JP2021519749A - 酸性自己安定化ジョイントを有する抗体薬物複合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、特殊な親水性酸性安定化ジョイント−薬物複合体を提供する。酸性安定化ジョイントの導入により、薬物担持量が比較的低い複合体に比べ、本発明の複合体は比較的高い薬物担持量（即ち、各標的化試薬におけるより多い親水性薬物ジョイント）を有するとともに、所望のＰＫ性質を保留し、体内で同等又はそれ以上の活性を有する。

Description

本発明は、抗体薬物複合体を用いて腫瘍又は他の疾患を治療することに関し、特に特殊な親水性酸性安定化ジョイントを用いて抗体薬物複合体を製造し、血漿中の薬物の安定性を向上させ、薬物代謝動態（ＰＫ）を顕著に改善することに関する。

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、新しい標的薬として、一般的には抗体又は抗体リガンド、低分子医薬品、及び抗体と薬物とを結合するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）の３つの部分からなる。抗体薬物複合体は、抗原に対する抗体の特異的識別により薬物分子を標的細胞の近傍まで輸送し、薬物分子を放出することにより治療の目的を達成する。２０１１年８月に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、シアトルジーンコーポレーションによって開発された、ホジキンリンパ腫及び再発性変性大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）の治療のための新しいＡＤＣ薬であるＡｄｅｃｔｅｉｓ^ＴＭの販売を承認した。臨床応用により、この薬物の安全性と有効性が証明されている。

抗体薬物複合体において、薬物分子と抗体を効率的に結合するために、現在臨床試験中の複合体は、通常リンカーをリガンド表面のリジン残基又は抗体ヒンジ領域のシステイン残基（鎖間ジスルフィド結合部分を還元して得られるもの）に結合する。しかし、抗体表面に大量のリジン残基（８０個超え）が存在すること及び結合の非選択性により、結合の数とサイトの不確実をもたらし、抗体薬物複合体の不均一性を引き起こす。チオール基による結合により製品品質の均一性が低いとの問題を有効に回避することができる。マレイミドは、ジョイントとして抗体のチオール基と温和な条件下で迅速かつ高選択的にマイケル付加反応を起こしてチオエーテル生成物を形成する。

しかし、より多くの研究により、スクシンイミドとチオール基との付加反応は可逆的プロセス（逆マイケル付加）であることが示されており、付加生成物が血漿に入った後、血漿中に遊離チオール基を含むタンパク質が大量存在するため、付加生成物がアルブミンのチオール基と交換反応を起こし、薬物分子が脱落することがはっきりと観察された。脱落した薬物分子は、有毒な副作用を引き起こすとともに、抗体薬物複合体の薬効を低下させる（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｖｉｖｏ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１２）３０：１８４−１８９；Ｂａｌｄｗｉｎ＆Ｋｉｉｃｋ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ ２０１１，２２，１９４６−１９５３；Ａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７５９−７６５）。

多くの文献には、血漿中の抗体薬物複合体の安定性の向上、及びチオール基の逆マイケル付加作用の低下について検討されている。マレイミドとチオール基により形成される環状チオエーテル付加生成物が水含有環境において加水分解してチオエーテル開環生成物を形成できることが報告されている。環状チオエーテル付加生成物と異なり、チオエーテル開環生成物は血漿中で安定し、他のチオール基と交換しなくなる。そこで、抗体薬物複合体が生体内に入る前に全て開環構造に変換できれば、チオール基置換の発生を効果的に回避することができる。

付加開環反応の速度は、反応条件のＰＨ、温度及び構造自体の様々な要因に影響される。ＰＨと温度に対する抗体の感度により、ジョイント構造を最適化することでそれを抗体が耐えられるＰＨ、温度下で迅速に開環させることが好ましい。国際出願ＷＯ２０１６０２５７５２にはスクシンイミド環外に強電子吸引基を導入する方法が開示されている。この方法は、電子吸引効果によりチオエーテル付加生成物とアルブミンの置換を弱くするが、電子吸引基の存在のため、スクシンイミドと薬物との結合体は全体として自然条件下で保存されにくく、強電子吸引基を有するスクシンイミドは加水分解して開環しやすいので、さらにチオール基と付加することができなくなる。

米国Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社の特許出願ＵＳ２０１３０３０９２５６には、スクシンイミドの近傍に塩基性基及び１つの電子吸引基を導入し、塩基性基の促進により付加生成物がアルブミンの置換率を効果的に低下でき、血漿中の安定性が顕著に向上するジョイントが開示されている。知られているように、人体の血漿のＰＨは弱塩基性であり、塩基性基の導入によりスクシンイミドの開環を促進できるが、分子親水性の改善には不利である。これは、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓの国際出願ＷＯ２０１５０５７６９９によって実証されている。この発明者は、分子に塩基性基を有する安定化ジョイントを導入したところ、比較的高い薬物担持量の場合、疎水性の原因で、抗体薬物複合体分子全体はマウス体内で依然として快速に分解されることを発見した（国際出願ＷＯ２０１５０５７６９９の第２２５頁を参照）。この問題を改善するために、この発明者は、分子の側鎖に複雑なポリエチレングリコール構造を導入して分子の集まりを改善した（国際出願ＷＯ２０１５０５７６９９を参照）。

アルブミン置換を低下させ、血漿安定性を向上させる以外、抗体薬物複合体の設計のために重量な要素は、各標的化剤が送達可能な薬物の量（即ち、各標的化剤（例えば、抗体）に結合する細胞毒性薬の数。薬物担持量（ｄｒｕｇ ｌｏａｄ）と呼ばれる）である。比較的高い薬物担持量の薬効は、比較的低い薬物担持量の薬効よりも高いとの仮説が提案されている（例えば、８−単位担持量は、４−単位担持量に対して生体内及び生体外においてより良好な薬効を有するはずである）。その理論的根拠は、薬物担持量が比較的高い複合体は、標的細胞により多くの薬物（細胞毒性薬）を送達できることである。生体外実験結果も比較的高い薬物担持量を有する複合体が生体外で細胞系に対してより高い活性を有することを証明した。しかし、その後のいくつかの研究により、この仮説は、動物体内モデルでは実証できなかったことが示されている。また、あるアウリスタチン薬物の４単位及び８単位薬物担持量を有する複合体は、マウスモデルにおいて予想外に類似する活性を有し、８単位薬物担持がより高い薬効有することが観察されなかった（Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０（２００４）を参照）。Ｈａｍｂｌｅｔｔらは上記実験現象の原因を述べ、より高い担持量を有するＡＤＣが動物モデルにおいてより速く循環システムからクリアされることをさらに発表した。これは、比較的高い担持量を有する複合体のＰＫが比較的低い担持量を有する複合体のＰＫよりも不安定であることを示している。また、比較的高い担持量を有する複合体は、マウスにおいてＭＴＤが比較的低いため、治療指数が比較的狭い。一方、モノクローナル抗体におけるエンジニアリングされた部位での薬物担持量が２であるＡＤＣは、４−単位担持量のＡＤＣと同等又はよりよいＰＫ性質及び治療指数を有することが報告されている（Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：４７６９（２０１０）を参照）。

理論的には、薬物担持量を向上させることで単一抗体が標的細胞内に運搬できる薬物数を増加できるが、薬物の疎水性のため、薬物の数が増加すると、ＡＤＣ薬物の疎水性が高くなり、その結果、ＡＤＣ薬物が体内で集まり、治療指数が低くなる。比較的高い担持量を有するＡＤＣのＰＫ低下傾向を克服するための代替的な方法は、ＡＤＣ構造に可溶化基を導入することを含む。例えば、リンカー（例えば、薬物と抗体の結合部位の間）にポリエチレングリコールポリマー又は他の水溶性ポリマーを増加して集まり傾向を克服してみた。例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社は、塩基性基を導入してジョイントを安定化する技術を開発した後においても、ジョイント−薬物複合体に側鎖ＰＥＧを導入する等の方法により高薬物担持量での薬物分子のＰＫを改善する必要がある。しかし、可溶化基の導入により、このような複合体の調製はより複雑になる恐れがある。

そのため、高薬物担持量（ＤＡＲ）による悪影響を改善する新しいＡＤＣ分野において、スクシンイミドのチオール基の置換を克服して血漿安定性を向上させるとともに、高ＤＡＲの抗体薬物複合体の薬物動態学的性質を改善できる新しい方法が必要である。本発明の酸性安定化ジョイントは、これらの需要を驚くほど満たしている。

本発明は、特殊な親水性酸性安定化ジョイント−薬物複合体を提供することを目的とする。発明者は、実験により、ＵＳ２０１３０３０９２５６に記載の塩基性基の導入と異なり、酸性のアミノ酸又はオリゴペプチドユニットの導入によりスクシンイミドと抗体複合体のチオール基との交換を減少でき、血漿において高安定性を保持できることを発見した。また、実験により、アミノ酸の導入により、設計された複合体は未結合標的化試薬と類似した親水性を有するため、体内における未結合標的化試薬と類似した薬物動態（ＰＫ）学的性質が保留されることを証明した。従って、酸性安定化ジョイントが存在する場合、上記２つの経路により血漿中の薬物の安定性を同時に向上させ、薬物代謝動態（ＰＫ）を改善することにより、薬効が向上する。

酸性安定化ジョイントの導入により、薬物担持量が比較的低い複合体に比べ、本発明の複合体は比較的高い薬物担持量（即ち、各標的化試薬におけるより多い親水性薬物ジョイント）を有するとともに、所望のＰＫ性質を保留し、体内で同等又はそれ以上の活性を有する。（例えば、４−単位担持量又は８−単位担持量の複合体は、それぞれその２又は４単位担持量の対応物と同等又はそれ以上のＰＫ性質を有することができる。このような４−単位担持量又は８−単位担持量複合体は、それぞれその２又は４単位担持量の対応物と同等又はそれ以上のＰＫ性質を有することができる）。

具体的には、本発明は、式Ｉで表される抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を提供する。

式中、Ｌは、抗体、抗体断片又はタンパク質であり、
Ｍは、スクシンイミド又は加水分解スクシンイミドであり、
Ａｃは、アミノ基と酸性基からなる断片、又は複数のアミノ酸からなるオリゴペプチドであり、アミノ基を介して丸に結合され、
Ｄは、薬物ユニットであり、
Ａは、リンカーであり、
丸は、足場を示し、置換若しくは非置換のＣ_１−８アルキレン基、Ｃ_１−８ヘテロアルキレン基、Ｃ_６−１０アリーレン基又はＣ_４−１０ヘテロアリーレン基であり、
ｍは、１−２０の整数であり、ｎは１又は２である。

このましくは、前記抗体は、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原に対する抗体である。

このましくは、Ａｃは、全体的に酸性を呈するアミノ酸ユニット又は酸性オリゴペプチドである。

より好ましくは、Ａｃは、等電点７．０以下の天然アミノ酸若しくは非天然アミノ酸、又はこれらのアミノ酸からなるオリゴペプチドである。

好ましい実施例において、前記オリゴペプチドユニットは２−５個のアミノ酸から構成される。

好ましい実施例において、前記Ａは、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーである。

好ましい実施例において、前記薬物は、細胞毒性薬、自己免疫疾患の治療薬、又は抗炎症薬である。

より好ましくは、薬物Ｄは、メイタンシン系薬物、アウリスタチン系薬物、ベンゾジピロール系薬物、ピロロベンゾジアゼピン系薬物、アマニタトキシン又はその誘導体、カンプトテシン系化合物からなる群より選択される。

好ましい実施例において、Ａは下式で表される構造を有する。

式中、Ｃは、末端の拡張可能なユニットであり、Ｅは、切断可能なユニットであり、Ｆは、スペーサーユニットを示し、下付き文字ｅ、ｆは０又は１である。波線は、酸性自己安定化ジョイント及び薬物ユニットまでの結合部位を示す。

好ましい実施例において、丸は、Ｃ_１−８アルキレン基又はＣ_１−８ヘテロアルキレン基を示す。

より好ましくは、丸は、Ｃ_１−３アルキレン基を示す。
好ましい実施例において、前記Ａｃは、（Ｄ／Ｌ）グリシン、（Ｄ／Ｌ）アラニン、（Ｄ／Ｌ）ロイシン、（Ｄ／Ｌ）イソロイシン、（Ｄ／Ｌ）バリン、（Ｄ／Ｌ）フェニルアラニン、（Ｄ／Ｌ）プロリン、（Ｄ／Ｌ）トリプトファン、（Ｄ／Ｌ）セリン、（Ｄ／Ｌ）チロシン、（Ｄ／Ｌ）システイン、（Ｄ／Ｌ）メチオニン、（Ｄ／Ｌ）アスパラギン、（Ｄ／Ｌ）グルタミン、（Ｄ／Ｌ）トレオニン、（Ｄ／Ｌ）アスパラギン酸、（Ｄ／Ｌ）グルタミン酸又は以下の構造式で表される化合物からなる群より選択される。

式中、波線は、足場までの結合部位を示し、Ｒは、アミノ基とリン酸基との間の任意の連結断片を示す。

本発明の別の態様において、下式で表される構造を有するジョイント−薬物結合体が提供される。

Ａｃは、等電点が７未満なアミノ酸ユニットであり、
Ｄは、薬物ユニットであり、
Ａは、リンカーであり、
ｑは、１−８の整数であり、ｎは１又は２である。

本発明によれば、抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤の薬物組成物が提供される。

がん、免疫疾患、炎症を治療するための薬物の製造における抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩の使用。

化合物１１のＭＳ−ＴＯＦ検出結果である。 Ｈ−１１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 Ｈ−２０のＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 Ｈ−２９のＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 Ｈ−３９のＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 Ｈ−４１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 Ｈ−４３のＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 ＤＰＲ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出結果である。 未結合抗体、酸性安定化ジョイントを有するＡＤＣ、及び対照ＡＤＣのマウス体内安定性の研究結果である。 酸性安定化ジョイントを有するＡＤＣ及び１種類の対照ＡＤＣのＨＩＣクロマトグラフィー結果である。 酸性安定化ジョイントを有するＡＤＣ及び１種類の対照ＡＤＣの体内薬効結果である。 実施例５６の実験結果を示す。

発明者は、鋭意な研究を行ったところ、酸性安定化ジョイントを有する抗体薬物複合体が血漿においてより優れた安定性を有し、従来の抗体薬物複合体に比べ、より良好な親水性を有し、結合した構造がより高い薬物担持量を有しながら、低担持量である場合の構造の薬物動態学を保持できることを発見した。また、より高い薬物担持量は、より高い活性及び治療効果をもたらす。

具体的には、本発明に係る酸性安定化ジョイントを有する抗体薬物複合体は、マレイミドユニットを有し、抗体のチオール基と結合した後、安定化酸性基の存在下で、マレイミドが加水分解して開環し、形成された構造は血漿における他のチオール基含有高分子と置換しないので、薬物分子の脱落が回避される。

また、親水性酸性基の存在により、形成された開環構造の抗体薬物複合体の親水性はより良好で、薬物担持量の増加による活性の低下等の問題を回避できる。

生成した抗体薬物複合体は、標的薬を標的細胞、例えば、腫瘍細胞に送達することに適用できる。抗体薬物複合体は、細胞表面タンパク質に特異的に結合することができ、生成した結合体は、細胞にランダムに取り込まれる。細胞内において、薬物は、活性薬物として放出されて作用する。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体；抗原に結合可能な抗体断片、抗体Ｆｃ融合タンパク質、又はタンパク質を含む。薬物は、高活性の薬物であり、メイタンシン類（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、アウリスタチン系薬物（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カリケアミシン類（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ドキソルビシン類（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｓ）、ベンゾジピロール系抗生物質（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ及びＣＣ−１０６５）、ピロロベンゾジアゼピン二量体類（ＰＢＤＳ）、アマニタトキシン類、カンプトテシン及びその誘導体、例えば、ＳＮ３８、イリノテカン、エキサテカン等を含むが、これらに限定されない。

発明の詳細な説明
略語と定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有するものとする。本明細書でブランド名が使用されている場合、特に明記しない限り、ブランド名にはこのブランド名の製品処方、一般薬、有効成分が含まれる。

用語「アルキレン基」とは、炭素数１−２０の二価直鎖飽和ヒドロカルビル基であり、炭素数１−１０の基を含む。アルキレン基の例には、メチレン基（−ＣＨ２−）、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ｎ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基、ｎ−ペンチレン基及びｎ−ヘキシル基等が含まれるが、これらに限定されない。特に明記しない限り、用語「アリール基」とは、多価不飽和基、一般的には、芳香族基であり、単環、縮合環又は共有結合した多環式基（最大三環式基）であってもよい。用語「ヘテロアリール基」とは、Ｎ、Ｏ又はＳから選択されるヘテロ原子を１−５個含むアリール基（又は環）であり、前記Ｎ及びＳ原子は必要に応じて酸化されてもよく、前記Ｎ原子は必要に応じて四級化されてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子により分子の他の部分に結合してもよい。アリール基の例には、フェニル基、ナフチル基、及びジフェニル基が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基の例には、ピリジル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、ピリミジニル基（ｐｙｒｉｍｉｎｄｉｎｙｌ）、トリアジニル基、キノリニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シノリニル基、フタラジニル基（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｉｙｌ）、ベンゾトリアジニル基、プリニル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾピラゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、ベンゾイソアゾール基、イソベンゾフラニル基、イソインドリル基、インダジニル基、ベンゾトリアジニル基、チエノピリジル基、チエノピリミジニル基、ピリドピリミジニル基、イミダゾピリジン基、ベンゾチアゾリル基（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｘｏｌｙｌ）、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、インドリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、イソチアゾリル基、ピラゾリル基、インダゾリル基、プテリジニル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピロリル基、チアゾリル基、フラニル基、及びチエニル基等が含まれるが、これらに限定されない。「置換されている」と記載されている場合、上記の芳香環およびヘテロ芳香環系の置換基は、以下の許容される置換基から選択される。

本明細書では、アリーレン基とは、上記のアリール構造において、プロ位、メタ位またはパラ位に２つの共有結合構造が存在することをいう。

特に明記しない限り、ヒドロカルビル基（通常、アルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基と呼ばれるものを含む）の置換基は、−ハロゲン、−ＯＲ'、−ＮＲ'Ｒ''、−ＳＲ'、−ＳｉＲ'Ｒ''Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＣＯ_２Ｒ'、−ＣＯＮＲ'Ｒ''、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ'Ｒ''、−ＮＲ''Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＮＲ'−Ｃ（Ｏ）ＮＲ''Ｒ'''、−ＮＲ''Ｃ（Ｏ）_２Ｒ'、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＲ'Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＲ'、−Ｓ（Ｏ）Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ'Ｒ''、−ＮＲ'Ｓ（Ｏ）_２Ｒ''、−ＣＮ及び−ＮＯ_２からなる群より選択される。置換基の数は０から（２ｍ'＋１）であり、ｍ'はこの基中の炭素の相数である。Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、それぞれ独立して水素、非置換のＣ_１−８アルキル基、非置換の芳基、１−３個のハロゲンで置換されているアリール基、非置換のＣ_１−８アルキル基、Ｃ_１−８アルコキシ基若しくはＣ_１−８チオアルコキシ基、又は非置換のアリール−Ｃ_１−４アルキル基である。Ｒ'とＲ''が同一の窒素原子に結合される場合、それらはこの窒素原子と一緒になって３、４、５、６又は７員環を形成してもよい。例えば、−ＮＲ'Ｒ''は、１−ピロリジニル基及び４−モルホリニル基を含む。

本明細書で用いる化合物の「誘導体」とは、化学構造が化合物と類似するが、少なくとも１つの化合物に存在しない化学基を含む、及び／又は少なくとも１つの化合物に存在する化学基が欠如した物質をいう。誘導体に対応する化合物は、「母体」化合物と呼ばれる。通常、「誘導体」は、１つ又は複数の化学反応工程において母体化合物から生成することができる。

抗体、抗体断片及びタンパク質
本発明の実施例における抗体、抗体断片及びタンパク質ユニットは、標的部分に特異的に結合する標的化剤である。本発明に記載の抗体は、細胞成分又は他の目的の標的分子に特異的に結合することができる。抗体ユニットの作用は、薬物ユニットをリガンドユニットと作用する特定の標的細胞群に送達することである。リガンドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及び非タンパク質（例えば、糖）を含むが、これらに限定されない。適切なリガンドユニットは、抗体、例えば、全長（完全）抗体及びその抗原結合断片を含む。リガンドユニットが非抗体標的化試薬である実施形態において、リガンドユニットは、ペプチド若しくはポリペプチド、又は非タンパク質分子であってもよい。このような標的化試薬の例には、インターフェロン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、コロニー刺激因子、ビタミン、栄養トランスポーター、又は他の細胞結合分子若しくは物質が含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーは、リガンドの硫黄原子に共有結合する。いくつかの実施形態において、硫黄原子は、システイン残基の硫黄原子であり、抗体の鎖間ジスルフィド結合を形成する。他の実施形態において、硫黄原子は、既にリガンドユニットに導入されたシステイン残基の硫黄原子であり、抗体の鎖間ジスルフィド結合を形成する。別の実施形態において、硫黄原子は、既にリガンドユニットに（例えば、部位特異的変異誘発又は化学反応により）導入されたシステイン残基の硫黄原子である。別の実施形態において、リンカーに結合した硫黄原子は、抗体を形成する鎖間ジスルフィド結合のシステイン残基又は既にリガンドユニットに（例えば、部位特異的変異誘発又は化学反応により）導入されたシステイン残基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｋａｂａｔ （Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２）に記載のＥＵインデックス番号付けシステムが使用される。

本明細書において、「抗体」又は「抗体ユニット」は抗体結合の任意部分を含む。このユニットは、受容体、抗原、又は標的細胞群体に含まれる他の受容体ユニットに結合、反応的に関連、又は複合することができる。抗体は、任意のタンパク質又はタンパク質類分子であってもよく、治療又は生物学的改造される細胞群体の一部に結合、複合又は反応することができる。

本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体である場合、免疫動物の血清の抗体分子異種群体に由来する。モノクローナル抗体は、マウス、ヒトのモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体又はキメラモノクローナル抗体、及び他の物種に由来の抗体を含むが、これらに限定されない。当該技術分野で知られている技術によりヒトモノクローナル抗体を製造することができる（Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０：７３０８−７３１２．Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，ＭＥｔｈａｎ，Ｅｎｚｙｍｏｌ ９２：３−１６）。

本発明の抗体薬物複合体を構成する抗体は、野生状態での元の抗原結合能力を維持することが好ましい。したがって、本発明の抗体は、抗原に特異的に結合できるものであることが好ましい。抗原は、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面受容体タンパク質及び他の細胞表面分子、細胞生存レギュレーター、細胞増殖レギュレーター、組織の成長と分化に関連する分子（例えば、機能性を有することが知られているか又は予測されるもの）、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、血管新生に関与する分子、及び血管新生関連分子（例えば、機能性を有することが知られているか又は予測されるもの）を含む。腫瘍関連因子は、クラスター分化因子（例えば、ＣＤタンパク質）であってもよい。

本発明において、抗体薬物複合体に用いる抗体は、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原に対する抗体を含むが、これらに限定されない。このような腫瘍関連抗原は、当該技術分野で知られているものであり、既知の抗体製造方法及び情報に従って製造することができる。がん診断及び治療に適用できる有効な細胞標的を開発するために、研究者は膜貫通ポリペプチド又は他の腫瘍関連ポリペプチドを探している。これらの標的は、１種又は複数種のがん細胞表面で特異的に発現することができ、１種又は複数種の非がん細胞表面でほとんど又は完全に発現しない。通常、非がん細胞表面に対して、このような腫瘍関連ポリペプチドは、がん細胞表面でより過度に発現する。このような腫瘍関連因子は、抗体によるがん治療の特異的標的化特性を大幅に向上できることが確認された。

本発明において、抗体薬物複合体の製造に用いるペプチド又はタンパク質は、エピトープ又は対応する受容体に対して親和力を有する任意のペプチド又はタンパク質であってよく、必ず免疫グロブリンファミリーに属するわけではない。これらのペプチドは、ファージディスプレイ抗体に使用される技術によって単離することができる（Ｓｚａｒｄｅｎｉｎｇｓ，Ｊ Ｒｅｃｅｐｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｒｅｓ．２００３：２３（４）：３０７−４９）。このようなランダムペプチドライブラリーからのペプチドの使用は、抗体及び抗体断片の使用と同様であり得る。ペプチド又はタンパク質の結合分子は、高分子又は材料（例えば、アルブミン、ポリマー、リポソーム、ナノ粒子、デンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない）に結合又は接続することができる。前記結合により、ペプチド又はタンパク質がその抗原結合特異性を保持できればよい。

腫瘍関連抗原は、当該技術分野で知られている抗原を含む。腫瘍関連抗原に対応する核酸及びタンパク質配列は、公に利用可能なデータベース、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されている。抗体標的化に対応する腫瘍関連抗原は、全てのアミノ酸配列の変異体及びホモログを含み、参考文献に確認された配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し、又は参考文献の腫瘍関連抗原の配列と完全に一致する生物学的特性と特徴を有する。

用語「抑制」又は「の抑制」とは、検出可能な量が減少されること、又は完全に阻害されることを指す。

用語「がん」とは、無秩序な細胞増殖を特徴とする生理学的病状又は疾患を指す。「腫瘍」は、がん細胞を含む。

用語「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織又はタンパク質に起因する疾患又は障害を指す。

本明細書では、用語「薬学的に許容される塩」とは、化合物（例えば、薬物、薬物−ジョイント又はリガンド−ジョイント−薬物複合体）の薬学的に許容される有機塩又は無機塩を指す。この化合物は、少なくとも１つのアミノ基又はカルボキシル基を含んでもよく、対応する酸又は塩基と付加塩を形成することができる。例示的な例には、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が含まれるが、これらに限定されない。また、薬学的に許容される塩は、その構造に複数の荷電原子を有する。複数の荷電原子は、薬学的に許容される塩の一部の例であり、複数の対イオンを有することができる。例えば、薬学的に許容される塩は、１つ若しくは複数の荷電原子及び／又は１つ若しくは複数の対原子を有する。

好ましい薬物は、がんの治療に適用する細胞毒性薬であり、メイタンシン又はメイタンシノイド、ドラスタチン１０（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ１０）の類似体、カリケアミシン類薬物、ドキソルビシン類ベンゾジピロール系抗生物質（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ，ＣＣ−１０６５等）、ピロロベンゾジアゼピン系（ｐｙｒｒｏｌｏ［２，１−ｃ］［１，４］ｂｅｎｚｏｄｉ−ａｚｅｐｉｎｅｓ，ＰＢＤｓ）又はＰＢＤ二量体類（ＰＢＤ ｄｉｍｍｅｒｓ）及び誘導体、アマニタトキシン又はその誘導体を含むが、これらに限定されない。カンプトテシン系化合物は、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、ＳＮ−３８、エキサテカン、イリノテカン等を含む。

一方、薬物は、上述した種類に限定されず、抗体薬物複合体に適用できる薬物の全て含む。

いくつかの実施例において、本発明は、酸性自己安定化ジョイントにより結合する薬物は、以下の放射性同位元素をさらに含む。^３Ｈ，^１１Ｃ，^１８Ｆ，^３２Ｐ，^３５Ｓ，^６４Ｃｕ，^６８Ｇａ，^８６Ｙ，^９９Ｔｃ，^１１１Ｉｎ，^１２３Ｉ，^１２５Ｉ，^１３１Ｉ，^１３３Ｘｅ，^１７７Ｌｕ，^２１１Ａｔ及び^２１３Ｂｉを含むが、これらに限定されない。

細胞内での薬物放出のメカニズムによって、本明細書でいう「リンカー」又は「抗体薬物複合体のリンカー」は、切断不可能なリンカーと切断可能なリンカーの２種類に分けられる。

切断不可能なリンカーを含む抗体薬物複合体では、その薬物放出メカニズムは、複合体が抗原に結合して細胞に取り込まれた後、抗体がリソソーム中で酵素加水分解され、低分子医薬品、リンカー及び抗体アミノ酸残基からなる活性分子が放出されることである。これによる薬物分子構造の変化は、その細胞毒性を低下させないが、活性分子は荷電（アミノ酸残基）であるため、隣接する細胞に入ることができない。そのため、このような活性薬物は、標的抗原（抗原陰性細胞）を発現しない隣接する腫瘍細胞を殺すことができない（傍観者効果、ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）（Ｄｕｃｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２１：５−１３）。

切断可能なリンカーは、標的細胞内で切断されて活性薬物（低分子医薬品それ自体）を放出することができる。切断可能なリンカーは、主に化学的不安定リンカーと酵素不安定リンカーの２種類に分けられる。

化学的不安定リンカーは、血漿及び細胞性質によって選択的に切断され得る。このような特性は、ｐＨ値、グルタチオン濃度等を含む。

いくつかの実施例において、リンカーは、ｐＨ値に敏感なリンカーであり、通常酸切断リンカーとも呼ばれる。このようなリンカーは、血液の中性環境（ｐＨ７．３−７．５）下で相対的に安定するが、弱酸性のエンドソーム（ｐＨ５．０−６．５）及びリソソーム（ｐＨ４．５−５．０）内では加水分解される。第一世代の抗体薬物複合体は、ほとんどこのようなリンカー（例えば、ヒドラゾン、カーボネート、アセタール、ケタール類）を使用する。酸切断リンカーの限られた血漿安定性のため、このようなリンカーを用いた抗体薬物複合体は、通常、半減期が比較的短い（２−３日）。このような短い半減期のため、ある程度にｐＨ敏感リンカーの次世代抗体薬物複合体における応用が制限される。

グルタチオンに敏感なリンカーは、ジスルフィド結合リンカーとも呼ばれる。薬物放出は、細胞内のグルタチオンの高濃度（ミリモル範囲）と血液中の比較的低いグルタチオン濃度（マイクロモル範囲）の差に引き起こされる。特に腫瘍細胞では、その低酸素含有量によりレダクターゼ活性が増強するため、グルタチオン濃度がより高くなる。ジスルフィド結合は、熱力学的安定性を有するため、血漿中で良好な安定性を有する。

酵素不安定リンカー、例えば、ペプチドリンカーは、薬物放出をより良好に制御することができる。ペプチドリンカーは、リソソーム内のプロテアーゼ、例えば、カテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ）又はプラスミン（いくつかの腫瘍組織においてこのような酵素の含有量が増加する）により効果的に切断され得る。このようなペプチドリンカーは、血漿循環において非常に安定すると考えられている。これは、細胞外の不適宜なｐＨ値及び血清プロテアーゼ阻害剤によりプロテアーゼ通常活性を有しないためである。比較的高い血漿安定性及び良好な細胞内切断選択性と有効性により、酵素不安定リンカーは、抗体薬物複合体の切断可能なリンカーとして幅広く使用されている。典型的な酵素不安定リンカーはＶａｌ−Ｃｉｔ（ｖｃ）、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ等を含む。

スペーサーユニットは、一般的に切断可能なリンカーと活性薬物との間に嵌合され、又はそれ自体が切断可能なリンカーの一部である。スペーサーユニットの作用メカニズムとして、切断可能なリンカーが適宜な条件下で切断された後、スペーサーユニットは自発的に構造再構成し、それに結合された活性薬物を放出することができる。一般的なスペーサーユニットは、ｐ−アミノベンジルアルコール類（ＰＡＢ）及びβ−グルクロニド類（β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）、置換又は非置換のエチレンジアミン等を含む。

略語と定義
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＤＣＣ：シクロジヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＦ：Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰ：４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＰＢＳ：リン酸緩衝液（ＰＨ７．０−７．５）。

薬学的に許容される賦形剤は、いかなる担体、希釈剤、アジュバント又は賦形剤、例えば、防腐剤及び酸化防止剤、フィラー、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、吸収遅延剤等を含む。これらの媒体及び薬剤の薬物活性物質における使用は、当該技術分野では知られているものである。従来の媒体又は試薬と有効成分との不適合性に加えて、治療用組成物におけるその使用も考慮に入れられてきた。治療的組み合わせの適切な形態として、補足的な有効成分もまた、前記組成物に組み込むことができる。

本発明は、以下の有益な効果を有する。
１、本発明の酸性安定化ジョイントを有する抗体薬物複合体は、複合体が体内でアルブミンチオール基と交換する可能性を大幅に減少させ、血漿安定性を顕著に向上させる。

２、本発明の酸性安定化ジョイントは、酸性基の導入により、分子がより良好な水溶性を有し、抗体薬物複合体のＰＫ性質を効果的に改善でき、より良好な体内薬効を有する。

３、本発明の酸性安定化ジョイントを有する抗体薬物複合体は、血漿安定性を増強させるとともに、最終的な複合体のＰＫ性質を改善することができる。これらの利点は、高薬物担持量の需要を満たすことができ、高薬物担持量下での抗体薬物複合体の集まりを減少させ、低薬物担持量より高い薬効を得ることができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明し、これらの実施例は本発明を例示するためだけに使用され、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解されたい。以下の実施例で特定の条件が指定されていない試験方法は、通常、従来の条件下又は製造元が推奨する条件下で行われる。特に明記しない限り、すべての百分率、比例、比率、又は割合は質量で示される。別段の定義がない限り、以下の本文で使用される専門用語および科学用語はすべて、当業者に一般的に理解されている意味を持つことを意図している。さらに、記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明によって構成される方法に適用することができる。以下の好ましい実施例の方法及び材料は、例示的なものである。

本発明の以下の実施例で用いる一般手順は以下の通りである。
一般手順Ａ
予備精製されたモノマー比が９５％超えの抗体分子を、限外濾過用遠沈管によりＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）に移す。抗体モル数の１０倍のＴＣＥＰを加え、室温で８時間反応させる。抗体鎖間ジスルフィド結合を開き、Ｅｌｌｍａｎ方法により遊離チオール基の数を測定し、ジスルフィド結合が完全に開かれたか否かを確認する。そして、抗体モル数の１０倍のｐａｙｌｏａｄを加え、室温で８時間反応させる。反応終了後、カットオフ分子量が３０ＫＤａの限外濾過用遠沈管によりＰＢＳに移し、未結合のｐａｙｌｏａｄを除去する。

一般手順Ｂ
薬物動態学の研究
血清中の抗体を検出するＥＬＩＳＡ方法
抗体２ｕｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩静置し、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴ ３７℃で１時間ブロックする。血清サンプルをインキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。３７℃で検出抗体（抗Ｆｃのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（ＨＲＰ標識））を１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＴＭＢで発色し、２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで測定する。

一般手順Ｃ
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による測定
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によりＡＤＣを分析する。０−１００％移動相Ｂ（ＭＰＢ）により溶出する。移動相Ａ（ＭＰＡ）は、１．５Ｍ硫酸アンモニウム及び．０２５Ｍリン酸ナトリウムからなり、ＭＰＢは、０．０２５Ｍリン酸ナトリウム、２５％イソプロパノールからなる。サンプルの注入量は約２０μｇであり、グラジエント溶出は１５分間内で完成する。ＵＶ２８０ｎｍで検出し、疎水性が強いほど、サンプルのピークが遅く出現する。

一般手順Ｄ
血漿安定性の研究
所定量のＡＤＣサンプルを取り、ヒトＩｇＧが除去されたヒト血漿に加え、各ＡＤＣについて３チューブずつ準備する。３７℃の水浴でインキュベートする。それぞれ０時間、７２時間後にＡＤＣサンプルを取り出し、各チューブにＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭ ＬＸ Ｌｏｔ：＃１０２２１４７９ ＧＥ，ＰＢＳで洗浄済）１００ｕｌを加え、縦型混合器で２時間振盪しながら吸着させ、洗浄した後、インキュベートされたＡＤＣを得る。所定時間インキュベートされたＡＤＣサンプルをＲＰ−ＨＰＬＣにより検出し、サンプルの血漿安定性を判定する。

一般手順Ｅ
部位特異的結合によるＡＤＣの調製
予備精製されたモノマー比が９５％超えの抗体分子を、限外濾過用遠沈管によりＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）に移す。抗体モル数の１０倍のＴＣＥＰを加え、室温で２時間反応させる。限外濾過用遠沈管によりｐＨ６．５のリン酸緩衝液に移し、抗体モル数の１０倍のＤＨＡＡを加え、室温で２時間反応させる。そして、抗体モル数の３倍のｐａｙｌｏａｄを加え、室温で４時間反応させる。反応終了後、カットオフ分子量が３０ＫＤａの限外濾過用遠沈管によりＰＢＳに移し、未結合のｐａｙｌｏａｄを除去し、部位特異的結合ＡＤＣ（ＤＡＲ＝２）を得る。

実施例１
化合物１の調製

化合物（Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ'−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２，３−ジアミノプロピオン酸５０ｇを５００ｍＬジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸５０ｍＬを加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。反応終了後、減圧下で濃縮して乾燥させ、酢酸エチルを加え、溶解し、さらにｎ−ヘキサンを加え、撹拌して固体を析出され、濾過し、乾燥させ、２１ｇの固体を得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：２３９．１（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例２
化合物２の調製

２００ｍＬベンジルアルコールを反応フラスコに入れ、水浴下で塩化チオニル（６．６９ｍＬ、９２．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、滴下終了後、１時間撹拌し、化合物１（２０ｇ、８４ｍｍｏｌ）をバッチで添加した後、室温で一晩撹拌した。反応終了後、オイルポンプによりベンジルアルコールを減圧留出し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン：メタノール＝１５０：１）により分離し、製品２２ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：３２９．１（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例３
化合物３の調製

化合物２（１０ｇ、３０．４ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬアセトニトリルに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，４．７２ｍＬ，３６．５８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下でｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（４．７５ｇ，２４．４ｍｍｏｌ）を滴下した後、３０分間反応させた後、室温に移して反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によりモニタリングした。反応終了後、減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン：メタノール＝１００：１）により分離し、製品５．９ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：４４３．３（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例４
化合物４の調製

化合物３（５．９ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）、３０ｍＬ１，４−ジオキサン、３０ｍＬ水を反応フラスコに入れ、さらに、ＤＩＥＡ（３．３ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を入れ、室温下でＢｏｃ無水物（１４．５ｇ，６６．７ｍｍｏｌ）を滴下し、反応液は黄色になり、滴下終了後、室温で３−４時間反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３０：１）によりモニタリングした。反応終了後、減圧濃縮によりジオキサンを除去し、ＤＣＭを加えて抽出し、減圧濃縮し、黄色油状物の粗製品を取得し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン：メタノール＝３００：１）により分離し、製品６．６ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：４４３．３（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，５４３．２（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例５
化合物５の調製

６．６ｇ化合物４を５０ｍｌメタノールに溶解し、１．３２ｇ５％Ｐｄ／Ｃを加え、水素ガスで２〜３回置換し、室温で反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によりモニタリングした。反応終了後、濾過し、４０℃で減圧濃縮し、得られた製品４．４ｇをそのまま次の反応に用いた。

実施例６
化合物６の調製

化合物５（４．４ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）を４０ｍＬ氷酢酸に溶解し、無水マレイン酸（２．７１ｇ，２７．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌しながら反応させた。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３：１）により反応をモニタリングした。完全に反応した後、減圧濃縮し、残留物を高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９０％Ａ，１０−２５ｍｉｎ，９０％Ａ〜４５％Ａ，２５−５５ｍｉｎ，４５％Ａ〜４０％Ａ
保持時間が４３ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、白色固体１．５１ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：３１７．９（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，４１７．９（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例７
化合物７の調製

化合物６（１．２ｇ，２．８８ｍｍｏｌ）を２５ｍＬ乾燥トルエン及び２．５ｍＬＤＭＡ溶液に溶解し、トリエチルアミン（１．２ｍＬ，８．６５ｍｍｏｌ）（いくつかの乾燥した分子篩を加えてもよい）を加え、窒素で置換し、１２０℃まで昇温して反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３：１）により反応をモニタリングした。反応終了後、オイルポンプにより減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール：２０／１−１０／１）により分離し、製品７００ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：２９９．２（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，３９９．３（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例８
化合物８の調製

７００ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ）化合物７を３．５ｍＬＤＭＦに溶解し、５３１ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）ＥＥＤＱ、７３３ｍｇ（１．９３ｍｍｏｌ）Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨを加え、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によりモニタリングした。反応終了後、４５℃でオイルポンプにより濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール：５０／１−２０／１）により分離し、５２０ｍｇ製品を得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：６６０．３（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，７６０．４（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例９
化合物９の調製

５２０ｍｇ（０．６８５ｍｍｏｌ）化合物８、１．０４ｇ（３．４２ｍｍｏｌ）ＮＣＰを順に反応フラスコに入れ、１０ｍＬＤＭＦを加えて溶解し、さらに０．３３ｍＬ（２．０５ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加え、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によりモニタリングした。反応終了後、４５℃でオイルポンプにより濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝３０／１）により分離し、５３０ｍｇ製品を得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：８２５．３（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，９２５．２（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例１０
化合物１０の調製

５３０ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）化合物９、１３．５ｍｇ（０．１ｍｏｌ）ＨＯＢＴを５ｍＬＤＭＦに溶解し、０．１７ｍＬ（１．０４ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加え、室温で１時間活性化させた後、３７３ｍｇ（０．５２ｍｍｏｌ）ＭＭＡＥを加え、室温で一晩反応させた。ＨＰＬＣによりモニタリングし、原料ＭＭＡＥが完全に反応した後、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，５０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速５０ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２０５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ，９０％Ａ，１０−２５ｍｉｎ，９０％Ａ〜４５％Ａ，２５−５５ｍｉｎ，４５％Ａ〜４０％Ａ
保持時間が３４ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥し、製品２００ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１５０３．２（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例１１
化合物１１の調製

７０ｍｇ化合物１０を１０ｍＬ乾燥ジクロロメタンに溶解し、４ｍＬトリフルオロ酢酸を加え、室温で１時間反応させ、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，３０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２５ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２０５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９５％Ａ，１０−３０ｍｉｎ ９５％Ａ〜８０％Ａ，３０−５０ｍｉｎ ８０％Ａ〜５０％Ａ
保持時間が３３ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品３４ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１３４７．８（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例１２
化合物１２の調製

化合物Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８ｇ，，３０．８ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬアセトニトリルに溶解し、ＤＩＥＡ（６ｍＬ，３７ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で２−ブロモ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニンベンジルエステル（１０．２ｇ，２６．１ｍｍｏｌ）を滴下し、滴下終了後、４０ｍｉｎ反応させた後、室温に移して反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によりモニタリングした。反応終了後、減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝１００／１）により分離し、製品８．１ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：５７１．２（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例１３
化合物１３の調製

８．１ｇ（１４．２ｍｍｏｌ）化合物１２、５０ｍＬ１，４−ジオキサン、５０ｍＬ水を反応フラスコに入れ、さらに３．５ ｍＬ（２１．３ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加え、室温下で１４．５ｇ（６６．７ｍｍｏｌ）Ｂｏｃ無水物を滴下し、反応液は黄色になり、滴下した後、室温で反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３０：１）によりモニタリングした。反応終了後、減圧濃縮によりジオキサンを除去し、ＤＣＭを加えて抽出し、減圧濃縮し、黄色油状物の粗製品を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝３００／１）により分離し、製品８．５５ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：４７１．１（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，５７１．３（Ｍ＋Ｈ）^＋．

実施例１４
化合物１４の調製

８．５ｇ化合物１３を７０ｍｌメタノールに溶解し、１．７ｇ ５％Ｐｄ／Ｃを加え、水素ガスで２〜３回置換し、室温で反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によりモニタリングした。反応終了後、濾過し、４０℃で減圧濃縮し、得られた製品５ｇをそのまま次の反応に用いた。

実施例１５
化合物１５の調製

５ｇ（１１．２ｍｍｏｌ）化合物１４を４０ｍＬ氷酢酸に溶解し、２．１９ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）無水マレイン酸を加え、室温で撹拌しながら反応させた。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３：１）により反応をモニタリングした。完全に反応した後、減圧濃縮し、残留物を高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９０％Ａ，１０−２５ｍｉｎ ９０％Ａ〜４５％Ａ，２５−５５ｍｉｎ ４５％Ａ〜４０％Ａ
保持時間が４８ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品２．３ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：４４５．２（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，５４５．３（Ｍ＋Ｈ）^＋。

実施例１６
化合物１６の調製

２ｇ（３．８０ｍｍｏｌ）化合物１５を２５ｍＬ乾燥トルエン及び２．５ｍＬＤＭＡ溶液に溶解し、１．５８ｍＬ（１１．４ｍｍｏｌ）トリエチルアミンを加え、窒素で置換し、１２０℃まで昇温して反応させ、ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３：１）により反応をモニタリングした。反応終了後、オイルポンプにより減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール２０／１〜１０／１）により分離し、製品１．１９ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：４２７．１（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，５２７．３（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例１７
化合物１７の調製

１．１９ｇ（１．７ｍｍｏｌ）化合物１６を３．５ｍＬＤＭＦに溶解し、５３１ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）ＥＥＤＱ、７３３ｍｇ（１．９３ｍｍｏｌ）Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨを加え、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によりモニタリングした。反応終了後、４５℃でオイルポンプにより濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール５０／１〜２５／１）により分離し、製品７５３ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：７８８．５（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，８８８．４（Ｍ＋Ｈ）^＋．

実施例１８
化合物１８の調製

７５３ｍｇ（０．８４９ｍｍｏｌ）化合物１７、１．２８ｇ（４．２４ｍｍｏｌ）ＮＣＰを順に反応フラスコに入れ、１５ｍＬＤＭＦを加えて溶解し、さらに０．３５ｍＬ（２．５５ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加え、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によりモニタリングした。反応終了後、４５℃でオイルポンプにより濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝２５／１）により分離し、製品７６２ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１０５３．６（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例１９
化合物１９の調製

７６２ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）化合物１８、１３．５ｍｇ（０．１ｍｏｌ）ＨＯＢＴを８ｍＬＤＭＦに溶解し、０．２３ｍＬ（１．４２ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加え、室温で１時間活性化させた後、４６３ｍｇ（０．６４５ｍｍｏｌ）ＭＭＡＥを加え、室温で一晩反応させた。ＨＰＬＣによりモニタリングし、原料ＭＭＡＥが完全に反応した後、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９０％Ａ，１０−２５ｍｉｎ ９０％Ａ〜４５％Ａ，２５−５５ｍｉｎ ４５％Ａ〜４０％Ａ
保持時間が３０ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品３００ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１６３１．６（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例２０
化合物２０の調製

１００ｍｇ化合物１９を１０ｍＬ乾燥ジクロロメタンに溶解し、４ｍＬトリフルオロ酢酸を加え、室温で２時間反応させ、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，３０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２５ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９５％Ａ，１０−２５ｍｉｎ ９５％Ａ〜８０％Ａ，２５−５５ｍｉｎ ８０％Ａ〜５５％Ａ
保持時間が３０ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品４５ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１４１９．１（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例２１−２９
化合物２１−２９の合成

実施例２１
化合物２１の調製

化合物３−ニトロ−４アミノ安息香酸１５ｇを１００ｍｌメタノールに溶解し、３ｇ ５％Ｐｄ／Ｃを加え、常圧で５時間水素化し、濾過し、濾過ケーキをメタノールで２回洗浄し、高真空、室温で濃縮して乾燥させ、精製せずにそのまま次の反応に用いた。

実施例２２
化合物２２の調製

化合物３，４−ジアミノ安息香酸（１０ｇ，６５．７ｍｍｏｌ）を１００ｍＬＤＭＦに溶解し、炭酸カリウム粉末（１３．６ｇ，９８．５５ｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（２．２ｇ，１．３１ｍｍｏｌ）を加え、窒素ガスの保護下でｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（１２．８ｇ，６５．７ｍｏｌ）を加え、滴下終了後、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によりモニタリングした。反応終了後、水、酢酸エチルを加えて抽出し、有機相を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝１５０／１〜１００／１）により精製し、分離し、製品を得た３．４６ｇ。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：２６７．４（Ｍ＋Ｈ）^＋；ＨＮＭＲ：７．５１−７．５３，ｄｄ，１Ｈ；７．４４−７．４５，ｄ，１Ｈ；６．６６−６．６９，ｄ，１Ｈ；４．６９，ｓ，２Ｈ；１．４９，ｓ，９Ｈ．

実施例２３
化合物２３の調製

３ｇ（１１．２ｍｍｏｌ）化合物２２、１５ｍＬ氷酢酸、無水マレイン酸（０．５５ｇ，５．６ｍｍｏｌ）、水を反応フラスコに加え、室温で反応させ、ＨＰＬＣによりモニタリングした。反応終了後、減圧濃縮により氷酢酸を除去し、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）により分取精製した。
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−５ｍｉｎ ８０％Ａ，５−３５ｍｉｎ ８０％Ａ〜６５％Ａ，３５−４５ｍｉｎ ６５％Ａ〜６０％Ａ
保持時間が３７ｍｉｎ−４２ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品２ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：３６５．４（Ｍ＋Ｈ）^＋，３０９．３（Ｍ＋Ｈ）^＋−ｔＢｕ。ＨＮＭＲ：１０．４８，ｓ，１Ｈ；７．４１−７．４４，ｄｄ，１Ｈ；７．３５−７．３６，ｄ，１Ｈ；６．９２，ｓ，２Ｈ；６．７０−６．７２，ｄ，１Ｈ；４．６８，ｓ，２Ｈ；１．４２，ｓ，９Ｈ．

実施例２４
化合物２４の調製

化合物２３（２ｇ，５．４９ｍｍｏｌ）を３０ｍｌＴＨＦに溶解し、Ｂｏｃ無水物（１．４４ｇ，６．５９ｍｍｏｌ），ＤＭＡＰ（１．３２ｇ，１０．９ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．８ｍＬ，１０．９８ｍｍｏｌ）を加え、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によりモニタリングした。反応終了後，シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝１００／１〜２０／１）により分離し、製品２．２ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：３６５．４（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ。ＨＮＭＲ：１０．５０，ｓ，１Ｈ；７．４６−７．４８，ｄｄ，１Ｈ；７．４１−７．４２，ｄ，１Ｈ；６．９５，ｓ，２Ｈ；６．７３−６．７５，ｄ，１Ｈ；４．６９，ｓ，２Ｈ；１．４８，ｓ，９Ｈ；１．４０，ｓ，９Ｈ．

実施例２５
化合物２５の調製

２ｇ（４．３１ｍｍｏｌ）化合物２４を１５ｍＬトルエン及び２ｍＬＤＭＡに溶解し、（１．２ｍＬ，８．６２ｍｍｏｌ）トリエチルアミンを加え、１２０℃で反応させた。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）により反応をモニタリングした。完全に反応した後、減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝１００／１〜５０／１）により精製し、分離し、製品１．６３ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：３４７．４（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ。ＨＮＭＲ：７．５０−７．５１，ｄｄ，１Ｈ；７．４３−７．４４，ｄ，１Ｈ；６．９７，ｓ，２Ｈ；６．７５−６．７７ｄ，１Ｈ；４．６７，ｓ，２Ｈ；１．４８，ｓ，９Ｈ；１．４０，ｓ，９Ｈ．

実施例２６
化合物２６の調製

１．６ｇ（３．５８ｍｍｏｌ）化合物２５を１０ｍＬＤＭＦに溶解し、１．７７ｇ（７．１７ｍｍｏｌ）ＥＥＤＱ、２．９８ｇ（７．８９ｍｍｏｌ）Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨを加え、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によりモニタリングした。反応終了後、４５℃でオイルポンプにより濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝１００／１〜２５／１）により分離し、製品２．１ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：７０９．８（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｂｏｃ，８０９．７（Ｍ＋Ｈ）^＋．

実施例２７
化合物２７の調製

２ｇ（２．４７ｍｍｏｌ）化合物２６、３．７１ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）ＮＣＰを順に反応フラスコに入れ、２０ｍＬＤＭＦを加えて溶解し、さらに１．２ｍＬ（７．４１ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加え、室温で反応させた。ＴＬＣ（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１５：１）によりモニタリングした。反応終了後、４５℃でオイルポンプにより濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝１００／１）により分離し、製品２．１ｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：９７３．３（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例２８
化合物２８の調製

１ｇ（１ｍｍｏｌ）化合物２７、１３．５ｍｇ（０．１ｍｏｌ）ＨＯＢＴを８ｍＬＤＭＦに溶解し、０．３３ｍＬ（２ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加え、室温で１時間活性化させた後、６４６ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）ＭＭＡＥを加え、室温で一晩反応させた。ＨＰＬＣによりモニタリングし、原料ＭＭＡＥが完全に反応した後、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９０％Ａ，１０−２５ｍｉｎ ９０％Ａ〜４５％Ａ，２５−５５ｍｉｎ ４５％Ａ〜４０％Ａ
保持時間が３０ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品５６０ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１５５１．７（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例２９
化合物２９の調製

１００ｍｇ化合物２８を１０ｍＬ乾燥ジクロロメタンに溶解し、４ｍＬトリフルオロ酢酸を加え、室温で２時間反応させ、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，３０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２５ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９５％Ａ，１０−２５ｍｉｎ ９５％Ａ〜８０％Ａ，２５−５５ｍｉｎ ８０％Ａ〜５５％Ａ
保持時間が３０ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品４５ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１３９５．７（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例３０−３９
化合物３０−３９合成

実施例３０
化合物３０の調製

５００ｍｌの丸底フラスコにおいて、炭酸カリウム（２４．７ｇ，１７９．２４ｍｍｏｌ）を２２０ｍｌ純水に溶解し、さらに（Ｓ）−３−アミノ−２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピオン酸（１６ｇ，６７．１６ｍｍｏｌ）を加え、大部分が溶解するまで撹拌した後、２−ブロモエチル−リン酸ジエチル（１０．９８ｇ，４４．８１ｍｍｏｌ）を加え、その後、８０℃のオイルバスに入れ、６時間撹拌しながら反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分取精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ５％Ｂ〜１５％Ｂ，１０−１５ｍｉｎ １５％Ｂ，１５−２５ｍｉｎ １５％Ｂ〜２０％Ｂ，２５−５０ｍｉｎ ２０％Ｂ〜３０％Ｂ，５０−５５ｍｉｎ ３０％Ｂ〜５０％Ｂ，５５−６５ｍｉｎ ５０％Ｂ〜９０％Ｂ
保持時間が４２〜４９ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、無色油状物の製品８．３８ｇを得た。収率は４６．５％であった。^１Ｈ ＮＭＲ ｄａｔａ（ＣＤＣｌ_３，４００ ＭＨｚ）：７．３９−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．５４−６．４１（ｍ，１Ｈ），５．１２−５．０１（ｍ，２Ｈ），４．６３−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．０３（ｍ，４Ｈ），３．４８−３．３６（ｍ，２Ｈ），３．３５−３．２５（ｍ，２Ｈ），２．３５−２．２３（ｍ，２Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝６．８ Ｈｚ，６Ｈ）；ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ ４０３．３（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１７Ｈ_２７Ｎ_２Ｏ_７Ｐ，４０２．１６）。

実施例３１
化合物３１の調製

１００ｍｌの三つ口フラスコにおいて、５０ｍｌジクロロメタン溶媒により化合物３０（８．３ｇ，２０．８５ｍｍｏｌ）を溶解させ、窒素ガスの保護下で０℃の低温反応器に置き、撹拌しながらＤＩＥＡ塩基（６．７ｇ，５２．１１ｍｍｏｌ）を滴下し、３０分間後、Ｂｏｃ無水物（５．０ｇ，２２．９３５ｍｍｏｌ）を滴下し、滴下終了後、室温に移し、２時間撹拌しながら反応させ、ＴＬＣ検出（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝４：１）により反応が完了したことを確定した。後処理：反応液に水を加えて３回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮し、残留物を高速液体クロマトグラフィーにより分取精製した。（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０ｍｉｎ ４０％Ｂ，０−１０ｍｉｎ ４０％Ｂ，１０−２０ｍｉｎ ４０％Ｂ〜４５％Ｂ，２０−３０ｍｉｎ ４５％Ｂ，３０−４５ｍｉｎ ４５％Ｂ〜８０％Ｂ，４５−５０ｍｉｎ ８０％Ｂ〜９５％Ｂ。
保持時間が２６〜２９．５ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、４．０２ｇの無色油状液体を得た。収率は３８．３％であった。^１Ｈ ＮＭＲ ｄａｔａ（ＣＤＣｌ_３，４００ ＭＨｚ）：７．３６−７．２８（ｍ，５Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），４．６３−４．４３（ｍ，１Ｈ），４．１４−４．０１（ｍ，４Ｈ），３．９２−３．６５（ｍ，２Ｈ），３．６１−３．２９（ｍ，２Ｈ），２．３４−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．３６−１．２２（ｍ，６Ｈ）；ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ ５０３．４（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２２Ｈ_３５Ｎ_２Ｏ_９Ｐ，５０２．２１）。

実施例３２
化合物３２の調製

１５０ｍｌの丸底フラスコにおいて、５０ｍｌメタノールで化合物３１（４．０ｇ，８．０ｍｍｏｌ）を溶解させ、さらに８００ｍｇのＰｄ／Ｃ（Ｐｄ含有量：５％）を加え、水素ガスで置換した後、室温で４時間撹拌しながら反応させ、ＴＬＣ検出（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝４：１）により反応が完了したことを確定した後、反応を停止させた。有機膜によりパラジウム炭素を濾別し、減圧濃縮し、残留物を精製せずに、そのまま次の反応に用いた。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ ３６９．４（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１４Ｈ_２９Ｎ_２Ｏ_７Ｐ，３６８．１７）。

実施例３３
化合物３３の調製

１００ｍｌの丸底フラスコに３０ｍｌ氷酢酸を加えて精製されていない化合物３２を溶解させ、さらに撹拌しながら無水マレイン酸（１．５７ｇ，１６．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。翌日に反応を停止させ、４５℃でオイルポンプにより減圧濃縮して氷酢酸を除去し、残留物を高速液体クロマトグラフィーにより分取精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０ｍｉｎ ５％Ｂ，０−１０ｍｉｎ ５％Ｂ〜１５％Ｂ，１０−２０ｍｉｎ １５％Ｂ〜３０％Ｂ，２０−３５ｍｉｎ ３０％Ｂ〜５５％Ｂ，３５−４５ｍｉｎ ５５％Ｂ，４５−５５ｍｉｎ ５５％Ｂ〜８０％Ｂ，５５−６０ｍｉｎ ８０％Ｂ〜９８％Ｂ
保持時間が２５〜２６．５ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、３．３５ｇ油状物を得た。２段階収率は９０％であった。^１Ｈ ＮＭＲ ｄａｔａ（ＣＤＣｌ_３，４００ ＭＨｚ）：６．４０（ｄ，Ｊ＝１２ Ｈｚ，１Ｈ），６．３５（ｄ，Ｊ＝１２ Ｈｚ，１Ｈ），４．９６−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．１９−３．９９（ｍ，４Ｈ），３．９８−３．６１（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．３６（ｍ，２Ｈ），２．２２−２．００（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝７．０ Ｈｚ，３Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝７．０ Ｈｚ，３Ｈ）；ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ ４６７．３（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１８Ｈ_３１Ｎ_２Ｏ_１０Ｐ，４６６．１７）。

実施例３４
化合物３４の調製

１００ｍｌの丸底フラスコにおいて、４０ｍｌトルエン及び４ｍｌのＤＭＡで化合物３３（３．３ｇ，７．０７ｍｍｏｌ）を撹拌して溶解させ、さらにトリエチルアミン（２．１ｇ，２１．２ｍｍｏｌ）を加え、水分離器及び還流冷却器を取り付け、１２０℃で３時間還流撹拌しながら反応させ、ＴＬＣ検出（展開剤ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝４：１）により反応が完了したことを確定した。後処理：４５℃で減圧濃縮してトルエンを除去し、残留物を高速液体クロマトグラフィーにより分取精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，１００ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２００ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０ｍｉｎ ５％Ｂ，０−１０ｍｉｎ ５％Ｂ〜１５％Ｂ，１０−２０ｍｉｎ １５％Ｂ〜３０％Ｂ，２０−３５ｍｉｎ ３０％Ｂ〜５５％Ｂ，３５−４５ｍｉｎ ５５％Ｂ，４５−５５ｍｉｎ ５５％Ｂ〜８０％Ｂ，５５−６０ｍｉｎ ８０％Ｂ〜９８％Ｂ
保持時間が２７〜２９ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、２．１２ｇの白色粉末状固体（すぐに吸湿して粘稠油状物になった）を得た。収率は６７％であった。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ ４４９．３（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１８Ｈ_２９Ｎ_２Ｏ_９Ｐ，４４８．１６）．

実施例３５
化合物３５の調製

化合物３４（２．１ｇ，４．６９ｍｍｏｌ）が入った１００ｍｌ丸底フラスコにおいて、オイルポンプにより可能な残留水分を完全に除去し、２０ｍｌの乾燥ＤＭＦを加え、撹拌して溶解し、その後、ＤＩＥＡ（１．８ｇ，１４．０７ｍｍｏｌ）を加え、さらに順にＥＤＣＩ（１．８１ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）及びＨｏＡｔ（１．２８ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌して化合物５を３０分間活性化させ、化合物６（２．６６ｇ，７．０３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌しながら反応させ、翌日に反応を停止させた。後処理：４５℃でオイルポンプにより減圧濃縮してＤＭＦ溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン：メタノール＝２０：１〜１０：１〜５：１）により精製し、１．０１ｇ白色粉末状固体を得た。収率は２６．６％であった。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ ８１０．４（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_３６Ｈ_５６Ｎ_７Ｏ_１２Ｐ，８０９．３７）。

実施例３６
化合物３６の調製

５０ｍｌの丸底フラスコにおいて、１５ｍｌの乾燥ＤＭＦで化合物３５（１．０ｇ，１．２４ｍｍｏｌ）を撹拌して溶解し、さらにＤＩＥＡ（９６１ｍｇ，７．４４ｍｍｏｌ）及びＮＰＣ（１．８８ｇ，６．２ｍｍｏｌ）を加え、その後、室温で一晩撹拌しながら反応させ、翌朝にＴＬＣ検出（展開剤ジクロロメタン：メタノール＝５：１）により反応が完了したことを確認し、反応を停止させた。後処理：４５℃でオイルポンプにより減圧濃縮し、残留物を分取薄層クロマトグラフィー（展開剤ジクロロメタン：メタノール＝６：１）により分取精製し、１．０２ｇの白色粉末状固体を得た。収率は８４．５％であった。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ ９７５．３（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_４３Ｈ_５９Ｎ_８Ｏ_１６Ｐ，９７４．３８）。

実施例３７
化合物３７の調製

１００ｍｌの丸底フラスコにおいて、１０ｍｌの乾燥ＤＭＦで化合物３６（１．０ｇ，１．０３ｍｍｏｌ）を溶解させ、さらにＨｏＢｔ（２８ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２６６ｍｇ，２．０６ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌しながら反応させた後、ＭＭＡＥ（７４０ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。後処理：反応液を分取液体クロマトグラフィーにより分取精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，５０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速５０ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０ｍｉｎ ５％Ｂ，０−１０ｍｉｎ ５％Ｂ〜１５％Ｂ，１０−２０ｍｉｎ １５％Ｂ〜３０％Ｂ，２０−３５ｍｉｎ ３０％Ｂ〜５５％Ｂ，３５−４５ｍｉｎ ５５％Ｂ〜７０％Ｂ，４５−５５ｍｉｎ ７０％Ｂ，５５−６０ｍｉｎ ７０％Ｂ〜９８％Ｂ
保留時間が３８−４０ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、３２０ｍｇ白色粉末状固体を得た。収率は２０％であった。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ １５５３．８（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_７６Ｈ_１２１Ｎ１_２Ｏ_２０Ｐ，１５５２．８５）。

実施例３８
化合物３８の調製

２５ｍｌの丸底フラスコにおいて５ｍｌの再蒸留したジクロロメタンで化合物３７（２６０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を溶解させ、窒素ガスの保護下で氷浴においてブロモトリメチルシラン（７８ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を加え、その後、室温に移して一晩撹拌しながら反応させ、翌朝に１ｍｌメタノールを加え、室温で１時間撹拌しながら反応させ、液相分析により化合物３７が完全に反応したことを確認した。後処理：反応液を減圧濃縮し、残留物を高速液体クロマトグラフィーにより分取精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，３０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２５ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０ｍｉｎ ５％Ｂ，０−１０ｍｉｎ ５％Ｂ〜１５％Ｂ，１０−２０ｍｉｎ １５％Ｂ〜３０％Ｂ，２０−３５ｍｉｎ ３０％Ｂ〜５５％Ｂ，３５−４５ｍｉｎ ５５％Ｂ〜７０％Ｂ，４５−５５ｍｉｎ ７０％Ｂ，５５−６０ｍｉｎ ７０％Ｂ〜９８％Ｂ
保持時間が２０−２３ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、１４０ｍｇの白色粉末状固体を得た。収率は５５％であった。

実施例３９
化合物３９の調製

２５ｍｌの丸底フラスコにおいて、２ｍｌジクロロメタンで化合物３８（１２０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）を撹拌して溶解させ、氷浴で８００μｌトリフルオロ酢酸を滴下し、その後、室温に移して１時間撹拌しながら完全に反応させた。後処理：反応液を減圧濃縮し、残留物を高速液体クロマトグラフィーにより分取精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，３０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２５ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１４ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０ｍｉｎ ５％Ｂ，０−１０ｍｉｎ ５％Ｂ〜１５％Ｂ，１０−２０ｍｉｎ １５％Ｂ〜３０％Ｂ，２０−３５ｍｉｎ ３０％Ｂ〜５５％Ｂ，３５−４５ｍｉｎ ５５％Ｂ〜７０％Ｂ，４５−５５ｍｉｎ ７０％Ｂ，５５−６０ｍｉｎ ７０％Ｂ〜９８％Ｂ
保持時間が１８−１９．５ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、５５ｍｇ白色粉末状固体を得た。収率は４９％であった。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１３９７．８（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例４０
化合物４０の調製

化合物７（３３２ｍｇ，０．８３６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタンに溶解し、ペンタフルオロフェノール（１８４ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２ｍｍｏｌ）を加え、化合物７がなくなるまで室温で３時間撹拌した。ＭＭＡＦ（４６０ｍｇ，０．５８５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，０．２７ｍＬ，１．６７ｍｍｏｌ）を加え、１５ｍＬ乾燥ジクロロメタン溶液に溶解し、窒素ガスの保護下、室温で４時間反応させた。減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離し、製品を得た２９０ｍｇ。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１１６８．８（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例４１
化合物４１の調製

１００ｍｇ化合物３９を１０ｍＬ乾燥ジクロロメタンに溶解し、４ｍＬトリフルオロ酢酸を加え、室温で２時間反応させ、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，３０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２５ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９５％Ａ，１０−２５ｍｉｎ ９５％Ａ〜７０％Ａ，２５−５５ｍｉｎ ７０％Ａ〜４０％Ａ
保持時間３３ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品５０ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：９５６．６（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例４２
化合物４２の調製

化合物１６（４００ｍｇ，０．７６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタンに乾燥し、ペンタフルオロフェノール（１８４ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２ｍｍｏｌ）を加え、化合物１６がなくなるまで室温で４時間撹拌した。ＭＭＡＦ（３８９ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，０．２５ｍＬ，１．５２ｍｍｏｌ）を加え、１５ｍＬ乾燥ジクロロメタンに溶解し、窒素ガスの保護下、室温で４時間反応させた。減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン／メタノール＝５０／１）により分離し、製品を得た３３０ｍｇ。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１２９６．８（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例４３
化合物４３の調製

１００ｍｇ化合物４１を１０ｍＬ乾燥ジクロロメタンに溶解し、４ｍＬトリフルオロ酢酸を加え、室温で２時間反応させ、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８，３０ｍｍ＊４５０ｍｍ，１０μｍ，アセトニトリル／水（０．２％ＴＦＡ），流速２５ｍＬ／ｍｉｎ，λ＝２１５ｎｍで検出）
溶媒Ａ：０．２％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：０−１０ｍｉｎ ９５％Ａ，１０−２５ｍｉｎ ９５％Ａ〜７０％Ａ，２５−５５ｍｉｎ ７０％Ａ〜４０％Ａ
保持時間が３０ｍｉｎの留分を収集し、凍結乾燥させ、製品４８ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ^＋）：１０２８．５（Ｍ＋Ｈ）^＋

実施例４４
抗体薬物複合体Ｈ−１１は、一般的な方法Ｂと同様にして調製され、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定した結果、その平均薬物抗体比（ＤＡＲ）の値はであった。７．２

実施例４５
抗体薬物複合体Ｈ−２０は、一般的な方法Ｂと同様にして調製され、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定した結果、その平均薬物抗体比（ＤＡＲ）の値は７．２であった。

実施例４６
抗体薬物複合体Ｈ−２９は、一般的な方法Ｂと同様にして調製され、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定した結果、その平均薬物抗体比（ＤＡＲ）の値は６．８であった。

実施例４７
抗体薬物複合体Ｈ−３９は、一般的な方法Ｂと同様にして調製され、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定した結果、その平均薬物抗体比（ＤＡＲ）の値は７．０であった。

実施例４８
抗体薬物複合体Ｈ−４１は、一般的な方法Ｂと同様にして調製され、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定した結果、その平均薬物抗体比（ＤＡＲ）の値は７．５であった。

実施例４９
抗体薬物複合体Ｈ−４３は、一般的な方法Ｂと同様にして調製され、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定した結果、その平均薬物抗体比（ＤＡＲ）の値は７．７であった。

実施例５０
引き続き合成して以下に示される薬物−ジョイント結合体が得られた。

式中、Ａｃは、非塩基性アミノ酸又はオリゴペプチドを示し、アミノ酸におけるアミノ基がアルキル基に結合される。ｎ＝１，２，３...である。

異なるアミノ酸及びオリゴペプチドの薬物ジョイントの合成及び特性を表１に示す。同表において、左側の第１列は化合物番号、第２列はアミノ酸の種類、第３列はｎの値、第４列は一般的な合成方法、第５、６列は薬物ジョイントの計算質量及び質量分析によって決定された質量である。

略語
Ｇｌｙ：Ｌ−グリシン、Ａｌａ：Ｌ−アラニン、Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン、Ｔｒｐ：Ｌ−チロシン、Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸、Ｓｅｒ：Ｌ−セリン、Ｖａｌ：Ｌ−バリン

実施例５２−５６
酸性自己安定化ジョイントを用いて製造されたＡＤＣの安定性、親水性及び薬理活性を評価するために、実施例に従って酸性安定化ジョイントを有する薬物−ジョイント結合体を製造した。このような結合体は、いずれも酸性安定化ジョイントを有し、切断可能又は切断不可能なリンカーを介して細胞毒性薬ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦに結合される。対照として、文献に記載の方法に従って典型的な非自己安定化薬物−ジョイント結合体（本明細書ではＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと呼ばれる）及び塩基性自己安定化ジョイントを有する薬物−ジョイント結合体（本明細書ではＤＰＲ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと呼ばれる）を合成した。

実施例５２：生体外血漿安定性
一般手順Ｄに従って血漿安定性を研究し、結果を下表に示す。実験結果から明らかなように、酸性安定化ジョイントを有するＡＤＣは、血漿においてインキュベートされた過程において薬物の損失がほとんどなかった一方、典型的なＭＣジョイントＡＤＣは、７２時間インキュベートされた後、ＤＡＲが顕著に低下した。これは、酸性安定化ジョイントは、ＡＤＣ薬物血漿安定性を向上できることを示している。

実施例５３：ＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出
複合して得られたＡＤＣサンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、注入して分析した。
装置：Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５（２４８９ＵＶ／Ｖｉｓ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ，５μｍ）
移動相Ａ：５０ｍＭ ＰＢ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ａｒｇ，５％ＩＰＡ，ｐＨ６．５
移動相Ａ：３０ｍｉｎイソクラティック溶離，流速：０．７１４ｍｌ／ｍｉｎ，カラム温度２５℃，検出波長：２８０ｎｍ。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより各ＡＤＣの凝集度が得られた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣピーク図を２Ａ−２Ｈに示す。データを下表に示す。酸性安定化ジョイントを導入したＡＤＣでは、モノマー比は顕著に向上し、凝集度は顕著に低下した。

実施例５４
マウス体内のＰＫ実験
マウスモデルにおいて、ＡＤＣ薬物（薬物担持量８）のＰＫ特性を測定した。投与量２ｍｇ／ｋｇでマウスの尾に単回静脈内注射し、一般手順Ｂに従って血液中の総抗体（Ｔｏｔａｌ Ａｂ）濃度を検出した。結果を図３に示す。実験結果から明らかなように、マウス体内において、酸性安定化ジョイントＡＤＣはＰＫを顕著に改善し、血液中の総抗体がより高い濃度をより長く維持できる。

実施例５５
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による測定
一般手順Ａに従って抗ＩｇＧ１抗体の全てを１抗体あたり８チオールに還元した後、非部位特異的結合により対応する抗体薬物複合体を製造した。疎水性相互作用クロマトグラフィーにより１抗体あたり８薬物の酸性安定化ジョイントを有するＡＤＣと従来のジョイントＡＤＣ（即ちＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）を分離して精製し、一般手順Ｃに従って、疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣによりＡＤＣを分析した。より高い疎水性又はより多くの薬物／分子を有するＡＤＣは、より遅い保持時間に溶出された。実験結果を図４に示す。酸性ジョイントを有するＡＤＣは、ＨＩＣにおいて保持時間が比較的短く、ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの抗体複合体は、保持時間が最も長かった。実験結果から明らかなように、酸性安定化ジョイントを有するＡＤＣ分子は、より高い親水性を有する。

実施例５６
生体内薬効実験（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）
ヒト膵臓腺がん細胞ＢｘＰｃ３を生体外で培養し、細胞数５×１０^６でＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背中の皮下に接種し、腫瘍が１００〜２００ｍｍ^３まで増殖した後、群に分け、３ｍｇ／ｋｇでＡＤＣ薬物を単回投与（尾静脈注射）した。また、溶媒対照群を構築し、定期的に体重を測り、腫瘍の体積を測定し、ＡＤＣ薬物の抗腫瘍効果等の指標を考察することにより、ＢｘＰｃ３モデルに対する薬物の薬効を評価した。実験結果を図５、６に示す。結果から明らかなように、酸性安定化ジョイントを有するＡＤＣ薬物は、ＤＡＲ＝２である場合、Ｄｐｒ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと類似する薬効を有し、Ｍｃ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥよりも顕著に高い。また、高い薬物担持量ＤＡＲ＝８である場合、ＢｘＰｃ３マウス皮下移植腫瘍モデルにおいて高い薬効を有する。

Claims (17)

1. 式Ｉで表される抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
   

   

   
   （式中、Ｌは、抗体、抗体断片又はタンパク質であり、
   Ｍは、スクシンイミド基、又は加水分解して開環したスクシンイミド基であり、
   Ａｃは、前記抗体薬物複合体を安定させる酸性ユニットであり、アミノ基と酸性基からなる断片又は複数のアミノ酸からなるオリゴペプチドであり、アミノ基を介して丸に結合され、
   Ｄは、薬物ユニットであり、
   Ａは、リンカーであり、
   丸は、足場を示し、Ｃ_１−_８アルキレン基、Ｃ_１−８ヘテロアルキレン基、Ｃ_６−１０アリーレン基、Ｃ_４−１０ヘテロアリーレン基、又はＡｃ及びＤへの結合に適した任意の反応部位であり、
   ｍは１−２０から選ばれ、ｎは１又は２である。）
2. 前記抗体は、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原に対する抗体である、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
3. Ａｃを構成する酸性基は、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基又はスルホン酸基からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
4. 前記Ａｃは、全体的に酸性を呈するアミノ酸ユニット又は酸性オリゴペプチドである、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
5. 前記オリゴペプチドユニットは、２−５個の天然アミノ酸、２−５個の非天然アミノ酸、又は２−５個の天然アミノ酸と非天然アミノ酸である、請求項４に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
6. 前記丸は、Ｃ_１−８アルキレン基、Ｃ_１−８ヘテロアルキレン基、Ｃ_６−１０アリーレン基又はＣ_４−１０ヘテロアリーレン基であり、前記ヘテロアルキレン基におけるヘテロ原子は、Ｏ、Ｓ、Ｎ又はＰ原子からなる群より選択され、
   アリーレン基は、フェニル基、ナフチル基又はジフェニル基からなる群より選択され、
   ヘテロアリーレン基は、ピリジル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、インドリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、イソチアゾリル基、ピラゾリル基、インダゾリル基、プテリジニル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピロリル基、チアゾリル基、フラニル基又はチエニル基からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
7. Ａは、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーである、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
8. 前記薬物Ｄは、細胞毒性薬、自己免疫疾患の治療薬、又は抗炎症薬である、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
9. 薬物Ｄは、メイタンシン系薬物、アウリスタチン系薬物、ベンゾジピロール系薬物、ピロロベンゾジアゼピン系薬物、アマニタトキシン、カンプトテシン系及び／又はこれらの薬学的に許容される塩若しくは誘導体からなる群より選択される、請求項８に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
10. Ａは、下式で表される構造を有する、請求項７に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
    

    

    
    （式中、Ｃは、末端の拡張可能なユニットであり、Ｅは、切断可能なユニットであり、Ｆは、スペーサーユニットを示し、下付き文字ｅ、ｆは０又は１であり、左側の波線は、足場までの結合部位を示し、右側の波線は、薬物ユニットまでの結合部位を示す。）
11. 切断可能なユニットＥは、ｅ＝０である場合に存在せず、ｅ＝１である場合に存在し、
    存在する場合、Ｅで示される切断可能なユニットは、腫瘍関連プロテアーゼ又は酸性ＰＨにより薬物ユニットＤ又はスペーサーユニットＦから切断される、請求項１０に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
12. スペーサーユニットＦは、ｆ＝０である場合に存在せず、ｆ＝１である場合に存在し、
    Ｆが存在する場合、Ｆは、ｐ−アミノベンジルアルコール、エチレンジアミンユニット及びその誘導体からなる群より選択される、請求項１０に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
13. 前記丸は、Ｃ_１−８アルキレン基、Ｃ_１−８ヘテロアルキレン基である、請求項６に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
14. 前記丸は、Ｃ_１−３アルキレン基である、請求項１３に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
15. 前記Ａｃは、（Ｄ／Ｌ）グリシン、（Ｄ／Ｌ）アラニン、（Ｄ／Ｌ）ロイシン、（Ｄ／Ｌ）イソロイシン、（Ｄ／Ｌ）バリン、（Ｄ／Ｌ）フェニルアラニン、（Ｄ／Ｌ）プロリン、（Ｄ／Ｌ）トリプトファン、（Ｄ／Ｌ）セリン、（Ｄ／Ｌ）チロシン、（Ｄ／Ｌ）システイン、（Ｄ／Ｌ）メチオニン、（Ｄ／Ｌ）アスパラギン、（Ｄ／Ｌ）グルタミン、（Ｄ／Ｌ）トレオニン、（Ｄ／Ｌ）アスパラギン酸、（Ｄ／Ｌ）グルタミン酸、又は以下の構造式で表される化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
    

    

    
    （式中、波線は、足場までの結合部位を示し、Ｒは、アミノ基とリン酸基との間の任意の連結断片である。）
16. 下式で表される構造を有する請求項１に記載のジョイント−薬物結合体。
    

    

    
    （式中、Ａｃは、アミノ基と酸性基からなる断片、又は複数のアミノ酸からなるオリゴペプチドであり、アミノ基を介してヒドロカルビル基に結合され、
    Ｄは薬物ユニットであり、
    Ａはリンカーであり、
    ｑは１−８の整数であり、ｎは１又は２である。）
17. がん、免疫疾患、炎症を治療するための薬物の製造における請求項１から１５のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩の使用。

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