CN101558049A - 作为ksp抑制剂的被取代的吡唑和三唑化合物 - Google Patents

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Abstract

公开了新的式(I)的被取代的吡唑和三唑化合物及其药学可接受的盐、酯或前体药物，所述衍生物以及药学可接受载体的组合物，及其用途。

Description

作为KSP抑制剂的被取代的吡唑和三唑化合物
发明背景
相关专利申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2006年11月13日提交的美国临时申请No.60/858,964的权益，所述申请被全文并入本文作为参考。
发明领域
本发明总体上涉及被取代的吡唑和三唑化合物以及其药学可接受的盐、酯或前体药物。本发明另外涉及这种化合物与药学可接受的载体的组合物、这种化合物的用途、制备和相关的中间体。
发明背景
驱动蛋白是使用三磷酸腺苷结合于微管并生成机械力的动力蛋白(motor protein)。驱动蛋白的特征在于具有约350个氨基酸残基的动力结构域(motor domain)。已经分辨出几种驱动蛋白动力结构域的晶体结构。
目前，已经确定了约100种与驱动蛋白相关的蛋白质(KRP)。驱动蛋白与多种细胞生物过程有关，包括细胞器和泡囊的转运，以及内质网的维持。几种KRP与有丝分裂纺锤体的微管相互作用或直接与染色体相互作用，似乎在细胞周期的有丝分裂阶段起到关键的作用。这些有丝分裂的KRP对于开发癌症治疗方案具有特别的重要性。
驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)(又名Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)是集中在有丝分裂纺锤体且已知是偶极有丝分裂纺锤体形成和/或功能所必需的几种驱动蛋白样动力蛋白中的一种。
在1995年，使用针对KSP羧基末端的抗体耗尽KSP表现出阻抑具有单星形微管排列(monoastral microtubule array)的HeLa细胞的有丝分裂(Blangy等人，Cell 83：1159-1169，1995)。被认为是KSP同系物的bimC和cut7基因的突变在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(Enos，A.P.，和N.R.Morris，Cell 60：1019-1027，1990)和裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)(Hagan，I.，和M.Yanagida，Nature347：563-566，1990)中引起中心体分离失败。用ATRA(全反式视黄酸)处理细胞，其在蛋白水平上减少KSP表达，或者使用反义寡核苷酸耗尽KSP，在DAN-G胰腺癌细胞中显示出显著的生长抑制，表明KSP可能与全反式视黄酸的抗增殖作用有关(Kaiser，A.，等人，J.Biol.Chem.274，18925-18931，1999)。有趣的是，光滑爪蟾(Xenopus laevis)(Aurora)-相关蛋白激酶pEg2表现出结合并磷酸化XlEg5(Giet，R.，等人，J.Biol.Chem.274：15005-15013，1999)。Aurora-相关激酶的可能的底物对于癌症药物开发特别重要。例如，在结肠癌患者中，Aurora 1和2激酶在蛋白质和RNA水平上过度表达且基因被扩增。
第一个可渗透细胞的小分子KSP抑制剂“monastrol”表现出阻抑具有单极纺锤体的细胞而不像常规的化疗药物例如紫杉烷类和长春花生物碱类那样影响微管聚合(Mayer，T.U.等人，Science 286：971-974，1999)。Monastrol在基于表型的筛选中被确定为抑制剂，且建议该化合物可以作为开发抗癌药的先导化合物。确定所述抑制相对于三磷酸腺苷不是竞争性的，且是可迅速逆转的(DeBonis，S.等人，Biochemistry，42：338-349，2003；Kapoor，T.M.，等人，J.Cell Biol.，150：975-988，2000)。
考虑到改进的化疗药物的重要性，需要体内有效抑制KSP和KSP相关蛋白的KSP抑制剂。
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及被取代的吡唑和三唑化合物及其药学可接受的盐、酯或前体药物，它们的制备方法、药物组合物和用于治疗由KSP介导的疾病的用途，其中所述化合物由式(I)表示：
Figure A20078004567400211
其中：
R1选自烷基和被取代的烷基；
R2选自氢、烷基和被取代的烷基；
R3选自-L1-A1，其中L1选自-C(O)-、-C(S)-、-S(O)-和-S(O)2-且A1选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基和NR8R9；
R4选自氢、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基和被取代的炔基；
或者R3和R4与各自结合的原子一起形成5-7元的杂环烷基或被取代的杂环烷基基团，其中任选地一个另外的环原子选自O、S或NR11；
X为CR5或N；
R5选自氢、卤代、烷基和被取代的烷基；
R6选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其均可任选地被-(R10)m取代，其中R10如本文中定义，m为1、2、3或4，且在m为2、3或4时，每个R10可以相同或不同；
R7为-L2-A2，其中L2为C1-C5亚烷基，且A2选自芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基，条件是R7不连接于X；
R8选自氢和烷基；
R9选自氢、羟基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基；
或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或被取代的杂环烷基；
R10选自氰基、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、-CF3、烷氧基、被取代的烷氧基、卤代和羟基；和
R11选自氢、烷基、被取代的烷基、-SO2烷基和-SO2被取代的烷基。
发明详述
A.本发明的化合物
本发明的化合物包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A20078004567400221
其中：
R1选自烷基和被取代的烷基；
R2选自氢、烷基和被取代的烷基；
R3选自-L1-A1，其中L1选自-C(O)-、-C(S)-、-S(O)-和-S(O)2-且A1选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基和NR8R9；
R4选自氢、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基和被取代的炔基；
或者R3和R4与各自结合的原子一起形成5-7元的杂环烷基或被取代的杂环烷基，其中任选地一个另外的环原子(除了R3和R4所连接的氮杂原子之外)选自O、S或NR11；
X为CR5或N；
R5选自氢、卤代、烷基和被取代的烷基；
R6选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其均可任选地被-(R10)m取代，其中R10如本文中定义，m为1、2、3或4，且在m为2、3或4时每个R10可以相同或不同；
R7为-L2-A2，其中L2为C1-C5亚烷基，且A2选自芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基，条件是R7不连接于X；
R8选自氢和烷基；
R9选自氢、羟基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基；
或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或被取代的杂环烷基；
R10选自氰基、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、-CF3、烷氧基、被取代的烷氧基、卤代和羟基；和
R11选自氢、烷基、被取代的烷基、-SO2烷基和-SO2被取代的烷基。
在一个实施方案中，R2为烷基。在一个方面中，R2为甲基。在另一个方面中，R1和R2是甲基。
在一个实施方案中，提供了式(Ia)-(Ie)的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A20078004567400231
Figure A20078004567400241
其中R1、R3、R4、X、R6和R7如式(I)中定义。
在式(I)和(Ia)-(Ie)的化合物的某些实施方案中，X为N。
在式(I)和(Ia)-(Ie)的化合物的其它实施方案中，X为CR5。在一些方面中，R5为氢。
在一个实施方案中，本发明的化合物由式(II)的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物表示：
Figure A20078004567400242
其中：
R1选自烷基和被取代的烷基；
R4为被1-5个取代基取代的烷基，所述取代基选自：羟基、烷氧基、被取代的烷氧基、氨基、被取代的氨基、酰基氨基、卤代、含氮的杂环烷基、被取代的含氮的杂环烷基、含氮的杂芳基和被取代的含氮的杂芳基；
A1选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基和NR8R9；
或者A1和R4与各自结合的原子一起形成杂环烷基或被取代的杂环烷基基团，其中任选地一个另外的环原子选自O、S或NR11；
X为CR5或N；
R5选自氢、卤代、烷基和被取代的烷基；
R7为-L2-A2，其中L2为C1-C5亚烷基且A2选自芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基；
R8选自氢和烷基；
R9选自氢、羟基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基；
或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或被取代的杂环烷基；
m为1、2、3或4，且在m为2、3或4时，每个R10可以相同或不同；和
R10选自氰基、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、-CF3、烷氧基、被取代的烷氧基、卤代和羟基；和
R11选自氢、烷基、被取代的烷基、-SO2烷基和-SO2被取代的烷基。
在式(II)的化合物的某些实施方案中，X为N。
在式(II)的化合物的其它实施方案中，X为CR5。在一些方面中，R5为氢。
在一个实施方案中，提供了式(IIa)的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A20078004567400251
在一个实施方案中，提供了式(IIb)的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A20078004567400261
在式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)和(IIa)-(IIb)的化合物的一个实施方案中，R1为烷基。在另一个实施方案中，R1选自异丙基、叔丁基和丙基。
在一个实施方案中，L1为-CO-。
在一个实施方案中，A1为芳基或被取代的芳基。在一些方面中，A1为被取代的或未被取代的苯基。
在一个实施方案中，A1为杂芳基或被取代的杂芳基。在一些方面中，A1为被取代的或未被取代的吡啶基。
在一个实施方案中，A1为环烷基或被取代的环烷基。
在一个实施方案中，A1为杂环烷基或被取代的杂环烷基。在一些方面中，A1为被取代的或未被取代的吗啉代。
在一个实施方案中，A1为烷基或被取代的烷基。在一些方面中，A1为被烷氧基或羟基取代的烷基。
在一个实施方案中，A1为1，3-苯并噻二唑-4-基、叔丁氧基、丁氧基、正丁氧基、环己基、2，2-二甲基丙氧基、乙氧基、呋喃-3-基、异噁唑-3-基、甲氧基、甲基、2-甲基丙氧基、苯基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、正丙氧基、吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、吡嗪-2-基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢-2H-吡喃-4-基、1H-四唑-1-基、2H-四唑-2-基、噻唑-4-基、1，3，4-噻二唑-2-基、1，3-苯并噻二唑-6-基、3，3-二氢苯并[1，2，3]噻二唑-4-基、苯并咪唑-2-基、苯并咪唑-6-基、苯并[1，2，5]噻二唑、苯并噁二唑-4-基、环戊基、咪唑-4-基、吲唑-6-基、异噁唑-5-基、吗啉-2-基、吗啉代、噻二唑-4-基、吡咯烷-N-基、吡唑-3-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、噁唑-4-基、四唑-5-基或哌啶-N-基。
在一个实施方案中，A1为被取代的芳基或杂芳基，选自5-甲基-2H-咪唑-4-基、2-氨基噻唑-4-基、4-叔丁基苯基、2-氯苯基、2-氯-6-甲基吡啶-4-基、3-氯苯基、4-氯苯基、6-氯吡啶-3-基、3，4-二氯苯基、2，4-二氟苯基、1，5-二甲基-1H-吡唑-3-基、2，4-二甲基噻唑-5-基、1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-基、2-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-甲基异噁唑-3-基、5-甲基异噁唑-4-基、4-甲基苯基、1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、1-甲基-5-氯-1H-吡唑4-基、5-甲基-1H-吡唑-3-基、6-甲基吡啶-3-基、2-吡咯烷-3-基苯基、4-(三氟甲基)苯基、6-(三氟甲基)吡啶-3-基、2，5-二甲基噁唑-4-基、2-氨基噻唑-4-基、4-甲基吡唑-5-基、3-三氟甲基吡唑-4-基、2-甲基-3-三氟甲基吡唑-5-基、4-氯-1，3-二甲基吡唑并[3，4]吡啶和1-甲基苯并咪唑-2-基。
在一个实施方案中，A1为被取代的杂环或环烷基，选自3-[(氨基乙酰基)氨基]环己基、1-甲基哌嗪-4-基、3-(2-氨基乙基磺酰基氨基)环己基、1-甲基羰基哌啶-4-基、1-甲氧基羰基哌啶-4-基、奎宁环-3-基、2-氧代吡咯烷-5-基、2-氧代吡咯烷-4-基、2-氧代-二氢呋喃-5-基、2-氧代噻唑烷-4-基和3-羟基吡咯烷-5-基。
在一个实施方案中，A1为2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基。
在一个实施方案中，A1为被取代的烷基，选自3-氨基-2-氧代-1(2H)-吡啶基甲基、氰基甲基、(N，N-二甲基氨基)甲基、乙氧基甲基、对氟苯氧基甲基、羟基甲基、1H-咪唑-1-基甲基、甲氧基甲基、(N-甲基氨基)甲基、甲基磺酰基甲基、(5-甲基-1H-四唑-1-基)甲基、(5-甲基-2H-四唑-2-基)甲基、吗啉-4-基甲基、1H-吡唑-1-基甲基、1H-1，2，3-三唑-1-基甲基、2H-1，2，3-三唑-2-基甲基、1H-1，2，4-三唑-1-基甲基、2H-1，2，4-三唑-2-基甲基、4H-1，2，4-三唑-4-基甲基、1H-四唑-1-基甲基、1H-四唑-5-基甲基、2H-四唑-2-基甲基、咪唑-4-基甲基、1-甲基吡唑-3-基甲基、哌啶-4-基甲基、三氟甲基、二甲基氨基乙基和2-氧代-3-氨基吡咯烷-1-基甲基。
在一个实施方案中，A1为NR8R9。
在一个实施方案中，R8为氢。
在一个实施方案中，R8和R9是氢。
在一个实施方案中，R8和R9是烷基。在一些方面中，R8和R9是甲基。
在一个实施方案中，R9选自烷基、被取代的烷基和环烷基。在一些方面中，R9选自甲基、羟基甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、呋喃-2-基甲基、2-羟基乙基、环丙基和异丙基。
在一个实施方案中，R9为芳基或被取代的芳基。在一些方面中，R9选自4-氰基苯基、3，4-二氟苯基、2，3，5-三氟苯基、3，5-二硝基苯基和苯基。
在一个实施方案中，R9为杂芳基或被取代的杂芳基。在一些实施方案中，R9选自噻吩-2-基、3，5-二甲基异噁唑-4-基和2，6-二氯吡啶-4-基。
在一个实施方案中，R9为杂环烷基或被取代的杂环烷基基团。在一些方面中，R9为四氢吡喃-4-基或4-(乙氧基羰基)哌啶-4-基。
在一个实施方案中，R9为羟基。
在一个实施方案中，R8和R9与它们所结合的氮原子环化，形成杂环或被取代的杂环。在一些方面中，-NR8R9选自硫代吗啉-N-基、1，1-二氧代硫代吗啉-N-基、1-氧代硫代吗啉-1-基、2-(氨基亚甲基)吡咯烷-N-基、2-(甲氧基羰基)吡咯烷-N-基、2，6-二甲基吗啉-N-基、3-羟基哌啶-N-基、3-羟基吡咯烷-N-基、4-(丁基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(环丙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(二甲基氨基)哌啶-N-基、4-(乙氧基羰基)哌嗪-N-基、4-(乙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(异丙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(甲基羰基)哌嗪-N-基、4-(甲基磺酰基)哌啶-N-基、4-(甲基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(吗啉-N-基)哌啶-N-基、4-(哌啶-N-基)哌啶-N-基、4-(丙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-环己基哌嗪-N-基、4-羟基哌啶-N-基、4-异丙基哌嗪-4-基、4-甲基哌啶-N-基、异噁唑烷-2-基、吗啉-N-基、哌嗪-N-基、哌啶-N-基、2-(肼基羰基)吡咯烷-N-基和吡咯烷-N-基。
在一些实施方案中，R4为被取代的烷基。在一些方面中，R4为被1-5个取代基取代的烷基，所述取代基选自：氨基、被取代的氨基、卤代、烷氧基、被取代的烷氧基和羟基。
在一些实施方案中，R4选自：氢、哌啶-4-基、-(CH2)2-NH2、-CH2-氮杂环丁烷-3-基、-CH2-(2，5-二氢吡咯-3-基)、-(CH2)3-咪唑-1-基、-CH2-(1H-咪唑-4-基)、-CH2-吡啶-3-基、-CH2-(2-羟基吡啶-4-基)、-CH2-(6-羟基吡啶-3-基)、-CH2-吗啉-2-基、-CH2-吡咯烷-3-基、-CH2-(3-氟吡咯烷-3-基)、-CH2-(3-羟基吡咯烷-3-基)、-CH2-(4-氟吡咯烷-3-基)、-CH2-(4-羟基吡咯烷-3-基)、-CH2-(2-羟基甲基吡咯烷-3-基)、-CH2-哌啶-3-基、-CH2-[1H-(1，2，3-三唑-4-基)]、-CH2CH(NH2)CH2OH、-(CH2)3-OH、-(CH2)3-O(CO)-苯基、-(CH2)3-NH2、-(CH2)3-NHCH3、-(CH2)3-N(CH3)2、-(CH2)3-NHOCH3、-(CH2)3-NHSO2CH3、-(CH2)3NH-(5-氰基吡啶-2-基)、-(CH2)3NH-环丙基、-(CH2)3NH-环丁基、-(CH2)3-(1H-咪唑-2-基)、-(CH2)3-(2-羟基乙基哌啶-1-基)、-(CH2)3NH(2-羟基甲基苯基)、-(CH2)3NH-(5-三氟甲基吡啶-2-基)、-(CH2)3NHCH2-环丙基、-(CH2)3NHCH2-{5-(吡啶-3-基氧基)-1H-吲唑-3-基}、-(CH2)3NHCH2-(5-甲氧基-1H-吲唑-3-基)、-(CH2)3NHCH2-(6-氟-1H-吲唑-3-基)、-CH2CHOHCH2NH2、-CH2CH(CH2OH)CH2NH2、-CH2C(CH3)2CH2-N(CH3)2、-CH2C(CH3)2CH2-(4-甲基哌嗪-1-基)、-(CH2)2C(O)NH2、-(CH2)2CH(NH2)C(O)NH2、-(CH2)2CH(NH2)C(O)OH、-(CH2)2CH(NH2)CH2C(O)NH2、-(CH2)2CH(NH2)CH2OH、-(CH2)2CH(NH2)CH3、-(CH2)3NHC(O)CH2NH2、-(CH2)3NHC(O)CH(NH2)CH(CH3)2、-CH2CHFCH2NH2、-(CH2)2NHC(O)CH2NH2、-(CH2)3-NHCH2CH2OH、-(CH2)3-NHCH2CO2H、-(CH2)3-NHCH2CO2CH2CH3、-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2、-CH2)3-NHCH(CH2OH)2、-(CH2)3CH3、-(CH2)2CH(NH2)CH2OH、-(CH2)2C(CH3)2NH2、-(CH2)2CH(NH2)CH2OCH3、-(CH2)2CH(NH2)CH2F、-CH2CHFCH(NH2)CH2OH和-(CH2)2螺环丙基-NH2。
在一个实施方案中，R4选自-(CH2)3NH2、-(CH2)2CH(CH2OH)NH2、-CH2CH(F)CH2NH2、-CH2-[2-(CH2OH)吡咯烷-3-基]、-CH2-[4-(OH)吡咯烷-3-基]、-CH2-C(F)(螺吡咯烷-3-基)、-(CH2)2CH(CH2F)NH2、-(CH2)2C(CH3)2NH2、-(CH2)2CH(CH3)NH2和-(CH2)CH(CH2OCH3)NH2。
在一些实施方案中，R3和R4或A1和R4与各自结合的原子一起形成5-7元的杂环烷基或被取代的杂环烷基基团。在一些方面中，所述被取代的杂环烷基被卤代、烷基或者被1-5个取代基取代的烷基所取代，所述取代基选自：氨基、被取代的氨基、卤代、烷氧基、被取代的烷氧基和羟基。
在一些方面中，所述杂环烷基或被取代的杂环烷基基团选自：
Figure A20078004567400301
在一个实施方案中，R6为芳基或被取代的芳基。在一些实施方案中，R6选自苯基、3-氯苯基、3-氟苯基、2，5-二氟苯基和2，3，5-三氟苯基。
在一个实施方案中，R6为杂芳基或被取代的杂芳基。
在一个实施方案中，R6选自苯基、3-溴苯基、2-氟-5-氯苯基、2-氯-5-氟苯基、3，5-二氯苯基、3-氯苯基、4-氰基苯基、2，5-二氟苯基、3-氟苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-甲基苯基、吡嗪-2-基、吡啶-2-基、噻唑-2-基、2-三氟甲基苯基和3-三氟甲基苯基。
在一个实施方案中，R6选自5-氯-2-氟苯基、2-氟-5-氯苯基、3，5-二氟苯基和3，5-二氯苯基。
在一个实施方案中，A2选自苯基、6-氨基吡啶-2-基、3-氯苯基、3-氰基苯基、2，4-二氟苯基、2，5-二氟苯基、3，5-二氟苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、3-羟基苯基、3-甲氧基苯基、1-(5-甲基)-异噁唑-3-基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、四氢吡喃-4-基、噻唑-4-基和5-三氟甲基呋喃-2-基。
在一个实施方案中，A2为3-溴苯基或3-三氟甲基苯基。
在一个实施方案中，L2为亚甲基，且A2选自苯基、3-氟苯基或3-羟基苯基。在一些方面中，R7为苄基。
在一个实施方案中，R1为叔丁基，L2为亚甲基，A2为苯基，且R6为苯基或被取代的苯基。
在另一个实施方案中，R1为叔丁基，L2为亚甲基，A2为苯基，R6为被1-2个卤代取代基如氯或氟取代的苯基。
在一个实施方案中，R1为叔丁基，R2为氢，L2为亚甲基，A2为苯基，R4为被取代的烷基。在一些这种实施方案中，R4为-(CH2)3NH2、-CH2CH(F)CH2NH2、-(CH2)2CH(CH2F)NH2、-(CH2)2CH(CH2OCH3)NH2、-(CH2)2CH(CH3)NH2、-(CH2)2C(CH3)2NH2或-(CH2)2CH(CH2OH)NH2。
本发明的代表性的化合物
本发明范围内的具体化合物在实验部分的表1中举例说明。
本发明的方法和组合物
还提供了组合物，所述组合物包含式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)和(IIa)-(IIb)的化合物(包括其混合物和/或盐)和一种药学可接受的赋形剂或载体。
另一方面，本发明提供治疗患有至少部分由KSP介导的病症的哺乳动物患者的方法。因此，本发明提供治疗需要这种治疗的哺乳动物患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的单独或与其它抗癌剂组合的式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)和(IIa)-(IIb)的化合物(包括其混合物)。
B.定义和概述
正如以上所讨论，本发明部分地涉及新的被取代的吡唑和三唑化合物。
应该理解的是，本文中使用的术语只是用于描述具体的实施方案而不意在限制本发明的范围。需要指出的是，如本文中和权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的指示，除非上下文明确指出。在该说明书和所附权利要求中，应该参考许多术语，所述术语具有以下含义：
如本文中使用的“烷基”是指具有1到6个碳原子、更优选1到3个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。该术语由例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等基团举例说明。
“被取代的烷基”是指具有1到3个、优选1到2个取代基的烷基基团，所述取代基选自烷氧基、被取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、被取代的氨基、氨基酰基、芳基、被取代的芳基、芳基氧基、被取代的芳基氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧酸酯、环烷基、被取代的环烷基、螺环烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环、被取代的杂环、-SO2-烷基和-SO2-被取代的烷基。
“亚烷基”是指优选具有1到5个碳原子、更优选1到3个碳原子的二价的饱和脂肪族烃基，其可以是直链或支链的。该术语由以下基团举例说明，例如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚正丙基(-CH2CH2CH2-)、亚异丙基(-CH2CH(CH3)-)或(-CH(CH3)CH2-)等。
“烷氧基”是指基团“烷基-O-”，其包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲-丁氧基、正戊氧基等。
“被取代的烷氧基”是指基团“被取代的烷基-O-”。
“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、被取代的烷基-C(O)-、链烯基-C(O)-、被取代的链烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、被取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、被取代的环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、被取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、被取代的杂芳基-C(O)-、杂环-C(O)-和被取代的杂环-C(O)-，其中烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、环烷基、被取代的环烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环如本文中定义。
“氨基酰基”是指基团-C(O)NRR，其中每个R独立地选自氢、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环、被取代的杂环，其中每个R与氮原子结合形成杂环或被取代的杂环，其中烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、环烷基、被取代的环烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环如本文中定义。
“酰基氧基”是指基团烷基-C(O)O-、被取代的烷基-C(O)O-、链烯基-C(O)O-、被取代的链烯基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、被取代的炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、被取代的芳基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、被取代的环烷基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、被取代的杂芳基-C(O)O-、杂环-C(O)O-和被取代的杂环-C(O)O-，其中烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、环烷基、被取代的环烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环如本文中定义。
“氧基酰基”或“羧酸酯”是指基团-C(O)O-烷基、-C(O)O-被取代的烷基、-C(O)O-链烯基、-C(O)O-被取代的链烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-被取代的炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-被取代的芳基、-C(O)O-环烷基、-C(O)O-被取代的环烷基、-C(O)O-杂芳基、-C(O)O-被取代的杂芳基、-C(O)O-杂环和-C(O)O-被取代的杂环，其中烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、环烷基、被取代的环烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环如本文中定义。
“链烯基”是指具有2到6个碳原子、优选2到4个碳原子且具有至少1个、优选1到2个链烯基不饱和位置的链烯基基团。这种基团由乙烯基、烯丙基、丁-3-烯-1基等举例说明。
“被取代的链烯基”是指具有1到3个、优选1到2个取代基的链烯基，所述取代基选自烷氧基、被取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、被取代的氨基、氨基酰基、芳基、被取代的芳基、芳基氧基、被取代的芳基氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧酸酯、环烷基、被取代的环烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环，条件是，任何羟基取代基不连接于乙烯基(不饱和的)碳原子。
“炔基”是指具有2到6个碳原子、优选2到3个碳原子且具有至少1个、优选1到2个炔基不饱和位置的炔基基团。
“被取代的炔基”是指具有1到3个、优选1到2个取代基的炔基基团，所述取代基选自烷氧基、被取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、被取代的氨基、氨基酰基、芳基、被取代的芳基、芳基氧基、被取代的芳基氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧酸酯、环烷基、被取代的环烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环，条件是，任何羟基取代基不连接于炔属碳原子。
“氨基”是指基团-NH2。
“氰基”是指基团-CN。
“被取代的氨基”是指基团-NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环、被取代的杂环、-SO2-烷基、-SO2-被取代的烷基，且其中R’和R”与它们所结合的氮原子一起形成杂环或被取代的杂环基团，条件是R’和R”不同时是氢。在R’为氢和R”为烷基时，所述被取代的氨基有时在本文中被称为烷基氨基。在R’和R”都是烷基时，所述被取代的氨基在本文中有时被称为二烷基氨基。在描述单取代的氨基时，意思是指R’或R”中的任一个为氢，但不同时为氢。在描述二取代的氨基时，意思是指R’和R”都不是氢。
“酰基氨基”是指基团-NRC(O)烷基、-NRC(O)被取代的烷基、-NRC(O)环烷基、-NRC(O)被取代的环烷基、-NRC(O)链烯基、-NRC(O)被取代的链烯基、-NRC(O)炔基、-NRC(O)被取代的炔基、-NRC(O)芳基、-NRC(O)被取代的芳基、-NRC(O)杂芳基、-NRC(O)被取代的杂芳基、-NRC(O)杂环和-NRC(O)被取代的杂环，其中R为氢或烷基，且其中烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、环烷基、被取代的环烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环如本文中定义。
“硝基”是指基团-NO2。
“芳基”或“Ar”是指具有单环(例如苯基)或多个稠合环(例如萘基或蒽基)的6到14个碳原子的单价芳香族碳环，其中所述稠合环可以是或者不是芳香族的(例如2-苯并噁唑啉酮、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，条件是连接点在芳族碳原子处。优选的芳基包括苯基和萘基。
“被取代的芳基”是指被1到3个、优选1到2个取代基取代的芳基，所述取代基选自羟基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、氨基、被取代的氨基、氨基酰基、芳基、被取代的芳基、芳基氧基、被取代的芳基氧基、羧基、羧酸酯、氰基、巯基、烷硫基、被取代的烷基硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、杂芳基硫基、被取代的杂芳基硫基、环烷基硫基、被取代的环烷基硫基、杂环硫基、被取代的杂环硫基、环烷基、被取代的环烷基、卤代、硝基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环、被取代的杂环、杂芳基氧基、被取代的杂芳基氧基、杂环基氧基、被取代的杂环基氧基、氨基磺酰基(NH2-SO2-)和被取代的氨基磺酰基。
“芳基氧基”是指基团芳基-O-，包括例如苯氧基、萘氧基等。
“被取代的芳基氧基”是指被取代的芳基-O-基团。
“羧基”是指-COOH或其盐。
“环烷基”是指具有单个或多个环的3到10个碳原子的环状烷基，包括例如金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。
“螺环烷基”是指具有环烷基环的3到10个碳原子的环状基团，其中所述环烷基环具有螺单元(spiro union)(所述单元是由作为多个环的唯一共用成员的单个原子形成)，例如通过以下结构举例说明：
Figure A20078004567400351
“被取代的环烷基”是指具有1到5个取代基的环烷基，所述取代基选自：烷基、被取代的烷基、氧代(＝O)、硫羰(thioxo)(＝S)、烷氧基、被取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、被取代的氨基、氨基酰基、芳基、被取代的芳基、芳基氧基、被取代的芳基氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧酸酯、环烷基、被取代的环烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环、被取代的杂环、-SO2-烷基和-SO2-环烷基。
“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘，优选为氟或氯。
“羟基”是指基团-OH。
“杂芳基”是指在环内具有1到10个碳原子和1到4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香族基团。这种杂芳基可以具有单个环(例如吡啶基或呋喃基)或多个稠合环(例如中氮茚基或苯并噻吩基)，其中所述稠合的环可以是或者不是芳香族的和/或包含杂原子，条件是所述连接点是通过芳香族杂芳基的原子。在一个实施方案中，所述杂芳基的氮和/或硫环原子任选地被氧化，以提供N-氧化物(N→O)、亚硫酰基或磺酰基部分。优选的杂芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。
“被取代的杂芳基”是指被1到3个取代基取代的杂芳基，所述取代基选自对于被取代的芳基所定义的相同的取代基。
“含氮的杂芳基”和“含氮的被取代的杂芳基”是指包括至少一个氮原子且可选地包括其它非氮环杂原子例如硫、氧等的杂芳基和被取代的杂芳基。
“杂芳基氧基”是指基团-O-杂芳基，“被取代的杂芳基氧基”是指基团-O-被取代的杂芳基，其中杂芳基和被取代的杂芳基如本文中定义。
“杂环”或“杂环”或“杂环烷基”或“杂环基”是指具有单个环或者多个稠合环的饱和或不饱和的(但不是芳香族的)基团，包括稠环、桥环和螺环系统，在环内具有1到10个碳原子和1到4个选自氮、硫或氧的杂原子，其中在稠环系统中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点是通过杂环。在一个实施方案中，所述杂环基团的氮和/或硫环原子任选地被氧化，以提供N-氧化物(N→O)、亚硫酰基或磺酰基部分。
“被取代的杂环”或“被取代的杂环烷基”或“被取代的杂环基”是指被1到3个与对于被取代的环烷基所定义的相同的取代基取代的杂环基。
杂环基和杂芳基的实例包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、中氮茚、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、2，3-二氮杂萘、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、邻苯二甲酰亚胺、1，2，3，4-四氢异喹啉、4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl，也称为硫吗啉基(thiamorpholinyl))、1，1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
“含氮的杂环”和“含氮的被取代的杂环”是指包括至少一个氮环原子且可选地包括其它非氮环杂原子例如硫、氧等的杂环基团和被取代的杂环基团。
“巯基”是指基团-SH。
“烷硫基”或“硫代烷氧基”是指基团-S-烷基。
“被取代的烷硫基”或“被取代的硫代烷氧基”是指基团-S-被取代的烷基。
“芳基硫基”是指基团-S-芳基，其中芳基如上述定义。
“被取代的芳基硫基”是指基团-S-被取代的芳基，其中被取代的芳基如上述定义。
“杂芳基硫基”是指基团-S-杂芳基，其中杂芳基如上述定义。
“被取代的杂芳基硫基”是指基团-S-被取代的杂芳基，其中被取代的杂芳基如上述定义。
“杂环基硫基”是指基团-S-杂环，“被取代的杂环硫基”是指基团-S-被取代的杂环，其中杂环和被取代的杂环如上述定义。
“杂环基氧基”是指基团杂环基-O-，“被取代的杂环基氧基”是指基团被取代的杂环基-O-，其中杂环基和被取代的杂环基如上述定义。
“环烷基硫基”是指基团-S-环烷基，“被取代的环烷基硫基”是指基团-S-被取代的环烷基，其中环烷基和被取代的环烷基如上述定义。
本文中使用的“生物学活性”是指在实施例12-14中的任一个中描述的至少一个试验中进行试验时的抑制浓度，或者如其至少一个实施例定义的抑制浓度。
如本文中使用的术语“药学可接受的盐”是指式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)和(IIa)-(IIb)化合物的无毒性酸或碱土金属盐。这些盐可以在式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)和(IIa)-(IIb)化合物的最终分离和纯化过程中就地制备，或者通过使碱或酸官能度分别与适合的有机或无机酸或碱反应来制备。代表性的盐包括但不限于以下：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐(undecanoate)。另外，碱性含氮基团可以用试剂如烷基卤化物、硫酸二烷基酯、长链卤化物、芳烷基卤化物等季铵化，所述烷基卤化物例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如硫酸的二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊基酯；长链卤化物例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基溴化物和苯乙基溴化物。从而得到水溶性或油溶性的或水可分散或油可分散的产物。
可以用于形成药学可接受酸加成盐的酸的实例包括无机酸如盐酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、甲磺酸、琥珀酸和柠檬酸。碱加成盐可以在式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)、和(IIa)-(IIb)化合物的最终分离和纯化过程中就地制备，或者通过使羧酸部分分别与适合的碱或氨或有机的伯胺、仲胺或叔胺反应来制备，所述适合的碱例如药学可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐。药学可接受的盐包括但不限于基于碱金属和碱土金属的阳离子如钠、锂、钾、钙、镁、铝盐等，以及铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、乙基胺等。可用于形成碱加成盐的其它代表性的有机胺包括二乙基胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
如本文中使用的术语“药学可接受的酯”是指在体内水解的酯，包括在人体内分解而留下母体化合物、其盐或其药学活性代谢物的那些。适合的酯基团包括例如衍生自药学可接受的脂肪族羧酸的那些，尤其是链烷酸、链烯酸、环烷酸、烷二酸，其中每个烷基或链烯基部分有利地具有不超过6个碳原子。具体的酯的代表性实例包括但不限于甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。
本文中使用的术语“药学可接受的前体药物”是指本发明化合物的那些前体药物，其在合理的医学裁判范围内适合于接触人和低等动物的组织，而没有过度的毒性、刺激性、变态反应等，具有合理的利益/风险比，且对于其预定用途是有效的，且在可能的情况下包括本发明化合物的两性离子形式。术语“前体药物”是指在体内迅速地转化以得到母体化合物或上述通式的药学活性代谢物的化合物，例如通过在血液中水解。关于该问题的讨论提供在T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugs as Novel Delivery Systems，Vol.14，A.C.S.Symposium Series，和Edward B.Roche，ed.，BioreversibleCarriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association andPergamon Press，1987中，二者都被全文并入本文作为参考。
如本文中使用的“抗癌药”或“用于治疗癌症的药物”是指包括只是作为例子的以下那些的活性剂：诱导凋亡的活性剂；多核苷酸(例如核酶)；多肽(例如酶)；药物；生物学模拟物；生物碱；烷化剂；抗肿瘤抗生素；抗代谢物；激素；铂化合物；与抗癌药、毒素和/或放射性核素缀合的单克隆抗体；生物反应调节物(例如干扰素和白细胞介素等)；过继性免疫疗法活性剂；造血生长因子；诱导肿瘤细胞分化的药物(例如全反式视黄酸等)；基因治疗试剂；反义治疗试剂和核苷酸；肿瘤疫苗；血管生成抑制剂等。许多其它的药物都是本领域技术人员所熟知的。
应该理解，在上述定义的所有被取代的基团中，通过用另外的取代基对取代基本身进行限定得到的聚合物意在不包括在本文中。在此情况下，这种取代基的最大数量为三个。例如，被两个其它被取代的芳基基团取代的芳基基团的连续取代限于-被取代的芳基-(被取代的芳基)-被取代的芳基。
类似地，应该理解，上述定义意在不包括不允许的取代型式(例如用5个氟取代甲基，或者乙烯或炔属不饱和的α位的羟基取代)。这种不允许的取代型式是本领域技术人员公知的。
本发明的化合物可以借助于化合物中的一个或多个不对称中心或手性中心的存在而表现出立体异构现象。本发明考虑了各种立体异构体及其混合物。除非特定的立体中心的立体化学被另外指出，对于式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)和(IIa)-(IIb)化合物的描述包括其立体异构体。本发明的某些化合物包括不对称取代的碳原子。这种不对称取代的碳原子可以产生本发明化合物，其包括在特定的不对称取代的碳原子处的立体异构体混合物或单独的立体异构体。结果，本发明化合物的外消旋混合物、非对映体混合物、单独的对映异构体以及单独的非对映体都包括在本发明中。本文中使用的术语“S”和“R”构型如IUPAC 1974“Recommendations for Section E，Fundamental Stereochemistry，”Pure Appl.Chem.45：13-30，1976所定义。可以通过本领域中公知的方法、从市售的手性原料进行手性合成得到期望的对映异构体，或者可以通过使用已知的技术分离期望的对映异构体而从对映异构体混合物得到期望的对映异构体。
本发明的化合物还可以表现出几何异构现象。几何异构体包括具有链烯基或亚链烯(alkenylenyl)部分的本发明化合物的顺式和反式形式。本发明包括单个的几何异构体及其立体异构体和混合物。
C.化合物制备
本发明的化合物可以使用以下一般方法和工艺从容易得到的原料制备。除非另有陈述，原料为市售可得的且是本领域中公知的。应该理解，在给出典型的或优选的工艺操作条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力)时，除非另有说明，也可以使用其它工艺操作条件。最佳的反应条件可以随使用的具体反应物或溶剂而变化，但是可以由本领域技术人员通过常规的优化方法来决定这种条件。
另外，如本领域技术人员显而易见的，可能需要使用常规的保护基来防止某些官能团发生不希望的反应。用于各种官能团的适合的保护基以及用于对具体的官能团进行保护和脱保护的适合的条件是本领域中公知的。例如，在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protecting Groups in OrganicSynthesis，第2版，Wiley，New York，1991以及其中引用的参考文献中描述了大量的保护基。
此外，本发明的化合物可以包含一个或多个手性中心。因此，如果期望，这种化合物可以制备或分离为纯的立体异构体，即作为单独的对映异构体或非对映体，或作为立体异构体富集的混合物。除非另有陈述，所有这种立体异构体(以及富集的混合物)都包括在本发明范围内。可以使用例如本领域中公知的光学活性原料或立体选择性试剂来制备纯的立体异构体(或富集混合物)。作为替代选择，可以使用例如手性柱色谱法、手性拆分试剂等来分离这种化合物的外消旋混合物。
在一个实施方案中，提供了制备其中X为N的式(I)化合物的方法：
Figure A20078004567400411
所述方法包括：
a)使式(III)化合物与式(IV)化合物在酰化条件下反应，形成式(V)化合物，其中R1、R2和R6如前述定义，PG为氮保护基
Figure A20078004567400412
b)加热式(V)的化合物，以形成式(VI)化合物
Figure A20078004567400421
c)使式(VI)化合物与R7-X7反应，以形成式(VIIa)或(VIIb)化合物，其中R7如前述定义，X7为离去基团
Figure A20078004567400422
d)使式(VIIa)或(VIIb)化合物暴露于脱保护条件，以便除去保护基PG，以形成(VIIIa)或(VIIIb)
Figure A20078004567400423
e)使式(VIIIa)或(VIIIb)化合物在偶联条件下与R4-X4反应或在还原胺化条件下与R4aCHO反应，其中R4如前述定义，和R4aCH2-为R4，X4为离去基团，以形成式(IXa)或(IXb)化合物
Figure A20078004567400424
f)使式(IXa)或(IXb)化合物与R3-X3在偶联条件下反应，其中R3如前述定义，X3为离去基团，以形成其中X为N的式(I)化合物
g)可选地将式(IXa)或(IXb)化合物转化为其中W为-C(Y)-X3的式(Xa)或(Xb)化合物，其中X3为离去基团，Y为＝O或＝S，并使其中W为-C(Y)-X3的化合物与HNR8R9反应，以形成其中R3为-C(Y)NR8R9的式(I)化合物
h)可选地将其中X为N的式(I)化合物转化为其酯、前体药物或药学可接受的盐。
在一个实施方案中，如下制备式(III)化合物，使其中R6如前述定义的腈(XI)与硫化物和有机碱反应，以形成硫代酰胺(XII)。
Figure A20078004567400432
适合的硫化物包括(NH4)2S，适合的胺包括三乙胺和/或吡啶。然后使硫代酰胺(XII)与一到二当量的肼在极性溶剂如乙醇中反应，得到(III)。其中R6为2，5-二氟苄腈的该工艺的实例描述在实施例1的步骤A中。
在另一个实施方案中提供了用于制备式(V)化合物的方法，使(III)与(IV)在酰化条件下反应。
Figure A20078004567400433
这种条件包括将(IV)转化为混合酸酐，如使(IV)与氯甲酸烷基酯如氯甲酸乙酯反应，用酰肼(III)处理得到的酸酐，以形成(V)。在一些方面中，胺保护基为叔丁氧基羰基氧基(Boc)。用于形成其中R6为2，5-二氟苄腈、PG为Boc、R1为叔丁基和R2为氢的(V)的该工艺的实例表示在实施例1的步骤B中。
在一个实施方案中提供了通过将(V)在沸点大于100℃的溶剂如二甲苯中加热来制备式(VI)化合物的方法。
Figure A20078004567400441
典型地，将(V)在二甲苯中加热到约150℃，使用Dean Stark分水器除去低沸点的水副产物。
在一个实施方案中，提供了用于制备式(VIIa)或(VIIb)化合物的方法。使式(VI)化合物与R7-X7反应，其中R7如前述定义，X7为离去基团。在一些方面中，R7为苄基。在其它方面中，X7为卤素。在其它方面中，R7-X7为苄基溴。反应可以在烷基化条件下进行。这种条件包括使用极性溶剂如二甲基甲酰胺和碱如Cs2CO3。反应可以得到(VIIa)和(VIIb)的混合物，当这些化合物被用作原料时，通过色谱法可将每种化合物在该阶段或者在随后阶段分别地分离。用于形成其中R7为苄基的(VIIa)和(VIIb)的实例表示在实施例1的步骤E中。
Figure A20078004567400442
在一个实施方案中提供了式(VIIIa)或(VIIIb)的中间化合物，其中R1、R2、R6和R7如式(I)中定义：
Figure A20078004567400443
在另一个实施方案中，提供了通过使式(VIIa)或(VIIb)化合物暴露于脱保护条件来制备式(VIIIa)或(VIIIb)的中间化合物的方法。在一个方面中，在PG为Boc时，通过暴露于酸性条件如用三氟乙酸处理来除去保护基。该脱保护的实例描述在实施例1的步骤F中。
在另一个实施方案中，提供了制备式(IXa)或(IXb)的中间化合物的方法：
Figure A20078004567400451
使式(VIIIa)或(VIIIb)化合物与其中X4为离去基团如卤素原子的R4-X4，或者与R4aCHO在还原胺化条件下反应，得到式(IXa)或(IXb)化合物，其中R4和R4a如前述定义。适合的还原胺化条件包括用弱酸处理包含(VIIIa)和(VIIIb)的溶液，形成亚胺，随后加入还原剂。在一些方面中，所述酸为有机酸如樟脑磺酸或无机酸如乙酸，所述还原剂为氢硼化物例如三乙酰氧基氢硼化物。
在另一个实施方案中，提供了通过使式(IXa)或(IXb)化合物在适合的偶联条件下与R3-X3反应来制备其中X为N的式(I)化合物的方法，
Figure A20078004567400452
其中R3如前述定义，X3为离去基团，如卤素原子。在一些方面中，R3-X3为酰卤，且反应在有机碱如三乙胺的存在下进行。
其中X为N的式(I)化合物可以任选地通过将式(IXa)或(IXb)化合物转化为式(Xa)或(Xb)化合物来制备，其中W为-C(Y)-X3，其中X3为离去基团，Y为＝O或＝S。在一个实例中，使(IXa)或(IXb)与三光气反应，以形成其中W为-C(O)-Cl的(Xa)或(Xb)。然后使得到的中间体与HNR8R9反应，以形成其中R3为-C(O)NR8R9的式(I)的脲化合物。
Figure A20078004567400453
对(Xa)和(Xb)进行另外的修饰以形成其中W和R4结合起来形成杂环烷基或被取代的杂环烷基环的式(I)化合物对于本领域技术人员来说是显而易见的。这种修饰的一个实例表示在实施例5中。
在另一个实施方案中，提供了如反应路线1所示的制备其中X为CR5的式(I)化合物的方法，其中R1、R2、R5、R6和R7如前述定义，PG为氮保护基。
反应路线1
Figure A20078004567400461
将酸(XIV)转化为其中LG为适合的离去基团如卤代或咪唑的(XV)，后者可以通过例如使(XIV)与偶联试剂如羰基二咪唑反应来制备。用有机碱如六甲基二甲硅烷氨基锂(lithium hexamethyldisilazide)处理酮R6COCH2R5，形成相应的烯醇盐，随后与(XV)反应得到β-酮化合物(XVI)。然后用叠氮化物R7NH2NH2处理化合物(XVI)，以形成吡唑(XVII)和(XVIIb)。作为替代选择，将(XVI)用肼处理，以形成其中氮原子未被取代的吡唑，随后用适合的R7化合物烷基化，以形成用于合成化合物(VIIa)和(VIIb)的如上所述的(XVII)和(XVIIb)。将(XVIIa)和(XVIIb)脱保护，得到相应的胺(XVIIIa)和(XVIIIb)。中间化合物(XVIIIa)和(XVIIIb)可以根据上述方法和对于式(VIIIa)或(VIIIb)化合物所述的实例的方法进一步官能化。
在一个实施方案中，提供了式(XVIIIa)和(XVIIIb)的中间化合物，其中R1、R2、R5、R6和R7如式(I)中定义：
Figure A20078004567400462
在另一个实施方案中，提供了制备式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)或(IIa)-(IIb)化合物的游离碱的方法，包括使所述化合物的酸加成盐与碱反应，以形成相应的游离碱。
在另一个实施方案中，提供了制备式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)或(IIa)-(IIb)化合物的盐的方法，包括：
a)使式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)或(IIa)-(IIb)化合物的游离碱与酸反应，得到酸加成盐；或
b)将式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)或(IIa)-(IIb)化合物的盐转化为式(I)、(Ia)-(Ie)、(II)或(IIa)-(IIb)化合物的另一种盐。
D.药物制剂
在用作药物时，本发明的化合物通常以药物组合物的形式施用。这些组合物可以通过多种途径施用，包括口服、胃肠外、透皮、局部、直肠和鼻内。这些化合物作为例如可注射的和口服的组合物都是有效的。这种组合物以药学领域公知的方式制备，且包含至少一种活性化合物。
本发明还包括如下的药物组合物，其包含作为活性成分的一种或多种上述的本发明化合物以及药学可接受的载体。在制备本发明的组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释，或包封在可以为胶囊、药袋、纸或其它容器形式的这种载体中。所用的赋形剂典型地为适合于对人类受试者或其它哺乳动物施用的赋形剂。在将赋形剂用作稀释剂时，所述赋形剂可以是固体、半固体或液体材料，起到活性成分的媒介物、载体或介质的作用。因此，所述组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、包含例如最多10重量％活性化合物的膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。
在制备制剂时，可能需要对活性化合物进行碾磨，以便在与其他成分组合之前提供适当的粒径。如果活性化合物实质上是不可溶的，通常将其碾磨到小于200目的粒径。如果活性化合物实质上是水可溶的，通常通过碾磨对粒径进行调整以便提供制剂中实质上均匀的分布，例如约40目。
适合的赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。制剂可以另外包括：润滑剂，如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和助悬剂；防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。可以通过本领域中已知的方法将本发明的组合物配制为用于在对患者施用之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
在药物组合物和单位剂型中的活性组分即本发明化合物的量可以宽泛地改变或调整，这取决于具体的应用、具体化合物的效力和期望的浓度。
优选将组合物配制为单位剂型，每个剂型包含约1-约500mg、通常约5-约100mg、有时为约10-约30mg的活性成分。术语“单位剂型”是指适合于作为用于人类受试者和其它哺乳动物的单次剂量的物理上离散的单位，每个单位包含计算的用于产生期望治疗效果的预定量的活性物质以及适合的药物赋形剂。优选地，上述本发明化合物以药物组合物的至多约20重量％的量使用，更优选为至多约15重量％，余量为药学惰性的载体。
活性化合物在宽剂量范围内有效，通常以药学有效量或治疗有效量施用。然而，应该理解，实际上施用的化合物的量由医生根据相关情况来决定，包括要治疗的病况、要治疗病况的严重程度、选择的施用途径、所施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。
在用于治疗或对抗哺乳动物的癌症的治疗用途中，所述化合物或其药物组合物可以通过任何适当的途径施用，例如口服、局部、透皮和/或胃肠外途径，剂量为可以获得和保持治疗有效的浓度，即在接受治疗的哺乳动物中的活性成分的量或血液水平。一般地，活性组分的剂量的这种治疗有效量(即有效剂量)为约0.1到约100mg/kg体重/天，更优选为约1.0到约50mg/kg体重/天。
对于制备固体组合物如片剂而言，将主要的活性成分与药物赋形剂混合，以形成包含本发明化合物的均匀混合物的固体预制剂组合物。在描述这些预制剂组合物为均质的时，意思是活性成分均匀地分散在组合物中，使得组合物可以容易地再分为同等地有效的单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊。然后将这种固体预制剂再分成上述类型的单位剂型，包含例如0.1-约500mg的本发明活性成分。
本发明的片剂或丸剂可以包衣或者以其它方式混合，以得到提供延长作用益处的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内部剂量组分和外部剂量组分，后者为内部剂量组分外的外壳形式。两种组分可以通过肠溶层分离，所述肠溶层用以防止在胃中崩解且允许内部组分完整地进入到十二指肠中或者延迟释放。有多种材料可以用于这种肠溶层或包衣，这种材料包括多种聚合酸类和聚合酸类与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。
其中可以包括本发明的新组合物的用于口服或通过注射施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水或油悬浮液，和包含可食用油如玉米油、棉子油、芝麻油、椰子油或花生油的调味乳剂，以及酏剂和类似的药物媒介物。
用于吸入或吹入的组合物包括在药学可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉剂。所述液体或固体组合物可以包含前述的适合的药学可接受的赋形剂。优选地，所述组合物通过口或鼻的呼吸途径施用，用于得到局部或全身的作用。在优选的药学可接受溶剂中的组合物可以通过使用惰性气体来雾化。雾化的溶液可以从雾化装置直接吸入，或者可以将雾化装置连接于面具罩，或者连接于间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当的方式递送制剂的装置优选经口或经鼻施用。
以下制剂实施例说明本发明的代表性的药物组合物。
制剂实施例1
制备包含以下成分的硬明胶胶囊：
            量
成分        (mg/胶囊)
活性成分    30.0
淀粉        305.0
硬脂酸镁    5.0
将上述成分混合，以340mg的量填充到硬明胶胶囊中。
制剂实施例2
使用以下成分制备片剂：
                量
成分            (mg/片)
活性成分        25.0
微晶纤维素      200.0
胶态二氧化硅    10.0
硬脂酸          5.0
将各组分混合，压片，形成片剂，每片称重为240mg。
制剂实施例3
制备包含以下组分的干燥粉末吸入制剂：
成分        重量％
活性成分    5
乳糖        95
将活性成分与乳糖混合，将混合物加入到干燥粉末吸入装置中。制剂实施例4
如下制备各自包含30mg活性成分的片剂
                                       量
成分                                   (mg/片)
活性成分                               30.0mg
淀粉                                   45.0mg
微晶纤维素                             35.0mg
聚乙烯吡咯烷酮(为10％的无菌水溶液)     4.0mg
羧甲基淀粉钠                           4.5mg
硬脂酸镁                               0.5mg
滑石                                   1.0mg
合计                                   120mg
使活性成分、淀粉和纤维素通过No.20目U.S.筛且充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮的溶液与得到的粉末混合，然后通过16目U.S.筛。将如此制备的颗粒在50℃-60℃干燥，通过16目U.S.筛。然后向颗粒加入预先通过No.30目U.S.筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石，在混合之后，将其在压片机上压制，得到每片称重为120mg的片剂。
制剂实施例5
如下制备每粒包含40mg药物的胶囊：
            量
成分        (mg/胶囊)
活性成分    40.0mg
淀粉        109.0mg
硬脂酸镁    1.0mg
合计        150.0mg
将活性成分、淀粉和硬脂酸镁混合，通过No.20目U.S.筛，以150mg的量填充到硬明胶胶囊中。
制剂实施例6
如下制备每粒包含25mg活性成分的栓剂：
成分                            量
活性成分                        25mg
饱和脂肪酸甘油酯，加至          2,000mg
使活性成分通过No.60目U.S.筛，悬浮在事先使用最小必须热量熔化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将混合物倾倒在公称容积为2.0g的栓剂模具中，使其冷却。
制剂实施例7
如下制备每5.0mL剂量包含50mg药物的悬浮液：
成分                        量
活性成分                    50.0mg
黄原胶                      4.0mg
羧甲基纤维素钠(11％)/       50.0mg
微晶纤维素(89％)
蔗糖                        1.75g
苯甲酸钠                    10.0mg
调味剂和着色剂              q.v.
净化水，加至                5.0mL
将活性成分、蔗糖和黄原胶混合，通过No.10目U.S.筛，然后与事先制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的水溶液混合。将苯甲酸钠、调味剂和着色剂用一定量的水稀释，在搅拌下加入。然后添加充足的水，得到所需体积。
制剂实施例8
                量
成分            (mg/胶囊)
活性成分        15.0mg
淀粉            407.0mg
硬脂酸镁        3.0mg
合计            425.0mg
将活性成分、淀粉和硬脂酸镁混合，通过No.20目U.S.筛，并以425.0mg的量填充到硬明胶胶囊中。
制剂实施例9
可如下制备皮下制剂：
成分            量
活性成分        5.0mg
玉米油          1.0mL
制剂实施例10
可如下制备局部制剂：
成分            量
活性成分        1-10g
乳化蜡          30g
液体石蜡        20g
白软石蜡        至100g
将白软石蜡加热，直到熔化。掺入液体石蜡和乳化蜡且搅拌，直到溶解。加入活性成分，继续搅拌，直到活性成分分散。然后将混合物冷却，直到得到固体。
制剂实施例11
可如下制备静脉内制剂：
成分        量
活性成分    250mg
等渗盐水    1000mL
用于本发明方法中的另一种优选的制剂采用透皮递送装置(“贴剂”)。这种透皮贴剂可用于以可控量进行本发明化合物的连续或间断输注。用于递送药物的透皮贴剂的结构和用途是本领域中公知的。参见例如1991年6月11日授权的美国专利5,023,252，其被并入本文作为参考。这种贴剂可以构造为用于药物的连续、脉冲或按需递送。
经常地，期望或者需要将药物组合物直接或间接地引入到脑。直接的技术通常包括将递送药物的导管放置在宿主的脑室系统中，以便绕过血脑屏障。用于转运生物因子到身体的特定解剖学区域中的这种可植入递送系统之一描述在美国专利5,011,472中，其被并入本文作为参考。
间接技术一般是优选的，通常包括通过将亲水性药物转化为脂溶性药物而将组合物配制为提供药物潜效化。潜效化一般通过封闭药物上存在的羟基、羰基、硫酸根和伯胺基团来实现，使得药物更具脂溶性且可以转运通过血脑屏障。或者，亲水性药物的递送可以通过可以短暂地打开血脑屏障的高渗溶液的动脉内输注而得以加强。
用于本发明的其它适合的制剂可以在Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中找到。
E.剂量和施用
如上所述，本文中描述的化合物适用于上述多种药物递送系统。另外，为了增加所施用化合物的体内血清半衰期，可以将化合物装入胶囊、引入到脂质体的腔中、制备为胶体，或者可以采用提供延长化合物血清半衰期的其它常规技术。有多种方法可用于制备脂质体，如例如Szoka，等人，美国专利4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述，所述专利的每一个都被并入本文作为参考。
本发明化合物可用于抑制或治疗至少部分由KSP活性介导的病症。在一个方面中，至少部分由KSP介导的所述病症是细胞增殖性病症。术语“细胞增殖性病症”或“细胞增殖病症”是指这些疾病，包括例如癌症、肿瘤、增生、再狭窄、心脏肥大、免疫病症和炎症。本发明提供治疗需要这种治疗的人或哺乳动物受试者的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的单独或与其它抗癌剂组合的式I或II的化合物。
本发明的化合物可以在体外或体内用于抑制癌细胞生长。术语“癌症”是指癌症疾病，包括例如：肺和支气管癌、前列腺癌、乳癌、胰腺癌、结肠和直肠癌、甲状腺癌、胃癌、肝脏和肝内胆管癌、肾脏和肾盂癌、膀胱癌、子宫体(uterine corpus)癌、子宫颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、食管癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病、脑癌、口腔和咽癌、喉癌、小肠癌、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和绒毛状结肠腺瘤(villous colon adenoma)。
癌症还包括选自以下的肿瘤或赘生物：癌、腺癌、肉瘤和血液学恶性肿瘤。
另外，癌症的类型可以选自以下：实体瘤/恶性肿瘤的生长、粘液样(myxoid)细胞和圆细胞癌、局部的晚期肿瘤(locally advanced tumors)、人软组织癌、癌症转移、鳞状细胞癌、食道鳞状细胞癌、口腔癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肾上腺皮质的癌症、生产ACTH的肿瘤、非小细胞癌、乳腺癌、胃肠癌、泌尿科癌症、女性生殖道的恶性肿瘤、男性生殖道的恶性肿瘤、肾癌、脑癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、腹膜渗出物、恶性胸腔积液、间皮瘤(mesothelioma)、Wilm’s肿瘤、胆囊癌、滋养细胞瘤(trophoblasticneoplasms)、血管外皮细胞瘤(hemangiopericytoma)和卡波济氏肉瘤。
本发明的化合物或组合物可以通过适合的途径对哺乳动物施用，例如通过口服、静脉内、胃肠外、透皮、局部、直肠或鼻内途径。
哺乳动物包括例如人和其它灵长类动物、宠物或陪伴动物如狗和猫、实验动物如大鼠、小鼠和兔和农畜如马、猪、羊和牛。
肿瘤或赘生物包括其中细胞的增殖是不受控制且是进行性的组织细胞生长。一些这种生长是良性的，但是其它的被称为“恶性的”且可能导致生物体死亡。恶性的赘生物或“癌症”与良性的生长之间的不同之处在于，除了表现出攻击性的细胞增殖之外，恶性的赘生物或“癌症”可以侵入周围的组织以及转移。此外，恶性的赘生物的特征在于它们表现出相对于彼此和相对于周围组织的更大的分化丧失(更大的“去分化(dedifferentiation)”)和结构的更大损失。这种性质被称为“退行发育”。
具有期望生物活性的化合物可以根据需要进行修饰来提供所需的性质，如改善的药理学性质(例如体内稳定性、生物利用度)或者在诊断应用中被检测到的能力。稳定性可以通过多种方式试验，如通过在与肽酶或人血浆或血清进行培养过程中测量化合物的半衰期。
对于诊断目的，可以为化合物连接可以直接或间接地提供可检测信号的各种标记物。因此，本发明的化合物和/或组合物可以通过多种方式进行修饰来用于多种目的，而仍保持生物活性。另外，可以引入各种活性部位用于连接于粒子、固体基质、大分子等。
可将标记的化合物用于多种体内或体外应用中。可以采用多种标记物，例如放射性核素(例如发射γ射线同位素，如锝-99或铟-111)、荧光剂(例如荧光素)、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、化学发光化合物、生物发光化合物等。本领域技术人员应知道用于结合于络合物的其它适合的标记物，或者能够使用常规实验来确定。这些标记物的结合使用本领域技术人员公知的标准技术来实现。
本发明的药物组合物适合用于多种药物递送系统。用于本发明的适合的制剂可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace PublishingCompany，Philadelphia，Pa.，17th ed.(1985)中找到。
对患者施用的量随所施用的药物、施用的目的如预防或治疗、患者的状态、施用方式等而不同。在治疗应用中，将组合物以足以治愈所述疾病及其并发症或至少部分抑制所述疾病及其并发症的进展或症状的量对已经患病的患者施用。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于所治疗的疾病状况以及主治临床医师根据各种因素得出的判断，如疾病、病症或病况的严重程度；患者的年龄、体重和一般状况等。
对患者施用的化合物典型地为上述的药物组合物的形式。这些组合物可以通过常规的灭菌技术灭菌，或者可以是无菌过滤的。所得到的水溶液可以经过包装就此使用，或者可以冻干，冻干的制备物在施用前与无菌含水载体合并。化合物制备物的pH典型地为约3-11，更优选为约5-9，且最优选为约7-8。应该理解，使用某些前述的赋形剂、载体或稳定剂会导致形成药用盐。
本发明的化合物和/或组合物的治疗剂量会随以下因素改变，例如进行治疗的具体用途、化合物的施用方式、患者的健康和状况、处方医生的判断。例如，对于口服施用，剂量典型地为每天每千克体重约5μg-约50mg，优选为每天每千克体重约1mg-约10mg。或者，对于静脉内施用而言，剂量典型地为每千克体重约5μg-约50mg，优选为每千克体重约500μg-约5000μg。所考虑的可供选择的施用途径包括但不限于鼻内、透皮、吸入、皮下和肌肉内的途径。有效剂量可以从体外或动物模型试验系统得到的剂量反应曲线外推得到。
通常，本发明的化合物和/或组合物通过对于用于类似用途的药物的任何允许的施用方式以治疗有效量施用。这种化合物的毒性和治疗效能可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法来测定，例如测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，其可以表示为LD50/ED50。优选表现出大治疗指数的化合物。
得自细胞培养试验和动物研究的数据可用于制定在人类中使用的剂量范围。优选这种化合物的剂量处于包括ED50在内的循环浓度范围内，有很少的毒性或没有毒性。取决于所用的剂型和所用的施用途径，剂量可以在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何化合物和/或组合物而言，治疗有效剂量可以最初从细胞培养试验来估算。可以在动物模型中制定实现包括在细胞培养中测定的IC50(实现活性的半数最大抑制的试验化合物浓度)在内的循环血浆浓度范围的剂量。这种信息可用于更精确地确定在人类中有用的剂量。可以通过例如高效液相色谱法测量血浆中的水平。
提供以下合成实施例和生物学实施例来说明本发明，不应以任何方式将其解释为限制本发明的范围。
实施例
参考以下的实施例，使用本文中所述的方法或本领域中公知的其它方法合成本发明的化合物。应该理解，未加以制备或分析的化合物可以通过本文中所述的方法或本领域中公知的其它方法来制备或分析。
化合物和/或中间体通过高效液相色谱法(HPLC)进行表征，使用具有2690分离模块的Waters Millenium色谱系统(Milford，MA)进行。分析柱是Alltima C-18反相柱，4.6×250mm，得自Alltech(Deerfield，IL)。使用梯度洗脱，典型地从5％乙腈/95％水开始，且在40分钟内递进到100％乙腈。所有的溶剂都包含0.1％的三氟乙酸(TFA)。化合物在220nm或254nm通过紫外(UV)吸收检测。HPLC溶剂得自Burdick and Jackson(Muskegan，MI)或Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)。在有些情况下，通过使用玻璃或塑料背层硅胶板如例如Baker-Flex Silica Gel 1B2-F柔性薄板的薄层色谱法(TLC)评价纯度。TLC结果容易地在紫外光下显像，或者通过采用公知的碘蒸气以及其它各种染色技术。
质谱分析在两个LC/MS仪器之一上进行：一个是WatersSystem(Alliance HT HPLC和Micromass ZQ质谱仪；柱：Eclipse XDB-C18，2.1×50mm；溶剂系统：含5-95％(或35-95％或65-95％或95-95％)乙腈的水，包含0.05％TFA；流速：0.8mL/min；分子量范围：500-1500；锥孔电压：20V；柱温40℃；或另一个是Hewlett Packard System(Series 1100HPLC；柱：Eclipse XDB-C18，2.1×50mm；溶剂系统：含1-95％乙腈的水，包含0.05％TFA；流速：0.4mL/min；分子量范围：150-850；锥孔电压：50V；柱温：30℃。所有的质量均作为质子化母体离子来报告。
GC/MS分析在Hewlett Packard仪器(HP6890 Series气相色谱仪，具有Mass Selective Detector 5973；注射器体积：1mL；初始柱温：50℃；最终柱温：250℃；升温时间：20分钟；气体流速：1mL/min；柱：5％苯基甲基硅氧烷，Model No.HP 190915-443，直径：30.0m×25m×0.25m)上进行。
使用Varian 300MHz NMR(Palo Alto，CA)对一些化合物进行核磁共振(NMR)分析。光谱的参比是TMS或已知的溶剂的化学位移。一些化合物样品的测试在高温(例如75℃)进行，以便增加样品溶解度。
通过元素分析(Desert Analytics，Tucson，AZ)来评价本发明的一些化合物的纯度。
在Laboratory Devices Mel-Temp装置(Holliston，MA)上测定熔点。
制备性分离使用Flash 40色谱系统和KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville，VA)进行，或者通过使用硅胶(230-400目)填充材料的快速柱色谱法进行，或者通过使用C-18反相柱的HPLC进行。对于Flash 40Biotage系统和快速柱色谱法所用的典型的溶剂是二氯甲烷、甲醇、EtOAc、己烷、丙酮、含水羟胺和三乙胺。对于反相HPLC所用的典型的溶剂是含0.1％三氟乙酸的不同浓度的乙腈和水。
除非另有说明，所有的温度都是摄氏温度。另外，在这些实施例中和在别处，缩写具有以下含义：
AcOH               ＝    乙酸
aq.                ＝    含水
ATP                ＝    三磷酸腺苷
Boc                ＝    叔丁基氧基羰基
BSA                ＝    牛血清白蛋白
CAM                ＝    钼酸铈铵
DCM                ＝    二氯甲烷
DIAD               ＝    偶氮二甲酸二异丙基酯
DIBAL              ＝    二异丁基氢化铝
DIEA               ＝    二异丙基乙基胺
DIPEA              ＝    二异丙基乙基胺
DMAP               ＝    二甲基氨基吡啶
DMF                ＝    二甲基甲酰胺
DMSO               ＝    二甲基亚砜
DTT                ＝    二硫苏糖醇
eq.                ＝    当量
Et2O               ＝    乙醚
Et3N               ＝    三乙胺
EtOAc              ＝    乙酸乙酯
EtOH               ＝    乙醇
g                  ＝    克
h                  ＝    小时
HPLC               ＝    高效液相色谱法
L                  ＝    升
LC/MS              ＝    液相色谱/质谱
M                  ＝    摩尔(摩尔浓度)
m                  ＝    米
m/z                ＝    质量/电荷比
MeNH2              ＝    甲基胺
mg                 ＝    毫克
min                ＝    分钟
mL                 ＝    毫升
mm                 ＝    毫米
mM                 ＝    毫摩尔(毫摩尔浓度)
mmol            ＝    毫摩尔
mol             ＝    摩尔
N               ＝    正常
nm              ＝    纳米
nM              ＝    纳摩尔(纳摩尔浓度)
NMR             ＝    核磁共振
PPh3            ＝    三苯膦
PhCF3           ＝    三氟甲基苯
psi             ＝    磅/平方英寸
RT              ＝    室温
sat.            ＝    饱和
TEA             ＝    三乙胺
THF             ＝    四氢呋喃
TFA             ＝    三氟乙酸
TLC             ＝    薄层色谱法
TMS             ＝    三甲基甲硅烷基
TMSCl           ＝    三甲基甲硅烷基氯
μg             ＝    微克
μL             ＝    微升
μM             ＝    微摩尔(微摩尔浓度)
实施例1
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺
Figure A20078004567400621
步骤A：硫代酰胺的合成：
Figure A20078004567400622
将搅拌的适当的苄腈、例如2，5-二氟苄腈(1-1)(15mmol)的吡啶(10mL)溶液用硫化物(20重量％的水溶液，16.5mmol)和三乙胺(16.5mmol)处理。将反应混合物在50℃搅拌5小时，直到反应完成。冷却到室温之后，将混合物用冷水稀释。用EtOAc萃取，将有机物分离，然后用H2O(x3)、饱和盐水(x3)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到粗品。在硅胶柱上纯化(20％乙酸乙酯/己烷)，得到硫代酰胺，为黄色固体1-2(收率88.5％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.12(m，2H)，7.90(br，2H)，8.08(m，1H)。
步骤B：酰肼形成：
向搅拌的硫代酰胺1-2，(5.0mmol)的EtOH(5mL)溶液加入肼(7.5mmol)。在室温搅拌30分钟之后，通过LC-MS显示反应完成，有白色固体沉淀出来。将沉淀物过滤，用己烷洗涤，得到酰肼1-3(收率94％)。
步骤C：酰肼的酰化：
Figure A20078004567400624
通过在-5℃-0℃加入含氯甲酸乙酯(2.4mmol)、Et3N(3mmol)的无水THF，将N-Boc-D-叔丁基甘氨酸1-3(2mmol)转化为混合酸酐。将混合物在-5℃搅拌30分钟。将得到的固体滤出。加入另外的无水THF洗涤沉淀物。在-5℃将得到的反应溶液加入到酰肼(1-3，2mmol)的THF溶液中。然后将反应物搅拌，逐渐回温到RT过夜。一旦反应完成，将混合物在EtOAc和H2O之间分配。将有机层分离，用H2O(x3)、饱和盐水(x3)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到粗产物，将其在硅胶柱上纯化(己烷/乙酸乙酯)，得到1-5(收率67％)。
步骤D：苯基-三唑形成：
Figure A20078004567400631
将化合物1-5(2.86mmol)溶解于二甲苯(5.7mL)。添加Dean-Stark分水器，将反应物加热到150℃。一旦反应完成，使混合物冷却到RT，然后在EtOAc和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机物分离，然后用饱和NaHCO3水溶液(x2)、H2O(x3)、饱和盐水(x3)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到苯基三唑6，其纯度足以直接用于下一步骤。
步骤E：苯基三唑的苄基化：
Figure A20078004567400632
向搅拌的三唑(2.0mmol)和Cs2CO3(4.0mmol)在DMF(5mL)中的溶液/悬浮液加入苄基化试剂，例如苄基溴(2.2mmol)。一旦反应完成，将混合物在EtOAc和H2O之间分配。将有机层分离，用H2O(x3)、饱和盐水(x3)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到粗的苄基化的苯基三唑混合物。将区域异构体1-7a和1-7b在硅胶柱(己烷/乙酸乙酯)上分离。通过1H NMR NOE实验检验区域化学的结果。
1-7a：晶体，MS(m/z)：457.3[MH+，rt＝4.00min；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.78(m，1H)，7.29-7.39(m，5H)，7.00-7.18(m，2H)，5.53(s，2H)，5.20(d，2H)，4.83(d，2H，J＝9.9Hz)，1.41(s，9H)，0.91(s，9H)。
1-7b：无色油，MS(m/z)：457.3[MH+，rt＝3.66min；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.25(m，5H)，7.15(m，2H)，7.05(m，1H)，5.45(d，2H)，5.28(s，2H)，4.85(d，2H)，1.43(s，9H)，0.97(s，9H)。
步骤F：脱保护得到游离胺：
Figure A20078004567400641
将Boc-保护的胺(1.0mmol)用含10％TFA的CH2Cl2(5mL)处理。一旦反应完成，将反应物真空浓缩，然后在EtOAc和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机物分离，然后用饱和NaHCO3水溶液(x2)、H2O(x2)、饱和盐水(x2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到苯基三唑游离胺，其纯度足以直接用于下一步骤。
步骤G：还原胺化以装配侧链：
向搅拌的三唑胺(1.0mmol)和适当的醛、例如(S)-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-4-氟丁醛(1.0mmol)在CH2Cl2(7mL)中的溶液加入AcOH(1.0mmol)。将混合物搅拌5分钟，之后添加三乙酰氧基硼氢化钠(1.10mmol)。一旦反应完成，将混合物真空浓缩，在EtOAc和2M Na2CO3水溶液之间分配。将有机物分离，然后用2M Na2CO3水溶液(x2)、H2O(x2)、饱和盐水(x2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到产物，将其通过硅胶柱纯化，或者更经常为纯度足以直接用于下一步骤。
步骤H：酰化：
Figure A20078004567400651
向搅拌的胺1-9(1.0mmol)的CH2Cl2(6mL)溶液加入Et3N(2.0mmol)，随后加入适当的酰氯，例如烟酰氯(1.0mmol)。一旦反应完成，将混合物在CH2Cl2和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机物分离，用H2O(x2)、饱和盐水(x2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到产物。
步骤I：最后脱保护得到Eg5抑制剂：
Figure A20078004567400652
向搅拌的邻苯二甲酰亚胺基化合物1-10(0.3mmol)在EtOH(1.5mL)中的溶液加入无水的肼(1.5mmol)。一旦反应完成，将反应物减压蒸发，得到标题化合物，将其通过反相制备性HPLC纯化。
实施例2
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺
Figure A20078004567400661
步骤A：氨基甲酰氯的形成：
Figure A20078004567400662
向胺9(0.154mmol)的DCM(2mL)溶液加入Et3N(0.615mmol)，随后加入三光气(0.184mmol)。一旦反应完成，将反应混合物真空浓缩，在EtOAc和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机物分离，然后用饱和NaHCO3水溶液(x2)、H2O(x1)、盐水(x2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到粗的氨基甲酰氯，将其直接用于下一步骤。
步骤B：脲形成：
Figure A20078004567400663
向搅拌的氨基甲酰氯(0.032mmol)的DCM(1mL)溶液加入Et3N(0.161mmol)，随后加入适当的胺，例如吗啉(0.097mmol)。一旦反应完成，将混合物真空浓缩，在EtOAc和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机物分离，然后用饱和NaHCO3水溶液(x2)、H2O(x1)、盐水(x2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发，得到粗产物。
步骤C：脱保护
Figure A20078004567400671
根据实施例1的方法除去邻苯二甲酰亚胺保护基，得到N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.80(m，1H)，7.43(m，2H)，7.35(m，3H)，7.1(m，2H)，5.85(d，1H)，5.50(d，1H)，5.25(s，1H)，3.98-4.30(m，2H)，3.45-3.80(m，8H)，3.0-3.2(m，3H)，1.25(m，2H)，0.8(s，9H)。
实施例3
(2，2-二甲基-[1，3]二氧杂环己烷-5-基)-甲醇的合成
将三醇3-1(1eq.)以大约0.5M的浓度溶解于DMF，加入2，2-二甲氧基丙烷(1.16eq.)和对甲苯磺酸一水合物(0.03eq.)。将溶液搅拌一天或数天，用TEA(0.5eq.)猝灭。真空除去尽可能多的溶剂，将残余物通过真空蒸馏纯化。
实施例4
2，2-二甲基-1，3-二氧杂环己烷-5-甲醛
Figure A20078004567400673
在N2气氛下，将草酰氯(1.4eq.)溶解于DCM，然后冷却到-78℃。滴加DMSO(2.2eq.)。将该溶液搅拌大约10分钟，然后将三醇3-2(1eq.)溶解于更多的DCM，得到0.2M的总浓度。在反应5分钟之后，加入TEA(5eq.)。将该混合物在-78℃搅拌10分钟，然后在室温搅拌另外10分钟。该反应最好通过TLC监控，使用1∶1比例的己烷∶乙酸乙酯作为展开剂，用CAM染色显像结果。反应混合物不经进一步后处理即使用。
实施例5
(R)-6-(氨基甲基)-4-((R)-1-(1-苄基-3-苯基-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-1，4-氧氮杂环庚烷-3-酮
Figure A20078004567400681
步骤A：还原胺化
Figure A20078004567400682
将溶解于DCM的胺5-1(1eq.)加入到醛4-2中，得到0.1-0.15M的总浓度。5分钟之后，将反应物冷却到0℃，加入Na(OAc)3BH(1.5eq.)和冰醋酸(1eq.)。通过LCMS监控反应完成。反应物用乙酸乙酯稀释，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。最后，产物用无水硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂。
步骤B：乙酰化
Figure A20078004567400691
将胺5-2溶解于DCM，得到0.2M溶液，冷却到0℃。缓慢加入TEA(5eq.)，搅拌5分钟。滴加氯乙酰氯(3eq.)。在反应完成后对反应物进行后处理，用乙酸乙酯稀释，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。最后，产物用无水硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂。产物通过色谱法纯化，使用约0-70％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。
步骤C：二醇脱保护
Figure A20078004567400692
将氯化物5-3溶解于乙腈，冷却到0℃。滴加3N HCl，通过LCMS监控反应，加入另外的HCl直到脱保护完成。将溶液真空浓缩，用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。最后，产物用无水硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂。
步骤D：环化
Figure A20078004567400693
将脱保护的醇溶解于DMF，得到0.1M溶液。加入一当量的Cs2CO3和催化量的TBAI(四丁基碘化铵)。将反应物加热到大约40-55℃达4-6小时。在完成时，将反应物真空浓缩，用EtOAc稀释，用饱和碳酸氢盐洗涤。将EtOAc层真空浓缩，通过色谱法纯化，使用约0-75％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。
步骤E.形成醛以将醇外消旋化
在N2气下，将草酰氯(1.4eq.)溶解于DCM，然后冷却到-78℃。滴加DMSO(2.2eq)。将该溶液搅拌约10分钟，然后将醇5-5(1eq.)溶解于更多的DCM，得到0.2M的总浓度。反应5分钟之后，加入TEA(5eq.)。将该混合物在-78℃搅拌10分钟，然后在室温搅拌另外10分钟。将反应物用乙酸乙酯稀释，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。最后，产物用无水硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂。
步骤F：转化为(R)和(S)醇
Figure A20078004567400702
将醛5-6溶解于甲醇以形成0.2M溶液，冷却到0℃。加入硼氢化钠(1.5eq.)，将反应物保持5到10分钟。将溶液真空浓缩，用EtOAc稀释，用饱和的碳酸氢盐洗涤。将EtOAc层真空浓缩，通过色谱法纯化。在该步骤中，通过反相HPLC分离醇的两个非对映体。
步骤F：转化为胺
Figure A20078004567400711
向溶解于无水THF的经拆分的每个醇非对映体加入5eq的树脂结合的PPh3、5eq的邻苯二甲酰亚胺和5eq DIAD。使反应物温热到约55℃达30分钟。在完全转化为邻苯二甲酰亚胺基衍生物后，将反应物用EOAc稀释，经硅藻土过滤，用饱和的NaHCO3洗涤。EtOAc层用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，通过HPLC纯化。纯化的邻苯二甲酰亚胺基衍生物经过最终的脱保护步骤，使用含2M MeNH2的甲醇(用作为溶剂)在60℃进行约1小时。粗产物通过反相HPLC纯化。
实施例6
β-氟代醛侧链中间体(6-7)的制备
Figure A20078004567400712
步骤A：胺保护
Figure A20078004567400713
向搅拌的无水K2CO3(46.53g，0.3371mol)的DMF(500mL)溶液中一次性加入D-丝氨酸甲酯盐酸盐(35.0g，0.2250mol)、KI(18.66g，0.1124mol)和苄基溴(96.18g，0.5623mol)。将反应混合物在RT剧烈搅拌5小时。在反应完成之后，将内容物倾倒在冰水中，用EtOAc提取。合并的有机层用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，得到粗产物6-2。通过柱色谱法进行纯化，得到纯的产物(61.7g，91.7％)，为浅黄色油。
步骤B：氟化
Figure A20078004567400721
在室温、在3小时的时间内向搅拌的二乙基胺三氟化硫(32.3mL，0.2006mol)的THF(400mL)溶液加入化合物6-2。在加入完成之后，继续搅拌另外1小时。混合物用乙酸乙酯萃取，将合并的有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤。真空除去溶剂，得到粗产物，将其通过柱色谱法纯化，使用己烷梯度变化到含3％EtOAc的己烷，得到产物6-3(70.4g，69.9％)，为浅黄色油。
步骤C：还原
Figure A20078004567400722
在N2下、-15℃、在3小时的时间内，通过加料漏斗向机械搅拌的LiBH4(230.8mL，0.4651mol)的THF(2.0L)溶液滴加在THF(1.0L)中的甲基酯6-3(100.0g，0.3322mol)。在加入完成之后，继续在室温搅拌4小时。向上述混合物滴加饱和NH4Cl溶液(500mL)，用EtOAc萃取。合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。将残余的油溶解于1NHCl(200mL)，用乙醚萃取，用NH4OH(50％，300mL)调节水层pH到10。生成物用EtOAc萃取，将合并的萃取液真空浓缩，得到产物6-4(86.2g，95.0％)，为浅棕色油。
步骤D：脱保护
Figure A20078004567400723
将醇6-4(50.g，0.18315mol)和披Pd(OH)2炭(20％，6.26g，0.04395mol)在无水乙醇(500mL)中的混合物在50-60psi的氢气压力下搅拌7小时。在反应之后，过滤去除炭，将残余物在旋转蒸发仪上浓缩，得到产物6-5(15.8g，92.7％)，为浅棕色油。
步骤E：Boc-保护
Figure A20078004567400731
在0℃向搅拌的氨基醇6-5(15.0g，0.16129mol)和K2CO3(33.39g，0.24195mol)在含水二氧杂环己烷(约25％，375mL二氧杂环己烷和125mL水)的混合物中滴加(Boc)2O(38.66g，0.17733mol)。在加入之后，将反应混合物室温搅拌过夜。将饱和KHSO4溶液加入到上述混合物中，以调节pH 3-4，用EtOAc萃取。将有机相真空浓缩，得到纯产物6-6(27.7g，89.0％)，为浅棕色油。
步骤F：氧化为醛
Figure A20078004567400732
向冷却的(-78℃)、搅拌的草酰氯(84mmol)的CH2Cl2(180mL)溶液加入DMSO(168mmol)的CH2Cl2(90mL)溶液。1小时之后，加入醇6-6(56mmol)的CH2Cl2(90mL)溶液。1小时之后，加入三乙胺(281mmol)，搅拌另外一小时。然后加入饱和NH4Cl水溶液，使其温热到室温。将有机物分离，用H2O(x2)、饱和盐水(x2)洗涤，然后干燥，过滤，减压蒸发，得到粗的醛。通过柱色谱法纯化，得到纯(S)-醛6-7。
从另一种对映异构体(L)-丝氨酸甲基酯开始，得到(R)对映异构体(6-8)。
Figure A20078004567400733
实施例7-A
具有β-氟代甲基侧链中间体的制备
步骤A：(S)-3-((苄基氧基)羰基)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丙酸的形成
Figure A20078004567400742
向搅拌的化合物7-1(10.0mmol)在20mL DCM中的溶液加入10mLTFA。将混合物在室温搅拌24小时。通过LC/MS跟踪反应进程。完成之后，通过减压蒸发除去溶剂和TFA，冷冻干燥，得到白色固体，为TFA盐。将粗固体悬浮在50mL THF中，加入N-乙氧羰基邻苯二甲酰亚胺(10.5mmol)、Et3N(10mmol)。将混合物在N2下回流18小时。将反应物冷却，将溶剂蒸发。加入DCM，用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(己烷/EtOAc)，得到2.68g无色油，化合物7-2。
步骤B：(S)-4-羟基-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁酸苄基酯的形成
Figure A20078004567400743
向-15℃、搅拌的(S)-3-((苄基氧基)羰基)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丙酸(化合物7-2，6.07mmol)在30mL无水THF中的溶液顺序加入N-甲基吗啉(6.07mmol)、氯甲酸异丁基酯(6.07mmol)。在-15℃搅拌5分钟之后，立即加入NaBH4(689mg，18.21mmol)在2.73mL水中的溶液。将反应物在-15℃搅拌2分钟，然后用水(30mL)水解。用EtOAc(x 3)萃取，用水(x 3)、盐水(x1)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(己烷/EtOAc)，得到1.9g无色油，化合物7-3。
步骤C：(S)-4-氟-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁酸苄基酯的形成
Figure A20078004567400751
向搅拌的(S)-4-羟基-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁酸苄基酯(7-3，5.6mmol)的乙腈(28mL)溶液加入全氟氟-1-丁烷磺酰氟(44.8mmol)、二异丙基乙基胺(44.8mmol)和二异丙基乙基胺三氢氟酸盐(134mmol)。将混合物在50℃搅拌过夜。通过LC/MS跟踪反应进程。在完成之后，将反应物冷却到RT，然后减压蒸发。然后将混合物用DCM分配，用水(x3)、盐水(x2)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(己烷/EtOAc)，得到浅黄色油，化合物7-4。
步骤D：(S)-4-氟-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁醛的形成
在-78℃向搅拌的(S)-4-氟-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁酸苄基酯(化合物7-4，0.5mmol)在无水乙醚(5mL)中的溶液滴加二异丁基氢化铝(1.0M，在甲苯中，1.5mmol)。将反应物在-78℃搅拌约30分钟，如通过LC/MS所监控。在完成之后，在-78℃加入水(10mL)将反应猝灭。用乙酸乙酯萃取，用水(x3)、盐水(x2)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩。将粗产物化合物7-5用于下一反应步骤。
实施例7-B
制备化合物7-5的可选途径
步骤A：化合物7-6的制备
Figure A20078004567400753
为了制备(S)-4-氟-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁酸，将化合物7-4(0.20mmol)溶解于乙醇(5mL)。将该溶液用氮气吹扫10分钟，然后在氮气氛下加入10％披钯炭(0.02mmol的钯)。然后在搅拌下将氢气快速鼓泡通过溶液，持续约1小时。通过LC/MS跟踪反应进程。
将反应混合物过滤通过硅藻土以除去钯。将硅藻土用二氯甲烷漂洗两次。然后将滤液浓缩，得到粗产物化合物7-6。将粗产物用于下一反应步骤。
步骤B：(S)-4-氟-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁酸硫代乙酯的形成
Figure A20078004567400761
将化合物7-5(0.20mmol)、1，3-二环己基碳二亚胺(0.30mmol)、乙硫醇(0.6mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.10mmol)溶解于DMF(5mL)中。将混合物在室温搅拌过夜。用LC/MS监控反应。
将EtOAc加入到反应混合物中。然后将其用水(2x)和盐水(2X)洗涤。然后将EtOAc层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩。然后使用快速色谱法纯化粗产物化合物7-7。
步骤C：(S)-4-氟-3-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丁醛的形成
将化合物7-7(0.20mmol)溶解于无水丙酮(10mL)。然后在氮气氛下加入10％的披钯(0.02mmol)炭。然后加入三乙基硅烷(0.5mmol)。在约10秒钟之后开始起泡，使反应继续，直到起泡停止(30分钟)。使用LC/MS监控反应。
将反应混合物过滤通过硅藻土短柱。将短柱用二氯甲烷洗涤两次，然后将滤液浓缩，得到粗产物化合物7-5。将粗产物用于下一反应。
从另一个(R)对映异构体(R)-3-((苄基氧基)羰基)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)丙酸开始，得到具有以下化学结构的(R)对映异构体(7-8)：
Figure A20078004567400771
实施例7-C
具有β-氟代甲基醛侧链的中间体的可选制备方法
反应路线3
步骤A：化合物7-10的制备
将甲醇(300mL)加入到1000mL圆底烧瓶中，将系统用冰浴冷却。在15分钟时间内滴加乙酰氯(89.3mL，1251mmol)。使得到的溶液回温到环境温度，一次性加入(S)-2-氨基-4-戊烯酸(7-9)(6.0g，139mmol)。将反应混合物加热回流2小时，然后冷却到环境温度。然后将混合物真空浓缩，得到浅黄色油。将产物分散在乙酸乙酯(150mL)中，再次真空浓缩。该过程重复四次。产物7-10为油，其在真空静置过夜时固化。1H NMR分析显示产物的纯度足以不经进一步纯化使用。
TLC：Rf＝7.1(二氧化硅，洗脱剂5∶3∶1CHCl3∶MeOH∶(7∶3H2O∶AcOH)；用茚三酮显像)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ5.84-5.73(m，1H)，5.32-5.26(m，2H)，4.17(dd，1H，J＝7.0，1.6MHz)，3.84(s，3H)，2.73-2.65(m，2H)；(400MHz，d6-DMSO)：δ8.7(br s，3H)，5.81-5.73(m，1H)，5.21-5.14(m，2H)，4.11(t，1H，J＝6.1Hz)，3.72(s，3H)，2.60(dd，2H，J＝7.1，0.9Hz)。
13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ169.33，131.37，119.88，52.65，51.65，34.22。
步骤B：化合物7-11的制备
在轻微加热下将得自前述步骤的粗(S)-2-氨基-4-戊烯酸甲基酯盐酸盐(7-10)溶解于THF(190mL)。将得到的溶液滴加到LiAlH4的THF溶液(280mL的1.0M溶液)中，加入速率使得内部温度保持为约5℃。间歇地使用轻微加热来温热包含(S)-2-氨基-4-戊烯酸甲基酯盐酸盐溶液的加料漏斗，以便使结晶的氨基酯再溶解。在加入完成时，将加料漏斗用另外20mL部分的THF漂洗。混合物然后用乙醚(500mL)稀释，通过顺序地加入H2O(11mL)、15％(w/v)NaOH水溶液(11mL)和H2O(33mL)破坏过量的LiAlH4，加入速率使得内部温度保持低于10℃。将混合物过滤，将滤饼用另外的乙醚洗涤。滤液用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，得到黄色液体(7-11，13.4g，基于139.0mmol的(S)-2-氨基-4-戊烯酸计算为95％的质量回收率)。氨基醇(7-11)可以通过蒸馏纯化(110℃，20torr)。然而，在后续的步骤中观察到微小的改善，因此一般将粗物质不经进一步纯化使用。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ5.87-5.77(m，1H)，5.05-4.97(m，2H)，3.26(dd，1H，J＝10.3，5.1Hz)，3.14(dd，1H，J＝10.3，6.7Hz)，2.69-2.63(m，1H)，2.15-2.09(m，1H)，1.92-1.86(m，1H)。
13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ136.49，116.31，66.13，52.53，38.51。
步骤C：化合物7-12的制备
将(S)-2-氨基-4-戊烯醇(7-11，13.4g，132.5mmol)和Na2CO3(70.8g，668.0mmol)溶解于H2O(400mL)。加入CH3CN(700mL)和2-[(琥珀酰亚胺基氧基)羰基苯甲酸甲酯(33.1g；119.4mmol)，将得到的混合物在环境温度剧烈搅拌。2小时之后，TLC分析显示2-[(琥珀酰亚胺基氧基)羰基苯甲酸甲酯被消耗。在旋转蒸发器上除去大部分CH3CN，将残余的物质转移到分液漏斗中，用EtOAc萃取(3×100mL)。合并的EtOAc萃取液用0.5MHCl(2×250mL)和盐水(250mL)洗涤。EtOAc相用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，得到黄色油(7-12；19.3g；70％)，其不经进一步纯化用于下一步。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ7.90-7.83(m，4H)，5.74-5.64(m，1H)，4.99-4.91(m，3H)，4.27-4.20(m，1H)，3.90-3.84(m，1H)，3.63-3.58(m，1H)，2.64-2.44(m，2H)。
13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ168.25，134.86，134.42，131.37，122.94，117.41，60.63，53.47，32.59。
步骤D：化合物7-13的制备
将N，N-二异丙基乙基胺(215mL，1240mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(81mL，496mmol)和全氟-1-丁烷磺酰氟(15.0mL，83.5mmol)加入到7-12(19.1g，82.7mmol)的PhCF3(310mL)溶液中，将得到的混合物在环境温度搅拌。分别在60、90、120、150和180分钟之后加入另外的全氟-1-丁烷磺酰氟(7.5mL，41.8mmol)。总共18小时之后，将反应混合物转移到分液漏斗中，用1.0N HCl洗涤两次、用饱和NaHCO3水溶液洗涤两次，用H2O洗涤一次。有机相用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到橙色油。将粗物质加载在二氧化硅垫上，用4∶1己烷∶EtOAc洗脱，得到产物(7-13)，为黄色油(15.4g，80％)。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ7.88-7.81(m，4H)，5.77-5.66(m，1H)，5.04-4.88(m，2.5H)，4.80-4.73(m，1H)，4.65-4.61(m，0.5H)，4.60-4.49(m，1H)，2.68-2.47(m，2H)。
13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ167.87，134.79，133.77，130.94，123.26，118.21，81.82(d，J＝170Hz)，50.47(d，J＝19Hz)，31.40(d，J＝6Hz)。
步骤E：化合物7-8的制备
将化合物7-13(15.3mmol)溶解于2∶1CH3OH∶H2O(1500mL)，加入OsO4的H2O溶液(29.3mL的4％w/v溶液)。然后一次性加入NaIO4(42.2g，197.2mmol)，将得到的混合物在环境温度搅拌。3小时之后，将混合物过滤以除去沉淀的固体，将滤饼用EtOAc洗涤。将滤液真空浓缩以除去大部分的有机溶剂。残余物用三份EtOAc萃取，将合并的EtOAc萃取液用Na2SO4干燥，过滤，浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2，加载到硅胶垫上，相继用含20％、30％、40％、50％和100％EtOAc的己烷洗脱。化合物7-8存在于30％-50％级分中，但是含极性更大的杂质。将所述级分合并，浓缩，将残余物应用至第二个二氧化硅垫，用含30％EtOAc的己烷洗脱，得到化合物7-8，为浅黄色固体(11.1g，72％)：
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ9.61(s，1H)，7.91-7.83(m，4H)，4.97-4.94(m，1H)，4.78(t，0.5H，J＝9.3Hz)，4.69-4.64(m，1H)，4.57-4.53(m，0.5H)，3.28-3.02(m，2H)。
13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ200.14，167.65，134.73，131.15，123.24，81.80(d，J＝171Hz)，44.81(d，J＝21Hz)，40.64(d，J＝6Hz)。
实施例7-D
化合物7-12的可选合成方法
反应路线2
Figure A20078004567400801
步骤A：化合物7-14的制备
使化合物7-9与2.2当量的邻苯二甲酸酐在2.2当量三乙胺存在下、在乙酸乙酯中回流，直到反应完成。减压除去溶剂。将残余物溶解于pH为4的水，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用pH为4的水洗涤两次。然后，有机相用硫酸钠干燥。除去溶剂，得到7-14，为白色固体。
步骤B：化合物7-12的制备
将化合物7-14和1.2当量DIEA和1.1当量BOP在THF中在室温搅拌，直到形成澄清的溶液。将溶液冷却到0℃，然后加入1.0当量NaBH4。将反应混合物在N2下、在0℃搅拌直到反应完成。将溶剂改变为DCM，将反应物用水洗涤一次。将DCM相加载在硅胶短柱上，用含15％EtOAc的己烷冲洗，得到化合物7-12，为无色油。
实施例8
中间体(S)-4-氧代丁烷-2-基氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸乙酯8-1(1eq.)和甲苯(x＝3)的共沸混合物溶解于二氯甲烷，冷却到-78℃。然后在N2气氛下滴加1M的DIBAL的甲苯溶液(2eq.)，在-78℃搅拌2小时。
将反应物用甲醇猝灭，浓缩。在0℃向浓缩的残余物加入2M酒石酸钠钾溶液，在室温剧烈搅拌30分钟。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥。过滤，蒸发，减压干燥，得到化合物8-2，为浅黄色粘稠液体。MS：MH+＝188.2。
实施例9
(R)-4-氧代丁烷-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成
步骤A：(R)-(3-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸苄酯的合成
Figure A20078004567400812
向在THF中的(R)-3-氨基丁酸苄酯硫酸盐9-1(1eq.)加入Boc-酸酐(2eq.)和二异丙基乙基胺(4eq.)。将反应混合物在室温搅拌72小时。将反应混合物浓缩，在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层分离，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发，减压干燥，得到化合物9-2，为白色固体。MS：MH+＝294.0。
步骤B：(R)-4-氧代丁烷-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure A20078004567400821
将(R)-(3-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸苄酯9-2(1eq.)和甲苯(x＝3)的共沸混合物溶解于二氯甲烷，冷却到-78℃。在N2气氛下滴加1M的DIBAL的甲苯溶液(2eq.)，在-78℃搅拌2小时。将反应用甲醇猝灭，然后浓缩。在0℃向浓缩残余物加入2M酒石酸钠钾溶液，在室温剧烈搅拌30分钟。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发，减压干燥，得到化合物9-3，为无色的粘稠液体。MS：MH+＝188.2。
实施例10
2-甲基-4-氧代丁烷-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成
步骤A：3-氨基-3-甲基丁酸甲酯的合成
Figure A20078004567400822
向0℃、在甲醇中的3-氨基-3-甲基-丁酸10-1(1eq.)加入2eq.的亚硫酰氯。将反应混合物温热到室温，搅拌过夜。将溶剂蒸发，得到10-2和甲苯(x＝3)的共沸混合物，将其用于步骤B。MS：MH+＝132.1。
步骤B：3-叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸甲酯的合成
Figure A20078004567400823
向THF中的3-氨基-3-甲基丁酸甲酯盐酸盐10-2(1eq.)加入Boc-酸酐(2eq.)和二异丙基乙基胺(4eq.)。将反应混合物在室温搅拌48小时。将反应混合物浓缩，在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层分离，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发，减压干燥，得到产物10-3，为白色固体。MS：MH+＝232.1。
步骤C：2-甲基-4-氧代丁烷-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure A20078004567400831
将3-叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸甲酯10-3(1eq.)和甲苯(x＝3)的共沸混合物溶解于二氯甲烷，冷却到-78℃。在N2气氛下向其中滴加1M的DIBAL的甲苯溶液(2eq.)，在-78℃搅拌2小时。将反应用甲醇猝灭，浓缩。在0℃向浓缩的残余物加入2M酒石酸钠钾溶液，在室温剧烈搅拌30分钟。将混合物在乙酸乙酯和水之间分配。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发，减压干燥，得到产物10-4，为无色的粘稠液体。MS：MH+＝202.1。
实施例11
Boc-保护的二氟甲基醛的制备
步骤A：还原胺化
Figure A20078004567400832
将4，4-二氟-3-酮丁酸乙酯(11-1，25g，15mmol)溶解于二氯乙烷(300mL)。然后加入苄基胺(49mL，45.2mmol)和三乙胺(83mL，60.2mmol)将溶液搅拌1分钟。然后滴加TiCl4溶液(1M，在DCM中，60mL，60.2mmol)。将混合物室温搅拌过夜。通过TLC跟踪反应进程。然后在1小时内滴加溶解于MeOH的氰基硼氢化钠。将反应物搅拌另外1小时。将反应混合物在EtOAc和饱和碳酸氢钠溶液之间分配。注意保持反应在通风橱中，使用氰化物检测器。然后将反应物用水(2X)和盐水(2X)洗涤。有机层用硫酸钠干燥，通过烧结过滤器过滤，真空浓缩。在Isco上进行纯化(在45分钟内从0变化到100％EtOAc)，得到11-2。收率36.3g(68％)。
步骤B：仲胺的脱苄基化
Figure A20078004567400841
将化合物11-2(1eq)溶解于乙酸中。加入披钯炭(0.25eq)和1，4-环己二烯(10eq)，将反应混合物加热到60℃。继续在60℃搅拌3小时。用LCMS跟踪反应。然后将反应物冷却到室温，通过硅藻土短柱过滤。硅藻土用甲醇漂洗。然后将滤液真空浓缩，得到粗产物。将粗物质11-3不经进一步纯化直接用于下一反应。
步骤C：用Boc保护仲胺
Figure A20078004567400842
将化合物11-3(1eq)、二碳酸二叔丁基酯(1.3eq)、碳酸钾(1.3eq)和二氧杂环己烷全部加入到烧瓶中。将反应物在氮气下在室温搅拌10小时。通过LCMS跟踪反应进程。然后将反应物蒸发到干燥。将剩余的物质在水和EtOAc之间分配。分层，将水层再用EtOAc萃取两次。将有机层合并，用硫酸钠干燥，通过烧结过滤器过滤，真空浓缩。通过ISCO柱进行纯化(在35分钟内从0％变化到30％EtOAc，在5分钟内从30％变化到100％，在100％保持5分钟)。
步骤D：乙酯还原为醛
Figure A20078004567400843
将化合物11-4(2.8g，10.48mmol)溶解于DCM，置于氮气气氛下。将该溶液在丙酮/干冰浴中冷却到-78℃。滴加DIBAL溶液(1M，在甲苯中，20.97mL，20.97mmol)。然后将反应物搅拌另外2小时。用LCMS跟踪反应。然后用甲醇猝灭反应，搅拌5分钟。然后将甲醇减压蒸发。剩余的水相用EtOAc萃取(3X)。将收集的EtOAc萃取物用硫酸钠干燥，通过烧结过滤器过滤，真空浓缩。通过ISCO进行纯化(在35分钟内从0％变化到40％EtOAc，在5分钟内从40％变化到100％，在100％保持10分钟)，得到11-5。收率：1.8g(77.0％)。
步骤E：还原胺化
将化合物11-5(31mg，0.14mmol)溶解于DCM。加入三唑(65mg，0.14mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(44mg，0.21mmol)和乙酸(0.013mL，0.21mmol)，将反应混合物在室温搅拌过夜。用LCMS跟踪反应。在完成之后，将反应物用水洗涤(2X)。然后将DCM层用硫酸钠干燥，用烧结过滤器过滤，真空浓缩。通过ISCO柱进行纯化(在25分钟内从0％变化到30％EtOAc，在10分钟内从30％变化到100％，在100％保持5分钟)。收率：58.0mg(77.0％)。
步骤F：酰化
Figure A20078004567400852
将化合物11-6(58.0mg，0.11mmol)溶解于在有螺旋盖小瓶中的DCM中。然后加入(S)-2-乙酰氧基丙酰氯(0.042mL，0.33mmol)和三乙胺(0.046mL，0.33mmol)。将小瓶密封，加热到40℃。将反应在40℃搅拌过夜。在反应完成之后，在真空下除去溶剂。将反应混合物置于乙腈和水中，使用反相色谱法分离异构体。S-异构体表现出在LCMS上的保留时间为1.29分钟；R-异构体表现出保留时间为1.33分钟，S-异构体的收率：15.4mg(20.7％)。R-异构体的收率：15.9mg(21.4％)。
使用前述实施例和方法中所述的方法制备下表中的化合物1-15和18-86。化合物16和17是预言性化合物，也可以按类似方式制备。在合成中所用的原料是本领域技术人员可知的、市售可得或者可以使用已知的方法制备。表1中的化合物使用ISIS/BASE的AUTONOM 2000(自动命名法)命名，执行IUPAC标准命名法。在一个实施方案中，提供了表1中任何一种化合物的立体异构体。在一个方面中，所述立体异构体为对映异构体。在另一个方面中，所述立体异构体为非对映体。
表1
Figure A20078004567400861
Figure A20078004567400871
Figure A20078004567400881
Figure A20078004567400891
Figure A20078004567400901
Figure A20078004567400921
Figure A20078004567400931
Figure A20078004567400951
Figure A20078004567400961
Figure A20078004567400971
Figure A20078004567400981
Figure A20078004567400991
Figure A20078004567401001
Figure A20078004567401011
Figure A20078004567401021
实施例12
用于测定KSP活性的试验
该实施例提供用于体外测定KSP活性的代表性体外试验。从Cytoskeleton Inc.(Denver，Colorado，USA)购买得自牛脑的纯化微管。将人KSP(Eg 5，KNSL1)的动力结构域克隆、表达、纯化到大于95％的均质性。Biomol Green购自Affinity Research Products Ltd.(Matford Court，Exeter，Devon，United Kingdom)。将微管和KSP动力蛋白质(即KSP动力结构域)在试验缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM MgCl2，10mM DTT和0.25mg/mL BSA)中稀释到35μg/mL微管和45nM KSP的最终浓度。然后将微管/KSP混合物在37℃预先孵育10分钟，以促进KSP结合于微管。
向包含1.25μL含抑制剂或试验化合物的DMSO(在对照的情况中只加入DMSO)的试验板(384孔板)的每个孔加入25μL ATP溶液(ATP在试验缓冲液中稀释到300μM浓度)和25μL上述的微管/KSP溶液。将板在RT孵育1小时。在孵育之后，向每孔中加入65μL Biomol Green(一种基于孔雀绿的染料，可以检测无机磷酸盐的释放)。将板孵育另外5-10分钟，然后使用Victor II读板器在630nm测定吸收。在630nm的吸收量对应于样品中KSP活性的量。然后基于每个浓度下630nm处吸收的减少，通过非线性回归，使用用于Excel的XLFit或使用GraphPad Software Inc的Prism数据分析软件，确定每种抑制剂或试验化合物的IC50。
本发明优选的化合物在实施例12所述的试验方案中具有IC50小于约1mM的生物活性，优选实施方案具有小于约25μM的生物活性，特别优选的实施方案具有小于约1000nM的生物活性，最优选的实施方案具有小于约100nM的生物活性。
在该试验中进行测试时，表1中的化合物71、85和86表现出大于1μM的IC50值。化合物77、78和80表现出大于100nM且小于或等于1μM的IC50值。表1中的化合物1-15、18-70、72-76、79和81-84表现出小于或等于100nM的IC50值。
实施例13
用KSP抑制剂处理的肿瘤细胞系中细胞增殖的抑制
将细胞在96孔板中以96孔板的每孔约500个细胞的密度接种，使其生长24小时。然后将细胞用不同浓度的化合物处理72小时。然后，加入100μl CellTiter Glo。CellTiter Glo为基于四唑鎓的试验物，使用试剂3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)(美国专利5,185,450)(参见Promega产品目录#G3580，CeIITiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)。然后将细胞在黑暗中孵育30分钟。使用Walloc Trilux读板器测定每孔的荧光量，其与每孔中细胞数目相关。将只接受DMSO(0.5％)的孔中的活细胞数作为0％抑制的标示，而将没有细胞的孔用作细胞生长的100％抑制。在连续暴露化合物72小时时，从转化为对数的剂量值对细胞计数(对照的百分比)的S形剂量反应曲线、通过绘图法确定产生50％生长抑制(GI50)的化合物浓度。
所用细胞系如以下列出。
如上所述进行细胞增殖试验。
癌细胞系
Colo 205-结肠癌
RPMI 1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S
+1％NaPyr.+Hepes
+4.5g/L葡萄糖+1％NaBicarb.
MDA 435-乳腺癌-高met
EMEM+10％FBS+1％P/S+1％L-谷氨酰胺
+1％NEAA+1％NaPyr+1％维生素
HCT-15和HCT116-结肠癌
RPMI 1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S
耐药细胞系
KB3.1-结肠表皮癌；母细胞系
Iscove’s+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S
KBV1-p-糖蛋白缔合的多药抗药性细胞系
RPMI 1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S
+0.2ug/mL长春碱
KB85-p-糖蛋白缔合的多药抗药性细胞系
DMEM+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S+
10ng/mL秋水仙碱
本发明优选的化合物在所述试验方案中具有GI50小于约1mM的生物活性，一些实施方案具有小于约25μM的生物活性，其它实施方案具有小于约1000nM的生物活性，再其它实施方案具有小于约100nM的生物活性。
实施例14
克隆形成软琼脂试验方案
将人癌细胞以3×105细胞/孔的密度在6孔板中接种。第二天，向每孔中加入确定浓度的有关化合物。在孵育24和48小时之后，收获细胞，洗涤，计数。使用Multimek 96自动机械进行以下步骤。然后，将每孔的500个活细胞铺板在包被有PolyHema以防止细胞粘附于孔底壁的96孔板中。将琼脂糖(3％储备液)熔化，在温热的培养基中稀释，以0.5％最终浓度加到细胞中。在软琼脂固化之后，将板在37℃孵育6天。向细胞添加Alamar蓝色染料，将板孵育另外6小时。在Tecan读板器上测量光密度变化，认为其与软琼脂中形成的菌落数相关。癌细胞能够在琼脂上生长，由此表现出光密度增加。光密度读数减小意味着癌细胞受到抑制。认为本发明化合物会显示光密度降低。

Claims (69)

1.式(I)的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A2007800456740002C1
其中：
R1选自烷基和被取代的烷基；
R2选自氢、烷基和被取代的烷基；
R3选自-L1-A1，其中L1选自-C(O)-、-C(S)-、-S(O)-和-S(O)2-且A1选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基和NR8R9；
R4选自氢、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基和被取代的炔基；
或者R3和R4与它们连接的氮原子一起形成5-7元的杂环烷基或被取代的杂环烷基基团，其中任选地一个另外的环原子选自O、S或NR11；
X为CR5或N；
R5选自氢、卤代、烷基和被取代的烷基；
R6选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其均可任选地被-(R10)m取代，其中R10如本文中定义，m为1、2、3或4，且在m为2、3或4时，每个R10可以相同或不同；
R7为-L2-A2，其中L2为C1-C5亚烷基且A2选自芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基，条件是R7不连接于X；
R8选自氢和烷基；
R9选自氢、羟基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基；
或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或被取代的杂环烷基；
R10选自氰基、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、-CF3、烷氧基、被取代的烷氧基、卤代和羟基；和
R11选自氢、烷基、被取代的烷基、-SO2烷基和-SO2被取代的烷基。
2.权利要求1的化合物，其中R2为烷基。
3.权利要求2的化合物，其中R2为甲基。
4.权利要求1的化合物，其中R1和R2是甲基。
5.式(Ia)-(Ie)的权利要求1的化合物，或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A2007800456740003C1
6.权利要求1或5的化合物，其中X为N。
7.权利要求1或5的化合物，其中X为CR5。
8.权利要求7的化合物，其中R5为氢。
9.权利要求1的化合物，其中L1为-CO-。
10.式(II)的权利要求1的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A2007800456740004C1
其中：
R1选自烷基和被取代的烷基；
R4为被1-5个取代基取代的烷基，所述取代基选自：羟基、烷氧基、被取代的烷氧基、氨基、被取代的氨基、酰基氨基、卤代、含氮的杂环烷基、被取代的含氮的杂环烷基、含氮的杂芳基和被取代的含氮的杂芳基；
A1选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基和NR8R9；
或者A1和R4与各自结合的原子一起形成杂环烷基或被取代的杂环烷基基团，其中任选地一个另外的环原子选自O、S或NR11；
X为CR5或N；
R5选自氢、卤代、烷基和被取代的烷基；
R7为-L2-A2，其中L2为C1-C5亚烷基且A2选自芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基；
R8选自氢和烷基；
R9选自氢、羟基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基和被取代的杂环烷基；
或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或被取代的杂环烷基；
m为1、2、3或4，且在m为2、3或4时，每个R10可以相同或不同；和
R10选自氰基、烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、-CF3、烷氧基、被取代的烷氧基、卤代和羟基；和
R11选自氢、烷基、被取代的烷基、-SO2烷基和-SO2被取代的烷基。
11.权利要求10的化合物，其中X为N。
12.权利要求10的化合物，其中X为CR5。
13.权利要求12的化合物，其中R5为氢。
14.式(IIa)的权利要求10的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A2007800456740005C1
15.式(IIb)的权利要求10的化合物或其药学可接受的盐、酯或前体药物：
Figure A2007800456740005C2
16.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R1为烷基。
17.权利要求16的化合物，其中R1选自异丙基、叔丁基和丙基。
18.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为芳基或被取代的芳基。
19.权利要求18的化合物，其中A1为被取代的或未被取代的苯基。
20.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为杂芳基或被取代的杂芳基。
21.权利要求20的化合物，其中A1为被取代的或未被取代的吡啶基。
22.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为杂环烷基或被取代的杂环烷基。
23.权利要求22的化合物，其中A1为被取代的或未被取代的吗啉代。
24.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为烷基或被取代的烷基。
25.权利要求24的化合物，其中所述被取代的烷基被烷氧基或羟基取代。
26.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为1，3-苯并噻二唑-4-基、叔丁氧基、丁氧基、正-丁氧基、环己基、2，2-二甲基丙氧基、乙氧基、呋喃-3-基、异噁唑-3-基、甲氧基、甲基、2-甲基丙氧基、苯基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、正-丙氧基、吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、吡嗪-2-基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢-2H-吡喃-4-基、1H-四唑-1-基、2H-四唑-2-基、噻唑-4-基、1，3，4-噻二唑-2-基、1，3-苯并噻二唑-6-基、3，3-二氢苯并[1，2，3]噻二唑-4-基、苯并咪唑-2-基、苯并咪唑-6-基、苯并[1，2，5]噻二唑、苯并噁二唑-4-基、环戊基、咪唑-4-基、吲唑-6-基、异噁唑-5-基、吗啉-2-基、吗啉代、噁唑-4-基、哌啶-N-基、吡唑-3-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、吡咯烷-N-基、四唑-5-基或噻二唑-4-基。
27.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为选自以下的被取代的芳基或杂芳基基团：5-甲基-2H-咪唑-4-基、2-氨基噻唑-4-基、4-叔丁基苯基、2-氯苯基、2-氯-6-甲基吡啶-4-基、3-氯苯基、4-氯苯基、6-氯吡啶-3-基、3，4-二氯苯基、2，4-二氟苯基、1，5-二甲基-1H-吡唑-3-基、2，4-二甲基噻唑-5-基、1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-基、2-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-甲基异噁唑-3-基、5-甲基异噁唑-4-基、4-甲基苯基、1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、1-甲基-5-氯-1H-吡唑-4-基、5-甲基-1H-吡唑-3-基、6-甲基吡啶-3-基、2-吡咯烷-3-基苯基、4-(三氟甲基)苯基、6-(三氟甲基)吡啶-3-基、2，5-二甲基噁唑-4-基、2-氨基噻唑-4-基、4-甲基吡唑-5-基、3-三氟甲基吡唑-4-基、2-甲基-3-三氟甲基吡唑-5-基、4-氯-1，3-二甲基吡唑并[3，4吡啶和1-甲基苯并咪唑-2-基。
28.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为选自以下的被取代的杂环或环烷基：3-[(氨基乙酰基)氨基]环己基、3-(2-氨基乙基磺酰基氨基)环己基、1-甲基哌嗪-4-基、1-甲基羰基哌啶-4-基、1-甲氧基羰基哌啶-4-基、奎宁环-3-基、2-氧代吡咯烷-5-基、2-氧代吡咯烷-4-基、2-氧代-二氢呋喃-5-基、2-氧代噻唑烷-4-基和3-羟基吡咯烷-5-基。
29.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为选自以下的被取代的烷基：3-氨基-2-氧代-1(2H)-吡啶基甲基、氰基甲基、(N，N-二甲基氨基)甲基、乙氧基甲基、对氟苯氧基甲基、羟基甲基、1H-咪唑-1-基甲基、甲氧基甲基、(N-甲基氨基)甲基、甲基磺酰基甲基、(5-甲基-1H-四唑-1-基)甲基、(5-甲基-2H-四唑-2-基)甲基、吗啉-4-基甲基、1H-吡唑-1-基甲基、1H-1，2，3-三唑-1-基甲基、2H-1，2，3-三唑-2-基甲基、1H-1，2，4-三唑-1-基甲基、2H-1，2，4-三唑-2-基甲基、4H-1，2，4-三唑-4-基甲基、1H-四唑-1-基甲基、1H-四唑-5-基甲基、2H-四唑-2-基甲基、咪唑-4-基甲基、1-甲基吡唑-3-基甲基、哌啶-4-基甲基、三氟甲基、二甲基氨基乙基和2-氧代-3-氨基吡咯烷-1-基甲基。
30.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A1为NR8R9。
31.权利要求30的化合物，其中R8为氢。
32.权利要求30的化合物，其中R8和R9都是氢。
33.权利要求30的化合物，其中R9选自烷基、被取代的烷基和环烷基。
34.权利要求33的化合物，其中R9选自甲基、羟基甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、呋喃-2-基甲基、2-羟基乙基、环丙基和异丙基。
35.权利要求30的化合物，其中R9为芳基或被取代的芳基。
36.权利要求35的化合物，其中R9选自4-氰基苯基、3，4-二氟苯基、2，3，5-三氟苯基、3，5-二硝基苯基和苯基。
37.权利要求30的化合物，其中R9为杂芳基或被取代的杂芳基。
38.权利要求37的化合物，其中R9选自噻吩-2-基、3，5-二甲基异噁唑-4-基和2，6-二氯吡啶-4-基。
39.权利要求30的化合物，其中R9为杂环烷基或被取代的杂环烷基基团。
40.权利要求39的化合物，其中R9为四氢吡喃-4-基或4-(乙氧基羰基)哌啶-4-基。
41.权利要求30的化合物，其中R9为羟基。
42.权利要求30的化合物，其中R8和R9与它们所结合的氮原子环化，形成选自以下的杂环或被取代的杂环-NR8R9：硫代吗啉-N-基、1，1-二氧代硫代吗啉-N-基、1-氧代硫代吗啉-1-基、2-(氨基亚甲基)吡咯烷-N-基、2-(甲氧基羰基)吡咯烷-N-基、2，6-二甲基吗啉-N-基、3-羟基哌啶-N-基、3-羟基吡咯烷-N-基、4-(丁基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(环丙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(二甲基氨基)哌啶-N-基、4-(乙氧基羰基)哌嗪-N-基、4-(乙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(异丙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(甲基羰基)哌嗪-N-基、4-(甲基磺酰基)哌啶-N-基、4-(甲基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(吗啉-N-基)哌啶-N-基、4-(哌啶-N-基)哌啶-N-基、4-(丙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-环己基哌嗪-N-基、4-羟基哌啶-N-基、4-异丙基哌嗪-4-基、4-甲基哌啶-N-基、异噁唑烷-2-基、吗啉-N-基、哌嗪-N-基、哌啶-N-基、2-(肼基羰基)吡咯烷-N-基和吡咯烷-N-基。
43.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R4为被取代的烷基。
44.权利要求43的化合物，其中R4为被1-5个取代基取代的烷基，所述取代基选自：氨基、被取代的氨基、卤代、烷氧基、被取代的烷氧基和羟基。
45.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R4选自氢、哌啶-4-基、-(CH2)2-NH2、-CH2-氮杂环丁烷-3-基、-CH2-(2，5-二氢吡咯-3-基)、-(CH2)3-咪唑-1-基、-CH2-(1H-咪唑-4-基)、-CH2-吡啶-3-基、-CH2-(2-羟基吡啶-4-基)、-CH2-(6-羟基吡啶-3-基)、-CH2-吗啉-2-基、-CH2-吡咯烷-3-基、-CH2-(3-氟吡咯烷-3-基)、-CH2-(3-羟基吡咯烷-3-基)、-CH2-(4-氟吡咯烷-3-基)、-CH2-(4-羟基吡咯烷-3-基)、-CH2-(2-羟基甲基吡咯烷-3-基)、-CH2-哌啶-3-基、-CH2-[1H-(1，2，3-三唑-4-基)、-CH2CH(NH2)CH2OH、-(CH2)3-OH、-(CH2)3-O(CO)-苯基、-(CH2)3-NH2、-(CH2)3-NHCH3、-(CH2)3-N(CH3)2、-(CH2)3-NHOCH3、-(CH2)3-NHSO2CH3、-(CH2)3NH-(5-氰基吡啶-2-基)、-(CH2)3NH-环丙基、-(CH2)3NH-环丁基、-(CH2)3-(1H-咪唑-2-基)、-(CH2)3-(2-羟基乙基哌啶-1-基)、-(CH2)3NH(2-羟基甲基苯基)、-(CH2)3NH-(5-三氟甲基吡啶-2-基)、-(CH2)3NHCH2-环丙基、-(CH2)3NHCH2-{5-(吡啶-3-基氧基)-1H-吲唑-3-基}、-(CH2)3NHCH2-(5-甲氧基-1H-吲唑-3-基)、-(CH2)3NHCH2-(6-氟-1H-吲唑-3-基)、-CH2CHOHCH2NH2、-CH2CH(CH2OH)CH2NH2、-CH2C(CH3)2CH2-N(CH3)2、-CH2C(CH3)2CH2-(4-甲基哌嗪-1-基)、-(CH2)2C(O)NH2、-(CH2)2CH(NH2)C(O)NH2、-(CH2)2CH(NH2)C(O)OH、-(CH2)2CH(NH2)CH2C(O)NH2、-(CH2)2CH(NH2)CH2OH、-(CH2)2CH(NH2)CH3、-(CH2)3NHC(O)CH2NH2、-(CH2)3NHC(O)CH(NH2)CH(CH3)2、-CH2CHFCH2NH2、-(CH2)2NHC(O)CH2NH2、-(CH2)3-NHCH2CH2OH、-(CH2)3-NHCH2CO2H、-(CH2)3NHCH2CO2CH2CH3、-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2、-(CH2)3-NHCH(CH2OH)2、-(CH2)3CH3、-(CH2)2CH(NH2)CH2OH、-(CH2)2C(CH3)2NH2、-(CH2)2CH(NH2)CH2OCH3、-(CH2)2CH(NH2)CH2F、-CH2CHFCH(NH2)CH2OH和-(CH2)2螺环丙基-NH2。
46.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R4选自-(CH2)3NH2、-(CH2)2CH(CH2OH)NH2、-CH2CH(F)CH2NH2、-CH2-[2-(CH2OH)吡各烷-3-基、-CH2-[4-(OH)吡咯烷-3-基、-CH2-C(F)(螺吡咯烷-3-基)、-(CH2)2CH(CH2F)NH2、-(CH2)2C(CH3)2NH2、-(CH2)2CH(CH3)NH2和-(CH2)CH(CH2OCH3)NH2。
47.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R3和R4或A1和R4与各自结合的原子一起形成5-7元的杂环烷基或被取代的杂环烷基基团。
48.权利要求47的化合物，其中所述杂环烷基或被取代的杂环烷基基团选自：
49.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R6为芳基或被取代的芳基且选自苯基、3-氯苯基、3-氟苯基、2，5-二氟苯基和2，3，5-三氟苯基。
50.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R6选自苯基、3-溴苯基、3-氯苯基、4-氰基苯基、3，5-二氟苯基、3-氟苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-甲基苯基、吡嗪-2-基、吡啶-2-基、噻唑-2-基、2-三氟甲基苯基和3-三氟甲基苯基。
51.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中A2选自苯基、6-氨基吡啶-2-基、3-氯苯基、3-氰基苯基、2，4-二氟苯基、2，5-二氟苯基、3，5-二氟苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、3-羟基苯基、3-甲氧基苯基、1-(5-甲基)-异噁唑-3-基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、四氢吡喃-4-基、噻唑-4-基和5-三氟甲基呋喃-2-基。
52.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中L2为亚甲基且A2选自苯基、3-氟苯基或3-羟基苯基。
53.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R7为苄基。
54.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R1为叔丁基，L2为亚甲基，A2为苯基且R6为苯基或被取代的苯基。
55.权利要求54的化合物，其中R1为叔丁基，L2为亚甲基，A1为苯基，R6为被1至2个卤代取代基取代的苯基。
56.权利要求1、5或10中任一项的化合物，其中R1为叔丁基，R2为氢，L2为亚甲基，A2为苯基，R4为被取代的烷基。
57.权利要求56的化合物，其中R4为-(CH2)3NH2、-CH2CH(F)CH2NH2、-(CH2)2CH(CH2F)NH2、-(CH2)2CH(CH2OCH3)NH2、-(CH2)2CH(CH3)NH2、-(CH2)2C(CH3)2NH2或-(CH2)2CH(CH2OH)NH2。
58.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1的化合物和药学可接受的载体。
59.权利要求58的组合物，进一步包含至少一种另外的用于治疗癌症的活性剂。
60.权利要求59的组合物，其中所述用于治疗癌症的另外的活性剂选自依立替康、拓扑替康、吉西他滨、伊马替尼、司徒曼布、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、卡铂、顺铂、多西他赛、紫杉醇、tezacitabine、环磷酰胺、长春花生物碱、蒽环类、利妥希玛和司徒曼布。
61.治疗哺乳动物患者的至少部分由KSP介导的病症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物患者施用治疗有效量的权利要求58的组合物。
62.权利要求61的方法，其中所述病症为细胞增殖性疾病。
63.权利要求62的方法，其中所述细胞增殖性疾病为癌症。
64.权利要求63的方法，其中所述癌症选自肺和支气管癌、前列腺癌、乳癌、胰腺癌、结肠和直肠癌、甲状腺癌、胃癌、肝脏和肝内胆管癌、肾脏和肾盂癌、膀胱癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、食管癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病、脑癌、口腔和咽癌、喉癌、小肠癌、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和绒毛状结肠腺瘤。
65.权利要求64的方法，进一步包括对所述哺乳动物患者施用一种另外的用于治疗癌症的活性剂。
66.权利要求65的方法，其中所述用于治疗癌症的另外的活性剂选自依立替康、拓扑替康、吉西他滨、伊马替尼、司徒曼布、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、卡铂、顺铂、多西他赛、紫杉醇、tezacitabine、环磷酰胺、长春花生物碱、蒽环类、利妥希玛和司徒曼布。
67.用于抑制哺乳动物患者的KSP驱动蛋白的方法，其中所述方法包括对所述患者施用抑制KSP有效量的权利要求1的化合物。
68.权利要求1的化合物，选自以下：
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)吗啉-4-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-甲氧基乙酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基乙酰胺；
N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)哌啶-1-甲酰胺；
N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)吗啉-4-甲酰胺；
(2S，6R)-N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2，6-二甲基吗啉-4-甲酰胺；
1-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-1-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-3，3-二甲基脲；
1-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-1-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-3-甲基脲；
(2S，6R)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2，6-二甲基吗啉-4-甲酰胺；
1-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-1-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-3，3-二甲基脲；
1-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-1-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-3-甲基脲；
N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)硫代吗啉-4-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)硫代吗啉-4-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)哌啶-1-甲酰胺；
(R)-6-(氨基甲基)-4-((R)-1-(1-苄基-3-苯基-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-1，4-氧氮杂环庚烷-3-酮；和
(S)-6-(氨基甲基)-4-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-1，4-氧氮杂环庚烷-3-酮；
或其药学可接受的盐、酯或前体药物。
69.权利要求1的化合物，选自以下：
N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基乙酰胺；
N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺；
N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-1，1-二氧代硫代吗啉-4-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-1，1-二氧代硫代吗啉-4-甲酰胺；
(2R)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酰胺；
(2S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酰胺；
(2R)-N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酰胺；
(2S)-N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酰胺；
(2S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基乙酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)吗啉-4-甲酰胺；
(2S，6R)-N-(3-氨基丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2，6-二甲基吗啉-4-甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-甲酰胺；
(2S)-N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(2S)-N-((S)-3-氨基-2-氟丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酰胺；
(2S，6R)-N-((S)-3-氨基-2-氟丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2，6-二甲基吗啉-4-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-2-氟丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基乙酰胺；
(2S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-四氢呋喃-2-甲酰胺；
(2S)-N-((R)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-四氢呋喃-2-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-6-甲基吡啶-3-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)异烟酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)吡啶甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-(甲基磺酰基)乙酰胺；
N-((S)-3-氨基-2-氟丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺；
(2S)-N-((S)-3-氨基-2-氟丙基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
N-((R)-1-(2-(3-溴苄基)-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-2-羟基乙酰胺；
(2S)-N-((R)-1-(2-(3-溴苄基)-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-2-羟基丙酰胺；
N-((R)-1-(2-(3-溴苄基)-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)烟酰胺；
N-((R)-1-(2-(3-溴苄基)-5-(2，5-二氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)苯甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(5-氯-2-氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-甲氧基乙酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(2-苄基-5-(5-氯-2-氟苯基)-2H-1，2，4-三唑-3-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基乙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)苯甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-4-甲基苯甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)烟酰胺；
(R)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-(3-溴苄基)-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)四氢呋喃-2-甲酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-(3-溴苄基)-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)四氢呋喃-2-甲酰胺；
(R)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)四氢呋喃-2-甲酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-(3-氰基苄基)-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)吗啉-4-甲酰胺；
(2S，6R)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2，6-二甲基吗啉-4-甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2-甲基丙基)苯甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2-甲基丙基)-4-甲基苯甲酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2-甲基丙基)-2-甲氧基乙酰胺；
N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2-甲基丙基)-2-羟基乙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2-甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-甲氧基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-甲基苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(2S，6R)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-甲基苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2，6-二甲基吗啉-4-甲酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(3，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(3，5-二氯苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(2S，6R)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(3，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2，6-二甲基吗啉-4-甲酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((R)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((R)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-甲基苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(1-(3-氰基苄基)-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((R)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(1-(3-氰基苄基)-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((R)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(三氟甲基)苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-甲基苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-(三氟甲基)苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(1-(3-溴苄基)-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((R)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(1-(3-溴苄基)-3-(2，5-二氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(2-氯-5-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4-氟丁基)-N-((R)-1-(1-苄基-3-(5-氯-2-氟苯基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2-甲基丙基)-3-(羟基甲基)吗啉-4-甲酰胺；
(S)-N-((S)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-异丙基苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；和
(S)-N-((R)-3-氨基-4，4-二氟丁基)-N-((R)-1-(3-(2，5-二氟苯基)-1-(3-异丙基苄基)-1H-1，2，4-三唑-5-基)-2，2-二甲基丙基)-2-羟基丙酰胺；
或其药学可接受的盐、酯或前体药物。
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