JPS63501765A - 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 抗体遺伝子のモジュール組立体、 それにより産生された抗体及び用途 発明の背景 本出願は、１９８５年１１月１日に出願された出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　７９ ３．　９８０の一部係属出願であり、その内容は本明細書において完全に準用す る。

発明の分野 本発明は、イムノグロブリンを産生ずる組変えＤＮＡ方法、それをコードする遺 伝子配列、並びにその様な配列を得る方法に関する。

背景技術 ］−ラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）〔ネイチャー 　（Ｎａｔｕｒｅ）、（ロンドン）、２５６：４９５．１９７５年）によるモノ クローナル抗体の製造のための細胞対細胞融合の応用は、影響力において組換え ＤＮＡクローニングの発明と等しい生物学における革命を引起こした。ハイブリ ドーマ−産生モノクローナル抗体は既に臨床診断及び基礎科学的研究において広 く使用されている。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ−産生モノクローナル抗体は癌、 ウィルス及び微生物感染症、減少した抗体産生を有するＢ細胞免疫不全その他の 病気及び免疫系統の障害の臨床治療に対して大きな見込みを有するものである。

不幸にして、ヒトハイブリドーマ細胞系からのモノクローナル抗体の収量は比較 的低く（マウスハイブリドーマ中の１００μｇ　／　ｍｌに対比してヒトＸヒト において１μｇ／ｍｌ）、及び大規模ヒト組織培養において作られる抗体に対す る製造コストが高い。他方、マウス×マウスハイブリドーマはそれらが多量のタ ンパク質を製造し、及びこれらの細胞系がヒト系よりもより安定であるので有用 である。しかしながら、マウス抗体などの「外来」抗体のヒトにおける繰返し注 射は有害な過敏症反応に導き得る。

従って、最近マウス−マウスハイブリドーマからのモノクローナルの利点を有し 、なおヒトモノクローナル抗体の種特異的性質を有する抗体を産生ずる可能性の 開発がなされた。

免疫学者の直面したもう一つの問題は細胞培養において得られた殆んどのヒトモ ノクローナル抗体（即ち、ヒト認識性質を有する抗体）は１ｇＭタイプであるこ とである。しかしながら、ＩｇＧタイプのヒトモノクローナルを得ることが望ま しい場合には、１ｇＭタイプの抗体を産生ずる大部分からＩｇＧその他のタイプ の抗体を産生ずるように切換わった少しの細胞を分離するために細胞分類などの 技術を用いることが必要であった。従って、所定の或いは所望の抗原特異性の任 意の抗体に対して抗体クラスのより容易な切換え方法に対する需要が存在する。

本発明は、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体技術の両者を橋渡しし、且つ キメラヒト／非−ヒト抗体、即ち「クラス切換え」抗体の改良された製造のため の迅速且つ効率的な方法並びにそれから得られた生成物を提（ｂ）の規定に従う ものである。加えて、本出願人等は、彼等の発明が挙げられた刊行物のいづれに も先立ってなされたものであることを示す権利を留保する。）キメラ抗体を製造 する問題に対する接近手法は色々な著者により刊行されている。

モリソン等（Ｍｏｒｒｌｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　）プロシーディン グズ拳オブ・ナショナルφアカデミツク・サイエンスＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ＵＳＡ）　８１　：　６８５１　。

−６８５５（１９８４年１１月）は、組換えＤＮＡ技術を用いて知られた抗原結 合特異性を有するマウス抗体−産生ミエローマ細胞系の可変領域遺伝子をヒトイ ムノグロブリン定常領域遺伝子に接合することにより製造された規定された抗原 結合特異性のマウス−ヒト抗体分子の製造を記載している。ミエローマ細胞系５ １０７からの重鎮可変領域エキソンがヒトＩｇＧ１或いはＩ　ｇＧ２重鎖定常領 域エキソンに、及び同一ミエローマからの軽鎖可変領域エキソンがヒトカッパ軽 鎖エキソンに良く接合されたキメラ遺伝子が造築された。これらの遺伝子はマウ スミエローマ細胞系中にトランスフェクションされ、キメラマウス−ヒト抗ホス ホコリン抗体を産生ずる形質転換細胞はこの様にして開発された。

モリソン等（Ｍｏｒｒｌｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、Ｅ−ｏ　ツ バ特許公告公報１７３４９４号（１９８６年５月５日公開）は、一つの種から得 られた可変領域及びもう一つの種から得られた定常領域を有するキメラ「レセプ ター」　（例、抗体）を開示している。これらの遺伝子を造築するために、ｃＤ ＮＡクローニングを利用することが述べられているが、しかしｃＤＮＡクローニ ング或いは合成開始の詳細は示されていない。（５，７及び８頁参照）。

ブリアンヌ等（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、　Ｇ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）ネイチャー（ Ｎａｔｕｒｅ）　、３１２　：　６４３　（１９８４年１２月１３日）も又ヒト 定常領域に接合したマウス可変領域よりなる抗体を製造した。彼等はハブテント リニトロフェニル（ＴＮＰ）に対して特異的なマウス可変領域をコード化するＤ ＮＡセグメントがヒトミニー及びカッパ定常領域をコード化するセグメントに接 合されたイムノグロブリＴＮＰ接合キメラＩｇＭとして表現された。

ブリアンヌ等（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ　ａｔ　ａｌ、）及びモリソン等（Ｍｏｒｒ ｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）の研究に対するコメントについては、ムンｏ　（Ｍ ｕｎｒｏ　）　、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１２　：５９７　（１９ ８４年１２月１３日）、ディクソン（Ｄｌｃｋｓｏｎ　）　、ジエネティック・ エンジニャリング・ニューズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅ ｗｓ）　５、Ｎｏ、　３、（１９８３年３月）、或いはマークス（Ｍａｒｘ）　 、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２９：４５５　（１９８５年８月）参照。

ノイバーガー等（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）ネイチャー 　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１４　：　２６８　（１９８５年３月２５日）も又ハ ブテン４−ヒドロキシ−３−ニトロフェナセチル（ＮＰ）に対して特異的なマウ ス可変領域をコード化するＤＮＡセグメントがヒトイプシロン領域をコード化す るセグメントに接合されたキメラ重鎖イムノグロブリン遺伝子を造築した。この キメラ遺伝子がＪ５５８Ｌ細胞系中にトランスフェクションされると、ＮＰハブ テンに結合し、ヒトＩｇＥの性質を有する抗体が産生された。

ノイバーガー等（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）は又Ｆｃ部 分が活性酸素部分〔ウィリアムス、　Ｇ、　（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｇ、）及びノ イバーガー、　Ｍ、　Ｓ、（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、）ジーン（Ｇｅｎ ｅ）４３　：　３１９，１９８６年〕或いはｃ−ｍｙｃ抗原決定基を表わすポリ ペプチド〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２：６０４．１９８４年〕のいづれ かで置換されたハブテン−特異的抗体を分泌する細胞系の調製を示す研究も公刊 した。

ノイバーガー等（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｐ　ＣＴ公 報ＷＯ８６１０１５３３（１９８６年３月１３日公開）は、又キメラ抗体の製造 を開示しく５頁参照）、及び技術の多くの用途の中で「クラス切換え」の概念を 示唆する（６頁参照）。

タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈ、　Ｍ、）　、ヨーロッパ特許公告公報１７１　４ ９６号（１９８５年２月１９日公告）は、実験動物から得られた腫瘍特異性を有 する可変領域及びヒトから得られた定常領域を有するキメラ抗体の製造を開示し ている。対応する重鎮及び軽鎖遺伝子はゲノム形態で製造され哺乳動物細胞内で 発現されている。

タケダ等（Ｔａｋｅｄａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ ）、３１４：４５２　（１９８５年４月４日）は、レトロウィルスベクターの使 用によりイントロン配列を除去したキメライムノグロブリン遺伝子の造築の潜在 的方法を記載した。しかしながら、予想外のスプライスドナ一部位がＶ領域リー ダー配列の削除を引起こした。この様に、この接近手法は完全なキメラ抗体分子 をもたらさなかった。

ギヤビリー等（Ｃａｂｉｌｌｙ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）プロシーディング・オ ブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンズＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ）８１　：　３２７３−３２７７　（１９８ ４年６月）は、抗−癌胚抗原（ＣＥＡ）抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＥ、コリ内 における合成を指示するプラスミドを記載している。もう一つのプラスミドは切 頭形態の重鎮（Ｆｄ’　）断片のＥ。

コリ内における発現のために造築された。機能的ＣＥＡ−結合活性はＥ、コリ抽 出物内における軽鎖を有する重鎮の一部のｉｎ　ｖｔｔｒｏの再構成により得ら れた。

ギヤビリー等（Ｃａｂｉｌｌｙ、　ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ヨーロー／パ特許 公告公報１２５０２３号（１９８４年１１月１４日公告）は、キメライムノグロ ブリン遺伝子及びそれらの推定生成物並びにその他の修飾形態を記載している。

２１．２８及び３３頁にはそれはｃＤＮＡクローニング及び合成開始を述べてい る。

ボス（Ｂｏｓｓ、　Ｍ、Ａ、）　、ヨーロッパ特許出願１２０６９４号（１９８ ４年１０月３日公開）は、４−ニトロフェニル特異性を有する非−キメライムノ グロブリン鎖のＥ、コリにおける発現を示している。キメラ抗体についての広範 囲の説明があるが、しかし、詳細はない（９頁参照）。

ウッド等（Ｗｏｏｄ、　Ｃ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、）ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ） 、３１４　：　４４６　（１９８５年４月）は、マウス抗−ＮＰ抗体タンパク質 の酵母における合成を指示するプラスミドを記載している。重鎮ミュー抗体タン パク質は酵母細胞内においてグリコジル化されたようであった。重鎮及び軽鎖の 両者を同一細胞内で合成すると、酵母細胞から製造された可溶性タンパク質内の 抗−ＮＰ結合活性により検出されたようにタンパク質のあるものは機能的抗体分 子内に組立てられた。

アレキサンダー等（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）　、プロシー ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）　７９　：３２６０− ３２６４　（１９８２）は、１９−アミノ酸リーダーに引続きＶ領域の最初の１ ５残基を含有する異常に短いヒトＩｇガンマ重鎖（０ＭＭガンマ３ＨｃＤ血清タ ンパク質）をコードするｃＤＮＡ配列の製造を記載し−ている。広範囲の内部削 除がＶの残部及び全ｃＨ１ドメインを除去する。これは内部削除分子をコードす るｃＤＮＡである。

ドルビィ等（Ｄｏｌｂｙ、　Ｔ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、）プロシーディング壷オブ ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス、ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１． 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＬＩＳＡ）７７　：　６０２７−６０３１　（１９ ８０）は、ｃＤＮＡ配列、及びそれを含有するミュー及びカッパヒトイムノグロ ブリンポリペプチドをコードする組換えプラスミドの製造を記載している。組換 えＤＮＡ分子の一部はＣＨ３定常領域ドメインの一部及び全３′非コ一ド化配列 に対するコドンを含有していた。

七ノ等（Ｓｅｎｏ＋　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、ヌクレイツク拳アシッズ・リ サーチ（Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、１１　ニア１９ −７２６　（１９８３）は、ｃＤＮＡ配列、及び可変領域の一部及びヒトＩｇＥ 重鎖（イプシロン鎖）の定常領域の全てをコードする該配列を含有する組換えプ ラスミドの製造を記載している。

クロカワ等（Ｋｕｒｏｋａｖａ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、　）　、同文献１１：３ ０７７−３０８５　（１９８３）は、ｃＤＮＡを用いてヒ）ＩｇＥ重鎮の定常部 分をコードする三つの発現プラスミドの造築を示している。

リュー等（Ｌｌｕ、　Ｆ、Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、）　、プロシーディングズ・オブ 争ナショナルやアカデミツク・サイエンス、ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　 Ａｅａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　）　８１　：　５３６９−５３７３　（１９８ ４年９月）は、ｃＤＮＡ配列、及びＣＨ２の約２／３及びヒトＩｇＥ重鎖のＣＨ ３及びＣＨ４ドメインの全てをコードする該配列を含有する組換えプラスミドの 製造を記載している。

ツジモト等（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ヌクレイツク・ アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１２　：８４ ０７−８４１４　（１９８４年１１月）は、クローニングされた定常領域遺伝子 をｃＤＮＡ合成のプライマーとして利用することによる１ｇラムダ−産生ヒトバ ーキットリンパ腫細胞系からのヒトＶラムダｃＤＮＡ配列の製造を記載している 。

マーフ（（Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｊ、）　、ＰＣＴ公報ＷＯ８３１０３９７１（１９ ８３年１１月２４日公開）は、毒素及び細胞−特異的リガント（それはおそらく 抗体であると示唆されている）を含んでなる断片から作られたハイブリッドタン パク質を開示している。

タン等（Ｔａｎ、　ｅｔ　ａｔ、　）　、ジャーナルφオブ・イムノロジー（Ｊ 、　Ｉ＋ａ＋ｌ１ｕｎｏ１．　）　１３５　：　８５６４　（１９８５年１１月 ）は、マウスミエローマ細胞内にトランスフェクション後キメラヒト−マウスイ ムノグロブリンゲノム遺伝子の発現を得た。

ジジーンズ等（Ｊｏｎｅｓ、　Ｐ、Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、　）　、ネイチャー（ Ｎａｔｕｒｅ）　３２１　：　５５２　（１９８６年５月）は、マウスモノクロ ーナル抗体からの可変領域のＣＤＲドメインを用いてヒト抗体における対応する ドメインを置換したゲノム構造体を造築及び発現した。

サン等（Ｓｕｎ、　Ｌ、に、、　ｅｔ　ａｔ、　）　ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒ ｉｄｏｍａ　）　５補遺Ｉ　Ｓ１７　（１９８６）は、潜在的腫瘍特異性を有す るキメラヒト／マウス抗体を記載している。このキメラ重鎖及び軽鎖遺伝子はゲ ノム造築体であり、哺乳動物細胞内で発現される。

サバガン等（Ｓａｈａｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブーイムノロ ジー（Ｊ、　Ｉｗａ＋ｕｎ、）１３７　：　１０６６−１０７４（１９８６年８ 月）は、ヒト腫瘍付随抗原に特異性を有し、それに対する遺伝子がゲノム配列か ら組立てられたキメラ抗体を記載している。

この分野の最近の総説としては、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ。

Ｓ、Ｌ、）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２９　：　１２０２−１２０７ 　（１９８５年９月２０日）及びオーイ等（０１゜Ｖ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、 　）　％バイオテクノロジー　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）４　：　２１４ 　（１９８６）も又参照。

オーイ等（Ｏｉ、　ｅｔ　ａｔ、’）の論文はｃＤＮＡ造築物からのキメラ抗体 の酵母及び／又は細菌における産生は必ずしも有利でないと論じているので関連 性があるものである。

又、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　４（１９８６）中 の８３５頁のコメントも参照。

発明の概要 本発明は、遺伝子クローニング及び軽及び重鎮の発現により所望の可変領域特異 性及び定常領域特性の遺伝子工学による抗体を製造するための新しい接近手法を 提供するものである。クローニングされたイムノグロブリン遺伝子生成物は遺伝 子工学による生物体内において発現することにより製造することができる。

化学的遺伝子合成、組換えＤＮＡクローニング、及び各種生物体内における特異 的イムノグロブリン鎖の製造の応用は、ヒト或いは非−ヒト、特に薩歯類、モノ クローナル抗体の抗原特異性を存するヒトモノクローナル抗体の効率的大規模製 造に対する効果的な解決を提供する。

本発明は又、任意のクラスの、ある結合特異性のイムノグロブリンを容易に調製 するようにクラス切換え抗体分子の問題にも解決を与えるものである。

本発明は、定常ヒト領域及び可変性、ヒト或いは非−ヒト領域を含んでなるイム ノグロブリン鎖をコードするｃＤＮＡ配列を提供する。これらのイムノグロブリ ン鎖は重鎮或いは軽鎖のいづれでもあり得る。

本発明は又、ヒト或いは非−ヒト起源のｃＤＮＡ可変領域及びヒト起源のゲノム 定常領域を含んでなるイムノグロブリン鎖をコードする遺伝子配列も提供する。

本発明は又、組換えＤＮＡ分子、特にプラスミドベクターなどのヒビクル内に存 在する所望の原核生物或いは真核生物宿主内で発現することのできる上記の如き 配列を提供するものである。

本発明は又、任意の所望特異性の可変領域をコードする任意のハイブリドーマｍ ＲＮＡのハイブリダイゼーシヨン及びｃＤＮＡ合成開始のためのプローブとして 有用であるコンセンサス配列及び特異性オリゴヌクレオチド配列を提供するもの である。

本発明は又、培養によりキメラ抗体を産生ずることができる宿主及びこれらの宿 主の使用方法も提供する。

本発明は又、キメライムノグロブリンの個々の鎖及びヒト定常領域及び両可変領 域が同一結合特異性を有する非−ヒト可変領域を有する全組立て分子も提供する 。

本発明により提供されるその他のイムノグロブリン鎖及び／又は分子の中には次 のものが含まれる：（ａ）次のものを含む機能的、イムノグロブリン分子＝（ｉ ）非−ヒト可変領域及びヒト定常領域を含んでなる二つの同一のキメラ重鎖、及 び、 （１１）二つの同一の全（即ち、非−キメラ）ヒト軽鎖。

（ｂ）次のものを含んでなる完全な機能的イムノグロブリン分子： （１）非−ヒト可変領域及びヒト定常領域を含んでなる二つの同一のキメラ重鎖 、及び （１１）二つの同一の全（即ち、非−キメラ）非−ヒト軽鎖。

（Ｃ）次のものを含んでなる一価抗体、即ち完全な機能的イムノグロブリン分子 ： （１）非−ヒト可変領域及びヒト定常領域を含んでなる二つの同一のキメラ重鎖 、及び （１１）その一方のみが重鎮の可変領域と同一の特異性を有する二つの異った軽 鎖。得られた抗体分子はその一端にのみ結合し、従って二価結合することができ ない。

（ｄ）次のものを含んでなる二つの異った特異性を有する抗体、即ち完全な機能 的イムノグロブリン：Ｏ）その第一のものが非−ヒト可変領域及びヒト定常領域 を含んでなり、第二番目が異った非−ヒト定常領域を含んでなる二つの異ったキ メラ重鎖、及び（１１）その第一のものが第一の重鎮可変領域と同一の特異性を 有する非−ヒト可変領域及びヒト定常領域を含んでなり、及び第二番目のものが 第二の重鎮可変領域と同一の特異性を有する非−ヒト可変領域及びヒト定常領域 を含んでなる二つの異ったキメラ軽鎖。

得れた抗体分子は二つの抗原に結合する。

上記キメラ鎖の組合せ或いは非−キメラ鎖の組合せをコードする遺伝子配列、特 にｃＤＮＡ配列も又本発明において提供される。

本発明は又、イムノグロブリン鎖とは異るポリペプチド（例、酵素）をコードす る配列に操作可能に結合された抗体分子型及び／又は軽鎖の可変領域をコードす る遺伝子配列、特にｃＤＮＡ配列も提供する。これらの配列は本発明の方法によ り組立てられ、発現されて、混合−機能分子を得ることができる。

ｃＤＮＡ配列の使用はゲノム配列（イントロンを含む）に対して、ｃＤＮＡ配列 がＲＮＡスプライシング系を欠乏する細菌その他の宿主内で発現することができ る点において特に有利である。

好ましい特別の抗体の中には癌−関連抗原に対して特異性を有するものがある。

図面の簡単な説明 第１図は、ＤＮＡ再配列及びイムノグロブリンミュー及びガンマ重鎮遺伝子の発 現を示す。これはヒト重鎮遺伝子複合体の比例的には示されていない概略図であ る。

重鎮可変Ｖ領域形成はＶＤ及びＪＨ遺伝子セグメンＨゝ トの結合により生ずる。これは活性ミュー遺伝子を発生する。異った種類の「ク ラス切換え」と称されるＤＮＡ再配列は接合されたＶ　Ｄ及びＪＨ領領域ミュ一 定常Ｈゝ Ｃ領域からもう一つの重鎖Ｃ領域に再配置する（益では、ガンマへの切換えが図 示されている）。この図式はＪ領域が全発現重鎮遺伝子の共通の特徴であること を強調している。このＪ領域は又発現軽鎖遺伝子の共通特徴でもある。

第２図は、ヒト及びマウスＪ領域の知られたヌクレオチド配列を示す。Ｊ領域に 対するコンセンサス配列が実際の配列の下に示されている。カッパＪ領域コンセ ンサス配列の下のオリゴヌクレオチド配列は本発明において用いられる一般イム ノグロブリン遺伝子（Ｕｎ１ｖｅｒｓａｌＩＩＩｎ＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　 Ｇｅｎｅ　）、（Ｕ　Ｉ　Ｇ）オリゴヌクレオチドである。

第３図は、ＵＩＧオリゴヌクレオチドブライマーのイムノグロブリンメツセンジ ャーＲＮＡの可変領域に相補的なｃＤＮＡの合成のための使用、或いはオリゴ− ｄＴのｃＤＮＡ合成のためのプライマーとしての使用、使用後ｔｎ　ＶｉｔｒＯ の突然変異誘発を行うことを示す図式である。

第４図は、その一つ（ｐＧＭＨ−６）がクローニングベクター（Ｂ）と利用され る三つの単離クローン（Ａ。

ｂ、＞を含むヒトＩｇＧ１遺伝子の合成及び分析を示す。

ＢａｍＨＩとＰｖｕＩＩの間のｐＢＲ３２２配列の１．５ｋｂ削除がマークされ ている。比例的尺度ではない。

第５図は、Ｋ　ｐ　ｎ　１部位においてｃＤＮＡクローニングに有用なりローニ ングベクターｐＱ２３、修飾ｐＢＲ３２２を示す。このベクターは又有用な制限 酵素部位Ｂｇｌｎプラス５ａｌＩも含有する。比例的尺度でない。

第６図は、Ａ、においてヒト軽鎖カッパ遺伝子の合成及び分析を示す。同図は又 、Ｂ、において（比例的尺度でない）ヒトＣＫ領域クローニングベクターｐｌＮ Ｇ２００１の造築も示す。

第７図は、イムノグロブリンＶ領域合成のために設計されたプライマーを示す。

（Ａ）は重鎖Ｊ−Ｃ領域及びプライマーを示す。各マウス１重領域のＤＮＡ翻訳 はその配列から設計されたプライマーのすぐ上に示されている。マウスＪ領域は ５′〜３′、左から右側であるのに対し、プライマーは３′〜５′左から右側で ある。プライマー名は括弧内に示され、ヌクレオチド（Ｎ）の数及び各ＪＨ領領 域の不適正塩基対の数は右側に掲げられている。ＢｓｔＥｎ部位を導入するプラ イマーは下線が引かれている。（Ｂ）は軽鎖Ｊ領域及びプライマーを示す。

軽鎖である以外は（Ａ）と同一である。Ｂｇｌｎ部位を導入するように設計され たプライマーはｐｌＮＧ２０１６Ｅに存在するＢｃ１１部位と同様に下線がひか れている。（Ｃ）はマウス可変領域コンセンサスＵＩＧプライマーを示す。実際 のプライマー配列はそのコンセンサス配列の下に示されている。ヒトＣＫ　Ｈ１ ｎ　ｄ　ＩＩ［ベクターｐＧＭＬ６０が下に示される。（Ｄ）はマウスガンマ２ ａＪ／Ｃ連結プライマーを示す。

第８図は、オリゴヌクレオチド合成開始ｃＤＮＡ合成を用いる重鎖Ｖ領域モジュ ール遺伝子の合成を示す。比例尺度ではない。

第９図は、ハイブリッドマウス−ヒトイムノグロブリン遺伝子の造築を示す。パ ネルＡは重鎮遺伝子の造築を示す。斑点領域はＣ領域モジュールを示すのに対し 、斜線或いは黒色領域はＶ領域モジュールを示す。比例尺度でない。

第１０図は、哺乳動物細胞のためのｃＤＮＡクローニング−発現シャトルベクタ ーの造築を示す。ベクターｐＩＮＧ２００３及びｐｌＮＧ２００３ＥはｐＩ、１ 、ｐＵｃ１２、ｐＳＶ２−ｎｅｏ及びＭ８−アルファＲＸ１２から誘導される。

斑点領域はマウス重鎮エンハンサ−ＤＮＡを示し、斜線部分はｐＬｌからの５Ｖ −４０ＤＮＡを示し、及び交差−斜線領域はｐＳＶ２−ｎｅ。

から（７）ＳＶ−４０ＤＮＡを示す。ベクターｐ　Ｉ　ＮＧ２００３及びｐｌＮ Ｇ２００３Ｈにおいて、太線はｐＳＶ２−ｎｅｏからのｐＢＲ３２２ＤＮＡを表 わすのに対し、細線はｐＵＣｉ２　ＤＮＡを表わす。矢印はＳｖ・４０初期領域 プロモータの位置及び方向を示し、及び完全な５Ｖ−４０イントロン配列を示す 。比例尺度ではない。

第１１図は、重鎮発現プラスミドｐｌＮＧ２００６Ｅの造築を示す。矢印は５Ｖ −４０プロモ一タ位置及び転写の方向を示す。斜線及び黒色領域はマウスＶ領域 モジュールを示すのに対し、斑点領域はヒトＣ領域モジュールを示す。比例尺度 ではない。

第１２図は、発現プラスミドｐ　ｌＮＧ２００６Ｅ及びｐｌＮＧ２０１２Ｅにお けるキメラ抗−肝炎重鎖遺伝子の構造を示す。パネルＡはマウス−ヒトキメラ抗 −肝炎重鎮遺伝子の構造を示す。ヒトＩｇＧ１　ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの構造は Ａ、ａ、に示されている。ヒト重鎖定常領域ｃＤＮＡクローンｐＧＭＨ−６及び マウス重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンｐＢｓ１３−１及びｐＪ３−１１を用いて ｐ　ｌＮＧ２００６Ｈにおいて用いたハイブリッド遺伝子を作成した。斜線を付 した遺伝子ブロックはマウス可変領域配列を示すのに対し、開放遺伝子ブロック はヒトＩｇＧ１定常領域配列を示す。パネルＢはｐｌＮＧ２００６Ｅ及びｐｌＮ Ｇ２０１２Ｅにおける抗−Ｂ型肝炎重鎮可変領域のヌクレオチド配列を示す。

ｐ　ｌＮＧ２０１２Ｅは先ずＢｇ１１１部位をｐＩＮＧ１２０２の５ａｌＩ部位 に挿入しく第１６図参照）、ｐｌＮＧ１２０２８ｇＩｎを形成した。このプラス ミドからのキメラ重鎖遺伝子を発現ベクターｐｌＮＧ２００３Ｅ中に挿入してｐ ｌＮＧ２０１２Ｅを得た。

ｐｌＮＧ２０１２ＥはｐＩＮＧ２００６ＥとイニシエーターＡＴＧの直ぐ上流の 領域において異る。下線を付したヌクレオチドはｃＤＮＡクローンｐＧＭＨ−６ からのヒトＪ領域配列を示す。星印のアミノ酸１１７はキメラ遺伝子Ｊ領域に導 入されたこの部位におけるマウスからヒト配列への単一の変化を示す（Ａｌａか らＳｅｔに）。

配列決定はプラスミド（開環）及びＭ１３（閉環）鋳型についてサンガー（Ｓａ ｎｇｅｒ）法により行った。

第１３図は、パネルＡにおいてｐｌＮＧ２００１から得られた軽鎖クローン（ｐ ＭＡＣＫ−３、ｐｌＮＧ２０１３Ｅ、ｐ　ｌＮＧ２００７Ｅ、ｐ　ｌＮＧ２０１ ０Ｅ−ｇｐｔ及びｐｌＮＧ２０１４Ｅ−ｇｐｔ）におけるＪ−Ｃ連結領域ヌクレ オチド配列を示す。ｐＩ２−３に起源するこのＪ領域配列はヒトＪＫ４と印され る。ゲノム配列決定によって予測されなかったＧヌクレオチドは星印のマークを 付されている。この配列を修飾するために用いられたオリゴヌクレオチドブライ マー（Ｋ２−４８ＣＬＩ）はヒトＪＫ４配列の下に示されている。パネルＢはｐ ｌＮＧ２０１６Ｅ−ｇｐｔを作るために用いられた部位一方向突然変異誘発の方 法を図示する。比例尺度ではない。

第１４図は、二つの形質転換体におけるトランスフェクションされた配列の遺伝 子複製数を示す。２ＡＥ９、２８Ｈ１０からのｎＤＮＡを、示した酵素で消化し た。

ＤＮＡの濃度をそれらの上に示した量でレーンに沿って滴定した。プローブはヒ トＣガンマ１配列（ｐｍｖＨｃ２４　Ａｐａｌ−ＢａｍＨＩ）を含有する。参照 は生殖系列即ちＡｐａｌで消化されたＧＭ２１４６　ｎＤＮＡである。３’Ａｐ ａ１部位はポリ（Ａ）付加（３）の部位よりも２ｂｐ向うにある。

第１５図は、Ｌ　６　Ｖ　ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンｐＨ３−６ａのＶ領域の ヌクレオチド配列を示す。この配列は遺伝子断片のＭ１３サブクローン（下に示 す）を用いたジデオキシ末端方法により決定された。開環はペプチド配列により 確認されたアミノ酸残基を示す。ＣＤＲ３領域におけるＤ　っと相同な配列には 下線を付しである。

ｓｐ、、− 第１６図は、Ｌ　６　Ｖ　Ｋｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンｐＬ３−１２ａのＶ領域の ヌクレオチド配列を示す。部位一方向突然変異誘発のために用いられたオリゴヌ クレオチドブライマーはＪＫ５セグメントの下に示される。開環はペプチド配列 により確認されたアミノ酸残基を示す。

第１７図は、キメラＬ６−ＶＨプラスヒトＣガンマ１発現プラスミドの造築を示 す。パネル（ａ）はＢＡＬ　−３１削除クロ一ンＭ１３ｍｐ１９−Ｃ１−デルタ ４（Ｃ１−デルタ４）及びＭ１３ｍｐ１９−ＣＩ−デルタ２１（Ｃ１−デルタ２ １）の配列を示す。このｃ　ＤＮＡクローンｐＨ３−６ａの５′末端は矢印で示 されている。

Ｍ１３配列は下線がひかれている。この実験のために用いられたオリゴヌクレオ チドブライマーはＲ３−６ａ（５’　−ＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧ−３’ 　）であり、それは成熟Ｎ末端近傍のＦＲＩにおいて合成を開始する。パネル（ ｂ）は各々２０ｎｇの３１−マーオリゴヌクレオチドＭＪＨ２−ＡｐａＩにアニ ーリングされた１ＭｇのクローンＣ１−デルタ４及びＣ１−デルタ２１の部位一 方向突然変異誘発のための方法を示す。ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用 いた相補的鎖合成は室温において３０分間次いで１５℃で７２時間行われた。

トランスフェクションされたファージプラークをニトロセルロースに吸着させ、 ＮａＯＨで固定し、及び３２Ｐ−標識化ＭＪＨ２−ＡｐａＩオリゴヌクレオチド に４×ＴＢＳ　（０，６Ｍ　ＮａＣ１，０，０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ ７，４）　、０．００４Ｍ　ＥＤＴＡＩ　＋１０％デキストランサルフェート中 において６５℃で１８時間ハイブリダイズされた。フィルターの最終洗浄は６５ ℃において４ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで１５分間であった。〔マニアティス 等（Ｍａｎｌａｔｌｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・クローニング： ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｌｎｇ　：　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）、１９８２年〕。陽性プラークは一晩Ｋ ｏｄａｋＸＡＲフィルムに曝して検出し、直接ＲＦ　ＤＮＡの生育及び制限酵素 分析に採用した。ＭＪＨ２−ＡｐａＩオリゴヌクレオチドのマウスＣＨ１に対す る不適正塩基対を示したところ、オリゴヌクレオチドの下に示したコード化変化 となった。パネル（Ｃ）は突然変異誘発されたＬ６−ＶＨモジュールの各々をキ メラ発現プラスミドｐｌＮＧ２０１２の常在性ＶＨ＋：：ｆｉｔ換してｐｌＮＧ ２１１１及びｐＩＮＧ２１１２を発生する方法を示すものである。

第１８図は、キメラし６発現プラスミドルｌＮＧ２１１９の造築を示す。ｐＩＮ Ｇ２１００がらのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片はｐＩＮＧ２１１２ＥからのＳａｌ ｌ−ＢａｍＨＩＡ断片と同一である。

第１９図は、ｖＫ遺伝子の修飾及び軽鎖及び重鎖プラス軽鎖発現プラスミドを造 築するに際してその使用を示す。

（ａ）Ｌ６のｖＫのオリゴｄ　（ＧＣ）セグメント５′の削除。このオリゴヌク レオチドは２２−マーであり、５ａｌｌ部位を含有する。三つの不適正塩基対が 示されている。このｖＫ遺伝子は突然変異誘発後、５ａｌｌ−ＨｉｎｄＩ［［断 片としてヒトＣＫモジュールに結合されている。この様にして形成された発現プ ラスミドはｐＩＮＧ２１１９である。

（ｂ）ｐＩＮＧ２１１４、重プラス軽鎖発現プラスミド。

この発現プラスミドｐＩＮＧ２１１４はｐＩＮＧ２１１１からＬ６重鎖キメラ遺 伝子及びｐｌＮＧ２１１９からのキメラ軽鎖を含有する（太線）。

第２０図は、Ｌ６キメラ抗体発現プラスミドの造築においてなされた配列変更の 一覧を示すものである。５′未翻訳領域において下線を付された残基はクローニ ングされたマウスカッパ及び重鎮遺伝子から得られたものである。Ｖ／Ｃ境界に おいて丸で囲まれた残基はこの領域において制限酵素部位を造出する突然変異操 作から生ずるものである。Ｌ６重鎖キメラ中のそれらの上に小火により示される 残基も又突然変異誘発から生ずるものである。それらは表置たない変化である。

第２１図は、２Ｈ７ｖＨ配列を示す。このｖＨ遺伝子はＪＨ１配列及びＤＳＰ、 ２配列要素を含む。アミノ酸残基上の小円はペプチド配列に一致したものである 。

第２２図は、２Ｈ７ｖＬ配列を示す。このｖＫ遺伝子はＪＫ５配列を含む。２２ −マーオリゴヌクレオチドを用いてＡＴＧイニシエーターの５ａｌｌ部位５′を 置いた。アミノ酸残基の上の小円はペプチド配列に一致したものを示す。

第２３図は、２Ｈ７特異性のキメライムノグロブリン遺伝子発現プラスミドを示 す。１遺伝子プラスミドはｐｌＮＧ２１０１　（ＶＨ％ｎｅｏ）、ｐｌＮＧ２１ ０６（ＶＫ、ｎｅｏ）及びｐ　ｌＮＧ２１０７　（ＶＫ％ｇｐｔ）である。その 他のものは２−遺伝子プラスミドである。

それらの造築はｐＩＮＧ２１０１及びｐｌＮＧ２１０７のより大きいＮｄｅＩ断 片のＮｄｅｌで部分的に消化された線状化ｐＩＮＧ２１０６への連結を含むもの であった。ｐＨＬ２−１１及びｐＨＬ２−２６はｐｌＮＧ２１０１及びｐｌＮＧ ２１０６から得られ、ｐＬＬ２−２５はｐｌＮＧ２１０７及びｐＩＮＧ２１０６ から得られた。

第２４図は、キメラプラスミドの造築においてｖＨ及びｖＨ内に導入されたヌク レオチド変化の一覧を示すものである。５′エンドにおける同起源のｖＨ及びＶ Ｋヌクレオチド残基は下線が付されている。Ｊ−Ｃ連結における丸印の残基はヒ トＣモジュールから得られたものである。

一般的に、抗体は二つの軽鎖及び二つの重鎮分子により構成されている。軽鎖及 び重鎮は構造的及び機能的相同性のドメインに分割される。軽（ｖＬ）及び重（ ｖＨ）鎖の両者の可変領域は認識及び特異性を決定する。軽（Ｃ）及び重（ＣＨ ）鎖の定常領域ドメインは抗体鎖り 会合、分泌、経胎盤易動度、補体結合などの重要な生物学的性質を与える。

複雑な一連の事象がＢ細胞におけるイムノグロブリン遺伝子発現に導く。抗原特 異性及び結合を与えるＶ領域遺伝子配列はＶＤ及びＪＨ１或いはＶＬ及びＪ、と Ｈゝ 称される別々の生殖系列遺伝子セグメントに位置している。これらの遺伝子セグ メントはＤＮＡ再配列によってそれぞれ重及び軽鎖において表現される完全Ｖ領 域を形成する（第１図）。この再配列、連結された（Ｖ、−Ｊ　及びｖ　Ｈ−Ｄ −ＪＨ）”セグメントは次いでそれぞし れ軽鎖及び重鎮の完全な可変領域即ち抗原結合ドメインをコード化する。

定　義 明細書及び請求の範囲を通して特定の用語及び語句が用いられた。以下の定義は 明確さ及び首尾一貫性の目的で与えられるものである。

１、　発現ベクター　−ベクター中に挿入することができる、遺伝子配列から得 られたｍＲＮＡの合成に必要な制御シグナルを含有するプラスミドＤＮＡ０２、 　モジュールベクター　−定常或いは可変領域遺伝子モジュールを含有するプラ スミドＤＮＡ０３、　発現プラスミド　−　キメライムノグロブリン遺伝子など の挿入遺伝子を含有する発現ベクター。

４、　遺伝子クローニング　−　遺伝子の合成、ＤＮＡベクター中への挿入及び ハイブリダイゼーションなどによる同定。

５、トランスフェクション　−　ＤＮＡの哺乳動物細胞中への転移。

遺伝子方法及び生成物 本発明は望ましい特異性を有するヒト抗体のクローニング及び製造のための新規 接近手法を提供するものである。一般的には、この方法は次の五つの要素を組合 わせるものである： （１）　特定の抗原に対してモノクローナル抗体を産生ずるＢ細胞ハイブリドー マ系からのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の単離、クローニング及びそれ からのｃＤＮＡ製造； （２）　特定のヒト或いは非−ヒトハイブリドーマ細胞系からの軽鎖及び重鎖ｍ ＲＮＡにおける可変領域遺伝子セグメントのクローニングのためのプライマー及 び／又はプローブとして有用な万能イムノグロブリン遺伝子（Ｕ　Ｉ　Ｇ）オリ ゴヌクレオチドの調製、及びそれからのｃＤＮＡの製造； （３）　ｃＤＮＡ調製及びクローニング或いはゲノム遺伝子調製及びクローニン グによる定常領域遺伝子セグメントモジュールの調製； （４）　上記（２）の部分のクローニングされた特定のイムノグロブリン可変領 域遺伝子セグメントをクローニングされたヒト定常領域遺伝子セグメントモジュ ールに結合することによる完全な重鎮或いは軽鎖コード化配列の造築； （５）　原核生物及び真核生物宿主を含む選ばれた宿主内において別々に発酵後 ｔｎ　ＶｉｔｒＯで抗体分子を組立てるか或いは両鏡を同一細胞内において産生 ずることによる軽鎖及び重鎮の発現及び産生。

本発明はｃＤＮＡクローニングのためのｍＲＮＡの単離のために規定された特異 性のモノクローナル抗体を産生ずるクローニングされたハイプリドーマＢ細胞系 を用いる。多くのリンパ細胞系は単離時にｍＲＮＡを劣化させる活性の高いヌク レアーゼを含有するので、本発明は活性のヌクレアーゼを含有する細胞及び組織 から影響を受けてないｍＲＮＡを単離するために特に開発されたｍＲＮＡ調製法 を用いる。一つのその様な方法は、ヌクレアーゼの作用を減少させるエタノール −過塩素酸ドライアイス混合物中における細胞或いは組織破壊により全ＲＮＡ調 製物をもたらす〔リザルディ等（Ｌｉｚａｒｄｉ、　Ｐ、Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、）　、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｒｌａｌ。

Ｂｉｏｃｈｃ＋＋＋、）　、９８：１１６　（１９７９））、この方法は完全な 翻訳可能なｍＲＮＡを与える。　′本発明のために用いられたその他の方法は細 胞を塩化リチウムプラス尿素〔オーフレー（Ａｕｆ’ｆ’ｒａｙ、　Ｃ，）及び ルージョン（Ｒｏｕｇｅｏｎ、　Ｐ、　）　、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、）、１０７　：　３ ０３　（１９８０）］或いはグアニジンチオシアネート〔チルギン等（Ｃｈｌｒ ｇｖＩｎ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ）　、１８　：　５２９４（１９７９））で抽出して全ＲＮＡを 調製することを含むものである。

全ての発現されたイムノグロブリン軽鎖及び重鎮遺伝子及びメツセンジャーＲＮ Ａの一つの普偏的特徴は所謂Ｊ領域（即ち連結領域、第１図参照）である。重鎮 及び軽鎖のＪ領域は異った配列を有するが、高い度合の配列相同性（８０％を越 える）が重ＪＨｉ’Ａ域或いはカッパ軽鎖Ｊ領域内に存在する。本発明はイムノ グロブリン軽鎖或いは重鎮ｍＲＮＡ或いは遺伝子をクローニングするためのプラ イマー或いはプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチド（姓においてＵ ＩＧと称する）の設計において有用な軽鎖及び重鎖Ｊ領域のコンセンサス配列を 提供する（第２図又は第７図）。特別のＵＩＧの設計の性質に応じて、それはマ ウスＪＨ３配列のみを検出するＵＩＧ−ＭＪＨ３のような単一の特別のＪ配列を 含有する全てのイムノグロブリンｍＲＮＡ或いは遺伝子にハイブリダイズするこ とが出来る（第７図）。

ある特別のＵＩＧプローブのもう一つの有用性は全てのマウスＪＫ含有配列を検 出するＵＩＧ−ＭＪＫなどの特定の定常領域の軽鎖或いは重鎮ｍＲＮＡへのハイ ブリダイゼーションである（第７図）。ＵＩＧ設計は又、イムノグロブリン遺伝 子のｃＤＮＡ複製中に制限酵素部位を導入するための配列を含むこともできる（ 第７図参照）。本発明は、例えば、所望の抗原特異性のモノクローナル抗体を作 るハイブリドーマ細胞からのイムノグロブリンｍＲＮＡ中のＶ領域をクローニン グするためのＵＩＧプローブを発生するために化学的遺伝子合成を利用してよい 。

ハイブリドーマ細胞軽鎖及び重鎖ｍＲＮＡから完全なＶ＋Ｃ領域ｃＤＮＡクロー ンを発生させるために多段操作を利用した。第一段階において、本発明は完全な Ｖ領域及び重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡのリーダーコード化配列の逆転写酵素複製のた めにＵＩＧプローブを「プライマー」として利用する（第３図）。プライマー延 長ｃＤＮＡの相補的路を次いで合成し、この二本鎖ｃＤＮＡを適当なｃＤＮＡク ローニングベクター例えばｐＢＲ３２２（ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）及びホフマ ン（Ｈｏｒｆｍａｎ　）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２５　：　２６３　（１９ ８３））或いはｐＱ２３〔第５図；マニアティス等（Ｍａｎｌａｔｉｓ、　Ｔ、 　ｅｔ　ａｌ、　）、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュ アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｓ　 Ｍａｎｕａｌ　）、ＣｏｌｄＳｐｒｌｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　、ニューヨーク、２２４頁（１９８２））中に おいてクローニングする。クローンをＵＩＧオリゴヌクレオチドプローブを用い て特異的ハイブリダイゼーションのスクリーニングを行う。このスクリーニング 操作により確認された陽性の重鎮及び軽鎖クローンをマツピングし、及び配列決 定してＶ領域及びリーダーコード化配列を含有するものを選択する。

代替的方法はプライマーとしてオリゴ−ｄＴを用いてｃＤＮＡクローンを作った 後、標準的ハイブリダイゼーション法により軽鎖及び重鎮クローンを選択する方 法である。

第二段階はＣ領域遺伝子セグメントのクローニングを利用して重鎮及び軽鎖モジ ュールベクターを形成する。

一つの方法において、ヒト重鎮及び軽鎖イムノグロブリンｍＲＮＡのｃＤＮＡク ローンが調製される。これらのｃＤＮＡクローンを次いで部位一方向突然変異誘 発によりＣ領域モジュールベクターに転換し、定常領域の境界の近辺の所望の位 置に制限部位を置く。代替的方法はＣ領域モジュールベクター源としてゲノムＣ 領域クローンを利用する。

ｃＤＮＡクローニングの第三段階は、結合されたＶ及びＣ領域を有する完全な軽 及び重鎖コード化配列の発生を含むものである。上記の如く発生されたクローニ ングされたＶ領域セグメントを切出して軽或いは重鎖Ｃ領域モジュールベクター に連続する。例えば、完全なヒトカッパ軽鎖Ｃ領域及び完全なヒトガンマＩＣ領 域をクローニングすることができる。加えて、ヒトガンマ１領域を修飾し、停止 コドンを導入することによりＦａｂ分子の重鎖部分をコード化する遺伝子配列を 得る。

操作的にＶ及びＣ領域を結合したコード化配列を次いで適当な宿主、原核生物或 いは真核生物において発現するために適当な発現系に転移する。操作的に結合し たとは、コード化配り１１をフレーム内結合してトリブレット読取りフレームの 変更或いは妨害なしに連続的に翻訳可能な遺伝子配列を誘導することを意味する 。

本発明においてｃＤＮＡ遺伝子配列を用いる一つの特別な利点は、それらが重鎮 或いは軽鎖のいづれかのイムノグロブリン鎖を連続的にコードするということで ある。

「連続的」とは配列がイントロンを含有しない（即ち、逆転写によりｍＲＮＡか ら誘導されているのでゲノム配列ではなくむしろ隣接エキソンの配列であること を意味する。本発明により提供されるｃＤＮＡ配列のこの特徴は、細菌などの原 核生物宿主或いは酵母などの低級真核生物宿主中においてそれらを発現可能とす る。

ｃＤＮＡクローニング方法のもう一つの利点はＶ領域遺伝子モジュールを得るこ との容易さ及び簡単さである。

本発明において用いられる「非−ヒト」という用語は免疫応答が発生することが でき、それが次いでウィルス形質転換などにより得られる対応するハイブリドー マ或いはＢ細胞クローンなどを生ずる使用可能なり細胞に導くヒト以外の任意の 動物を包含する。その様な動物は通常マウス或いはラットなどの縞歯類を包含す る。製造の容易性及び利用可能性の大きさによりマウスが現在で最も好ましい非 −ヒト動物である。このマウス−マウスハイブリドーマが好ましい重鎮及び軽鎖 可変領域源として利用される。

好ましくは、本発明は全Ｖ及び／又はＣ領域ｃ　ＤＮＡ配列を提供する。これは 配列が如何なる主たるその構造部分を欠乏することなく実質的に操作可能なＶ及 び／又はＣ領域をコードすることを意味する。

「定常的」及び「可変」という用語は天然弁−キメラ抗体における可変及び定常 領域が有する性質及び特徴をコードする重鎮或いは軽鎖のいづれかのイムノグロ ブリン鎖のそれらの領域を示すために機能的に用いられる。

前記の如く、機能的に操作領域が存在し、利用可能である限り、可変成いは定常 領域のための完全なコード化領域が存在することは必要でない。

広範囲の源ハイブリドーマがｍＲＮＡの調製に利用可能である。例えば、カタロ グＡＴＣＣ細胞系及びハイブリドーマ（ＡＴＣＣＣＥＬＬ　ＬＩＮＥＳ　ＨＹＢ ＲＩＤＯＭＡＳ）　、１９８４年１２月、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１バークローンドライブ、ロック ビル、メリーランド州２０８５２、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、５〜９頁及びＥＣＡＣＣカ タログ、第２版；　ＰＨＬＳ　ＣＡＭＲＰｏｒｔｏｒ　Ｄｏｗｎ、　５ａ１１ｓ ｂｕｒｙ。

Ｗｌｌｌｓ　；５Ｐ４０ＪＧ、　Ｕ、　Ｋ、３０〜３５頁及び４０〜４６頁参照 。それらの中には広範囲の抗原に反応性のモノクローナル抗体を分泌するハイブ リドーマが掲載されており、この収集から利用可能であり、本発明において使用 可能である。特に興味深いのはウィルス抗原と反応性の抗体を分泌するハイブリ ドーマであり、例えばデンゾ（Ｄｅｎｇｕｅ）コンプレックス特異性（ＡＴＣＣ ＨＢ１１４）、デングタイブ１ウィルス（ＡＴＣＣＨＢ４７）、デングタイブ２ ウィルス（ＡＴＣＣＨＢ４６）、デングタイブ３ウィルス（ＡＴＣＣＨＢ４９） 、デンジタイプ４ウイルス（ＡＴＣＣＨＢ４８）、エプスタイン・バー（Ｅｐｓ ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）レセプター　（ＡＴＣＣＨＢ　１３５）　、フラビウィル ス群（ＡＴＣＣＨＢ　１１２）　、Ｂ型肝炎表面抗原（ＡＴＣＣＣＲＬ　８０１ ７及び８０１８）、ヘルペスシンプレックスタイプＩ　（ＡＴＣＣＨＢ８０６８ ）、ヘルペスシンプレックスタイプ■（ＡＴＣＣＨＢ　８０６７）　、インフル エンザウィルス（ＡＴＣＣＣＬ　１８９）　、インフルエンザＡウィルス、マト リックスタンパク質（ＡＴＣＣＨＢ６４）、インフルエンザＡウィルス、ヌクレ オタンパク質（ＡＴＣＣＨＢ　６５）　、インフルエンドＡパンコック／１／７ ９ＨＡ　（ＡＴＣＣＨＢ　６６）　、インフルエンザＡＷＳＮ　ＮＰ　（ＡＴＣ ’ＣＨＢ　６７）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原（ＡＴＣＣＴＩＢ　１１５）、ＳＶ４０ 大型Ｔ抗原、Ｃ−末端（ＡＴＣＣＴｌＢ１１７）及びＳＶ４０／ンウィルスＴ抗 原（ＡＴＣＣＴＩＢ　１１６）などが挙げられる。その他のハイブリドーマの例 としては、腫瘍付随抗原或いはヒトリンパ球抗原に対する抗体を分泌するもの、 例えばヒト腫瘍−付随ＣＥＡ、高ｍｗ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８０１９）；ヒト腫 瘍−付随アルファーフェトプロティン、ＩｇＧＩＫ（ＡＴＣＣＨＢ　１３４）； ヒトＢリンパ球ＨＬＡ　−ＤＲ１単−形、Ｉ　ｇＧ２．（ＡＴＣＣＨＢ　１０４ ）；ヒトＴリンパ球Ｔ細胞プリカーサ−１■ｇＧ１（ＡＴＣＣＣＲＬ　８０２２ ）；ヒトＴリンパ球Ｔ細胞サブセット、ヘルパー、ＩｇＧ２ｂ（ＡＴＣＣＣＲＬ 　８００２）；Ｔサブセット、サプレッサー／細胞毒、ヒト、ＩｇＧ１（ＡＴＣ ＣＣＲＬ　８０１３）；Ｔ細胞サブセット、サプレッサー／細胞毒、ヒト、Ｉｇ Ｇ２ａ（ＡＴＣＣＣＲＬ　８０１４）；Ｔ細胞、末梢、ヒトＩｇＧ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ　８０００）；Ｔ細胞、末梢、ヒト、Ｉ　ｇ　Ｇ　２　ａ（Ａ　Ｔ　ＣＣ ＣＲＬ８００１）；胸腺細胞、「共通」、ヒト、Ｉ　ｇ　Ｇ　１（ＡＴＣＣＣＲ Ｌ　８０２０）などがある。

これらの系及び同様な性質のその他のものを利用してＵＩＧプローブを用いて可 変領域をコードするｍＲＮＡを複製することができる。特に興味深いのはヒト腫 瘍抗原に対して特異性を有する抗体である。

発現ビヒクルとしてはプラスミドその他のベクターが挙げられる。これらの中で 好ましいのは任意の適当な付着端を有する可変重鎮或いは軽鎖配列が容易にその 中に挿入できるように工学的に設計された適当な制限部位を有する機能的に完全 なヒト定常重鎮或いは軽鎖配列を有するビヒクルである。従って、ヒト定常重鎮 或いは軽鎖配列−含有ビヒクルは本発明の重要な実施態様である。

これらのビヒクルは任意の適当な宿主内における任意の所望の完全重鎮或いは軽 鎖の発現のための中間体として使用することができる。

一つの好ましい宿主は酵母である。酵母はイムノグロブリン軽鎖及び重鎮の製造 のための実質的利点を提供する。酵母はグリコジル化を含む後−翻訳的ペプチド 修正を行う。酵母における所望のタンパク質の表立った生産のために用いること のできる強いプロモニタ配列及び高複製数プラスミドを利用する数多くの組換え ＤＮＡ技術が現在存在する。酵母はクローニングされた哺乳動物遺伝子生成物上 にリーダー配列を認識し、リーダー゛配列を有するペプチド（即ちプレペプチド ）を分泌する〔ヒララマン等（Ｈｌｔｚｃａｎ、　ｅｔ　ａｔ、　）　、第１１ 回酵母に関する国際会議、遺伝学及び分子生物学（１１ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌＣｏｎｌ’ｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｙｅａｓｔ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏ−１ｏｇｙ）　、モンペリエ、フランス、 ９月１３〜１７日、１９８２年〕。

酵母の遺伝子発現系統は日常的に重鎮及び軽鎖産生のレベル、タンパク質安定性 及び分泌と評価することができる。酵母がグルコースに富んだ培地内で生育され た際に、多量に生産される糖分解酵素をシードする活性に発現された遺伝子から プロモータ及び停止要素を導入する一連の酵母遺伝子発現系統の任意のものを利 用することができる。公知の糖分解遺伝子も又極めて効率的な転写コントロール シグナルを提供することができる。例えば、イソ−１−シトクロームＣ（ＣＹＣ −１）遺伝子のプロモータ及びターミネータシグナルを利用することができる。

酵母内にクローニングされたイムノグロブリンｃＤＮＡの発現に対して最適発現 プラスミドの評価のために次の手法を採用することができる。

（１）■及びＣ領域を結合するクローニングされたイムノグロブリンＤＮＡを異 った転写プロモータ及びターミネータＤＮＡ断片に付着する。

（２）　タンパク質過剰生産のために用いられた酵母プラスミド上にキメラ遺伝 子を置く　〔例えば、ペックス（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、　）　、モレキュラー ・ジエネティックス・アンド・イースト（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ　ａｎｄ　Ｙｅａｓｔ）、Ａｌｌ’ｒｅｄ　Ｂｅｎ５ｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｌｕ Ｉｌｌ、　１８　％コペンハーゲン（１９８１）参照〕。

（３）　酵母リーダーペプチドなどの追加の遺伝子単位をイムノグロブリンＤＮ Ａ造成物上に含ませて抗体分泌を得てよい。

（４）　一部の配列、しばしば遺伝子配列の最初の６〜２０コドンを修飾して好 ましい酵母コドン用途を表わしてよい。

（５）　キメラ遺伝子を酵母染色体中に合体させるために用いるプラスミド上に 置く。

酵母内において同時に軽鎖及び重鎮遺伝子を発現するために次の手法を採用する ことができる。

（１）　軽鎖及び重鎮遺伝子を各々酵母プロモータ及びターミネータ配列に付着 し、同一プラスミド上に置く。

このプラスミドは酵母における自律的複製或いは酵母染色体中の特定部位におけ る合体のいづれかのために設計することができる。

（２）　軽鎖及び重鎮遺伝子の各々を異った選択マーカーを含有する別々のプラ スミドの酵母プロモータ及びターミネータ配列に付着させる。例えば、軽鎖遺伝 子を選択マーカーとしてｔｒｐｌ遺伝子を含有するプラスミド上に置くことがで きるのに対し、重鎮遺伝子を選択マーカーとしてＵｒａ３を含有するプラスミド 上に置くことができる。これらのプラスミドは酵母中の自律的複製或いは酵母染 色体中の特定部位における合体のいづれに対しても設計することができる。両選 択マーカーの欠ける酵母株は軽鎖遺伝子を含有するプラスミド及び重鎮遺伝子を 含有するプラスミドで同時に或いは逐次形質転換される。

（３）　軽鎖及び重鎮遺伝子の各々をそれぞれ上記（２）において説明したよう な各々異った選択マーカーを含有する別々のプラスミド上の酵母プロモータ及び ターミネータ配列に付着する。軽鎖及び重鎮発現プラスミド上に見出される選択 マーカー（上記例においてｔ　ｒｐｌ及びｕｒｅ３）に欠ける酵母交配タイプａ ′株は、これらの二つの選択マーカーの一方（上記例においてｔｒｐｌ）を選択 することにより軽鎖遺伝子を含有するプラスミドで形質転換される。“ａ″株（ 即ち具体例としてｔｒｐｌ及びＵｒａ３）と同一の選択マーカーに欠ける酵母交 配タイプアルファ”株は代替的選択マーカー（即ち、上記例においてはＵｒａ３ ）を選択することにより重鎮遺伝子を含有するプラスミドで形質転換される。軽 鎖プラスミドを含有する“ａ″株（表現形：上記例においてＴｒｐ”Ｕｒａ−） 及び重鎖プラスミドを含有する株（表現形二上記例においてはＴｒｐ−Ｕｒａ” ）交配し、上記選択マーカー（上記例においてＴｒｐ”Ｕｒａ　）の両者に対し て原栄養株である二倍体が選択される。

形質転換宿主として利用される細菌宿主の中では、Ｅ。

コリに１２菌株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）が特に有用である。その他の使 用される微生物菌株としてはＥ。

コリ　Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ３１５３７）が挙げられる。上記菌株並びにＥ、 コリ　Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７Ｂ２５）及びその他のエンテロバクテリア例 えばサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｏ＋ｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕＩＭ）或いはセラチア・マルセセンス（ＳｅｒｒａｔＩａ　ｍａｒｃｅｓｃ ｅｎｓ）及び各種シュードモナス種が使用される。

一般的に、宿主細胞と適合性の種から誘導されたレプリコン及びコントロール配 列を含有するプラスミドベクターがこれらの宿主に関連して用いられる。ベクタ ーは通常複製部位並びに形質転換細胞内に表現形選択を与えることのできる特別 の遺伝子を有する。例えば、Ｅ、コリはＥ、コリ種から得られるプラスミドであ るｐＢＲ３２２を用いて容易に形質転換される〔ポリバー等（Ｂｏｌｉｖａｒ、 　Ｃｔ　ａｌ、　）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２　：　９５（１９７７））。

ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、従っ て形質転換された細胞を確認するのに容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラ スミド或いはその他の微生物プラスミドは又それ自身のタンパク質の発現のため に微生物により使用することのできるプロモータを含有するか或いは含有するよ うに修飾されなければならない。組換えＤＮＡ造成において最も普通に用いられ るプロモータとしては、ベーターラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）及びラクトー ス（ベーターガラクトシダーゼ）プロモータ系〔チャン等（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　 ａｌ、）　、ネイチャー等（Ｎａｔｕｒｅ）　、２７５　：６１５　（１９７８ ）；イタクラ等（Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ）、１９８：１０５６　（１９７７））及びトリプトファンプロモータ系（ゲ ラデル等（Ｇｏｅｄｄｅ１６ｔ　ａｌ、）　、ヌクレイツク・アシッド・リサー チ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　８　：　４０５７　（１ ９８０）　、ＥＰＯ公開公報００３６７７６号〕などが挙げられる。これらが最 も普通に用いられるものであるが、その他の微生物プロモータも発見され利用さ れている。

例えば、任意の重或いは軽キメライムノグロブリン鎖に対する遺伝子造成体をバ クテリオファージラムダ（ＰＬ）の左方向プロモータのコントロール下におくこ とができる。このプロモータはコントロールするこトノできる最も強い公知のプ ロモータの−っである。コントロールはラムダリプレッサーにより行われ、隣接 の制限部位は公知である。

イムノグロブリン鎖配列の発現は又その未形質転換状態において生物体と「相同 」であるその他の制御配列のコントロール下に置かれることもできる。例えば、 ラクトース依存Ｅ、コリ染色体ＤＮＡは酵母ベーターガラクトシダーゼを作り上 げることによりラクトース消化を媒介するラクトース或いはｌａｃオペロンを含 んでなる。

これらのｌａｃコントロール要素はＥ、コリに対して感染性であるバクテリオフ ァージラムダｐＬＡＣ５から得られる。このｌａｃプロモーターオペレータ系は Ｉ　ＰＴＧにより誘発することができる。

その他のプロモータ／オペレータ系或いはその部分も同様に用いることができる 。例えば、アラビノース、コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリホスファター ゼ、トリプトファン、キシロース、ｔａｃなどを用いることができる。

その他の好ましい宿主は組織培養中でｊｎ　ｖｌｔｒｏで或いは動物内でｉｎ　 ｖｌν０で生育された哺乳動物細胞である。

咄乳動物細胞はリーダーペプチド除去、重鎮及び軽鎖の正しい折込み及び組立て 、正しい部位におけるグリコジル化、及びＨ２Ｌ　２分子などの細胞からの機能 的抗体タンパク質の分泌などを含むイムノグロブリンタンパク質分子への後−翻 訳修飾を提供する。

抗体タンパク質の製造のために宿主とし有用な哺乳動物細胞は繊維芽球起源の細 胞例えばＶｅｒｏ（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１）或いはＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣＣ ＲＬ６１）、或いはリンパ起源の細胞例えばハイブリドーマＳｐ２１０−Ａｇ１ ４　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）或いはミニｏ−ｖＰ３Ｘ６３Ａｇ８　（ＡＴ ＣＣＴＩＢ９）、及びその誘導体などが挙げられる。

クローニングされた重鎮及び軽鎖遺伝子の哺乳動物細胞内における発現のために は幾つかの可能性のあるベクター系が利用可能である。一つのクラスのベクター は動物ウィルス例えばウシパビロマウィルス〔サーバー等（Ｓａｒｖｅｒ、　Ｎ 、　ｅｔ　ａｌ。）、プロシーディングスーオブ※ナショナル・アカデミツク・ サイエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、　ＵＳＡ）７９　：　７１４７　（１９８ ２）　）、ポリオマウィルス〔ディーンズ等（Ｄｅａｎｓ、　Ｒ，Ｊ、　ｅｔａ ｌ−）、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス、 Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．、　ＵＳＡ　）　、８１　：１２９２　（１９８４）　）　、或いはＳ Ｖ４０ウィルス〔ラスキー（Ｌａｓｋｙ、　Ｍ、　）及びボッチャン（Ｂｏｔｃ ｈａｎ、　Ｍ、　）　、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、２９３　ニア９　（ １９８１））などから得られる自律的に複製する染色体プラスミドを提供するＤ ＮＡ要素を利用する。第二のクラスのベクターは所望遺伝子配列の宿主細胞染色 体への合体に依存するものである。安定にそれらの染色体内に導入ＤＮＡを合体 した細胞は、又Ｅ、コリｇｐｔ〔マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，）及 びベルブ（９ｅｒｇ、　Ｐ、）、プロシーディングズφオブφナショナル・アカ デミツク・サイエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃ１．、　 ＬＩＳＡ　）　７８　：２０７２　（１９８１））或いはＴｎ５　ｎｅｏ　（サ ザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、Ｊ、）及びベルブ（Ｂｅｒｇ、　Ｐ、）　、 ジャーナル・オブ・モレキュラー・アプライド・ジエネテイツクス（Ｊ、　Ｍｏ １．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｃｔ、）、１　：　３２７　（１９８２））などの薬 品耐性遺伝子を導入することによっても選択することができるる。この選択可能 マーカー遺伝子は発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接に結合されてもよく、或い は共−トランスフェクションにより同一細胞内に導入されてもよい〔ウィグラー 等（Ｗｌｇｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　）、セル（Ｃｅｌｌ）、１６：７７ 　（１９７９））。

イムノグロブリンｃＤＮＡは抗体タンパク質或いはその前駆体をコード化する成 熟ｍＲＮＡを表わす配列のみにより構成されるので、遺伝子の転写及びＲＮＡの プロセシングを制御する追加の遺伝子発現要素がイムノグロブリンｍＲＮＡの最 適合成に必要とされる。これらの要素はスプライスシグナル、並びに誘発性プロ モータ、エンハンサ−及び停止シグナルを含む転写プロモータを包含する。その 様な要素を組込んだｃＤＮＡ発現ベクターとしてはオカヤマ（Ｏｋａｙａａａ、 　Ｈ，）及びベルブ（Ｂｅｒｇ。

Ｐ、）、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｌｏｔ、　 ）　、３　：　２８０　（１９８Ｂ）　、セブコ等（Ｃｅｐｋｏ　。

Ｃ，Ｌ、　ａｔ　ａｔ、　）　、セル（Ｃｅｌｌ）　、３７　：１０５３（１９ ８４）、及びカウフマン（Ｋｏｕｆ’ｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、　）プロシーディング ズ・オブ・ナショナル−アすデミツク會サイエンスやＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、　ＵＳＡ　）８２　：　６８９　（１９ ８５）により記載されたものが挙げられる。

哺乳動物細胞内におけるイムノグロブリンｃＤＮＡの発現のための最適ベクター を評価する一つの手法は、先ずイムノグロブリンＤＮＡ配列を細胞ゲノム中に安 定に合体することのできるベクター中におくこと或いは染色体外プラスミドとし て自律的に複製することを含む。これらのベクターを用いて最適イムノグロブリ ン合成のための異った遺伝子発現要素を評価することができる。

宿主として哺乳動物細胞の付加的利点はゲノム配列から得られたキメライムノグ ロブリン遺伝子を発現することのできるそれらの能力である。即ち、哺乳動物細 胞は可変領域ｃＤＮＡモジュールプラス全部或いは部分的にゲノム配列により構 成されている定常領域で構成されるキメライムノグロブリン遺伝子を発現する。

幾つかのヒト定常領域ゲノムクローンが記載されている〔エリソン等（ＥＩｌｌ ｓｏｎ、　Ｊ、Ｗ、　ｅｔ　ａｔ、）　、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（ Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１０　：　４０７１（１９８２）、或い はマックス等（Ｍａｘ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）　、２９　 ：　６９１　（１９ｇ２））、その様なゲノム配列の使用はイムノグロブリンエ ンハンサ−、スプライスシグナル、及び転写停止シグナルの定常領域遺伝子セグ メントと同時導入に便利である。

完全なＨ２Ｌ　２抗体を得るために異った手法に従うことができる。

先ず、軽鎖及び重鎮を別々に発現した後に精製された軽鎖及び重鎮を完全なＨ２ Ｌ２　■ｇＧ抗体中に１ｎＶｌｔｒｏで組立てることができる。細胞内における 完全なＨ２Ｌ２１ｇＧ分子を発生するために用いられるこれらの組立て経路は広 汎に研究されている〔例えば、シャーフ（Ｓｃｈａｒｆ’ｌ’、　Ｍ、　）　ハ ーベイ・レクチャーズ（ＨａｒｖｅｙＬｅｃｔｕｒｅｓ）　、６９　：１２５　 （１９７４）参照〕。減少された単離軽鎖及び重鎖からのＩｇＧ抗体の形成のた めの１ｎ　ＶＨｒｏの反応パラメータはペイショック（Ｂｅｙｃｈｏｋ。

Ｓ、）、セルズ赤オブ・イムノグロブリン・シンセシス（Ｃｅｌｌｓ　ｏｆ’　 Ｉａｕｎｕｎｏｇｌｏｂｕｌｌｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）　、Ａｃａｄｅｍｉ ｃＰｒｅｓｓ　、ニューヨーク、６９頁、１９７９年により規定重鎮及び軽鎖の 完全Ｈ２Ｌ２１ｇＧ抗体中への細胞内会合及び結合を達成することが可能で牟る 。この共−発現は同−宿主内に同−或いは異ったプラスミドを用いることにより 生じうる。

在に説明された方法を、ヒトであると、非−ヒトであるとに拘らず、ある特異性 及びクラスの任意の抗体のクラスを同一特異性であるがしかし異ったクラスの抗 体に切換えるために用いることもできる。例えば、元のＩｇＭ抗体を産生ずる細 胞から得られた可変ヒトｃＤＮＡ配列に結合されたヒト定常１ｇＧ　ｃＤＮＡ或 いはゲノム配列を含有する造成体を調製することによりヒトＩｇＧ抗体をヒトＩ ｇＧ抗体に変質することができる。これらの造成体を次いで適当な宿主内に導入 し、完本発明は重鎮或いは軽鎖のいづれかの「キメラ」イムノグロブリン鎖を提 供する。キメラ鎖は天然ヒトイムノグロブリンの重鎮に存在するそれに実質的に 同様な定常領域及び任意の所望抗原特異性を有する可変領域を含む。

この可変領域はヒト或いは非−ヒト起源のいづれのものであってもよい。

本発明は又、全分子が所望の結合及び認識特性を示すように会合した重鎮及び軽 鎖を存するイムノグロブリン分子を提供する。各種タイプのイムノグロブリン分 子が提供される。即ち、−価、二価、二特異性（即ち異った可変領域を有する） 、キメラ重鎖及び非−キメラ軽鎖を有する分子、或いは所望機能を有するペプチ ド部分に付着した可変結合ドメインを存する分子などが提供される。

同−或いは異った可変領域結合特異性のキメラ重鎖及び非−キメラ（即ち、全ヒ ト或いは全弁−ヒト）軽鎖を有する抗体が必要とされるポリペプチド鎖の適当な 会合により調製することができる。これらの鎖は本発明のモジュール組立て法に より個々に調製される。

用　途 ヒト定常領域を有する本発明の抗体は血清病気或いはアナフィラキシ−ショック などの陰性免疫反応なしに特にヒトにおいて受動免疫に利用することができる。

これらの抗体は勿論、標識が放射能発生物質、或いはＮＭＲコントラスト化剤例 えば炭素−１３核、或いはＸ線コントラスト化剤、例えば重金属核などであり得 る１ｎ　ｖｌｖ。

造影のための標識化された形態における従来技術の免疫診断アッセイ及びキット においても利用することができる。これらの抗体は又適当な標識化によりｉｎ　 ｖｌｔｒｏの抗原の局在化に用いることもできる。

これらの抗体はそれ自体補体媒介溶解において治療目的のために使用することが でき、或いは毒素或いはその他の治療部分と結合することができる。

抗体のクラス切換えは細胞融合或いはハイブリドーマ技術から得られる抗体の会 合、凝集成いはその他の性質を変更することが望ましい場合に有用である。例え ば、殆んどのヒト−ヒトモノクローナルはそれらの減少及び凝集の容易さが知ら れている１ｇＭクラスのものである。

その様な抗体を他の抗体タイプ例えばＩｇＧＳ　ＩｇＡ或いはＩｇＨに変更する ことは、従って極めて大きな利益がある。

混合抗体−酵素分子はＥＬＩＳＡなどの免疫診断方法に用いることができる。混 合抗体−ペプチドエフェクター複合体は高度の効率及び特異性をもってエフェク タ一部分の目標をもった移動に用いることができる。

以上、一般的に本発明を説明したが、本発明は例示を目的としてのみ包含され、 特に断りのない限り、限定することを意図するものではないある具体例を参照す ることにより更に理解されるであろう。

ヒト細胞系ＧＭ２１４６及び０Ｍ１５００はヒト突然変異細胞貯蔵所（Ｈｕａ＋ ａｎ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）　（カムデン、ニュー ジャージ州）から得られ、ＲＰＭ　１１６４０プラス１０％ウシ胎児血清（Ｍ、 Ａ、　Ｂｊｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で培養した。これらの細胞系Ｓ　ｐ　２１０ 及びＣＲＬ８０１７はアメリカン・タイプ争カルチャー・コレクション（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から得られ、 ダルベツコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）プラス４．５ｇ／ρグルコース（Ｍ 、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）プラス１０％ウシ胎児血漬０１ｙｃｌｏｎｅ 、　５ｔｅｒｉｌｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　ｏ　−ガン、ユタ州）中で生育された 。培地にはペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ　、アービン、カリフォルニア州）が補給された。

組換えプラスミド及びバクテリオファージＤＮＡプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＬ 、／及びｐＵｃ１２はファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｌｃａｌｓ）　（ミルウオーキー、ライスコンシン州 ）から購入した。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ及びｐＳＶ２−ｇｐｔはＢＲＬ　 （ゲイタースバーグ、メリーランド州）から得、アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴＹｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ）　（ロックビル、メリーランド州）から利用可能である。ｐＨｕ　 −ガンマ−１はヒトＩｇＧ１染色体遺伝子の８．　３ＫｂＨｉｎｄＩＩＩ〜Ｂａ ｍＨＩ断片のサブクローンである。ヒトＩｇＧＩ染色体遺伝子の別の単離体はエ リソン等（Ｅｌｌｌｓｏｎ、　Ｊ、Ｗ、　ｅｔ　ａｔ、）　、ヌクレイツク会ア シツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１０　：　４０７ １（１９８２）により説明されている。Ｍ８アルファＲＸ１２はＭ１３ｍｐ　１ ０中に挿入されたＭ６０３染色体遺伝子〔デービス等（Ｄｅｖｌｓ、　Ｍ、　ｅ ｔ　ａｌ、）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２８３　：　７３３）のＪ− Ｃイントロン領域からのマウス重鎮エンハンサ−を含有する０、７ＫｂＸｂａＩ −ＥｃｏＲＩ断片を含有する。Ｇ−尾部ｐＵＣ９はファルマシアＰ　−Ｌ　（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　）から購入した。浮遊密度遠心分離によるプラスミ ドＤＮＡの精製、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片の精 製、Ｅ、コリの連結及び形質転換を含むＤＮＡ操作はマニアティス等（Ｍａｎｉ ａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　）　％モレキュラー・クローニング；ア・ラ ボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｉｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）（１９８２）により説明されている。制限酵素 及びその他のＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素はベーリンガーーマンノ１イム（Ｂｏｃｈ ｒｉｎｇｃｒ−Ｍａｎｎｈｃｉｍ　）　（インシイアナポリス、インディアナ州 ）　、ＢＲＬ、ニュー゛・イングランド・Ｉ（イオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｂｌｏｌａｂｓ　）　（ベバリー、マサチューセ−／　ツ州）及びファル マシアＰ　−Ｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ）から購入した。

オリゴヌクレオチド調製 オリゴヌクレオチド類はイト−等（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、）　（ヌクレイツク・ アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　）１０　：１７５ ５　（１９８２））のトリエステル法により合成したか或いはＥＬＥＳＥＮ、ロ サンゼルス、カリフォルニア州から購入した。トリチル化された、脱保護された オリゴヌクレオチド類は５ｅｐｈａｄｅｘ　−Ｇ　５０上で精製した後Ｃ１８ｕ 　Ｂｏｎｄａｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ１ａｔｅｓ　）上で１０ ｍＭ）リエチルアミンー酢酸、ｐＨ７，２中で０〜２５％勾配のアセトニトリル で逆相ＨＰＬＣを行った。脱トリチル化は８０％酢酸中で３０分間行った後、３ 回蒸発させた。オリゴヌクレオチド類は〔ガンマ−３２Ｐ）ＡＴＰプラスＴ４ポ リヌクレオチドキナーゼで標識化した。

ＲＮＡ調製及び分析 全細胞ＲＮＡはオーフレー（Ａｕｆ’ｆ’ｒａｙ＋　Ｃ，）及びルージョン（Ｒ ｏｕｇｅｏｎ、　Ｆ、　）の方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ ミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　ＢｉｏｃｈｅｒＡ、）、１０７　：　３０３　（ １９８０）］或いはチルギン等（Ｃｈｌｒｇｖｌｎ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、 　）　Ｃバイオケミストリ（Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ）　１８　：　５２９４ 　（１９７９）　）の方法により組織培養細胞から調製した。ポリ（Ａ）”　Ｒ ＮＡ、メチル−水銀アガロースゲル電気泳動及びニトロセルロースへのｒノーザ ン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）　Ｊ転移は上記マニアテイス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　 Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　）により説明されるものと同様である。全細胞ＲＮＡ或い はポリ（Ａ）”　ＲＮＡは先ずＲＮＡをホルムアルデヒドで処理することにより 〔ホワイト（Ｗｈｉｔｅ、　Ｂ、Ａ、及びバンクロフト（Ｂａｎｃｒｏｉ’ｔ。

Ｆ、Ｃ，）　、ジャーナルψオブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｌｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、）２５７　：　８５６９　（１９８２）　）、直接にニトロセ ルロースに結合した。フィルター結合ＲＮＡへのハイブリダイゼーションはマル グリース等（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、　Ｄ、１１．　ａｔ　ａｌ、）　（ネイチャ ー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２９５　：　１６８　（１９８２））により説明された 条件を用いてニック−トランスレーションされたＤＮＡ断片を用いて或いは４Ｘ ＳＳＣ，ＩＯＸデンハルト１００μｇ／　ｍｌサケ精子ＤＮＡを３７℃で一晩用 いて３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドにより行った後３７℃で４ＸＳＳＣ中で 洗浄した。

ｃＤＮＡ調製及びクローニング オリゴ−ｄｔ合成開始ｃＤＮＡライブラリーはＧＭ１５００及び０Ｍ２１４６細 胞からランド等（Ｌａｎｄ、　Ｈ。

ｅｔ　ａｌ、）　（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｃｓ　Ｒｅｓ、）　９　：　２２５１　（１９８１）　）　、及びガブラ −（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｖ、）及びホフマン（Ｈｏｒｌ’ｌｌ１ａｎ、　Ｂ、Ｊ、 　）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２５　：　２６３　（１９８３）　）　（１）方 法によりそれぞれ調製された。これらのｃＤＮＡライブラリーについてｔｎ　５ ｔｔｕハイブリダイゼーシヨン〔上記Ｔ、マニアティス（Ｍａｎｌａｔｉｓ、　 Ｔ、）　）により上記条件を用いて３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドにより或 いはデランゲ等（ｄｅ　Ｌａｎｇｅ　ｅｔ　ａｔ、　）　（セル（Ｃｅ１１）　 ３４：８９１（１９８３）］の条件を用いてニック−トランスレーションされた ＤＮＡ断片でスクリーニングを行った。

オリゴヌクレオチドプライマー延長及びクローニングポリ（Ａ）　ＲＮＡ　（２ ０Ｍｇ）を１２．μｇのプライマーと４０Ｍｇの６４ｍＭ　ＫＣｌ中で混合した 。

９０℃で５分間変性及び水中で冷却後、３単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼ抑制 剤（ＢＲＬ）を３μｇのＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，３に添加した。このオ リゴヌクレオチドを４２℃のＲＮＡに１５分間アニーリングし、次いで１２Ｍｇ の、０５Ｍ　ＤＴＴ、、０５ＭＭｇＣ１２、及び各々１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴ Ｐ。

ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを添加した。２μｇのアルファー３２Ｐ　−ｄＡＴＰ　（ ４０００１／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ　）を添加した 後３μｇのＡＭＶ逆転写酵素を添加した（１９単位／　ｕＲｓ　Ｌｉｆｅ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ　）。

４２℃で１０５分間インキュベーション後、２μｇの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ及び５ ０μｉ）の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，６を添加した。組込まれなかったヌクレオチド類を ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０スパンカラムクロマトグラフイにより除去し、Ｒ ＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをフェノール、次いでクロロホルムで抽出し、エタノ ールで沈澱させた。二番目の鎖合成、ｄＣＴＰ或いはｄＣＴＰによるホモポリマ ーティリング及びホモポリマーティリングされたベクター中への挿入は上記ガブ ラー（Ｇｕｂｌｅｒ）及びホフマン（ＨｏｆＴｍａｎ　）により説明される通り である。

部位一方向突然変異誘発 一本鎖Ｍ１３サブクローンＤＮＡ　（１Ｍｇ）を１２、　５ｕｌ）のＨｉｎ緩衝 液（７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６，７ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．５ ０ｍＭＮａＣ１）中において２０ｎＨのオリゴヌクレオチドブライマーと合一し た。密封管中において、９５℃に加熱後、プライマーをゆっくり７０℃から３７ ℃に９０分間冷却することにより鋳型にアニーリングした。２μｇのｄＮＴＰｓ 　（各１ｍＭ）、１μρ３２Ｐ　−ｄＡＴＰ　（１０μＣＩ）％１μｇのＤＴＴ 　（０，１Ｍ）及び０．４μｇのフレノウＤＮＡ　Ｐｏ　Ｉ　Ｉ　Ｃ２ｕ、Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅｉｍ）を添加し、鎖を３７℃で３０分間延長 した。これに１ｕＤ　（１０ｎｇ）Ｍ１３逆ブライ？　−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）を添加し、加熱／アニーリング及び鎖延長工程が繰返さ れた。反応は２μｇの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８プラス８０ｕｆｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ。

ｐ）ｉ７．６．１ｍＭ　ＥＤＴＡで停止された。生成物をフェノール抽出し、５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０スパンカラムクロマトグラフイにより精製し、エタ ノール沈澱してから制限酵素消化及び適当なベクターへの連結を行った。

ミエローマ組織培養細胞のトランスフェクションプロトプラスト融合のためにオ チ等（Ｏｃｈｉ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　３ ０２　：　３４０　（１９８３）　）の方法の変法を用いた。０．７のＡ６ｏｏ における５０ｍ１の細菌をサンドリーゴルディン等（Ｓａｎｄｒｉ−Ｇｏｌｄｉ ｎ、　Ｒ，Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、）　（モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏｌ、）　、１　：　７４３　（１９８１）　）の方法により転換し 、次いで２０　ｍｌ　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍプラス１０九ＦＢＳで希釈した（最終容積 は２５ｍ１）、５ｐ２１０細胞を採取し、２　＋　２００　ｘ　ｇでペレット化 し、洗浄し、再ベレット化し、及び２−５Ｘ１０６／ｍｌでＤＭＥＭ中に再懸濁 した。細菌プロトプラスト（１０ｍｌ）を１０×１０６Ｓｐ２１０細胞と混合し 、４，０００Ｘｇにおいて２２℃で２０分間遠心分離によりペレット化した。上 澄液をピペットで除去した後、ベレットを管を振盪させることにより残存培地滴 中に懸濁した。ＤＭＥＭ中の２ｍｌの１０％ＤＭＳ０，３７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ６０００（Ｋｏｄａｋ　）を混合しながら４５秒間に亘って滴加した。

１５秒後、ＤＭＥＭ中４２％のＰＥ０６０００．２ｍｌを４５秒間に亘って添加 した。完全ＤＭＥＭ　（４５ｍｌ）を混合しながらゆっくり添加した。細胞を２ ，５００Ｘｇでベレット化後洗浄し３回ペレット化した。

ボッター等（Ｐｏｔｔｅｒ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　）　［プロシーディングズ拳 オブーナショナル・アカデミツク番サイエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　）　、８１　ニア１６１　（１９ ８４））のエレクトロポレーション法を用いた。トランスフェクション後細胞を 完全Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中において４８〜７２時間回収させ、次いで９６−ウェル培 養プレート内において選択培地の存在下においてウェル当り１０．０００〜５０ ，０００細胞を接種した。

Ｇ　４１８　（ＧＩＢＣＯ）選択は０．８ｍｇ／ｍｌで行われ、ミコフェノール 酸（ＣａｌｂｉｏｃｈｅＩｌｌ）は６１１Ｊ’／ｍｌプラス０．２５ｍｇ／ｍｌ キサンチンであり、ＨＡＴ　（Ｓｉｇｍａ　）は標準濃度であった。

イムノグロブリン合成及び分泌のアッセイ分泌されたイムノグロブリンは直接組 織培養細胞上澄液から測定された。細胞質タンパク質抽出物は１×１０６個の細 胞を１６０μｇの１％ＮＰ４０．０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、 １ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ７，６中において０℃で１５分間渦巻攪拌した後１０．０００Ｘｇにおいて 遠心分離して不溶性破片を除去して調製した。

アフィニティ精製抗血清を用いる二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ（ホラ−等（ Ｖｏｌｌｅｒ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、？−ユアル・オブ・クリニカル・ イムノロジー（Ｍａｎｕａｌ　ｏｒＣＩｉｎｌｃａｌ　ＩｍＩｎｕｎｏｌｏｇｙ 　）−第２版、Ｒｏｓｅ＋　Ｎ、及びＦｒ１ｅｄ−１ａＬ　ｎ、編、３５９−３ ７１頁、１９８０年〕を用いて特異性イムノグロブリンを検出した。ヒトＩｇＧ の検出のためには、ブレート−結合抗血清は１／１０００稀釈率のヤギ抗−ヒト Ｉ　ｇＧ　（ＫＰＬ、ゲイサースバーグ、メリーランド州）であったのに対して 、ペルオキシダーゼ−結合抗血清は１／４０００の稀釈率におけるヤギ抗−ヒト ＩｇＧ（ＫＰＬ或いはＴａｇｏｓバーリンガム）である。ヒトイムノグロブリン カッパの検出のためにはプレート−結合抗血清は１１５００稀釈率におけるヤギ 抗−ヒトカッパ（Ｔａｇｏ）であるのに対し、ペルオキシダーゼ−結合抗血清は １／１０００稀釈率のヤギ抗−ヒトカッパ（Ｃａｐｐｅ　ｌ　）である。

Ｂ型肝炎表面抗原を結合する抗体は市販の（Ａｂｂｏｔｔ。

ＡＵＳＡＢ　）アッセイを用いて検出した。

具　体　例 以下の具体例は各々ヒト定常領域及び非−ヒト可変領域を有するキメラ抗体の製 造を示す。これらの具体例は段階的キメラ抗体の製造方法を素描するものである 。

（１）重鎮ヒト定常領域のためのｃＤＮＡクローン及びそれを含むビヒクルの調 製 細胞系ＧＭ２１４６をｍＲＮＡ調製及びｃＤＮＡクローニングにおける源として 用いた。この細胞系はＩｇＧ１を分泌する〔シモンズ、Ｊ、Ｇ、等Ｃ３ｌａａｏ ｎｓ、　Ｊ、Ｇ。

ｅｔ　ａｔ、）　、スカンディナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ（Ｓｃ ａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｏｏｎｕｎｏｌ、）　、１４　：　１−１３．１９８１年〕 。この細胞系の試験はそれがＩｇＡ並びにＩｇＧを分泌することを示した。

この細胞系をクローニングしたところ、６個のサブクローンのうち５個はＩｇＧ のみを分泌するのに対し、６個のサブクローンのうち１個はＩｇＡのみを分泌し た。

ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを細胞系から調製し、ｃＤＮＡライブラリーをこのポリ（ Ａ）”　ＲＮＡかうガブラー、Ｕ。

（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、）及びホフマン、Ｂ、Ｊ、（Ｈｏｆｆ’ｍａｎ、　Ｂ、 Ｊ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２５　：　２６３−２６９　（１９８３年）の 方法により調製した。Ｅ、コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１　）菌株ＨＢ１０１及びＲＲＩ 中に形質転換されたｃＤＮＡの初期ブレーティングでは合計１５００のコロニー をもたらし、これをヒトＩｇＧ１　（ｐＨｕ−ガンマ−１）のゲノムクローンの ＨｉｎｄＩＩ［〜ＢａｍＨ１断片にハイブリダイズすることによりスクリーニン グした。４個の陽性クローンが見出された。これらのクローンの一つのＣＨ３コ ード領域を含む断片ｐＧＭＨ−３（第４図）を用いて元のライブラリープラス約 ５０００のコロニーの新しい形質転換を再スクリーニングした。二つの最も大き いクローンｐＧＭＨ−６及びｐＧＭＨ−１５を制限酵素消化により分析した（第 ４図）。両クローンはヒトＩｇＧ１の全定常領域を含有したが、ｐＧＭＨ−６は 明らかにＩｇＧ１　ｃＤＮＡ配列に影響を及ぼすことな（ｐＢＲ３２２ＤＮＡの 約１５００塩基対を削除していたことが見出された。

クローンｐＧＭＨ−６は重鎮可変領域クローニングに対するクローニングベクタ ーの造築におけるＩｇＧ１定常領域モジュールを与えた。

（２）軽鎖ヒト定常領域のためのｃＤＮＡクローン及びそれを含むビヒクルの調 製 １ｇ０２Ｋを産生ずるヒト細胞系（０Ｍ１５００）を初期クローニング相用に選 択した。０Ｍ１５００から調製されたポリ（Ａ）”　ＲＮＡはウサギ網状赤血球 抽出物を用いたｉｎ　ｖｉｔｏｒの翻訳において活性である。ｃＤＮＡライブラ リーをこのＲＮＡからラント等（Ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｔ、）、ヌクレイツク・ア シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、９　：　２２５１− ２２６６　（１９８１年）の方法によりＫｐｎｌ消化及びｄＧ−尾部付ｐＱ２３ をクローニングベクターとして利用して調製した（第５図）。このベクターはｐ ＢＲ３２２のＢａｍＨＩ及び５ａｌＩ部位の間にＢｇｌｍ、ＫｐｍＩ及び５ｓｔ １部位を挿入して含有する。

軽鎖ｍＲＮＡに対応するＧＭ１５００ＲＮＡから発生したｃＤＮＡクローンを同 定するために、ＤＮＡプローブ、ＵＩＧ−ＨｕＫを合成し、精製した。このＵＩ Ｇ−ＨｕＫオリゴヌクレオチドは ５’　−ＡＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴ−３’の配列を有し、Ｊ−Ｃ接合点に おける全ての機能的ヒトカッパｍＲＮＡ種にハイブリダイズするように設計され ている。

このプローブを用いてジデオキシヌクレオチド及び逆転写酵素の存在下にｃＤＮ Ａの合成を０Ｍ１５００ＲＮＡ上で開始した。合計１．２μｇから０Ｍ１５００ ポリ（Ａ）　ＲＮＡを本実験において用い、全Ｊ配列及びＶ領域のいくつかを読 取り、（１）ＧＭＩ５００ＲＮＡが完全であり、（２）カッパプローブが正しい 配列であり、及び（３）ＧＭ１５００軽鎖ｍＲＮＡがＪＫ４配列を含むことを示 した。

軽鎖プローブにハイブリダイズする陽性のｃＤＮＡクローンを選択した。このプ ローブはＪ−Ｃ接合点にハイブリダイズするので、最も重要な点は、クローンが Ｊ領域に加えて完全な定常領域配列を有するかどうかを決定することであった。

二つの最も大きいカッパｃＤＮＡクローンの挿入サイズは０．６及び０．９ｋｂ であり、制限酵素地図作成は全定常領域コード化配列が両クローン中に存在する ことを示した（第６図）。ヒトカッパｃＤＮＡクローンｐｋ２−３を用いてヒト カッパ定常及びＪ領域を含んでなる５ａｕ３Ａ断片をｐＢＲ３２５のＢｃｌＩ部 位中に挿入することにより軽鎖定常領域ベクターｐｌＮＧ２００１を作成した（ 第６Ｂ図）。

ヒトカッパｃＤＮＡクローンの変種をＨｉｎｄｍ部位をＪ領域中に置くことによ り作成した。これはＪ　ＫＨＩ　ＮＤＩＩＩオリゴヌクレオチドブライマーを用 いたｉｎ　ｖｌｔｒｏの突然変異誘発により行われた（第７Ｃ図）。

得られたプラスミドはｐＧＭＬ６０である。

ベクターｐｌＮＧ２００３を哺乳動物細胞内におけるｃＤＮＡ配列の転移及び発 現のために造築した（第１０図）。このベクターはｐＵｃ１２及びＳＶ４０配列 を含有する二つのプラスミドから造築した。ｐＬｌはＳＶ４０早期領域プロモー タ及びＳＶ４０後期領域スプライス配列を提供する。ｐＳＶ２−ネオ配列は、哺 乳動物細胞形質転換及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列のための選択可能 なマーカーを提供する。ｐＵｃ１２はｃＤＮＡ挿入のための多重クローニング部 位を提供する。

このｐｌＮＧ２００Ｂベクターは修飾のための幾つかの有用な制限部位を有する 。これらにはエンハンサ−配列の挿入のために有用なＨｉｎｄＩ［［部位及び交 互プロモータ配列の挿入のために有用なＨｉｎｄｎＩ〜ＸｈｏＩ断片などを包含 する。このベクターは哺乳動物細胞内におけるｃＤＮＡ遺伝子の発現に有用であ る。

エンハンサ−要素のｐＩＮ０２００３への付加イムノグロブリンエンハンサ−要 素は安定に形質転換されたマウスミエローマ細胞におけるそれらの近傍における 遺伝子の転写を数百倍高めることが示された〔ギリース、Ｓ、Ｄ、等（Ｇｉｌｌ ｉｅｓ、　Ｓ、Ｄ、　Ｃｔ　ａｔ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）　、３３　：　７１ ７．１９８３年；及びバナージ。

Ｊｏ等（Ｂａｎｅｒｊｉ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）　、３ ３　ニア２９．１９８３年〕。マウスミエローマ細胞内におけるマウス−ヒトイ ムノグロブリン遺伝子の発現を容易にするために、マウスイムノグロブリン重鎮 エンハンサ−要素をｃＤＮＡ発現ベクターｐｌＮＧ２００３に付加した（第１０ 図）。マウス重鎮エンハンサ−領域ＤＮＡをマウス重鎖ゲノムＤＮＡのＭ１Ｂサ ブクローンから単離した（ＭＳ−アルファーＲＸ１２、ディーンズ、Ｒ，Ｊ。

（Ｄｅａｎｓ、　Ｒ，Ｊ、　）未刊〕。このサブクローンの５ａｉｌプラスＥｃ ｏＲＩ消化から単離されたＤＮＡをＨｉｎｄ■リンカ−で修飾し、ｐ　ｌＮＧ２ ００３のＨｉｎｄＩＩＩ部位中に挿入したところ、新しいｃＤＮＡ発現ベクター ｐ　ｌＮＧ２００３Ｅが得られた。このベクターは哺乳動物細胞、特にマウスミ エローマ或いはハイブリドーマ細胞系におけるｃＤＮＡ遺伝子の効率的な発現に 有用である。

例■：　ヒトーマウスキメラ抗−ＨＢｓＡＧ抗体鎖（１）重鎮マウス抗−ＨＢｓ Ａｇ可変領域のためのｃＤＮＡクローン及びそれを含むビヒクルの調製細胞系Ｃ ＲＬ８０１７をＡＴＣＣから得、サブクローニングした。サブクローンを生育し 、市販の抗−ＨＢｓＡｇ検出キットを用いてマウスＩｇＧ抗−Ｂ型肝炎結合活性 を試験した。３個の陽性サブクローンが見出された。ポリ（Ａ）　ＲＮＡはこれ らのサブクローンの一つから調製され、メチル水銀アガロースゲル上で分別され た。このＲＮＡはカッパＵＩＧ−ＭＪＫプライマー及びマウス重鎖ＵＩＧ−ＭＪ Ｈ３プローブに対する特異的ハイブリダイゼーションから推論されるように完全 な軽鎖及び重鎮ｍＲＮＡを含有した（第７図参照）。加えて、ＵＩＧ−ＭＪＫプ ライマーをジデオキシ配列決定反応における抗−ＨＢｓＡｇポリ（Ａ）　ＲＮＡ の特異的合成開始に用いた。十分な配列が読取られ、抗−ＨＢｓＡｇ細胞系の主 なカッパＲＮＡがＪＫ２配列を含有することを示した。

可変領域ｃＤＮＡ合成のための条件は抗−ＨＢｓＡｇを用いることにより最適化 された。ジデオキシ鎖延長実験は、マウスＵＩＧ−ＭＪＫプライマー及びＵＩＧ −ＪＨ３プライマーは正確にカッパ及び重鎖ＲＮＡの合成を開始したことを示し た。逆転写がジデオキシヌクレオチドの不存在下において行われた場合には、カ ッパＵＩＧ−ＭＪＫプライマーを用いた主生成物は４１０±２０ヌクレオチド断 片であっただのに対し、重鎖ＵＩＧ−ＪＨ３プライマーを用いた主生成物は４３ ０±３０ヌクレオチド断片であった。これらはカッパ及び重鎮イムノグロブリン ｍ　ＲＮ　Ａの可変及び５′未翻訳領域の予想された長さに対応する。ＣＲＬ８ ０１７細胞からのポリ（Ａ）　ＲＮＡの最適合成開始のための条件はモノクロー ナル抗体を産生ずる任意の細胞系から単離されるポリ（Ａ）”　ＲＮＡに対して 良く作用すべきである。

オリゴヌクレオチドを用いてハイブリドーマｍＲＮＡの合成開始のための最適条 件を決定した後、二つのオリゴヌクレオチドを設計し、重鎖Ｖ領域ｃＤＮＡ合成 のために用いた。これらの二つのオリゴヌクレオチドはＵＩＧ−ＭＪＨＢＳＴＥ Ｉ　Ｉ　（１３）及びＵＩＧ−ＭＪＨ３である（第７図及び第８図）。プライマ ー配列は、それがその部位において後者のＪ領域における同様な位置においてヒ トＩｇＧ１定常モジユールに接合することができるようにクローン中にＢｓｔＥ ＩＩ認識部位（ＧＧＴＧＡＣＣ）を導入するように設計された。この場合に、プ ライマーはＪＨ３コード化配列配列いるマウスｍＲＮＡ配列と単一のＧ対Ｕ不適 正塩基配列を有した。

ＵＩＧ−ＭＪＨＢＳＴＥＩ　Ｉ　（１３）プライマーは１３塩基長であり、不適 正配列残基はその７個の組合せ５′及び５個の組合せ３′により側面が配置され た。これが１３−７−Ｂ　ｓ　ｔ　ＥＩ［プライマーであった。この１３−マー ＢｓｔＥＩＩオリゴヌクレオチドの合成開始効率を評価するために、マウスＪＨ ３（ＵＩＧ−ＭＪＨ３）に特異的な２１−ｍｅｒプライマーを用いた。このプラ イマーはその３′末端上の１７個のヌクレオチドに対して完全な組合せを有した 。

これらの二つのプライマー及びＪＨ３コード化配列配列８図に示す。１３−ｖ− ＢｓｔＥＩＩ及び２ｌ−７−ＪＨ３プライマーを介して作られた第一の鎖ｃＤＮ Ａ生成物は全ｖＨ領域を表わす約４３０個のヌクレオチドのバンドを包含した。

用いられた標準的合成開始条件下においては１３−マーＢｓｔＥＩＩの合成開始 効率は２１−マーＪＨ３のそれよりはるかに小さかった。従って、ｃＤＮＡライ ブラリーはこれらのプライマーの各々の最初の鎖合成から上記ガブラー（Ｇｕｂ ｌｅｒ）及びホフマン（Ｈｏｆ’ｆ’ｍａｎ　）の方法を用いて得られた。

先ず、２１−マーＪＨ３ライブラリーを２１−マーＪＨ３オリゴヌクレオチドを 用いてスクリーニングした。

フィルターハイブリダイゼーションをランゲ、Ｔ０等（Ｌａｎｇｅ、　Ｔ、　ｅ ｔ　ａｌ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）　、３４　：　８９１−９００　（１９８３ 年）に従って３０°で一晩行った。フィルターを次いで５１＠において６ＸＳＳ Ｃ，０，１％ＳＤＳ中において洗浄した。５個のコロニーを選択した。

最大のものは約４６０ｂｐのインサートを有した。より重要なことは、それがプ ライマー配列の上流に存在する公知のＪＨ３配列から予測された三つの制限部位 を含有したことである。このクローンｐＪ３−１１を鎖−末端法【ワラス、Ｒ， Ｂ、等（Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、）　、シリＪＨ３プライマ ーを用いて配列決定した。得られた配列は残りのＪＨ３コード化セグメントを有 する。直ぐ上流における１３−ヌクレオチドセグメントが公開されたＤセグメン ト配列（Ｄｓｐ　２．２）（クロサワ、Ｙ等（Ｋｕｒｏｓａｖａ、　Ｙ、　ｅｔ 　ａｌ、　）　、ジャーナル−オン９エキスベリメンタルψメデイシン（Ｊ、　 Ｅｘｐ、　Ｗｅｄ、）　、１５５　：２０１　（１９８２）　、及びトネガワ、 Ｓ、（Ｔｏｎｅｇａｖａ。

Ｓ、）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３０２　：　５７５（１９８３）） と一致した。この領域から予測されたノナペプチドは、重鎮分子のＦＲＢを含ん でなるアミノ酸残基８６〜９４における公刊されたマウス重鎖Ｖサブグループに 対する特性的相同を示した。プラスミドｐＪ３−１１は再配列ＶＤＪ配列を表わ し、及び明らかに細胞系により産生された抗−ｖＨ肝炎配列を含有した。

Ｊ領域において、ＢｓｔＥＩＩ部位を有したＶａ領領域ＤＮＡクローンを単離す るために、ｐＪ３−１１からの２６５ヌクレオチド長のＡｌｕｌ−５ａｕ９６１ プローブを次いで用いて１３−マーＢｓｔＥｎプライマーから発生したｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングした。

６個の陽性クローンが単離された。最も大きいｐＢＳ１３−１を更に分析した。

インサートは２８０ヌクレオチド長でありその制限地図は導入したＢｓｔＥｎ部 位以外はｐＪ３−１１のそれと合致した。第９図はこれらの二つのインサートが 如何に組合されてモジュール−接合ＢｓｔＥ１１部位を有するｖＨクローンであ るｐＭＶＨＣａ　−１３を発生するかを図示する。３個の追加のＶ　Ｈｃ　Ｄ　 Ｎ　ＡクローンをＢｓｔＥ１１部位を含有する２１−マーオリゴヌクレオチドＵ ＩＧ−ＭＪＨ３ＢＳＴＥＩ　Ｉプライマーから発生されたｃＤＮＡライブラリー から単離した。これらのクローンはヒトＣ配列に接合する代替的Ｖ　ａ　ｃ　Ｄ 　Ｎ　Ａ配列を提供する。

（２）軽鎖マウス抗−ＨＢｓＡｇ可変領域のためのｃＤＮＡクローン及びそれを 含むビヒクルの調製ＪＫ２配列は抗−肝炎ハイブリドーマ細胞系から調製された ｍＲＮＡ中に存在するので、オリゴヌクレオチドＵＩＧ−ＪＫ２ＢＧＬＩ　Ｉ　 （第７Ｂ図）はＢｇｌＩ［部位をＪＫ２領域中に導入するように設計された。Ｂ ｇｌｍによる消化は次いで前記ヒトＣＫベクターｐＩＮＧ２００１のＢｅ１１部 位中へのＶ　Ｋｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　：’−ド化領域の直接挿入を可能にするであろ う。この挿入の結果、マウス可変領域セグメント（Ｊ領域を含む）のヒトカッパ 定常領域セグメントへのそれぞれ適当なコード化フレームにおける且つマウス可 変領域或いはヒト定常領域のいづれに対してもアミノ酸配列の変更のない正確な 連結を生ずるであろう。

ＪＫ２ＢＧＬ　Ｉ　Ｉオリゴヌクレオチドを用いて抗−ＨＢｓＡｇ　ｍＲＮＡの 合成を開始して、ｐＵＣ９における上記重鎮に対すると同様にｃＤＮＡライブラ リーを形成した。このＣＤＮＡはクローニングに先立ちポリアクリルアミドゲル 電気泳動によりサイズ選択し、８０％のｃＤＮＡクローンは３００〜７５０ヌク レオチド長さの間のインサートサイズを有することが示された。このライブラリ ーのレプリカフィルターを二つのオリゴヌクレオチド、元のプライマー及び元の プライマーに対するＪＫ２配列５′に相補的な第二のプローブを用いてスクリー ニングした。

抗−Ｂ型肝炎モノクローナル細胞系ＣＲＬ８０１７は少なくとも二つの異った軽 鎖を有するイムノグロブリンを分泌するこが見出された。それらの一方は抗−Ｂ 型肝炎細胞系を発生する際の融合パートナ−として用いられたミエローマＮ５− １から誘導される。Ｎ５−１はミエローマＭＯＰＣ２１から誘導されるので、Ｍ ＯＰＣ２１Ｖ　Ｋｍ　ＲＮ　Ａが抗−肝炎モツクローナル細胞系からのＶ　ｘ　 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー中に存在する可能性が検討された。事実、分析され た一つのｃＤＮＡクローン（ｐ６Ｄ４Ｂ）は挿入されたＢｇｌｌＩ部位を除いて はＭＯＰ　Ｃ２１ＶＫｃ　Ｄ　ＮＡのそれと同一の制限酵素地図を有する。

これらの結果から二つの結論を引出すことができる。

第一は、ハイブリドーマ細胞系からｖＫ領領域クローニングしながら制限酵素部 位を導入するために有効的にオリボヌクレオチドを用いることが可能である。第 二は、その１個のみが目的配列である複数のＶ領域配列の存在に対してハイブリ ドーマ細胞系を注意深く追跡しなければならないことである。

更に、細胞系ｍＲＮＡ中に存在するカッパ軽鎖Ｊ領域を特性化するために、ポリ （Ａ）”　ＲＮＡをホワイト（Ｗｈｉｔｅ　）及びバンクロフト（Ｂａｎｃｒｏ ｆ’ｔ）　、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｌｏ ｌ。

Ｃｈｅｍ、）　、２５７　：　８５６９　（１９８２）のホルムアルデヒド「ド ツトプロット」法によりニトロセルロースに結合した。このＲＮＡを各機能的カ ッパＪ領域に特異的な３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした 。これらのプローブは第７Ｂ図にＵＩＧプローブ５ＪＫ１、ＭＪＫ、５ＪＫ４及 び５ＪＫ５として示されている。これらの結果はｍＲＮＡがＭＪＫ及び５ＪＫ４ オリゴヌクレオチドプローブの両者に強くハイブリダイズしたことを示し、Ｊ　 ２及びＪＫ４配列が共に存在することを示た。Ｊ　ｘ　２　ｒｎ　ＲＮ　Ａは先 に親ハイブリドーマパートナ−ＮＳ−１から誘導されたものとして確認されたの で、Ｊ　Ｋ４　ｒｎ　ＲＮ　ＡはＣＲＬ８０１７細胞の抗−肝炎結合特異性をコ ード化するものと結論付けられた。

二つの異ったｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてＪＫ４配列をコード化 するＶ領域クローンを単離した。第一のものは上記ＪＫ２ＢＧＬＩＩにより合成 を開始された。第二のものはＪ　Ｋ４　ｍ　ＲＮ　Ａに対して特異的でありクロ ーン化Ｖ領域のＪ領域中にＢａｌＩＩ部位を導入するオリゴヌクレオチドブライ マーＪＫ４ＢＧＬＩＩを用いて作った。ＪＫ４ＢＧＬＩＩプライマーを用いて第 −鎖ｃＤＮＡ合成を開始し、ｃＤＮＡがクローニングに先立ちサイズ選択されな かった以外はＪＫ２ＢＧＬＩＩ合成開始ｃＤＮＡライブラリーを造築するのに用 いたのと同一方法によりｃＤＮＡライブラリーを造築した。

第７Ｂ図は各プライマーが他の機能的マウスカッパＪ領域配列に対して有する不 適正塩基配列を表示するものである。ＪＫ４はＪＫ２ＢＧＬＩ　Ｉプライマーと 対比した際に２１個のヌクレオチド中に５個の不適正塩基配列を有し、及びＪＫ ４ＢＧＬＩＩプライマーと対比した場合に２３個中に３個の不適正塩基配列を有 することに注意。

両うイブラリーＪＫ４配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（５Ｊ 　Ｋ４）にハイブリダイズさせることによりＪＫ４配列を含有するＶ領域クロー ンについてスクリーニングした。このスクリーニングの結果を表１に示す。

表　１＊ ライブラリー　プローブ特異性 ＪＫ２ＢＧＬＩＩ　２％（３０／１５００）　０．１５％（２／１５００）ＪＫ ４ＢＧＬＩＩ　Ｎ／Ｄ　３．５％（３１／８７５）＊ＪＫ２或いはＪＫ４配列プ ラスＶ領域を含有するクローンのパーセント。用いられたプローブはオリゴヌク レオチド５ＪＫ４　（ＪＫ４特異性、第７図）及びＮ５−１　（ＭＯＰＣ２１） Ｖ領域配列を含有するｐ６Ｄ４Ｂであった。Ｎ／Ｄは行われなかった。

両ライブラリーから単離された幾つかのＪＫ４　ｖ領域ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン の特性を決定した。これらのクローンはオリゴヌクレオチド合成開始ｃＤＮＡク ローニング操作から生ずる設計されたＢｇｌｎ部位を含む同一の制限酵素地図を をする。一つのクローンｐＶ１７の制限地図及び配列はｐＶ１７がＶ領域遺伝子 配列を含有するこ六を示す。

これらの結果は、ＪＫ２ＢＧＬＩ　Ｉプライマーが不十分ではあるが、正確にＪ 　Ｋ　４　ｍ　ＲＮ　Ａ配列の合成を開始しうろことを示している。ＪＫ２ＢＧ ＬＩＩプライマーはＪ　Ｋ４　ｍ　ＲＮ　Ａとよりも他の如何なるＪＫ領域ｍＲ ＮＡとより少ない不適正塩基配列を有したので（第７Ｂ図）、その他のＪ　Ｋ　 ｍ　ＲＮ　ＡはＪＫ２ＢＧＬ　Ｉ　Ｉプライマーを用いてより良い効率で正しい 位置に合成開始され得ることが予想される。この様に、ＪＫ２ＢＧＬＩＩ及びＪ Ｋ４ＢＧＬＩＩプライマーの混合物を用いるこにより任意の機能的マウスカッパ Ｖ領域の効率的ｃＤＮＡクローニングが得られる。

■領域のｃＤＮＡクローニングに際してＪ領域中にＢｇ１１１部位を入れること はクローン化マウスＶ領域遺伝子モジュールのヒトカッパ定常領域遺伝子モジニ ールへの接合を可能にする（第９Ｂ図）。

前記実験が行われた後にｃＤＮＡクローンｐＶ１７は完全な５′コード化領域を 欠乏することが判明した。ヌクレオチド配列決定は開始コドンＡＴＧのＡがｐＶ １７中で複製されなかったことを示した。これは二つの他のｃＤＮＡクローンが 同一欠陥を有したのでランダムｃＤＮＡクローニング人工産物ではなかった。二 つの接近手法を工夫して完全な５′コード化領域を有する軽鎖遺伝子を得た。

第一に、新しいｃＤＮＡライブラリーを先ず５′末端から１５５塩基のｐｖ１７ 配列に相補的なオリゴヌクレオチド（５’　−ＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴ ＣＴ−３′）を用い合成開始することにより造築した。このライブラリーから、 ｐＶ１７　ＤＮＡ断片プローブにハイブリダイズするクローンを選択し、これら の新しいｃＤＮＡクローンの幾つかは開始ＡＴＧプラス約２０ヌクレオチドの５ ′未翻訳領域ををする。これらのクローンの一つ、ｐ２−１２は２３個のヌクレ オチドの５′未翻訳領域及び完全なＡＴＧ開始コドンを供給する。ｐ２−１２を ｐＶ１７誘導配列と組合せると、完全な５′末端を有する可変領域が形成された （ｐＩＮＧ２０１３Ｅ）。

二番目に、存在する軽鎖クローン上の部位一方向突然変異誘発を用いて同時にポ リーＧ路を除去し、リポソーム認歳配列をイニシェーク−ＡＴＧに隣接しておい た。

ｐＶ１７からのＰｓｔｌ断片をＭ１３ｍｐ１８中にサブクローニングした。次い でオリゴヌクレオチド（Ｖ１７−　ＩＶＭ、５’　−ＧＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧ ＣＡＴＧＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣ−３’　”）をプライマーとして用いてｐ Ｖ１７配列を突然変異させて５ａｌＩ部位及びイニシェークーＡＴＧをｐＶ１７ 配列中に導入した。

得られたプラスミドｐＶ１７−ＩＶＭはヒト定常領域モジュールに接合するため の代替的なマウス可変領域を提供した。

ｐＶ１７からの可変領域の完全なヌクレオチド配列を次いで決定した。この配列 は、ｐＶ１７が、幾っがの保存されたアミノ酸を含有するｖＫ−ＪＫ接合領域、 及びＪＫ４ＲＮＡをＵＩＧ−ＪＫ２ＢＧＬＩ　Ｉオリゴヌクレオチドにより合成 開始することにより形成されたハイブリッドＪＫ２／ＪＫ４領域を含有すること を示す。しかしながら、ｐＶ１７中のｖＫ領領域、ＶＫ及びＪＫ領領域同一コー ド化フレーム中にないので非−機能的である。

従ってｐＶ１７　Ｖ領域の翻訳の結果、Ｊ領域が不正確なフレーム内で翻訳され る異常なイムノグロブリン軽鎖が生ずる。この欠陥はケリー、　Ｄ、Ｅ、：等（ Ｋｅｌｌｅｙ、　Ｄ。

Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｈｏｔ、 　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｔ、）　、５　：１６６０−１６７５（１９８５）により 観察されたように非−機能的カッパｍＲＮＡを生ずる誤ったＶ　−Ｊ接合により 引起こされるのかもしれない。

ｐＶ１７　Ｖ領域は異常なイムノグロブリンをコード化するので、この軽鎖が機 能的抗−肝炎抗体分子の一部であることは到底ありそうもない。これらの結果は その一つのみが目的配列であるＶ領域をコード化する複数のＲＮＡ種の存在に対 してハイブリドーマ細胞を追跡することの重要性を示している。

コレ迄見出された二つのｖＫｃＤＮＡ（ＭＯＰｃ２１−９６Ｄ４Ｂ、ｐＶ１７） のいづれのものからでもないＶ　Ｋｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンを探索するために更 にＣＲＬ８０１７　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。先ず、Ｃ ＲＬ８０１７　ＲＮＡから作成されたオリゴ−ｄＴ合成開開始ＤＮＡライブラリ ーをカッパ定常領域に対して特異的なりＮＡ断片プローブを用いて、及び別々に ＭＯＰＣ２１及びｐｖ１７　ｖＫ領領域対して特異的なプローブを用いてスクリ ーニングした。カッパ定常領域を有するが、しかし、ＭＯＰＣ２１或いはｐＶ１ ７のそれとは異るｖＫ領領域有するｃＤＮＡクローン（ｐｌＥ９Ｌ−８１）が見 出された。このオリゴ−ｄＴ合成開開始ＤＮＡライブラリーのスクリーニング方 法は、ニック−トランスレーションされた高特異活性のプローブが用いられるの で、ｃＤＮＡライブラリーのオリゴヌクレオチドスクリーニングに対する有用な 代替法である。又、この方法は適当なプローブ選択により全ｖＫクローンなどの 幾つかのクラスのＶ領域クローンの同時単離を可能にする。第二に、ＣＲＬ８０ １７ＲＮＡから作られたＵＩＧ−ＪＫ２ＢＧＬＩ　Ｉ−合成開始ｃＤＮＡライブ ラリーをＵＩＧ−５ＪＫ２オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニング した（第７図参照）。その構成員がｐｌＥ９Ｌ−８１に相同的であり、ＵＩＧ− ５ＪＫ２プローブにはハイブリダイズするが、しかし、ＭＯＰＣ２１−ＶＫＫｃ −ブにはしない新しいクラスのＶ　Ｋｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンが見出された。こ れらのクローンの制限酵素部位地図及びヌクレオチド配列は又ＣＲＬ８０１７細 胞からのＭＯＰＣ２１−相同性ＶＫｃＤＮＡクローンと異る。しかしながら、こ れらのクローンは非機能的ｍＲＮＡを生ずる誤ったＶ−Ｊ接合を有し、キャビン −（Ｃａｂｉｌｌｙ　）及びリッグス（Ｒｌｇｇｓ）　（ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ４０：１５７　（１９８５））により説明されたものと同一であるように思われ る。

従って、抗−Ｂ型肝炎細胞系ＣＲＬ８０１７は上記ｃＤＮＡクローンｐ６Ｄ４Ｂ 　（ＭＯＰＣ２１）、ｐｌＥ９Ｌ、及びＩ）　Ｖ　１７　ニ対応すルＶ　ｙ、　 ｍ　ＲＮ　Ａ　（Ｄ少なくとも三つのクラスを有すると結論付けられた。

ｐｌＥ９Ｌ及びｐＶ１７クローンは誤って再配列されたカッパ遺伝子からのｍＲ ＮＡから誘導されるのに対し、ｐ６Ｄ４Ｂクローンは親ハイブリドーマ融合パー トナ−ＮＳ−１から誘導される。これらのクローンのいづれも目的抗−肝炎軽鎖 をコード化するようには思われない。

（３）ヒト定常／マウス可変領域を含有する重鎮の調製及び発現 ｐＭＶＨＣａ　−１３におけるＶ領域配列をヒトＩｇＧ１定常（Ｃ）領域クロー ンｐＧＭＨ−６に接合した。ｐＧＭＨ−６のＩｇＧＩＣＨ１領域内の第二のＢｓ ｔＥ１１部位の存在により、多段連結が必要とされた。

先ず、ｐＧＭＨ−６のＪ−ＣＨＩ領域からの２２０個のヌクレオチドＢｓｔＥｎ 断片をｐＧＭＨ−６の１１００個のヌクレオチドＩｇＧ領域ＢｓｔＥＩＩ　〜Ｂ ａｍＨＩ断片に連結した。別の連結において、マウスＶ領域を含んでなるｐＭＶ ＨＣａ−１３の４２０個のヌクレオチドＢｓｔＥＩ［〜ＢａｍＨＩ断片を仔つシ 直腸ホスファターゼ処理ＢａｍＨＩプラスミドベクターに接合した。これらの二 つの連結体を合一し、リガーゼを添加し、及び生成物をＨＢ　１０１中に形質転 換したところ、キメラマウスｖ−ヒトＣりｏ−ンｐＭＶＨＣｃ　−２４が得られ た（第９Ａ図）。

ｐＭＶＨＣｃ−２４中のハイブリッド重鎮遺伝子のＶ領域を更に部分配列分析に より分析した。この分析はクローン化されたＶ領域が公知のＤ配列ＤＳＰ２．２ 　（上記クロサワ及びトネガワ）に一致する。Ｄ配列を含有することを示した。

この配列は又公知のマウスＶ重鎖す−ダーペプチド配列と同様な１９個のアミノ 酸リーダーペプチド及び少なくとも３個のヌクレオチドの５′未翻訳領域も予測 した。

ｐＭＶＨＣｃ−２４のマウスーヒトハイブリッド重鎮遺伝子を含有するＢａｍＨ Ｉ断片をＢａｍＨ１消化ｐｌＮＧ２００３Ｅベクターにクローニングしたところ 、発現プラスミドｐｌＮＧ２００６Ｅを得た（第１１図）。

ｐ　ｌＮＧ２００６Ｅプラスミドはマウス重鎖エンノ〜ンサー領域の存在故にＢ リンパ細胞中におけるマウス−ヒトキメライムノグロブリン遺伝子の効率的発現 の増大した確率を有すべきである。

ｐＭＶＨＣｃ−２４中に存在するキメラ重鎖遺伝子の修飾を行って初期ＡＴＧに 先行するオリゴ−ｄＣ領域を欠乏する代替的重鎮遺伝子を与えた。ｐｌＮＧ２０ １２Ｅ及びｐ　ｌＮＧ２００６Ｅベクターは、第１２図に示される如＜、ＡＴＧ の直前のヌクレオチド以外は同一である。

ｐ　ｌＮＧ２００６Ｅ及びｐＳＶ２−ｎｅｏプラスミドを宿す細菌をサンドリー ゴルディン、　Ｒ，Ｍ、等（Ｓａｍｄｒｉ−Ｇｏｌｄｌｎ、　Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　 ａｌ、）　、モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　 Ｂｉｏｌ、）　、１　：　７４３（１９８１年）の方法によりプロトプラストに 転換した。

これらのプロトプラストを次いで別々にポリエチレングリコールにより処理〔オ チ等（Ｏｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　）　、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３０２ 　：　３４０，１９８３）によりＳＰ２１０−Ａｇ１４ハイブリドーマ細胞（Ａ ＴＣＣＣＲＬ　１５８１）中に融合した。融合細胞を完全培地中において７２時 間回復させてから９６−ウェル組織培養プレート内でウェル当り１０．０００或 いは５０．０００細胞にてブレーティングした。これらのセルを６４１８を０． ．８ｍｇ／ｍｌで用いて幾つかのウェル内の生育が明確となった２週間選択した 。これらの選択条件下において、５ｐ２１０細胞はＧ４１８により４〜７日以内 に完全に殺された。ベクター内に存在するｎｅ。

遺伝子を合体し、発現した細胞のみが６４１８選択下に生育する。これらの合体 トランスフェクシントによる成長が陽性であるウェルの数を表２に示す。

１０．００１１細胞数　５０．０００細胞数菌株／プラスミド　／ウェル　／ウ ェルＭＣ１０６１／ ｐｌＮＧ２００６Ｅ　３（１３％）　１２（５０％）ＭＣ１０６１／ ｐｓＶ２−ｎｅｏ　７　（２９％）　４（１７％）ＭＣ１０６１／なし　ＯＯ ＊ウェルのパーセントは２４個のウェルからの陽性の生育を示す。

ｐ　ｌＮＧ２００６Ｅ及びｐＳＶ２−ｎｅｏによりトランスフェクションされた 細胞のＲＮＡ及びタンパク質レベルにおけるイムノグロブリン遺伝子発現の試験 を行った。全細胞ＲＮＡはトランスフェクションされた細胞から調製され、ニト ロセルロースに結合され、及びマウス−ヒトハイブリッド重鎮遺伝子に特異的な ニック−トランスレーションされたプローブに／Ｘイブリダイズされた。

遺伝子の発現をＲＮＡレベルで表わす強いシグナルを有する二つのクローンが見 出された。マウス−ヒトプローブにハイブリダイズする全細胞ＲＮＡの量は元の ／Ｘイブリドーマ細胞内の重鎖ＲＮＡ割合の約１／１０であるように思われた。

これはおそれらくトランスフェクションされた細胞の全ｍＲＮＡの約１％を表わ した。

トランスフェクションされたマウス細胞をＥＬＩＳＡアッセイによる細胞質ヒト 重鎮タンパク質産生について試験した。７個のｐｌＮＧ−２００６Ｅ）ランスフ エクションされた細胞系のうち３個は検出可能なレベルのヒト重鎮タンパク質を 産生ずることが見出された。最も多いマウス−ヒト重鎮タンパク質を産生ずるマ ウス細胞形質転換体は完全なヒトイムノグロブリンＩｇＧ１を産生するヒトＢ細 胞系の１／１００の稀釈率のそれに匹敵するＥＬＩＳＡアッセイにおけるシグナ ルを与えた。この適度なレベルの検出されたマウス−ヒト重鎮タンパク質はハイ ブリドーマ細胞内における軽鎖の不存在における重鎮の不安定性、或いはキメラ 遺伝子転写の不正確な操作などを含む幾つかの要因によるものと思われる。

（４）合体キメラ遺伝子の遺伝子増幅 サザーンプロット分析はｐＩＮＧ２００６Ｅ　ＤＮＡ配列の複数の複製はマウス ゲノム内において縦に一列に並んで合体されたことを示した。制限酵素Ａｐａｌ 及びＢｇｌｍは共にｐＩＮＧ２００６Ｅを単一に切断する。

形質転換体２ＡＥ９において、予想されたサイズ（８，２ｋｂ）の、ＡｐａＩ或 いは８ｇ１ｍ消化からのバンドはヒトＣガンマ１配列にハイブリダイズすること が判明した（データを示さず）。正しいサイズ（１，６ｋｂ）のＢａｍＨＩバン ドはヒト並びにＩＦ５　ｖＨ配列にハイブリダイズすることが判明した。遺伝子 −複製通宝実験（第１４図）は２ＡＥ９ゲノム内に約５個のｐＩＮＧ２００６Ｅ の複製があることを示した。ＡｐａＩ或いはＢｇｌＩＩレーン内に単一バンドの みが検出されたという事実はこれらの個々の複製が縦に一列に配列されているこ とを示す。１組の二重消化はｐｌＮＧ２００６Ｅ配列がそれらのマウスＤＮＡ中 の導入において再配列を被らなかったことを示した（データは示さず）。

我々は次いで２ＡＥ９細胞を異った選択可能なマーカー、ｇｐｔ遺伝子、を含有 するプラスミドでトランスフェクションし、ＤＭＥＭ−ＨＡＴ中に生育するクロ ーンを選択した。一つのクローン２ＢＨ１０は１０６個の細胞当り約３８ｎｇの 可溶性ヒトガンマ１タンパク質を有する。サザーン分析は２ＢＨ１０が約３０個 のｐｌＮＧ２００６Ｈの複製を有することを示た（第１４図）。そレラは２ＡＥ Ｑ中においてＤＮＡ配列の再配列なしに５個の複製から増幅された（２ＡＥ９パ ネルを２８Ｈ１０と対比せよ）。Ｓ１データ（データ示さず）は、鋳型における この増大がより多量のＩｇＧ遺伝子転写体に導いたことを現わした。これらの配 列は第二の選択の結果として隣接する細胞配列と共に共増幅されたものと思われ る。

例■：　癌抗原特異性を有するヒト−マウスキメラ抗体（１）抗体Ｌ６ Ｌ６モノクローナル抗体（ＭＡｂ）はヒト肺癌からの細胞で免疫化されたマウス から得られ、その後牌臓細胞をＮ５−１マウスミエローマ細胞とハイブリダイズ させた。この抗体は肺癌（腺癌、うろこ状癌）、乳癌、直腸癌及び卵巣癌などを 含む殆んどのヒトの癌からの細胞の表面に多量に発現される従来同定されていな い炭水化物抗原に結合するのに対し、この抗原は成人宿主からの正常細胞中には 僅かに微量存在するに過ぎない。ＭＡｂＬ６はＩｇＧ２ａであり、Ｌ６陽性腫瘍 細胞を溶解するようにイフェクター細胞源としてのヒト末梢血液白血球の存在下 において抗体依存性細胞毒性ＡＤＣＣを媒介することができ、及びそれは補体源 としてのヒト血清の存在下においてＬ６陽性腫瘍細胞を溶解することができ、こ の溶解は４時間のインキュベーション期間に亘る標識化細胞からの５１Ｃ「の放 出として検出される。ＭＡｂＬ６はヌードマウス上に異種移植されたＬ６陽性腫 瘍に局在化することができ、及びそれはその様な腫瘍の成長を阻止することがで きる。ＭＡｂ　Ｌ６はキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）　４ ６　：　３９１７−３９２３．１９８６年（ＭＡｂ特異性について）及びプロシ ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　８３　：　７０５９−７０６３．１９８６ 年（ＭＡｂ機能について）に説明されている。

（２）Ｌ６のイムノグロブリンｍＲＮＡ中のＪ配列の同定凍結細胞を氷上で１０ 分間次いで室温で解凍した。懸濁液を１５ｍＩＰＢＳで稀釈し、細胞を遠心分離 した。それらをＰＢＳで洗浄後１６ｍ１３Ｍ　Ｌ　ｉ　Ｃ１，６Ｍ尿素中に再懸 濁し、ポリトロン剪断機内で破壊した。

ｍＲＮＡの調製及びポリ（Ａ）＋画分の選択はアラフレイ、Ｃ，（Ａｕｆ’ｆｒ ａｙ、　Ｃ，）及びルージョン、Ｆ。

（Ｒｏｕｇｅｏｎ、　Ｆ、　）　、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ ミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１０７　：３０３．１９８ ０年に従って行った。

Ｌ６からのポリ（Ａ”　）ＲＮＡはノブレガ等（Ｎｏｂｒｅｇａ　ｅｔ　ａｔ、 ）アナリテイカル・バイオケミストリー　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋　） 　１３１　：　１４１．　１９８３年により説明された条件下において個々に標 識化されたＪＨｌ、Ｊ　２、Ｊ　３及びＪＨ４オリゴヌクレオチドとバイブＨ リダイズさせた。これらの生成物を次いで１．７％アガロース−ＴＢＥゲル中に おいて電気泳動に付した。ゲルを１０％ＴＣＡ中に固定し、吸取紙で乾燥し、及 びオートラジオグラフィのために露光した。結果はＬ　６　Ｖ　ａがＪ　Ｈ２配 列を含むことを示した。

Ｖ　Ｋ　ｍＲＮ　Ａの分析のために、ホワイト（Ｗｈｌｔｅ　）及びバンクロフ ト（Ｂａｎｃｒｏｆｔ）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｌｌｌ、）　２５７　：８５６９　（１９８２）のドツ ト−プロット法を用いた。

ポ！Ｊ　（Ａ”　）ＲＮＡをニトロセルロースフィルター上に固定化し、４０′ ′において４ＸＳＳＣ中において標識化されたブローブーオリゴヌクレオチドに ハイブリダイズさせた。これらの実験はＬ６がＪＫ５配列を含有することを示す 。僅かなＪＫ２へのハイブリダイゼーシヨンが観察された。

（３）■領域ｃＤＮＡクローン Ｌ６ボリ（Ａ”　）ＲＮＡ上においてオリゴ（ｄＴ）により合成開始したライブ ラリーについてマウスＣＫ領域プローブを用いてカッパクローンのスクリーニン グを行った。このＬ６ライブラリーから幾つかのクローンを単離した。５′　Ｊ Ｋ５特異的プローブを用いた第二のスクリーニングはＬ６　（ＪＫ５）軽鎖クロ ーンを同定した。

Ｌ６の重鎮クローンはＪＨ２Ｈ２オリゴヌクレオチドいたスクリーニングにより 単離した。

ｃＤＮＡクローン、ｐＨ３−６ａ及びりＬ３−１２ａからの重鎖及び軽鎖遺伝子 及び遺伝子断片をヌクレオチド配列分析のためにＭ１３バクテリオファージベク ター中に挿入した。これらのクローンの可変領域の完全なヌクレオチド配列はジ デオキシ鎖末端法により決定した（第１５図及び第１６図）。これらの配列は観 察された組成と良く一致するＶ領域アミノ酸組成を予測し、且つＶ領域の部分の 直接アミノ酸配列決定により実証されたペプチド配列を予測する。

ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、それらがＶ領域を診断するアミノ酸残 基を含有するのでそれらはイムノグロブリンＶ領域クローンであることを示す〔 カバット等（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｔ、）　、免疫学的興味のあるタンパク質の 配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏ（’　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ）　；　ＨＨＳの米国部、１９８３年〕。

Ｌ６　ｖＨはサブグループＨに属する。このｃ　ＤＮＡは公知のＶＨ（４５−１ ６５ＣＲＩ　；マルゴリーズ等（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ　ａｔ　ａｌ、）モレキュ ラー・イムノロジー（Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１８　：　１０６５． １９８１年〕のそれと同一の２４個のアミノ酸残基のＮ−末端配列を予測する。

このＬ６ｖＨはＪＨ２配列を有する。このＬ６ＶＬはＶ　Ｋ　−Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ 族〔ニジ等（Ｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｔ、）プロシーディングズ・オブ・ナショナ ル・アカデミツク・サイエンス−ニーーミス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａ ｃｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　）８２７６Ｂ９９．１９８５年〕からのものであり、ＪＫ５を使用する 。クローニングされたＬ６　ｖＬは残基１８−４０及び８０−９６に対応するＬ ６軽鎖からのペプチドのアミノ酸配列決定により確認されたアミノ酸配列を予測 する。

（４）ヒトＣ−モジュールに接合するためのＪ領域における制限酵素部位を造出 するための及びＶモジュールへのオリゴ（ｄＣ）配列５′を除去するための１ｎ ｖｔｔｒｏ突然変異誘発 オリゴ（ｄＴ）ｉ、５　Ｖｘ及びＬ６　ＶＨを用いて合成開始することにより生 成されたクローンは共に修飾される必要がある。Ｌ６　ＶＫに対しては、第１７ 図に示されたようなＪ−領域突然変異誘発プライマーＪＫＨｉｎｄＩＩ［が利用 された。ｃＤＮＡクローンから誘導されたヒトＣＫモジュールを突然変異誘発し てＨｉｎｄｍ配列を含有させる（第１７Ａ図参照）。突然変異誘発反応はこれら の遺伝子のＭ１３サブクローンについて行った。突然変異体クローンの頻度は得 られたプラークの０．５〜１９６の範囲であった。

従来、ｖＨキメラ遺遺伝円内ＡＵＧコドンの上流オリゴ（ｄ　Ｃ）配列が一つの 特別の遺伝子造築体における適当なスプライシングを妨害することが観察されて いた。

おそら＜、ＲＮＡ転写体の７０％もがリーダー配列における隠れた３′スプライ スアクセプターが用いられたミス−スプライシングを行ったものと推定された。

従って、イニシエーターＡＵＧの上流のオリゴ（ｄＣ）配列は全てのクローンに おいて除去された。

一つの接近法において、Ｌ６　ｖＫツクーンを突然変異誘発するために５ａｌｌ 制限部位を含有するオリゴヌクレオチドが用いられた。このオリゴヌクレオチド 一方向付された突然変異誘発に用いられたプライマーはオリゴ（ｄＣ）及びイニ シエーターｍｅｔコドンの間に５ａｌＩ部位を導入する２２−マーである（第１ ９図）。

異った接近手法においては、Ｌ６　ｖＨツクーンｐＨ３−６ａにおけるオリゴ（ ｄＣ）を噛去るためにヌクレアーゼＢＡＬ−３１が用いられた。得られた二つの 突然変異体における削除のサイズはヌクレオチド配列決定により決定され第１７ 図に示される。これらの突然変異体の両者（デルタ４及びデルタ２１）において 、コード化領域への全てのオリゴ（ｄＣ）５’が削除された。

これらのクローンは次いでＭＪＨ２−Ａｐａｌルミｌプライマーたオリゴヌクレ オチド一方向突然変異誘発により修飾された（第１７図）。この３１−塩基プラ イマーはヒトＣガンマ１　ｃＤＮＡ遺伝子モジュールにおける存在するＡｐａＩ 部位と同様な位置においてマウス−はヒトＣガンマ１遺伝子に対する適当なコド ンを導入する。突然変異誘発されたマウスｖＨ遺伝子モジュールをヒトＣＨモジ ュールに接合することにより作られたこのキメラ重鎖遺伝子はこの様に全ｖＨ領 域に対するヒトアミノ酸を含有しないキメラタンパク質をコード化する。

このヒトＣガンマ１遺伝子モジユールは０Ｍ２１４６細胞から誘導されたｃＤＮ Ａである〔ヒト遺伝子突然変異細胞貯蔵所（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕ ｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、ニューワーク、ニュージャージ 州〕。このＣガンマ１遺伝子モジユールは予めマウスＶａ遺伝子モジュールと組 合わされてキメラ発現プラスミドｐｌＮＧ２０１２Ｅを形成した。

（５）Ｌ６キメラ発現プラスミド Ｌ６キメラ重鎖発現プラスミドは■□モジュールｐＩＮＧ２０１２Ｅを突然変異 体デルタ２１及びデルタ４のｖＨモジュールと置換して誘導され、発現プラスミ ドｐｌＮＧ２１１１及びｐｌＮＧ２１１２を与えた（第１７図）。これらのプラ スミドは哺乳動物細胞中にトランスフェクションされた場合にキメラム６重鎖の 合成を指示する。

Ｌ６軽鎖キメラ遺伝子に対して、マウスｖＫモジュールの５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩ Ｉ［断片を第１８図に素描する操作によりヒトＣＫモジュールに接合してｐＩＮ Ｇ２１１９を形成した。ｐｓｖ２−ｇｐｔから誘導されたＥ、コリｇｐｔ遺伝子 によるｎｅｏ配列の置換の結果、哺乳動物中にトランスフェクションした際にＬ ６キメラ軽鎖を発現し、ミコフェノール酸耐性を与えるｐｌＮＧ２１２０が生じ た。

同一プラスミド中に重鎮及び軽鎖キメラ遺伝子の両者を包含させることはバラン スのとれた遺伝子投与量に導く１：１遺伝子比の重鎮及び軽鎖遺伝子のトランス フェクションされた細胞中への導入を可能にする。これは最適キメラ抗体発現の ための発現を改良し、及びトランスフェクションされた細胞の操作を減少させる 。この目的のために、ｐｌＮＧ２１１１及びｐｌＮＧ２１１９のキメラ重鎮及び 軽鎖遺伝子から誘導されたＤＮＡ断片を発現プラスミドルｌＮＧ２１１４中に合 一した（第１９図）。この発現プラスミドは、選択可能なｎｅｏＲマーカー、及 び各々マウスの重鎮エンハンサ−を含む各キメラ遺伝子に対する別々の転写単位 を含有する。

Ｌ６キメラ遺伝子の修飾及びＶ−Ｃ接合領域を第２０図にまとめて示す。

（６）キメラ抗体産生のためのマウスリンパ球の安定なトランスフェクション Ｌ６キメラ発現プラスミドＤＮＡのマウス５ｐ２１０細胞中への導入のためにエ レクトロポレーションを用いた〔上記ボッター等（Ｐｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、 　）　；　）ネグッゾー等（Ｔｏｎｃｇｕｚｚｏ　ｅｔ　ａｌ、）モレキュラー ・セル・バイオロジ＝　（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　）　６　：　７０ ３　１９８６年〕。

このエレクトロポーション技術はＳ　ｐ２１０細胞に対して１〜１０×１０−５ のトランスフェクション頻度を与えた。

これらの二つの遺伝子発現プラスミドｐｌＮＧ２１１４をＡａｔｎ制限酵素で消 化して線形化し、５ｐ２１０細胞中にトラスンフェクションし、ヒト重鎮及び軽 鎖合成のスクリーニングを行った約５０個の０４１８耐性クローンを得た。二つ の産生体Ｄ７及び３Ｅ３からのキメラ抗体鎖合成のレベルを表３に示す。キメラ ム６抗体はＨＥＰＥＳ緩衝液及びペニシリン及びストレプトマイシンを補給され たらｇＤＭＥＭ中においてＤ７トランスフエクタント細胞を２×１０７細胞／ｍ ｌで２４時間培養することにより調製した。上澄液を１０ｍＭリン酸ナトリウム 緩衝液ｐＨ８，０中においてＡａ＋１ｃｏｎＹ　Ｍ　３０膜上で濃縮した。この 調製物をＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけ、それはイムノグロブリンを未結合 及び結合画分に分離した。ＤＥＡＥ−未結合、ＤＥＡＥ−結合及びプレーＤＥＡ Ｅ調剤（１，６μｇの培地から）を０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３，５で 溶出するＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム上のアフィニティ力ラ ムクロマトグラフィにより別々に精製した。溶出した抗体を中和し、リン酸緩衝 塩水中においてＡｍｆｃｏｎセントリコンン濾過により濃縮した。三つの調製物 に対する収量は１２μｇ　（ＤＥＡＥ未結合）、６μｇ　（ＤＥＡＥ結合）、及 び９μｇ（プレーＤＥＡＥカラム）であった。抗体鎖のウェスタン分析は天然イ ムノグロブリンと同様にそれらがＨ２Ｌ　２テトラマー内に組込まされていたこ とを示した。

（７）組織培養において分泌されるキメラム６抗体のための２回目の精製 ａ、　５ｐ２１０．ｐｌＮＧ２１１４．Ｄ７細胞を培養培地〔１０％ウシ胎児血 清（Ｈｙｃ！ｏｎｅ　＃Ａ−１１１１−Ｄ　）を補給したＤＭＥＭ　（Ｇｌｂｃ ｏ　！＋３２０−１９８５　）　、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｌｘグルタミンーペン ソートレップ（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｌｅｎｔｌｆ’ｉｃ　＄９３１８　）　）中 において１×１０６細胞／ｍｌまで生育した。

ｂ、　細胞を次いで４００ｘｇで遠心分離し、血清のない培養培地中に２×１０ ６細胞／ｍ＋で１８−２４時間再懸濁させた。

Ｃ１培地をＪＳ−４，２０−ター（３０００ｘ　ｇ）内で４００ＯＲＰＭで１５ 分間遠心分離した。

ｄ、　１．６１）の上澄液を次いで０．４５ミクロフイルターを通して濾過し、 次いでＹＭ３０　（Ａｍｉｃｏｎ社）フィルター上で２５ｍ１に濃縮した。

ｅ、　濃縮上澄液の導電率を５．　７〜５．　６ｍＳ／ｃｍに調製し、ｐＨを８ ．０に調製した。

ｆ、　上澄液を２０００ｘｇで５分間遠心分離した後、１０ｍＭリン酸ナトリウ ムｐＨ８，０で予備平衡化された４０ｍ１ＤＥＡＥカラムにかけた。

ｇ、　流通画分を集め、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８，０で予備平衡化さ れた１　ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｓｉｇ＋＋＋ａ） カラムにかけた。

ｈ、カラムを先ず６ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐｌ（−８，０で洗 浄し、８ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ−３，５で洗浄し、次いで６ｍ ｌの０，１Ｍクエン酸（ｐＨ−２，２）で洗浄した。０．５ｍｌの画分を５０μ ｊｌ１２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基（Ｓｉｇｍａ　）を含有する管内に集めた。

ｔ、　ＩｇＧの大部分はｐＨ−３，５溶出液中にあり、プールされ及びＣｅｎｔ ｒｉｃｏｎ　３０　（Ａｍｉｃｏｎ社）で約、０６ｍ１に濃縮された。

ｊｏ　緩衝液を繰返されたＰＢＳによる稀釈及び再濃縮によりＣｅｎｔｒｉｃｏ ｎ　３０中においてＰＢＳ　（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ−７，４，０，１ ５Ｍ　ＮａＣ１）血清アルブミン（画分Ｖ、　Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ　）を安定化試薬として１．０％まで添加した。

（８）腹水中に分泌されたキメラム６抗体の産生及び精製ａ、　腹水を先ず２． ０００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離した。

ｂ、　上澄液の導電率を５．７〜５．６ｍＳ／ｃｍに調整し、そのｐＨを８．０ に調整した。

ｐＨ８，０で予備平衡化された４０ｍ１ＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけた。

ｄ、　ＤＥＡＥカラムからの流出液を集め、そのｐＨを７．４に調整し、次いで １．０ｍｌヤギ抗−ヒトヒトＧＣＨ＋Ｌ）　−セファロースカラムにかけた。

ｅ、カラムを先ず６ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム で洗浄後、８ｍｌの０．５ＭＮＨ４ＯＨ及び３Ｍナトリウムチオシアネートで洗 浄した。

ｆ、ナトリウムチオシアネート流出液をプールし、２Ｌ　ＰＢＳに対して一晩透 析した。

この抗体は更に前記操作の工程ｊ、及びに８　により濃縮することができる。

表　３ Ｓｐ２１０トランスフエクタントａからの分泌キメラム６鎖のレベル ５ｐ２１０．　Ｄ７　５ｐ２１０．３Ｅ３４、Ｂａ１ｂ／ｃ　腹水　−５，１［ ｉｏ　１９，１７０　ＮＤ　ＮＤａ−ｐＩＮＧ２１１４　（ｐＬ６ＨＬ）により エレクトロポレーションによりトランスフェクションされたＳ　ｐ２１０細胞 ｂ−ヒトカッパーヒトＢｅｎｃｅ　−Ｊｏｎｅｓタンパク質標準に対標準特異的 なＥＬＩＳＡにより７１１１１１定されたμｇ／ｆ１ ０−ヒトガンマ−ヒトＩｇＧ標準に対して特異的なＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定さ れたμｇ／ＤＮＤ−測定されず ＦＢＳ−ウシ胎児血清 （９）キメラム６抗体について行われた研究。

先ず試料を結合アッセイにより試験したが、同アッセイにおいてはＬ６抗原−陽 性及びＬ６抗原−陰性細胞系の両者の細胞を標準マウスモノクローナル抗体Ｌ６ 、細胞培養液上澄液から得られたキメラム６抗体及び腹水（前記の通り）から得 られたキメラム６抗体とインキュベートし、次いで第二の試薬、ヒト（或いは標 準としてマウス）イムノグロブリンに対するフルオレッセインーイソチオシアネ ー）（ＦＩＴＣ）　−複合ヤギ抗体とインキュベートした。

この結合アッセイはＬ６抗原陽性細胞系上のキメラＬ６の強い反応性及び陰性細 胞上の反応性の全くの欠乏を示したので、次の工程はキメラＬ６のマウスＬ６の 抗原陽性細胞への結合を抑制する能力を試験することであつた。その様な抑制ア ッセイは二つの抗体の抗原の認識の同一性を確立するために日常的に用いられる ものである。これらのデータは以下に論じる（「結合の抑制」）。

これらの研究の一部として抗体アヴイディティ（結合活性）の大雑把な推定を行 った。

最後に、抗体機能の二つの側面、ヒト末梢血液白血球の存在下におけるＡＤＣＣ を媒介する能力及び補体源としてのヒト血清の存在下におけるＬ６陽性腫瘍細胞 を殺す能力を研究した（下記「機械的アッセイ」参照）。

結合アッセイ　細胞表面において約５×１０５分子のＬ６抗原を表現することが 予め示されたヒト結腸癌細胞系３３４７からの細胞を目標として用いた。Ｔ細胞 系Ｈ３Ｂ２からの細胞を、それらが従来の試験によると検出可能な量のＬ６抗原 を表現しないので陰性対照として用いた。目標細胞を先ずマウス腹水から精製さ れたキメラム６或いはマウスＬ６標準のいづれかと４℃で３０分間インキュベー トした。次いで、キメラ抗体に対してＴＡＧＯ（バーリンガム、カリフォルニア 州）から得られたヤギー抗−ヒトイムノグロブリンであり、１：５０の稀釈度で 用いられた第二のＦＩＴＣ−標識化試薬とインキュベートした。マウス標準に対 しては、それは又ＴＡＧＯから得られ、１：５０の稀釈率で用いられたヤギー抗 −マウスイムノグロブリンであった。細胞表面への抗体結合はコールタ−・モデ ルＥ　Ｐ　Ｉ　Ｃ−Ｃ（ＣｏｕｌｔｅｒＭｏｄｅｌ　ＥＰＩＣ−Ｃ）細胞分類器 を用いて決定した。　６表４及び表４Ａに示した如く、キメラ及びマウス標準Ｌ ６は共に相当に、且つほぼ同一程度にＬ６陽性３３４７系に結合した。それらは Ｌ６陰性ＨＳＢ２系にはバックグラウンドを越えて結合しなかった。

表４に示された三つの異ったキメラム６試料が結合アッセイにおいて同様に挙動 したという事実に鑑み、それらを以下に示す抑制研究のためにプールした。表４ Ａに示された腹水から銹導されたキメラＬ６に対しては同一の抑制研究が行われ た。

結合の抑制　次にキメラム６抗体或いは標準マウスＬ６の等級化された投与量が ＦＩＴＣ−標識化マウスＬ６の抗原陽性３３４７結腸癌細胞の表面への結合を抑 制する程度を研究した。

キメラ及びマウス標準Ｌ６は共に直接的標識化Ｌ６抗体の結合を抑制し、結合曲 線は平行であった。プールされたキメラＬ６　ＭＡｂの３．４μｇ　／　ｍｌが 標準マウスＬ６　ＭＡｂの２．０ｎｇ／ｍｌに対比して結合の５０９６抑制に必 要とされたこと、及びキメラＬ６（腹水から得られたもの）の５．５μｇ　／　 ｍｌが標準マウスＬ６ＭＡｂの２．７μｇ　／　ｍｌに対比して結合の５０％抑 制に必要とされたことを示した結果により示されるように、キメラ抗体は標準よ りも僅かに有効性が少ながった。

これらの研究の一部として抗体アヴイディティについての大雑把な推定を行った 。標準マウスＬ６のアヴイディティは先に約４×１０８と決定されていた。デー タはキメラとマウスＬ６の間にアヴイディティにおける有意な相異がないことを 示した。

機能的アッセイ　エフェクター細胞源としてのヒト末梢血液白血球（抗体依存細 胞毒性ＡＤＣＣの媒介）或いは補体源としてのヒト血清（補体−依存細胞溶解Ｃ ＤＣの媒介）の存在下におけるＬ６抗原陽性細胞を溶解するキメラＬ６及び標準 マウスＬ６の能力の間の比較が行われた。

表５及び表５Ａ−５Ｄに示される如く、キメラＬ６は同時に試験されたマウスＬ ６の試料よりも４時間５１ｃｒ放出試験で測定されたようにＡＤＣＣを引起こす ことにおいてより優れていた。

表６及び６Ａ−６Ｂは補体−媒介目標細胞溶解についての研究からのデータを示 す。この場合には、マウス及びキメラム６抗体の両者につして高い細胞溶解活性 が観察された。

結　論 上記に示された結果は、本発明のキメラム６モノクローナル抗体の多くの重要な 、予想外の性質を示す。先ず、キメラム６抗体はＬ６抗原陽性腫瘍細胞にマウス 上６標準とほぼ同一程度に且つほぼ同一アヴイディティをもって結合する。これ は次の理由により有意義である。即ち、Ｌ６抗体は（ａ）表面炭化水素化物抗原 及び（ｂ）約２０．０００ダ５ルトンのタンパク質抗原を規定し、それらの各々 は非−小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びある種のその他のヒト癌細胞に特性的であ る。有意義なことに、Ｌ６抗体は主たる器官の繊維芽球、内皮細胞或いは表皮細 胞などの正常細胞には検知可能に結合しない。即ち、キメラム６モノクローナル 抗体は癌細胞に特異的であり正常細胞には特異的ではない抗原を規定する。

本発明のキメラム６モノクローナル抗体の悪性細胞に特異的に結合し、腫瘍を局 在化させる能力に加えて、キメラＬ６はその目標に結合する豊富な生物学的影響 を及ぼし、それらはキメラ抗体を腫瘍免疫治療に対する最良の候補者とする。在 に示された結果は、キメラＬ６が腫瘍細胞に結合することができ、結合時にＡＤ ＣＣ或いはＣＤＣのいづれかにより腫瘍細胞を殺すことを示している。その様な 腫瘍殺傷活性は０．０１μｇ／ｍｌ（１００ｇ／ｍ＋）程度の低いキメラム６抗 体の濃度を用いて示された。

試みられているモノクローナル抗体を用いる腫瘍治療の見込みは魅力的なもので あり、幾つかの部分的腫瘍の退行が報告されているが、今日までその様なモノク ローナル抗体治療は限られた成功を納めているに過ぎない〔ツートン（Ｈｏｕｇ ｈｔｏｎ）　、１９８５年２月、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ デミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　８ ２　：　１２４２−１２４６）。マウスモノクローナル抗体（それらはこれ迄試 みられてきたものである）の治療効果は殆んどの実用目的のために余りにも低い ように思われる。癌細胞抗原に対するその特異性を伴うキメラＬ６の豊富な生物 学的活性の発見はキメラム６抗体をｉｎ　ｖｌｖｏにおける腫瘍の治療のための 選択治療試薬とする。更に、キメラム６モノクローナル抗体をＩｎ　ｖｉｖｏに おけるクリアランスに対してより耐性とする「ヒト」特性のためにこのキメラム ６モノクローナル抗体は未修飾キメラ抗体を用いる治療のみならず、各種薬品、 毒素、免疫調節剤、アイソトープなどとの免疫複合体の開発並びに適当に標識化 されたキメラム６抗体を用いる１ｎ　ＶＩＶＯでの腫瘍の影像化などの診断目的 のために有利に用いられるであろう。その様な免疫複合技術は当業者に知られて おり、本発明のキメラム６抗体分子を修飾するために用いることができる。

本出願の出願臼に先立ち、二つのキメラム６抗体を分泌する細胞系の実例がＡＴ ＣＣ（ロックビル、メリーランド州）に寄託された。これらはトランスフェクシ ョンされたハイブリドーマＣ２５５（上記３Ｅ３細胞に対応）ＡＴＣＣＨＢ　９ ２４０及びトランスフェクションされたハイブリドーマＣ２５６（上記Ｃ７細胞 ）ＡＴＣＣＨＢ　９２４１である。

（１０）　Ｌ６鎖の酵母における発現 キメラム６抗体の重鎖及び軽鎖に対する遺伝子配列暗号が調製され、ベクター中 に導入された。酵母細胞がそれらにより形質転換され、Ｌ６抗体に対する別々の 重及び軽抗体鎖の発現を検出した。

本発明の寄託された実施態様は本発明の一側面の単一の例示を意図するものであ り、機能的に等価である全ての細胞系は本発明の範囲内のものであるので、寄託 された細胞系によっては範囲が限定されるものではない。事実、前記説明及び付 属の図面から示されるものに加えて、本発明の各種修正が可能である。その様な 修正は本発明表　４ キメラム６抗体及びマウスＬ６モノクローナル抗体のＬ６抗原陽性及びＬ６抗原 陰性細胞系上における結合アッセイ 標準Ｌ６　５６．６　４．２ キメラＬ６　ａ　１．３　１１０．３ ｂ　１．３１１０．３ ｃ　１．３１１０．３ Ｈ８Ｂ−２細胞（Ｌ、６−）” 標準Ｌ６　１．１１．１ キメラＬ６　ａ　１．０　１．０ ＊全てのアッセイは１０μｇ　／　ｍｌの抗体濃度を用いて行われた。結合比は 、ＧＡＭ　（Ｆ　ＩＴＣ複合ヤギ−抗−マウス）或いはＧＡＨ（Ｆ　ＩＴＣｍ合 ヤギ−抗−ヒト）単独で処理された対照試料よりも試験試料は一層有望な倍数で ある。１の比は試験試料が丁度と対照例と同じ有望性であることを意味し、２の 比率は試験試料が対照例よりも２倍の有望性であるなどを意味する。

表　４Ａ キメラム６抗体及びマウスモノクローナル抗体のＬ６抗原陽性及びＬ６抗原陰性 細胞系における結合アッセイ標準Ｌ６　３０　３８　４ キメラＬ６　３０　２１ｏ８ （腹水）　１０　２　１０８ キメラＬ６　３０　１１ｏ５ （細胞培養液）　１０　１　８６ Ｈ３Ｂ−２細胞本本 標準Ｌ６　１０　１　１ キメラＬ６　１０　１　１ （腹水） キメラＬ６　１０　１　１ （細胞培養液） ・　独で処理された対照例よりも試験試料が一層有望な倍数である。１の比率は 試験試料が対照例と同じ有望性のものであることを、２の比率は試験試料が対照 例より２倍の有望性であることなどを意味する。

表　５ 結腸癌細胞系３３４７上におけるキメラＬ６（マウス）Ｌ６抗体のＡＤＣＣ 抗体濃度目標細胞　オ 抗　体　（８ｇ　／　ｍｌ　）　当りＰＢＬ　細胞溶解％キメラＬ６　１０　１ ００　６４ 標準Ｌ６　１０　１００　２４ な　し　０　１００　１ ＊　目標細胞を５１ｃ、で標識化し、ＭＡｂ及びヒト末梢血液白血球（Ｐ　Ｂ　 Ｌ）の組合せに４時間曝し、５１Ｃｒの放出を引続いて測定した。５１ｃ、の放 出（未処理細胞からの自然放出に対する値の補正後）は細胞溶解％の目安である 。

表　５Ａ キメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の結腸癌細胞系３３４７におけるＡＤＣ Ｃ抗体濃度目標細胞　オ 抗　体　（８ｇ　／　ｍｌ　）　当りＰＢＬ　細胞溶解％キメラＬ６　２０　１ ００　８０ （腹水＞　１０　１００　７４ ２．５　１００　７１ キメラＬ６　１０　１００　８４ （細胞培養液）５　１００７４ ２．５　１００　６．７ 標準Ｌ６　２０　１００　３２ 本目標細胞を５１Ｃｒで標識化し、ＭＡｂ及びヒト末梢血液白血球（Ｐ　Ｂ　Ｌ ）の組合せに４時間曝し、５１Ｃｒの放出を引続いて測定した。５１ｃ、の放出 （未処理細胞からの自然放出に対する値の補正後）は細胞溶解％の目安である。

表　５Ｂ キメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の結腸癌細胞系３３４７上におけるＡＤ ＣＣ抗体濃度目標細胞　オ 抗　体　（８ｇ　／　ｍｌ　）　当りＰＢＬ　細胞溶解％キメラＬ６５　１００ ８４ （腹水）２．５　１００　７８ １．２５　１００　８５ ０．６３　１００　８１ ０．３１　１００　８０ ０．１６　１００　７１ ０．０８　１００　６５ な　し　０　１００　１９ 本目標細胞を５１ｃｒで標準化し、ＭＡｂ及びヒト末梢血液白血球（ＰＢＬ）の 組合せに４時間曝し、５１ｃｒの放出を引続いて測定した。５１Ｃｒの放出（未 処理細胞からの自然放出に対する値の補正後）は細胞溶解％の目安である。

表　５０ キメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の肺癌細胞系Ｈ２６６９におけるＡＤＣ Ｃ抗体濃度目標細胞　オ 抗　体　（８ｇ　／　ｍｌ　）　当りＰＢＬ　細胞溶解％キメラＬ６　１０　１ ００．’　３５ （腹水）　１　１００　３１ ０．１　１００　２７ ０．０１　１００　１５ ０．００１　１００　１３ ０．０００１　０　１５ 標準Ｌ６　１０　１００　９゜ な　し　０　１００　９ キメラＬ６１０　１０　１９ （腹水）　１　１０　１５ ０．１　１０　１１ ０．０１　１０　１３ ０．００１　１０　２２ ０．０００１　１０　１１ 標準Ｌ６　１０　１０　７ な　し　０　１０　８ 表　５Ｃ（続き） 抗体濃度目標細胞　オ 抗　体　（μｇ／ｍｌ）　当りＰＢＬ　細胞溶解２６キメラＬ６　１０　０　４ （腹水） 標準Ｌ６　１０　０　９ 零目標細胞を５１Ｃｒで標準化し、ＭＡｂ及びヒト末梢血液白血球（Ｐ　Ｂ　Ｌ ）の組合せに４時間曝し、５ＩＣ，のらの自然放出に対する値の補正後）は細胞 溶解％の目安である。

表　５Ｄ キメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の結腸癌細胞系Ｈ３３４７におけるＡＤ ＣＣ抗体濃度目標細胞　オ 抗　体　（８ｇ　／　ｍｌ　）　当りＰＢＬ　細胞溶解％キメラＬ６　１０　１ ００　６２ （腹水）　１　１００　６６ ０．１　１００　６９ ０．０１　１００　２６ ０．００１　１００　８ ０．０００１　０　３ 標準Ｌ６　１０　１００　１９ な　し　０　１００　８ ＊目標細胞を５１ｃ、で標識化し、ＭＡｂ及びヒト末梢血液白血球（Ｐ　Ｂ　Ｌ ）の組合せに４時間曝し、５１ｃ、の放出を引続いて測定した。５１Ｃｒの放出 （未処理細胞からの自然放出に対する値の補正後）は細胞溶解％の目安である。

表　６ ４時間５１ｃ、−放出アッセイにより測定された、キメラ及び標準（マウス）Ｌ ６の系３３４７がらの結腸癌細胞に及ぼす補体−依存細胞毒効果。

健康人からの血清を補体源として用いた。

抗　体　ヒト補体　細胞溶解％ Ｌ６標準１０μｇ／ｍ＋　あり　９０ Ｌ６キメラ１０μｇ／ｍｌ　あり　８９Ｌ６標準１０μｇ／ｍｌ　なし　Ｏ Ｌ６キメラ１０μｇ／ｍｌ　なし　１ 表　６Ａ キメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の結腸癌細胞系３３４７に及ぼす補体依 存性細胞毒効果 キメラＬ６　２０　＋　２９ （腹水）　１０　＋　２３ ２０　不活性化　０ キメラＬ６　２０　＋　２９ （細胞培養液）５　＋２６ 標準Ｌ６　２０　＋　５５ ２０　不活性化　０ より測定した。健常人からのヒト血清を補体源として用いた。

表　６Ｂ キメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の結腸癌細胞系３３４７に及ぼす補体依 存性細胞毒効果 抗体濃度目標細胞　オ 抗　体　（μｇ　／　ｍｌ　）　当りＰＢＬ　細胞溶解％キメラＬ６　１０　＋ 　２０９ （腹水＞　５　＋　１５５ ２．５　＋　１６６ １．２５　＋　１１４ 標準Ｌ６　１０　＋　９６ な　し　０　＋　Ｑ より測定した。健常人からのヒト血清を補体源として用いた。

例■：　ヒトＢ−細胞抗原に対して特異性を有する２Ｈ７マウスモノクローナル 抗体（ガンマ２ｂＫ）はヒトＢ−細胞表面抗原、Ｂｐ３５を認識する〔クラーク 。

Ｅ、Ａ、等（Ｃ１ａｒｋ、　Ｅ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）　、プロシーディングズ ・オブ・ナショナルやアカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｅ ａｄ、　Ｓｅｔ、　）　ＵＳＡ、　８２　：　１７６６（１９８５））。Ｂｐ３ ５分子はＢ−細胞活性化に役割を果す。ｍＲＮＡがこの２Ｈ７細胞系から調製さ れた。

二つのｃＤＮＡライブラリーが得られ、一つは重鎖ＵＩＧ−Ｈプライマーを用い 、他方はオリゴ（ｄＴ）を用いて得られた。一つのＶＨツクーンｐＨ２−１１が 同−ＵＩＧ−Ｈオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングして単離された。軽 鎖クローンを単離するために、マウスカッパー特異性ＤＮＡ断片を用いてオリゴ （ｄＴ）ライブラリーをスクリーニングした。候補クローンを更にマウスＪＫ５ 配列を用いてスクリーニングした。一つのｖＫツクーン、ｐＬ２−１２をこの様 にして単離した。

この軽鎖ＵＩＧ−Ｋを次いで用いてＪ領域に制限酵素を工学的に作成した。

これらの二つのｃＤＮＡクローンを又５′末端で修飾して人工オリゴｄ　（Ｃ） 配列を除去した。ｐＨ２−１１において、これはＡＴＧイニシエーターコドンの 一つのヌクレオチド残基５′を切断する制限酵素ＮｃｏＩを用いて行われた。ｐ Ｌ２−１２においては、これは５ａ１１部位を含有する２２−マーを用いるオリ ゴヌクレオチドの１ｎ　ｖｌｔｒｏの突然変異誘発により達成された。

これらの二つのクローンのＤＮＡ配列を第２１図、第２２図に示す。キメラ重鎖 プラスミドを造成するためにＶ　モジュールをＪ　ｕ　Ｂ　ｓ　ｔ　Ｅ　ＩＩ部 位においてヒトＣガンマ１モジユール（ｐＧＭＨ６）に接合し、及びキメラ軽鎖 を造出するためにＶ　モジュールをＪ　Ｋ　Ｈ１ｎ　ｄ■部位においてヒトＣＫ モジュール（ｐＧＭＬ６０）に接合した。これらの発現ベクター配列はｐＩＮＧ ２０１２−ｎｅｏ並びにｐＩＮＧ２０１６−ｇｐｔから得られた。造成されたプ ラスミドはｐｌＮＧ２１０１（ｖＨＣガン７ｌ−ｎｅｏ）、ｐＩＮＧ２１０６　 （ＶＫＣ−ｎｅｏ）、ｐＩＮＧ２１０７（ＶＫＣＫ−ｇｐｔ）であった。ｐＩＮ Ｇ２１０１及びｐＩＮＧ２１０６を用いて又両遺伝子を含むプラスミドを作成し た。それらはｐＨＬ２−１１及びｐＨＬ２−２６である。加えて、ｐｌＮＧ２１ ０６及びｐＩＮＧ２０１４を組合せて二つの軽鎖プラスミド、ｐＬＬ２−２５に し、トランスフェクションされた細胞における軽鎖タンパク質の（長鎖に比べて ）より貧弱な定常状態の蓄積の補償をした（第２３図参照）。第２４図は二〇造 築に際して可変領域配列に行われた変化を示す。

プラスミドｐＨＬ２−１１はＡａｔＩＩにより線形化され、及びＤＮＡを用いて エレクトロポレーションにより５ｐ２１０細胞をトランスフェクションした。形 質転換体を０４１８−ＤＮＥＭ中において選択した。一つの形質転換体ＩＣ９は ＥＬ　Ｉ　ＳＡによりアッセイされた９、３ｍｇ／ｍｌのキメラカッパ及び３３ −７２ｎｇ／ｍ＋キメラガンマ１タンパク質を生成する。ＩＣ９ＤＮＡのサザー ン分析は、５ｐ２１０ゲノムに合体された一つのプラスミドの複製があることを 示した。

（原文明細書の第８９／１および８９／２の添附頁の抄訳） 原文明細書第７５頁第２６行に記載の微生物寄託当局：アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション 住　所：１２３０１　パークローン・ドライブ・ロックヴイル・メリーランド２ ０８５２、合衆国 寄託臼＝１９８６年１０月２４日 受託番号：ＨＢ９２４０ 微生物の表示：ハイブリドーマＣ２５５（キメラム６抗体） 原文明細書第７５頁第２７行に記載の微生物寄託当局：アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション 住　所７１２３０１　バークローン・ドライブ・ロックヴイル・メリーランド２ ０８５２、合衆国 寄託臼：１９８６年１０月２４日 受託番号：ＨＢ９２４１ 微生物の表示：ハイブリドーマＣ２５６（キメラし６υ 浄書・（内’、Ｊ１＋Ｚ更なし） Ｖ　ＤＪ　ＣＨＩ　ＨＣＨ２ＣＨ３Ｂ’ＬＩＴＢ、　Ｖ　４ｉ　ｘｔｘ　ｆシ、 −ルｆｆ入ｎＴ：ｈｔ＋と）ＩｑＧｌｌ　市４’ｉｆ４りＣ１−：：ｔり’：９ ７？−ンｒ゛亡：に＋”；芭；：二：更なし）ＦＩＧ、５ 浄−９（内容に変更なし） ＦＩＧ、６ Ｂ、ｈ）ＣＫｆＪ４り０−二ンク＼シダしの迄プ央４　−　豐　″″′Ｎ　＄ 沖の（［−容に変更なし） ：’；；　ＣｒＺ”：に変更なし） ＦＩＧ、８ 電塗貞■匂に或杉１−ル迂ブを円台・成浄６０り容に変更なし） こ・−’：ＪＪ　（ｒ’；容に変更なし）ＦＩＧ、１１ 浄魯（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１３ 浄魯（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１４ ｐＭｖＨｃ２４　ＡｐａニーθａｍＨＩ　（ＣＨ）灯”書（内容Ｑ：変更なし） ＦＩＧ、１８ ５ｅｒｔｌ　Ｎｔｄｌｔｌ 浄書（内容に変更なし） ← Ｃ 大 Ｊ☆ 大 χ ☆ ト 、− ｈｑｃ ９　文 ζ リ リ 嘗

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．非−ヒトイムノグロブリン鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を含んで なることを特徴とするポリヌクレオチド分子。
2. ２．イムノグロブリン鎖の全可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を含んでなるこ とを特徴とするポリヌクレオチド分子。
3. ３．該鎖が重鎖である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の分子。
4. ４．該鎖が軽鎖である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の分子。
5. ５．ヒトイムノグロブリン鎖の定常領域をコードする付加的配列を更に含んでな り、該配列の両者が相互に操作可能に結合されている、請求の範囲第１項又は第 ２項記載の分子。
6. ６．該付加的配列がｃＤＮＡ配列である、請求の範囲第５項記載の分子。
7. ７．該付加的配列がゲノム配列である、請求の範囲第５項記載の分子。
8. ８．該非−ヒトが醤歯動物である、請求の範囲第５項記載の分子。
9. ９．組換えＤＮＡ分子である、請求の範囲第１項又は第２項記載の分子。
10. １０．二本鎖ＤＮＡ形態である、請求の範囲第９項記載の分子。
11. １１．発現可能なビヒクルである、請求の範囲第９項記載の分子。
12. １２．該ビヒクルがプラスミドである、請求の範囲第１１項に記載の分子。
13. １３．請求の範囲第５項記載の分子により形質転換された原核生物宿主。
14. １４．細菌である、請求の範囲第１３項記載の宿主。
15. １５．請求の範囲第５項記載の分子でトランスフェクションされた真核生物宿主 。
16. １６．酵母或いは哺乳動物細胞である、請求の範囲第１５項記載の宿主。
17. １７．定常ヒト領域及び可変非−ヒト領域を含んでなるイムノグロブリン重鎖。
18. １８．定常ヒト領域及び可変非−ヒト領域を含んでなるイムノグロブリン軽鎖。
19. １９．二つの軽鎖及び二つの重鎖を含んでなり、該鎖の各々が定常ヒト領域及び 可変非−ヒト領域を含んでなるキメラ抗体分子。
20. ２０．該重鎖が共にそれらの可変領域において同一の結合特異性を有する、請求 の範囲第１９項記載の分子。
21. ２１．該重鎖の各々がその可変領域において異った結合特異性を有する、請求の 範囲第１９項記載の分子。
22. ２２．（１）それらの可変領域において同一の結合特異性を有する二つのキメラ 重鎖、及び（ｉｉ）それらの可変領域にキメラ重鎖の可変領域のそれと同一の結 合特異性を有する二つの全−ヒト或いは全非−ヒト軽鎖を含んでなる抗体分子。
23. ２３．（ｉ）それらの可変領域に同−の結合特異性を有する二つのキメラ重鎖、 及び（ｉｉ）それらの可変領域において異った結合特異性を有する二つの全−ヒ ト或いは非−ヒト軽鎖を含んでなり、該軽鎖の一方の可変領域の結合特異性が該 キメラ重鎖の可変領域の結合特異性と同一であることを特徴とする抗体分子。
24. ２４．定常ヒト領域及び可変非−ヒト領域を有するイムノグロブリン重鎖の製造 方法であって、該鎖を発現することのできる宿主を培養条件下に培養し、及び 該培養液から該重鎖を回収する ことを特徴とする方法。
25. ２５．定常ヒト領域及び可変非−ヒト領域を有するイムノグロブリン軽鎖を製造 する方法であって、該鎖を培養条件下に発現することのできる宿主を培養し、 該培養液から該軽鎖を回収する ことを特徴とする方法。
26. ２６．重鎖及び軽鎖を含有し、該重鎖及び軽鎖の各々が定常ヒト領域及び可変非 −ヒト領域を有するキメライムノグロブリンを製造する方法であって、該重鎖或 いは該軽鎖或いは両者を発現することのできる宿主を培養条件下に培養し、及び 該培養液からキメライムノグロブリン分子を回収することを特徴とする方法。
27. ２７．該宿主が原核生物である、請求の範囲第２４項、第２５項又は第２６項の いづれか一項に記載の方法。
28. ２８．該宿主が真核生物である、請求の範囲第２４項、第２５項又は第２６項の いづれか一項に記載の方法。
29. ２９．重鎖イムノグロブリン分子のＪ領域に対するコンセンサス配列を含んでな ることを特徴とするポリヌクレオチド分子。
30. ３０．該配列がヒト重鎖Ｊ領域のためのものである、請求の範囲第２９項記載の 分子。
31. ３１．該配列がマウス重領Ｊ領域のためのものである、請求の範囲第２９項記載 の分子。
32. ３２．軽鎖イムノグロブリン分子のＪ領域のためのコンセンサス配列を含んでな ることを特徴とするポリヌクレオチド分子。
33. ３３．該配列がヒトカッパＪ領域のためのものである、請求の範囲第３２項記載 の分子。
34. ３４．該配列がマウスカッパＪ領域のためのものである、請求の範囲第３２項記 載の分子。
35. ３５．該配列がマウスラムダＪ領域のためのものである、請求の範囲第３２項記 載の分子。
36. ３６．第一のクラスからの抗体鎖分子のクラスを第二のクラスに切換える方法で あって、 該鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を得、該ｃＤＮＡ配列を該第二のクラ スの特性を有する抗体鎖の定常領域をコードする遺伝子配列に操作可能に結合し 、 該結合配列で該配列を発現することのできる宿主を形質転換し、 該宿主を培養条件下に培養し、及び 該培養液から該第二のクラスの特性を有する該重鎖を回収する ことを特徴とする方法。
37. ３７．該第一のクラスがＩｇＭであり及び第二のクラスがＩｇＧである、請求の 範囲第３４項記載の方法。
38. ３８．該鎖が重鎖である、請求の範囲第３６項記載の方法。
39. ３９．該鎖が軽鎖である、請求の範囲第３６項記載の方法。
40. ４０．任意の所望特異性の定常ヒト領域及び可変非−ヒト領域を有するキメライ ムノグロブリン鎖をコードする遺伝子配列の製造方法であって、 （ａ）該所望特異性のモノクローナル抗体を分泌する細胞から該可変領域をコー ドするｍＲＮＡを提供し、てｂ）該イムノグロブリン鎖のＪ領域のためのコンセ ンサス遺伝子配列を含んでなるポリヌクレオチド分子を用いて、該ｍＲＮＡを鋳 型として用いる逆転写によりそれから誘導されるｃＤＮＡの形成を開始し、（ｃ ）該ヒト定常領域をコードする遺伝子配列を提供し、及び （ｄ）工程（ｂ）の該ｃＤＮＡ配列を工程（ｃ）の該配列に操作可能に結合する ことを特徴とする方法。
41. ４１．工程（ｄ）が、該ｃＤＮＡ配列を工程（ｃ）の該配列に発現ビヒクル内で 操作可能に結合することからなる、請求の範囲第４０項記載の方法。
42. ４２．該ビヒクルがプラスミドである、請求の範囲第４１項記載の方法。
43. ４３．更に該プラスミドを該プラスミドを発現することのできる宿主中に形質転 換することを含んでなる、請求の範囲第４２項記載の方法。
44. ４４．該鎖が重鎖である、請求の範囲第４０項〜第４３項のいづれか一項に記載 の方法。
45. ４５．該鎖が軽鎖である、請求の範囲第４０項〜第４３項のいづれか一項に記載 の方法。
46. ４６．該コンセンサス遺伝子配列が下記領域よりなる群から選ばれる、請求の範 囲第４０項記載の方法。 （ｉ）ヒト重鎖Ｊ領域、 （ｉｉ）マウス重鎖Ｊ領域、 （ｉｉｉ）ヒトカッパＪ領域、 （ｉｖ）マウスカッパＪ領域、及び （ｖ）マウスラムダＪ領域。
47. ４７．該コンセンサス遺伝子配列が第７図においてＭＪＨ１、ＭＪＨ２、ＭＪＨ ３、ＭＪＨ３−ＢＳＴＥＩＩ、ＭＪＨ−ＢＳＴＥＩＩ（１３）、ＭＪＨ４、５Ｊ Ｋ１、５ＪＫ２、ＪＫ２ＢＧｌＩＩ、５ＪＫ４、ＪＫ４ＢＧｌＩＩ、５ＪＫ５及 びＭＪＫと示されるものよりなる群から選ばれる、請求の範囲第４０項記載の方 法。
48. ４８．該コンセンサス配列が制限酵素の認識部位をコードする配列を更に含んで なる、請求の範囲第４０項記載の方法。
49. ４９．哺乳動物細胞内のｃＤＮＡの発現のために有用な第１０図におけるベクタ ーｐＩＮＧ２００３及びｐＩＮＧ２００３Ｅと実質的に同様である制限酵素部位 地図を有するｃＤＮＡ発現ベクター。
50. ５０．該コンセンサス遺伝子配列が第７図においてＵＩＧＨ、ＵＩＧＫ、及びＭ ＪＨ２−ＡｐａＩとして示されるものよりなる群から選ばれる、請求の範囲第４ ０項記載の方法。