JP2016516035A - 細胞増殖阻害剤およびそれらのコンジュゲート - Google Patents

細胞増殖阻害剤およびそれらのコンジュゲート Download PDF

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Abstract

細胞増殖性障害の処置に有用な、抗体等の抗原結合部分に連結するＥｇ５の阻害剤を含むイムノコンジュゲートが、本明細書に開示される。細胞増殖障害を処置するために単独でまたはイムノコンジュゲートの一部分としてのいずれかで用いられうる新規なＥｇ５の阻害剤も、また開示される。Ｅｇ５阻害剤は、本明細書に記載されるこの式：［６８頁からここに最後の構造を挿入］の化合物を含む。本発明は、これらの化合物およびイムノコンジュゲートを含む医薬組成物をさらに提供し、治療補助剤、ならびに細胞増殖障害の処置のためのこれらの化合物、コンジュゲート、および組成物の使用方法を任意選択で含む。

Description

本発明は、Ｅｇ５活性を阻害することにより細胞増殖を阻害し、したがって過剰なＥｇ５活性に関連する細胞増殖性障害を処置するのに有用である化合物を提供する。本発明は、また抗原結合部分に連結するＥｇ５の阻害剤を含むコンジュゲート、およびこれらのコンジュゲートを含有する医薬組成物も含む。さらに、がんを含む細胞増殖性障害を処置するための、これらの化合物およびコンジュゲートの使用方法も含む。
近年、非常に多くの研究は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成することによる、細胞増殖阻害剤および細胞毒性剤を除去の標的とされた特定の細胞に送達する抗体の使用を志向してきた。ＡＤＣは、通常、治療的介入のために標的とされた細胞に結合する能力のために選択され、細胞増殖抑制性または細胞毒性の活性のために選択された薬物に連結する抗体を含有する。抗体の標的細胞への結合により、薬物が治療効果を必要とする部位へと送達され、したがってペイロード化合物が利用される効率を改善する一方、非特異的活性を減少させる。
がん細胞のような、標的細胞を認識し選択的に結合する多くの抗体は、ＡＤＣにおける使用のために開示されており、細胞毒等のペイロード（薬物）化合物を抗体に付着するための多くの方法も、また記載されている。けれども、ＡＤＣに関する広範な研究にもかかわらず、ほんの数種類の細胞増殖阻害剤または細胞毒が、ＡＤＣペイロードとして広範に用いられている。米国でヒトに使用するために認可された最初のＡＤＣは、２０００年に開始されたけれども（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、のちに市場から撤退した）、１０年後に数種類のみの化学的薬物化合物類（マイタンシノイド、オーリスタチン、カリチアマイシンおよびデュオカルマイシン）が、ＡＤＣのためのペイロードとして臨床試験に到達した。Antibody-Drug Conjugates: the Next Generation of Moving Parts, A. Lash, Start-Up, Dec. 2011, 1-6.これは、効果的なＡＤＣペイロードをもたらす薬物化合物の適切な種類を同定することがいかに困難であるかを示唆している。治療用としての、詳細にはがん処置のためのＡＤＣの広く認識された価値を考慮すると、したがってＡＤＣにおけるペイロードとしての使用に適する新規な細胞増殖阻害剤に関する必要性が依然として存在する。
本発明は、小分子医薬品としてのまたは抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物成分（ペイロード）としてのいずれかの、新規なＥｇ５の阻害剤およびＥｇ５阻害剤の使用方法を含む。
Ｅｇ５は、またキネシン紡錘体タンパク質またはＫＳＰとして知られており、キネシンモータータンパク質であり、有糸分裂中に微小管の架橋に関与し、したがって細胞分裂において必要である。Ｅｇ５の阻害剤は、がんのような細胞増殖性障害を処置するのに有用であることが知られている（Rath and Kozielski, Nature Rev. Cancer, vol. 12, 527-39 (2012)；ＷＯ０６／００２２３６、ＷＯ２００７／０２１７９４、ＷＯ２００８／０６３９１２、ＷＯ２００９／０７７４４８、ＷＯ２０１１／１２８３８１、ＷＯ２０１１／１２８３８８、およびＷＯ２００６／０４９８３５も参照のこと）。Ｅｇ５阻害剤の多数の異なる化学種が知られている一方、それらは今までＡＤＣに用いられていない。本発明は、ＡＤＣのための薬物ペイロードとしてのＥｇ５阻害剤、ならびにＡＤＣペイロードとしておよび小分子医薬品として有用である新規なＥｇ５阻害剤の使用を含む。本発明は、さらにＡＤＣ内に特定のＥｇ５阻害剤を組み込むために有用な方法および中間体、ならびに細胞増殖性障害を処置するための新規な化合物およびコンジュゲートの使用方法を含む。
本発明は、抗体または抗体断片等の抗原結合部分に連結するＥｇ５の阻害剤を含有するイムノコンジュゲート（例えば、ＡＤＣ）を提供する。Ｅｇ５阻害剤を含むこれらのコンジュゲートは、細胞増殖性障害を処置するのに有用であり、詳細にはＥｇ５阻害剤はがん細胞を認識する抗体に連結した場合、したがって攻撃標的のがん細胞へのＥｇ５阻害剤の送達を促進する。イムノコンジュゲートは、本明細書でさらに詳述するように、特に特定のがんの処置に有用である。本明細書に提供されたデータにより、これらのイムノコンジュゲートは、理論に制約されることなく、細胞増殖およびある種のがんの処置において効果的な阻害剤であることが実証され、それらの活性は細胞内でのＥｇ５の阻害によるものであると確信されている。
一態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、この式
Figure 2016516035
の化合物を含み：
Ａｂは、抗原結合部分を表し；
Ｌは、ＸをＡｂに接続する連結基を表し
ｍは、１〜４の整数であり；
ｎは、１〜１６の整数であり；
Ｘは、独立して、出現する毎に、Ｅｇ５の阻害剤を表す。
ｍが１より大きい場合、各Ｌは、独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｌは同一である。
これらのイムノコンジュゲートにおいて、Ｘは、本明細書に記載される式ＩＩの化合物、またはＥｇ５の阻害に対して約１００ｎＭ未満のＩＣ−５０を有する任意のＥｇ５阻害剤でありうる。そのような多くのＥｇ５阻害剤が知られており、イスピネシブ、ＳＢ−７４３９２１、ＡＺＤ４８７７、ＡＲＱ６２１、ＡＲＲＹ−５２０、ＬＹ２５２３３５５、ＭＫ−０７３１、ＥＭＤ５３４０８５、およびＧＳＫ−９２３２９５、ならびにＷＯ０６／００２２３６、ＷＯ２００７／０２１７９４、ＷＯ２００８／０６３９１２、ＷＯ２００９／０７７４４８、ＷＯ２０１１／１２８３８１、ＷＯ２０１１／１２８３８８、およびＷＯ２００６／０４９８３５に記載されているＥｇ５阻害剤を含む。
通常、ｍは、この式のイムノコンジュゲートにおいて１または２、好ましくは１であり；ｎは、２〜８、好ましくは約２〜約６、さらに好ましくは３〜５の間である。Ａｂは、任意の適切な抗原結合部分でありえて、抗体であることが多い。適切な抗体は、当技術分野で周知であり、自然の抗体シーケンスでありうるかまたは、例えば、タンパク質工学技法により修飾されてその有用性もしくは活性を改善しうるかのいずれかである。Ｌは、１つまたは複数のＸ基をＡｂに付着する任意の適切なリンカーでありえて；Ｌは、リシンデルタアミノ基、または抗体のシステインスルフヒドリルに付着していることが多い。これらは天然起源の残基でありうるか、または抗体シーケンス内の選択される位置に導入されうる。
適切なＸの選択肢は、本明細書に開示される式（ＩＩ）の化合物を含み、同様にモナストロール（エチル４−（３−ヒドロキシフェニル）−６−メチル−２−スルファニリデン−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリミジン−５−カルボキシレート）；（２Ｓ）−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−メチル−４−ピペリジニル］−２，５−ジヒドロ−２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−１−カルボキサミド（ＭＫ−０７３１、ＣＡＳ ８４５２５６−６５−７）；リトロネシブ（ＬＹ２５２３３５５、ＣＡＳ ９１０６３４−４１−２）；および（２Ｓ）−２−（３−アミノプロピル）−５−（２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−２−フェニル−１，３，４−チアジアゾール−３（２Ｈ）−カルボキサミド（ＡＲＲＹ５２０）；およびＡＺ３１４６（９−シクロペンチル−２−［［２−メトキシ−４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］−フェニル］アミノ］−７−メチル−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン）も含む。
特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは式（Ｉ）
Figure 2016516035
であり、
Ａｂは、抗体または抗体断片等の抗原結合部分を表し；
Ｌは、共有または非共有結合によりＸをＡｂに接続する連結基を表し、２個以上のＸをＡｂに任意選択で付着しえて、ｉｎ ｖｉｖｏで開裂を促進するように設計されうるかまたは設計されえず；
Ｘは、独立して、出現する毎に、式（ＩＩ）
Figure 2016516035
の化合物を表し：
さらに以下の記載のように；
ｍは、１〜４の整数であり、通常、１〜２の整数であり；
ｎは、１〜１６の整数であり、好ましくは２〜８の整数である。
２個以上の連結基Ｌが存在する場合、各Ｌは、独立して選択されうる。いくつかの実施形態では、各Ｌ基は同一である。
本発明は、送達されるペイロード（薬物）として、Ｅｇ５阻害剤、詳細には式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物を用いたＡＤＣの製造方法、および細胞増殖性障害を処置するためのこれらのＡＤＣの使用方法を提供する。
本発明は、また本明細書に式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）および（ＩＩＣ）と記載される式（ＩＩ）の修飾化合物も提供し：これらは反応性官能基および任意選択で１つまたは複数の付着するリンカー成分を有する式（ＩＩ）の化合物を含む構造であり、化合物を直接的または間接的のいずれかで抗体または抗原結合性断片に接続することを促進する。これらの化合物は、イムノコンジュゲートを作製するのに有用である。したがって、別の一態様では、本発明は式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）および（ＩＩＣ）
Figure 2016516035
の化合物を提供する：
式中、Ｗは（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）または（ＩＩＣ）をリンカー成分に接続するか、または直接的にＡｂに接続するために用いられうる反応性官能基を含み、式（Ｉ）のイムノコンジュゲート、およびＡＤＣ作製のためにこれらの化合物を使用する方法を提供する。
別の一態様では、本発明は本明細書に記載される式（ＩＩＩ）
Figure 2016516035
の新規なＥｇ５阻害剤、および薬学的に許容されるそれらの塩を提供する。
これらの化合物は新規なＥｇ５の阻害剤であり、本明細書に示す抗がん活性を持つ。それらは本明細書で実証されるようにＡＤＣペイロードとして用いられえて、または他のＥｇ５の阻害剤のように、細胞増殖性障害の処置のための小分子治療剤として用いられうる。
別の一態様では、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と混合された、２つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と任意選択で混合された式（Ｉ）のイムノコンジュゲートまたは式（ＩＩＩ）の化合物を含む医薬組成物、および細胞増殖性障害を処置するためのこれらの組成物の使用方法を提供する。
別の一態様では、本発明は、過剰のまたは所望されない細胞増殖を特徴とする状態を処置するための、そのような処置を必要とする対象に有効量の式（Ｉ）のイムノコンジュゲートもしくは式（ＩＩＩ）の化合物、または本明細書に記載される任意のそれらの亜族、またはそのような化合物もしくはイムノコンジュゲートを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。処置の対象は哺乳動物、および好ましくはヒトでありうる。本明細書に記載される化合物および方法により処置できる状態は、胃腫瘍、骨髄腫瘍、結腸腫瘍、上咽頭腫瘍、食道腫瘍、および前立腺腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞系列の急性リンパ性白血病またはＴ−ＡＬＬ）、リンパ腫（特に非ホジキン病）、膀胱、腎、胃（例えば、消化管間葉性腫瘍（ＧＩＳＴ））、肝、および膵がん、ならびに肉腫等の、さまざまな形態のがんを含む。これらの方法および組成物によって処置されうる他の細胞増殖性障害は、糖尿病性網膜症、肝および肺線維症、シェーグレン症候群、ならびにエリテマトーデスを含む。
本発明は、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の組成物、および本明細書に記載されるそれらの亜族、ならびに全ての立体異性体（ジアステレオ異性体およびエナンチオマーを含む）、互変異性体およびそれらの同位体的な濃縮物（重水素置換を含む）同様に薬学的に許容されるこれらの化合物の塩を含む。本発明の組成物は、また式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の多形（またはそれらの亜形）、および塩、詳細には薬学的に許容されるそれらの塩も含む。
別の一態様では、本発明は、抗体を本明細書に記載されるＥｇ５阻害剤を含む細胞毒等のペイロードと接続する改善された連結基を含むイムノコンジュゲートを提供する。これらのイムノコンジュゲートは、式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−の基を含む連結基を含み、アミドまたはカルバミン酸塩でありえて、Ｒ２１は式−（ＣＨ２）１〜４−Ｒ２２のものであり、Ｒ２２は−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｎ（Ｒ２３）２、ＣＯＯＲ２３、ＣＯＮ（Ｒ２３）２、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＲ２３、および−ＳＯ２Ｒ２３から選択される極性基であり、ｋは０〜４であり、各Ｒ２３は独立してＨまたはＣ１〜４アルキルである。これらの連結基はイムノコンジュゲートの凝集を減少させる。
重鎖および軽鎖の負荷に基づくＡＤＣに関する平均薬物負荷の決定（ＤＡＲ、薬物対抗体の比）を示す図である。 重鎖および軽鎖の負荷に基づくＡＤＣに関する平均薬物負荷の決定（ＤＡＲ、薬物対抗体の比）を示す図である。 細胞培養における式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の様々な化合物の抗増殖活性を示すグラフである。 細胞培養における式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の様々な化合物の抗増殖活性を示すグラフである。 細胞培養における式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の様々な化合物の抗増殖活性を示すグラフである。 細胞培養における式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の様々な化合物の抗増殖活性を示すグラフである。 細胞培養における式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の様々な化合物の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 高Ｈｅｒ２発現のために改変されている細胞株ｖｓマッチした親（Ｈｅｒ２−低）細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 内因性Ｈｅｒ２発現を有する細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 内因性Ｈｅｒ２発現を有する細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 内因性Ｈｅｒ２発現を有する細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 内因性Ｈｅｒ２発現を有する細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 内因性Ｈｅｒ２発現を有する細胞株に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を示すグラフである。 ＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片におけるＴＢＳ−化合物２２０コンジュゲートの効力を示すグラフである。 ＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片におけるＴＢＳ−化合物２２０コンジュゲートの効力を示すグラフである。 ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ異種移植片におけるＴＢＳ−化合物２２０コンジュゲートの効力を示すグラフである。 ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ異種移植片におけるＴＢＳ−化合物２２０コンジュゲートの効力を示すグラフである。 ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ異種移植片におけるＴＢＳ−化合物２１５コンジュゲートの効力を示すグラフである。 ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ異種移植片におけるＴＢＳ−化合物２２３コンジュゲートの効力を示すグラフである。 サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された場合の、ＡＤＣ−１１０と称される構築物の凝集度を示すグラフである。検出された凝集体の量は、合計検出コンジュゲートの約１２％である。 ＡＤＣ−１１１の凝集体の量を示すグラフであり、該量は約２．４％である。 ＡＤＣ−１１２の凝集体の量を示すグラフであり、該量は約２．７％である。 様々な細胞型に対抗するＡＤＣ−１１０およびＡＤＣ−１１１のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。 様々な細胞型に対抗するＡＤＣ−１１０およびＡＤＣ−１１１のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。 様々な細胞型に対抗するＡＤＣ−１１０およびＡＤＣ−１１１のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。 抗体ｃＫｉｔＡに連結された、異なるペイロード（表５から５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆ）を有する一連のイムノコンジュゲートの活性を示すグラフである。全てがＳＫ−ＯＶ−３ｉｐに対して細胞培養中の良好〜優れた活性を呈する。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 様々な腫瘍細胞株に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた選択ペイロードの活性を示すグラフであり、式ＩＩの様々なペイロードが様々ながん細胞株に対抗して活性であることを実証している。ペイロード化合物は表５および６において見出される。 他の化合物クラス由来のＥｇ５阻害剤と比較した、本発明の代表的阻害剤を示すグラフであり；図１４における化合物は全て、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーを介してトラスツズマブに連結されている。 他の化合物クラス由来のＥｇ５阻害剤と比較した、本発明の代表的阻害剤を示すグラフであり；図１４における化合物は全て、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーを介してトラスツズマブに連結されている。 メイタンシンペイロードとのイムノコンジュゲートと比較した、高Ｈｅｒ２および低Ｈｅｒ２の細胞株に対する本発明のトラスツズマブイムノコンジュゲートの活性を示すグラフである。非Ｈｅｒ２抗原バインダーを用いるイムノコンジュゲートが比較のために含まれている。 トラスツズマブ単独で、化合物５Ｂ（５ｍｇ／ｋｇ用量および１０ｍｇ／ｋｇ用量）とコンジュゲートされたトラスツズマブ、および抗原結合基が腫瘍抗原を認識しない対照コンジュゲートで処理されたマウス異種移植片腫瘍（ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ）に対するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害結果を示すグラフである。 メイタンシンペイロード、ならびにペイロードが欠如している１つの対照および腫瘍結合抗体を用いない１つの対照とのコンジュゲートと比較した、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）上にＥｇ５阻害剤ペイロードを有するイムノコンジュゲートで処理されたマウス異種移植片腫瘍（ＳＫ＿ＯＶ−３ｉｐ）に対するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害活性を示すグラフである。 ｃＫｉｔＡ（抗ｃＫｉｔ抗体）上にＥｇ５阻害剤ペイロードを有するイムノコンジュゲートで処理されたマウス異種移植片腫瘍（Ｈ５２６）に対するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害活性を示すグラフである。 メイタンシンペイロード（ＤＭ１）を含有するｃＫｉｔＡコンジュゲートと比較した、ｃＫｉｔＡ（抗ｃＫｉｔ抗体）上にＥｇ５阻害剤ペイロードを有するイムノコンジュゲートで処理されたマウス異種移植片腫瘍（Ｈ５２６）に対するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害活性を示すグラフである。 ｃＫｉｔＡ（抗ｃＫｉｔ）抗体上およびトラスツズマブ抗体上にＥｇ５阻害剤ペイロードを有するイムノコンジュゲートで処理された２つの異種移植片腫瘍（Ｈ５２６およびＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ）を持つマウスに対するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害活性を示すグラフである。 マウス異種移植片ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ腫瘍上で試験された、トラスツズマブ抗体との様々なＥｇ５阻害剤イムノコンジュゲートの活性を示すグラフである。比較のため、オーリスタチンペイロード（ＭＭＡＥ）およびメイタンシンペイロード（ＤＭ１）とコンジュゲートされた同じ抗体を有するイムノコンジュゲート。 比較物としてＫａｄｃｙｌａ（登録商標）および抗ＨＥＲ２抗体ならびに対照としてビヒクルのみを使用する、マウス異種移植片腫瘍における表５からのいくつかのイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。 Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）、および化合物６Ｕ−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲート、ならびに比較物としてウイルス性糖タンパク質、ｇＨに特異的なｉｇＧ１カッパ鎖、および対照としてビヒクルのみを使用する、マウス異種移植片における表５からのいくつかのイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。 対照としてビヒクルのみを使用する、マウス異種移植片における表５からのいくつかのイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。イムノコンジュゲートは、表５からの化合物にコンジュゲートされた抗ｃＫｉｔ抗体を有し、細胞株はｃｋｉｔ抗体に感受性である。 対照としてビヒクルのみを使用する、マウス異種移植片における表５からのいくつかのイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。イムノコンジュゲートは、表５からの化合物にコンジュゲートされた抗ｃＫｉｔ抗体を有する。 マウス異種移植片中にペイロード−リンカー化合物５Ｂ、および３つの異なる抗ｃＫｉｔ抗体を有するイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。ｃＫｉｔＡは親抗体であり；ｃＫｉｔＢおよびｃＫｉｔＣは、本明細書記載されている通りのｃＫｉｔＡのシステイン改変ムテインである。結果は、対照としてのビヒクルのみとともに、２つの異なる投薬レベルで示されている。両方の用量で、システイン改変突然変異体抗体の各々は、天然抗体より活性なイムノコンジュゲートを提供した。 ｃＫｉｔＡ抗体（非コンジュゲート）および対照としてビヒクルとともに、化合物５Ｂとコンジュゲートされた抗体ｃＫｉｔＡを含むイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。 様々な異なる腫瘍細胞型上で試験された、本発明の広範囲のイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）活性を示すグラフである。最後の図（図２８〜２９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がＤＡＲにおける小さい変動によって有意に影響されないことを示している。
別段の規定がない限り、以下の定義が適用される。
用語「アミノ酸」は、正準の、合成の、および非天然のアミノ酸、同様に標準アミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体および擬態アミノ酸も表す。標準アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるタンパク新生のアミノ酸であり、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、同様にセレノシステイン、ピロリシン、およびピロリン−カルボキシ−リシンを含む。アミノ酸類似体は、標準アミノ酸と同一の基本的な化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合しているアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを表す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）、または修飾ペプチド骨格を有するが、標準アミノ酸と同一の基本的な化学構造を保持している。
本明細書で用いられる用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合することが可能な部分を表し、抗体および抗体断片を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、かつ特定の方法で結合することが可能な免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを表す。例えば、天然起源のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記）、および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３ドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）、および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、ＣＬの１ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変領域、より維持されて領域に組み込まれているフレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられた領域にさらに細分されうる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、以下の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配列している：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと宿主組織または因子との結合を媒介しえて、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）、および古典的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）を含むが、これらに限定されない。抗体は任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のものでありうる。
軽鎖および重鎖は両方とも、構造的および機能的な相同性の領域に分類される。用語「定常性の」および「可変の」は、機能性に用いられる。この点において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の両方の部分が、抗原の認識および特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、例えば分泌、経胎盤性移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要な生物学的特性を与える。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて大きくなる。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域であり；ＣＨ３およびＣＬドメインは実際、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを含む。
本明細書で用いられる用語「抗原結合性断片」は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による）能力を保持する抗体の１つまたは複数の部分を表す。結合断片の例として、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインで構成される一価の断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成されるＦｄ断片；抗体の１本アームのＶＬおよびＶＨドメインで構成されるＦｖ断片；ＶＨドメインで構成されるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているけれども、その２つのドメインは、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価の分子を形成している１本鎖のタンパク質（１本鎖のＦｖ（「ｓｃＦｖ」）として知られている；例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988; およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照のこと）として作製されることを可能にする合成リンカーにより、組換え方法を用いて結合されうる。そのような１本鎖抗体は、また用語「抗原結合性断片」内に包含されることも意図する。これらの抗原結合性断片は当業者に周知の従来技術を用いて得られ、該断片はインタクト抗体におけるのと同一の方法により、有用性をスクリーニングされる。
抗原結合性断片は、また単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照のこと）に組み入れられうる。抗原結合性断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）等のポリペプチドをベースにした足場に接合されうる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディが記載されている米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと）。
抗原結合性断片は、１対の直列型Ｆｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む１本鎖分子に組み入れられ、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、１対の抗原結合性領域を形成しうる（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; および米国特許第５，６４１，８７０号）。
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、実質的に同じアミノ酸シーケンスを有するかまたは同一の遺伝源に由来する抗体および抗原結合性断片を含むポリペプチドを表す。この用語は、また単一分子組成物の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域が両方ともヒト起源のシーケンスに由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含有する場合は、その定常領域も、またそのようなヒトシーケンス、例えばヒトの生殖系シーケンス、またはヒトの生殖系シーケンスの突然変異型またはヒトのフレームワークシーケンス解析に由来する共通フレームワークシーケンスを含有する抗体に由来し、例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000に記載されている）。
本発明のヒト抗体は、ヒトシーケンスによってコードされていないアミノ酸残基を含みうる（例えば、無秩序にもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏの部位特定の変異誘発によってもしくはｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入された突然変異、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換）。
本明細書で用いられる用語「ヒト化」抗体は、ヒトにおいて免疫原性がより少ないが一方、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体を表す。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、かつ抗体の残存部分をヒト抗体の相当する部分と置換することにより達成されうる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照のこと。
用語「特異的な結合」、または「選択的な結合」は、抗原（例えば、タンパク質）と抗体、抗体断片、または抗体由来の結合剤との相互作用を記述する文脈で用いられた場合、タンパク質および他の生物製剤、例えば生体試料、例えば血液、血清、血漿または組織試料のような不均一集団において、抗原の存在を決定する力を持つ結合反応を表す。したがって、特定の指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍の特定の抗原と結合し、試料中に存在する他の抗原と有意量で実質的に結合しない。一実施形態において、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも１０倍の特定の抗原と結合し、試料中に存在する他の抗原と有意量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗体または結合剤との特異的結合は、抗体または薬剤が、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択される必要がありうる。所望されるまたは適切なように、この選択は、他の種（例えば、マウスもしくはラット）または他の亜類型由来の分子と交差反応する抗体を取り去ることにより達成されうる。代替的に、いくつかの実施形態では、特定の所望の分子と交差反応する抗体または抗体断片が選択される。
多様なイムノアッセイフォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性を持つ抗体を選択するために用いられうる。例えば、固相のＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性を持つ抗体を選択するために常に用いられる（例えば、特定の免疫反応性を判定するために用いられうるイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載がある、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照のこと）。通常、特定のまたは選択的な結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍超、より通常には、バックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍超のシグナルを生み出すであろう。
本明細書で用いられる用語「親和性」は、単一の抗原部位における抗体と抗原との相互作用の強さを表す。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、多くの部位で抗原と弱い非共有結合性の力を介して相互作用し；相互作用がより多くなるにつれて、親和性はより強くなる。
用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に無含有である抗体を表す。しかしながら、１つの抗原と特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対して交差反応性を有しうる。その上、単離抗体は他の細胞物質および／または化学物質を実質的に無含有でありうる。
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを表す。該用語は、標準アミノ酸ポリマーと同様に非標準アミノ酸ポリマーにも適用される。特に明記されない限り、特定のポリペプチドシーケンスは、またそれらの保存的に修飾された変異体も暗黙のうちに包含する。
本明細書で用いられる用語「イムノコンジュゲート」または「抗体コンジュゲート」は、抗体またはその抗原結合性断片等の抗原結合部分と、例えば、化学療法剤、毒物、免疫療法剤、イメージング用プローブ、分光学的プローブ等の別の薬剤との連結を表す。連結は共有結合、または非共有結合的な相互作用でありえて、キレート化も含みうる。当技術分野で周知のさまざまなリンカーは、イムノコンジュゲートを形成する目的で使用されうる。さらに、イムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートをコードしているポリヌクレオチドから発現されうる融合タンパク質の形態で提供されうる。本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、本来、別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）をコードしている２つ以上の遺伝子または遺伝子断片の結合を介して生み出されるタンパク質を表す。融合遺伝子の翻訳は、結果的に元の各タンパク質に由来する機能的特性を有する単一のタンパク質となる。
本明細書で用いられる用語「細胞毒」または「細胞毒性剤」は、細胞の成長および増殖にとって有害である任意の薬剤を表し、細胞または悪性腫瘍を減少、阻害、または破壊するように作用しうる。
本明細書で用いられる用語「抗がん剤」は、がん等の細胞増殖性障害を処置するために用いられうる任意の薬剤を表し、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法剤および放射線治療剤、標的抗がん剤、ならびに免疫療法剤を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる用語「薬物部分」または「ペイロード」は、Ｅｇ５の阻害剤を含むが、これらに限定されず、抗体または抗原結合性断片にコンジュゲートされてイムノコンジュゲートを形成しえて、抗体または抗原結合性断片に付着するのに有用である任意の部分を含みうる化学物質的部分を表す。本発明のイムノコンジュゲートは、ペイロードとして例えばＥｇ５阻害剤を含むが、１つまたは複数の他のペイロードも含みうる。例えば、薬物部分またはペイロードは、抗がん剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、または麻酔剤でありうる。特定の実施形態では、薬物部分は、Ｖ型ＡＴＰアーゼ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定剤、微小管非安定剤、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質の核外輸送阻害剤、ＣＲＭ１、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリア中のリン酸移行反応阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤、およびＤＨＦＲ阻害剤から選択される。適切な例として、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ等のオーリスタチン；ガンマ−カリチアマイシン等のカリチアマイシン；およびＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４等のマイタンシノイドが挙げられる。これらのそれぞれを抗体に適合するリンカーに付着する方法および本発明の方法は当技術分野で知られている。例えば、Singh et al., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参照のこと。さらに、ペイロードは生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外プローブ、親和性プローブ、キレート剤、分光学的プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、糖類もしくは多糖類、本明細書に記載されるもの等の反応性官能基、またはコンジュゲートを別の部分もしくは表面に接続しうる結合剤等でありうる。
「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、腫瘍性の細胞成長および増殖を表し、全ての前がん性およびがん性の細胞と組織を表す。
用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖、生存能、または転移性活性の速度低下を意味する。抗腫瘍活性を示す可能な方法は、治療中に生じる異常な細胞の成長速度の減少または腫瘍の大きさの安定性もしくは減少を示すことである。そのような活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで認められている腫瘍モデルを用いて評価されえて、異種移植モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を調査するための当技術分野で知られている他の周知のモデルを含むが、これらに限定されない。
用語「悪性腫瘍」は、非良性の腫瘍またはがんを表す。本明細書に用いられる用語「がん」は、無秩序なまたは無制御の細胞成長を特徴とする悪性腫瘍を含む。例示的ながんとして：癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
用語「がん」は、原発性の悪性腫瘍（例えば、その細胞が最初の腫瘍部位以外の対象の身体内の部位に移動しなかったがん）、および二次性の悪性腫瘍（例えば、腫瘍細胞が最初の腫瘍部位とは異なる第二部位へ移動、転移することにより生じるがん）を含む。
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、染料等、ならびに当業者に周知のそれらの組合せ（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照のこと）を含む。任意の従来の担体が有効成分と不適合である場合を除いて、治療的または医薬組成物におけるその使用が考えられる。
用語、本発明の化合物の「治療有効量」は、対象の生物学的または医学的な応答、例えば、酵素もしくはタンパク質の活性の低減もしくは阻害、または症状の回復、状態の軽減、疾患の進行の緩徐化もしくは遅延、または疾患の予防等を引き出す、本発明の化合物の量を表す。非限定的な一実施形態では、用語「治療有効量」は、対象に投与された場合、状態、または障害もしくは疾患を、少なくとも部分的に軽減し、阻害し、予防し、かつ／または回復させるのに効果的な本発明の化合物の量を表す。
別の非限定的な実施形態では、用語「治療有効量」は、細胞、または組織、または細胞構造ではない生物学的物質、または媒体に投与された場合、少なくとも部分的にＥｇ５の活性を低減するかまたは阻害するのに効果的な本発明の化合物の量を表す。
本明細書で用いられる用語「対象」は動物を表す。通常、該動物は哺乳動物である。対象は、また例えば、霊長類（例えば、ヒト、男性または女性）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚類、鳥類等も表す。特定の実施形態では、対象は霊長類である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で用いられる用語「阻害する」、「阻害」、または「阻害すること」は、所与の状態、症状、もしくは障害、もしくは疾患の低下または抑制、または生物活性もしくはプロセスの基本的活動における有意な減少を表す。
本明細書で用いられる用語、任意の疾患または障害を「処置する」、「処置すること」または「処置」は、一実施形態では、疾患または障害を回復させること（すなわち、疾患またはそれらの少なくとも１つの臨床症状の発達の緩徐化または抑止または減少）を表す。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、患者に認識されえないものも含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和するか、または回復させることを表す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害を身体的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）のいずれか、またはその両方で調節することを表す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害の進行を予防または遅延することを表す。
本明細書で用いられるように、対象が生物学的に、医療的にまたは生活の質においてそのような処置から利益を得る場合、そのような対象は処置を「必要として」いる。
本明細書で用いられる用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および本発明の文脈において用いられる同様の用語（特に、クレームの文脈において）は、本明細書において特に明記されるかまたは文脈に明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈されうる。
特定の実施形態では、本発明の修飾イムノコンジュゲートは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８、または１２、または１６の「Ｘ基−対−抗体」比に基づいて記載される；この比は式（Ｉ）の「ｎ」に相当する。この比は特定のコンジュゲート分子に関して整数値を有するが一方、多くの分子を含有する試料を記載するために、イムノコンジュゲート試料内のある程度の不均質性のために、平均値が通常用いられることが理解されている。イムノコンジュゲート試料に関する平均負荷量は、本明細書で「薬物抗体比」、またはＤＡＲとして表される。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは約１〜約１６の間であり、通常、約１、２、３、４、５、６、７、または８である。いくつかの実施形態では、試料の少なくとも５０重量％は、プラスまたはマイナス２の平均ＤＡＲを有する化合物であり、好ましくは試料の少なくとも５０重量％は、プラスまたはマイナス１．５の平均ＤＡＲを含有する生成物である。好ましい実施形態では、ＤＡＲが約２から約８、例えば、約２、約３、約４、約５、約６、約７、または約８であるイムノコンジュゲートを含む。これらの実施形態では、「約ｑ」のＤＡＲは、ＤＡＲの測定値がｑの±２０％内であるか、または好ましくはｑの±１０％内であることを意味する。
本明細書で用いられる用語「光学異性体」または「立体異性体」は、本発明の所与の化合物として存在しうるさまざまな任意の異性体立体配置を表し、幾何異性体を含む。置換基が炭素原子のキラル中心に付着しうると理解されている。用語「キラル」は、その鏡像対の上に重ね合わせることができないという特性を有する分子を表し、一方、用語「アキラル」は、その鏡像対の上に重ね合わせることができる分子を表す。したがって、本発明は化合物のエナンチオマー、ジアステレオ異性体またはラセミ体を含む。「エナンチオマー」は、互いの鏡像と重ね合わせることができない立体異性体の対である。エナンチオマー対の１：１混合物は「ラセミ」混合物である。該用語は、必要に応じて、ラセミ混合物を明示するために用いられる。「ジアステレオ異性体」は、少なくとも２つの不斉原子を有するが、互いの鏡像ではない立体異性体である。絶対立体化学はＣａｈｎ−ｌｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ Ｒ−Ｓ則に基づいて特定される。化合物が純粋なエナンチオマーである場合、各キラル炭素における立体化学はＲかＳのいずれかで特定されうる。その絶対配置が未知である分析される化合物は、その化合物がナトリウムＤ線の波長で平面偏光を回転する方向（右旋性または左旋性）に応じて（＋）または（−）と指定されうる。本明細書に記載される特定の化合物は、１つまたは複数の不斉中心または軸を含有し、したがって絶対立体化学に関して、（Ｒ）−または（Ｓ）−と定義されうるエナンチオマー、ジアステレオ異性体、および他の立体異性体を生じうる。
出発物質および手順の選択に応じて、化合物は可能な異性体の１つの形態としてまたはそれらの混合物として、不斉炭素原子の数に応じて、例えば純粋な光学異性体として、またはラセミ体およびジアステレオ異性体混合物等の異性体混合物として存在しうる。本発明は、例えば、特定の異性体が確認された場合等、他に記載されない限り、ラセミ混合物、ジアステレオ異性体混合物、および光学的に純粋な形態を含む、全てのそのような可能な異性体を含むことを意味する。光学活性（Ｒ）および（Ｓ）異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を用いて調製されうるか、または従来技術を用いて分解されうる。化合物が二重結合を含有する場合、その置換基はＥまたはＺ配置でありうる。化合物が二置換シクロアルキルを含有する場合、シクロアルキル置換基はシス−またはトランス−配置を有しうる。全ての互変異性形態も、また含まれることを意図する。
本明細書で用いられる用語「塩」、または「塩（複数）」は、本発明の化合物の酸付加または塩基付加塩を表す。「塩」は詳細には「薬学的に許容される塩」を含む。用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生物学的な有効性および特性を保持する塩を表し、通常、生物学的にではなくまたはそうでない場合は望ましくない。多くの場合、本発明の化合物は、アミノおよび／もしくはカルボキシル基またはそれらと同様の基の存在のために、酸および／または塩基塩の形成が可能である。
薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸を用いて、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物塩／臭化水素酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ショウノウスルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロロテオフィリン酸塩、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロネート、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素／リン酸二水素、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩が形成されうる。
塩が得られうる無機酸として、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。
塩が得られうる有機酸として、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸等が挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基を用いて形成されうる。
塩が得られうる無機塩基として、例えば、アンモニウム塩および周期表のＩ〜ＸＩＩ族の金属が挙げられる。特定の実施形態では、塩はナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅に由来し；詳細には適切な塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩を含む。
塩が得られうる有機塩基として、例えば一級、二級、および三級アミン、天然起源の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、塩基イオン交換樹脂等が挙げられる。特定の有機アミンは、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン、およびトロメタミンを含む。
本発明の薬学的に許容される塩は、塩基または酸部分から、従来の化学的方法により合成されうる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸形態と、化学量論量の適切な塩基（例えばＮａ、Ｃａ、Ｍｇ、もしくはＫの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）とを反応させることにより、またはこれらの化合物の遊離塩基形態と、化学量論量の適切な酸とを反応させることにより調製されうる。そのような反応は、通常、水中もしくは有機溶媒中、またはそれら２つの混合物中で実施される。一般に、実行可能な場合は、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体の使用が望ましい。補足的な適切な塩の一覧は、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); および"Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)に見出されうる。
本明細書で与えられる任意の式は、また化合物の標識されていない形態と同様に同位体標識された形態を表すことも意図している。同位体標識された化合物は、１つまたは複数の原子が選択された原子質量または質量数を有する原子により置換されている場合を除いて、本明細書で与えられた式により示された構造を有する。本発明の化合物内に組み込まれうる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、および塩素、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、１２５Ｉ等の同位体が挙げられる。本発明は、本明細書に定義された同位体標識されたさまざまな化合物、例えばその中に３Ｈおよび１４Ｃ等の放射性同位体が、またはその中に２Ｈおよび１３Ｃ等の非放射性同位体が存在するものを含む。そのような同位体標識された化合物は、代謝性の研究（１４Ｃを用いて）、反応速度論研究（例えば、２Ｈまたは３Ｈを用いて）、薬物もしくは基体組織分布アッセイを含む陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）もしくは単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）等の検出もしくは画像処理技術、または患者の放射線処置において有用である。詳細には、１８Ｆまたは標識された化合物は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ研究において詳細には望ましくありうる。式（Ｉ）の同位体標識された化合物は、当業者に周知の従来技術により、または以前に使われた非標識の試薬の代わりに適切な同位体標識された試薬を用いて、付随の実施例および調製に記載されるものと類似のプロセスにより一般に調製されうる。
さらに、より重い同位体、詳細には重水素（すなわち、２ＨまたはＤ）を用いた置換により、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の増加または投薬必要量の減少または治療指数の改善のようなより大きい代謝安定性に起因する特定の治療的利点が得られうる。そのようなより重い同位体、特に重水素の濃度は、同位体濃縮係数により定義されうる。本明細書で用いられる用語「同位体濃縮係数」は、特定の同位体の同位体存在度と自然存在度との比を意味する。本発明の化合物の置換基が重水素を意味する場合は、そのような化合物は、指定された各重水素原子に関して、少なくとも３５００（各指定された重水素原子において５２．５％の重水素組み込み）、少なくとも４０００（６０％の重水素組み込み）、少なくとも４５００（６７．５％の重水素組み込み）、少なくとも５０００（７５％の重水素組み込み）、少なくとも５５００（８２．５％の重水素組み込み）、少なくとも６０００（９０％の重水素組み込み）、少なくとも６３３３．３（９５％の重水素組み込み）、少なくとも６４６６．７（９７％の重水素組み込み）、少なくとも６６００（９９％の重水素組み込み）、または少なくとも６６３３．３（９９．５％の重水素組み込み）の同位体濃縮係数を有する。
本明細書で用いられる用語「チオールマレイミド」は、チオールとマレイミドとの反応により形成される基を表し、この一般式
Figure 2016516035
を有し、
ＹおよびＺは、チオール−マレイミド結合を介して接続される基であり、リンカー成分、抗体、またはペイロードを含みうる。
本明細書で用いられる「開裂可能な」は、共有結合性の接続により２つの部分を接続しているが、生理学的に適当な条件下で分解してその部分間の共有結合性の接続を切断する連結基またはリンカー成分を表し、通常、開裂可能な連結基はｉｎ ｖｉｖｏで細胞内の環境において、細胞外の場合よりもより迅速に切断され、標的細胞内部で優先的に起きるペイロードの放出を起こす。開裂は酵素的または非酵素的でありうるが、一般に抗体を分解することなく、抗体からペイロードを放出する。開裂はペイロードに付着している連結基またはリンカー成分のいくらかの部分を残しうるか、または連結基の残基を何ら残さずペイロードを放出しうる。
本明細書で用いられる「Ｐｃｌ」は、ピロリンカルボキシリシンを表し、例えば、
Figure 2016516035
Ｒ２０はＨであり、ペプチドに組み入れられる場合、以下の式：
Figure 2016516035
を有する。
Ｒ２０がメチルである対応する化合物はピロリシンである。
本明細書で用いられる「開裂可能ではない」は、例えば、イムノコンジュゲートの抗体または抗原結合性断片の部分と少なくとも同程度に安定である生理学的条件下で特に分解されやすいわけではない連結基またはリンカー成分を表す。そのような連結基は、時々「安定な」と表され、それらが十分に分解に耐性を示し、抗原結合部分Ａｂ自体が少なくとも部分的に分解するまでＡｂに接続しているペイロードを保持し、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｂの分解が連結基の開裂に先行することを意味する。安定なまたは開裂可能ではない連結基を有するＡＤＣの抗体部分の分解は、連結基、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで送達されるペイロードまたは薬物部分に付着している、抗体からの１つまたは複数のアミノ酸基のいくらかまたは全てを残しうる。
本明細書で用いられる用語「ハロゲン」（またはハロ）は、フッ素、臭素、塩素、またはヨウ素、詳細にはフッ素、または塩素を表す。ハロゲンにより置換されたアルキル（ハロアルキル）等のハロゲン置換の基および部分は、モノ−、ポリ−、またはペル−ハロゲン化されうる。
本明細書で用いられる用語「ヘテロ原子」は、別段の規定がない限り、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）原子、詳細には窒素または酸素を表す。
本明細書で用いられる用語「アルキル」は、完全飽和した分岐のまたは分岐していない炭化水素部分を表す。別段の規定がない限り、アルキルは、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、または１〜４個の炭素原子を有する炭化水素部分を表す。アルキルの代表例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等が挙げられるが、これらに限定されない。
置換アルキルは、水素の代わりに１個または複数の、１個、２個または３個等の置換基、非置換アルキル基上に存在する水素の数まで等の置換基を含有するアルキル基である。アルキル基に対して適切な置換基は、他に記載されない限り、ハロゲン、ＣＮ、オキソ、ヒドロキシ、Ｃ１〜４アルコキシ、置換または非置換のＣ３〜６シクロアルキル、置換または非置換のフェニル、アミノ、（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、Ｃ１〜４アルキルチオ、Ｃ１〜４アルキルスルホニル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｃ１〜４アルキルおよび−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＣ１〜４アルキル基から選択されうる。アルキル基に対して好ましい置換基は、ハロゲン、ＣＮ、オキソ、ヒドロキシ、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキル、フェニル、アミノ、（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、Ｃ１〜４アルキルチオ、Ｃ１〜４アルキルスルホニル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｃ１〜４アルキルおよび−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＣ１〜４アルキル基を含む。いくつかの実施形態では、特に明記しない限り、Ｃ１〜４置換アルキルは１〜３個の置換基を有する。
本明細書で用いられる用語「アルキレン」は、１〜１０個の炭素原子、および他のフィーチャーに付着する２つの開いた原子価を有する二価のアルキル基を表す。別段の規定がない限り、アルキレンは、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、または１〜４個の炭素原子を有する部分を表す。アルキレンの代表例として、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、イソブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、イソペンチレン、ネオペンチレン、ｎ−ヘキシレン、３−メチルヘキシレン、２，２−ジメチルペンチレン、２，３−ジメチルペンチレン、ｎ−ヘプチレン、ｎ−オクチレン、ｎ−ノニレン、ｎ−デシレン等が挙げられるが、これらに限定されない。置換アルキレンは、１個または複数の、１個、２個または３個等の置換基を含有するアルキレン基であり；特に明記しない限り、適切な置換基はアルキル基に関して上に列記した置換基から選択される。
本明細書で用いられる用語「ハロアルキル」は、本明細書に定義される１つまたは複数のハロ基により置換されている本明細書に定義されるアルキルを表す。ハロアルキルは、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル、またはペルハロアルキルを含むポリハロアルキルでありうる。モノハロアルキルは、アルキル基内に１個のヨウ素、臭素、塩素またはフッ素を有しうる。アルキルまたはシクロアルキル基に関して塩素およびフッ素が好ましく；アリールまたはヘテロアリール基に関してフッ素、塩素および臭素が好ましいことが多い。ジハロアルキルおよびポリハロアルキル基は、アルキル内に２個以上の同一のハロ原子、または異なるハロ基の組合せを有しうる。通常、ポリハロアルキルは、１２個まで、または１０個、または８個、または６個、または４個、または３個、または２個のハロ基を含有する。ハロアルキルの非限定的な例として、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、およびジクロロプロピルが挙げられる。ペルハロアルキルは、例えば、トリフルオロメチルのように、全ての水素原子がハロ原子によって置換されているアルキルを表す。
本明細書で用いられる用語「アルコキシ」は、アルキルが上に定義されている、アルキル−Ｏ−を表す。アルコキシの代表例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられるが、これらに限定されない。通常、アルコキシ基は、１〜１０個、または１〜６個の炭素、さらに一般に１〜４個の炭素原子を有する。
「置換アルコキシ」は、アルコキシのアルキル部分に、１個または複数の、１個、２個、または３個等の置換基を含有するアルコキシ基である。特に明記しない限り、適切な置換基は、ヒドロキシルおよびアミノが炭素上に通常は存在せず置換「アルキル−Ｏ」基の酸素に直接付着していることを除いては、アルキル基に関して上に列記した置換基から選択される。
同様に、「アルキルアミノカルボニル」、「アルコキシアルキル」、「アルコキシカルボニル」、「アルコキシ−カルボニルアルキル」、「アルキルスルホニル」、「アルキルスルホキシル」、「アルキルアミノ」のような他の基の各アルキル部分は、上記「アルキル」の定義に記載したものと同一の意味を有するものとする。このように用いられる場合、特に明記されない限り、アルキル基は１〜４個の炭素のアルキルであることが多く、挙げられた成分以外の基によりさらに置換されない。そのようなアルキル基が置換される場合、適切な置換基は、特に明記しない限り、アルキル基に関して上に挙げられた置換基である。
本明細書で用いられる用語「ハロアルコキシ」は、ハロアルキル−Ｏ−を表し、ハロアルキルは上に定義されている。ハロアルコキシの代表例として、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、トリクロロメトキシ、２−クロロエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロポキシ等が挙げられるが、これらに限定されない。通常、ハロアルキル基は１〜４個の炭素原子を有する。
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、飽和または不飽和の非芳香族の単環式、二環式、三環式またはスピロ環式の３〜１２個の炭素原子の炭化水素基を表し：シクロアルキル基は不飽和でありえて、着目している分子式に接続しているシクロアルキル基の環原子が芳香環炭素でない場合に、飽和、不飽和または芳香族でありうる他の環と縮合しうる。別段の規定がない限り、シクロアルキルは、３〜９個の間の環炭素原子または３〜７個の間の環炭素原子を有する環式炭化水素基を表す。好ましくは、シクロアルキル基は、特に明記しない限り、３〜７個の環原子を有する飽和単環式である。
置換シクロアルキルは、１個、または２個、または３個、または非置換基上の水素の数までの３個より多い置換基により置換されているシクロアルキル基である。通常、置換シクロアルキルは、１〜４個または１〜２個の置換基を有する。適切な置換基は、特に明記しない限り、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、シアノ、ニトロ、オキソ、Ｃ１〜４−アルキルイミノ、Ｃ１〜４−アルコキシミノ、ヒドロキシイミノ、Ｃ１〜４−アルキル、Ｃ２〜４−アルケニル、Ｃ２〜４−アルキニル、Ｃ１〜４−アルコキシ、Ｃ１〜４−チオアルキル、Ｃ２〜４−アルケニルオキシ、Ｃ２〜４−アルキニルオキシ、Ｃ１〜４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１〜４−アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１〜４−アルキルアミノ、ジ−Ｃ１〜４−アルキルアミノ、Ｃ１〜４−アルキルアミノカルボニル、ジ−Ｃ１〜４−アルキルアミノカルボニル、Ｃ１〜４−アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１〜４−アルキルカルボニル（Ｃ１〜４−アルキル）アミノ、Ｃ１〜４−アルキルスルホニル、Ｃ１〜４アルキルスルファモイル、およびＣ１〜４アルキルアミノスルホニルからなる群から独立して選択され、前述の各炭化水素基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ残基）は、本明細書の「アルキル」基に関する好ましい置換基の一覧から、出現する毎に、独立して選択される１つまたは複数の基によりさらに置換されうる。シクロアルキルに関する好ましい置換基は、Ｃ１〜４アルキル、ハロゲン、ＣＮ、オキソ、ヒドロキシ、Ｃ１〜４アルコキシ、アミノ、（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、Ｃ１〜４アルキルチオ、Ｃ１〜４アルキルスルホニル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｃ１〜４アルキルおよび−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＣ１〜４アルキル基を含む。
例示的な単環式炭化水素基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシルおよびシクロヘキセニル等が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な二環式炭化水素基としては、ボルニル、インジル、ヘキサヒドロインジル、テトラヒドロナフチル、デカヒドロナフチル、ビシクロ［２．１．１」ヘキシル、ビシクロ［２．１．１」ヘプチル、ビシクロ［２．２．１」ヘプテニル、６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１」ヘプチル、２，６，６−トリメチルビシクロ［３．１．１」ヘプチル、ビシクロ［２．２．２」オクチル等が挙げられる。例示的な三環式炭化水素基としては、アダマンチル等が挙げられる。
同様に、「シクロアルキルオキシ」、「シクロアルコキシアルキル」、「シクロアルコキシカルボニル」、「シクロアルコキシ−カルボニルアルキル」、「シクロアルキルスルホニル」、「ハロシクロアルキル」のような他の基の各シクロアルキル部分は、上記「シクロアルキル」の定義に記載したものと同一の意味を有するものとする。これらの用語内で用いられる場合、シクロアルキルは、通常、非置換または１〜２基で置換されている単環式３〜７個の炭素の環である。任意選択で置換されている場合、置換基は、通常Ｃ１〜Ｃ４アルキルおよびシクロアルキル基に関して適切な基として上述したものから選択される。
本明細書で用いられる用語「アリール」は、環部に６〜１４個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基を表す。通常、アリールは、６〜１４個の炭素原子、しばしば６〜１０個の炭素原子を有する、例えば、フェニルまたはナフチルのような、単環式、二環式または三環式のアリールである。さらに、本明細書で用いる用語「アリール」は、単芳香環、または互いに縮合する多芳香環でありうる芳香族置換基を表す。テトラヒドロナフチルが、テトラヒドロナフチル基の芳香環の炭素を介して記載される式に接続される場合は、非限定的な例としてフェニル、ナフチルおよび１，２，３，４−テトラヒドロナフチルが挙げられる。
置換アリールは、ヒドロキシル、チオール、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜４−アルキル、Ｃ２〜４−アルケニル、Ｃ２〜４−アルキニル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４−チオアルキル、Ｃ２〜４−アルケニルオキシ、Ｃ２〜４−アルキニルオキシ、ハロゲン、Ｃ Ｃ１〜４−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１〜４−アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１〜４−アルキルアミノ、ジ−Ｃ１〜４−アルキルアミノ、Ｃ１〜４アルキルアミノカルボニル、ジ−Ｃ１〜４−アルキルアミノカルボニル、Ｃ１〜４−アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１〜４アルキルカルボニル（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、Ｃ１〜４アルキルスルホニル、スルファモイル、Ｃ１〜４アルキルスルファモイル、およびＣ１〜４アルキルアミノスルホニルからなる群から独立して選択される１〜５個（１個、または２個、または３個等）の置換基により置換されているアリール基であって、前述の各炭化水素基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ残基）は、アルキル基に関して適切な置換基として上に列記した基から、出現する毎に、独立して選択される１つまたは複数の基によりさらに置換されうる。アリール基に関して好ましい置換基は、Ｃ１〜４アルキル、ハロゲン、ＣＮ、ヒドロキシ、Ｃ１〜４アルコキシ、アミノ、（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、Ｃ１〜４アルキルチオ、Ｃ１〜４アルキルスルホニル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｃ１〜４アルキルおよび−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＣ１〜４アルキル基である。
同様に、「アリールオキシ」、「アリールオキシアルキル」、「アリールオキシカルボニル」、「アリールオキシ−カルボニルアルキル」のような他の基の各アリール部分は、上記「アリール」の定義に記載したものと同一の意味を有するものとする。
本明細書で用いられる用語「ヘテロシクリル」は、飽和または部分的に不飽和であるが芳香族ではなく、単環式、または多環式（多環式の場合は詳細には二環式、三環式またはスピロ環式）でありうる複素環基を表し；３〜１４個、より一般に４〜１０個、および最も好ましくは５または６個の環原子を有し；１個または複数の、好ましくは１〜４個、特に１個または２個の環原子は、Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択されるヘテロ原子である（したがって、残りの環原子は炭素である）。例えば、Ｃ５〜６原子環と記載したけれども、複素環は、環原子として少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、例えば、この例で５〜６個と述べた数の環原子を有する。好ましくは、ヘテロシクリル基は、環原子として１または２個のそのようなヘテロ原子を有し、好ましくはヘテロ原子は互いに直接に接続しない。結合環（すなわち、着目している式と接続している環）は、好ましくは４〜１２個、特に５〜７個の環原子を有する。複素環基は、着目している式に付着している複素環基の原子が芳香族でない場合は、芳香環と縮合しうる。複素環基は、ヘテロ原子（通常、窒素）または複素環基の炭素原子を介して、着目している式に付着しうる。ヘテロシクリルは、縮合または架橋環、同様にスピロ環を含みえて、多環式複素環基の１つの環のみが、環原子としてヘテロ原子を含有する必要がある。複素環の例として、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジヒドロフラン、１，４−ジオキサン、モルホリン、１，４−ジチアン、ピペラジン、ピペリジン、１，３−ジオキソラン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピロリン、ピロリジン、テトラヒドロピラン、ジヒドロピラン、オキサチオラン、ジチオラン、１，３−ジオキサン、１，３−ジチアン、オキサチアン、チオモルホリン等が挙げられる。
置換ヘテロシクリルは、シクロアルキル基に関する上述の置換基から選択される１〜５個（１個、または２個、または３個等）の置換基により、独立して置換されている複素環基である。
同様に、「ヘテロシクリルオキシ」、「ヘテロシクリルオキシアルキル」、「ヘテロシクリルオキシカルボニル」のような、他の基の各ヘテロシクリル部分は、上記「ヘテロシクリル」の定義に記載したものと同一の意味を有するものとする。
本明細書で用いられる「環状エーテル」は、特に明記しない限り、環員として酸素原子、および５個以上の原子の環に関して２個の非隣接酸素原子を任意選択で含有する、４〜７個の環原子を含有する複素環を表す。通常の例として、オキセタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、オキセパン、および１，４−ジオキサンが挙げられる。
本明細書で用いられる用語「ヘテロアリール」は、環員として１〜８個のヘテロ原子を有する、５〜１４員環の単環式、または二環式、または三環式の芳香環系を表し；ヘテロ原子はＮ、Ｏ、およびＳから選択される。ヘテロアリールおよび複素環は、本明細書で、例えば、Ｃ５〜６ヘテロアリールまたは複素環と表されえて：この記載が用いられている場合、炭素およびヘテロ原子の両方を含んで、５〜６が環原子の合計数を表していると理解され；そのような環は、代替的に５〜６員環のヘテロアリールまたは複素環基を表しうる。通常、ヘテロアリールは環員として少なくとも１個のヘテロ原子を含有する５〜１０員環系、例えば５〜６員環の単環式または８〜１０員環の二環式である。一般的なヘテロアリール基は、２−または３−チエニル、２−または３−フリル、２−または３−ピロリル、２−、４−、または５−イミダゾリル、１−、３−、４−、または５−ピラゾリル、２−、４−、または５−チアゾリル、３−、４−、または５−イソチアゾリル、２−、４−、または５−オキサゾリル、３−、４−、または５−イソオキサゾリル、３−または５−１，２，４−トリアゾリル、４−または５−１，２，３−トリアゾリル、１−または２−テトラゾリル、２−、３−、または４−ピリジル、３−または４−ピリダジニル、３−、４−、または５−ピラジニル、２−ピラジニル、および２−、４−、または５−ピリミジニルを含む。
用語「ヘテロアリール」は、また芳香族複素環が１つまたは複数のアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリル環と縮合する基も表し、基または着目している式への付着点は、芳香族複素環上にある。非制限的例として、１−、２−、３−、５−、６−、７−、または８−インドリジニル、１−、３−、４−、５−、６−、または７−イソインドリル、２−、３−、４−、５−、６−、または７−インドリル、２−、３−、４−、５−、６−、または７−インダゾリル、２−、４−、５−、６−、７−、または８−プリニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、または９−キノリジニル、２−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−キノリイル、１−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−イソキノリイル、１−、４−、５−、６−、７−、または８−フタラジニル、２−、３−、４−、５−、または６−ナフチリジニル、２−、３−、５−、６−、７−、または８−キナゾリニル、３−、４−、５−、６−、７−、または８−シンノリニル、２−、４−、６−、または７−プテリジニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−４ａＨカルバゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−カルブザオリル、１−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、または９−カルボリニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−、または１０−フェナントリジニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、または９−アクリジニル、１−、２−、４−、５−、６−、７−、８−、または９−ペリミジニル、２−、３−、４−、５−、６−、８−、９−、または１０−フェナトロリニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、または９−フェナジニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−、または１０−フェノチアジニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−、または１０−フェノキサジニル、２−、３−、４−、５−、６−、または１−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、または１０−ベンゾイソキノリニル、２−、３−、４−、またはチエノ［２，３−ｂ］フラニル、２−、３−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、または１１−７Ｈ−ピラジノ［２，３−ｃ］カルバゾリル、２−、３−、５−、６−、または７−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］−ピラニル、２−、３−、４−、５−、７−、または８−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］−ｏ−オキサジニル、１−、３−、または５−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］−オキサゾリル、２−、４−、または５４Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］チアゾリル、３−、５−、または８−ピラジノ［２，３−ｄ］ピリダジニル、２−、３−、５−、または６−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル、１−、３−、６−、７−、８−、または９−フロ［３，４−ｃ］シンノリニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、８−、９−、１０、または１１−４Ｈ−ピリド［２，３−ｃ］カルバゾリル、２−、３−、６−、または７−イミダゾ［１，２−ｂ］［１，２，４］トリアジニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾオキサゾリル、２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾイミダゾリル、２−、４−、４−、５−、６−、または７−ベンゾチアゾリル、１−、２−、４−、５−、６−、７−、８−、または９−ベンゾオキサピニル、２−、４−、５−、６−、７−、または８−ベンゾオキサジニル、１−、２−、３−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、または１１−１Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］［２］ベンゾアザピニル。一般的な縮合ヘテロアリール基は、２−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−キノリニル、１−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−イソキノリニル、２−、３−、４−、５−、６−、または７−インドリル、２−、３−、４−、５−、６−、または７−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾオキサゾリル、２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾイミダゾリル、および２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾチアゾリルを含むが、これらに限定されないが挙げられる。
置換ヘテロアリールは、アリール基に関して適切として上述した置換基から選択される１つまたは複数の置換基を含有するヘテロアリール基である。
同様に、「ヘテロアリールオキシ」、「ヘテロアリールオキシアルキル」、「ヘテロアリールオキシカルボニル」のような他の基の各ヘテロアリール部は、上記「ヘテロアリール」の定義に記載したものと同一の意味を有するものとする。
一態様では、本発明は、Ｅｇ５の阻害剤を薬物またはペイロードとして含むイムノコンジュゲート（例えば、ＡＤＣ）、ならびにそのようなイムノコンジュゲートまたはＡＤＣを、細胞増殖障害を処置するために用いる組成物および方法を提供する。特定のイミダゾールおよびトリアゾール化合物は、Ｅｇ５の阻害剤として、かつ、細胞増殖障害を処置するための治療剤として、当技術分野で周知であり、ＡＤＣペイロードとして用いられえて；例えば、ＷＯ２００７／０２１７９４、ＷＯ２００６／００２２３６、ＷＯ２００８／０６３９１２、ＷＯ２００９／０７７４４８、ＷＯ２０１１／１２８３８１、およびＷＯ２０１１／１２８３８８を参照のこと。ＡＤＣペイロードとしての使用に適合しうる、当技術分野で周知の他のＥｇ５阻害剤は、例えば、ＷＯ２００６／０４９８３５、米国特許第７，５０４，４０５号、米国特許第７，９３９，５３９号、およびRath and Kozielski, Nature Reviews: Cancer, vol. 12, 527-39 (Aug. 2012)の図３に開示される化合物を含む。
Ｅｇ５阻害剤をペイロード（薬物）として含むイムノコンジュゲートは、式（Ｉ）：
Figure 2016516035
のコンジュゲートを含み、
Ａｂは、抗体または抗体断片等の抗原結合部分を表し；
Ｌは、２つ以上のＸをＡｂに任意選択で付着しえて、開裂可能なリンカー成分を含有しうるかまたは含有しえない、ＸをＡｂに共有または非共有結合により接続する連結基を表し；
Ｘは、本明細書に記載される式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩＩ）の化合物、またはRath (Rath and Kozielski, Nature Rev. Cancer, vol. 12, 527-39 (2012))に開示される化合物を含む、イスピネシブ、ＳＢ−７４３９２１、ＡＺＤ４８７７、ＡＲＱ６２１、ＡＲＲＹ−５２０、ＬＹ２５２３３５５、ＭＫ−０７３１、ＥＭＤ５３４０８５、およびＧＳＫ−９２３２９５を含む、他のＥｇ５の阻害剤、ならびにＷＯ０６／００２２３６、ＷＯ２００７／０２１７９４、ＷＯ２００８／０６３９１２、ＷＯ２００９／０７７４４８、ＷＯ２０１１／１２８３８１、ＷＯ２０１１／１２８３８８、およびＷＯ２００６／０４９８３５に記載されるＥｇ５阻害剤等のＥｇ５阻害剤を表し；
ｍは、１〜４の整数であり、通常、１〜２の整数であり；
ｎは、１〜１６の整数であり、好ましくは２〜８の整数である。
本発明の特定の態様および実施例は、以下のように列挙される実施形態において提供される：
１．式（Ｉ）
Figure 2016516035
のイムノコンジュゲート。
［式中、Ａｂは、抗原結合部分を表し；
Ｌは、ＸをＡｂに接続する連結基を表し；
ｍは、１〜４の整数であり；
ｎは、１〜１６の整数であり；
Ｘは、ＬによりＡｂに接続される式（ＩＩ）
Figure 2016516035
の基を表す
（式中、
Ｚは、ＮまたはＣＨであり；
Ａｒ１は、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される３個までの基で任意選択で置換されているフェニルであり、；
Ａｒ２は、フェニルまたはピリジニルまたは４〜６原子の環状エーテルであり、Ａｒ２は、ハロ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、ヒドロキシル、アミノ、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されており；
Ｒ１は、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される２個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜６シクロアルキル、または−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜７ヘテロシクリル（４〜７員環の複素環）であり、各Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、またはＣ４〜７ヘテロシクリルは、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル−アミノ、およびＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されており；さらに、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ１〜６アルキル、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜６アルキルを任意選択で含み；
Ｒ２は、Ｈ、またはＣ１〜４アルキルであり；
Ｔは、（ＣＨ２）１〜３であり；
Ｙは、Ｃ１〜３アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルから選択され、Ｃ１〜３アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルはそれぞれ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、およびＣ１〜４ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されており；
Ａは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）、または式（ＩＩ）のカルボニルとＱとの間の結合であり；
Ｑは、Ｃ１〜４アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜６ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜６シクロアルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ５〜６ヘテロアリール、および−（ＣＨ２）０〜２−フェニルから選択され、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、−ＳＨ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＲ、−Ｏ−グルクロネート、および−ＮＲ２から選択される３個までの基で任意選択で置換されており、各Ｒは、ハロ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ＯＭｅ、または−ＯＨで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルであり；いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｃ３〜６シクロアルキル、または環員としてＮ、ＯまたはＳを含有する４〜６員環の複素環でもありえて、各Ｒは、独立して、ハロ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ＯＭｅ、または−ＯＨで任意選択で置換されている）］
通常、ｍは１または２であり、好ましくは１であり；ｎは２〜８であり、好ましくは約２〜約４、または３〜５の間である。
いくつかの実施形態では、ｎは２、４、６、または８である。いくつかの実施形態では、２つ以上のＬが存在する場合、各Ｌは独立して選択される。別の実施形態では、各Ｌは同一である。
これらのいくつかの実施形態では、Ｒ１は環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される２個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜６シクロアルキル、または−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜７ヘテロシクリルであり、各Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、またはＣ４〜７ヘテロシクリルは、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル−アミノ、およびＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されている。特定の実施形態では、各Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、またはＣ４〜７ヘテロシクリルは、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、およびヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキルから選択される２個までの基で、Ｆ、ヒドロキシ、メトキシ、およびアミノから選択される好ましい置換基で、置換されている。適切なＲ１基の例として、ｔ−ブチル、２−メトキシ−２−プロピル、４−テトラヒドロピラニル、および式
Figure 2016516035
の基を含み、
Ａは−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、または−ＳＨであり；これらのいくつかの実施形態では、リンカーＬはＲ１またはＡの水素原子の１つとの置換により、部分Ａに付着している。
Ｒ１の特定の実施形態は、４−テトラヒドロピラニルおよび
Figure 2016516035
Figure 2016516035
を含み、ならびに任意選択で、
Figure 2016516035
も含み；
Ａは−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、または−ＳＨであり、点線は各Ｒ１の、式ＩＩへの付着点を示す。
１Ａ．前述のいくつかの実施形態では、Ｒ２はＨである。
１Ｂ．前述のいくつかの実施形態では、ＡはカルボニルとＱとの間の結合である。別の実施形態では、ＡはＮＨである。前述のいくつかの実施形態では、Ｙがヘテロシクリルまたはシクロアルキルである場合ＴはＣＨ２であり、ＹがＣ１〜３アミノアルキルである場合ＴはＣＨ２、またはＣＨ２ＣＨ２である。
１Ｃ．前述のいくつかの実施形態では、Ｑはヒドロキシ、アミノ、チオール、アミノ−Ｃ１〜４−アルキルオキシ、またはアミノ−Ｃ１〜４−アルキルチオから選択される、１個または２個の基で置換されているＣ１〜４アルキルである。別の実施形態では、Ｑはモルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピペラジン、フェニルおよびピリジンから選択される環であり、環はＣ１〜４アルキル、ハロ、ＣＮ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１〜４アルキル−アミノ、Ｃ１〜４アルキルスルホニル、およびＣ１〜４アルコキシから選択される２個までの基で任意選択で置換されている。
１Ｄ．前述のいくつかの実施形態では、Ｙはハロ、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルキル、アミノ−Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル−アミノ、およびＣ１〜４アルコキシから選択される２個までの基で任意選択で置換されているピロリジン環である。ピロリジンに関して好ましい置換基は、Ｆ、メチル、ヒドロキシ、およびヒドロキシメチルを含む。
２．Ｒ２がＨである、実施形態１に記載のイムノコンジュゲート。
３．ＺがＣＨである、実施形態１または実施形態２に記載のイムノコンジュゲート。
４．ＺがＮである、実施形態１または２に記載のイムノコンジュゲート。
５．Ｒ１がテトラヒドロピラニル環であり、Ｒ１がオキソおよびメチルから選択される２個までの基で任意選択で置換されている、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
６．Ａｒ１がジハロフェニルである、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。特定の実施形態では、Ａｒ１は２，５−ジハロフェニルであり、例えば、Ａｒ１は２，５−ジフルオロフェニルでありうる。
これらの実施形態では、Ａｒ２はフェニル、ハロフェニル、ヒドロキシフェニル、またはアミノピリジン、例えば、フェニル、３−フルオロフェニル、３−ヒドロキシフェニル、３−アミノ−２−ピリジニルでありうる。
７．式（ＩＩ）の化合物が、式
Figure 2016516035
を有し：
式（Ｉ）のＬは、Ｙに、またはＱに、または式（ＩＩ）のＲ１に付着している、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。好ましい実施形態では、Ｌは、Ｙ基の一部、またはＱ基の一部である酸素原子またはアミン窒素に付着している。
７Ａ．式（ＩＩ）の化合物が式
Figure 2016516035
を有し：
ＬはＲ１に付着しており、Ｒ１は、任意選択で置換アルキル基である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。これらのいくつかの実施形態では、Ｒ１は一般式−ＣＭｅ２（ＣＨ２）０〜２−Ｇ−［Ｌ］のＣ３〜６アルキル基であり、［Ｌ］はＲ１がＬに付着している点を示し、Ｇは結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−または−ＣＯＯ−でありうる。これらのいくつかの実施形態では、Ｒ１は−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２−Ｒ３０であり、Ｒ３０はヒドロキシ、カルボキシ、またはアミノである。これらの実施形態では、Ｌは、Ｒ３０基を介してＲ１に付着していることが多い。Ｒ１の実施形態は、−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２−Ｏ−［Ｌ］、−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２−ＮＨ−［Ｌ］、−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ（＝Ｏ）−［Ｌ」、および−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−［Ｌ」を含み、［Ｌ］は式（ＩＩ）の化合物が式（Ｉ）のリンカーＬに付着している点を示す。
８．Ｒ１が４−テトラヒドロピラニルである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。例えば、Ｒ１は
Figure 2016516035
である。テトラヒドロピラン環は、ヒドロキシ、メチル、メトキシ、およびハロから選択される１個または２個の置換基により任意選択で置換されうる。
９．式（ＩＩ）のＱが、ヒドロキシルおよびアミノから選択される１個または２個の基で置換されているＣ１〜４アルキルである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。ＡがＮＨまたはＮ（アルキル）である実施形態では、Ｑは−ＯＨおよび−ＮＨ２から選択される１個または２個の基で置換されている−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、またはＣ２〜４アルキルであることが多い。Ａが結合である場合、Ｑは−ＯＨおよび／またはＮＨ２で任意選択で置換されているＣ１〜３アルキルでありうる。Ｑ基のヒドロキシルまたはアミンは、式（ＩＩ）の化合物を式（Ｉ）のＬに付着するために用いられうる。
１０．Ｙが、フルオロ、アミノ、ヒドロキシル、メトキシ、およびヒドロキシメチルから選択される１個または２個の基で任意選択で置換されているピロリジンである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。これらの実施形態では、ピロリジン環ＮＨ、またはピロリジン環上のアミノもしくはヒドロキシルは、式（ＩＩ）の化合物の、式（Ｉ）のＬへの付着点でありうる。
１１．Ａが−ＮＨ−である、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１１Ｂ．代替的に、Ａが結合である、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１２．連結基が開裂可能である、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。開裂可能な連結基は、細胞内の酵素的開裂のための部位を提供するジペプチド等のリンカー成分（例えば、ｖａｌ−ｃｉｔ）；ｐＨ感受性で、かつ細胞内部で開裂しがちであるヒドラゾンもしくはイミン等のリンカー成分；細胞内部で開裂する傾向があるジスルフィドのリンカー成分；または、アミノベンジルオキシ基のフェニル環上にＯ−グルクロン酸基を有するｐ−アミノベンジルオキシカルボニル部分等のグルクロニダーゼ感受性のリンカー成分を含む。
１３．連結基が開裂可能ではない、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１３Ａ．リンカーが、−（ＣＨ２）１〜２−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜２−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、もしくは−ＳＯ３Ｈ、または薬学的に許容されるその塩から選択される極性基で置換されている、実施形態１３に記載のイムノコンジュゲート。
１４．式（ＩＩＩ）の化合物：
Figure 2016516035
または薬学的に許容されるその塩。
［式中、
Ｚは、ＮまたはＣＨであり；
Ａｒ１は、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される３個までの基で任意選択で置換されているフェニルであり；
Ａｒ２は、ハロ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、ヒドロキシル、アミノ、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されているフェニルまたはピリジニルであり；
Ｒ１は、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜７ヘテロシクリルまたは−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜７シクロアルキルであり、Ｃ４〜７ヘテロシクリルは、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される２個までのヘテロ原子を含有する４〜７員環であり、Ｃ４〜７ヘテロシクリルおよびＣ３〜７シクロアルキルはそれぞれ、ハロ、Ｃ１〜４アルキル（例えば、メチル）、Ｃ１〜４ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、またはＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されており；ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、オキソ、または−ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されており；
Ｒ２は、Ｈ、またはＣ１〜４アルキルであり；
Ｔは、（ＣＨ２）１〜３であり；
Ｙは、Ｃ１〜２アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルから選択され、Ｃ１〜２アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルは、それぞれアミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（Ｃ１〜４アルキル）、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されており；
Ａは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）、または式（ＩＩＩ）のカルボニルとＱとの間の結合であり；
Ｑは、Ｃ１〜４アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜６ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ５〜６ヘテロアリール、および−（ＣＨ２）０〜２−フェニルから選択され、Ｑは、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、−ＳＨ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−Ｎ３、−ＮＨＲ、−Ｏ−グルクロネート、および−ＮＲ２から選択される３個までの基で任意選択で置換されており、各Ｒは、ハロ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ＯＭｅ、または−ＯＨで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルである］
式（ＩＩＩ）のこれらのいくつかの実施形態では、Ｒ１は、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される２個までのヘテロ原子を含有する、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜６シクロアルキル、または−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜７ヘテロシクリルであり、各Ｃ３〜６シクロアルキル、またはＣ４〜７ヘテロシクリルは、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル−アミノ、およびＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されている。特定の実施形態では、Ｃ３〜６シクロアルキル、またはＣ４〜７ヘテロシクリルは、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、およびヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキルから選択される２個までの基で、Ｆ、ヒドロキシ、メトキシ、およびアミノから選択される好ましい置換基で置換されている。
特定の実施形態では、Ｒ１は、４−テトラヒドロピラニルおよび
Figure 2016516035
から選択され
Figure 2016516035
からも任意選択で選択され、
Ａは−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、または−ＳＨであり、点線は各Ｒ１の付着点を示す。
式（ＩＩＩ）の前述のいくつかの実施形態では、Ｒ２はＨである。
式（ＩＩＩ）の前述のいくつかの実施形態では、ＡはカルボニルとＱとの間の結合である。他の実施形態では、ＡはＮＨである。前述のいくつかの実施形態では、Ｙがヘテロシクリルまたはシクロアルキルである場合ＴはＣＨ２であり、ＹがＣ１〜３アミノアルキルである場合ＴはＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２である。
式（ＩＩＩ）の前述のいくつかの実施形態では、Ｑは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アミノ−Ｃ１〜４−アルキルオキシ、またはアミノ−Ｃ１〜４−アルキルチオから選択される１個または２個の基で置換されているＣ１〜４アルキルである。他の実施形態では、Ｑはモルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピペラジン、フェニルおよびピリジンから選択される環であり、該環はＣ１〜４アルキル、ハロ、ＣＮ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１〜４アルキル−アミノ、Ｃ１〜４アルキルスルホニル、およびＣ１〜４アルコキシから選択される２個までの基で任意選択で置換されている。
式（ＩＩＩ）の前述のいくつかの実施形態では、Ｙはハロ、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルキル、アミノ−Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル−アミノ、およびＣ１〜４アルコキシから選択される２個までの基で任意選択で置換されているピロリジン環である。ピロリジンに関して好ましい置換基は、Ｆ、メチル、ヒドロキシ、およびヒドロキシメチルを含む。
これらの新規なＥｇ５阻害剤は、低分子量の薬物化合物として、がんを処置するために用いられうるか、または標的とされたｉｎ ｖｉｖｏでの送達のために、ＡＤＣ内に組み込まれうる。
１５．Ｒ１がテトラヒドロピラニルである実施形態１４に記載の化合物であり；いくつかの実施形態では、Ｒ１はテトラヒドロピラン−４−イルである。
１６．式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）の化合物。
Figure 2016516035
［式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｔ、Ｑ、Ｙ、およびＡは、上記実施形態１中の式（ＩＩ）で定義されている通りであり、
Ｑ＊は−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｍｅ）−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＮＭｅ−、−ＣＨ（Ｍｅ）Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ（Ｏ−）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ（ＮＨ−）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｏ−）−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ（ＮＨ−）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＮＨ−、
Figure 2016516035
から選択され、
これらのいくつかの実施形態では、Ｑ＊は−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＮＭｅ−、−ＣＨ（Ｍｅ）Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ（Ｏ−）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ（ＮＨ−）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｏ−）−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ（ＮＨ−）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＮＨ−、
Figure 2016516035
Figure 2016516035
から選択され；
Ｙ＊は、−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨ−、
Figure 2016516035
（Ｒ１０およびＲ１１は、独立して、Ｈ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、ＣＯＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、ＣＯＮ（Ｃ１〜４アルキル）２、またはＯＨである）
から選択され、
Ｗは、１つまたは複数のリンカー成分および反応性官能基を含む連結部分である。マレイミド等の反応性官能基との適切な連結部分は、本明細書に開示され、
Figure 2016516035
Figure 2016516035
（各ＲＮは、独立して、ＨまたはＣＨ２ＣＨ２−Ｒ３０であり、Ｒ３０は、ヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシであり、ＲＮは、好ましくはＨである）
を含み、
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
および
Figure 2016516035
（Ｘは、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）の化合物を表し、ＬＧは、Ｃｌ、−Ｏ−ベンゾトリアゾール（−ＯＢｔ）、−Ｏ−アザベンゾトリアゾール（−ＯＡｔ）、−Ｏ−スクシンイミド、置換フェノキシ、−ＯＣ（Ｏ）（フェニルもしくは置換フェニル）、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、または−ＯＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）等のアシル化剤を提供するのに適切な脱離基である）
も任意選択で含む］
１６Ｂ．代替の実施形態は、式（ＩＩＣ）
Figure 2016516035
の化合物を含み：
Ａｒ１、Ａｒ２、Ｚ、Ｒ２、Ｔ、Ｑ、Ｙ、Ｗ、およびＡは、上記式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）で定義されている通りであり、Ｒ１＊はオキソ、ヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシで任意選択で置換されているＣ３〜６アルキルであり、例えば、Ｒ１＊は−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２−Ａであり、Ａは、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＣＯＮＨ２、または−ＳＨであり；Ｗは、１つまたは複数のリンカー成分および反応性官能基を含む連結部分である。
例えば、Ｗは−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−Ｌ５−Ｇでありえて、Ｇは反応性官能基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は本明細書に記載されるものから選択されるリンカー成分である。適切な反応性官能基（Ｇ）は、適切な反応性を有し、それぞれ、システインまたはリシンの−ＳＨ、または−ＮＨ２等の、抗体または抗原結合部分におけるアミノ酸のアミノ酸側鎖と共有結合を形成する官能基である。適切な反応性官能基の例として、マレイミド、アルファ−ハロアセトアミド（ハロ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、アルデヒド（ＣＨＯ）、チオール（ジスルフィドを形成する）、２−アミノベンズアルデヒド（ＡＢＡ）、２−アミノ−ベンゾフェノン（ＡＢＰ）、２−アミノアセトフェノン（ＡＡＰ）、カルボン酸塩、ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびその類似体のエステル等の、遊離アミン基とアミドを容易に形成する活性化エステルが挙げられる。適切な反応性官能基、ＡＢＡ、ＡＡＰおよびＡＢＰは、以下の基：
Figure 2016516035
を含む。
ペイロードと反対側にある任意の連結基の端に位置する、これらの部分は、Ou, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 2011, 108(26), 10437-42に記載されてるようにＰｃｌまたはＰｙｌと反応し、連結基を形成し、Ｌ１は、
Figure 2016516035
であり、
Ｒ２０はＨまたはＭｅであり、Ｒ３０はＨ、Ｍｅまたはフェニルである。
本発明のこれらの実施形態は、上述の式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物と同様のＥｇ５阻害剤ペイロードを含むコンジュゲートの調製に有用な活性中間体である。これらの実施形態では、化合物は、開裂可能ではないリンカー、例えば、式（ＩＩ）のＹまたはＱに相当する原子に付着している連結基との使用に関してさえも、良好な許容性を示す位置に配置されている反応性官能基を含む。
１７．Ｗが、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅ、Ｎ−マレイミド、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−ＣＨ２−ハロ、−ＣＯＯＨ、および−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’から選択される反応性官能基を含み、ハロがＣｌ、ＢｒおよびＩから選択され、−ＯＲ’が、活性化エステルの脱離基部分である、実施形態１６に記載の化合物。
１８．Ａｒ１が、ジハロフェニルである、実施形態１４〜１７のいずれか１つに記載の化合物。詳細には、適切な基は、２，５−ジフルオロフェニル、２−フルオロ−５−クロロフェニルおよび２−クロロ−５−フルオロフェニルを含む。
１９．Ａｒ２が、フェニルまたはハロフェニルである、実施形態１４〜１８のいずれか１つに記載の化合物。詳細には、適切な基は、フェニルおよび３−フルオロフェニルを含む。
２０．Ｚが、ＣＨである、実施形態１４〜１９のいずれか１つに記載の化合物。
２１．Ｚが、Ｎである、実施形態１４〜１９のいずれか１つに記載の化合物。
２２．Ｒ１が、４−テトラヒドロピラニルである、実施形態１６〜２１のいずれか１つに記載の化合物。
２２Ａ．Ｒ１＊が−Ｃ（Ｍｅ）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−［Ｗ」であり、［Ｗ］はＲ１＊の、Ｗへの付着点を示す、実施形態１６〜２１のいずれか１つに記載の化合物。
２３．Ｒ２が、Ｈである、実施形態１４〜２２のいずれか１つに記載の化合物。代替の実施形態では、Ｒ２はメチルでありうる。
２４．Ａが、−ＮＨ−である、実施形態１４〜２３のいずれか１つに記載の化合物。
２５．Ａが、結合である、実施形態１４〜２３のいずれか１つに記載の化合物。
２６．Ｔが、ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２である、実施形態１４〜２５のいずれか１つに記載の化合物。好ましくは、ＹまたはＹ＊が、−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＮＨ２または−ＣＨ２ＮＨ２等のアミノアルキルである場合ＴはＣＨ２ＣＨ２であり；ＹまたはＹ＊が、
Figure 2016516035
等の任意選択で置換されたピロリジンである場合Ｔは、−ＣＨ２−である。
２７．Ｙが−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＮＨ２、
Figure 2016516035
［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、独立して、Ｈ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、またはＯＨである］
から選択される、実施形態１４〜２６のいずれか１つに記載の化合物。
そのような化合物の特定の実施形態では、Ｙは−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＮＨ２、
Figure 2016516035
から選択される。
Ｙの好ましい実施形態は、
Figure 2016516035
を含み、
［Ｔ］はＹの、式中のＴへの付着点を示す。
Ｙ＊の好ましい実施形態は、
Figure 2016516035
を含み、
［Ｔ］はＹ＊の、式中のＴへの付着点を示し；［Ｗ］はＹ＊の、Ｗへの付着点を示す。
２８．Ｑが、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２−ＮＨ２、−ＣＨ（Ｍｅ）ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＮＨ２、
Figure 2016516035
から選択される、実施形態１４〜２７のいずれか１つに記載の化合物。
−Ａ−Ｑの組合せの好ましい実施形態は、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ、および−ＮＨ−ＣＨＭｅ−ＣＨ２ＯＨを含む。詳細には、−Ａ−Ｑは、
Figure 2016516035
から選択されえて、
［ＣＯ］は−Ａ−Ｑの、式中のカルボニルへの付着点を示す。
２９．表１の化合物および薬学的に許容されるそれらの塩から選択される、実施形態１４に記載の化合物。
３０．実施形態１５〜２９のいずれか１つに記載の化合物、または薬学的に許容されるそれらの塩、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
３１．治療有効量の実施形態１４〜１５のいずれか１つに記載の化合物または薬学的に許容されるそれらの塩、および１つまたは複数の治療活性補助剤を含む組合せ。
３２．細胞増殖障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート、または実施形態１４〜１５のいずれか１つに記載の化合物、または薬学的に許容されるそれらの塩を投与することを含む方法。
３３．医薬として使用するための、実施形態１４〜１５のいずれか１つに記載の化合物、または実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート、または薬学的に許容されるそれらの塩。
３４．その医薬が、がんの処置に使用するためのものである、実施形態３３に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
特定の実施形態では、がんは、胃腫瘍、骨髄腫瘍、結腸腫瘍、上咽頭腫瘍、食道腫瘍、および前立腺腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞系列の急性リンパ性白血病またはＴ−ＡＬＬ）、リンパ腫（特に非ホジキン病）、膀胱、腎、胃（例えば、消化管間葉性腫瘍（ＧＩＳＴ））、肝、および膵がん、ならびに肉腫から選択される。
３５．がんの処置に使用するための、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩。
３６．実施形態１に記載のイムノコンジュゲートであって、
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
から選択される式を有し、
Figure 2016516035
からも任意選択で選択される式を有するイムノコンジュゲート。
特定の例として、これら：
Figure 2016516035
が挙げられ、
Figure 2016516035
も任意選択で含む。
３７．がんの処置に使用するための、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩。
３８．イムノコンジュゲートＡｂ−Ｌ＊−Ｘであって、抗体（Ａｂ）に連結するペイロード（Ｘ）を含み、連結基Ｌ＊は、式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−の基を含み、Ｒ２１は式−（ＣＨ２）１〜４−Ｒ２２のものであり、Ｒ２２は、−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｎ（Ｒ２３）２、ＣＯＯＲ２３、ＣＯＮ（Ｒ２３）２、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＲ２３、および−ＳＯ２Ｒ２３から選択される極性基であり、ｋは、０〜４であり、各Ｒ２３は、独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである、イムノコンジュゲートＡｂ−Ｌ＊−Ｘ。好ましくは、Ｘは実施形態１４〜２９のいずれか１つに記載の化合物を含む、Ｅｇ５の阻害剤である。
３９．式（Ｉ）
Figure 2016516035
のイムノコンジュゲート。
［式中、Ａｂは、抗原結合部分を表し；
Ｌは、ＸをＡｂに接続する連結基を表し；
ｍは、１〜４の整数であり；
ｎは、１〜１６の整数であり；
Ｘは独立して、出現する毎に、Ｅｇ５の阻害剤を表す］
多くの実施形態では、Ｘは実施形態１４〜２９のいずれか１つに記載の化合物である。これらの特定の実施形態では、Ｘはこの式：
Figure 2016516035
の化合物であり、
Ｒ４ａはＨ、ＦまたはＯＨであり；
Ｒ４ｂはＨまたはＦであり；
Ｒ１は
Figure 2016516035
から選択され、
Ｙ４は
Figure 2016516035
から選択され、
Ｑ４は
Figure 2016516035
から選択され、
リンカーＬはＹ４、Ｑ４、またはＲ１でＸに付着している。
これらの実施形態に関して好ましいリンカーＬは、
Figure 2016516035
を含み、［Ａｂ］は、抗体への付着点を指定しており、
または、Ｑ４が
Figure 2016516035
である場合、
Ｌは
Figure 2016516035
である。
最後の選択肢では、
Figure 2016516035
が結合してこの−Ｑ４−Ｌ基
Figure 2016516035
を形成する。
４０．Ｘが、表１から選択される化合物である、実施形態３９に記載のイムノコンジュゲート。
４１．ｍが、１であり、イムノコンジュゲートが、Ａｂと、表２から選択される化合物との反応により形成される、実施形態３９または４０に記載のイムノコンジュゲート。
４２．少なくとも１つの遊離チオール基を含有する抗体と、以下の基：
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
から選択されるマレイミド化合物との反応によって作製されるイムノコンジュゲート。
これらのイムノコンジュゲートのいくつかの実施形態では、抗体は、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ｃＫｉｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ腫瘍性タンパク質抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体、および抗Ｔｎ−抗原抗体から選択される。
これらのイムノコンジュゲートは、薬物抗体比（ＤＡＲ）１〜８の間、通常、２〜６の間、好ましくは３〜５の間を有しうる。
４４．抗原結合部分が、定常領域に導入された少なくとも１つの非天然システイン残基を有する抗体またはその抗原結合性断片であり、連結基Ｌが、非天然システイン残基に付着している
、実施形態１〜１４または３８〜４３のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
４５．ｍが、１であり、ｎが、１〜５の間であり、好ましくは約２または約４である、請求項４４に記載のイムノコンジュゲート。
４６．前記抗体またはその抗原結合性断片が、２つ以上のアミノ酸のその定常領域上の非天然システインによる置換の組合せを含む、実施形態４４に記載のイムノコンジュゲート。
４７．非天然システインの置換が、抗体重鎖のポジション３６０、および抗体カッパ軽鎖のポジション１０７から選択され、前記ポジションはＥＵシステムに基づいて番号付けされる、実施形態４６に記載のイムノコンジュゲート。
４８．非天然システインが、抗体重鎖のポジション１５２および３７５から選択され、前記ポジションはＥＵシステムに基づいて番号付けされる、実施形態４６に記載のイムノコンジュゲート。
以上のように列挙される実施形態では、Ａｂは他に定義されない限り、任意の抗原結合部分でありえて、好ましくは、がん細胞等の標的細胞の特徴を示していると本明細書に記載されるもの等の細胞表面マーカーを認識する抗体または抗原結合性断片である。腫瘍に関連した抗原が特に適切である。
列挙された実施形態では、Ｘは式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の任意の化合物、詳細には、上記の実施形態１〜１１または実施形態１４〜１５に開示される任意の化合物でありえて、表１の任意の種を含む。実施形態３６の好ましい実施例では、Ｘは、
Figure 2016516035
から選択され：
［Ｌ］は、Ｘのどの原子が実施形態３６に示された連結基に付着するかを示す。
付加的な実施形態では、Ｘは式：
Figure 2016516035
Figure 2016516035
のものである。
上記任意の実施形態におけるＡｂは、他に記載されない限り、任意の抗原結合部分で、通常、がん細胞等の医薬的介入の標的とされた細胞の特徴を示している抗原を認識する抗原結合部分でありうる。多くの適切な抗原は、当技術分野で周知であり；特別に着目している特定の抗原が、本明細書に記載されている。通常、Ａｂは単離されまたは構築されうる抗体であり、天然もしくは修飾（設計）されえて、または抗体と同様の抗原結合性活性を保持している抗体断片でありうる。
上記実施形態におけるＬは、Ａｂを１つまたは複数のＸ基に接続する任意の連結基でありえて、Ａｂを式（ＩＩ）の化合物の原子に直接結合する単結合を含む。ＡＤＣに使用するための適切なリンカーは当技術分野で周知であり、本発明のコンジュゲートに用いられうる。ＬはＡｂ上の任意の適切な利用可能なポジションでＡｂに付着しえて：通常、Ｌは利用可能なアミノ窒素原子（すなわち、アミドよりむしろ一級もしくは二級アミン）またはヒドロキシルの酸素原子、またはシステイン上等の利用可能なスルフヒドリルに付着する。
式（Ｉ）のこれらのいくつかの実施形態では、ｍは１または２であり、好ましくはｍは１である。
式（Ｉ）のこれらのいくつかの実施形態では、ｎは１〜１０であり、一般に１〜８または１〜６であり、好ましくはｎは１、２、３、４、または５である。
式（ＩＩ）、ＩＩＡ、ＩＩＢ、およびＩＩＩの化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１は３〜６員環のシクロアルキル環または４〜６員環の複素環基であるかそれを含み、列挙されたさまざまな実施形態に記載されるように置換されうる。いくつかの実施形態では、Ｒ１は非置換の５〜６員環の複素環基である。他の実施形態では、Ｒ１はアミンまたはヒドロキシルにより置換された５〜６員環の複素環基であり、そのどちらとも任意選択で連結基のための付着点である。
前述の任意の実施形態では、Ｌは本明細書にさらに記載したように、６個までのリンカー成分、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６を含みうる。したがって例えば、式（Ｉ）のイムノコンジュゲートは式（ＩＡ）：
Figure 2016516035
でありえて、
Ａｂは、抗原結合部分を表し；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、それぞれ独立してリンカー成分を表し；
ｎは、１〜１６の整数であり；
Ｘは本明細書に記載される、例えば、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物のようなＥｇ５阻害剤を表す。
これらのイムノコンジュゲートは、以下のように同等に示されえて、リンカー成分Ｌ６は式（ＩＩ）
Figure 2016516035
［式中、Ａｂは抗原結合部分を表し；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、それぞれ独立してリンカー成分を表し；
ｎは、１〜１６の整数であり；
Ａｒ１、Ａｒ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｔ、Ｙ、Ａ、ＱおよびＺは、本明細書の式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）で定義されている。この式のＬ６は示された化学構造に付着しており：−Ｌ６−は式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の基の置換基と考えられうる。いくつかの実施形態では、Ｌ６はＱ、Ｙ、もしくはＲ１の原子に、しばしばＱ、Ｙ、もしくはＲ１の酸素原子または窒素原子またはそれらの置換基の１つにおいて付着している］
の化合物に付着していることを示す。
これらの実施形態では、各リンカー成分は、任意選択でリンカー成分の両側にある基と結合する結合でありえて、そのため、いくつかの実施形態では、式（ＩＡ）の化合物は、ＡｂをＸに接続する０個、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のリンカー成分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６を含む。
連結基Ｌを形成するための適切なリンカー成分は、連結基Ｌを構築するための方法として、当技術分野で周知である。これらの成分は、１つの基をアミノ酸に付着するために一般に用いられる基、アルキレン基およびエチレンオキシドオリゴマー等のスペーサー、アミノ酸およびその長さの中で約４つまでのアミノ酸の短ペプチド；結合；ならびにカルボニル、カルバミン酸塩、炭酸塩、尿素、エステル、およびアミド結合等を含む。
これらのコンジュゲートのいくつかの実施形態では、Ｌ１は反応性官能基と、例えば、システインのチオール、またはリシンの遊離−ＮＨ２、または抗体へと設計されるＰｃｌもしくはＰｙｌ基のような、コンジュゲーションに一般に用いられるアミノ酸側鎖の１つとの反応により形成される基から選択される。例えば、Ou, et al., PNAS 108(26), 10437-42 (2011)を参照のこと。適切な−Ｌ１−基は、詳細にはＡｂのシステイン残基に付着するための、単結合、
Figure 2016516035
ならびに
詳細にはＡｂのリシン残基の−ＮＨ２に付着するための、
Figure 2016516035
（各ｐは１〜１０であり、各Ｒは独立してＨまたはＣ１〜４アルキル（好ましくはメチル）である）
ならびに
ＰｃｌまたはＰｙｌ基に連結するための、
Figure 2016516035
［式中、Ｒ２０はＨまたはＭｅであり、Ｒ３０はＨ、Ｍｅまたはフェニルであり、示されたアシル基が、操作された抗体中のＰｃｌまたはＰｙｌのリシン部分に付着する］
を含むが、これらに限定されない。
リンカー成分Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５の適切な選択は、例えば、アルキレン基−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、通常、１〜１０または１〜６である）、エチレングリコール単位（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎ（ｎは１〜２０であり、通常、１〜１０または１〜６である）−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（＝Ｏ）−を含みＲ２１が本明細書に記載される極性置換基を有する置換アルキルであるアミドまたはカルバミン酸塩、エステル−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、フェニル（１，２−、１，３−および１，４−二置換のフェニルを含む）、Ｃ５〜６ヘテロアリール、１，１−二置換のシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル、および１，４−二置換のシクロヘキシルを含むＣ３〜８シクロアルキル、ならびにＣ４〜８ヘテロシクリル環、ならびに以下に示す特定の例から選択される二価の環等の付着に利用可能な２つの点を有する環系；アミノ酸−ＮＨ−ＣＨＲ＊−Ｃ＝Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ＊−ＮＨ−、または隣接構造のＮ（例えば、マレイミド窒素）に付着する、式［Ｎ」−ＣＨＲ＊−Ｃ（＝Ｏ）−を有し、Ｒ＊は周知のアミノ酸（しばしば標準アミノ酸、例えば、トリプトファン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、グリシン等の１つ、しかし、例えば、ノルバリン、ノルロイシン、ホモセリン、ホモシステイン、フェニルグリシン、シトルリン、および他に一般にアルファ−アミノ酸と名付けられたものも含む）の１つの側鎖である、アミノ酸に由来する基、周知のアミノ酸のポリペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等）、チオール−マレイミド結合（−ＳＨをマレイミドに添加することによる）、−Ｓ−ＣＲ２−およびＲは独立して出現する毎にＨまたはＣ１〜４アルキル、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−である−Ｓ−ＣＲ２−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＲ２−Ｓ−等の他のチオールエステル、ならびにジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、同様に以下に記載のこれらの任意の他のリンカー成分との組合せ、例えば、結合、非酵素的に開裂可能なリンカー、開裂可能ではないリンカー、酵素的に開裂可能なリンカー、光安定性のリンカー、光開裂可能なリンカー、または自壊性スペーサーを含むリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、各リンカー成分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、結合、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＲ２）ｑ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲ−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−、−ＮＨ−ＣＨＲ＊−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ＊−ＮＲ−、−ＣＨＲ＊−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ−、−（ＣＨ２）ｑＳ（ＣＨ２）ｑ−、
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
［式中、Ｒ２０はＨまたはＭｅであり、Ｒ３０はＨ、Ｍｅまたはフェニルであり、
各ｑは０〜１０であり、好ましくは０〜６または１〜６であり；
各Ｒ、Ｒ５、およびＲ６は独立してＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
Ｒ＊はグリシン、アラニン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、システイン、メチオニン、セリン、スレオニン、フェニルグリシン、ｔ−ブチルグリシン等の一般のアミノ酸の側鎖であり；
Ｒ７は独立してＨ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジンおよびピリジンから選択され；
Ｒ８は独立して
Figure 2016516035
から選択され；
Ｒ９は独立してＨ、Ｃ１〜４アルキル、およびＣ１〜６ハロアルキルから選択され；
任意のまたは全てのＬ１〜Ｌ６は、非存在でありえて、すなわち、任意のまたは全てのＬ１からＬ６はそれらが付着している２つの基の間の結合を表しうる］
からなる群から選択される。
特定の実施形態では、リンカーＬは、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ２１−もしくは−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ２１−、−ＮＲ２１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−の少なくとも１つのリンカー成分を含み、Ｒ２１は式−（ＣＨ２）１〜４−Ｒ２２のものであり、Ｒ２２は−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｎ（Ｒ２３）２、ＣＯＯＲ２３、ＣＯＮ（Ｒ２３）２、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＲ２３、または−ＳＯ２Ｒ２３等の極性基であり、ｋは０〜４であり、各Ｒ２３は独立してＨまたはＣ１〜４アルキルである。抗体をペイロードに接続する連結基内のこの部分の使用により、コンジュゲートの凝集が減少し、それにより、イムノコンジュゲートの溶解度および有効性が改善されることが見出された。好ましい実施形態では、Ｒ２２は−（ＣＨ２）２−ＯＨまたは−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨである。
詳細には、リンカー成分Ｌ６の適切な選択は、本明細書に説明された共有結合、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、
Figure 2016516035
を含み；
Ｇはグルクロネート等の酵素開裂可能基であり、各ｑは１〜１０であり、Ｚは−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ３Ｈ等の極性基であり、各Ｒは独立してＨまたはＣ１〜４アルキル（好ましくはＨまたはメチル）である。
別の一態様では、本発明は、抗体（Ａｂ）に連結するペイロード（Ｘ）を含む、イムノコンジュゲートＡｂ−Ｌ＊−Ｘを提供し、連結基Ｌ＊は式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−の基を含み、Ｒ２１は式−（ＣＨ２）１〜４−Ｒ２２のものであり、Ｒ２２は−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｎ（Ｒ２３）２、ＣＯＯＲ２３、ＣＯＮ（Ｒ２３）２、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＲ２３、および−ＳＯ２Ｒ２３から選択される極性基であり、ｋは０〜４であり、各Ｒ２３は独立してＨ、またはＣ１〜４アルキルである。ペイロードは、マイタンシノイド、オーリスタチン、アマトキシン、もしくはアマニチン、またはＡＤＣにおける治療的有用性を有する他の周知のペイロードのような細胞毒等の、任意の適切なペイロードでありうる。これらのイムノコンジュゲートのいくつかの実施形態では、Ｘは本明細書に記載されるもの等のＥｇ５阻害剤である。
式Ｉの実施形態におけるＸは、任意のＥｇ５阻害剤でありうるが、好ましくは上述の式ＩＩの化合物、または上述の式（ＩＩＩ）の化合物等の、列挙された実施形態に記載されるこの式の任意のサブクラスである。いくつかの実施形態では、Ｘは表１から選択される化合物である。式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は「中性の」化合物と記載されるが、コンジュゲートの文脈においては、Ｘは、Ｌにまたは直接的にＡｂに共有結合的に付着する１つの原子を含むと理解されている。
別段の規定がない限り、Ｘは任意の利用可能なポジションを介して、上記式の連結基に付着している。いくつかの実施形態では、Ｘは、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）のどちらかの、Ｑで表される基、またはＹで表される基、またはＲ１で表される基の１つの原子を介して、連結基に付着している。
同様に、Ａｂは本明細書に記載されるものを含む、任意の抗原結合部分でありうる。好ましくは、Ａｂは修飾されえて；例えば、Ａｂは本発明のＥｇ５阻害剤の少なくとも１つにさらに付着する他のペイロードを有しうる抗体である。Ａｂがスクシンイミド環にまたは連結基Ｌの−ＣＨ２−もしくは−Ｓ−に付着している実施形態では、それは通常Ａｂのシステインの硫黄原子に接続しており；Ａｂが連結基のカルボニルにおいて連結基に付着している実施形態では、それは通常Ａｂ内のリシンのアミン等の窒素原子を介して付着している。
本発明は、イムノコンジュゲートのための細胞毒性のペイロードとして、任意の小分子Ｅｇ５阻害剤の使用を考える。式（ＩＩ）のＥｇ５阻害剤が図示されているが、これらの阻害剤に限定されず、他の種類のＥｇ５阻害剤と共に機能することが実証されている。好ましい実施形態では、Ｅｇ５阻害剤は式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物であり、詳細には、表１の任意の化合物を含む。
式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物は、それらがイムノコンジュゲートの一部である場合、連結基Ｌに（もしくはＬの一部であるリンカー成分に）、またはＡｂ自体に共有結合的に付着していることが理解されている。したがって、本発明のイムノコンジュゲートにおいて、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物は、それによりＬに共有結合的に連結する（またはＡｂに直接的に連結する）開いた原子価を有し、好ましくは、阻害または除去の標的とされた細胞へのｉｎ ｖｉｖｏでの送達にかなり十分である。通常、Ｅｇ５阻害剤とＡｂとの間の連結は、本明細書に記載されるもの等の、１つまたは複数のリンカー成分を含む連結基を介することが多く、抗原結合部分ＡｂのＥｇ５阻害剤（複数可）への共有結合性の接続を含む。
ＡＤＣが標的細胞上の抗原に到達し結合する前に、またはより通常には、後のどちらかの使用において、Ｅｇ５阻害剤はＡｂから放出され：Ｅｇ５阻害剤は、ＡＤＣが表面抗原に結合し次に標的細胞に内部移行した後に、主に標的細胞内で放出されることが好ましい。いくつかの実施形態では、連結基Ｌは開裂可能であるように設計され、Ｅｇ５阻害剤は内部移行の後にＡＤＣから脱離する。
いくつかの実施形態では、連結基は開裂可能であるように設計されておらず、Ｅｇ５阻害剤の放出は、抗原結合性の基（例えば、抗体）がｉｎ ｖｉｖｏで分解した場合、結果として生じる。通常、Ａｂの分解は、プロテアーゼによる消化により標的細胞内部で起こる。これらの実施形態では、Ｘ上に残存する連結基Ｌの一部分がＥｇ５の阻害に関して阻害剤Ｘのマイクロモル未満の親和性を妨害しないならば、少なくとも連結基Ｌの一部分がＥｇ５阻害剤Ｘに付着したままでありうる。
ＡＤＣに使用するための多種の連結基は、周知であり（例えば、Lash, Antibody-Drug Conjugates: the Next Generation of Moving Parts, Start-Up, Dec. 2011, 1-6 を参照のこと）、本発明の範囲内でコンジュゲートに用いられうる。連結基は、Ｅｇ５阻害剤の原子と抗体の原子との間の単共有結合でありえて；例えば、Ｑは、メチル等のアルキル基でありえてＡは、式（ＩＩ）で非存在でありえて、この式：
Figure 2016516035
のＥｇ５阻害剤を提供する。
この阻害剤を抗原結合部分に付着するために、それを反応性官能基としてヨウ素（Ｉ）を有する、以下の式：
Figure 2016516035
の修飾Ｅｇ５阻害剤に転換しえて、
ヨウ素化合物、アルファ−ハロアセトアミドは、抗体上の遊離チオール基と直接に反応しえて、この式：
Figure 2016516035
のイムノコンジュゲートを提供し、Ｓは、抗体のシステイン残基の硫黄原子であり、式（Ｉ）の連結基Ｌは、ＣＨ２とＳとの間の共有結合を表す。
式（Ｉ）のコンジュゲートの別の実施形態では、Ｌは、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６のような２個、３個、４個、５個、６個または６個より多くのリンカー成分を含みうる。複数のリンカー成分を含む多くのリンカーは、当技術分野で周知であり、さまざまなリンカー成分は、選択され結合されえて本発明の操作可能なイムノコンジュゲートを提供する。特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、式（ＩＡ）
Figure 2016516035
のものであり：
Ａｂは、抗原結合部分を表し；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、リンカー成分を表し；
ｎは、１〜１６の整数であり；
Ｘは、例えば、本明細書に記載される式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物のようなＥｇ５阻害剤を表す。
そのような化合物では、Ｌ１は通常、反応性官能基と、例えば、システインのチオール、または抗体上のリシンの遊離−ＮＨ２、または抗体へと設計されるＰｃｌもしくはＰｙｌ基のような、コンジュゲーションに一般に用いられるアミノ酸側鎖の１つとの反応により形成される基から選択される。例えば、Ou, et al., PNAS 108(26), 10437-42 (2011)を参照のこと。適切な−Ｌ１−基は、上記の単結合、
Figure 2016516035
（詳細にはＡｂのシステイン残基に付着するための）
ならびに
Figure 2016516035
（詳細にはＡｂのリシン残基に付着するためであり、各ｎは１〜１０であり、各Ｒは独立してＨまたはＣ１〜４アルキル（好ましくはメチル）である）
を含むが、これらに限定されない。
リンカー成分Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５の適切な選択は、例えば、結合に加えて、アルキレン基−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、通常１〜１０または１〜６である）、エチレングリコール単位（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎ（ｎは通常１〜１０、または１〜６である）、−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、エステル−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、二価のフェニル、Ｃ５〜６ヘテロアリール、Ｃ３〜８シクロアルキルまたはＣ４〜８ヘテロシクリル基等の付着に利用可能な２つの点を有する環、アミノ酸−ＮＨ−ＣＨＲ＊−Ｃ＝Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ＊−ＮＨ−、またはＮ（例えば、マレイミド窒素）に付着する式［Ｎ」−ＣＨＲ＊−Ｃ（＝Ｏ）−を有し、Ｒ＊は周知のアミノ酸（しばしば標準アミノ酸の１つ、しかし、例えば、ノルバリン、ノルロイシン、ホモセリン、ホモシステイン、フェニルグリシン、シトルリン、および他にアルファ−アミノ酸と名付けられたものも含む）の側鎖である、アミノ酸に由来する基、周知のアミノ酸のポリペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等）、チオール−マレイミド結合（−ＳＨをマレイミドに添加することによる）、−Ｓ−ＣＲ２−およびＲは独立して出現する毎にＨまたはＣ１〜４アルキル、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−である−Ｓ−ＣＲ２−Ｃ（＝Ｏ）−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＲ２−Ｓ−等の他のチオールエステル、およびジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、同様に以下に記載のこれらの任意の他のリンカー成分との組合せ、例えば、結合、非酵素的に開裂可能なリンカー、開裂可能ではないリンカー、酵素的に開裂可能なリンカー、光安定性のリンカー、光開裂可能なリンカーまたは自壊性スペーサーを含む。
いくつかの実施形態では、各リンカー成分は、両側の基の間の結合（リンカー成分が事実上に非存在であり、そのためそれに隣接する基が互いに結合していることを意味する）、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲ−（ＣＨ２）ｑ−、−ＮＨ−ＣＨＲ＊−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨＲ＊−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ＊−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｑＳ（ＣＨ２）ｑ−
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
からなる群から選択され
各ｑは、１〜１０であり、好ましくは０〜６または１〜６であり；
各Ｒ、Ｒ５、およびＲ６は、独立してＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
Ｒ７は、独立してＨ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジンおよびピリジンから選択され；
Ｒ８は、独立して
Figure 2016516035
Figure 2016516035
から選択され；
Ｒ９は、独立してＨ、Ｃ１〜４アルキル、およびＣ１〜６ハロアルキルから選択され；
各Ｒ＊は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸の１つでありうるアミノ酸の側鎖、または例えばシトルリン、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ホモセリン等のアルファ−アミノ酸類似体を表し；これらの任意のまたは全ては、非存在でありえて、すなわち、それらが付着する２つの基の間の結合を表しうる。
リンカー成分Ｌ６の好ましい選択は、共有結合、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、
Figure 2016516035
を含み；
Ｇは、グルクロネート等の酵素開裂可能な基であり、各ｎは、１〜１０であり、各Ｒは、独立してＨまたはＣ１〜４アルキル（好ましくはメチル）である。
本発明の別の態様は、ＡＤＣ凝集を減少させしたがってＡＤＣの機能および特性を改善するリンカーを提供する。ＡＤＣの凝集は、その活性に害を及ぼしえて、凝集はペイロードと同様にリンカーの特徴に依存することが周知である。特定の親水性のリンカーは、凝集を減少させるために用いられてきた。実施例４に凝集を減少させる新規なリンカー（例えば、ＡＤＣ−１１１およびＡＤＣ−１１２のリンカー）が図示されている。これらの新規なリンカーは、一般式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−のＮ−置換のアミドまたはカルバミン酸塩であるリンカー成分を含み、Ｒ２１は、ヒドロキシ、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミン、カルボン酸塩、カルボキサミド、またはアルキルスルホニル等の極性基で置換されているアルキル基である。実施例４および図１０（Ａ）〜１０（Ｃ）のデータが実証するように、極性基を単一リンカーのアミドに添加することにより、そうでなければサイズ排除クロマトグラフィーにより測定されるような有意な凝集を呈するＡＤＣの凝集が減少する。したがって本発明は、一般式Ａｂ−Ｌ＊−ＸのＡＤＣを含み、Ａｂは本明細書に記載されるもの等の抗体であり、Ｘは細胞毒または本明細書に記載される任意のＥｇ５阻害剤等のＥｇ５阻害剤等のペイロードであり、Ｌ＊は式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１−もしくは−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−のアミドまたは式−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ２１−もしくは−ＮＲ２１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏのカルバミン酸塩を含むリンカーであり、Ｒ２１は式−（ＣＨ２）１〜４−Ｒ２２のものであり、Ｒ２２は−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｎ（Ｒ２３）２、ＣＯＯＲ２３、ＣＯＮ（Ｒ２３）２、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＲ２３、および−ＳＯ２Ｒ２３から選択される極性基であり、ｋは０〜４であり各Ｒ２３は独立してＨまたはＣ１〜４アルキルである。リンカーの好ましい実施形態は、Ｒ２１が式−（ＣＨ２）１〜２Ｒ２３のものであるものを含み；Ｒ２３の好ましい実施形態は、ヒドロキシおよびカルボキシを含む。
同様に、がん細胞に関連する多くの抗原が知られており、これらの抗原に結合する抗体は、本発明の範囲内のイムノコンジュゲートに用いられうる。例えば、Ｌａｓｈに報告されたＡＤＣの臨床候補は、４つのみのペイロードクラスを利用する一方、それらはさまざまな標的細胞に関連する少なくとも１５の抗原を含む。本発明のイムノコンジュゲートの代表例は、本明細書に記載されているが、その例は、本発明の範囲またはクレームを制限しない。
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に明記されるかまたは文脈に明らかに矛盾しない限り任意の適切な順序で実施されうる。本明細書に提示される任意のおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば「等の」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図し、別にクレームされた本発明の範囲の制限をもたらさない。
列挙されたさまざまな本発明の実施形態は、本明細書に記載されている。各実施形態に特定されたフィーチャーは、他の特定されたフィーチャーと組み合わせられえて、本発明のさらなる実施形態を提供することが認識されるであろう。
本発明に基づく薬学的に許容される溶媒和物は、結晶化の溶媒が同位体置換され、例えばＤ２Ｏ、ｄ６−アセトン、ｄ６−ＤＭＳＯ、同様に溶媒を多く含まない溶媒和物でありうるものを含む。
本発明の化合物、すなわち、水素結合の供与体および／またはアクセプターとして作用できる基を含有する式（Ｉ）の化合物は、適切な共結晶形成剤を用いて共結晶を形成することが可能でありうる。これらの共結晶は、周知の共結晶形成の手順により式（Ｉ）の化合物から調製されうる。そのような手順は、結晶化条件下での式（Ｉ）の化合物と共結晶形成剤との溶液内での粉砕、加熱、共昇華、共融解、または接触およびそれにより形成された共結晶の単離を含む。適切な共結晶形成剤は、ＷＯ２００４／０７８１６３に記載されるものを含む。したがって本発明はさらに式（Ｉ）の化合物を含む共結晶を提供する。
本発明の化合物の任意の不斉原子（例えば、炭素等）は、ラセミ体内にまたは鏡像異性体を多く含む、例えば（Ｒ）−、（Ｓ）−または（Ｒ，Ｓ）−配置内に存在しうる。特定の実施形態では、各不斉原子は、（Ｒ）−または（Ｓ）−配置のどちらかの少なくとも５０％の鏡像体過剰率、少なくとも６０％の鏡像体過剰率、少なくとも７０％の鏡像体過剰率、少なくとも８０％の鏡像体過剰率、少なくとも９０％の鏡像体過剰率、少なくとも９５％の鏡像体過剰率、または少なくとも９９％の鏡像体過剰率を有し；すなわち、光学活性化合物に対して、他のエナンチオマーの実質的排除に１つのエナンチオマーを使用することが好ましいことが多い。不飽和二重結合を有する原子の置換基は、可能ならば、シス−（Ｚ）−またはトランス−（Ｅ）−形態で存在しうる。
したがって、本明細書に用いられているように本発明の化合物は、可能な異性体、回転異性体、アトロプ異性体、互変異性体またはそれらの混合物、例えば、実質的に純粋な幾何（シスまたはトランス）異性体、ジアステレオ異性体、光学異性体（アンチポード）、ラセミ体またはそれらの混合物の１つの形態でありうる。本明細書に用いられる「実質的に純粋な」または「実質的に他の異性体を含まない」は、生成物が好ましい異性体の量に対して、５重量％未満、好ましくは２重量％未満の他の異性体を含有することを意味する。
任意の得られた異性体の混合物は、構成要素の物理化学的差異に基づいて、例えば、クロマトグラフィーおよび／または分別再結晶により、純粋なまたは実質的に純粋な幾何または光学異性体、ジアステレオ異性体、ラセミ体に分離されうる。
最終生成物または中間体である任意の得られたラセミ体は、周知の方法により、例えば、光学活性の酸または塩基を用いて、かつ光学活性の酸または塩基化合物の遊離により得られるそれらのジアステレオ異性体塩の分離により、光学的アンチポードに分離されうる。詳細には、塩基部分は、このように使用されて本発明の化合物をそれらの光学的アンチポードに、例えば、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジ−Ｏ，Ｏ’−ｐ−トルオイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸またはショウノウ−１０−スルホン酸のような光学活性の酸を用いて形成される塩の、例えば分別再結晶により、分離しうる。ラセミ体生成物は、またキラルクロマトグラフィー、例えば、キラル吸着剤を用いる高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっても分離されうる。
さらに、それらの塩を含有する本発明の化合物は、またそれらの水和物の、または結晶化に用いられた他の溶媒を含む形態でも得られうる。本発明の化合物は、本来または意図的に、薬学的に許容される溶媒（水を含む）を用いて溶媒和物を形成しうる；したがって、本発明は溶媒和および非溶媒和の形態の両方を包含することを意図する。用語「溶媒和物」は、本発明の化合物の１つまたは複数の溶媒分子を伴う分子錯体（薬学的に許容されるそれらの塩を含む）を表す。そのような溶媒分子は、レシピエントに対して無害であることが知られている、例えば、水、エタノール等の医薬的分野で一般に用いられるものである。用語「水和物」は、溶媒分子が水である場合の錯体を表す。
それらの塩、水和物および溶媒和物を含む本発明の化合物は、本来または意図的に多形を形成しうる。
Ｅｇ５阻害剤
本発明のＡＤＣは、任意の適切なＥｇ５阻害剤、特に１０００Ｄａ未満、好ましくは７００Ｄａ未満の分子量を有する阻害剤を含みうる。いくつかの実施形態では、Ｅｇ５阻害剤は、１マイクロモル未満のＩＣ−５０を有し；好ましい実施形態では、ペイロードとして使用するＥｇ５阻害剤は、１００ナノモル（ｎＭ）未満のＩＣ−５０を有する。この目的のためのＩＣ５０は、ＷＯ２００６／００２２３６に記載されるように測定されうる。適切なＥｇ５阻害剤は、イスピネシブ、ＳＢ−７４３９２１、ＡＺＤ４８７７、ＡＲＱ６２１、ＡＲＲＹ−５２０、ＬＹ２５２３３５５、ＭＫ−０７３１、ＥＭＤ５３４０８５、およびＧＳＫ−９２３２９５、およびＷＯ０６／００２２３６、ＷＯ２００７／０２１７９４、ＷＯ２００８／０６３９１２、ＷＯ２００９／０７７４４８、ＷＯ２０１１／１２８３８１、ＷＯ２０１１／１２８３８８、およびＷＯ２００６／０４９８３５：に記載されるＥｇ５阻害剤を含む、Rath (Rath and Kozielski, Nature Rev. Cancer, vol. 12, 527-39 (2012)に開示される化合物を含み、好ましいペイロードは、本明細書に記載される式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物である。
Figure 2016516035
ＡＤＣペイロードとして使用するための式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のＥｇ５阻害剤は、阻害剤上のさまざまなポジションで連結基Ｌに（または直接Ａｂに）付着しえて；いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、ＱまたはＹまたはＲ１の基の原子を介してＬに付着している。式（ＩＩ）の化合物上の任意の利用可能な原子価は、Ｌに付着しうるが、コンジュゲートまたは式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）の修飾Ｅｇ５阻害剤の簡便な調製のために、Ｌへの付着は、通常、ＱまたはＹのヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳ）において起きる。式（Ｉ）のコンジュゲートのいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物を連結基Ｌに付着するために用いられる、遊離−ＮＨ−または遊離−ＯＨまたは遊離−ＳＨを含む。いくつかの実施形態では、遊離−ＮＨ−、−ＯＨ、または−ＳＨは、式（ＩＩ）内のＱまたはＹまたはＲ１の基の一部分である。遊離−ＮＨ−は、アミノ基（−ＮＨ２）、環状アミン（例えば、ピロリドン、ピペリジン、もしくはモルホリン等の環基中の−ＮＨ−）、または二級非環式アミンでありうることに留意されたい；各場合に、−ＮＨ−基は、好ましくはアミドの一部ではないかまたはその反応性を低減させるカルボニルまたはアリールまたはヘテロアリール環にコンジュゲートしている。
コンジュゲートを構築するためにそのようなペイロードを連結基に付着する方法は、当技術分野で周知である。一般に、遊離の一級もしくは二級アミンまたはヒドロキシル基は、アシル化反応により、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはスルホン酸置換Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性化エステルを含むリンカー成分を用いて、エステルまたはアミド結合を形成してコンジュゲートされる。代替的に、一級アミンは、リンカー成分のカルボニル（通常、−ＣＨ（＝Ｏ）または−Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅ）を用いてシッフ塩基の形成によりコンジュゲートされうる。Ｅｇ５阻害剤がチオール基を含む場合、コンジュゲートは、マレイミドまたはアルファ−ハロアセトアミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＬＧ、ＬＧはＢｒ、Ｃｌもしくはｌ）を含むリンカー成分を用いて形成されうるか、またはチオール含有リンカー成分にまたはジスルフィド結合を形成することにより抗原結合部分にコンジュゲートされうる。
本発明の一態様では、式（ＩＩＩ）のＥｇ５阻害剤が提供される。式ＩＩＩの化合物は、小分子治療剤として用いられうるか、またはそれらはＡＤＣ内にペイロードとして組み込まれうる。
Figure 2016516035
［または薬学的に許容されるその塩、
式中、
Ｚは、ＮまたはＣＨであり；
Ａｒ１は、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される３個までの基で任意選択で置換されているフェニルであり；
Ａｒ２は、ハロ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、ヒドロキシル、アミノ、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されているフェニルまたはピリジニルであり；
Ｒ１は、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜７ヘテロシクリルであり、Ｃ４〜７ヘテロシクリルは、環員としてＮ、Ｏ、およびＳから選択される２個までのヘテロ原子を含有し、ハロ、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、メチル、トリフルオロメチル、またはＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されており；ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、オキソ、またはＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されており；
Ｒ２は、Ｈ、またはＣ１〜４アルキルであり；
Ｔは、（ＣＨ２）１〜３であり；
Ｙは、Ｃ１〜２アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルから選択され、Ｃ１〜２アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルはそれぞれ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（Ｃ１〜４アルキル）、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されており；
Ａは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）、または式（ＩＩＩ）のカルボニルとＱとの間の結合であり；
Ｑは、Ｃ１〜４アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜６ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ５〜６ヘテロアリール、および−（ＣＨ２）０〜２−フェニルから選択され、Ｑは、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、−ＳＨ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＲ、および−ＮＲ２から選択される３個までの基で任意選択で置換されており、各Ｒは、ハロ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ＯＭｅ、または−ＯＨで任意選択で置換されている］
付加的な実施形態は、式（ＩＩＩ）の化合物を含み、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、−ＣＯＮＭｅ２、ＣＯＮＨＭｅ、または−ＣＯＮＨ２で置換されているＣ３〜５アルキルであり；他の全てのフィーチャーは、上述の式（ＩＩＩ）の通りである。
これらの化合物において、ＺはＣＨまたはＮでありえて；多くの実施形態では、ＺはＣＨである。
これらの化合物において、Ａｒ１は、上述の通りの置換フェニル、通常、ジハロフェニル等の二置換フェニルでありうる。好ましい実施形態では、Ａｒ１は、２，５−ジフルオロフェニル、２−クロロ−５−フルオロフェニル、または２−フルオロ−５−クロロフェニル等の２，５−ジハロフェニルである。
これらの化合物において、Ａｒ２は、上述の通りの置換フェニルもしくはピリジン、または任意選択で置換環状エーテルでありうる。多くの実施形態では、Ａｒ２は、非置換または一置換のフェニルまたはピリジンである。置換Ａｒ２として適切な置換基は、ハロ、ヒドロキシル、およびアミノを含み；該置換基は、任意のポジションでありえて、例えば、それは式中のイミダゾール／トリアゾール環に付着しているＡｒ２のポジションに対してメタ位でありうる。
式（ＩＩＩ）の化合物のこれらの任意の実施形態では、Ｒ２はＨまたはＣ１〜４アルキルでありえて、通常、ＨまたはＭｅ、好ましくはＨである。
式（ＩＩＩ）の化合物のこれらの任意の実施形態では、Ｒ１は、上述の通りの置換または非置換の複素環基でありえて；いくつかの実施形態では、Ｒ１は、テトラヒドロピラン−４−イル、テトラヒドロピラン−３−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、またはオキセタン−３−イル等の環状エーテルである。テトラヒドロピラン−４−イルが、時々好ましく：ＡＤＣに組み込まれている場合は、この部分は例えば、Ｒ１がｔ−ブチルである場合に起こりうるコンジュゲートの凝集を減少させ、そのためこの部分は、ＡＤＣ目的にとって特に有利である。この利点を実証するデータは、本明細書の表７に含まれている。
式（ＩＩＩ）の化合物のこれらの任意の実施形態では、Ｔは、メチレン、エチレンまたはプロピレンでありうる。好ましい実施形態では、Ｙが記載される複素環またはシクロアルキル基の１つである場合Ｔはメチレンであり、Ｙが式（ＩＩＩ）の範囲内のアミノアルキル基である場合Ｔはメチレンまたは−ＣＨ２ＣＨ２−である。
式（ＩＩＩ）の化合物のこれらの任意の実施形態では、Ａは、結合でありえて；他の実施形態では、Ａは、好ましくは−ＮＨ−である。
式（ＩＩＩ）の化合物のこれらの任意の実施形態では、Ｙは、上述の通りのアミノアルキル基または複素環基でありうる。いくつかの実施形態では、Ｙは、１−フルオロ−２−アミノ−２−エチルまたは１−アミノ−２−エチルまたは１−メトキシ−２−アミノ−２−エチル等のアミノアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、ピロリジン環、例えば、ピロリジン−３−イルであり、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＦ３、Ｍｅ、またはＯＨで置換されうる。好ましい実施形態では、Ｙは、これらの基（Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＦ３、Ｍｅ、またはＯＨ）の１つで４位で置換されている３−ピロリジニルである。
式（ＩＩＩ）の化合物のこれらの任意の実施形態では、Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜４アルキルでありえて；いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｈまたはメチル、好ましくはＨである。
本発明のイムノコンジュゲートに使用するためのＥｇ５阻害剤のいくつかの例として：
Figure 2016516035
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等の表１の任意の化合物が挙げられる。
同様に、以下：
Figure 2016516035
の任意のＥｇ５阻害剤は、本発明のイムノコンジュゲートに使用されうる。
式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物の特定の実施形態では、Ｒ１は、例えば、テトラヒドロピラニル基（例えば、４−テトラヒドロピラン）のような環状エーテル等の複素環基であり：式（ＩＩ）の化合物内のＲ１における複素環基は、ＡＤＣペイロードとして用いられた場合、Ｒ１としてｔ−ブチル基を有するコンジュゲートと比較して、凝集を減少させ、したがってこれらの化合物は、周知のＥｇ５の阻害剤を超える利点を呈する。
連結基
式（Ｉ）の連結基Ｌは、ペイロード化合物ＸをＡｂに直接に接続する結合でありうる（すなわち、Ｌまたは各リンカー成分はそれと互いに隣接する基を接続する結合を表しうる）か、またはそれは、１つまたは複数のリンカー成分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６等を含む連結部分でありうる。いくつかの好ましい連結基は、本明細書に示されている。ＡＤＣのための連結基は、コンジュゲート組み立てにおいて便宜上選択されうる、一般に２つ以上のリンカー成分を含有するか、またはそれらはコンジュゲートの特性に影響を与えるように選択されうる。リンカー成分として、例えば、チオールマレイミド基、チオエーテル、アミド、およびエステル等の、ＡｂをＸに接続する場合に容易に形成される化学基；例えばジスルフィド、ヒドラゾン、Ｖａｌ−Ｃｉｔのようなジペプチド、置換ベンジルオキシカルボニル基等の、標的細胞の中で、上でまたは周りで見出される条件下のｉｎ ｖｉｖｏで、容易に開裂する基；フェニル、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル環、およびアルキレン鎖等の、Ａｂに対して適切なポジションにＸを方向付けるスペーサー；および／または１つまたは複数の極性基（カルボキシ、スルホン酸塩、ヒドロキシル、アミン、アミノ酸、糖類）、およびグリコールエーテル（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｐ（ｐは１〜１０である）等のメチレン基の代わりに、溶解性を高めるかまたは分子間凝集を減少させうる、１つまたは複数の−ＮＨ−または−Ｏ−を含有するアルキレン鎖で置換されているアルキレン等の薬物動態学的特性強化基が挙げられる。
連結基は、１つのみのＸ基をＡｂに連結できることを意味する二価でありうるか、またはそれは三価（２つのＸ基をＡｂに連結することができる）でありうるか、またはそれは多価でありうる。三価、四価、および多価の連結基は、抗体上への薬物の負荷を増加させるために用いられえて、連結基に付着するために抗体上の付加的な部位を必要とすることなく薬物抗体比（ＤＡＲ）を増加させる。そのような連結基は、当技術分野で周知であり、例えば、Bioconjugate Chem., 1999 Mar-Apr;10(2):279-88;ＵＳ６６３８４９９; Clin Cancer Res October 15, 2004 10; 7063;ＷＯ２０１２／１１３８４７Ａ１を参照のこと。
式（Ｉ）のイムノコンジュゲートに使用するための連結基は、開裂可能または開裂可能ではなくありうる。ヒドラゾン、ジスルフィド、ジペプチドＶａｌ−Ｃｉｔを含有するもの、およびグルクロニダーゼ開裂可能ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル部分を含有するもの等の開裂可能な連結基は、当技術分野で周知であり、用いられうる。例えば、Ducry, et al., Bioconjugate Chem., vol. 21, 5-13 (2010)を参照のこと。これらのイムノコンジュゲートに関して、連結基は、イムノコンジュゲートが細胞に結合するかまたは入るまでｉｎ ｖｉｖｏで分子内酵素または分子内の化学的条件（ｐＨ、還元容量）のいずれかの点で実質的に安定であり、連結基を開裂させてＥｇ５阻害剤を遊離させる。
代替的に、開裂可能ではない連結基は、式（Ｉ）のイムノコンジュゲートに用いられうる。開裂可能ではないリンカーは、細胞内で分解するように設計された構造成分を欠いており、したがってそれらの構造は、実質的に変わりうる。例えば、Ducry, et al., Bioconjugate Chem., vol. 21, 5-13 (2010)を参照のこと。これらのイムノコンジュゲートは、標的細胞に入り連結基分解よりも抗体のタンパク質分解を実行することが確信されており；したがって連結基の少なくとも一部分、および抗体または抗体断片のいくらかさえも、Ｅｇ５阻害剤に付着して残りうる。式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）および（ＩＩＣ）は、連結基および／または抗体の残留部分が、Ｅｇ５の阻害を妨げないことが示されている特定のポジションに付着している連結基を有する活性化Ｅｇ５阻害剤を表し；したがって開裂可能ではない連結基が用いられる場合、式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）および（ＩＩＣ）にＷで表されているポジションでの連結基の付着が好ましい。
詳細には適切な連結基は、凝集を減少させる連結基である。本明細書の化合物３６７および３６８内の連結基は、本明細書に記載されるＥｇ５阻害剤と共に用いられる場合に凝集を減少させる効果を有することが示されている。したがって式（Ｖ）
Figure 2016516035
の連結基：
［式中、Ｒ２１は、式−（ＣＨ２）１〜４−Ｒ２２のものであり、Ｒ２２は−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｎ（Ｒ２３）２、ＣＯＯＲ２３、ＣＯＮ（Ｒ２３）２、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＲ２３、および−ＳＯ２Ｒ２３から選択される極性基であり、ｋは、０〜４であり各Ｒ２３は、独立してＨまたはＣ１〜４アルキルであり；ｊは、数１、２、３、および４から選択される整数であり］；抗体（Ａｂ）に連結するペイロード（Ｘ）を含み、連結基Ｌ＊は、式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−の基を含む、イムノコンジュゲートＡｂ−Ｌ＊−Ｘも、また本発明に含まれる。好ましくは連結基は、式（Ｖ）のものである。式（Ｖ）において、［ＰＬ］は、ペイロードの付着点を示し、［Ａｂ］は、抗体への付着点を示す。抗体は、通常、自然の抗体シーケンスまたはタンパク質設計により導入されたシステイン由来のシステインでありうる、システイン残基の硫黄原子を介してＬ＊に接続する。これらのリンカーに好ましい極性基は、ヒドロキシおよびカルボキシを含み、ｊは、通常、２、３、または４であり、Ｒ２１は、−（ＣＨ２）２〜３−Ｒ２３であることが多い。
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式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）および（ＩＩＣ）の化合物
式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）および（ＩＩＣ）の化合物は、反応性基に付着されているＥｇ５阻害剤、および任意選択により、Ｅｇ５阻害剤を反応性基に接続する１種または複数のリンカー構成成分を含む。表２は、表１に示されているものなどのＥｇ５阻害剤プラス反応性官能基、および任意選択により１種または複数のリンカー構成成分を含むこれらの化合物の例を図示している。
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エントリー５０８および５０９は比較例として提供され、Ｅｇ５阻害剤は当技術分野において知られているが、式ＩＩの範囲内でない。
抗原結合部分
式（Ｉ）または（ＩＡ）における抗原結合部分は、標的化細胞型上に見出される細胞表面マーカーに選択的に結合する任意の部分であり得る。一部の態様では、Ａｂは、がん細胞の表面上で優勢にまたは優先的に見出される抗原、例えば腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗体の抗原結合断片）である。一部の態様では、Ａｂは、細胞表面受容体タンパク質もしくは他の細胞表面分子、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織の発達または分化に関連する（例えば、機能的に寄与することが知られているまたは疑われるため）分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子、または血管形成に関連する（例えば、機能的に寄与することが知られているまたは疑われるため）分子に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片）である。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（即ち、ＣＤタンパク質）であってよい。本発明の一部の態様では、本発明の抗原結合部分は、１つの抗原に特異的に結合する。本発明の一部の態様では、本発明の抗原結合部分は、本明細書に記載されている２種以上の抗原に特異的に結合し、例えば、本発明の抗原結合部分は、二特異的抗体もしくは多特異的抗体またはそれらの抗原結合断片である。
例証的な抗体または抗原結合断片としては、以下に限定されないが、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ｃＫｉｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ腫瘍性タンパク質抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１−抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異的抗原抗体、抗ｔａｕ抗原抗体、抗線維化薬抗体、抗ケラチン抗体、および抗Ｔｎ−抗原抗体が挙げられる。
一実施形態では、式（Ｉ）または（ＩＡ）の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗原結合部分は、ＥｒｂＢ遺伝子によってコードされた受容体に特異的に結合する。該抗原結合部分は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から選択されるＥｒｂＢ受容体に特異的に結合することができる。抗原結合部分は、ＨＥＲ２受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合するとともにＨＥＲ２受容体を過剰発現させる腫瘍細胞の成長を阻害する抗体であり得る。該抗体は、モノクローナル抗体、例えばマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってよい。ヒト化抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７またはｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ）であってよい。該抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ断片であってよい。
本明細書における実施例において使用される抗体は、表３にリストされている重鎖および軽鎖の配列を有する。該配列は、トラスツズマブのためのものと同じであり、該抗体は、本明細書において「トラスツズマブ」または「ＴＢＳ」と称される。トラスツズマブは、式（Ｉ）または（ＩＡ）のイムノコンジュゲートにおける使用のための１つの適当な抗体である。
Figure 2016516035
式ＩまたはＩＡにおける抗原結合部分としては、以下に限定されないが、細胞表面受容体および腫瘍関連抗原に対抗する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片）が挙げられる。こうした腫瘍関連抗原は当技術分野において知られており、当技術分野においてよく知られている方法および情報を使用して抗体を生じさせる際における使用のために調製することができる。がんの診断および治療のための有効な細胞性標的を発見するという試みにおいて、研究者らは、１つまたは複数の正常の非がん性細胞（複数可）上と比較して、がん細胞の１つまたは複数の特別な型（複数可）の表面上で特異的に発現される膜貫通ポリペプチドまたは別段に腫瘍関連ポリペプチドを同定しようと努めてきた。しばしば、こうした腫瘍関連ポリペプチドは、非がん性細胞の表面上と比較して、がん細胞の表面上の方が豊富に発現される。こうした腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体に基づいた治療を介して破壊のためのがん細胞を特異的に標的にする能力を生じさせた。
本発明のイムノコンジュゲートに有用な抗体および抗体断片（例えば、抗原結合断片）としては、修飾または改変抗体、例えば、天然配列の少なくとも１種のアミノ酸の代わりにシステイン残基またはリシン残基を導入し、したがってＥｇ５阻害剤へのコンジュゲーションのために抗体または断片上に反応部位を提供するために修飾された抗体が挙げられる。同様に、該抗体または抗体断片は、Ｅｇ５阻害剤へのコンジュゲーションのための部位としてＰｃｌまたはピロリシンを組み込むために修飾することができる（Noren et al., (1989) Science 14;244(4901):182-188; Mendel et al., (1995) Annu Rev Biophys Biomol Struct. 24:435-462）。こうした抗体をペイロードまたはリンカー−ペイロード組合せとコンジュゲートするための方法は、当技術分野において知られている。
本発明において有用な抗原結合部分（例えば、抗体および抗原結合断片）は、他の修飾を有すること、または以下に限定されないが、ポリエチレングリコールタグ、アルブミン、および他の融合ポリペプチドなどの他の部分にコンジュゲートすることもできる。
抗体の生成
本発明の該抗体および抗体断片（例えば、抗原結合断片）は、以下に限定されないが、組換え発現、化学合成、および抗体四量体の酵素消化を含めて、当技術分野において知られている任意の手段によって生成することができ、一方、全長モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマまたは組換え体の生成によって得ることができる。組換え発現は、当技術分野において知られている任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などからであってよい。
本発明は、さらに、本明細書に記載されている抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、重鎖もしくは軽鎖可変領域、または本明細書に記載されている通りの相補的決定領域を含むセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、または抗体もしくはその結合断片をコードする現存の配列（例えば、下記の実施例に記載されている通りの配列）のＰＣＲ変異誘発によって生成することができる。核酸の直接的化学合成は、当技術分野において知られている方法、例えば、Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979のホスホトリエステル方法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル方法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホラミダイト方法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法によって達成することができる。ＰＣＲによって突然変異体をポリヌクレオチド配列に導入することは、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載されている通りに実施することができる。
本発明においてその上提供されるのは、上に記載されている抗体または抗体断片を生成するための発現ベクターおよび宿主細胞である。様々な発現ベクターが、本発明の抗体鎖または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現するために用いられ得る。ウイルスに基づく発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの両方が、哺乳動物宿主細胞において抗体を生成するために使用され得る。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系としては、プラスミド、典型的にはタンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットと一緒のエピソームベクター、およびヒト人工染色体が挙げられる（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ＆Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、および他のタンパク質を発現させるための当技術分野において知られている多数の他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルスに基づくベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バールウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、ベクターが発現されるべきである目的の宿主細胞に依存する。典型的に、発現ベクターは、本発明の抗体鎖または抗体断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。一部の実施形態では、誘発性プロモーターが、誘発条件下を除く挿入配列の発現を防止するために用いられる。誘発性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換生物体の培養は、発現生成物が宿主細胞によってより耐性が高いコード配列の集団を偏らせることなく、非誘発条件下で拡大することができる。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、本発明の抗体鎖または抗体断片の効果的な発現のために必要とされ得るかまたは所望され得る。これらのエレメントとしては、典型的に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソームの結合部位または他の配列が挙げられる。加えて、発現の効率は、使用時の細胞系に適切なエンハンサーの包含によって増強することができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるために使用され得る。
該発現ベクターは、挿入抗体配列によってコードされたポリペプチドを有する融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供することができる。よりしばしば、挿入抗体配列は、ベクターの包含前にシグナル配列に連結される。抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するために使用されるべきベクターは、時々、定常領域またはその一部分もコードする。こうしたベクターは、定常領域との融合タンパク質として可変領域の発現を可能にし、それによって、インタクトな抗体またはその断片をもたらす。典型的に、こうした定常領域はヒトである。
本発明の抗体鎖を保有および発現するための宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。大腸菌（E. Coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび発現させるのに有用な１つの原核宿主である。使用に適当な他の微生物宿主としては、桿菌、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）、および他の腸内細菌科、例えば、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、および様々なシュードモナス（Pseudomonas）種が挙げられる。これらの原核宿主において、人は、宿主細胞と適合性のある発現制御配列（例えば、複製起源）を典型的に含有する発現ベクターを構築することもできる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系など、様々な周知プロモーターが幾つでも存在し得る。プロモーターは、典型的に、任意選択によりオペレーター配列とともに発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母など他の微生物も、本発明の抗体または抗体断片を発現するために用いることができる。バキュロウイルスベクターとの組合せにおける昆虫細胞も使用され得る。
一態様では、哺乳動物宿主細胞は、本発明の抗体および抗体断片を発現および生成するために使用される。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株（例えば、実施例に記載されている通りの骨髄腫ハイブリドーマクローン）または外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞株のいずれかであり得る。これらは、任意の正常な致死のまたは正常もしくは異常な不死の動物またはヒトの細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含めて、インタクトな免疫グロブリンを分泌できる多数の適当な宿主細胞株が開発されてきた。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養の使用が一般に、例えばWinnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において考察されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターとしては、発現制御配列、例えば、複製起源、プロモーターおよびエンハンサー（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびに必要なプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、ならびに転写ターミネーター配列が挙げられ得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子からまたは哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーターを含有する。適当なプロモーターは、恒常的、細胞型特異的、段階特異的、および／またはモジュレート可能もしくは調節可能なであり得る。有用なプロモーターとしては、以下に限定されないが、メタロチオネインプロモーター、恒常的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘発性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、恒常的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘発性ＣＭＶプロモーター（ヒト即時−早期ＣＭＶプロモーターなど）、恒常的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野において知られているプロモーター−エンハンサー組合せが挙げられる。
興味対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型に依存して変動する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、共通して、原核細胞のために利用されるが、一方、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主のために使用され得る（一般に、Sambrook et al., supraを参照されたい）。他の方法としては、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道的方法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強取り込み、およびエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期高収率生成のため、安定発現がしばしば所望される。例えば、抗体鎖または結合断片を安定して発現する細胞株は、ウイルス性複製起源または内因性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含有する本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入に続き、細胞は、１〜２日間、富化培地中にて、それらが選択的培地に転換される前に成長するのを可能にされ得る。選択可能マーカーの目的は、選択に抵抗性を付与することであり、それの存在は、選択的培地中で導入配列を首尾よく発現する細胞の成長を可能にする。抵抗性の、安定してトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適切な組織培養技法を使用して増殖させることができる。
イムノコンジュゲート
本発明は、抗体または抗体断片などの抗原結合部分に連結されているＥｇ５阻害剤を含むイムノコンジュゲートを提供する。本発明の好ましいイムノコンジュゲートは、本明細書に記載されている通りの式（Ｉ）または（ＩＡ）のものである。こうしたイムノコンジュゲートを構築するための方法は、当技術分野においてよく知られている。好ましいイムノコンジュゲートとしては、表５および６に開示されているもの、ならびにトラスツズマブの代わりに別の抗原結合部分を有するそれらの変異物、特に、トラスツズマブが以下のリストから選択される抗体によって置き換えられているようなコンジュゲートが挙げられる：抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ｃＫｉｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ腫瘍性タンパク質抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１−抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異的抗原抗体、抗ｔａｕ抗原抗体、抗線維化薬抗体、抗ケラチン抗体、および抗Ｔｎ−抗原抗体。
一部の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、抗原結合活性を有する抗体または抗体断片Ａｂを含み、ここで、連結基Ｌは、Ａｂのシステイン硫黄原子でＡｂに付着されている：
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式中、ＬおよびＸは、式（Ｉ）について定義されている通りであり、Ｒ’およびＲ”は、Ａｂにおけるシステインに隣接するアミノ酸の側鎖である。これらの実施形態では、−Ｓ−Ｌ−は、しばしば、チオール−マレイミド連結を含み、Ｌは、任意選択により、追加のリンカー構成成分を含む。他の態様では、コンジュゲートは、−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６−を含む連結基を介してＸに連結されており、ここで、リンカー構成成分Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、式（ＩＡ）について定義されている通りである。アルファ−ハロアセトアミドまたはマレイミドを有する化合物と、抗原結合部分（抗体）におけるシステイン残基の硫黄原子との反応によってこれらのコンジュゲートを形成するための方法は、当技術分野においてよく知られている。
好ましいイムノコンジュゲートとしては、抗体（ＡｎｔｉＢ）とコンジュゲートされている以下の表（表５および６）におけるペイロード化合物のいずれかを含むイムノコンジュゲートが挙げられ、ここで、コンジュゲートは、表に示されている構造を有し、ここで、ＡｎｔｉＢ−Ｓ−は、抗体のシステイン残基の硫黄原子（構造中のＳ）を介してマレイミド環に結合されている抗体を表す。好ましい実施形態では、抗体（ＡｎｔｉＢ）は、がん細胞上で発現される抗原を認識する抗体である。適当な抗原は抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ｃＫｉｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ腫瘍性タンパク質抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１−抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異的抗原抗体、抗ｔａｕ抗原抗体、抗線維化薬抗体、抗ケラチン抗体、および抗Ｔｎ−抗原抗体を含めて、本明細書において開示されている。
抗体をマレイミド化合物に接続するシステイン残基は、天然抗体中に天然に存在することがあるか、またはそれは当技術分野において知られているタンパク質改変方法によって抗体に導入されることがあった。タンパク質改変によって導入されたシステイン残基を含有するために改変された抗体が時々好ましい。特に、以下の部位の少なくとも１つの代わりにシステインを導入するために改変された抗体は、本発明のイムノコンジュゲートにおける使用のために特に適当である：重鎖部位Ｋ３６０、Ｅ１５２およびＳ３７５；ならびに軽鎖残基Ｋ１０７。特に、ＨＣ−Ｋ３６０ＣとＬＣ−Ｋ１０７Ｃとの組合せ、およびＨＣ−Ｅ１５２ＣとＨＣ−Ｓ３７５Ｃとの組合せは非常に適当である。（ＥＵ番号付け）
該抗体は１つより多いペイロードを含有することができ：典型的な実施形態では、該コンジュゲートは、２つの重鎖および２つの軽鎖のペプチドからなる抗体上に２〜６種、好ましくは３〜５種のペイロード化合物（Ｅｇ５阻害剤）を含有すると理解される。
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別の態様では、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、経口投与、非経口投与および直腸投与などの特別な投与経路のために製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定せずに、カプセル、錠剤、ピル、顆粒、粉末または坐剤を含める）で、または液状形態（限定せずに、溶液、懸濁液またはエマルジョンを含める）で構成することができる。該医薬組成物は、滅菌など従来の製薬作業にかけることができ、および／または従来の不活性希釈剤、潤滑剤もしくは緩衝剤、ならびにアジュバント、例えば、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤および緩衝剤などを含有することができる。
本発明のイムノコンジュゲートは、典型的に、緩衝水溶液および／または等張水溶液中の溶液または懸濁液として製剤化される。それらは典型的に、タンパク質構成成分の安定性を保護するために中性に近いｐＨで、例えば６から８の間のｐＨで製剤化および投与され、薬学的に許容される塩が挙げられ得る。および／または緩衝剤。タンパク質構成成分は典型的に細胞から生成されるので、それらは、細胞中に見出される対イオン、例えば、ホスフェート、アセテート、ナトリウムおよびカリウムなどを含有することがあり、こうした対イオンは、存在するならば、典型的に、特異的に同定または特徴付けされない。さらに、それらは典型的に、ホスフェート−緩衝生理食塩水などの緩衝溶液中で単離および取り扱われ、存在する任意の対イオンは、活性に影響するとは予想されない。イムノコンジュゲートは、典型的に、注射または注入のいずれかによって非経口的に投与される。それらの製剤化および投与のための方法は、抗体治療薬など他の生物学に基づく医薬品の製剤化および投与のためのものと同様であり、当業者に知られている。
小分子医薬品としての使用のための式（ＩＩＩ）の化合物は、経口的に、局所的に、非経口的に、頬側に、吸入によって、または坐剤としてなど、従来の経路のために製剤化され、それらによって投与することができる。
経口投与のための適当な組成物は、錠剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散性の粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬および軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシルの形態における本発明の化合物の有効量を含む。経口使用が意図された組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野において知られている任意の方法に従って調製され、こうした組成物は、医薬として優雅および美味な調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１種または複数の薬剤を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適当である非毒性の薬学的に許容される賦形剤との添加混合物において活性成分を含有することができる。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；顆粒化剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチまたはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；ならびに潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。錠剤は、非コーティングであるか、または消化管における崩解および吸収を遅延させるため公知の技法によってコーティングされ、それによって、より長い期間にわたる持続作用を提供する。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料が用いられ得る。経口使用のための製剤は、該活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセルとして、または活性成分が、水もしくは油媒体、例えば、落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合される軟ゼラチンカプセルとして存在することができる。
特定の注射可能組成物は、等張水溶液または懸濁液であり、坐剤は、有利には、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調製される。前記組成物は滅菌することができ、ならびに／あるいは保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶液プロモーター、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤などのアジュバントを含有することができる。加えて、それらは、他の治療上貴重な物質を含有することもできる。前記組成物は、それぞれ従来の混合、顆粒化またはコーティングの方法に従って調製され、活性成分を約０．１〜７５％含有するか、または約１〜５０％含有する。
経皮適用のための適当な組成物は、適当な担体とともに本発明の化合物の有効量を含む。経皮送達に適当な担体は、宿主の皮膚を貫通するのを補助するための、吸収可能な薬理学的に許容される溶媒を含む。例えば、経皮的装置は、裏当て部材、任意選択により担体とともに該化合物を含有するリザーバー、任意選択により、延長された時間期間にわたり制御および予定された速度で宿主の皮膚の化合物を送達するための速度制御障壁、ならびに皮膚に装置を固定する手段を含む包帯の形態である。
例えば皮膚および目への局所適用のための適当な組成物としては、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲルまたはスプレー可能な製剤、例えばエアロゾルなどによる送達用が挙げられる。こうした局所送達系は、特に、皮膚適用に、例えば皮膚がんの処置に、例えば日焼けクリーム、ローションおよびスプレーなどにおける予防的使用に適切である。それらは、したがって、当技術分野においてよく知られている化粧製剤を含めた局所における使用に特に適当である。こうしたものは、可溶化剤、安定剤、張度増強剤、緩衝剤および保存料を含有することができる。
本明細書で使用される場合、局所適用は、吸入または鼻腔内適用にも関連し得る。それらは、好都合には、乾燥粉末吸入器からの乾燥粉末（混合物、例えばラクトースとの乾燥ブレンドとして単独で、または例えばリン脂質との混合構成成分粒子のいずれかで）、または適当な噴霧剤の使用の有無における、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーもしくはネブライザーからのエアゾールスプレープレゼンテーションの形態で送達することができる。
本発明は、さらに、本発明の化合物を活性成分として含む無水の医薬組成物および剤形を提供するが、というのは、水は特定の化合物の劣化を容易にするからである。
本発明の無水の医薬組成物および剤形は、無水または低水分含有成分および低水分または低湿度条件を使用して、調製することができる。無水医薬組成物は、その無水性質が維持されるように調製および貯蔵することができる。したがって、無水組成物は、それらに、適当なフォーミュラリーキットが含まれ得るように、水への曝露を防止することが知られている材料を使用してパッケージされる。適当なパッケージ材の例としては、以下に限定されないが、密閉されたホイル、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパックおよびストリップパックが挙げられる。
本発明は、さらに、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を低減する１種または複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。本明細書において「安定剤」として称されるような薬剤としては、以下に限定されないが、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、ｐＨ緩衝剤または塩緩衝剤などが挙げられる。
遊離形態または塩形態における式Ｉの化合物（イムノコンジュゲート）は、貴重な薬理活性を呈し：本明細書におけるデータが実証している通り、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は腫瘍細胞の成長を阻害し、したがって、がんを処置するのに有用である。データがさらに実証している通り、これらの化合物は、有利には、ＡＤＣのペイロードとして送達することができる。本明細書において実証されているようなコンジュゲートは、異なるヒトがんを表す異種移植片腫瘍の強力な成長阻害によって実証されている通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏの標的化細胞上およびｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍上で実質的な活性を呈する。したがって、抗体などの抗原結合部分に連結されている式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のペイロードを含む本発明のイムノコンジュゲートは、がん、例えば神経膠腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳がん、肺がん、卵巣がん、直腸結腸がん、甲状腺がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ−系譜急性リンパ芽球性白血病またはＴ−ＡＬＬ）、リンパ腫（殊に、非ホジキン）、膀胱、腎性、胃（例えば、消化管ストロマ腫瘍（ＧＩＳＴ））、肝臓および膵臓のがんおよび肉腫を処置するのにも有用である。
本発明の化合物およびイムノコンジュゲートは、特に、Ｅｇ５に反する活性の化合物によって阻害されることが当技術分野において知られているがん、および本発明の化合物およびコンジュゲートによる阻害に感受性であると本明細書において実証されているような腫瘍型を処置するのに有用である。処置のための適当な適応症としては、以下に限定されないが、胃、骨髄、結腸、鼻咽頭、食道および前立腺の腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳がん、肺がん、卵巣がん、直腸結腸がん、甲状腺がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ−系譜急性リンパ芽球性白血病またはＴ−ＡＬＬ）、リンパ腫（殊に、非ホジキン）、膀胱、腎臓、胃（例えば、消化管ストロマ腫瘍（ＧＩＳＴ））、肝臓および膵臓のがんおよび肉腫が挙げられる。
したがって、さらなる実施形態として、本発明は、治療における式（Ｉ）もしくは（ＩＩＩ）の化合物または本明細書に記載されている通りの式（Ｉ）および（ＩＩＩ）の範囲内の実施形態のいずれかの使用を提供する。さらなる実施形態では、該治療は、Ｅｇ５の阻害によって処置され得る疾患用である。別の実施形態では、本発明の化合物は、以下に限定されないが、乳がん、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、白血病、骨髄性白血病、リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ヘアリー細胞白血病および多発性骨髄腫を含めて、がんを処置するのに有用である。
該方法は、典型的に、本明細書に記載されている通りの化合物の有効量、またはこうした化合物を含む医薬組成物を、こうした処置を必要としている対象に投与することを含む。該化合物は、本明細書に記載されているものなどの任意の適当な方法によって投与することができ、投与は、処置する医師によって選択される間隔で反復することができる。
したがって、さらなる実施形態として、本発明は、医薬の製造のための、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物または本明細書に記載されているこうした化合物の実施形態のいずれかの使用を提供する。さらなる実施形態では、該医薬は、Ｅｇ５の阻害によって処置され得る疾患の処置用である。別の実施形態では、該疾患は、胃、骨髄、結腸、鼻咽頭、食道および前立腺の腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳がん、肺がん、卵巣がん、直腸結腸がん、甲状腺がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ−系譜急性リンパ芽球性白血病またはＴ−ＡＬＬ）、リンパ腫（殊に、非ホジキン）、膀胱、腎臓、胃（例えば、消化管ストロマ腫瘍（ＧＩＳＴ））、肝臓および膵臓のがんおよび肉腫から選択される。
本発明の医薬組成物または組合せは、約５０〜７０ｋｇの対象について活性成分（複数可）約１〜１０００ｍｇ、または活性成分約１〜５００ｍｇもしくは約１〜２５０ｍｇもしくは約１〜１５０ｍｇもしくは約０．５〜１００ｍｇもしくは約１〜５０ｍｇの単位投与量であり得る。化合物、医薬組成物、またはそれらの組合せの治療有効投与量は、対象の種、体重、年齢および個体の状態、処置されている障害もしくは疾患またはその重症度に依存する。通常技能の医師、臨床医または獣医は、障害または疾患の進行を防止、処置または阻害するのに必要な活性成分の各々の有効量を容易に決定することができる。
医薬組合せは、１つの投与単位形態における固定組合せ、または組合せ投与のいずれかを指し、ここで、本発明の化合物および組合せパートナー（例えば、「治療剤」または「共薬剤」とも称される、下記に説明されている通りの別の薬物）が、同じ時に独立してまたは時間間隔内で別々に投与され、殊に、これらの時間間隔は、組合せパートナーが協同効果、例えば相乗効果を示すことを可能にする。単一の構成成分は、キット中にまたは別々にパッケージすることができる。構成成分の一方または両方（例えば、粉末または液体）は、投与より前に所望の用量に再構成または希釈することができる。「同時投与」または「組合せ投与」などという用語は、本明細書において利用される場合、選択された組合せパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に投与することを包含すると意味され、薬剤が同じ投与経路によってまたは同じ時に必ずしも投与されるわけではない処置レジメンを含むと意図される。「医薬組合せ」という用語は、本明細書で使用される場合、１種より多い活性成分を混合または組み合わせることに起因する生成物を意味し、活性成分の固定および非固定組合せの両方を含む。「固定組合せ」という用語は、活性成分、例えば本発明の化合物および組合せパートナーが両方ともに、単一の実体または投与量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「非固定組合せ」という用語は、活性成分、例えば本発明の化合物および組合せパートナーが両方ともに、特定の時間限定なく同時に、平行してまたは順次にのいずれかで別々の実体として患者に投与されることを意味し、ここで、こうした投与は、患者の身体において２種の化合物の治療有効レベルを提供する。後者は、カクテル療法、例えば３種以上の活性成分の投与にも適用する。
上記引用の投与量特性は、有利には哺乳動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、モンキーまたはそれらの単離された器官、組織および調製物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験において実証可能である。本発明の化合物は、溶液、例えば水溶液の形態にてｉｎ ｖｉｔｒｏで、および経腸的に、非経口的に、有利には静脈内に、例えば懸濁液としてまたは水溶液中のいずれかにてｉｎ ｖｉｖｏで適用することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの投与量は、約１０−３モルから１０−９モル濃度の間を範囲とすることができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの治療有効量は、経路投与に依存して、約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇの間または約１〜１００ｍｇ／ｋｇの間を範囲とすることができる。
本発明の化合物は、１種または複数の治療共薬剤（複数可）と同時に、またはその前もしくは後のいずれかで投与することができる。本発明の化合物は、同じもしくは異なる投与経路によって別々に、または共薬剤（複数可）として同じ医薬組成物中で一緒に投与することができる。
一実施形態では、本発明は、治療における同時、別々または順次の使用のための組合せ調製物として、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１種の他の治療共薬剤を含む生成物を提供する。一実施形態では、該治療は、がんなどＥｇ５によって媒介される疾患または状態の処置である。組合せ調製物として提供される生成物としては、式（Ｉ）もしくは（ＩＩＩ）の化合物および他の治療共薬剤（複数可）を同じ医薬組成物中に一緒に、または式（Ｉ）もしくは（ＩＩＩ）の化合物および他の治療共薬剤（複数可）を別々の形態で、例えばキットの形態で含む組成物が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物および別の治療共薬剤（複数可）を含む医薬組成物を提供する。任意選択により、該医薬組成物は、上に記載されている通りの薬学的に許容される担体を含むことができる。
本発明の化合物およびコンジュゲートとの使用のための適当な共薬剤としては、他の抗がん剤、抗アレルギー剤、抗吐き気剤（または制吐薬）、疼痛軽減薬、抗炎症剤、細胞保護剤、およびそれらの組合せが挙げられる。
本明細書において開示されている化合物およびコンジュゲートとの組合せにおける使用が考慮される特定の共薬剤としては、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロランブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキセート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（phoenix）（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントとのポリフェプロザン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
一部の患者は、投与中またはその後で本発明の化合物および／または他の抗がん剤（複数可）に対するアレルギー反応を経験することがあり；そのため、抗アレルギー剤が、アレルギー反応のリスクを最小化するためにしばしば投与される。適当な抗アレルギー剤としては、副腎皮質ステロイド、例えばデキサメタゾン（例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、ベクロメタゾン（例えば、Ｂｅｃｌｏｖｅｎｔ（登録商標））、ヒドロコルチゾン（コルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウムとしても知られており、Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（登録商標）、リン酸ヒドロコルチゾン、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、ＨｙｄｒｏｃｏｒｔＡｃｅｔａｔｅ（登録商標）およびＬａｎａｃｏｒｔ（登録商標）という商標下で販売されている）、プレドニゾロン（Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｌ（登録商標）、Ｏｒａｐｒｅｄ（登録商標）、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（登録商標）およびＰｒｅｌｏｎｅ（登録商標）という商標下で販売されている）、プレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標）、ＬｉｑｕｉｄＲｅｄ（登録商標）、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（登録商標）およびＯｒａｓｏｎｅ（登録商標）という商標下で販売されている）、メチルプレドニゾロン（６−メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウムとしても知られており、Ｄｕｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）およびＳｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）という商標下で販売されている）；抗ヒスタミン薬、例えばジフェンヒドラミン（例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ（登録商標））、ヒドロキシジンおよびシプロヘプタジン；ならびに気管支拡張薬、例えばベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、アルブテロール（例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ（登録商標））、およびテルブタリン（Ｂｒｅｔｈｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
一部の患者は、本発明の化合物および／または他の抗がん剤（複数可）の投与中およびその後に吐き気を経験することがあり；そのため、制吐薬が、吐き気（上部胃）および嘔吐を防止する際に使用される。適当な制吐薬としては、アプレピタント（Ｅｍｅｎｄ（登録商標））、オンダンセトロン（Ｚｏｆｒａｎ（登録商標））、グラニセトロンＨＣｌ（Ｋｙｔｒｉｌ（登録商標））、ロラゼパム（Ａｔｉｖａｎ（登録商標）。デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、プロクロルペラジン（Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標））、カソピタント（Ｒｅｚｏｎｉｃ（登録商標）およびＺｕｎｒｉｓａ（登録商標））、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
処置期間中に経験される疼痛を軽減するための薬物療法は、しばしば、患者をより快適にするために処方される。Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標）などの一般店頭鎮痛薬がしばしば使用される。しかしながら、オピオイド鎮痛薬、例えばヒドロコドン／パラセタモールまたはヒドロコドン／アセトアミノフェン（例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ（登録商標））、モルヒネ（例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ（登録商標）またはＡｖｉｎｚａ（登録商標））、オキシコドン（例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ（登録商標）またはＰｅｒｃｏｃｅｔ（登録商標））、塩酸オキシモルホン（Ｏｐａｎａ（登録商標））、およびフェンタニル（例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ（登録商標））は、中程度のまたは激しい疼痛にも有用である。
処置毒性から正常細胞を保護するため、および器官毒性を制限するための努力において、細胞保護剤（例えば神経保護薬、フリーラジカルスカベンジャー、心保護薬、アントラサイクリン血管外漏出中和剤、および栄養素など）が、補助治療として使用され得る。適当な細胞保護剤としては、アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標））、グルタミン、ジメスナ（Ｔａｖｏｃｅｐｔ（登録商標））、メスナ（Ｍｅｓｎｅｘ（登録商標））、デクスラゾキサン（Ｚｉｎｅｃａｒｄ（登録商標）またはＴｏｔｅｃｔ（登録商標））、キサリプロデン（Ｘａｐｒｉｌａ（登録商標））、およびロイコボリン（カルシウムロイコボリン、シトロボラム因子およびフォリン酸としても知られている）が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種が式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物を含有する２種以上の別々の医薬組成物を含むキットを提供する。一実施形態では、該キットは、前記組成物を別々に保持する手段、例えば容器、分割瓶、または分割箔パケットを含む。こうしたキットの例は、錠剤およびカプセルなどのパッケージ材用に典型的に使用される通りのブリスターパックである。
本発明のキットは、異なる剤形、例えば、経口および非経口剤形を投与するため、異なる投与間隔で別々の組成物を投与するため、または別々の組成物を互いに対して滴定するために使用することができる。コンプライアンスを補助するため、本発明のキットは、投与の指示書を典型的に含む。
本発明の組合せ治療において、本発明の化合物および他の治療共薬剤は、同じまたは異なる製造者によって製造および／または製剤化することができる。さらに、本発明の化合物および他の治療共薬剤は：（ｉ）医師に組合せ生成物を出す前に（例えば、本発明の化合物および他の治療剤を含むキットの場合において）；（ｉｉ）医師自身によって（または医師の指導の下で）投与の少し前に；（ｉｉｉ）患者自身において、例えば本発明の化合物および他の治療剤の順次投与中に一緒にされて組合せ治療をもたらすことができる。
したがって、本発明は、Ｅｇ５によって媒介される疾患または状態を処置するための式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物の使用を提供し、ここで、該医薬は、別の治療剤との投与のために調製される。本発明は、疾患または状態を処置するための別の治療共薬剤の使用も提供し、ここで、該医薬は式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物とともに投与される。
本発明は、Ｅｇ５によって媒介される疾患または状態を処置する方法における使用のための式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物も提供し、ここで、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物は、別の治療剤との投与のために調製される。本発明は、Ｅｇ５によって媒介される疾患または状態を処置する方法における使用のための別の治療共薬剤も提供し、ここで、他の治療共薬剤は、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物との投与のために調製される。本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物が別の治療共薬剤とともに投与される、Ｅｇ５によって媒介される疾患または状態を処置する方法における使用のための式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物も提供する。本発明は、他の治療共薬剤が式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物とともに投与される、Ｅｇ５によって媒介される疾患または状態を処置する方法における使用のための別の治療共薬剤も提供する。
本発明は、患者が以前に（例えば２４時間以内）別の治療剤で処置された、Ｅｇ５によって媒介される疾患または状態を処置するための式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物の使用も提供する。本発明は、患者が以前に（例えば２４時間以内）式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物で処置された、Ｅｇ５によって媒介される疾患または状態を処置するための別の治療剤の使用も提供する。
合成方法
本発明の化合物を合成するために利用される全ての出発材料、基礎単位、試薬、酸、塩基、脱水剤、溶媒および触媒は、商業的に入手可能であるか、または当業者に知られている有機合成方法（例えば、Houben-Weyl 4th Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21を参照されたい）によって生成することができるのいずれかである。さらに、本発明の化合物は、以下の実施例に照らして、当業者に知られている有機合成方法によって生成することができる。
式（ＩＩ）の多くのＥｇ５阻害剤化合物は、ＷＯ２００７／０２１７９４、ＷＯ２００６／００２２３６、ＷＯ２００８／０６３９１２、ＷＯ２００９／０７７４４８、ＷＯ２０１１／１２８３８１およびＷＯ２０１１／１２８３８８に開示されている方法を含めて、当技術分野において知られている方法に従って調製することができる。
式（ＩＩＩ）の化合物は、本明細書に記載されている方法との組合せにおける公知の方法を使用して、同様に調製することができる。これらの化合物の合成の例示的な例は、以下の一般的スキームに提供されている。
Figure 2016516035
このプロセスは、アルファ炭素にＴＨＰ基を有する公知の保護キラルアミノ酸、および所望のＡｒ１基を提供するための適切なアルファ−ハロアセトフェノンを用いるエステルの形成から始まる。酢酸アンモニウムを用いる処理は、イミダゾール環のＣ−２上の基にキラリティーが保持されている置換イミダゾールを提供する。イミダゾール窒素は、マイルドな塩基でアルキル化されることでＡｒ２ＣＨ２−を導入することができる。カルバメートの脱保護は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（ＤＭＰ）または同様の酸化を用いる酸化およびシッフ塩基形成、続いて、シアノホウ化水素または同様の還元剤を使用するイミンの還元によって、適当な第１級アルコールでアルキル化することができる、遊離アミンを提供する。該スキームにおいて、このステップはピロリジン環を導入するが、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の範囲内の他の基が同様に導入されることで、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物のための異なる−Ｔ−Ｙ基を有する他の化合物を提供することができる。保護基は、例えば様々なＲ１０基がピロリジン環上に存在するのを可能にすること、または必要とされる場合にＡｒ１またはＡｒ２上の置換を順応させることが必要とされる場合に利用することができる。
遊離アミンは、次いで、当技術分野において知られている従来の方法を使用して適切な−Ａ−Ｑ部分を導入するために、任意の適当なアシル化剤でアシル化することができる。該スキームの例示的な例において、キラルラクテート誘導体は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）におけるＡ基のための結合を有する保護形態でのアシル基、およびＱ基のための保護ヒドロキシアルキル基を導入するために使用される。ピロリジン環窒素およびＱ上のヒドロキシル基の脱保護は、式（ＩＩＩ）の化合物を提供する。
本発明の化合物を作製するための多くの適当なピロリジン環は当技術分野において知られており、スキーム２は、これらの確実な合成を図示している。公知の３−ピロリン環は、カルボベンジルオキシ（ＣＢＺ）または他の適当な保護基で保護され、メタ−クロロペルオキシ安息香酸で酸化される。エポキシドは次いで、臭化銅（Ｉ）の存在下にてビニルグリニャールなどのグリニャール試薬で開かれて、トランス二置換ピロリジンを提供する。これは、様々なピロリジン中間体を作製するために使用することができ、そのエナンチオマーは、容易に分離することができる。それは、例えばスキーム２に図示されている通りに使用されることで、フッ素化ピロリジン環を調製することができる。ヒドロキシル基は、フッ化ペルフルオロ−１−ブタンスルホニル（ＰＢＳＦ）またはＤＡＳＴなどのフッ素化試薬を使用し、立体化学の反転で、Ｆによって置き換えることができる。ビニル基は、次いで、四酸化オスミウムで酸化させることができ、その結果得られるアルデヒドは、水素化ホウ素ナトリウムなどの従来の方法によって還元されることで、スキーム１で使用されるキラルピロリジンを提供することができる。
Figure 2016516035
Figure 2016516035
スキーム３は、スキーム１からの中間体で始めるＡが−ＮＨ−である化合物の合成を例示している。ジクロロメタン中のホスゲン、続いて、適当なアミンの導入は、保護中間体を提供し、脱保護は、従来の条件下、例えば、メタノール中の炭素担持パラジウム下、ギ酸アンモニウムまたは水素を使用して達成することができる。
Figure 2016516035
スキーム３Ａは、式（ＩＩ）の化合物のアシル基を介して付着されている反応性官能基（この場合においてマレイミド）を有する、即ち、ＬがＱに付着されている式（ＩＩＡ）の化合物を合成するための方法を例示している。スキーム２からの、示されている中間体は、ビス−（パラ−ニトロフェノール）カーボネートを使用して活性化アシル化剤に変換されて、ｐ−ニトロフェノキシ脱離基を有する混合カーボネートを形成する。混合カーボネートは、次いで、適当なアミンと反応させることが可能であり、その後、ピロリジン環窒素の脱保護に続いて、Ｗが、Ａｂ上のまたはＡｂに付着されているリンカー構成成分上のチオールとの反応に適当なマレイミドである式（ＩＩＡ）の化合物を提供する。この例における生成物は切断不可能なリンカーと考えられるが、というのは、存在するリンカー構成成分はいずれも、該部分が式（Ｉ）のＡＤＣ中で付着されている抗体の分解速度より速い速度でのｉｎ ｖｉｖｏ切断のためには設計されていないからである。
Figure 2016516035
Figure 2016516035
スキーム３Ｂは、スキーム１の生成物を使用して式（ＩＩＢ）の化合物を調製するための方法を例示している。この方法において、マレイミド含有連結基前駆体の混合カーボネートは、ビス（パラ−ニトロフェノール）カーボネートを使用して形成される。混合カーボネートは、次いで、Ｅｇ５阻害剤のピロリジン窒素をアシル化するために使用されて、上記に示されている式（ＩＩＢ）の化合物を提供する。この例において、式（ＩＩＢ）におけるＷの反応性官能基はマレイミドであり、Ｗ基におけるリンカー構成成分は切断可能なリンカー（ｖａｌ−ｃｉｔ）を含むので、この化合物は、カテプシンＢによる切断を受ける切断可能な連結基を有するコンジュゲートの例となる。パラ−アミノベンジルオキシカーバメートリンカー構成成分は、自己犠牲リンカーとして機能し：カテプシンＢがパラ−アミノ基からｖａｌ−ｃｉｔジペプチドを切断すると、カルバミン酸ベンジルは自然発生的に分解して、Ｅｇ５化合物を放出する。
Figure 2016516035
Figure 2016516035
本発明は、さらに、本プロセスの任意の変異形を含み、ここでは、その任意の段階で得られる中間生成物は出発材料として使用され、残りのステップが実施されるか、または出発材料は反応条件下にてその場で形成されるか、または反応構成成分は、それらの塩もしくは光学的に純粋な材料の形態で使用される。
以下の実施例は、本発明を例示することが目的であり、それらに対する限定として解釈されるべきでない。温度は摂氏温度で示されている。別段に記述されていないならば、全ての蒸発は、減圧下で、典型的には約１５ｍｍＨｇから１００ｍｍＨｇ（＝２０〜１３３ｍｂａｒ）の間で実施される。最終生成物、中間体および出発材料の構造は、標準的分析方法、例えば微量分析および分光学的特性、例えばＭＳ、ＩＲ、ＮＭＲによって確認されている。使用される略語は、当技術分野における従来のものである。
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＡＤ：アゾジカルボン酸ジイソプロピル
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＴＯＡＣ：酢酸エチル
ＴＢＳＣｌ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
全ての反応は、任意でさらに蒸留することなく商品グレード溶媒を使用し、Ａｒ下にて実施した。試薬は、さらなる精製を用いず商品グレードとして使用した。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ Ｆ２５４）０．２ｍｍを用い、ＴＬＣ−アルミニウムシートを使用して実施した。カラムクロマトグラフィーは、フラッシュグレードプレパックＲｅｄｉｓｅｐ（登録商標）カラムを使用するＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎシステムを使用して実施した。
ＮＭＲスペクトルは、以下の分光計を使用して２３℃または２９℃で記録した：、１．７ｍｍの１Ｈ｛１３Ｃ，１５Ｎ｝ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（商標）が備えられているＢｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚおよびＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ６００ＭＨｚプロトン周波数。分取ＨＰＬＣは、以下の条件を使用するＷａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム上で実施した：Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×１００ｍｍ、５μ、３０ｍｌ／ｍｉｎで水＋０．１％ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ中のＣＨ３ＣＮを用いる勾配溶出。
ＬＣ／ＭＳデータは、光ダイオードアレイ検出器およびシングル四重極質量検出器を使用するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ／ＳＱＤシステムで生成した。以下の条件を利用した：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍ
溶離液Ａ：水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム
溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
カラム温度：６０℃
注射体積１μｌ、部分的なループ
ＰＤＡフルスキャン２１０−４５０ｎｍおよび１つのユーザー選択可能な波長
方法Ａ：ＬＣＭＳ＿２＿ＭＩＮＵＴＥＳ
流れ１．０ｍｌ／ｍｉｎ
停止時間２．００分
Figure 2016516035
方法Ｂ：ＬＣＭＳ＿１０＿ＭＩＮＵＴＥＳ
流れ１．０ｍｌ／ｍｉｎ
停止時間１０．００分
Figure 2016516035
方法Ｃ：ＬＣ−ＭＳ Ｃｏｌｕｍｎ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ、２．１＊５０ｍｍ
５分（流れ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ギ酸、勾配：４．３分で２０％から１００％Ｂ）
ＬＣ方法が明記されていない場合、保持時間が１．５分を下回るならば方法Ａを使用し、１．５分から１０分の間の保持時間には方法Ｂを使用した。
ＵＰＬＣＭＳ−方法Ｄ（極性法、２分実行）：
システム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＱ検出器を用いるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ。
カラム：ＡｃｑｕｉｔｙＨＳＳ Ｔ３ １．８μｍ２．１×５０ｍｍ。
流れ：１ｍｌ／ｍｉｎ。カラム温度：６０℃。
勾配：１．４分で１％から９８％Ｂ、Ａ＝水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ＝アセトニトリル＋０．０．４％ギ酸。
ＵＰＬＣＭＳ方法Ｅ（４分実行）
システム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＱ検出器を用いるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ。
カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ２．１×２０ｍｍ。
流れ：０．６２ｍｌ／ｍｉｎ。カラム温度：４０℃。
勾配：４分で５％から１００％Ｂ、Ａ＝水＋０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸。
分取ＬＣ方法
順相クロマトグラフィー−ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ
システム：ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆ２００。
カラム：ＲｅｄｉＳｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｉｌｉｃａ。
勾配：０から１００％Ｂ、Ａ＝ヘプタン、Ｂ＝酢酸エチル。
順相クロマトグラフィー−ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ
システム：ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆ２００。
カラム：ＲｅｄｉＳｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｉｌｉｃａ。
勾配：０から１００％Ｂ、Ａ＝ジクロロメタン、Ｂ＝ＭｅＯＨ。
分取逆相クロマトグラフィー−ＰｒｅｐＬＣ方法Ｃ
システム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＱ検出器を用いるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＰｒｅｐＬＣ／ＭＳ。
カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ１８、５μｍ、３０×１００ｍｍ。
流れ：３０ｍｌ／ｍｉｎ。
勾配：５％から１００％Ｂ、Ａ＝アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ＋水＋０．１％トリフルオロ酢酸。
分取逆相クロマトグラフィー−ＰｒｅｐＬＣ方法Ｄ
システム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＱ検出器を用いるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＰｒｅｐＬＣ／ＭＳ。
カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ１８、５μｍ、３０×１５０ｍｍ。
流れ：６０ｍｌ／ｍｉｎ。
勾配：５％から１００％Ｂ、Ａ＝アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ＋水＋０．１％トリフルオロ酢酸。
選択された中間体の合成
ベンジル２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ジオキサン（１０００ｍＬ）中の２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール（３０ｇ、４３４ｍｍｏｌ、９６％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ製）の溶液（０．４３Ｍ溶液）に、ＣｂｚＯＳｕ（１３０ｇ、５２１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間撹拌した後に、反応混合物を約３００ｍＬに濃縮し、ＥｔＯＡｃ１０００ｍＬで希釈した。有機層を水およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。所望のベンジル２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレートを、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって、収率９１％（８０．０ｇ）で無色油状物として得た。Ｒｆ＝０．６（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ7.32 (5H, m), 5.80 (2H, m), 5.77 (2H, s), 4.22 (4H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２０４．２、１６０．１（−４４）、０．８６分。
ベンジル６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキシレート
Figure 2016516035
ジクロロメタン（５４０ｍＬ）中のベンジル２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（３３ｇ、１６３ｍｍｏｌ；９０％、Ａｌｄｒｉｃｈ製）の溶液（０．３Ｍ溶液）に、ｍ−ＣＰＢＡ（４４ｇ、３４０ｍｍｏｌ、７７％、Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した後に、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液５００ｍＬを添加し、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。有機層を分離し、水およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。黄色油状物としての所望の生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって、収率８３％（２９．５ｇ）で得た。Ｒｆ＝０．５（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 3.38 (2H, dd, J=12.8, 6.0Hz), 3.68 (2H, d, J=3.6Hz), 3.87 (2H, dd, J=13.2, 19.6), 5.11 (2H, s), 7.33( 5H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２２０．０、０．６９分。
ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
無水ＴＨＦ（２６０ｍＬ）中のベンジル６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキシレート（２８．５ｇ、１３０ｍｍｏｌ）およびＣｕＢｒＳＭｅ２（２６．７ｇ、１３０ｍｍｏｌ）の溶液（０．５Ｍ溶液）に−４０℃で、臭化ビニルマグネシウム（５２０ｍＬ、ＴＨＦ中の１．０Ｍ溶液）をゆっくり添加した。次いで、反応混合物を２時間、−２０℃まで加温した。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２００ｍＬ）でクエンチした後に、反応混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で抽出した。有機層を水およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。ｔｒａｎｓ−（±）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレートの所望のラセミ混合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって、収率４８％（１５．５ｇ）で黄色油状物として得た。Ｒｆ＝０．２（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 2.71 (1H, m), 3.28 (2H, m), 3.72 (2H, m), 4.11 (1H, m), 5.14 (2H, s), 5.16-5.23 (2H, m), 5.69 (1H, m), 7.33 (5H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２４８．０、０．７８分。
ｔｒａｎｓ−（±）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレートの分割
Figure 2016516035
ｔｒａｎｓ−（±）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート（１４ｇ）のラセミ混合物を、ＢａｓｅｌにあるＳｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（連絡先：Ｄｒ．Ｅｒｉｃ Ｆｒａｎｃｏｔｔｅ、Ｔｅｌ．＋４１ ６１６９ ６２９７１）に送付した。所望の鏡像異性的に富化された（３Ｓ，４Ｒ）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート（６．３ｇ、＞９９．５％ｅｅ）および不所望の（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート（６．７ｇ、９９．５％ｅｅ）を回収率９２％で得た。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−フルオロ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＰｈＣＦ３（８１ｍＬ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート（５．０ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）の溶液（０．２５Ｍ溶液）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５３ｍＬ、３０３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（１９．８ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）、およびペルフルオロ−１−ブタンスルホニルフルオリド（ＰＢＳＦ、３．６ｍＬ、２０．２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で撹拌した。６０および１２０分後に、追加のペルフルオロ−１−ブタンスルホニルフルオリド（３．６ｍＬ、２０．２ｍｍｏｌ）を添加した。１８時間後に、反応混合物を分液漏斗に移し、１．０Ｎ ＨＣｌ５０ｍＬで２回（多大な熱が生じるので注意されたい）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で２回、ならびにＨ２Ｏおよびブラインで１回洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮して、粗製の茶色油状物を得た。純粋な（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−フルオロ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレートを、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中の１０％〜３０％ＥｔＯＡｃ）によって、収率８１％（４．１ｇ）で黄色油状物として得た。Ｒｆ＝０．５５（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 7.37-7.25 (5H, m), 5.9 (1H, m), 5.24 (2H, m), 5.14 (2H, m), 5.03 (1H, dt, J=52.8, 3.2Hz), 3.9-3.5 (3H, m), 3.53 (1H, q, J=10.4Hz), 2.83 (1H, m). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 154.7, 154.6, 136.6, 131.89, 131.83, 128.48, 128.02, 127.94, 119.00, 118.94, 95.23, 94.47, 93.42, 92.67, 66.99, 66.94, 53.16, 52.94, 52.83, 52.60, 48.17, 48.02, 47.91, 47.83, 47.2, 47.1.ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２５０．０、０．９３分。
（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＣＨ３ＯＨおよびＨ２Ｏ（２：１、１８ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−フルオロ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート（１．７８ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ中のＯｓＯ４の溶液（４％ｗ／ｖ溶液３ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＮａＩＯ４（４．６ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）を一度にすべて添加し、得られた混合物を室温で撹拌した。２時間後に、混合物を濾過して、沈澱した白色固体を除去し、濾過ケーキをＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を真空中で濃縮して、大部分の有機溶媒を除去した。残渣をＥｔＯＡｃで３回に分けて抽出し、合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗製の（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレートをさらに精製せずに、次のステップのために使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２０８．２（−４４）、０．６９分。
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレートの上記の粗製物の氷冷溶液に、ＮａＢＨ４（３３０ｍｇ、１４．３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で撹拌した。反応が完了したら、粗製の混合物を０．５Ｍ ＨＣｌで酸性化し、３０分間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（２回）および水（２回）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４下で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させて、所望の生成物（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（１．７ｇ、６．９ｍｍｏｌ、９７％）を油状物として得た。粗製物を何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２５４．２、２１０．２（−４４）、０．７８分。
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート。
アセトン（３７２ｍＬ）中の（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）酢酸（４．８２ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（２．３ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、２−クロロ−１−（２，５−ジフルオロフェニル）エタノン（４．２５ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を、続いて、ＫＩ（０．７７ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌しながら、反応物を室温にした。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、混合物を０℃に冷却し、冷水（６００ｍＬ）でクエンチした。０℃で１５分間撹拌した後に、反応混合物を濾過し、沈殿物をアセトン／Ｈ２Ｏ（１／３）で洗浄して、（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテートを固体（４．１ｇ、９．７１ｍｍｏｌ、５２％）として得た。この固体を高真空下で終夜乾燥し、何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。1H-NMR (CDCl3, 600MHz): δ 7.66 (1H, m), 7.61 (1H, m), 7.49 (1H, m), 7.32 (1H, m), 5.33 (2H, m), 4.06 (1H, m), 3.86 (2H, m), 3.24 (2H, m), 2.01 (1H, m), 1.75-1.4 (13H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ４１４．１、１．１１分（方法Ａ）。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート。
Figure 2016516035
トルエン（５０ｍＬ）中の（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート（４．１ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸アンモニウム（１５ｇ、１９４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を還流下加熱した（１１０℃）。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡＣとＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ（２回）および飽和溶液ＮａＨＣＯ３（２回）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させて、粗製の（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメートを茶色固体（４ｇ、９．７ｍｍｏｌ、９９％）として得た。この固体を高真空下で終夜乾燥し、何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３９４．２、０．９９分（方法Ａ）。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート。
Figure 2016516035
ＤＭＦ（６８ｍＬ）中の（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート（４ｇ、９．７ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（２．８ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、臭化ベンジル（１．４ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で１時間撹拌し、続いて、室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、水８０ｍＬを添加し、添加すると、固体が沈澱する。この固体を濾過し、ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（１／１）で洗浄して、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート（３．７ｇ、７．６ｍｍｏｌ、７３％）を得た。この固体を高真空下で終夜乾燥し、何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ 7.85 (1H, m), 7.36 (4H, m), 7.21 (2H, m), 7.05 (1H, m), 6.87 (1H, m), 5.30 (1H, m), 5.22 (1H, m), 5.13 (1 H, d, m), 4.69 (1H, m), 4.00 (1 H, m), 3.81 (1H, m), 3.30 (2H, m), 2.13 (1H, m), 1.80 (1H, m), 1.45 (9H, m), 1.30 (1H, m), 1.01 (1H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ４８４．３、１．３４分（方法Ａ）。
（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミン。
Figure 2016516035
ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）中の（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート（３．７ｇ、７．６ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、粗製物をＣＨ２Ｃｌ２中で希釈し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２と飽和溶液ＮａＨＣＯ３との間で分配した。有機層を分離し、飽和溶液ＮａＨＣＯ３（２回）および水（２回）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させて、粗製の（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミン（２．８ｇ、７．３ｍｍｏｌ、９５％）をＴＦＡ塩として得た。粗製物を高真空下で終夜乾燥し、何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３８４．２、０．８３分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２．９ｇ、１１．４ｍＬ）の溶液に、デス−マーチンペルヨージナン（６．５ｇ、１５．２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応が完了したら、粗生成物（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレートを溶液として、さらに処理することなく、次のステップで使用した。
ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）中の（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミン（２．９ｇ、７．６ｍｍｏｌ）、およびトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（８．１ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液に、先行するステップからのＣＨ２Ｃｌ２中の（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレートの溶液を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２中で希釈した後に、これを、ＣＨ２Ｃｌ２とＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を分離し、飽和溶液ＮａＨＣＯ３（２回）およびＨ２Ｏ（２回）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレートを、順相カラムクロマトグラフィーによる精製（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ、２．７ｇ、４．５ｍｍｏｌ、５９％）の後に得た。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６１９．３、１．２３分（方法Ａ）。
中間体をＮ−アシル化するための一般手順
ＣＨ２Ｃｌ２（０．１Ｍ）中のアミン（１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ｉＰｒ２ＥｔＮ（７ｍｍｏｌ）を、続いて、塩化アシル（６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、混合物をＣＨ２Ｃｌ２中で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２とＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を分離し、飽和溶液ＮａＨＣＯ３（２回）およびＨ２Ｏ（２回）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。所望のＣｂｚ−アミドのペイロードを、順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法ＡまたはＣ）による精製の後に得た。
選択されたリンカーの合成
リンカー１。
Figure 2016516035
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）（２−ヒドロキシエチル）カルバメート
Figure 2016516035
Liang, Qiren; De Brabander, Jef K., Tetrahedron, 2011, vol. 67, pp. 5046 − 5053において記載されているとおりに調製した。
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：トルエン１０ｍＬ中の−７８℃のＤＩＡＤ（０．２３７ｍＬ、１．２２１ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３２０ｍｇ、１．２２１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、新たに調製したＴＨＦ１０ｍＬ中のマレイミド（１１８ｍｇ、１．２２１ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）（２−ヒドロキシエチル）カルバメート（３００ｍｇ、０．９３９ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温に加温し、終夜撹拌し、ＤＣＭで希釈し、水で洗浄した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（シリカゲル２４ｇ、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡＣの勾配、２３２ｍｇ、０．５８２ｍｍｏｌ、６２％）の後に、黄色固体として得た。回転異性体の混合物が、室温で１Ｈ−ＮＭＲによって観察された。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.09および6.97 (2H, s), 3.68-3.63 (2H, m), 3.57-3.52 (2H, m), 3.20-3.14 (2H, m), 3.40-3.36 (2H, m), 1.31 (9H, s), 0.85 (9H, s), 0.02 (6H, s).ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ３９９．４、１．３９分。
１−（２−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＡＤＣ−１のためのリンカー１）
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート（２２０ｍｇ、０．５５２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ２０ｍＬに溶かし、ＴＦＡ（２．１２６ｍＬ、２７．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、アセトニトリルおよび水の混合物に再び溶かし、凍結乾燥して、所望の生成物（１８５ｍｇ、０．５５２ｍｍｏｌ、収率１００％）を黄色油状物としてトリフルオロ酢酸塩として得た。リンカー１をさらに精製せずに使用した。1H-NMR (CD3OD, 400MHz): 1H-NMR (CD3OD, 400MHz): δ 6.94 (2H, s), 3.92-3.87 (2H, m), 3.83-3.79 (2H, m), 3.32-3.28 (2H, m), 3.23-3.18 (2H, m).
リンカー２の合成
Figure 2016516035
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）プロパノエート
Figure 2016516035
Ａｅｂｉ， Ｊｏｈａｎｎｅｓ；Ｂｉｎｇｇｅｌｉ， Ａｌｆｒｅｄ；Ｇｒｅｅｎ， Ｌｕｋｅ；Ｈａｒｔｍａｎｎ， Ｇｕｉｄｏ；Ｍａｅｒｋｉ， Ｈａｎｓ Ｐ．；Ｍａｔｔｅｉ， Ｐａｔｒｉｚｉｏ；Ｒｉｃｋｌｉｎ， Ｆａｂｉｅｎｎｅ；Ｒｏｃｈｅ， Ｏｌｉｖｉｅｒ、特許：ＵＳ２０１０／１６２８２ Ａ１、２０１０；２３頁において記載されているとおりに得た。
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）プロパノエート
Figure 2016516035
Ｎ２下で、ｔｅｒｔ−ブチル３−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）プロパノエート（１３０４ｍｇ、６．８９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ２０ｍＬに溶かし、トリエチルアミン（０．９６０ｍＬ、６．８９ｍｍｏｌ）、続いて、Ｂｏｃ−無水物（１．６００ｍＬ、６．８９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチルとブラインとの間で分配した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（シリカゲル８０ｇ、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃの勾配、９８８ｍｇ、３．４１ｍｍｏｌ、５０％）の後に、無色油状物として得た。
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）プロパノエート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：−７８℃で撹拌されているトルエン１０ｍＬ中のＤＩＡＤ（０．８６３ｍＬ、４．４４ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１１６４ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、新たに調製されたＴＨＦ１０ｍＬ中のマレイミド（４３１ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）プロパノエート（９８８ｍｇ、３．４１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水で洗浄した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（シリカゲル８０ｇ、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃの勾配、９０３ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、４３％、ＬＣ−ＭＳによる純度６０％、ＵＶ）の後に、無色油状物として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ３６９．３、１．１１分。
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）プロパノエート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）プロパノエート（８７０ｍｇ、２．３６１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ５ｍＬに溶かし、反応混合物を−１０℃に冷却した。ＴＦＡ（５ｍＬ、６４．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を−１０℃で３時間撹拌し、次いで、真空中で濃縮し、アセトニトリルおよび水の混合物に再び溶かし、凍結乾燥して、所望の粗生成物１０８６ｍｇ（１．４２０ｍｍｏｌ、収率６０．１％、小さなバッチの精製によって決定されたとおり純度約５０％）を黄色油状物として得た。
粗製の化合物１００ｍｇを、逆相カラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋なリンカー２（トリフルオロ酢酸塩として）５０ｍｇを得た。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ 6.76 (2H, s), 3.96-3.91 (2H, m), 3.39-3.29 (4H, m), 2.79-2.73 (2H, m), 1.48 (9H, s).ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ２６９．６、０．４８分。
リンカー４の合成
Figure 2016516035
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
乾燥ＴＨＦ（５３ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（１．４０ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）の溶液に−７８℃で、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１．０４ｍｌ、５．３４ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下添加し、得られた混合物を５分間撹拌した。次いで、ｔｅｒｔ−ブチル３−（ヒドロキシメチル）アゼチジン−１−カルボキシレート（１．００ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）を反応物に５分かけて添加した。マレイミド（０．５１８ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）を添加したら、得られた溶液をさらに５分間撹拌した。反応混合物を室温に加温し、さらに１８時間撹拌した。反応物を濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率４４％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２６７．０；方法Ａ。
３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−イウム２，２，２−トリフルオロアセテート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（２３．５ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート（６２４ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（９．０３ｍｌ、１１７ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物を濃縮乾固して、所望の生成物を淡黄色固体として収率９９％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．２２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １６７．０；方法Ａ。
リンカー５の合成
Figure 2016516035
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−３−オキソプロピル）カルバメート
Figure 2016516035
ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸（５００ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１．５０ｇ、３．９３ｍｍｏｌ）の溶液にトリエチルアミン（１．３７ｍｌ、９．８４ｍｍｏｌ）を、続いて、１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（５００ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｍ ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機層を抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率２４％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．６５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３１２．１；方法Ａ。
３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−３−オキソプロパン−１−アミニウム２，２，２−トリフルオロアセテート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（２３．５ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート（６２４ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．８０ｍｌ、１０．４ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物を濃縮乾固して、所望の生成物を淡黄色固体として定量的収率で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．２４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２１２．１；方法Ａ。
２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル（４−ニトロフェニル）カルボネート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（８．９ｍｌ）中の１−（２−ヒドロキシエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（２５０ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍｌ、８．８６ｍｍｏｌ）およびビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（７０１ｍｇ、２．３０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応物を水およびＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色固体として収率８８％で得た；H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 8.34-8.32 (2H, m), 7.54-7.51 (2H, m), 7.09 (2H, s), 4.36-4.34 (2H, m), 3.81-3.79 (2H, m).
１−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン
Figure 2016516035
飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１５０ｍｌ）中の（２−アミノエトキシ）エタノール（２．９ｍｌ、２９．０ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、Ｎ−（メトキシカルボニル）マレイミド（４．５ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３０分間、次いで、室温でさらに３時間撹拌した。反応物をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を淡黄色油状物として収率５３％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．３５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １８６．０；方法Ｅ。
２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル（４−ニトロフェニル）カルボネート
Figure 2016516035
２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル（４−ニトロフェニル）カルボネートと類似の方法で、代わりに１−（２（２−ヒドロキシエトキシ）エチル−１Ｈ）−ピロール−２，５−ジオンを使用して、当該生成物を合成した；収率６３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．８０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９７．０；方法Ｅ。
スルホネート置換リンカーの合成
このリンカーを製造するための一般方法は、公開されている方法であるJ. Med. Chem. 2011, vol. 54, 3606-23をアレンジしたものであり；参照文献において使用されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドの代わりに、ペンタフルオロフェニルエステルを選択した。
Figure 2016516035
合成例１．（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７３３．３、１．３６分（方法Ａ）。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
（Ｃｂｚ脱保護のための一般方法）
Figure 2016516035
ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１１５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（３０．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびギ酸アンモニウム（１０８ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間５５℃で加熱した。完了したら、反応物を濾過して、Ｐｄ／Ｃを除去し、溶媒を減圧下で蒸発させて、粗製の（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテートを得た：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５９９．２、０．９２分。粗製物を、何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。
ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中の、Ｃｂｚ脱保護ステップからの（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテートの溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１９７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、粗製の混合物を濾過して、固体を除去し、所望の生成物（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミドを、逆相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｃ）によって精製して得た（６０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、６３％）。生成物をＴＦＡ塩として単離した。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.80 (1H, m), 7.75 (1H, m), 7.45-.7.25 (6H, m), 7.09 (1H, m), 5.71 (1H, m), 5.25 (2H, m), 5.11 (1H, m), 4.95 (1H, m), 4.05 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.35 (2H, m), 3.20 (1H, m), 2.90 (1H, m), 2.83 (1H, m), 2.73 (1H, m), 2.68 (1H, m), 2.22 (1H, m), 1.87 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.35 (1H, m), 1.25 (3H, m), 1.09 (1H, m), 0.67 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌ）：ＭＨ＋ ５５７．２、０．８４分（方法Ａ）。
ＢＯＣ保護のための一般方法
ＭｅＯＨ（０．１Ｍ）中の尿素ペイロード（１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ無水物（３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物を濾過して、固体を除去し、所望の生成物Ｂｏｃ−尿素を、順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法ＡまたはＢ）による精製の後に単離した。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６５７．３、１．３０分（方法Ａ）。
合成例２．（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−３−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
Ｃｂｚ脱保護のための一般手順。１８ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、４９％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.80 (1H, m), 7.75 (1H, m), 7.40 (2H, m), 7.32 (4H, m), 7.11 (1H, m), 5.27 (1H, m), 5.29 (1H, m), 5.14 (1H, m), 4.98 (1H, m), 3.82 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.65 (1H, m), 3.51 (1H, m), 3.40 (2H, m), 2.92 (1H, m), 2.84 (1H, m), 2.78 (1H, m), 2.59 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.01 (1H, m), 1.88 (1H, m), 1.65 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.30 (1H, m), 1.18 (1H, m), 0.89 (1H, m), 0.65 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５７２．２、０．７１分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ保護のための一般手順：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７７２．２、１．３６分（方法Ａ）。
合成例３．（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
７９２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、７６％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.70 (1H, m), 7.52 (1H, m), 7.30-7.10 (10H, m), 6.90 (1H, m), 5.78 (s, 1H), 5.37 (2H, bs), 5.34 (2H, m), 5.30 (1H, bs), 5.05 (1H, m), 4.92 (2H, bs), 4.25 (2H, bs), 3.87 (2H, m), 3.81 (1H, m), 3.71 (1H, m), 3.64 (2H, m), 3,43 (2H, m), 3.26 (1H, m), 2.61 (1H, m), 2.45 (1H, m), 2.01 (1H, m), 1.61-1.25 (4H, m), 1.12 (3H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７２０．３、１．２５分。（方法Ａ）。
合成例４．（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−１−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
２８７０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ、６０％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７４８．２、１．１９分（方法Ａ）。
合成例５．（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
６７０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、３９％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７３６．２、１．１６分。（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−ヒドロキシアゼチジン−１−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
５７２ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、６６％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７１８．２、１．２３分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
異性体Ａ：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７４６．２、１．２７分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７４６．２、１．２８分（方法Ａ）。
Ｃｂｚ脱保護：
ＭｅＯＨ（０．１Ｍ）中のＣｂｚ−尿素ペイロード（１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（含有率１０％、０．２ｍｍｏｌ）およびギ酸アンモニウム（１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を３０分間５５℃で加熱した。完了したら、反応物を濾過して、Ｐｄ／Ｃを除去し、所望の尿素を、逆相カラムクロマトグラフィーで単離した。（ＰｒｅｐＬＣ方法ＣまたはＤ）。
合成例６．１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−１−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）尿素
Figure 2016516035
1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.75 (2H, m), 7.40-7.25 (6H, m), 7.09 (1H, m), 5.90 (1H, bs), 5.36-5.30 (3H, m), 4.96 (1H, m), 4.71 (1H, m), 3.85 (2H, m), 3.79 (1H, m), 3.58 (2H, m), 3.29 (4H, m), 2.79 (2H, m), 2.57 (1H, bs), 2.17 (1H, bs), 1.72 (1H, m), 1.60 (1H, m), 1.38 (2H, m), 0. 95 (2H, m), 1.08 (3H, bs).１シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５８６．３、０．８６分。（方法Ａ）。
１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−１−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−３−（２−ヒドロキシエチル）尿素。
Figure 2016516035
１５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、１９％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ7.78-7.68 (2H, m), 7.44-7.36 (2H, m), 7.36-7.25 (4H, m), 7.15-7.04 (1H, m), 6.45-6.28 (1H, m), 5.45-5.21 (3H, m), 5.10-4.91 (1H, m), 4.71-4.57 (1H, m), 3.91-3.79 (1H, m), 3.67-3.52 (2H, m), 3.28-3.14 (4H, m), 3.09-2.91 (1H, m), 2.84-2.68 (1H, m), 2.24-2.12 (1H, m), 1.97-1.78 (1H, m), 1.59-1.49 (1H, m), 1.47-1.37 (1H, m), 1.36-1.27 (1H, m), 1.22-1.10 (1H, m), 0.79-0.60 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５７２．２、０．８３分（方法Ａ）。
合成例７．（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−１−カルボキサミド
Figure 2016516035
1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.73 (2H, bs), 7.38-7.25 (6H, m), 7.06 (1H, bs), 5.5 (2H, m), 4.95 (1H, m), 4.84 (2H, bs), 4.82 (1H, bs), 4.02 (2H, m), 3.81 (1H, m), 3.60 (1H, bs), 3.49 (2H, bs), 3.27 (1H, m), 3.13 (1H, bs), 2.93 (1H, m), 2.72 (1H, m), 2.39 (1H, bs), 2.28 (1H, m), 1.85 (1H, bs), 1.73 (1H, m), 1.58 (1H, m), 1.03 (1H, m), 0.97 (1H, m), 0.28 (1H, m), 5Hが溶媒ピークに隠れて行方不明.ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６１４．３、０．８２分。（方法Ａ）。
合成例８．１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−１−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）尿素
Figure 2016516035
1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.76 (2H, bs), 7.40-7.25 (6H, m), 7.09 (1H, bs), 6.36 (1H, bs), 5.40 (1H, bs), 5.30 (2H, m), 4.95 (1H, m), 4.79 (1H, bs), 4.60 (1H, bs), 3.84 (1H, m), 3.61 (1H, m), 3.56 (1H, m), 3.54 (1H, bs), 3.29 (1H, m), 3.25 (4H, m), 3.10 (1H, m), 2.94(1H, m), 2. 68 (1H, m), 2.56 (1H, m), 2.13 (1H, m), 1.80 (1H, m), 1.49 (1H, m), 1.42 (1H, m), 1.35 (1H, m), 1.18 (1H, m), 0.71 (1H, m).２シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６０２．３、０．７８分。（方法Ａ）。
Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−３−ヒドロキシアゼチジン−１−カルボキサミド。
Figure 2016516035
４５ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ、９２％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５８４．２、０．８４分（方法Ａ）。
Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキサミド。
Figure 2016516035
異性体Ａ：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６１２．３ ０．８８分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６１２．３ ０．８９分（方法Ａ）。
合成例９．（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Ｂｏｃ−尿素ペイロードを合成するための一般手順：
尿素カップリング：ＣＨ２Ｃｌ２（０．１Ｍ）中のホスゲン（トルエン中２０％、２ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（１Ｍ）中のアミン（１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、尿素のための所望のアミン（２０ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を６０℃で２時間、次いで、室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、粗製の溶媒を減圧下で蒸発させ、順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法ＡまたはＢ）による精製の後に、所望の生成物を得た。
Figure 2016516035
０．４９ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、６８％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６８６．３、１．２５分。（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（２−ヒドロキシエチル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
１．０５ｇ、１．６ｍｍｏｌ、８５％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７８２．２、０．９０分（方法Ａ）。
合成例１０．（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−１−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
８１７ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ、４７％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７１４．２、１．１８分。（方法Ａ）。
合成例１１．（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
３１７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、４９％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７０２．２、１．１６分。（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−ヒドロキシアゼチジン−１−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
２４０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、７３％。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６８４．２、１．２３分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
異性体Ａ：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７１２．３、１．２９分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｃｌ）：ＭＨ＋ ７１２．３、１．３０分（方法Ａ）。
合成例１２．（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｓ）−１−アジドプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＣＨ２Ｃｌ２（０．８ｍＬ）およびピリジン（２４μＬ、０．２９ｍｍｏｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ｐ−塩化トシル（４０．３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物を室温で撹拌した。反応が完了したら、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２中で希釈し、Ｈ２ＯとＣＨ２Ｃｌ２との間で分配した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させて、粗製の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−（トシルオキシ）プロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１０９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、７１％）を得た。粗製の混合物をさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：７０４．３（−１３５）。（方法Ａ）。
ＤＭＦ（０．６ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−（トシルオキシ）プロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１０９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化ナトリウムを添加し、反応混合物を７０℃で撹拌した。反応が完了したら、混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）中で希釈した。反応混合物をＨ２ＯとＥｔＯＡｃとの間で分配した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の生成物（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｓ）−１−アジドプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレートを、カラムクロマトグラフィーによる精製（ヘプタン中３０〜１００％ＥｔＯＡＣの勾配、４０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ、５２％）の後に得た。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.73 (1H, bs), 7.68 (1H, bs), 7.36-7.29 (6H, m), 7.09 (1H,bs), 6.29 (1H, bs), 5.34 (2H, m), 5.07 (1H, m), 3.97 (1H, m), 3.85 (1H, m), 3.70 (2H, m), 3.50 (1H, m), 3.37-3.20 (6H, m), 2.69 (1H, m), 2.58 (1H, m), 2.17 (1H, m), 1.96 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.30 (1H, m), 1.18 (9H, s), 1.12 (1H, m), 0.86 (2H, m).３シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７１１．４、１．４１分。（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｓ）−１−アミノプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＴＨＦ（２ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｓ）−１−アジドプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１００ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（１１１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（５１μＬ、２．８１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃で撹拌した。反応が完了したら、混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で希釈した。反応混合物をＥｔＯＡｃとＨ２Ｏとの間で分配した。有機層をＨ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の生成物（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｓ）−１−アミノプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレートを、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中の０〜１０％ＭｅＯＨの勾配、５１ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ、５０％）の後に単離した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６８５．４、１．０８分。（方法Ａ）。
３−（（Ｓ）−１−アミノプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−１−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）尿素
Figure 2016516035
アセトニトリル（１．２ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｓ）−１−アミノプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（４０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．６ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。反応が完了したら、粗製物を濾過して、固体を除去し、所望の生成物３−（（Ｓ）−１−アミノプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−１−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）尿素を、逆相カラムクロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中の５％〜３５％ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）の勾配、１９．１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、５３％）の後に単離した。ＴＦＡ塩を、ＰＬ−ＨＣＯ３ ＭＰ ＳＰＥカラムで中和して、遊離塩基を得た。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.75 (2H, bs), 7.40-7.28 (6H, m), 7.09 (1H, bs), 6.02 (1H, bs), 5.40-5.30 (3H, m), 4.95 (1H, m), 3.84 (1H, m), 3.74 (1H, m), 3.61 (2H, m), 3.34 (2H, m), 3.24 (2H, m), 2.95 (1H, m), 2.72 (1H, m), 2.66 (1H, m), 2.59 (1H, m), 2.55 (1H, m), 2.19 (1H, m), 1.82 (1H, m), 1.56 (1H, m), 1.42 (1H, m), 1.34 (1H, m), 1.119 (1H, m), 1.08 (3H, bs), 0.71 (1H, m).２シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５８５．３、０．７３分。（方法Ａ）。
合成例１３．
Figure 2016516035
（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３，３−ジメチルペンタ−４−エン酸 ＷＯ２００５／５４１８６ Ａ２、２００５；４８〜４９頁において記載されているとおりに調製した。
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３，３−ジメチルペンタ−４−エノエート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：アセトン１５０ｍＬ中の２−クロロ−１−（２，５−ジフルオロフェニル）エタノン（１．９７４ｇ、１０．３６ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．０７４ｇ、７．７７ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３，３−ジメチルペンタ−４−エン酸（２．１ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）を、続いて、ＫＩ（０．３５８ｇ、２．１５８ｍｍｏｌ）を添加し、冷却浴を外し、反応混合物を室温で３．５時間撹拌した。
反応混合物を砕氷に注ぎ入れ、ＤＣＭで抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（シリカゲル８０ｇ、ヘプタン中０〜２０％ＥｔＯＡＣの勾配、２．９５ｇ、８６％）の後に、黄色固体として得た。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 7.72-7.57 (2H, m), 7.55-7.45 (1H, m), 6.94 (1H, d, 8.9Hz), 5.97 (1H, dd, 17.4, 10.7Hz), 5.40-5.25 (2H, m), 5.10-4.95 (2H, m), 4.11 (1H, d, 9.0Hz), 1.39 (9H, s), 1.13 (6H, s).ＬＣ／ＭＳ（方法Ｃ）：ＭＨ＋ ３９８．２、３．２５分。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）カルバメート
Figure 2016516035
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３，３−ジメチルペンタ−４−エノエート（２．９５ｇ、７．４２ｍｍｏｌ）を、トルエン４５ｍＬに溶かし、酢酸アンモニウム（１１．４４ｇ、１４８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を４０時間加熱還流した。
反応混合物を室温に冷却し、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。残渣を減圧下、４０℃で４２時間乾燥した。（２．６９ｇ、９３％、ＬＣ−ＭＳによる純度９７％、ＵＶ）を黄色泡として、さらに精製せずに次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ３７８．５、１．２２分。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）カルバメート
Figure 2016516035
ＤＭＦ２０ｍＬ中の（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）カルバメート（２．６９ｇ、６．９１ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、Ｋ２ＣＯ３（１．９１１ｇ、１３．８３ｍｍｏｌ）を、続いて、臭化ベンジル（０．９０４ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。
氷水を添加して、沈殿物を生じさせた。オフホワイト色固体を濾過によって収集し、ＤＭＦ／水（１／２）、水で洗浄し、減圧下で４８時間乾燥して、所望の生成物（２．９ｇ、９０％）を固体として得、さらに精製せずに、次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ４６８．２、１．５３分。
（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−アミン
Figure 2016516035
Ｎ２下で：（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）カルバメート（１０．７６８ｇ、２３．０３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ１８０ｍＬに溶かし、反応混合物を０℃に冷却し、次いで、ＴＦＡ（４４．４ｍｌ、５７６ｍｍｏｌ）を滴下添加した。反応混合物を０℃で５分間、次いで、室温で１時間撹拌した。残渣を減圧濃縮し、ＤＣＭで希釈し、ＮａＯＨ（２Ｍ）で塩基性にした。ＤＣＭ（３×）で抽出し、有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。所望の生成物（８．７ｇ、２３．６８ｍｍｏｌ、収率１００％、純度９７％）を、黄色がかった固体として得、何ら精製せずに、次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ３６８．３、０．９０分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ＣＨ２Ｃｌ２（１２０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（４．０７ｇ、１８．５５ｍｍｏｌ）の溶液に、デス−マーチンペルヨージナン（１３．１１ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応が完了したら、粗製の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレートを溶液として、さらに処理することなく、次のステップで使用した。
ＣＨ２Ｃｌ２（１２０ｍＬ）中の（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−アミン（５．６８ｇ、１５．４６ｍｍｏｌ）、トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１６．３８ｇ、７７ｍｍｏｌ）および分子ふるい（２０ｇ）の溶液に０℃で、先行するステップからのＣＨ２Ｃｌ２中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレートの溶液を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、ＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（３３０ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜４０％ＥｔＯＡｃ、３．１８６ｇ、５．６ｍｍｏｌ、３６％）の後に得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：ＭＨ＋ ５６９．３、６．６０分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（３．０３ｇ、５．３３ｍｍｏｌ）に０℃で、ＤＩＰＥＡ（４．６５ｍｌ、２６．６ｍｍｏｌ）を、続いて、（Ｓ）−２−アセトキシプロピオニルクロリド（１．３４９ｍｌ、１０．６６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を０℃で５分間撹拌し、次いで、室温まで加温し、２時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で、次いで、飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮し、ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（１２０ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜５０％ＥｔＯＡｃ、３．１４３ｇ、４．６ｍｍｏｌ、８６％）の後に、無色固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ６８３．３、１．５１分。
合成例１４．
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１．５ｇ、２．１９７ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、ＴＨＦ中のボランの溶液（４．３９ｍＬ、４．３９ｍｍｏｌ、１Ｍ）を滴下添加した。反応混合物を室温まで加温し、４時間撹拌した。これを０℃に冷却し、ＴＨＦ／ＥｔＯＨ １：１ ２５ｍＬで、続いて、リン酸緩衝液（ｐＨ７）４０ｍＬでクエンチし、最後に、Ｈ２Ｏ２（２．２４４ｍＬ、２１．９７ｍｍｏｌ、３０％水溶液）を添加し、反応混合物を室温で終夜撹拌した。ブラインを、反応混合物に添加し、これを、ＥＴＯＡｃで３回抽出した。有機層を冷飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ５、水、およびブラインで連続して３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（８０ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ、１．０７５ｇ、１．５１９ｍｍｏｌ、６９％）の後に、無色油状物として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ７０１．４、１．３３分。室温での１Ｈ−ＮＭＲによると回転異性体の混合物。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 7.85-7.65 (2H, m), 7.41-7.28 (6H, m), 7.15-7.05 (1H, m), 5.86および5.81 (1H, 一重線が2本、回転異性体), 5.40-5.17 (3H, m), 4.96 (1H, d, 15Hz), 4.22-4.14 (1H, m), 3.95-3.70 (2H, m), 3.27-3.20 (1H, m), 3.15-2.97 (1H, m), 2.63-2.55 (1H, m), 2.22-2.14 (1H, m), 2.11 (3H, s), 1.70-1.49 (5H, m), 1.35-1.20 (3H, m), 1.09 (9H, s), 0.95 (6H, s).
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１６時間）によって、逆相カラムクロマトグラフィーによる精製（１７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、収率８５％、ＴＦＡ塩として）の後に、標題化合物を調製した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５５９．３；Ｒｔ３．２５分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物、比が約3:1): δ 9.01 (1H, br s), 8.69 (1H, br s), 8.00および7.92 (1H, 2つの回転異性体に二重線2本、3.6および4.2Hz), 7.45-7.30 (7H, m), 7.17-7.07 (1H, m), 5.87および5.85 (1H, 2つの回転異性体に一重線2本), 5.50-5.00 (3H, m), 4.65-4.58 (1H, m), 4.30-3.90 (2H, m), 3.35-3.15 (6H, m), 2.42-2.32 (1H, m), 1.97-1.85 (2H, m), 1.55-1.40 (1H, m), 1.40-1.20 (4H, m), 1.02および0.90 (3H, 2つの回転異性体に一重線2本), 0.82および0.68 (3H, 2つの回転異性体に一重線2本).
合成例１５．
Figure 2016516035
ステップ１：（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸
Figure 2016516035
アセトン（体積：７ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２００ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、Ｊｏｎｅｓ試薬（２Ｍ、０．８５６ｍｌ、１．７１２ｍｍｏｌ）を滴下添加した。得られた黄色溶液を室温で２．５時間撹拌した。
過剰のＪｏｎｅｓ試薬を、イソプロパノール（２ｍｌ）で０℃で滴下でクエンチし、次いで、反応混合物を濃縮し、水で希釈し、酢酸エチル（×３）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、蒸発させて、標題化合物（１９８ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ、収率８９％、純度９２％）を得、これを、何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１５．３、Ｒｔ１．２７分。
ステップ２：（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタン酸
Figure 2016516035
メタノール（体積：４０ｍｌ）中の（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸（ステップ１）（９２８ｍｇ、１．０７８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮａＯＨ（１Ｍ、３．２３ｍｌ、３．２３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、蒸発させ、ＨＣｌ（１Ｍ）で酸性化し、ＥＡ（×３）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、濃縮して、所望の生成物（９８０ｍｇ、１．００５ｍｍｏｌ、収率９３％、純度６９％）を得、これを何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６７３．４、Ｒｔ１．２３分。
ステップ３：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−４−（メチルアミノ）−４−オキソブチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタン酸（ステップ２）（３８ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ中の２Ｍメチルアミンの溶液（０．１１３ｍｌ、０．２２６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（体積：２ｍｌ）に溶かし、ＤＩＰＥＡ（０．０４９ｍｌ、０．２８２ｍｍｏｌ）、続いて、ＨＡＴＵ（３２．２ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＥＡで希釈し、ブライン（×３）で洗浄した。合わせた有機層を乾燥し、濃縮して、所望の生成物３７ｍｇ（３７ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、収率４６．８％、純度４９％）を得、これを何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８６．３、Ｒｔ１．２２分。
ステップ４：（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−Ｎ，３，３−トリメチルブタンアミド
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−４−（メチルアミノ）−４−オキソブチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ３）（３７ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、純度４９％）をアセトニトリル（体積：２ｍｌ）に溶かし、ＴＦＡ（０．４１６ｍｌ、５．４０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。濃縮し、逆相クロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物（６．５ｍｇ、９．２９μｍｏｌ、ＴＦＡ塩として収率３５％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８６．７、Ｒｔ３．０３分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 比が約5:1の回転異性体の混合物、副回転異性体のいくつかのピークははっきり確認できない): δ 8.99 (1.2H, br s), 8.71 (1.2H, br s), 7.91-7.86 (0.2H, m), 7.84-7.81 (1H, m), 7.80-7.75 (1H, m), 7.69-7.65 (1H, m), 7.57 (0.2H, d, 3.6Hz), 7.45-7.29 (6.5H, m), 7.15-7.10 (1.4H, m), 6.22 (1H, s), 5.78 (0.2H, s), 5.59 (0.2H, d, 16.2Hz), 5.48 (0.2H, d, 16.2Hz), 5.34 (1H, d, 15.1Hz), 5.17 (1H, d, 15.1Hz), 5.10 (1H, d, 52.2Hz), 4.83-4.77 (0.2H, m), 4.57-4.51 (1H, m), 4.49-4.42 (0.2H, m), 4.06-4.01 (0.4H, m), 3.95-3.92 (2H, m), 3.35-3.24 (1.2H, m), 3.14-3.00 (1.2H, m), 2.56 (0.6H, d, 4.2Hz), 2.31-2.23 (1H, m), 2.19 (1H, d, 13.5Hz), 2.10-2.00 (0.4H, m), 2.00-1.92 (1H, m), 1.90 (1H, d, 13.5Hz), 1.72-1.58 (1H, m), 1.35 (3H, d, 6.0Hz), 1.15 (0.6H, s), 1.08 (0.6H, s), 1.05 (3H, s), 0.95 (3H, s), 0.77 (0.6H, d, 6.0Hz).１個のＣＨ３基は、ＤＭＳＯピークの下に隠されており、ＯＨは見られない。
合成例１６．
Figure 2016516035
ステップ１：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（２Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（１Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，４−ジヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
水（６ｍＬ）中の４−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（７３．６ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ）および四酸化オスミウム４％（０．０８２ｍＬ、１０．４７μｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴＨＦ（４ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１４３ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ５水溶液でクエンチし、これを室温で１時間撹拌し、次いで、ＤＣＭ（３回）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物１５７ｍｇ（１５７ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ、収率８１％、純度７７％）を得、これを何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１７．３；Ｒｔ１．２３／１．２８分。（２種のジアステレオ異性体）。
ステップ２：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−３−オキソプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（（（２Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（１Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，４−ジヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ１）（１２０ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（３５．６ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６ｍＬ）に溶かした。水（４ｍｌ）中のＮａＩＯ４（８３ｍｇ、０．３８７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌した。白色沈澱物を濾過によって除去し、次いで、濾液をＥＡで３回抽出した。有機層を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ５で、次いで、ブラインで連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。さらに精製せずに、所望の生成物１０５ｍｇ（１０５ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ、収率７０％、純度５９％）を得、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８５．４；Ｒｔ１．４２分。
ステップ３：（Ｒ）−３−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロパン酸
Figure 2016516035
Ｎ２下で：アセトン（１０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−３−オキソプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ２）（１０２ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、Ｊｏｎｅｓ試薬２Ｍ（０．３７２ｍＬ、０．７４５ｍｍｏｌ）を滴下添加した。得られた黄色溶液を室温で３時間撹拌した。過剰のＪｏｎｅｓ試薬をイソプロパノール（６ｍＬ）で０℃で滴下でクエンチし、次いで、反応混合物を濃縮し、水で希釈し、酢酸エチル（×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。
所望の生成物８１．５ｍｇ（８１．５ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ、収率５２％、純度６７％）を得、さらに精製せずに、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７０１．３；Ｒｔ１．２９分。
ステップ４：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−３−（メチルアミノ）−３−オキソプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＴＨＦ（０．６５６ｍｌ、１．３１３ｍｍｏｌ）中の（Ｒ）−３−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロパン酸（ステップ３）（４６ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）およびメチルアミン２ＭをＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かした。ＤＩＰＥＡ（０．０５７ｍＬ、０．３２８ｍｍｏｌ）を、続いて、ＨＡＴＵ（３７．４ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物４６．９ｍｇ（４６．９ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ、収率１００％）を得、これを何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１４．３；Ｒｔ１．２９分。
ステップ５：（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−３−（メチルアミノ）−３−オキソプロピル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−３−（メチルアミノ）−３−オキソプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ４）（４６．９ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍｌ）および水（１ｍｌ）に溶かした。ＴＦＡ（０．５０６ｍｌ、６．５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６０℃で４時間撹拌した。溶液をＥＡ中で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で、次いで、ブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。さらに精製せずに、所望の生成物４０．３ｍｇ（４０．３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ、収率１００％）を得、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６１４．３；Ｒｔ０．８９分。
ステップ６：（Ｒ）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−Ｎ，２，２−トリメチルプロパンアミド
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−３−（メチルアミノ）−３−オキソプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ５）（４０．３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍＬ）に溶かした。Ｋ２ＣＯ３（４５．４ｍｇ、０．３２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４０分間撹拌した。
混合物を濾過し、逆相クロマトグラフィーによる精製に掛けた。予測生成物８．９ｍｇ（８．９ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、収率１９％、純度９４％）をＴＦＡ塩として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５７２．２；Ｒｔ２．９２分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物、主回転異性体のピークは報告済み): δ 9.04 (1H, br s), 8.85 (1H, br s), 7.76-7.70 (3H, m), 7.45-7.31 (6H, m), 7.13-7.07 (1H, m), 6.42 (1H, s), 5.25-5.20 (2H, m), 5.14-5.09 (1H, m), 4.57-4.51 (1H, m), 3.92-3.85 (2H, m), 3.35-3.25 (1H, m), 3.20-3.05 (1H, m), 2.48 (3H, d, 4.5Hz), 2.33-2.25 (1H, m), 1.98-1.88 (1H, m), 1.82-1.68 (1H, m), 1.36-1.32 (6H, m), 1.06 (3H, s).
合成例１７．
Figure 2016516035
ステップ１：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＴＨＦ（１２ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−３−オキソプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２３２．６ｍｇ、０．３４０ｍｍｏｌ）の溶液に０℃でＮ２下で、ＮａＢＨ４（１９．２８ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ２ｍＬを添加して、透明な溶液を得た。反応混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を０℃で、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液１ｍＬでクエンチし、ＥＡで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。
さらに精製せずに、所望の生成物２３３ｍｇ（２３３ｍｇ、０．３４０ｍｍｏｌ、収率１００％、純度１００％）を得、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８７．３；Ｒｔ１．３７分
ステップ２：（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ１）（２６ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）に溶かした。ＴＦＡ（０．２９２ｍＬ、３．７９ｍｍｏｌ）を添加し、これを６０℃で１時間撹拌した。反応混合物をＥＡ中で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で、次いで、ブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。
さらに精製せずに、所望の生成物２２．２ｍｇ（２２．２ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ、収率１００％）を得、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８７．３；Ｒｔ０．９３分
ステップ３：（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
メタノール（２ｍＬ）中の（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（ステップ２）（２２．２ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２６．２ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。混合物を濾過し、逆相クロマトグラフィーによる精製に掛けた。予測生成物８．８ｍｇ（８．８ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、収率３５％、純度１００％）をＴＦＡ塩として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５４５．３；Ｒｔ３．２４分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物、主回転異性体のピークは報告済み): δ 9.09 (1H, br s), 8.87 (1H, br s), 7.80-7.87(1H, m), 7.70-7.76 (1H, m), 7.30-7.44 (6H, m), 7.1-7.15 (1H, m), 6.03 (1H, s), 5.35-5.08 (3H, m), 4.60-4.55 (1H, m), 4.05-3.85 (2H, m), 3.35-3.20 (2H, m), 3.12-3.04 (2H, m), 2.41-2.31 (1H, m), 2.01-1.79 (2H, m), 1.35 (3H, d, 6.2Hz), 0.90 (3H, s), 0.80 (3H, s).
合成例１８．
Figure 2016516035
ステップ１：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：乾燥ＤＣＭ（１２ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２００ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）の溶液に、デス−マーチンペルヨージナン（１６１ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３５分間撹拌した。溶液をＤＣＭ中で希釈し、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。
さらに精製せずに、所望の生成物１９９ｍｇ（１９９ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ、収率１００％）を得、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９９．５；Ｒｔ１．３９分
ステップ２：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（２Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（１Ｒ，Ｅ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルスルフィニル）イミノ）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２５０ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）、２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド（ステップ１）（２１７ｍｇ、１．７８９ｍｍｏｌ）、およびＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（４４７ｍｇ、１．７８９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中、５０℃で４２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、沈澱物をさらなるＤＣＭで洗浄した。濾液（＝生成物）を真空中で濃縮した。
さらに精製せずに、所望の生成物４９６ｍｇ（４９６ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ、収率９９％、純度５７％）を得、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８０２．５；Ｒｔ１．４８分。
ステップ３：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（２Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（１Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（１，１−ジメチルエチルスルフィンアミド）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（２Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（１Ｒ，Ｅ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルスルフィニル）イミノ）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ２）（４９６ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に溶かした。ＮａＢＨ４（６６．７ｍｇ、１．７６３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物の色が変わり（茶色）、泡立った。これを室温で４時間撹拌した。残渣をＥＡ中で希釈し、水で、次いで、ブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。
さらに精製せずに、所望の生成物３７９ｍｇ（３７９ｍｇ、０．４２０ｍｍｏｌ、収率１１９％（乾燥していない）、純度８９％）を得、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８０４．７；Ｒｔ１．４２分。
ステップ４：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−４−アミノ−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（２Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（１Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（１，１−ジメチルエチルスルフィンアミド）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ３）（１０６ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍＬ）に０℃で、Ｎ２下で溶かした。ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（０．０５９ｍＬ、０．２３５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間２０分撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３で０℃でクエンチした。溶液をＥＡ中で希釈し、水で、次いで、ブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。
さらに精製せずに、所望の生成物８２ｍｇ（８２ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ、収率６５％、純度６５％）を得、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７００．５；保持時間１．０４分。
ステップ５：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−４−アセトアミド−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブチル）−２−アセトキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−４−アミノ−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ４）（４４ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２１ｍＬ、０．１２３ｍｍｏｌ）。塩化アセチル（４．３５μｌ、０．０６１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間２０分撹拌した。反応混合物をＤＣＭ中で希釈し、水、飽和ＮａＨＣＯ３、およびブラインで連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。
さらに精製せずに、所望の生成物３０．３ｍｇ（３０．３ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、収率１００％）を得、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４２．５；Ｒｔ１．２５分。
ステップ６：（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−４−アセトアミド−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−４−アセトアミド−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブチル）−２−アセトキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ５）（３０．３ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍｌ）および水（１ｍｌ）に溶かした。ＴＦＡ（０．１５７ｍｌ、２．０４２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６０℃で１時間４０分撹拌した。
溶液をＥＡ中で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で、次いで、ブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。さらに精製せずに、所望の生成物３０．３ｍｇ（２６．２ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、収率１００％）を得、次のステップのために使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６４２．４；Ｒｔ０．８４分。
ステップ７：（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−４−アセトアミド−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
メタノール（２ｍＬ）中の（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−４−アセトアミド−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（ステップ６）（２６．２ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２８．２ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。溶液を濾過し、逆相クロマトグラフィーによる精製に掛けた。予測生成物７．７ｍｇ（７．７ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、収率２６％、純度１００％）をＴＦＡ塩として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６００．４；Ｒｔ３．０９分。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.06 (1H, br s), 8.78 (1H, br s), 7.93 (1H, d, 3.7Hz), 7.80-7.74 (1H, m), 7.60-7.55 (1H, m), 7.44-7.30 (6H, m), 7.17-7.09 (1H, m), 5.84 (1H, s), 5.40-5.06 (3H, m), 4.62-4.56 (1H, m), 4.05-3.90 (2H, m), 3.35-3.21 (2H, m), 2.90-2.80 (2H, m), 2.45-2.35 (1H, m), 2.00-1.85 (2H, m), 1.73 (3H, s), 1.38-1.41 (1H, m), 1.35 (3H, d, 6.2Hz),1.18-1.11 (2H, m), 0.93 (3H, s), 0.80 (3H, s)
合成例１９．
Figure 2016516035
ステップ１：（Ｒ）−２−（（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル）アミノ）−２−（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセトニトリル
Figure 2016516035
ＤＣＭ（体積：５０ｍｌ）中の４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−カルボアルデヒド（４．８ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。（Ｓ）−（＋）−フェニルグリシノール（５．６５ｇ、４１．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。トリメチルシリルシアニド（７．４９ｍｌ、５６．２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物をＮａＯＨ（２Ｍ）でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機物をＮａＯＨ（２Ｍ）で再び洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。ＴＨＦ（２０ｍＬ）に再び溶かし、ＨＣｌ（濃）１０ｍＬで酸性化した。次いで、ＮａＯＨ（２Ｍ）で塩基性にし、ＥＡで抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮し、Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。残渣を、ヘプタン／酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（１２０ｇ、シリカゲル）によって精製して、２種のジアステレオ異性体：無色油状物として所望のジアステレオ異性体４．１７ｇ（収率４１％）および不所望のジアステレオ異性体１．６９ｇ（収率１５％）を得た。
所望のジアステレオ異性体についての分析データ：
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ２７５．４、Ｒｔ０．８８分。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 7.40-7.25 (5H, m), 5.18 (1H, t, J=5.7Hz), 3.90-3.82 (1H, m), 3.60-3.33 (6H, m), 3.09 (1H, d, J=12.9Hz), 2.63 (1H, d, J=12.9), 1.68-1.36 (3H, m), 1.31-1.22 (1H, m), 1.10 (3H, s).
第２のジアステレオ異性体についての分析データ：
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ２７５．４、Ｒｔ０．８２分。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 7.42-7.21 (5H, m), 4.79 (1H, t, J=5.4Hz), 3.81-3.62 (4H, m), 3.55-3.42 (4H, m), 2.69 (1H, dd, J=9.5, 4.7Hz), 1.71-1.55 (2H, m), 1.48-1.36 (1H, m), 1.34-1.22 (1H, m), 1.09 (3H, s).
（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）酢酸
Figure 2016516035
ステップ２：（Ｒ）−２−（（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル）アミノ）−２−（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセトニトリル（ステップ１）（４．１７ｇ、１５．２０ｍｍｏｌ）を、濃ＨＣｌ（５７．７ｍｌ、６０８ｍｍｏｌ、３２％）およびＡｃＯＨ（２５ｍｌ、４３７ｍｍｏｌ）の混合物中で、３時間８５℃で加熱した。濃縮し、トルエン（２回）と共に同時蒸発させた。何ら精製せずに、次のステップで使用した。
ステップ３：残渣をＭｅＯＨ（体積：７０ｍＬ）に溶かし、反応混合物をＮ２でパージし、次いで、Ｐｄ−Ｃ（１．６０８ｇ、１．５１１ｍｍｏｌ、１０％）を添加し、水素を充填したバルーンを隔膜に取り付けた。反応混合物を水素でパージし、次いで、出発物質が消費されるまで、水素下、室温で３日間撹拌した。セライトで濾過し、ＭｅＯＨで溶離し、濃縮した。
ステップ４：残渣をＤＣＭ（体積：４０ｍＬ）に懸濁し、ジイソプロピルアミン（６．５０ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ）を、続いて、Ｂｏｃ２Ｏ（３．３１ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。濃縮し、ＮａＯＨ（０．２Ｍ）で希釈し、ＤＣＭで洗浄した。水層を、ＨＣｌ（４Ｍ）でｐＨ１まで酸性化し、生成物をＥＡで抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物（１．８９ｇ、６．５７ｍｍｏｌ、収率４４％）を得た。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 12.59 (1H, s), 6.92 (1H, d, J=9.2Hz), 3.98 (1H, d, J=9.2Hz), 3.69-3.55 (2H, m), 3.54-3.42 (2H, m), 1.70-1.45 (2H, m), 1.39 (9H, s), 1.36-1.21 (2H, m), 0.99 (3H, s).
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート
Figure 2016516035
スキーム１において記載した方法と同様の方法によって、（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）酢酸を（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）酢酸）に置き換えることによって、標題化合物を調製した；無色固体（６．９ｇ、１６．１４ｍｍｏｌ、収率８８％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ４２８．２、Ｒｔ１．１６分。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート
Figure 2016516035
スキーム１において記載した方法と同様の方法によって、（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテートを（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテートに置き換えることによって、標題化合物を調製した；黄色泡（６．５８ｇ、１６．１４ｍｍｏｌ、収率１００％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ４０８．２、Ｒｔ１．０６分。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート
Figure 2016516035
スキーム１において記載した方法と同様の方法によって、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメートを（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメートに置き換えることによって、標題化合物を調製した；黄色がかった固体（６．５８ｇ、１０．５８ｍｍｏｌ、収率７８％）。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ４９８．３、Ｒｔ１．４４分。
（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミン
Figure 2016516035
スキーム１において記載した方法と同様の方法によって、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメートを（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメートに置き換えることによって、標題化合物を調製した；黄色がかった固体（４．２３ｇ、１０．５８ｍｍｏｌ、収率９９％、ＴＦＡ塩として）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ３９８．２、Ｒｔ０．９０分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
スキーム１において記載した方法と同様の方法によって、（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミンを（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミンに置き換えることによって、標題化合物を調製した；無色油状物（３６０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、収率４４％）。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６３３．３、Ｒｔ６．０５分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
尿素化合物を合成するための一般手順において記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。
無色油状物（２０７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、収率４２％、純度８５％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７３４．３、Ｒｔ１．３２分。
１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−１−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）尿素
Figure 2016516035
Ｃｂｚ脱保護のための一般手順において記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。
ＴＦＡ塩を、ＰＬ−ＨＣＯ３カートリッジに通すことによって、遊離塩基に変換した。無色固体（８ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、収率１４％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６００．２、Ｒｔ３．７１分。1H-NMR (DMSO, 600MHz) (回転異性体の混合物): δ 7.87-7.80 (1H, m), 7.77-7.68 (1H, m), 7.43-7.26 (6H, m), 7.13-7.06 (1H, m), 6.13-6.05 (1H, m), 5.67-5.62 (1H, m), 5.37-5.22 (2H, m), 5.94-4.91 (1H, m), 4.66 (1H, br s), 3.95-3.75 (2H, m), 3.70-3.55 (2H, m), 3.46-3.38 (2H, m), 3.27-3.17 (2H, m), 2.97-2.81 (1H, m), 2.68-2.54 (1H, m), 2.08-2.02 (1H, m), 1.89-1.74 (1H, m), 1.56-1.44 (2H, m), 1.35-1.28 (2H, m), 1.17-0.98 (7H, m).一部のシグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。
合成例２０．
Figure 2016516035
ステップ１：（Ｓ）−４−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）モルホリン−２−カルボン酸
Figure 2016516035
（Ｓ）−モルホリン−２−カルボン酸塩酸塩［ＣＡＳ１５４７３１−８１−４］（１００ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２５１ｍｇ、２．９８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（３ｍｌ）に溶かし、ジオキサン（４ｍｌ）中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ［Ａｌｄｒｉｃｈ、８２９１１−６９−１］（３０２ｍｇ、０．８９５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。ＲＭを室温で３時間撹拌した。ＥｔＯＡｃとＮａＨＣＯ３（飽和）との間で分配した。水層をＥＡで洗浄し、次いで、ｐＨ３に酸性化し（１Ｍ ＨＣｌで）、で抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。所望の生成物２１０ｍｇを無色油状物として得た。
無色油状物（２１０ｍｇ、０．５８２ｍｍｏｌ、収率９８％、純度９８％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ３５４．１、［Ｍ＋ＮＨ４］＋ ３７１．１、Ｒｔ０．９３分。
ステップ２：（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル２−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）モルホリン−４−カルボキシレート
Figure 2016516035
（Ｓ）−４−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）モルホリン−２−カルボン酸（ステップ１）（２１０ｍｇ、０．５８２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶かし、次いで、ＤＭＦ（７．９５μｌ、０．１０３ｍｍｏｌ）を、続いて、塩化オキサリル（０．０８１ｍｌ、０．９２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮し、トルエンと共に２回同時蒸発させた。残渣をＤＣＭ１０ｍＬに溶かし、０℃に冷却し、ピリジン（０．３３２ｍｌ、４．１０ｍｍｏｌ）を、続いて、ＤＭＡＰ（２．５０７ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を添加した。（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１２０ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）を最後に、ＤＣＭ５ｍＬ中の溶液として滴下添加した。ＲＭを０℃で１５分間、次いで、室温で２時間撹拌した。ＮａＨＣＯ３（飽和）で希釈し、ＤＣＭで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。残渣を、ヘプタン／酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（４０ｇ、シリカゲル）によって精製して、所望の生成物１３５ｍｇを無色油状物として得た。
無色油状物（１３５ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ、収率６９％、純度９７％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９２０．４ Ｒｔ１．５３分。
ステップ３：（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）モルホリン−２−カルボキサミド
Figure 2016516035
Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中でピペリジンと反応させることによって除去した。
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１６時間）によって、逆相カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、標題化合物を調製した（２３ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、収率６５％、複ＴＦＡ塩として）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５９８．２、Ｒｔ２．２３分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物, 120℃): δ 7.83-7.77 (1H, m), 7.68 (1H, br s), 7.45-7.35 (3H, m), 7.30-7.22 (3H, m), 7.12-7.05 (1H, m), 5.42-5.13 (4H, m), 4.71 (1H, br s), 4.05-3.92 (2H, m), 3.90-3.80 (2H, m), 3.73-3.64 (2H, m), 3.50-3.15 (9H, m), 2.72-2.61 (2H, m), 2.30-2.10 (1H, m), 1.50-1.20 (3H, m), 0.97-0.80 (1H, m).
Figure 2016516035
ステップ１：（Ｒ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル２−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）モルホリン−４−カルボキシレート
Figure 2016516035
（Ｓ）−ジアステレオ異性体について記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。ヘプタン／酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（４０ｇ、シリカゲル）によって精製して、所望の生成物１０４ｍｇを無色油状物として得た。
無色油状物（１３５ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ、収率３４％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９２０．３ Ｒｔ１．５４分。
（Ｓ）−ジアステレオ異性体も得た：無色油状物（１９０ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ、収率６２％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９２０．３ Ｒｔ１．５６分。
ステップ２：（Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）モルホリン−２−カルボキサミド
Figure 2016516035
Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中でピペリジンと反応させることによって除去した。
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１６時間）によって、逆相カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、標題化合物を調製した（１５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、収率９８％、複ＴＦＡ塩として）。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５９８．２、Ｒｔ２．５５分。
合成例２１．４−ヒドロキシ−ＴＨＰ−中心骨格の合成
Figure 2016516035
４−（（２Ｒ，５Ｓ）−５−イソプロピル−３，６−ジメトキシ−２，５−ジヒドロピラジン−２−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−オール。
Figure 2016516035
ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の（Ｓ）−２−イソプロピル−３，６−ジメトキシ−２，５−ジヒドロピラジン（５．４ｍＬ、３０ｍｍｏｌ、１当量）の予め冷却した（−７８℃）溶液上に、ｎＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍ、３１．５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。反応混合物を−７８℃で１時間撹拌した。１時間後に、ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４（３Ｈ）−オン（３ｇ、３０ｍｍｏｌ、１当量）を、ＴＨＦ中の溶液（４０ｍＬ）として添加した。反応混合物を−２０℃で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物を、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＡｃＯＨ（１．８ｍＬ、３１．５ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液でクエンチし、室温に加温した。反応混合物をＥｔ２ＯとＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を、順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）によって精製して、所望の生成物（７．３ｇ、２５．７ｍｍｏｌ、８６％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２８５．２、０．９６分（方法Ａ）。
（Ｒ）−メチル２−アミノ−２−（４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート。
Figure 2016516035
ＴＨＦ（１０７ｍＬ）中の４−（（２Ｒ，５Ｓ）−５−イソプロピル−３，６−ジメトキシ−２，５−ジヒドロピラジン−２−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−オール（４．３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液上に、ＨＣｌ（０．２Ｎｍ １５１ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物をｐＨ＝８まで、ＮａＯＨ（１．０Ｍ）でクエンチし、溶液として次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋１９０．１、０．１７分（方法Ｄ、Ｐｏｌａｒ法）。
（Ｒ）−メチル２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート。
Figure 2016516035
先行するステップからの溶液（６．６２ｇ、１４ｍｍｏｌ、１当量）上に、ＮａＨＣＯ３（４．１ｇ、４９ｍｍｏｌ、３．５当量）およびＣｂｚ−Ｃｌ（５ｍＬ、３５ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）とＨ２Ｏ（１００ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製して、所望の生成物（５．４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ、６０％を得た）。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３２４．２、０．７８分。
（Ｒ）−メチル２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート。
Figure 2016516035
ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の（Ｒ）−メチル２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート（２．３ｇ、６．４ｍｍｏｌ、１当量）の氷冷溶液上に、２，６−ルチジン（５ｍＬ、４２．９ｍｍｏｌ、６．７当量）およびＴＢＳＯＴｆ（５ｍＬ、２１．８、３．４当量）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製して、所望の生成物（２．１ｇ、４．６ｍｍｏｌ、７３％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ４３８．２、１．４２分（方法Ａ）。
（Ｒ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）酢酸。
Figure 2016516035
ＴＨＦ中の（Ｒ）−メチル２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート（２．１ｇ、４．９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液上に、ＫＯＨ（１．０Ｍ、１４．７ｍＬ、１４．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。反応が完了したら（ｕｐｌｃ、方法Ａ）、反応混合物をｐＨ＝４まで、ＨＣｌ（１．０Ｍ）でクエンチした。反応物をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）とＨ２Ｏ（６０ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させて、所望の生成物（２．２ｇ、４．８ｍｍｏｌ、９９％）を得た。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋４２４．３、１．２５分（方法Ａ）。
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセテート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５７８．３、１．４９分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ベンジル（（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５５８．３、１．４８分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ベンジル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６４８．６．３、１．６４分（方法Ａ）。
（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミン。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、一般Ｃｂｚ脱保護について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５１４．６、１．４０分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７１５．６、１．６５分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８１７．５、１．５９分（方法Ａ）。
合成例２２．シクロプロパノール−中心骨格の合成
Figure 2016516035
（Ｒ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（１−ヒドロキシシクロプロピル）酢酸から出発して、記載されたプロトコール：Esposito, A.; Paolo-Piras, P.; Ramazzotti, D.; Taddei, M. Org. Lett. 2001, 3, 3273-3275に従って調製した。
（Ｒ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）酢酸。
Figure 2016516035
ＤＭＦ（２３ｍＬ）中の（Ｒ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（１−ヒドロキシシクロプロピル）酢酸（３ｇ、１１．３ｍｍｏｌ、１当量）およびイミダゾール（２．３ｇ、３４ｍｍｏｌ、３当量）の溶液上に、ＴＢＳＣｌ（４．３ｇ、２８．３ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）とＨＣｌ（１．０Ｍ、１００ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させて、黄色油状物を得た。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３８０．３、１．２５分（方法Ａ）。
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）アセテート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５３４．４、１．５１分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ベンジル（（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５１４．８、１．４７分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ベンジル（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）メチル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６０４．１、１．６４分（方法Ａ）。
（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）メタンアミン。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、一般Ｃｂｚ脱保護について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ４７０．３、１．２６分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）メチル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７０６．４、１．６２分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（１−（（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８０７．６、１．６０分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロプロピル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した保護基交換（Ｃｂｚ脱保護、Ｂｏｃ保護）のための手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）によって精製した。
Ｃｂｚ脱保護：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ６７２．４、１．２５分（方法Ａ）。
Ｂｏｃ保護：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ７７２．７。１．６１分（方法Ａ）。
合成例２３．２−メトキシプロピル−中心骨格の合成
Figure 2016516035
（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−メチルブタン酸。
Figure 2016516035
ＴＨＦ中のＮａＨ（６０％鉱油、２．５ｇ、６４．ｍｍｏｌ、３当量）および（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸（５ｇ、２１．４ｍｍｏｌ、１当量）の氷冷溶液に、ＭｅＩ（１．６ｍＬ、２５．７ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応物をｐＨ＝３まで、ＨＣｌ（１．０Ｍ）でクエンチした。粗製の反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）とＨＣｌ（１．０Ｍ、１００ｍＬ）との間で分配し、２層を分離し、有機層をＨＣｌ（１．０Ｍ、３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させて、（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−メチルブタン酸を得た。粗製物を、何らさらに精製せずに、次のステップで使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ２４８．２、０．７９分（方法Ｄ、Ｐｏｌａｒ方法）。
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−メチルブタノエート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ４０２．２、１．２０分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３８２．３、１．０８分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ４７２．４、１．４４分（方法Ａ）。
（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロパン−１−アミン。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３７２．４、０．８８分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５７３．７、１．３８分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６７４．４、１．３４分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）アミノ）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中の（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロパン−１−アミン（０．７ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（８．１ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレートを添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２とＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を分離し、飽和溶液ＮａＨＣＯ３（２回）およびＨ２Ｏ（２回）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製して、（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）アミノ）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（２５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、４６％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６８５．９、１．７６分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ７９９．５、１．６９分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
ＴＨＦ（２ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（１０８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液上に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、０．１５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応物をＮＨ４Ｃｌ（飽和溶液）とＣＨ２Ｃｌ２との間で分配した。有機層を分離し、ＮａＣｌ（飽和溶液）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６８５．６、１．３４分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６４３．３、１．３０分（方法Ａ）。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）によって精製した。１７．６ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、７１％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 7.93-7.87 (1H, m), 7.80-7.71 (1H, m), 7.45-7.28 (6H, m), 7.15-7.06 (1H, m), 6.00-5.87 (1H, m), 5.46-5.31 (1H, m), 5.18-5.05 (1H, m), 4.93-4.77 (2H, m), 4.77-4.64 (1H, m), 3.69-3.53 (3H, m), 2.95-2.83 (3H, m), 2.75-2.63 (1H, m), 2.39-2.28 (1H, m), 2.26-2.07 (1H, m), 1.59-1.45 (1H, m), 1.44-1.34 (3H, m), 1.33-1.22 (3H, m), 1.21-1.12 (1H, m), 0.79-0.69 (3H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５４３．３、０．９１分（方法Ａ）。
合成例２４．２−ヒドロキシプロピル−中心骨格の合成
Figure 2016516035
（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシ−３−メチルブタノエート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３８８．３、１．０４分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ３６８．５、０．９６分（方法Ａ）。
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）カルバメート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ２＋ ４５９．５、１．３６分（方法Ａ）。
（Ｓ）−１−アミノ−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メチルプロパン−２−オール。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を何らさらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ２＋ ３５９．３、０．８０分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ５９３．３、１．２４分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−２−メチルプロピル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１．５ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、１当量）の氷冷溶液上に、２，６−ルチジン（０．７ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ、６当量）およびＴＢＳＯＴｆ（０．７ｍＬ、３．８ｍＬ、４当量）を添加した。反応物を０℃で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製して、所望の生成物（０．１３ｍｍｏｌ、１３０ｍｇ、１４％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７０７．３、１．７０分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（１−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−２−メチルプロピル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ８０８．４、１．６４分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−２−メチルプロピル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
この化合物を調製するためには、ＴＨＰシリーズの類似化合物について記載した保護基交換（Ｃｂｚ脱保護、Ｂｏｃ保護）のための手順に従う。粗製物を順相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）によって精製した。
Ｃｂｚ脱保護：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ６７４．４、１．３３分（方法Ａ）。
Ｂｏｃ保護：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ７７４．４。１．６６分（方法Ａ）。
Figure 2016516035
合成例２５．（３Ｓ，４Ｒ）−ベンジル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（５４ｍｌ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート（４．００ｇ、１６．１８ｍｍｏｌ）をイミダゾール（１．６５ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）で、続いて、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２．９３ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）で処理し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチし、有機層をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を淡黄色油状物として収率１０２％（未精製）で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．５６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３６２．２；方法Ａ。
（３Ｓ，４Ｓ）−ベンジル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−（（Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ｔｅｒｔ−ブタノール（４０ｍｌ）および水（２８ｍｌ）の混合物中の（３Ｓ，４Ｒ）−ベンジル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレート（４．９０ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、水（１０ｍｌ）中の過マンガン酸カリウム（１．６３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（０．３５２ｇ、８．８１ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、セライトで濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率６４％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３９６．１；方法Ａ。
（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−（（Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
メタノール（５５ｍｌ）中の（３Ｓ，４Ｓ）−ベンジル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−（（Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３．４１ｇ、８．６２ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で、炭素上の１０％パラジウム（０．９１７ｇ、０．８６２ｍｍｏｌ）を、続いて、ギ酸アンモニウム（６．５２ｇ、１０３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を５０℃で３０分間撹拌した。次いで、混合物を室温に冷却し、セライトで濾過し、メタノールで洗浄した。濾液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．６３ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。メタノールを蒸発によって除去し、次いで、反応混合物を酢酸エチルおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。次いで、有機層をブラインで洗浄し、有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％（ＤＣＭ中の１０％メタノール）で溶離するシリカクロマトグラフィーによる粗生成物の精製によって、標題化合物を淡黄色油状物として収率８５％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３６２．１；方法Ａ。
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
メタノール（４４ｍｌ）および水（１１ｍｌ）の混合物中の（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−（（Ｒ）−１，２−ジヒドロキシエチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２．９５ｇ、８．１６ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、過ヨウ素酸ナトリウム（２．０９ｇ、９．７９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で４５分間撹拌した。反応混合物を濾過し、メタノールを蒸発によって除去した。水（１５ｍｌ）を添加し、反応物をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、セライトで濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を淡黄色油状物として収率１００％で得た；1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 9.69 (1H, br s), 4.57-4.53 (1H, m), 3.71-3.49 (3H, m), 3.24-3.19 (1H, m), 3.01-2.95 (1H, m), 1.45 (9H, s), 0.88 (9H, s), 0.08 (6H, s).
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（１４ｍｌ）中のトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（５．７７ｇ、２７．２ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミン（２．０９ｇ、５．４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物に、ＤＣＭ（１４ｍｌ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−４−ホルミルピロリジン−１−カルボキシレート（２．６９ｇ、８．１６ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、混合物を水の添加でクエンチし、反応混合物をＮａ２Ｓ２Ｏ３の１Ｍ水溶液およびＤＣＭで抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液、次いで、ブラインで洗浄した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率９５％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９７．８；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
乾燥ＤＣＭ（２６ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（１．７９ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（０．６３ｍｌ、３．６０ｍｍｏｌ）を、続いて、（Ｓ）−１−クロロ−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（０．３６ｍｌ、２．８３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物を０℃で５分間撹拌し、次いで、室温に加温し、さらに１．５時間撹拌した。反応物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率８８％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１１．２；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＴＨＦ（１２ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（１．９２ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラブチルアンモニウムフルオリド（０．６１９ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率６６％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９６．９；方法Ａ。
Figure 2016516035
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、例２５と類似の方法で、（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−ヒドロキシ−４−ビニルピロリジン−１−カルボキシレートを代わりに使用して合成した；収率１０５％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９７．０；方法Ａ。
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
定量的収率；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１１．０；方法Ａ。
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率３２％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９６．９；方法Ｅ。
Figure 2016516035
合成例２６，
（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロパン−１−アミン
Figure 2016516035
ＷＯ２００８０８６１２２ Ａ２、２００８；５０〜５２頁において記載されているとおりに調製した。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）アミノ）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、実施例１と類似の方法で、（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロパン−１−アミンを使用して合成した；収率９３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．６６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６９．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率３９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．８６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７８３．６；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率４３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．９６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６９．４；方法Ｅ。
合成例２７．
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｒ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（７．２ｍＬ）中のホスゲン（トルエン中２０％、０．７６ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（７．２ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（０．５０ｇ、０．７１７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．３０ｍＬ、２．１５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温で４５分間撹拌した。Ｌ−アラニノール（１．２６ｍＬ、１６．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を４０℃で１６時間撹拌した。反応物を濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色固体として収率７６％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．５４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９７．９；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｒ）−１−アセトキシプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
乾燥ＤＣＭ（５．４ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｒ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（０．４３ｇ、０．５３９ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でピリジン（０．８７ｍｌ、１０．８ｍｍｏｌ）を、続いて、無水酢酸（１．０１ｍｌ、１０．８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応物を濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色固体として収率８９％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４０．０；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｒ）−１−アセトキシプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、実施例１と類似の方法で合成した；収率７６％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７２５．９；方法Ａ。
合成例２８．
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（１９ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（１．３２ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、塩化メタンスルホニル（０．７４ｍｌ、９．４７ｍｍｏｌ）を、続いて、トリエチルアミン（１．３ｍｌ、９．４７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で１．５時間撹拌した。反応物を濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色固体として収率４７％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．６７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７５．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＭｅＯＨ（９ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（６９３ｍｇ、０．８９４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１４８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物をブラインで希釈し、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、粗製の標題化合物を淡黄色固体として定量的収率で得、さらに精製せずに次のステップで使用した；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７３３．４；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（８．９ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（６５５ｍｇ、０．８９４ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｈ−イミダゾール（０．９１ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を、続いて、ｔｅｒｔ−ブチルクロロジメチルシラン（２０２ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１ｍｇ、ｃａｔ）を添加し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。追加のｔｅｒｔ−ブチルクロロジメチルシラン（２２９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を、続いて、１Ｈ−イミダゾール（０．５５ｍｇ、０．８０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに２日間撹拌した。反応物をブラインで希釈し、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物をオフホワイト色固体として収率３６％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．３２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４７．６；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−アセトキシ−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＭＦ（０．６ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（５２ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸カリウム（１２ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１１０℃で２時間撹拌した。反応物を室温に冷却し、水で希釈し、ＭＴＢＥで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、粗生成物を黄色固体として収率８８％で得、これをさらに精製せずに、次のステップで使用した；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．４１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１１．６；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＭｅＯＨ（０．５５ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−アセトキシ−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（４４ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（８ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２０分間撹拌した。反応物を濃縮乾固して、標題化合物を淡黄色固体として定量的収率で得、さらに精製せずに、次のステップで使用した；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．１７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６９．６；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（２．１ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（１６０ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で塩化メタンスルホニル（０．０８ｍｌ、１．０４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮乾固して、粗生成物の精製を、ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって行って、標題化合物を淡黄色固体として収率８５％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．２７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４７．６；方法Ｅ。
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−アジド−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＭＦ（１．８ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（１４９ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化ナトリウム（０．０１４ｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６５℃で１８時間撹拌した。反応物を水でクエンチし、ＴＢＭＥで抽出し、有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色固体として収率７２％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．５５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９４．６；方法Ｅ。
合成例２９．
Figure 2016516035
ベンジル３−（１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−メトキシ−２−オキソエチリデン）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（１２２ｍｌ）中のベンジル３−オキソアゼチジン−１−カルボキシレート（５．０ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）およびメチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（ジメトキシホスホリル）アセテート（７．２４ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）の溶液に、２，３，４，６，７，８，９，１０−オクタヒドロピリミド［１，２−ａ］アゼピン（４．４ｍｌ、２９．２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応物を濃縮乾固した。水を添加し、反応物を２Ｎ ＨＣｌ水溶液の添加で酸性にした。次いで、反応物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率８８％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．２４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３９９．１；方法Ｅ；
ベンジル３−（１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−メトキシ−２−オキソエチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＥｔＯＡｃ（４７ｍｌ）中のベンジル３−（１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−メトキシ−２−オキソエチリデン）アゼチジン−１−カルボキシレート（８．０ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン下で炭素上の１０％パラジウム（３．３９ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を添加した。雰囲気を水素に置き換え、得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応物をセライトで濾過し、次いで、濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ（４８ｍｌ）に溶かし、続いて、０℃でトリエチルアミン（５．９ｍｌ、４２．５ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸ベンジル（４．８ｍｌ、３１．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で７２時間撹拌した。反応物を２Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性化し、反応物をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色固体として収率３５％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．０３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３７９．４；方法Ａ。
２−（１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）アゼチジン−３−イル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸
Figure 2016516035
メタノール（３６ｍｌ）中のベンジル３−（１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−メトキシ−２−オキソエチル）アゼチジン−１−カルボキシレート（２．７１ｇ、７．１６ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、水（３６ｍｌ）中の炭酸カリウム（１．９８ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。メタノールを減圧下で除去し、溶液を、１０％ＨＣｌ水溶液の添加によって、約６のｐＨにした。次いで、反応物を濃縮乾固した。得られた固体をＤＣＭ２００ｍＬ中で室温で２時間撹拌し、次いで、この固体を濾過によって除去した。濾液をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を白色固体として収率８９％で得、これをさらに精製せずに、次のステップで使用した；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．９２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］− ３６３．２；方法Ａ。
ベンジル３−（１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエトキシ）−２−オキソエチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、実施例１３と類似の方法で、２−（１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）アゼチジン−３−イル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸を代わりに使用して合成した；収率９７％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ５４１．３；方法Ｅ。
ベンジル３−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率８１％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．８２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４９９．３；方法Ｅ。
ベンジル３−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率４２％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．７１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８９．４；方法Ｅ。
（Ｒ）−ベンジル３−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ベンジル３−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート（４．１２ｇ）のラセミ混合物を、ＢａｓｅｌにあるＳｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（連絡先：Ｄｒ．Ｅｒｉｃ Ｆｒａｎｃｏｔｔｅ、Ｔｅｌ．＋４１ ６１６９ ６２９７１）に送付した。所望の鏡像異性的に富化された（Ｒ）−ベンジル３−（アミノ（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート（１．５１ｇ、９９．３％ｅｅ）および不所望の（Ｓ）−ベンジル３−（アミノ（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート（１．５３ｇ、９８．０％ｅｅ）を回収率７４％で得た。絶対立体配置を、標題化合物のＸ線結晶学によって立証した。
（Ｒ）−ベンジル３−（アミノ（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
定量的収率；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．９３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４８９．３；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）アゼチジン−３−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率３４％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．２７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９０．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）アゼチジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率８７％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．０５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８０４．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−アゼチジン−３−イル（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
メタノール（１０．２ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）アゼチジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（８２０ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で、炭素上の１０％パラジウム（５４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を、続いて、ギ酸アンモニウム（７７２ｍｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応物をセライトで濾過し、濃縮乾固した。ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液を添加し、反応物をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ＤＣＭ中の０〜１００％ＭｅＯＨで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色固体として収率８３％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．９２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６７０．４；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−アゼチジン−３−イル（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
メタノール（２．８ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−アゼチジン−３−イル（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５７１ｍｇ、０．８５３ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、ＮａＢＨ４（２１３ｍｇ、５．６３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を０℃で７時間撹拌した。反応物を、０℃で飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を滴下添加してクエンチし、反応物をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。逆相クロマトグラフィー（ＭｅＣＮ中の５％ＴＦＡ／水中の５％ＴＦＡ）によって粗生成物を精製して、凍結乾燥の後に、標題化合物を淡黄色固体としてＴＦＡ塩として収率３５％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６２８．０；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−アセチルアゼチジン−３−イル）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−アゼチジン−３−イル（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレートの合成の副生成物として、当該生成物を得た；収率１９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．２７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６７０．３；方法Ｅ。
合成例３０．
Figure 2016516035
２−（１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）ピペリジン−４−イル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸
Figure 2016516035
ＷＯ０２０７６４５０ Ａ１、２００２；６６頁において記載されているとおりに調製した。
ベンジル４−（１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（２−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソエトキシ）−２−オキソエチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、実施例１３と類似の方法で、２−（１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）ピペリジン−４−イル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸を代わりに使用して合成した；収率９６％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］− ５４５．０；方法Ａ。
ベンジル４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率１０３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］− ５２５．１；方法Ａ。
ベンジル４−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率４５％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．４５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６１７．５；方法Ａ。
（Ｒ）−ベンジル４−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ベンジル４−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（６．００ｇ）のラセミ混合物を、ＢａｓｅｌにあるＳｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（連絡先：Ｄｒ．Ｅｒｉｃ Ｆｒａｎｃｏｔｔｅ、Ｔｅｌ．＋４１ ６１６９ ６２９７１）に送付した。所望の鏡像異性的に富化された（Ｒ）−ベンジル４−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（１．９１ｇ、＞９９．５％ｅｅ）および不所望の（Ｓ）−ベンジル４−（（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（２．２０ｇ、＞９９．５％ｅｅ）を回収率６９％で得た。絶対立体配置を、標題化合物のＸ線結晶学によって立証した。
（Ｒ）−ベンジル４−（アミノ（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
定量的収率；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．０１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５１７．３；方法Ｅ。
ベンジル４−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率７９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．３２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１８．４；方法Ｅ。
ベンジル４−（（Ｒ）−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率７６％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．１５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８３２．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（ピペリジン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率５６％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．９４分；ＭＳ ｍ／ｚ Ｍ＋Ｈ］＋ ６９８．４；方法Ｅ。
合成例３１．
Figure 2016516035
（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＷＯ０６０６６８９６、２００６；３８５〜３８８頁において記載されているとおりに調製した。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
乾燥ＤＣＭ（３８ｍｌ）中の（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（５．２３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）の溶液に、デス−マーチンペルヨージナン（１２．８４ｇ、３０．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。次いで、この溶液を、ＤＣＭ（３８ｍｌ）中の（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メタンアミン（５．８０ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１６．０ｇ、７６．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。次いで、混合物を、水の添加でクエンチし、反応混合物をＮａ２Ｓ２Ｏ３の１Ｍ水溶液およびＤＣＭで抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液で、次いで、ブラインで洗浄した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を黄色油状物として収率５１％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１１．４；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（５５ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３．９ｇ、５．４９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、ジイソプロピルエチルアミン（１．３４ｍｌ、７．６８ｍｍｏｌ）を、続いて、（Ｓ）−１−クロロ−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（０．８３ｍｌ、６．５８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温に加温し、１６時間撹拌した。反応物をＤＣＭで抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率７８％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．５４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８２５．６；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＴＨＦ（２１．５ｍｌ）中で、（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３．５５ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（１．６９ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で希釈し、反応物をＤＣＭで抽出し、有機層をブラインで洗浄した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率７９％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１１．４；方法Ｅ。
（３Ｓ，４Ｒ）−４−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸
Figure 2016516035
アセトン（２．１ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３００ｍｇ、０．４２２ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で、Ｈ２ＳＯ４水溶液中の２Ｍ三酸化クロム（１．３ｍｌ、３．９３ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。過剰のＪｏｎｅｓ試薬を、０℃でイソプロパノール（４ｍｌ）を滴下添加することでクエンチした。反応物を濃縮乾固した。水を添加し、反応物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を固体として収率８１％で得、これをさらに精製せずに、次のステップで使用した；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．６５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３１２．１；方法Ａ。
合成例３２．
Figure 2016516035
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）カルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＭＦ（１．５ｍｌ）中の２−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−イル）安息香酸（１５２ｍｇ、０．５２３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（２４８ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．２２ｍｌ、１．３１ｍｍｏｌ）、および（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−アミン（１６０ｍｇ、０．４３５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応物を濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物をジアステレオ異性体混合物として、無色固体として収率７７％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．９３および２．９６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６４１．３；方法Ｅ。
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）カルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、実施例１４と類似の方法で合成した；収率６７％（ジアステレオ異性体の混合物）；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５４および２．５８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６５９．３；方法Ｅ。
（４Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（２−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−イル）ベンズアミド）−３，３−ジメチルブタン酸
Figure 2016516035
収率２８％（ジアステレオ異性体の混合物）；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．６４および２．６５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６７３．１；方法Ｅ。
合成例３３．
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（メトキシカルボニル）フェノキシ）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＭＦ（１６．２ｍｌ）中の２−フルオロ安息香酸メチル（０．８３ｍｌ、６．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔ−ブチル３−ヒドロキシアゼチジン−１−カルボキシレート（１．１２４ｇ、６．４９ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（１０．６ｇ、３２．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を７５℃で１８時間撹拌した。反応物を水およびＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を無色油状物として収率１７％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．１０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ；方法Ｅ。
２−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アゼチジン−３−イル）オキシ）安息香酸
Figure 2016516035
メタノール（４．４ｍｌ）および水（０．９ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（メトキシカルボニル）フェノキシ）アゼチジン−１−カルボキシレート（３２５ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（１２７ｍｇ、５．２９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応物を１Ｍ ＨＣｌ水溶液およびＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を無色固体として収率９４％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３３０．０；方法Ｅ。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）カルバモイル）フェノキシ）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、実施例９と類似の方法で合成した；収率１０３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．９５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６４３．２；方法Ｅ。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）カルバモイル）フェノキシ）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率３０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６１．２；方法Ｅ。
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（２−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アゼチジン−３−イル）オキシ）ベンズアミド）−３，３−ジメチルブタン酸
Figure 2016516035
収率３２％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．６７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６７５．１；方法Ｅ。
合成例３４．
Figure 2016516035
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
当該生成物を、実施例４と類似の方法で合成した；収率７９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．１５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５６６．９；方法Ａ。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率９１％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６７．９；方法Ａ。
追加のペイロードの実施例：
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
メタノール（１．１ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（１５０ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（３６ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応物をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液およびＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を透明な油状物として定量的収率で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６５５．５；方法Ａ。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；収率６１％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．７８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５５５．５；方法Ａ。
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレートと類似のプロトコールを使用して、当該生成物を生成した；定量的収率；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．１９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６５５．０；方法Ａ。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；収率５４％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．７９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５５５．５；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレートと類似のプロトコールを使用して、当該生成物を生成した；定量的収率；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．８８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６２７．３；方法Ｅ。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；ＴＦＡ塩として収率６７％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．９４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５２７．２；方法Ｅ。1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 7.88-7.87 (1H, m), 7.81-7.76 (1H, m), 7.41-7.28 (7H, m), 7.12-7.06 (1H, m), 5.80 (1H, s), 5.59-5.58 (1H, m), 5.34-5.30 (1H, m), 5.05-4.95 (2H, m), 4.72-4.65 (1H, m), 3.93-3.87 (1H, m), 3.75-3.66 (2H, m), 3.08-3.03 (1H, m), 2.73-2.64 (1H, m), 2.18-2.14 (1H, m), 1.75-1.58 (1H, m), 1.30-1.28 (3H, m), 0.80 (9H, s).
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（ペンチルカルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
乾燥ＤＭＦ（０．０７ｍｌ）中の（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（４．６ｍｇ、０．００６６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．００１１ｍｌ、０．０６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（４．５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。ペンチルアミン（０．００３ｍｌ、０．０２７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１．５時間撹拌した。反応物を水およびＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を淡黄色固体として収率９９％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．１６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１０．５；方法Ｅ。
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イルペンチルカルバメート
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール１を使用して、当該生成物を脱保護した；収率４３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．９６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６８．５；方法Ｅ；1H-NMR (CDCl3, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.71 (2H, br), 7.72-7.67 (1H, m), 7.40-7.13 (7H, m), 7.04-6.92 (1H, m), 6.85-6.78 (1H, m), 5.67-5.64 (1H, m), 5.32-4.86 (3H, m), 4.65-4.38 (1H, m), 3.89-1.72 (15H, m), 1.51-1.07 (13H, m), 0.84-0.58 (3H, m).
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（ペンチルカルバモイル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（０．１８ｍｌ）中のペンチルアミン（０．０２３ｍｌ、０．１１９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（８８ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）を、続いて、ＤＭＦ（０．１８ｍｌ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−４−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸（８０ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応物を水およびＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を淡黄色固体として定量的収率で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．３５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９４．２；方法Ｅ。
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−Ｎ−ペンチルピロリジン−３−カルボキサミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール１を使用して、当該生成物を脱保護した；ＴＦＡ塩として収率４３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．９４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６５２．５；方法Ａ；1H-NMR (CDCl3, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 10.31 (1H, br), 8.78 (1H, br), 7.94-7.66 (1H, m), 7.51-7.42 (1H, m), 7.32-7.24 (2H, m), 7.17-7.15 (2H, m), 7.01-6.91 (2H, m), 6.84-6.80 (1H, m), 5.61-5.58 (1H, m), 5.20-5.16 (1H, m), 5.05-5.01 (1H, m), 4.67-4.49 (1H, m), 3.86-3.83 (1H, m), 3.63-2.54 (14H, m), 2.05-1.96 (1H, m), 1.44-1.36 (2H, m), 1.32-1.13 (10H, m), 0.83-0.80 (3H, m).
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
実施例１と類似の方法で、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレートを使用して、当該生成物を合成した；収率５９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．３６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８０．９；方法Ａ。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率８８％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６３９．４；方法Ｅ。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（Ｓ）−ピロリジン−３−イルメチル）プロパンアミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；５０当量；収率７０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５３８．８；方法Ａ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 7.87-7.82 (1H, m), 7.51-7.52 (1H, m), 7.40-7.23 (4H, m), 7.09-7.03 (2H, m), 6.92-6.86 (1H, m), 5.75-5.72 (1H, m), 5.36-5.32 (1H, m), 5.10-5.06 (1H, m), 4.57-4.52 (1H, m), 3.99-3.96 (1H, m), 3.80-3.76 (1H, m), 3.52-3.21 (4H, m), 2.97-2.91 (1H, m), 2.78-2.69 (2H, m), 2.55-2.50 (1H, m), 2.08-2.04 (1H, m), 1.67-1.60 (2H, m), 1.50-1.47 (1H, m), 1.42-1.28 (6H, m), 0.90-0.80 (1H, m).
１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）−１−（（Ｓ）−ピロリジン−３−イルメチル）尿素
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；５０当量ＴＦＡ；収率６０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８４．３；方法Ａ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 7.84-7.82 (1H, m), 7.47-7.46 (1H, m), 7.35-7.24 (5H, m), 7.05-6.99 (1H, m), 6.85-6.84 (1H, m), 5.92 (1H, s, br), 5.50-5.43 (2H, m), 5.10-5.03 (1H, m), 3.99-2.07 (17H, m), 1.64-0.75 (9H, m).
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−アセチルアゼチジン−３−イル）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；５０当量；収率４５％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．４５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５７０．１；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.07 (1H, s, br), 8.72 (1H, s, br), 7.83-7.66 (2H, m), 7.44-7.28 (5H, m), 7.15-7.10 (1H, m), 7.03-6.98 (1H, m), 6.23-5.65 (1H, m), 5.52-5.10 (3H, m), 4.54-4.44 (1H, m), 4.34-2.69 (11H, m), 2.44-2.11 (2H, m), 1.70-1.55 (3H, m), 1.30-0.98 (3H, m).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（メトキシカルボニル）アゼチジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＣＭ（０．２７ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−アゼチジン−３−イル（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロギ酸メチル（０．００４２ｍｌ、０．０５４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０１５ｍｌ、０．１０８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（０．３ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液およびＤＣＭで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を無色固体として収率１２４％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８６．２；方法Ｅ。
メチル３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；５０当量；収率４８％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８６．１；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.05 (1H, s, br), 8.65 (1H, s, br), 7.83-7.66 (2H, m), 7.43-7.29 (5H, m), 7.15-7.10 (1H, m), 7.00-6.98 (1H, m), 6.24-5.71 (1H, m), 5.51-5.09 (3H, m), 4.52-4.43 (1H, m), 4.22-2.76 (14H, m), 2.47-2.10 (2H, m), 1.29-0.97 (3H, m).
４−ニトロフェニル４−（（Ｒ）−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
乾燥ＤＭＦ（０．５７ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（ピペリジン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（８０ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．２０ｍｌ、１．１５ｍｍｏｌ）およびビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（７０ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応物を水およびＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、淡黄色固体として収率１３８％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．４４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８６３．０；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（ペンチルカルバモイル）ピペリジン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＭｅＯＨ（０．７ｍｌ）中の４−ニトロフェニル４−（（Ｒ）−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（１２０ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）およびペンチルアミン（０．０２４ｍｌ、０．２０９ｍｍｏｌ）の溶液をマイクロ波内で、１時間１００℃に加熱した。追加のペンチルアミン（０．０４８ｍｌ、０．４１７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を再び、マイクロ波内で、１時間１００℃に加熱した。このサイクルを、反応が完了するまで、さらに３回繰り返した。次いで、炭酸カリウム（２３ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１８時間撹拌した。次いで、反応物をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液およびＤＣＭで抽出し、次いで、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液で洗浄した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を黄色固体として、収率６０％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．７５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６９．６；方法Ｅ。
４−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−Ｎ−ペンチルピペリジン−１−カルボキサミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；５０当量；ＴＦＡ塩として収率５０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．８６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６９．４；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.11-9.02 (1H, m), 8.84 (1H, br), 7.86-7.68 (2H, m), 7.41-7.38 (2H, m), 7.35-7.31 (1H, m), 7.28-7.26 (1H, m), 7.15-7.07 (2H, m), 6.35-6.32 (1H, br), 5.62-5.02 (4H, m), 4.54-4.36 (1H, m), 4.01-3.18 (9H, m), 2.95-2.94 (2H, m), 2.69-2.02 (4H, m), 1.45-1.17 (11H, m), 0.94-0.84 (5H, m), 0.49-0.40 (1H, m).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−アセチルピペリジン−４−イル）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−アセチルアゼチジン−３−イル）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミドの形成と類似の反応によって、当該生成物を生成した；定量的収率；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４０．５；方法Ａ。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−アセチルピペリジン−４−イル）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール１を使用して、当該生成物を脱保護した；収率３７％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．４６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５９８．４；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 8.97-8.80 (1H, m), 8.63-8.53 (1H, m), 7.79-7.62 (2H, m), 7.34-6.99 (7H, m), 5.59-5.44 (1H, m), 5.33-4.95 (3H, m), 4.45-1.98 (14H, m), 1.88-1.79 (3H, m), 1.47-0.26 (7H, m).
エチル４−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（メトキシカルボニル）アゼチジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレートの形成と類似の反応によって、クロロギ酸エチルを代わりに使用して、当該生成物を生成した；定量的収率；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．９４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７０．５；方法Ｅ。
エチル４−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール１を使用して、当該生成物を脱保護した；収率２４％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６２８．５；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.04-8.96 (1H, m), 8.68-8.59 (1H, m), 7.87-7.70 (2H, m), 7.42-7.07 (7H, m), 5.64-5.52 (1H, m), 5.41-5.02 (3H, m), 4.53-4.35 (1H, m), 4.03-3.18 (11H, m), 2.86-2.57 (3H, m), 2.27-2.06 (1H, m), 1.51-1.37 (1H, m), 1.31-0.40 (9H, m).
４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−２−オン
Figure 2016516035
ＤＣＭ（８０ｍｌ）中の４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−オン（１．００ｇ、８．６９ｍｍｏｌ）の溶液に、イミダゾール（８８７ｍｇ、１３．０ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルクロロジメチルシラン（１．５７ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応物を濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、透明な油状物として収率１０１％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．９５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２３０．０；方法Ｅ。
１−（（ベンジルオキシ）メチル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−２−オン
Figure 2016516035
ＴＨＦ（２９ｍｌ）中の４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−２−オン（２．００ｇ、８．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（３８４ｍｇ、９．５９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。次いで、（（クロロメトキシ）メチル）ベンゼン（２．０５ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応物を、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、透明な油状物として収率１１％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．７９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３７２．２；方法Ｅ。
１−（（ベンジルオキシ）メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−オン
Figure 2016516035
ＴＨＦ（３．２ｍｌ）中の１−（（ベンジルオキシ）メチル）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ピロリジン−２−オン（３４０ｍｇ、９７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（２５４ｍｇ、０．９７３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応物をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、透明な油状物として収率９０％で得た；1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ 7.55-7.7.27 (5H, m), 4.89-4.85 (2H, s), 4.55-4.52 (2H, s), 3.65-3.53 (3H, m), 3.35-3.31 (1H, m), 2.56-2.48 (2H, m), 2.27-2.20 (1H, m).
４−（（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１−（（ベンジルオキシ）メチル）ピロリジン−２−オン
Figure 2016516035
実施例１と類似の方法で、１−（（ベンジルオキシ）メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−オンを使用して、当該生成物を合成して、当該生成物をジアステレオ異性体の混合物として得た；収率３６％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．８８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６０１．４；方法Ｅ。
（２Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（１−（（ベンジルオキシ）メチル）−５−オキソピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート
Figure 2016516035
実施例１と類似の方法で、当該生成物を合成した；収率３５％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１５．５；方法Ｅ。
（２Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（１−（（ベンジルオキシ）メチル）−５−オキソピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
メタノール（１．０ｍｌ）中の（２Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（１−（（ベンジルオキシ）メチル）−５−オキソピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（７２ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２１ｍｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。反応物をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、生成物を淡黄色固体として収率９５％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６７３．３；方法Ａ。
（２Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（５−オキソピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド
Figure 2016516035
ＤＣＭ（１．０ｍｌ）中の（２Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（１−（（ベンジルオキシ）メチル）−５−オキソピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド（６５ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ中の１．２５Ｍ ＨＣｌ溶液（１．２２ｍｌ、１．５３ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した。反応物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を収率１３％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．９７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５５３．４；方法Ａ；1H-NMR (CDCl3, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 7.76-7.70 (1H, m), 7.45-7.42 (1H, m), 7.29-7.24 (3H, m), 7.14-7.13 (2H, m), 7.00-6.92 (1H, m), 6.83-6.79 (1H, m), 5.66-5.63 (1H, m), 5.25-5.19 (1H, m), 5.01-4.95 (1H, m), 4.33-4.26 (1H, m), 3.90-3.87 (1H, m), 3.71-3.68 (1H, m), 3.54-3.08 (5H, m), 2.91-2.74 (1H, m), 2.68-2.59 (1H, m), 2.35-0.71 (8H, m).
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−４−オキソ−４−（ペンチルアミノ）ブチル）カルバモイル）フェノキシ）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＤＭＦ（０．４５ｍｌ）中の（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（２−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アゼチジン−３−イル）オキシ）ベンズアミド）−３，３−ジメチルブタン酸（３０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（２０．３ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．０４ｍｌ、０．２２２ｍｍｏｌ）、およびペンチルアミン（０．００６ｍｌ、０．０４９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。追加のＨＡＴＵ（８．５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．０２３ｍｌ、０．１３３ｍｍｏｌ）、およびペンチルアミン（０．００５ｍｌ、０．０４４ｍｍｏｌ）、ならびに反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。反応物をＮａ２ＣＯ３の２Ｍ水溶液およびＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を無色固体として収率１０９％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．７２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４４．３；方法Ｅ。
（Ｒ）−２−（アゼチジン−３−イルオキシ）−Ｎ−（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチル−４−オキソ−４−（ペンチルアミノ）ブチル）ベンズアミド
Figure 2016516035
脱保護のための一般プロトコール２を使用して、当該生成物を脱保護した；２０当量ＴＦＡ；収率８３％（ＴＦＡ塩）；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．９６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６４４．２；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 9.01-9.00 (1H, m), 8.94-8.85 (2H, m), 7.97-7.94 (1H, m), 7.78-7.74 (1H, m), 7.65-7.63 (1H, m), 7.59-7.58 (1H, m), 7.46-7.42 (1H, m), 7.38-7.24 (6H, m), 7.11-7.06 (2H, m), 6.82-6.80 (1H, m), 5.56-5.39 (3H, m), 5.18-5.12 (1H, m), 4.50-4.46 (1H, m), 4.40-4.36 (1H, m), 4.30-4.24 (1H, m), 4.18-4.12 (1H, m), 3.10-2.93 (2H, m), 2.77-2.74 (1H, m), 2.23-2.20 (1H, m), 1.38-1.31 (2H, m), 1.24-1.19 (4H, m), 1.09 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.83-0.79 (3H, m).
合成例３５．ベンジル基の改変
Figure 2016516035
（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−アミン、ＴＦＡ塩
ＤＣＭ１５０ｍＬ中の（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）カルバメート１１ｇおよびＴＦＡ９ｍＬの溶液を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、茶色／緑色油状物１８．８ｇを得た。この物質をそのまま、次のステップに送った（変換率１００％および純度４８．５％と想定）。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．７３分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２７８．２；方法Ａ。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
ステップ１：乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ）−ベンジル３−フルオロ−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（８．２８ｇ）の撹拌溶液をアルゴン雰囲気下に置き、溶液の温度を、周囲温度の水が入った水浴を使用することによって、一定に維持した（同様の反応で、温度制御が重要であることが見出されていた：反応混合物の温度が数度高いと、フルオロ基の除去がある程度生じる。同様に、反応をより低い温度（０℃〜１０℃）で行うと、酸化反応が十分に早くならない）。次いで、デス−マーチンペルヨージナン（１５．８５ｇ）を一度に添加し、反応混合物を（約）１８℃で２０分間撹拌し、次いで、そのまま、ステップ２に入れた。
ステップ２：ステップ１からの反応混合物を０．４５ｕｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターを介して、乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中の（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−アミン、ＴＦＡ塩（１８．８４ｇ）およびトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１９．８ｇ）の撹拌溶液へと濾過した。注意：この溶液を予め超音波処理して、トリアセトキシホウ水素化物の大きな塊をいずれも分散および可溶化した。撹拌をアルゴン雰囲気下で継続したが、その間、温度が２０℃を超えないことを保証した（水道水浴を使用することによって）。２時間後に、ＬＣ−ＭＳは、反応が、所望の生成物への３１％の変換率で事実上終了したことを示した。反応物を脱イオン水（１５０ｍＬ）の添加でクエンチし、得られたスラリーを室温で１時間激しく撹拌した。得られた無機固体をＮｏ．１濾紙で濾過し、濾液を、炭酸水素ナトリウムを少量ずつ添加することでゆっくり塩基性にしたが、その間、激しく撹拌もした。炭酸水素ナトリウムの添加が完了したら（さらなる泡立ちが観察されない）、その二相溶液を分液漏斗に移し、層を分離した。水層をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機物を飽和炭酸水素塩（１５０ｍｌ）、飽和ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、暗茶色油状物を得た。物質をそのまま次のとおりに精製した：
システム：Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ４順相精製システム
固定相：４０＋Ｍシリカカートリッジ
二成分溶媒系：極性溶媒：２０％ｖ／ｖメタノール／ジクロロメタン、非極性溶媒：ジクロロメタン
勾配：０％非極性／極性溶媒を２５分間維持し、次いで、３５分かけて４０％極性溶媒に傾斜させ、次いで、このレベルでさらに１５分間維持したが、この時までに、生成物はすでに、カラムから溶離していた。生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、暗茶色ガラス様油状物１２．６５ｇ、ＬＣＭＳによると純度約４７％を得た。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．１５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５１４．３；方法Ａ。
この物質を、次のステップにそのまま送った。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
無水ＤＭＦ（１００ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１２．６５ｇ）および３−（メトキシメトキシ）ベンジルメタンスルホネート（８．５７ｇ、Bioorg.Med.Chem. 2006、14、1771〜1784によって調製）の溶液に、室温で、アルゴン雰囲気下で、炭酸カリウム（８．０２ｇ）を添加した。水コンデンサーを取り付け、混合物を７５℃で３時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が完了したことを示した。反応混合物を室温に冷却し、脱イオン水（１２０ｍＬ）と酢酸エチル（１２０ｍｌ）との間で分配した。抽出の後に、水性相を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で再抽出した。次いで、合わせた有機物を飽和ブライン（１２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、暗茶色油状物を得た。粗収量：１９．８８ｇ。物質を、次のとおりにそのまま精製した：
システム：Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ４順相精製システム
固定相：４０＋Ｍシリカカートリッジ
二成分溶媒系：極性溶媒：酢酸エチル、非極性溶媒：ｎ−ヘプタン
段階的勾配：
１． ０％極性溶媒 → ５分間維持
２． ０％極性溶媒 → １５分かけて５％極性溶媒に傾斜
３． ５％極性溶媒 → １０分間維持
４． ５％極性溶媒 → １０分かけて７％極性溶媒に傾斜
５． ７％極性溶媒 → ２０分間維持
６． ７％極性溶媒 → １０分かけて１２％極性溶媒に傾斜
７． １２％極性溶媒 → ３分間維持
８． １２％極性溶媒 → １０分かけて２０％極性溶媒に傾斜
９． ２０％極性溶媒 → １０分間維持
１０． ２０％極性溶媒 → １０分かけて２５％極性溶媒に傾斜
１１． ２５％極性溶媒 → ３０分間維持。
所望の生成物は、７％極性溶媒と１２％極性溶媒との間で、カラムから溶離し始めた。生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、茶色油状物を得た。収量：７．７ｇ、ＬＣ−ＭＳによる純度６５％。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６４．５；方法Ａ。
この物質を、次のステップにそのまま送った。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレートと同様に調製した。
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝５．７３分；方法Ｂ。
この物質を、次のステップにそのまま送った。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（３．８５ｇ）の溶液を、氷浴で０℃に冷却した。この溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．９７８ｍＬ）および（Ｓ）−１−クロロ−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（０．９５６ｍＬ、Ｆｌｕｋａ）を添加すると、濁った煙が観察された。暗オレンジ色に着色した反応混合物を室温に加温し、撹拌を１時間継続したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が、所望の生成物への変換を完了したことを示した。揮発性物質を高真空下で除去し、粗製物質を、次のとおりにそのまま精製した：
システム：Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ４順相精製システム
固定相：４０＋Ｍシリカカートリッジ
二成分溶媒系：極性溶媒：酢酸エチル、非極性溶媒：ｎ−ヘプタン
段階的勾配：
１． ０％極性溶媒 → １０分間維持
２． ０％極性溶媒 → ２０分かけて４６％極性溶媒に傾斜
３． ４６％極性溶媒 → ３０分間維持。この段階までに、すべての所望の生成物がすでに、カラムから溶離した。ランをこの時点で停止した。
生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、茶色油状物を得た。
収量：２．５４５ｇ、ＬＣ−ＭＳによる純度９５％。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．４９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７７．５；方法Ａ。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）アミノ）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１．２ｇ）の溶液を、氷浴で０℃に冷却した。この溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．８２２ｍＬ）および（Ｓ）−１−クロロ−１−オキソプロパン−２−イルアセテート（０．３９７ｍＬ、Ｆｌｕｋａ）を添加すると、濁った煙が観察された。暗オレンジ色に着色した反応混合物を室温に加温し、撹拌を１時間継続したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が、所望の生成物への変換を完了したことを示した。次いで、反応混合物を脱イオン水（１００ｍＬ）とジクロロメタン（７０ｍｌ）との間で分配した。抽出の後に、水性相をジクロロメタン（７０ｍＬ）で再抽出した。次いで、合わせた有機物を飽和ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、暗オレンジ色に着色した油状物を得た。収量：１．４ｇ ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．４６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９６．５；方法Ａ。
この物質は、さらに精製する必要なしに、次のステップでそのまま使用するために適した純度のものであった。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２．５４５ｇ）の溶液を氷浴で０℃に冷却し、次いで、１．０ＭボランＴＨＦ錯体（１２．４５ｍＬ）を滴下添加して処理した。反応混合物を室温に加温し、撹拌を４時間継続した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、過剰のボランを、ＴＨＦ：ＥｔＯＨの１：１混合物（７０ｍＬ）、ｐＨ７．０リン酸塩緩衝液（９０ｍＬ）、および３０％過酸化水素溶液（４．４５ｍＬ）を順次添加することでクエンチした。反応混合物を室温で１６時間撹拌し続け、次いで、飽和ブライン（１５ｍｌ）を混合物に添加した。混合物を分液漏斗に移し、酢酸エチル（２×２００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機物を２０％ｗ／ｖＮａ２Ｓ２Ｏ５（３×８０ｍｌ）、飽和ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、薄茶色ワックス様固体を得た。
収量：２．５９１７ｇ、ＬＣ−ＭＳによる純度６１％。物質を、精製する必要なしに、次のステップに送った。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９５．６；方法Ａ。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルブタ−３−エン−１−イル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１．４ｇ）の溶液を、アルゴン雰囲気下に置き、氷浴で０℃に冷却した。次いで、これを、１．０ＭボランＴＨＦ錯体（６．２７ｍＬ）を滴下添加することで処理した。反応混合物を室温に加温し、撹拌を４時間継続した。次いで、混合物を０℃に冷却し、過剰のボランを、ＴＨＦ：ＥｔＯＨの１：１混合物（７０ｍＬ）、ｐＨ７．０リン酸緩衝液（９０ｍＬ）、および３０％過酸化水素溶液（２．２４ｍＬ）を連続して添加することでクエンチした。混合物を室温で１６時間撹拌し続け、次いで、飽和ブライン（１５ｍｌ）を混合物に添加した。混合物を分液漏斗に移し、酢酸エチル（２×２００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機物を２０％ｗ／ｖＮａ２Ｓ２Ｏ５（２×８０ｍｌ）、飽和ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、薄茶色ワックス様固体を得た。収量：１．４４５ｇ、ＬＣ−ＭＳによる純度７４％。物質を、精製する必要なしに、次のステップに送った。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１４．７；方法Ａ。
Figure 2016516035
（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート
アルゴンでパージしておいたメタノール（５０ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２．５９ｇ）の溶液に、ギ酸アンモニウム（２．５０８ｇ）および炭素上の５重量％パラジウム（４２３ｍｇ）を添加した。得られた黒色懸濁液を、アルゴン雰囲気下、５０℃で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が完了したことを示した。反応混合物をＮｏ．１濾紙で濾過し、パラジウム触媒濾過ケーキをメタノール（２×３０ｍｌ）およびジクロロメタン（３０ｍｌ）で洗浄した。次いで、濾液を次のステップにそのまま送った（６０％の純度で変換率１００％と想定した）。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６６１．８；方法Ａ。
Figure 2016516035
（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテート
アルゴンでパージしておいたメタノール（２０ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ベンジル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１．４４５ｇ）の溶液に、ギ酸アンモニウム（２．４８９ｇ）および炭素上の５重量％パラジウム（２８０ｍｇ）を添加した。得られた黒色懸濁液をアルゴン雰囲気下、５０℃で１．５時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が完了したことを示した。反応混合物をＮｏ．１フィルター濾紙で濾過し、パラジウム触媒濾過ケーキをメタノール（２×３０ｍｌ）およびジクロロメタン（３０ｍｌ）で洗浄した。次いで、濾液を次のステップにそのまま送った（６０％の純度で変換率１００％と想定した）。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
新たに調製した（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテートを含有する濾液に、追加のメタノール（５０ｍＬ）およびＢＯＣ Ａ無水物（０．８６４ｇ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、ピロリジンＢＯＣ保護が完了したことを示した。揮発性物質を真空中で濃縮し、残渣を酢酸エチル（１５０ｍＬ）と脱イオン水（１００ｍＬ）との間で分配した。混合物を分液漏斗に移し、抽出の後に、水性相を酢酸エチル（１００ｍｌ）で再抽出した。注意：抽出プロセスの間に、エマルジョンが形成した。これを、少量の飽和ブラインを分液漏斗に添加することによって溶かした。次いで、合わせた有機物を飽和ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、事実上透明で無色の油状物を得た。粗収量：２．６９５ｇ、２５４ｎｍでのＬＣ−ＭＳによる純度５６％。精製を、次のとおりに行った：
システム：Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ４順相精製システム
固定相：２５＋Ｍシリカカートリッジ
二成分溶媒システム：極性溶媒：酢酸エチル、非極性溶媒：ｎ−ヘプタン
段階的勾配：
１． ０％極性溶媒 → ５分間維持
２． ０％極性溶媒 → ３０分かけて８０％極性溶媒に傾斜
３． ８０％極性溶媒 → ２５分間維持
４． ８０％極性溶媒 → １０分かけて１００％極性溶媒に傾斜
５． １００％極性溶媒 → １５分間維持
生成物含有画分を合わせ、高真空下で濃縮して、白色泡を得た。収量：１．２５ｇ、２５４ｎｍでのＬＣ−ＭＳによる純度８７％。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．３０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６１．６；方法Ａ。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
新たに調製した（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアセテートを含有する濾液に、追加のメタノール（２０ｍＬ）およびＢＯＣ無水物（０．７６７ｇ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、ピロリジンＢＯＣ保護が完了したことを示した。揮発性物質を真空中で濃縮し、次のとおりにそのまま精製した：
システム：Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ４順相精製システム
固定相：２５＋Ｍシリカカートリッジ
二成分溶媒システム：極性溶媒：酢酸エチル、非極性溶媒：ｎ−ヘプタン
段階的勾配：
１． ０％極性溶媒 → ５分間維持
２． ０％極性溶媒 → ３０分かけて５０％極性溶媒に傾斜
３． ５０％極性溶媒 → １０分間維持
４． ５０％極性溶媒 → ２０分かけて８０％極性溶媒に傾斜
５． ８０％極性溶媒 → １０分間維持
生成物含有画分を合わせ、高真空下で濃縮して、ほぼ透明で無色のワックス様油状物を得た。収量：０．６７６ｇ、２５４ｎｍでのＬＣ−ＭＳによる純度９６％ ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７８０．５；方法Ａ。
Figure 2016516035
Figure 2016516035
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
アセトニトリル（１ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５０ｍｇ）の溶液に、６Ｍ ＨＣｌ（０．９９８ｍＬ）を添加し、ＲＭを６０℃で３時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が、所望物への完全な変換を完了したことを示した。混合物を０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、得られた透明な溶液を、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、オフホワイト色粉末を得た。収量：１２．９ｍｇ ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．７７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５７５．２；方法Ａ。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．８７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５７５．２；方法Ｂ。
Figure 2016516035
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
アセトニトリル（１ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５０ｍｇ）の溶液に、６Ｍ ＨＣｌ（１．０３ｍＬ）を添加し、混合物を６０℃で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が、所望の生成物への完全な変換を完了したことを示した。混合物を０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、得られた透明な溶液を逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。生成物含有画分を合わせ、終夜凍結乾燥して、オフホワイト色のふわふわした粉末を得た。収量：１９．４ｍｇ ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．７０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５９３．１；方法Ａ。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５９３．２；方法Ｂ。1H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.80-7.73 (m, 1H), 7.41-7.30 (m, 1H), 7.18-7.09 (m, 1H), 6.69-6.57 (m, 2H), 6.52 (dd, J=16.2, 10.3Hz, 1H), 5.80 (s, 1H), 5.39-5.21 (m, 2H), 4.97 (d, J=15.5Hz, 1H), 4.64-4.57 (m, 1H), 4.08-3.98 (m, 1H), 3.95-3.85 (m, 1H), 3.37-3.27 (m, 2H), 3.23 (dt, J=9.9, 5.0Hz, 2H), 2.48-2.36 (m, 1H), 2.08-1.95 (m, 1H), 1.94-1.86 (m, 1H), 1.51 (ddd, J=23.3, 13.9, 6.7Hz, 1H), 1.35 (t, J=7.0Hz, 3H), 1.30-1.22 (m, 1H), 0.93 (s, 3H), 0.84 (s, 3H).
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸
無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５２０ｍｇ）の冷却（０℃）溶液に、二クロム酸ピリジニウム（７８３ｍｇ）を添加した。添加が完了した後に、暗赤れんが色／くすんだオレンジ色に着色したＲＭを室温で終夜撹拌したが、この時までに、色は暗茶色に変わっていた。ＲＭを酢酸エチル（１５０ｍＬ）と脱イオン水（１００ｍＬ）との間で分配した。混合物を分液漏斗に移し、抽出の後に、水性相を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で再抽出した。次いで、合わせた有機物を、脱イオン水（１００ｍｌ）、飽和ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、茶色のワックス様油状物質を得た。粗収量：５６３．８ｍｇ ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７５．４；［Ｍ−Ｈ］− ７７３．４ 方法Ａ。
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸
無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（３００ｍｇ）の冷却（０℃）溶液に、二クロム酸ピリジニウム（９７４ｍｇ）を添加した。添加が完了した後に、暗赤れんが色／くすんだオレンジ色に着色したＲＭを室温で終夜撹拌したが、この時までに、色は暗茶色に変わっていた。ＲＭを酢酸エチル（１００ｍＬ）と脱イオン水（１００ｍＬ）との間で分配した。混合物を分液漏斗に移し、抽出の後に、水性相を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で再抽出した。次いで、合わせた有機物を脱イオン水（１００ｍｌ）、飽和ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、茶色ワックス様油状物質を得た。粗収量：３２２ｍｇ ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］− ７９１．２ 方法Ａ。
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−Ｎ，３，３−トリメチルブタンアミド
ステップ１：無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸（６０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（１８９μＬ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１２４ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で１０分間撹拌し、次いで、塩酸メチルアミン（７３ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で終夜撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が完了したことを示した。揮発性物質を高真空下で除去し、粗製の残渣をアセトニトリル：水の１：１混合物（４ｍｌ）に溶かした。ＲＭを０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、得られた透明な溶液を２×２ｍＬバッチに分割し、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。両方のランからの生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、淡青色固体を得た：収量：１５ｍｇ、これを、次のステップにそのまま入れた：
ステップ２：ＢＯＣおよびＭＯＭ脱保護：ステップ１からの粗生成物に、アセトニトリル（１ｍｌ）および６Ｍ ＨＣｌ（１．０８ｍＬ）を添加した。ＲＭを５０℃で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が脱保護を完了して、所望の最終生成物が得られたことを示した。ＲＭを０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、次いで、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。生成物含有画分を終夜凍結乾燥して、白色のふわふわした粉末を得た。収量：８．９ｍｇ
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６０３．３；方法Ｂ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）は、標的構造と一致した。
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−Ｎ，３，３−トリメチルブタンアミド
ステップ１：無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中の（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸（６０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（２６４μＬ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１７３ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で１０分間撹拌し、次いで、塩酸メチルアミン（１０２ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が完了したことを示した。ＲＭを高真空下で濃縮して、茶色のワックス様油状物を得た。これを、次のステップにそのまま送った。
ステップ２：ＢＯＣ、ＭＯＭ、およびアシル脱保護：ステップ１からの粗生成物をアセトニトリル（２ｍｌ）に溶かし、６Ｍ ＨＣｌ（１．５ｍＬ）を添加した。ＲＭを６０℃で２時間撹拌し、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が、最終生成物への脱保護を完了していたことを示した。次いで、ＲＭを、脱イオン水（５０ｍＬ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）との間で分配した。抽出の後に、水性相を酢酸エチル（７０ｍＬ）で再抽出した。次いで、合わせた有機物を、飽和ブライン（７０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、オフホワイト色固体を得た。ＲＭを水：アセトニトリルの２：１溶液（４ｍＬ）に溶かし、これを、０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過した。得られた溶液を２×２ｍＬバッチに分割し、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。生成物含有画分を合わせ、次いで、終夜凍結乾燥して、白色のふわふわした粉末を得た。収量：１８．９ｍｇ。
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６１８．３；方法Ｂ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）は標的構造と一致した。
ペイロード−リンカー組合せの合成
切断可能なリンカー：ＭＣ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ ＡＤＣ：
ＤＭＳＯ（０．１Ｍ）中のペイロード（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ｉＰｒ２ＥｔＮ（６当量）および４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（４−ニトロフェニル）カルボネート（０．０９ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、粗製物を濾過して、固体を除去し、そのまま逆相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法ＣまたはＤのいずれかを使用）によって精製して、所望のＭＣ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ペイロードをＴＦＡ塩として得た。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.98 (1H, m), 8.09 (1H, m), 7.80 (1H, m), 7.74 (1H, m), 7.71 (2H, m), 7.56 (2H, m), 7.37 (3H, m), .7.31 (4H, m), 7.09 (1H, m), 7.00 (2H, m), 6.01 (1H, m), 5.68 (1H, m), 5.28 (1H, m), 5.18 (1H, m), 5.15 (2H, m), 5.01 (1H, m), 4.88 (1H, m), 4.73 (1H, m) 4.50 (1H, m), 4.39 (1H, m), 4.21 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.50-3.25 (8H, m), 3.37 (2H, m), 3.03 (1H, m), 2.98 (1H, m), 2.82 (1H, m), 2.60 (1H, m), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.18 (1H, m), 2.14 (1H, m), 2.13 (1H, m), 2.12 (1H, m), 1.98 (1H, m), 1. 71 (1H, m), 1.50 (3H, m), 1.49-1.35 (3H, m), 1.27 (3H, m), 1.23 (1H, m), 1.10 (1H, m), 0.98 (1H, m), 0.86 (6H, m), 0.70 (1H, m).欠測ピークは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋：１１５５．５、１．０７分（方法Ａ）。
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.99 (1H, m), 8.09 (1H, m), 7.80 (1H, m), 7.71 (2H, m), 7.57 (3H, m), 7.35 (2H, m), 7.30 (4H, m), 7.23 (1H, m), 7.09 (1H, m), 7.00 (2H, s), 5.97 (2H, m), 5.35 (2H, m), 5.07 (2H, m), 4.89 (1H, m), 4.77 (1H, m), 4.42 (1H, m), 4.20 (1H, m), 3.84 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.64 (2H, m), 3.40-3.23 (8H, m), 3.03 (1H, m), 2.96 (2H, m), 2.81 (1H, m), 2.57 (1H, m), 2.25 (1H, m), 2.15 (2H, m), 2.00 (1H, m), 1.66 (2H, m), 1.52-1.25 (8H, m), 1.21 (2H, m), 1.07 (3H, m), 0.84 (6H, m), 0. 77 (1H, m).欠測ピークは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １１８４．５、１１８５．５（＋Ｈ）、１．０４分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−１−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート。
Figure 2016516035
1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.99 (1H, m), 8.08 (1H, m), 7.80 (1H, m), 7.71 (2H, m), 7.58 (2H, m), 7.36 (2H, m), 7.21 (2H, m), 7.20 (2H, m), 7.17 (2H, m), 7.09 (1H, m), 7.00 (2H, s), 6.01 (1H,m), 5.75 (1H, m), 5.37 (1H, m), 5.13 (1H, m), 4.89 (3H, m), 4.41 (1H, m), 4.21 (1H, m), 4.06 (1H, m), 3.98 (1H, m), 3. 82 (1H, m), 3. 41 (1H, m), 3.37 (2H, m), 3.32 (2H, m), 3.13 (2H, m), 3.05 (1H, m), 2.97 (2H, m), 2.38 (1H, m), 2.35-2.05 (3H, m), 1. 97 (2H, m), 1.70 (2H, m), 1.65 (2H, m), 1.60-1.40 (6H, m), 1.36 (2H, m), 1.19 (2H, m), 1.04 (1H, m), 1.01 (1H, m), 0.87 (6H, m), 0.46 (2H, m).欠測ピークは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １２１２．４、２．４８分。
４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）カルバメート。
Figure 2016516035
1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 10.03-9.92 (1H, m), 9.09-8.90 (1H, m), 8.66-8.47 (1H, m), 8.14-7.96 (1H, m), 7.84-7.70 (3H, m), 7.68-7.53 (2H, m), 7.47-7.36 (2H, m), 7.36-7.21 (7H, m), 7.17-7.06 (1H, m), 7.06-6.94 (2H, m), 6.34-6.11 (1H, m), 6.10-5.90 (1H, m), 5.41-5.09 (4H, m), 5.05-4.89 (2H, m), 4.46-4.31 (1H, m), 4.31-4.14 (1H, m), 3.91-3.79 (3H, m), 3.79-3.69 (1H, m), 3.65-3.53 (1H, m), 3.52-3.27 (6H, m), 3.26-3.16 (1H, m), 3.16-3.07 (2H, m), 3.07-2.99 (1H, m), 2.99-2.89 (1H, m), 2.63-2.47 (2H, m), 2.45-2.29 (1H, m), 2.27-2.04 (2H, m), 2.03-1.86 (2H, m), 1.77-1.65 (1H, m), 1.65-1.55 (1H, m), 1.55-1.31 (7H, m), 1.30-1.14 (4H, m), 1.11-0.96 (3H, m), 0.91-0.78 (6H, m), 0.75-0.61 (1H, m).欠測ピークは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １１８３．６。０．９４分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率１０％。ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．０１分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １１５３．４；方法Ａ。
（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率１４％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．０９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １１３７．４；方法Ａ。
安定なリンカー：
ａ）カルバメート結合
Figure 2016516035
ＤＭＦ（０．１Ｍ）中のＢｏｃ−ペイロード（０．０９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ｉＰｒ２ＥｔＮ（０．９ｍｍｏｌ、１０当量）を、続いて、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（０．１４ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加し、室温で１時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、リンカー（３当量）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、溶媒を減圧下で蒸発させ、所望の生成物（Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐ）を、順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）による精製の後に得た。
ｂ）アミド結合
Figure 2016516035
ＤＭＦ（０．３Ｍ）中のカルボン酸リンカー（０．２３ｍｍｏｌ、１．８当量）、ＨＡＴＵ（０．２７ｍｍｏｌ、２．１当量）の溶液に、ｉＰｒ２ＥｔＮ（１．４ｍｍｏｌ、１１当量）を添加し、続いて、Ｂｏｃ−ペイロード（０．１３ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物をＥｔＯＡｃ中で希釈し、ＥｔＯＡｃとＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ（２回）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）による精製の後に、所望の生成物を得た。
ｃ）クリック化学
Figure 2016516035
ＴＨＦ（０．１Ｍ）中のアジド−Ｂｏｃ−ペイロード（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）および１−（プロパ−２−イン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（０．０７８ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液に、Ｈ２Ｏ（１Ｍ）中のＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏおよびアスコルビン酸ナトリウムの溶液を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、反応混合物をＥｔＯＡｃ中で希釈し、ＥｔＯＡｃとＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の生成物を順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）によって単離した。
ｄ）スルホＧＭＢＳカップリング
Figure 2016516035
ＣＨ２Ｃｌ２（０．１Ｍ）中のＢｏｃ−ペイロード（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液上に、ｉＰｒ２ＥｔＮＨ（０．３０ｍｍｏｌ、６当量）および１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４−オキソ−４−（ペルフルオロフェノキシ）ブタン−２−スルホン酸（０．１５ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。反応物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、溶媒を減圧下で蒸発させた。所望の生成物を、順相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ｂ）によってジアステレオ異性体の混合物として単離した。
リンカー結合のための一般プロトコール１
Figure 2016516035
乾燥ＤＭＦ（０．１Ｍ）中のＢｏｃ−ペイロード（１当量）の溶液に、ｉＰｒ２ＥｔＮ（１０当量）を、続いて、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（２．２当量）を添加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）によって完了したら、リンカー（４当量）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。反応物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を得た。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率８０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８６３．１；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
一般プロトコール１を使用して、ただし、１．５当量のビス（４−ニトロフェニル）カルボネート、アミンとして１．５当量の２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エタンアミニウムクロリド、および１５当量のＤＩＰＥＡを使用して生成物を合成し、所望の生成物を収率３２％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．６２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ９０７．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキシル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
一般プロトコール１を使用して、ただし、アミンとして６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン−１−アミニウム２，２，２−トリフルオロアセテートを使用して生成物を合成し、所望の生成物を収率８６％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．３５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ９１９．２；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボニル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
一般プロトコール１を使用して、ただし、１．５当量のビス（４−ニトロフェニル）カルボネート、アミンとして１．５当量の３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−イウム２，２，２−トリフルオロアセテート、および１５当量のＤＩＰＥＡを使用して生成物を合成し、所望の生成物を収率３９％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．６６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８８９．４；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−３−オキソプロピル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
一般プロトコール１を使用して、ただし、１．５当量のビス（４−ニトロフェニル）カルボネート、アミンとして１．５当量の３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−３−オキソプロパン−１−アミニウム２，２，２−トリフルオロアセテート、および１５当量のＤＩＰＥＡを使用して生成物を合成し、所望の生成物を収率８０％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．６６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ９３４．３；方法Ｅ。
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率８１％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８６３．３；方法Ａ。
（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率５０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ９０７．３；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率６７％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．０５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８３５．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｒ）−１−アセトキシプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率７０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９２．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（３−（（Ｒ）−１−アセトキシプロパン−２−イル）−１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）ウレイド）メチル）−４−（（（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバモイル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率４５％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ９３６．３；方法Ａ。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−１４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−メチル−３，８−ジオキソ−７，１２−ジオキサ−２，４，９−トリアザテトラデシル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率３１％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８７８．２；方法Ａ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−（（３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボニル）オキシ）プロパン−２−イル）ウレイド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率３４％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．２８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８７８．２；方法Ａ。
リンカー結合のための一般プロトコール２
Figure 2016516035
乾燥ＤＭＦ（０．２Ｍ）中のＢｏｃ−ペイロード（１当量）の溶液に、ｉＰｒ２ＥｔＮ（３当量）を、続いて、２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル（４−ニトロフェニル）カルボネート（１．１当量）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）によって完了したら、反応物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を得た。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）カルボニル）アゼチジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率４２％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９５．３；方法Ｅ。
２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル４−（（Ｒ）−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率３２％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．７４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ９０９．６；方法Ｅ。
リンカー結合のための一般プロトコール３
Figure 2016516035
ＤＣＭ（０．２Ｍ）中のカルボン酸リンカー（１．８当量）、ＨＡＴＵ（２．１当量）の溶液に、ｉＰｒ２ＥｔＮ（１１当量）を、続いて、ＤＭＦ（ＤＣＭと１：９比）中のＢｏｃ−ペイロード（１当量）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）によって反応が完了したら、反応混合物をＥｔＯＡｃ中で希釈し、ＥｔＯＡｃとＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を得た。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）ピペリジン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率９９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４９．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパノイル）ピペリジン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率９９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９３．５；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）アゼチジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率４３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．３２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７９．２；方法Ｅ。
リンカー結合のための一般プロトコール４
Figure 2016516035
ＤＭＦ（０．２Ｍ）中のＢｏｃ−ペイロード（１．０当量）およびｉＰｒ２ＥｔＮ（７．０当量）の溶液に、ＨＡＴＵ（２．０当量）を、続いて、アミンリンカー（２．０当量）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）によって反応が完了したら、反応混合物をＥｔＯＡｃ中で希釈し、ＥｔＯＡｃとＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を得た。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率５３％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４７．０；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）プロパンアミド）メチル）−４−（（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率２７％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９０．９；方法Ｅ；
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）カルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
リンカー結合のための一般プロトコール４を使用して、ただし、１．２当量のＨＡＴＵ、１．１当量のアミンリンカー、および５当量のＤＩＰＥＡを使用して生成物を合成し、所望の生成物を収率８９％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４７および２．５０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９５．４；方法Ｅ。
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）カルバモイル）フェノキシ）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
リンカー結合のための一般プロトコール４を使用して、ただし、１．２当量のＨＡＴＵ、１．１当量のアミンリンカー、および５当量のＤＩＰＥＡを使用して生成物を合成し、所望の生成物を収率９６％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．４４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９７．３；方法Ｅ。
（３Ｒ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）−４−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ＭｅＣＮ（０．３ｍｌ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−アジド−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパンアミド）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（４０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）および１−（プロパ−２−イン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（１０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）の溶液に、水（０．３ｍｌ）中のヨウ化銅（Ｉ）（１０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）の溶液を、続いて、トリエチルアミン（０．０７ｍｌ、０．０５０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過し、ＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄した。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。ヘプタン中の０〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、標題化合物を淡黄色油状物として収率７７％で得た；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．１９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ９２９．６；方法Ｅ。
Ｎ−ＢＯＣおよび−Ｏ−アセテートまたは−Ｏ−ＴＢＳを同時脱保護するための一般プロトコール１
基質（１．０当量）を、アセトニトリルおよび水の２：１混合物（０．１Ｍ）に溶かした。ＴＦＡ（５０当量）を添加し、ＵＰＬＣ−ＭＳによって決定して完了するまで（７〜７２時間）、反応混合物を６０℃で撹拌した。反応物を濾過し、逆相カラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物をＴＦＡ塩として、凍結乾燥して白色粉末として単離した。
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率４１％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７２１．１；方法Ａ。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.11-8.63 (2H, m), 7.91-7.51 (2H, m), 7.45-7.05 (8H, m), 7.04-6.92 (2H, m), 5.65-4.98 (3H, m), 4.94-4.82 (1H, m), 4.55-4.44 (1H, m), 3.89-2.84 (13H, m), 2.69-1.70 (4H, m), 1.55-0.48 (7H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率２４％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６５．１；方法Ａ；1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.07-8.71 (2H, m), 7.89-7.73 (2H, m), 7.42-7.07 (8H, m), 7.02-6.99 (2H, m), 5.65-5.49 (1H, m), 5.40-5.03 (2H, m), 4.49-4.47 (1H, m), 3.92-2.91 (18H, m), 2.69-2.10 (3H, m), 1.53-0.52 (7H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキシル）カルバメート
Figure 2016516035
収率３７％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．９５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７７．２；方法Ａ；1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物): δ 8.96-8.75 (2H, m), 7.88-7.54 (2H, m), 7.43-7.26 (6H, m), 7.17-7.07 (2H, m), 7.01-7.00 (2H, m), 5.65-5.04 (3H, m), 4.94-4.85 (1H, m), 4.50-4.42 (1H, m), 3.94-2.83 (14H, m), 2.68-1.75 (3H, m), 1.52-0.51 (15H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率４０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．９０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４７．２；方法Ａ；1H-NMR (CDCl3, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 10.25-9.50 (2H, m), 7.93-7.56 (2H, m), 7.46-7.27 (5H, m), 7.22-6.91 (2H, m), 6.76-6.74 (2H, m), 5.98-4.44 (3H, m), 4.05-3.58 (10H, m), 3.45-3.18 (3H, m), 3.09-2.19 (9H, m),1.40-0.64 (7H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−３−オキソプロピル）カルバメート
Figure 2016516035
収率２６％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９２．１；方法Ａ；1H-NMR (CDCl3, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.97-9.51 (2H, m), 7.88-7.61 (2H, m), 7.44-7.29 (5H, m), 7.14-6.81 (2H, m), 6.73-6.69 (2H, m), 5.98-4.44 (5H, m), 3.97-3.94 (1H, m), 3.75-2.32 (22H, m), 1.43-0.66 (7H, m).
（３Ｒ，４Ｒ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率３０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７２０．３；方法Ａ；1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物): δ 8.96-8.85 (2H, m), 7.92-7.66 (2H, m), 7.42-6.89 (10H, m), 5.66-5.03 (3H, m), 4.54-4.43 (1H, m), 4.08-2.93 (18H, m), 1.52-0.51 (7H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
（３Ｒ，４Ｒ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率４２％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６５．２；方法Ａ；1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物): δ 8.97-8.85 (2H, m), 7.93-7.66 (2H, m), 7.42-6.84 (10H, m), 5.67-5.04 (3H, m), 4.55-4.43 (1H, m), 4.09-2.93 (21H, m), 1.52-0.51 (7H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２，２−ジメチルプロピル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率６０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．０５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９３．２；方法Ｅ；
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）ピペリジン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
収率３０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．５７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７０７．４；方法Ｅ。1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 8.98-8.90 (1H, m), 8.64-8.56 (1H, m), 7.78-7.61 (2H, m), 7.34-7.18 (6H, m), 7.06-7.02 (1H, m), 6.93 (2H, s), 5.60-5.44 (1H, m), 5.34-4.96 (3H, m), 4.46-4.29 (1H, m), 4.19-1.97 (17H, m), 1.42-0.29 (7H, m).
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパノイル）ピペリジン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
収率２９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．５９分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７５１．５；方法Ｅ。1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.02-8.93 (1H, m), 8.66-8.57 (1H, m), 7.85-7.69 (2H, m), 7.42-7.24 (6H, m), 7.15-7.07 (1H, m), 7.01 (2H, s), 5.67-5.51 (1H, m), 5.42-5.03 (3H, m), 4.53-4.35 (1H, m), 4.27-2.05 (22H, m), 1.51-0.34 (7H, m).
２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル４−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
収率２１％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６７．５；方法Ｅ。
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）ピロリジン−３−カルボキサミド
Figure 2016516035
収率２８％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７０５．３；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 8.64-8.51 (2H, m), 8.34-8.32 (1H, m), 7.82-7.67 (2H, m), 7.43-7.27 (6H, m), 7.15-7.09 (1H, m), 7.02-7.00 (2H, m), 5.62-4.47 (1H, m), 5.36-5.01 (2H, m), 4.51-4.39 (1H, m), 3.89-2.99 (18H, m), 1.83-0.50 (7H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−Ｎ−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）ピロリジン−３−カルボキサミド
Figure 2016516035
収率７５％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．８０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４９．４；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 8.62-8.58 (2H, m), 8.32-8.27 (1H, m), 7.83-7.64 (2H, m), 7.43-7.27 (6H, m), 7.15-7.09 (1H, m), 7.04-7.02 (2H, m), 5.63-4.46 (1H, m), 5.36-5.03 (2H, m), 4.44-4.40 (1H, m), 3.88-3.08 (21H, m), 2.84-2.62 (1H, m), 1.91-0.51 (7H, m).
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率２９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７５０．２；方法Ａ；
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）ウレイド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率４８％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９４．２；方法Ａ；
全体脱保護のための一般プロトコール２
基質（１．０当量）をＤＣＭ（０．１Ｍ）に溶かし、ＴＦＡ（２０〜５０当量）を添加し、反応混合物を室温で１〜２時間撹拌した。反応物を濾過し、逆相カラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物をＴＦＡ塩として、凍結乾燥の後に白色粉末として単離した。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｓ）−４−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
５０当量ＴＦＡ、収率２４％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１５．４；方法Ｅ。1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.04-8.82 (2H, m), 8.09-8.04 (1H, m), 7.88-7.76 (1H, m), 7.71-7.60 (1H, m), 7.42-7.05 (9H, m), 5.58-5.55 (1H, m), 5.39-4.98 (5H, m), 4.68-4.66 (2H, m), 4.01- 2.46 (10H, m), 1.47-0.45 (9H, m).
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）アゼチジン−３−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
５０当量ＴＦＡ；収率２６％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．４６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６７９．２；方法Ｅ。1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.04 (1H, s, br), 8.69 (1H, s, br), 7.83-7.65 (2H, m), 7.43-7.29 (6H, m), 7.15-7.10 (1H, m), 7.02-6.97 (2H, m), 6.25-5.65 (1H, m), 5.52-5.07 (3H, m), 4.56-4.26 (1H, m), 4.16-2.76 (17H, m), 2.48-2.08 (3H, m), 1.30-0.97 (3H, m).
２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
５０当量ＴＦＡ；収率６０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９５．３；方法Ｅ。1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体の混合物): δ 9.05 (1H, s, br), 8.69 (1H, s, br), 7.84-7.66 (2H, m), 7.43-7.29 (6H, m), 7.15-7.10 (1H, m), 7.02-6.98 (2H, m), 6.25-5.70 (1H, m), 5.51-5.08 (3H, m), 4.51-4.26 (1H, m), 4.15-2.76 (17H, m), 2.43-2.07 (3H, m), 1.29-0.97 (3H, m).
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル３−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）アゼチジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
５０当量ＴＦＡ；収率７５％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７８分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７８．３；方法Ｅ；
Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）−２−（ピロリジン−３−イル）ベンズアミド
Figure 2016516035
２０当量のＴＦＡ；ジアステレオ異性体の混合物；収率８８％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９５．２；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 9.50-9.46 (1H, m), 8.87-8.82 (2H, m), 8.12-8.10 (1H, m), 7.80-7.73 (1H, m), 7.53-7.26 (11H, m), 7.10-7.06 (1H, m), 6.97 (2H, s), 5.54-5.38 (3H, m), 3.76-3.57 (1H, m), 3.54-2.89 (8H, m), 2.87-2.80 (1H, m), 2.30-1.82 (3H, m), 1.10-1.08 (3H, m), 0.86-0.85 (3H, m).
（Ｒ）−２−（アゼチジン−３−イルオキシ）−Ｎ−（１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）ベンズアミド
Figure 2016516035
２０当量のＴＦＡ；収率７８％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９７．２；方法Ｅ；1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 9.02-9.00 (1H, m), 8.87 (2H, s, br), 8.09-8.06 (1H, m), 7.79-7.75 (1H, m), 7.64-7.62 (1H, m), 7.59-7.58 (1H, m), 7.47-7.42 (1H, m), 7.36-7.26 (6H, m), 7.12-7.06 (2H, m), 6.85 (2H, s), 6.82-6.80 (1H, m), 5.53-5.38 (3H, m), 5.18-5.12 (1H, m), 4.52-4.45 (1H, m), 4.40-4.36 (1H, m), 4.28-4.22 (1H, m), 4.18-4.12 (1H, m), 3.46-3.42 (2H, m), 3.35-3.27 (1H, m), 3.19-3.11 (1H, m), 2.74-2.70 (1H, m), 2.20-2.17 (1H, m), 1.03 (3H, s), 0.89 (3H, s).
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−ピロリジン−３−イルメチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
収率４０％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．７２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７７８．４；方法Ｅ。
リンカー−ペイロードのＢｏｃ脱保護のための一般手順：
ＭｅＣＮ（０．１Ｍ）中の上記Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐ組合せ（０．００８ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、粗製物を逆相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法ＣまたはＤのいずれかを使用）によって精製した。生成物をＴＦＡ塩として単離する。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）オキシ）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードヒドロキシルでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−アミノ−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノエート（リンカー３、ＴＦＡ塩）（４５ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を使用して、標題化合物を調製した。
所望の生成物をさらに精製せずに、次のステップで使用した
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９６７．５、Ｒｔ１．４２分。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８９６．６、１．３１分（方法Ａ）。
５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、６７％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.05 (1H, m), 8.67 (1H, m), 7.77 (3H, m), 7.39 (2H, m), 7.32 (2H, m), 7.27 (2H, m), 7.10 (1H, m), 7.01 (2H, m), 6.33 (1H, m), 5.34 (2H, m), 5.25 (1H, m), 5.20 (1H, m), 3.96 (2H, m), 3.89 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.73 (1H, m), 3.60 (1H, m), 3.56 (4H, m), 3.39 (2H, m), 3.35 (1H, m), 3.30 (1H, m), 3.09 (2H, m), 2.59 (1H, m), 2.54 (1H, m), 2.26 (1H, m), 2.00 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.25-1.05 (2H, m), 1.10 (3H, m), 0.75 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７９６．８、０．９２分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキシル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９０８．６、１．３７分（方法Ａ）。
４．５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、５３％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.02 (1H, m), 8.65 (1H, m), 7.77 (2H, m), 7.39 (2H, m), 7.32 (2H, m), 7.27 (2H, m), 7.10 (1H, m), 7.01 (1H, m), 6.99 (2H, m), 6.32 (1H, m), 5.33 (2H, m), 5.24 (1H, m) 5.20 (1H, m), 3.94 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.72 (1H, m), 3. 60 (1H, m), 3.38 (3H, m), 3.32 (3H, m), 3.21 (1H, m), 2.95 (2H, m), 2.60 (1H, m), 2.53 (1H, m), 2.27 (1H, m), 2.00 (1H, m), 1.47 (2H, m), 1.36 (2H, m), 1.21 (5H, m), 1.09 (4H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８０８．５、１．０分（方法Ａ）。
Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヨードアセトアミド。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７５３．３、１．４０分（方法Ａ）。
リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ６５３．２、０．９４分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２−ヨードアセトアミド）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９８４．３、１．２７分（方法Ａ）。
リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８８４．４、０．９１分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（６−（２−ヨードアセトアミド）ヘキシル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９９６．６、１．３３分（方法Ａ）。
４ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、４０％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.00 (1H, m), 8.63 (1H, m), 8.19 (1H, m), 7.77 (3H, m), 7.39 (2H, m), 7.30 (1H, m), 7.27 (2H, m), 7.10 (1H, m), 7.05 (1H, m), 6.31 (1H, m), 5.33 (2H, m) 5.23 (1H, m), 5.19 (1H, m), 3.94 (4H, m), 3.83 (1H, m), 3.71 (1H, m), 3.60 (2H, m), 3.47 (1H, m), 3.34 (3H, m), 3.20 (1H, m), 3.02 (2H, m), 2.95 (2H, m), 2.58 (1H, m), 2.54 (1H, m), 2.25 (1H, m), 2.00 (1H, m), 1.37 (5H, m), 1.24 (5H, m), 1.08 (3H, m), 0.69 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８９６．５、０．９７分（方法Ａ）。
１−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（Ｓ）−１−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）プロパン−２−イル）−１−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）尿素。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８４６．５、１．３１分（方法Ａ）。
５．５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、８６％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.07 (1H, m), 8.52 (1H, m), 8.03 (1H, m), 7.79 (1H, m), 7.75 (1H, m), 7.38 (2H, m), 7.32 (2H, m), 7.24 (2H, m), 7.11 (1H, m), 7.09 (2H, m), 6.42 (1H, m), 5.30-5.15 (4H, m), 4.67 (2H, m), 4.42 (2H, m), 4.21 (1H, m), 3.81 (1H, m), 3.58 (1H, m), 3.39 (3H, m), 3.30 (1H, m), 3.20 (1H, m), 2.53 (1H, m), 2.47 (1H, m), 2.30 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.35 (1H, m), 1.25 (1H, m), 1.11 (4H, m), 0.65 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７４６．２、０．９２分（方法Ａ）。
（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８６７．４、１．３３分（方法Ａ）。
２ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、３６％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.11 (1H, m), 8.80 (1H, m), 7.78 (2H, m), 7.51 (1H, m), 7.40 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.22 (2H, m), 7.10 (1H, m), 7.02 (2H, m), 5.61 (1H, m), 5.52 (1H, m), 5.23 (1H, m), 5.09 (1H, m), 5.02 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.75 (1H, m), 3.62 (1H, m), 3.54 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.23 (2H, m), 3.09 (2H, m), 2.66 (1H, m), 2.61 (1H, m), 2.31 (1H, m), 2.18 (1H, m), 1.42 (3H, m), 1.38 (2H, m), 1.10 (1H, m), 0.67 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７６７．３、０．９２分（方法Ａ）。
（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキシル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８７９．６、１．４０分（方法Ａ）。
３．２ｍｇ、０．００３４ｍｍｏｌ、２７％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.20-9.06 (1H, m), 8.97-8.33 (1H, m), 7.83-7.73 (2H, m), 7.56-7.46 (1H, m), 7.44-7.36 (2H, m), 7.35-7.28 (2H, m), 7.27-7.19 (2H, m), 7.17-7.08 (1H, m), 7.03-6.96 (2H, m), 5.66-5.59 (1H, m), 5.59-5.43 (1H, m), 5.26-4.98 (3H, m), 3.88-3.77 (1H, m), 3.77-3.68 (1H, m), 3.36-3.27 (4H, m), 3.27-3.17 (2H, m), 3.07-2.96 (1H, m), 2.95-2.82 (1H, m), 2.72-2.56 (2H, m), 2.37-2.24 (1H, m), 2.23-2.05 (1H, m), 1.52-1.28 (9H, m), 1.28-1.16 (2H, m), 1.16-0.97 (3H, m), 0.73-0.56 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７７９．４、１．０１分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９４０．４、１．２９分（方法Ａ）。
４ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、４７％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 8.95 (1H, m), 8.45 (1H, m), 7.79 (1H, m), 7.76 (1H, m), 7.40 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.27 (2H, m), 7.11 (1H, m), 7.06 (1H, m), 7.03 (2H, m), 6.32 (1H, m), 5.34 (2H, m), 5.15-5.25 (2H, m), 3.96 (1H, m), 3.91 (1H, m), 3.85 (1H, m), 3.75 (1H, m), 3.60 (1H, m), 3.55-3.25 (12H, m), 3.18 (1H, m), 3.11 (2H, m), 2.65 (2H, m), 2.51 (1H, m), 2.28 (1H, m), 2.00 (1H, m), 1.40 (2H, m), 1.23 (1H, m), 1.10 (3H, m), 0.65 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８４０．３、０．９４分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８５２．４、１．２８分（方法Ａ）。
１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、６９％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.03 (1H, m), 8.64 (1H, m), 7.78 (1H, m), 7.77 (1H, m), 7.40 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.27 (2H, m), 7.20 (1H, m), 7.08 (1H, m), 7.01 (2H, m), 6.92 (1H, m), 6.30 (1H, m), 5.34 (2H, m), 5.22 (2H, m), 3.90 (3H, m), 3.80 (1H, m), 3.74 (1H, m), 3.60 (1H, m), 3.33 (2H, m), 3.20 (1H, m), 3.13 (2H, m), 2.61 (1H, m), 2.54 (1H, bs), 2.28 (1H, m), 1.99 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.30-1.15 (2H, m), 1.11 (3H, m), 0.68 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７５２．３、０．９０分（方法Ａ）。
２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）エチル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８８２．２、１．２６分（方法Ａ）。
１４ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、７１％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.11-9.00 (1H, m), 8.75-8.60 (1H, m), 7.81-7.71 (2H, m), 7.43-7.36 (2H, m), 7.36-7.24 (4H, m), 7.14-7.06 (1H, m), 7.05-7.00 (2H, m), 7.00-6.95 (1H, m), 6.79-6.65 (1H, m), 5.38-5.11 (4H, m), 4.02-3.95 (2H, m), 3.71-3.64 (1H, m), 3.64-3.59 (1H. m), 3.59-3.54 (2H, m), 3.54-.344 (3H, m), 3.44-3.26 (7H, m), 3.26-3.16 (1H, m), 3.13-3.04 (2H. m), 2.65-2.44 (2H, m), 2.43-2.26 (1H, m), 2.02-1.83 (1H, m), 1.45-1.33 (1H, m), 1.30-1.12 (2H, m), 0.78-0.60 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７８２．２、０．９０分（方法Ａ）。
Ｎ−（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）−３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパンアミド。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８８０．４、１．２５分（方法Ａ）。
１０．５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、８９％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.06 (1H, m), 8.70 (1H, m), 7.99 (1H, m), 7.78 (1H, m), 7.76 (1H, m), 7.40 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.28 (2H, m), 7.10 (1H, m), 7.02 (2H, m), 6.35 (1H, m), 5.40-5.10 (4H, m), 3.83 (3H, m), 3.72 (1H, m), 3.45 (2H, m), 3.37-3.25 (4H, m), 3.25-3.05 (4H, m), 2.57 (1H, m), 2.50 (2H, m), 2.42 (1H, m), 2.30 (2H, m), 1.92 (1H, m), 1.40 (1H, m), 1.25 (1H, m), 1.22 (1H, m), 1.04 (3H, m), 0.70 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７８０．３、０．９３分（方法Ａ）。
２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８９６．２、１．２７分（方法Ａ）。
９ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、４０％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.11-8.96 (1H, m), 8.74-8.59 (1H, m), 7.82-7.69 (2H, m), 7.45-7.36 (2H, m), 7.35-7.20 (5H, m), 7.15-7.06 (1H, m), 7.05-6.98 (2H, m), 6.34-6.15 (1H, m), 5.38-5.12 (4H, m), 4.08-3.96 (2H, m), 3.90-3.79 (2H, m), 3.79-3.67 (1H, m), 3.40-3.27 (4H, m), 3.26-3.18 (1H, m), 3.12-2.98 (2H, m), 2.65-2.46 (3H, m), 2.46-2.30 (1H, m), 2.04-1.87 (1H, m), 1.46-1.34 (1H, m), 1.31-1.12 (2H, m), 1.09-0.97 (3H, m), 0.78-0.60 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７９６．２、０．９３分（方法Ａ）。
Ｎ−（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８７８．３、１．２８分（方法Ａ）。
１９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、３１％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.05 (1H, m), 8.72 (1H, m), 7.97 (1H, m), 7.77 (2H, m), 7.40 (2H, m), 7.35 (2H, m), 7.29 (2H, m), 7.11 (1H, m), 7.01 (2H, m), 6.40 (1H, m), 5.33 (2H, m), 5.28-5.20 (2H, m), 3.84 (2H, m), 3.70 (1H, m), 3.60 (1H, m), 3.45 (1H, m), 3.37 (2H, m), 3.33 (2H, m), 3.22 (2H, m), 3.10 (1H, m), 2.57 (2H, m), 2.51 (2H, m), 2.44 (1H, m), .2.07 (2H, m), 1.92 (1H, m), 1.49 (3H, m), 1.38 (1H, m), 1.24 (1H, m), .1.19 (2H, m), 1.04 (3H, m), 0.70 (1H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋７７８．２、０．９６分（方法Ａ）。
（３Ｓ，４Ｒ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメートおよび
（３Ｒ，４Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
２種の異なる異性体を、２個のＯＨの連続した保護−脱保護ステップによって調製して、対応するリンカー位置異性体をそれぞれ純粋な異性体として生成した。各位置異性体を帰属するための構造決定は行わなかった。
異性体Ａ：Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０３８．７、１．５０分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ １０３９．２、１．４９分（方法Ａ）。
異性体Ａ：２．３ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、３０％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.04 (1H, m), 8.74 (1H, m), 7.76 (2H, m), 7.39 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.25 (2H, m), 7.09 (2H, m), 7.02 (2H, m), 5.67 (1H, m), 5.38 (1H, m), 5.25 (1H, m), 4.93 (1H, m), 4.71 (1H, m), 4.27 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.71 (2H, m), 3.57 (4H, m), 3.40 (2H, m), 3.30 (4H, m), 3.27 (4H, m), 3.11 (2H, m), 2.81 (1H, m), 2.37 (1H, m), 2.22 (1H, m), 2.17 (1H, m), 1.70 (1H, m), 1.20 (1H, m), 1.05 (1H, m), 0.68 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８２４．１、０．９０分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：６．２ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、４３％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.03 (1H, m), 8.76 (1H, m), 7.75 (2H, m), 7.39 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.25 (2H, m), 7.10 (2H, m), 7.03 (2H, m), 5.71 (1H, m), 5.37 (1H, m), 5.25 (1H, m), 4.89 (1H, m), 4.77 (1H, m), 4.24 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.78 (1H, m), 3.58 (4H, m), 3.51 (3H, m), 3.40 (2H, m), 3.29 (1H, m), 3.14 (2H, m), 3.10 (2H, m), 2.80 (1H, m), 2.36 (2H, m), 2.30 (1H, m), 2.13 (1H, m), 1.72 (1H, m), 1.08 (1H, m), 0.88 (1H, m), 0.33 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８２４．１、０．９１分（方法Ａ）。
（３Ｒ，４Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメートおよび
（３Ｓ，４Ｒ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
２種の異なる異性体を、２個のＯＨの連続した保護−脱保護ステップによって調製して、対応するリンカー位置異性体をそれぞれ純粋な異性体として生成した。各位置異性体を帰属するための構造決定は行わなかった。
異性体Ａ：Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９９５．２、１．５２分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９９４．２、１．５１分（方法Ａ）。
異性体Ａ：１１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、５８％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.09-8.94 (1H, m), 8.71-8.53 (1H, m), 7.82-7.69 (2H, m), 7.42-7.36 (2H, m), 7.36-7.21 (5H, m), 7.16-7.06 (1H, m), 7.03-6.97 (2H, m), 5.72-5.62 (1H, m), 5.44-5.34 (1H, m), 5.34-5.16 (1H, m), 4.94-4.86 (1H, m), 4.74-4.66 (1H, m), 4.33-4.21 (1H, m), 3.88-3.76 (1H, m), 3.76-3.65 (2H, m), 3.65-3.53 (1H, m), 3.22-3.16 (4H, m), 3.16-3.03 (2H, m), 2.90-2.77 (1H, m), 2.45-2.10 (3H, m), 1.77-1.67 (1H, m), 1.12-0.99 (1H, m), 0.91-0.81 (1H, m), 0.34-0.15 (1H, m). 1H, m), 4.74-4.66 (1H, m), 4.33-4.21 (1H, m), 3.88-3.76 (1H, m), 3.76-3.65 (2H, m), 3.65-3.53 (1H, m), 3.22-3.16
異性体Ｂ：１０ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ、９４％、1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.11-8.94 (1H, m), 8.80-8.57 (1H, m), 7.84-7.72 (2H, m), 7.44-7.36 (2H, m), 7.36-7.28 (3H, m), 7.28-7.20 (2H, m), 7.14-7.07 (1H, m), 7.05-6.99 (2H, m), 5.79-5.69 (1H, m), 5.43-5.33 (1H, m), 5.31-5.16 (1H, m), 4.91-4.82 (1H, m), 4.82-4.72 (1H, m), 4.27-4.17 (1H, m), 3.92-3.74 (2H, m), 3.24-3.02 (4H, m), 2.83-2.71 (1H, m), 2.44-2.25 (3H, m), 2.14-2.03 (1H, m), 1.76-1.64 (1H, m), 1.12-0.98 (1H, m), 0.92-0.79 (1H, m), 0.37-0.19 (1H, m). 9.11-8.94 (1H, m), 8.80-8.57 (1H, m), 7.84-7.72 (2H, m), 7.44-7.36 (2H, m), 7.36-7.28 (3H, m), 7.28-7.20 (2H, m),
（３Ｒ，４Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキシル）カルバメートおよび
（３Ｓ，４Ｒ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシピロリジン−３−イル（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキシル）カルバメート。
Figure 2016516035
２種の異なる異性体を、２個のＯＨの連続した保護−脱保護ステップによって調製して、対応するリンカー位置異性体をそれぞれ純粋な異性体として生成した。各位置異性体を帰属するための構造決定は行わなかった。
異性体Ａ：Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０５０．３、１．５７分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０５０．３、１．５７分（方法Ａ）。異性体Ａ：１２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、８３％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ9.06-8.93 (1H, m), 8.74-8.61 (1H, m), 7.84-7.69 (2H, m), 7.45-7.28 (4H, m), 7.28-7.21 (2H, m), 7.18-7.06 (2H, m), 7.05-6.96 (2H, m), 5.70-5.59 (1H, m), 5.43-5.33 (1H, m), 5.33-5.17 (1H, m), 4.99-4.88 (1H, m), 4.75-4.63 (1H, m), 4.33-4.20 (1H, m), 3.85-3.75 (1H, m), 3.75-3.63 (2H, m), 3.63-3.52 (1H, m), 3.30-3.19 (3H, m), 3.17-3.05 (1H, m), 3.01-2.89 (2H, m), 2.87-2.74 (1H, m), 2.44-2.08 (3H, m), 1.77-1.62 (1H, m), 1.54-1.44 (2H, m), 1.43-1.32 (2H, m), 1.31-1.13 (4H, m), 1.09-0.95 (1H, m), 0.93-0.79 (1H, m), 0.31-0.15 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８３６．２、０．９５分（方法Ａ）、４．００分（方法Ｆ）。
異性体Ｂ：９．５ｍｇ、０．００９５ｍｍｏｌ、７２％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.07-8.93 (1H, m), 8.76-8.63 (1H, m), 7.80-7.70 (2H, m), 7.43-7.36 (2H, m), 7.36-7.28 (2H, m), 7.27-7.21 (2H, m), 7.18-7.13 (1H, m), 7.13-7.06 (1H, m), 7.04-6.98 (2H, m), 5.80-5.63 (1H, m), 5.42-5.32 (1H, m), 5.32-5.12 (1H, m), 4.97-4.83 (1H, m), 4.82-4.72 (1H, m), 4.23-4.17 (1H, m), 3.89-3.72 (2H, m), 3.72-3.56 (2H, m), 3.31-3.24 (2H, m), 3.21-3.05 (2H, m), 3.03-2.88 (2H, m), 2.86-2.71 (1H, m), 2.44-2.23 (2H, m), 2.21-1.99 (1H, m), 1.80-1.65 (1H, m), 1.55-1.43 (2H, m), 1.43-1.32 (2H, m), 1.31-1.14 (4H, m), 1.13-0.98 (1H, m), 0.94-0.80 (1H, m), 0.40-0.33 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。
（Ｒ）−１−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）−３−ヒドロキシプロパン−２−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０２６．３、１．５１分（方法Ａ）、７．１０分（方法Ｂ）。
６．１ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、５１％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.15-8.96 (1H, m), 8.69-8.48 (1H, m), 7.83-7.67 (2H, m), 7.47-7.37 (2H, m), 7.37-7.21 (4H, m), 7.18-7.07 (1H, m), 7.07-6.99 (2H, m), 6.98-6.86 (1H, m), 6.80-6.59 (1H, m), 5.38-5.09 (4H, m), 4.78-4.63 (1H, m), 3.88-3.77 (1H, m), 3.54-3.43 (4H, m), 3.42-3.26 (6H, m), 3.25-3.14 (2H, m), 3.15-2.98 (2H, m), 2.61-2.44 (3H, m), 2.43-2.25 (2H, m), 2.00-1.78 (1H, m), 1.43-1.30 (1H, m), 1.30-1.08 (2H, m), 0.76-0.57 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８１２．２、０．８６分（方法Ａ）、３．３７分（方法Ｂ）。
（Ｒ）−３−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）−２−ヒドロキシプロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０２６．３、１．５２分（方法Ａ）、７．１７分（方法Ｂ）。
４．０ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、７０％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.09-8.93 (1H, m), 8.59-8.37 (1H, m), 7.85-7.70 (2H, m), 7.45-7.36 (2H, m), 7.36-7.23 (4H, m), 7.15-7.06 (2H, m), 7.06-7.01 (2H, m), 6.68-6.56 (1H, m), 5.40-5.12 (4H, m), 4.06-3.95 (1H, m), 3.90-3.77 (2H, m), 3.77-3.65 (2H, m), 3.26-2.97 (5H, m), 2.64-2.46 (3H, m), 2.46-2.27 (1H, m), 1.98-1.81 (1H, m), 1.45-1.36 (1H, m), 1.30-1.10 (2H, m), 0.77-0.60 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８１２．２、０．８６分（方法Ａ）、３．４１分（方法Ｂ）。
（Ｒ）−１−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）−３−ヒドロキシプロパン−２−イル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９８２．３、１．５１分（方法Ａ）。
３．８ｍｇ、０．００４１ｍｍｏｌ、４１％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.09-8.89 (1H, m), 8.55-8.35 (1H, m), 7.84-7.69 (2H, m), 7.45-7.36 (2H, m), 7.36-7.23 (4H, m), 7.16-7.07 (2H, m), 7.05-6.98 (2H, m), 6.73-6.58 (1H, m), 5.40-5.10 (4H, m), 4.87-4.64 (2H, m), 3.88-3.79 (1H, m), 3.72-3.64 (1H, m), 3.63-3.56 (1H, m), 3.25-3.03 (6H, m), 2.43-2.26 (1H, m), 1.96-1.80 (1H, m), 1.44-1.32 (1H, m), 1.29-1.09 (2H, m), 0.75-0.57 (1H, m). 9.09-8.89 (1H, m), 8.55-8.35 (1H, m), 7.84-7.69 (2H, m), 7.45-7.36 (2H, m), 7.36-7.23 (4H,
Ｎ−（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）−４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）シクロヘキサンカルボキサミド。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９０４．３、１．２９分（方法Ａ）。
３１ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、８５％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.14-8.91 (1H, m), 8.76-8.59 (1H, m), 7.94-7.83 (1H, m), 7.83-7.68 (2H, m), 7.48-7.37 (2H, m), 7.37-7.23 (4H, m), 7.18-7.07 (1H, m), 7.06-6.98 (2H, m), 6.54-6.24 (1H, m), 5.43-5.14 (4H, m), 3.91-3.76 (2H, m), 3.76-3.65 (1H, m), 3.65-3.54 (1H, m), 3.52-3.28 (4H, m), 3.28-3.13 (3H, m), 3.13-3.01 (1H, m), 2.67-2.47 (2H, m), 2.47-2.31 (1H, m), 2.14-2.00 (1H, m), 2.00-1.86 (1H, m), 1.77-1.66 (2H, m), 1.66-1.57 (2H, m), 1.57-1.47 (1H, m), 1.44-1.35 (1H, m), 1.34-1.10 (4H, m), 1.08-0.99 (3H, m), 0.97-0.83 (2H, m), 0.78-0.60 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８０４．２、０．９３分（方法Ａ）。
１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）アゼチジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８９４．２、１．２６分（方法Ａ）。
２３ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、６１％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.15-8.97 (1H, m), 8.77-8.60 (1H, m), 7.88-7.78 (1H, m), 7.78-7.69 (1H, m), 7.43-7.37 (2H, m), 7.37-7.29 (3H, m), 7.28-7.21 (2H, m), 7.14-7.08 (1H, m), 7.05-6.99 (2H, m), 5.56-5.44 (1H, m), 5.43-5.21 (2H,), 5.16-4.96 (2H, m), 4.46-4.35 (1H, m), 4.12-4.03 (1H, m), 4.03-3.95 (1H, m), 3.88-3.80 (1H, m), 3.46-3.24 (6H, m), 3.26-3.13 (1H, m), 3.13-.303 (2H, m), 2.76-2.62 (1H, m), 2.58-2.34 (3H, m), 1.95-1.80 (1H, m), 1.68-1.53 (1H, m), 1.15-0.93 (1H, m), 0.49-0.30 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７９４．２、０．９１分（方法Ａ）。
１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）ピペリジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
ジアステレオ異性体の混合物として得、リンカーをカップリングする前に分離した。
純粋なジアステレオ異性体として単離したＢｏｃ−リンカー−ペイロード。
異性体Ａ、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９２２．３、１．３３分（方法Ａ）。
異性体Ｂ、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９２２．３、１．３４分（方法Ａ）。
異性体Ａ：１０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、４７％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.11-8.93 (1H, m), 8.87-8.69 (1H, m), 7.85-7.74 (1H, m), 7.74-7.64 (1H, m), 7.45-7.36 (2H, m), 7.36-7.28 (2H, m), 7.27-7.18 (2H, m), 7.15-7.06 (1H, m), 7.06-6.97 (3H, m), 5.69-5.59 (1H, m), 5.46-5.36, (1H, m), 5.31-5.13 (1H, m), 4.72-4.62 (1H, m), 4.62-4.54 (1H, m), 3.71-3.60 (2H, m), 3.59-3.46 (6H, m), 3.46-3.31 (4H, m), 3.31-3.16 (2H, m), 3.15-3.00 (4H, m), 2.99-2.90 (1H, m), 2.89-2.75 (1H, m), 2.48-2.30 (2H, m), 2.29-2.10 (1H, m), 1.94-1.80 (1H, m), 1.79-1.59 (2H, m), 1.58-1.48 (1H, m), 1.47-1.36 (1H, m), 1.19-1.04 (1H, m), 0.89-0.76 (1H, m), 0.55-0.38 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８２２．３、０．９６分（方法Ａ）。
異性体Ｂ：２２．５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、５２％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ9.19-8.99 (1H m), 8.92-8.76 (1H, m), 7.81-7.73 (1H, m), 7.71-7.63 (1H, m), 7.45-7.37 (2H, m), 7.37-7.27 (2H, m), 7.26-7.20 (2H, m), 7.14-7.06 (2H, m), 7.05-6.99 (2H, m), 5.58-5.47 (1H, m), 5.42-5.31 (1H, m), 5.25-5.07 (1H, m), 4.69-4.61 (1H, m), 4.56-4.47 (1H, m), 3.90-3.70 (2H, m), 3.65-3.46 (6H, m), 3.45-3.33 (5H, m), 3.33-3.20 (1H, m), 3.17-2.98 (4H, m), 2.98-2.86 (2H, m), 2.50-2.21 (3H, m), 1.99-1.87 (1H, m), 1.79-1.71 (1H, m), 1.71-1.63 (1H, m), 1.63-1.43 (2H, m), 1.22-1.06 (1H, m), 0.90-0.76 (1H, m), 0.55-0.39 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８２２．３、０．９７分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−３−オキソプロピル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９２３．２、１．２２分（方法Ａ）。
６．１ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、３７％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.05 (1H, m), 8.64 (1H, m), 8.01 (1H, m), 7.78 (2H, m), 7.40 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.27 (2H, m), 7.12 (1H, m), 7.01 (2H, m), 6.97 (1H, m), 6.31 (1H, m), 5.34 (2H, m), 5.25 (1H, m), 5.20 (1H, m), 3.94 (3H, m), 3.80 (1H, m), 3.75 (1H, m), 3.50 (1H, m), 3.45 (2H, m), 3.25 (2H, m), 3.15 (4H, m), 2.59 (1H, m), 2.50 (1H, m), 2.26 (1H, m), 2.17 (2H, m), 2.01 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.30-1.20 (2H, m), 1.10 (3H, m), 0.68 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：８２３．２、０．９０分（方法Ａ）。
２−アミノ−３−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−３−オキソプロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード、ジアステレオ異性体の混合物、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９８２．３、１．３９分および１．４０分（方法Ａ）。
生成物を、ジアステレオ異性体の分離不可能な混合物として（ＬＣ／ＭＳによると４：１、方法Ａ）を得た。１７．８ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、７０％。1H-NMR (DMSO, 600MHz) 主ジアステレオ異性体: δ 9.34-9.21 (1H, m), 9.19-9.05 (1H, m), 8.71-8.55 (3H, m), 7.94-7.86 (1H, m), 7.82-7.72 (1H, m), 7.45-7.37 (2H, m), 7.37-7.31 (2H, m), 7.31-7.26 (1H, m), 7.26-7.21 (2H, m), 7.16-7.08 (1H, m), 7.06-7.01 (2H, m), 5.56-5.49 (1H, m), 5.41-5.35 (1H, m), 5.35-5.22 (1H, m), 5.19-5.07 (1H, m), 4.56-4.47 (1H, m), 4.38-4.29 (1H, m), 4.19-4.10 (1H, m), 4.00-3.90 (1H, m), 3.78-3.68 (1H, m), 3.63-3.54 (3H, m), 3.54-3.48 (3H, m), 3.31-3.22 (1H, m), 3.22-3.02 (3H, m), 2.83-2.71 (1H, m), 2.68-2.56 (1H, m), 2.46-2.35 (1H, m), 2.02-1.83 (1H, m), 1.45-1.33 (1H, m), 1.28-1.18 (1H, m), 1.01-0.86 (1H, m), 0.52-0.36 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７８２．３、０．７８分（主）および０．７９分（副）（方法Ａ）。
Ｎ−（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８３６．２、１．２６分（方法Ａ）。
４ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、２４％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.05 (1H, m), 8.67 (1H, m), 8.14 (1H, m), 7.79 (1H, m), 7.75 (1H, m), 7.40 (2H, m), 7.33 (2H, m), 7.27 (2H, m), 7.10 (1H, m), 7.02 (2H, m), 6.35 (1H, m), 5.35-5.25 (4H, m), 3.81 (2H, m), 3.75 (1H, m), 3.62 (3H, m), 3.45 (2H, m), 3.37 (2H, m), 3.16 (2H, m), 3.07 (1H, m), 2.57 (1H, m), 2.41 (1H, m), 2.39 (2H, m), 1.90 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.25 (1H, m), 1.15 (1H, m), 1.02 (3H, m), 0.70 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７３６．２、０．８９分（方法Ａ）。
４−（（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）アミノ）−１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４−オキソブタン−２−スルホン酸。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード、ジアステレオ異性体の混合物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９３０．５、１．０１分（異性体Ａ）および１．０２分（異性体Ｂ）、（方法Ａ）。
ジアステレオ異性体の混合物を、Ｂｏｃ脱保護の後に逆相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）を使用して分離した。
異性体Ａ、３１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、１０％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.08-8.48 (1H, m), 8.90-8.75 (1H, m), 7.94-7.84 (1H, m), 7.81-7.68 (2H, m), 7.47-7.36 (2H, m), 7.35-7.23 (4H, m), 7.15-7.04 (1H, m), 7.03-6.94 (2H, m), 6.20-6.08 (1H, m), 5.46-5.20 (4H, m), 3.95-3.67 (6H, m), 3.29-3.11 (2H, m), 2.90-2.64 (4H, m), 2.59-2.44 (3H, m), 2.13-1.91 (1H, m), 1.78-1.59 (1H, m), 1.52-1.36 (1H, m), 1.35-1.23 (1H, m), 1.19-1.07 (1H, m), 1.06-0.94 (3H, m), 0.70-0.53 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。９．０８−８．４８（１Ｈ、ｍ）、８．９０−８．７５（１Ｈ、ｍ）、７．９４−７。
異性体Ｂ、３５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、１１％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ -NMR (DMSO, 600MHz): mmol, 11%. m), 7.94-7.84 (1H, m), 7.81-7.68 (2H, m), 7.47-7.36 (2H, m), 7.35-7.23 (4H, m), 7.15-7.04 (1H, m), 7.03-6.94 (2H, m), 6.20-6.08 (1H, m), 5.46-5.20 (4H, m), 3.95-3.67 (6H, m), 3.29-3.66 (5H, m), 3.29-3.16 (2H, m), 2.84-2.74 (1H, m), 2.73-2.58 (1H, m), 2.57-2.42 (5H, m), 2.08-1.97 (1H, m), 1.71-1.55 (1H, m), 1.42-1.24 (2H, m), 1.21-1.08 (1H, m), 1.07-0.95 (3H, m), 0.69-0.51 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８３０．５、０．８９分。（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（１−ヒドロキシシクロプロピル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９８２．５、１．６４（方法Ａ）。
１７．７ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、６６％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.20-9.08 (1H, m), 8.91-8.71 (1H, m), 7.89-7.81 (1H, m), 7.81-7.74 (1H, m), 7.40-7.36 (2H, m), 7.35-7.29 (2H, m), 7.27-7.23 (2H, m), 7.15-7.09 (1H, m), 7.05-7.00 (3H, m), 6.38-6.28 (1H, m), 5.37-5.14 (4H, m), 4.03-3.78 (4H, m), 3.77-3.68 (1H, m), 3.61-3.52 (2H, m), 3.52-3.45 (2H, m), 3.44-3.29 (4H, m), 3.13-3.03 (2H, m), 3.03-2.93 (1H, m), 2.57-2.42 (3H, m), 1.16-1.06 (3H, m), 0.69-0.50 (3H, m), 0.50-0.36 (1H. m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７６８．３、０．９４分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９８４．５、１．６５分（方法Ａ）。
４．１ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、５４％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.26-9.05 (1H, m), 9.00-8.76 (1H, m), 7.99-7.84 (1H, m), 7.83-7.71 (1H, m), 7.51-7.24 (6H, m), 7.19-7.09 (1H, m), 7.08-6.95 (3H, m), 6.55-6.37 (1H, m), 5.50-5.15 (4H, m), 4.09-3.88 (2H, m), 3.88-3.74 (2H, m), 3.60-3.53 (3H, m), 3.53-.344 (3H, m), 3.44-3.23 (4H,), 3.15-3.01 (2H, m), 2.70-2.59 (1H, m), 2.39-2.12 (1H, m), 2.08-1.93 (1H, m), 1.17-1.09 (3H, m), 1.09-0.98 (3H, m), 0.97-0.78 (3H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７７０．６、０．９５分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｓ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０２６．６、１．５８分（方法Ａ）。
１１．３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、３２％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.17-8.95 (1H, m), 8.77-8.59 (1H, m), 8.02-7.88 (1H, m), 7.87-7.74 (1H, m), 7.45-7.38 (2H, m), 7.38-7.32 (2H, m), 7.32-7.27 (2H, m), 7.18-7.11 (1H, m), 7.06-6.99 (3H, m), 6.51-6.34 (1H, m), 5.55-5.10 (4H, m), 4.02-3.88 (4H, m), 3.88-3.71 (2H, m), 3.69-3.60 (1H, m), 3.60-3.54 (3H, m), 3.54-3.45 (3H, m), 3.44-3.37 (2H, m), 3.36-3.24 (3H, m), 3.16-3.02 (2H, m), 2.72-2.58 (1H, m), 2.40-2.20 (1H, m), 2.14-1.93 (1H, m), 1.52-1.33 (2H, m), 1.21-1.02 (5H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８１２．５、０．９１分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８８４．６、１．３６分（方法Ａ）。２５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、８２％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ9.10-8.93 (1H, m), 8.78-8.61 (1H, m), 7.96-7.83 (1H, m), 7.82-7.70 (1H, m), 7.48-7.26 (6H, m), 7.20-7.08 (1H, m), 7.08-6.98 (3H, m), 6.55-6.38 (1H, m), 5.65-5.45 (1H, m), 5.45-5.25 (2H, m), 5.25-5.08 (1H, m), 3.62-3.53 (2H, m), 3.53-3.45 (2H, m), 3.45-3.35 (2H, m), 3.34-3.17 (2H, m), 3.16-3.05 (2H, m), 3.05-2.92 (3H, m), 2.58-2.39 (2H, m), 2.26-2.02 (1H, m), 2.02-1.82 (1H, m), 1.42-1.23 (3H, m), 1.23-1.06 (3H, m), 0.92-0.73 (3H, m).ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７８４．４、１．０１分（方法Ａ）。
（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−メトキシ−２−メチルプロピル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−リンカー−ペイロード、ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋８９５．３、１．３７分（方法Ａ）。
２６．８ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、７９％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ9.06-8.90 (1H, m), 8.88-8.73 (1H, m), 8.72-8.63 (1H, m), 7.96-7.91 (1H, m), 7.90-7.69 (2H, m), 7.45-7.30 (8H, m), 7.29-7.24 (1H, m), 7.19-7.07 (3H, m), 7.06-6.98 (3H, m), 6.00-5.84 (1H, m), 5.62-5.32 (2H, m), 5.17-5.03 (2h, m), 4.92-4.82 (2H, m), 4.81-4.70 (3H, m), 4.62-4.49 (2H, m), 4.11-3.99 (1H, m), 3.97-3.86 (2H, m), 3.83-3.73 (1H, m), 3.62-3.45 (7H, m), 3.44-3.28 (4H, m), 3.22-3.05 (5H, m), 3.04-2.96 (1H, m), 2.92-2.71 (4H, m), 2.43-2.33 (1H, m),2.04-1.85 (2H, m), 1.66-1.51 (m, 1H), 1.50-1.41 (1H, m), 1.36-1.30 (3H, m), 1.30-1.24 (3H, m), 1.08-0.98 (1H, m), 0.89-0.79 (2H, m), 0.77-0.65 (3H, m).ＮＭＲによって、回転異性体の混合物を観察することができる。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ７５３．３、０．９８分（方法Ａ）。
（Ｓ）−２−（（（（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパン酸
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（６０℃、３日間）によって、逆相カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、標題化合物を調製した（８ｍｇ、１７％、ＴＦＡ塩として）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６９．４、Ｒｔ３．２１分。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 12.89 (1H, br s), 8.97 (1H, br s), 8.54 (1H, br s), 7.97 (1H, d, 3.9Hz), 7.80-7.70 (1H, m), 7.45-7.30 (7H, m), 7.17-7.08 (1H, m), 6.99 (2H, s), 5.84 (1H, s), 5.40 (1H, d, 15.3Hz), 5.25 (1H, d, 56Hz), 5.06 (1H, d, 15.3Hz), 4.63-4.54 (1H, m), 4.21-4.11 (1H, m), 4.06-3.88 (2H, m), 3.80-3.63 (4H, m), 3.34-3.23 (2H, m), 2.40-2.35 (1H, m), 2.00-1.85 (1H, m), 1.58-1.46 (1H, m), 1.35 (3H, d, 6.2Hz), 1.32-1.21 (1H, m), 0.95 (3H, s), 0.71 (3H, s).１ＨはＤＭＳＯの下に隠されており、ＯＨは見られない。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）オキシ）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ＤＭＦ１ｍＬ中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（４０ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．２９９ｍＬ、１．７１２ｍｍｏｌ）を、続いて、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（３９．９ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）によって完了したら、１−（２−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（リンカー１、ＴＦＡ塩）（６６．１ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。別の１−（２−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（リンカー１、ＴＦＡ塩）（６６．１ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。酢酸エチルおよび冷水を添加し、有機層をブラインで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（４ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ、１８ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、２９％、純度８５％）の後に、無色油状物として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９１１．５、Ｒｔ１．２７分。
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブチル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）カルバメート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）オキシ）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１８ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１ｍＬ）および水（０．５００ｍＬ）の混合物に溶かした。ＴＦＡ（０．０６５ｍＬ、０．８４０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６０℃で７日間撹拌した。逆相カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、所望の生成物（９ｍｇ、５９％、ＴＦＡ塩として）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６９．５、Ｒｔ３．３５分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 比が1:1の回転異性体の混合物): δ9.02 (1H, br s), 8.68 (1H, br s), 7.98 (1H, s), 7.82-7.73 (1H, m), 7.44-7.31 (6H, m), 7.16-7.10 (1H, m), 6.97および6.96 (2H, 一重線が2本、回転異性体), 5.84および5.84 (1H, 一重線が2本、回転異性体), 5.41 (1H, d, 15.4Hz), 5.27 (1H, d, 54Hz), 5.06 (1H, d, 15.4Hz), 4.62-4.57 (1H, m), 4.05-3.90 (2H, m), 3.82-3.67 (2H, m), 3.57-3.49 (2H, m), 3.46-3.07 (8H, m), 2.42-2.36 (1H, m), 1.98-1.85 (2H, m), 1.58-1.49 (1H, m), 1.38-1.23 (4H, m), 1.01および0.97 (3H, 一重線が2本、回転異性体), 0.69および0.67 (3H, 一重線が2本、回転異性体).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−１４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−２−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロパノイル）−４，４−ジメチル−８−オキソ−７，１２−ジオキサ−２，９−ジアザテトラデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードヒドロキシルでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。精製せず。無色油状物（４０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、収率５５％、純度５２％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９１２．２、Ｒｔ１．３４分。
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブチル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（６０℃、２９時間）によって、標題化合物を調製した。逆相カラムクロマトグラフィーによって精製、無色固体（１９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、収率９４％、ＴＦＡ塩）。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７６９．３、Ｒｔ３．７９分。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.04 (1H, br s), 8.73 (1H, br s), 7.97-7.93 (1H, m), 7.78-7.72 (1H, m), 7.44-7.30 (6H, m), 7.16-7.09 (1H, m), 7.00 (2H, s), 6.93-6.88 (1H, m), 5.84 (1H, s), 5.40 (1H, d, 15Hz), 5.25 (1H, d, 54Hz), 5.06 (1H, d, 15Hz), 4.62-4.56 (1H, m), 4.05-3.65 (4H, m), 3.45-3.40 (2H, m), 3.37-3.15 (2H, m), 3.12-3.05 (2H, m), 2.42-2.33 (1H, m), 2.00-1.85 (2H, m), 1.60-1.50 (1H, m), 1.35 (3H, d, 5.9Hz), 1.32-1.24 (1H, m), 0.93 (3H, s), 0.73 (3H, s).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−アセトキシプロパノイル）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，４−ジメチル−８−オキソ−７，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−オクタオキサ−２，９−ジアザドトリアコンチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードヒドロキシルでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。精製せず。無色油状物（２８ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、粗製）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ １１７５．４、［Ｍ＋ＮＨ４］＋ １１９２．５、Ｒｔ１．３４分。
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブチル（２３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコシル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相カラムクロマトグラフィーによって精製。ＴＦＡ塩としての無色固体（２．３ｍｇ、２．００５μｍｏｌ、収率９％、純度１００％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ １０３３．３；Ｒｔ４．０２分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
カラムクロマトグラフィー（４０ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製。無色油状物（５００ｍｇ、０．６０４ｍｍｏｌ、収率６０％、純度９６％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９５．６、Ｒｔ１．２０分。
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタン酸（９８０ｍｇ、１．００５ｍｍｏｌ）およびＮ−（２−アミノエチル）マレイミド（ＴＦＡ塩、５１１ｍｇ、２．０１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶かし、ＤＩＰＥＡ（０．８７８ｍｌ、５．０３ｍｍｏｌ）、続いて、ＨＡＴＵ（５７３ｍｇ、１．５０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をＥＡで希釈し、ブライン（３回）で洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（４０ｇ、シリカゲル、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、無色油状物（５００ｍｇ、０．６０４ｍｍｏｌ、収率６０％、純度９６％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９５．６、Ｒｔ１．２０分。
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製、無色固体（１１２ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ、ＴＦＡ塩として収率５５％）。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２００ｍｇ、０．２５２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４ｍｌ）に溶かした。ＴＦＡ（１．９４ｍｌ、２５．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。濃縮し、逆相クロマトグラフィーによって精製して、無色固体（１１２ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ、ＴＦＡ塩として収率５５％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６９５．４、Ｒｔ３．０２分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 比が5:1の回転異性体の混合物、副回転異性体のいくつかのピークは明確に帰属できない): δ 8.96 (1.2H, br s), 8.66 (1.2H, br s), 7.85-7.80 (2H, m), 7.80-7.75 (1H, m), 7.44-7.31 (6.8H, m), 7.16-7.09 (1.6H, m), 7.01 (0.4H, s), 6.99 (2H, s), 6.17 (1H, s), 5.72 (0.2H, s), 5.55 (0.2H, d, 15.9Hz), 5.46 (0.2H, d, 15.9Hz), 5.33 (1H, d, 15.0Hz), 5.17-5.05 (2.2H, m), 4.80-4.74 (0.2H, m), 4.57-4.50 (1H, m), 4.47-4.41 (0.2H, m), 4.04-3.99 (0.4H, m), 3.95-3.90 (2H, m), 3.41 (2H, t, 6.0Hz), 3.34-2.98 (5.2H, m), 2.31-2.22 (1.2H, m), 2.12 (1H, d, 13.8Hz), 2.08-2.02 (0.2H, m), 1.99-1.89 (1.2H, m), 1.82 (1H, d, 13.8Hz), 1.73-1.58 (1H, m), 1.35 (3H, d, 6.0Hz), 1.11 (0.6H, s), 1.04 (0.6H, s), 1.00 (3H, s), 0.92 (3H, s), 0.77 (0.6H, d, 6.0Hz).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
カラムクロマトグラフィー（２４ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製。無色油状物（１０８ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、収率４４％、純度８５％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８３９．５、Ｒｔ１．２１分。
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製、ＴＦＡ塩としての無色固体（２３ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、収率４８％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７３９．４、Ｒｔ３．２０分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 比が5:1の回転異性体の混合物、副回転異性体のいくつかのピークははっきり確認できない): δ 8.93 (1.2H, br s), 8.61 (1.2H, br s), 7.86-7.76 (2.6H, m), 7.72-7.67 (1H, m), 7.60-7.56 (0.2H, m), 7.46-7.30 (7.2H, m), 7.16-7.09 (1.8H, m), 6.99 (2.4H, br s), 6.19 (1H, s), 5.69 (0.2H, s), 5.58 (0.2H, d, 15.0Hz), 5.48 (0.2H, d, 15.0Hz), 5.33 (1H, d, 15.0Hz), 5.20-5.05 (2.2H, m), 4.81-4.75 (0.2H, m), 4.58-4.51 (1.2H, m), 4.05-3.90 (2.4H, m), 3.37-3.25 (7.2H, m), 3.15-3.00 (5.2H, m), 2.60-2.55 (1.2H, m), 2.32-2.25 (2H, m), 2.21 (1H, d, 13.8Hz), 2.12-2.02 (0.4H, m), 2.00-1.90 (2.2H, m), 1.74-1.60 (1H, m), 1.35 (3H, d, 6.6Hz), 1.13 (0.6H, s), 1.07 (0.6H, s), 1.04 (3H, s), 0.93 (3H, s), 0.77 (0.6H, d, 5.4Hz).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−３−オキソプロピル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
精製せず。粗製の化合物
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７８１．４、Ｒｔ１．１９分。
（Ｒ）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−３−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−２，２−ジメチルプロパンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製、ＴＦＡ塩としての無色固体（２．４ｍｇ、３．０２μｍｏｌ、収率７％、純度１００％）。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８１．２；Ｒｔ３．１３分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物、主回転異性体のピークは報告済み): δ 8.95 (1H, br s), 8.67 (1H, br s), 7.84-7.73 (2H, m), 7.65 (1H, d, 3.7Hz), 7.45-7.28 (6H, m), 7.15-7.05 (1H, m), 6.94 (2H, s), 6.42 (1H, s), 5.22-5.18 (2H, m), 5.16-5.07 (1H, m), 4.57-4.51 (1H, m), 3.95-3.85 (2H, m), 3.40-3.25 (3H, m), 3.15-3.00 (3H, m), 2.30-2.22 (1H, m), 1.97-1.87 (1H, m), 1.80-1.65 (1H, m), 1.34-1.30 (6H, m), 1.02 (3H, s).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−（（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−３−オキソプロピル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
精製なし。粗製の化合物
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８２５．４、Ｒｔ１．２０分。
（Ｒ）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）−３−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−２，２−ジメチルプロパンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製、ＴＦＡ塩としての無色固体（２．４ｍｇ、２．８６μｍｏｌ、収率６％、純度１００％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７２５．３；Ｒｔ３．２８分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物、主回転異性体のピークは報告済み): δ 8.93 (1H, br s), 8.63 (1H, br s), 7.83-7.72 (1H, m), 7.71-7.66 (2H, m), 7.46-7.26 (6H, m), 7.13-7.06 (1H, m), 6.99 (2H, s), 6.43 (1H, s), 5.25-5.17 (2H, m), 5.16-5.03 (1H, m), 4.57-4.51 (1H, m), 3.95-3.83 (2H, m), 3.46-3.39 (2H, m), 3.34-3.21 (3H, m), 3.19-3.01 (4H, m), 2.98-2.86 (1H, m), 2.30-2.22 (1H, m), 1.97-1.87 (1H, m), 1.75-1.60 (1H, m), 1.40 (3H, s), 1.34 (3H, d, 6.2Hz), 1.02 (3H, s).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）−２，２−ジメチルプロピル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードヒドロキシルでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。精製せず。無色油状物（２７ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、粗製）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８５３．４、Ｒｔ１．３３分。
（Ｒ）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−２，２−ジメチルプロピル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（６０℃、１７時間）によって、標題化合物を調製した。ＴＦＡ塩としての無色固体（４ｍｇ、４．８５μｍｏｌ、収率１５％、純度１００％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１１．３；Ｒｔ３．５９分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物、主回転異性体のピークは報告済み): δ 9.01 (1H, br s), 8.73 (1H, br s), 7.90 (1H, d, 3.8Hz), 7.80-7.74 (1H, m), 7.44-7.30 (6H, m), 7.16-7.08 (2H, m), 6.99 (2H, s), 6.04 (1H, s), 5.36 (1H, d, 15.2Hz), 5.22-5.04 (2H, m), 4.59-4.54 (1H, m), 4.05-3.85 (2H, m, 水のピークと重複), 3.80-3.72 (2H, m), 3.45 (2H, t, 6.0Hz), 3.40-3.25 (2H, m), 3.14-3.08 (2H, m), 2.36-2.28 (1H, m), 2.00-1.90 (1H, m), 1.80-1.68 (1H, m), 1.34 (3H, d, 6.2Hz), 0.87 (3H, s), 0.80 (3H, s).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−アセトキシプロパノイル）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−１３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，４−ジメチル−７−オキソ−６，１１−ジオキサ−２，８−ジアザトリデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードヒドロキシルでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。精製せず。無色油状物（３７ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、粗製）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９７．５、Ｒｔ１．３４分。
（Ｒ）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−２，２−ジメチルプロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（６０℃、１６時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物を得た。ＴＦＡ塩としての無色固体（７．７ｍｇ、７．９８μｍｏｌ、収率１９％、純度９０％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７５５．３；Ｒｔ３．６０分。1H-NMR (DMSO, 600MHz 回転異性体の混合物、主回転異性体のピークは報告済み): δ 9.00 (1H, br s), 8.70 (1H, br s), 7.90 (1H, d, 3.9Hz), 7.84-7.74 (1H, m), 7.45-7.32 (6H, m), 7.16-7.09 (1H, m), 7.01 (2H, s), 6.94 (1H, t, 5.9Hz), 6.07 (1H, s), 5.37 (1H, d, 15.3Hz), 5.21-5.06 (2H, m), 4.60-4.53 (1H, m), 4.07-3.85 (2H, m), 3.80-3.70 (2H, m, 水のピークと重複), 3.60-3.22 (7H, m, 水のピークと重複), 3.20-3.00 (3H, m), 2.35-2.27 (1H, m), 2.00-1.90 (1H, m), 1.85-1.70 (1H, m), 1.34 (3H, d, 6.1Hz), 0.91 (3H, s), 0.83 (3H, s).
Figure 2016516035
Figure 2016516035
ステップ１：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−１８−アジド−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロパノイル）−４，４−ジメチル−６−オキソ−１０，１３，１６−トリオキサ−２，７−ジアザオクタデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタン酸（６０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）および１１−アジド−３，６，９トリオキサウンデカン−１−アミン（０．０１７ｍｌ、０．０８６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かし、ＤＩＰＥＡ（０．０３７ｍｌ、０．２１４ｍｍｏｌ）、続いて、ＨＡＴＵ（２４．４２ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＥＡで希釈し、ブライン（×３）で洗浄した。合わせた有機層を乾燥し、濃縮して、所望の生成物３７ｍｇ（収率１００％）を得、これをさらに精製せずに、次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８７３．５、Ｒｔ１．２７分。
ステップ２：（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−１８−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−２−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロパノイル）−４，４−ジメチル−６−オキソ−１０，１３，１６−トリオキサ−２，７−ジアザオクタデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
アセトニトリル（１ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−１８−アジド−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロパノイル）−４，４−ジメチル−６−オキソ−１０，１３，１６−トリオキサ−２，７−ジアザオクタデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（ステップ１）（３７ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）および１−（プロパ−２−イン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（９．９４ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）に、水（１ｍＬ）中のＣｕＩ（９．３４ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）の溶液を、続いて、ＴＥＡ（６．８３μｌ、０．０４９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で６０時間撹拌した。反応混合物を濾過し、酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（１２ｇシリカゲル、メタノール中の０〜２０％ＤＣＭ）によって精製した。無色油状物（２４ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、収率２７％、純度５５％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ １００８．５、Ｒｔ１．１５分。
ステップ３：（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（２−（２−（２−（２−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物（２．８ｍｇ、２．６０μｍｏｌ、収率２１．６８％、ＴＦＡ塩）を無色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９０８．５、Ｒｔ３．０８分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 比が5:1の回転異性体の混合物、副回転異性体のいくつかのピークは明確に帰属できない): δ 8.97 (1.2H, br s), 8.69 (1.2H, br s), 7.96 (1.2H, s), 8.03-7.93 (0.2H, m), 7.85-7.75 (3.4H, m), 7.59-7.55 (0.2H, m), 7.45-7.29 (7.4H, m), 7.16-7.09 (1.6H, m), 7.07 (2H, s), 6.21 (1H, s), 5.72 (0.2H, s), 5.59 (0.2H, d, 16.2Hz), 5.48 (0.2H, d, 16.2Hz), 5.34 (1H, d, 15.0Hz), 5.20-5.06 (2.2H, m), 4.82-4.76 (0.2H, m), 4.65 (2.4H, s), 4.57-4.52 (1H, m), 4.50-4.44 (2.8H, m), 4.07-4.02 (0.2H, m), 3.97-3.93 (2H, m), 3.38 (2.4H, t, 5.1Hz), 3.52-3.40 (10H, m), 3.32-3.25 (2.4H, m), 3.17-3.12 (2.4H, m), 3.07-3.02 (0.4H, m), 2.32-2.25 (1.2H, m), 2.22 (1H, d, 15.0Hz), 2.12-2.01 (0.6H, m), 2.00-1.90 (2.2H, m), 1.75-1.60 (1H, m), 1.36 (3H, d, 6.0Hz), 1.15 (0.6H, s), 1.09 (0.6H, s), 1.06 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.78 (0.6H, d, 6.0Hz).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−１４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−メチル−３，８−ジオキソ−７，１２−ジオキサ−２，４，９−トリアザテトラデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードヒドロキシルでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（２４ｇ、シリカゲル）によって精製。無色油状物（７０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ、収率５１％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ９１０．４、Ｒｔ１．３５分。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物（３５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ、収率４９％、ＴＦＡ塩）を無色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１０．２、Ｒｔ４．１０分。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 8.94 (1H, bs), 8.48 (1H, bs), 7.92 (1H, d, 3.9Hz), 7.78-7.70 (1H, m), 7.45-7.25 (7H, m), 7.15-7.07 (1H, m), 7.03 (2H, s), 6.45 (1H, d, 7.4Hz), 5.56 (1H, s), 5.39 (1H, d, 15.3Hz), 5.30-5.07 (2H, m), 4.05-3.85 (4H, m), 3.84-3.70 (1H, m), 3.60-3.45 (6H, m), 3.43-3.20 (6H, m), 3.12-3.02 (2H, m), 2.47-2.37 (1H, m), 2.30-2.10 (1H, m), 1.82-1.67 (1H, m), 1.54-1.35 (2H, m), 1.30-1.20 (1H, m), 1.17-1.05 (6H, m), 0.97-0.89 (1H, m).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードアミンでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。精製せず（３６ｍｇ、純度３８％、粗製、収率６９％、０．０１６ｍｍｏｌ）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８５１．５；Ｒｔ１．２５分。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）−２，２−ジメチルブチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（６０℃、２０時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＴＦＡ塩としての無色固体（６ｍｇ、６．８２μｍｏｌ、収率４３％、純度９２％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７０９．４；Ｒｔ３．２７分。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.05 (1H, br s), 8.75 (1H, br s), 7.93 (1H, d, 3.8Hz), 7.80-7.74 (1H, m), 7.74-7.66 (1H, m), 7.44-7.30 (6H, m), 7.16-7.09 (1H, m), 6.99 (2H, s), 5.84 (1H, s), 5.38 (1H, d, 15.4Hz), 5.25-5.19 (1H, m), 5.09 (1H, d, 15.4Hz), 4.63-4.55 (1H, m), 4.05-3.90 (2H, m), 3.58-3.53 (2H, m, 水のピークと重複), 3.35-3.15 (2H, m), 2.86-2.78 (2H, m), 2.41-2.35 (1H, m), 2.31-2.23 (2H, m), 1.97-1.85 (2H, m), 1.41-1.32 (4H, m), 1.17-1.06 (1H, m), 0.92 (3H, s), 0.79 (3H, s).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパンアミド）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードアミンでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。精製せず（３３ｍｇ、収率１００％、粗製、０．０３７ｍｍｏｌ）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９５．５；Ｒｔ１．２６分。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパンアミド）−２，２−ジメチルブチル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（６０℃、２０時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＴＦＡ塩としての無色固体（１０ｍｇ、１１．０２μｍｏｌ、収率３０％、純度９７％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７５３．４；Ｒｔ３．３３分。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.05 (1H, br s), 8.75 (1H, br s), 7.93 (1H, d, 3.6Hz), 7.80-7.74 (1H, m), 7.57-7.52 (1H, m), 7.45-7.30 (6H, m), 7.16-7.07 (1H, m), 7.01 (2H, s), 5.84 (1H, s), 5.38 (1H, d, 15.3Hz), 5.32-5.17 (1H, m), 5.09 (1H, d, 15.3Hz), 4.63-4.55 (1H, m), 4.05-3.85 (2H, m, 水のピークと重複), 3.55-3.51 (4H, m), 3.47-3.43 (2H, m), 3.40-3.15 (2H, m), 2.90-2.80 (2H, m), 2.42-2.32 (1H, m), 2.23-2.16 (2H, m), 1.92-1.88 (1H, m), 1.45-1.30 (4H, m), 1.20-1.10 (1H, m), 0.93 (3H, s), 0.80 (3H, s).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）モルホリン−２−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードアミンでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（２４ｇ、シリカゲル）によって精製した。無色油状物（５０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ、収率７２％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４９．２；Ｒｔ１．２６分。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）モルホリン−２−カルボキサミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、６時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＴＦＡ塩としての無色固体（１２ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、収率４５％、純度９５％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４９．２；Ｒｔ３．２７分。1H-NMR (DMSO, 600MHz, 回転異性体の混合物, 120℃): δ 7.83-7.77 (1H, m), 7.67 (1H, d, 3.7Hz), 7.45-7.32 (3H, m), 7.30-7.15 (3H, m), 7.10-7.07 (1H, m), 6.93 (2H, s), 5.40-5.10 (4H, m), 4.40-4.15 (1H, m), 4.05-3.85 (4H, m), 3.76-3.62 (4H, m), 3.55-3.25 (7H, m), 2.95-2.85 (1H, m), 2.75-2.55 (5H, m), 2.37-2.20 (1H, m), 1.55-1.25 (3H, m), 1.05-0.85 (1H, m).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパノイル）モルホリン−２−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードアミンでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（１２ｇ、シリカゲル）によって精製した。黄色油状物（３０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、収率５７％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９３．３；Ｒｔ１．２７分。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパノイル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）モルホリン−２−カルボキサミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、４時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＴＦＡ塩としての無色固体（２２ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、収率７２％、純度９９％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９３．１；Ｒｔ３．５６分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）モルホリン−２−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードアミンでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（４ｇ、シリカゲル）によって精製した。黄色油状物（１３ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、収率３５％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９１．３；Ｒｔ１．３１分。
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）モルホリン−２−カルボキサミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、６時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＴＦＡ塩としての無色固体（１０ｍｇ、１０．７２μｍｏｌ、収率７４％、純度９７％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９１．３；Ｒｔ３．７２分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）モルホリン−２−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードアミンでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（１２ｇ、シリカゲル）によって精製した。無色油状物（１５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、収率６０％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４９．２；Ｒｔ１．３０分。
（Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）モルホリン−２−カルボキサミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、３時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＴＦＡ塩としての無色固体（１５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、収率９５％、純度９９％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４９．１；Ｒｔ３．５６分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）モルホリン−２−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードアミンでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（４ｇ、シリカゲル）によって精製した。黄色油状物（２２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、収率８４％）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９１．２；Ｒｔ１．３３分。
（Ｒ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）モルホリン−２−カルボキサミド
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、６時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＴＦＡ塩としての無色固体（１５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、収率６６％、純度９９％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ７９１．２；Ｒｔ３．８８分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−メチル−３，８−ジオキソ−７，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−オクタオキサ−２，４，９−トリアザドトリアコンチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
ペイロードをペイロードヒドロキシルでリンカー成分に結合する際に記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。精製なし。黄色油状物（６３ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、収率８３％、粗製）。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ １１７４．６、［Ｍ＋ＮＨ４］＋ １１９１．７、Ｒｔ１．３５分。
（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル（２３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコシル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカー−ペイロードの組合せをＢｏｃ脱保護するための一般方法において記載した方法と同様の方法（室温、１時間）によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物（１０ｍｇ、８．３３μｍｏｌ、収率１６％、ＴＦＡ塩）を無色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂｖ２）：［Ｍ＋Ｈ］＋ １０７４．４、Ｒｔ４．４９分。
４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（３−（Ｎ−（（Ｒ）−１−（３−ベンジル−７−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）−２−メチルプロピル）−４−メチルベンズアミド）プロピル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカーを式（ＩＩ）のペイロード化合物中のアミンに結合するための一般手順において記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、無色固体（８ｍｇ、６．７４μｍｏｌ、収率１４％、純度９４％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ １１１５．６；Ｒｔ５．７１分。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 9.96 (1H, s), 8.23 (1H, d, J=8.6Hz), 8.07 (1H, d, J=7.5Hz), 7.83-7.74 (2H, m), 7.65 (1H, dd, J=8.6, 2.1Hz), 7.61-7.54 (2H, m), 7.41-7.10 (12H m), 7.00 (2H, s), 6.77 (1H, t, J=5.9Hz), 5.97 (2H, br s), 5.88 (1H, d, J=16.3Hz), 5.53 (1H, d, J=10.5Hz), 5.07 (1H, d, J=16.3Hz), 4.89-4.75 (2H, m), 4.43-4.33 (1H, m), 4.19 (1H, dd, J=8.6, 6.7Hz), 3.40-3.20 (6H, m), 3.08-2.90 (2H, m), 2.79-2.68 (1H, m), 2.46-2.40 (2H, m), 2.31 (3H, s), 2.24-2.04 (2H, m), 2.02-1.90 (1H, m), 1.76-1.10 (10H, m), 0.92-0.79 (9H, m), 0.48 (3H, d, J=6.4Hz).
４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（３−（Ｎ−（（Ｒ）−１−（３−ベンジル−７−クロロ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）−２−メチルプロピル）−４−メチルベンズアミド）プロピル）カルバメート
Figure 2016516035
リンカーを式（ＩＩ）のペイロード化合物中のアミンに結合するための一般手順において記載した方法と同様の方法によって、標題化合物を調製した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、無色固体（２６ｍｇ、２３μｍｏｌ、収率３８％、純度９９％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ １１１５．５；Ｒｔ５．５８分。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ 9.96 (1H, s), 8.11-8.04 (2H, m), 7.90 (1H, s), 7.83-7.76 (1H, d, J=8.6Hz), 7.61-7.52 (3H, m), 7.29-7.11 (12H, m), 7.00 (2H, s), 5.99 (2H, br s), 5.76 (1H, d, J=10.0Hz), 4.90-4.77 (2H, m), 4.42-4.32 (1H, m), 4.23-4.12 (2H, m), 3.95-3.85 (1H, m), 3.42-3.25 (3H, m), 3.06-2.88 (2H, m), 2.64-2.53 (6H, m), 2.31 (3H, s), 2.25-2.05 (1H, m), 2.02-1.87 (1H, m), 1.75-1.65 (1H, m), 1.65-1.29 (7H, m), 1.25-1.10 (3H, m), 0.97 (3H, d, J=6.6Hz), 0.87-0.79 (6H, m), 0.57-0.50 (3H, m).
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）オキシ）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ＤＭＦ５ｍＬ中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．３７４ｍＬ、２．１４０ｍｍｏｌ）を、続いて、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（５０ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）によって完了したら、１−（２−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（リンカー１、ＴＦＡ塩）（１８０ｍｇ、０．６０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。酢酸エチルおよび冷水を添加し、有機層をブラインで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物をカラムクロマトグラフィーによる精製（４ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ、９ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ、１４％）の後に、無色油状物として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ９１１．７、１．２６分。
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−アセトキシプロパノイル）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−９−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−４，４，１４，１４−テトラメチル−８，１２−ジオキソ−７，１３−ジオキサ−２，９−ジアザペンタデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート
Figure 2016516035
Ｎ２下で：ＤＭＦ５ｍＬ中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．３７４ｍＬ、２．１４０ｍｍｏｌ）を、続いて、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（５０ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）によって完了したら、ｔｅｒｔ−ブチル３−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）プロパノエート（リンカー２、ＴＦＡ塩）（５４．６ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。酢酸エチルおよび冷水を添加し、有機層をブラインで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。Ｉｓｏｌｕｔｅに吸収させた。所望の生成物を、カラムクロマトグラフィーによる精製（４ｇシリカゲル、ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ、４０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ、５６％）の後に、無色油状物として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＭＨ＋ ９９５．８、１．４７分。
３−（（（（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブトキシ）カルボニル）（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）プロパン酸
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−アセトキシプロパノイル）−３−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−９−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−４，４，１４，１４−テトラメチル−８，１２−ジオキソ−７，１３−ジオキサ−２，９−ジアザペンタデシル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（４０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１ｍＬ）および水（１ｍＬ）の混合物に溶かした。ＴＦＡ（０．１５５ｍＬ、２．０１０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、６０℃で３日間撹拌した。
逆相カラムクロマトグラフィーによる精製の後に所望の生成物（１３ｍｇ、３５％、ＴＦＡ塩として）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：ＭＨ＋ ７９７．４、３．４３分。室温での１Ｈ−ＮＭＲによると回転異性体の混合物であり、一部のピークは、水の下に隠されている。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 12.27 (1H, br s), 8.98 (1H, br s), 8.63 (1H, br s), 7.96 (1H, s), 7.76 (1H, s), 7.45-7.30 (6H, m), 7.16-7.09 (1H, m), 6.97および6.96 (2H, 一重線が2本、回転異性体), 5.83 (1H, s), 5.45-5.37 (1H, m), 5.26 (1H, d, 54Hz), 5.09-5.03 (1H, m), 4.62-4.57 (1H, m), 4.04-3.90 (2H, m), 3.82-3.66 (2H, m), 2.46-2.35 (3H, m), 2.00-1.85 (2H, m), 1.55-1.20 (5H, m), 1.03および0.96 (3H, 一重線が2本、回転異性体), 0.67および0.63 (3H, 一重線が2本、回転異性体).
（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブチル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
Figure 2016516035
（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）の混合物に溶かした。ＴＦＡ（０．２２２ｍＬ、２．８８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６０℃で２０時間撹拌した。
逆相カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、所望の生成物（１７ｍｇ、３４％、ＴＦＡ塩として）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：ＭＨ＋ ７２５．４、３．５９分。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.01 (1H, br s), 8.68 (1H, br s), 7.96 (1H, s), 7.76 (1H, s), 7.45-7.30 (6H, m), 7.15-7.03 (2H, m), 6.99 (2H, s), 5.84 (1H, s), 5.40 (1H, d, 15Hz), 5.25 (1H, d, 54Hz), 5.06 (1H, d, 15Hz), 4.62-4.56 (1H, m), 4.05-3.65 (4H, m), 3.45-3.40 (2H, m), 3.37-3.15 (2H, m), 3.12-3.05 (2H, m), 2.42-2.33 (1H, m), 2.00-1.85 (2H, m), 1.60-1.50 (1H, m), 1.35 (3H, d, 5.9Hz), 1.32-1.24 (1H, m), 0.93 (3H, s), 0.73 (3H, s).
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブチル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
ステップ１（ａ）、活性化：ＤＭＦ（４ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（１２８ｍｇ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（３０４μｌ）およびビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（８８ｍｇ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が所望の中間体生成物への変換を完了したことを示した。
ステップ１（ｂ）、アミノ分解：上記の粗製の混合物に、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート（９８ｍｇ）を添加した。ＲＭを５０℃でさらに２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、所望の中間体生成物への変換を示した。ＲＭを分液漏斗に移し、脱イオン水（４０ｍＬ）および酢酸エチル（４０ｍＬ）を添加した。抽出の後に、水層を酢酸エチル（４０ｍｌ）で再抽出し、次いで、合わせた有機物を飽和ブライン（８０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、濾液を真空中で濃縮して、黄色油状物を得た。粗収量：２７０ｍｇ、これをそのまま、次のステップに送った。
ステップ２：ＢＯＣおよびＭＯＭおよびアシル脱保護：ステップ１（ｂ）からの粗生成物をアセトニトリル（１ｍｌ）に溶かし、６Ｍ ＨＣｌ（１ｍＬ）を添加した。ＲＭを６０℃で３時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が所望の最終生成物への脱保護をほぼ完了したことを示した。ＲＭを０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、得られた透明な溶液を逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。生成物含有画分を終夜凍結乾燥して、白色のふわふわした粉末を得た。収量：２４．７ｍｇ
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．８５分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４１．３；方法Ａ。
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝３．３０分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７４１．３；方法Ｂ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）は標的構造と一致した。
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブチル（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバメート
ステップ１：無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中のトリホスゲン（１１９ｍｇ）の撹拌溶液を０℃に冷却し、アルゴン雰囲気下に置いた。ＤＣＭ（２ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２，２−ジメチルブチル）プロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（８０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．２５８ｍｌ）の溶液を滴下添加し、ＲＭを室温に加温した。撹拌を室温で２時間継続した。
ステップ２：上記の粗製のＲＭを０℃に冷却し、ＤＣＭ（３ｍＬ）中のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート（１５０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．２５８ｍｌ）の溶液を滴下添加した。ＲＭを室温に加温し、撹拌を１０分間継続した。次いで、温度を５０℃に上げ、撹拌を１時間継続したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、所望の中間体生成物への変換を示した。ＲＭを高真空下で濃縮して、暗オレンジ色油状物を得た。これをそのまま、次のステップに送った。
ステップ３：ＢＯＣ、ＭＯＭ、およびアシル脱保護：ステップ２からの粗生成物をアセトニトリル（２ｍｌ）に溶かし、６Ｍ ＨＣｌ（１．６ｍＬ）を添加した。ＲＭを６０℃で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が最終生成物への脱保護を完了したことを示した。ＲＭを０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、得られた溶液を２×２ｍＬバッチに分割し、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。
生成物含有画分を合わせ、次いで、終夜凍結乾燥して、白色のふわふわした粉末を得た。収量：３４．３ｍｇ
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝０．７４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］− ７５７．３；方法Ａ。
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．９４分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７５９．２；方法Ｂ
1H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H), 9.03 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.81-7.73 (m, 1H), 7.41-7.29 (m, 1H), 7.19-7.10 (m, 1H), 7.06 (t, J=6.2Hz, 1H), 6.98 (s, 2H), 6.70-6.58 (m, 2H), 6.53 (d, J=10.5Hz, 1H), 5.79 (s, 1H), 5.37-5.21 (m, 2H), 4.95 (d, J=15.6Hz, 1H), 4.60 (q, J=6.3Hz, 1H), 4.03 (dd, J=16.1, 4.4Hz, 1H), 3.89 (dd, J=15.9, 7.4Hz, 1H), 3.82 (q, J=8.3Hz, 2H), 3.65-3.37 (m, 2H), 3.37-3.17 (m, 2H), 3.08 (q, J=5.9Hz, 2H), 2.47-2.33 (m, 1H), 2.07-1.84 (m, 2H), 1.69 (dt, J=14.2, 7.0Hz, 1H), 1.35 (d, J=6.2Hz, 4H), 0.95 (s, 3H), 0.77 (s, 3H).
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド
ステップ１：無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸（８０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（１８９μＬ）の溶液に、ＨＡＴＵ（８２ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で１０分間撹拌し、次いで、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート（９２ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で週末にかけて撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が完了したことを示した。ＲＭをジクロロメタン（４０ｍＬ）と脱イオン水（４０ｍＬ）との間で分配した。混合物を分液漏斗に移し、抽出の後に、水性相をジクロロメタン（４０ｍｌ）で再抽出した。次いで、合わせた有機物を脱イオン水（４０ｍｌ）、飽和ブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、Ｎｏ．１濾紙で濾過し、真空中で濃縮して、茶色のワックス様油状物質を得た。粗収量：２５１ｍｇ。生成物はなお多少のＤＭＦを含有したが、そのまま、次のステップに送った：
ステップ２：ＢＯＣ、ＭＯＭ、およびアシル脱保護：ステップ１からの粗生成物に、アセトニトリル（４ｍｌ）および６Ｍ ＨＣｌ（１．２ｍＬ）を添加した。ＲＭを６０℃で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が脱保護を完了して、所望の最終生成物が得られたことを示した。ＲＭを０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、得られた透明な溶液を２×２．６ｍＬバッチに分割し、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。生成物含有画分を合わせ、終夜凍結乾燥して、ベージュ／クリーム色に着色したふわふわした粉末を得た。収量：７ｍｇ
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．７２分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ７１１．３；方法Ｂ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）は標的構造と一致した。
Figure 2016516035
（Ｒ）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−ヒドロキシベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド
ステップ１：無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中の（Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−アセトキシ−Ｎ−（（（３Ｒ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）プロパンアミド）−４−（４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−フルオロ−５−（メトキシメトキシ）ベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−３，３−ジメチルブタン酸（１４４ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（４５０μＬ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１４７ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で１０分間撹拌し、次いで、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート（１６４ｍｇ）を添加した。ＲＭを室温で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、中間体生成物を得るための反応が完了したことを示した。ＲＭを真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶かした。溶液を０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、２×１．５ｍＬバッチに分割した。これらを、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。
生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、白色粉末を得た。収量：４３ｍｇ
ステップ２：ＢＯＣ、ＭＯＭ、およびアシル脱保護：ステップ１からの生成物をアセトニトリル（２ｍｌ）に溶かし、６Ｍ ＨＣｌ（１．０ｍＬ）を添加した。ＲＭを６０℃で２時間撹拌したが、この時までに、ＬＣ−ＭＳは、反応が最終生成物への脱保護を事実上完了したことを示した。ＲＭを０．２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターで濾過し、得られた溶液を２×２ｍＬバッチに分割し、逆相分取スケールＨＰＬＣ、方法Ｃによって精製した。
生成物含有画分を合わせ、次いで、終夜凍結乾燥して、白色のふわふわした粉末を得た。収量：２３．２ｍｇ
ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝２．５６分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］− ７２７．４；方法Ｂ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）は標的構造と一致した。
システイン代謝産物：
システイン代謝産物を合成するための一般手順：
Figure 2016516035
アセトニトリル（１ｍＬ）中のＢｏｃ−リンカー−ペイロード（０．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、Ｌ−システイン（１ｍｍｏｌ、１０当量）および水（０．１ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、粗製物（Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−代謝産物）をそのまま、次のステップで使用した。
先行するステップの溶液に、ＴＦＡ（１５０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ、方法Ａ）によって反応が完了したら、粗製物を逆相カラムクロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法ＣまたはＤ）、Ｈ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中のＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）の勾配によって精製した。生成物をＴＦＡ塩として単離した。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（（１Ｒ，５Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−５−メチル−３，８−ジオキソ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−７，１２−ジオキサ−２，４，９−トリアザテトラデカン−１４−イル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ １０１７．６、１．０７分。（方法Ａ）。
２１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１６％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.17-8.59 (1H, m), 8.81-8.59 (1H, m), 8.58-8.31 (3H, m), 7.83-7.69 (2H, m), 7.45-7.36 (2H, m), 7.35-7.21 (4H, m), 7.14-6.98 (2H, m), 6.43-6.23 (1H, m), 5.38-5.28 (2H, m), 5.27-5.10 (2H, m), 4.31-4.21 (1H, m), 4.15-4.03 (1H, m), 4.00-3.80 (4H, m), 3.78-3.68 (1H, m), 3.27-3.15 (5H, m), 3.14-3.02 (4H, m), 2.65-2.47 (4H, m), 2.33-2.15 (1H, m), 2.07-1.90 (1H, m), 1.46-1.32 (1H, m), 1.28-1.15 (2H, m) 1.14-1.02 (3H, m), 0.79-0.58 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９１７．６、０．８０分。（方法Ａ）。
（３Ｒ）−６−（（１Ｒ，５Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−５−メチル−３，８，１６−トリオキソ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−７，１２−ジオキサ−２，４，９，１５−テトラアザヘプタデカン−１７−イル）−５−オキソチオモルホリン−３−カルボン酸。
Figure 2016516035
４ｍｇ、０．００３７ｍｍｏｌ、９９％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ -NMR (DMSO, 600MHz): . イル-4-(2,5-ジフルオロフェニル)-1H-イミダゾール-2-イル)-2-(((3S,4R)-4-フルオロピロリジン-3-イル)メチル)-5-メチル-3,8,16-トリオキソ-42-6.21 (1H, m), 5.40-5.09 (4H, m), 4.38-4.26 (1H, m), 4.06-3.80 (5H, m), 3.80-3.68 (1H, m), 3.68-3.55 (2H, m), 3.26-3.07 (8H, m), 3.05-2.91 (1H, m), 2.80-2.69 (1H, m), 2.66-2.54 (1H, m), 2.36-2.15 (1H, m), 2.09-1.91 (1H, m), 1.47-1.35 (1H, m), 1.32-1.15 (2H, m), 1.14-1.04 (3H, m), 0.78-0.59 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９１７．４、０８４分。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（（１−（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９６７．５、１．０６分。（方法Ａ）。
１０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、６２％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.20-8.90 (1H, m), 8.69-8.23 (4H, m), 8.08-7.97 (1H, m), 7.83-7.70 (2H, m), 7.41-7.36 (2H, m), 7.35-7.29 (2H, m), 7.26-7.22 (2H, m), 7.14-7.08 (1H, m), 6.58-6.31 (1H, m), 5.39-5.07 (4H, m), 4.72-4.58 (2H, m), 4.49-4.34, (2H, m), 4.33-4.06 (4H, m), 3.92-3.81 (2H, m), 3.79-3.67 (2H, m), 3.11-2.98 (1H, m), 2.70-2.43 (4H, m), 2.38-2.18 (1H, m), 2.06-1.80 (1H, m), 1.41-1.29 (1H, m), 1.28-1.19 (1H, m), 1.18-1.02 (4H, m), 0.75-0.55 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ８６７．５、０．７８分。（方法Ａ）。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（４−（（（Ｓ）−２−（３−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）ウレイド）プロピル）アミノ）−４−オキソ−２−スルホブチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−ｃｙｓ−代謝産物（ジアステレオ異性体の混合物）：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ １０５１．５、０．９７分。（方法Ａ）。
Ｂｏｃ脱保護の後に、逆相クロマトグラフィー（ＰｒｅｐＬＣ方法Ａ）を使用して、ジアステレオ異性体の混合物を分離した。
異性体Ａ、２７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、８％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.12-8.96 (1H, m), 8.96-8.78 (1H, m), 8.48-8.24 (3H, m), 7.97-7.84 (1H, m), 7.81-7.65 (2H, m), 7.48-7.37 (2H, m), 7.36-7.24 (4H, m), 7.17-7.01 (1H, m), 6.18-6.01 (1H, m), 5.49-5.16 (4H, m), 4.34-4.20 (1H, m), 4.15-4.05 (1H, m), 3.96-3.66 (6H, m), 2.87-2.64 (4H, m), 2.61-2.39 (3H, m), , 2.13-1.97 (1H, m), 1.93-1.58 (2H, m), 1.50-1.36 (1H, m), 1.35-1.20 (1H, m, 1.19-0.93 (4H, m), 0.71-0.52 (1H, m).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９５１．５、０．７９分。（方法Ａ）。
異性体Ｂ、２８ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、８％。1H-NMR (DMSO, 600MHz): δ 9.14-8.96 (1H, m), 8.86-8.61 (1H, m), 8.51-8.24 (3H, m), 8.11-7.89 (1H, m), 7.80-7.65 (2H, m), 7.49-7.38 (2H, m), 7.37-7.23 (4H, m), 7.16-7.01 (1H, m), 6.01-5.90 (1H, m), 5.49-5.17 (4H, m), 4.35-4.19 (1H, m), 4.16-3.96 (2H, m), 3.92-3.66 (6H, m), 3.11-2.98 (1H, m), 2.89-2.77 (1H, m), 2.75-2.59 (1H, m), 2.58-2.44 (4H, m), 2.10-1.93 (1H, m), 1.72-1.56 (1H, m), 1.41-1.24 (2H, m), 1.21-1.09 (1H, m), 1.08-0.95 (3H, m), 0.75-0.53 (1H).欠測シグナルは、溶媒ピークの下に隠されている。ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：ＭＨ＋ ９５１．５、０．８１分。（方法Ａ）。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（（１Ｒ，５Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−５−メチル−３，８−ジオキソ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−７−オキサ−２，４，９−トリアザペンタデカン−１５−イル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０２９．７、１．１２分（方法Ａ）。
Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９２９．６、０．８３分（方法Ａ）。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（（１Ｒ，４Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−４−メチル−３，６−ジオキソ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−５，１０−ジオキサ−２，７−ジアザドデカン−１２−イル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９８８．５、１．１０分（方法Ａ）。
Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ８８８．５、０．７９分（方法Ａ）。
（３Ｒ）−６−（（１Ｒ，４Ｓ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−４−メチル−３，６，１４−トリオキソ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−５，１０−ジオキサ−２，７，１３−トリアザペンタデカン−１５−イル）−５−オキソチオモルホリン−３−カルボン酸。
Figure 2016516035
Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ８８８．５、０．８３分（方法Ａ）。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（６−（（（（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）オキシ）カルボニル）アミノ）ヘキシル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸。
Figure 2016516035
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ １０００．５、１．１４分（方法Ａ）。
Ｃｙｓ−代謝産物：ＬＣ／ＭＳ（ｕｐｌｃ）：Ｍ＋ ９００．４、０．８３分（方法Ａ）。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（３−（（Ｓ）−２−（（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）モルホリノ）−３−オキソプロピル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸
Figure 2016516035
ステップ１：アセトニトリル（体積：１．５ｍｌ）および水（体積：０．５００ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−４−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル）モルホリン−２−カルボキサミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（２５ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）に、Ｌ−システイン（５．３５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＭを室温で２時間撹拌した。
ステップ２：ＨＣｌ（２５％水溶液）（０．１７９ｍｌ、１．４７２ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＭを室温で２時間撹拌し、別のＨＣｌ（２５％水溶液）（０．１７９ｍｌ、１．４７２ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＭを室温で４時間撹拌した。濃縮した。
逆相クロマトグラフィーによって精製して、無色固体の複ＴＦＡ塩（１６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、収率５０％、純度９９％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８７０．２；Ｒｔ２．７３分。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（２−（（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド）エチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸
Figure 2016516035
ステップ１：アセトニトリル（体積：１．５ｍｌ）および水（体積：０．５００ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（３０ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）に、Ｌ−システイン（１３．７ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＭを室温で１６時間撹拌した。
ステップ２：ＴＦＡ（０．１４５ｍｌ、１．８８７ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＭを室温で６０時間撹拌した。濃縮した。
逆相クロマトグラフィーによって精製して、無色固体の複ＴＦＡ塩（３７ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、収率９３％、純度９９％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１６．３；Ｒｔ２．３７分。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（２−（２−（（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド）エトキシ）エチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸
Figure 2016516035
ステップ１：アセトニトリル（体積：１．５ｍｌ）および水（体積：０．５００ｍｌ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−１−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エチル）アミノ）−２，２−ジメチル−４−オキソブチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）−４−フルオロピロリジン−１−カルボキシレート（５４ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ、純度８５％）に、Ｌ−システイン（１９．９ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＭを室温で１６時間撹拌した。
ステップ２：ＴＦＡ（０．２１１ｍｌ、２．７４ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＭを６０℃で４時間撹拌した。濃縮した。
逆相クロマトグラフィーによって精製して、無色固体の複ＴＦＡ塩（４８ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、収率８１％、純度９９％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８６０．５；Ｒｔ２．５０分。
（２Ｓ）−２−アミノ−３−（（１−（（Ｓ）−２−（（（（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブトキシ）カルボニル）アミノ）−２−カルボキシエチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸
Figure 2016516035
無色粉末１１ｍｇをＴＦＡ塩（１１ｍｇ、９．８４μｍｏｌ、収率１３．２％、純度１００％）として得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８９０．３；Ｒｔ２．５４／２．６３分（２種のジアステレオ異性体）。
化合物５Ａ、５Ｄ、および５Ｅのシステイン代謝産物を調製したが、すべてが、それぞれ＜０．５ｎＭ、０．５ｎＭ、および０．６ｎＭのＩＣ−５０で、Ｅｇ５の高度に効力のある阻害薬であった。
異化代謝産物を合成するための一般プロトコール２
Figure 2016516035
水（０．１Ｍ）中の（Ｌ）−システイン（１０当量）の溶液に、ＤＭＦ（０．１Ｍ）中のＢｏｃ保護リンカー−ペイロード（１．０当量）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。反応物は、酢酸エチルを伴った。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ（０．１Ｍ）に溶かし、トリフルオロ酢酸（５０当量）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌し、その後、濃縮乾固した。ＤＣＭ中の０〜１００％メタノールで溶離するシリカクロマトグラフィーよって粗生成物を生成して、標題化合物を得た。
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（２−（（（（（３Ｓ，４Ｓ）−４−（（（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）メチル）ピロリジン−３−イル）オキシ）カルボニル）アミノ）エチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸
Figure 2016516035
収率４９％；ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ＝１．６６および１．６７分；ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ８４２．３；方法Ａ。1H-NMR (DMSO, 400MHz, 回転異性体およびジアステレオ異性体の混合物): δ 7.99-6.77 (12H, m), 5.64-4.99 (3H, m), 4.87-4.85 (1H, m), 4.53-4.51 (1H, m), 4.03-2.05 (25H, m), 1.51-0.57 (7H, m).
転位システイン代謝産物：
（３Ｒ）−６−（２−（（２−（（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−５−オキソチオモルホリン−３−カルボン酸
Figure 2016516035
（２Ｒ）−２−アミノ−３−（（１−（２−（（Ｒ）−４−（１−ベンジル−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−４−（（Ｓ）−Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−３−イル）メチル）−２−ヒドロキシプロパンアミド）−３，３−ジメチルブタンアミド）エチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）プロパン酸（１７ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（体積：０．５ｍＬ）に溶かし、ＰＢＳ緩衝液１．５ｍＬ（ｐＨ７．２）を添加した。ＲＭを室温で１０日間撹拌した。逆相クロマトグラフィーによって精製して、無色固体の複ＴＦＡ塩（９ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、収率５７％、純度９５％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ８１６．５；Ｒｔ２．５４分。
ＡＤＣの合成
以下の一般的コンジュゲーション手順に記載されている通りに、ＡＤＣを得て、特徴付けた。
抗原結合部分を有するリンカー−ペイロード（Ｌ−Ｐ）コンジュゲーションのための一般的方法
ペイロードを、２ステッププロセスにて部分還元ヒンジおよび鎖間ジスルフィドで抗原結合部分（例えば、抗体のＩｇＧ１カッパまたはラムダ）にコンジュゲートした。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体を、最初に、５０ｍＭメルカプトエチルアミン（固体として添加）を用いて３７℃で１時間から１．５時間の間部分的に還元した。脱塩および１％ｗ／ｖのＰＳ−２０洗剤の添加の後、部分還元抗体（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍｇの抗体当たり、ＤＭＳＯまたは他の適当な溶媒中に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させたリンカー−ペイロード化合物０．５〜１ｍｇの量と、４℃で終夜反応させた。抗体−薬物コンジュゲートをタンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製する。ＰＢＳでベースライン洗浄した後、コンジュゲートを５０ｍＭシトレート、ｐＨ２．７、１４０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、中和し、滅菌濾過した。表５〜６に記載されているＡＤＣを、この手順に従って調製した。この手順は、１抗体当たりペイロード４〜６分子の平均薬物負荷を与え：この一般的手順の生成物の具体例を、トラスツズマブの配列を有する抗体に付着されている連結基−ペイロード部分を同定しているとともに各コンジュゲートに関する測定ＤＡＲ値および％凝集データを提供している表５〜６に示す。表５〜６からの選択コンジュゲートに関する生物学データを以下のセクションおよび関連図で提供する。
新たなシステイン残基がタンパク質改変によってコンジュゲーション部位として導入された抗体には、異なるプロセスを使用した。全ての天然ジスルフィド結合および改変システイン残基のシステインまたはＧＳＨ付加物間に結合されたジスルフィドを還元するために、新たに調製されたＤＴＴを、抗体の事前に精製されたＣｙｓ突然変異体に、２０ｍＭの最終濃度に添加した。ＤＴＴを用いて３７℃で１時間の間インキュベーションした後、混合物を４℃でＰＢＳに対して３日間毎日緩衝剤交換を用いて透析することで、ＤＴＴを除去し、天然ジスルフィド結合を再酸化させた。代替方法は、脱塩カラム、セファデックスＧ−２５を介して還元試薬を除去することである。タンパク質が完全に還元されると、１ｍＭ酸化アスコルベート（デヒドロ−アスコルビン酸）を脱塩試料に添加し、再酸化インキュベーションを２０時間の間実施する。再酸化は鎖内ジスルフィドを回復し、一方透析は、新たに導入されたシステイン（複数可）に接続されているシステインおよびグルタチオンが透析分離されるのを可能にする。これらの方法の両方は同様の結果を生むが、ＣｕＳＯ４を使用する文献において前に記載されている再酸化プロトコールに続く試みは、タンパク質沈殿をもたらした。本明細書における全ての実施例は、上に記載されている透析プロトコールを使用する。
再酸化抗体を、マレイミド化合物０．３５ｍＭを用いて１時間の間、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．２）中で５ｍｇ／ｍｌの抗体をインキュベートすることによって化合物２２３（５Ｂ）とコンジュゲートした。反応の完了度をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニタリングし、３〜４のＤＡＲを典型的に得た。ｃＫｉｔＡに関し、このプロセスによって作製された試料についてのＤＡＲは３．２であった。改変抗体は同条件下でわずかに高いＤＡＲを与え、ｃＫｉｔＢ−５ＢコンジュゲートはＤＡＲ＝３．９であり、ｃＫｉｔＣ−５ＢコンジュゲートはＤＡＲ＝４．０であった。ＤＡＲ測定をＭＳによってさらに検証した。
上記の手順によって、抗体としてトラスツズマブのような抗ＨＥＲ２抗体（本明細書において「ＴＢＳ」と称される）を使用し、以下のＡＤＣを調製して、ペイロード化合物として式ＩＩのＥｇ５阻害剤の一般性および効力を実証した。Ａｂ＝ＴＢＳとの多数のイムノコンジュゲートに関する特徴付けデータ（ＤＡＲおよび％凝集）を表７に提示し；ＡＤＣ番号１１０からＡＤＣ番号１３３に関する構造をここに示す。
Figure 2016516035
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Figure 2016516035
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Figure 2016516035
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Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
抗体−薬物コンジュゲートの特徴付け
上に記載されている通りに調製されたイムノコンジュゲートを、１つのイムノコンジュゲートについて図１に例示されている通り、ＬＣ／ＭＳによって特徴付けた。コンジュゲーションは、典型的に、抗体に結合されているリンカー−ペイロード部分のコピー数が異なるコンジュゲートの混合物を提供する。質量スペクトル分析は、リンカー−ペイロード基が、表５〜６中のコンジュゲートの各々における軽鎖および／または重鎖に付着されていることを実証している。該コンジュゲートを、試料に対する平均薬物負荷（ＤＡＲ、抗体に対する薬物の比）および凝集（％で表される）の点から特徴付けた。
ＤＡＲ値を還元および脱グリコシル化試料に関するＬＣ−ＭＳデータから外挿する。トラスツズマブと化合物番号２２３（ＴＢＳ−化合物２２３）とのコンジュゲートに関して図１に例示されている通り、ＬＣ／ＭＳは、ＡＤＣにおける抗体に付着されているペイロード（薬物）の分子の平均数の定量化を可能にする。ＨＰＬＣは抗体を軽鎖および重鎖に分離し、１鎖当たりのリンカー−ペイロード基の数に従って重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を分離する。質量スペクトルデータは、混合物中の構成成分種、例えば、ＬＣ、ＬＣ＋１、ＬＣ＋２、ＨＣ、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２などの同定を可能にする。ＬＣ鎖およびＨＣ鎖への平均負荷から、抗体に対する平均薬物の比（ＤＡＲ）がＡＤＣに関して算出され得る（図１Ｂを参照されたい）。所定のコンジュゲート試料に関するＤＡＲは、２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する四量体抗体に付着されている薬物（ペイロード）分子の平均数を表す。この例において、ＤＡＲは５．８である。
一部のコンジュゲートは凝集体を形成することが見出され、本明細書に記載されているコンジュゲートは凝集の程度によっても特徴付けた。凝集を分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＰＢＳ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬを実行）によって測定した。凝集の程度は、リンカー−ペイロードおよびＤＡＲに依存することが観察された。より低いパーセント凝集を有するコンジュゲートは、一部の目的により有用であり得、したがって、５０％未満の凝集、および好ましくは２０％未満の凝集を呈するイムノコンジュゲートが好ましくあり得る。該データは、所定のペイロードに関する凝集の程度が、連結基の選択およびＤＡＲによって操作され得ることも実証している。表７は、各コンジュゲートのための連結基が安定または切断可能であることも示している。
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
Figure 2016516035
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これらのＡＤＣ（ＡＤＣ−１１０からＡＤＣ−１３３）の確かな構造は、先行セクションで見出される。ＡＤＣ−１２７およびＡＤＣ−１２８は、式（ＩＩ）の範囲外のペイロードを有する比較例であることに留意されたい。一部のＡＤＣは該表に１回より多く現れ、ＡＤＣの異なる調製を表し、これは％凝集およびＤＡＲにおける一部の変動を例示する。ＤＡＲにおける最大１５〜２０％までの変動は、観察された生理活性における変化をほとんど引き起こさず、図２８〜２９を参照されたい。
表７における例がトラスツズマブにコンジュゲートされている一方で、本発明のリンカー−ペイロード組合せのいくつかは、異なる抗原に向かう他の抗体および抗原結合部分にもコンジュゲートされている。他の抗体の記載ならびにそれらの特徴付けおよび活性の概要を下記の活性実施例で提供し、これらのコンジュゲートの多くに関する特徴付けデータを下記に提供する。他の腫瘍細胞抗原に向かう抗体を有するコンジュゲートは、ＡＤＣにおける抗体によって認識される抗原の高レベルを表す細胞に対する成長阻害効果が、その抗原を欠如している細胞に対するものより大きいことが示された。これは、それらのペイロードとして式（ＩＩ）のＥｇ５阻害剤を有するＡＤＣが使用されることで、標的化細胞株上の抗原を認識する抗体を選択することによって異なる細胞株または腫瘍型を標的にすることができることを実証し、本発明の有効なコンジュゲートは他の細胞および抗原を標的にする抗体を利用することができるという証拠を提供している。
Figure 2016516035
ｃＫｉｔＡ抗体および抗ｇＨ抗原結合部分は実施例に記載されており、実施例５および実施例８を参照されたい。
活性実施例１．Ｅｇ５阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性
式（ＩＩ）の化合物は、公知のＥｇ５阻害剤と構造的に同様である。標的部位でのそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、Ｅｇ５に対するＩＣ５０’を決定することによって検証した。以下の表は本発明の選択化合物に関するＩＣ−５０データを提供し：使用されたアッセイ条件に関する下限は０．０００５μＭであった。
Figure 2016516035
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材料および方法
細胞株
Ｈｅｒ２過剰発現細胞株を生じさせるため、Ｈｅｒ２抗原（ＮＭ＿００４４４８；コドンＫ７５３Ｍ）の突然変異形態をコードし、キナーゼ活性を欠如し、そのため非発癌性であるが抗ＨＥＲ２抗体によってまだ認識されるレンチウイルス構築物（ｐＬｅｎｔｉ ６．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；サイトメガロウイルスエンハンサー−プロモーターによって推進される）で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を安定して形質導入した。Ｈｅｒ２過剰発現株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｈｅｒ２ｍｕｔａｎｔ Ｃｌｏｎｅ １６（「Ｃｌｏｎｅ １６」）を、ブラストサイジンを用いる蛍光活性化細胞選別および選択によって単離した。同じ方式で、モック形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｍ４０株（レンチウイルスで形質導入されたが外因性Ｈｅｒ２を発現しない）を単離した。Ｃｌｏｎｅ １６および親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１培養物を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清が補充されたＲＰＭＩ−１６４０成長培地中の継代によって維持した。げっ歯類宿主中で発育する細胞用に選択するため、マウスの腹膜腔中におけるＳＫ−ＯＶ−３細胞の連続継代で、代替モデルＳＫ−ＯＶ−３ｉｐを単離した。ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清が補充されたマッコイ５Ａ成長培地中の継代によって維持した。Ｔ４７Ｄ２細胞はＴ４７Ｄ乳がん細胞株の変異体である。高いレベルのＨｅｒ２抗原を発現する他の細胞株としては、乳がん株ＨＣＣ１９５４および卵巣がん株ＯＥ−１９が挙げられる。胃がん株ＮＣＩ−Ｎ８７は、追加の効力試験を提供する中程度のＨｅｒ２発現体である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１親およびＭ４０株、ならびにＨｅｒ２陰性乳がん株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を使用して、Ｈｅｒ２発現についての選択性を評価した。抗ｃＫｉｔ ＡＤＣ（ｃＫｉｔＡ、ｃＫｉｔＢおよびｃＫｉｔＢ）を、ｃＫｉｔ高ＮＣＩ−Ｈ５２６細胞（小細胞肺がん株）およびｃＫｉｔ陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞上で試験した。全ての他の細胞株は、標準的供給元から容易に入手可能である。全ての細胞株を、５％ＣＯ２の雰囲気が充填されている加湿された３７℃のインキュベーター内の連続継代によって維持した。
抗体−薬物コンジュゲート処理を有する細胞増殖
０日目に、９０μＬの成長培地中１ウェル当たり３０００細胞で９６ウェル透明底の黒壁プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６０３）中に細胞を播種した。１日目に、１．５ｎｇ／ｍＬに下がる３倍系列希釈を用いて９０μｇ／ｍＬで出発し、最終濃度の１０倍で、抗体−薬物コンジュゲートを細胞成長培地中に希釈した。コンジュゲート希釈物（１０μＬ／ウェル）を次いで細胞の９６ウェルプレート中に添加し；最終濃度は９０００ｎｇ／ｍＬから下は０．１５ｎｇ／ｍＬの範囲である。デュプリケートまたはトリプリケートの試料を調製した。５％ＣＯ２の雰囲気が充填されている加湿された３７℃のインキュベーターに、細胞を入れた。５日目または６日目に、９６ウェルプレートをインキュベーターから除去し、室温に平衡化させた。Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２（５０μＬ／ウェル；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７１）を、１０分かき混ぜながら各ウェルに添加した。Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して、生物発光（ＡＴＰの相対的レベルを示す）を測定した。
Ｅｇ５阻害剤処理を有する細胞増殖
０日目に、９０μＬの成長培地中１ウェル当たり３０００細胞で９６ウェル透明底の黒壁プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６０３）中に細胞を播種した。１日目に、５１ｐＭに下がる３倍系列希釈を用いて１０００ｎｍで出発し、最終濃度の１０倍で、Ｅｇ５阻害剤を細胞成長培地中に希釈した。阻害剤希釈物（１０μＬ／ウェル）を次いで細胞の９６ウェルプレート中に添加し；最終濃度は１００ｎＭから下は５．１ｐＭの範囲である。デュプリケートまたはトリプリケートの試料を調製した。５％ＣＯ２の雰囲気が充填されている加湿された３７℃のインキュベーターに、細胞を入れた。５日目または６日目に、９６ウェルプレートをインキュベーターから除去し、室温に平衡化させた。Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２（５０μＬ／ウェル；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７１）を、１０分かき混ぜながら各ウェルに添加した。Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して、生物発光（ＡＴＰの相対的レベルを示す）を測定した。
効力値の定義および誘導
Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２データをレプリケート試料のために平均化し、次いで、未処理細胞に正規化した。ＭｉｃｒｏＳｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの付属品として使用されるＸＬ−Ｆｉｔソフトウェアパッケージ（ＩＤＢＳ）によって提供される通りの４パラメータロジスティックモデル（Ｓ字形用量応答モデル＃２０５）を使用して、用量応答曲線を誘導した。
ｆｉｔ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））））
ｉｎｖ＝（Ｃ／（（（（Ｂ−Ａ）／（ｙ−Ａ））−１）＾（１／Ｄ）））
ｒｅｓ＝（ｙ−ｆｉｔ）
ＥＣ５０＝フィットＣｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２シグナルが、未処理細胞によって発生されたシグナルの５０％である試験物品の濃度。
ＩＣ５０＝フィットＣｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２シグナルが、未処理細胞と試験物品の最大効果との間の示差的なシグナルの５０％低減されている試験物品の濃度。例えば、最大効果が、未処理細胞の４０％に下がっているシグナルの低減であるならば、ＩＣ５０は、フィット用量応答曲線が未処理細胞の７０％に達する濃度である。ＩＣ５０は、上記で提供されているフィッティングアルゴリズムにおけるパラメータ「Ｃ」に相当する。
結果
Ｅｇ５阻害剤の存在下での細胞増殖を、上記の方法に記載されている通りに実施した。５日または６日後、インキュベーションが３日間であった図２（Ａ）〜（Ｂ）を除いて、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２試薬（図２）を使用して細胞カウントを決定した。デュプリケート試料に関するデータを平均化し、次いで平均を、未処理細胞または試験された最低濃度で処理された細胞の平均値に正規化した。両方の正常化方法が同等の所見を生じた。図２（Ｅ）〜（Ｆ）における化合物番号２（表１）および化合物番号１４（表１）の比較を、試験された最低濃度に正規化された１濃度当たり単一試料で実施した。式（ＩＩ）の選択阻害剤の細胞性活性および比較Ｅｇ５阻害剤に関するデータを以下の表に提供する。
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これらのＥｇ５阻害剤は、多くの異なる系譜由来の細胞株にわたって抗増殖活性を有し、これらの分子がＡＤＣペイロードとしておよびがん治療剤として広範な潜在性を有することを示している。これらのアッセイの阻害濃度は、一般に、任意の所定化合物のための狭い範囲内であった。最大阻害において観察された変動は、Ｇ２／Ｍ遷移での細胞周期の停止、続いてアポトーシスと一致していると思われ；アポトーシスの開始のタイミングは細胞株の間で広く変動し、これが最大化合物効果における変動を説明し得る。
Ｅｇ５阻害剤のパネルの中で比較する場合、ある範囲の抗増殖活性が観察される。化合物効力の序列は、一般に、１つの細胞株から別の細胞株へ維持されることに留意されたい。細胞能力は、Ｅｇ５酵素活性の固有の阻害および化合物への細胞膜の透過性を含めて、多くの因子によって影響を及ぼされる。例えば、化合物番号７７は、生理的ｐＨで大きく脱プロトン化されるカルボン酸を含有し、これは、なぜこの化合物がこの試験において他のものより幾分強力でない（図１Ｅ）かを説明することができる。
様々な化学的足場は強い抗増殖活性を与えることが示される。例えば、図２（Ａ）〜（Ｅ）は、ｔ−ブチルおよびＴＨＰシリーズ（それぞれ、Ｒ１＝ｔ−ブチルまたは４−テトラヒドロピラニル）におけるＥｇ５阻害剤、およびコア尿素（Ａ＝ＮＨ）またはコアアミド（Ａ＝結合）を有するＴＨＰシリーズ阻害剤の例を示す。各シリーズからの例は、サブナノモル濃度で増殖を阻害する。相対的に少ない効力を有する化合物も観察され：一部の場合において、より低い効力を有する化合物は、抗体−薬物コンジュゲートの形態で細胞に送達される場合に細胞増殖の阻害剤として不相応に有効であった。
図３（Ａ）〜（Ｌ）は、異なる系譜から誘導される様々ながん細胞株にわたる特定のＥｇ５阻害剤の抗増殖活性の例を例示している（下記の表８を参照されたい）。効力は変動するが、これらの系譜にわたる全ての細胞株は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物に感受性である。
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活性実施例２．Ｅｇ５阻害剤ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性
抗ＨＥＲ２トラスツズマブ抗体（「ＴＢＳ」）およびＥｇ５阻害剤との抗体−薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）の存在下での細胞増殖を、上記の方法に記載されている通りに実施した。５日または６日後、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２試薬を使用して、細胞カウントを決定した。デュプリケート試料に関するデータを平均化し、次いで、平均を未処理細胞の平均値に正規化した。図４Ａ〜Ｖは、高Ｈｅｒ２ Ｃｌｏｎｅ １６細胞ｖｓ低Ｈｅｒ２親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＡＤＣの抗増殖性効果を例示する用量−応答グラフの組を示す。用いられた特定のリンカー化学に関係なく、ＡＤＣの活性は、Ｈｅｒ２発現の上昇に高選択的であった。
図４Ａ〜Ｈは、リソソーム中で切断されて標的細胞の内側で非修飾Ｅｇ５阻害剤を放出するように設計されているリンカーを用いるＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を例示している。異なるペイロード（異なる構造のファミリー由来）と２つの異なる切断可能なリンカー（ジペプチドバリン−シトルリンまたはグリカン−グルクロニドを含有する）との組合せは、一般に、Ｃｌｏｎｅ １６細胞に対して抗増殖性であるが、親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してはずっと少なかった。
図４Ｇ〜Ｈは、カルボキシレート含有Ｅｇ５阻害剤化合物番号７７を組み込むＴＢＳ−化合物３１２の選択的活性を例示している。フリーの化合物は、おそらく細胞外ｐＨ（およそ７）での乏しい膜透過性により、中程度の抗増殖活性を有している（図２Ｅ）。酸性リソソーム（およそ５のｐＨ）中で放出される場合、カルボキシレートは部分的にプロトン化されて、電荷を除去および膜透過性を改善し、これが順じてＡＤＣの活性を説明し得る。
異なる特性は切断不可能なリンカーの使用を介して得ることができ、これによって、ＡＤＣの細胞内代謝は、抗体から誘導される１種または複数のアミノ酸にカップリングされるペイロードおよびリンカーの付加物を発生させることが予想される。切断不可能なリンカーを有する例証的ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を図４Ｉ〜Ｒに例示する。このシリーズは、Ｅｇ５結合に関与しないことが知られているまたは予測されるＥｇ５阻害剤の領域で付着されるリンカーを含む。図４Ｉ〜Ｒにおいて表されているリンカーは、ペイロードへおよび抗体システインへの付着のモードに関して変動する。追加として、リンカーは、長さおよび予測される物理的特性、例えば親油性および配座柔軟性が変動する。
これらのＡＤＣの全ては、チオールカップリングのためにヨードアセトアミド基を用いるＴＢＳ−化合物３００を除いて、リンカー中のマレイミド基を介して抗体システインに付着する（図４Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｐ）。このＡＤＣのＨｅｒ２選択的ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力は、マレイミドが抗増殖活性に必要とされないことを実証している。
異なる部位でペイロードに付着されている切断不可能なリンカーを用いることで、図４Ｓ〜Ｖに例示されているｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有するＡＤＣを生成した。また、ペイロード上の異なる位置での該連結基の付着は、Ｈｅｒ２依存細胞能力を達成するのを防止せず、式（ＩＩ）の化合物上の連結基付着点が変動され得ることを実証している。
ＡＤＣはＨｅｒ２を内在的に発現する細胞の増殖を阻害できることを実証するため、抗ＨＥＲ２抗体を有する選択ＡＤＣを、ＨＣＣ１９５４（図５Ａ、Ｂ）またはＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ（図５Ｃ〜Ｅ）のいずれかの細胞とともにインキュベートした。異なるリンカー−ペイロード構造のファミリーから誘導された切断可能なまたは切断不可能なリンカーのいずれかを有するＡＤＣは、これらの高Ｈｅｒ２細胞株の増殖を阻害した。
活性実施例３．Ｅｇ５阻害剤ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ効力の判定
トラスツズマブ（ＴＢＳ）にコンジュゲートされた本発明の化合物は、免疫欠損ヌードマウスへのヒト腫瘍細胞株の移植に基づく異種移植片腫瘍モデルにおける有意な活性も実証した。前に記載されている通り（Sausville and Burger, 2006）、こうした腫瘍異種移植片マウスを用いる研究は、抗がん試薬のｉｎ ｖｉｖｏ効力への貴重な洞察を提供してきた。詳細には、５．０×１０６個のＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ細胞（Yoneda et al., 1998）またはＨＣＣ１９５４細胞が皮下に注射されたｎｕ／ｎｕマウスを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ効力研究を実施した。これらの細胞株は、抗原依存方式において、前に記述のＥｇ５阻害剤ＡＤＣにそれらの高い感受性を明らかにしている前のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイに基づいて選択した。腫瘍が約２００〜２５０ｍｍ３のサイズに達した後、Ｅｇ５阻害剤ＡＤＣを、実験に依存して０．３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの用量にて単回用量で静脈内に注射し、各処理群は９匹のマウスを含む。抗体−薬物コンジュゲートを投与した後、腫瘍体積を毎週２回モニタリングした。全ての動物研究は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（NIH publication; National Academy Press, 8th edition, 2001）に従って行った。
図６（Ａ）および６（Ｂ）は、マウスにおけるＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片腫瘍に対するトラスツズマブ（ＴＢＳ−化合物２２０）とコンジュゲートされているリンカー−ペイロード化合物番号２２０を有するＡＤＣの効力を示している。図６（Ａ）は、ペイロードとして化合物１２（表１）を含有するＴＢＳ−化合物２０コンジュゲートの１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの単回用量で約５５日の期間にわたる腫瘍サイズ変化を示している。１ｍｇ／ｋｇ用量は、Ｅｇ５阻害剤を有しない対照と比較して中程度の腫瘍成長低減を示し、一方、２ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ用量は試験中に腫瘍成長を防止した。図３ｂは、腫瘍拡大を防止した３ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの投与量の結果を示している。
試験された最も高いコンジュゲート用量における抗体の量に対応して、ＴＢＳ単独で（Ｅｇ５阻害剤を含有しない抗ＨＥＲ２抗体）（図６（Ｂ））６ｍｇ／ｋｇにて処理された動物は、試験期間かけておよそ四倍の腫瘍体積を可能にし、ビヒクルのみの対照処理と同様に思われる。他の動物は、ＨＣＣ１９５４細胞を標的にしない抗体に付着されている同じペイロードとのコンジュゲートであるアイソタイプ対照−化合物２２０コンジュゲートを受けた。Ｅｇ５阻害剤の同様の投与量で、アイソタイプ対照は、ＴＢＳ対照に対してわずかな腫瘍成長阻害を呈したが、アイソタイプ対照がＴＢＳ−化合物２２０に対してほぼ同等の活性を示した６ｍｇ／ｋｇの用量を除いて、ＨＣＣ１９５４細胞を標的にするＴＢＳ−化合物２２０コンジュゲートよりも、腫瘍成長を抑制することに明らかに有効でなかった。
図７（Ａ）および７（Ｂ）は、ＳＫＯＶ３ｉｐ異種移植片における同様の結果を示している。化合物２２０とＴＢＳとのコンジュゲートの単回用量を、化合物１２の５マイクログラム／ｋｇから９６マイクログラム／ｋｇの用量を送達する０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに投与した。この異種移植片において、ＴＢＳ−化合物２２０コンジュゲートの３ｍｇ／ｋｇの用量は、強力な腫瘍成長阻害を実証した。この腫瘍モデルにおいて、アイソタイプ対照はＴＢＳコンジュゲートよりも少ないが一部の腫瘍成長阻害も示し、トラスツズマブ抗体は単独で、ビヒクル対照に対して小さい成長阻害効果を有していた。
図８は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量での化合物２１５とトラスツズマブとのコンジュゲート（ＴＢＳ−化合物２１５）の単回用量後のＳＫＯＶ３ｉｐ異種移植片の腫瘍成長を要約している。５ｍｇ／ｋｇ投与量は有意な成長阻害を達成し、一方、１０ｍｇ／ｋｇ用量は腫瘍を収縮させた。この実験において、５ｍｇ／ｋｇ用量のトラスツズマブ単独で（Ｅｇ５阻害剤がない）および５ｍｇ／ｋｇ用量のアイソタイプ対照（ＳＫＯＶ３ｉｐ腫瘍細胞を認識しない抗体にコンジュゲートされている化合物２１５）は両方とも、腫瘍成長を阻害すると思われる。さらに、これらのいずれも、同等の投与量でＴＢＳ−化合物２１５コンジュゲートほど有効でなかった。
図９は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量での、ペイロードとして化合物１７を含有する化合物２２３とトラスツズマブとのコンジュゲート（ＴＢＳ−化合物２２３またはＴＢＳ−５Ｂ）の単回用量後のＳＫＯＶ３ｉｐ異種移植片の腫瘍成長を要約している。５ｍｇ／ｋｇ投与量は有意な成長阻害を達成し、一方、１０ｍｇ／ｋｇ用量は腫瘍滞留をもたらした。この実験において、１０ｍｇ／ｋｇ用量のトラスツズマブは単独で（Ｅｇ５阻害剤がない）腫瘍成長を中程度に阻害した。５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量のアイソタイプ対照（ＳＫＯＶ３ｉｐ腫瘍細胞を認識しない抗体にコンジュゲートされている化合物２１５）は、ビヒクル処理腫瘍と比較して腫瘍成長を有意に阻害することがない。
活性実施例４．ＡＤＣ凝集を低減する新規なリンカー。
この実施例において、単純なリンカーならびに著しいおよび望ましくない量の凝集を生じさせたペイロード化合物を用いて、ＡＤＣを構築した。この実施例において使用されるＡＤＣの各々における抗体はＴＢＳである。ＡＤＣ−１１０と称される構築物は、非分岐リンカーを使用し、約１２％の凝集を呈する。図１０（Ａ）を参照されたい。アシル化窒素から極性基を導入するためにこのＡＤＣのリンカーを修飾することは（ＡＤＣ−１１１およびＡＤＣ−１１２を参照されたい）、凝集を３％未満に低減する。図１０（Ｂ）および図１０（Ｃ）を参照されたい。
これらのＡＤＣの各々ためのペイロードおよびペイロードプラスリンカー付着点：
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したがって、ＡＤＣ−１１１は、化合物３６７のマレイミド基に付着されている抗体トラスツズマブからなり、ＡＤＣ−１１２は、化合物３６８のマレイミド基に付着されている同じ抗体からなる。ＡＤＣ−１１０は、化合物３６６およびトラスツズマブからなる。これらのＡＤＣにおけるリンカーは切断不可能と考えられる。これらのＡＤＣは、式ＩＩ、ＩＩＣおよびＩＩＩの化合物におけるＲ１は、標的結合部分、例えば切断不可能なリンカーが使用される場合にさえ、抗体への付着点として使用することができることを実証している。
図１１は、いくつかのがん性細胞株に対するＡＤＣ−１１０およびＡＤＣ−１１１のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を示しており、コンジュゲートが、高Ｈｅｒ２レベルを有する細胞株（ＳＫＯＶ３ｉｐおよびＭＢ２３１−Ｍ１６）に対して高活性であり、Ｈｅｒ２を有するがおそらくＨｅｒ２ターンオーバー速度（ＭＢ２３１−Ｗ６）によりトラスツズマブＡＤＣに応答性の少ない細胞に対して活性が少なく、Ｈｅｒ２陰性細胞（ＭＢ４６８）に対して、これらの細胞がＥｇ５阻害剤に高感受性であっても、それほど活性でないことを実証している。ＳＫＯＶ３ｉｐおよびＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｍ１６の細胞株は、高Ｈｅｒ２発現を有し、したがって、これらのトラスツズマブコンジュゲートに感受性であると予想される。ＭＢ２３１−Ｗ６もＨｅｒ２発現を有するが、おそらくＨｅｒ２に関するターンオーバー速度によりトラスツズマブＡＤＣに感受性が少ない。ＭＤＡ−ＭＢ４６８は、Ｈｅｒ２陰性であるが、Ｅｇ５阻害剤に高感受性である。
図１１（Ａ）は、ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞がＡＤＣ−１１０およびＡＤＣ−１１１に高感受性であることを示しており、これは、これらの細胞に対する高Ｈｅｒ２レベルによると予想される。ＭＢ４６８細胞株は、それのＨｅｒ２欠如に基づいて予想される通りに、それほど感受性でない。図１１Ｂは、ＭＢ３２１−Ｍ１６細胞株がＭＢ３２１−Ｗ６より感受性であることを示しており、これは、ＭＢ３２１−Ｗ６細胞におけるＡＤＣのより非効果的な内部移行を示すＨｅｒ２抗原のより低いターンオーバーによると考えられる。図１１（Ｃ）は、低感受性細胞株のＭＢ４６８およびＭＢ２３１−Ｗ６の両方とＳＫＯＶ３ｉｐを比較している。図１１中におけるデータは、ＡＤＣ−１１１中の分岐リンカーが、ＡＤＣ−１１０中の非分岐リンカーに対して、それの活性を有意に影響することがないことも示している。したがって、分岐リンカーは、効力に干渉することなくＡＤＣの凝集を低減する。
同様に、抗体ＴＢＳおよびペイロード／リンカー化合物６Ｄを使用して、ＡＤＣを作製した（表６を参照されたい）。このＡＤＣは、リンカーのアルキル鎖上に直接カルボキシレート基を有するリンカーを有する。リンカー上にカルボキシレートが欠如している、別段に同一のＡＤＣを作製した。リンカー上にカルボン酸基を有するＡＤＣは、ＤＡＲ＝４．９および３％の凝集を有しており、一方、リンカー上でカルボン酸基が欠如している対応のＡＤＣは、ＤＡＲ＝４．２を有していたが、凝集は１１．６％であった。また、リンカー上の極性基は凝集を有意に低減した。これらのＡＤＣの両方が、Ｈｅｒ２＋細胞株上での細胞培養における腫瘍細胞成長の抗体依存性阻害を呈していたが、リンカー上にカルボン酸を有するＡＤＣは、有意にＭＢ４６８細胞上でより活性であった（乳がん）。
活性実施例５．他の抗原を標的にするイムノコンジュゲートの活性。
ｃＫｉｔＡと称される抗体とコンジュゲートされている表５に示されているペイロード化合物から、イムノコンジュゲートを調製した。この抗体は、トラスツズマブと称される抗体由来の異なる抗原を認識し、それは、ＣＤ１１７とも称される抗原ｃＫｉｔに対して選択的である。ｃＫｉｔは造血幹細胞および前駆細胞上で見出され、肥満細胞新生物、消化管ストロマ腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍および一部の白血病に関連する。したがって、抗ｃＫｉｔ抗体を有する本発明のイムノコンジュゲートは、これらの状態を処置するのに有用である。
３．０から４．５の間の、抗体に対する薬物比（ＤＡＲ）を有するコンジュゲーを、上に記載されている方法によってこの抗体を用いて調製した。抗ｃＫｉｔ抗体のｃＫｉｔＡによって認識されると予想される細胞株における活性について、イムノコンジュゲートを試験した。図１２は、これらのイムノコンジュゲートの６つによる細胞成長の阻害を示している。活性がペイロードで変動する一方で、全てが、１ｍｌ当たりイムノコンジュゲート１マイクログラムを下回る濃度でかなり活性であり、最も活性なものは約１ｎｇ／ｍＬで強力な細胞成長阻害を示した。
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活性実施例６．リンカー変動とのイムノコンジュゲートの比較。
本明細書に記載の方法によって表５および６における化合物から、イムノコンジュゲートを調製した。これらの化合物は、ペイロードとして同様のＥｇ５阻害剤を含有するが、異なるリンカーを有する。各場合において、ペイロードは式ＩＩにおけるＲ１に対応する基を介して連結されている。本明細書においてＴＢＳと称される抗体を使用した。イムノコンジュゲートは全て、３から５の間のＤＡＲを有していた。これらのイムノコンジュゲートを、抗体に対する感受性が変動すると予想される４つの異なる細胞株に対する細胞成長阻害について試験した。全ての細胞株が該化合物の各々によって阻害されることが見出された。本明細書に記載されている通りの式ＩＩの範囲内のリンカーにおける変動は、図１３における阻害曲線によって例示されている通り、細胞成長阻害に対して測定可能であるが一般に中程度の効果を有していた。リンカーのための１つの付着点である、Ｒ１のアゼチジン環の窒素原子は、試験条件下で活性を有意に低減した。該データは、様々なリンカーが、式ＩＩのペイロード化合物を含有する式Ｉのイムノコンジュゲートにおける使用に適当であることを実証している。留意すべきことに、Ａｒ２に対応するフェニル環上にヒドロキシ基を置くことで、細胞培養において活性を有意に増加または減少させることはない。
活性実施例７．ＡＤＣペイロードとしての他のＥｇ５阻害剤との式ＩＩのＥｇ５阻害剤の比較。
表２におけるペイロード６Ｎ（ペイロード−リンカー化合物５０９）および６Ｐ（化合物５０８）から、イムノコンジュゲートを調製した。これらのペイロードは、文献において知られているＥｇ５の強力な阻害剤であり、式ＩＩの化合物以外の化合物のクラスを表す。比較のため、ペイロードとして式ＩＩの化合物（化合物２２０）を有し、６Ｎおよび６Ｐとして同じ「ｖａｌ−ｃｉｔ」切断可能なリンカーを含有するイムノコンジュゲートを、Ｅｇ５阻害剤の他のクラスと一緒に試験した。Ｅｇ５阻害剤の他のクラスがペイロードとしての活性を呈した一方、それらのイムノコンジュゲートは、図１４に例示されている通り、式ＩＩペイロード化合物を有するイムノコンジュゲートより約１０倍少ない活性であった。
ｉｎ ｖｉｖｏ活性
一般的手順：雌性ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）に、２００μＬの合計体積で５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のＨＢＳＳに懸濁させた５×１０６個のＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ１腫瘍細胞を、右側腹部の皮下に注射した。代替として、雌性ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）に、２００μＬの合計体積で５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のＨＢＳＳに懸濁させた５×１０６個のＨ５２６腫瘍細胞を、右側腹部の皮下に注射した。全ての動物研究は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（NIH publication; National Academy Press, 8th edition, 2001）に従って行った。
効力研究のため、マウスをインプラント後７〜１０日目の間に無作為化し、動物をおよそ２２５ｍｍ３の平均腫瘍体積を用いる研究に登録した。典型的に、各処理群のために少なくとも５匹のマウスを使用し、試験結果を要約している図中に、１群当たりのマウスの数を示す。マウスに側尾静脈を介して抗体−薬物コンジュゲートまたはビヒクル（５０ｍＭシトレート、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を静脈内に１回投薬した。
腫瘍異種移植片を、０日目に投薬の開始から毎週２回デジタルノギスを用いて２つの寸法（ＬおよびＷ）で測定した。腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２として算出した。体重を毎週２回測定し、臨床的観察を毎日記録した。腫瘍体積および体重をＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒソフトウェア（ＳｔｕｄｙＬｏｇ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって取り込み、保存した。研究持続期間の５０日後、動物を人道的に安楽死させた。
活性実施例８．
抗体（ＡｎｔｉＢ）がトラスツズマブである、表５における式５Ｂのイムノコンジュゲートを、本明細書に記載されている通りに調製した（ＴＢＳ−５Ｂ）。その活性を、細胞アッセイにおいて、同じ抗体および公知のＡＤＣペイロード（ＤＭ１）を有するイムノコンジュゲート（ＴＢＳ−ＤＭ１）、およびＡｎｔｉＢがウイルス糖タンパク質に特異的なｉｇＧ１カッパ鎖であるイムノコンジュゲートｇＨ（イムノコンジュゲート：ｇＨ−５Ｂ）に対して比較した。図１５は、高Ｈｅｒ２発現を有する細胞株（ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ、ヒト卵巣がん細胞株）におけるＴＢＳ−５Ｂ、ＴＢＳ−ＤＭ１およびｇＨ−５Ｂに関する細胞増殖結果を示している。ペイロードとして５Ｂを有するコンジュゲートは、ペイロードとしてＤＭ１を有するものと活性において同等であり、ＡＤＣペイロードとしてＥｇ５阻害剤の高い効力を実証した。予想される通り、抗体構成成分としてｇＨを有するコンジュゲートは、同じ細胞株においてほとんど全く活性を呈さず、これは、ＴＢＳ−５Ｂコンジュゲートの活性がＴＢＳ抗体に依存性であることを実証している。比較のため、５Ｂ−ＴＢＳも、低Ｈｅｒ２発現を有する細胞株上で試験した。予想される通り、イムノコンジュゲートは、その抗体によって標的化されている抗原（Ｈｅｒ２）が欠如している細胞株に対して活性でなかった。これは、５Ｂの活性が、イムノコンジュゲートの抗体をその標的化抗原の発現と細胞上でマッチさせることに依存性であることを実証している。
同じイムノコンジュゲートを次いで、マウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ異種移植片腫瘍上にてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。この異種移植片はＴＢＳ−ＤＭ１に不十分に応答する。
図１６は、本発明のイムノコンジュゲートであるＴＢＳ−５Ｂによる強力な腫瘍成長阻害を示している。２つの対照群を使用し：一方の対照群をＴＢＳ抗体単独で（ＴＢＳ）処理し、他方を、５Ｂと糖タンパク質ｇＨに特異的ＩｇＧカッパとのコンジュゲート（ｇＨ−５Ｂ）で処理した。ＴＢＳ−５Ｂイムノコンジュゲートは、表示標準を使用して２０日目までに、ビヒクルおよびｇＨ対照に対して正常の用量応答および統計的に有意な腫瘍阻害を生じた。１０ｍｇ／ｋｇ用量で、３０日まで腫瘍成長はほとんど出現しなかった。各群は９匹のマウスを有し、該群のいずれもが処理中に有意な体重損失を示さなかった。対照による腫瘍成長阻害は低く、表示標準を使用する試験の条件下で統計的に有意でなかった。これらの結果は、Ｅｇ５阻害剤が、その抗体によって標的化される腫瘍を処理するためにｉｎ ｖｉｖｏにおける使用のための有効なＡＤＣペイロードであること、ならびに効力がＥｇ５阻害剤および細胞株とマッチさせた抗体の両方に依存することを示している。
図１７は、Ｅｇ５イムノコンジュゲートが、同じ抗体（ＴＢＳ）に付着されている臨床トライアル（ＤＭ１）におけるＡＤＣ中に使用されているペイロードを含有するコンジュゲートよりも、マウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ異種移植片腫瘍上にてｉｎ ｖｉｖｏで活性であることを例示している。また、腫瘍成長は１０ｍｇ／ｋｇ用量でＴＢＳ−５Ｂイムノコンジュゲートによってほぼ完全に停止され、表示標準を使用して３０日までに、対照に対して統計的に有意であった。ＴＢＳ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の同等用量は、それほど有効でなく、３０日までに統計的有意性に達しなかった。抗体単独で（ＴＢＳ）またはｇＨウイルス糖タンパク質ＩｇＧに付着されているＤＭ１もしくは５Ｂのいずれかでの処理は、それほど活性でなかった。これは、Ｅｇ５阻害剤ペイロードが、少なくとも、臨床トライアルで成功している他のペイロードクラスと同じに有効であること（ＤＭ１は、ＦＤＡ承認イムノコンジュゲートＫａｄｃｙｌａ（登録商標）のためのペイロードである）、およびそのｉｎ ｖｉｖｏ効力が、イムノコンジュゲートの抗体によって標的化腫瘍細胞の特異的認識に依存性であることを実証している。
活性実施例９：他の抗体とのｉｎ ｖｉｖｏ効力
本明細書において「ｃＫｉｔ抗体」と称されるｃＫｉｔ抗原に特異的な抗体に連結されている本発明のＥｇ５阻害剤を含有するイムノコンジュゲートを調製した。ｃＫｉｔコンジュゲートをマウスにおけるヒト小細胞肺がん異種移植片腫瘍（Ｈ５２６）上で試験した。（ｎ＝５；任意の群に関する有意な体重損失なし）図１８は、６．５ｍｇ／ｋｇの用量で第１のｃＫｉｔ抗体（ｃＫｉｔＡ）上にペイロード−リンカー５Ｂを有するイムノコンジュゲートによるＨ５２６腫瘍成長阻害を示している。より低い用量は、それほど活性でなく、ｃＫｉｔＡ抗体単独でも、ウイルス糖タンパク質ｇＨに特異的な抗原結合基にコンジュゲートあれているＥｇ５ペイロード−リンカー組合せ（５Ｂ）でも、測定可能な腫瘍成長を呈していなかった。
図１９は、Ｅｇ５阻害剤（５Ｂ）およびＳＭＣＣ−ＤＭ１とのｃＫｉｔＡイムノコンジュゲートの比較の結果を要約している（各曲線についてｎ＝５；任意の群における有意な体重損失なし）。マウスにおけるＨ５２６異種移植片腫瘍の腫瘍成長の阻害が、付着されている５ＢまたはＳＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかとのｃＫｉｔＡイムノコンジュゲートについて示されている。ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは、表示標準を使用して、１０ｍｇ／ｋｇ用量で腫瘍成長の統計的に有意な阻害を呈したが、５ｍｇ／ｋｇでは呈さなかった。５Ｂコンジュゲートは、統計的に有意であるとともにＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの１０ｍｇ／ｋｇ用量と同等である５ｍｇ／ｋｇで阻害を与え、５Ｂ（Ｅｇ５阻害剤）コンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇ用量ではるかに活性であった。対照は、ウイルス糖タンパク質ｇＨに特異的であるｇＨとの５Ｂのコンジュゲートに対して活性を示さなかった。
活性実施例１０．クロスオーバー実験。
この実験のため、各マウスに、２つの異なる異種移植片腫瘍ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐを身体の片側に、およびＨ５２６を他の側に移植した。ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ細胞株はＨｅｒ２−陽性の（Ｈｅｒ２＋）であり、ｃＫｉｔ（ｃＫｉｔ−）が欠如しており、一方、Ｈ５２６細胞株はＨｅｒ２陰性（Ｈｅｒ２−）およびｃＫｉｔ陽性（ｃＫｉｔ＋）である。各マウスを次いで、ビヒクルまたは３つのイムノコンジュゲート：ｇＨ−５Ｂ、ＴＢＳ−５ＢもしくはｃＫｉｔＡ−５Ｂの１つで処理した。図２０が示している通り、ＴＢＳ抗体へのその予想される結合により予想される通りに［Ｈｅｒ２＋、ｃＫｉｔ−］腫瘍成長はＴＢＳ−５Ｂによって強く阻害された。他の処理のいずれも、腫瘍成長に有意に影響しなかった。同様に、［Ｈｅｒ２−、ｃＫｉｔ＋］腫瘍成長は、ｃＫｉｔ−５Ｂコンジュゲートによってのみ阻害され、他の処理のいずれにも影響されなかった。このクロスオーバー実験は、腫瘍阻害がイムノコンジュゲートによるものであり、抗体または放出ペイロードのいずれかから出現するのではなく、抗体が腫瘍上の抗原とマッチするインタクトなイムノコンジュゲートのみが有効であることを証明している。
活性実施例１１．リンカー変動の影響
この実施例は、ペイロード（５Ｂ、５Ｈ、５Ｇおよび５Ａ−表５を参照されたい）として同様のＥｇ５阻害剤を有するイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効力に対するリンカー変動の効果を例示している。同様のＥｇ５阻害剤をトラスツズマブ抗体に付着させるための異なるリンカーを使用して、４つのイムノコンジュゲートを調製した。図２１は、全てが１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ腫瘍異種移植片の阻害で同様に有効であるイムノコンジュゲートの活性を要約している。これらのイムノコンジュゲートは、その上、臨床トライアルにおいてＡＤＣ中に使用されるペイロードであるＭＭＡＦとの同じ抗体（ＴＢＳ）のイムノコンジュゲート（ＴＢＳ−ＭＣ−ＭＭＡＦ）と活性が同様であり、同じ抗体上でメイタンシンペイロードとのイムノコンジュゲート（ＴＢＳ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）より活性であった。予想される通り、ウイルス糖タンパク質（ｇＨ）に特異的な抗体にコンジュゲートされている同じペイロードを使用する対照、および非コンジュゲート抗体ＴＢＳは、ほとんどまたは全く腫瘍成長阻害を呈していなかった。（試験される各イムノコンジュゲートについて１群当たり９匹のマウス（ｎ＝９）；いずれの群においても有意な体重損失なし）。
活性実施例１２．ｉｎ ｖｉｖｏにおける多様なＥｇ５ペイロード／リンカー組合せの活性
この実施例は、全てがトラスツズマブ抗体とコンジュゲートされている各付着点に２つの異なるリンカー（５Ｂ、５Ｅ、５Ｆおよび５Ｄ−表５を参照されたい）を使用して２つの異なる位置で付着されているリンカーとの、ペイロードとしてＥｇ５阻害剤を有するイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効力を比較して、異なるリンカー付着点およびリンカーを比較する。図２２は、全てが１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ腫瘍異種移植片の成長を阻害したイムノコンジュゲートの活性を要約している。これらのイムノコンジュゲートは、活性が同様であり、ＴＢＳ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較した場合に等しいか、またはより良好であった。予想される通り、非コンジュゲート抗体（ＴＢＳ）を使用する対照は、ほとんど成長阻害を呈していなかった。（試験される各イムノコンジュゲートについて１群あたり８匹のマウス（ｎ＝８）；いずれの群においても有意な体重損失なし）。
活性実施例１３．ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片に対する多様なＥｇ５イムノコンジュゲートの活性
この実施例は、阻害するのがより困難である腫瘍細胞株（ＮＣＩ−Ｎ８７、胃腫瘍株）に対する、リンカーを用いてペイロードとして様々なＥｇ５阻害剤を有するイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効力を比較する。全てがトラスツズマブ抗体とコンジュゲートされている異なるＥｇ５阻害剤−ペイロード組合せを使用して、Ｅｇ５阻害剤ペイロードとの４つのイムノコンジュゲート（５Ｂ、５Ｅ、５Ｄおよび６Ｕ−表５〜６を参照されたい）を調製した。図２３は、全てが１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスにおけるＮ８７腫瘍異種移植片の成長を阻害したイムノコンジュゲートの活性を要約している。これらのイムノコンジュゲートは、このモデルにおける活性が変動しており、トラスツズマブ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１イムノコンジュゲートと比較される。イムノコンジュゲートの全てが腫瘍成長を阻害すると思われ；５Ｂおよび６ＵならびにＤＭ１コンジュゲートは、表示標準を使用する試験条件下で統計的有意性を達成した。予想される通り、非コンジュゲート抗体（ＴＢＳ）を使用する対照は、ほとんど成長阻害を呈していなかった。（試験される各イムノコンジュゲートについて１群あたり８匹のマウス（ｎ＝８）；いずれの群においても有意な体重損失なし）。
活性実施例１４．Ｈ５２６異種移植片に対するＥｇ５イムノコンジュゲートの活性
この実施例は、ｃＫｉｔ（Ｈ５２６）を発現する腫瘍細胞株に対するｃＫｉｔ抗体とコンジュゲートされているペイロードとして様々なＥｇ５阻害剤を有するイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効力を比較している。全てがｃＫｉｔ抗体（ｃＫｉｔＡ）とコンジュゲートされている異なるＥｇ５阻害剤−ペイロード組合せを使用して、Ｅｇ５阻害剤ペイロードとの６つのイムノコンジュゲート（５Ｂ、５Ｅ、５Ｆ、５Ｃ、５Ａおよび５Ｄ−表５を参照されたい）を調製した。図２４は、全てが５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスにおけるＨ５２６腫瘍異種移植片の成長を阻害したイムノコンジュゲートの活性を要約している。（試験される各イムノコンジュゲートについて１群当たり５匹のマウス（ｎ＝５）；いずれの群においても有意な体重損失なし）。ペイロード／リンカー組合せ５Ｅおよび５Ｄは、表示標準を使用して統計的に有意な腫瘍成長阻害を達成する５ｍｇ／ｋｇ用量で、より強力であった。
図２５は、１０ｍｇ／ｋｇでＨ５２６異種移植片に対する同じイムノコンジュゲートの活性を要約している。（試験される各イムノコンジュゲートについて１群当たり５匹のマウス（ｎ＝５）；いずれの群においても有意な体重損失なし）。イムノコンジュゲートは、このモデルにおいて１０ｍｇ／ｋｇで活性が変動し、５Ｄが最も活性であり、長く続くと思われ；５Ｄおよび５Ｅの両方が、表示標準を使用するこの用量で統計的に有意な腫瘍成長阻害を達成した。
活性実施例１５．Ｅｇ５阻害剤コンジュゲートにおけるｃＫｉｔ抗体の比較
この実施例は、ｃＫｉｔ（Ｈ５２６）を発現する腫瘍細胞株に対する、Ｅｇ５阻害剤ペイロードとの異なるｃＫｉｔ抗体を有するイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効力を比較している。ｃＫｉｔＡで開始して、２種の修飾ｃＫｉｔ抗体を以下の一般的方法によって調製した。前に記載されている通り（Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 （2001)）、一過性のトランスフェクション方法を使用して重鎖および軽鎖のプラスミドを共トランスフェクトすることによって２９３個のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞中で、ｃＫｉｔＡ抗体のＣｙｓ突然変異体を発現させた。製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎプラスミド調製キット使用して、共トランスフェクションにおいて使用されたＤＮＡプラスミドを調製した。５％ＣＯ２下にて３７℃でＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における懸濁液中で、２９３個のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞を培養した。トランスフェクションの前日に、細胞を新たな培地中へ０．７×１０６個の細胞／ｍｌにスプリットした。トランスフェクション当日に、細胞密度は、典型的に、１．５×１０６個の細胞／ｍｌに達した。ＰＥＩ方法（Meissner et al., 2001）を使用して１：１の比の重鎖および軽鎖のプラスミドの混合物で、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を５日間さらに培養した。２０分間２０００ｘｇでの培養物の遠心分離によって、培養物からの培地を収集し、０．２マイクロメーターフィルターに濾過させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して濾過培地から、発現抗体を精製した。抗体ＩｇＧを溶出緩衝剤（ｐＨ３．０）によってＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムから溶出し、直ちに１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、その後、ＰＢＳへの緩衝剤交換が続いた。
改変Ｃｙｓ ＡＤＣは、を部分的還元天然ジスルフィドへのコンジュゲーションによってまたは天然リシン残基を介して作製されるＡＤＣよりも、マウスおよびラット動物モデルにおいて耐性が高いことが報告されている。改変Ｃｙｓ抗体を介してコンジュゲートされたＡＤＣと部分的還元天然ジスルフィド結合にコンジュゲートされたＡＤＣとの間のｉｎ ｖｉｖｏ効力における差異を評価するため、Ｅｇ５リンカー−ペイロード化合物２２３を、抗体ｃＫｉｔＡ ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ二重突然変異体（ｃＫｉｔＢ：該イムノコンジュゲートはｃＫｉｔＢ−化合物２２３またはｃＫｉｔＢ−５Ｂと称される）およびｃＫｉｔＡ ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ二重突然変異体（ｃＫｉｔＣ：イムノコンジュゲートはｃＫｉｔＣ−化合物２２３またはｃＫｉｔＣ−５Ｂと称される）ならびに野生型ｃＫｉｔＡ抗体（イムノコンジュゲートのｃＫｉｔＡ−化合物２２３またはｃＫｉｔＡ−５Ｂ）にコンジュゲートした。（残基番号はＥＵ番号である）
改変抗体は、ペイロード付着に特に適当であると見出された特定位置に、新たに導入されたシステイン残基を含有する。抗体ｃＫｉｔＢは、その重鎖に改変された２つのシステイン残基を有するｃＫｉｔＡの修飾バージョンであり、ｃＫｉｔＣは、その重鎖に改変された１つのシステイン残基およびその軽鎖に改変された１つのシステイン残基を有するｃＫｉｔＡの修飾バージョンである。ｃＫｉｔＢおよびｃＫｉｔＣは各々、２つの重鎖および２つの軽鎖を有するので、修飾抗体は、鎖間のジスルフィドの還元を必要とせずにコンジュゲーションに有用な４個の新たに付加されたシステイン残基を有し、そのため、付着されている４つのペイロード基（ＤＡＲ＝４）を有するイムノコンジュゲートが調製され得る。抗体配列を修飾する効果を比較するために、本明細書に記載されている方法を使用して、各ｃＫｉｔ抗体をペイロード／リンカー組合せ５Ｂとコンジュゲートした。
実施例５に記載されているプロトコールに従って、抗体ｃＫｉｔＡならびに突然変異体ｃＫｉｔＢおよびｃＫｉｔＣを調製した。実施例６に記載されているプロトコールに従って、ｃＫｉｔＢおよびｃＫｉｔＣを還元および再酸化した。５ｍｇ／ｍｌの抗体を０．３５ｍＭ化合物２２３で１時間の間、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．２）中でインキュベートすることによって、再酸化抗体を化合物２２３とコンジュゲートした。反応の完了度をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニタリングし、それぞれｃＫｉｔＢおよびｃＫｉｔＣコンジュゲートについて３．９および４．０のＤＡＲが得られた。ＤＡＲ測定をＭＳによってさらに検証した。ＡＤＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞死滅アッセイにおいて強力であると示され、非担腫瘍マウスにおいて非コンジュゲート抗体と同様の薬物動態特性を有していた。
ｃＫｉｔＡの天然ジスルフィド結合にコンジュゲートされた化合物２２３とのＡＤＣを、２ステッププロセスにおいて以下の通りに調製した。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度での抗体は、最初に、５０ｍＭメルカプトエチルアミン（固体として添加）を用いて３７℃で１時間の間、部分的に還元した。脱塩および１％ｗ／ｖのＰＳ−２０洗剤の添加後、部分的に還元された抗体（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍｇの抗体当たり、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌで溶解させた化合物２２３、０．５〜１ｍｇの量と、終夜４℃で反応させた。ＡＤＣをＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーによって精製した。ＰＢＳを用いるベースライン洗浄後、コンジュゲートを５０ｍＭシトレート、ｐＨ２．７、１４０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、中和し、滅菌濾過した。平均ＤＡＲは３．２であった。
３つのｃＫｉｔＡＤＣの特性：
ｃＫｉｔＡ−５Ｂ：ＤＡＲ＝３．２、凝集０．８％
ｃＫｉｔＢ−５Ｂ：ＤＡＲ＝３．９、凝集１．５％
ｃＫｉｔＣ−５Ｂ：ＤＡＲ＝４．０、凝集３．２％
ｃＫｉｔおよびトラスツズマブ抗体ならびに突然変異抗体とのペイロードの以下の組合せとのイムノコンジュゲートを調製し、同じ方法によって特徴付けた。改変抗体は、１つの抗体複合体当たり４個の付加システイン残基が全てペイロードにコンジュゲートされているならば予想される負荷である４に近いＤＡＲを一貫して提供したことに留意されたい：
Figure 2016516035
図２６は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスにおけるＨ５２６腫瘍異種移植片の成長を阻害した、システイン改変ｃＫｉｔ抗体で製造されたイムノコンジュゲートの２つの活性を要約している。（試験される各イムノコンジュゲートについて１群当たり６匹のマウス（ｎ＝６）；いずれの群においても有意な体重損失なし）。おそらく、改変抗体は天然ジスルフィド架橋構造を妨げることなくコンジュゲートを形成することができるので、それらのイムノコンジュゲートは、両方の用量でｃＫｉｔＡのコンジュゲートより活性であった。したがって、非修飾されているものを含めて様々なｃＫｉｔ抗体とのＥｇ５阻害剤のイムノコンジュゲートは活性であったが、これは、新たなシステイン残基を一定の領域に導入するためのタンパク質改変、およびペイロード／リンカー基のための付着点として新たなシステイン残基を使用することは、改善されたイムノコンジュゲートを提供することができることを実証している。
腫瘍細胞成長阻害に関する追加の活性データ
図２８は、本発明のイムノコンジュゲートが腫瘍細胞の成長を阻害することを実証する追加のデータを提供している。図２８におけるデータは、これらのイムノコンジュゲートが、ＳＫ−ＯＶ−３ｉｐ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｍ４０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｍ１６、Ｈ５２６およびＮＣＩ−Ｎ８７を含めて様々な腫瘍細胞株の成長を阻害することを実証している。各場合において、ＡＤＣの活性は、予想される通り、処理細胞上でＡＤＣの抗体によって認識される抗原の発現レベルによって一部決定される。追加のデータは、式（ＩＩ）の範囲を代表する構造の変動が、一般に、活性のレベルが細胞株にわたって変動しても活性ＡＤＣを生成することを実証している。該データは、さらに、多種多様なリンカーが使用され得ること、ならびにリンカーがＲ１基、Ｙ基およびＱ基上の位置で付着され得ることを実証している。
本発明の様々なＡＤＣによるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞成長阻害の要約を、以下の表に提供する。第１の欄は、ＡＤＣにおいて使用されたペイロード／リンカー組合せについて表２、５または６からの化合物ＩＤ番号をリストしており；第２の欄は、どの抗体がＡＤＣに使用されているかを示している。第３の欄は、ＡＤＣが試験されている細胞株を同定しており：ＡＤＣの大部分について、強い活性が予想される高抗原細胞株、および抗体送達が非効果的であると予想されるために活性がはるかに低いと予想される低抗原細胞株の両方に対抗する活性を決定した。活性を、絶対ＡＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）、Ａｉｎｆ（％）、および相対ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）として報告する。このデータのために使用される方法についての情報を表の後に提供する。
Figure 2016516035
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Figure 2016516035
Figure 2016516035
先行する表に使用されている細胞株：
Figure 2016516035
効力値の定義および誘導：
Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ２データをレプリケート試料のために平均化し、次いで未処理細胞に正規化した。アッセイは、非阻害細胞成長を反映する未処理細胞のウェルを含む。処理試料からの結果を％スケールに正規化するために、対照の平均を使用した。標準的アッセイデータ分析ソフトウェア（Ｈｅｌｉｏｓソフトウェアアプリケーション）を用いる４パラメータロジスティックモデルを使用して、正規化データの分析を行った。
Figure 2016516035
４つのパラメータとしては、Ａｉｎｆ（高［ＡＤＣ］で一般に見出される最大活性のプラトー）、Ａ０（低［ＡＤＣ］で一般に見出される最小活性のプラトー）、ｙ軸上のこれらの２つのプラトー間の中点におけるＡＤＣの濃度、および２つのプラトー間の中点におけるフィット曲線の傾斜ｎが挙げられる。
各化合物について、ソフトウェアは、絶対ＡＣ５０、相対ＥＣ５０およびＡｉｎｆの３つの測定基準を誘導した。絶対ＡＣ５０（表中の「Ａｂｓ ＡＣ５０」）は、フィット曲線がｙ軸上の５０％を横切るＡＤＣの濃度である。相対ＥＣ５０（表中の「Ｒｅｌ ＥＣ５０」）は、Ａ０とＡｉｎｆとの間のフィット曲線の中点におけるＡＤＣの濃度である。
比較イムノコンジュゲート：
ＴＢＳ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１：抗体＝トラスツズマブ；リンカー＝ＳＭＣＣ；ペイロード＝ＤＭ１：ＤＡＲは約３．５である。
Figure 2016516035
マレイミドカプロイルリンカーを使用するＭＣ−ＭＭＡＦコンジュゲート：
Figure 2016516035

Claims (45)

  1. 式（Ｉ）
    Figure 2016516035
    のイムノコンジュゲート。
    ［式中、Ａｂは、抗原結合部分を表し；
    Ｌは、ＸをＡｂに接続する連結基を表し；
    ｍは、１〜４の整数であり；
    ｎは、１〜１６の整数であり；
    Ｘは、独立して、出現する毎に、ＬによりＡｂに接続される式（ＩＩ）
    Figure 2016516035
    の基を表す
    （式中、
    Ｚは、ＮまたはＣＨであり；
    Ａｒ１は、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される３個までの基で任意選択で置換されているフェニルであり；
    Ａｒ２は、フェニルまたはピリジニルであり、Ａｒ２は、ハロ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、ヒドロキシル、アミノ、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されており；
    Ｒ１は、環員としてＮ、Ｏ、およびＳから選択される２個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜６シクロアルキル、または−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜７ヘテロシクリルであり、各Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、またはＣ４〜７ヘテロシクリルは、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、オキソ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、およびＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されており；
    Ｒ２は、Ｈ、またはＣ１〜４アルキルであり；
    Ｔは、（ＣＨ２）１〜３であり；
    Ｙは、Ｃ１〜３アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルから選択され、Ｃ１〜３アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルはそれぞれ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、およびＣ１〜４ハロアルキルから選択される３個までの基で任意選択で置換されており；
    Ａは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）、または式（ＩＩ）のカルボニルとＱとの間の結合であり；
    Ｑは、Ｃ１〜４アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜６ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜６シクロアルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ５〜６ヘテロアリール、および−（ＣＨ２）０〜２−フェニルから選択され、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、−ＳＨ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＲ、−Ｏ−グルクロネート、および−ＮＲ２から選択される３個までの基で任意選択で置換されており、各Ｒは、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、または環員としてＮ、ＯまたはＳを含有する４〜６員環の複素環であり、各Ｒは、独立して、ハロ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ＯＭｅ、または−ＯＨで任意選択で置換されている）］
  2. Ｒ２が、Ｈである、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  3. Ｚが、ＣＨである、請求項１または２に記載のイムノコンジュゲート。
  4. Ｚが、Ｎである、請求項１または２に記載のイムノコンジュゲート。
  5. Ｒ１が、テトラヒドロピランであり、Ｒ１が、オキソおよびメチルから選択される２個までの基で任意選択で置換されている、請求項１から４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  6. Ａｒ１が、ジハロフェニルである、請求項１から５のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  7. 式（ＩＩ）の化合物が、式
    Figure 2016516035
    を有し
    Ｌは、Ｙ、またはＱ、またはＲ１に付着している、請求項１から６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  8. Ｒ１が、４−テトラヒドロピラニルである、請求項１から７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  9. Ｒ１が、−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２Ｒ３０であり、Ｒ３０が、−ＯＨ、ＣＯＯＨ、またはＮＨ２であり、Ｌが、Ｒ１に付着している、請求項１から８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  10. Ｑが、ヒドロキシルおよびアミノから選択される１個または２個の基で置換されているＣ１〜４アルキルである、請求項１から９のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  11. Ｙが、ハロ、アミノ、またはヒドロキシで任意選択で置換されているピロリドンである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  12. Ａが、−ＮＨ−である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  13. 前記連結基が、開裂可能である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  14. 前記連結基が、開裂可能ではない、請求項１から１２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  15. 式（ＩＩＩ）の化合物：
    Figure 2016516035
    または薬学的に許容されるそれらの塩。
    ［式中、
    ＺがＮまたはＣＨであり；
    Ａｒ１は、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される３個までの基で任意選択で置換されているフェニルであり；
    Ａｒ２は、ハロ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、ヒドロキシル、アミノ、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される２個までの基で任意選択で置換されている、フェニルまたはピリジニルであり；
    Ｒ１は、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜７ヘテロシクリルもしくは−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ３〜７シクロアルキルであり、前記Ｃ４〜７ヘテロシクリルは、環員としてＮ、Ｏ、およびＳから選択される２個までのヘテロ原子を含有し、Ｃ４〜７ヘテロシクリルおよびＣ３〜７シクロアルキルはそれぞれ、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、およびＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）から選択される３個までの基で任意選択で置換されているか；または、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨもしくは−ＮＨ２で置換されているＣ３〜６アルキルであり；
    Ｒ２は、Ｈ、またはＣ１〜４アルキルであり；
    Ｔは、（ＣＨ２）１〜３であり；
    Ｙは、Ｃ１〜２アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルから選択され、Ｃ１〜２アミノアルキル、Ｃ４〜６ヘテロシクリル、およびＣ３〜６シクロアルキルはそれぞれ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシル置換Ｃ１〜４アルキル、アミノ置換Ｃ１〜４アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（Ｃ１〜４アルキル）、ＣＯＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、ＣＯＮ（Ｃ１〜４アルキル）２、およびＣ１〜３ハロアルキルから選択される３個までの基で任意選択で置換されており；
    Ａは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）、または式（ＩＩＩ）のカルボニルとＱとの間の結合であり；
    Ｑは、Ｃ１〜４アルキル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ４〜６ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）０〜２−Ｃ５〜６ヘテロアリール、および−（ＣＨ２）０〜２−フェニルから選択され、Ｑは、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、−ＳＨ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＲ、−Ｎ３、および−ＮＲ２から選択される３個までの基で任意選択で置換されており、各Ｒは、ハロ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ＯＭｅ、および−ＯＨから選択される３個までの基で任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルである］
  16. Ｒ１が、テトラヒドロピラニルである、請求項１５に記載の化合物。
  17. Ｒ１が、式−Ｃ（Ｍｅ）２−（ＣＨ２）０〜２Ｒ３０の基であり、Ｒ３０が、−ＯＨ、ＣＯＯＨ、またはＮＨ２である、請求項１５に記載の化合物。
  18. 式（ＩＩＡ）、または（ＩＩＢ）、または（ＩＩＣ）の化合物。
    Figure 2016516035
    ［式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｔ、Ｑ、Ｙ、およびＡは、請求項１で定義されている通りであり、
    Ｑ＊は、−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｍｅ）−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＮＭｅ−、−ＣＨ（Ｍｅ）Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨ２）−Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＮＨ−、
    Figure 2016516035
    から選択され、
    Ｙ＊は、−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨ−
    Figure 2016516035
    （式中、Ｒ１０およびＲ１１は、独立して、Ｈ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、ＣＯＮ（Ｃ１〜４アルキル）２、ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、またはＯＨである）
    から選択され、
    Ｒ１＊は、ヒドロキシ、アミノまたはカルボキシで置換されているＣ３〜６アルキルから選択され；
    Ｗは、１つまたは複数のリンカー成分および反応性官能基を含む連結部分である］
  19. Ｗが、−ＳＨ，−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅ、Ｎ−マレイミド、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−ＣＨ２−ハロ、−ＣＯＯＨ、および−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’から選択される反応性官能基を含み、ハロは、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩから選択され、−ＯＲ’は、活性化エステルの脱離基部分である、請求項１６に記載の化合物。
  20. Ａｒ１が、ジハロフェニルである、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の化合物。
  21. Ａｒ２が、フェニルまたはハロフェニルまたはヒドロキシフェニルである、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の化合物。
  22. Ｚが、ＣＨである、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の化合物。
  23. Ｚが、Ｎである、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の化合物。
  24. Ｒ１が、４−テトラヒドロピラニルである、請求項１５または１８から２３のいずれか一項に記載の化合物。
  25. Ｒ２が、Ｈである、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の化合物。
  26. Ａが、−ＮＨ−である、請求項１５から２５のいずれか一項に記載の化合物。
  27. Ａが、結合である、請求項１５から２５のいずれか一項に記載の化合物。
  28. Ｔが、ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２である、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の化合物。
  29. Ｙが、−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＮＨ２、
    Figure 2016516035
    ［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、独立して、Ｈ，Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ（Ｃ１〜４アルキル）、またはＯＨである］
    から選択される、請求項１５から２８のいずれか一項に記載の化合物。
  30. Ｑが、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２−ＮＨ２、−ＣＨ（Ｍｅ）ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＮＨ２、
    Figure 2016516035
    から選択される、請求項１５から２９のいずれか一項に記載の化合物。
  31. 表１の化合物および薬学的に許容されるそれらの塩から選択される、請求項１５に記載の化合物。
  32. 請求項１５から３１のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるそれらの塩、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  33. 治療有効量の請求項１５から３１のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるそれらの塩、および１つまたは複数の治療活性補助剤を含む組合せ。
  34. 細胞増殖性障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項１５から１７のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるそれらの塩を投与することを含む、方法。
  35. 医薬として使用するための、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１から１４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または薬学的に許容されるそれらの塩。
  36. 前記医薬が、がんの処置に使用するためのものである、請求項３５に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
  37. がんの処置に使用するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩。
  38. イムノコンジュゲートＡｂ−Ｌ＊−Ｘであって、抗体（Ａｂ）に連結するペイロード（Ｘ）を含み、連結基Ｌ＊は、式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１−または−ＮＲ２１−Ｃ（Ｏ）−の基を含み、Ｒ２１は、式−（ＣＨ２）１〜４−Ｒ２２のものであり、Ｒ２２は、−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｎ（Ｒ２３）２、ＣＯＯＲ２３、ＣＯＮ（Ｒ２３）２、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＲ２３、および−ＳＯ２Ｒ２３から選択される極性基であり、ｋは、０〜４であり、各Ｒ２３は、独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである、イムノコンジュゲートＡｂ−Ｌ＊−Ｘ。
  39. 式（Ｉ）
    Figure 2016516035
    のイムノコンジュゲート。
    ［式中、Ａｂは、抗原結合部分を表し；
    各Ｌは、ＸをＡｂに接続する、独立して選択される連結基を表し；
    ｍは、１〜４の整数であり；
    ｎは、１〜１６の整数であり；
    Ｘは、独立して、出現する毎に、Ｅｇ５の阻害剤を表す］
  40. Ｘが、表１から選択される化合物である、請求項３９に記載のイムノコンジュゲート。
  41. ｍが、１であり、前記イムノコンジュゲートが、Ａｂと、表２から選択される化合物との反応により形成される、請求項３９に記載のイムノコンジュゲート。
  42. 表５から選択される化合物またはそのイムノコンジュゲート。
  43. ＡｎｔｉＢが抗体を表す、表５のイムノコンジュゲートから選択されるイムノコンジュゲート。
  44. 前記抗原結合部分が、定常領域に導入された少なくとも１つの非天然システイン残基を有する抗体であり、前記連結基Ｌが、前記非天然システイン残基に付着している、請求項１から１４または３８から４３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  45. ｍが、１であり、ｎが、１〜５の間であり、好ましくは約２または約４である、請求項４４に記載のイムノコンジュゲート。
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