CN105050661B - 吡咯并苯并二氮杂卓‑抗体结合物 - Google Patents
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Abstract
结合至CD19的抗体与PBD二聚体的结合物。
Description
技术领域
本发明涉及具有以与抗体的接头形式的不稳定的C2或N10保护基团的吡咯并苯并二氮杂(吡咯并苯并二氮杂卓，pyrrolobenzodiazepines)(PBD)。
背景技术
吡咯并苯并二氮杂
一些吡咯并苯并二氮杂(PBD)能够识别和结合于DNA的特定序列；优选的序列是PuGPu。于1965年发现第一PBD抗肿瘤抗生素，安曲霉素(anthramycin)(Leimgruber,etal.,J.Am.Chem.Soc.,87,5793-5795(1965)；Leimgruber,et al.,J.Am.Chem.Soc.,87,5791-5793(1965))。其后，已报道许多自然存在的PBD，并且针对各种类似物已开发超过10种合成途径(Thurston,et al.,Chem.Rev.1994,433-465(1994)；Antonow,D.andThurston,D.E.,Chem.Rev.2011111(4),2815-2864)。家族成员包括abbeymycin(Hochlowski,et al.,J.Antibiotics,40,145-148(1987))、奇卡霉素(chicamycin)(Konishi,et al.,J.Antibiotics,37,200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180487；Thurston,et al.,Chem.Brit.,26,767-772(1990)；Bose,et al.,Tetrahedron,48,751-758(1992))、甲基氨茴霉素(mazethramycin)(Kuminoto,et al.,J.Antibiotics,33,665-667(1980))、新丝拉霉素(neothramycin)A和B(Takeuchi,et al.,J.Antibiotics,29,93-96(1976))、porothramycin(Tsunakawa,et al.,J.Antibiotics,41,1366-1373(1988))、prothracarcin(Shimizu,et al,J.Antibiotics,29,2492-2503(1982)；Langley andThurston,J.Org.Chem.,52,91-97(1987))、西班米星(sibanomicin)(DC-102)(Hara,etal.,J.Antibiotics,41,702-704(1988)；Itoh,et al.,J.Antibiotics,41,1281-1284(1988))、西伯里亚霉素(sibiromycin)(Leber,et al.,J.Am.Chem.Soc.,110,2992-2993(1988))和托马霉素(tomamycin)(Arima,et al.,J.Antibiotics,25,437-444(1972))。PBD为以下一般结构：
它们的区别在于取代基的数量、类型和位置，在于它们的芳族A环和吡咯并C环两者，以及在于C环的饱和度。在B环中，在N10-C11位置(其是负责使DNA烷基化的亲电中心)处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(carbinolamine)(NH-CH(OH))或甲醇胺甲醚(NH-CH(OMe))。所有已知的天然产物在手性C11a位置处具有(S)-构型，当从C环到A环观察时，该构型向它们提供右手扭转(right-handed twist)。这给予它们用于与B型DNA的小沟的等螺旋性(isohelicity)的适当的三维形状，获得在结合位点处的滑动配合(Kohn,In AntibioticsIII.Springer-Verlag,New York,pp.3-11(1975)；Hurley and Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力使得它们可以干扰DNA加工，因此它们可用作抗肿瘤剂。
由Gregson et al.作为化合物1(Chem.Commun.1999,797-798)以及由Gregson etal.作为化合物4a(J.Med.Chem.2001,44,1161-1174)描述了特别有利的吡咯并苯并二氮杂化合物。该化合物，也称为SG2000，在以下示出：
WO 2007/085930描述了具有用于连接至细胞结合剂(如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物的制备。接头存在于连接二聚体的单体PBD单元的桥中。
本发明人在WO 2011/130613和WO 2011/130616中已经描述了具有用于连接至细胞结合剂(如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物。这些化合物中的接头通过C2位连接至PBD核心，并且通常被接头基团上酶的作用切割。在WO 2011/130598中，这些化合物中的接头连接至PBD核上可获得的N10位中的一个，并且通常被接头基团上酶的作用切割。
抗体-药物结合物
已经建立用于患有癌症、免疫疾病和血管疾病患者的靶向治疗的抗体疗法(Carter,P.(2006)Nature Reviews Immunology 6:343-357)。癌症治疗中用于局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即，药物)以杀死或抑制肿瘤细胞的抗体-药物结合物(ADC)(即，免疫结合物)的使用靶向将药物部分递送至肿瘤，并且在其中细胞内积聚，而这些非结合药物试剂的全身给予可以导致对正常细胞不可接受的毒性水平(Xie et al(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291；Kovtun et al(2006)Cancer Res.66(6):3214-3121；Law et al(2006)Cancer Res.66(4):2328-2337；Wu et al(2005)NatureBiotech.23(9):1137-1145；Lambert J.(2005)Current Opin.in Pharmacol.5:543-549；Hamann P.(2005)Expert Opin.Ther.Patents 15(9):1087-1103；Payne,G.(2003)CancerCell 3:207-212；Trail et al(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Syrigosand Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614)。
由此观察到具有最小毒性的最大疗效。设计和改善ADC的努力集中在单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物作用机制、药物连接、药物/抗体比值(负载)和药物释放性质上(Junutula,et al.,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan et al(2009)Blood114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249；McDonagh(2006)ProteinEng.Design&Sel.19(7):299-307；Doronina et al(2006)Bioconj.Chem.17:114-124；Erickson et al(2006)Cancer Res.66(8):1-8；Sanderson et al(2005)Clin.CancerRes.11:843-852；Jeffrey et al(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358；Hamblett et al(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070)。药物部分可以通过包括微管结合、DNA结合、蛋白酶体和/或拓扑异构酶抑制的机制赋予它们细胞毒性和细胞抑制作用。在结合至大抗体或蛋白质受体配体时，一些细胞毒性药物趋向于不活泼或较不活泼。
本发明人已经开发了特定的PBD二聚体抗体结合物。
发明内容
本发明的第一方面包括式L-(DL)p的结合物，其中，DL为式I或式II：
其中：
L是如下限定的抗体(Ab)；
当C2’和C3’之间存在双键时，R12选自由以下组成的组：
(ia)C5-10芳基基团，可选地被选自包含以下的组中的一个或多个取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基和双-氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂肪族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)其中，R21、R22和R23中的每个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中，R12基团中碳原子的总数为不大于5；
(ie)其中，R25a和R25b中的一个是H并且另一个选自：苯基，该苯基可选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；和苯硫基；和
(if)其中，R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，该苯基可选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；和苯硫基；
当C2’和C3’之间存在单键时，
R12是其中，R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，该烷基和烯基基团可选地被选自C1-4烷基氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或者，当R26a和R26b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR′、硝基、Me3Sn和卤素；
其中，R和R’独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基基团；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NHRR’、硝基、Me3Sn和卤素；
R″是C3-12亚烷基基团，该链可以由一个或多个以下项所中断：杂原子，例如O、S，NRN2(其中RN2是H或C1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶；
Y和Y′选自O、S或NH；
R6’、R7’、R9’分别选自与R6、R7和R9相同的基团；
[式I]
RL1’是用于连接至抗体(Ab)的接头；
R11a选自OH、ORA，其中，RA是C1-4烷基和SOzM，其中，z是2或3并且M是单价的药学上可接受的阳离子；
R20和R21或者一起形成它们连接的氮和碳原子之间的双键；或者
R20选自H和RC，其中，RC是封端基团；
R21选自OH、ORA和SOzM；
当C2和C3之间存在双键时，R2选自由以下组成的组：
(ia)C5-10芳基基团，可选地被选自包含以下的组中的一个或多个取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基和双-氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂肪族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)其中，R11、R12和R13中的每个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中，R2基团中碳原子的总数不大于5；
(ie)其中，R15a和R15b中的一个是H，并且另一个选自：苯基，该苯基可选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；和苯硫基；和
(if)其中，R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，该苯基可选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；和苯硫基；
当C2和C3之间存在单键时，
R2是其中，R16a和R16b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，该烷基和烯基基团可选地被选自C1-4烷基氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R16a和R16b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
[式II]
R22是式IIIa、式IIIb或式IIIc：
其中，A是C5-7芳基基团，并且或者
(i)Q1是单键，并且Q2选自单键和-Z-(CH2)n-，其中Z选自单键、O、S和NH，并且n是1至3；或者
(ii)Q1是-CH＝CH-，并且Q2是单键；
其中，
RC1、RC2和RC3独立地选自H和未取代的C1-2烷基；
其中，Q选自O-RL2’、S-RL2’和NRN-RL2’，并且RN选自H、甲基和乙基；
X选自包括以下的组，：O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’、NH-C(＝O)-RL2’、NHNH-RL2’、CONHNH-RL2’、 NRNRL2’，其中，RN选自包括H和C1-4烷基的组；
RL2’是用于连接至抗体(Ab)的接头；
R10和R11或者一起形成它们连接的氮和碳原子之间的双键；或者
R10是H并且R11选自OH、ORA和SOzM；
R30和R31或者一起形成它们连接的氮和碳原子之间的双键；或者
R30是H并且R31选自OH、ORA和SOzM。
在一些实施方式中，结合物不是：
ConjA
ConjB
ConjC：
ConjD
ConjE：
在其他实施方式中，可能优选的是结合物选自式ConjA、ConjB、ConjC、ConjD和ConjE的结合物。
式I中的下标p是1至20的整数。因此，结合物包含通过接头单元共价连接至至少一个药物单元的如下限定的抗体(Ab)。配体单元是结合至靶向部分的靶向试剂，下文进行了更全面的描述。因此，本发明还提供用于治疗例如各种癌症和自身免疫疾病的方法。载药量(drug loading)由p表示，其是每抗体药物分子的数目。载药量可以在1至20个药物单元(DL)/抗体的范围内。对于组合物，p表示该组合物中结合物的平均载药量，并且p在1至20的范围内。
本发明的第二方面提供制备根据本发明的第一方面的结合物的方法，包括将式IL或式IIL的化合物：
结合至如下限定的抗体(Ab)，其中：
RL1是适用于连接至抗体(Ab)的接头；
R22L是式IIIaL、式IIIbL或式IIIcL：
其中，QL选自O-RL2、S-RL2和NRN-RL2，并且RN选自H、甲基和乙基；
XL选自包括以下的组，：O-RL2、S-RL2、CO2-RL2、CO-RL2、N＝C＝O-RL2、NHNH-RL2、CONHNH-RL2、NRNRL，其中，RN选自包括H和C1-4烷基的组；
RL2是适用于连接至抗体(Ab)的接头；
并且所有剩余基团如第一方面限定的。
因此，在第二方面可能优选的是，本发明提供制备选自由ConjA、ConjB、ConjC、ConjD和ConjE组成的组的结合物的方法，包括将分别选自A：
B：
C：
D：
和E：
的化合物与如下限定的抗体结合。
WO 2011/130615公开了化合物26：
其是A的母体化合物。化合物A包含该PBD与用于连接至细胞结合剂的接头。细胞结合剂提供多个乙二醇部分以提供溶解性，其在结合物的合成中是有用的。
WO 2010/043380和WO 2011/130613公开了化合物30：
WO 2011/130613还公开了化合物51：
化合物B与化合物30不同在于：在PBD部分之间仅具有(CH2)3链(tether)，而非(CH2)5链，这降低释放的PBD二聚体的亲脂性。连接基团在对位而非间位连接至C2-苯基基团。
WO 2011/130613公开了化合物93：
化合物C在两方面与其不同。细胞结合剂提供增加数目的乙二醇部分以提供溶解性，这在结合物的合成中是有用的，并且苯基取代基提供两个而非一个氧原子，这也有助于溶解。化合物C的结构还可以意味着它更强地结合在小沟中。
化合物A、B和C在每个C环上具有两个sp2中心，其可以允许比在每个C环中仅具有一个sp2中心的化合物在DNA小沟中的更强结合。
WO 2011/130598公开了化合物80：
化合物D通过包含用于连接至细胞结合剂的碘代乙酰胺而与其不同。该基团在结合至细胞结合剂时的稳定性方面，可以提供超过化合物80的优势(参见下文)。化合物80中的马来酰亚胺基团可以经历逆向Michael反应，变得不与细胞结合剂结合，因此易于被包含硫醇的其他生物分子(如白蛋白和谷胱甘肽)清除。用化合物A不能发生这种不结合。另外，碘代乙酰胺基团可以避免其他不希望的副反应。
化合物E通过以下与之前公开的PBD二聚体(具有有C2-3环内双键的药物接头)不同：具有较小的、较不亲脂的C2取代基，例如，4F-苯基、亚丙基。这样，化合物B的结合物(参见以下)在合成时更少地倾向于聚集。可以通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量结合物的这种聚集。
化合物D和E在每个C环中都具有两个sp2中心，这可以允许比在每个C环中仅具有一个sp2中心的化合物在DNA小沟中的更强结合。
可以将WO 2010/043880、WO 2011/130613、WO 2011/130598和WO 2011/130616中公开的药物接头用在本发明中，并且通过引用结合于此。可以根据这些公开中所描述的合成本文描述的药物接头。
具体实施方式
本发明适用于在将PBD化合物提供至受试者中优选的位置方面使用。结合物允许释放不保留接头的任何部分的活性PBD化合物。不存在可以影响PBD化合物的反应活性的短截(残留，stub)。因此，ConjA将释放化合物RelA：
ConjB将释放化合物RelB：
ConjC将释放化合物RelC：
ConjD将释放化合物RelD：
以及，ConjE将释放化合物RelE：
本发明中的PBD二聚体和抗体之间的特定接头优选地是细胞外稳定的。在输送或递送进入细胞之前，抗体-药物结合物(ADC)优选地是稳定的并且保持完整，即，抗体保持连接至药物部分。接头在靶细胞外是稳定的，并且在细胞内可以以有效速率切割。有效的接头将：(i)保持抗体的特异性结合性质；(ii)允许结合物或药物的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即，直到结合物被递送或输送至它的靶向位点才被切割；以及(iv)保持PBD药物部分的细胞毒性作用、细胞杀伤作用或细胞抑制作用。可以通过标准分析技术如质谱、HPLC和分离/分析技术LC/MS测量ADC的稳定性。
通过酶(如组织蛋白酶)在连接基团上、并且特别是在缬氨酸-丙氨酸二肽部分上的作用，在式ConjA、ConjB、ConjC、ConjD或ConjE的结合物的期望激活位点处实现了式RelA、RelB、RelC、RelD或RelE的化合物的递送。
抗体
一方面，抗体是结合至CD19的抗体，该抗体包含具有根据SEQ ID NO.1、2、3、4、5或6中任一种的序列的VH结构域。
抗体可以进一步包含VL结构域。在一些实施方式中，抗体进一步包含具有根据SEQID NO.7、8、9、10、11或12中任一种的序列的VL结构域。
在一些实施方式中，抗体包含与VL结构域成对的VH结构域，VH结构域和VL结构域具有选自由以下组成的组的序列：
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.1；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.2；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.3；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.4；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.5；和
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.6。例如，与SEQ IDNO.7成对的SEQ ID NO.1、与SEQ ID NO.8成对的SEQ ID NO.2、与SEQ ID NO.9成对的SEQID NO.3、与SEQ ID NO.10成对的SEQ ID NO.4、与SEQ ID NO.11成对的SEQ ID NO.5或与SEQ ID NO.12成对的SEQ ID NO.6。
VH结构域和VL结构域可以成对以形成结合CD19的抗体抗原结合位点。
在一些实施方式中，抗体是包含与VL结构域成对的VH结构域的完整抗体，VH结构域和VL结构域具有选自由以下组成的组的序列：
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.1；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.2；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.3；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.4；
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.5；和
与SEQ ID NO.7、8、9、10、11或12中任一种成对的SEQ ID NO.6。例如，与SEQ IDNO.7成对的SEQ ID NO.1、与SEQ ID NO.8成对的SEQ ID NO.2、与SEQ ID NO.9成对的SEQID NO.3、与SEQ ID NO.10成对的SEQ ID NO.4、与SEQ ID NO.11成对的SEQ ID NO.5或与SEQ ID NO.12成对的SEQ ID NO.6。
在一些实施方式中，该抗体与用于结合至CD19的由杂交瘤细胞ATCC登录号HB-305分泌的抗体竞争。在一个实施方式中，抗体以不低于杂交瘤细胞分泌的抗体的2、5倍或10倍较低的缔合常数(Ka)结合CD19。
一方面，抗体是本文描述的抗体，已经如以下所描述的被修饰(或进一步修饰)。在一些实施方式中，抗体是本文公开的抗体的人源化、去免疫化(deimmunised)或表面重建的(resurfaced)变体。
术语
本文的术语“抗体”是在最广义上使用并且具体地覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、完整抗体和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性，例如，结合CD19的能力(Miller et al(2003)Jour.of Immunology170:4854-4861)。抗体可以是鼠科动物抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来自其他物种的抗体。抗体是能够识别和结合至特异性抗原的由免疫系统产生的蛋白质。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immuno Biology,5th Ed.,GarlandPublishing,New York)。靶抗原通常具有许多结合位点，也称为表位，其由在多种抗体上的CDR所识别。特异性结合至不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合感兴趣的靶的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，这种靶包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫病相关的自身免疫性抗体的细胞。免疫球蛋白可以是任何形式(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别，或同种异型(allotype)(例如，人类G1m1、G1m2、G1m3、非G1m1[即，除G1m1之外的任何同种抗原免疫球蛋白]、G1m17、G2m23、G3m21、G3m28、G3m11、G3m5、G3m13、G3m14、G3m10、G3m15、G3m16、G3m6、G3m24、G3m26、G3m27、A2m1、A2m2、Km1、Km2和Km3)的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可以源自任何物种，包括人源、鼠源或兔源。
如本文所使用的，“结合CD19”用于指抗体以高于非特异性伴侣如牛血清白蛋白(BSA，Genbank登录号CAA76847，版本号CAA76847.1GI:3336842，记录更新日期：2011年1月7日，02:30PM)的亲和力结合CD19。在一些实施方式中，在生理溶液条件下测量时，抗体以高于针对BSA的抗体缔合常数至少2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104、105或106倍的缔合常数(Ka)结合CD19。本发明的抗体可以以高亲和力结合CD19。例如，在一些实施方式中，抗体可以以等于或小于约10-6M，如1×10-6、10-7、10-8、10-9,10-10、10-11、10-12、10-13或10-14的KD结合CD19。
在一些实施方式中，CD19多肽对应于Genbank登录号NP_001171569，版本号NP_001171569.1GI:296010921，记录更新日期：2012年9月10日12:43AM。在一个实施方式中，编码CD19多肽的核酸对应于Genbank登录号NM_001178098，版本号NM_001178098.1GI:296010920，记录更新日期：2012年9月10日12:43AM。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和scFv片段；双体；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体，CDR(互补决定区)，和任何以上免疫特异性结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的表位结合片段，单链抗体分子，和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如在本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质抗体的群体的抗体，即，除可以以少量存在的可能的天然存在的突变之外，包括该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点是高度特异性的。此外，相对于多克隆抗体制剂，其包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性以外，单克隆抗体是有利的，因为它们可以被合成而不被其他抗体污染。修饰语“单克隆”是指获自抗体的基本上同质群体的抗体的特性，并且不应当解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，通过Kohler et al(1975)Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法可以制备，或可以通过DNA重组方法(参见US 4816567)制备根据本发明使用的单克隆抗体。也可以使用Clackson et al(1991)Nature,352:624-628；Marks et al(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体库或从携带完整人类免疫球蛋白系统的转基因小鼠(Lonberg(2008)Curr.Opinion 20(4):450-459)分离单克隆抗体。
本文的单克隆抗体确切地包括“嵌合”抗体，其中，重链和/或轻链的部分与源自特定物种的抗体中的对应序列相同或同源或者属于特定特定抗体类别或子类别，而链的剩余部分与源自另一物种的抗体中的对应序列相同或同源或者属于另一抗体类别或子类别，以及这种抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(US 4816567；和Morrison et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。嵌合抗体包括包含源自非人类灵长类动物(例如，旧大陆猴或猿猴)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区域序列的“灵长类化的”抗体。
本文的“完整抗体”是包含VL结构域和VH结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然的序列恒定结构域(例如，人类天然序列恒定结构域)或它的氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，其是指由抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸序列变体Fc区域)引起的生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；和细胞表面受体(如B细胞受体和BCR)的下调。
取决于它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将完整抗体分为不同“类别”。存在完整抗体的5种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为“子类别”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA和IgA2。对应于抗体的不同类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。免疫球蛋白的不同类别的子单元结构和三种尺寸构型是熟知的。
抗体的修饰
可以修饰本文公开的抗体。例如，使它们对人类受试者是更少免疫原性的。这可以使用本领域技术人员熟知的多项技术中的任一项实现。以下更详细地描述了这些技术中的一些。
人源化
降低非人类抗体或抗体片段的体内免疫原性的技术包括称作“人源化”的那些。
“人源化抗体”是指包含人类抗体的至少部分修饰的可变区域的多肽，其中，部分的可变区域，优选地明显小于完整的人类可变结构域的部分，已经被来自非人类物种的对应序列置换，并且其中，修饰的可变区域连接至另一蛋白质的至少另一部分，优选地人类抗体的恒定区。表述“人源化抗体”包括人类抗体，其中，一个或多个互补决定区(“CDR”)氨基酸残基和/或一个或多个构架区(“FW”或“FR”)氨基酸残基被来自啮齿动物或其他非人类抗体中的同功(analogous)位点置换。表述“人源化抗体”还包含免疫球蛋白氨基酸序列或它的片段，其包括基本具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的FR和基本具有非人类免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR。
“人源化”形式的非人类(例如，鼠科动物)抗体是包含源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。或以另一种方式看，人源化抗体是还包含代替人类序列的、来在非人类(例如，鼠科动物)抗体的选定序列的人类抗体。人源化抗体可以包括来自相同或不同物种的保守性氨基酸置换或非天然残基，不显著改变它的结合和/或生物活性。这种抗体是包含源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。
存在大量人源化技术，包括‘CDR移植’、‘定向选择’、‘去免疫’、‘表面重建’(还称为‘外饰(veneering)’)、‘复合抗体’、‘人类链含量优化(Human String ContentOptimisation)’和框架混合。
CDR移植
在该技术中，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中，来自受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望性质的来自非人类物种如小鼠、大鼠、骆驼、牛、山羊或兔的CDR(供体抗体)取代(实际上，非人类CDR被‘移植”至人类框架上)。在一些实施例中，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人类残基取代(例如，这可以发生在当特定的FR残基对结合抗原具有显著作用时)。
此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或植入的CDR或框架序列中都不能找到的残基。进行这些修饰以进一步改善和最大化抗体性能。因此，一般来说，人源化抗体将包含至少一种以及在一方面中两种的全部可变结构域，其中，所有的高可变区环或全部的高变区环对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且所有或基本所有的FR区是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分或人类免疫球蛋白的至少一部分。
定向选择
该方法由以下组成：将对特定表位特异性的给定非人类抗体的VH或VL结构域与人类VH或VL文库组合并且针对兴趣的抗原选择特异的人类V结构域。然后将该选定的人类VH与VL文库组合以产生完整的人类VHxVL组合。Nature Biotechnology(N.Y.)12,(1994)899-903中描述了该方法。
复合抗体
在该方法中，将来自人类抗体的氨基酸序列的两个或多个区段(segment)组合在最终的抗体分子内。它们通过将多个人类VH和VL区段组合在组合体中而构建，该组合体在最终的复合抗体V区中限制或避开人类T细胞表位。当需要时，通过用避开T细胞表位的可替代片段交换有助于或编码T细胞表位的V区的区段来限制或避开T细胞表位。US 2008/0206239A1中描述了该方法。
去免疫
该方法涉及从治疗性抗体(或其他分子)的V区除去人类(或其他第二物种)T细胞表位。例如，通过与MHC结合基序(如，存储在www.wehi.edu.au中的“基序”数据库)比较，分析治疗性抗体V区序列中MHC类II结合基序的存在。可替代地，可以使用如Altuvia et al.(J.Mol.Biol.249244-250(1995))设计的计算线程方法识别MHC类II结合基序；在这些方法中，针对来自V区序列的连续的重叠肽测试了它们与MHC类II蛋白质的结合能。然后将该数据与其他序列特征上的信息组合，该信息涉及成功地呈递肽，如两亲性、Rothbard基序和组织蛋白酶B和其他加工酶的切割位点。
当已经识别可能的第二物种(例如，人类)的T细胞表位时，通过改变一种或多种氨基酸消除它们。修饰的氨基酸通常在T细胞表位自身内，但是也可以临近蛋白质的初级或二级结构的表位(因此，在初级结构中可能是不临近的)。最常见地，改变是通过置换的方式，但是在一些情况中，氨基酸添加或删除会更适当。
通过DNA重组技术可以实现所有改变，使得可以通过使用良好建立的方法(如定向诱变)由重组宿主的表达制备最终的分子。然而，也可以使用蛋白质化学或任何其他分子改变方式。
表面重建
该方法涉及：
(a)通过构建非人类抗体可变区的三维模型，确定非人类(例如，啮齿动物)抗体(或它的片段)的构象结构；
(b)使用相对可达到分布由足量的非人类和人类抗体可变区重链和轻链的x-射线晶体结构产生序列对齐，以给出一组重链和轻链框架位置，其中，对齐位置在98％足量的非人类抗体重链和轻链中是相同的；
(c)使用步骤(b)中产生的框架位置组确定待人源化的非人类抗体，一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基；
(d)由人类抗体氨基酸序列识别一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基，该氨基酸残基与步骤(c)中限定的一组表面暴露的氨基酸残基最为相似，其中，来自人类抗体的重链和轻链自然成对或不能自然成对；
(e)在待人源化的非人类抗体的氨基酸序列中，用在步骤(d)中识别的一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基置换步骤(c)中限定的一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基；
(f)构建由步骤(e)指定的置换得到的非人类抗体的可变区的三维模型；
(g)通过比较步骤(a)和(f)中构建的三维模型，识别步骤(c)或(d)中识别的组的任何氨基酸残基，该氨基酸残基在待人源化非人类抗体的互补决定区的任何残基的任何原子的5埃内；以及
(h)将步骤(g)中识别的任何残基从人类氨基酸残基变化为原始的非人类氨基酸残基，从而限定表面暴露的氨基酸残基的非人类抗体人源化组；条件是不需要首先进行步骤(a)，但是必须在步骤(g)之前进行步骤(a)。
超人源化
该方法将非人类序列与功能性人类生殖种系基因谱系(human germline generepertoire)比较。选择编码与非人类序列相同或密切相关的典型(canonical)结构的那些人类基因。将在CDR内具有最高同源性的这些选定的基因选作FR供体。最终，非人类CDR被移植到这些人类FR上。专利WO 2005/079479A2中描述了该方法。
人类链含量优化
该方法将非人类(例如，小鼠)序列与人类生殖种系基因的谱系比较，并且将差异评分为在可能的MHC/T细胞表位的水平上定量序列的人类链含量(HSC)。然后通过使靶序列的HSC最大化而不是使用全局同一性测量来将靶序列人源化以产生多种不同的人源化变体(在Molecular Immunology,44,(2007)1986-1998中描述)。
框架混合
将非人类抗体的CDR框内融合至包含所有已知的重链和轻链人类生殖种系基因框架的cDNA池中。然后通过例如淘选(panning)噬菌体展示的抗体文库选择人源化抗体。这在Methods 36,43-60(2005)中被描述。
定义
药学上可接受的阳离子
药学上可接受的单价和二价阳离子的实例讨论于Berge,et al.,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)，其通过引用结合于此。
药学上可接受的阳离子可以是无机阳离子或有机阳离子。
药学上可接受的单价无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子如Na+和K+。药学上可接受的二价无机阳离子的实例包括但不限于碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+。药学上可接受的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些适合的取代的铵离子的实例是源自以下的那些取代的铵离子：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的实例是N(CH3)4 +。
取代基
如在本文中所使用的，短语“可选取代”涉及其可以是未取代的或其可以是取代的母基团。
除非另有规定，如在本文中所使用的，术语“取代”涉及其带有一个或多个取代基的母基团。术语“取代基”在本文中是在常规意义上使用并且是指这样的化学部分，其共价连接于，或者如果合适的话，稠合于母基团。各种的取代基是众所周知的，并且用于它们的形成和引入至各种的母基团的方法也是众所周知的。
在下文更详细描述取代基的实例。
C1-12烷基：如在本文中所使用的，术语“C1-12烷基”涉及通过从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子去除氢原子所获得的单价部分，其可以是脂族或脂环族，并且其可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。如在本文中所使用的，术语“C1-4烷基”涉及通过从具有1至4个碳原子的烃化合物的碳原子去除氢原子所获得的单价部分，其可以是脂族或脂环族，并且其可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括下文讨论的亚类：烯基、炔基、环烷基等。
饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)和庚基(C7)。
饱和线性烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)和正庚基(C7)。
饱和支链烷基的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)和新戊基(C5)。
C2-12烯基：如在本文中所使用的，术语“C2-12烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基。
不饱和烯基的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl)(乙烯基，vinyl，-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)和己烯基(C6)。
C2-12炔基：如在本文中所使用的，术语“C2-12炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基。
不饱和炔基的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(2-propynyl)(炔丙基(propargyl)，-CH2-C≡CH)。
C3-12环烷基：如在本文中所使用的，术语“C3-12环烷基”涉及也是环基的烷基；即，通过从环烃(碳环)化合物的脂环原子去除氢原子所获得的单价部分，该单价部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基的实例包括但不限于那些环烷基，其源自：
饱和单环烃化合物；
环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)和甲基环己烷(C7)；
不饱和单环烃化合物；
环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)和甲基环己烯(C7)；以及
饱和多环烃化合物：
降蒈烷(norcarane)(C7)、降蒎烷(norpinane)(C7)、降莰烷(降冰片烷，norbornane)(C7)。
C3-20杂环基：如在本文中所使用的，术语“C3-20杂环基”涉及通过从杂环化合物的环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有3至20个环原子，其中1至10个是环杂原子。优选地，每个环具有3至7个环原子，其中1至4个是环杂原子。
在此上下文中，前缀(例如C3-20、C3-7、C5-6,等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，而不管是碳原子或杂原子。例如，如在本文中所使用的，术语“C5-6杂环基”涉及具有5或6个环原子的杂环基。
单环杂环基的实例包括但不限于源自以下的那些单环杂环基：
N1：氮丙啶(C3)、氮杂环丁烷(C4)、吡咯烷(四氢吡咯)(C5)、吡咯啉(例如，3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯，异噁唑)(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、氮杂(C7)；
O1：氧杂环丙烷(oxirane)(C3)、氧杂环丁烷(oxetane)(C4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊二烯(氧杂茂，oxole)(二氢呋喃)(C5)、氧杂环己烷(exane)(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、氧杂(噁庚，oxepin)(C7)；
S1：硫杂环丙烷(C3)、硫杂环丁烷(C4)、硫杂环戊烷(四氢噻吩)(C5)、硫杂环己烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(thiepane)(C7)；
O2：二氧杂环戊烷(C5)、二氧杂环已烷(C6)和二氧杂环庚烷(dioxepane)(C7)；
O3：三氧杂环己烷(C6)；
N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二偶氮烷)(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
N1O1：四氢噁唑(C5)、二氢噁唑(C5)、四氢异噁唑(C5)、二氢异噁唑(C5)、吗啉(C6)、四氢噁嗪(C6)、二氢噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；
N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、硫代吗啉(C6)；
N2O1：噁二嗪(C6)；
O1S1：氧硫杂环戊二烯(噁噻吩，oxathiole)(C5)和氧硫杂环己烷(噻噁烷)(C6)；以及
N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
取代的单环杂环基的实例包括那些取代的单环杂环基，其源自环形式的糖类，例如，呋喃糖(C5)，如阿拉伯呋喃糖、来苏呋喃糖(lyxofuranose)、呋喃核糖和呋喃木糖(xylofuranse)，以及吡喃糖(C6)，如别吡喃糖(allopyranose)、吡喃阿卓糖、吡喃葡萄糖、吡喃甘露糖、吡喃古洛糖(gulopyranose)、吡喃艾杜糖(idopyranose)、吡喃半乳糖和吡喃塔罗糖(talopyranose)。
C5-20芳基：如在本文中所使用的，术语“C5-20芳基”涉及通过从芳族化合物的芳环原子去除氢原子所获得的单价部分，其具有3至20个环原子。如在本文中所使用的，术语“C5-7芳基”涉及通过从芳族化合物的芳环原子去除氢原子所获得的单价部分，其具有5至7个环原子，以及如在本文中所使用的，术语“C5-10芳基”涉及通过从芳族化合物的芳环原子去除氢原子所获得的单价部分，其具有5至10个环原子。优选地，每个环具有5至7个环原子。
在此上下文中，前缀(例如C3-20、C5-7、C5-6、C5-10等)表示环原子(碳原子或杂原子)的数目或环原子的数目的范围。例如，如在本文中所使用的，术语“C5-6芳基”涉及具有5或6个环原子的芳基。
环原子可以都是碳原子，如在“碳芳基”中。
碳芳基的实例包括但不限于源自以下的那些碳芳基：苯(即苯基)(C6)、萘(C10)、薁(甘菊环)(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、萘并萘(C18)和芘(C16)。
包含稠环(其至少之一是芳环)的芳基的实例包括但不限于源自以下的基团：茚满(例如2,3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢化萘(1,2,3,4-四氢萘(C10)、苊(C12)、芴(C13)、非那烯(C13)、醋菲(C15)和醋蒽(C16)。
可替换地，环原子可以包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。单环杂芳基的实例包括但不限于源自以下的那些：
N1：吡咯(Pyrrole)(唑，azole)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；
O1：呋喃(氧杂茂，oxole)(C5)；
S1：噻吩(thiophene)(噻吩，thiole)(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
N3O1：噁三唑(C5)；
N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；
N3：三唑(C5)、三嗪(C6)；以及
N4：四唑(C5)。
包含稠环的杂芳基的实例包括但不限于：
源自以下的C9(具有2个稠环)：苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、氮茚(N1)、吲哚啉(N1)、异吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并二氧杂环戊二烯(苯并二噁茂)(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并三唑(N3)、苯并噻吩(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
源自以下的C10(具有2个稠环)：色烯(O1)、异色烯(O1)、色满(chroman)(O1)、异色满(O1)、苯并二噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(phthalazine)(N2)、萘啶(二氮杂萘，naphthyridine)(N2)、蝶啶(N4)；
源自以下的C11(具有2个稠环)：苯并二氮杂(N2)；
源自以下的C13(具有3个稠环)：咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、呸啶(萘嵌间二氮杂苯，perimidine)(N2)、吡啶并吲哚(N2)；以及
源自以下的C14(具有3个稠环)：吖啶(N1)、呫吨(xanthene)(O1)、噻吨(S1)、噁蒽(oxanthrene)(O2)、吩噁噻(phenoxathiin)(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、菲咯啉(N2)、吩嗪(N2)。
上述基团，无论单独地或是另一取代基的一部分，可以本身可选地被选自它们本身和以下列出的另外的取代基的一个或多个基团取代。
卤素：-F、-Cl、-Br和-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R是醚取代基，例如，C1-7烷基(还被称为C1-7烷氧基，下文讨论的)、C3-20杂环基(还被称为C3-20杂环氧基)或C5-20芳基(还被称为C5-20芳氧基)，优选C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R是烷基，例如，C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括但不限于-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)和-O(tBu)(叔丁氧基)。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地是缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，或者，在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2连同它们所连接的两个氧原子和它们所连接的碳原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OMe)2、-CH(OEt)2和-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1是半缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2是如针对缩醛所限定的，以及R是除氢以外的缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2和-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1是如针对半缩醛所限定，并且R是除氢以外的半缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)和-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代(酮基、-酮)：＝O。
硫酮(Thione)(硫代酮，thioketone)：＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R是亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe、＝Net和＝NPh。
甲酰基(甲醛，carbaldehyde,carboxaldehyde)：-C(＝O)H。
酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如，C1-7烷基(还被称为C1-7烷酰基)、C3-20杂环基(还被称为C3-20杂环酰基)或C5-20芳基(还被称为C5-20芳酰基)，优选C1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基，苯酮)。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
巯基代羧基(硫醇羧基，Thiolocarboxy)(巯基代羧酸(硫醇羧酸)，thiolocarboxylic acid)：-C(＝O)SH。
硫羰羧基(硫羰羧酸)：-C(＝S)OH。
亚胺酸(Imidic acid)：-C(＝NH)OH。
异羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯(carboxylate,carboxylic acid ester)，氧基羰基(oxycarbonyl))：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3和-C(＝O)Oph。
酰氧基(反向酯)：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph、和-OC(＝O)CH2Ph。
氧基羰氧基(Oxycarboyloxy)：-OC(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3和-OC(＝O)Oph。
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基(还被称为C1-7烷基氨基或二C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基，或者，在“环状”氨基的情况下，R1和R2连同它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可以是伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NHR1)或叔氨基(-NHR1R2)，以及在阳离子形式中，可以是季氨基(-+NR1R2R3)。氨基的实例包括但不限于-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-NHPh。环状氨基的实例包括但不限于氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷并、哌啶子基(piperidino)、哌嗪子基(piperazino)、吗啉代和硫代吗啉代。
酰氨基(氨基甲酰基，氨基甲酰，氨基羰基，甲酰胺)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3和-C(＝O)N(CH2CH3)2，以及酰氨基，其中R1和R2连同它们所连接的氮原子一起形成杂环结构，如在，例如，哌啶子基羰基、吗啉代羰基、硫代吗啉代羰基和哌嗪子基羰基中。
硫代酰氨基(硫代氨基甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2和-C(＝S)NHCH2CH3。
酰基酰氨基(酰氨基)：-NR1C(＝O)R2，其中R1是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基，以及R2是酰基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酰胺基团的实例包括但不限于-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3和-NHC(＝O)Ph。R1和R2可以一起形成环状结构，如在，例如，琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和苯邻二甲酰亚胺基中：
氨基羰氧基：-OC(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。氨基羰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2和-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的，以及R1是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。脲基的实例包括但不限于-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2和-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
四唑基：具有4个氮原子和一个碳原子的五元芳环，
亚氨基：＝NR，其中R是亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。亚氨基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe和＝NEt。
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中每个R是脒取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。脒基团的实例包括但不限于-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2和-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈，nitrile，carbonitrile)：-CN。
异氰基：-NC。
氰酰基(Cyanato)：-OCN。
异氰酰基：-NCO。
硫氰基(Thiocyano)(硫氰基)：-SCN。
异硫氰基(isothiocyano)(异硫氰基，isothiocyanato)：-NCS。
巯基(Sulfhydryl)(硫醇，thiol；巯基，mercapto)：-SH。
硫醚(硫化物)：-SR，其中R是硫醚取代基，例如，C1-7烷基(还被称为C1-7烷硫基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。C1-7烷硫基的实例包括但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R是二硫化物取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基(在本文中还称为C1-7烷基二硫化物)。C1-7烷基二硫化物基团的实例包括但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
硫肟基(锍化物，sulfine)(亚硫酰基，亚砜)：-S(＝O)R，其中R是硫肟基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫肟基基团的实例包括但不限于-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R是砜取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，包括，例如，氟化或全氟化C1-7烷基。砜基团的实例包括但不限于-S(＝O)2CH3(甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基，triflyl)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基，esyl)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基，nonaflyl)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基，tresyl)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(牛磺酰基，tauryl)、-S(＝O)2Ph(苯磺酰，苯磺酰基(besyl))、4-甲基苯磺酰(甲苯磺酰基(tosyl))、4-氯苯磺酰(氯苯磺酰基(closyl))、4-溴苯磺酰(溴苯磺酰基(brosyl))、4-硝基苯基(硝基苯磺酰基(nosyl))、2-萘磺酸酯(萘磺酰基，napsyl)和5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基(dansyl))。
亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH、-SO2H。
磺酸(磺基)：-S(＝O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯(sulfinate)(亚磺酸酯，sulfinic acid ester)：-S(＝O)OR；其中R是亚磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)OCH3(甲氧基亚硫酰基；亚磺酸甲酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚硫酰基；亚磺酸乙酯)。
磺酸酯(sulfonate)(磺酸酯，sulfonic acid ester)：-S(＝O)2OR，其中R是磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；磺酸甲酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；磺酸乙酯)。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R是亚硫酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚硫酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R是磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。
硫酸酯：-OS(＝O)2OR；其中R是硫酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫酸酯基团的实例包括但不限于-OS(＝O)2OCH3和-SO(＝O)2OCH2CH3。
氨磺酰(sulfamyl)(氨磺酰(sulfamoyl)；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。氨磺酰的实例包括但不限于-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2和-S(＝O)NHPh。
亚磺酰氨基(亚氨磺酰基；磺酸酰胺；氨磺酰)：-S(＝O)2NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。亚磺酰氨基的实例包括但不限于-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2和-S(＝O)2NHPh。
磺氨基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1是氨基取代基，如针对氨基所限定的。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺酰氨基(Sulfonamino)：-NR1S(＝O)2R，其中R1是氨基取代基，如针对氨基所限定的，以及R是磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺酰氨基(Sulfinamino)：-NR1S(＝O)R，其中R1是氨基取代基，如针对氨基所限定的，并且R是亚磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
膦基(膦)：-PR2，其中R是膦基取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括但不限于-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2和-P(Ph)2。
二氧磷基：-P(＝O)2。
磷酰基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中R是氧膦基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰基的实例包括但不限于-P(＝O)(CH3)2、-P(＝O)(CH2CH3)2、-P(＝O)(t-Bu)2和-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中R是膦酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯基团的实例包括但不限于-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2和-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(膦酰氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯(膦酰氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中R是磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2和-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中R是亚磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2和-OP(OPh)2。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1和R2是亚磷酰胺取代基，例如，-H、(可选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酰胺基团的实例包括但不限于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
氨基磷酸酯：-OP(＝O)(OR1)-NR2 2，其中R1和R2是氨基磷酸酯取代基，例如，-H、(可选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。氨基磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
亚烷基
C3-12亚烷基：如在本文中所使用的，术语“C3-12亚烷基”涉及通过从具有3至12个碳原子(除非另有规定)的烃化合物的相同碳原子去除两个氢原子或从两个不同的碳原子各去除一个氢原子所获得的二齿部分，其可以是脂族或脂环族，并且其可以是饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括下文讨论的以下亚类：亚烯基、亚炔基、环亚烷基等。
直链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-(CH2)n-，其中n是3至12的整数，例如，-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)和-CH2CH2CH2CH-2CH2CH2CH2-(亚庚基)。
支链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-和-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
直链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH＝CH-和-CH2-C≡C-CH2-。
支链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-C(CH3)＝CH-。-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH(CH3)-和-C≡C-CH(CH3)-。
脂环族饱和C3-12亚烷基(C3-12环亚烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(例如环戊-1,3-亚基)和亚环己基(例如环己-1,4-亚基)。
脂环族部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12环亚烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(例如4-环戊烯-1,3-亚基)、亚环己烯基(例如2-环己烯-1,4-亚基；3-环己烯-1,2-亚基；2,5-环己二烯-1,4-亚基)。
氨基甲酸酯氮保护基团：术语“氨基甲酸酯氮保护基团”涉及这样的部分，其掩蔽在亚胺键中的氮，并且是本领域中众所周知的。这些基团具有以下结构：
其中R’10是如上文所限定的R。大量的适合基团描述于Greene,T.W.and Wuts,G.M.,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition,John Wiley&Sons,Inc.,1999的第503至549页，其通过引用结合于此。
半缩醛胺氮保护基团：术语“半缩醛胺氮保护基团”涉及具有以下结构的基团：
其中R’10是如上文所限定的R。大量的作为酰胺保护基团的适合基团描述于Greene,T.W.and Wuts,G.M.,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition,John Wiley&Sons,Inc.,1999的第633至647页，其通过引用结合于此。
基团氨基甲酸酯氮保护基团和半缩醛氮保护基团可以共同地称为“用于合成的氮保护基团”。
结合物
本发明提供包含经由接头单元连接至抗体的PBD化合物的结合物。
在一个实施方式中，结合物包含连接至间隔子连接基团的抗体、连接至引发剂(trigger)的间隔子、连接至自分解(自消除，自毁，self-immolative)接头的引发剂和连接至PBD化合物的N10位置的自分解接头。以下说明了这种结合物：
其中，Ab是以上限定的抗体并且PBD是本文所描述的吡咯并苯并二氮杂化合物(D)。说明示出了对应于本发明的某些实施方式中的RL’、A、L1和L2的部分。RL’可以是RL1’或RL2’。D是其中除去RL1’或RL2’的DL。
本发明适用于将PBD化合物提供至受试者中优选的位置的用途。在优选的实施方式中，结合物允许释放不保留任何接头部分的活性PBD化合物。不存在可以影响PBD化合物的反应活性的残留。
接头通过一个或多个共价键将抗体连接至PBD药物部分D。接头是双官能的或多官能的部分，可被用于连接一个或多个药物部分(D)和抗体单元(Ab)以形成抗体-药物结合物(ADC)。接头(RL’)在细胞之外(即，细胞外)可以是稳定的，或它是通过酶活性、水解或其他新陈代谢条件可切割的。使用具有用于结合至药物部分和抗体的反应官能度的接头可以方便地制备抗体-药物结合物(ADC)。抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇或胺，例如N端或氨基酸侧链(如赖氨酸)，可以与接头或间隔子试剂、PBD药物部分(D)或药物-接头试剂(DL，D-RL)的官能团形成键，其中，RL可以是RL1或RL2。
ADC的接头优选地防止ADC分子的聚集，并且保持ADC易溶于水性介质以及将其保持在单体状态。
ADC的接头优选地在细胞外稳定。在输送或递送至细胞之前，抗体-药物结合物(ADC)优选地是稳定的并且保持完整，即，抗体保持连接至药物部分。接头在靶细胞外是稳定的，并且在细胞内可以以有效速率切割。有效的接头将：(i)保持抗体的特异性结合性质；(ii)允许结合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即，直到结合物被递送或输送至它的靶向位点才切割；以及(iv)保持PBD药物部分的细胞毒性作用、细胞杀伤作用或细胞抑制作用。可以通过标准分析技术如质谱、HPLC和分离/分析技术LC/MS测量ADC的稳定性。
抗体和药物部分的共价连接需要接头具有两个反应性官能团，即，反应意义上的二价。可用于连接两个或多个功能部分或生物活性部分如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报告基团的二价接头是已知的，并且已经有方法描述了它们得到的结合物(Hermanson,G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press:New York,p 234-242)。
在另一个实施方式中，接头可以由调节聚集、溶解度或反应性的基团取代。例如，磺酸酯取代基可以增加试剂的水溶解度并且促进接头试剂与抗体或药物部分的偶联反应，或促进Ab-L与DL或DL-L与Ab的偶联反应，这取决于制备ADC使用的合成路径。
在一个实施方式中，L-RL’是以下基团：
其中，星号表示连接至药物单元(D)的点，Ab是抗体(L)，L1是接头，A是将L1连接至抗体的连接基团，L2是共价键或与-OC(＝O)-一起形成自分解接头，以及L1或L2是可切割的接头。
L1优选地是可切割的接头，并且可以由称为用于激活接头切割的引发剂。
当存在时，L1和L2的性质可以广泛改变。基于它们的切割特征来选择的这些基团，其可以由结合物所递送的位点的条件来决定。尽管也可以使用通过pH变化(例如，酸或碱不稳定性)、温度或通过辐射(例如，对光的不稳定性)是可切割的接头，但是通过酶的作用切割的那些接头是优选的。也可以在本发明中使用在还原或氧化条件下可切割的接头。
L1可以包含氨基酸的连续序列。氨基酸序列可以是用于酶切割的靶底物，从而允许从N10位置释放L-RL’。
在一个实施方式中，可以由酶的作用切割L1。在一个实施方式中，酶是酯酶或肽酶。
在一个实施方式中，存在L2并且与-C(＝O)O-一起形成自分解接头。在一个实施方式中，L2是用于酶活性的底物，从而允许从N10位置释放L-RL’。
在一个实施方式中，当L1在酶的作用是可切割的并且存在L2时，酶切割L1和L2之间的键。
L1和L2(当存在时)可以通过选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-、
-C(＝O)O-、
-NHC(＝O)-、
-OC(＝O)-、
-OC(＝O)O-、
-NHC(＝O)O-、
-OC(＝O)NH-和
-NHC(＝O)NH-。
连接至L2的L1的氨基基团可以是氨基酸的N-端，或可以源自氨基酸侧链(例如赖氨酸氨基酸侧链)的氨基基团。
连接至L2的L1的羧基基团可以是氨基酸的C-端，或可以源自氨基酸侧链(例如谷氨酸氨基酸侧链)的羧基基团。
连接至L2的L1的羟基基团可以源自氨基酸侧链(例如丝氨酸氨基酸侧链)的羟基基团。
术语“氨基酸侧链”包括在以下中发现的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；(ii)微量氨基酸(minor amino acids)，如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然存在的氨基酸的合成类似物和衍生物；以及(iv)所有对映异构体、非对映异构体、富含的同分异构体、同位素标记的(例如，2H、3H、14C、15N)、受保护形式和它们的外消旋混合物。
在一个实施方式中，-C(＝O)O-和L2一起形成以下基团：
其中，星号表示连接至N10位置的点，波浪线表示连接至接头L1的点，Y是-N(H)-、-O-、-C(＝O)N(H)-或-C(＝O)O-，并且n是0至3。亚苯基环可选地被本文所描述的一个、两个或三个取代基取代。在一个实施方式中，亚苯基基团可选地被卤素、NO2、R或OR取代。
在一个实施方式中，Y是NH。
在一个实施方式中，n是0或1。优选地，n是0。
当Y是NH并且n是0时，自分解接头可以被称为对氨基苄基羰基接头(PABC)。
当远端位点被活化时，允许自分解接头释放受保护的化合物，其沿以下所示的路线进行(n＝0)：
其中，L*是接头的剩余部分的活化形式。这些基团具有使活化位点与受保护的化合物分离的优势。如以上所描述的，亚苯基基团可以是可选取代的。
在本文所述的一个实施方式中，基团L*是如本文所描述的接头L1，其可以包括二肽基团。
在另一个实施方式中，-C(＝O)O-和L2一起形成选自以下的基团：
其中，星号、波浪线、Y和n如以上所限定的。每个亚苯基环可选地被本文所描述的一个、两个或三个取代基取代。在一个实施方式中，具有Y取代基的亚苯基环是可选取代的并且不具有Y取代基的亚苯基环是未取代的。在一个实施方式中，具有Y取代基的亚苯基环是未取代的并且不具有Y取代基的亚苯基环是可选取代的。
在另一个实施方式中，-C(＝O)O-和L2一起形成选自以下的基团：
其中，星号、波浪线、Y和n是如以上所限定的，E是O、S或NR，D是N、CH或CR，并且F是N、CH或CR。
在一个实施方式中，D是N。
在一个实施方式中，D是CH。
在一个实施方式中，E是O或S。
在一个实施方式中，F是CH。
在优选的实施方式中，接头是组织蛋白酶不稳定性接头。
在一个实施方式中，L1包括二肽。该二肽可以表示为-NH-X1-X2-CO-，其中，-NH-和-CO-分别表示氨基酸基团X1和X2的N和C端。该二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。当接头是组织蛋白酶不稳定性接头时，二肽可以是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。
另外，对于具有羧基或氨基侧链官能度的那些氨基酸基团，分别例如Glu和Lys，CO和NH可以表示该侧链官能度。
在一个实施方式中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-，选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-、
-Phe-Cit-、
-Leu-Cit-、
-Ile-Cit-、
-Phe-Arg-、
-Trp-Cit-，
其中，Cit是瓜氨酸。
优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-，选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-。
更优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-，是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
可以使用其他二肽组合，其包括Dubowchik et al.,Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869描述的那些，通过引用将其结合于此。
在一个实施方式中，在适当情况下，氨基酸侧链是衍生的。例如，氨基酸侧链的氨基基团或羧基基团可以是衍生的。在一个实施方式中，侧链氨基酸(如赖氨酸)的氨基基团NH2是选自由NHR和NRR’组成的组的衍生形式。在一个实施方式中，侧链氨基酸(如天冬氨酸)的羧基基团COOH是选自由COOR、CONH2、CONHR和CONRR’组成的组的衍生形式。
在一个实施方式中，在适当情况下，氨基酸侧链是化学保护的。侧链保护基团可以是以下关于基团RL讨论的基团。本发明人已经确定受保护的氨基酸序列是被酶可切割。例如，已经确定包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列是组织蛋白酶可切割的。
用于氨基酸侧链的保护基团在本领域中是熟知的并且在Novabiochem目录中描述。在Protective Groups in Organic Synthesis,Greene and Wuts中描述了其他保护基团策略。
对于具有反应性侧链官能度的那些氨基酸，以下示出了可能的侧链保护基团：
Arg：Z、Mtr、Tos；
Asn：Trt、Xan；
Asp：Bzl、t-Bu；
Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；
Glu：Bzl、t-Bu；
Gln：Trt、Xan；
His：Boc、Dnp、Tos、Trt；
Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc；
Ser：Bzl、TBDMS、TBDPS；
Thr：Bz；
Trp：Boc；
Tyr：Bzl、Z、Z-Br。
在一个实施方式中，当存在时，选择侧链保护基与提供为封端基团或部分封端基团的基团正交。因此，除去侧链保护基团不除去封端基团或任何是封端基团的一部分的保护基团官能度。
在本发明的其他实施方式中，选定的氨基酸是不具有反应性侧链官能度的那些。例如，氨基酸可以选自：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro和Val。
在一个实施方式中，与自分解接头组合使用二肽。自分解接头可以连接至-X2-。
当存在自分解接头时，-X2-直接连接至自分解接头。优选地，基团-X2-CO-连接至Y，其中，Y是NH，从而形成基团-X2-CO-NH-。
-NH-X1-直接连接至A。A可以包含官能团-CO-，从而形成与-X1-连接的酰胺。
在一个实施方式中，L1和L2与-OC(＝O)-一起包含基团NH-X1-X2-CO-PABC-。PABC基团直接连接至N10位置。优选地，自分解接头和二肽一起形成基团-NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-，其在以下示出：
其中，星号表示连接至N10位置的点，以及波浪线表示连接至接头L1的剩余部分的点或连接至A的点。优选地，波浪线表示连接至A的点。Lys氨基酸的侧链可以是受保护的，例如，用以上描述的Boc、Fmoc或Alloc保护。
可替代地，自分解接头和二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其在以下示出：
其中，星号和波浪线如以上所限定的。
可替代地，自分解接头和二肽一起形成基团-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-，其在以下示出：
其中，星号和波浪线如以上所限定的。
在一个实施方式中，A是共价键。因此，L1和抗体是直接连接的。例如，当L1包含连续的氨基酸序列时，序列的N端可以直接连接至抗体。
因此，当A是共价键时，抗体和L1之间的连接可以选自：
-C(＝O)NH-、
-C(＝O)O-、
-NHC(＝O)-、
-OC(＝O)-、
-OC(＝O)O-、
-NHC(＝O)O-、
-OC(＝O)NH-、
-NHC(＝O)NH-、
-C(＝O)NHC(＝O)-、
-S-、
-S-S-、
-CH2C(＝O)-和
＝N-NH-。
连接至抗体的L1的氨基基团可以是氨基酸的N端，或可以源自氨基酸侧链(例如赖氨酸氨基酸侧链)的氨基基团。
连接至抗体的L1的羧基基团可以是氨基酸的C端，或可以源自氨基酸侧链(例如谷氨酸氨基酸侧链)的羧基基团。
连接至抗体的L1的羟基基团可以源自氨基酸侧链(例如丝氨酸氨基酸侧链)的羟基基团。
连接至抗体的L1的硫醇基团可以源自氨基酸侧链(例如丝氨酸氨基酸侧链)的硫醇基团。
以上关于L1的氨基、羧基、羟基和硫醇基团的注释也可应用至抗体。
在一个实施方式中，L2与-OC(＝O)-一起表示：
其中，星号表示连接至N10位置的点，波浪线表示连接至L1的点，n是0至3，Y是共价键或官能团，以及E是可激活基团，例如通过酶作用或光，从而产生自分解的单元。亚苯基环可选地被本文所描述的一个、两个或三个取代基进一步取代。在一个实施方式中，亚苯基基团可选地被卤素、NO2、R或OR进一步取代。优选地，n是0或1，最优选地是0。
选择E使得基团易于激活，例如，通过光或通过酶的作用激活。E可以是-NO2或葡萄糖醛酸。前者可能易受硝基还原酶的作用，后者可能易受β-葡萄糖醛酸酶的作用。
在该实施方式中，当E被活化时，自分解接头将允许释放受保护的化合物，其沿以下所示的路线进行(n＝0)：
其中，星号表示连接至N10位置的点，E*是E的活化形式，并且Y如以上所描述。这些基团具有使活化位点与受保护的化合物分离的优势。如以上所描述的，亚苯基基团可以是可选地进一步取代的。
基团Y可以至L1的共价键。
基团Y可以是选自以下的官能团：
-C(＝O)-、
-NH-、
-O-、
-C(＝O)NH-、
-C(＝O)O-、
-NHC(＝O)-、
-OC(＝O)-、
-OC(＝O)O-、
-NHC(＝O)O-、
-OC(＝O)NH-、
-NHC(＝O)NH-、
-NHC(＝O)NH、
-C(＝O)NHC(＝O)-和
-S-。
当L1是二肽时，优选的是Y是-NH-或-C(＝O)-，从而形成L1和Y之间的酰胺键。在该实施方式中，二肽序列不需要是酶活性的底物。
在另一个实施方式中，A是间隔子基团。因此，L1和抗体是间接连接的。
L1和A可以通过选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-、
-C(＝O)O-、
-NHC(＝O)-、
-OC(＝O)-、
-OC(＝O)O-、
-NHC(＝O)O-、
-OC(＝O)NH-和
-NHC(＝O)NH-。
在一个实施方式中，基团A是：
其中，星号表示连接至L1的点，波浪线表示连接至抗体的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A是：
其中，星号表示连接至L1的点，波浪线表示连接至抗体的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A是：
其中，星号表示连接至L1的点，波浪线表示连接至抗体的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8以及最优选地4或8。在另一个实施方式中，m是10至30，并且优选地是20至30。可替代地，m是0至50。在该实施方式中，m优选地是10-40，并且n是1。
在一个实施方式中，基团A是：
其中，星号表示连接至L1的点，波浪线表示连接至抗体的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8以及最优选地4或8。在另一个实施方式中，m是10至30，并且优选地是20至30。可替代地，m是0至50。在该实施方式中，m优选地是10-40，并且n是1。
在一个实施方式中，抗体和A之间的连接通过抗体的硫醇残基和A的马来酰亚胺基团。
在一个实施方式中，抗体和A之间的连接是：
其中，星号表示连接至A的剩余部分的点，并且波浪线表示连接至抗体的剩余部分的点。在这个实施方式中，S原子通常源自抗体。
在以上实施方式的每一个中，可以使用可替代的官能度代替以下示出的源自马来酰亚胺的基团：
其中，波浪线如以前一样表示连接至抗体的点，并且星号表示至A基团的剩余部分的键。
在一个实施方式中，用以下基团代替源自马来酰亚胺的基团：
其中，波浪线表示连接至抗体的点，并且星号表示至A基团的剩余部分的键。
在一个实施方式中，源自马来酰亚胺的基团被基团代替，该基团可选地与抗体一起，选自：
-C(＝O)NH-、
-C(＝O)O-、
-NHC(＝O)-、
-OC(＝O)-、
-OC(＝O)O-、
-NHC(＝O)O-、
-OC(＝O)NH-、
-NHC(＝O)NH-、
-NHC(＝O)NH、
-C(＝O)NHC(＝O)-、
-S-、
-S-S-、
-CH2C(＝O)-、
-C(＝O)CH2-、
＝N-NH-和
-NH-N＝。
在一个实施方式中，源自马来酰亚胺的基团被基团代替，该基团可选地与抗体一起，选自：
其中，波浪线表示连接至抗体的点或至A基团的剩余部分的键，并且星号表示连接至抗体的另外的点或至A基团的剩余部分的键。
WO 2005/082023中描述了适用于将L1连接至抗体的其他基团。
在一个实施方式中，存在连接基团A，存在引发剂L1并且不存在自分解接头L2。因此，L1和药物单元经由键直接连接。等同于在该实施方式中，L2是键。当DL是式II时，这可以是特别有意义的。
L1和D可以通过选自以下的键连接：
-C(＝O)N<，
-C(＝O)O-、
-NHC(＝O)-、
-OC(＝O)-、
-OC(＝O)O-、
-NHC(＝O)O-、
-OC(＝O)N<，和
-NHC(＝O)N<，
其中，N<或O-是D的一部分。
在一个实施方式中，L1和D由选自以下的键连接：
-C(＝O)N<，以及
-NHC(＝O)-。
在一个实施方式中，L1包含二肽并且二肽的一端连接至D。如以上所描述的，二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方式中，二肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定的接头时，二肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。则二肽是组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方式中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-，选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-、
-Phe-Cit-、
-Leu-Cit-、
-Ile-Cit-、
-Phe-Arg-和
-Trp-Cit-；
其中，Cit是瓜氨酸。在这种二肽中，-NH-是X1的氨基基团，并且CO是X2的羰基基团。
优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-，选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-和
-Val-Cit-。
更优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-，是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
其他感兴趣的二肽组合包括：
-Gly-Gly-、
-Pro-Pro-和
-Val-Glu-。
可以使用其他二肽组合，包括以上描述的那些。
在一个实施方式中，L1-D是：
其中，-NH-X1-X2-CO是二肽，-N<是药物单元的一部分，星号表示连接至药物单元的剩余部分的点，并且波浪线表示连接至L1的剩余部分的点或连接至A的点。优选地，波浪线表示连接至A的点。
在一个实施方式中，二肽是缬氨酸-丙氨酸并且L1-D是：
其中星号、-N<和波浪线如以上所限定的。
在一个实施方式中，二肽是苯丙氨酸-赖氨酸并且L1-D是：
其中星号、-N<和波浪线如以上所限定的。
在一个实施方式中，二肽是缬氨酸-瓜氨酸。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8、最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至7、优选地3至7、最优选3或7。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8、最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8、最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，S是配体单元的硫基团，波浪线表示连接至配体单元的其余部分的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，S是配体单元的硫基团，波浪线表示连接至配体单元的剩余部分的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，S是配体单元的硫基团，波浪线表示连接至配体单元的剩余部分的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8、最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至7、优选地4至8、最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的剩余部分的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的剩余部分的点，并且n是0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的剩余部分的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8、最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中，星号表示连接至L2或D的点，波浪线表示连接至配体单元的剩余部分的点，n是0或1，并且m是0至30。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至8、优选地4至8、最优选4或8。
基团RL’可源自基团RL。通过将抗体连接至RL的官能团可以将基团RL转化为基团RL’。可以采取其他步骤将RL转化为RL’。这些步骤可以包括除去存在的保护基团或引入适当的官能团。
RL
接头可以包括包含一个或多个氨基酸单元的蛋白酶可切割的肽部分。可以通过肽化学领域熟知的固相或液相合成方法(E. and K.Lübke,The Peptides,volume1,pp 76-136(1965)Academic Press)，包括t-BOC化学(Geiser et al"Automation ofsolid-phase peptide synthesis"in Macromolecular Sequencing and Synthesis,AlanR.Liss,Inc.,1988,pp.199-218)和Fmoc/HBTU化学(Fields,G.and Noble,R.(1990)"Solidphase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids",Int.J.Peptide Protein Res.35:161-214)，在自动化合成仪如Rainin Symphony肽合成仪(Protein Technologies,Inc.,Tucson,AZ)或Model 433(Applied Biosystems,FosterCity,CA)上制备肽接头试剂。
示例性的氨基酸接头包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)示例性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些以及微量氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。在它们对于由特定酶例如肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤维蛋白酶的酶切割的选择性方面，可以设计和优化氨基酸接头。
氨基酸侧链包括天然存在的那些以及微量氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。氨基酸侧链包括氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基、苯基、环己基以及以下结构：
当氨基酸侧链包括除了氢(甘氨酸)之外时，氨基酸侧链连接的碳原子是手性的。氨基酸侧链连接的每个碳原子独立地是(S)或(R)构型，或外消旋混合物。因此，药物-接头试剂可以是对映体纯的、外消旋的或非对映体的。
在示例性的实施方式中，氨基酸侧链选自天然和非天然氨基酸的那些，包括丙氨酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、α,α-二甲基γ-氨基丁酸、β,β-二甲基γ-氨基丁酸、鸟氨酸和瓜氨酸(Cit)。
具有对氨基苄基氨甲酰基(PAB)自分解的间隔子的、适用于构成用于结合至抗体的接头-PBD药物部分中间体的示例性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有以下结构：
其中，Q是C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；并且m是0-4的整数。
可以根据Dubowchik,et al.(1997)Tetrahedron Letters,38:5257-60制备具有对氨基苄基基团的示例性phe-lys(Mtr)二肽接头试剂，并且具有以下结构：
其中，Mtr是单-4-甲氧基三苯甲基，Q是C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；并且m是0-4范围的整数。
“自分解接头”PAB(对氨基苄氧基氨甲酰基)在抗体药物结合物中将药物部分连接至抗体(Carl et al(1981)J.Med.Chem.24:479-480；Chakravarty et al(1983)J.Med.Chem.26:638-644；US 6214345；US20030130189；US20030096743；US6759509；US20040052793；US6218519；US6835807；US6268488；US20040018194；WO98/13059；US20040052793；US6677435；US5621002；US20040121940；WO2004/032828)。除PAB之外，自分解的间隔子的其他实例包括但不限于：(i)电荷类似于PAB基团的芳香族化合物如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay et al.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)，噻唑(US7375078)，多、延伸的PAB单元(de Groot et al(2001)J.Org.Chem.66:8815-8830)；和邻-氨基苯缩醛或对氨基苯缩醛；和(ii)确认的苯乙烯基PAB类似物(US 7223837)。可以使用通过酰胺键水解经历环化的间隔子，如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues et al(1995)Chemistry Biology 2:223)、适当取代的双环[2.2.1]环体系和双环[2.2.2]环体系(Storm et al(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry,et al(1990)J.Org.Chem.55:5867)。消去在甘氨酸处取代的含胺药物(Kingsbury et al(1984)J.Med.Chem.27:1447)也是在ADC中有用的自分解间隔子的实例。
在一个实施方式中，缬氨酸-瓜氨酸二肽PAB类似物试剂具有2,6-二甲基苯基基团并且具有以下结构：
有用于本发明的抗体药物结合物的接头试剂包括但不限于：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，以及双-马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1,8-双-马来酰亚胺二甘醇(BM(PEO)2)和1,11-双-马来酰亚胺三甘醇(BM(PEO)3)，其由Pierce Biotechnology,Inc.、ThermoScientific、Rockford,IL和其他试剂供应商商业可获得。双-马来酰亚胺试剂允许以顺序或同时的方式将抗体的半胱氨酸的游离硫醇基团连接至含硫醇的药物部分、标记或接头中间体。除马来酰亚胺之外，与抗体、PBD药物部分或接头中间体的硫醇基团反应的其他官能团包括碘代乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
接头试剂的其他实施方式是：N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP，Carlsson et al(1978)Biochem.J.173:723-737)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯(如二甲基己二酰亚胺酯HCl)的双官能衍生物、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。通过其他商业来源，如MolecularBiosciences Inc.(Boulder,CO)也可以得到有用的接头试剂，或根据Toki et al(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO03/026577；WO 03/043583；和WO 04/032828中描述的步骤也可以合成有用的接头试剂。
接头可以是用于通过支化的、多官能的接头部分将多于一个药物部分共价连接至抗体的树枝状聚合物类型接头(US 2006/116422；US 2005/271615；de Groot et al(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494；Amir et al(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499；Shamis et al(2004)J.Am.Chem.Soc.126:1726-1731；Sun et al(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun et al(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry 11:1761-1768；King et al(2002)Tetrahedron Letters43:1987-1990)。树枝状聚合物接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即，载药量，其与ADC的效力相关。因此，当抗体仅带有一个反应性半胱氨酸硫醇基团时，大量药物部分可以通过树枝状聚合物或支链接头连接。
树枝状聚合物类型接头的一个示例性实施方式具有以下结构：
其中，星号表示连接至PBD部分的N10位置的点。
Rc，封端基团
本发明的第一方面的结合物在N10位置处可以具有封端基团RC。化合物E可以具有封端基团RC。
在一个实施方式中，当结合物是其中每个单体为式(A)的二聚体时，一个单体单元中的基团R10是封端基团RC或是基团R10。
在一个实施方式中，当结合物是其中每个单体为式(A)的二聚体时，一个单体单元中的基团R10是封端基团RC。
在一个实施方式中，当化合物E是其中每个单体为式(E)的二聚体时，一个单体单元中的基团RL是封端基团RC或是用于连接至抗体的接头。
在一个实施方式中，当结合物是其中每个单体为式(E)的二聚体时，一个单体单元中的基团RL是封端基团RC。
从PBD部分的N10位置可除去基团RC从而剩余N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺，其中，QR11是OSO3M、二硫化物加合物、硫代甲醇胺、取代的硫代甲醇胺或取代的甲醇胺。
在一个实施方式中，RC可以是可除去的保护基团从而剩余N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺，或二硫化物加合物，其中，QR11是OSO3M。在一个实施方式中，RC是可除去从而剩余N10-C11亚胺键的保护基团。
旨在在与用于除去基团R10所需条件相同的条件下例如产生N10-C11亚胺键、甲醇胺等的条件下，可除去基团Rc。封端基团起N10位置处的预期官能团的保护基团的作用。旨在封端基团不与抗体反应。例如，RC与RL不同。
在具有亚胺单体的二聚体的合成中，可以将具有封端基团的化合物用作中间体。可替代地，可以将具有封端基团的化合物用作结合物，其中，从靶向位置除去封端基团以产生亚胺、甲醇胺、取代的甲醇胺等。因此，在该实施方式中，封端基团可被称为治疗上可除去的氮保护基团，如在发明人的早期申请WO 00/12507中所限定的。
在一个实施方式中，在切割基团R10的接头RL的条件下，可除去基团RC。因此，在一个实施方式中，封端基团在酶作用下可切割。
在一个可替代的实施方式中，在将接头RL连接至抗体之前，可除去封端基团。在该实施方式中，在不切割接头RL的条件下可除去封端基团。
当化合物包含官能团G1形成与抗体的连接时，在添加或未掩蔽G1之前，可除去封端基团。
可以将封端基团用作保护基团策略的一部分以确保二聚体中的仅一个单体单元连接至抗体。
可以将封端基团用作N10-C11亚胺键的掩蔽物(mask)。可以在化合物中需要亚胺官能团的时间除去封端基团。封端基团也是以上所描述的甲醇胺、取代的甲醇胺和二硫化物加合物的掩蔽物。
RC可以是N10保护基团，如在发明人的早期申请WO 00/12507中描述的那些基团。在一个实施方式中，RC是治疗上可除去的氮保护基团，如在发明人的早期申请WO 00/12507中所限定的。
在一个实施方式中，RC是氨基甲酸酯保护基团。
在一个实施方式中，氨基甲酸酯保护基团选自：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz和PNZ。
可选地，氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在一个实施方式中，RC是缺少用于连接至抗体的官能团的接头基团RL。
本申请特别考虑了那些是氨基甲酸酯的RC基团。
在一个实施方式中，RC是以下基团：
其中，星号表示连接至N10位置的点，G2是封端基团，L3是共价键或可切割的接头L1，L2是共价键或与OC(＝O)一起形成自分解接头。
当L3和L2都是共价键时，G2和OC(＝O)一起形成以上限定的氨基甲酸酯基团。
如以上所限定的，L1与R10相关。
如以上所限定的，L2与R10相关。
在以下描述多种封端基团，包括基于熟知的保护基团的那些。
在一个实施方式中，L3是可切割的接头L1，并且L2与OC(＝O)一起形成自分解接头。在该实施方式中，G2是Ac(乙酰基)或Moc，或选自以下的氨基甲酸酯保护基团：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz和PNZ。
可选地，氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在另一个实施方式中，G2是酰基基团-C(＝O)G3，其中，G3选自烷基(包括环烷基、烯基和炔基)、杂烷基、杂环基和芳基(包括杂芳基和碳芳基(carboaryl))。这些基团可以是可选取代的。合适时，芳基基团与L3或L2的氨基基团一起可以形成酰胺键。合适时，芳基基团与L3或L2的羟基基团一起可以形成酯键。
在一个实施方式中，G3是杂烷基。杂烷基基团可以包括聚乙二醇。杂烷基基团可以具有临近芳基基团的杂原子，如O或N，从而在合适时，与存在于基团L3或L2中的杂原子形成氨基甲酸酯或碳酸酯基团。
在一个实施方式中，G3选自NH2、NHR和NRR’。优选地，G3是NRR’。
在一个实施方式中，G2是以下基团：
其中，星号表示连接至L3的点，n是0至6，并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2和卤素。基团OH、SH、NH2和NHR是受保护的。在一个实施方式中，n是1至6，并且优选地n是5。在一个实施方式中，G4是OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’和NRR’。在一个实施方式中，G4是OR、SR和NRR’。优选地，G4选自OR和NRR’，最优选地，G4是OR。最优选地，G4是OMe。
在一个实施方式中，基团G2是：
其中，星号表示连接至L3的点，并且n和G4如以上所限定。
在一个实施方式中，基团G2是：
其中，星号表示连接至L3的点，n是0或1，m是0至50，并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2和卤素。在一个优选的实施方式中，n是1并且m是0至10、1至2、优选地4至8以及最优选地4或8。在另一个实施方式中，n是1并且m是10至50，优选地是20至40。基团OH、SH、NH2和NHR是受保护的。在一个实施方式中，G4是OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’和NRR’。在一个实施方式中，G4是OR、SR和NRR’。优选地，G4选自OR和NRR’，最优选地，G4是OR。优选地，G4是OMe。
在一个实施方式中，基团G2是：
其中，星号表示连接至L3的点，以及n、m和G4如以上所限定的。
在一个实施方式中，基团G2是：
其中，n是1-20，m是0-6，并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2和卤素。在一个实施方式中，n是1-10。在另一个实施方式中，n是10至50，优选地是20至40。在一个实施方式中，n是1。在一个实施方式中，m是1。基团OH、SH、NH2和NHR是受保护的。在一个实施方式中，G4是OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’和NRR’。在一个实施方式中，G4是OR、SR和NRR’。优选地，G4选自OR和NRR’，最优选地，G4是OR。优选地，G4是OMe。
在一个实施方式中，基团G2是：
其中，星号表示连接至L3的点，以及n、m和G4如以上所限定的。
在以上实施方式的每个中，G4可以是OH、SH、NH2和NHR。这些基团优选地是受保护的。
在一个实施方式中，用Bzl、TBDMS或TBDPS保护OH。
在一个实施方式中，用Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me或Trt保护SH。
在一个实施方式中，用Boc、Moc、Z-Cl、Fmoc、Z或Alloc保护NH2或NHR。
在一个实施方式中，基团G2与基团L3组合存在，该基团L3是二肽。
封端基团旨在不用于连接至抗体。因此，存在于二聚体中的其他单体用作经由接头连接至抗体的点。因此，优选的是存在于封端基团中的官能团不可用于与抗体反应。因此，优选地避免反应性官能团，如OH、SH、NH2、COOH。然而，如果受保护，如以上所描述的，这种官能团可以存在于封端基团中。
实施方式
本发明的实施方式包括ConjA，其中，抗体如以上所限定的。
本发明的实施方式包括ConjB，其中，抗体如以上所限定的。
本发明的实施方式包括ConjC，其中，抗体如以上所限定的。
本发明的实施方式包括ConjD，其中，抗体如以上所限定的。
本发明的实施方式包括ConjE，其中，抗体如以上所限定的。
如上所述，本发明的一些实施方式不包括ConjA、ConjB、ConjC、ConjD和ConjE。
载药量
载药量是每抗体(例如，抗体)PBD药物的平均数目。当本发明的化合物键连至半胱氨酸时，载药量可以在每抗体1至8个药物(DL)的范围内，即，其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接至抗体。结合物的组合物包括结合有1至8个范围内药物的抗体的集合。当本发明的化合物键连至赖氨酸时，载药量可以在每抗体1至80个药物(DL)的范围内，尽管40、20、10或8个的上限可能是优选的。结合物的组合物包括结合有1至80、1至40、1至20、1至10或1至8个范围内药物的抗体的集合。
在来自结合反应的ADC制备品中，每抗体药物的平均数目可以由常规方式，如UV、反向HPLC、HIC、质谱、ELISA测定和电泳表征。也可以确定用p表示的ADC的定量分布。通过ELISA，可以确定在特定的ADC的制备品中p的平均值(Hamblett et al(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Sanderson et al(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，通过抗体-抗原结合和ELISA的检测限，p(药物)值的分布是不可识别的。另外，用于检测抗体-药物结合物的ELISA测定不能确定药物部分在什么位置连接至抗体，如重链或轻链片段或特定的氨基酸残基。在某些情况下，可以通过如反相HPLC或电泳的方式来实现均相ADC(其中p是特定的值)与具有其他载药量的ADC的分离、纯化和表征。这种技术也适用于其他类型的结合物。
对于某些抗体-药物结合物，p可以由抗体上连接位点的数目限制。例如，抗体可以具有仅一个或具有多个半胱氨酸硫醇基团，或可以具有仅一个或具有多个充分反应性的硫醇基团，通过该硫醇基团可以连接接头。较高的载药量，例如p>5，可以引起某些抗体-药物结合物的聚集、不溶、毒性或细胞通透性丧失。
通常，将少于理论最大量的药物部分通过结合反应结合至抗体。例如，抗体可以包含许多不与药物-接头中间体(D-L)或接头试剂反应的赖氨酸残基。仅最具反应性的赖氨酸基团可以与胺反应性接头试剂反应。另外，仅最具反应性的半胱氨酸基团可以与硫醇反应性接头试剂反应。通常，抗体不包含许多(如果有的话)游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团，其可以连接至药物部分。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在，并且必须在部分或全部还原条件下用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP将其还原。可以以多种方式控制ADC的载药量(药物/抗体比)，包括：(i)限制药物-接头中间体(D-L)或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制结合反应时间或温度，以及(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件。
某些抗体具有可还原的链内二硫化物，即，半胱氨酸桥。对于与接头试剂的结合，通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理可以使抗体变得具有反应性。因此，理论上每个半胱氨酸桥将形成两个反应性硫醇亲核体。通过得到胺成为硫醇的转化的赖氨酸与2-亚氨基噻吩(Traut’s试剂)的反应，可以将另外的亲核基团引入至抗体中。通过设计1、2、3、4或更多半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸残基的突变抗体)可以将硫醇基团引入至抗体(或它们的片段)。US 7521541教导通过引入反应性半胱氨酸氨基酸设计抗体。
可以在抗体中的反应位点处设计半胱氨酸残基并且其不形成链内或分子内二硫键(Junutula,et al.,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan et al(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249)。设计的半胱氨酸硫醇可以与具有硫醇反应性、亲电基团(如马来酰亚胺或α-卤代酰胺)的接头试剂或本发明的药物-接头试剂反应以形成具有设计的半胱氨酸的抗体和PBD药物部分的ADC。因此，可以设计、控制以及已知药物部分的位置。由于设计的半胱氨酸硫醇基团通常以高产率与硫醇反应性接头试剂或药物-接头试剂反应，所有可以控制载药量。通过在重链或轻链的单一位点置换来设计IgG抗体以引入半胱氨酸氨基酸在对称抗体上产生两个新的半胱氨酸。通过结合产物ADC的接近同质性，可以实现接近2的载药量。
可替代地，如Axup et al.((2012),Proc Natl Acad Sci U S A.109(40):16101-16116)所描述的，通过将抗体设计为在它们的重链和/或轻链包含非天然氨基酸，可以实现位点特异性结合。非天然氨基酸提供了另外的优势，即可以设计正交化学来连接接头试剂和药物。
当抗体的多于一个亲核或亲电基团与药物-接头中间体或药物部分试剂之前的接头试剂反应时，那么得到的产物是具有连接至抗体的药物部分(例如，1、2、3个等)的分布的ADC化合物的混合物。液相色谱法，如聚合物反相(PLRP)和疏水相互作用可以通过载药量值分离混合物中的化合物。可以分离具有单一载药量值(p)的ADC的制备品，然而，这些单一载药量值ADC仍然可以是多种的混合物，因为药物部分可以经由接头连接在抗体的不同位点上。
因此，本发明的抗体-药物结合组合物包括抗体-药物结合化合物的混合物，其中，抗体具有一个或多个PBD药物部分，并且其中，药物部分可以在不同氨基酸残基处连接至抗体。
在一个实施方式中，每抗体的二聚体吡咯并苯并二氮杂基团的平均数目在1至20的范围内。在一些实施方式中，范围选自1至8、2至8、2至6、2至4和4至8。
在一些实施方式中，每抗体中存在一个二聚体吡咯并苯并二氮杂。
包括其他形式
除非另有规定，在上文中包括这些取代基的众所周知的离子、盐、溶剂化物和保护形式。例如，提及羧酸(-COOH)还包括其阴离子(羧酸根)形式(-COO-)、盐或溶剂化物，以及常规保护形式。类似地，提及氨基包括氨基的质子化形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂化物，例如，盐酸盐，以及氨基的常规保护形式。类似地，提及羟基还包括其阴离子形式(-O-)、盐或溶剂化物，以及常规保护形式。
盐
可以方便的或所期望的是，制备、纯化和/或处理活性化合物的相应盐，例如，药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例讨论于Berge,et al.,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)。
例如，如果化合物是阴离子化合物，或具有其可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，那么可以与合适的阳离子形成盐。适合的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子如Na+和K+，碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+，以及其他阳离子如Al+3。适合的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些适合的取代的铵离子的实例是那些取代的铵离子，其源自：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇(tromethamine)，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的实例是N(CH3)4 +。
如果化合物是阳离子化合物，或具有其可以是阳离子的官能团(例如-NH2可以是-NH3 +)，那么可以与合适的阴离子形成盐。适合的无机阴离子的实例包括但不限于源自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
适合的有机阴离子的实例包括但不限于源自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙烷二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸和戊酸。适合的高分子有机阴离子的实例包括但不限于那些高分子有机阴离子，其源自以下聚合酸：丹宁酸、羧甲基纤维素。
溶剂化物
可以方便的或所期望地制备、纯化和/或处理活性化合物的相应溶剂化物。术语“溶剂化物”在本文中以常规含义来使用，用来指溶质(例如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂是水，溶剂化物可以方便地称作水合物，例如，一水合物、二水合物、三水合物等。
本发明包括其中横过(across)PBD部分的亚胺键添加溶剂的化合物，其示出下文，其中溶剂是水或醇(RAOH，其中RA是C1-4烷基)：
这些形式可以被称为PBD的甲醇胺和甲醇胺醚形式(如在以上关于R10的部分中所描述的)。这些等式的平衡取决于发现化合物的条件以及部分本身的特性。
例如，可以通过冷冻干燥以固体形式来分离这些特定化合物。
异构体
本发明的某些化合物可以以一种或多种特定的几何形式、光学形式、对映体形式、非对映体形式、差向异构体形式、异位异构体(atropic)形式、立体异构体形式、互变异构体形式、构象形式或异头异构体(anomeric)形式，包括但不限于顺式和反式；E型和Z型；c式、t式和r式；内形式和外形式；R型、S型和内消旋型；D型和L型；d型和l型；(+)和(-)形式；酮式、烯醇式和烯醇化物形式；顺式和反式；向斜形式和背斜形式；α形式和β形式；轴向形式和平伏形式；船式、椅式、扭式、信封式和半椅式；并且它们的组合，在下文中统称为“异构体”(或“异构体形式”)。
术语“手性”是指具有镜像伴侣的非重叠(不可重叠，non-superimposability)性质的分子，而术语“非手性”是指在它们的镜像伴侣上是重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学构成、但是在空间上原子或基团排布不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或多个手性中心、并且其分子相互不是另一个的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如，熔点、沸点、光谱性质和反应性。可以在高的再溶解分析步骤下如电泳和色谱分离非对映异构体的混合物。
“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，其是彼此的非重叠镜像。
本文使用的立体化学限定和规定通常遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；andEliel,E.and Wilen,S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”,John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。本发明的化合物可以包含不对称或手性中心，因此以不同的立体异构体形式存在。旨在本发明的化合物的所有立体异构体形式包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体(atropisomer)以及它们的混合物(如外消旋混合物)，形成本发明的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即，它们具有使平面偏振光的平面旋转的能力。在描述光学活性化合物中，前缀D和L或R和S用于表示分子关于它的手性中心的绝对构型。使用前缀d和l或(+)和(-)来指定化学物的平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l是指化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体除了它们是彼此的镜像外是相同的。特定的立体异构体可以由称为对映异构体，并且经常将这种异构体的混合物称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，这在不具有立体选择性或立体特异性的化学反应或过程中可以发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种没有光学活性的对映异构体物质的等摩尔混合物。
要注意的是，除非如下文针对互变异构体形式所讨论的，从术语“异构体”(如在本文中所使用的)明确排除结构(或构造)异构体(即，其差异在于在原子之间的连接而不仅在于原子在空间中的位置的异构体)。例如，提及甲氧基(-OCH3)并不被解释为提及它的结构异构体(羟甲基，-CH2OH)。类似地，提及邻氯苯基并不被解释为提及它的结构异构体(间氯苯基)。然而，提及一类结构可以包括落在上述类型的范围之内的结构异构体形式(例如C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基和对甲氧基苯基)。
上述排除并不涉及互变异构体形式，如在，例如，以下互变异构体对中：酮/烯醇(如下图所示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮和硝基/异硝基中的例如，酮式、烯醇式和烯醇化物形式。
术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指不同能量的结构异构体，其通过低能量势垒是可互变的。例如，质子互变异构体(也称为质子性互变异构体)包括通过质子的迁移的互变现象，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变异构体包括通过一些成键电子的重组(reorganization)的互变现象。
要注意的是，术语“异构体”特别包括具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D)和3H(T)；C可以是任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以是任何同位素形式，包括16O和18O；等等。
可以结合至本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如但不限于2H(氘，D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl和125I。本发明的各种同位素标记的化合物，例如放射性同位素如3H、13C、14C并入到这些化合物中。这样的同位素标记的化合物可以用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术，如正电子断层扫描成像(PET)或单光子发射计算机断层成像术(SPECT)，包括药物或底物组织分布分析，或在患者的放射性治疗中。本发明的氘标记的或取代的治疗性化合物可以具有改善的DMPK(药物代谢及药物动力学)性质，涉及分布、代谢以及排泄(ADME)。用较重的同位素(如氘)取代可以提供因更高的代谢稳定性而产生的某种治疗优点，例如，体内半衰期增加或所需的剂量减少。18F标记的化合物对PET或SPECT研究是有用的。本发明的同位素标记的化合物通常能够通过以下制备：实施在如下所述的反应方案或实施例以及制备例中披露的步骤(程序)，用容易获得的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。另外，用较重的同位素，尤其是氘(即，2H或D)替代，可以提供因更高的代谢稳定性而产生的某种治疗优点，例如，体内半衰期增加或所需的剂量减少或治疗指数增加。应当理解的是将上下文中的氘视作取代基。这种较重同位素(尤其是氘)的浓度可以通过同位素富集因子来限定。在本发明的化合物中，任何没有明确指明为具体同位素的原子是指该原子的任何稳定的同位素。
除非另外说明，否则提到的具体化合物包括全部这些异构体形式，包括其(全部或部分地)外消旋和其他混合物。用于这种异构体形式的制备(例如，不对称合成)和分离(例如，分步结晶和色谱法)的方法是本领域已知的，或者通过已知的方式调整本文所教导的方法或已知的方法是容易得到的。
生物活性
体外细胞增殖测定
通常，通过以下测量抗体-药物结合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制活性：将具有受体蛋白质的哺乳细胞暴露于细胞培养基中ADC的抗体；培养细胞一段约6小时至约5天的时间段；以及测量细胞生存能力。基于细胞的体外测定用于测量本发明的ADC的生存能力(增殖)、细胞毒性和细胞死亡的诱导(半胱天冬酶激活)。
可以通过细胞增殖测定测量抗体-药物结合物的体外效力。Luminescent细胞生存能力测定仪是商业可获得的(Promega Corp.,Madison,WI)，基于Coleoptera luciferase的重组表达的同质测定方法(US专利号5583024；5674713和5700670)。该细胞增殖测定基于存在ATP的定量确定培养基中生存细胞的数目，该ATP是代谢活性细胞的指示(Crouch et al(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6602677)。在96孔板中进行测定，使它可经受高通过量筛选(HTS)的检验(Cree et al(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404)。同种测定步骤涉及直接添加单一试剂(试剂)至培养在补充血清的培养基的细胞。细胞洗涤、除去培养基和多次移液步骤是不需要的。添加试剂和混合之后，在10分钟内体系检测到384孔板中低至15细胞/孔。可以用ADC连续处理细胞，或可以处理细胞并将其与ADC分离。通常，简单处理(即，3小时)的细胞示出与连续处理的细胞的相同效力。
同质的“添加-混合-测量”模式导致胞溶作用和与存在ATP的量成比例的发光(luminescent)信号的产生。ATP的量与存在于培养基中的细胞的数目直接成比例。测定产生由荧光素酶反应产生的“生长型”发光信号，取决于使用的细胞类型和培养基，其具有通常大于5小时的半衰期。生存细胞反应在相对发光单元(RLU)上。通过重组萤火虫荧光素酶与ATP至AMP的伴随转化和光子的产生，底物Beetle Luciferin(甲虫荧光素)被氧化脱羧基。
也可以通过细胞毒性测定测量抗体-药物结合物的体外效力。用PBS洗涤、用胰蛋白酶分离培养的粘附细胞，将其稀释在包含10％FCS的完全培养基中，离心、再悬浮于新鲜培养基中，并用血细胞计数器(haemocytometer)计数。直接计数悬浮培养物。适用于计数的单分散细胞悬浮物可能需要通过重复送气以打散细胞团来搅动悬浮物。
将细胞悬浮物稀释至期望的接种密度并将其分散至黑色的96孔板中(100μl/孔)。孵育粘附细胞系的板过夜以允许粘附。可以在接种当天使用培养的悬浮细胞。
在适当的细胞培养基中制备ADC(20μg/ml)的储备液(1ml)。通过顺序地将100μl转移至900μl的细胞培养基，在15ml离心管中制备储备ADC的一系列10倍稀释液。
在用细胞悬浮液(100μl)铺板之前，将每个ADC稀释液(100μl)的四个重复孔分散在96孔黑板中，得到最终体积200μl。对照孔接收细胞培养基(100μl)。
如果细胞系的倍增时间大于30小时，那么ADC孵育5天，否则在四天内完成孵育。
在孵育时间段最后，用阿尔玛(Alamar)蓝测定评估细胞生存能力。将阿尔玛蓝(Invitrogen)分散在整个板上(20μl/孔)并且孵育4小时。在Varioskan快速读板器上以570nm激发、585nm发射测量阿尔玛蓝荧光。与对照孔中的平均荧光相比，由ADC处理的孔中的平均荧光计算百分比细胞存活率。
用途
本发明的结合物可被用于在靶向位置提供PBD化合物。
靶向位置优选地是增殖的细胞群体。抗体是用于存在于增殖细胞群体上的抗原的抗体。
在一个实施方式中，与存在于增殖细胞群体(例如，肿瘤细胞群体)中的抗原的量相比，抗原不存在或以降低水平存在于非增殖细胞群体中。
在靶向位置，接头可以切割，从而释放化合物RelA、RelB、RelC、RelD或RelE。因此，可以将结合物用于将化合物RelA、RelB、RelC、RelD或RelE选择性提供至靶向位置。
接头可以由存在于靶向位置的酶切割。
靶向位置可以是体外、体内或离体。
本发明的抗体-药物结合物(ADC)化合物包括具有用于抗癌活性效用的那些。具体地，化合物包括结合的，即，通过接头共价连接至PBD药物部分(即，毒素)的抗体。当药物没有结合至抗体时，PBD药物具有细胞毒性作用。因此，通过与抗体的结合调节PBD药物部分的生物活性。本发明的抗体-药物结合物(ADC)将有效剂量的细胞毒性试剂选择性递送至肿瘤组织，从而可以实现较高的选择性，即，较少的有效剂量。
因此，一方面，本发明提供本文所描述的用于在治疗中使用的结合物化合物。
在进一步的方面，还提供本文所描述的用于在增生性疾病的治疗中使用的结合物化合物。本发明的第二方面提供结合物化合物在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。
本领域普通技术人员能够容易地确定候选结合物是否治疗任何特定细胞类型的增生性病症。例如，在以下的实例中描述了这样的测定法，它们可以方便地用于评估由特定化合物所提供的活性。
术语“增生性疾病”涉及不希望的过度或异常细胞的不需要的或不受控制的细胞增生，如，新生性或增生性生长(不管是体外或体内)。
增生性病症的实例包括但不限于良性、恶化前和恶性细胞增生，包括但不限于新生物和肿瘤(例如，组织细胞瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤)、淋巴瘤、白血病、牛皮癣、骨病、纤维增生性疾病(例如结缔组织的纤维增生性疾病)和动脉粥样硬化。特别感兴趣的癌症包括但不限于白血病和卵巢癌。
可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于肺、胃肠道(包括，例如，肠、结肠)、乳(乳房)、卵巢、前列腺、肝脏(肝)、肾脏(肾)、膀胱、胰腺、脑和皮肤。
特别感兴趣的紊乱包括但不限于非霍奇金淋巴瘤包括弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、慢性淋巴淋巴瘤(CLL)和白血病如毛细胞白血病(HCL)、毛细胞白血病变异型(HCL-v)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。
预期本发明的抗体-药物结合物(ADC)可被用于治疗多种疾病或紊乱，例如，由肿瘤抗原的过表达表征。示例性病症或过度增生性紊乱包括良性或恶性肿瘤；白血病、血液和淋巴系统恶性肿瘤。其他包括以下的紊乱：神经元的、神经胶质细胞的、星形细胞的、下丘脑的、腺体的、巨噬细胞的、上皮的、基质的、囊胚腔的、炎症性的、血管产生的和免疫学的，包括自身免疫性紊乱。
通常，待治疗的疾病或紊乱是过度增生性疾病，如癌症。本文中待治疗的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更具体地实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、肺的鳞状细胞癌和肺的腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
在治疗中可以使用ADC的自身免疫疾病包括风湿性疾病(如例如，类风湿关节炎、干燥综合征、硬皮病、狼疮如SLE和狼疮性肾炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)，骨关节炎、自身免疫性胃肠和肝紊乱(如例如，炎症性肠疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻、血管炎(如例如，ANCA相关的血管炎，包括丘-施血管炎、韦格纳肉芽肿病和多动脉炎)、自身免疫性神经紊乱(如，例如，多发性硬化、斜视眼肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和自身免疫性多发性神经病变)、肾脏疾病(如例如，肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征和贝格尔氏病)、自身免疫性皮肤病紊乱(如例如，牛皮癣、荨麻疹、麻疹、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液学紊乱(如例如，血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听觉紊乱(如例如，内耳病和听力损失)、贝切特氏病、雷诺氏综合征、器官移植和自身免疫性内分泌紊乱(如例如，糖尿病相关自身免疫病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病和自身免疫性甲状腺病(例如，格雷夫斯病和甲状腺炎))。更优选的这种疾病包括，例如，风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关的血管炎、狼疮、多发性硬化症、干燥综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
治疗方法
本发明的结合物可以在治疗方法中使用。还提供的是一种治疗的方法，包括向需要的受试者给予治疗有效量的本发明的结合物化合物。术语“治疗有效量”是足以显示对患者有益处的量。上述益处可以是至少改善一种症状。给予的实际量以及给予的速率和时间进程将取决于待治疗的性质和严重性。治疗处方，例如剂量决定，是在全科医师和其他医生的责任范围内。
可以单独给予或与其他治疗组合给予本发明的化合物，同时给予还是顺序给予取决于待治疗的病症。治疗和疗法的实例包括但不限于化学疗法(给予活性剂，包括例如药物，如化疗)；手术；和放射疗法。
不考虑作用机制，“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的类别包括但不限于烷化试剂、抗代谢物、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括在“靶向疗法”和常规化疗中使用的化合物。
化疗剂的实例包括：厄洛替尼(Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS No.51-21-8)、吉西他滨(Lilly)、PD-0325901(CAS No.391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺-二胺，二氯铂(II)，CAS No.15663-27-1)、卡铂(CAS No.41575-94-4)、紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠单抗(Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS No.85622-93-1，Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺、)和多柔比星Akti-1/2、HPPD和雷帕霉素。
化疗剂的更多实例包括：奥沙利铂(Sanofi)、硼替佐米(Millennium Pharm.)、索坦(SU11248,Pfizer)、来曲唑(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma，AstraZeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(AstraZeneca)、亚叶酸钙(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，Wyeth)、拉帕替尼(GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(AstraZeneca)、伊立替康(CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含聚氧乙烯蓖麻油)、紫杉醇的白蛋白纳米设计制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg,Il)、凡德他尼(rINN，ZD6474，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU5271；Sugen)、西罗莫司(Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、莰佛(Telik)、塞替派和环磷酰胺烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺(甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；内酯(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成的类拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的]阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和的隐藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin(软珊瑚醇)；水鬼蕉碱；sarcodictyin(匍枝珊瑚醇)；spongistatin；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素如烯二炔抗生素(例如卡里奇霉素、卡里奇霉素γ1I、卡里奇霉素ΩI1(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素(dynemicin)、达内霉素A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素，放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、奈莫柔比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(Demecolcine)；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登醇(maytansinoid)如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；硝嗪(根瘤菌剂(nitraerine))；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼；甲基苄肼；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；卡培他滨(Roche)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DFMO)；类视黄醇类(类维生素A)如视黄酸；以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
还包括在“化疗剂”的限定中的是：(i)作用为调节或抑制肿瘤上的激素作用的抗激素试剂如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如包括它莫西芬(包括柠檬酸它莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和(柠檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节产生于肾上腺的雌激素如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法倔唑、(伏氯唑)、(来曲唑；Novartis)和(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白质激酶抑制剂如MEK抑制剂(WO 2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中受影响的信号通路的基因例如PKC-α、Raf和H-Ras表达的那些，如奥利默森(oblimersen)(Genta Inc.)；(vii)核糖酶如VEGF表达抑制剂(例如，)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗如基因疗法疫苗，例如和rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂如rmRH；(ix)抗血管产生剂如贝伐珠单抗(Genentech)和以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
还包括在“化疗剂”限定中的是治疗性抗体如阿仑单抗(Campath)、贝伐珠单抗(Genentech)；西妥昔单抗(Imclone)；帕尼单抗(Amgen)、利妥昔单抗(Genentech/Biogen Idec)、奥法木单抗(GSK)、帕妥珠单抗(PERJETATM，OMNITARGTM，2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(Genentech)、托西莫单抗(Bexxar，Corixia)和抗体药物结合物、吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)(Wyeth)。
具有与本发明的结合物组合作为化疗剂的治疗潜力的人源化单克隆抗体包括：阿仑单抗、阿泊珠单抗、阿塞珠单抗、atlizumab、巴品珠单抗(bapineuzumab)、贝伐珠单抗、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达利珠单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、非维珠单抗、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、吉妥珠单抗、英妥珠单抗(Inotuzumab Ozogamicin)、伊匹单抗、拉贝珠单抗、林妥珠单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、莫维珠单抗、motovizumab、那他珠单抗、尼妥珠单抗、nolovizumab、numavizumab、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕考珠单抗、pecfusituzumab、pectuzumab、帕妥珠单抗、培克珠单抗、ralivizumab、雷珠单抗、reslivizumab、瑞利珠单抗、resyvizumab、rovelizumab、鲁利单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗(Siplizumab)、索土珠单抗、他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗、特非珠单抗、塔西单抗、托利珠单抗(toralizumab)、曲妥单抗、tucotuzumabcelmoleukin、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗和维西珠单抗(visilizumab)。
按照本发明的和按照本发明使用的药物组合物，除活性成分(即，结合物化合物)以外，还可以包含药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。这样的物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的效力。载体或其他物质的确切性质将取决于给予途径，该给予途径可以是口服或通过注射(例如皮肤、皮下或静脉内)。
用于口服给予的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、散剂或液体形式。片剂可以包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油(petroleum)、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊剂可以包含固体载体如明胶。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在痛苦部位处的注射，活性组分将具有胃肠道外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并具有适合的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员能够使用例如，等渗载体如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来很好地制备适合的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
制剂
尽管可以单独使用(例如，给予)结合物化合物时，往往优选的是使其作为组合物或制剂存在。
在一个实施方式中，组合物是包含本文所描述的结合物化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物(例如，制剂、配制品、药品)。
在一个实施方式中，组合物是包含至少一种本文所描述的结合物化合物与一种或多种本领域技术人员熟知的药学上可接受的成分的药物组合物，该成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填料、缓冲液、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如，润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
在一个实施方式中，组合物进一步包含其他活性剂，例如，其他治疗剂或预防剂。
可以在标准药品文本中找到合适的载体、稀释剂、赋形剂等。参见，例如，Handbook of Pharmaceutical Additives,2nd Edition(eds.M.Ash and I.Ash),2001(SynapseInformation Resources,Inc.,Endicott,New York,USA),Remington's Pharmaceutical Sciences,20th edition,pub.Lippincott,Williams &Wilkins,2000；和Handbook of Pharmaceutical Excipients,2nd edition,1994。
本发明的另一方面涉及制备药物组合物的方法，包括将本文限定的至少一种[11C]-放射性同位素标记的结合物或结合类化合物与一种或多种本领域技术人员熟知的其他药学上可接受的成分混合在一起，例如，载体、稀释剂、赋形剂等。如果配制为离散单元(例如，片剂等)，那么每个单元包含预定量(剂量)的活性化合物。
本文所用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其在合理的医学判断范围内、适用于与所讨论的受试者(例如，人类)的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，并与合理的利益/风险比相称。每种载体、稀释剂、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
可通过药学领域熟知的任何方法来制备制剂。这样的方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般而言，制剂通过使活性化合物与载体(例如，液体载体、精细固体载体等)均匀和紧密地结合，然后如必要的话使产品成形来制备。
可以将制剂制备为快速或慢速释放；立即、延迟、即时或缓慢释放；或它们的组合。
适于胃肠外给予(例如，通过注射)的制剂包括水性或非水性的、等渗的、无热原的、无菌液体(例如溶液，悬浮液)，其中活性成分被溶解、悬浮或以其他方式提供(例如，在脂质体或其他微粒中)。这种液体可以另外含有其他药学上可接受的成分如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、助悬剂、增稠剂以及使制剂与预期受体的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括，例如，水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于此类制剂的合适等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏液(Ringer's Solution)或乳酸林格氏注射液。通常，液体中活性成分的浓度是约1ng/ml至约10μg/mL，例如约10ng/mL至约1μg/mL。该制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器，例如安瓿和小药瓶中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下储藏，仅需在临用前加入无菌液体载体例如注射用水。可以由无菌粉末、颗粒和片剂当场制备注射溶液和悬浮液。
剂量
本领域技术人员应当理解的是，结合物化合物和包含该结合物化合物的组合物的适当剂量可因患者而异。确定最佳剂量一般将牵涉使治疗益处的水平与任何风险或有害副作用平衡。选择的剂量水平将取决于多个因素，包括但不限于特定化合物的活性、给予途径、给予时间、化合物的排泄时间、治疗的持续时间、其他药物、化合物和/或组合使用的物质、病况的严重性和物种、性别、年龄、体重、病况、总体健康状况和患者的病史。化合物的量和给予途径最终将由医师、兽医或临床医师慎重决定，但是一般而言，将选择剂量以在作用部位达到实现所期望的作用而不会造成实质性损害或有害副作用的局部浓度。
在整个治疗过程中，可以单剂量、连续或间歇地(例如，以适当时间间隔分剂量)实现给予。确定最有效的给予手段和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并且将随用于疗法的制剂、疗法目的、所治疗的(多种)靶细胞和所治疗的受试者的不同而改变。可以用治疗医师、兽医或临床医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次给予。
一般而言，活性化合物的合适剂量是在约100μg至约25mg(更通常地约1μg至约10mg)/千克受试者体重/天的范围内。在该化合物是盐、酯、酰胺、前药等的情况下，基于母体化合物计算给予量，所以所用的实际重量成比例增加。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将活性化合物给予至人类患者：约100mg，每天3次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将活性化合物给予至人类患者：约150mg，每天2次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将活性化合物给予至人类患者：约200mg，每天2次。
然而，在一个实施方式中，根据以下剂量方案将结合物化合物给予至人类患者：约50或约75mg，每天3或4次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将结合物化合物给予至人类患者：约100或约125mg，每天2次。
以上描述的剂量可以适用于结合物(包含PBD部分和至抗体的接头)或适用于提供的PBD化合物的有效量，例如，接头切割后释放的化合物的量。
对于预防或治疗疾病，本发明的ADC的适当剂量将取决于待治疗的以上限定的疾病类型、疾病的严重度和情况(无论给予分子是用于预防还是治疗目的)、先前治疗、患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。一次或通过一系列治疗将分子合适地给予至患者。取决于疾病的类型和严重程度，无论，例如通过一次或多次单独给予或通过连续输注，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)的分子是用于给予至患者的初始候选剂量。通常的每日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，这取决于上述的因素。给予至患者的ADC的示例性剂量在约0.1至约10mg/kg患者重量的范围内。对于几天或更长的重复给予，取决于病症，治疗持续到实现疾病症状的期望抑制。示例性剂量方案包括给予约4mg/kg初始载药量的情况，随后每周、每两周或每三周添加另外剂量的ADC。其他剂量方案可以是有用的。该疗法的进展易于通过常规技术和测定法监测。
治疗
在治疗病症的情况下本文所使用的术语“治疗”通常涉及无论人类或动物(例如，兽医应用)的治疗和疗法，其中，其中实现了一些期望的疗效，例如，对病症发展的抑制，并且包括发展速度降低、发展速度减半、病症恢复、病症改善和病症康复。还包括作为预防性措施(即，预防、防止)的治疗。
本文所使用的术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂型的量，当根据期望的治疗方案给予时，其对于产生一些期望的疗效是有效的、与合理的利益/风险比相当。
类似地，本文所使用的术语“预防有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂型的量，当根据期望的治疗方案给予时，其对于产生一些期望的预防效果是有效的、与合理的利益/风险比相当。
药物结合物的制备
可以通过本领域技术人员已知的多种途径，使用有机化学反应、条件和试剂，包括抗体的亲核基团与药物-接头试剂的反应，制备抗体药物结合物。可以使用该方法来制备本发明的抗体-药物结合物。
抗体上的亲核基团包括但不限于侧链硫醇基团，例如，半胱氨酸。硫醇基团是亲核的并且能够与接头部分上的亲电基团(如本发明的那些)反应形成共价键。某些抗体具有可还原的链内二硫化物，即，半胱氨酸桥。通过用还原剂如DTT(克莱兰氏试剂(Cleland's)，二硫代苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)磷化氢盐酸化物；Getz et al(1999)Anal.Biochem.Vol273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)处理可以使抗体与接头试剂的结合变得易反应。因此，每理论上个半胱氨酸二硫桥将形成两个反应性硫醇亲核体。通过产生胺至硫醇的转化的赖氨酸与2-亚氨基噻吩(特劳特氏(Traut’s)试剂)的反应，可以将其他亲核基团引入至抗体中。
受试者/患者
受试者/患者可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋动物(例如，袋鼠、袋熊)、单孔目动物(例如，鸭嘴兽)、啮齿动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如，小鼠)、兔类动物(例如，家兔)、鸟类(例如，鸟)、犬科动物(例如，家犬)、猫科动物(例如，家猫)、马科动物(例如，马)、猪科动物(例如，家猪)、绵羊类(例如，绵羊)、牛科动物(例如，奶牛)、灵长类动物、猿类(例如，猴子或类人猿)、猴(例如，狨猴、狒狒)、类人猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
此外，受试者/患者可是其发育的任何形式，例如胎儿。在一个优选实施方式中，受试者/患者是人类。
进一步的优选项
以下优选可以适用于以上描述的发明的所有方面或可涉及单一方面。该优选可以以任何组合组合在一起。
在一些实施方式中，R6’、R7’、R9’和Y’优选地分别与R6、R7、R9和Y相同。
二聚体连接
Y和Y’优选是O。
R”优选是没有取代基的C3-7亚烷基。更优选地，R”是C3、C5或C7亚烷基。最优选地，R”是C3或C5亚烷基。
R6至R9
R9优选是H。
R6优选选自H、OH、OR、SH、NH2、硝基和卤素，并且更优选H或卤素，并且最优选地是H。
R7优选选自H、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’和卤素，并且更优选地独立选自H、OH和OR，其中R优选选自可选取代的C1-7烷基、C3-10杂环基和C5-10芳基。R可以更优选地是可以或不可以被取代的C1-4烷基。感兴趣的取代基是C5-6芳基(例如苯基)。在7位置处的特别优选的取代基是OMe和OCH2Ph。特别令人感兴趣的其他取代基是二甲基氨基(即–NMe2)；-(OC2H4)qOMe，其中q是0至2；含氮C6杂环基，包括吗啉代、哌啶基和N-甲基-哌嗪基。
这些优选项分别适用于R9’、R6’和R7’。
R12
当C2’和C3’之间存在双键时，R12选自：
(a)C5-10芳基，可选地由选自包括以下的组的一个或多个取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、C1-7烷基、C3-7杂环基和双-氧基-C1-3亚烷基；
(b)C1-5饱和脂族烷基；
(c)C3-6饱和环烷基；
(d)其中R21、R22和R23各自独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中在R12基团中碳原子的总数不大于5；
(e)其中R25a和R25b中的一个是H而另一个选自：苯基(其是由选自卤代甲基、甲氧基的基团可选取代的)；吡啶基；和苯硫基；以及
(f)其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基(其是由选自卤代甲基、甲氧基的基团可选取代的)；吡啶基；以及苯硫基。
当R12是C5-10芳基时，它可以是C5-7芳基。C5-7芳基可以是苯基或C5-7杂芳基，例如呋喃基、苯硫基和吡啶基。在一些实施方式中，R12优选是苯基。在其他实施方式中，R12优选是苯硫基，例如，噻吩-2-基和噻吩-3-基。
当R12是C5-10芳基时，它可以是C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可以通过任何可用的环位置结合于PBD核心。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基和喹啉-8-基。其中，喹啉-3-基和喹啉-6-基可以是优选的。异喹啉基可以是异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。其中，异喹啉-3-基和异喹啉-6-基可以是优选的。
当R12是C5-10芳基时，它可以带有任何数量的取代基。它优选带有1至3个取代基，其中1和2个取代基是更加优选的，并且单取代的基团是最优选的。取代基可以是在任何位置。
在R12是C5-7芳基的情况下，单取代基优选是在环原子上，其并不相邻于与化合物的剩余部分的键，即，它优选是与化合物的剩余部分的键的β或γ位。因此，在C5-7芳基是苯基的情况下，取代基优选是在间位或对位，并且更优选地是在对位。
在R12是C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基的情况下，它可以在喹啉或异喹啉环的任何位置处带有任何数量的取代基。在一些实施方式中，它带有一个、两个或三个取代基，并且这些取代基可以是在近侧或远侧环或两者上(如果一个以上的取代基)。
R12取代基，当R12是C5-10芳基基团时
当R12是C5-10芳基时，如果在R12上的取代基是卤素，则它优选是F或Cl，更优选Cl。
当R12是C5-10芳基时，如果在R12上的取代基是醚，则在一些实施方式中它可以是烷氧基，例如，C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)，或在一些实施方式中它可以是C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。烷氧基本身可以进一步被取代，例如由氨基(例如二甲基氨基)。
当R12是C5-10芳基时，如果在R12上的取代基是C1-7烷基，它可以优选为C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
当R12是C5-10芳基时，如果在R12上的取代基是C3-7杂环基，则在一些实施方式中它可以是C6含氮杂环基，例如吗啉代、硫代吗啉代、哌啶基、哌嗪基。这些基团可以经由氮原子结合于PBD部分的剩余部分。这些基团可以进一步被取代，例如，由C1-4烷基。如果C6含氮杂环基是哌嗪基，则所述进一步的取代基可以是在第二氮环原子上。
当R12是C5-10芳基时，如果在R12上的取代基是双-氧基-C1-3亚烷基，这优选是双-氧基-亚甲基或双-氧基-亚乙基。
当R12是C5-10芳基时，如果R12上的取代基是酯，那么它优选地是甲基酯或乙基酯。
当R12是C5-10芳基时，特别优选的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟基、氯基、氰基、双-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉代和甲基-苯硫基。用于R12的其他特别优选的取代基是二甲基氨基丙氧基和羧基。
当R12是C5-10芳基时，特别优选的取代的R12基团包括但不限于：4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-二氧亚甲基-苯基、4-甲基苯硫基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、异喹啉-3-基和异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基和萘基。另一种可能的取代的R12基团是4-硝基苯基。特别感兴趣的R12基团包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基和3,4-双氧亚甲基-苯基。
当R12是C1-5饱和脂族烷基时，它可以是甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些实施方式中，它可以是甲基、乙基或丙基(正戊基或异丙基)。在这些实施方式的一些中，它可以是甲基。在其他实施方式中，它可以是丁基或戊基，其可以是直链或支链的。
当R12是C3-6饱和环烷基时，它可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方式中，它可以是环丙基。
当R12是时，R21、R22和R23各自独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中在R12基团中的碳原子的总数不大于5。在一些实施方式中，在R12基团中的碳原子的总数不大于4或不大于3。
在一些实施方式中，R21、R22和R23中的一种是H，而其他两种基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基。
在其他实施方式中，R21、R22和R23中的两种是H，而其他一种基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基。
在一些实施方式中，不是H的基团选自甲基和乙基。在这些实施方式的一些中，不是H的基团是甲基。
在一些实施方式中，R21是氢。
在一些实施方式中，R22是氢。
在一些实施方式中，R23是氢。
在一些实施方式中，R21和R22是H。
在一些实施方式中，R21和R23是H。
在一些实施方式中，R22和R23是H。
特别令人感兴趣的R12基团是：
当R12是时，R25a和R25b中的一个是氢，而另一个选自：苯基(其是由选自卤素、甲基、甲氧基的基团可选取代的)；吡啶基；和苯硫基。在一些实施方式中，不是H的基团是可选取代的苯基。如果苯基可选的取代基是卤素，则它优选是氟。在一些实施方式中，苯基是未取代的。
当R12是时，R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基(其是由选自卤代甲基、甲氧基的基团可选取代的)；吡啶基；以及苯硫基。如果苯基可选的取代基是卤素，则它优选是氟。在一些实施方式中，苯基是未取代的。
在一些实施方式中，R24选自H、甲基、乙基、乙烯基和乙炔基。在这些实施方式的一些中，R24选自H和甲基。
当C2’和C3’之间存在单键时，
R12是其中，R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，该烷基和烯基基团可选地被选自C1-4烷基氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或者，当R26a和R26b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
在一些实施方式中，优选的是R26a和R26b都是H。
在其他实施方式中，优选的是R26a和R26b都是甲基。
在进一步的实施方式中，优选的是R26a和R26b中的一个是H而另一个选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，其中烷基和烯基基团是可选取代的。在这些进一步的实施方式中，可以进一步优选的是不是H的基团选自甲基和乙基。
R2
以上对于R12的优选项同样适用于R2。
R22
在一些实施方式中，R22是式IIa。
当它是式IIa时，R22中的A可以是苯基基团或C5-7杂芳基基团，例如呋喃基、苯硫基和吡啶基。在一些实施方式中，A优选是苯基。
Q2-X可以在C5-7芳基基团的任何可用的环原子上，但优选地在与化合物的剩余部分的键不相邻的环原子上，即，优选地是在化合物的剩余部分的键的β或γ位。因此，当C5-7芳基基团(A)是苯基时，取代基(Q2-X)优选地在间位或对位，并且更优选地在对位。
在一些实施方式中，Q1是单键。在这些实施方式中，Q2选自单键和-Z-(CH2)n-，其中，Z选自单键、O、S和NH，并且n是1至3。在这些实施方式的一些中，Q2是单键。在其他实施方式中，Q2是-Z-(CH2)n-。在这些实施方式中，Z可以是O或S，并且n可以是1或n可以是2。在这些实施方式的其他的中，Z可以是单键，并且n可以是1。
在其他实施方式中，Q1是-CH＝CH-。
在其他实施方式中，R22是式IIb。在这些实施方式中，RC1、RC2和RC3独立地选自H和未取代的C1-2烷基。在一些优选的实施方式中，RC1、RC2和RC3都是H。在其他实施方式中，RC1、RC2和RC3都是甲基。在某些实施方式中，RC1、RC2和RC3独立地选自H和甲基。
X选自包含以下的列表的基团：O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’、NH-C(＝O)-RL2’、NHNH-RL2’、CONHNH-RL2’、 NRNRL2’，其中，RN选自包括H和C1-4烷基的组。X可以优选地是：OH、SH、CO2H、-N＝C＝O或NHRN，并且可以更优选地是：O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、-NH-C(＝O)-RL2’或NH-RL2’。特别优选的基团包括：O-RL2’、S-RL2’和NH-RL2’，NH-RL2’是最优选的基团。
在一些实施方式中，R22是式IIc。在这些实施方式中，优选的是Q是NRN-RL2’。在其他实施方式中，Q是O-RL2’。在进一步的实施方式中，Q是S-RL2’。RN优选地选自H和甲基。在一些实施方式中，RN是H。在其他实施方式中，RN是甲基。
在一些实施方式中，R22可以是-A-CH2-X和-A-X。在这些实施方式中，X可以是O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’和NH-RL2’。在特别优选的实施方式中，X可以是NH-RL2’。
R10、R11
在一些实施方式中，R10和R11一起形成它们连接的氮和碳原子之间的双键。
在一些实施方式中，R11是OH。
在一些实施方式中，R11是OMe。
在一些实施方式中，R11是SOzM，其中，z是2或3并且M是单价的药学上可接受的阳离子。
R11a
在一些实施方式中，R11a是OH。
在一些实施方式中，R11a是OMe。
在一些实施方式中，R11a是SOzM，其中，z是2或3并且M是单价的药学上可接受的阳离子。
R20、R21
在一些实施方式中，R20和R21一起形成它们连接的氮和碳原子之间的双键。
在一些实施方式中，R20是H。
在一些实施方式中，R20是RC。
在一些实施方式中，R21是OH。
在一些实施方式中，R21是OMe。
在一些实施方式中，R21是SOzM，其中，z是2或3并且M是单价的药学上可接受的阳离子。
R30、R31
在一些实施方式中，R30和R31一起形成它们连接的氮和碳原子之间的双键。
在一些实施方式中，R31是OH。
在一些实施方式中，R31是OMe。
在一些实施方式中，R31是SOzM，其中，z是2或3并且M是单价的药学上可接受的阳离子。
M和z
优选地，M是单价的药学上可接收的阳离子，并且更优选地是Na+。
z优选地是3。
本发明的第一方面的优选结合物可以具有式Ia的DL：
其中，
RL1’、R20和R21是如以上所限定的；
n是1或3；
R1a是甲基或苯基；并且
R2a选自：
本发明的第一方面的优选结合物可以具有式Ib的DL：
其中，
RL1’、R20和R21如以上所限定的；
n是1或3；并且
R1a是甲基或苯基。
本发明的第一方面的优选结合物可以具有式Ic的DL：
其中，RL2’、R10、R11、R30和R31如以上所限定的，
n是1或3；
R12a选自：
氨基基团在苯基基团的间位或对位。
本发明的第一方面的优选结合物可以具有式Id的DL：
其中，RL2’、R10、R11、R30和R31如以上所限定的，
n是1或3；
R1a是甲基或苯基；
R12a选自：
本发明的第一方面的优选结合物可以具有式Ie的DL：
其中，RL2’、R10、R11、R30和R31如以上所限定的，
n是1或3；
R1a是甲基或苯基；
R12a选自：
实施例
通用实验方法
在ADP 220旋光仪(Bellingham Stanley Ltd.)上测量旋光性并以g/100mL为单位来给出浓度(c)。使用数字熔点仪(Electrothermal)来测量熔点。用Perkin-ElmerSpectrum 1000FT IR分光计来记录IR谱。在300K下，利用Bruker Avance NMR分光计，分别在400和100MHz处获得1H和13C NMR谱。相对于TMS(δ＝0.0ppm)报告化学位移，并将信号指示为s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、dt(双三重峰)、dd(双峰的双峰)、ddd(双峰的双双峰)或m(多重峰)，其中以赫兹(Hz)为单位来给出偶合常数。利用连接于具有Waters 2996PDA的Waters 2695HPLC上的Waters Micromass ZQ仪器来收集质谱(MS)数据。使用的WatersMicromass ZQ参数是：毛细管(kV)，3.38；锥电压(V)，35；提取器(V)，3.0；源温度(℃)，100；去溶剂化温度(℃)，200；锥流速(L/h)，50；去溶剂化流速(L/h)，250。使用金属涂覆的硼硅玻璃尖端来将样品引入仪器，以正W模式在Waters Micromass QTOF Global上记录高分辨率质谱(HRMS)数据。在硅胶铝板(Merck 60,F254)上进行薄层色谱(TLC)，并利用硅胶(Merck60，230-400目ASTM)来进行快速色谱。除HOBt(NovaBiochem)和固体支持剂(Argonaut)之外，所有其他化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich并如供应的使用而没有进一步的纯化。在有适当干燥剂存在的条件下，在干燥氮气气氛下，通过蒸馏来制备无水溶剂，并存储在分子筛或钠线上。石油醚是指在40-60℃沸腾的馏分。
通常的LC/MS条件：
方法1(默认方法，除非另外指出，否则使用)
使用水(A)(甲酸0.1％)和乙腈(B)(甲酸0.1％)的流动相运行HPLC(WatersAlliance 2695)。梯度：初始组成5％B，持续1.0分钟，然后，在3分钟内，从5％B升高到95％B。将上述组成保持在95％B下0.1分钟，然后在0.03分钟内回到5％B并保持0.87min。总梯度运行时间等于5分钟。
方法2
使用水(A)(甲酸0.1％)和乙腈(B)(甲酸0.1％)的流动相进行HPLC(WatersAlliance 2695)。梯度：初始组成5％B，持续1.0分钟，然后，在2.5分钟内，从5％B升高到95％B。将上述组成保持在95％B下0.5分钟，然后在0.1分钟内回到5％B并保持0.9min。总梯度运行时间等于5分钟。
对于每个方法
流速3.0mL/min，经由零死容积T形管(其通入质谱仪)来分开400μL。波长检测范围：220至400nm。功能类型：二极管阵列(535扫描)。柱： Onyx MonolithicC18 50×4.60mm。
反相快速纯化条件如下：使用水(A)和乙腈(B)的流动相进行快速纯化系统(Varian 971-Fp)。梯度：在20C.V(柱体积)下，初始组成5％B，然后在60C.V内从5％B至70％B。将95％B的组成保持15C.V.，然后在5C.V.内回到5％B，并保持在5％B持续10C.V.。总梯度运行时间等于120C.V。流速：6.0mL/min。波长检测范围：254nm。柱：Agilent AX1372-1SF10-5.5gC8。
制备型HPLC：在以下尺寸的Phenomenex Gemini NX 5μC-18柱上进行反相超高效液相色谱法(UPLC)。150×4.6mm用于分析，以及150×21.20mm用于制备工作。通过梯度条件执行所有UPLC实验。洗脱液是溶剂A(具有0.1％富马酸的H2O)和溶剂B(具有0.1％富马酸的CH3CN)。使用的流速是1.0ml/min用于分析，和20.0ml/min用于制备型HPLC。在254nm和280nm处检测。
中间体12的合成
(a)1’,3’-双[2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苯氧基]丙烷(3)
在0-5℃(冰/丙酮)下，在氮气气氛下，在60min时间段内将偶氮二羧酸二异丙基酯(71.3mL，73.2g，362mmol)逐滴添加至香草酸甲酯2(60.0g，329mmol)和Ph3P(129.4g，494mmol)在无水THF(800mL)中的上方带搅拌的溶液中。允许在0-5℃搅拌反应混合物另外1小时，在该时间后，在20min时间段内逐滴添加1,3-丙二醇(11.4mL，12.0g，158mmol)在THF(12mL)中的溶液。允许将反应混合物升温至室温，并且搅拌5天。通过真空过滤收集得到的白色沉淀物3，用THF洗涤以及在真空干燥器中干燥至恒重。产量＝54.7g(基于1,3-丙二醇，84％)。纯度满意度，LC/MS(3.20min(ES+)m/z(相对强度)427([M+Na]+.，10)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.64(dd，2H，J＝1.8，8.3Hz)，7.54(d，2H，J＝1.8Hz)，6.93(d，2H，J＝8.5Hz)，4.30(t，4H，J＝6.1Hz)，3.90(s，6H)，3.89(s，6H)，2.40(p,2H，J＝6.0Hz)。
(b)1’,3’-双[2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)-5-硝基苯氧基]丙烷(4)
在0-5℃(冰/丙酮)下，将固体Cu(NO3)2·3H2O(81.5g，337.5mmol)缓慢添加至双-酯3(54.7g，135mmol)在乙酸酐(650mL)中的上部带搅拌的浆料中。允许在0-5℃搅拌反应混合物1小时，然后允许其升温至室温。在该阶段，观察到轻微放热(约40-50℃)，伴随着混合物变稠和NO2的释放。添加另外的乙酸酐(300mL)，并且允许在室温下搅拌反应混合物16小时。将反应混合物倒在冰(～1.5L)上，并且搅拌以及允许其返回至室温。通过真空过滤收集得到的黄色沉淀物，并且在干燥器中干燥以提供期望的双-硝基化合物4黄色固体。产量＝66.7g(100％)。纯度满意度，LC/MS(3.25min(ES+)m/z(相对强度)517([M+Na]+.，40)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.49(s，2H)，7.06(s，2H)，4.32(t，4H，J＝6.0Hz)，3.95(s，6H)，3.90(s，6H)，2.45-2.40(m,2H)。
(c)1’,3’-双(4-羧基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丙烷(5)
用1N NaOH(700mL)处理甲酯4(66.7g，135mmol)在THF(700mL)中的浆料，并且允许在室温下剧烈搅拌反应混合物。搅拌4天后，该浆料变为深色溶液，使该溶液在减压下经历旋转蒸发以除去THF。用浓HCl酸化得到的含水残留至pH 1，并且收集无色沉淀物5，以及在真空烘箱(50℃)中彻底干燥。产量＝54.5g(87％)。纯度满意度，LC/MS(2.65min(ES+)m/z(相对强度)489([M+Na]+.,30)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.62(s，2H)，7.30(s，2H)，4.29(t，4H，J＝6.0Hz)，3.85(s，6H)，2.30-2.26(m，2H)。
(d)1,1’-[[(丙烷-1,3-二基)二氧]双[(5-甲氧基-2-硝基-1,4-亚苯基)羰基]]双[(2S,4R)-甲基-4-羟基吡咯烷-2-羧酸酯](6)
将草酰氯(24.5mL，35.6g，281mmol)添加至对硝基苯甲酸5(43g，92.3mmol)和MDF(6mL)在无水DCM(600mL)的搅拌悬浮液中。初始泡腾后，反应悬浮液变为溶液，并且允许在室温下搅拌混合物16小时。通过用MeOH处理反应混合物的样品确定酸氯化物的转化率，并且通过LC/MS观察得到的双-甲基酯。通过在减压下蒸发除去大部分溶剂；将得到的浓缩溶液再溶解在最小量的无水DCM中，并且用二乙醚打浆。通过过滤收集得到的黄色沉淀物，用冷二乙醚洗涤，并且在40℃真空烘箱中干燥1小时。在25min时间段内，在-40℃(干冰/CH3CN)下将固体酸氯化物分批添加至(2S,4R)-甲基-4-羟基吡咯烷-2-羧酸酯盐酸化物(38.1g，210mmol)和TEA(64.5mL，g，463mmol)在DCM(400mL)中的搅拌悬浮液中。立刻，通过LC/MS(2.47min(ES+)m/z(相对强度721([M+H]+.，100)判定反应完成。用DCM(200mL)稀释并且用1N HCl(300mL)、饱和NaHCO3(300mL)、盐水(400mL)、干燥的(MgSO4)洗涤混合物，过滤并在真空内蒸发溶剂，以得到为橙色固体的纯产物6(66.7g，100％)。[α]22 D＝-46.1°(c＝0.47，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)(旋转异构体)δ7.63(s，2H)，6.82(s，2H)，4.79-4.72(m，2H)，4.49-4.28(m，6H)，3.96(s，6H)，3.79(s，6H)，3.46-3.38(m，2H)，3.02(d，2H，J＝11.1Hz)，2.48-2.30(m，4H)，2.29-2.04(m，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)(旋转异构体)δ172.4，166.7，154.6，148.4，137.2，127.0，109.7，108.2，69.7，65.1，57.4，57.0，56.7，52.4，37.8，29.0；IR(ATR，CHCl3)3410(br)，3010，2953，1741，1622，1577，1519，1455，1429，1334，1274，1211，1177，1072，1050，1008，871cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)721([M+H]+.，47)，388(80)；HRMS[M+H]+.理论的C31H36N4O16m/z721.2199，发现(ES+)m/z 721.2227。
(e)1,1’-[[(丙烷-1,3-二基)二氧基]双(11aS,2R)-2-(羟基)-7-甲氧基-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂5,11-二酮](7)
方法A：将硝基酯6(44g，61.1mmol)在MeOH(2.8L)中的溶液添加至5L 3颈圆底烧瓶中的新购买的镍(～50g，水中的～50％浆料)和抗暴沸颗粒中。在回流下加热混合物，然后用水合肼(21.6mL，22.2g，693mmol)在MeOH(200mL)中的溶液逐滴处理，此时，观察到充分的泡腾。当完成添加(～45min)时，小心添加另外的镍直到泡腾停止，并且排出初始的黄色反应混合物。在回流下另外加热混合物5min，此时，由TLC(90:10v/v CHCl3/MeOH)和LC/MS(2.12min(ES+)m/z(相对强度)597([M+H]+.,100)反应视为完成。立即通过包含硅藻土(celite)与真空吸管的烧结漏斗热过滤反应混合物。通过真空蒸发减小滤液体积，此时，形成无色沉淀，通过过滤收集沉淀和在真空干燥器中干燥以提供7(31g，85％)。[α]27 D＝+404°(c＝0.10，DMF)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.2(s，2H，NH)，7.26(s，2H)，6.73(s，2H)，5.11(d，2H，J＝3.98Hz，OH)，4.32-4.27(m，2H)，4.19-4.07(m，6H)，3.78(s，6H)，3.62(dd，2H，J＝12.1，3.60Hz)，3.43(dd，2H，J＝12.0，4.72Hz)，2.67-2.57(m，2H)，2.26(p，2H，J＝5.90Hz)，1.99-1.89(m，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ169.1，164.0，149.9，144.5，129.8，117.1，111.3，104.5，54.8，54.4，53.1，33.5，27.5；IR(ATR，纯)3438，1680，1654，1610，1605，1516，1490，1434，1379，1263，1234，1216，1177，1156，1115，1089，1038，1018，952，870cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)619([M+Na]+.，10)，597([M+H]+.，52)，445(12)，326(11)；HRMS[M+H]+.理论C29H32N4O10m/z 597.2191，发现(ES+)m/z597.2205。
方法B：将10％Pd/C(7.5g，10％w/w)在DMF(40mL)中的悬浮液添加至硝基酯6(75g，104mmol)在DMF(360mL)中的溶液中。在Parr氢化装置中氢化该悬浮液超过8小时。氢吸收停止后，通过LC/MS监测反应进程。通过过滤除去固体Pd/C，并且通过在真空(低于10mbar)下在40℃旋转蒸发浓缩滤液，以提供包含痕量DMF和残留炭的深色油。在40℃在水浴(旋转蒸发浴)上将残留物吸收(消化，digest)在EtOH(500mL)中，并且通过硅藻土过滤得到的悬浮液以及用乙醇(500mL)洗涤，从而产生清澈的滤液。将水合肼(10mL，321mmol)添加至溶液中且在回流下加热该反应混合物。20分钟之后，观察到白色沉淀形成，并且允许回流继续另外30分钟。允许将混合物冷却至室温，并且通过过滤回收沉淀、用二乙醚(沉淀的2:1体积比)洗涤和在真空干燥器中干燥，以提供7(50g，81％)。方法B的分析数据：与方法A得到的分析数据相同(旋光度，1H NMR，LC/MS和TLC)。
(f)1,1’-[[(丙烷-1,3-二基)二氧基]双(11aS,2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂-5,11-二酮](8)
在0℃(冰/丙酮)下将TBSCl(27.6g，182.9mmol)和咪唑(29.9g，438.8mmol)添加至四内酰胺7(21.8g，36.6mmol)在无水DMF(400mL)中的混浊溶液中。允许在氮气气氛下搅拌混合物3小时，该时间之后通过LC/MS(3.90min(ES+)m/z(相对强度)825([M+H]+.，100)判断确认反应完成。将反应混合物倒在冰(～1.75L)上，并且在搅拌下允许其升温至室温。通过真空过滤收集得到的白色沉淀，用H2O、二乙醚洗涤，并且在真空干燥器中干燥，以提供纯的8(30.1g，99％)。[α]23 D＝+234°(c＝0.41，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.65(s，2H，NH)，7.44(s，2H)，6.54(s，2H)，4.50(p，2H，J＝5.38Hz)，4.21-4.10(m，6H)，3.87(s，6H)，3.73-3.63(m，4H)，2.85-2.79(m，2H)，2.36-2.29(m，2H)，2.07-1.99(m，2H)，0.86(s，18H)，0.08(s，12H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.4，165.7，151.4，146.6，129.7，118.9，112.8，105.3，69.2，65.4，56.3，55.7，54.2，35.2，28.7，25.7，18.0，-4.82和-4.86；IR(ATR，CHCl3)3235，2955，2926，2855，1698，1695，1603，1518，1491，1446，1380，1356，1251，1220，1120，1099，1033cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)825([M+H]+.，62)，721(14)，440(38)；HRMS[M+H]+.理论C41H60N4O10Si2m/z 825.3921，发现(ES+)m/z825.3948。
(g)1,1’-[[(丙烷-1,3-二基)二氧基]双[(11aS,2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂5,11-二酮](9)
在-30℃(干冰/乙二醇)下，在氮气气氛下将n-BuLi(己烷中的68.3mL的1.6M溶液，109mmol)逐滴添加至四内酰胺8(30.08g，36.4mmol)在无水THF(600mL)中的搅拌悬浮液中。允许在该温度下搅拌反应混合物1小时(现在是略带红色的橙色)，此时，逐滴添加SEMCl(19.3mL，18.2g，109mmol)在无水THF(120mL)中的溶液。允许反应混合物缓慢升温至至室温，并且在氮气气氛下搅拌16小时。通过TLC(EtOAc)和LC/MS(4.77min(ES+)m/z(相对强度)1085([M+H]+.，100)判断，反应视为完成。通过真空下蒸发除去THF，并且将得到的残留溶解在EtOAc(750mL)中，用H2O(250mL)、盐水(250mL)洗涤，干燥(MgSO4)，真空下过滤和蒸发，以提供为油状的粗N10-SEM-保护的四内酰胺9(maxm 39.5g，100％)。使产物进行下一步骤而无需纯化。[α]23 D＝+163°(c＝0.41，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.33(s，2H)，7.22(s，2H)，5.47(d，2H，J＝9.98Hz)，4.68(d，2H，J＝9.99Hz)，4.57(p，2H，J＝5.77Hz)，4.29-4.19(m，6H)，3.89(s，6H)，3.79-3.51(m，8H)，2.87-2.81(m，2H)，2.41(p，2H，J＝5.81Hz)，2.03-1.90(m，2H)，1.02-0.81(m，22H)，0.09(s，12H)，0.01(s，18H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.0，165.7，151.2，147.5，133.8，121.8，111.6，106.9，78.1，69.6，67.1，65.5，56.6，56.3，53.7，35.6，30.0，25.8，18.4，18.1，-1.24，-4.73；IR(ATR，CHCl3)2951，1685，1640，1606，1517，1462，1433，1360，1247，1127，1065cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)1113([M+Na]+.，48)，1085([M+H]+.，100)1009(5)，813(6)；HRMS[M+H]+.理论C53H88N4O12Si4m/z 1085.5548，发现(ES+)m/z 1085.5542。
(h)1,1’-[[(丙烷-1,3-二基)二氧基]双[(11aS,2R)-2-羟基-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂5,11-二酮]](10)
在室温下将TBAF(在THF中的150mL、1.0M溶液，150mmol)添加至粗双-甲硅烷基酯9[84.0g(maxm 56.8g)，52.4mmol]在THF(800mL)中的搅拌的溶液中。搅拌1小时后，通过TLC(5:5v/v CHCl3/MeOH)分析反应混合物显示反应完成。在室温下，在减压下通过蒸发除去THF，并且将得到的残留溶解在EtOAc(500mL)中并且用NH4Cl(300mL)洗涤。用盐水(60mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤以及在减压下蒸发结合的有机层，以提供粗产物。通过快速色谱法纯化(梯度洗脱液：100％CHCl3至96:4v/vCHCl3/MeOH)产生为白色泡沫的纯的四内酰胺10(36.0g，79％)。LC/MS3.33min(ES+)m/z(相对强度)879([M+Na]+.，100)，857([M+H]+.，40)；[α]23 D＝+202°(c＝0.34，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.28(s，2H)，7.20(s，2H)，5.44(d，2H，J＝10.0Hz)，4.72(d，2H，J＝10.0Hz)，4.61-4.58(m，2H)，4.25(t，4H，J＝5.83Hz)，4.20-4.16(m，2H)，3.91-3.85(m，8H)，3.77-3.54(m，6H)，3.01(br s，2H，OH)，2.96-2.90(m，2H)，2.38(p，2H，J＝5.77Hz)，2.11-2.05(m，2H)，1.00-0.91(m，4H)，0.00(s，18H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ169.5，165.9，151.3，147.4，133.7，121.5，111.6，106.9，79.4，69.3，67.2，65.2，56.5，56.2，54.1，35.2，29.1，18.4，-1.23；IR(ATR，CHCl3)2956，1684，1625，1604，1518，1464，1434，1361，1238，1058，1021cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)885([M+29]+.，70)，857([M+H]+.，100)，711(8)，448(17)；HRMS[M+H]+.理论C41H60N4O12Si2m/z 857.3819，发现(ES+)m/z 857.3826。
(i)1,1’-[[(丙烷-1,3-二基)二氧基]双[(11aS)-7-甲氧基-2-氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂5,11-二酮]](11)
在Ar下，将二醇10(25.6g，30mmol，1当量)、NaOAc(6.9g，84mmol，2.8当量)和TEMPO(188mg，1.2mmol，0.04当量)溶解在DCM(326mL)中。将其冷却至-8℃(内部温度)，并且在15分钟内逐批添加TCCA(9.7g，42mmol，1.4当量)。30分钟后，TLC(EtOAc)和LC/MS[3.60min.(ES+)m/z(相对强度)854.21([M+H]+.，40)，(ES-)m/z(相对强度)887.07([M–H+Cl]-.，10)]指示反应完成。添加冷DCM(200mL)，并且在用饱和的碳酸氢钠/硫代硫酸钠溶液(1:1v/v；200mL×2)洗涤之前，通过硅藻土滤板过滤混合物。用MgSO4干燥，过滤有机层，并且真空除去溶剂，以产生黄色/橙色海绵状物(25.4g，99％)。LC/MS[3.60min.(ES+)m/z(相对强度)854.21([M+H]+.，40)；[α]20 D＝+291°(c＝0.26，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.32(s，2H)，7.25(s，2H)，5.50(d，2H，J＝10.1z)，4.75(d，2H，J＝10.1Hz)，4.60(dd，2H，J＝9.85，3.07Hz)，4.31-4.18(m，6H)，3.89-3.84(m，8H)，3.78-3.62(m，4H)，3.55(dd，2H，J＝19.2，2.85Hz)，2.76(dd，2H，J＝19.2，9.90Hz)，2.42(p，2H，J＝5.77z)，0.98-0.91(m，4H)，0.00(s，18H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ206.8，168.8，165.9，151.8，148.0，133.9，120.9，111.6，107.2，78.2，67.3，65.6，56.3，54.9，52.4，37.4，29.0，18.4，-1.24；IR(ATR，CHCl3)2957，1763，1685，1644，1606，1516，1457，1434，1360，1247，1209，1098，1066，1023cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)881([M+29]+.，38)，853([M+H]+.，100)，707(8)，542(12)；HRMS[M+H]+.理论C41H56N4O12Si2m/z 853.3506，发现(ES+)m/z 853.3502。
(j)1,1’-[[(丙烷-1,3-二基)二氧基]双(11aS)-7-甲氧基-2-[[(三氟甲基)磺酰基]氧基]-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,10,11,11a-四氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂5,11-二酮(12)
在-45℃(干冰/乙腈)下，在氮气气氛下，以1份将无水2,6-二甲基吡啶(5.15mL，4.74g，44.2mmol)注入双酮11(6.08g，7.1mmol)在无水DCM(180mL)中的剧烈搅拌溶液中。快速逐滴注入从新鲜开口的小瓶中取出的无水三氟甲磺酸酐(7.2mL，12.08g，42.8mmol)，同时保持温度在-40℃或以下。允许在-45℃搅拌反应混合物1小时，此时，TLC(50/50v/v正己烷/EtOAc)显示起始材料完全耗尽。立即用DCM(200mL)稀释冷的反应混合物，并且剧烈摇晃，用水(1×100mL)、5％柠檬酸溶液(1×200mL)、饱和的NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤，并干燥(MgSO4)。在减压下过滤和蒸发提供了粗产物，通过快速柱色谱(梯度洗脱：90:10v/v正己烷/EtOAc至70:30v/v正己烷/EtOAc)纯化该粗产物以提供为黄色泡沫的双烯醇三氟甲磺酸酯(盐)(5.5g，70％)。LC/MS 4.32min(ES+)m/z(相对强度)1139([M+Na]+.，20)；[α]24 D＝+271°(c＝0.18，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.33(s，2H)，7.26(s，2H)，7.14(t，2H，J＝1.97Hz)，5.51(d，2H，J＝10.1Hz)，4.76(d，2H，J＝10.1Hz)，4.62(dd，2H，J＝11.0，3.69Hz)，4.32-4.23(m，4H)，3.94-3.90(m，8H)，3.81-3.64(m，4H)，3.16(ddd，2H，J＝16.3，11.0，2.36Hz)，2.43(p，2H，J＝5.85Hz)，1.23-0.92(m，4H)，0.02(s，18H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ167.1，162.7，151.9，148.0，138.4，133.6，120.2，118.8，111.9，107.4，78.6，67.5，65.6，56.7，56.3，30.8，29.0，18.4，-1.25；IR(ATR，CHCl3)2958，1690，1646，1605，1517，1456，1428，1360，1327，1207，1136，1096，1060，1022，938，913cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度1144([M+28]+.，100)，1117([M+H]+.，48)，1041(40)，578(8)；HRMS[M+H]+.理论C43H54N4O16Si2S2F6m/z 1117.2491，发现(ES+)m/z 1117.2465。
实施例1
(a)(S)-三氟甲磺酸8-(3-(((S)-2-(4-氨基苯基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基酯(13)
将Pd(PPh3)4(116.9mg，0.101mmol)添加至双-烯醇三氟甲磺酸酯12(5.65g，5.06mmol)、4-氨基苯基硼酸频哪醇酯(1g，4.56mmol)、Na2CO3(2.46g，23.2mmol)、MeOH(37mL)、甲苯(74mL)和水(37mL)的搅拌混合物中。允许在氮气气氛下在30℃搅拌反应混合物24小时，该时间之后，所有硼酸酯被耗尽。然后在从EtOAc(150mL)中取出残留之前，蒸发反应混合物至干燥，并且用H2O(2×100mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO4)，在减压下过滤和蒸发，以提供粗产物。通过快速色谱法纯化(梯度洗脱：80:20v/v己烷/EtOAc至60:40v/v己烷/EtOAc)提供了为淡黄色泡沫的产物13(2.4g，45％)。LC/MS 4.02min(ES+)m/z(相对强度)1060.21([M+H]+.，100)；1H-NMR：(CDCl3，400MHz)δ7.40(s，1H)，7.33(s，1H)，7.27(bs，3H)，7.24(d，2H，J＝8.5Hz)，7.15(t，1H，J＝2.0Hz)，6.66(d，2H，J＝8.5Hz)，5.52(d，2H，J＝10.0Hz)，4.77(d，1H，J＝10.0Hz)，4.76(d，1H，J＝10.0Hz)，4.62(dd，1H，J＝3.7，11.0Hz)，4.58(dd，1H，J＝3.4，10.6Hz)，4.29(t，4H，J＝5.6Hz)，4.00-3.85(m，8H)，3.80-3.60(m，4H)，3.16(ddd，1H，J＝2.4，11.0，16.3Hz)，3.11(ddd，1H，J＝2.2，10.5，16.1Hz)，2.43(p，2H，J＝5.9Hz)，1.1-0.9(m，4H)，0.2(s，18H)。13C-NMR：(CDCl3，100MHz)δ169.8，168.3，164.0，162.7，153.3，152.6，149.28，149.0，147.6，139.6，134.8，134.5，127.9，127.5，125.1，123.21，121.5，120.5，120.1，116.4，113.2，108.7，79.8，79.6，68.7，68.5，67.0，66.8，58.8，58.0，57.6，32.8，32.0，30.3，19.7，0.25。
(b)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-(3-(((S)-2-环丙基-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂5,11(10H,11aH)-二酮(14)
在氩气气氛下，将三苯基胂(0.24g，0.8mmol)、氧化银(I)(1.02g，4.4mmol)、环丙基硼酸(0.47g，5.5mmol)和起始材料13(1.15g，1.1mmol)溶解在二氧六环(30mL)中。用杵和研钵研磨磷酸三钾(2.8g，13.2mmol)，并将其快速添加至反应混合物中。排空反应混合物，并且用氩气冲洗3次，并加热至71℃。添加双(氯化苯甲腈)钯(II)(84mg，0.22mmol)，并排空反应容器且用氩气冲洗3次。10分钟后，提取少量样品用于通过TLC(80:20v/v乙酸乙酯/己烷)和LC/MS分析。30分钟后，反应进行完全(LC/MS分析指示起始材料被完全消耗)，以及通过硅藻土和用乙酸乙酯(400mL)洗涤的滤板过滤反应物。用水(2x200mL)和盐水(2x200mL)洗涤滤液。用MgSO4干燥有机层、真空过滤除去溶剂。通过硅胶柱色谱(30:70v/v己烷/乙酸乙酯)纯化提供了为橙色/黄色固体的产物14(0.66g，63％)。方法1，LC/MS(3.85min(ES+)m/z(相对强度)952.17([M+H]+，100)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.36(d，2H，J＝8.4Hz)，7.30(s，1H)，7.25-7.19(m，4H)，6.68(s，1H)，6.62(d，2H，J＝8.4Hz)，5.49(dd，2H，J＝5.6，10.0Hz)，4.73(app.t，2H，J＝10.8Hz)，4.54(dd，1H，J＝3.2，10.4Hz)，4.40(dd，1H，J＝3.2，10.4Hz)，4.29-4.23(m，4H)，3.91-3.85(m，7H)，3.80-3.71(m，2H)，3.70-3.61(m，2H)，3.38-3.32(m，1H)，3.12-3.01(m，1H)，2.50-2.69(m，1H)，2.40(q，2H，J＝5.6Hz)，1.50-1.43(m，1H)，0.99-0.71(m，6H)，0.54-0.59(m，2H)，0.00(s，18H)ppm。
(c)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-(3-(((S)-2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂5(11aH)-酮(15)
在氩气气氛下，将SEM双内酰胺14(0.66g，0.69mmol)溶解于THF(23mL)中并冷却至-78℃。在5分钟内逐滴添加溶液(1.7mL，THF中1M)同时监测温度。20分钟后，提取少量样品，并且用水洗涤用于LC/MS分析。添加水(50mL)并除去冷浴。萃取有机层，并用盐水(60mL)洗涤。用CH2Cl2/MeOH(90/10v/v)(2×50mL)洗涤结合的水层。用MgSO4干燥结合的有机层、过滤，并且真空除去溶剂。将粗产物溶解在MeOH(48mL)、CH2Cl2(18mL)和水(6mL)中，并且添加足够的硅胶以形成稠密的悬浮液。搅拌5天后，通过烧结漏斗过滤悬浮液，并且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(～200mL)洗涤直到产物被完全洗脱。用盐水(2x70mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，真空过滤除去溶剂。通过硅胶柱色谱纯化(100％CHCl3至96:4v/vCHCl3/MeOH)提供了为黄色固体的产物15(302mg，66％)。方法1，LC/MS(2.42min(ES+)m/z(相对强度)660.74([M+H]+，30)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.86(d，1H，J＝3.6Hz)，7.78(d，1H，J＝3.6Hz)，7.58-7.44(m，3H)，7.34-7.20(m，3H)，6.88-6.66(m，4H)，4.35-4.15(m，6H)，3.95-3.75(m，7H)，3.39-3.22(m，1H)，3.14-3.04(m，1H)，2.93-2.85(m，1H)，2.46-2.36(m，2H)，1.49-1.41(m，1H)，0.80-0.72(m，2H)，0.58-0.51(app.s，2H)ppm。
(d)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙基酯(16)
在填充有氩气的脱气圆底烧瓶中，将HO-Ala-Val-alloc(149.6mg，0.549mmol)和EEDQ(135.8mg，0.549mmol)溶解在干燥的CH2Cl2/MeOH(5mL)的9:1混合物中。用铝箔包裹烧瓶，并且在添加起始材料15(302mg，0.457mmol)之前，允许在室温下搅拌反应混合物1小时。在减压下通过旋转蒸发除去挥发物之前，在室温下搅拌反应混合物另外40小时(反应之后是LC/MS，RT起始材料2.32min，(ES+660.29([M+H]+.，100))。通过硅胶色谱柱(100％CHCl3至90/10v/v CHCl3/MeOH)直接纯化粗产物，以42％产率(174mg)提供纯产物(16)。方法2，LC/MS(2.70min(ES+)m/z(相对强度)914.73([M+H]+，60)，660.43(60)，184.31(100)。
(e)(2S)-2-氨基-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(17)
在填充有氩气的圆底烧瓶中，在添加吡咯烷(41μL，0.21mmol)之前，将起始材料16(170mg，0.185mmol)溶解在干燥的CH2Cl2(5mL)中。在添加Pd(PPh3)4(14mg，0.084mmol)之前，用氩气吹扫/再填充烧瓶三次，并且重复冲洗操作。1小时后，观察到起始材料被完全耗尽(反应之后是LC/MS)，并且将Et2O(50mL)添加至反应混合物允许搅拌直到产物从溶液析出。通过烧结漏斗过滤固体，并用Et2O洗涤两次(2x25mL)。置换收集烧瓶，并且将分离的固体溶解在CHCl3中(100mL或直到所有产物都穿过烧结漏斗)。然后在减压下通过旋转蒸发除去挥发物以提供粗产物17，其将在接下来的步骤中被直接使用(168mg)。LC/MS方法2(2.70min(ES+)m/z(相对强度)830.27([M+H]+，50)，660.13(80)，171.15(100))。
(f)N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(18)。
在用氩气吹扫和填充的圆底烧瓶中，将起始材料17(154mg，0.185mmol)和EDCI.HCl(110mg，0.185mmol)溶解在干燥的CH2Cl2(5mL)中。在添加PEG8-马来酰亚胺(35.6mg，0.185mmol)之前，在室温下搅拌混合物1小时，以及搅拌反应混合物另外16小时(或直到反应完成，通过LC/MS监测)。用CH2Cl2(50mL)稀释反应溶液，并在用MgSO4干燥之前用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤有机物，过滤且在减压下通过旋转蒸发除去溶剂，以提供粗产物。硅胶柱色谱(100％CHCl3至85/15v/v CHCl3/MeOH)纯化产生期望的产物(135mg)，但是(通过LC/MS，2.21min，方法2)观察到剩余了痕量的未反应PEG8-马来酰亚胺。自动反相硅胶色谱(H2O/CH3CN)(参见条件的一般信息)成功地除去了杂质，提供了纯的最终产物(18，起始于110mg的37mg纯产物，33％)。整体产率＝17％。方法2，LC/MS(2.58min(ES+)m/z(相对强度)1404.03([M+H]+，20)，702.63(100))。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.91(t，J＝3.5Hz，1H)，7.80(d，J＝4.0Hz，1H)，7.75(d，J＝8.8Hz，1H)，7.69(d，J＝8.7Hz，1H)，7.54-7.50(m，2H)，7.45(s，1H)，7.39-7.31(m，2H)，6.87(d，J＝10.5Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.72-6.68(m，2H)，4.74-4.62(m，1H)，4.45-4.17(m，7H)，3.95(s，3H)，3.94(s，3H)，3.67-3.58(m，34H)，3.54(m，2H)，3.42(dd，J＝10.2，5.2Hz，2H)，3.16-3.07(m，1H)，2.92(dd，J＝16.1，4.1Hz，1H)，2.62-2.49(m，4H)，2.48-2.39(m，2H)，2.37-2.25(m，1H)，1.92(s，1H)，1.52-1.44(m，3H)，1.10-0.93(m，6H)，0.79(dd，J＝9.2，5.3Hz，2H)，0.57(dd，J＝9.2，5.3Hz，2H)，没有观察到NH。
实施例2
(a)(R)-2-((R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁氨基)丙酸(20b)
将HO-Ala-Val-H 20a(350mg，1.86mmol)和Na2CO3(493mg，4.65mmol)溶解在蒸馏的H2O(15mL)中，并在添加二氧六环(15mL)之前将混合物冷却至0℃(发生氨基酸盐的部分沉淀)。在剧烈搅拌下，经10分钟，逐滴添加Fmoc-Cl(504mg，1.95mmol)在二氧六环(15mL)中的溶液。在除去冰浴以前，在0℃搅拌得到的混合物2小时，然后持续搅拌16小时。在减压下通过旋转蒸发除去溶剂，并将残留物溶解在水(150mL)中。用1N HCl将pH从9调节至2，随后用EtOAc(3x100mL)萃取水层。用盐水(100mL)洗涤合并的有机物，用MgSO4干燥，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去挥发物以提供纯的HO-Ala-Val-Fmoc 20b(746mg，97％产率)。LC/MS2.85min(ES+)m/z(相对强度)410.60；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.79(d，J＝7.77Hz，2H)，7.60(d，J＝7.77Hz，2H)，7.43(d，J＝7.5Hz，2H)，7.34(d，J＝7.5Hz，2H)，6.30(bs，1H)，5.30(bs，1H)，4.71-7.56(m，1H)，4.54-4.36(m，2H)，4.08-3.91(m，1H)，2.21-2.07(m，1H)，1.50(d，J＝7.1Hz，3H)，1.06-0.90(m，6H)。
(b)((S)-3-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)氨基)丙烷-2-基)氨基)丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯((9H-fluoren-9-yl)methyl((S)-3-methyl-1-oxo-1-(((S)-1-oxo-1-((4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborola n-2-yl)phenyl)amino)propan-2-yl)amino)butan-2-yl)carbamate)(20)
在室温下，将4-氨基苯基硼酸频哪醇酯(146.9mg，0.67mmol)添加至先前已搅拌30分钟的用氩气冲洗的烧瓶中的HO-Ala-Val-Fmoc 20b(330mg，0.8mmol)、DCC(166mg，0.8mmol)和DMAP(5mg，催化剂)在无水DCM(8mL)中的溶液中。然后允许在室温下搅拌反应混合物过夜。反应后伴随着LCMS和TLC。用CH2Cl2(50mL)稀释反应混合物，并在用MgSO4干燥之前用H2O和盐水洗涤有机物，在减压下过滤且通过旋转蒸发除去溶剂。将粗产物干燥负载在硅胶色谱柱(己烷/EtOAc，6:4)上，并且以88％产率(360mg)分离为白色固体的纯产物20。
(c)三氟甲磺酸8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁氨基)丙氨基)苯基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基酯(21)
将双-三氟甲磺酸酯12(2.03g，1.81mmol)、硼酸频哪醇酯(1g，1.63mmol)和Na2CO3(881mg，8.31mmol)溶解在甲苯/MeOH/H2O(2:1:1，40mL)的混合物中。在添加四(三苯基膦)钯(0)(41mg，0.035mmol)之前，用氩气吹扫和填充反应烧瓶，并且将反应混合物整夜加热至30℃。在减压下除去溶剂，以及将残留提取在H2O(100mL)中并且用EtOAc(3x100mL)萃取。用盐水(100mL)洗涤合并的有机物，用MgSO4干燥，过滤并通过在减压下旋转蒸发除去挥发物。通过硅胶色谱柱(己烷/EtOAc,8:2to 25:75)纯化粗产物以提供33％产率(885mg)的纯21。LC/MS 3.85min(ES+)m/z(相对强度)1452.90；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.78-7.16(m，17H)，7.13(s，1H)，6.51-6.24(m，1H)，5.51(dd，J＝10.0，5.1Hz，2H)，5.36-5.11(m，1H)，4.74(dd，J＝10.1，4.4Hz，2H)，4.70-4.53(m，2H)，4.47(d，J＝6.4Hz，1H)，4.37(d，J＝7.2Hz，1H)，4.27(m，4H)，4.20-4.14(m，1H)，3.90(s，3H)，3.89(s，3H)，3.77(ddd，J＝16.7，9.0，6.4Hz，3H)，3.71-3.61(m，2H)，3.24-2.91(m，3H)，2.55-2.33(m，2H)，2.22-2.07(m，1H)，1.52-1.37(m，3H)，1.04-0.86(m，10H)，0.00(s，18H)。
(d)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(22)((9H-fluoren-9-yl)methyl((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-cyclopropyl-7-methoxy-5,11-dioxo-10-((2-(trimethylsilyl)ethoxy)methyl)-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-benzo[e]pyrrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-yl)oxy)propoxy)-7-methoxy-5,11-dioxo-10-((2-(trimethylsilyl)ethoxy)methyl)-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-benzo[e]pyrrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-yl)phenyl)amino)-1-oxopropan-2-yl)amino)-3-methyl-1-oxobutan-2-yl)carbamate)
在氩气气氛下，将三苯基胂(42mg，0.137mmol)添加至PBD-三氟甲磺酸酯21(250mg，0.172mmol)、环丙基硼酸(73.9mg，0.86mmol)、氧化银(159mg，0.688mmol)和磷酸三钾(438mg，2.06mmol)在干燥二氧六环(10mL)中的混合物中。用氩气冲洗反应3次，并添加双(苯甲腈)氯化钯(II)(13.2mg，0.034mmol)。在将反应升温至75℃之前，用氩气冲洗反应3次以上，以及搅拌10分钟。通过硅藻土滤板过滤反应混合物，随后用乙酸乙酯漂洗。在减压下通过旋转蒸发除去溶剂。使得到的残留进行快速柱色谱(硅胶；1％甲醇/氯仿)。收集并合并纯的部分，并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以提供期望的产物22(132mg，50％产率)。LC/MS3.83min(ES+)m/z(相对强度)1345.91；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.88-7.14(m，17H)，6.69(s，1H)，6.45-6.25(m，1H)，5.57-5.41(m，2H)，5.34-5.14(m，1H)，4.78-4.67(m，2H)，4.62-4.55(m，1H)，4.50-4.45(m，2H)，4.51-4.44(m，1H)，4.31-4.21(m，4H)，4.16(m，1H)，3.92(s，3H)，3.86(s，3H)，3.82-3.71(m，2H)，3.66(m，3H)，3.40-3.28(m，1H)，3.07(m，1H)，2.70-2.57(m，1H)，2.47-2.36(m，2H)，2.15(m，1H)，1.51-1.40(m，3H)，1.03-0.87(m，11H)，0.77-0.71(m，2H)，0.60-0.54(m，2H)，0.00(t，J＝3.0Hz，18H)。
(e)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(23)
在氩气气氛下，在-78℃将(0.5mL，在THF中1M)逐滴添加至SEM双内酰胺22(265mg g，0.19mmol)在THF(10mL)中的溶液中。在5分钟内完成添加以保持反应混合物的内部温度恒定。20分钟后，用水淬灭等分反应用于LC/MS分析，该分析显示反应完成。添加水(20mL)至反应混合物中并除去冷浴。用EtOAc(3x30mL)萃取有机层，并用盐水(50mL)洗涤合并的有机物，用MgSO4干燥，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去溶剂。将粗产物溶解在MeOH(12mL)、CH2Cl2(6mL)和水(2mL)以及足够的硅胶中以形成稠密的搅拌悬浮液。5天后，通过烧结漏斗过滤悬浮液，并且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(200mL)洗涤直到产物被完全洗脱。用盐水(2x70mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去溶剂。通过硅胶柱色谱(100％CHCl3至96％CHCl3/4％MeOH)纯化提供了产物23，为黄色固体(162mg，78％)。LC/MS 3.02min(ES+)m/z(相对强度)1052.37。
(f)(2S)-2-氨基-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(17)
添加过量哌啶(0.2mL，2mmol)至SEM-双内酰胺23(76mg,0.073mmol)在DMF(1mL)中的溶液中。允许在室温下搅拌混合物20分钟，此时，反应进行至完成(通过LC/MS监测)。用CH2Cl2(75mL)释稀反应混合物，并且使用H2O(3x75mL)洗涤有机相直至完全去除哌啶。用MgSO4干燥有机相，在减压下过滤并通过旋转蒸发除去过量溶剂以提供粗产物17，直接在下一步骤中使用。LC/MS 2.32min(ES+)m/z(相对强度)830.00。
(g)N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(18)。
在氩气气氛下，将EDCI盐酸化物(14mg，0.0732mmol)添加至马来酰亚胺-PEG8-酸(43.4mg，0.0732mmol)在干燥CH2Cl2(5mL)中的悬浮液中。在添加PBD 17(60.7mg，0.0732mmol)之前，在室温下搅拌混合物1小时。持续搅拌直到反应完成(通常是5小时)。用CH2Cl2稀释反应，并在用MgSO4干燥之前用H2O和盐水洗涤有机相，过滤且在减压下通过旋转蒸发除去过量的溶剂。通过小心的硅胶色谱(从100％CHCl3开始至9:1CHCl3/MeOH缓慢洗脱)纯化产物，随后进行反相色谱以除去未反应的马来酰亚胺-PEG8-酸。以17.6％(21.8mg)的产率分离产物18。LC/MS 2.57min(ES+)m/z(相对强度)1405.30；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.91(t，J＝3.5Hz，1H)，7.80(d，J＝4.0Hz，1H)，7.75(d，J＝8.8Hz，1H)，7.69(d，J＝8.7Hz，1H)，7.54-7.50(m，2H)，7.45(s，1H)，7.39-7.31(m，2H)，6.87(d，J＝10.5Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.72-6.68(m，2H)，4.74-4.62(m，1H)，4.45-4.17(m，7H)，3.95(s，3H)，3.94(s，3H)，3.67-3.58(m，34H)，3.54(m，2H)，3.42(dd，J＝10.2，5.2Hz，2H)，3.16-3.07(m，1H)，2.92(dd，J＝16.1，4.1Hz，1H)，2.62-2.49(m，4H)，2.48-2.39(m，2H)，2.37-2.25(m，1H)，1.92(s，1H)，1.52-1.44(m，3H)，1.10-0.93(m，6H)，0.79(dd，J＝9.2，5.3Hz，2H)，0.57(dd，J＝9.2，5.3Hz，2H)，没有观察到NH。
实施例3
(a)三氟甲磺酸(S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂-2-基酯(24)((S)-7-methoxy-8-(3-(((S)-7-methoxy-2-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)-5,11-dioxo-10-((2-(trimethylsilyl)ethoxy)methyl)-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-yl)oxy)propoxy)-5,11-dioxo-10-((2-(trimethylsilyl)ethoxy)methyl)-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-yl trifluoromethanesulfonate)
将Pd(PPh3)4(20.6mg，0.018mmol)添加至双-烯醇三氟甲磺酸酯12(500mg，0.44mmol)、N-甲基哌嗪硼酸酯(100mg，0.4mmol)、Na2CO3(218mg，2.05mmol)、MeOH(2.5mL)、甲苯(5mL)和水(2.5mL)的搅拌混合物中。允许在氮气气氛下在30℃搅拌反应混合物24小时，该时间之后，所有硼酸酯被耗尽。然后在EtOAc(100mL)中取出残留之前，蒸发反应混合物至干燥，并且用H2O(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并在减压下蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法纯化(梯度洗脱：80:20v/v己烷/EtOAc至60:40v/v己烷/EtOAc)提供了产物24，为淡黄色泡沫(122.6mg，25％)。
LC/MS 3.15min(ES+)m/z(相对强度)1144([M+H]+，20％)。
(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(25)
将PBD-三氟甲磺酸酯24(359mg，0.314mmol)、硼酸频哪醇酯20(250mg，0.408mmol)和三乙胺(0.35mL，2.51mmol)溶解在甲苯/MeOH/H2O(2:1:1，3mL)的混合物中。在添加四(三苯基膦)钯(0)(21.7mg，0.018mmol)之前，用氩气冲洗并填充微波容器，并且将反应混合物放置在80℃的微波中10分钟。随后，添加CH2Cl2(100mL)，并在用MgSO4干燥之前用水(2x50mL)和盐水(50mL)洗涤有机物，过滤且在减压下通过旋转蒸发除去挥发物。通过硅胶色谱柱(CHCl3/MeOH，100％至9:1)纯化粗产物，以提供纯的25(200mg，43％产率)。LC/MS3.27min(ES+)m/z(相对强度)1478([M+H]+，100％)。
(c)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(26)
在氩气气氛下，在-78℃将(0.34mL，在THF中1M)的溶液逐滴添加至SEM-双内酰胺25(200mg g，0.135mmol)在THF(5mL)中的溶液中。在5分钟内完成添加以保持反应混合物的内部温度恒定。20分钟后，用水淬灭等分反应用于LC/MS分析，该分析显示反应完成。添加水(20mL)至反应混合物中并除去冷浴。用EtOAc(3x30mL)萃取有机层并且用盐水(50mL)洗涤合并的有机物，用MgSO4干燥，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去溶剂。将粗产物溶解在MeOH(6mL)、CH2Cl2(3mL)和水(1mL)以及足够的硅胶中以形成稠密的搅拌悬浮液。5天后，通过烧结漏斗过滤悬浮液，并且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(100mL)洗涤直到产物被完全洗脱。用盐水(2x50mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去溶剂。通过硅胶柱色谱(100％CHCl3至96％CHCl3/4％MeOH)纯化提供了产物26，为黄色固体(100mg，63％)。LC/MS 2.67min(ES+)m/z(相对强度)1186([M+H]+，5％)。
(d)(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((R)-7-甲氧基-8-(3-(((R)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(27)
将过量哌啶(0.1mL，1mmol)添加至PBD 26(36.4mg，0.03mmol)在DMF(0.9mL)中的溶液中。允许在室温下搅拌混合物20分钟，此时，反应进行至完成(通过LC/MS监测)。用CH2Cl2(50mL)释稀反应混合物，并且使用H2O(3x50mL)洗涤有机相直至完全去除哌啶。用MgSO4干燥有机相，在减压下过滤并通过旋转蒸发除去过量溶剂以提供粗产物27，直接在下一步骤中使用。LC/MS 2.20min(ES+)m/z(相对强度)964([M+H]+，5％)。
(e)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺(28)
在氩气气氛下，将EDCI盐酸盐(4.7mg，0.03mmol)添加至6-马来酰亚胺己酸(6.5mg，0.03mmol)在干燥CH2Cl2(3mL)中的悬浮液中。在添加PBD 27(34mg，粗)之前，在室温下搅拌混合物1小时。持续搅拌直到反应完成(6小时)。用CH2Cl2稀释反应，并在用MgSO4干燥之前用H2O和盐水洗涤有机相，过滤且在减压下通过旋转蒸发除去过量的溶剂。通过小心的硅胶色谱(从100％CHCl3开始至9:1CHCl3/MeOH缓慢洗脱)纯化产物，随后进行反相色谱以除去未反应的马来酰亚胺-PEG8-酸。在两步之上以41％(14.6mg)产率分离了产物28。LC/MS2.40min(ES+)m/z(相对强度)1157([M+H]+，5％)。
实施例4-化合物25的可替代合成
将PBD-三氟甲磺酸酯21(469mg，0.323mmol)、硼酸频哪醇酯(146.5mg，0.484mmol)和Na2CO3(157mg，1.48mmol)溶解在甲苯/MeOH/H2O(2:1:1，10mL)的混合物中。在添加四(三苯基膦)钯(0)(7.41mg，0.0064mmol)之前，用氩气吹扫反应烧瓶，并且将反应混合物加热至30℃过夜。在减压下除去溶剂，以及将残留提取在H2O(50mL)中并且用EtOAc(3x50mL)萃取。用盐水(100mL)洗涤合并的有机物，用MgSO4干燥，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl3100％至CHCl3/MeOH 95％:5％)纯化粗产物，以33％的产率提供纯的25(885mg)。LC/MS 3.27min(ES+)m/z(相对强度)1478([M+H]+，100％)。
实施例5
(a)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂5,11(10H,11aH)-二酮(29)
在氮气气氛下，将3,4-(亚甲二氧基)苯基硼酸(356mg，2.1mmol，1.3当量)、TEA(1.8mL，12.9mmol，8当量)和三氟甲磺酸酯/苯胺13(1.75g，1.7mmol，1当量)溶解在乙醇(7mL)、甲苯(13mL)和水(2mL)的混合物中。排空反应混合物并在添加四(三苯膦)钯(0)(114mg，0.1mmol，0.06当量)以前，用Ar冲洗3次。再次排空烧瓶并用Ar冲洗3次，以及在80℃在微波中加热8分钟，其中30秒为预搅拌时间。TLC(80:20v/v乙酸乙酯/己烷)分析指示起始材料被完全消耗。用二氯甲烷(50mL)稀释反应混合物并用水(50mL)洗涤。用MgSO4干燥有机层、真空过滤除去溶剂。通过硅胶柱色谱(60:40至20:80v/v己烷/乙酸乙酯)纯化提供了为黄色固体的产物29(1.21g，71％)。LC/MS(3.92min(ES+)m/z(相对强度)1032.44([M+H]+，100)。
(b)(S)-2-(4-氨基丙基)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂5(11aH)-酮(30)
在Ar气氛下，将SEM双内酰胺29(0.25g，0.24mmol，1当量)溶解在THF(8mL)中并冷却至-78℃。在5分钟内逐滴添加(0.6mL，THF中1M，2.5当量)，同时监测温度。20分钟后，提取少量样品，并检查(work-up)用于LCMS分析。添加水(50mL)，除去冷浴，并且用乙酸乙酯(50mL)洗涤溶液。萃取有机层并用盐水(60mL)洗涤，用MgSO4干燥，真空过滤并除去溶剂。将粗产物溶解在EtOH(15mL)、CH2Cl2(7.5mL)和水(2.5mL)中，并且添加足够的硅胶以形成稠密的悬浮液。搅拌5天后，通过烧结漏斗过滤，并且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(100mL)洗涤直到产物被完全洗脱。用盐水(2x50mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，真空过滤除去溶剂。通过硅胶柱色谱(CHCl3，1％至4％MeOH梯度)纯化提供了为黄色固体的产物30(94mg，53％)。LC/MS(2.53min(ES+)m/z(相对强度)739.64([M]+，70)。
(c)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙基酯(31)
在Ar气氛下，搅拌丙氨酸-缬氨酸-Alloc(180mg，0.66mmol，1.2当量)与无水CH2Cl2(21mL)和甲醇(1mL)中的EEDQ(163mg，0.66mmol，1.2当量)。将PBD 30(407mg，0.55mmol，1当量)溶解在无水CH2Cl2(21mL)和甲醇(1mL)中，并将其添加至反应中。室温下搅拌5天后，LC/MS示出主产物形成。在通过柱色谱(CH2Cl2与1％至6％MeOH梯度)纯化之前，真空除去溶剂，以产生为黄色固体的产物31(184mg，34％)。LC/MS(2.95min(ES+)m/z(相对强度)994.95([M+H]+，60)。
(d)(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(32)
在Ar气氛下，将亚胺31(100mg，0.1mmol，1当量)溶解在无水DCM(10mL)中(辅助以一滴甲醇来帮助溶解)。在排空烧瓶并用Ar冲洗三次之前，逐滴添加吡咯烷(30μL，0.15mmol，1.5当量)。在排空烧瓶并用Ar冲洗三次之前，添加Pd(PPh3)4(7mg，6μmol，0.06当量)。1小时后，LC/MS分析指示产物形成和起始材料的完全消失。添加Et2O(60mL)至反应混合物中，并搅拌其直到所有产物已经从溶液中析出。通过烧结漏斗过滤沉淀，并用Et2O洗涤两次(2x20mL)。置换收集烧瓶，以及溶解并通过用CHCl3(100mL)烧结物洗涤分离的固体。真空除去溶剂以提供为黄色固体的粗产物32，在下一步骤中直接使用该粗产物32。LC/MS(1.14min(ES+)m/z(相对强度)910.40([M+H]+，67)。
(e)N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(3-(2,5-二氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(33)。
将亚胺32(92mg，0.1mmol，1.1当量)溶解在CHCl3(6mL)中，通过一滴无水MeOH来帮助溶解。添加马来酰亚胺-PEG8-酸(53mg，0.09mmol，1当量)，随后添加EEDQ(33mg，0.14mmol，1.5当量)。在Ar下在室温下剧烈搅拌其，直到LC/MS分析示出主产物形成。真空除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(CHCl3与1％至10％MeOH梯度)部分纯化粗产物，产生33(81mg)。进一步通过制备型HPLC纯化材料，以产生为黄色固体的33(26.3mg，18％)。快速甲酸运行：LC/MS(1.39min(ES+)m/z(相对强度)1485.00([M+H]+，64)。
实施例6
(a)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧代环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(34)
在Ar气氛下，将三氟甲酸酯21(0.5g，0.35mmol，1当量)、3,4-(亚甲基二氧基)苯基硼酸(75mg，0.45mmol，1.3当量)和Na2CO3(0.17g，1.6mmol，4.5当量)溶解在甲苯(11mL)、EtOH(5.5mL)和水(5.5mL)中。排空烧瓶，并且用Ar冲洗三次。添加Pd(PPh3)4(24mg，0.02mmol，0.06当量)，并再次排空烧瓶并用Ar冲洗三次。将其加热至30℃并搅拌过夜。LC/MS分析示出起始材料完全消失。真空除去溶剂，并在用乙酸乙酯(60mLx3)洗涤之前将残留溶解在水(60mL)中。用盐水(50mL)洗涤结合的有机层，用MgSO4干燥，真空过滤除去溶剂。通过柱色谱(50:50至25:75v/v己烷/乙酸乙酯)纯化提供了为黄色固体的产物34(310mg，64％)。LC/MS(1.44min(ES-)m/z(相对强度)1423.35([M-H]-.，79)。
(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(35)
在Ar气氛下，将SEM双内酰胺34(0.31g，0.22mmol，1当量)溶解在THF(10mL)中并冷却至-78℃。在5分钟内逐滴添加(0.5mL，THF中1M，2.5当量)同时监测温度。30分钟后，提取少量样品，并检查用于LC/MS分析。添加水(50mL)，除去冷浴，并用乙酸乙酯(50mL)洗涤溶液。萃取有机层并用盐水(60mL)洗涤，用MgSO4干燥，真空过滤除去溶剂。将粗产物溶解在EtOH(13.2mL)、CH2Cl2(6.6mL)和水(2.2mL)中，并且添加足够的硅胶以形成稠密的悬浮液。搅拌5天后，通过烧结漏斗过滤，并且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(100mL)洗涤直到产物被完全洗脱。用盐水(2x50mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，真空过滤除去溶剂。通过硅胶柱色谱(CHCl3，1％至4％MeOH梯度)纯化提供了纯产物35，为黄色固体(185mg，75％)。LC/MS(1.70min(ES+)m/z(相对强度)1132.85([M+H]+，60)。
(c)(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-a][1,4]苯并二氮杂2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(32)
在缓慢添加哌啶(0.2mL，2mmol，过量)之前，将亚胺35(82mg，0.07mmol，1当量)溶解在DMF(1mL)中。在室温下搅拌该溶液20分钟，直到LC/MS分析示出起始材料被完全消耗。用CH2Cl2(50mL)稀释反应混合物，用水(50mLx4)洗涤，用MgSO4干燥，真空过滤除去溶剂。在无需下一步骤进一步纯化的情况下使用产物33。LC/MS(1.15min(ES+)m/z(相对强度)910.60([M+H]+，58)。
实施例7
(i)(S)-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)(2-(((叔丁基二
甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(49)
(a)5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲醛(42)
将纯三异丙基氯硅烷(triisopropylsilylchloride)(56.4mL，262mmol)加入至咪唑(48.7g，715.23mmol)和4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛41(47g，238mmol)的混合物中(一起研磨)。加热混合物直至苯酚和咪唑熔融并成为溶液(100℃)。允许搅拌反应混合物15分钟，然后使其冷却，届时，在瓶底部观察到固体形成(氯化咪唑)。用5％EtOAc/己烷稀释反应混合物，并将其直接负载在硅胶上，并用5％EtOAc/己烷、随后用10％EtOAc/己烷洗脱(由于轻微过量，在产物中发现非常少量的未反应的TIPSCl)。用5％乙酸乙酯在己烷中的溶液洗脱所需产品。通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液，随后在高真空下干燥以提供结晶光感固体(74.4g，88％)。纯度满意度，LC/MS(4.22min(ES+)m/z(相对强度)353.88([M+H]+.，100))；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.43(s，1H)，7.60(s，1H)，7.40(s，1H)，3.96(s，3H)，1.35-1.24(m，3H)，1.10(m，18H)。
(b)5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酸(43)
在室温下，将亚氯酸钠(47.3g，523mmol，80％技术等级)和磷酸二氢钠单碱(35.2g，293mmol)(NaH2PO4)在水(800mL)中的溶液添加至化合物2(74g，209mmol)在四氢呋喃(500mL)中的溶液中。将过氧化氢(60％w/w，140mL，2.93mol)立即添加至剧烈搅拌的双相混合物中。反应混合物放出气体(氧气)，起始材料溶解并且反应混合物的温度升高至45℃。30分钟后，LC/MS显示反应完成。在冰浴中冷却反应混合物，并添加盐酸(1M)以将pH降低至3(在许多情况中，发现该步骤是不必要的，因为反应最后的pH已经是酸性；在萃取之前请检查pH)。然后，用乙酸乙酯(1L)萃取反应混合物，用盐水洗涤有机相(2×100mL)并用硫酸镁干燥。过滤有机相，并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂以提供定量产率的为黄色固体的产物43。LC/MS(3.93min(ES-)m/z(相对强度)367.74([M-H]- .，100))；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.36(s，1H)，7.24(s，1H)，3.93(s，3H)，1.34-1.22(m，3H)，1.10(m，18H)。
(c)((2S,4R)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)甲酮(45)
在0℃将DCC(29.2g，141mmol，1.2当量)添加至酸3(43.5g，117.8mmol，1当量)和羟基苯并三唑水合物(19.8g，129.6mmol，1.1当量)在二氯甲烷(200mL)中的溶液中。除去冷浴并允许反应在室温下进行30分钟，此时，在-10℃在氩气下快速添加(2S,4R)-2-t-丁基二甲基甲硅烷氧基甲基-4-羟基吡咯烷44(30g，129.6mmol，1.1当量)和三乙胺(24.66mL，176mmol，1.5当量)在二氯甲烷(100mL)中的溶液(大量，通过冷却反应混合物更长时间可以缩短添加时间)。允许在室温下搅拌反应混合物40分钟至1小时，并通过LC/MS和TLC(EtOAc)监测。通过在硅藻土上的过滤除去固体，并用冷的0.1M HCl水溶液洗涤有机相，直到测得的pH是4或5。然后用水洗涤有机相，随后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相。用硫酸镁干燥有机层，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂。使残留物进行快速柱色谱(硅胶；梯度：40/60乙酸乙酯/己烷至80/20乙酸乙酯/己烷)。通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂提供纯产物45(45.5g的纯产物66％，和17g轻微不纯的产物，总共90％)。LC/MS，4.23min(ES+)m/z(相对强度)582.92([M+H]+，100)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.66(s，1H)，6.74(s，1H)，4.54(s，1H)，4.40(s，1H)，4.13(s，1H)，3.86(s，3H)，3.77(d，J＝9.2Hz，1H)，3.36(dd，J＝11.3，4.5Hz，1H)，3.14-3.02(m，1H)，2.38-2.28(m，1H)，2.10(ddd，J＝13.3，8.4，2.2Hz，1H)，1.36-1.19(m，3H)，1.15–1.05(m，18H)，0.91(s，9H)，0.17-0.05(m，6H)，(存在旋转异构体)。
(d)(S)-5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)吡咯烷-3-酮(46)
在0℃将TCCA(8.82g，40mmol，0.7当量)添加至45(31.7g，54mmol，1当量)和TEMPO(0.85g，5.4mmol，0.1当量)在干燥的二氯甲烷(250mL)中的搅拌溶液中。剧烈搅拌反应混合物20分钟，此时，TLC(50/50乙酸乙酯/己烷)显示起始材料被完全消耗。通过硅藻土过滤反应混合物，并用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)、硫代硫酸钠(在300mL中9g)、盐水(100mL)洗涤滤液，并用硫酸镁干燥。在减压下旋转蒸发提供了定量产率的产物46。LC/MS 4.52min(ES+)m/z(相对强度)581.08([M+H]+，100)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.78-7.60(m，1H)，6.85-6.62(m，1H)，4.94(dd，J＝30.8，7.8Hz，1H)，4.50-4.16(m，1H)，3.99-3.82(m，3H)，3.80-3.34(m，3H)，2.92-2.17(m，2H)，1.40-1.18(m，3H)，1.11(t，J＝6.2Hz，18H)，0.97-0.75(m，9H)，0.15-0.06(m，6H)，(存在旋转异构体)。
(e)(S)-三氟甲磺酸5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-4,5-二氢-1H-吡咯-3-基酯(47)
在-50℃(丙酮/干冰浴)下，在存在2,6-二甲基吡啶(25.6mL，23.5g，220mmol，4当量，用分子筛干燥)的情况下将三氟甲磺酸酐(27.7mL，46.4g，165mmol，3当量)注射至剧烈搅拌的酮46(31.9g，55mmol，1当量)在无水二氯甲烷(900mL)中的混悬液中。允许搅拌反应混合物1.5小时，当LC/MS在微型检查(mini work-up)(水/二氯甲烷)时显示反应完全。将水加入到仍冷的反应混合物中，分离有机层并用饱和碳酸氢钠、盐水和硫酸镁洗涤。过滤有机相，并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂。使残留经受快速柱色谱(硅胶；10/90v/v乙酸乙酯/己烷)，除去过量洗脱液提供了产物47(37.6g，96％)LC/MS，方法2，4.32min(ES+)m/z(相对强度)712.89([M+H]+.，100)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.71(s，1H)，6.75(s，1H)，6.05(d，J＝1.8Hz，1H)，4.78(dd，J＝9.8，5.5Hz，1H)，4.15-3.75(m，5H)，3.17(ddd，J＝16.2，10.4，2.3Hz，1H)，2.99(ddd，J＝16.3，4.0，1.6Hz，1H)，1.45-1.19(m，3H)，1.15-1.08(m，18H)，1.05(s，6H)，0.95-0.87(m，9H)，0.15-0.08(m，6H)。
(f)(S)-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)甲酮(48)
在氩气气氛下，将三苯基胂(1.71g，5.60mmol，0.4当量)添加至三氟甲磺酸酯47(10.00g，14mmol，1当量)、甲基硼酸(2.94g，49.1mmol，3.5当量)、氧化银(13g，56mmol，4当量)和磷酸三钾(17.8g，84mmol，6当量)在无水二噁烷(80mL)中的混合物中。用氩气冲洗反应3次，并加入二(苯甲腈)氯化钯(II)(540mg，1.40mmol，0.1当量)。在瞬间升温至110℃之前，用氩气冲洗反应3次以上(添加烧瓶之前，将drysyn加热块升温至110℃)。10分钟后，将反应冷却至室温，并通过硅藻土滤板过滤。在减压下通过旋转蒸发除去溶剂。使得到残余物经受快速柱色谱(硅胶；10％乙酸乙酯/己烷)。收集并合并纯的部分，并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以提供产物48(4.5g，55％)。LC/MS，4.27min(ES+)m/z(相对强度)579.18([M+H]+.，100)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.70(s，1H)，6.77(s，1H)，5.51(d，J＝1.7Hz，1H)，4.77-4.59(m，1H)，3.89(s，3H)，2.92-2.65(m，1H)，2.55(d，J＝14.8Hz，1H)，1.62(d，J＝1.1Hz，3H)，1.40-1.18(m，3H)，1.11(s，9H)，1.10(s，9H)，0.90(s，9H)，0.11(d，J＝2.3Hz，6H)。
(g)(S)-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(49)
在大约15℃，将锌粉(28g，430mmol，37当量)添加至化合物48(6.7g，11.58mmol)在5％甲酸在乙醇v/v(70mL)中的溶液中。使用冰浴控制产生的放热以将反应混合物的温度保持在30℃以下。30分钟之后，通过硅藻土滤板过滤反应混合物。用乙酸乙酯稀释滤液，用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤有机相。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发去除过量溶剂。使得到的残留经受快速柱色谱(硅胶；己烷中10％乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分，并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂以提供产物49(5.1g，80％)。LC/MS，4.23min(ES+)m/z(相对强度)550.21([M+H]+，100)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.28(s，1H)，6.67(s，1H)，6.19(s，1H)，4.64-4.53(m，J＝4.1Hz，1H)，4.17(s，1H)，3.87(s，1H)，3.77-3.69(m，1H)，3.66(s，3H)，2.71-2.60(m，1H)，2.53-2.43(m，1H)，2.04-1.97(m，J＝11.9Hz，1H)，1.62(s，3H)，1.26-1.13(m，3H)，1.08-0.99(m，18H)，0.82(s，9H)，0.03-0.03(m，J＝6.2Hz，6H)。
(ii)(11S,11aS)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-((5-碘代戊基)氧基)-
7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-10
(5H)-羧酸烯丙基酯
(a)(S)-(2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸烯丙基酯(50)
在-78℃(丙酮/干冰浴)下，在存在无水吡啶(0.48mL，6.00mmol，2.2当量)的情况下，将氯甲酸烯丙酯(0.30mL，3.00mmol，1.1当量)添加至胺49(1.5g，2.73mmol)在无水二氯甲烷(20mL)中的溶液中。30分钟后，除去所述浴，并将反应混合物加热至室温。用二氯甲烷稀释反应混合物，并添加饱和的硫酸铜水溶液。然后顺序用饱和的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤有机层。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂以提供产物50，所得产物50直接在下一反应中使用。LC/MS，4.45min(ES+)m/z(相对强度)632.91([M+H]+，100)。
(b)(S)-(2-(2-(羟基甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸烯丙基酯(51)
将粗产物50溶解在乙酸/甲醇/四氢呋喃/水(28:4:4:8mL)的7:1:1:2混合物中，并在室温下搅拌。3小时后，通过LC/MS观察起始材料完全消失。用乙酸乙酯稀释反应混合物，并依次用水(2×500mL)、饱和碳酸氢钠(200mL)和盐水洗涤。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶；己烷中25％乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以提供期望的产物51(1g，71％)。LC/MS，3.70min(ES+)m/z(相对强度)519.13([M+H]+.，95)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(s，1H)，7.69(s，1H)，6.78(s，1H)，6.15(s，1H)，5.95(ddt，J＝17.2，10.5，5.7Hz，1H)，5.33(dq，J＝17.2，1.5Hz，1H)，5.23(ddd，J＝10.4，2.6，1.3Hz，1H)，4.73(tt，J＝7.8，4.8Hz，1H)，4.63(dt，J＝5.7，1.4Hz，2H)，4.54(s，1H)，3.89-3.70(m，5H)，2.87(dd，J＝16.5，10.5Hz，1H)，2.19(dd，J＝16.8，4.6Hz，1H)，1.70(d，J＝1.3Hz，3H)，1.38-1.23(m，3H)，1.12(s，10H)，1.10(s，8H)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(52)
在氩气氛下，在-78℃(干冰/丙酮浴)下，将二甲亚砜(0.35mL，4.83mmol，2.5当量)逐滴添加至草酰氯(0.2mL，2.32mmol，1.2当量)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中。10分钟后，仍然在-78℃，缓慢添加51(1g，1.93mmol)在无水二氯甲烷(8mL)中的溶液。15分钟后，逐滴添加三乙胺(1.35mL，通过分子筛干燥，9.65mmol，5当量)并除去干冰/丙酮浴。使反应混合物达到室温并用冷盐酸(0.1M)、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水萃取。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供产物52(658mg，66％)。LC/MS，3.52min(ES+)m/z(相对强度)(400MHz，CDCl3)δ7.20(s，1H)，6.75-6.63(m，J＝8.8，4.0Hz，2H)，5.89-5.64(m，J＝9.6，4.1Hz，2H)，5.23-5.03(m，2H)，4.68-4.38(m，2H)，3.84(s，3H)，3.83-3.77(m，1H)，3.40(s，1H)，3.05-2.83(m，1H)，2.59(d，J＝17.1Hz，1H)，1.78(d，J＝1.3Hz，3H)，1.33-1.16(m，3H)，1.09(d，J＝2.2Hz，9H)，1.07(d，J＝2.1Hz，9H)。
(d)(11S,11aS)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(53)
在氩气下，在0℃将叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.70mL，3.00mmol，3当量)添加至化合物52(520mg，1.00mmol)和2,6-二甲基吡啶(0.46mL，4.00mmol，4当量)在无水二氯甲烷(40mL)中的溶液中。10min后，除去冷浴并且在室温下搅拌反应混合物1小时。用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水萃取反应混合物。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂。使得到的残留经受快速柱色谱(硅胶；梯度，己烷中10％乙酸乙酯至己烷中20％乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以得到产物53(540mg，85％)。LC/MS，4.42min(ES+)m/z(相对强度)653.14([M+Na]+.，100)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.20(s，1H)，6.71-6.64(m，J＝5.5Hz，2H)，5.83(d，J＝9.0Hz，1H)，5.80-5.68(m，J＝5.9Hz，1H)，5.14-5.06(m，2H)，4.58(dd，J＝13.2，5.2Hz，1H)，4.36(dd，J＝13.3，5.5Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.71(td，J＝10.1，3.8Hz，1H)，2.91(dd，J＝16.9，10.3Hz，1H)，2.36(d，J＝16.8Hz，1H)，1.75(s，3H)，1.31-1.16(m，3H)，1.12-1.01(m，J＝7.4，2.1Hz，18H)，0.89-0.81(m，9H)，0.25(s，3H)，0.19(s，3H)。
(e)(11S,11aS)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(54)
将醋酸锂(87mg，0.85mmol)添加至化合物53(540mg，0.85mmol)在含水二甲基甲酰胺(6mL，50:1DMF/水)中的溶液中。4小时后，反应完全，用乙酸乙酯(25mL)稀释反应混合物并用柠檬酸水溶液(约pH 3)、水和盐水洗涤。用硫酸镁干燥有机层，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶；梯度，己烷中25％至75％乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以得到产物54(400mg，定量)。LC/MS，(3.33min(ES+)m/z(相对强度)475.26([M+H]+，100)。
(f)(11S,11aS)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-((5-碘代戊基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(55)
将二碘戊烷(0.63mL、4.21mmol、5当量)和碳酸钾(116mg、0.84mmol、1当量)添加至苯酚54(400mg、0.84mmol)在丙酮(4mL、用分子筛干燥)中的溶液中。然后，将反应混合物加热至60℃并搅拌6小时。在减压下通过旋转蒸发除去丙酮。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶；50/50，v/v，己烷/乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分并除去过量洗脱液以提供90％产率的55。LC/MS，3.90min(ES+)m/z(相对强度)670.91([M]+，100)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.23(s，1H)，6.69(s，1H)，6.60(s，1H)，5.87(d，J＝8.8Hz，1H)，5.83-5.68(m，J＝5.6Hz，1H)，5.15-5.01(m，2H)，4.67-4.58(m，1H)，4.45-4.35(m，1H)，4.04-3.93(m，2H)，3.91(s，3H)，3.73(td，J＝10.0，3.8Hz，1H)，3.25-3.14(m，J＝8.5，7.0Hz，2H)，2.92(dd，J＝16.8，10.3Hz，1H)，2.38(d，J＝16.8Hz，1H)，1.95-1.81(m，4H)，1.77(s，3H)，1.64-1.49(m，2H)，0.88(s，9H)，0.25(s，3H)，0.23(s，3H)。
(iii)(11S,11aS)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲
基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-10(5H)-羧酸4-(2-
(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊烷-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)肼基)苄基
酯(70)
(a)3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)肼基)丙氨基)-4-甲基-2-氧代戊酸烯丙基酯(56)
在5℃(冰浴)，将三乙胺(2.23mL，18.04mmol，2.2当量)添加至胺49(4g，8.20mmol)和三光气(778mg，2.95mmol，0.36当量)在无水四氢呋喃(40mL)中的搅拌溶液中。通过从反应混合物间歇移除部分，用甲醇终止并进行LC/MS分析来监测异氰酸酯反应的进展。一旦异氰酸酯的形成完成，则通过注射将alloc-Val-Ala-PABOH(4.12g，12.30mmol，1.5当量)和三乙胺(1.52ml，12.30mmol，1.5当量)在无水四氢呋喃(40mL)中的溶液快速添加至新鲜制备的异氰酸酯中。然后在40℃搅拌反应混合物4小时。在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶，梯度，氯仿中1％甲醇至5％甲醇)。(使用EtOAc和己烷的替代色谱条件也是成功的)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以得到产物56(3.9g，50％)。LC/MS，4.23min(ES+)m/z(相对强度)952.36([M+H]+.，100)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.62(br s，1H)，8.46(s，1H)，7.77(br s，1H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(d，J＝8.5Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.57(d，J＝7.6Hz，1H)，6.17(s，1H)，6.03-5.83(m，1H)，5.26(dd，J＝33.8，13.5Hz，3H)，5.10(s，2H)，4.70-4.60(m，2H)，4.58(dd，J＝5.7，1.3Hz，2H)，4.06-3.99(m，1H)，3.92(s，1H)，3.82-3.71(m，1H)，3.75(s，3H)，2.79-2.64(m，1H)，2.54(d，J＝12.9Hz，1H)，2.16(dq，J＝13.5，6.7Hz，1H)，1.67(s，3H)，1.46(d，J＝7.0Hz，3H)，1.35-1.24(m，3H)，1.12(s，9H)，1.10(s，9H)，0.97(d，J＝6.8Hz，3H)，0.94(d，J＝6.8Hz，3H)，0.87(s，9H)，0.07-0.02(m，6H)。
(b)3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(羟基甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)肼基)丙氨基)-4-甲基-2-氧代戊酸烯丙基酯(57)
将TBS醚56(1.32g，1.38mmol)溶解在乙酸/甲醇/四氢呋喃/水(14:2:2:4mL)的7:1:1:2混合物中并允许在室温下搅拌。3小时后，通过LC/MS观察不到起始材料。用乙酸乙酯(25mL)稀释反应混合物并顺序用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。使得到的残留物进行快速柱色谱(硅胶；2％甲醇/二氯甲烷)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以提供所需的产物57(920mg，80％)。LC/MS，3.60min(ES+)m/z(相对强度)838.18([M+H]+.，100)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.55(s，1H)，8.35(s，1H)，7.68(s，1H)，7.52(d，J＝8.1Hz，2H)，7.31(d，J＝8.4Hz，2H)，6.77(s，1H)，6.71(d，J＝7.5Hz，1H)，6.13(s，1H)，5.97-5.82(m，J＝5.7Hz，1H)，5.41-5.15(m，3H)，5.10(d，J＝3.5Hz，2H)，4.76-4.42(m，5H)，4.03(t，J＝6.6Hz，1H)，3.77(s，5H)，2.84(dd，J＝16.7，10.4Hz，1H)，2.26-2.08(m，2H)，1.68(s，3H)，1.44(d，J＝7.0Hz，3H)，1.30(dt，J＝14.7，7.4Hz，3H)，1.12(s，9H)，1.10(s，9H)，0.96(d，J＝6.8Hz，3H)，0.93(d，J＝6.8Hz，3H)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊烷-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)肼基)苄基酯(58)
在氩气氛下，在-78℃(干冰/丙酮浴)将二甲亚砜(0.2mL，2.75mmol，2.5当量)逐滴添加至草酰氯(0.11mL，1.32mmol，1.2当量)在无水二氯甲烷(7mL)中的溶液中。10分钟后，仍然在-78℃，缓慢添加57(920mg，1.10mmol)在无水二氯甲烷(5mL)中的溶液。15分钟后，逐滴添加三乙胺(0.77mL，通过分子筛干燥，5.50mmol，5当量)并除去干冰/丙酮浴。使反应混合物达到室温并用冷盐酸(0.1M)、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水萃取。通过硫酸镁干燥有机相，过滤并且在减压下通过旋转蒸发去除过量的二氯甲烷。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶，梯度，二氯甲烷中2％甲醇至5％甲醇)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以提供产物58(550mg，60％)。LC/MS，3.43min(ES+)m/z(相对强度)836.01([M]+，100)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.39(s，1H)，7.52-7.40(m，2H)，7.21-7.08(m，J＝11.5Hz，2H)，6.67(s，1H)，6.60-6.47(m，J＝7.4Hz，1H)，5.97-5.83(m，1H)，5.79-5.66(m，1H)，5.38-4.90(m，6H)，4.68-4.52(m，J＝18.4，5.5Hz，4H)，4.04-3.94(m，J＝6.5Hz，1H)，3.87-3.76(m，5H)，3.00-2.88(m，1H)，2.66-2.49(m，2H)，2.21-2.08(m，2H)，1.76(s，3H)，1.45(d，J＝7.0Hz，3H)，1.09-0.98(m，J＝8.9Hz，18H)，0.96(d，J＝6.7Hz，3H)，0.93(d，J＝6.9Hz，3H)。
(d)(11S,11aS)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊烷-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)肼基)苄基酯(59)
在氩气下，在0℃将叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.38mL，1.62mmol，3当量)添加至化合物58(450mg，0.54mmol)和2,6-二甲基吡啶(0.25mL，2.16mmol，4当量)在无水二氯甲烷(5mL)中的溶液中。10min后，除去冷浴并且在室温下搅拌反应混合物1小时。用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水萃取反应混合物。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂。使得到的残留经受快速柱色谱(硅胶；50/50v/v己烷/乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以得到产物59(334mg，65％)。LC/MS，4.18min(ES+)m/z(相对强度)950.50([M]+，100)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.53(s，1H)，8.02(s，1H)，7.44(d，J＝7.6Hz，2H)，7.21(s，1H)，7.08(d，J＝8.2Hz，2H)，6.72-6.61(m，J＝8.9Hz，2H)，6.16(s，1H)，5.97-5.79(m，J＝24.4，7.5Hz，2H)，5.41-5.08(m，5H)，4.86(d，J＝12.5Hz，1H)，4.69-4.60(m，1H)，4.57(s，1H)，4.03(t，J＝6.7Hz，1H)，3.87(s，3H)，3.74(td，J＝9.6，3.6Hz，1H)，2.43-2.09(m，J＝34.8，19.4，11.7Hz，3H)，1.76(s，3H)，1.43(d，J＝6.9Hz，3H)，1.30-1.21(m，3H)，0.97(d，J＝6.7Hz，3H)，0.92(t，J＝8.4Hz，3H)，0.84(s，9H)，0.23(s，3H)，0.12(s，3H)。
(e)(11S,11aS)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊烷-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)肼基)苄基酯(60)
将醋酸锂(50mg，0.49mmol)添加至化合物59(470mg，0.49mmol)在含水二甲基甲酰胺(4mL，50:1DMF/水)中的溶液中。4小时后，反应完全，用乙酸乙酯稀释反应混合物并用柠檬酸(约pH 3)、水和盐水洗涤。用硫酸镁干燥有机层，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶；梯度，50/50至25/75v/v己烷/乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以得到产物60(400mg，定量)。LC/MS，3.32min(ES+)m/z(相对强度)794.18([M+H]+，100)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.53(s，1H)，8.02(s，1H)，7.44(d，J＝7.6Hz，2H)，7.21(s，1H)，7.08(d，J＝8.2Hz，2H)，6.72-6.61(m，J＝8.9Hz，2H)，6.16(s，1H)，5.97-5.79(m，J＝24.4，7.5Hz，2H)，5.41-5.08(m，5H)，4.86(d，J＝12.5Hz，1H)，4.69-4.60(m，1H)，4.57(s，1H)，4.03(t，J＝6.7Hz，1H)，3.87(s，3H)，3.74(td，J＝9.6，3.6Hz，1H)，2.43-2.09(m，J＝34.8，19.4，11.7Hz，3H)，1.76(s，3H)，1.43(d，J＝6.9Hz，3H)，1.30–1.21(m，3H)，0.97(d，J＝6.7Hz，3H)，0.92(t，J＝8.4Hz，3H)，0.84(s，9H)，0.23(s，3H)，0.12(s，3H)。
(iv)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,
11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-
氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-10(5H)-羧酸4-((2S,5S)-
37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,
19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷氨基)苄基酯(64)((11S,11aS)-4-((2S,
5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-5-isopropyl-2-methyl-4,7,35-
trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triazaheptatri acontanamido)
benzyl11-hydroxy-7-methoxy-8-((5-(((S)-7-methoxy-2-methyl-5-oxo-5,11a-
dihydro-1H-benzo[e]pyrrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-yl)oxy)pentyl)oxy)-2-methyl-
5-oxo-11,11a-dihydro-1H-benzo[e]pyrrolo[1,2-a][1,4]diazepine-10(5H)-
carboxylate)
(a)(11S)-8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊烷-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)肼基)苄基)氧基)羰基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)戊基)氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(61)
将碳酸钾(70mg，0.504mmol，1当量)添加至55(370mg，0.552mmol，1.2当量)和苯酚60(400mg，0.504mmol)在干燥丙酮(25mL)中的溶液中。在70℃搅拌反应8小时。LC/MS示出所有起始材料未消耗，因此使反应在室温下搅拌过夜并在第二天再搅拌2小时。在减压下通过旋转蒸发除去丙酮。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶；己烷中80％乙酸乙酯至100％乙酸乙酯)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以得到产物61(385mg，57％)。LC/MS，4.07min(ES+)m/z(相对强度)1336.55([M+H]+，50)。
(b)(11S)-8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊烷-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)肼基)苄基)氧基)羰基)-11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)戊基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(62)
将四正丁胺氟化物(1M，0.34mL，0.34mmol，2当量)添加至61(230mg，0.172mmol)在无水四氢呋喃(3mL)中的溶液中。10分钟后，起始材料被全部耗尽。用乙酸乙酯(30mL)稀释反应混合物并用水和盐水顺序洗涤。用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。将得到的残留物62用作下一反应的粗混合物。LC/MS，42.87min(ES+)m/z(相对强度)1108.11([M+H]+，100)。
(c)(11S)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-((7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-(2-(1-((1-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)肼基)苄基酯(63)
将四(三苯基膦)钯(0)(12mg，0.01mmol，0.06当量)添加至粗62(0.172mmol)和吡咯烷(36μL，0.43mmol，2.5当量)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中。搅拌反应混合物20分钟并用二氯甲烷稀释，以及顺序用饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤。使用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发去除过量的二氯甲烷。将得到的残留物63用作下一反应的粗混合物。LC/MS，42.38min(ES+)m/z(相对强度)922.16([M+H]+，40)。
(d)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷氨基)苄基酯(64)
将1-乙基-3-(3’-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDCI，33mg，0.172mmol)添加至粗63(0.172mmol)和Mal-(PEG)8-酸(100mg，0.172mmol)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中。搅拌反应2小时并且通过LC/MS不能再观察到起始材料的存在。用二氯甲烷稀释反应并用水和盐水顺序洗涤。使用硫酸镁干燥有机相，过滤并在减压下通过旋转蒸发去除过量的二氯甲烷。使得到的残留物经受快速柱色谱(硅胶，100％氯仿至氯仿中10％甲醇)。收集并合并纯的部分并在减压下通过旋转蒸发除去过量洗脱液以提供64(E)(60mg，3步产率为25％)。
实施例8
化合物65是WO 2011/130598的化合物79。
(11S)-11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-(1-碘代-20-异丙基-23-甲基-2,18,21-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19,22-三氮杂二十四烷氨基)苄基酯(66)((11S)-4-(1-iodo-20-isopropyl-23-methyl-2,18,21-trioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3,19,22-triazatetracosanamido)benzyl11-hydroxy-7-methoxy-8-(3-((7-methoxy-5-oxo-2-((E)-prop-1-en-1-yl)-5,11a-dihydro-1H-benzo[e]pyrrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-yl)oxy)propoxy)-5-oxo-2-((E)-prop-1-en-1-yl)-11,11a-dihydro-1H-benzo[e]pyrrolo[1,2-a][1,4]diazepine-10(5H)-carboxylate)
将N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC，4.71μL，0.0304mmol)添加至胺65(0.0276mmol)和碘代-(PEG)4-酸(13.1mg，0.0304mmol)在无水二氯甲烷(0.8mL)中的溶液中。搅拌反应3小时并且通过LC/MS不能再观察到起始材料的存在。将反应混合物直接负载至薄层色谱(TLC)板上并通过prep-TLC(氯仿中10％甲醇)纯化。从TLC板上刮下纯带，提取在氯仿中10％甲醇中，过滤并在减压下通过旋转蒸发除去过量溶剂以得到66(D)(20.9mg，56％)。LC/MS，方法2，3.08min(ES+)m/z(相对强度)1361.16([M+H]+，100)。
实施例9的通用实验方法
利用具有Agilent 6110四极MS的Agilent 1200系列LC/MS，用电喷射离子化来获得LCMS数据。流动相A–在水中的0.1％乙酸。流动相B–在乙腈中的0.1％。流速为1.00ml/分钟。梯度为经3分钟从5％B上升到95％B，保持在95％B下1分钟，然后经6秒回落到5％B。总运行时间是5分钟。柱：Phenomenex Gemini-NX 3μm C18，30×2.00mm。基于在254nm处的UV检测的层析图。利用MS并以阳离子模式(positive mode)来获得质谱。基于δ尺度以400MHz使用Bruker AV400，来测量质子NMR化学位移值。已使用了以下缩写词：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽。以Hz为单位来报告偶合常数。除非另有说明，用MerckKieselgel硅石(Art.9385)进行柱层析(通过快速程序)。利用偶合于Waters 2795HPLC分离模块的Waters Micromass LCT仪器来采集质谱法(MS)数据。用硅胶铝板(Merck 60,F254)进行薄层层析(TLC)。所有其他化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich或Fisher Scientific并且如供应的使用而没有进一步的纯化。
用ADP 220旋光仪(Bellingham Stanley Ltd.)来测量旋光度(Opticalrotation)并以g/100mL为单位来给出浓度(c)。利用数字熔点仪(Electrothermal)来测量熔点。用Perkin-Elmer Spectrum 1000FT IR分光计来记录IR谱。在300K下使用BrukerAvance NMR分光计，分别在400和100MHz处获得1H和13C NMR谱。相对于TMS(δ＝0.0ppm)来报告化学位移，并且信号被指定为s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、dt(双三重峰)、dd(双峰的双峰)、ddd(双峰的双双峰)或m(多重峰)，并以赫兹(Hz)为单位给出偶合常数。利用偶合于具有Waters 2996PDA的Waters 2695HPLC的Waters MicromassZQ仪器来采集质谱法(MS)数据。使用的Waters Micromass ZQ参数是：毛细压力(kV)，3.38；锥体(V)，35；提取器(V)，3.0；源温度(℃)，100；去溶剂化温度(℃)，200；锥体流动速率(L/h)，50；去溶剂化流速(L/h)，250。用Waters Micromass QTOF Global并以阳离子W模式来记录高分辨率质谱法(HRMS)数据，其中利用金属涂覆的硼硅玻璃尖端来将样品引入仪器。用硅胶铝板(Merck60,F254)进行薄层层析(TLC)，并且用硅胶(Merck 60,230-400目ASTM)来进行快速层析。除HOBt(NovaBiochem)和固体支持剂(Argonaut)之外，所有其他化学品和溶剂均购自Sigma-Aldrich并如供应的使用而没有进一步的纯化。在干燥氮气气氛下，在有适当干燥剂存在的条件下，通过蒸馏来制备无水溶剂，并在分子筛或钠线上存储。石油醚是指在40-60℃沸腾的馏分。
一般的LC/MS条件：使用水(A)(甲酸0.1％)和乙腈(B)(甲酸0.1％)的流动相运行HPLC(Waters Alliance 2695)。梯度：初始成分5％B，经1.0分钟，然后在3分钟内5％B到95％B。在95％B下，保持组成0.5分钟，原来在0.3分钟内回到5％B。总梯度运行时间等于5分钟。流速为3.0mL/分钟，经由零死体积T形管来分开400μL，其被通入质谱仪。波长检测范围：220至400nm。功能类型：二极管阵列(535扫描)。柱： Onyx MonolithicC1850×4.60mm。
实施例9
(i)主要中间体
(a)
(a-i)(S)-2-(烯丙氧羰基氨基)-3-甲基丁酸(I2)
将氯甲酸烯丙酯(36.2mL，340.59mmol，1.2当量)逐滴添加至L-缬氨酸(I1)(33.25g，283.82mmol，1.0当量)和碳酸钾(59.27g，425.74mmol，1.5当量)在水(650mL)和THF(650mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌18小时，然后减压浓缩溶剂并用二乙醚(3×100mL)萃取剩余溶液。用浓HCl将水性部分酸化至pH 2并用DCM(3×100mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机物，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩以提供为无色油的产物(57.1g，假定产率100％)。LC/MS(1.966min(ES+))，m/z：202.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.57(br s，1H)，7.43(d，1H，J＝8.6Hz)，5.96–5.86(m，1H)，5.30(ddd，1H，J＝17.2，3.4，1.7Hz)，5.18(ddd，1H，J＝10.4，2.9，1.6Hz)，4.48(dt，2H，J＝5.3，1.5Hz)，3.85(dd，1H，J＝8.6，6.0Hz)，2.03(oct，1H，J＝6.6Hz)，0.89(d，3H，J＝6.4Hz)，0.87(d，3H，J＝6.5Hz)。
(a-ii)(S)-2-(烯丙氧羰基氨基)-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(I3)
向保护的酸I2(60.6g，301.16mmol，1.0当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(34.66g，301.16mmol，1.0当量)在无水THF(800mL)中的搅拌溶液中添加二环己基碳二亚胺(62.14g，301.16mmol，1当量)。在室温下将反应搅拌18小时。然后过滤反应混合物，用THF洗涤固体并在减压下浓缩合并的滤液。将残留重新溶解在DCM中并在0℃使其静置30分钟。过滤悬浮液并用冷DCM洗涤。在减压下浓缩的滤液提供了为粘稠无色油的产物(84.7g，假定100％产率)，无需进一步纯化将其用于下一步骤。LC/MS(2.194min(ES+))，m/z：321.0[M+Na]+。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.0(d，1H，J＝8.3Hz)，5.97-5.87(m，1H)，5.30(ddd，1H，J＝17.2，3.0，1.7Hz)，5.19(ddd，1H，J＝10.4，2.7，1.4Hz)，4.52(dt，2H，J＝5.3，1.4Hz)，4.32(dd，1H，J＝8.3，6.6Hz)，2.81(m，4H)，2.18(oct，1H，J＝6.7Hz)，1.00(d，6H，J＝6.8Hz)，
(a-iii)(S)-2-((S)-2-(烯丙氧羰基氨基)-3-甲基丁氨基)丙酸(I4)
将琥珀酰亚胺酯I3(12.99g，43.55mmol，1.0当量)在THF(50mL)中的溶液添加至L-丙氨酸(4.07g，45.73mmol，1.05当量)和NaHCO3(4.02g，47.90mmol，1.1当量)在THF(100mL)和H2O(100mL)中的溶液中。当在减压下除去THF时，在室温下将混合物搅拌72小时。用柠檬酸将pH调节至3-4以沉淀白色胶(gum)。用乙酸乙酯(6×150mL)萃取后，用H2O(200mL)洗涤合并的有机物，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。用二乙醚研制以提供为白色粉末的产物并通过过滤和用二乙醚(5.78g，49％)洗涤收集所述产物。LC/MS(1.925min(ES+))，m/z：273.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.47(br s，1H)，8.17(d，1H，J＝6.8Hz)，7.16(d，1H，J＝9.0Hz)，5.95-5.85(m，1H)，5.29(dd，1H，J＝17.2，1.7Hz)，5.17(dd，1H，J＝10.4，1.5Hz)，4.46(m，2H)，4.18(quin，1H，J＝7.2Hz)，3.87(dd，1H，J＝9.0，7.1Hz)，1.95(oct，1H，J＝6.8Hz)，1.26(d，3H，J＝7.3Hz)，0.88(d，3H，J＝6.8Hz)，0.83(d，3H，J＝6.8Hz)
(a-iv)(S)-1-((S)-1-(4-(羟甲基)苯氨基)-1-氧代丙-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸烯丙基酯(I5)
将EEDQ(5.51g，22.29mmol，1.05当量)添加至对氨基苄醇(2.74g，22.29mmol，1.05当量)和酸I4(5.78g，21.23mmol，1当量)在无水THF(100mL)中的溶液中并在室温下搅拌72小时。然后，减压浓缩反应混合物并用二乙醚研制所得的棕色固体并过滤，随后用过量的二乙醚洗涤以提供为灰白色固体的产物(7.1g，88％)。LC/MS(1.980min(ES+))，m/z：378.0[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.89(br s，1H)，8.13(d，1H，J＝7.0Hz)，7.52(d，2H，J＝8.5Hz)，7.26(m，1H)，7.23(d，2H，J＝8.5Hz)，5.91(m，1H)，5.30(m，1H)，5.17(m，1H)，4.46(m，2H)，5.09(t，1H，J＝5.6Hz)，4.48(m，2H)，4.42(m，3H)，3.89(dd，1H，J＝8.6，6.8Hz)，1.97(m，1H)，1.30(d，3H，J＝7.1Hz)，0.88(d，3H，J＝6.8Hz)，0.83(d，3H，J＝6.7Hz)。
(b)
1-碘代-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(I7)
将碘代乙酸酐(0.250g，0.706mmol，1.1当量)在无水DCM(1mL)中的溶液添加至氨基-PEG(4)-酸I6(0.170g，0.642mmol，1.0当量)在DCM(1mL)中的溶液中。在室温下在暗处搅拌混合物过夜。用0.1M HCl、水洗涤反应混合物，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(硅胶，3％甲醇和0.1％甲酸在氯仿中的溶液至10％甲醇和0.1％甲酸在氯仿中的溶液)纯化残余物以提供为橙色油的产物(0.118g，42％)。LC/MS(1.623min(ES+))，m/z：433.98[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.069(s，1H)，7.22(br s，1H)，3.79(t，2H，J＝5.8Hz)，3.74(s，2H)，3.72-3.58(m，14H)，3.50-3.46(m，2H)，2.62(t，2H，J＝5.8Hz)。
(ii)(11S,11aS)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-8-(3-碘代丙氧基)-7-甲氧基-
5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-10
(5H)-羧酸烯丙基酯(74)
(a)(S)-三氟甲磺酸5-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-(三异丙基甲硅烷氧基)苯甲酰基)-4,5-二氢-1H-吡咯-3-基酯(47)
在-50℃，将三氟甲磺酸酐(28.4g，100.0mmol，3.0当量)在25分钟内逐滴添加至剧烈搅拌的含有2,6-二甲基吡啶(14.4g，130.0mmol，4.0当量)的酮46(19.5g，30.0mmol，1.0当量)在DCM(550mL)中的溶液中。搅拌反应混合物1.5小时，此时LC/MS指示反应完成。依次用水(100mL)、饱和碳酸氢钠(150mL)、盐水(50mL)洗涤有机相并用MgSO4干燥有机相，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，90/10v/v正己烷/EtOAc)纯化残留以提供为浅黄色油的产物(19.5g，82％)。LC/MS(4.391min(ES+))，m/z：713.25[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.68(s，1H)，6.72(s,1H)，6.02(t，1H，J＝1.9Hz)，4.75(m，1H)，4.05(m，2H)，3.87(s，3H)，3.15(ddd，1H，J＝16.2，10.3，2.3Hz)，2.96(ddd，1H，J＝16.2，4.0，1.6Hz)，1.28-1.21(m，3H)，1.07(d，18H，J＝7.2Hz)，0.88(s，9H)，0.09(s，3H)，0.08(s，3H)。
(b)(S,E)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基)甲酮(67)
在氮气气氛下，将四(三苯基膦)钯(0)(0.41g，0.35mmol，0.03当量)添加至三氟甲磺酸酯47(8.4g，11.8mmol，1.0当量)、E-1-丙烯-1-基硼酸(1.42g，16.5mmol，1.4当量)和磷酸钾(5.0g，23.6mmol，2.0当量)在无水二噁烷(60mL)中的混合物中。在25℃，搅拌混合物120分钟，此时LC/MS显示反应完全。加入乙酸乙酯(120mL)和水(120mL)，除去有机相，用盐水(20mL)洗涤，用MgSO4干燥，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，95/5v/v正己烷/EtOAc至90/10v/v正己烷/EtOAc)纯化残留以提供为黄色泡沫的产物(4.96g，70％)。LC/MS(4.477min(ES+))，m/z：605.0[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.67(s，1H)，6.74(s，1H)，5.93(d，1H，J＝15.4Hz)，5.67(s，1H)，4.65(m，1H)，4.04(m，2H)，3.86(s，3H)，2.85(m，1H)，2.71(m，1H)，1.72(dd，3H，J＝6.8，1.0Hz)，1.30-1.22(m，3H)，1.07(d，18H，J＝7.2Hz)，0.87(s，9H)，0.08(s，3H)，0.07(s，3H)。
(c)(S,E)-(2-氨基-5-甲氧基-4-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基)(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(68)
使用冰浴将温度维持在25-30℃之间，在20分钟内，将锌粉(22.0g，0.33mol，37当量)部分添加至丙烯基中间体67(5.5g，9.1mmol，1.0当量)在5％v/v甲酸/乙醇(55mL)中的溶液中。30分钟后，通过硅藻土的短床层过滤反应混合物。用乙酸乙酯(65mL)洗涤硅藻土并依次用水(35mL)、饱和碳酸氢钠(35mL)和盐水(10mL)洗涤合并的有机相。用MgSO4干燥有机相，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，90/10v/v正己烷/EtOAc)纯化残留以提供为浅黄色油的产物(3.6g，69.0％)。LC/MS(4.439min(ES+))，m/z：575.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.75(m，1H)，6.40(br s，1H)，6.28(m，1H)，6.11(d，1H，J＝15.4Hz)，5.53(m，1H)，4.67(m，1H)，4.36(m，2H)，3.93(br s，1H)，3.84(br s，1H)，3.73(s，3H)，2.86(dd，1H，J＝15.7，10.4Hz)，2.73(dd，1H，J＝15.9，4.5Hz)，1.80(dd，3H，J＝6.8，1.3Hz)，1.35-1.23(m，3H)，1.12(d，18H，J＝7.3Hz)，0.89(s，9H)，0.08(s，3H)，0.07(s，3H)。
(d)(S,E)-2-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基氨基甲酸烯丙基酯(69)
在-78℃，将氯甲酸烯丙酯(0.83g，6.88mmol，1.1当量)添加至含有无水吡啶(1.09g，13.77mmol，2.2当量)的胺68(3.6g，6.26mmol，1.0当量)在无水DCM(80mL)中的溶液中。除去干冰并将反应混合物升温至室温。再搅拌15分钟后，LC/MS显示反应完全。依次用0.01N HCl(50mL)、饱和碳酸氢钠(50mL)、盐水(10mL)洗涤有机相，用MgSO4干燥，减压过滤并浓缩以产生浅黄色油，所述油不用进一步纯化而用于下一步(4.12g，假定产率100％)。LC/MS(4.862min(ES+))，m/z：659.2[M+H]+。
(e)(S,E)-2-(2-(羟基甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基氨基甲酸烯丙基酯(70)
将粗中间体69(假定产率100％，4.12g，6.25mmol，1.0当量)溶解在乙酸(70mL)、甲醇(10mL)、THF(10mL)和水(20mL)的混合物中并在室温下搅拌。6小时后，用乙酸乙酯(500mL)稀释反应混合物并依次用水(2×500mL)、饱和碳酸氢钠(300mL)和盐水(50mL)洗涤。用MgSO4干燥有机相，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，1/99v/v甲醇/DCM至5/95v/v甲醇/DCM)纯化残余物以提供为黄色油的产物并且回收了1g未反应的起始材料。使该材料经受与以上相同的反应条件，但是搅拌16h。在后处理和纯化后，分离另外的产物(2.7g，79％，2步)，LC/MS(3.742min(ES+)，m/z：545.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.38(m，1H)，7.72(m，1H)，6.81(s，1H)，6.37(m，1H)，6.10(d，1H，J＝15.8Hz)，5.97(m，1H)，5.53(m，1H)，5.36(ddd，1H，J＝17.2，3.1，1.5Hz)，5.25(ddd，1H，J＝10.4，2.5，1.3Hz)，4.78(m，1H)，4.65(dt，2H，J＝5.7，1.3Hz)，3.84(m，3H)，3.79(s，3H)，3.04(dd，1H，J＝16.7，10.5Hz)，2.40(dd，1H，J＝16.0，4.5Hz)，1.82(dd，3H，J＝6.8，1.0Hz)，1.36-1.26(m，3H)，1.14(d，18H，J＝7.3Hz)。
(f)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(71)
在氮气氛下，在-78℃将无水二甲亚砜(1.16g，14.87mmol，3.0当量)逐滴添加至草酰氯(0.94g，7.43mmol，1.5当量)在DCM(25mL)中的溶液中。将温度保持在-78℃，10分钟后，逐滴添加伯醇70(2.7g，4.96mmol，1.0当量)在DCM(20mL)中的溶液。另外15分钟后，加入无水三乙胺(2.5g，24.78mmol，5.0eq)并且将反应混合物加热到室温。依次用冷的0.1N的HCl(50ml)、饱和碳酸氢钠(50mL)、盐水(10mL)洗涤反应混合物并用MgSO4干燥有机层，减压过滤并浓缩以产生为黄色油的产物，所述产物不用进一步纯化而用于下一步(2.68g，假定产率100％)。LC/MS(3.548min(ES+))，m/z：543.2[M+H]+。
(g)(11S,11aS)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷基氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(72)
在氮气氛下，在0℃，将叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(3.93g，14.87mmol，3.0当量)添加至甲醇胺71(假定产率100％，2.68g，4.96mmol，1.0当量)和2,6-二甲基吡啶(2.12g，19.83mmol，4.0当量)在无水DCM(40mL)中的溶液中。10分钟后，将反应混合物加热到室温并另外搅拌60分钟。依次用水(10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)和盐水(5mL)洗涤有机相，用MgSO4干燥，减压过滤并浓缩。通过快速色谱法(硅胶，氯仿至2/98v/v醇/氯仿)纯化残余物以提供为黄色油的产物(2.0g，63％，2步)。LC/MS(4.748min(ES+))，m/z：657.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.19(s，1H)，6.86(m，1H)，6.66(s，1H)，6.22(d，1H，J＝15.4Hz)，5.81(d，1H，J＝8.8Hz)，5.78(m，1H)，5.48(m，1H)，5.11(d，1H，J＝5.0Hz)，5.08(m，1H)，4.58(dd，1H，J＝13.4，5.4Hz)，4.35(dd，1H，J＝13.2，5.7Hz)，3.83(s，3H)，3.76(s，1H)，3.00(dd，1H，J＝15.6，11.0Hz)，2.53(m，1H)，1.81(dd，3H，J＝6.8，0.9Hz)，1.30-1.18(m，3H)，1.08(d，9H，J＝2.3Hz)，1.06(d，9H，J＝2.3Hz)，0.86(s，9H)，0.25(s，3H)，0.18(s，3H)。
(h)(11S,11aS)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸烯丙基酯(73)
在25℃，将二水合醋酸锂(0.31g，3.04mmol，1.0eq)添加至二氮杂72(2.0g，3.04mmol，1.0eq)在含水DMF(20mL)中的溶液中并搅拌4小时。用乙酸乙酯(200mL)稀释反应混合物，依次用0.1M柠檬酸(50mL，pH 3)、水(50mL)和盐水(10mL)洗涤，用MgSO4干燥，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，50/50v/v正己烷/EtOAc至25/75v/v正己烷/EtOAc)纯化残留以提供浅黄色固体产物(0.68g，45％)。LC/MS(3.352min(ES+))，m/z：501.1[M+H]+。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.02(s，1H)，6.66(m，1H)，6.53(s，1H)，6.03(d，1H，J＝15.5Hz)，5.80(s，1H)，5.63(d，1H，J＝8.9Hz)，5.55(m，1H)，5.29(m，1H)，4.87(m，2H)，4.39(dd，1H，J＝13.5，4.2Hz)，4.20(dd，1H，J＝13.2，5.7Hz)，3.73(s，3H)，3.59(m，1H)，2.81(dd，1H，J＝16.1，10.5Hz)，2.35(d，1H，J＝15.7Hz)，1.61(d，3H，J＝6.4Hz)，0.67(s，9H)，0.05(s，3H)，0.00(s，3H)。
(i)(11S,11aS)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-8-(3-碘代丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(74)
将二碘丙烷(0.295g，1.00mmol，5.0当量)和碳酸钾(0.028g，0.20mmol，1.0当量)添加至苯酚33(0.100g，0.020mmol，1.0当量)在干燥丙酮(5ml)中的溶液中。将反应混合物在60℃加热6小时，此时LC/MS示出反应完全。将反应混合物在减压下浓缩至干燥并通过快速色谱(硅胶，75/25v/v正己烷/EtOAc至50/50v/v正己烷/EtOAc)纯化残留物以提供为无色油的产物(0.074g，56％)。LC/MS(3.853min(ES+))，m/z：669.0[M+H]+。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.26(s，1H)，6.90(s，1H)，6.68(s，1H)，6.24(d，1H，J＝15.3Hz)，5.87(d，1H，J＝8.9Hz)，5.78(m，1H)，5.53(m，1H)，5.12(m，2H)，4.65(m，2H)，4.41(m，1H)，4.11(m，1H)，3.93(s，3H)，3.81(m，1H)，3.40(t，2H，J＝6.7Hz)，3.05(dd，1H，J＝16.3，10.1Hz)，2.57(m，1H)，2.34(m，2H)，1.84(d，3H，J＝6.6Hz)，0.92(s，9H)，0.28(s，3H)，0.26(s，3H)。
(iii)(11S,11aS)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-
((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-10(5H)-羧酸
4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁氨基)丙氨基)苄基酯(79)
(a)((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙基酯(75)
在5℃(冰浴)下，将三乙胺(0.256ml，1.84mmol，2.2当量)添加至胺68(0.480g，0.835mmol，1.0当量)和三光气(0.089g，0.301mmol，0.36当量)在无水THF(15mL)中的搅拌溶液中。通过从反应混合物间歇移除部分，用甲醇终止并进行LCMS分析来监测异氰酸酯反应的进展。一旦异氰酸酯的反应完成，则通过注射将alloc-Val-Ala-PABOH I5(0.473g，1.25mmol，1.5当量)和三乙胺(0.174ml，1.25mmol，1.5当量)在无水THF(10mL)中的溶液快速添加至新鲜制备的异氰酸酯中。在40℃，将反应搅拌4小时，随后在室温下搅拌过夜。减压浓缩混合物并通过快速色谱(硅胶，20/80v/v正己烷/EtOAc至50/50v/v正己烷/EtOAc，然后1/99v/v DCM/MeOH至5/95v/v DCM/MeOH)纯化以提供黄色固体状产物(0.579g，71％)。LC/MS(4.468min(ES+))，m/z：978.55[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.63(br s，1H)，8.42(s，1H)，7.78(br s，1H)，7.53(d，2H，J＝8.1Hz)，7.31(d，2H，J＝8.6Hz)，6.76(s，1H)，6.59(d，1H，J＝7.6Hz)，6.36(br s，1H)，6.04(d，1H，J＝15.9Hz)，5.90(m，1H)，5.55(m，1H)，5.33-5.21(m，3H)，5.10(s，2H)，4.66(m，2H)，4.57(dd，2H，J＝5.6，1.0Hz)，3.98(dd，1H，J＝7.3，6.8Hz)，3.90(m，1H)，3.81(m，1H)，3.78(s，3H)，2.82(dd，1H，J＝15.4，9.6Hz)，2.72(dd，1H，J＝15.9，3.5Hz)，2.17(m，1H)，1.78(dd，3H，J＝6.5，0.8Hz)，1.46(d，3H，J＝7.1Hz)，1.29(m，3H)，1.11(d，18H，J＝7.1Hz)，0.97(d，3H，J＝6.8Hz)，0.92(d，3H，J＝6.8Hz)，0.83(s，9H)，0.04(s，3H)，0.01(s，3H)。
(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(羟甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙基酯(76)
将甲硅烷基醚75(1.49g，1.52mmol，1.0当量)溶解在乙酸/甲醇/四氢呋喃/水(14:2:2:4ml)的7:1:1:2混合物中并在室温下搅拌。2小时后，用EtOAc(100mL)稀释反应，依次用水、碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用盐水洗涤。然后用MgSO4干燥有机相，减压过滤并浓缩。通过快速色谱法(硅胶，100/0，然后99/1至92/8v/v DCM/甲醇)纯化残余物以提供为橙色固体的产物(1.2g，92％)。LC/MS(3.649min(ES+))，m/z：865.44[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.44(s，1H)，8.35(s，1H)，7.69(br s，1H)，7.53(d，2H，J＝8.7Hz)，7.32(d，2H，J＝8.3Hz)，6.78(s，1H)，6.56(m，2H)，6.32(brs，1H)，6.05(d，1H，J＝14.9Hz)，5.90(m，1H)，5.56(m，1H)，5.30(m，2H)，5.22(m，1H)，5.10(d，2H，J＝3.1Hz)，4.73(m，1H)，4.64(m，1H)，4.57(d，2H，J＝5.8Hz)，4.01(m，1H)，3.79(m，2H)，3.76(s，3H)，2.98(dd，1H，J＝16.3，10.2Hz)，2.38(dd，1H，J＝16.6，4.1Hz)，2.16(m，1H)，1.78(dd，3H，J＝6.8，0.9Hz)，1.46(d，3H，J＝7.1Hz)，1.29(m，3H)，1.11(d，18H，J＝7.4Hz)，0.97(d，3H，J＝6.7Hz)，0.92(d，3H，J＝6.8Hz)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁氨基)丙氨基)苄基酯(77)
在氮气氛下，在-78℃将无水二甲亚砜(0.180g，2.3mmol，3.0当量)逐滴添加至草酰氯(0.147g，1.1mmol，1.5当量)在DCM(10mL)中的溶液中。将温度维持在-78℃，20分钟后，逐滴添加伯醇76(0.666g，0.77mmol，1.0当量)在DCM(10mL)中的溶液。另外15分钟后，加入无水三乙胺(0.390g，3.85mmol，5.0当量)并且将反应混合物升温至室温。依次用冷的0.1N的HCl(10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)和盐水(5mL)洗涤反应混合物。然后用MgSO4干燥有机层，减压过滤并浓缩。然后通过快速色谱(硅胶，50/50v/v正己烷/EtOAc至25/75v/v正己烷/EtOAc)纯化残留以提供白色固体状产物(0.356g，54％)。LC/MS(3.487min(ES+))，m/z：862.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(br s，1H)，7.47(d，2H，J＝7.6Hz)，7.17(s，1H)，7.14(d，2H，J＝7.5Hz)，6.86(br s，1H)，6.65(br s，1H)，6.42(d，1H，J＝7.6Hz)，6.22(d，1H，J＝14.4Hz)，5.80(m，1H)，5.40(m，1H)，5.53(m，1H)，5.32(m，1H)，5.21(d，2H，J＝9.6Hz)，5.06(d，1H，J＝12.3Hz)，4.90(m，1H)，4.58(m，3H)，3.98(m，1H)，3.84(m，1H)，3.81(s，3H)，3.50(m，1H)，3.05(dd，1H，J＝16.0，10.3Hz)，2.76(m，1H)，2.15(m，1H)，1.80(dd，3H，J＝6.7，0.8Hz)，1.44(d，3H，J＝7.1Hz)，1.16(m，3H)，1.01(d，18H，J＝6.6Hz)，0.96(d，3H，J＝6.8Hz)，0.92(d，3H，J＝6.8Hz)。
(d)(11S,11aS)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁氨基)丙氨基)苄基酯(78)
在氮气氛下，在0℃，将叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.46g，1.74mmol，3.0当量)添加至仲醇77(0.5g，0.58mmol，1.0当量)和2,6-二甲基吡啶(0.25g，2.32mmol，4.0当量)在无水DCM(10mL)中的溶液中。10分钟后，将反应混合物加热到室温并另外搅拌120分钟。然后依次用水(10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)和盐水(5mL)洗涤有机相，用MgSO4干燥，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，50/50v/v正己烷/EtOAc)纯化残留以提供为白色固体的产物(0.320g，57％)。LC/MS(4.415min(ES+))，m/z：976.52[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.31(br s，1H)，7.48(d，2H，J＝8.0Hz)，7.21(s，1H)，7.14(d，2H，J＝8.3Hz)，6.89(s，1H)，6.65(s，1H)，6.38(d，1H，J＝7.3Hz)，6.25(d，1H，J＝14.6Hz)，5.93(m，1H)，5.85(d，1H，J＝8.8Hz)，5.50(m，1H)，5.34(m，1H)，5.24(m，2H)，5.15(d，1H，J＝12.5Hz)，4.86(d，1H，J＝12.2Hz)，4.62(m，3H)，4.01(m，1H)，3.86(s，3H)，3.78(m，1H)，3.04(m，1H)，2.56(m，1H)，2.20(m，1H)，1.84(dd，3H，J＝6.6，0.7Hz)，1.48(d，3H，J＝6.8Hz)，1.20(m，3H)，1.05(d，9H，J＝2.9Hz)，1.03(d，9H，J＝2.9Hz)，0.99(d，3H，J＝6.8Hz)，0.95(d，3H，J＝6.8Hz)，0.88(s，9H)，0.27(s，3H)，0.14(s，3H)。
(e)(11S,11aS)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁氨基)丙氨基)苄基酯(79)
在25℃，将二水合醋酸锂(0.010g，0.10mmol，1.0当量)添加至甲硅烷基醚78(0.100g，0.10mmol，1.0当量)在含水DMF(2mL)中的溶液中3小时。然后用乙酸乙酯(20mL)稀释反应混合物，依次用0.1M柠檬酸(20mL，pH 3)、水(20mL)和盐水(5mL)洗涤，用MgSO4干燥，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，5/95v/v甲醇/DCM)纯化残留物以提供为浅黄色油的产物(0.070g，83％)。LC/MS(3.362min(ES+))，m/z：820.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.39(s，1H)，7.48(d，2H，J＝8.2Hz)，7.25(s，1H)，7.12(d，2H，J＝8.1Hz)，6.88(s，1H)，6.68(s，1H)，6.47(d，1H，J＝7.6Hz)，6.24(d，1H，J＝15.2Hz)，6.03(s，1H)，5.92(m，1H)，5.84(d，1H，J＝8.9Hz)，5.50(m，1H)，5.34(m，1H)，5.26(m，2H)，5.18(d，1H，J＝12.3Hz)，4.80(d，1H，J＝12.4Hz)，4.66-4.60(m，3H)，4.02(m，1H)，3.95(s，3H)，3.81(m，1H)，3.03(m，1H)，2.57(m，1H)，2.19(m，1H)，1.84(dd，3H，J＝6.8，0.8Hz)，1.48(d，3H，J＝7.1Hz)，1.00(d，3H，J＝6.8Hz)，0.95(d，3H，J＝6.8Hz)，0.87(s，9H)，0.26(s，3H)，0.12(s，3H)。
(iv)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-
1-烯基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-8-基氧基)丙氧基)-5-氧
代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
-10(5H)-
羧酸4-((20S,23S)-1-碘代-20-异丙基-23-甲基-2,18,21-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,
19,22-三氮杂二十四烷氨基)苄基酯(66，D)
(a)(11S,11aS)-8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁氨基)丙氨基)苄氧基)羰基)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基氧基)丙氧基)-11-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(80)
将碳酸钾(0.030g，0.21mmol，1.0当量)添加至苯酚79(0.175g，0.21mmol，1.0当量)和碘接头74(0.214g，0.32mmol，1.5当量)在丙酮(10mL)中的溶液中。将反应混合物在氮气氛下在75℃在密封三角瓶中加热17小时。将反应混合物在减压下浓缩至干燥并通过快速色谱(硅胶，2/98v/v甲醇/DCM至5/95v/v甲醇/DCM)纯化以提供为浅黄色固体的产物(0.100g，35％)。LC/MS(4.293min(ES+))，m/z：1359.13[M]+。
(b)(11S,11aS)-8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁氨基)丙氨基)苄氧基)羰基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基氧基)丙氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸烯丙基酯(81)
将四正丁胺氟化物(1M，0.22mL，0.22mmol，2当量)添加至甲硅烷基醚80(0.150g，0.11mmol，1.0当量)在无水THF(2mL)中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物20分钟，此时LC/MS指示反应完全。用乙酸乙酯(10mL)稀释反应混合物并用水(5mL)和盐水(5mL)顺序洗涤。用MgSO4干燥有机相，减压过滤并浓缩以留下黄色固体。通过快速色谱(硅胶，6/94v/v甲醇/DCM至10/90v/v甲醇/DCM)进行纯化以提供为浅黄色固体的产物(0.090g,73％)。LC/MS(2.947min(ES+))，m/z：1154.0[M+Na]+。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.39(br s，1H)，7.39(d，2H，J＝7.6Hz)，7.18(d，2H，J＝10.6Hz)，7.10(m，3H)，6.86(d，2H，J＝10.0Hz)，6.74(s，1H)，6.55(s，1H)，6.22(dd，2H，J＝15.3，6.6Hz)，5.85(m，2H)，5.74(m，3H)，5.52(m，2H)，5.22(m，1H)，5.00(m，2H)，4.57(m，6H)，4.41(m，2H)，4.09(m，4H)，3.85(m，11H)，3.06(m，2H)，2.76(m，2H)，2.20(m，2H)，2.08(m，1H)，1.79(d，6H，J＝6.4Hz)，1.40(d，3H，J＝6.1Hz)，0.90(m，6H)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基氧基)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-氨基-3-甲基丁氨基)丙氨基)苄基酯(65)
将四(三苯基膦)钯(0)(0.005g，0.005mmol，0.06当量)添加至双-甲醇胺81(0.090g，0.08mmol，1.0当量)和吡咯烷(16μL，0.20mmol，2.5当量)在无水DCM(5mL)中的溶液中。20分钟后，用DCM(10mL)稀释反应混合物并依次用饱和氯化铵水溶液(5mL)和盐水(5mL)洗涤，用MgSO4干燥，减压过滤除去溶剂以剩余浅黄色固体状粗产物，无需进一步纯化将其用于下一步骤(0.075g，假定100％产率)。LC/MS(2.060min(ES+))，m/z：947.2[M+H]+。
(d)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基氧基)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸4-((20S,23S)-1-碘代-20-异丙基-23-甲基-2,18,21-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19,22-三氮杂二十四烷氨基)苄基酯(66，D)
将EDCI(0.015g，0.08mmol，1.0当量)添加至胺65(假定100％产率，0.075g，0.08mmol，1.0当量)和碘代乙酰胺-PEG4-酸I7(0.034g，0.08mmol，1.0当量)在无水二氯甲烷(5mL)中的溶液中并在暗处搅拌反应。50分钟后，添加另外量的碘代乙酰胺-EG4-酸I7(0.007g，0.016mmol，0.2当量)与另外量的EDCI(0.003g，0.016mmol，0.2当量)。总共2.5小时后，用二氯甲烷(15mL)稀释反应混合物并依次用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤。用MgSO4干燥有机相，减压过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，氯仿100％至90:10v/v氯仿:甲醇)纯化得到的残留物。合并纯的部分以提供产物(0.0254g，23％，2步)。收集粗产物部分并通过制备型TLC(硅胶，90:10v/v氯仿:甲醇)纯化以提供第二批的产物(0.0036g，3％，2步)。LC/MS(2.689min(ES+))，m/z：681.01/2[M+2H]+。
实施例10:释放的化合物的活性
K562测定
在37℃，在含5％CO2的潮湿气氛中，将K562人类慢性髓性白血病细胞保持在补充有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPM1 1640培养基中并且在37℃在暗处、用特定剂量的药物孵育1小时或96小时。通过离心(5min,300g)终止孵育并用无药物的培养基洗涤细胞一次。在适当的药物处理后，将细胞转移至96-孔的微量滴定板中(104细胞/孔，8孔/样品)。将该板保持在37℃、含5％CO2的潮湿气氛的暗处。测定是以活细胞将黄色可溶性四唑盐(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑(MTT,Aldrich-Sigma))还原为不溶性紫色甲臜沉淀的能力为基础的。接下来孵育板4天(以允许控制细胞在数量方面增加大约10倍)，将20μL MTT溶液(磷酸盐缓冲的生理盐水中5mg/mL)至每个孔并将板进一步孵育5h。然后以300g离心板5min，将大多数培养基从细胞沉淀吸出，留下10–20μL/孔。向每孔中添加DMSO(200μL)并搅拌样品以确保完全混合。然后在Titertek Multiscan ELISA酶标仪上在550nm的波长下读取光密度并且构建剂量-响应曲线。对于每条曲线，将IC50值解读为将最终光密度降低至对照值的50％所需的剂量。
在该测定中，化合物RelC具有小于0.1pM的IC50。
在该测定中，化合物RelE具有0.425nM的IC50。
实施例11:结合物的形成
通用的抗体结合步骤
在还原缓冲溶液(实例：磷酸盐缓冲生理盐水PBS、组氨酸缓冲溶液、硼酸钠缓冲溶液、TRIS缓冲溶液)中将抗体稀释至1-5mg/mL。将新鲜制备的TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)的溶液添加至选择性还原的半胱氨酸二硫化物桥中。TCEP的量与还原(减少，reduction)的靶向水平成比例，在1至4摩尔当量/抗体内，产生2至8个反应性硫醇。在37℃还原数小时后，将混合物冷却至室温并且添加过量的药物-接头(A、B、C、D、E)作为稀释的DMSO溶液(最终的DMSO含量高达10％体积/反应混合物的体积)。在4℃或室温下轻轻摇晃混合物适当的时间，通长是1-3小时。在结合最后，过量反应性硫醇可以与“硫醇封端试剂”(如N-乙基马来酰亚胺(NEM))反应。使用具有10kDa或更高的分子量截止值的离心过滤器浓缩抗体-药物结合物，然后通过切向流过滤(TFF)或快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化。使用与UV-可见光、荧光或质谱仪检测结合的反向色谱(RP)或疏水作用色谱(HIC)，可以通过高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UHPLC)分析确定对应的抗体-药物结合物以评估药物/抗体比值(DAR)；使用与UV-可见光、荧光或质谱仪检测结合的尺寸排阻，可以通过HPLC或UHPLC分析聚集水平和单体纯度。可以通过光谱(在280，214和330nm处吸收)和生物化学测定的组合确定最终的结合物浓度(bicinchonic acid assay BCA；Smith,P.K.,et al.(1985)Anal.Biochem.150(1):76–85；使用已知浓度的IgG抗体作为参考)。通常在防腐条件下使用0.2μm过滤器无菌过滤抗体-药物结合物并将其存储在+4℃、-20℃或-80℃。
DAR确定
通过添加10μL硼酸盐缓冲溶液(100mM，pH 8.4)和5μL DTT(在水中0.5M)还原抗体或ADC(约35μg中35μL)并在37℃加热15分钟。用1体积的乙腈:水:甲酸(49％:49％:2％v/v)稀释样品并在将其注射至UPLC系统(Shimadzu Nexera)中、80℃的Widepore 3.6μXB-C18150×2.1mm(P/N00F-4482-AN)柱(Phenomenex Aeris)中，流动速率为1ml/min，用75％缓冲溶液A(水，三氟乙酸(0.1％v/v)(TFA)、25％缓冲溶液B(乙腈：水：TFA90％:10％:0.1％v/v)平衡。在10min内使用25％至55％缓冲溶液梯度洗脱结合材料。积分214nm处的UV吸收峰。对每个ADC或抗体识别接下来的峰：天然抗体轻链(L0)、天然抗体重链(H0)和添加有药物-接头的这些链中的每个(对于具有一个药物的轻链标记为L1以及对于具有1、2或3个连接的药物-接头的重链标记为H1、H2、H3。将330nm处的UV色谱用于识别包含药物-接头的片段(即，L1、H1、H2、H3)。
计算轻链和重链的PBD/蛋白质摩尔比：
按照以下计算最终的DAR：
在214nm处进行DAR测量，因为214nm将药物-接头吸收的干扰最小化。
ADC的产生
将抗体A(包含可变结构域，其是与SEQ ID NO.7成对的SEQ ID NO.1)与药物接头A结合以得到Conj A-A，并且测得的DAR是2.35。
将抗体B(包含可变结构域，其是与SEQ ID NO.8成对的SEQ ID NO.2)与药物接头A结合以得到Conj B-A，并且测得的DAR是2.2(参见下表)。
将抗体C(包含可变结构域，其是与SEQ ID NO.12成对的SEQ ID NO.6)与药物接头A结合以得到Conj C-A，并且测得的DAR是1.97。
将抗体D(包含可变结构域，其是与SEQ ID NO.10成对的SEQ ID NO.4)与药物接头A结合以得到Conj D-A，并且测得的DAR是1.99。
将抗体E(包含可变结构域，其是与SEQ ID NO.11成对的SEQ ID NO.5)与药物接头A结合以得到Conj E-A，并且测得的DAR是1.89。
将抗体B(包含可变结构域，其是与SEQ ID NO.8成对的SEQ ID NO.2)与药物接头D结合以得到Conj B-D，并且测得的DAR是2.18(参见下表)。
将抗体B(包含可变结构域，其是与SEQ ID NO.8成对的SEQ ID NO.2)与药物接头E结合以得到Conj B-E，并且测得的DAR是1.93(参见下表)。
RB4v1.2是包含具有根据SEQ ID NO.2的序列的VH结构域和具有根据SEQ ID NO.8的序列的VK结构域的抗CD19抗体。
如以上所描述的，通过将RB4v1.2抗体结合至药物接头A、E或D产生靶向CD19的ADC。得到的ADC列于下表中，旁边是测得的DAR。使用B12抗-HIV gp120抗体产生对照非CD19靶向ADC。
| ADC | DAR | 浓度[mg/ml] | 产率[％] |
| RB4v1.2-A | 2.2 | 0.683 | 56 |
| RB4v1.2-E | 1.93 | 0.636 | 66 |
| RB4v1.2-D | 2.18 | 0.859 | 57 |
| B12-A | 2.03 | 0.98 | 71 |
| B12-E | 1.84 | 0.515 | 70 |
| RB4v1.2-DM4 | 3.27 | 2.62 | 81 |
实施例12：ADC的体外细胞毒性
细胞培养
WSU-DLCL2和SU-DHL-1细胞来自于Leibniz Institute DSMZ-德国微生物菌种保藏中心。Ramos和Daudi细胞来自于美国典型菌种保藏中心。细胞培养基是补充有L-谷氨酸和10％FBS的RPMI 1640。细胞生长在37℃、5％CO2、潮湿的温箱中。
细胞毒性检测
通过与台盼(Trypan)蓝1:1混合确定悬浮细胞培养物(至多1×106/ml)的浓度和生存能力并用血细胞计数器数器计数透明(活)/蓝(死)细胞。将细胞悬浮液稀释至所需的接种密度(通常是105/ml)并将其分配至96孔平底板中。对于阿尔玛蓝测定，将100μl/孔分配在黑孔板中。对于MTS测定，将50μl/孔分配在透明的孔板中。通过将无菌过滤的ADC稀释至细胞培养基中制备ADC(20μg/ml)的储备液(1ml)。通过将100μl连续转移至900μl的细胞培养基中，在24孔板中制备储备ADC的一组8×10倍稀释液。将每个ADC稀释液(对于阿尔玛蓝100μl/孔，对于MTS 50μl/孔)分配至包含细胞悬浮液的96孔板的4个重复孔中。对照孔仅接收相同体积的培养基。孵育4天后，通过阿尔玛蓝或MTS分析测量细胞生存能力。
将(Invitrogen，目录编号DAL1025)分配至每个孔中(20μl/孔)并在37℃在供应CO2的孵育器中孵育4小时。在激发570nm、发射585nm出测量孔荧光。，由4个ADC处理的孔中的平均荧光与4个对照孔中的平均荧光相比(100％)的比值计算细胞存活率(％)。
将MTS(Promega，目录编号G5421)分配至每个孔中(20μl/孔)并在37℃在供应CO2的孵育器中孵育4小时。在490nm处测量吸收。由4个ADC处理的孔中的平均吸收与4个对照孔中的平均吸收相比(100％)计算细胞存活率(％)。由3组重复实验的平均数据产生剂量响应曲线并通过使用Prism(GraphPad，San Diego，CA)将数据拟合至具有可变斜率的S形的剂量响应曲线来确定EC50。
体外细胞毒性
针对CD19+ve细胞系Daudi、Ramos和WSU-DLCL2测试RB4v1.2-A的效力。使用SU-DHL-1细胞作为CD19-ve对照。
图1示出RB4v1.2-A的体外效力。用Daudi、Ramos、WSU-DLCL2或SU-DHL-1细胞孵育RB4v1.2-A的系列10倍稀释液(μg/mL)。在孵育阶段最后进行阿尔玛蓝测定并计算细胞存活率。图像代表三个重复实验的平均值。
RB4v1.2-A示出对Daudi和Ramos细胞的显著细胞毒性，对WSU-DLCL2细胞具有稍低的细胞毒性(图1)。
| RB4v1.2-A | SUDHL1 | Daudi | Ramos | WSU-DLCL2 |
| EC50(μg/mL) | ～6.706 | 0.001115 | 0.001021 | 0.1171 |
图2示出RB4v1.2-E的体外效力。用Daudi、Ramos、WSU-DLCL2或SU-DHL-1细胞孵育RB4v1.2-E的系列10倍的稀释液(μg/mL)。在孵育阶段最后进行阿尔玛蓝测定，并计算细胞存活率。图像代表三个重复实验的平均值。
RB4v1.2-E示出针对Daudi和Ramos细胞的显著细胞毒性，针对WSU-DLCL2细胞具有稍低的细胞毒性(图2)。
| RB4v1.2-E | SUDHL1 | Daudi | Ramos | WSU-DLCL2 |
| EC50(μg/mL) | 0.5390 | 0.001216 | 0.001467 | 0.03099 |
图3示出RB4v1.2-D的体外效力。用Daudi、Ramos、WSU-DLCL2或SU-DHL-1细胞孵育RB4v1.2-D的系列10倍稀释液(μg/mL)。在孵育阶段最后进行阿尔玛蓝测定，并计算细胞存活率。图像代表三个重复实验的平均值。
RB4v1.2-D示出针对Daudi和Ramos细胞的显著细胞毒性，针对WSU-DLCL2细胞具有稍低的细胞毒性(图3)。
| RB4v1.2-D | SUDHL1 | Daudi | Ramos | WSU-DLCL2 |
| EC50(μg/mL) | ～0.7540 | 0.001022 | 0.0007979 | 0.02190 |
实施例13-ADC的体内抗肿瘤活性
使用CD19+(ve)人伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤来源的细胞系Ramos确定体内用于RB4v1.2的最有效的PBD药物接头。将抗体结合至如以上描述的A、E或D药物-接头，并在Ramos异种移植模型中测试。使用连接至A或E的抗HIV gp120(B12)抗体作为非CD19结合对照。同时，为了研究用无PBD头部(warhead)的RB4v1.2观察到的任何可能的抗肿瘤活性，在体内测试结合至DM4的RB4v1.2，DM4是起微管蛋白抑制剂作用的美登醇衍生物。
研究设计
药物和治疗：
| 组号 | 动物/组 | ADC | 剂量水平((mg/kg) | 剂量体积(ml/kg) |
| 1 | 10 | [无治疗] | - | - |
| 2 | 10 | [仅载体] | - | - |
| 3 | 10 | RB4v1.2[无PBD] | 1.0 | 10 |
| 4 | 10 | RB4v1.2-A | 0.3 | 10 |
| 5 | 10 | RB4v1.2-A | 1.0 | 10 |
| 6 | 10 | RB4v1.2-E | 0.3 | 10 |
| 7 | 10 | RB4v1.2-E | 1.0 | 10 |
| 8 | 10 | RB4v1.2-D | 0.3 | 10 |
| 9 | 10 | RB4v1.2-D | 1.0 | 10 |
| 10 | 10 | B12-E | 1.0 | 10 |
| 11 | 10 | B12-A | 1.0 | 10 |
步骤：
·设定CR雌性NCr nu/nu小鼠，具有在胁部(flank)在0％Matrigel sc中的I xRamos-SPN肿瘤细胞。
·细胞注射体积是0.1mL/小鼠。
·起始日期的年龄：8至12周。
·当肿瘤达到100-150mm3的平均尺寸时，进行成对匹配并开始治疗。
·体重：qd×5，然后bi-wk到最后。
·卡尺测量：bi-wk到最后。
·即时报告任何不良反应或死亡。
·安乐死具有单次观察到的>30％的体重减轻或三次连续测量到>25％体重减轻的任何个体动物。
·对两次测量到具有>20％的平均体重减轻或>10％死亡率的任何组会停止给药。不安乐死该组并允许恢复。在具有>20％重量减轻的组内，将安乐死达到单次体重减轻终点的个体。如果与体重减轻相关的治疗组恢复至原始重量的10％内，那么可以以较低剂量或较低频率的给药方案继续给药。可以在个案分析的基础上允许非治疗体重％恢复的例外(exception)。
·终点TGD。将单独监测动物。实验终点是为2000mm3的肿瘤体积或60天，无论哪个先达到。响应者可以进行地更久。当达到终点时，安乐死动物。
通用方法途径
对于组平均肿瘤体积的计算，应用一下规则：当动物由于肿瘤大小退出研究时，将为动物记录的最终肿瘤体积与数据包括在内，用于计算后续时间点的平均体积。误差棒图指示平均的标准误差(SEM)。当组中少于50％动物保留在研究中时，不将肿瘤体积值用于计算组平均肿瘤体积。使用Prism(GraphPad，San Diego，CA)用于图形表示和数据分析。
结果
图4示出药物接头对于RB4v1.2-ADC的选择性。当每实验组平均肿瘤体积达到0.1cm3时，向小鼠给药，并且以0.3和1mg/kg(对于结合ADC)以及1mg/kg(对于非结合ADC)的ADC单次剂量通过尾静脉中的IV治疗它们。数据表示来自每组10只小鼠的平均肿瘤体积(+/-SEM)。
RB4v1.2-A、RB4v1.2-E和RB4v1.2-D都表现出抗肿瘤活性，RB4v1.2-E和RB4v1.2-D看起来比RB4v1.2-A更有效(参见图4)。非结合ADC对照(B12-A和B12-E)都没有示出显著的抗肿瘤活性。
缩写
Ac 乙酰基
Acm 乙酰氨基甲基
Alloc 烯丙氧基羰基
Boc 二碳酸二叔丁基酯
t-Bu 叔丁基
Bzl 苄基，其中，Bzl-OMe是甲氧基苄基以及Bzl-Me是甲基苄基
Cbz或Z 苄氧基-羰基，其中Z-Cl和Z-Br分别是氯苄氧基羰基和溴苄氧基羰基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
Dnp 二硝基苯基
DTT 二硫苏糖醇
Fmoc 9H-芴-基甲氧基羰基
imp N-10亚胺保护基团：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB
MC-OSu 马来酰亚胺己酰基-O-N-琥珀酰亚胺
Moc 甲氧基羰基
MP 马来酰亚胺丙酰胺
Mtr 4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基
PAB 对氨基苄氧基羰基
PEG 乙烯氧基
PNZ 对硝基苄基氨基甲酸酯
Psec 2-(苯基磺酰基)乙氧基羰基
TBDMS 叔丁基二甲基甲硅烷基
TBDPS 叔丁基二苯基甲硅烷基
Teoc 2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基
Tos 甲苯磺酰基
Troc 2,2,2-三氯乙氧基羰基氯化物
Trt 三苯甲基
Xan 呫吨基
序列
SEQ ID NO.1(RB4v1.0VH)：
QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFKGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVS
SEQ ID NO.2(RB4v1.2VH)：
QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVS
SEQ ID NO.3(B43VH)：
QVQLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLRSEDSAVYSCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVT
SEQ ID NO.4(HD37 VH)：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVS
SEQ ID NO.5(4G7 VH)：
EVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVS
SEQ ID NO.6(FMC63 VH)：
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVS
SEQ ID NO.7(RB4v1.0 VK)：
EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.8(RB4v1.2 VK)：
EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.9(B43 VK)：
ELVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.10(HD37 VK)：
DILLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.11(4G7 VK)：
DIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.12(FMC63 VK)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
Claims (19)
1.一种以下式的结合物：
ConjA：
ConjB：
ConjC：
ConjD：
或ConjE：
其中，Ab代表抗体，所述抗体是：
包含与具有SEQ ID NO.7的序列的VL结构域成对的具有SEQ ID NO.1的序列的VH结构域的抗体；或
包含与具有SEQ ID NO.8的序列的VL结构域成对的具有SEQ ID NO.2的序列的VH结构域的抗体。
2.根据权利要求1所述的结合物，其中，所述抗体是包含与具有SEQ ID NO.8的序列的VL结构域成对的具有SEQ ID NO.2的序列的VH结构域的抗体。
3.根据权利要求1所述的结合物，其中，所述结合物是ConjE。
4.根据权利要求1所述的结合物，其中，所述结合物是ConjE并且所述抗体是包含与具有SEQ ID NO.8的序列的VL结构域成对的具有SEQ ID NO.2的序列的VH结构域的抗体。
5.根据权利要求1所述的结合物，其中，所述抗体是完整抗体。
6.根据权利要求1所述的结合物，其中，所述抗体是人源化、去免疫或表面重建的。
7.根据权利要求1所述的结合物，其中，药物至抗体的载药量是1至8的整数。
8.根据权利要求7所述的结合物，其中，所述载药量是1、2、3或4。
9.根据权利要求7所述的结合物，包括所述抗体-药物结合物化合物的混合物，其中，所述抗体-药物结合物化合物的混合物中的平均载药量/抗体是2至5。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的结合物，用于在治疗中使用。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的结合物，用于在受试者中的增生性疾病的治疗中使用。
12.根据权利要求11所述的结合物，其中，所述疾病是癌症。
13.一种药物组合物，包含权利要求1至12中任一项所述的结合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
14.一种药物组合物，包含权利要求1至12中任一项所述的结合物和药学上可接受的稀释剂。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，进一步包含治疗有效量的化疗剂。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的结合物在制备用于在受试者中的增生性疾病的治疗中使用的药物中的用途。
17.权利要求13或14所述的药物组合物在制备用于治疗患者中癌症的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中，将化疗剂与所述结合物组合给予至所述患者。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述化疗剂是利妥昔单抗。
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