmisehung wurde 2 Stunde bei RT gerühr Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 325x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.2 mg (13 %) der Verbindung N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)acetyl]-beta-alanyl-S-(l 1- {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyi)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein.
LC-MS (Methode 6): Rt - 1.31 min; MS (ESIpos): m/z - 925 (M+H)+. 11.3 mg (0.01 1 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-diiiydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-beta-alanyl-S-(l 1-{(1R)- l-[l -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimeihylOT
5-oxa-7,l I -diaza-2-siiatridecan-13-yl)-L-cystem wurden in 2.0 mL Trifiuorethanol gelöst und mit 5.0 mg (0.04 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10.7 mg (0.04 mmol) Etlry3endiamin- ,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (40 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 781 (M+H)+.
Intermediat F264
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydrolH-pyrroi- 1 -yl)hexanoyl] -beta-alanyl-S- {2-[(3-aminopropyl) {(1R)- 1-[1 -benzy3-4-(2,5 lifiuorphenyi)- lH^yiTol-2-yl]-2,2-dimelhylpropyl}amino]-2-oxoetiiyl} -L- cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
30.0 mg (0.036 mmol) R-(l l- {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluo hen l)-lH- ^τol-2-yl]-2,2- dimethytpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 - liaza-2-silatridecan-l 3-yt)-L-cystein- trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) und 12.2 mg (0.04 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-
3 H-pyrro3~i -yi)hexanoyl]-beta-alanin (Intermediat L79) wurden in 1.0 mL DMF gelöst und mit 36.4 mg (0.04 mmol) HA TU und 34.0 mg (0.1 3 mmol) N.N-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 8.9 mg (24 %) der Verbindung N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l - yl)hexanoyl]-beta-alanyl-S-(l 1 -{(1 )-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difiuoφhenyί)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethy]-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan- 13-y])-L-cystein.
LC-MS (Methode 6): R, - 1.38 min; MS (ESIpos): m/z - 983 (M+H)+.
15.3 mg (0.015 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH^^
{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5 -difluo henyl) H yIτol-2-yl]-2,2-dimeth lpropyl} -2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluoreihanol gelöst und mit 6.3 mg (0.045 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsrnischung wurde mit 13.5 mg (0.045 mmol) Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/ Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.1 mg (62 %>) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R. = 0.92 min; MS (ESTpos): m/z - 837 (M+H)+.
Intermediat F265
Trifluoressigsäure N-(3-amrnopropyl)-N- {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl} -22-(2,5-dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-6, 17-dioxo- 30, 13-dioxa-3-thia- 7, 16-diazadocosa - 1 -amid (1 : 1)
30.0 mg (42.7 fimol) 1 3 - {( ^)- 1-[1-Βει^1-4-(2,5-άί11υοφ1ιεην1)-1 Η^ΓΤο1-2-γ3]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyl -6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 1 1 -diaza-2-si laheptadecan- 17-säure (intermediat C69) und 25.3 mg (55.6 μηιοΐ) Trifluoressigsäure N-{2-[2-(2- aminoethoxy)ethoxy]ethy] } -6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanamid ( 1 : 1 ) (Intermediat L82) wurden in 1 .9 mL Aceton itril vorgelegt und mit 60 μί (340 μπιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethyiamin und 33 μ! (56 μηιοί) 2,4,6-Tripropyl- 1 ,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid 50 % in Ethylacetat versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nach! bei RT nachgerührt Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben und die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 26.7 mg (60 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-26-(2,5-dioxo-2,5-dih^
dioxa-7-thia-4,l l ,20-triazahexacos-l-yl]carbamat
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.40 min; MS (ESIpos): m/z - 1025 (M+H)+.
25.3 mg (24.7 μιτιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH- pyrrol-2-y3]-2,2-dimethylpropyl } -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 3 -yl)-5, 10,21 -trioxo- 14,17- dioxa-7-thia-4,l 1 ,20-triazahexacos-l-yl]carbamat wurden in 2.0 mJL Trifluorethanol gelöst und mit 20.2 mg (348 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 43.3 mg (148 μηιοΐ) Etliylendiamin- ,N,N!,N!-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 23.4 mg (95 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R* = 0.89 min; MS (ESIpos): m z = 881 (M+ITf .
Intennedjat F2 6
Trifluoressigsäure N-(3- minopropyl)-N- {ίlR)-l-[l -benz}d-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yί]- 2,2-dimemylpropyl}-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l-yl)-2,13-dioxo-6,9-dioxa-16-thia-3,1.2- diazaoctadecan- 1 8-amid (1 : 1 )
30.0 mg (0.043 mmol) 1 l- {(l.R)-l -[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermedia! C69) wurden zusammen mit 22.2, mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N-{2-[2-(2- aminoethoxy)ethoxy]eihyl}-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1: 1) (Intemiediat L83) in 1.9 L Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 60 μΐ (0,34 mmol) N,N-Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.056 mmol) T3P (50 % in Et iylacetat) zugetropfi. Die Reaktionsrnischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsrnischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/mm, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.5 mg (49 % d. Tb.) der Verbindung 2- (TIΈΏethylsilyl)emyl-[19-{(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo~2 ,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)~2 ,13,18-trioxo-6,9-dioxa- 16-thia- 3,12,39-triazadocosan-22-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.38 min; MS (ESIpos): m/z - 969 (M+H)+.
19.1 mg (19.7 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[19- {(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 1■ (2,5■ dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,i 3,18-trioxo-6,9■ dioxa- 16-thia-3,12,19-triazadocosan-22-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 16.1 mg ( 1 18 μιτ-οΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsrnischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsrnischung wurde mit 34,6 mg (1 18 μιηοΐ) Etliylendiamm-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA), Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 13.9 mg (75 % d. Tit.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 825 (M+H)+.
Int_^3B£dj tjF2iiZ
S- {2-[(3-Aminopropyl) {(1R)~1 -[1 -benzyl-4-(2,5-diflu^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2^
dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} -N-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-
6,9J2,15 etaoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl-beia-alanin -trifluoressigsäure 1 : 1)
Unter Argon wurden 13.4 mg (33.3 μηιοΐ) 1 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)-2-oxo- 6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-säure (Intennediat L74) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 9.3 μΐ (54.4 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 12.6 mg (33.3 μηιοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 25.0 mg (27.7 μηιοΐ) S-(11-{(1R)-1-[1-Benzyl- 4-(2,5-dii iiorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropy
diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 : 1) (siehe Synthese Intermediat F216) gelöst in 4,7 μΐ (27.7 μηιοΐ) N,N-Diisopropyle1hylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 90 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 mg ( 19 % d. Th.) der Verbindung S - ( 1 1 - {(1 R)- 1 -[l-Benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2^-dimethylpropyl } -2 dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)-2,l 8- dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyi-beta-alanin.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.44 min; MS (ESIpos): m z - 1172 (M+H)+. 6,70 mg (5.71 μπιο3) S-(i 1 - {(1 )-1-[1-Βεηζγ1-4-(2,5-άί«υο 1ιειιν1)-Ι Η-ργΓτο1-2-ν1]-2,2- dimetliylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 3 1 -diaza-2-silatrideean- 33-yl)-N-[l -(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-I H-pyrroi- 1 -yl)-2, 18-dioxo-6,9, i 2, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-yl]-L-cysteinyl- beta-alarrin wurden in 1.0 mL Trifluorethano! gelöst und mit 4.67 mg (34.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte I h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10 mg (34.3 μιηοί) Ethylendiamin- , ,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.85 min; MS (ESIpos): m/z - 1028 (M+H)+. Intermediat F268
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyi)-N- {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl} -28-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 3 H-pyrrol- 1 -yl)-6,23-dioxo- 10.13,16, 19-tetraoxa- 3 -tili a-7,22-di azaoctacosan- 1 -amid (1 : 1)
30.0 mg (0.043 mmol) 1 1 - {( 3 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimeihyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l i -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermedia! C69) wurden zusammen mit 30.2 mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N-(14-amino- 3,6,9, 32-tetraoxatetradec- 3 -yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 3 -yl)hexanamid ( 3 : 3 ) (Intermediat L84) in 2.0 mL Acetoniüü vorgelegt. Dann wurden 60 μί (0,34 mmol) N,N- Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.056 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 27.9 mg (59 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trim.ethylsily^
dimethylpropy!} -32-(2,5-dioxo-2,5-dftydro^
7-thia-4, 11 ,26-triazadotriacont- 1 -yljcarbamat
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 1114 ( \M I ) .
25.6 mg (23.0 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pynOl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -32-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTol-l-yl)- 14, r7,20,23-tetraoxa-7-thia-4,l 1 ,26-triazadotriacont-l -yljcarbamat wurden in 2.5 mL Trifiuorethanol gelöst und mit 18.8 mg (138 μηιοΐ) Zinkdic orid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 40.3 mg (138 μηιοΐ) Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 22.2 mg (88 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 0.94 min; MS (ESIpos): m/z - 969 (M+H)+.
Intermediat F269
4- {[(8R,14R)-13-(3-AminorJrop l) 4 1-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2- l]-l-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)- 15,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-lhia-3,6, 13-triazahexadecan-8- yljamino} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1: 1)
O
17.0 mg (0.0195 mmol) S-(l 1- {(1R)-1■[ 1 -Ββηζγ1-4-(2,5-<3ϊΑαο ΐ!αιγ1)-1Η-ργΓΓθ1-2- ΐ]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden zusammen mit 4.99 mg (0.0253 mmol) N-(2- Aminoetliyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-iH-pyiTol-i-yl)acetamid (InteiTnediat LI) in 1.0 mL Aceionitril vorgelegt. Dann mirden 27 μΐ (0.16 mmol) Ν,Ν-Diisopropyiethylamin zugegeben und 15 μΐ (0.025 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropfl. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % T'FA) gereinigt. Die Lösemittei wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (46 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-4- {[(16R)-11- {(1R)-1-[1- be zyl-4~(2,5~difίuoφhe yί)~lH~ y^
pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-6,12, 17,22-tetraoxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 , 18,21 -te.traaza-2-silatricosan- 16- yljamino } -4 - oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.47 min; MS (ESIpos): m/z - 1052 (M+H)\ 8.3 mg (7.89 μηιοΐ) tert-LVutyi-4- {[(16RH l-{(iR) -[l-ben^
ylj-2,2-dimethylpropyi} -23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-6,12, 17,22- tetraoxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 , 18,21 -teiraaza-2-silairicosan- 1 ό-yljamino} -4-oxobutanoat wurden in 1,0 L Trifluorethanol gelöst und mit 6.45 mg (47.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 6 h hei 50 °C. 6.45 mg (47.3 μ.ηιοί) Zinkdichiorid wurden zugegeben und die Reaktionsmisehung rührte über Nacht hei 50 °C Die Reaktionsmisehung wurde mit 27.7 mg (94.6 μιηοΐ) F.thylendiamin-N, , ',N'"tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.10 mg (14 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 852 (M+H)+. Intermediat F270
Trifluoressigsäure --N-(3-aminopropyl)-N- {(l R)-l-[ l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyiTol-2- yl]-2,2-dimetiiylpropyl} -N'-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTol-l - y 1) ac ety 1] amino e thyl) suc cinamid (1 : 1 )
Linter Argon wurden 15.0 mg (2,2.9 μηϊοΐ) 1 i - {(1R)- 1 -[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimeÜ!ylpropyl}-2^-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,i 1 -diaza-2-silapentadecan- 15-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μΐ (45.8 μτηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylarnin und 10.4 mg (27.4 μηιοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT geröhrt. 8.54 mg (27.4 μηιοΐ) Trifluoressigsäure -(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyri l-l- yl)acetamid (1 : 1) (Intermediat LI) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; Ι Ομ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 34.7 mg (77 % d. Th.) der Verbindung 2- (Trimethylsilyl)etiiyl-[3-({(lR)- l -[l -benzyl-4-(2,5-difluorpheTiyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} {4-[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTOl- l -yl)ace1yl]a]Tiino}ethyl)amiiio]-4- oxobutanoyl}ammo)propyl]carbamat.
LC-MS (Methode 5): R, - 1.33 min; MS (ESIpos): m/z - 835 (M+H)+.
13.2 mg (15.8 μπιοΐ) 2-(Trime lsilyl)eihyl 3-({(lR) 1-benzyl-4-(2,5^fluoiphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {4-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino} eihyl)ammo]-4-oxobuianoyl} amino)propyljcarbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.9 mg (94.8 μτηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 27.7 mg (94.6 μτηοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.9 mg (83 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.83 mim MS (ESTpos): m/z - 691 (M+H)+.
Intermediat F271
4-{[(20R,26R)-25-(3-Aminopropyl)-26-[l-ber^l-4-(2,5-^
dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-27,27 limeihyl-2, 19^4-trioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-22-thia- 3, 18,25-iriazaoctacosan-20-yl]amino} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1: 1)
Unter Argon wurden 19.4 mg (22.2 μηιοΐ) S-(l 1 -{(l )-l-[l-Benz l-4-(2,5-difluorplieDyl)-lH- pynOl-2-yl]-2,2-dimethylp!Opyl}-2,2-dime1l!yl-6,l2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)- N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein (Interaiediat C77) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit 21.7 mg (44.4 μιηοΐ) Trifluoressigsäure --N-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (1 : 1) (Intermedia* L74), 12 μΐ (67 μη-οί) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 16.9 mg (44.4 μηιοΓ) HA TU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Ii bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.1 mg (66 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-4-{[(16R)-l l-{(lR)-l-[l-^^
dimethy Ipropyl} -35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimet yl-6, 12,17,34-tetraoxo- 5,21 ,24,27, 30-pentaoxa-l 4-thia~7, 1 1,18,33-teUaaza-2-silapentatriacontan- 16-yljamino} -4- oxobutanoat.
LC-MS (Methode 4): Rt - 1.79 min; MS (ESTpos): m/z - 1250 (M+ a)+.
3 8.1 mg ( 14.7 μηιοΐ) tert-Butyl-4-{[(16R)-l l-{(lR)- l -[l -beDzyl-4-(2,5-difluorplieDyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-6, 12,17,34- tetraoxo-5,21,24,27,30-pentaoxa- 14-thia-7,l 1 , 18,33 etraaza-2-silapenta1riacontan-l 6-yl]ammo} -4- oxobutanoat wurden in 2.0 rnL. Trifluorethanoi gelöst und mit 12.0 mg (88.4 μηιοΐ) Zinkdiehlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 25.8 mg (88.4 μηιοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 12.3 mg (73 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z - 1 28 (M+H)+. Intermediat F272
Trifluoressigsäure — N-(3-aminopropyl)-N- {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorplienyl)- 1 H-pyrrol-2- ylj-2,2-dimethy3propyl} -N'-[ 17-(2,5 lioxo-2,5 lihydro- lH-pyrrolv
15-azalieptadec-i -yl]succinamid (1: 1)
Unter Argon wurden 15,0 mg (22.9 .iimol) 11■ {(1R)- 1 -[l-Benz l-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-p rrol- 2-yl]-2,2-dimeÜ!yipropyl}-2^-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,11 -diaza-2-silapentadecan- 15-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μΐ (45.8 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylemylamin und 10.4 mg (27.4 μπωϊ) HATU versetzt. Die Reaktionsmisehung wurde 10 min bei RT gerührt. 13.4 mg (27.4 μιηοΐ) Trifluoressigsäure N-( 14-amirio-3,6,9,12-tetraoxatetradec-i-yl)-2-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (1: 1) (Intermediat L85) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μναοϊ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmisehung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 L/min, MeCNAV asser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (68 % d. Th.) der Verbindung
2,2-dimethylpropyi} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,19,22-trioxo-6,9, 12,15-tetraoxa- 3,18,23 -triazahexacosan-26-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.35 min; MS (ESIpos): m/z - 1011 (M+H)+.
15.1 mg (14.9 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[23- {(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l-yl)-2,19,22-trioxo-
6,9,12,15-tetraoxa-3,18,23-triazahexacosan-26-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorelhanol gelöst und mit 12.2 mg (89.6 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmisehung röhrte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 26.2 mg (89.6 μιηοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.3 mg (70 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.88 min; MS (ESTpos): m/z - 867 (M+H)+. Intermediat F273
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N-{(l )-l -[I -benz l-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-
2,2-dirnethylpropy1}~l-(2 ^
thia-3, 3 8-diazatetracosan-24-amid (1 : 1)
Unter Argon wurden 20.0 mg (28.5 μ.ηιοί) 1 1 - {( 1 R)-l -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difiuo!phenyl)- 1 H-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2»2-dimetliyi-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l i-diaza-2-silaheptadecan-17- säure (Intermediat C69) in 1 .0 ml DMF vorgelegt, mit 10.0 μ! (57.0 μηωΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 13.0 mg (34.2 μιηοί) HATU versetzt. Die Reaktionsrnischung wurde 10 min bei RT gerührt. 16.7 mg (34.2 μηιοΐ) Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12- ietraoxatetradec- 1 -y l)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yTiacetamid (1 : 1) (Intermediat L85 ) gelöst in 5.0 μΐ (28.5 μχηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsrnischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/ Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.6 mg (62 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[25-{(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difiuorphenyd)- 3 H-pyrro3-2-yl]-2,2-dimethydpropyl}-l-(2,5-di
yi)-2,19,24-trioxo-6,9,12,15-tetraoxa-22-thia-3,l 8,25-triazaoctacosan-28-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 3 .37 min; MS (ESTpos): m/z - 1057 (M+H)+.
17.1 mg (16.2 μηω3) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[25- {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-2,19,24-trioxo- 6,9,12, 35-tetraoxa-22-thia-3, 1 8,25 riazaoctacosan-28-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 13.2 mg (97.0 μηιοί) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 28.4 mg (97.0 μηιοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 1 0μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.80 mg (59 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.88 min; MS (ESI os): m/z - 913 (M+FTf .
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pynOl-l-yl)ace1yl]-L-valyl-L-alanyl-S-{2-[(3-aminopropyl) {(lR)-
1 -[ 1 -henzyl-4-(2,5-difTuorphenyl)- lH~pyiTol-2~y1]-2,2-dimethylpropyi} amino]-2-oxoethyl} -L- cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
13.9 mg (0.0167 mmol) S-(l 1 - {(^)-1-[1-Βς·η^Ι-4-(2,5-άϊ1]υο 1ις^1)-1 Η-ρνΓΓθ1-2-^]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 3 1 -diaza-2-silatrideean- 33-yl)-L-cystein trifluoressigsäure (3 : 1) (Intermediat C71) wurden zusammen mit 7.07 mg (0.0217 mmol) N-[(2,5- Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)acetyl]-L-valyl-L-alanin (Intermediat L86) in 2.0 L Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 23 μΐ (0.13 mmol) Ν,Ν-Diisopropyieihylamin zugegeben und 13 μΐ (0.022 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.70 mg (19 % d. Tli.) der Verbindung N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L- alanyl-S-(l 1 - {(1R)- 1 -[ 1 -be zyl-4-(2,5-d!fluo hen l)-ί H-pyrrol-2-y3]-2,2-dimetiiylpropyl } -2,2- cümethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 1024 (M+H)\
10.6 mg (10.3 pmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl-S-(l l-
{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lFI-pyrrol-2-yl]-2,2-dirnethylpropyl} -2,2-dm
dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluoreihanol gelöst und mit 8.46 mg (62.1 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 18.1 mg (62.1 μτηοΐ) Ethylendiamin-lS^NjN^N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.60 mg (54 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 32): Rt - 1.69 min; MS (ESIpos): m/z - 880 (M+H)+. lütcrmcdiat F275
-[3-({2-ί(3-Amlno ro yl) {(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-iH^^
dimeihylpropyl}amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)propanoylj-N-(2- {[(2,5
l-yl)acetyi]amino}ethyl)-L-aipha-glutamin -trifluoressigsäure (1: 1)
39.0 mg (55.6 μιτιοΐ) I l- {(l ) -[I -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiToi-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimeihyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l l -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (lntermediat C69) wurden in 4.0 mL DMF vorgelegt, mit 41.6 mg (I I I μπιοΐ) l-Benzyl-5-[2- (triniethylsilyl)eihyl]-L-glutaniathydrochlorid (1 : 1 ) (lntermediat L89), 29 μ.1 (170 μηιοΐ) , - Diisopropylethylamin und 42.3 mg (11 1 umol) HATU versetzt und 1 Stunde bei RT naehgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mUmin, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 53.1 mg (93 % d. Th.) der Verbindung I -Benzyl-5-[2- (trimethylsiiyl)ethyl]-N-( i 1 - {( 1R)- i -[ 1 -benz i -4-(2,5-difluorphenyi)-l H-p rrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl}-2,2Hiimethyl-6,l2,I 7-1xioxo-5-oxa-l4-lhia-7,l I -diaza-2-silaheptadecan-I7-yi)-L- glutamat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.71 min; MS (ESIpos): m/z - 1021 [M+H]+
Unter Argon wurden 7.60 mg (33,9 μηιοΐ) Palladium(ll)acetat in 3.0 ml Dichloromethan vorgelegt und mit 14 μΐ (100 μηιοί) Triethylamin und 110 μΐ (680 μηιοΐ) Triethylsilan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min bei RT gerührt und mit 69.2 mg (67.7 μηιοΐ) l-Benzyl-5-[2- (trime lsilyl)et yl]-N-(i 3 - {(i R) 14^e zyl-4-(2,5-dir o
dimet ylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia~7, 1 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-L- glutamat gelöst in 3.0 mL Dichlomiethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethari nachgewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; ίθμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 38.4 mg (61 % d. Th.) der Verbindung (19S)-1 1- {(1R)-1-[1 - Benzy l-4-(2, -difluo henyl)- 1 H-p rrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12, 17-trioxo- 19- {3-oxo-3-[2-(üimethylsilyl)ethoxy]propyl} -5-oxa-14-thia-7,l l,18-triaza-2-silaicosan-20-säure. LC-MS (Methode 1): Rt - 1.53 min; MS (ESIpos): m/z - 931 (M+H)+.
10.0 mg (10.7 μηιοΐ) (19S)-1 l- {(lR)-l -[l -Benz d-4-(2,5-difluo hen l)-lH- τrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12 J 7-trioxo-19- {3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)eihoxy]propyl}-5- oxa-14-thia-7,l l,18-triaza-2-silaicosan-20-säure wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 6.73 mg (21.5 μιηοΐ) N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l -yl)acetamid 2,2,2- trifluorethan- 1 , 1 -diol (1 : 1 ) (Intermediat LI), 5.6 μ! (32 umol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 8.3 7 mg (21.5 umol) HA TU versetzt und 1 Stunde bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunde bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 rng (58 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N2-(l l- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difiuoiphenyl)-lFI-pyrrol-2-yl]-2,2-diniethylpropyl} -2,2-dimethy 1-6,12, 17-trioxo-5-oxa-14-thia- 7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)ac ety 1 ] amino } ethyl) -L - alpha- glutaminat .
LC-MS (Methode 1): R, - 1.57 min; MS (ESIpos): m z - 1 110 [M+Hf 6.90 mg (6.23 μιτιοΐ) 2-(Trimethylsilyl^
pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy3pi pyl}-2,2-dimethy3-6,12,3 7-trioxo-5-oxa- 34-thia-7,i 3 -diaza-2- silaheptadecan- 37-yi)-N-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl janiino} ethyl)-L-alpha- glutaminat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.1 mg (37.2 μmo3) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 10.1 mg (74.4 μηιοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C und 72 h bei RT. Die Reaktionsmischung wurde mit 54.5 mg (186 μηιοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- letraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0, 1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.4 mg (39 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 866 (M+Hf.
Int_^3B£dj tjF27
S- {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)-l-[l -benzy
dimethylpropyl}amko]-2-oxoethyl}^
yl)acetyl]aniino ihoxy)eihoxy]propanoyl}-L-cystem -tnfluoressigsäure (1 : 1)
Unter Argon wurden 9.08 mg (28.9 μηιοΐ) 3-[2-(2- {[(2,5-Dioxo-2,5-di'hydro-lH-pyrrol-l - yl)acety!]amino} ethoxy)ethoxy]propansäure (intermediat L87) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.33 μΐ (48.2 μπιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 11.0 mg (28.9 μιηοί) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 20.0 mg (27.7 μπιοΐ) S-(l 1-{(1R)-1-[1 -Benzyl- 4-(2,5-άϊΑυο ηε^ί)-1Η-ρνττοΙ-2^3]-2,2^!™β^ 1 - diaza-2-silatridecari- 13-yl)-L-eystein -trifluoressigsäure ( 1 : 1 ) (intermediat C71 ) gelöst in 4,67 μΐ (24.1 μηιοί) Ν, -Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.70 mg (19 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)- N- {3-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]amino}eihoxy)eihoxy]prop cystein. LC-MS (Methode 12): R, - 2.47 min; MS (ESIpos): rn/z - 1013 (M+H)4
13.9 mg ( 13.7 μπιοΐ) S-(l H(i ) ■ l·-Be z ί-4■ 2 dif uo:
dmethylpropy!} -2,2-dimethyl-6,i2-^
{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]ammo} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein wurden in 2.0 ml, Trifiuorethanol gelöst und mit 5.6 mg (41.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. 5.6 mg (41.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 30 Minuten bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.1 mg (82.4 μιηοί) Ethylendiamin- ,N,N',N'-teiraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.8 mg (80 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 32): Rt - 1.58 min; MS (ESIpos): m/z - 869 (M+H)4. Intermediat F277
N 3-({2-[(3-Aminopropyl) {(lR)- l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) H^yriOl-2-yl]-2,2- dmethylpropyl}ammo]-2-oxoethyl}sxilf
trifluoressigsäure 1 : 1)
8,90 mg (8.88 μηιοΐ) Trifiuoressigsäure 2-(trimetliyisiiyl)ethyl-3-amiDO-N-(l l-{(I R)-l-[l-benz l- 4-(2,5-difluorphenyr)-l H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dirnethylpropy] }-2,2-dimethyl-6,l 2,17-trioxo-5-o a-14- lllia-7, l l -diaza-2-silahq)tadecan- 17-yl)-D-alanΓnat (1:1) (Intermediat C80) und 2.31 mg (9.77 μιηοΐ) I -(2-Bromacetoxy)pynolidin-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethyifomiamid gelöst und mit 2.9 μΐ (27 μηιοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/O, l%TFA), Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.80 mg (65% d. Th.) der Verbinfung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1-{(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyTroi-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17 -trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3- [(bromacetyl)aminoj-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.57 min; MS (ESIpos): m/z - 1008 (M+H)+.
5.80 mg (5.75 μπιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1- {(1 R)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-l H- pyrrol-2-yl]-2,2-d!methylpropyl}-2y2-dimethyi-6,12,17-teioxo-5-oxa-14-thia-7, l l-diaza-2- silabeptadecaD-17-yl)-3-[(bromace1yl)ami-no]-D-aianinat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.70 mg (34.5 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 4.70 mg (34.5 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 5 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 20.2 mg (69.0 μηιοΐ) Ethylend!amin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/mm, MeCN/Wasser, 0.1%, TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.70 mg (34 %> d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.90 min; MS (ESIpos): m/z - 764 (M+H)+.
Irctermeriiat F278
-[3-( {2-[(3- Aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethy]propyl} ammo]-2-oxoethyl}sulfany])piOpanoyl]-3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- IH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}-D-alanin -trifiuoressigsäure (1 : 1 )
10.0 mg (9.98 μιηοΐ) Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyi)ethyl-3-amino-N-(l 1 - {(1R)- l-[l-benzyl-
tbia-7, 11 -diaza-2-silah ptadecaii- 17- l)-D-alaninal (1 : 1) (Intennediat C80) und 2.77 mg (11.0 μτηοΐ) l- {2-[(2,5-DioxopynOlidin-l-yl)oxy]-2-oxoeihyl) -iH-pynOl-2,5-dion wurden in 1 ml Dimelhylfomiamid gelöst und mit 3.3 μΐ (30 μηιοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmisehung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 2.0 μΐ (35 μηιοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.50 mg (54% d. Th.) der Verbinrung 2-(Trimefhylsilyl)etliyi-N-(l 1 - {(1 R)- 1-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorplienyl)- 1 H-pyrrol-2- yl]-2,2-diniethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17 rioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza
17-yl)-3-{[(2,5 lioxcH2,5-dihydro-lH^yiTol-l-yl)ace1yl]amino}-D-alaninat
LC-MS (Methode 1): R, - 1. 1 min; MS (ESIpos): m/z = 1024 (M+H)+.
5.50 mg (5.36 μηιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyi-N-(l 1■ {(1R)- l-[l 3€myl-4-(2,5^iüuo^hcayl) H- pyrrol-2-yi] -2,2-dimethy3propyl -2,2 liinethyl-6,12,17 r l-diaza-2- silaheptadecan- 17- i)-3- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)acetyl]amino} -D-alaninat wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.39 mg (32.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. 4.39 mg (32.2 μιτιοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. . 4.39 mg (32.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischimg iiihrte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionstnischung wurde mit 28.2 mg (96.5 μηιοΐ) Ethy]endiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.70 mg (56 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 781 (M+H)+. Intermediat F279
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-di ydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)-l^
difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2κumethylpropyl}[( {(2R)-2-carr > y-2- cai"box ropanoyl)amino]ethyl} sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid
12.2 mg (14 μmol) S-(l l -{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyί)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2y2-dimetiiyl-6,i2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden in 2.0 mL Trifiuorethanol gelöst und mit 11.4 mg (83.8 μιηοί) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.5 mg (83.8 μηϊοί) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA), Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet Man erhielt 4.60 mg (42 % d. Th.) der Verbindung 4-{[(lR)-2-( {2-[(3- Ammo ro yl) {(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhen l)- lH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)- 1 -carboxyethy]]amino} -4-oxobutansäure trifluoressigsäure ( 1 : 1 ).
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 673 (M+H)+.
10.0 mg (12.7 μιηοΐ) 4- {[(iR)-2-({2-[(3-Ammopropy
lH-p rrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}suifanyl)-l-carboxyethyl]
oxobutansäure -trifluoressigsäure ( 1 : 1) und 7.41 rng (12.7 μηιοΐ) 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yi)liexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (Intermedia! L88) wurden in 1.5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 4.4 μΐ (25 μηιοΐ) N/N-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerülrri. Die Reakiionsmisciiung wurde mit 2.0 μΐ (35 μηιοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.20 mg (39% d. Th.) der Titel Verbinfung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.11 min; MS (ESTpos): m/z - 1036 (M+H)+.
Intermediat F280
Trifluoressigsäure ~~]\i-[2-({(2S)-2~amino~4~[ {(l R)-l~[ l -benzy/M
ylj-2,2-dimethylpropy1}(glycoloy1)amino]butanoy1}amino)ethylj-3-(2,5-dioxo-2,^
pyrrol- 1 -yl)benzamid (1 : 1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C64 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem l-(3-{[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]carbonyl}pheoyl)-lH^yrrol-^ und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 755 (M+H)+. Intermediat F281
Ν- {(25)-2-ΑηΊίηο-4-[ {(1Κ)-1 -[1 ^6ΐιζγ1-4-(2,5-(1ϊί1πο 1ΐ6ην1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)ammo]bu1anoy
trifluoressigsäure
Zunächst wurden die modifizierten Aminosäurebausteine N-(Bromacetyl)-beta-alartin sowie 2- (Trimelhylsilyl)e1hyl-3-aniino-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alaTU^ nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Anschließend wurden diese in Gegenwart von HATU und Moipholin miteinander gekuppelt. Dann wui'de mittels 10%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die teri. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe abgelöst und so das intermediat 2-(Trimethyisilyi) ethyl-3- {[N- (bromacetyl)-beta-alanyl]amino} -D-a]aninat erhalten.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Tntermediats mit intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methyimorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z - 791 und 793 (M+H)" .
Intermediat F282
Trifluoressigsäure --(2S)-2-amino-4-[ {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-(3- {[N-(bromacetyl)glycyl]ammo}propyl)butanamid (1 : 1)
Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von tert-Butylglycinat und Bromessigsäureanhydrid das Intermediat Trifiuoressigsäure — ~(3~aminopropyl)- 2- (bromacetyl)glycinamid ( 1:1) hergestellt.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Memylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): R, - 0.83 min; MS (ESIpos): m'z - 747 und 749 (M+H .
Intermediat F283 (2R)-2-({(2S)-2~Amino-4 {(lRH 1~ben^^
dimemylpropyl}(glycoloyl)amino]bu1anoy] }ann^
asparagin -trifiuoressigsäure (1: 1)
Zunächst wurde ausgehend von (2S)-2-Ainin<>4-oxo-4-[2-(lximethylsilyl)ethoxy]butansäure und Bromessigsäureanhydrid der modifizierten Aminosäurebaustein (2S)-2-[(Bromacetyl)amino]-4- oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy3butansäure sowie ausgehend von kommerziell erhältlichem 3- {[(Berizyloxy)carbonyl]ammo}-N-(tert-butoxyearbonyl)-D-alanin --N-cyclohexylcyclohexanamin (1 :1) der Aminosäurebaustein 2-(Trimethylsilyl)ethyl-3-amino-]Si-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanina hergestellt. Beide Bausteine wurden in Gegenwart von HATU und Morpholin miteinander gekuppelt und anschließend wurde mittels 5%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgrappe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppen abgelöst und so das Intermediat Trifluoressigsäure -2-(trimethylsilyl)ethyl-N-{(2R)-2-amino-3-oxo-3-[2- (trämethylsilyl)ethoxy] propyl}-N2-(bromacetyl)-L-alpha-asparaginat (1: 1) erhalten.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses lntermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Enischützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.84 min; MS (ESTpos): m/z - 835 und 837 (M+H)+.
Intermediat F284
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)-lH-pyrrol-2-yi3-2,2- dimethylpropyl} (glycoloy aminojbutanoy 1} -3- {[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18- dioxo-6,9,12,l S-tetraoxa-3-azaociadecan-18-yl]ammo) -D-alanin -trifluoressigsäure (1: 1)
Zunächst wurde Intermediat L80 mit kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l-yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt und anschließend wurde mittels 16%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppe abgelöst Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermedia* C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 12): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 984.45 (M+H)+.
Intermediat F285
N- {'(2S)-2-Amino-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 ~benzyl~4~(2 difluorphenyl)~ lH-pyrrol~2-yi]~2,2~
dimetbylpropyl} {glycoloyl)amino]butanoyl} -3-[( 1 8-brom- 17-oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa- 16- azaoctadecan-1 -oyl)amino] -D-alanin -trifiuoressigsäure ( 1 : 1 )
Zunächst wurde Intermediat L80 mit kommerziell erhältlichem Bromessigsäureanhydrid acyliert und anschließend wurde mittels 20%-iger Trifiuoressigsäure in Dichlorrnethan die tert. Butoxycarhonyi-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppe abgelöst.
Schließlich wurde die Tiieiverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethy amin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergesteilt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.85 min; MS (ESIpos): m/z - 967 und 969 (M+H)' l-[(N-{(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l -[l -bra^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-di ydro-lH-pyrrol-l -yl) acelyljami -trifluoressigsäure (1 : 1)
Zunächst wurde Mermediat L91 mit (2,5-Dioxo-2,5-di ydro-lH-pyrrol-l-yi)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin gekuppelt und anschließend wurde mit 12.5%-iger TFA in DCM die Boc-Schutzgruppe abgelöst. Das so erhaltene Intermediat wurde mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin gekuppelt und anschließend durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titelverbindung überfuhrt.
LC-MS (Methode 3 ): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 984 (M+H)4'
Intermediat F288 - {(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-p rrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3-( {N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- IH-pyrrol- 1 - yl)acetyl]-L-se!yl}amino)-D-alanii! -trifluoressigsäure (1 : 1)
35 mg (39 μτηοΐ) von Interniediat C74 wurden in Gegenwart von HATU und N, N- Diisopropyethylamin mit N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yi)acetyl]-L-serin gekuppelt, das zuvor ausgehend von tert-Butyl-O-tert-butyl-L-serinat and (2,5-Dioxo-2,5-d!hydro-lH-pyrrol-l- yi)essigsäure hergestellt wurde. Nach Entsehützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (38% d. Th. ) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.43 min; MS (ESIpos): m/z - 824.34 (M+H)+.
Intermediat F289
N X2S)-2-Ammo-4»[ {(lR) »[l»benzyM
dimethylpropyl}
lysin -trifluoressigsäure (1 : 1)
Zunächst wurde Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-N°-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- l-yl)acetyl]-D-lysinat (1 :1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von N6~ [(Benzyloxy)carbonyl]-N''-(tert-butoxycarbonyl)-D-iysin hergestellt,
12.5 mg (25 μπιοΐ) von diesem intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- Melhylmorpholin mit 15 mg (23 μτηοΐ) von Intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (53% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.83 min; MS (ESIpos): m/z - 779 (M+H)4'.
Intermediat F290
N X2S)-2-A mo-4»[ {(lR) »[l»benzy
dimethy ure (1 : 1)
Zunächst wurde Trifluoressigsäure -2-(trimethylsilyl)etiiyl-N6-(bromacetyl)-D-lysinat (1 : 1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von N*-[(Benzyloxy)carbonyl]-N2-(tert- butoxycarbonyl)-D-lysin hergestellt
12 mg (25 μηιοΐ) von diesem intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- Methylmorpholin mit 15 mg (23 μηιοΐ) von Intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 7 mg (36% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 762 und 764 (M+H)4 N (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroH^
difluo henyl)-lH-p rrol-2-yl]-2,2-dime1hyl ro yl} (glycoloyl)amino] ro yl} -L-alanmamid
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HA'T'U und N,N-Diisopropylethyiamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das entschützte Tntermediat anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 - yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropyletbylamin in die Titelverbindung überführt,
LC-MS (Methode 1): R, - 1.21 min; MS (ESlpos): m z - 777 (M+H)+.
Intermediat F293
N- {(2S)-2-Arnino-4-[ {(iR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)aminojbutanoyl} -3- { [3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)benzoyl]amino} -D-alanin -trifiuoressigsäure (1 : 1 )
35 mg (39 μιηοΐ) von Intermedial C74 wurden in 4 ml DMF gelöst und in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin mit 13.5 mg (43 μηιοΐ) kommerziell erhältlichem l-(3- {[(2,5- Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy] carbonyl} phenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 12 rng (34% d. Th.) der Titelverbindung erhallen.
LC-MS (Methode 32): Rt - 0.93 min; MS (ESIpos): m/z - 799 (M+H)+.
Intermediat F294
N- {5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-5-oxopentanoyl} -L-valyl-N- {(lS)-3-[ {(lR)- l-[l-benzyl-4- (2,5-difluoiphenyl)- lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)ainino]-l -carboxypropyl}-L- a
41 mg (0.05 mmol) von Intermediat C76 gelöst in 12 ml, Methanol wurden über 10 mg 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92% d.Th.) des entschützten Intermediats.
15 mg (0.022 mmol) von diesem Intermedia! wurden in DMF gelöst und mit 13 mg (0.039 mmol) l,l'-[(l,5-DioxopenlBn-l,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidiri-2,5-dion und 7 N, N-Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 9 mg (45%· d. Th.) der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z - 895 (M+H)4'
Intermediat F295
N-[(2,5-Dioxo-2,5-ciihydro-iH-pyrroi-i-yl)acetyl]-L-valyl-N- {(lS)-3-[ {(lR)-l-[i^
difluo henyl)-lH-pyrrol-2- l]-2,2-dimethylprop l}(glycolo l)amirlo]-l-carbox propyl} -L- alaninami
41 mg (0.05 mmol) von Intermediat C76 gelöst in 12 mL Methanol wurden über 10 mg 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92% d.Th.) des entschützten Intermediats.
15 mg (0.022 mmol) von diesem Intermediat wurden in 4 mL DMF gelöst und mit 10 mg (0.039 mmol) l- {2-[(2,5-Dioxopyrrolidin- 3 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-i H-pyrrol-2,5-dion und 7 xL N, N- Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 2 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 10 mg (56% d. T .) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z - 821 (M+H . Trifluoressigsäure --(2S)~2-amino-4-[ {(lR)-l ~[l ~benzy1-4~(2,5~difl^^
dimethylpropyl} (glycotoyl)amino]-N-{2-[(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 - y 1) ac ety 1 ] am in o } ethy 1) sulfony 1] ethyl } butan amid ( 1 : 1 )
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L81 durch Kupplung mit intermediat C58 in Gegenwart von HAITI und N,N-Diisopropylethylamin hergesteilt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 : 1 bei RT unter Wasserstoff- Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und , N Diisopropylethylamin und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.83 min; MS (ESIpos): m/z - 785 (M+H)+. Intermediat F297
S-{2-[ {(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5<iifiuo^heny
ylmethyl)arnino]-2-oxoethyl} -N^
trifluoressigsäure (1 : 1) (Isomer 1)
Eine Lösung von 36 mg (0.03 mmol, 68% Reinheit) S-[2-({(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5- (1ϊί1ιΐ0 1ΐ6ην1)-1Η-ρ3^ΠΌΐ-2-γ1]-2,2-(5ϊιη6ί1ιν1ρΐΌργ1} {[1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yi]methyI} amino)-2-oxoethyl]-N-[6^
(Intermediat C92) in 0.74 ml 2,2,2-Trifiuoroethanoi unter Argon wurde mit 15 mg (0.11 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 32 mg (0.11 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 6,4 mg (25 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.95 min; MS (ESIpos): m/z - 792 ί VI } {-CT ;C< H { ;· .
Intgrmgdjat F298
S- {2-[{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-dfflu^^
ylmemyl)ammo]-2-oxoethyl}-N-[6-(2,5-dio^
trifluoressigsäure (1 : 1) (Isomer 2)
difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2- l]-2,2-dirnethylprop l} {[l -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yljmethyl} airrino)-2-oxoethyi]-N-[6-(2,5-dioxo-2,5Klihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-cystein (Intermediat C91) in 0,94 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 19 mg (0.14 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C geröhrt. Anschließend wurden 42 mg (0.14 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 5,7 mg (18 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.96 min; MS (ESIpos): m/z - 791 (M+H-CFsCCfeH)4.
S-(2-{(3-Amino ro yl)[(R)-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-l H-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)methyl]amino}-2-oxoethyl)-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- y])hexanoyl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1 )
Eine Lösung von 88,0 mg (0,09 mmol) S-{ l l -[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyi)-lH-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)methyl]-2,2-dimethyl-6,12-dio^
dioxo-2,5-dihydiO-iH-pyrrol-l-yi)hexanoylj-L-cysiein ( ermediat C84) in 1.88 ml 2,2,2- Trifluoroethanol wurde mit 76.8 mg (0.57 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 164.6 mg (0.57 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 33 mg (35 % d, Tb ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): R 1.82 min; MS (ESIpos): m/z - 792 (M+H)+. Intermediat F300
(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difruorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropy 1 } (glycoloyl)amino]-N-(2- { [(2R)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)propanoyl] amino } ethyl)butanamid
Eine Lösung von 7 mg (0.08 mmol)) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-{(2S)-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)aminoj- 1 -[(2- { [(2R)-2-(2,5-dioxo- 2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-i -yl)propanoyl]amino} ethyl)amino]- 1 -oxobutan-2-yl} carbamat
(Intermediat C100) in 0.2 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 1 1 mg (0.08 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C geröhrt. Ansehließend wurden 14 mg (0.05 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsrnisehung wurde mit Etbylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 1,6 mg (27 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 707 (M+H-CF3C )2H)+.
IntennedM F3
S~{2~[ {(lR) 1~benzy -4~(2,5~diÖuoroph
ylme1hyl)amir!o]-2-oxoe1hyl} -N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-py!Tol- 1 -yl)acetyl]-L-eysteir!e trifluoroacetate (3 : 1) (Isomer 1)
Eine Mischung von 56.9 mg (58.2 mmol, 85 % Reinheit) S-[2-( {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5- dif!Uo 3henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpi pyl} {[(l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)acetyl]-L-cystein (intermediat C94) in 1.4 ml 2,2,2 -Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 31.7 mg (0.23 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 68.0 mg (0.23 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewasclien. Die organische Phase wurde über Magnesiumsuifat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (13 % d. Th) der Titel Ver indung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 736 (M+H-CFsCCfeH)4.
Intermediat F304
N-(2- {[3-({2-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyi)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (pynOlidin-3-yhnethyl)amino]-2-oxoethyl}sul anyl)propanoyl]amino} ethyl)-6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanamid (1 : 1) Trifluoressigsäure (Isomer 2)
Eine Lösung von 22.3 mg (0.02 mmol) tert-Butyl-3-[2- {(lR)-l-[l-benzy1-4-(2,5-difluo^ lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpro^
tbia-2,9, 12-triazaoctadec- 1 -y ljpyrrolidin- 1 -carboxy lat (iniermediat 98) in 0,64 ml 2,2,2- Trifluoroeihanol wurde mit 13.2 mg (0.10 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgenriseh wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Ansehließend wurden 28.36 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. HPLC gereinigt, Man erhielt 5 mg ( 24 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): R, 3.05 min; MS (ESIpos): m/z = 819 (M+H-CF3C02H)+.
Intermedia* F305 ~ {(lR)~l -[l -i:knzyi~4-(2,5-difiuoip
2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)-6,l 7-dioxo-N-(pyrrolidm-3-ylmethyl)- 10,13-dioxa-3-thia-7,16- diazadocosan- 1 -amid (1 : 1) Trifluoressigsäure (isomer 2)
Eine Lösung von 24.80 mg (0.02 mmol) tert-Buiyl-3-[2- {{3 R)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-24-(2,5-dioxo
12, 15-dioxa-5-thia-2,9,l 8-triazatetracos- 1 -y!]pyrrolidm- 1 -carboxylat (Intermediat C99) in 0.65 ml 2,2,2-Trifiuoroethanoä wurde mit 13.42 mg (0.10 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 28.78 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparaiive HPLC gereinigt. Man erhielt 10 mg (44 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): R, - 3.1 1 min; MS (ESIpos): m/z - 907 (M+H-CFsCChH)"1".
Intermediat F3Q6 6-(N-{(2S)-2-Amino-4 {(lR)-1 1-benzyl-4 2,5-clifluo henyl)-lH-pyπ·ol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl } -beta-alany 1)-N2- {N- [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 3 -yl)acetyl]-L-valyl-L-a3any3-beta-a3any3 } -L-lysin -trifluoressigsäure ( 1 : 1 )
Die Titeiverbindung wurde durch Kupplung von 24 mg (0.029 mmol) des Intermediats C61 mit 30 mg (0.035 mmol) von Intermediat 1.99 in Gegenwart von 16.7 mg (0.044 mmol) HATU sowie 15 μΐ Ν,Ν-Diisopropyle!hylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifiuorethanol wie in Intermediat F I 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 19 rng (52% d. 'Iii. über 2 Stufen) der Titeiverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 1091 ·>! · I i ) . Intermediat F3Q7
N^6-(2,5-Dioxo-2,5-d&ydro-lH^yr^
ami opropy1)-14- i -benzyί-4-(2,5-difluo henyl)-lH- yrrol-2-ylj-5-carboxy-15 5-d
2,7, 12 -trioxo- 10-thia-3,6, 13-triazahexadec- 1 -yl} -L-cystein -trifluoressigsäure (1: 1)
8,90 mg (8.88 μηιοΐ) Trifiuoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(l l- {( l R)-l -[l -benzyl-
4- (2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dimethylpropy] }-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14- thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- i 7-yl)-D-alanmat (1:1) (Intermediat C80) und 2.31 mg (9.77 μιηοΐ) I -(2-Bromacetoxy)pynolidin-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethyifomiamid gelöst und mit 2.9 μΐ (27 μηιοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wuixien im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.80 mg (65% d. Th.) der Verbinfung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1-{(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethy 1-6, 12,1 7 -trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3- [(bromacetyl)aminol-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.57 min; MS (ESIpos): m/z - 1008 (M+H)+. 2-(Trimetbylsilyl)e l-N-(l ! -{^
dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,l 7-trioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silalieptadecan-l 7-yl)-3-
[(bromaeetyl)amino]-D-alaninat (31.9 mg, 31.6 μηιοί) und L-Cystein (7.66 mg, 63.2 μτηοΐ) wurden in 3.0 ml DMF gelöst und über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmiscliung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 28.1 mg (76% d. Th.) der Verbinfung S-[(19R)-11- {(1R)-1- [ 1 -Ben.yl-4-(2,5-difiuo^henyl)-lH-py^^ 17,22- tetraoxo-19- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-5-oxa-14-thia-7,l 1,18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 23-ylj-L-cysiein -trifiuoressigsäure (1 : 1).
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.52 min; MS (ESIpos): m/z - 1049 [M+Hf
5- [(19R)- i l- {(lR)-l -[l -Benzj -4-(2,5-difiuorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2
dimethyl-6, 12, 17,22-tetraoxo- 19- {[2-(trimethylsiiyl)etl oxy]carbonyl} -5-oxa- 14-thia-7, 1 1 , 18,21 - tetraaza-2-silatricosan-23-yll-L-cystein -trifiuoressigsäure ( 1 : 1 ) (13.5 mg, 1 1.6 μη οΐ) wurde in 1.0 ml DMF gelöst, mit 2,5-IMoxopyrrolidin-l -yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yi)hexa:noyij-L-valyi-L-a3a:ninat (6.76 mg, 11.6 μηιοΓ) (Intermediat L88) und N,N- Diisopropylethylamin (4.0 μΐ, 23 μηιοΐ) versetzt und 1h bei RT nachgerührt gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.1 mg (68% d. Th.) der Verbinfung N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi-i-yi)hexanoyi]-L-vaiyl-L-alanyl-S-[(19R) benz l-4-(2,5-difluorplienyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2y2-dimetliylpropyl} -2,2-dimethyl-6,l 2, 17,22- tetraoxo-19- { [2-(trimethy3si3y3)ethoxy]earbonyi } -5-oxa- 34-thia-7, 11,18,21 -tetraaza-2-silatrieosan- 23~yij-L-cystei:n.
LC-MS (Methode 14): Rt - 7.38 min; MS (ESIpos): m/z - 1412 [M+H]"
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi- 1 -yl)hexanoyl]i-valyl-L-alanyl-S-[(19R)- 11- {(1R)-1 -[ 1 - benzyl-4-(2,5-difluo^henyl)-lH^yirol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-^
tetraoxo- 19- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy Jcarbonyl} - 5-oxa- 14-thia-7, 11,18,21 -tetra aza-2-silatricosan- 23-yl]-L-c stein (9.40 mg, 6,65 μηιοί) wurde in 2.0 ml Trifiuorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (5.44 mg, 39.9 μτηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (5.44 mg, 39.9 μηιοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsä re (23.4 mg, 79.8 μητοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.60 mg (66 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode l): Rt = 0.93 min; MS (ESTpos): m/z - 1 168 (M+H)+.
Intermediat F308
N 6-(2,5-Dioxo-2,5-dmydro H^yrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[(12R,19R)-19-amino-4- {(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difiuo henyl)-iH- yr ol-2-yί]-2,2-dimethylpropyl} -12,19-di
trioxo-7, 17-dithia -4, 11 , 14-triazanonadec- 1 -yl] -L-alaninamid -trifluoressigsäure (1: 1)
N-[3-( {2-[(3-Arrrinopropyl) {(lR)-l
dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfany
trifluoressigsäure (1 : 1) (12.7 mg, 14.5 μπιοΐ) und N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- cystein (3.84 mg, 14.5 μηιοΐ) wurden in 1.5 ml DMF gelöst und über Nacht bei RT nachgerührt. Dann wurde N,N~Diisopropylethylamin (2.5 μΐ, 14 Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei RT und wurde dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mUmin, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.40 mg (48 % d. Th.) der Verbindung S- {(5R,14R)-13-(3-Aminopropyl)- 14-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-5-carboxy-i 5
thia-3,6, 13-triazahexadec- 1 -yl} -N- {[2-(trimethylsilyi)ethoxy]carboiiyi} -L-cystein
trifluoressigsäure (1: 1).
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.03 min; MS (ESIpos): m/z - 949 [M+Hf
S- {(5R,14R)-13-(3-Aminopropyl)~14~[l~benzyM^
15,15-dimethyl-2,7,12-trioxo-10-thia-3,6,1 3-triazaliexadec-i-yl}-N-{[2-
(trimethylsilyl)ethoxyjcarbonyl} -L-cystein -trifluoressigsäure (1: 1) (7.50 mg, 7.05 μπιοΐ) wurde in 1.0 ml DMF gelöst und mit 2,5-Dioxopynolidin- 1 -yi-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 - yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (4.1 1 mg, 82 % Reinheit, 7.05 μιηοΐ) (Intermediat L88) und N,N- Diisopropylethylamin (2.5 μί, 14 μπιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT geröhrt und dann direkt mittles präp. P-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden ini Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.30 mg (46 %) der Verbindung N-[6-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yI^
difluorplienyl)-lH-pyrrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl}-8, i 5-dica boxy-2,2-dimethyl-6,12,i 7,22- tetraoxo-5-oxa- 10,20-dithia-7,l 3,16,23-te1raaza-2-sila exacosan-26-yl]-L-alaninamid.
LC-MS (Methode 14): R - 6.47 mm; MS (ESIpos): m/z - 1312 ; Vi ! i |
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-d!liydro-lH-pyrrol-i-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[(8Ra SR)
berizyl-4-(2,5-dffluo^henyi)-lH-pyro
6, 12,17,22-tetraoxo-5-oxa-l 0,20-dithia-7, 13,16,23-tetraaza-2-silahexacosan-26-yl]-L-alaninamid (4.00 mg, 3.05 μπιοΐ) wurde in 1.0 ml Trifluorethanol gelöst und mit Zinkdichlorid (2.49 mg, 18.3 μmoί) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C und wurde dann mit Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (5.34 mg, 18.3 μηιοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt.. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.50 mg (64 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.00 min; MS (ESIpos): m/z - 1168 [M+H]+ Intermediat F3Q9
4- {[(l lR,17R)-16-(3-Amino ro yl)-17-[l-benz l-4-(2,5-difluo henyl)-lH yrrol-2- l]-l-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yi)-18, 18-dimethyl-6,6-dioxido-2, 10, 15-trioxo-61ambda6, 13-dithia- 3,9, 36-triazanonadecan-l l-yl]amino} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
S-(l 1- {(1Κ) - 1-Β€ηζ^ -4-(2,5-ά!Παο 1ϊ€ηγ1) Η- /ΓΓθ1-2-^
6,12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein (50.0 mg, 57.3 μηιοΐ) (Intermediat C77) und Trifluoressigsäure -benzyl- {2-[(2- aminoethyi)sulfonyl]ethyl} carbamat (1 : 1) (27.5 mg, 68.7 μητοΐ) (Intermediat L81) wurden in 4.0 ml DMF vorgelegt, mit HATU (26.1 mg, 68.7 μηιοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin: (30 μΐ, 170 umoi) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 53.9 mg (81 %) der Verbindung tert-Butyl-4- {[(12R)-17- {(l R)-l -[l -benzy]-4-(2,5- difiuorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yi]-2,2-dimeA
tetraoxo- 1 -phenyl-2,23-dioxa-71amfoda6,14-dithia-4,10,l 7,23 -tetraaza-26-silaheptaeosan- 12- yijamino} -4-oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.54 min; MS (ESIpos): m/z - 1 141 [M+H]+
Unter Argon, wurde Palladium(ll)acelat (5.12 mg, 22.8 μιηοΐ) in 3.0 ml DCM vorgelegt, mit Triethylamin (9.5 μΐ, 68 μητοΐ) und Triethylsilan (73 μΐ, 460 μχηοΐ) versetzt und 5 min. gerührt. Dann wurde tert-Butyl-4-{[(12R)-17- {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-dlfluo henyl)-l H- yr ol-2-ylj-2,2- dimethylpropy 1 } -26,26-dimethyl-7,7-dioxido-3, 1 1 , 16,22-tetraoxo- 1 -phenyl-2,23-dioxa- 71ambda6, 14-dithia-4, 10, 17,21 -tetraaza-26-silaheptaeosan- 12-yl jamino } -4-oxobutanoat (52.1 mg, 45.6 μΐΉοΙ) in 2.0 ml DCM zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und mit 2.0 ml Wasser versetzt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Acetonitril versetzt, filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/ Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.4 mg (85 %) der Verbindung tTifluoressigsäure .ert-butyi-4- {[(16R)-23-amino-l 1 - {(1R)-1 -[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- lH-p rrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12, 17-trioxo-5 - oxa- 14,21 lambda6-dithia-7, 11 ,18-triaza-2-silatricosan- i 6-yl]amino} -4-oxobutanoat (1 : 1).
LC-MS (Method 1): Rt - 1.21 min; MS (ESIpos): m/z - 1007 [M+H]"
Trifluoressigsäure-tert-butyl-4- { [( 16R)-23-amino- 11 - { ( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H- p rrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14,21 lambda6- dühia-7,11,18-lriaza-2-sila1xicosan-16-yl]amino} -4-oxobutanoat (1 : 1) (20.0 mg, 17.8 μιηοΐ) und (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yi)essigsäure (3.32 mg, 21.4 μιηοΐ) wurden in 2.0 ml DMF vorgelegt, und mit HATU (8.14 mg, 21.4 μηιοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (9.3 μΐ, 54 μηιοΐ) versetzt.
Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT nacligerüiirt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 ml/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hoclwakuum getrocknet. Man erhielt 1 7.4 mg (85 %) der Verbindung tert-Butyl-4- {[(16R)- l 1- {(1R)~ 1 -[ I - benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 1.H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12, 17,25-tetraoxo-5-oxa- 14,21 lambdaü-dithia-
7.11.18.24- tetraaza-2-silahexacosan- 16-yl]amino} -4-oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z - 1144 [M+Hf
Tert-Butyl-4- { [( 16R)- 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-diüuorphenyl)- 1 H-pyrroi-2-yl 1-2,2- dimethylpropyl} -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-
6.12.17.25- teü-aoxo-5-oxa-14,211ambda6-dithia-7,l 1 ,18,24-tetraaza-2-silahexacosan-16-yl]amino} - 4-oxobutanoat (15.9 mg, 13.9 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (1 1 .4 mg, 83.4 μ.ηιοί) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (1 1.4 mg, 83.4 μηιοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (1 1 .4 mg, 83.4 μητοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N, , ',N'-tetraessigsäure (73.2 mg, 250 μηιοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; ί θμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10 mg (68 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.45 mm; MS (ESIpos): m z - 944 [M+H Intermediat F310
Trifluoressigsäure-N-[(8R, 14R)- 13-(3-aminopropyl)- 14-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorplien.yl)-lH- p rrol-2-yl]- l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-p rrol- 1-yl)- 15,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- i 0-thia- 3,6,13-triazahexadecan-8-yi]-2,5,8,l 1 -tetraoxatetradecan- 14-amid (1 : 1)
8-(11-{(1Κ)-1-[1-Ββη-^1-4 2,5-άΜυο ^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1: 1) (100 mg, 120 μηιοΐ) (iniermediat C70) und l -[(14-Oxo-2,5,8,l l -telraoxatelradecan-14-yl)oxy]pyrrolidin-2,5- dion (44.1 mg, 132 μηιοΐ) wurden in 3.0 ml DMF vorgelegt und mit 4-Metliylmorpholin (40 μΐ, 360 μπιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt, mit Essigsäure (420 μηιοΐ) gequencht und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 69.4 mg (62 % d. Th.) der Verbindung S- (1 1 - {(^) "[1-Βεηζν1-4"(2,5^ι0υοφη^
6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-(14-oxo-2,5,8,l l-tetraoxatetradecan-14-yl)-L- cysiein.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.61 mm; MS (ESIneg): m z - 933 [M-H]'
S-(l l-{(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiToi-2-yl]-2,2-dimethylpro^^^
6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-(l 4-oxo-2,5,8, 3 1 -tetraoxatetradecan- 14-yl)-L- cystein (27.0 mg, 28.9 μιτιο!) wurde in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit N-(2-Aminoethyi)-2-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)acetamid (1 1.4 mg, 57.7 μητοΐ) (Intermediat LI ), N,N- Diisopropylethylamin (15 μΐ, 87 μ/mol) und HATU (22.0 mg, 57.7 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3h bei RT geröhrt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 13.7 mg (43 % d. Th.) der Verbindung 2■(Trimethylsilyl)eth ί- {(16R)-21-{(lR)■l-[l-benz l-4-(2,5-d!f3uo hen ί)- lH-pyrrol-2-ylj-2,2-ctimethylpropyl}- 16-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-i - yl)acetyl]amino} ethyl)carbamoyl]-14,20-dioxo-2,5,8,l l-tetraoxa-18-lhia- 15,21 -diaza tetracosan-24- yl}carbamat.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.54 min; MS (ESIpos): m/z - 1114 [M+Hf
2-(Trimethylsilyl)ethyl- { ( 16R)-21 - {( 1 R)-l -[ 1 -benzy 1-4-(2,5^Αυοφηε^1)-1Η-ρνιτο1-2^1]-2,2- dimethylpropyl} - 16-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -y!)aeetyl]amino} ethyl)carbamoy!]- l4,20-dioxcn2,5,8,nHetraoxa-l 8-tiiia-l5,2l^iazate1iacosan-24-yl}carbarnat (13.7 mg, 12.3 μηιοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (10.1 mg, 73.8 μηιοΐ) versetzt, Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (21.6 mg, 73.8 μηιοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.30 mg (47 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.01 min; MS (ESIpos): m/z - 970 [M+Hf Intermediat F311
S-{2 (3-Ammopropyl) {(lR)-l-[l-berizyM
dimemylrjropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dmydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2,30-dioxo-
6,9,12,i5,18,21,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein-trifluoressigsäure (1 : 1)
l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydio- l H-pyrrol-l ^
30-säure (10.8 mg, 1 8,7 μιτιοΐ) (Iniennediat 1,97) wurde in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit N,N- Diisopropylethylamin (5.4 μί, 31.2 umol) und HA TU (7.10 mg, 18.7 μηιοΐ) versetzt und 10min. nachgerührt. Dann wurde S-(l 1 - {(1R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7, 3 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein Irifluoressigsäure (1 : 1) ( 12.9 mg, 15.6 μτηοΐ) (Intermediat C71) in 1.0 ml DMF und N,N- Diisopropylethylamin (2.7 μΐ, 15.6 μηιοΐ) gelöst, zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Ii bei RT geröhrt und dann direki mittles präp. RP-HPLC (Säuie: Reprosil 125x30: 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.5 mg (18 %) der Verbindung S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyί-4-(2,5-difluoφhen l)-^
dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yt)-2,30- dioxo-6,9,12,15,18,21 ,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.30 min; MS (ESineg): m z - 1276 [M-H]"
S-(l 1■ {( )A -[l -Bewzyl -(2,5-0 uor ^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)- 2,30-dioxo-6,9,12,15,18,21,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein (3.50 rng, 2.74 μηιοΐ) wurde in 1.0 ml Trifluoreihanol gelöst, mit Zinkdichlorid (6.25 mg, 16.4 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (47 μΐ, 16 μτηοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.0 mg (59 % d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 1): R, - 0.94 min; MS (ESIpos): m/z - 1 133 (M+H)+.
Intermediat F312
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 3 H-pyrrol-l-yl^
difίuo henyl)■lH yίτo3"2■yl]"2,2 linlethyl ro yl}(glycolo l)am
glutamylamino)emyl]amino} -1 -oxobutan-2-ylj-L-alaninamid -trifluoressigsäure (1 :1)
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C103 durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch. 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 : 1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid und Reinigung durch präparative HPLC in die Titel v erbindung überfuhrt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.9 min; MS (ESIpos): m/z - 992 (M+H)\ S-[2-({(lR)-l -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorahenyl)-lH^yrrol-2^
Üuorpyrrolidin~3-yl]methyl} amino)-2-oxoethyl]-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-di]iydro-lH-pyrrol-l-yl)- 2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan-l 8-yl]-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1)
Zu einer Lösung von 55.0 mg (0.14 mmol) von l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyri l-l-yl)-2-oxo- 6,9,12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-säure in 2.60 ml DMF unter Argon wurden 16.9 mg (0.13 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 50.0 mg (0.13 mmol) HA TU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 40.0 mg (0.05 mmol) S■ [2-{ {(1 R)- -Benzyl-4-(2,5■ difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl} {[(3R,4R)-4-fli[or-l- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi}pynOlidin-3- yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein (Iniennediat C107) hinzugegeben und das Gemisch über Nacht bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dicnlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurdemittels präp. HPLC gereinigt Man erhielt 10 mg (13 % d. Th., Reinheit 82%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 1145 (M+H)+.
Eine Lösung von 10.9 mg (7.8 mmol, 82% Reinheit) S-[2-( {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [(3R,4R)-4-fluor- 1 - { [2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}pyrroli^
dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -y])-2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]- L-cystein in 0.85 ml 2,2,2-Trifluoroefhanol wurde mit 4.3 mg (0.03 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 "C gerührt. Anschließend wurden 9.1 mg (0.03 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 2.3 mg ( 2.6 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 781 (M+H-CF3C02H)"h.
Intermedia! F314
Trifluoressigsäure 3- {[2-({(lR)-l-[l -Benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrroI-2-yi dimethylpropyl} { [(3S,4R)-4-fluoroyrrolidin-3-yl]methyl) armno)-2-oxoethyl]sulfanyl} -N-(2- {[(2,5^oxo-2,5-dmydro-lH^yirol-l-yl)ace1yi]ammo} ethyl)propanamid
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.04 mmol, ) von 3- {[2-({(^) 1-ΒεΓ^1-4-(2,5-άιί^θ 1ιεηνί)- l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R, 4R)-4-fluor-l - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} pyrroiidin-3-yl]niethyl}amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propansäure (interniediat C106) in 3.14 ml DMF unter Argon wurden 16.89 mg (0.13 mmol) N.N-diisoprylethylamin und 33.13 mg (0.087 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerühr Anschließend wurde eine Lösung von 27.29 mg (0,09 mmol) N-(2-Arninoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 :1 )Trifluoressigsäure (Interaiediat LI) hinzugegeben und das Gemisch 15 Minuten bei RT gerährt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlomiethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiunisuifat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurdemitiels präp. HPLC gereinigt Man erhielt 41 mg (68 % d. Th, Reinheit 66%.) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.55 min; MS (ESIneg): m/z - 959 (M-H+Na)". Eine Lösung von 41.1 mg (0.03 mmol, Reinheit 66%) 2-(Trimethylsiiyi)ethyl-(3R,4R)-3-[2- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - ί 4-(2,5- dioxo-2,5-dihydiO- lH-pyrrol- 1 -yl)-3,8, 13 -trioxo-5-thia-2,9, 12-triazatetradec- 1 -yl]-4- fluorpyrrolidin- 1 -carboxylat in 2.54 rnl 2,2,2-Trifluoroeihanol wurde mit 24.7 mg (0.18 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 53.0 mg (0.18 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 30 mg ( 36 % d. Th ) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): Rt 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H-CF3C02H) ". Iratennediat F315
S- {2-[(3-Ammo ro l){(lR) -[l-benzyl-4-(2,5-difluo hen ί)-ίH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} ammo]-2-oxoethyl} -N- {3-[5-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino} ethyl)-i,2,4-oxadiazol-3-yljpropanoyl}-L-cystein
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.07 mmol) von 3-[5-(2-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihydiO-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino} ethyl)-l,2,4-oxadiazol-3-yl]propaiisäi!re (Intermediat L100) in 3,5 ml DMF unter Argon wurden 18.02 mg (0.14 mmol) N, ~diisoprylethylamin und 31.82 mg (0.09 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 50.0 mg (0.07 mmol) N-(2-Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-].H-pyiTol-l - yl)hexanamidacetat (1: 1) (Intermediat C107) hinzugegeben und das Gemisch 2h bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 49 mg (21 % d. Th, Reinheit 31 .) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.30 min; MS (ESIpos): m/z - 1022 (M+H)+.
Eine Lösung von 49.0 mg (0.035 mmol, 31% Reinheit) S-(i 1 - {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difiuorpheny1)4 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dim
siiatrid.eca.n43-yl) -N- {3-[5-(2- { [(2,5 -dioxo-2,5-dihydro 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino} ethyl)- 1 ,2,4- oxadiazol-3-yl]propanoyl}-L-cystein_in 0.5 ml 2,2,2-Trifiuoroetha.noI wurde mit 8.0 mg (0.06 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 17.2 mg (0.06 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mitteis präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 3 mg ( 21 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode l ): t = 0.91 min; MS (ESTpos): m/z - 877 (M+H-CF3C02H)+.
Intermediat F316
Triüuoressigsäuxe-N-{2-[ß^
dimethylpropyl} {[(3S,4R)-4-rluoφyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoetiiyl]sulfarjyl}propanoyl)amino]ethyl} -6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)hexanamid (1 : 1)
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.04 mmol, 65% Reinheit) von 3-{[2-({(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5- difluorphenyl)-] H-pyrrol-2-yi]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R, 4R)-4-f-uor-i- {[2-(trimethylsilyl) ethoxy ] carbony I } Pyrrolidin- 3 -yljmethyl } amino)-2 - oxoethyl] su lfany 1 } propansäure (Intermediat 106) in 3.0 ml DMF unier Argon wurden 16.89 mg (0.13 mmol) Ν,Ν-diisopiylethylamin und 33.13 mg (0.087 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Ansehließend wurde eine Lösung von 37.2 mg (0.09 mmol, Reinheiete 70%) N-(2- Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydiO- 1 H-pyrrol- 1 -yljhexanamidacetat (1 : 1) (intermediat L73) hinzugegeben und das Gemisch 7 Minuten bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlorniethan extraliiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 57 mg (77 % d. Th, Reinheit 59%.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.60 min; MS (ESIpos): m/z - 981 (M+H)+.
Eine Lösung von 56.0 mg (0.03 mmol, 59% Reinheit) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3-[2- {(lR)- 1 -[ 1 -benzyi-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} - 18-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH^yrrol-i -yi)-3,8,13-trioxo-5 hia-2,9,12-triazaoctadec-i -yl]-4-fluorpyrrolidin- 1-carboxyiat in
2.8 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 36.0 mg (0.2,7 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 78.3 mg (0.27 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp.
HPLC gereinigt. Man erhielt 16 mg ( 44 % d. Th., 85% Reinheit ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 837 (M+H-AcOH) .
Intgnngdjat F317
3 -[(S- {2-[(3 -Aminopropyl) {( 1 R)- 3■{ 1 -benz l-4-(2,5-diflu^henylHH^yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } amino]-2-oxoethyl} -N-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yi)-2, 18-dioxo-
6,9,12J5-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl)amino]-3,6,942-tetraoxapentadecan-15^ säure -trifluoressi säure (1 : 1)
Unter Argon wurden 30.2 mg (0.06 mmol) N,N'-Bis[(berizyloxy)carbonyl]-L-cystin in 2.0 mL Wasser und 2.0 mL iso-Propanol vorgelegt und mit 56,7 mg (0.20 mmol) TCEP versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Es wurden dann 50,0 mg (0.08 mmol) 2-
dimethylpropyI}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 2.0 mL iso- Propanol und 122.2 mg (0.48 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Dann wurden nochmals 122.2 mg (0.48 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C geröhrt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarborjat-Lsg. extrahiert und mit ges. NaCl-Lsg, gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rüeksiand wurde mittles präp, RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.1 mg (64 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(1 R)- 1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- 1 H^yrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2»dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,i 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 851 (M+H)+.
Unter Argon wurde S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrroi-2-ylj-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N- [(benzyloxy)carbonylj-L-cystein (50.0 mg, 59 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF gelöst und mit N,N- Diisopropylethylamm (20.5 μΐ, 117 μηιοΐ) und HATU (26.8 mg, 70 μπιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min nachgeröhrt. Tert-Butyl-1 -amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-oat (22.6 mg, 70 μηιοί) wurde dann gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde nachgeröhrt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; Ι Ομ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 59.3 mg (87.5 % d. Th.) der Verbindung tert- Butyl- 1 -({S-(l 3 - {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-diflu(^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dimetlrylpropy] } - 2,2-dimethy3-6,12~dioxo-5~oxa-7, l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L- cysteinyl} amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.97 mm; MS (ESIpos): m/z - 1154 [M+HJ+
Unter Argon wurde Palladium(II)acetat (6.74 mg, 30.0 μηιοΐ) in 3,0 ml Diehlorrnethan vorgelegt und mit Triethylamin (13 μΐ, 90 μπιοΐ) und Triethylsilan (96 μΐ, 600 μπιοι) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min geröhrt und dann, mit tert-Butyl-l-( {S-(l l- {(lR)-l-[l -benzyl-4- (2,5-difluo henyl)-lH yπΏl-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1- diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cysteinyl} amino)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-oat (69.3 mg, 60.0 μητοΐ) in 1.0 ml Diehlorrnethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT nachgerührt und dann mit Triethylsilan (48 μΐ, 300 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stimde bei RT nachgerührt und mit 2.0 ml Wasser (0,1%TFA) versetzt. Das Lösemittel wurde im Vakuum ohne Erwärmen verdampft. Der Rückstand wurde in Aceonitril aufgenommen, durch einen Spritzenfilter filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 lvmin, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 65.9 mg (97 % d. Th.) der Verbindung Trifluoressigsäure tert-butyl-1- f[S-(l 1-{(1R)-1-[1- benz l-4-(2,5-difluorplienyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimetliyIpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7,1 l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteii!yl]amiDo}-3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat (1 : 1). LC-MS (Methode 1): R, - 1.22 min; MS (ESIpos): m/z - 1020 [M+H]+
Unter Argon wurde 1 -(2,5-Dioxo-2,5-d!hydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-2-oxo-6,9, 12, i 5-tetraoxa-3- azaoctadecan- 18-säure (4.26 mg, 10.6 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit N,N- Diisopropylethylamin (3.2 μΐ, 18 μηιοΐ) und HATU (4.02 mg, 10.6 μηιο1)ν6Γ8εΐζΙ, Die Reaktionsmischung wurde 10 min gerührt und dann mit Trifluoressigsäure tert-bulyl-l- {[S-(l l- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-py
dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-siiatridecan- 13-yl)-L-cysteinyl]amino} -3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15- oat (1:1) (10.0 mg, 8.82 μπιοΐ) in 1.0 ml DMF und Ν,Ν-Msopropyiethylamin (1 ,5 μΐ, 8.8 versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei RT nachgerährt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosit 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.9 mg (93 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyi-i -({S-( i 1 - {(1R)~ 1 -[ 1 - benzyl-4-(2 ,5 -difiuorphenyl)- 1 H- pyrroi-2 -vi] -2
7, 3 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- IH-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-
6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-yi]-L-cysteinyl} amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-oat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.44 min; MS (ESIpos): m/z - 1404 [M+Hf
Tert-Butyl -({S-(l l- {(lR)-l-[l-ber^l-4-(2,5-dmuo henyi)-lH-pyrrol-2- l]-2^- dimethylpropyl} -2,2-dirnethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18~yl]~L~
cysteinyl} amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat (8.20 mg, 5.84 μτηοΐ) wurde in 2.0 Trifluorethanol gelöst und mit Zinkchlorid (4.77 mg, 35.0 μητοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 50°C gerührt.
Zinkchlorid (4.77 mg, 35.0 μ.ηιοί) wurde versetzt und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 50°C nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (10.2 mg, 35.0 μηιοΐ) versetzt, 10 min geröhrt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 1 0μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.1 mg (53 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 1204 [M+Hf Intermediat F318
Trifluoressigsäure 3- {[2-([3-ainmo-4-fluorbutyl] {(lR)-l-[l-beiizyl-4-(2,5-difluoiplienyi)-lH- pyrrol-2-yl]-2^-dimethylpropyl} amino)-2-oxoe&yl]sulfanyl^
pyTrol-l-yl)acet l]amino}ethyl)propanamid (1 : 1)
(1R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dimethy lpropan- 1 -arrrin ( 124 mg, 350 μτηοΐ) (Intermediat C52) wurde in 5.0 ml Dichlormethan vorgelegt und mit atriumiriacetoxyborhydrid (104 mg, 491 μηιοΐ) und Essigsäure (23 μΐ, 400 μπιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min bei RT gerührt und dann, mit tert-Butyl-[l-£luor-4-oxobutan-2- yljcarbamat (82.7 mg, 403 μιτιοΐ) (Intermediat LI 23) in 3.0 ml Dichlormethan gelöst versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und dann, mit Ethylacetat versetzt. Der Ansatz wurde zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridiösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säuienchromatographie über Biotage fsolera (SNAP 25g) mit Cyciohexan Ethyiacetat 95:5 als Eiuent gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 146 mg (77 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-[4-( {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrroi-2- yl]-2,2-dimethylpropyi} amino)- 1 -fluorbutan-2-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 13): Rt - 2.57 mm; MS (ESIneg): m/z - 588 [M+CHOOH-H]"
Tm-Butyl-[4-({(lR)- l -[l -benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH-pyriOl-2-yl]-2,2- dimethy]propyl}amino)- l -fluorbutan-2-yl]carbamat (100mg, 1 84 μ-ηοΐ) wurde in 6.0 ml DCM gelöst und mit Triethylamin (85 μί, 610 μπιοΐ) und Chloracetylchlorid (47 μΐ, 590 μιχιοΐ) bei 0°C versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Aceonitril/Wasser aufgenommen und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCNAVasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 80 mg (70 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-{4-[{(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- iH-pyrroi-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (chlordcetyl)amino]-l-fluorbutan-2- yl}carbamat.
LC-MS (Methode 12): R, - 2.67 mm; MS (ESIneg): m/z - 664 [M-H+COOH]"
Teri-Bu!yl- {4-[ {(lR)-1 1 -benzyl-4-(2,5-difluo 3henyl) H-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethyipropy!}(c oracetyl)animo]-l -fluorbutan-2-yl}carbamat (79.2 mg, 128 μιηοΐ) und 3- Sulfanylpropansäure (12 μΐ, 340 μηιοί) wurden in 3.0 ml Methanol mit einem Tropfen Wasser vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde mit Kaliumcarbonat (61.8 mg, 447 μ.ηιοί) versetzt und 4h bei 50°C nachgerührt. Der Ansatz wurde mit Ethyl Acetat versetzt und mehrmals mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 68.6 mg (78 % d. Th.) der Verbindung 9- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-6-(fluormethyl)-2,2-dime
diazapentadecan-15-säure.
LC-MS Methode 12): Rt - 2.46 min; MS (ESIneg): m/z - 688 [M-H]"
9- {(1R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -6-(fluoraiethyl)- 2,2-dimethyi-4,10-dioxo-3-oxa- 12-thia-5,9-diazapentadecan-15-säure (15.0 mg, 21.7 μπιοΐ) und Trifluoressigsäure N-(2-aminoethy])-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : 1) (8.12 mg, 26.1 μηιοΐ) (Intermediat LI) wurden in 1.6 ml DMF vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde mit HATU (9.92, mg, 26.1 μηιοΐ) und mit N,N-Diisopropylethyiamin (11 μΐ, 65 μηιοΐ) versetzt und 5 min bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser (0, 1 %TFA) versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; Ι Ομ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.6 mg (98 % d. Th.) der Verbindung terl-Butyl-[13- f(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropy 1} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)- 17-fluor-2,7, 12-trioxo- 10- thia-3 ,6,13-triazaheptadecan- 16-yl jcarbamat.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.36 min; MS (ESIpos): m/z - 869 [M+H]+ Tert-Bulyl-[13- {(lR)-l-[l-ben-yl^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 3 H-pyrrol-1 -y^
yijcarbamat (17.0 mg, 19.6 μπιοΐ) wurde in 2.0 ml Trilluoreihanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkehlorid (16.0 mg, 1 17 μπιοΐ) versetzt und 1 Stande bei 50°C gerühr Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (16.0 mg, 117 μπιοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin- ,N,N',N'-tetraessigsaeure (68.6 mg, 234 μηιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0, 1 %TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 2,50x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /W asser, 0.3 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 10.7 mg (60 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 14): Rt - 5.51 min; MS (ESIpos): m/z = 769 [M+H]+ Intermediat F319
N-(3-{[2-({(lRH -[ l -Ber^M-(2 difl^^^
(2, -dioxo-2,5-dihydro- 3.H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} ainirio)propyl]amirio)-2- oxoeth ljsulfanyl } propanoyl)-beta-alanyl-L-asparaginsäure
Unter Argon wurden N-[6-(2,,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 3 -yl)hexa.noy1]-L-valyl-N-[3~( {
carboxyethyl)amino]-3-oxopropyi}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninarnid (9.80 mg, 9.88 μ-ηοΐ) (Intermedia! Cl 16) und Di-tert-butyl-L-aspartathy\iroehlorid (1 : 1) (3.34 mg, 1 1.9 μηιοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 1 1.9 μιτιοΐ) und Ν,Ν-Diisopropylethylamin (5.2 μΐ, 30 μπιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT nachgerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.5 mg (87 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyi-N-(3- {[2-({(lR)-l-[l- beiiz l-4-(2,5-dffluo^henyi)-lH-^
dihyxiro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} amino)propyl]arnino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-aspartat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.33 min; MS (ESIpos): m/z - 1219 [M+H]+
Di ert~butyl-N~(3 - { [2-( { ( 1 RH ^
dimethylpropyl} [3-( {N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 ~yl)hexanoyl J-L-valyl-L- alanyl } amino)propyl]amino)-2-oxoethyl]sul any }propanoyi)-beta-aiany3-L-aspartat (9.70 mg, 7.95 μηιοί) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (6.50 mg, 47.7 μ.ηιοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (6.50 mg, 47.7 μπιοΓ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Etiiylendiamin-N,N,N\N'-tetraessigsaeure (2,7.9 mg, 55.4 μπιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 4.10 mg (47 % d. Th.) der tilel Verbindung. LC-MS (Methode 1): R, = 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 1107 [M+Hf
Intermediat F320
N- [6- (2,5 - Dioxo-2,5 - dihydxo- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valy l-N-[3-( { ( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5 - difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yί]-2,2-dimeΐhylpropyί} {[(3- {[(lS)-l ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)sulfanyl]acetyl} amino)propyl]-L-alaninamid
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l -yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-( {(lR)- l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy]propyl} {[(2- earboxyethyl)suifanyl]aeeiyi} aniino)propyi]-L-alaninamid (20.0 mg, 21.7 μηιοΐ) (Intermediat C115) und di-iert-butyl-L-giuiamathydroc orid (1 : 1) (7.71 mg, 26.1 μιηοΐ) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (9.91 mg, 26.1 μηιοΐ) und N.N-Diisopropylethyiamin (11 μΐ, 65 μτηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; ίθμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.4 mg (65 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyi-(2S)-2- {[(13S,i 6S)-7- {(lR)-l -[i- berizyl-4-(2,5-difiuo^henyl)-lH^ TO
pyrrol- 1 -yl)-l 6-isopropy 1- 13-methyl-6, 12,15,18- tetraoxo-4-thia-7, 11 , 14, 17-tetraazairicosan- 1 - oyl] amino } pentandioat.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.40 min; MS (ESlpos): m/z - 1162 [M+H]+
Di-tert-butyl-(2S)-2- {[(13S,16S)-7- {(lR)-l
dimethyipropyl}-23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrro
tetraoxo-4-thia-7,l l , 14,r7-tetraazatricosan- 3 -oyl]amino}pentandioat ( 14.7 mg, 12.6 u ol) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (10.3 mg, 75.9 μιηοί) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkehlorid (10.3 mg, 75.9 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamm- ,N,N',N'-tetraessigsaeure (44.4 mg, 152 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1 %TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 6.0 mg (45 % d. Th.) der titei Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.10 min; MS (ESIneg): m/z - 1048 [M-H]"
Intermediat F321
N-(3-{[2-({(lR)-l -[ l -BOTzyl-4 2,5-difluorphenyl) H^yrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl^
(2,5-dioxo-2,5-dihy<ko H^yrrol-l-yi)hexanoyl]-L-valyli-alanyl}amino)propyl]amino)-2- oxoeth ljsulfanyl } propanoyl)-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-iH-pyrrol-l-yl)hexanoyi]-L-valyl-N-[3-({(lR)- 1 -[1 -benzyl~4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl]-2,2 -dimeth ipropyl} [( { 3 - [(2 - carboxyeihyl)amrno]-3-oxopropyl) suifanyl)aeetyl]amino)propyl]-L-alaninamid (9.80 mg, 9.88 μιηοί) (Intermediat C116) und Di-tert-butyl-D-glutamathydrochlorid (1: 1) (3.51 mg, 11.9 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 11.9 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (5.2 μΐ, 30 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.7 mg (96 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-N-(3-{'[2-({(lR)-l-[l - 06η^1-4-(2,5-άΐ0υο η6ηγ1)-1Η^^ dihydro- lH-p rrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl } amino)propyl]amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoy])-beta-alanyl-D-glutamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 1233 [M+H]+
Di4ert-bu!yi-N-(3- {[2^
dimethylpropyl } [3-( {N- [6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 3 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl}ammo)propyl]ammo)-2-oxoethyl]sulfanyl}pro^ (11.5 mg,
9.32 μηιοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsniisehung wurde mit (7.62 mg, 55.9 μτηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsniisehung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (7.62 mg, 55.9 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Etliylendiamin- jIsijN'jN'-tetraessigsaeure (32.6 mg, 112 μπιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1 'T'FA) versetzt und anschiießend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisier Man erhielt 6.5 mg (62 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode l ): Rt = 1.07 min; MS (ESTpos): m/z - 1 121 [M+H]+
IntennedMjLF322
N-(3-{[2-({(lR)-l -[l -Benzyi-4-(2,5-difluorphenyl) H-pyiToi-2-yl]-2,2-^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yi)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} amino)propyl]ammo)-2 oxoeth l]suifanyl}propanoyl)-beta-alanyT-L-glutaminsäure
Unter Argon würden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pytrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-vatyt-N-[3-( {( 1R)- l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime1hylpropyl} [({3-[(2- carboxyethyl)amino]-3-oxopropyl}sulfanyl)acety^ (9.80 mg, 9.88 μ-ηοί) (Intermediat C116) und Di-tert-buiyl-L-glutamathydrochlorid (1 : 1) (3.51 mg, 11.9 μηιοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 1 1.9 μηιοΐ) und N,N»Diisopropylethylamin (5.2 μΐ, 30 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wui'den im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1.3 mg (93 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-N-(3- {[2-({(lR)-l -[l - benzyl-4-(2,5-difluoiphenylH
dihydro-lH-pyirol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} amino)propyl]amino)-2- oxoethyl]sul anyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-glutamat.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.34 min; MS (ESTpos): m/z - 1233 [M+H]+
Di-tert-bu1yl-N-(3- {[2-({(lR)-l-[l-berizyl-4-(2,5-difluorphenyl)-m-pyrrol-2-yl]-2,2
dimethylpropyl} [3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl} amino)propyi]amino)-2-oxoethyl]suifaDyl } propanoyl)-beta-alanyl-L-glutamat ( 1 1.0 mg, 8.92 μηιοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (7.29 mg, 53.5 μηιοί) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (7.29 mg, 53.5 μτηοΐ) versetzt und 1 Stande bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendia.inin-N,N,N',N'-teiraessigsaeure (31.2 mg, 107 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0, 1 %TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 5.10 mg (51 % d. Th.) der titel Verbindung. LC-MS (Methode 1): Rt - 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 1121 [M+H]+
Ilttgnnediat_F323
N-[6-(2,5-moxo-2,5-dihydro-m-p rrol- l -yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({[(3- {[(lR)-2-(L-beta- asparagylaniino)-l-carboxyethyl]amino} -3-oxopropyl)sulfanyl]acetyl} {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH-p rrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} amino)propyl]-L-alaninamid trifluoressigsäure (1 : 1)
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-d!hydro-IH-pyrrol-l-yl)hexanoyi]-L-valyl-N-[3-({(lR)- l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo hen l) H Iτol-2-yl]-2,2-dimelll l ropyl} {[(2- carboxyethyi)sulfanyl]acetyl}a!runo)propyl]-L-alaninamid (10,0 mg, 7.05 μιηοΓ) (Intermediat Cl 15) and tert-Butyl-N- {(2R)-2-ammo-3-oxo-3-[2-(trimetiiylsilyl)ethoxy]propyi} - 2-(tert- butoxycarrx>nyl)-L-asparaginat (4.02 rng, 8.46 μηιοΐ) (Intermediat LI 24) in 2.0 rnl DMF vorgelegt und mit HAITI (3.22 mg, 8.46 μιηοΐ) und N,N-Diisopropyletliylamin (3.7 μΐ, 21 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 4.3 mg (32 % d. Th.) der Verbindung 6-tert-Butyl-l l -[2-
yl]-2,2-dinKthylpropyl}-35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-
4,8,13,18,24,27,30 -eptaoxo-3-oxa 6 lna-5,9,12^
dicarboxylat.
LC-MS (Methode 5): Rt - 5.32 min; MS (ESIpos): m/z - 1379 [M+Hf 6 ert-Butyl 1 2-(tnmetl silyl)ethyl]-(6S,l lR,25S,28S) 9-{(lR)^
difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl}-35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- yrrol-l-yl)- 28-isopropyi-2,2^5-1rimethyl-4,8,l3,l8^4,27,30-heptaoxo-3-oxa 6-thia-5,9,l 2,l9,23,26,29- heptaazapentatriacoritan-6,1 1-dicarboxylat (4, 10 mg, 73 % Reinheit, 2.37 μτηοΓ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid ( 1.77 mg, 13.0 μηιοΐ) versetzt und 3 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmiscliung wurde noch fünfmal mit Zinkchiorid (1.77 mg, 13.0 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethy3e:ndiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (22.0 mg, 78 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: SO mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 2.1 mg (69 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.98 min; MS (ESIpos): m/z - 1122 [M+H]+
Intermediat F324
S-[2-({(lR)- 3 -[ 3 -Benzyl-4-(2,5-difluo^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [pyrrolidm ylmethyl]amino)-2-oxoethyl]-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-6,9,l 2,15- ietraoxa-3-azaociadecan-18- l]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Isomer 1)
Unter Argon wurde l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pynOl-i-yl)-2-oxo-6,9,12,l 5~tetraoxa-3~ azaoctadecan- 18-säure (99.6 mg, 247 μηιοΐ) (intermediat L74) in 1.4 ml DMF vorgelegt und mit HATU (90.4 mg, 238 μηιοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (41 μΐ, 240 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und mit S-[2-( {(1 R)- 1 -[1 -Benzyl-4-(2,5- difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yl]methy3}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein (70.0 mg, 95.2 μητοΐ) (Intermediat C90) in 1.4 ml DMF gelöst versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL rnin, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 19.0 mg ( 18.4 % d. Th.) der Verbindung S-[2- ({(1R)- 1 1-Β6ηζγ1-4-(2,5^ΑυοφΚ6ηγ1) Η- ττο1-2-γί]-2,2-άΐ™β ί Γο γ1} {[(3R)- 1 -(tert- butoxycarbonyl pyrroiidin-3 -yl]methyl} amino)-2-oxoethyl]-N- [ i -(2,5-dioxo-2,5-dihydro 1H- pyrrol- 1 -yl) -2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3- azaoctadecan- 18-ylj-L-cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.29 mm; MS (ESIpos): m z - 1082 [M+H
S-[2-({(lR)~l -[l -Benzyl~4-(2,5-diüuorpte
butoxyearbonyl)pyrrolidin-3-yi]methyl} amino)-2-oxoethyi]-]Si-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH~ pyrrol- 1 -yl)-2,l 8-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-yl]-L-cystein (17.0 mg, 15.7 μιτιοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorefhanol gelöst. Die Reaktionsmiscliung wurde mit Zinkchlorid (8.56 mg, 62.8 μηιοί) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (8.56 mg, 62.8 umol) versetzt und 2 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin- ,N,N',N'~tetraessigsaeure (36.7 mg, 126 μητοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.90 mg (22 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 983 [M+H]+
Intermediat F325
N-[2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(IR)-i -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl]-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]-D-alpha-glutamin -triiluoressigsäure (1 : 1)
30 mg (0.046 mmol) von Intermediat C58 wurden mit 2,9 mg (0.055 mmol) Trifluoressigsäure - benz l-N-(2-aminoe1hyl)-N2-[(berizyloxy)carboi!yi]-D-aipha-glutemm (1 : 1) in Gegenwart von 1.5 Equiv. HATU und 3 Equiv. Λ/Α'-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC mirden 39.5 mg (82% d.Th.) des geschützten Intennediats erhalten. Von diesem wurden zunächst hydrogenolytiseh die Benzylestergruppen abgespalten. Die anschlieiknde Kupplung mit ].- {2-[(2,5-DioxopyiTolidin- l -yl)oxy]-2-oxoethy] }-lH-pyiTol-2,5-dion in DMF in Gegenwart, von 3 Equiv. N,N-Diisopropyletliylamm sowie die Abspaltung der Teoc-Schutzgrappe mit Zinkchiorid in Trifluoretiianol wie in Intemiediat F l 19 führte dann in 2, weiteren Schritten zur Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): R - 1.44 mm; MS (ESIpos): m z - 822 ·>! · I i ) .
Intermediat F326
N 2-({(2S)-2-Am!no~4-[ {(lR)~l -[i -benzyi~4-(2^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}an
trifluoressigsäure ( 1 : 1 )
43 mg (0.066 mmol) von intemiediat C58 wurden mit 57 mg (0.077 mmol) Intemiediat L125 in Gegenwart von 1.5 Equiv. HATU und 4 Equiv. 4-Methylmorpholin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 27 mg (34% d.Th.) des geschützten Tntermediats erhalten. Dieses wurde anschließend mit Zinkchiorid in Trifluoretiianol wie in Intemiediat Fl 19 beschrieben in die Titelverbindung überfuhrt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.83 min; MS (ESIpos): m/z - 805 und 807 (M+H)4. B: Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADO
Die anti-CD 123- Antikörper wurden durch CDR -Umsetzung („CDR grafting") erhalten. Die Sequenz des 7G3 Antikörpers (EP2426148) stellt den Ausgangspunkt der humanisierten Antikörper wie z.B. TPP-5969 und TPP-5971 dar. Bispezifische scFv Immuno fusionsproteine basierend auf 12F1 werden in WO 2013/173820 offenbart. Basierend auf der Veröffentlichung der Sequenzen der variablen Regionen (VH und VL) von 12F1 (WO 2013/173820) wurden folgende Antikörper- Sequenzen durch Fusion der variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins (VH und VL) mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers erhalten. Eine cliimäre Varianten des 12F1 wurde generiert.
Humanisierung
Die murine Antikörpersequenz des 7G3 Antikörpers wurde durch Umsetzen der CDRs in ein humanes Antikörpergerüst humanisiert. Zur Definition der CDRs nach Kabat, siehe Andre CR. Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains" in Antibody Engineering (Springer Lab Manuals), Eds.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer- Verlag, Heidelberg. Nach dem Vergleich der murinen Rahmensequenzen (ohne CDRs) mit humanen Keimbahnsequenzen wurde eine ähnliche, häufig vorkommende humane Rahmensequenz ausgewählt. In diesem Fall handelt es sich um die schwere Kette IGHV1 -46-01 mit der J-Sequenz IGHJ4-03, sowie die leichte Kette IGKV4-1 -01 mit dem J-Segment TGKJ2. Die Keimbahnsequenzen stammen aus der VBASE2 Datenbank: (Retter I, Althaus HH, Münch R, Müller W: VBASE2, an integrative V gene database. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1; 33(Database issue):D671-4). Die Benennung der Sequenzen erfolgte nach dem IMGT System (Lefranc, M.-P., Giudicelli, V., Ginestoux, C, Jabado-Michaloud, J., Folch, G., Bellahcene, F., Wu, Y ., Gemrot, E., Brochet, X., Lane, J., Regnier, L., Ehrenmann, F., Lefranc, G. and Duroux, P. IMGT©, the international ImMunoGeneTics Information System®. Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009); doi: 10.1093/nar/gkn838). Die hier beschriebenen Antikörpervarianten TPP-5968, TPP-5969 und TPP-5971 tragen verschieden, von der humanen Keimbahnsequenz abweichende Einzelmutationen, die deren Eigenschaften beeinflussen können. B-2. Allgemeines Verfahren zur Expression von Anti-CD 1.23 Antikörpern in Säugerzeilen
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-6013 und TPP-5969 wurden in transienten Säugerzellkuliuren produziert, wie von Tom et al, Kapitel 12 in Methode Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben.
B-3. Allgejneings Ver^^
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-6013 und TPP-5969 wurde aus den Zellkulturüberständen gewonnen. Die Zellüberstände wurden durch Zentrifugation von Zellen geklärt. Anschließend wurde der Zellüberstand durch Affini täts Chromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wurde die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich) equillibriert, der Zellüberstand aufgetragen und die Säule mit ca 3 0 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper wurden in 50 mM Natriumacetat pH 3.5 + 500 mM Natriumchlorid eluiert und anschliessend durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Helthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt.
Die Antikörper wurden weiterhin über ihre Bindungsaffinität an lösliches lL3Ratpha (bezogen von R&D Systems) mittels BlAcore- Analyse charakterisiert. Um die Zellbindungseharakteristika der anti-CD123 Antikörper zu bestimmen, wurde die Bindung mittels Durchflusszytometrie an CD123- positiven Krebszelllinien(MOLM-13, THP-1) gemessen.
B-4. Ajlj ernej e^
In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: Anti-CD123 AK1A (TPP-5969) Anti-CD123 AKJB (TPP-5971 ) Anti-CD123 AKic (TPP-6013) Anti-CD ! 23 AKlD (TPP-5968)
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 rng/iiiL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 1h bei T gerührt Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5- 10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinrmid- Vorläufer- Verbindung oder Halogenid- Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSÖ hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde bei Maleinirnid-Precursern 60-240 min bei RT und bei Halogenid-Precursern zwischen 8 und 24 h bei RT gerührt und anschließend über in PBS equiJlibierte PD 10-SäuJen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach .Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 mL PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine .Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durcligeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zuiückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/'iriL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausfuhrungsbeispieien jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
Die in den Beispielen dargestellten ADCs können in Abhängigkeit vom Linker gegebenenfalls auch mehr oder weniger stark ausgeprägt in Form der hydrolysierten offenkettigen Bemsteinsäurearnide mit den Antikörpern verknüpft vorliegen.
Insbesondere die KSP-I-ADCs, die über die Linker-Substruktur
mit Thiolgruppen der Antikörper verknüpft sind, können auch ggf. durch Umpuffern im Anschluss an die Kupplung und ca. 20-24-stündiges Runren bei pH 8 gemäß Schema 26 gezielt in die die über offenkettige Berste ins äureamide verknüpften ADCs hergestellt werden.
#1 stellt die Schwefelbrücke zum Antikörper dar und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-Inhibitor
Solche ADCs, bei denen der Li nker über hydrolysierte offenkettige Bemsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegt, können gegebenenfalls auch gezielt nach einer exemplarischen Vorschrift wie folgt dargestellt werden:
Small Scale Kupplung:
Zu einer Lösung von 2-5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Pufifer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg mL und 20 rng/rnL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ml bis 15 mg ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxye1hyl)phosphin-Hydro- ehiorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis lh bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antiköipers in der in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorläufer-Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde 60-240 min bei RT gerührt und anschließend mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 3-7 ml verdünnt und über Nacht bei RT unter Argon gerühr Diese Lösung wurde dann über ei ne mit PBS-Puffer pH7.2 equill ibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH7.2 eluiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Medium scale Kupplung:
60 mg des betreffenden Antikörpers in 5 ml PBS-Puffer (c~12 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,344mg TCEP in Ι ΟΟμΙ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.003 mmol einer Maleinimid- Vorläuferverbindung gelöst in 600μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 1.5 -2h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1075 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equiilibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat wiffde mit PBS-Puffer pH8 auf ein Gesamtvolumen von 14 ml verdünnt. Diese Lösung wiffde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Dann erfolgte ggf. wieder ein Urnpuffern auf pH 7.2. Die ADC-Lösung wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH7.2) und dann ggf. erneut bis auf eine Konzen tration von etwa 10mg/mL aufkonzentriert.
Weitere potentiell hydrolyse-sensitive TManykuccirdmid-Brücken zum Antikörper in den Ausführungsbeispielen enthalten folgende Linker-Substrukturen, wobei #1 die Thioetherv erknüpf ung zum Antikörper und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP- Inhibitor darstellt:
Diese Linker-Substrukturen stellen die Verknüpfungseinheit zum Antikörper dar und haben (neben der weiteren Linkerzusammensetzung) einen signifikanten Einfluß auf die Struktur und das Profil der in Tumorzeilen gebildeten Metabolite. In den dargestellten Straktuiforrneln hat dabei AKJA, AKIB, AKIC u d AKID die Bedeutung: AKIA - Anti-CD123 AK!A (TPP-5969) (partiell reduziert)- S§' AK ΐίϊ = Anti-CD 123 AK]B (TPP-5971 ) (partiell reduziert)- S§ AKic = Anti-CD123 AKic (TPP-6013) (partiell reduziert)- S§ AKro - Anti-CD 1 23 AK1D (TPP-5968) (partiell reduziert)- S§
wobei
§ ' die Verknüpfung mit der Succinimid-Gruppe oder mit ggf. daraus entstandenen isomeren hydrolysierten offenkettigen Bemsteinsäureamiden bzw. des Alkylenrestes bedeutet, und
S für das Schwefelalom eines Cystein-Restes des partiell reduzierten Antikörpers sieht.
B-5. AUgemejngs_Vjr rra^
In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: Anti-CD123 AKIA (TPP-5969) Anti-CD123 AK]B (TPP-5971 ) Anti-CD123 AKic (TPP-6013) Anti-CD ! 23 AKlD (TPP-5968)
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg/mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 8 Äquivalente der zu kuppelnden Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer-Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD 1 -Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Losungen des entsprechenden ADCs in 3.5 L PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/niL eingestellt.
Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispieien jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/rnAh Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
In den dargestellten Strukturformeln haben dabei ΑΚΣΑ , AKJB, AK2C und AKZD die Bedeutung: AK2A = Anti-CD 123 AK- A (TPP-5969) - NH§2 A K - , - Anti-CD 123 AKlis (TPP-5971) - NH§2 AK.2C = Anti-CD123 AKlc(TPP-60i3) - NH§2 AK20 - Anti-CD123 AK!D (TPP-5968)■ NH§2
wobei
§2 die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und
NH für die Seitenketten- Aminogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht. B-6a. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von geschlossenem Succinimid-Cystein-Addukten:
In einer beispielhaften Ausführung wurden 10 μχηοΐ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen wurden in 3-5 mL DMF aufgenommen und mit 2.1 mg (20 μχηοΐ) L- Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen 2h und 24 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt.
Cy em-Ad l kten;,
In einer beispielhaften Ausführung wurden 68 μ.ηιοί der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen in 15 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (136 μητοΐ) -{[2- (Trimeihylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteia versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde ~20h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 131 μΙ_ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT geröhrt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden -50% d. Tb. der regioisomeren geschützten Interaiediate als farbloser Schaum erhalten.
Im letzten Schritt wurden 0.023 mmol von diesen regiosisomeren Hydrolyseprodukten in 3 mL 2,2,2-Trif!uorethanol gelöst. Es wurden 32.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C geröhrt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethyiendia.iiiin-N,N,N',N'~ tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden die hydrolysierten offenen Sulfanylbemsteinsäure- amide als Regioisomer engemisch erhalten.
Weitere Aufreinigung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen Konjugate
Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch iJltrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugat lyophilisiert werden. B-7, Bestimmung des Antikörpers, der Toxophorbeladung und des Anteils geöffneter Cystein- Addukte
Zur Protein-Identifizierung wurde neben der Molekulargewichtsbestininiung nach Deglykosilierung und/oder Denaturierung ein tryptiseher Verdau durchgeführt, der nach Denaturierung, Reduktion und Derivatisierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptischen Peptide bestätigt.
Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Konjugale in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung wie folgt bestimmt:
Die Bestimmung der Toxophor Beladung von Lysin-verknüpften ADCs erfolgte nach massenspektrometrisc er Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosyliert, die Probe angesäuert und nach HPLC-Trennung Entsalzung massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofq (Broker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion C romatogramm) wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt Deconvolution kalkuliert. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/Antibody Ratio) berechnet.
Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein-verknüpften Konjugalen wurde über Reversed-Phase-Chjomatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC- Lösung (lmg/mL, 50μΕ) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCi) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΐ,) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analy siert.
Die HPLC- Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.3 x! 50 mm, 8 uro particle size, 1000 Ä) bei einer Flussrate von 3 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 25 %B; 3 min, 25 %B; 28 min, 50 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden der leichten Kette mit einem Toxophor (LI) und den schweren Ketten mit einem, zwei und drei Toxophoren (Hl, H2, H3) zugeordnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch, die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnet, und wobei sich die HC-load aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnet In vereinzelten Fällen kann es vorkommen, dass die Toxophorbeladung aufgrund von Ko-Elutionen einiger Peaks nicht exakt möglich ist.
In den Fällen, in denen keine ausreichende HPLC-Trennung von leichter und schwerer Kette möglich war, erfolgte die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein verknüpften Konjugaten mittels massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette.
Zur ADC-Lösung (Img/mL, 50 ,L) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCl) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΕ) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C iiikubiert und massenspektrometrisch nach online Entsaltzimg mittels ESI- MicroTofq (Bruker Daltonik) analysiert.
Zur DAR-Bestimmung wurden alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnet, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnet.
Zur Bestimmung des Anteils des geöffneten Cystein-Addukts wurde das Molekulargewichtsflächenverhältnis vom geschlossenen und offenen Cystein-Addukt (Molekulargewichtsdelta l SDalton) aller einfach konjugierten leichten und schweren Kettenvarianten bestimmt. Der Mittelwert über alle Varianten ergab den Anteil des geöffneten Cystein-Addukts. B-8. Üba rüfu j^^
Die Bindefälligkeit des Binders an das Zieitnolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder Oberflächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen, beispielsweise für Antikörper -Konjugate mittels Proteinbestimmung, (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21:778-784 und Polson et al, Blood 2007; 1 102:616-623).
Ausführungsbcispiele Metabolite Beispiel Ml
8-[1-(2- {[2-({(28)-2-^ώο-4-[{(1Κ) -[1-0βη^1-4-(2,5-ώ1]υο Κ6ηγ1)-1Η-ργττοί-2-γ1]-2^- dimelhylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)emyl]amino} -2-oxoethyl)-2,5-dioxop rrolidin- 3-yl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
1.8 mg (2 μιηοΐ) von Intermediat F104 wurden in 1 ml DMF aufgenommen und mit 2.7 mg (22 μηιοί) L-Cy stein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Es verblieben 0.6 mg (26% d. Th.) der Titel Verbindung als farbloser Schaum.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.80 min; MS (EIpos): m/z = 814 [M+HJ Beispiel M2
4-[(2-{[2-a(2S)-2-Amino-4-[ {(iR)-i-[l-benzy
dimeihylpropyl}(glycoloyl)arnmo]ta
amino-2-carrx>xyethyl]sutfanyl} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
und
4~[(2~{[2-({(2S)-2~Amino~4-[ {(iR)~l-[l^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)eÜiyljammo} -2-oxoetiiyl)arnino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.80 min; MS (EIpos): m/z - 814 [M+Hf.
Zunächst wurde L-Cystein mit l -({[2-(Triniethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrTolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in N- {[2-(Trime1hylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- eystein überführt.
406 mg (1.53 mmol) N-{ [2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein wurden in 10 ml DMF gelöst und mit 157.5 mg (1.606 mmol) Maleinsäureanhydrid versetzt und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. 130 μΐ, dieser Lösung wurden mit 7.5 mg (0.03 mmol) von Intermediat C66 versetzt und der Ansatz 5 min bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Das Lösemeittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 10 mg (89%) des geschützten Intermedia^ erhalten, wobei weder im HPLC noch im LC-MS die Regioisomere aufgetrennt werden konnten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.38 min; MS (Eipos): m z - 1 120 [M+H]+.
Im letzten Schritt wurden die 10 mg von diesem Intermediat in 2 ml, 2,2,2-Trifiuorethano! gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 30 min bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin-N,N,NYN'-tetraessigsäiire zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitrii/Wasser wurden 8,3 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 87: 13 erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.3 min und 2.43 min; MS (ESlpos): m/z = 832 (M+H)+.
'H-NMR Hauptregioisomer: (500 MHz, DMSO-de): δ - 8.7 (m, 1H), 8.5 (m, 2H), 8.1 (m, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.5 (s, 1H) 7.4-7.15 (m, 6H), 6.9-7.0 (m, 1H), 6.85 (s, 1 H), 5.61 (s, 1H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 4.26 und 4.06 (2d, 2H), 3.5-3.8 (m, 5H), 3.0-3.4 (rn, 5H), 2.75-3.0 (m, 3! i L 2.58 und 2.57 (dd, 1H), 0.77 und 1,5 (2m, 2H), 0.81 (s, 9H).
Alternativ wurden die regioisomeren Titelverbindungen wie folgt hergestellt:
Zunächst wurde dazu L-Cyslein mit i-( {[2-(Trmiethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pynOlidine-2,5- dion in DMF in Gegenwart von /v'/v-Diisopropylethylamin in N- {[2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein überfuhrt.
55 mg (0.068 mmol) von Intermediat F 304 und 36 mg (0.136 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxyjcarbonyl} -L-cystein 15 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 Ii bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 131 μΕ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 37 mg (50% d. Th.) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 3.33 min und 3.36 min; MS (ESlpos): m/z = 976 (M+H)"h.
Im letzten Schritt wurden 25 mg (0.023 mmol) von diesem Intermediat in 3 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 32.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitrii/Wasser wurden 18.5 mg (85% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 21 :79 erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.37 min und 3.44 min; MS (ESlpos): m/z - 832 (M+H)+. Beispiel M3
4-[(2- {[(2R)-2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-H^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)-2-carboxyethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-3-
{[(2R)-2-aniino-2-carboxyethyl]sulfariyl}-4-oxobuiansäure -trifluoressigsäure (1 : 1) und
4-[(2- {[(2R)-2-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-l -[l-ben^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyi} amino)-2-carboxyethyl]ainino} -2-oxoethyl)ainino]-2- {[(2R)-2-aniino-2-carboxyeÜiyljsulfanyi}-4-oxobiiiansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Zunächst wurde L-Cystein mit l -({[2-(Trimethylsiiyl)etlioxy]carbonyl}oxy)pyrroiidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylarnm in N- { [2-(Trimetiiylsilyl)eihoxy]carbonyl} -L- cystein überführt,
11 mg (0.013 mmol) von Intermediat F193 und 8 mg (0.016 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxyjcarbonyl} -L-cystein wurden 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 h bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt.
Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 inL THF/W asser 1 : 1 gelöst. Es wurden 19 μΙ< einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Dann wurden nochmals 19 μΕ der 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde mit einer IM Salzsäure neutral gesteilt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 4.1 mg (38% d. Th.) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.03 min (breit); MS (ESIpos): m/z - 1020 ·>! · I i ) . Im letzten Schritt wurden 4.3 mg (0,004 mmol) von diesem Iniermediat in 3 mL 2,2,2- Tri luorethanol gelöst. Es wurden 3 mg (0.022 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 6 mg (0.022 mmol) Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure und 2 ml einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophil] sation des Rückstands aus Acetonitril/W asser wurden 5 mg (quant.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 20:80 erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 0.78 min (breit); MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H)+.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.36 min und 2.39 min; MS (ESIpos): m/z - 876 (M+H)+.
Beispiel M4
S-(l - {2-[2-({(2S)-2~Amino~4-[ {(lR)~l -[l^
dimethylpropyl} (glycoloyl)aminojbutanoyl} amino)ethoxy]ethyl} ~2,5-dioxopyrrolidm~3-y[)~L~ cystein -trifluoressigsäure (1 : 1 )
3 mg (4 μπιοΐ) von Intermediat F248 wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 0.9 mg (8 μιηοΐ) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingeengt und nach Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser verblieben 1.1 mg (32% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff.
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.78 min; MS (EIpos): m/z - 801 [M+Hf. Beispiel M5
(3R,7S)-7-Amino- 17- { [(2R)-2-ammo-2-carboxyethyl]s fanyI}-3-[^
lH-pyrrol-2-yl]-4-glycoloyl-2,2-dimethyl-8,l 6- !ioxo- 12-oxa-4,9, 15-triazanonadecan- 19-sä re trifluoressigsäure (1 : 1)
und
(3R ,7S)-7-Amino-l 8- {[(2R)-2-arnino-2-carboxyethyl]sulfanylj ~3~[I -benzyl~4-(2,5-difiuoiphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-4-glycoloyl-2^2-dimetliyl-8,l 6-dioxo- 12-oxa-4,9, 15-triazanonadecan- 19-säure trifluoressigsäure ( 1 : 1 )
8 mg (0.010 mmol) von der geschützten Zwischenstufe von Intermedia! F248 und 5.3 mg (0.02, mmol) N- {[2-(Trimethylsilyl) ethoxyjcarbonyl} -L-cystein 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerülirt und anschließend 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 mL THF7W asser 1 : 1 gelöst. Es wurden 15 ,uL einer 2M wässrigen LiihiumhydiOxidlösung zugegeben und der Ansatz 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure auf einen pH-Wert von ~3 eingestellt, mit 20 ml Kochsalzlösung verdünnt und zweimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. Es wurden 8.4 mg (78% d. Th. über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 1.44 min und 3.43 min; MS (ESIpos): m/z - 1107 (M+H)" .
Im letzten Schritt wurden 8 mg (0.007 mmol) von diesem Intermedia! in 5 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 9.8 mg (0.072 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1.5 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde Ethyiendia.min-N,N,N',N'-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 4 mg (59% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch im Verhältnis 31 :67 erhalten. LC-MS (Methode 1): R, - 0.79 min und 0.8 ! min; MS (ESIpos): m/z - 839 (M+H)+. Beispiel M6
2- {[(2R)-2-Amko-2-carboxye l]suIfe^^
difluorpiienyl)-lH-pyrrol-2-yl3- 15,15-dimethyl-2,7, i 2-trioxo- 10-thia-3,6,13-triazahexadec- 1- yl}amino)-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1:2) und
3- {[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-( {( 14R)-13-(3-aminopropyl)-14-[l-benzyl-4-i difiuo^henyl) H-pyrrol-2-yl] 5,15-dm
yl}amino)-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1:2)
18 mg (0.021 mmol) von Intennediat F213 und 3 1.2 mg (0.04 mmol) N-{[2-(Trimethy3si3yi) ethoxy]carbonyl} -L-cystein 2 m3 DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt Die Reaktionsmisehung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (21.2 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1: 1 gelöst. Es wurden 0.04 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunden bei RT gerührt Es wurden 0.02 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 7.2 mg (0.12 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 13 mg (57% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .03 min; MS (ESTpos): m/z - 1020 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 13 mg (0.01 mmol) von diesem Intermediat in 2 L 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.2 mg (0.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 7 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.3 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Produkt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 10.3 mg (81.4%) der Titelverbindung als Regioisornerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.03 min; MS (ESlpos): m/z - 875 (M+H)+.
Beispiel M7
S-(2- {[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {( l R)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)ammo]butanoyl}amino)ethyl]amino}-2-oxoethyl)-L-cystein trifluoressigsäu
6 mg (8 μιτίοΐ) von Intermediat Fi 19 wurden in 3 mL DMF aufgenommen und mit 1.8 mg (15 μηιοί) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt und dann 3 Tage bei RT stehen gelassen. Anschließend wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.81 min; MS (ESlpos): m/z - 717 (M+H . Beispiel M8
(3R)-6- { ( 11 S, 15R)- 11 -Amino- 15-[ 1 -benzyl-4-(2,5-dil luorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] - 14-glycoloyl- 16, 16-dimethyl-2,5,l 0-trioxo-3,6,9, 14-tetraazaheptadec- 1 -yl} -5-οχοί1ηοηιο ^1ϊη-3-03Γΐ5οη8§ΐ£Γ6 - trifluoressigsäure ( 1 : 1 )
4 mg (0,004 mmol) der Verbindung aus Beispiel 135 wurden in 4 mL THF/Wasser gelöst und mit 48 \xL einer 2moiaren wässrigen LithiumhydroxidlösuDg versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend eingeengl und mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung, Einengen und Lyophil] sation aus Acetonitril/W asser der entsprechenden Fraktionen wurden 2.4 mg (60% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (EIpos): m/z - 814 [Μ+Η . Beispiel M9
N-(3-Aminopropyl)-N-{(lR) 1 -benzyl-4-(2,5-difluo^
dimethy lpropy 1 } - 2 - hy droxy ac etamid
150.0 mg (0.42 mmol) (lR)-l-ί Be zyl-4-(2,5-d!ίluo he yi)-lH-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethylpropan- 1 -amin (Interniediat C52) wurden in 2.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 29.2 mg (0.49 mmol) HOAc und 125.6 mg (0.59 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid versetzt und 5 min bei RT gerührt. Es wurden 98.9 mg (0.49 mmol) 3-(l,3-Dioxo-l,3-dihydro-2H-isoindol-2- yl)propanal zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. Natriuraearbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsuifat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan Methanol 100: 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 188.6 mg (74 %) der Verbindung 2-[3-( {(1 R)- 1-[1 -Benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimeihylpropyl} aminojpropylj- lH-isoindol- 1 ,3(2H)-dion.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.00 min; MS (ESIpos): m/z - 541 [M+Hf.
171.2 mg (0.32 mmol) 2 3-({(lR) -[l-Benzyl-4-(2,S-difli^henyl) H-pyrroi-2-ylj-2,2- dimethylpropyi } amino)propyi] - 1 H-isoindol- 1 ,3(2H)-dion wurden in 5.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 73.6 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Bei 0 °C wurden 94.9 mg (0.70 mmol) Acetoxyessigsäureehlorid zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. atriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsuifat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 30 g SN AP, Fluss 12 niL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 :3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 159.0 mg (77 %) der Verbindung 2-( {(lR)-l- [l-Berizyl-4-(2,5-dfflu^he^
2H-isoindol-2-yl)propyl]amino)-2-oxoethylacetat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.35 min; MS (ESIpos): m z - 642 [M+Hf,
147.2 mg (0.23 mmol) 2~( {(l )-l~ i~Benzyl-4~(2,5~dlf^uo heny^
dimethylpropy1} [3-(l ,3-dioxo~l ,3-dihyd^
wurden in 4.0 mL Ethanol vorgelegt und mit 356.2 mg (4.59 mmol) Methanamin (40 % in Wasser) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 50 °C geröhrt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand dreimal mit Toluol kodestilliert. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan Methanol 10: 1 ) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 67.4 mg (63 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 470 [M+H]+. Beispiel MIO
(2R,28R)-28-Arrino-2-[({2-[(3-aminoprop^^
2-yl]-2,2-(HmeÜiylpropyl}ammo]-2-oxoethyl}sulfanyl)methyl]-25-(carboxy^
7, 10, 13, 16-tetraoxa-26-thia-3, 19,23 -triazanonacosan- 1 ,29-disäure -trifluoressigsäure (1 :2) und
(lR,28R,34R)-l-Amino-33-(3-aminopropyl)-34-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH
35,35-dimethy1-6,10,26,32-tetrao^
tetraazahexatriacontan- 1 ,4,28-tricarbonsäure -trifluoressigsäure ( 1 :2)
20 mg (0.018 mmol) R-{2 (3-Aininopropyl){(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-dif3uoiphenyi)-lH-pyTroi-2- y 11 -2,2-dimetliylpropyl } amino]-2 - oxoethy 1} -N-[ 39-(2,5 -dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17- oxo-4,7, 30,13-tetraoxa-16-azanonadecan-l-oyl]-L-cystein-ti"ifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat F209) und 9.78 mg (0.036 mmol) N- {[2-(Trimethylsilyi) ethoxyjcarbonyl} -L-cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsrnischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (47.7 mg) wurde in 3 rnL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 0.08 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt Anschließend wurde der Ansatz mit 9.26 mg (0.15 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von -7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 ml min, MeCN/W asser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 15.3 mg (29% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.
LC-MS (Methode 6): R, - 12.26 min und 12.30min; MS (ESIpos): m/z = 1254 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 15.3 mg (0.01 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.1 mg (0.05 mmol) Zinkchiorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.1 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Produkt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetoniüil W asser wurden 11.9 mg (79.5%) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode i ): Rt = 0.85 min; MS (ESTpos): m/z = 1 1 10 (M+H)+. Beispiel Mll
S-{2-[(3-Ammopropyl) {(lR)-l-[l-benzyt-4-^
dimemylpropyi} amino]-2-oxoeth l} -L-cystein -trifluoressigsäure (1:2)
15.0 mg (0.018 mmol) S-( l l- {(lR)-l -[ l -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2- l]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein trifluoressigsäure (1:1) (Intermediat C71) wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 7.4 mg (0.054 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 15.8 mg (0.054 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 1 0μ, Fluss: 50 mL/mm, MeCN/Wasser, 0. 1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1.1 mg (77 %) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 573 (M+H)+.
Beispiel M12
dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} suifanyl)- 1 -carboxyethyljamino} -4-oxobutansäure trifiuoressi säure ( 1 : 3 )
dimethylpropyl} ~2,2~dimethyl-6,12-dioxo~5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxohutanoyl)-L-eystein (Intermediat C77) wurden in 2.0 iriL Trifluorethanol gelöst und mit 3 1.4 mg (0.084 mmol) Zmkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.5 mg (0.084 mmol) Ethylendiamin- ,N,N!,N!-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.6 mg (42 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)4'. Beispiel M13
4~[(2~{[2-({(2S)-2~Ami )~4-[ {(^
dimethylpropyl} (glycoloyl)airdno]butooyl} ainino)ethyl]ainino} -2-oxoethy!)arnino]-2- { [(2R)-2- amiDo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutai!säure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Regioisomer 1, Epimer 1 (2R) oder (2S)
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+H]+.
Zunächst wurde Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 : 1) mit l -({[2-(T'rimethylsilyl)ethoxy] earbonyl}oxy)pyrrolidme-2,5~dion in DMF in Gegenwart von NNDiisopropylethylamin in Methyl-N- { [2-(irimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteinat überführt.
408 mg ( 1.93 mmol) von kommerziell erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyi-N- {[2-(trime ylsilyl)e1hoxy3carbonyl} -L-cysteinat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 147 mg (0.97 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmals 136 mg (0.64 mmol) 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) l ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 153 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-metboxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)etlioxy]carboDyl}amiDo)propyl] sulfanyl } -4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.74 mm; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)~.
Von diesem Intermediat wurden 145 mg mittels überkritischer Fluidchromatograpbie über chirale Säulen in die Einzeidiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 250x20 mm; Fluss: 80 mL/min; Methode: AD-25%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 63 mg (43%) und von Epimer 2 58 mg (40%) erhalten. Epimer 1 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.94 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)".
1 1-NM R: (400 MHz, DMSO-de): δ - 7.57 (d, 1H), 4.24 (m, 1H), 4.05 (ΐ, 2H), 3.67 (t, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.05 (dd, 1H), 2.70-2.88 (m, 2H), 2.59 (dd, 1H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
Epimer 2 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.95 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)".
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-de): δ - 7.58 (d, 1H), 4.16-4.23 (m, 1H), 4.05 (t, 2H), 3.67 (dd, I i ! ). 3.65 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.04 (dd, 1 H), 2.88 (dd, 1H), 2.77 (dd, 1 H), 2.61 (dd, 1H), 0.92 (ΐ, 2H), 0.02 (s, 9H).
32.5 mg (0.079 mmol) von Epimer 1 worden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Tb.) vom voll geschützten Intermediat Methyl-4- {[(8S)-8-{2-[ {(lR)-l-[l-ben^
propyl}(glycoloyl)ammo]ethyl}-2,2-dimet^^
15-yl]amino} -2-{[(2R)-3-methoxy-3-ox<>2-({[2-(trimethyisiiyi)ethoxy]carbonyl}a
sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol) dieses Intermediats mit 0.9 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in I i ml Methanol 20 min lang bei RT geröhrt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 12 mg (31 % d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 4.74 min; MS (ESIpos): m/z - 1120 [M+Hf.
10 mg (0.009 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/W asser wurden 2.6 mg (30% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+Hf. Beispiel M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l-te^
dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)e thyl ] amino}-2-oxoethyl)amino]-2-{[(2R)-2- amiDo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Regioisomer 1, Epimer 2 (2R oder 2S)
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (EIpos): m/z - 832 [M+H]+.
Das in Beispiel M13 beschriebene intermediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Besehreibung in Beispiel Ml 3 umgesetzt:
32,5 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Meihyl-4- {[(8S)-8-{2 {(lRH 1-benzyl-4-(2,5^
propyl}(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dime
15-y]]amino}-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)etlaoxy]carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol) dieses Intermediats mit 0.9 mL einer 2, molaren Lithiumhydroxidlösung in 1 1 ml Methanol 20 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylesiergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 11 mg (28% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 4.74 min; MS (ESIpos): m/z - 1120 [M+H]+.
10 mg (0.009 mmol) von diesem Intermediat wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifiuorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Aceto itril/Wasser wurden 4.4 mg (52% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+Hf.
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(iR)- 3 -[l ^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl } amino)etiiyl]amino} -2-oxoethyl)animo]-3-{[(2R)-2- amino-2-earboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäitre -trifluoressigsäure (1: 1)
Regioisomer 2, Epimer 1 (3R oder 3S)
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.45 min; MS (EIpos): m/z - 832 [M+H]\
742.8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi}-L-cysteinat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative FIPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (triniethylsilyl)ethoxyjcarbonyl amino)propyi]sulfanyl}-4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 3.13 min; MS (ESIpos): m/z - 424 (M+H)+. Von diesem Intermediat wurden 510 mg mittels überkritischer Fluidcliroinatographie über chirale Säulen in die Einzeldiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 250x20 mm; Fluss: 80 mL/min; Methode: AD-10%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 100 mg (20%) und von Epimer 2 141 mg (28%) erhalten.
Epimer 1 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 1): t - 0.99 min; MS (ESIneg): m/z - 422 (M-H)".
Ί-1-NMR: (400 MHz, DMSO-de): δ - 7.60 i d. I i ! ). 4.18-4.26 im, 1H), 4.01-4.08 (m, 4H), 3.63 (s, 3H), 3.59 (dd, 1H), 3.04 (dd, 1 H), 2.92 (dd, 1 H), 2.80 (dd, 1H), 2.63 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
Epimer 2 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.95 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)'.
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-de): δ - 7.56 (d, 1H), 4.21 -4.29 ( , 1H), 4.01-4.1 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 3.58 (dd, 1 H), 3.08 (dd, 1 H), 2.85 (dd, 3 H), 2.78 (dd, 1H), 2.60 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
33.6 rng (0.079 mmol) von Epimer 1 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Ethyl-4- {[(8S)-8-{2-[ {(i R)-l-[i -benz
propyI}(glycoloyl)amino]ethyl}-2,2 üme&^
15-yl]ammo} -3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)etiioxy] carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 49 mg (0.042 mmol) dieses Intermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 12 ml THF/ Wasser 1 : 1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC -Reinigung wurden 1 3 mg (24% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 4.68 min; MS (ESIpos): m/z - 1120 [M+H]+.
11 mg (0.01 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 3.7 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 5): R, - 2.45 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
Beispiel Ml 6
4-[(2- {[2-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR) -[l-benzyl-4-^^^
dimelhylpropyl}(glycoloyl)arnino]bu^
amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1 )
Regioisomer 2, Epimer 2 (3R oder 3S)
LC-MS (Methode 5): R, - 2.44 min; MS (EIpos): m/z - 832 [M+H]+.
Das in Beispiel M15 beschriebene Intermediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Beschreibung in Beispiel Mi 5 umgesetzt:
33.6 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HAT'IJ und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63% d. Th.) vom voll geschützten intermediat Ethyi-4- {[(8S)-8-{2 {(lR)- i -[ i -benzyl-4-(2,5-diiluorphenyl)-^
propyl (g3yco3oyl)ami:nojethylj -2^njime1hy3-6,9,l4-lxioxo-5-oxa-7,l0,l3-triaza-2-silapeniadecan- 15-yl]amino}-3- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(irimetliylsilyl)ethoxy3 carbonyl} aroino)propyl] sulfanyl} -4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 49 mg (0.042 mmol) dieses intermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 12 ml THF/W asser 1 : 1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide Melhylestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC-Reinigung wurden 13.4 mg (2,8% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.66 min; MS (ESIpos): m/z - 1 120 | M · ί 1 ] .
1 3.4 mg (0.012 mmol) dieses Interaiediats mirden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig enischüizt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 7.5 mg (66% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+H]\
Beispiel M17
(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-i-[i-benzyl-4-(2,5-difl^
(glycoloyl)amino]butansäurehydrochlorid (1 : 1)
150 mg (0.2 mmol) von Intermediat C53 wurden in 15 mL DMF gelöst und mit 2.29 g (20.39 mmol) DABCO versetzt. Der Ansatz wurde 30 min im Ultraschallbad behandeit. Durch Zugabe von 1.1 7 ml Essigsäure wurde der Ansatz dann auf pH 3-4 gebracht und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und die entsprechenden Fraktionen wurden bei RT im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Acetonitril/Wasser 1 : 1 aufgenommen, mit 5 mL einer 4N Salzsäure versetzt und anschließend lyophilisiert. So wurden 81 mg (68% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.69 min; MS (EIpos): m/z - 514 [Μ+ΗΓ. Beispiel M18
N 2-({(2S)-2-Ammo~4-[ {(l )~I -[] -be^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butm -trifluoressigsäure (1 : 1)
Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie Trifluoressigsäure ~benzyl~N-(2- arnmoethyl)-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-glutamir!at (1 : 1) hergestellt. Diese Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Intermediat C58 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst durch hydrogenolytische Spaltung die Renzyloxycarhonyl-Schutzgrappe sowie der Benzylester entfernt und anschließend mit Zinkchlorid die 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-Schutzgrupe. LC-MS (Methode 6): R, - 1.91 min; MS (EIpos): m/z - 685 [M+H]+.
Beispiel Ml 9 l^-( - {(2S)-2-Amino-4 {(lR) 1-benzyl-4-(2,5-dffluo^henyl) H-pyrrol-2
dimethylpropyi} (g äure (1: 1)
Zunächst wurde nach in der Peptidchemie bekannten klassischen Schuizgruppenoperationen Trifluoressigsäure --2-(üimethylsilyl)ethyl-N2-[(benzyioxy)carbonyi]-L-lysinat (1 : 1) hergestellt. Dieses Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst mit Zinkchlorid die 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-Schutzgrupe sowie der 2-(Trimethylsilyl)ethylester gespalten. Schließlich wurde die Titelverbindung durch hydrogenolytische Spaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe und Reinigung durch präparative HPLC erhalten.
HPLC (Methode i 1): R. - 1.65 min;
Beispiel M20
(lR,4R,27R,33R)-l -Amino-32-(3-amnopropyl)-33- yl]-34,34-dimethyl-6,9,25,3 l-tetraoxo 3,l6,l 9,22 e1raoxa-3,29-dithia-7,l0,26,32- tetraaza entatriacontan- 1 ,4,27-triearbonsäure -trifluoressigsäure (1 :2)
Zunächst wurde Methyl-I^cysteinaihydrochlorid (1 : 1) mit l -({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in Methyi-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteinat überführt.
408 mg (1.93 mmol) von kommerziell erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyl- - {[2-(trimethylsilyi)etlioxy]carbonyl}-L-cysteinat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 147 mg (0.97 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)tmdec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmals 136 mg (0.64 mmol) 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 151 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)propyl] sulfanyl} -4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.74 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)\
3.66 mg (8.93 μπιοΐ) von 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (triniethylsilyl)ethoxyjcarbonyl amino)propyl] sulfanyl} -4-oxobutansäure wurden in Gegenwart von 3.66 mg (8.93 μηιοΐ) HATU und 1.6 μΐ (15 μτηοΐ) 4-Methylmorpholin mit 13.0 mg (7.44 μιηοΐ) von S-(l l- {(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyΓrol-2-yl]-2,2-dimeΐllyl ro yl} - 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 15-(glycylamino)-4,7, 10, 13- tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein -Irifluoressigsäure (1 : 1 ) (Intermediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.9 mg (37% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat S-(l 1 - {( 1 R)-1-[1-
oxa-7 ,1 l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l 5-({N-[(8R,l lR)-8 ,1 l-bis(methoxycarbonyl)-2,2- dimethyl-6,13-dioxo-5-oxa- 10-thia-7-aza-2-silatridecan- 13-yljglycyl} amino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein erhalten wurden.
Anschließend wurden 3.90 mg (2.76 μτηοΐ) dieses Intermediats mit 35 μΐ einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1.0 ml THF/W asser 3: 1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 3.60 mg (94% d. Th.) des Die arbonsäur ede r ivats erhalte .
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.83 min; MS (ESIpos): m z - 1385 | M · ί 1 i .
3.6 mg (2.6 μΐΉοΙ) dieses intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophil] sation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 1.92 mg (55% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.72 min; MS (ESIneg): m/z - 1094 [M-H]\
Beispiel M21
(2R,24S,27R)-27-Amino-2-[( {2-[(3-ammopropyl) {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-dirtaphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-cümethylpropyl} arxnno]-2-oxoethyl} sulfany!)methyl]-24-(ca^
trioxo-7,10, 13,16-tetraoxa-25-thia-3, 19,22-triazaoctacosan- 1 ,28-disäure -trifluoressigsäure (1 :2)
742.8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethyisiiyi)ethoxy]earbonyl}-L-cystemat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl3sulfanyi}-4H)xobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 3.13 min; MS (ESlpos): m/z = 424 (M+H)+.
4.36 mg (10.3 μτηοί) von 4-Ethoxy-2-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimetliylsilyl)ethoxyjcarbonyl) amino)propyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure wurden in Gegenwart von 3.92 mg (10.3 μηιοΐ) HATU und 1.9 μί (17 μηιοΐ) 4-Methylmorpholin mit 15.0 mg (8.59 μηιοΐ) von S-(l l- {(lR) -[l -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl) H-p ^τol-2-yl]-2,2-dimeth lpropyl} - 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 15-(glycylammo)-4,7, 10, 13- tetraoxapentadecan- 1 -oyt]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (intermediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.6 mg (26% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat S-(11-{(1R)-1-[1- Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTOl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5- oxa-7,1 l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[15-({N-[(8R,l l S)-l l-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-8- (methoxycarbonyl)-2,2-dimethyl-6, 32-dioxo-5-oxa- 10-thia-7-aza-2-siladodecan- 12- yljglycyl} amino)-4,7, 10, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein erhalten wurden.
Anschließend wurden 6.20 mg (2.82 μηιοΐ) dieses Intermediats mit 35 μΐ einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1.0 ml THF/Wasser 1 : 1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Estergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC-Reinigung wurden 3.60 mg (92% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.71 min; MS (ESIpos): m/z - 1385 | \ i · ! 1 1 .
3.60 mg (1.69 μιηοΐ) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschlieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus AcetonitriiAV asser wurden 0.88 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.72 min; MS (ESTneg): m/z - 1094 [M-H]".
(2R,27R)-27- Amino-2-[( {2-[(3-aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-
2-yl]-2,2-diniethylpropyl}aniino]~2-oxoetliyl}suifanyl)methyi]-24-(carboxynie
7, 10,13,1 6-tetraoxa~25-thia-3,l .9,22-triazaoetacosan-l ,28-disäure-trifluoressigsäure (1 :2) und
(lR,27R,33RH-Ammo-32-(3-aminopropyl)-33-[l-ben^^^^
34,34^ethyl-6,9^5,3 l-tetraoxo 3,l6,l9,22-te1raoxa-3,29-diihia-7,l 0,26,32- tetraazapentatriacontan- 1 ,4,27-tricarbonsäure :-trifluoress igsäure ( 1 :2)
16.5 mg (0.015 mmol) S- {2-[(3-Arninopropyl) {(l R)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl } aminol -2-oxoethyl } -N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l-yl)-2,18- dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat F257) und 8.18 mg (0.031 mmol) N- {[2-(TrimethyIsilyl) ethoxyjcarbonyl } -L-cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischimg wurde im Vakuum verdampft Der Rückstand (28.9 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 0.046 mL einer 2,M wässrigen Lilhiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunde bei RT gerührt Anschließend wurde der Ansatz mit 5.2 μϊ (0.092, mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/rnin, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 12.1 mg (58% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediale erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.82 mm; MS (ESIpos): m z - 1240 (M+H)4.
Im letzten Schritt wurden 12, 1 mg (0.009 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 7.3 mg (0.054 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 15.7 mg (0.054 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 6.4 mg (59%) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 1096 (M+H)4. Beispiel M23
N- {(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-l-[l -berrzyl-4-(2 ^
propyl}(glycoloyl)aminojbutanoyl} -beta-alanyl-L-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamate hydrochloride (1 : 1) in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde das geschützte Intermediat in Trifluoretiianol aufgenommen und durch Runren über Nacht bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+. Beispiel M24
N- {(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)- l -[ l -benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH-pyriOl-2-yl]-2,2- dimelhylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyi } -beta-alanyl-D-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1:1)
Zunächst wurde Di-tert-butyl D-glutamat Hydroclilorid (1: 1) in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin mit Interaiediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde das geschützte Intennediat in Trifluorethanol aufgenommen und durch Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.41 mm; MS (ESIpos): m/z - 714 [M+Hf. Beispiel M25
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluo^henyl) H^yrrol-2-yi]-2,2-dimethyl propyl} (glycoloyl)amino jbutanoyl} -L-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamat Hydrochioride (1 : 1) in Gegenwart von HATIJ und N,N- Diisopropylethylamin mit Tntermediat C61 gekuppelt. Im nächsten Schritt wurde die Z- Schutzgruppe durch 45-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Anschließend wurde das partiell geschützte Intermediat in Trifluorethanol aufgenommen und durch 7 stündiges Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.44 mm; MS (ESIpos): m/z - 643 [M+Hf.
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Ammo-4-[{(lR)4-[l-b^
dimethylpropyl} (glycoloyl)aminojbutanoyl} amino)ethyl]arnino} -2-oxoethyl)amino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäitre -trifluoressigsäure (1: 1)
Regioisomer 1, Epimerengemisch
Dieses Beipiel beschreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 13 und Beispiel 14. Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 13, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chromatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.43 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+Hf.
Beispiel M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(lR) -^^^^
dimelhylpropyl}(glycoloyl)amin^^
amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäitre -trifluoressigsäure (1: 1)
Regioisomer 2, Epimerengemisch
Dieses Beipiel besehreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 15 und Beispiel 16. Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 15, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chromatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.45 min; MS (EIpos): m/z = 832 [M+Hl
AusfiUmmgsbdsBieje ADCs
Die in den Strukturformen der Ausführungsbeispiele dargestellten ADCs, die über Maleinimid- Reste an Cysteinseitenketten der Antikörper gekuppelt wurden, liegen in Abhängigkeit vom Linker und von dem Kupplungsprotokoll zum überwiegenden Teil in den jeweils dargestellten ringgeöffneten bzw. ring-geschlossenen Formen vor. Zu einem kleinen Anteil kann jedoch die jeweils andere Form in der Präparation enthalten sein.
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F194 5 mg Anti-CD 123 AKJA (TPP-5969) in 500 μΕ PBS (c = 10 mg/mL). Zunächst wurden 5Eq von Intermediat F194 gelöst in Ι ΟΟμΙ, DMSO zugesetzt und nach lh Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT geröhrt. Anschließend wurde der Ansatz über eine Sephadex- Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS,
Protein Konzentration: 3 .28 mg 'mL
Drug/mAb Ratio: 3.3
Beispiel 1 4m2
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat Fl 94 5 mg Anti-CD 123 AKIB (TPP-5971) in 500 μΐ PBS (c = 10 mg/mL). Zunächst wurden 5Eq von Intermediat F l 94 gelöst in ΙΟΟμΕ DMSO zugesetzt und nach lh Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz über eine Sephadex- Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.18 mg mL
Drug/mAb Ratio: 3.2 Beispiel 194 m?
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermedial Fl 94 5 mg Anti-CD 123 AKic (TPP-6013) in 500 μΙ_ PBS (e = 10 mg/mL). Zunächst wurden 5Eq von Inier ediat F194 gelöst in ΙΟΟμΙ, DMSO zugesetzt und nach Ih Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wunde der Ansatz über eine Sephadex- Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 0.42 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.9
Beispiel 208ml
1 mg Anti-CD123 AK1A (TPP-5969) in 93 μΤ PBS (c=10.2 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.006 mg TCEP in 10 μΐ PBS-Pufter versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.043 mg (0.053 μηιοΐ) von Iniermediat F104 gelöst in 10 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 2387 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equiliibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pFI 8 auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend wieder mittel PD-10 Säulen auf pH 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde dduurrcchh UUllttrraazzeennttririffuuggaatitioonn a auuffkkoonnzzeennttrriieertrt,, r rüücckkvveerrddüünnnntt mmiitt PPBBSS--PPuuffffeerr ( (ppHH 7,2) und erneut aauuffkkoonnzzeennttrriieertrt.. D Deerr eerrhhaalltteennee AADDCC BBaattcchh w wuurrddee f foollggeennddeerrmmaaßßeenn cchhaarraakktteerriissiieerrtt::
PPrrootteeiinn KKoonnzzeennttrraattiioonn:: 00..5544 mmgg//mmLL
D Drruugg//mmAAbb RRaattiioo:: 22..55
250 mg Anti-CD123 AK!A (TPP-5969) in 21.7 ml PBS (c=11.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 1.4 mg TCEP in 0.83 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 10.76 mg (0.0133 mmol) von Intermedial F104 gelöst in 2500 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Etuate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 125 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 9.79 mg mL
Drug/mAb Ratio: 2.9
Beispiel 208m2
5 mg Anti-CD123 AKiB (TPP-5971) in 450 μL ml PBS (c=l l.l mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.287 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.215 mg (0.000267 mmol) von Intermediat Fl 04 gelöst in 50 μ! DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH 8 auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend wieder mittel PD- 10 Säulen auf pH 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.76 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.8 Beispiel 208m3
5 mg Anii-CD123 AKiC (TPP-6013) in 450 μΐ ml PBS (c=l l.l mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.29 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.215 mg (0.000267 mmol) von Intermediat Fl 04 gelöst in 50 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH 8 auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend wieder mittel PD-10 Säulen auf pH 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Uitrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.99 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.9
Beispiel 208m3 (TV)
250 mg Anti-CD123 AKic (TPP-6013) in 21.7 ml PBS (c-1 1.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 1.4 mg TCEP in 0.83 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 10.76 mg (0.0133 mmol) von intermediat F104 gelöst in 2500 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD- 10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 125 ml verdünnt Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut auf konzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konze tration: 11.06 mg mL
Drug/mAb Ratio: 3.4
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöffneten Bernsteinsäureamid-Form von 86.1% ermittelt.
Beispiel 208m4
5 mg Anti-CD 123 AKiD (TPP-5968) in 450 μΐ. ml PBS (c=l l.l mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.29 mg TCEP in 0.05 mi PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.215 mg (0.000267 mmol) von Intermediat F 104 gelöst in 50 μ! DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equiitibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluieri. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH 8 auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend wieder mittel PD-10 Säulen auf pH 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Ulirazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.41 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 3.8
BgisBi<JJj40ml
5 mg Anti-CD 123 AKiA (TPP-5969) in 366 μΐ ml PBS (c- 13.66 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1984 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.199 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F240 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Runren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch LJltrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Balch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.84 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 2.7 Beispiel
5 mg Anti-CD123 AKJB (TPP-5971) in 337 μΕ ml PBS (c-14.85 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μΙ PBS -Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2013 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wiffde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.199 mg (0.00023 mmol) von Intermediai F240 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sep adex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unier diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.74 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.7
Beispiel 240 m3
5 rng Anti-CD123 AK1C (TPP-6013) in 371 μΕ ml PBS (c-13.49 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1979 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.199 mg (0.00023 mmol) von Tntermediat F240 gelöst in ΙΟΟμ.1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Uitrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.58 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.3
Bei dieser ADC-Präparaiion wurde ein Anteil der ring-geöffneien Bernsteinsäureamid-Fonn von 92.9% ermittelt.
5 mg Anti-CD 123 AKiA (TPP-5969) in 366 μΐ, ml PBS (c=13.66 mg 'mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1984 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.290 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F257 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.78 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 3.2
Beispiel 257ml (TV)
250 mg Anti-CD 123 AKiA (TPP-5969) in 21 .7 ml PBS (c=11.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 1.4 mg TCEP in 0.83 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 8.92 mg (0.0083 mmol) von Intermediat F257 gelöst in 2500 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD- 10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 125 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 11.27 rng/rnL
Drug/mAb Ratio: 3.6
Beisgiel_257nj2
5 mg Anti-CD123 AKiB (TPP-5971) in 337 μL· ml PBS (c=14.85 mg/rnL.) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2013 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.290 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F257 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equiilibrierte PD 10- Säulen (Sephadex* G-2,5, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.54 mg/ml,
Drug/mAb Ratio: 3.1
Beispiel 2§7m3
5 mg Anti-CD123 AK1C (TPP-6013) in 371 μΕ ml PBS (c=l 3.49 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.02,9 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1979 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und I h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.290 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F257 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wui'de der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equiilibrierte PD 10- Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.59 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.4 Beispiel 257m3 (TV)
250 mg Anti-CD123 AKic (TPP-6013) in 21.7 ml PBS (c=l 1.5 mg 'mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 1.4 mg TCEP in 0.83 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT geröhrt und anschließend wurden 8.93 mg (0.0083 mmol) von Intermediat F257 gelöst in 2500 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH- Werl von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 125 ml verdünnt Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 13.36 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.3
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöffneten Bernsteinsäureamid-Form von 78.7% ermittelt.
Beispiel 259 ml
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F259 5 mg Anti-CD123 AKJA (TPP-5969) in 450 μΕ PBS (c=l l.l mg mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers betrug 30 min und nach Zusatz von 0.245 mg (0.267 μηιοΐ) F259 wurde der Ansatz 20 h bei RT geröhrt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS. Protein Konzentration: 1.70 mg/ml.
Drug/mAb Ratio: 1.7
EEiinnggeesseettzztt w wuurrddeenn h liiieerr zzuurr KKuupppplluunngg m miitt IInntteerrmmeeddiiaatt FF225599 55 mmgg AAnnttii--CCDD 112233 AAKKImB ((TTPPPP--55997711)) iinn 445500 \ -iLLL PPBBSS ((cc--1111..11 m mgg/mmLL)).. DDiiee R Reedduukkttiioonnsszzeeiitt ddeess AAnnttiikköörrppeerrss bbeettrruugg 3300 mmiinn uunndd nnaacchh ZZuussaattzz vvoonn 00..224455 mmgg ((00..226677 μμιιηηοοΐΐ)) FF225599 wwuurrddee ddeerr AAnnssaattzz 2200 IIii bbeeii RRTT ggeerrüühhrrtt uunndd a annsscchhlli ieeßßeenndd üübbeerr SSeepphhaaddeexx ggeerreeiinniiggtt.. S Scchhlliieeßßlliicchh w wuurrddee mmiitttteellss UUllttrraazzeennttririffuuggaattiioonn aauuffkkoonnzzeennttrriieerrtt uunndd rrüücckkvveerrddüünnnntt mmiitt PPBBSS..
PPrrootteeiinn KKoonnzzeennttrraattiioonn:: 11..7722 mmgg//mmLL
DDrruugg//mmAAbb RRaattiioo:: 11..88
E Eiinnggeesseettzztt wwuurrddeenn hhiieerr zzuurr KKuupppplluunngg mmiitt iinntteerrmmeeddiiaatt FF225599 55 mmgg AAnnttii--CCDD112233 AAKKJJ CC ((TTPPPP--66001133)) iinn 445500 μμΕΕ PPBBSS ((cc==ll ll..ll m mgg//mmLL)).. DDiiee RReedduukkttiioonnsszzeeiitt ddeess AAnnttiikköörrppeerrss bbeettrruugg 3300 mmiinn uunndd nnaacchh ZZuussaattzz v voonn 00..224455 mmgg ((00..226677 μμηπιιοοΓΓ)) FF225599 wwuurrddee ddeerr A Annssaattzz 22,00 hh bbeeii RRTT ggeerrüühhrtrt uunndd aannsscchhlliieeßßeenndd üübbeerr SSeepphhaaddeexx ggeerreeiinniiggtt.. SScchhlliieeßßlliicchh wwuurrddee mmiitttteellss UUllttrraazzeennttrriiffuuggaattiioonn aauuffkkoonnzzeennttrriieertrt uunndd rrüücckkvveerrddüünnnntt mmiitt PPBBSS..
PPrrootteeiinn KKoonnzzeennttrraattiioonn:: 11..5577 mmgg//mmLL
DDrruugg//mmAAbb RRaattiioo:: 22..00
Beispiel 260 ml (TV)
250 mg Anti-CD123 AK!A (TPP-5969) in 21.7 ml PBS (e=11.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 1.4 mg TCEP in 0.83 ml PBS-Puf er versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT geröhrt und anschließend wurden 3 5.1 mg (0.0133 mmol) von Tntermediat F260 gelöst in 2500 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rüliren bei RT wurde der mitteis PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH- Werl von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 125 ml verdünnt Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 9.47 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.0
Beispiel 260 m2
5 mg Anti-CD123 AKIB (TPP-5971 ) in 450 iL ml PBS (c= 1 1.1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT geröhrt und anschließend wurden 0.302 mg (0.00027 mmol) von Tntermediat F260 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rüliren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ringgeschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.62 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.5
Beispiel 260m3 (TV)
250 mg Anti-CD123 AK1C (TPP-6013) in 23 .7 ml PBS (c=1 1.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 1.4 mg TCEP in 0.83 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 15.1 mg (0.0133 mmol) von Tntermediat F260 gelöst in 2,500 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD- 10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 125 ml verdünnt Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 12.08 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.8
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöff eten Bernsteinsäureamid-Form von 84.5% ermittelt.
5 mg Anti-CD 323 AK1A (TPP-5969) in 366 (iL ml PBS (c-13.66 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1984 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 Ii bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.188 mg (0.00023 mmol) von Intennediat F270 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonze triert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.71 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.7
Beispiel 270m2
5 mg Ami-CD123 AK,B (TPP-5971) in 337 yL ml PBS (c=14.85 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2013 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.188 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F270 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch. Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.65 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.9
Beispiel 27öm3
5 mg Anti-CD 123 AK1C (TPP-6013) in 371 μΐ ml PBS (c-13.49 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1979 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 Ii bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.188 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F270 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonze triert und räckverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.51 mg mL
Drug/mAb Ratio: 2.4
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöffheten Bernsteinsäureamid-Form von 94.4% ermittelt.
30 mg Anti-CD 123 AK!A (TPP-5969) in 3.0 ml PBS (c=10.0 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.172 mg TCEP in 0.30 ml PBS-Pufier versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT geriihrt und anschließend wurden 1 .14 mg (0.001 mmol) von Intemiediat F271 gelöst in 300 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD- 10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 14 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Uitrazenirifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konze tration: 11.82 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.1
5 mg Anti-CD123 AKJC (TPP-6013) in 450 μΐ, ml PBS (c= 11.1 1 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.267 mg (0.00023 mmol) von Intemiediat F271 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD IG-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuier Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünni mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendeimaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.33 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 4.2
BcispidL274inl
5 mg Anti-CD 123 AKiA (TPP-5969) in 366 -iL ml PBS (c=13.66 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1984 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.232 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F274 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschiossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.92 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 3.2 Beispiel 274 m2
5 mg Anti-CD123 AK!B (TPP-5971) in 337 μΐ ml PBS (c-14.85 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2013 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.232 mg (0.00023 mmol) von Tntermediat F274 gelöst in ΙΟΟμ.1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equilJibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschtossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.84 mg/mL
Drug/rnAb Ratio: 3.2
5 mg Anti-CDl 23 AKic (TPP-6013) in 371 μΐ, ml PBS (c=13.49 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1979 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.232 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F274 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pHS equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.69 mg/mL
Drug/rnAb Ratio: 3.0
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöffneten Bernsteinsäureamid-Form von 89.5% ermittelt. Beispiel 276ml
55 mmgg AAnnttii--CCDD112233 AAKKIIAA ((TTPPPP--55996699)) iinn 445500 μμΕΕ mmll PPBBSS ((cc== 11 11..11 11 mmgg//mmLL)) wwuurrddeenn uunntteerr AArrggoonn mmiitt eeiinneerr LLöössuunngg aauuss 00..002299 mmgg TTCCEEPP i inn 5500μμ11 PPBBSS--PPuuffffeerr vveerrsseettzztt.. DDeerr AAnnssaattzz wwuurrddee 3300 mmiinn bbeeii RRTT ggeerrüühhrtrt.. AAnnssechhlliieeßßeenndd wwuurrddeenn 00..222299 mmgg ((00..0000002233 mmmmooll)) vvoonn IInntteerrmmeeddiiaatt FF227766 ggeellöösstt iinn 5500μμ11 DDMMSSOO zzuuggeeggeebbeenn.. NNaacchh wweeiitteerreenn 9900 mmiinn RRüühhrreenn bbeeii RRTT w wuurrddee ddeerr AAnnssaattzz mmiitt 11995500 μμΐΐ PPBBSS-- P Puuffffeerr,, ddeerr zzuuvvoorr aauuff ppHH 88 e eiinnggeesstteelllltt wwuurrddee,, vveerrddüünnnntt uunndd ddaannnn üübbeerr mmiitt PPBBSS--PPuuffffeerr ppHH88 e eqquuiilllliibbrriieerrttee P PDD 1100--SSääuulleenn ( (SSeepphhaaddeexx®® GG--2255,, G GEE HHeeaalltthhccaarree)) ggeeggeebbeenn uunndd mmiitt PPBBSS--PPuuffffeerr ppHH88 eelluuiieerrii.. DDaass EElluuaatt üübbeerr NNaacchhtt bbeeii RRTT uunntteerr AArrggoonn ggeerrüühhrrtt uunndd aannsscchhlliieeßßeenndd dduurrcchh UUllttrraazzeennttrriiffuuggaattiioonn aauuffkkoonnzzeennttrriieerrtt uunndd rrüücckkvveerrddüünnnntt mmiitt PPBBSS--PPuuffffeerr ((ppHH 77..22)).. EEiinn TTeeiill ddeess AADDCCss kkaannnn uunntteerr ddiieesseenn BBeeddiinngguunnggeenn aauucchh iinn ddeerr rriinngg--ggeesscchhlloosssseenneenn FFoorrmm vvoorrlliieeggeenn.. DDeerr eerrhhaalltteennee AADDCC B Baattcchh w wuurrddee ffoollggeennddeerrmmaaßßeenn cchhaarraakktteerriissiieerrtt::
PPrrootteeiinn KKoonnzzeennttrraattiioonn:: 11..2266 mmgg/mmLL
D Drruugg//mmAAbb RRaattiioo:: 33..88
5 mg Anti-CD123 AKJC (TPP-6013) in 450 μΐ., ml PBS (c= 11.1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.229 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F276 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentri ugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.39 mg/mL
Drag/m Ab Ratio: 4.0
Beispiel 281m3
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F281 5 mg Anti-CD123 AKic (TPP-6013) in 500 μΕ PBS bei pH 7.2 (c= 0 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0,029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.25 mg (0,27 μηιοΐ) F281 in 50 μΐ, DMSO 20 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.42 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.8
5 mg Anti-CD123 AKJA (TPP-5969) in 450 xL ml PBS (c= 11.1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,029 mg TCEP in 50μί PBS-Puifer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.256 mg (0.00023 mmol) von Intermedia! F284 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puifer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sepiiadex'*' G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzeniriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unier diesen Bedingungen auch in der ringgeschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.78 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.7
Beispiel 284
5 mg Anti-CD123 AK)B (TPP-5971 ) in 450 \xL ml PBS (c= 1 1.1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,029 mg TCEP in 50μΙ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.256 mg (0.000233 mmol) von Intermedia! F284 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt. Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eiuat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und räckveröünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2), Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ringgeschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.83 mg/mL Drag/mAb Ratio: 3.3 Beispiel 28 m3
5 mg Anti-CD 123 AKic (TPP-6013) in 510 μΕ ml PBS (c=9.8 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0,26 mg (0.23 μπιοΐ) von Intermediat F284 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT gerührt. Das Eiuat wurde anschließend durch Ultrazentrirugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.54 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 2.2
25 mg Anti-CD123 AKIA (TPP-5969) in 2,5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.14 mg TCEP in 0.25 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30mm bei RT gerührt und anschließend wurden 1 .05 mg (0.0012 mmol) von Intermediat F296 gelöst in 250 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde mit 2 ml PBS Puffer, der auf pH 8 eingestellt war, verdünnt und der Ansatz über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH- Wert von 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Ultrazentriiügation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 7.66 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.8
BchpieL296in2
5 mg Anti-CD 123 AK!B (TPP-5971) in 500 iL ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ.Ι PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0,21 mg (0.23 μηιοΐ) von Tntermediat F296 gelöst in 50μ3 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluierl und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Pufter (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.7mg/ ml,
Drug/mAb Ratio: 2.8 Beispiel 296m3
5 mg Anti-CD 123 AKic (TPP-6013) in 500 iL ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0,21 mg (0.23 μιηοΐ) von intermediat F296 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equilhbrierte PD 10-Säule (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.51 mg/mL Drug/mAb Ratio: 2.1
Beispie! 297 ml
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intemiediat F297 5 mg Anti-CD 123 AKJA (TPP-5969) in 427 μ-L PBS bei pH 7.2 (c= 13.66 rng/rnL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrag 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.2,3 mg (0.26 μηιοί) F297 in 50 μΐ, DMSO, 2 Ii bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrirugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.81 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 2.5
Beispiel 297m2
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit intermedia! F297 5 mg Anti-CD 123 AKre (TPP-5971) in 427 μΕ PBS bei pH 7.2 (c= 14.85 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrag 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.23 mg (0.26 μηιοΐ) F297 in 50 μΕ DMSO, 2 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrirugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.64 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.4
Beispiel 297m3
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intemiediat F297 5 mg Anti-CD 123 AKic (TPP-6013) in 427 μί, PBS bei pH 7.2 (c= 13.49 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.23 mg (0.26 μηιοΐ) F297 in 50 μΐ. DMSO, 2 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrirugation aufkonzentriert und räckverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.81 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 2.1 Beispiel 309 ml
5 mg Anti-CD123 AKJ A (TPP-5969) in 450 μΐ, ml PBS (c= 1 1.1 3 mg/inL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.247 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F309 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 1 0-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 0.77 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 4.1
Beispiel 309 m3
5 mg Anti-CD123 AKic (TPP-6013) in 450 μΕ ηι! PBS (c= 11.1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.247 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F309 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuierl. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt and anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puf er (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.15 mg 'mL
Drug/mAb Ratio: 4.2
Beispiel 310ml
30 mg Anu-CD123 AKiA (TPP-5969) in 3.0 ml PBS (c=10.0 g/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.172 mg TCEP in 0.30 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 1.08 mg (0.001 mmol) von Intermediat F310 gelöst in 300 μϊ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 14 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 13.04 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.0 Beispiel 310ίη3
5 mg Anti-CD123 AKic (TPP-6013) in 450 μΕ ηι! PBS (c= I I . I i mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Ansehließend wurden 0.253 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F310 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluieri. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.84 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 4.4
Be ]jiel_314ml
5 mg Arjti-CD123 AKIA (TPP-5969) in 450 μΕ ml PBS (c= 1 1.1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.209 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F314 gelöst in 50μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD IG-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eiual über Nacht bei RT unier Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.42 mg/ml,
Drag/mAb Ratio: 4.0
BchpieL314m3
5 mg Anti-CD123 AK1C (TPP-6013) in 450 μ.Ε ml PBS (c= 1 1.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCF.P in 50μΙ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.2,09 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F314 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.29 mg mL
Drug/mAb Ratio: 4.3
Beispiel 317ml
5 mg Anti-CD123 AKJA (TPP-5969) in 450 L ml PBS (c= 11.11 rng/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.308 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F317 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μ] PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrirugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.59 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.5
Beispiel 317m3
5 mg Anti-CDl 23 AKic (TPP-6013) in 450 μΐ. ml PBS (c= 11.11 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.308 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F317 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säuien (Sephadex® G-25, GE Healtiicare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unier Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifisgation aufkonzentriert und rückverdünni mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.61 mg/ml,
Drag/mAb Ratio: 2.7
Beispiel 318ml
5 mg Anti-CD123 AKIA (TPP-5969) in 450 μΐ, ml PBS (c= 1 1.1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.2,06 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F318 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aulkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.39 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 5.2 Beispiel 318ίη3
5 mg Anti-CD123 AKic (TPP-6013) in 450 xL ml PBS (c= 11.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Ansehließend wurden 0.206 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F318 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.46 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 4.0
25 mg Anti-CD123 AK!A (TPP-5969) in 2.5 ml PBS (c-10.0 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.143 mg TCEP in 0.25 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.923 mg (0.00083 mmol) von Intermediat F319 gelöst in 250 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 2 ml PBS Puffer verdünnt. Anschließend wurde der Ansatz über PD- i O Säulen gereinigt und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 14 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer und erneut aufkonzentriert Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 12.79 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.9
Beispiel 320ml
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit intermediat F320 5 mg Anti-CD123 AK[A (TPP-5969) in 374 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c= 33.36 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart, von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.245 mg (0.23 μηιοΐ) F320 in 100 uL DMSO, 90 min bei RT gerührt, und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.84 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 1.8
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit intermediat F321 5 mg Anti-CD123 AK[A (TPP-5969) in 374 μί PBS bei pH 7.2 (c= 13.36 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.262 mg (0.23 μτηοΐ) F321 in 100 uL DMSO, 90 min bei RT gerührt, und anschließend über Sep adex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation außconzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1 .93 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 1.9
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F322 5 mg Anti-CD 123 AKJA (TPP-5969) in 374 μL PBS bei pH 7.2 (c= 13.36 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.262 mg (0.23 μιτιοΐ) F322, in 100 μΐ, DMSO, 90 min bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich, wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.88 mg/ml,
Drug/mAb Ratio: 1.8
51 (
5 mg Anti-CD123 AK[A (TPP-5969) in 450 μL ml PBS (c= 11.1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0. 328 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F323 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μ] PBS- Puffer verdünnt und dann über PD 10-Säulen (Sephadex® 0-25, GE Healthcare) gereinigt. Anschließend wurde der Ansatz durch Ultrazentrirugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 2.03 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 2.9
Beispiel 323m3
5 mg Anti-CD123 AK1C (TPP-6013) in 450 μΕ ml PBS (c= 11.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μΙ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0. 328 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F323 gelöst in 50μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer verdünnt und dann über PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gereinigt. Anschließend wurde der Ansatz durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 2.06 mg/mL Drug/mAb Ratio
5 mg Anti-CD123 AKjA (TPP-5969) in 450 μΐ, ml PBS (c= 1 1.1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.2,56 mg (0.00023 mmol) von Intermedia! F324 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säuien (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünni mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-gesehlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.48 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.1
Beispiel 324m3
5 rng Anti-CD123 AKic (TPP-6013) in 450 μΕ ml PBS (c= 11.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.256 mg (0.00023 mmol) von intermediat F324 gelöst in 50μ! DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch iJltrazentriiugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.42 mg/ml,
Drug/'mAb Ratio: 4.4
5 mg Anti-CD123 AK!C (TPP-6013) in 0.400 ml PBS (c=12.5 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50 μΐ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F325 gelöst in 50 μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G~ 25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ulirazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.87 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 4.1 Beispiei 326jn3
5 mg Anti-CD 123 AK!C (TPP-6013) in 0.400 ml PBS (c-32.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50 μΐ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermedia! F326 gelöst in 50 μ{ DMSO zugegeben. Der Ansatz wurde anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt, dann mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH7.2 equitlibrierte PD 10-Säule (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.33 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 6.0
C: Bewer mg der biologisches Wirksamkeit
Die biologische Wirkung der erfindungsgernäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden:
C-la Be^timmu ^^^
Die Analyse der zytotoxischen Wirkung der anti-CD123-ADCs und der korrespondierendenMetaboliten erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:
NC1-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinomzellen, ATCC-CRL- 1848, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #80415).
MOLM- 13: humane akute monozytäre Leukämiezellen (AML-M5a), DSMZ, No. ACC 554, Standardmedium: RPMI 1640 (Fa. gibco; #21875 - 059, stab. L-Glutamin) + 20% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); CD123-positiv.
THP-1 : humane monozytäre Leukämiezellen, ATCC, NO. TIB-202, Standardmedium: RPMI 1640 (Fa. Gibco; #21875-059, stab. L-Glutamin) + 10% heat inactivated FCS (Fa. gibco, No. 10500- 064) + 2,5g Glucose (20 % Glucose Solution, Fa. gibco, No.19002); CD 123-positiv.
KG-1: aus Knochenmark gewonnene humane akute myeloische Leukämiezellen, DSMZ , No. ACC 14, Standardrastern: RPMI 1640 (Gibco; #21875-059, stab. L-Glutamin) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064) + 2,5g Glucose (20 % Glucose Solution, Fa. Gibco, No. l 9002); CD123-positiv.
Die Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) oder dem Leibniz-Institut DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren GmbH (DSMZ) für die jeweiligen Zelllinien angegeben.
MTT-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C- l angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NCT H292: 2500 Zellen/well; MOLM-13: 2000 Zellen/well; THP- 1: 8000 Zellen/well; KG-1: 5000 Zellen/well in ΙΟΟμΙ Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank: bei 37°C und 5% Kohlendioxid inlcubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Dann wurden die Antikörper-Wirkstoff-Konjugate oder die Metaboliten in ΙΟμΙ, Kulturmedium in Konzentrationen von 10°M bis 10"'·'Μ zu den Zellen (Triplikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproliferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-1010K). Hierzu wurde das MIT Reagens für 4h mit den Zeilen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffe erfolgte bei 570nm (infinite Ml 000 pro, Fa. Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde der lCso-Wertder Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die Proliferation ohne Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert.
In der folgenden Tabelle 1 sind die ICso-Werte repräsentativer Ausfuhrungsbeispiele mit verschiedenen anti-CD 123 Antikörper aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle 1:
MOLM 13 THP-1 KG-1
Beispiel IC58 [M] ICso [M] IC50 [M]
M T-Assay MTT-Assay MTT-Assay
194ml 5.25E-08 2.56E-10 1.23E-08
194m2 4.82E-08 2.05E-10 1.92E-08
194m3 1.24E-07 1.77E-10 1.24E-08
208ml 1.00E-08 l,39E-09
208mlTV 3.28E-09 1.03E-10
208m2 9 8SE-08 9.15E-10
208m3 4.62E-08 2.75E-09
208m3 TV 2,37E-09 2J0E-09
208m4 6.95E-09 8.80E-10 MOLM 13 THP-1 KG-1
Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT-Assay MTT-Assay MTT-Assay
240ml 2.47E-08 1.51 E-09
240m2 2.20E-08 2.00E-09
240m3 2.30E-08 1.70E-09
257ml 2.39E-08 3.42E- 10 4.05E-08
257m2 2.27E-08 3.50E- 10 1.92E-07
257m3 2.02E-08 1 .1 1E-09 2.07E-07
257m3 TV 1.23E-10 2.23E-10
259ml 1.90E-07 1.50E-08
259m2 5.00E-07 7.51E-08
259m3 5.00E-07 4.08E-08
260ml 2.01E-08 2.86E-09
260ml TV 5.09E-09 4.00E-09
260m2 2.07E-08 1.14E-09
260m3 TV 1.35E-08 4.95E-10
270ml 2.26E-07 1.50E-08
270m2 7.50E-08 7.20E-08
270m3 1.37E-07 2.60E-08
271ml 4.60E-09 4,69E-09
271m3 1.03E-09 9.58E-10
274ml 2.13E-07 1.85E-08
274m2 2.26E-07 1 .1 8E-09
274m3 2.95E-07 5.63E- 30
276ml 3.35E-09 1.35E-09
276m3 4.83E-10 6.62E-10 MOLM 13 THP-1 KG-1
Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT-Assay MTT-Assay MTT-Assay
281m3 2.15E-10 4.37E-09
284ml 2.62E-07 5.001E-07
284m2 2.39E-07 2.43E-07
284m3 1.66E-08 7.13E-09
296ml 1.28E-08 2.74E-09
296m2 9.44E-09 i .34E-09
296m3 1.42E-08 2.61E-09
297ml 3.64E-07 5.72E-09
297m2 1.70E-07 4.72E-09
297m3 4.65E-07 2.54E-09
309ml 9.40E-09 3.22E-09
309m3 4.36E-09 9.09E-10
310ml 3.58E-09 4.1 1 E-09
310m3 3.19E- 30 3.50E-10
314ml 5.12E-9 4.78E-10
314m3 1.88E-9 2.59E-10
317ml 1.66E-08 7.13E-09
317m3 1.60E-08 7.68E-09
318ml 1.61E-08 3.71E-09
318m3 4.41 E-09 2.92E-09
319ml 2.5 i E- 10 1 .15E-09
320ml 7.69E-09 1 .91E-09
321ml 3,29E-09 1.48E-09
322ml 3.26E-09 9.70E-10 MOLM 13 THP-1 KG-1
Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT-Assay MTT-Assay MTT-Assay
323ml 2.71E-09 1.07E-09
323m3 1.93E-10 7.76E-10
324ml 2.50E-09 3.57E-10
324m3 4.43E-10 4.49E- 10
325m3 ??F-10
326m3 1.66E-09
Die angegebenen Wirkdaien beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführimgsbeispiele mit den angegebenen Drug/mAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den TCso- Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Experimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der anti-CD123- war selektiv gegenüber der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt.
C-lb Bestimmung der Inhibition des Kinesinspindelproteins KSP/ Eg5 durch ausgewählte Beispiele
Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP /Eg5 (Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc, No. 027EG01-XL) wurde in einer Konzentration von Ι ΟηΜ mit 50μζ/πΑ Taxol (Fa. Sigma o. T7191 -5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc) für 5 min bei RT in 15mM PIPES, pH 6,8 (5mM MgCt2 und lOmM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Greiner bio-one REF 781096) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1.0 xlO-6M bis l .Ox 10-13M und ATP (finale Konzentration 500μΜ; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit-Grün delektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50min Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgt. Als Positivkontrolle wurden Monastrol (Fa. Sigma, M8515- lmg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience AI 0486) verwendet. Die Einzeldaten der Dosis- Wirkungskurve stellen achtfach Bestimmungen dar. Bei den IC50- Werten handelt es sieh um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe.
In der folgenden Tabelle 2 sind die ICso-Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus dem beschriebenen Assay aufgeführt sowie die korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT-Assay).
Tabelle 2
NCT-H292 KPL
Beispiele KSP-Assay
ICSji IM] ICso fM]
ICss, \M]
MTT Assav MTT Assay
Ml 2.01E-09 5.00E-07 5.00E-07
M2 2.45E-09 2.04E-07 1.63E-07
M3 1.52E-09 3.21E-08 9.00E-08
M4 2.71E-10 4.43E-08 1.76E-07
M5 4.57E- 1 0 7.94E-08 2.22E-07
M6 1.78E-09 4.63E-08 1.93E-07
M7 6.2 I E- 10 2.22E-08
9.25E-08
M9 1.07E-09 7,74E-10 2.57E-10
MIO 4.70E- 1 0 3.03E-07 2.26E-07
Ml l 1.1 1E-09 4.32E-1 1
MI 2 4.46E-10 3.3E-08
M13 1 .50E-09 1 .52E-07
3 .69E-07
M14 2.16E-09 1.74E-07 1.82E-07
Ml 5 9.64E-10 1.33E-07 1.69E-07
Ml 6 1.48E-09 1.43E-07 1.95E-07
M17 4.Γ7Ε-09 7.35E-09
Ml 8 5.17E-09 3.55E-08
Ml 9 2.58E-09 1.23 E-07
M20 1.50E-09 1 .49E-07 2.13E-07
M21 2.31E-09
M22 8.27E-10 2.89E-08 1.82E-07
M23 1.26E-09 5.00E-07 5.00E-07
M24 2.90E-09 1 .67E-07 5.00E-07
M25 2.91E-09 5.00E-07 5.00E-07
M26 9.44E-10 6.38E-08 NCI-H292 KPL4
Beispiele KSP-Assay
ICso {M} ICso [M]
ICso [M]
MTT Assay MTT Assay
M27 2.03E-09 2.76E-07
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele.
C-2a Intemaiisiemngsassay
Intemalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper- Wirkstoff- Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen CD 123- Antikörpern und einem Isolyp-Kontrollantikörper markiert mit einem pH- sensitiven Fluorophor verfolgt. Hierzu wurde zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgte mit zweifach, molarem Überschuss von CypHer 5E mono NHS ester (Batch 357392, Fa. GE Healthcare) bei pH 8,3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischung gelchromatographisch aufgereinigt (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768; Elutionspuffer: DIJLBECCO'S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH-Wert zu adjustieren. Die Arikon Zentrierung der Proteinlösung erfolgte mittels VIVASPIN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec VS0131). Die dye ioad Bestimmung des Antikörpers wurde mit Hilfe einer spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung mit nachfolgender Gleichung D: P : (A2so-0, 16Adve)sdye durchgefühlt. Die dye ioad der hier untersuchten CD123-Antikörper sowie der Isotyp-Kontrolie lagen in vergleichbarer Größenordnung. In Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die Konjugation zu keiner Affinitätsänderung der Antikörper führte. Das zu untersuchende Antigen wird von hämatopoetischen Suspensionszeilen exprimiert, so dass die Intemalisierung der markierten CD123-Antikörper in einem FACS-basierten Internalisierungs- Assay untersucht wurde. Hierzu wurden Zelllinien mit unterschiedlichem Expressionsniveau des Rezeptors gewählt und getestet. Die Zellen (5x1 Oßweil) wurden in einer 96-MTP in ΙΟΟμΙ, Gesamtvolumen ausgesät (Fa. greiner bio-one, CELLSTAR, 650 180, U-bottom). Nach Zugabe des zu untersuchenden anti-CD123- Antikörpers in einer Finalkonzentration von 1 O^ig/mL wurden die Zellansätze unterschiedlich lang bei 37°C inkubiert (lh, 2h, 6h, Triplikate). Das gleiche Behandlungsschema erfolgte mit der markierten Isotyp-Kontrolie (negative Kontrolle). Parallel wurden identische Versuchsansätze bei 4°C durchgeführt (negativ Kontrolle). Die FACS Analyse wurde dann mit Hilfe des Guava flow cytometer (Fa. Millipore) durchgeführt. Es erfolgte eine kinetische Evaluierung über die Messung der Fiuoreszenzintensität mit der guavaSoft 2,6 Software (Fa.Millipore). Es konnte Target- vermittelte, spezifische Internalisierung mit den anti-CD 123 -Antikörpern in verschiedenen Krebszelllinien (MOLM- 13, THP-1, KG- 1) beobachtet werden, wohingegen die Isotyp-Kontrolle sowie die 4°C Ansätze keine Intemalisierung zeigten.
Die Freisetzung des toxischen Wirkstoffes aus den Antikörper-Wirkstof -Konjugaten erfolgt im Lysosorn, bedingt durch die Wahl des Linkers. Der Transport des Antikörpers zu diesem Organeil ist somit von entscheidender Bedeutung. Durch Co-Lokalisation des Antikörpers mit für das Lysosorn spezifischen Marker-Proteinen (z.B. Oberflächenprotein bzw. kleine GTPasen) können Antikörper mit geeignetem Profil identifiziert werden. Hierzu wurden die CD123-positiven Zellen (5xl04/well) zunächst in Ι ΟΟμί Medium in eine 96-MTP ausgesät (Fa. greiner bio-one, CELLSTAR, 650 180, U-bottom). Nach. Zugabe des CypHerSE markierten anti-CD123- Antikörpers (20fig/mL finale Konzentration) wurden die Ansätze als Duplikate 6h, bei 37°C inkubiert. Jeweils 30min vor Ablauf der Inkubationszeit wurde den Proben ein Lysosom- spezifischer Lebendfarbstoff zugefügt. Mittels CytoPainter LysoGreen Indicator Reagent (finale Konzentration 1 :2000; Fa. abcam, abl 76826) wurde eine Anfärbung der Lysosomen erzielt. Nach der Inkubation wurden 200μΕ eiskalter FACS-Puffer (DULBECCO'S PBS, Fa. Sigma-Aldrich, No. D8537 + 3 % FBS heat inactivated FBS, Fa. gibco, No. 10500-064) zum Ansatz pipettiert und die Zellsuspension für 5min, 400xg bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in 300μΕ eiskaltem FACS Puffer resuspendiert und erneut zentrifugiert (4min, 400xg bei 4°C). Der Überstand wurde nach der Zentrüxigation verworfen und das Pellet in 30μί eiskaltem FACS Puffer aufgenommen. Die so vorbereiteten Proben wurden sofort einer FACS/Image Analyse unterzogen (FlowSight a nis, Fa.Millipore). Die Co-Lokalisation wurde mit der spezifischen Co-lokalization Software IDE AS Application v6.1 ausgewertet. In Tabelle 3 sind die Daten aus diesem Assay für die untersuchten anti-CD 123 Antikörper zusammengefasst
Tabelle 3
C-3 Tn vitro Tests zur Bestimmimg der Zell -Permeabilität
Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in viVro-Testung in einem Flux-Assa unter Verwendung von Caco-2-Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch-Filterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem REPES- Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol-Massenspektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp- Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et d. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et dl., J. Med. Chem. 46, 1716-172,5 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Papp (B-A) zu PapP (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0,5 war.
Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [PapP (B-A)] und das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A-B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2-Zellen. Gibt das efflux ratio zudem keine Hinweise auf aktiven Transport, kann die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilen. Damit steigt auch die Zeit, die für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin-Spindelprotein, KSP / Eg5) zur Verfügung steht.
In der folgenden Tabelle 4 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausföhrungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle 4
Ausführungsbeispiel Papp (B-A) Efflux ratio
[nm/s]
Ml 7.8 4
M2 4.8 6.4
M3 1.4 1 .3
M4 21.3 18.7
M5 20.3 26.5 Ausführungsbeispiel Papp (B-A) Efflux ratio
üiffi/s]
M6 1.7 0.7
M7 5.6 2.2
M9 213 16
Ml l 24.3
M12 3.3 1.8
M13 7.1 3.6
Ml 4 12.7 6.6
Ml 5 6.4 4.4
Ml 6 9.0 7.0
M17 93.6 81.5
Ml 8 1.6 2.9
M19 1 .9 2.9
M21 0.5 1.5
M22 0.9 0.9
M23 2.8 2.0
M24 3.9 1.0
M25 8.1 3.6
M26 13.0 9.6
M27 13.2 1 1.9
C-4 In vitro Tests zur Bestimmung der Suhstrateigenschaften für P-Glycoprotein (P-gp)
Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen.
Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCB1) wurden mittels eines Flux-Assays unter Verwendung von LLC-PKl -Zellen, die P-gp überexpnmieren (L-MDRl -Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et ed., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PKl - oder L-MDR1 -Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kuliiviert. Zur Bestimmung der Permeaüon wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermeetin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-Sysiem war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol-Massenspektrometer API 3000 (Applied Biosysteins Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp- Wertes bewertet, weicher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux- Verhältnis PapP (B-A) zu PapP (A-B) >2 war.
Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Subsüateigenschaften können die Efflux - Verhältnisse in L-MDR1- und LLC-PKi -Zellen oder das Efflux-Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp- Substrat.
C-5 Pharmakokinetik
C5a: Identifizierung der ADC-Metabolite nach internal isierung in vitro Methodenbeschreibung:
Internalisierangsuntersuchungen mit Immunkonjugaten werden durchgeführt, um intrazellulär entstandene Metaboliten zu analysieren. Hierzu werden humane Lungentumorzellen NCI H292 (3xl05/well) in 6-weli Platten ausgesät und über Nacht inkubiert (37 °C, 5% CC)3). Es erfolgt eine Behandlung mit 10 iig/mL (66 nM) des zu untersuchenden ADCs. Die Intemalisierung wurde bei 37 °C und 5% C02 durchgefühlt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 24, 48, 72h) werden Zellproben zur weiteren Analyse genommen. Zunächst werden die Überstände (ca. 5 mL) geerntet und nach erfolgter Zentrifugation (2 min, RT, 1000 rpm Heraeus Variofuge 3.0R) bei -80 °C gelagert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit Accutase abgelöst und die Zellzahl bestimmt. Nach erneutem Waschen wird eine definierte Zellzahl (2x1 *) mit 100 mL Lysis Puffer (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1) versetzt und unter ständigem Schütteln (Thermomixer, 15mm, 4°C, 650 rpm) in Protein LoBind tubes (eppendorf Cat.No. 0030 108.1 16) inkubiert. Nach der Inkubation wird das Lysat zentrifugiert (10min, 4°C, 12000g, eppendorf 5415R) und der Überstand geerntet. Der gewonnene Überstand wird bei -80 °C gelagert. Alle Proben werden anschließend wie folgt analysiert.
Die Messung der Verbindungen im Kulturüberstand bzw. Zellysat erfolgt nach Fällung der Proteine mit Methanol oder Acetonitril durch eine Hochdruck-Fiüssigkeits-ChromatograpMe (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
Zur Aufarbeitung von 50 μ.Ι, Kulturüberstand/Zelllysat werden diese mit 150 μΐ. Fällungsreagenz (in der Regel Acetonitril) versetzt und für 30 Sekunden geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20- 100 ng/mL). Nach dem 3minütigen Zentrifugieren bei 16000 g wird der Überstand in ein Autosampler- Vial überführt, mit 500 μΙ_, eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt.
Die Messung beider Matrixproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Tripie- Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Firma AB SCiEX Deutschland GmbH.
Zur Kalibrierung werden Plasmaproben mit Konzentrationen von 0.5 - 2000 μ$Ί, versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) liegt bei ca. 2, μg.L. Der lineare Bereich, erstreckt sich von 2 bis 1000 μα/L·
Zur Kalibrierung der Tumorproben wird der Überstand unbehandelter Tumore mit Konzentrationen von 0.5 - 200 versetzt. Die Nachweisgrenze liegt bei 4 $Ί,. Der lineare Bereich erstreckt sich von 4 bis 200 μg/L.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 5 und 50 μ^Ί_. C5b: Identifizierung der ADC-Metabolite in vivo
Nach i.v. Applikation von 3-30 mg/kg verschiedener ADCs können die Plasma- und Tumorkonzentrationen des ADCs sowie potentiell auftretender Metaboliten gemessen und die pharmakokinetischen Parameter wie Clearance (CL), Fläche unter der Kurve (AUC) und Halbwertszeit (h/2) berechnet werden.
Die Messung der Verbindungen in Plasma und Tumor erfolgt nach Fällung der Proteine mit Methanol oder Acetonitril durch eine Hochdrack-Flüssigkeits-Cliromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS). Zur Aufarbeitung von 50 -iL Plasma werden diese mit 250 μΕ Fällungsreagenz (in der Regel Acetonitril) versetzt und für 10 Sekunden geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20- 100 ng/niL). Nach dem 3minütigen Zentrifugieren bei 16000 g wird der Liberstand in ein Autosampier- Vial überführt, mit 500 μΐ, eines auf das Laufinittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt.
Bei der Aufarbeitung eines Tumors wird dieser mit der 3 fachen Menge an Extraktionspuffer versetzt. Der Extraktionspuffer enthält 50 mL Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockibrd, IL), zwei Pellets Complete-Protease-Inhibitor-Coektail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und Phenyimethylsulfonylfluorid (Sigma, St. Louis, MO) in einer finaler Konzentration von 1 rnM. Im Tissuelyser II (Qiagen) wird die Probe zweimal 20 Minuten bei maximaler Schlagzahl homogenisiert, 50 }.i.L des Homogenats wird in ein Autosampier- Vial überführt und mit 150 μί, Methanol inklusive ISTD aufgefüllt. Nach 3minütigem Zentrifugieren bei 16000 g werden 10 μΕ des Überstands mit 180 μί eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt. Danach ist die Tumorprobe messfertig.
Die Messung beider Matrixproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple- Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.
Zur Kalibrierung werden Plasmaproben mit Konzentrationen von 0.5 - 2000 μg/L versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) liegt bei ca. 2 μ^. Der lineare Bereich erstreckt sich von 2 bis 1000 ■ig/L.
Zur Kalibrierung der Tumorproben wird der Überstand unbehandelter Tumore mit Konzentrationen von 0.5 - 200 iig/Ί., versetzt. Die Nachweisgrenze liegt bei 5 μg/L. Der lineare Bereich erstreckt sich von 5 bis 200 μ§ ί.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 5 und 50 ,g/L, in Plasma zusätzlich 500 μg/L.
Analytik zur Quantifizierung der verwendeten Antikörper
Der Antikörperteil der ADCs wurde mittels Liganden-Bindungs-Assay (ELISA) als Gesamt-IgG- Konzentration in Plasmaproben und Tumorlysaten bestimmt. Dabei wurde das Sandwich-ELISA- Format verwendet. Dieser ELISA war qualifiziert und validiert für die Bestimmung in Plasma- und Tumorproben. Die ELISA-Platten wurden mit anii-human-igG-Fc-Antikörpem der Ziege beschichtet. Nach Inkubation mit der Probe wurden die Platten gewaschen und mit einem Detektor- Konjugal aus anti-hunran-IgG(H+L)- Antikörper des Affen und Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde das HRP-Substrat OPD hinzugegeben und die Farbentwicklung über die Absorption bei 490 nm verfolgt. Standardproben mit bekannter IgG- Konzentration wurden mittels 4-Parameter-Gleichung gefittet. Innerhalb der unteren (LLOQ) und oberen (ULOQ) Quantifizierungsgrenzen wurden die unbekannten Konzentrationen über Interpolation ermittelt.
C-6 Wirksamkeitstest in vivo
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugale konnte in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet werden. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO 2005/08371 i ; Poison et al., Cancer Res. 2009 Mar 35;69(6):2358-64).
Beispielsweise wurden hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmoiekü! des Binders exprirniert, implantiert. Anschließend wurden den Implantat-Tieren entweder ein erfindungsgemäßes Konjugal, ein Isot p-Antikörper-Kontrollkonjugate oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgte einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wurden die Tumorgröße im Vergleich von Konjugat- behandelten Tieren und der Kontrollgruppe (Kotrollkonjugat) bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße.
C-6a. Wachstumshemmung / Regression von experimentelles* Tumoren in der Maus
Humane Tumorzellen, die das Antigen für das Antikörper- WirkstoiTkoniueat exprimieren, wurden subkutan in die Flanke von irrrmunsupprrmierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nudeoder SCID-Mäuse. 1-10 Millionen Zeilen wurden aus der Zeilkultur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Medium / Matrigel resuspendiert. Die Zellsuspension wurde unter die Haut der Maus gespritzt.
Innerhalb von einigen Tagen wuchs ein Tumor heran. Die Behandlung begann nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 40 mm2. Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 50-100 mm2 begonnen werden. Die Behandlung mit den ADCs erfolgte über die intraperitoneale (i.p.) Route der Maus. Das ADC wird mit einem Volumen von 5 mL / kg appliziert.
Das Behandlungsschema richteie sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers-Konjugates. Als Standard wurde vier Mal in Folge jeden vierten Tag behandelt. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei Behandlungstagen anschließen.
Standardmäßig wurden 8 Tiere pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wurde eine Gruppe als Kontrollgruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt.
Im Verlauf des Experiments wurde die Tumorfläche regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorfläche wurde mittels Länge x Breite bestimmt Der Vergleich der mittleren Tumorfläche der Behandiungsgruppe mit der Kontroligruppe wurde als T/C area angegeben.
Wurden alle Gappen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, konnten die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontroligruppe wurde als T/C weighi angegeben.
C-6b. Wirksamkeit in humanen Tumor•-Xenografimodellen
Die jeweiligen Tumorzellen wurden subkutan in die Flanke von weiblichen NMRI-nude Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer Tumorgröße von ~-40 mm2 wurde intravenös mit dem Antikörper- Wirkstoffkonjugat behandelt. Im Anschluss an die Behandlung wurde das Tumorwachstum ggf. weiterverfolgt.
Die Behandlung mit den anti CD123- Antiköiper-Wirkstoffkonjugaten führte zu einer deutlichen und lang anhaltenden Wachstumshemmung der Tumore im Vergleich zur Kontrollgruppe und den Isotyp- Wirkstofflconjugaten. Die Tabelle 5 gibt die T/C Werte an, ermittelt über die Tumorfläche am Tag mit dem letzten Messwert der Isotypgruppe gerechnet nach Inokulation. Beispiel Tumor Modell Dosis Dosis- T/C area
schema
257-ml (TV) THP-1 (humane akute 10 mg/kg Q4dx4
0.41 (Tag 33) myeloische Leukämie)
257-1Ή3 (TV) THP-1 (humane akute 10 mg/kg Q4dx4
0.3 (Tag 33) myeloische Leukämie)
257-ml (TV) MOLM-13 (humane akute 10 mg/kg Q4dx4
0.26 (Tag 26) myeloische Leukämie)
257-m3 (TV) MOLM-13 (humane akute 10 mg/kg Q4dx4
0.22 (Tag 26) myeloische Leukämie)
208-ml (TV) MOLM-13 (humane akute 10 mg/kg Q4dx4
0.28 (Tag 22) myeloische Leukämie)
208-m3 (TV) MOLM-13 (humane akute 10 mg/kg Q4dx4
0.38 (Tag 22) myeloische Leukämie)
Alisführungsbeispiele für anti-CD123-Antikörper
Alle Beispiele wurden unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt, die dem Fachmann bekannt sind, sofern sie nicht hier im Detail beschrieben werden. Routine- Molekularbiologie- Verfahren der folgenden Beispiele können wie in Standardlaborbüchern beschrieben ausgeführt werden, wie Sambrook et al., Molecular Cloning: ein Laboratory Manual, 2 Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, .Y., 1989.
Bestimmung der Bindungsaffinität der Antikörper mittels Oberflächenplasmonenresonanz:
Oberflächenplasmonenresonanz-Experimente zur quantitativen Bindungsanalyse wurden mit einem Biacore T200 Instrument (GE Healthcare Biacore, Inc.) durchgeführt. Hierbei wurden die zu untersuchenden Antikörper mithilfe eines an die Sensorchipoberfläche amingekoppelten antihuman Fc Antikörpers ("Human Antibody Capture Kit", BR- 1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.") fixiert. Die Aminkopplung wurde nach den Herstellervorschriften mit l-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), -hydiOxysuccinimide (NHS) und Ethanolamin-HCl pH 8.5 („Amine Coupling Kit" BR-1000-50, GE Healthcare Biacore, Inc.) durchgeführt. Für die Analysen wurden Series S Sensor Chips CM5 (GE Healtchare Biacore, Inc.) mit dem Laufpuffer HBS-EP+ verwendet ( 1 0 mM HEPES pH 7.4, 150 mM aCi, 3 mM EDTA, 0,05 % Surfactant P20). Alle experimentellen Schritte erfolgten bei 25 °C, Nach erfolgter Fixierung der zu untersuchenden anti-CD123 Antikörper wurden Injektionen der extrazellulären Domäne von IL3Ra (Analyt, R&D Systems) im Konzentrationsbereich von 1,56 bis 200 nM vorgenommen, wobei nach jeder Antigeninjektion die Sensoroberfläche mit Glycin-HCl pH 2.0 regeneriert wurde. Vor einer erneuten Analvtinjektion wurden jeweils Antikörper unter identischen Bedingungen wie zuvor fixiert Bei allen Messungen diente eine vorgeschaltete Flusszelle, in der lediglich ammgekoppelier anti-human Fe Antikörper iminobilisieri vorlag, als Referenzzelle. Die Auswertung der erhaltenen Sensorgramme erfolgte nach Doppelreferenzierung (Subtraktion des Referenzflusszellensignals und einer Pufferinjektion) durch einen globalen Fit basierend auf einem 1 : 1 Langmuir Bindungsmodell mithilfe der Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare Biacore, Inc.).
J: Verwendetes rekombinantes Antigene (IL3R3alpha/CD123) zur Affinitätsbestimmung
Table 6b: Monovalente KD Werte der anti-CD 123 Antikörper bestimmt durch Biacore mit IL3Ra- ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
TPP-6013 3.0E+05 1 .9E-04 0.6E-09
Bindung von anti-CD 123 Antikörpern an verschie Antigen-exprimierende
Krebszclllinien
Die Bindung der anti-CD123 Antikörper wurde mittels Durchflusszytometrie an verschiedenen humanen hämatologischen Zelllinien (MOLM-13, T'HP-l, KG-1) untersucht. Hierzu wurden die Zellen (5xl 05 cells/well) in FACS Buffer (PBS ohne Ca/Mg, 3% FCS. Biochrom) mit lOfig/mL Primärantikörperlösung (Startkonzentration) auf Eis für 30-45 min lichtgeschützt inkubiert. Es wurde eine Dosiswirkungskurven (1 :5 Verdünnung) erhoben. Nach erfolgter Inkubation wurden 200f.iL eiskalten FACS Puffer zupipettiert und die Zellsuspension bei 4°C, 400g, für 4min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 300μΙ, eiskaltem FACS -Puffer gewaschen, bevor das gewonnen Pellet in ΙΟΟμΕ FACS-Puffer resuspendiert und mit Sekundärantikörper (monoclonal Anti-Kappa light chains-FITC antibody, Fa. Sigma, No. SAB4700605) in einer 1 : 10 Verdünnung erneut 30min auf Eis inkubiert wurde. Danach wurden die Zellen mit eiskaltem FACS-Puffer gewaschen und auf eine Zellkonzentration von 0.5x106 Zellen/mL eingestellt, bevor die Durchflusszytometrie mit einem Guava flow cytometer (Fa. Millipore) durchgeführt wurde. Propidium lodid (finale Konzentration I fig/niL) wurde zur Lebendfärbung genutzt, Mittels Titratio nskurven wurden die EC50 Werte der zu untersuchenden Antikörper ermittelt (Tabelle 7)
Table 7: FACS Analyse: Bindung der anti-CD123 Antikörper an verschiedene Ki-ebszelllinien..
Cell Line Sosirce TPP-6013 TPP-5969
KG1 ATCC CCL-246 3.0E-09 2.8E-09
MOLM-13 DSMZ No, ACC 554 2.4E-09 5.3E-09
THP-1 ATCC No. TIB-202 "u. i i-:- 09 8.9E-09
MV-4-11 ATCC No.CRL 9591 l .OE-09 2.6E-092
L428 DSMZ No. ACC 197 2.2E-09

Claims

Konjugal eines Antikörpers mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen der folgenden Formel:
BINDER KSP wooei für einen anti-CD123-Antikörper, weicher eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers 7G3 oder 12F1 ist, oder für ein antigenbindendes Fragment von diesem steht, für einen Linker steht, für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, und
KSP für eine Verbindung der folgenden Formel (I) steht:
Formel (I):
wobei
R1 -H, -L-#l , -MOD oder -(CH2)o-3Z darstellt,
wobei Z -H, - HY3, -OY3, -SY3, Halogen, Vi Ο ί Λ V . oder
C(=0)-OY3 darstellt. unabhängig voneinander -H, -NH2,
-«.Ί Ι Π Ι -Ο).·, -( S :/· (z.B.
-(CH2)o-3Z'), oder -VWiCW W )/ - darstellen
Y3 -H oder -( 'i i },, =/ · darstellt,
Z' -H, -NH2, -SO3H, -COOH,
-NH-C( ))-CH2-CH2-CH(NH2)COOH
oder -(CO-NH-CHY )i-3COOH darstellt;
W H oder OH darstellt,
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NH-C(=0)-
NH2 substituiertes Aikyl oder gegebenenfalls mit - H2 substituiertes Aryi oder Benzyl darstellt;
R2 -H, -MOD, -C(0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2V3Z darstellt,
wobei
Z - i L Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY!Y2 oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -Ntfe oder -(CH2J0-3Z'
darstellen,
Y3 -H oder -(CH2)< )Z' darstellt,
Z ' -H, -SO3H, -NH oder -COOH darstellt;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit
-NH-C(0)-NH2 substituiertes, C .1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und
Y5 -H oder ( '·; OK ί IV ΑΉ · darstellt,
Y6 lineares oder verzweigtes Cj-6 Alkyl darstellt;
R4 -H, -L-#l, -SGlys-(C=O)0-i-R4', ~C(==0)-CHY4-NHYs oder - K i ! }„ =/ darstellt, wobei
SGjys eine durch iysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, wobei R" eine C1-10- Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, C5-10-
Heteroalkyl-, G-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, C5-10- Heterocycioalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryi-alkoxy-, Cj-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Cer 10- Aralkoxy-, Cs-i o-Heteroaralkoxy-,
G-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy- Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH-Alkyi, -N(Alkyi)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(AIkyl)-C(-0)-Alkyl, -SO ! i. -Si 0) -\H . -S ))?- fAikyij2, -COOK, -C(=0)-NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)v-R^" darstellt,
wobei x 0 oder 1 ist,
wobei v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, wobei R4' ' I !. -Alkyl (vorzugsweise G-12-Alkyl),
-CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt; wobei Z -H, Halogen, -OYJ, -SYJ, -NHY , -0(=Ο)- ΥΎ', oder
--C(0)-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander ~H, -NH L 22< oder -(CH2V3Z' darstellen, wobei Y"' -Ii oder -(CH2)0.3Z' darstellt, wobei Z' -H, -SO3H, -Ni oder -COOH darstellt;
wobei Y Ά' imeares oder verzweigtes.
gegebenenfalls mit
-NH-C(=0)-NH2 substituiertes, C 1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt,
wobei Y5 -H oder </i '- !)-( '! IV - NU.
darstellt und wobei Y° lineares oder verzweigtes
Cj-6 Alkyl darstellt; oder
R und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR' '- oder
-CHRn-CH2- darstellen,
wobei
R!i -H, - Ϊ-Ϊ2, -SO3H, -COOK, -SH, Halogen (insbesondere F oder Ci), C Alkyl, C1- Haloalkyl, CwAlkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyl, -OH darstellt;
A -C( OK -S(=G)-, -S(=0)2-, -S(=0)2-NH- oder -C(=N-NH2)- darstellt;
R3 -L-#l, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-,
Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heteroeycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine Ci-io-Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Ci-io-Heteroalkyl-, Cj-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl- Gruppe, die jeweils substituiert sein können mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 -O-Alkyi Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -0-C(=0)-Alkyl Gruppen, 1-3 -0-C(=0)-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -M i -Cl O)- A lkyl Gruppen, 1-3 -NH-C(=0)-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -S( ))„- Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(=0)2-NH- Alkyl Gappen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 ~NH2 Gappen oder 1-3 -(CH2)o-3 Gruppen,
wobei
n für 0, 1 oder 2 steht,
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - HY3, -C 't 0)-N V V oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z'
darstellen,
Y3 -H, ·((, ! ! ·), :· ( !· Ν Π ·ί, ! ( >)·
01 1 :}/.·. -(01 ! ·), : ·(.Ί {(Μ 1;)Ζ·. oder
•·;(.Ί ί · ίο =/.· darstellt,
Z ' -H, -SO3H, -NH2 oder -COOH darstellt, -H, -NH2, -NO2, Halogen (insbesondere F, CI, Br), -CN, CF3,
-OCF3, ·( '! ·: i . "CH2F, SH oder - Κ Ί Ι.·)., :/ darstellt,
wobei
Z -H, -OY3, SY :. Halogen, \ ! ! Y ;. -Ci ( >;- N V ^ \. oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y 1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2, oder -(ϋΐί -ιΖ' darstellen.
-H oder -! ( '! !. ·., =/ " darstellt,
Z' -H, -SO3H, - H2 oder -COOH darstellt;
R6 und R7 unabhängig voneinander -H, Cyano, d-io-Alkyl, Fluor- Cno-A]kyi,C_-i©- Alkenyl, Fluor- C2-io-Alkenyl, C2-10- Alkinyl, Fluor- C2-io-Alkinyl, Hydroxy, -NO2, - H2, -COOH oder Halogen darstellen,
R8 Ci-io-Alkyl, Fluor-Ci-io-Alkyl, C2-io-Alkenyl, Fluor-C2-io-Alkenyl, C2-10- Alkinyl, Fluor-C2-jo- Alkinyl, C^so-Cycloalkyl, Fiuor-C io-Cyeioalkyl oder ■(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, welche ein- oder zweifach, gleich oder verschieden mit -OH, -COOH oder -NH2 substituiert sein können und
wobei
HZ2 einen 4 bis 7-gliedrigen Heierocvcius mit bis zu zwei
Heieroatoinen ausgewählt aus N, O und S darstellt,
R9 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 darstellt;
WODCl
:r der Substituenten R1, R3 und R4 -L-#3 darstellt, für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht, --(NRi0)n-(Gl )0-G2-G3 darstellt,
wobei
II oder C-C.-Alkyl darstellt; ΝΠ ·( ί (»- oder -C(=0)-NH- darstellt (wobei wenn Gl -NH-C(=0)- darstellt R10 nicht -NH2 ist);
0 oder 1 ist;
0 oder 1 ist; und
eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10
Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch, eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-,
•Si (>)-. ·Η· <))··. - Ry-, -NRyC(=0)-,
-C(=0)- Ry-, -NRy y-, Si 0)-\R \R ·. ff Oi-\R \R ..
wobei
Ry -H, Phenyl, C 1 -C 1 Q-Alkyl, C2-C j 0-
Alkenyl oder C2-Ci Q-Alkinyl darstellt, die jeweils ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit
•Xil-Ci θ;·\Ίί2. -COOH, -OH, -NH2,
-NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
und oder die ein- oder mehlfach, gleich oder verschieden durch -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein können, wobei
Rx -H, C } -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt und wobei
die Kohienwasserstoffkette einschließlich einer gegebenenfalls an der Kohlenwasserstoff gruppe substituierten Ci-Cio-Alkylgruppe als Seitenkette, mit Mi-O ( >;-Nl{ 2. -COOH, -OH, -NH2, - H-CN-NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann. G3 H oder -COOH darstellt, und
wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine
Gruppe COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate,Salze der Solvate und Epirnere.
2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei A für -C(=0)- steht.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei R1 für -H, -L-# 1 , -COOH, -C(=0)-NHNH2, ·{< i i - i :N1 I;. ·( ·{ < ! ) ·Ν/. · · ί ( I i ) . N M; und -C(=0)-NZ"CH2COOH ist, wobei Z" für -H oder -NH2 steht,
4. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R und R4 für -H stehen, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines P rrolidinringes) -CHR n-CH2- oder -CHa-CHR1 1- darstellen; wobei R1 1 -H, -COOH, -F, Methyl, -CH2F, -O-Metlryl, -CH2OH, -C(=0)-0-(C Alkyi) oder -OH darstellt.
5. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R3 für -L- #1 steht oder fiir eine Phenylgruppe, die ein- oder mehrfach mit Halogen, C3.3 Alkyl oder Fluor-Ci . Aikyl substituiert sein kann, oder eine Ci-io-Alkyigruppe oder Fluor -
Ci-10-Alkyigruppe darstellt, die gegebenenfalls mit -OY4, -SY4, -0-C(=0)-Y4, •O-Ci OJ- N i i- V . -NH-C(-0)-Y4, - H-C(-0)-NH-Y4, -S(0)n-Y4 , -S; O i - N H-V . -NH-Y4, oder -N(Y4)2, substituiert sein kann,
wobei
n 0, 1 oder 2 darstellt,
Y für -H, Phenyi, welches gegebenfalls ein- oder mehlfach mit Halogen, C1 _3 Aikyl oder Fluor- C i _3 Alkyl substituiert ist, steht oder fiir Aikyl steht, welches mit -OH, -COOH, und/oder substituiert sein kann.
6. Konjugat nach Anspruch 5, wobei das Konjugat die folgende Formel (IT j ) aufweist:
wobei
-L-#l darstellt;
A -C(=0)- darstellt; und
6, R7, Rs und die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) in Anspruch 1 aufweisen.
Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Substituent R1 ί · · I darstellt.
Konjugal nach Anspruch 7, wobei das Konjugat die Formel Ilk) aufweist:
(Ilk)
-L-#l darstellt;
A -C(=0)- und
R3 -CH2OH- darstellt:
R6, R . R8, und R die gleiche Bedeutung wie in Formet (1) in Anspruch 1 aulweisen.
9. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergellenden Ansprüche, wobei 5 -H oder -F ist.
10. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R6 und R'' unabhängig voneinander -H, Ci-3-Alkyl, Fluor- Cw-Alkyl, C2-4-AIkenyl, Fluor- C2- - Alkenyl, C?.-4-AlkinyL Fluor C2-4-AlkinyL -Hydroxy oder Halogen darstellen.
11. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R8 eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl ist.
12. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei Ry -H oder Fluor ist.
13. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, wobei der Linker -L- eine der folgenden Gnmdstrakturen (i) bis (iv) aufweist:
(i) .(( ( ))... s< , i -i. I - 1.2-
(ii) -(CO)m -Ll -SG-Ll -L2-
(iii) -(CO)m -Ll-L2-
(iv) -(CO)m -Ll-SG-L2
wobei m 0 oder 1 ist, SG und SGI eine in vivo spaltbare Gruppe ist, LI unabhängig voneinander für in vivo nicht spallbare organische Gruppen stehen, und L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder steht.
14. Konjugal nach Anspruch 13, wobei die in vivo spaltbare Gruppe SG eine 2-8
Oligopeptidgruppe, bevorzugt, eine Dipeptidgruppe oder ein Disulnd, ein Hydrazon, ein Acelal oder ein Aminal ist und SGI eine 2-8 Oligopeptidgruppe, bevorzugt eine Dipeptidgruppe ist.
15. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergellenden Ansprüche,
wobei der Linker L an eine Cystein-Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden ist und die folgende Formel aufweist:
§-(C(=0)-)m-Ll-L2-§§
wobei 0 oder 1 ist;
die Bindung an das Wirkstofrmolekül darstellt und
die Bindung an den Antikörper darstellt, und
steht, wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers
kennzeichnet,
#2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet,
L1 -(NR10)n-(Gl)o-G2- darstellt,
wobei
R!0 -H, - H2 oder Cs-Cs-Alkyl darstellt;
G l - H-C(O)- darstellt;
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 25) Kohlenstoffatomen aus Arylgruppen, und/oder geradkettigen und'oder verzweigten Alkylgruppen, und/oder eyelischen Alkylgruppen ist, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C i OK -N-CHs-, - HNH-, -Sf ( !) · Ν! Ι\Π· . -Ni l -C< OK -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis i Ogliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozykius mit 1 bis 4 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen und/ oder Heterogruppen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder unterbrochen sein kann
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette gegebenenfalls mit -NH-C(-0)-NH2, -COOK, -OH, ··>. ! ! ·. -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann, eine der folgenden Gruppen darstellt:
wobei Rx •H, Ci-Cs-Alkyl oder Phenyl darstellt.
16. Konjugal nach Anspruch 15, wobei L2 dargeste :11t wird durch eine oder beide der folgenden Formeln:
wobei #' die Verknüpfüngsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, # die Verknüpfungssteile mit der Gruppe L1 kennzeichnet,
R22 -COOK darstellt, und die Bindungen an das Schwefelatom des Binders zu über 80 %, (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder) in einer dieser beiden Strukturen vorli egen .
Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 15 oder 16, wobei L1 die folgenden Formeln aufweist:
in denen
r eine Zahl von 0 bis 8 Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergenderi Anspräche, wobei de Linker -L- an eine Cy stein- Seitenkette bzw. Cysieim-est gebunden ist und di folgende Formel aufweist:
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffinolekül darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,
m 0, 1, 2, oder 3 ist;
n 0, 1 oder 2 ist;
P 0 bis 20 beträgt; und
L3
wobei
o 0 oder 1 istjund
eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 25) Kohlenstoffatomen aus Aiylgruppen, und'oder geradkettigen und/oder verzweigten Alkylgruppen, und/oder eyclischen Alkyigruppen ist, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -N-CH3-, -NHNH-, -S(0)2- FTNH-, •Xil-C'i O ·( ( <>}-\Ί!-. ·('( θ;-·ΝΠ\Π· und einen 5 bis 1 Ogliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit 1 bis 4 gleichen oder verschiedenen Heteroato en und/ oder Heterogruppen, ausgewählt aus N, O und S, unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette gegebenenfalls mit ΛΠ-Γ· 0)·\Π . -COOH, -OH, Nil-. -NH-CN- H2, Sulfonamid, Sulfon, Suifoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprach Konjugal eine der folgenden Formeln aufweist:
A 1 einet! über Cystein verknüpften und AK2 einen über Lysin verknüpften anti- CD 123-Antikörper, v/elcher eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers 7G3 oder 12F1 ist, darstellt,
n eine Zahl von 1 bis 20 darstellt; und
Li eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, Cyciopentyl, Piperidinyl, Phenyl unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -COOH, oder -NH2 substituiert, sein kann,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere. l nach Anspruch 19, wobei der Linker Li für die Gruppe §-NH-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)s-§§;
§-NH-(CH2)2 »0- (CH2)2- § § ;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH- H-C(=0)-(CH,)5-§§;
§-Nil-(CH:)2-C(-0)-O-(CH2)2-§§;
§_NH-(CH:)2-C(-0)-NH-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C( ))-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(K))-CH(CH3)-§§;
§- H-(CH2)2-0-(CH2)2- H-C(0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2- § § ;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§ -NH-(CH2)2-NH-C(=0) -CHiCÄCOOH)- § § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-((CH2)2-0)3-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2.)2-S(=0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2.)2-NH-C(=0)-CH2-NH-C(0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)3-NH-C(=0)-CH2-NH-C(0)-CH2-§§;
§-NH-CH(C X H)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2COOH)-§§;
§-NH-(CH2)2->JH-C(=0)-CH(C2H4COOH)-NH-C( ))-CH2-§§;
§-NH-CH(CO H)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(<))-(CH2)2-CH(C(X)H)-NH-C(K))-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2OH)- H-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH[C( >)-NH-(C^
§- Η ;Η(ΟΟΟΗΚΉ.:- ^^
§-NH-{CH2)4-CH(COOH)->m-C( )) H(CH3)-NH-C( ))-CH(isoCjH7)-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)- H-C( ))-CH(CH?)-NH-C( ))-CH(isoC3H7)-NH-
C(=0)-(CH2)5-§§;
· -%!!-{<■[ i->.-C( ( >}-Ni {··!(·} |.·).:-Π iifi K >i h-NH-Ci ί ) Ί ί·;(.Ί ί.ί-\! i-Vi ( ))·· CH(isoC3H7)- H-C(=0)-CH2-§§; ί·Μ !-(( i;) -Ci {);·Ν!!·{(.Ί{·ί,(.Ί{{(;(Κ)1Μ·\!ί·{·{ < > s Π( Π ) Π <. ( <>)· CH(isoC3H7)-NH-C(0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH[(CH2)3-NH-C( J)-NH2]-NH-C(-0)- CH( i C;ll }·ΝίΙ·(. i <>) · (CH2)5 - § § ;
Η·) Nü-Cs ΟΗΠη·-ί/Π·ΟΚ)!!!·.\Π-η {>;· (·!!:( !!. i-Xli Ci <>)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-CH(CH3)-CK))-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C( 3)-
CH(isoC3H7)-NH-C(K))-(CH2)5-§§;
i-N!{-(CH.);-Ci 0)·Χίί·ί(Ή }:·('!Ιί('<Κί!!}·ΝΠ·( ί (>}-CHji('il. };-\im <))- NH2]- H-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-ΝΗ C( ))-NH-(CH2)2-§§;
§-ΝΗ ' C(-0)- H-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§-
§* ν -
-NH-C(-0)-CH(isoC3H7)-NH-C(==0)-(CH2)5-§§;
§-ΝΗ C( ))-NH<CH2)4-CH(C(X)H)-NH-C(K))-CH[(CH2)3-]SiH-C( ))- H2]- H-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-ΝΗ ' C(-0)- H-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(-0)-CH(CH3)-NH-C( ))- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(isoC3H7)-C(=0)-]StH-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-
( (>)-<> " -/ - C(=0)-CH2-§§;
§-NH-{CH2}2"C(=0)-NH-CH(isoC3H7)-C(==0)-NH-CH(CH3)-C(==0)-0
-H-
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0) ' ^ §§;
§-NH-(CH2)2-C(=O)-lStH-CH(CH; -C( ))-NH-CT[(CT2)3- H-C( ))-NH2]-
C( <>i-\H §§;
§-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
§-CH(CH3)- H-C(=0)-CH(isoC3H7)-§§;
§ -CH(CH3) ·'% !·:·(·{ <)! -CH(isoC3H7) -\fl-C{ Ο Π· - § § ;
(. ilf(. ίΙ;)·\ίί·{·{ (»-CiiiisoCMI )-\fl-C{ < )!·((.'!{· ) ^;
. ·(·(! !··(·( <)ί·\1Ι·ί((. U-) ·<)):·{(.Ίί-ί .Μ!·( ί (>}·{ ! ·ίί:
§-CH(CH3)- H-C(K))-CH(isoC3H7)-NH ;(K)) (CH2 -0)4-(CH2)2-NH
(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)5-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-]SiH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(<))-NH-(CH2)2-NH-C(<))-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C( )- H-(CH2)2-NH-C(=0)-CH5-§§;
S-Cll;-S iCl !;;··(·· <))·Μ!·(·1ΐ!(·(Κ)ί!}·(·ί!-\Π·(·( OKI
S-Cll ·Η·(Ί{·(·Π;ΝίΙ-)·(·ί 0}··\Π-((. Η·). Nü-Cs ΟΗΓίί -c^:
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)- H-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(===0)-CH2-§§;
^C!i -S-iCii ;··(·· )-ΝΠ-({< I ) -< 5: -(CH2)2-NH-C ))-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C( ))-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C.(= ))-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C( ))-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-m-C.(= ))-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-CH2CH(C(X)H)-NH-C(K))-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C( ))-CH2-§§; §-CH2-S^2CH(C<X)H)-NH-^^^
§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)- H-C(K^)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH (-0)-(CH2)2- §§;
§~CH2-S^CH2)2~C(-0)- H-CH(C2H4COOH)-C(=0)- H-{CH2)2- H-C(=0)-CH2"
§§;
§-CH2-S H2CH| IH-C(==0)-(CH2)2-COOH]-C(==0)-NH-(CH2)2-NH-C(= ))-CH2-
§§; §-CH S ;H2CH H-C(<^
CH2-§§;
H il-S-CH (·!!ί(0(>ί!)·\Π·(;( 0)-(Ή!(Ή.)-Ν!Κ ! ( >}·( 'ί is isoi.';} I }·ΝΠ· C( OK Π-iS:
§-CH2-S H2CH| IH-C(==0)-(CH2)2-COOH]-C(==0)-NH-(CH2)2-S(==0)2-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
H'li-S-CII.-nijMi-CC (>)-(Π1 ·).·-<·'( >01I|-Cf t > )- N ί I -( ( Π . ) -i >}. -(C i ί. > -·χ =
C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)- H-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0 -(CH2)2- H-
C(=0)-CH2-§§;
C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0
(CH2)2- H-C ))-CH2-§§
(CH2)2- H-C(-0)-CH2- § § ;
oder
§-CH2-S-CH2CH(COOH)- H-C(=0)-CH[(CH2)2-COOH]- H-C(=0)-((CH2)2-0
«.ΊΙ·).-Νί1-( OJ-iCii ;··^.
stellt,
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt und
isoCiH? einen isoPropyl-Rest darstellt,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Konjugat eine dt folgenden Formeln aufweist:
wobei
AKi einen über Cystein verknüpften und AK2 einen über Lysin verknüpften anti- CD 123 -Antikörper, welcher eine chiinäre oder humanisierte Variante des Antikörpers 7G3 oder 12 F 1 ist, darstellt und
n eine Zahl von I bis 20 darstellt.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- CD 123-Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon umfasst:
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schwer€3! Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8 oder
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 18 oder
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 28 oder
eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie
eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 38.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- CD123-Antikorper oder ein antigenbindendes Fragment davon umfasst: eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: ! , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:5 oder
eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: I i , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15 oder
eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:21 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:25 oder
eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:31 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:35.
24. Konjugat gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti-CD123-Antikörper ein IgG Antikörper ist.
25. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- CD123-Antikörper umfasst: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:40.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Konjugat nach einem oder nieirreren der Ansprüche 1 bis 25 in Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff. Konjugal nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 25 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/Oder Prophylaxe von Krankheiten.
Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 25 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von hyperproliferat/iven und/oder angiogenen Erkrankungen.
EP16736011.4A 2015-06-23 2016-06-20 Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-cd123-antikörpern Pending EP3313524A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15173479 2015-06-23
PCT/EP2016/064133 WO2016207098A1 (de) 2015-06-23 2016-06-20 Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-cd123-antikörpern

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3313524A1 true EP3313524A1 (de) 2018-05-02

Family

ID=53487251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP16736011.4A Pending EP3313524A1 (de) 2015-06-23 2016-06-20 Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-cd123-antikörpern

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10744205B2 (de)
EP (1) EP3313524A1 (de)
JP (1) JP6768011B2 (de)
CN (1) CN107921146A (de)
AR (1) AR108156A1 (de)
CA (1) CA2990398A1 (de)
TW (1) TW201720463A (de)
WO (1) WO2016207098A1 (de)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20180610A1 (es) 2015-06-22 2018-04-09 Bayer Pharma AG CONJUGADOS DE LIGADOR-PRINCIPIO ACTIVO (ADCs) Y CONJUGADOS DE LIGADOR-PROFARMACO (APDCs) CON GRUPOS ENZIMATICAMENTE ESCINDIBLES
US10744205B2 (en) 2015-06-23 2020-08-18 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (KSP) inhibitors with anti-CD123-antibodies
US10973923B2 (en) 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
RU2018136778A (ru) 2016-03-24 2020-04-24 Байер Фарма Акциенгезельшафт Пролекарства цитотоксических лекарственных средств, содержащие ферментативно расщепляемые группы
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
RU2761390C2 (ru) 2016-12-21 2021-12-07 Байер Фарма Акциенгезельшафт Конъюгаты связующего и активного вещества (adc), имеющие ферментативно расщепляемые группы
CA3047522A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
CN110835316A (zh) * 2018-08-17 2020-02-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途
US11034669B2 (en) 2018-11-30 2021-06-15 Nuvation Bio Inc. Pyrrole and pyrazole compounds and methods of use thereof
JP2023537002A (ja) * 2020-08-06 2023-08-30 アブプロ コーポレーション 抗クローディン１８．２多重特異性抗体及びそれらの使用
WO2022144836A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Sanofi Multifunctional natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and cd123
CN116143832A (zh) * 2023-04-17 2023-05-23 中国中医科学院医学实验中心 一种甲拌磷半抗原及其合成工艺

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080193445A1 (en) 2002-01-18 2008-08-14 Liliane Goetsch Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
EP1635641B1 (de) * 2003-06-12 2009-03-25 Merck & Co., Inc. Inhibitoren von mitotischem kinesin
EP1790664A1 (de) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoklonale Antikörper gegen Claudin-18 zur Behandlung von Krebs
WO2008127735A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Stemline Therapeutics, Inc. Il3ralpha antibody conjugates and uses thereof
NZ604510A (en) * 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use
HUE059815T2 (hu) * 2012-05-18 2022-12-28 Aptevo Res & Development Llc Bispecifikus SCFV immunofuziós (BIF) kötõdés a CD123-hoz és a CD3-hoz
JP6559066B2 (ja) * 2012-10-30 2019-08-14 エスペランス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 抗体／薬剤結合体及び使用方法
WO2014093640A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Mersana Therapeutics,Inc. Hydroxy-polmer-drug-protein conjugates
US9498532B2 (en) * 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CN105451773A (zh) * 2013-03-15 2016-03-30 诺华股份有限公司 细胞增殖抑制剂及其缀合物
US9498540B2 (en) 2013-03-15 2016-11-22 Novartis Ag Cell proliferation inhibitors and conjugates thereof
EP3054991B1 (de) * 2013-10-11 2019-04-03 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-wirkstoffkonjugate
SG11201604664PA (en) * 2013-12-12 2016-07-28 Stemcentrx Inc Novel anti-dpep3 antibodies and methods of use
ES2815098T3 (es) 2013-12-23 2021-03-29 Bayer Pharma AG Conjugados de ligadores (ADCs) con inhibidores de KSP
JP2017509337A (ja) * 2014-03-12 2017-04-06 ノバルティス アーゲー イムノコンジュゲートを作製する抗体を修飾するための特定部位
US10786578B2 (en) * 2014-08-05 2020-09-29 Novartis Ag CKIT antibody drug conjugates
JP6743015B2 (ja) 2014-12-15 2020-08-19 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤の脱グリコシル化抗ｔｗｅａｋｒ抗体との抗体薬物複合体（ａｄｃ類）
PE20180610A1 (es) 2015-06-22 2018-04-09 Bayer Pharma AG CONJUGADOS DE LIGADOR-PRINCIPIO ACTIVO (ADCs) Y CONJUGADOS DE LIGADOR-PROFARMACO (APDCs) CON GRUPOS ENZIMATICAMENTE ESCINDIBLES
US20180318438A1 (en) 2015-06-23 2018-11-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-tweakr-antibodies
US20180185510A1 (en) 2015-06-23 2018-07-05 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-b7h3-antibodies
US10744205B2 (en) 2015-06-23 2020-08-18 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (KSP) inhibitors with anti-CD123-antibodies
EP3313522A1 (de) 2015-06-23 2018-05-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-b7h3-antikörpern
US10973923B2 (en) 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
RU2018136778A (ru) 2016-03-24 2020-04-24 Байер Фарма Акциенгезельшафт Пролекарства цитотоксических лекарственных средств, содержащие ферментативно расщепляемые группы
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
RU2761390C2 (ru) 2016-12-21 2021-12-07 Байер Фарма Акциенгезельшафт Конъюгаты связующего и активного вещества (adc), имеющие ферментативно расщепляемые группы
WO2018114798A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
CN107921146A (zh) 2018-04-17
TW201720463A (zh) 2017-06-16
WO2016207098A1 (de) 2016-12-29
AR108156A1 (es) 2018-07-25
JP2018520130A (ja) 2018-07-26
US10744205B2 (en) 2020-08-18
JP6768011B2 (ja) 2020-10-14
US20180318437A1 (en) 2018-11-08
CA2990398A1 (en) 2016-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016207098A1 (de) Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-cd123-antikörpern
EP3086814B1 (de) Binder-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
EP3233127A1 (de) Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit aglycosylierten anti-tweakrantikörpern
EP3313521A1 (de) Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-tweakr-antikörpern
JP6905941B2 (ja) キネシンスピンドルタンパク質（ｋｓｐ）阻害剤の抗ｂ７ｈ３抗体との抗体薬物複合体
WO2016207089A1 (de) Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
WO2016207103A1 (de) Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-b7h3-antikörpern
EP3432934B1 (de) Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
EP3558387B1 (de) Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
WO2013087716A2 (de) Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
WO2012143499A2 (de) Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
JP2022514949A (ja) リファマイシンアナログおよびその抗体薬物コンジュゲート

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20180123

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20200925

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

111L Licence recorded

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

Free format text: EXCLUSIVE LICENSE

Name of requester: VINCERX PHARMA, INC., US

Effective date: 20210407