JP2005527191A - 新規の細胞死関連タンパク質ならびにアポトーシス制御におけるthap1およびpar4の経路 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、THAP(タナトスTHanatos(死)関連タンパク質)ファミリーの遺伝子およびタンパク質、ならびにその使用に関する。特に本発明は、THAPドメインを含むポリペプチド、THAP媒介性活性の調節およびこれらの活性を調節する化合物の同定に関する。
細胞増殖および細胞死の協調は、多細胞生物における正常な発達および組織恒常性のために必要である。これら2つの過程の正常な協調の欠陥は、腫瘍形成のための基本的要件である。
POD(PML発癌ドメイン)、ND10(核ドメイン10)およびKr小体としても知られるPML核小体(PML−NB)は、ヒト骨髄性白血病の異なる亜型である急性前骨髄球性白血病(APL)からの細胞中で特異的に破壊される別個の核内ドメインである(Maul et al., 2000; Ruggero et al., 2000; Zhong et al., 2000a)。それらの名称は、それらの最も集中的に研究されたタンパク質構成成分である、前骨髄球性白血病タンパク質(PML)、すなわち、APLにおいてレチノイン酸受容体(RAR)遺伝子座のt(15;17)染色体の転位相手として元々クローン化された遺伝子によりコードされるRINGフィンガーIFN−誘導性タンパク質に由来する。APL細胞では、白血病誘発性融合タンパク質PML−RARの存在が、PML−NBの崩壊、PMLおよびその他のPML−NBタンパク質の異常核構造への局在化をもたらす(Zhong et al., 2000a)。
PML−RAR腫瘍性タンパク質の分解を誘導するレチノイン酸によるAPL細胞および患者の処置はそれぞれ、PMLおよびその他のNB構成成分のPML−NBへの再局在化、ならびに臨床的疾患の完全寛解を生じる。したがってPML−RARによるPML−NBの脱制御は、腫瘍形成において重要な役割を演じると考えられる。PML遺伝子が相同組換えにより破壊されたマウスの分析は、PMLが多数のアポトーシス経路(Wang et al., 1998b)に不可欠であるin vivo腫瘍サプレッサーとして機能すること(Wang e
t al., 1998a)を明示した。Pml−/−マウスおよび細胞は、Fas、TNFα、セラミドおよびIFN誘導性アポトーシスから、ならびにDNA損傷誘導性アポトーシスから保護される。しかしながらPMLがプロアポトーシス刺激に対する応答を調節する分子メカニズムは、十分に理解されているわけではない(Wang et al., 1998b; Quignon et al., 1998)。近年の研究は、PMLがp53依存性およびp53非依存性アポトーシス経路の両方に関与し得る、ということを示す(Guo et al., 2000; Fogal et al., 2000)。p53依存性DNA損傷誘導性アポトーシス、p53による転写活性化およびp53標的遺伝子の誘導は、全てPML−/−プライマリー細胞において減弱される(Guo et al., 2000)。PMLはp53と物理的に相互作用し、p53に関するコーアクチベーターとして作用する。PMLのこのコーアクチベーター的役割は完全に、PML−NBにp53を動員する能力に依存する(Guo et al., 2000; Fogal et al., 2000)。PML−およびp53−依存性増殖抑制経路間のクロストークの存在は、p53機能のモジュレーターとしてのPML−NBおよびPML−NB−関連タンパク質の重要な役割を暗示する。p53のほかに、好アポトーシス因子Daxxは、PML好アポトーシス活性の別の重要な媒介物質であり得る(Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000b; Li et al., 2000)。Daxxは、Fas誘導性細胞死を強化する能力により最初に同定された。DaxxはPMLと相互作用し、そして核に選択的に局在し、PML−NB中に蓄積する(Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000b; Li et al., 2000)。PMLの不活性化は、PML−NBからのDaxxの異常局在化ならびにDaxx好アポトーシス活性の完全阻害を生じる(Zhong et al., 2000b)。Daxxは強力な転写リプレッサー活性を有する、ということが近
年見出された(Li et al., 2000)。PML−NBにDaxxを動員することにより、P
MLはDaxx媒介性転写抑制を阻止し、したがってある種の好アポトーシス遺伝子の発現を可能にする。
Sp100関連タンパク質Sp140(Bloch et al., 1999)、網膜芽細胞腫サプレッサーpRB(Alcalay et al., 1998)、転写コーアクチベーターCBP(LaMorte et al., 1998)、ブルーム症候群DNAヘリカーゼBLM(Zhong et al., 1999)および小ユビキチン様修飾因子SUMO−1(セントリン−1またはPIC1としても既知である、近年のレビューに関しては、Yeh et al., 2000; Melchior, 2000; Jentsch and Pyrowolakis,
2000参照)が挙げられる。SUMO−1によるPMLの共有結合修飾(SUMO化)は
、NB中へのPML蓄積(Muller et al., 1998)およびPML−NBへの他のNB構成
成分の動員(Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000c)に重要な役割を演じると考え
られる。
前立腺アポトーシス応答−4(PAR4)は、アポトーシスを受けている前立腺腫瘍細胞において特異的に発現上昇する遺伝子の産物として最初に同定された38kDaタンパク質である(Rangnekar, 1998; Mattson et al., 1999参照)。アポトーシスにおけるP
AR4の重要な役割と一致して、培養細胞におけるPAR4の誘導は専らアポトーシス期間中に見出され、そしてNIH−3T3細胞(Diaz-Meco et al., 1996)、ニューロン(Guo et al., 1998)、前立腺癌および黒色腫細胞(Sells et al., 1997)におけるPAR4の異所性発現は、アポトーシス刺激に対してこれらの細胞を感作することが示されている。さらに、PAR4の発現低下は、ras誘導性生存および腫瘍進行にとって重要であり(Barradas et al., 1999)、そしてアンチセンス技術によるPAR4産生の抑制は、
神経変性障害の異なるモデル(Mattson et al., 1999)を含むいくつかの系においてアポトーシスを防止し(Sells et al., 1997; Guo et al., 1998)、アポトーシスにおけるPAR4の重要な役割をさらに強調する。カルボキシ末端では、PAR4は、ロイシンジッパードメイン(Par4LZ、アミノ酸290〜332)および部分的に重複するデスド
メイン(Par4DD、アミノ酸258〜332)の両方を含有する。このカルボキシ末端部分の欠失は、PAR4の好アポトーシス機能を妨げる(Diaz-Meco et al., 1996; Sells et al., 1997; Guo et al., 1998)。他方で、PAR4ロイシンジッパー/デスドメインの過剰発現は、ドミナントネガティブに作用して、全長PAR4により誘導されるアポトーシスを防止する(Sells et al., 1997; Guo et al., 1998)。PAR4ロイシンジッパー/デスドメインは、2つの異なる種類のモチーフ:ウィルムス腫瘍サプレッサータンパク質WT1の亜鉛フィンガー(Johnstone et al., 1996)およびタンパク質キナーゼCの非定型アイソフォーム(Diaz-Meco et al., 1996)、ならびに死関連タンパク質(DAP)様キナーゼDlkからのアルギニン豊富ドメイン(Page et al., 1999)を認識す
ることにより、他のタンパク質とPAR4との相互作用を媒介する。これらの相互作用の中で、PAR4とaPKCの結合、ならびにその結果としてのその酵素活性の抑制は、aPKCが細胞生存に重要な役割を演じることが既知であり、そしてその過剰発現はアポトーシスを誘導するPAR4の能力を妨げることが示されているため(Diaz-Meco et al., 1996; Berra et al., 1997)、特に機能的に関連している。
ケモカインSLC/CCL21(SLC、CKβ−9、6Cカインおよびエキソダス−2としても知られている)は、CC(β)−ケモカインサブファミリーのメンバーである。SLC/CCL21は、βケモカインに特徴的な4つの保存システインと2つの付加的システインをその異常に長いカルボキシル末端ドメイン中に含有する。ヒトSLC/CCL21 cDNAは、134アミノ酸残基の塩基性に富んだ前駆体タンパク質をコードし、そのうちの23アミノ酸残基のシグナルペプチドが切断されて111アミノ酸残基と予測される成熟タンパク質を形成する。マウスSLC/CCL21cDNAは、23残基のシグナルペプチドが切断されて110残基の成熟タンパク質を生成する133アミノ酸残基のタンパク質をコードする。ヒトおよびマウスSLC/CCL21は高度に保存されて、86%のアミノ酸配列同一性を示す。ヒトSLC/CCL21に関する遺伝子は、多数のヒトCCケモカインの遺伝子が密集している染色体17ではなく、ヒト染色体9p13に位置する。SLC/CCL21遺伝子は、別の近年同定されたCCケモカインであるMIP−3β/ELC/CCL19に関する遺伝子と同様、約100kbの領域内に存在する。SLC/CCL21は、mRNAレベルでリンパ系組織中で高度に発現されることが知られており、Tリンパ球およびBリンパ球に対する化学誘引物質であることが既知であった(Nagira, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 19518-19524; Hromas, et al. (1997) J. Immunol. 159: 2554-2558; Hedrick, et al. (1997) J. Immunol. 159: 1589-1593; Gunn, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 258-263)。SLC/CCL21は、細胞間接着分子−1へのリンパ球の接着と、回転細胞の休止の両方を誘導する(Campbell, et al. (1998) Science 279: 381-384)。上記の特性は全て、リンパ系組織を通じてリンパ球の輸送を調節するというSLC/CCL21の役割と一致する。ほとんどのCCケモカインとは異なって、SLC/CCL21は単球に対して走化性でない。しかしながら、用量依存的に造血性前駆コロニー形成を抑制することが報告されている(Hromas et al. (1997) J. Immunol. 159: 2554-58)。
13803; Yoshida et al. (1998 J. Biol. Chem. 273: 7118; Campbell, et al. (1998) J
Cell Biol 141: 1053)。CCR7はT細胞および樹状細胞(DC)において発現しており、これはリンパ球および成熟DCの両方に対するSLC/CCL21の走化性作用と一致している。記憶(CD45RO+)およびナイーブ(CD45RA+)CD4+およびCD8+T細胞は、CCR7受容体を発現する(Sallusto et al. (1999) Nature 401: 708)。記憶T細胞集団内で、CCR7発現は、炎症化組織に移動し得るエフェクター機能を有するT細胞(CCR7−)とエフェクター機能を提示する前に二次刺激を要するT細
胞(CCR7+)との間を識別する(Sallusto et al. (1999) Nature 401: 708)。成熟DCとは違って、未熟DCはCCR7を発現せず、それらはCCL21の走化性作用に対して応答しない(Sallusto et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 2760; Dieu et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 373)。
DCがリンパ節に移動できないことに大いに起因する、重度に低減した一次T細胞応答を有する(Forster et al. (1999) Cell 99: 23)。今日までの全体的知見は、CCR7お
よびその2つのリガンド、CCL19およびCCL21が、T細胞/DC相互作用の制御を介するT細胞応答の重要な調節物質である、という見解を支持する。CCR7は、二次リンパ系器官への細胞の遊走の決定に際して、有益な役割を有する重要な調節分子である(Forster et al. (1999) Cell 99: 23; Nakano et al. (1998) Blood 91: 2886)。
THAP1(タナトス関連タンパク質1)
過去数年、本発明者等は後毛細管高内皮細静脈の特殊化内皮細胞(HEVEC)中で発現される新規遺伝子の分子的解析に集中した(Girard and Springer, 1995a; Girard and
Springer, 1995b; Girard et al., 1999)。本発明において、彼等は、PML−NBに
局在するタンパク質であるTHAP1(タナトス(死)関連タンパク質−1)の解析を報告する。THAP1ベイトを用いたHEVEC cDNAライブラリーの2−ハイブリッドスクリーニングは、ユニークな相互作用相手である好(pro)アポトーシスタンパク質PAR4の同定をもたらす。PAR4はPML−NB中に蓄積すること、THAP1/PAR4複合体のPML−NLへのターゲッティングはPMLにより媒介されることが判明した。PAR4と同様に、THAP1は好アポトーシスポリペプチドである。その好アポトーシス活性は、THAPドメインと呼ばれるアミノ末端部分における新規のタンパク質モチーフを要する。総合してこれらの結果は、THAP1/PAR4好アポトーシス複合体を包含するアポトーシスに関する新規のPML−NB経路を定義する。
りコードされるポリペプチドと相同なポリペプチドを包含する。したがって本発明は、診断および活性測定も含み、そしてTHAPファミリータンパク質またはその一部分の治療における使用、ならびにTHAPファミリーメンバーの好アポトーシス活性を抑制(または刺激)し得る化合物を同定するための薬剤スクリーニングアッセイも含む。
P1、またはそのSLC/CCL21結合断片を、薬学的に許容可能な担体とともに含む薬剤を用意する。本明細書中に記載された薬剤は、治療および/または予防のために有用であり得る。
(a)配列番号1〜114からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むTHAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を試験化合物と接触させること、および
(b)上記化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節するか否かを決定することを含み、
上記試験化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節するという決定は、上記化合物がアポトーシスの候補モジュレーターであるということを示す方法。
パク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を有する段落2〜15のいずれかの方法。
(a)配列番号2のアミノ酸第1〜90位、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(b)本質的に配列番号3のアミノ酸第1〜89位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(c)本質的に配列番号4のアミノ酸第1〜89位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(d)本質的に配列番号5のアミノ酸第1〜89位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(e)本質的に配列番号6のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(f)本質的に配列番号7のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(g)本質的に配列番号8のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(h)本質的に配列番号9のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(i)本質的に配列番号10のアミノ酸第1〜92位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(j)本質的に配列番号11のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(k)本質的に配列番号12のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
(l)本質的に配列番号13のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、および
(m)本質的に配列番号14のアミノ酸第1〜90位からなるTHAPファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド。
(ii)配列番号160〜175からなる群から選択される配列の核酸配列およびそれと相補的な配列を含む核酸分子、および
(iii)その配列が(i)および(ii)で定義されたような核酸配列に対する遺伝
暗号の結果として縮重性である核酸からなる群から選択されるアポトーシス活性を有するTHAPファミリーポリペプチドをコードする単離された核酸。
(ii)配列番号1および2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むアポトーシス活性を有するTHAPファミリーポリペプチドをコードする単離された核酸。
i)配列番号1〜114のポリペプチドおよび配列番号160〜175の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群から選択される配列と少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
ii)アポトーシス活性を保有する上記ポリペプチドの断片
をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
配列番号1〜114のいずれか1つのTHAPファミリータンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主細胞の集団を供給すること、および
上記組換え核酸の発現を促す条件下で宿主細胞の上記集団を培養することを含み、
それにより上記ポリペプチドは宿主細胞の上記集団内で産生される方法。
のポリペプチドを含む段落38のポリペプチド。
(a)THAPファミリーポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
(b)THAPファミリーポリペプチドの細胞のアポトーシスを誘導する能力を評価することを含む方法。
(a)THAPファミリーポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
(b)THAPファミリーポリペプチドのDNA結合能力を評価することを含む方法。
択される少なくとも1つの活性を有する、天然のTHAPファミリーポリペプチドまたはその断片を含む段落49の方法。
(a)被験体からの生物学的試料を、
配列番号160〜175の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
配列番号1〜114のポリペプチドと選択的に結合する検出可能なポリペプチド
と接触させる工程、および
(b)上記ポリヌクレオチドと上記試料内のRNA種との間のハイブリダイゼーションの存在または非存在、あるいは上記試料内のポリペプチドと上記検出可能なポリペプチドの結合の存在または非存在を検出する工程を含み、
上記ハイブリダイゼーション、または上記結合の検出は、上記THAPファミリーポリペプチドが上記試料内で発現されることを示す方法。
(a)THAPファミリーポリペプチドに対する結合部位を含む核酸分子を、
(i)被験体からの生物学的試料、または
(ii)被験体からの生物学的試料から単離されるTHAPファミリーポリペプチドであって、配列番号1〜114のうちの1つのアミノ酸配列を含む、THAPファミリーポリペプチド
と接触させる工程、および
(b)上記核酸分子およびTHAPファミリーポリペプチド間の結合を評価する
工程を含み、
対照THAPファミリー核酸への結合レベルと比較した場合の結合低減の検出は、上記試料がTHAPファミリー活性を欠損していることを示す方法。
(a)上記哺乳類からの生物学的試料を供給する工程、および
(b)上記生物学的試料内の配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドの量または配列番号1〜114のポリペプチドをコードするTHAPファミリーRNA種の量を、対照試料中に検出されるかまたはそれから予測されるレベルと比較する工程を含み、
上記対照試料中に検出されるかまたはそれから予測されるレベルと比較した場合の上記生物学的試料中の上記THAPファミリーポリペプチドまたは上記THAPファミリーRNA種の量の増大は、上記哺乳類においてTHAPファミリー発現のレベルが増大していることを示し、ならびに上記対照試料中に検出されるかまたはそれから予測される上記レベルと比較した場合の上記生物学的試料内の上記THAPファミリーポリペプチドまたは上記THAPファミリーRNA種の量の低減は、上記哺乳類においてTHAPファミリー発現レベルが低減していることを示す方法。
(a)配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドあるいは配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸の連続スパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
(b)上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
(a)上記THAPファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
(b)上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1
つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
(a)上記THAPファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および
(b)上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定が、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
(a)配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドあるいは配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸の連続スパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
(b)上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、上記化合物が上記ペプチドの候補活性化剤であるということを示す方法。
4のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸の連続スパンを含む断片の候補活性化剤を同定する方法であって、
(a)上記ポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
(b)上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物が上記ポリペプチドの候補活性化剤であるということを示す方法。
(a)上記THAPファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および
(b)上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物が上記ポリペプチドの候補活性化剤であるということを示す方法。
(a)PAR4ポリペプチドまたはその断片を用意すること、
(b)PML−NBポリペプチドまたはPML−NBに関連するポリペプチドまたはそれらの断片を用意すること、および
(c)上記PML−NBポリペプチドまたはPML−NBに関連するポリペプチドと結合する上記PAR4ポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に調節するか否かを決定することを含み、
上記PML−NBポリペプチドまたはPML−NBに関連するポリペプチドと結合する上記PAR4ポリペプチドの能力を上記試験化合物が選択的に抑制するという決定は、上記化合物がPAR4活性の候補モジュレータであることを示す方法。
(a)PAR4ポリペプチドまたはその断片を用意すること、および
(b)PML−NBに局在化する上記PAR4ポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に調節するか否かを決定することを含み、
PML−NBに局在化する上記PAR4ポリペプチドの能力を上記試験化合物が選択的
に抑制するという決定は、上記化合物がPAR4活性の候補モジュレータであることを示す方法。
(a)配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチド、または配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸の連続スパンを含む断片を供給すること、
(b)THAPファミリー標的ポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
(c)上記THAPファミリー標的ポリペプチドと結合する上記THAPファミリーポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記THAPファミリー標的ポリペプチドと結合する上記THAPファミリーポリペプチドの能力を上記試験化合物が選択的に抑制するという決定は、上記化合物がTHAPファミリー活性の候補インヒビターであることを示す方法。
(b)THAPファミリー標的ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む二次発現ベクター
を含む細胞を供給することを含む段落82の方法。
を誘導し、細胞分裂を抑制し、転移能を抑制し、腫瘍負荷量を低減し、化学療法または放射線療法に対する感受性を増大し、癌細胞を殺傷し、癌細胞の増殖を抑制し、内皮細胞を殺傷し、内皮細胞の増殖を抑制し、血管新生を抑制し、あるいは腫瘍退縮を誘導する段落108の方法。
(a)THAPファミリーポリペプチドを標識化ランダム核酸のプールとともにインキュベートすること、
(b)上記THAPファミリーポリペプチドおよび少なくとも1つの核酸間の複合体を上記プールから単離すること、
(c)増幅反応を実施して、上記複合体中に存在する少なくとも1つの核酸を増幅するすること、
(d)上記少なくとも1つの増幅核酸を上記THAPファミリーポリペプチドとともにインキュベートすること、
(e)上記少なくとも1つの増幅核酸と上記THAPファミリーポリペプチドの複合体を単離すること、
(f)工程(c)、(d)および(e)を複数回反復すること、および
(g)上記複合体中の上記核酸の配列を決定することを含む方法。
配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むTHAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を試験化合物と接触させること、および
上記試験化合物が上記THAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片の活性を選択的に調節するか否かを決定することを含み、上記試験化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節するという決定は、上記試験化合物がTHAP媒介性活性の候補モジュレーターであるということを示す方法。
ドメインポリペプチド。
配列番号1〜114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTHAPファミリーポリペプチドあるいは配列番号1〜114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
上記THAPファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のP
ML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
上記THAPファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および
上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドまたは配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片を供給すること、
THAPファミリー標的ポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
上記THAPファミリー標的ポリペプチドと結合する上記THAPファミリーポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に調節するか否かを決定することを含み、
上記試験化合物が上記THAPファミリー標的ポリペプチドと結合する上記THAPファミリーポリペプチドの能力を選択的に調節するという決定は、上記化合物がTHAPファミリー活性の候補モジュレーターであるということを示す方法。
配列番号1〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTHAPファミリーポリペプチドあるいは配列番号1〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定が、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
上記THAPファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドとの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
上記THAPファミリーポリペプチドを試験化合物を含む細胞と接触させること、および
上記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドとの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
THAPおよびPAR4生物学的経路
上記のように、アポトーシスに関与する新規のクラスのタンパク質を本発明者等は発見した。次に本発明者等はまた、この新規のクラスの一成員を別の(PAR4)アポトーシス経路に結びつけ、さらにPML−NBに対するこれらの経路の両方に結びつけた。さらに本発明者等はまた、これらの経路両方を内皮細胞と関連させて、一連の新規のならびに潜在的選択性療法的処置を提供した。特に、THAP1(タナトス(死)関連タンパク質)はPML−NBに局在する、ということが発見された。さらに、THAP1ベイトを用いたHEVEC cDNAライブラリーの2ハイブリッドスクリーニングは、独特の相互作用相手であるプロアポトーシスタンパク質PAR4の同定をもたらす。PAR4はPML−NB中に蓄積することも見出される。PML−NBに対するTHAP−1/PAR4複合体のターゲッティングは、PMLにより媒介される。PAR4と同様に、THAP1はプロアポトーシス活性を有する。この活性は、THAPドメインとよばれるアミノ末端部分における新規のモチーフを含む。合わせて考えると、これらの結果は、THAP1/PAR4プロアポトーシス複合体を包含するアポトーシスに関する新規のPML−NB経路を限定する。
本発明は、プロアポトーシスポリペプチドTHAP−0〜THAP11の一ファミリーをコードするポリヌクレオチド、ならびにアポトーシス関連およびその他のTHAP媒介性活性の調整のためのそれらの使用を含む。プロアポトーシスタンパク質PAR4と複合体を形成し、PML核小体として既知の離散性核内ドメインに局在するTHAP1が含まれる。さらに、THAPファミリーポリペプチドは、SLC/CCL21(SLC)の生物学的利用能を変えるかまたは他の方法で調整するために用いられ得る。
ロトコールの開発であった。ヒト扁桃から新たに精製されたHEVECから全RNAが得られるプロトコールが開発された。高度精製HEVECを、機械的および酵素的手法、免疫磁気枯渇および陽性選択の組合せにより得た。扁桃をスチール製スクリーン上で鋏で細かく切り刻み、コラゲナーゼ/ジスパーゼ酵素ミックスで消化し、次に免疫磁気枯渇を用いて望ましくない夾雑細胞を枯渇させた。次に、HEV特異的抗体MECA−79と接合させた磁気ビーズを用いた免疫磁気陽性選択により、HEVECを選択した。98%MECA−79−陽性であるこれらのHEVECから、1μgの総RNAを用いて、THAP1cDNAクローニングおよびRT−PCR分析のための全長cDNAを生成した。
され得る。
列を互いとハイブリダイズさせたままにする中等度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションに関する条件を説明するよう意図される。好ましくは条件は、互いに少なくとも約70%、さらに好ましくは少なくとも約80%、さらに好ましくは少なくとも約85%、90%、95%または98%相同である配列が典型的には互いとハイブリダイズしたままであるようなものである。ストリンジェントな条件は当業者に既知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件の好ましい例を以下に挙げるが、これらに限定されない:ハイブリダイゼーション工程は、6×SSC緩衝液、5×デンハート溶液、0.5%SDSおよび100μg/mlのサケ精子DNAの存在下で65℃で実現される。ハイブリダイゼーション工程は、その後4つの洗浄工程が続く:
−好ましくは2×SSCおよび0.1%SDS緩衝液中で65℃で、5分間2回洗浄、
−好ましくは2×SSCおよび0.1%SDS緩衝液中で65℃で、30分間1回洗浄、
−好ましくは0.1×SSCおよび0.1%SDS緩衝液中で65℃で、10分間1回洗浄。
これらのハイブリダイゼーション条件は、約20ヌクレオチド長の核酸分子に適している。上記のハイブリダイゼーション条件は、当業者に既知の技法に従って、所望の核酸の長さにより適合されるべきものであり、例えばHames B.D. and Higgins S.J. (1985) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach. Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford;およびCurrent Protocols in Molecular Biolog(上記)に開示された教示に従っ
て適合される、と理解される。好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号160〜175の配列とハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然核酸分子に対応する。本明細書中で用いる場合、「天然」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子(例えば天然タンパク質をコードする)を指す。
援用される。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、語長=12を用いて実施されて、本発明のTHAPファミリー核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア=50、語長=3を用いて実施されて、本発明のTHAPファミリータンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得る。比較のためのギャップ有りアラインメントを得るために、Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402に記載されたように、ギャップ有りBLASTが利用され得る。BLASTおよびギャップ有りBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えばXBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが用いられ得る(www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい例はMyers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムであるが、これに限定されない。このようなアルゴリズムは、GCG配
列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)で援用される。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティーおよび4のギャップペナルティーが用いられ得る。
上記のように、前立腺アポトーシス応答−4(PAR4)は、アポトーシスを受けている前立腺腫瘍細胞において特異的にアップレギュレートされる遺伝子の産物として最初に同定された38kDaタンパク質である(再検討のためには、Rangnekar, 1998; Mattson
et al., 1999参照)。PAR4核酸およびアミノ酸配列、Johnstone et al, Mol. Cell.
Biol. 16 (12), 6945-6956 (1996);およびGenbank寄託番号U63809(配列番号1
18)参照。
分子が下流細胞活性を調整するよう、間接的活性、例えばPAR4タンパク質とPAR4標的分子との相互作用により媒介される活性である(例えばPAR4分子とPAR4標的分子との相互作用は細胞内シグナル伝達経路におけるその標的分子の活性を調整し得る)。
SLCの生物学的役割
T細胞自己免疫疾患中のT細胞浸潤を媒介するシグナルは、十分に理解されてはいない。SLC/CCL21(配列番号119)は、T細胞移動の誘引に対して非常に強力であり且つ非常に特異的である。それは、二次リンパ系器官においてのみ発現されて、ナイーブT細胞を抗原提示の領域に向けると最初は考えられた。しかしながら免疫組織学を用いて、CCL21の発現はT細胞自己免疫浸潤性皮膚疾患の内皮細胞において高度に誘導される、ということが判明した(Christopherson et al. (2002) Blood electronic publication prior to printed publication)。他のT細胞ケモカインは、これらのT細胞皮膚疾患においては一貫して誘導されなかった。CCL21に関する受容体であるCCR7は、浸潤T細胞で高度に発現され、その大多数は記憶CD45Ro表現型を発現する、ということも判明した。したがってT細胞浸潤性自己免疫皮膚疾患においてSLC/CCL21を発現する炎症性細静脈内皮細胞は、これらの組織へのT細胞移動の調節に重要な役割を演じ得る。
細胞の移動は、EAEの開始に決定的に関与する。この過程におけるケモカインの直接関与は、Gプロテイン媒介性シグナル伝達がin vivoでのBBB内皮上の脳炎誘発性T細胞の接着強化を促すために必要とされる、という観察により示唆された。in situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学によるBBBに存在するケモカインに関する検索は、炎症細胞により取り囲まれた細静脈におけるリンパ系ケモカインCCL19/ELCおよびCCL21/SLCの発現を明示した(Alt et al. (2002) Eur J Immunol 32: 2133-44)。それらの発現は、EAEに罹患したマウスの脳および脊髄切片中の炎
症細胞におけるそれらの一般的受容体CCR7の存在が並行する。脳炎誘発性T細胞はCCR7の表面発現を示し、そしてin vitroでのナイーブリンパ球に匹敵する濃度依存性および百日咳毒素感受性方式でCCL19またはCCL21の両方に向けて特異的に走化した。EAE脳の凍結切片に関する結合アッセイは、脳中の炎症性細静脈への脳炎誘発性Tリンパ球の接着強化におけるCCL19およびCCL21の機能的関与を実証した(Alt et al. (2002) Eur J Immunol 32: 2133-44)。合わせて考えると、これらのデ
ータは、リンパ系ケモカインCCL19およびCCL21が、二次リンパ系組織へのリンパ球ホーミングの調節に加えて、免疫監視および慢性炎症中の免疫学的特権中枢神経系へのTリンパ球移動に関与する、ということを示唆した。
および実験的自己免疫糖尿病(Hjelmstrom et al. (2000) Am J Path 156: 1133-1138)
が挙げられる。したがって、ケモカインSLC/CCL21は、T細胞自己免疫疾患における重要な薬理学的標的であり得る。SLC/CCL21のインヒビターは、SLC/CCL21を発現する内皮細胞による循環から病理学的炎症の部位へのT細胞の異常動員を妨げることにより、これらのT細胞浸潤性疾患の治療時に有効な作用物質であり得る。関連組織へのT細胞移動の低減は、それらの疾患に認められるT細胞加害性損傷を低減する。
E−1(+)リンパ管内皮には存在しない。PSCにおける肝臓内リンパ球としては、CCR7(+)T細胞の集団が挙げられるが、その半分だけがCD45RAを発現し、そしてマイグレイションアッセイにおいてCCL21に応答する。PSCにおける門脈中の粘膜アドレッシン細胞接着分子−1に関連したCCL21の発現は、CCR7(+)粘膜リンパ球の動員および保持を促して、慢性門脈炎症の確立ならびに門脈関連リンパ系組織拡張をもたらし得る。これらの知見は、抗SLC/CCL21抗体が高内皮細静脈および門脈関連リンパ系組織の発達を防止することを示す、慢性肝臓炎症の動物モデルにおける研究により支持される(Yoneyama et al. (2001) J Exp Med 193: 35-49)。
本明細書中に記載したようなアポトーシスにおけるTHAP1タンパク質の生物学的活性の解明に基づいて、本明細書中でTHAPドメインとよばれる新規のタンパク質モチーフを本発明者等は同定し、さらに特性化した。THAPドメインは、本明細書中でさらに説明するように、いくつかのその他のポリペプチドにおいて本発明者等により同定された
。THAPドメインの構造および機能についての知識は、THAPファミリー標的分子との相互作用を調整し、細胞周期および細胞増殖を調整し、アポトーシスを誘導し、あるいはアポトーシスの誘導を強化するかまたはそれに参加することができる薬剤の調製またはスクリーニングに用いられ得るスクリーニングアッセイの実施を可能にする。
、これらに限定されない。
上記のように、当業者らは、THAP−0、THAP1、THAP−2、THAP−3、THAP−4、THAP−5、THAP−6、THAP−7、THAP−8、THAP−9、THAP−10、およびTHAP−11を含むいくつかのTHAPファミリー成員
を同定する。
配列番号160で示される約639ヌクレオチド長であるヒトTHAP1コード配列は、約213アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに説明されるようなTHAP1タンパク質またはその生物学的活性部分をコードする精製または単離核酸分子、ならびにその核酸断片に関する。上記の核酸は、例えば本明細書中でさらに説明されるように、治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。
サスアミノ酸配列を有するTHAPドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。THAP1核酸は、アミノ酸残基の少なくとも約95%、90%、85%、50〜80%、好ましくは少なくとも約60〜70%、さらに好ましくは少なくとも約65%がTHAPドメインコンセンサス配列(配列番号1および2)と同一または類似アミノ酸であるTHAPドメインもコードし得る。本発明は、配列番号1および2の式による少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8または10アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも15、25、30、35、40、45、50、60、70、80または90アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドをコードする単離、精製および組換えポリヌクレオチドも例示する。
「THAP1ポリペプチド」という用語は、本発明のタンパク質およびポリペプチドの全てを包含するために本明細書中で用いられる。本発明のポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドも、本発明の一部を構成する。本発明は、ヒトからのTHAP1タンパク質、例えば配列番号3の配列からなるか、または本質的にそれからなるか、またはそれを含む単離または精製THAP1タンパク質を例示する。
それらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、THAP1ポリペプチドは、少なくとも約95%、90%、85%、50〜80%、好ましくは少なくとも約60〜70%、さらに好ましくは少なくとも約65%のアミノ酸残基がTHAPドメインコンセンサス配列(配列番号1および2)と同一または類似アミノ酸であるTHAPドメインをコードし得る。本発明は、配列番号3で示されるアミノ酸位置1〜90のTHAPドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるTHAP1ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
上記のように、本発明は、THAPファミリーのいくつかの成員を提供する。THAP−2、THAP−3、THAP−4、THAP−5、THAP−6、THAP−7、THAP−8、THAP−9、THAP10、THAP11およびTHAP−0が本明細書中に記載される。ヒトcDNA配列に対応するヒトおよびマウスヌクレオチド配列が配列番号161〜171に列挙され、ヒトアミノ酸配列はそれぞれ配列番号4〜14に列挙されている。上記THAPファミリー配列のオルトログ、例えばマウス、ラット、ブタおよびその他のオルトログも本発明に包含され、それらのアミノ酸配列は、配列番号16〜114に列挙され、そしてcDNA配列は配列番号172〜175に列挙される。
配列番号161で示される約1302ヌクレオチド長であるヒトTHAP−2 cDNAは、配列番号4で示される約228アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−2タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−2遺伝子は、第12および3染色体に局在化される。THAP−2タンパク質は、アミノ酸1〜89にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−2が以下のように発現されることを示唆する:BG677995(扁平上皮癌);AV718199(視床下部);BI600215(視床下部);AI208780(ソアレス精巣(Soares testis)NHT);BE56699
5(癌細胞株);AI660418(プールされた胸腺)。
配列番号162で示される約1995ヌクレオチド長であるヒトTHAP−3 cDNA。このTHAP−3遺伝子は、配列番号5で示される約239アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−3タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、
ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−3遺伝子は、第1染色体に局在化される。THAP−3タンパク質は、アミノ酸1〜89にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−3が以下のように発現されることを示唆する:BG700517(海馬);BI460812(精巣);BG707197(視床下部);AW960428(−);BG437177(大細胞癌);BE962820(腺癌);BE548411(子宮頸癌細胞株);AL522189(神経芽細胞腫細胞);BE545497(子宮頸癌細胞株);BE280538(絨毛癌);BI086954(頚部);BE744363(腺癌);およびBI549151(海馬)。
配列番号163で示される1999ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−4 cDNAは、配列番号6で示される約577アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−4タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。THAP−4タンパク質は、アミノ酸1〜90にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−4が以下のように発現されることを示唆する:AL544881(胎盤);BE384014(メラニン性黒色腫);AL517205(神経芽細胞腫細胞);BG394703(網膜芽細胞腫);BG472327(網膜芽細胞腫);BI196071(神経芽細胞腫);BE255202(網膜芽細胞腫);BI017349(肺腫瘍);BF972153(平滑筋肉腫細胞株);BG116061(十二指腸腺癌細胞株);AL530558(神経芽細胞腫細胞);AL520036(神経芽細胞腫細胞);AL559902(バーキットリンパ腫からのB細胞);AL534539(胎児脳);BF686560(平滑筋肉腫細胞株);BF345413(1p/19q損失を伴う未分化乏突起神経膠腫);BG117228(腺癌細胞株);BG490646(大細胞癌);およびBF769104(epid腫瘍)。
配列番号164で示される1034ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−5 cDNAは、配列番号7で示される約239アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−5タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−5遺伝子は、第7染色体に局在化される。THAP−5タンパク質は、アミノ酸1〜90にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−5が以下のように発現されることを示唆する:BG575430(乳房腺癌細胞株);BI545812(海馬);BI560073(精巣);BG530461(胎児性癌);BF244164(膠芽細胞腫);BI461364(精巣);AW407519(胚中心B細胞);BF103690(胎児性癌);およびBF939577(腎臓)。
配列番号165で示される2291ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−6 cDNAは、配列番号8で示される約222アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−6タン
パク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−6遺伝子は、第4染色体に局在化される。THAP−6タンパク質は、アミノ酸1〜90にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−6が以下のように発現されることを示唆する:AV684783(肝細胞癌);AV698391(肝細胞癌);BI560555(精巣);AV688768(肝細胞癌);AV692405(肝細胞癌);およびAV696360(肝細胞癌)。
配列番号166で示される1242ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−7 cDNAは、配列番号9で示される約309アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−7タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−7遺伝子は、第22q11.2染色体に局在化される。THAP−7タンパク質は、アミノ酸1〜90にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−7が以下のように発現されることを示唆する:BI193682(類上皮癌細胞株);BE253146(網膜芽細胞腫);BE622113(メラニン性黒色腫);BE740360(腺癌細胞株);BE513955(バーキットリンパ腫);AL049117(精巣);BF952983(神経性、正常);AW975614(−);BE273270(腎細胞腺癌);BE738428(膠芽細胞腫);BE388215(子宮内膜腺癌細胞株);BF762401(結腸、est);およびBG329264(網膜芽細胞腫)。
配列番号167で示される1387ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−8 cDNAは、配列番号10で示される約274アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−8タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−8遺伝子は、第19染色体に局在化される。THAP−8タンパク質は、アミノ酸1〜92にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−8が以下のように発現されることを示唆する:BG703645(海馬);BF026346(メラニン性黒色腫);BE728495(メラニン性黒色腫);BG334298(メラニン性黒色腫);およびBE390697(子宮内膜腺癌細胞株)。
配列番号168で示される693ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−9 cDNAは、配列番号11で示される約231アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−9タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。THAP−9タンパク質は、アミノ酸1〜92にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−9が以下のよ
うに発現されることを示唆する:AA333595(8週胚)。
配列番号169で示される771ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−10 cDNAは、配列番号12で示される約257アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−10タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−10遺伝子は、第15染色体に局在化される。THAP−10タンパク質は、アミノ酸1〜90にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP10が以下のように発現されることを示唆する:AL526710(神経芽細胞腫細胞);AV725499(視床下部);AW966404(−);AW296810(肺);およびAL557817(T細胞白血病からのT細胞)。
配列番号170で示される942ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−11 cDNAは、配列番号13で示される約314アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−11タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−11遺伝子は、第16染色体に局在化される。THAP−11タンパク質は、アミノ酸1〜90にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP11が以下のように発現されることを示唆する:AU142300(網膜芽細胞腫);BI261822(リンパ腫細胞株);BG423102(腎細胞腺癌);およびBG423864(腎臓)。
配列番号171で示される2283ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトTHAP−0 cDNAは、配列番号14で示される約761アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなTHAP−0タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトTHAP−0遺伝子は、第11染色体に局在化される。THAP−0タンパク質は、アミノ酸1〜90にTHAPドメインを含む。データベース中の発現配列(指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る)の分析は、THAP−0が以下のように発現されることを示唆する:BE713222(頭、首);BE161184(頭、首);AL119452(扁桃);AU129709(奇形癌);AW965460(−);AW965460(−);AW958065(−);およびBE886885(平滑筋肉腫)。
る。本発明の別の目的は、本明細書中に明記されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号161〜171または173〜175のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む精製、単離または組換え核酸、あるいはそれと相補的な配列、またはその変異体またはその生物学的活性断片に関する。さらなる実施形態では、本発明の核酸は、配列番号161〜171または173〜175からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンを含む単離、精製または組換えポリヌクレオチド、あるいはその相補体を含む。
で示される上記ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それにより安定二重鎖を形成し得るよう、配列番号161〜171および173〜175で示されたそれぞれのヌクレオチド配列と十分に相補的である。
ドする核酸断片は、THAP−2〜THAP11またはTHAP−0生物学的活性(本明細書中に記載されたTHAPファミリータンパク質の生物学的活性)を有するポリペプチドをコードする配列番号161〜171および173〜175からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部分を単離し、THAP−2〜THAP11またはTHAP−0タンパク質のコードした部分を発現させ(例えばin vitroまたはin vivoでの組換え発現により)、そしてTHAP−2〜THAP11またはTHAP−0タンパク質のコードした部分の活性を評価することにより調節され得る。
「THAP−2〜THAP11またはTHAP−0ポリペプチド」という用語は、THAP−2、THAP−3、THAP−4、THAP−5、THAP−6、THAP−7、THAP−8、THAP−9、THAP10、THAP11およびTHAP−0に関する本発明のタンパク質およびポリペプチドの全てを包含するために本明細書中で用いられる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドも、本発明の一部を構成する。本発明は、ヒトからのTHAP−2〜THAP11またはTHAP−0タンパク質、例えば配列番号4〜14、17〜21、23〜40、42〜56、58〜98および100〜114からなる群から選択される配列からなるか、または本質的にそれからなるか、またはそれを含む単離または精製THAP−2〜THAP11またはTHAP−0タンパク質を例示する。
−0タンパク質をコードし得る。
るTHAPドメインを含み得る。本発明は、配列番号6で示されるアミノ酸位置1〜90のTHAPドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるTHAP−4ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
Pドメインコンセンサスドメイン(配列番号1および2)と同一または類似アミノ酸であるTHAPドメインを含み得る。本発明は、配列番号9で示されるアミノ酸位置1〜90のTHAPドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるTHAP−7ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
は少なくとも約60〜70%、さらに好ましくは少なくとも約65%のアミノ酸残基がTHAPドメインコンセンサスドメイン(配列番号1および2)と同一または類似アミノ酸であるTHAPドメインを含み得る。本発明は、配列番号12で示されるアミノ酸位置1〜90のTHAPドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるTHAP10ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
〜THAP11またはTHAP−0タンパク質の機能的活性を保持するアミノ酸を含むタンパク質である。好ましくはタンパク質は、配列番号4〜14、17〜21、23〜40、42〜56、58〜98または100〜114と少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または99.8%相同であるが、しかし配列番号4〜14、17〜21、23〜40、42〜56、58〜98または100〜114と同一ではない。好ましくはTHAP−2〜THAP11またはTHAP−0は、天然に生じるTHAP−2〜THAP11またはTHAP−0と同一(例えば100%同一性)未満である。相同性%は、上でさらに詳述したように決定され得る。
THAPファミリーポリペプチドの機能を特性化することにより、本発明はさらに、THAPファミリーまたはTHAPドメインヌクレオチド配列の機能的断片および変異体の活性を試験し、またはそれらを得る方法であって、変異体または修飾THAPファミリーまたはTHAPドメイン核酸を提供し、そしてそれによりコードされたポリペプチドが本発明のTHAPファミリー活性を示すか否かを評価する方法を提供する、と理解される。したがってTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドの機能を評価する方法であって、(a)THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログを提供すること、(b)上記THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログをTHAPファミリー活性に関して試験することを含む方法が含まれる。任意の適切なフォーマット、例えば無細胞、細胞ベースおよびin vivoフォーマットが用いられ得る。例えば上記のアッセイは、宿主細胞中でTHAPファミリーまたはTHAPドメイン核酸を発現し、そして上記細胞中のTHAPファミリー活性を観察することを含むことができる。別の例では、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログが細胞に導入され、そしてTHAPファミリー活性が観察される。THAPファミリー活性は、本明細書中に記載されたような任意の活性、例えば(1)細胞中で発現されるかまたは細胞に導入された場合、アポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、最も好ましくはアポトーシスを誘導しまたは強化すること、および/または最も好ましくは細胞増殖を低減すること;(2)内皮細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること;(3)過増殖性細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること;(4)CNS細胞、好ましくは神経細胞または神経膠細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること;あるいは(5)血管新生を媒介すること、好ましくは抑制すること、炎症を媒介すること、好ましくは抑制すること、癌性組織の転移可能性を抑制すること、腫瘍負荷量の低減、化学療法または放射線療法に対する感受性の増大、癌細胞の殺害、癌細胞の増殖抑制、または腫瘍退縮の誘導からなる群から選択される動物において決定される活性であり得る。
PファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドと融合されるもの、例えばリーダーまたは分泌配列、または変異型THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドの精製のために用いられる配列、あるいは前タンパク質配列が意図される。このような変異体は、当業者の範囲内であるとみなされる。
ファン)、β分枝側鎖(例えばトレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがってTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログ中の予測非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられ得る。あるいは別の実施形態では、突然変異は、例えば飽和変異法により、ランダムにTHAPファミリーまたはTHAPドメインコード配列の全部または一部と一緒に導入され、その結果生じる変異体は、活性を保持する変異体を同定するためにTHAPファミリー生物学的活性に関してスクリーニングされ得る。配列番号1〜114のうちの1つの突然変異誘発素、コード化タンパク質は組換え的に発現され、タンパク質の活性が決定され得る。
に試験し得る。例証的実施形態では、THAPファミリータンパク質のペプチジル部分、例えばTHAPドメインまたはTHAPファミリー標的結合領域(例えばTHAP1、THAP−2およびTHAP−3の場合のPAR4)が、各々がTHAPファミリータンパク質の別個の断片を含有するチオレドキシン融合タンパク質としての発現により、THAPファミリー活性に関して試験され得る(例えば米国特許第5,270,181号および第5,292,646号;ならびにPCT公告WO94/02502参照)。
能、あるいは安定性(例えばex vivo有効期間およびin vivoでのタンパク質分解に対する耐性)を強化するといった目的のために用いられ得る。このような修飾ペプチドは、天然に生じる形態のタンパク質の少なくとも1つの活性を保有するよう意図される場合、本明細書中でさらに詳細に記載されるTHAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質の機能的等価物と考えられる。このような修飾ペプチドは、例えばアミノ酸置換、欠失または付加により生成され得る。
れてきた(例えばScott et al. (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al. (1992)
PNAS 89: 2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382;ならびに米国特許第5,223,409号、第5,198,346号および第5,096,815号参照)。
137: 109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J Biochem. 218: 597-601; Nagashima et
al. (1993) J Biol. Chem. 268: 2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30: 10832-10838;および Cunningham et al. (1989) Science 244: 1081-1085)、リンカー走査変異法により(Gustin et al. (1993) Virology 193: 653-660; Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232: 316)、飽和変異法により(Meyers et al. (1986) Science 232: 613)、PCR変異法により(Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1: 1-19)、あるいはランダム変異法により(Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHI Press, Cold Spring Harbor, NY;およびGreener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7: 32-34)、生成され、ライブラリーから単離され得る。
同様に、蛍光標識THAPファミリー標的を用いて、潜在的機能性THAPファミリーホモログについて評価し得る。細胞は、蛍光顕微鏡下で視覚的に検査されて分離されるか、あるいは細胞の形態学的に可能であれば、蛍光活性化細胞選別機により分離され得る。
を崩壊することなく融合タンパク質を生成するために、ファージgIIIまたはgVIIIコートタンパク質のいずれかが用いられ得る場合、ほとんど同一のエシェリヒア・コリ糸状ファージM13、fdおよびflの群が、ファージ表示ライブラリーに最も高頻度に用いられる(Ladner et al. PCT公開公報WO90/02909;Gerrard et al., PCT公開公報WO92/09690;Marks et al. (1992) J Biol. Chem. 267: 16007-16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628;およびBarbas et al. (1992) PNAS 89: 4457-4461)。例証的実施形態では、THAPファミリー組合せライブラリーの発現に用いるために、組換えファージ抗体系(RPAS、ファルマシア(Pharmacia)カタログ番号27−9400−01)が容易に修
飾され、THAPファミリーファージライブラリーが固定THAPファミリー標的化分子上でパニングされ得る(グルタチオン固定THAPファミリー標的−GST融合タンパク質または固定化DNA)。繰り返しファージ増幅し、パニングすると、THAPファミリーホモログが非常に濃化されるが、これは、THAPファミリー標的と結合する能力を保持し、そしてその後アゴニストとアンタゴニスト間を区別するために、自動化アッセイで生物学的活性に関してさらにスクリーニングされ得る。
後−逆ペプチド(例えば米国特許第5,116,947号および第5,219,089号、ならびにPallai et al. (1983) Int J Pept Protein Res 21: 84-92参照)、
ベンゾジアゼピン(例えばFreidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、
アゼピン(例えばHuffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall
ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、
置換γラクタム環(Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)、
ケト−メチレン擬似ペプチド(Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29: 295;およびEwenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、
P−ターンジペプチドコア(Nagai et al. (1985) Tetrahedron Left 26: 647;およびSato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 123 1)、ならびに
P−アミノアルコール(Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126: 419;
およびDann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134: 71)
本発明のある種の実施形態は、オリゴマー、例えば二量体、三量体またはそれ以上の多量体のオリゴマーの形態でのTHAP1ポリペプチドを包含する。オリゴマーは、例えば異なるTHAP1ポリペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合により生成され得る。その他の実施形態では、オリゴマーは、THAP1ポリペプチドに融合されたペプチド部分間の共有結合または非共有的相互作用により連結される、2〜4のTHAP1ポリペプチドを含む。このようなペプチド部分は、ペプチドリンカー(スペーサー)、あるいはオリゴマー形成を促進するという特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパーおよび抗体由来のある種のポリペプチドは、それに結合されるTHAP1ポリペプチドのオリゴマー化を促進し得るペプチドの1つである。THAP1オリゴマーまたはこのようなオリゴマーの構成成分である融合タンパク質をコードするDNA配列が、本明細書中で提供される。
et al., Science 240: 1759, 1988)、以来、種々の異なるタンパク質中に見出されてきた。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する、天然型のペプチドおよびそれらの誘導体が含まれる。THAP1オリゴマーを生成するのに適したロイシンジッパードメインの例は、国際公開番号WO94/10308に記載されたものである。溶液中で二量体化または三量体化するペプチドに融合されたTHAP1ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、その結果生じる可溶性オリゴマーTHAP1が培養上清から回収される。
”, in Current Protocols in Immunology, Supp. 4, pages 10.19.1-10.19.11, 1992に
記載されている。THAP1/Fc融合タンパク質は、非常に類似した抗体分子を組み立て、その上に、ジスルフィド結合がFcポリペプチド間に形成され、二価THAP1を産生する。TNF受容体およびFcの、同様の融合タンパク質(例えばMoreland et al. (1997) N. Engl. J. Med. 337(3): 141-147; van der Poll et al. (1997) Blood 89(10): 3727-3734;およびAmmann et al. (1997) J. Clin. Invest. 99(7): 1699-1703参照)が、慢性関節リウマチを治療するために首尾よく用いられてきた。可溶性誘導体も、免疫グロブリン定常(Fc)部に融合された細胞表面糖タンパク質の細胞外ドメインからなる免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー中の細胞表面糖タンパク質から製作された(例えばCapon, D.J. et al. (1989) Nature 337: 525-531ならびにCapon 米国特許第5,116
,964号および第5,428,130号(CD4−IgG1構築物);Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730(CD28−IgG1構築物およびB7−1−IgG1構築物);ならびにLinsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 561-569
ならびに米国特許第5,434,131号(CTLA4−IgG1)参照)。このような融合タンパク質は、受容体−リガンド相互作用を調節するのに有用であることが立証された。
ノ酸20はLeuからGluに変えられ、そしてアミノ酸22はGlyからAlaに変えられていた。この突然変異タンパク質Fcは、免疫グロブリン受容体に対する親和性低減を示す。
〜213)を含むその断片の融合物を用いて、SLCと結合することができる。例えば、配列番号3(のアミノ酸143〜213)の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70連続アミノ酸のサイズのTHAP1断片を含むオリゴマーが生成され得る。THAP1オリゴマーを構成するアミノ酸断片は、同一のまたは異なる長さを有する。いくつかの実施形態では、完全THAP1タンパク質またはその生物学的活性部位は、一緒に融合されて、SLCと結合可能なオリゴマーを形成し得る。SLCと結合可能なTHAPファミリーポリペプチド、例えばTHAP2〜11およびTHAP0、配列番号16〜114のTHAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的活性断片も、その生物学的利用能を低減するかまたはそうでなければこのケモカインの活性を崩壊させるために、SLCと結合するオリゴマーを作製するために用いられ得る。
結合に影響を及ぼす試験化合物は、THAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的活性断片が試験化合物と接触されるスクリーニング方法を用いて同定され得る。いくつかの実施形態では、THAPファミリーポリペプチドは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。試験化合物がSLCとTHAPファミリーポリペプチド、例えばTHAP1(配列番号3)の結合を調整するか否かは、試験化合物がTHAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的活性断片の活性を調整するか否かを決定することにより、決定される。THAPファミリーポリペプチドの生物学的活性断片は、少なくとも5、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220または少なくとも220より長いアミノ酸長であり得る。試験化合物が上記ポリペプチドの活性を調節すると決定することは、試験化合物がTHAP媒介性活性のモジュレーターの候補であることを示す。
本発明のプライマーおよびプローブは、任意の適切な方法により、例えば適切な配列のクローニングおよび制限、ならびにNarang SA等(Methods Enzymol 1979; 68: 90-98)のホスホジエステル法、Brown EL等(Methods Enzymol 1979; 68: 109-151)のホスホジエ
ステル法、Beaucage等(Tetrahedron Lett 1981, 22: 1859-1862)のジエチルホスホラミダイト法、およびEP 0 707 592に記載された固体支持体法のような方法による直接化学合成により、調製され得る。
。
意のポリヌクレオチドが標識され得る。有用な標識としては例えば、放射性物質(例えば32P、35S、3H、125I)、蛍光染料(例えば5−ブロモデソキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン)、またはビオチンが挙げられる。好ましくは、ポリヌクレオチドは3’および5’末端で標識される。核酸断片の非放射性ラベリングの例は、Urdea et al.(Nucleic Acids Research. 11: 4937-4957, 1988)またはSanchez-Pescador et al.(J. Clin. Microbiol. 26(10): 1934-1938, 1988)
に記載されている。さらに、本発明によるプローブは、シグナル増幅を可能にするような構造的特徴を有し、このような構造的特徴は、例えばUrdea et al(Nucleic Acids Symp.
Ser. 24: 197-200, 1991)あるいは欧州特許第EP0 225 807号(Chiron)に
記載された分枝鎖DNAプローブである。
その他の形態であり得る。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブは、個々に固体支持体上に結合または固定されるか、あるいは本発明の少なくとも2、5、8、10、12、15、20または25のポリヌクレオチド群で、単一固体支持体に結合または固定され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドは、1つまたは2以上の本発明のポリヌクレオチドと同一の固体支持体に結合され得る。
本発明の別の態様は、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログをコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に操作可能的に連結される1つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて「操作可能的に連結される」とは、当該ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現が可能になるように、(例えばin vitro転写/翻訳系で、あるいはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で)調節配列(単数または複数)に連結されることを意味する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御因子(例えばポリアデニル化シグナル)を含むよう意図される。このような調節配列は、例えばGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多数の型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、ならびにある種の宿主細胞中だけでのヌクレオチド配列の発現を指図するもの(例えば組織特異的調節配列)が挙げられる。発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベル等といった因子に応じて設計されると当業者は理解する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより本明細書中に記載された核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド、例えば融合タンパク質またはペプチドを生成し得る(例えばTHAPファミリータンパク質、変異体形態のTHAPファミリータンパク質、融合タンパク質、または前記タンパク質のいずれかの断片等)。
AL(New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびpRIT5(Pharmacia, Piscataway, N. J.)が挙げられ、これらはそれぞれグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GS
T)、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを標的組換えタンパク質に融合する。
、該骨髄細胞は放射線処置レシピエントに移植され得る。次に十分な時間(例えば6週間)が経過した後、被験体レシピエントの病態が検査される。
YepSec1(Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943)、pJRY88(Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)およびpicZ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)が挙げられる。
329: 840)およびpMT2PC(Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195)が挙げ
られる。哺乳類細胞中で用いられる場合、発現ベクターの制御機能が、ウイルス調節因子により用意されることが多い。例えば一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40由来である。原核生物および真核生物細胞の両方に関するその他の適切な発現系に関しては、Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989の第16および17章を参照されたい。別の実施形態では、組換
え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において選択的に核酸の発現を指図することができる(例えば組織特異的調節因子が核酸を発現するために用いられる)。組織特異的調節
因子は当該技術分野で既知であり、以下でさらに説明される。
in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
被験体に投与するための好ましいベクターは、既知の方法に従って構築され得る。ベクターは、標的化細胞中で核酸の発現を指図することができる調節因子(例えばプロモーター、エンハンサー等)を含む。したがってヒト細胞が標的とされる場合、ヒト細胞中で発現可能なプロモーターに隣接して、そしてその制御下で核酸コード領域を配置するのが好ましい。
ター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長いターミナル反復、Pアクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼは、当該コード配列の高レベル発現を得るために用いられ得る。当該コード配列の発現を達成するための、当該技術分野で既知のその他のウイルスまたは哺乳類細胞または細菌ファージプロモーターの使用が同様に意図されるが、発現のレベルが所定の目的のために十分である必要がある。既知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の当該タンパク質の発現のレベルおよびパターンが最適化され得る。
(Gossen and Bujard, 1992; Gossen et al, 1995)により最初に開発されたTet−O
ffまたはTet On系(Clontech, Palo Alto, CA)である。この系は、テトラサイ
クリンまたはテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリンに応答して調節される高レベルの遺伝子発現も可能にする。Tet−On系では、遺伝子発現はドキシサイクリンの存在下で作動され、一方、Tet−Off系では、遺伝子発現はドキシサイクリンの非存在下で作動される。これらの系は、エシェリヒア・コリのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する2つの調節因子を基礎にしている。即ち、テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質である。当該遺伝子は、その中に存在するテトラサイクリン応答因子を有するプロモーターの後ろのプラスミド中でクローン化される。二次プラスミドは、テトラサイクリン制御性トランスアクチベーターと呼ばれる調節因子を含有するが、これは、TetOff系中で、単純ヘルペスウイルスからのVP16ドメイン、および野生型テトラサイクリンリプレッサーからなる。
LTR、アデノウイルスプロモーター、例えばEIA、E2AまたはMLP領域からのもの、AAV LTR、カリフラワーモザイクウイルス、HSV−TKならびに鳥肉腫ウイルスが挙げられる。
(i)脂肪組織:リポタンパク質リパーゼ(Zechner et al., 1988)、アジプシン(Spiegelman et al., 1989)、アセチル−CoAカルボキシラーゼ(Pape and Kim, 1989)、
グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ(Dani et al., 1989)、脂肪細胞P2(Hunt et
al., 1986);(j)血液:P−グロビン。
ン調節性プロモーター、例えば甲状腺、下垂体および副腎ホルモンに応答性であるものは、本発明において有用であると予測される。用いられ得るサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、KおよびTキニノゲン(Kageyama et al., 1987)
、c−fos、TNF−α、C−反応性タンパク質(Arcone et al., 1988)、ハプトグ
ロビン(Oliviero et al., 1987)、血清アミロイドA2、C/EBPα、IL−1、I
L−6(Poli and Cortese, 1989)、補体C3(Wilson et al., 1990)、IL−8、α
−1酸性糖タンパク質(Prowse and Baumann, 1988)、α−1アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ(Zechner et al., 1988)、アンギオテンシノーゲン(Ron et al., 1991)、フィブリノーゲン、c−jun(ホルボールエステル、TNFα、UV照射、レチ
ノイン酸および過酸化水素により誘導可能)、コラゲナーゼ(ホルボールエステルおよびレチノイン酸により誘導される)、メタロチオネイン(重金属および糖質コルチコイド誘導性)、ストロメリシン(ホルボールエステル、インターロイキン−1およびEGFにより誘導可能)、α−2マクログロブリンおよびα−Iアンチキモトリプシンが挙げられる。
の他のアミノ酸プロモーター、U1 snRNA(Bartlett et al., 1996)、MC−1
、PGK、−アクチンおよびα−グロビンが挙げられる。有用であり得る多数のその他のプロモーターは、Walther and Stein (1996)にリストされている。
エンハンサーは、DNAの同一分子上の遠位に位置するプロモーターからの転写を増大する遺伝因子である。エンハンサーは、プロモーターと同じように組織化される。即ち、それらは多数の個々の因子からなり、その各々は1つまたは複数の転写タンパク質と結合する。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的区別は、操作可能性である。エンハンサー領域は全体として、一定距離で転写を刺激できなければならないが、プロモーター領域またはその構成成分因子にとってこれは必要とは言えない。他方で、プロモーターは、特定部位でそして特定配向でRNA合成の開始を指図する1つまたは複数の因子を有さなければならず、一方エンハンサーはこの特異性を有さない。プロモーターおよびエンハンサーはしばしば重複し、且つ連続的であり、しばしば非常によく似たモジュラー機構を有すると考えれる。
ることができる。
y, 1988; Baichwal and Sugden, 1986)であった。これらは、外来DNA配列に対して相対的に低い能力を有し、宿主のスペクトラムが制限される。
1986)。
cDNA挿入物が用いられる場合、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を実行するために、ポリアデニル化シグナルを含むことが一般的には望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明を首尾よく実行するためのきわめて重要な要件であるとは考えられず、任意の配列、例えばヒトまたはウシ成長ホルモン、ならびにSV40ポリアデニル化シグナルが用いられ得る。さらにまた、発現カセットの一因子として、ターミネーターが考慮される。これらの因子は、メッセージレベルを強化し、そしてカセットから他の配列へのリードスルー(read through)を最小限にする。
「アンチセンス核酸」という用語は、DNAおよびRNAの塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドを指すよう意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞中に導入されると、それらの標的核酸と特異的に結合して、転写、RNAプロセシング、輸送および/または翻訳を妨げる。オリゴヌクレオチドによる二本鎖(ds)DNAのターゲッティングは、三重螺旋形成をもたらす。RNAのターゲッティングは、二重螺旋形成をもたらす。
たらしやすく且つ増大しやすいが、多数のその他の因子がハイブリダイゼーションの特異性の決定に関与する。オリゴヌクレオチドの、その相補的ターゲットに対する結合親和性
および配列特異性はともに、長さが増大するとともに増大する。8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれより多い塩基対のオリゴヌクレオチドが用いられるということが意図される。内因性遺伝子の機能が影響を受けるか否か、または相補的配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けるか否かを決定するために、構築物を単にin vitroで試験することにより、所定のアンチセンス核酸が対応する宿主細胞遺伝子のターゲッティングに有効であるか否かを容易に決定することができる。
標的化アンチセンス送達の代替物として、標的化リボザイムが用いられ得る。「リボザイム」という用語は、腫瘍遺伝子DNAおよびRNA中の特定の塩基配列をターゲッティングし、切断することができるRNAベースの酵素を指す。リボザイムは、リボザイム配列を組入れるRNAオリゴ−ヌクレオチドの形態で細胞に対して直接的にターゲッティングされるか、あるいは所望のリボザイムRNAをコードする発現構築物として細胞中に導入され得る。リボザイムは、アンチセンス核酸に関して記載された方法とほとんど同じ方法で用いられ、適用され得る。
・
細胞中での導入遺伝子発現の実行を媒介するためには、細胞に本発明の療法的発現構築物を移入する必要がある。本節は、ウイルス生成およびウイルス遺伝子移入の方法および組成物、ならびに非ウイルス遺伝子移入方法について考察する。
THAPファミリー遺伝子は、ウイルス感染性粒子中に組入れられて、細胞への遺伝子移入を媒介する。本明細書中に記載されたその他の療法的作用物質をコードする付加的発現構築物も、感染性ウイルス粒子を用いて(例えば本明細書で以下に記載される本発明のアデノウイルスベクターを用いた形質転換により)、ウイルス形質導入により移入され得る。あるいは、レトロウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスが用いられ得るが、これらはともに当該遺伝子(単数または複数)による宿主細胞の恒久的形質転換を可能にする。したがって一実施形態では、治療的に有意の遺伝子を細胞に送達するために、細胞のウイルス感染が用いられる。典型的には、ウイルスは単に、生理学的条件下で適切な宿主細胞に曝露されて、ウイルスの取込みを可能にする。アデノウイルスが例示されるが、本発明の方法は以下で考察される他のウイルスまたは非ウイルスベクターとともに好ましく用いられ得る。
アデノウイルスは、そのDNAゲノムが中サイズであり、操作が容易であり、高力価であり、標的細胞範囲が広く、かつ高感染性であるので、遺伝子移入ベクターとして用いるのに特に適している。およそ36kBのウイルスゲノムが、ウイルスDNA複製およびパッケージングに必要なシス作用因子を含入される100〜200塩基対(bp)逆方向末端反復(ITR)により結合される。異なる転写単位を含むゲノムの初期(E)および後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始により分割される。
I、L2、U、L4およびL5)の生産物は、主要後期プロモーター(MLP)に由来する(issued)単一一次転写体の有意のプロセシング後にのみ発現される。MLP(16.8マップ単位に位置する)は感染の後期に特に効率的であり、そしてこのプロモーターに由来するmRNAは全て、5’三連リーダー(TL)配列を保有するので、翻訳のための好ましいmRNAである。
al., 1991)。
に存在することが示されている(Tibbetts, 1977)。後者の研究では、ゲノムのEIA(194〜358bp)領域に欠失を有する突然変異体は、初期(EIA)機能を補足した細胞株においてさえ、増殖が不十分であることが示された(Hearing and Shenk, 1983)
。代償性(compensating)アデノウイルスDNA(0〜353bp)が変異体の右端に組換えられると、ウイルスは正常にパッケージされた。さらに突然変異分析により、Ad5ゲノムの左端における短い反復化位置依存性因子を同定した。反復の一コピーは、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合には効率的パッケージングに十分であることが判明したが、しかしAd5 DNA分子の内部に向かって移動された場合には十分でなかった(Hearing et al., 1987)。
レトロウイルスは、逆転写の過程により、感染細胞中でそのRNAを二本鎖DNAに転換する能力により特徴付けられる一本鎖RNAウイルスの一群である(Coffin, 1990)。その結果生じるDNAは、プロウイルスとして細胞染色体中に安定に組み込まれて、ウイルスタンパク質の合成を指図する。
)。ヒトcDNAをレトロウイルスLTRおよびT配列とともに含む組換えプラスミドがこの細胞株に導入されると(例えばリン酸カルシウム沈降により)、T配列は組換えプラスミドのRNA転写体をウイルス粒子中にパッケージングさせ、次に培地中に分泌される(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983)。組換えレトロウイルスを含む培地が収集され、任意に濃縮されて遺伝子移入のために用いられる。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかしながら多数の型のレトロウイルスの組込みおよび安定発現は、宿主細胞の分裂を必要とする(Paskind et al., 1975)。
ーチが、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて近年開発された。この修飾により、アシアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞のような細胞の特異的感染が可能になる。
IおよびクラスII抗原に対する抗体を用いて、それらの表面抗原を保有する種々のヒト細胞が感染したことが、in vitroでのエコトロピックウイルスを用いて実証された(Roux et al., 1989)。
AAVは、約4700塩基対の線状一本鎖DNAを利用する。逆方向末端反復は、ゲノムと側面を接する(flank)。2つの遺伝子がゲノム内に存在して、多数の異なる遺伝子
産物を生じる。第一のcap遺伝子は、VP−1、VP2およびVP−3と呼ばれる3つの異なるビリオンタンパク質(VP)を生成する。
vivoでの考え得る遺伝子療法における広範な用途に関して、前臨床および臨床段階で開発され、試験されてきている(Carter and Flotte, 1996; Chattedee et al., 1995;
Ferrari et al., 1996; Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Goodman et al.,
1994; Kaplitt et al., 1994; 1996, Kessler et al., 1996; Koeberl et al., 1997; Mizukami et al., 1996; Xiao et al., 1996)。
1996; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; 1996; Koeberl et al., 1997; McCown et al., 1996; Ping et al., 1996;およびXiao et al., 1996)。
その他のウイルスベクターは、本発明において発現構築物として用いられ得る。ワクシニアウイルス(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988)およびB型肝炎ウイルスなどのウイルス由来のベクターも開発されており、本発明において有用である。それらは、種々の哺乳類細胞に関するいくつかの魅力的な特徴を提供する(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988;およびHorwich et al., 1990)。
ード配列の代わりに、アヒルB型肝炎ウイルスゲノム中にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を導入した。それは、鳥肝細胞腫細胞株中に野生型ウイルスと同時トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含む培地を用いて、一次子アヒル肝細胞を感染させた。安定なCAT遺伝子発現が、トランスフェクション後少なくとも24時間検出された(Chang et al., 1991)。
ウイルスエンベロープにラクトース残基を化学的付加することによるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的ターゲッティングを可能にするように設計された新規のアプローチが近年開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能にし得る。
ラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を用いて、それらの表面抗原を保有する種々の
ヒト細胞が感染することが、in vitroでのエコトロピックウイルスを用いて実証された(Roux et al., 1989)。
本発明のDNA構築物は一般に、細胞に送達される。ある状況では、移入される核酸は非感染性であり、非ウイルス法を用いて移入され得る。
、直接マイクロインジェクション(Harland and Weintraub, 1985)、DNA負荷リポソ
ーム(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979)、細胞超音波処理(Fechheimer et al., 1987)、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子銃(Yang et al., 1990
)、ならびに受容体媒介性トランスフェクション(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)が挙げられる。
縮小球への位相幾何学的移行を引き起こす(Radler et al., 1997)。これらのDNA−
脂質複合体は、遺伝子療法に用いるための潜在的非ウイルスベクターである。
ェクション」技法も包含される。
複合されるか、または一緒に用いられ得る(Kato et al., 1991)。さらに別の実施形態
では、リポソームはHVJおよびHMG−1と複合されるか、または一緒に用いられ得る。このような発現構築物がin vitroおよびin vivoでの核酸の移入および発現に首尾よく用いられた場合には、それらを本発明に適用することができる。
増殖因子(EGF)も扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達するために用いられている(Myers
、EPO0273085)。
用いて、リポソーム中に組入れて、肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みにおける増大を観察した。したがって、リポソームを用いてまたは用いずに、任意数の受容体−リガンド系により、前立腺、上皮または腫瘍細胞のような種類の細胞中に、治療用遺伝子をコードする核酸が特異的に送達され得る。例えばヒト前立腺特異的抗原(Watt et al., 1986
)は、前立腺組織における核酸の媒介性送達のための受容体として用いられ得る。
学的に不活性な物質(例えばタングステンまたは金ビーズ)で構成される。
ポリクローナル抗THAPファミリーまたは抗THAPドメイン抗体は、THAPファミリーまたはTHAPドメイン免疫原で適切な被験体を免疫感作することにより、上記のように調製され得る。免疫感作被験体における抗THAPファミリーまたは抗THAPドメイン抗体力価は、標準技法により、例えば固定化THAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質を用いた酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)により、長時間に亘ってモニタリングされ得る。所望により、THAPファミリーに対して向けられる抗体分子は、哺乳類から(例えば血液から)単離され、既知の技法により、例えばプロテインAクロマトグラフィーによりさらに精製されて、IgG分画を生じる。免疫感作後の適切な時期に、例えば抗THAPファミリー抗体力価が最高になった時に、抗体産生細胞が被験体から採取され、標準技法(例えば以下の参考文献に記載された技法)により、モノクローナル抗体を調製するために用いられ得る。
Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497により最初に記載されたハイブリドーマ技法(Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31;およびYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75も参照)、より最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4: 72)、EBV−ハイブリドーマ技法(Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)またはトリオーマ技法。
モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成するための技法は既知である(一般的には、R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol.
Med., 54: 387-402; M.L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-36参照
)。簡単に述べると、不死細胞株(典型的には骨髄腫)が、上記のようなTHAPファミリー免疫原で免疫感作された哺乳類からのリンパ球(典型的には脾臓細胞)と融合され、その結果生じたハイブリドーマ細胞の培養上清がスクリーニングされて、THAPファミリーを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
抗体ファージ表示ライブラリー)をスクリーニングし、それによりTHAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質を結合する免疫グロブリンライブラリー成員を単離することにより、モノクローナル抗THAPファミリーまたは抗THAPドメイン抗体が同定されて単離され得る。ファージ表示ライブラリーを生成し、スクリーニングするためのキットが市販されている(例えばファルマシア組換えファージ抗体系、カタログ番号27−9400−01;およびストラタジーンSurfZAP.TM.ファージ表示キット、カタログ番号240612)。さらに、抗体表示ライブラリーを生成およびスクリーニングする場合に特に好ましい方法および試薬の例は、例えば米国特許第5,223,409号(Ladner等);PCT国際公開番号WO92/18619(Kang等);PCT国際公開番号WO91/17271(Dower等);PCT国際公開番号WO92/20791(Winter等);PCT国際公開番号WO92/15679(Markland等);PCT国際公開番号
WO93/01288(Breitling等);PCT国際公開番号WO92/01047(McCafferty等);PCT国際公開番号WO92/09690(Garrard等);PCT国際公開番号WO90/02809(Ladner等);Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628;
Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982;およびMcCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554に見
出され得る。
特許出願第171496号(Taniguchi, M等);欧州特許出願第173,494号(Morrison等);PCT国際公開番号WO86/01533(Neuberger等);米国特許第4,
816,567号(Cabilly等);欧州特許出願第125,023号(Cabilly等);Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J.Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449;およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, S.L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) Bio Techniques 4: 214; 米国特許第5,225,539号(Winter); Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534;およびBeidler et al. (1988) J. Immunol.
141: 4053-4060に記載された方法を用いて産生され得る。
種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチン、およびアビジン/ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる。適切な放射性物質の例としては、125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
本発明は、THAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質と結合し、例えばTHAPファミリー発現または好ましくはTHAPファミリー活性に対する抑制または活性化作用を有するモジュレーター、あるいは例えばTHAPファミリー標的分子の活性に対する抑制または活性化作用を有するモジュレーター、即ち候補または試験化合物または作用物質(例えば好ましくは小分子、しかしペプチド、ペプチド模倣物またはその他の薬剤も含む)を同定するための方法(本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)を用意する。いくつかの実施形態では、小分子はコンビナトリアルケミストリーを用いて生成され得るし、あるいは天然産物ライブラリーから得られる。アッセイは、細胞ベース、非細胞ベースまたはin vivoアッセイであり得る。薬剤スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、またはより好ましくはさらに説明されるような機能アッセイであり得る。
の増殖抑制、または腫瘍退縮の誘導;からなる群から選択される動物における生物学的機能を示す活性、あるいは(6)THAPファミリー標的分子またはTHAPドメイン標的分子との相互作用、好ましくはタンパク質または核酸との相互作用は、薬剤スクリーニングアッセイで検出され得る。
リーポリペプチドとの結合またはTHAPファミリーポリペプチドにより媒介されるSLCに対する細胞応答のような相互作用に対する抑制または活性化作用を有するモジュレーター、即ち候補または試験化合物または作用物質(例えば好ましくは小分子、しかしペプチド、ペプチド模倣物またはその他の薬剤も含む)を同定するための方法(本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)も提供する。
ファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと結合するかそれらの活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該技術分野で既知の組合せライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができ、例えば生物学的ライブラリー;空間的アドレス可能平行固相または溶液相ライブラリー;デコンボリューションを要する合成ライブラリー法;「一ビーズ、一化合物」ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーとともに用いられるが、一方、他の4つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用することができる(Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。
Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061;お
よびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233が挙げられる。
、胞子(米国特許第5,223,409号(Ladner))上に、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上に、またはファージ(Scott and
Smith (1990) Science 249: 386-390);(Devin (1990) Science 249: 404-406);(Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382);(Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310);(Ladner、同上)上に存在し得る。
ー)は、光学指定ポテンショメータセンサー(LAPS)を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物およびコグネイト標的分子間の相互作用の指標として用いられ得る。
THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを発現する細胞を、THAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質標的分子と接触させ、それによりアッセイ混合物を生成すること、
アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および
THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含み、
ここで、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力の決定は、THAPファミリーポリペプチド発現細胞の生物学的活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含む。
THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを発現する細胞を、試験化合物と接触させること、および
THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含み、
ここで、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力の決定は、THAPファミリーポリペプチド発現細胞の生物学的活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含む。
THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと応答性である細胞を、THAPファミリータンパク質またはその生物学的活性部分と接触させ、それによりアッセイ混合物を生成すること、
アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および
THAPファミリーまたはその生物学的活性部分の活性を調整する試験化合物の能力を決定することを含み、
ここで、THAPファミリータンパク質またはその生物学的活性部分の活性を調整する試験化合物の能力の決定は、THAPファミリーポリペプチド応答性細胞の生物学的活性を調整する試験化合物の能力の決定(例えばTHAPファミリーポリペプチド活性を調整する試験化合物の能力の決定)を含む。
THAPファミリー標的分子(即ち、THAPファミリーポリペプチドが相互作用する分子)を発現する細胞を試験化合物と接触させること、および
THAPファミリー標的分子の活性を調整する(例えば刺激するかまたは抑制する)試験化合物の能力を決定することを含む細胞ベースアッセイである。
THAPファミリー標的分子の活性を調整する試験化合物の能力の決定は、例えば、THAPファミリー標的分子と結合するかまたは相互作用するTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力を決定することにより達成されうる。
相互作用物質のいずれも標識しない、リアルタイムでの生体特異的相互作用を試験するための技法である(例えばBIAコア)。表面プラズモン共鳴(SPR)の光学的現象の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として用いられ得る。
HAPファミリー標的分子の下流エフェクター(例えば増殖因子媒介性シグナル伝達経路構成成分)の活性をさらに調節するTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力を決定することにより達成されうる。例えば、適切な標的上のエフェクター分子の活性が決定され得るし、あるいは適切な標的とのエフェクターの結合が上記のように決定され得る。
THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを、THAPファミリータンパク質と結合する既知の化合物と接触させる、それによりアッセイ混合物を生成すること、
アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および
THAPファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、THAPファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、THAPファミリー標的分子と選択的に結合するかまたはその活性を調整するTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力を決定することを含む。
ルエーテル)n、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ]−1−プロパンスルホネート(CHAPS)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート(CHAPSO)またはN−ドデシル=N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネートが挙げられる。
ープレート上に吸着され、これは次に、試験化合物と併合、あるいは試験化合物および非吸着標的タンパク質またはTHAPファミリータンパク質と併合され、そして混合物が複合体を形成する条件(例えば、塩およびpHに関する生理学的条件)下でインキュベートされ得る。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウエルは洗浄されて、任意の非結合構成成分、ビーズの場合には固定されたマトリックスを除去し、例えば上記のように直接または間接的に複合体が決定される。あるいは複合体は、マトリッ
クスから解離され、標準技法を用いてTHAPファミリーポリペプチド結合または活性のレベルが決定され得る。
−NHS(N−ヒドロキシ−スクシンイミド)から調製され、ストレプトアビジン被覆96ウエルプレート(Pierce Chemicals)のウエル中に固定され得る。あるいは、THAPファミリータンパク質または標的分子と反応性であるが、THAPファミリータンパク質とその標的分子との結合を妨害しない抗体がプレートのウエルに誘導されて、非結合の標的またはTHAPファミリータンパク質が抗体結合によりウエル中に捕捉される。このような複合体の検出方法としては、GST−固定化複合体に関して上記されたものの他に、THAPファミリータンパク質または標的分子と反応性である抗体を用いた複合体の免疫検出、及びTHAPファミリータンパク質または標的分子と関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
本発明の別の実施形態では、THAPファミリーDNA結合活性を妨害する化合物を同定するための方法であって、固体支持体上に固定されたTHAPファミリータンパク質またはその一部分を、試験化合物およびDNA断片の両方と接触させる工程、又は固体支持体上に固定されたDNA断片を試験化合物およびTHAPファミリータンパク質の両方と接触させる工程を含む方法が提供される。DNAと、THAP−タンパク質またはその一部分との間の結合が検出され、試験化合物の非存在下でのDNA結合と比較した場合のDNA結合の低減は、試験化合物がTHAPファミリーDNA結合活性のインヒビターであることを示し、そして試験化合物の非存在下でのDNA結合と比較した場合のDNA結合の増大は、試験化合物がTHAPファミリーDNA結合活性の誘導物質であるかまたはそれを回復したことを示す。さらに考察されるように、DNA断片は、例えば実施例20に記載されるようにして得られる特異的THAPファミリータンパク質標的DNAであるよう選択され得るし、あるいは非特異的THAPファミリー標的DNAであり得る。タンパク質−DNA相互作用の検出方法は、当該技術分野で既知であり、例としては、最も一般的に用いられる電気泳動移動度シフト解析(EMSA)またはフィルター結合法(Zabel et al, (1991) J. Biol. Chem. 266: 252およびOkamoto and Beach, (1994) Embo. J. 13: 4816)が挙げられる。特異的および非特異的DNA結合の高処理量(ハイスループット)検出および定量が容易にできるその他のアッセイが利用可能である(Amersham, N.J.;
およびGal S. et al, 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9 Sept 2000, Vancouver, B.C.)。
る。
前記試験物質の非存在下でのTHAPファミリータンパク質の結合の量と比較することを含み、前記結合の量を増大する試験物質は療法に用いるための候補である方法、が提供される。
させるオリゴヌクレオチドが単離され得る。変異型THAPファミリータンパク質またはその一部分およびランダムオリゴヌクレオチドは、その上にTHAPファミリー特異的DNA断片が固定される固体支持体に加えられる。固体支持体に結合するオリゴヌクレオチドが回収され、分析される。固体支持体との結合が変異型THAPファミリータンパク質の存在に依存するものは、変異型タンパク質と結合し、そしてその形状を回復することにより、支持体におそらくは結合している。
THAPファミリーポリペプチドまたはTHAPドメイン活性の検出を可能にする任意の適当なアッセイが用いられ得る、と理解される。試験化合物の存在下または非存在下でのタンパク質相互作用、核酸結合またはアポトーシスの調節を試験するためのアッセイの例が、本明細書中でさらに記載される。したがって本発明は、候補THAPファミリーポリペプチドモジュレーター(例えば活性化剤または抑制剤)を同定する方法であって、
a)THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログを含む細胞を用意すること、
b)上記細胞を試験化合物と接触させること、および
c)上記化合物がTHAPファミリーポリペプチド活性、好ましくはプロアポトーシス(pro-apoptotic)活性、またはTHAPファミリーもしくはTHAPドメイン標的結合
を選択的に調節する(例えば活性化するかまたは抑制する)か否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節する(例えば活性化するかまたは抑制する)という決定が、上記化合物が上記ポリペプチドの候補モジュレーター(例えばそれぞれ活性化剤または抑制剤)である、ということを示す方法を含む。好ましくはTHAPファミリーまたはTHAPドメイン標的は、タンパク質または核酸である。
ン標的相互作用の検出のためのアッセイのいくつかの例は本明細書中に記載されており、タンパク質相互作用および核酸結合の検出に関するアッセイが含まれる。
を分析するために以前に用いられた3T3細胞は、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされて、THAPファミリーポリペプチドの異所性(ectopic)発現を可能にし得る。次に血清回収に対するア
ポトーシス応答が試験化合物の存在下でアッセイされて、アポトーシスを誘導するTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドの能力を増強するかまたは抑制する試験化合物の同定を可能にする。トランスフェクトされた細胞は血清から取り出され、アポトーシス核酸を有する細胞が計数される。アポトーシス核酸は、DAPI染色及びインサイチュ(in situ)TUNELアッセイにより計数され得る。
例示的方法において、THAP/THAP標的相互作用アッセイは、THAP1およびTHAP標的Par4に関して記載される。しかしながら、その他のTHAPファミリー成員またはTHAPドメインおよびその他のTHAP標的分子のモジュレーターに関するスクリーニングのためのアッセイは、これらを下記の方法においてTHAP1およびPar4に置換することにより実行され得る、と理解される。例えばいくつかの実施形態では、THAPファミリーポリペプチドとSLCとの間の相互作用に影響を及ぼすモジュレーターが同定される。
1)THAPファミリーベイト(bait)とプレイ(prey)としてのPAR4またはSLCとの相互作用を壊す薬剤を見出すための2ハイブリッドベースアッセイ
2)組換えTHAPファミリーポリペプチドおよびPAR4またはSLCタンパク質を用いたインビトロ相互作用アッセイ
3)組換えTHAPファミリーポリペプチドおよびPAR4またはSLCタンパク質を用いたチップベース結合アッセイ
2)THAPファミリーポリペプチドおよび蛍光タンパク質と融合されたPAR4またはSLCタンパク質を用いた蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)細胞ベースアッセイ
a)THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログおよびPAR4またはSLCポリペプチドまたはその断片を用意すること、
b)上記THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
c)上記化合物がTHAPファミリー/PAR4またはSLC相互作用活性を選択的に調節する(例えば活性化するかまたは抑制する)か否かを決定する
ことを含む方法を含む。
a)THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログを含む細胞、およびPAR4あるいはSLCポリペプチドまたはその断片を用意すること、
b)上記細胞を試験化合物と接触させること、および
c)上記化合物がTHAPファミリー/PAR4またはSLC相互作用活性を選択的に調節する(例えば活性化するかまたは抑制する)か否かを決定する
ことを含む方法が考えられる。
et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696;およびWO94/10300(Brent)参照)において、THAP
ファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログは「ベイトタンパク質」として用いられ、そしてPAR4またはSLCタンパク質は「プレイタンパク質」として用いられ得る(あるいはその逆に)。2ハイブリッド系は、分離可能DNA結合および活性化ドメインからなるほとんどの転写因子の調節性(modular nature)に基づいている。要するに、このアッセイは2つの異なるDNA構築物を利用する。一構築物では、THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログをコードする遺伝子は、既知の転写
因子(例えばGAL−4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物では、THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログ(「プレイ」または「試料」)をコードする遺伝子は、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、THAPファミリーポリペプチド/PAR4複合体を形成し得る場合、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは非常に接近するようになる。この接近は、転写因子に応答する転写調節部位に操作可能的に連結されるレポーター遺伝子(例えばLacZ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され、機能的転写因子を含む細胞コロニーが単離されて、THAPファミリータンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために用いられ得る。したがってこのアッセイは、試験化合物の存在下または非存在下で実行され、それによりTHAPファミリーポリペプチド/PAR4またはSLC相互作用の調節が、レポーター遺伝子のより低い転写または転写の欠如により検出され得る。
実施例8および実施例9に示されるように、THAP1およびPar4がPML NBに局在するということを、いくつかの実験方法を用いて本発明者等は実証した。
ノクローナル抗PML抗体およびポリクローナル抗Daxx抗体で染色した。
THAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質、特にTHAP1、PML−NBタンパク質との結合、あるいはPML−NBへの局在化を調節する(刺激するかまたは抑制する)薬剤の同定に関するアッセイが提供される。概して、タンパク質−タンパク質相互作用の検出のための任意の適切なアッセイが用いられ得る。高処理量スクリーニングアッセイの2つの例を以下に挙げる:1)THAP1ベイトとPML−NBタンパク質プレイとの相互作用を破壊する化合物を見出すための酵母における2ハイブリッドベースアッセイ;ならびに2)組換えTHAP1およびPML−NBタンパク質を用いたインビトロ相互作用アッセイ。このようなアッセイは、THAPファミリー/Par4アッセイに関して上記したのと同様に実行され得るが、但し、PML−NBタンパク質がPar4の代わりに用いられる。結合は、例えばTHAPファミリータンパク質およびPMLタンパク質またはPML関連タンパク質、例えばdaxx、sp100、sp140、p53、pRB、CBP、BLMまたはSUMO−1間で検出され得る。
PML−NBタンパク質と結合するPAR4、又はPML−NBへの局在化を調節する(刺激するかまたは抑制する)薬剤の同定に関するアッセイが提供される。概して、タンパク質−タンパク質相互作用の検出のための任意の適切なアッセイが用いられ得る。高処理量スクリーニングアッセイの2つの例を以下に挙げる:1)PAR4ベイトとPML−NBタンパク質プレイとの相互作用を破壊する化合物を見出すための酵母における2ハイブリッドベースアッセイ;ならびに2)組換えPAR4およびPML−NBタンパク質を用いたインビトロ相互作用アッセイ。このようなアッセイは、THAPファミリーポリペプチド/Par4アッセイに関して上記したのと同様に実行され得るが、但し、PML−NBタンパク質がTHAPファミリーポリペプチドの代わりに用いられる。結合は、例えばPar4タンパク質およびPMLタンパク質またはPML関連タンパク質、例えばda
xx、sp100、sp140、p53、pRB、CBP、BLMまたはSUMO−1間で検出され得る。
れる化合物の構造および/または特性に基づいて合成され得る。別の例示的な実施形態では、本発明は、THAPファミリータンパク質またはその生物学的活性部分が試験化合物と接触され、そしてTHAPファミリータンパク質またはその生物学的活性部分と結合するかまたはその活性を調節する(例えば刺激するかまたは抑制する)試験化合物の能力が決定される方法により得られる化合物の構造および/または特性に基づいた薬剤または薬学的組成物を合成または製造する方法を含む。
任意の適切なアポトーシスアッセイを用いて、THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログのアポトーシス活性を評価し得る、と理解されよう。
本発明の核酸およびポリペプチドの評価に関しては、本発明のスクリーニング法で評価されるアポトーシス指標は、細胞の生育可能性の実質的に任意の指標であり得る。例として、生育可能性指標は、細胞数、細胞屈折性、細胞脆弱性、細胞サイズ、細胞液胞の数、生細胞を死細胞と区別する染色、メチレンブルー染色、芽体サイズ、芽体位置、核形態および核染色からなる群から選択され得る。本明細書中に記載されたその他の生育可能性指標および生育可能性指標の組合せは当該技術分野で既知であり、本発明のスクリーニング法に用いられ得る。
はホースラディッシュペルオキシダーゼ接合UTPで遊離DNAを標識することにより、DNAのニック末端を免疫組織化学的に検出することを含む。通常どおり、ヨウ化プロピジウム(PI)染色によっても核形態を検査し得る。3つのアッセイ(DNAラダー、末端標識およびPI標識)はすべておおまかな測定であり、すでに死亡したかまたは死の間際にある細胞に関しては良好である。
al., (1993) Cell 74 (5): 845-531)および/または酸性スフィンゴミエリナーゼの活
性化(Wiegmann et al., (1994) Cell 78 (6): 1005-15)の生起に関して試験し得る。アポトーシスの調節に関するアッセイは、例えば神経細胞およびリンパ球においても実行され得るが、この場合、生き残るために神経成長因子を要する神経細胞(Martin, D.P. et al, (1998) J. Cell Biol 106, 829-844)、および生存が特定のリンホカインに依存するリンパ球(Kyprianou, N. and Issacs, J.T. (1988) Endrocrinology 122: 552-562)に
関して実証されているように、因子回収(factor withdrawal)が細胞自殺を誘導するこ
とは既知である。
一つの方法において、THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログをコードする発現ベクターを用いて、細胞中でアポトーシスを誘導する本発明のポリペプチドの能力を評価し得る。所望により、THAPファミリーもしくはTHAPドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログを発現する細胞の同定を促進するために、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドは検出可能マーカーと融合され得る。例えば、グリーンフルオレセンスタンパク質が増強された発光クラゲ(Aequoria victoria)GFP変異体(E
GFP)は、融合タンパク質生成に用いられ得る(CLONTECH Laboratories、 Inc., 1020
East Meadow Circle, Palo Alto、 Calif. 94303)(さらに米国特許第6,191,2
69号に記載)。
ミリーまたはTHAPドメインポリペプチドEGFPが関連する蛍光の分布は、アポトーシスに関連した核DNA変化を検出するために慣用的に用いられるDAPIまたはHoechst33342染料の分布と同一である(Cohen et al.、上記)。特徴的EGFP蛍光を示す最低約100個の細胞が、蛍光顕微鏡により評価される。アポトーシスは、核断片化、顕著なアポトーシス小体および細胞質蒸発(cytoplasmic boiling)として得点付
けされる。核断片化の特徴は、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド−EGFPがアポトーシス小体中で凝縮した場合、特に可視的である。
0gのプラスミドDNAでトランスフェクトした。用いられたプラスミドは、CMVエンハンサー/プロモーターおよびTHAPファミリーまたはTHAPドメイン−EGFPコード配列を含む。アポトーシスは、TUNELおよびDAPI染色によりトランスフェクションの24時間後に評価される。THAPファミリーまたはTHAPドメイン−EGFPベクターでトランスフェクトされた細胞は蛍光顕微鏡で評価され、アポトーシスの指標としてのEGFPマーカーの典型的核凝集が観察される。アポトーシス性である場合、THAPファミリーまたはTHAPドメイン−EGFPを発現する細胞中のEGFPシグナルの分布は、アポトーシスに関連した核DNA変化を検出するために通常に用いられるDAPIまたはHochest 33342染料の分布と同一である(Cohen et al.、上記)。
−結腸癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(細胞株KM12;HT−29;SW−620;COLO205;HCT−5;HCC2998;HCT−116);
−CNS腫瘍、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(細胞株SF−268、星状細胞腫;SF−539、神経膠芽腫;SNB−19、神経膠芽腫;SNB−75、星状細胞腫;およびU251、神経膠芽腫);
−白血病細胞、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(細胞株CCRF−CEM、急性リンパ性白血病(ALL);K562、急性骨髄性白血病(AML);MOLT−4、ALL;SR、免疫芽細胞腫大細胞;およびRPMI8226、骨髄芽細胞腫);
−前立腺癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(PC−3);
−腎臓癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(細胞株768−0;UO−31;TK10;ACHN);
−皮膚癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(黒色腫)(細胞株SKMEL−28;M14;SKMEL−5;MALME−3);
−肺癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(細胞株HOP−92;NCI−H460;HOP−62;NCI−H522;NCI−H23;A549;NCI−H226;EKVX;NCI−H322);
−乳癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後96時間でのアポトーシスの評価(細胞株MCF−7;T−47D;MCF−7/ADR;MDAMB43;MDAMB23;MDA−N;BT−549);
−卵巣癌、レトロウイルス発現ベクターおよびプロトコールまたはシンドビスウイルス発現ベクターおよびプロトコールを用いた発現、レトロウイルスを用いて感染後96時間での、またはシンドビスウイルスベクターを用いて感染後24時間でのアポトーシスの評価(細胞株OVCAR−8;OVCAR−4;IGROV−1;OVCAR−5;OVCAR3;SK−OV−3)。
21793-0127、カタログ番号CC−2519)、HMVEC−L(肺からのヒト微小血管
内皮細胞;BioWhittaker-Clonetics, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793-0
127、カタログ番号CC−2527)、HMVEC−d(皮膚からのヒト微小血管内皮細
胞;BioWhittaker-Clonetics, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793-0127、
カタログ番号CC−2543)。これらのおよびその他の内皮細胞のタイプは、血管新生(angiogenesis)の調節のための療法戦略においてアポトーシスを誘導するTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドの能力の指標を提供するに際してのモデルとして有用であり得る。一過性発現戦略は、長期選択に関連した人工物を伴わずに、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド媒介性アポトーシスの誘導を評価するために用いられる。下記のTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド−EGFP融合タンパク質をコードする発現ベクターは、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドを発現する細胞の同定を促進するために用いられ得る。細胞は、試験される細胞に最適な方法(CaPO4またはリポフェクチンのいずれか)により一過的にトランスフェクトされる。THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドの発現およびアポトーシスの誘導は、トランスフェクション後24時間および48時間目に蛍光顕微鏡を用いて検査される。特徴的EGFP蛍光を示す最低約100個の細胞が、蛍光顕微鏡により評価される。アポトーシスは、核断片化、顕著なアポトーシス小体および細胞質蒸発として採点される。核断片化の特徴は、THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチド−EGFPがアポトーシス小体中で凝縮した場合、特に可視的である。
al., Cell 75: 653-660 (1993); Kumar et al., Genes Dev. 8: 1613-1626 (1994); Wang et al., Cell 78: 739-750 (1994);および米国特許第6,221,615号)。トラ
ンスフェクションの1日前に、細胞(例えばRat−1細胞)は、3.5*104細胞/
ウエルで24ウエル皿中で平板培養される。翌日、細胞は、リポフェクトアミン手法(Gibco/BRL)により、β−ガラクトシダーゼをコードするマーカープラスミドを、THAP
ファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドをコードする発現プラスミドと組合せて用いて、トランスフェクトされる。トランスフェクション後24時間目に、細胞は固定され、X−Galで染色されて、プラスミドDNAを受容した細胞中でのβ−ガラクトシダーゼ発現を検出される(Miura et al.、上記)。青色細胞の数が顕微鏡検査により計数され、生(平坦青色細胞)または死(球状青色細胞)として採点される。このアッセイにおけるTHAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドの殺細胞活性は、対照発現ベクター(THAPファミリーまたはTHAPドメインポリペプチドcDNA挿入物を伴わない)を用いたβ−galプラスミドの共トランスフェクションと比較して、得られた青色細胞の大幅な減少により明示される。
青色細胞の数は、計数により決定される。代表的1実験からの平均数が示される。
死細胞集団は、細胞周期の3つの時期のいずれかで生きている細胞集団と同一のDNA量を含有するため、2つの細胞集団を区別する方法はない。ヨウ化プロピジウム(PI)染色とともにアポトーシスの生物学的マーカー(例えばターミニンTp30、米国特許第5,783,667号)の陽性と関する二重ラベリングを実施し得る。アポトーシスの生物学的マーカーおよびPI染色に関するラベリング指数の測定は、組合せて用いられて、生きており、瀕死のG1における細胞の精確な分画を得ることができる。同様の概算は、S期およびG2期細胞集団についてなされ得る。
アポトーシス調節戦略を用いて実行された実験から収集された証拠の大部分は、アポトーシス誘導性または細胞増殖低減性のタンパク質に作用する処置が広範な障害に対する新規の治療方法を提供し得る、ということを示唆する。多数のタンパク質に関して提供される新規の機能、ならびにいくつかの生物学的経路の関連を考えると、本発明の治療方法は種々の方法で働き得る。
NS細胞、好ましくは神経細胞または神経膠細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、あるいは(5)血管新生を媒介すること、好ましくは抑制すること、炎症を媒介すること、好ましくは抑制すること、癌性組織の転移可能性の抑制、腫瘍負荷量の低減、化学療法または放射線療法に対する感受性増大、癌細胞殺傷、癌細胞の増殖の抑制、あるいは腫瘍退縮の誘導からなる群から選択される、動物中で決定される活性、からなる群から選択される任意のその他の活性を調節することを含み得る。THAPファミリー活性の検出は、本明細書中で考察された症状に関連した任意の適切な療法的終点を検出することも含み得る。
アポトーシスを抑制する本発明の分子(例えば本明細書中に記載されたスクリーニング法を用いて得られるもの、ドミナントネガティブ変異体、抗体等)も、疾患の治療および/または予防に有用であると予測される。アポトーシスを防止するのが望ましい疾患としては、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性および小脳変性;骨髄異形成症候群、例えば再生不良性貧血;虚血性疾患、例えば心筋梗塞および卒中;肝疾患、例えばアルコール性肝炎、B型肝炎およびC型肝炎;関節疾患、例えば骨関節炎;アテローム硬化症等が挙げられる。本発明のアポトーシス
抑制剤は、神経変性疾患の予防または治療の作用薬として用いられることが特に好ましい。(Adams, J. M., Science, 281: 1322 (1998)も参照)。
本発明は、癌、心臓血管性疾患および炎症性疾患の治療に有用であると予測される被験体の血管新生を調節する方法も提供する。不死化細胞のアポトーシスの誘導物質は、悪性腫瘍における腫瘍形成および/または転移を抑圧するのに有用であると予測される。悪性腫瘍の例としては、白血病(例えば骨髄性白血病、リンパ性白血病、例えばバーキットリンパ腫)、消化管癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、その他の癌腫および肉腫が挙げられる。本発明者等は、ヒト内皮細胞からTHAP1およびPAR4cDNAをともに単離したし、PAR4およびPMLはともに、血管内皮細胞で優勢に発現されることが既知であり(Boghaert et al., (1997) Cell Growth Differ 8(8): 881-90; Terris B. et al, (1995) Cancer Res. 55(7): 1590-7, 1995)、このことは、PML−NBおよび新規の関連THAP1/PAR4プロアポトーシス複合体がインビボでの内皮細胞アポトーシスの主要な調節因子であり、したがって血管新生依存性疾患に対する魅力的な治療目標を構成し得る、ということを示唆する。例えばTHAP1およびPAR4経路は、血管新生を調節する(例えば刺激するかまたは阻害する)選択的治療を可能にし得る。
R4に関しては、THAP1との結合のためにはロイシンジッパードメインが必要とされる(そしてそれで十分である)。
血管新生は、成体器官における先在血管からの新芽形成の過程による新血管の形成として定義される。この新血管新生は内皮細胞の活性化、移動および増殖を含み、いくつかの刺激、中でも剪断応力により推進される。正常生理学的条件下では、ヒトまたは動物は、ごく特定の限定状況でのみ血管新生を被る。例えば血管新生は、正常では、創傷治癒、胎児および胚性発達、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。本発明の分子は、内皮抑制または誘導活性を有し、一般に血管新生を抑制するかまたは誘導する能力を有する。
一態様では、本発明は、広範な種々の疾患、例えば癌、動脈硬化症、肥満症、関節炎、十二指腸潰瘍、乾癬、増殖性皮膚障害、心臓血管障害、および例えば糖尿病により引き起こされる異常眼性脈管形成のための考え得る治療としての抗血管新生療法を提供する(Folkman, Nature Medicine 1:27 (1995)およびFolkman, Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston, New England Journal of Medicine, 333: 1757 (1995))。抗血管新生療法は、新たな血管の形成を抑制することにより作用すると考えられる。
ドメイン核酸、タンパク質またはその他の誘導物質の投与は、それらの腫瘍の成長または拡張を防止する。THAPファミリー活性は、疾患の治療のために他の組成物および手法と組合せて用いられ得る。例えば腫瘍は、外科手術、放射線照射または化学療法を、THAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質と組合せて用いて慣用的に治療され、次に、微小転移の活動停止を拡張するために、そして任意の残留原発性腫瘍を安定化するために、後続してTHAPファミリーまたはTHAPドメインタンパク質が投与され得る。
別の態様では、THAPファミリータンパク質活性、特にTHAP1活性のインヒビターは抗アポトーシス剤として、したがって脈管形成療法として用いられ得る。脈管形成療法は、創傷治癒を促進するための、ならびに閉塞血管をバイパスするために新しい血管の増殖を刺激するための考え得る処置である。したがって前脈管形成療法は、おそらくは、バイパス手術およびバルーン血管形成術(PTCA)を補うかまたはそれらに取って代わり得る。例えば閉塞血管をバイパスするための血管新生(neovascularization)に関して、「治療的有効量」とは、正常では遮断された血管を通過する血液の少なくともいくらかを輸送し得る新血管の形成を生じる量である。
管新生特性を評価することが挙げられる、と理解される。
本発明のTHAPファミリー活性を抑制し得る化合物、好ましくは小分子(しかしペプチドも含む)、THAPファミリー核酸分子、THAPファミリータンパク質および抗THAPファミリー抗体(本明細書中では「活性化合物」とも呼ばれる)は、投与に適した薬学的組成物中に混入され得る。このような組成物は典型的には、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書中で用いる場合、「薬学的に許容可能な担体」という語は、薬学的投与に適合性のある任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含むよう意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は、当該技術分野で既知である。任意の慣用的媒質または作用物質が活性化合物と非適合性である限り以外は、組成物中のその使用が意図され
る。補助的活性化合物も組成物中に混入され得る。
用により成し遂げられ得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該技術分野で一般的に既知であるような軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム中に処方される。最も好ましくは活性化合物は、静脈内注射により被験体に送達される。
本明細書中に記載された核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログおよび抗体は、1つまたは複数の以下の方法:診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験および薬理遺伝学に、ならびに本明細書中にさらに記載されるような薬剤スクリーニングおよび治療方法(例えば治療的および予防的)に用いられ得る。
断的および予後的アッセイを提供する。THAPファミリー成員およびTHAPファミリー標的分子間の相互作用を検出するための診断的および予後的アッセイも提供される。好ましい例では、THAPファミリー成員は、THAP1、THAP2またはTHAP3であり、THAPファミリー標的はPAR4またはPML−NBタンパク質である。
こと、およびb)上記試料内の上記ポリヌクレオチドおよびRNA種間のハイブリダイゼーションの存在または非存在を、あるいは上記試料内のポリペプチドとの上記検出可能ポリペプチドの結合の存在または非存在を検出することを含む方法を含む。上記ハイブリダイゼーションの、または上記結合の検出は、上記THAPファミリー成員が上記試料内で発現されることを示す。好ましくはポリヌクレオチドはプライマーであり、この場合、上記ハイブリダイゼーションは、上記プライマー配列を含む増幅産物の存在を検出することにより検出され、あるいは検出可能ポリペプチドは抗体である。
生物学的試料中のTHAPファミリータンパク質または核酸の存在(定量的にまたはそうでなく)または非存在を検出するための例示的方法は、試験被験体からの生物学的試料を得て、THAPファミリータンパク質または核酸の存在が生物学的試料中で検出されるよう、THAPファミリータンパク質またはTHAPファミリータンパク質をコードする核酸(例えばmRNA、ゲノムDNA)を検出し得る化合物または作用物質と生物学的試料を接触させることを含む。THAPファミリーmRNAまたはゲノムDNAを検出するための好ましい薬剤は、THAPファミリーmRNAまたはゲノムDNAとハイブリダイズし得る標識化核酸プローブである。核酸プローブは、例えば全長THAPファミリー核酸、例えば配列番号160の核酸、例えば少なくとも15、30、50、100、250
、400、500または1000ヌクレオチド長の、ストリンジェントな条件下でTHAPファミリーmRNAまたはゲノムDNA、またはTHAPファミリー核酸の一部分と特異的にハイブリダイズするのに十分な核酸である。本発明の診断アッセイに用いるためのその他の適切なプローブは、本明細書中に記載されている。
子のメッセンジャーRNA転写物のレベルの全体的変化、(vi)THAPファミリー遺伝子の異常修飾、例えばゲノムDNAのメチル化パターンの異常修飾、(vii)THAPファミリー遺伝子のメッセンジャーRNA転写体の非野生型スプライシングパターンの存在、ならびに(vii)THAPファミリー標的タンパク質の非野生型レベル、のうちの少なくとも1つの存在を確認することにより検出され得る。
他(1994) Human Mol Genet 3: 893-895参照)。消化されたDNAは、ゲル電気泳動によ
り分離され、例えばゲノムまたはcDNA配列由来のプローブとハイブリダイズされる。
THAPファミリー遺伝子のメチル化状態は、試料DNAから生成される制限パターンを既知のメチル化の標準に関するパターンと比較することにより、決定され得る。
出は、例えば野生型形態のTHAP1タンパク質に対する抗体を用いたイムノアッセイによる、あるいは検出可能タグを含む融合タンパク質としてタンパク質を用意するベクター中で試料THAP1遺伝子をクローニングすることにより用意される標識によるものである。例えばmycエピトープは、試料THAP1遺伝子を有する融合タンパク質の一部として用意され得る。このような融合タンパク質は、検出可能標識を用意するほかに、固定化標的への適用前に、溶解物からの試料THAP1タンパク質の精製も可能にする。本発明のスクリーニングアッセイのさらに別の実施形態では、添付の実施例に記載された2ハイブリッドアッセイを用いて、2つのタンパク質間の複合体形成を変更するTHAPファミリー遺伝子またはTHAPファミリー標的遺伝子における突然変異を検出し得る。
)(例えばLandegern et al. (1988) Science 241: 1077-1080およびNakezawa et al. (1994) PNAS 91: 360-364参照)におけるプローブ/プライマーの使用を含み、後者は、T
HAPファミリー遺伝子における点突然変異を検出するために特に有用であり得る(Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682参照)。この方法は、患者から細
胞の試料を収集する工程、試料の細胞から核酸(例えばゲノム、mRNAまたはその両方)を単離する工程、核酸試料を、THAPファミリー遺伝子(存在する場合)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でTHAPファミリー遺伝子と特異的にハイブリダイズする1つまたは複数のプライマーと接触させる工程、および増幅産物の存在または非存在を検出するか、あるいは増幅産物のサイズを検出し、かつ対照試料に対して長さを比較する工程を含み得る。PCRおよび/またはLCRは、本明細書中に記載された突然変異を検出するために用いられる手法のいずれかとともに、予備増幅工程として用いることが望ましい、と予測される。
い超感受性検出方法も利用可能である。両アレル性多型性を検出するために用いられ得る当業者に既知の方法としては、例えば慣用的ドットブロット分析、Orita et al., PNAS 86: 2766-2770 (1989)により記載された一本鎖コンフォーメーション多型性分析(SSC
P)、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ヘテロ二重鎖分析、ミスマッチ切断アッセイ、ならびにSheffield et al. (1991), White et al. (1992)およびGrompe et al. (1989
および1993)(Sheffield, V.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 49: 699-706 (1991); White, M.B. et al., Genomics 12: 301-306 (1992); Grompe, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86: 5855-5892 (1989);およびGrompe, M. Nature Genetics 5: 111-117 (1993))に記載されるようなその他の慣用的手法のような方法が挙げられる。特定の多型性部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するための別の方法は、米国特許第4,656,127号に記載されているような特殊化エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いる。さらなる方法を以下に記載する。
は、染料−プライマーサイクルシーケンシングプロトコールを用いて自動ダイデオキシターミネーターシーケンシング反応に付される。配列分析は、両アレル性マーカー部位に存在する塩基の同定を可能にする。
Research 25: 347-353 1997)およびChen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94/20 10756-10761, 1997)により記載されている。この方法では、多型性部位を含有する増幅ゲ
ノムDNA断片は、対立性の染料標識化ダイデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩および修飾化Taqポリメラーゼの存在下で、5’−フルオレセイン−標識化プライマーとともにインキュベートされる。染料標識化プライマーは、鋳型上に存在する対立遺伝子に特異的な染料−ターミネーターにより1塩基延長される。遺伝子型判定反応終了時に、反応混合物中の2つの染料の蛍光強度が、分離または精製を伴わずに直接的に分析される。これらの工程は全て、同一試験管中で実施され、蛍光変化がリアルタイムでモニタリングされ得る。あるいは伸長プライマーは、MALDI−TOF質量分析により分析され得る。多型性部位の塩基は、マイクロシーケンシングプライマー上に加えられた質量により同定される(Haff and Smirnov, 1997, Genome Research, 7: 378-388, 1997参照)。別の例で
は、Pastinen et al. (Genome Research, 7: 606-614, 1997)は、固相ミニシーケンシン
グ原理がオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用される単一ヌクレオチド多型性の多重検出方法を記載する。固体支持体(DNAチップ)に結合されたDNAプローブの高密度アレイを、以下にさらに記載する。
チ検出アッセイが挙げられる。重合反応は、増幅プライマーの3’末端の正しい塩基対合に特にストリンジェントな要件を置き、標的DNA配列とハイブリダイズされる2つのオリゴヌクレオチドの連結は、特に3’末端の連結部位付近のミスマッチに非常に感受性である。
る二重鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、厳密に相補的な核酸鎖間、あるいはミスマッチの小領域を含有する核酸鎖間で起こり得る。両アレル性マーカーの一形態とハイブリダイズするが、しかし他方とはハイブリダイズせず、したがって異なる対立遺伝子形態間を区別し得る特異的プローブが設計され得る。対立遺伝子特異的プローブはしばしば対で用いられ、対の一成員はオリジナル対立遺伝子を含有する標的配列との完全な一致を示し、そして他方はもう一方の対立遺伝子を含有する標的配列と完全な一致を示す。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度に有意の差が存在し、好ましくは本質的に二元性応答が存在し、それによりプローブが対立遺伝子の一方のみとハイブリダイズするよう、十分にストリンジェントであるべきである。プローブが厳密に相補的な標的配列のみとハイブリダイズするストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で既知である(Sambrook et al., 1989)
。ハイブリッド二重鎖の検出は、多数の方法により実行され得る。標的またはプローブに結合された検出可能標識を利用して、ハイブリッド二重鎖の検出を可能にする種々の検出アッセイフォーマットが既知である。典型的には、ハイブリダイゼーション二重鎖は、非ハイブリダイズ化核酸から分離され、次に二重鎖に結合された標識が検出される。さらに、標準的な異種アッセイフォーマットは、プライマーおよびプローブ上に存在する標識を用いてハイブリッドを検出するのに適している(Landegren U. et al., Genome Research, 8: 769-776, 1998参照)。
新規のHEVECタンパク質の機能および関与する細胞内経路を限定しようと努力して、微小血管ヒトHEV内皮細胞(HEVEC)から生成される2ハイブリッドcDNAライブラリーをスクリーニングするために異なるベイトを本発明者らは用いた。上記のように(Girard and Springer (1995) Immunity 2: 113-123)、モノクローナル抗体MECA−79を用いた免疫磁気選択により、ヒト扁桃からHEVECを精製した。まずSMART PCR cDNAライブラリー構築キット(Clontech, Palo Alto, CA, USA)を用いて、HEVECの総RNA1μgから、全長cDNAを生成した。次にオリゴ−dT−プライマーが結合したHEVECのcDNAをSfiIで消化して、pGAD424(Clontech)のEcoRIおよびBamHIクローニング部位間にSfiIリンカー(5’−GAATTCGGCCATTATGGCCTGCAGGATCCGGCCGCCTCGGCCCAGGATCC−3’)(配列番号181)を挿入することにより生成された2ハイブリッドベクターpGAD424−Sfi中に指向的にクローン化する。その結果生じたpGAD424−HEVECのcDNAの2ハイブリッドライブラリー(平均挿入サイズ>1kb1、〜3×106の独立クローン)を大腸菌中で増幅させる。ケモカインSLC/6Ckineと相互作用しうるタンパク質を同定するために、プライマーhSLC.5’(5’−GCGGGATCCGTAGTGATGGAGGGGCTCAGGACTGTTG−3’)(配列番号183)およびhSLC.3’(5’−GCGGGATCCCTATGGCCCTTTAGGGGTCTGTGACC−3’)(配列番号184)を用いてHEVECのRNAからPCRにより増幅し、BamHIで消化して、MATCHMAKER2ハイブリッド系2ベクターpGBT9(Clontech)のBamHIクローニング部位に挿入した成熟型のヒトSLC/CCL21をコードするcDNA(アミノ酸24〜134、GenBank寄託番号NP_002980、配列番号182)をベイトとして用いて、2ハイブリッドHEVECのcDNAライブラリーのスクリーニングを実施した。要するに、pGBT9−SLCをpGAD424−HEVECのcDNAライブラリーを用いて酵母株Y190(Clontech)中で共形質転換した。1.5×107個の酵母形質転換体をスクリーニングし、His栄養要求性により陽性タンパク質相互作用を選択した。プレートを30℃で5日間インキュベートした。プラスミドDNAを陽性コロニーから抽出し、pGBT9−SLCまたは対照ベイトpGBT9、pGBT9−ラミンを用いてAH109中で共形質転換することにより、相互作用の特異性を立証するために用いた。この2ハイブリッドスクリーンで単離された8つの独立クローンを特性化した。それらは、そのマウスオルトログと93%の同一性を示す、THAP1と呼ばれる213アミノ酸の新規のヒトタンパク質をコードする独特のヒトcDNAに対応することが判明した(図1A)。THAP1予測タンパク質配列中の唯一の注目に値するモチーフは、中間部の短いプロリンリッチドメインならびにカルボキシ末端部分のコンセンサス核局在化配列(NLS)であった(図1B)。THAP1配列に関するデータベース検索は、アポトーシスに関連した新規のタンパク質モチーフを限定し得る最初の90個のアミノ酸(以後THAPドメインと呼ぶ)を除いて、前に特性化されたタンパク質との有意の類似性を明示できなかった(図1B、図9A〜図9Cおよび図10参照)。
THAP1のmRNAの組織分布を決定するために、12の異なるヒト成人組織のノー
ザンブロット分析を実施した(図2)。メーカーの使用説明書に従って、多ヒト組織ノーザンブロット(CLONTECH)をハイブリダイズした。プローブは、THAP1のORFに対応するPCR産物で、プライマー−一遺伝子ラベリング系(PROMEGA)で32P標識した
。2.2kbのmRNAのバンドを脳、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓および胎盤で検出した。主要な2.2kbのバンドほかに、低分子量帯域が検出されたが、これらはTHAP1のmRNAの前駆体の代替的スプライシングまたはポリアデニル化に対応すると思われる。多数の異なる組織中におけるTHAP1のmRNAの存在は、THAP1が、ヒト身体中で、広範なしかし普遍的ではない組織分布を有するということを示唆する。
THAP1タンパク質の細胞内の局在を分析するために、THAP1のcDNAを、GFP(グリーン蛍光タンパク質)をコードする配列と融合させた。プライマー2HMR10(5’−CCGAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT−3’)(配列番号185)および2HMR9(5’−CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC−3’)(配列番号186)を用いてHEVECのcDNAからPCRにより、THAP1の全長コード領域を増幅し、EcoRIおよびBamHIで消化し、pEGFP.C2ベクター(Clontech)中で増強グリーン蛍光タンパク質(EGFP)ORFの下流でインフレームでクローン化して、pEGFP.C2−THAP1を生成した。次にGFP/THAP1発現構築物を臍帯静脈からの初代培養のヒト内皮細胞(HUVEC、PromoCell, Heidelberg, Germany)中にトランスフェクトした。HUVECを完全ECGM培地(PromoCell, Heidelberg, Germany)中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、メーカーの使用説明書(Stratagene, La Jolla, CA, USA)に従って、GeneJammerトランスフェクション試薬を用いてRPM
I培地中で一過的にトランスフェクトした。24時間後の蛍光顕微鏡による分析によって、GFP/THAP1融合タンパク質はもっぱら核内に局在し、拡散性分布を伴って、蓄積して斑点を生じたが、一方、GFP単独の場合は、細胞全体に染みが広がっただけである、ということが明示された。GFP/THAP1が会合する斑点状に染まったドメインの同一性を調べるために、間接免疫蛍光顕微鏡を用いて、既知の核ドメイン(複製ファクトリー、スプライシングセンター、核小体)と共にGFP/THAP1を含有する核のドットの考え得る共局在化を調べた。
)。次に細胞を、室温で5分、PBS−BSA中で3回洗浄し、PBS−BSA中に希釈したCy3(レッド蛍光)抗マウスIgGヤギ抗体(二次抗体)または抗ウサギIgGヤギ抗体(二次抗体)(1/1000、Amersham Pharmacia Biotech)とともに1時間インキュベートした。PBS中で広範に洗浄後、試料を風乾して、Mowiolに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。GFP(グリーン)およびCy3(レッド)蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
THAP1は好アポトーシスタンパク質PAR4と複合体を形成する
THAP1と相互作用しうるタンパク質を同定するために、MATCHMAKER2ハイブリッド系3ベクターpGBKT7(Clontech)に挿入したヒトTHAP1全長cDNAをベイトとして用いて、2ハイブリッドHEVECのcDNAライブラリーのスクリーニングを実施した。要するに、プライマー2HMR10(5’−CCGAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT−3’)(配列番号187)および2HMR9(5’−CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC−3’)(配列番号188)を用いてHEVECのcDNAからPCRにより、THAP1の全長コード領域を増幅し、EcoRIおよびBamHIで消化し、pGBKT7ベクター中でGal4結合ドメイン(Gal4−BD)の下流でインフレームでクローン化して、pGBKT7−THAP1を生成した。次にpGBKT7−THAP1を、酵母株AH109(Clontech)中でpGAD424−HEVECのcDNAライブラリーを用いて共形質転換化した。メーカーの使用説明書(MATCHMAKER2ハイブリッド系3、Clontech)に従って、1.5×107個の酵母形質転換体をスクリーニングして、HisおよびAde二重栄養要求性により陽性タンパク質相互作用を選択した。プレートを30℃で5日間インキュベートした。プラスミドDNAをこれらの陽性クローンから抽出し、pGBKT7−THAP1または対照ベイトpGBKT7、pGBKT7−ラミンおよびpGBKT7−ヘビンを用いてAH109中で共形質転換することにより、相互作用の特異性を立証するために用いた。THAP1と特異的に相互作用した3つのクローンを、スクリーニングで得た:これらのクローンのシーケンシングは、ヒトの好アポトーシスタンパク質PAR4の最後の147アミノ酸(位置193〜342)をコードする部分的cDNAに対応する3つの同一ライブラリープラスミドを明示した(図3A)。全長Par4ベイト(pGBKT−Par4)およびプレイ(pGADT7−Par4)を用いて、THAP1およびPar4間の陽性の相互作用を確認した。プライマーPar4.8(5’−GCGGAATTCATGGCGACCGGTGGCTACCGGACC−3’)(配列番号189)およびPar4.5(5’−GCGGGATCCCTCTACCTGGTCAGCTGACCCACAAC−3’)(配列番号190)を用いて、ヒト胸腺cDNA(Clontech)からPCRにより全長ヒトPar4を増幅し、EcoRIおよびBamHIで消化し、pGBKT7およびpGADT7ベクター中でクローン化して、pGBKT7−Par4およびpGADT7−Par4を生成した。メーカーの使用説明書(MATCHMAKER2ハイブリッド系3、Clontech)に従って、pGBKT7−THAP1およびpGADT7−Par4、あるいはpGBKT7−Par4およびpGADT7−THAP1を用いたAH109の共形質転換、ならびにHisおよびAde二重栄養要求性による形質転換体の選択により、THAP1およびPar4間の陽性の相互作用を確認した。pGADT7−THAP1を生成するために、プライマー2HMR10(5’−CCGAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT−3’)(配列番号191)および2HMR9(5’−CGCGGATCCTGCTGGTACT
TCAACTATTTCAAAGTAGTC−3’)(配列番号192)を用いてHEVECのcDNAからPCRにより、THAP1の全長コード領域を増幅し、EcoRIおよびBamHIで消化し、pGADT7 2ハイブリッドベクター(Clontech)中でGal4活性化ドメイン(Gal4−AD)の下流にインフレームでクローン化した。
酵母で観察された相互作用を確認するために、in vitroGSTプルダウンアッセイを実施した。GSTタグが付加された融合タンパク質として発現され、グルタチオンセファロース上に固定されるPar4DDを、in vitroで翻訳され放射能で標識されたTHAP1とともにインキュベートした。GST−Par4DD発現ベクターを生成するために、プライマーPar4.10(5’−GCCGGATCCGGGTTCCCTAGATATAACAGGGATGCAA−3’)(配列番号194)およびPar4.5を用いてPCRにより、Par4DD(アミノ酸250〜342)を増幅し、pGEX−2T原核生物発現ベクター(Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, France)のBamHI部位、すなわち、グルタチオンS−TトランスフェラーゼORFの下流にインフレームでクローン化した。次に、プラスミドpGEX−2T−Par4DDによりコードされるGST−Par4DD(アミノ酸250〜342)融合タンパク質、ならびにプラスミドpGEX−2Tによりコードされる対照GSTタンパク質を大腸菌DH5α中で発現させて、供給元の使用説明書(Amersham Pharmacia Biotech)に従ってグルタチオンセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。SDS−ポリアリールアミドゲル電気泳動(PAGE)およびクーマシーブルー染色分析により、GSTプルダウンアッセイに用いられるタンパク質の収量を決定した。pGBKT7−THAP1ベクターを鋳型として用いて、TNT結合網状赤血球溶解物系(Promega, Madison, WI, USA)により、in vitroで翻訳されたTHAP1を生成した。25μlの35S
で標識した野生型THAP1を、固定化GST−Par4またはGSTタンパク質とともに4℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした:10mMのNaPO4、pH8.0、140mMのNaCl、3mMのMgCl2、1mMのジチオトレイトール(D
TT)、0.05%NP40および0.2mMのフッ化フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、1mMのバナジン酸ナトリウム、50mMのβグリセロホスフェート、25μg/mlのキモトリプシン、5μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン。次にビーズを1mlの結合緩衝液中で5回洗浄した。結合タンパク質を2× Laemmli SDS−PAGE試料緩衝液で溶出し、10%SDS−PAGEにより分画して、アムプリファイ(Amplify)(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて蛍光
間接撮影により可視化した。予測どおり、GST/Par4DDはTHAP1と相互作用した(図3B)。これに反して、THAP1はGSTビーズと相互作用しなかった。
THAP1およびPar4間の生理学的相互作用に関するさらなる証拠を提供するために、THAP1およびPAR4間のin vivoでの相互作用を調べた。そのために、pEF−mycPar4DD真核生物発現ベクターおよびGFPまたはGFP−THAP1発現ベクター(それぞれpEGFP.C2およびpEGFP.C2−THAP1)を用いて一過的に同時トランスフェクトされた一次ヒト内皮細胞中のエピトープタグが付加されたPar4DDの細胞内局在化を、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて分析した。pEF−mycPar4DDを生成するために、プライマーmyc.BD7(5’−GCGCTCTAGAGCCATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATC−3’)(配列番号195)およびPar4.9(5’−CTTGCGGCCGCCTCTACCTGGTCAGCTGACCCACAAC−3’)(配列番号196)とともに、鋳型としてpGBKT7−Par4DDを用いて、PCRによりmycPar4DD(アミノ酸250〜342)を増幅し、pEF−BOS発現ベクターのXbaIおよびNotI部位でクローン化した(Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Research, 18: 5322, 1990)。臍帯静脈由来の初代培養のヒト内皮細胞(HUVEC、PromoCell, Heidelberg, Germany)を、完全ECGM培地(PromoCell, Heidelberg, Germany)中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、メーカーの使用説明書(Stratagene; La Jolla, CA, USA)に従って、Ge
neJammerトランスフェクション試薬を用いてRPMI培地中で一過的にトランスフェクトした。pEF−mycPar4DDおよびGFPタグが付加された発現構築物で同時トランスフェクトした細胞を、カバーガラス上で24時間〜48時間増殖させた。細胞をPBSで2回洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドを含有するPBS中に室温で15分間固定し、PBSで再び洗浄した後、PBS中の50mMのNH4Clで、室温で5分間、中和した。もう一度PBSで洗浄後、0.1%トリトン−X100を含有するPBS中で、室温で5分間、細胞を透過処理し、再びPBSで洗浄した。次に、透過処理された細胞をPBS−BSA(1%ウシ血清アルブミンを含有するPBS)で10分間遮断し、次にPBS−BSA中に希釈した抗mycエピトープ マウスモノクローナル抗体(マウス
IgG1、1/200、Clontech)とともに、室温で2時間インキュベートした。次に細胞を、室温で5分、PBS−BSA中で3回洗浄し、PBS−BSA中に希釈したCy3(レッド蛍光)結合抗マウス(1/1000、Amersham Pharmacia Biotech)ヤギ抗体(二次抗体)とともに1時間インキュベートした。PBS中で十分に洗浄後、試料を風乾して、Mowiolに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。GFP(グリーン)およびCy3(レッド)蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
の作用は、それがTHAP1およびアポトーシスとは無関係な核酵素であるGFP−APSキナーゼ−1(APSK−1)を用いた場合は観察されなかったため、特異的であった(Besset et al., Faseb J, 14: 345-354, 2000)。この後者の結果は、GFP−THA
P1がPML−NBにmyc−Par4DDを動員し、THAP1と好アポトーシスタンパク質Par4と直接相互作用を有するというin vivoの証拠を提供する、ということを示す。
Par4と結合するTHAP1を仲介する配列を同定するために、一連のTHAP1欠失構築物を生成した。プラスミドpEGFP.C2−THAP1を鋳型とし、以下のプライマーを用いて、PCRにより、アミノ末端(THAP1−C1、−C2、−C3)およびカルボキシ末端(THAP1−N1、−N2、−N3)欠失変異体の両方(図4A)を増幅した:THAP1−C1(アミノ酸90〜213)に関しては、2HMR12(5’−GCGGAATTCAAAGAAGATCTTCTGGAGCCACAGGAAC−3’)(配列番号197)および2HMR9(5’−CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC−3’)(配列番号198);THAP1−C2(アミノ酸120〜213)に関しては、PAM2(5’−GCGGAATTCATGCCGCCTCTTCAGACCCCTGTTAA−3’)(配列番号199)および2HMR9;THAP1−C3(アミノ酸143〜213)に関しては、PAPM3(5’−GCGGAATTCATGCACCAGCGGAAAAGGATTCATCAG−3’)(配列番号200)および2HMR9;THAP1−N1(アミノ酸1〜90)に関しては、2HMR10(5’−CCGAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT−3’)(配列番号201)および2HMR17(5’−GCGGGATCCCTTGTCATGTGGCTCAGTACAAAGAAATAT−3’)(配列番号202);THAP1−N2(アミノ酸1〜166)に関しては、2HMR10およびPAPN2(5’−CGGGATCCTGTGCGGTCTTGAGCTTCTTTCTGAG−3’)(配列番号203);ならびにTHAP1−N3(アミノ酸1〜192)に関しては、2HMR10およびPAPN3(5’−GCGGGATCCGTCGTCTTTCTCTTTCTGGAAGTGAAC−3’)(配列番号204)。
験した。pGBKT7−THAP1−C1、−C2、−C3、−N1、−N2または−N3ベクターを鋳型として用いて、TNT結合網状赤血球溶解物系(Promega, Madison, WI, USA)により、in vitroで翻訳したTHAP1変異体を生成した。それぞれ2
5μlの35Sで標識されたTHAP1変異体を、固定化GSTまたはGST−Par4タンパク質とともに4℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした:10mMのNaPO4、pH8.0、140mMのNaCl、3mMのMgCl2、1mMのジチオトレイトール(DTT)、0.05%NP40および0.2mMのフッ化フェニルメチルスルホニルフロライド(PMSF)、1mMのバナジン酸ナトリウム、50mMのβグリセロホスフェート、25μg/mlのキモトリプシン、5μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン。次にビーズを1mlの結合緩衝液中で5分間洗浄した。結合タンパク質を2×LaemmliSDS−PAGE試料緩衝液で溶出し、10%SDS−PAGEにより分画して、アムプリファイ(Amplify)(Amersham Pharmacia Biotech)
を用いて蛍光間接撮影により可視化した。予測どおり、THAP1−C1、−C2、−C3および−N3はGST/Par4DDと相互作用した(図4B)。これに対して、THAP1−N1および−N2はGST/Par4DDビーズと相互作用できなかった。
RR/AA−1(5’−CCGCACAGCAGCGATGCGCTGCTCAAGAACGGCAGCTTG−3’)(配列番号206)および
RR/AA−2(5’−CAAGCTGCCGTTCTTGAGCAGCGCATCGCTGCTGTGCGG−3’)(配列番号207)、または変異体THAP1ΔQRCRRに関してはプライマーΔRR−1(5’−GCTCAAGACCGCACAGCAAGAACGGCAGCTTG−3’)(配列番号208)およびΔRR−2(5’−CAAGCTGCCGTTCTTGCTGTGCGGTCTTGAGC−3’)(配列番号209)と一緒に用いて、2連続回のPCRにより、これら2つの新規のTHAP1変異体、THAP1 RR/AA(残基R171AおよびR172Aの置換)およびTHAP1ΔQRCRR(残基168〜172の欠失)を生成した。その結果生じたPCR断片をEcoRIおよびBamHIで消化し、pGBKT7 2ハイブリッドベクター(Clontech)中のGal4結合ドメイン(Gal4−BD)の下流でインフレームでクローン化して、pGBKT7−THAP1−RR/AAおよびΔ(QRCRR)を生成し、あるいはpEGFP.C2ベクター(Clontech)中の増強グリーン蛍光タンパク質(EGFP)ORFの下流でインフレームでクローン化して、pEGFP.C2−THAP1−RR/AAおよび−Δ(QRCRR)を生成した。次に、THAP1−C1、−C2、−C3、−N1、−N2または−N3変異体に関して上記したように、3つのTHAP1/Par4相互作用アッセイ(2ハイブリッドアッセイ、in vitroTHAP1/Par4相互作用アッセイ、in vivoTHAP1/Par4相互作用アッセイ)でTHAP1
RR/AAおよびTHAP1ΔQRCRR THAP1変異体を試験した。この分析は
、2つの変異体が3つのアッセイすべてにおいてPar4との相互作用を欠いていたことを明示した(図5B)が、これは、本発明者らが同定した新規のアルギニンリッチ配列モチーフが新規のPar4結合モチーフであることを示す。
次に、THAP1およびPAR4間の生理学的相互作用に関するさらなる証拠を提供するために、PAR4がTHAP1とin vivoで共局在化するか否かを決定したいと考えた。まず、初代培養のヒト内皮細胞中におけるPar4の細胞内の局在を分析した。メタノール/アセトンで固定したHUVEC内皮細胞においてアフィニティー精製抗PAR4抗体を用いた共焦点免疫蛍光顕微鏡検査(Sells et al., 1997; Guo et al., 1998)を実施したが、これはPML−NB構成成分を抗体に対してアクセス可能にする(Sternsdorf et al., 1997)。細胞をメタノール中で−20℃で5分間固定し、その後、冷えた
アセトン中で−20℃で30秒間インキュベートした。次に透過処理した細胞をPBS−BSA(1%ウシ血清アルブミンを含有するPBS)で10分間ブロッキングし、次にヒトPar4に対するウサギポリクローナル抗体(1/50、R−334、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)および抗PMLマウスモノクローナル抗体(マウス
IgG1、1/30、mAb PG−M3(Dako, Glostrup, Denmark))とともに室温
で2時間インキュベートした。次に細胞を、室温で5分、PBS−BSA中で3回洗浄し、PBS−BSA中に希釈したCy3(レッド蛍光)結合抗ウサギIgGヤギ抗体(二次抗体)(1/1000、Amersham Pharmacia Biotech)およびFITCで標識された抗マウス−IgGヤギ抗体(二次抗体)(1/40、Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)抗体とともに1時間インキュベートした。PBS中で広範に洗浄後、試料
を風乾して、Mowiolに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。FITC(グリーン)およびCy3(レッド)蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。この分析は、核質および細胞質に広がった染色のほかに、核の点状の構造体とのPAR4免疫反応性の関連を示した。抗PML抗体を用いた二重免疫染色は、PAR4のフォーカスが細胞核中でPML−NBと完全に共局在化することを明示した。PML−NBにおけるPar4とGFP−THAP1との共局在化を、異所的なGFP−THAP1を発現するトランスフェクトされたHUVEC細胞で分析した。HUVECを完全ECGM培地(PromoCell, Heidelberg, Germany)中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、メーカーの使用説明書(Stratagene; La
Jolla, CA, USA)に従って、GeneJammerトランスフェクション試薬を用いて
RPMI培地中のGFP/THAP1発現構築物(pEGFP.C2−THAP1)で一過的にトランスフェクトした。抗Par4ウサギ抗体を用いて24時間後に間接的免疫蛍光顕微鏡によるトランスフェクトされた細胞を分析したところ、全ての内因性PAR4フォーカスがPML−NB中で異所性GFP/THAP1と共局在化することを明示し、さらに、in vivoでのTHAP1/PAR4複合体とPML−NBとの会合を確認した。
PMLは、他の構成成分を動員することによりPML−NBのアセンブリーに重要な役割を果たすことが示されたため、次に、PMLがPML−NBへのTHAP1/PAR4の動員に役割を果たすか否かを決定したいと考えた。このために、内因性のPAR4と異所的なGFP−THAP1とがともに、ヒトHeLa細胞のPML−NB中に蓄積しない、という観察を利用した。GFP−THAP1およびHA−PML(またはHA−SP100)に関する発現ベクターをこれらの細胞中で同時トランスフェクトさせて、内因性PAR4、GFP−THAP1およびHA−PML(またはHA−SP100)の局在を三
重染色共焦点顕微鏡により分析した。
用いて、リン酸カルシウム法で一過的にトランスフェクトした。pcDNA3発現ベクター(Invitrogen, San Diego, CA, USA)のBamHI部位中にpGADT7−HA−PML3からのBglII−BamHI断片をサブクローニングすることにより、pcDNA.3−HA−PML3を構築した。pGADT7−HA−PML3を生成するために、pACT2−PML3(De The博士( Paris, France)から寄贈)を鋳型として、以下のプライマー:PML−1(5’−GCGGGATCCCTAAATTAGAAAGGGGTGGGGGTAGCC−3’)(配列番号210)およびPML−2(5’−GCGGAATTCATGGAGCCTGCACCCGCCCGATC−3’)(配列番号211)
とともに用いて、PCRによりPML3のORFを増幅し、pGADT7のEcoRIおよびBamHI部位にクローン化した。
クローナル抗体(マウスIgG1、1/1000、mAb 16B12(BabCO, Richmond, CA, USA))とともに室温で2時間インキュベートした。次に細胞を、室温で5分、PBS−BSA中で3回洗浄し、PBS−BSA中に希釈したCy3(レッド蛍光)結合抗ウサギIgGヤギ抗体(二次抗体)(1/1000、Amersham Pharmacia Biotech)およびアレキサフルオル(Alexa Fluor)−633(ブルー蛍光)結合抗マウス−IgGヤギ抗
体(二次抗体)(1/100、Molecular Probes, Eugene, OR, USA)とともに1時間イ
ンキュベートした。PBS中で広範に洗浄後、試料 を風乾して、Mowiolに封入し
た。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。GFP(グリーン)およびCy3(レッド)およびアレクサ633(ブルー)蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
THAP1は新規の好アポトーシス因子である
PMLおよびPML−NBは細胞死の調節と関連付けられ、PAR4は十分に確立された好アポトーシス因子であるため、THAP1が細胞生存を調節し得るか否かを調べた。PAR4の好アポトーシス活性を分析するために従来用いられてきたマウス3T3細胞(Diaz-Meco et al, 1996; Berra et al., 1997)を、GFP−THAP1、GFP−PA
R4、ならびにネガティブコントロールとしてTHAP1およびアポトーシスに関連する
核酵素であるGFP−APSキナーゼ−1(APSK−1)の発現ベクター(Girard et al., 1998; Besset et al., 2000)でトランスフェクトした。次にTHAP1の異所的な発現が血清撤去に対するアポトーシス応答を強化するか否かを決定した。トランスフェクトされた細胞に24時間までの間、血清を与えず、DAPI染色により、かつin situTUNELアッセイにおいて明示されるようなアポトーシス性の核を有する細胞を計数した。
発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。37℃で6時間後、DNA−脂質混合物を取り出し、細胞を完全培地中に24時間回収した。培地を0%血清に変えることにより、一過性トランスフェクトされた細胞の血清飢餓を誘導し、GFP陽性アポトーシス細胞の量を血清飢餓の誘導の24時間後に評価した。3.7%ホルムアルデヒドを含有するPBS中に細胞を固定し、免疫蛍光下で、上記のように0.1%トリトン−X100で透過処理し、核凝縮を示すアポトーシス核のin situTUNEL(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性dUTPニック末端ラベリング)および/またはDAPI(4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)染色により、アポトーシスを調べた。in situ細胞死検出キットTMRレッド(Roche Diagnostics, Meylan, France)を用いて、37℃で1時間、TUNEL反応を実施した。0.2:g/mlの最終濃
度でのDAPI染色を、室温で10分間実施した。蛍光顕微鏡を用いて、各実験時点に関して、少なくとも100個の細胞を調べた。
で24時間、一過性トランスフェクトされた細胞をインキュベートすることにより、TNFα誘導性アポトーシスアッセイを実施した。血清撤去誘導性アポトーシスに関して記載されたように、アポトーシスを調べた。結果を、図6Bに示す。図6Bに示したように、THAP1はアポトーシスを誘導した。
THAP1の機能的活性におけるアミノ末端THAPドメイン(アミノ酸1〜89)の役割を決定するために、THAPドメインが欠失したTHAP1変異体(THAP1ΔTHAP)を生成した。鋳型としてのpEGFP.C2−THAP1を、プライマー2HMR12(5’−GCGGAATTCAAAGAAGATCTTCTGGAGCCACAGGAAC−3’)(配列番号212)および2HMR9(5’−CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC−3’)(配列番号213)とともに用いて、PCRにより、THAP1ΔTHAP(アミノ酸90〜213)を増幅し、EcoRIおよびBamHIで消化し、pGBDT7およびpEGFP−C2ベクター中でクローン化して、pGBKT7−THAP1ΔTHAPおよびpEGFP.C2−THAP1ΔTHAP発現ベクターを生成した。次に、THAP1のPML NBの局在、Par4との結合、または好アポトーシス活性におけるTHAPドメインの役割を分
析した。
フェクション試薬を用いてRPMI培地中で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、カバーガラス上で48時間増殖させた。次に細胞をPBSで2回洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドを含有するPBS中に室温で15分間固定し、PBSで再び洗浄した後、PBS中の50mMのNH4Clで、室温で5分間、中和した。もう一度PBSで洗浄後、0.1%トリトン−X100を含有するPBS中で、室温で5分間、細胞を透過処理し、再びPBSで洗浄した。次に透過処理された細胞をPBS−BSA(1%ウシ血清アルブミンを含有するPBS)で10分間ブロッキングし、次にPBS−BSA中に希釈した抗PMLマウスモノクローナル抗体(マウスIgG1、1/30、mAb PG−M3(Dako, Glostrup, Denmark))とともに、室温で2時間インキュベート
した。次に細胞を、室温で5分、PBS−BSA中で3回洗浄し、PBS−BSA中に希釈したCy3(レッド蛍光)結合抗マウスIgGヤギ抗体(二次抗体)(1/1000、Amersham Pharmacia Biotech)とともに1時間インキュベートした。PBS中で広範に洗浄後、試料を風乾して、Mowiolに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。GFP(グリーン)およびCy3(レッド)蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
1ΔTHAPを生成した。25μlの35Sで標識されたTHAP1ΔTHAPを、固定化GST−Par4またはGSTタンパク質とともに4℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした:10mMのNaPO4、pH8.0、140mMのNaCl、3mMのMgCl2、1mMのジチオトレイトール(DTT)、0.05%NP40および0.2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、1mMのバナジン酸ナトリウム、50mMのβグリセロホスフェート、25μg/mlのキモトリプシン、5μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン。次にビーズを1mlの結合緩衝液中で5分間洗浄した。結合タンパク質を2×LaemmliSDS−PAGE試料緩衝液で溶出し、10%SDS−PAGEにより分画して、アムプリファイ(Amersham Pharmacia
Biotech)を用いて蛍光間接撮影により可視化した。
〜50%密集度で12ウエルプレート中のカバーガラス上に植え付け、そして供給元の使用説明書に従って、リポフェクタミンプラス試薬(Life Technologies)を用いてGFP
−APSK1、GFP−THAP1またはGFP−THAP1ΔTHAP融合タンパク質発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。37℃で6時間後、DNA−脂質混合物を取り出し、細胞を完全培地中で24時間回復させた。培地を0%血清に変えることにより、一過性トランスフェクトされた細胞の血清飢餓を誘導し、GFP陽性アポトーシス細胞の量を血清飢餓の誘導の24時間後に評価した。3.7%ホルムアルデヒドを含有するPBS中に細胞を固定し、免疫蛍光下で、上記のように0.1%トリトン−X100で透過処理し、核凝縮を示すアポトーシス核のin situTUNEL(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性dUTPニック末端ラベリング)および/またはDAPI(4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)染色により、アポトーシスを調べた。in situ細胞死検出キットTMRレッド(Roche Diagnostics, Meylan, France)を用いて、37℃で1時間、TUNEL反応を実施した。0.2μg/mlの最終
濃度でのDAPI染色を、室温で10分間実施した。蛍光顕微鏡を用いて、各実験時点に関して、少なくとも100個の細胞を調べた。
THAP1と相同的なおよび/またはTHAPドメインを含有する新規のヒトタンパク質を発見するために、National Center for Biotechnology InformationのGenBan
k非重複ヒトESTおよびドラフトヒトゲノムデータベース(sss.ncbi.nlm.nih.gov)を、BLASTNプログラム、TBLASTNプログラムおよびBLASTPプログラムを用いて、THAP1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方で検索した(Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-410)。これにより、12の別個のヒトTHA
P含有タンパク質の同定が可能となった(hTHAP0〜hTHAP11;図8)。部分長配列の場合、対応するゲノムDNAクローンに関するGENESCAN(Burge, C. and Karlin, S. (1997). Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J Mol Biol 268: 78-94)およびGENEWISE(Jareborg, N., Birney, E. and Durbin, R. (1999). Comparative analysis of noncoding regions of 77 orthologous mouse and human gene pairs. Genome Res. 9: 815-824)と共に、遺伝子予測を伴う重複E
STのアセンブリーを用いて、全長ヒトTHAPタンパク質ならびにそれらの対応するcDNAおよび遺伝子を特定した。CLUSTALW(Higgins, D.G., Thompson, J.D. and Gibson, T.J. (1996). Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol 266: 383-402)を用いて、コンピュータープログラムBoxshade(www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)を用いて彩色されたショウジョウバエP因子トラ
ンスポザーゼのDNA結合ドメイン(Lee, C.C., Beall, E.L.,and Rio, D.C. (1998) Embo J. 17: 4166-74)で、12のヒトTHAPドメインのアラインメントを実行した(図
9Aおよび図9B参照)。上記のものと等価のアプローチは、マウス、ラット、ブタおよびヒトTHAPタンパク質の他の種々のオルソログを同定するために用いられる(図9C
)。結局は、コンピュータ内のかつ実験的なアプローチは、好アポトーシス因子のTHAPファミリーの12の別個のヒト成員(hTHAP0〜hTHAP11)の発見をもたらした(図8)。
THAP2およびTHAP3がPar−4と相互作用し得るか否かを評価するために、Par−4野生型ベイトを用いた酵母2ハイブリッドアッセイ(図10B)およびin vitroGSTプルダウンアッセイ(図10C)を、上記のように実施した(実施例4および実施例5)。図10Bおよび図10Cに示したように、THAP2およびTHAP3は、Par−4と相互作用し得た。THAP1、THAP2およびTHAP3間のTHAPドメインおよびPAR4結合ドメインの比較を示す配列アラインメントを、図10Aに示す。
GFP−APSK1、GFP−THAP2またはGFP−THAP3発現ベクターでトランスフェクトした細胞において、血清誘導性またはTNFαアポトーシス分析を上記(実施例10)と同様に実施した。血清撤去のまたはTNFα付加の24時間後、アポトーシス核のDAPI染色によりアポトーシスを定量した。結果を図11A(血清撤去)および図11B(TNFα)に示す。これらの結果は、THAP−2およびTHAP3がアポトーシスを誘導することを示す。
ヒトTHAP1のSLC/CCL21ケモカイン結合ドメインを同定するために、一連のTHAP1欠失構築物を、実施例7に記載したように生成した。
酵母2ハイブリッド系で観察された相互作用を確証するために、in vitroGSTプルダウンアッセイを実施した。GST−タグが付加された融合タンパク質として発現され、グルタチオンセファロース上に固定されるTHAP1を、in vitroで翻訳されかつ放射能で標識されたSLC/CCL21とともにインキュベートした。
GCGGATCCGTGCAGTCCTGCTCCGCCTACGGC−3’)(配列番号214)および2HMR11(5’−CCGAATTCTTATGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAG−3’)(配列番号215)を用いてPCRにより、THAP1(アミノ酸1〜213)のコード領域の全長を増幅し、BamHIおよびEcoRIで消化して、pGEX−2T原核生物発現ベクター(Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, France)のBamHIおよびEcoRI部位間、すなわち、グルタチオンS−TトランスフェラーゼORFの下流でインフレームでクローン化した。プラスミドpGEX−2T−THAP1によりコードされるGST−THAP1融合タンパク質、ならびにプラスミドpGEX−2Tによりコードされる対照GSTタンパク質を次に、大腸菌DH5α中で発現させて、供給元の使用説明書(Amersham Pharmacia Biotech)に従ってグルタチオンセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。SDS−ポリアリールアミドゲル電気泳動(PAGE)およびクーマシーブルー染色分析により、GSTプルダウンアッセイに用いられるタンパク質の収量を決定した。
SLC/CCL21を生成した(実施例15参照)。25μlの35Sで標識された野生型SLC/CCL21を、固定されたGST−THAP1またはGSTタンパク質とともに4℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした:10mMのNaPO4、pH8.0、140mMのNaCl、3mMのMgCl2、1mMのジチオトレイトール(DTT)、0.05%NP40および0.2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、1mMのバナジン酸ナトリウム、50mMのβグリセロホスフェート、25μg/mlのキモトリプシン、5μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン。次にビーズを1mlの結合緩衝液中で5回洗浄した。結合タンパク質を2×LaemmliSDS−PAGE試料緩衝液で溶出し、10%SDS−PAGEにより分画して、アムプリファイ(Amplify)(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて蛍光間接撮影により可
視化した。予測どおり、GST/THAP1はSLC/CCL21と相互作用した(図13)。これに対して、SLC/CCL21はGSTビーズと相互作用しなかった。
ヒトケモカインSLC/CCL21上のTHAP1結合部位を決定するために、SLC特異的塩基カルボキシ末端延長を欠くSLC/CCL21欠失変異体(SLC/CCL21ΔCOOH)(アミノ酸102〜134;GenBank寄託番号NP_002980)を生成した。SLC/CCL21のCCR7ケモカイン受容体結合ドメイン(アミノ酸24〜101)を保持するこのSLC/CCL21ΔCOOHを、THAP1ベイトを伴う酵母2ハイブリッドアッセイおよびGST−THAP1を伴うin vitroGSTプルダウンアッセイの両方に用いた。
訳されたSLC/CCL21COOHを用いたGSTプルダウンアッセイを、実施例16と同様に実施した。図13は、SLC/CCL1野生型およびSLC/CCL21COOH欠失変異体がともにTHAP1と結合し得たことを示す。
本実施例は、THAP1または抗体に由来するFc領域ポリペプチドと融合されたTHAP1のSLC/CCL21ケモカイン結合ドメインを含む融合タンパク質の調製を記載する。
は、McMahan et al. (1991). EMBO J. 10: 2821により記載されているように、アフリカ
ミドリザル腎臓細胞株CV−1(ATCC CCL 70)に由来する。トランスフェクトされた細胞を培養して、THAP1/FcまたはTHAP1/Fc融合タンパク質のSLC/CCL21ケモカイン結合ドメインの一過的発現を可能にし、これらは培地中に分泌される。分泌タンパク質は、成熟型のTHAP1またはFcポリペプチドに融合されたTHAP1のSLC/CCL21ケモカイン結合ドメインを含有する。THAP1/FcおよびTHAP1/Fc融合タンパク質のSLC/CCL21ケモカイン結合ドメインは二量体を形成すると考えられるが、この場合、2つのこのような融合タンパク質は、そのFc部分間に生じるジスルフィド結合により連結される。プロテインA保有クロマトグラフィーカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより、THAP1/FcおよびTHAP1/Fc融合タンパク質のSLC/CCL21ケモカイン結合ドメインを培地から回収し得る。
異なるヒトTHAPタンパク質の細胞内局在化を決定するために、一連のGFP−THAP1発現構築物を初代培養のヒト内皮細胞中にトランスフェクトした。DNA結合因子としてのTHAPタンパク質の考え得る機能と一致して、分析されたヒトTHAPタンパク質は全て(THAP0、1、2、3、6、7、8、10、11)、細胞核に選択的に局在する、ということを本発明者らは見出した(図14)。それらの拡散性の核への局在のほかに、THAPタンパク質のいくつかは、別個の細胞内構造と関連しても存在した:THAP2およびTHAP3に関しては仁、THAP7、THAP8およびTHAP11に関しては断続核小体。抗PML抗体を用いた間接的免疫蛍光顕微鏡は、THAP8およびTHAP11核小体がPML−NBと共局在する、ということを明示した。THAP7核小体はしばしばPML−NBと密接に関連して出現したが、しかしそれらは決して共局在しなかった。
ら(BglIIおよびBamHIで消化して)、プライマーTHAP8−1(5’−GCGAGATCTCGATGCCCAAGTACTGCAGGGCGCCG−3’)(配列番号226)およびTHAP8−2(5’−GCGGAATTCTTATGCACTGGGGATCCGAGTGTCCAGG−3’)(配列番号227)を用いてImageクローンNo:4819178から(BglIIおよびEcoRIで消化し)、それぞれImageクローンNo:3606376からPCRにより、ヒトTHAP2、3、7、6および8のコード領域を増幅し、同一酵素で消化されたpEGFPC2ベクター(Clontech)中で増強グリーン蛍光タンパク質(EGFP)ORFの下流でインフレームでクローン化して、pEGFPC2−THAP2、−THAP3、−THAP7、−THAP6および−THAP8を生成した。プライマーTHAP10−1(5’−GCGGAATTCATGCCGGCCCGTTGTGTGGCCGC−3’)(配列番号228)およびTHAP10−2(5’−GCGGGATCCTTAACATGTTTCTTCTTTCACCTGTACAGC−3’)(配列番号229)を用いて(EcoRIおよびBamHIで消化し)、プライマーTHAP11−1(5’−GCGAGATCTCGATGCCTGGCTTTACGTGCTGCGTGC−3’)(配列番号230)およびTHAP11−2(5’−GCGGAATTCTCACATTCCGTGCTTCTTGCGGATGAC−3’)(配列番号231)を用いて(BglIIおよびEcoRIで消化し)、それぞれHeLaのcDNAからPCRにより、ヒトTHAP10およびTHAP11コード領域を増幅し、pEGFP−C2ベクターの同一部位でクローン化して、pEGFPC2−THAP10および−THAP11を生成した。
THAPドメインの三次元構造をモデル化するために、本発明者らはPDB結晶データベースを検索した。二次構造情報を補助的に用いた場合は、配列相同性検出はより感受性が高くで且つ選択的になるので、配列および二次構造アラインメントを組合せるSeqFoldスレッディングプログラム(Olszewski et al. (1999) Theor. Chem. Acc. 101, 57-61)を用いて、ヒトTHAP1のTHAPドメインのホモログを検索した。甲状腺ホルモン受容体βDBD(PDBコード:2NLL)の結晶構造は最も高いスコアを出したので、本発明者らは、図15Aに示したその結果生じた構造アラインメントを用いて、ヒトTHAP1からのTHAPドメインの相同性ベースのモデルを得た(図15B)。THAPドメイン中のCys残基の分布は甲状腺ホルモン受容体βDBDのものと完全には適合せず(図15A)、それゆえ2つの特徴的「C4型」Zn−フィンガーの形成を可能にすることができない(図15Aで赤色にコード化)ことに留意されたい。しかしながらリシン側鎖の芳香族/疎水性残基または脂肪族部分間のスタッキング相互作用の網状構造は、THAPドメインの構造の安定性を保証する(図15Aおよび図15Bでシアン色コード化)。興味深いことに、同一のスレッディング法は、最も高いスコアを生じる場合、糖質コルチコイド受容体DBD(PDBコード:1GLU)の結晶構造を同定されたショウジョウバエP因子トランスポザーゼDBDに、独立して当てはまった。同一方法で、本発明者らは、図15Dに示したその結果生じた構造アラインメントを用いて、トランスポザーゼDBDのモデルを構築した(図15C)。THAPドメインのものと等価の疎水性コアの存在に留意されたい(図15Cおよび図15Dでシアン色コード化)。核受容体のDNA結合ドメインは全て、主として2つの相互作用αらせんに基づく典型的パターンにフォールディングし、第一のものは標的DNAの主溝中に挿入する。本発明者らのスレッディングおよびモデリング結果は、THAPドメインおよび黄色ショウジョウバエP因子トランスポザーゼDBDが核受容体のDBDのものと類似する共通のトポロジーを共有すると思われる、ということを示す。
II、SeqFold、Homology and Discoverモジュールを用いて、分子モデリングを実施した。SeqFold内のDSC法により、問題のタンパク質ドメインの最適な二次構造の予測を確認した。スレッディング由来の二次構造アラインメントを相同性モデリングのための入力データとして用い、上記のプロトコール(Manival et al. (2001) Nucleic Acids Res 29: 2223-2233)に従って実施した。ラマチャンドラ
ン(Ramachandran)分析および以前に報告されたような(Manival et al. (2001) Nucleic Acids Res 29: 2223-2233)フォールディングの一貫性の証明の両方により、モデルの妥
当性を調べた。
THAP1のホモ二量体化を媒介する配列を同定するために、一連のTHAP1検出構築物を、実施例7に記載されたように生成した。
異体を生成した。25μlの35Sで標識されたTHAP1変異体をそれぞれ、固定化GSTまたはGST−THAP1野生型タンパク質とともに4℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした:10mMのNaPO4、pH8.0、140mMのNaCl、3mMのMgCl2、1mMのジチオトレイトール(DTT)、0.05%NP40および0.2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、1mMのバナジン酸ナトリウム、50mMのβグリセロホスフェート、25μg/mlのキモトリプシン、5μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン。次にビーズを1mlの結合緩衝液中で5分間洗浄した。結合タンパク質を2×LaemmliSDS−PAGE試料緩衝液で溶出し、10%SDS−PAGEにより分画して、アムプリファイ(Amplify)(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて蛍光間接撮影により可視化した。予測どおり、THA
P1−C1、−C2、−C3および−N3はGST/THAP1と相互作用した(図16B)。これに対して、THAP1−N1および−N2はGST/THAP1ビーズと相互作用しなかった。したがって、2つのTHAP1/THAP1相互作用アッセイでは、本質的に同一結果が得られた。THAP1のTHAP1ホモ二量体化ドメインは、ヒトTHAP1の143番目のアミノ酸残基と192番目のアミノ酸残基の間に見出される。
2つの別個のTHAP1のcDNA、即ちTHAP1aおよびTHAP1bを発見した
(図17A)。これらのスプライス変異体を、プライマー2HMR10(5’−CCGAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT−3’)(配列番号232)および2HMR9(5’−CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC−3’)(配列番号233)を用いてHEVECのcDNAからPCRにより増幅し、EcoRIおよびBamHIで消化し、pEGFP.N3ベクター(Clontech)中で増強グリーン蛍光タンパク質(EGFP)ORFの上流でインフレームでクローン化して、pEGFP.N3−THAP1aおよびpEGFP−THAP1bを生成した。DNAシーケンシングは、THAP1bのcDNAアイソフォームがヒトTHAP1遺伝子のエキソン2(ヌクレオチド273〜468)を欠くことを明示した(図17B)。ヒトTHAP1のこの代替的にスプライスされたアイソフォーム(〜2kb
mRNA)は、ノーザンブロット分析により、多数のその他の組織中でも観察された(図2参照)。次に、THAP1a/GFPおよびTHAP1b/GFP発現構築物をCOS7細胞(ATCC)中にトランスフェクトし、融合タンパク質の発現を、抗GFP抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。結果を図17Cに示すが、これは、ヒトTHAP1の第二のアイソフォーム(THAP1b)が、アミノ酸末端のその後の部分(配列番号3のアミノ酸1〜142)を欠く不完全なTHAP1タンパク質(THAP1 C3)をコードすることを実証する。
THAPファミリーポリペプチドである、テトラサイクリン調節性発現を示す3T3細胞株における血清撤去誘導性アポトーシスを基礎にして、THAPファミリーポリペプチドの好アポトーシス活性を阻止するかまたは刺激する分子に関する高処理量スクリーニングアッセイを開発した。
pTRE−mycTHAP1を生成した。3T3−TO−mycTHAP1安定細胞株を確立するために、マウス3T3−TO繊維芽細胞(Clontech)を40〜50%の集密度で植え付け、そして供給元の使用説明書に従って、リポフェクタミンプラス試薬(Life Technologies)を用いて、1:10の比率で、ハイグロマイシンB耐性遺伝子、およびmy
cTHAP1発現ベクター(pTRE−mycTHAP1)を含有するpREP4プラスミド(Invitrogen)を用いて同時トランスフェクトした。ハイグロマイシンB(250U/ml;Calbiochem)およびテトラサイクリン(2ug/ml;Sigma)を含有する培地
中で、トランスフェクトされた細胞を選択した。いくつかの耐性コロニーを選択し、抗mycエピトープモノクローナル抗体(マウスIgG1、1/200、Clontech)を用いて、間接免疫蛍光法により、mycTHAP1の発現に関して分析した。mycTHAP1を発現する安定3T3−TO細胞株(3T3−TO−mycTHAP1)を選択し、10%ウシ胎仔血清、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(全てLife Technologies, Grand
Island, NY, USAから)およびテトラサイクリン(2ug/ml;Sigma)を補足したダ
ルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。この3T3−TO−mycTHAP1細胞株へのTHAP1発現の誘導は、完全培地中のテトラサイクリンの除去後48時間目に得られた。
各ウエル中のTMRレッド蛍光の強度を定量して、蛍光シグナルを修飾し、THAP1の好アポトーシス活性を増強するかまたは抑制する試験化合物を同定する。
THAP1/Par4またはTHAP1/SLC相互作用を調整する薬剤を同定するために、2ハイブリッドベース高処理量スクリーニングアッセイを実施し得る。
中5mg/ml;Chembridge)を付加する。プレートを30℃で4〜5日間インキュベートし、THAP1/Par4またはTHAP1/SLC2ハイブリッド相互作用を破壊することにより酵母細胞の増殖を抑制する小分子が、さらなる分析のために選択される。
THAP機能の小分子モジュレーターを同定するために、蛍光極性化(FP)に基づいた高処理量スクリーニングを用いて、Par4(Par4DD)融合タンパク質または組換えGST−SLC/CCL21融合タンパク質の組換えグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)−THAP結合ドメインからの蛍光標識THAP1タンパク質の置換をモニタリングする。
リーンで標識したTHAP1ペプチドを滴定することにより、アッセイを較正し得る。ペプチドの結合には極性化(mP、ミリ極性化)の増大を伴う。
4−ピンアレイ(Genetix)を用いることにより、小分子(DMSO中5mg/ml;Chembridge)を移入する。プレートを25℃で1〜2時間インキュベートし、Analys
tプレート読取り器(LJL Biosystems)を用いてFP値を決定する。
標識されていないTHAPおよびTHAPファミリー標的タンパク質を用いた結合アッセイに基づくチップアッセイ(Degterev et al, (2000) Nature Cell Biol. 3: 173-182
)を利用して、THAPファミリーおよびTHAPファミリー標的相互作用を妨害し得る
分子を同定し、高感受性を用意し、そして標識部分からの潜在的干渉を回避する。この実施例では、Par4タンパク質(Par4DD)またはSLC/CCL21のTHAP1結合ドメインを、表面強化レーザー脱着/イオン化(SELDI)チップに共有的に結合し、試験化合物の存在下における、標識されていないTHAP1タンパク質と固定化タンパク質との結合を質量分光測定によりモニタリングする。
THAP1タンパク質を1μlの総容積中で、4℃で12時間、湿室中でインキュベートして、SELDIチップの各スポットに結合させ、次に高pHおよび低pH緩衝液で交互に洗浄する(0.5MのNaClを含有する0.1M酢酸ナトリウム、その後、0.01MのHEPES、pH7.3)。試料をα−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中に包埋し、マトリックス補助レーザー脱着イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)質量分析法により、執拗に関して分析する。一定設定条件での100レーザースポットショットの平均を、各試料中の20スポットに亘って収集する。
THAP1および蛍光タンパク質と融合させたPAR4またはSLC/CCL21タンパク質間で、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)アッセイを実行する。アッセイは、Majhan et al, Nature Biotechnology 16: 547-552 (1998)およびDegterev et al, Nature Cell Biol. 3: 173-182 (2001)の場合と同様に実行し得る。
THAP1−1のcDNAをサブクローニングすることにより、THAP1−CFP発現ベクターを生成する。PAR4−YFPまたはSLC/CCL21−CYP発現ベクターは、pEYFP−N1ベクター(Clontech)中にPAR4またはSLC/CCL21のcDNAをサブクローニングすることにより生成する。
、HEK−293細胞を、THAP1−CFPおよびPAR4−YEPまたはSLC/CCL21−YEP発現ベクターでトランスフェクトする。24時間後、細胞を試験化合物で処理して、種々の時間、例えば48時間まで、インキュベートする。任意に試験化合物を補足したPBS中に細胞を収集し、C−60蛍光計(PTI)またはワラックWallacプレート読取り器で蛍光を測定する。THAP1−CFPおよびPAR4−YFPまたはSLC/CCL21−YFPを別々に発現する試料中の蛍光を一緒に付加し、THAP−1/PAR4またはTHAP1/SLC/CCL21結合の非存在下でのFRET値を概算するために用いる。
測定する)。試験化合物での処理時のFRET比の変化(試験化合物の非存在下での同時トランスフェクション後に観察されたものを上回る)は、THAP−1タンパク質およびPAR4またはSLC/CCL21タンパク質の相互作用を調節し得る化合物を示す。
あり得る部位をランダムにプールした中からTHAP1タンパク質のTHAPドメインにより選択される結合部位をランダムすることが可能となる、ランダムオリゴヌクレオチド選択法を用いて、THAP1のDNA結合特異性を決定した。本方法は、Bouvet (2001) Methods Mol Biol. 148: 603-10に記載されたものと実質的に同様に実行した。Pollack
and Treisman (1990) Nuc. Acid Res. 18: 6197-6204; Blackwell and Weintraub, (1990) Science 250: 1104-1110; Ko and Engel, (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 4011-4022; Merika and Orkin, (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 3999-4010;およびKrueger and Morimoto, (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7592-7603も参照されたい。
ヒトTHAP−1のTHAPドメイン(配列番号3のアミノ酸1〜90)をコードするcDNA断片を、以下のプライマー:5’−GCGCATATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCTACGGC−3’(配列番号242)および5’−GCGCTCGAGTTTCTTGTCATGTGGCTCAGTACAAAG−3’(配列番号243)とともに、鋳型としてpGADT7−THAP−1(実施例4参照)を用いて、PCRによりクローン化した。PCR産物を、カルボキシ末端にHisタグをコードする配列を付加してインフレームでpET−21c原核生物発現ベクター(Novagen)中にNdeI−X
hoI断片としてクローン化して、pET−21cTHAPを生成した。
することによりタンパク質の発現を誘導し、インキュベーションを4時間継続した。
Bouvet (2001) Methods Mol Biol. 148: 603-10に記載されたSELEXプロトコール
に従って、以下のような配列を有する62bpオリゴヌクレオチドを合成した:5’−TGGGCACTATTTATATCAAC−N25−AATGTCGTTGGTGGCCC−3’(配列番号244)(ここで、Nは任意のヌクレオチドであり、プライマーは各末端と相補的である)。プライマーPは:5’−ACCGCAAGCTTGGGCACTATTTATATCAAC−3’(配列番号245)であり、プライマーRは:5’−GGTCTAGAGGGCCACCAACGCATT−3’(配列番号246)である。PおよびRプライマーを用いてPCRにより62−merオリゴヌクレオチドを二本鎖にして、80bpのランダムのプールを生成する。
シンチレーション近接アッセイを用いて、THAP1特異的DNA結合の検出および定量のためのハイスループットアッセイを実行する。材料はAmersham(Piscataway, NJ)から入手し、Gal S. et al, 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9 Sept 2000, Vancouver, B.C.に従って実行し得る。
。THAP1タンパク質またはその一部分を準備し、THAP1タンパク質またはその一部分の量をELISAにより決定する。アッセイを発展させるために、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を実行して、適切なアッセイパラメーターを選択し得る。ハイスループットアッセイのために、結合緩衝液(Hepes、pH7.5;EDTA;DTT;10mMの硫酸アンモニウム;KClおよびTween−20)中で3Hで標識したDNA、抗THAP1モノクローナル抗体、およびTHAP1を併合する。
このアッセイは、標準96ウエルプレート中でなされ、室温で5〜30分間インキュベートした後、50〜100μlの結合緩衝液中の0.5〜2mgのPVTプロテインA SPAビーズを付加する。SPAビーズに結合された放射能を、TopCountTM微小プレート計数器(Packard Biosciences, Meriden, CT)を用いて測定する。
シンチレーション近接アッセイを用いて、THAP1特異的DNA結合の検出および定量のためのハイスループットアッセイを実行する。材料はAmersham(Piscataway, NJ)から入手し、Gal S. et al, 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9 Sept 2000, Vancouver, B.C.に従ってアッセイを実行し得る。
実質的に純粋なTHAP1タンパク質またはその一部分を生成する。例えばアミコンフィルター装置上での濃縮により、最終調製物中のタンパク質の濃度を、2〜3μg/mlのレベルに調節する。次にタンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、以下のように調製する:ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生:Kohler
and Milstein (Nature, 256: 495, 1975)の古典的方法またはその派生的方法(Harlow and Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 53-242, 1988 参照)に従って、ネズミハイブリドーマから、THAP1タンパク質またはそ
の一部分中のエピトープに対するモノクローナル抗体を調製し得る。
入れて、そこで培養の増殖を継続させる。イムノアッセイ手法、例えばEngvall, E., Meth. Enzymol. 70: 419 (1980)により最初に記載されたようなELISAによるウエルの上清液中の抗体の検出により、抗体産生クローンを同定する。選択陽性クローンを拡張させて、それらのモノクローナル抗体産物を使用するために収集した。モノクローナル抗体産生に関する詳細な手法は、Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York., Section 21-2に記載されている。
無修飾であるかまたは免疫原性を強化するために修飾され得るTHAP1タンパク質またはその一部分で適切なヒト以外の動物を免疫感作することにより、THAP1タンパク質またはその一部分中の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清を調製し得る。適切なヒト以外の動物、好ましくはヒト以外の哺乳類を選択する。例えば動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマであり得る。あるいはTHAP1またはその一部分に関して濃縮された粗製タンパク質調製物を用いて、抗体を生成し得る。このようなタンパク質、断片または調製物を、当該技術分野で既知である適切なアジュバント(例えば水酸化アルミニウム、RIBI等)の存在下でヒト以外の哺乳類中に導入する。さらにタンパク質、断片または調製物は、抗原性を増大する作用物質を用いて前処理され得るが、このような作用物質は当該技術分野で既知であり、例としては、例えばメチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、B型肝炎表面抗原およびカギアナカサガイヘモシアニン(KLH)が挙げられる。免疫感作動物からの血清を収集し、既知の手法に従って処理し、試験する。血清が望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する場合、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリクローナル抗体を精製し得る。
et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988-991 (1971)に見出され得る。一定間隔で追加の免疫注射を施し、その抗体力価が、例えば既知の濃度の抗原に対する寒天中での二重免疫拡散により半定量的に決定した場合に、下がり始めたら、抗血清を収穫し得る(例えばOuchterlony, O. et al., Chap. 19 in : Handbook of Experimental Immunology D.
Wier (ed) Blackwell (1973)参照)。抗体のプラトー濃度は、通常は0.1〜0.2m
g/mlの血清(約12:M)の範囲である。例えばFisher, D., Chap. 42 in : Manual
of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980)に記載されているように、競合的結合曲線を調製することにより、抗原に対する抗血清の親和性を決定する。
Claims (80)
- THAP媒介性活性を調節する試験化合物を同定する方法であって、
THAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を試験化合物と接触させる工程、及び
前記試験化合物が前記THAPファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片の活性を選択的に調節するか否かを決定する工程を含み、
前記THAPファミリーポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、
前記試験化合物が前記ポリペプチドの活性を選択的に調節することの決定は前記試験化合物がTHAP媒介性活性の候補モジュレーターであることを示すことを特徴とする方法。 - 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号5のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号8のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号11のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号12のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列またはその生物学
的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。 - 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号14のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドは、配列番号15〜114からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1記載の方法。
- 前記THAP媒介性活性は、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 前記THAP媒介性活性はPAR−4への結合である請求項17記載の方法。
- 前記THAP媒介性活性はSLCへの結合である請求項17記載の方法。
- 前記THAP媒介性活性はアポトーシスの誘導である請求項17記載の方法。
- 前記核酸は配列番号140〜159からなる群から選択される塩基配列を含む請求項17記載の方法。
- 前記アミノ酸同一性は、スコア=50および語長=3のパラメーターを有するXBLAST、XBLASTのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りBLAST、およびXBLASTのデフォルトパラメーターを有するBLASTからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される請求項1記載の方法。
- 本質的に配列番号1および2、配列番号3〜5のアミノ酸1〜89、配列番号6〜9のアミノ酸1〜90、配列番号10のアミノ酸1〜92、配列番号11〜14のアミノ酸1〜90、任意の前記配列と少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、核酸に結合する、単離または精製されたTHAPドメインポリペプチド。
- 本質的に配列番号1からなる請求項23記載の単離または精製されたTHAPドメインポリペプチド。
- 前記アミノ酸同一性は、スコア=50および語長=3のパラメーターを有するXBLAST、XBLASTのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りBLAST、およびXBLASTのデフォルトパラメーターを有するBLASTからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される請求項23記載の単離または精製されたTHAPドメインポリペプチド。
- 前記核酸は配列番号140〜159からなる群から選択される塩基配列を含む請求項23記載の単離または精製されたTHAPドメインポリペプチド。
- 請求項23記載のTHAPドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
- 本質的に配列番号3のアミノ酸143〜192、配列番号4のアミノ酸132〜181、
配列番号5のアミノ酸186〜234、配列番号15、任意の前記配列と少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、PAR4に結合する、単離または精製されたPAR4結合ドメインポリペプチド。 - 本質的に配列番号15からなる請求項28記載の単離または精製されたPAR4結合ドメイン。
- 本質的に配列番号3のアミノ酸143〜193からなる請求項28記載の単離または精製されたPAR4結合ドメイン。
- 本質的に配列番号4のアミノ酸132〜181からなる請求項28記載の単離または精製されたPAR4結合ドメイン。
- 本質的に配列番号5のアミノ酸186〜234からなる請求項28記載の単離または精製されたPAR4結合ドメイン。
- 前記アミノ酸同一性は、スコア=50および語長=3のパラメーターを有するXBLAST、XBLASTのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りBLAST、およびXBLASTのデフォルトパラメーターを有するBLASTからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される請求項28記載の単離または精製されたPAR4結合ドメインポリペプチド。
- 請求項28記載のPAR4結合ドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
- 本質的に配列番号3のアミノ酸143〜213、少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、SLCに結合する、単離または精製されたSLC結合ドメインポリペプチド。
- 前記アミノ酸同一性は、スコア=50および語長=3のパラメーターを有するXBLAST、XBLASTのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りBLAST、およびXBLASTのデフォルトパラメーターを有するBLASTからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される請求項35記載の単離または精製されたSLC結合ドメインポリペプチド。
- 請求項35記載のSLC結合ドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
- 配列番号3のアミノ酸143〜213、ならびに少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに融合された免疫グロブリンのFc領域を含む融合タンパク質。
- 複数のTHAPポリペプチドを含むオリゴマーTHAPタンパク質であって、各THAPポリペプチドが配列番号3のアミノ酸143〜213、ならびに少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 有効量のTHAP1ポリペプチドまたはそのSLC結合断片を薬学的に許容可能な担体とともに含む薬剤。
- 本質的に配列番号3のアミノ酸143および192ならびに少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、THAPファミリーポリペプチドと結合する、単離または精製されたTHAP二量体化ドメインポリペプチド。
- 前記アミノ酸同一性は、スコア=50および語長=3のパラメーターを有するXBLAST、XBLASTのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りBLAST、およびXBLASTのデフォルトパラメーターを有するBLASTからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される請求項41記載の単離または精製されたTHAP二量体化ドメインポリペプチド。
- 請求項41記載のTHAP二量体化ドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
- 配列番号160〜175、少なくとも18連続ヌクレオチドを含むその一部分を有する核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列と操作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
- 前記プロモーターは天然ゲノムにおいて配列番号160〜175からなる群から選択される前記核酸と操作可能に連結されないプロモーターである請求項44記載の発現ベクター。
- 請求項44記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 配列番号1〜114ならびに少なくとも18連続ヌクレオチドを含むその一部分からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
- 前記プロモーターは天然ゲノムにおいて配列番号160〜175からなる群から選択される前記核酸と操作可能的に連結されないプロモーターである請求項47記載の発現ベクター。
- 請求項47記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- THAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療のための候補化合物を同定する方法であって、
配列番号1〜114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTHAPファミリーポリペプチドあるいは配列番号1〜114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
前記化合物が前記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
前記化合物が前記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、前記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。 - アポトーシスの候補インヒビター、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物、または配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドまたは配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補インヒビターを同定する方法であって、
前記THAPファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
前記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定すること含み、
前記化合物が前記ポリペプチドの前記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、前記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。 - アポトーシスの候補インヒビター、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物、または配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドまたは配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補インヒビターを同定する方法であって、
前記THAPファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および
前記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドとの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
前記化合物が前記ポリペプチドの前記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、前記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。 - THAPファミリー活性の候補モジュレーターを同定する方法であって、
配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドまたは配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片を供給すること、
THAPファミリー標的ポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
前記THAPファミリーポリペプチドの前記THAPファミリー標的ポリペプチドへの結合能を試験化合物が選択的に調節するか否かを決定することを含み、
前記試験化合物が前記THAPファミリーポリペプチドの前記THAPファミリー標的ポリペプチドへの結合能を選択的に調節するという決定は、前記化合物がTHAPファミリー活性の候補モジュレーターであるということを示す方法。 - 前記THAPファミリーポリペプチドは配列番号1〜114のTHAPファミリーポリペプチドまたは配列番号1〜114のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸の連続スパンを含む断片をコードする核酸を含む一次発現ベクターにより供給され、そして前記THAPファミリー標的ポリペプチドはTHAPファミリー標的ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む二次発現ベクターにより供給される請求項53記載の方法。
- 前記THAPファミリー活性はアポトーシス活性である請求項53記載の方法。
- 前記THAPファミリー標的タンパク質はPAR−4である請求項53記載の方法。
- 前記THAPファミリーポリペプチドはTHAP−1、THAP−2またはTHAP−3タンパク質であり、前記THAPファミリー標的タンパク質がPAR−4である請求項5
3記載の方法。 - 前記THAPファミリー標的タンパク質はSLCである請求項53記載の方法。
- THAPファミリータンパク質の活性を調節することを含む、細胞におけるアポトーシスを調節する方法。
- 前記THAPファミリータンパク質は配列番号1〜114からなる群から選択される請求項59記載の方法。
- 前記THAPファミリータンパク質の活性の調節はTHAPファミリータンパク質とTHAPファミリー標的タンパク質の相互作用の調節を含む請求項59記載の方法。
- 前記THAPファミリータンパク質の調節はTHAPファミリータンパク質とPAR4タンパク質の相互作用の調節を含む請求項59記載の方法。
- THAPファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療のための候補化合物を同定する方法であって、
配列番号1〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTHAPファミリーポリペプチドあるいは配列番号1〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
前記化合物が前記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
前記化合物が前記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、前記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。 - アポトーシスの候補活性化剤、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物または配列番号1〜98のTHAPファミリーポリペプチドまたは配列番号1〜98のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補活性化剤を同定する方法であって、
前記THAPファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
前記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
前記化合物が前記ポリペプチドの前記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、前記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。 - アポトーシスの候補活性化剤、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物または配列番号1〜98のTHAPファミリーポリペプチドまたは配列番号1〜98のポリペプチドの少なくとも6連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補活性化剤を同定する方法であって、
前記THAPファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および
前記化合物が、THAPファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、PAR−4への結合、SLCへの結合、PMLへの結合、PMLへの結合、PML−NB中に見出されるポリペプチドへの結合、PML−NBへの局在化、THAPファミリー標
的タンパク質のPML−NBへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
前記化合物が前記ポリペプチドの前記少なくとも1つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、前記化合物がTHAPファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。 - THAPファミリータンパク質のSLC結合ドメインを含むポリペプチドを個体に投与することを含む、個体におけるSLCの活性に関連した症状を改善する方法。
- 前記ポリペプチドは配列番号3のアミノ酸143〜213および少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと融合された免疫グロブリンのFc領域を含む融合タンパク質を含む請求項66記載の方法。
- 前記ポリペプチドは複数のTHAPポリペプチドを含むオリゴマーTHAPタンパク質を含み、各THAPポリペプチドが配列番号3のアミノ酸143〜213および少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項66記載の方法。
- 個体におけるTHAPファミリータンパク質の活性を調節することを含む、個体における血管新生を調節する方法。
- 前記THAPファミリータンパク質は配列番号1〜114からなる群から選択される請求項69記載の方法。
- 前記調節は抑制である請求項69記載の方法。
- 前記調節は誘導である請求項69記載の方法。
- 個体におけるTHAPファミリータンパク質の活性を抑制することを含む、個体における細胞死を低減させる方法。
- 前記THAPファミリータンパク質は配列番号1〜114からなる群から選択される請求項73記載の方法。
- 前記THAPファミリータンパク質の活性はCNSにおいて抑制される請求項73記載の方法。
- 個体におけるTHAPファミリータンパク質の活性を調節することを含む、個体における炎症または炎症性障害を低減させる方法。
- 前記THAPファミリータンパク質は配列番号1〜114からなる群から選択される請求項76記載の方法。
- 個体におけるTHAPファミリータンパク質の活性を調節することを含む、個体における癌の程度を低減させる方法。
- 前記THAPファミリータンパク質は配列番号1〜114からなる群から選択される請求
項78記載の方法。 - 前記THAPファミリータンパク質の活性増大は、アポトーシスを誘導し、細胞分裂を抑制し、転移能力を抑制し、腫瘍負荷量を低減し、化学療法または放射線療法に対する感受性を増大し、癌細胞を殺傷し、癌細胞の増殖を抑制し、内皮細胞を殺傷し、内皮細胞の増殖を抑制し、血管新生を抑制し、または腫瘍退縮を誘導する請求項78記載の方法。
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