JP2010158248A - 新規の細胞死関連タンパク質ならびにアポトーシス制御におけるｔｈａｐ１およびｐａｒ４の経路 - Google Patents

新規の細胞死関連タンパク質ならびにアポトーシス制御におけるｔｈａｐ１およびｐａｒ４の経路 Download PDF

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Abstract

【課題】ＳＬＣ／ＣＣＬ２１により媒介される症状の治療に有用な薬学的組成物を提供する。
【解決手段】薬学的に許容可能な担体中のケモカイン結合物質を含む薬学的組成物であって、該ケモカイン結合物質は、複数の特定の配列のいずれか１つ、いずれか１つと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、いずれか１つのケモカイン結合ドメイン、およびいずれか１つのケモカイン結合ドメインと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【選択図】なし

Description

［発明の分野］
本発明は、ＴＨＡＰ（タナトスTHanatos（死）関連タンパク質）ファミリーの遺伝子およびタンパク質、ならびにその使用に関する。特に本発明は、ＴＨＡＰドメインを含むポリペプチド、ＴＨＡＰ媒介性活性の調節およびこれらの活性を調節する化合物の同定に関する。
［背景］
細胞増殖および細胞死の協調は、多細胞生物における正常な発達および組織恒常性のために必要である。これら２つの過程の正常な協調の欠陥は、腫瘍形成のための基本的要件である。
細胞周期全体を通しての進行は高度に調節され、多数のチェックポイントの通過を要する（Hunter, 1993参照）。細胞死の程度は、アポトーシスとよばれる形態学的に認識可能な死を生じるプログラムされた自殺経路の活性化により、生理学的に制御される（Jacobson
et al, 1997; Vaux et al, 1994）。例えば腫瘍壊死因子などの細胞外シグナル、および例えばｐ５３などの細胞内シグナルはともに、アポトーシス性細胞死を誘導し得る。アポトーシスまたは細胞周期に関与する多数のタンパク質が同定されているが、これら２つの経路が調和的に働くメカニズムは十分に理解されてはいない。
アポトーシスを調節する分子が細胞死および細胞増殖に関連した広範囲の症状を治療する潜在能力を有する、ということは十分実証されている。例えばこのような分子は、癌の治療のために細胞死を誘導し、神経変性障害の治療のために細胞死を抑制し、そして血管新生を調節するために細胞死を抑制または誘導するために用いられ得る。しかしながら細胞周期およびアポトーシスを制御する多数の細胞学的経路は未だ十分に解明されていないため、これらの障害の治療のための治療用分子の開発のための生物学的標的の同定が必要とされている。
ＰＭＬ核小体
ＰＯＤ（ＰＭＬ発癌ドメイン）、ＮＤ１０（核ドメイン１０）およびＫｒ小体としても知られるＰＭＬ核小体（ＰＭＬ−ＮＢ）は、ヒト骨髄性白血病の異なる亜型である急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）からの細胞中で特異的に破壊される別個の核内ドメインである（Maul et al., 2000; Ruggero et al., 2000; Zhong et al., 2000a）。それらの名称は、それらの最も集中的に研究されたタンパク質構成成分である、前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）、すなわち、ＡＰＬにおいてレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）遺伝子座のｔ（１５；１７）染色体の転位相手として元々クローン化された遺伝子によりコードされるＲＩＮＧフィンガーＩＦＮ−誘導性タンパク質に由来する。ＡＰＬ細胞では、白血病誘発性融合タンパク質ＰＭＬ−ＲＡＲの存在が、ＰＭＬ−ＮＢの崩壊、ＰＭＬおよびその他のＰＭＬ−ＮＢタンパク質の異常核構造への局在化をもたらす（Zhong et al., 2000a）。ＰＭＬ−ＲＡＲ腫瘍性タンパク質の分解を誘導するレチノイン酸によるＡＰＬ細胞および患者の処置はそれぞれ、ＰＭＬおよびその他のＮＢ構成成分のＰＭＬ−ＮＢへの再局在化、ならびに臨床的疾患の完全寛解を生じる。したがってＰＭＬ−ＲＡＲによるＰＭＬ−ＮＢの脱制御は、腫瘍形成において重要な役割を演じると考えられる。ＰＭＬ遺伝子が相同組換えにより破壊されたマウスの分析は、ＰＭＬが多数のアポトーシス経路（Wang et al., 1998b）に不可欠であるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍サプレッサーとして機能すること（Wang et al., 1998a）を明示した。Ｐｍｌ−／−マウスおよび細胞は、Ｆａｓ、ＴＮＦα、セラミドおよびＩＦＮ誘導性アポトーシスから、ならびにＤＮＡ損傷誘導性アポトーシスから保護される。しかしながらＰＭＬがプロアポトーシス刺激に対する応答を調節する分子メカニズムは、十分に理解されているわけではない（Wang et al., 1998b; Quignon et al., 1998）。近年の研究は、ＰＭＬがｐ５３依存性およびｐ５３非依存性アポトーシス経路の両方に関与し得る、ということを示す（Guo et al., 2000; Fogal et al., 2000）。ｐ５３依存性ＤＮＡ損傷誘導性アポトーシス、ｐ５３による転写活性化およびｐ５３標的遺伝子の誘導は、全てＰＭＬ−／−プライマリー細胞において減弱される（Guo et al., 2000）。ＰＭＬはｐ５３と物理的に相互作用し、ｐ５３に関するコーアクチベーターとして作用する。ＰＭＬのこのコーアクチベーター的役割は完全に、ＰＭＬ−ＮＢにｐ５３を動員する能力に依存する（Guo et al., 2000; Fogal et al., 2000）。ＰＭＬ−およびｐ５３−依存性増殖抑制経路間のクロストークの存在は、ｐ５３機能のモジュレーターとしてのＰＭＬ−ＮＢおよびＰＭＬ−ＮＢ−関連タンパク質の重要な役割を暗示する。ｐ５３のほかに、好アポトーシス因子Ｄａｘｘは、ＰＭＬ好アポトーシス活性の別の重要な媒介物質であり得る（Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000b; Li et al., 2000）。Ｄａｘｘは、Ｆａｓ誘導性細胞死を強化する能力により最初に同定された。ＤａｘｘはＰＭＬと相互作用し、そして核に選択的に局在し、ＰＭＬ−ＮＢ中に蓄積する（Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000b; Li et al., 2000）。ＰＭＬの不活性化は、ＰＭＬ−ＮＢからのＤａｘｘの異常局在化ならびにＤａｘｘ好アポトーシス活性の完全阻害を生じる（Zhong et al., 2000b）。Ｄａｘｘは強力な転写リプレッサー活性を有する、ということが近年見出された（Li et al., 2000）。ＰＭＬ−ＮＢにＤａｘｘを動員することにより、ＰＭＬはＤａｘｘ媒介性転写抑制を阻止し、したがってある種の好アポトーシス遺伝子の発現を可能にする。
ＰＭＬ−ＮＢは、Ｄａｘｘおよびｐ５３のほかに、いくつかのその他のタンパク質を含有する。これらの例としては、自己抗原Ｓｐ１００（Sternsdorf et al., 1999）およびＳｐ１００関連タンパク質Ｓｐ１４０（Bloch et al., 1999）、網膜芽細胞腫サプレッサーｐＲＢ（Alcalayet al., 1998）、転写コーアクチベーターＣＢＰ（LaMorte et al., 1998）、ブルーム症候群ＤＮＡヘリカーゼＢＬＭ（Zhong et al., 1999）および小ユビキチン様修飾因子ＳＵＭＯ−１（セントリン−１またはＰＩＣ１としても既知である、近年のレビューに関しては、Yeh et al., 2000; Melchior, 2000; Jentsch and Pyrowolakis, 2000参照）が挙げられる。ＳＵＭＯ−１によるＰＭＬの共有結合修飾（ＳＵＭＯ化）は、ＮＢ中へのＰＭＬ蓄積（Muller et al., 1998）およびＰＭＬ−ＮＢへの他のＮＢ構成成分の動員（Ishovet al., 1999; Zhong et al., 2000c）に重要な役割を演じると考えられる。
前立腺アポトーシス応答−４
前立腺アポトーシス応答−４（ＰＡＲ４）は、アポトーシスを受けている前立腺腫瘍細胞において特異的に発現上昇する遺伝子の産物として最初に同定された３８ｋＤａタンパク質である（Rangnekar, 1998; Mattson et al., 1999参照）。アポトーシスにおけるＰＡＲ４の重要な役割と一致して、培養細胞におけるＰＡＲ４の誘導は専らアポトーシス期間中に見出され、そしてＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Diaz-Meco et al., 1996）、ニューロン（Guo et al.,1998）、前立腺癌および黒色腫細胞（Sells et al., 1997）におけるＰＡＲ４の異所性発現は、アポトーシス刺激に対してこれらの細胞を感作することが示されている。さらに、ＰＡＲ４の発現低下は、ｒａｓ誘導性生存および腫瘍進行にとって重要であり（Barradas et al., 1999）、そしてアンチセンス技術によるＰＡＲ４産生の抑制は、神経変性障害の異なるモデル（Mattson et al., 1999）を含むいくつかの系においてアポトーシスを防止し（Sells et al., 1997; Guo et al., 1998）、アポトーシスにおけるＰＡＲ４の重要な役割をさらに強調する。カルボキシ末端では、ＰＡＲ４は、ロイシンジッパードメイン（Ｐａｒ４ＬＺ、アミノ酸２９０〜３３２）および部分的に重複するデスドメイン（Ｐａｒ４ＤＤ、アミノ酸２５８〜３３２）の両方を含有する。このカルボキシ末端部分の欠失は、ＰＡＲ４の好アポトーシス機能を妨げる（Diaz-Meco et al., 1996; Sells et al., 1997; Guo et al., 1998）。他方で、ＰＡＲ４ロイシンジッパー／デスドメインの過剰発現は、ドミナントネガティブに作用して、全長ＰＡＲ４により誘導されるアポトーシスを防止する（Sells et al., 1997; Guo et al., 1998）。ＰＡＲ４ロイシンジッパー／デスドメインは、２つの異なる種類のモチーフ：ウィルムス腫瘍サプレッサータンパク質ＷＴ１の亜鉛フィンガー（Johnstone et al., 1996）およびタンパク質キナーゼＣの非定型アイソフォーム（Diaz-Meco et al., 1996）、ならびに死関連タンパク質（ＤＡＰ）様キナーゼＤｌｋからのアルギニン豊富ドメイン（Page et al., 1999）を認識することにより、他のタンパク質とＰＡＲ４との相互作用を媒介する。これらの相互作用の中で、ＰＡＲ４とａＰＫＣの結合、ならびにその結果としてのその酵素活性の抑制は、ａＰＫＣが細胞生存に重要な役割を演じることが既知であり、そしてその過剰発現はアポトーシスを誘導するＰＡＲ４の能力を妨げることが示されているため（Diaz-Meco et al., 1996; Berra et al., 1997）、特に機能的に関連している。
ＳＬＣ／ＣＣＬ２１
ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１（ＳＬＣ、ＣＫβ−９、６Ｃカインおよびエキソダス−２としても知られている）は、ＣＣ（β）−ケモカインサブファミリーのメンバーである。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１は、βケモカインに特徴的な４つの保存システインと２つの付加的システインをその異常に長いカルボキシル末端ドメイン中に含有する。ヒトＳＬＣ／ＣＣＬ２１ｃＤＮＡは、１３４アミノ酸残基の塩基性に富んだ前駆体タンパク質をコードし、そのうちの２３アミノ酸残基のシグナルペプチドが切断されて１１１アミノ酸残基と予測される成熟タンパク質を形成する。マウスＳＬＣ／ＣＣＬ２１ｃＤＮＡは、２３残基のシグナルペプチドが切断されて１１０残基の成熟タンパク質を生成する１３３アミノ酸残基のタンパク質をコードする。ヒトおよびマウスＳＬＣ／ＣＣＬ２１は高度に保存されて、８６％のアミノ酸配列同一性を示す。ヒトＳＬＣ／ＣＣＬ２１に関する遺伝子は、多数のヒトＣＣケモカインの遺伝子が密集している染色体１７ではなく、ヒト染色体９ｐ１３に位置する。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１遺伝子は、別の近年同定されたＣＣケモカインであるＭＩＰ−３β／ＥＬＣ／ＣＣＬ１９に関する遺伝子と同様、約１００ｋｂの領域内に存在する。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１は、ｍＲＮＡレベルでリンパ系組織中で高度に発現されることが知られており、Ｔリンパ球およびＢリンパ球に対する化学誘引物質であることが既知であった（Nagira, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 19518-19524; Hromas, etal. (1997) J. Immunol. 159: 2554-2558; Hedrick, et al. (1997) J. Immunol. 159:1589-1593; Gunn, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 258-263）。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１は、細胞間接着分子−１へのリンパ球の接着と、回転細胞の休止の両方を誘導する（Campbell, et al. (1998) Science 279: 381-384）。上記の特性は全て、リンパ系組織を通じてリンパ球の輸送を調節するというＳＬＣ／ＣＣＬ２１の役割と一致する。ほとんどのＣＣケモカインとは異なって、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１は単球に対して走化性でない。しかしながら、用量依存的に造血性前駆コロニー形成を抑制することが報告されている（Hromas et al. (1997) J. Immunol. 159: 2554-58）。
ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１は、ケモカイン受容体ＣＣＲ７のリガンドである（Rossi et al.(1997) J. Immunol. 158: 1033; Yoshida et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:13803; Yoshidaet al. (1998 J. Biol. Chem. 273: 7118; Campbell, et al. (1998) J Cell Biol 141:1053）。ＣＣＲ７はＴ細胞および樹状細胞（ＤＣ）において発現しており、これはリンパ球および成熟ＤＣの両方に対するＳＬＣ／ＣＣＬ２１の走化性作用と一致している。記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）およびナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＣＲ７受容体を発現する（Sallusto et al. (1999) Nature 401: 708）。記憶Ｔ細胞集団内で、ＣＣＲ７発現は、炎症化組織に移動し得るエフェクター機能を有するＴ細胞（ＣＣＲ７−）とエフェクター機能を提示する前に二次刺激を要するＴ細胞（ＣＣＲ７＋）との間を識別する（Sallusto et al. (1999) Nature 401: 708）。成熟ＤＣとは違って、未熟ＤＣはＣＣＲ７を発現せず、それらはＣＣＬ２１の走化性作用に対して応答しない（Sallusto et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 2760; Dieu et al. (1998)J. Exp. Med. 188: 373）。
ＣＣＲ７およびその２つのリガンドであるＳＬＣ／ＣＣＬ２１およびＭＩＰ３ｂ／ＣＣＬ１９の重要な機能は、Ｔ細胞への効率的な抗原曝露を促すために、二次リンパ系器官への細胞の動員および保持を促すことである。ＣＣＲ７欠損マウスは、不十分に発達した二次器官を有し、リンパ節、パイエル板および脾臓の細動脈周囲リンパ組織鞘内のリンパ球の不規則な分布を示す（Forster et al. (1999) Cell 99: 23）。これらの動物は、嵌入ＤＣがリンパ節に移動できないことに大いに起因する、重度に低減した一次Ｔ細胞応答を有する（Forster et al. (1999) Cell 99: 23）。今日までの全体的知見は、ＣＣＲ７およびその２つのリガンド、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１が、Ｔ細胞／ＤＣ相互作用の制御を介するＴ細胞応答の重要な調節物質である、という見解を支持する。ＣＣＲ７は、二次リンパ系器官への細胞の遊走の決定に際して、有益な役割を有する重要な調節分子である（Forster et al. (1999) Cell 99: 23; Nakano et al. (1998) Blood 91:2886）。
［発明の要約］
ＴＨＡＰ１（タナトス関連タンパク質１）
過去数年、本発明者等は後毛細管高内皮細静脈の特殊化内皮細胞（ＨＥＶＥＣ）中で発現される新規遺伝子の分子的解析に集中した（Girard and Springer, 1995a; Girard and Springer, 1995b; Girard etal., 1999）。本発明において、彼等は、ＰＭＬ−ＮＢに局在するタンパク質であるＴＨＡＰ１（タナトス（死）関連タンパク質−１）の解析を報告する。ＴＨＡＰ１ベイトを用いたＨＥＶＥＣｃＤＮＡライブラリーの２−ハイブリッドスクリーニングは、ユニークな相互作用相手である好（ｐｒｏ）アポトーシスタンパク質ＰＡＲ４の同定をもたらす。ＰＡＲ４はＰＭＬ−ＮＢ中に蓄積すること、ＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４複合体のＰＭＬ−ＮＬへのターゲッティングはＰＭＬにより媒介されることが判明した。ＰＡＲ４と同様に、ＴＨＡＰ１は好アポトーシスポリペプチドである。その好アポトーシス活性は、ＴＨＡＰドメインと呼ばれるアミノ末端部分における新規のタンパク質モチーフを要する。総合してこれらの結果は、ＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４好アポトーシス複合体を包含するアポトーシスに関する新規のＰＭＬ−ＮＢ経路を定義する。
本発明は、アポトーシスに関与する遺伝子、タンパク質および生物学的経路を包含する。いくつかの実施形態において、明細書中に開示された遺伝子、タンパク質および経路は、ポリペプチド、核酸または低分子療法の開発のために用いられ得る。
本発明は、新規のタンパク質モチーフ、ＴＨＡＰドメインを用意する。本発明者等は、ＴＨＡＰ１のアミノ末端部分における９０残基のタンパク質モチーフとしてＴＨＡＰドメインを最初に同定したが、これはＴＨＡＰ１好アポトーシス活性に不可欠である。本発明者らにより特定されたようなＴＨＡＰ１（タナトス（死）関連タンパク質−１）は、好アポトーシスタンパク質ＰＡＲ４との複合体を形成する好アポトーシスポリペプチドであり、ＰＭＬ核小体として既知の分離した核内領域中に局在する。しかしながらＴＨＡＰドメインは、タンパク質の新規のファミリー、即ちＴＨＡＰファミリーも定義し、本発明者等は、ヒトゲノム中の少なくとも１２の別個のメンバー（ＴＨＡＰ−０〜ＴＨＡＰ１１）も用意したが、これらは全て、それらのアミノ末端部分にＴＨＡＰドメイン（典型的には８０〜９０アミノ酸）を含有する。したがって本発明は、核酸分子、例えば特に、ＴＨＡＰファミリーのメンバーをコードする完全ｃＤＮＡ配列、ＴＨＡＰドメインをコードするその一部分、あるいはそれと相同なポリペプチド、ならびにＴＨＡＰファミリー遺伝子によりコードされるポリペプチドと相同なポリペプチドを包含する。したがって本発明は、診断および活性測定も含み、そしてＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分の治療における使用、ならびにＴＨＡＰファミリーメンバーの好アポトーシス活性を抑制（または刺激）し得る化合物を同定するための薬剤スクリーニングアッセイも含む。
ＴＨＡＰファミリーメンバーの一例では、ＴＨＡＰ１はヒト内皮細胞（ＨＥＶＥＣ）において発現されるアポトーシス誘導性ポリペプチドであると決定され、ＴＨＡＰ１ポリペプチドにおけるアポトーシス活性に必要とされるＴＨＡＰ配列の解析を提供する。さらなる態様において、本発明は、ＴＨＡＰ１の、好アポトーシスタンパク質ＰＡＲ４との、及びＰＭＬ−ＮＢとの相互作用、例えば疾患の治療のためのＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４相互作用を調節する方法にも向けられる。本発明は、ＰＡＲ４およびＰＭＬ−ＮＢ間の相互作用にも関し、該相互作用（または局在化）の検出のための診断、ならびに疾患の治療のための該相互作用の調節にも関する。
ＴＨＡＰファミリーメンバーおよびＴＨＡＰファミリー標的分子間、ＴＨＡＰドメインまたはＴＨＡＰ−ドメイン標的分子間の、あるいはＰＡＲ４およびＰＭＬ−ＮＢタンパク質間の相互作用を調節する化合物は、種々のヒト疾患における異なる細胞型のアポトーシスを抑制する（または刺激する）ために用いられ得る。例えばこのような化合物は、血管新生依存性疾患、例えば癌、心臓血管性疾患、炎症性疾患（これらに限定されない）における内皮細胞のアポトーシスを抑制または刺激するために、そして急性および慢性神経変性障害、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＨＩＶ脳炎、脳卒中、癲癇発作（これらに限定されない）におけるニューロンのアポトーシスを抑制するために用いられ得る。
ＴＨＡＰ１ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびに上記のプライマーおよびプローブを用いたＤＮＡ増幅および検出方法も本発明の一部である。
ＴＨＡＰファミリーメンバーまたはＴＨＡＰドメインの断片としては、配列番号１６０〜１７５からなる群から選択される少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００または１０００の連続したヌクレオチドを含む核酸によりコードされる断片、あるいは配列番号１〜１１４からなる群から選択される少なくとも８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。
本発明のさらなる態様は、上記の核酸配列のいずれかを含む組換えベクター、特にＴＨＡＰ１調節配列またはＴＨＡＰ１タンパク質をコードする配列、ＴＨＡＰファミリーメンバー、ＴＨＡＰドメイン、ＴＨＡＰファミリーメンバーおよびＴＨＡＰドメインの断片、ＴＨＡＰファミリーメンバー／ＴＨＡＰドメインのホモログを含む組換えベクター、ならびに上記の核酸配列または組換えベクターを含む細胞宿主およびトランスジェニック非ヒト動物を包含する。
本発明の別の態様は、ＴＨＡＰ１遺伝子またはＴＨＡＰファミリーメンバーをコードする遺伝子の発現を抑制するかまたは増大する物質または分子のスクリーニング方法、ならびにＴＨＡＰ１ポリペプチドまたはＴＨＡＰファミリーポリペプチドと相互作用するか、および／またはその活性を抑制または増大する物質または分子のスクリーニング方法に関する。
別の態様によれば、本発明は、有効量のＴＨＡＰファミリータンパク質、例えばＴＨＡＰ１、またはそのＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合断片を、薬学的に許容可能な担体とともに含む薬剤を用意する。本明細書中に記載された薬剤は、治療および／または予防のために有用であり得る。
別の態様に関連するものとして、本発明は特に、抗炎症薬としてのＴＨＡＰファミリータンパク質、そのホモログおよびその断片、例えばＴＨＡＰ１、またはそのＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合断片の使用に関する。ＴＨＡＰファミリータンパク質、例えばＴＨＡＰ１およびその断片は、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１により媒介される症状の治療に有用である。
さらなる態様において、本発明は、例えばＴＨＡＰ１またはそのＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合断片などのＴＨＡＰファミリータンパク質であるＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合分子を供給する工程、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合ＴＨＡＰ１分子を試料と接触させる工程、および、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合ＴＨＡＰ１分子と試料中のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカインとの相互作用を検出する工程を含む検出方法を提供する。
一例では、本発明は、生物学的試料中のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカインの存在を検出するために用いられ得る。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合ＴＨＡＰ１分子は、例えばＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合物として、固体支持体上に有効に固定され得る。
別の態様に従って、本発明は、試料中のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカインの活性の抑制方法であって、試料を、ＴＨＡＰ１タンパク質またはそのＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合断片である有効量のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載されたような方法または薬剤において使用するための精製ＴＨＡＰ１タンパク質またはそのＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合断片、またはＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合物、ならびにこのような精製ＴＨＡＰ１タンパク質または断片を含むキットを提供する。
本発明は、ＴＨＡＰ１タンパク質の断片であって、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合特性を有する断片の使用も予見する。断片は、タンパク質由来のペプチドであり得る。例えば全タンパク質と比較した場合のペプチドの低減化免疫原性のために、このようなペプチドの使用は、全タンパク質またはタンパク質の実質的部分の使用より望ましい。このようなペプチドは、種々の技法により、例えば組換えＤＮＡ技術および合成化学的方法により調製され得る。
本発明に用いるためのＴＨＡＰ１タンパク質は、種々の方法で、特に種々の発現系における組換えタンパク質として調製され得るということも明らかである。任意の標準系、例えばバキュロウイルス発現系または哺乳類細胞株発現系が用いられ得る。
本発明の他の態様は、以下の番号付けした段落において、説明される。
１．アポトーシスの候補モジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）上記化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節するか否かを決定することを含み、
上記試験化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節するという決定は、上記化合物がアポトーシスの候補モジュレーターであるということを示す方法。
２．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
３．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
４．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
５．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
６．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
７．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号８のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
８．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
９．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
１０．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
１１．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
１２．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
１３．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
１４．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１５〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１の方法。
１５．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質の上記の生物学的活性断片は、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を有する段落１の方法。
１６．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を有する段落２〜１５のいずれかの方法。
１７．アポトーシス活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、上記ポリペプチドは本質的に以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする核酸：
（ａ）配列番号２のアミノ酸第１〜９０位、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）本質的に配列番号３のアミノ酸第１〜８９位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）本質的に配列番号４のアミノ酸第１〜８９位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｄ）本質的に配列番号５のアミノ酸第１〜８９位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｅ）本質的に配列番号６のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｆ）本質的に配列番号７のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｇ）本質的に配列番号８のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｈ）本質的に配列番号９のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｉ）本質的に配列番号１０のアミノ酸第１〜９２位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｊ）本質的に配列番号１１のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｋ）本質的に配列番号１２のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
（ｌ）本質的に配列番号１３のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、および
（ｍ）本質的に配列番号１４のアミノ酸第１〜９０位からなるＴＨＡＰファミリードメインを含むポリペプチド、アポトーシス活性を有するその断片、またはそれと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド。
１８． （ｉ）配列番号１〜１１４からなる群から選択される配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｉｉ）配列番号１６０〜１７５からなる群から選択される配列の核酸配列およびそれと相補的な配列を含む核酸分子、および
（ｉｉｉ）その配列が（ｉ）および（ｉｉ）で定義されたような核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重性である核酸からなる群から選択されるアポトーシス活性を有するＴＨＡＰファミリーポリペプチドをコードする単離された核酸。
１９．配列番号５、７、８および１１からなる群から選択される核酸を含む段落１８の核酸。
２０．配列番号１６２、１６４、１６５および１６８からなる群から選択される核酸を含む段落１８の核酸。
２１． （ｉ）配列番号１および２の核酸配列またはそれと相補的な配列、または
（ｉｉ）配列番号１および２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むアポトーシス活性を有するＴＨＡＰファミリーポリペプチドをコードする単離された核酸。
２２．
ｉ）配列番号１〜１１４のポリペプチドおよび配列番号１６０〜１７５の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
ｉｉ）アポトーシス活性を保有する上記ポリペプチドの断片
をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
２３．配列番号５、７、８および１１のポリペプチドならびに配列番号１６２、１６４、１６５および１６８の核酸によりコードされるポリペプチド、またはアポトーシス活性を保有する上記ポリペプチドの断片からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする段落２３の核酸。
２４．上記ポリペプチドは、配列番号５、７、８および１１の配列ならびに配列番号１６２、１６４、１６５および１６８の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む段落２３の核酸。
２５．ポリペプチド同一性は、スコア＝５０および語長＝３のパラメーターを有するＸＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される段落２３の核酸。
２６．プロモーターと操作可能的に連結された段落１７の核酸。
２７．段落２６の核酸を含む発現カセット。
２８．段落２７の発現カセットを含む宿主細胞。
２９．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを製造する方法であって、
配列番号１〜１１４のいずれか１つのＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主細胞の集団を供給すること、および
上記組換え核酸の発現を促す条件下で宿主細胞の上記集団を培養することを含み、
それにより上記ポリペプチドは宿主細胞の上記集団内で産生される方法。
３０．上記の供給工程は、配列番号５、７、８および１１のいずれか１つのＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主細胞の集団を供給することを含む段落２９の方法。
３１．上記細胞の集団から上記ポリペプチドを精製することをさらに含む段落２９の方法。
３２．配列番号１６０〜１７５のいずれか１つの核酸によりコードされる単離ＴＨＡＰポリペプチド。
３３．配列番号５、７、８、１１、１６２、１６４、１６５および１６８からなる群から選択される核酸によりコードされる段落３２のポリペプチド。
３４．上記ポリペプチドは、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列との結合、ＰＡＲ４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する段落３２のポリペプチド。
３５．配列番号１〜１１４からなる群から選択される配列の少なくとも１２連続アミノ酸を含む、単離されたＴＨＡＰポリペプチドまたはその断片。
３６．配列番号５、７、８、および１１からなる群から選択される配列の少なくとも１２連続したアミノ酸を含む段落３５のポリペプチド。
３７．上記ポリペプチドは、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する段落３５のポリペプチド。
３８．配列番号１〜１１４からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列またはその断片を含む、単離ＴＨＡＰポリペプチドまたはその断片であって、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、単離ＴＨＡＰポリペプチドまたはその断片。
３９．上記ＴＨＡＰポリペプチドまたはその断片は、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、配列番号５、７、８、および１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列またはその断片を含む段落３８のポリペプチド。
４０．抗原性ポリペプチドまたはその抗原性断片に対して産生される抗体により選択的に結合され、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１〜１１４のいずれか１つのポリペプチドを含む段落３８のポリペプチド。
４１．抗原性ポリペプチドまたはその抗原性断片に対して産生される抗体により選択的に結合され、上記抗原性ポリペプチドは配列番号５、７、８、および１１のいずれか１つのポリペプチドを含む段落３８のポリペプチド。
４２．配列番号１〜１１４のポリペプチドを含む段落３８のポリペプチド。
４３．配列番号５、７、８および１１からなる群から選択されるポリペプチドを含む段落３８のポリペプチド。
４４．段落３８のポリペプチドと選択的に結合する抗体。
４５．上記ポリペプチドとＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドとの結合を抑制し得る段落４４の抗体。
４６．段落４４の抗体であって、上記ポリペプチドにより媒介されるアポトーシスを抑制し得る抗体。
４７．同一性が、スコア＝５０および語長＝３のパラメーターを有するＸＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される段落３８のポリペプチド。
４８．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの生物学的活性を評価する方法であって、
（ａ）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
（ｂ）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの細胞のアポトーシスを誘導する能力を評価することを含む方法。
４９．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの生物学的活性を評価する方法であって、
（ａ）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
（ｂ）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＤＮＡ結合能力を評価することを含む方法。
５０．工程（ａ）は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターを細胞に導入することを含む段落４８または４９の方法。
５１．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、配列番号１および２に示されるＴＨＡＰコンセンサスアミノ酸配列またはその断片を含む段落４９または５０の方法。
５２．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、配列番号１〜１１４からなる配列の群から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含む段落４９の方法。
５３．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、天然のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその断片を含む段落４９の方法。
５４．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその断片を含み、上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその断片は少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換または挿入を含む段落４９の方法。
５５．配列番号１〜１１４のアミノ酸配列を含む単離されたＴＨＡＰファミリーポリペプチドであって、配列番号１〜１１４の上記アミノ酸配列に関して少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換または挿入を含む、単離されたＴＨＡＰファミリーポリペプチド。
５６．配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＨＡＰファミリーポリペプチドであって、配列番号１〜１１４の上記アミノ酸配列に関して少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換または挿入を含み、野生型ポリペプチドと比較して、アポトーシスを誘導する能力またはＤＮＡを結合する能力の低減を示す、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド。
５７．配列番号１〜１１４のアミノ酸配列を含むＴＨＡＰファミリーポリペプチドであって、配列番号１〜１１４の上記アミノ酸配列に関して少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換または挿入を含み、野生型ポリペプチドと比較して、アポトーシスを誘導する能力またはＤＮＡを結合する能力の低減を示す、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド。
５８．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドが生物学的試料内で発現されるか否か決定する方法であって、
（ａ）被験体からの生物学的試料を、
配列番号１６０〜１７５の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
配列番号１〜１１４のポリペプチドと選択的に結合する検出可能なポリペプチド
と接触させる工程、および
（ｂ）上記ポリヌクレオチドと上記試料内のＲＮＡ種との間のハイブリダイゼーションの存在または非存在、あるいは上記試料内のポリペプチドと上記検出可能なポリペプチドの結合の存在または非存在を検出する工程を含み、
上記ハイブリダイゼーション、または上記結合の検出は、上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドが上記試料内で発現されることを示す方法。
５９．上記被験体は細胞増殖性障害に罹患している、罹患している疑いがある、または感受性である段落５８の方法。
６０．上記細胞増殖性障害はアポトーシスの調節に関連した障害である段落５９の方法。
６１．上記ポリヌクレオチドはプライマーであり、上記ハイブリダイゼーションは上記プライマー配列を含む増幅産物の存在を検出することにより検出される段落５８の方法。
６２．上記検出可能ポリペプチドは抗体である段落５８の方法。
６３．生物学的試料中のＴＨＡＰファミリー活性を評価する方法であって、
（ａ）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドに対する結合部位を含む核酸分子を、
（ｉ）被験体からの生物学的試料、または
（ｉｉ）被験体からの生物学的試料から単離されるＴＨＡＰファミリーポリペプチドであって、配列番号１〜１１４のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド
と接触させる工程、および
（ｂ）上記核酸分子およびＴＨＡＰファミリーポリペプチド間の結合を評価する工程を含み、
対照ＴＨＡＰファミリー核酸への結合レベルと比較した場合の結合低減の検出は、上記試料がＴＨＡＰファミリー活性を欠損していることを示す方法。
６４．哺乳類がＴＨＡＰファミリーの発現レベルの増大または低減を示すか否かを決定する方法であって、
（ａ）上記哺乳類からの生物学的試料を供給する工程、および
（ｂ）上記生物学的試料内の配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドの量または配列番号１〜１１４のポリペプチドをコードするＴＨＡＰファミリーＲＮＡ種の量を、対照試料中に検出されるかまたはそれから予測されるレベルと比較する工程を含み、上記対照試料中に検出されるかまたはそれから予測されるレベルと比較した場合の上記生物学的試料中の上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは上記ＴＨＡＰファミリーＲＮＡ種の量の増大は、上記哺乳類においてＴＨＡＰファミリー発現のレベルが増大していることを示し、ならびに上記対照試料中に検出されるかまたはそれから予測される上記レベルと比較した場合の上記生物学的試料内の上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは上記ＴＨＡＰファミリーＲＮＡ種の量の低減は、上記哺乳類においてＴＨＡＰファミリー発現レベルが低減していることを示す方法。
６５．上記哺乳類は細胞増殖性障害に罹患している、罹患している疑いがある、または感受性である段落６４の方法。
６６．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療のための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドあるいは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
６７．アポトーシスの候補インヒビター、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物、または配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片の候補インヒビターを同定する方法であって、
（ａ）上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
（ｂ）上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
６８．アポトーシスの候補インヒビター、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物または配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片の候補インヒビターを同定する方法であって、
（ａ）上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定が、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
６９．工程（ｂ）はアポトーシス活性を評価することを含み、上記化合物がアポトーシスを抑制するという決定は、上記化合物が上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビターであることを示す段落６７または６８の方法。
７０．段落６８の方法であって、段落３２〜４３のいずれか１つに記載の上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を上記細胞中に導入することを含む方法。
７１．固体支持体に結合される段落１７〜２５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７２．段落７１の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのアレイ。
７３．アドレス可能な（addressable）である段落７２のアレイ。
７４．ラベルをさらに含む段落１７〜２５のいずれか１つのポリヌクレオチド。
７５．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補活性化剤を同定する方法であって、
（ａ）配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドあるいは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、上記化合物が上記ペプチドの候補活性化剤であるということを示す方法。
７６．配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片の候補活性化剤を同定する方法であって、
（ａ）上記ポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
（ｂ）上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへ
の結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物が上記ポリペプチドの候補活性化剤であるということを示す方法。
７７．配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片の候補活性化剤を同定する方法であって、
（ａ）上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物が上記ポリペプチドの候補活性化剤であるということを示す方法。
７８．上記決定工程はアポトーシス活性を評価することを含み、上記化合物がアポトーシス活性を増大するという決定は、上記化合物が上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補活性化剤であることを示す段落７６または７７の方法。
７９．工程ａ）は第１７項〜第２５項のいずれか１つに記載の上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を上記細胞中に導入することを含む第７７項の方法。
８０．ＰＡＲ４活性の候補モジュレータを同定する方法であって、
（ａ）ＰＡＲ４ポリペプチドまたはその断片を用意すること、
（ｂ）ＰＭＬ−ＮＢポリペプチドまたはＰＭＬ−ＮＢに関連するポリペプチドまたはそれらの断片を用意すること、および
（ｃ）上記ＰＭＬ−ＮＢポリペプチドまたはＰＭＬ−ＮＢに関連するポリペプチドと結合する上記ＰＡＲ４ポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に調節するか否かを決定することを含み、
上記ＰＭＬ−ＮＢポリペプチドまたはＰＭＬ−ＮＢに関連するポリペプチドと結合する上記ＰＡＲ４ポリペプチドの能力を上記試験化合物が選択的に抑制するという決定は、上記化合物がＰＡＲ４活性の候補モジュレータであることを示す方法。
８１．ＰＡＲ４活性の候補モジュレータを同定する方法であって、
（ａ）ＰＡＲ４ポリペプチドまたはその断片を用意すること、および
（ｂ）ＰＭＬ−ＮＢに局在化する上記ＰＡＲ４ポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に調節するか否かを決定することを含み、
ＰＭＬ−ＮＢに局在化する上記ＰＡＲ４ポリペプチドの能力を上記試験化合物が選択的に抑制するという決定は、上記化合物がＰＡＲ４活性の候補モジュレータであることを示す方法。
８２．ＴＨＡＰファミリー活性の候補インヒビターを同定する方法であって、
（ａ）配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチド、または配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片を供給すること、（ｂ）ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
（ｃ）上記ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドと結合する上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドと結合する上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの能力を上記試験化合物が選択的に抑制するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリー活性の候補インヒビターであることを示す方法。
８３． （ａ）配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片をコードする核酸を含む一次発現ベクター、および
（ｂ）ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む二次発現ベクター
を含む細胞を供給することを含む段落８２の方法。
８４．上記ＴＨＡＰファミリー活性はアポトーシス活性である段落８２の方法。
８５．上記ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質はＰＡＲ−４である段落８２の方法。
８６．上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドはＴＨＡＰ−１、ＴＨＡＰ−２またはＴＨＡＰ−３タンパク質であり、そして上記ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質はＰＡＲ−４である段落８２の方法。
８７．ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することを含む、細胞におけるアポトーシスを調節する方法。
８８．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落８７の方法。
８９．ＰＭＬ核小体へのＰＡＲ−４の動員を調節することを含む、細胞におけるアポトーシスを調節する方法。
９０．ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することはＴＨＡＰファミリータンパク質およびＴＨＡＰファミリー標的タンパク質の相互作用を調節することを含む段落８９の方法。
９１．ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することはＴＨＡＰファミリータンパク質およびＰＡＲ４タンパク質の相互作用を調節することを含む段落８９の方法。
９２．ＴＨＡＰ−１、ＴＨＡＰ−２またはＴＨＡＰ−３タンパク質とＰＡＲ−４タンパク質との間の相互作用を調節することを含む段落９１の方法。
９３．ＰＡＲ−４タンパク質およびＴＨＡＰファミリータンパク質の相互作用を調節することを含む、ＰＭＬ核小体へのＰＡＲ−４の動員を調節する方法。
９４．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落９３の方法。
９５．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することを含む、個体における血管新生を調節する方法。
９６．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落９５の方法。
９７．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を抑制することを含む、個体における細胞死を予防する方法。
９８．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落９７の方法。
９９．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性はＣＮＳにおいて抑制される段落９７の方法。
１００．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を抑制することを含む、個体における血管新生を誘導する方法。
１０１．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１００の方法。
１０２．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性は内皮細胞において抑制される段落１００の方法。
１０３．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を増大させることを含む、個体における血管新生を抑制するためのまたは癌を治療するための方法。
１０４．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１０３の方法。
１０５．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を増大させることを含む、個体における炎症または炎症性障害を治療する方法。
１０６．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１０５の方法。
１０７．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性は内皮細胞において増大される段落１０３または１０５の方法。
１０８．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を増大させることを含む、個体における癌を治療する方法。
１０９．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１０８の方法。
１１０．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を増大させることは、アポトーシスを誘導し、細胞分裂を抑制し、転移能を抑制し、腫瘍負荷量を低減し、化学療法または放射線療法に対する感受性を増大し、癌細胞を殺傷し、癌細胞の増殖を抑制し、内皮細胞を殺傷し、内皮細胞の増殖を抑制し、血管新生を抑制し、あるいは腫瘍退縮を誘導する段落１０８の方法。
１１１．上記細胞において機能するプロモーターに操作可能的に連結された段落３２〜４３のいずれかのＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする組換えベクターと上記被験体を接触させることを含む段落８７〜１１０のいずれかの方法。
１１２．上記プロモーターは内皮細胞において機能する段落１１１の方法。
１１３．段落３２〜４３のＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする組換えウイルスベクターを含むウイルス組成物。
１１４．上記組換えウイルスベクターはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスベクターである段落１１３の組成物。
１１５．ランダム核酸のプールをＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその一部分と接触させること、および上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドと上記プールからの少なくとも１つの核酸を含む複合体を単離することを含む、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドにより認識される核酸配列を取得する方法。
１１６．核酸の上記プールは標識された段落１１５の方法。
１１７．上記複合体はゲルシフト分析を実施することにより単離される段落１１６の方法。
１１８．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドにより認識される核酸配列を同定する方法であって、
（ａ）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを標識化ランダム核酸のプールとともにインキュベートすること、
（ｂ）上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドおよび少なくとも１つの核酸間の複合体を上記プールから単離すること、
（ｃ）増幅反応を実施して、上記複合体中に存在する少なくとも１つの核酸を増幅するすること、
（ｄ）上記少なくとも１つの増幅核酸を上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドとともにインキュベートすること、
（ｅ）上記少なくとも１つの増幅核酸と上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの複合体を単離すること、
（ｆ）工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を複数回反復すること、および
（ｇ）上記複合体中の上記核酸の配列を決定することを含む方法。
１１９．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの核酸への結合能を抑制する化合物を同定する方法であって、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは核酸中の結合部位を認識するその断片を、試験化合物の存在下または非存在下で、上記結合部位を含有する核酸とともにインキュベートすること、および上記試験化合物の存在下で上記核酸と上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドとの結合のレベルが上記試験化合物の非存在下での結合のレベルより低いか否かを決定することを含む方法。
１２０．ＴＨＡＰ媒介性活性を調節する試験化合物を同定する方法であって、
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を試験化合物と接触させること、および
上記試験化合物が上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片の活性を選択的に調節するか否かを決定することを含み、上記試験化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節するという決定は、上記試験化合物がＴＨＡＰ媒介性活性の候補モジュレーターであるということを示す方法。
１２１．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２２．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２３．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２４．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２５．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２６．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２７．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２８．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号８のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１２９．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１３０．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１３１．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１３２．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１３３．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１３４．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１３５．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは配列番号１５〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む段落１２０の方法。
１３６．上記ＴＨＡＰ媒介性活性は、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＳＬＣへの結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される段落１２０の方法。
１３７．上記ＴＨＡＰ媒介性活性はＰＡＲ−４との結合である段落１３６の方法。
１３８．上記ＴＨＡＰ媒介性活性はＳＬＣとの結合である段落１３６の方法。
１３９．上記ＴＨＡＰ媒介性活性はアポトーシスの誘導である段落１３６の方法。
１４０．上記核酸は配列番号１４０〜１５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む段落１３６の方法。
１４１．上記アミノ酸同一性は、スコア＝５０および語長＝３のパラメーターを有するＸＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される段落１２０の方法。
１４２．本質的に配列番号１および２、配列番号３〜５のアミノ酸１〜８９、配列番号６〜９のアミノ酸１〜９０、配列番号１０のアミノ酸１〜９２、配列番号１１〜１４のアミノ酸１〜９０ならびに任意の上記配列と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、核酸と結合する、単離または精製されたＴＨＡＰドメインポリペプチド。
１４３．本質的に配列番号１からなる段落１４２の単離または精製されたＴＨＡＰドメインポリペプチド。
１４４．上記アミノ酸同一性は、スコア＝５０および語長＝３のパラメーターを有するＸＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される段落１４２の単離または精製されたＴＨＡＰドメインポリペプチド。
１４５．上記核酸は配列番号１４０〜１５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む段落１４２の単離または精製されたＴＨＡＰドメインポリペプチド。
１４６．段落１４２のＴＨＡＰドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
１４７．本質的に配列番号３のアミノ酸１４３〜１９２、配列番号４のアミノ酸１３２〜１８１、配列番号５のアミノ酸１８６〜２３４、配列番号１５ならびに任意の上記配列と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、ＰＡＲ４と結合する、単離または精製されたＰＡＲ−４結合ドメインポリペプチド。
１４８．本質的に配列番号１５からなる段落１４７の単離または精製されたＰＡＲ−４結合ドメイン。
１４９．本質的に配列番号３のアミノ酸１４３〜１９３からなる段落１４７の単離または精製されたＰＡＲ−４結合ドメイン。
１５０．本質的に配列番号４のアミノ酸１３２〜１８１からなる段落１４７の単離または精製されたＰＡＲ−４結合ドメイン。
１５１．本質的に配列番号５のアミノ酸１８６〜２３４からなる段落１４７の単離または精製されたＰＡＲ−４結合ドメイン。
１５２．上記アミノ酸同一性は、スコア＝５０および語長＝３のパラメーターを有するＸＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される段落１４７の単離または精製されたＰＡＲ−４結合ドメインポリペプチド。
１５３．段落１４７のＰＡＲ−４結合ドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
１５４．本質的に配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３ならびに少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択され、ＳＬＣと結合する、単離または精製されたＳＬＣ結合ドメインポリペプチド。
１５５．上記アミノ酸同一性は、スコア＝５０および語長＝３のパラメーターを有するＸＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される段落１５４の単離または精製されたＳＬＣ結合ドメインポリペプチド。
１５６．第１５４項のＳＬＣ結合ドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
１５７．配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログに融合された免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質。
１５８．複数のＴＨＡＰポリペプチドを含むオリゴマーＴＨＡＰタンパク質であって、各ＴＨＡＰポリペプチドが配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３ならびに少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
１５９．有効量のＴＨＡＰ１ポリペプチドまたはそのＳＬＣ結合断片を薬学的に許容可能な担体とともに含む薬剤。
１６０．本質的に配列番号３のアミノ酸１４３および１９２ならびに少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドと結合する、単離または精製されたＴＨＡＰ二量体化
ドメインポリペプチド。
１６１．上記アミノ酸同一性は、スコア＝５０および語長＝３のパラメーターを有するＸＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴからなる群から選択されるアルゴリズムを用いて決定される段落１６０の単離または精製されたＴＨＡＰ二量体化ドメインポリペプチド。
１６２．段落１６０のＴＨＡＰ二量化ドメインポリペプチドをコードする単離または精製された核酸またはその相補体。
１６３．配列番号１６０〜１７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列ならびに少なくとも１８連続ヌクレオチドを含むその一部分を有する核酸と操作可能的に連結されるプロモーターを含む発現ベクター。
１６４．上記プロモーターは天然ゲノム中で配列番号１６０〜１７５からなる群から選択される上記核酸と操作可能的に連結されないプロモーターである段落１６３の発現ベクター。
１６５．段落１６３の発現ベクターを含む宿主細胞。
１６６．配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドならびに少なくとも１８連続ヌクレオチドを含むその一部分をコードする核酸と操作可能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
１６７．上記プロモーターは天然ゲノム中の配列番号１６０〜１７５からなる群から選択される上記核酸と操作可能的に連結されないプロモーターである段落１６６の発現ベクター。
１６８．段落１６６の発現ベクターを含む宿主細胞。
１６９．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療のための候補化合物を同定する方法であって、
配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＨＡＰファミリーポリペプチドあるいは配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸のスパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
１７０．アポトーシスの候補インヒビター、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物または配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補インヒビターを同定する方法であって、
上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＳＬＣへの結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
１７１．アポトーシスの候補インヒビター、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物または配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補インヒビターを同定する方法であって、
上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを含む細胞を試験化合物と接触させること、および上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＳＬＣへの結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドへの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に抑制するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補インヒビター、アポトーシスの候補インヒビターまたは細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
１７２．ＴＨＡＰファミリー活性の候補モジュレーターを同定する方法であって、
配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸のスパンを含む断片を供給すること、
ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドまたはその断片を供給すること、および
上記ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドと結合する上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの能力を試験化合物が選択的に調節するか否かを決定することを含み、
上記試験化合物が上記ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドと結合する上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの能力を選択的に調節するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリー活性の候補モジュレーターであるということを示す方法。
１７３．上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、配列番号１〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜１１４のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸の連続スパンを含む断片をコードする核酸を含む一次発現ベクターにより用意され、そして上記ＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドはＴＨＡＰファミリー標的ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む二次発現ベクターにより供給される段落１７２の方法。
１７４．上記ＴＨＡＰファミリー活性はアポトーシス活性である段落１７２の方法。
１７５．上記ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質はＰＡＲ−４である段落１７２の方法。
１７６．上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドはＴＨＡＰ−１、ＴＨＡＰ−２またはＴＨＡＰ−３タンパク質であり、上記ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質はＰＡＲ−４である段落１７２の方法。
１７７．上記ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質はＳＬＣである段落１７２の方法。
１７８．ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することを含む、細胞におけるアポトーシスを調節する方法。
１７９．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１７８の方法。
１８０．ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性の調節はＴＨＡＰファミリータンパク質とＴＨＡＰファミリー標的タンパク質の相互作用の調節を含む段落１７８の方法。
１８１．ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性の調節はＴＨＡＰファミリータンパク質とＰＡＲ４タンパク質の相互作用の調節を含む段落１７８の方法。
１８２．ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療のための候補化合物を同定する方法であって、
配列番号１〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＨＡＰファミリーポリペプチドあるいは配列番号１〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸のスパンを含む断片を試験化合物と接触させること、および
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドと選択的に結合するという決定が、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
１８３．アポトーシスの候補活性化剤、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物または配列番号１〜９８のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜９８のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補活性化剤を同定する方法であって、
上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＳＬＣへの結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドとの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
１８４．アポトーシスの候補活性化剤、細胞増殖性障害の治療のための候補化合物または配列番号１〜９８のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは配列番号１〜９８のポリペプチドの少なくとも６連続アミノ酸のスパンを含む断片の候補活性化剤を同定する方法であって、
上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを試験化合物を含む細胞と接触させること、および上記化合物が、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との相互作用、核酸配列への結合、ＰＡＲ−４への結合、ＳＬＣへの結合、ＰＭＬへの結合、ＰＭＬ−ＮＢ中に見出されるポリペプチドとの結合、ＰＭＬ−ＮＢへの局在化、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質のＰＭＬ−ＮＢへのターゲッティングおよびアポトーシスの誘導からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するか否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの上記少なくとも１つの生物学的活性を選択的に活性化するという決定は、上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの候補活性化剤、アポトーシスの候補活性化剤または細胞増殖性障害の治療の候補化合物であるということを示す方法。
１８５．ＴＨＡＰファミリータンパク質のＳＬＣ結合ドメインを含むポリペプチドを個体に投与することを含む、個体におけるＳＬＣの活性に関連した症状を改善する方法。
１８６．上記ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３および少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと融合された免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質を含む段落１８５の方法。
１８７．上記ポリペプチドは複数のＴＨＡＰポリペプチドを含むオリゴマーＴＨＡＰタンパク質を含み、各ＴＨＡＰポリペプチドが配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３および少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む段落１８５の方法。
１８８．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することを含む、個体における血管新生を調節する方法。
１８９．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１８８の方法。
１９０．上記調節は抑制である段落１８８の方法。
１９１．上記調節は誘導である段落１８８の方法。
１９２．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を抑制することを含む、個体における細胞死を低減させる方法。
１９３．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１９２の方法。
１９４．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性はＣＮＳにおいて抑制される段落１９２の方法。
１９５．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することを含む、個体における炎症または炎症性障害を低減させる方法。
１９６．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１９５の方法。
１９７．個体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調節することを含む、個体における癌の程度を低減する方法。
１９８．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質は配列番号１〜１１４からなる群から選択される段落１９７の方法。
１９９．上記ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性増大は、アポトーシスを誘導し、細胞分裂を抑制し、代謝潜在能力を抑制し、腫瘍負荷量を低減し、化学療法もしくは放射線療法に対する感受性を増大し、癌細胞を殺害し、癌細胞の増殖を抑制し、内皮細胞を殺害し、内皮細胞の増殖を抑制し、血管新生を抑制し、または腫瘍退縮を誘導する第１９７項の方法。
Ａは、ヒトＴＨＡＰ１（ｈＴＨＡＰ１）（配列番号３）およびマウスＴＨＡＰ１（ｍＴＨＡＰ１）（配列番号９９）オルソロガスポリペプチドのアミノ酸配列アラインメントを示す。同一アミノ酸残基を星印で示す。Ｂは、ヒトＴＨＡＰ１ポリペプチドの一次構造を示す。ＴＨＡＰドメイン、富プロリン領域（ＰＲＯ）および二極性核局在化配列（ＮＬＳ）の位置を示す。 １２のヒト組織におけるＴＨＡＰ１ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析の結果を示す。各レーンは、指示されたヒト組織から単離した２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含有する。ブロットを、高ストリンジェントな条件下で、３２Ｐ標識ＴＨＡＰ１ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて、−７０℃で７２時間曝露した。 Ａは、酵母２ハイブリッド系におけるＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４間の相互作用を示す。特にＴＨＡＰ１は野生型ＰＡＲ４（Ｐａｒ４）およびロイシンジッパー含有Ｐａｒ４死ドメイン（Ｐａｒ４ＤＤ）（ＰＡＲ４のアミノ酸２５０〜３４２）と結合するが、しかし死ドメインを欠くＰａｒ４欠失変異体（ＰＡＲ４Δ）（ＰＡＲ４のアミノ酸１〜２７６）とは結合しない。Ａ（＋）は結合していることを示し、一方（−）は結合の欠如を示す。 Ｂは、ＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤポリペプチド融合物とのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳化３５Ｓ−メチオニン標識ＴＨＡＰ１の結合を示す。Ｐａｒ４ＤＤをＧＳＴ融合タンパク質として発現し、次にグルタチオンセファロースのアフィニティーマトリックス上で精製した。ＧＳＴは陰性対照として供した。インプットは、結合アッセイに用いた物質の１／１０を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方におけるＰＡＲ４といくつかのＴＨＡＰ１欠失変異体との間の相互作用を示す。各ＴＨＡＰ１欠失変異体を、酵母２ハイブリッド系（２ハイブリッドベイト）においてはＰＡＲまたはＰＡＲ４ＤＤとの、ＧＳＴプルダウンアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏ）においてはＰＡＲ４ＤＤとの、ならびに一次ヒト内皮細胞（ｉｎ ｖｉｖｏ）においてはｍｙｃ−ＰＡＲ４ＤＤとの結合に関して試験した。Ａ（＋）は結合していることを示し、一方（−）は結合の欠如を示す。 ＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤポリペプチド融合物とのいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳化３５Ｓ−メチオニン標識ＴＨＡＰ１欠失変異体の結合を示す。Ｐａｒ４ＤＤをＧＳＴ融合タンパク質として発現し、次にグルタチオンセファロースのアフィニティーマトリックス上で精製した。ＧＳＴは陰性対照として供した。インプットは、結合アッセイに用いた物質の１／１０を表す。 Ａは、ヒトＴＨＡＰ１（配列番号１１７）およびマウスＴＨＡＰ１（配列番号１１６）オルソロガスポリペプチドのＰａｒ４結合ドメインのアミノ酸配列アラインメントを、別のＰａｒ４結合相手であるマウスＺＩＰキナーゼ（配列番号１１５）とともに示す。このアラインメントに由来する富アルギニンコンセンサスＰａｒ４結合部位（配列番号１５）も示す。Ｂは、ＴＨＡＰ１野生型ポリペプチド、ならびに２つのＴＨＡＰ１変異体（ＴＨＡＰ１Δ（ＱＲＣＲＲ）およびＴＨＡＰ１ＲＲ／ＡＡ）の一次構造を示す。ＴＨＡＰ１Δ（ＱＲＣＲＲ）はＴＨＡＰ１（配列番号３）の位置１６８〜１７２にアミノ酸の欠失を有する欠失変異体であり、一方、ＴＨＡＰＲＲ／ＡＡはアラニンに置換されたＴＨＡＰ１（配列番号３）に対するアミノ酸位置１７１および１７２に配置された２つのアルギニンを有する変異体である。Ｐａｒ４およびＰａｒ４ＤＤベイト（２ハイブリッドベイト）を用いた酵母２ハイブリッド系で、ＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤを用いたＧＳＴプルダウンアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で、ならびにｍｙｃ−Ｐａｒ４ＤＤを用いたｉｎ ｖｉｖｏ相互作用試験で、一次ヒト内皮細胞（ｉｎ ｖｉｖｏ）で得られた結果を要約する。 Ａは、ＧＦＰ−ＡＰＳＫ１、ＧＦＰ−Ｐａｒ４またはＧＥＰ−ＴＨＡＰ１発現ベクターでトランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスレベルを比較するグラフである。血清撤退の２４時間後に、アポトーシス核をＤＡＰＩ染色することにより、アポトーシスを定量化した。値は、３つの個々の実験の平均である。Ｂは、ＧＦＰ−ＡＰＳＫ１またはＧＥＰ−ＴＨＡＰ１発現ベクターでトランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスレベルを比較するグラフである。ＴＮＦαの付加の２４時間後に、アポトーシス核をＤＡＰＩ染色することにより、アポトーシスを定量化した。値は、３つの個々の実験の平均である。 Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳化３５Ｓメチオニン標識ＴＨＡＰ１（ｗｔ）またはＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ（Δ）のＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤポリペプチド融合物との結合を示す。Ｐａｒ４ＤＤをＧＳＴ融合タンパク質として発現し、次にグルタチオンセファロースのアフィニティーマトリックス上で精製した。ＧＳＴは陰性対照として供した。インプットは、結合アッセイに用いた物質の１／１０を表す。Ｂは、ＴＨＡＰ１のプロアポトーシス活性を欠失されたそのＴＨＡＰドメイン（配列番号３のアミノ酸１〜９０）を示すＴＨＡＰ１変異体と比較するグラフである。ＤＡＰＩ染色後のアポトーシス核を計数することにより、ＧＦＰ−ＡＰＳＫ１（対照）、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１（ＴＨＡＰ１）またはＧＦＰ−ＴＨＡＰΔＴＨＡＰ（ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ）を過剰発現するマウス３Ｔ３繊維芽細胞中のアポトーシス細胞のパーセンテージを決定した。値は３つの別々の実験の平均である。 １２のヒトＴＨＡＰタンパク質の一次構造を示す。ＴＨＡＰドメイン（灰色部分）を１２のヒトＴＨＡＰタンパク質の各々のアミノ末端に配置する。ＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３における中黒部分は、３つのタンパク質中に保存される塩基性残基に富んだ核局在化配列を示す。各ＴＨＡＰタンパク質中のアミノ酸の数を示す。（＊）は全長でないタンパク質を示す。 Ａは、ヒトのＴＨＡＰ１のＴＨＡＰドメイン（ｈＴＨＡＰ１、配列番号１２３）のアミノ酸配列アラインメントを黄色ショウジョウバエＰ因子トランスポザーゼのＤＮＡ結合ドメイン（ｄｍトランスポザーゼ、配列番号１２４）とともに示す。同一残基を黒色枠内に、保存残基を灰色枠内に示す。ＴＨＡＰドメインコンセンサス配列（配列番号１２５）も示す。Ｂは、ヒトＴＨＡＰファミリーの１２の成員のＴＨＡＰドメインのアミノ酸配列アラインメント（ｈＴＨＡＰ１、配列番号後１２６；ｈＴＨＡＰ２、配列番号後１３１；ｈＴＨＡＰ３、配列番号後１２７；ｈＴＨＡＰ４、配列番号後１３０；ｈＴＨＡＰ５、配列番号後１２８；ｈＴＨＡＰ６、配列番号後１３５；ｈＴＨＡＰ７、配列番号後１３３；ｈＴＨＡＰ８、配列番号後１２９；ｈＴＨＡＰ９、配列番号後１３４；ｈＴＨＡＰ１０、配列番号後１３７；ｈＴＨＡＰ１１、配列番号後１３６；ｈＴＨＡＰ０、配列番号後１３２）を、黄色ショウジョウバエＰ因子トランスポザーゼのＤＮＡ結合ドメイン（ｄｍトランスポザーゼ、配列番号１３８）を示す。１３の配列のうちの少なくとも７つの間で保存された残基を枠で囲む。中黒枠は同一残基を示し、一方、灰色枠は類似のアミノ酸を示す。破線は、配列を一列に並べるために導入されたギャップを表す。ＴＨＡＰドメインコンセンサス配列（配列番号１３９）も示す。 Ｃは、９５の別個のＴＨＡＰドメイン配列のアミノ酸配列アラインメント、例えばｈＴＨＡＰ１〜ｈＴＨＡＰ１１およびｈＴＨＡＰ０（配列番号３〜１４、上から開始して順次列挙）を、ヒトＴＨＡＰ配列でGenBankゲノムおよびＥＳＴデータベースを検索することにより同定した他の種からの８３ＴＨＡＰドメイン（配列番号１〜９８；ｓＴＨＡＰ１を意味する配列で開始して、ｃｅＮＰ＿４９８７４７．１を意味する配列で終わるよう順次列挙）とともに示す。配列の少なくとも５０％の間に保存された残基を枠で囲む。中黒枠は同一残基を示し、一方灰色枠は類似アミノ酸を示す。破線は、配列を一列に並べるために導入されたギャップを表す。種を以下に示す：ヒト（ｈ）；イノシシ（ｓ）；ウシ（ｂ）；ハツカネズミ（ｍ）；ドブネズミ（ｒ）；ウコッケイ（ｇ）；アフリカツメガエル（ｘ）；ゼブラフィッシュ（ｚ）；メダカ（ｏ）；黄色ショウジョウバエ（ｄｍ）；ガンビエハマダラカ（ａ）；カイコ（ｂｍ）；線虫（ｃｅ）。コンセンサス配列（配列番号２）も示す。コンセンサス配列中の下線を付したアミノ酸は、すべての９５ＴＨＡＰ配列中に保存されている残基である。 Ｃは、９５の別個のＴＨＡＰドメイン配列のアミノ酸配列アラインメント、例えばｈＴＨＡＰ１〜ｈＴＨＡＰ１１およびｈＴＨＡＰ０（配列番号３〜１４、上から開始して順次列挙）を、ヒトＴＨＡＰ配列でGenBankゲノムおよびＥＳＴデータベースを検索することにより同定した他の種からの８３ＴＨＡＰドメイン（配列番号１〜９８；ｓＴＨＡＰ１を意味する配列で開始して、ｃｅＮＰ＿４９８７４７．１を意味する配列で終わるよう順次列挙）とともに示す。配列の少なくとも５０％の間に保存された残基を枠で囲む。中黒枠は同一残基を示し、一方灰色枠は類似アミノ酸を示す。破線は、配列を一列に並べるために導入されたギャップを表す。種を以下に示す：ヒト（ｈ）；イノシシ（ｓ）；ウシ（ｂ）；ハツカネズミ（ｍ）；ドブネズミ（ｒ）；ウコッケイ（ｇ）；アフリカツメガエル（ｘ）；ゼブラフィッシュ（ｚ）；メダカ（ｏ）；黄色ショウジョウバエ（ｄｍ）；ガンビエハマダラカ（ａ）；カイコ（ｂｍ）；線虫（ｃｅ）。コンセンサス配列（配列番号２）も示す。コンセンサス配列中の下線を付したアミノ酸は、すべての９５ＴＨＡＰ配列中に保存されている残基である。 Ａは、ヒトＴＨＡＰ１（配列番号３）、ＴＨＡＰ２（配列番号４）およびＴＨＡＰ３（配列番号５）タンパク質配列のアミノ酸配列アラインメントを示す。３つの配列のうちの少なくとも２つの間で保存された残基を四角で囲む。中黒枠は同一残基を示し、一方灰色枠は類似アミノ酸を示す。破線は、配列を一列に並べるために導入されたギャップを表す。ＴＨＡＰドメイン、ＰＡＲ４結合ドメインに従う領域および核局在化シグナル（ＮＬＳ）も示す。Ｂは、ヒトＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３の一次構造、ならびに酵母２ハイブリッド系における各ＴＨＡＰタンパク質とＰａｒ４またはＰａｒ４死ドメイン（Ｐａｒ４ＤＤ）との間の２ハイブリッド相互作用の結果を示す。Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳化３５Ｓメチオニン標識ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３のＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤポリペプチド融合物との結合を示す。Ｐａｒ４ＤＤをＧＳＴ融合タンパク質として発現し、次にグルタチオンセファロースのアフィニティーマトリックス上で精製した。ＧＳＴは陰性対照として供した。インプットは、結合アッセイに用いた物質の１／１０を表す。 Ａは、ＧＦＰ−ＡＰＳＫ１、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ２またはＧＥＰ−ＴＨＡＰ３発現ベクターでトランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスレベルを比較するグラフである。血清撤退の２４時間後に、アポトーシス核をＤＡＰＩ染色することにより、アポトーシスを定量化した。値は、２つの個々の代表的実験の平均である。Ｂは、ＧＦＰ−ＡＰＳＫ１、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ２またはＧＥＰ−ＴＨＡＰ３発現ベクターでトランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスレベルを比較するグラフである。ＴＮＦαの付加の２４時間後に、アポトーシス核をＤＡＰＩ染色することにより、アポトーシスを定量化した。値は、２つの個々の代表的実験の平均である。 ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ベイトを用いて酵母２ハイブリッド系におけるいくつかの異なるＴＨＡＰ１変異体をスクリーニングすることにより得られた結果を示す。試験した各ＴＨＡＰ１欠失変異体の一次構造を示す。ＴＨＡＰ１の７０個のカルボキシ末端残基（アミノ酸１４３〜２１３）は、ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１との結合のために十分である。 ＴＨＡＰ１と野生型ＳＬＣ／ＣＣＬ２１および塩基性カルボキシ末端延長を欠失したＳＬＣ／ＣＣＬ２１変異体（ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ΔＣＯＯＨ）との相互作用を示す。酵母２ハイブリッド系ではＴＨＡＰ１ベイトで、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＧＳＴ−ＴＨＡＰ１によるＧＳＴ−プルダウンアッセイを用いて、相互作用を分析した。 ＧＦＰ−ＴＨＡＰ０、１、２、３、６、７、８、１０、１１（グリーン蛍光）発現構築物でトランスフェクトした一次ヒト内皮細胞の顕微鏡写真を示す。ヒトＴＨＡＰタンパク質の核局在化を明示するために、ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。バーは５μｍである。 Ａは、ヒトＴＨＡＰ１のＴＨＡＰドメイン（ＴＨＡＰ１）（配列番号３のアミノ酸１〜８１）と甲状腺受容体βＤＮＡ結合ドメイン（ＮＬＬＢ）（配列番号１２１）との間のスレッディング由来構造的アラインメントである。カラーコードは図１５Ｄに記載したものと同一である。Ｂは、甲状腺受容体βの結晶構造とのその相同性を基礎にしたヒトＴＨＡＰ１のＴＨＡＰドメインの三次元構造のモデルを示す。カラーコードは図１５Ｄに記載したものと同一である。Ｃは、糖質コルチコイド受容体のＤＮＡ結合ドメイン結晶構造とのその相同性を基礎にしたショウジョウバエトランスポザーゼ（ＤｍＴＲＰ）のＤＮＡ結合ドメインの三次元構造のモデルを示す。カラーコードは図１５Ｄに記載したものと同一である。Ｄは、キイロショウジョウバエトランスポザーゼＤＮＡ結合ドメイン（ＤｍＴＲＰ）（配列番号１２０）と糖質コルチコイド受容体ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＬＵＡ）（配列番号１２２）との間のスレッディング由来構造的アラインメントである。図１５Ａ〜１５Ｃにおける配列および構造に従って、カラーコードは以下のとおりである：褐色はα螺旋中の残基を示す；藍色はβ鎖中の残基を示す；赤色はＮＬＬＢおよびＧＬＵＡ中の８つの保存Ｃｙｓ残基を、あるいはＴＨＡＰ１およびＤｍＴＲＰと共通のＣｙｓ残基を意味する；深紅色は、ＴＨＡＰ１またはＤｍＴＲＰ中のその他のＣｙｓを示す；シアン青色は、ＴＨＡＰ１またはＤｍＴＲＰにおいて着色された疎水性相互作用網目構造に関与する残基を意味する。 Ａは、ＴＨＡＰ１ベイトを用いて酵母２ハイブリッド系におけるいくつかの異なるＴＨＡＰ１変異体をスクリーニングすることにより得られた結果を示す。試験した各ＴＨＡＰ１欠失変異体の一次構造を示す。Ａ（＋）は結合していることを示し、一方（−）は結合していないことを示す。Ｂは、ＧＳＴ−ＴＨＡＰ１ポリペプチド融合物とのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳化３５Ｓ−メチオニン標識ＴＨＡＰ１欠失変異体の結合を示す。野生型ＴＨＡＰ１をＧＳＴ融合タンパク質として発現し、次にグルタチオンセファロースのアフィニティーマトリックス上で精製した。ＧＳＴは陰性対照として供した。インプットは、結合アッセイに用いた物質の１／１０を表す。 Ａは、ＲＴ−ＰＣＲにより得られた２つの別個のＴＨＡＰ１ｃＤＮＡ断片を示すアガロースゲルである。２つの別個のＴＨＡＰ１ｃＤＮＡは、〜４００および６００ヌクレオチド長であった。Ｂは、４００ヌクレオチド断片が、エキソン２（配列番号１６０のヌクレオチド２７３〜４６８）を欠くヒトＴＨＡＰ１ｃＤＮＡの代替的スプライス化アイソフォームに対応することを示す。Ｃは、ヒトＴＨＡＰ１の二次アイソフォーム（ＴＨＡＰ１ｂ）が、アミノ末端ＴＨＡＰドメインを欠く切頭化ＴＨＡＰ１タンパク質（ＴＨＡＰ１ Ｃ３）をコードすることを示すウエスタンブロットである。 Ａは、ヒトＴＨＡＰ１のＴＨＡＰドメインにより認識される特異的ＤＮＡ結合部位を示す。ＴＨＡＰドメインは、５ヌクレオチド間隔を有する定方向反復（ＤＲ−５）として選択的に組織されるＧＧＧＣＡＡまたはＴＧＧＣＡＡＤＮＡ標的配列を認識する。コンセンサス配列５’−ＧＧＧＣＡＡｎｎｎｎｎＴＧＧＣＡＡ−３’（配列番号１４９）。ＴＨＡＰ１により結合された９核酸（配列番号１４０〜１４８、上から開始して順次）の検査により、ＤＲ−５コンセンサスを生成した。Ｂは、ヒトＴＨＡＰ１のＴＨＡＰドメインにより認識される二次特異的ＤＮＡ結合部位を示す。ＴＨＡＰドメインは、コンセンサス配列５’−ＴＴＧＣＣＡｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎＧＧＧＣＡＡ−３’（配列番号１５９）を有する１１ヌクレオチド間隔を有する反転反復（ＥＲ−１１）を認識する。ＴＨＡＰ１により結合された９核酸（配列番号１５０〜１５８、上から開始して順次）の検査により、ＥＲ−１１コンセンサスを生成した。
［発明の詳細な説明］
ＴＨＡＰおよびＰＡＲ４生物学的経路
上記のように、アポトーシスに関与する新規のクラスのタンパク質を本発明者等は発見した。次に本発明者等はまた、この新規のクラスの一成員を別の（ＰＡＲ４）アポトーシス経路に結びつけ、さらにＰＭＬ−ＮＢに対するこれらの経路の両方に結びつけた。さらに本発明者等はまた、これらの経路両方を内皮細胞と関連させて、一連の新規のならびに潜在的選択性療法的処置を提供した。特に、ＴＨＡＰ１（タナトス（死）関連タンパク質）はＰＭＬ−ＮＢに局在する、ということが発見された。さらに、ＴＨＡＰ１ベイトを用いたＨＥＶＥＣｃＤＮＡライブラリーの２ハイブリッドスクリーニングは、独特の相互作用相手であるプロアポトーシスタンパク質ＰＡＲ４の同定をもたらす。ＰＡＲ４はＰＭＬ−ＮＢ中に蓄積することも見出される。ＰＭＬ−ＮＢに対するＴＨＡＰ−１／ＰＡＲ４複合体のターゲッティングは、ＰＭＬにより媒介される。ＰＡＲ４と同様に、ＴＨＡＰ１はプロアポトーシス活性を有する。この活性は、ＴＨＡＰドメインとよばれるアミノ末端部分における新規のモチーフを含む。合わせて考えると、これらの結果は、ＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４プロアポトーシス複合体を包含するアポトーシスに関する新規のＰＭＬ−ＮＢ経路を限定する。
ＴＨＡＰファミリー成員およびそれらの使用
本発明は、プロアポトーシスポリペプチドＴＨＡＰ−０〜ＴＨＡＰ１１の一ファミリーをコードするポリヌクレオチド、ならびにアポトーシス関連およびその他のＴＨＡＰ媒介性活性の調整のためのそれらの使用を含む。プロアポトーシスタンパク質ＰＡＲ４と複合体を形成し、ＰＭＬ核小体として既知の離散性核内ドメインに局在するＴＨＡＰ１が含まれる。さらに、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１（ＳＬＣ）の生物学的利用能を変えるかまたは他の方法で調整するために用いられ得る。
本発明は、ＴＨＡＰ１のアミノ末端部分における８９アミノ酸ドメイン中に見出される、そしてＴＨＡＰ１プロアポトーシス活性に関与する新規のタンパク質モチーフであるＴＨＡＰドメインも包含する。ＴＨＡＰドメインは、全てそれらのアミノ末端部分にＴＨＡＰドメインを含有するヒトゲノムにおける少なくとも１２の別個の成員（ＴＨＡＰ０〜ＴＨＡＰ１１）を有するタンパク質の新規のファミリーであるＴＨＡＰファミリーを限定する。したがって本発明は、ＴＨＡＰファミリーの成員をコードする核酸分子、例えばゲノム、特に完全ｃＤＮＡ配列に、ならびに対応する翻訳産物、ＴＨＡＰドメインをコードする核酸、そのホモログ、配列番号１６０〜１７５からなる群から選択される配列の少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０または２００連続アミノ酸（上記スパンが特定の配列番号と一致する範囲まで）をコードする核酸に関する。
ＴＨＡＰ１は、血液からの高レベルのリンパ球血管外遊出を支持する慢性炎症性疾患中のリンパ系組織および非リンパ系組織中に見出される特殊化後毛細管細静脈であるＨＥＶにおけるその発現に基づいて同定された。ＨＥＶＥＣは２〜３時間より長い時間、それらのネイティブ環境の外でそれらの表現型を保持できないため、ＨＥＶＥＣからのＴＨＡＰ１ｃＤＮＡのクローニングにおける重要な要素は、ＨＥＶＥＣ ＲＮＡを得るためのプロトコールの開発であった。ヒト扁桃から新たに精製されたＨＥＶＥＣから全ＲＮＡが得られるプロトコールが開発された。高度精製ＨＥＶＥＣを、機械的および酵素的手法、免疫磁気枯渇および陽性選択の組合せにより得た。扁桃をスチール製スクリーン上で鋏で細かく切り刻み、コラゲナーゼ／ジスパーゼ酵素ミックスで消化し、次に免疫磁気枯渇を用いて望ましくない夾雑細胞を枯渇させた。次に、ＨＥＶ特異的抗体ＭＥＣＡ−７９と接合させた磁気ビーズを用いた免疫磁気陽性選択により、ＨＥＶＥＣを選択した。９８％ＭＥＣＡ−７９−陽性であるこれらのＨＥＶＥＣから、１μｇの総ＲＮＡを用いて、ＴＨＡＰ１ｃＤＮＡクローニングおよびＲＴ−ＰＣＲ分析のための全長ｃＤＮＡを生成した。
本明細書中で用いる場合、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むよう意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、しかし好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本明細書全体を通して、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を区別せずに呼ぶために用いられ得る。より正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は、核酸物質それ自体を包含し、したがって特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的に特性化する配列情報（即ち４つの塩基文字間で選択される文字の連続）に限定されない。さらにまた、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書中では互換的に用いられる。
「単離」核酸分子とは、核酸の天然供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されるものである。好ましくは「単離」核酸は、核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおいて核酸と天然に側面を接する配列（即ち核酸の５’および３’末端に位置する配列）を有さない。例えば種々の実施形態では、単離ＴＨＡＰファミリー核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子と天然に側面を接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに「単離」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、他の細胞物質を、または組換え技術により生成される場合には培地を実質的に含有せず、あるいは化学的に合成される場合には、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含有しない。本発明の核酸分子、例えば配列番号１６０〜１７５のヌクレオチド配列またはその一部分を有する核酸分子は、標準分子生物学的技法および本明細書中で提供された配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１６０〜１７５の核酸配列の全部または一部を用いて、ＴＨＡＰファミリー核酸分子が標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技法（例えばSambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, ALaboratory Manual. 2nd, ed., ColdSpring HarborLaboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989に記載されているような）を用いて単離され得る。
さらに、例えば配列番号１６０〜１７５の全部または一部を包含する核酸分子は、配列番号１６０〜１７５の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離され得る。
本発明の核酸は、標準ＰＣＲ増幅技法による鋳型および適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは代替的にゲノムＤＮＡを用いて増幅され得る。そのように増幅された核酸は、適切なベクター中でクローン化され、ＤＮＡ配列分析により特性化され得る。さらに、ＴＨＡＰファミリーヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いて、標準合成技法により調製され得る。
本明細書中で用いる場合、「〜とハイブリダイズする」という用語は、好ましくはハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が互いに少なくとも６０％相同であるヌクレオチド配列を互いとハイブリダイズさせたままにする中等度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションに関する条件を説明するよう意図される。好ましくは条件は、互いに少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％相同である配列が典型的には互いとハイブリダイズしたままであるようなものである。ストリンジェントな条件は当業者に既知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例を以下に挙げるが、これらに限定されない：ハイブリダイゼーション工程は、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡの存在下で６５℃で実現される。ハイブリダイゼーション工程は、その後４つの洗浄工程が続く：
−好ましくは２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩衝液中で６５℃で、５分間２回洗浄、
−好ましくは２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩衝液中で６５℃で、３０分間１回洗浄、−好ましくは０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩衝液中で６５℃で、１０分間１回洗浄。
これらのハイブリダイゼーション条件は、約２０ヌクレオチド長の核酸分子に適している。上記のハイブリダイゼーション条件は、当業者に既知の技法に従って、所望の核酸の長さにより適合されるべきものであり、例えばHames B.D. and Higgins S.J. (1985) Nucleic Acid Hybridization: APractical Approach. Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford;およびCurrentProtocols in Molecular Biolog（上記）に開示された教示に従って適合される、と理解される。好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号１６０〜１７５の配列とハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然核酸分子に対応する。本明細書中で用いる場合、「天然」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば天然タンパク質をコードする）を指す。
２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸の相同性％を決定するために、配列は、最適比較目的のために一列に並べられる（例えば、二次アミノ酸または核酸配列との最適アラインメントのためにギャップが一次アミノ酸の配列中または核酸配列中に導入され、非相同配列は比較目的のために無視され得る）。好ましい実施形態では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％である（例えば２１３個のアミノ酸残基を有する配列番号３のＴＨＡＰ−１アミノ酸配列に対して二次配列を整列させる場合、少なくとも５０、好ましくは少なくとも１００、さらに好ましくは少なくとも２００のアミノ酸残基が整列され、あるいは２１７３ヌクレオチドまたはＴＨＡＰ１タンパク質のアミノ酸をコードするヌクレオチド２０２〜８３５を有する配列番号１６０のＴＨＡＰ−１ｃＤＮＡ配列に対して二次配列を整列させる場合、好ましくは少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、さらに好ましくは少なくとも３００、さらにより好ましくは少なくとも４００、さらにより好ましくは少なくとも５００、６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２００、少なくとも１４００、少なくとも１６００、少なくとも１８００または少なくとも２０００ヌクレオチドが整列される）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次に比較される。一次配列中の位置が二次配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合には、分子はその位置で相同である（即ち、本明細書中で用いる場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間の相同性％は、配列により共有される同一位置の数の一関数である（即ち、相同性％＝同一位置の数（＃）／位置１００の総数（＃））。
２つの配列間の配列の比較、ならびに相同性％の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの好ましい例は、Karlin
and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68のアルゴリズム（Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77で修正）であるが、これに限定されない。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）で援用される。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて実施されて、本発明のＴＨＡＰファミリー核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施されて、本発明のＴＨＡＰファミリータンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得る。比較のためのギャップ有りアラインメントを得るために、Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402に記載されたように、ギャップ有りＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップ有りＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが用いられ得る（www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい例はMyers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムであるが、これに限定されない。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）で援用される。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーが用いられ得る。
「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さと関係なくアミノ酸のポリマーを指し、したがってペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を特定または除外せず、例えばグリコシル基、アセチル基、ホスフェート基、脂質基等の共有結合を含むポリペプチドは、ポリペプチドという用語により明白に包含される。アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば非天然アミノ酸、無関係生物学的系において天然に存在するだけであるアミノ酸、哺乳類系からの修飾アミノ酸を含む）を含有するポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するおよび非天然の、当該技術分野で既知のその他の修飾も定義内に含まれる。
「単離」または「精製」タンパク質またはその生物学的活性部分は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはそのタンパク質の生物学的活性断片またはホモログが由来する細胞または組織供給源からの細胞物質またはその他の夾雑タンパク質を実質的に含有しないし、あるいは化学的に合成される場合、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含有しない。「細胞物質を実質的に含有しない」という語は、それが単離されるかまたは組換え的に生成される細胞の細胞構成成分からタンパク質が分離される本発明によるタンパク質の調製物（例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログ）を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含有しない」という語は、約３０％未満（乾燥重量）のＴＨＡＰファミリータンパク質以外のタンパク質（本明細書中では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）、さらに好ましくは約２０％未満の本発明によるタンパク質以外のタンパク質、さらにより好ましくは約１０％未満の本発明によるタンパク質以外のタンパク質、最も好ましくは約５％未満の本発明によるタンパク質以外のタンパク質を有する本発明によるタンパク質の調製物を含む。本発明によるタンパク質またはその生物学的活性部分が組換え的に生成される場合、それは好ましくは培地を実質的に含有せず、即ち培地は、約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満の容積のタンパク質調製物を表す。
「化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含有しない」という語は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログの調製物を含むが、この場合、タンパク質は、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体またはその他の化学物質から分離される。一実施形態では、「化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含有しない」という語は、約３０％未満（乾燥重量）の化学的前駆体または非ＴＨＡＰファミリー化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン化学物質を有するＴＨＡＰファミリータンパク質の調製物を含む。
「組換えポリペプチド」という用語は、人工的に設計された、そしてそれらの初期天然環境中で連続ポリペプチド配列として見出されない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチドを指すために、あるいは組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを指すために、本明細書中で用いられる。
したがって本発明の別の態様は、抗ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン抗体に関する。「抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子、例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログを指す。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例としては、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログを結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの特定エピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の１つだけの種を含有する抗体分子の集団をさす。したがってモノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質に関して単一結合親和性を示す。
ＰＡＲ４
上記のように、前立腺アポトーシス応答−４（ＰＡＲ４）は、アポトーシスを受けている前立腺腫瘍細胞において特異的にアップレギュレートされる遺伝子の産物として最初に同定された３８ｋＤａタンパク質である（再検討のためには、Rangnekar, 1998; Mattson et al., 1999参照）。ＰＡＲ４核酸およびアミノ酸配列、Johnstone et al, Mol. Cell. Biol. 16 (12), 6945-6956 (1996)；およびGenbank寄託番号Ｕ６３８０９（配列番号１１８）参照。
本明細書中で互換可能的に用いられるように、「ＰＡＲ４活性」、「ＰＡＲ４の生物学的活性」または「ＰＡＲ４の機能的活性」とは、標準技法に従って、ｉｎｖｉｖｏでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで決定した場合、ＰＡＲ４タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子により発揮される活性をさす。一実施形態では、ＰＡＲ４活性は、直接的活性、例えばＰＡＲ４標的分子との会合、または最も好ましくはアポトーシス誘導活性、あるいは細胞増殖または細胞周期の抑制である。本明細書中で用いる場合、「標的分子」とは、ＰＡＲ４媒介性機能が達成されるよう、ＰＡＲ４タンパク質が現実に結合するかまたは相互作用する分子である。ＰＡＲ４標的分子の例は、ＴＨＡＰファミリータンパク質、例えばＴＨＡＰ１またはＴＨＡＰ２、またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質である。ＰＡＲ４標的分子は、ＰＡＲ４タンパク質またはポリペプチドあるいは非ＰＡＲ４分子であり得る。例えばＰＡＲ４標的分子は、非ＰＡＲ４タンパク質分子であり得る。あるいはＰＡＲ４活性は、標的分子が下流細胞活性を調整するよう、間接的活性、例えばＰＡＲ４タンパク質とＰＡＲ４標的分子との相互作用により媒介される活性である（例えばＰＡＲ４分子とＰＡＲ４標的分子との相互作用は細胞内シグナル伝達経路におけるその標的分子の活性を調整し得る）。
ＰＡＲ４標的分子（例えば本明細書中に記載されたＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４）との、またはその他の標的との結合または相互作用は、例えばＰＡＲ４ベイトと標的（例えばＰＡＲ４）プレイとの相互作用を崩壊する薬剤を見出すために酵母における２ハイブリッドベースアッセイを用いて、あるいは組換えＰＡＲ４および標的タンパク質（例えばＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４）を用いたｉｎｖｉｔｒｏ相互作用アッセイを用いて、検出され得る。
ＳＬＣ／ＣＣＬ２１（ＳＬＣ）
ＳＬＣの生物学的役割
Ｔ細胞自己免疫疾患中のＴ細胞浸潤を媒介するシグナルは、十分に理解されてはいない。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１（配列番号１１９）は、Ｔ細胞移動の誘引に対して非常に強力であり且つ非常に特異的である。それは、二次リンパ系器官においてのみ発現されて、ナイーブＴ細胞を抗原提示の領域に向けると最初は考えられた。しかしながら免疫組織学を用いて、ＣＣＬ２１の発現はＴ細胞自己免疫浸潤性皮膚疾患の内皮細胞において高度に誘導される、ということが判明した（Christopherson et al. (2002) Blood electronic publication prior toprinted publication）。他のＴ細胞ケモカインは、これらのＴ細胞皮膚疾患においては一貫して誘導されなかった。ＣＣＬ２１に関する受容体であるＣＣＲ７は、浸潤Ｔ細胞で高度に発現され、その大多数は記憶ＣＤ４５Ｒｏ表現型を発現する、ということも判明した。したがってＴ細胞浸潤性自己免疫皮膚疾患においてＳＬＣ／ＣＣＬ２１を発現する炎症性細静脈内皮細胞は、これらの組織へのＴ細胞移動の調節に重要な役割を演じ得る。
内皮細胞におけるＳＬＣ／ＣＣＬ２１の発現誘導が、病理学的炎症の部位への循環からのＴ細胞の異常動員を引き起こし得る多数のその他の自己免疫疾患が存在する。例えばケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１は、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における異所性Ｔ細胞浸潤に関して重要であると思われる（Alt et al. (2002) Eur J Immunol 32: 2133-44）。血液脳関門（ＢＢＢ）を通り抜ける自己攻撃性Ｔ細胞の移動は、ＥＡＥの開始に決定的に関与する。この過程におけるケモカインの直接関与は、Ｇプロテイン媒介性シグナル伝達がｉｎｖｉｖｏでのＢＢＢ内皮上の脳炎誘発性Ｔ細胞の接着強化を促すために必要とされる、という観察により示唆された。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学によるＢＢＢに存在するケモカインに関する検索は、炎症細胞により取り囲まれた細静脈におけるリンパ系ケモカインＣＣＬ１９／ＥＬＣおよびＣＣＬ２１／ＳＬＣの発現を明示した（Alt et al. (2002) Eur J Immunol 32: 2133-44）。それらの発現は、ＥＡＥに罹患したマウスの脳および脊髄切片中の炎症細胞におけるそれらの一般的受容体ＣＣＲ７の存在が並行する。脳炎誘発性Ｔ細胞はＣＣＲ７の表面発現を示し、そしてｉｎｖｉｔｒｏでのナイーブリンパ球に匹敵する濃度依存性および百日咳毒素感受性方式でＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の両方に向けて特異的に走化した。ＥＡＥ脳の凍結切片に関する結合アッセイは、脳中の炎症性細静脈への脳炎誘発性Ｔリンパ球の接着強化におけるＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１の機能的関与を実証した（Alt et al. (2002) Eur J Immunol 32: 2133-44）。合わせて考えると、これらのデータは、リンパ系ケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１が、二次リンパ系組織へのリンパ球ホーミングの調節に加えて、免疫監視および慢性炎症中の免疫学的特権中枢神経系へのＴリンパ球移動に関与する、ということを示唆した。
細静脈内皮細胞中のＳＬＣ／ＣＣＬ２１の発現を誘導するその他の疾患が観察されており、例としては、慢性関節リウマチ（Page et al. (2002) J Immunol 168: 5333-5341）および実験的自己免疫糖尿病（Hjelmstrom et al. (2000) Am J Path 156: 1133-1138）が挙げられる。したがって、ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１は、Ｔ細胞自己免疫疾患における重要な薬理学的標的であり得る。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１のインヒビターは、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１を発現する内皮細胞による循環から病理学的炎症の部位へのＴ細胞の異常動員を妨げることにより、これらのＴ細胞浸潤性疾患の治療時に有効な作用物質であり得る。関連組織へのＴ細胞移動の低減は、それらの疾患に認められるＴ細胞加害性損傷を低減する。
異所性リンパ組織形成は、多数の炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性結腸炎）、自己免疫糖尿病、慢性炎症性皮膚疾患（扁平苔癬、乾癬）、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群、胃リンパ腫および慢性炎症性肝疾患の一特徴である（Girard and Springer (1995) Immunol today 16: 449-457; Takemura etal. (2001) J Immunol 167: 1072-1080; Grant et al. (2002) Am J Pathol 2002 160:1445-55; Yoneyama et al. (2001) J Exp Med 193: 35-49）。
ＳＬＣ／ＣＣＬ２１の異所性発現は、マウスにおいて、ならびにヒト炎症性疾患においてともに、リンパ系新生を誘導することが示されている。マウスでは、非リンパ系組織である膵臓におけるＳＬＣ／ＣＣＬ２１のトランスジェニック発現（Fan et al. (2002) J Immunol 164: 3955-3959; Chen et al. (2002) JImmunol 168: 1001-1008; Luther et al. (2002) J Immunol 169: 424-433）は、ＴおよびＢリンパ球の示差的動員による異所性リンパ系組織の発達および組織化のために、ならびにリンパ球移動に関する特殊化血管である高内皮細静脈の誘導のために十分であることが判明した（Girard and Springer (1995) Immunol today 16: 449-457）。ヒトにおいては、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１の肝臓発現は、慢性炎症性肝臓疾患における高内皮細静脈および門脈関連リンパ系組織の発達を促すことが示された（Grant et al. (2002) Am J Pathol 2002 160: 1445-55; Yoneyama et al.(2001) J Exp Med 193: 35-49）。慢性炎症性肝臓疾患の原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）は、門脈炎症および肝臓における新生新派系組織の発達と関連する。７０％より多くのＰＳＣ患者が炎症性腸疾患の病歴を有し、ＰＳＣにおける門脈関連リンパ系組織中のＣＤ３４（＋）血管内皮におけるＳＬＣ／ＣＣＬ２１の強力な誘導が報告されている（Grant et al.
(2002) Am J Pathol 2002 160: 1445-55）。これに対比して、ＣＣＬ２１は、ＬＹＶＥ−１（＋）リンパ管内皮には存在しない。ＰＳＣにおける肝臓内リンパ球としては、ＣＣＲ７（＋）Ｔ細胞の集団が挙げられるが、その半分だけがＣＤ４５ＲＡを発現し、そしてマイグレイションアッセイにおいてＣＣＬ２１に応答する。ＰＳＣにおける門脈中の粘膜アドレッシン細胞接着分子−１に関連したＣＣＬ２１の発現は、ＣＣＲ７（＋）粘膜リンパ球の動員および保持を促して、慢性門脈炎症の確立ならびに門脈関連リンパ系組織拡張をもたらし得る。これらの知見は、抗ＳＬＣ／ＣＣＬ２１抗体が高内皮細静脈および門脈関連リンパ系組織の発達を防止することを示す、慢性肝臓炎症の動物モデルにおける研究により支持される（Yoneyama et al. (2001) J Exp Med 193: 35-49）。
炎症部位でのケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１の誘導は、病変を急性から慢性状態に転換し、異所性リンパ系組織の対応する発達を伴う。したがって慢性炎症性疾患におけるケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１活性の遮断は、十分な治療価値を有する。
本明細書中で用いる場合、「ＳＬＣ／ＣＣＬ２１」および「ＳＬＣ」は同義である。
ＴＨＡＰドメインを含むＴＨＡＰファミリー成員
本明細書中に記載したようなアポトーシスにおけるＴＨＡＰ１タンパク質の生物学的活性の解明に基づいて、本明細書中でＴＨＡＰドメインとよばれる新規のタンパク質モチーフを本発明者等は同定し、さらに特性化した。ＴＨＡＰドメインは、本明細書中でさらに説明するように、いくつかのその他のポリペプチドにおいて本発明者等により同定された。ＴＨＡＰドメインの構造および機能についての知識は、ＴＨＡＰファミリー標的分子との相互作用を調整し、細胞周期および細胞増殖を調整し、アポトーシスを誘導し、あるいはアポトーシスの誘導を強化するかまたはそれに参加することができる薬剤の調製またはスクリーニングに用いられ得るスクリーニングアッセイの実施を可能にする。
本明細書中で互換可能的に用いる場合、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはポリペプチド、あるいはＴＨＡＰファミリー成員は、本明細書中に記載されたＴＨＡＰドメインを有する任意のポリペプチドを指す。上記のように、いくつかの特定のＴＨＡＰファミリー成員を本発明者等は提供した。したがって本明細書中で言及する場合、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはポリペプチド、あるいはＴＨＡＰファミリー成員としては、ＴＨＡＰ−０、ＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ−２、ＴＨＡＰ−３、ＴＨＡＰ−４、ＴＨＡＰ−５、ＴＨＡＰ−６、ＴＨＡＰ−７、ＴＨＡＰ−８、ＴＨＡＰ−９、ＴＨＡＰ１０またはＴＨＡＰ１１ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で互換可能的に用いる場合、「ＴＨＡＰファミリー活性」、「ＴＨＡＰファミリー成員の生物学的活性」または「ＴＨＡＰファミリー成員の機能的活性」とは、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたは核酸分子、あるいは標準技法に従って、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで決定した場合にＴＨＡＰを含むその生物学的活性断片またはホモログにより発揮される活性を指す。一実施形態では、ＴＨＡＰファミリー活性は、直接的活性、例えばＴＨＡＰファミリー標的分子との会合、または最も好ましくはアポトーシス誘導活性、あるいは細胞増殖または細胞周期の抑制である。本明細書中で用いる場合、「ＴＨＡＰファミリー標的分子」とは、ＴＨＡＰファミリー媒介性機能が達成されるよう、ＴＨＡＰファミリータンパク質が現実に結合するかまたは相互作用する分子である。例えばＴＨＡＰファミリー標的分子は、実質的に同一であるか、または構造的類似性を共有する（例えば二量体または多量体を形成する）別のＴＨＡＰファミリータンパク質またはポリペプチドであり得る。別の例では、ＴＨＡＰファミリー標的分子は、タンパク質分子、または非自己分子、例えば死ドメイン受容体を含む非ＴＨＡＰファミリーであり得る。ＴＨＡＰファミリー標的分子（例えば本明細書中に記載されたＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４）との、あるいは他の標的との結合または相互作用は、例えばＴＨＡＰファミリーベイトと標的（例えばＰＡＲ４）プレイとの相互作用を崩壊する薬剤を見出すために酵母における２ハイブリッドベースアッセイを用いて、あるいは組換えＴＨＡＰファミリーおよび標的タンパク質（例えばＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４）を用いたｉｎｖｉｔｒｏ相互作用アッセイを用いて、検出され得る。さらに別の例では、ＴＨＡＰファミリー標的分子は核酸分子であり得る。例えばＴＨＡＰファミリー標的分子はＤＮＡであり得る。
あるいはＴＨＡＰファミリー活性は、標的分子が下流細胞活性を調整するよう、間接的活性、例えばＴＨＡＰファミリータンパク質とＴＨＡＰファミリー標的分子との相互作用により媒介される活性であり得る（例えばＴＨＡＰファミリー分子とＴＨＡＰファミリー標的分子との相互作用は、細胞内シグナル伝達経路におけるその標的分子の活性を調整し得る）。
ＴＨＡＰファミリー活性はアポトーシス活性の誘導に限定されないが、しかしアポトーシス活性強化も含み得る。死ドメインはタンパク質−タンパク質相互作用、例えば他の死ドメインとの相互作用を媒介し得るので、ＴＨＡＰファミリー活性は細胞破壊シグナルを伝達することを含み得る。
アポトーシスを検出するためのアッセイは既知である。好ましい例では、アッセイは、ＴＨＡＰドメインを含むＴＨＡＰファミリー成員のテトラサイクリン調節性発現を示す３Ｔ３細胞株における血清撤退誘導性アポトーシスに基づいている。他の例も述べられるが、これらに限定されない。
一例では、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログは、細胞傷害性死シグナルの発生に必要とされ、そのために十分であるポリペプチドの最小領域であり得る。アポトーシス活性に関する例示的アッセイが、本明細書中でさらに提供される。
特定の実施形態において、ＰＡＲ４は好ましいＴＨＡＰ１および／またはＴＨＡＰ２標的分子である。別の態様において、ＴＨＡＰ１標的分子はＰＭＬ−ＮＢタンパク質である。
さらなる態様では、ＴＨＡＰドメインまたはＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含む。
その他の態様において、ＴＨＡＰファミリー活性は、以下の活性のいずれかをアッセイすることにより検出される：（１）細胞中で発現されるかまたは細胞中に導入された場合、アポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、最も好ましくはアポトーシスを誘導するかまたは強化し、および／または最も好ましくは細胞増殖を低減すること；（２）内皮細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること；（３）高増殖性細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること；（４）ＣＮＳ細胞の、好ましくは神経細胞または神経膠細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること；（５）血管新生を媒介すること、好ましくは抑制すること、炎症を媒介すること、好ましくは抑制すること、癌性組織の転移可能性を抑制すること、腫瘍負荷量の低減、化学療法または放射線療法に対する感受性の増大、癌細胞の殺害、癌細胞の増殖抑制、または腫瘍退縮の誘導からなる群から選択された動物において決定される活性；あるいは（６）ＴＨＡＰファミリー標的分子またはＴＨＡＰドメイン標的分子との相互作用、好ましくはタンパク質または核酸との相互作用。ＴＨＡＰファミリー活性の検出は、「治療方法」という表題の節で本明細書中に考察された任意の適切な治療終点を検出することも含み得る。ＴＨＡＰファミリー活性は、アッセイの種類およびフォーマットに応じて、ｉｎｖｉｔｒｏ（細胞または非細胞ベース）またはｉｎ ｖｉｖｏでアッセイされ得る。
ＴＨＡＰドメインは、配列分析および機能的アッセイに基づいて、配列番号３の約アミノ酸１から約アミノ酸８９まで、ＴＨＡＰ１タンパク質のＮ末端領域で同定された。ＴＨＡＰドメインも、配列番号４〜１４のＴＨＡＰ２〜ＴＨＡＰ０で同定された。しかしながら、機能的ＴＨＡＰドメインは、タンパク質の小部分、即ち約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸長、あるいは約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸長、あるいは約３０アミノ酸〜約３５アミノ酸長、あるいは約４０アミノ酸〜約４５アミノ酸長、あるいは約５０アミノ酸〜約５５アミノ酸長、あるいは約６０アミノ酸〜約７０アミノ酸長、あるいは約８０アミノ酸〜約９０アミノ酸長、あるいは約１００アミノ酸長に過ぎないと理解される。あるいはＴＨＡＰドメインまたはＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性は、上記のように、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ結合、細胞アッセイにより、または配列アラインメントにより限定され得るよりも大きいネイティブタンパク質部分を必要とし得る。約１１０アミノ酸〜約１１５アミノ酸長、あるいは約１２０アミノ酸〜約１３０アミノ酸長、あるいは約１４０アミノ酸〜約１５０アミノ酸長、あるいは約１６０アミノ酸〜約１７０アミノ酸長、あるいは約１８０アミノ酸〜約１９０アミノ酸長、あるいは約２００アミノ酸〜約２５０アミノ酸長、あるいは約３００アミノ酸〜約３５０アミノ酸長、あるいは約４００アミノ酸〜約４５０アミノ酸長、あるいは約５００アミノ酸〜約６００アミノ酸長、あるいは上記長さが配列番号と一致する程度までのＴＨＡＰドメイン含有ポリペプチドの一部、あるいは全長タンパク質、例えば配列番号１〜１１４の任意の全長タンパク質が、機能のために必要とされ得る。
上記のように、本発明は、ＴＨＡＰファミリー成員のいくつかの例を含めた新規のタンパク質ドメインを含む。したがって本発明は、タンパク質中の少なくとも１つのＴＨＡＰドメイン配列または対応する核酸分子、好ましくは配列番号１および２に対応するＴＨＡＰドメイン配列を有するポリペプチドを含むＴＨＡＰファミリー成員を包含する。ＴＨＡＰファミリー成員は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０〜９０アミノ酸残基長のアミノ酸配列を含み、そのうちの少なくとも約５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％、７５％または９０％のアミノ酸残基が、ＴＨＡＰコンセンサスドメイン配列番号１および２と同一のまたは類似のアミノ酸である。
同一性または類似性は、任意の所望のアルゴリズム、例えば本明細書中に記載された相同性を決定するためのアルゴリズムおよびパラメーターを用いて決定され得る。
任意に、ＴＨＡＰドメイン含有ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。本明細書中で用いる場合、核局在化配列という用語は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドを細胞核に局在させるかまたは輸送させるアミノ酸配列を指す。核局在化配列は一般に、少なくとも１０、好ましくは約１３、好ましくは約１６、さらに好ましくは約１９、さらにより好ましくは約２１、２３、２５、３０、３５または４０アミノ酸残基を含む。あるいはＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、修飾ＴＨＡＰファミリーポリペプチドが細胞核に局在化されないかまたは輸送されないよう、一部のまたは全ＮＬＳの欠失を、あるいはＮＬＳ配列中の置換または挿入を含み得る。
本発明の単離タンパク質、好ましくはＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログは、配列番号１および２のコンセンサスアミノ酸配列と十分に相同であるアミノ酸配列を有する。本明細書中で用いる場合、「十分に相同である」という用語は、一次および二次アミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインまたはモチーフを、および／または共通の機能的活性を共有するよう、二次アミノ酸またはヌクレオチド配列と同一または等価の（例えば類似の側鎖を有するアミノ酸残基）アミノ酸残基またはヌクレオチドを十分数または最小数含有する一次アミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。例えば共通の構造ドメインを共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、ドメインのアミノ酸配列を通して少なくとも約３０〜４０％の同一性を、好ましくは少なくとも４０〜５０％の同一性を、さらに好ましくは少なくとも５０〜６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約６０〜７０％、７０〜８０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．８％の同一性を有し、そして少なくとも１つ、好ましくは２つの構造ドメインまたはモチーフを含有し、十分に相同であると本明細書中で明示される。さらに、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．８％の同一性を共有し、そして共通の機能的活性を共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、十分に相同であると本明細書中で明示される。
本発明は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのいずれか、ならびにその断片、それと相補的な核酸およびストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズすることができる核酸を包含する、と理解される。
ＴＨＡＰ−０〜ＴＨＡＰ１１
上記のように、当業者らは、ＴＨＡＰ−０、ＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ−２、ＴＨＡＰ−３、ＴＨＡＰ−４、ＴＨＡＰ−５、ＴＨＡＰ−６、ＴＨＡＰ−７、ＴＨＡＰ−８、ＴＨＡＰ−９、ＴＨＡＰ−１０、およびＴＨＡＰ−１１を含むいくつかのＴＨＡＰファミリー成員を同定する。
ＴＨＡＰ１核酸
配列番号１６０で示される約６３９ヌクレオチド長であるヒトＴＨＡＰ１コード配列は、約２１３アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに説明されるようなＴＨＡＰ１タンパク質またはその生物学的活性部分をコードする精製または単離核酸分子、ならびにその核酸断片に関する。上記の核酸は、例えば本明細書中でさらに説明されるように、治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。
ヒトＴＨＡＰ１遺伝子は、第８、１８、１１染色体に局在する。
ＴＨＡＰ１タンパク質は、アミノ酸１〜８９にＴＨＡＰドメインを含み、アポトーシスにおけるその役割が、本明細書中でさらに実証される。ＴＨＡＰ１タンパク質は、ヒトＴＨＡＰ１のアミノ酸１３６〜１６９にインターフェロンγ相同性モチーフを含有し（ＮＹＴＶＥＤＴＭＨＱＲＫＲＩＨＱＬＥＱＱＶＥＫＬＲＫＫＬＫＴＡＱＱＲ）（配列番号１７８）、ヒトインターフェロンγと３４残基重複（アミノ酸９８〜１３１）して４１％の同一性を示す。ＰＭＬ−ＮＢはＩＦＮγとぴったり連結され、多数のＰＭＬ−ＮＢ構成成分がＩＦＮγにより誘導されて、対応する遺伝子のプロモーター中にＩＦＮγ応答要素を含有する。ＴＨＡＰ１タンパク質も、ヒトＴＨＡＰ１のアミノ酸１４６〜１６５に核局在化配列を含む（ＲＫＲＩＨＱＬＥＱＱＶＥＫＬＲＫＫＬＫＴ）（配列番号１７９）。この配列は、核中のＴＨＡＰの局在化に関与する。本明細書中に提供された実施例において実証されるように、この配列を欠くＴＨＡＰ１の欠失変異体は、細胞核中にもはや局在化されない。ＴＨＡＰ１タンパク質はさらに、ＰＡＲ４結合モチーフ（ＬＥ（Ｘ）１４ＱＲＸＲＲＱＸＲ（Ｘ）１１ＱＲ／ＫＥ）（配列番号１８０）を含む。このモチーフのコアは、部位特異的変異法により、そしてマウスＺＩＰ／ＤＡＰ様キナーゼ（別のＰＡＲ４結合相手）との比較により実験的に限定され、それはヒトＴＨＡＰ１のアミノ酸１６８〜１７５と重複するが、しかしそのモチーフは上流および下流に２〜３の残基も含み得る。
ＴＨＡＰ１に対応するＥＳＴが同定されており、本発明の核酸に特定的に含まれ得るかまたは除外され得る。ＥＳＴは、寄託番号により以下に示されるように、ＴＨＡＰ１に関する組織分布の証拠を以下に提供する：ＡＬ５８２９７５（バーキットリンパ腫からのＢ細胞）；ＢＧ７０８３７２（視床下部）；ＢＧ５６３６１９（肝臓）；ＢＧ４９７５２２（腺癌）；ＢＧ６１６６９９（肝臓）；ＢＥ９３２２５３（頭、首）；ＡＬ５３０３９６（神経芽細胞腫）。
本発明の目的は、配列番号１６０のヌクレオチド配列、それに対する相補的配列およびその断片を含む精製、単離または組換え核酸である。本発明は、配列番号１６０のポリヌクレオチドと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を、有益には９９％のヌクレオチド同一性を、好ましくは９９．５％のヌクレオチド同一性を、最も好ましくは配列番号１６０のポリヌクレオチドと９９．８％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれと相補的な配列、あるいはその生物学的活性断片を含む精製または単離核酸にも関する。本発明の別の目的は、本明細書中で定義されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１６０のポリヌクレオチド、またはそれと相補的な配列、あるいはその変異体またはその生物学的活性断片とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む精製、単離または組換え核酸に関する。さらなる実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１６０の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００または１０００ヌクレオチドの連続スパンを含む単離、精製または組換えポリヌクレオチド、あるいはその相補体を包含する。
本明細書中にさらに記載されるように、本発明のＴＨＡＰ１ポリペプチドをコードする精製、単離または組換え核酸ポリヌクレオチドも包含される。
別の好ましい態様において、本発明は、ＴＨＡＰ１タンパク質の一部分または変異体をコードする精製または単離核酸分子に関するが、この場合、部分または変異体は本発明のＴＨＡＰ１活性を示す。好ましくは上記部分または変異体は、天然に存在する全長ＴＨＡＰ１タンパク質の一部分または変異体である。一例において、本発明は、配列番号１６０の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００または１０００ヌクレオチドの連続スパンを含み、本質的にそれらからなり、またはそれらからなるポリヌクレオチドを提供するが、この場合、上記核酸は、ＴＨＡＰ１部分または本明細書中に記載されたＴＨＡＰ１活性を有する変異体をコードする。その他の実施形態では、本発明は、配列番号３の８〜２０、２０〜５０、５０〜７０、６０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２０５または２０５〜２１２アミノ酸からなるＴＨＡＰ１部分をコードするポリヌクレオチドあるいはその変異体に関するが、この場合、上記ＴＨＡＰ１部分は本明細書中に記載されたＴＨＡＰ１活性を示す。
配列番号１６０の配列は、ヒトＴＨＡＰ１ ｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは、ヒトＴＨＡＰ１タンパク質をコードする配列（即ち、ヌクレオチド２０２〜８４０からの「コード領域」）、ならびに５’非翻訳化配列（ヌクレオチド１〜２０１）および３’非翻訳化配列（ヌクレオチド８４１〜２１７３）を含む。
本明細書中に記載されたＴＨＡＰ１核酸と相補的である核酸分子も、本発明のＴＨＡＰ１核酸に包含される。好ましくは相補的核酸は、それが配列番号１６０で示されたヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それにより安定二重鎖を形成し得るよう、配列番号１６０で示されたヌクレオチド配列と十分に相補的である。
本発明の別の目的は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、本質的にそれらからなり、またはそれらからなるＴＨＡＰ１ポリペプチド、またはその断片をコードする精製、単離または組換え核酸であり、この場合、単離核酸分子は、ＴＨＡＰドメイン、ＴＨＡＰ１標的結合領域、核局在化シグナルおよびインターフェロンγ相同性モチーフからなる群から選択される１つまたは複数のモチーフをコードする。好ましくは上記ＴＨＡＰ１標的結合領域は、ＰＡＲ４結合領域またはＤＮＡ結合領域である。例えば精製、単離または組換え核酸は、配列番号３のポリペプチドまたはその断片をコードするゲノムＤＮＡまたはその断片を、あるいは配列番号１６０の配列またはその断片からなるか、本質的にそれからなるかまたはそれを含むｃＤＮＡを含み得るが、この場合、単離核酸分子は、ＴＨＡＰドメイン、ＴＨＡＰ１標的結合領域、核局在化シグナルおよびインターフェロンγ相同性モチーフからなる群から選択される１つまたは複数のモチーフをコードする。上記モチーフの任意の組合せも特定され得る。好ましくは上記ＴＨＡＰ１標的結合領域は、ＰＡＲ４結合領域またはＤＮＡ結合領域である。本発明の特に好ましい核酸としては、配列番号１６０の６０７〜７０８、６３７〜６９６および７０３〜７４７からなるヌクレオチド位置範囲からなる群から選択される配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００または３００ヌクレオチドの連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製または組換えＴＨＡＰ１核酸が挙げられる。好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ１核酸は、少なくとも２つのＴＨＡＰ１機能性ドメイン、例えばＴＨＡＰドメインおよびＰＡＲ４結合領域を含むＴＨＡＰ１ポリペプチドをコードする。
さらに好ましい実施態様では、ＴＨＡＰ１核酸は、配列番号１および２の式のコンセン
サスアミノ酸配列を有するＴＨＡＰドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。ＴＨＡＰ１核酸は、アミノ酸残基の少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％がＴＨＡＰドメインコンセンサス配列（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインもコードし得る。本発明は、配列番号１および２の式による少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８または１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドをコードする単離、精製および組換えポリヌクレオチドも例示する。
ＴＨＡＰ１遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他のＴＨＡＰ１ファミリー成員（例えば新規の機能性ドメインを共有する）、ならびに他の種からのＴＨＡＰ１ホモログを同定および／またはクローニングするのに用いるために意図されるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。
「ＴＨＡＰ１タンパク質の生物学的活性部分」をコードする核酸断片は、ＴＨＡＰ１生物学的活性（本明細書中に記載されたＴＨＡＰ１タンパク質の生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする配列番号１６０のヌクレオチド配列の一部分を単離し、ＴＨＡＰ１タンパク質のコードした部分を発現させ（例えばｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換え発現により）、そしてＴＨＡＰ１タンパク質のコードした部分の活性を評価することにより調節され得る。
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重のために本発明のＴＨＡＰ１ヌクレオチド配列と異なり、そして本発明の同一ＴＨＡＰ１タンパク質および断片をコードする核酸分子を包含する。
上記ＴＨＡＰ１ヌクレオチド配列のほかに、ＴＨＡＰ１タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多形性が集団（例えばヒト集団）内に存在し得る、ということが当業者に理解される。このような遺伝的多形性は、天然対立遺伝子変動のために、集団内の個体間に存在し得る。このような天然対立遺伝子変動は、典型的にはＴＨＡＰ１遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％分散を生じ得る。
本発明のＴＨＡＰ１核酸の天然対立遺伝子変異体およびホモログに対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準ハイブリダイゼーション技法によるハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書中に開示されたｃＤＮＡまたはその一部分を用いて、本明細書中に開示されたＴＨＡＰ１核酸とのそれらの相同性を基礎にして単離され得る。
ＴＨＡＰ１ヌクレオチド配列を基礎にしたプローブを用いて、同一または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出し得る。好ましい実施形態では、プローブはさらに、それに結合される標識基を含み、例えば標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、例えば被験体からの細胞の試料中のＴＨＡＰ１コード核酸のレベルを測定することにより、例えばＴＨＡＰ１ｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノムＴＨＡＰ１遺伝子が突然変異されたかまたは欠失されたか否かを決定することにより、ＴＨＡＰ１タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いられ得る。
ＴＨＡＰ１ポリペプチド
「ＴＨＡＰ１ポリペプチド」という用語は、本発明のタンパク質およびポリペプチドの全てを包含するために本明細書中で用いられる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドも、本発明の一部を構成する。本発明は、ヒトからのＴＨＡＰ１タンパク質、例えば配列番号３の配列からなるか、または本質的にそれからなるか、またはそれを含む単離または精製ＴＨＡＰ１タンパク質を例示する。
本発明は、配列番号１６０のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、その相補的配列、またはそれの断片に関する。
本発明は、配列番号３の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０または１００アミノ酸の連続スパンを含む単離、精製および組換えポリペプチドを例示する。他の好ましい実施形態では、アミノ酸の連続伸長は、突然変異または機能的突然変異の部位、例えばＴＨＡＰ１タンパク質配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換または切断の部位を含む。本発明は、本発明のＴＨＡＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。
本発明の一態様は、単離ＴＨＡＰ１タンパク質およびその生物学的活性部分、ならびに抗ＴＨＡＰ１抗体を産生するための免疫原として用いるのに適したポリペプチド断片に関する。一実施形態では、ネイティブＴＨＡＰ１タンパク質は、標準タンパク質精製技法を用いて、適切な精製計画により細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＴＨＡＰ１タンパク質は、組換えＤＮＡ技法により生成される。組換え発現に代わるものとして、ＴＨＡＰ１タンパク質またはポリペプチドは、標準ペプチド合成技法を用いて化学的に合成され得る。
典型的には、生物学的活性部分は、ＴＨＡＰ１タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明は、配列番号３の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００または２００アミノ酸の連続スパンを含む一ＴＨＡＰ１ポリペプチドの単離、精製および組換え部分または断片を例示する。配列番号３の１０〜２０、２０〜５０、３０〜６０、５０〜１００または１００〜２００アミノ酸を含むＴＨＡＰ１ポリペプチドも包含される。その他の好ましい実施形態では、アミノ酸の連続伸長は突然変異または機能的突然変異の部位、例えばＴＨＡＰ１タンパク質配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換または切断を含む。
生物学的活性ＴＨＡＰ１タンパク質は、例えば配列番号３からの少なくとも１、２、３、５、１０、２０または３０アミノ酸変化を含み得るし、あるいは配列番号３の配列からのアミノ酸の少なくとも１％、２％、３％、５％、８％、１０％または１５％変化を含む生物学的活性ＴＨＡＰ１タンパク質をコードし得る。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ１タンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸位置１〜８９のＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。他の態様では、ＴＨＡＰ１ポリペプチドは、ＴＨＡＰ１標的結合領域、核局在化シグナルおよび／またはインターフェロンγ相同性モチーフを含む。好ましくはＴＨＡＰ１標的結合領域は、ＰＡＲ４結合領域またはＤＮＡ結合領域である。本発明は、本発明のＴＨＡＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号３の位置１〜９０、１３６〜１６９、１４６〜１６５および１６８〜１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０、９０または１００アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ１ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサス配列（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインをコードし得る。本発明は、配列番号３で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ１ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
その他の実施形態では、本明細書中でさらに説明されるように、ＴＨＡＰ１タンパク質は配列番号３の配列と実質的に相同であり、ＴＨＡＰ１タンパク質の機能的活性を保持し、さらに天然対立遺伝子変動または突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。したがって別の実施形態では、ＴＨＡＰ１タンパク質はそれぞれ、配列番号３のアミノ酸配列と約６０％より多いがしかし１００％未満の相同性を共有し、そして配列番号３のＴＨＡＰ１タンパク質の機能的活性を保持するアミノ酸配列を含むタンパク質である。好ましくはタンパク質は、配列番号３と少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．８％相同であるが、しかし配列番号３と同一ではない。好ましくはＴＨＡＰ１は、天然ＴＨＡＰ１と同一（例えば１００％同一性）未満である。相同性％は、上でさらに詳述したように決定され得る。
ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１およびＴＨＡＰ−０核酸
上記のように、本発明は、ＴＨＡＰファミリーのいくつかの成員を提供する。ＴＨＡＰ−２、ＴＨＡＰ−３、ＴＨＡＰ−４、ＴＨＡＰ−５、ＴＨＡＰ−６、ＴＨＡＰ−７、ＴＨＡＰ−８、ＴＨＡＰ−９、ＴＨＡＰ１０、ＴＨＡＰ１１およびＴＨＡＰ−０が本明細書中に記載される。ヒトｃＤＮＡ配列に対応するヒトおよびマウスヌクレオチド配列が配列番号１６１〜１７１に列挙され、ヒトアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４〜１４に列挙されている。上記ＴＨＡＰファミリー配列のオルトログ、例えばマウス、ラット、ブタおよびその他のオルトログも本発明に包含され、それらのアミノ酸配列は、配列番号１６〜１１４に列挙され、そしてｃＤＮＡ配列は配列番号１７２〜１７５に列挙される。
ＴＨＡＰ−２
配列番号１６１で示される約１３０２ヌクレオチド長であるヒトＴＨＡＰ−２ ｃＤＮＡは、配列番号４で示される約２２８アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−２タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−２遺伝子は、第１２および３染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−２タンパク質は、アミノ酸１〜８９にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−２が以下のように発現されることを示唆する：ＢＧ６７７９９５（扁平上皮癌）；ＡＶ７１８１９９（視床下部）；ＢＩ６００２１５（視床下部）；ＡＩ２０８７８０（ソアレス精巣(Soares testis)ＮＨＴ）；ＢＥ５６６９９５（癌細胞株）；ＡＩ６６０４１８（プールされた胸腺）。
ＴＨＡＰ−３
配列番号１６２で示される約１９９５ヌクレオチド長であるヒトＴＨＡＰ−３ ｃＤＮＡ。このＴＨＡＰ−３遺伝子は、配列番号５で示される約２３９アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−３タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−３遺伝子は、第１染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−３タンパク質は、アミノ酸１〜８９にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−３が以下のように発現されることを示唆する：ＢＧ７００５１７（海馬）；ＢＩ４６０８１２（精巣）；ＢＧ７０７１９７（視床下部）；ＡＷ９６０４２８（−）；ＢＧ４３７１７７（大細胞癌）；ＢＥ９６２８２０（腺癌）；ＢＥ５４８４１１（子宮頸癌細胞株）；ＡＬ５２２１８９（神経芽細胞腫細胞）；ＢＥ５４５４９７（子宮頸癌細胞株）；ＢＥ２８０５３８（絨毛癌）；ＢＩ０８６９５４（頚部）；ＢＥ７４４３６３（腺癌）；およびＢＩ５４９１５１（海馬）。
ＴＨＡＰ−４
配列番号１６３で示される１９９９ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−４ ｃＤＮＡは、配列番号６で示される約５７７アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−４タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ＴＨＡＰ−４タンパク質は、アミノ酸１〜９０にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−４が以下のように発現されることを示唆する：ＡＬ５４４８８１（胎盤）；ＢＥ３８４０１４（メラニン性黒色腫）；ＡＬ５１７２０５（神経芽細胞腫細胞）；ＢＧ３９４７０３（網膜芽細胞腫）；ＢＧ４７２３２７（網膜芽細胞腫）；ＢＩ１９６０７１（神経芽細胞腫）；ＢＥ２５５２０２（網膜芽細胞腫）；ＢＩ０１７３４９（肺腫瘍）；ＢＦ９７２１５３（平滑筋肉腫細胞株）；ＢＧ１１６０６１（十二指腸腺癌細胞株）；ＡＬ５３０５５８（神経芽細胞腫細胞）；ＡＬ５２００３６（神経芽細胞腫細胞）；ＡＬ５５９９０２（バーキットリンパ腫からのＢ細胞）；ＡＬ５３４５３９（胎児脳）；ＢＦ６８６５６０（平滑筋肉腫細胞株）；ＢＦ３４５４１３（１ｐ／１９ｑ損失を伴う未分化乏突起神経膠腫）；ＢＧ１１７２２８（腺癌細胞株）；ＢＧ４９０６４６（大細胞癌）；およびＢＦ７６９１０４（ｅｐｉｄ腫瘍）。
ＴＨＡＰ−５
配列番号１６４で示される１０３４ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−５ ｃＤＮＡは、配列番号７で示される約２３９アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−５タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−５遺伝子は、第７染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−５タンパク質は、アミノ酸１〜９０にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−５が以下のように発現されることを示唆する：ＢＧ５７５４３０（乳房腺癌細胞株）；ＢＩ５４５８１２（海馬）；ＢＩ５６００７３（精巣）；ＢＧ５３０４６１（胎児性癌）；ＢＦ２４４１６４（膠芽細胞腫）；ＢＩ４６１３６４（精巣）；ＡＷ４０７５１９（胚中心Ｂ細胞）；ＢＦ１０３６９０（胎児性癌）；およびＢＦ９３９５７７（腎臓）。
ＴＨＡＰ−６
配列番号１６５で示される２２９１ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−６ ｃＤＮＡは、配列番号８で示される約２２２アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−６タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−６遺伝子は、第４染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−６タンパク質は、アミノ酸１〜９０にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−６が以下のように発現されることを示唆する：ＡＶ６８４７８３（肝細胞癌）；ＡＶ６９８３９１（肝細胞癌）；ＢＩ５６０５５５（精巣）；ＡＶ６８８７６８（肝細胞癌）；ＡＶ６９２４０５（肝細胞癌）；およびＡＶ６９６３６０（肝細胞癌）。
ＴＨＡＰ−７
配列番号１６６で示される１２４２ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−７ ｃＤＮＡは、配列番号９で示される約３０９アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−７タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−７遺伝子は、第２２ｑ１１．２染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−７タンパク質は、アミノ酸１〜９０にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−７が以下のように発現されることを示唆する：ＢＩ１９３６８２（類上皮癌細胞株）；ＢＥ２５３１４６（網膜芽細胞腫）；ＢＥ６２２１１３（メラニン性黒色腫）；ＢＥ７４０３６０（腺癌細胞株）；ＢＥ５１３９５５（バーキットリンパ腫）；ＡＬ０４９１１７（精巣）；ＢＦ９５２９８３（神経性、正常）；ＡＷ９７５６１４（−）；ＢＥ２７３２７０（腎細胞腺癌）；ＢＥ７３８４２８（膠芽細胞腫）；ＢＥ３８８２１５（子宮内膜腺癌細胞株）；ＢＦ７６２４０１（結腸、ｅｓｔ）；およびＢＧ３２９２６４（網膜芽細胞腫）。
ＴＨＡＰ−８
配列番号１６７で示される１３８７ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−８ ｃＤＮＡは、配列番号１０で示される約２７４アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−８タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−８遺伝子は、第１９染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−８タンパク質は、アミノ酸１〜９２にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−８が以下のように発現されることを示唆する：ＢＧ７０３６４５（海馬）；ＢＦ０２６３４６（メラニン性黒色腫）；ＢＥ７２８４９５（メラニン性黒色腫）；ＢＧ３３４２９８（メラニン性黒色腫）；およびＢＥ３９０６９７（子宮内膜腺癌細胞株）。
ＴＨＡＰ−９
配列番号１６８で示される６９３ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−９ ｃＤＮＡは、配列番号１１で示される約２３１アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−９タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ＴＨＡＰ−９タンパク質は、アミノ酸１〜９２にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−９が以下のように発現されることを示唆する：ＡＡ３３３５９５（８週胚）。
ＴＨＡＰ−１０
配列番号１６９で示される７７１ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−１０ ｃＤＮＡは、配列番号１２で示される約２５７アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−１０タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−１０遺伝子は、第１５染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−１０タンパク質は、アミノ酸１〜９０にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ１０が以下のように発現されることを示唆する：ＡＬ５２６７１０（神経芽細胞腫細胞）；ＡＶ７２５４９９（視床下部）；ＡＷ９６６４０４（−）；ＡＷ２９６８１０（肺）；およびＡＬ５５７８１７（Ｔ細胞白血病からのＴ細胞）。
ＴＨＡＰ−１１
配列番号１７０で示される９４２ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−１１ ｃＤＮＡは、配列番号１３で示される約３１４アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−１１タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−１１遺伝子は、第１６染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−１１タンパク質は、アミノ酸１〜９０にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ１１が以下のように発現されることを示唆する：ＡＵ１４２３００（網膜芽細胞腫）；ＢＩ２６１８２２（リンパ腫細胞株）；ＢＧ４２３１０２（腎細胞腺癌）；およびＢＧ４２３８６４（腎臓）。
ＴＨＡＰ−０
配列番号１７１で示される２２８３ヌクレオチド長を有する配列として示すヒトＴＨＡＰ−０ ｃＤＮＡは、配列番号１４で示される約７６１アミノ酸残基長であるタンパク質をコードする。本発明の一態様は、本明細書中でさらに記載されるようなＴＨＡＰ−０タンパク質をコードする精製または単離核酸分子あるいはその生物学的活性部分、ならびにその核酸断片に関する。上記核酸は、例えば本明細書中でさらに記載されるような治療方法および薬剤スクリーニングアッセイに用いられ得る。ヒトＴＨＡＰ−０遺伝子は、第１１染色体に局在化される。ＴＨＡＰ−０タンパク質は、アミノ酸１〜９０にＴＨＡＰドメインを含む。データベース中の発現配列（指示寄託番号。本発明の核酸に特定的に含まれるかまたは除外され得る）の分析は、ＴＨＡＰ−０が以下のように発現されることを示唆する：ＢＥ７１３２２２（頭、首）；ＢＥ１６１１８４（頭、首）；ＡＬ１１９４５２（扁桃）；ＡＵ１２９７０９（奇形癌）；ＡＷ９６５４６０（−）；ＡＷ９６５４６０（−）；ＡＷ９５８０６５（−）；およびＢＥ８８６８８５（平滑筋肉腫）。
本発明の一目的は、配列番号１６１〜１７１、１７３〜１７５のヌクレオチド配列を含む精製、単離または組換え核酸、あるいはそれと相補的な配列およびその断片である。本発明は、配列番号１６１〜１７１または１７３〜１７５のポリヌクレオチドと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を、有益には配列番号１６１〜１７１または１７３〜１７５のポリヌクレオチドと９９％ヌクレオチド同一性、好ましくは９９．５％ヌクレオチド同一性、最も好ましくは９９．８％ヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含む精製または単離核酸、あるいはそれと相補的な配列、またはその生物学的活性断片にも関する。本発明の別の目的は、本明細書中に明記されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１６１〜１７１または１７３〜１７５のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む精製、単離または組換え核酸、あるいはそれと相補的な配列、またはその変異体またはその生物学的活性断片に関する。さらなる実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１６１〜１７１または１７３〜１７５からなる群から選択される配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００または１０００ヌクレオチドの連続スパンを含む単離、精製または組換えポリヌクレオチド、あるいはその相補体を含む。
本明細書中にさらに記載されるように、本発明のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ポリペプチドをコードする精製、単離または組換え核酸ポリヌクレオチドも包含される。
別の好ましい態様では、本発明は、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質の一部分または変異体をコードする精製または単離核酸分子に関するが、この場合、部分または変異体は本発明のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０活性を示す。好ましくは上記部分または変異体は、天然に存在する全長ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質の一部分または変異体である。一例では、本発明は、配列番号１６１〜１７１、１７３〜１７５からなる群から選択される配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００または１０００ヌクレオチドの連続スパンを、上記スパンの長さが配列番号の長さと一致する程度まで含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなるポリヌクレオチドを提供するが、この場合、上記核酸は、本明細書中に記載されたＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０活性を有するＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０部分または変異体をコードする。その他の実施形態では、本発明は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８、１００〜１１４からなる群から選択される配列の、上記部分の長さが配列番号の長さと一致する程度まで、８〜２０、２０〜５０、５０〜７０、６０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０または２５０〜３５０アミノ酸からなるＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０部分をコードするポリヌクレオチド、またはその変異体に関するが、この場合、上記ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０部分は、本明細書中に記載されたＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０活性を示す。
ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０変異型核酸は、例えば配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８および１００〜１１４からなる群から選択されるそれぞれの配列からの少なくとも１、２、３、５、１０、２０または３０アミノ酸変化を含む生物学的に活性なＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質をコードし得るし、あるいは配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８および１００〜１１４のそれぞれの配列からのアミノ酸の少なくとも１％、２％、３％、５％、８％、１０％または１５％変化を含む生物学的活性ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質をコードし得る。
配列番号４〜１４の配列は、それぞれヒトＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１およびＴＨＡＰ−０ ＤＮＡに対応する。配列番号１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８、１００〜１１４は、マウス、ラット、ブタおよびその他のオルトログに対応する。
本明細書中に記載されたＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０核酸と相補的である核酸分子も、本発明のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１およびＴＨＡＰ−０核酸に包含される。好ましくは相補的核酸は、それが配列番号１６１〜１７１および１７３〜１７５で示される上記ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それにより安定二重鎖を形成し得るよう、配列番号１６１〜１７１および１７３〜１７５で示されたそれぞれのヌクレオチド配列と十分に相補的である。
本発明の別の目的は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８、１００〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸を含む、本質的にそれらからなるまたはそれらからなるＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ポリペプチドをコードする精製、単離または組換え核酸、あるいはその断片であって、この場合、単離核酸分子は、ＴＨＡＰドメイン、あるいはＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０標的結合領域をコードする。好ましくは上記標的結合領域は、タンパク質結合領域、好ましくはＰＡＲ−４結合領域であり、あるいは好ましくは上記標的結合領域はＤＮＡ結合領域である。例えば精製、単離または組換え核酸は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８、１００〜１１４からなる群から選択される配列を有するポリペプチド、あるいはその断片をコードするゲノムＤＮＡまたはその断片を含み得る。精製、単離または組換え核酸は、代替として、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８、１００〜１１４からなる群から選択される配列、あるいはその断片からなるか、本質的にそれらからなるか、またはそれらを含むｃＤＮＡを含み得るが、この場合、単離核酸分子は、ＴＨＡＰドメインあるいはＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０標的結合領域をコードする。好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０核酸は、少なくとも２つのＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０機能性ドメイン、例えばＴＨＡＰドメインおよびＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０標的結合領域等のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ポリペプチドをコードする。
本発明の特に好ましい核酸としては、配列番号１６１〜１７１および１７３〜１７５で示されるような関連核酸をコードするヌクレオチド位置からなる群から選択される配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００または２５０ヌクレオチドの連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製または組換えＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０核酸が挙げられる。
さらに好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０核酸は、配列番号１および２の式のコンセンサスアミノ酸配列を有するＴＨＡＰドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０核酸は、アミノ酸残基の少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％がＴＨＡＰコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインもコードし得る。本発明は、配列番号１および２の式の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８または１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドをコードする単離、精製および組換えポリヌクレオチドも例示する。
ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他のＴＨＡＰファミリー成員、特にＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０に関連した配列（例えば新規の機能性ドメインを共有する）、ならびに他の種からのＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ホモログを同定および／またはクローニングするのに用いるために意図されるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。
ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質の生物学的活性部分をコードする核酸断片は、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０生物学的活性（本明細書中に記載されたＴＨＡＰファミリータンパク質の生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする配列番号１６１〜１７１および１７３〜１７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部分を単離し、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質のコードした部分を発現させ（例えばｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換え発現により）、そしてＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質のコードした部分の活性を評価することにより調節され得る。
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重のために本発明のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ヌクレオチド配列と異なり、そして本発明の同一ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質あるいはその断片をコードする核酸分子を包含する。
上記ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ヌクレオチド配列のほかに、それぞれのＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多形性が集団（例えばヒト集団）内に存在し得る、ということが当業者に理解される。このような遺伝的多形性は、天然対立遺伝子変動のために、集団内の個体間に存在し得る。このような天然対立遺伝子変動は、典型的には特定のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％分散を生じ得る。
本発明のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０核酸の天然対立遺伝子変異体およびホモログに対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準ハイブリダイゼーション技法によるハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書中に開示されたｃＤＮＡまたはその一部分を用いて、本明細書中に開示されたＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０核酸とのそれらの相同性を基礎にして単離され得る。
ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ヌクレオチド配列を基礎にしたプローブを用いて、同一または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出し得る。好ましい実施形態では、プローブはさらに、それに結合される標識基を含み、例えば標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、例えば被験体からの細胞の試料中のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０コード核酸のレベルを測定することにより、例えばＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノムＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０遺伝子が突然変異されたかまたは欠失されたか否かを決定することにより、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質を誤発現する（misexpress）細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いられ得る。
ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ポリペプチド
「ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ポリペプチド」という用語は、ＴＨＡＰ−２、ＴＨＡＰ−３、ＴＨＡＰ−４、ＴＨＡＰ−５、ＴＨＡＰ−６、ＴＨＡＰ−７、ＴＨＡＰ−８、ＴＨＡＰ−９、ＴＨＡＰ１０、ＴＨＡＰ１１およびＴＨＡＰ−０に関する本発明のタンパク質およびポリペプチドの全てを包含するために本明細書中で用いられる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドも、本発明の一部を構成する。本発明は、ヒトからのＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質、例えば配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８および１００〜１１４からなる群から選択される配列からなるか、または本質的にそれからなるか、またはそれを含む単離または精製ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質を例示する。
本発明は、配列番号１６１〜１７１，１７２〜１７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、およびその相補的配列、およびそれの断片に関する。
本発明は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８および１００〜１１４からなる群から選択される配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００または５００アミノ酸の連続スパンを、上記スパンが特定の配列番号と一致する程度まで含む単離、精製および組換えポリペプチドを例示する。他の好ましい実施形態では、アミノ酸の連続伸長は、突然変異または機能的突然変異の部位、例えばＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換または切断の部位を含む。
本発明の一態様は、単離ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１およびＴＨＡＰ−０タンパク質およびその生物学的活性部分、ならびに抗ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０抗体を産生するための免疫原として用いるのに適したポリペプチド断片に関する。一実施形態では、ネイティブＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質は、標準タンパク質精製技法を用いて、適切な精製計画により細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質は、組換えＤＮＡ技法により生成される。組換え発現に代わるものとして、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質あるいはポリペプチドは、標準ペプチド合成技法を用いて化学的に合成され得る。
ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質の生物学的活性部分は、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質のアミノ酸配列と十分に相同であるかまたはそれらに由来するアミノ酸配列、例えばそれぞれの全長ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質の少なくとも１つの活性を示す配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。本発明は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８および１００〜１１４からなる群から選択される配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００または５００アミノ酸の連続スパンを上記スパンが特定の配列番号と一致する程度まで含むＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ポリペプチドの単離、精製および組換え部分または断片を例示する。配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８および１００〜１１４からなる群から選択される配列の１０〜２０、２０〜５０、３０〜６０、５０〜１００または１００〜２００アミノ酸を含むＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０ポリペプチドも包含される。その他の好ましい実施形態では、アミノ酸の連続伸長は突然変異または機能的突然変異の部位、例えばＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換または切断を含む。
生物学的活性ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質は、例えば配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４の配列からの少なくとも１、２、３、５、１０、２０または３０アミノ酸変化を含み得るし、あるいは配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４の配列からのアミノ酸の少なくとも１％、２％、３％、５％、８％、１０％または１５％変化を含む生物学的活性ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質をコードし得る。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−２タンパク質は、好ましくは配列番号４で示されるアミノ酸位置１〜８９のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−２ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号４のアミノ酸位置１〜８９を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または８９アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−２ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号４で示されるアミノ酸位置１〜８９のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−２ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。好ましくは上記ＴＨＡＰ−２ポリペプチドは、ＰＡＲ−４結合ドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインを含む。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−３タンパク質は、好ましくは配列番号５で示されるアミノ酸位置１〜８９のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−３ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−３ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号５のアミノ酸位置１〜８９を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または８９アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−３ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸位置１〜８９のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−３ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。好ましくは上記ＴＨＡＰ−３ポリペプチドは、ＰＡＲ−４結合ドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインを含む。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−４タンパク質は、好ましくは配列番号６で示されるアミノ酸位置１〜９０のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−４ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−４ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号６のアミノ酸位置１〜９０を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−４ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号６で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−４ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−５タンパク質は、好ましくは配列番号７で示されるアミノ酸位置１〜９０のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−５ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−５ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号７のアミノ酸位置１〜９０を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−５ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号７で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−５ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−６タンパク質は、好ましくは配列番号８で示されるアミノ酸位置１〜９０のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−６ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−６ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号８のアミノ酸位置１〜９０を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−６ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−６ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−７タンパク質は、好ましくは配列番号９で示されるアミノ酸位置１〜９０のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−７ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−７ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号９のアミノ酸位置１〜９０を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−７ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号９で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−７ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−８タンパク質は、好ましくは配列番号１０で示されるアミノ酸位置１〜９２のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−８ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−８ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号１０のアミノ酸位置１〜９２を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−８ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号１０で示されるアミノ酸位置１〜９２のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−８ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−９タンパク質は、好ましくは配列番号１１で示されるアミノ酸位置１〜９２のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−９ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−９ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号１１のアミノ酸位置１〜９２を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−９ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号１１で示されるアミノ酸位置１〜９２のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−９ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ１０タンパク質は、好ましくは配列番号１２で示されるアミノ酸位置１〜９０のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ１０ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ１０ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号１２のアミノ酸位置１〜９０を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ１０ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号１２で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ１０ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ１１タンパク質は、好ましくは配列番号１３で示されるアミノ酸位置１〜９０のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ１１ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ１１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号１３のアミノ酸位置１〜９０を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ１１ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号１３で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ１１ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
好ましい実施形態では、ＴＨＡＰ−０タンパク質は、好ましくは配列番号１４で示されるアミノ酸位置１〜９０のアミノ酸配列を有するＴＨＡＰ−０ ＴＨＡＰドメイン、あるいはその断片または変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本発明は、本発明のＴＨＡＰ−０ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相補的配列またはその断片にも関する。したがって本発明は、配列番号１４のアミノ酸位置１〜９０を含む配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０または９０アミノ酸の連続スパンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる単離、精製および組換えポリペプチドも例示する。別の態様では、ＴＨＡＰ−０ポリペプチドは、少なくとも約９５％、９０％、８５％、５０〜８０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸残基がＴＨＡＰドメインコンセンサスドメイン（配列番号１および２）と同一または類似アミノ酸であるＴＨＡＰドメインを含み得る。本発明は、配列番号１４で示されるアミノ酸位置１〜９０のＴＨＡＰドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＴＨＡＰ−０ポリペプチド、あるいはその断片または変異体をコードする単離、精製核酸も包含する。
他の実施形態では、本明細書中でさらに説明されるように、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４の配列と実質的に相同であり、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質の機能的活性を保持し、さらに天然対立遺伝子変動または突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。したがって別の実施形態では、ＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４のアミノ酸配列と約６０％以上しかし１００％未満の相同性を共有し、そしてそれぞれ配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４のＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０タンパク質の機能的活性を保持するアミノ酸を含むタンパク質である。好ましくはタンパク質は、配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４と少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．８％相同であるが、しかし配列番号４〜１４、１７〜２１、２３〜４０、４２〜５６、５８〜９８または１００〜１１４と同一ではない。好ましくはＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０は、天然に生じるＴＨＡＰ−２〜ＴＨＡＰ１１またはＴＨＡＰ−０と同一（例えば１００％同一性）未満である。相同性％は、上でさらに詳述したように決定され得る。
ポリペプチドの評価、変異型核酸およびポリペプチドを生成する方法
ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの機能を特性化することにより、本発明はさらに、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインヌクレオチド配列の機能的断片および変異体の活性を試験し、またはそれらを得る方法であって、変異体または修飾ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン核酸を提供し、そしてそれによりコードされたポリペプチドが本発明のＴＨＡＰファミリー活性を示すか否かを評価する方法を提供する、と理解される。したがってＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの機能を評価する方法であって、（ａ）ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログを提供すること、（ｂ）上記ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログをＴＨＡＰファミリー活性に関して試験することを含む方法が含まれる。任意の適切なフォーマット、例えば無細胞、細胞ベースおよびｉｎｖｉｖｏフォーマットが用いられ得る。例えば上記のアッセイは、宿主細胞中でＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン核酸を発現し、そして上記細胞中のＴＨＡＰファミリー活性を観察することを含むことができる。別の例では、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログが細胞に導入され、そしてＴＨＡＰファミリー活性が観察される。ＴＨＡＰファミリー活性は、本明細書中に記載されたような任意の活性、例えば（１）細胞中で発現されるかまたは細胞に導入された場合、アポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、最も好ましくはアポトーシスを誘導しまたは強化すること、および／または最も好ましくは細胞増殖を低減すること；（２）内皮細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること；（３）過増殖性細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること；（４）ＣＮＳ細胞、好ましくは神経細胞または神経膠細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること；あるいは（５）血管新生を媒介すること、好ましくは抑制すること、炎症を媒介すること、好ましくは抑制すること、癌性組織の転移可能性を抑制すること、腫瘍負荷量の低減、化学療法または放射線療法に対する感受性の増大、癌細胞の殺害、癌細胞の増殖抑制、または腫瘍退縮の誘導からなる群から選択される動物において決定される活性であり得る。
集団中に存在し得るＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン配列の天然に生じる対立遺伝子変異体のほかに、配列番号１６０〜１７１のヌクレオチド配列中の突然変異により変化が導入され、それによりＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の機能的能力の変更を伴いまたは伴わずに、コード化ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらし得る、と当業者は理解する。
いくつかの種類の変異体、例えば１）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基で置換され、そしてこのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされ得るかまたはされないものであり得るもの、あるいは２）１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは３）変異型ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増大する化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合されるもの、あるいは４）付加的アミノ酸が変異型ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドと融合されるもの、例えばリーダーまたは分泌配列、または変異型ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの精製のために用いられる配列、あるいは前タンパク質配列が意図される。このような変異体は、当業者の範囲内であるとみなされる。
例えばアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、タンパク質の生物学的活性を実質的に変えない配列番号１６０〜１７５の配列中でなされ得る。アミノ酸残基は、生物学的活性の変更を伴わずに、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドをコードする野生型配列あるいはその生物学的活性断片またはホモログから変更され得る。概して、本発明のＴＨＡＰドメイン含有タンパク質のＴＨＡＰファミリー間で保存されるアミノ酸残基は、変化をあまり受け易くないと予測される。さらに付加的保存アミノ酸残基は、本発明のＴＨＡＰファミリータンパク質間に保存されるアミノ酸であり得る。
一態様では、本発明は、活性に不可欠でないアミノ酸残基の変化を含有するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログをコードする核酸分子に関する。このようなＴＨＡＰファミリータンパク質は、配列番号後１〜１１４とアミノ酸配列が異なるが、生物学的活性を保持する。一実施形態では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むが、この場合、タンパク質は、配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６５〜７０％相同であり、さらに好ましくは配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７５〜８０％の同一性を共有し、さらにより好ましくは配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．８％の同一性を共有する。
別の態様では、本発明は、生物学的活性増大または生物学的活性修飾を生じるアミノ酸残基中の変化を含有するＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする核酸分子に関する。別の態様では、本発明は、ＴＨＡＰファミリー活性に不可欠であるアミノ酸残基中の変化を含有するＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＴＨＡＰファミリータンパク質は、配列番号１〜１１４とアミノ酸配列が異なり、１つまたは複数のＴＨＡＰファミリー生物学的活性の低減を示すかまたは本質的にそれらを欠く。本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドのドミナントネガティブ変異体として有用であり得るＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログも包含する。
配列番号１〜１１４のいずれかのタンパク質と相同であるＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログをコードする単離核酸分子は、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がコード化タンパク質中に導入されるよう、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を配列番号１〜１１４のヌクレオチド配列中に導入することにより作製され得る。突然変異は、標準技法により、例えば部位特異的変異法およびＰＣＲによる変異法により、配列番号１〜１１４のいずれかの中に導入され得る。例えば保存的アミノ酸置換は、１つまたは複数の予測非必須アミノ酸残基に作製され得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがってＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログ中の予測非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられ得る。あるいは別の実施形態では、突然変異は、例えば飽和変異法により、ランダムにＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインコード配列の全部または一部と一緒に導入され、その結果生じる変異体は、活性を保持する変異体を同定するためにＴＨＡＰファミリー生物学的活性に関してスクリーニングされ得る。配列番号１〜１１４のうちの１つの突然変異誘発素、コード化タンパク質は組換え的に発現され、タンパク質の活性が決定され得る。
好ましい実施形態では、本発明のＴＨＡＰドメイン核酸のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログによりコードされる変異型ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログが、任意の適切なアッセイ（この例は本明細書中に提示されている）においてＴＨＡＰファミリー活性に関してアッセイされ得る。
本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書中で用いる場合、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＴＨＡＰファミリーまたは非ＴＨＡＰドメインポリペプチドに操作可能的に連結された、好ましくはインフレームで融合された本発明のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン融合タンパク質は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性部分を含む。別の好ましい実施形態では、ＴＨＡＰファミリー融合タンパク質は、ＴＨＡＰファミリータンパク質の少なくとも２つの生物学的活性部分を含む。例えば一実施形態では、融合タンパク質は、ＴＨＡＰファミリー配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ−ＴＨＡＰファミリー融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＴＨＡＰファミリーポリペプチドの精製を促し得る。別の実施形態では、融合タンパク質は、他とある種の宿主細胞中での所望の細胞局在かを可能にするために、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有するＴＨＡＰファミリータンパク質である。
本発明のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン融合タンパク質は、薬学的組成物中に混入されて、ｉｎ ｖｉｖｏで被験体に投与され得る。さらに本発明のＴＨＡＰファミリー融合またはＴＨＡＰドメインタンパク質は、被験体中で抗ＴＨＡＰファミリーまたは抗ＴＨＡＰドメイン抗体を産生するための免疫原として用いられて、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインリガンドを精製し得るし、そしてスクリーニングアッセイでは、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインとＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン標的分子との相互作用を抑制する分子を同定するために用いられ得る。
さらに被験体ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の単離ペプチジル部分は、このようなペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え的に産生されるペプチドをスクリーニングすることによっても生成され得る。さらに断片は、当該技術分野で既知の技法を用いて、例えば慣用的メリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学を用いて、化学的に合成され得る。例えば本発明のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質は、断片の重複を伴わずに所望の長さの断片に随意に分断され得るか、あるいは好ましくは所望の長さの重複断片に分断され得る。断片が生成され（組換え的にまたは化学合成により）、そして例えばマイクロインジェクションアッセイにより、またはｉｎｖｉｔｒｏタンパク質結合アッセイにより、ＴＨＡＰファミリータンパク質活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得るペプチジル断片を同定するために試験し得る。例証的実施形態では、ＴＨＡＰファミリータンパク質のペプチジル部分、例えばＴＨＡＰドメインまたはＴＨＡＰファミリー標的結合領域（例えばＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ−２およびＴＨＡＰ−３の場合のＰＡＲ４）が、各々がＴＨＡＰファミリータンパク質の別個の断片を含有するチオレドキシン融合タンパク質としての発現により、ＴＨＡＰファミリー活性に関して試験され得る（例えば米国特許第５，２７０，１８１号および第５，２９２，６４６号；ならびにＰＣＴ公告ＷＯ９４／０２５０２参照）。
本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン模倣物として、あるいはＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインインヒビターとして機能するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の変異体にも関する。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の変異体は、変異法により、例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の別個の点突然変異または切断により生成され得る。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質のアゴニストは、実質的に同一のまたはサブセットの、天然に生じる形態のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の生物学的活性を保有し得る。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質のアンタゴニストは、例えばＴＨＡＰファミリー標的分子とのＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の会合を競合的に抑制することにより、天然に生じる形態のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の１つまたは複数の活性を抑制し得る。したがって特定の生物学的作用は、限定機能を有する変異体を用いた治療により引き出され得る。一実施形態では、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインアゴニスト（模倣物）として、あるいはＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインアンタゴニストとして機能するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の変異体は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の変異体、例えば切頭化変異体の組合せライブラリーをスクリーニングすることにより、同定され得る。一実施形態では、ＴＨＡＰファミリー変異体の多様化ライブラリーは、核酸レベルでの組合せ変異法により生成され、多様化遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＴＨＡＰファミリー変異体の多様化ライブラリーは、縮重組の潜在的ＴＨＡＰファミリー配列が個々のポリペプチドとして、あるいはその中にＴＨＡＰファミリー配列組を含有する一組の巨大融合タンパク質（例えばファージ表示のために）として発現可能であるよう、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に結繋することにより生成され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ＴＨＡＰファミリー変異体のライブラリーを生成するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機で実施され、次に合成遺伝子は適切な発現ベクターに結繋され得る。縮重組の遺伝子の使用は、所望組の潜在的ＴＨＡＰファミリー配列をコードする配列の全ての、一混合物中での、提供を可能にする。
さらに、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質コード配列の断片のライブラリーを用いて、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の変異体のスクリーニングおよびその後の選択のためにＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン断片の多様化集団を生成し得る。一実施形態では、分子当たり約１回だけニッキングが起きる条件下で、ＴＨＡＰファミリーコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して、異なるニック化産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを生成して、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成二重鎖から一本鎖部分を除去し、そしてその結果生じた断片ライブラリーを発現ベクターに結繋することにより、コード配列断片のライブラリーが生成され得る。この方法により、種々のサイズのＴＨＡＰファミリータンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーが得られる。
修飾ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質は、治療的または予防的効能、あるいは安定性（例えばｅｘ ｖｉｖｏ有効期間およびｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解に対する耐性）を強化するといった目的のために用いられ得る。このような修飾ペプチドは、天然に生じる形態のタンパク質の少なくとも１つの活性を保有するよう意図される場合、本明細書中でさらに詳細に記載されるＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の機能的等価物と考えられる。このような修飾ペプチドは、例えばアミノ酸置換、欠失または付加により生成され得る。
ペプチドのアミノ酸配列中の変化が機能性ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインホモログ（例えばそれが野生型形態を模倣するかまたは拮抗するよう作用するという意味で機能的である）を生じるか否かは、野生型ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質と類似の様式で細胞中で応答を生じるか、あるいはこのような応答を競合的に抑制する変異体ペプチドの能力を評価することにより、用意に決定され得る。１以上置換が起きていたペプチドは、同一方式で容易に試験され得る。
本発明はさらに、本発明に開示されたＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の組合せ変異体ならびに切頭化および断片化変異体の組の生成方法を意図しており、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン−標的タンパク質との結合に際しては機能的であるが、しかし例えば効能、効力および／または細胞内半減期が野生型形態のタンパク質と異なる潜在的変異体配列を同定するために特に有用である。このような組合せライブラリーをスクリーニングするための一目的は、例えば野生型タンパク質の生物学的活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し、あるいは新規の活性全てを一緒に保有する新規のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインホモログを単離することである。例えば突然変異誘発は、細胞内半減期が対応する野生型タンパク質と劇的に異なるＴＨＡＰファミリーホモログを生じ得る。変更タンパク質は、ＴＨＡＰファミリータンパク質の崩壊を、またはそうでなければ不活性化を生じるタンパク質分解またはその他の細胞過程に対してより安定にさせるかより安定性を低くさせ得る。このようなＴＨＡＰファミリーホモログ、ならびにそれらをコードする遺伝子は、組換えタンパク質の半減期を調整することにより、特定の組換えＴＨＡＰファミリータンパク質に関する発現の外被を変更するために利用され得る。例えば短い半減期は、特定の組換えＴＨＡＰファミリータンパク質に関連したより一過性の生物学的作用を生じ、誘導可能発現系の一部である場合、細胞内の組換えタンパク質レベルのよりしっかりした制御を可能にする。上記のようにこのようなタンパク質および特にそれらの組換え核酸構築物は、遺伝子療法プロトコールに用いられ得る。
この方法の例証的実施形態では、ＴＨＡＰファミリーホモログまたはその他の関連タンパク質の集団に関するアミノ酸配列が、好ましくは最高相同性を助長することができるよう整列される。変異体のこのような集団としては、例えば１つまたは複数の種からのＴＨＡＰファミリーホモログ、あるいは同一種（しかし突然変異のために異なる）からのＴＨＡＰファミリーホモログが挙げられる。整列配列の各位置に出現するアミノ酸は、組合せ配列の縮重組を作るよう選択される。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ＴＨＡＰファミリーホモログのライブラリーが生成され得る多数の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で実行され、次に合成遺伝子は発現のための適切なベクターに結繋され得る。縮重組の遺伝子の目的は、所望組の潜在的ＴＨＡＰファミリー配列をコードする配列の全てを、一混合物中で、提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野で既知である（例えばNarang, SA (1983) Tetrahedron 393; Itakura
et al. (1981) RecombinantDNA, Proc 3rdCleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp.273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al.(1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477参照）。このような技法は、他のタンパク質の定方向進化に用いられてきた（例えばScott et al. (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al. (1992) PNAS89: 2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990)PNAS 87: 6378-6382；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号および第５，０９６，８１５号参照）。
あるいは他の形態の変異法が利用されて、特に他の天然に生じるホモログが未だシーケンシングされたことのない組合せライブラリーを生成し得る。例えばＴＨＡＰファミリーホモログ（アゴニストおよびアンタゴニスト形態の両方）は、例えばアラニン走査変異法等を用いてスクリーニングすることにより（Ruf et al. (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang et al. (1994) JBiol. Chem. 269: 3095-3099; Balint et al. (1993) Gene 137: 109-118; Grodberg etal. (1993) Eur. J Biochem. 218: 597-601; Nagashima et al. (1993) J Biol. Chem.268: 2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30: 10832-10838;および Cunningham et al. (1989) Science 244: 1081-1085）、リンカー走査変異法により（Gustin et al. (1993) Virology 193: 653-660; Brown et al. (1992) Mol.Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232: 316）、飽和変異法により（Meyers et al. (1986) Science 232: 613）、ＰＣＲ変異法により（Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1: 1-19）、あるいはランダム変異法により（Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHIPress, Cold Spring Harbor, NY;およびGreener et al. (1994)Strategies in Mol Biol 7: 32-34）、生成され、ライブラリーから単離され得る。
点突然変異により作製された組合せライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、ならびにある種の特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、広範な種々の技法が当該技術分野で既知である。このような技法は一般に、ＴＨＡＰファミリータンパク質の組合せ変異法により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングのために適合可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に用いられる技法は、典型的には、複製可能な発現ベクター中で遺伝子ライブラリをクローニングし、その結果生じるベクターライブラリで適切な細胞を形質転換し、そして所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの相対的に容易な単離を促す条件下で組合せ遺伝子を発現させることを含む。
下記の例証的アッセイはそれぞれ、組合せ変異法により作製された多数の縮重ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン配列をスクリーニングするために必要な場合、高処理量（high through-put）分析に対応することができる。一スクリーニングアッセイでは、候補遺伝子産物は、細胞またはウイルス粒子の表面に表示され、この遺伝子産物を介してＴＨＡＰファミリー標的分子（タンパク質またはＤＮＡ）と結合する特定細胞またはウイルス粒子の能力が、「パニングアッセイ」で検出される。例えば遺伝子ライブラリーは、細菌細胞の表面膜タンパク質に関する遺伝子中にクローン化され、その結果生じた融合タンパク質がパニングにより検出される（Ladner et al., WO 88/06630; Fuchs et al. (1991) Biol Technology 9:1370-1371およびGoward et al. (1992) TIBS 18: 136-140）。同様に、蛍光標識ＴＨＡＰファミリー標的を用いて、潜在的機能性ＴＨＡＰファミリーホモログについて評価し得る。細胞は、蛍光顕微鏡下で視覚的に検査されて分離されるか、あるいは細胞の形態学的に可能であれば、蛍光活性化細胞選別機により分離され得る。
代替的実施形態では、遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子の表面で融合タンパク質として発現される。例えば糸状ファージ系では、外来ペプチド配列は感染性ファージの表面で発現され、それにより２つの有意の利点を付与する。第一に、これらのファージは極高濃度でアフィニティーマトリックスに適用されるため、多数のファージが一度にスクリーニングされ得る。第二に、各感染性ファージはその表面に組合せ遺伝子産物を表示するため、特定のファージが低収率でアフィニティーマトリックスから回収された場合、ファージはもう１回感染されることにより増幅され得る。ウイルス粒子の最終的パッケージングを崩壊することなく融合タンパク質を生成するために、ファージｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩコートタンパク質のいずれかが用いられ得る場合、ほとんど同一のエシェリヒア・コリ糸状ファージＭ１３、ｆｄおよびｆｌの群が、ファージ表示ライブラリーに最も高頻度に用いられる（Ladner et al. ＰＣＴ公開公報ＷＯ９０／０２９０９；Gerrard etal., ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０９６９０；Marks et al. (1992) J Biol.Chem. 267: 16007-16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Clackson etal. (1991) Nature 352: 624-628;およびBarbas et al. (1992)PNAS 89: 4457-4461）。例証的実施形態では、ＴＨＡＰファミリー組合せライブラリーの発現に用いるために、組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、ファルマシア(Pharmacia)カタログ番号２７−９４００−０１）が容易に修飾され、ＴＨＡＰファミリーファージライブラリーが固定ＴＨＡＰファミリー標的化分子上でパニングされ得る（グルタチオン固定ＴＨＡＰファミリー標的−ＧＳＴ融合タンパク質または固定化ＤＮＡ）。繰り返しファージ増幅し、パニングすると、ＴＨＡＰファミリーホモログが非常に濃化されるが、これは、ＴＨＡＰファミリー標的と結合する能力を保持し、そしてその後アゴニストとアンタゴニスト間を区別するために、自動化アッセイで生物学的活性に関してさらにスクリーニングされ得る。
本発明は、ＴＨＡＰファミリー標的分子（タンパク質またはＤＮＡ）と本発明のポリペプチドとの結合を切断することができるＴＨＡＰファミリードメイン、特に模倣物（例えばペプチドまたは非ペプチド作用物質）を生成するための、ＴＨＡＰファミリーのＴＨＡＰドメインの機能的最小サイズの確認またはそのサイズへの低減も提供する。したがって、上記のような変異法は、例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン標的タンパク質またはＤＮＡとの結合に関与するタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用に関わるＴＨＡＰファミリータンパク質の決定因子をマッピングするためにも有用である。例証するために、ＴＨＡＰファミリー標的の分子認識に関与するＴＨＡＰファミリータンパク質の重要な残基が決定され、ＴＨＡＰファミリー標的とのＴＨＡＰファミリータンパク質の結合を競合的に抑制するＴＨＡＰファミリー標的−１３Ｐ−由来ペプチド模倣物を生成するために用いられ得る。例えば、ＴＨＡＰファミリー標的を結合するのに関与する特定のＴＨＡＰファミリータンパク質のアミノ酸残基をマッピングするために走査変異法を用いることにより、ペプチド模倣性化合物が生成され得るが、これらは、ＴＨＡＰファミリー標的との結合においてそれらの残基を模倣し、そしてＴＨＡＰファミリー標的分子とのＴＨＡＰファミリータンパク質の結合を抑制することにより、１つまたは複数の遺伝子の転写調節におけるＴＨＡＰファミリータンパク質の機能を妨害し得る。このような残基の非加水分解性ペプチドアナログは、例えば、以下のものを用いて生成され得る。
後−逆ペプチド（例えば米国特許第５，１１６，９４７号および第５，２１９，０８９号、ならびにPallai etal. (1983) Int J Pept Protein Res 21: 84-92参照）、
ベンゾジアゼピン（例えばFreidinger et al. in Peptides: Chemistryand Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照）、
アゼピン（例えばHuffman et al. in Peptides: Chemistry andBiology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照）、
置換γラクタム環（Garvey et al. inPeptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall
ed., ESCOM Publisher: Leiden,Netherlands, 1988）、
ケト−メチレン擬似ペプチド（Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29: 295；およびEwenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings ofthe 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland,IL, 1985）、
Ｐ−ターンジペプチドコア（Nagai et al. (1985) Tetrahedron Left 26:647;およびSato
et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:123 1）、ならびに
Ｐ−アミノアルコール（Gordon et al. (1985) Biochem Biophys ResCommun 126: 419;およびDann et al. (1986) Biochem BiophysRes Commun 134: 71）
単離ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質、あるいはその一部分または断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技法を用いて、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質を結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。完全長ＴＨＡＰファミリータンパク質を用いてもよく、あるいは本発明は、免疫原として用いるためのＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の抗原性ペプチド断片を提供する。少なくとも１つの抗原決定基を含む、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の任意の断片を用いて、抗体を生成し得る。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の抗原性ペプチドは、配列番号１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、そして該ペプチドに対して産生された抗体が、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質と特異的免疫複合体を形成するよう、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質のエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも１０アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置する、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の領域（例えば親水性領域）である。
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質免疫原は、典型的には、免疫原で適切な被験体（例えばウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳類）を免疫感作することにより抗体を調製するために用いられる。適切な免疫原性調製物は、例えば組換え的発現ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質、あるいは化学合成ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドを含み得る。調製物はさらに、アジュバント（例えばフロイント完全または不完全アジュバント）、あるいは同様の免疫刺激剤を含み得る。免疫原性ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質調製物による適切な被験体の免疫感作は、ポリクローナル抗ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質抗体応答を誘導する。
本発明は、配列番号１〜１１４の、アミノ酸位置１〜約９０からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００または１００より多いアミノ酸連続スパンを有するポリペプチドを含むエピトープと、選択的に結合可能か、または選択的に結合する、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体組成物に関する。本発明は、変異型ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質と、あるいは変異型ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質のエピトープを含むその断片または変異体と特異的に結合可能な、精製または単離抗体にも関する。
オリゴマー形態のＴＨＡＰ１
本発明のある種の実施形態は、オリゴマー、例えば二量体、三量体またはそれ以上の多量体のオリゴマーの形態でのＴＨＡＰ１ポリペプチドを包含する。オリゴマーは、例えば異なるＴＨＡＰ１ポリペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合により生成され得る。その他の実施形態では、オリゴマーは、ＴＨＡＰ１ポリペプチドに融合されたペプチド部分間の共有結合または非共有的相互作用により連結される、２〜４のＴＨＡＰ１ポリペプチドを含む。このようなペプチド部分は、ペプチドリンカー（スペーサー）、あるいはオリゴマー形成を促進するという特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパーおよび抗体由来のある種のポリペプチドは、それに結合されるＴＨＡＰ１ポリペプチドのオリゴマー化を促進し得るペプチドの１つである。ＴＨＡＰ１オリゴマーまたはこのようなオリゴマーの構成成分である融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が、本明細書中で提供される。
本発明の一実施態様では、オリゴマーＴＨＡＰ１は、ペプチドリンカーを介して連結される、２つまたはそれ以上のＴＨＡＰ１ポリペプチドを含み得る。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号に記載されたペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーにより分離される複数のＴＨＡＰ１ポリペプチドを含む融合タンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技法を用いて製造され得る。
ＴＨＡＰ１オリゴマーの別の調製方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促すペプチドである。ロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で最初に同定され（Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988）、以来、種々の異なるタンパク質中に見出されてきた。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する、天然型のペプチドおよびそれらの誘導体が含まれる。ＴＨＡＰ１オリゴマーを生成するのに適したロイシンジッパードメインの例は、国際公開番号ＷＯ９４／１０３０８に記載されたものである。溶液中で二量体化または三量体化するペプチドに融合されたＴＨＡＰ１ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、その結果生じる可溶性オリゴマーＴＨＡＰ１が培養上清から回収される。
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＨＡＰ１の二量体は、ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１とのＴＨＡＰ１の結合に実質的に影響を及ぼさない方法で、抗体由来のＦｃ領域ポリペプチドにＴＨＡＰ１を融合することにより作製される。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（例えばＦｃ領域）に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenazi et al. (1991) PNAS 88: 10535、Byrnet al. (1990) Nature 344: 667およびHollenbaugh and Aruffo“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, in Current Protocols inImmunology, Supp. 4, pages 10.19.1-10.19.11, 1992に記載されている。ＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合タンパク質は、非常に類似した抗体分子を組み立て、その上に、ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成され、二価ＴＨＡＰ１を産生する。ＴＮＦ受容体およびＦｃの、同様の融合タンパク質（例えばMoreland et al. (1997) N. Engl. J. Med. 337(3): 141-147; van derPoll et al. (1997) Blood 89(10): 3727-3734;およびAmmann etal. (1997) J. Clin. Invest. 99(7): 1699-1703参照）が、慢性関節リウマチを治療するために首尾よく用いられてきた。可溶性誘導体も、免疫グロブリン定常（Ｆｃ）部に融合された細胞表面糖タンパク質の細胞外ドメインからなる免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー中の細胞表面糖タンパク質から製作された（例えばCapon, D.J. et al. (1989) Nature 337: 525-531ならびにCapon 米国特許第５，１１６，９６４号および第５，４２８，１３０号（ＣＤ４−ＩｇＧ１構築物）；Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730（ＣＤ２８−ＩｇＧ１構築物およびＢ７−１−ＩｇＧ１構築物）；ならびにLinsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 561-569ならびに米国特許第５，４３４，１３１号（ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ１）参照）。このような融合タンパク質は、受容体−リガンド相互作用を調節するのに有用であることが立証された。
いくつかの実施形態は、ＴＨＡＰ−免疫グロブリン融合タンパク質、および免疫グロブリン分子またはその断片とのＴＨＡＰ ＳＬＣ−結合ドメイン融合物に関する。このような融合物は、標準的方法を用いて、例えば抗体ポリペプチドと融合されたＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合タンパク質ＴＨＡＰ１をコードする発現ベクターを作製し、そして適切な宿主細胞中に該ベクターを挿入することにより生成され得る。適切なＦｃポリペプチドの一つは、ヒトＩｇＧ１由来ネイティブＦｃ領域ポリペプチドであって、これは国際公開番号ＷＯ９３／１０１５１に記載されている。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号に記載されているＦｃ突然変異タンパク質である。突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、国際公開番号ＷＯ９３／１０１５１に示されたネイティブＦｃ配列のものと同一であるが、但し、アミノ酸１９はＬｅｕからＡｌａに変えられ、アミノ酸２０はＬｅｕからＧｌｕに変えられ、そしてアミノ酸２２はＧｌｙからＡｌａに変えられていた。この突然変異タンパク質Ｆｃは、免疫グロブリン受容体に対する親和性低減を示す。
完全タンパク質よりむしろ、ヒトＴＨＡＰ１のＳＬＣ結合断片が本発明の方法に用いられ得る。断片は、対応する全長タンパク質より低免疫原性であり得る。ケモカインＳＬＣと結合する断片の能力は、標準アッセイを用いて決定され得る。断片は、多数の慣用的方法のいずれかにより調製され得る。例えば、所望のＤＮＡ配列は化学的に合成されるか、または完全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化により生成され、アガロースゲル上での電気泳動により分離され得る。制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するリンカーは、発現ベクター中に所望のＤＮＡ断片を挿入するために用いられ、あるいは断片は天然に存在する切断部位で消化され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も、所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を単離するために用いられ得る。所望の断片の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ手法における５’および３’プライマーとして用いられる。さらに、既知の変異技法を用いて、所望の部位に、例えば所望の断片の最終アミノ酸に関するコドンの直下流に、停止コドンを挿入することができる。
その他の実施形態では、ＴＨＡＰ１またはその生物学的活性断片、例えばＴＨＡＰ１のＳＬＣ結合ドメインは、抗体重鎖または軽鎖の可変部の代わりに置換され得る。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方で作製される場合、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または９つより多いＴＨＡＰ１ポリペプチドを有するＴＨＡＰ１オリゴマーを形成可能である。
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＨＡＰ−ＳＬＣ結合は、ＳＬＣの生物学的利用能を低減するために、またはそうでなければＳＬＣの活性を崩壊するために用意され得る。例えば本発明のＴＨＡＰファミリーポリペプチド、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＳＬＣ結合ドメイン、ＴＨＡＰオリゴマー、およびＳＬＣ結合ドメイン−ＴＨＡＰ１−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＳＬＣと相互作用し、それによりそれが正常生物学的役割を果たさないようにするために用いられ得る。いくつかの実施形態では、完全ＴＨＡＰ１ポリペプチド（配列番号３）を用いて、ＳＬＣと結合し得る。他の実施形態では、ＴＨＡＰ１の断片、例えばＴＨＡＰ１のＳＬＣ結合ドメイン（配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３）を用いて、ＳＬＣと結合し得る。このような断片は、配列番号３の少なくとも８から、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０または少なくとも２１３連続アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、断片は（配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３の）少なくとも８から、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０連続アミノ酸であり得る。ＳＬＣと結合可能なＴＨＡＰファミリーポリペプチド、例えばＴＨＡＰ２〜１１およびＴＨＡＰ０、またはその生物学的活性断片も、ＳＬＣと結合するために用いられ、その生物学的利用能を低減するかまたはそうでなければこのケモカインの活性を崩壊させる。
いくつかの実施形態では、複数のＴＨＡＰファミリータンパク質、例えば２つまたはそれ以上のＴＨＡＰ１タンパク質またはＳＬＣ結合ドメイン（配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３）を含むその断片の融合物を用いて、ＳＬＣと結合することができる。例えば、配列番号３（のアミノ酸１４３〜２１３）の少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０連続アミノ酸のサイズのＴＨＡＰ１断片を含むオリゴマーが生成され得る。ＴＨＡＰ１オリゴマーを構成するアミノ酸断片は、同一のまたは異なる長さを有する。いくつかの実施形態では、完全ＴＨＡＰ１タンパク質またはその生物学的活性部位は、一緒に融合されて、ＳＬＣと結合可能なオリゴマーを形成し得る。ＳＬＣと結合可能なＴＨＡＰファミリーポリペプチド、例えばＴＨＡＰ２〜１１およびＴＨＡＰ０、配列番号１６〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその生物学的活性断片も、その生物学的利用能を低減するかまたはそうでなければこのケモカインの活性を崩壊させるために、ＳＬＣと結合するオリゴマーを作製するために用いられ得る。
本発明の別の実施形態によれば、ＴＨＡＰファミリータンパク質、例えばＴＨＡＰ１またはＳＬＣ結合ドメイン（配列番号３のアミノ酸１４３〜２１３）を含むＴＨＡＰ１の一部分は、免疫グロブリンまたはその一部分と融合される。該一部分は、全免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＥであり得る。さらに免疫グロブリンの一部分、例えば免疫グロブリンのＦｃドメインは、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド（例えばＴＨＡＰ１、その断片またはそのオリゴマー）と融合され得る。ＴＨＡＰ１の断片は、例えば配列番号３（アミノ酸１４３〜２１３）の少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０連続アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＬＣと結合可能なＴＨＡＰファミリーポリペプチド、例えばＴＨＡＰ２〜１１およびＴＨＡＰ０、配列番号１６〜１１４のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその生物学的活性断片も、その生物学的利用能を低減するかまたはそうでなければこのケモカインの活性を崩壊させるために、ＳＬＣと結合する免疫グロブリン融合物を形成するために用いられ得る。
本発明の別の態様に従って、本発明のＴＨＡＰファミリーポリペプチド、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＳＬＣ結合ドメイン、ＴＨＡＰオリゴマーおよびＳＬＣ結合ドメイン−ＴＨＡＰ１−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に含まれ得る。このような薬学的組成物は、ＳＬＣの生物利用能および機能性を低減するために用いられ得る。例えば本発明のＴＨＡＰファミリーポリペプチド、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＳＬＣ結合ドメイン、ＴＨＡＰオリゴマーおよびＳＬＣ結合ドメイン−ＴＨＡＰ１−免疫グロブリン融合タンパク質は、細胞の表面でのＳＬＣとその受容体（例えばＣＣＲ７）との
間の相互作用を抑制し、それによりＳＬＣ媒介性応答を抑圧するために、被験体に投与され得る。ケモカインＳＬＣの抑制は、炎症性または増殖性障害の治療のために、ならびに細胞分化、細胞増殖および／または細胞死を調節する（例えば促進または抑制する）ために、治療上有用であり得る。
本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＴＨＡＰファミリーポリペプチド、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＳＬＣ結合ドメイン、ＴＨＡＰオリゴマー、およびＳＬＣ結合ドメイン−ＴＨＡＰ１−免疫グロブリン融合タンパク質は、生物学的試料中の、ならびにスクリーニングアッセイにおけるＳＬＣの存在を検出して、ＴＨＡＰ１とＳＬＣの相互作用を抑制する分子を同定するために用いられ得る。このようなスクリーニングアッセイは、ＰＡＲ４−ＴＨＡＰ相互作用に関して以下に記載されるものと同様である。
本発明のある種の態様は、ＴＨＡＰ媒介性活性を調節する試験化合物を同定する方法に関する。いくつかの場合、ＴＨＡＰ媒介性活性は、ＳＬＣ結合である。ＴＨＡＰ−ＳＬＣ結合に影響を及ぼす試験化合物は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその生物学的活性断片が試験化合物と接触されるスクリーニング方法を用いて同定され得る。いくつかの実施形態では、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。試験化合物がＳＬＣとＴＨＡＰファミリーポリペプチド、例えばＴＨＡＰ１（配列番号３）の結合を調整するか否かは、試験化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはその生物学的活性断片の活性を調整するか否かを決定することにより、決定される。ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの生物学的活性断片は、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０または少なくとも２２０より長いアミノ酸長であり得る。試験化合物が上記ポリペプチドの活性を調節すると決定することは、試験化合物がＴＨＡＰ媒介性活性のモジュレーターの候補であることを示す。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチド、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＳＬＣ結合ドメイン、ＴＨＡＰオリゴマーおよびＳＬＣ結合ドメイン−ＴＨＡＰ１免疫グロブリン融合タンパク質は、上記のＳＬＣ相互作用のために用いられ得るが、しかしＴＨＡＰファミリーポリペプチド、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＳＬＣ結合ドメイン、ＴＨＡＰオリゴマーおよびＳＬＣ結合ドメイン−ＴＨＡＰ１免疫グロブリン融合タンパク質のホモログを、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのＳＬＣ結合ドメイン、ＴＨＡＰオリゴマーおよびＳＬＣ結合ドメイン−ＴＨＡＰ１免疫グロブリン融合タンパク質の代わりに用いてもよいと理解される。例えば、配列番号１〜１１４のアミノ酸配列またはその一部分と少なくとも約３０〜４０％の同一性、好ましくは少なくとも約４０〜５０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約５０〜６０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０〜７０％、７０〜８０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．８％の同一性を有するホモログが用いられ得る。
プライマーおよびプローブ
本発明のプライマーおよびプローブは、任意の適切な方法により、例えば適切な配列のクローニングおよび制限、ならびにNarangSA等（Methods Enzymol 1979; 68: 90-98）のホスホジエステル法、Brown EL等（Methods Enzymol 1979; 68: 109-151）のホスホジエステル法、Beaucage等（Tetrahedron Lett 1981, 22:1859-1862）のジエチルホスホラミダイト法、およびＥＰ ０ ７０７ ５９２に記載された固体支持体法のような方法による直接化学合成により、調製され得る。
検出プローブは一般に、核酸配列または非荷電核酸アナログ、例えば国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２に開示されているペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，５０６号および第５，１４２，０４７号に記載されているモルホリノアナログである。所望により、プローブは、付加的ｄＮＴＰが該プローブに付加されることがないように、「延長不可能」にされ得る。アナログ自体が、通常は延長不可能であり、ヒドロキシル基が延長に関与できないように、核酸プローブはプローブの３’末端を修飾されることにより伸長不可能にされ得る。例えばプローブの３’末端は、捕捉または検出標識で機能化され、それによりヒドロキシル基を使い果たす（consume）か、または遮断する。
所望により、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検出可能であることが当該技術分野で既知である任意の標識を組入れることにより、本発明の任意のポリヌクレオチドが標識され得る。有用な標識としては例えば、放射性物質（例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）、蛍光染料（例えば５−ブロモデソキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）、またはビオチンが挙げられる。好ましくは、ポリヌクレオチドは３’および５’末端で標識される。核酸断片の非放射性ラベリングの例は、Urdea et al.（Nucleic Acids Research. 11:4937-4957, 1988）またはSanchez-Pescador et al.（J. Clin. Microbiol. 26(10): 1934-1938, 1988）に記載されている。さらに、本発明によるプローブは、シグナル増幅を可能にするような構造的特徴を有し、このような構造的特徴は、例えばUrdea et al（Nucleic Acids Symp. Ser. 24:197-200, 1991）あるいは欧州特許第ＥＰ０ ２２５ ８０７号（Chiron）に記載された分枝鎖ＤＮＡプローブである。
標識は、固体支持体上に、プライマーまたはプライマー延長産物（例えば増幅ＤＮＡ）の固定を促すように、プライマーを捕捉するためにも用いられ得る。捕捉標識は、プライマーまたはプローブに結合され、固相試薬の特異的結合成員（例えばビオチンおよびストレプトアビジン）と結合対を形成する特異的結合成員であり得る。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブにより保有される標識の種類によって、それは標的ＤＮＡを捕捉、または検出するために用いられ得る。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それら自体、捕捉標識となると理解される。例えば固相試薬の結合成員が核酸配列である場合、それはプライマーまたはプローブの相補的部分と結合し、それによりプライマーまたはプローブを固相に固定するように選択され得る。ポリヌクレオチドプローブそれ自体が結合成員となる場合、プローブは標的と相補的でない配列または「尾（tail）」を含むと当業者は理解する。ポリヌクレオチドプライマーそれ自体が捕捉標識となる場合、プライマーの少なくとも一部分は、固相上で核酸とハイブリダイズするために遊離している。ＤＮＡラベリング法は当業者に既知である。
本発明のプローブは多数の用途に有用である。それらは、特にゲノムＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションに用いられ得る。プローブは、ＰＣＲ増幅産物を検出するためにも用いられ得る。それらは、他の技法を用いて、ＴＨＡＰファミリー遺伝子またはｍＲＮＡ中のミスマッチを検出するためにも用いられ得る。
本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれかは、固体支持体上に固定され得るので便利である。固体支持体は当業者に既知であり、例としては、反応トレーのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、微小粒子（例えばラテックス粒子）、ヒツジ（または他の動物）の赤血球、硬膜細胞（duracyte）等が挙げられる。固体支持体は本質ではなく、当業者により選択され得る。したがってラテックス粒子、微小粒子、磁気または非磁気ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウエルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の適切な動物）の赤血球およびduracyteが適切な例である。固相上に核酸を固定するための適切な方法としては、イオン性、疎水性、共有的相互作用等が挙げられる。固体支持体とは、本明細書中で用いられる場合、不溶性であるか、あるいはその後の反応により不溶性にされ得る任意の物質を意図する。固体支持体は、捕捉試薬を引き付けて固定するその固有の能力によって選択され得る。あるいは固相は、捕捉試薬を引き付けて固定する能力を有する付加的受容体を有し得る。付加的受容体としては、捕捉試薬それ自体に、または捕捉試薬に接合された帯電物質に対して相対して帯電される帯電物質が挙げられる。さらに、受容体分子は、固体支持体上に固定（結合）され、そして特異的結合反応により捕捉試薬を固定する能力を有する任意の特異的結合成員であり得る。受容体分子は、アッセイの実施前または実施中に、固体支持物質への捕捉試薬の間接的結合を可能にする。したがって固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気または非磁気金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターウエル、シート、ビーズ、微小粒子、チップ、ヒツジ（またはその他の適切な動物）の赤血球、duracyte、ならびに当業者に既知のその他の形態であり得る。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブは、個々に固体支持体上に結合または固定されるか、あるいは本発明の少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０または２５のポリヌクレオチド群で、単一固体支持体に結合または固定され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドは、１つまたは２以上の本発明のポリヌクレオチドと同一の固体支持体に結合され得る。
本明細書中に提供された任意のポリヌクレオチドは、固体支持体上の重複領域に、またはランダム位置に結合され得る。あるいは本発明のポリヌクレオチドは、各ポリヌクレオチドが任意の他のポリヌクレオチドの結合部位と重複することなく、固体支持体の別個の領域に規則正しい配置で結合され得る。好ましくは、このポリヌクレオチドの規則正しい配置は、別個の位置が記録されてアッセイ手法の一部としてアクセスされ得る場合、「アドレッサブル」であるよう意図される。アドレッサブルポリヌクレオチドアレイは典型的には、種々の既知の位置における基質の表面に結合される、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置についての精確な位置に関する知見は、これらの「アドレッサブル」アレイを、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用にする。当該技術分野で既知の任意のアドレッサブルアレイ技術は、本発明のポリヌクレオチドとともに用いられ得る。これらのポリヌクレオチドアレイの特定の一実施形態は遺伝子チップとして既知であり、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴＷＯ９０／１５０７０および９２／１００９２に一般的に記載されている。
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログをコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
ベクターは、本発明の組換えタンパク質の調製における使用、あるいは遺伝子療法における使用のための、特定の用途を有し得る。この遺伝子療法は、疾患の治療においてアポトーシスを調節するために、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログを被験体に送達するための一手段を提供する。
本明細書中で用いられる場合、「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を送達することができる核酸分子を指す。ベクターの一態様は「プラスミド」であり、これは付加的ＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウイルスベクターであり、この場合には付加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自律的に複製することが可能である（例えば複製の細菌起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞中に導入された場合に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらにある種のベクターは、それらが操作可能的に連結された遺伝子の発現を指図することができる。このようなベクターは、「発現ベクター」として本明細書中で言及される。概して、組換えＤＮＡ技術において有用性を有する発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的な使用形態であるので、互換可能的に用いられ得る。しかしながら本発明は、等価機能物として作用するその他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むよう意図される。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主中での核酸の発現に適した形態で本発明のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン核酸を含み、このことはは、組換え発現ベクターが
、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に操作可能的に連結される１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて「操作可能的に連結される」とは、当該ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現が可能になるように、（例えばｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、あるいはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で）調節配列（単数または複数）に連結されることを意味する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むよう意図される。このような調節配列は、例えばGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多数の型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、ならびにある種の宿主細胞中だけでのヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベル等といった因子に応じて設計されると当業者は理解する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより本明細書中に記載された核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド、例えば融合タンパク質またはペプチドを生成し得る（例えばＴＨＡＰファミリータンパク質、変異体形態のＴＨＡＰファミリータンパク質、融合タンパク質、または前記タンパク質のいずれかの断片等）。
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログの発現のために設計され得る。例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質は、細菌細胞（例えばエシェリヒア・コリ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現され得る。適切な宿主細胞は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, Calif. (1990)でさらに考察されている。あるいは組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏで転写され、翻訳され得る。
原核生物でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指図する構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、エシェリヒア・コリ中で最も高頻度に実行される。融合ベクターは、そこでコードされるタンパク質に（通常は組換えタンパク質のアミノ末端に）多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは典型的には、以下の３つの用途を有する：１）組換えタンパク質の発現を増大する；２）組換えタンパク質の溶解性を増大する；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助ける。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解性切断部位が融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合部分からの組換えタンパク質の分離と、その後の融合タンパク質の精製を可能にする。このような酵素、ならびにそれらのコグネイト認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B and Johnson, K. S.(1988) Gene67:31-40）、ｐＭＡＬ（New EnglandBiolabs, Beverly, Mass.）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N. J.）が挙げられ、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する。
精製融合タンパク質は、ＴＨＡＰファミリー活性アッセイ（例えば以下に詳細に記載される直接アッセイまたは競合的アッセイ）に、あるいは例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質に特異的な抗体を生成するために利用され得る。好ましい実施形態では、本発明のレトロウイルス発現ベクター中で発現されるＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン融合タンパク質は、骨髄細胞に感染させるために利用され、その後、該骨髄細胞は放射線処置レシピエントに移植され得る。次に十分な時間（例えば６週間）が経過した後、被験体レシピエントの病態が検査される。
適切な誘導性非融合エシェリヒア・コリ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Amann et
al.,(1988) Gene 69: 301-315）およびｐＥＴ １１ｄ（Studier et al., GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,Calif. (1990) 60-89）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写によって異なる。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーター（Ｔ７ ｇｎ １）からの転写によって異なる。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下のＴ７ｇｎ１遺伝子を保有する常在性プロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
エシェリヒア・コリにおける組換えタンパク質発現を最大にするための一戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現することである（Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128）。別の戦略は、各アミノ酸に関する個々のコドンがエシェリヒア・コリにおいて選択的に利用されるるよう、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変えることである（Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的ＤＮＡ合成技法により実行され得る。
別の実施形態では、ＴＨＡＰファミリー発現ベクターは酵母発現ベクターである。ビール酵母菌（Saccharomycescerevisiae菌)中での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）およびｐｉｃＺ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif.）が挙げられる。
あるいはＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39）が挙げられる。特に好ましい実施形態では、ＴＨＡＰファミリータンパク質は、Karniski et al, Am. J. Physiol. (1998) 275: F79-87に従って発現される。
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞中で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed, B. (1987) Nature 329: 840）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanet al. (1987) EMBO J. 6: 187-195）が挙げられる。哺乳類細胞中で用いられる場合、発現ベクターの制御機能が、ウイルス調節因子により用意されることが多い。例えば一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核生物および真核生物細胞の両方に関するその他の適切な発現系に関しては、Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: ALaboratory Manual. 2nd, ed., ColdSpring HarborLaboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989の第１６および１７章を参照されたい。別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において選択的に核酸の発現を指図することができる（例えば組織特異的調節因子が核酸を発現するために用いられる）。組織特異的調節因子は当該技術分野で既知であり、以下でさらに説明される。
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクター中においてクローン化される、本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＴＨＡＰファミリーｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするように、調節配列に操作可能的に連結される。種々の細胞型でのアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指図する、アンチセンス方向でクローン化された核酸に操作可能的に連結される調節配列（例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）が選択され、あるいはアンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現または細胞型特異的発現を指図する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で生成される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり、その活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察に関しては、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for geneticanalysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中では互換可能的に用いられる。このような用語は、特定の被験体細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫も意図すると理解される。特定の修飾が、突然変異または環境的影響のために次の世代で起こり得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一でないが、しかし本明細書中で用いられるような用語の範囲内に依然として含まれる。
宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物細胞であり得る。例えばＴＨＡＰファミリータンパク質は、細菌細胞、例えばエシェリヒア・コリ、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞またはヒト細胞）中で発現され得る。その他の適切な宿主細胞は当業者に既知であり、例えば実施例でさらに説明されるようなマウス３Ｔ３細胞が挙げられる。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション法により、原核生物または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で用いられる場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞中に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための種々の当該技術分野で認識されている技術、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム同時沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を指すよう意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Sambrook et al. ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd,ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., 1989)およびその他の実験マニュアルに見出され得る。
哺乳類細胞の安定トランスフェクションに関しては、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション法によって、細胞の小分画のみがそれらのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込み得ることが既知である。これらの組込み体を同定および選択するために、選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が一般に、対象となる遺伝子とともに宿主細胞中に導入される。好ましい選択可能マーカーとしては、薬剤（例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセート）に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択可能マーカーをコードする核酸は、ＴＨＡＰファミリータンパク質をコードするベクターと同一のベクター上で宿主細胞中に導入され得るか、あるいは別個のベクター上で導入され得る。導入核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定され得る（例えば選択可能マーカー遺伝子を組入れられた細胞は生存するが、一方他の細胞は死滅する）。
本発明の宿主細胞、例えば培養中の原核生物または真核生物宿主細胞は、ＴＨＡＰファミリータンパク質を生成する（即ち発現する）ために用いられ得る。したがって本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いたＴＨＡＰファミリータンパク質の生成方法を提供する。一実施形態では、該方法は、ＴＨＡＰファミリータンパク質が生成されるよう、適切な培地中で本発明の宿主細胞（ＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養することを含む。別の実施形態では、該方法はさらに、培地または宿主細胞からＴＨＡＰファミリータンパク質を単離することを含む。
別の実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを発現可能な細胞を用意すること、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質が生成されるよう、適切な培地中で前記細胞を培養すること、および培地または細胞からＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質を単離または精製することを含む方法を含む。
本発明の宿主細胞は、例えばＴＨＡＰファミリータンパク質が関与する疾患の研究のために、非ヒトトランスジェニック動物を生成するためにも用いられ得る。例えば一実施形態では、本発明の宿主細胞は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインコード配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。このような宿主細胞は次に、外因性ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン配列がそれらのゲノム中に導入された非ヒトトランスジェニック動物、あるいは内因性ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン配列が変更された相同組換え動物を作製するために用いられ得る。このような動物は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその断片の機能および／または活性を試験するために、そしてＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で用いる場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくは齧歯類、例えばラットまたはマウスであって、この場合、該動物の１つまたは複数の細胞が導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物のその他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発達し、成熟動物のゲノム中に存続し、それによりトランスジェニック動物の１つまたは複数の細胞型または組織中でのコード化遺伝子産物の発現を指図する細胞のゲノム中に組み込まれる外因性ＤＮＡである。本明細書中で用いられる場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであって、この場合、内因性ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン遺伝子は、動物の発達前に、内因性遺伝子と動物の細胞（例えば動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えにより変更された。特にマウスのような動物の胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物を生成するための方法は、当該技術分野では一般的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号（ともにLeder等）、米国特許第４，８７３，１９１号（Wagner等）ならびにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, （ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）に記載されている。
遺伝子療法ベクター
被験体に投与するための好ましいベクターは、既知の方法に従って構築され得る。ベクターは、標的化細胞中で核酸の発現を指図することができる調節因子（例えばプロモーター、エンハンサー等）を含む。したがってヒト細胞が標的とされる場合、ヒト細胞中で発現可能なプロモーターに隣接して、そしてその制御下で核酸コード領域を配置するのが好ましい。
種々の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長いターミナル反復、Ｐアクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼは、当該コード配列の高レベル発現を得るために用いられ得る。当該コード配列の発現を達成するための、当該技術分野で既知のその他のウイルスまたは哺乳類細胞または細菌ファージプロモーターの使用が同様に意図されるが、発現のレベルが所定の目的のために十分である必要がある。既知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の当該タンパク質の発現のレベルおよびパターンが最適化され得る。
特定の生理学的または合成シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導的発現を可能にし得る。例えば多シストロン性ベクターが利用される場合に、ベクターが生成される細胞に対して単数または複数の導入遺伝子の発現が毒性である場合、１つまたは複数の導入遺伝子の発現を妨げるかまたは低減するのが望ましい。導入遺伝子産物が毒性であり得るウイルスベクターの産生のために、いくつかの誘導的プロモーター系が利用可能である。
エクジソン（ecdysone）系（Invitrogen,Carlsbad, CA）は、このような系の１つである。この系は、哺乳類細胞中での当該遺伝子の調節発現を可能にするよう設計される。それは、導入遺伝子の事実上ＮＯ基本レベル発現であるが、しかし２００倍を超える誘導可能性を可能にするタイトに調節された発現メカニズムからなる。この系は、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソン受容体を基礎にしており、エクジソンまたはそのアナログ、例えばムリステロンＡが受容体と結合する場合、受容体はプロモーターを活性化して、下流導入遺伝子の発現を作動させて、高レベルのｍＲＮＡ転写体を得る与える。この系では、ヘテロ二量体受容体の両単量体が１つのベクターから構成的に発現され、一方、当該遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にある。したがって当該遺伝子移入ベクター中にこの種類の系を工学処理することが有用である。プロデューサー細胞株中に、当該遺伝子および受容体単量体を含有させるプラスミドの同時トランスフェクションは、潜在的毒性導入遺伝子の発現を伴うことなく遺伝子移入ベクターを生成することを可能にする。適切な時点で、導入遺伝子の発現は、エクジソンまたはムリステロンＡを用いて活性化され得る。有用である別の誘導性系は、Gossen とBujard （Gossenand Bujard, 1992; Gossen et al, 1995）により最初に開発されたＴｅｔ−ＯｆｆまたはＴｅｔ Ｏｎ系（Clontech, Palo Alto, CA）である。この系は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリンに応答して調節される高レベルの遺伝子発現も可能にする。Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、遺伝子発現はドキシサイクリンの存在下で作動され、一方、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系では、遺伝子発現はドキシサイクリンの非存在下で作動される。これらの系は、エシェリヒア・コリのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節因子を基礎にしている。即ち、テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質である。当該遺伝子は、その中に存在するテトラサイクリン応答因子を有するプロモーターの後ろのプラスミド中でクローン化される。二次プラスミドは、テトラサイクリン制御性トランスアクチベーターと呼ばれる調節因子を含有するが、これは、ＴｅｔＯｆｆ系中で、単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６ドメイン、および野生型テトラサイクリンリプレッサーからなる。
したがってドキシサイクリンの非存在下では、転写は構成的に進行する。Ｔｅｔ−ＯｎＴｍ系では、テトラサイクリンリプレッサーは野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化する。遺伝子療法ベクター生成に関しては、ＴｅｔＯｆｆ系が好ましく、したがってプロデューサー細胞はテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で増殖され、潜在的毒性導入遺伝子の発現を抑制し得るが、しかしベクターが患者に導入される場合、遺伝子発現は構成的に進行する。
いくつかの環境では、遺伝子療法ベクター中における導入遺伝子の発現を調節することが望ましい。例えば所望の発現のレベルによって、種々の強度の活性を有する異なるウイルスプロモーターが利用され得る。哺乳類細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターがしばしば用いられ、強力な転写活性を用意する。低効力性であるＣＭＶプロモーターの修飾バージョンも、導入遺伝子の発現レベルを低減させたい場合に用いられてきた。造血細胞中の導入遺伝子の発現が望ましい場合、レトロウイルスプロモーター、例えばＭＬＶまたはＭＭＴＶからのＬＴＲがしばしば用いられる。所望の作用によって用いられ得るその他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨｆＶ−２ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター、例えばＥＩＡ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域からのもの、ＡＡＶ ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫならびに鳥肉腫ウイルスが挙げられる。
同様に、組織特異的プロモーターは、非標的組織に対する潜在的毒性または望ましくない作用を低減させるために用いられ、特定の組織または細胞中での転写を実行することができる。例えばＰＳＡ、プロバシン、前立腺酸性ホスファターゼまたは前立腺特異的腺性カリクレイン（ｈＫ２）のようなプロモーターを用いて、前立腺中での遺伝子発現をターゲッティングし得る。同様に、以下のようなプロモーターを用いて、他の組織中での遺伝子発現をターゲッティングし得る。
組織特異的プロモーターとしては、以下のものが挙げられる：（ａ）膵臓：インスリン、エラスチン、アミラーゼ、ｐｄｒ−Ｉ、ｐｄｘ−Ｉ、グルコキナーゼ；（ｂ）肝臓：アルブミンＰＥＰＣＫ、ＨＢＶエンハンサー、αフェトタンパク質、アポリポタンパク質Ｃ、α−Ｉアンチトリプシン、ビテロゲニン、ＮＦ−ＡＢ、トランスチレチン；（ｃ）骨格筋：ミオシンＨ鎖、筋クレアチンキナーゼ、ジストロフィン、カルパインｐ９４、骨格α−アクチン、速筋トロポニン１；（ｄ）皮膚：ケラチンＫ６、ケラチンＫＩ；（ｅ）肺：ＣＦＴＲ、ヒトサイトケラチンＩＳ（Ｋ １８）、肺サーファクタントプロテインＡ、ＢおよびＣ、ＣＣ−１０、Ｐｉ；（ｆ）平滑筋：ｓｍ２２α、ＳＭ−α−アクチン；（ｇ）内皮細胞：エンドセリン−Ｉ、Ｅ−セレクチン、フォン・ウィルブランド因子、ＴＩＥ（Korhonen et al., 1995）、ＫＤＲ／ｆｌｋ−Ｉ；（ｈ）メラノサイト：チロシナーゼ；（ｉ）脂肪組織：リポタンパク質リパーゼ（Zechner et al., 1988）、アジプシン（Spiegelman etal., 1989）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Pape and Kim, 1989）、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（Dani et al., 1989）、脂肪細胞Ｐ２（Hunt et al., 1986）；（ｊ）血液：Ｐ−グロビン。
ある適応症では、遺伝子療法ベクターを投与してから特定時間後に転写を活性化するのが望ましい。これは、調節可能なホルモンまたはサイトカインであるプロモーターを用いて実行され得る。例えば、特定のステロイドが産生されるかまたは輸送される生殖腺組織における適応症に対する遺伝子療法適用では、アンドロゲンまたはエストロゲン調節プロモーターの使用は有益であり得る。調節可能なホルモンであるプロモーターとしては、ＭＭＴＶ、ＭＴ−１、エクジソンおよびルビスコ(RuBisco)が挙げられる。その他のホルモン調節性プロモーター、例えば甲状腺、下垂体および副腎ホルモンに応答性であるものは、本発明において有用であると予測される。用いられ得るサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫおよびＴキニノゲン（Kageyama et al., 1987）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ−反応性タンパク質（Arcone et al., 1988）、ハプトグロビン（Oliviero etal., 1987）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Poli and Cortese, 1989）、補体Ｃ３（Wilson et al.,1990）、ＩＬ−８、α−１酸性糖タンパク質（Prowseand Baumann, 1988）、α−１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Zechner et al., 1988）、アンギオテンシノーゲン（Ron etal., 1991）、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦα、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素により誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸により誘導される）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメリシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦにより誘導可能）、α−２マクログロブリンおよびα−Ｉアンチキモトリプシンが挙げられる。
細胞周期調節可能プロモーターは、本発明において有用であり得ると予見される。例えばバイ（bi）シストロン遺伝子療法ベクターにおいて、最初の遺伝子（例えばＧ１期に細胞を停止するｐ１６）の発現を駆動するための強力なＣＭＶプロモーターの使用の後に、細胞周期のＧ１期に活性であるプロモーターの制御下での二次遺伝子（、例えばｐ５３）の発現が続き、したがって、細胞をアポトーシスに導く「二次ヒット」を用意する。その他のプロモーター、例えば種々のサイクリン、ＰＣＮＡ、ガレクチン−３、Ｅ２ＦＩ、ｐ５３およびＢＲＣＡＩが用いられ得る。
腫瘍特異的プロモーター、例えばオステオカルシン、低酸素応答性因子（ＨＲＥ）、ＮＩＡＧＥ−４、ＣＥＡ、α−フェトタンパク質、ＧＲＰ７８／ＢｉＰおよびチロシナーゼも、腫瘍細胞における遺伝子発現を調節するために用いられ得る。本発明にしたがって用いられ得るその他のプロモーターとしては、Ｌａｃ−調節性、化学療法誘導性（例えばＭＤＲ）および熱（高熱）誘導性プロモーター、放射線照射誘導性（例えばＥＧＲ（Joki et al., 1995））、α−インヒビン、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩｔＲＮＡｍｅｔおよびその他のアミノ酸プロモーター、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ（Bartlett et al., 1996）、ＭＣ−１、ＰＧＫ、−アクチンおよびα−グロビンが挙げられる。有用であり得る多数のその他のプロモーターは、Waltherand Stein (1996)にリストされている。
上記のプロモーターのいずれかは、単独でまたは別のものと組合せされ、所望の作用により本発明に従って好ましく用いられ得ると予見される。
さらにプロモーターのこのリストは網羅的または限定的な例示であるとみなされるず、本明細書中に開示されたＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン核酸、および方法とともに用いられ得るその他のプロモーターが当業者に知られている。
１．エンハンサー
エンハンサーは、ＤＮＡの同一分子上の遠位に位置するプロモーターからの転写を増大する遺伝因子である。エンハンサーは、プロモーターと同じように組織化される。即ち、それらは多数の個々の因子からなり、その各々は１つまたは複数の転写タンパク質と結合する。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的区別は、操作可能性である。エンハンサー領域は全体として、一定距離で転写を刺激できなければならないが、プロモーター領域またはその構成成分因子にとってこれは必要とは言えない。他方で、プロモーターは、特定部位でそして特定配向でＲＮＡ合成の開始を指図する１つまたは複数の因子を有さなければならず、一方エンハンサーはこの特異性を有さない。プロモーターおよびエンハンサーはしばしば重複し、且つ連続的であり、しばしば非常によく似たモジュラー機構を有すると考えれる。
以下は、上記の組織特異的プロモーターに付加されるプロモーター、細胞性プロモーター／エンハンサー、ならびに発現構築物中の当該遺伝子をコードする核酸と組合せて用いられ得る誘導性プロモーター／エンハンサーのリストである（エンハンサーの一覧、ならびに表１）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）も、遺伝子の発現を駆動するために用いられ得る。真核生物細胞は、送達複合体の一部としてまたは付加的遺伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼが用意された場合、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写をサポートすることができる。
適切なエンハンサーとしては、以下のものが挙げられる：免疫グロブリン重鎖；免疫グロブリン軽鎖；Ｔ細胞受容体；ＨＬＡ ＤＱ（ｘおよびＤＱβ）；β−インターフェロン；インターロイキン−２；インターロイキン−２受容体；ＭＨＣクラスＩＩ５；ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲα；β−アクチン；筋クレアチンキナーゼ；プレアルブミン（トランスチレチン）；エラスターゼＩ；メタロチオネイン；コラゲナーゼ；アルブミン遺伝子；α−フェトタンパク質；−グロビン；β−グロビン；ｅ−ｆｏｓ；ｃ−ＨＡ−ｒａｓ；インスリン；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；αａ１−アンチトリプシン；Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン；マウスまたはＩ型コラーゲン；グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ９４およびＧＲＰ７８）；ラット成長ホルモン；ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）；トロポニン１（ＴＮ１）；血小板由来成長因子；デュシェンヌ筋ジストロフィー；ＳＶ４０；ポリオーマ；レトロウイルス；ＴＨＡピローマウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス；サイトメガロウイルス；およびギボンザル白血病ウイルス。
本発明の好ましい実施形態では、発現構築物はウイルス、またはウイルスゲノム由来の工学処理構築物を含む。受容体媒介性エンドサイトーシスにより細胞に進入し、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてウイルス遺伝子を安定にかつ効率的に発現する能力を有するある種のウイルスは、哺乳類細胞中に外来遺伝子をトランスファーするための魅力的な候補である（Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden,1986; Temin, 1986）。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスは、ＤＮＡウイルス、例えばパポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルスおよびポリオーマ）（Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986）ならびにアデノウイルス（Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986）であった。これらは、外来ＤＮＡ配列に対して相対的に低い能力を有し、宿主のスペクトラムが制限される。
さらに許容細胞中でのそれらの腫瘍遺伝子潜在性および細胞傷害性作用は、安全性の問題を生じさせる。それらは、８ｋＢまでの外来遺伝物質のみを収容し得るが、しかし種々の細胞株および実験動物に容易に導入され得る（Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986）。
（ｉｉｉ）ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡ挿入物が用いられる場合、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を実行するために、ポリアデニル化シグナルを含むことが一般的には望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明を首尾よく実行するためのきわめて重要な要件であるとは考えられず、任意の配列、例えばヒトまたはウシ成長ホルモン、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられ得る。さらにまた、発現カセットの一因子として、ターミネーターが考慮される。これらの因子は、メッセージレベルを強化し、そしてカセットから他の配列へのリードスルー（read through）を最小限にする。
アンチセンス構築物
「アンチセンス核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドを指すよう意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞中に導入されると、それらの標的核酸と特異的に結合して、転写、ＲＮＡプロセシング、輸送および／または翻訳を妨げる。オリゴヌクレオチドによる二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡのターゲッティングは、三重螺旋形成をもたらす。ＲＮＡのターゲッティングは、二重螺旋形成をもたらす。
アンチセンス構築物は、プロモーターおよびその他の制御領域、エキソン、イントロンまたは遺伝子のエキソン−イントロン境界でさえ結合するよう設計される。アンチセンスＲＮＡ構築物またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの宿主細胞内、例えば宿主動物内（例えばヒト被験体内）での遺伝子転写または翻訳、あるいはその両方を抑制するために用いられ得る。相補的ヌクレオチドを含む核酸配列は、標準ワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対合することができるものである。即ち、より大きいプリンがより小さいピリミジンと塩基対合して、シトシンと対合されたグアニンの組合せ（Ｇ：Ｃ）のみを形成し、ＤＮＡの場合にはチミンと（Ａ：Ｔ）、ＲＮＡの場合にはウラシルと（Ａ：Ｕ）対合されたアデニンを形成する。
本明細書中で用いられる場合、「相補的」または「アンチセンス配列」という用語は、それらの全長に亘って実質的に相補的であり、塩基ミスマッチが非常に少ない核酸配列を意味する。例えば１５塩基長の核酸配列は、それらがシングルまたはダブルのミスマッチのみを伴って１３または１４位置に相補的ヌクレオチドを有する場合に、相補的であると称される。本来「完全に相補的」である核酸配列は、それらの全長を通して完全に相補的であり、塩基ミスマッチが全くない核酸配列である。
遺伝子配列の全部または一部がアンチセンス構築の環境で用いられ得るが、統計学的には、任意の１７塩基長配列がヒトゲノム中に１回だけ生じるはずであるので、特有の標的配列を特定するには十分である。
オリゴマーが短いほどｉｎ ｖｉｖｏでのアクセシビリティー（accessibility）をもたらしやすく且つ増大しやすいが、多数のその他の因子がハイブリダイゼーションの特異性の決定に関与する。オリゴヌクレオチドの、その相補的ターゲットに対する結合親和性および配列特異性はともに、長さが増大するとともに増大する。８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い塩基対のオリゴヌクレオチドが用いられるということが意図される。内因性遺伝子の機能が影響を受けるか否か、または相補的配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けるか否かを決定するために、構築物を単にｉｎｖｉｔｒｏで試験することにより、所定のアンチセンス核酸が対応する宿主細胞遺伝子のターゲッティングに有効であるか否かを容易に決定することができる。
ある種の実施形態では、他の因子（例えばＣ−５プロピンピリミジン）を含むアンチセンス構築物を用いることが望ましい。
ウリジンおよびシチジンのＣ−５プロピン誘導体を含むオリゴヌクレオチドは高親和性でＲＮＡと結合し、そして遺伝子発現の強力なアンチセンスインヒビターであることが示されている（Wagner et al, 1993）。
リボザイム構築物
標的化アンチセンス送達の代替物として、標的化リボザイムが用いられ得る。「リボザイム」という用語は、腫瘍遺伝子ＤＮＡおよびＲＮＡ中の特定の塩基配列をターゲッティングし、切断することができるＲＮＡベースの酵素を指す。リボザイムは、リボザイム配列を組入れるＲＮＡオリゴ−ヌクレオチドの形態で細胞に対して直接的にターゲッティングされるか、あるいは所望のリボザイムＲＮＡをコードする発現構築物として細胞中に導入され得る。リボザイムは、アンチセンス核酸に関して記載された方法とほとんど同じ方法で用いられ、適用され得る。
遺伝子移入方法
細胞中での導入遺伝子発現の実行を媒介するためには、細胞に本発明の療法的発現構築物を移入する必要がある。本節は、ウイルス生成およびウイルス遺伝子移入の方法および組成物、ならびに非ウイルス遺伝子移入方法について考察する。
（ｉ）ウイルスベクター媒介性移入
ＴＨＡＰファミリー遺伝子は、ウイルス感染性粒子中に組入れられて、細胞への遺伝子移入を媒介する。本明細書中に記載されたその他の療法的作用物質をコードする付加的発現構築物も、感染性ウイルス粒子を用いて（例えば本明細書で以下に記載される本発明のアデノウイルスベクターを用いた形質転換により）、ウイルス形質導入により移入され得る。あるいは、レトロウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスが用いられ得るが、これらはともに当該遺伝子（単数または複数）による宿主細胞の恒久的形質転換を可能にする。したがって一実施形態では、治療的に有意の遺伝子を細胞に送達するために、細胞のウイルス感染が用いられる。典型的には、ウイルスは単に、生理学的条件下で適切な宿主細胞に曝露されて、ウイルスの取込みを可能にする。アデノウイルスが例示されるが、本発明の方法は以下で考察される他のウイルスまたは非ウイルスベクターとともに好ましく用いられ得る。
２．アデノウイルス
アデノウイルスは、そのＤＮＡゲノムが中サイズであり、操作が容易であり、高力価であり、標的細胞範囲が広く、かつ高感染性であるので、遺伝子移入ベクターとして用いるのに特に適している。およそ３６ｋＢのウイルスゲノムが、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシス作用因子を含入される１００〜２００塩基対（ｂｐ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）により結合される。異なる転写単位を含むゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により分割される。
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび２〜３の細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。
これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞シャットオフに関与する（Renan, 1990）。大多数のウイルスキャプシドタンパク質を含む後期遺伝子（ＬＩ、Ｌ２、Ｕ、Ｌ４およびＬ５）の生産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に由来する（issued）単一一次転写体の有意のプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は感染の後期に特に効率的であり、そしてこのプロモーターに由来するｍＲＮＡは全て、５’三連リーダー（ＴＬ）配列を保有するので、翻訳のための好ましいｍＲＮＡである。
遺伝子療法のためにアデノウイルスを最適化するためには、ＤＮＡの大型セグメントが含まれ得るよう、保有能力を最大にする必要がある。ある種のアデノウイルス産物に関連した毒性および免疫学的反応を低減することも非常に望ましい。２つの目的は、アデノウイルス遺伝子の排除により両末端を用意するという点で、ある程度関連している。本発明により、関連症例に関する治療用構築物を操作する能力を保持しつつ、これらの目標をともに達成し得る。
ウイルスＤＮＡ複製に必要とされるシス因子は全て、線状ウイルスゲノムの一端の逆方向末端反復（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化されるため、ＤＮＡを大置換（large displacement）することが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下で複製し得る（Hay et al., 1984）。したがってアデノウイルスベクター中にこれらの因子を含入することにより、複製を可能にすることができるはずである。
さらにウイルスキャプシド形成のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）間に局在する（Hearing et al., 1987）。このシグナルは、左端近くの特定配列であるが付着末端配列の外側にある特定配列が、頭構造（head structure）中へＤＮＡを挿入するために必要とされるタンパク質との結合を媒介する、バクテリオファージｋＤＮＡ中のタンパク質認識部位を模倣する。ＡｄのＥｌ置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）断片が２９３細胞におけるパッケージングを指図し得ることを実証した（Levrero et al., 1991）。
従来、アデノウイルスゲノムのある種の領域が、哺乳類細胞のゲノムおよびコードされた遺伝子中に組み入れられて、それにより発現されることが示されてきた。これらの細胞株は、細胞株によりコードされるアデノウイルス機能を欠くアデノウイルスベクターの複製をサポートすることができる。ベクター（例えば野生型ウイルスまたは条件欠陥突然変異体）を「ヘルプする」ことによる複製欠損アデノウイルスベクターの相補性についても報告されている。
複製欠陥アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスにより、トランスで補足され得る。しかしながら、この作用だけでは複製欠陥ベクターを単離することはできない。複製機能を用意するために必要とされるヘルパーウイルスが存在するため、任意の調製物を汚染するからである。したがって複製および／または複製欠陥ベクターのパッケージングに特異性を付加する付加的因子が必要とされた。その因子は、本発明において示されるようにアデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスに関するパッケージングシグナルは慣用的アデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Tibbetts,1977）。後者の研究では、ゲノムのＥＩＡ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有する突然変異体は、初期（ＥＩＡ）機能を補足した細胞株においてさえ、増殖が不十分であることが示された（Hearing and Shenk, 1983）。代償性（compensating）アデノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が変異体の右端に組換えられると、ウイルスは正常にパッケージされた。さらに突然変異分析により、Ａｄ５ゲノムの左端における短い反復化位置依存性因子を同定した。反復の一コピーは、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合には効率的パッケージングに十分であることが判明したが、しかしＡｄ５ＤＮＡ分子の内部に向かって移動された場合には十分でなかった（Hearing et al., 1987）。
パッケージングシグナルの変異型バージョンを用いることにより、種々の効率でパッケージされるヘルパーウイルスを作製することができる。典型的には突然変異は、点突然変異または欠失である。低効率パッケージングを有するヘルパーウイルスがヘルパー細胞中で増殖されると、ウイルスはパッケージされ、野生型ウイルスと比較して低率ではあるが、しかしそれによりヘルパーの増殖を可能にする。しかしながらこれらのヘルパーウイルスが、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスと一緒に細胞中で増殖されると、野生型パッケージングシグナルが変異型バージョン全体で選択的に認識される。特定量のパッケージング因子を投与すると、野生型シグナルを含有するウイルスは、ヘルパーと比較して選択的にパッケージされる。選択性が非常に高い場合、均質に近いストックが達成されるはずである。
３．レトロウイルス
レトロウイルスは、逆転写の過程により、感染細胞中でそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転換する能力により特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスの一群である（Coffin, 1990）。その結果生じるＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体中に安定に組み込まれて、ウイルスタンパク質の合成を指図する。
組込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列を保持させる。レトロウイルスゲノムは、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ構成成分をコードする、３つの遺伝子−ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ−を含む。ｇａｇ遺伝子から上流に見出される配列（Ｔと呼ばれる）は、ビリオン中へのゲノムのパッケージングのためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、そしてさらにまた宿主細胞ゲノム中に組み込むために必要とされる（Coffin, 1990）。
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸が、あるウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入されて、複製欠損性であるウイルスを生成する。ビリオンを生成するためには、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびＴ構成成分を有さないパッケージング細胞株が構築される（Mann et al., 1983）。ヒトｃＤＮＡをレトロウイルスＬＴＲおよびＴ配列とともに含む組換えプラスミドがこの細胞株に導入されると（例えばリン酸カルシウム沈降により）、Ｔ配列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写体をウイルス粒子中にパッケージングさせ、次に培地中に分泌される（Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983）。組換えレトロウイルスを含む培地が収集され、任意に濃縮されて遺伝子移入のために用いられる。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかしながら多数の型のレトロウイルスの組込みおよび安定発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskind et al., 1975）。
レトロウイルスベクターの特異的ターゲッティングを可能にするよう設計されたアプローチが、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて近年開発された。この修飾により、アシアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞のような細胞の特異的感染が可能になる。
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチニル化抗体、および特定細胞受容体に対するビオチニル化抗体が用いられる、組換えレトロウイルスのターゲッティングの異なるアプローチが設計された。抗体は、ストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン構成成分を介して結合された（Roux et al., 1989）。主要組織適合複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、それらの表面抗原を保有する種々のヒト細胞が感染したことが、ｉｎｖｉｔｒｏでのエコトロピックウイルスを用いて実証された（Roux et al., 1989）。
４．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の線状一本鎖ＤＮＡを利用する。逆方向末端反復は、ゲノムと側面を接する（flank）。２つの遺伝子がゲノム内に存在して、多数の異なる遺伝子産物を生じる。第一のｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ２およびＶＰ−３と呼ばれる３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。
第二のｒｅｐ遺伝子は、非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。１つまたは複数のこれらのｒｅｐ遺伝子産物は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
ＡＡＶ中の３つのプロモーターは、ゲノム中のマップ単位におけるそれらの位置により設計される。これらは、左から右に、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写は６つの転写体を生じ、２つは３つのプロモーターの各々で開始されて各対の１方がスプライシングされる。
マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転写体に関して同一である。４つの非構造タンパク質は明らかにより長い転写体に由来し、３つのビリオンタンパク質は全て最小の転写体から生じる。
ＡＡＶは、ヒトにおける任意の病理学的状態と関連がない。興味深いことに、効率的複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびもちろんアデノウイルスのようなウイルスからの「ヘルピング」機能を必要とする。
ヘルパーとして最も特性化されているのはアデノウイルスであり、このウイルスに関する多数の「初期」機能は、ＡＡＶ複製を促進することが示されている。ＡＡＶｒｅｐタンパク質の低レベルの発現はＡＡＶ構造発現を抑止すると考えられ、そしてヘルパーウイルス感染はこの抑止を解消すると考えられる。
ＡＡＶベクターの末端反復は、ＡＡＶ、または修飾ＡＡＶゲノムを含有するｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化により（Samulski et al, 1987）、あるいは当業者に既知のその他の方法、例えばＡＡＶの公開配列に基づいた末端反復の化学的または酵素的合成（これらに限定されない）により得られる。機能（即ち安定的および部位特異的組込み）を可能にするために必要とされるＡＡＶＩＴＲの最小配列または一部を、欠失分析などの既知の方法により当業者は決定し得る。
安定な、部位特異的組込みを指図する末端反復の能力を保持しながら、配列のマイナー修飾が耐容され得ることも、当業者は決定し得る。
ＡＡＶベースのベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子送達のための安全且つ有効なビヒクルであることが立証されており、これらのベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｖｏでの考え得る遺伝子療法における広範な用途に関して、前臨床および臨床段階で開発され、試験されてきている（Carterand Flotte, 1996; Chattedee et al., 1995; Ferrari et al., 1996; Fisher et al.,1996; Flotte et al., 1993; Goodman et al., 1994; Kaplitt et al., 1994; 1996,Kessler et al., 1996; Koeberl et al., 1997; Mizukami et al., 1996; Xiao et al.,1996）。
肺におけるＡＡＶ媒介性効率的遺伝子移入および発現は、嚢胞性繊維症の治療のための臨床試験をもたらした（Carterand Flotte, 1996; Flotte et al., 1993）。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性遺伝子送達による筋ジストロフィーの治療；脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の治療；肝臓へのＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの治療；ならびにおそらくは、心臓への血管内皮増殖因子遺伝子による心筋梗塞の治療への期待、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性遺伝子発現は非常に効率的であることが近年示されたため、有望であると思われる（Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994;1996; Koeberl et al., 1997; McCown et al., 1996; Ping et al., 1996;およびXiao et al., 1996）。
５．その他のウイルスベクター
その他のウイルスベクターは、本発明において発現構築物として用いられ得る。ワクシニアウイルス（Ridgeway,1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988）およびＢ型肝炎ウイルスなどのウイルス由来のベクターも開発されており、本発明において有用である。それらは、種々の哺乳類細胞に関するいくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Couparet al., 1988;およびHorwich et al., 1990）。
欠損Ｂ型肝炎ウイルスについての近年の認識によって、異なるウイルス配列の構造−機能相関関係の新しい知見が得られた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、そのゲノムの８０％まで欠失しても、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写に関する能力をウイルスが保持し得ることを示した（Horwich et al., 1990）。これは、ゲノムの大部分が外来遺伝物質で置換され得ることを示唆した。Chang等は、近年、ポリメラーゼ、表面および前表面コード配列の代わりに、アヒルＢ型肝炎ウイルスゲノム中にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。それは、鳥肝細胞腫細胞株中に野生型ウイルスと同時トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含む培地を用いて、一次子アヒル肝細胞を感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現が、トランスフェクション後少なくとも２４時間検出された（Chang et al., 1991）。
本発明のさらに別の実施形態では、送達される核酸は、特異的結合リガンドを発現するように工学処理された感染性ウイルス内に収容される。したがってウイルス粒子は、標的細胞のコグネイト（cognate）受容体と特異的に結合し、コンテンツを細胞に送達する。
ウイルスエンベロープにラクトース残基を化学的付加することによるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的ターゲッティングを可能にするように設計された新規のアプローチが近年開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能にし得る。
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチニル化抗体、ならびに特定の細胞受容体に対するビオチニル化抗体が用いられる、組換えレトロウイルスのターゲッティングの別のアプローチが設計された。該抗体は、ストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン構成成分を介して結合された（Roux et al., 1989）。主要組織適合複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、それらの表面抗原を保有する種々のヒト細胞が感染することが、ｉｎｖｉｔｒｏでのエコトロピックウイルスを用いて実証された（Roux et al., 1989）。
（ｉｉ）非ウイルス移入
本発明のＤＮＡ構築物は一般に、細胞に送達される。ある状況では、移入される核酸は非感染性であり、非ウイルス法を用いて移入され得る。
培養哺乳類細胞へ発現構築物を移入するためのいくつかの非ウイルス法が、本発明により意図される。これらの例としては、リン酸カルシウム沈降（Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al.,1990）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Gopal, 1985）、エレクトロポレーション（Tur Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984）、直接マイクロインジェクション（Harland and Weintraub, 1985）、ＤＮＡ負荷リポソーム（Nicolauand Sene, 1982; Fraley et al., 1979）、細胞超音波処理（Fechheimeret al., 1987）、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子銃（Yang et al., 1990）、ならびに受容体媒介性トランスフェクション（Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988）が挙げられる。
一旦構築物が細胞中に送達されれば、治療用遺伝子をコードする核酸が配置され、異なる部位で発現され得る。ある実施形態では、治療用遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。この組込みは、相同組換えによりコグネイト位置および配向であり得る（遺伝子置換）し、あるいはそれはランダム非特異的位置で組み込まれ得る（遺伝子増強）。さらに別の実施形態では、核酸はＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞中に安定に保持され得る。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期とは無関係にまたはそれと同調して、保持および置換を可能にするのに十分な配列をコードする。
発現構築物を細胞に送達する方法、ならびに核酸が存続する細胞中での位置は、用いられる発現構築物の種類によって異なる。
本発明の特定の実施形態では、発現構築物はリポソーム中に封入され得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒質により特徴付けられる小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒質により分離された多脂質層を有する。それらは、リン脂質が水溶液に過剰に懸濁されると自発的に形成する。脂質構成成分は、閉鎖構造の形成前に自己再編成を経て、脂質二重膜の間に水および溶解溶質を封入する（Ghosh and Bachhawat, 1991）。カチオン性リポソームへのＤＮＡの付加は、リポソームから光学的複屈折性液晶濃縮小球への位相幾何学的移行を引き起こす（Radler et al., 1997）。これらのＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子療法に用いるための潜在的非ウイルスベクターである。
外来ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでのリポソーム媒介性核酸送達および発現は、非常に好ましい。Ｐ−ラクタマーゼ遺伝子を用いて、培養ヒヨコ胚細胞、ＨｅＬａ細胞および肝細胞腫細胞中で、外来ＤＮＡのリポソーム媒介性送達および発現を実現することができることを、Wong等（1980）は実証した。静脈内注射後のラットにおけるリポソーム媒介性遺伝子移入を、Nicolau等（1987）は成し遂げた。種々の商業的アプローチ、例えば「リポフェクション」技法も包含される。
本発明のある実施形態では、リポソームはセンダイウイルス（hemagglutinating virus）（ＨＶＪ）と複合され得る。これは、細胞膜との融合を助長し、そしてリポソーム封入ＤＮＡの細胞進入を促進することが示されている（Kaneda et al., 1989）。
その他の実施形態では、リポソームは核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合されるか、または一緒に用いられ得る（Kato et al., 1991）。さらに別の実施形態では、リポソームはＨＶＪおよびＨＭＧ−１と複合されるか、または一緒に用いられ得る。このような発現構築物がｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの核酸の移入および発現に首尾よく用いられた場合には、それらを本発明に適用することができる。
細胞中に治療用遺伝子をコードする核酸を送達するために用いられ得るその他のベクター送達系は、受容体媒介性送達ビヒクルである。これらは、ほとんど全ての真核細胞生物における受容体媒介性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取込みを利用する。種々の受容体の細胞型特異的分布のために、送達は高度に特異的であり得る（Wu and Wu, 1993）。
受容体媒介性遺伝子ターゲッティングビヒクルは一般に、２つの構成成分からなる：即ち、細胞受容体特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤である。いくつかのリガンドが受容体媒介性遺伝子移入のために用いられてきた。最も詳細に特徴付けられたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（Wu and Wu, 1987）およびトランスファーリング（Wagner et al.,1990）である。
近年、ＡＳＯＲと同一の受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が、遺伝子送達ビヒクルとして用いられており（Ferkolet al., 1993; Perales et al., 1994）、そして上皮増殖因子（ＥＧＦ）も扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達するために用いられている（Myers、ＥＰＯ０２７３０８５）。
他の実施形態では、送達ビヒクルはリガンドおよびリポソームを含み得る。例えばNicolau等（1987）は、ラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドを用いて、リポソーム中に組入れて、肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みにおける増大を観察した。したがって、リポソームを用いてまたは用いずに、任意数の受容体−リガンド系により、前立腺、上皮または腫瘍細胞のような種類の細胞中に、治療用遺伝子をコードする核酸が特異的に送達され得る。例えばヒト前立腺特異的抗原（Watt et al., 1986）は、前立腺組織における核酸の媒介性送達のための受容体として用いられ得る。
本発明の別の実施形態では、発現構築物は単に、裸組換えＤＮＡまたはプラスミドからなり得る。構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上記の方法のいずれかにより実施され得る。これはｉｎｖｉｔｒｏでの移入のために特に適用可能であるが、しかしながらそれは同様にｉｎ ｖｉｖｏでも適用され得る。成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓中に、ＣａＰＯ４沈降物の形態のポリオーマウイルスＤＮＡをDubensky等（1984）は首尾よく注射し、能動的ウイルス置換および急性感染を実証した。
ＣａＰＯ４沈降プラスミドの直接腹腔内注入がトランスフェクトされた遺伝子の発現を引き起こすことをBenvenistyとNeshif（1986）も実証した。ＣＡＭをコードするＤＮＡもｉｎ ｖｉｖｏで同様の方法で移入され、ＣＡＭを発現し得ると予見される。
細胞中への裸ＤＮＡ発現構築物の移入に関する本発明の別の実施形態は、微粒子銃（particlebombardment）を含み得る。この方法は、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルを高速に加速して、それらに細胞膜を貫通させ、それらを殺す（kill）ことなく細胞に進入させる能力に依存する（Klein et al., 1987）。微粒子を加速するためのいくつかの装置が開発された。このような装置の１つは、高電圧放電により電流を発生し、次いで輸送力を発生するする（Yang et al., 1990）。用いられるマイクロプロジェクタイルは、生物学的に不活性な物質（例えばタングステンまたは金ビーズ）で構成される。
抗体
ポリクローナル抗ＴＨＡＰファミリーまたは抗ＴＨＡＰドメイン抗体は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン免疫原で適切な被験体を免疫感作することにより、上記のように調製され得る。免疫感作被験体における抗ＴＨＡＰファミリーまたは抗ＴＨＡＰドメイン抗体力価は、標準技法により、例えば固定化ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質を用いた酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、長時間に亘ってモニタリングされ得る。所望により、ＴＨＡＰファミリーに対して向けられる抗体分子は、哺乳類から（例えば血液から）単離され、既知の技法により、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによりさらに精製されて、ＩｇＧ分画を生じる。免疫感作後の適切な時期に、例えば抗ＴＨＡＰファミリー抗体力価が最高になった時に、抗体産生細胞が被験体から採取され、標準技法（例えば以下の参考文献に記載された技法）により、モノクローナル抗体を調製するために用いられ得る。
Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497により最初に記載されたハイブリドーマ技法（Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J.Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31;およびYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75も参照）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4: 72）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, Inc., pp. 77-96）またはトリオーマ技法。
モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成するための技法は既知である（一般的には、R.H. Kenneth, inMonoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, PlenumPublishing Corp., New York, N.Y. (1980); E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med.,54: 387-402; M.L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-36参照）。簡単に述べると、不死細胞株（典型的には骨髄腫）が、上記のようなＴＨＡＰファミリー免疫原で免疫感作された哺乳類からのリンパ球（典型的には脾臓細胞）と融合され、その結果生じたハイブリドーマ細胞の培養上清がスクリーニングされて、ＴＨＡＰファミリーを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
リンパ球と不死化細胞株を融合するために用いられる多数の既知のプロトコールのいずれかが、抗ＴＨＡＰファミリーまたは抗ＴＨＡＰドメインモノクローナル抗体を生成するために適用され得る（例えばG. Galfre et al. (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al.
SomaticCell Genet., 上記引用；Lerner, Yale J Biol. Med.上記引用；Kenneth, Monoclonal Antibodies,上記引用、を参照）。さらに、このような有用な方法には多数の変法が存在すると当業者は理解する。典型的には、不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同一哺乳類種に由来する。例えばネズミハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫感作されたマウスからのリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合することにより製造され得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株のいずれか、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株は、標準技法による融合パートナーとして用いられ得る。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ−感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾臓細胞と融合される。融合に起因するハイブリドーマ細胞は次に、ＨＡＴ培地を用いて選択されるが、これは、非融合化および非生産的融合化骨髄腫細胞を死滅させる（非融合化脾臓細胞は、形質転換されないため、数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質を結合する抗体に関して、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の代わりに、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質を用いて組換え組合せ免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージ表示ライブラリー）をスクリーニングし、それによりＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質を結合する免疫グロブリンライブラリー成員を単離することにより、モノクローナル抗ＴＨＡＰファミリーまたは抗ＴＨＡＰドメイン抗体が同定されて単離され得る。ファージ表示ライブラリーを生成し、スクリーニングするためのキットが市販されている（例えばファルマシア組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーンＳｕｒｆＺＡＰ．ＴＭ．ファージ表示キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体表示ライブラリーを生成およびスクリーニングする場合に特に好ましい方法および試薬の例は、例えば米国特許第５，２２３，４０９号（Ladner等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９（Kang等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１（Dower等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０７９１（Winter等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９（Markland等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９３／０１２８８（Breitling等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７（McCafferty等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０（Garrard等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９（Ladner等）；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al.(1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734;Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991)Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982;およびMcCaffertyet al. Nature (1990) 348: 552-554に見出され得る。
さらに、標準組換えＤＮＡ技法を用いて製造され得る、ヒトおよび非ヒト部分を含む組換え抗ＴＨＡＰファミリーまたは抗ＴＨＡＰドメイン抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法により、例えば国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（Robinson等）；欧州特許出願第１８４，１８７号（Akira等）；欧州特許出願第１７１４９６号（Taniguchi, M等）；欧州特許出願第１７３，４９４号（Morrison等）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３（Neuberger等）；米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly等）；欧州特許出願第１２５，０２３号（Cabilly等）；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J.Immunol.139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al. (1987)Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449;およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison,S.L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) Bio Techniques 4: 214; 米国特許第５，２２５，５３９号（Winter）; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534;およびBeidleret al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060に記載された方法を用いて産生され得る。
抗ＴＨＡＰファミリーまたは抗ＴＨＡＰドメイン抗体（例えばモノクローナル抗体）は、標準技法（例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法）により、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質を単離するために用いられ得る。例えば抗ＴＨＡＰファミリー抗体は、細胞からの天然ＴＨＡＰファミリーの精製、および宿主細胞中で発現される組換え産生ＴＨＡＰファミリーの精製を容易にすることができる。さらに抗ＴＨＡＰファミリー抗体は、ＴＨＡＰファミリータンパク質を検出して（例えば細胞溶解物または細胞上清中）、ＴＨＡＰファミリータンパク質の発現の量およびパターンを評価するために用いられ得る。抗ＴＨＡＰファミリー抗体は、診断的に、例えば所定の治療レジメンの効力を決定するために用いられて、臨床試験手法の一部として、組織中のタンパク質レベルをモニタリングし得る。検出は、抗体を検出可能物質とカップリングさせる（即ち、物理的に連結する）ことにより促進され得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる。適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
薬剤スクリーニングアッセイ
本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質と結合し、例えばＴＨ
ＡＰファミリー発現または好ましくはＴＨＡＰファミリー活性に対する抑制または活性化作用を有するモジュレーター、あるいは例えばＴＨＡＰファミリー標的分子の活性に対する抑制または活性化作用を有するモジュレーター、即ち候補または試験化合物または作用物質（例えば好ましくは小分子、しかしペプチド、ペプチド模倣物またはその他の薬剤も含む）を同定するための方法（本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を用意する。いくつかの実施形態では、小分子はコンビナトリアルケミストリーを用いて生成され得るし、あるいは天然産物ライブラリーから得られる。アッセイは、細胞ベース、非細胞ベースまたはｉｎｖｉｖｏアッセイであり得る。薬剤スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、またはより好ましくはさらに説明されるような機能アッセイであり得る。
概して、ＴＨＡＰファミリータンパク質の任意の適切な活性、例えば（１）細胞中で発現されるかまたは細胞中に導入された場合、アポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、最も好ましくはアポトーシスを誘導するかまたは強化し、および／または最も好ましくは細胞増殖を低減すること、（２）内皮細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、（３）高増殖性細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、（４）ＣＮＳ細胞の、好ましくは神経細胞または神経膠細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、（５）血管新生を媒介すること、好ましくは抑制すること；炎症を媒介すること、好ましくは抑制すること；癌性組織の転移可能性を抑制すること；腫瘍負荷量（turmor burden）の低減；化学療法または放射線療法に対する感受性の増大；癌細胞の殺害、癌細胞の増殖抑制、または腫瘍退縮の誘導；からなる群から選択される動物における生物学的機能を示す活性、あるいは（６）ＴＨＡＰファミリー標的分子またはＴＨＡＰドメイン標的分子との相互作用、好ましくはタンパク質または核酸との相互作用は、薬剤スクリーニングアッセイで検出され得る。
本発明は、ＴＨＡＰ１、ＰＡＲ４またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質と結合するモジュレーターであって、かつＰＭＬ−ＮＢへのＰＡＲ４またはＴＨＡＰ１リクルートメント（recruitment）もしくは結合またはそれとの会合に対する、あるいはＳＬＣとＴＨＡＰファミリーポリペプチドとの結合またはＴＨＡＰファミリーポリペプチドにより媒介されるＳＬＣに対する細胞応答のような相互作用に対する抑制または活性化作用を有するモジュレーター、即ち候補または試験化合物または作用物質（例えば好ましくは小分子、しかしペプチド、ペプチド模倣物またはその他の薬剤も含む）を同定するための方法（本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）も提供する。
一実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの標的分子である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと結合するかそれらの活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該技術分野で既知の組合せライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができ、例えば生物学的ライブラリー；空間的アドレス可能平行固相または溶液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「一ビーズ、一化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーとともに用いられるが、一方、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用することができる（Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145）。
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野において見出されうる。例えばDeWitt
et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678; Choet al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed.Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061;およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233が挙げられる。
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えばHoughten (1992) Biotechniques 13:412-421）、あるいはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-84）上に、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-556）上に、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号（Ladner））上に、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号（Ladner））上に、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869）上に、またはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390）；（Devin (1990) Science 249: 404-406）；（Cwirlaet al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382）；（Felici(1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310）；（Ladner、同上）上に存在し得る。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力の決定は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な断片またはホモログと、そのコグネイト標的分子の結合が複合体中の標識化ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを検出することにより決定され得るよう、例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片またはホモログを放射性同位元素または酵素標識をカップリングすることによって達成されうる。例えば化合物（例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログ）は、直接または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで標識され、放射性同位元素が放射能放出の直接計数により、またはシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは化合物は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素によって標識され、そして酵素標識は、適切な物質が生成物に転換することをを決定することにより検出される。標識分子はそのコグネイト分子と接触させられ、複合物形成の程度が測定される。例えば複合体形成の程度は、複合体を免疫沈降させることにより、またはゲル電気泳動を実施することにより測定され得る。
相互作用物質のいずれかの標識を伴わずに、そのコグネイト標的分子と相互作用する化合物（例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログ）の能力を決定することも、本発明の範囲内である。例えばマイクロフィジオメーターを用いて、化合物または標的分子のいずれかを標識することなく、化合物とそのコグネイト標的分子との相互作用を検出し得る（McConnell, H.M. et al. (1992) Science 257: 1906-1912）。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー）は、光学指定ポテンショメータセンサー（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物およびコグネイト標的分子間の相互作用の指標として用いられ得る。
好ましい実施形態では、アッセイは、
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを発現する細胞を、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質標的分子と接触させ、それによりアッセイ混合物を生成すること、
アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含み、
ここで、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力の決定は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド発現細胞の生物学的活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含む。
別の実施形態では、アッセイは、
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを発現する細胞を、試験化合物と接触させること、および
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含み、
ここで、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力の決定は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド発現細胞の生物学的活性を抑制するかまたは増大する試験化合物の能力を決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、アッセイは、
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと応答性である細胞を、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分と接触させ、それによりアッセイ混合物を生成すること、
アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および
ＴＨＡＰファミリーまたはその生物学的活性部分の活性を調整する試験化合物の能力を決定することを含み、
ここで、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分の活性を調整する試験化合物の能力の決定は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド応答性細胞の生物学的活性を調整する試験化合物の能力の決定（例えばＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性を調整する試験化合物の能力の決定）を含む。
別の実施形態では、アッセイは、
ＴＨＡＰファミリー標的分子（即ち、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドが相互作用する分子）を発現する細胞を試験化合物と接触させること、および
ＴＨＡＰファミリー標的分子の活性を調整する（例えば刺激するかまたは抑制する）試験化合物の能力を決定することを含む細胞ベースアッセイである。
ＴＨＡＰファミリー標的分子の活性を調整する試験化合物の能力の決定は、例えば、ＴＨＡＰファミリー標的分子と結合するかまたは相互作用するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力を決定することにより達成されうる。
ＴＨＡＰファミリー標的分子と結合するかまたは相互作用するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力の決定は、直接結合を決定するための上記の方法のうちの１つにより達成されうる。好ましい実施形態では、ＴＨＡＰファミリー標的分子と結合するかまたは相互作用するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力の決定は、標的分子の活性を決定することにより達成されうる。例えば標的分子の活性は、標的分子をＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと接触させること、および標的（即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等）の細胞性二次メッセンジャーの誘導を測定すること、適切な物質を用いて標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能マーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸と操作可能的に連結された標的応答性調節因子を含む）の誘導を検出すること、または標的調節化細胞応答、例えばシグナル伝達またはタンパク質：タンパク質相互作用を検出することにより決定され得る。
さらに別の実施形態では、本発明のアッセイは、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログが試験化合物と接触されて、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと結合する試験化合物の能力が決定される無細胞アッセイである。試験化合物とＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログとの結合は、上記のように直接または間接的に決定され得る。好ましい実施形態では、アッセイは、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログをＴＨＡＰファミリーポリペプチド（例えばＴＨＡＰファミリー標的分子）を結合する既知の化合物と接触させ、それによりアッセイ混合物を生成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、およびＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここでＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、既知の化合物と比較した場合にＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと選択的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
別の実施形態では、アッセイは、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログが試験化合物と接触されて、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を調整する（例えば刺激するかまたは抑制する）試験化合物の能力が決定される無細胞アッセイである。ＴＨＡＰファミリータンパク質の活性を調整する試験化合物の能力の決定は、例えば直接結合を決定するための上記の方法のうちの１つにより、ＴＨＡＰファミリー標的分子と結合するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力を決定することにより達成されうる。ＴＨＡＰファミリー標的分子と結合するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力の決定は、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）のような技法を用いて達成されうる（Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345およびSzabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705）。本明細書中で用いる場合、「ＢＩＡ」とは、相互作用物質のいずれも標識しない、リアルタイムでの生体特異的相互作用を試験するための技法である（例えばＢＩＡコア）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として用いられ得る。
代替的実施形態では、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの活性を調整する試験化合物の能力の決定は、ＴＨＡＰファミリー標的分子の下流エフェクター（例えば増殖因子媒介性シグナル伝達経路構成成分）の活性をさらに調節するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力を決定することにより達成されうる。例えば、適切な標的上のエフェクター分子の活性が決定され得るし、あるいは適切な標的とのエフェクターの結合が上記のように決定され得る。
さらに別の実施形態では、無細胞アッセイは、
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログを、ＴＨＡＰファミリータンパク質と結合する既知の化合物と接触させる、それによりアッセイ混合物を生成すること、
アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および
ＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、ＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、ＴＨＡＰファミリー標的分子と選択的に結合するかまたはその活性を調整するＴＨＡＰファミ
リーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログの能力を決定することを含む。
本発明の無細胞アッセイでは、可溶性および／または膜結合形態の単離タンパク質（例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログ、あるいはＴＨＡＰファミリー標的が結合する分子）を容易に使用することができる。膜結合形態の単離タンパク質が用いられる無細胞アッセイの場合、膜結合形態の単離タンパク質が溶液中に保持されるよう、可溶化剤を利用するのが望ましい。このような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン［ＲＴＭＸ−１００、トリトンＲＴＭ Ｘ１１４、テシット(Thesit.)ＲＴＭ］、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが挙げられる。
本発明の上記のアッセイ方法のうちの１つより多い実施形態では、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログ、あるいはその標的分子を固定して、非複合形態の一方または両方のタンパク質からの複合形態のタンパク質の分離を容易にし、かつアッセイの自動化を適応させるのが望ましい。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドあるいはその生物学的活性断片またはホモログと試験化合物の結合、あるいは候補化合物の存在下および非存在下でのＴＨＡＰファミリータンパク質と標的分子との相互作用は、試薬を含有するのに適した任意の容器中で達成されうる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心管が挙げられる。一実施形態では、融合タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＴＨＡＰファミリー融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着され、これは次に、試験化合物と併合、あるいは試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＴＨＡＰファミリータンパク質と併合され、そして混合物が複合体を形成する条件（例えば、塩およびｐＨに関する生理学的条件）下でインキュベートされ得る。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウエルは洗浄されて、任意の非結合構成成分、ビーズの場合には固定されたマトリックスを除去し、例えば上記のように直接または間接的に複合体が決定される。あるいは複合体は、マトリックスから解離され、標準技法を用いてＴＨＡＰファミリーポリペプチド結合または活性のレベルが決定され得る。
マトリックス上にタンパク質を固定するためのその他の手法も、本発明のスクリーニングアッセイに用いられ得る。例えばＴＨＡＰファミリータンパク質またはＴＨＡＰファミリー標的分子が、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定され得る。ビオチニル化ＴＨＡＰファミリータンパク質または標的分子は、当該技術分野で既知の手法（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IlI）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、ストレプトアビジン被覆９６ウエルプレート（Pierce Chemicals）のウエル中に固定され得る。あるいは、ＴＨＡＰファミリータンパク質または標的分子と反応性であるが、ＴＨＡＰファミリータンパク質とその標的分子との結合を妨害しない抗体がプレートのウエルに誘導されて、非結合の標的またはＴＨＡＰファミリータンパク質が抗体結合によりウエル中に捕捉される。このような複合体の検出方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体に関して上記されたものの他に、ＴＨＡＰファミリータンパク質または標的分子と反応性である抗体を用いた複合体の免疫検出、及びＴＨＡＰファミリータンパク質または標的分子と関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
別の実施形態では、ＴＨＡＰファミリー又はＴＨＡＰドメインポリペプチドの発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、細胞中のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現が決定される方法において同定される。候補化合物の存在下でのＴＨＡＰファミリーポリペプチドｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、候補化合物の非存在下でのＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメインｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較される。次に候補化合物が、この比較に基づいて、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド発現のモジュレーターとして同定され得る。例えばＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメインｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下より存在下においてより大きい（統計学的に有意に大きい）場合、候補化合物は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメインｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激剤として同定される。あるいは、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメインｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下より存在下においてより小さい（統計学的に有意に小さい）場合、候補化合物は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメインｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメインｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメインｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本明細書中に記載された方法により決定され得る。
本発明のさらに別の態様では、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログは、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＰＡＲ４相互作用アッセイにおける使用に関して上記された方法を用いて、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおける「ベイト（bait）タンパク質」として用いられて、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド（「ＴＨＡＰファミリー結合タンパク質」または「ＴＨＡＰファミリーｂｐ」）と結合するかまたは相互作用し、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性に関与する、その他のタンパク質を同定し得る。このようなＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン結合タンパク質は、例えばＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメイン媒介性シグナル伝達経路の下流要素としての、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質、又はＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質標的によるシグナルの伝達に関与するとも考えられる。あるいはこのようなＴＨＡＰファミリー結合タンパク質は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドインヒビターであるかもしれない。
ＴＨＡＰ／ＤＮＡ結合アッセイ
本発明の別の実施形態では、ＴＨＡＰファミリーＤＮＡ結合活性を妨害する化合物を同定するための方法であって、固体支持体上に固定されたＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分を、試験化合物およびＤＮＡ断片の両方と接触させる工程、又は固体支持体上に固定されたＤＮＡ断片を試験化合物およびＴＨＡＰファミリータンパク質の両方と接触させる工程を含む方法が提供される。ＤＮＡと、ＴＨＡＰ−タンパク質またはその一部分との間の結合が検出され、試験化合物の非存在下でのＤＮＡ結合と比較した場合のＤＮＡ結合の低減は、試験化合物がＴＨＡＰファミリーＤＮＡ結合活性のインヒビターであることを示し、そして試験化合物の非存在下でのＤＮＡ結合と比較した場合のＤＮＡ結合の増大は、試験化合物がＴＨＡＰファミリーＤＮＡ結合活性の誘導物質であるかまたはそれを回復したことを示す。さらに考察されるように、ＤＮＡ断片は、例えば実施例２０に記載されるようにして得られる特異的ＴＨＡＰファミリータンパク質標的ＤＮＡであるよう選択され得るし、あるいは非特異的ＴＨＡＰファミリー標的ＤＮＡであり得る。タンパク質−ＤＮＡ相互作用の検出方法は、当該技術分野で既知であり、例としては、最も一般的に用いられる電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）またはフィルター結合法（Zabel et
al, (1991) J. Biol. Chem. 266: 252およびOkamoto and Beach, (1994) Embo. J. 13: 4816）が挙げられる。特異的および非特異的ＤＮＡ結合の高処理量（ハイスループット）検出および定量が容易にできるその他のアッセイが利用可能である（Amersham, N.J.;およびGal S. et al, 6ｔｈ Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9 Sept 2000, Vancouver, B.C.）。
第一の態様では、スクリーニングアッセイは、特異的ＴＨＡＰファミリー結合配列についての従来の知識を用いずに、ＴＨＡＰファミリーＤＮＡ結合活性を妨げる化合物を同定することを含む。例えば、ＴＨＡＰファミリータンパク質は、試験化合物、及び特異的ＤＮＡ配列に基づいて選択されないオリゴヌクレオチドのライブラリーまたはＤＮＡ断片の試料の両方と接触される。好ましくは、ＴＨＡＰファミリータンパク質は、固体支持体（例えばアレイまたはカラム）上に固定される。非結合ＤＮＡは、ＴＨＡＰファミリータンパク質に結合されたＤＮＡから分離され、当該技術分野で既知の任意の手段により、ＴＨＡＰファミリータンパク質に結合されたＤＮＡが検出され、定量され得る。例えばＤＮＡ断片は、検出可能部分、例えば放射性部分、比色定量部分または蛍光部分で標識される。ＤＮＡをそのように標識するための手法は、当該技術分野で既知である。
ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分に結合されるＤＮＡは、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分に特異的な抗体を用いた免疫沈降により、非結合ＤＮＡから分離される。２つの異なるモノクローナル抗ＴＨＡＰファミリー抗体の使用は、そのいずれか１つだけよりも完全な免疫沈降を生じ得る。免疫沈降物中に存在するＤＮＡの量は、当該技術分野で既知の任意の手段により定量され得る。ＤＮＡと結合するＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分は、ゲルシフトアッセイ（Tan Cell, 62: 367, 1990）、ヌクレアーゼ保護アッセイまたはメチラーゼ干渉アッセイによっても検出され得る。
本発明のさらに別の目的は、ＤＮＡ配列と結合する変異体ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分の能力を回復する化合物を同定する方法を提供することである。一実施形態では、療法に用いるための作用物質のスクリーニング方法であって、患者の細胞中に見出される変異遺伝子によりコードされるＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分と、ＤＮＡ分子、好ましくは核酸ライブラリーからのランダムオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片との結合の量を測定すること；試験物質の存在下での前記ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分と前記核酸分子との結合の量を測定すること；および前記試験物質の存在下でのＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分の結合の量を、前記試験物質の非存在下でのＴＨＡＰファミリータンパク質の結合の量と比較することを含み、前記結合の量を増大する試験物質は療法に用いるための候補である方法、が提供される。
本発明の別の実施形態では、コンセンサス結合配列または適合配列（conforming sequence）に結合する能力を変異型ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分に取り戻させるオリゴヌクレオチドが単離され得る。変異型ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分およびランダムオリゴヌクレオチドは、その上にＴＨＡＰファミリー特異的ＤＮＡ断片が固定される固体支持体に加えられる。固体支持体に結合するオリゴヌクレオチドが回収され、分析される。固体支持体との結合が変異型ＴＨＡＰファミリータンパク質の存在に依存するものは、変異型タンパク質と結合し、そしてその形状を回復することにより、支持体におそらくは結合している。
所望により、当該技術分野で既知の任意の手段により、特異的結合が非特異的結合と区別され得る。例えば、特異的結合相互作用は、非特異的結合相互作用より強い。したがって、インキュベーション混合物は、特異的結合反応が検出される優勢なものであるように、タンパク質／ＤＮＡ相互作用を不安定化する任意の作用物質または条件さらされ得る。あるいは、以下でより特定的に教示されるように、ｄＩ−ｄＣのような非特異的競合体が、インキュベーション混合物に加えられ得る。特異的結合部位を有するＤＮＡが標識され、競合体が標識されない場合には、特異的結合反応は標識化ＤＮＡが測定される際に主として検出されるものであろう。
本発明の別の実施形態によれば、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分を特異的ＤＮＡ断片と一緒にインキュベートした後、ＤＮＡ断片と結合しない細胞溶解物の全構成成分が除去される。これは、中でも、アガロース、セルロース等のような不溶性高分子支持体に付加されたＤＮＡ断片を用いることにより成し遂げられ得る。結合後、全ての非結合構成成分が洗い落とすことができ、ＤＮＡ／支持体に結合したＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分が残る。ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分は、当該技術分野で既知の任意の手段により定量され得る。それは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはウエスタンブロッティングのような免疫学的アッセイを用いて決定され得る。
本発明の別の実施態様では、ＴＨＡＰファミリー特異的ＤＮＡ配列と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、固体支持体上に固定されたＴＨＡＰファミリー特異的ＤＮＡ断片を試験化合物および野生型ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分の両方と接触させて、野生型ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分をＤＮＡ断片に結合させる工程、および同ＤＮＡ断片に結合した野生型ＴＨＡＰファミリータンパク質の量を決定する工程を含み、試験化合物を欠く対照に対する試験化合物による野生型ＴＨＡＰファミリータンパク質の結合の抑制は、ＴＨＡＰファミリー特異的ＤＮＡ結合配列と試験化合物との結合を示唆する方法が提供される。
本発明のさらに別の目的は、特異的ＤＮＡ結合配列に結合する変異型ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分の能力を回復する化合物を同定する方法を提供することである。一実施形態では、療法に用いるための作用物質のスクリーニング方法であって、患者の細胞中に見出される変異型遺伝子によりコードされるＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分と、特異的ＴＨＡＰファミリー標的ヌクレオチド配列の１よりも多いモノマーを含むＤＮＡ分子との結合の量を測定すること；試験物質の存在下での上記ＴＨＡＰファミリータンパク質と上記核酸分子との結合の量を測定すること；および上記試験物質の存在下でのＴＨＡＰファミリータンパク質の結合の量を、上記試験物質の非存在下でのＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分の結合の量と比較することを含み、結合の量を増大する試験物質は、療法に用いるための候補である方法が提供される。
本発明の別の実施態様では、療法に用いるための作用物質のスクリーニング方法であって、トランスフェクトされた細胞を試験物質と接触させること（上記トランスフェクトされた細胞は、患者の細胞中に見出される変異型遺伝子によりコードされるＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分、ならびにアッセイ可能産物をコードするレポーター遺伝子およびＴＨＡＰファミリーＤＮＡ結合部位に適合する配列を含むレポーター遺伝子構築物を含み、上記配列は上記レポーター遺伝子の上流でそれに隣接する）；及び上記レポーター遺伝子の発現量が試験物質により変更されるか否かを決定することを含み、上記レポーター遺伝子の発現量を変更する試験物質は、療法に用いるための候補である方法が提供される。
さらに別の実施形態では、療法に用いるための作用物質のスクリーニング方法であって、ＲＮＡポリメラーゼリボヌクレオチドおよびＴＨＡＰファミリータンパク質またはその一部分を転写構築物に加えること（上記転写構築物はアッセイ可能産物をコードするレポーター遺伝子およびＴＨＡＰファミリーコンセンサス結合部位に適合する配列を含み、上記配列は上記レポーター遺伝子の上流でそれに隣接し、上記加える工程は試験物質の存在下および非存在下で実行される）；上記レポーター遺伝子の転写の量が上記試験物質の存在により変更されるか否かを決定することを含み、上記レポーター遺伝子の転写の量を変更する試験物質は、療法に用いるための候補である方法が提供される。
本発明によれば、ＴＨＡＰファミリー活性を有する化合物は、ＴＨＡＰファミリー特異的ＤＮＡ結合部位と特異的に複合体を形成するものである。オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドも、ＴＨＡＰファミリー特異的ＤＮＡ結合部位と複合体を形成可能な化合物の１つとして意図される。
６．インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性を調節するためのさらなるアッセイ
ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰドメイン活性の検出を可能にする任意の適当なアッセイが用いられ得る、と理解される。試験化合物の存在下または非存在下でのタンパク質相互作用、核酸結合またはアポトーシスの調節を試験するためのアッセイの例が、本明細書中でさらに記載される。したがって本発明は、候補ＴＨＡＰファミリーポリペプチドモジュレーター（例えば活性化剤または抑制剤）を同定する方法であって、
ａ）ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログを含む細胞を用意すること、
ｂ）上記細胞を試験化合物と接触させること、および
ｃ）上記化合物がＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性、好ましくはプロアポトーシス（pro-apoptotic）活性、またはＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメイン標的結合
を選択的に調節する（例えば活性化するかまたは抑制する）か否かを決定することを含み、
上記化合物が上記ポリペプチドの活性を選択的に調節する（例えば活性化するかまたは抑制する）という決定が、上記化合物が上記ポリペプチドの候補モジュレーター（例えばそれぞれ活性化剤または抑制剤）である、ということを示す方法を含む。好ましくはＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン標的は、タンパク質または核酸である。
好ましくは、前記細胞は、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログをコードする組換え発現ベクターでトランスフェクトされた細胞である。
アポトーシスの検出のためのアッセイのいくつかの例は、本明細書中で「アポトーシスアッセイ」という表題の項に記載されている。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン標的相互作用の検出のためのアッセイのいくつかの例は本明細書中に記載されており、タンパク質相互作用および核酸結合の検出に関するアッセイが含まれる。
アポトーシス活性に関するアッセイの一例では、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドプロアポトーシス活性を阻止するかまたは刺激する分子に関する高処理量スクリーニングアッセイが、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログのテトラサイクリン調節性発現を伴う３Ｔ３細胞株中での血清回収（serum-withdrawal）誘導性アポトーシスに基づいて用意される。アポトーシス細胞は、９６−または３８４ウエルマイクロプレート中でのＴＵＮＥＬ標識により検出され得る。薬剤スクリーニングアッセイは、実施例１３に記載されるようにして実行され得る。ＰＡＲ４（Diaz-Meco et al, 1996; Berra et al., 1997）のプロアポトーシス活性を分析するために以前に用いられた３Ｔ３細胞は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされて、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの異所性（ectopic）発現を可能にし得る。次に血清回収に対するアポトーシス応答が試験化合物の存在下でアッセイされて、アポトーシスを誘導するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの能力を増強するかまたは抑制する試験化合物の同定を可能にする。トランスフェクトされた細胞は血清から取り出され、アポトーシス核酸を有する細胞が計数される。アポトーシス核酸は、ＤＡＰＩ染色及びインサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ＴＵＮＥＬアッセイにより計数され得る。
Ｂ．さらなるＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＴＨＡＰ−標的相互作用アッセイ
例示的方法において、ＴＨＡＰ／ＴＨＡＰ標的相互作用アッセイは、ＴＨＡＰ１およびＴＨＡＰ標的Ｐａｒ４に関して記載される。しかしながら、その他のＴＨＡＰファミリー成員またはＴＨＡＰドメインおよびその他のＴＨＡＰ標的分子のモジュレーターに関するスクリーニングのためのアッセイは、これらを下記の方法においてＴＨＡＰ１およびＰａｒ４に置換することにより実行され得る、と理解される。例えばいくつかの実施形態では、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドとＳＬＣとの間の相互作用に影響を及ぼすモジュレーターが同定される。
実施例４、５、６および７ならびに図３、４および５に示されているように、本発明者等は、いくつかの実験方法を用いて、ＴＨＡＰ１がプロアポトーシスタンパク質Ｐａｒ４と相互作用することを実証した。特に、ＴＨＡＰ１は、酵母の２ハイブリッド系においてＰａｒ４野生型（Ｐａｒ４）およびＰａｒ４死ドメイン（Ｐａｒ４ＤＤ）と相互作用することが示された。酵母細胞は、ＢＤ７−ＴＨＡＰ１およびＡＤ７−Ｐａｒ４、ＡＤ７、ＡＤ７−Ｐａｒ４ＤＤまたはＡＤ７−Ｐａｒ４発現ベクターを用いて共形質転換された。形質転換体は、ヒスチジンおよびアデニンを欠く培地上で選択された。同一の結果が、ＢＤ７−Ｐａｒ４、ＢＤ７、ＢＤ７−Ｐａｒ４ＤＤまたはＢＤ７−Ｐａｒ４と、ＡＤ７−ＴＨＡＰ１との共形質転換により得られた。
本発明者等は、ＴＨＡＰ１とＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤとのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）結合も実証した。Ｐａｒ４ＤＤは、ＧＳＴ融合タンパク質として発現され、グルタチオンセファロース上で精製され、そしてインビトロ翻訳化３５Ｓ−メチオニン標識ＴＨＡＰ１の結合のための親和性マトリックスとして用いられた。ＧＳＴは、陰性対照として働いた。
さらに、ＴＨＡＰ１がＰａｒ４ＤＤおよびＳＬＣの両方とインビボで相互作用する、ということを本発明者等は示した。Ｍｙｃ−Ｐａｒ４ＤＤおよびＧＦＰ−ＴＨＡＰ１発現ベクターは、一次ヒト内皮細胞中で共トランスフェクトされた。Ｍｙｃ−Ｐａｒ４ＤＤはモノクローナル抗ｍｙｃ抗体で染色された。グリーンフルオレッセンス、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１；レッド蛍光、Ｐａｒ４ＤＤ。
したがって本発明は、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＰＡＲ４結合を調節する（刺激するかまたは抑制する）分子の同定のためのアッセイを含む。好ましい実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４結合またはＴＨＡＰ１／ＳＬＣ結合を調節する（刺激するかまたは抑制する）分子の同定のためのアッセイを含む。
高処理量スクリーニングアッセイの４つの例は、以下を含む：
１）ＴＨＡＰファミリーベイト（bait）とプレイ（prey）としてのＰＡＲ４またはＳＬＣとの相互作用を壊す薬剤を見出すための２ハイブリッドベースアッセイ
２）組換えＴＨＡＰファミリーポリペプチドおよびＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質を用いたインビトロ相互作用アッセイ
３）組換えＴＨＡＰファミリーポリペプチドおよびＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質を用いたチップベース結合アッセイ
２）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドおよび蛍光タンパク質と融合されたＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）細胞ベースアッセイ
したがって本発明は、候補ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＰＡＲ４またはＳＬＣ相互作用モジュレーターを同定する方法であって、
ａ）ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログおよびＰＡＲ４またはＳＬＣポリペプチドまたはその断片を用意すること、
ｂ）上記ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドを試験化合物と接触させること、および
ｃ）上記化合物がＴＨＡＰファミリー／ＰＡＲ４またはＳＬＣ相互作用活性を選択的に調節する（例えば活性化するかまたは抑制する）か否かを決定する
ことを含む方法を含む。
また、
ａ）ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログを含む細胞、およびＰＡＲ４あるいはＳＬＣポリペプチドまたはその断片を用意すること、
ｂ）上記細胞を試験化合物と接触させること、および
ｃ）上記化合物がＴＨＡＰファミリー／ＰＡＲ４またはＳＬＣ相互作用活性を選択的に調節する（例えば活性化するかまたは抑制する）か否かを決定する
ことを含む方法が考えられる。
概して、タンパク質−タンパク質相互作用の検出のための任意の適切なアッセイが用いられ得る。
一例では、２ハイブリッドアッセイ（例えば米国特許第５，２８３，３１７号；Zervos et al.(1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054;Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene8: 1693-1696;およびＷＯ９４／１０３００（Brent）参照）において、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログは「ベイトタンパク質」として用いられ、そしてＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質は「プレイタンパク質」として用いられ得る（あるいはその逆に）。２ハイブリッド系は、分離可能ＤＮＡ結合および活性化ドメインからなるほとんどの転写因子の調節性（modular nature）に基づいている。要するに、このアッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一構築物では、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログをコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物では、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログ（「プレイ」または「試料」）をコードする遺伝子は、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＰＡＲ４複合体を形成し得る場合、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは非常に接近するようになる。この接近は、転写因子に応答する転写調節部位に操作可能的に連結されるレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され、機能的転写因子を含む細胞コロニーが単離されて、ＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために用いられ得る。したがってこのアッセイは、試験化合物の存在下または非存在下で実行され、それによりＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＰＡＲ４またはＳＬＣ相互作用の調節が、レポーター遺伝子のより低い転写または転写の欠如により検出され得る。
他の例では、インビトロＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＰＡＲ４またはＳＬＣ相互作用アッセイが実行され、そのいくつかの例が本明細書中でさらに記載される。例えば組換えＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログは、組換えＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質あるいはその生物学的活性部分と接触され、そしてＴＨＡＰファミリータンパク質と結合するＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質の能力が決定される。ＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質化合物とＴＨＡＰファミリータンパク質の結合は、本明細書中に記載されているように直接または間接的に決定され得る。好ましい実施形態では、アッセイは、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログを、ＴＨＡＰファミリータンパク質（例えばＴＨＡＰファミリー標的分子）に結合するＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質と接触させ、それによりアッセイ混合物を生成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、およびＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、ＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質と比較した場合のＴＨＡＰファミリーまたはその生物学的活性部分と選択的に結合する試験化合物の能力の決定を含む。例えばＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、ＴＨＡＰファミリータンパク質／Ｐａｒ４またはＳＬＣ複合体からのＰａｒ４またはＳＬＣを置換し、それによりＴＨＡＰファミリータンパク質／化合物複合体を形成する化合物の能力を決定することを含み得る。あるいは、ＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することもできる、と理解されるが、この場合、ＰＡＲ４またはＳＬＣタンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、ＴＨＡＰファミリータンパク質と比較して、ＰＡＲ４もしくはＳＬＣまたはその生物学的活性部分と選択的に結合する試験化合物の能力の決定を含む。例えばＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、ＴＨＡＰファミリータンパク質／Ｐａｒ４またはＳＬＣ複合体からのＰａｒ４またはＳＬＣを置換し、それによりＴＨＡＰファミリータンパク質／化合物複合体を形成する化合物の能力を決定することを含む。
ＰＭＬ核小体（ＰＭＬ ＮＢ）におけるＴＨＡＰファミリーポリペプチドおよび／またはＰａｒ４輸送を調節するためのアッセイ
実施例８および実施例９に示されるように、ＴＨＡＰ１およびＰａｒ４がＰＭＬ ＮＢに局在するということを、いくつかの実験方法を用いて本発明者等は実証した。
ＴＨＡＰ１はＰＭＬ核小体に関連した新規のタンパク質である、ということを本発明者等は実証した。二重免疫蛍光染色は、ＴＨＡＰ１と、ＰＭＬ−ＮＢタンパク質、ＰＭＬおよびＤａｘｘとの共局在化（colocalization）を示した。一次ヒト内皮細胞をＧＦＰ−ＴＨＡＰ１発現ベクターでトランスフェクトし、内因性ＰＭＬおよびＤａｘｘをそれぞれモノクローナル抗ＰＭＬ抗体およびポリクローナル抗Ｄａｘｘ抗体で染色した。
いくつかの実験により、Ｐａｒ４はインビボでＴＨＡＰ１と共局在する、ということも本発明者等は実証した。一つの実験では、二重免疫蛍光染色は、一次ヒト内皮細胞または繊維芽細胞中で、Ｐａｒ４およびＰＭＬのＰＭＬ−ＮＢでの共局在化を明示した。内因性ＰＡＲ４およびＰＭＬをそれぞれポリクローナル抗ＰＡＲ４抗体およびモノクローナル抗ＰＭＬ抗体で染色した。別の実験では、二重染色は、異所性ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１を発現する細胞中で、Ｐａｒ４およびＴＨＡＰ１の共局在化を明示した。一次ヒト内皮細胞または繊維芽細胞をＧＦＰ−ＴＨＡＰ１発現ベクターでトランスフェクトし、内因性Ｐａｒ４をポリクローナル抗ＰＡＲ４抗体で染色した。
ＰＭＬはＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４複合体をＰＭＬ−ＮＢに動員する、ということを本発明者等はさらに実証した。三重免疫蛍光染色は、ＰＭＬを過剰発現する細胞中でのＴＨＡＰ１、Ｐａｒ４およびＰＭＬの共局在化、ならびに異所性Ｓｐ１００を発現する細胞における共局在化の非存在を示した。ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＨＡＰ１およびＨＡ−ＰＭＬまたはＨＡ−ＳＰ１００発現ベクターで共トランスフェクトし、ＨＡ−ＰＭＬまたはＨＡ−ＳＰ１００および内因性Ｐａｒ４を、それぞれモノクローナル抗ＨＡ抗体およびポリクローナル抗Ｐａｒ４抗体で染色した。
Ｃ．ＰＭＬ核小体におけるＴＨＡＰファミリータンパク質輸送を調節するためのアッセイＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質、特にＴＨＡＰ１、ＰＭＬ−ＮＢタンパク質との結合、あるいはＰＭＬ−ＮＢへの局在化を調節する（刺激するかまたは抑制する）薬剤の同定に関するアッセイが提供される。概して、タンパク質−タンパク質相互作用の検出のための任意の適切なアッセイが用いられ得る。高処理量スクリーニングアッセイの２つの例を以下に挙げる：１）ＴＨＡＰ１ベイトとＰＭＬ−ＮＢタンパク質プレイとの相互作用を破壊する化合物を見出すための酵母における２ハイブリッドベースアッセイ；ならびに２）組換えＴＨＡＰ１およびＰＭＬ−ＮＢタンパク質を用いたインビトロ相互作用アッセイ。このようなアッセイは、ＴＨＡＰファミリー／Ｐａｒ４アッセイに関して上記したのと同様に実行され得るが、但し、ＰＭＬ−ＮＢタンパク質がＰａｒ４の代わりに用いられる。結合は、例えばＴＨＡＰファミリータンパク質およびＰＭＬタンパク質またはＰＭＬ関連タンパク質、例えばｄａｘｘ、ｓｐ１００、ｓｐ１４０、ｐ５３、ｐＲＢ、ＣＢＰ、ＢＬＭまたはＳＵＭＯ−１間で検出され得る。
標準方法が既知であるその他のアッセイには、ＴＨＡＰ１とＰＭＬ−ＮＢとの共局在化を調節する、一般的に抑制する分子を同定するためのアッセイが含まれる。検出は、適切な標識、例えば抗ＴＨＡＰ１抗体、及びＰＭＬ−ＮＢタンパク質の検出を可能にする抗体を用いて実行される。
Ｄ．ＰＭＬ小体におけるＰＡＲ４輸送を調節するためのアッセイ
ＰＭＬ−ＮＢタンパク質と結合するＰＡＲ４、又はＰＭＬ−ＮＢへの局在化を調節する（刺激するかまたは抑制する）薬剤の同定に関するアッセイが提供される。概して、タンパク質−タンパク質相互作用の検出のための任意の適切なアッセイが用いられ得る。高処理量スクリーニングアッセイの２つの例を以下に挙げる：１）ＰＡＲ４ベイトとＰＭＬ−ＮＢタンパク質プレイとの相互作用を破壊する化合物を見出すための酵母における２ハイブリッドベースアッセイ；ならびに２）組換えＰＡＲ４およびＰＭＬ−ＮＢタンパク質を用いたインビトロ相互作用アッセイ。このようなアッセイは、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／Ｐａｒ４アッセイに関して上記したのと同様に実行され得るが、但し、ＰＭＬ−ＮＢタンパク質がＴＨＡＰファミリーポリペプチドの代わりに用いられる。結合は、例えばＰａｒ４タンパク質およびＰＭＬタンパク質またはＰＭＬ関連タンパク質、例えばｄａｘｘ、ｓｐ１００、ｓｐ１４０、ｐ５３、ｐＲＢ、ＣＢＰ、ＢＬＭまたはＳＵＭＯ−１間で検出され得る。
標準方法が既知であるその他のアッセイとしては、ＰＡＲ４とＰＭＬ−ＮＢとの共局在化を調節する、一般的に抑制する分子を同定するためのアッセイが挙げられる。検出は、適切な標識、例えば抗ＰＡＲ４抗体、及びＰＭＬ−ＮＢタンパク質の検出を可能にする抗体を用いて実行される。
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規の作用物質、及びこれらのアッセイの使用による前記のような作用物質を製造する方法に関する。したがって、一実施形態では、本発明は、上記のスクリーニングアッセイ（例えば細胞ベースアッセイまたは無細胞アッセイ）のいずれか１つの工程を含む方法により得られる化合物または作用物質を含む。例えば一実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリー標的分子を発現する細胞を試験化合物と接触させること、およびＴＨＡＰファミリー標的分子と結合するかまたはその活性を調節する試験化合物の能力を決定することを含む方法により得られる化合物または作用物質を含む。別の実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリー標的分子を発現する細胞をＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分と接触させてアッセイ混合物を生成させること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、およびＴＨＡＰファミリー標的分子と相互作用するかまたはその活性を調節する試験化合物の能力を決定することを含む方法により得られる化合物または作用物質を含む。別の実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分を試験化合物と接触させること、およびＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分と結合するかまたはその活性を調節する（例えば刺激するかまたは抑制する）試験化合物の能力を決定することを含む方法により得られる化合物または作用物質を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分をＴＨＡＰファミリータンパク質を結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を生成させること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、およびＴＨＡＰファミリータンパク質と相互作用するかまたはその活性を調節する試験化合物の能力を決定することを含む方法により得られる化合物または作用物質を含む。
したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書中に記載されたように同定される作用物質をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば本明細書中に記載されたように同定される作用物質（例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン調節作用物質、アンチセンスＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン核酸分子、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン特異的抗体、あるいはＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン結合相手）は、このような作用物質を用いた治療の有効性、毒性または副作用を決定するために動物モデルに用いられ得る。あるいは本明細書中に記載されたように同定される作用物質は、このような作用物質の作用メカニズムを決定するために動物モデルに用いられ得る。さらに本発明は、本明細書中に記載されたような治療のための上記スクリーニングアッセイにより同定される新規の作用物質の使用に関する。
本発明は、本明細書中に記載されたような診断、予後および治療に関する上記スクリーニングアッセイにより同定される新規の作用物質の使用にも関する。したがって、本明細書中に記載されたような診断、予後または治療に用いるための薬剤または薬学的組成物の設計、処方、合成、製造および／または生成におけるこのような作用物質の使用は、本発明の範囲内である。例えば一実施形態では、本発明は、上記のスクリーニングアッセイの１つにより得られる化合物の構造および／または特性に対する参照による薬剤または薬学的組成物を合成または製造する方法を含む。例えば薬剤または薬学的組成物は、ＴＨＡＰファミリー標的分子を発現する細胞が試験化合物と接触され、ＴＨＡＰファミリー標的分子と結合するかまたはその活性を調節する試験化合物の能力が決定される方法により得られる化合物の構造および／または特性に基づいて合成され得る。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分が試験化合物と接触され、そしてＴＨＡＰファミリータンパク質またはその生物学的活性部分と結合するかまたはその活性を調節する（例えば刺激するかまたは抑制する）試験化合物の能力が決定される方法により得られる化合物の構造および／または特性に基づいた薬剤または薬学的組成物を合成または製造する方法を含む。
Ｅ．アポトーシスアッセイ
任意の適切なアポトーシスアッセイを用いて、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログのアポトーシス活性を評価し得る、と理解されよう。
アポトーシスは、形態学的、生化学的および分子的変化の特徴的パターンにより認識され得る。アポトーシスが進行中の細胞は、収縮し、球状に見え、それらは培養皿から剥がれるようになる。形態学的変化は、顕微鏡により容易に同定され得るクロマチンおよび細胞質の凝縮の特徴的パターンを包む。ＤＮＡ結合染料、例えばＨ３３２５８により染色されると、アポトーシス細胞は均質な円形核の代わりに、標準的に凝縮した、斑点状の核を示す。
アポトーシスの特徴は内部ヌクレオチド鎖切断（エンドヌクレオリシス）であり、これは核ＤＮＡがヌクレオソームのリンカー切断で最初に分解されて、単一および多ヌクレオソームと等価の断片を生じる分子変化である。これらのＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動に付されると、ゲル上で互いに略等距離に配置される一連のＤＮＡバンドを示す。互いの隣の２つのバンド間のサイズ差は、ほぼ１ヌクレオソーム、即ち１２０塩基対の長さである。ＤＮＡバンドのこの特徴的表示は、ＤＮＡラダーと呼ばれ、細胞のアポトーシスを示す。アポトーシス細胞は、細胞ＤＮＡ含量、変性に対するＤＮＡの感受性増大、または光散乱特性変化の測定に基づいたフローサイトメトリー法により同定され得る。これらの方法は当該技術分野で既知であり、本発明の意図の範囲内である。
アポトーシスに特徴的な異常ＤＮＡ分断は、当該技術分野で既知の任意の手段により検出され得る。好ましい一実施形態では、ＤＮＡ分断はビオチニル化ｄＵＴＰ（ｂ−ｄＵＴＰ）で標識される。米国特許第５，８９７，９９９号に記載されているように、細胞は固定され、ビオチニル化ｄＵＴＰの存在下で、外因性ターミナルトランスフェラーゼ（ターミナルＤＮＡトランスフェラーゼアッセイ；ＴｄＴアッセイ）またはＤＮＡポリメラーゼ（ニックトランスレーションアッセイ；ＮＴアッセイ）とともにインキュベートされる。ビオチニル化ｄＵＴＰは、異常ＤＮＡ分断が修復される場所で染色体中に組み入れられ、蛍光顕微鏡下でアビジンと接合されたフルオレセインで検出される。
ＴＨＡＰファミリー、ＴＨＡＰドメインおよびＰＡＲ４ポリペプチド活性の評価
本発明の核酸およびポリペプチドの評価に関しては、本発明のスクリーニング法で評価されるアポトーシス指標は、細胞の生育可能性の実質的に任意の指標であり得る。例として、生育可能性指標は、細胞数、細胞屈折性、細胞脆弱性、細胞サイズ、細胞液胞の数、生細胞を死細胞と区別する染色、メチレンブルー染色、芽体サイズ、芽体位置、核形態および核染色からなる群から選択され得る。本明細書中に記載されたその他の生育可能性指標および生育可能性指標の組合せは当該技術分野で既知であり、本発明のスクリーニング法に用いられ得る。
細胞死状態は、ＤＮＡ完全性に基づいて評価され得る。この決定のためのアッセイは、オリゴヌクレオソームラダーへのＤＮＡ分断を同定するためにアガロースゲル上でＤＮＡをアッセイすること、及び、ターミナルトランスフェラーゼを介してフルオレセインまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ接合ＵＴＰで遊離ＤＮＡを標識することにより、ＤＮＡのニック末端を免疫組織化学的に検出することを含む。通常どおり、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によっても核形態を検査し得る。３つのアッセイ（ＤＮＡラダー、末端標識およびＰＩ標識）はすべておおまかな測定であり、すでに死亡したかまたは死の間際にある細胞に関しては良好である。
好ましい一例では、アポトーシスアッセイは、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログのテトラサイクリン調節性発現を示す３Ｔ３細胞株中での血清回収誘導性アポトーシスに基づいている。アポトーシス細胞の検出は、９６ウエルまたは３８４ウエルマイクロプレート中での細胞のＴＵＮＥＬ標識により成し遂げられる。この例は、実施例１３にさらに記載されている。
他の態様では、アッセイは、ＴＨＡＰファミリータンパク質が細胞中で過剰発現されるかまたは異所性発現される場合、細胞傷害性死シグナル、抗ウイルス応答（Tartaglia et al., (1993) Cell 74 (5): 845-531）および／または酸性スフィンゴミエリナーゼの活性化（Wiegmann et al., (1994) Cell 78 (6): 1005-15）の生起に関して試験し得る。アポトーシスの調節に関するアッセイは、例えば神経細胞およびリンパ球においても実行され得るが、この場合、生き残るために神経成長因子を要する神経細胞（Martin, D.P. et al, (1998) J. Cell Biol 106, 829-844）、および生存が特定のリンホカインに依存するリンパ球（Kyprianou, N. and Issacs, J.T. (1988) Endrocrinology 122: 552-562）に関して実証されているように、因子回収（factor withdrawal）が細胞自殺を誘導することは既知である。
細胞アッセイにおけるＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド−マーカー融合
一つの方法において、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログをコードする発現ベクターを用いて、細胞中でアポトーシスを誘導する本発明のポリペプチドの能力を評価し得る。所望により、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログを発現する細胞の同定を促進するために、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドは検出可能マーカーと融合され得る。例えば、グリーンフルオレセンスタンパク質が増強された発光クラゲ(Aequoria victoria)ＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰ）は、融合タンパク質生成に用いられ得る（CLONTECH Laboratories、 Inc., 1020 EastMeadow Circle, Palo Alto、 Calif. 94303）（さらに米国特許第６，１９１，２６９号に記載）。
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドｃＤＮＡ配列は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドをコードするｃＤＮＡをインフレームでプラスミドｐＥＧＦＰ−ＮＩ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号＃Ｕ５５７６２）のＳａｌＩ−ＢｍＨＩ部位に挿入することにより、融合される。細胞は、試験される細胞に最適な方法（ＣａＰＯ４またはリポフェクチンのいずれか）により、一過的にトランスフェクトされる。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの発現およびアポトーシスの誘導は、トランスフェクション後２４時間および４８時間目に蛍光顕微鏡で検査される。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬ法（切断核および／または形態学的判定基準ＤＮＡの３’末端ラベリングを含む）により評価され得る（Cohen et al. (1984) J.Immunol. 132: 38-42）。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドおよびレポーターポリペプチド（例えばＥＧＦＰ）を含む融合ポリペプチドをスクリーニングに用いる場合、アポトーシスは、断片化核小体またはアポトーシス小体中のレポーターポリペプチドの核局在化の検出により評価され得る。例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド−ＥＧＦＰ融合ポリペプチドが用いられる場合、アポトーシス細胞中のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドＥＧＦＰが関連する蛍光の分布は、アポトーシスに関連した核ＤＮＡ変化を検出するために慣用的に用いられるＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染料の分布と同一である（Cohen et al.、上記）。特徴的ＥＧＦＰ蛍光を示す最低約１００個の細胞が、蛍光顕微鏡により評価される。アポトーシスは、核断片化、顕著なアポトーシス小体および細胞質蒸発（cytoplasmic boiling）として得点付けされる。核断片化の特徴は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド−ＥＧＦＰがアポトーシス小体中で凝縮した場合、特に可視的である。
核局在化を受ける、そしてＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドのアポトーシスを誘導する能力は、２９３ヒト腎臓細胞中での一過性発現により試験され得る。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン誘導性アポトーシスに感受性であることが立証された場合、２９３細胞は、その他（例えば内皮細胞または癌細胞）においてアポトーシスを誘導するとも思われるＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログに関する便利な最初のふるいとして役立ち得る。例示的プロトコールでは、２９３細胞は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン−ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドベクターでトランスフェクトされる。１００ｍｍ皿中の約５*１０６の２９３細胞を、リン酸カルシウム法を用いて１０ｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。用いられたプラスミドは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン−ＥＧＦＰコード配列を含む。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬおよびＤＡＰＩ染色によりトランスフェクションの２４時間後に評価される。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされた細胞は蛍光顕微鏡で評価され、アポトーシスの指標としてのＥＧＦＰマーカーの典型的核凝集が観察される。アポトーシス性である場合、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン−ＥＧＦＰを発現する細胞中のＥＧＦＰシグナルの分布は、アポトーシスに関連した核ＤＮＡ変化を検出するために通常に用いられるＤＡＰＩまたはＨｏｃｈｅｓｔ３３３４２染料の分布と同一である（Cohen et al.、上記）。
ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログのアポトーシスを誘導する能力は、例えばＮＣＩから入手可能なヒト癌細胞における発現アッセイによっても試験され得る。ベクターのタイプ（例えばプラスミドまたはレトロウイルスまたはシンドビス・ウイルス）は、細胞のタイプにおける効率に基づいて選択され得る。指示された期間後、例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン−ＥＧＦＰのアポトーシス小体への凝集を含む、アポトーシスの形態学的徴候について、細胞が評価される。細胞は蛍光顕微鏡下で計数され、アポトーシス徴候の存在または非存在に関して採点されるか、あるいは細胞は蛍光ＴＵＮＥＬアッセイにより採点され、フローサイトメーターで計数される。アポトーシスは、アポトーシスの典型的進行変化を示す細胞のパーセントとして表される。
腫瘍細胞のＮＣＩパネルからの細胞は、例えば以下のものを含む：
−結腸癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（細胞株ＫＭ１２；ＨＴ−２９；ＳＷ−６２０；ＣＯＬＯ２０５；ＨＣＴ−５；ＨＣＣ２９９８；ＨＣＴ−１１６）；
−ＣＮＳ腫瘍、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（細胞株ＳＦ−２６８、星状細胞腫；ＳＦ−５３９、神経膠芽腫；ＳＮＢ−１９、神経膠芽腫；ＳＮＢ−７５、星状細胞腫；およびＵ２５１、神経膠芽腫）；
−白血病細胞、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；Ｋ５６２、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＭＯＬＴ−４、ＡＬＬ；ＳＲ、免疫芽細胞腫大細胞；およびＲＰＭＩ８２２６、骨髄芽細胞腫）；
−前立腺癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（ＰＣ−３）；
−腎臓癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（細胞株７６８−０；ＵＯ−３１；ＴＫ１０；ＡＣＨＮ）；
−皮膚癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（黒色腫）（細胞株ＳＫＭＥＬ−２８；Ｍ１４；ＳＫＭＥＬ−５；ＭＡＬＭＥ−３）；
−肺癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（細胞株ＨＯＰ−９２；ＮＣＩ−Ｈ４６０；ＨＯＰ−６２；ＮＣＩ−Ｈ５２２；ＮＣＩ−Ｈ２３；Ａ５４９；ＮＣＩ−Ｈ２２６；ＥＫＶＸ；ＮＣＩ−Ｈ３２２）；
−乳癌、レトロウイルス発現ベクターを用いた発現、感染後９６時間でのアポトーシスの評価（細胞株ＭＣＦ−７；Ｔ−４７Ｄ；ＭＣＦ−７／ＡＤＲ；ＭＤＡＭＢ４３；ＭＤＡＭＢ２３；ＭＤＡ−Ｎ；ＢＴ−５４９）；
−卵巣癌、レトロウイルス発現ベクターおよびプロトコールまたはシンドビスウイルス発現ベクターおよびプロトコールを用いた発現、レトロウイルスを用いて感染後９６時間での、またはシンドビスウイルスベクターを用いて感染後２４時間でのアポトーシスの評価（細胞株ＯＶＣＡＲ−８；ＯＶＣＡＲ−４；ＩＧＲＯＶ−１；ＯＶＣＡＲ−５；ＯＶＣＡＲ３；ＳＫ−ＯＶ−３）。
さらなる代表例では、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログにより誘導されるアポトーシスに対する悪性黒色腫細胞の感受性は、以下のいくつかの既知の黒色腫細胞型で試験され得る：ヒト黒色腫ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６７６）；ヒト悪性黒色腫Ａ−３７５（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１６１９）；ヒト悪性黒色腫Ａ２０５８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１１４７）；ヒト悪性黒色腫ＳＫ−ＭＥＬ−３１（ＡＴＣＣＨＴＢ−７３）；ヒト悪性黒色腫ＲＰＭＩ−７５９１ ＡＴＣＣ ＨＴＢ−６６（リンパ節に転移）。原発性黒色腫単離物も試験され得る。さらに、ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４３）および２９３ヒト腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）（形質転換化一次胚細胞）が試験される。正常ヒト一次皮膚繊維芽細胞およびＲａｔ−１繊維芽細胞は、対照として使用できる。すべての黒色腫細胞株は、転移物または転移結節からのそれらの単離を基礎として、転移性である。一過性発現戦略は、長期選択に関連した人工物を伴わずに、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド媒介性アポトーシスの誘導を評価するために用いられる。下記のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド−ＥＧＦＰ融合タンパク質をコードする発現ベクターは、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドを発現する細胞の同定を促進するために用いられ得る。細胞は、試験される細胞に最適な方法（ＣａＰＯ４またはリポフェクチンのいずれか）により一過的にトランスフェクトされる。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの発現およびアポトーシスの誘導は、トランスフェクション後２４時間および４８時間目に蛍光顕微鏡を用いて検査される。特徴的ＥＧＦＰ蛍光を示す最低約１００個の細胞が、蛍光顕微鏡により評価される。アポトーシスは、核断片化、顕著なアポトーシス小体および細胞質蒸発として採点される。核断片化の特徴は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド−ＥＧＦＰがアポトーシス小体中で凝縮した場合、特に可視的である。
さらなる一例では、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログにより誘導されるアポトーシスに対する内皮細胞の感受性が、以下のいくつかの既知の内皮細胞型で試験され得る：ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞；BioWhittaker-Clonetics, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793-0127、カタログ番号ＣＣ−２５１９）、ＨＭＶＥＣ−Ｌ（肺からのヒト微小血管内皮細胞；BioWhittaker-Clonetics, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD21793-0127、カタログ番号ＣＣ−２５２７）、ＨＭＶＥＣ−ｄ（皮膚からのヒト微小血管内皮細胞；BioWhittaker-Clonetics,8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793-0127、カタログ番号ＣＣ−２５４３）。これらのおよびその他の内皮細胞のタイプは、血管新生（angiogenesis）の調節のための療法戦略においてアポトーシスを誘導するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの能力の指標を提供するに際してのモデルとして有用であり得る。一過性発現戦略は、長期選択に関連した人工物を伴わずに、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド媒介性アポトーシスの誘導を評価するために用いられる。下記のＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド−ＥＧＦＰ融合タンパク質をコードする発現ベクターは、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドを発現する細胞の同定を促進するために用いられ得る。細胞は、試験される細胞に最適な方法（ＣａＰＯ４またはリポフェクチンのいずれか）により一過的にトランスフェクトされる。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの発現およびアポトーシスの誘導は、トランスフェクション後２４時間および４８時間目に蛍光顕微鏡を用いて検査される。特徴的ＥＧＦＰ蛍光を示す最低約１００個の細胞が、蛍光顕微鏡により評価される。アポトーシスは、核断片化、顕著なアポトーシス小体および細胞質蒸発として採点される。核断片化の特徴は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチド−ＥＧＦＰがアポトーシス小体中で凝縮した場合、特に可視的である。
別の例では、一過性トランスフェクションアッセイ手法は、ＩＬ−１−β−転換酵素により誘導されるアポトーシスの検出に関して前に記載されたものと同様である（Miura et al., Cell 75: 653-660 (1993); Kumar et al., Genes Dev. 8:1613-1626 (1994); Wang et al., Cell 78: 739-750 (1994)；および米国特許第６，２２１，６１５号）。トランスフェクションの１日前に、細胞（例えばＲａｔ−１細胞）は、３．５*１０４細胞／ウエルで２４ウエル皿中で平板培養される。翌日、細胞は、リポフェクトアミン手法（Gibco/BRL）により、β−ガラクトシダーゼをコードするマーカープラスミドを、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドをコードする発現プラスミドと組合せて用いて、トランスフェクトされる。トランスフェクション後２４時間目に、細胞は固定され、Ｘ−Ｇａｌで染色されて、プラスミドＤＮＡを受容した細胞中でのβ−ガラクトシダーゼ発現を検出される（Miura et al.、上記）。青色細胞の数が顕微鏡検査により計数され、生（平坦青色細胞）または死（球状青色細胞）として採点される。このアッセイにおけるＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドの殺細胞活性は、対照発現ベクター（ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドｃＤＮＡ挿入物を伴わない）を用いたβ−ｇａｌプラスミドの共トランスフェクションと比較して、得られた青色細胞の大幅な減少により明示される。
さらに別の例では、β−ガラクトシダーゼ共トランスフェクションアッセイは、細胞死の決定のために用いられ得る。アッセイは、記載されたようにして実施される（Hsu, H. et
al, (1995). Cell 81, 495-504; Hsu, H. et al, (1996a).Cell 84, 299-308;およびHsu, H. et al, (1996b) Immunity 4,387-396並びに米国特許第６，２４２，５６９号）。トランスフェクトされた細胞は、Shu, H.B. etal, （(1995) J. Cell Sci. 108, 2955-2962）に記載されたようにＸ−ｇａｌで染色される。３５ｍｍ皿の８つの観察域からの青色細胞の数は、計数により決定される。代表的１実験からの平均数が示される。
アポトーシスに関するアッセイは、アポトーシスの任意の適切な生物学的マーカーを用いることによっても実行され得る。いくつかの方法を以下に記載する。
一態様では、細胞死状態の蛍光細胞計測試験が実行され得る。蛍光細胞計測試験に用いられる手法は、細胞周期の３つの異なる時期：Ｇ１、ＳおよびＧ２での細胞の同定を用いる。これは、ヨウ化プロピジウムラベリングによるＤＮＡ量染色により広く行われる。瀕死細胞集団は、細胞周期の３つの時期のいずれかで生きている細胞集団と同一のＤＮＡ量を含有するため、２つの細胞集団を区別する方法はない。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色とともにアポトーシスの生物学的マーカー（例えばターミニンＴｐ３０、米国特許第５，７８３，６６７号）の陽性と関する二重ラベリングを実施し得る。アポトーシスの生物学的マーカーおよびＰＩ染色に関するラベリング指数の測定は、組合せて用いられて、生きており、瀕死のＧ１における細胞の精確な分画を得ることができる。同様の概算は、Ｓ期およびＧ２期細胞集団についてなされ得る。
このアッセイでは、細胞は、ホルムアルデヒド固定および０．０５％トリトンでの抽出について処理される。その後、細胞検体は、室温または３７℃で一晩、アポトーシスのマーカーに対するモノクローナル抗体とともにインキュベートされる。この後、フルオレセイン化ヤギ抗マウス抗体とともにインキュベートされて、その後、ヨウ化プロピジウム染色によるインキュベーションがなされる。完全に処理された細胞検体は次に、同一細胞集団とともに、細胞当たりでの蛍光（アポトーシスのマーカー）およびローダミン（ＰＩ）ラベリング強度に関して、蛍光細胞計測測定により評価される。
別の態様では、アポトーシスの治療的誘導による細胞増殖に及ぼす抑制作用を評価できる。特定の化学療法薬が癌細胞増殖を抑制し得るか否かを決定するための一つのルーチン法は、細胞のコロニーサイズまたは数の低減を測定するか、または軟質寒天コロニーでの生育あるいはヌードマウスでのインビボ腫瘍形成を測定することにより、培養における細胞集団のサイズを調べることであるが、この手法は、検出可能であるに十分な大きさであるコロニーまたは腫瘍の発達に時間を要する。これらのアプローチに関与する実験は概して、大規模計画作製および長時間の実験期間（少なくとも３週間）の多数回反復を要する。しばしばこれらのアッセイは、薬剤が細胞増殖を抑制しておらず、むしろ細胞を殺害し得る（癌の化学療法治療に必要とされるより好ましい結果である）という事実を考慮しない。したがってアポトーシス活性の評価は、休止中の、非循環または非増殖細胞に特異的な生物学的または生化学的マーカーの使用を含み得る。例えばモノクローナル抗体は所定組織中の細胞の非増殖集団を評価するために用いられ得るが、これは腫瘍または細胞塊の増殖部分の測定値を間接的に示す。この検出は、生物学的または生化学的マーカー（例えば抗体）と組合せて、瀕死細胞集団プールを検出し、癌性細胞増殖の封じ込めにおける任意の所定の薬剤の有効性の強力且つ迅速な評価を提供する。適用は、培養細胞または組織切片に関して免疫蛍光顕微鏡レベルで容易に実施され得る。
他の態様では、生物学的または生化学的マーカーは、変性疾患における細胞死頻度の抑制における薬理学的介入を評価するために用いられ得る。アルツハイマー病またはパーキンソン病のような変性疾患に関しては、これらの損失は、ニューロンにおける細胞死プログラムの早期活性化のためであり得る。破骨細胞では、細胞損失は、骨組織が産生し得るより多くの細胞を殺害する過剰活性プログラム細胞死過程による、骨芽細胞および破骨細胞間の異常なバランスによるものであり得る。その他の関連現象は、創傷治癒過程、組織移殖ならびに腎臓感染中の糸球体における細胞増殖においても起こり得るが、この場合、生および死細胞集団間の平衡は組織の健康状態の本質的問題であり、「治療方法」という表題の項でさらに記載される。瀕死細胞集団の迅速評価は、変性組織におけるアポトーシスの生物学的または生化学的マーカーの免疫組織化学的および生化学的測定によりなされ得る。一例では、生物学的または生化学的マーカーは、多発性硬化症に付随する乏突起神経膠細胞における細胞死状態を評価するために用いられ得る。アポトーシスのマーカー（例えばＴｐ３０、米国特許第５，７８３，６６７号）に対するモノクローナル抗体の陽性染色は、瀕死の培養ヒト乏突起神経膠細胞で起こる。プログラム細胞死事象は、血清の総喪失により、または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）による処置によって、これらの乏突起神経膠細胞において活性化される。
通常、生物学的または生化学的マーカーは、動物モデルでの薬理学的試験における細胞死状態を評価するためにも用いられ得る。癌の場合の細胞死速度の低減、または神経変性の場合の細胞死速度増大を制御するための試みが、近年、新方式の疾患介入として見られてきた。既知の薬剤または遺伝子療法を用いた介入による多くのアプローチが、変更されたプログラム細胞死過程の修正の基礎から開始して、任意の所定組織中の平衡細胞塊の維持に関する概念を用いて進行中である。これらの療法的介入に関しては、培養細胞における研究と臨床試験との間の架け橋は動物試験であり、即ち、通常の研究室動物、あるいはノックアウトされた、または過剰発現表現型を保有するトランスジェニックマウスにおける動物モデルを用いた介入の成功である。したがってアポトーシスの生物学的または生化学的マーカー、例えばアポトーシス特異的タンパク質に対する抗体は、正常および実験的に操作された動物の間の瀕死細胞数の変化に関してアポトーシス死状態を検査するための有用なツールである。この情況において、本発明は、細胞死状態を評価するための診断ツールとして、薬剤または遺伝子療法的アプローチの効果および潜在能力を決定するために役立ち得る。
上記のように、ＴＨＡＰファミリー成員の活性ならびにＴＨＡＰファミリー成員または関連する生物学的経路に作用する療法的処置を評価するための方法が提供される。しかしながら他の態様では、同一の方法が、ＴＨＡＰファミリー成員がアポトーシスの生物学的マーカーとして用いられる場合、一般にアポトーシスの評価のために用いられ得る。したがって本発明は、細胞死またはアポトーシス活性のマーカーとしてＴＨＡＰファミリー成員を用いた診断およびアッセイ方法も提供する。さらに診断アッセイも、本明細書中の「診断的および予後的使用」という表現の節において提供される。
治療方法
アポトーシス調節戦略を用いて実行された実験から収集された証拠の大部分は、アポトーシス誘導性または細胞増殖低減性のタンパク質に作用する処置が広範な障害に対する新規の治療方法を提供し得る、ということを示唆する。多数のタンパク質に関して提供される新規の機能、ならびにいくつかの生物学的経路の関連を考えると、本発明の治療方法は種々の方法で働き得る。
ここに、ＴＨＡＰファミリー成員の機能化に基づいた治療方法が提供される。ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログは、本明細書中でさらに記載されるように、アポトーシスまたは細胞増殖の調節に有用であり得る。
この治療方法は、本発明の分子（即ち、ＴＨＡＰファミリー成員ポリペプチド、ＴＨＡＰファミリー標的あるいはＰＡＲ４またはＰＡＲ４標的）に作用することを含む。ＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性、ＴＨＡＰファミリー標的活性あるいはＰＡＲ４またはＰＡＲ４標的活性を調節することを含む方法が含まれる。この活性の調節（増大または低減）は多くの適切な方法で実行され、このうちのいくつかは本出願に記載されている。
例えば治療方法は、「ＴＨＡＰファミリー活性」、「ＴＨＡＰファミリー成員の生物学的活性」または「ＴＨＡＰファミリー成員の機能的活性」を調節することを含み得る。ＴＨＡＰファミリー活性の調節は、ＴＨＡＰファミリー標的分子との会合（例えばＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２またはＴＨＡＰ３とＰａｒ４との会合、あるいはＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２またはＴＨＡＰ３とＰＭＬ−ＮＢタンパク質との会合）、または好ましくは、（１）細胞中で発現されるか細胞中に導入された場合、アポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、最も好ましくはアポトーシスを誘導するかまたは増強すること、および／または最も好ましくは細胞増殖を低減すること、（２）内皮細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、（３）過増殖性細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、（４）ＣＮＳ細胞、好ましくは神経細胞または神経膠細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を媒介すること、あるいは（５）血管新生を媒介すること、好ましくは抑制すること、炎症を媒介すること、好ましくは抑制すること、癌性組織の転移可能性の抑制、腫瘍負荷量の低減、化学療法または放射線療法に対する感受性増大、癌細胞殺傷、癌細胞の増殖の抑制、あるいは腫瘍退縮の誘導からなる群から選択される、動物中で決定される活性、からなる群から選択される任意のその他の活性を調節することを含み得る。ＴＨＡＰファミリー活性の検出は、本明細書中で考察された症状に関連した任意の適切な療法的終点を検出することも含み得る。
別の例では、治療方法は、「ＰＡＲ４活性」、「ＰＡＲ４の生物学的活性」または「ＰＡＲ４の機能的活性」を調節することを含み得る。ＰＡＲ４活性の調節は、ＰＡＲ４−標的分子（例えばＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２、ＴＨＡＰ３またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質）との会合、または最も好ましくはＰＡＲ４アポトーシス誘導または増強（例えばシグナル伝達）活性、あるいは細胞増殖または細胞周期の抑制を調節することを含み得る。
治療方法は、ＰＭＬ−ＮＢへのタンパク質の動員、結合または会合を調節すること、あるいはそうでない場合は、ＰＭＬ−ＮＢ活性を調節することを含み得る。本発明は、ＰＡＲ４活性を調節する方法であって、ＴＨＡＰファミリータンパク質ならびにＰＡＲ４およびＰＭＬ−ＮＢとのＰＡＲ４相互作用を調節すること、ならびにＴＨＡＰファミリー活性を調節することであって、例えばＰＭＬ−ＮＢとのＴＨＡＰ１相互作用を調節することを含む方法も提供する。本発明は、ＰＭＬ−ＮＢへのＴＨＡＰ１またはＰＡＲ４の動員を抑制するかまたは増大することを含む。ＰＭＬ−ＮＢとのＴＨＡＰ１またはＰＡＲ４のいずれかまたは両方の結合の防止は、ＴＨＡＰ１および／またはＰＡＲ４の生物利用能を増大し、したがってＴＨＡＰ１および／またはＰＡＲ４活性を増大する方法を提供する。本発明は、ＰＭＬ−ＮＢとの、またはＰＭＬ−ＮＢと会合する別のタンパク質、例えば、ｄａｘｘ、ｓｐ１００、ｓｐ１４０、ｐ５３、ｐＲＢ、ＣＢＰ、ＢＬＭ、ＳＵＭＯ−１からなる群から選択されるタンパク質との、ＴＨＡＰファミリータンパク質（例えばＴＨＡＰ１）またはＰＡＲ４の結合を抑制するかまたは増大することも含む。例えば本発明は、ＴＨＡＰ１のＰＡＲ４との結合を防止することにより、またはＰＡＲ４のＰＭＬ−ＮＢへの動員またはそれとの結合を防止することにより、ＰＡＲ４活性を調節することを含む。
本発明の治療方法および組成物は、（１）アポトーシスまたは細胞増殖を調節し、最も好ましくはアポトーシスを誘導するかまたは強化し、および／または最も好ましくは細胞増殖を低減すること；（２）内皮細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を調節すること；（３）高増殖性細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を調節すること；（４）ＣＮＳ細胞の、好ましくは神経細胞または神経膠細胞のアポトーシスまたは細胞増殖を調節すること；（５）癌性組織の転移可能性を抑制すること、腫瘍負荷量の低減、化学療法または放射線療法に対する感受性の増大、癌細胞の殺傷、癌細胞の増殖抑制、または腫瘍退縮の誘導；あるいは（６）ＴＨＡＰファミリー標的分子またはＴＨＡＰドメイン標的分子との相互作用、好ましくはタンパク質または核酸との相互作用を含み得る。方法は、本明細書中でさらに記載されるような症状を改善することまたは状態を回復することも含み得る。
抗アポトーシス療法
アポトーシスを抑制する本発明の分子（例えば本明細書中に記載されたスクリーニング法を用いて得られるもの、ドミナントネガティブ変異体、抗体等）も、疾患の治療および／または予防に有用であると予測される。アポトーシスを防止するのが望ましい疾患としては、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性および小脳変性；骨髄異形成症候群、例えば再生不良性貧血；虚血性疾患、例えば心筋梗塞および卒中；肝疾患、例えばアルコール性肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎；関節疾患、例えば骨関節炎；アテローム硬化症等が挙げられる。本発明のアポトーシス抑制剤は、神経変性疾患の予防または治療の作用薬として用いられることが特に好ましい。（Adams, J. M., Science, 281: 1322 (1998)も参照）。
本明細書中に記載されるようなアポトーシスのインヒビターとして、一般に、ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログ、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質またはＰＡＲ４の活性（特にＰＡＲ４／ＰＭＬ−ＮＢタンパク質相互作用）を抑制する任意の分子が含まれる。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドインヒビターとしては、例えば抗体、ペプチド、ドミナントネガティブＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインアナログ、小分子、リボザイムまたはアンチセンス核酸が挙げられ得る。これらのインヒビターは、神経変性障害の治療に特に有益であり得る。特に好ましいのは、ＴＨＡＰファミリータンパク質とＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との結合に影響を及ぼすインヒビター、ならびにＴＨＡＰファミリータンパク質のＤＮＡ結合活性に影響を及ぼすインヒビターである。
さらに好ましい態様では、本発明はＴＨＡＰファミリー活性のインヒビターを用意し、例としては内皮細胞関連障害および神経変性障害の治療のための、ＴＨＡＰファミリータンパク質とＰＡＲ４の相互作用を妨害するかまたは抑制する分子が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＡＲ４は、種々の神経変性障害におけるニューロンアポトーシスに重要な役割を果たすと思われる、として、文献中に支持が見出される（Guo et al., 1998; Mattson et al., 2000; Mattson et al., 1999;Mattson et al., 2001）。したがって脳で発現され、ＰＡＲ４と会合するＴＨＡＰ１も、ニューロンアポトーシスに重要な役割を果たす。ＴＨＡＰファミリーを抑制しおよび／またはＴＨＡＰファミリー／ＰＡＲ４複合体形成を抑制する薬剤は、神経変性障害のための新規の予防的および治療的戦略の開発をもたらし得る。
内皮細胞におけるアポトーシス調節
本発明は、癌、心臓血管性疾患および炎症性疾患の治療に有用であると予測される被験体の血管新生を調節する方法も提供する。不死化細胞のアポトーシスの誘導物質は、悪性腫瘍における腫瘍形成および／または転移を抑圧するのに有用であると予測される。悪性腫瘍の例としては、白血病（例えば骨髄性白血病、リンパ性白血病、例えばバーキットリンパ腫）、消化管癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、その他の癌腫および肉腫が挙げられる。本発明者等は、ヒト内皮細胞からＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４ｃＤＮＡをともに単離したし、ＰＡＲ４およびＰＭＬはともに、血管内皮細胞で優勢に発現されることが既知であり（Boghaert et al., (1997) Cell Growth Differ 8(8): 881-90;
Terris B.et al, (1995) Cancer Res. 55(7): 1590-7, 1995）、このことは、ＰＭＬ−ＮＢおよび新規の関連ＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４プロアポトーシス複合体がインビボでの内皮細胞アポトーシスの主要な調節因子であり、したがって血管新生依存性疾患に対する魅力的な治療目標を構成し得る、ということを示唆する。例えばＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４経路は、血管新生を調節する（例えば刺激するかまたは阻害する）選択的治療を可能にし得る。
第一の態様では、本発明は、ＴＨＡＰ１またはＰＡＲ４インヒビター、あるいは任意にＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４相互作用インヒビター、あるいは任意にＴＨＡＰ１ＤＮＡ結合活性のインヒビターを投与することによる、内皮細胞アポトーシスを抑制する方法を提供する。本明細書中にさらに記載されているように、ＴＨＡＰドメインは、ＴＨＡＰ１プロアポトーシス活性に関与する。実施例１１に示されるように、ＴＨＡＰドメインの欠失は、マウス３Ｔ３繊維芽細胞におけるＴＨＡＰ１のプロアポトーシス活性を除去する。さらにまた、本明細書中にさらに記載されているように、残基１６８〜１７２の欠失または残基１７１〜１７２の置換は、インビトロおよびインビボの両方でのＰＡＲ４に結合するＴＨＡＰ１を阻害し、ＰＭＬ−ＮＢへのＴＨＡＰ１によるＰＡＲ４の動員の欠如を生じる。ＰＡＲ４に関しては、ＴＨＡＰ１との結合のためにはロイシンジッパードメインが必要とされる（そしてそれで十分である）。
内皮細胞アポトーシスの抑制は、虚血を有する患者における血管新生（angiogenesis）および脈管形成（vasculogenesis）を改善し、そしてアテローム硬化症進行に関する重要なメカニズムである限局性調節不全血管リモデリングも妨害し得る。
別の態様では、本発明は、例えば生物学的活性ＴＨＡＰファミリーポリペプチド、例えばＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはＰＡＲ４ポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片もしくはホモログ、あるいはＴＨＡＰ１またはＰＡＲ４刺激剤を投与することによる、内皮細胞アポトーシスを誘導する方法を提供する。内皮細胞アポトーシスの刺激は血管新生を防止するかまたは抑制し、したがって腫瘍または炎症組織の望ましくない血管新生（neovascularization）を制限し得る（Dimmeler andZeiher, Circulation Research, 2000, 87: 434-439参照）。
血管新生
血管新生は、成体器官における先在血管からの新芽形成の過程による新血管の形成として定義される。この新血管新生は内皮細胞の活性化、移動および増殖を含み、いくつかの刺激、中でも剪断応力により推進される。正常生理学的条件下では、ヒトまたは動物は、ごく特定の限定状況でのみ血管新生を被る。例えば血管新生は、正常では、創傷治癒、胎児および胚性発達、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。本発明の分子は、内皮抑制または誘導活性を有し、一般に血管新生を抑制するかまたは誘導する能力を有する。
制御化および非制御化の血管新生はともに、同様の方法で進行すると考えられる。基底膜に取り囲まれた内皮細胞および周皮細胞は、毛細血管を形成する。血管新生は、内皮細胞および白血球により放出される酵素による基底膜の浸食で開始する。血管の管腔を裏打ちする内皮細胞は、次に、基底膜を通して突出する。血管新生刺激剤は、浸食された基底膜を通して移動するよう内皮細胞を誘導する。移動細胞は、親血管からの「出芽」を形成し、ここで内皮細胞は有糸分裂を経て、増殖する。内皮細胞出芽は互いに合体して、毛管ループを形成し、新血管を作成する。
持続性の、非調節性脈管形成は、多数の疾患状態、腫瘍転移および内皮細胞による異常成長において起こり、これらの症状で観察される病理学的損傷を支持する。非調節性血管新生が存在する多様な病理学的疾患状態は、血管新生依存性または血管新生関連疾患として一緒に分類されていた。したがって、血管新生により媒介される疾患および過程、例えば血管腫、固形腫瘍、白血病、転移、末梢血管拡張乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、プラーク新血管新生、側副冠動脈、虚血性四肢血管新生、角膜疾患、皮膚潮紅、新生血管性緑内障、糖尿病性網膜症、後水晶体繊維増殖症、関節炎、糖尿病性新血管新生、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、血管形成、造血、排卵、月経および胎盤形成（これらに限定されない）を治療するための方法および組成物を提供することが本発明の一目的である。
（ｉ）抗血管新生療法
一態様では、本発明は、広範な種々の疾患、例えば癌、動脈硬化症、肥満症、関節炎、十二指腸潰瘍、乾癬、増殖性皮膚障害、心臓血管障害、および例えば糖尿病により引き起こされる異常眼性脈管形成のための考え得る治療としての抗血管新生療法を提供する（Folkman, Nature Medicine 1:27 (1995)およびFolkman,Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston, New England Journalof Medicine, 333: 1757 (1995)）。抗血管新生療法は、新たな血管の形成を抑制することにより作用すると考えられる。
したがって本発明は、血管新生を抑制するのに十分な投与量で、実質的精製ＴＨＡＰファミリーもしくはＴＨＡＰドメインポリペプチドまたはそれらの生物学的活性断片、ホモログまたは誘導体を含む組成物をヒトまたは動物に投与し、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質をコードする核酸を発現し得るベクターを投与し、あるいはＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の発現または活性を有する任意のその他の誘導物質を投与することにより、望ましくない且つ非制御化の血管新生により媒介される疾患および過程を治療するための方法および組成物を提供する。本発明は、腫瘍を治療するためにまたはその成長を退縮させるために特に有用である。前血管新生化（prevascularized）転移腫瘍を有するヒトまたは動物へのＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメイン核酸、タンパク質またはその他の誘導物質の投与は、それらの腫瘍の成長または拡張を防止する。ＴＨＡＰファミリー活性は、疾患の治療のために他の組成物および手法と組合せて用いられ得る。例えば腫瘍は、外科手術、放射線照射または化学療法を、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質と組合せて用いて慣用的に治療され、次に、微小転移の活動停止を拡張するために、そして任意の残留原発性腫瘍を安定化するために、後続してＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質が投与され得る。
好ましい例では、ＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性、好ましくはＴＨＡＰ１活性は、関節炎、例えば慢性関節リウマチの治療のために用いられる。慢性関節リウマチは、滑膜で裏打ちされた関節の対称性多間接性炎症により性格付けれれ、関節外組織、例えば心膜、肺および血管を含み得る。
（ｉｉ）脈管形成療法
別の態様では、ＴＨＡＰファミリータンパク質活性、特にＴＨＡＰ１活性のインヒビターは抗アポトーシス剤として、したがって脈管形成療法として用いられ得る。脈管形成療法は、創傷治癒を促進するための、ならびに閉塞血管をバイパスするために新しい血管の増殖を刺激するための考え得る処置である。したがって前脈管形成療法は、おそらくは、バイパス手術およびバルーン血管形成術（ＰＴＣＡ）を補うかまたはそれらに取って代わり得る。例えば閉塞血管をバイパスするための血管新生（neovascularization）に関して、「治療的有効量」とは、正常では遮断された血管を通過する血液の少なくともいくらかを輸送し得る新血管の形成を生じる量である。
本発明のＴＨＡＰファミリータンパク質は、例えばアポトーシスのインヒビターとして用いられ得る抗体を生成するために用いられ得る。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。さらに、ＴＨＡＰファミリータンパク質と特異的に結合するこれらの抗体は、体液中のＴＨＡＰファミリータンパク質を検出するかまたは定量するために、当業者に既知の診断方法およびキットに用いられ得る。これらの試験からの結果を用いて、癌およびその他の脈管形成媒介性疾患の発生または再発を診断するかまたは予測し得る。
ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質のその他のインヒビター、例えば上記の方法を用いて同定される小分子、アンチセンス核酸、ドミナントネガティブＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質またはペプチドも、血管新生療法に用いられ得る、と理解される。
血管新生療法および抗血管新生療法の両方における適用を考慮して、本発明の分子は内皮抑制または誘導活性を有し、一般に脈管形成を抑制するかまたは誘導する能力を有し得る。このような能力を評価する方法は当該技術分野で既知であり、例としては例えば繊維芽細胞増殖因子の存在下での培養中のウシ毛管内皮細胞の増殖を抑制する能力として抗血管新生特性を評価することが挙げられる、と理解される。
本発明は、内皮抑制またはアポトーシス活性を有するＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインポリペプチドおよびその生物学的活性断片もしくはホモログの任意の誘導体を含むよう意図される、と理解される。本発明は、全長ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質、ＴＨＡＰファミリーおよびＴＨＡＰドメインタンパク質の誘導体およびＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰドメインタンパク質の生物学的活性断片を含む。これらは、アミノ酸置換を有するか、糖を有するか、またはアミノ酸官能基に結合したその他の分子を有するＴＨＡＰファミリータンパク質活性を有するタンパク質を包含する。本方法は、ＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする遺伝子の使用、ならびにそれらの遺伝子により発現されるタンパク質も意図する。
上記のように、いくつかの方法が、治療を必要とする被験体へのモジュレーター、例えば小分子モジュレーター、遺伝子療法ベクターを介して含まれる核酸、ならびにポリペプチド、例えばペプチド模倣物、活性ポリペプチド、ドミナントネガティブポリペプチドおよび抗体を送達するために本明細書中に記載されている。したがって、「薬剤スクリーニングアッセイ」という表題の項における方法にしたがって同定される本発明のモジュレーター、例えばＴＨＡＰファミリーポリペプチド、特にＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２またはＴＨＡＰ３／ＰＡＲ４相互作用、ＴＨＡＰファミリーＤＮＡ結合またはＰＡＲ４／ＰＭＬ−ＮＢ相互作用は、症状を改善するかまたは予防するそれらの能力に関して、細胞または動物モデルでさらに試験され得る、と理解される。同様に、核酸、ポリペプチドおよびベクター（例えばウイルス）も、同様の方法で評価され得る。
本発明の方法により治療される「個体」は、脊椎動物、特に哺乳類（例えばヒト疾患のモデル動物、農場動物、競技用動物およびペット）、典型的にはヒトである。
「治療」とは、治療される個体の自然の経過を改変する試みにおける臨床的介入を指し、そして予防のためにまたは臨床的病態の経過中に実行され得る。望ましい作用としては、疾患の発生または再発の防止、症候の緩和、過剰応答、炎症または壊死のような、疾患の任意の直接的または間接的病理学的結果の減少、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または軽減、ならびに予後の軽減または改善が挙げられる。疾患状態に関連した「病態」とは、罹患個体の安寧、正常生理学または生活の質を危うくする全てのものである。
治療は、有効量のＴＨＡＰファミリーポリペプチドインヒビターまたは活性化剤を投与することにより実施される。「有効量」とは、有益なまたは望ましい臨床結果を実行するのに十分な量であり１または複数回用量で投与され得る。
本発明の脂質組成物を用いた治療様式に対する応答を評価するための判定基準は、特定の症状により決定され、症状に適した標準医学手法に従って測定される。
薬学的組成物
本発明のＴＨＡＰファミリー活性を抑制し得る化合物、好ましくは小分子（しかしペプチドも含む）、ＴＨＡＰファミリー核酸分子、ＴＨＡＰファミリータンパク質および抗ＴＨＡＰファミリー抗体（本明細書中では「活性化合物」とも呼ばれる）は、投与に適した薬学的組成物中に混入され得る。このような組成物は典型的には、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書中で用いる場合、「薬学的に許容可能な担体」という語は、薬学的投与に適合性のある任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含むよう意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は、当該技術分野で既知である。任意の慣用的媒質または作用物質が活性化合物と非適合性である限り以外は、組成物中のその使用が意図される。補助的活性化合物も組成物中に混入され得る。
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口的、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口的、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含み得る：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、ならびに浸透圧を調節するための剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基で、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多用量バイアル注に封入され得る。
注射用使用に適した薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性）または分散液、ならびに滅菌注射溶液または分散液のその場での調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に関しては、適切な担体としては、生理食塩水、静菌性水、クレモフォアＥＬα（BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合に、組成物は滅菌性でなければならず、容易に注射できる程度に流動性である必要がある。それは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に抗して保存されねばならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えばコーティング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により保持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成され得る。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば一ステアリン酸アンモニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによりもたらされ得る。
活性化合物がタンパク質、ペプチドまたは抗ＴＨＡＰファミリー抗体である場合、滅菌注射溶液は、上に列挙した成分のうちの１つまたはそれらの組合せを有する適切な溶媒中に、必要量で活性化合物（例えば、）を混入し、必要な場合にはその後、濾過滅菌することにより調製され得る。一般に分散液は、基本的な分散媒質および上記のものからの必要なその他の成分を含有する滅菌賦形剤中に活性化合物を混入することにより調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分及び任意の付加的な所望の成分の粉末を産生する真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセル中に封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口療法投与のために、活性化合物は、賦形剤と一緒に混入され、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いられ得る。吸入による投与のためには、化合物は、適切な噴射剤、例えば気体（二酸化炭素等）を含有する加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エーロゾルスプレーの形態で送達される。全身投与は、経粘膜または経皮的手段により得る。経粘膜または経皮投与のためには、透過されるバリヤに適した浸透剤が配合物中に用いられる。このような浸透剤は一般に当該技術分野で既知であり、例としては例えば経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは座薬の使用により成し遂げられ得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該技術分野で一般的に既知であるような軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム中に処方される。最も好ましくは活性化合物は、静脈内注射により被験体に送達される。
一実施形態では、活性化合物は、制御放出配合物、例えば移植片および微小封入送達系のように、身体からの迅速排除に対して化合物を保護する担体とともに調製される。生分解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられ得る。このような配合物の調製方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に得られる。リポソーム懸濁液（例えばウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に対して標的化されるリポソーム）も、薬学的許容可能な担体として用いられ得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような当業者に既知の方法に従って、調製され得る。
投与を容易にし、そして投薬量を均一にするために、単位剤形で経口または好ましくは非経口組成物を処方することは、特に有益である。単位剤形は、本明細書中で用いる場合、治療される被験体のための単位投薬量として適合される物理的に別個の単位をさす。各々の単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるよう算定された予定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形に関する仕様書は、活性化合物の独自の特徴および達成されるべき特定の治療効果に、ならびに個体の治療のためのこのような活性化合物を調合する当該技術分野に固有の制限より指図され、そして直接的にそれらに拠る。
このような化合物の毒性および治療効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準薬学的手法により決定され得る。毒性および治療作用間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が用いられ得るが、非感染細胞に対して考え得る損害を最小限にし、それにより副作用を低減するために、このような化合物が罹患組織の部位を標的とする送達系を設計するよう注意すべきある。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のために一連の投薬量を処方するのに用いられ得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く有さないＥＤ５０を含む一連の循環濃度内である。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路によって、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に用いられる任意の化合物に関しては、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。細胞培養で決定した場合、ＩＣ５０（即ち症候の最大半分抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するような用量が、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより精確に決定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
薬学的組成物は、容器、パックまたはディスペンサー内に、投与のための使用説明書と一緒に含入され得る。
診断的および予後的使用
本明細書中に記載された核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログおよび抗体は、１つまたは複数の以下の方法：診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験および薬理遺伝学に、ならびに本明細書中にさらに記載されるような薬剤スクリーニングおよび治療方法（例えば治療的および予防的）に用いられ得る。
本発明は、本発明でさらに説明されるようなＴＨＡＰファミリー成員の検出のための診断的および予後的アッセイを提供する。ＴＨＡＰファミリー成員およびＴＨＡＰファミリー標的分子間の相互作用を検出するための診断的および予後的アッセイも提供される。好ましい例では、ＴＨＡＰファミリー成員は、ＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２またはＴＨＡＰ３であり、ＴＨＡＰファミリー標的はＰＡＲ４またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質である。
本発明は、ＰＭＬ−ＮＢに局在するかまたはそれと会合する、あるいはＰＭＬ−ＮＢ関連タンパク質、例えばｄａｘｘ、ｓｐ１００、ｓｐ１４０、ｐ５３、ｐＲＢ、ＣＢＰ、ＢＬＭ、ＳＵＭＯ−１と会合するかまたはそれと結合するＴＨＡＰ１および／またはＰＡＲ４を検出するための診断的および予後的アッセイも提供する。好ましい方法では、本発明は、ＰＭＬ−ＮＢに局在するかまたはそれと会合するＰＡＲ４を検出することを提供する。さらなる態様では、本発明は、ＴＨＡＰファミリー核酸結合活性を検出することを提供する。
本発明の単離核酸分子は、以下でさらに記載されるように、例えばＴＨＡＰファミリーポリペプチドｍＲＮＡ（例えば生物学的試料中）またはＴＨＡＰファミリー遺伝子の遺伝的変化を検出するために、そしてＴＨＡＰファミリーポリペプチド活性を調節するために用いられ得る。ＴＨＡＰファミリータンパク質は、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはＴＨＡＰファミリー標的分子の不十分なまたは過剰な産生により特性化される障害を治療するために用いられ得る。さらにＴＨＡＰファミリータンパク質は、天然ＴＨＡＰファミリー標的分子に関してスクリーニングするために、ＴＨＡＰファミリー活性を調節する、好ましくは抑制する薬剤または化合物に関してスクリーニングするために、ならびにＴＨＡＰファミリータンパク質の不十分なまたは過剰な産生あるいはＴＨＡＰファミリー野生型タンパク質と比較して活性の低減または異常を示すＴＨＡＰファミリータンパク質形態の産生により特性化される障害を治療するために用いられ得る。さらに、本発明の抗ＴＨＡＰファミリー抗体は、ＴＨＡＰファミリータンパク質を検出し、単離するために、ＴＨＡＰファミリータンパク質の生物利用能を調節するために、そしてＴＨＡＰファミリー活性を調節するために用いられ得る。
したがって本発明の一実施態様は、例えば上記のＴＨＡＰファミリー活性のいずれかが示される疾患および／または症状を診断、予後および／または治療するために、本発明の分子（例えばＴＨＡＰファミリータンパク質、ＴＨＡＰファミリー核酸または最も好ましくはＴＨＡＰファミリーインヒビターまたは活性化剤）が用いられる使用方法（例えば診断アッセイ、予後アッセイまたは処置の予防的／治療的方法）を含む。別の実施形態では、本発明は、上記の活性のいずれかが病理学的に撹乱される被験体、好ましくはヒト被験体の診断、予後および／または治療のために本発明の分子（例えばＴＨＡＰファミリータンパク質、ＴＨＡＰファミリー核酸または最も好ましくはＴＨＡＰファミリーインヒビターまたは活性化剤）が用いられる使用方法（例えば診断アッセイ、予後アッセイまたは処置の予防的／治療的方法）を含む。好ましい実施形態では、使用方法（例えば診断アッセイ、予後アッセイまたは処置の予防的／治療的方法）は、診断、予後および／または療法的処置のために本発明の分子（例えばＴＨＡＰファミリータンパク質、ＴＨＡＰファミリー核酸または最も好ましくはＴＨＡＰファミリーインヒビターまたは活性化剤）を被験体、好ましくはヒト被験体に投与することを含む。別の実施形態では、使用方法（例えば診断アッセイ、予後アッセイまたは処置の予防的／治療的方法）は、本発明の分子（例えばＴＨＡＰファミリータンパク質、ＴＨＡＰファミリー核酸またはＴＨＡＰファミリーインヒビターまたは活性化剤）をヒト被験体に投与することを含む。
例えば本発明は、ＴＨＡＰファミリー成員が生物学的試料内で発現されるか否かを決定する方法であって、ａ）上記生物学的試料を、ｉｉ）ストリンジェントな条件下でＴＨＡＰファミリー核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはｉｉｉ）ＴＨＡＰファミリーポリペプチドと選択的に結合する検出可能ポリペプチド（例えば抗体）と接触すること、およびｂ）上記試料内の上記ポリヌクレオチドおよびＲＮＡ種間のハイブリダイゼーションの存在または非存在を、あるいは上記試料内のポリペプチドとの上記検出可能ポリペプチドの結合の存在または非存在を検出することを含む方法を含む。上記ハイブリダイゼーションの、または上記結合の検出は、上記ＴＨＡＰファミリー成員が上記試料内で発現されることを示す。好ましくはポリヌクレオチドはプライマーであり、この場合、上記ハイブリダイゼーションは、上記プライマー配列を含む増幅産物の存在を検出することにより検出され、あるいは検出可能ポリペプチドは抗体である。
哺乳類、好ましくはヒトがＴＨＡＰファミリー成員の発現レベルの上昇または低減を示すか否かを決定する方法であって、ａ）上記哺乳類からの生物学的試料を用意すること、およびｂ）上記生物学的試料内のＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたはＴＨＡＰファミリーポリペプチドをコードするＴＨＡＰファミリーＲＮＡ種の量を、対照試料中で検出されるかまたはそれから予測されるレベルと比較することを含む方法も予見される。上記対照試料中で検出されるかまたはそれから予測される上記レベルと比較した場合の、上記生物学的試料内の上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは上記ＴＨＡＰファミリーＲＮＡ種の量の増大は、上記哺乳類がＴＨＡＰファミリー発現レベル上昇を有することを示し、そして上記対照試料中で検出されるかまたはそれから予測される上記レベルと比較した場合の、上記生物学的試料内の上記ＴＨＡＰファミリーポリペプチドまたは上記ＴＨＡＰファミリーＲＮＡ種の量の低減は、上記哺乳類がＴＨＡＰファミリー成員の発現レベルの低減を有することを示す。
本発明は、診断アッセイ、予後アッセイおよびモニタリング臨床試験が予後（予測）目的のために用いられ、それにより個体が予防的に処置される予測医学の分野にも関する。したがって本発明の一態様は、生物学的試料（例えば血液、血清、細胞、組織）の情況において、ＴＨＡＰファミリータンパク質および／または核酸発現、ならびにＴＨＡＰファミリー活性を決定し、それにより個体が疾患または障害に苦しめられているか、あるいは異常ＴＨＡＰファミリー発現または活性に関連した障害を発症する危険に直面しているか否かを決定するための、診断アッセイに関する。本発明は、個体がＴＨＡＰファミリータンパク質、核酸発現または活性と関連する障害を発症する危険に直面しているか否かを決定するための予後（または予測）アッセイも提供する。例えばＴＨＡＰファミリー遺伝子の突然変異が、生物学的試料中でアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後または予測目的のために用いられ、それにより、ＴＨＡＰファミリータンパク質、核酸発現または活性により特性化されるかまたはそれに関連した障害の開始前に、個体を予防的に処置し得る。
したがって本発明の方法は、アポトーシスの調節に関連した疾患、例えば望ましくない細胞増殖または一般に分化の異常制御により特性化される障害、例えば新生物形成性または過形成性障害、ならびに内皮細胞の増殖またはその欠如に関連した障害、炎症性障害および神経変性障害（これらに限定されない）に一般的に適用可能である。
診断アッセイ
生物学的試料中のＴＨＡＰファミリータンパク質または核酸の存在（定量的にまたはそうでなく）または非存在を検出するための例示的方法は、試験被験体からの生物学的試料を得て、ＴＨＡＰファミリータンパク質または核酸の存在が生物学的試料中で検出されるよう、ＴＨＡＰファミリータンパク質またはＴＨＡＰファミリータンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または作用物質と生物学的試料を接触させることを含む。ＴＨＡＰファミリーｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい薬剤は、ＴＨＡＰファミリーｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズし得る標識化核酸プローブである。核酸プローブは、例えば全長ＴＨＡＰファミリー核酸、例えば配列番号１６０の核酸、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、４００、５００または１０００ヌクレオチド長の、ストリンジェントな条件下でＴＨＡＰファミリーｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、またはＴＨＡＰファミリー核酸の一部分と特異的にハイブリダイズするのに十分な核酸である。本発明の診断アッセイに用いるためのその他の適切なプローブは、本明細書中に記載されている。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）本発明のＴＨＡＰファミリータンパク質のうちの１つをコードする遺伝子の突然変異、または（ｉｉ）ＴＨＡＰファミリー遺伝子の誤発現のうちの少なくとも１つにより特性化される遺伝子損傷の存在または非存在を、被験体（例えばヒト患者）の組織試料中で検出することを一般に含むことにより特性化され得る。例証するために、このような遺伝子損傷は、（ｉ）ＴＨＡＰファミリー遺伝子からの１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）このようなＴＨＡＰファミリー遺伝子への１つまたは複数のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）ＴＨＡＰファミリー遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＴＨＡＰファミリー遺伝子の総染色体再配列（gross chromosomal rearrangement）または増幅、（ｖ）ＴＨＡＰファミリー遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの全体的変化、（ｖｉ）ＴＨＡＰファミリー遺伝子の異常修飾、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常修飾、（ｖｉｉ）ＴＨＡＰファミリー遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写体の非野生型スプライシングパターンの存在、ならびに（ｖｉｉ）ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質の非野生型レベル、のうちの少なくとも１つの存在を確認することにより検出され得る。
ＴＨＡＰファミリータンパク質を検出するための好ましい薬剤は、ＴＨＡＰファミリータンパク質と結合し得る抗体、好ましくは検出可能標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、さらに好ましくはモノクローナルであり得る。無傷（intact）の抗体またはその断片（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が用いられ得る。「標識された」という用語は、プローブまたは抗体に関しては、プローブまたは抗体への検出可能物質のカップリング（即ち物理的連結）によるプローブまたは抗体の直接ラベリング、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的ラベリングを含むよう意図される。間接的ラベリングの例としては、それが蛍光標識化ストレプトアビジンで検出され得るよう、蛍光標識（化）二次抗体およびビオチンによるＤＮＡプローブの末端ラベリングを用いた一次抗体の検出が挙げられる。「生物学的試料」という用語は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および液体を含むよう意図される。即ち、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボでの生物学的試料中のＴＨＡＰファミリーｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するために用いられ得る。例えばＴＨＡＰファミリーｍＲＮＡの検出のためのインビトロ手法としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションが挙げられる。ＴＨＡＰファミリータンパク質の検出のためのインビトロ手法としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法が挙げられる。ＴＨＡＰファミリーゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ手法としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＴＨＡＰファミリータンパク質の検出のためのインビボ手法としては、標識化抗ＴＨＡＰファミリー抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば抗体は、被験体中のその存在および位置が標準画像診断手法により検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
さらに別の例示的実施形態では、ＴＨＡＰファミリー遺伝子の異常メチル化パターンは、メチル化に感受性であり、そのための認識部位がＴＨＡＰファミリー遺伝子中（例えばフランキングおよびイントロン配列中）に存在する１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼで患者試料からのゲノムＤＮＡを消化することにより検出され得る（例えばBuiting他(1994) Human Mol Genet 3: 893-895参照）。消化されたＤＮＡは、ゲル電気泳動により分離され、例えばゲノムまたはｃＤＮＡ配列由来のプローブとハイブリダイズされる。ＴＨＡＰファミリー遺伝子のメチル化状態は、試料ＤＮＡから生成される制限パターンを既知のメチル化の標準に関するパターンと比較することにより、決定され得る。
さらに、本明細書中に記載されたようなゲノム構築物は、診断アッセイで利用されて、例えば形質転換化細胞の表現型の決定に際して、細胞の増殖または分化状態がもはやＴＨＡＰファミリータンパク質の調節機能に応じていないか否かを決定し得る。このような知見は、予後的および治療的利益を有し得る。例証するために、組織からの細胞の試料が患者から得られ、適切な細胞培地中に分散されて、試料中の細胞の一部分が、例えば本明細書中に記載された発現ベクターでのトランスフェクションにより、組換えＴＨＡＰファミリータンパク質またはＴＨＡＰファミリー標的タンパク質を発現させ、あるいは内因性ＴＨＡＰファミリータンパク質またはＴＨＡＰファミリー標的タンパク質の発現または活性を増大させて、細胞のその後の増殖が評価される。ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰファミリー標的タンパク質の発現にかかわらず細胞の表現型における変化の非存在は、ＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰファミリー標的タンパク質を含む細胞調節経路、例えばＴＨＡＰファミリーまたはＴＨＡＰファミリー標的−媒介性転写への依存性の欠如を示す。当該組織の性質に応じて、試料は、例えば血液試料、剥離細胞試料、微細針吸引試料、または生検組織試料から単離された細胞の形態であり得る。初期試料が固体塊である場合、当該技術分野で既知のように、組織試料は切り刻まれるか、そうでなければ細胞が培養され得るよう分散される。
さらに別の実施形態では、他の細胞タンパク質と結合する、例えば生検細胞から単離されたＴＨＡＰファミリー遺伝子産物の能力を検出する診断アッセイが提供される。例えば、細胞中で容易に評価できるレベルで発現される一方で、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質との結合時に検出可能である（結合親和性減少または増強を示す）ＴＨＡＰファミリー変異体を検出することが望ましい。このような変異体は、例えば診断ＤＮＡシーケンシング手法により、または上記の免疫アッセイにより検出することが非実用的であり得る突然変異、例えば点突然変異から生じ得る。したがって本発明はさらに、試料細胞からの１つまたは複数のＴＨＡＰファミリー遺伝子をクローニングし、そして組換え遺伝子産物と標的タンパク質、例えばＴＨＡＰ１遺伝子と標的ＰＡＲ４タンパク質またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質との間の相互作用の検出を可能にする条件下でクローン化遺伝子を発現することを一般に含む診断スクリーニングアッセイを意図する。下記の種々の薬剤スクリーニングアッセイの説明から明らかになるように、広範な種々の手法を用いて、他の細胞構成成分と結合するＴＨＡＰファミリータンパク質の能力を決定し得る。これらの手法は、野生型ＴＨＡＰファミリーと比較してより高いかまたはより低いＴＨＡＰファミリー標的タンパク質に対する結合親和性を有する変異型タンパク質を生じるＴＨＡＰファミリー遺伝子における突然変異を検出するために用いられ得る。逆に、ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質およびＴＨＡＰファミリータンパク質が「ベイト」であり、患者試料から得られるものを切り替えることにより、本発明のアッセイは、野生型形態のＴＨＡＰファミリー標的タンパク質と比較してより高いかまたはより低いＴＨＡＰファミリータンパク質に対する結合親和性を有するＴＨＡＰファミリー標的タンパク質変異体を検出するためにも用いられ得る。
例示的実施形態では、ＰＡＲ４またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質（例えば野生型）は、例えばＧＳＴ融合タンパク質およびグルタチオン処理マイクロタイタープレートにより、固定化タンパク質（「標的」）として用意され得る。ＴＨＡＰ１遺伝子（「試料」遺伝子）は、例えばＰＣＲにより患者試料の細胞から増幅され、発現ベクターに結繋されて、適切な宿主細胞中で形質転換される。組換え的に産生されたＴＨＡＰ１タンパク質は次に、例えば溶解物（lysate）または半精製調製物として固定化ＰＡＲ４またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質と接触されて、複合物が洗浄され、ＰＡＲ４またはＰＭＬ−ＮＢタンパク質／ＴＨＡＰ１複合体の量が決定され、対照で形成された野生型複合体のレベルと比較される。検出は、例えば野生型形態のＴＨＡＰ１タンパク質に対する抗体を用いたイムノアッセイによる、あるいは検出可能タグを含む融合タンパク質としてタンパク質を用意するベクター中で試料ＴＨＡＰ１遺伝子をクローニングすることにより用意される標識によるものである。例えばｍｙｃエピトープは、試料ＴＨＡＰ１遺伝子を有する融合タンパク質の一部として用意され得る。このような融合タンパク質は、検出可能標識を用意するほかに、固定化標的への適用前に、溶解物からの試料ＴＨＡＰ１タンパク質の精製も可能にする。本発明のスクリーニングアッセイのさらに別の実施形態では、添付の実施例に記載された２ハイブリッドアッセイを用いて、２つのタンパク質間の複合体形成を変更するＴＨＡＰファミリー遺伝子またはＴＨＡＰファミリー標的遺伝子における突然変異を検出し得る。
したがって本発明は、ＴＨＡＰファミリー標的「ベイト」タンパク質と物理的に相互作用できないタンパク質をコードするＴＨＡＰファミリー遺伝子の変異体を検出するための便利な方法を提供するが、この方法は、ＴＨＡＰファミリー／ＴＨＡＰファミリー標的依存する様式で転写活性化剤の再構築を検出することに拠る。
一実施形態では、生物学的試料は試験被験体からのタンパク質分子を含有する。あるいは生物学的試料は、試験被験体からのｍＲＮＡ分子または試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、被験体から慣用的手段により単離された血清試料である。別の実施形態では、本発明はさらに、対照被験体から対照生物学的試料を得ること、ＴＨＡＰファミリータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が生物学的試料中で検出されるよう、対照試料を、ＴＨＡＰファミリータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または作用物質と接触させること、および対照試料中のＴＨＡＰファミリータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中のＴＨＡＰファミリータンパク質、ｍＲＮＡまたは下のｍＤＮＡの存在と比較することを含む。本発明は、生物学的試料中のＴＨＡＰファミリータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を検出するためのキットも包含する。例えばキットは、生物学的試料中のＴＨＡＰファミリータンパク質またはｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る標識化化合物または作用物質；試料中のＴＨＡＰファミリー成員の量を決定する手段；ならびに試料中のＴＨＡＰファミリー成員の量を標準と比較するための手段を含み得る。化合物または作用物質は、適切な容器中にパッケージされ得る。キットはさらに、ＴＨＡＰファミリータンパク質または核酸を検出するためのキットを用いるための使用説明書を含み得る。
ある実施形態では、検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号参照）、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥＰＣＲにおける、あるいは結繋連鎖反応（ligation chain reaction）（ＬＣＲ）（例えばLandegern et al. (1988) Science 241: 1077-1080およびNakezawa et al. (1994) PNAS 91: 360-364参照）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、ＴＨＡＰファミリー遺伝子における点突然変異を検出するために特に有用であり得る（Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682参照）。この方法は、患者から細胞の試料を収集する工程、試料の細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離する工程、核酸試料を、ＴＨＡＰファミリー遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でＴＨＡＰファミリー遺伝子と特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーと接触させる工程、および増幅産物の存在または非存在を検出するか、あるいは増幅産物のサイズを検出し、かつ対照試料に対して長さを比較する工程を含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載された突然変異を検出するために用いられる手法のいずれかとともに、予備増幅工程として用いることが望ましい、と予測される。
診断のための遺伝子型判定（genotyping）アッセイは一般に、当該両アレル性（biallelic）マーカーを保持するＤＮＡ領域の事前の増幅を要する。しかしながら増幅を要しない超感受性検出方法も利用可能である。両アレル性多型性を検出するために用いられ得る当業者に既知の方法としては、例えば慣用的ドットブロット分析、Orita et al., PNAS 86: 2766-2770 (1989)により記載された一本鎖コンフォーメーション多型性分析（ＳＳＣＰ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二重鎖分析、ミスマッチ切断アッセイ、ならびにSheffield et al. (1991), White et al. (1992)およびGrompe et al. (1989および1993)（Sheffield, V.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 49: 699-706(1991); White, M.B. et al., Genomics 12: 301-306 (1992); Grompe, M. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86: 5855-5892 (1989);およびGrompe,M. Nature Genetics 5: 111-117 (1993)）に記載されるようなその他の慣用的手法のような方法が挙げられる。特定の多型性部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するための別の方法は、米国特許第４，６５６，１２７号に記載されているような特殊化エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いる。さらなる方法を以下に記載する。
多型性部位に存在するヌクレオチドは、シーケンシング法により決定され得る。好ましい実施形態では、ＤＮＡ試料は上記のようなシーケンシングの前にＰＣＲ増幅に付される。ＤＮＡシーケンシング法は、「Sequencing Of Amplified Genomic DNA And Identification Of SingleNucleotide Polymorphisms」に記載されている。好ましくは増幅ＤＮＡは、染料−プライマーサイクルシーケンシングプロトコールを用いて自動ダイデオキシターミネーターシーケンシング反応に付される。配列分析は、両アレル性マーカー部位に存在する塩基の同定を可能にする。
マイクロシーケンシング法では、標的ＤＮＡ中の多型性部位のヌクレオチドは、単一プライマー伸長反応により検出される。この方法は、標的核酸中の当該多型性塩基の直上流でハイブリダイズする適切なマイクロシーケンシングプライマーを包む。ポリメラーゼは、多型性部位のヌクレオチドと相補的な一つの単一ｄｄＮＴＰ（鎖ターミネーター）を有するプライマーの３’末端を特異的に伸長するために用いられる。次に、組入れられたヌクレオチドの同定は、任意の適した方法で決定される。通常、マイクロシーケンシング反応は、蛍光ｄｄＮＴＰを用いて実行され、伸長マイクロシーケンシングプライマーは、ＡＢＩ３７７シーケンシング機での電気泳動により分析されて、ＥＰ４１２ ８８３に記載されたようにして組込まれたヌクレオチドの同一性を決定する。あるいはキャピラリー電気泳動は、多数のアッセイを同時に処理するために用いられ得る。ｄｄＮＴＰのラベリングおよび検出のために、異なるアプローチが用いられ得る。蛍光共鳴エネルギー移動に基づいた均一相検出法は、Chen and Kwok (1997)ならびにChen and Kwok(Nucleic Acids Research 25: 347-353 1997)およびChen et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94/20 10756-10761, 1997)により記載されている。この方法では、多型性部位を含有する増幅ゲノムＤＮＡ断片は、対立性の染料標識化ダイデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩および修飾化Ｔａｑポリメラーゼの存在下で、５’−フルオレセイン−標識化プライマーとともにインキュベートされる。染料標識化プライマーは、鋳型上に存在する対立遺伝子に特異的な染料−ターミネーターにより１塩基延長される。遺伝子型判定反応終了時に、反応混合物中の２つの染料の蛍光強度が、分離または精製を伴わずに直接的に分析される。これらの工程は全て、同一試験管中で実施され、蛍光変化がリアルタイムでモニタリングされ得る。あるいは伸長プライマーは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析され得る。多型性部位の塩基は、マイクロシーケンシングプライマー上に加えられた質量により同定される（Haff and Smirnov, 1997, Genome Research, 7: 378-388, 1997参照）。別の例では、Pastinen et al. (Genome Research, 7: 606-614, 1997)は、固相ミニシーケンシング原理がオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用される単一ヌクレオチド多型性の多重検出方法を記載する。固体支持体（ＤＮＡチップ）に結合されたＤＮＡプローブの高密度アレイを、以下にさらに記載する。
その他のアッセイとしては、ポリメラーゼおよびリガーゼの特異性に基づいたミスマッチ検出アッセイが挙げられる。重合反応は、増幅プライマーの３’末端の正しい塩基対合に特にストリンジェントな要件を置き、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズされる２つのオリゴヌクレオチドの連結は、特に３’末端の連結部位付近のミスマッチに非常に感受性である。
対立遺伝子に存在するヌクレオチドの同一性を決定する好ましい方法は、核酸ハイブリダイゼーションを含む。任意のハイブリダイゼーションアッセイ、例えばサザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび固相ハイブリダイゼーションが用いられ得る（Sambrook et al., Molecular Cloning- A Laboratory Manual, SecondEdition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989参照）。ハイブリダイゼーションとは、相補的塩基対合のための２つの一本鎖核酸による二重鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、厳密に相補的な核酸鎖間、あるいはミスマッチの小領域を含有する核酸鎖間で起こり得る。両アレル性マーカーの一形態とハイブリダイズするが、しかし他方とはハイブリダイズせず、したがって異なる対立遺伝子形態間を区別し得る特異的プローブが設計され得る。対立遺伝子特異的プローブはしばしば対で用いられ、対の一成員はオリジナル対立遺伝子を含有する標的配列との完全な一致を示し、そして他方はもう一方の対立遺伝子を含有する標的配列と完全な一致を示す。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度に有意の差が存在し、好ましくは本質的に二元性応答が存在し、それによりプローブが対立遺伝子の一方のみとハイブリダイズするよう、十分にストリンジェントであるべきである。プローブが厳密に相補的な標的配列のみとハイブリダイズするストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で既知である（Sambrook et al., 1989）。ハイブリッド二重鎖の検出は、多数の方法により実行され得る。標的またはプローブに結合された検出可能標識を利用して、ハイブリッド二重鎖の検出を可能にする種々の検出アッセイフォーマットが既知である。典型的には、ハイブリダイゼーション二重鎖は、非ハイブリダイズ化核酸から分離され、次に二重鎖に結合された標識が検出される。さらに、標準的な異種アッセイフォーマットは、プライマーおよびプローブ上に存在する標識を用いてハイブリッドを検出するのに適している（Landegren U. et al., Genome Research, 8:
769-776, 1998参照）。
オリゴヌクレオチドアレイに基づいたハイブリダイゼーションアッセイは、完全一致およびミスマッチ標的配列変異体に対する短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性の差に拠る。多型性情報への効率的アクセスは、選定位置で固体支持体（例えばチップ）に結合されたオリゴヌクレオチドプローブの高電子密度アレイを含む基本構造により得られる。複対立遺伝子多型性の検出に用いるための種々のフォーマットのチップは、Affymetrex (GeneChip)、Hyseq （HyChip and HyGnostics）およびProtogeneLaboratoriesによりカスタマイズ化ベースで製造され得る。
概してこれらの方法は、標的配列が多型性マーカーを含む個体由来の標的核酸配列セグメントと相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いる。ＥＰ７８５２８０は、単一ヌクレオチド多型性の検出のためのタイリング方法を記載している。要するに、アレイは一般に、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５にさらに記載された多数の特異的多型性に関して「タイリングされ」得る。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄の完了時に、標的配列がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定するために、アレイは走査される。次に走査アレイからのハイブリダイゼーションデータが分析されて、複対立遺伝子マーカーの単数または複数の対立遺伝子が試料中に存在することを同定する。ハイブリダイゼーションおよび走査は、ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１００９２およびＷＯ９５／１１９９５および米国特許第５，４２４，１８６号に記載されているように実行され得る。固体支持体および固体支持体に結合される本発明のポリヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」にさらに記載されている。
本発明を一般的に説明してきたが、本明細書中に提示されるある特定の実施例を参照することによりさらなる理解が得られる。実施例は本発明を例証するためにのみ提示され、別記しない限り本発明を限定するものではない。
ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１を用いた２ハイブリッドスクリーンにおけるＴＨＡＰ１ｃＤＮＡの単離
新規のＨＥＶＥＣタンパク質の機能および関与する細胞内経路を限定しようと努力して、微小血管ヒトＨＥＶ内皮細胞（ＨＥＶＥＣ）から生成される２ハイブリッドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために異なるベイトを本発明者らは用いた。上記のように（Girard and Springer (1995) Immunity 2: 113-123）、モノクローナル抗体ＭＥＣＡ−７９を用いた免疫磁気選択により、ヒト扁桃からＨＥＶＥＣを精製した。まずＳＭＡＲＴＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Clontech, Palo Alto, CA, USA）を用いて、ＨＥＶＥＣの総ＲＮＡ１μｇから、全長ｃＤＮＡを生成した。次にオリゴ−ｄＴ−プライマーが結合したＨＥＶＥＣのｃＤＮＡをＳｆｉＩで消化して、ｐＧＡＤ４２４（Clontech）のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位間にＳｆｉＩリンカー（５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣ−３’）（配列番号１８１）を挿入することにより生成された２ハイブリッドベクターｐＧＡＤ４２４−Ｓｆｉ中に指向的にクローン化する。その結果生じたｐＧＡＤ４２４−ＨＥＶＥＣのｃＤＮＡの２ハイブリッドライブラリー（平均挿入サイズ＞１ｋｂ１、〜３×１０６の独立クローン）を大腸菌中で増幅させる。ケモカインＳＬＣ／６Ｃｋｉｎｅと相互作用しうるタンパク質を同定するために、プライマーｈＳＬＣ．５’（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧ−３’）（配列番号１８３）およびｈＳＬＣ．３’（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＣＣ−３’）（配列番号１８４）を用いてＨＥＶＥＣのＲＮＡからＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩで消化して、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系２ベクターｐＧＢＴ９（Clontech）のＢａｍＨＩクローニング部位に挿入した成熟型のヒトＳＬＣ／ＣＣＬ２１をコードするｃＤＮＡ（アミノ酸２４〜１３４、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００２９８０、配列番号１８２）をベイトとして用いて、２ハイブリッドＨＥＶＥＣのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを実施した。要するに、ｐＧＢＴ９−ＳＬＣをｐＧＡＤ４２４−ＨＥＶＥＣのｃＤＮＡライブラリーを用いて酵母株Ｙ１９０（Clontech）中で共形質転換した。１．５×１０７個の酵母形質転換体をスクリーニングし、Ｈｉｓ栄養要求性により陽性タンパク質相互作用を選択した。プレートを３０℃で５日間インキュベートした。プラスミドＤＮＡを陽性コロニーから抽出し、ｐＧＢＴ９−ＳＬＣまたは対照ベイトｐＧＢＴ９、ｐＧＢＴ９−ラミンを用いてＡＨ１０９中で共形質転換することにより、相互作用の特異性を立証するために用いた。この２ハイブリッドスクリーンで単離された８つの独立クローンを特性化した。それらは、そのマウスオルトログと９３％の同一性を示す、ＴＨＡＰ１と呼ばれる２１３アミノ酸の新規のヒトタンパク質をコードする独特のヒトｃＤＮＡに対応することが判明した（図１Ａ）。ＴＨＡＰ１予測タンパク質配列中の唯一の注目に値するモチーフは、中間部の短いプロリンリッチドメインならびにカルボキシ末端部分のコンセンサス核局在化配列（ＮＬＳ）であった（図１Ｂ）。ＴＨＡＰ１配列に関するデータベース検索は、アポトーシスに関連した新規のタンパク質モチーフを限定し得る最初の９０個のアミノ酸（以後ＴＨＡＰドメインと呼ぶ）を除いて、前に特性化されたタンパク質との有意の類似性を明示できなかった（図１Ｂ、図９Ａ〜図９Ｃおよび図１０参照）。
ノーザンブロット
ＴＨＡＰ１のｍＲＮＡの組織分布を決定するために、１２の異なるヒト成人組織のノーザンブロット分析を実施した（図２）。メーカーの使用説明書に従って、多ヒト組織ノーザンブロット（CLONTECH）をハイブリダイズした。プローブは、ＴＨＡＰ１のＯＲＦに対応するＰＣＲ産物で、プライマー−一遺伝子ラベリング系（PROMEGA）で３２Ｐ標識した。２．２ｋｂのｍＲＮＡのバンドを脳、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓および胎盤で検出した。主要な２．２ｋｂのバンドほかに、低分子量帯域が検出されたが、これらはＴＨＡＰ１のｍＲＮＡの前駆体の代替的スプライシングまたはポリアデニル化に対応すると思われる。多数の異なる組織中におけるＴＨＡＰ１のｍＲＮＡの存在は、ＴＨＡＰ１が、ヒト身体中で、広範なしかし普遍的ではない組織分布を有するということを示唆する。
細胞内ＴＨＡＰ１局在化の分析
ＴＨＡＰ１タンパク質の細胞内の局在を分析するために、ＴＨＡＰ１のｃＤＮＡを、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）をコードする配列と融合させた。プライマー２ＨＭＲ１０（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号１８５）および２ＨＭＲ９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号１８６）を用いてＨＥＶＥＣのｃＤＮＡからＰＣＲにより、ＴＨＡＰ１の全長コード領域を増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＧＦＰ．Ｃ２ベクター（Clontech）中で増強グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ＯＲＦの下流でインフレームでクローン化して、ｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１を生成した。次にＧＦＰ／ＴＨＡＰ１発現構築物を臍帯静脈からの初代培養のヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、PromoCell, Heidelberg, Germany）中にトランスフェクトした。ＨＵＶＥＣを完全ＥＣＧＭ培地（PromoCell, Heidelberg, Germany）中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、メーカーの使用説明書（Stratagene, La Jolla, CA, USA）に従って、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒトランスフェクション試薬を用いてＲＰＭＩ培地中で一過的にトランスフェクトした。２４時間後の蛍光顕微鏡による分析によって、ＧＦＰ／ＴＨＡＰ１融合タンパク質はもっぱら核内に局在し、拡散性分布を伴って、蓄積して斑点を生じたが、一方、ＧＦＰ単独の場合は、細胞全体に染みが広がっただけである、ということが明示された。ＧＦＰ／ＴＨＡＰ１が会合する斑点状に染まったドメインの同一性を調べるために、間接免疫蛍光顕微鏡を用いて、既知の核ドメイン（複製ファクトリー、スプライシングセンター、核小体）と共にＧＦＰ／ＴＨＡＰ１を含有する核のドットの考え得る共局在化を調べた。
ＧＦＰタグが付加された発現構築物でトランスフェクトした細胞を、カバーガラス上で２４時間〜４８時間増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に室温で１５分間固定し、ＰＢＳで再び洗浄した後、ＰＢＳ中の５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌで、室温で５分間、中和した。もう一度ＰＢＳで洗浄後、０．１％トリトン−Ｘ１００を含有するＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を透過処理し、再びＰＢＳで洗浄した。次に透過処理された細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）で１０分間遮断し、次にＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈した以下の一次抗体とともに、室温で２時間インキュベートした：ヒトＤａｘｘに対するウサギポリクローナル抗体（１／５０、Ｍ−１１２、Santa Cruz Biotechnology）または抗ＰＭＬマウスモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、１／３０、ｍＡｂＰＧ−Ｍ３（Dako, Glostrup, Denmark））。次に細胞を、室温で５分、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で３回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈したＣｙ３（レッド蛍光）抗マウスＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）または抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）（１／１０００、Amersham Pharmacia Biotech）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で広範に洗浄後、試料を風乾して、Ｍｏｗｉｏｌに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。ＧＦＰ（グリーン）およびＣｙ３（レッド）蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
この分析は、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１による染色が、ＰＭＬに対する抗体を用いて得られた染色パターンと完全に重複することを示す、ということを明示した。ＧＦＰ／ＴＨＡＰ１およびＰＭＬの共局在化が、少数のＰＭＬ−ＮＢ（１０未満）を有する核ならびに多数のＰＭＬ−ＮＢを有する核の両方で観察された。ＰＭＬ−ＮＢのもうひとつの十分に特性化された構成成分であるＤａｘｘに対して向けられる抗体を用いた間接免疫蛍光染色を実施して、ＧＦＰ／ＴＨＡＰ１とＰＭＬ−ＮＢとの会合を確かめた。ＰＭＬ−ＮＢ中のＧＦＰ／ＴＨＡＰ１およびＤａｘｘの完全共局在化を、本発明者らは見出した。合わせて考えると、これらの結果は、ＴＨＡＰ１がＰＭＬ−ＮＢと会合する新規のタンパク質であることを明示する。
ヒトＨＥＶＥＣにおいてＴＨＡＰ１と相互作用するタンパク質の同定：２ハイブリッドアッセイ
ＴＨＡＰ１は好アポトーシスタンパク質ＰＡＲ４と複合体を形成する
ＴＨＡＰ１と相互作用しうるタンパク質を同定するために、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３ベクターｐＧＢＫＴ７(Clontech)に挿入したヒトＴＨＡＰ１全長ｃＤＮＡをベイトとして用いて、２ハイブリッドＨＥＶＥＣのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを実施した。要するに、プライマー２ＨＭＲ１０（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号１８７）および２ＨＭＲ９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号１８８）を用いてＨＥＶＥＣのｃＤＮＡからＰＣＲにより、ＴＨＡＰ１の全長コード領域を増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＢＫＴ７ベクター中でＧａｌ４結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＢＤ）の下流でインフレームでクローン化して、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１を生成した。次にｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１を、酵母株ＡＨ１０９（Clontech）中でｐＧＡＤ４２４−ＨＥＶＥＣのｃＤＮＡライブラリーを用いて共形質転換化した。メーカーの使用説明書（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３、Clontech）に従って、１．５×１０７個の酵母形質転換体をスクリーニングして、ＨｉｓおよびＡｄｅ二重栄養要求性により陽性タンパク質相互作用を選択した。プレートを３０℃で５日間インキュベートした。プラスミドＤＮＡをこれらの陽性クローンから抽出し、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１または対照ベイトｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７−ラミンおよびｐＧＢＫＴ７−ヘビンを用いてＡＨ１０９中で共形質転換することにより、相互作用の特異性を立証するために用いた。ＴＨＡＰ１と特異的に相互作用した３つのクローンを、スクリーニングで得た：これらのクローンのシーケンシングは、ヒトの好アポトーシスタンパク質ＰＡＲ４の最後の１４７アミノ酸（位置１９３〜３４２）をコードする部分的ｃＤＮＡに対応する３つの同一ライブラリープラスミドを明示した（図３Ａ）。全長Ｐａｒ４ベイト（ｐＧＢＫＴ−Ｐａｒ４）およびプレイ（ｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４）を用いて、ＴＨＡＰ１およびＰａｒ４間の陽性の相互作用を確認した。プライマーＰａｒ４．８（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＣ−３’）（配列番号１８９）およびＰａｒ４．５（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＣ−３’）（配列番号１９０）を用いて、ヒト胸腺ｃＤＮＡ（Clontech）からＰＣＲにより全長ヒトＰａｒ４を増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＢＫＴ７およびｐＧＡＤＴ７ベクター中でクローン化して、ｐＧＢＫＴ７−Ｐａｒ４およびｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４を生成した。メーカーの使用説明書（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３、Clontech）に従って、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１およびｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４、あるいはｐＧＢＫＴ７−Ｐａｒ４およびｐＧＡＤＴ７−ＴＨＡＰ１を用いたＡＨ１０９の共形質転換、ならびにＨｉｓおよびＡｄｅ二重栄養要求性による形質転換体の選択により、ＴＨＡＰ１およびＰａｒ４間の陽性の相互作用を確認した。ｐＧＡＤＴ７−ＴＨＡＰ１を生成するために、プライマー２ＨＭＲ１０（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号１９１）および２ＨＭＲ９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号１９２）を用いてＨＥＶＥＣのｃＤＮＡからＰＣＲにより、ＴＨＡＰ１の全長コード領域を増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＡＤＴ７２ハイブリッドベクター（Clontech）中でＧａｌ４活性化ドメイン（Ｇａｌ４−ＡＤ）の下流にインフレームでクローン化した。
次に、ＷＴ−１およびａＰＫＣと結合するＰａｒ４に関与することが以前示されたＰａｒ４のＣ末端のロイシンジッパー／デスドメインがＴＨＡＰ１およびＰａｒ４間の相互作用に必要か否かを調べた。そのために、２つのＰａｒ４変異体、Ｐａｒ４ΔおよびＰａｒ４ＤＤを構築した。Ｐａｒ４Δはロイシンジッパー／デスドメインを欠き、一方、Ｐａｒ４ＤＤはこのドメインを含有する。ｐＧＢＫＴ７およびｐＧＡＤＴ７のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位中にｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４からのＥｃｏＲＩ−ＢｇＩＩＩ断片をサブクローニングすることにより、ｐＧＢＫＴ７−Ｐａｒ４Δ（アミノ酸１〜２７６）およびｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４Δを構築した。プライマーＰａｒ４．４（５’−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＴＡＧＡＴＡＴＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡ−３’）（配列番号１９３）およびＰａｒ４．５とともに、鋳型としてｐＧＢＫＴ７−Ｐａｒ４を用いて、ＰＣＲによりＰａｒ４ＤＤを増幅し、ｐＧＢＫＴ７およびｐＧＡＤＴ７のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位でクローン化して、ｐＧＢＫＴ７−Ｐａｒ４ＤＤおよびｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４ＤＤを生成した。メーカーの使用説明書（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３、Clontech）に従って、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１およびｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４Δ、あるいはｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４ＤＤを用いたＡＨ１０９の共形質転換、ならびにＨｉｓおよびＡｄｅ二重栄養要求性による形質転換体の選択により、ＴＨＡＰ１およびＰａｒ４変異体間の２ハイブリッド相互作用を試験した。Ｐａｒ４ロイシンジッパー／デスドメイン（Ｐａｒ４ＤＤ）は、ＴＨＡＰ１との相互作用に必要であるだけでなく、そのために十分である、ということを本発明者らは見出した（図３Ａ）。ＴＨＡＰ１の代わりにベイトとしてＰａｒ４またはＰａｒ４変異体（Ｐａｒ４ΔおよびＰａｒ４ＤＤ）を用いて、逆配向で２ハイブリッド実験を実施した場合、同様の結果を得た（図３Ａ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイ
酵母で観察された相互作用を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウンアッセイを実施した。ＧＳＴタグが付加された融合タンパク質として発現され、グルタチオンセファロース上に固定されるＰａｒ４ＤＤを、ｉｎｖｉｔｒｏで翻訳され放射能で標識されたＴＨＡＰ１とともにインキュベートした。ＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤ発現ベクターを生成するために、プライマーＰａｒ４．１０（５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴＡＧＡＴＡＴＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡ−３’）（配列番号１９４）およびＰａｒ４．５を用いてＰＣＲにより、Ｐａｒ４ＤＤ（アミノ酸２５０〜３４２）を増幅し、ｐＧＥＸ−２Ｔ原核生物発現ベクター（Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, France）のＢａｍＨＩ部位、すなわち、グルタチオンＳ−ＴトランスフェラーゼＯＲＦの下流にインフレームでクローン化した。次に、プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｐａｒ４ＤＤによりコードされるＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤ（アミノ酸２５０〜３４２）融合タンパク質、ならびにプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔによりコードされる対照ＧＳＴタンパク質を大腸菌ＤＨ５α中で発現させて、供給元の使用説明書（Amersham PharmaciaBiotech）に従ってグルタチオンセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ−ポリアリールアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびクーマシーブルー染色分析により、ＧＳＴプルダウンアッセイに用いられるタンパク質の収量を決定した。ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１ベクターを鋳型として用いて、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物系（Promega, Madison, WI, USA）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたＴＨＡＰ１を生成した。２５μｌの３５Ｓで標識した野生型ＴＨＡＰ１を、固定化ＧＳＴ−Ｐａｒ４またはＧＳＴタンパク質とともに４℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした：１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．０５％ＮＰ４０および０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのβグリセロホスフェート、２５μｇ／ｍｌのキモトリプシン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン。次にビーズを１ｍｌの結合緩衝液中で５回洗浄した。結合タンパク質を２× Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して、アムプリファイ(Amplify)（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて蛍光間接撮影により可視化した。予測どおり、ＧＳＴ／Ｐａｒ４ＤＤはＴＨＡＰ１と相互作用した（図３Ｂ）。これに反して、ＴＨＡＰ１はＧＳＴビーズと相互作用しなかった。
ｉｎ ｖｉｖｏＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイ
ＴＨＡＰ１およびＰａｒ４間の生理学的相互作用に関するさらなる証拠を提供するために、ＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４間のｉｎ ｖｉｖｏでの相互作用を調べた。そのために、ｐＥＦ−ｍｙｃＰａｒ４ＤＤ真核生物発現ベクターおよびＧＦＰまたはＧＦＰ−ＴＨＡＰ１発現ベクター（それぞれｐＥＧＦＰ．Ｃ２およびｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１）を用いて一過的に同時トランスフェクトされた一次ヒト内皮細胞中のエピトープタグが付加されたＰａｒ４ＤＤの細胞内局在化を、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて分析した。ｐＥＦ−ｍｙｃＰａｒ４ＤＤを生成するために、プライマーｍｙｃ．ＢＤ７（５’−ＧＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣ−３’）（配列番号１９５）およびＰａｒ４．９（５’−ＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＣ−３’）（配列番号１９６）とともに、鋳型としてｐＧＢＫＴ７−Ｐａｒ４ＤＤを用いて、ＰＣＲによりｍｙｃＰａｒ４ＤＤ（アミノ酸２５０〜３４２）を増幅し、ｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターのＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位でクローン化した（Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Research, 18: 5322, 1990）。臍帯静脈由来の初代培養のヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、PromoCell, Heidelberg, Germany）を、完全ＥＣＧＭ培地（PromoCell,Heidelberg, Germany）中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、メーカーの使用説明書（Stratagene;La Jolla, CA, USA）に従って、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒトランスフェクション試薬を用いてＲＰＭＩ培地中で一過的にトランスフェクトした。ｐＥＦ−ｍｙｃＰａｒ４ＤＤおよびＧＦＰタグが付加された発現構築物で同時トランスフェクトした細胞を、カバーガラス上で２４時間〜４８時間増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に室温で１５分間固定し、ＰＢＳで再び洗浄した後、ＰＢＳ中の５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌで、室温で５分間、中和した。もう一度ＰＢＳで洗浄後、０．１％トリトン−Ｘ１００を含有するＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を透過処理し、再びＰＢＳで洗浄した。次に、透過処理された細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）で１０分間遮断し、次にＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈した抗ｍｙｃエピトープマウスモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、１／２００、Clontech）とともに、室温で２時間インキュベートした。次に細胞を、室温で５分、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で３回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈したＣｙ３（レッド蛍光）結合抗マウス（１／１０００、Amersham Pharmacia Biotech）ヤギ抗体（二次抗体）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で十分に洗浄後、試料を風乾して、Ｍｏｗｉｏｌに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。ＧＦＰ（グリーン）およびＣｙ３（レッド）蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
ｐＥＦ−ｍｙｃＰａｒ４ＤＤおよびＧＦＰ発現ベクターで一過的に同時トランスフェクトされた細胞では、異所的に発現したｍｙｃ−Ｐａｒ４ＤＤが、大多数の細胞の細胞質および核の両方に蓄積することが判明した。これに対して、ｐＥＦ−ｍｙｃＰａｒ４ＤＤおよびＧＦＰ−ＴＨＡＰ１を発現ベクターで一過的に同時トランスフェクトした場合は、ｍｙｃ−Ｐａｒ４ＤＤは、拡散した細胞質および核への局在化からＰＭＬ−ＮＢとの選択的会合へと劇的にシフトした。ｍｙｃ−Ｐａｒ４ＤＤの局在化に及ぼすＧＦＰ−ＴＨＡＰ１の作用は、それがＴＨＡＰ１およびアポトーシスとは無関係な核酵素であるＧＦＰ−ＡＰＳキナーゼ−１（ＡＰＳＫ−１）を用いた場合は観察されなかったため、特異的であった（Besset et al., Faseb J, 14: 345-354, 2000）。この後者の結果は、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１がＰＭＬ−ＮＢにｍｙｃ−Ｐａｒ４ＤＤを動員し、ＴＨＡＰ１と好アポトーシスタンパク質Ｐａｒ４と直接相互作用を有するというｉｎｖｉｖｏの証拠を提供する、ということを示す。
新規なアルギニンリッチＰａｒ４結合モチーフの同定
Ｐａｒ４と結合するＴＨＡＰ１を仲介する配列を同定するために、一連のＴＨＡＰ１欠失構築物を生成した。プラスミドｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１を鋳型とし、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、アミノ末端（ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３）およびカルボキシ末端（ＴＨＡＰ１−Ｎ１、−Ｎ２、−Ｎ３）欠失変異体の両方（図４Ａ）を増幅した：ＴＨＡＰ１−Ｃ１（アミノ酸９０〜２１３）に関しては、２ＨＭＲ１２（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣ−３’）（配列番号１９７）および２ＨＭＲ９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号１９８）；ＴＨＡＰ１−Ｃ２（アミノ酸１２０〜２１３）に関しては、ＰＡＭ２（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＴＴＡＡ−３’）（配列番号１９９）および２ＨＭＲ９；ＴＨＡＰ１−Ｃ３（アミノ酸１４３〜２１３）に関しては、ＰＡＰＭ３（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＴＣＡＧ−３’）（配列番号２００）および２ＨＭＲ９；ＴＨＡＰ１−Ｎ１（アミノ酸１〜９０）に関しては、２ＨＭＲ１０（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号２０１）および２ＨＭＲ１７（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴ−３’）（配列番号２０２）；ＴＨＡＰ１−Ｎ２（アミノ酸１〜１６６）に関しては、２ＨＭＲ１０およびＰＡＰＮ２（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＣＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’）（配列番号２０３）；ならびにＴＨＡＰ１−Ｎ３（アミノ酸１〜１９２）に関しては、２ＨＭＲ１０およびＰＡＰＮ３（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＣ−３’）（配列番号２０４）。
このようにして得られたＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＢＫＴ７ ２ハイブリッドベクター（Clontech）中のＧａｌ４結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＢＤ）の下流でインフレームでクローン化して、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３を生成し、あるいはｐＥＧＦＰ．Ｃ２ベクター（Clontech）中の増強グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ＯＲＦの下流でインフレームでクローン化して、ｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３を生成した。
メーカーの使用説明書（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３、Clontech）に従って、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３およびｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４ＤＤを用いたＡＨ１０９の共形質転換、ならびにＨｉｓおよびＡｄｅ二重栄養要求性による形質転換体の選択により、ＴＨＡＰ１変異体およびＰａｒ４ＤＤ間の２ハイブリッド相互作用を試験した。Ｐａｒ４ＤＤとの２ハイブリッドの陽性の相互作用は、変異体ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３および−Ｎ３を用いた場合は観察されたが、変異体ＴＨＡＰ１−Ｎ１および−Ｎ２を用いた場合は観察されなかった。このことは、Ｐａｒ４結合部位がＴＨＡＰ１の１４３番目のアミノ酸残基と１９２番目のアミノ酸残基の間に見出されることを示唆する。
ＴＨＡＰ１変異体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイでも試験した。ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３ベクターを鋳型として用いて、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物系（Promega, Madison, WI, USA）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳したＴＨＡＰ１変異体を生成した。それぞれ２５μｌの３５Ｓで標識されたＴＨＡＰ１変異体を、固定化ＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｐａｒ４タンパク質とともに４℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした：１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．０５％ＮＰ４０および０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルフロライド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのβグリセロホスフェート、２５μｇ／ｍｌのキモトリプシン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン。次にビーズを１ｍｌの結合緩衝液中で５分間洗浄した。結合タンパク質を２×ＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して、アムプリファイ(Amplify)（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて蛍光間接撮影により可視化した。予測どおり、ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３および−Ｎ３はＧＳＴ／Ｐａｒ４ＤＤと相互作用した（図４Ｂ）。これに対して、ＴＨＡＰ１−Ｎ１および−Ｎ２はＧＳＴ／Ｐａｒ４ＤＤビーズと相互作用できなかった。
最後に、ｐＥＦ−ｍｙｃＰａｒ４ＤＤおよびｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３発現ベクターを用いて、実施例６に記載されたようなｉｎｖｉｖｏでのＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイにより、ＴＨＡＰ１変異体のＰａｒ４結合活性も分析した。
３つのＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイに関して、本質的に同一の結果を得た（図４Ａ）。即ち、Ｐａｒ４結合部位は、ヒトＴＨＡＰ１の１４３番目のアミノ酸残基と１９２番目のアミノ酸残基との間に見出された。この領域と、別のＰａｒ４相互作用タンパク質であるマウスＺＩＰキナーゼのＰａｒ４結合ドメインとの比較は、Ｐａｒ４結合部位に対応し得る保存されたアルギニンリッチ配列モチーフ（配列番号２０５、２６３および１５）の存在を明示した（図５Ａ）。部位特異的変異法により、このアルギニンリッチ配列モチーフにおける突然変異を生成した。鋳型としてのｐＥＧＦＰ．Ｃ２ならびにプライマー２ＨＭＲ１０および２ＨＭＲ９を、変異体ＴＨＡＰ１ＲＲ／ＡＡに関してはプライマー：
ＲＲ／ＡＡ−１（５’−ＣＣＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＧ−３’）（配列番号２０６）および
ＲＲ／ＡＡ−２（５’−ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＧ−３’）（配列番号２０７）、または変異体ＴＨＡＰ１ΔＱＲＣＲＲに関してはプライマーΔＲＲ−１（５’−ＧＣＴＣＡＡＧＡＣＣＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＧ−３’）（配列番号２０８）およびΔＲＲ−２（５’−ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＣＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号２０９）と一緒に用いて、２連続回のＰＣＲにより、これら２つの新規のＴＨＡＰ１変異体、ＴＨＡＰ１ＲＲ／ＡＡ（残基Ｒ１７１ＡおよびＲ１７２Ａの置換）およびＴＨＡＰ１ΔＱＲＣＲＲ（残基１６８〜１７２の欠失）を生成した。その結果生じたＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＢＫＴ７２ハイブリッドベクター（Clontech）中のＧａｌ４結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＢＤ）の下流でインフレームでクローン化して、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１−ＲＲ／ＡＡおよびΔ（ＱＲＣＲＲ）を生成し、あるいはｐＥＧＦＰ．Ｃ２ベクター（Clontech）中の増強グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ＯＲＦの下流でインフレームでクローン化して、ｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１−ＲＲ／ＡＡおよび−Δ（ＱＲＣＲＲ）を生成した。次に、ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３変異体に関して上記したように、３つのＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイ（２ハイブリッドアッセイ、ｉｎｖｉｔｒｏＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４相互作用アッセイ）でＴＨＡＰ１ＲＲ／ＡＡおよびＴＨＡＰ１ΔＱＲＣＲＲ ＴＨＡＰ１変異体を試験した。この分析は、２つの変異体が３つのアッセイすべてにおいてＰａｒ４との相互作用を欠いていたことを明示した（図５Ｂ）が、これは、本発明者らが同定した新規のアルギニンリッチ配列モチーフが新規のＰａｒ４結合モチーフであることを示す。
ＰＡＲ４はｉｎ ｖｉｖｏでＴＨＡＰ１と共局在化するＰＭＬ−ＮＢの新規の構成成分である
次に、ＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４間の生理学的相互作用に関するさらなる証拠を提供するために、ＰＡＲ４がＴＨＡＰ１とｉｎ ｖｉｖｏで共局在化するか否かを決定したいと考えた。まず、初代培養のヒト内皮細胞中におけるＰａｒ４の細胞内の局在を分析した。メタノール／アセトンで固定したＨＵＶＥＣ内皮細胞においてアフィニティー精製抗ＰＡＲ４抗体を用いた共焦点免疫蛍光顕微鏡検査（Sells et al., 1997; Guo et al., 1998）を実施したが、これはＰＭＬ−ＮＢ構成成分を抗体に対してアクセス可能にする（Sternsdorf et al., 1997）。細胞をメタノール中で−２０℃で５分間固定し、その後、冷えたアセトン中で−２０℃で３０秒間インキュベートした。次に透過処理した細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）で１０分間ブロッキングし、次にヒトＰａｒ４に対するウサギポリクローナル抗体（１／５０、Ｒ−３３４、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）および抗ＰＭＬマウスモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、１／３０、ｍＡｂＰＧ−Ｍ３（Dako, Glostrup, Denmark））とともに室温で２時間インキュベートした。次に細胞を、室温で５分、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で３回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈したＣｙ３（レッド蛍光）結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）（１／１０００、Amersham Pharmacia Biotech）およびＦＩＴＣで標識された抗マウス−ＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）（１／４０、Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA）抗体とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で広範に洗浄後、試料を風乾して、Ｍｏｗｉｏｌに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。ＦＩＴＣ（グリーン）およびＣｙ３（レッド）蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。この分析は、核質および細胞質に広がった染色のほかに、核の点状の構造体とのＰＡＲ４免疫反応性の関連を示した。抗ＰＭＬ抗体を用いた二重免疫染色は、ＰＡＲ４のフォーカスが細胞核中でＰＭＬ−ＮＢと完全に共局在化することを明示した。ＰＭＬ−ＮＢにおけるＰａｒ４とＧＦＰ−ＴＨＡＰ１との共局在化を、異所的なＧＦＰ−ＴＨＡＰ１を発現するトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞で分析した。ＨＵＶＥＣを完全ＥＣＧＭ培地（PromoCell, Heidelberg, Germany）中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、メーカーの使用説明書（Stratagene; La Jolla, CA, USA）に従って、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒトランスフェクション試薬を用いてＲＰＭＩ培地中のＧＦＰ／ＴＨＡＰ１発現構築物（ｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１）で一過的にトランスフェクトした。抗Ｐａｒ４ウサギ抗体を用いて２４時間後に間接的免疫蛍光顕微鏡によるトランスフェクトされた細胞を分析したところ、全ての内因性ＰＡＲ４フォーカスがＰＭＬ−ＮＢ中で異所性ＧＦＰ／ＴＨＡＰ１と共局在化することを明示し、さらに、ｉｎｖｉｖｏでのＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４複合体とＰＭＬ−ＮＢとの会合を確認した。
ＰＭＬはＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４複合体をＰＭＬ−ＮＢに動員する
ＰＭＬは、他の構成成分を動員することによりＰＭＬ−ＮＢのアセンブリーに重要な役割を果たすことが示されたため、次に、ＰＭＬがＰＭＬ−ＮＢへのＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４の動員に役割を果たすか否かを決定したいと考えた。このために、内因性のＰＡＲ４と異所的なＧＦＰ−ＴＨＡＰ１とがともに、ヒトＨｅＬａ細胞のＰＭＬ−ＮＢ中に蓄積しない、という観察を利用した。ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１およびＨＡ−ＰＭＬ（またはＨＡ−ＳＰ１００）に関する発現ベクターをこれらの細胞中で同時トランスフェクトさせて、内因性ＰＡＲ４、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１およびＨＡ−ＰＭＬ（またはＨＡ−ＳＰ１００）の局在を三重染色共焦点顕微鏡により分析した。
ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（全てLifeTechnologies, Grand Island, NY, USAから）を補ったダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、２μｇのｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１およびｐｃＤＮＡ．３−ＨＡ−ＰＭＬ３またはｐＳＧ５−ＨＡ−Ｓｐ１００（Dejean博士(Institut Pasteur, Paris, France)から寄贈）プラスミドＤＮＡを用いて、リン酸カルシウム法で一過的にトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Invitrogen, San Diego, CA, USA）のＢａｍＨＩ部位中にｐＧＡＤＴ７−ＨＡ−ＰＭＬ３からのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をサブクローニングすることにより、ｐｃＤＮＡ．３−ＨＡ−ＰＭＬ３を構築した。ｐＧＡＤＴ７−ＨＡ−ＰＭＬ３を生成するために、ｐＡＣＴ２−ＰＭＬ３（De The博士( Paris, France)から寄贈）を鋳型として、以下のプライマー：ＰＭＬ−１（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＴＴＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＧＣＣ−３’）（配列番号２１０）およびＰＭＬ−２（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＡＴＣ−３’）（配列番号２１１）とともに用いて、ＰＣＲによりＰＭＬ３のＯＲＦを増幅し、ｐＧＡＤＴ７のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローン化した。
ＧＦＰタグおよびＨＡ−タグを付加した発現構築物でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、カバーガラス上で２４時間〜４８時間増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、メタノール中で−２０℃で５分間固定し、その後、冷えたアセトン中で−２０℃で３０秒間インキュベートした。次に透過処理した細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）で１０分間ブロッキングし、次にＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈した以下の初代培養の抗体：ヒトＰａｒ４に対するウサギポリクローナル抗体（１／５０、Ｒ−３３４、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）および抗ＨＡタグマウスモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、１／１０００、ｍＡｂ１６Ｂ１２（BabCO, Richmond, CA, USA））とともに室温で２時間インキュベートした。次に細胞を、室温で５分、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で３回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈したＣｙ３（レッド蛍光）結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）（１／１０００、Amersham Pharmacia Biotech）およびアレキサフルオル(AlexaFluor)−６３３（ブルー蛍光）結合抗マウス−ＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）（１／１００、MolecularProbes, Eugene, OR, USA）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で広範に洗浄後、試料 を風乾して、Ｍｏｗｉｏｌに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。ＧＦＰ（グリーン）およびＣｙ３（レッド）およびアレクサ６３３（ブルー）蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
ＨＡ−ＰＭＬでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞では、内因性ＰＡＲ４およびＧＦＰ−ＴＨＡＰ１はＰＭＬ−ＮＢに動員されたが、一方、ＨＡ−ＳＰ１００でトランスフェクトされた細胞では、ＰＡＲ４およびＧＦＰ−ＴＨＡＰ１はともに、ＰＭＬ−ＮＢ中での蓄積を伴わずに、広く染色された。これらの知見は、ＰＭＬ−ＮＢへのＴＨＡＰ１／ＰＡＲ４複合体の動員はＰＭＬに拠るが、しかしＳＰ１００には拠らないことを示す。
ＴＨＡＰ１はアポトーシス誘導性ポリペプチドである
ＴＨＡＰ１は新規の好アポトーシス因子である
ＰＭＬおよびＰＭＬ−ＮＢは細胞死の調節と関連付けられ、ＰＡＲ４は十分に確立された好アポトーシス因子であるため、ＴＨＡＰ１が細胞生存を調節し得るか否かを調べた。ＰＡＲ４の好アポトーシス活性を分析するために従来用いられてきたマウス３Ｔ３細胞（Diaz-Meco et al, 1996; Berra et al., 1997）を、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１、ＧＦＰ−ＰＡＲ４、ならびにネガティブコントロールとしてＴＨＡＰ１およびアポトーシスに関連する核酵素であるＧＦＰ−ＡＰＳキナーゼ−１（ＡＰＳＫ−１）の発現ベクター（Girard et al., 1998; Besset et al., 2000）でトランスフェクトした。次にＴＨＡＰ１の異所的な発現が血清撤去に対するアポトーシス応答を強化するか否かを決定した。トランスフェクトされた細胞に２４時間までの間、血清を与えず、ＤＡＰＩ染色により、かつｉｎｓｉｔｕＴＵＮＥＬアッセイにおいて明示されるようなアポトーシス性の核を有する細胞を計数した。
細胞死アッセイ：マウス３Ｔ３−ＴＯ繊維芽細胞を４０〜５０％の密集度で１２ウエルプレート中のカバーガラス上に植え付け、そして供給元の使用説明書に従って、リポフェクタミンプラス試薬（Life Technologies）を用いてＧＦＰまたはＧＦＰ融合タンパク質発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。３７℃で６時間後、ＤＮＡ−脂質混合物を取り出し、細胞を完全培地中に２４時間回収した。培地を０％血清に変えることにより、一過性トランスフェクトされた細胞の血清飢餓を誘導し、ＧＦＰ陽性アポトーシス細胞の量を血清飢餓の誘導の２４時間後に評価した。３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に細胞を固定し、免疫蛍光下で、上記のように０．１％トリトン−Ｘ１００で透過処理し、核凝縮を示すアポトーシス核のｉｎｓｉｔｕＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端ラベリング）および／またはＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色により、アポトーシスを調べた。ｉｎｓｉｔｕ細胞死検出キットＴＭＲレッド（Roche Diagnostics, Meylan, France）を用いて、３７℃で１時間、ＴＵＮＥＬ反応を実施した。０．２：ｇ／ｍｌの最終濃度でのＤＡＰＩ染色を、室温で１０分間実施した。蛍光顕微鏡を用いて、各実験時点に関して、少なくとも１００個の細胞を調べた。
血清の存在下でのアポトーシスの基本レベルは、１〜３％の範囲であった。血清撤去の２４時間後、アポトーシスは、トランスフェクトされていない３Ｔ３細胞の１８％で、およびＧＦＰ−ＡＰＳＫ−１を過剰発現する３Ｔ３細胞において見出された。血清撤去誘導性アポトーシスのレベルは、それぞれＧＦＰ−ＰＡＲ４およびＧＦＰ−ＴＨＡＰ１を過剰発現する細胞において約７０％および６５％に有意に増大した（図６Ａ）。これらの結果は、ＴＨＡＰ１が、ＰＡＲ４と同様に、アポトーシス誘導性ポリペプチドであることを実証する。
３０ｎｇ／ｍｌのｍＴＮＦαを含有する完全培地（R &D, Minneapolis, MN, USA）中で２４時間、一過性トランスフェクトされた細胞をインキュベートすることにより、ＴＮＦα誘導性アポトーシスアッセイを実施した。血清撤去誘導性アポトーシスに関して記載されたように、アポトーシスを調べた。結果を、図６Ｂに示す。図６Ｂに示したように、ＴＨＡＰ１はアポトーシスを誘導した。
ＴＨＡＰドメインはＴＨＡＰ１好アポトーシス活性に不可欠である
ＴＨＡＰ１の機能的活性におけるアミノ末端ＴＨＡＰドメイン（アミノ酸１〜８９）の役割を決定するために、ＴＨＡＰドメインが欠失したＴＨＡＰ１変異体（ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ）を生成した。鋳型としてのｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１を、プライマー２ＨＭＲ１２（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣ−３’）（配列番号２１２）および２ＨＭＲ９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号２１３）とともに用いて、ＰＣＲにより、ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ（アミノ酸９０〜２１３）を増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＢＤＴ７およびｐＥＧＦＰ−Ｃ２ベクター中でクローン化して、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰおよびｐＥＧＦＰ．Ｃ２−ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ発現ベクターを生成した。次に、ＴＨＡＰ１のＰＭＬＮＢの局在、Ｐａｒ４との結合、または好アポトーシス活性におけるＴＨＡＰドメインの役割を分析した。
ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰの細胞内の局在を分析するために、ＧＦＰ／ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ発現構築物を臍帯静脈由来の初代培養のヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、PromoCell,Heidelberg, Germany）中でトランスフェクトした。ＨＵＶＥＣを完全ＥＣＧＭ培地（PromoCell,Heidelberg, Germany）中で増殖させて、カバーガラス上で平板培養し、メーカーの使用説明書（Stratagene;La Jolla, CA, USA）に従って、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒトランスフェクション試薬を用いてＲＰＭＩ培地中で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、カバーガラス上で４８時間増殖させた。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に室温で１５分間固定し、ＰＢＳで再び洗浄した後、ＰＢＳ中の５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌで、室温で５分間、中和した。もう一度ＰＢＳで洗浄後、０．１％トリトン−Ｘ１００を含有するＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を透過処理し、再びＰＢＳで洗浄した。次に透過処理された細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）で１０分間ブロッキングし、次にＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈した抗ＰＭＬマウスモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、１／３０、ｍＡｂＰＧ−Ｍ３（Dako, Glostrup, Denmark））とともに、室温で２時間インキュベートした。次に細胞を、室温で５分、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で３回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈したＣｙ３（レッド蛍光）結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）（１／１０００、Amersham Pharmacia Biotech）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で広範に洗浄後、試料を風乾して、Ｍｏｗｉｏｌに封入した。ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を収集した。ＧＦＰ（グリーン）およびＣｙ３（レッド）蛍光シグナルを、同一画像視野に逐次記録して、チャンネル間のクロストークを回避した。
この分析は、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ染色が、ＰＭＬに対する抗体を用いて得られた染色パターンと完全に重複する、ということを明示したが、これは、ＴＨＡＰドメインがＰＭＬＮＢへのＴＨＡＰ１の局在に必要とされないことを示す。
Ｐａｒ４との結合におけるＴＨＡＰドメインの役割を調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウンアッセイを実施した。ＧＳＴ−タグが付加された融合タンパク質として発現され、グルタチオンセファロース上に固定されるＰａｒ４ＤＤを、ｉｎｖｉｔｒｏで翻訳され放射能で標識されたＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰとともにインキュベートした。ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰベクターを鋳型として用いて、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物系（Promega,Madison, WI, USA）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰを生成した。２５μｌの３５Ｓで標識されたＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰを、固定化ＧＳＴ−Ｐａｒ４またはＧＳＴタンパク質とともに４℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした：１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．０５％ＮＰ４０および０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのβグリセロホスフェート、２５μｇ／ｍｌのキモトリプシン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン。次にビーズを１ｍｌの結合緩衝液中で５分間洗浄した。結合タンパク質を２×ＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して、アムプリファイ（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて蛍光間接撮影により可視化した。
この分析は、ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰがＧＳＴ／Ｐａｒ４ＤＤと相互作用することを明示したが、これは、ＴＨＡＰドメインがＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４の相互作用に関与しないことを示す（図７Ａ）。
ＴＨＡＰ１好アポトーシス活性におけるＴＨＡＰドメインの役割を調べるために、マウス３Ｔ３細胞における細胞死アッセイを実施した。マウス３Ｔ３−ＴＯ繊維芽細胞を４０〜５０％密集度で１２ウエルプレート中のカバーガラス上に植え付け、そして供給元の使用説明書に従って、リポフェクタミンプラス試薬（Life Technologies）を用いてＧＦＰ−ＡＰＳＫ１、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１またはＧＦＰ−ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰ融合タンパク質発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。３７℃で６時間後、ＤＮＡ−脂質混合物を取り出し、細胞を完全培地中で２４時間回復させた。培地を０％血清に変えることにより、一過性トランスフェクトされた細胞の血清飢餓を誘導し、ＧＦＰ陽性アポトーシス細胞の量を血清飢餓の誘導の２４時間後に評価した。３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に細胞を固定し、免疫蛍光下で、上記のように０．１％トリトン−Ｘ１００で透過処理し、核凝縮を示すアポトーシス核のｉｎｓｉｔｕＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端ラベリング）および／またはＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色により、アポトーシスを調べた。ｉｎｓｉｔｕ細胞死検出キットＴＭＲレッド（Roche Diagnostics, Meylan, France）を用いて、３７℃で１時間、ＴＵＮＥＬ反応を実施した。０．２μｇ／ｍｌの最終濃度でのＤＡＰＩ染色を、室温で１０分間実施した。蛍光顕微鏡を用いて、各実験時点に関して、少なくとも１００個の細胞を調べた。
血清撤去の２４時間後、アポトーシスは、トランスフェクトされていない３Ｔ３細胞の１８％で、およびＧＦＰ−ＡＰＳＫ−１を過剰発現する３Ｔ３細胞において見出された。血清撤去誘導性アポトーシスのレベルは、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１を過剰発現する細胞において約７０％に有意に増大した。ＴＨＡＰドメインの欠失は、血清撤去誘導性アポトーシスがＧＦＰ−ＴＨＡＰ１ΔＴＨＡＰを過剰発現する細胞において２８％に低減したため、この作用のほとんどを阻止した（図７Ｂ）。これらの結果は、ＴＨＡＰドメインは、ＴＨＡＰ１ＰＭＬ−ＮＢの局在およびＰａｒ４の結合に必要でないが、ＴＨＡＰ１好アポトーシス活性には不可欠であることを示す。
ＴＨＡＰドメインはタンパク質の新規のファミリーであるＴＨＡＰファミリーを限定するＴＨＡＰ１と相同的なおよび／またはＴＨＡＰドメインを含有する新規のヒトタンパク質を発見するために、NationalCenter for Biotechnology InformationのＧｅｎＢａｎｋ非重複ヒトＥＳＴおよびドラフトヒトゲノムデータベース（sss.ncbi.nlm.nih.gov）を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、ＴＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて、ＴＨＡＰ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方で検索した（Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J.(1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-410）。これにより、１２の別個のヒトＴＨＡＰ含有タンパク質の同定が可能となった（ｈＴＨＡＰ０〜ｈＴＨＡＰ１１；図８）。部分長配列の場合、対応するゲノムＤＮＡクローンに関するＧＥＮＥＳＣＡＮ（Burge, C. and Karlin, S. (1997). Prediction of complete genestructures in human genomic DNA. J Mol Biol 268: 78-94）およびＧＥＮＥＷＩＳＥ（Jareborg, N., Birney, E. and Durbin, R. (1999). Comparative analysisof noncoding regions of 77 orthologous mouse and human gene pairs. Genome Res.9: 815-824）と共に、遺伝子予測を伴う重複ＥＳＴのアセンブリーを用いて、全長ヒトＴＨＡＰタンパク質ならびにそれらの対応するｃＤＮＡおよび遺伝子を特定した。ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Higgins, D.G., Thompson, J.D. and Gibson, T.J. (1996). Using CLUSTALfor multiple sequence alignments. Methods Enzymol 266: 383-402）を用いて、コンピュータープログラムＢｏｘｓｈａｄｅ（www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）を用いて彩色されたショウジョウバエＰ因子トランスポザーゼのＤＮＡ結合ドメイン（Lee, C.C., Beall, E.L.,and Rio, D.C. (1998) Embo J. 17: 4166-74）で、１２のヒトＴＨＡＰドメインのアラインメントを実行した（図９Ａおよび図９Ｂ参照）。上記のものと等価のアプローチは、マウス、ラット、ブタおよびヒトＴＨＡＰタンパク質の他の種々のオルソログを同定するために用いられる（図９Ｃ）。結局は、コンピュータ内のかつ実験的なアプローチは、好アポトーシス因子のＴＨＡＰファミリーの１２の別個のヒト成員（ｈＴＨＡＰ０〜ｈＴＨＡＰ１１）の発見をもたらした（図８）。
ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３はＰａｒ−４と相互作用する
ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３がＰａｒ−４と相互作用し得るか否かを評価するために、Ｐａｒ−４野生型ベイトを用いた酵母２ハイブリッドアッセイ（図１０Ｂ）およびｉｎｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウンアッセイ（図１０Ｃ）を、上記のように実施した（実施例４および実施例５）。図１０Ｂおよび図１０Ｃに示したように、ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３は、Ｐａｒ−４と相互作用し得た。ＴＨＡＰ１、ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３間のＴＨＡＰドメインおよびＰＡＲ４結合ドメインの比較を示す配列アラインメントを、図１０Ａに示す。
ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３はアポトーシスを誘導し得る
ＧＦＰ−ＡＰＳＫ１、ＧＦＰ−ＴＨＡＰ２またはＧＦＰ−ＴＨＡＰ３発現ベクターでトランスフェクトした細胞において、血清誘導性またはＴＮＦαアポトーシス分析を上記（実施例１０）と同様に実施した。血清撤去のまたはＴＮＦα付加の２４時間後、アポトーシス核のＤＡＰＩ染色によりアポトーシスを定量した。結果を図１１Ａ（血清撤去）および図１１Ｂ（ＴＮＦα）に示す。これらの結果は、ＴＨＡＰ−２およびＴＨＡＰ３がアポトーシスを誘導することを示す。
ヒトＴＨＡＰ１のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメインの同定
ヒトＴＨＡＰ１のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメインを同定するために、一連のＴＨＡＰ１欠失構築物を、実施例７に記載したように生成した。
メーカーの使用説明書（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３、Clontech）に従って、ｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３およびｐＧＢＫＴ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１を用いたＡＨ１０９の共形質転換、ならびにＨｉｓおよびＡｄｅ二重栄養要求性による形質転換体の選択により、ＴＨＡＰ１変異体およびケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１間の２ハイブリッド相互作用を試験した。ベクターｐＧＢＫＴ７（Clontech）の独特のＢａｍＨＩクローニング部位へのｐＧＢＴ９ＳＬＣからのＢａｍＨＩＳＬＣ／ＣＣＬ２１断片（実施例１参照）をサブクローニングすることにより、ｐＧＢＫＴ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ベクターを生成した。ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１との陽性２ハイブリッド相互作用は、変異体ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３を用いた場合には観察されたが、しかし変異体ＴＨＡＰ１−Ｎ１、−Ｎ２および−Ｎ３を用いた場合は観察されず、このことは、ヒトＴＨＡＰ１のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合部位がＴＨＡＰ１の１４３番目のアミノ酸残基と２１３番目のアミノ酸残基の間に見出されることを示唆する（図１２）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏＴＨＡＰ１／ケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１相互作用アッセイ
酵母２ハイブリッド系で観察された相互作用を確証するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウンアッセイを実施した。ＧＳＴ−タグが付加された融合タンパク質として発現され、グルタチオンセファロース上に固定されるＴＨＡＰ１を、ｉｎｖｉｔｒｏで翻訳されかつ放射能で標識されたＳＬＣ／ＣＣＬ２１とともにインキュベートした。
ＧＳＴ−ＴＨＡＰ１発現ベクターを生成するために、プライマー２ＨＭＲ８（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＧＧＣ−３’）（配列番号２１４）および２ＨＭＲ１１（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧ−３’）（配列番号２１５）を用いてＰＣＲにより、ＴＨＡＰ１（アミノ酸１〜２１３）のコード領域の全長を増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ｐＧＥＸ−２Ｔ原核生物発現ベクター（Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, France）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位間、すなわち、グルタチオンＳ−ＴトランスフェラーゼＯＲＦの下流でインフレームでクローン化した。プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＨＡＰ１によりコードされるＧＳＴ−ＴＨＡＰ１融合タンパク質、ならびにプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔによりコードされる対照ＧＳＴタンパク質を次に、大腸菌ＤＨ５α中で発現させて、供給元の使用説明書（Amersham PharmaciaBiotech）に従ってグルタチオンセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ−ポリアリールアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびクーマシーブルー染色分析により、ＧＳＴプルダウンアッセイに用いられるタンパク質の収量を決定した。
ｐＧＢＫＴ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ベクターを鋳型として用いて、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物系（Promega,Madison, WI, USA）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳で翻訳されたＳＬＣ／ＣＣＬ２１を生成した（実施例１５参照）。２５μｌの３５Ｓで標識された野生型ＳＬＣ／ＣＣＬ２１を、固定されたＧＳＴ−ＴＨＡＰ１またはＧＳＴタンパク質とともに４℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした：１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．０５％ＮＰ４０および０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのβグリセロホスフェート、２５μｇ／ｍｌのキモトリプシン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン。次にビーズを１ｍｌの結合緩衝液中で５回洗浄した。結合タンパク質を２×ＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して、アムプリファイ(Amplify)（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて蛍光間接撮影により可視化した。予測どおり、ＧＳＴ／ＴＨＡＰ１はＳＬＣ／ＣＣＬ２１と相互作用した（図１３）。これに対して、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１はＧＳＴビーズと相互作用しなかった。
ヒトケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１のＴＨＡＰ１結合ドメインの同定
ヒトケモカインＳＬＣ／ＣＣＬ２１上のＴＨＡＰ１結合部位を決定するために、ＳＬＣ特異的塩基カルボキシ末端延長を欠くＳＬＣ／ＣＣＬ２１欠失変異体（ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ΔＣＯＯＨ）（アミノ酸１０２〜１３４；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００２９８０）を生成した。ＳＬＣ／ＣＣＬ２１のＣＣＲ７ケモカイン受容体結合ドメイン（アミノ酸２４〜１０１）を保持するこのＳＬＣ／ＣＣＬ２１ΔＣＯＯＨを、ＴＨＡＰ１ベイトを伴う酵母２ハイブリッドアッセイおよびＧＳＴ−ＴＨＡＰ１を伴うｉｎ ｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウンアッセイの両方に用いた。
２ハイブリッドアッセイのために、酵母細胞を、ＢＤ７−ＴＨＡＰ１およびＡＤ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１またはＡＤ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ΔＣＯＯＨ発現ベクターで共形質転換した。ｐＧＡＤＴ７発現ベクター（Clontech）中でｐＧＫＴ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１（実施例１５参照）からのＢａｍＨＩ断片（ＳＬＣアミノ酸２４〜１３４をコードする）またはＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片（ＳＬＣアミノ酸２４〜１０２をコードする）をサブクローニングすることにより、ＡＤ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１またはＡＤ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ΔＣＯＯＨ発現ベクターを生成した。ヒスチジンおよびアデニンを欠く培地上で、形質転換体を選択した。図１３は、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１野生型およびＳＬＣ／ＣＣＬ２１ＣＯＯＨ欠失変異体がともにＴＨＡＰ１と結合し得たことを示す。同一の結果は、ＢＤ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１またはＢＤ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ΔＣＯＯＨを用いたＡＤ７−ＴＨＡＰ１の共形質転換により得られた。
ｐＧＢＫＴ７−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１ΔＣＯＯＨを鋳型として用いて、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物系（Promega, Madison, WI, USA）により生成される、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたＳＬＣ／ＣＣＬ２１ＣＯＯＨを用いたＧＳＴプルダウンアッセイを、実施例１６と同様に実施した。図１３は、ＳＬＣ／ＣＣＬ１野生型およびＳＬＣ／ＣＣＬ２１ＣＯＯＨ欠失変異体がともにＴＨＡＰ１と結合し得たことを示す。
ＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合タンパク質の調製
本実施例は、ＴＨＡＰ１または抗体に由来するＦｃ領域ポリペプチドと融合されたＴＨＡＰ１のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメインを含む融合タンパク質の調製を記載する。
ＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターは、以下のように構築される。
要するに、ヒトＴＨＡＰ１の全長コード領域（配列番号３；アミノ酸−１〜２１３）またはヒトＴＨＡＰ１のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメイン（配列番号３；アミノ酸−１４３〜２１３）を、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲで５’プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ制限部位上流を付加する付加的配列を含有する。３’プライマーは、Ｆｃポリペプチドの最初の２つのアミノ酸をコードする付加的配列、ならびにＴＨＡＰ１およびＦｃ配列のＢｇｌＩＩ制限部位下流を付加する配列を含む。ヒトＴＨＡＰ１ｃＤＮＡを含有する組換えベクターを、ＰＣＲにおける鋳型として用いるが、これは、慣用的手法に従って構築される。次に増幅ＤＮＡをＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、所望の断片をアガロースゲル上での電気泳動により精製する。
クローン化ＦｃコードＤＮＡを含有するベクターをＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化することにより、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片を単離する。ＢｇｌＩＩは、ＢｇｌＩＩ部位が３および４つのＦｃポリペプチドのアミノ酸に関するコドンを包含するよう、Ｆｃコード配列の５’末端付近に導入される独特のＢｇｌＩＩ部位を切断する。ＮｏｔＩは、Ｆｃコード配列の下流を切断する。ＦｃポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、コードアミノ酸配列とともに、国際公開番号ＷＯ９３／１０１５１に見出され得る。
スリーウェイライゲーションでは、上記のＴＨＡＰ１（またはＴＨＡＰ１のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメイン）コードＤＮＡおよびＦｃコードＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化されていた発現ベクター中に挿入し、ホスファターゼで処理して、挿入物を用いずに任意のベクターＤＮＡの再環化を最小限にする。用いられ得るベクターの一例は、ｐＤＣ４０６（McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991に記載）であり、これは大腸菌中での複製も可能にする哺乳類発現ベクターである。
次にライゲーション混合物で大腸菌細胞をトランスフェクトして、所望の組換えベクターを単離する。ベクターは、ＴＨＡＰ１配列（配列番号３）のアミノ酸−１〜２１３あるいはＦｃポリペプチドのＮ末端に融合された配列番号３のＴＨＡＰ１配列のアミノ酸−１４３〜２１３をコードする。コードされたＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域からネイティブＣ末端に延長し、即ち、実質的に全長の抗体Ｆｃ領域である。
次に、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞を、大腸菌から単離された所望の組換え体でトランスフェクトする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８）は、慣用的手法により組換えベクターでトランスフェクトし得る。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株は、McMahan et al. (1991). EMBO J. 10: 2821により記載されているように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ ７０）に由来する。トランスフェクトされた細胞を培養して、ＴＨＡＰ１／ＦｃまたはＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合タンパク質のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメインの一過的発現を可能にし、これらは培地中に分泌される。分泌タンパク質は、成熟型のＴＨＡＰ１またはＦｃポリペプチドに融合されたＴＨＡＰ１のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメインを含有する。ＴＨＡＰ１／ＦｃおよびＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合タンパク質のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメインは二量体を形成すると考えられるが、この場合、２つのこのような融合タンパク質は、そのＦｃ部分間に生じるジスルフィド結合により連結される。プロテインＡ保有クロマトグラフィーカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより、ＴＨＡＰ１／ＦｃおよびＴＨＡＰ１／Ｆｃ融合タンパク質のＳＬＣ／ＣＣＬ２１ケモカイン結合ドメインを培地から回収し得る。
ＴＨＡＰドメインは核因子の一ファミリーを限定する
異なるヒトＴＨＡＰタンパク質の細胞内局在化を決定するために、一連のＧＦＰ−ＴＨＡＰ１発現構築物を初代培養のヒト内皮細胞中にトランスフェクトした。ＤＮＡ結合因子としてのＴＨＡＰタンパク質の考え得る機能と一致して、分析されたヒトＴＨＡＰタンパク質は全て（ＴＨＡＰ０、１、２、３、６、７、８、１０、１１）、細胞核に選択的に局在する、ということを本発明者らは見出した（図１４）。それらの拡散性の核への局在のほかに、ＴＨＡＰタンパク質のいくつかは、別個の細胞内構造と関連しても存在した：ＴＨＡＰ２およびＴＨＡＰ３に関しては仁、ＴＨＡＰ７、ＴＨＡＰ８およびＴＨＡＰ１１に関しては断続核小体。抗ＰＭＬ抗体を用いた間接的免疫蛍光顕微鏡は、ＴＨＡＰ８およびＴＨＡＰ１１核小体がＰＭＬ−ＮＢと共局在する、ということを明示した。ＴＨＡＰ７核小体はしばしばＰＭＬ−ＮＢと密接に関連して出現したが、しかしそれらは決して共局在しなかった。
ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１融合タンパク質の細胞内局在の分析を、上記と同様に実施した（実施例３）。ＧＦＰ−ＴＨＡＰ１構築物を、以下のように生成した：プライマーＴＨＡＰ０−１（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣ−３’）（配列番号２１６）およびＴＨＡＰ０−２（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＡＴＴＡＴＣ−３’）（配列番号２１７）を用いてＨｅｖｅｃのｃＤＮＡからＰＣＲにより、ヒトＴＨＡＰ０コード領域を増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２ベクターの同一部位でクローン化して、ｐＥＧＦＰＣ２−ＴＨＡＰ０を生成した。プライマーＴＨＡＰ２−１（５’−ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＴＧＧ−３’）（配列番号２１８）およびＴＨＡＰ２−２（５’−ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＣＣＡＡＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧ−３’）（配列番号２１９）を用いて（ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩで消化し）、プライマーＴＨＡＰ３−１（５’−ＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＴＣ−３’）（配列番号２２０）およびＴＨＡＰ３−２（５’−ＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＣＧ−３’）（配列番号２２１）を用いて、プライマーＴＨＡＰ７−１（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣ−３’）（配列番号２２２）およびＴＨＡＰ７−２（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣ−３’）（配列番号２２３）を用いてＩｍａｇｅクローンＮｏ：４８１３３０２およびＮｏ：３６３３７４３から（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して）、プライマーＴＨＡＰ６−１（５’−ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＴＧＧＡ−３’）（配列番号２２４）およびＴＨＡＰ６−２（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＣ−３’）（配列番号２２５）を用いてＩｍａｇｅクローンＮｏ：７５７７５３から（ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化して）、プライマーＴＨＡＰ８−１（５’−ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＣＧ−３’）（配列番号２２６）およびＴＨＡＰ８−２（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧ−３’）（配列番号２２７）を用いてＩｍａｇｅクローンＮｏ：４８１９１７８から（ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し）、それぞれＩｍａｇｅクローンＮｏ：３６０６３７６からＰＣＲにより、ヒトＴＨＡＰ２、３、７、６および８のコード領域を増幅し、同一酵素で消化されたｐＥＧＦＰＣ２ベクター(Clontech)中で増強グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ＯＲＦの下流でインフレームでクローン化して、ｐＥＧＦＰＣ２−ＴＨＡＰ２、−ＴＨＡＰ３、−ＴＨＡＰ７、−ＴＨＡＰ６および−ＴＨＡＰ８を生成した。プライマーＴＨＡＰ１０−１（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧＧＣＣＧＣ−３’）（配列番号２２８）およびＴＨＡＰ１０−２（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣ−３’）（配列番号２２９）を用いて（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し）、プライマーＴＨＡＰ１１−１（５’−ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣ−３’）（配列番号２３０）およびＴＨＡＰ１１−２（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＣＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＧＧＡＴＧＡＣ−３’）（配列番号２３１）を用いて（ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し）、それぞれＨｅＬａのｃＤＮＡからＰＣＲにより、ヒトＴＨＡＰ１０およびＴＨＡＰ１１コード領域を増幅し、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２ベクターの同一部位でクローン化して、ｐＥＧＦＰＣ２−ＴＨＡＰ１０および−ＴＨＡＰ１１を生成した。
ＴＨＡＰドメインは核ホルモン受容体のＤＮＡ結合ドメインと構造類似性を共有する
ＴＨＡＰドメインの三次元構造をモデル化するために、本発明者らはＰＤＢ結晶データベースを検索した。二次構造情報を補助的に用いた場合は、配列相同性検出はより感受性が高くで且つ選択的になるので、配列および二次構造アラインメントを組合せるＳｅｑＦｏｌｄスレッディングプログラム（Olszewski et al. (1999) Theor. Chem. Acc. 101, 57-61）を用いて、ヒトＴＨＡＰ１のＴＨＡＰドメインのホモログを検索した。甲状腺ホルモン受容体βＤＢＤ（ＰＤＢコード：２ＮＬＬ）の結晶構造は最も高いスコアを出したので、本発明者らは、図１５Ａに示したその結果生じた構造アラインメントを用いて、ヒトＴＨＡＰ１からのＴＨＡＰドメインの相同性ベースのモデルを得た（図１５Ｂ）。ＴＨＡＰドメイン中のＣｙｓ残基の分布は甲状腺ホルモン受容体βＤＢＤのものと完全には適合せず（図１５Ａ）、それゆえ２つの特徴的「Ｃ４型」Ｚｎ−フィンガーの形成を可能にすることができない（図１５Ａで赤色にコード化）ことに留意されたい。しかしながらリシン側鎖の芳香族／疎水性残基または脂肪族部分間のスタッキング相互作用の網状構造は、ＴＨＡＰドメインの構造の安定性を保証する（図１５Ａおよび図１５Ｂでシアン色コード化）。興味深いことに、同一のスレッディング法は、最も高いスコアを生じる場合、糖質コルチコイド受容体ＤＢＤ（ＰＤＢコード：１ＧＬＵ）の結晶構造を同定されたショウジョウバエＰ因子トランスポザーゼＤＢＤに、独立して当てはまった。同一方法で、本発明者らは、図１５Ｄに示したその結果生じた構造アラインメントを用いて、トランスポザーゼＤＢＤのモデルを構築した（図１５Ｃ）。ＴＨＡＰドメインのものと等価の疎水性コアの存在に留意されたい（図１５Ｃおよび図１５Ｄでシアン色コード化）。核受容体のＤＮＡ結合ドメインは全て、主として２つの相互作用αらせんに基づく典型的パターンにフォールディングし、第一のものは標的ＤＮＡの主溝中に挿入する。本発明者らのスレッディングおよびモデリング結果は、ＴＨＡＰドメインおよび黄色ショウジョウバエＰ因子トランスポザーゼＤＢＤが核受容体のＤＢＤのものと類似する共通のトポロジーを共有すると思われる、ということを示す。
Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｏ２ワークステーションで作動されるAccelrys（San Diego, CA）分子モデリングソフトウェア（バージョン９８）からのＩｎｓｉｇｈｔＩＩ、ＳｅｑＦｏｌｄ、Ｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒモジュールを用いて、分子モデリングを実施した。ＳｅｑＦｏｌｄ内のＤＳＣ法により、問題のタンパク質ドメインの最適な二次構造の予測を確認した。スレッディング由来の二次構造アラインメントを相同性モデリングのための入力データとして用い、上記のプロトコール（Manival et al. (2001) Nucleic Acids Res 29: 2223-2233）に従って実施した。ラマチャンドラン(Ramachandran)分析および以前に報告されたような（Manival etal. (2001) Nucleic Acids Res 29: 2223-2233）フォールディングの一貫性の証明の両方により、モデルの妥当性を調べた。
ヒトＴＨＡＰ１のホモ二量体化ドメイン
ＴＨＡＰ１のホモ二量体化を媒介する配列を同定するために、一連のＴＨＡＰ１検出構築物を、実施例７に記載されたように生成した。
メーカーの使用説明書（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３、Clontech）に従って、ｐＧＡＤＴ７−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３およびｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１野生型を用いたＡＨ１０９の共形質転換、ならびにＨｉｓおよびＡｄｅ二重栄養要求性による形質転換体の選択により、ＴＨＡＰ１変異体およびＴＨＡＰ１野生型間の２ハイブリッド相互作用を試験した。ＴＨＡＰ１野生型との陽性２ハイブリッド相互作用は、変異型ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３および−Ｎ３を用いた場合は観察されたが、変異型ＴＨＡＰ１−Ｎ１および−Ｎ２を用いた場合は観察されず、このことは、ＴＨＡＰ１ホモ二量体化ドメインがＴＨＡＰ１の１４３番目のアミノ酸残基と１９２番目のアミノ酸残基の間に見出されることを示唆する（図１６Ａ）。
酵母で得られた結果を確認するために、ＴＨＡＰ１変異体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウンアッセイでも試験した。ＧＳＴタグが付加された融合タンパク質として発現され、グルタチオンセファロース上に固定される（実施例１６に記載されているのと同様）野生型ＴＨＡＰ１を、ｉｎｖｉｔｒｏで翻訳されかつ放射能で標識されたＴＨＡＰ１変異体とともにインキュベートした。ｐＧＡＤＴ７−ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２または−Ｎ３ベクターを鋳型として用いて、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物系（Promega, Madison, WI, USA）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたＴＨＡＰ１変異体を生成した。２５μｌの３５Ｓで標識されたＴＨＡＰ１変異体をそれぞれ、固定化ＧＳＴまたはＧＳＴ−ＴＨＡＰ１野生型タンパク質とともに４℃で一晩、以下の結合緩衝液中でインキュベートした：１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．０５％ＮＰ４０および０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのβグリセロホスフェート、２５μｇ／ｍｌのキモトリプシン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン。次にビーズを１ｍｌの結合緩衝液中で５分間洗浄した。結合タンパク質を２×ＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して、アムプリファイ(Amplify)（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて蛍光間接撮影により可視化した。予測どおり、ＴＨＡＰ１−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３および−Ｎ３はＧＳＴ／ＴＨＡＰ１と相互作用した（図１６Ｂ）。これに対して、ＴＨＡＰ１−Ｎ１および−Ｎ２はＧＳＴ／ＴＨＡＰ１ビーズと相互作用しなかった。したがって、２つのＴＨＡＰ１／ＴＨＡＰ１相互作用アッセイでは、本質的に同一結果が得られた。ＴＨＡＰ１のＴＨＡＰ１ホモ二量体化ドメインは、ヒトＴＨＡＰ１の１４３番目のアミノ酸残基と１９２番目のアミノ酸残基の間に見出される。
ヒトＴＨＡＰ１の代替的にスプライスされたアイソフォーム
２つの別個のＴＨＡＰ１のｃＤＮＡ、即ちＴＨＡＰ１ａおよびＴＨＡＰ１ｂを発見した（図１７Ａ）。これらのスプライス変異体を、プライマー２ＨＭＲ１０（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号２３２）および２ＨＭＲ９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号２３３）を用いてＨＥＶＥＣのｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＧＦＰ．Ｎ３ベクター（Clontech）中で増強グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ＯＲＦの上流でインフレームでクローン化して、ｐＥＧＦＰ．Ｎ３−ＴＨＡＰ１ａおよびｐＥＧＦＰ−ＴＨＡＰ１ｂを生成した。ＤＮＡシーケンシングは、ＴＨＡＰ１ｂのｃＤＮＡアイソフォームがヒトＴＨＡＰ１遺伝子のエキソン２（ヌクレオチド２７３〜４６８）を欠くことを明示した（図１７Ｂ）。ヒトＴＨＡＰ１のこの代替的にスプライスされたアイソフォーム（〜２ｋｂｍＲＮＡ）は、ノーザンブロット分析により、多数のその他の組織中でも観察された（図２参照）。次に、ＴＨＡＰ１ａ／ＧＦＰおよびＴＨＡＰ１ｂ／ＧＦＰ発現構築物をＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ）中にトランスフェクトし、融合タンパク質の発現を、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。結果を図１７Ｃに示すが、これは、ヒトＴＨＡＰ１の第二のアイソフォーム（ＴＨＡＰ１ｂ）が、アミノ酸末端のその後の部分（配列番号３のアミノ酸１〜１４２）を欠く不完全なＴＨＡＰ１タンパク質（ＴＨＡＰ１Ｃ３）をコードすることを実証する。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチド好アポトーシス活性のモジュレーターに関する高処理量
スクリーニングアッセイ
ＴＨＡＰファミリーポリペプチドである、テトラサイクリン調節性発現を示す３Ｔ３細胞株における血清撤去誘導性アポトーシスを基礎にして、ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの好アポトーシス活性を阻止するかまたは刺激する分子に関する高処理量スクリーニングアッセイを開発した。
好ましい例では、インフレームｍｙｃタグ配列を有するＴＨＡＰ１のｃＤＮＡを、プライマーｍｙｃ．ＢＤ７（５’−ＧＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣ−３’）（配列番号２３４５）および２ＨＭＲ１５（５’−ＧＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧ−３’）（配列番号２３５）とともに、鋳型としてｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１を用いて、ＰＣＲにより増幅し、ＸｂａＩ制限部位を用いて、プラスミドベクターｐＴＲＥ（Clontech, Palo Alto, CA）中のテトラサイクリン調節化プロモーターの下流でクローン化して、ｐＴＲＥ−ｍｙｃＴＨＡＰ１を生成した。３Ｔ３−ＴＯ−ｍｙｃＴＨＡＰ１安定細胞株を確立するために、マウス３Ｔ３−ＴＯ繊維芽細胞（Clontech）を４０〜５０％の集密度で植え付け、そして供給元の使用説明書に従って、リポフェクタミンプラス試薬（Life Technologies）を用いて、１：１０の比率で、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、およびｍｙｃＴＨＡＰ１発現ベクター（ｐＴＲＥ−ｍｙｃＴＨＡＰ１）を含有するｐＲＥＰ４プラスミド（Invitrogen）を用いて同時トランスフェクトした。ハイグロマイシンＢ（２５０Ｕ／ｍｌ；Calbiochem）およびテトラサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ；Sigma）を含有する培地中で、トランスフェクトされた細胞を選択した。いくつかの耐性コロニーを選択し、抗ｍｙｃエピトープモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、１／２００、Clontech）を用いて、間接免疫蛍光法により、ｍｙｃＴＨＡＰ１の発現に関して分析した。ｍｙｃＴＨＡＰ１を発現する安定３Ｔ３−ＴＯ細胞株（３Ｔ３−ＴＯ−ｍｙｃＴＨＡＰ１）を選択し、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（全てLife Technologies, Grand Island, NY, USAから）およびテトラサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ；Sigma）を補足したダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。この３Ｔ３−ＴＯ−ｍｙｃＴＨＡＰ１細胞株へのＴＨＡＰ１発現の誘導は、完全培地中のテトラサイクリンの除去後４８時間目に得られた。
３Ｔ３−ＴＯ−ｍｙｃＴＨＡＰ１細胞株を用いた薬剤スクリーニングアッセイは、以下のように実行し得る。３Ｔ３−ＴＯ−ｍｙｃＴＨＡＰ１細胞を９６−または３８４ウエル微小プレート中で平板培養し、完全培地中のテトラサイクリンの除去により、ＴＨＡＰ１発現を誘導する。４８時間後、血清撤去に対するアポトーシス性応答を試験化合物の存在下でアッセイして、アポトーシスを誘導するＴＨＡＰ１ポリペプチドの活性を増強するかまたは抑制する試験化合物の同定を可能にする。培地を０％血清に変えることにより、３Ｔ３−ＴＯ−ｍｙｃＴＨＡＰ１細胞の血清飢餓を誘導し、アポトーシス核を有する細胞の量を、９６−または３８４ウエル微小プレート中でのＴＵＮＥＬラベリングにより、血清飢餓の誘導の２４時間後に評価する。３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に細胞を固定し、０．１％トリトン−Ｘ１００で透過処理し、アポトーシス核のｉｎｓｉｔｕＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端ラベリング）染色により、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット、ＴＭＲレッド（Roche Diagnostics, Meylan, France）を用いて、３７℃で１時間、アポトーシスを調べた。次に各ウエル中のＴＭＲレッド蛍光の強度を定量して、蛍光シグナルを修飾し、ＴＨＡＰ１の好アポトーシス活性を増強するかまたは抑制する試験化合物を同定する。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＴＨＡＰファミリー標的タンパク質相互作用を調整する薬剤に関する高処理量２ハイブリッドスクリーニングアッセイ
ＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４またはＴＨＡＰ１／ＳＬＣ相互作用を調整する薬剤を同定するために、２ハイブリッドベース高処理量スクリーニングアッセイを実施し得る。
実施例１７に記載したように、プラスミドｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１およびｐＧＡＤＴ７−Ｐａｒ４またはｐＧＡＤＴ７−ＳＬＣを用いて共形質転換したＡＨ１０９酵母細胞（Clontech）を、メーカーの使用説明書（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ２ハイブリッド系３、Clontech）に従って、ヒスチジンおよびアデニンを欠く選択培地中で３８４ウエルプレート中で増殖させ得る。
ヒスチジンおよびアデニンを欠く培地上での形質転換体の増殖は、ＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４またはＴＨＡＰ１／ＳＬＣ２ハイブリッド相互作用に完全に依存しており、したがってＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４またはＴＨＡＰ１／ＳＬＣ結合を崩壊する薬剤は酵母細胞増殖を抑制する。
プラスチック３８４−ピンアレイ（Genetix）を用いることにより、小分子（ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌ；Chembridge）を付加する。プレートを３０℃で４〜５日間インキュベートし、ＴＨＡＰ１／Ｐａｒ４またはＴＨＡＰ１／ＳＬＣ２ハイブリッド相互作用を破壊することにより酵母細胞の増殖を抑制する小分子が、さらなる分析のために選択される。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＴＨＡＰファミリータンパク質標的相互作用のインヒビターを同定するための高処理量ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＴＨＡＰ機能の小分子モジュレーターを同定するために、蛍光極性化（ＦＰ）に基づいた高処理量スクリーニングを用いて、Ｐａｒ４（Ｐａｒ４ＤＤ）融合タンパク質または組換えＧＳＴ−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１融合タンパク質の組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＴＨＡＰ結合ドメインからの蛍光標識ＴＨＡＰ１タンパク質の置換をモニタリングする。
Degterev et al, Nature Cell Biol. 3: 173-182 (2001)およびDandlikeret al, Methods
Enzymol. 74: 3-28 (1981)の場合と実質的に同様に、アッセイを実行する。漸増量のＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤまたはＧＳＴ−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１タンパク質を用いてオレゴングリーンで標識したＴＨＡＰ１ペプチドを滴定することにより、アッセイを較正し得る。ペプチドの結合には極性化（ｍＰ、ミリ極性化）の増大を伴う。
上記と同様に、ＴＨＡＰ１およびＰＡＲ４ポリペプチドおよびＧＳＴ融合物を生成し得る。メーカーの使用説明書に従って、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔキット（Qiagen）を用いてＴＨＡＰ１ペプチドを発現し、精製した。要するに、全ＴＨＡＰ１コード配列を、プライマー２ＨＭＲ８（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＧＧＣ−３’）（配列番号２３６）および２ＨＭＲ９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号２３７）とともに、鋳型としてｐＧＢＫＴ７−ＴＨＡＰ１を用いて、ＰＣＲにより増幅し、ｐＱＥ３０ベクター（Qiagen）のＢａｍＨＩ部位中にクローン化した。その結果生じたｐＱＥ３０−ＨｉｓＴＨＡＰ１プラスミドを、大腸菌Ｍ１５株（Qiagen）中で形質転換させた。変性条件下でＮｉ−アガロースカラム（Qiagen）上の封入体から６×Ｈｉｓタグ化ＴＨＡＰ１タンパク質を精製し、溶出物をｉｎ ｖｉｔｒｏ相互作用アッセイのために用いた。ＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤ融合タンパク質を生成するために、Ｐａｒ４ＤＤを、プライマーＰａｒ４．１０（５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴＡＧＡＴＡＴＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡ−３’）（配列番号２３８）およびＰａｒ４．５（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＣ−３’）（配列番号２３９）を用いてＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＸ−２Ｔ原核生物発現ベクター（Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, France）のＢａｍＨＩ部位に、グルタチオンＳ−Ｔトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ＯＲＦの下流でインフレームでクローン化した。同様に、ＧＳＴ−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１融合タンパク質を生成するために、成熟型のヒトＳＬＣ／ＣＣＬ２１（アミノ酸２４〜１３４）を、プライマーｈＳＬＣｂａｍ．５’（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧ−３’）（配列番号２４０）およびｈＳＬＣｂａｍ．３’（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＣＣ−３’）（配列番号２４１）を用いてＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩで消化して、ｐＧＥＸ−２ＴベクターのＢａｍＨＩクローニング部位に挿入した。ＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤ（アミノ酸２５０〜３４２）およびＧＳＴ−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１（アミノ酸２４〜１３４）融合タンパク質を大腸菌ＤＨ５α中で発現させて（ｓｕｐＥ４４、ＤＥＬＴＡｌａｃＵ１６９（８０ｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ１、ｒｅｌＡ１）、供給元の使用説明書（Amersham Pharmacia Biotech）に従って、グルタチオンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
小分子をスクリーニングするために、ＴＨＡＰ１ペプチドをスクシニミジルオレゴングリーン（MolecularProbes, Oregon）で標識し、ＨＰＬＣにより精製する。ＰＢＳ、ｐＨ７．２（Gibco ）と混合した３３ｎＭの標識されたＴＨＡＰ１ペプチド、２μＭのＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤまたはＧＳＴ−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１タンパク質、０．１％ウシγグロブリン（Sigma）および１ｍＭのジチオトレイトールを、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ（LabSystems）とともに３８４ウエルブラックプレート（Lab Systems）に付加する。プラスチック３８４−ピンアレイ（Genetix）を用いることにより、小分子（ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌ；Chembridge）を移入する。プレートを２５℃で１〜２時間インキュベートし、Ａｎａｌｙｓｔプレート読取り器（LJLBiosystems）を用いてＦＰ値を決定する。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＴＨＡＰファミリータンパク質標的相互作用のインヒビターを同定するための高処理量チップアッセイ
標識されていないＴＨＡＰおよびＴＨＡＰファミリー標的タンパク質を用いた結合アッセイに基づくチップアッセイ（Degterevet al, (2000) Nature Cell Biol. 3: 173-182）を利用して、ＴＨＡＰファミリーおよびＴＨＡＰファミリー標的相互作用を妨害し得る分子を同定し、高感受性を用意し、そして標識部分からの潜在的干渉を回避する。この実施例では、Ｐａｒ４タンパク質（Ｐａｒ４ＤＤ）またはＳＬＣ／ＣＣＬ２１のＴＨＡＰ１結合ドメインを、表面強化レーザー脱着／イオン化（ＳＥＬＤＩ）チップに共有的に結合し、試験化合物の存在下における、標識されていないＴＨＡＰ１タンパク質と固定化タンパク質との結合を質量分光測定によりモニタリングする。
組換えＴＨＡＰ１タンパク質、ＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤおよびＧＳＴ−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１融合タンパク質を、実施例２５に記載されたように調製する。精製組換えＧＳＴ−Ｐａｒ４ＤＤまたはＧＳＴ−ＳＬＣ／ＣＣＬ２１タンパク質を、その第一アミンを介して、カルボニルジイミダゾール（Ciphergen）で誘導されたＳＥＬＤＩチップ表面に結合する。
ＴＨＡＰ１タンパク質を１μｌの総容積中で、４℃で１２時間、湿室中でインキュベートして、ＳＥＬＤＩチップの各スポットに結合させ、次に高ｐＨおよび低ｐＨ緩衝液で交互に洗浄する（０．５ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、その後、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）。試料をα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス中に包埋し、マトリックス補助レーザー脱着イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法により、執拗に関して分析する。一定設定条件での１００レーザースポットショットの平均を、各試料中の２０スポットに亘って収集する。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチド／ＴＨＡＰファミリータンパク質標的相互作用のインヒビターを同定するための高処理量細胞アッセイ
ＴＨＡＰ１および蛍光タンパク質と融合させたＰＡＲ４またはＳＬＣ／ＣＣＬ２１タンパク質間で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを実行する。アッセイは、Majhan et al, Nature Biotechnology 16: 547-552 (1998)およびDegterev et al, Nature Cell Biol. 3: 173-182 (2001)の場合と同様に実行し得る。
ＴＨＡＰ１タンパク質をシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）と融合し、そしてＰＡＲ４またはＳＬＣ／ＣＣＬ２１タンパク質を黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）と融合する。ＴＨＡＰファミリーおよびＴＨＡＰファミリー標的タンパク質を含有するベクターは、Majhan et al (1998)と本質的に同様に構築し得る。ｐＥＣＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech）中にＴＨＡＰ１−１のｃＤＮＡをサブクローニングすることにより、ＴＨＡＰ１−ＣＦＰ発現ベクターを生成する。ＰＡＲ４−ＹＦＰまたはＳＬＣ／ＣＣＬ２１−ＣＹＰ発現ベクターは、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech）中にＰＡＲ４またはＳＬＣ／ＣＣＬ２１のｃＤＮＡをサブクローニングすることにより生成する。
ベクターをＨＥＫ−２９３細胞に同時トランスフェクトし、細胞を試験化合物で処理する。リポフェクトアミンプラス（Gibco）またはトランスＬＴ−１（Pan Vera）を用いて、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＴＨＡＰ１−ＣＦＰおよびＰＡＲ４−ＹＥＰまたはＳＬＣ／ＣＣＬ２１−ＹＥＰ発現ベクターでトランスフェクトする。２４時間後、細胞を試験化合物で処理して、種々の時間、例えば４８時間まで、インキュベートする。任意に試験化合物を補足したＰＢＳ中に細胞を収集し、Ｃ−６０蛍光計（ＰＴＩ）またはワラックWallacプレート読取り器で蛍光を測定する。ＴＨＡＰ１−ＣＦＰおよびＰＡＲ４−ＹＦＰまたはＳＬＣ／ＣＣＬ２１−ＹＦＰを別々に発現する試料中の蛍光を一緒に付加し、ＴＨＡＰ−１／ＰＡＲ４またはＴＨＡＰ１／ＳＬＣ／ＣＣＬ２１結合の非存在下でのＦＲＥＴ値を概算するために用いる。
ＣＦＰおよびＹＦＰ間のＦＲＥＴの程度を、４３３ｎｍでの励起後の５２７ｎｍでの蛍光と４７５ｎｍでの蛍光の間の比として決定する。ＴＨＡＰ−１タンパク質およびＰＡＲ４またはＳＬＣ／ＣＣＬ２１タンパク質の同時トランスフェクションは、１．０の参照ＦＲＥＴ比を上回るＦＲＥＴ比の増大を生じる（タンパク質を別々に発現する試料を用いて測定する）。試験化合物での処理時のＦＲＥＴ比の変化（試験化合物の非存在下での同時トランスフェクション後に観察されたものを上回る）は、ＴＨＡＰ−１タンパク質およびＰＡＲ４またはＳＬＣ／ＣＣＬ２１タンパク質の相互作用を調節し得る化合物を示す。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチドの標的ＤＮＡを同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
あり得る部位をランダムにプールした中からＴＨＡＰ１タンパク質のＴＨＡＰドメインにより選択される結合部位をランダムすることが可能となる、ランダムオリゴヌクレオチド選択法を用いて、ＴＨＡＰ１のＤＮＡ結合特異性を決定した。本方法は、Bouvet (2001) Methods Mol Biol. 148: 603-10に記載されたものと実質的に同様に実行した。Pollack and Treisman (1990) Nuc. Acid Res. 18: 6197-6204; Blackwelland Weintraub, (1990) Science 250: 1104-1110; Ko and Engel, (1993) Mol. Cell.Biol. 13: 4011-4022; Merika and Orkin, (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 3999-4010;およびKrueger and Morimoto, (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7592-7603も参照されたい。
組換えＴＨＡＰドメイン発現および精製
ヒトＴＨＡＰ−１のＴＨＡＰドメイン（配列番号３のアミノ酸１〜９０）をコードするｃＤＮＡ断片を、以下のプライマー：５’−ＧＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＧＧＣ−３’（配列番号２４２）および５’−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＡＧ−３’（配列番号２４３）とともに、鋳型としてｐＧＡＤＴ７−ＴＨＡＰ−１（実施例４参照）を用いて、ＰＣＲによりクローン化した。ＰＣＲ産物を、カルボキシ末端にＨｉｓタグをコードする配列を付加してインフレームでｐＥＴ−２１ｃ原核生物発現ベクター（Novagen）中にＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片としてクローン化して、ｐＥＴ−２１ｃＴＨＡＰを生成した。
ＴＨＡＰ−Ｈｉｓ６の発現のために、ｐＥＴ−２１ｃ−ＴＨＡＰで大腸菌ＢＬ−２１ ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。細菌を、３７℃で、６００ｎｍでの光学濃度０．６に増殖させて、１ｍＭの最終濃度でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（Sigma）を付加することによりタンパク質の発現を誘導し、インキュベーションを４時間継続した。
遠心分離により細胞を収集し、氷冷緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％β−メルカプトエタノール、１０ｍＭのイミダゾール）中に再懸濁した。細胞を超音波処理により溶解し、溶解物を１２０００ｇで４５分間の遠心分離により清澄化した。上清を、緩衝液Ａで平衡させたＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）上に載せた。緩衝液Ａおよび４０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａで洗浄後、タンパク質を緩衝液Ｂ（Ａと同一。０．０５％β−メルカプトエタノールおよび２５０ｍＭのイミダゾール）で溶出した。
ＴＨＡＰ−Ｈｉｓ６を含有する分画をプールし、緩衝液Ｃ（トリス−ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）で平衡させたスーパーデックス(Superdex)７５ゲル濾過カラムに適用した。ＴＨＡＰ−Ｈｉｓ６タンパク質を含有する分画をプールし、ｗｉｔｈｎ ＹＭ−３アミコンフィルター装置により濃縮して、２０％グリセロールを含有する緩衝液Ｃ中で、４℃で保存するかまたは−８０℃で凍結させた。ＳＤＳ−ポリアリールアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびクーマシーブルー染色分析により、試料の純度を評価した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計を用いてＥＳＩ質量分析およびペプチド質量マッピングにより、タンパク質調製物の構造的全体性を調べた。ブラッドフォード(Bradford)タンパク質アッセイによりタンパク質濃度を決定した。
ランダムオリゴヌクレオチド選択
Bouvet (2001) Methods Mol Biol. 148: 603-10に記載されたＳＥＬＥＸプロトコールに従って、以下のような配列を有する６２ｂｐオリゴヌクレオチドを合成した：５’−ＴＧＧＧＣＡＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＡＣ−Ｎ２５−ＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号２４４）（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、プライマーは各末端と相補的である）。プライマーＰは：５’−ＡＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２４５）であり、プライマーＲは：５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＡＴＴ−３’（配列番号２４６）である。ＰおよびＲプライマーを用いてＰＣＲにより６２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを二本鎖にして、８０ｂｐのランダムのプールを生成する。
約２５０ｎｇのＴＨＡＰ−Ｈｉｓ６を、ローラー上で４℃で３０分間、ＮＴ２緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ＮＰ−４０）中でＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズとともにインキュベートした。ビーズを５００μｌのＮＴ２緩衝液で２回洗浄して、非結合タンパク質を除去した。固定されたＴＨＡＰ−Ｈｉｓ６を、１００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ＮＰ−４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２０〜５０μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ））中の二本鎖８０ｂｐＤＮＡ（２〜５μｇ）のランダムプールとともに室温で１０分間インキュベートした。次にビーズを５００μｌのＮＴ２緩衝液で６回洗浄した。次にタンパク質／ＤＮＡ複合体をフェノール／クロロホルムによる抽出に付して、担体として１０μｇのグリコーゲンを用いてエタノールで沈降させた。次に回収したＤＮＡの約５分の１を、１５〜２０回のＰＣＲにより増幅して、次回の選択のために用いた。８回の選択後、ＮａＣｌ濃度を徐々に１５０ｍＭに増大した。
ＴＨＡＰ−Ｈｉｓ６による１２回の選択後、増幅オリゴヌクレオチドのプールをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Stratagene）中でクローン化し、個々のクローンを、Ｂｉｇ Ｄｙｅターミネーターキット（Applied Biosystem）を用いてシーケンシングした。
配列分析の結果は、ヒトＴＨＡＰ１のＴＨＡＰドメインが部位特異的ＤＮＡ結合ドメインである、ということを示す。上記のＳＥＬＥＸ手法から得た２組のヌクレオチド配列のアラインメントから、２つのコンセンサス配列を推定した（各組は９核酸配列を含有する）。特に、ＴＨＡＰドメインは、５塩基空いたダイレクトリピート（ＤＲ−５モチーフ）を選択的に構成する、ＧＧＧＣＡＡまたはＴＧＧＣＡＡという標的ＤＮＡ配列を認識することが判明した。コンセンサス配列は、ＧＧＧＣＡＡｎｎｎｎｎＴＧＧＣＡＡ（配列番号１４９）である。さらにＴＨＡＰは、ＴＴＧＣＣＡｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎＧＧＧＣＡＡというコンセンサス配列（配列番号１５９）を有する１１塩基空いたインバーティッドリピート（ＥＲ−１１モチーフ）を認識する。ＧＧＧＣＡＡおよびＴＧＧＣＡＡ配列はＴＨＡＰドメインのＤＮＡ結合部位を選択的に構成するが、ＧＧＧＣＡＴ、ＧＧＧＣＡＧおよびＴＧＧＣＡＧ配列も、ＴＨＡＰドメインにより認識される標的ＤＮＡ配列である。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのインヒビターまたは非特異的ＤＮＡ標的とのＴＨＡＰファミリー相互作用を同定するためのハイスループットｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
シンチレーション近接アッセイを用いて、ＴＨＡＰ１特異的ＤＮＡ結合の検出および定量のためのハイスループットアッセイを実行する。材料はAmersham（Piscataway, NJ）から入手し、Gal S. et al, 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9Sept 2000, Vancouver, B.C.に従って実行し得る。
適切な特異的活性に対して、［３Ｈ］ＴＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼを用いて、ランダム二重鎖ＤＮＡプローブを準備し標識する（例えば約４２０ｉ／ｍｍｏｌ）。ＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分を準備し、ＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分の量をＥＬＩＳＡにより決定する。アッセイを発展させるために、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実行して、適切なアッセイパラメーターを選択し得る。ハイスループットアッセイのために、結合緩衝液（Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５；ＥＤＴＡ；ＤＴＴ；１０ｍＭの硫酸アンモニウム；ＫＣｌおよびＴｗｅｅｎ−２０）中で３Ｈで標識したＤＮＡ、抗ＴＨＡＰ１モノクローナル抗体、およびＴＨＡＰ１を併合する。
このアッセイは、標準９６ウエルプレート中でなされ、室温で５〜３０分間インキュベートした後、５０〜１００μｌの結合緩衝液中の０．５〜２ｍｇのＰＶＴプロテインＡＳＰＡビーズを付加する。ＳＰＡビーズに結合された放射能を、ＴｏｐＣｏｕｎｔTM微小プレート計数器（Packard Biosciences, Meriden, CT）を用いて測定する。
ＴＨＡＰファミリーポリペプチドのインヒビターまたは特異的ＤＮＡ標的とのＴＨＡＰファミリー相互作用を同定するためのハイスループットｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
シンチレーション近接アッセイを用いて、ＴＨＡＰ１特異的ＤＮＡ結合の検出および定量のためのハイスループットアッセイを実行する。材料はAmersham（Piscataway, NJ）から入手し、Gal S. et al, 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9Sept 2000, Vancouver, B.C.に従ってアッセイを実行し得る。
実施例２０により得られるＴＨＡＰ１ ＤＮＡ結合配列に対応するＴＨＡＰ１特異的二本鎖ＤＮＡプローブを準備する。適切な特異的活性に対して、［３Ｈ］ＴＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼを用いて、プローブを標識する（例えば約４２０ｉ／ｍｍｏｌ）。ＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分を準備し、ＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分の量をＥＬＩＳＡにより決定する。アッセイを発展させるために、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実行して、適切なアッセイパラメーターを選択し得る。ハイスループットアッセイのために、結合緩衝液（Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５；ＥＤＴＡ；ＤＴＴ；１０ｍＭの硫酸アンモニウム；ＫＣｌおよびＴｗｅｅｎ−２０）中で、３Ｈで標識したＤＮＡ、抗ＴＨＡＰ１モノクローナル抗体、１μｇの非特異的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖ポリ−ｄＡｄＴ）およびＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分を混合した。このアッセイは、標準９６ウエルプレート中でなされ、室温で５〜３０分間インキュベートした後、５０〜１００μｌの結合緩衝液中の０．５〜２ｍｇのＰＶＴプロテインＡ ＳＰＡビーズを付加する。ＳＰＡビーズに結合された放射能を、ＴｏｐＣｏｕｎｔTM微小プレート計数器（PackardBiosciences,Meriden, CT）を用いて測定する。
抗体組成物の調製
実質的に純粋なＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分を生成する。例えばアミコンフィルター装置上での濃縮により、最終調製物中のタンパク質の濃度を、２〜３μｇ／ｍｌのレベルに調節する。次にタンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、以下のように調製する：ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生：Kohler and Milstein (Nature, 256: 495, 1975)の古典的方法またはその派生的方法（Harlow and Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, pp. 53-242, 1988 参照）に従って、ネズミハイブリドーマから、ＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分中のエピトープに対するモノクローナル抗体を調製し得る。
要するに、２〜３週間に亘って、２〜３μｇのＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分を反復的にマウスに接種する。次にマウスを屠殺して、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールにより、脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合し、過剰な非融合細胞を、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上の系の増殖により破壊する。首尾よく融合された細胞を希釈し、希釈アリコートをマイクロタイタープレートのウエル中に入れて、そこで培養の増殖を継続させる。イムノアッセイ手法、例えばEngvall, E., Meth.
Enzymol. 70: 419 (1980)により最初に記載されたようなＥＬＩＳＡによるウエルの上清液中の抗体の検出により、抗体産生クローンを同定する。選択陽性クローンを拡張させて、それらのモノクローナル抗体産物を使用するために収集した。モノクローナル抗体産生に関する詳細な手法は、Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, NewYork., Section 21-2に記載されている。
免疫感作によるポリクローナル抗体産生
無修飾であるかまたは免疫原性を強化するために修飾され得るＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分で適切なヒト以外の動物を免疫感作することにより、ＴＨＡＰ１タンパク質またはその一部分中の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清を調製し得る。適切なヒト以外の動物、好ましくはヒト以外の哺乳類を選択する。例えば動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマであり得る。あるいはＴＨＡＰ１またはその一部分に関して濃縮された粗製タンパク質調製物を用いて、抗体を生成し得る。このようなタンパク質、断片または調製物を、当該技術分野で既知である適切なアジュバント（例えば水酸化アルミニウム、ＲＩＢＩ等）の存在下でヒト以外の哺乳類中に導入する。さらにタンパク質、断片または調製物は、抗原性を増大する作用物質を用いて前処理され得るが、このような作用物質は当該技術分野で既知であり、例としては、例えばメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原およびカギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙げられる。免疫感作動物からの血清を収集し、既知の手法に従って処理し、試験する。血清が望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する場合、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリクローナル抗体を精製し得る。
有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種にともに関連した多数の因子により影響を及ぼされる。さらにまた、宿主動物は、接種の部位、ならびに低力価抗体を生じる抗原のミスマッチまたは過剰用量の両方を伴う用量に応答して変わる。多皮膚内部位に投与される少量の（ｎｇレベル）抗原が、最も確かであると思われる。ポリクローナル抗血清を産生し、加工処理するための技法は、当該技術分野で既知である（例えばMayer and Walker (1987)参照）。ウサギに関する有効免疫感作プロトコールは、Vaitukaitis, J.et
al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988-991 (1971)に見出され得る。一定間隔で追加の免疫注射を施し、その抗体力価が、例えば既知の濃度の抗原に対する寒天中での二重免疫拡散により半定量的に決定した場合に、下がり始めたら、抗血清を収穫し得る（例えばOuchterlony, O. et al., Chap. 19 in : Handbook of ExperimentalImmunology D. Wier (ed) Blackwell (1973)参照）。抗体のプラトー濃度は、通常は０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの血清（約１２：Ｍ）の範囲である。例えばFisher, D., Chap. 42 in : Manual of Clinical Immunology, 2d Ed.(Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980)に記載されているように、競合的結合曲線を調製することにより、抗原に対する抗血清の親和性を決定する。
モノクローナルまたはポリクローナルプロトコールに従って調製される抗体調製物は、生物学的試料中の抗原保有物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用である。あるいはそれらは、生物学的試料中の抗原の存在を同定するために、半定量的または定性的にも用いられる。抗体は、タンパク質を発現する細胞を殺害するためにあるいは身体中のタンパク質のレベルを低減するために治療的組成物中にも用いられ得る。

Claims (10)

  1. 薬学的に許容可能な担体中のケモカイン結合物質を含む薬学的組成物であって、該ケモカイン結合物質は、配列番号３〜１４のいずれか１つ、配列番号３〜１４のいずれか１つと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、配列番号３〜１４のいずれか１つのケモカイン結合ドメイン、および配列番号３〜１４のいずれか１つのケモカイン結合ドメインと少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、薬学的組成物。
  2. 前記ポリペプチドが免疫グロブリンのFc領域に融合されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記ポリペプチドがTHAP二量体化ドメインを含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のケモカイン結合物質の有効量とSLCとを接触させることを含む、ケモカインSLCを結合する方法。
  5. 前記ケモカイン結合物質が、配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ケモカイン結合物質が、配列番号３のアミノ酸配列１４３〜２１３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
  7. 前記ケモカイン結合物質が配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
  8. 前記ケモカイン結合物質が、配列番号３のアミノ酸配列１４３〜２１３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
  9. 配列番号３〜１４のいずれか１つのケモカイン結合ドメインのペプチドフラグメント、および配列番号３〜１４のいずれか１つのケモカイン結合ドメインに対して少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、ケモカイン結合物質。
  10. 前記ポリペプチドフラグメントが免疫グロブリンのFｃ領域に融合されている、請求項９に記載のケモカイン結合物質。
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