JP2015536990A - Malt1の低分子阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年11月9日提出の米国特許仮出願第61/724,650号の優先権を主張し、その開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
非ホジキンリンパ腫(NHL)は7番目に発生頻度が高い癌である(Siegel et al., 2012)。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)はNHLの最も一般的な亜型で、すべてのリンパ腫症例の約25%を占める(Swerdlow, 2008)。遺伝子発現プロファイリングにより、DLBCLの胚中心B細胞様(GCB)DLBCL、活性化B細胞様(ABC)DLBCLおよび原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)を含む、異なる分子亜型への細分類が可能となった(Alizadeh et al., 2000;Rosenwald et al., 2003)。これらの亜型は、その再発性体細胞変異の範囲、異なるシグナル伝達経路への依存、および現行の標準的療法への反応において著しく異なる(Lenz et al., 2008b;Wright et al., 2003)。GCB亜型を有する患者は、ABC亜型を有する患者に比べて、全生存が有意に良好である(Alizadeh et al., 2000;Rosenwald et al., 2002)。すべてのDLBCLに対する改善された療法が必要であるが、最も化学療法抵抗性のABC-DLBCLに関して最も緊急性が高い。
MALT1は、ABC-DLBCLにおいて異所性発癌シグナリングを伝達する特有のパラカスパーゼタンパク質である。本発明者らは、本明細書において低分子阻害剤のスクリーニングを可能にするMALT1の構成的活性化型の開発を開示し、B細胞リンパ腫などの医学的障害を処置するためのMALT1阻害化合物およびそれらの使用を特許請求する。化合物MI-2は不可逆的MALT1プロテアーゼ阻害剤で、細胞検定におけるナノモル活性およびABC-DLBCLに対する選択的活性を有するリード化合物として特定された。重要なことに、本発明者らは、MALT1阻害剤がインビトロおよびインビボでABC-DLBCLを死滅させ、動物に対しては無毒で、かつ初代ヒト非GCB-DLBCL試料も抑制することを示す。したがって、本発明者らは、MALT1が本物の治療標的であることを示し、B細胞リンパ腫に対する治療薬の新しいクラスの基礎となるリード化合物を提供する。
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し;
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し;Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり;
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、また酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず;
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり;J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり;
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり;J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており;
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり;J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。
概要
様々な態様において、本発明は、MALT1を調節する方法であって、MALT1を式(I)の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体の有効な量または濃度と接触させる段階を含む方法を提供する:
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し;
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し;Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり;
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、また酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず;
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり;J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり;
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり;J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており;
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり;J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。
式中、R1、Ar1、およびAr2は式(I)の化合物について定義したとおりである。
式中、Ar2およびAr3は式(I)の化合物について定義したとおりである。
は、本明細書に記載の一重、二重または三重結合でありうる結合を示す。炭素-炭素二重結合の周りの置換基は、「Z」または「E」立体配置であると命名され、ここで用語「Z」および「E」はIUPAC標準に従って用いる。特に記載がないかぎり、二重結合を示す構造は「E」および「Z」異性体の両方を含む。炭素-炭素二重結合の周りの置換基は、代わりに、「シス」または「トランス」と呼ぶこともでき、ここで「シス」は二重結合の同じ側の置換基を意味し、「トランス」は二重結合の反対側の置換基を意味する。
本発明者らは、MALT1低分子阻害剤は、MALT1の生物学を試験するための、およびMALT1依存性腫瘍を処置するための有用な化学的ツールであると判断した。しかし、全長MALT1およびそのパラカスパーゼドメイン(アミノ酸340〜789)はモノマーとして生理的溶液中にもともと存在し、これは非常に低いタンパク質分解活性を有する。カスパーゼは一般に最大触媒活性のためにホモ二量体化しなければならず(Pop et al., 2006;Walker et al., 1994;Yin et al., 2006)、したがって最近報告された、ペプチド系阻害剤との複合体でのMALT1のパラカスパーゼドメインの構造は二量体である(Wiesmann et al., 2012;Yu et al., 2011)。阻害剤についてスクリーニングするための有効な検定のために触媒的に活性なMALT1を生成するために、本発明者らは、MALT1の二量体化および活性化を促進するロイシンジッパー二量体化モティーフと融合したMALT1(340〜789)の組換え型(LZ-MALT1)を生化学的に操作した(図1A)。本発明者らは、蛍光発生物質AMC(7-アミノ-4-メチルクマリン)に連結されたMALT1基質ペプチドLRSRを用いてのMALT1活性検定を開発した。Ac-LRSR-AMC基質のMALT1による切断はAMCおよび蛍光シグナルの放出を引き起こした。
MI-2について、AMRIからのID番号はALB-H03200218であり;
MI-2A1:CGX-01216062;
MI-2A2:CGX-01216044;
MI-2A3:CGX-01207032;
MI-2A4:ALB-H09612295;
MI-2A5:ALB-H01205459である。
MALT1活性はABC-DLBCL細胞株の増殖を選択的に維持する上で重要な役割を果たす(Ngo et al., 2006)。したがって、ABCおよびGCB-DLBCL細胞株は、ペプチドZ-VRPR-FMKによるMALT1切断阻害に対して差次的選択性を示す(Ferch et al., 2009;Hailfinger et al., 2009;Rebeaud et al., 2008)。候補低分子が類似の特性を示すかどうかを調べるために、2つのABC-DLBCL細胞株、HBL-1およびTMD8、ならびに1つのGCB-DLBCL細胞株、OCI-Ly1を19個の選択した分子の漸増濃度に曝露した。細胞増殖を、単一用量の化合物への48時間の曝露後に、ATPに基づく代謝発光検定を用いて測定した(図1Cに要約)。3つの化合物は一貫してABC-DLBCL細胞の有意な選択的用量依存的抑制を誘導した(MI-2、p<0.0001;MI-4、p=0.006およびMI-11、p<0.0001 - 回帰余分平方和(Regression extra sum-of-squares)F検定)。したがって、これらの化合物は細胞内で活性であり、ABC-DLBLに選択的で、かつ非特異的細胞毒性はなかった。MI-6およびMI-15もABC-DLBCL細胞の差次的阻害を示したが、統計学的有意性には達しなかった。
化合物MI-2がMALT1阻害剤の開発のための骨格として可能性があるかどうかを確立するために、本発明者らはMI-2を他の化学化合物とインシリコで比較して、可能性のある類縁体を特定した。利用可能なライブラリから類似性スコアが≧70%(Tanimoto類似性関数)である合計704個の類縁体化合物を、LZ-MALT1蛍光検定によりスクリーニングした。MI-2と同等またはそれよりも高い活性を示す19個の類縁体を選択した(図2A)。MI-2とほぼ同等の範囲内の生化学IC50を有する5個の類縁体を、細胞増殖検定におけるさらなる特徴付けのために選択した(図2Bおよび2C)。5個の類縁体(MI-2A1〜5)はすべて、ABC-DLBCL細胞株の選択的抑制の同じ傾向を示し、GI25濃度はマイクロモル濃度の範囲であった(図2C)。化学対照として用いた、インビトロでLZ-MALT1阻害活性のない2個の類縁体化合物(MI-2A6〜7)は、同じ用量範囲で細胞増殖に対してまったく効果がなかった。5個の活性MI-2類縁体を、CYLDのMALT1切断の阻害について検定した。5μMで投与した5個の化合物はすべて、8時間で、陽性対照として用いたZ-VRPR-FMK MALT1ブロッキングペプチド(50μM)と類似の切断阻害を示した(図2D)が、MI-2自体が依然として最も強力な化合物であった。まとめると、化学的に関連する化合物の間のインビトロおよび細胞検定におけるMALT1阻害活性の保存は、MI-2およびその類縁体のMALT1のリード化合物阻害剤としての適合性を示している。
本発明者らは次に、MI-2がMALT1に直接結合するのか、またはMALT1活性に間接的に、例えば、融合タンパク質のLZ領域への結合を通じて影響を及ぼすのかを調べた。異核種単一量子コヒーレンス(HSQC)核磁気共鳴(NMR)分光法を用いて、MALT1のパラカスパーゼドメイン(残基329〜728)へのMI-2の結合を特徴付けた。MI-2を滴定していくと、MALT1の非結合状態に対応する共鳴の強度が低下する一方で、MALT1-MI-2複合体に対応する別の共鳴の組が徐々に現れた(図3A)。この化学シフト変化のパターンはNMR時間スケールにおけるゆっくりした交換に特徴的で、MALT1とMI-2との間の強固な相互作用を示している。対照的に、NMR分光試験では、不活性類縁体MI-2A6およびMI-2A7による結合の証拠は見られなかった(図3B)。
MI-2をリード化合物として確認した後、本発明者らは次にABC-DLBCL細胞におけるMALT1シグナル伝達に対するその効果を調べた。本発明者らはまず、A20、BCL10およびRELBなどのさらなるMALT1基質の切断に対するMI-2の影響を調べた。これらのタンパク質は切断後にプロテアソーム分解に向けられる(Coornaert et al., 2008;Hailfinger et al., 2011;Rebeaud et al., 2008)ため、本発明者らはプロテアソーム阻害剤MG-132を用いて、切断生成物の可視化を促進した(図4A)。HBL-1およびTMD8細胞株をMI-2(2μM)または媒体のいずれかに30分間曝露し、続いてMALT1基質の切断型をMI-2への曝露中に蓄積させるために、5μMのMG-132にさらに1時間(レーン2、3)または2時間(レーン4、5)曝露した。予想どおり、MG132への曝露は、これらのDLBCL細胞においてMALT1の構成的活性によるA20、BCL10およびRELB切断生成物の蓄積を明らかにした。しかし、MI-2への曝露は、切断型の存在量を減少させ、かつ/または全長タンパク質の存在量を増加させ、MALT1酵素活性の欠損と一致していた(図4A)。
MI-2仲介性MALT1阻害効果の範囲をさらに調べるために、本発明者らは6つのABC-DLBCLおよび2つのGCB-DLBCL細胞株のより大きいパネルに向かった。これらの細胞株におけるB細胞受容体およびNF-κB経路に影響を及ぼす遺伝的特徴を表1にまとめている。
インビボ試験のためのMALT1リード化合物としてのその適合性を判定するために、本発明者らはMI-2がマウスで毒性効果を誘導するかどうかを調べた。5匹のC57BL/6マウスを、0.05〜25mg/kgの範囲で10日間、累積用量51.1mg/kgまでの漸増用量のMI-2の1日1回腹腔内(IP)投与に曝露し、別の5匹のマウスを媒体のみ(5%DMSO、n=5)に曝露した(図6A、毒性1)。嗜眠、体重減少(図6B、毒性1)または病気の他の身体的指標の徴候はなかった。25mg/kgの最大投与用量が14日のスケジュールで安全かどうかを確認するために、本発明者らは10匹のマウスを25mg/kgを14日間、累積用量350mg/kgまでのMI-2の1日1回IP投与に曝露し、対照として媒体のみを注射した5匹のマウスを用いた(図6A、毒性2)。5匹のマウスをMI-2投与の14日間の過程後に(5匹の対照と共に)屠殺し、他の5匹を10日間の休薬期間後に屠殺して、遅延毒性を評価した。有毒作用または体重減少(図6B、毒性2)もしくは組織損傷(肉眼的または顕微鏡的)を含む病気の他の指標は見られなかった(図6C1および6C2)。脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、腸、脾臓、胸腺および骨髄組織を試験した。骨髄は、三血球系が成熟中の血液生成を示す、正形成髄であった。骨髄と赤血球との比は4〜5:1であった。巨核球の数および分布は正常であった。線維症も、芽球またはリンパ球の数の増大もなかった。全末梢血球数、生化学検査および肝機能検査は正常であった(表2)。
a媒体およびMI-2処理動物の両方においてグルコースの軽度の増加が見られ、これはおそらくは賦形剤としてのデキストロースの投与によるか、またはマウスが絶食でなかったためであろう。
MI-2がインビボでDLBCLを抑制しうるかどうかを判定するために、本発明者らは、HBL-1およびTMD8(MALT1依存性)ならびにOCI-Ly1(MALT1非依存性)DLBCL細胞をNOD-SCIDマウスの右側腹領域に移植した。腫瘍が平均120mm3の体積に達すれば、マウスをMI-2 25mg/kg/日(TMD8ではn=10、HBL1ではn=5、およびOCI-Ly1ではn=10)または媒体(5%DMSO、TMD8ではn=10、HBL1ではn=4、およびOCI-Ly1ではn=10)のIP注射を受けるように無作為化した。14回目の注射の24時間後に動物を屠殺した。顕著なことに、MI-2は媒体と比べてTMD8(p=0.015、t-検定)およびHBL1(p=0.014、t-検定)ABC-DLBCL異種移植片両方の成長を著しく抑制したが、OCI-Ly1腫瘍(p=0.47、t-検定)の成長には影響がなかった(図7A)。OCI-Ly1腫瘍が影響を受けなかったという事実は、MI-2活性が、宿主の微小環境ではなく、リンパ腫細胞へのその効果によることを示唆している。アポトーシス細胞を検出するための、TUNEL検定を用いての組織検査は、媒体に比べて、MI-2処理したHBL-1(p=0.0008、t-検定)およびTMD8(p<0.0001、t-検定)異種移植片におけるアポトーシス細胞の有意な増大を示したが、OCI-Ly1異種移植片(p=0.5580、t-検定)では差は観察されなかった(図7B)。本発明者らはまた、媒体に比べて、HBL-1(p<0.0001、t-検定)およびTMD8異種移植片(p=0.0006、t-検定)におけるKi-67染色によって測定した増殖の有意な低減を観察したが、OCI-Ly1異種移植片(p=1.0、t-検定)では差は観察されなかった(図7C)。異種移植片におけるNF-κBシグナル伝達に対するMI-2処理の効果を評価するために、c-REL免疫蛍光をパラフィン腫瘍切片で実施した。図4Bおよび4Cに示すデータと一致して、MI-2処理した腫瘍はc-REL核タンパク質の低減を示した(図7D)。したがって、MI-2低分子MALT1阻害剤は、インビボでABC-DLBCLにおける増殖、生存およびNF-κB活性を、リンパ腫細胞自発的様式で特異的に抑制する。
Ac-LRSR-AMCを基質として用い、反応を360/465nmの励起/発光波長で測定した。対照値の平均を阻害パーセントの計算において用いた。最終阻害パーセントを以下の式で計算した:{[蛍光試験化合物(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]/[蛍光陽性対照(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]}×100。Z-VRPR-FMK(300nM)を陽性対照として用い、緩衝液のみを陰性対照として用いた。
細胞増殖を、発光法(CellTiter-Glo、Promega、Madison、WI)およびトリパンブルー色素排除(Sigma、St. Louis、MO)を用いてのATP定量によって判定した。薬物処理細胞における細胞生存度を、それぞれの対照に対して正規化し(分画生存度)、結果を1-分画生存度として示す。CompuSynソフトウェア(Biosoft、Cambridge、UK)を用いて、対照に比べての分画増殖を阻害する薬物濃度を求めた。
8週齢の雄SCID NOD.CB17-Prkdcscid/Jマウスに、継代数の少ない107個のヒトHBL-1、TMD8またはOCI-Ly1細胞を注射した。処置を腹腔内注射により投与した。腫瘍体積を週に3回のデジタルキャリパー測定によりモニターした。すべての手順はUS NIHプロトコルに従い、Animal Institute Committee of the Weill Cornell Medical Collegeによって承認された。
マイクロアレイデータ:GSE40003。
スクリーニングは、緩衝液A(20mM HEPES pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM DTT、0.01%トリトンX-100)中の100nM LZ-MALT1、200μM Ac-LRSR-AMC、および12.5μM試験化合物を含む、384穴黒色プレート(Greiner Bio One、Wemmel、Belgium、カタログ#784076)中の反応液20μlで構成された。反応を、Envision Multilabel Reader(Perkin-Elmer、Waltham、MA)を用い、360/465nmの励起/発光波長で測定した。各反応について2つの時点を測定し;化合物の自己蛍光による偽陽性を排除するために、時点間の蛍光の差(T2-T1)をMALT1活性と考えた。対照値の平均を阻害パーセントの計算において用いた。最終阻害パーセントを以下の式で計算した:{[蛍光試験化合物(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]/[蛍光陽性対照(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]}×100。Z-VRPR-FMK(300nM)を陽性対照として用い、緩衝液のみを陰性対照として用いた。40%阻害を閾値として用い、324個の化合物をMALT1阻害剤の可能性があるとして特定した。陽性ヒットについて、0.122μM〜62.5μMの用量範囲内の濃度-反応実験で妥当性の確認を行い、化合物のIC50(50%の阻害)を求めた。活性はまた、スクリーニングに用いたLZ-MALT1に加え、組換え全長野生型MALT1を用いて、その妥当性を確認した。
MALT1(340〜789)を、GCN4(251〜281)からのロイシンジッパー配列と、N-末端で融合した(LZ-MALT1)。N-末端his標識LZ-MALT1を大腸菌(E. Coli)内で発現させ、Ni-NTAアフィニティクロマトグラフィ(Qiagen、Valencia、CA)と、続いて20mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、および5mM DTTを含む緩衝液中、Superdex 200 HR 10/300(GE Healthcare、UK)でのゲルろ過クロマトグラフィにより精製した。
DLBCL細胞株OCI-Ly1、OCI-Ly7およびOCI-Ly10は80%Iscove培地、20%FBSおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で増殖させた。DLBCL細胞株HBL-1、TMD8、U2932は90%RPMI培地、10%FBS、2mMグルタミン、10mM HepesおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で培養した。DLBCL細胞株OCI-Ly3およびHLY1は80%RPMI培地、20%FBS、2mMグルタミン、10mM HepesおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で培養した。293T細胞は90%D-MEM、10%FBSおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で培養した。すべての細胞株は5%CO2の加湿雰囲気下、37℃で培養した。細胞株を一塩基多型プロファイリング(フィンガープリンティング)によって確認した。
DLBCL細胞株を、48時間の処理中、指数関数的増殖条件下で増殖させた。細胞増殖を、発光法(CellTiter-Glo、Promega、Madison、WI)およびトリパンブルー色素排除(Sigma、St. Louis、MO)を用いてのATP定量によって判定した。発光は、Synergy4マイクロプレートリーダー(BioTek Instruments、Winooski、VT)を用いて測定した。各細胞株の標準曲線を、発光値に対する細胞数(トリパンブルー法で判定)をプロットすることにより計算し、それに応じて細胞の数を計算した。薬物処理細胞における細胞生存度を、それぞれの対照に対して正規化し(分画生存度)、結果を1-分画生存度として示す。CompuSynソフトウェア(Biosoft、Cambridge、UK)を用いて、対照に比べて25%細胞株の増殖を阻害する薬物濃度を求めた(GI25)。実験は三つ組で行った。
類似性検索を0.7カットオフに設定し、Collaborative Drug Discovery(CDD、Burlingame、CA)データベース(www.collaborativedrug.com)の類似性検索機能を用いて実施した。CDD検索機能はChemAxon(www.chemaxon.com、Budapest、Hungary)の(http://www.chemaxon.com/jchem/doc/dev/search/index.html#simil)に記載のハッシュフィンガープリントの標準タニモト類似性機能に基づいている。簡単に言うと、あらゆる問い合わせ構造のハッシュフィンガープリントを計算し、次いで以下の非類似性式を適用する:1-(NA&B/NA+NB-NA&B)、ここでNAおよびNBはそれぞれ分子AおよびBのフィンガープリントにおいて設定されたビット数であり、NA&Bは両方のフィンガープリントにおいて設定されたビット数である。非類似性の閾値は0と1との間の数で、類似性計算におけるカットオフ限界を規定する。非類似性値が閾値未満であれば、問い合わせ構造および所与のデータベース構造は類似であると考えられる。類縁体スクリーニングを、三つ組で行った以外は、一次スクリーニングと同じ方法を用いて実施した。MI-2よりも活性が高い19個の化合物を、さらなる妥当性確認のために選択した。
均一に15Nおよび13C標識されたMALT1(329〜728)を、1g/l [15N]塩化アンモニウムおよび3g/l [13C]グルコース(Cambridge Isotope Labs、Andover、MA)を含むM9培地中で増殖中のBL21(DE3)大腸菌内で発現させ、大腸菌細胞溶解物から(Wiesmann et al., 2012)に記載のとおりに精製した。
HPLC/ESI-MS実験を、1mg/mlタンパク質濃度の5μlの試料で実施した。タンパク質の分離をHP1100システム(Hewlett Packard、Palo Alto、CA、USA)で、POROS R1/Hを充填した1mm×150mm LC Packingsカラム(Perseptive Biosystems、Foster City、CA、USA)を用いて行った。カラムは80℃に維持した。試料をカラムに、Valco model C6UW HPLCバルブ(Valco、Houston、TX、USA)および10μl注入ループを取り付けたCTC PALオートサンプラー(CTC、Zwingen Switzerland)を用いて注入した。HPLCはMassLynxソフトウェア(Micromass、Manchester、UK)により制御した。UV検出は214nmで行った。溶離剤Aは0.05%TFAを含む水であった。溶離剤Bは水:0.045%TFA含有アセトニトリルの1:9混合物であった。20%Bから90%Bの勾配を20分間で流した。流速は典型的には60μl/分であった。LCシステムからの全流量をUV検出セルに導入した後、ESI源に導入した。MassLynxソフトウェアを用いて、HPLCシステムを制御し、UV検出器からのシグナルを処理した。質量分析を、Micromass Z-typeエレクトロスプレーイオン化源を備えたQ-tof(Micromass、Manchester、UK)四重極飛行時間ハイブリッドタンデム質量分析計を用いて行った。取得質量範囲は典型的にはm/z 500〜2000であった。データはMassLynxソフトウェアを用いて記録し、処理した。500〜2000 m/zスケールの較正は、ウマ心臓ミオグロビン(MW 16,951.5Da)の多価イオンピークにより達成した。
384穴黒色プレート(Greiner Bio One、Wemmel Belgium、カタログ#784076)中、8pmolの精製したLZ-MALT1を異なる濃度の化合物MI-2(125、62.5、31.25、15.625、7.8125または0μM)と共に、5%DMSO、20mM HEPES pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCL2、1mM EDTA、1mM DTT、0.01%トリトンX-100を含む緩衝液中、室温で、示した時間(5分から80分)インキュベートし、次いで4μmolのAc-LRSR-AMCを各混合物に加えて、反応を開始した。反応をSpectraMax M5プレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、California USA)により、360/465nmの励起/発光波長、20秒間隔でモニターした。阻害の正規化したパーセンテージを、以下の式で計算した:(M(T2-T1)-N(T2-T1))/(P(T2-T1)-N(T2-T1))*100。ここでM(T2-T1)は200sおよび0sの時点の差シグナルであり、N(T2-T1)は陰性対照の緩衝液だけの差シグナルでありP(T2-T1)は陽性対照のZ-VRPR-FMKの差シグナルである。
MI-2の構造を生成し、その幾何学を最適化した。そのパラカスパーゼおよびIg3ドメインを、Z-VRPR-FMKペプチド阻害剤(PDB ID:3UOA)との複合体で含む、MALT1の原子座標(Wiesmann et al., 2012;Yu et al., 2011)を阻害剤ドッキングのために選択した。ペプチド阻害剤および溶媒分子の除去後、水素原子をMALT1構造に加えた。ドッキングシミュレーションを、MI-2に対するMALT1の可能な3D格子を規定することにより開始した。計算した格子マップは寸法60×40×40ポイントで、間隔0.375Å/ポイントのものであった。AutoDock 4.2(Morris et al., 2009)における一般的アルゴリズムを用い、ドッキングを剛性分子としてのMALT1で実施する一方で、MI-2阻害剤における柔軟性は許容した。最終結果を予測された結合自由エネルギーに基づいて順位付けた。
同量の全タンパク質(20〜75μg)をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)上で分離し、ニトロセルロース膜上に電気泳動転写した。膜を一次抗体(MALT1、BCL-10、CYLDはSanta Cruz Biotechnologies、Santa Cruz、CAから;A20はeBioscience、San Diego、CAから;ホスホ-IκB-α、IκB-α、c-REL、RELBはCell Signaling、Danvers、MAから、およびα-チューブリンはSigmaから)と、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体と共にインキュベートし、化学発光(Pierce、Thermo Scientific、Rockford、IL)により検出した。
細胞増殖におけるMI-2の効果を試験するために、細胞をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシンイミジルエステル(CFSE、Invitrogen、Life Technologies、Grand Island、NY)により、0.5μM、37℃で10分間標識した。CFSEは長命の細胞内分子をカルボキシフルオレセインで共有結合により標識する。各細胞分裂後、蛍光分子は娘細胞中に希釈され、細胞分裂の動力学の比較試験を可能にする。細胞をDAPI(Sigma)で染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。DAPIneg細胞を分析のためにゲートした。
レポーター検定を、12穴皿のウェルごとに2×105細胞の密度で播種した293T細胞中で実施した。100ngの(NF-κB)5-Luc2CP-pGL4および10ngのTK-Renilla内部対照プラスミドを、25ngの示したプラスミド(MIGR1-MALT1WTまたはMIGR1-MALT1C464AおよびpcDNA4-Flag-Bcl10)と共に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて同時形質移入した。溶解物を二重ルシフェラーゼ検定に、製造者のプロトコル(Promega)に従って供した。HBL-1中、5×106細胞あたり5μgの(NF-κB)5-Luc2CP-pGL4および50ngのTK-Renilla内部対照プラスミドを、nucleofection(Amaxa、Lonza、Basel、Switzerland)を用いて同時形質移入した。形質移入の48時間後、細胞を24穴プレートのウェルごとに5×104細胞の密度で播種し、示したとおりに処理した。溶解物を二重ルシフェラーゼ検定に、製造者のプロトコル(Promega)に従って供した。
HBL-1およびTMD8細胞からのRNAを、示した濃度の化合物MI-2または媒体で8時間処理し、mRNAをRNeasy Plusキット(Qiagen、Valencia、CA)を用いて単離し、続いてRNase-Free DNase試薬(Qiagen)を用いてDNアーゼ処理した。RNAの完全性を、RNA 6000 Nano LabChip KitをAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、Santa Clara、CA)で用いて判定した。試料をIlluminaの推奨に従って処理し、cRNAをHumanHT-12 v4 Expression BeadChip(Illumina、San Diego、CA)にハイブリダイズした。アレイをiScanシステム上で走査した。データの前処理および品質管理を、GenomeStudioを用いて実施した。データをクオンタイル正規化と合わせてlog2変換した(Du et al., 2008)。GEOアクセッション番号GSE40003。
8週齢の雄SCID NOD.CB17-Prkdcscid/JマウスをJackson Laboratories(Bar Harbor、MN)から購入し、清浄な環境で飼育した。マウスに、50%マトリゲル(BD Biosciences、#354234)中の、継代数の少ない107個ヒトTMD8またはOCI-Ly1細胞を注射した。処置を、腫瘍が120mm3の平均サイズに達した時点(移植後17日)で開始した。薬物をDMSO中で再構成し、-80℃で使用まで保存し、腹腔内注射により投与した。腫瘍体積を週に3回のデジタルキャリパー測定(Fisher Scientific、Thermo Scientific、Rockford、IL)によりモニターし、式(最小径2×最大径)/2を用いて計算した。データは平均±SEMで表し、差は対応スチューデントt検定によりp<0.05で統計学的に有意と考えた。動物を含むすべての手順はUS NIHプロトコルに従い、Animal Institute Committee of the Weill Cornell Medical College of Cornell Universityによって承認された。
パラフィン包埋した腫瘍異種移植片を切断し、脱ろうし、抗原賦活化にかけた。IF-Pのために、InvitrogenのAlexa Fluor-488結合二次抗体を用い、細胞核をDAPIで対比染色した。蛍光画像を、Axiovert 200M蛍光顕微鏡(Carl Zeiss Inc.、Thornwood、NY).Oberkochen、Germany)を用いて得た。IHCのために、ビオチン結合二次抗体を用いた。次いで、アビジン/ビオチンペルオキシダーゼをスライドに適用した(Vector Laboratories)。ジアミノベンゾアート色素原ペルオキシダーゼ基質(Vector)で発色させ、ヘマトキシリン-エオシンで対比染色した。写真をAxioSkop II光学顕微鏡(Carl Zeiss Inc.)に取り付けたAxioCam(Carl Zeiss Inc.)カメラを用いて得た。試料を病理学者が再検討した。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識、TUNEL検定(ApopTag、Chemicon、Temecula、CA)を用いて、アポトーシスDNA断片化を検出した(Gavrieli et al.、1992)。簡単に言うと、ホルマリン固定したパラフィン包埋異種移植腫瘍を脱ろうし、トリプシン(Zymed、San Francisco、CA)で前処理して、DNAを露出した。内因性ペルオキシダーゼを、3%過酸化水素(Sigma)を用いて反応停止させ、続いてTdT酵素と共に1時間インキュベートした。次いで、抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼをスライドに適用した。ジアミノベンゾアート色素原ペルオキシダーゼ基質(Vector Laboratories、Burlingame、CA)で発色させ、メチルグリーン(Fisher Scientific、Thermo Scientific、Rockford、IL)で対比染色した。写真をAxioSkop II光学顕微鏡(Carl Zeiss Inc.)に取り付けたAxioCam(Carl Zeiss Inc.)カメラを用いて得た。試料を病理学者が再検討した。
患者の非特定化組織をWeill Cornell Medical College Review Boardの指針および承認に従って入手した。患者試料を以前に記載されたとおりに処理した(Cerchietti et al.、2010)。簡単に言うと、リンパ節生検からの単細胞懸濁液を組織の物理的破壊によって得、続いて細胞密度勾配分離を行った(Fico/Lite LymphoH、Atlanta Biologicals、Lawrenceville、Georgia)。細胞数および生存度をトリパンブルー排除により判定した。初代DLBCL細胞を96穴プレート中で培養した。細胞を、20%FBSを含み、抗生物質を補足したアドバンストRPMI培地中で48時間増殖させた。細胞を0.8μMのMI-2(Pt.2には1μM)または対照(DMSO)に四つ組で曝露した。48時間の曝露後、生存度を、トリパンブルー(Sigma)を用いて判定した。すべての試料をそれら自体の重複する対照に対して正規化した。統計学的有意性を、対応T検定を用いて計算した。
Claims (13)
- MALT1を調節する方法であって、MALT1を式(I)の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体の有効な量または濃度と接触させる段階を含む、方法:
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し;
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し;Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり;
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず;
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり;J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり;
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり;J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており;
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり;J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。 - MALT1を生きている動物内部で処理する、請求項1記載の方法。
- 生きている動物が、癌に罹っているヒトである、請求項5記載の方法。
- 癌を処置または予防する方法であって、式(I)の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体の有効用量を患者に投与する段階を含む、方法:
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し;
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し;Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり;
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず;
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり;J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり;
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり;J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており;
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり;J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。 - 癌がリンパ腫である、請求項7記載の方法。
- リンパ腫がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫である、請求項11記載の方法。
- MALT1の低分子調節剤を特定する方法であって、ロイシンジッパー二量体化モティーフと融合したMALT1(340〜789)の組換え型(LZ-MALT1)と、候補調節化合物とを、蛍光発生物質AMC(7-アミノ-4-メチルクマリン)に連結されたMALT1基質ペプチドLRSRを用いて、Ac-LRSR-AMC基質のMALT1による切断がAMCおよび蛍光シグナルの放出をきたすように接触させる段階を含み、ここで候補調節剤存在下でのAc-LRSR-AMC基質のMALT1の組換え型による切断の低減は、候補調節剤がMALT1の低分子調節剤であることを示す、方法。
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