CN105451773A - 细胞增殖抑制剂及其缀合物 - Google Patents

细胞增殖抑制剂及其缀合物 Download PDF

Info

Publication number
CN105451773A
CN105451773A CN201480028219.0A CN201480028219A CN105451773A CN 105451773 A CN105451773 A CN 105451773A CN 201480028219 A CN201480028219 A CN 201480028219A CN 105451773 A CN105451773 A CN 105451773A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alkyl
antibody
compound
immunoconjugates
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480028219.0A
Other languages
English (en)
Inventor
P·A·巴尔桑蒂
S·沙穆安
L·杜玛普姆-迈托尔
B·H·盖尔斯坦格尔
R·M·格罗茨费尔德
S·盖罗-拉加斯
D·B·琼斯
A·卡尔波夫
M·拉弗朗斯
C·涅托-欧伯胡贝尔
W·欧
G·皮兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IRM LLC
Novartis AG
Original Assignee
IRM LLC
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IRM LLC, Novartis AG filed Critical IRM LLC
Publication of CN105451773A publication Critical patent/CN105451773A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C07D249/10—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/86—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 4
    • C07D239/88—Oxygen atoms
    • C07D239/91—Oxygen atoms with aryl or aralkyl radicals attached in position 2 or 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本文公开了用于治疗细胞增殖性障碍的免疫缀合物，其包含连接至抗原结合部分例如抗体的Eg5抑制剂。还公开了可以单独使用或作为免疫缀合物的组成部分使用的新的Eg5抑制剂，其用于治疗细胞增殖性障碍。所述Eg5抑制剂包括如本文所述的如下通式的化合物：

Description

细胞增殖抑制剂及其缀合物
发明领域
本发明提供通过抑制Eg5活性来抑制细胞增殖且由此用于治疗与过度Eg5活性相关的细胞增殖性障碍的化合物。本发明还包括包含连接至抗原-结合部分的Eg5抑制剂的缀合物和包含这些缀合物的药物组合物。还包括使用这些化合物和缀合物治疗细胞增殖性障碍包括癌症的方法。
背景
近年来，大量研究定向于使用抗体、通过形成抗体-药物缀合物(ADCs)以将细胞增殖抑制剂和细胞毒性剂递送至靶向要消除的特定细胞中。ADCs典型地包含抗体，选择它的原因在于其结合治疗干预所靶向的细胞得能力，其连接至因其细胞生长抑制或细胞活性而选择的药物。抗体结合靶向的细胞将药物递送至其中需要其治疗作用的部位，且由此减少了脱靶活性，同时改善了使用有效负荷的化合物的效能。
已经公开了识别和选择性地结合靶细胞如癌细胞的许多抗体用于ADCs中，并且还描述了用于使有效负荷的(药物)化合物例如细胞毒素连接至抗体的许多方法。尽管对ADCs进行了广泛的研究工作，但是，仅几种类型的细胞增殖抑制剂或细胞毒素广泛用作ADC有效负荷。尽管在2000年在美国经批准用于人的第一种ADC投放市场(随后从市场上退出)，但是十年后，仅有少数几个化学类型的药物化合物(美登素(maytansinoids)、阿里他汀(auristatins)、刺孢霉素和多卡米星)达到作为ADCs的有效负荷的临床试验。Antibody-DrugConjugates：theNextGenerationofMovingParts，A.Lash，Start-Up，2011年12月，1-6。这表明鉴定形成有效ADC有效负荷的药物化合物的适合类型是何等困难。由于得到了ADCs作为治疗剂的价值得到广泛认可，特别是用于治疗癌症，因此，对于适合于用作ADCs中的有效负荷的新的细胞增殖抑制剂仍然存在需求。
发明概述
本发明提供新的Eg5抑制剂和使用Eg5抑制剂作为小分子药物或作为抗体-药物缀合物(ADC)的药物成分(有效负荷)的方法。
Eg5，也称作驱动蛋白纺锤体蛋白或KSP，是驱动蛋白动力蛋白，其牵涉有丝分裂过程中微管的交联，且由此是细胞分裂所需的。已知Eg5抑制剂可用于治疗细胞增殖性障碍，如癌症(Rath和Kozielski，NatureRev.Cancer，第12卷，527-39(2012)；另外参见WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388和WO2006/049835)。尽管已知Eg5抑制剂的许多不同化学家族，但是迄今为止，它们尚未用于ADCs。本发明包括Eg5抑制剂作为ADCs的药物有效负荷的用途，和用作ADC的有效负荷和作为小分子药物的新的Eg5抑制剂。本发明还包括用于将一些Eg5抑制剂掺入ADCs的方法和中间体，和使用所述新的化合物和缀合物治疗细胞增殖性障碍的方法。
本发明提供免疫缀合物(例如ADCs)，其包含连接至抗原结合部分例如抗体或抗体片段的Eg5抑制剂。这些包含Eg5抑制剂的缀合物用于治疗细胞增殖性障碍，特别是在Eg5抑制剂连接至识别癌细胞且由此促进Eg5抑制剂递送至目的攻击的癌细胞的抗体时。所述免疫缀合物尤其是用于治疗本文进一步详细描述的一些癌症。本文提供的数据证实，这些免疫缀合物是有效的细胞增殖抑制剂并且可用于治疗一些类型的癌症；不希望受到理论约束，认为其活性归因于抑制细胞中的Eg5。
在一个方面，本发明的免疫缀合物包括这种下式的化合物：
其中Ab表示抗原结合部分；
L表示使X连接至Ab的连接基；
m是1-4的整数；
n是1-16的整数；且
X每次出现时独立地表示Eg5抑制剂。
其中m大于1，L各自独立地选择。在一些实施方案中，L各自是相同的。
在这些免疫缀合物中，X可以是如本文所述的式II的化合物或具有低于约100nM的IC-50的用于抑制Eg5的任意Eg5抑制剂。许多这类Eg5抑制剂是已知的，包括伊匹尼塞、SB-743921、AZD4877、ARQ621、ARRY-520、LY2523355、MK-0731、EMD534085和GSK-923295和描述在WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388和WO2006/049835中的Eg5抑制剂。
典型地，m在这种通式的免疫缀合物中是1或2，优选1；且n是2-8，优选约2-约6，更优选3-5。Ab可以是任意适合的抗原结合部分，且通常是抗体。适合的抗体是本领域众所周知的且可以是天然抗体序列或它们可以通过例如蛋白质改造技术被修饰以改善其有用性或活性。L可以是适合于使一个或多个X基团连接至Ab的任意的连接基；L通常连接至抗体的赖氨酸δ-氨基或半胱氨酸巯基。这些可以是天然存在的残基或它们可以被导入抗体序列上的选择的位置。
X的适合选择包括本文公开的式(II)的化合物以及monastrol(4-(3-羟基苯基)-6-甲基-2-亚硫烷基-3，4-二氢-1H-嘧啶-5-甲酸乙酯)；(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-N-[(3R，4S)-3-氟-1-甲基-4-哌啶基]-2，5-二氢-2-(羟基甲基)-N-甲基-2-苯基-1H-吡咯-1-甲酰胺(MK-0731，CAS845256-65-7)；利曲尼塞(LY2523355，CAS910634-41-2)；和(2S)-2-(3-氨基丙基)-5-(2，5-二氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基-2-苯基-1，3，4-噻二唑-3(2H)-甲酰胺(ARRY520)；和AZ3146(9-环戊基-2-[[2-甲氧基-4-[(1-甲基哌啶-4-基)氧基]-苯基]氨基]-7-甲基-7，9-二氢-8H-嘌呤-8-酮)。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物具有式(I)
其中Ab表示抗原结合部分，例如抗体或抗体片段；
L表示通过共价键合或非共价键合使X连接至Ab的连接基，其可以任选地使一个以上X连接至Ab，且可以将其设计成、也可以不设计成促进有利于体内裂解；
X每次出现时独立地表示式(II)的化合物：
如下文进一步所述；
m是1-4的整数，典型地是1-2；且
n是1-16的整数，优选2-8。
其中存在一个以上连接基L，L各自可以独立地选择。在一些实施方案中，基团L各自是相同的。
本发明提供使用Eg5抑制剂、特别是式(II)或(III)的化合物作为所递送的有效负荷(药物)制备ADCs的方法和使用这些ADCs治疗细胞增殖性障碍的方法。
本发明还提供修饰的式(II)的化合物，它们在本文中被描述为式(IIA)和(IIB)和(IIC)：这些是包含具有反应官能团和任选的一个或多个所连接的连接基成分的式(II)化合物的结构，以便有利于使该化合物直接或间接地连接至抗体或抗原结合片段。这些化合物可用于制备免疫缀合物。因此，在另一个方面，本发明提供式(IIA)和(IIB)和(IIC)的化合物：
其中W包含反应官能团，其可以用于使(IIA)或(IIB)或(IIC)连接至连接基成分或直接连接至Ab，得到式(I)的免疫缀合物；且本发明还提供使用这些化合物制备ADCs的方法。
在另一个方面，本发明提供如本文所述的式(III)的新Eg5抑制剂及其药学上可接受的盐，
这些化合物是新的Eg5抑制剂并且具有如本文所示的抗癌活性。它们可以用作如本文所证实的ADC的有效负荷，或如其它的Eg5抑制剂，它们可以用作用于治疗细胞增殖性障碍的小分子治疗剂。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含式(I)或式(III)的化合物的免疫缀合物，其中混合有至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，任选地混合有两种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；且本发明还提供使用这些组合物治疗细胞增殖性障碍的方法。
在另一个方面，本发明提供治疗特征在于过度或不期望的细胞增殖的病症的方法，该方法包括对有这种治疗需要的受试者施用有效量的如本文所述的式(I)或式(III)或其任意子式的化合物的免疫缀合物或包含这类化合物或免疫缀合物的药物组合物。治疗的受试者可以是哺乳动物，且优选是人。可用本文所述的化合物和方法治疗的病症包括各种形式的癌症，例如胃肿瘤、骨髓瘤、结肠肿瘤、鼻咽肿瘤、食管肿瘤和前列腺肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其是非霍奇金淋巴瘤)、膀胱癌、肾癌、胃癌(例如胃肠道间质肿瘤(GIST))、肝癌和胰腺癌和肉瘤。可以用这些方法和组合物治疗的其它细胞增殖性障癌包括糖尿病视网膜病变、肝和肺纤维化、斯耶格仑综合征和红斑狼疮。
本发明包括如本文所述的式(I)-(III)及其子式及其所有立体异构体(包括非对映异构体和对映体)、互变体和同位素富集形式(包括氘取代物)和这些化合物的药学上可接受的盐的组合物。本发明的组合物还包含式(I)-(III)(或其子-式)和盐、特别是药学上可接受的盐的多晶型物。
在另一个方面，本发明提供免疫缀合物，其包含使抗体与有效负荷例如细胞毒素、包括本文所述的Eg5抑制剂连接的改进的连接基。这些免疫缀合物包含连接基，其包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-的基团，该基团可以是酰胺或氨基甲酸酯，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，R22是选自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23和-SO2R23的极性基团，其中k是0-4，且R23各自独立地是H或C1-4烷基。这些连接基减少了所述免疫缀合物的聚集。
附图简述
图1A-1B：基于重链和轻链负荷的ADC的平均药物载量(DAR，药物与抗体之比)的测定。
图2A-2E：不同的式(II)和(III)的化合物在细胞培养物中的抗增殖活性。
图3A-3L：一些Eg5抑制剂对来源于不同谱系的各种癌细胞系的抗-增殖活性。
图4A-4V：ADCs对改造为高Her2表达的细胞系与匹配的亲代(Her2-低)细胞系比较的体外抗-增殖活性。
图5A-5E：ADCs对具有内源性Her2表达的细胞系的体外抗-增殖活性。
图6(A)：TBS-化合物220缀合物在HCC1954乳腺癌异种移植物中的效能。
图6(B)：TBS-化合物220缀合物在HCC1954乳腺癌异种移植物中的效能。
图7(A)和(B)显示TBS-化合物220缀合物在SK-OV-3ip异种移植物中的效能。
图8显示TBS-化合物215缀合物在SK-OV-3ip异种移植物中的效能。
图9显示TBS-化合物223缀合物在SK-OV-3ip异种移植物中的效能。
图10(A)显示如通过大小排阻色谱法测定的称作ADC-110的构建体的聚集度。所检测的聚集物的量约占总检测缀合物的12％。
图10(B)显示ADC-111的聚集量约为2.4％。
图10(C)显示ADC-112的聚集量约为2.7％。
图11显示ADC-110和ADC-111对不同细胞类型的体外活性。
图12显示一系列具有连接至抗体cKitA的不同有效负荷(来自表5的5A、5B、5C、5D、5E和5F)的免疫缀合物的活性。均显示在细胞培养物中对SK-OV-3ip的良好至极佳活性。
图13显示与曲妥珠单抗(TBS)缀合的所选择的有效负荷对不同肿瘤细胞系的活性，证实式II的各种有效负荷对各种癌细胞系具有活性。有效负荷的化合物见于表5和6。
图14显示与来自其它化合物类型的Eg5抑制剂相比较的本发明有代表性的抑制剂；图14中的化合物均通过Val-Cit连接基连接至曲妥珠单抗。
图15显示与具有美坦辛有效负荷的免疫缀合物相比较的本发明的曲妥珠单抗免疫缀合物对Her2-高和Her2-低细胞系的活性。包括具有非-Her2抗原结合物的免疫缀合物用于比较。
图16显示用单独的曲妥珠单抗、与化合物5B缀合的曲妥珠单抗(5mg/kg剂量和10mg/kg剂量)和对照缀合物(其中抗原结合基团不识别肿瘤抗原)治疗的小鼠异种移植物肿瘤(SK-OV-3ip)的体内肿瘤生长抑制结果。
图17显示与具有美坦辛有效负荷的缀合物和一种无有效负荷的对照品和一种无肿瘤结合抗体的对照品相比较，用曲妥珠单抗(抗-Her2抗体)上具有Eg5抑制剂有效负荷的免疫缀合物治疗的小鼠异种移植物肿瘤(SK_OV-3ip)的体内肿瘤生长抑制结果。
图18显示用cKitA(抗-cKit抗体)上具有Eg5抑制剂有效负荷的免疫缀合物治疗的小鼠异种移植物肿瘤(H526)体内肿瘤生长抑制活性。
图19显示与包含美坦辛有效负荷(DM1)的cKitA缀合物相比较，用cKitA(抗-cKit抗体)上具有Eg5抑制剂有效负荷的免疫缀合物治疗的小鼠异种移植物肿瘤(H526)体内肿瘤生长抑制活性。
图20显示用cKitA(抗-cKit)抗体和曲妥珠单抗抗体上具有Eg5抑制剂有效负荷的免疫缀合物治疗的携带两种异种移植物肿瘤(H526和SK-OV-3ip)的小鼠的体内肿瘤生长抑制活性。
图21显示对小鼠异种移植物SK-OV-3ip肿瘤测试的具有曲妥珠单抗抗体的不同Eg5抑制剂免疫缀合物的活性。为了比较，使用具有相同抗体、与阿里他汀有效负荷(MMAE)和美坦辛有效负荷(DM1)缀合的免疫缀合物。
图22显示使用和抗-Her2抗体作为对比物和仅有媒介物作为对照品，来自表5的几种免疫缀合物在小鼠异种移植物肿瘤中的体内活性。
图23显示使用和化合物6U-抗-Her2抗体缀合物和对于病毒糖蛋白gH具有特异性的igG1κ链作为对比物和仅有媒介物作为对照品，来自表5的几种免疫缀合物在小鼠异种移植物中的体内活性。
图24显示使用仅有媒介物作为对照品，来自表5的几种免疫缀合物在小鼠异种移植物中的体内活性。所述免疫缀合物具有与来自表5的化合物缀合的抗-cKit抗体，且细胞系对ckit抗体敏感。
图25显示使用仅有媒介物作为对照品，来自表5的几种免疫缀合物在小鼠异种移植物中的体内活性。所述免疫缀合物具有与来自表5的化合物缀合的抗-cKit抗体。
图26显示具有有效负荷-连接基化合物5B的免疫缀合物在小鼠异种移植物中、和3种不同的抗-cKit抗体的体内活性。cKitA是亲代抗体；cKitB和cKitC是如本文所述的cKitA半胱氨酸-改造的突变蛋白。结果以两种不同施用水平显示，其中仅有媒介物的作为对照。在两种剂量下，半胱氨酸改造的突变抗体各自提供比天然抗体更具有活性的免疫缀合物。
图27显示包含与化合物5B缀合的抗体cKitA的免疫缀合物、与cKitA抗体(未缀合)和作为对照的媒介物的体内活性。
图28包括对不同肿瘤细胞类型测试的本发明广泛免疫缀合物的体外(细胞培养物)的示意图。最后的图(图28-29)显示体外活性显然不受DAR的小改变所影响。
发明详述
除非另有特别地提供，否则适用下列定义。
术语“氨基酸”是指典型的、合成和非天然的氨基酸以及按照与典型氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。典型的氨基酸是由遗传密码编码的蛋白质生成的氨基酸，且包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸以及硒代胱氨酸、吡咯赖氨酸(pyrrolysine)和吡咯啉-羧基-赖氨酸。氨基酸类似物是指具有与典型氨基酸相同的基础化学结构即结合氢、羧基、氨基和R基团的α-碳的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与典型氨基酸相同的基础化学结构。
本文所用的术语“抗原结合部分”是指能够特异性地结合抗原的部分，且包括、但不限于抗体和抗体片段。
本文所用的术语“抗体”是指能够可逆地并且以一种特异性方式结合相应的抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键互联的至少两个重(H)链和两个(L)轻链的四聚体。重链各自由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。轻链各自由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可以再被分成高变区，称作互补决定区(CDR)，其以更保守的区分散，称作框架区(FR)。VH和VL各自由按照如下顺序从氨基-末端到羧基-末端排列的3个CDRs和4个FRs组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原发生相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和典型补体系统的第一种成分(Clq)的结合。
术语“抗体”包括、但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体和抗特应型(抗-Id)抗体(包括例如抗-Id抗体至本发明的抗体)。抗体可以具有任意的同种型/类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
轻链和重链被分成结构和功能同源的区。术语“恒定”和“可变”在功能方面使用。在这方面，可以理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域均决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学特性，例如分泌、经胎盘流动、Fc受体结合、补体结合等。根据规定，恒定区结构域的编号在它们变成更远离抗体的抗原结合位点或氨基-末端时增加。N-末端是可变区，且在C-末端上是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基-末端结构域。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指保留特异性地与抗原表位发生相互作用(例如通过结合、位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力的抗体的一个或多个部分。结合片段的实例包括、但不限于单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab′)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；F(ab)2片段、包含两个通过二硫键在铰链区连接的Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等人，Nature341：544-546，1989)，其由VH结构域组成；和抗体的分离的互补决定区(CDR)或其它表位-结合片段。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法用合成连接基连接它们，所述合成连接基能够使得它们作为单一蛋白质链形成，其中VL和VH区对形成一价分子(称作单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等人，Science242：423-426，1988；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883，1988)。预期这类单链抗体也包括在术语“抗原结合片段”范围内。使用本领域技术人员公知的常规技术得到这些抗原结合片段，且以与完整抗体相同方式筛选所述片段的用途。
还可以将抗原结合片段掺入单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、细胞内抗体、双体、三体(triabodies)、四体(tetrabodies)、v-NAR和双-scFv(参见例如Hollinger和Hudson，NatureBiotechnology23：1126-1136，2005)。抗原结合片段可以被接枝入基于多肽类的骨架，例如纤连蛋白III型(Fn3)(参见美国专利US6,703,199，该文献描述纤连蛋白多肽单体(monobodies))。
可以将抗原结合片段掺入包含一对串连Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子，其与互补轻链多肽一起形成抗原结合区对(Zapata等人，ProteinEng.8：1057-1062，1995；和美国专利US5,641,870)。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指多肽类，包括具有基本上相同的氨基酸序列或来源于相同遗传来源的抗体和抗原结合片段。该术语还包括单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示出单一结合特异性和对特定表位的亲和力。
本文所用的术语“人抗体(humantibody)”包括：具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均来源于人来源的序列。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于这类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式；或包含来源于人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86，2000所述)。
本发明的人抗体可以包括不被人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变或保守取代导入的突变，以促进稳定性或制备)。
本文所用的术语“人源化”抗体是指保留非人抗体的反应性、同时在人体中免疫原性较低的抗体。例如，可以通过保留非人CDR区并且用其人副本替代基团的其余部分实现这一结果。参见例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)。
术语“特异性结合”或“选择性结合”在上下文中用于描述抗原(例如蛋白质)与抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间的相互作用时，是指对于抗原在蛋白质和其它生物制品的异源群体中的存在起决定性作用的结合反应，例如在生物样品中，例如血液、血清、血浆或组织样品。因此，在一些指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂以至少2倍于背景结合特定抗原，并且基本上不大量地结合存在于样品中的其它抗原。在一个实施方案中，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂以至少十(10)倍于背景结合于特定抗原，并且基本上不大量地结合存在于样品中的其它抗原。在这类条件下特异性结合抗体或结合剂，可能需要筛选抗体或结合剂对特定蛋白质的特异性。如果期望或适合，这种筛选可以通过扣除掉与来自其它种类(例如小鼠或大鼠)的分子发生交叉反应的抗体或其它亚型来进行。或者，在一些实施方案中，筛选与一些期望的分子发生交叉反应的抗体或抗体片段。
各种免疫测定方式可以用于筛选与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法通常用于筛选与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow&Lane，UsingAntibodies，ALaboratoryManual(1998)，用于描述可以用于测定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件)。典型地，特异性或选择性结合反应产生至少2倍于背景信号以上的信号，且更典型地至少为背景的10-100倍。
本文所用的术语“亲和力”是指在单一抗原部位上抗体与抗原之间的相互作用强度。在每种抗原部位内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与大量位置上的抗原发生相互作用；相互作用越多，则亲和力越强。
术语“分离的抗体”是指基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体。然而，特异性结合一种抗原的分离的抗体可以具有与其它抗原的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于典型的氨基酸聚合物和非典型的氨基酸聚合物。除非另有指示，否则特定的多肽序列还意味着涵盖其保守修饰的变体。
本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体缀合物”是指抗原结合部分例如抗体或其抗原结合片段与另一种活性剂例如化疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针、分光光度探针等的连接物。连接键可以是共价键或非共价相互作用且可以包括鳌合。本领域已知的各种连接基可以用于形成免疫缀合物。另外，所述免疫缀合物可以以融合蛋白的形式提供，所述融合蛋白可以由编码所述免疫缀合物的多核苷酸表达。本文所用的“融合蛋白”是指通过最初编码单独蛋白质(包括肽类和多肽类)的两种或多种基因或基因片段的连接生成。融合基因的翻译产生具有来源于每种起始蛋白质的功能特性的单一蛋白质。
本文所用的术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”是指对于细胞生长和增殖有害并且可以起减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的作用的任意活性剂。
本文所用的术语“抗-癌药”是指可以用于治疗细胞增殖性障碍包括癌症的任意活性剂，包括、但不限于细胞毒性剂、化疗剂、放疗和放疗剂、靶向抗癌药和免疫治疗剂。
本文所用的术语“药物部分”或“有效负荷”包括但不限于Eg5抑制剂，是指是或可以与抗体或抗原结合片段缀合形成免疫缀合物的化学部分，且可以包括任何可用于连接至抗体或抗原结合片段的部分。例如，本发明的免疫缀合物包含Eg5抑制剂作为有效负荷，而且还可以包括一种或多种另外的有效负荷。例如，药物部分或有效负荷可以是抗-癌药、抗炎药、抗真菌药、抗菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药或麻醉剂。在一些实施方案中，药物部分选自V-ATPase抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸胺基肽酶)、蛋白质CRM1的出核转运抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA起嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。适合的实例包括阿里他汀，例如MMAE和MMAF；刺孢霉素，例如γ-刺孢霉素；和美登素，例如DM1、DM3和DM4。使它们各自连接至与抗体相容性的连接基的方法和本发明的方法是本领域公知的。参见例如Singh等人，(2009)TherapeuticAntibodies：MethodsandProtocols，第525卷，445-457。此外，有效负荷可以是生物物理学探针、荧光团、自旋标记、红外探头、亲和探针、鳌合剂、分光光度探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记、DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米粒、量子点、脂质体、PLGA颗粒、糖或多糖、反应官能团例如本文所述的那些，或可以使所述缀合物连接至另一个部分或表面的结合剂等。
“肿瘤”是指赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，和所有的癌前期细胞和癌细胞和组织。
术语“抗-肿瘤活性”是指肿瘤细胞增殖、活力或转移活性的速率降低。显示抗肿瘤活性的可能方式在于在疗法过程中产生的异常细胞生长速率降低或肿瘤大小稳定或减小。这类活性可以使用已接受的体外或体内肿瘤模型评估，包括、但不限于异种移植物模型、异体移植物模型、MMTV模型和本领域中已知研究抗肿瘤活性的其它已知模型。
术语“恶性肿瘤”是指非良性的肿瘤或癌症。本文所用的术语“癌症”包括特征在于失调或不受控制的细胞生长的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如其细胞在受试者体内未迁移至非原发肿瘤部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如来源于转移的那些，肿瘤细胞迁移至非原始肿瘤部位的继发部位)。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任意和所有的溶剂、分散介质、包衣衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的(参见例如Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPrintingCompany，1990，pp.1289-1329)。除外与活性成分不相容的任意常用的载体，否则考虑其在治疗或药物组合物中的应用。
术语本发明化合物的“治疗有效量”是指引起受试者的生物学或医学响应的本发明化合物的用量，例如降低或抑制酶或蛋白质活性或改善症状、缓解病情、减缓或延迟疾病发展或预防疾病等。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”是指在施用于受试者时有效地至少部分缓解、抑制、预防和/或改善病症或障碍或疾病的本发明化合物的用量。
在另一个非限制性实施方案中，术语本发明化合物的“治疗有效量”是指在施用于细胞或组织或非细胞生物材料或介质时有效地至少部分降低或抑制Eg5活性的本发明化合物的用量。
如本文所用的术语“受试者”是指动物。典型地所述动物是哺乳动物。受试者也是指例如灵长类动物(例如人，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在一些实施方案中，所述受试者是灵长类动物。在具体实施方案中，所述受试者是人。
如本文所用的术语“抑制”是指指定的病患、症状或病症或疾病的减轻或遏抑，或者生物学活性或过程的基线活性的显著降低。
如本文所用的术语“治疗”任何疾病或病症在一个实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数。在又一个实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在又一个实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的发展。
如本文所用，如果受试者在生物学上、医学上或生活质量上受益于治疗，则此类受试者是“需要”此类治疗。
本发明上下文中(尤其是权利要求上下文中)所用的术语“一(a)”、“一(an)”、“该(the)”和类似术语的使用应被解释为同时包括单数和复数，除非本文中另有指示或者根据上下文明显矛盾。
在一些实施方案中，本发明修饰的免疫缀合物根据“X基团与抗体”之比描述为例如1、2、3、4、5、6、7或8或12或16；该比值相当于式(I)中的“n”。尽管该比值对于特定的缀合物分子具有整数值，但是应当理解，平均值典型地用于描述包含许多分子的样品，这归因于免疫缀合物样品内一定程度的不均一性。免疫缀合物样品的平均载量在本文中称作“药物与抗体之比”或DAR。在一些实施方案中，DAR在约1-约16，且典型地约为1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，样品重量的至少50％是具有平均DAR±2的化合物，且优选至少样品的50％是包含平均DAR±1.5的产品。优选的实施方案包括免疫缀合物，中DAR约为2-约8，例如约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8。在这些实施方案中，“约q”的DAR是指DAR的测量值在q的±20％或优选q的±10％范围内。
本文所用的术语“旋光异构体”或“立体异构体”是指对于本发明的给定化合物来说可存在的任何各种立体异构构型并且包括几何异构体。可以理解，取代基可以连接在碳原子的手性中心上。术语“手性”是指在其镜像配偶体上具有不能重叠特性的分子，而术语“非手性”是指在其镜像配偶体上为能够重叠的分子。因此，本发明包括化合物的对映体、非对映体或外消旋体。“对映体”是彼此互为非重叠镜像的一对立体异构体。一对对映体的1∶1混合物是“外消旋”混合物。在适当的情况下，该术语用于指明外消旋混合物。“非对映体”是具有至少两个不对称原子、但彼此不互为镜像的立体异构体。绝对的立体化学是根据Cahn-Ingold-PrelogR-S体系指定的。当化合物是纯对映体时，在每个手性碳上的立体化学可以被指定为R或S。绝对构型是未知的经拆分的化合物可以根据在钠D线波长下它们旋转平面偏振光的方向(右旋或左旋)指定为(+)或(-)。本文所述的某些化合物含有一个或多个不对称中心或轴，并因此可以产生根据绝对立体化学能定义为(R)-或(S)-的对映异构体、非对映异构体和其它立体异构体形式。
根据原料和方法选择的不同，化合物可以以可能的异构体之一或其混合物的形式存在，例如为纯的光学异构体或异构体混合物，例如外消旋体和非对映异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。本发明意欲包括所有这类可能的异构体，包括外消旋混合物、非对映异构体混合物和光学纯的形式，除非另有描述，例如，其中鉴定了特定的异构体。可以使用手性合成子或手性试剂制备旋光(R)-和(S)-异构体，或使用常规技术拆分它们。如果化合物包含双键，则取代基可以为E或Z构型。如果化合物包含二-取代的环烷基，则环烷基取代基可以具有顺式-或反式-构型。还意欲包括所有的互变异构体形式。
如本文所用的术语“盐”是指本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别地包括“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和性质的盐，且通常不是生物学或在其它方面不可取的盐。在许多情况下，本发明化合物能通过存在的氨基和/或羧基或与其相似的基团形成酸和/或碱盐。
药学上可接受的酸加成盐可与无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以由其衍生得到盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以由其衍生得到盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、磺基水杨酸等。药学上可接受的碱加成盐可与无机碱和有机碱形成。
可以由其衍生得到盐的无机碱包括例如铵盐和周期表的I族至XII族的金属。在一些实施方案中，该盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别适合的盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。
可以由其衍生得到盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、包括天然存在的取代的胺、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括例如异丙胺、苄星青霉素(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺(meglumine)、哌嗪和氨丁三醇。
通过常规化学方法，可以从碱性或酸性部分合成本发明的药学上可接受的盐。一般来讲，可以如下制备所述的盐：使这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当的碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应或使这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当的酸反应。这类反应通常在水或有机溶剂或两者的混合溶剂中进行。一般来讲，在可行时，使用非水介质例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是可取的。其它合适的盐的列表可以见于Remington′sPharmaceuticalSciences，第20版，Mack出版公司(MackPublishingCompany)，Easton，Pa.(1985)，以及见于Stahl和Wermuth的“HandbookofPharmaceuticalSalts：Properties，Selection，andUse”(Wiley-VCH，Weinheim，德国，2002)。
本文给出的任何通式亦意欲表示该化合物的未标记形式和同位素标记形式。同位素标记的化合物具有本文给出的通式描绘的结构，除了一个或多个原子被具有所选择原子量或质量数的原子替换。可引入至本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如分别为2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本发明包括本文定义的各种同位素标记的化合物，例如存在放射性同位素例如3H和14C的那些化合物或存在非放射性同位素例如2H和13C的那些化合物。这些同位素标记的化合物可用于代谢研究(用14C)、反应动力学研究(用例如2H或3H)，检测或成像技术如正电子发射断层显像(PET)或单光子发射计算机断层显像(SPECT)、包括药物或底物组织分布分析，或在患者的放射治疗中。特别是，18F或标记化合物特别优选用于PET或SPECT研究。式(I)的同位素标记化合物可一般地通过本领域技术人员公知的常规技术或与附带实施例和制备中所述类似的方法、使用适合的同位素标记的试剂替代所用的非同位素标记的试剂进行制备。
此外，用较重同位素、特别是氘(即2H或D)取代可因更大的代谢稳定性而提供某些治疗优势，例如体内半衰期延长或所需剂量降低或治疗指数改善。该较重同位素、具体而言是氘的浓度可通过同位素富集因子来界定。本文所用的术语“同位素富集因子”是指特定同位素的同位素丰度与天然丰度的比率。如果本发明化合物中的取代基表示为氘，则对于各指定氘原子，该化合物具有至少至少3500(在各指定氘原子处具有52.5％氘纳入)、至少4000(60％氘纳入)、至少4500(67.5％氘纳入)、至少5000(75％氘纳入)、至少5500(82.5％氘纳入)、至少6000(90％氘纳入)、至少6333.3(95％氘纳入)、至少6466.7(97％氘纳入)、至少6600(99％氘纳入)或至少6633.3(99.5％氘纳入)的同位素富集因子。
本文所用的术语“巯基-马来酰亚胺”是指通过巯基与马来酰亚胺反应形成的基团，其具有如下这种通式：
其中Y和Z是通过巯基-马来酰亚胺连接基连接的基团且可以包含连接基成分、抗体或有效负荷。
本文所用的“可裂解的”是指通过共价连接连接两个部分、但在生理学相关条件下分解成以切断所述部分之间的共价连接的连接基或连接基成分，典型地，可裂解基团在胞内环境中以比细胞外部更快速地方式被切断，导致有效负荷优先在靶细胞内部释放。裂解可以是酶促的或非酶促的，但通常在不降解抗体的情况下从抗体中释放有效负荷。裂解可以遗留连接至有效负荷的连接基或连接基成分的一些部分，或可以释放有效负荷而不带有任何连接基残基。
本文所用的“Pcl”是指吡咯啉羧基赖氨酸，例如
其中R20是H，它在掺入肽时具有下式：
相应的化合物(其中R20是甲基)是吡咯赖氨酸。
本文所用的“不能裂解的”是指尤其是在生理学条件下对分解不敏感的连接基或连接基成分，例如它至少与免疫缀合物的抗体或抗原结合片段部分一样稳定。这种连接基有时称作“稳定的”，其含义是它们足以抵抗降解以保持连接至抗原结合部分Ab的有效负荷，直到Ab自身至少部分被降解为止，即Ab的降解先于体内连接基裂解发生。具有稳定或不能裂解的连接基的ADC的抗体部分降解可能遗留来自连接至体内递送的有效负荷或药物部分的、抗体的一些或全部连接基，例如一个或多个氨基酸基团。
本文所用的术语“卤素”(卤代)是指氟、溴、氯或碘，特别是氟或氯。卤素-取代的基团和部分例如被卤素取代的烷基(卤代烷基)可以是单-、多-或全-卤代的。
本文所用的术语“杂原子”是指氮(N)、氧(O)或硫(S)原子、特别是氮或氧，另有提供的除外。
本文所用的术语“烷基”是指完全饱和的支链或无支链烃部分。除非另有提供，否则烷基是指具有1-10个碳原子、1-6个碳原子1-4个碳原子的烃部分。烷基的有代表性的实例包括、但不限于甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、仲-丁基、异-丁基、叔丁基、正-戊基、异戊基、新戊基、正-己基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、正-庚基、正-辛基、正-壬基、正-癸基等。
取代的烷基是包含一个或多个替代氢的取代基的烷基，例如1、2或3个取代基，直到未取代的烷基上存在的氢原子数。如果没有另外指定，则烷基的适合的取代基可以选自卤素、CN、氧代、羟基、C1-4烷氧基、取代将未取代的C3-6环烷基、取代将未取代的苯基、氨基、(C1-4烷基)氨基、二(C1-4烷基)氨基、C1-4烷硫基、C1-4烷基磺酰基、-C(＝O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C＝O)-C1-4烷基、-NHC(＝O)C1-4烷基和-NHC(＝O)OC1-4烷基。烷基的优选的取代基包括卤素、CN、氧代、羟基、C1-4烷氧基、C3-6环烷基、苯基、氨基、(C1-4烷基)氨基、二(C1-4烷基)氨基、C1-4烷硫基、C1-4烷基磺酰基、-C(＝O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C＝O)-C1-4烷基、-NHC(＝O)C1-4烷基和-NHC(＝O)OC1-4烷基。在一些实施方案中，C1-4取代的烷基具有1-3个取代基，另外指定的除外。
本文所用的术语“亚烷基”是指具有1-10个碳原子和2个开放式化合价以结合其它特征的二价烷基。除非另有提供，否则亚烷基是指具有1-10个碳原子、1-6个碳原子或1-4个碳原子的部分。亚烷基的有代表性的实例包括、但不限于亚甲基、亚乙基、亚正-丙基、亚异-丙基、亚正-丁基、亚仲-丁基、亚异-丁基、亚叔丁基、亚正-戊基、亚异戊基、亚新戊基、亚正-己基、3-甲基亚己基、2，2-二甲基亚戊基、2，3-二甲基亚戊基、亚正-庚基、亚正辛基、亚正-壬基、亚正-癸基等。取代的亚烷基是包含一个或多个例如1、2或3个取代基的亚烷基；除非另有指定，否则适合的取代基选自上述对烷基列出的取代基。
本文所用的术语“卤代烷基”是指如本文所定义的烷基，其被一个或多个如本文所定义的卤素取代。卤代烷基可以是一卤代烷基、二卤代烷基、三卤代烷基或多卤代烷基，包括全卤代烷基。一卤代烷基可以在烷基内具有1个碘、溴、氯或氟。氯和氟优选位于烷基或环烷基上；氟、氯和溴通常优选位于芳基或杂芳基上。二卤代烷基和多卤代烷基可以在烷基内具有2个或以上相同的卤原子或不同卤原子的组合。典型地，多卤代烷基包含至多12个或10个或8个或6个或4个或3个或2个卤素基团。卤代烷基的非限制性实例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。全卤代-烷基是指全部氢原子被卤原子替代的烷基，例如三氟甲基。
本文所用的术语“烷氧基”是指烷基-O-，其中烷基如上述所定义。烷氧基的有代表性的实例包括、但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔-丁氧基、戊氧基、己氧基等。典型地，烷氧基具有1-10个或1-6个碳，更通常地具有1-4个碳原子。
“取代的烷氧基”是在烷氧基的烷基部分上包含一个或多个、例如1、2或3个取代基的烷氧基。除非另有指定，否则适合的取代基选自上述对烷基所列的取代基，除外羟基和氨基通常不存在于直接连接至取代的“烷基-O”基团的碳上。
类似地，其它基团如“烷氨基羰基”、“烷氧基烷基”、“烷氧羰基”、“烷氧基-羰基烷基”、“烷基磺酰基”、“烷基磺酰氧基(sulfoxyl)”、“烷氨基”的烷基部分各自具有于上述举出的“烷基”定义中所述相同的含义。当按照这种方式使用时，除非另有指示，否则烷基通常是1-4个碳的烷基且不另外被非命名的成分的基团取代。当这类烷基被取代时，适合的取代基是上述对烷基命名的那些，另外指定的除外。
本文所用的术语“卤代烷氧基”是指卤代烷基-O-，其中卤代烷基如上述所定义。卤代烷氧基的有代表性的实例包括、但不限于氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、三氯甲氧基、2-氯乙氧基、2，2，2-三氟乙氧基、1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙氧基等。典型地，卤代烷基具有1-4个碳原子。
本文所用的术语“环烷基”是指3-12个碳原子的饱和或不饱和非芳族单环、双环、三环或螺环烃基：环烷基可以是不饱和的且可以与另一个可以为饱和、不饱和或芳族的环稠合，条件是连接至所关注分子式的环烷基的环原子不是芳族环碳。除非另有提供，否则环烷基是指具有3-9个环碳原子或3-7个环碳原子的环烃基。优选地，环烷基是具有3-7个环原子的饱和单环，另有指定的除外。
取代的环烷基是被1或2或3或以3个以上取代基取代的环烷基，至多达未取代的基团上的氢数。典型地，取代的环烷基具有1-4或1-2个取代基。除非另有指定，否则适合的取代基独立地是选自卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、氧代，C1-4-烷基亚氨基、C1-4-烷氧基亚氨基(alkoximino)、羟基亚氨基、C1-4-烷基、C2-4-酰基、C2-4-炔基、C1-4-烷氧基、C1-4-硫代烷基、C2-4-烯氧基、C2-4-炔氧基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4-烷氧羰基、氨基、C1-4-烷氨基、二-C1-4-烷氨基、C1-4-烷氨基羰基、二-C1-4-烷氨基羰基、C1-4-烷基羰基氨基、C1-4-烷基羰基(C1-4-烷基)氨基、C1-4-烷基磺酰基、C1-4烷基氨磺酰基和C1-4烷氨基磺酰基，其中上述举出的烃基(例如烷基、烯基、炔基、烷氧基残基)各自可以进一步被一个或多个基团取代，所述基团在每次出现时独立地选自本文对“烷基”基团所述的优选取代基清单。环烷基优选的取代基包括C1-4烷基、卤素、CN、氧代、羟基、C1-4烷氧基、氨基、(C1-4烷基)氨基、二(C1-4烷基)氨基、C1-4烷硫基、C1-4烷基磺酰基、-C(＝O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C＝O)-C1-4烷基、-NHC(＝O)C1-4烷基和-NHC(＝O)OC1-4烷基。
示例性单环烃基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基等。示例性双环烃基包括冰片基、吲哚基、六氢吲哚基、四氢萘基、十氢萘基、双环[2.1.1]己基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.1]庚烯基、6，6-二甲基双环[3.1.1]庚基、2，6，6-三甲基双环[3.1.1]庚基、双环[2.2.2]辛基等。示例性三环烃基包括金刚烷基等。
类似地，其它基团如“环烷氧基”、“环烷氧基烷基”、“环烷氧羰基”、“环烷氧基-羰基烷基”、“环烷基磺酰基”、“卤代环烷基”的环烷基部分各自应具有与上述举出的“环烷基”定义中所述相同的含义。当用于这些术语时，环烷基典型地是单环3-7碳环，其未被取代或被1-2个基团取代。当被任选取代时，取代基典型地选自C1-C4烷基和上述适合于环烷基举出的那些。
本文所用的术语“芳基”是指环部分上具有6-14个碳原子的芳族烃基。典型地，芳基是具有6-14个碳原子、通常具有6-10个碳原子的单环、双环或三环芳基，例如苯基或萘基。此外，本文所用的术语“芳基”是指芳族取代基，其可以是单芳族环或彼此稠合的多芳族环。非限制性实例包括苯基、萘基和1，2，3，4-四氢萘基，条件是四氢萘基通过四氢萘基的芳族环碳连接至所述的通式。
取代的芳基是被1-5(例如1或2或3)个取代基取代的芳基，所述取代基独立地选自羟基、巯基、氰基、硝基、C1-4-烷基、C2-4-烯基、C2-4-炔基、C1-4烷氧基、C1-4-硫代烷基、C2-4-烯氧基、C2-4-炔氧基、卤素、C1-4-烷基羰基、羧基、C1-4-烷氧羰基、氨基、C1-4-烷氨基、二-C1-4-烷氨基、C1-4烷氨基羰基、二-C1-4-烷氨基羰基、C1-4-烷基羰基氨基、C1-4烷基羰基(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基磺酰基、氨磺酰基、C1-4烷基氨磺酰基和C1-4烷氨基磺酰基，其中上述举出的烃基(例如烷基、烯基、炔基、烷氧基残基)各自可以进一步被一个或多个基团取代，所述基团在每次出现时独立地选自上述对烷基所述优选取代基列出的基团。芳基优选的取代基是C1-4烷基、卤素、CN、羟基、C1-4烷氧基、氨基、(C1-4烷基)氨基、二(C1-4烷基)氨基、C1-4烷硫基、C1-4烷基磺酰基、-C(＝O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C＝O)-C1-4烷基、-NHC(＝O)C1-4烷基和-NHC(＝O)OC1-4烷基。
类似地，其它基团如“芳氧基”、“芳氧基烷基”、“芳氧羰基”、“芳氧基-羰基烷基”的芳基部分各自应具有与上述举出的“芳基”的定义中所述相同的含义。
本文所用的术语“杂环基”是指杂环基团，其为饱和的或部分不饱和的，但不是芳族的，且可以是单环或多环(就多环而言，特别是双环、三环或螺环)；且具有3-14个、更常见的是4-10个且最优选5或6个环原子；其中一个或多个、优选1-4个、尤其是1或2个环原子是独立地选自O、S和N的杂原子(其余环原子由此是碳)。尽管描述为例如C5-6原子的环，但是杂环包含至少一个杂原子作为环原子且具有所述的环原子数，例如在本实例中为5-6个。优选地，杂环基具有1或2个杂原子作为环原子且优选杂原子彼此不直接连接。键合的环(即连接至所关注通式的环)优选具有4-12个、尤其是5-7个环原子。杂环基可以与芳族环稠合，条件是连接至所关注通式的杂环基的原子不是芳族的。杂环基可以通过杂原子(典型地是氮)或杂环基的碳连接至所关注通式。杂环基可以包括稠合或桥连的环和螺环，且多环杂环基的仅1个环需要包含杂原子作为环原子。杂环的实例包括四氢呋喃(THF)、二氢呋喃、1，4-二烷、吗啉、1，4-二噻烷、哌嗪、哌啶、1，3-二氧戊环、咪唑烷、咪唑啉、吡咯啉、吡咯烷、四氢吡喃、二氢吡喃、氧杂硫戊环(oxathiolane)、二硫戊环、1，3-二烷、1，3-二噻烷、氧杂噻烷(oxathiane)、硫吗啉等。
取代的杂环基是独立地被1-5(例如1或2或3)个取代基取代的杂环基，所述取代基独立地选自上述对环烷基所述的取代基。
类似地，其它基团如“杂环氧基”、“杂环氧基烷基”、“杂环氧基羰基”的杂环基部分各自应具有与上述举出的“杂环基”定义中所述相同的含义。
除非另有指定，否则本文所用的“环醚”是指包含4-7个环原子的杂环，其包含氧原子作为环成员和任选的2个不相邻的氧原子(对于5或以上个原子的环)。典型的实例包括氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢吡喃、氧杂庚环和1，4-二烷。
本文所用的术语“杂芳基”是指5-14元单环-或双环-或三环-芳族环系，其具有1-8个杂原子作为环成员；所述杂原子选自N、O和S。杂芳基和杂环在本文中可以称作例如C5-6杂芳基或杂环：应当理解，当使用这种描述时，5-6是指环原子总数，包括碳和杂原子；或者，这类环可以称作5-6元杂芳基或杂环基。典型地，杂芳基是5-10元环系，例如包含至少一个杂原子作为环成员的5-6元单环或8-10元双环基团。典型的杂芳基包括2-或3-噻吩基、2-或3-呋喃基、2-或3-吡咯基、2-，4-或5-咪唑基、1-，3-，4-或5-吡唑基、2-，4-或5-噻唑基、3-，4-或5-异噻唑基、2-，4-或5-唑基、3-，4-或5-异唑基、3-或5-1，2，4-三唑基、4-或5-1，2，3-三唑基、1-或2-四唑基、2-，3-或4-吡啶基、3-或4-哒嗪基、3-、4-或5-吡嗪基、2-吡嗪基和2-，4-或5-嘧啶基。
术语“杂芳基”还指这样的基团，其中杂芳族还与一个或多个芳基、环烷基或杂环基环稠合，其中与所关注通式的连接基团或连接点位于杂芳族环上。限制性实例包括1-，2-，3-，5-，6-，7-或8-吲嗪基、1-，3-，4-，5-，6-或7-异吲哚基、2-，3-，4-，5-，6-或7-吲哚基、2-，3-，4-，5-，6-或7-吲唑基、2-，4-，5-，6-，7-或8-嘌呤基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-或9-喹嗪基、2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-喹啉基、1-，3-，4-，5-，6-，7-或8-异喹啉基、1-，4-，5-，6-，7-或8-酞嗪基、2-，3-，4-，5-或6-萘啶基、2-，3-，5-，6-，7-或8-喹唑啉基、3-，4-，5-，6-，7-或8-噌啉基、2-，4-，6-或7-蝶啶基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-4aH咔唑基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-咔唑基、1-，3-，4-，5-，6-，7-，8-或9-咔啉基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-，9-或10-菲啶基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-或9-吖啶基、1-，2-，4-，5-，6-，7-，8-或9-萘嵌间二氮苯基(perimidinyl)、2-，3-，4-，5-，6-，8-，9-或10-菲咯啉基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-或9-吩嗪基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-，9-或10-吩噻嗪基、1-，2-，3-，4-，6-，7-，8-，9-或10-吩嗪基、2-，3-，4-，5-，6-或l-，3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-或10-苯并异喹啉基、2-，3-，4-或噻吩并[2，3-b]呋喃基、2-，3-，5-，6-，7-，8-，9-，10-或11-7H-吡嗪并[2，3-c]咔唑基、2-，3-，5-，6-或7-2H-呋喃并[3，2-b]-吡喃基、2-，3-，4-，5-，7-或8-5H-吡啶并[2，3-d]-o-嗪基、1-，3-或5-1H-吡唑并[4，3-d]-唑基、2-，4-或54H-咪唑并[4，5-d]噻唑基、3-，5-或8-吡嗪并[2，3-d]哒嗪基、2-，3-，5-或6-咪唑并[2，1-b]噻唑基、1-，3-，6-，7-，8-或9-呋喃并[3，4-c]噌啉基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，8-，9-，10或11-4H-吡啶并[2，3-c]咔唑基、2-，3-，6-或7-咪唑并[1，2-b][1，2，4]三嗪基、7-苯并[b]噻吩基、2-，4-，5-，6-或7-苯并唑基、2-，4-，5-，6-或7-苯并咪唑基、2-，4-，4-，5-，6-或7-苯并噻唑基、1-，2-，4-，5-，6-，7-，8-或9-苯并庚因基、2-，4-，5-，6-，7-或8-苯并嗪基、1-，2-，3-，5-，6-，7-，8-，9-，10-或11-1H-吡咯并[1，2-b][2]苯并氮杂庚因基。典型的稠合杂芳基包括、但不限于2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-喹啉基、1-，3-，4-，5-，6-，7-或8-异喹啉基、2-，3-，4-，5-，6-或7-吲哚基、2-，3-，4-，5-，6-或7-苯并[b]噻吩基、2-，4-，5-，6-或7-苯并唑基、2-，4-，5-，6-或7-苯并咪唑基和2-，4-，5-，6-或7-苯并噻唑基。
取代的杂芳基是包含一个或多个选自上述对适合于芳基所述的取代基的杂芳基。
类似地，其它基团如“杂芳氧基”、“杂芳氧基烷基”、“杂芳氧羰基”的杂芳基部分各自应具有与上述举出的“杂芳基”定义中所述相同的含义。
在一个方面，本发明提供包含Eg5抑制剂作为药物或有效负荷的免疫缀合物(例如ADCs)和使用这类免疫缀合物或ADCs治疗细胞增殖性障碍的组合物和方法。一些咪唑和三唑化合物在本领域中已知作为治疗细胞增殖性障碍的Eg5抑制剂和治疗剂，并且可以用作ADC有效负荷；参见例如WO2007/021794、WO2006/002236、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381和WO2011/128388。其它本领域中已知适合于用作ADC有效负荷的Eg5抑制剂包括例如WO2006/049835、美国专利US7,504,405、美国专利US7,939,539和Rath和Kozielski，NatureReviews：Cancer，第12卷，527-39(2012年8月)的图3中公开的化合物。
包含Eg5抑制剂作为有效负荷(药物)的免疫缀合物包括式(I)的缀合物：
其中Ab表示抗原结合部分，例如抗体或抗体片段；
L表示通过共价或非共价键合使X连接至Ab的连接基，其可以任选地使一个以上X连接至Ab且可以包含、也可以不包含可裂解的连接基成分；
X表示Eg5抑制剂，例如如本文所述的式(II)或式(III)的化合物；或其它Eg5抑制剂，包括Rath(Rath和Kozielski，NatureRev.Cancer，第12卷，527-39(2012))中公开的化合物，包括伊匹尼塞、SB-743921、AZD4877、ARQ621、ARRY-520、LY2523355、MK-0731、EMD534085和GSK-923295和WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388和WO2006/049835中所述的Eg5抑制剂；
m是1-4的整数，典型地是1-2；且
n是1-16的整数，优选2-8。
如下枚举的实施方案清单中提供了本发明的一些方面和实例：
1.式(I)的免疫缀合物：
其中Ab表示抗原结合部分；
L表示使X连接至Ab的连接基；
m是1-4的整数；
n是1-16的整数；且
X表示式(II)的基团
其通过L连接至Ab，
其中：
Z是N或CH；
Ar1是任选被至多3个基团取代的苯基，所述基团选自卤素、C1-3烷基和C1-3卤代烷基；
Ar2是苯基或吡啶基或4-6个原子的环醚，且Ar2任选地被至多2个选自卤素、CN、C1-3烷基、羟基、氨基和C1-3卤代烷基的基团取代；
R1是C1-6烷基、-(CH2)0-2-C3-6环烷基或包含至多2个选自N、O和S的杂原子作为环成员的-(CH2)0-2-C4-7杂环基(4-7元杂环)，其中C1-6烷基、C3-6环烷基或C4-7杂环基各自任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基、氧代、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、C1-4烷基-氨基和COO(C1-4烷基)；且进一步任选地包括-C(O)-C1-6烷基、-C(O)-NH-C1-6烷基和-C(O)O-C1-6烷基；
R2是H或C1-4烷基；
T是(CH2)1-3；
Y选自C1-3氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基，其中C1-3氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基各自任选地被至多2个基团取代，所述基团选自氨基、氧代、卤素、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)、-C(＝O)NH(C1-4烷基)、-C(＝O)N(C1-4烷基)2和C1-4卤代烷基；
A是NH、N(C1-4烷基)或式(II)中的羰基与Q之间价键；
Q选自C1-4烷基、-O-C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6杂环基、-(CH2)0-2-C3-6环烷基、-(CH2)0-2-C5-6杂芳基和-(CH2)0-2-苯基，且任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、羟基、氨基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR、-O-葡糖醛酸酯和-NR2，其中R各自是任选地被卤素、-SH、-NH2、OMe或-OH取代的C1-6烷基；在一些实施方案中，R还可以是C3-6环烷基或包含N、O或S作为环成员的4-6元杂环，且R各自独立地任选地被卤素、-SH、-NH2、OMe或-OH取代。
典型地，m是1或2，优选1；且n是2-8，优选约2-约4或3-5。
在一些实施方案中，n是2、4、6或8。在一些实施方案中，其中存在一个以上L，L各自独立地选择。在其它实施方案中，L各自是相同的。
在这些实施方案的一些中，R1是C1-6烷基、-(CH2)0-2-C3-6环烷基或包含至多2个选自N、O和S的杂原子作为环成员的-(CH2)0-2-C4-7杂环基，其中C1-6烷基、C3-6环烷基或C4-7杂环基各自任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基、氧代、羟基-取代的C1-4烷基、C1-4烷基-氨基和COO(C1-4烷基)。在一些实施方案中，C1-6烷基、C3-6环烷基或C4-7杂环基各自被至多2个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基和羟基-取代的C1-4烷基，其中优选的取代基选自F、羟基、甲氧基和氨基。适合的R1基团的实例包括叔丁基、2-甲氧基-2-丙基、4-四氢吡喃基和式的基团，其中A是-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NHC(O)H或-SH；且在这些实施方案的一些中，通过替代R1或A的氢原子之一，连接基L连接至部分A。
R1的一些实施方案包括4-四氢吡喃基和
且任选地还包括
其中A是-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NHC(O)H或-SH，且虚线表示每个R1与式II的连接点。
1A.上述实施方案的一些，R2是H。
1B.上述实施方案的一些，A是羰基与Q之间的价键。在其它实施方案中，A是NH。上述实施方案的一些中，当Y是杂环基或环烷时，T是CH2，且当Y是C1-3氨基烷基时，T是CH2或CH2CH2。
1C.上述实施方案的一些中，Q是被1或2个基团取代的C1-4烷基，所述基团选自羟基、氨基、巯基、氨基-C1-4-烷氧基或氨基-C1-4-烷硫基。在其它实施方案中，Q是选自吗啉、硫吗啉、吡咯烷、四氢呋喃、哌嗪、苯基和吡啶的环，其中所述环任选地被至多2个基团取代，所述基团选自C1-4烷基、卤素、CN、羟基、氨基、C1-4烷基-氨基、C1-4烷基磺酰基和C1-4烷氧基。
1D.上述实施方案的一些中，Y是被至多2个基团取代的吡咯烷环，所述基团选自卤素、C1-4烷基、羟基、氨基、羟基-C1-4烷基、氨基-C1-4烷基、C1-4烷基-氨基和C1-4烷氧基。吡咯烷优选的取代基包括F、甲基、羟基和羟基甲基。
2.实施方案1的免疫缀合物，其中R2是H。
3.实施方案1或实施方案2的免疫缀合物，其中Z是CH。
4.实施方案1或2的免疫缀合物，其中Z是N。
5.实施方案1-4任一项的免疫缀合物，其中R1是四氢吡喃基环，且R1任选地被至多2个选自氧代和甲基的基团取代。
6.上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中Ar1是二卤代苯基。在一些实施方案中，Ar1是2，5-二卤代苯基，例如Ar1可以是2，5-二氟苯基。
在这些实施方案中，Ar2可以是苯基、卤代苯基、羟基苯基或氨基吡啶，例如苯基、3-氟苯基、3-羟基苯基、3-氨基-2-吡啶基。
7.上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中式(II)的化合物具有下式：
其中式(I)中的L连接至式(II)中的Y或Q或R1。在优选的实施方案中，L连接至作为基团Y的部分或基团Q的部分的氧原子或胺氮。
7A.上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中式(II)的化合物具有下式：
其中L连接至R1，且R1是任选取代的烷基。在这些实施方案的一些中，R1是式-CMe2(CH2)0-2-G-[L]的C3-6烷基，其中[L]表示R1连接至L的点，且G可以是价键、-O-、-NH-、-S-、-CONH-或-COO-。在这些实施方案的一些中，R1是-C(Me)2-(CH2)0-2-R30，其中R30是羟基、羧基或氨基。在这些实施方案的一些中，L通常通过R30基团连接至R1。R1的实施方案包括-C(Me)2-(CH2)0-2-O-[L]、-C(Me)2-(CH2)0-2-NH-[L]、-C(Me)2-(CH2)0-2-C(＝O)-[L]和-C(Me)2-(CH2)0-2-C(＝O)-NH-[L]，其中[L]表示式(II)的化合物连接至式(I)中的连接基L的点。
8.实施方案1-7任一项的免疫缀合物，其中R1是4-四氢吡喃基。例如，R1是任选地，四氢吡喃环可以被1或2个选自羟基、甲基、甲氧基和卤素的取代基取代。
9.上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中式(II)中的Q是被1或2个选自羟基和氨基的基团取代的C1-4烷基。在其中A是NH或N(烷基)的实施方案中，Q通常-CH2OH、-CH2NH2或C2-4烷基，被1或2个选自-OH和-NH2的基团取代。如果A是价键，则Q可以是任选地被-OH和/或NH2取代的C1-3烷基。基团Q的羟基或胺可以用于使式(II)的化合物连接至式(I)中的L。
10.上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中Y是任选地被1或2个选自氟、氨基、羟基、甲氧基和羟基甲基的基团取代的吡咯烷。在这些实施方案中，吡咯烷环NH或吡咯烷环上的氨基或羟基可以是式(II)的化合物连接至式(I)中的L的点。
11.上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中A是-NH-。
11B.或者，上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中A是价键。
12.上述实施方案任一项的免疫缀合物，其中连接基是可裂解的。可裂解的连接基包括：连接基成分，例如提供细胞中酶裂解的位点的二肽(例如val-cit)；连接基成分，例如为pH敏感的且倾向于细胞内部裂解的腙或亚胺；倾向于在细胞内部裂解的二硫化物连接基成分；或葡糖醛酸糖苷酶敏感性连接基成分，例如对-氨基苄氧羰基部分，在氨基苄氧基的苯环上具有-O-葡萄糖醛酸基团的部分。
13.实施方案1-11任一项的免疫缀合物，其中连接基是不能裂解的。
13A.实施方案13的免疫缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述连接基被选自-(CH2)1-2-COOH、-(CH2)1-2-OH、-COOH或-SO3H的极性基团取代。
14.式(III)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
Z是N或CH；
Ar1是任选地被至多3个选自卤素、C1-3烷基和C1-3卤代烷基的基团取代的苯基；
Ar2是苯基或吡啶基，其任选地被至多2个选自卤素、CN、C1-3烷基、羟基、氨基和C1-3卤代烷基的基团取代；
R1是-(CH2)0-2-C4-7杂环基或-(CH2)0-2-C3-7环烷基，其中C4-7杂环基是包含至多2个选自N、O和S的杂原子作为环成员的4-7元环，且C4-7杂环基和C3-7环烷基各自任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基(例如甲基)、C1-4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-4烷氧基、羟基、氨基、氧代，羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基或COO(C1-4烷基)；任选地被至多3个选自卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、氧代或-COO(C1-4烷基)的基团取代；
R2是H或C1-4烷基；
T是(CH2)1-3；
Y选自C1-2氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基，其中C1-2氨基烷基、C4-6杂环基，且C3-6环烷基各自任选地被至多2个基团取代，所述基团选自氨基、氧代、卤素、羟基、C1-4烷氧基、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)和C1-3卤代烷基；
A是NH、N(C1-4烷基)或式(III)中的羰基与Q之间的价键；
Q选自C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6杂环基、-(CH2)0-2-C5-6杂芳基和-(CH2)0-2-苯基，且Q任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、羟基、氨基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-N3、-NHR、-O-葡糖醛酸酯和-NR2，其中R各自是任选地被卤素、-SH、-NH2、OMe或-OH取代的C1-6烷基。
在式(III)的这些实施方案的一些中，R1是-(CH2)0-2-C3-6环烷基或包含至多2个选自N、O和S的杂原子作为环成员的-(CH2)0-2-C4-7杂环基，其中C3-6环烷基或C4-7杂环基各自任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基、氧代、羟基-取代的C1-4烷基、C1-4烷基-氨基和COO(C1-4烷基)。在一些实施方案中，C3-6环烷基或C4-7杂环基被至多2个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基和羟基-取代的C1-4烷基，其中优选的取代基选自F、羟基、甲氧基和氨基。
在一些实施方案中，R1选自4-四氢吡喃基和
且还任选自
其中A是-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NHC(O)H或-SH，且虚线表示每个R1的连接点。
在上述式(III)的实施方案的一些中，R2是H。
在上述式(III)的实施方案的一些中，A是羰基与Q之间的价键。在其它实施方案中，A是NH。上述实施方案的一些中，当Y是杂环基或环烷基时，T是CH2，且当Y是C1-3氨基烷基时，T是CH2或CH2CH2。
在上述式(III)的实施方案的一些中，Q是被1或2个选自羟基、氨基、巯基、氨基-C1-4-烷氧基或氨基-C1-4-烷硫基的基团取代的C1-4烷基。在其它实施方案中，Q是选自吗啉、硫吗啉、吡咯烷、四氢呋喃、哌嗪、苯基和吡啶的环，其中所述环任选地被至多2个基团取代，所述基团选自C1-4烷基、卤素、CN、羟基、氨基、C1-4烷基-氨基、C1-4烷基磺酰基和C1-4烷氧基。
在上述式(III)的实施方案的一些中，Y是任选地被至多2个基团取代的吡咯烷，所述基团选自卤素、C1-4烷基、羟基、氨基、羟基-C1-4烷基、氨基-C1-4烷基、C1-4烷基-氨基和C1-4烷氧基。吡咯烷优选的取代基包括F、甲基、羟基和羟基甲基。
这些新的Eg5抑制剂可以作为低分子量药物化合物用于治疗癌症，或可以将它们掺入ADC用于体内靶向递送。
15.实施方案14的化合物，其中R1是四氢吡喃基；在一些实施方案中，R1是四氢吡喃-4-基。
16.式(IIA)或(IIB)的化合物
其中Ar1、Ar2、Z、R1、R2、T、Q、Y和A如上述实施方案1中对式(II)所定义，
Q＊选自-CH2-、-CH(Me)-、-CH(Me)CH2-、-CH2CH2-、-CH2O-、-CH2S-、-CH2-NH-、-CH2-NMe-、-CH(Me)O-、-CH(OH)-CH2O-、-CH(O-)-CH2OH、-CH(OH)-CH2NH-、-CH(NH-)-CH2OH、-CH(O-)-CH2NH2、-CH(NH-)-CH2OH、-CH(Me)S-、-CH(Me)NH-、-CH2CH2O-、-CH2CH2NH-、-CH2CH2S-、-CH(Me)CH2O-、-CH(Me)CH2S-、-CH(Me)CH2NH-、
且在这些实施方案的一些中，Q＊选自-CH2O-、-CH2S-、-CH2-NH-、-CH2-NMe-、-CH(Me)O-、-CH(OH)-CH2O-、-CH(O-)-CH2OH、-CH(OH)-CH2NH-、-CH(NH-)-CH2OH、-CH(O-)-CH2NH2、-CH(NH-)-CH2OH、-CH(Me)S-、-CH(Me)NH-、-CH2CH2O-、-CH2CH2NH-、-CH2CH2S-、-CH(Me)CH2O-、-CH(Me)CH2S-、-CH(Me)CH2NH-、
Y＊选自-CH(CH2F)NH-、-CH2NH-、
其中R10和R11独立地是H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、COOH、COO(C1-4烷基)、CONH(C1-4烷基)、CON(C1-4烷基)2或OH；
且W是包含一个或多个连接基成分和反应官能团的连接部分。带有反应官能团例如马来酰亚胺的适合的连接部分如本文所公开的，包括
其中RN各自独立地是H或CH2CH2-R30，其中R30是羟基、氨基或羧基，且RN优选是H；
且任选地还包括
其中X表示式(IIA)或(IIB)的化合物，且LG是适合于提供酰化剂的离去基，例如Cl、-O-苯并三唑(-OBt)、-O-氮杂苯并三唑(-OAt)、-O-琥珀酰亚胺、取代的苯氧基、-OC(O)(苯基或取代的苯基)、-OC(O)(C1-6烷基)或-OC(O)O(C1-6烷基)。
16B.备选的实施方案，包括式(IIC)的化合物：
其中Ar1、Ar2、Z、R2、T、Q、Y、W和A如上述对式(IIA)和(IIB)所定义，R1＊是任选地被氧代、羟基、氨基或羧基取代的C3-6烷基，例如R1＊是-C(Me)2-(CH2)0-2-A，其中A是氨基、羟基、羧基、CONH2或-SH；且W是包含一个或多个连接基成分和反应官能团的连接部分。
例如，W可以是-L1-L2-L3-L4-L5-G，其中G是反应官能团，且L1、L2、L3、L4和L5是选自如本文所述的那些的连接基成分。适合的反应官能团(G)是具有适合的反应性以便分别与抗体或抗原结合部分上的氨基酸的氨基酸侧链形成共价键的反应官能团，例如半胱氨酸或赖氨酸的-SH或-NH2。适合的反应官能团的实例包括马来酰亚胺、α-卤代乙酰胺类(卤素＝Cl、Br或I)、醛(CHO)、巯基(形成二硫化物)、2-氨基苯甲醛类(ABA)、2-氨基-二苯甲酮类(ABP)、2-氨基苯乙酮类(AAP)、甲酸酯类和与游离胺基反应易于形成酰胺类的活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺的酯类及其类似物。适合的反应官能团ABA、AAP和ABP包括如下基团：
如Ou等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.2011，108(26)，10437-42所述，位于与有效负荷相对的任选的连接基末端上的这些部分与Pcl或Pyl反应，形成连接基，其中L1是
其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基。
本发明的这些实施方案是用于制备包含与上述式(II)和(III)的化合物类似的Eg5抑制剂有效负荷的缀合物的活化的中间体。在这些实施方案中，所述化合物包含位于可充分耐受的位置上的反应官能团，甚至与不能连接的连接基一起使用，例如连接基连接至相当于式(II)中的Y或Q的原子。
17.实施方案16的化合物，其中W包含选自-SH、-NH2、-C(＝O)H、-C(＝O)Me、N-马来酰亚胺、-NHC(＝O)-CH2-卤素、-COOH和-C(＝O)-OR’的反应官能团，其中卤素选自Cl、Br和I，且-OR’是活化酯的离去基部分。
18.实施方案14-17任一项的化合物，其中Ar1是二卤代苯基。特别适合的基团包括2，5-二氟苯基、2-氟-5-氯苯基和2-氯-5-氟苯基。
19.实施方案14-18任一项的化合物，其中Ar2是苯基或卤代苯基。特别适合的基团包括苯基和3-氟苯基。
20.实施方案14-19任一项的化合物，其中Z是CH。
21.实施方案14-19任一项的化合物，其中Z是N。
22.实施方案16-21任一项的化合物，其中R1是4-四氢吡喃基。
22A.实施方案16-21任一项的化合物，其中R1＊是-C(Me)2CH2C(O)NH-[W]，其中[W]表示R1＊连接至W的点。
23.实施方案14-22任一项的化合物，其中R2是H。在备选的实施方案中，R2可以是甲基。
24.实施方案14-23任一项的化合物，其中A是-NH-。
25.实施方案14-23任一项的化合物，其中A是价键。
26.实施方案14-25任一项的化合物，其中T是CH2或CH2CH2。优选地，当Y或Y＊是氨基烷基例如-CH(CH2F)NH2或-CH2NH2时，T是CH2CH2；且当Y或Y＊是任选取代的吡咯烷例如如下基团时，T是-CH2-，
OH或NH2
OH或NH2。
27.实施方案14-26任一项的化合物，其中Y选自-CH(CH2F)NH2、
其中R10和R11独立地是H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、COOH、COO(C1-4烷基)或OH。
在这类化合物的一些实施方案中，Y选自-CH(CH2F)NH2、
Y的优选实施方案包括
其中[T]表示Y连接至通式中的T的点。
Y＊的优选实施方案包括
其中[T]表示Y＊连接至通式中的T的点；且[W]表示其中Y＊连接至W。
28.实施方案14-27任一项的化合物，其中Q选自-CH2OH、-CH2-NH2、-CH(Me)OH、-CH(OH)-CH2OH、-CH(OH)-CH2NH2、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(Me)SH、-CH(Me)NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2CH2SH、-CH(Me)CH2OH、-CH(Me)CH2SH、-CH(Me)CH2NH2、
组合-A-Q的优选实施方案包括-CH2OH、-CH(Me)OH、-NH-CH2-CHOH-CH2OH、-NH-CH2-CH2OH和-NH-CHMe-CH2OH。具体地，-A-Q可以选自
其中[CO]表示-A-Q连接至通式中的羰基的点。
29.实施方案14的化合物，选自表1中的化合物及其药学上可接受的盐。
30.药物组合物，包含实施方案15-29任一项的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体。
31.组合，包含治疗有效量的实施方案14-15之一的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种具有治疗活性的共活性剂(co-agents)。
32.治疗细胞增殖性障碍的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案1-13任一项的免疫缀合物或实施方案14-15的任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
33.实施方案14-15的任一项的化合物或实施方案1-13任一项的免疫缀合物或其药学上可接受的盐，用作药剂。
34.实施方案33的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述药剂用于治疗癌症。
在一些实施方案中，所述癌症选自胃肿瘤、骨髓瘤、结肠肿瘤、鼻咽肿瘤、食管肿瘤和前列腺肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其是非霍奇金淋巴瘤)、膀胱癌、肾癌、胃癌(例如胃肠道间质肿瘤(GIST))、肝癌和胰腺癌和肉瘤。
35.实施方案1-13任一项的免疫缀合物或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症。
36.实施方案1的免疫缀合物，具有选自如下的式：
其中RN各自独立地是H或CH2CH2-R30，其中R30是羟基、氨基或羧基，且RN优选是H；
其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基。
且还任选
具体实例包括这些：
且还任选地包括
37.实施方案1-14任一项的免疫缀合物或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症。
38.免疫缀合物Ab-L＊-X，包含连接至抗体(Ab)的有效负荷(X)，其中连接基L＊包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-的基团，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22是极性基团，其选自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23和-SO2R23，其中k是0-4，且R23各自独立地是H或C1-4烷基。优选地，X是Eg5抑制剂，包括实施方案14-29任一项的化合物。
39.式(I)的免疫缀合物：
其中Ab表示抗原结合部分；
L表示使X连接至Ab的连接基；
m是1-4的整数；
n是1-16的整数；且
X每次出现时独立地表示Eg5抑制剂。
在许多实施方案中，X是实施方案14-29任一项的化合物。
在这些实施方案的一些中，X是如下这种通式的化合物：
其中R4a是H、F或OH；
R4b是H或F；
R1选自
Y4选自
且Q4选自
其中连接基L连接至Y4、Q4或R1上的X。
这些实施方案优选的连接基L包括，其中[Ab]表示连接至抗体的点：
或L是当Q4是
在最后的位置上，
合并成这种基团-Q4-L：
40.实施方案39的免疫缀合物，其中X是选自表1的化合物。
41.实施方案39或40的免疫缀合物，其中m是1，且通过使Ab与选自表2的化合物反应形成所述免疫缀合物。
42.免疫缀合物，通过使包含至少一个游离巯基的抗体与选自如下组的马来酰亚胺化合物反应制备：
在这些免疫缀合物的一些实施方案中，所述抗体选自抗-雌激素受体抗体、抗-孕激素受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2抗体、抗-cKit抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙黏着糖蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白质抗体、抗-ras癌蛋白质抗体、抗-LewisX抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑色素小体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
这些免疫缀合物可以具有的药物与抗体之比(DAR)为1-8，典型地为2-6，且优选3-5。
44.实施方案1-14或38-43任一项的免疫缀合物，其中抗原结合部分是抗体或其抗原结合片段，其具有导入恒定区的至少一个非天然半胱氨酸残基，其中连接基L连接至非天然半胱氨酸残基。
45.权利要求44的免疫缀合物，其中m是1，且n是1-5，优选约2或约4。
46.实施方案44的免疫缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在其恒定区上包含两种或多种氨基酸被非天然半胱氨酸取代的组合。
47.实施方案46的免疫缀合物，其中所述非天然半胱氨酸取代选自抗体重链的360位和抗体κ轻链的107位，其中所述位置根据EU体系编号。
48.实施方案46的免疫缀合物，其中所述非天然半胱氨酸选自抗体重链的152和375位，其中所述位置根据EU体系编号。
在上述枚举的实施方案中，Ab可以是任意的抗原结合部分，另有定义的除外，且优选是识别细胞表面标记例如本文所述为靶细胞例如癌细胞特征的那些的抗体或抗原结合片段。肿瘤相关抗原是特别稳定的。
在枚举的实施方案中，X可以是任意式(II)或(III)的化合物，特别是上述实施方案1-11或实施方案14-15中公开的任意化合物，且包括表1中的任意种类。实施方案36的优选实施方式中，X选自：
其中[L]表示X连接至实施方案36中所示的连接基的原子。
在另外的实施方案中，X具有下式：
除非另有描述，否则上述实施方案任一项中的Ab可以是任意的抗原结合部分，其典型地识别待药物干预所靶向细胞例如癌细胞的特征抗原。许多适合的抗原是本领域众所周知的；特别关注的具体那些如本文所述。典型地，Ab是可以分离或构建且可以是天然或修饰的(改造的)抗体或保留与该抗体类似的抗原结合活性的抗体片段。
上述实施方案中的L可以是使Ab连接至一个或多个X基团的任意连接基，包括使Ab直接连接至式(II)化合物的原子的单键。用于ADCs的适合的连接基是本领域众所周知的，且可以用于本发明的缀合物。L可以在Ab上任意适合的可利用位置连接至Ab：典型地，L连接至可利用的氨基氮原子(即伯胺或仲胺，而不是酰胺)或羟基氧原子或例如半胱氨酸上的可利用的巯基。
在式(I)的这些实施方案的一些中，m是1或2，且m优选是1。
在式(I)的这些实施方案的一些中，n是1-10，通常是1-8或1-6，且优选n是1、2、3、4或5。
在式(II)、IIA、IIB和III化合物的一些实施方案中，R1是或包含3-6元环烷基环或4-6元杂环基，且可以如各种枚举的实施方案中所述被取代。一些实施方案中，R1是未被取代的5-6元杂环基。在其它实施方案中，R1是被胺或羟基取代的5-6元杂环基，所述胺或羟基的任一个任选地是连接基的连接点。
在任意上述实施方案中，L可以由至多6个如本文进一步描述的连接基成分L1、L2、L3、L4、L5和L6组成。因此，例如，式(I)的免疫缀合物可以具有式(IA)：
其中Ab表示抗原结合部分；
L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地表示连接基成分；
n是1-16的整数；且
X表示Eg5抑制剂，例如如本文所述的式(II)或式(III)的化合物。
这些免疫缀合物可等同地如下所述，表示连接基成分L6连接至式(II)的化合物：
其中Ab表示抗原结合部分；
L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地表示连接基成分；
n是1-16的整数；且
Ar1、Ar2、R1、R2、T、Y、A、Q和Z如对本文式(II)或式(III)所定义。该式中的L6连接至所示的化学结构：-L6-可以被视为式(II)或(III)的基团的取代基。在一些实施方案中，L6连接至Q、Y或R1的原子，通常位于Q、Y或R1的氧原子或其取代基之一。
在这些实施方案中，连接基成分各自可以任选地是连接连接基成分侧面上的基团的键，因此，在一些实施方案中，式(IA)的化合物包括0、1、2、3、4、5或6个使Ab连接至X的连接基成分L1、L2、L3、L4、L5和L6。
用于形成连接基L的适合的连接基成分是本领域公知的，如用于构建连接基L的方法。这些成分包括常用于使基团连接至氨基酸的基团；间隔基，例如亚烷基和环氧乙烷寡聚体、氨基酸和长度至多约4个氨基酸的短肽类；价键；和羰基、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、酯和酰胺连接等。
在这些缀合物的一些实施方案中，L1选自反应官能团与常用于缀合的氨基酸侧链之一反应时形成的基团，例如半胱氨酸的巯基或赖氨酸的游离-NH2或改造成抗体的Pcl或Pyl基团。参见例如Ou等人，PNAS108(26)，10437-42(2011)。适合的-L1-基团包括、但不限于单键、
特别是用于连接至Ab的半胱氨酸残基；和
特别是用于连接至Ab的赖氨酸残基的-NH2，其中p各自是1-10，且R各自独立地是H或C1-4烷基(优选甲基)；和
其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基，其用于连接至Pcl或Pyl基团，其中所示的酰基连接至改造的抗体中的Pcl或Pyl的赖氨酸部分。
用于连接基成分L2、L3、L4和L5的适合的选择包括例如亚烷基-(CH2)n-(其中n典型地是1-10或1-6)、乙二醇单元(-CH2CH2O-)n(其中n是1-20，典型地是1-10或1-6)、-O-、-S-、羰基(-C(＝O)-)、酰胺类-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-、酰胺类或包含-C(＝O)-NR21-或-NR21-C(＝O)-的氨基甲酸酯类，其中R21是被如本文所述的极性取代基取代的烷基；酯类-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-；具有两个可利用的连接点的环系，例如二价环，选自苯基(包括1，2-1，3-和1，4-二-取代的苯基)、C5-6杂芳基、C3-8环烷基，包括1，1-二取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基，和1，4-二取代的环己基，和C4-8杂环基环，和如下所示的具体实例；氨基酸-NH-CHR＊-C＝O-或-C(＝O)-CHR＊-NH-，或衍生自氨基酸、连接至具有式[N]-CHR＊-C(＝O)-的相邻结构(例如马来酰亚胺氮)的N的基团，其中R＊是已知氨基酸的侧链(通常是典型氨基酸之一，例如trp、ala、asp、Lys、gly等，但也包括例如正缬氨酸、正亮氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸、苯基甘氨酸、瓜氨酸和其它通常命名的α-氨基酸)、已知氨基酸的多肽类(例如二肽类、三肽类、四肽类等)、巯基-马来酰亚胺连接基(来自-SH添加至马来酰亚胺上)、-S-CR2-和其它巯基醚类，例如-S-CR2-C(＝O)-或-C(＝O)-CR2-S-，其中R在每次出现时独立地是H或C1-4烷基、-CH2-C(＝O)-和二硫化物(-S-S-)以及任意这些与下述其它连接基成分的组合：例如价键、非酶裂解的连接基、不能裂解的连接基、酶促可裂解的连接基、耐光的连接基、光可裂解的连接基或包含自我降解的(self-immolative)间隔基的连接基。
在一些实施方案中，连接基成分L1、L2、L3、L4、L5和L6各自选自价键、-(CH2)q-、-(CR2)q-、-(CH2CH2O)q-、-(CH2)q-NR-(CH2)q-、-(CH2)q-O-(CH2)q-、-NH-CHR＊-C(＝O)-、-C(＝O)-CHR＊-NR-、-CHR＊-C(＝O)-、-C(＝O)NR-、-NRC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRC(＝O)O-、-OC(＝O)NR-、-(CH2)qS(CH2)q-、
其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基，
其中q各自是0-10，优选0-6或1-6；
R、R5和R6各自独立地是H或C1-4烷基，
R＊是常见氨基酸例如gly、ala、trp、tyr、phe、Leu、ile、val、asp、glu、gln、asn、his、arg、Lys、cys、met、ser、thr、苯丙氨酸、叔丁基甘氨酸的侧链；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
且L1-L6的任意一个或全部可以不存在，即任意或全部的它们可以表示它们所连接的两个基团之间的价键。
在一些实施方案中，连接基L包含式-C(O)-NR21-或-NR21-C(O)-或-O-C(＝O)-NR21-、-NR21-C(＝O)-O-的至少一种连接基成分，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22是极性基团，例如-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23或-SO2R23，其中k是0-4，且R23各自独立地是H或C1-4烷基。已经发现，这种部分在使抗体连接至有效负荷的连接基中的应用减少了缀合物的聚集，且由此改善了免疫缀合物的溶解度和效能。在优选的实施方案中，R22是-(CH2)2-OH或-(CH2)2-COOH。
用于连接基成分L6的特别适合的选择包括如本文解释的共价键、羰基[-C(＝O)-]、
其中G是酶可裂解的基团，例如葡糖醛酸酯，q各自是1-10，Z是极性基团，例如-COOH或-SO3H，且R各自独立地是H或C1-4烷基(优选H或甲基)。
在另一个方面，本发明提供免疫缀合物Ab-L＊-X，其包含连接至抗体(Ab)的有效负荷(X)，其中连接基L＊包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-的基团，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22是极性基团，其选自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23和-SO2R23，其中k是0-4，且R23各自独立地是H或C1-4烷基。所述有效负荷可以是任意适合的有效负荷，例如细胞毒素，如美登素、阿里他汀(auristatin)、鹅膏毒素(amatoxin)或鹅膏蕈碱(amanitin)或其它已知的对ADC具有治疗用途的有效负荷。在这些免疫缀合物的一些实施方案中，X是Eg5抑制剂，例如如本文所述的那些。
式I的实施方案中的X可以是任意的Eg5抑制剂，但优选是如上所述的式II化合物或枚举实施方案中所述的该式的任意子类，例如如上所述的式(III)的化合物。在一些实施方案中，X是选自表1的化合物。尽管式(II)和(III)描述“中性”化合物，但是应当理解在缀合物的上下文中，X包含共价连接至L或直接连接至Ab的一个原子。
除非另有提供，否则X通过任意可利用的位置连接至上述式中的连接基。在一些实施方案中，X通过式(II)或式(III)中Q表示的基团或Y表示的基团或R1表示的基团的原子之一连接至连接基。
类似地，Ab可以是任意的抗原结合部分，包括本文所述的那些。优选地，Ab是可以被修饰的抗体；例如，除本发明的至少一种Eg5抑制剂外，Ab还可以具有另外连接的有效负荷。在其中Ab连接至琥珀酰亚胺环或连接基L的-CH2-或-S-的实施方案中，它典型地通过Ab的半胱氨酸的硫原子连接；在其中Ab在连接基羰基上连接至连接基的实施方案中，它典型地通过Ab中的氮原子、例如赖氨酸的胺连接。
本发明关注任意小分子Eg5抑制剂作为免疫缀合物的细胞毒性有效负荷的用途。使用式(II)的Eg5抑制剂示例，但不限于这些抑制剂，且已经证实与其它类型的Eg5抑制剂共同起作用。在优选的实施方案中，Eg5抑制剂是式(II)或(III)的化合物，特别是表1中的任意化合物。
应当理解，式(II)或(III)的化合物当是免疫缀合物的组成部分时共价连接至连接基L(或连接至作为L的组成部分的连接基成分)或Ab自身。因此，在本发明的免疫缀合物中，式(II)或(III)的化合物具有开放的化合价，由此它们共价连接至L(或直接连接至Ab)，优选充分地足以在体内递送至抑制或消除所靶向的细胞。典型地，Eg5抑制剂与Ab之间的连接包括抗原结合部分Ab与Eg5抑制剂的共价连接，该连接通常通过包含一个或多个连接基成分的连接基，例如本文所述的那些。
在应用中，在ADC达到和结合靶细胞上的抗原之前或更典型地在其之后，Eg5抑制剂从Ab中释放：优选地，Eg5抑制剂主要在ADC结合表面抗原、然后被摄入靶细胞后在靶细胞内释放。在一些实施方案中，连接基L被设计成可裂解的，且在摄入后Eg5抑制剂从ADC中脱离。
在一些实施方案中，不将连接基设计成可裂解的，且在抗原结合基团(例如抗体)在体内降解时释放Eg5抑制剂产物。典型地，Ab降解发生在靶细胞内部，如通过蛋白酶消化。在这些实施方案中，连接基L的至少部分可以保持连接至Eg5抑制剂X，条件是保留在X上的连接基L的部分不干扰用于抑制Eg5的抑制剂X的亚微摩尔亲和力。
用于ADCs的各种连接基是已知的(参见例如Lash，Antibody-DrugConjugates：theNextGenerationofMovingParts，Start-Up，2011年12月，1-6)且可以用于本发明范围内的缀合物中。连接基可以是Eg5抑制剂的原子与抗体原子之间的单一共价键；例如，Q可以是烷基，例如甲基，且A在式(II)中可以不存在，提供如下这种通式的Eg5抑制剂：
为了使这种抑制剂连接至抗原结合部分，可以将其转化成下式的修饰的Eg5抑制剂，其具有碘化物(I)作为反应官能团：
这种碘化物化合物即α-卤代乙酰胺，可以直接与抗体上的游离巯基反应，得到如下这种通式的免疫缀合物：
其中S是抗体的半胱氨酸残基的硫原子，且式(I)中的连接基L表示CH2与S之间的共价键。
在式(I)的缀合物的其它实施方案中，L可以由2、3、4、5、6或6个以上连接基成分例如L1、L2、L3、L4、L5和L6组成。包含多个连接基成分的许多连接基是本领域公知的，且不同的连接基成分可以选择并且合并得到本发明的可操作的免疫缀合物。在一些实施方案中，所述免疫缀合物具有式(IA)：
其中Ab表示抗原结合部分；
L1、L2、L3、L4、L5和L6表示连接基成分；
n是1-16的整数；且
X表示Eg5抑制剂，例如如本文所述的式(II)或式(III)的化合物。
在这类化合物中，L1典型地选自反应官能团与常用于缀合的氨基酸侧链之一、例如抗体上半胱氨酸的巯基或赖氨酸的游离-NH2或改造成抗体的Pcl或Pyl基团反应时形成的基团。参见例如Ou等人，PNAS108(26)，10437-42(2011)。适合的-L1-基团包括、但不限于如上所述的单键、
其特别地用于连接至Ab的半胱氨酸残基；和
其特别地用于连接至Ab的赖氨酸残基，其中n各自是1-10，且R各自独立地是H或C1-4烷基(优选甲基)。
连接基成分L2、L3、L4和L5的适合的选择包括例如除价键外，还有亚烷基-(CH2)n-(其中n典型地是1-10或1-6)、乙二醇单元(-CH2CH2O-)n(其中n典型地是1-10或1-6)、-O-、-S-、羰基(-C(＝O)-)、酰胺类-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-、酯类-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-、具有两个可利用的连接点的环例如二价苯基、C5-6杂芳基、C3-8环烷基或C4-8杂环基、氨基酸-NH-CHR＊-C＝O-或-C(＝O)-CHR＊-NH-，或衍生自氨基酸、连接至N(例如马来酰亚胺氮)的基团，其具有式[N]-CHR＊-C(＝O)-，其中R＊是已知氨基酸(通常是典型氨基酸之一，但也包括例如正缬氨酸、正亮氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸、苯基甘氨酸、瓜氨酸和其它命名的α-氨基酸)的侧链、已知氨基酸的多肽类(例如二肽类、三肽类、四肽类等)、巯基-马来酰亚胺连接基(从-SH添加到马来酰亚胺上)、-S-CR2-和其它巯基醚，例如-S-CR2-C(＝O)-或-C(＝O)-CR2-S-，其中R在每次出现时独立地是H或C1-4烷基、-CH2-C(＝O)-和二硫化物(-S-S-)，以及任意的这些与其它下述连接基成分的组合：例如价键、非酶促裂解的连接基、不能连接的连接基或酶促可裂解的连接基、耐光的连接基、光可裂解的连接基或自我降解的间隔基。
在一些实施方案中，连接基成分各自选自任一侧面上的基团之间的价键(即连接基成分有效地不存在，使得位于其侧面的基团彼此连接)、-(CH2)q-、-(CH2CH2O)q-、-(CH2)q-NR-(CH2)q-、-NH-CHR＊-C(＝O)-、-CHR＊-C(＝O)-、-C(＝O)-CHR＊-NH-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-(CH2)qS(CH2)q-
其中q各自是0-10，优选0-6或1-6；
R、R5和R6各自独立地是H或C1-4烷基，
R7独立地是选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
且R＊各自表示氨基酸侧链，所述氨基酸可以是由遗传密码编码的氨基酸之一；或α-氨基酸类似物，例如瓜氨酸、叔丁基甘氨酸、苯丙氨酸、高丝氨酸等；且任意或所有这些氨基酸可以不存在，即它们可以表示所连接的两个基团之间的价键。
连接基成分L6的优先选择包括共价键、羰基[-C(＝O)-]、
其中G是酶可裂解的基团，例如葡糖醛酸酯，n各自是1-10，且R各自独是H或C1-4烷基(优选甲基)。
本发明的另一个方面提供减少ADC聚集且由此改善ADC功能和特性的连接基。众所周知，ADCs聚集可以对其活性有害，且聚集依赖于有效负荷和连接基的特性。一些亲水性连接基已经用于减少聚集。实施例4示例了减少聚集的新的连接基(例如ADC-111和ADC-112中的连接基)。这些新的连接基包含连接基成分，其为式-C(O)-NR21-或-NR21-C(O)-或-O-C(＝O)-NR21-或-NR21-C(＝O)-O-的N-取代的酰胺或氨基甲酸酯，其中R21是被极性基团取代的烷基，所述极性基团例如羟基、氨基、一-或二-烷基胺、甲酸酯、羧酰胺或烷基磺酰基。正如实施例4中的数据和图10(A)-10(C)证实，在简单连接基的酰胺上添加极性基团减少了ADC聚集，否则显示如大小排阻色谱法所测定的显著聚集。因此，本发明包括式Ab-L＊-X的ADCs，其中Ab是抗体，例如本文所述的那些，X是有效负荷，例如细胞毒素或Eg5抑制剂，例如本文所述的任意Eg5抑制剂，且L＊是包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-的酰胺或式-O-C(＝O)-NR21-或-NR21-C(＝O)-O的氨基甲酸酯的连接基，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22是选自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23和-SO2R23的极性基团，其中k是0-4，且R23各自独立地是H或C1-4烷基。连接基的优选实施方案包含这样的实施方案，其中R21具有式-(CH2)1-2R23；R23的优选实施方案包括羟基和羧基。
同样，许多与癌细胞相关的抗原是已知的且结合这些抗原的抗体可以用于本发明范围内的免疫缀合物。例如，尽管Lash中报道的临床候选物ADCs仅使用4种类型的有效负荷，但是它们包括至少15种与不同靶细胞相关的抗原。本发明的免疫缀合物的有代表性的实例如本文所述，但实例不限制本发明或权利要求的范围。
本文所述的所有方法均可以按照任意适合的顺序进行，除非本文另有指示或上下文中另外有明显相反的描述。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(如“例如”)仅预以更好地示例本发明，但不对另外请求保护的本发明的范围做出限定。
本发明的各种枚举的实施方案如本文所述。认为各实施方案中指定的特征可以与其它指定的特征组合，得到本发明另外的实施方案。
根据本发明的药学上可接受的溶剂合物包括这样的溶剂合物，结晶溶剂可以是同位素取代的，例如D2O、d6-丙酮、d6-DMSO以及具有非富集溶剂的溶剂合物。
本发明化合物，即含有能够充当氢键的供体和/或受体的基团的式(I)化合物，能够与适合的共晶体形成剂(co-crystalformer)形成共晶体。这些共晶体可由式(I)化合物、通过已知的共晶体形成方法制备。此类方法包括研磨、加热、共升华、共熔化或在结晶条件下在溶液中使式(I)化合物与共晶体形成剂接触以及分离由此形成的共晶体。适合的共晶体形成剂包括描述于WO2004/078163中的那些。因此，本发明进一步提供了包含式(I)化合物的共晶。
本发明化合物的任何不对称原子(例如碳等)可以以外消旋或对映体富集例如(R)-、(S)-或(R，S)-构型存在。在一些实施方案中，每个不对称原子在(R)-或(S)-构型中具有至少50％对映体过量、至少60％对映体过量、至少70％对映体过量、至少80％对映体过量、至少90％对映体过量、至少95％对映体过量、或至少99％对映体过量；即对于旋光化合物，通常优选使用一种对映体，基本上排除另一种对映体。具有不饱和键的原子上的取代基可以，如有可能，以顺式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。
因此，如本文所用，本发明化合物可以呈可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体或其混合物之一的形式，例如作为基本上纯的几何(顺式或反式)异构体、非对映体、旋光异构体(对映体)、外消旋体或其混合物。本文所用的“基本上纯”或“基本上不含其它异构体”是指相对于优选的异构体的量、包含按重量计低于5％且优选低于2％的其它异构体的产物。
可以基于成分的物化差异将任意得到的异构体混合物分离成纯的或基本上纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋体，例如，通过色谱法和/或分级结晶。
任何所产生的终产物或中间体的外消旋体可通过已知方法例如通过分离用旋光性酸或碱获得的其对映体盐并且释放该旋光性酸或碱化合物而拆分成旋光对映体。特别是，碱性部分由此可用于将本发明化合物拆分成它们的旋光对映体，例如通过对与旋光性酸如酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二乙酰基酒石酸、二-O，O′-对甲苯酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸形成的盐进行分级结晶来拆分。外消旋产体也可通过手性色谱法例如高压液相色谱法(HPLC)、使用手性吸附剂来拆分。
此外，本发明的化合物、包括其盐还可以以其水合物的形式得到，或包括用于其结晶的其它溶剂。本发明的化合物可以内在地或通过设计与药学上可接受的溶剂(包括水)形成溶剂合物；因此，预期本发明包括溶剂化和非溶剂化形式。术语“溶剂合物”是指本发明化合物(包括其药学上可接受的盐)与一种或多种溶剂分子的分子配合物。这类溶剂分子是常用于制药领域的那些，已知它们对接受者无害，例如水、乙醇等。术语“水合物”是指配合物，其中溶剂分子是水。
本发明的化合物、包括其盐、水合物和溶剂合物可以内在地或通过设计形成多晶型物。
Eg5抑制剂
本发明的ADCs可以包括任意适合的Eg5抑制剂，尤其是具有1000Da以下、优选700Da以下分子量的抑制剂。在一些实施方案中，Eg5抑制剂具有低于1微摩尔的IC-50；在优选的实施方案中，用作有效负荷的Eg5抑制剂具有低于100纳摩尔(nM)的IC-50。可以如WO2006/002236中所述测定用于该目的的IC50。适合的Eg5抑制剂包括Rath(Rath和Kozielski，NatureRev.Cancer，第12卷，527-39(2012)中公开的化合物，包括伊匹尼塞(ispinesib)、SB-743921、AZD4877、ARQ621、ARRY-520、LY2523355、MK-0731、EMD534085和GSK-923295和WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388和WO2006/049835中所述的Eg5抑制剂：优选的有效负荷是本文所述的式(II)和(III)的化合物。
用作ADC有效负荷的式(II)或(III)的Eg5抑制剂可以连接至该抑制剂上不同位置上的连接基L(或直接连接至Ab)；在一些实施方案中，式(II)的化合物通过基团Q或Y或R1的原子连接至L。式(II)化合物上的任意可利用的化合价可以连接至L，但为便利地制备缀合物或式(IIA)或(IIB)的修饰的Eg5抑制剂，连接至L典型地发生在Q或Y的杂原子(N、O或S)上。在式(I)的缀合物的一些实施方案中，式(II)的化合物包含游离-NH-或游离-OH或游离-SH，其用于使式(II)的化合物连接至链接基L。在一些实施方案中，游离-NH-、-OH或-SH是式(II)中基团Q或Y或R1的部分。注意，游离-NH-可以是氨基(-NH2)、环胺(例如环状基团例如吡咯烷酮、哌啶或吗啉中的-NH-)或仲无环胺；在每种情况中，-NH-基团优选不是酰胺的组成部分或与羰基或芳基或杂芳基环缀合，这可以减少其反应性。
使这类有效负荷连接至连接基用于构建缀合物的方法是本领域公知的。通常，游离伯或仲胺或羟基通过酰化反应、使用连接基成分缀合，所述连接基成分包含活化的酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或磺酸酯-取代的N-羟基琥珀酰亚胺酯，以形成酯或酰胺键。或者，伯胺可以通过形成希夫碱与连接基成分的羰基(典型地是-CH(＝O)或-C(＝O)Me)缀合。如果Eg5抑制剂包含巯基，则所述缀合物可以与连接基成分形成，所述连接基成分包含马来酰亚胺或α-卤代乙酰胺(-NH-C(＝O)-CH2LG，其中LG是Br、Cl或I)；或可以通过形成二硫键与包含巯基的连接基成分或抗原结合部分缀合。
在本发明的一个方面中，提供式(III)的Eg5抑制剂。式III的化合物可以用作小分子治疗剂，或它们可以作为有效负荷被掺入ADC。
或其药学上可接受的盐，其中：
Z是N或CH；
Ar1是任选地被至多3个选自卤素、C1-3烷基和C1-3卤代烷基的基团取代的苯基；
Ar2是苯基或吡啶基，其任选地被至多2个选自卤素、CN、C1-3烷基、羟基、氨基和C1-3卤代烷基的基团取代；
R1是-(CH2)0-2-C4-7杂环基，其中C4-7杂环基包含至多2个选自N、O和S的杂原子作为环成员，且任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷氧基、羟基、氨基、氧代、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、甲基、三氟甲基或COO(C1-4烷基)；任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、氧代或-COO(C1-4烷基)；
R2是H或C1-4烷基；
T是(CH2)1-3；
Y选自C1-2氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基，其中C1-2氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基各自任选地被至多2个基团取代，所述基团选自氨基、氧代、卤素、羟基、C1-4烷氧基、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)和C1-3卤代烷基；
A是NH、N(C1-4烷基)或式(III)中的羰基与Q之间的价键；
Q选自C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6杂环基、-(CH2)0-2-C5-6杂芳基和-(CH2)0-2-苯基，且Q任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、羟基、氨基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR和-NR2，其中R各自是任选地被卤素、-SH、-NH2、OMe或-OH取代的C1-6烷基。
另外的实施方案包括式(III)的化合物，其中或R1是被-OH、-NH2、-COOH、-COO(C1-4烷基)、-CONMe2、CONHMe或-CONH2取代的C3-5烷基；且所有其它特征如上述对式(III)所述。
在这些化合物中，Z可以是CH或N；在许多实施方案中，Z是CH。
在这些化合物中，Ar1可以是如上所述的取代的苯基，典型地是二-取代的苯基，例如二卤代苯基。在优选的实施方案中，Ar1是2，5-二卤代苯基，例如2，5-二氟苯基、2-氯-5-氟苯基或2-氟-5-氯苯基。
在这些化合物中，Ar2可以是如上所述的取代的苯基或吡啶或任选取代的环醚。在许多实施方案中，Ar2是未取代或单-取代的苯基或吡啶。取代的Ar2的适合的取代基包括卤素、羟基和氨基；取代基可以在任意的位置上，例如它可以位于连接至通式中的咪唑/三唑环的Ar2位置的间位上。
在式(III)的化合物的任意这些实施方案中，R2可以是H或C1-4烷基，典型地其为H或Me，优选H。
在式(III)的化合物的任意这些实施方案中，R1可以是如上所述的取代或未取代的杂环；在一些实施方案中，R1是环醚，例如四氢吡喃-4-基、四氢吡喃-3-基、四氢呋喃-3-基或氧杂环丁烷-3-基。有时优选四氢吡喃-4-基：例如，当掺入ADC时，该部分减少了可能在R1是叔丁基时发生的缀合物聚集，由此该部分尤其对ADC目的有利。证实这一优点的数据包括在本文的表7中。
在式(III)化合物的任意这些实施方案中，T可以是亚甲基、亚乙基或亚丙基。在优选的实施方案中，当Y是所述杂环或环烷基之一时，T是亚甲基，且当Y是式(III)范围内的氨基烷基时，T是亚甲基或-CH2CH2-。
在式(III)化合物的任意这些实施方案中，A可以是价键；在其它实施方案中，A优选是-NH-。
在式(III)化合物的任意这些实施方案中，Y可以是如上所述的氨基烷基或杂环基。在一些实施方案中，Y是氨基烷基，例如1-氟-2-氨基-2-乙基或1-氨基-2-乙基或1-甲氧基-2-氨基-2-乙基。在一些实施方案中，Y是吡咯烷环，例如吡咯烷-3-基且可以被F、CH2F、CF3、Me或OH取代。在优选的实施方案中，Y是在4位上被这些基团(F、CH2F、CF3、Me或OH)之一取代的3-吡咯烷基。
在式(III)化合物的任意这些实施方案中，R2可以是H或C1-4烷基；在一些实施方案中，R2是H或甲基，优选H。
用于本发明免疫缀合物的Eg5抑制剂的一些实例包括表1中的任意化合物，例如：
类似地，任意如下的Eg5抑制剂可以用于本发明的免疫缀合物：
在式(II)或(III)的化合物的一些实施方案中，R1是杂环基，例如环醚，例如四氢吡喃基(例如4-四氢吡喃)：式(II)化合物中R1上的杂环基在用作ADC有效负荷时，与具有叔丁基作为R1的缀合物相比减少聚集，因此，这些化合物显示超过已知Eg5抑制剂的优势。
连接基
式(I)中的连接基L可以是使有效负荷化合物X直接连接至Ab的价键(即L或连接基成分各自可以表示使位于其侧面的基团彼此连接的价键)或它可以是包含一个或多个连接基成分L1、L2、L3、L4、L5、L6等的连接部分。一些优选的连接基如本文所述。ADCs的连接基通常包含两个或多个连接基成分，其可以为便利地组装缀合物而选择，或可以选择它们以影响缀合物特性。连接基成分包括在使Ab连接至X时易于形成的化学基团，例如巯基-马来酰亚胺基团、硫醚类、酰胺类和酯类；易于在体内在靶细胞中、靶细胞上或周围发现的条件下易于裂解的基团，例如二硫化物、腙类、二肽类如Val-Cit、取代的苄氧羰基等；定向X于相对于Ab的适合位置上的间隔基，例如苯基、杂芳基、环烷基或杂环基环和亚烷基链；和/或药代动力学增强基团，例如被一个或多个极性基团(羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖)取代的亚烷基，和包含一个或多个替代亚甲基的-NH-或-O-的亚烷基，例如乙二醇醚(-CH2CH2O-)p，其中p是1-10，例如，其可以提高溶解度或减少分子间聚集。
连接基可以是二价的，即它可以仅使一个X基团连接至Ab，或它可以是三价的(能够使两个X基团连接至Ab)，或它可以是多价的。三价、四价和多价连接基可以用于增加抗体上药物的载量，增加药物与抗体之比(DAR)，无需抗体上有用于连接连接基的另外的位点。这类连接基是本领域公知的，参见例如BioconjugateChem.，1999年3月-4月；10(2)：279-88；US6638499；ClinCancerRes，10月15日，200410；7063；WO2012/113847A1。
用于式(I)的免疫缀合物中的连接基可以是可裂解的或不能裂解的。可裂解的连接基例如包含腙、二硫化物、二肽Val-Cit的那些，和包含葡糖醛酸糖苷酶-可裂解的对-氨基苄氧羰基部分的那些，是本领域众所周知的，且可以使用。参见例如Ducry等人，BioconjugateChem.，第21卷，5-13(2010)。对于这些免疫缀合物，连接基基本上在体内是稳定的，直到该免疫缀合物结合或进入细胞，此时，胞内酶或胞内化学条件(pH，还原容量)裂解连接基以游离Eg5抑制剂。
或者，不能裂解的连接基可以用于式(I)的免疫缀合物。不能裂解的连接基不含设计用于在细胞中降解的结构成分，且由此其结构显著可变。参见例如Ducry等人，BioconjugateChem.，第21卷，5-13(2010)。认为这些免疫缀合物进入靶细胞，并且经历对抗体的蛋白水解降解，而不是连接基分解；因此，连接基的至少部分且甚至抗体或抗体片段的一些可以保持连接至Eg5抑制剂。式(IIA)和(IIB)和(IIC)表示具有连接在特定位置上的连接基的活化Eg5抑制剂，其中已经证实，连接基和/或抗体的残留部分不会防止Eg5抑制；因此，当使用不能裂解的连接基时，连接基连接在式(IIA)和(IIB)和(IIC)中的W表示的位置上是优选的。
特别适合的连接基是减少聚集的那些。已经证实本文化合物367和368上的连接基在与本文所述的Eg5抑制剂一起使用时具有减少聚集的作用。因此，本发明还包括式(V)的连接基：
其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22是选自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23和-SO2R23的极性基团，其中k是0-4，且R23各自独立地是H或C1-4烷基；且j是选自1、2、3和4的整数；且免疫缀合物Ab-L＊-X包含连接至抗体(Ab)的有效负荷(X)，其中连接基L＊包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-的基团，也包括在本发明范围内。优选连接基具有式(V)。在式(V)中，[PL]表示有效负荷的连接点，且[Ab]表示与抗体的连接点。该抗体典型地通过半胱氨酸残基的硫原子连接至L＊，所述半胱氨酸残基可以是来自天然抗体序列的半胱氨酸，或通过蛋白质改造导入的半胱氨酸。这些连接基的优选的极性基团包括羟基和羧基，j典型地是2、3或4，且R21通常是-(CH2)2-3-R23。
表1.Eg5抑制剂。
式(IIA)和(IIB)和(IIC)的化合物
式(IIA)和(IIB)和(IIC)的化合物包含连接至反应基团的Eg5抑制剂和使Eg5抑制剂连接至反应基团的任选的一种或多种连接基成分。表2描述了这些化合物的实例，其包含例如表1中所示那些的Eg5抑制剂+反应官能团和任选的一种或多种连接基成分。
表2.与Ab缀合前的有效负荷-连接基组合。
将条目508和509提供为对比例，其中Eg5抑制剂为本领域中已知的，但不在式II的范围内。
抗原-结合部分
式(I)或(IA)的抗原-结合部分可以是选择性地结合靶细胞类型上发现的细胞表面标记物的任意部分。在一些方面，Ab是特异性地结合主要或优先在癌细胞表面上发现的抗原例如肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段(例如抗体的抗原结合片段)。在一些方面，Ab是特异性地结合细胞表面受体蛋白或其它细胞表面分子、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如已知或疑似在功能上促成)的分子、淋巴因子、细胞因子、牵涉细胞周期调节的分子、牵涉血管发生的分子或与血管发生相关(例如已知或疑似在功能上促成)的分子的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。肿瘤相关抗原可以是簇鉴别因子(即CD蛋白)。在本发明的一些方面，本发明的抗原结合部分特异性地结合一种抗原。在本发明的一些方面，本发明的抗原结合部分特异性地结合两种或多种本文所述的抗原，例如，本发明的抗原结合部分是双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。
示例性抗体或抗原结合片段包括、但不限于抗-雌激素受体抗体、抗-孕激素受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2抗体、抗-cKit抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙黏着蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白质抗体、抗-ras癌蛋白质抗体、抗-LewisX抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑色素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
在一个实施方案中，式(I)或(IA)的抗体-药物缀合物(ADC)的抗原结合部分特异性地结合由ErbB基因编码的受体。所述抗原结合部分可以特异性地结合选自EGFR、HER2、HER3和HER4的ErbB受体。所述抗原结合部分可以是特异性地结合胞外HER2受体的细胞外结构域(ECD)并且抑制超表达HER2受体的肿瘤细胞生长的抗体。该抗体可以是单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。人源化抗体可以是huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4，huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7或huMAb4D5-8(曲妥珠单抗)。该抗体可以是抗体片段，例如Fab片段。
本文实施例中所用的抗体具有表3中列出的重链和轻链序列。所述序列与曲妥珠单抗的那些序列相同，且该抗体在本文中称作“曲妥珠单抗”或“TBS”。曲妥珠单抗由此是一种用于式(I)或(IA)的免疫缀合物的适合的抗体。
表3.用于如下实施例中的抗体TBS的序列。
重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO：1)
轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO：2)
式I或IA中的抗原-结合部分包括、但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。这类肿瘤相关抗原是本领域已知的，且可以制备它们以便使用本领域众所周知的方法和信息生成抗体。在尝试发现用于癌症诊断和疗法的有效细胞靶标的过程中，研究人员寻求鉴定跨膜或另外的肿瘤相关多肽类，与在一种或多种正常的非癌细胞上相比，它们特异性地在一种或多种特定癌细胞类型的表面上表达。通常，与在非癌细胞的表面上相比，这类肿瘤相关多肽在癌细胞表面上的表达更为丰富。鉴定这类肿瘤相关细胞表面抗原多肽类产生了特异性地靶向癌细胞的能力，以便通过基于抗体的疗法破坏。
用于本发明免疫缀合物的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)包括修饰的或改造的抗体，例如被修饰为导入半胱氨酸残基或赖氨酸残基替代天然序列的至少一种氨基酸的抗体，由此在抗体或片段上提供反应部位，以便与Eg5抑制剂缀合。类似地，所述抗体或抗体片段可以被修饰以掺入Pcl或吡咯赖氨酸(Noren等人，(1989)Science14；244(4901)：182-188；Mendel等人，(1995)AnnuRevBiophysBiomolStruct.24：435-462)作为与Eg5抑制剂缀合的位点。用于使这类抗体与有效负荷或连接基-有效负荷组合缀合的方法是本领域公知的。
用于本发明的抗原-结合部分(例如抗体和抗原结合片段)还可以具有其它修饰或与其它部分缀合，例如、但不限于聚乙二醇标记、白蛋白和其它融合多肽。
抗体的生产
本发明的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)可以通过本领域公知的任意方式生产，包括、但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶消化，从而可以通过例如杂交瘤或重组生产得到全长单克隆抗体。重组表达可以由本领域公知的任意适合的宿主细胞进行，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本发明还提供编码本文所述抗体的多核苷酸，例如编码重链或轻链可变区或包含如本文所述的互补决定区的片段的多核苷酸。
可以通过全新固相DNA合成或编码抗体或通过编码抗体或其结合片段的现存序列(例如如下文实施例中所述的序列)的PCR诱变来生产多核苷酸序列。可以通过本领域公知的方法进行核酸的直接化学合成，例如Narang等人，Meth.Enzymol.68：90，1979的磷酸三酯方法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109，1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra.Lett.，22：1859，1981的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利US4,458,066的固相支持物方法。通过PCR在多核酸序列上导入突变可以如下列文献中所述进行：例如，PCRTechnology：PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification，H.A.Erlich(Ed.)，FreemanPress，NY，NY，1992；PCRPROTOCOLS：AGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS，Innis等人(Ed.)，AcademicPress，SanDiego，CA，1990；Mattila等人，NucleicAcids Res.19：967，1991；和Eckert等人，PCRMethodsandApplications1：17，1991。
本发明中还提供用于生产上述抗体或抗体片段的表达载体和宿主细胞。各种表达载体可以用于表达编码本发明抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的和非病毒表达载体可以用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人类人工染色体(参见例如Harrington等人，NatGenet15：345，1997)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达多核苷酸和多肽类的非病毒载体包括pThioHisA，B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHisA，B&C(Invitrogen，SanDiego，CA)、MPSV载体和本领域已知用于表达其它蛋白的大量其它载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头瘤病毒、HBPEB病毒的载体、痘苗病毒载体和西门利克森林病毒(SFV)。参见，Smith，Annu.Rev.Microbiol.49：807，1995；和Rosenfeld等人，Cell68：143，1992。
表达载体的选择取决于载体待表达的预期的宿主细胞。典型地，表达载体包含启动子和其它调节序列(例如增强子)，它们可操作地与编码本发明抗体链或片段的多核苷酸连接。在一些实施方案中，诱导型启动子用于防止插入的序列的表达，除外在诱导条件下。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、LacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化的生物体培养物可以在非诱导条件下扩展，不会偏移用于编码序列的群体，其表达产物更好地被宿主细胞所耐受。除启动子外，其它调节元件对于有效地表达本发明的抗体链或片段也可能是需要的或期望的。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻核糖体结合位点或其它序列。此外，表达效率可以通过包含适合于应用中的细胞系统的增强子得以提高(参见例如Scharf等人，ResultsProbl.CellDiffer.20：125，1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.，153：516，1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以便与由插入的抗体序列编码的多肽类形成融合蛋白。更常见地，插入的抗体序列与信号序列连接，然后包含在载体中。用于接受编码抗体轻链和重链可变区的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这类载体允许表达作为带有恒定区的融合蛋白的可变区，由此导致完整抗体或其片段产生。典型地，这类恒定区是人类的。
用于荷载和表达本发明抗体链的宿主细胞可以是原核宿主细胞或真核宿主细胞。大肠杆菌(E.coli)是一种可用于克隆和表达本发明多核苷酸的原核宿主。适用的其它微生物宿主包括杆菌(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如沙门菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)；和各种假单胞菌属(Pseudomonas)的种类。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其典型地包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，任意数量的各种众所周知的启动子可以存在，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地控制表达，任选地与操纵子序列一起控制表达，且具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其它微生物例如酵母也可以用于表达本发明的抗体或抗体片段。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在一个方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗体和抗体片段。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如如实施例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或荷载外源性表达载体的哺乳动物细胞系。它们包括任意正常死亡或正常或异常无限增殖动物或人细胞。例如，已经研发了能够分泌完整免疫球蛋白的大量适合的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞和杂交瘤。表达多肽类的哺乳动物组织细胞培养物的应用一般在如下文献中讨论：例如Winnacker，FROMGENESTOCLONES，VCHPublishers，N.Y.，N.Y.，1987。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列例如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68，1986)和必需的加工信息位点例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常包含来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。适合的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括、但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松-诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRPpolIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素-诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域中公知的启动子-增强子组合。
用于导入包含所关注的多核苷酸序列的表达载体的方法可以根据细胞宿主类型的不同而改变。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其它细胞宿主(一般参见Sambrook等人，上文)。其它方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和微注射、冲击方法、病毒体、免疫脂质体、多聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人造病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O′Hare，Cell88：223，1997)、试剂增强的DNA摄入和离体转导。为了长期高收率生产重组蛋白，通常期望稳定的表达。例如，可以使用本发明包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因的表达载体来制备稳定表达抗体链或结合片段的细胞系。在导入所述载体后，允许细胞在富集的培养基中生长1-2天，然后将它们转变成选择培养基。可选择标记物的目的在于赋予筛选抗性，且其存在能够使得在选择培养基中成功表达所导入序列的细胞生长。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术使抗性的稳定转染的细胞增殖。
免疫缀合物
本发明提供免疫缀合物，其包含连接至抗原-结合部分例如抗体或抗体片段的Eg5抑制剂。本发明优选的免疫缀合物是如本文所述的式(I)或(IA)的那些。用于制备这类免疫缀合物的方法是本领域众所周知的。优选的免疫缀合物包括表5和6中公开的那些及其变化形式，其具有另一种抗原结合部分而不是曲妥珠单抗，特别地，其中曲妥珠单抗被选自如下清单的抗体替代的这类缀合物：抗-雌激素受体抗体、抗-孕激素受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2抗体、抗-cKit抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙黏着蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-p-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白质抗体、抗-ras癌蛋白质抗体、抗-LewisX抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑色素小体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含具有抗原-结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接基L在Ab的半胱氨酸硫原子上连接至Ab：
其中L和X如对式(I)所定义，且R’和R”是Ab中与半胱氨酸相邻的氨基酸侧链。在这些实施方案中，-S-L-通常包含巯基-马来酰亚胺连接基，且L任选地包含另外的连接基成分。在其它实施方案中，所述缀合物通过包含-S-CH2-C(＝O)-NH-L2-L3-L4-L5-L6-的连接基连接至X，其中连接基成分L2、L3、L4、L5和L6如对式(IA)所定义。通过使具有α-卤代乙酰胺或马来酰亚胺的化合物与抗原结合部分(抗体)中的半胱氨酸残基的硫原子反应形成这些缀合物的方法是本领域众所周知的。
优选的免疫缀合物包括包含下表(表5和6)中与抗体(AntiB)缀合的任意有效负荷化合物的免疫缀合物，其中该缀合物具有表中所示的结构，其中AntiB-S-表示抗体通过抗体半胱氨酸残基的硫原子(结构中的S)与马来酰亚胺键合。在优选的实施方案中，所述抗体(AntiB)是识别癌细胞上表达的抗原的抗体。适合的抗原如本文所公开，包括抗-雌激素受体抗体、抗-孕激素受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2抗体、抗-cKit抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙黏着糖蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白质抗体、抗-ras癌蛋白质抗体、抗-LewisX抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑色素小体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
使抗体连接至马来酰亚胺化合物的半胱氨酸残基可以天然存在于天然抗体中，或可以通过本领域公知的蛋白质改造方法将其导入抗体。经改造的包含通过蛋白质工程导入的半胱氨酸残基的抗体有时是优选的。特别地，经改造的导入半胱氨酸以替代如下位点的至少一个的抗体特别适用于本发明的免疫缀合物：重链位点K360、E152和S375；和轻链残基K107。特别地，HC-K360C与LC-K107C和HC-E152C与HC-S375C的组合是充分适合的(EU编号)。
应当理解，所述抗体可以包含一种以上有效负荷：在典型的实施方案中，所述缀合物在由2各重链和2个轻链肽组成的抗体上包含2-6、优选3-5种有效负荷化合物(Eg5抑制剂)。
表5：有效负荷/连接基组合和缀合物。AntiB是优选缀合物中的抗体。或者，AntiB表示通过其硫原子连接至缀合物中的琥珀酰亚胺环的半胱氨酸残基。
表6.另外的有效负荷-连接基化合物和缀合物。AntiB是优选免疫缀合物中的抗体。或者，AntiB表示通过其硫原子连接至这些缀合物中的琥珀酰亚胺环的半胱氨酸残基。
另一个方面，本发明提供包含本发明化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。可以为特定施用途经配制药物组合物，例如口服施用、胃肠外施用和直肠施用等。此外，可以将本发明的药物组合物制成固体形式(包括、但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)或液体形式(包括、但不限于溶液、混悬液或乳剂)。可以将药物组合物进行常规的制药操作，例如灭菌和/或该药物组合物可以包含常用的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂以及佐剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂和缓冲剂等。
典型地将本发明的免疫缀合物配制成在水性缓冲液和/或等渗水溶液中的溶液或混悬液。典型地在pH近中性时配制和施用它们，以保护蛋白质成分的稳定性，例如在pH6-8，且可以包括药学上可接受的盐和/或缓冲剂。因为蛋白质成分典型地由细胞产生，所以它们可以包含在细胞中发现的抗衡离子，例如磷酸盐、乙酸盐、钠、钾等，且这类抗衡离子(如果存在)典型地不具体地鉴定或表征。此外，典型地用缓冲溶液例如磷酸缓冲盐水分离和操作它们，且不预期任意存在的抗衡离子影响活性。所述免疫缀合物典型地通过注射或输注经胃肠外施用。其配制和施用方法与其它基于生物制品的药物例如抗体治疗剂的配制和施用的方法类似并且是本领域技术人员公知的。
用作小分子药物的式(III)化合物可以配制并且通过常规途经施用，例如通过口服，典型地通过胃肠外、口含、通过吸入或作为栓剂施用。
适合口服施用的组合物包括片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散的粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂或者糖浆剂或酏剂形式的有效量的本发明化合物。按照本领域已知的制备药物组合物的任意方法来制备用于口服使用的组合物，这类组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的物质，以提供药学上美观和可口的制剂。片剂可含有与适合制备片剂的无毒、可药用的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂是例如：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂是未被包衣的或者通过已知技术对其进行包衣，以延缓胃肠道中的崩解和吸收并由此提供历经较长时间的持久作用。例如，可以采用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服使用的制剂可以被制备成硬明胶胶囊剂，其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者被制备成软明胶胶囊剂，其中活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
某些可注射的组合物是水性等张溶液或混悬液，栓剂可由脂肪乳剂或混悬剂有利地制备。所述组合物可以被灭菌和/或含有佐剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它在治疗上有价值的物质。所述组合物可分别按照常规的混合、制粒或包衣方法制备，并且含有约0.1-75％、优选约1-50％的活性成分。
适合透皮应用的组合物包含有效量的本发明化合物和适合载体。适用于透皮递送的载体包括可吸收的药理学可接受的溶剂，以帮助穿过宿主的皮肤。例如，透皮装置是绷带剂的形式，该绷带剂包含背衬部分、含有化合物和任选的载体的贮库、任选的速率控制屏障(以便历经较长时间以受控和预定的速率递送化合物至宿主皮肤)和固定该装置于皮肤的用具。
适合局部应用、例如应用于皮肤和眼的组合物包括水性溶液剂、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂或可喷雾的制剂，例如用于通过气溶胶等递送的那些制剂。这类局部传递系统将特别适于皮肤应用，例如用于治疗皮肤癌、例如在防晒霜、洗剂、喷雾剂中的预防性应用等。因此，它们特别适用于本领域众所周知的局部制剂，包括化妆品。这类制剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
如本文所用，局部应用也可涉及吸入或鼻内应用。它们可方便地以干粉形式、单独地或作为混合物、例如与乳糖的干掺合物递送，或为混合型组分颗粒、例如与磷脂的颗粒由干粉吸入器递送，或为气雾喷雾呈递形式由加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷射器递送，使用和不使用适宜的推进剂。
本发明还提供了包含作为活性成分的本发明化合物的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进一些化合物的降解。
可以使用无水或含水量低的成分以及低水分或低湿度的条件来制备本发明的无水药物组合物和剂型。可以制备和贮存无水的药物组合物，以便保持其无水的性质。因此，使用已知可阻止与水接触的材料来包装无水组合物，以便它们可以被包含在适宜的制剂药盒中。适宜包装的实例包括但不限于密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如小瓶)、泡罩包装和窄条袋。
本发明还提供了包含一种或多种降低作为活性成分的本发明化合物分解速率的试剂的药物组合物和剂型。这类试剂在本文中称为“稳定剂”，包括但不限于抗氧化剂如抗坏血酸、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。
式I的游离形式或盐形式的化合物(免疫缀合物)显示出有价值的药理学活性：正如本文数据证实，式(II)和(III)的化合物抑制肿瘤细胞生长且由此用于治疗癌症。正如该数据进一步证实，这些化合物可以有利地作为ADC的有效负荷递送。如本文所证实，这类缀合物显示出对体外靶细胞和体内肿瘤的显著活性，正如对代表不同人癌的异种移植物肿瘤的有效生长抑制所证实。因此，包含连接至抗原结合部分例如抗体的式(II)或(III)的有效负荷的本发明的免疫缀合物也用于治疗癌症，例如神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其是非霍奇金淋巴瘤)、膀胱癌、肾癌、胃癌(例如胃肠道间质肿瘤(GIST))、肝癌和胰腺癌和肉瘤。
本发明的化合物和免疫缀合物特别用于治疗本领域公知被对Eg5具有活性的化合物抑制的癌症，和本文所证实的倾向于被本发明化合物和缀合物抑制的那些肿瘤类型。适合的治疗适应征包括、但不限于胃肿瘤、骨髓瘤、结肠肿瘤、鼻咽肿瘤、食管肿瘤和前列腺肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其是非霍奇金淋巴瘤)、膀胱癌、肾癌、胃癌(例如胃肠道间质肿瘤(GIST))、肝癌和胰腺癌和肉瘤。
因此，作为另一个实施方案，本发明提供如本文所述的式(I)或(III)或式(I)和(III)范围内的任意实施方案的化合物在疗法中的用途。在另一个实施方案中，所述疗法用于可以通过抑制Eg5治疗的疾病。在另一个实施方案中，本发明的化合物用于治疗癌症，包括、但不限于乳腺癌、霍金奇淋巴瘤(HL)、非霍金奇淋巴瘤(NHL)、白血病、髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病和多发性骨髓瘤。
所述方法典型地包括对有这种治疗需要的这类受试者施用有效量的如本文所述的化合物或包含这类化合物的药物组合物。可以通过任意适合的方法例如本文所述的那些方法施用所述化合物，且施用可以以由主治医师选择的间隔反复进行。
因此，作为另一个实施方案，本发明提供本文所述的式(I)或(III)的化合物或这类化合物的任意实施方案在制备药剂中的用途。在另一个实施方案中，所述药剂用于治疗可以通过抑制Eg5治疗的疾病。在另一个实施方案中，所述疾病选自胃肿瘤、骨髓瘤、结肠肿瘤、鼻咽肿瘤、食管肿瘤和前列腺肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其是非霍奇金淋巴瘤)、膀胱癌、肾癌、胃癌(例如胃肠道间质肿瘤(GIST))、肝癌和胰腺癌和肉瘤。
对于约50-70kg的受试者，本发明的药物组合物或组合可以是约1-1000mg活性成分或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg的活性成分的单位剂量。化合物、其药物组合物或其组合的治疗有效剂量依赖于受试者的种类、体重、年龄和个体情况、待治疗的障碍或其严重性。内科医师、临床医师或兽医技术人员易于确定预防、治疗或抑制所述障碍或疾病发展所必需的活性成分各自的有效量。
药物组合是指一个剂量单位形式的固定组合或组合施用，其中本发明的化合物及组合伴侣(例如下文解释的另一种药物，也称为“治疗剂或共活性剂(co-agent)”)可同时独立地施用或以时间间隔分别地施用，尤其是这些时间间隔允许组合伴侣显示合作效应，例如协同效应。可以将单一成分包装在药盒中或将其单独包装。成分的一种或两种(例如粉末或液体)可以在施用前重构或稀释成期望的剂量。本文所用的术语“共施用”或“组合施用”等意指包括向需要其的单个受试者(例如患者)施用所选择的组合伴侣，并且意欲包括治疗方案，其中不一定通过相同的施用途径或同时施用这些活性剂。本文所用的术语“药物组合”意指由混合或组合多于一种活性成分而产生的产品并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”意指活性成分、例如本发明的化合物和组合伴侣均以单一实体或剂量的形式同时向患者施用。术语“非固定组合”是指活性成分、例如本发明的化合物和组合伴侣以单独实体同时、并行或在无具体时间限制下相继向患者施用，其中此类施用提供了患者体内的两种化合物的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种活性成分。
上述剂量特性在体外和体内试验中使用有利的哺乳动物可证实，所述哺乳动物例如小鼠、大鼠、狗、猴子或其分离的器官、组织和制品。本发明的化合物在体外可以以溶液形式例如水溶液施用，且在体内通过肠、胃肠外、有利地通过静脉内例如作为混悬液或水溶液形式施用。体外剂量可以在约10-3摩尔-10-9摩尔浓度。体内的治疗有效量可以根据施用途经的不同在约0.1-500mg/kg或约1-100mg/kg的范围。
本发明的化合物可以与一种或多种共活性剂一起同时或在其之前或之后施用。本发明的化合物可以通过相同或不同施用途经单独地施用或在同一药物组合物中作为共活性剂一起施用。
在一个实施方案中，本发明提供一种产品，其包含式(I)的化合物和至少另一种治疗共活性剂，该产品作为组合制剂用于同时、单独或依次用于疗法。在一个实施方案中，所述疗法是治疗由Eg5介导的疾病或病症，例如癌症。提供作为组合制剂的产品，其包括在同一药物组合物中包含式(I)或(III)的化合物和另一种治疗共活性剂的组合物，或单独形式例如药盒形式的式(I)或(III)的化合物和另一种治疗共活性剂。
在一个实施方案中，本发明提供包含式(I)或(III)的化合物和另一种治疗共活性剂的药物组合物。任选地，所述药物组合物可以包含如上所述的药学上可接受的载体。
与本发明化合物和缀合物一起使用的适合的共活性剂包括其它的抗癌药、抗过敏药、抗恶心药(或止吐药)、疼痛缓解剂、抗炎药、细胞保护剂及其组合。
被视为用于与本文公开的化合物和缀合物组合应用的具体共活性剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉立滨环磷酰胺(或阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷阿糖胞苷脂质体注射剂达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素枸橼酸柔红霉素脂质体注射剂地塞米松、多西他赛盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞二磷胆碱)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天门冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌麦罗塔、紫杉醇phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20与卡莫司汀植入物枸橼酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明注射用盐酸拓扑替康长春碱长春新碱和长春瑞滨
一些患者可以在施用过程中或之后经历对本发明化合物和/或其它抗癌药的过敏反应；因此，通常施用抗-过敏药以便将过敏反应的风险降至最低。适合的抗-过敏药包括皮质类固醇，例如地塞米松(例如)、倍氯米松(例如)、氢化可的松(也称作可的松、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松磷酸酯钠并且在商品名下销售、磷酸氢化可的松、Hydrocort和)、泼尼松龙(以商品名和销售)、泼尼松(以商品名Liquid和销售)、甲泼尼龙(也称作6-甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、琥珀酸钠甲基强的松龙，以商品名和销售)；抗组织胺药，例如苯海拉明(例如)、羟嗪和赛庚啶；和支气管扩张药，例如肾上腺素能β激动剂、沙丁胺醇(例如)和特布他林
一些患者可能在施用本发明化合物和/或其它抗癌药过程中和之后经历恶心；因此，止吐药用于预防恶心(上部胃)和呕吐。适合的止吐药包括阿瑞匹坦昂丹司琼格拉司琼HCl劳拉西泮(地塞米松丙氯拉嗪卡索匹坦(和)及其组合。
通常开据缓解治疗期间经历的疼痛的药物的处方以使患者更舒适。通常使用常用的非处方止痛药，例如然而，阿片样物质镇痛药例如氢可酮/扑热息痛或氢可酮/对乙酰氨基酚(例如)、吗啡(例如或)、羟可酮(例如或)、盐酸羟吗啡酮和芬太尼(例如)也用于中度或重度疼痛。
在防止正常细胞经历治疗毒性和限制器官毒性的尝试中，细胞保护剂(例如神经保护剂、自由基清除剂、心脏保护剂、蒽环类抗生素外渗中和剂、营养物等)可以用作辅助疗法。适合的细胞保护剂包括氨磷汀谷氨酰胺、地美司钠美司钠右丙亚胺(或)、扎利罗登和亚叶酸(也称作甲酰四氢叶酸钙、噬橙菌因子(citrovorumfactor)和亚叶酸)。
在一个实施方案中，本发明提供一种药盒，其包含两种或多种药物组合物，其中的至少一种包含式(I)或(III)的化合物。在一个实施方案中，该药盒包含用于单独保留所述组合物的用具，例如容器、分开的瓶子或分开的箔袋。这种药盒的实例是泡罩包，如典型地用于包装片剂、胶囊等。
本发明的药盒可以用于施用不同的剂型，例如口服和胃肠外剂型，用于在不同剂量间隔施用单独的组合物，或用于彼此递增单独组合物的剂量。为了有助于依从性，本发明的药盒典型地包含施用说明书。
在本发明的联合疗法中，可以由相同或不同制造商制备和/或配制本发明的化合物和另一种治疗共活性剂。此外，可以将本发明的化合物与另一种治疗剂一起用于联合疗法：(i)在向临床医师发放组合产品之前(例如在包含本发明的化合物和另一种治疗剂的药盒的情况中)；(ii)在施用前即刻由临床医师自身(或在临床医师的指导下)；(iii)由患者自身，例如在依次施用本发明的化合物和另一种治疗剂的过程中。
因此，本发明提供式(I)或(III)的化合物在治疗由Eg5介导的疾病或病症中的用途，其中制备与另一种治疗剂一起施用的药剂。本发明还提供另一种治疗共活性剂在治疗疾病或病症中的用途，其中将所述药剂与式(I)或(III)的化合物一起施用。
本发明还提供式(I)或(III)的化合物，其用于治疗由Eg5介导的疾病或病症的方法中，其中制备与另一种治疗剂一起施用的式(I)或(III)的化合物。本发明还提供另一种治疗共活性剂，用于治疗由Eg5介导的疾病或病症的方法中，其中制备与式(I)或(III)的化合物一起施用的另一种治疗共活性剂。本发明还提供式(I)或(III)的化合物，用于治疗由Eg5介导的疾病或病症的方法中，其中将式(I)或(III)的化合物与另一种治疗共活性剂一起施用。本发明还提供另一种治疗共活性剂，用于治疗由Eg5介导的疾病或病症的方法中，其中将另一种治疗共活性剂与式(I)或(III)的化合物一起施用。
本发明还提供式(I)或(III)的化合物在治疗由Eg5介导的疾病或病症中的用途，其中预先已经用另一种治疗剂治疗所述患者(例如在24小时内)。本发明还提供另一种治疗剂在治疗由Eg5介导的疾病或病症中的用途，其中预先已经用式(I)或(III)的化合物治疗所述患者(例如在24小时内)。
合成方法
用于合成本发明化合物的所有原料、构件、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂均为商购或可以通过本领域技术人员公知的有机合成方法生产(参见例如Houben-Weyl4thEd.1952，MethodsofOrganicSynthesis，Thieme，第21卷)。此外，本发明的化合物可以通过本领域普通技术人员公知的有机合成方法根据如下实施例生产。
可以根据本领域公知的方法制备许多Eg5抑制剂，即式(II)的化合物，包括WO2007/021794、WO2006/002236、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381和WO2011/128388中公开的方法。
可以类似地使用已知方法与本文所述方法的组合制备式(III)的化合物。合成这些化合物的示例性实例在下列通用方案中提供。
方案1.
该方法从在α-碳上带有THP基团的已知的被保护手性氨基酸开始，与适合的α-卤代苯乙酮形成酯，得到期望的Ar1基团。用乙酸铵处理，得到取代的咪唑，其在咪唑环C-2上的基团上保留了手性。可以用弱碱使咪唑氮烷基化，以引入Ar2CH2-。使氨基甲酸酯脱保护，得到游离胺，可以用适合的伯醇、通过用戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martinperiodinane)(DMP)氧化或类似的氧化和希夫碱形成使其烷基化，然后使用氰基硼氢化物或类似的还原剂还原亚胺。在该方案中，这种步骤引入了吡咯烷环，但式(II)或(III)范围内的其它基团可以类似地被引入，得到对于式(II)或(III)化合物而言具有不同-T-Y基团的其它化合物。可以根据需要使用保护基，以便例如允许不同的R10基团存在于吡咯烷环上或根据需要在Ar1或Ar2上容纳取代。
然后可以用任意适合的酰化基使游离胺酰化，以便使用本领域公知的常规方法引入适合的-A-Q部分。在该方案的示例性实例中，手性乳酸酯衍生物用于引入被保护形式的、具有式(II)和(III)中用于基团A的价键的酰基，和用于基团Q的被保护的羟基烷基。使吡咯烷环氮和Q上的羟基脱保护，得到式(III)的化合物。
用于制备本发明化合物的许多适合的吡咯烷环是本领域公知的，且方案2描述了它们中的一些的合成。已知的3-吡咯啉环被苄酯基(CBZ)或其它适合的保护基保护，且被间-氯过苯甲酸氧化。然后用格氏试剂例如乙烯基格氏试剂在溴化亚铜(I)存在下使环氧化物开放，得到反式-二取代的吡咯烷。该步骤可以用于制备不同的吡咯烷中间体，且其对映体易于分离。例如，可以如方案2中所述使用，以便制备氟化的吡咯烷环。使用氟化试剂例如全氟-1-丁磺酰氟(PBSF)或DAST，羟基可以被F替代，立体化学倒置。然后可以用四氧化锇氧化乙烯基，并且可以通过常规方法例如硼氢化钠还原得到的醛，得到用于方案1的手性吡咯烷。
方案2：吡咯烷中间体的合成
方案3.
方案3示例从来自方案1的中间体开始的化合物的合成，其中A是-NH-。使用在二氯甲烷中的光气，然后导入适合的胺，得到被保护的中间体，且脱保护可以在常规条件例如在甲醇中的披钯碳下使用甲酸铵或氢进行。
方案3A.
方案3A示例合成式(IIA)化合物的方法，该化合物具有反应官能团(在这种情况中是马来酰亚胺)，该反应官能团通过式(II)化合物的酰基即L连接至Q。使用双-(对-硝基苯酚)碳酸酯将所示来自方案2的中间体转化成活化的酰化剂，形成带有对硝基苯氧基离去基的混合的碳酸酯。然后使混合的碳酸酯与适合的胺反应，然后对吡咯烷环氮脱保护，得到式(IIA)的化合物，其中W是马来酰亚胺，其适合于与Ab或连接至Ab的连接基成分上的巯基反应。该实例中的产物可以被视为不能裂解的连接基，因为存在的连接基成分中无一被设计成以快于抗体的降解速率在体内裂解，所述抗体部分将连接在式(I)的ADC中。
方案3B.
方案3B示例了使用方案1的产物制备式(IIB)化合物的方法。在该方法中，使用双(对-硝基苯酚)碳酸酯形成包含马来酰亚胺的连接基前体的混合碳酸酯。然后该混合的碳酸酯用于使Eg5抑制剂的吡咯烷氮酰化，得到上述所示的式(IIB)化合物。在该实例中，式(IIB)中W的反应官能团是马来酰亚胺，且基团W中的连接基成分包括可裂解的连接基(val-cit)，由此这种化合物示例了具有进行组织蛋白酶B导致的裂解的可裂解连接基的缀合物。对-氨基苄氧基氨基甲酸酯连接基成分作为可自我降解的连接基起作用：一旦组织蛋白酶B从对氨基上裂解val-cit二肽，则氨基甲酸苄酯自发地分解以释放Eg5化合物。
本发明还包括本发明方法的任意变化形式，其中在其任意阶段可得到的中间体产物用作原料，且进行其余步骤，或其中原料在反应条件下在原位形成，或其中反应成分以其盐或光学纯材料的形式使用。
下列实施例欲以示例本发明，但不应被视为对本发明起限定作用。温度以摄氏度给出。如果没有另外举出，则所有的蒸发均减压进行，典型地在约15mmHg-100mmHg(＝20-133mbar)。终产物、中间体和原料的结构通过标准分析方法证实，例如微量分析和光谱表征，例如MS、IR、NMR。所用的缩写为本领域常规的那些。
DCM：二氯甲烷
DIAD：偶氮二甲酸二异丙酯
DIPEA：二异丙基乙胺
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
ETOAC：乙酸乙酯
TBSCl：叔丁基二甲基甲硅烷基氯
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
所有反应均使用不经任何进一步蒸馏的商品级溶剂在Ar气氛中进行。使用不经进一步纯化的商品级试剂。使用TLC-铝片与0.2mm硅胶(MerckF254)进行薄层色谱法。使用ISCOCombiflashCompanion系统、应用快速等级的预填充的柱进行柱色谱法。
在23℃或29℃、使用如下分光光度计记录NMR光谱：Bruker400MHz和BrukerAVANCE600MHz质子频率，其安装1.7mm1H{13C，15N}CryoProbeTM。使用WatersAutopurification系统、应用如下条件进行制备型HPLC：柱SunfireC1830x100mm，5μ，使用CH3CN的水溶液+0.1％TFA-CH3CN以30ml/min梯度洗脱。
使用WatersAcquityUPLC/SQD系统、应用光电二极管阵列检测器和单一四极质量检测器产生LC/MS数据。使用如下条件：
柱：WatersAcquityHSST31.8μm2.1x50mm
洗脱液A：水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵
洗脱液B：乙腈+0.04％甲酸
柱温：60℃
注射-体积1μl，部分环路
PDA全扫描210-450nm和单用户-可选波长
方法A：LCMS_2_MINUTES
流速1.0ml/min
终止时间2.00min
质量范围ESI+/-：100-1200m/z
方法B：LCMS_10_MINUTES
流速1.0ml/min
终止时间10.00min
质量范围ESI+/-：100-1600m/z
方法C：LC-MS柱AcquityUPLCBEHC181.7um，2.1＊50mm
5分钟(流速0.7ml/min，溶剂A：水+0.1％甲酸，溶剂B：ACN+0.1％甲酸，梯度：20-100％B，4.3min)
其中LC方法未指定，如果保留时间低于1.5分钟，则使用方法A，且如果保留时间为1.5-10分钟，则使用方法B。
UPLCMS-方法D(极性方法，2mins运行)：
系统：带有WatersSQ检测器的WatersAcquityUPLC
柱：AcquityHSST31.8μm2.1x50mm.
流速：1ml/min.柱温：60℃.
梯度：1-98％B，1.4min，A＝水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵，B＝乙腈+0.0.4％甲酸.
UPLCMS方法E(4分钟运行)
系统：带有WatersSQ检测器的WatersAcquityUPLC
柱：SunfireC183.5μm2.1x20mm.
流速：0.62ml/min.柱温：40℃.
梯度：5-100％B，4min，A＝水+0.1％三氟乙酸，B＝乙腈+0.1％三氟乙酸
制备型LC方法
正相色谱法-制备型LC方法A
系统：CombiFlashRf200.
柱：RediSepColumnSilica.
梯度：0-100％B，A＝庚烷，B＝乙酸乙酯.
正相色谱法-PrepLC方法B
系统：CombiFlashRf200.
柱：RediSepColumnSilica.
梯度：0-100％B，A＝二氯甲烷，B＝MeOH.
制备型反相色谱法-制备型LC方法C
系统：带有WatersSQ检测器的WatersAcquityPrepLC/MS
柱：Sunfire制备型C18，5μm，30x100mm.
流速：30ml/min.
梯度：5-100％B，A＝乙腈+0.1％三氟乙酸，B+水+0.1％三氟乙酸
制备型反相色谱法-制备型LC方法D
系统：带有WatersSQ检测器的WatersAcquityPrepLC/MS
柱：Sunfire制备型C18，5μm，30x150mm.
流速：60ml/min.
梯度：5-100％B，A＝乙腈+0.1％三氟乙酸，B+水+0.1％三氟乙酸
选择的中间体的合成
2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸苄酯
向2，5-二氢-1H-吡咯(30g，434mmol，96％，来自AlfaAesar)在二烷溶液(1000mL，0.43M溶液)中的溶液中加入CbzOSu(130g，52lmmol)。在室温搅拌18h后，将该反应混合物浓缩至约300mL，用1000mLEtOAc稀释。用水和盐水洗涤有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速柱色谱法得到期望的2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸苄酯，收率为91％(80.0g)，为无色油状物。Rf＝0.6(30％EtOAc的己烷溶液)。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ7.32(5H，m)，5.80(2H，m)，5.77(2H，s)，4.22(4H，m).LC/MS(uplc)：MH+204.2，160.1(-44)，0.86min。
6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸苄酯
向2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸苄酯(33g，163mmol；90％，来自Aldrich)在二氯甲烷(540mL，0.3M溶液)中的溶液中加入m-CPBA(44g，340mmol，77％，来自Aldrich)。在室温将该反应混合物搅拌18h后，加入500mL饱和Na2CO3水溶液，在室温将得到的混合物搅拌1h。分离有机层，用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速柱色谱法得到期望的产物，为黄色油状物，收率为83％(29.5g)。Rf＝0.5(30％EtOAc的己烷溶液)。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ3.38(2H，dd，J＝12.8，6.0Hz)，3.68(2H，d，J＝3.6Hz)，3.87(2H，dd，J＝13.2，19.6)，5.11(2H，s)，7.33(5H，m).LC/MS(uplc)：MH+220.0，0.69min。
3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯
在-40℃向6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸苄酯(28.5g，130mmol)和CuBr·SMe2(26.7g，130mmol)在无水THF(260mL，0.5M溶液)中的溶液中缓慢地加入溴化乙烯基镁(520mL，1.0M的THF溶液)。然后将该反应混合物温热至-20℃2h。用饱和NH4Cl水溶液(200mL)猝灭后，用EtOAc(500ml)萃取该混合物。用水和盐水洗涤有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速柱色谱法得到反式-(±)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯的期望的外消旋混合物，收率为48％(15.5g)，为黄色油状物。Rf＝0.2(30％EtOAc的己烷溶液).1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ2.71(1H，m)，3.28(2H，m)，3.72(2H，m)，4.11(1H，m)，5.14(2H，s)，5.16-5.23(2H，m)，5.69(1H，m)，7.33(5H，m).LC/MS(uplc)：MH+248.0，0.78min。
反式-(±)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯的拆分
将反式-(±)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯的外消旋混合物(14g)在Basel进行SeparationLaboratory处理(接触：Dr.EricFrancotte，Tel.+41616962971)。得到期望的富含对映体的(3S，4R)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯(6.3g，＞99.5％ee)和不期望的(3R，4S)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯(6.7g，99.5％ee)，收率为92％。
(3R，4R)-3-氟-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯
向(3S，4R)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯(5.0g，20.2mmol)在PhCF3(81mL，0.25M溶液)中的溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(53mL，303mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(19.8mL，121mmol)和全氟-1-丁磺酰氟(PBSF，3.6ml，20.2mmol)。将得到的混合物在室温搅拌。在60和120分钟后，再加入全氟-1-丁磺酰氟(3.6mL，20.2mmol)。18小时后，将该反应混合物转入分液漏斗，用50mL1.0NHCl洗涤2次(谨慎！产生大量热)，用饱和NaHCO3水溶液洗涤2次，用H2O和盐水洗涤1次。用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，得到粗的棕色油状物。通过快速柱色谱法(SiO2，10％-30％EtOAc的己烷溶液)得到纯(3R，4R)-3-氟-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯，收率为81％(4.1g)，为黄色油状物。Rf＝0.55(30％EtOAc的己烷溶液).1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ7.37-7.25(5H，m)，5.9(1H，m)，5.24(2H，m)，5.14(2H，m)，5.03(1H，dt，J＝52.8，3.2Hz)，3.9-3.5(3H，m)，3.53(1H，q，J＝10.4Hz)，2.83(1H，m).13CNMR(CDCl3，100MHz)：δ154.7，154.6，136.6，131.89，131.83，128.48，128.02，127.94，119.00，118.94，95.23，94.47，93.42，92.67，66.99，66.94，53.16，52.94，52.83，52.60，48.17，48.02，47.91，47.83，47.2，47.1.LC/MS(uplc)：MH+250.0，0.93min。
(3R，4S)-3-氟-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
向(3R，4R)-3-氟-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.78g，7.15mmol)在CH3OH和H2O(2∶1，18ml)中的溶液中加入OsO4的H2O溶液(3ml4％w/v溶液，0.5mmol)。然后一次加入NaIO4(4.6g，21.5mmol)，在室温搅拌得到的混合物。2小时后，过滤该混合物，以除去沉淀的白色固体，用EtOAc洗涤滤饼。真空浓缩滤液，以除去大部分有机溶剂。用3部分EtOAc萃取残余物，用无水Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩。将粗(3R，4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸苄酯不经进一步纯化用于下一步。LC/MS(uplc)：MH+208.2(-44)，0.69min。
向冰冷却的上述粗(3R，4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸苄酯在CH2Cl2(20mL)中的溶液中加入NaBH4(330mg，14.30mmol)。在室温搅拌该反应体系。反应完成时，用0.5MHCl酸化粗混合物，搅拌30min。使该反应混合物分配在CH2Cl2与水之间。用饱和NaHCO3(2次)和水(2次)洗涤有机层，然后用Na2SO4干燥，减压蒸发溶剂，得到期望的产物(3R，4S)-3-氟-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.7g，6.9mmol，97％)，为油状物。将该粗产物不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(uplc)：MH+254.2，210.2(-44)，0.78min。
(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸2-(2，5-二氟苯基)-2- 氧代乙酯.
向冰冷却的(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸(4.82g.18.6mmol)和K2CO3(2.3g，16.7mmol)在丙酮(372ml)中的溶液中加入2-氯-1-(2，5-二氟苯基)乙酮(4.25g，22.3mmol)，然后加入KI(0.77g，4.6mmol)。使该反应体系在搅拌的同时达到室温。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，将该混合物冷却至0℃，用冷水(600ml)猝灭。在0℃搅拌15min后，过滤该反应混合物，用丙酮/H2O(1/3)洗涤沉淀，得到(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯，为固体(4.1g，9.71mmol，52％)。高度真空干燥固体过夜，不经任何进一步纯化用于下一步。
1H-NMR(CDCl3，600MHz)：δ7.66(1H，m)，7.61(1H，m)，7.49(1H，m)，7.32(1H，m)，5.33(2H，m)，4.06(1H，m)，3.86(2H，m)，3.24(2H，m)，2.01(1H，m)，1.75-1.4(13H，m).LC/MS(uplc)：MH+414.1，1.11min(方法A)。
(R)-((4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸 叔丁酯.
向(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯(4.1g，9.71mmol)在甲苯(50mL)中的溶液中加入乙酸铵(15g，194mmol)。回流加热得到的溶液(110℃)。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，将该混合物冷却至室温，使其分配在EtOAC与H2O之间。分离有机层，用H2O(2次)和饱和NaHCO3溶液(2次)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，得到粗(R)-((4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，为棕色固体(4g，9.7mmol.99％)。高度真空干燥固体过夜，不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(uplc)：MH+394.2，0.99min(方法A)。
(R)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨 基甲酸叔丁酯.
向冰冷却的(R)-((4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(4g，9.7mmol)和K2CO3(2.8g，20.4mmol)在DMF(68ml)中的溶液中加入苄基溴(1.4ml，11.2mmol)，将该反应体系在0℃搅拌1h，然后在室温搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，加入80mL水，在添加时，固体沉淀。过滤固体，用DMF/H2O(1/1)洗涤。得到(R)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(3.7g，7.6mmol，73％)。高度真空干燥固体过夜，不经任何进一步纯化用于下一步。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.85(1H，m)，7.36(4H，m)，7.21(2H，m)，7.05(1H，m)，6.87(1H，m)，5.30(1H，m)，5.22(1H，m)，5.13(1H，d，m)，4.69(1H，m)，4.00(1H，m)，3.81(1H，m)，3.30(2H，m)，2.13(1H，m)，1.80(1H，m)，1.45(9H，m)，1.30(1H，m)，1.01(1H，m).LC/MS(uplc)：MH+484.3，1.34min(方法A)。
(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺.
向冰冷却的(R)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(3.7g，7.6mmol)在CH2Cl2(80mL)中的溶液中加入三氟乙酸(20mL)。在室温搅拌该反应混合物。在通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，用CH2Cl2稀释粗产物，使该混合物分配在CH2Cl2与饱和NaHCO3溶液之间。分离有机层，用饱和NaHCO3溶液(2次)和水(2次)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，得到粗(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺(2.8g，7.3mmol，95％)，为TFA盐。高度真空干燥粗产物过夜，不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(uplc)：MH+384.2，0.83min(方法A)。
(3R，4R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃- 4-基)甲基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
向(3R，4S)-3-氟-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(2.9g，11.4mL)在CH2Cl2(80ml)中的溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(6.5g，15.20mmol)。将该反应混合物在室温搅拌30min。反应完成时，将粗产物(3R，4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸苄酯作为溶液不经进一步纯化用于下一步。
向(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺(2.9g，7.6mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(8.1g，38mmol)在CH2Cl2(60mL)中的溶液中加入来自上述步骤的(3R，4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸苄酯在CH2Cl2中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌2h。用CH2Cl2稀释该反应混合物时，使其分配在CH2Cl2与H2O之间。分离有机层，用饱和NaHCO3溶液(2次)和H2O(2次)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，在通过正相柱色谱法纯化后得到期望的(3R，4R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(PrepLC方法A，2.7g，4.5mmol，59％)。LC/MS(uplc)：MH+619.3，1.23min(方法A)。
用于中间体的N-酰化的通用方法
向冰冷却的胺(1mmol)在CH2Cl2(0.1M)中的溶液中加入iPr2EtN(7mmol)，然后加入酰氯(6mmol)。在室温搅拌该反应混合物。在通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，用CH2Cl2稀释该混合物，使其分配在CH2Cl2与H2O之间。分离有机层，用饱和NaHCO3溶液(2次)和H2O(2次)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。在通过正相柱色谱法(PrepLC方法A或C)纯化后得到期望的Cbz-酰胺有效负荷。
选择的连接基的合成
连接基1.
a：TBSCl，咪唑，DMF，室温，53％收率；b：马来酰亚胺，DIAD，pph3，-78...RT，THF，甲苯，62％收率；c：CF3COOH，CH2Cl2，100％收率。
(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)(2-羟基乙基)氨基甲酸叔丁酯
如Liang，Qiren；DeBrabander，JefK.，Tetrahedron，2011，第67卷，pp.5046-5053中所述制备。
(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
在N2气氛中：在-78℃向搅拌的DIAD(0.237ml，1.221mmol)和三苯膦(320mg，1.221mmol)在10ml甲苯中的溶液中加入新鲜制备的马来酰亚胺(118mg，1.221mmol)和(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)(2-羟基乙基)氨基甲酸叔丁酯(300mg，0.939mmol)在10mLTHF中的溶液。将该混合物温热至RT，搅拌过夜，用DCM稀释，用水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(硅胶24g，梯度0-100％EtOAC的庚烷溶液，232mg，0.582mmol，62％)，为黄色固体。在室温通过1H-NMR测定旋转异构体混合物。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.09和6.97(2H，s)，3.68-3.63(2H，m)，3.57-3.52(2H，m)，3.20-3.14(2H，m)，3.40-3.36(2H，m)，1.31(9H，s)，0.85(9H，s)，0.02(6H，s).LC/MS(方法A)：MH+399.4，1.39min。
1-(2-((2-羟基乙基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(ADC-1的连接基1)
在N2气氛中：将(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(220mg，0.552mmol)溶于20mLDCM，加入TFA(2.126ml，27.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌2h。真空浓缩反应混合物，再溶于乙腈和水的混合物，冷冻干燥，得到期望的产物(185mg，0.552mmol，100％收率)，为黄色油状物，为三氟乙酸盐。连接基1不经进一步纯化使用。1H-NMR(CD3OD，400MHz)：1H-NMR(CD3OD，400MHz)：δ6.94(2H，s)，3.92-3.87(2H，m)，3.83-3.79(2H，m)，3.32-3.28(2H，m)，3.23-3.18(2H，m)。
连接基2的合成
a：乙醇胺，90％收率；b：二碳酸二叔丁酯，TEA，50％收率；c：马来酰亚胺，DIAD，pph3，43％收率；d：CF3COOH，60％收率
3-((2-羟基乙基)氨基)丙酸叔丁酯
如Aebi，Johannes；Binggeli，Alflred；Green，Luke；Hartmann，Guido；Maerki，HansP.；Mattei，Patrizio；Ricklin，Fabienne；Roche，Olivier，专利：US2010/16282A1，2010；P.23中所述得到。
3-((叔丁氧羰基)(2-羟基乙基)氨基)丙酸叔丁酯
在N2气氛中，将3-((2-羟基乙基)氨基)丙酸叔丁酯(1304mg，6.89mmol)溶于20mLTHF和三乙胺(0.960ml，6.89mmol)，然后加入Boc-酸酐(1.600ml，6.89mmol)。将反应混合物在室温搅拌4hr。真空浓缩反应混合物，使其分配在乙酸乙酯与盐水之间。用Na2SO4干燥有机层，过滤，使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(硅胶80g，梯度0-100％EtOAC的庚烷溶液，988mg，3.41mmol，50％)，为无色油状物。
3-((叔丁氧羰基)(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)丙酸叔丁酯
在N2气氛中：在-78℃向搅拌的DIAD(0.863ml，4.44mmol)和三苯膦(1164mg，4.44mmol)在10ml甲苯中的溶液中加入新鲜制备的马来酰亚胺(431mg，4.44mmol)和3-((叔丁氧羰基)(2-羟基乙基)氨基)丙酸叔丁酯(988mg，3.41mmol)在10mlTHF中的溶液。将反应混合物温热至室温，搅拌过夜。用DCM稀释反应混合物，用水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(硅胶80g，梯度0-100％EtOAC的庚烷溶液，903mg，1.48mmol，43％，通过LC-MS、UV证实纯度为60％)，为无色油状物。LC/MS(方法A)：MH+369.3，1.11min。
3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)丙酸叔丁酯
在N2气氛中：将3-((叔丁氧羰基)(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)丙酸叔丁酯(870mg，2.361mmol)溶于5mLDCM，将反应混合物冷却至-10C。加入TFA(5mL，64.9mmol)。将反应混合物在-10℃搅拌3hr，然后真空浓缩，再溶于乙腈和水的混合物，冷冻干燥，得到1086mg粗的期望产物(1.420mmol，60.1％收率，约50％纯，正如通过小批量纯化测定)，为黄色油状物。
通过反相柱色谱法纯化100mg粗化合物，得到50mg纯连接基2(为三氟氟乙酸盐)。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ6.76(2H，s)，3.96-3.91(2H，m)，3.39-3.29(4H，m)，2.79-2.73(2H，m)，1.48(9H，s).LC/MS(方法A)：MH+269.6，0.48min。
连接基4的合成
3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在-78℃在5min内向三苯膦(1.40g，5.34mmol)在干THF(53ml)中的溶液中滴加偶氮二甲酸二异丙酯(1.04ml，5.34mmol)，将得到的混合物搅拌5mins。然后在5mins内向该反应体系中加入3-(羟基甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.00g，5.34mmol)。当加入马来酰亚胺(0.518g，5.34mmol)时，将得到的溶液再搅拌5mins。将该反应体系温热至RT，再搅拌18h。将该反应体系浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，收率为44％；UPLC-MS：Rt＝0.87mins；MSm/z[M+H]+267.0；方法A。
3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-2，2，2-三氟乙酸盐
向3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(624mg，2.34mmol)在DCM(23.5ml)中的溶液中缓慢地加入三氟乙酸(9.03ml，117mmol)，将该反应混合物在RT搅拌30mins。将该反应体系浓缩至干，得到期望的产物，为淡黄色固体，收率为99％；UPLC-MS：Rt＝0.22mins；MSm/z[M+H]+167.0；方法A。
连接基5的合成
(3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
向3-(叔丁氧羰基)氨基)丙酸(500mg，1.97mmol)和HATU(1.50g，3.93mmol)在DMF(20ml)中的溶液中缓慢地加入三乙胺(1.37ml，9.84mmol)，然后加入1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(500mg，1.97mmol)，将该反应混合物在RT搅拌24h。用EtOAc稀释该反应体系，用1MHCl水溶液洗涤。萃取有机层，用饱和NaHCO3水溶液洗涤。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，收率为24％；UPLC-MS：Rt＝0.65mins；MSm/z[M+H]+312.1；方法A。
3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-3-氧代丙-1-胺2，2，2-三氟乙酸盐
向3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(624mg，2.34mmol)在DCM(23.5ml)中的溶液中缓慢地加入三氟乙酸(0.80ml，10.4mmol)，将该反应混合物在RT搅拌30mins。将该反应体系浓缩至干，得到期望的产物，为淡黄色固体，定量收率；UPLC-MS：Rt＝0.24mins；MSm/z[M+H]+212.1；方法A。
2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基(4-硝基苯基)碳酸酯
向1-(2-羟基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(250mg，1.77mmol)在DCM(8.9ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(1.5ml，8.86mmol)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(701mg，2.30mmol)，将该反应混合物在RT搅拌3h。用水和DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，收率为88％；H-NMR(DMSO，400MHz)：δ8.34-8.32(2H，m)，7.54-7.51(2H，m)，7.09(2H，s)，4.36-4.34(2H，m)，3.81-3.79(2H，m)。
1-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮
在0℃向(2-氨基乙氧基)乙醇(2.9ml，29.0mmol)在饱和NaHCO3水溶液(150ml)中的溶液中加入N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(4.5g，29.0mmol)，将该反应混合物在RT搅拌30mins，然后在RT再搅拌3h。用DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为淡黄色油状物，收率为53％；UPLC-MS：Rt＝0.35mins；MSm/z[M+H]+186.0；方法E。
2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基(4-硝基苯基)碳酸酯
按照与2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基(4-硝基苯基)碳酸酯类似的方式、而使用1-(2(2-羟基乙氧基)乙基-1H)-吡咯-2，5-二酮合成产物；63％收率；UPLC-MS：Rt＝1.80mins；MSm/z[M+H]+697.0；方法E。
磺酸酯-取代的连接基合成
制备这种连接基的通用方法改进自J.Med.Chem.2011，第54卷，3606-23公布的方法；选择五氟苯酯而不是参考文献中使用的N-羟基琥珀酰亚胺。
合成实施例1.(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯 基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄 酯.
LC/MS(uplc)：MH+733.3，1.36min(方法A)。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基) 甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
(用于Cbz-脱保护的通用方法)
向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(115mg，0.14mmol)在MeOH(2ml)中的溶液中加入Pd/C(30.4mg，0.03mmol)和甲酸铵(108mg，1.7mmol)。将该反应混合物在55℃加热1h。完成时，过滤该反应体系，以除去Pd/C，减压蒸发溶剂，得到粗(S)-乙酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯：LC/MS(uplc)：MH+599.2，0.92min。将粗产物不经任何进一步纯化用于下一步。
向来自Cbz-脱保护步骤的(S)-乙酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯在MeOH(3ml)中的溶液中加入K2CO3(197mg，1.4mmol)。将该反应体系在室温搅拌1h。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，过滤该粗混合物，以除去固体，通过反相柱色谱法纯化时，得到期望的产物(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺(PrepLC方法C)，60mg，0.09mmol，63％)。分离产物，为TFA盐。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.80(1H，m)，7.75(1H，m)，7.45-.7.25(6H，m)，7.09(1H，m)，5.71(1H，m)，5.25(2H，m)，5.11(1H，m)，4.95(1H，m)，4.05(1H，m)，3.80(1H，m)，3.35(2H，m)，3.20(1H，m)，2.90(1H，m)，2.83(1H，m)，2.73(1H，m)，2.68(1H，m)，2.22(1H，m)，1.87(1H，m)，1.45(1H，m)，1.35(1H，m)，1.25(3H，m)，1.09(1H，m)，0.67(1H，m).丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(upl)：MH+557.2，0.84min(方法A)。
用于BOC保护的通用方法
向脲有效负荷(1mmol)在MeOH(0.1M)中的溶液中加入K2CO3(2mmol)和Boc酸酐(3mmol)。在室温搅拌该反应混合物。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，过滤该反应混合物以除去固体，通过正相柱色谱法(PrepLC方法A或B)纯化后分离期望的产物Boc-脲。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢- 2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
LC/MS(uplc)：MH+657.3，1.30min(方法A)。
合成实施例2.(S)-2-氨基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基) (四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-3-羟基丙酰胺
用于Cbz-脱保护的通用方法.18mg，0.023mmol，49％.1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.80(1H，m)，7.75(1H，m)，7.40(2H，m)，7.32(4H，m)，7.11(1H，m)，5.27(1H，m)，5.29(1H，m)，5.14(1H，m)，4.98(1H，m)，3.82(1H，m)，3.79(1H，m)，3.65(1H，m)，3.51(1H，m)，3.40(2H，m)，2.92(1H，m)，2.84(1H，m)，2.78(1H，m)，2.59(1H，m)，2.20(1H，m)，2.01(1H，m)，1.88(1H，m)，1.65(1H，m)，1.45(1H，m)，1.30(1H，m)，1.18(1H，m)，0.89(1H，m)，0.65(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+572.2，0.71min(方法A)。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
用于Boc保护的通用方法：LC/MS(uplc)：MH+772.2，1.36min(方法A)。
合成实施例3.(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基) (四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄 酯
792mg，1.0mmol，76％.1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.70(1H，m)，7.52(1H，m)，7.30-7.10(10H，m)，6.90(1H，m)，5.78(s，1H)，5.37(2H，bs)，5.34(2H，m)，5.30(1H，bs)，5.05(1H，m)，4.92(2H，bs)，4.25(2H，bs)，3.87(2H，m)，3.81(1H，m)，3.71(1H，m)，3.64(2H，m)，3，43(2H，m)，3.26(1H，m)，2.61(1H，m)，2.45(1H，m)，2.01(1H，m)，1.61-1.25(4H，m)，1.12(3H，m).LC/MS(uplc)：MH+720.3，1.25min.(方法A)。
合成实施例4.(3R，4R)-3-(((3S，4R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪 唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3，4-二羟基吡咯烷-1-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯 烷-1-甲酸苄酯
2870mg，2.3mmol，60％.LC/MS(uplc)：MH+748.2，1.19min(方法A).
合成实施例5.(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基) (四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(2，3-二羟基丙基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯
670mg，0.9mmol，39％.LC/MS(uplc)：MH+736.2，1.16min.(方法A)。
(3R，4R)-3-((N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
572mg，0.64mmol，66％.LC/MS(uplc)：MH+718.2，1.23min(方法A)。
(3R，4R)-3-((N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-羟基哌啶-1-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
异构体A：LC/MS(uplc)：MH+746.2，1.27min(方法A).
异构体B：LC/MS(uplc)：MH+746.2，1.28min(方法A).
Cbz脱保护：
向Cbz-脲有效负荷(1.0mmol)在MeOH中的溶液(0.1M)中加入Pd/C(含量10％，0.2mmol)和甲酸铵(12mmol)。将该反应体系在55℃加热30min。完成时，过滤该反应体系，以除去Pd/C，经反相柱色谱分离期望的脲。(PrepLC方法C或D).
合成实施例6.1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡 喃-4-基)甲基)-1-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.75(2H，m)，7.40-7.25(6H，m)，7.09(1H，m)，5.90(1H，bs)，5.36-5.30(3H，m)，4.96(1H，m)，4.71(1H，m)，3.85(2H，m)，3.79(1H，m)，3.58(2H，m)，3.29(4H，m)，2.79(2H，m)，2.57(1H，bs)，2.17(1H，bs)，1.72(1H，m)，1.60(1H，m)，1.38(2H，m)，0.95(2H，m)，1.08(3H，bs).1个信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+586.3，0.86min.(方法A)。
1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-3-(2-羟基乙基)脲.
15mg，0.025mmol，19％.1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.78-7.68(2H，m)，7.44-7.36(2H，m)，7.36-7.25(4H，m)，7.15-7.04(1H，m)，6.45-6.28(1H，m)，5.45-5.21(3H，m)，5.10-4.91(1H，m)，4.71-4.57(1H，m)，3.91-3.79(1H，m)，3.67-3.52(2H，m)，3.28-3.14(4H，m)，3.09-2.91(1H，m)，2.84-2.68(1H，m)，2.24-2.12(1H，m)，1.97-1.78(1H，m)，1.59-1.49(1H，m)，1.47-1.37(1H，m)，1.36-1.27(1H，m)，1.22-1.10(1H，m)，0.79-0.60(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+572.2，0.83min(方法A)。
合成实施例7.(3S，4R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四 氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-3，4-二羟基吡咯烷-1-甲 酰胺
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.73(2H，bs)，7.38-7.25(6H，m)，7.06(1H，bs)，5.5(2H，m)，4.95(1H，m)，4.84(2H，bs)，4.82(1H，bs)，4.02(2H，m)，3.81(1H，m)，3.60(1H，bs)，3.49(2H，bs)，3.27(1H，m)，3.13(1H，bs)，2.93(1H，m)，2.72(1H，m)，2.39(1H，bs)，2.28(1H，m)，1.85(1H，bs)，1.73(1H，m)，1.58(1H，m)，1.03(1H，m)，0.97(1H，m)，0.28(1H，m)，5H隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+614.3，0.82min.(方法A)。
合成实施例8.1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡 喃-4-基)甲基)-3-(2，3-二羟基丙基)-1-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.76(2H，bs)，7.40-7.25(6H，m)，7.09(1H，bs)，6.36(1H，bs)，5.40(1H，bs)，5.30(2H，m)，4.95(1H，m)，4.79(1H，bs)，4.60(1H，bs)，3.84(1H，m)，3.61(1H，m)，3.56(1H，m)，3.54(1H，bs)，3.29(1H，m)，3.25(4H，m)，3.10(1H，m)，2.94(1H，m)，2.68(1H，m)，2.56(1H，m)，2.13(1H，m)，1.80(1H，m)，1.49(1H，m)，1.42(1H，m)，1.35(1H，m)，1.18(1H，m)，0.71(1H，m)。2个信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+602.3，0.78min.(方法A).
N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酰胺.
45mg，0.073mmol，92％.LC/MS(uplc)：MH+584.2，0.84min(方法A)。
N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-3-羟基哌啶-1-甲酰胺.
异构体A：LC/MS(uplc)：MH+612.30.88min(方法A)。
异构体B：LC/MS(uplc)：MH+612.30.89min(方法A)。
合成实施例9.(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基) (四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔 丁酯
用于合成Boc-脲有效负荷的通用方法：
脲偶合：向冰冷却的光气(20％的甲苯溶液，2mmol)在CH2Cl2中的溶液(0.1M)中加入胺(1mmol)和三乙胺(3mmol)在CH2Cl2中的溶液(1M)。将该反应混合物在室温搅拌30min。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，加入用于脲的期望的胺(20mmol)，将该反应体系在60℃搅拌2h，然后在室温搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，减压蒸发粗溶剂，通过正相柱色谱法(PrepLC方法A或B)纯化后得到期望的产物。
0.49mg，0.69mmol，68％.LC/MS(uplc)：MH+686.3，1.25min.(方法A)。(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(2-羟基乙基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
1.05g，1.6mmol，85％.LC/MS(uplc)：MH+782.2，0.90min(方法A)。
合成实施例10.(3R，4R)-3-(((3S，4R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3，4-二羟基吡咯烷-1-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯 烷-1-甲酸叔丁酯
817mg，1.09mmol，47％.LC/MS(uplc)：MH+714.2，1.18min.(方法A)。
合成实施例11.(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(2，3-二羟基丙基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔 丁酯
317mg，0.43mmol，49％.LC/MS(uplc)：MH+702.2，1.16min.(方法A)。
(3R，4R)-3-((N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
240mg，0.33mmol，73％.LC/MS(uplc)：MH+684.2，1.23min(方法A)。
(3R，4R)-3-((N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-羟基哌啶-1-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
异构体A：LC/MS(uplc)：MH+712.3，1.29min(方法A)。
异构体B：LC/MS(upcl)：MH+712.3，1.30min(方法A)。
合成实施例12.(3R，4R)-3-((3-((S)-1-叠氮基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2， 5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸 叔丁酯
向冰冷却的(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(100mg，0.15mmol)在CH2Cl2(0.8ml)和吡啶(24μL，0.29mmol)中的溶液中缓慢地加入对甲苯磺酰氯(40.3mg，0.21mmol)。在室温搅拌该反应混合物。反应完成时，用CH2Cl2稀释该反应混合物，使其分配在H2O与CH2Cl2之间。分离有机层，用H2O洗涤2次，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发，得到粗(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-(甲苯磺酰氧基)丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(109mg，0.1mmol，71％)。将粗混合物不经进一步纯化使用。LC/MS(uplc)：704.3(-135).(方法A)。
向(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-(甲苯磺酰氧基)丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(109mg，0.1mmol)在DMF(0.6ml)中的溶液中加入叠氮化钠，在70℃搅拌该反应混合物。反应完成时，将该混合物冷却至室温，用EtOAc(5mL)稀释。使该反应混合物在H2O与EtOAc之分配间。分离有机层，用H2O洗涤2次，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(3R，4R)-3-((3-((S)-1-叠氮基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(梯度30-100％EtOAC的庚烷溶液，40mg，0.053mmol，52％)。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.73(1H，bs)，7.68(1H，bs)，7.36-7.29(6H，m)，7.09(1H，bs)，6.29(1H，bs)，5.34(2H，m)，5.07(1H，m)，3.97(1H，m)，3.85(1H，m)，3.70(2H，m)，3.50(1H，m)，3.37-3.20(6H，m)，2.69(1H，m)，2.58(1H，m)，2.17(1H，m)，1.96(1H，m)，1.45(1H，m)，1.30(1H，m)，1.18(9H，s)，1.12(1H，m)，0.86(2H，m).3个信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+711.4，1.41min.(方法A)。
(3R，4R)-3-((3-((S)-1-氨基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4R)-3-((3-((S)-1-叠氮基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(100mg，0.14mmol)在THF(2ml)中的溶液中加入三苯膦(111mg，0.42mmol)和H2O(51μL，2.81mmol)。在50℃搅拌该反应混合物。反应完成时，将该混合物冷却至室温，用EtOAc(5ml)稀释。使该反应混合物分配在EtOAc与H2O之间。用H2O洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。柱色谱后分离期望的产物(3R，4R)-3-((3-((S)-1-氨基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(梯度为0-10％MeOH/CH2Cl2溶液，51mg，0.071mmol，50％)。LC/MS(uplc)：MH+685.4，1.08min.(方法A)。
3-((S)-1-氨基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基) (四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲
向(3R，4R)-3-((3-((S)-1-氨基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(40mg，0.058mmol)在乙腈(1.2ml)中的溶液中加入三氟乙酸(0.6ml)，在室温搅拌该反应混合物。反应完成时，过滤粗产物，以除去固体，反相柱色谱后分离期望的产物3-((S)-1-氨基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲(梯度5％-35％MeCN(+0.1％TFA)的H2O溶液(+0.1％TFA)，19.1mg，0.031mmol，53％)。用PL-HCO3MPSPE柱中和TFA盐，得到游离碱。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.75(2H，bs)，7.40-7.28(6H，m)，7.09(1H，bs)，6.02(1H，bs)，5.40-5.30(3H，m)，4.95(1H，m)，3.84(1H，m)，3.74(1H，m)，3.61(2H，m)，3.34(2H，m)，3.24(2H，m)，2.95(1H，m)，2.72(1H，m)，2.66(1H，m)，2.59(1H，m)，2.55(1H，m)，2.19(1H，m)，1.82(1H，m)，1.56(1H，m)，1.42(1H，m)，1.34(1H，m)，1.119(1H，m)，1.08(3H，bs)，0.71(1H，m)。2个信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+585.3，0.73min.(方法A)。
合成实施例13.
(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3-二甲基戊-4-烯酸：如WO2005/54186A2，2005；P.48-49中所述制备。
(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3-二甲基戊-4-烯酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯
在N2气氛中：向冰冷却的2-氯-1-(2，5-二氟苯基)乙酮(1.974g，10.36mmol)和K2CO3(1.074g，7.77mmol)在150ml丙酮中的溶液中加入(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3-二甲基戊4-烯酸(2.1g，8.63mmol)，然后加入KI(0.358g，2.158mmol)，除去冷却浴，将该反应混合物在RT搅拌3.5h。
将该反应混合物倾倒在碎冰上，用DCM萃取。用Na2SO4干燥有机层，过滤，使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(硅胶80g，梯度0-20％EtOAC的庚烷溶液，2.95g，86％)，为黄色固体。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ7.72-7.57(2H，m)，7.55-7.45(1H，m)，6.94(1H，d，8.9Hz)，5.97(1H，dd，17.4，10.7Hz)，5.40-5.25(2H，m)，5.10-4.95(2H，m)，4.11(1H，d，9.0Hz)，1.39(9H，s)，1.13(6H，s).LC/MS(方法C)：MH+398.2，3.25min。
(R)(1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯
将(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3-二甲基戊-4-烯酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯(2.95g，7.42mmol)溶于45ml甲苯，加入乙酸铵(11.44g，148mmol)。将得到的混合物加热至回流40h。将该反应混合物冷却至RT，用水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。在40℃减压干燥残余物42h。(2.69g，93％，97％纯，通过LC-MS、UV证实)，为黄色泡沫体，不经进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：MH+378.5，1.22min。
(R)-(1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯
在0℃向(R)-(1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯(2.69g，6.91mmol)在20mlDMF中的溶液中加入K2CO3(1.911g，13.83mmol)，然后加入苄基溴(0.904ml，7.6mmol)。将得到的混合物在RT搅拌3h。
加入冰水，导致沉淀。通过过滤采集黄白色固体，用DMF/水(1/2)、水洗涤，减压干燥48h，得到期望的产物(2.9g，90％)，为固体，不经进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：MH+468.2，1.53min。
(R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-胺
在N2气氛中：将(R)-(1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯(10.768g，23.03mmol)溶于180mlDCM，将反应混合物冷却至0℃，然后滴加TFA(44.4ml，576mmol)。将反应混合物在0℃搅拌5min，然后在RT搅拌1h。减压浓缩残余物，用DCM稀释，用NaOH(2M)碱化。用DCM(3x)萃取，用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。得到期望的产物(8.7g，23.68mmol，100％收率，97％纯)，为淡黄色固体，不经进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：MH+368.3，0.90min。
(3R，4R)-3-((((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在N2气氛中：向(3R，4S)-3-氟-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(4.07g，18.55mmol)在CH2Cl2(120ml)中的溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(13.11g，30.9mmol)。将该反应混合物在室温搅拌30min。反应完成时，将粗(3R，4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯作为溶液不经进一步处理用于下一步。
在0℃向(R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-胺(5.68g，15.46mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(16.38g，77mmol)和分子筛(20g)在CH2Cl2(120ml)中的溶液中加入来自上述步骤的(3R，4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯在CH2Cl2中的溶液。将该反应混合物在RT搅拌1h。过滤该反应混合物，用DCM稀释，用饱和NaHCO3和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(330g硅胶，0-40％EtOAc的庚烷溶液，3.186g，5.6mmol，36％)。LC/MS(方法B)：MH+569.3，6.60min。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在N2气氛中：在0℃向在CH2Cl2(50ml)中的(3R，4R)-3-((((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(3.03g，5.33mmol)加入DIPEA(4.65ml，26.6mmol)，然后加入(S)-2-乙酰氧基丙酰氯(1.349ml，10.66mmol)。将得到的溶液在0℃搅拌5min，然后温热至RT，搅拌2h。用DCM稀释反应混合物，用饱和NaHCO3，然后用饱和NaCl洗涤。干燥有机层，浓缩，使其吸附在isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(120g硅胶，0-50％EtOAc的庚烷溶液，3.143g，4.6mmol，86％)，为无色固体。LC/MS(方法A)：MH+683.3，1.51min。
合成实施例14.
3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在N2气氛中：将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.5g，2.197mmol)在THF(20ml)中的溶液冷却至0℃，滴加硼烷的THF溶液(4.39ml，4.39mmol，1M)。将反应混合物温热至RT，搅拌4h。冷却至0℃，用25mlTHF/EtOH1∶1、然后用40ml磷酸盐缓冲液(pH7)猝灭，最终加入H2O2(2.244ml，21.97mmol，30％水溶液)，将反应混合物在RT搅拌过夜。向该反应混合物中加入盐水，用ETOAc将其萃取3次。依次用冷饱和Na2S2O5、水和盐水洗涤3次，用Na2SO4干燥，过滤，使其吸附在isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(80g硅胶，0-100％EtOAc的庚烷溶液，1.075g，1.519mmol，69％)，为无色油状物。LC/MS(方法A)：MH+701.4，1.33min。在室温通过1H-NMR测定为旋转异构体混合物。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ7.85-7.65(2H，m)，7.41-7.28(6H，m)，7.15-7.05(1H，m)，5.86和5.81(1H，2个单峰，旋转异构体)，5.40-5.17(3H，m)，4.96(1H，d，15Hz)，4.22-4.14(1H，m)，3.95-3.70(2H，m)，3.27-3.20(1H，m)，3.15-2.97(1H，m)，2.63-2.55(1H，m)，2.22-2.14(1H，m)，2.11(3H，s)，1.70-1.49(5H，m)，1.35-1.20(3H，m)，1.09(9H，s)，0.95(6H，s)。
(S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合的Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法(RT，16h)，在通过反相柱色谱法纯化后制备标题化合物(17mg，0.024mmol，85％收率，为TFA盐)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+559.3；Rt3.25min.1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，比例约3∶1)：δ9.01(1H，brs)，8.69(1H，brs)，8.00和7.92(1H，两种旋转异构体的两个双峰3.6和4.2Hz)，7.45-7.30(7H，m)，7.17-7.07(1H，m)，5.87和5.85(1H，两种旋转异构体的两个单峰)，5.50-5.00(3H，m)，4.65-4.58(1H，m)，4.30-3.90(2H，m)，3.35-3.15(6H，m)，2.42-2.32(1H，m)，1.97-1.85(2H，m)，1.55-1.40(1H，m)，1.40-1.20(4H，m)，1.02和0.90(3H，两种旋转异构体的两个单峰），0.82和0.68(3H，两种旋转异构体的两个单峰)。
合成实施例15.
步骤1：(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3，3-二甲基丁酸
在0℃向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(200mg，0.285mmol)在丙酮(体积：7ml)中的溶液中滴加Jones试剂(2M，0.856ml，1.712mmol)。将得到的黄色溶液在室温搅拌2.5h。
在0℃通过滴加异丙醇(2ml)使过量的Jones试剂猝灭，然后浓缩该反应混合物，用水稀释，用乙酸乙酯(＊3)萃取。干燥合并的有机层，蒸发，得到标题化合物(198mg，0.255mmol，89％收率，92％纯)，不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+715.3，Rt1.27min。
步骤2：(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酸
在搅拌的(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3，3-二甲基丁酸(步骤1)(928mg，1.078mmol)在甲醇(体积：40ml)中的溶液中加入NaOH(1M，3.23ml，3.23mmol)，将该反应混合物在室温搅拌1h。用水稀释反应混合物，蒸发，用HCl(1M)酸化，用EA(＊3)萃取。干燥合并的有机层，浓缩，得到期望的产物(980mg，1.005mmol，93％收率，69％纯)，不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+673.4，Rt1.23min。
步骤3：(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-4-(甲基氨基)-4-氧代丁基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酸(步骤2)(38mg，0.056mmol)和2M甲胺的THF溶液(0.113ml，0.226mmol)溶于DMF(体积：2ml)，加入DIPEA(0.049ml，0.282mmol)，然后加入HATU(32.2mg，0.085mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1h。用EA稀释，用盐水(＊3)洗涤。干燥合并的有机层，浓缩，得到37mg期望的产物(37mg，0.026mmol，46.8％收率，49％纯)，不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+686.3，Rt1.22min。
步骤4：(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-N，3，3-三甲基丁酰胺
将(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-4-(甲基氨基)-4-氧代丁基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(步骤3)(37mg，0.026mmol，49％纯)溶于乙腈(体积：2ml)，加入TFA(0.416ml，5.40mmol)，将该反应混合物在rt搅拌1h。浓缩，通过反相色谱法纯化，得到期望的产物(6.5mg，9.29μmol，35％收率，为TFA盐)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+586.7，Rt3.03min.1H-NMR(DMSO，600MHz，具有约5∶1之比的旋转异构体混合物，较少的旋转异构体的一些峰不能清楚地鉴定)：δ8.99(1.2H，brs)，8.71(1.2H，brs)，7.91-7.86(0.2H，m)，7.84-7.81(1H，m)，7.80-7.75(1H，m)，7.69-7.65(1H，m)，7.57(0.2H，d，3.6Hz)，7.45-7.29(6.5H，m)，7.15-7.10(1.4H，m)，6.22(1H，s)，5.78(0.2H，s)，5.59(0.2H，d，16.2Hz)，5.48(0.2H，d，16.2Hz)，5.34(1H，d，15.1Hz)，5.17(1H，d，15.1Hz)，5.10(1H，d，52.2Hz)，4.83-4.77(0.2H，m)，4.57-4.51(1H，m)，4.49-4.42(0.2H，m)，4.06-4.01(0.4H，m)，3.95-3.92(2H，m)，3.35-3.24(1.2H，m)，3.14-3.00(1.2H，m)，2.56(0.6H，d，4.2Hz)，2.31-2.23(1H，m)，2.19(1H，d，13.5Hz)，2.10-2.00(0.4H，m)，2.00-1.92(1H，m)，1.90(1H，d，13.5Hz)，1.72-1.58(1H，m)，1.35(3H，d，6.0Hz)，1.15(0.6H，s)，1.08(0.6H，s)，1.05(3H，s)，0.95(3H，s)，0.77(0.6H，d，6.0Hz)。1个CH3基团被隐藏在DMSO峰下，OH未观察到。
合成实施例16.
步骤1：(3R，4R)-3-(((2S)-2-乙酰氧基-N-((1R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3，4-二羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在搅拌的4-甲基吗啉-N-氧化物(73.6mg，0.628mmol)和四氧化锇4％(0.082ml，10.47μmol)在水(6ml)中的溶液中加入在THF(4ml)中的(3R，4R)--3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(143mg，0.209mmol)。将混合物在室温搅拌18h。用饱和Na2S2O5水溶液使反应混合物猝灭，将其在室温搅拌1h，然后用DCM萃取(3次)。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩，得到157mg期望的产物(157mg，0.169mmol，81％收率，77％纯)，不经任何进一步纯化用于下一步。
LC/MS(方法A)：[M+H]+717.3；Rt1.23/1.28min.(2种非对映异构体)。
步骤2：(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-3-氧代丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
将(3R，4R)-3-(((2S)-2-乙酰氧基-N-((1R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3，4-二羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(步骤1)(120mg，0.129mmol)和K2CO3(35.6mg，0.258mmol)溶于THF(6mL)。加入NaIO4(83mg，0.387mmol)的水(4ml)溶液。将混合物在室温搅拌3h。通过过滤除去白色沉淀，然后用EA将滤液萃取3次。用饱和Na2S2O5、然后用盐水依次洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩。不再纯化，得到105mg期望的产物(105mg，0.090mmol，70％收率，59％纯)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+685.4；Rt1.42min。
步骤3：(R)-3-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙酸
在N2气氛中：在0℃在(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-3-氧代丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(步骤2)(102mg，0.149mmol)在丙酮(10ml)中的溶液中滴加Jones试剂2M(0.372ml，0.745mmol)。将得到的黄色溶液在室温搅拌3h。在0℃通过滴加异丙醇(6mL)使过量的Jones试剂猝灭，然后浓缩该反应混合物，用水稀释，用乙酸乙酯(＊3)萃取。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩。
得到81.5mg期望的产物(81.5mg，0.078mmol，52％收率，67％纯)，不经进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+701.3；Rt1.29min。
步骤4：(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-3-(甲基氨基)-3-氧代丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
将(R)-3-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙酸(步骤3)(46mg，0.066mmol)和甲胺2M的THF溶液(0.656ml，1.313mmol)溶于DMF(2ml)。加入DIPEA(0.057ml，0.328mmol)，然后加入HATU(37.4mg，0.098mmol)。将反应混合物在室温搅拌24h。用乙酸乙酯稀释混合物，用盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩，得到46.9mg期望的产物(46.9mg，0.066mmol，100％收率)，不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+714.3；Rt1.29min。
步骤5：(S)-乙酸1-(((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-3-(甲基氨基)-3-氧代丙基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯
将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-3-(甲基氨基)-3-氧代丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(步骤4)(46.9mg，0.066mmol)溶于乙腈(2ml)和水(1ml)。加入TFA(0.506ml，6.57mmol)，将该反应混合物在60℃搅拌4h。用EA稀释溶液，用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。不再进一步纯化，得到40.3mg期望的产物(40.3mg，0.066mmol，100％收率)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+614.3；Rt0.89min。
步骤6：(R)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-N，2，2-三甲基丙酰胺
将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-3-(甲基氨基)-3-氧代丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(步骤5)(40.3mg，0.066mmol)溶于MeOH(3ml)。加入K2CO3(45.4mg，0.328mmol)。将反应混合物在室温搅拌40min。
过滤混合物，通过反相色谱法进行纯化。得到8.9mg预期的产物(8.9mg，0.012mmol，19％收率，94％纯)，为TFA盐。
LC/MS(方法B)：[M+H]+572.2；Rt2.92min.1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，报道主要旋转异构体的峰)：δ9.04(1H，brs)，8.85(1H，brs)，7.76-7.70(3H，m)，7.45-7.31(6H，m)，7.13-7.07(1H，m)，6.42(1H，s)，5.25-5.20(2H，m)，5.14-5.09(1H，m)，4.57-4.51(1H，m)，3.92-3.85(2H，m)，3.35-3.25(1H，m)，3.20-3.05(1H，m)，2.48(3H，d，4.5Hz)，2.33-2.25(1H，m)，1.98-1.88(1H，m)，1.82-1.68(1H，m)，1.36-1.32(6H，m)，1.06(3H，s)。
合成实施例17.
步骤1：(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羟基-2，2-二甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃、在N2气氛中向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-3-氧代丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(232.6mg，0.340mmol)在THF(12ml)中的溶液中加入NaBH4(19.28mg，0.510mmol)和2mlMeOH，得到澄清溶液。将反应混合物在室温搅拌1h。在0℃用1ml饱和NH4Cl水溶液使混合物猝灭，用EA萃取，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩。
不再纯化，得到233mg期望的产物(233mg，0.340mmol，100％收率，100％纯)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+687.3；Rt1.37min。
步骤2：(S)-乙酸1-(((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羟基-2，2-二甲基丙基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯
将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羟基-2，2-二甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(步骤1)(26mg，0.038mmol)溶于乙腈(1ml)和水(0.5ml)。加入TFA(0.292ml，3.79mmol)，将其在60℃搅拌1h。用EA稀释反应混合物，用饱和NaHCO3洗涤，然后用盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。
不再纯化，得到22.2mg期望的产物(22.2mg，0.038mmol，100％收率)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+587.3；Rt0.93min。
步骤3：(S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羟基-2，2-二甲基丙基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
在搅拌的(S)-乙酸1-(((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羟基-2，2-二甲基丙基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯(步骤2)(22.2mg，0.038mmol)在甲醇(2ml)中的溶液中加入K2CO3(26.2mg，0.189mmol)。将反应混合物在室温搅拌1.5h。过滤混合物，通过反相色谱法进行纯化，得到8.8mg预期的产物(8.8mg，0.013mmol，35％收率，100％纯)，为TFA盐。
LC/MS(方法B)：[M+H]+545.3；Rt3.24min.1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，报道主要旋转异构体的峰)：δ9.09(1H，brs)，8.87(1H，brs)，7.80-7.87(1H，m)，7.70-7.76(1H，m)，7.30-7.44(6H，m)，7.1-7.15(1H，m)，6.03(1H，s)，5.35-5.08(3H，m)，4.60-4.55(1H，m)，4.05-3.85(2H，m)，3.35-3.20(2H，m)，3.12-3.04(2H，m)，2.41-2.31(1H，m)，2.01-1.79(2H，m)，1.35(3H，d，6.2Hz)，0.90(3H，s)，0.80(3H，s)。
合成实施例18.
步骤1：(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在N2气氛中：向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(200mg，0.285mmol)在干DCM(12ml)中的溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(161mg，0.380mmol)。将该反应混合物在室温搅拌35min。用DCM稀释溶液，用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩。
不再纯化，得到199mg期望的产物(199mg，0.285mmol，100％收率)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+699.5；Rt1.39min。
步骤2：(3R，4R)-3-(((2S)-2-乙酰氧基-N-((1R，E)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((叔丁基亚磺酰基)亚氨基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(250mg，0.358mmol)、2-甲基丙-2-亚磺酰胺(步骤1)(217mg，1.789mmol)和CuSO4.5H2O(447mg，1.789mmol)在DCM(10ml)中在50℃搅拌42h。过滤该反应混合物，再用DCM洗涤沉淀。真空浓缩滤液(＝产物)。
不再纯化，得到496mg期望的产物(496mg，0.353mmol，99％收率，57％纯)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+802.5；Rt1.48min。
步骤3：(3R，4R)-3-(((2S)-2-乙酰氧基-N-((1R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(1，1-二甲基乙基亚磺酰氨基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将(3R，4R)-3-(((2S)-2-乙酰氧基-N-((1R，E)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((叔丁基亚磺酰基)亚氨基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(步骤2)(496mg，0.353mmol)溶于MeOH(15ml)。缓慢地加入NaBH4(66.7mg，1.763mmol)。反应混合物的颜色改变(棕色)，起泡。将其在室温搅拌4h。用EA稀释残余物，用水、然后用盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。
不再纯化，得到379mg期望的产物(379mg，0.420mmol，119％收率(不干燥)，89％纯)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+804.7；Rt1.42min。
步骤4：(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-4-氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲叔丁基酸酯
在0℃、在N2气氛中将(3R，4R)-3-(((2S)-2-乙酰氧基-N-((1R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(1，1-二甲基乙基亚磺酰氨基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(步骤3)(106mg，0.117mmol)溶于MeOH(3ml)。加入HCl4M的二噁烷溶液(0.059ml，0.235mmol)。将反应混合物在0℃搅拌1h20，然后在0℃用饱和NaHCO3猝灭。用EA稀释该溶液，用水、然后用盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。
不再纯化，得到82mg期望的产物(82mg，0.076mmol，65％收率，65％纯)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+700.5；Rt1.04min。
步骤5：(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-4-乙酰氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁基)-2-乙酰氧基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-4-氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
向在DCM(1ml)中的(步骤4)(44mg，0.041mmol)和DIPEA(0.021ml，0.123mmol)中加入乙酰氯(4.35μl，0.061mmol)。将混合物在室温搅拌1h20。用DCM稀释反应混合物，依次用水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩。
不再纯化，得到30.3mg期望的产物(30.3mg，0.041mmol，100％收率)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+742.5；Rt1.25min。
步骤6：(S)-乙酸1-(((R)-4-乙酰氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-4-乙酰氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁基)-2-乙酰氧基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将(步骤5)(30.3mg，0.041mmol)溶于乙腈(2ml)和水(1ml)。加入TFA(0.157ml，2.042mmol)，将该反应体系在60℃搅拌1h40。
用EA稀释溶液，用饱和NaHCO3、然后用盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。不再纯化，得到30.3mg期望的产物(26.2mg，0.041mmol，100％收率)，用于下一步。LC/MS(方法A)：[M+H]+642.4；Rt0.84min。
步骤7：(S)-N-((R)-4-乙酰氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
在搅拌的(S)-乙酸1-(((R)-4-乙酰氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯(步骤6)(26.2mg，0.041mmol)在甲醇(2ml)中的溶液中加入K2CO3(28.2mg，0.204mmol)，将该反应混合物在室温搅拌1h。过滤溶液，通过反相色谱法进行纯化。得到7.7mg预期的产物(7.7mg，0.011mmol，26％收率，100％纯)，为TFA盐。
LC/MS(方法B)：[M+H]+600.4；Rt3.09min。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.06(1H，brs)，8.78(1H，brs)，7.93(1H，d，3.7Hz)，7.80-7.74(1H，m)，7.60-7.55(1H，m)，7.44-7.30(6H，m)，7.17-7.09(1H，m)，5.84(1H，s)，5.40-5.06(3H，m)，4.62-4.56(1H，m)，4.05-3.90(2H，m)，3.35-3.21(2H，m)，2.90-2.80(2H，m)，2.45-2.35(1H，m)，2.00-1.85(2H，m)，1.73(3H，s)，1.38-1.41(1H，m)，1.35(3H，d，6.2Hz)，1.18-1.11(2H，m)，0.93(3H，s)，0.80(3H，s)。
合成实施例19.
步骤1：(R)-2-(((S)-2-羟基-1-苯基乙基)氨基)-2-(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙腈
将4-甲基四氢-2H-吡喃-4-甲醛(4.8g，37.5mmol)在DCM(体积：50ml)中的溶液冷却至0℃。加入(S)-(+)-苯基甘氨醇(glycinol)(5.65g，41.2mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1h。滴加三甲基甲硅烷基氰化物(7.49ml，56.2mmol)，将反应混合物在室温搅拌24h。用NaOH(2M)使反应混合物猝灭，用DCM萃取。再用NaOH(2M)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩。再溶于THF(20ml)，用10mlHCl(浓)酸化。然后用NaOH(2M)碱化，用EA萃取。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩，使其吸附在Isolute上。通过快速色谱法纯化残余物(120g，硅胶)，用庚烷/乙酸乙酯洗脱，得到两种非对映异构体：4.17g(41％收率)期望的非对映异构体，为无色油状物，1.69g(15％收率)不期望的非对映异构体。
期望的非对映异构体的分析数据：
LC/MS(方法A)：[M+H]+275.4，Rt0.88min。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ7.40-7.25(5H，m)，5.18(1H，t，J＝5.7Hz)，3.90-3.82(1H，m)，3.60-3.33(6H，m)，3.09(1H，d，J＝12.9Hz)，2.63(1H，d，J＝12.9)，1.68-1.36(3H，m)，1.31-1.22(1H，m)，1.10(3H，s)。
第二种非对映异构体的分析数据：
LC/MS(方法A)：[M+H]+275.4，Rt0.82min。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ7.42-7.21(5H，m)，4.79(1H，t，J＝5.4Hz)，3.81-3.62(4H，m)，3.55-3.42(4H，m)，2.69(1H，dd，J＝9.5，4.7Hz)，1.71-1.55(2H，m)，1.48-1.36(1H，m)，1.34-1.22(1H，m)，1.09(3H，s)。
(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸
步骤2：将(R)-2-(((S)-2-羟基-1-苯基乙基)氨基)-2-(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙腈(步骤1)(4.17g，15.20mmol)在浓HCl(57.7ml，608mmol，32％)和AcOH(25ml，437mmol)的混合物中在85℃加热3h。浓缩，与甲苯共蒸发(2次)。不进行任何纯化用于下一步。
步骤3：将残余物溶于MeOH(体积：70ml)，用N2净化该反应混合物，然后加入Pd-C(1.608g，1.511mmol，10％)，将充氢气的气囊连接隔板。给反应混合物充氢气，然后在室温在氢气气氛中搅拌3天，直到原料耗尽。通过硅藻土过滤，用MeOH洗脱，浓缩。
步骤4：将残余物混悬于DCM(体积：40ml)，加入二异丙胺(6.50ml，30.2mmol)，然后加入Boc2O(3.31g，15.2mmol)，将反应混合物在RT搅拌16h。浓缩，用NaOH(0.2M)稀释，用DCM洗涤。用HCl(4M)将水层酸化至pH1，用EA萃取产物。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩，得到期望的产物(1.89g，6.57mmol，44％收率)。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ12.59(1H，s)，6.92(1H，d，J＝9.2Hz)，3.98(1H，d，J＝9.2Hz)，3.69-3.55(2H，m)，3.54-3.42(2H，m)，1.70-1.45(2H，m)，1.39(9H，s)，1.36-1.21(2H，m)，0.99(3H，s)。
(R)-2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙基-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸酯
通过与方案1中所述类似的方法、用(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸)替代(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸，制备标题化合物；无色固体(6.9g，16.14mmol，88％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+428.2，Rt1.16min。
(R)-((4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯
通过与方案1中所述类似的方法、用(R)-2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙基-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸酯替代(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯，制备标题化合物；黄色泡沫体(6.58g，16.14mmol，100％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+408.2，Rt1.06min。
(R)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯
通过与方案1中所述类似的方法、用(R)-((4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯替代(R)-((4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，制备标题化合物；淡黄色固体(6.58g，10.58mmol，78％收率)。LC/MS(方法A)：[M+H]+498.3，Rt1.44min。
(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺
通过与方案1中所述类似的方法、用(R)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯替代(R)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，制备标题化合物；淡黄色固体(4.23g，10.58mmol，99％收率，为TFA盐)。LC/MS(方法A)：[M+H]+398.2，Rt0.90min。
(3R，4R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯
通过与方案1中所述类似的方法、用(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺替代(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺，制备标题化合物；无色油状物(360mg，0.55mmol，44％收率)。LC/MS(方法B)：[M+H]+633.3，Rt6.05min。
(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯
通过与用于合成脲化合物的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物。无色油状物(207mg，0.24mmol，42％收率，85％纯)。LC/MS(方法A)：[M+H]+734.3，Rt1.32min。
1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲
通过与用于Cbz脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物。
将TFA盐通过使其通过PL-HCO3柱转化成游离碱。无色固体(8mg，0.012mmol，14％收率)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+600.2，Rt3.71min。1H-NMR(DMSO，600MHz)(旋转异构体混合物)：δ7.87-7.80(1H，m)，7.77-7.68(1H，m)，7.43-7.26(6H，m)，7.13-7.06(1H，m)，6.13-6.05(1H，m)，5.67-5.62(1H，m)，5.37-5.22(2H，m)，5.94-4.91(1H，m)，4.66(1H，brs)，3.95-3.75(2H，m)，3.70-3.55(2H，m)，3.46-3.38(2H，m)，3.27-3.17(2H，m)，2.97-2.81(1H，m)，2.68-2.54(1H，m)，2.08-2.02(1H，m)，1.89-1.74(1H，m)，1.56-1.44(2H，m)，1.35-1.28(2H，m)，1.17-0.98(7H，m)。一些信号隐藏在溶剂峰下。
合成实施例20.
步骤1：(S)-4-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)吗啉-2-甲酸
将(S)-吗啉-2-甲酸盐酸盐[CAS154731-81-4](100mg，0.597mmol)和碳酸氢钠(251mg，2.98mmol)溶于H2O(3ml)，加入Fmoc-OSu[Aldrich，82911-69-1](302mg，0.895mmol)在二噁烷(4ml)中的溶液。将反应混合物在RT搅拌3h。分配在EtOAc与NaHCO3(饱和)之间。用EA洗涤水层，然后酸化至pH3(用HCl1M)，萃取。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。得到210mg期望的产物，为无色油状物。
无色油状物(210mg，0.582mmol，98％收率，98％纯)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+354.1，[M+NH4]+371.1，Rt0.93min。
步骤2：(S)-2-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)吗啉-4-甲酸(9H-芴-9-基)甲酯
将(S)-4-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)吗啉-2-甲酸(步骤1)(210mg，0.582mmol)溶于DCM(10ml)，然后加入DMF(7.95μl，0.103mmol)，然后加入草酰氯(0.081ml，0.924mmol)。将反应混合物在室温搅拌1h，浓缩，与甲苯一起共蒸发2次。将残余物溶于10mlDCM，冷却至0℃，加入吡啶(0.332ml，4.10mmol)，然后加入DMAP(2.507mg，0.021mmol)。最终滴加(3R，4R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(120mg，0.205mmol)在5mlDCM中的溶液。将反应混合物在0℃搅拌15min，然后在室温搅拌2h。用NaHCO3(饱和)稀释，用DCM萃取，用Na2SO4干燥，过滤，使其吸附在Isolute上。通过快速色谱法纯化残余物(40g，硅胶)，用庚烷/乙酸乙酯洗脱，得到135mg期望的产物，为无色油状物。无色油状物(135mg，0.142mmol，69％收率，97％纯)。LC/MS(方法A)：[M+H]+920.4Rt1.53min。
步骤3：(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)吗啉-2-甲酰胺
通过与哌啶在DMF中反应除去Fmoc基团。
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护(RT，16h)的通用方法中所述类似的方法，在通过反相柱色谱法纯化后制备标题化合物(23mg，0.028mmol，65％收率，为双TFA盐)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+598.2，Rt2.23min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，120℃)：δ7.83-7.77(1H，m)，7.68(1H，brs)，7.45-7.35(3H，m)，7.30-7.22(3H，m)，7.12-7.05(1H，m)，5.42-5.13(4H，m)，4.71(1H，brs)，4.05-3.92(2H，m)，3.90-3.80(2H，m)，3.73-3.64(2H，m)，3.50-3.15(9H，m)，2.72-2.61(2H，m)，2.30-2.10(1H，m)，1.50-1.20(3H，m)，0.97-0.80(1H，m)。
步骤1：(R)-2-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)吗啉-4-甲酸(9H-芴-9-基)甲酯
通过与(S)-非对映异构体所述类似的方法制备标题化合物。通过快速色谱法纯化(40g，硅胶)，用庚烷/乙酸乙酯洗脱，得到104mg期望的产物，为无色油状物。无色油状物(135mg，0.113mmol，34％收率)。LC/MS(方法A)：[M+H]+920.3Rt1.54min。
也得到(S)-非对映异构体：无色油状物(190mg，0.207mmol，62％收率)。LC/MS(方法A)：[M+H]+920.3Rt1.56min。
步骤2：(R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)吗啉-2-甲酰胺
通过与哌啶在DMF中反应除去Fmoc基团。
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护(RT，16h)的通用方法中所述类似的方法，在通过反相柱色谱法纯化后，制备标题化合物(15mg，0.018mmol，98％收率，为双TFA盐)。LC/MS(方法B)：[M+H]+598.2，Rt2.55min。
合成实施例21.4-羟基-THP-核心骨架的合成
4-((2R，5S)-5-异丙基-3，6-二甲氧基-2，5-二氢吡嗪-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇.
向预冷却的(-78℃)(S)-2-异丙基-3，6-二甲氧基-2，5-二氢吡嗪(5.4ml，30mmol，1eq)在THF(60ml)中的溶液中加入nBuLi(1.6M庚烷溶液，31.5mmol，1.1eq)。将该反应混合物在-78℃搅拌1h。1h后，加入二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮(3g，30mmol，1eq)在THF(40ml)中的溶液。将该反应混合物在-20℃搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，用AcOH(1.8ml，31.5mmol，1.1eq)的THF(15ml)溶液使该反应混合物猝灭，温热至rt。使该反应混合物分配在Et2O与H2O之间。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相柱色谱法(PrepLC方法B)纯化粗产物，得到期望的产物(7.3g，25.7mmol，86％)。LC/MS(uplc)：MH+285.2，0.96min(方法A)。
(R)-2-氨基-2-(4-羟基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸甲酯.
向4-((2R，5S)-5-异丙基-3，6-二甲氧基-2，5-二氢吡嗪-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(4.3g，15.1mmol，1eq)在THF(107ml)中的溶液中加入HCl(0.2Nm151ml，30.2mmol，2eq)。在室温搅拌该反应混合物。在通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，用NaOH(1.0M)使该反应混合物猝灭，直到pH＝8，将其作为溶液用于下一步。LC/MS(uplc)：MH+190.1，0.17min(方法D，极性方法)。
(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(4-羟基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸甲酯.
向来自上述步骤的溶液(6.62g，14mmol，1eq)中加入NaHCO3(4.1g，49mmol，3.5eq)和Cbz-Cl(5ml，35mmol，2.5eq)。在室温搅拌该反应混合物。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，使该反应体系分配在EtOAc(100ml)与H2O(100ml)之间。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物，得到期望的产物(5.4g，16.7mmol，60％)。LC/MS(uplc)：MH+324.2，0.78min。
(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸甲酯.
向冰冷却的(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(4-羟基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸甲酯(2.3g，6.4mmol，1eq)在CH2Cl2(5ml)中的溶液中加入2，6-卢剔啶(5ml，42.9mmol，6.7eq)和TBSOTf(5ml，21.8，3.4eq)。在室温搅拌该反应混合物。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，使该反应混合物分配在H2O(50ml)与CH2Cl2(50ml)之间。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物，得到期望的产物(2.1g，4.6mmol，73％)。LC/MS(uplc)：MH+438.2，1.42min(方法A)。
(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸.
向(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸甲酯(2.1g，4.9mmol，1eq)在THF中的溶液中加入KOH(1.0M，14.7ml，14.7mmol)。在室温搅拌该反应混合物。通过(uplc，方法A)证实反应完成时，用HCl(1.0M)使该反应混合物猝灭，直到pH＝4。使该反应体系分配在EtOAc(60ml)与H2O(60ml)之间。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，得到期望的产物(2.2g，4.8mmol，99％)。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+424.3，1.25min(方法A)。
(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列的类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+578.3，1.49min(方法A)。
(S)-((4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氨基甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列的类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+558.3，1.48min(方法A)。
(S)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列的类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+648.6.3，1.64min(方法A)。
(S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺.
为了制备该化合物，遵循对通用Cbz-脱保护所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+514.6，1.40min(方法A)。
(3R，4R)-3-((((S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列的类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+715.6，1.65min(方法A)。
(3R，4R)-3-((1-((S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列的类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+817.5，1.59min(方法A)。
合成实施例22.环丙醇-核心骨架的合成
以(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(1-羟基环丙基)乙酸为原料、按照所述方案制备：Esposito，A.；Paolo-Piras，P.；Ramazzotti，D.；Taddei，M.Org.Lett.2001，3，3273-3275。
(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)乙酸.
向(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(1-羟基环丙基)乙酸(3g，11.3mmol，1eq)和咪唑(2.3g，34mmol，3eq)在DMF(23ml)中的溶液中加入TBSCl(4.3g，28.3mmol，2.5eq)。在室温搅拌该反应混合物。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，使该反应混合物分配在EtOAc(100ml)与HCl(1.0M，100ml)之间。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发，得到黄色油状物。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+380.3，1.25min(方法A)。
(R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)乙酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+534.4，1.51min(方法A)。
(S)-((1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氨基甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+514.8，1.47min(方法A)。
(S)-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)甲基)氨基甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+604.1，1.64min(方法A)。
(S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)甲胺.
为了制备该化合物，遵循对通用Cbz-脱保护所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+470.3，1.26min(方法A)。
(3R，4R)-3-((((S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)甲基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+706.4，1.62min(方法A)。
(3R，4R)-3-((1-((S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+807.6，1.60min(方法A)。
(3R，4R)-3-((1-((S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)环丙基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述保护基交换(Cbz-脱保护，Boc-保护)的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法B)纯化粗产物。
Cbz-脱保护：LC/MS(uplc)：M+672.4，1.25min(方法A)。
Boc-保护：LC/MS(uplc)：M+772.7.1.61min(方法A)。
合成实施例23.2-甲氧基丙基-核心骨架的合成
(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲氧基-3-甲基丁酸
向冰冷却的NaH(60％的矿物油溶液，2.5g，64.mmol，3eq)和(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-羟基-3-甲基丁酸(5g，21.4mmol，1eq)在THF中的溶液中加入MeI(1.6ml，25.7mmol，1.2eq)，在室温搅拌该反应混合物。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，用HCl(1.0M)使该反应体系猝灭，直到pH＝3。使粗反应体系分配在EtOAc(100ml)与HCl(1.0M，100ml)之间，分离两层，用HCl(1.0M，3x100ml)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，得到(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲氧基-3-甲基丁酸。将粗产物不经任何进一步纯化用于下一步。LC/MS(uplc)：MH+248.2，0.79mi(方法D，极性方法)。
(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲氧基-3-甲基丁酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+402.2，1.20min(方法A)。
(S)-(1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)氨基甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+382.3，1.08min(方法A)。
(S)-(1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)氨基甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+472.4，1.44min(方法A)。
(S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙-1-胺.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+372.4，0.88min(方法A)。
(3R，4R)-3-((((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+573.7，1.38min(方法A)。
(3R，4R)-3-((1-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+674.4，1.34min(方法A)。
(3R，4S)-3-((((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
向(S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙-1-胺(0.7g，0.72mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(8.1g，38mmol)在CH2Cl2(3ml)中的溶液中加入(3S，4R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯在CH2Cl2中的溶液(1ml)。在室温搅拌该反应混合物，通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，使该反应混合物分配在CH2Cl2与H2O之间。分离有机层，用饱和NaHCO3溶液(2次)和H2O(2次)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相柱色谱法纯化粗产物(PrepLC方法A)，得到(3R，4S)-3-((((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(250mg，0.33mmol，46％)。LC/MS(uplc)：MH+685.9，1.76min(方法A)。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：M+799.5，1.69min(方法A)。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
向(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(108mg，0.13mmol，1eq)在THF(2ml)中的溶液中加入TBAF(1.0M的THF溶液，0.15mmol，1.1eq)。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，使该反应体系分配在NH4Cl(饱和溶液)与CH2Cl2之间。分离有机层，用NaCl(饱和溶液)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相柱色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+685.6，1.34min(方法A)。
(3R，4S)-3-(((S)-N-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法B)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+643.3，1.30min(方法A)。
(S)-N-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-2-羟基-N-(((3S，4S)-4-羟基吡咯烷-3-基)甲基)丙酰胺.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相柱色谱法(PrepLC方法B)纯化粗产物。17.6mg，0.031mmol，71％。
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ7.93-7.87(1H，m)，7.80-7.71(1H，m)，7.45-7.28(6H，m)，7.15-7.06(1H，m)，6.00-5.87(1H，m)，5.46-5.31(1H，m)，5.18-5.05(1H，m)，4.93-4.77(2H，m)，4.77-4.64(1H，m)，3.69-3.53(3H，m)，2.95-2.83(3H，m)，2.75-2.63(1H，m)，2.39-2.28(1H，m)，2.26-2.07(1H，m)，1.59-1.45(1H，m)，1.44-1.34(3H，m)，1.33-1.22(3H，m)，1.21-1.12(1H，m)，0.79-0.69(3H，m)。LC/MS(uplc)：MH+543.3，0.91min(方法A)。
合成实施例24.2-羟基丙基-核心骨架的合成
(R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-羟基-3-甲基丁酸2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+388.3，1.04min(方法A)。
(S)-(1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羟基-2-甲基丙基)氨基甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH+368.5，0.96min(方法A)。
(S)-(1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羟基-2-甲基丙基)氨基甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH2+459.5，1.36min(方法A)。
(S)-1-氨基-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲基丙-2-醇.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。不经任何进一步纯化使用粗产物。LC/MS(uplc)：MH2+359.3，0.80min(方法A)。
(3R，4R)-3-((((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羟基-2-甲基丙基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：MH+593.3，1.24min(方法A)。
(3R，4R)-3-((((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-甲基丙基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
在冰冷却的(3R，4R)-3-((((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羟基-2-甲基丙基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.5g，0.94mmol，1eq)在CH2Cl2(5ml)中的溶液中加入2，6-卢剔啶(0.7ml，5.7mmol，6eq)和TBSOTf(0.7ml，3.8ml，4eq)。在0℃搅拌该反应体系。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，使该反应体系分配在H2O(20ml)和CH2Cl2(20ml)之间。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物，得到期望的产物(0.13mmol，130mg，14％)。LC/MS(uplc)：MH+707.3，1.70min(方法A)。
(3R，4R)-3-((1-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-甲基丙基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。LC/MS(uplc)：M+808.4，1.64min(方法A)。
(3R，4R)-3-((1-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-甲基丙基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯.
为了制备该化合物，遵循对THP系列类似化合物所述的保护基交换(Cbz-脱保护，Boc-保护)的方法。通过正相色谱法(PrepLC方法A)纯化粗产物。
Cbz-脱保护：LC/MS(uplc)：M+674.4，1.33min(方法A)。
Boc-保护：LC/MS(uplc)：M+774.4.1.66min(方法A)。
合成实施例25.(3S，4R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯
用咪唑(1.65g，24.3mmol)、然后用叔丁基二甲基甲硅烷基氯(2.93g，19.4mmol)处理在DCM(54ml)中的(3S，4R)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯(4.00g，16.18mmol)，将反应混合物在室温搅拌16小时。用饱和NH4Cl水溶液使该混合物猝灭，用DCM萃取有机层。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，得到标题化合物，为淡黄色油状物，收率102％(不纯)；UPLC-MS：Rt＝1.56mins；MSm/z[M+H]+362.2；方法A。
(3S，4S)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-((R)-1，2-二羟基乙基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
在0℃向(3S，4R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯(4.90g，13.6mmol)在叔丁醇(40ml)和水(28ml)的混合物中的溶液中缓慢地加入高锰酸钾(1.63g，10.3mmol)和氢氧化钠(0.352g，8.81mmol)在水(10ml)中的溶液。将该反应混合物在0℃搅拌1小时。用DCM萃取该混合物。合并有机层，用Na2SO4干燥，通过硅藻土过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，64％收率；UPLC-MS：Rt＝1.21mins；MSm/z[M+H]+396.1；方法A。
(3S，4S)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-((R)-1，2-二羟基乙基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在氩气气氛中向(3S，4S)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-((R)-1，2-二羟基乙基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(3.41g，8.62mmol)在甲醇(55ml)中的溶液中加入10％披钯碳(0.917g，0.862mmol)，然后加入甲酸铵(6.52g，103mmol)，将该反应混合物在50℃搅拌30mins。然后将该混合物冷却至RT，用硅藻土过滤。用甲醇洗涤。向滤液中加入二碳酸二-叔丁酯(2.63g，12.1mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。通过蒸发除去甲醇，然后用乙酸乙酯和饱和NaHCO3水溶液萃取该反应混合物。然后用盐水洗涤有机层，合并有机相，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％(10％甲醇的DCM溶液)的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，85％收率；UPLC-MS：Rt＝1.25mins；MSm/z[M+H]+362.1；方法A。
(3S，4R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃向(3S，4S)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-((R)-1，2-二羟基乙基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.95g，8.16mmol)在甲醇(44ml)和水(11ml)的混合物中的溶液中加入高碘酸钠(2.09g，9.79mmol)，将该反应混合物在RT搅拌45mins。过滤该反应混合物，通过蒸发除去甲醇。加入水(15ml)，用DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，通过硅藻土过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为淡黄色油状物，100％收率；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ9.69(1H，brs)，4.57-4.53(1H，m)，3.71-3.49(3H，m)，3.24-3.19(1H，m)，3.01-2.95(1H，m)，1.45(9H，s)，0.88(9H，s)，0.08(6H，s)。
(3R，4S)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向三乙酰氧基硼氢化钠(5.77g，27.2mmol)在DCM(14ml)中的溶液中加入(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺(2.09g，5.44mmol)。向该反应混合物中缓慢地加入(3S，4R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.69g，8.16mmol)在DCM(14ml)中的溶液，将该反应混合物在RT搅拌16h。然后通过添加水使该混合物猝灭，用1MNa2S2O3水溶液和DCM萃取该反应混合物。用饱和NaHCO3水溶液、然后用盐水洗涤有机层。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，95％收率；UPLC-MS：Rt＝1.64mins；MSm/z[M+H]+697.8；方法A。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃向(3R，4S)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.79g，2.57mmol)在干DCM(26ml)中的溶液中缓慢地加入N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.63ml，3.60mmol)，然后加入(S)-乙酸1-氯-1-氧代丙-2-基酯(0.36ml，2.83mmol)。将该反应混合物在0℃搅拌5mins，然后温热至RT，再搅拌1.5h。用饱和NaHCO3水溶液使反应淬灭，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，88％收率；UPLC-MS：Rt＝1.63mins；MSm/z[M+H]+811.2；方法A。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.92g，2.37mmol)在THF(12ml)中的溶液中缓慢地加入氟化四丁基铵(0.619g，2.37mmol)。将该反应混合物在RT搅拌30mins。用饱和NH4Cl水溶液使反应淬灭，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，66％收率；UPLC-MS：Rt＝1.25mins；MSm/z[M+H]+696.9；方法A。
(3S，4R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例25类似的方式，但使用(3R，4S)-3-羟基-4-乙烯基吡咯烷-1-甲酸苄酯合成该产物；105％收率；UPLC-MS：Rt＝1.63mins；MSm/z[M+H]+697.0；方法A。
(3S，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
定量收率；UPLC-MS：Rt＝1.63mins；MSm/z[M+H]+811.0；方法A。
(3S，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
32％收率；UPLC-MS：Rt＝1.26mins；MSm/z[M+H]+696.9；方法E。
合成实施例26.
(R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙-1-胺
如WO2008086122A2，2008；P.50-52中所述制备。
(3R，4S)-3-((((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例1类似的方式，使用(R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙-1-胺合成该产物；93％收率；UPLC-MS：Rt＝2.66mins；MSm/z[M+H]+669.5；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
39％收率；UPLC-MS：Rt＝3.86mins；MSm/z[M+H]+783.6；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
43％收率；UPLC-MS：Rt＝2.96mins；MSm/z[M+H]+669.4；方法E。
合成实施例27.
(3R，4S)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((R)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向光气(20％的甲苯溶液，0.76ml，1.4mmol)在DCM(7.2ml)中的溶液中加入(3R，4S)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.50g，0.717mmol)和三乙胺(0.30ml，2.15mmol)在DCM(7.2ml)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌45mins。加入L-丙氨醇(1.26ml，16.1mmol)，将该反应体系在40℃搅拌16h。将该反应体系浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，76％收率；UPLC-MS：Rt＝1.54mins；MSm/z[M+H]+797.9；方法A。
(3R，4S)-3-((3-((R)-1-乙酰氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在RT向(3R，4S)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((R)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.43g，0.539mmol)在干DCM(5.4ml)中的溶液中缓慢地加入吡啶(0.87ml，10.8mmol)，然后加入乙酸酐(1.01ml，10.8mmol)。将该反应混合物在RT搅拌16h。将该反应体系浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，89％收率；UPLC-MS：Rt＝1.60mins；MSm/z[M+H]+840.0；方法A。
(3R，4S)-3-((3-((R)-1-乙酰氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例1中类似的方式合成该产物；76％收率；UPLC-MS：Rt＝1.23mins；MSm/z[M+H]+725.9；方法A。
合成实施例28.
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃向(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.32g，1.89mmol)在DCM(19ml)中的溶液中加入甲磺酰氯(0.74ml，9.47mmol)，然后加入三乙胺(1.3ml，9.47mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1.5h。将该反应体系浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，47％收率；UPLC-MS：Rt＝2.67mins；MSm/z[M+H]+775.5；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(693mg，0.894mmol)在MeOH(9ml)中的溶液中加入碳酸钾(148mg，1.07mmol)，将该反应混合物在RT搅拌30mins，用盐水稀释该反应体系，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到粗标题化合物，为淡黄色固体，定量收率，不经进一步纯化用于下一步；UPLC-MS：Rt＝2.54mins；MSm/z[M+H]+733.4；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(655mg，0.894mmol)在DCM(8.9ml)中的溶液中加入1H-咪唑(0.91mg，1.34mmol)，然后加入叔丁基氯化二甲基硅烷(202mg，1.34mmol)和DMAP(1mg，催化剂)，将该反应混合物在RT搅拌4h。再加入叔丁基氯化二甲基硅烷(229mg，1.52mmol)，然后加入1H-咪唑(0.55mg，0.804mmol)，将该反应体系再搅拌2天。用盐水稀释该反应体系，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为黄白色固体，36％收率；UPLC-MS：Rt＝3.32mins；MSm/z[M+H]+847.6；方法E。
(3R，4R)-3-乙酰氧基-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(52mg，0.061mmol)在DMF(0.6ml)中的溶液中加入乙酸钾(12mg，0.123mmol)，将该反应混合物在110℃搅拌2h。将该反应体系冷却至RT，用水稀释，用MTBE萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到粗产物，为黄色固体，88％收率，将其不经进一步纯化用于下一步；UPLC-MS：Rt＝3.41mins；MSm/z[M+H]+811.6；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4R)-3-乙酰氧基-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(44mg，0.054mmol)在MeOH(0.55ml)中的溶液中加入碳酸钾(8mg，0.054mmol)，将该反应混合物在RT搅拌20mins。将该反应体系浓缩至干，得到标题化合物，为淡黄色固体，定量收率，不经进一步纯化用于下一步；UPLC-MS：Rt＝3.17mins；MSm/z[M+H]+769.6；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃向(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(160mg，0.208mmol)在DCM(2.1ml)中的溶液中加入甲磺酰氯(0.08ml，1.04mmol)和三乙胺(0.15ml，1.04mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1.5h。将该反应混合物浓缩至干，通过硅胶色谱法对粗产物进行纯化，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，85％收率；UPLC-MS：Rt＝3.27mins；MSm/z[M+H]+847.6；方法E。
(3S，4R)-3-叠氮基-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)-4-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(149mg，0.176mmol)在DMF(1.8ml)中的溶液中加入叠氮化钠(0.014g，0.211mmol)，将该反应混合物在65℃搅拌18h。用水使反应淬灭，用TBME萃取，合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，72％收率；UPLC-MS：Rt＝3.55mins；MSm/z[M+H]+794.6；方法E。
合成实施例29.
3-(1-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲氧基-2-氧代亚乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯
向3-氧代氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯(5.0g，24.4mmol)和2-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(7.24g，24.4mmol)在DCM(122ml)中的溶液中滴加2，3，4，6，7，8，9，10-八氢嘧啶并[1，2-a]吖庚因(4.4ml，29.2mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。将该反应体系浓缩至干。加入水，通过添加2NHCl水溶液使该反应体系呈酸性。然后用EtOAc萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，88％收率；UPLC-MS：Rt＝2.24mins；MSm/z[M+Na]+399.1；方法E。
3-(1-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲氧基-2-氧代乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯
在氩气气氛中向3-(1-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲氧基-2-氧代亚乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯(8.0g，21.3mmol)在EtOAc(47ml)中的溶液中加入10％披钯碳(3.39g，3.19mmol)。用氢气替代所述气氛，将得到的反应混合物在RT搅拌2h。通过硅藻土过滤该反应体系，然后浓缩至干。将残余物溶于DCM(48ml)，然后在0℃添加三乙胺(5.9ml，42.5mmol)和氯甲酸苄酯(4.8ml，31.9mmol)。将该反应体系在RT搅拌72h。用2NHCl水溶液酸化该反应体系，用DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，35％收率；UPLC-MS：Rt＝1.03mins；MSm/z[M+H]+379.4；方法A。
2-(1-((苄氧基)羰基)氮杂环丁烷-3-基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酸
在0℃向3-(1-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲氧基-2-氧代乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯(2.71g，7.16mmol)在甲醇(36ml)中的溶液中滴加碳酸钾(1.98g，14.3mmol)的水(36ml)溶液，将该反应混合物在RT搅拌18h。减压除去甲醇，通过添加10％HCl水溶液使该溶液达到pH～6。然后将该反应体系浓缩至干。将得到的固体在RT在200mlDCM中搅拌2h，然后通过过滤除去固体。用Na2SO4干燥滤液，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为白色固体，89％收率，不经进一步纯化用于下一步；UPLC-MS：Rt＝0.92mins；MSm/z[M-H]-363.2；方法A。
3-(1-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙氧基)-2-氧代乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯
按照与实施例13类似的方式、但使用2-(1-((苄氧基)羰基)氮杂环丁烷-3-基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酸合成该产物；97％收率；UPLC-MS：Rt＝2.53mins；MSm/z[M+Na]+541.3；方法E。
3-(((叔丁氧羰基)氨基)(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯
81％收率；UPLC-MS：Rt＝1.82mins；MSm/z[M+H]+499.3；方法E。
3-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯
42％收率；UPLC-MS：Rt＝2.71mins；MSm/z[M+H]+589.4；方法E。
(R)-3-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯
将3-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯的外消旋混合物(4.12g)委托给在Basel的SeparationLaboratory处理(联系：Dr.EricFrancotte，Tel.+41616962971)。得到期望的富含对映体的(R)-3-(氨基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯(1.51g，99.3％ee)和不期望的(S)-3-(氨基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯(1.53g，98.0％ee)，收率为74％。通过标题化合物的x-射线晶体学建立绝对构型。
(R)-3-(氨基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸苄酯
定量收率；UPLC-MS：Rt＝1.93mins；MSm/z[M+H]+489.3；方法E。
(3R，4R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((苄氧基)羰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
34％收率；UPLC-MS：Rt＝2.27mins；MSm/z[M+H]+690.5；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((苄氧基)羰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
87％收率；UPLC-MS：Rt＝3.05mins；MSm/z[M+H]+804.5；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-氮杂环丁烷-3-基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在氩气气氛中向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((苄氧基)羰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(820mg，1.02mmol)在甲醇(10.2ml)中的溶液中加入10％披钯碳(54mg，0.051mmol)，然后加入甲酸铵(772mg，12.2mmol)，将该反应混合物在RT搅拌2h。用硅藻土过滤该反应体系，浓缩至干。加入饱和NaHCO3水溶液，用DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％MeOH的DCM溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色固体，83％收率；UPLC-MS：Rt＝1.92mins；MSm/z[M+H]+670.4；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-氮杂环丁烷-3-基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-氮杂环丁烷-3-基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(571mg，0.853mmol)在甲醇(2.8ml)中的溶液中缓慢地加入NaBH4(213mg，5.63mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌7h。通过在0℃滴加饱和NH4Cl水溶液使反应停止，用DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过反相色谱法纯化粗产物(5％TFA的MeCN溶液/5％TFA的水溶液)，冻干后得到标题化合物，为淡黄色固体，为TFA盐，35％收率；UPLC-MS：Rt＝1.79mins；MSm/z[M+H]+628.0；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-乙酰基氮杂环丁烷-3-基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
得到产物，为合成(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-氮杂环丁烷-3-基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的副产物；19％收率；UPLC-MS：Rt＝2.27mins；MSm/z[M+H]+670.3；方法E。
合成实施例30.
2-(1-((苄氧基)羰基)哌啶-4-基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酸
如WO02076450A1，2002；P.66中所述制备。
4-(1-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2-(2，5-二氟苯基)-2-氧代乙氧基)-2-氧代乙基)哌啶-1-甲酸苄酯
按照与实施例13类似的方式、但使用2-(1-((苄氧基)羰基)哌啶-4-基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酸合成该产物；96％收率；UPLC-MS：Rt＝1.27mins；MSm/z[M-H]-545.0；方法A。
4-(((叔丁氧羰基)氨基)(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯
103％收率；UPLC-MS：Rt＝1.22mins；MSm/z[M-H]-525.1；方法A。
4-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯
45％收率；UPLC-MS：Rt＝1.45mins；MSm/z[M+H]+617.5；方法A。
(R)-4-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯
将4-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯的外消旋混合物(6.00g)委托给在Basel的SeparationLaboratory处理(联系：Dr.EricFrancotte，Tel.+41616962971)。得到期望的富含对映体的(R)-4-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯(1.91g，＞99.5％ee)和不期望的(S)-4-((1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((叔丁氧羰基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯(2.20g，＞99.5％ee)，收率为69％。通过标题化合物的x-射线晶体学建立绝对构型。
(R)-4-(氨基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯
定量收率；UPLC-MS：Rt＝2.01mins；MSm/z[M+H]+517.3；方法E。
4-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯
79％收率；UPLC-MS：Rt＝2.32mins；MSm/z[M+H]+718.4；方法E。
4-((R)-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸苄酯
76％收率；UPLC-MS：Rt＝3.15mins；MSm/z[M+H]+832.5；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(哌啶-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
56％收率；UPLC-MS：Rt＝1.94mins；MSm/z[M+H]+698.4；方法E。
合成实施例31.
(3S，4S)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
如WO06066896，2006；P.385-388中所述制备。
(3R，4S)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3S，4S)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(5.23g，15.1mmol)在干DCM(38ml)中的溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(12.84g，30.3mmol)，将得到的混合物在RT搅拌1.5h。然后将该溶液加入到(R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺(5.80g，15.1mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(16.0g，76.0mmol)在DCM(38ml)中的混悬液中。将得到的混合物在RT搅拌18h。然后通过添加水使该混合物猝灭，用1MNa2S2O3水溶液和DCM萃取该反应混合物。用饱和NaHCO3水溶液、然后用盐水洗涤有机层。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为黄色油状物，51％收率；UPLC-MS：Rt＝1.61mins；MSm/z[M+H]+711.4；方法A。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃向(3R，4S)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(3.9g，5.49mmol)在DCM(55ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(1.34ml，7.68mmol)，然后加入(S)-乙酸1-氯-1-氧代丙-2-基酯(0.83ml，6.58mmol)，将该反应混合物温热至RT，搅拌16h。用DCM萃取该反应体系，用饱和NaHCO3水溶液洗涤。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，78％收率；UPLC-MS：Rt＝3.54mins；MSm/z[M+H]+825.6；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(3.55g，4.30mmol)在THF(21.5ml)中的溶液中加入TBAF(1.69g，6.45mmol)，将该反应混合物在RT搅拌2h。用饱和NH4Cl水溶液稀释该反应体系，用DCM萃取该反应体系，用盐水洗涤有机层。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，79％收率；UPLC-MS：Rt＝2.42mins；MSm/z[M+H]+711.4；方法E。
(3S，4R)-4-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-3-甲酸
在0℃向(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(300mg，0.422mmol)在丙酮(2.1ml)中的溶液中滴加2M三氧化铬的H2SO4水溶液(1.3ml，3.93mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。在0℃通过滴加异丙醇(4ml)使过量的Jones试剂猝灭。将该反应体系浓缩至干。加入水，用EtOAc萃取该反应体系，合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为固体，81％收率，将其不经进一步纯化用于下一步；UPLC-MS：Rt＝0.65mins；MSm/z[M+H]+312.1；方法A。
合成实施例32.
3-(2-(((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向2-(1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-3-基)苯甲酸(152mg，0.523mmol)在DMF(1.5ml)中的溶液中加入HATU(248mg，0.653mmol)、二异丙基乙胺(0.22ml，1.31mmol)和(R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-胺(160mg，0.435mmol)，将得到的反应混合物在RT搅拌1h。将该反应体系浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为非对映异构体混合物，为无色固体，77％收率；UPLC-MS：Rt＝2.93和2.96mins；MSm/z[M+H]+641.3；方法E。
3-(2-(((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例14类似的方式合成该产物；67％收率(非对映异构体混合物)；UPLC-MS：Rt＝2.54和2.58mins；MSm/z[M+H]+659.3；方法E。
(4R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(2-(1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-3-基)苯甲酰氨基)-3，3-二甲基丁酸
28％收率(非对映异构体混合物)；UPLC-MS：Rt＝2.64和2.65mins；MSm/z[M+H]+673.1；方法E。
合成实施例33.
3-(2-(甲氧基羰基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向2-氟苯甲酸甲酯(0.83ml，6.49mmol)在DMF(16.2ml)中的溶液中加入3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.124g，6.49mmol)和碳酸铯(10.6g，32.4mmol)，将该反应混合物在75℃搅拌18h。用水和DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为无色油状物，17％收率；UPLC-MS：Rt＝2.10mins；MSm/z[M+Na]+；方法E。
2-((1-(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷-3-基)氧基)苯甲酸
向3-(2-(甲氧基羰基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(325mg，1.06mmol)在甲醇(4.4ml)和水(0.9ml)中的溶液中加入氢氧化锂(127mg，5.29mmol)，将该反应混合物在RT搅拌18h。用1MHCl水溶液和DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为无色固体，94％收率；UPLC-MS：Rt＝1.71mins；MSm/z[M+Na]+330.0；方法E。
(R)-3-(2-((1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基甲酰基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例9类似的方式合成该产物；103％收率；UPLC-MS：Rt＝2.95mins；MSm/z[M+H]+643.2；方法E。
(R)-3-(2-((1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)氨基甲酰基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
30％收率；UPLC-MS：Rt＝2.53mins；MSm/z[M+H]+661.2；方法E。
(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(2-((1-(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷-3-基)氧基)苯甲酰氨基)-3，3-二甲基丁酸
32％收率；UPLC-MS：Rt＝2.67mins；MSm/z[M+H]+675.1；方法E。
合成实施例34.
(R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例4类似的方式合成该产物；79％收率；UPLC-MS：Rt＝1.15mins；MSm/z[M+H]+566.9；方法A。
(R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
91％收率；UPLC-MS：Rt＝1.25mins；MSm/z[M+H]+667.9；方法A。
另外的有效负荷实施例：
(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(150mg，0.215mmol)在甲醇(1.1ml)中的溶液中加入碳酸钾(36mg，0.258mmol)，将该反应混合物在RT搅拌18h。用饱和NH4Cl水溶液和DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为澄清油状物，定量收率；UPLC-MS：Rt＝1.20mins；MSm/z[M+H]+655.5；方法A。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基-N-(((3S，4S)-4-羟基吡咯烷-3-基)甲基)丙酰胺
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；61％收率；UPLC-MS：Rt＝0.78mins；MSm/z[M+H]+555.5；方法A。
(3S，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
使用与(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯类似的方案生成该产物；定量收率；UPLC-MS：Rt＝1.19mins；MSm/z[M+H]+655.0；方法A。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基-N-(((3R，4R)-4-羟基吡咯烷-3-基)甲基)丙酰胺
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；54％收率；UPLC-MS：Rt＝0.79mins；MSm/z[M+H]+555.5；方法A。
(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
使用与(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯类似的方案生成该产物；定量收率；UPLC-MS：Rt＝2.88mins；MSm/z[M+H]+627.3；方法E。
(S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基-N-(((3S，4S)-4-羟基吡咯烷-3-基)甲基)丙酰胺
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；67％收率，为TFA盐；UPLC-MS：Rt＝1.94mins；MSm/z[M+H]+527.2；方法E。1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ7.88-7.87(1H，m)，7.81-7.76(1H，m)，7.41-7.28(7H，m)，7.12-7.06(1H，m)，5.80(1H，s)，5.59-5.58(1H，m)，5.34-5.30(1H，m)，5.05-4.95(2H，m)，4.72-4.65(1H，m)，3.93-3.87(1H，m)，3.75-3.66(2H，m)，3.08-3.03(1H，m)，2.73-2.64(1H，m)，2.18-2.14(1H，m)，1.75-1.58(1H，m)，1.30-1.28(3H，m)，0.80(9H，s)。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((戊基氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(S)-乙酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4S)-4-羟基吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯(4.6mg，0.0066mmol)和二异丙基乙胺(0.0011ml，0.066mmol)在干DMF(0.07ml)中的溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(4.5mg，0.015mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。加入戊胺(0.003ml，0.027mmol)，将该反应体系在RT搅拌1.Sh。用水和EtOAc萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为淡黄色固体，99％收率；UPLC-MS：Rt＝1.16mins；MSm/z[M+H]+810.5；方法E。
(3S，4S)-戊基氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
使用用于脱保护的通用方案1使产物脱保护；43％收率；UPLC-MS：Rt＝1.96mins；MSm/z[M+H]+668.5；方法E；1H-NMR(CDCl3，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.71(2H，br)，7.72-7.67(1H，m)，7.40-7.13(7H，m)，7.04-6.92(1H，m)，6.85-6.78(1H，m)，5.67-5.64(1H，m)，5.32-4.86(3H，m)，4.65-4.38(1H，m)，3.89-1.72(15H，m)，1.51-1.07(13H，m)，0.84-0.58(3H，m)。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(戊基氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向戊胺(0.023ml，0.119mmol)在DCM(0.18ml)中的溶液中加入HATU(88mg，0.232mmol)，然后加入(3S，4R)-4-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-3-甲酸(80mg，0.110mmol)在DMF(0.18ml)中的溶液，将该反应混合物在RT搅拌1h。用水和EtOAc萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为淡黄色固体，定量收率；UPLC-MS：Rt＝1.35mins；MSm/z[M+H]+794.2；方法E。
(3S，4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-N-戊基吡咯烷-3-甲酰胺
使用用于脱保护的方案1使产物脱保护；43％收率，为TFA盐；UPLC-MS：Rt＝0.94mins；MSm/z[M+H]+652.5；方法A；1H-NMR(CDCl3，400MHz，旋转异构体混合物)：δ10.31(1H，br)，8.78(1H，br)，7.94-7.66(1H，m)，7.51-7.42(1H，m)，7.32-7.24(2H，m)，7.17-7.15(2H，m)，7.01-6.91(2H，m)，6.84-6.80(1H，m)，5.61-5.58(1H，m)，5.20-5.16(1H，m)，5.05-5.01(1H，m)，4.67-4.49(1H，m)，3.86-3.83(1H，m)，3.63-2.54(14H，m)，2.05-1.96(1H，m)，1.44-1.36(2H，m)，1.32-1.13(10H，m)，0.83-0.80(3H，m)。
(R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例1类似的方式、使用(R)-3-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯合成该产物；59％收率；UPLC-MS：Rt＝1.36mins；MSm/z[M+H]+680.9；方法A。
(R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
88％收率；UPLC-MS：Rt＝2.55mins；MSm/z[M+H]+639.4；方法E。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基-N-((S)-吡咯烷-3-基甲基)丙酰胺
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；50当量；70％收率；UPLC-MS：Rt＝0.81mins；MSm/z[M+H]+538.8；方法A；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ7.87-7.82(1H，m)，7.51-7.52(1H，m)，7.40-7.23(4H，m)，7.09-7.03(2H，m)，6.92-6.86(1H，m)，5.75-5.72(1H，m)，5.36-5.32(1H，m)，5.10-5.06(1H，m)，4.57-4.52(1H，m)，3.99-3.96(1H，m)，3.80-3.76(1H，m)，3.52-3.21(4H，m)，2.97-2.91(1H，m)，2.78-2.69(2H，m)，2.55-2.50(1H，m)，2.08-2.04(1H，m)，1.67-1.60(2H，m)，1.50-1.47(1H，m)，1.42-1.28(6H，m)，0.90-0.80(1H，m)。
1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)-1-((S)-吡咯烷-3-基甲基)脲
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；50当量TFA；60％收率；UPLC-MS：Rt＝0.82mins；MSm/z[M+H]+584.3；方法A；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ7.84-7.82(1H，m)，7.47-7.46(1H，m)，7.35-7.24(5H，m)，7.05-6.99(1H，m)，6.85-6.84(1H，m)，5.92(1H，s，br)，5.50-5.43(2H，m)，5.10-5.03(1H，m)，3.99-2.07(17H，m)，1.64-0.75(9H，m)。
(S)-N-((R)-(1-乙酰基氮杂环丁烷-3-基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；50当量；45％收率；UPLC-MS：Rt＝1.45mins；MSm/z[M+H]+570.1；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.07(1H，s，br)，8.72(1H，s，br)，7.83-7.66(2H，m)，7.44-7.28(5H，m)，7.15-7.10(1H，m)，7.03-6.98(1H，m)，6.23-5.65(1H，m)，5.52-5.10(3H，m)，4.54-4.44(1H，m)，4.34-2.69(11H，m)，2.44-2.11(2H，m)，1.70-1.55(3H，m)，1.30-0.98(3H，m)。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(甲氧基羰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-氮杂环丁烷-3-基(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(20mg，0.027mmol)在DCM(0.27ml)中的溶液中加入氯甲酸甲酯(0.0042ml，0.054mmol)、三乙胺(0.015ml，0.108mmol)和DMAP(0.3mg，0.003mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1.5h。用饱和NaHCO3水溶液和DCM萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为无色固体，124％收率；UPLC-MS：Rt＝2.51mins；MSm/z[M+H]+686.2；方法E。
3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸甲酯
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；50当量；48％收率；UPLC-MS：Rt＝1.63mins；MSm/z[M+H]+586.1；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.05(1H，s，br)，8.65(1H，s，br)，7.83-7.66(2H，m)，7.43-7.29(5H，m)，7.15-7.10(1H，m)，7.00-6.98(1H，m)，6.24-5.71(1H，m)，5.51-5.09(3H，m)，4.52-4.43(1H，m)，4.22-2.76(14H，m)，2.47-2.10(2H，m)，1.29-0.97(3H，m)。
4-((R)-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸4-硝基苯酯
向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(哌啶-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(80mg，0.115mmol)在干DMF(0.57ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(0.20ml，1.15mmol)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(70mg，0.229mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。用水和EtOAc萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到淡黄色固体，138％收率；UPLC-MS：Rt＝1.44mins；MSm/z[M+H]+863.0；方法A。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(戊基氨基甲酰基)哌啶-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将4-((R)-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸4-硝基苯酯(120mg，0.139mmol)和戊胺(0.024ml，0.209mmol)在MeOH(0.7ml)中的溶液在微波中加热至100℃1h。再加入戊胺(0.048ml，0.417mmol)，将该反应混合物在微波中再加热至100℃1h。将该循环再重复3次，直到反应完成。然后加入碳酸钾(23mg，0.167mmol)，将该反应体系在RT搅拌18h。然后用饱和NH4Cl水溶液和DCM萃取该反应体系，然用饱和NaHCO3水溶液洗涤。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物，为黄色固体，60％收率；UPLC-MS：Rt＝2.75mins；MSm/z[M+H]+769.6；方法E。
4-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-N-戊基哌啶-1-甲酰胺
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；50当量；50％收率，为TFA盐；UPLC-MS：Rt＝1.86mins；MSm/z[M+H]+669.4；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.11-9.02(1H，m)，8.84(1H，br)，7.86-7.68(2H，m)，7.41-7.38(2H，m)，7.35-7.31(1H，m)，7.28-7.26(1H，m)，7.15-7.07(2H，m)，6.35-6.32(1H，br)，5.62-5.02(4H，m)，4.54-4.36(1H，m)，4.01-3.18(9H，m)，2.95-2.94(2H，m)，2.69-2.02(4H，m)，1.45-1.17(11H，m)，0.94-0.84(5H，m)，0.49-0.40(1H，m)。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-乙酰基哌啶-4-基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与形成(S)-N-((R)-(1-乙酰基氮杂环丁烷-3-基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺类似的反应生成该产物；定量收率；UPLC-MS：Rt＝2.53mins；MSm/z[M+H]+740.5；方法A。
(S)-N-((R)-(1-乙酰基哌啶-4-基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
使用用于脱保护的方案1使产物脱保护；37％收率；UPLC-MS：Rt＝1.46mins；MSm/z[M+H]+598.4；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ8.97-8.80(1H，m)，8.63-8.53(1H，m)，7.79-7.62(2H，m)，7.34-6.99(7H，m)，5.59-5.44(1H，m)，5.33-4.95(3H，m)，4.45-1.98(14H，m)，1.88-1.79(3H，m)，1.47-0.26(7H，m)。
4-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)哌啶-1-甲酸乙酯
通过与形成(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(甲氧基羰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯类似的反应、但使用氯甲酸乙酯生成该产物；定量收率；UPLC-MS：Rt＝2.94mins；MSm/z[M+H]+770.5；方法E。
4-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)哌啶-1-甲酸乙酯
使用用于脱保护的方案1使产物脱保护；24％收率；UPLC-MS：Rt＝1.78mins；MSm/z[M+H]+628.5；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.04-8.96(1H，m)，8.68-8.59(1H，m)，7.87-7.70(2H，m)，7.42-7.07(7H，m)，5.64-5.52(1H，m)，5.41-5.02(3H，m)，4.53-4.35(1H，m)，4.03-3.18(11H，m)，2.86-2.57(3H，m)，2.27-2.06(1H，m)，1.51-1.37(1H，m)，1.31-0.40(9H，m)。
4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-2-酮
向4-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮(1.00g，8.69mmol)在DCM(80ml)中的溶液中加入咪唑(887mg，13.0mmol)和叔丁基氯化二甲基硅烷(1.57g，10.4mmol)，将该反应混合物在RT搅拌3h。将该反应体系浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到澄清油状物，101％收率；UPLC-MS：Rt＝1.95mins；MSm/z[M+H]+230.0；方法E。
1-((苄氧基)甲基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-2-酮
向4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-2-酮(2.00g，8.72mmol)在THF(29ml)中的溶液中加入氢化钠(384mg，9.59mmol)，将该反应体系在RT搅拌30mins。然后加入((氯甲氧基)甲基)苯(2.05g，13.1mmol)，将该反应混合物在RT搅拌18h。用饱和NH4Cl水溶液使反应淬灭，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到澄清油状物，11％收率；UPLC-MS：Rt＝2.79mins；MSm/z[M+Na]+372.2；方法E。
1-((苄氧基)甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮
向1-((苄氧基)甲基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-2-酮(340mg，973mmol)在THF(3.2ml)中的溶液中加入TBAF(254mg，0.973mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1.5h。用饱和NH4Cl水溶液使反应停止，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到澄清油状物，90％收率；1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.55-7.7.27(5H，m)，4.89-4.85(2H，s)，4.55-4.52(2H，s)，3.65-3.53(3H，m)，3.35-3.31(1H，m)，2.56-2.48(2H，m)，2.27-2.20(1H，m)。
4-((((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)甲基)-1-((苄氧基)甲基)吡咯烷-2-酮
按照与实施例1类似的方式、使用1-((苄氧基)甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮合成该产物，得到产物，为非对映异构体的混合物；36％收率；UPLC-MS：Rt＝1.88mins；MSm/z[M+H]+601.4；方法E。
(2S)-乙酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)((1-((苄氧基)甲基)-5-氧代吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯
按照与实施例1类似的方式合成该产物；35％收率；UPLC-MS：Rt＝2.59mins；MSm/z[M+H]+715.5；方法E。
(2S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-((1-((苄氧基)甲基)-5-氧代吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
向(2S)-1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)((1-((苄氧基)甲基)-5-氧代吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基乙酸酯(72mg，0.101mmol)在甲醇(1.0ml)中的溶液中加入碳酸钾(21mg，20.9mmol)，将该反应混合物在RT搅拌0.5h。用饱和NH4Cl水溶液使反应淬灭，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，得到产物，为淡黄色固体，95％收率；UPLC-MS：Rt＝1.21mins；MSm/z[M+H]+673.3；方法A。
(2S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基-N-((5-氧代吡咯烷-3-基)甲基)丙酰胺
向(2S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-((1-((苄氧基)甲基)-5-氧代吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺(65mg，0.096mmol)在DCM(1.0ml)中的溶液中滴加1.25MHCl的MeOH溶液(1.22ml，1.53mmol)，将该反应混合物在60℃搅拌18h。用饱和NaHCO3水溶液使反应淬灭，用DCM萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，13％收率；UPLC-MS：Rt＝0.97mins；MSm/z[M+H]+553.4；方法A；1H-NMR(CDCl3，400MHz，旋转异构体混合物)：δ7.76-7.70(1H，m)，7.45-7.42(1H，m)，7.29-7.24(3H，m)，7.14-7.13(2H，m)，7.00-6.92(1H，m)，6.83-6.79(1H，m)，5.66-5.63(1H，m)，5.25-5.19(1H，m)，5.01-4.95(1H，m)，4.33-4.26(1H，m)，3.90-3.87(1H，m)，3.71-3.68(1H，m)，3.54-3.08(5H，m)，2.91-2.74(1H，m)，2.68-2.59(1H，m)，2.35-0.71(8H，m)。
(R)-3-(2-((1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-4-氧代-4-(戊基氨基)丁基)氨基甲酰基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(2-((1-(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷-3-基)氧基)苯甲酰氨基)-3，3-二甲基丁酸(30mg，0.044mmol)在DMF(0.45ml)中的溶液中加入HATU(20.3mg，0.053mmol)、二异丙基乙胺(0.04ml，0.222mmol)和戊胺(0.006ml，0.049mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。再加入HATU(8.5mg，0.022mmol)、二异丙基乙胺(0.023ml，0.133mmol)和戊胺(0.005ml，0.044mmol)，将该反应混合物在RT搅拌0.5h。用2MNa2CO3水溶液和EtOAc萃取该反应体系。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％EtOAc的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为无色固体，109％收率；UPLC-MS：Rt＝2.72mins；MSm/z[M+H]+744.3；方法E。
(R)-2-(氮杂环丁烷-3-基氧基)-N-(1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基-4-氧代-4-(戊基氨基)丁基)苯甲酰胺
使用用于脱保护的通用方案2使产物脱保护；20当量TFA；83％收率(TFA盐)；UPLC-MS：Rt＝1.96mins；MSm/z[M+H]+644.2；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ9.01-9.00(1H，m)，8.94-8.85(2H，m)，7.97-7.94(1H，m)，7.78-7.74(1H，m)，7.65-7.63(1H，m)，7.59-7.58(1H，m)，7.46-7.42(1H，m)，7.38-7.24(6H，m)，7.11-7.06(2H，m)，6.82-6.80(1H，m)，5.56-5.39(3H，m)，5.18-5.12(1H，m)，4.50-4.46(1H，m)，4.40-4.36(1H，m)，4.30-4.24(1H，m)，4.18-4.12(1H，m)，3.10-2.93(2H，m)，2.77-2.74(1H，m)，2.23-2.20(1H，m)，1.38-1.31(2H，m)，1.24-1.19(4H，m)，1.09(3H，s)，0.94(3H，s)，0.83-0.79(3H，m)。
合成实施例35.苄基修饰
(R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-胺，TFA盐
将11g(R)-(1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯和9mLTFA在150mLDCM中的溶液在室温搅拌16h。真空浓缩该反应混合物，得到18.8g棕色/绿色油状物。将该物质直接用于下一步(推定100％转化率和48.5％纯度)。UPLC-MS：Rt＝0.73mins；MSm/z[M+H]+278.2；方法A。
(3R，4R)-3-((((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯- 1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯
步骤1：将搅拌的(3R，4S)-3-氟-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(8.28g)在干DCM(100mL)中的溶液置于氩气气氛中，通过使用包含环境温度水的水浴保持该溶液的温度恒定。(在类似反应中，发现温度控制是重要的：如果反应混合物的温度热几度，则氟基团的消去发生至一定程度。类似地，如果反应在较为冷却的温度(0℃-10℃)下进行，则氧化反应的速度不够快)。然后一次加入戴斯-马丁高碘烷(15.85g)，将该反应混合物在(约)18℃搅拌20分钟，然后直接用于步骤2。
步骤2：将来自步骤1的反应混合物-通过0.45umPTFE注射器式滤器-过滤入搅拌的(R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-胺TFA盐(18.84g)和三乙酰氧基硼氢化钠(19.8g)在干DCM(150mL)中的溶液。注意：将该溶液预先超声处理以分散和溶解任意大块的三乙酰氧基硼氢化物。在氩气气氛中持续搅拌-同时确保温度不超过20℃(通过使用自来水浴)。2小时后，LC-MS显示实际上反应完成，31％转化为期望的产物。通过添加去离子水(150mL)使反应淬灭，将得到的淤浆在RT剧烈搅拌1小时。通过1号滤纸过滤得到的无机固体，通过逐步添加碳酸氢钠缓慢地使滤液呈碱性-同时还剧烈搅拌。一旦添加碳酸氢钠完成(不再观察到泡腾)，将双相溶液转入分液漏斗，分离各层。再用二氯甲烷(2x100mL)萃取水层。用饱和碳酸氢盐(150ml)、饱和盐水(150mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩。得到深棕色油状物。如下直接纯化该物：
系统：BiotageSP4正相纯化系统
固定相：40+M硅胶柱
二元溶剂系统：极性溶剂：20％v/v甲醇/二氯甲烷；非-极性溶剂：二氯甲烷
梯度：0％非极性/极性溶剂维持25分钟，然后历经35分钟变换至40％极性溶剂-然后维持在该水平再经过15分钟-此时，已经从柱上洗脱下产物。合并包含产物的级分，真空浓缩，得到12.65g深棕色玻璃样油状物，通过LCMS证实约47％纯。UPLC-MS：Rt＝1.15min；MSm/z[M+H]+514.3；方法A。
将该物质直接用于下一步。
(3R，4R)-3-((((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪 唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯
在室温和氩气气氛中向(3R，4R)-3-((((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(12.65g)和甲磺酸3-(甲氧基甲氧基)苄酯(8.57g，根据Bioorg.Med.Chem.2006，14，1771-1784制备)在无水DMF(100ml)中的溶液中加入碳酸钾(8.02g)。安装水冷凝器，将该混合物在75℃搅拌3小时-此时，LC-MS显示反应完成。将该反应混合物冷却至室温，使其分配在去离子水(120mL)与乙酸乙酯(120ml)之间。萃取后，再用乙酸乙酯(150mL)萃取水相。然后用饱和盐水(120mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩。得到深棕色油状物。粗产物收率：19.88g。如下直接纯化该物质：
系统：BiotageSP4正相纯化系统
固定相：40+M硅胶柱
二元溶剂系统：极性溶剂：乙酸乙酯；非-极性溶剂：正庚烷
阶式梯度：
1.0％极性溶剂-->维持5分钟
2.0％极性溶剂-->15分钟内变换至5％极性溶剂
3.5％极性溶剂-->维持10分钟
4.5％极性溶剂-->10分钟内变换至7％极性溶剂
5.7％极性溶剂-->维持20分钟
6.7％极性溶剂-->10分钟内变换至12％极性溶剂
7.12％极性溶剂-->维持3分钟
8.12％极性溶剂-->10分钟内变换至20％极性溶剂
9.20％极性溶剂-->维持10分钟
10.20％极性溶剂-->10分钟内变换至25％极性溶剂
11.25％极性溶剂-->维持30分钟
在7％极性溶剂与12％极性溶剂之间从柱上开始洗脱下期望的产物。合并包含产物的级分，真空浓缩，得到棕色油状物。收率：7.7g-通过LC-MS证实65％纯。UPLC-MS：Rt＝1.25min；MSm/z[M+H]+664.5；方法A。将该物质直接用于下一步。
(3R，4R)-3-((((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)- 1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯
按照与(3R，4R)-3-((((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯类似的方式制备。UPLC-MS：Rt＝5.73min；方法B。
将该物质直接用于下一步。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲 氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1- 甲酸苄酯
用冰浴将(3R，4R)-3-((((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(3.85g)在无水DCM(50mL)中的溶液冷却至0℃。向该溶液中加入DIPEA(1.978mL)和(S)-乙酸1-氯-1-氧代丙-2-基酯(0.956mL，Fluka)-观察到浑浊烟雾。将深橙色反应混合物温热至室温，持续搅拌1小时，此时LC-MS显示反应完全转化成期望的产物。高度真空干燥挥发性物质，如下直接纯化粗物质：
系统：BiotageSP4正相纯化系统
固定相：40+M硅胶柱
二元溶剂系统：极性溶剂：乙酸乙酯；非-极性溶剂：正庚烷
阶式梯度：
1.0％极性溶剂-->维持10分钟
2.0％极性溶剂-->20分钟内变换至46％极性溶剂
3.46％极性溶剂-->维持30分钟-截止到该阶段，已经从柱上洗脱下所有期望的产物。此时终止运行。
合并包含产物的级分，真空浓缩，得到棕色油状物。收率：2.545g-通过LC-MS证实95％纯。UPLC-MS：Rt＝1.49min；MSm/z[M+H]+777.5；方法A。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧 基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯 烷-1-甲酸苄酯
用冰浴将(3R，4R)-3-((((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.2g)在无水DCM(20mL)中的溶液冷却至0℃。向该溶液中加入DIPEA(0.822mL)和(S)-乙酸1-氯-1-氧代丙-2-基酯(0.397mL，Fluka)-观察到浑浊烟雾。将深橙色反应混合物温热至RT，持续搅拌1小时，此时LC-MS显示反应完全转化成期望的产物。然后使该反应混合物分配在去离子水(100mL)与二氯甲烷(70ml)之间。萃取后，再用二氯甲烷(70mL)萃取水相。然后用饱和盐水(100mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到深橙色油状物。收率：1.4g；UPLC-MS：Rt＝1.46min；MSm/z[M+H]+796.5；方法A。
该物质具有适合纯度直接用于下一步，无需进一步纯化。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲 氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲 酸苄酯
用冰浴将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(2.545g)在无水THF(25mL)中的溶液冷却至0℃，然后通过滴加1.0M硼烷THF复合物(12.45mL)处理。将该反应混合物温热至室温，持续搅拌4小时。然后将该反应混合物冷却至0℃，通过依次添加1∶1的THF∶EtOH混合物(70mL)、pH7.0磷酸盐缓冲溶液(90mL)和30％过氧化氢溶液(4.45mL)使过量的硼烷猝灭。将该反应混合物在室温保持搅拌16小时，然后向该混合物中加入饱和盐水(15ml)。将该混合物转入分液漏斗，用乙酸乙酯(2x200ml)萃取。用20％w/vNa2S2O5(3x80ml)、饱和盐水(150ml)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到浅棕色蜡样固体。
收率：2.5917g-通过LC-MS证实61％纯。将该物质无需纯化用于下一步。UPLC-MS：Rt＝1.29min；MSm/z[M+H]+795.6；方法A。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧 基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷- 1-甲酸苄酯
将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.4g)在无水THF(25mL)中的溶液置于氩气气氛中，用冰浴冷却至0℃。然后通过滴加1.0M硼烷THF复合物(6.27mL)处理。将该反应混合物温热至室温，持续搅拌4小时。然后将该混合物冷却至0℃，通过依次添加1∶1THF∶EtOH混合物(70mL)、pH7.0磷酸盐缓冲溶液(90mL)和30％过氧化氢溶液(2.24mL)使过量的硼烷猝灭。将该混合物在室温保持搅拌16小时，然后向该混合物中加入饱和盐水(15ml)。将该混合物转入分液漏斗，用乙酸乙酯(2x200ml)萃取。用20％w/vNa2S2O5(2x80ml)、饱和盐水(150ml)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到浅棕色蜡样固体。收率：1.445g-通过LC-MS证实74％纯。将该物质无需纯化用于下一步。UPLC-MS：Rt＝1.28min；MSm/z[M+H]+814.7；方法A。
(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑- 2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2- 基酯
向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄酯(2.59g)在甲醇(50ml)中的溶液中-已经充氩气-加入甲酸铵(2.508g)和5wt％披钯碳(423mg)。将得到的黑色混悬液在氩气气氛中在50℃搅拌2小时，此时LC-MS显示反应完成。通过1号滤纸过滤该反应混合物-用甲醇(2x30ml)和二氯甲烷(30ml)洗涤钯催化剂滤饼。然后将滤液直接用于下一步(推定100％的转化率，纯度为60％)UPLC-MS：Rt＝0.85min；MSm/z[M+H]+661.8；方法A。
(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H- 咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代 丙-2-基酯
向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸苄基酯(1.445g)在甲醇(20ml)中的溶液中-已经充氩气-加入甲酸铵(2.489g)和5wt％披钯碳(280mg)。将得到的黑色混悬液在氩气气氛中在50℃搅拌1.5小时，此时LC-MS显示反应完成。通过1号滤纸过滤该反应混合物-用甲醇(2x30ml)和二氯甲烷(30ml)洗涤钯催化剂滤饼。然后将滤液直接用于下一步(推定100％的转化率，纯度为76％)。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲 氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲 酸叔丁酯
向新鲜制备的包含(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯的滤液中再加入甲醇(50mL)和BOC酸酐(0.864g)。将该反应混合物在RT搅拌30分钟，此时LC-MS显示吡咯烷BOC-保护完成。真空浓缩挥发性物质，使残余物分配在乙酸乙酯(150mL)与去离子水(100mL)之间。将该混合物转入分液漏斗，萃取后，用乙酸乙酯(100ml)再萃取水相。注意：在萃取过程中，形成乳状液。通过向分液漏斗中添加少量饱和盐水将其再溶解。然后用饱和盐水(150ml)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到实际上澄清和无色油状物。粗产物收率：2.695g，通过LC-MS254nm证实56％纯。如下进行纯化：
系统：BiotageSP4正相纯化系统
固定相：25+M硅胶柱
二元溶剂系统：极性溶剂：乙酸乙酯；非-极性溶剂：正庚烷
阶式梯度：
1.0％极性溶剂-->维持5分钟
2.0％极性溶剂-->历经30分钟变换至80％极性溶剂
3.80％极性溶剂-->维持25分钟
4.80％极性溶剂-->历经10分钟变换至100％极性溶剂
5.100％极性溶剂-->维持15分钟
合并包含产物的级分，高度真空浓缩，得到白色泡沫体。收率：1.25g，通过LC-MS254nm证实87％纯。UPLC-MS：Rt＝1.30min；MSm/z[M+H]+761.6；方法A。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧 基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷- 1-甲酸叔丁酯
向新鲜制备的包含(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯的滤液中再加入甲醇(20mL)和BOC酸酐(0.767g)。将该反应混合物在室温搅拌1小时，此时LC-MS显示吡咯烷BOC-保护完成。真空浓缩挥发性物质，如下直接纯化：
系统：BiotageSP4正相纯化系统
固定相：25+M硅胶柱
二元溶剂系统：极性溶剂：乙酸乙酯；非-极性溶剂：正庚烷
阶式梯度：
1.0％极性溶剂-->维持5分钟
2.0％极性溶剂-->30分钟内变换至50％极性溶剂
3.50％极性溶剂-->维持10分钟
4.50％极性溶剂-->20分钟内变换至80％极性溶剂
5.80％极性溶剂-->维持10分钟
合并包含产物的级分，高度真空浓缩，得到几乎澄清和无色蜡样油状物。收率：0.676g，通过LC-MS254nm证实96％纯。UPLC-MS：Rt＝1.28min；MSm/z[M+H]+780.5；方法A。
(S)-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2， 2-二甲基丁基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(50mg)在乙腈(1ml)中的溶液中加入6MHCl(0.998mL)，将反应混合物在60℃搅拌3小时，此时LC-MS显示反应完成，完全转化为期望的产物。将该混合物通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤，通过反相制备型HPLC方法C纯化得到的澄清溶液。合并包含产物的级分，真空浓缩，得到黄白色粉末。收率：12.9mg，UPLC-MS：Rt＝0.77min；MSm/z[M+H]+575.2；方法A。UPLC-MS：Rt＝2.87min；MSm/z[M+H]+575.2；方法B。
(S)-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟 基-2，2-二甲基丁基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(50mg)在乙腈(1ml)中的溶液中加入6MHCl(1.03mL)，将该混合物在60℃搅拌2小时，此时LC-MS显示反应完成，完全转化为期望的产物。将该混合物通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤，通过反相制备型HPLC方法C纯化得到的澄清溶液。合并包含产物的级分，冻干过夜，得到黄白色松散粉末。收率：19.4mg；UPLC-MS：Rt＝0.70min；MSm/z[M+H]+593.1；方法A。UPLC-MS：Rt＝2.59min；MSm/z[M+H]+593.2；方法B。1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ10.10(s，1H)，9.04(s，1H)，8.71(s，1H)，7.91(s，1H)，7.80-7.73(m，1H)，7.41-7.30(m，1H)，7.18-7.09(m，1H)，6.69-6.57(m，2H)，6.52(dd，J＝16.2，10.3Hz，1H)，5.80(s，1H)，5.39-5.21(m，2H)，4.97(d，J＝15.5Hz，1H)，4.64-4.57(m，1H)，4.08-3.98(m，1H)，3.95-3.85(m，1H)，3.37-3.27(m，2H)，3.23(dt，J＝9.9，5.0Hz，2H)，2.48-2.36(m，1H)，2.08-1.95(m，1H)，1.94-1.86(m，1H)，1.51(ddd，J＝23.3，13.9，6.7Hz，1H)，1.35(t，J＝7.0Hz，3H)，1.30-1.22(m，1H)，0.93(s，3H)，0.84(s，3H)。
(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲 基)丙酰氨基)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-3，3- 二甲基丁酸
向冷却的(0℃)(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(520mg)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入吡啶重铬酸盐(783mg)。添加完成后，将深红棕色/雾状橙色反应混合物在RT搅拌过夜，此时颜色变成深棕色。使反应混合物分配在乙酸乙酯(150mL)与去离子水(100mL)之间。将该混合物转入分液漏斗，萃取后，再用乙酸乙酯(2x100ml)萃取水相。然后用去离子水(100ml)、饱和盐水(150ml)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到棕色蜡样油状物。粗产物收率：563.8mg；UPLC-MS：Rt＝1.27min；MSm/z[M+H]+775.4；[M-H]-773.4方法A。
(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲 基)丙酰氨基)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)- 3，3-二甲基丁酸
向冷却的(0℃)(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(300mg)在无水DMF(5mL)中的溶液中加入吡啶重铬酸盐(974mg)。添加完成后，将深红棕色/雾状橙色反应混合物在RT搅拌过夜，此时颜色变成深棕色。使反应混合物分配在乙酸乙酯(100mL)与去离子水(100mL)之间。将该混合物转入分液漏斗，萃取后，再用乙酸乙酯(2x100ml)萃取水相。然后用去离子水(100ml)、饱和盐水(150ml)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到棕色蜡样油状物。粗产物收率：322mg；UPLC-MS：Rt＝1.26min；MSm/z[M-H]-791.2方法A。
(R)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S， 4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-N，3，3-三甲基丁酰胺
步骤1：向(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-3，3-二甲基丁酸(60mg)和DIPEA(189μL)在无水DMF(2mL)中的溶液中加入HATU(124mg)。将反应混合物在RT搅拌10分钟，然后加入甲胺盐酸盐(73mg)。将反应混合物在RT搅拌过夜，此时LC-MS显示反应完成。高度真空除去挥发性物质，将粗残余物溶于1∶1乙腈∶水的混合物(4ml)。通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤反应混合物，将得到的澄清溶液分成2x2mL批量，通过反相制备型HPLC方法C纯化。合并来自两次运行的包含产物的级分，真空浓缩，得到淡蓝色固体：收率：15mg，将该物质直接用于下一步：
步骤2：BOC&MOM脱保护：向来自步骤1的粗产物中加入乙腈(1ml)和6MHCl(1.08mL)。将反应混合物在50℃搅拌2小时，此时LC-MS显示反应已经进行完成脱保护，得到期望的终产物。通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤反应混合物，然后通过反相制备型HPLC方法C纯化。将包含产物的级分冻干过夜，得到白色松散粉末。收率：8.9mg。UPLC-MS：Rt＝2.41min；MSm/z[M+H]+603.3；方法B。1H-NMR(HSQC)与目标结构一致。
(R)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N- (((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-N，3，3-三甲基丁酰胺
步骤1：向(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-3，3-二甲基丁酸(60mg)和DIPEA(264μL)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入HATU(173mg)。将反应混合物在RT搅拌10分钟，然后加入甲胺盐酸盐(102mg)。将反应混合物在RT搅拌2小时，此时LC-MS显示反应完成。高度真空浓缩反应混合物，得到棕色蜡样油状物。将其直接用于下一步。
步骤2：BOC、MOM&酰基脱保护：将来自步骤1的粗产物溶于乙腈(2ml)，加入6MHCl(1.5mL)。将反应混合物在60℃搅拌2小时，此时LC-MS显示反应已经进行完成脱保护，得到终产物。然后使反应混合物分配在去离子水(50mL)与乙酸乙酯(50ml)之间。萃取后，再用乙酸乙酯(70mL)萃取水相。然后用饱和盐水(70mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到类白色固体。将反应混合物溶于2∶1的水∶乙腈溶液(4mL)，将其通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤。将得到的溶液分成2x2mL批量，通过反相制备型HPLC方法C纯化。合并包含产物的级分，然后冻干过夜，得到白色松散粉末。收率：18.9mg。
UPLC-MS：Rt＝2.41min；MSm/z[M+H]+618.3；方法B。
1H-NMR(HSQC)与目标结构一致。
有效负荷-连接基组合的合成
可裂解的连接基：MC-ValCit-PABCADCs：
向有效负荷(0.05mmol，1eq)在DMSO(0.1M)中的溶液中加入iPr2EtN(6eq)和4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(0.09mmol，1.6eq)。在室温搅拌该反应混合物。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，过滤粗产物，以除去固体，直接通过反相柱色谱法纯化(使用PrepLC方法C或D)，得到期望的MC-ValCit-PABC-有效负荷，为TFA盐。
3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸(3R，4R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯.
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.98(1H，m)，8.09(1H，m)，7.80(1H，m)，7.74(1H，m)，7.71(2H，m)，7.56(2H，m)，7.37(3H，m)，.7.31(4H，m)，7.09(1H，m)，7.00(2H，m)，6.01(1H，m)，5.68(1H，m)，5.28(1H，m)，5.18(1H，m)，5.15(2H，m)，5.01(1H，m)，4.88(1H，m)，4.73(1H，m)4.50(1H，m)，4.39(1H，m)，4.21(1H，m)，3.80(1H，m)，3.50-3.25(8H，m)，3.37(2H，m)，3.03(1H，m)，2.98(1H，m)，2.82(1H，m)，2.60(1H，m)，2.30(1H，m)，2.20(1H，m)，2.18(1H，m)，2.14(1H，m)，2.13(1H，m)，2.12(1H，m)，1.98(1H，m)，1.71(1H，m)，1.50(3H，m)，1.49-1.35(3H，m)，1.27(3H，m)，1.23(1H，m)，1.10(1H，m)，0.98(1H，m)，0.86(6H，m)，0.70(1H，m)。丢失的峰隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：M+：1155.5，1.07min(方法A)。
3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸(3R，4R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯.
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.99(1H，m)，8.09(1H，m)，7.80(1H，m)，7.71(2H，m)，7.57(3H，m)，7.35(2H，m)，7.30(4H，m)，7.23(1H，m)，7.09(1H，m)，7.00(2H，s)，5.97(2H，m)，5.35(2H，m)，5.07(2H，m)，4.89(1H，m)，4.77(1H，m)，4.42(1H，m)，4.20(1H，m)，3.84(1H，m)，3.79(1H，m)，3.64(2H，m)，3.40-3.23(8H，m)，3.03(1H，m)，2.96(2H，m)，2.81(1H，m)，2.57(1H，m)，2.25(1H，m)，2.15(2H，m)，2.00(1H，m)，1.66(2H，m)，1.52-1.25(8H，m)，1.21(2H，m)，1.07(3H，m)，0.84(6H，m)，0.77(1H，m)。丢失的峰隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：M+1184.5，1185.5(+H)，1.04min(方法A)。
3-(((3S，4R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3，4-二羟基吡咯烷-1-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸(3R，4R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯.
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.99(1H，m)，8.08(1H，m)，7.80(1H，m)，7.71(2H，m)，7.58(2H，m)，7.36(2H，m)，7.21(2H，m)，7.20(2H，m)，7.17(2H，m)，7.09(1H，m)，7.00(2H，s)，6.01(1H，m)，5.75(1H，m)，5.37(1H，m)，5.13(1H，m)，4.89(3H，m)，4.41(1H，m)，4.21(1H，m)，4.06(1H，m)，3.98(1H，m)，3.82(1H，m)，3.41(1H，m)，3.37(2H，m)，3.32(2H，m)，3.13(2H，m)，3.05(1H，m)，2.97(2H，m)，2.38(1H，m)，2.35-2.05(3H，m)，1.97(2H，m)，1.70(2H，m)，1.65(2H，m)，1.60-1.40(6H，m)，1.36(2H，m)，1.19(2H，m)，1.04(1H，m)，1.01(1H，m)，0.87(6H，m)，0.46(2H，m)。丢失的峰隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：M+1212.4，2.48min。
((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯.
1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ10.03-9.92(1H，m)，9.09-8.90(1H，m)，8.66-8.47(1H，m)，8.14-7.96(1H，m)，7.84-7.70(3H，m)，7.68-7.53(2H，m)，7.47-7.36(2H，m)，7.36-7.21(7H，m)，7.17-7.06(1H，m)，7.06-6.94(2H，m)，6.34-6.11(1H，m)，6.10-5.90(1H，m)，5.41-5.09(4H，m)，5.05-4.89(2H，m)，4.46-4.31(1H，m)，4.31-4.14(1H，m)，3.91-3.79(3H，m)，3.79-3.69(1H，m)，3.65-3.53(1H，m)，3.52-3.27(6H，m)，3.26-3.16(1H，m)，3.16-3.07(2H，m)，3.07-2.99(1H，m)，2.99-2.89(1H，m)，2.63-2.47(2H，m)，2.45-2.29(1H，m)，2.27-2.04(2H，m)，2.03-1.86(2H，m)，1.77-1.65(1H，m)，1.65-1.55(1H，m)，1.55-1.31(7H，m)，1.30-1.14(4H，m)，1.11-0.96(3H，m)，0.91-0.78(6H，m)，0.75-0.61(1H，m)。丢失的峰隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：M+1183.6.0.94min(方法A)。
3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸(3R，4S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯
10％收率。UPLC-MS：Rt＝1.01mins；MSm/z[M+H]+1153.4；方法A。
3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸(R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯
14％收率；UPLC-MS：Rt＝1.09mins；MSm/z[M+H]+1137.4；方法A。
稳定的连接基：
a)氨基甲酸酯连接
向Boc-有效负荷(0.09mmol，1eq)在DMF(0.1M)中的溶液中加入iPr2EtN(0.9mmol，10eq)，然后加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(0.14mmol，1.6eq)，在室温搅拌1h。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，加入连接基(3eq)，将该反应混合物在室温搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，减压蒸发溶剂。通过正相色谱法(PrepLC方法B)纯化后得到期望的产物(Boc-L-P)。
b)酰胺连接
向羧酸连接基(0.23mmo，1.8eq)、HATU(0.27mmol，2.1eq)在DMF(0.3M)中的溶液中加入iPr2EtN(1.4mmol，11eq)，然后添加Boc-有效负荷(0.13mmol，1eq)。将该反应混合物在室温搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，用EtOAc稀释该反应混合物，使其分配在EtOAc与H2O之间。分离有机层，用H2O洗涤(2次)，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相柱色谱法(PrepLC方法B)纯化后得到期望的产物。
c)Click化学
向叠氮化物-Boc-有效负荷(0.05mmol，1eq)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2，5-二酮(0.078mmo，1.5eq)在THF(0.1M)中的溶液中加入CuSO4.5H2O和抗坏血酸钠H2O溶液(1M)。在室温搅拌该反应混合物。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，用EtOAc稀释该反应混合物，使其分配在EtOAc与H2O之间。分离有机层，用H2O洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相柱色谱法(PrepLC方法B)分离期望的产物。
d)磺基GMBS偶联
向Boc-有效负荷(0.05mmol，1eq)在CH2Cl2(0.1M)中的溶液中加入iPr2EtNH(0.30mmol，6eq)和1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-氧代-4-(全氟苯氧基)丁-2-磺酸(0.15mmol，3eq)。将该反应体系在室温搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，减压蒸发溶剂。通过正相柱色谱法(PrepLC方法B)分离期望的产物，为非对映体混合物。
用于连接基连接的通用方案1
向Boc-有效负荷(1当量)在干DMF(0.1M)中的溶液中加入iPr2EtN(10当量)，然后加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(2.2当量)，将该反应体系在室温搅拌30mins。通过LC/MS(uplc)证实反应完成时，加入连接基(4eq)，将该反应体系在室温搅拌1h。用水使反应淬灭，用乙酸乙酯萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
80％收率；UPLC-MS：Rt＝1.24mins；MSm/z[M+H]+863.1；方法A。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
使用通用方案1、但使用1.5当量的碳酸双(4-硝基苯基)酯、1.5当量的氯化2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙胺鎓作为胺和15当量的DIPEA合成该产物，得到期望的产物，32％收率；UPLC-MS：Rt＝2.62mins；MSm/z[M+H]+907.5；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
使用通用方案1、但使用6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己-1-胺鎓2，2，2-三氟乙酸盐作为胺合成该产物，得到期望的产物，86％收率；UPLC-MS：Rt＝1.35mins；MSm/z[M+H]+919.2；方法A。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
使用通用方案1、但使用1.5当量的碳酸双(4-硝基苯基)酯、1.5当量的3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-鎓2，2，2-三氟乙酸盐作为胺和15当量的DIPEA合成该产物，得到期望的产物，39％收率；UPLC-MS：Rt＝2.66mins；MSm/z[M+H]+889.4；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
使用通用方案1、但使用1.5当量的碳酸双(4-硝基苯基)酯、1.5当量的3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-3-氧代丙-1-胺鎓2，2，2-三氟乙盐作为胺和15当量的DIPEA合成该产物，得到期望的产物，80％收率；UPLC-MS：Rt＝2.66mins；MSm/z[M+H]+934.3；方法E。
(3S，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
81％收率；UPLC-MS：Rt＝1.27mins；MSm/z[M+H]+863.3；方法A。
(3S，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-(((2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
50％收率；UPLC-MS：Rt＝1.28mins；MSm/z[M+H]+907.3；方法A。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
67％收率；UPLC-MS：Rt＝3.05mins；MSm/z[M+H]+835.5；方法E。
(3R，4S)-3-((3-((R)-1-乙酰氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
70％收率；UPLC-MS：Rt＝1.26mins；MSm/z[M+H]+892.5；方法E。
(3R，4S)-3-((3-((R)-1-乙酰氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-(((2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
45％收率；UPLC-MS：Rt＝1.28mins；MSm/z[M+H]+936.3；方法A。
(R)-3-((S)-2-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-14-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-3，8-二氧代-7，12-二氧杂-2，4，9-三氮杂十四基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
31％收率；UPLC-MS：Rt＝1.29mins；MSm/z[M+H]+878.2；方法A。
(3R，4R)-3-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-((3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)氧基)丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
34％收率；UPLC-MS：Rt＝1.28mins；MSm/z[M+H]+878.2；方法A。
连接基连接的通用方案2
向Boc-有效负荷(1当量)在干DMF(0.2M)中的溶液中加入iPr2EtN(3当量)，然后加入2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基(4-硝基苯基)碳酸酯(1.1当量)，将该反应体系在室温搅拌1h。在通过LC/MS(uplc)证实完成时，用水使反应淬灭，用乙酸乙酯萃取。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)羰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
42％收率；UPLC-MS：Rt＝2.49mins；MSm/z[M+H]+795.3；方法E。
4-((R)-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙酯
32％收率；UPLC-MS：Rt＝2.74mins；MSm/z[M+H]+909.6；方法E。
用于连接基连接的通用方案3
向羧酸连接基(1.8当量)、HATU(2.1当量)在DCM中的溶液(0.2M)中加入iPr2EtN(11当量)，然后加入在DMF中的Boc-有效负荷(1当量)(1∶9与DCM之比)。将该反应混合物在RT搅拌1h。通过LC/MS(uplc)证实反应完成时，用EtOAc稀释该反应混合物，使其分配在EtOAc与H2O之间。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)哌啶-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
99％收率；UPLC-MS：Rt＝2.58mins；MSm/z[M+H]+849.5；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰基)哌啶-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
99％收率；UPLC-MS：Rt＝2.59mins；MSm/z[M+H]+893.5；方法E。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
43％收率；UPLC-MS：Rt＝2.32mins；MSm/z[M+H]+779.2；方法E。
用于连接基连接的通用方案4
向Boc-有效负荷(1.0当量)和iPr2EtN(7.0当量)在DMF中的溶液(0.2M)中加入HATU(2.0当量)，然后加入胺连接基(2.0当量)。将该反应混合物在RT搅拌1h。通过LC/MS(uplc)证实反应完成时，用EtOAc稀释该反应混合物，使其分配在EtOAc与H2O之间。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
53％收率；UPLC-MS：Rt＝2.46mins；MSm/z[M+H]+847.0；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)丙酰氨基)甲基)-4-((2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
27％收率；UPLC-MS：Rt＝2.48mins；MSm/z[M+H]+890.9；方法E。
3-(2-(((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
使用用于连接基连接的通用方案4，但使用1.2当量的HATU、1.1当量的胺连接基和5当量的DIPEA合成该产物，得到期望的产物，89％收率；UPLC-MS：Rt＝2.47和2.50mins；MSm/z[M+H]+795.4；方法E。
(R)-3-(2-((1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)氨基甲酰基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
使用用于连接基连接的通用方案4，但使用1.2当量的HATU、1.1当量的胺连接基和5当量的DIPEA合成该产物，得到期望的产物，96％收率；UPLC-MS：Rt＝2.44mins；MSm/z[M+H]+797.3；方法E。
(3R，4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)-4-(4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向(3S，4R)-3-叠氮基-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙酰氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(40mg，0.050mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2，5-二酮(10mg，0.076mmol)在MeCN(0.3ml)中的溶液中加入碘化亚铜(I)(10mg，0.050mmol)在水(0.3ml)中的溶液，然后加入三乙胺(0.07ml，0.050mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。用硅藻土过滤该反应混合物，用EtOAc萃取，用盐水洗涤。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物，77％收率；UPLC-MS：Rt＝3.19mins；MSm/z[M+H]+929.6；方法E。
用于N-BOC+-O-乙酸酯或-O-TBS同时脱保护的通用方案1
将底物(1.0当量)溶于2∶1乙腈和水的混合物(0.1M)。加入TFA(50当量)，将该反应混合物在60℃搅拌至完成(7-72h)，如通过UPLC-MS测定。过滤该反应体系，通过反相柱色谱法纯化。分离产物，为TFA盐，冻干后为白色粉末。
(3S，4S)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
41％收率；UPLC-MS：Rt＝0.86mins；MSm/z[M+H]+721.1；方法A。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物)：δ9.11-8.63(2H，m)，7.91-7.51(2H，m)，7.45-7.05(8H，m)，7.04-6.92(2H，m)，5.65-4.98(3H，m)，4.94-4.82(1H，m)，4.55-4.44(1H，m)，3.89-2.84(13H，m)，2.69-1.70(4H，m)，1.55-0.48(7H，m)。
(3S，4S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
24％收率；UPLC-MS：Rt＝0.89mins；MSm/z[M+H]+765.1；方法A；1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物)：δ9.07-8.71(2H，m)，7.89-7.73(2H，m)，7.42-7.07(8H，m)，7.02-6.99(2H，m)，5.65-5.49(1H，m)，5.40-5.03(2H，m)，4.49-4.47(1H，m)，3.92-2.91(18H，m)，2.69-2.10(3H，m)，1.53-0.52(7H，m)。
(3S，4S)-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
37％收率；UPLC-MS：Rt＝0.95mins；MSm/z[M+H]+777.2；方法A；1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物)：δ8.96-8.75(2H，m)，7.88-7.54(2H，m)，7.43-7.26(6H，m)，7.17-7.07(2H，m)，7.01-7.00(2H，m)，5.65-5.04(3H，m)，4.94-4.85(1H，m)，4.50-4.42(1H，m)，3.94-2.83(14H，m)，2.68-1.75(3H，m)，1.52-0.51(15H，m)。
(3S，4S)-3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
40％收率；UPLC-MS：Rt＝0.90mins；MSm/z[M+H]+747.2；方法A；1H-NMR(CDCl3，400MHz，旋转异构体混合物)：δ10.25-9.50(2H，m)，7.93-7.56(2H，m)，7.46-7.27(5H，m)，7.22-6.91(2H，m)，6.76-6.74(2H，m)，5.98-4.44(3H，m)，4.05-3.58(10H，m)，3.45-3.18(3H，m)，3.09-2.19(9H，m)，1.40-0.64(7H，m)。
(3S，4S)-(3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
26％收率；UPLC-MS：Rt＝0.84mins；MSm/z[M+H]+792.1；方法A；1H-NMR(CDCl3，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.97-9.51(2H，m)，7.88-7.61(2H，m)，7.44-7.29(5H，m)，7.14-6.81(2H，m)，6.73-6.69(2H，m)，5.98-4.44(5H，m)，3.97-3.94(1H，m)，3.75-2.32(22H，m)，1.43-0.66(7H，m)。
(3R，4R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
30％收率；UPLC-MS：Rt＝0.87mins；MSm/z[M+H]+720.3；方法A；1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物)：δ8.96-8.85(2H，m)，7.92-7.66(2H，m)，7.42-6.89(10H，m)，5.66-5.03(3H，m)，4.54-4.43(1H，m)，4.08-2.93(18H，m)，1.52-0.51(7H，m)。
(3S，4S)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
(3R，4R)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
42％收率；UPLC-MS：Rt＝0.89mins；MSm/z[M+H]+765.2；方法A；1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物)：δ8.97-8.85(2H，m)，7.93-7.66(2H，m)，7.42-6.84(10H，m)，5.67-5.04(3H，m)，4.55-4.43(1H，m)，4.09-2.93(21H，m)，1.52-0.51(7H，m)。
(3S，4S)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯
60％收率；UPLC-MS：Rt＝2.05mins；MSm/z[M+H]+693.2；方法E；
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)哌啶-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
30％收率；UPLC-MS：Rt＝1.57mins；MSm/z[M+H]+707.4；方法E.1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ8.98-8.90(1H，m)，8.64-8.56(1H，m)，7.78-7.61(2H，m)，7.34-7.18(6H，m)，7.06-7.02(1H，m)，6.93(2H，s)，5.60-5.44(1H，m)，5.34-4.96(3H，m)，4.46-4.29(1H，m)，4.19-1.97(17H，m)，1.42-0.29(7H，m)。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰基)哌啶-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
29％收率；UPLC-MS：Rt＝1.59mins；MSm/z[M+H]+751.5；方法E.1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.02-8.93(1H，m)，8.66-8.57(1H，m)，7.85-7.69(2H，m)，7.42-7.24(6H，m)，7.15-7.07(1H，m)，7.01(2H，s)，5.67-5.51(1H，m)，5.42-5.03(3H，m)，4.53-4.35(1H，m)，4.27-2.05(22H，m)，1.51-0.34(7H，m)。
4-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)哌啶-1-甲酸2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙酯
21％收率；UPLC-MS：Rt＝1.70mins；MSm/z[M+H]+767.5；方法E。
(3S，4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-N-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)吡咯烷-3-甲酰胺
28％收率；UPLC-MS：Rt＝1.77mins；MSm/z[M+H]+705.3；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ8.64-8.51(2H，m)，8.34-8.32(1H，m)，7.82-7.67(2H，m)，7.43-7.27(6H，m)，7.15-7.09(1H，m)，7.02-7.00(2H，m)，5.62-4.47(1H，m)，5.36-5.01(2H，m)，4.51-4.39(1H，m)，3.89-2.99(18H，m)，1.83-0.50(7H，m)。
(3S，4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-N-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)吡咯烷-3-甲酰胺
75％收率；UPLC-MS：Rt＝1.80mins；MSm/z[M+H]+749.4；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ8.62-8.58(2H，m)，8.32-8.27(1H，m)，7.83-7.64(2H，m)，7.43-7.27(6H，m)，7.15-7.09(1H，m)，7.04-7.02(2H，m)，5.63-4.46(1H，m)，5.36-5.03(2H，m)，4.44-4.40(1H，m)，3.88-3.08(21H，m)，2.84-2.62(1H，m)，1.91-0.51(7H，m)。
(3S，4S)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)吡咯烷-3-基酯
29％收率；UPLC-MS：Rt＝0.87mins；MSm/z[M+H]+750.2；方法A；
(3S，4S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸4-((1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羟基丙-2-基)脲基)甲基)吡咯烷-3-基酯
48％收率；UPLC-MS：Rt＝0.88mins；MSm/z[M+H]+794.2；方法A。
用于完全脱保护的通用方案2
将底物(1.0当量)溶于DCM(0.1M)，加入TFA(20-50当量)，将反应混合物在RT搅拌1-2h。过滤该反应体系，通过反相柱色谱法纯化。分离产物，为TFA盐，冻干时为白色粉末。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4S)-4-(4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
50当量TFA，24％收率；UPLC-MS：Rt＝1.65mins；MSm/z[M+H]+715.4；方法E。1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.04-8.82(2H，m)，8.09-8.04(1H，m)，7.88-7.76(1H，m)，7.71-7.60(1H，m)，7.42-7.05(9H，m)，5.58-5.55(1H，m)，5.39-4.98(5H，m)，4.68-4.66(2H，m)，4.01-2.46(10H，m)，1.47-0.45(9H，m)。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)氮杂环丁烷-3-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
50当量TFA；26％收率；UPLC-MS：Rt＝1.46mins；MSm/z[M+H]+679.2；方法E。1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.04(1H，s，br)，8.69(1H，s，br)，7.83-7.65(2H，m)，7.43-7.29(6H，m)，7.15-7.10(1H，m)，7.02-6.97(2H，m)，6.25-5.65(1H，m)，5.52-5.07(3H，m)，4.56-4.26(1H，m)，4.16-2.76(17H，m)，2.48-2.08(3H，m)，1.30-0.97(3H，m)。
3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酯
50当量TFA；60％收率；UPLC-MS：Rt＝1.65mins；MSm/z[M+H]+695.3；方法E。1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体混合物)：δ9.05(1H，s，br)，8.69(1H，s，br)，7.84-7.66(2H，m)，7.43-7.29(6H，m)，7.15-7.10(1H，m)，7.02-6.98(2H，m)，6.25-5.70(1H，m)，5.51-5.08(3H，m)，4.51-4.26(1H，m)，4.15-2.76(17H，m)，2.43-2.07(3H，m)，1.29-0.97(3H，m)。
(S)-3-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯
50当量TFA；75％收率；UPLC-MS：Rt＝1.78mins；MSm/z[M+H]+778.3；方法E；
N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)-2-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺
20当量的TFA；非对映异构体混合物；88％收率；UPLC-MS：Rt＝1.72mins；MSm/z[M+H]+695.2；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ9.50-9.46(1H，m)，8.87-8.82(2H，m)，8.12-8.10(1H，m)，7.80-7.73(1H，m)，7.53-7.26(11H，m)，7.10-7.06(1H，m)，6.97(2H，s)，5.54-5.38(3H，m)，3.76-3.57(1H，m)，3.54-2.89(8H，m)，2.87-2.80(1H，m)，2.30-1.82(3H，m)，1.10-1.08(3H，m)，0.86-0.85(3H，m)。
(R)-2-(氮杂环丁烷-3-基氧基)-N-(1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)苯甲酰胺
20当量TFA；78％收率；UPLC-MS：Rt＝1.70mins；MSm/z[M+H]+697.2；方法E；1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ9.02-9.00(1H，m)，8.87(2H，s，br)，8.09-8.06(1H，m)，7.79-7.75(1H，m)，7.64-7.62(1H，m)，7.59-7.58(1H，m)，7.47-7.42(1H，m)，7.36-7.26(6H，m)，7.12-7.06(2H，m)，6.85(2H，s)，6.82-6.80(1H，m)，5.53-5.38(3H，m)，5.18-5.12(1H，m)，4.52-4.45(1H，m)，4.40-4.36(1H，m)，4.28-4.22(1H，m)，4.18-4.12(1H，m)，3.46-3.42(2H，m)，3.35-3.27(1H，m)，3.19-3.11(1H，m)，2.74-2.70(1H，m)，2.20-2.17(1H，m)，1.03(3H，s)，0.89(3H，s)。
(S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-吡咯烷-3-基甲基)脲基)丙酯
40％收率；UPLC-MS：Rt＝1.72mins；MSm/z[M+H]+778.4；方法E。
用于连接基-有效负荷Boc-脱保护的通用方案：
向在MeCN(0.1M)中的上述Boc-L-P组合(0.008mmol)中加入三氟乙酸(0.5ml，6.5mmol)，将该反应混合物在室温搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，通过反相柱色谱法(使用PrepLC方法C或D)纯化粗产物。分离产物，为TFA盐。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羟基乙基)氨基甲酰基)氧基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷羟基上连接至连接基成分中所述类似的方法、使用(S)-2-氨基-3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸叔丁酯(连接基3，TFA盐)(45mg，0.127mmol)制备标题化合物。
将期望的产物不经进一步纯化用于下一步。
LC/MS(方法A)：[M+H]+967.5，Rt1.42min。
(S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+896.6，1.31min(方法A)。
5mg，0.005mmol，67％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.05(1H，m)，8.67(1H，m)，7.77(3H，m)，7.39(2H，m)，7.32(2H，m)，7.27(2H，m)，7.10(1H，m)，7.01(2H，m)，6.33(1H，m)，5.34(2H，m)，5.25(1H，m)，5.20(1H，m)，3.96(2H，m)，3.89(1H，m)，3.83(1H，m)，3.73(1H，m)，3.60(1H，m)，3.56(4H，m)，3.39(2H，m)，3.35(1H，m)，3.30(1H，m)，3.09(2H，m)，2.59(1H，m)，2.54(1H，m)，2.26(1H，m)，2.00(1H，m)，1.45(1H，m)，1.25-1.05(2H，m)，1.10(3H，m)，0.75(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+796.8，0.92min(方法A)。
(S)-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+908.6，1.37min(方法A)。
4.5mg，0.005mmol，53％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.02(1H，m)，8.65(1H，m)，7.77(2H，m)，7.39(2H，m)，7.32(2H，m)，7.27(2H，m)，7.10(1H，m)，7.01(1H，m)，6.99(2H，m)，6.32(1H，m)，5.33(2H，m)，5.24(1H，m)5.20(1H，m)，3.94(1H，m)，3.83(1H，m)，3.72(1H，m)，3.60(1H，m)，3.38(3H，m)，3.32(3H，m)，3.21(1H，m)，2.95(2H，m)，2.60(1H，m)，2.53(1H，m)，2.27(1H，m)，2.00(1H，m)，1.47(2H，m)，1.36(2H，m)，1.21(5H，m)，1.09(4H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+808.5，1.0min(方法A)。
N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-碘乙酰胺
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+753.3，1.40min(方法A)。
连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+653.2，0.94min(方法A)。
(S)-(2-(2-(2-碘乙酰氨基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+984.3，1.27min(方法A)。
连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+884.4，0.91min(方法A)。
(S)-(6-(2-碘乙酰氨基)己基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+996.6，1.33min(方法A)。
4mg，0.004mmol，40％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.00(1H，m)，8.63(1H，m)，8.19(1H，m)，7.77(3H，m)，7.39(2H，m)，7.30(1H，m)，7.27(2H，m)，7.10(1H，m)，7.05(1H，m)，6.31(1H，m)，5.33(2H，m)5.23(1H，m)，5.19(1H，m)，3.94(4H，m)，3.83(1H，m)，3.71(1H，m)，3.60(2H，m)，3.47(1H，m)，3.34(3H，m)，3.20(1H，m)，3.02(2H，m)，2.95(2H，m)，2.58(1H，m)，2.54(1H，m)，2.25(1H，m)，2.00(1H，m)，1.37(5H，m)，1.24(5H，m)，1.08(3H，m)，0.69(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+896.5，0.97min(方法A)。
1-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-(4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙-2-基)-1-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+846.5，1.31min(方法A)。
5.5mg，0.006mmol，86％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.07(1H，m)，8.52(1H，m)，8.03(1H，m)，7.79(1H，m)，7.75(1H，m)，7.38(2H，m)，7.32(2H，m)，7.24(2H，m)，7.11(1H，m)，7.09(2H，m)，6.42(1H，m)，5.30-5.15(4H，m)，4.67(2H，m)，4.42(2H，m)，4.21(1H，m)，3.81(1H，m)，3.58(1H，m)，3.39(3H，m)，3.30(1H，m)，3.20(1H，m)，2.53(1H，m)，2.47(1H，m)，2.30(1H，m)，1.90(1H，m)，1.35(1H，m)，1.25(1H，m)，1.11(4H，m)，0.65(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+746.2，0.92min(方法A)。
(S)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+867.4，1.33min(方法A)。
2mg，0.002mmol，36％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.11(1H，m)，8.80(1H，m)，7.78(2H，m)，7.51(1H，m)，7.40(2H，m)，7.33(2H，m)，7.22(2H，m)，7.10(1H，m)，7.02(2H，m)，5.61(1H，m)，5.52(1H，m)，5.23(1H，m)，5.09(1H，m)，5.02(1H，m)，3.83(1H，m)，3.75(1H，m)，3.62(1H，m)，3.54(4H，m)，3.30(1H，m)，3.23(2H，m)，3.09(2H，m)，2.66(1H，m)，2.61(1H，m)，2.31(1H，m)，2.18(1H，m)，1.42(3H，m)，1.38(2H，m)，1.10(1H，m)，0.67(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+767.3，0.92min(方法A)。
(S)-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+879.6，1.40min(方法A)。
3.2mg，0.0034mmol，27％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.20-9.06(1H，m)，8.97-8.33(1H，m)，7.83-7.73(2H，m)，7.56-7.46(1H，m)，7.44-7.36(2H，m)，7.35-7.28(2H，m)，7.27-7.19(2H，m)，7.17-7.08(1H，m)，7.03-6.96(2H，m)，5.66-5.59(1H，m)，5.59-5.43(1H，m)，5.26-4.98(3H，m)，3.88-3.77(1H，m)，3.77-3.68(1H，m)，3.36-3.27(4H，m)，3.27-3.17(2H，m)，3.07-2.96(1H，m)，2.95-2.82(1H，m)，2.72-2.56(2H，m)，2.37-2.24(1H，m)，2.23-2.05(1H，m)，1.52-1.28(9H，m)，1.28-1.16(2H，m)，1.16-0.97(3H，m)，0.73-0.56(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+779.4，1.01min(方法A)。
(S)-(2-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+940.4，1.29min(方法A)。
4mg，0.004mmol，47％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ8.95(1H，m)，8.45(1H，m)，7.79(1H，m)，7.76(1H，m)，7.40(2H，m)，7.33(2H，m)，7.27(2H，m)，7.11(1H，m)，7.06(1H，m)，7.03(2H，m)，6.32(1H，m)，5.34(2H，m)，5.15-5.25(2H，m)，3.96(1H，m)，3.91(1H，m)，3.85(1H，m)，3.75(1H，m)，3.60(1H，m)，3.55-3.25(12H，m)，3.18(1H，m)，3.11(2H，m)，2.65(2H，m)，2.51(1H，m)，2.28(1H，m)，2.00(1H，m)，1.40(2H，m)，1.23(1H，m)，1.10(3H，m)，0.65(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+840.3，0.94min(方法A)。
(S)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+852.4，1.28min(方法A)。
10mg，0.011mmol，69％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.03(1H，m)，8.64(1H，m)，7.78(1H，m)，7.77(1H，m)，7.40(2H，m)，7.33(2H，m)，7.27(2H，m)，7.20(1H，m)，7.08(1H，m)，7.01(2H，m)，6.92(1H，m)，6.30(1H，m)，5.34(2H，m)，5.22(2H，m)，3.90(3H，m)，3.80(1H，m)，3.74(1H，m)，3.60(1H，m)，3.33(2H，m)，3.20(1H，m)，3.13(2H，m)，2.61(1H，m)，2.54(1H，bs)，2.28(1H，m)，1.99(1H，m)，1.45(1H，m)，1.30-1.15(2H，m)，1.11(3H，m)，0.68(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+752.3，0.90min(方法A)。
(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)乙酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+882.2，1.26min(方法A)。
14mg，0.015mmol，71％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.11-9.00(1H，m)，8.75-8.60(1H，m)，7.81-7.71(2H，m)，7.43-7.36(2H，m)，7.36-7.24(4H，m)，7.14-7.06(1H，m)，7.05-7.00(2H，m)，7.00-6.95(1H，m)，6.79-6.65(1H，m)，5.38-5.11(4H，m)，4.02-3.95(2H，m)，3.71-3.64(1H，m)，3.64-3.59(1H.m)，3.59-3.54(2H，m)，3.54-.344(3H，m)，3.44-3.26(7H，m)，3.26-3.16(1H，m)，3.13-3.04(2H.m)，2.65-2.44(2H，m)，2.43-2.26(1H，m)，2.02-1.83(1H，m)，1.45-1.33(1H，m)，1.30-1.12(2H，m)，0.78-0.60(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+782.2，0.90min(方法A)。
N-((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)-3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+880.4，1.25min(方法A)。
10.5mg，0.011mmol，89％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.06(1H，m)，8.70(1H，m)，7.99(1H，m)，7.78(1H，m)，7.76(1H，m)，7.40(2H，m)，7.33(2H，m)，7.28(2H，m)，7.10(1H，m)，7.02(2H，m)，6.35(1H，m)，5.40-5.10(4H，m)，3.83(3H，m)，3.72(1H，m)，3.45(2H，m)，3.37-3.25(4H，m)，3.25-3.05(4H，m)，2.57(1H，m)，2.50(2H，m)，2.42(1H，m)，2.30(2H，m)，1.92(1H，m)，1.40(1H，m)，1.25(1H，m)，1.22(1H，m)，1.04(3H，m)，0.70(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+780.3，0.93min(方法A)。
((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)氨基甲酸2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+896.2，1.27min(方法A)。
9mg，0.009mmol，40％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.11-8.96(1H，m)，8.74-8.59(1H，m)，7.82-7.69(2H，m)，7.45-7.36(2H，m)，7.35-7.20(5H，m)，7.15-7.06(1H，m)，7.05-6.98(2H，m)，6.34-6.15(1H，m)，5.38-5.12(4H，m)，4.08-3.96(2H，m)，3.90-3.79(2H，m)，3.79-3.67(1H，m)，3.40-3.27(4H，m)，3.26-3.18(1H，m)，3.12-2.98(2H，m)，2.65-2.46(3H，m)，2.46-2.30(1H，m)，2.04-1.87(1H，m)，1.46-1.34(1H，m)，1.31-1.12(2H，m)，1.09-0.97(3H，m)，0.78-0.60(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+796.2，0.93min(方法A)。
N-((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+878.3，1.28min(方法A)。
19mg，0.02mmol，31％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.05(1H，m)，8.72(1H，m)，7.97(1H，m)，7.77(2H，m)，7.40(2H，m)，7.35(2H，m)，7.29(2H，m)，7.11(1H，m)，7.01(2H，m)，6.40(1H，m)，5.33(2H，m)，5.28-5.20(2H，m)，3.84(2H，m)，3.70(1H，m)，3.60(1H，m)，3.45(1H，m)，3.37(2H，m)，3.33(2H，m)，3.22(2H，m)，3.10(1H，m)，2.57(2H，m)，2.51(2H，m)，2.44(1H，m)，.2.07(2H，m)，1.92(1H，m)，1.49(3H，m)，1.38(1H，m)，1.24(1H，m)，.1.19(2H，m)，1.04(3H，m)，0.70(1H，m)。LC/MS(uplc)：MH+778.2，0.96min(方法A)。
(3S，4R)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-3-基酯和
(3R，4S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-3-基酯.
通过对2个OH依次保护-脱保护步骤制备2种不同的异构体，生成相应的连接基-位置异构体，它们各自为纯的异构体。归属每种位置异构体的结构测定未进行。
异构体A：Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+1038.7，1.50min(方法A)。
异构体B：Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+1039.2，1.49min(方法A)。
异构体A：2.3mg，0.002mmol，30％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.04(1H，m)，8.74(1H，m)，7.76(2H，m)，7.39(2H，m)，7.33(2H，m)，7.25(2H，m)，7.09(2H，m)，7.02(2H，m)，5.67(1H，m)，5.38(1H，m)，5.25(1H，m)，4.93(1H，m)，4.71(1H，m)，4.27(1H，m)，3.80(1H，m)，3.71(2H，m)，3.57(4H，m)，3.40(2H，m)，3.30(4H，m)，3.27(4H，m)，3.11(2H，m)，2.81(1H，m)，2.37(1H，m)，2.22(1H，m)，2.17(1H，m)，1.70(1H，m)，1.20(1H，m)，1.05(1H，m)，0.68(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+824.1，0.90min(方法A)。
异构体B：6.2mg，0.006mmol，43％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.03(1H，m)，8.76(1H，m)，7.75(2H，m)，7.39(2H，m)，7.33(2H，m)，7.25(2H，m)，7.10(2H，m)，7.03(2H，m)，5.71(1H，m)，5.37(1H，m)，5.25(1H，m)，4.89(1H，m)，4.77(1H，m)，4.24(1H，m)，3.83(1H，m)，3.78(1H，m)，3.58(4H，m)，3.51(3H，m)，3.40(2H，m)，3.29(1H，m)，3.14(2H，m)，3.10(2H，m)，2.80(1H，m)，2.36(2H，m)，2.30(1H，m)，2.13(1H，m)，1.72(1H，m)，1.08(1H，m)，0.88(1H，m)，0.33(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+824.1，0.91min(方法A)。
(3R，4S)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-3-基酯和
(3S，4R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-3-基酯.
通过对2个OH依次保护-脱保护步骤制备2种不同的异构体，生成相应的连接基-位置异构体，它们各自为纯的异构体。归属每种位置异构体的结构测定未进行。
异构体A：Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+995.2，1.52min(方法A)。
异构体B：Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+994.2，1.51min(方法A)。
异构体A：11mg，0.012mmol，58％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.09-8.94(1H，m)，8.71-8.53(1H，m)，7.82-7.69(2H，m)，7.42-7.36(2H，m)，7.36-7.21(5H，m)，7.16-7.06(1H，m)，7.03-6.97(2H，m)，5.72-5.62(1H，m)，5.44-5.34(1H，m)，5.34-5.16(1H，m)，4.94-4.86(1H，m)，4.74-4.66(1H，m)，4.33-4.21(1H，m)，3.88-3.76(1H，m)，3.76-3.65(2H，m)，3.65-3.53(1H，m)，3.22-3.16(4H，m)，3.16-3.03(2H，m)，2.90-2.77(1H，m)，2.45-2.10(3H，m)，1.77-1.67(1H，m)，1.12-0.99(1H，m)，0.91-0.81(1H，m)，0.34-0.15(1H，m)。.1H，m)，4.74-4.66(1H，m)，4.33-4.21(1H，m)，3.88-3.76(1H，m)，3.76-3.65(2H，m)，3.65-3.53(1H，m)，3.22-3.16
异构体B：10mg，0.0011mmol，94％，1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.11-8.94(1H，m)，8.80-8.57(1H，m)，7.84-7.72(2H，m)，7.44-7.36(2H，m)，7.36-7.28(3H，m)，7.28-7.20(2H，m)，7.14-7.07(1H，m)，7.05-6.99(2H，m)，5.79-5.69(1H，m)，5.43-5.33(1H，m)，5.31-5.16(1H，m)，4.91-4.82(1H，m)，4.82-4.72(1H，m)，4.27-4.17(1H，m)，3.92-3.74(2H，m)，3.24-3.02(4H，m)，2.83-2.71(1H，m)，2.44-2.25(3H，m)，2.14-2.03(1H，m)，1.76-1.64(1H，m)，1.12-0.98(1H，m)，0.92-0.79(1H，m)，0.37-0.19(1H，m)。.9.11-8.94(1H，m)，8.80-8.57(1H，m)，7.84-7.72(2H，m)，7.44-7.36(2H，m)，7.36-7.28(3H，m)，7.28-7.20(2H，m)。
(3R，4S)-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-3-基酯和
(3S，4R)-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-3-基酯.
通过对2个OH依次保护-脱保护步骤制备2种不同的异构体，生成相应的连接基-位置异构体，它们各自为纯的异构体。归属每种位置异构体的结构测定未进行。
异构体A：Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+1050.3，1.57min(方法A)。
异构体B：Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+1050.3，1.57min(方法A)。
异构体A：12mg，0.012mmol，83％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.06-8.93(1H，m)，8.74-8.61(1H，m)，7.84-7.69(2H，m)，7.45-7.28(4H，m)，7.28-7.21(2H，m)，7.18-7.06(2H，m)，7.05-6.96(2H，m)，5.70-5.59(1H，m)，5.43-5.33(1H，m)，5.33-5.17(1H，m)，4.99-4.88(1H，m)，4.75-4.63(1H，m)，4.33-4.20(1H，m)，3.85-3.75(1H，m)，3.75-3.63(2H，m)，3.63-3.52(1H，m)，3.30-3.19(3H，m)，3.17-3.05(1H，m)，3.01-2.89(2H，m)，2.87-2.74(1H，m)，2.44-2.08(3H，m)，1.77-1.62(1H，m)，1.54-1.44(2H，m)，1.43-1.32(2H，m)，1.31-1.13(4H，m)，1.09-0.95(1H，m)，0.93-0.79(1H，m)，0.31-0.15(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+836.2，0.95min(方法A)，4.00min(方法F)。
异构体B：9.5mg，0.0095mmol，72％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.07-8.93(1H，m)，8.76-8.63(1H，m)，7.80-7.70(2H，m)，7.43-7.36(2H，m)，7.36-7.28(2H，m)，7.27-7.21(2H，m)，7.18-7.13(1H，m)，7.13-7.06(1H，m)，7.04-6.98(2H，m)，5.80-5.63(1H，m)，5.42-5.32(1H，m)，5.32-5.12(1H，m)，4.97-4.83(1H，m)，4.82-4.72(1H，m)，4.23-4.17(1H，m)，3.89-3.72(2H，m)，3.72-3.56(2H，m)，3.31-3.24(2H，m)，3.21-3.05(2H，m)，3.03-2.88(2H，m)，2.86-2.71(1H，m)，2.44-2.23(2H，m)，2.21-1.99(1H，m)，1.80-1.65(1H，m)，1.55-1.43(2H，m)，1.43-1.32(2H，m)，1.31-1.14(4H，m)，1.13-0.98(1H，m)，0.94-0.80(1H，m)，0.40-0.33(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。
(R)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸1-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)-3-羟基丙-2-基酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+1026.3，1.51min(方法A)，7.10min(方法B)。
6.1mg，0.006mmol，51％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.15-8.96(1H，m)，8.69-8.48(1H，m)，7.83-7.67(2H，m)，7.47-7.37(2H，m)，7.37-7.21(4H，m)，7.18-7.07(1H，m)，7.07-6.99(2H，m)，6.98-6.86(1H，m)，6.80-6.59(1H，m)，5.38-5.09(4H，m)，4.78-4.63(1H，m)，3.88-3.77(1H，m)，3.54-3.43(4H，m)，3.42-3.26(6H，m)，3.25-3.14(2H，m)，3.15-2.98(2H，m)，2.61-2.44(3H，m)，2.43-2.25(2H，m)，2.00-1.78(1H，m)，1.43-1.30(1H，m)，1.30-1.08(2H，m)，0.76-0.57(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+812.2，0.86min(方法A)，3.37min(方法B)。
(R)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸3-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)-2-羟基丙基酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+1026.3，1.52min(方法A)，7.17min(方法B)。
4.0mg，0.004mmol，70％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.09-8.93(1H，m)，8.59-8.37(1H，m)，7.85-7.70(2H，m)，7.45-7.36(2H，m)，7.36-7.23(4H，m)，7.15-7.06(2H，m)，7.06-7.01(2H，m)，6.68-6.56(1H，m)，5.40-5.12(4H，m)，4.06-3.95(1H，m)，3.90-3.77(2H，m)，3.77-3.65(2H，m)，3.26-2.97(5H，m)，2.64-2.46(3H，m)，2.46-2.27(1H，m)，1.98-1.81(1H，m)，1.45-1.36(1H，m)，1.30-1.10(2H，m)，0.77-0.60(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+812.2，0.86min(方法A)，3.41min(方法B)。
(R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸1-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)-3-羟基丙-2-基酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+982.3，1.51min(方法A)。
3.8mg，0.0041mmol，41％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.09-8.89(1H，m)，8.55-8.35(1H，m)，7.84-7.69(2H，m)，7.45-7.36(2H，m)，7.36-7.23(4H，m)，7.16-7.07(2H，m)，7.05-6.98(2H，m)，6.73-6.58(1H，m)，5.40-5.10(4H，m)，4.87-4.64(2H，m)，3.88-3.79(1H，m)，3.72-3.64(1H，m)，3.63-3.56(1H，m)，3.25-3.03(6H，m)，2.43-2.26(1H，m)，1.96-1.80(1H，m)，1.44-1.32(1H，m)，1.29-1.09(2H，m)，0.75-0.57(1H，m)。.9.09-8.89(1H，m)，8.55-8.35(1H，m)，7.84-7.69(2H，m)，7.45-7.36(2H，m)，7.36-7.23(4H，
N-((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)-4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷甲酰胺.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：M+904.3，1.29min(方法A)。
31mg，0.032mmol，85％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.14-8.91(1H，m)，8.76-8.59(1H，m)，7.94-7.83(1H，m)，7.83-7.68(2H，m)，7.48-7.37(2H，m)，7.37-7.23(4H，m)，7.18-7.07(1H，m)，7.06-6.98(2H，m)，6.54-6.24(1H，m)，5.43-5.14(4H，m)，3.91-3.76(2H，m)，3.76-3.65(1H，m)，3.65-3.54(1H，m)，3.52-3.28(4H，m)，3.28-3.13(3H，m)，3.13-3.01(1H，m)，2.67-2.47(2H，m)，2.47-2.31(1H，m)，2.14-2.00(1H，m)，2.00-1.86(1H，m)，1.77-1.66(2H，m)，1.66-1.57(2H，m)，1.57-1.47(1H，m)，1.44-1.35(1H，m)，1.34-1.10(4H，m)，1.08-0.99(3H，m)，0.97-0.83(2H，m)，0.78-0.60(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+804.2，0.93min(方法A)。
(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-3-基酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+894.2，1.26min(方法A)。
23mg，0.024mmol，61％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.15-8.97(1H，m)，8.77-8.60(1H，m)，7.88-7.78(1H，m)，7.78-7.69(1H，m)，7.43-7.37(2H，m)，7.37-7.29(3H，m)，7.28-7.21(2H，m)，7.14-7.08(1H，m)，7.05-6.99(2H，m)，5.56-5.44(1H，m)，5.43-5.21(2H，)，5.16-4.96(2H，m)，4.46-4.35(1H，m)，4.12-4.03(1H，m)，4.03-3.95(1H，m)，3.88-3.80(1H，m)，3.46-3.24(6H，m)，3.26-3.13(1H，m)，3.13-.303(2H，m)，2.76-2.62(1H，m)，2.58-2.34(3H，m)，1.95-1.80(1H，m)，1.68-1.53(1H，m)，1.15-0.93(1H，m)，0.49-0.30(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+794.2，0.91min(方法A)。
(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)哌啶-3-基酯.
得到非对映异构体体混合物，连接基偶联前分离。
Boc-连接基-有效负荷，分离为纯非对映异构体。
异构体A，LC/MS(uplc)：M+922.3，1.33min(方法A)。
异构体B，LC/MS(uplc)：M+922.3，1.34min(方法A)。
异构体A：10mg，0.010mmol，47％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.11-8.93(1H，m)，8.87-8.69(1H，m)，7.85-7.74(1H，m)，7.74-7.64(1H，m)，7.45-7.36(2H，m)，7.36-7.28(2H，m)，7.27-7.18(2H，m)，7.15-7.06(1H，m)，7.06-6.97(3H，m)，5.69-5.59(1H，m)，5.46-5.36，(1H，m)，5.31-5.13(1H，m)，4.72-4.62(1H，m)，4.62-4.54(1H，m)，3.71-3.60(2H，m)，3.59-3.46(6H，m)，3.46-3.31(4H，m)，3.31-3.16(2H，m)，3.15-3.00(4H，m)，2.99-2.90(1H，m)，2.89-2.75(1H，m)，2.48-2.30(2H，m)，2.29-2.10(1H，m)，1.94-1.80(1H，m)，1.79-1.59(2H，m)，1.58-1.48(1H，m)，1.47-1.36(1H，m)，1.19-1.04(1H，m)，0.89-0.76(1H，m)，0.55-0.38(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+822.3，0.96min(方法A)。
异构体B：22.5mg，0.022mmol，52％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.19-8.99(1m)，8.92-8.76(1H，m)，7.81-7.73(1H，m)，7.71-7.63(1H，m)，7.45-7.37(2H，m)，7.37-7.27(2H，m)，7.26-7.20(2H，m)，7.14-7.06(2H，m)，7.05-6.99(2H，m)，5.58-5.47(1H，m)，5.42-5.31(1H，m)，5.25-5.07(1H，m)，4.69-4.61(1H，m)，4.56-4.47(1H，m)，3.90-3.70(2H，m)，3.65-3.46(6H，m)，3.45-3.33(5H，m)，3.33-3.20(1H，m)，3.17-2.98(4H，m)，2.98-2.86(2H，m)，2.50-2.21(3H，m)，1.99-1.87(1H，m)，1.79-1.71(1H，m)，1.71-1.63(1H，m)，1.63-1.43(2H，m)，1.22-1.06(1H，m)，0.90-0.76(1H，m)，0.55-0.39(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+822.3，0.97min(方法A)。
(S)-(3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+923.2，1.22min(方法A)。
6.1mg，0.006mmol，37％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.05(1H，m)，8.64(1H，m)，8.01(1H，m)，7.78(2H，m)，7.40(2H，m)，7.33(2H，m)，7.27(2H，m)，7.12(1H，m)，7.01(2H，m)，6.97(1H，m)，6.31(1H，m)，5.34(2H，m)，5.25(1H，m)，5.20(1H，m)，3.94(3H，m)，3.80(1H，m)，3.75(1H，m)，3.50(1H，m)，3.45(2H，m)，3.25(2H，m)，3.15(4H，m)，2.59(1H，m)，2.50(1H，m)，2.26(1H，m)，2.17(2H，m)，2.01(1H，m)，1.45(1H，m)，1.30-1.20(2H，m)，1.10(3H，m)，0.68(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：823.2，0.90min(方法A)。
(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-氨基-3-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-3-氧代丙酯.
Boc-连接基-有效负荷，非对映异构体混合物，LC/MS(uplc)：M+982.3，1.39min和1.40min(方法A)。
得到产物，为可分离的非对映异构体混合物(4：1，LC/MS，方法A)。17.8mg，0.017mmol，70％。1H-NMR(DMSO，600MHz)主要非对映异构体：δ9.34-9.21(1H，m)，9.19-9.05(1H，m)，8.71-8.55(3H，m)，7.94-7.86(1H，m)，7.82-7.72(1H，m)，7.45-7.37(2H，m)，7.37-7.31(2H，m)，7.31-7.26(1H，m)，7.26-7.21(2H，m)，7.16-7.08(1H，m)，7.06-7.01(2H，m)，5.56-5.49(1H，m)，5.41-5.35(1H，m)，5.35-5.22(1H，m)，5.19-5.07(1H，m)，4.56-4.47(1H，m)，4.38-4.29(1H，m)，4.19-4.10(1H，m)，4.00-3.90(1H，m)，3.78-3.68(1H，m)，3.63-3.54(3H，m)，3.54-3.48(3H，m)，3.31-3.22(1H，m)，3.22-3.02(3H，m)，2.83-2.71(1H，m)，2.68-2.56(1H，m)，2.46-2.35(1H，m)，2.02-1.83(1H，m)，1.45-1.33(1H，m)，1.28-1.18(1H，m)，1.01-0.86(1H，m)，0.52-0.36(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+782.3，0.78min(主要)和0.79min(次要)(方法A)。
N-((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)-3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺
Boc-连接基-有效负荷：LC/MS(uplc)：MH+836.2，1.26min(方法A)。
4mg，0.004mmol，24％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.05(1H，m)，8.67(1H，m)，8.14(1H，m)，7.79(1H，m)，7.75(1H，m)，7.40(2H，m)，7.33(2H，m)，7.27(2H，m)，7.10(1H，m)，7.02(2H，m)，6.35(1H，m)，5.35-5.25(4H，m)，3.81(2H，m)，3.75(1H，m)，3.62(3H，m)，3.45(2H，m)，3.37(2H，m)，3.16(2H，m)，3.07(1H，m)，2.57(1H，m)，2.41(1H，m)，2.39(2H，m)，1.90(1H，m)，1.45(1H，m)，1.25(1H，m)，1.15(1H，m)，1.02(3H，m)，0.70(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+736.2，0.89min(方法A)。
4-(((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)氨基)-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-氧代丁-2-磺酸.
Boc-连接基-有效负荷，非对映异构体混合物：LC/MS(uplc)：MH+930.5，1.01min(异构体A)和1.02min(异构体B)(方法A)。
在Boc-脱保护后，使用反相色谱法(PrepLC方法A)分离非对映异构体混合物。
异构体A，31mg，0.031mmol，10％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.08-8.48(1H，m)，8.90-8.75(1H，m)，7.94-7.84(1H，m)，7.81-7.68(2H，m)，7.47-7.36(2H，m)，7.35-7.23(4H，m)，7.15-7.04(1H，m)，7.03-6.94(2H，m)，6.20-6.08(1H，m)，5.46-5.20(4H，m)，3.95-3.67(6H，m)，3.29-3.11(2H，m)，2.90-2.64(4H，m)，2.59-2.44(3H，m)，2.13-1.91(1H，m)，1.78-1.59(1H，m)，1.52-1.36(1H，m)，1.35-1.23(1H，m)，1.19-1.07(1H，m)，1.06-0.94(3H，m)，0.70-0.53(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下9.08-8.48(1H，m)，8.90-8.75(1H，m)，7.94-7.
异构体B，35mg，0.017mmol，11％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：-NMR(DMSO，600MHz)：mmol，11％.m)，7.94-7.84(1H，m)，7.81-7.68(2H，m)，7.47-7.36(2H，m)，7.35-7.23(4H，m)，7.15-7.04(1H，m)，7.03-6.94(2H，m)，6.20-6.08(1H，m)，5.46-5.20(4H，m)，3.95-3.67(6H，m)，3.29-3.66(5H，m)，3.29-3.16(2H，m)，2.84-2.74(1H，m)，2.73-2.58(1H，m)，2.57-2.42(5H，m)，2.08-1.97(1H，m)，1.71-1.55(1H，m)，1.42-1.24(2H，m)，1.21-1.08(1H，m)，1.07-0.95(3H，m)，0.69-0.51(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+830.5，0.89min。(方法A)。
(S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-羟基环丙基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷，LC/MS(uplc)：M+982.5，1.64(方法A)。
17.7mg，0.018mmol，66％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.20-9.08(1H，m)，8.91-8.71(1H，m)，7.89-7.81(1H，m)，7.81-7.74(1H，m)，7.40-7.36(2H，m)，7.35-7.29(2H，m)，7.27-7.23(2H，m)，7.15-7.09(1H，m)，7.05-7.00(3H，m)，6.38-6.28(1H，m)，5.37-5.14(4H，m)，4.03-3.78(4H，m)，3.77-3.68(1H，m)，3.61-3.52(2H，m)，3.52-3.45(2H，m)，3.44-3.29(4H，m)，3.13-3.03(2H，m)，3.03-2.93(1H，m)，2.57-2.42(3H，m)，1.16-1.06(3H，m)，0.69-0.50(3H，m)，0.50-0.36(1H.m)。LC/MS(uplc)：MH+768.3，0.94min(方法A)。
(S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羟基-2-甲基丙基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷，LC/MS(uplc)：M+984.5，1.65min(方法A)。
4.1mg，0.004mmol，54％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.26-9.05(1H，m)，9.00-8.76(1H，m)，7.99-7.84(1H，m)，7.83-7.71(1H，m)，7.51-7.24(6H，m)，7.19-7.09(1H，m)，7.08-6.95(3H，m)，6.55-6.37(1H，m)，5.50-5.15(4H，m)，4.09-3.88(2H，m)，3.88-3.74(2H，m)，3.60-3.53(3H，m)，3.53-.344(3H，m)，3.44-3.23(4H，)，3.15-3.01(2H，m)，2.70-2.59(1H，m)，2.39-2.12(1H，m)，2.08-1.93(1H，m)，1.17-1.09(3H，m)，1.09-0.98(3H，m)，0.97-0.78(3H，m)。LC/MS(uplc)：MH+770.6，0.95min(方法A)。
(S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((S)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-羟基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷，LC/MS(uplc)：M+1026.6，1.58min(方法A)。
11.3mg，0.012mmol，32％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.17-8.95(1H，m)，8.77-8.59(1H，m)，8.02-7.88(1H，m)，7.87-7.74(1H，m)，7.45-7.38(2H，m)，7.38-7.32(2H，m)，7.32-7.27(2H，m)，7.18-7.11(1H，m)，7.06-6.99(3H，m)，6.51-6.34(1H，m)，5.55-5.10(4H，m)，4.02-3.88(4H，m)，3.88-3.71(2H，m)，3.69-3.60(1H，m)，3.60-3.54(3H，m)，3.54-3.45(3H，m)，3.44-3.37(2H，m)，3.36-3.24(3H，m)，3.16-3.02(2H，m)，2.72-2.58(1H，m)，2.40-2.20(1H，m)，2.14-1.93(1H，m)，1.52-1.33(2H，m)，1.21-1.02(5H，m)。LC/MS(uplc)：MH+812.5，0.91min(方法A)。
(S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯.
Boc-连接基-有效负荷，LC/MS(uplc)：MH+884.6，1.36min(方法A)。25mg，0.026mmol，82％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：.9.10-8.93(1H，m)，8.78-8.61(1H，m)，7.96-7.83(1H，m)，7.82-7.70(1H，m)，7.48-7.26(6H，m)，7.20-7.08(1H，m)，7.08-6.98(3H，m)，6.55-6.38(1H，m)，5.65-5.45(1H，m)，5.45-5.25(2H，m)，5.25-5.08(1H，m)，3.62-3.53(2H，m)，3.53-3.45(2H，m)，3.45-3.35(2H，m)，3.34-3.17(2H，m)，3.16-3.05(2H，m)，3.05-2.92(3H，m)，2.58-2.39(2H，m)，2.26-2.02(1H，m)，2.02-1.82(1H，m)，1.42-1.23(3H，m)，1.23-1.06(3H，m)，0.92-0.73(3H，m)。LC/MS(uplc)：MH+784.4，1.01min(方法A)。
(3S，4S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸4-(((S)-N-((S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基酯.
Boc-连接基-有效负荷，LC/MS(uplc)：MH+895.3，1.37min(方法A)。
26.8mg，0.031mmol，79％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：9.06-8.90(1H，m)，8.88-8.73(1H，m)，8.72-8.63(1H，m)，7.96-7.91(1H，m)，7.90-7.69(2H，m)，7.45-7.30(8H，m)，7.29-7.24(1H，m)，7.19-7.07(3H，m)，7.06-6.98(3H，m)，6.00-5.84(1H，m)，5.62-5.32(2H，m)，5.17-5.03(2h，m)，4.92-4.82(2H，m)，4.81-4.70(3H，m)，4.62-4.49(2H，m)，4.11-3.99(1H，m)，3.97-3.86(2H，m)，3.83-3.73(1H，m)，3.62-3.45(7H，m)，3.44-3.28(4H，m)，3.22-3.05(5H，m)，3.04-2.96(1H，m)，2.92-2.71(4H，m)，2.43-2.33(1H，m)，2.04-1.85(2H，m)，1.66-1.51(m，1H)，1.50-1.41(1H，m)，1.36-1.30(3H，m)，1.30-1.24(3H，m)，1.08-0.98(1H，m)，0.89-0.79(2H，m)，0.77-0.65(3H，m)。可以通过NMR测定旋转异构体混合物。LC/MS(uplc)：MH+753.3，0.98min(方法A)。
(S)-2-((((R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁氧基)羰基)氨基)-3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸
通过与连接基-有效负荷组合Boc脱保护的通用方法(60℃，3天)中所述类似的方法，在通过反相柱色谱法纯化后制备标题化合物(8mg，17％，为TFA盐)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+769.4，Rt3.21min。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ12.89(1H，brs)，8.97(1H，brs)，8.54(1H，brs)，7.97(1H，d，3.9Hz)，7.80-7.70(1H，m)，7.45-7.30(7H，m)，7.17-7.08(1H，m)，6.99(2H，s)，5.84(1H，s)，5.40(1H，d，15.3Hz)，5.25(1H，d，56Hz)，5.06(1H，d，15.3Hz)，4.63-4.54(1H，m)，4.21-4.11(1H，m)，4.06-3.88(2H，m)，3.80-3.63(4H，m)，3.34-3.23(2H，m)，2.40-2.35(1H，m)，2.00-1.85(1H，m)，1.58-1.46(1H，m)，1.35(3H，d，6.2Hz)，1.32-1.21(1H，m)，0.95(3H，s)，0.71(3H，s)。1H隐藏在DMSO下，未观察到OH。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羟基乙基)氨基甲酰基)氧基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在N2气氛中：向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(40mg，0.057mmol)在DMF1ml中的溶液中加入DIPEA(0.299ml，1.712mmol)，然后加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(39.9mg，0.131mmol)。将反应混合物在室温搅拌16h。在通过LC/MS(uplc)证实完成时，加入1-(2-((2-羟基乙基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(连接基1，TFA盐)(66.1mg，0.114mmol)，将该反应混合物在室温搅拌16h。再加入1-(2-((2-羟基乙基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(连接基1，TFA盐)(66.1mg，0.114mmol)，将该反应混合物在室温搅拌16h。加入乙酸乙酯和冷水，用盐水将有机层洗涤2次，用Na2SO4干燥，过滤，真空除去溶剂。使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(4g硅胶，0-100％EtOAc的庚烷溶液，18mg，0.017mmol，29％，纯度85％)，为无色油状物。LC/MS(方法A)：[M+H]+911.5，Rt1.27min。
(R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羟基乙基)氨基甲酸4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酯
将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羟基乙基)氨基甲酰基)氧基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(18mg，0.017mmol)溶于乙腈(1ml)和水(0.500ml)的混合物。加入TFA(0.065ml，0.840mmol)，将该反应混合物在60℃搅拌7天。通过反相柱色谱法纯化后得到期望的产物(9mg，59％，为TFA盐)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+769.5，Rt3.35min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物1：1之比)：δ9.02(1H，brs)，8.68(1H，brs)，7.98(1H，s)，7.82-7.73(1H，m)，7.44-7.31(6H，m)，7.16-7.10(1H，m)，6.97和6.96(2H，2个单峰，旋转异构体)，5.84和5.84(1H，2个单峰，旋转异构体)，5.41(1H，d，15.4Hz)，5.27(1H，d，54Hz)，5.06(1H，d，15.4Hz)，4.62-4.57(1H，m)，4.05-3.90(2H，m)，3.82-3.67(2H，m)，3.57-3.49(2H，m)，3.46-3.07(8H，m)，2.42-2.36(1H，m)，1.98-1.85(2H，m)，1.58-1.49(1H，m)，1.38-1.23(4H，m)，1.01和0.97(3H，2个单峰，旋转异构体)，0.69和0.67(3H，2个单峰，旋转异构体)。
(3R，4R)-3-((R)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-14-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-((S)-2-羟基丙酰基)-4，4-二甲基-8-氧代-7，12-二氧杂-2，9-二氮杂十四基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷羟基上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。不纯化。无色油状物(40mg，0.023mmol，55％收率，52％纯)。LC/MS(方法A)：[M+H]+912.2，Rt1.34min。
(R)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酯
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法(60℃，29h)中所述类似的方法制备标题化合物。通过反相柱色谱法纯化，无色固体(19mg，0.022mmol，94％收率，TFA盐)。LC/MS(方法B)：[M+H]+769.3，Rt3.79min。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.04(1H，brs)，8.73(1H，brs)，7.97-7.93(1H，m)，7.78-7.72(1H，m)，7.44-7.30(6H，m)，7.16-7.09(1H，m)，7.00(2H，s)，6.93-6.88(1H，m)，5.84(1H，s)，5.40(1H，d，15Hz)，5.25(1H，d，54Hz)，5.06(1H，d，15Hz)，4.62-4.56(1H，m)，4.05-3.65(4H，m)，3.45-3.40(2H，m)，3.37-3.15(2H，m)，3.12-3.05(2H，m)，2.42-2.33(1H，m)，2.00-1.85(2H，m)，1.60-1.50(1H，m)，1.35(3H，d，5.9Hz)，1.32-1.24(1H，m)，0.93(3H，s)，0.73(3H，s)。
(3R，4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙酰氧基丙酰基)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-32-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，4-二甲基-8-氧代-7，12，15，18，21，24，27，30-八氧杂-2，9-二氮杂三十二烷基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷羟基上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。不纯化。无色油状物(28mg，0.024mmol，粗产物)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+1175.4，[M+NH4]+1192.5，Rt1.34min。
(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁基(23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十三烷基)氨基甲酸酯
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相柱色谱法纯化。无色固体，为TFA盐(2.3mg，2.005μmol，9％收率，100％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+1033.3；Rt4.02min。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过柱色谱法纯化(40g硅胶，0-100％EtOAc的庚烷溶液)。无色油状物(500mg，0.604mmol，60％收率，96％纯)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+795.6，Rt1.20min。
将(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酸(980mg，1.005mmol)和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(TFA盐，511mg，2.010mmol)溶于DMF(30ml)和DIPEA(0.878ml，5.03mmol)，然后加入HATU(573mg，1.508mmol)。将反应混合物在RT搅拌1h。用EA稀释反应混合物，用盐水洗涤(3次)。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩。通过柱色谱法纯化(40g，硅胶，0-100％EtOAc的庚烷溶液)，得到无色油状物(500mg，0.604mmol，60％收率，96％纯)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+795.6，Rt1.20min。
(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相柱色谱法纯化，无色固体(112mg，0.137mmol，55％收率，为TFA盐)。
将(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(200mg，0.252mmol)溶于DCM(4ml)。加入TFA(1.94ml，25.2mmol)，将该反应混合物在RT搅拌1h。浓缩，通过反相色谱法纯化，得到无色固体(112mg，0.137mmol，55％收率，为TFA盐)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+695.4，Rt3.02min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体之比5∶1混合物，对于次要旋转异构体的一些峰不能明确地归属)：δ8.96(1.2H，brs)，8.66(1.2H，brs)，7.85-7.80(2H，m)，7.80-7.75(1H，m)，7.44-7.31(6.8H，m)，7.16-7.09(1.6H，m)，7.01(0.4H，s)，6.99(2H，s)，6.17(1H，s)，5.72(0.2H，s)，5.55(0.2H，d，15.9Hz)，5.46(0.2H，d，15.9Hz)，5.33(1H，d，15.0Hz)，5.17-5.05(2.2H，m)，4.80-4.74(0.2H，m)，4.57-4.50(1H，m)，4.47-4.41(0.2H，m)，4.04-3.99(0.4H，m)，3.95-3.90(2H，m)，3.41(2H，t，6.0Hz)，3.34-2.98(5.2H，m)，2.31-2.22(1.2H，m)，2.12(1H，d，13.8Hz)，2.08-2.02(0.2H，m)，1.99-1.89(1.2H，m)，1.82(1H，d，13.8Hz)，1.73-1.58(1H，m)，1.35(3H，d，6.0Hz)，1.11(0.6H，s)，1.04(0.6H，s)，1.00(3H，s)，0.92(3H，s)，0.77(0.6H，d，6.0Hz)。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过柱色谱法纯化(24g硅胶，0-100％EtOAc的庚烷溶液)。无色油状物(108mg，0.109mmol，44％收率，85％纯)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+839.5，Rt1.21min。
(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相柱色谱法纯化，无色固体，为TFA盐(23mg，0.026mmol，48％收率)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+739.4，Rt3.20min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体之比5∶1混合物，对于次要旋转异构体的一些峰不能清楚地鉴定)：δ8.93(1.2H，brs)，8.61(1.2H，brs)，7.86-7.76(2.6H，m)，7.72-7.67(1H，m)，7.60-7.56(0.2H，m)，7.46-7.30(7.2H，m)，7.16-7.09(1.8H，m)，6.99(2.4H，brs)，6.19(1H，s)，5.69(0.2H，s)，5.58(0.2H，d，15.0Hz)，5.48(0.2H，d，15.0Hz)，5.33(1H，d，15.0Hz)，5.20-5.05(2.2H，m)，4.81-4.75(0.2H，m)，4.58-4.51(1.2H，m)，4.05-3.90(2.4H，m)，3.37-3.25(7.2H，m)，3.15-3.00(5.2H，m)，2.60-2.55(1.2H，m)，2.32-2.25(2H，m)，2.21(1H，d，13.8Hz)，2.12-2.02(0.4H，m)，2.00-1.90(2.2H，m)，1.74-1.60(1H，m)，1.35(3H，d，6.6Hz)，1.13(0.6H，s)，1.07(0.6H，s)，1.04(3H，s)，0.93(3H，s)，0.77(0.6H，d，5.4Hz)。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-3-氧代丙基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
不纯化。粗化合物。
LC/MS(方法A)：[M+H]+781.4，Rt1.19min。
(R)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-3-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-2，2-二甲基丙酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相柱色谱法纯化，无色固体，为TFA盐(2.4mg，3.02μmol，7％收率，100％纯)。LC/MS(方法B)：[M+H]+681.2；Rt3.13min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，报道主要旋转异构体的峰)：δ8.95(1H，brs)，8.67(1H，brs)，7.84-7.73(2H，m)，7.65(1H，d，3.7Hz)，7.45-7.28(6H，m)，7.15-7.05(1H，m)，6.94(2H，s)，6.42(1H，s)，5.22-5.18(2H，m)，5.16-5.07(1H，m)，4.57-4.51(1H，m)，3.95-3.85(2H，m)，3.40-3.25(3H，m)，3.15-3.00(3H，m)，2.30-2.22(1H，m)，1.97-1.87(1H，m)，1.80-1.65(1H，m)，1.34-1.30(6H，m)，1.02(3H，s)。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-3-氧代丙基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
不纯化。粗化合物。LC/MS(方法A)：[M+H]+825.4，Rt1.20min。
(R)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)-3-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-2，2-二甲基丙酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相柱色谱法纯化，无色固体，为TFA盐(2.4mg，2.86μmol，6％收率，100％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+725.3；Rt3.28min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，报道主要旋转异构体的峰)：δ8.93(1H，brs)，8.63(1H，brs)，7.83-7.72(1H，m)，7.71-7.66(2H，m)，7.46-7.26(6H，m)，7.13-7.06(1H，m)，6.99(2H，s)，6.43(1H，s)，5.25-5.17(2H，m)，5.16-5.03(1H，m)，4.57-4.51(1H，m)，3.95-3.83(2H，m)，3.46-3.39(2H，m)，3.34-3.21(3H，m)，3.19-3.01(4H，m)，2.98-2.86(1H，m)，2.30-2.22(1H，m)，1.97-1.87(1H，m)，1.75-1.60(1H，m)，1.40(3H，s)，1.34(3H，d，6.2Hz)，1.02(3H，s)。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)-2，2-二甲基丙基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷羟基上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。不纯化。无色油状物(27mg，0.032mmol，粗产物)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+853.4，Rt1.33min。
(R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-2，2-二甲基丙酯
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(60℃，17h)。通过反相柱色谱法纯化，无色固体，为TFA盐(4mg，4.85μmol，15％收率，100％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+711.3；Rt3.59min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，报道主要旋转异构体的峰)：δ9.01(1H，brs)，8.73(1H，brs)，7.90(1H，d，3.8Hz)，7.80-7.74(1H，m)，7.44-7.30(6H，m)，7.16-7.08(2H，m)，6.99(2H，s)，6.04(1H，s)，5.36(1H，d，15.2Hz)，5.22-5.04(2H，m)，4.59-4.54(1H，m)，4.05-3.85(2H，m，与水的峰重叠)，3.80-3.72(2H，m)，3.45(2H，t，6.0Hz)，3.40-3.25(2H，m)，3.14-3.08(2H，m)，2.36-2.28(1H，m)，2.00-1.90(1H，m)，1.80-1.68(1H，m)，1.34(3H，d，6.2Hz)，0.87(3H，s)，0.80(3H，s)。
(3R，4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙酰氧基丙酰基)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，4-二甲基-7-氧代-6，11-二氧杂-2，8-二导致十三烷基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷羟基上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。不纯化。无色油状物(37mg，0.042mmol，粗产物)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+897.5，Rt1.34min。
(R)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-2，2-二甲基丙酯
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(60℃，16h)。通过反相色谱法纯化，得到期望的产物。无色固体，为TFA盐(7.7mg，7.98μmol，19％收率，90％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+755.3；Rt3.60min。1H-NMR(DMSO，600MHz旋转异构体混合物，报道主要旋转异构体的峰)：δ9.00(1H，brs)，8.70(1H，brs)，7.90(1H，d，3.9Hz)，7.84-7.74(1H，m)，7.45-7.32(6H，m)，7.16-7.09(1H，m)，7.01(2H，s)，6.94(1H，t，5.9Hz)，6.07(1H，s)，5.37(1H，d，15.3Hz)，5.21-5.06(2H，m)，4.60-4.53(1H，m)，4.07-3.85(2H，m)，3.80-3.70(2H，m，与水的峰重叠)，3.60-3.22(7H，m，与水的峰重叠)，3.20-3.00(3H，m)，2.35-2.27(1H，m)，2.00-1.90(1H，m)，1.85-1.70(1H，m)，1.34(3H，d，6.1Hz)，0.91(3H，s)，0.83(3H，s)。
步骤1：(3R，4R)-3-((R)-18-叠氮基-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((S)-2-羟基丙酰基)-4，4-二甲基-6-氧代-10，13，16-三氧杂-2，7-二氮杂十八基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酸(60mg，0.043mmol)和11-叠氮基-3，6，9-三氧杂十一烷-1-胺(0.017ml，0.086mmol)溶于DMF(2ml)和DIPEA(0.037ml，0.214mmol)，然后加入HATU(24.42mg，0.064mmol)。将反应混合物在室温搅拌1h。用EA稀释，用盐水洗涤(＊3)。干燥合并的有机层，浓缩，得到37mg(100％收率)期望的产物，将其不经进一步纯化用于下一步。
LC/MS(方法A)：[M+H]+873.5，Rt1.27min。
步骤2：(3R，4R)-3-((R)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-18-(4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-((S)-2-羟基丙酰基)-4，4-二甲基-6-氧代-10，13，16-三氧杂-2，7-二氮杂十八基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向在乙腈(1ml)中的(3R，4R)-3-((R)-18-叠氮基-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((S)-2-羟基丙酰基)-4，4-二甲基-6-氧代-10，13，16-三氧杂-2，7-二氮杂十八基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(步骤1)(37mg，0.043mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2，5-二酮(9.94mg，0.074mmol)中加入CuI(9.34mg，0.049mmol)在水(1ml)中的溶液，然后加入TEA(6.83μl，0.049mmol)。将反应混合物在室温搅拌60h。过滤该反应混合物，用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥。通过柱色谱法纯化(12g硅胶，0-20％DCM的甲醇溶液)。无色油状物(24mg，0.013mmol，27％收率，55％纯)。LC/MS(方法A)：[M+H]+1008.5，Rt1.15min。
步骤3：(R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相色谱法纯化，得到期望的产物(2.8mg，2.60μmol，21.68％收率，TFA盐)，为无色固体。
LC/MS(方法B)：[M+H]+908.5，Rt3.08min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体之比5∶1混合物，一些次要旋转异构体的峰不能明确地归属)：δ8.97(1.2H，brs)，8.69(1.2H，brs)，7.96(1.2H，s)，8.03-7.93(0.2H，m)，7.85-7.75(3.4H，m)，7.59-7.55(0.2H，m)，7.45-7.29(7.4H，m)，7.16-7.09(1.6H，m)，7.07(2H，s)，6.21(1H，s)，5.72(0.2H，s)，5.59(0.2H，d，16.2Hz)，5.48(0.2H，d，16.2Hz)，5.34(1H，d，15.0Hz)，5.20-5.06(2.2H，m)，4.82-4.76(0.2H，m)，4.65(2.4H，s)，4.57-4.52(1H，m)，4.50-4.44(2.8H，m)，4.07-4.02(0.2H，m)，3.97-3.93(2H，m)，3.38(2.4H，t，5.1Hz)，3.52-3.40(10H，m)，3.32-3.25(2.4H，m)，3.17-3.12(2.4H，m)，3.07-3.02(0.4H，m)，2.32-2.25(1.2H，m)，2.22(1H，d，15.0Hz)，2.12-2.01(0.6H，m)，2.00-1.90(2.2H，m)，1.75-1.60(1H，m)，1.36(3H，d，6.0Hz)，1.15(0.6H，s)，1.09(0.6H，s)，1.06(3H，s)，0.94(3H，s)，0.78(0.6H，d，6.0Hz)。
(3R，4R)-3-((S)-2-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-14-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-3，8-二氧代-7，12-二氧杂-2，4，9-三氮杂十四基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷羟基上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。通过快速色谱法纯化(24g，硅胶)，用DCM/MeOH洗脱。无色油状物(70mg，0.077mmol，51％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+910.4，Rt1.35min。
(S)-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相色谱法纯化，得到期望的产物(35mg，0.038mmol，49％收率，TFA盐)，为无色固体。
LC/MS(方法B)：[M+H]+810.2，Rt4.10min。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ8.94(1H，bs)，8.48(1H，bs)，7.92(1H，d，3.9Hz)，7.78-7.70(1H，m)，7.45-7.25(7H，m)，7.15-7.07(1H，m)，7.03(2H，s)，6.45(1H，d，7.4Hz)，5.56(1H，s)，5.39(1H，d，15.3Hz)，5.30-5.07(2H，m)，4.05-3.85(4H，m)，3.84-3.70(1H，m)，3.60-3.45(6H，m)，3.43-3.20(6H，m)，3.12-3.02(2H，m)，2.47-2.37(1H，m)，2.30-2.10(1H，m)，1.82-1.67(1H，m)，1.54-1.35(2H，m)，1.30-1.20(1H，m)，1.17-1.05(6H，m)，0.97-0.89(1H，m)。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氨基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷胺上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。不纯化(36mg，纯度38％，粗产物，收率69％，0.016mmol)。LC/MS(方法A)：[M+H]+851.5；Rt1.25min。
(S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氨基)-2，2-二甲基丁基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(60℃，20h)。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，为TFA盐(6mg，6.82μmol，43％收率，92％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+709.4；Rt3.27min。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.05(1H，brs)，8.75(1H，brs)，7.93(1H，d，3.8Hz)，7.80-7.74(1H，m)，7.74-7.66(1H，m)，7.44-7.30(6H，m)，7.16-7.09(1H，m)，6.99(2H，s)，5.84(1H，s)，5.38(1H，d，15.4Hz)，5.25-5.19(1H，m)，5.09(1H，d，15.4Hz)，4.63-4.55(1H，m)，4.05-3.90(2H，m)，3.58-3.53(2H，m，与水的峰重叠)，3.35-3.15(2H，m)，2.86-2.78(2H，m)，2.41-2.35(1H，m)，2.31-2.23(2H，m)，1.97-1.85(2H，m)，1.41-1.32(4H，m)，1.17-1.06(1H，m)，0.92(3H，s)，0.79(3H，s)。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰氨基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷胺上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。不纯化(33mg，收率100％，粗产物，0.037mmol)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+895.5；Rt1.26min。
(S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰氨基)-2，2-二甲基丁基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(60℃，20h)。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，为TFA盐(10mg，11.02μmol，30％收率，97％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+753.4；Rt3.33min。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.05(1H，brs)，8.75(1H，brs)，7.93(1H，d，3.6Hz)，7.80-7.74(1H，m)，7.57-7.52(1H，m)，7.45-7.30(6H，m)，7.16-7.07(1H，m)，7.01(2H，s)，5.84(1H，s)，5.38(1H，d，15.3Hz)，5.32-5.17(1H，m)，5.09(1H，d，15.3Hz)，4.63-4.55(1H，m)，4.05-3.85(2H，m，与水的峰重叠)，3.55-3.51(4H，m)，3.47-3.43(2H，m)，3.40-3.15(2H，m)，2.90-2.80(2H，m)，2.42-2.32(1H，m)，2.23-2.16(2H，m)，1.92-1.88(1H，m)，1.45-1.30(4H，m)，1.20-1.10(1H，m)，0.93(3H，s)，0.80(3H，s)。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)吗啉-2-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷胺上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。通过快速色谱法纯化(24g，硅胶)，用DCM/MeOH洗脱。无色油状物(50mg，0.059mmol，72％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+849.2；Rt1.26min。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)吗啉-2-甲酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(60℃，6h)。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，为TFA盐(12mg，0.013mmol，45％收率，95％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+749.2；Rt3.27min。1H-NMR(DMSO，600MHz，旋转异构体混合物，120℃)：δ7.83-7.77(1H，m)，7.67(1H，d，3.7Hz)，7.45-7.32(3H，m)，7.30-7.15(3H，m)，7.10-7.07(1H，m)，6.93(2H，s)，5.40-5.10(4H，m)，4.40-4.15(1H，m)，4.05-3.85(4H，m)，3.76-3.62(4H，m)，3.55-3.25(7H，m)，2.95-2.85(1H，m)，2.75-2.55(5H，m)，2.37-2.20(1H，m)，1.55-1.25(3H，m)，1.05-0.85(1H，m)。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰基)吗啉-2-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷胺上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。通过快速色谱法纯化(12g，硅胶)，用DCM/MeOH洗脱。黄色油状物(30mg，0.034mmol，57％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+893.3；Rt1.27min。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)吗啉-2-甲酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，4h)。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，为TFA盐(22mg，0.024mmol，72％收率，99％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+793.1；Rt3.56min。
(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)吗啉-2-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷胺上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。通过快速色谱法纯化(4g，硅胶)，用DCM/MeOH洗脱。黄色油状物(13mg，0.014mmol，35％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+891.3；Rt1.31min。
(S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)吗啉-2-甲酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，6h)。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，为TFA盐(10mg，10.72μmol，74％收率，97％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+791.3；Rt3.72min。
(3R，4R)-3-(((R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)吗啉-2-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷胺上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。通过快速色谱法纯化(12g，硅胶)，用DCM/MeOH洗脱。无色油状物(15mg，0.018mmol，60％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+849.2；Rt1.30min。
(R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)吗啉-2-甲酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，3h)。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，为TFA盐(15mg，0.017mmol，95％收率，99％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+749.1；Rt3.56min。
(3R，4R)-3-(((R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)吗啉-2-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷胺上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。通过快速色谱法纯化(4g，硅胶)，用DCM/MeOH洗脱。黄色油状物(22mg，0.025mmol，84％收率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+891.2；Rt1.33min。
(R)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)吗啉-2-甲酰胺
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，6h)。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，为TFA盐(15mg，0.017mmol，66％收率，99％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+791.2；Rt3.88min。
(3R，4R)-3-((S)-2-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-32-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-3，8-二氧代-7，12，15，18，21，24，27，30-八氧杂-2，4，9-三氮杂三十二烷基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
通过与有效负荷在有效负荷羟基上连接至连接基成分中所述类似的方法制备标题化合物。不纯化。黄色油状物(63mg，0.054mmol，83％收率，粗产物)。LC/MS(方法A)：[M+H]+1174.6，)，[M+NH4]+1191.7，Rt1.35min。
(S)-(23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十三烷基)氨基甲酸2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙酯
通过与用于连接基-有效负荷组合Boc-脱保护的通用方法中所述类似的方法制备标题化合物(RT，1h)。通过反相色谱法纯化，得到期望的产物(10mg，8.33μmol，16％收率，TFA盐)，为无色固体。
LC/MS(方法Bv2)：[M+H]+1074.4，Rt4.49min。
(3-(N-((R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基)-4-甲基苯甲酰氨基)丙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯
通过对将连接基连接至式(II)的有效负荷化合物中的胺的通用方法所述的类似的方法制备标题化合物。通过反相色谱法纯化，得到无色固体(8mg，6.74μmol，14％收率，94％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+1115.6；Rt5.71min。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ9.96(1H，s)，8.23(1H，d，J＝8.6Hz)，8.07(1H，d，J＝7.5Hz)，7.83-7.74(2H，m)，7.65(1H，dd，J＝8.6，2.1Hz)，7.61-7.54(2H，m)，7.41-7.10(12Hm)，7.00(2H，s)，6.77(1H，t，J＝5.9Hz)，5.97(2H，brs)，5.88(1H，d，J＝16.3Hz)，5.53(1H，d，J＝10.5Hz)，5.07(1H，d，J＝16.3Hz)，4.89-4.75(2H，m)，4.43-4.33(1H，m)，4.19(1H，dd，J＝8.6，6.7Hz)，3.40-3.20(6H，m)，3.08-2.90(2H，m)，2.79-2.68(1H，m)，2.46-2.40(2H，m)，2.31(3H，s)，2.24-2.04(2H，m)，2.02-1.90(1H，m)，1.76-1.10(10H，m)，0.92-0.79(9H，m)，0.48(3H，d，J＝6.4Hz)。
(3-(N-((R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-4H-色烯-2-基)-2-甲基丙基)-4-甲基苯甲酰氨基)丙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯
通过对将连接基连接至式(II)的有效负荷化合物中的胺的通用方法所述的类似的方法制备标题化合物。通过反相色谱法纯化，得到无色固体(26mg，23μmol，38％收率，99％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+1115.5；Rt5.58min。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ9.96(1H，s)，8.11-8.04(2H，m)，7.90(1H，s)，7.83-7.76(1H，d，J＝8.6Hz)，7.61-7.52(3H，m)，7.29-7.11(12H，m)，7.00(2H，s)，5.99(2H，brs)，5.76(1H，d，J＝10.0Hz)，4.90-4.77(2H，m)，4.42-4.32(1H，m)，4.23-4.12(2H，m)，3.95-3.85(1H，m)，3.42-3.25(3H，m)，3.06-2.88(2H，m)，2.64-2.53(6H，m)，2.31(3H，s)，2.25-2.05(1H，m)，2.02-1.87(1H，m)，1.75-1.65(1H，m)，1.65-1.29(7H，m)，1.25-1.10(3H，m)，0.97(3H，d，J＝6.6Hz)，0.87-0.79(6H，m)，0.57-0.50(3H，m)。
(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羟基乙基)氨基甲酰基)氧基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在N2气氛中：向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(50mg，0.071mmol)在DMF5ml中的溶液中加入DIPEA(0.374ml，2.140mmol)，然后加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(50mg，0.164mmol)。将反应混合物在室温搅拌16h。在通过LC/MS(uplc)证实完成时，加入1-(2-((2-羟基乙基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(连接基1，TFA盐)(180mg，0.604mmol)，将该反应混合物在室温搅拌16h。加入乙酸乙酯和冷水，用盐水将有机层洗涤2次，用Na2SO4干燥，过滤，真空除去溶剂。使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(4g硅胶，0-100％EtOAc的庚烷溶液，9mg，0.071mmol，14％)，为无色油状物。LC/MS(方法A)：MH+911.7，1.26min。
(3R，4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙酰氧基丙酰基)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-9-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-4，4，14，14-四甲基-8，12-二氧代-7，13-二氧杂-2，9-二氮杂十五基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在N2气氛中：向(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(50mg，0.071mmol)在DMF5ml中的溶液中加入DIPEA(0.374ml，2.140mmol)，然后加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(50mg，0.164mmol)。将反应混合物在室温搅拌16h。在通过LC/MS(uplc)证实完成时，加入3-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)丙酸叔丁酯(连接基2，TFA盐)(54.6mg，0.143mmol)，将该反应混合物在室温搅拌16h。加入乙酸乙酯和冷水，用盐水将有机层洗涤2次，用Na2SO4干燥，过滤，真空除去溶剂。使其吸附在Isolute上。通过柱色谱法纯化后得到期望的产物(4g硅胶，0-100％EtOAc的庚烷溶液，40mg，0.040mmol，56％)，为无色油状物。LC/MS(方法A)：MH+995.8，1.47min。
3-((((R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁氧基)羰基)(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)丙酸
将(3R，4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙酰氧基丙酰基)-3-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-9-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-4，4，14，14-四甲基-8，12-二氧代-7，13-二氧杂-2，9-二氮杂十五基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(40mg，0.040mmol)溶于乙腈(1ml)和水(1ml)的混合物。加入TFA(0.155ml，2.010mmol)，将该反应混合物在60℃搅拌3天。
通过反相柱色谱法纯化后得到期望的产物(13mg，35％，为TFA盐)。
LC/MS(方法B)：MH+797.4，3.43min。在室温通过1H-NMR证实旋转异构体混合物，一些峰隐藏在水下。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ12.27(1H，brs)，8.98(1H，brs)，8.63(1H，brs)，7.96(1H，s)，7.76(1H，s)，7.45-7.30(6H，m)，7.16-7.09(1H，m)，6.97和6.96(2H，2个单峰，旋转异构体)，5.83(1H，s)，5.45-5.37(1H，m)，5.26(1H，d，54Hz)，5.09-5.03(1H，m)，4.62-4.57(1H，m)，4.04-3.90(2H，m)，3.82-3.66(2H，m)，2.46-2.35(3H，m)，2.00-1.85(2H，m)，1.55-1.20(5H，m)，1.03和0.96(3H，2个单峰，旋转异构体)，0.67和0.63(3H，2个单峰，旋转异构体)。
(R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酯
将(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(50mg，0.073mmol)溶于乙腈(1ml)和水(0.5ml)的混合物。加入TFA(0.222ml，2.88mmol)，将该反应混合物在60C搅拌20h。
通过反相柱色谱法纯化后得到期望的产物(17mg，34％，为TFA盐)。LC/MS(方法B)：MH+725.4，3.59min。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.01(1H，brs)，8.68(1H，brs)，7.96(1H，s)，7.76(1H，s)，7.45-7.30(6H，m)，7.15-7.03(2H，m)，6.99(2H，s)，5.84(1H，s)，5.40(1H，d，15Hz)，5.25(1H，d，54Hz)，5.06(1H，d，15Hz)，4.62-4.56(1H，m)，4.05-3.65(4H，m)，3.45-3.40(2H，m)，3.37-3.15(2H，m)，3.12-3.05(2H，m)，2.42-2.33(1H，m)，2.00-1.85(2H，m)，1.60-1.50(1H，m)，1.35(3H，d，5.9Hz)，1.32-1.24(1H，m)，0.93(3H，s)，0.73(3H，s)。
(R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-(4-(2，5-二氟 苯基)-1-(3-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)- 2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酯
步骤1(a)-活化：向搅拌的(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(128mg)在DMF(4mL)中的溶液中加入DIPEA(304μl)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(88mg)。将该混合物在RT搅拌2小时，此时LC-MS显示反应完全转化成期望的中间体产物。
步骤1(b)-氨解：向上述粗混合物中加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(98mg)。将反应混合物在50℃再搅拌2小时，此时LC-MS显示完全转化成期望的中间体产物。将反应混合物转入分液漏斗，加入去离子水(40mL)和乙酸乙酯(40mL)。萃取后，再用乙酸乙酯(40ml)萃取水层，然后用饱和盐水(80mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩滤液，得到黄色油状物。粗产物收率：270mg。将其直接用于下一步。
步骤2：BOC&MOM&酰基脱保护：将来自步骤1(b)的粗产物溶于乙腈(1ml)，加入6MHCl(1mL)。将反应混合物在60℃搅拌3小时，此时LC-MS显示反应几乎完成进行脱保护，得到期望的终产物。通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤反应混合物，通过反相制备型HPLC方法C纯化得到的澄清溶液。将包含产物的级分冻干过夜，得到白色松散粉末。收率：24.7mg。
UPLC-MS：Rt＝0.85min；MSm/z[M+H]+741.3；方法A。
UPLC-MS：Rt＝3.30min；MSm/z[M+H]+741.3；方法B。
1H-NMR(HSQC)与目标结构一致。
(R)-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸4-(4-(2，5-二氟 苯基)-1-(3-氟-5-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲 基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酯
步骤1：将搅拌的三光气(119mg)在无水DCM(5mL)中的溶液冷却至0℃，置于氩气气氛中。滴加(3R，4R)-3-(((S)-2-乙酰氧基-N-((R)-1-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-4-羟基-2，2-二甲基丁基)丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(80mg)和DIPEA(0.258ml)在DCM(2ml)中的溶液，将反应混合物温热至RT。在RT持续搅拌2小时。
步骤2：将上述粗反应混合物冷却至0℃，滴加N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(150mg)和DIPEA(0.258ml)在DCM(3mL)中的溶液。将反应混合物温热至RT，持续搅拌10分钟。然后使温度升至50℃，持续搅拌1小时，此时LC-MS显示转化成期望的中间体产物。高度真空浓缩反应混合物，得到深橙色油状物。将其直接用于下一步。
步骤3：BOC，MOM&酰基脱保护：将来自步骤2的粗产物溶于乙腈(2ml)，加入6MHCl(1.6mL)。将反应混合物在60℃搅拌2小时，此时LC-MS显示反应进行完全脱保护，得到终产物。通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤反应混合物，将得到的溶液分成2x2mL批量，通过反相制备型HPLC方法C纯化。
合并包含产物的级分，然后冻干过夜，得到白色松散粉末，收率：34.3mg。
UPLC-MS：Rt＝0.74min；MSm/z[M-H]-757.3；方法A.
UPLC-MS：Rt＝2.94min；MSm/z[M+H]+759.2；方法B
1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ10.10(s，1H)，9.03(s，1H)，8.70(s，1H)，7.93(s，1H)，7.81-7.73(m，1H)，7.41-7.29(m，1H)，7.19-7.10(m，1H)，7.06(t，J＝6.2Hz，1H)，6.98(s，2H)，6.70-6.58(m，2H)，6.53(d，J＝10.5Hz，1H)，5.79(s，1H)，5.37-5.21(m，2H)，4.95(d，J＝15.6Hz，1H)，4.60(q，J＝6.3Hz，1H)，4.03(dd，J＝16.1，4.4Hz，1H)，3.89(dd，J＝15.9，7.4Hz，1H)，3.82(q，J＝8.3Hz，2H)，3.65-3.37(m，2H)，3.37-3.17(m，2H)，3.08(q，J＝5.9Hz，2H)，2.47-2.33(m，1H)，2.07-1.84(m，2H)，1.69(dt，J＝14.2，7.0Hz，1H)，1.35(d，J＝6.2Hz，4H)，0.95(s，3H)，0.77(s，3H)。
(R)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2，5-二氧 代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟 基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰胺
步骤1：向(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-3，3-二甲基丁酸(80mg)和DIPEA(189μL)在无水DMF(2mL)中的溶液中加入HATU(82mg)。将反应混合物在RT搅拌10分钟，然后加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(92mg)。将反应混合物在RT在1个周末内搅拌，此时LC-MS显示反应完成。使反应混合物分配在二氯甲烷(40mL)与去离子水(40mL)之间。将该混合物转入分液漏斗，萃取后，再用二氯甲烷(40ml)萃取水相。然后用去离子水(40ml)、饱和盐水(50ml)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，通过1号滤纸过滤，真空浓缩，得到棕色蜡样油状物。粗产物收率：251mg。产物仍然包含一些DMF，但直接用于下一步：
步骤2：BOC，MOM&酰基脱保护：向来自步骤1的粗产物中加入乙腈(4ml)和6MHCl(1.2mL)。将反应混合物在60℃搅拌2小时，此时LC-MS显示反应进行完全脱保护，得到期望的终产物。通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤反应混合物，将得到的澄清溶液分成2x2.6mL批量，通过反相制备型HPLC方法C纯化。合并包含产物的级分，冻干过夜，得到黄褐色/奶油色松散粉末。收率：7mg。
UPLC-MS：Rt＝2.72min；MSm/z[M+H]+711.3；方法B
1H-NMR(HSQC)与目标结构一致。
(R)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-羟基苄基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2，5- 二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)- 2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰胺
步骤1：向(R)-4-((S)-2-乙酰氧基-N-(((3R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)丙酰氨基)-4-(4-(2，5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苄基)-1H-咪唑-2-基)-3，3-二甲基丁酸(144mg)和DIPEA(450μL)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入HATU(147mg)。将反应混合物在RT搅拌10分钟，然后加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(164mg)。将反应混合物在RT搅拌2小时，此时LC-MS显示得到中间体的反应完成。真空浓缩反应混合物，将残余物溶于乙腈(3mL)。通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤该溶液，分成2x1.5mL批量。通过反相制备型HPLC方法C纯化它们。
合并包含产物的级分，真空浓缩，得到白色松散粉末，收率：43mg。
步骤2：BOC，MOM&酰基脱保护：将来自步骤1的产物溶于乙腈(2ml)，加入6MHCl(1.0mL)。将反应混合物在60℃搅拌2小时，此时LC-MS显示反应实际上进行完全脱保护，得到终产物。通过0.2μmPTFE注射器式滤器过滤反应混合物，将得到的溶液分成2x2mL批量，通过反相制备型HPLC方法C纯化。
合并包含产物的级分，然后冻干过夜，得到白色松散粉末，收率：23.2mg。UPLC-MS：Rt＝2.56min；MSm/z[M-H]-727.4；方法B。
1H-NMR(HSQC)与目标结构一致。
半胱氨酸代谢物：
用于合成半胱氨酸-代谢物的通用方法：
向Boc-连接基-有效负荷(0.1mmol，1eq))在乙腈(1ml)中的溶液中加入L-半胱氨酸(1mmol，10eq)和水(0.1ml)。将该反应混合物在室温搅拌1h。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，将粗产物(Boc-Cys-代谢物)就此用于下一步。
向上述步骤的溶液中加入TFA(150mmol)，将该反应混合物在室温搅拌。通过LC/MS(uplc，方法A)证实反应完成时，通过反相柱色谱法(PrepLC方法C或D)纯化粗产物，梯度MeCN(+0.1％TFA)/H2O(+0.1％TFA)。分离产物，为TFA盐。
(2R)-2-氨基-3-((1-((1R，5S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-5-甲基-3，8-二氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7，12-二氧杂-2，4，9-三氮杂十四-14-基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸
Boc-Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：MH+1017.6，1.07min。(方法A)。
21mg，0.018mmol，16％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.17-8.59(1H，m)，8.81-8.59(1H，m)，8.58-8.31(3H，m)，7.83-7.69(2H，m)，7.45-7.36(2H，m)，7.35-7.21(4H，m)，7.14-6.98(2H，m)，6.43-6.23(1H，m)，5.38-5.28(2H，m)，5.27-5.10(2H，m)，4.31-4.21(1H，m)，4.15-4.03(1H，m)，4.00-3.80(4H，m)，3.78-3.68(1H，m)，3.27-3.15(5H，m)，3.14-3.02(4H，m)，2.65-2.47(4H，m)，2.33-2.15(1H，m)，2.07-1.90(1H，m)，1.46-1.32(1H，m)，1.28-1.15(2H，m)1.14-1.02(3H，m)，0.79-0.58(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+917.6，0.80min。(方法A)。
(3R)-6-((1R，5S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-5-甲基-3，8，16-三氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7，12-二氧杂-2，4，9，15-四氮杂十七烷-17-基)-5-氧代硫吗啉-3-甲酸.
4mg，0.0037mmol，99％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：-NMR(DMSO，600MHz)：基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-5-甲基-3，8，16-三氧代-42-6.21(1H，m)，5.40-5.09(4H，m)，4.38-4.26(1H，m)，4.06-3.80(5H，m)，3.80-3.68(1H，m)，3.68-3.55(2H，m)，3.26-3.07(8H，m)，3.05-2.91(1H，m)，2.80-2.69(1H，m)，2.66-2.54(1H，m)，2.36-2.15(1H，m)，2.09-1.91(1H，m)，1.47-1.35(1H，m)，1.32-1.15(2H，m)，1.14-1.04(3H，m)，0.78-0.59(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：M+917.4，084min。
(2R)-2-氨基-3-((1-((1-((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸.
Boc-Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：MH+967.5，1.06min。(方法A)。
10mg，0.009mmol，62％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.20-8.90(1H，m)，8.69-8.23(4H，m)，8.08-7.97(1H，m)，7.83-7.70(2H，m)，7.41-7.36(2H，m)，7.35-7.29(2H，m)，7.26-7.22(2H，m)，7.14-7.08(1H，m)，6.58-6.31(1H，m)，5.39-5.07(4H，m)，4.72-4.58(2H，m)，4.49-4.34，(2H，m)，4.33-4.06(4H，m)，3.92-3.81(2H，m)，3.79-3.67(2H，m)，3.11-2.98(1H，m)，2.70-2.43(4H，m)，2.38-2.18(1H，m)，2.06-1.80(1H，m)，1.41-1.29(1H，m)，1.28-1.19(1H，m)，1.18-1.02(4H，m)，0.75-0.55(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+867.5，0.78min。(方法A)。
(2R)-2-氨基-3-((1-(4-(((S)-2-(3-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)脲基)丙基)氨基)-4-氧代-2-磺基丁基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸.
Boc-cys-代谢物(非对映异构体混合物)：LC/MS(uplc)：MH+1051.5，0.97min。(方法A)。
使用反相色谱法(PrepLC方法A)在Boc-脱保护后分离非对映异构体混合物。
异构体A，27mg，0.024mmol，8％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.12-8.96(1H，m)，8.96-8.78(1H，m)，8.48-8.24(3H，m)，7.97-7.84(1H，m)，7.81-7.65(2H，m)，7.48-7.37(2H，m)，7.36-7.24(4H，m)，7.17-7.01(1H，m)，6.18-6.01(1H，m)，5.49-5.16(4H，m)，4.34-4.20(1H，m)，4.15-4.05(1H，m)，3.96-3.66(6H，m)，2.87-2.64(4H，m)，2.61-2.39(3H，m)，，2.13-1.97(1H，m)，1.93-1.58(2H，m)，1.50-1.36(1H，m)，1.35-1.20(1H，m，1.19-0.93(4H，m)，0.71-0.52(1H，m)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+951.5，0.79min。(方法A)。
异构体B，28mg，0.025mmol，8％。1H-NMR(DMSO，600MHz)：δ9.14-8.96(1H，m)，8.86-8.61(1H，m)，8.51-8.24(3H，m)，8.11-7.89(1H，m)，7.80-7.65(2H，m)，7.49-7.38(2H，m)，7.37-7.23(4H，m)，7.16-7.01(1H，m)，6.01-5.90(1H，m)，5.49-5.17(4H，m)，4.35-4.19(1H，m)，4.16-3.96(2H，m)，3.92-3.66(6H，m)，3.11-2.98(1H，m)，2.89-2.77(1H，m)，2.75-2.59(1H，m)，2.58-2.44(4H，m)，2.10-1.93(1H，m)，1.72-1.56(1H，m)，1.41-1.24(2H，m)，1.21-1.09(1H，m)，1.08-0.95(3H，m)，0.75-0.53(1H)。丢失的信号隐藏在溶剂峰下。LC/MS(uplc)：MH+951.5，0.81min。(方法A)。
(2R)-2-氨基-3-((1-((1R，5S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-5-甲基-3，8-二氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7-氧杂-2，4，9-三氮杂十七烷-15-基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸.
Boc-Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：M+1029.7，1.12min(方法A)。
Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：M+929.6，0.83min(方法A)。
(2R)-2-氨基-3-((1-((1R，4S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-4-甲基-3，6-二氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5，10-二氧杂-2，7-二氮杂十二烷-12-基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸.
Boc-Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：M+988.5，1.10min(方法A)。
Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：M+888.5，0.79min(方法A)。
(3R)-6-((1R，4S)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-4-甲基-3，6，14-三氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5，10-二氧杂-2，7，13-三氮杂十五-15-基)-5-氧代硫吗啉-3-甲酸.
Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：M+888.5，0.83min(方法A)。
(2R)-2-氨基-3-((1-(6-(((((S)-1-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氧基)羰基)氨基)己基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸.
Boc-Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：M+1000.5，1.14min(方法A)。
Cys-代谢物：LC/MS(uplc)：M+900.4，0.83min(方法A)。
(2R)-2-氨基-3-((1-(3-((S)-2-(((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酰基)吗啉代)-3-氧代丙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸
步骤1：向含(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-4-(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基)吗啉-2-甲酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(25mg，0.029mmol)的乙腈(体积：1.5ml)和水(体积：0.500ml)中加入L-半胱氨酸(5.35mg，0.044mmol)，将反应混合物在RT搅拌2h。
步骤2：加入HCl(25％水溶液)(0.179ml，1.472mmol)，将反应混合物在RT搅拌2h，再加入HCl(25％水溶液)(0.179ml，1.472mmol)，将反应混合物在RT搅拌4h。浓缩。
通过反相色谱法纯化，得到无色固体，双TFA盐(16mg，0.015mmol，50％收率，99％纯)。LC/MS(方法B)：[M+H]+870.2；Rt2.73min。
(2R)-2-氨基-3-((1-(2-((R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰氨基)乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸
步骤1：向含(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(30mg，0.038mmol)的乙腈(体积：1.Sml)和水(体积：0.500ml)中加入L-半胱氨酸(13.7mg，0.113mmol)，将反应混合物在RT搅拌16h。
步骤2：加入TFA(0.145ml，1.887mmol)，将反应混合物在RT搅拌60h。浓缩。
通过反相色谱法纯化，得到无色固体，双TFA盐(37mg，0.035mmol，93％收率，99％纯)。LC/MS(方法B)：[M+H]+816.3；Rt2.37min。
(2R)-2-氨基-3-((1-(2-(2-((R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰氨基)乙氧基)乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸
步骤1：向含(3R，4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基)-2，2-二甲基-4-氧代丁基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(54mg，0.055mmol，85％纯)的乙腈(体积：1.5ml)和水(体积：0.500ml)中加入L-半胱氨酸(19.9mg，0.164mmol)，将反应混合物在RT搅拌16h。
步骤2：加入TFA(0.211ml，2.74mmol)，将反应混合物在60℃搅拌4h。浓缩。
通过反相色谱法纯化，得到无色固体，双TFA盐(48mg，0.044mmol，81％收率，99％纯)。LC/MS(方法B)：[M+H]+860.5；Rt2.50min。
(2S)-2-氨基-3-((1-((S)-2-((((R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁氧基)羰基)氨基)-2-羧基乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸
得到11mg无色粉末，为TFA盐(11mg，9.84μmol，13.2％收率，100％纯)。LC/MS(方法B)：[M+H]+890.3；Rt2.54/2.63min(2种非对映异构体)。
制备化合物5A、5D和5E的半胱氨酸代谢物，它们均为Eg5高度有效的抑制剂，其中IC-50分别为＜0.5nM、0.5nM和0.6nM。
用于分解代谢物合成的通用方案2
向(L)-半胱氨酸(10当量)在水(0.1M)中的溶液中加入含Boc-保护的连接基-有效负荷(1.0当量)的DMF(0.1M)，将该反应体系在室温搅拌1h。与乙酸乙酯进行反应。合并有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。将残余物溶于DCM(0.1M)，加入三氟乙酸(50当量)。将该反应体系在RT搅拌2h，然后浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化粗产物，用0-100％甲醇的DCM溶液洗脱，得到标题化合物。
(2R)-2-氨基-3-((1-(2-(((((3S，4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)甲基)吡咯烷-3-基)氧基)羰基)氨基)乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸
49％收率；UPLC-MS：Rt＝1.66和1.67mins；MSm/z[M+H]+842.3；方法A。1H-NMR(DMSO，400MHz，旋转异构体和非对映异构体混合物)：δ7.99-6.77(12H，m)，5.64-4.99(3H，m)，4.87-4.85(1H，m)，4.53-4.51(1H，m)，4.03-2.05(25H，m)，1.51-0.57(7H，m)。
重排的半胱氨酸代谢物：
(3R)-6-(2-((2-((R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-5-氧代硫吗啉-3-甲酸
将(2R)-2-氨基-3-((1-(2-((R)-4-(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基)甲基)-2-羟基丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰氨基)乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)丙酸(17mg，0.016mmol)溶于乙腈(体积：0.5ml)，加入1.SmlPBS缓冲液(pH7.2)。将反应混合物在RT搅拌10天。通过反相色谱法纯化，得到无色固体，双TFA盐(9mg，0.016mmol，57％收率，95％纯)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+816.5；Rt2.54min。
ADCs的合成
如下通用缀合方法中所述得到ADCs并表征。
用于连接基-有效负荷(L-P)与抗原结合部分缀合的通用方法
在2-步法中使有效负荷与抗原结合部分(例如抗体的IgG1κ或λ)在部分还原的铰链和链间二硫键上缀合。首先在37℃将在包含2mMEDTA的PBS中5-10mg/ml浓度的抗体用50mM巯基乙胺(加入为固体)还原1-1.5小时。脱盐和添加1％w/vPS-20洗涤剂后，在4℃使部分还原的抗体(1-2mg/ml)与以10mg/ml溶解于DMSO或其他适合溶剂中的、每10mg抗体0.5-1mg量的连接基-有效负荷化合物反应过夜。通过蛋白质A色谱法纯化抗体-药物缀合物。用PBS进行基线洗涤后，用50mM柠檬酸盐pH2.7、140mMNaCl洗脱缀合物，中和，无菌过滤。根据该方法制备表5-6中所述的ADCs。该方法得到的平均药物载量为4-6个分子的有效负荷/抗体：该通用方法产物的具体实例如表5-6中所示，其鉴定了连接至具有曲妥珠单抗序列的抗体的连接基-有效负荷部分，并且提供了每种缀合物的测量DAR值和％聚集数据。在如下部分和相关附图中提供了来自表5-6的选择的缀合物的生物学数据。
不同方法用于抗体，其中通过蛋白质改造导入新的半胱氨酸残基作为缀合位置。为了还原所有天然的二硫键和半胱氨酸或改造的半胱氨酸残基的GSH加合物之间结合的二硫化物，将新鲜制备的DTT加入到预先纯化的抗体的Cys突变体，直到终浓度为20mM。在与DTT一起在37℃温育1小时后，在4℃将该混合物对PBS透析3天，每日进行缓冲液交换，以除去DTT，再氧化天然二硫键。可选方法在于通过脱盐柱SephadexG-25除去还原试剂。一旦完全还原蛋白质，则向脱盐的样品中加入1mM氧化的抗坏血酸盐(脱氢-抗坏血酸)，将再氧化温育进行20小时。再氧化恢复了链内二硫键，同时透析允许半胱氨酸和谷胱甘肽连接至新导入的半胱氨酸以便透析掉。(这些方法均产生类似的结果，但尝试遵循文献中预先描述的再氧化方案、使用CuSO4导致蛋白质沉淀。本文的所有实施例均使用上述透析方案。
通过将5mg/ml抗体与0.35mM马来酰亚胺化合物一起在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中温育1小时，使再氧化的抗体与化合物223(5B)缀合。通过RP-HPLC监测反应的完全性，典型地得到3-4个DAR。对于cKitA，使用该方法制备的样品的DAR为3.2。改造的抗体在相同条件下得到稍高的DAR，其中cKitB-5B缀合物的DAR＝3.9，cKitC-5B缀合物的DAR＝4.0。通过MS进一步验证DAR测量值。
使用抗-Her2抗体如曲妥珠单抗作为抗体(本文称作“TBS”)、通过上述方法制备如下ADCs，证实了式II的Eg5抑制剂作为有效负荷化合物的通用性和效能。对于大量具有Ab＝TBS的免疫缀合物的表征数据(DAR和％聚集)如表7中所示；ADC编号110至ADC编号133的结构如本文所示。
ADC-110.
ADC-111.
ADC-112.
ADC113.
ADC-114.
ADC-115.
ADC-116.
ADC-117.
ADC-118.
ADC-119.
ADC-120.
ADC-121.
ADC-122.
ADC-123.
ADC-124.
ADC-125.
ADC-126.
ADC-127.
ADC-128.
ADC-129.
ADC-130.
ADC-131.
ADC-132.
ADC-133.
抗体-药物缀合物的表征
通过LC/MS表征如上所述制备的免疫缀合物，如图1中对于一种免疫缀合物所示例。缀合典型地提供在结合抗体的连接基-有效负荷部分拷贝数方面不同的缀合物混合物。质谱分析证实：连接基-有效负荷基团连接至表5-6中缀合物各自的轻链和/或重链。在样品的平均值药物载量(DAR，药物与抗体之比)和聚集度(以％表示)方面表征缀合物。
从有关还原和脱糖基化的样品的LC-M数据中推断DAR值。如图1中对曲妥珠单抗与化合物编号223的缀合物(TBS-化合物223)所示例，LC/MS能够定量连接至ADC中的抗体的有效负荷(药物)的平均分子数。HPLC将抗体分离成轻链和重链，且根据每个链的连接基-有效负荷基团数分离重链(HC)和轻链(LC)。质谱数据能够鉴定混合物中的成分种类，例如LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。根据LC和HC链上的平均载量，可以计算ADC的平均药物与抗体比(DAR)(参见图1B)。对于指定缀合物样品的DAR表示连接至包含2个轻链和2个重链的四聚化抗体的平均药物(有效负荷)分子数。在该实施例中，DAR是5.8。
发现一些缀合物形成聚集物，且还根据聚集的程度表征本文所述的缀合物。通过分析型大小排阻色谱法测定聚集度(Superdex2005/150GL，在PBS中运行)。观察到，聚集度取决于连接基-有效负荷和DAR。具有较低聚集百分比的缀合物更可以用于更多的一些目的，因此，可以优选显示低于50％聚集度且优选低于20％聚集度的免疫缀合物。该数据还证实，可以通过选择连接基和DAR操控指定有效负荷的聚集度。表7还显示了用于每种缀合物的连接基是稳定的还是可裂解的。
表7.免疫缀合物的表征。
在上述部分中测定了这些ADCs的一些(ADC-110-ADC-133)的结构。注意，ADC-127和ADC-128是对比例，其具有的有效负荷在式(II)的范围外。一些ADCs在表中显示了一次以上，代表不同的ADC制品，其示例了％聚集和DAR的一些改变。DAR中达15-20％的改变几乎不会导致所观察到的生物活性改变-参见图28-29。
尽管表7中的实施例与曲妥珠单抗缀合，但是本发明的连接基-有效负荷组合中的几种还与定向于不同抗原的抗原结合部分和其它抗体缀合。其它抗体的描述及其表征和活性的概述在如下活性实施例中提供，且在下文中提供了大量这些缀合物的表征数据。经证实与定向于其它肿瘤细胞抗原的抗体的缀合物，对表达高水平由ADC中的抗体识别的抗原的细胞具有的生长抑制作用，高于对缺乏该抗原的细胞的生长抑制作用。这表明，通过选择识别靶细胞系上抗原的抗体，具有式(II)的Eg5抑制剂作为其有效负荷的ADCs可以用于靶向不同细胞系或肿瘤类型，从而提供了本发明有效的缀合物可以使用靶向其它细胞和抗原的抗体的证据。
cKitA抗体和抗-gH抗原结合部分描述在实施例中-参见实施例5和实施例8。
活性实施例1：Eg5抑制剂的体外抗-增殖活性
式(II)的化合物在结构上与已知Eg5抑制剂类似。其在靶位点上的体外活性通过测定对Eg5的IC50来验证。下表提供所选择的本发明化合物的IC-50数据：所用测定条件的下限为0.0005μM.
材料和方法
细胞系
为了生成超表达Her2的细胞系，用慢病毒构建体(pLenti6.3(Invitrogen)；由巨细胞病毒增强子-启动子驱动)稳定转导MDA-MB-231乳腺癌细胞，所述慢病毒构建体编码Her2抗原(NM_004448；密码子K753M)的突变体形式、缺乏激酶活性且由此是不形成肿瘤的，但仍然由抗-Her2抗体识别。通过荧光激活细胞分选术和使用杀稻瘟素筛选分离超表达Her2的品系MDA-MB-231/Her2突变体克隆16(“克隆16”)。按照相同方式，分离模拟转导的MDA-MB-231-M40品系(用慢病毒转导，但不表达外源性Her2)。通过在补充10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640生长培养基中传代来维持克隆16和亲代MDA-MB-231培养物。SK-OV-3细胞在小鼠腹腔内连续传代时，分离可选的模型SK-OV-3ip，以筛选在啮齿动物宿主繁殖的细胞。通过在补充10％(v/v)胎牛血清的McCoy's5A-1640生长培养基中传代来维持SK-OV-3ip细胞。T47D2细胞是T47D乳腺癌细胞系的变体。表达高水平Her2抗原的其它细胞系包括乳腺癌品系HCC1954和卵巢癌品系OE-19。胃癌细胞系NCI-N87是Her2的适度表达者，提供效能的额外测试。使用MDA-MB-231亲代和M40品系和Her2-阴性乳腺癌品系MDA-MB-468评估对Her2表达的选择性。对ckit-高NCI-H526细胞(小细胞肺癌品系)和cKit-阴性MDA-MB-468细胞测试抗-cKitADCs(cKitA、cKitB和cKitB)。全部其它细胞系易于购自标准供应商。通过在加载5％CO2气氛的加湿37℃温育器中连续传代来维持全部细胞系。
使用抗体-药物缀合物处理的细胞增殖
在第0天时，将细胞以3000细胞/孔接种入96-孔澄清底黑色壁培养板(Costar#3603)的90μl生长培养基。在第1天时，将抗体-药物缀合物以高于终浓度10-倍稀释入细胞生长培养基，从90μg/mL开始以3-倍连续稀释至1.5ng/mL。然后将缀合物稀释液(10μl/孔)加入96-孔培养板中的细胞；终浓度为9000ng/mL至0.15ng/mL。一式两份或一式三份制备样品。将细胞置于加载5％CO2气氛的加湿37℃温育器中，在第5或6天时，从温育器中取出96-孔培养板，使其平衡至室温。将细胞TiterGlo2(50μl/孔；Promega#G7571)在10分钟搅拌下加入到每个孔中。使用WallacMicroBeta发光计测定生物发光(表示ATP的相对水平)。
使用Eg5抑制剂处理的细胞增殖
在第0天时，将细胞以3000细胞/孔接种入96-孔澄清底黑色壁培养板(Costar#3603)的90μl生长培养基。在第1天时，将Eg5抑制剂以高于终浓度10-倍稀释入细胞生长培养基，从1000nM开始以3-倍连续稀释至51pM。然后将缀合物稀释液(10μl/孔)加入96-孔培养板中的细胞；终浓度为100ng/mL至5.1pM。一式两份或一式三份制备样品。将细胞置于加载5％CO2气氛的加湿37℃温育器中，在第5或6天时，从温育器中取出96-孔培养板，使其平衡至室温。将细胞TiterGlo2(50μl/孔；Promega#G7571)在10分钟搅拌下加入到每个孔中。使用WallacMicroBeta发光计测定生物发光(表示ATP的相对水平)。
效能值的定义和导出
对复制样品求细胞TiterGlo2数据的平均值，然后对未处理的细胞校准。使用作为另外加到MicroSoftExcel上使用的XL-Fit软件包(IDBS)所提供的4-参数逻辑模型(S形剂量响应模型#205)导出剂量响应曲线。
fit＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))
inv＝(C/((((B-A)/(y-A))-1)^(1/D)))
res＝(y-fit)
EC50＝拟合的细胞TiterGlo2信号是未处理细胞生成信号的50％时的测试制品浓度。
IC50＝拟合的细胞TiterGlo2信号降至未处理细胞与测试制品的最大效应之间的信号差的50％时的测试制品浓度。例如，如果最大效应是信号降至未处理细胞的40％，则IC50是拟合剂量响应曲线达到未处理细胞的70％时的浓度。IC50相当于上述提供的拟合算法中的参数“C”。
结果
如上述方法中所述进行Eg5抑制剂存在下的细胞增殖。5或6天后，使用细胞TiterGlo2试剂测定细胞计数(图2)，除外图2(A)-(B)，其中温育进行3天。求一式两份样品的数据的平均值，然后将平均值校准为未处理细胞和在最低测试浓度下处理的细胞的平均值。两种校准方法得到相差无几的发现。使用每种浓度的单一样品进行图2(E)-(F)中化合物#2(表1)和化合物#14(表1)的比较，将它们校准为最低测试浓度。下表中提供了式(II)的选择的抑制剂和对比Eg5抑制剂的细胞活性数据。
这些Eg5抑制剂对来自许多不同品系的细胞系具有抗-增殖活性，表明这些分子具有作为ADC有效负荷和作为癌症治疗剂的宽泛潜能。在这些测定法中的抑制浓度对于任意指定化合物而言一般在严格范围内。在最大抑制中观察到的变化显示与G2/M过渡时的细胞周期阻滞一致，然后是细胞凋亡；细胞凋亡启动时间在细胞系中广泛改变，这可以解释最大化合物作用中的变异性。
当在一组Eg5抑制剂中比较时，观察到一定范围的抗-增殖活性。注意，化合物效能的等级次序一般在细胞系彼此之间得以维持。细胞效能受许多因素影响，包括Eg5酶活性的内在抑制和细胞膜对化合物的渗透性。例如，化合物#77包含主要在生理学pH下脱质子化的羧酸，这可以解释该化合物的效能为何比测试中的其它化合物稍有降低(图1E)。
显示了赋予强抗-增殖活性的各种化学骨架。例如，图2(A)-(E)显示叔丁基和THP系列中的Eg5抑制剂(R1分别＝叔丁基或4-四氢吡喃基)和具有核心脲(A＝NH)或核心酰胺(A＝键)的THP系列抑制剂实施例。来自每种系列的实施例以亚纳摩尔浓度抑制增殖。还观察到具有相对较低效能的化合物：在一些情况中，当以抗体-药物缀合物的形式递送至细胞时，具有较低效能的化合物作为细胞增殖抑制剂的有效性不成比例。
图3(A)-(L)示例了具体Eg5抑制剂在来源于不同谱系的各种癌细胞系的抗-增殖活性的实例(参见下表8)。尽管效能确实改变，但是这些谱系的所有细胞系均对式(II)和(III)的化合物敏感。
表8.
活性实施例2：Eg5抑制剂ADC的体外抗-增殖活性
如上述方法中所述在具有抗-Her2曲妥珠单抗抗体(“TBS”)和Eg5抑制剂的抗体-药物缀合物(“ADCs”)存在下进行细胞增殖。5或6天后，使用细胞TiterGlo2试剂测定细胞计数。求一式两份样品的数据的平均值，然后将该平均值对未处理相比的平均值校准。图4A-V显示剂量-响应示意图对，其示例了ADCs对Her2-高克隆16细胞与Her2-低亲代MDA-MB-231细胞比较的抗-增殖作用。与所用的具体连接基化学无关，ADCs的活性对于升高的Her2表达具有高度选择性。
图4A-H示例了使用连接基的ADCs的体外效能，所述连接基被设计成在溶酶体中裂解，从而将未修饰的Eg5抑制剂释放入靶细胞内部。不同有效负荷(来自不同结构家族)与两种不同可裂解连接基(包含二肽缬氨酸-瓜氨酸或聚糖-葡萄糖醛酸苷)的组合一般对克隆16具有抗-增殖作用，但对亲代MDA-MB-231细胞的作用非常低。
图4G-H示例了TBS-Cmpd312的选择性活性，其掺入了包含羧酸酯的Eg5抑制剂化合物#77。该游离化合物具有适度的抗-增殖活性(图2E)，可能归因于在胞外pH(约7)下膜的渗透性差。当在酸性溶酶体中释放时(pH约为5)，羧酸酯被部分质子化，从而除去电荷并且改善膜渗透性，由此可以解释ADC的活性。
预期可以通过使用不能裂解的连接基得到不同的特性，由此ADC的胞内代谢将生成偶合至来源于抗体的一个或多个氨基酸的有效负荷和连接基的加合物。具有不能裂解的连接基的示例性ADCs的体外抗-增殖活性示例在图4I-R中。该系列包含在已知或预计不牵涉Eg5结合的Eg5抑制剂区域上连接的连接基。图4I-R中表示的连接基在连接至有效负荷和连接至抗体半胱氨酸的模式方面不同。另外，连接基的长度和预期物理特性如亲脂性和构象灵活性方面可变。
所有这些ADCs通过连接基上的马来酰亚胺基团连接至抗体半胱氨酸，除外TBS-Cmpd300(图4K、L、O、P)，它们使用碘乙酰胺基团用于巯基偶联。这种ADC的Her2-选择性体外效能证实抗-增殖活性无需马来酰亚胺。
在不同位置上连接至有效负荷的不能裂解的连接基用于产生具有图4S-V中示例的体外活性的ADCs。此外，有效负荷上不同位置上的连接基连接不会阻止实现Her2-依赖性细胞效能，这表明式(II)化合物上的连接基连接点可变。
为了证实ADCs可以抑制内源性表达Her2的细胞增殖，将选择的具有抗-Her2抗体的ADCs与HCC1954(图5A，B)或SK-OV-3ip(图5C-E)细胞一起温育。带有可裂解或不能裂解的连接基、来源于不同连接基-有效负荷结构家族的ADCs抑制这些Her2-高细胞系的增殖。
活性实施例3：Eg5抑制剂ADC的体内效能评价
本发明与曲妥珠单抗(TBS)缀合的化合物还显示在异种移植物肿瘤模型中的显著活性，所述异种移植物肿瘤模型基于将人肿瘤细胞植入免疫缺陷型裸鼠。如上所述(Sausville和Burger，2006)，使用这类肿瘤异种移植物小鼠的研究已经提供了抗癌试剂的体内效能的有价值的洞察。特别地，使用皮下注射5.0x106SK-OV-3ip细胞(Yoneda等人，1998)或HCC1954细胞的裸小鼠进行体内效能研究。基于在先的体外效能测定选择这些细胞系，所述测定揭示出其以抗原依赖性方式对上述举出的Eg5抑制剂ADCs的高敏感性。在肿瘤达到约200-250mm3的尺寸后，以单剂量静脉内注射Eg5抑制剂ADCs，根据实验的不同剂量为0.3mg/kg-10mg/kg，其中每个治疗组包含9只小鼠。施用抗体-药物缀合物后，每周2次监测肿瘤体积。根据GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals(NIH出版物；NationalAcademyPress，第8版，2001)进行全部动物研究。
图6(A)和6(B)显示具有缀合了曲妥珠单抗的连接基-有效负荷化合物编号220(TBS-化合物220)的ADC对小鼠的HCC1954乳腺癌异种移植物肿瘤的效能。图6(A)显示使用1、2或3mg/kg的单剂量的TBS-化合物20缀合物在约55天期限内的肿瘤大小改变，其中所述TBS-化合物20缀合物包含化合物12(表1)作为有效负荷。1mg/kg剂量与不具有Eg5抑制剂的对照品相比显示适度的肿瘤生长减缓，而2mg/kg和3mg/kg剂量在测试过程中防止了肿瘤生长。图3b显示3mg/kg和6mg/kg剂量的结果，其防止肿瘤增大。
使用单独的TBS(不含Eg5抑制剂的抗-Her2抗体)(图6(B))以6mg/kg治疗的动物(相当于在最高缀合物中抗体测试剂量下的量)在测试期间肿瘤体积约增长4倍且显示与仅有媒介物的对照组治疗类似。其它动物接受同种型对照-化合物220缀合物，其为与连接至不靶向HCC1954细胞的抗体的相同有效负荷的缀合物。在类似Eg5抑制剂剂量下，该同种型相对于TBS对照品展示出轻度的肿瘤生长抑制，但在抑制肿瘤生长方面的有效性显然低于确实靶向HCC1954细胞的TBS化合物220缀合物，除外6mg/kg剂量，其中同种型对照品显示与TBS-化合物220几乎相差无几的活性。
图7(A)和7(B)显示SKOV3ip异种移植物中的类似结果。将单剂量的化合物220与TBS的缀合物以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的剂量施用于小鼠，这可以递送5-96微克/kg化合物12的剂量。在这种异种移植物中，3mg/kg剂量的TBS-化合物220缀合物显示有效的肿瘤生长抑制。在这种肿瘤模型中，同种型对照品也显示一些肿瘤生长抑制，不过，低于TBS缀合物，而单独的曲妥珠单抗抗体相对于媒介物对照品具较小的生长抑制作用。
图8概述了5mg/kg和10mg/kg单剂量的化合物215与曲妥珠单抗的缀合物(TBS-化合物215)后SKOV3ip异种移植物的肿瘤生长。5mg/kg剂量实现显著的生长抑制，而10mg/kg剂量使肿瘤萎缩。在该实验中，单独的5mg/kg剂量的曲妥珠单抗(无Eg5抑制剂)和5mg/kg剂量的同种型对照品(与不识别SKOV3ip肿瘤细胞的抗体缀合的化合物215)均显然抑制肿瘤生长。此外，它们在相当的剂量下无一与TBS-化合物215缀合物一样有效。
图9概述了5mg/kg和10mg/kg单剂量的化合物223(包含化合物17作为有效负荷)与曲妥珠单抗(TBS-化合物223或TBS-5B)的缀合物后SKOV3ip异种移植物的肿瘤生长。5mg/kg剂量实现显著的生长抑制，而10mg/kg剂量导致肿瘤停滞。在该实验中，单独的10mg/kg剂量的曲妥珠单抗(无Eg5抑制剂)适度地抑制肿瘤生长。5mg/kg和10mg/kg剂量的同种型对照品(与不识别SKOV3ip肿瘤细胞的抗体缀合的化合物215)与媒介物处理的肿瘤相比不会显著地抑制肿瘤生长。
活性实施例4：减少ADC聚集的新连接基
在本实施例中，用简单连接基和产生显著和不期望的聚集量的有效负荷化合物构建ADC。本实施例中使用的ADCs各自的抗体是TBS。称作ADC-110的该构建体使用无支链连接基且显示约12％的聚集度。参见图10(A)。修饰这种ADC的连接基(参见ADC-111和ADC-112)以引入远离酰化氮的极性基团将聚集度降至3％以下。参见图10(B)和图10(C)。
这些ADCs各自的有效负荷和有效负荷+连接基连接点：
因此，ADC-111由连接至化合物367的马来酰亚胺基团的抗体曲妥珠单抗组成，且ADC-112由连接化合物368的马来酰亚胺基团的相同抗体组成。ADC-110由化合物366和曲妥珠单抗组成。在这些ADCs中的连接基被视为不能裂解的。这些ADCs显示可以使用式II、IIC和III化合物中的R1作为连接至靶向结合部分的点，所述靶向结合部分例如甚至在使用不能裂解的连接基时的抗体。
图11显示ADC-110和ADC-111对几种癌细胞系的体外效能，证实所述缀合物对具有高Her2水平的细胞系(SKOV3ip和MB231-M16)具有高度活性，对具有Her2、但对曲妥珠单抗ADCs响应较低的细胞活性较低，这可能归因于Her2更新率(MB231-W6)，且对Her2阴性细胞(MB468)活性更低，不过，这些细胞对Eg5抑制剂高度敏感。SKOV3ip和MDA-MB231-M16细胞系具有高Her2表达且由此预期对这些曲妥珠单抗缀合物敏感。MB231-W6也具有Her2表达，但对曲妥珠单抗ADCs敏感性较低，可能归因于Her2的更新率。MDA-MB468是Her2-阴性的，但对Eg5抑制剂高度敏感。
图11(A)显示SKOV3ip细胞对ADC-110和ADC-111高度敏感，预计这归因于对这些细胞的高Her2水平。MB468细胞系的敏感性非常低，正如基于其缺乏Her2所预期的。图11B显示MB321-M16细胞系比MB321-W6更敏感，认为这归因于Her2抗原的更新率较低，使得ADC内化在MB321-W6细胞的效率较低。图11(C)比较KOV3ip与两种低敏感性细胞系MB468和MB231-W6。图11中的数据也显示相对于ADC-110中的无支链连接基，ADC-111中的支链连接基不会显著地影响其活性。因此，支链连接基减少了ADC聚集，不干扰效能。
类似地，使用抗体TBS和有效负荷/连接基化合物6D制备ADC(参见表6)。这种ADC具有带有直接在连接基烷基链上的羧酸酯基团的连接基。制备另外相同的在连接基上不含羧酸酯的ADC。带有在连接基上的羧酸酯基团的ADC具有DAR＝4.9和3％聚集度，而相应的不含连接基上的羧酸基团的ADC具有DAR＝4.2，但聚集度为11.6％。此外，连接基上的极性基团显著地降低了聚集度。这些ADCs均在细胞培养物中对Her2+细胞系显示抗体-依赖性的肿瘤细胞生长抑制，但在连接基上带有羧酸的ADC对MB468细胞(乳腺癌)具有更显著的活性。
活性实施例5：靶向其它抗原的免疫缀合物的活性
由表5中所示的有效负荷化合物制备免疫缀合物，其与称作cKitA的抗体缀合。该抗体识别来自称作曲妥珠单抗的抗体的不同抗原-它对于抗原cKit、也称作CD117具有选择性。在造血干细胞和先祖细胞上发现cKit，且其与肥大细胞肿瘤、胃肠道间质肿瘤(GISTs)、生殖细胞肿瘤和一些白血病相关。因此，本发明具有抗-cKit抗体的免疫缀合物用于治疗这些病症。
通过上述方法、使用这种抗体制备具有药物与抗体比(DAR)为3.0-4.5的缀合物。在预期由抗-cKit抗体cKitA识别的细胞系中测试免疫缀合物的活性。图12显示这些免疫缀合物的6种对细胞生长的抑制作用。尽管活性随有效负荷改变，但是在低于1微克免疫缀合物/mL的浓度下均具有相当的活性，其中最大活性显示在约1ng/mL下的有效细胞生长抑制作用。
活性实施例6：具有连接基改变的免疫缀合物的比较
通过本文所述的方法、由表5和6中的化合物制备免疫缀合物。这些化合物包含类似的Eg5抑制剂作为有效负荷，但具有不同的连接基。在每种情况中，有效负荷通过相当于式II中的R1的基团连接。使用称作TBS的抗体。免疫缀合物均具有3-5的DAR。测试这些免疫缀合物对预期对抗体敏感性可变的4种不同细胞系的细胞生长抑制作用。发现全部细胞系均被每种化合物抑制。如本文所述的式II范围内的连接基的改变对细胞生长抑制具有可测定的、但通常是适度的作用，如图13中的抑制曲线所示例。用于连接基的一个连接点即R1的氮杂环丁烷环的氮原子在测试条件下确实显著地降低了活性。该数据表明：各种连接基适用于包含式II的有效负荷化合物的式I的免疫缀合物。注意，将羟基置于相当于Ar2的苯环上不会显著地增加或降低细胞培养物中的活性。
活性实施例7：式II的Eg5抑制剂与其它Eg5抑制剂作为ADC有效负荷的比较
由表2中的有效负荷6N(有效负荷-连接基化合物509)和6P(化合物508)制备免疫缀合物。这些有效负荷是文献中已知的Eg5的有效抑制剂，并且代表非式II化合物的化合物类型。为了比较，测试具有式II的化合物(化合物220)作为有效负荷且包含相同“val-cit”可裂解连接基作为6N和6P的免疫缀合物与其它类型的Eg5抑制剂。尽管其它类型的Eg5抑制剂显示作为有效负荷的活性，但是其免疫缀合物的活性比具有式II有效负荷化合物的免疫缀合物低约10倍，如图14中所示例。
体内活性
一般方法：给雌性裸小鼠(HarlanLaboratories，Livermore，CA)的右腹侧经皮下注射5x106SK-OV-3ip1肿瘤细胞，所述细胞混悬于HBSS的50％MatrigelTM溶液(BDBiosciences)中，总体积为200μL。或者，给雌性SCID/浅褐色小鼠(HarlanLaboratories，Livermore，CA)的右腹侧经皮下注射5x106H526肿瘤细胞，所述细胞混悬于HBSS的50％MatrigelTM溶液(BDBiosciences)中，总体积为200μL。全部动物研究均根据GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals(NIH出版物；NationalAcademyPress，第8版，2001)进行。
为了进行效能研究，将小鼠在植入后7-10天随机分组，并且在本研究中登记的动物的平均肿瘤体积约为225mm3。典型地，至少5只小鼠用于每个治疗组-每组中小鼠的数量在概述测试结果的附图中显示。给小鼠通过侧面尾静脉经静脉内施用抗体-药物缀合物或媒介物(50mM柠檬酸盐，140mMNaCl，pH7.3)一次。
从第0天时施用开始，每周2次用数字卡钳测量肿瘤异种移植物的二维尺寸(L和W)。将肿瘤体积计算为(LxW2)/2。每周测量2次体重，并且每日记录临床观察结果。用StudyDirector软件(StudyLog，SouthSanFrancisco，CA)俘获和储存肿瘤体积和体重。50天研究期后，人道地对动物实施安乐死。
活性实施例8
如本文所述制备表5中的式5B的免疫缀合物，其中抗体(AntiB)是曲妥珠单抗(TBS-5B)。在细胞试验中，将其活性与具有相同抗体和已知ADC有效负荷(DM1)的免疫缀合物(TBS-DM1)和其中AntiB是对病毒糖蛋白gH具有特异性的G1κ链的免疫缀合物(免疫缀合物：gH-5B)比较。图15显示TBS-5B、TBS-DM1和gH-5B在具有高Her2表达的细胞系(SK-OV-3ip，人卵巢癌细胞系)中的细胞增殖结果。具有5B作为有效负荷的缀合物的活性与具有DM1作为有效负荷的缀合物的活性相当，证实了Eg5抑制剂作为ADC有效负荷的高效能。如所预计的，具有gH作为抗体成分的缀合物在同一细胞系中几乎不显示活性，这证实TBS-5B缀合物的活性依赖于TBS抗体。为了进行比较，还对具有低Her2表达的细胞系测试了5B-TBS。如所预计的，该免疫缀合物对不含由其抗体靶向的抗原(Her2)的细胞系无活性。这证实5B的活性依赖于免疫缀合物的抗体与其细胞上靶向抗原的表达的匹配。
然后对小鼠SK-OV-3ip异种移植物肿瘤在体内测试同一免疫缀合物。这种异种移植物难以对TBS-DM1有响应。
图16显示本发明的免疫缀合物TBS-5B的有效肿瘤抑制作用。使用两个对照组：1个对照组用单独的TBS抗体(TBS)治疗，而另一个用5B与对糖蛋白gH具有特异性的IgGK的缀合物(gH-5B)治疗。截至到第20天，使用所示的标准，TBS-5B免疫缀合物产生正常的剂量响应和相对于媒介物和gH对照组的具有统计学显著性的肿瘤抑制作用。在10mg/kg剂量，直到30天时几乎无肿瘤生长。每个组具有9只小鼠，且各组在治疗期间无一显示明显的体重减轻。使用所示的标准，对照组的肿瘤生长抑制作用低，且在测试条件下无统计学显著性。这些结果表明：Eg5抑制剂是体内用于治疗由其抗体靶向的肿瘤的有效的ADC有效负荷，且效能依赖于Eg5抑制剂和与细胞系匹配的抗体。
图17示例了Eg5免疫缀合物在体内对小鼠SK-OV-3ip异种移植物肿瘤的活性高于包含用于临床试验(DM1)的连接至同一抗体(TBS)的ADCs的有效负荷的缀合物。此外，在10mg/kg剂量，截至到30天时，使用所示的标准，TBS-5B免疫缀合物几乎完全停止了肿瘤生长，且相对于对照组具有统计学显著性。TBS-SMCC-DM1的相当剂量有效性较低，截至到30天时未达到统计学显著性。用单独的抗体(TBS)或用连接至gH病毒糖蛋白IgG的DM1或5B治疗活性更低。这表明：Eg5抑制剂有效负荷至少与已经成功地应用于临床试验的其它有效负荷类型同样有效(DM1是用于FDA-批准的免疫缀合物的有效负荷)，且其体内效能依赖于免疫缀合物的抗体对靶向肿瘤细胞的特异性识别。
活性实施例9：使用其它抗体的体内效能
制备包含连接至对cKit抗原具有特异性的抗体(本文称作‘cKit抗体’)的本发明Eg5抑制剂的免疫缀合物。对小鼠的人小细胞肺癌异种移植物肿瘤(H526)测试cKit缀合物(n＝5；对于任意组均无显著性的体重减轻)。图18显示第一种cKit抗体(cKitA)上具有有效负荷-连接基5B的免疫缀合物在6.5mg/kg剂量下的H526肿瘤生长抑制作用。较低剂量的活性非常低，且单独的cKitA抗体、与对病毒糖蛋白gH具有特异性的抗原结合基团缀合的Eg5有效负荷-连接基组合(5B)均未显示可测定的肿瘤生长。
图19概述了具有Eg5抑制剂(5B)和SMCC-DM1的cKitA免疫缀合物的比较结果(对于每条曲线，n＝5；任意组中无明显的体重减轻)。显示具有连接的5B或SMCC-DM1的cKitA免疫缀合物对小鼠H526异种移植物肿瘤的肿瘤生长抑制作用。使用所示的标准，SMCC-DM1缀合物在10mg/kg剂量下显示对肿瘤生长具有统计学显著性的抑制作用，但在5mg/kg剂量下无此结果。5B缀合物在5mg/kg下产生抑制作用，这种作用具有统计学显著性且与10mg/kg剂量的SMCC-DM1缀合物的作用相当，且5B(Eg5抑制剂)缀合物在10mg/kg剂量下活性更高。对照组对于5B与对病毒糖蛋白gH具有特异性的gH的缀合物未显示活性。
活性实施例10：交叉试验
对于本实验，给每只小鼠植入两种不同的异种移植物肿瘤，一个体侧植入SK-OV-3ip，而另一侧植入H526。SK-OV-3ip细胞系是Her2-阳性(Her2+)且不含cKit(cKit-)，而H526细胞系是Her2-阴性(Her2-)和cKit阳性(cKit+)。然后用媒介物或3种免疫缀合物之一治疗每只小鼠：gH-5B、TBS-5B或cKitA-5B。如图20显示，如预期的，用TBS-5B强烈地抑制[Her2+，cKit-]肿瘤生长，这归因于预期其结合TBS抗体。其它治疗无一显著地影响肿瘤生长。类似地，[Her2-，cKit+]肿瘤生长仅被cKit-5B缀合物抑制且不受任何其它治疗方法影响。这种交叉实验证实：肿瘤抑制归因于免疫缀合物，且不会从抗体或释放的有效负荷中发生-仅抗体匹配肿瘤上的抗原的完整免疫缀合物是有效的。
活性实施例11：连接基改变的影响
本实施例示例了连接基改变对具有类似Eg5抑制剂作为有效负荷(5B、5H、5G和5A-参见表5)的免疫缀合物的功能效能的影响。使用不同连接基使类似Eg5抑制剂连接至曲妥珠单抗抗体来制备4种免疫缀合物。图21概述了免疫缀合物的活性，它们均类似地以10mg/kg剂量有效地抑制小鼠SK-OV-3ip肿瘤异种移植物。这些免疫缀合物的活性也与同一抗体(TBS)与MMAF(即用于临床试验的ADCs中的有效负荷)的免疫缀合物(TBS-MC-MMAF)类似，且比在同一抗体上具有美登素有效负荷的免疫缀合物(TBS-SMCC-DM1)活性更高。如所预计，使用同一有效负荷缀合于对病毒糖蛋白(gH)具有特异性的抗体的对照品和未缀合的抗体TBS显示几乎没有或无肿瘤生长抑制作用(对于每种测试的免疫缀合物，9只小鼠/组(n＝9)；在任意组中无明显的体重减轻)。
活性实施例12：不同Eg5有效负荷/连接基组合的体内活性
本实施例比较了不同连接基连接点和连接基，比较了具有Eg5抑制剂作为有效负荷和连接体的免疫缀合物的体内功效，所述连接基连接在两个不同的位置，对每一个连接点使用两种不同的连接基(5B、5E、5F和5D-参见表5)，它们均缀合了曲妥珠单抗抗体。图22概述了免疫缀合物的活性，它们在10mg/kg剂量下均抑制小鼠SK-OV-3ip肿瘤异种移植物生长。这些免疫缀合物的活性类似且在与TBS-SMCC-DM1缀合物比较时等同或更好。如所预计，使用未缀合抗体(TBS)的对照品几乎不显示生长抑制作用(对于每种测试的免疫缀合物，8只小鼠/组(n＝8)；在任意组中无明显的体重减轻)。
活性实施例13：不同Eg5免疫缀合物对NCI-N87异种移植物的活性
本实施例比较了具有不同Eg5抑制剂作为有效负荷与连接基的免疫缀合物对更难以抑制的肿瘤细胞系(NCI-N87，胃肿瘤品系)的体内效能。使用不同的Eg5抑制剂-有效负荷组合制备4种具有Eg5抑制剂有效负荷(5B、5E、5D和6U-参见表5-6)的免疫缀合物，它们均缀合了曲妥珠单抗抗体。图23概述了免疫缀合物的活性，它们在10mg/kg剂量下均抑制小鼠N87肿瘤异种移植物生长。这些免疫缀合物的活性在该模型中可变，可以与曲妥珠单抗-SMCC-DM1免疫缀合物比拟。所有免疫缀合物均显示抑制肿瘤生长；使用所示的标准，5B和6U和DM1缀合物在测试条件下达到统计学显著性。如所预计，使用未缀合的抗体(TBS)的对照品几乎不显示生长抑制作用(对于每种测试的免疫缀合物，8只小鼠/组(n＝8)；在任意组中无明显的体重减轻)。
活性实施例14：Eg5免疫缀合物对H526异种移植物的活性
本实施例比较了具有不同Eg5抑制剂作为有效负荷、缀合了cKit抗体的免疫缀合物对表达cKit的肿瘤细胞系(H526)的体内效能。使用不同的Eg5抑制剂-有效负荷组合制备6种具有Eg5抑制剂有效负荷(5B、5E、5F、5C、5A和5D-参见表5)的免疫缀合物，它们均缀合了cKit抗体(cKtA)。图24概述了免疫缀合物的活性，它们在5mg/kg剂量下均抑制小鼠H526肿瘤异种移植物生长(对于每种测试的免疫缀合物，5只小鼠/组(n＝5)；在任意组中无明显的体重减轻)。有效负荷/连接基组合5E和5D在5mg/kg剂量下更有效，使用所示的标准达到了具有统计学显著性的肿瘤生长抑制作用。
图25概述了同一免疫缀合物在10mg/kg下对H526异种移植物的活性(对于每种测试的免疫缀合物，5只小鼠/组(n＝5)；在任意组中无明显的体重减轻)。该免疫缀合物在这种模型中在10mg/kg下的活性可变。其中5D显示最具活性且持续时间长；使用所示的标准，5D和5E在该剂量下均达到了具有统计学显著性的肿瘤生长抑制作用。
活性实施例15：Eg5抑制剂缀合物中cKit抗体的比较
本实施例比较了具有不同cKit抗体与Eg5抑制剂有效负荷的免疫缀合物对表达cKit的肿瘤细胞系(H526)的体内效能。从使用cKitA开始，通过如下一般方法制备两种修饰的cKit抗体。通过使用如上所述的瞬时转染方法共转染重链和轻链质粒、在293FreestyleTM细胞中表达cKitA抗体的Cys突变体(Meissner等人，BiotechnolBioeng.75：197-203(2001))。使用Qiagen质粒制备试剂盒、根据制造商的方案制备用于共转染的DNA质粒。在37℃、在5％CO2气氛中在FreestyleTM表达培养基(Invitrogen)中培养混悬液形式的293FreestyleTM细胞。在转染前的当天，将细胞分成0.7x106细胞/ml进入新鲜培养基。在转染的当天，细胞密度典型地达到1.5x106细胞/ml。用1∶1的重链和轻链质粒的混合物、使用PEI方法(Meissner等人，2001)转染细胞。将转染的细胞再培养5天。通过以2000xg将培养物离心20min，收集来自培养物的培养基，通过0.2微米滤膜过滤。使用蛋白质A-SepharoseTM(GEHealthcareLifeSciences)从过滤的培养基中纯化表达的抗体。从蛋白质柱A-SepharoseTM上用洗脱缓冲液(pH3.0)洗脱抗体IgGs，即刻用1MTris-HCl(pH8.0)中和，然后将缓冲液交换成PBS。
已经报道改造的CysADCs在小鼠和大鼠动物模型中的耐受性比通过缀合部分还原的天然二硫化物或通过天然赖氨酸残基制备的ADCs更好。为了评价通过改造的Cys抗体缀合的ADCs与缀合了部分还原的天然二硫键的ADCs之间的体内效能差异，使Eg5连接基-有效负荷化合物223与抗体cKitAHC-E152C-S375C双重突变体(cKitB：免疫缀合物称作cKitB-化合物223或cKitB-5B)和cKitAHC-K360C-LC-K107C双重突变体(cKitC：免疫缀合物称作cKitC-化合物223或cKitC-5B)以及野生型cKitA抗体(免疫缀合物cKitA-化合物223或cKitA-5B)缀合。(残基编号为EU编号)。
改造的抗体在发现特别适合于有效负荷连接的特定位置上包含新导入的半胱氨酸残基。抗体cKitB是具有改造入其重链的两个半胱氨酸残基的cKitA的修饰形式，且cKitC是具有1个改造入其重链的半胱氨酸残基和1个改造入其轻链的半胱氨酸残基的cKitA的修饰形式。因为cKitB和cKitC各自具有2个重链和2个轻链，所以修饰的抗体具有4个新添加的用于缀合的半胱氨酸残基，无需还原链间二硫键，由此可以制备具有4个连接的有效负荷基团(DAR＝4)的免疫缀合物。使用本文所述的方法使每种cKit抗体与有效负荷/连接基组合5B缀合，以便比较修饰抗体序列的效果。
按照实施例5中所述的方案制备抗体cKitA和突变体cKitB和cKitC。按照实施例6中所述的方案还原和再氧化cKitB和cKitC。通过将5mg/ml抗体与0.35mM化合物223在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中一起温育1小时，使再氧化的抗体与化合物223缀合。通过RP-HPLC监测反应完全性，且对于cKitB和cKitC缀合物分别得到3.9和4.0的DAR。通过MS进一步验证DAR测量值。经证实ADCs在体外细胞杀伤测定中为有效的，并且与无肿瘤小鼠中的未缀合抗体具有类似的药代动力学特性。
如下以2-步法制备具有与cKitA的天然二硫键缀合的化合物223的ADC。首先用50mM巯基乙胺(添加为固体)将在包含2mMEDTA的PBS中的5-10mg/ml浓度的抗体在37℃部分还原1小时。在脱盐和添加1％w/vPS-20洗涤剂后，在4℃使部分还原的抗体(1-2mg/ml)与0.5-1mg量的、以每10mg抗体10mg/ml溶于DMSO的Cmpd223反应过夜。通过蛋白质A色谱法纯化ADC。在使用PBS的基线洗涤后，用50mM柠檬酸盐pH2.7、140mMNaCl洗脱缀合物，中和，无菌过滤。DAR平均值为3.2。
3种cKitADCs的特性：
cKitA-5B：DAR＝3.2，聚集度0.8％
cKitB-5B：DAR＝3.9，聚集度1.5％
cKitC-5B：DAR＝4.0，聚集度3.2％
通过相同方法制备和表征具有如下有效负荷与cKit和曲妥珠单抗抗体和突变抗体的组合的免疫缀合物。注意，改造的抗体始终如一地提供接近4的DAR，预期的载量，如果每种抗体复合物添加的4个半胱氨酸残基全部与有效负荷缀合：
图26概述了使用半胱氨酸改造的cKit抗体制备的两种免疫缀合物的活性，其以5mg/kg和10mg/kg的剂量抑制小鼠H526肿瘤异种移植物生长。(对于每种测试的免疫缀合物，6只小鼠/组(n＝6)；在任意组中无明显的体重减轻)。可能因为改造的抗体可以形成缀合物，而不破坏天然二硫桥结构，所以其免疫缀合物比cKitA缀合物在两种剂量下更具有活性。因此，尽管Eg5抑制剂的免疫缀合物与不同cKit抗体、包括未修饰的抗体共同具有活性，但是这表明：将新的半胱氨酸残基导入恒定区的蛋白质改造和使用新的半胱氨酸残基作为有效负荷/连接基的连接点可以提供改进的免疫缀合物。
肿瘤细胞生长抑制的另外的活性数据
图28提供了另外的数据以证实本发明的免疫缀合物抑制肿瘤细胞生长。图28中的数据证实：这些免疫缀合物抑制不同肿瘤细胞系的生长，包括SK-OV-3ip、MDA-MB-231、HCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231-M40、MDA-MB-231-M16、H526和NCI-N87。在每种情况中，如所预计，ADC的活性部分地由处理细胞上ADC抗体识别的抗原表达水平确定。另外的数据证实：式(II)范围的有代表性的结果改变通常产生活性ADCs，不过，活性水平随细胞系改变。该数据进一步证实可以使用各种连接基，且该连接基可以连接在基团R1、Y和Q上的位置上。
下表中提供了本发明不同ADCs的体外细胞生长抑制作用的概述。第一栏列出了来自表2、5或6的、用于ADC的有效负荷/连接基组合的化合物ID编号；第二栏显示用于ADC的抗体。第三栏鉴定ADC所测试的细胞系：对于大部分ADCs，对两种抗原-高细胞系和抗原-低细胞系测定活性，在抗原-高细胞系中，预期活性稳定，而在抗原-低细胞系中，预期抗体递送无效，因此，预期活性非常低。将活性报道为绝对AC50(ng/mL)、Ainf(％)和相对EC50(ng/mL)。有关用于该数据的方法的信息在表后面提供。
用于前述表的细胞系：
细胞系谱系
Calu-3肺
CMK-11-5造血
HCC1954乳腺
HCC70乳腺
HT-29结肠
MDA-MB-231乳腺
MDA-MB-231-M16乳腺
MDA-MB-231-M40乳腺
MDA-MB-486乳腺
NCI-H2170肺
NCI-H526肺
NCI-N87胃
OE19卵巢
PC-3前列腺
SK-OV-3ip卵巢
UACC-812乳腺
效能值的定义和导出：
对于复制样品求细胞TiterGlo2数据的平均值，然后对未处理的细胞校准。测定包括未处理细胞的孔，其反映出未抑制的细胞生长。对照组的平均值用于将来自处理样品的结果校准至％尺度。使用4参数逻辑模型与标准测定数据分析软件(Helios软件应用)对校准的数据进行分析。
y = A inf + A 0 - A inf 1 + 10 n · ( log 10 x - log 10 AC 50 )
4参数包括Ainf(最大活性的坪值，一般在高[ADC]下测定)、A0(最小活性的坪值，一般在[ADC]下测定)、y-轴上这两种坪值之间的中点的ADC浓度和n-两种坪值之间的中点处的拟合曲线的斜率。
对于每种化合物，软件导出了3个量度：绝对AC50、相对EC50和Ainf。绝对AC50(表中的“AbsAC50”)是ADC浓度，其中拟合曲线交叉通过Y-轴上的50％。相对EC50(表中的“RelEC50”)是A0与Ainf之间的拟合曲线中点处的ADC浓度。
对比免疫缀合物：
TBS-SMCC-DM1：抗体＝曲妥珠单抗；连接基＝SMCC；有效负荷＝DM1：DAR约为3.5
MC-MMAF缀合物，其使用马来酰亚氨基己酰基连接基：

Claims (45)

1.式(I)的免疫缀合物：
其中Ab表示抗原结合部分；
L表示使X连接至Ab的连接基；
m是1-4的整数；
n是1-16的整数；且
X在每次出现时独立地表示式(II)的基团
其通过L连接至Ab，
其中：
Z是N或CH；
Ar1是任选地被至多3个选自卤素、C1-3烷基和C1-3卤代烷基的基团取代的苯基；
Ar2是苯基或吡啶基，且Ar2任选地被至多2个选自卤素、CN、C1-3烷基、羟基、氨基和C1-3卤代烷基的基团取代；
R1是C1-6烷基、-(CH2)0-2-C3-6环烷基或包含至多2个选自N、O和S的杂原子作为环成员的-(CH2)0-2-C4-7杂环基，其中C1-6烷基、C3-6环烷基或C4-7杂环基各自是任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基,C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基、羧基、氧代、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、–C(O)-C1-6烷基、-C(O)-NH-C1-6烷基、–C(O)O-C1-6烷基和COO(C1-4烷基)；
R2是H或C1-4烷基；
T是(CH2)1-3；
Y选自C1-3氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基，其中C1-3氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基各自任选地被至多3个基团取代，所述基团选自氨基、氧代、卤素、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)、-C(＝O)NH(C1-4烷基)、-C(＝O)N(C1-4烷基)2和C1-4卤代烷基；
A是NH、N(C1-4烷基)或式(II)中的羰基与Q之间的价键；
Q选自C1-4烷基、-O-C1-4烷基,-(CH2)0-2-C4-6杂环基、-(CH2)0-2-C3-6环烷基、-(CH2)0-2-C5-6杂芳基和-(CH2)0-2-苯基，且任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、羟基、氨基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR、-O-葡糖醛酸酯和-NR2，其中R各自是C1-6烷基、C3-6环烷基或包含N、O或S作为环成员的4-6元杂环，且R各自独立地任选地被卤素、–SH、-NH2、OMe或–OH取代。
2.权利要求1的免疫缀合物，其中R2是H。
3.权利要求1或权利要求2的免疫缀合物，其中Z是CH。
4.权利要求1或权利要求2的免疫缀合物，其中Z是N。
5.权利要求1-4任一项的免疫缀合物，其中R1是四氢吡喃，且R1任选地被至多2个选自氧代和甲基的基团取代。
6.上述权利要求任一项的免疫组合物，其中Ar1是二卤代苯基。
7.上述权利要求任一项的免疫组合物，其中式(II)的化合物具有下式：
其中L连接至Y或连接至Q或连接至R1。
8.上述权利要求任一项的免疫组合物，其中R1是4-四氢吡喃基。
9.权利要求1-8任一项的免疫缀合物，其中R1是–C(Me)2-(CH2)0-2R30，其中R30是–OH、COOH或NH2，且L连接至R1。
10.上述权利要求任一项的免疫组合物，其中Q是被1或2个选自羟基和氨基的基团取代的C1-4烷基。
11.上述权利要求任一项的免疫组合物，其中Y是任选地被卤素、氨基或羟基取代的吡咯烷酮。
12.上述权利要求任一项的免疫组合物，其中A是–NH-。
13.上述权利要求任一项的免疫缀合物，其中所述连接基是可裂解的。
14.权利要求1-12任一项的免疫缀合物，其中所述连接基是不可裂解的。
15.式(III)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
Z是N或CH；
Ar1是任选地被至多3个选自卤素、C1-3烷基和C1-3卤代烷基的基团取代的苯基；
Ar2是苯基或吡啶基，其任选地被至多2个选自卤素、CN、C1-3烷基、羟基、氨基和C1-3卤代烷基的基团取代；
R1是–(CH2)0-2-C4-7杂环基或–(CH2)0-2-C3-7环烷基，其中C4-7杂环基包含至多2个选自N、O和S的杂原子作为环成员，且C4-7杂环基和C3-7环烷基各自任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基、氧代、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、C1-4卤代烷基和COO(C1-4烷基)；或R1是被–OH、-COOH或–NH2取代的C3-6烷基；
R2是H或C1-4烷基；
T是(CH2)1-3；
Y选自C1-2氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基，其中C1-2氨基烷基、C4-6杂环基和C3-6环烷基各自任选地被至多3个基团取代，所述基团选自氨基、氧代、卤素、羟基、C1-4烷氧基、羟基-取代的C1-4烷基、氨基-取代的C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)、CONH(C1-4烷基)、CON(C1-4烷基)2和C1-3卤代烷基；
A是NH、N(C1-4烷基)或式(III)中的羰基与Q之间的价键；
Q选自C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6杂环基、-(CH2)0-2-C5-6杂芳基和-(CH2)0-2-苯基，且Q任选地被至多3个基团取代，所述基团选自卤素、羟基、氨基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR、-N3和-NR2，其中R各自是任选地被至多3个选自卤素、–SH、-NH2、OMe和–OH的基团取代的C1-6烷基。
16.权利要求15的化合物，其中R1是四氢吡喃基。
17.权利要求15的化合物，其中R1是式–C(Me)2-(CH2)0-2R30的基团，其中R30是–OH、COOH或NH2。
18.式(IIA)或(IIB)或(IIC)的化合物：
其中Ar1、Ar2、Z、R1、R2、T、Q、Y和A如权利要求1中所定义，
Q*选自–CH2-、-CH(Me)-、-CH(Me)CH2-、-CH2CH2-,–CH2O-、-CH2S-、-CH2-NH-、-CH2-NMe-、-CH(Me)O-、-CH(OH)-CH2O-、-CH(CH2OH)-O-、-CH(OH)-CH2NH-、-CH(CH2OH)-NH-、-CH(CH2NH2)-O-、-CH(CH2OH)-NH-、-CH(Me)S-、-CH(Me)NH-、-CH2CH2O-、-CH2CH2NH-、-CH2CH2S-、-CH(Me)CH2O-、-CH(Me)CH2S-、-CH(Me)CH2NH-、
Y*选自–CH(CH2F)NH-、-CH2NH-、
其中R10和R11独立地是H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、COOH、CONH(C1-4烷基)、CON(C1-4烷基)2、COO(C1-4烷基)或OH，
R1*选自被羟基、氨基或羧基取代的C3-6烷基；
且W是包含一个或多个连接基成分和反应官能团的连接部分。
19.权利要求16的化合物，其中W包含反应官能团，其选自–SH、-NH2、-C(＝O)H、-C(＝O)Me、N-马来酰亚胺、-NHC(＝O)-CH2-卤素、-COOH和-C(＝O)-OR’，其中卤素选自Cl、Br和I，且–OR’是活化酯的离去基部分。
20.权利要求15-19任一项的化合物，其中Ar1是二卤代苯基。
21.权利要求15-20任一项的化合物，其中Ar2是苯基或卤代苯基或羟基苯基。
22.权利要求15-21任一项的化合物，其中Z是CH。
23.权利要求15-21任一项的化合物，其中Z是N。
24.权利要求15或18-23任一项的化合物，其中R1是4-四氢吡喃基。
25.权利要求15-24任一项的化合物，其中R2是H。
26.权利要求15-25任一项的化合物，其中A是–NH-。
27.权利要求15-25任一项的化合物，其中A是价键。
28.权利要求15-27任一项的化合物，其中T是CH2或CH2CH2。
29.权利要求15-28任一项的化合物，其中Y选自-CH(CH2F)NH2、
其中R10和R11独立地是H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、COOH、COO(C1-4烷基)或OH。
30.权利要求15-29任一项的化合物，其中Q选自-CH2OH、-CH2-NH2、-CH(Me)OH、-CH(OH)-CH2OH、-CH(OH)-CH2NH2、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(Me)SH、-CH(Me)NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2CH2SH、-CH(Me)CH2OH、-CH(Me)CH2SH、-CH(Me)CH2NH2、
31.权利要求15的化合物，其选自表1中的化合物及其药学上可接受的盐。
32.药物组合物，包含权利要求15-31任一项的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体。
33.组合，包含治疗有效量的权利要求15-31任一项的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种治疗共活性剂。
34.治疗细胞增殖性障碍的方法，包含对有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-14任一项的免疫缀合物或权利要求15-17任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
35.权利要求15-17任一项的化合物或权利要求1-14任一项的免疫缀合物或其药学上可接受的盐，用作药剂。
36.权利要求35的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述药剂用于治疗癌症。
37.权利要求1-14任一项的免疫缀合物或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症。
38.免疫组合物Ab-L*-X，包含连接至抗体(Ab)的有效负荷(X)，其中连接基L*包含式–C(O)NR21-或–NR21-C(O)-的基团，其中R21具有式–(CH2)1-4-R22，其中R22是选自–OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23和-SO2R23的极性基团，其中k是0-4，且R23各自独立地是H或C1-4烷基。
39.式(I)的免疫缀合物：
其中Ab表示抗原结合部分；
L各自表示独立选择的使X连接至Ab的连接基；
m是1-4的整数；
n是1-16的整数；且
X在每次出现时独立地表示Eg5抑制剂。
40.权利要求39的免疫缀合物，其中X是选自表1中的化合物。
41.权利要求39的免疫缀合物，其中m是1，且该免疫缀合物通过使Ab与选自表2的化合物反应形成。
42.选自表5的化合物或其免疫缀合物。
43.选自表5中的免疫缀合物的免疫缀合物，其中AntiB表示抗体。
44.权利要求1-14或38-43任一项的免疫缀合物，其中所述抗原结合部分是抗体，其具有至少一个导入恒定区的非天然半胱氨酸残基，其中连接基L连接至非天然半胱氨酸残基。
45.权利要求44的免疫缀合物，其中m是1，且n是1-5，优选约2或约4。
CN201480028219.0A 2013-03-15 2014-03-12 细胞增殖抑制剂及其缀合物 Pending CN105451773A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361799384P 2013-03-15 2013-03-15
US61/799,384 2013-03-15
US201361869496P 2013-08-23 2013-08-23
US61/869,496 2013-08-23
PCT/US2014/024795 WO2014151030A1 (en) 2013-03-15 2014-03-12 Cell proliferation inhibitors and conjugates thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105451773A true CN105451773A (zh) 2016-03-30

Family

ID=50721875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480028219.0A Pending CN105451773A (zh) 2013-03-15 2014-03-12 细胞增殖抑制剂及其缀合物

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP2968591A1 (zh)
JP (1) JP2016516035A (zh)
CN (1) CN105451773A (zh)
TW (1) TW201512174A (zh)
UY (1) UY35471A (zh)
WO (1) WO2014151030A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022242278A1 (zh) * 2021-05-16 2022-11-24 上海鼎雅药物化学科技有限公司 乌帕替尼及其中间体的制备方法

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9504756B2 (en) 2012-05-15 2016-11-29 Seattle Genetics, Inc. Self-stabilizing linker conjugates
CN108465112B (zh) * 2012-05-15 2022-04-29 西雅图基因公司 自稳定接头偶联物
EA201591465A1 (ru) 2013-02-08 2015-12-30 АйАрЭм ЭлЭлСи Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов
KR102329024B1 (ko) * 2013-12-23 2021-11-19 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 키네신 스핀들 단백질(ksp)과의 항체 약물 접합체 (adcs)
WO2016020791A1 (en) * 2014-08-05 2016-02-11 Novartis Ag Ckit antibody drug conjugates
EP3233127A1 (de) * 2014-12-15 2017-10-25 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit aglycosylierten anti-tweakrantikörpern
CN104478957A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 一种含腈基苯和双o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途
PT3271329T (pt) 2015-03-19 2021-10-25 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Novos ligantes hidrofílicos e conjugados ligando-fármaco dos mesmos
EP3310440A1 (de) * 2015-06-22 2018-04-25 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CN107921146A (zh) * 2015-06-23 2018-04-17 拜耳医药股份有限公司 纺锤体驱动蛋白(ksp)抑制剂与抗‑cd123的抗体的抗体药物缀合物(adc)
WO2016207104A1 (de) * 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-b7h3-antikörpern
CN107921145A (zh) 2015-06-23 2018-04-17 拜耳医药股份有限公司 Ksp抑制剂与抗‑tweakr抗体的抗体药物缀合物（adc）
JP2018524313A (ja) * 2015-06-23 2018-08-30 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト キネシンスピンドルタンパク質（ｋｓｐ）阻害剤の抗ｂ７ｈ３抗体との抗体薬物複合体
MX2017017138A (es) 2015-06-23 2018-04-30 Bayer Pharma AG Conjugados homogeneos especificos de sitio con inhibidores de ksp.
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
SG11201808167VA (en) 2016-03-24 2018-10-30 Bayer Pharma AG Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
EP3452492A1 (en) 2016-05-05 2019-03-13 Novartis AG Amatoxin derivatives and conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase
JP7022707B2 (ja) * 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
JP2019522050A (ja) * 2016-06-17 2019-08-08 マジェンタ セラピューティクス インコーポレイテッドＭａｇｅｎｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 細胞の枯渇のための組成物および方法
SG10202100726XA (en) * 2016-06-17 2021-02-25 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for the depletion of cd117+cells
BR112019001945A2 (pt) 2016-08-09 2019-05-07 Seattle Genetics, Inc. composição de conjugado de fármaco aglutinante, formulação farmaceuticamente aceitável, métodos para tratar uma doença ou afecção hiperproliferativa, para inibir a multiplicação de uma célula tumoral ou célula cancerígena e para preparar uma composição de conjugado de fármaco aglutinado, e, composto
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
MX2019007641A (es) 2016-12-21 2019-09-09 Bayer Pharma AG Conjugados de ligando-farmaco (adcs) con grupos escindibles enzimaticamente.
CN108452321B (zh) * 2017-06-19 2021-11-26 四川百利药业有限责任公司 一种带酸性自稳定接头的抗体-药物偶联物
US10646585B2 (en) 2017-09-15 2020-05-12 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and ligand-drug conjugates thereof
BR112020025718A2 (pt) 2018-06-18 2021-04-06 Bayer Aktiengesellschaft Conjugados de ligante/agente ativo direcionados contra cxcr5, tendo aglutinantes enzimaticamente cliváveis e perfil de atividade melhorado

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101558049A (zh) * 2006-11-13 2009-10-14 诺瓦提斯公司 作为ksp抑制剂的被取代的吡唑和三唑化合物
CN101622247A (zh) * 2007-01-05 2010-01-06 诺瓦提斯公司 作为驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂的咪唑衍生物
WO2011128388A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 Novartis Ag Oxazole and thiazole compounds as ksp inhibitors
WO2012171020A1 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
CN102844307A (zh) * 2010-04-15 2012-12-26 诺瓦提斯公司 作为ksp抑制剂的三唑化合物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7662581B1 (en) * 2003-12-18 2010-02-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Eg5 co-crystals
RU2427572C2 (ru) * 2004-06-18 2011-08-27 Чирон Корпорейшн N-(1-(1-бензил-4-фенил-1н-имидазол-2-ил)-2,2-диметилпропил)бензамидные производные и родственные соединения в качестве ингибиторов кинезинового белка веретена (ksp) для лечения рака
TW200800951A (en) * 2005-08-09 2008-01-01 Novartis Ag Substituted imidazole compounds as KSP inhibitors
US8252832B2 (en) * 2007-12-14 2012-08-28 Novartis Ag Kinesin inhibitors as cancer therapeutics
ES2545977T3 (es) * 2008-03-18 2015-09-17 Genentech, Inc. Combinaciones de un conjugado de anticuerpo-fármaco anti-HER2 y agentes quimioterapéuticos, y métodos de uso
EP2389363A1 (en) * 2009-01-26 2011-11-30 Novartis AG Salts and polymorphs of a kinesin inhibitor compound
JP6581774B2 (ja) * 2011-05-27 2019-09-25 アンブルックス, インコーポレイテッドAmbrx, Inc. 非天然アミノ酸結合ドラスタチン誘導体を含有する化合物またはその化合物の溶媒和物、およびドラスタチンアナログを誘導体化するための方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101558049A (zh) * 2006-11-13 2009-10-14 诺瓦提斯公司 作为ksp抑制剂的被取代的吡唑和三唑化合物
CN101622247A (zh) * 2007-01-05 2010-01-06 诺瓦提斯公司 作为驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂的咪唑衍生物
WO2011128388A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 Novartis Ag Oxazole and thiazole compounds as ksp inhibitors
CN102844307A (zh) * 2010-04-15 2012-12-26 诺瓦提斯公司 作为ksp抑制剂的三唑化合物
WO2012171020A1 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022242278A1 (zh) * 2021-05-16 2022-11-24 上海鼎雅药物化学科技有限公司 乌帕替尼及其中间体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
TW201512174A (zh) 2015-04-01
UY35471A (es) 2014-10-31
EP2968591A1 (en) 2016-01-20
WO2014151030A1 (en) 2014-09-25
JP2016516035A (ja) 2016-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105451773A (zh) 细胞增殖抑制剂及其缀合物
CN105683188B (zh) 作为fgfr4抑制剂的稠环二环吡啶基衍生物
CN109071504B (zh) 受体相互作用蛋白激酶1的抑制剂
CN104185477B (zh) 细胞毒性肽及其抗体‑药物缀合物
AU2020227006B2 (en) Cytotoxic benzodiazepine derivatives
TWI735448B (zh) 包含可酶解之基團的結合劑-活性物質共軛物（ａｄｃ）及結合劑-前藥共軛物（ａｐｄｃ）
TWI740833B (zh) 半胱胺酸工程改造抗體之結合物
CN105050661B (zh) 吡咯并苯并二氮杂卓‑抗体结合物
TWI650136B (zh) 具有ＫＳＰ－抑制劑的抗體藥物接合物（ＡＤＣｓ）
CN105658646B (zh) 作为激酶抑制剂的氨基杂芳基苯甲酰胺
CN104955485B (zh) 吡咯并苯并二氮杂卓‑抗her2抗体结合物
CN106029663B (zh) 作为抗癌剂的新颖三环化合物
CN105102068B (zh) 吡咯并苯并二氮杂卓-抗体结合物
CN106164072B (zh) 用于治疗细菌感染的单环内酰胺有机化合物
CN112004817A (zh) 作为囊性纤维化跨膜传导调节因子的调节剂的大环化合物、其药物组合物、它们在治疗囊性纤维化中的用途，以及它们的制备方法
CN106573956A (zh) 澳瑞他汀衍生物及其缀合物
CN110088096A (zh) 作为泛素特异性蛋白酶7的抑制剂的哌啶衍生物
CN107921146A (zh) 纺锤体驱动蛋白(ksp)抑制剂与抗‑cd123的抗体的抗体药物缀合物(adc)
CN108727407A (zh) 新型苯并二氮杂*衍生物
CN107635586A (zh) Ksp抑制剂与无糖基化抗‑tweakr抗体的抗体‑药物缀合物(adc)
CN109790146A (zh) 药物化合物
TW201713364A (zh) ＫＳＰ抑制劑與抗-Ｂ７Ｈ３抗體之抗體藥物結合物（ＡＤＣｓ）
KR20230137295A (ko) 접합체 및 이의 용도
CN110461860A (zh) 卡奇霉素衍生物及其抗体药物缀合物
AU2021255711A1 (en) Diels-alder conjugation methods

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160330