TWI618697B - 化合物、連接子－藥物、及配體－藥物耦合體 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供一種具有式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽類或溶劑化物。式(I)中，每一R1、R2與R3獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、C1-C6烷氧基、羧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基、C1-C6胺基羰基、C1-C6烷基、C1-C6分支型烷基、C1-C6環烷基、C1-C6雜環基、芳基或雜芳基，R1與R3至少其中之一為胺基。本揭露亦提供一種包含該化合物的連接子-藥物及配體-藥物耦合體。

Description

化合物、連接子-藥物、及配體-藥物耦合體
本揭露係有關於一種化合物，特別是有關於一種海兔毒素衍生物(auristatine derivative)、新穎連接子、以及包含該海兔毒素衍生物的連接子-藥物、及配體-藥物耦合體。
抗體對於與之相對應的抗原具有高度的辨識能力，加上許多具有細胞毒性的藥物分子因無法選擇性毒殺癌症細胞而無法用於癌症治療，有鑑於此，將抗體與高毒殺性的藥物(例如毒素)設計為連結在一起，成為具有高度選擇性、專一性的耦合體藥物。由於耦合體藥物具有選擇性毒殺癌症細胞的特性，可望成為臨床上實用的藥物。抗體-藥物耦合體(Antibody-Drug Conjugates，ADCs)的概念在30年前就已經被提出。世界各大藥廠及許多小至中型的生技公司皆投入大量資金人物力或藉由合作方式來進行新穎性ADCs藥物的開發。
目前，已有超過40個ADCs藥物在進行不同階段的臨床試驗。各種ADCs藥物在臨床上成功使用的結果，顯示開發新穎性ADCs藥物是協助人類滿足抗癌醫療需求的重要工作。
本揭露的一實施例提供一種具有式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽類：
式(I)中，每一R1、R2與R3獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、C1-C6烷氧基、羧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基、C1-C6胺基羰基、C1-C6烷基、C1-C6分支型烷基、C1-C6環烷基、C1-C6雜環基、芳基或雜芳基，R1與R3至少其中之一為胺基。
本揭露的另一實施例提供一種具有式(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽類：
式(II)中，每一R4、R5與R6獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、C1-C6烷氧基、羧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基、C1-C6胺基羰基、C1-C6烷基、C1-C6分支型烷基、C1-C6環烷基、C1-C6雜環基、芳基或雜芳基。
本揭露的又一實施例提供一種具有式(III)的連接子-藥物或其藥學上可接受的鹽類：C-SAAs-AAs-D (III)
式(III)中，C-為一耦合單元，選自由 以及所組成的族群，其中R7選自由-C1-C10亞烷基-、-C3-C8碳環基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環基)-、-(C3-C8碳環基)-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環基)-、-(C3-C8雜環基)-C1-C10亞烷基-、-(伸乙氧基)r-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-所組成的族群，以及r為1-10之整數。
式(III)中，-SAAs-為一具有式(IV)的糖胺基酸單元：
式(IV)中，x為1-8之整數，y為1-4之整數，為四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃，每一R8與R10獨立地為單鍵、亞甲基、羥基亞甲基、伸乙基、亞乙基、羥基伸乙基、羥基亞乙基、二羥基伸乙基、二羥基亞乙基、伸乙烯基、亞乙烯基、伸丙基(propylene)、亞丙基、三亞甲基(trimethylene)、羥基伸丙基(hydroxypropylene)、羥基亞丙基、羥基三亞甲基(hydroxytrimethylene)、二羥基伸丙基(dihydroxypropylene)、二羥基亞丙基、二羥基三亞甲基(dihydroxytrimethylene)、三羥基伸丙基(trihydroxypropylene)、三羥基亞丙基或三羥基三亞甲基(trihydroxytrimethylene)，每一R9獨立地為羥基、甲基、羥甲基、乙基、羥乙基、二羥乙基、丙基、羥丙基、二羥丙基或三羥丙基、或同一環中任意兩R9與其連接之碳原子形成羰基、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之第二個四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9與一亞甲基、亞乙基、1-亞丙基、2-亞丙基或苯亞甲基形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之環狀縮醛或縮酮。
式(III)中，-AAs-為一具有式(V)的胜肽單元：
式(V)中，z為0-10之整數，R11為-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2或-(CH2)4NHCONH2，R12為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、苯基或苯甲基，R13為氫、甲基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、環己基、苯基、苯甲基、p-羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶甲基、3-吡啶甲基或4-吡啶甲基。
式(III)中，-D為一細胞毒性劑，選自由鵝膏蕈鹼(amanitins)、蒽環類物(anthracyclines)、海兔毒素(auristatins)、漿果赤黴素(baccatins)、刺孢黴素(calicheamicins)、喜樹鹼(camptothecins)、西地黴素(cemadotins)、秋水仙鹼(colchicines)、秋水仙胺(colcimids)、考布他汀(combretastatins)、隱花素(cryptophysins)、蒂克黴素(discodermolides)、多卡黴素(duocarmycins)、棘黴素(echinomycins)、艾榴塞洛素(eleutherobins)、埃博黴素(epothilones)、雌莫司汀(estramustines)、偏端黴素(lexitropsins)、美登木素生物鹼 (maytansinoids)、紡錘黴素(netropsins)、嘌呤黴素(puromycins)、吡咯并苯并二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepines)、根黴素(rhizoxins)、紫杉烷(taxanes)、小管素(tubulysins)以及長春花生物鹼(vinca alkaloids)所組成的族群。
本揭露的再一實施例提供一種具有式(VI)的配體-藥物耦合體：L-(C-SAAs-AAs-D)p (VI)
式(VI)中，p為1-20之整數，L-為一配體單元，選自由全長抗體、抗體片段、蛋白質、小分子量蛋白質、多肽、寡肽、適體、凝集素、醣蛋白、脂蛋白、醣脂、維生素、營養傳輸分子、激素、寡糖、多醣以及任何其他細胞結合分子或物質所組成的族群。式(VI)中，L-進一步連接至上述式(III)C-SAAs-AAs-D。
為讓本發明之上述目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉一較佳實施例，並配合所附的圖式，作詳細說明如下。
第1圖顯示Erbitux-MHT-71的HIC態樣；以及第2圖顯示Erbitux與Erbitux-ADCs於50℃的熱應力穩定性試驗結果。
本揭露化合物
具有苯胺基團之海兔毒素衍生物
本揭露提供一種新穎的海兔毒素衍生物，其特徵在於以一苯胺基團為連接點與連接子、配體或傳輸分子連接，且使該毒素具備更高抗癌活性的潛力，對抗一系列人類癌細胞株。在一實施例中，該海兔毒素衍生物為具有式(I)包含苯胺基團的化合物。本揭露亦提供該海兔毒素衍生物的藥學上可接受鹽類。
式(I)中，每一R1、R2與R3可獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、C1-C6烷氧基、羧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基、C1-C6胺基羰基、C1-C6正烷基、C1-C6分支型烷基、C1-C6環烷基、C1-C6雜環基、芳基或雜芳基，R1與R3至少其中之一為胺基。
在一實施例中，R1為氫，R2為氫、羧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基羰基或C1-C6烷基，以及R3為胺基。
在另一實施例中，該海兔毒素F衍生物為具有式(II)包含苯胺基團的化合物。本揭露亦提供該海兔毒素F衍生物的藥學上可接受鹽類：
式(II)中，每一R4、R5與R6可獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、C1-C6烷氧基、羧基、C1-C6烷氧基羰基、 C1-C6胺基、C1-C6胺基羰基、C1-C6烷基、C1-C6分支型烷基、C1-C6環烷基、C1-C6雜環基、芳基或雜芳基。
在一實施例中，R4、R5與R6為氫。
包含糖胺基酸之連接子
本揭露提供一種新穎的包含糖胺基酸的連接子，其特徵在於其C端具有可被組織蛋白酶B(cathepsin B)辨識的雙肽，以及其N端具有高親水性的糖胺基酸基團，以提升該連接子或含連接子物質的水溶性。連接子C端的羧基與N端的胺基均可作為連接點，與間隔物、連接子、配體、藥物、毒素、成像分子、抗體、胜肽或傳輸分子連接。
本揭露連接子單元包括一糖胺基酸單元(-SAAs-)以及一胜肽單元(-AAs-)。胜肽單元可為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽。
在一實施例中，糖胺基酸單元(-SAAs-)具有式(IV)：
式(IV)中，x為1-8的整數，y為1-4的整數，可為四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃，每一R8與R10可獨立地為單鍵、亞甲基、羥基亞甲基、伸乙基、亞乙基、羥基伸乙基、羥基亞乙基、二羥基伸乙基、二羥基亞乙基、伸乙烯基、亞乙烯基、伸丙基(propylene)、亞丙基、三亞甲基(trimethylene)、羥基伸丙基(hydroxypropylene)、羥基亞丙基、 羥基三亞甲基(hydroxytrimethylene)、二羥基伸丙基(dihydroxypropylene)、二羥基亞丙基、二羥基三亞甲基(dihydroxytrimethylene)、三羥基伸丙基(trihydroxypropylene)、三羥基亞丙基或三羥基三亞甲基(trihydroxytrimethylene)，每一R9可獨立地為羥基、甲基、羥甲基、乙基、羥乙基、二羥乙基、丙基、羥丙基、二羥丙基或三羥丙基、或同一環中任意兩R9與其連接之碳原子形成羰基、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之第二個四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9與一亞甲基、亞乙基、1-亞丙基、2-亞丙基或苯亞甲基形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之環狀縮醛或縮酮。
在本揭露中，糖胺基酸的例子包括但不限於以下所述：
在一實施例中，胜肽單元(-AAs-)具有式(V)：
式(V)中，z為0-10的整數，R11可為-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2或-(CH2)4NHCONH2，R12可為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、苯基或苯甲基，R13可為氫、甲基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、環己基、苯基、苯甲基、p-羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶甲基、3-吡啶甲基或4-吡啶甲基。
可藉由一或多種酵素對胜肽單元進行酵素截切，例如藉由腫瘤相關蛋白酶，以釋放藥物單元(-D)。
連接子-藥物
本揭露的一實施例提供一種具有式(III)的連接子-藥物或其藥學上可接受鹽類：C-SAAs-AAs-D (III)
式(III)中，C-為一耦合單元，選自由 以 及所組成的族群，其中R7選自由-C1-C10亞烷基-、 -C3-C8碳環基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環基)-、-(C3-C8碳環基)-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環基)-、-(C3-C8雜環基)-C1-C10亞烷基-、-(伸乙氧基)r-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-所組成的族群，以及r為1-10的整數。
式(III)中，-SAAs-為一具有式(IV)的糖胺基酸單元：
式(IV)中，x為1-8的整數，y為1-4的整數，可為四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃，每一R8與R10可獨立地為單鍵、亞甲基、羥基亞甲基、伸乙基、亞乙基、羥基伸乙基、羥基亞乙基、二羥基伸乙基、二羥基亞乙基、伸乙烯基、亞乙烯基、伸丙基(propylene)、亞丙基、三亞甲基(trimethylene)、羥基伸丙基(hydroxypropylene)、羥基亞丙基、羥基三亞甲基(hydroxytrimethylene)、二羥基伸丙基(dihydroxypropylene)、二羥基亞丙基、二羥基三亞甲基(dihydroxytrimethylene)、三羥基伸丙基(trihydroxypropylene)、三羥基亞丙基或三羥基三亞甲基(trihydroxytrimethylene)，每一R9可獨立地為羥基、甲基、羥甲基、乙基、羥乙基、二羥乙基、丙基、羥丙基、二羥丙基或三羥丙基、或同一環中任意兩R9與其連接之碳原子形成羰基、或任意兩R9、R8與任意一R9、 或R10與任意一R9形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之第二個四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9與一亞甲基、亞乙基、1-亞丙基、2-亞丙基或苯亞甲基形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之環狀縮醛或縮酮。
式(III)中，-AAs-為一具有式(V)的胜肽單元，：
式(V)中，z為0-10的整數，R11可為-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2或-(CH2)4NHCONH2，R12可為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、苯基或苯甲基，R13可為氫、甲基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、環己基、苯基、苯甲基、p-羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶甲基、3-吡啶甲基或4-吡啶甲基。
式(III)中，-D為一細胞毒性劑，選自由鵝膏蕈鹼(amanitins)、蒽環類物(anthracyclines)、海兔毒素(auristatins)、 漿果赤黴素(baccatins)、刺孢黴素(calicheamicins)、喜樹鹼(camptothecins)、西地黴素(cemadotins)、秋水仙鹼(colchicines)、秋水仙胺(colcimids)、考布他汀(combretastatins)、隱花素(cryptophysins)、蒂克黴素(discodermolides)、多卡黴素(duocarmycins)、棘黴素(echinomycins)、艾榴塞洛素(eleutherobins)、埃博黴素(epothilones)、雌莫司汀(estramustines)、偏端黴素(lexitropsins)、美登木素生物鹼(maytansinoids)、紡錘黴素(netropsins)、嘌呤黴素(puromycins)、吡咯并苯并二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepines)、根黴素(rhizoxins)、紫杉烷(taxanes)、小管素(tubulysins)以及長春花生物鹼(vinca alkaloids)所組成的族群。
在一實施例中，C-為耦合單元，選自由 以及 所組成的族群，其中R7選自由-1,5-伸戊基-、-1,6-伸己基-、-1,4-伸環己基-、-(伸乙氧基)r-CH2-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-亞甲基-所組成的族群，以及r為2-5的整數。
在一實施例中，-SAAs-為糖胺基酸單元，選自由 以及所組成的族群。
在一實施例中，-AAs-為胜肽單元，選自由-纈胺酸-瓜胺酸-、-纈胺酸-離胺酸-、-纈胺酸-魚精胺酸-、-苯丙胺酸-瓜胺酸-、-苯丙胺酸-離胺酸-以及-苯丙胺酸-魚精胺酸-所組成的族群。
在一實施例中，-D為細胞毒性劑，選自由 以及 所組成的族群，其中每一R1、R2、R3、R4、R5與R6獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、甲氧基、乙氧基、羧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、甲基胺基、二甲基胺基、乙基胺基、二乙基胺基、1-吡咯啶基、1-哌啶基、1-哌嗪基、胺基羰基、甲基胺基羰基、二甲基胺基羰基、乙基胺基羰基、二乙基胺基羰基、1-吡咯啶基羰基、1-哌啶基羰基、1-哌嗪基羰基、甲基、乙基、丙基、異丙基或苯基。
配體-藥物耦合體
本揭露的一實施例提供一種具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類：L-(C-SAAs-AAs-D)p (VI)
式(VI)中，p為1-20的整數，L-為一配體單元，選自由全長抗體、抗體片段、蛋白質、小分子量蛋白質、多肽、寡肽、適體、凝集素、醣蛋白、脂蛋白、醣脂、維生素、營養傳輸分子、激素、寡糖、多醣以及任何其他細胞結合分子或物質所組成的族群。
式(VI)中，C-為一耦合單元，選自由 以及所組成的族群，其中R7選自由-C1-C10亞烷基-、-C3-C8碳環基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環基基)-、-(C3-C8碳環基)-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環基)-、-(C3-C8雜環基)-C1-C10亞烷基-、-(伸乙氧基)r-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-所組成的族群，以及r為1-10的整數。
式(VI)中，-SAAs-為一具有式(IV)的糖胺基酸單元：
式(IV)中，x為1-8的整數，y為1-4的整數，可為四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃，每一R8與R10可獨立地為單鍵、亞甲基、羥基亞甲基、伸乙基、亞乙基、羥基伸乙基、羥基亞乙基、二羥基伸乙基、二羥基亞乙基、伸乙烯基、亞乙烯基、伸丙基(propylene)、亞丙基、三亞甲基 (trimethylene)、羥基伸丙基(hydroxypropylene)、羥基亞丙基、羥基三亞甲基(hydroxytrimethylene)、二羥基伸丙基(dihydroxypropylene)、二羥基亞丙基、二羥基三亞甲基(dihydroxytrimethylene)、三羥基伸丙基(trihydroxypropylene)、三羥基亞丙基或三羥基三亞甲基(trihydroxytrimethylene)，每一R9可獨立地為羥基、甲基、羥甲基、乙基、羥乙基、二羥乙基、丙基、羥丙基、二羥丙基或三羥丙基、或同一環中任意兩R9與其連接之碳原子形成羰基、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之第二個四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9與一亞甲基、亞乙基、1-亞丙基、2-亞丙基或苯亞甲基形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之環狀縮醛或縮酮。
式(VI)中，-AAs-為一具有式(V)的胜肽單元：
式(V)中，z為0-10的整數，R11可為-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2或-(CH2)4NHCONH2，R12可為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、苯基或苯甲基，R13可為氫、甲基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、環己基、苯基、苯甲基、p-羥基苯甲基、-CH2OH、 -CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶甲基、3-吡啶甲基或4-吡啶甲基。
式(VI)中，-D為一細胞毒性劑，選自由鵝膏蕈鹼(amanitins)、蒽環類物(anthracyclines)、海兔毒素(auristatins)、漿果赤黴素(baccatins)、刺孢黴素(calicheamicins)、喜樹鹼(camptothecins)、西地黴素(cemadotins)、秋水仙鹼(colchicines)、秋水仙胺(colcimids)、考布他汀(combretastatins)、隱花素(cryptophysins)、蒂克黴素(discodermolides)、多卡黴素(duocarmycins)、棘黴素(echinomycins)、艾榴塞洛素(eleutherobins)、埃博黴素(epothilones)、雌莫司汀(estramustines)、偏端黴素(lexitropsins)、美登木素生物鹼(maytansinoids)、紡錘黴素(netropsins)、嘌呤黴素(puromycins)、吡咯并苯并二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepines)、根黴素(rhizoxins)、紫杉烷(taxanes)、小管素(tubulysins)以及長春花生物鹼(vinca alkaloids)所組成的族群。
在一實施例中，配體單元(L-)為與抗原結合的抗體。
在一實施例中，抗體可為嵌合抗體、人源化抗體或其功能活性片段。
在一實施例中，抗體藉由該抗體的半胱氨酸殘基 連接至耦合單元。
式(VI)中，p為2-8的整數，或為整數4。
在一實施例中，配體單元可為葉酸、甲氨蝶呤(methotrexate)或與葉酸受體結合的葉酸受體結合配體。
在一實施例中，配體單元可為促黃體激素釋放激素(LHRH)、促黃體激素釋放激素促效劑、促黃體激素釋放激素拮抗劑或與促黃體激素釋放激素受體結合的促黃體激素釋放激素受體結合配體。
在一實施例中，式(VI)中的C-為耦合單元，選自由 、以及所組成的族群，其中R7選自由-1,5-伸戊基-、-1,6-伸己基-、-1,4-伸環己基-、-(伸乙氧基)r-亞甲基-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-亞甲基-所組成的族群，以及r為2-5的整數。
在一實施例中，式(VI)中的-SAAs-為糖胺基酸單元， 選自由、、 、以及所組成的族群。
在一實施例中，式(VI)中的-AAs-為胜肽單元，選自由-纈胺酸-瓜胺酸-、-纈胺酸-離胺酸-、-纈胺酸-魚精胺酸-、-苯丙胺酸-瓜胺酸-、-苯丙胺酸-離胺酸-以及-苯丙胺酸-魚精胺酸-所組成的族群。
在一實施例中，式(VI)中的-D為細胞毒性劑，選自 由、 以及 所組成的 族群，其中每一R1、R2、R3、R4、R5與R6獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、甲氧基、乙氧基、羧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、甲基胺基、二甲基胺基、乙基胺基、二乙基胺基、1-吡咯啶基、1-哌啶基、1-哌嗪基、胺基羰基、甲基胺基羰基、二甲基胺基羰基、乙基胺基羰基、二乙基胺基羰基、1-吡咯啶基羰基、1-哌啶基羰基、1-哌嗪基羰基、甲基、乙基、丙基、異丙基或苯基。
本揭露亦提供配體-藥物耦合體，用於藥物的標的傳輸。配體-藥物耦合體包括一配體單元，共價連接於至少一藥物單元。藥物單元可直接或藉由一連接子單元共價連接配體單元。
耦合單元
耦合單元可將一配體單元連接至一連接子單元至一藥物單元。天然或經化學手段存在於配體中有用的官能基團包括但不限定於巰基、胺基、羥基、羰基、甲醯基及羧基。適合的官能基團為巰基及胺基。在一實施例中，可藉由還原配體中的分子內二硫鍵形成巰基。在另一實施例中，可藉由配體中的離胺酸的胺基與Traut’s試劑或其他巰基產生試劑反應形成巰基。在一特定實施例中，配體為一重組抗體，且經工程化以攜帶一或多個離胺酸或半胱胺酸。
在一實施例中，耦合單元與配體單元中的一硫原子形成一鍵結。上述硫原子可來自配體的一巰基。
在另一實施例中，耦合單元與配體單元中的兩硫原子形成兩鍵結。上述兩硫原子可來自配體的兩巰基。上述兩 巰基可來自配體的一雙硫鍵。
在部分實施例中，藥物單元可為刺孢黴素(calicheamicin)、喜樹鹼(camptothecin)、美登木素生物鹼(maytansinoid)、或蒽環類物(anthracycline)。在部分實施例中，藥物單元可為紫杉烷(taxane)、拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)或其類似物。在部分典型實施例中，適合的細胞毒性劑包括，例如，DNA小溝結合物(例如烯二炔類(enediynes)及偏端黴素(lexitropsins)，CBI化合物，參見美國專利US 6,130,237)、多卡黴素(duocarmycins)、紫杉烷(taxanes)(例如紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇(docetaxel))、嘌呤黴素(puromycins)及長春花生物鹼(vinca alkaloids)。其他細胞毒性劑包括，例如，CC-1065、SN-38、拓樸替康(topotecan)、多柔比星(doxorubicin)、根瘤菌素(rhizoxin)、氰基嗎啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、棘黴素(echinomycin)、考布他汀(combretastatin)、紡錘菌素(netropsin)、埃博黴素(epothilone)、雌莫司汀(estramustine)、隱花素(cryptophysin)、西地黴素(cemadotin)、美登木素生物鹼(maytansinoid)、蒂克黴素(discodermolide)、艾榴塞洛素(eleutherobins)或米托蒽醌(mitoxantrone)。
藥物單元
在部分實施例中，藥物單元可為抗微管蛋白劑。抗微管蛋白劑的例子包括海兔毒素(auristatin)、紫杉烷(taxane)及長春花生物鹼(vinca alkaloid)。其他抗微管蛋白劑包括，例 如，漿果赤黴素(baccatin)衍生物、西地黴素(cemadotin)、秋水仙鹼(colchicine)、秋水仙胺(colcimid)、考布他汀(combretastatins)、隱花素(cryptophysins)、蒂克黴素(discodermolide)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、雌莫司汀(estramustine)、美登木素生物鹼(maytansinoid)、諾考達唑(nocodazole)或紫杉烷類似物。
在特定實施例中，細胞毒性劑可為美登木素生物鹼(maytansinoids)或另一群組的抗微管蛋白劑。例如，在特定實施例中，美登木素生物鹼(maytansinoid)為美登素(maytansine)或DM-1(ImmunoGen,Inc.；參見Chari et al.，1992，Cancer Res.52：127-131)。
在特定實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑可為多拉司他汀(dolastatin)。在特定實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑為海兔毒素類。因此，在特定實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑為海兔毒素(MMAE)。
配體單元
耦合體化合物的配體單元包括任何與受體、抗原或其他給定靶細胞群(given target-cell population)有關的接受性基團產生鍵結或反應性結合或複合作用的配體單元。配體為與欲成為標的之細胞群之基團相結合、錯合或反應的分子。在一觀點來看，配體單元扮演將藥物單元傳輸至與配體單元反應的特定標的細胞群的角色。該等配體包括但不限定於，大分子量蛋白質(例如全長抗體)、抗體片段、蛋白質、小分子量蛋白質、多肽、寡肽、凝集素、適體、醣蛋白、非肽類、維生素、 營養傳輸分子(例如，但不限定於轉鐵蛋白)或任何其他細胞結合分子或物質。
配體單元可與一連接子單元或一藥物單元形成鍵結。配體單元可藉由該配體的一異原子與一連接子單元形成鍵結。可存在於配體單元上的異原子包括硫原子(在一實施例中，來自配體的巰基)、氧原子(在一實施例中，來自配體的羰基、羧基或羥基)及氮原子(在一實施例中，來自配體的一級或二級胺基)。該些異原子可以配體的自然狀態存在於配體上，例如天然存在的抗體，或可藉由化學修飾導入配體中。
在一實施例中，配體具有一巰基，且該配體藉由該巰基的硫原子與連接子單元連接。在另一實施例中，配體具有一或多個離胺酸殘基，可藉由化學修飾導入一或多個巰基。配體單元藉由巰基與連接子單元連接。可用於修飾離胺酸的試劑包括但不限定於N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫代乙酸酯(SATA)及2-亞胺基硫烷鹽酸鹽(Traut's試劑)。
在另一實施例中，配體具有一或多個醣基，可藉由化學修飾形成一或多個巰基。配體單元藉由巰基的硫原子與連接子單元連接。在另一實施例中，配體具有一或多個醣基，可經氧化提供醛基(-CHO)(參見Laguzza et al.，1989，J.Med.Chem.32(3)：548-55)。此相對應的醛可與位於一部分連接子單元上的反應區形成鍵結。可與配體上的羰基反應的反應區包括但不限定於肼及羥胺。其他為連接或聯合藥物單元而修飾蛋白質的方案描述於Coligan等人(Current Protocols in Protein Science，vol.2，John Wiley & Sons(2002))，已併入此案以供 參考。
配體單元包括，例如，蛋白質，多肽或肽，但不限定於轉鐵蛋白、表皮生長因子(“EGF”)、鈴蟾肽、胃泌素、胃泌素釋放肽、血小板衍生生長因子、IL-2、IL-6、轉化生長因子(“TGF”)(例如TGF-α或TGF-β)、牛痘生長因子(“VGF”)、胰島素及胰島素樣生長因子I、II、凝集素及來自低密度脂蛋白的載脂蛋白。
配體單元亦包括抗體，例如多株抗體或單株抗體。抗體可為特定的抗原決定位，包括例如：癌症細胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白質、胜肽、碳水化合物、化學物質、核酸、或其片段。多株抗體的製造方法為本技術領域所習知。單株抗體(mAb)至感興趣的抗原可利用任何本技術領域習知的技術製備而成。這些技術包括但不限於例如最初由Köhler和Milstein所描述的融合瘤技術(1975,Nature 256,495-497)、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor et al.,1983,Immunology Today 4：72)、EBV-融合瘤技術(Cole et al.,1985，單株抗體及癌症療法，Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。這種抗體可為任何一種免疫球蛋白類型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、及IgD，及其任何亞型。本揭露中由融合瘤所產生之單株抗體(mAb)可於體外(in vitro)或體內(in vivo)進行培養。
單株抗體可為例如：人類單株抗體、人類化單株抗體、抗體片段、或嵌合抗體(例如：人類-小鼠抗體)。人類單株抗體可由任何本技術領域習知的技術製造(例如：Teng et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：7308-7312；Kozbor et al., 1983,Immunology Today 4：72-79；and Olsson et al.,1982,Meth.Enzymol.92：3-16)。
抗體也可為一雙特異性抗體。雙特異性抗體的製造方法為本技術領域所習知。全長雙特異性抗體的傳統製造方法是基於兩個免疫球蛋白的重鏈-輕鏈對的共現性(coexpression)，其中這兩個鏈具有不同的特異性(參見例如：Milstein et al.,1983,Nature 305：537-539；國際公開號No.WO 93/08829,Traunecker et al.,1991,EMBO J.10：3655-3659)。
根據不同的方式(approach)，具有結合特異性的抗體變異區域(抗體-抗原結合位)融合至免疫球蛋白恆定區域的序列所述融合較佳具有一免疫球蛋白重鏈恆定區域，包括至少一部份的鉸鏈區域、CH2區域、及CH3區域。較佳具有第一重鏈恆定區域(CH1)，其包含輕鏈結合所必須的位點，存在於至少一個融合中。具有編碼免疫球蛋白重鏈融合以及，若需要，免疫球輕鏈的核酸，被插入至單獨的表現載體中，並且共同轉染至合適的宿主生物(organism)。當使用了比例不均等的三個多胜肽鏈之構築提供最佳產量時，其提供了調整三個多胜肽片段於實施例中相互比例的彈性。然而，當至少兩個多胜肽鏈的表現為相等比例導致高產量或當各比例沒有特別明顯時，有可能在一個表現載體中插入兩個或所有三個多胜肽鏈的編碼序列。
例如，雙特異性抗體可具有一雜交免疫球蛋白鏈，在其中一臂中具有第一結合特異性，且在另外一臂中具有一雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)。這種不對稱 的結構有助於所期望的雙特異性化合物從不想要的免疫球蛋白鏈結合中分離，由僅存在於一個半的雙特異性分子中的免疫球蛋白輕鏈提供容易的分離方式(國際公開號No.WO 94/04690)，其整體併入本文做為參考。
更詳細之雙特異性抗體的產生可參見例如Suresh et al.,1986,Methods in Enzymology 121：210；Rodrigues et al.,1993,J.Immunology 151：6954-6961；Carter et al.,1992,Bio/Technology 10：163-167；Carter et al.,1995,J.Hematotherapy 4：463-470；Merchant et al.,1998,Nature Biotechnology 16：677-681。利用這些技術，可製備出雙特異性抗體用於治療或避免此處所定義之疾病。
雙功能抗體也被描述於歐洲專利公開號EPA 0105 360。如此參考文獻所揭露，雜交或雙功能抗體可生物性地(即，藉由細胞融合技術)或化學性地衍生，特別係透過交聯劑或是二硫化橋鍵形成試劑，且可包括整個抗體或其片段。獲得這種雜交抗體的方法揭露於例如：國際公開號WO 83/03679及歐洲專利公開號EPA 0217577，兩者皆在此併入本文作為參考。
抗體也可為功能性活性片段、抗體的衍生物或類似物，其中該抗體免疫特異性地結合至目標抗原(例如：癌症抗原、病毒抗原、微生物抗原、或其他結合至細胞或基質的抗體)。在此，“功能性活性”代表所述片段、衍生物或類似物可辨認衍生自片段，衍生物或類似物的抗體所辨認相同的抗原。特別地，於一實施例中，免疫球蛋白分子的遺傳性型(idiotype)的抗原性可藉由刪除框架及CDR序列而提升，所述CDR序列為 C-端的CDR序列，其專一性地辨認抗原。為了判斷哪一個CDR序列結合至抗原，可在結合試驗(binding assay)中使用包含CDR序列的合成胜肽，以及任何結合試驗中本技術領域所習知的抗原(例如：BIA core assay)(參見例如：Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.；Kabat et al.,1980,J.Immunology 125(3)：961-969)。
其他有用的抗體包括抗體的片段，例如但不限於：F(ab’)2片段、Fab片段、Fab’、Fv片段及抗體的重鏈及輕鏈二聚體、或其任何最小片段像是Fvs或單鏈抗體(SCAs)(例如：U.S.Pat.No.4,946,778；Bird,1988,Science 242：423-42；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；and Ward et al.,1989,Nature 334：544-54中所述)。
也可使用重組抗體，像是嵌合或人類化單株抗體，包括人類和非人類蛋白質，皆可利用標準重組DNA技術製備(參見例如U.S.Pat.No.4,816,567；及U.S.Pat.No.4,816,397)。人源化抗體為來自非人類物種的抗體分子，具有來自非人類物種的一或多種互補決定區(complementarity determining regions；CDRs)以及來自人類免疫球蛋白分子的框架區域(參見例如U.S.Pat.No.5,585,089)。嵌合和人類化單株抗體可藉由本技術領域習知的重組DNA技術產生，例如使用國際公開號WO 87/02671；歐洲專利公開號0184187；歐洲專利公開號0171496；歐洲專利公開號0173494；國際公開號WO 86/01533；U.S.Pat.No.4,816,567；歐洲專利公開號012023；Berter et al., 1988,Science 240：1041-1043；Liu et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu et al.,1987,J.Immunol.139：3521-3526；Sun et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura et al.,1987,Cancer.Res.47：999-1005；Wood et al.,1985,Nature 314：446-449；Shaw et al.,1988,J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559；Morrison,1985,Science 229：1202-1207；Oi et al.,1986,BioTechniques 4：214；U.S.Pat.No.5,225,539；Jones et al.,1986,Nature 321：552-525；Verhoeyan et al.,1988,Science 239：1534；and Beidler et al.,1988,J.Immunol.141：4053-4060所述的方法。
也可使用完整的人類抗體。人類抗體可利用例如無法表現內源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的轉基因小鼠，但其可以表現人類重鏈和輕鏈基因。轉基因小鼠以正常方式以經選擇之抗原進行免疫，例如：本發明全部或部分的多胜肽。直接對抗抗原的單株抗體可利用傳統融合瘤技術獲得。轉基因小鼠包含的人類免疫球蛋白轉基因在B細胞分化時重新排序(rearrange)，且接著進行類型轉換及體細胞突變。因此，利用這種技術，將可能產生有治療效果的IgG、IgA、IgM及IgE抗體。綜觀產生人類抗體的技術可參見Lonberg and Huszar(1995,Int.Rev.Immunol.13：65-93)。關於產生人類抗體的技術及產生此種抗體的規定之更詳細討論可參見例如：U.S.Pat.Nos.5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；以及5,545,806。其他人類抗體可藉由商業上獲得，例如來自Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)以及Genpharm(San Jose,Calif.)。
可利用稱為“定向選擇(guided selection)”的技術產生辨認經選擇的抗原決定位(epitope)的人類抗體。在此方式中，經選擇的非人類單株抗體，例如：小鼠抗體，用來定向(guide)會辨認相同抗原決定位的完整人類抗體的選擇(參見例如：Jespers et al.,1994,Biotechnology 12：899-903)。也可利用各種本技術領域習知的技術產生人類抗體，包括噬菌體展示庫(參見例如：Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.227：381；Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.222：581；Quan and Carter,2002,“The rise of monoclonal antibodies as therapeutics,”in Anti-IgE and Allergic Disease,Jardieu,P.M.and Fick Jr.,R.B,eds.,Marcel Dekker,New York,N.Y.,Chapter 20,pp.427-469)。
於其他實施例中，抗體為抗體的融合蛋白、或其功能性活性片段。例如，抗體可藉由非抗體的另一個蛋白質(或其部分，像是蛋白質的至少10、20或50個胺基酸)的胺基酸序列的N-端或C-端共價鍵進行融合(例如：胜肽鍵)。
抗體也包括經修飾或未經修飾(亦即，藉由任何分子的共價連接)的類似物和衍生物，只要這樣的共價連接允許抗體保留其抗原結合免疫特異性。例如但不限於：抗體的類似物和衍生物，包括經過進一步修飾，例如：醣基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由習知的保護/阻隔基衍生化、蛋白酶切割、連接至細胞抗體單元或其他蛋白質等。可利用習知技術實現任何大量的化學修飾，包括但不限於專一性化學切割、乙醯化、甲醯化、衣黴素存在下的代謝合成等。此外， 類似物或衍生物可包括一種或多種非天然胺基酸。
抗體可在與Fc受體作用的胺基酸殘基中具有修飾(例如：取代、刪除或增加)。特別地，抗體包括在胺基酸殘基中具有修飾的抗體，經辨認為包含在抗Fc區域和FcRn受體之間的交互作用中(參見例如：國際公開號WO 97/34631，其整體在此併入本文作為參考)。對於目標抗原的抗體免疫特異性可從商業上獲得或是來自其他來源或利用本技術領域具有通常知識者所習知的方法產生，像是例如：化學合成或重組表現技術。編碼對於癌症抗原之抗體特異性的核苷酸序列可經由例如：GenBank數據庫或類似的數據庫、公開文獻、或是例行的基因選殖(cloning)及定序而獲得。
實施例
本揭露藉由以下實施例做更詳細說明。MMAE(已知的毒素)、海兔毒素F(AF，已知的毒素)與vedotin(已知的連接子-毒素)購自Concortis Biotherapeutics。根據文獻合成Z-Val-Cit-OH、Z-Phe-Cit-OH及各種糖胺基酸。
用於連接子、毒素與連接子-毒素的縮寫及其相對應的化學結構列於表1。
<毒素>
實施例1
NPEA-AF及APEA-AF之合成
將HATU(101mg，0.2654mmol)加入含海兔毒素(165mg，0.2212mmol)、4-硝基苯乙胺鹽酸鹽(45mg，0.2212mmol)、DIPEA(0.155mL，0.8847mmol)、DMF(0.100mL)以 及二氯甲烷(1mL)的攪拌溶液中。於室溫攪拌12小時後，移除溶劑，並以製備型反相HPLC對殘留物進行純化。之後，進行凍乾，以獲得白色粉末的NPEA-AF(188mg，95%)。LC-MS：NPEA-AF(C48H75N7O9)required[MH+]=894.6，found[MH+]=895.6。
將NPEA-AF(188mg，0.2103mmol)溶於乙醇(50mL)，並混入HCl(0.4206mmol)及鈀催化劑(22mg)。於氫氣氣氛下，對混合物進行攪拌16小時。將催化劑濾除，並以20mL乙醇清洗之。於減壓環境下，移除溶劑。將殘留物與水(10mL)混合，之後，進行凍乾，以獲得白色粉末的APEA-AF(178mg，98%)。LC-MS：APEA-AF(C48H77N7O9)required[MH+]=864.6，found[MH+]=865.5。
實施例2
NPEA(COOMe)-AF及NPEA(COOH)-AF之合成
將海兔毒素F(200mg，0.26mmol)溶於少量DMF (1mL)，並以DCM(10mL)進行稀釋。將溶液浸於冰浴中，並加入L-(4-硝基)苯基丙胺酸甲酯鹽酸鹽(67mg，0.26mmol)及HATU(117mg，0.31mmol)。於加入DIPEA(0.18mL)後，將反應混合物自冰浴中移出，並於室溫攪拌過夜。於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(46%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的NPEA(COOMe)-AF(175mg，72%)。LC-MS：NPEA(COOMe)-AF(C50H77N7O11)required[MH+]=952.6，found[MH+]=952.5。
將NPEA(COOMe)-AF(20mg)溶於THF與水的混合液(1：1，10mL)，並以氫氧化鈉(2.5mg)處理之。於2小時後，於減壓環境下，蒸餾THF。水溶液以2N鹽酸進行酸化，並予以冷凍乾燥。以製備型HPLC(46%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的NPEA(COOH)-AF(15mg，75%)。LC-MS：NPEA(COOH)-AF(C49H75N7O11)required[MH+]=938.6，found[MH+]=939.3。
實施例3
APEA(COOMe)-AF及APEA(COOH)-AF之合成
將NPEA(COOMe)-AF(100mg，0.105mmol)溶於包含2N鹽酸(15μL)的乙醇(10mL)。於加入催化劑Pd/C(10%，17mg)後，反應以氫氣球進行，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。以製備型HPLC(33% ACN/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的APEA(COOME)-AF(36mg)。LC-MS：APEA(COOME)-AF(C50H79N7O9)required[MH+]=922.6，found[MH+]=923.5。
將APEA(COOMe)-AF(25mg)溶於THF與水的混合液(1：1，10mL)，並以氫氧化鈉(2.1mg)處理之。於2小時後，於減壓環境下，蒸餾THF。水溶液以2N鹽酸進行酸化，並予以冷凍乾燥。以製備型HPLC(29%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的APEA(COOH)-AF(14mg，58%)。LC-MS： APEA(COOH)-AF(C49H77N7O9)required[MH+]=908.6，found[MH+]=909.5。
實施例4
PEA-ANF及PEA-AAF之合成
將Boc-L-對硝基苯基丙胺酸(4.66g，15mmol)及苯乙胺(1.94g，16mmol)加入含有二氯甲烷(200mL)的燒瓶中，並加入偶聯劑N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ，17g，17mmol)，於室溫攪拌混合物過夜。以TLC(EtOAc/n-Hex=1：1，產物Rf=0.5)確認反應。於減壓環境下，蒸餾DCM。以正己烷(200mL)煮沸固體產物，並同時過濾。以熱的正己烷(50mL)清洗固體產物2次，並吸氣乾燥，以獲得白色粉末的 Boc-(Nitro)Phe-PEA(4.81g，77.6%)。
將Boc-(Nitro)Phe-PEA(4.80g，11.6mmol)溶於二氯甲烷(150mL)，並混入三氟乙酸(6.84g，4.6mL，60mmol)。將溶液於室溫靜置過夜。於減壓環境下，蒸餾二氯甲烷。將殘留物與THF(50mL)混合，並再次蒸餾。殘留物以1N碳酸鈉溶液(250mL)進行處理，並以二氯甲烷(100mL)萃取2次。以無水硫酸鎂對有機溶液進行乾燥，並過濾之。於減壓環境下，蒸餾濾液，並以正己烷(50mL)攪拌淺黃色殘留物，直至固體形成。於減壓環境下，蒸餾正己烷，並於高真空環境下，乾燥產物，以獲得定量(Nitro)Phe-PEA。
將多拉普林鉀鹽(dolaproline potassium salt)(325mg，1.0mmol)溶於甲醇(20mL)，並以四乙基溴化銨(232mg，1.1mmol)進行處理。於3小時後，於減壓環境下，蒸餾甲醇。以二氯甲烷(10mL)處理殘留物，並過濾以移除溴化鉀。將濾液與(Nitro)Phe-PEA(422mg，1.1mmol)及HATU(456mg，1.2mmol)混合。於室溫攪拌過夜後，於減壓環境下，蒸餾二氯甲烷，並以製備型HPLC(70%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的Boc-Dap-(Nitro)Phe-PEA(527mg，產率90%)。LC-MS：Boc-Dap-(Nitro)Phe-PEA(C31H42N4O7)required[MH+]=583.3，found[MH+]=584.4。
將Boc-Dap-(Nitro)Phe-PEA(527mg，0.9mmol)溶於二氯甲烷(20mL)，並以三氟乙酸(7mL)進行處理。於4小時後，於減壓環境下，移除溶劑。將殘留物與乙酸乙酯(50mL) 混合，並再次蒸餾。將殘留物與水(20mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色粉末的Dap-(Nitro)Phe-PEA(426mg，98%)。LC-MS：Dap-(Nitro)Phe-PEA(C26H34N4O5)required[MH+]=483.3，found[MH+]=484.3。
將Dov-Val-Dil(64.5mg，0.15mmol)、Dap-(Nitro)Phe-PEA(72mg，0.15mmol)及HATU(68mg，0.18mmol)溶於二氯甲烷(20mL)，並以DIPEA(86mg，0.66mmol)進處理。於室溫攪拌過夜後，於減壓環境下，蒸餾二氯乙烷，並以製備型HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的PEA-ANF(96.7mg，產率72%)。LC-MS：PEA-ANF(C48H75N7O9)required[MH+]=894.6，found[MH+]=895.6。
將PEA-ANF(20mg，0.022mmol)溶於乙醇(30mL)，並混入鹽酸(0.067mmol)。於加入催化量(16mg)的10% Pd/C後，將反應混合物導入氫氣球並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑濾除後，於減壓環境下，蒸餾濾液，以獲得白色固體的PEA-AAF(24.2mg，51%)。LC-MS：PEA-AAF(C48H77N7O7)required[MH+]=864.6，found[MH+]=865.6。
實施例5
3AQ-ANF及3AQ-AAF之合成
將Boc-(Nitro)Phe(46.55g，0.15mol)溶於二氯甲烷(1L)，並加入N-羥基琥珀醯亞胺(17.26g，0.15mol)及EDCI(28.76g，0.15mol)。於4小時後，加入3AQ(21.63g，0.15mol)及乙基嗎啉(17.28g，0.15mol)，並於室溫攪拌3天。於減壓環境下，蒸餾二氯甲烷。殘留物與檸檬酸溶液(1M，500mL)及乙酸乙酯(500mL)攪拌30分鐘。過濾固體產物，並以水(200mL)清洗2次。將濕的粗產物溶於熱的丙酮(1.5L)，並以無水硫酸鎂乾燥及過濾。於減壓環境下，蒸餾濾液，以獲得Boc-(Nitro)Phe-3AQ(31.52，48.1%)。
將Boc-(Nitro)Phe-3AQ(30.55g，0.07mol)溶於二氯甲烷(300mL)，並以三氟乙酸(50mL，74.45g，653mmol)進行處理。於室溫攪拌過夜後，於減壓環境下，蒸餾反應混合物。於油狀殘留物中，加入乙酸乙酯(100mL)，並於減壓環境下，進行蒸餾。上述步驟重複兩次以上，並於油狀產物中，加入乙醚(300mL)，以迫使三氟乙酸酯析出。固體產物懸浮於碳酸鈉溶液(1M，500mL)與甲醇(500mL)的混合液中，並攪拌直至懸浮均勻。於減壓環境下，蒸餾甲醇，並過濾固體產物，以水(200mL)清洗2次。將濕的產物予以冷凍乾燥，以獲得(Nitro)Phe-3AQ(20.35g，86.4%)。
將多拉普林鉀鹽(487.5mg，1.5mmol)溶於甲醇(50mL)，並以四乙基溴化銨(316.4mg，1.4mmol)進行處理。於4小時後，於減壓環境下，蒸餾甲醇。殘留物以二氯甲烷(10mL)進行處理，並過濾以移除溴化鉀。將濾液與(Nitro)Phe-3AQ(556mg，1.65mmol)及HATU(685mg，1.8mmol)混合。於室溫攪拌過夜後，於減壓環境下，蒸餾二氯甲烷，並以製備型HPLC(42%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的Boc-Dap-(Nitro)Phe-3AQ(781mg，產率86%)。LC-MS：Boc-Dap-(Nitro)Phe-3AQ(C32H39N5O7)required[MH+]=606.3，found[MH+]=607.4。
將Boc-Dap-(Nitro)Phe-3AQ(606mg，1mmol)溶於二氯甲烷(10mL)，並以三氟乙酸(6mL)進行處理。於2小時後，於減壓環境下，移除溶劑。殘留物與乙酸乙酯(50mL)混合， 並再次蒸餾。殘留物與水(20mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色粉末的Dap-(Nitro)Phe-3AQ(500mg，99%)。LC-MS：Dap-(Nitro)Phe-3AQ(C27H31N5O5)required[MH+]=506.2，found[MH+]=507.1。
將Dov-Val-Dil(200mg，0.466mmol)、Dap-(Nitro)Phe-3AQ(236mg，0.466mmol)與HATU(213mg，0.56mmol)溶於二氯甲烷(5mL)，並以DIPEA(267mg，2.05mmol)進行處理。於室溫攪拌過夜後，於減壓環境下，蒸餾二氯甲烷，並以製備型preparative HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的3AQ-ANF(345.2mg，產率82%)。LC-MS：3AQ-ANF(C49H72N8O9)required[MH+]=917.5，found[MH+]=918.5。
將3AQ-ANF(105mg，0.114mmol)溶於乙醇(30mL)。於加入催化量(10mg)的10% Pd/C後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌4小時。以矽藻土墊將催化劑濾除後，於減壓環境下，蒸餾濾液，並以製備型HPLC(36%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對殘留物進行純化。於減壓環境下，蒸餾含有3AQ-ANF的分餾物，以移除乙腈。將酸性水溶液以碳酸鈉進行鹼化，並過濾之，以獲得3AQ-AAF(80mg，79%)。LC-MS：3AQ-AAF(C49H74N8O7)required[MH+]=887.6，found[MH+]=888.5。
<糖胺基酸>
實施例6
糖胺基酸1(SAA1)及糖胺基酸2(SAA2)衍生物之合成
將核糖衍生物N3-SAA1(X)-OMe(3.6g)溶於甲醇。於加入催化量的Pd/C後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑濾除後，於減壓環境下，蒸餾甲醇，以獲得淡黃色液體的SAA1(X)-OMe(3.14g)。
將Z-OSu(9.75g)及DIPEA(6.8mL)加入SAA1(X)-OMe(8.72g)/DCM(300mL)溶液。於17小時後，以1N碳酸鈉清洗反應混合物。有機層以無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓環境下，蒸餾二氯甲烷，以獲得棕色液體的粗產物Z-SAA1(X)-OMe(13.6g)。
將粗產物Z-SAA1(X)-OMe(1g)溶於THF(50mL)，並以1N氫氧化鉀(6mL)進行處理。於3小時後，於減壓環境下，蒸餾THF。將粗產物水溶液與DCM(100mL)混合，並以檸檬酸溶液小心酸化，直至pH達約3-4。以水清洗有機溶液數次，並以無水硫酸鎂進行乾燥。於移除二氯甲烷後，以製備型HPLC(45%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x500mm；流速55mL/min；Z-SAA1(X)-OH RT 11min；Z-SAA2(X)-OH RT 12min)對粗產物液體進行純化。於收集Z-SAA1(X)-OH及Z-SAA2(X)-OH溶液後立即鹼化。於移除乙腈後，將Z-SAA1(X)-OH及Z-SAA2(X)-OH水溶液與二氯甲烷混合，並以檸檬酸溶液小心酸化，直至pH達約3-4。以二氯甲烷對Z-SAA1(X)-OH及Z-SAA2(X)-OH溶液進行萃取，並以無水硫酸鎂對有機層進行乾燥。於移除二氯甲烷後，獲得半固體的416mg的Z-SAA1(X)-OH及104mg的Z-SAA2(X)-OH。
<中間體>
實施例7
Val-Cit-APEA-AF之合成
將Z-Val-Cit(16.34g，40mmol)及APEA-Boc(5.91g，25mmol)加入二氯甲烷(1.5L)與異丙醇(0.5L)的混合液中，並攪拌3小時，之後，加入EEDQ(9.89g，40mmol)。於室溫對混濁溶液進行攪拌。由於產物的析出，未溶的Z-Val-Cit逐漸消 失，且於1日後，溶液逐漸混濁。於48小時後，以HPLC測試反應完成。於減壓環境下，蒸餾反應混合物，直至形成厚的糊狀物。對混合物進行過濾，並以異丙醇(400mL)清洗2次，以水(400mL)清洗2次。固體產物懸浮於水(800mL)中，並予以冷凍乾燥，以獲得白色粉末的Z-Val-Cit-APEA-Boc(16.62g，61%)。
將Z-Val-Cit-APEA-Boc(18.80g，30mmol)加入二氯甲烷(200mL)中，並以三氟乙酸(15mL)進行處理過夜。於減壓環境下，蒸餾二氯甲烷。於油狀殘留物中，加入乙酸乙酯(100mL)，並於減壓環境下，進行蒸餾。上述步驟重複兩次以上，並於油狀產物中，加入乙醚(300mL)，以迫使三氟乙酸酯析出。將乙醚溶液倒出。固體產物以乙酸乙酯(500mL)進行攪拌，並過濾之。固體產物懸浮於碳酸鈉溶液(1M，500mL)中，並攪拌直至懸浮均勻。將混合物離心，並倒出上清液。固體重懸浮於水(500mL)中，並進行離心。上述步驟進行兩次。將灰白色濕的固體產物再懸浮於水(500mL)中，並予以冷凍乾燥，以獲得Z-Val-Cit-APEA(9.87g，63%)。
將海兔毒素F鹽酸鹽(626mg，0.8mmol)溶於DMF(10mL)與二氯甲烷(10mL)的混合液中。於加入Z-Val-Cit-APEA(506mg，0.96mmol，1.2eq)及HATU(365mg，0.96mmol，1.2eq)後，將反應混合物浸於冰浴中，之後，加入DIPEA(351mg，2.72mmol，3.4eq)。於30分鐘後，移開冰浴，於室溫攪拌反應混合物過夜。之後，於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(45%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化， 以獲得白色固體的Z-Val-Cit-APEA-AF(574mg，51%)。LC-MS：Z-Val-Cit-APEA-AF(C67H103N11O12)required[MH+]=1254.8，found[MH+]=1256.1。
將Z-Val-Cit-APEA-AF(502mg，0.42mmol)溶於包含2N鹽酸(630μL)的乙醇(30mL)。於加入Pd/C(10%，30mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水(10mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Val-Cit-APEA-AF(420mg，83%)。LC-MS：Val-Cit-APEA-AF(C59H97N11O10)required[MH+]=1121.5，found[MH+]=1121.5。
<連接子-毒素>
實施例8
MC-Val-Cit-APEA-AF之合成
將Val-Cit-APEA-Boc(65mg)與MC-OPFP(50mg)溶於DME(5mL)，並加入DIPEA(0.023mL)。於5小時後，於減壓環境下，移除DME與DIPEA。以製備型HPLC(50%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱50x500mm；流速80mL/min；RT 13.60min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-Val-Cit-APEA-Boc(40mg)。LC-MS：MC-Val-Cit-APEA-Boc(C34H51N7O8)required[MH+]=686.4，found[MH+]=687.3。
於室溫，將MC-Val-Cit-APEA-Boc(40mg)/DCM(5mL)以TFA(300L)進行處理。於17小時後，於減壓環境下，移 除DCM與TFA，以獲得淡黃色固體的MC-Val-Cit-APEA(46mg)。LC-MS：MC-Val-Cit-APEA(C29H43N7O6)required[MH+]=586.3，found[MH+]=586.7。
將MC-Val-Cit-APEA(37mg)與海兔毒素F(47mg)溶於DCM與DMF(10：1，3.7mL)的混合液中。之後，加入HBTU(37mg)與DIPEA(0.037mL)。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM與DMF以製備型HPLC(40%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min；RT 14min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-Val-Cit-APEA-AF(9mg)。LC-MS：MC-Val-Cit-APEA-AF(C70H109N11O13)required[MH+]=1312.8，found[MH+]=1315.2。
實施例9
MC-SAA1-Phe-Cit-APEA-AF之合成
將Z-Phe-Cit(9.13g，20mmol)加入二氯甲烷(750mL)及異丙醇(250mL)的混合液中，並攪拌直至雙肽完全溶解。之後，加入APEA-Boc(7.09g，30mmol)及EEDQ(7.42g，30mmol)，並於室溫攪拌混合物3天。於減壓環境下，移除溶劑，並加入乙醚(300mL)於殘留物中。過濾混合物，並將粗產物再懸浮於乙醚(300mL)中。上述步驟重複3次。於真空環境下，對收集的固體產物進行乾燥，以獲得Z-Phe-Cit-APEA-Boc(9.53g，產率70.6%)。產物以PMR進行鑑定。
將Z-Phe-Cit-APEA-Boc(2.02g，3mmol)溶於THF(250mL)與甲醇(50mL)的混合液中。於加入催化量的Pd/C(10%)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑濾除後，於減壓環境下，蒸餾濾液，以獲得白色固體的Phe-Cit-APEA-Boc(1.61g，99%)。
將HBTU(1.118g)與DIPEA(1.02mL)加入N3-SAA1(X)-OH(633mg)與Phe-Cit-APEA-Boc(1.33g)溶於DCM與DMF(10：1，110mL)的混合液中。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM。於剩餘的粗DMF溶液中，加入水與乙醚，於過濾後，獲得米色固體。以濃檸檬酸水溶液清洗固體數次，以移除大部分的HOBt與DMF。以製備型HPLC(50%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm)對N3-SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc進行純化。於減壓環境下，蒸餾乙腈，並對剩餘的水溶液進行冷凍乾燥，以獲得含有N3-SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc與N3-SAA1-Phe-Cit-APEA-Boc的白色固體(1g)。LC-MS： N3-SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc(C38H53N9O9)required[MH+]=780.9，found[MH+]=781.8；N3-SAA1-Phe-Cit-APEA-Boc(C35H49N9O9)required[MH+]=740.8，found[MH+]=741.7。
將N3-SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc與N3-SAA1-Phe-Cit-APEA-Boc的混合物(100mg)溶於甲醇(50mL)。於加入催化量的Pd/C(10%)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑濾除後，於減壓環境下，移除甲醇，以獲得含有SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc與SAA1-Phe-Cit-APEA-Boc的白色固體(78mg)。
將MC-OPFP(103mg)加入SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc/SAA1-Phe-Cit-APEA-Boc(210mg)/甲醇(50mL)的溶液中，之後，加入DIPEA(0.047mL)。於17小時後，對反應混合物進行濃縮。以製備型HPLC(50%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x500mm；流速40mL/min)對粗產物進行純化，以獲得MC-SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc與MC-SAA1-Phe-Cit-APEA-Boc的溶液。
以濃鹽酸(10eq.)對MC-SAA1(X)-Phe-Cit-APEA-Boc與MC-SAA1-Phe-Cit-APEA-Boc的溶液進行處理。反應由分析型HPLC進行監測，直至水解完成。於減壓環境下，移除乙腈，並於水溶液進行冷凍乾燥後，獲得固體的MC-SAA1-Phe-Cit-APEA。LC-MS：MC-SAA1-Phe-Cit-APEA(C40H54N8O10)required[MH+]=807.4，found[MH+]=809.1。
將MC-SAA1-Phe-Cit-APEA(110mg)溶於DCM與DMF(10：1，10mL)的混合液中，並分別加入海兔毒素F(93mg)、HBTU(55mg)與DIPEA(0.077mL)。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM、DMF及DIPEA。以製備型HPLC(35%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速40mL/min)對粗產物進行純化。於減壓環境下，移除標的分餾物中的乙腈，並對剩餘的水溶液進行冷凍乾燥，以獲得白色固體的MHT-47(20mg)。LC-MS：MC-SAA1-Phe-Cit-APEA-AF(C80H119N13O17)required[MH+]=1534.9，found[MH+]=1538.0。
實施例10
MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將HBTU(32.5mg)與DIPEA(0.029mL)分別加入Z-SAA1(X)-OH(26.1mg)與Val-Cit-APEA-AF(80mg)溶於DCM與DMF(10：1，4.4mL)的混合液中。於18小時後，於減壓環境下，移除溶劑，並以製備型HPLC(45%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x500mm；流速65mL/min；RT 11min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液置於冰箱中過夜，直至Z-SAA1(X)-Val-Cit-APEA-AF完全轉變為Z-SAA1-Val-Cit-APEA-AF。對水溶液進行冷凍乾燥，以獲得白色固體的Z-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(63mg，兩步驟以上的產率63%)。
將Z-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(63mg)溶於甲醇(5mL)，之後，加入催化劑Pd/C。將反應混合物導入氫氣球，並攪拌3小時。以矽藻土墊將Pd/C濾除後，於減壓環境下，蒸餾濾液，以獲得白色固體的SAA1-Val-Cit-APEA-AF(52.5mg)。
將DIPEA(0.0056mL)加入SAA1-Val-Cit-APEA-AF(40mg)/MC-OPFP(11.6mg)/甲醇(4mL)的溶液中。反應攪拌過夜，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(35%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x500mm；流速70mL/min；RT 18min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(MHT-71)(27mg，47%)。LC-MS：MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C76H120N13O17)required[MH+]=1486.9，found[MH+]=1487.2。
實施例11
Cl2MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將3,4-二氯-呋喃-2,5-二酮(10.34g，0.0619mol)與6-胺基己酸(8.13g,0.0619mmol)混合於冰醋酸(50mL)中。混合物回流12小時。於減壓環境下，蒸餾溶劑後，以快速管柱色層分析(乙酸乙酯/己烷=2/3)對殘留物進行純化，以獲得白色粉末的Cl2MC(12.48g，72%)。LC-MS：Cl2MC(C10H11Cl2NO4)required[M-CO2]+=235.0，found[M-CO2]+=235.0。
將DCC(0.83g，4.0mmol)加入Cl2MC(1.06g，3.8mmol)/五氟苯酚(0.84g，4.5mmol)/二氯甲烷(25mL)的溶液中。於室溫攪拌反應混合物12小時，並過濾以移除不溶性的DCU。於減壓環境下，蒸餾反應混合物，直至體積達到約10mL。將溶液儲存於4℃冰箱2小時。濾除不溶性材料，並將濾液以快速管柱色層分析(乙酸乙酯/己烷=1/30-1/20)進行純化，以獲得白色固體的Cl2MC-OPFP(1.39g，82%)。
將DIPEA(0.002mL，0.0116mmol)加入SAA1-Val-Cit-APEA-AF(5.0mg，0.0039mmol)/Cl2MC-OPFP(2.0mg，0.0046mmol)/DMF(1mL)的溶液中。於室溫攪拌混 合物1小時，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(35%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的Cl2MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(3.0mg，50%)。LC-MS：Cl2MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C76H117Cl2N13O17)required[M+2H]2+=777.9，found[M+2H]2+=779.4。
實施例12
Br2MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將氯甲酸甲酯(0.303mL，3.92mmol)加入3,4-二溴-吡咯-2,5-二酮(1.00g，3.92mmol)/N-甲基嗎啉(0.431mL，3.92mmol)/THF(35mL)的溶液中。於室溫攪拌反應混合物3小時，之後，加入二氯甲烷(40mL)，並以水(40mL)清洗有機相3次。以無水硫酸鎂對有機溶液進行乾燥，並於減壓環境下，進行蒸餾，以獲得粉色粉末的3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氫-吡咯-1-羧酸甲酯(1.13g，93%)。
將6-胺基己酸(476.0mg，3.6mmol)溶於乙腈與水的混合溶液(3：2，50mL)中。溶液於冰浴中冷卻，並以飽和碳 酸氫鈉溶液(1mL)進行處理，之後，加入3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氫-吡咯-1-羧酸甲酯(1.13g，3.6mmol)。於室溫攪拌混合物12小時，並以檸檬酸溶液調整pH至3-4。於減壓環境下，蒸餾混合物，以移除乙腈。以快速管柱色層分析(乙酸乙酯/己烷，2/3)對殘留物進行純化，以獲得白色粉末的Br2MC(1.33g，99%)。LC-MS：Br2MC(C10H11Br2NO4)required[M+H]+=369.9，found[M+H]+=371.0。
將DCC(0.79g，3.8mmol)加入Br2MC(1.33g，3.86mmol)/五氟苯酚(0.80g，4.3mmol)/二氯甲烷(40mL)的溶液中。於室溫攪拌反應混合物12小時，並過濾以移除不溶性的DCU。於減壓環境下，蒸餾反應混合物，直至體積達到約10mL。將溶液儲存於4℃冰箱2小時。濾除不溶性材料，並將濾液以快速管柱色層分析(乙酸乙酯/己烷=1/30-1/20)進行純化，以獲得白色固體的Br2MC-OPFP(1.50g，78%)。
將DIPEA(0.0036mL，0.0206mmol)加入SAA1-Val-Cit-APEA-AF(8.9mg，0.0069mmol)/Br2MC-OPFP(4.5mg，0.0083mmol)/DMF(1mL)的溶液中。於室溫攪拌混合物1小時，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(35%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的Br2MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(5.6mg，50%)。LC-MS：Br2MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C76H117Br2N13O17)required[M+H]+=1644.7，found[M+H]+=1645.1。
實施例13
MC-SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF之合成
將Z-Val-Cit-OH(3.24g，7.93mmol)加入二氯甲烷與甲醇的混合液(3：1，80mL)中。於加入APEA(COOMe)-Boc(2.8g，9.52mmol)後，加入偶聯劑EEDQ(2.47g，9.52mmol)，並於室溫對混濁溶液進行攪拌。未溶的Z-Val-Cit逐漸消失，溶液逐漸清澈。於48小時後，以HPLC測試反應完成。於減壓環境下，蒸餾反應混合物，直至形成厚的糊狀物。對混合物進行過濾，並以正己烷(50mL)清洗2次，以水(50mL)清洗2次，以乙醚(50mL)清洗2次。於真空環境下，對固體產物進行乾燥，以獲得棕色粉末的Z-Val-Cit-APEA(COOMe)-Boc(75.0mg，1.4%)。
將Z-Val-Cit-APEA(COOMe)-Boc(75.0mg，0.11mmol)加入二氯甲烷(8mL)中，並於室溫以三氟乙酸(0.09mL)進行處理。於4小時後，於減壓環境下，蒸餾溶劑。將殘留物與水(10mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色粉末的Z-Val-Cit-APEA(COOMe)(96.0mg)。
將海兔毒素F(80.0mg，0.102mmol)溶於少量DMF(1mL)，並以DCM(10mL)進行稀釋。將溶液浸於冰浴中，並加入Z-Val-Cit-APEA(COOMe)(71.4mg，0.102mmol)及HATU(43.0mg，0.113mmol)。於加入DIPEA(0.071mL)後，移開冰浴。於室溫攪拌混合物4小時後，於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的Z-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(82.0mg，61%)。
將Z-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(82.0mg， 0.062mmol)溶於包含鹽酸(0.24mmol)的乙醇(10mL)。於加入Pd/C(10%，10mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將殘留物與水(10mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色粉末的Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(72.8mg，96%)。LC-MS：Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(C61H99N11O12)required[MH+]=1178.8，found[MH+]=1179.7。
將Z-SAA1(X)-OH(22.0mg，0.06mmol)溶於二氯甲烷(10mL)。於加入HATU(25.3mg，0.066mmol)後，將反應混合物浸於冰浴中，之後，加入DIPEA(0.032mL，0.06mmol)。於10分鐘後，移開冰浴，並將Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(72.8mg，0.06mmol)/DMF(3mL)溶液於室溫加入反應混合物中。於3小時後，於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(45%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，以使Z-SAA1(X)-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF完全水解。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Z-SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(43.5mg，兩步驟以上的產率49%)。LC-MS：Z-SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(C79H120N12O18)required[MH+]=1525.9，found[MH+]=1526.8。
將Z-SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(43.5mg，0.029mmol)溶於包含鹽酸(0.06mmol)的乙醇(5mL)。於加入Pd/C(10%，4.7mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過 夜。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將殘留物與水(5mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色粉末的SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(38.4mg，94%)。
將DIPEA(0.004mL)加入SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(15.0mg，0.011mmol)/MC-OPFP(4.5mg，0.012mmol)/DMF(4mL)的溶液中。於室溫攪拌混合物1小時，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(36%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(10.0mg，60%)。LC-MS：MC-SAA1-Val-Cit-APEA(COOMe)-AF(C78H121N13O19)required[MH+]=1544.9，found[MH+]=1545.8。
實施例14
MC-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將Z-SAA1(X)-OH(28.0mg，0.076mmol)溶於二氯甲烷(1mL)。於加入HATU(23.4mg，0.061mmol)後，將反應混合物浸於冰浴中，之後，加入DIPEA(7.9mg，0.061mmol)。於10分鐘後，移開冰浴，並將SAA1-Val-Cit-APEA-AF(70.0mg，0.051mmol)/DMF(3mL)溶液於室溫加入反應混合物中。於1小時後，於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(39%乙 腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，以使Z-SAA1(X)-SAA1-Val-Cit-APEA-AF完全水解。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Z-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(64mg，兩步驟以上的產率78%)。LC-MS：Z-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C81H125N13O20)required[MH+]=1602.0，found[MH+]=1601.5。
將Z-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(64.0mg，0.042mmol)溶於包含鹽酸(0.136mmol)的乙醇(20mL)。於加入Pd/C(10%，6.5mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水(10mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(60.0mg，97%)。LC-MS：SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C73H119N13O18)required[MH+]=1466.9，found[MH+]=1467.5。
將SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(30.0mg，0.019mmol)與DIPEA(7.4mg，0.057mmol)溶於DMF(2mL)。將反應混合物浸於冰浴後，加入MC-OPFP(9.0mg，0.023mmol)。於10分鐘後，移開冰浴，並於室溫攪拌混合物1小時。於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(18.5mg，53%)。LC-MS：MC-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C83H130N14O21)required [MH+]=1660.0，found[MH+]=1660.7。
實施例15
Cl2MC-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(3.0mg，0.00065mmol)與DIPEA(0.003mL，0.0164mmol)溶於DMF(1mL)。將反應混合物浸於冰浴後，加入Cl2MC-OPFP(3.0mg，0.0065mmol)。於10分鐘後，移開冰浴，並於室溫攪拌混合物1小時。於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的Cl2MC-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(2.8mg，30%)。LC-MS：Cl2MC-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C83H128Cl2N14O21)required[M+H]+=1727.9，found[M+H]+=1729.6。
實施例16
Cl2MC-SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將DCC(0.133g，0.6411mmol)加入Z-SAA1(X)-OH(0.221g，0.6048mmol)/五氟苯酚(0.134g，0.7258mmol)/二氯甲烷(20mL)的溶液中。於室溫攪拌反應混合物12小時，並過濾以移除不溶性的DCU。於減壓環境下，蒸餾反應混合物，直至體積達到約10mL。將溶液儲存於4℃冰箱2小時。濾除不溶 性材料，並將濾液以快速管柱色層分析(乙酸乙酯/己烷=1/4-1/2)進行純化，以獲得白色固體的Z-SAA1(X)-OPFP(0.201g，63%)。LC-MS：Z-SAA1(X)-OPFP(C24H22F5NO7)required[M+H]+=532.1，found[M+H]+=533.1。
將SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(4.8mg，0.0090mmol)與DIPEA(0.004mL，0.0225mmol)溶於DMF(1mL)。將反應混合物浸於冰浴後，加入Z-SAA1(X)-OPFP(4.8mg，0.009mmol)。於10分鐘後，移開冰浴，並於室溫攪拌混合物3小時。於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，以水解縮丙酮基。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Z-SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(13.0mg，兩步驟以上的產率97%)。LC-MS：Z-SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C88H136N14O24)required[M+H]+=1774.0，found[M+H]+=1774.9。
將Z-SAA1-SAA-SAA1-Val-Cit-APEA-AF[FCW-043](13.0mg，0.0075mmol)溶於包含鹽酸(0.0126mmol)的乙醇(10mL)。於加入Pd/C(10%，0.8mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌過夜。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水(5mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(9.0mg，75%)。LC-MS：SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C80H130N14O22)required [M+H]+=1640.0，found[M+H]+=1640.9。
將SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(5.0mg，0.0031mmol)與DIPEA(0.002mL，0.0092mmol)溶於DMF(1mL)。將反應混合物浸於冰浴後，加入Cl2MC-OPFP(2.0mg，0.0037mmol)。於10分鐘後，移開冰浴，並於室溫攪拌混合物3小時。於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的Cl2MC-SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(1.0mg，17%)。LC-MS：Cl2MC-SAA1-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C90H139Cl2N15O25)required[M+H]+=1901.0，found[M+H]+=1902.8。
實施例17
MC-SAA3-Val-Cit-APEA-AF之合成
將HATU(22.0mg，0.0572mmol)與DIPEA(0.027mL，0.156mmol)分別加入Z-SAA3(X)-OH(18.2mg，0.052mmol)與Val-Cit-APEA-AF(60.0mg，0.052mmol)溶於DCM與DMF(10：1，6mL)的混合液中。於18小時後，於減壓環境下，移除溶劑，並以製備型HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，直至縮丙酮基完全移除。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Z-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(48.0mg，兩步驟以上的產率65%)。
將Z-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(48.0mg，0.034mmol)溶於包含鹽酸(0.014mL)的乙醇(5mL)。於加入Pd/C(10%，4.7mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌5小時。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水 (5mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的SAA3-Val-Cit-APEA-AF(42.0mg，94%)。
將DIPEA(0.006mL)加入SAA3-Val-Cit-APEA-AF(20.0mg，0.015mmol)/MC-OPFP(6.3mg，0.0165mmol)/DMF(4mL)的溶液中。反應於室溫攪拌1小時，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(36%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(12.2mg，55%)。LC-MS：MC-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(C75H117N13O17)required[MH+]=1473.8，found[MH+]=1473.6。
實施例18
MC-SAA3-SAA3-Val-Cit-APEA-AF之合成
將HATU(17.3mg，0.045mmol)與DIPEA(0.02mL，0.123mmol)分別加入Z-SAA3(X)-OH(14.5mg，0.041mmol)與SAA3-Val-Cit-APEA-AF(54.5mg，0.041mmol)溶於DCM與DMF(10：1，6mL)的混合液中。於18小時後，於減壓環境下，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(41%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，直至縮酮基完全移除。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Z-SAA3-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(21.3mg，兩步驟以上的產率33%)。
將Z-SAA3-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(21.3mg，0.0135mmol)溶於包含鹽酸(0.052mmol)的乙醇(5mL)。於加入Pd/C(10%，2.5mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌5小時。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水(5mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的SAA3-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(16.1mg，81%)。
將DIPEA(0.004mL)加入SAA3-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(16.1mg，0.0109mmol)/MC-OPFP(4.5mg，0.012mmol)/DMF(5mL)的溶液中。於室溫攪拌反應混合物1小時，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA3-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(9.2mg，52%)。LC-MS：MC-SAA3-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(C81H126N14O21) required[MH+]=1633.0，found[MH+]=1633.2。
實施例19
MC-SAA4-Val-Cit-APEA-AF之合成
將HATU(18.1mg，0.0473mmol)與DIPEA(0.023mL，0.129mmol)分別加入Z-SAA4(X)-OH(15.2mg，0.043mmol)與Val-Cit-APEA-AF(50.0mg，0.043mmol)溶於DCM與DMF(10：1，6mL)的混合液中。於18小時後，於減壓環境下，移除溶劑，並以製備型HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，直至丙酮基完全移除。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的 Z-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(32.4mg，兩步驟以上的產率53%)。
將Z-SAA3-Val-Cit-APEA-AF(32.4mg，0.0229mmol)溶於包含鹽酸(0.09mmol)的乙醇(5mL)。於加入Pd/C(10%，4.0mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌5小時。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水(5mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的SAA4-Val-Cit-APEA-AF(30.0mg，98%)。
將DIPEA(0.006mL)加入SAA4-Val-Cit-APEA-AF(20.0mg，0.015mmol)/MC-OPFP(6.3mg，0.0165mmol)/DMF(4mL)的溶液中。反應於室溫攪拌1小時，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(36%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA4-Val-Cit-APEA-AF(15.6mg，70%)。LC-MS：MC-SAA4-Val-Cit-APEA-AF(C75H117N13O17)required[MH+]=1473.8，found[MH+]=1473.6。
實施例20
MC-SAA5-Val-Cit-APEA-AF之合成
將HATU(40mg，0.1060mmol)加入Val-Cit-APEA-AF(99mg，0.0884mmol)、Z-SAA5-OH(36mg，0.1060mmol)與DIPEA(0.046mL，0.2651mmol)溶於DMF(2mL)與二氯甲烷(20mL)的攪拌溶液中。於室溫攪拌12小時後，蒸餾溶劑，並以製備型HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，直至丙酮基完全移除。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色粉末的Z-SAA5-Val-Cit-APEA-AF(33mg，26%)。LC-MS：Z-SAA5-Val-Cit-APEA-AF(C75H115N11O17)required[M+2H]2+=721.9，found[M+2H]2+=723.6。
將Z-SAA5-Val-Cit-APEA-AF(35.0mg，0.024mmol)溶於包含鹽酸(0.048mmol)的乙醇(8mL)。於加入Pd/C(10%， 2.6mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌16小時。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水(1 0mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的SAA5-Val-Cit-APEA-AF(30.0mg，95%)。LC-MS：SAA5-Val-Cit-APEA-AF(C67H109N11O15)required[M+2H]2+=654.9，found[M+2H]2+=656.6。
將DIPEA(0.0066mL，0.0378mmol)加入SAA5-Val-Cit-APEA-AF(16.5mg，0.0126mmol)/MC-OPFP(5.7mg，0.0151mmol)/DMF(3mL)的溶液中。反應於室溫攪拌3小時，並於減壓環境下，進行蒸餾。以製備型HPLC(36%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30x250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA5-Val-Cit-APEA-AF(12.0mg，63%)。LC-MS：MC-SAA5-Val-Cit-APEA-AF(C77H120N12O18)required[M+2H]2+=751.4，found[M+2H]2+=753.1。
實施例21
MC-SAA6-Val-Cit-APEA-AF之合成
將質子海綿(63mg)與HBTU(170mg)加入Z-SAA6(X)-OH(100mg)/二氯甲烷(10mL)的溶液中。之後，加入Val-Cit-APEA-Boc(150mg)/DMF(1mL)溶液，並靜置過夜。於移除溶劑後，以製備型HPLC(50%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*500mm；流速70mL/min；RT 15min)對粗產物進行純化。於移除乙腈後，將水溶液於室溫靜置過夜，直至丙酮基完全移除。將水溶液予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Z-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(122.1mg)。LC-MS：Z-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(C40H57N7O11)required[MH+]= 812.42，found[MH+]=813.2。
將Z-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(50mg)溶於甲醇(2mL)，之後，加入催化劑Pd/C。將反應混合物導入氫氣球，並靜置17小時。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾甲醇，以獲得白色固體的SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(37.4mg)。
將SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(47mg)與MC-OPFP(28mg)溶於DMF(4mL)。加入DIPEA(0.0141mL)於反應混合物中。於5小時後，於減壓環境下，移除DMF與DIPEA。以製備型HPLC(50%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*500mm；流速45-50mL/min；RT 10.8min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(42.5mg)。LC-MS：MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(C42H62N8O12)required[MH+]=871.46，found[MH+]=871.5。
以TFA(0.1mL)於室溫對MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-Boc(42.5mg)/DCM(10mL)進行處理。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM與TFA，以獲得淡黃色固體的[00358]MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA(40mg)。LC-MS：MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA(C37H54N8O10)required[MH+]=771.40，found[MH+]=771.9。
將MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA(32mg)與海兔毒素F(27mg)溶於DCM與DMF(10：1，12mL)的混合液中。之後，分別加入HBTU(20.5mg)與DIPEA(0.022mL)。於17小時後， 於減壓環境下，移除DCM與DMF。以製備型HPLC(40%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*500mm；流速30mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-AF(15mg)。LC-MS：MC-SAA6(X)-Val-Cit-APEA-AF(C77H119N13O17)required[MH+]=1498.89，found[MH+]=1500.7。
實施例22
MC-SAA7-Val-Cit-APEA-AF之合成
將Val-Cit-APEA-Boc(2.46g，5mmol)與 Z-SAA7-OH(1.71g，5mmol)溶於DMF(100mL)。之後，將DIPEA(646.2mg，5mmol)與HATU(1.90g，5mmol)加入反應混合物中。於室溫攪拌混合物16小時後，於減壓環境下，蒸餾溶劑。以乙酸乙酯(200mL)攪拌殘留物數小時，直至細白色粉末形成。濾除固體產物。以水(200mL)煮沸白色粉末15分鐘，並同時過濾。以熱水(50mL)清洗產物2次，並於真空下乾燥，以獲得Z-SAA7-Val-Cit-APEA-Boc。
將Z-SAA7-Val-Cit-APEA-Boc(200mg)溶於甲醇(50mL)，之後，加入催化劑Pd/C。將反應導入氫氣球，並靜置17小時。以矽藻土墊將催化劑濾除，並於減壓環境下，蒸餾甲醇，以獲得白色固體的SAA7-Val-Cit-APEA-Boc(148mg)。
將SAA7-Val-Cit-APEA-Boc(240mg)、MC-OPFP(144mg)與DIPEA(0.072mL)溶於DMF(20mL)。於5小時後，於減壓環境下，移除DMF與DIPEA。將殘留物與45%乙腈/水(20mL)混合，並進行離心。於移除液體部分後，獲得白色固體的MC-SAA7-Val-Cit-APEA-Boc(200mg)。LC-MS：MC-SAA7-Val-Cit-APEA-Boc(C41H62N8O13)required[MH+]=875.5，found[MH+]=875.8。
以TFA(0.5mL)於室溫對MC-SAA7-Val-Cit-APEA-Boc(200mg)/DCM(30mL)進行處理。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM與TFA，以獲得淡黃色固體的MC-SAA7-Val-Cit-APEA(180mg)。LC-MS：MC-SAA7-Val-Cit-APEA(C36H54N8O11)required[MH+]=775.4，found[MH+]=776.0。
將MC-SAA7-Val-Cit-APEA(80mg)與海兔毒素F(77mg)溶於DCM與DMF(10：1，16.6mL)的混合液中。之後，分別加入HBTU(64mg)與DIPEA(0.064mL)。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM與DMF。以製備型HPLC(40%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速25mL/min；RT 10.42min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA7-Val-Cit-APEA-AF(50.9mg)。LC-MS：MC-SAA7-Val-Cit-APEA-AF(C77H120N12O18)required[MH+]=1503.0，found[MH+]=1504.1。
實施例23
MC-SAA8-Val-Cit-APEA-AF之合成
將質子海綿(63mg)與HBTU(170mg)加入Z-SAA8(X)-OH(100mg)/DCM(10mL)的溶液中。之後，加入 Val-Cit-APEA-Boc(150mg)/DMF(1mL)溶液，並將反應混合物靜置過夜。於移除溶劑後，以製備型HPLC(55%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*500mm；流速60mL/min；RT 13min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的Z-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(144.6mg)。LC-MS：Z-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(C40H57N7O11)required[MH+]=812.4，found[MH+]=813.4。
將Z-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(70mg)溶於甲醇(10mL)，之後，加入催化劑Pd/C。將反應導入氫氣球，並靜置17小時。以矽藻土墊將催化劑濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液，以獲得白色固體的SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(54mg)。
將SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(44mg)與MC-OPFP(24.2mg)溶於DMF(4mL)。之後，加入DIPEA(0.0141mL)。於5小時後，於減壓環境下，移除DMF與DIPEA。以製備型HPLC(45%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速35-40mL/min；RT 13min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(40mg)。LC-MS：MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(C42H62N8O12)required[MH+]=871.5，found[MH+]=872.0。
以TFA(0.1mL)於室溫對MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-Boc(40mg)/DCM(2mL)進行處理。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM與TFA，以獲得淡黃色固體的MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA(40mg)。LC-MS：MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA(C37H54N8O10)required[MH+]= 771.4，found[MH+]=771.9。
將MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA(25.6mg)與海兔毒素F(24.5mg)溶於DCM與DMF(10：1，5.5mL)的混合液中。之後，分別加入HBTU(20.5mg)與DIPEA(0.022mL)。於17小時後，於減壓環境下，移除DCM與DMF。以製備型HPLC(40%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速35-40mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-AF(3.3mg)。LC-MS：MC-SAA8(X)-Val-Cit-APEA-AF(C78H120N12O17)required[MH+]=1497.9，found[MH+]=1500.5。
實施例24
MC-Val-Cit-AAF-3AQ之合成
將AAF-3AQ(30.8mg，0.035mmol)溶於EtOH(10mL)與DCM(10mL)的混合液中。於加入Z-Val-Cit(15.7mg，0.038mmol)與EEDQ(13mg，0.052mmol)後，於室溫攪拌混合物7天。於減壓環境下，蒸餾反應混合物，並以製備型HPLC(34%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm； 流速24mL/min)純化之，以獲得白色固體的Z-Val-Cit-AAF-3AQ(4.83mg，10.7%)。LC-MS：Z-Val-Cit-AAF-3AQ(C69H101N11O12)required[MH+]=1277.6，found[MH+]=1278.9。
將Z-Val-Cit-AAF-3AQ(4.8mg，0.00376mmol)溶於乙醇(10mL)。於加入Pd/C(10%，16mg)後，將反應混合物導入氫氣球，並攪拌4小時。以矽藻土墊將催化劑Pd/C濾除，並於減壓環境下，蒸餾濾液。將產物與水(5mL)混合，並予以冷凍乾燥，以獲得白色固體的Val-Cit-AAF-3AQ(4.2mg，98%)。LC-MS：Val-Cit-AAF-3AQ(C61H95N11O10)required[MH+]=1143.5，found[MH+]=1144.7。
將Val-Cit-AAF-3AQ(4.8mg，0.00367mmol)與MC-OPFP(1.67mg，0.0044mmol)溶於DMF(0.5mL)。加入DIPEA(1.9mg，0.0147mL)於反應混合物中。於3小時後，於減壓環境下，移除DMF與DIPEA。以製備型HPLC(32%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對粗產物進行純化，以獲得白色固體的MC-Val-Cit-AAF-3AQ。LC-MS：MC-Val-Cit-AAF-3AQ(C71H106N12O13)required[MH+]=1336.7，found[MH+]=1337.7。
<效力試驗>
實施例25
海兔毒素衍生物之效力
將FaDu細胞以2500細胞/孔的密度接種於Corning CellBIND 96-孔盤中。於培養24小時後，移除舊的培養基，並 將細胞培養於包含MMAE、海兔毒素或海兔毒素衍生物，且濃度為10-12M至10-6M(對數連續稀釋)的培養基中120小時。之後，將細胞漂洗一次，並以MTT方法測定細胞存活率。將舊的培養基吸出，並於每孔加入包含100μL、0.5mg/mL MTT的培養基。於培養4小時後，移除MTT試劑，並將沈澱物溶於DMSO。以吸收波長570nm的微量盤式分析儀(Multiskan Ascent,Thermo Labsystems)測量細胞的光度強度。以下列方程式計算細胞存活率。
細胞存活率(%)=(Ins-Inb)/(Inc-Inb)×100%
方程式中，“Ins”為以既定毒素培養的細胞的光度強度，“Inb”為未接種細胞的空白井的強度，以及“Inc”為僅以培養基培養的細胞的強度(正控制)。
於不同藥物濃度(n=6)下，曝露於毒素達120小時後，紀錄FaDu細胞的體外存活率，並利用Origin軟體的Sigmoidal模型進行數據擬合，以獲得IC50值。
表2顯示FaDu細胞中APEA-AF、PEA-AF、PEA-ANF、PEA-AAF、3AQ-ANF、3AQ-AAF、NPEA(COOMe)-AF及APEA(COOMe)-AF的效力與已知毒素MMAE相當，明顯優於另一已知毒素-海兔毒素F(AF)。結果指出本揭露新穎的海兔毒素衍生物不但提升對細胞膜的通透性，亦維持對微管蛋白聚合的抑制效果。再者，NPEA(COOH)-AF具有與海兔毒素相近的效力，且APEA(COOH)-AF顯示為最低效力，此結果顯示羧基可能會干擾毒素穿過細胞膜的通透性。本揭露新穎毒素的此種行為進一步用於構建無旁觀者效應的新穎藥物。
<抗體-藥物耦合體(ADCs)>
實施例26
Erbitux衍生之ADCs之製備
以2.4莫耳當量TCEP/0.025M硼酸鈉/0.025M氯化鈉/1mM DTPA(pH=8)於37℃對Erbitux進行處理2小時。未進一步純化，將反應混合物冷卻至0℃。之後，以5.5莫耳當量連接子-毒素於0℃對部分還原的Erbitux進行烷基化反應30分鐘。以半胱氨酸(終濃度1mM)淬滅任何未反應、過量的連接子-毒素。以脫鹽管柱(ThermoFisher Scientific，MWCO：40K)對ADCs進行純化。於沖提過程中，將緩衝液更換為Dulbecco's磷酸鹽緩 衝鹽水(ThermoFisher Scientific，PBS)。以HIC分析ADCs的耦合體分布，並計算平均藥物-抗體比(DAR)。
第1圖顯示本揭露新穎的連接子-毒素MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF成功地與Erbitux形成耦合體，且以HIC所測定的平均藥物-抗體比為3.8。
<熱應力試驗>
實施例27
ADCs之熱應力試驗
將500μL、3mg/mL的Erbitux與ADCs/PBS培養於50℃的水浴中。之後，於0、4、7及24小時對抗體與ADCs採樣，進行SEC分析。利用Waters PDA 996 HPLC的Yarra 3μm SEC-3000(300x7.8mm)管柱依大小分離抗體單體與集合產物。流動相由0.020M磷酸鉀、0.025M氯化鉀與5%(v/v)異丙醇組成，pH 6.95。將30μL樣品以0.5mL/min的流速注入管柱中，並於等位條件下分離。於280nm檢測吸光度。一併整合於主峰前沖堤出的所有物種，並稱為高分子量物種(HMWS)。
第2圖顯示其連接子包含糖胺基酸單元的Erbitux-MC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF及Erbitux-MC-SAA1-SAA1-Val-Cit-APEA-AF較其連接子不包含任何糖胺基酸單元的Erbitux-Vedotin及Erbitux-Val-Cit-APEA-AF具有較低的HMWS百分比。因此，此試驗顯示具有糖胺基酸單元的連接子不但增加親水性，亦大幅提升ADCs的熱穩定性。
<胜肽-藥物耦合體(PDCs)>
實施例28
Zoptarelin-GA-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將DIPEA(0.071mL，0.4070mmol)加入zoptarelin(170mg，0.1356mmol)/戊二酸酐(17mg，0.1492mmol)/DMF(4mL)的攪拌溶液中。於室溫攪拌12小時後，移除溶劑，並以製備型HPLC對殘留物進行純化，以獲得白色粉末的Zoptarelin-GA(100mg，54%)。LC-MS：Zoptarelin-GA(C64H90N18O16)，required[MH+]=1367.7，[M+2H+]=684.4；found[MH+]=1368.7，[M+2H+]=685.5。
將DCC(1.8mg，0.0088mmol)加入Zoptarelin-GA(10mg，0.0073mmol)/五氟苯酚(1.6mg，0.0088mmol)/DMF(1mL)的溶液中。於室溫攪拌反應混合物12小時，之後，加入SAA1-Val-Cit-APEA-AF(9mg，0.0072mmol)/DIPEA(0.0038mL，0.0216mmol)/DMF(1mL)。再經12小時後，移除溶劑， 並以製備型HPLC對殘留物進行純化，以獲得白色粉末的Zoptarelin-GA-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(8mg，43%)。LC-MS：Zoptarelin-GA-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C130H196N30O29)，required[M+2H+]=1322.6，[M+3H+]=882.1，[M+4H+]=661.8；found[M+2H+]=1323.7，[M+3H+]=882.7，[M+4H+]=662.6。
<小分子-藥物耦合體(SMDCs)>
實施例29
FA-C-APEA-AF之合成
將ZC-APEA(10.2mg，0.027mmol)加入海兔毒素(20.8mg，0.027mmol)/DMF(0.5mL)/DCM(1mL)的溶液中。加入額外的DMF(1mL)與HATU(10.7mg，0.028mmol)於反應混合物中。混合物於冰浴中冷卻，並加入DIPEA(8.03mg，0.062mmol)。於室溫反應2小時後，於減壓環境下，蒸餾混合物。以 製備型HPLC(45%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化，以獲得白色固體的ZC-APEA-AF(18.2mg，51.1%)。LC-MS：ZC-APEA-AF(C62H94N8O10)required[MH+]=1111.7，found[MH+]=1112.5。
將10% Pd/C(3mg)與2M鹽酸(0.016mL，0.032mmol)加入ZC-APEA-AF(18.2mg，0.014mmol)/EtOH(5mL)的溶液中。系統中的空氣以氫氣替代。反應於環境大氣下進行。當ZC-APEA-AF完全消耗時，以濾紙自反應混合物中移除催化劑，並濃縮濾液，之後，與水(5mL)混合，並進行凍乾，以獲得C-APEA-AF(14.5mg，99%)。
於冰浴中，使葉酸(8.0mg，0.018mmol)與EDCI(6.2mg，0.040mmol)/NHS(2.6mg，0.026mmol)/DMF(2mL)進行反應。於30分鐘後，加入C-APEA-AF(17.4mg，0.017mmol)與DIPEA(8.8mg，0.068mmol)。於HPLC指示C-APEA-AF幾乎消耗後，自混合物中移除DMF，並以製備型HPLC(36%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。將特定分餾物進行濃縮並凍乾，以獲得黃色固體的FA-C-APEA-AF(5.4mg，23.3%)。LC-MS：FA-C-APEA-AF(C73H105N15O13)required[MH+]=1400.8，found[MH+]=1401.8。
實施例30
FA-Val-Cit-APEA-AF之合成
將DIPEA(6.5mg，0.050mmol)、Val-Cit-APEA-AF(20.9mg，0.018mmol)、NHS(3.0mg，0.026mmol)與EDCI(4.0mg，0.026mmol)加入葉酸(11.5mg，0.026mmol)/DMF(1.5mL)的溶液中。反應混合物攪拌過夜。自反應混合物中移除DMF後，以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。將特定分餾物進行濃縮並凍乾，以獲得黃色固體的FA-Val-Cit-APEA-AF(11.6mg，37.4%)。LC-MS：FA-Val-Cit-APEA-AF(C78H114N18O14)required[MH+]=1543.9，found[MH+]=1544.8。
實施例31
FA-C-Val-Cit-APEA-AF之合成
將ZC(9.2mg，0.037mmol)、HATU(16.0mg，0.042mmol)與DIPEA(9.0mg，0.069mmol)加入Val-Cit-APEA-AF(35.6mg，0.029mmol)/DMF(1mL)/DCM(3mL)的溶液中。於室溫攪拌混合物過夜。移除溶劑，以製備型HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。將特定分餾物進行濃縮並凍乾，以獲得黃色固體的ZC-Val-Cit-APEA-AF(19.0mg，42.9%)。LC-MS：ZC-Val-Cit-APEA-AF(C73H114N12O13)required[MH+]=1367.9，found[MH+]=1368.9。
將5% Pd/C(4.4mg)與2M鹽酸(0.015mL，0.030 mmol)加入ZC-Val-Cit-APEA-AF(19.0mg，0.014mmol)/EtOH(5mL)的溶液中。系統中的空氣以氫氣替代。反應於環境大氣下進行過夜。當ZC-Val-Cit-APEA-AF完全消耗時，以濾紙自反應混合物中移除催化劑，並於旋轉蒸發器上進行濾液濃縮，之後，進行凍乾，以獲得C-Val-Cit-APEA-AF(17.7mg，99%)。
將DIPEA(2.7mg，0.021mmol)、C-Val-Cit-APEA-AF(9.0mg，0.069mmol)、NHS(1.2mg，0.010mmol)與EDCI(1.6mg，0.010mmol)加入葉酸(5.0mg，0.011mmol)/DMF(0.75mL)的溶液中。反應混合物攪拌過夜。以HPLC監測反應進程。自反應混合物中移除DMF後，以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。將特定分餾物進行濃縮並凍乾，以獲得黃色固體的FA-C-Val-Cit-APEA-AF(4.5mg，34.7%)。LC-MS：FA-C-Val-Cit-APEA-AF(C84H125N19O16)required[MH+]=1657.0，found[MH+]=1657.9。
實施例32
FA-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將DIPEA(5.8mg，0.045mmol)、 SAA1-Val-Cit-APEA-AF(22.3mg，0.018mmol)、NHS(3.0mg，0.026mmol)與EDCI(4.0mg，0.026mmol)加入葉酸(11.2mg，0.025mmol)/DMF(1.5mL)的溶液中。反應混合物攪拌過夜。以HPLC監測反應進程。自反應混合物中移除DMF後，以製備型HPLC(33%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。將特定分餾物進行濃縮並凍乾，以獲得黃色固體的FA-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(11.8mg，37.4%)。LC-MS：FA-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C85H125N19O19)required[MH+]=1716.9，found[MH+]=1717.9(M+H)。
實施例33
FA-C-SAA1-Val-Cit-APEA-AF之合成
將ZC(15.0mg，0.057mmol)、HATU(16.8mg，0.044mmol)與DIPEA(11.5mg，0.089mmol)加入SAA1-Val-Cit-APEA-AF(44.0mg，0.029mmol)/DMF(1mL)/DCM(3mL)的溶液中。攪拌混合物過夜。於旋轉蒸發器上進行溶劑移除，並以製備型HPLC(43%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。收集分餾物，並進行濃縮及凍乾，以獲得白色固體的ZC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(30.0mg，62.5%)。LC-MS：ZC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C80H125N13O17)required[MH+]=1540.9，found[MH+]=1541.8。
將5% Pd/C(5.2mg)與2M鹽酸(0.019mL，0.038mmol)加入ZC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(30.0mg，0.018mmol)/EtOH的溶液中。系統中的空氣以氫氣替代。反應於環境大氣下進行過夜。當ZC-SAA1-Val-Cit-APEA-AF完全消耗時，以濾紙自反應混合物中移除催化劑，並於旋轉蒸發器上進行濾液濃縮，之後，進行凍乾，以獲得C-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(24.9mg，92.8%)。LC-MS：C-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C72H119N13O15)required[M+2H]2+=704.0，found[M+2H]2+=705.1。
將DIPEA(2.70mg，0.021mmol)、C-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(11.0mg，0.007mmol)、NHS(1.2mg，0.010mmol)與EDCI(1.6mg，0.010mmol)加入葉酸(4.5mg，0.013mmol)/DMF(0.7mL)的溶液中。反應混合物攪拌過夜。以HPLC監測反應進程。自反應混合物中移除DMF後，以製備型HPLC(31%乙腈/水/0.1% TFA；UV 210nm；ODS-3管柱30*250mm；流速24mL/min)對殘留物進行純化。將特定分餾物進行濃縮並凍乾，以獲得黃色固體的FA-C-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(3.9mg，25.5%)。LC-MS：FA-C-SAA1-Val-Cit-APEA-AF(C91H136N20O20)required[MH+]=1830.1，found[MH+]=1831.0。
雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作任意之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為 準。

Claims (21)

  1. 一種具有式(I)的化合物或其藥學上可接受鹽類： 其中每一R1、R2與R3獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、C1-C6烷氧基、接基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基、C1-C6胺基羰基、C1-C6烷基、C1-C6分支型烷基、C1-C6環烷基、C1-C6雜環基、芳基或雜芳基，R1與R3至少其中之一為胺基。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之具有式(I)的化合物或其藥學上可接受鹽類，其中R1為氫，R2為氫、羧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基羰基或C1-C6烷基，以及R3為胺基。
  3. 一種具有式(II)的化合物或其藥學上可接受鹽類： 其中每一R4、R5與R6獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、C1-C6烷氧基、羧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6胺基、C1-C6胺基羰基、C1-C6烷基、C1-C6分支型烷基、 C1-C6環烷基、C1-C6雜環基、芳基或雜芳基。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之具有式(II)的化合物或其藥學上可接受鹽類，其中R4、R5與R6為氫。
  5. 一種具有式(III)的連接子-藥物或其藥學上可接受鹽類：C-SAAs-AAs-D (III)其中C-為一耦合單元，選自由 以及所組成的族群，其中R7選自由-C1-C10亞烷基-、-C3-C8碳環基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環基)-、-(C3-C8碳環基)-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環基)-、-(C3-C8雜環基)-C1-C10亞烷基-、-(伸乙氧基)r-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-所組成的族群，以及r為1-10之整數；-SAAs-為一具有式(IV)之糖胺基酸單元： 其中x為1-8之整數，y為1-4之整數，為四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃，每一R8與R10獨立地為單鍵、亞甲基、羥基亞甲基、伸乙基、亞乙基、羥基伸乙基、羥基亞乙基、二羥基伸乙基、二羥基亞乙基、伸乙烯基、亞乙烯基、伸丙基(propylene)、亞丙基、三 亞甲基(trimethylene)、羥基伸丙基(hydroxypropylene)、羥基亞丙基、羥基三亞甲基(hydroxytrimethylene)、二羥基伸丙基(dihydroxypropylene)、二羥基亞丙基、二羥基三亞甲基(dihydroxytrimethylene)、三羥基伸丙基(trihydroxypropylene)、三羥基亞丙基或三羥基三亞甲基(trihydroxytrimethylene)，每一R9獨立地為羥基、甲基、羥甲基、乙基、羥乙基、二羥乙基、丙基、羥丙基、二羥丙基或三羥丙基、或同一環中任意兩R9與其連接之碳原子形成羰基、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之第二個四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9與一亞甲基、亞乙基、1-亞丙基、2-亞丙基或苯亞甲基形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之環狀縮醛或縮酮；-AAs-為一具有式(V)的胜肽單元： 其中z為0-10之整數，R11為-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2或-(CH2)4NHCONH2，R12為氫、甲基、乙基、 丙基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、苯基或苯甲基，R13為氫、甲基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、環己基、苯基、苯甲基、p-羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶甲基、3-吡啶甲基或4-吡啶甲基；以及-D為一細胞毒性劑，選自由鵝膏蕈鹼(amanitins)、蒽環類物(anthracyclines)、海兔毒素(auristatins)、漿果赤黴素(baccatins)、刺孢黴素(calicheamicins)、喜樹鹼(camptothecins)、西地黴素(cemadotins)、秋水仙鹼(colchicines)、秋水仙胺(colcimids)、考布他汀(combretastatins)、隱花素(cryptophysins)、蒂克黴素(discodermolides)、多卡黴素(duocarmycins)、棘黴素(echinomycins)、艾榴塞洛素(eleutherobins)、埃博黴素(epothilones)、雌莫司汀(estramustines)、偏端黴素(lexitropsins)、美登木素生物鹼(maytansinoids)、紡錘黴素(netropsins)、嘌呤黴素(puromycins)、吡咯并苯并 二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepines)、根黴素(rhizoxins)、紫杉烷(taxanes)、小管素(tubulysins)以及長春花生物鹼(vinca alkaloids)所組成的族群。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之具有式(III)的連接子-藥物或其藥學上可接受鹽類，其中C-為該耦合單元，選自由 以及所組成的族群，其中R7選自由-1,5-伸戊基-、-1,6-伸己基-、-1,4-伸環己基-、-(伸乙氧基)r-亞甲基-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-亞甲基-所組成的族群，以及r為2-5之整數。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之具有式(III)的連接子-藥物或其藥學上可接受鹽類，其中-SAAs-為該糖胺基酸單元，選自由 以及所組成的族群。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之具有式(III)的連接子-藥物或其藥學上可接受鹽類，其中-AAs-為該胜肽單元，選自由-纈胺酸-瓜胺酸-、-纈胺酸-離胺酸-、-纈胺酸-魚精胺酸-、-苯丙胺酸-瓜胺酸-、-苯丙胺酸-離胺酸-以及-苯丙胺酸-魚精胺酸-所組成的族群。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之具有式(III)的連接子-藥物或其藥學上可接受鹽類，其中-D為該細胞毒性劑，選自由 以 及所組成的族群，其中每一R1、R2、R3、R4、R5與R6獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、甲氧基、乙氧基、羧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、甲基胺基、二甲基胺基、乙基胺基、二乙基胺基、1-吡咯啶基、1-哌啶基、1-哌嗪基、胺基羰基、甲基胺基羰基、二甲基胺基羰基、乙基胺基羰基、二乙基胺基羰基、1-吡咯啶基羰基、1-哌啶基羰基、1-哌嗪基羰基、甲基、乙基、丙基、異丙基或苯基。
  10. 一種具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類：L-(C-SAAs-AAs-D)p (VI)其中p為1-20之整數；L-為一配體單元，選自由全長抗體、抗體片段、蛋白質、小分子量蛋白質、多肽、寡肽、適體(aptamers)、凝集素、醣蛋白、脂蛋白、醣脂、維生素、營養傳輸分子、激素、寡糖、多醣以及任何其他細胞結合分子或物質所組成的族群； C-為一耦合單元，選自由 以及所組成的族群，其中R7選自由-C1-C10亞烷基-、-C3-C8碳環基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環基)-、-(C3-C8碳環基)-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環基)-、-(C3-C8雜環基)-C1-C10亞烷基-、-(伸乙氧基)r-以及-(伸乙氧基)r-CH2-所組成的族群，以及r為1-10之整數；-SAAs-為一具有式(IV)的醣胺基酸單元： 其中x為1-8之整數，y為1-4之整數，為四氫呋 喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃，每一R8與R10獨立地為單鍵、亞甲基、羥基亞甲基、伸乙基、亞乙基、羥基伸乙基、羥基亞乙基、二羥基伸乙基、二羥基亞乙基、伸乙烯基、亞乙烯基、伸丙基(propylene)、亞丙基、三亞甲基(trimethylene)、羥基伸丙基(hydroxypropylene)、羥基亞丙基、羥基三亞甲基(hydroxytrimethylene)、二羥基伸丙基(dihydroxypropylene)、二羥基亞丙基、二羥基三亞甲基(dihydroxytrimethylene)、三羥基伸丙基(trihydroxypropylene)、三羥基亞丙基或三羥基三亞甲基(trihydroxytrimethylene)，每一R9獨立地為羥基、甲基、羥甲基、乙基、羥乙基、二羥乙基、丙基、羥丙基、二羥丙基或三羥丙基、或同一環中任意兩R9與其連接之碳原子形成羰基、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之第二個四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃、或任意兩R9、R8與任意一R9、或R10與任意一R9與一亞甲基、亞乙基、1-亞丙基、2-亞丙基或苯亞甲基形成與原四氫呋喃、二氫呋喃、四氫哌喃或二氫哌喃融合之環狀縮醛或縮酮；-AAs-為一具有式(V)的胜肽單元： 其中z為0-10之整數，R11為-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2或-(CH2)4NHCONH2，R12為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、苯基或苯甲基，R13為氫、甲基、異丙基、環丙基、丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、環己基、苯基、苯甲基、p-羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶甲基、3-吡啶甲基或4-吡啶甲基；以及-D為一細胞毒性劑，選自由鵝膏蕈鹼(amanitins)、蒽環類物(anthracyclines)、海兔毒素(auristatins)、漿果赤黴素(baccatins)、刺孢黴素(calicheamicins)、喜樹鹼(camptothecins)、西地黴素(cemadotins)、秋水仙鹼(colchicines)、秋水仙胺(colcimids)、考布他汀(combretastatins)、隱花素(cryptophysins)、蒂克黴素(discodermolides)、多卡黴素(duocarmycins)、棘黴素(echinomycins)、艾榴塞洛素(eleutherobins)、埃博黴素(epothilones)、雌莫司汀(estramustines)、偏端黴素(lexitropsins)、美登木素生物鹼(maytansinoids)、紡錘 黴素(netropsins)、嘌呤黴素(puromycins)、吡咯并苯并二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepines)、根黴素(rhizoxins)、紫杉烷(taxanes)、小管素(tubulysins)以及長春花生物鹼(vinca alkaloids)所組成的的族群。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中該配體單元為與抗原結合之抗體。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中該抗體為嵌合抗體、人源化抗體或其功能活性片段。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中該抗體藉由該抗體之一半胱氨酸殘基連接至該耦合單元。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中p為2-8之整數。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中p為整數4。
  16. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中該配體單元為葉酸、甲氨蝶呤(methotrexate)或與葉酸受體結合之葉酸受體結合配體。
  17. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中該配體單元為促黃體激素釋放激素(LHRH)、促黃體激素釋放激素促效劑、 促黃體激素釋放激素拮抗劑或與促黃體激素釋放激素受體結合之促黃體激素釋放激素受體結合配體。
  18. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中C-為該耦合單元，選自由 以及所組成的族群，其中R7選自由-1,5-伸戊基-、-1,6-伸己基-、-1,4-伸環己基-、-(伸乙氧基)r-亞甲基-以及-(伸乙氧基)r-亞甲基-亞甲基-所組成的族群，以及r為2-5之整數。
  19. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中-SAAs-為該糖胺基酸單元，選自由 以及所組成的族群。
  20. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中-AAs-為該胜肽單元，選自由-纈胺酸-瓜胺酸-、-纈胺酸-離胺酸-、-纈胺酸-魚精胺酸-、-苯丙胺酸-瓜胺酸-、-苯丙胺酸-離胺酸-以及-苯丙胺酸-魚精胺酸-所組成的族群。
  21. 如申請專利範圍第10項所述之具有式(VI)的配體-藥物耦合體或其藥學上可接受鹽類，其中-D為該細胞毒性劑，選自由 以 及所組成的族群，其中每一R1、R2、R3、R4、R5與R6獨立地為氫、胺基、硝基、鹵素、羥基、甲氧基、乙氧基、羧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、甲基胺基、二甲基胺基、乙基胺基、二乙基胺基、1-吡咯啶基、1-哌啶基、1-哌嗪基、胺基羰基、甲基胺基羰基、二甲基胺基羰基、乙基胺基羰基、二乙基胺基羰基、1-吡咯啶基羰基、1-哌啶基羰基、1-哌嗪基羰基、甲基、乙基、丙基、異丙基或苯基。
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